JPS62190084A - ミュレル管抑制物質の活性を示すポリペプチドをコードするｄｎａ，組換ｄｎａおよび形質転換宿主 - Google Patents
ミュレル管抑制物質の活性を示すポリペプチドをコードするｄｎａ，組換ｄｎａおよび形質転換宿主Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の要約〕
少なくとも１種のＭＴＳ一様ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列、この種の配列を含む組換ＤＮＡ分子、この
種の配列を含む宿主および前記ＤＮＡ配列で形質転換さ
れた宿主における前記ポリペプチドの製造方法につき開
示する。
ＤＮＡ配列、この種の配列を含む組換ＤＮＡ分子、この
種の配列を含む宿主および前記ＤＮＡ配列で形質転換さ
れた宿主における前記ポリペプチドの製造方法につき開
示する。
Ｍ Ｉ Ｓ一様ポリペプチドは卵巣癌やその他の惑受性
癌を処置するのに有用である。
癌を処置するのに有用である。
本発明はＤＮＡ配列１組１ＱＤＮＡ分子およびミュレル
管抑制物質（Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎ
ｇＳｕｂｓｔａｎｃｅ） （Ｍ Ｉ Ｓ ）一様ポリ
ペプチドの製造方法に関するものである。さらに詳細に
は、本発明は、少なくとも１種のＭＩＳ一様ポリペプチ
ドをコードすることを特徴とするＤＮＡ配列および組換
ＤＮＡ分子に関するものである。
管抑制物質（Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎ
ｇＳｕｂｓｔａｎｃｅ） （Ｍ Ｉ Ｓ ）一様ポリ
ペプチドの製造方法に関するものである。さらに詳細に
は、本発明は、少なくとも１種のＭＩＳ一様ポリペプチ
ドをコードすることを特徴とするＤＮＡ配列および組換
ＤＮＡ分子に関するものである。
したがって、これら配列により形質転換された宿主を本
発明の方法に使用して、本発明のＭＩＳ。
発明の方法に使用して、本発明のＭＩＳ。
一様ポリペプチドを産生させることができる。
これらのポリペプチドは抗腫瘍活性を有すると共に、特
に女性生殖系の瘍（たとえば卵巣癌）のような癌を処置
するのに有用である。
に女性生殖系の瘍（たとえば卵巣癌）のような癌を処置
するのに有用である。
分化直後の男性生殖腺による少なくとも２種の畢丸因子
の生成は、ジョストの兎去勢実験により正常な雄生殖発
育にとって必要であることが最初に示された（Ｃ，Ｒ，
Ｓｏｃ、Ｂｉｏｌ、第１４０巻、第４６３〜４６４頁（
１９４６）およびＣ，Ｒ，Ｓｏｃ。
の生成は、ジョストの兎去勢実験により正常な雄生殖発
育にとって必要であることが最初に示された（Ｃ，Ｒ，
Ｓｏｃ、Ｂｉｏｌ、第１４０巻、第４６３〜４６４頁（
１９４６）およびＣ，Ｒ，Ｓｏｃ。
Ｂｉｏｌ、第１４１巻、第１３５〜１３６頁（１９４７
））。１つの因子であるテストステロンは、ウオルフ氏
管からの副工丸、輸ネｈ管および貯積！の分化に寄与す
ることが示されてし）る。しかしながら、第２の因子で
ある非ステロイド系因子が存在してミュレル管（すなわ
ち雌生殖系の原基）の退行を刺戟しなければ、雄の男性
化は完全でなかった。ジョストは、この第２の調整因子
をミュレル管抑制物質（ＭＩＳ）と名付けた（Ｒｅｃ、
Ｐｒｏｇ、）ｆｏｒｍ Ｒｅｓ 、第８巻、第３７９〜
４１８頁（１９５３））。Ｍｉｓを精製する関心が高ま
ったのは、ウシＭＩＳが発育におけるその重要な役割に
加えてヒ、ト卵巣腫瘍細胞ラインＨＯＣ−２１に対しイ
ンビトロにて細胞毒性である〔ドナホーエ等、サイエン
ス、第２０５巻、第９１３〜９１５頁（１９７９）およ
びフラー等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍ
ｅｔａｂ 。
））。１つの因子であるテストステロンは、ウオルフ氏
管からの副工丸、輸ネｈ管および貯積！の分化に寄与す
ることが示されてし）る。しかしながら、第２の因子で
ある非ステロイド系因子が存在してミュレル管（すなわ
ち雌生殖系の原基）の退行を刺戟しなければ、雄の男性
化は完全でなかった。ジョストは、この第２の調整因子
をミュレル管抑制物質（ＭＩＳ）と名付けた（Ｒｅｃ、
Ｐｒｏｇ、）ｆｏｒｍ Ｒｅｓ 、第８巻、第３７９〜
４１８頁（１９５３））。Ｍｉｓを精製する関心が高ま
ったのは、ウシＭＩＳが発育におけるその重要な役割に
加えてヒ、ト卵巣腫瘍細胞ラインＨＯＣ−２１に対しイ
ンビトロにて細胞毒性である〔ドナホーエ等、サイエン
ス、第２０５巻、第９１３〜９１５頁（１９７９）およ
びフラー等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍ
ｅｔａｂ 。
第５４巻、第１０５１〜１０５５頁（１９８２）〕と共
に裸ネズミモデルにてインビボでも細胞毒性である〔ド
ナホーエ等、Ａｎｎ、Ｓｕｒｇ、第１９４巻、第４７２
〜４８０頁＜１９８１）〕ことが判明したからである。
に裸ネズミモデルにてインビボでも細胞毒性である〔ド
ナホーエ等、Ａｎｎ、Ｓｕｒｇ、第１９４巻、第４７２
〜４８０頁＜１９８１）〕ことが判明したからである。
高度に精製したウシＭ ］ Ｓのフラクションは、患者
に由来する主として卵果および子宮癌のコロニー成長を
も抑制する〔フラー等、Ｇｙｎ、０ｎｃｏ＋ 、 （
１９８５） ）。
に由来する主として卵果および子宮癌のコロニー成長を
も抑制する〔フラー等、Ｇｙｎ、０ｎｃｏ＋ 、 （
１９８５） ）。
ＭＩＳの精製を試みて種々の方法が使用されている〔た
とえばジヨツブ等、Ｒｅｃ、Ｐｒｏｇ、Ｈｏｍ。
とえばジヨツブ等、Ｒｅｃ、Ｐｒｏｇ、Ｈｏｍ。
Ｒｅｓ 、第３３巻、第１１７〜１６７頁（１９７７）
およびドナホーエ等、Ｒｅｃ、Ｐｒｏｇ、！ｌａｍ、Ｒ
ｅｓ、第３８巻、第２７９〜３３０頁（１９８２）参照
〕。
およびドナホーエ等、Ｒｅｃ、Ｐｒｏｇ、！ｌａｍ、Ｒ
ｅｓ、第３８巻、第２７９〜３３０頁（１９８２）参照
〕。
ウシ新生児の畢九は誕生後８週間まで高レベルのＭｉｓ
を含有し〔ドナホーエ等、Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ ％
第１６巻、第２３８〜２４３頁（１９ママ）〕。
