JPH09504423A

JPH09504423A - 修飾マキサディランタンパク質、その調製と使用、および該タンパク質をコードするｄｎａ

Info

Publication number: JPH09504423A
Application number: JP7506514A
Authority: JP
Inventors: マサヒロタジマ; マナミオーヌマ; イーザンエル．ラーナー
Original assignee: Shiseido Co Ltd; General Hospital Corp
Current assignee: Shiseido Co Ltd; General Hospital Corp
Priority date: 1993-08-06
Filing date: 1994-08-05
Publication date: 1997-05-06
Also published as: AU678515B2; WO1995004829A1; CA2167489A1; US5480864A; DE69422928T2; EP0713532B1; DE69422928D1; AU7451494A; EP0713532A1

Abstract

(57)【要約】サシチョウバエ、ルッツォミア・ロンギパルピス(Lutzomyia longipalpis)由来の天然マキサディランに比して強力な生物学的活性を示す修飾マキサディランタンパク質を提供した。修飾マキサディラン融合タンパク質は、トロンビン切断部位を含む。このことにより、融合タンパク質としての修飾マキサディランの製造、およびトロンビンによる消化後の修飾マキサディランタンパク質の回収が可能となった。修飾マキサディランは、強力な血管拡張剤である。

Description

【発明の詳細な説明】修飾マキサディランタンパク質、その調製と使用、および該タンパク質をコードするDNA発明の属する技術分野本発明は、強力な血管拡張因子ペプチドである修飾マキサディラン(maxadilan )タンパク質、および修飾マキサディラン融合タンパク質に関する。本発明はまた、修飾マキサディランおよび修飾マキサディラン融合タンパク質をコードする DNA配列、およびこれらのDNA配列を含有するベクターにも関する。本発明はさらに、増加した特異的活性を有する修飾マキサディランを製造する方法、および組み換え法を用いて製造されるマキサディランタンパク質の収率を増加させる方法に関する。従来技術マキサディランは、サシチョウバエ(sand fly)、ルッツォミア・ロンギパルピス(Lutzomyia longipalpis)の唾液中に存在する、強力な血管拡張因子ペプチドである。このサシチョウバエは、血液を食事として摂る際にその犠牲者の体内に原生動物の寄生虫リーシュマニア(Leishmania)を分泌することによりリーシュマニア症(leishmaniasis)という疾患を蔓延させる。マキサディランの強力な血管拡張効果により、寄生虫の感染力が強化されると考えられている。マキサディランは、患者の体内の一定の領域の血流を増加させることができる治療剤として有用である。マキサディランの生物学的活性を完全に特徴づけ、そしてこの重要なタンパク質の治療への使用を完全に調査するために、マキサディランタンパク質の十分な供給が不可欠である。現在マキサディランは、サシチョウバエ唾液腺からの唾液マキサディランの精製により、または組み換えDNA法により得ることができる。L ernerらおよびShoemakerは、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)という細菌タンパク質との融合タンパク質として、マキサディランの遺伝子をクローニングし発現させた。「Lerner et al.,"Maxadilan:Cloning And Functional Expres si on Of A Gene Encoding This Potent Vasodilator Peptide",Journal of Bio log ical Chemistry,Vol.267,No.2,pp.1062-66,1992」。 GST融合タンパク質を因子Xaで切断すると、マキサディランタンパク質が切り出される。因子Xaは、高価な切断酵素であり、期待ほど効率よくはマキサディランGST融合タンパク質を切断しない。費用が高額なため、そして因子Xaの切断効率が期待以下であるため、より安価に、そしてより効率よく大量の組換え体マキサディランを製造することが本技術分野に必要である。発明の開示したがって本発明は、天然マキサディランタンパク質のN末端にペプチドG-S-I -Lを融合した修飾マキサディランタンパク質を提供することにより、本技術分野における上記の必要を満たすために役立つ。本発明の一つの態様において、修飾マキサディランタンパク質は、残基G-S-I-L-C-D-A-Tをタンパク質のN末端の最初の8アミノ酸として有する。本発明はまた、本発明の修飾マキサディランタンパク質をコードするDNA配列を提供する。該DNA配列は、修飾マキサディランタンパク質を製造するために有用である。さらに本発明は、本発明のDNA配列を含有するベクターを提供する。本ベクターは、原核細胞または真核細胞の宿主における複製または発現に適したベクターでありうる。本発明のベクターを含む宿主細胞微生物もまた、提供される。さらに本発明は、ペプチドL-V-P-R-G-S-I-LのN末端にC末端で融合した細菌タンパク質を含み、さらに該ペプチドのC末端にN末端で融合したマキサディラン天然タンパク質を含む、融合タンパク質を提供する。本発明の典型的な融合タンパク質中の細菌タンパク質は、グルタチオンS-トランスフェラーゼである。さらに本発明は、組換え体修飾マキサディラン融合タンパク質が製造されるような適当な培養条件下で本発明の宿主細胞を培養することにより、本発明の融合タンパク質を製造する方法を提供する。本発明の修飾マキサディランタンパク質を製造するもう一つの方法において、組換え体マキサディラン融合タンパク質が製造されるような適当な培養条件下で本発明の宿主細胞を培養し、そして組換え体融合タンパク質をトロンビンで切断して修飾マキサディランを得る。本発明の方法により製造される修飾マキサディランタンパク質もまた、提供される。本発明はさらに、有効成分として本発明の修飾マキサディランタンパク質を含む血管拡張組成物を提供する。修飾マキサディランは、哺乳類において血管拡張活性を示す。本発明の組成物は、局所適用および皮下注射により優れた効果を提供する。さらに本発明は、哺乳類において血管拡張を誘導し、維持し、そして増加させる方法を提供する。本方法は、血管拡張を誘導し、維持し、または増加させる量の本発明の修飾マキサディランタンパク質を投与することを含む。本発明はまた、哺乳類の皮膚への局所適用に適した組成物を提供する。組成物は、薬剤学的に許容される担体中に、血管拡張を誘導し、維持し、または増加させる量の修飾マキサディランタンパク質を含む。本発明の修飾マキサディランは、天然マキサディラン、または従来のGST融合タンパク質から切断されたマキサディランの少なくとも10倍の特異的活性を有することが見出された。さらに、融合タンパク質をトロンビンで切断することを含む、組換え体修飾マキサディランを製造する操作法が見出された。これにより、因子Xaを用いてGST融合タンパク質を切断する場合の2倍以上の量の修飾マキサディランが製造される。図面の簡単な説明本明細書に含まれ、その一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの態様を図解し、そして説明文と共に本発明の原理を説明するために役立つ。図面において、図１は、プラスミドpUC19-Mas(60K,61A)-GKからのBamHI/EcoRI断片のcDNA配列を示す図である。図２は、プラスミドpGST-GSIL-Max(60K,61A)-GKの構造を示す図である。図３は、本発明のGST−修飾マキサディラン融合タンパク質のアミノ酸配列およびDNA配列を示す図である。図４は、GST-GILマキサディラン融合タンパク質のアミノ酸配列およびDNA配列を示す図である。図５は、GSIL−マキサディランおよびGIL−マキサディランの逆相HPLC溶出曲線を示す図である。図６は、本発明の修飾マキサディランタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。図７は、本発明の修飾マキサディランタンパク質のアミノ酸配列およびDNA配列を示す図である。発明を実施するためのもっとも好ましい態様本発明は、G-S-I-L-C-D-A-TというN末端配列を有する修飾マキサディランタンパク質、および該タンパク質を製造するための操作法に関する。本発明の操作法により、従来の方法により製造されるレベルの2倍以上のレベルで修飾マキサディランを製造できる。本発明の修飾マキサディランタンパク質は、高い生物学的活性を有する。皮膚紅斑アッセイを用いた生物学的活性は、天然マキサディラン、または従来の組換え体融合タンパク質から切断されたマキサディランの活性の少なくとも10倍であった。Ｉ．定義本発明をより完全に理解するため、以下に本明細書で用いる用語を定義する。ａ．アミノ酸の定義アミノ酸残基を表記するため、以下の標準的な略語および記号を本明細書で用いる。ｂ．G-S-I-Lペプチドグリシン−セリン−イソロイシン−ロイシンという配列を有するペプチドを「 G-S-I-L」ペプチドと表記する。アミノ酸配列のN末端が最初のアミノ酸であり、左から右へと進む。最後のアミノ酸がC末端である。従って、G-S-I-Lペプチドは、そのN末端としてアミノ酸残基グリシン(G)、そのC末端としてアミノ酸残基ロイシン(L)を有する。ｃ．G-I-Lペプチドグリシン−イソロイシン−ロイシンという配列を有するペプチドを「G-I-L」ペプチドと表記する。同様に、G-I-Lペプチドは、そのN末端としてアミノ酸残基グリシン残基(G)、そのC末端としてアミノ酸残基ロイシン(L)を有する。ｄ．天然マキサディランタンパク質「天然マキサディランタンパク質」という用語は、サシチョウバエ、ルッツォミア・ロンギパルピスが産生するマキサディランタンパク質を表記するために用いる。本タンパク質は、哺乳類で血管拡張活性を示す。「天然マキサディランタンパク質」および「天然マキサディラン」という用語は、本明細書において交換可能に用いられる。ｅ．修飾マキサディランタンパク質「修飾マキサディランタンパク質」とは、最初の4アミノ酸がG-S-I-LであるN 末端を有する天然マキサディランタンパク質を含むタンパク質である。「修飾マキサディランタンパク質」、「修飾マキサディラン」、および「G-S-I-Lマキサディラン」は、本明細書において交換可能に用いられる。ｆ．修飾マキサディラン融合タンパク質「修飾マキサディラン融合タンパク質」とは、余分なアミノ酸が付加された修飾マキサディランタンパク質である。ｇ．G-I-Lマキサディラン G-I-LというN末端を有する天然マキサディランタンパク質を、本明細書において「G-I-Lマキサディラン」と表記する。ｈ．ヌクレオチドの定義以下の標準的な略語を用い、塩基の化学名によりヌクレオチドを表記する。アデニン A チミン T グアニン G シトシン C ウラシル U ２．天然マキサディランタンパク質以前に、サシチョウバエの唾液腺溶解物からのペプチドが同定され、そして哺乳類で血管を拡張できること、および一時的に免疫を抑制できることが示された。「International Patent Publication No.WO91/00293 of Lerner et al.」および「Ribeiro et al.,Science,Vol.243,pp.212-214(1989)」を参照。本明細書で用いているように、ルッツォミアタンパク質という用語は、ペプチド、活性アナログ、および活性断片などすべてをさす。マキサディランまたはその活性断片は、本発明における使用に適当なルッツォミアタンパク質の例である。マキサディランは、約6800ダルトンの分子量を有し、以下の発明の説明において代表的なペプチドとして用いられる。ルッツォミアタンパク質の少なくとも2つの異型(variant)が、文献で報告されている。一つの型の成虫ルッツォミアタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列およびそれから推測されるアミノ酸配列は、以下の通りである。ゲノムのルッツォミアタンパク質DNA配列およびそれから推測されるアミノ酸配列は、以下の通りである。ゲノムの天然ルッツォミアタンパク質DNA配列は、天然ルッツォミアタンパク質cDNA配列と幾分異なり、異型の天然マキサディランタンパク質遺伝子を表していると考えられている。ゲノムのルッツォミアタンパク質DNA配列は、17アミノ酸リーダーペプチドのDNA配列およびそれから推測されるアミノ酸配列を含む。ルッツォミアタンパク質のシグナル配列もまた、ゲノムDNA配列中に存在する（ヌクレオチド1-51）。