を含有し〔ドナホーエ等、Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ ％
第１６巻、第２３８〜２４３頁（１９ママ）〕。
生生化学精精に利用しうる組織源を供給する。
ドナホーエおよび共同研究者等は、プロテアーゼ阻止剤
の存在下でグアニジン塩酸塩と共に培養することにより
、ウシ来光の活性かつ粗製のＭＩＳ調製物を初めて得た
〔スワン等、Ｄｅｓ・。
の存在下でグアニジン塩酸塩と共に培養することにより
、ウシ来光の活性かつ粗製のＭＩＳ調製物を初めて得た
〔スワン等、Ｄｅｓ・。
Ｂｉｏｌ、第６９巻、第７３〜８４頁（１９７９１゜イ
オン交換またはゲル濾過クロマ（・グー７フイーによる
その後の分画は純度を約３倍高めた。胎児ウシ景丸から
の培養培地を用いた他の研究により、同様な結果が得ら
れた〔ピカード等、バイオメジスン、第２５巻、第１４
７〜１５０頁（１９７６）およびジヨツブ等、Ｒｅｃ、
Ｐｒｏｇ、ｌｌｏ＋ｎ。
オン交換またはゲル濾過クロマ（・グー７フイーによる
その後の分画は純度を約３倍高めた。胎児ウシ景丸から
の培養培地を用いた他の研究により、同様な結果が得ら
れた〔ピカード等、バイオメジスン、第２５巻、第１４
７〜１５０頁（１９７６）およびジヨツブ等、Ｒｅｃ、
Ｐｒｏｇ、ｌｌｏ＋ｎ。
Ｒｅｓ ％第３３巻、第１１７〜１６７頁（１９７７）
）、。
）、。
順次のイオン交換クロマトグラフィーを順次のレクチン
親和性クロマＩ・グラフィーと組合せることにより、ウ
シＭＩＳの純度がさらに高められた〔ブジク等、セル、
第２１巻、第９０９〜９１５頁（１９８０）；米国特許
第４，４０４，１８８号；および米国特許第４，５１０
，１３１号〕。プジク等（上記）の結果は、ウシＭＩＳ
が高分子量のグリコ蛋白であって、半端製したＭＩＳフ
ラクションを与え、これを用いて抗−Ｍ■Ｓモノクロー
ナル抗体を作成したことを示唆している〔ムシエンド−
ハンター等、ジャーナル・イミュノロジー、第１２８巻
、第１３２７〜１３３３頁（１９Ｂ２）；シマ等、ハイ
ブリドーマ、第３巻、第２０１〜２１４頁（１９８４）
；および米国特許第４ 、４８７ 、８３３号〕。自然
条件下でのゲル濾過により分画したレクチン親和性精製
したウシＭＩＳは約２００，０００ダルトンに単一のピ
一りを示したが、ポリアクリルアミドゲルでの変性に際
しこのフラクションは複数成分を含有して、複数サブ単
位構造を示唆した〔ブジク等、セル、第２１巻、第９０
９〜９１５頁（１９８０） ） 。
親和性クロマＩ・グラフィーと組合せることにより、ウ
シＭＩＳの純度がさらに高められた〔ブジク等、セル、
第２１巻、第９０９〜９１５頁（１９８０）；米国特許
第４，４０４，１８８号；および米国特許第４，５１０
，１３１号〕。プジク等（上記）の結果は、ウシＭＩＳ
が高分子量のグリコ蛋白であって、半端製したＭＩＳフ
ラクションを与え、これを用いて抗−Ｍ■Ｓモノクロー
ナル抗体を作成したことを示唆している〔ムシエンド−
ハンター等、ジャーナル・イミュノロジー、第１２８巻
、第１３２７〜１３３３頁（１９Ｂ２）；シマ等、ハイ
ブリドーマ、第３巻、第２０１〜２１４頁（１９８４）
；および米国特許第４ 、４８７ 、８３３号〕。自然
条件下でのゲル濾過により分画したレクチン親和性精製
したウシＭＩＳは約２００，０００ダルトンに単一のピ
一りを示したが、ポリアクリルアミドゲルでの変性に際
しこのフラクションは複数成分を含有して、複数サブ単
位構造を示唆した〔ブジク等、セル、第２１巻、第９０
９〜９１５頁（１９８０） ） 。
その後、マトリックス・ゲル・グリーンＡを用いて２０
００倍以上のウシＭＩＳ精製を達成すると共に、出発時
の活性の６０％回収を得た。
００倍以上のウシＭＩＳ精製を達成すると共に、出発時
の活性の６０％回収を得た。
これは、透析可能な保護剤である２−メルカプトエタノ
ールとＥＤＴＡとノニデットーＰ４０（ＮＰ４０）とで
Ｍｉｓ活性を安定化させることにより達成された。５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による２０００倍
精製ＭＩＳフラクションの分析は、多数の成分が検出さ
れたが１４０，０００ダルトンにて移動する。１種のみ
の成分が減成に対し感受性であることを示した。
ールとＥＤＴＡとノニデットーＰ４０（ＮＰ４０）とで
Ｍｉｓ活性を安定化させることにより達成された。５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による２０００倍
精製ＭＩＳフラクションの分析は、多数の成分が検出さ
れたが１４０，０００ダルトンにて移動する。１種のみ
の成分が減成に対し感受性であることを示した。
電気泳動前の試料の減成は１４０，０００ダルトンの喪
失と同時に７４ 、０００ダルトンの新たなバンドを示
したのに対し、このフラクションにおける他の全成分、
の移動は効果上未変化であった〔ブジク等、セル、第３
４巻、第３０７〜３１４頁（１９８３））。このことは
、ウシＭＩＳが１２４ 、０００ダル］・ンの総分子量
を有するジスルフィド結合サブ単位の二量体であるとい
う示唆と一致する〔ビカード等、Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｎ第１２＠、第１７〜３０頁（１
９７８））。
失と同時に７４ 、０００ダルトンの新たなバンドを示
したのに対し、このフラクションにおける他の全成分、
の移動は効果上未変化であった〔ブジク等、セル、第３
４巻、第３０７〜３１４頁（１９８３））。このことは
、ウシＭＩＳが１２４ 、０００ダル］・ンの総分子量
を有するジスルフィド結合サブ単位の二量体であるとい
う示唆と一致する〔ビカード等、Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｎ第１２＠、第１７〜３０頁（１
９７８））。
より高い純度のＭＩＳが腫瘍学研究のため緊急に多量必
要である。何故なら、女性生殖系の癌を処置する現在の
方法は不充分であるからである。女性生殖系の癌は、人
間における痛全体の約９％を占める。現在、医者は、生
殖系癌が早期に検出された場合（たとえば卵巣癌第■−
Ｕａ期）、手術または放射線照射を行なう。これらの処