天然マキサディランは、外科的に摘出したサシチョウバエ、ルッツォミア・ロンギパルピス唾液腺の通常の精製クロマトグラフィーにより得られる。一対の唾液腺が、約10〜15ngの天然マキサディランを含む。天然マキサディランは、サシチョウバエ、ルッツォミア・ロンギパルピスの唾液腺中の全タンパク質の約1％を占める。天然マキサディランタンパク質の配列を知ることにより、当業者が、治療に使用するための大量のタンパク質を作成することができる。天然マキサディランはまた、通常の化学的な固相または液相ペプチド合成法を用いて合成することもできる。以下に、3-13プライマー（上線）とオリゴ(dT)プライマー（下線の結合部位）でPCRにより増幅したcDNA断片のヌクレオチド配列、アミノ酸翻訳を示す。3-13 プライマー配列中のA Yは、その位置においてCおよびTいずれでもよいことを示す。この配列は、「Lernerら、1064ページ」で報告された。上流プライマー（示していない）と3'-UTプライマー（下線の結合部位）でPCR により増幅したマキサディラン遺伝子断片のヌクレオチド配列およびアミノ酸翻訳を、以下に示す。A、B、C、およびDプライマーの位置は、上線により示す。 Lernerらが用いたCOOH-末端PCRプライマーは、DNAライブラリーを製造するために用いた単離物とは異なるサシチョウバエ単離物に基づいて設計された。したがって組換え体マキサディランのCOOH末端は、60-61の位置に、上記のcDNAおよび遺伝子の配列によりコードされるSer-SerではなくLys-Alaを有する。「Lerner ら、1063ページ」。本発明で用いるのに適当な天然マキサディランタンパク質は、一次アミノ酸構造のかわりに、その化学的および生物学的性質により特徴づけることができる。特に、本発明において用いるのに適した天然マキサディランタンパク質は、哺乳類における血管拡張、または一時的な免疫抑制を引き起こすことができる。「国際特許出願公開第WO91/00293号」で開示されたように、天然マキサディランタンパク質の血管拡張活性は、収縮したウサギ大動脈弓(aortic ring)の少なくとも約100％の弛緩により示される。「国際特許出願公開第WO91/00293号」に開示されたように、一時的な免疫抑制は、免疫刺激のマーカーとしてのマクロファージによるH₂O₂生成のアッセイにより示される。例えば、H₂O₂生成が、本アッセイにおいて少なくとも約75％抑制される。本発明の一つの態様において、天然マキサディランタンパク質は、質量分析により決定した約6839ダルトンの分子量を有する。もう一つの態様において、本発明において用いられる天然マキサディランタンパク質は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)との関係により特徴づけられる。すなわち、天然マキサディランタンパク質は、逆相高速液体クロマトグラフィーカラムにおけるアセトニトリル-H₂O-トリフルオロ酢酸溶出で、CGRPより先に溶出されるという特徴を有する。「国際特許出願公開第WO91/00293号」を参照。天然マキサディランタンパク質は、動物皮膚における紅斑誘導により測定される血管拡張活性が、「国際特許出願公開第WO91/00293」で開示されたアッセイにより決定したCGPRの活性より少なくとも80〜100倍大きいをいうことによっても特徴づけられる。天然マキサディランタンパク質、またはその活性アナログおよび断片が、本発明の実施において用いられうる。天然マキサディランタンパク質の活性アナログおよび断片は典型的に、天然マキサディランタンパク質の活性部分の配列の十分に類似した(duplicative)アミノ酸配列を含むタンパク質であり、哺乳類における天然マキサディランの生物学的効果を誘導し、維持し、または増加させることができる。本発明のタンパク質は、「国際特許出願公開第WO91/00293号」、または本明細書で開示されるものと同一である必要はない。変化は、天然マキサディランタンパク質に関連する生物学的性質を実質的に減少させないような局所的な変異によりおこりうる。そのような変化は、溶解物から単離したタンパク質、および化学的にまたは組み換え法により構築したタンパク質中に見られる。３．本発明の修飾マキサディランタンパク質天然マキサディランタンパク質は、C-D-A-TというN末端配列を有する。本発明は、N末端配列G-S-I-L-C-D-A-Tを有する天然マキサディランタンパク質である、修飾マキサディランタンパク質を提供する。本発明の修飾マキサディランタンパク質は、天然マキサディランタンパク質より高い生物学的活性を有する。特に、修飾マキサディランの生物学的活性は、皮膚紅斑アッセイで、天然マキサディランの活性の少なくとも10倍である。４．本発明の修飾マキサディラン融合タンパク質本発明のもう一つの態様において、修飾マキサディランタンパク質は、N末端を有し、そしてタンパク質のN末端の近傍にプロテアーゼトロンビンの切断部位が導入されている。そのため、融合タンパク質の切断により、哺乳類において血管拡張活性を有する修飾マキサディランタンパク質を含むポリペプチドを生じる。トロンビン切断部位は、修飾マキサディランタンパク質のN末端の上流に、トロンビンが特異的な適当なアミノ酸を供給することにより、導入される。トロンビンは、Arg/Lys-Xaa結合においてポリペプチド基質を切断するプロテアーゼである。これらのアミノ酸残基を、修飾マキサディランタンパク質のN末端の直前に融合させる。トロンビンによる効率的な切断のため、修飾マキサディラン基質のトロンビン切断部位に隣接してArgまたはLysを供給するべきである。例えば、トロンビンのための適当な切断部位は、(a)P3およびP4は疎水性アミノ酸で、P1'およびP2'は非酸性アミノ酸である、P4-P3-Pro-Arg-P1'-P2'、および( b)P2またはP1'がGlyである、P2-Arg-P1'という構造を有する。「Eur.J.Biochem. ,151,217-224(1985)」を参照。本発明の好ましい態様において、トロンビンの切断部位は、P2-Arg-P1'の構造を有する。P2はVal、P1'はGlyであり、そしてP1'は修飾マキサディランタンパク質のN末端と一致する。トロンビン切断部位は、修飾マキサディランタンパク質のN末端の上流の4アミノ酸以内に供給される。本発明の好ましい態様において、トロンビン切断部位を含むアミノ酸を、修飾マキサディランのN末端に直接的に融合させる。