置方法は有効ではあるが、患者を不妊症にする。患者が
手術不可能であると判定さ、１′また進行癌の場合（第
１Ｉ＋ −■期）には、化学療法が用いられる。化学療
法剤のうちシスプラ千ヌム、７１゛リアマイシュノおよ
びシ１キサンが最も一般的に１吏用される。これらの薬
剤：ま シスプラチタム含有の処方と組合せて長期間使
用すわば最も効果的であることが判明している。これら
の各薬剤は毒性が高いと思われ、その使用には患者の間
けつ的入院を必要とする。
要である。何故なら、女性生殖系の癌を処置する現在の
方法は不充分であるからである。女性生殖系の癌は、人
間における痛全体の約９％を占める。現在、医者は、生
殖系癌が早期に検出された場合（たとえば卵巣癌第■−
Ｕａ期）、手術または放射線照射を行なう。これらの処
置方法は有効ではあるが、患者を不妊症にする。患者が
手術不可能であると判定さ、１′また進行癌の場合（第
１Ｉ＋ −■期）には、化学療法が用いられる。化学療
法剤のうちシスプラ千ヌム、７１゛リアマイシュノおよ
びシ１キサンが最も一般的に１吏用される。これらの薬
剤：ま シスプラチタム含有の処方と組合せて長期間使
用すわば最も効果的であることが判明している。これら
の各薬剤は毒性が高いと思われ、その使用には患者の間
けつ的入院を必要とする。
天然の生物学的退行剤としてのＭＩＳは、その特異性に
より副作用が少ないと思われる。他の潜在的なＭＩＳの
用途は、高レベルの上皮成長因子（ＥＧＦ）リセブタ（
たとえば頭および首、肺、消化管上皮系、角膜および皮
膚などからのもの）によるＩ！ｆｆｉ瘍の処置を包含す
る〔ハットソン等、サイエンス、第２２３巻、第５８６
〜５８９頁（１９８４））。さらに、Ｍｉｓは生殖細胞
減数分裂を抑制すると思われる。何紗なら、この物質は
グラフ卵胞の顆粒膜ＩＩｌ胞に局在しているからである
。たとえば、避妊剤としてのその使用が開発されつつあ
る。これら幅広い潜在的用途は、Ｍｉｓの充分な供給源
を提供する重要性をさらに増大させる。
より副作用が少ないと思われる。他の潜在的なＭＩＳの
用途は、高レベルの上皮成長因子（ＥＧＦ）リセブタ（
たとえば頭および首、肺、消化管上皮系、角膜および皮
膚などからのもの）によるＩ！ｆｆｉ瘍の処置を包含す
る〔ハットソン等、サイエンス、第２２３巻、第５８６
〜５８９頁（１９８４））。さらに、Ｍｉｓは生殖細胞
減数分裂を抑制すると思われる。何紗なら、この物質は
グラフ卵胞の顆粒膜ＩＩｌ胞に局在しているからである
。たとえば、避妊剤としてのその使用が開発されつつあ
る。これら幅広い潜在的用途は、Ｍｉｓの充分な供給源
を提供する重要性をさらに増大させる。
ウシＭＩＳの精製法がドナホーエおよび共同研究者によ
り案出されている〔ブジク等、発生メカニズム：正常お
よび異常１．Ｊ、Ｗ、 ラッシュ編、アラン・Ｒ・リス
・インコーポレーシシン、科学・医学および学術出版、
第２０７〜２２３頁（１９８５））。規模拡大した方法
を用いて、８０％純度の蛋白的１■をウシ新生児の畢九
１０００個から分離することができる。
り案出されている〔ブジク等、発生メカニズム：正常お
よび異常１．Ｊ、Ｗ、 ラッシュ編、アラン・Ｒ・リス
・インコーポレーシシン、科学・医学および学術出版、
第２０７〜２２３頁（１９８５））。規模拡大した方法
を用いて、８０％純度の蛋白的１■をウシ新生児の畢九
１０００個から分離することができる。
しかしながら、この精製法は労力を要しかつ高価につく
、特に重大なことは、広範なＩＩｔ瘍学碩学研究分な原
料を提供し得ないことである。組換ＤＮＡ技術は、より
大きいウシＭＩＳの供給源をもたらす。
、特に重大なことは、広範なＩＩｔ瘍学碩学研究分な原
料を提供し得ないことである。組換ＤＮＡ技術は、より
大きいウシＭＩＳの供給源をもたらす。
ＭＩＳに関する殆んどの研究はウシＭＩＳについて行わ
れているが、ひな鳥ＭＩＳにも若干の興味が持たれる。
れているが、ひな鳥ＭＩＳにも若干の興味が持たれる。
ケミカルウィーク（１９８５年１月３０日、第６９頁）
の論文に見られるように、Ｃ，Ｓ、テンプはひな鳥ＭＴ
Ｓを精製しかつひな鳥の胚からＭＩＳ遺伝子を分離した
。
の論文に見られるように、Ｃ，Ｓ、テンプはひな鳥ＭＴ
Ｓを精製しかつひな鳥の胚からＭＩＳ遺伝子を分離した
。
しかしながら、それ以上の詳細は報告されていない。
臨床用途には、動物源のＭＩＳよりもヒトＭＩＳが好ま
しい。しかしながら、ヒトＭＩＳは、ヒト組織が充分量
で得られないため入手するのがずっと困難である。した
がって、ヒトＭＩｓを製造する唯一の途は組換ＤＮＡ技
術である。よって、ＭＩＳ用のヒト遺伝子を分離するこ
とが極めて重要である。
しい。しかしながら、ヒトＭＩＳは、ヒト組織が充分量
で得られないため入手するのがずっと困難である。した
がって、ヒトＭＩｓを製造する唯一の途は組換ＤＮＡ技
術である。よって、ＭＩＳ用のヒト遺伝子を分離するこ
とが極めて重要である。
本発明の目的、少なくとも１種のＭＩＳ一様ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列、この種の配列を含む組換Ｄ
ＮＡ分子、この種の配列を含む宿主、並びに前記ＤＮＡ
配列により形質転換された宿主にて前記ポリペプチドを
従来可能であったよりも、高純度で製造する方法を提供
することにより、上記問題を解決するにある。
ドをコードするＤＮＡ配列、この種の配列を含む組換Ｄ
ＮＡ分子、この種の配列を含む宿主、並びに前記ＤＮＡ
配列により形質転換された宿主にて前記ポリペプチドを
従来可能であったよりも、高純度で製造する方法を提供
することにより、上記問題を解決するにある。
ｃ問題点を解決するための手段〕
本発明のＤＮＡ配列は、
＜８１式
％式％
ＣＣＡＧＧＧＡＧＴＴＧＣＡＴＧＧＧＧＣＡＧＴＧＣＣ
ＣＧＧＧＣＣＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴ
ＴＧＴＴＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＣＡＧＴＡＣＴＧＡＧ入
ＡＣＡＧＣＧＴＡＧＡＡＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＧ
ＧＣＴＧＣＣＧＡＧＣＴＧＣＧＡＡＧＣＣＴＣＣＣＧＧ
ＧＴＣＴＧＣＣＴＣＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴ
ＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＴＧＣ
ＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧ
（ヒト遺伝子の配列）； ＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣ
ＧＧＴＧＡＣＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＴ
ＣＴＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴ
ＧＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＧＧＧＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧ
ＴＣＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＣＡＧＣＧＣＧＧＧＧＧＣＣ
ＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣＧＧＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＣ
ＴＧＣＧＣＧＡＧＣＴＣＡＧＣＧＴＡＧＡＣＣＴＣＣＧ
ＣＧＣＣＧＡＧＣＧＣ’ｒＣＣＧＴＡＣＴＣＡＴＣＣＣ
ＣＣ （ヒ］・ｃＤＮＡの配列）； ＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧ
ＣＴＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＧ
ＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＧＧＧＧＧＧＣＧ
ＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧ
ＣＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣ’ｒ’ＧＣＡＧＡＣＧ
ＧＧＣＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＧＴＧＡＧＣＴＧＡＧ
ＣＧＴ入ＧＡＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＴＣＧ
ＧＴＧＣＴＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＡＣＡＴＡＣＣＡＧＧ
ＣＣ（ウシ遺伝子の配列）；および 八ＧＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＣ
ＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧ
ＴＡＣＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣＡ
ＣＴＧＴＣＡＣＣＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＧ
Ｇ入ＧＣＴＧＡＧＣＧＴＡＧ入ＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧ
ＡＧＣＧＣＴＣＧＧＴＧＣ’ｌ’Ｃ入ＴＣＣＣＣＧＡＧ
ＡＣ入ＴＡＣＣＡＧＧＣＣＡＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＧＧ
ＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＧＧＡ
ＣＣ（ウシｃＤＮＡの配列）；並びに （ｂｌ 上記ＤＮＡ配列にハイブリッド化しかつ発現
に際しヒトＭＩＳ一様ポリペブチドまたはウシＭＩＳ一
様ポリペブチドをコードし、好ましくは前記ＤＮＡ配列
に対し実質的な同質性程度（より好ましくは少なくとも
約７０％の同質性、特に好ましくは少なくとも約８０％
の同質性）を有するＤＮＡ配列；および（Ｃ１上記Ｄ
Ｎ Ａ配列のいずれかにより発現に際しコードされたポ
リペプチドを発現に際しコードするＤＮＡ配列 よりなる群から選択される。これらＤＮＡ配列を含む組
換ＤＮＡ分子、これらにより形質転換された宿主、およ
びこれらにより発現に際しコードされるＭＩＳ一様ポリ
ペプチドも本発明の一部を構成する。
ＣＧＧＧＣＣＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴ
ＴＧＴＴＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＣＡＧＴＡＣＴＧＡＧ入
ＡＣＡＧＣＧＴＡＧＡＡＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＧ
ＧＣＴＧＣＣＧＡＧＣＴＧＣＧＡＡＧＣＣＴＣＣＣＧＧ
ＧＴＣＴＧＣＣＴＣＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴ
ＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＴＧＣ
ＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧ
（ヒト遺伝子の配列）； ＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣ
ＧＧＴＧＡＣＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＴ
ＣＴＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴ
ＧＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＧＧＧＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧ
ＴＣＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＣＡＧＣＧＣＧＧＧＧＧＣＣ
ＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣＧＧＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＣ
ＴＧＣＧＣＧＡＧＣＴＣＡＧＣＧＴＡＧＡＣＣＴＣＣＧ
ＣＧＣＣＧＡＧＣＧＣ’ｒＣＣＧＴＡＣＴＣＡＴＣＣＣ
ＣＣ （ヒ］・ｃＤＮＡの配列）； ＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧ
ＣＴＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＧ
ＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＧＧＧＧＧＧＣＧ
ＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧ
ＣＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣ’ｒ’ＧＣＡＧＡＣＧ
ＧＧＣＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＧＴＧＡＧＣＴＧＡＧ
ＣＧＴ入ＧＡＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＴＣＧ
ＧＴＧＣＴＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＡＣＡＴＡＣＣＡＧＧ
ＣＣ（ウシ遺伝子の配列）；および 八ＧＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＣ
ＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧ
ＴＡＣＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣＡ
ＣＴＧＴＣＡＣＣＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＧ
Ｇ入ＧＣＴＧＡＧＣＧＴＡＧ入ＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧ
ＡＧＣＧＣＴＣＧＧＴＧＣ’ｌ’Ｃ入ＴＣＣＣＣＧＡＧ
ＡＣ入ＴＡＣＣＡＧＧＣＣＡＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＧＧ
ＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＧＧＡ
ＣＣ（ウシｃＤＮＡの配列）；並びに （ｂｌ 上記ＤＮＡ配列にハイブリッド化しかつ発現
に際しヒトＭＩＳ一様ポリペブチドまたはウシＭＩＳ一
様ポリペブチドをコードし、好ましくは前記ＤＮＡ配列
に対し実質的な同質性程度（より好ましくは少なくとも
約７０％の同質性、特に好ましくは少なくとも約８０％
の同質性）を有するＤＮＡ配列；および（Ｃ１上記Ｄ
Ｎ Ａ配列のいずれかにより発現に際しコードされたポ
リペプチドを発現に際しコードするＤＮＡ配列 よりなる群から選択される。これらＤＮＡ配列を含む組
換ＤＮＡ分子、これらにより形質転換された宿主、およ
びこれらにより発現に際しコードされるＭＩＳ一様ポリ
ペプチドも本発明の一部を構成する。
本発明のＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子、宿主および方法
は、卵巣癌や他の感受性癌の処置に使用するためのＭＩ
Ｓ一様ポリペプチドの製造を可能にする。
は、卵巣癌や他の感受性癌の処置に使用するためのＭＩ
Ｓ一様ポリペプチドの製造を可能にする。
さらに、本発明の範囲内には、式
％式％
（ヒトＭＩＳ蛋白の完全アミノ酸配列）；ＬＲＡＥＥＰ
ＡＶＧＴＳＧＬＩＦＲＥＤＬＤＷＰＰＧＩＰＱＥＰＬＣ
ＬＶＡＬＧＧＤＳＮＧＳＳＳＰＬＲＶＶＧ（成熟ヒトＭ
ＩＳ蛋白のアミノ酸配列）：ＬＥＲＬＬＤＧＥＥＰＬＬ
ＬＬＬＰＰＴ入ＡＴＴＧＶＰＡＴＰＱＧＰＫＳＰＬＷ入
ＡＧＬＡＲＲＶＡＡＥＬＱＡＶ入ＡＥＬＲＡＬＰＧＬＰ
Ｐ入ＡＰＰ１．、Ｌ入ＲＬＬＡＬＣＰＧＮＰＤＳＰＧＧ
ＰＬＲＡＬＬＬＬ）ＣＡＬＱＧＬＲ（ウシＭＩＳ蛋白の
完全アミノ酸配列）；（成熟ウシＭＩＳＩ白のアミノ酸
配列）；およこれらに関連するＭ Ｔ Ｓ −１１＞ポ
リペプチドよりなる群から選択されるポリペプチド、並
びにこわらポリペプチドの１種と医薬上許容しうるキャ
リヤとからなる抗癌医薬組成物および女性住殖系の癌（
たとえば卵巣癌）などの感受性癌を処置する際の前記組
成物の使用方法も包含される。
ＡＶＧＴＳＧＬＩＦＲＥＤＬＤＷＰＰＧＩＰＱＥＰＬＣ
ＬＶＡＬＧＧＤＳＮＧＳＳＳＰＬＲＶＶＧ（成熟ヒトＭ
ＩＳ蛋白のアミノ酸配列）：ＬＥＲＬＬＤＧＥＥＰＬＬ
ＬＬＬＰＰＴ入ＡＴＴＧＶＰＡＴＰＱＧＰＫＳＰＬＷ入
ＡＧＬＡＲＲＶＡＡＥＬＱＡＶ入ＡＥＬＲＡＬＰＧＬＰ
Ｐ入ＡＰＰ１．、Ｌ入ＲＬＬＡＬＣＰＧＮＰＤＳＰＧＧ
ＰＬＲＡＬＬＬＬ）ＣＡＬＱＧＬＲ（ウシＭＩＳ蛋白の
完全アミノ酸配列）；（成熟ウシＭＩＳＩ白のアミノ酸
配列）；およこれらに関連するＭ Ｔ Ｓ −１１＞ポ
リペプチドよりなる群から選択されるポリペプチド、並
びにこわらポリペプチドの１種と医薬上許容しうるキャ
リヤとからなる抗癌医薬組成物および女性住殖系の癌（
たとえば卵巣癌）などの感受性癌を処置する際の前記組
成物の使用方法も包含される。
本発明を一層充分に理解しうるよう、以下詳細に説明す
る。
る。
以下の説明において、次の用語を使用する：ヌクレオチ
ド：糖成分（ペントース）と燐酸塩と含窒素複素環塩基
とからなるＤＮＡもしくはＲＮへの単Ｐ体単位。塩基は
、グルコシドＭヌモ（ペントースの１′炭素）を介して
糖成分に結合される。塩基と糖との結合体はヌクし・オ
シ１と呼ばれる。各ヌクＬ・オチ１：ｊその塩刀二を特
徴とする。４種の丁） Ｎ、へ也２Ｊ、はアデニン（″
へ′）、グアニン（Ｇ”）、シＩ・シン（Ｃ”）および
チミン（Ｔ″）である。４種のＲＮＡ塩基はＡ、 Ｇ
、 Ｃおよびウラシル（“Ｕ”）である。