本発明の好ましい態様において、修飾マキサディラン融合タンパク質は、ペプチドL-V-P-RのC末端にN末端で融合した修飾マキサディランタンパク質を含む。驚くべきことに、天然マキサディランのN末端にペプチドL-V-P-R-G-S-I-Lを融合させることにより天然マキサディランを変化させると、トロンビンが切断し、高収率、高純度、そして高生物学的活性の本発明の修飾マキサディランを生じるような部位が供給される。トロンビン認識配列に融合した修飾マキサディランを含む修飾マキサディラン融合タンパク質を、さらに異種のポリペプチドのC末端にN末端で融合させることにより、タンパク質の生産、加工処理、および回収を促進させることができる。本発明の好ましい態様において、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)と修飾マキサディランタンパク質との間にトロンビン認識配列を有する、GSTとの修飾マキサディラン融合タンパク質が、提供される。融合タンパク質においてGST を使用することにより、トロンビンでの消化の前にグルタチオン−アガロースアフィニティーカラムにより容易に精製できるようになるため有利である。その他のポリペプチドとの修飾マキサディランの融合タンパク質が、本発明において用いられうるということが理解される。その他の融合タンパク質の例としては、β −ガラクトシダーゼ(β-galactosidase)、チミジンキナーゼ(thymidine kinase) 、クロロアンフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(chloroamphenicol acet yl transferase)、プロテインA(protein A)、および分泌可能タンパク質(secret able proteins)を基本としたものが挙げられる。５．本発明のタンパク質の発現本発明の修飾マキサディランタンパク質は化学的手法により合成できるが、組み換え法による修飾マキサディランの調製により、従来より高純度、低コストの良いタンパク質供給源が提供される。特に、修飾マキサディランタンパク質は、適当な微生物中でタンパク質をコードするDNA配列を発現させることにより調製できる。したがって、本発明は、本発明の修飾マキサディランタンパク質または融合タンパク質をコードするDNA配列を含む。天然マキサディランタンパク質をコードするDNAは、通常の手法により調製できる。例えば、RNAをサシチョウバエ、ルッツォミア・ロンギパルピスの摘出唾液腺から抽出できる。RNAを逆転写してcDNAを製造し、そのcDNAを適当なプライマーを用いてポリメラーゼチェーン反応により増幅できる。完全な天然マキサディランコード配列が既知であるため、天然マキサディラン遺伝子はPCRにより増幅できる。本手法は、「Lerner et al.,J.Biol.Chem.,267:1062-1066(1992)」に開示されている。本発明のタンパク質の製造に利用される宿主細胞に適したコドンを置換することにより、組換え体マキサディランの収率がさらに増加しうる。天然マキサディランタンパク質をコードするDNAは、G-S-I-Lペプチド、またはトロンビン認識部位が必要な場合にはペプチドL-V-P-R-G-S-I-LをコードするDNA 断片の結合により、修飾される。DNA断片は、一本鎖または二本鎖である。断片が一本鎖の場合、通常の方法に従いDNAポリメラーゼを用いて二本鎖に変換しうる。天然マキサディランタンパク質をコードするDNAに結合させる核酸断片は、いかなる部位とも組み合わせが容易な付着末端を有していてもよい。また核酸断片は、タンパク質をコードするDNAの対応する平滑末端に結合させることができる、一つまたは複数の平滑末端を有していてもよい。結合させる核酸断片は、もし必要であれば、つづいてエキソヌクレアーゼ消化することにより処理することができる。その結果、結合させる核酸断片が望ましい組み合わせの付着末端を含まない場合、断片をリンカー(linker)またはアダプター(adaptor)を追加することにより修飾できる。本発明の修飾マキサディランタンパク質の製造において、広範な種類の宿主細胞および発現ベクターを用いることができる。適当な宿主および発現ベクターの選択は、当業者に周知の数多くの変量(variables)により制御される。これらの変量には、マキサディランに融合したタンパク質の毒性や精製の容易性、融合タンパク質の発現の容易性、およびコストが含まれるが、これらに限定されない。本発明の好ましい態様において、修飾マキサディランタンパク質は、ペプチド L-V-P-R-G-S-I-LをコードするDNA配列が結合した5'末端を有する、天然マキサディランをコードするDNA配列から調製される。結果として得られるDNA配列がコードするマキサディラン前駆体ポリペプチドは、酵素トロンビンの切断部位を有する。意外にも、この切断部位は酵素トロンビンの影響を受けやすく、トロンビンは逆に修飾マキサディランタンパク質の生物学的活性には影響を及ぼさないことが見出された。この前駆体ポリペプチドをトロンビンで切断すると、因子Xaを用いずに修飾マキサディランタンパク質が得られる。さらに、意外なことに、従来用いられてきたマキサディラン前駆体ポリペプチドを、トロンビンが因子Xaより効率よく切断するということが見出された。本発明のもう一つの好ましい態様において、修飾マキサディランタンパク質は、ペプチドL-V-P-R-G-S-I-Lをコードする第一のDNA配列、そして第一のDNA配列の上流で第一のDNA配列に結合した第二のDNA配列を結合した5'末端を有する、天然マキサディランタンパク質をコードするDNA配列の発現により調製される。異種ペプチドをコードする第二のDNA配列は、すでに述べた。異種ペプチドの一例は、グルタチオンS-トランスフェラーゼである。このペプチドのDNA配列は、当業者によく知られている。「Smith et al.,Gene(Amst.)67:31-40(1988)」を参照。細菌サブクローニングベクターM13 mp10およびM13 mp11を、本発明におけるcD NAのサブクローニングに用いた。その他の適当なサブクローニングベクターには、pUC18およびpUC19が含まれる。本発明は、細菌融合タンパク質、細菌発現ベクター、および細菌宿主細胞を用いて実施した。その他の発現系も、トロンビンにより切断されうる修飾マキサディラン融合タンパク質を発現するために用いられうる。例えば、酵母および哺乳類発現ベクターが用いられうる。典型的なベクターは、pMC1871、pEZZ18、pMSG-CAT、pCH110、およびpBPVである。