ド：糖成分（ペントース）と燐酸塩と含窒素複素環塩基
とからなるＤＮＡもしくはＲＮへの単Ｐ体単位。塩基は
、グルコシドＭヌモ（ペントースの１′炭素）を介して
糖成分に結合される。塩基と糖との結合体はヌクし・オ
シ１と呼ばれる。各ヌクＬ・オチ１：ｊその塩刀二を特
徴とする。４種の丁） Ｎ、へ也２Ｊ、はアデニン（″
へ′）、グアニン（Ｇ”）、シＩ・シン（Ｃ”）および
チミン（Ｔ″）である。４種のＲＮＡ塩基はＡ、 Ｇ
、 Ｃおよびウラシル（“Ｕ”）である。
ＤＮＡ配列：隣接ペントースの３′炭素と５′炭素との
間のホスホジエステル結合により互いに結合されたヌク
レオチドの線状列。
間のホスホジエステル結合により互いに結合されたヌク
レオチドの線状列。
コドン： ｍＲＮＡを介してアミノ酸と翻訳開始信号と
翻訳終了信号とをコードする３種のヌクレオチド（トリ
プレット）のＤＮＡ配列。たとえばヌクレオチドトリプ
レットＴＴＡ、、ＴＴＧ。
翻訳終了信号とをコードする３種のヌクレオチド（トリ
プレット）のＤＮＡ配列。たとえばヌクレオチドトリプ
レットＴＴＡ、、ＴＴＧ。
ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸ロイシ
ン（’Ｌｅｕ”）をコードし、ＴＡＧ。
ン（’Ｌｅｕ”）をコードし、ＴＡＧ。
ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止信号であり、ＡＴＣは翻
訳開始信号である。
訳開始信号である。
る際のコドンのグループ化。翻訳の際、適切なＭ読枠を
維持せねばならない。たとえば、ＤＮＡ配列ＧＣＴＣ；
Ｃ；ＴＴＧＴＡＡＧは３つの解読枠（すなわち相）にお
いて発現することができ、その各々、は異なるアミノ酸
配列 −Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｃ； ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ
−−Ｌｅｕ−Ｖａ １−Ｖａ Ｉ ＧＣＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ −−Ｔ
ｒｐ−Ｌｅｕ−（停止） を与える。
維持せねばならない。たとえば、ＤＮＡ配列ＧＣＴＣ；
Ｃ；ＴＴＧＴＡＡＧは３つの解読枠（すなわち相）にお
いて発現することができ、その各々、は異なるアミノ酸
配列 −Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｃ； ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ
−−Ｌｅｕ−Ｖａ １−Ｖａ Ｉ ＧＣＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ −−Ｔ
ｒｐ−Ｌｅｕ−（停止） を与える。
ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミン基とカル
ボキシル基との間のペプチド結合により互いに結合され
たアミノ酸の線状列。
ボキシル基との間のペプチド結合により互いに結合され
たアミノ酸の線状列。
ゲノム：ＩＩ胞もしくはウィルスの全ＤＮＡ。
これは、特に物質のポリペプチドをコードする構造遺伝
子、ならびにオペレータ、プロモータおよびリポソーム
結合ならびにたとえばシャインーダルガーノ配列のよう
な配列を含めて相互作用配列を包含する。
子、ならびにオペレータ、プロモータおよびリポソーム
結合ならびにたとえばシャインーダルガーノ配列のよう
な配列を含めて相互作用配列を包含する。
遺伝子：雛型もしくはメンセンジャーＲＮＡ（“ｒｎＲ
ＮＡ”）を介して、特定ポリペプチドに特徴的なアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ配列。
ＮＡ”）を介して、特定ポリペプチドに特徴的なアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ配列。
転写：遺伝子もしくはＤＮＡ配列からｍＲＮＡを生成す
る過程。
る過程。
翻ｉｆｆ ： ｍ ＲＮ Ａからポリペプチドを生成す
る過程。
る過程。
発現：ポリペプチドを生成するため遺伝子もしくはＤＮ
Ａ配列により受ける過程。これは、転写と翻訳との組合
せである。
Ａ配列により受ける過程。これは、転写と翻訳との組合
せである。
ｃＤＮＡクローン：ｍＲＮＡから合成されかつイントロ
ンを含有しないＤＮＡ挿入物を含むクローン、ベクター
はプラスミドまたはファージとすることができる。
ンを含有しないＤＮＡ挿入物を含むクローン、ベクター
はプラスミドまたはファージとすることができる。
ゲノムクローン：ゲノムの断片であるＤＮＡ挿入物を含
むクローン（すなわち、全細胞ＤＮＡから分離される）
。これは、遺伝子の蛋白コード化領域を中断するイント
ロンを含むことができる。ベクターはプラスミド、ファ
ージまたはコスミドとすることができる。
むクローン（すなわち、全細胞ＤＮＡから分離される）
。これは、遺伝子の蛋白コード化領域を中断するイント
ロンを含むことができる。ベクターはプラスミド、ファ
ージまたはコスミドとすることができる。
エクソン：転写後に、先駆体ＲＮＡのスプライス後のｍ
ＲＮＡに維持される遺伝子の部分。
ＲＮＡに維持される遺伝子の部分。
イントロン：転写後にスプライ２、・アラ１される遺伝
子の部分。
子の部分。
プラスミド：完全「レプリコン」からなる非りロモソー
ムニ重鎮ＤＮＡ配列であり、これによりプラスミドは宿
主細胞内で複製される。プラスミドを単細胞微生物に入
れると、その生物の特性がプラスミドのＤＮＡ挿入の結
果として変化または形質転換する。たとえば、テトラサ
イクリン耐性（Ｔ ｅ ｔＰ−）についての遺伝子を担
持するプラスミドは従前テトラサイクリンに感受性であ
った細胞をこれに対し抵抗性の細胞に形質転換させる。
ムニ重鎮ＤＮＡ配列であり、これによりプラスミドは宿
主細胞内で複製される。プラスミドを単細胞微生物に入
れると、その生物の特性がプラスミドのＤＮＡ挿入の結
果として変化または形質転換する。たとえば、テトラサ
イクリン耐性（Ｔ ｅ ｔＰ−）についての遺伝子を担
持するプラスミドは従前テトラサイクリンに感受性であ
った細胞をこれに対し抵抗性の細胞に形質転換させる。
プラスミドにより形質転換された細胞を「（形質転換体
）」と呼ぶ。
）」と呼ぶ。
ファージまたはバクテリオファージ：細菌性ウィルスで
あり、その多くは蛋白質エンベロブもしくは被覆（「カ
プシド」）中にカプセル化されたＤＮＡ配列からなって
いる。
あり、その多くは蛋白質エンベロブもしくは被覆（「カ
プシド」）中にカプセル化されたＤＮＡ配列からなって
いる。
コスミド：バクテリオファージλの凝築末端（ｒｃｏｓ
Ｊ）部位を有するプラスミド。コスミドは、ｃｏｓ部位
が存在するため、ノコ−１−蛋白中に封入され、これを
用いて適当な宿主にインフエクトすることができる。外
来ＤＮＡの大型断片に対するその能力のため、コスミド
はクローン化ベヒクルとして有用である。
Ｊ）部位を有するプラスミド。コスミドは、ｃｏｓ部位
が存在するため、ノコ−１−蛋白中に封入され、これを
用いて適当な宿主にインフエクトすることができる。外
来ＤＮＡの大型断片に対するその能力のため、コスミド
はクローン化ベヒクルとして有用である。
クローン化へヒクル；宿主細胞中で複製しうるプラスミ
ド、ファージＤＮＡ、コスミドまたはその他のＤＮＡ配
列であり、これは１個または少数のエンドヌクレアーゼ
認識部位を特徴とし、その部位においてこのＤＮＡ配列
はＤＮＡの本質的な生物学的機能（たとえば再現性）、
被覆蛋白質の生成の喪失またはプロモータもしくは結合
部位の喪失を伴わずに決定可能に切断され、またこの部
位は形質転換細胞の同定（たとえばテトラサイクリン耐
性またはアンピシリン耐性）に使用するのに適する標識
を有する。
ド、ファージＤＮＡ、コスミドまたはその他のＤＮＡ配
列であり、これは１個または少数のエンドヌクレアーゼ
認識部位を特徴とし、その部位においてこのＤＮＡ配列
はＤＮＡの本質的な生物学的機能（たとえば再現性）、
被覆蛋白質の生成の喪失またはプロモータもしくは結合
部位の喪失を伴わずに決定可能に切断され、またこの部
位は形質転換細胞の同定（たとえばテトラサイクリン耐
性またはアンピシリン耐性）に使用するのに適する標識
を有する。
クローン化ベヒクルはしばしばベクター（Ｖｅｃ ｔｏ
ｒ）と呼ばれる。
ｒ）と呼ばれる。
クローン化：微生物またはＤＮＡ配列の増殖を得る過程
であって、無性増殖によりこの種の一種の微生物才たは
配列から得られる。
であって、無性増殖によりこの種の一種の微生物才たは
配列から得られる。
組換ＤＮＡ分子すなわちヒブリＦＤＮＡ：生体細胞の外
部で末端−末端結合されかつ生存細胞に維持される能力
を有する、異なるゲノムからのＤＮＡ断片よりなる分子
。
部で末端−末端結合されかつ生存細胞に維持される能力
を有する、異なるゲノムからのＤＮＡ断片よりなる分子
。
発現制御配列：遺伝子の発現をこれら遺伝子に作用結合
された際に制御しかつ調整するヌクレオチドの配列。こ
れらはｌａｃ系、β−ラクタマーザ系、ｔｒ工系、ｔａ
ｃおよびｔｒｃ系、ファージλの主オペレータおよびプ
ロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、ＳＶ４０の
早期および後期プロモータ、ポリオーマウィルスおよび
アデノウィルスから生ずるプロモータ、メタロチオニン
ブロモータ、３−ホスホグリセレートキナーゼもしくは
その他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファターゼの
プロモータ（たとえばＰｂｏ２）、酵母α−交配因子の
プロモータ、並びに原核もしくは真核細胞およびそのウ
ィルスまたはその組合せの遺伝子の発現を制御すること
が知られた配列を包含する。哺乳動物細胞の場合、遺伝
子は、たとえばジヒドロホレートレダクターゼをコード
する遺伝子に結合されかつ支那ハムスター卵細胞で選択
増幅されて活性転写された真核遺伝子の多コピーを有す
る細胞ラインを生成するＳＶ４０早期領域に対するよう
な真核プロモータに結合することができる。
された際に制御しかつ調整するヌクレオチドの配列。こ
れらはｌａｃ系、β−ラクタマーザ系、ｔｒ工系、ｔａ
ｃおよびｔｒｃ系、ファージλの主オペレータおよびプ
ロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、ＳＶ４０の
早期および後期プロモータ、ポリオーマウィルスおよび
アデノウィルスから生ずるプロモータ、メタロチオニン
ブロモータ、３−ホスホグリセレートキナーゼもしくは
その他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファターゼの
プロモータ（たとえばＰｂｏ２）、酵母α−交配因子の
プロモータ、並びに原核もしくは真核細胞およびそのウ
ィルスまたはその組合せの遺伝子の発現を制御すること
が知られた配列を包含する。哺乳動物細胞の場合、遺伝
子は、たとえばジヒドロホレートレダクターゼをコード
する遺伝子に結合されかつ支那ハムスター卵細胞で選択
増幅されて活性転写された真核遺伝子の多コピーを有す
る細胞ラインを生成するＳＶ４０早期領域に対するよう
な真核プロモータに結合することができる。
ＭＩＳ一様ポリペブチド：ＭＩＳ−蛋白の生物学的もし
くは免疫学的活性を示すポリペプチド。本明細書に使用
するｒＭＩｓ蛋白の生物学的活性」という用語は、ＭＩ
Ｓ一様ポリペプチドが天然ＭＩＳ蛋白と実質的に同様な
生物学的活性の交差部分を有することを意味すると理解
すべきである（たとえば、これはミュレル管の退行を刺
戟することができ、または卵巣腫瘍細胞のＬ種もしくは
それ以上、たとえば細胞ラインＨＯＣ−２１に対し細胞
毒性であり、好ましくはこれはミュレル管の退行を刺戟
すると共に卵巣腫瘍細胞の１種もしくはそれ以上に刻′
−細胞毒性である）。本明１１Ｉ書に使用するｒＭＴＳ
蛋白の免疫学的活性」という用語は、天然Ｍ Ｉ Ｓ蛋
白に対し特異性である抗体と交差反応するＭＩＳ一様ポ
リペプチドの能力を意味すると理解すべきである。この
種の抗体の例は米国特許第４，４８７，８３３号公報に
開示されている。ＭＩＳ一様ポリペプチドは、天然ＭＩ
Ｓ蛋白の他にアミノ酸を含むことができ、或いは天然Ｍ
ＩＳ蛋白のアミノ酸全部を含まなくてもよい。たとえば
、これはＮ−末端メチオニンを含むことができる。さら