本発明の好ましい発現ベクターは、pGEX-2Tである。その理由は、トロンビン切断部位をコードするDNA配列を含むためである。多くの異なる細胞が、本発明のタンパク質の製造に適している。これらには、細菌（枯草菌、大腸菌）、酵母細胞、および哺乳類細胞などの有名な宿主細胞が含まれる。本発明のタンパク質の発現に好ましい宿主細胞には、lac I^qを含む大腸菌、例えば大腸菌JM105およびM15が含まれる。すでに言及したように、本発明の修飾マキサディラン融合タンパク質をトロンビンで切断することにより、修飾マキサディランが供給される。約1μg/mlから約100mg/mlまでのトロンビン濃度が、約1μg/mlから約10g/mlまでの修飾マキサディラン融合タンパク質を切断するために用いられうる。トロンビン消化は、約 5分から約30時間、約15℃から約40℃までの温度で、約6から約9のpHで、緩衝液の存在下で行うことができる。適当な緩衝液の例としては、HEPES-塩酸、TRIS- 塩酸、リン酸ナトリウム、または酢酸カリウム緩衝液が挙げられる。好ましい緩衝液は、 TRIS-塩酸である。緩衝液として50mM TRIS-塩酸を用い、10μg/mlトロンビン、一時間、37℃、pH7.4の条件下で本発明の融合タンパク質を切断すると、逆相HPL Cによる精製後に高純度および高生物学的活性を有する修飾マキサディランタンパク質が製造されることが見いだされた。本発明のタンパク質は、切断消化により回収し、それから精製する。好ましくは、タンパク質は逆相高圧液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)により精製されるが、当業者に知られたその他の精製法も用いられうる。これらのその他の精製法の典型的なものは、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過である。組み換え法による天然マキサディランタンパク質の発現の一例は、「"Express ion of Recombinant Maxadilan,Maxadilan,Cloning and Functional Expression of the Gene Encoding This Potent Vasodilator Peptide",-Journal of Biolo gical Chemistry,Vol.267,No.2,Issue of January 15,pp,1063,Ethan Lerner an d Charles Shoemaker,authors」という題の論文中に見出される。６．本発明の修飾マキサディランタンパク質を用いる組成物および方法本発明の修飾マキサディランタンパク質は、哺乳類に有効量の該タンパク質を投与することにより、哺乳類において血管拡張を誘導し、維持し、または増加させるために有用である。対象は、ヒトであることが好ましいが、本発明の組成物および方法は、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、およびその他の哺乳類のようなその他の霊長類およびその他の動物にも用いることができる。該タンパク質は、局所適用または皮下注射により目的の部位に適用することができる。 (a)局所適用のための組成物本発明の組成物は、修飾マキサディランタンパク質を適当な担体中に取り込ませることにより、局所適用に適した形態へと処方することができる。局所適用のための担体は、組成物が適当な濃度で皮膚上に実質的に平均に適用され分配されるように、修飾マキサディランタンパク質および組成物中のその他の剤のための希釈剤、分散剤、または溶剤としてはたらく物質である。好ましくは、担体は、修飾マキサディランタンパク質を皮膚へ浸透させ、血管拡張が必要な環境への直接的な到達を促進するものである。担体は、表面的に(cosmetically)許容される、薬剤学的に許容される、または生理学的に許容される固体、半固体、または液体の担体であり、修飾マキサディランタンパク質を皮膚へ適当な希釈度で輸送できる担体である。担体の性質は、選択された組成物の投与方法に依存する。担体は、それ自体不活性であってもよく、または組成物に対して生理学的または薬剤学的な利益をもたらすものであってもよい。薬剤学的に許容される担体の例としては、水、スクアレン、流動パラフィン、脂肪酸、一価アルコール、多価アルコール、またはプロピレングリコールが挙げられる。本発明の組成物の局所適用のための担体は、水、または水以外の少なくとも表面的に許容される担体を基本とする。非水溶性の表面的に許容される担体は、局所適用に適した組成物を提供するために水と組み合わせることもできるということが理解されよう。本発明の組成物において用いられうる担体には、皮膚軟化剤 (emollients)、溶剤(solvents)、湿潤剤(humectants)、濃縮剤(thickeners)、または粉末(powders)のような、固体または液体が含まれる。表面的に許容される担体の例としては、硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン付加物(polyoxyethylene adduct of hardened castor oil)、グリセロール(glycerol)、ジプロピレングリコール(dipropylene glycol)、1,3-ブチレングリコール(1,3-butylene glycol )、ポリエチレングリコール(polyethylene glycol)、セチルイソオクタン酸(cet ylisooctanate)、スクアレン、ワセリン(vaseline)、プロピルパラベン(propylp araben)、水、流動パラフィン、セトステリアリルアルコール(cetosterearyl al cohol)、モノステアリン(glyceryl monostearate)、およびエチレンオキシドアルキルエーテル(ethylene oxide alkyl ether)が挙げられる。修飾マキサディランタンパク質は、本発明の方法および組成物において、またはそれらとその他の既知の治療剤との組み合わせにおいて利用されうる。例えば、修飾マキサディランは、一つまたは複数の以下の剤と組み合わせて用いられうる。血管拡張剤、アミノ酸、皮膚亢進剤(skin-hyperactive agents)、抗炎症剤、メントールや油脂や高級脂肪酸や高級アルコールなどの冷媒(refrigerants)、および多価アルコール。界面活性剤、香料、抗酸化剤、紫外線吸収剤、色素、エタノール、水、湿潤剤、高圧ガス(propellants)、および濃縮剤が、本発明の効果を減じない程度に本発明の方法および組成物において選択的に用いられうる。本発明の修飾マキサディランタンパク質は本発明の組成物においてきわめて低レベルで用いられるが、一般的に修飾マキサディランタンパク質は、局所適用において、組成物の総重量に対して約1x10^-5から約5％、好ましくは約1x10^-5から約3％の量で用いられる。本発明による組成物は、皮膚に直接適用されるか、または皮下注射により適用される。本発明による組成物の投与量は、年齢、個人差、症状などにより多様に変化するが、成人の場合一日に体重1kgあたり修飾マキサディランタンパク質が5 00fgから500mgの範囲、好ましくは100pgから100mgの範囲が一般的である。成人ヒトの血管拡張効果は、一日に宿主体重1kgあたり約100fgから約100mg、より好ましくは約100pgから約100mgの修飾マキサディランタンパク質の有効量の組成物を投与することにより達成される。一つの態様において、マキサディランは、平方cmあたり100fgから100mg、好ましくは100pgから100mgの範囲でヒトに適用される。マキサディランは、局所組成物中に体重の約5.0x10^-5から約5.0x10^-1 パーセント、好ましくは約5.0x10^-8から約5.0x10^-3パーセントの量で含まれる。用いられる正確な投与法(regime)は、個人の状態のようないくつかの要因に依存するが、治療する医者により容易に決定される。治療は、少なくとも目的の効果が得られるまで継続するべきである。 (b)皮下注射のための組成物本発明の組成物の患者への局所適用に加えて、本発明の組成物は、皮下注射によっても患者に投与され、血管拡張を誘導し、維持し、または増加させうる。修飾マキサディランタンパク質はきわめて優れた血管拡張効果を有し、そのため皮下注射により一日に宿主体重1kgあたり少なくとも1pgの投与量で有効である。天然マキサディランタンパク質、および本発明の修飾マキサディランタンパク質は、1993年2月12日に出願された米国特許出願第08/017,016号(Attorney Docke t No.05136.002)に開示された方法および組成物においても有用である。本発明はその開示全体を参照しており、それは本明細書に参照として含まれる。実施例1 サシチョウバエマキサディランcDNAのサブクローニングおよび単離マキサディランcDNAを、Lernerらにより提供された発現プラスミドpGEX-3X-Ma_x より得た。このプラスミドを、制限酵素BamHIおよびEcoRIで切断した。DNAの0. 2Kb断片を、低温溶解アガロース(low temperature melted agarose)からフェノール抽出により単離した。これらの断片を、サブクローニングベクターM13mp10 およびM13mp11にサブクローニングした。M13mp10およびM13mp11のDNAを制限酵素 BamHIおよびEcoRIで消化し、それからBamHIおよびEcoRI-切断cDNAをこれらのベクターにT4DNAリガーゼを用いて挿入した。いくつかの異なるサブクローンを選択し、制限酵素BamHIおよびEcoRIまたはHi ndIIIで切断することにより、サブクローニングしたマキサディランcDNAをサブクローニングベクターより切り出した。0.2kbのサイズ領域を有する断片を、制限マッピングおよび直接DNA配列決定により解析した。断片のDNA配列を、DNAシーケンサー(日立 WS-10A)を用いてシーケナーゼジデオキシチェーンターミネーション法（米国バイオケミカル社/United States Biochemical Corporation）により決定した。実施例2 マキサディラン-GST融合タンパク質の発現ａ．発現ベクターの構築図1に示すようなマキサディランcDNA配列を有するプラスミドpUC19-Max(60K,6 1A)-GKを、マキサディラン融合タンパク質発現プラスミドpGST-GSIL-Max(60K,61 A)-GKを製造するために用いた。アミノ酸残基L-V-D-Rをコードする市販の発現ベクターpGEX-2T（ファルマシア社）を、BamHIおよびEcoRIで切断した。プラスミドpUC19-Max(60K,61A)-GKをBamHIおよびEcoRIで切断し、図1に示すようなマキサディランcDNA配列を切り出した。このcDNA配列を、BamHIおよびEcoRI 切断-pGEX2Tへ挿入した。これに続き、マキサディランcDNA含有pGEX2TプラスミドをBamHIで切断した。付着末端をT4DNAポリメラーゼで埋め、それからライゲーションした。ベクターpGST-GSIL-Max(60K,61A)-GKの最終的な構造を図2に示す。これは、GSTをコードする配列、L-V-P-R-G-S-I-LをコードするDNA、マキサディランをコードする配列をこの順に含む。配列L-V-P-R-G-S-I-Lは、トロンビン切断部位をコードする。GST-LVPR-GSIL-マキサディラン融合タンパク質のアミノ酸およびDNAの配列を、図3に示す。比較のため、もう一つの発現プラスミドpGIL-Max(60K,61A)-GKを、1063ページに開示されたLernerらの方法を用いて構築した。このプラスミドは、ペプチドE- G-R-G-I-Lがマキサディランに融合し、それにGSTが融合したものを含む融合タンパク質をコードする。配列E-G-R-G-I-Lは、因子Xa切断部位をコードする。GST-E GRGIL-マキサディラン融合タンパク質のアミノ酸およびDNAの配列を図4に示す。この融合タンパク質を因子Xaで切断したとき、生じるマキサディランはN末端アミノ酸配列G-I-L-C-D-A-Tを有する。「J.Biol.Chem.267,1062-1066(1992)」を参照。ｂ．トランスフェクションおよび発現 MandellおよびHigaのトランスフェクション法を用いて、発現ベクターpGST-GS IL-Max(60K,61A)-GKを大腸菌HA101にトランスフェクションした。「Mandel,M.,a nd Higa,A.,1970,Calcium,dependent bacteriophage DNA Infection.J.Mol.Biol .53,154」。 GSTプラスミドを含む形質転換大腸菌を、37℃で3時間LB培地で培養した。これらの細胞を、10⁹細胞につき2ミリモルの濃度のイソプロピル-β-D-チオ-ガラクトピラノシド(IPTG)で誘導した。5時間後、上清中のタンパク質レベルは、全細胞タンパク質の10％であった。細菌を、遠心分離により上清より分離した。ｃ．融合タンパク質の切断および精製上清中のGSIL-マキサディランGST融合タンパク質を、10μg/mlトロンビン（持田）を用いて切断した。消化は、37℃で一時間行った。 GIL-マキサディラン融合タンパク質を、37℃で5時間、100μg/mlの濃度の因子 Xaで切断した。切断後、GILマキサディランタンパク質およびGSILマキサディランタンパク質をRP-HPLCを用いて精製した。CAPCELL PAKC-8 SG 300（資生堂）カラムを、島津社製のShimadzu LC6Aシステムで用いた。タンパク質を、アセトニトリル勾配(0. 1％TFA/水溶液(pH2.0)および0.1％ TFA/アセトニトリル溶液）を用いて溶出した。RP HPLCカラムは、50〜100kg-f/cm²の圧力で20分間行った。 GSILおよびGILマキサディランタンパク質の、RP IIPLC精製の結果を図5に示す。約7.1分の保持時間の物質が、ABI 471Aペプチドシーケンサーを用いたN末端ペプチド配列分析により、マキサディランであることが決定された。このピーク中のタンパク質はまた、マキサディランのダイマーと予想される大きさを有していることが、SDS-PAGEデータより決定された。修飾マキサディランタンパク質のアミノ酸配列を、図6に示す。修飾マキサディランタンパク質のアミノ酸およびcDN Aの配列を図7に示す。 RP HPLCを用いて精製したGSILおよびGILマキサディランタンパク質の純度は、 RP-HPLC分析データを用いて95％以上の純度であると決定された。ｄ．トロンビンまたは因子Xaで切断した融合タンパク質のタンパク質収率および切断酵素効率の比較プラスミドpGST-GSIL-Max(60K,61A)-GKをトランスフェクションした大腸菌の1 リットルの培養液から、精製および融合タンパク質のトロンビン切断後に、0.7m gのGSIL-マキサディランタンパク質が得られた。対照的に、pGILをトランスフェクションした大腸菌の培養液からは、精製および融合タンパク質の因子Xa切断後に、0.3mgのGIL-マキサディランタンパク質しか得られなかった。トロンビンまたは因子Xaのいずれかによる、GST-マキサディラン融合タンパク質の切断の結果を表1にまとめる。明らかに、トロンビンは因子Xaよりマキサディラン融合タンパク質の切断において効率がよい。トロンビンは、モルを基本として、因子Xaより効率がよい。トロンビンと因子Xaの分子量は、各々37および56kDaである。実施例3 生物学的活性アッセイ GSIL-マキサディラン、GIL-マキサディラン、および天然マキサディランの生物学的活性を、「Lernerら、1063ページ」の方法に従いウサギ皮膚紅斑アッセイを用いて分析した。簡潔に述べると、ニホンシロウサギにGSIL-マキサディラン、GIL-マキサディラン、または天然マキサディラン（Lernerら）を経皮的に注射した。生理食塩水およびカルシトニン遺伝子−関連ペプチド（CGRP）を、対照として用いた。CGRPは、血管拡張因子ペプチドである。「Lernerら、1065ページ」。マキサディランタンパク質（すべて純度約96％）を、2x10^-5μg/mlの濃度で、 0.9％生理食塩水溶液中に懸濁した。50μlのタンパク質または対照溶液を、ウサギの背の皮膚の下に経皮的に注射した。注射した皮膚の写真を、15分および6時間の間隔で撮影した。紅斑アッセイの結果を表2に示す。試験したマキサディランまたは対照物質の各濃度に対して、5つの異なる測定を行った。 GSIL-マキサディランは、GIL-マキサディランまたは天然マキサディランより生物学的活性が高い。GISL-マキサディランの注射では10^-11または10^-12ｇでも1 5分後に紅斑を刺激したが、GIL-マキサディランおよび天然マキサディランはこれらの濃度で不活性であった。6時間後、GSIL-マキサディランは10^-12gのレベルでも活性であったが、GIL-および天然マキサディランは不活性であった。要約すると、本発明により、大量のマキサディランをより効率的にかつより低コストで製造することが可能となる。本発明の組換え体修飾マキサディランタンパク質は、高い生物学的活性を有する。これらの目的を達成するため、マキサディランDNAをクローニングし、クローニングしたDNAを組み換えDNA法を用いて発現させ、修飾マキサディランタンパク質を含む融合タンパク質を製造した。融合タンパク質は、マキサディランタンパク質のN末端にそのC末端で融合したペプチドL-V-P-R-G-S-I-LにそのC末端で融合したGSTを含む。アミノ酸配列L-V-P-R-G-S -I-Lは、トロンビン切断部位をコードし、そして従来用いられていた因子Xa切断部位は除去された。 Lernerらの因子XaによるGST融合タンパク質の切断により、N末端配列G-I-L-C- D-A-Tを有する修飾マキサディランタンパク質が生じるが、一方天然非修飾マキサディランのN末端配列は、C-D-A-Tである。トロンビンで切断すると、本発明の融合タンパク質は、そのN末端配列としてアミノ酸G-S-I-L-C-D-A-Tを有する修飾マキサディランタンパク質を生じる。以下は、修飾マキサディランタンパク質を含む本発明の組成物の具体例である。実施例4 水中油型エマルションエマルションが、以下の組成を有する相A、相B、相C、相D、および相Eより調製される。相A 修飾マキサディランタンパク質 1.0 ポリオキシエチレン(60モル)付加硬化ヒマシ油 2.0 グリセロール 10.0 ジプロピレングリコール 10.0 1,3-ブチレングリコール 5.0 ポリエチレングリコール1500 5.0相B セチルイソオクタン酸 10.0 スクアレン 5.0 ワセリン 2.0 プロピルパラベン 2.0 相C 1％カルボキシビニルポリマー水溶液 30.0 ヘキサメタリン酸ナトリウム 0.03 脱イオン水 8.35相D 脱イオン水 4.5相E 水酸化カリウム 0.12 脱イオン水 5.0 相Aおよび相Bを別々に60℃で加熱溶解し、それからホモミキサー(homomixer) で混合しゲルを製造する。それに相Dを徐々に添加し、ホモミキサーにより分散させる。続いてそれに分散させた相Cを添加し、最後に相Eを添加し、次にホモミキサー処理により水中油型の乳液を得る。実施例5 クリームの組成クリームが、以下の組成を有する相Aおよび相Bより調製される。相A 修飾マキサディランタンパク質 5.0 流動パラフィン 5.0 セトステリアリルアルコール 5.5 モノステアリン 3.0 EO-(20モル)-2-オクチルドデシルエーテル 3.0 プロピルパラベン 0.3 香料 0.1相B グリセロール 8.0 ジプロピレングリコール 20.0 ポリエチレングリコール4000 5.0 ヘキサメタリン酸ナトリウム 0.005 脱イオン水 49.095 相Aおよび相Bを各々別々に加熱溶解し、それから互いに混合する。ホモミキサーにより乳化し、クリームを得る。実施例6 ゲルの組成ゲルが、以下の組成を有する5つの相を組み合わせることにより調製される。相A 修飾マキサディランタンパク質 3.0 ポリオキシエチレン(60モル)付加硬化ヒマシ油 2.0 グリセロール 10.0 1,3-ブチレングリコール 5.0 ポリエチレングリコール1500 5.0相B セチルイソオクタン酸 10.0 ワセリン 8.0 プロピルパラベン 2.0相C 1％カルボキシビニルポリマー水溶液 30.0 ヘキサメタリン酸ナトリウム 0.03 脱イオン水 8.35相D 脱イオン水 4.5相E 水酸化カリウム 0.12 脱イオン水 12.0 相Aおよび相Bを各々別々に60℃で加熱溶解し、それからホモミキサーにより混合してゲルを製造する。それに相Dを徐々に添加し、ホモミキサーで分散させる。続いて、分散させた相Cをそれに添加し、最後に相Eを添加し、ホモミキサー処理によりゲル組成物を得る。本発明のその他の態様が、本明細書に開示した具体例および実施例を考慮することにより、当業者に明らかになるであろう。具体例および実施例は、例としてのみ考慮されたい。本発明の範囲および趣旨は以下の請求の範囲に示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＲ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．ペプチドG-S-I-Lが天然マキサディランタンパク質のN末端に融合した、修飾マキサディランタンパク質２．N末端の最初の8アミノ酸がG-S-I-L-C-D-A-Tである、請求の範囲１記載の修飾マキサディランタンパク質３．図6のアミノ酸配列を有する、請求の範囲１記載の修飾マキサディランタンパク質。４．10^-12g投与することによって皮膚紅斑を刺激することができる、請求の範囲 3記載の修飾マキサディランタンパク質。５．天然マキサディランタンパク質より10倍皮膚紅斑刺激活性が強い、請求の範囲3記載の修飾マキサディランタンパク質。６．請求の範囲1記載の修飾マキサディランタンパク質をコードするDNA配列。７．図7のDNA配列を有する請求の範囲6記載のDNA配列。８．請求の範囲6記載のDNA配列を含むベクター。９．原核細胞ベクターおよび真核細胞ベクターからなる群の中から選ばれる請求の範囲8記載のベクター。１０．請求の範囲8記載のベクターを含む細胞。１１．原核細胞および真核細胞からなる群の中から選ばれる請求の範囲10記載の細胞。１２．修飾マキサディランタンパク質がN末端を有し、ArgまたはLysを含むペプチド配列が修飾マキサディランタンパク質のN末端に隣接して融合しており、該ペプチド配列はトロンビン切断部位を含む、請求の範囲1記載の修飾マキサディランタンパク質を含む修飾マキサディラン融合タンパク質。１３．N末端配列L-V-P-R-G-S-I-Lを有する天然マキサディランタンパク質を含む、請求の範囲12記載の修飾マキサディラン融合タンパク質。１４．C末端を有する細菌タンパク質グルタチオンS-トランスフェラーゼが、C末端において修飾マキサディランタンパク質のN末端に融合した、請求の範囲13記載の修飾マキサディラン融合タンパク質。１５．図3のアミノ酸配列を有する請求の範囲12記載の修飾マキサディラン融合タンパク質。１６．請求の範囲12記載の修飾マキサディラン融合タンパク質をコードするDNA 配列。１７．図3のDNA配列を有する請求の範囲16記載のDNA配列。１８．請求の範囲16記載のDNA配列を含むベクター。１９．原核細胞ベクターおよび真核細胞ベクターからなる群の中から選ばれる請求の範囲18記載のベクター。２０．GSIL-MAX(60K,61A)-GKである請求の範囲18記載のベクター。２１．請求の範囲18記載のベクターを含む細胞。２２．原核細胞および真核細胞からなる群の中から選ばれる請求の範囲21記載の細胞。２３．大腸菌HA101、大腸菌JM105、大腸菌M15からなる群の中から選ばれる請求の範囲22記載の細胞。２４．修飾マキサディラン融合タンパク質が製造される培養条件下で請求の範囲 21記載の細胞を培養することを含む、修飾マキサディラン融合タンパク質を製造する方法。２５．（ａ）修飾マキサディラン融合タンパク質が製造される培養条件下で請求の範囲21記載の細胞を培養すること、および（ｂ）融合タンパク質をトロンビンで切断し修飾マキサディランタンパク質を生成することを含む修飾マキサディランタンパク質を製造する方法。２６．請求の範囲25記載の方法により製造された修飾マキサディランタンパク質。２７．血管拡張を誘導し、維持し、または増加させる量の請求の範囲１記載の修飾マキサディランタンパク質を哺乳類の皮膚に投与することを含む、哺乳類において血管拡張を誘導し、維持し、または増加させる方法。２８．修飾マキサディランタンパク質をヒトに投与する請求の範囲27記載の方法。２９．修飾マキサディランタンパク質をヒトに局所的に投与する請求の範囲27記載の方法。３０．薬剤学的に許容される担体中に、血管拡張を誘導し、維持し、または増加させる量の請求の範囲1記載の修飾マキサディランタンパク質を含む、哺乳類の皮膚への局所投与に適した組成物。３１．スクアレン、流動パラフィン、脂質、リポソーム、脂肪酸、一価アルコール、多価アルコール、プロピレングリコール、または水からなる群の中から選ばれた薬剤学的に許容される担体中の修飾マキサディランタンパク質を含む、請求の範囲30記載の組成物。３２．ポリオキシエチレン付加硬化ヒマシ油、グリセロール、ジプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、セチルイソオクタン酸、スクアレン、ワセリン、プロピルパラベン、水、流動パラフィン、セトステリアリルアルコール、モノステアリン、およびエチレンオキシドアルキルエーテルからなる群の中から選ばれた表面的に許容される担体中の修飾マキサディランタンパク質を含む、請求の範囲30記載の組成物。