に、このポリペプチドは成熟蛋白もしくは未熟蛋白とす
ることができ、或いは未熟蛋白から誘導される蛋白（た
とえば信号配列の１部のみが切断されている蛋白）とす
ることもできる。この種のポリペプチドの例は、ＭＩＳ
アミノ酸配列配列変してその性質（たとえば、より大き
い貯蔵安定性または増大したインビボにおける半減期）
の向上を得るべく作成したＭ Ｔ Ｓポリペプチドの誘
導体である。本明１０書において「誘導されるＭＴＳｉ
、！ポリペブチ１ｊという用語は、本発明におけるＭ
Ｉ Ｓポリペブチｌ （たとえば、ランＭ Ｉ Ｓも１
．７りはヒトへ４Ｉｓ）だけでなく、この定義に記載し
た種類の各種の関連ポリペプチドをも意味すると理解す
べきである。
くは免疫学的活性を示すポリペプチド。本明細書に使用
するｒＭＩｓ蛋白の生物学的活性」という用語は、ＭＩ
Ｓ一様ポリペプチドが天然ＭＩＳ蛋白と実質的に同様な
生物学的活性の交差部分を有することを意味すると理解
すべきである（たとえば、これはミュレル管の退行を刺
戟することができ、または卵巣腫瘍細胞のＬ種もしくは
それ以上、たとえば細胞ラインＨＯＣ−２１に対し細胞
毒性であり、好ましくはこれはミュレル管の退行を刺戟
すると共に卵巣腫瘍細胞の１種もしくはそれ以上に刻′
−細胞毒性である）。本明１１Ｉ書に使用するｒＭＴＳ
蛋白の免疫学的活性」という用語は、天然Ｍ Ｉ Ｓ蛋
白に対し特異性である抗体と交差反応するＭＩＳ一様ポ
リペプチドの能力を意味すると理解すべきである。この
種の抗体の例は米国特許第４，４８７，８３３号公報に
開示されている。ＭＩＳ一様ポリペプチドは、天然ＭＩ
Ｓ蛋白の他にアミノ酸を含むことができ、或いは天然Ｍ
ＩＳ蛋白のアミノ酸全部を含まなくてもよい。たとえば
、これはＮ−末端メチオニンを含むことができる。さら
に、このポリペプチドは成熟蛋白もしくは未熟蛋白とす
ることができ、或いは未熟蛋白から誘導される蛋白（た
とえば信号配列の１部のみが切断されている蛋白）とす
ることもできる。この種のポリペプチドの例は、ＭＩＳ
アミノ酸配列配列変してその性質（たとえば、より大き
い貯蔵安定性または増大したインビボにおける半減期）
の向上を得るべく作成したＭ Ｔ Ｓポリペプチドの誘
導体である。本明１０書において「誘導されるＭＴＳｉ
、！ポリペブチ１ｊという用語は、本発明におけるＭ
Ｉ Ｓポリペブチｌ （たとえば、ランＭ Ｉ Ｓも１
．７りはヒトへ４Ｉｓ）だけでなく、この定義に記載し
た種類の各種の関連ポリペプチドをも意味すると理解す
べきである。
本発明は、ＭＩＳボリペブヂドをコードするＤＮＡ配列
および組換ＤＮＡ分子、並びにこれらポリペプチドの製
造方法に関するものである。
および組換ＤＮＡ分子、並びにこれらポリペプチドの製
造方法に関するものである。
本発明によるＤＮＡ配列の分離およびクローン化番ごお
いて、ウシＭＩＳ蛋白に基づく選択手段を採用した。し
たがって、本発明によれば、ウシ畢九からウシＭＩＳ蛋
白質を精製し、かつこの蛋白の各種断片のアミノ酸配列
を決定した。
いて、ウシＭＩＳ蛋白に基づく選択手段を採用した。し
たがって、本発明によれば、ウシ畢九からウシＭＩＳ蛋
白質を精製し、かつこの蛋白の各種断片のアミノ酸配列
を決定した。
これら蛋白配列に基づき、次いで最小のヌクレオチド縮
退を有する精製ウシ蛋白の領域に対応する数種の反対方
向のオリゴヌクレオチドＤＮＡ試料を合成した０次いで
これらの試料を用いて、ファージクローン化ベクター中
に挿・入されたウシ筆先ｃＤＮＡ配列を含むイー・コリ
細胞からなるウシｃ ＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングした。
退を有する精製ウシ蛋白の領域に対応する数種の反対方
向のオリゴヌクレオチドＤＮＡ試料を合成した０次いで
これらの試料を用いて、ファージクローン化ベクター中
に挿・入されたウシ筆先ｃＤＮＡ配列を含むイー・コリ
細胞からなるウシｃ ＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングした。
スクリーニングするため、プラークハイブリッド化ス”
クリーニング分析を利用してオリゴヌクレオチド試料を
ウシＣＤＮＡライブラリーにハイブリッド化させかつこ
れら多数の試料にハイブリッド化するクローンを選択し
た。選択したウシＣＤＮＡ挿入物を分離しかつプラスミ
ド中にサブクローン化した後、そのヌクレオチド配列を
決定しかつ精製ウシＭＩＳ蛋白のペプチド′から得られ
たアミノ酸配列と比較した。この比較の結果、分離した
全クローンのヌクレオチド配列がウシＭＩＳ蛋白のアミ
ノ酸配列をコードすることを突き止めた。
クリーニング分析を利用してオリゴヌクレオチド試料を
ウシＣＤＮＡライブラリーにハイブリッド化させかつこ
れら多数の試料にハイブリッド化するクローンを選択し
た。選択したウシＣＤＮＡ挿入物を分離しかつプラスミ
ド中にサブクローン化した後、そのヌクレオチド配列を
決定しかつ精製ウシＭＩＳ蛋白のペプチド′から得られ
たアミノ酸配列と比較した。この比較の結果、分離した
全クローンのヌクレオチド配列がウシＭＩＳ蛋白のアミ
ノ酸配列をコードすることを突き止めた。
１種のウシＭｉｓ ｃＤＮＡりｏ−７ＣｐＳ２１）の
挿入物を用いて、ヒ）Ｍｉｓ遺伝子をヒトコスミドライ
ブラリーから分離しかつ部分ｃＤＮＡクローンをヒトｃ
ＤＮＡライブラリーから分離した。ヒト新生児の筆先か
ら抽出した全ＲＮＡからヒトｃＤＮＡライブラリーを作
成した。
挿入物を用いて、ヒ）Ｍｉｓ遺伝子をヒトコスミドライ
ブラリーから分離しかつ部分ｃＤＮＡクローンをヒトｃ
ＤＮＡライブラリーから分離した。ヒト新生児の筆先か
ら抽出した全ＲＮＡからヒトｃＤＮＡライブラリーを作
成した。
本発明のｃＤＮＡ配列もしくはゲノムＤＮＡ配列は発限
制御配列に作用結合させることができ、かつこれを各種
の哺乳動物またはその他の真核もしくは原核宿主細胞に
使用して、これらによりコードされたＭＩｓ用ポリペプ
チドを産生させることができる。さらに、本発明のＣＤ
ＮＡ配列もしくはゲノムＤＮＡ配列は、Ｍ Ｉ Ｓ用ポ
リペプチドをコードする他の配列につきヒトｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングする試料として有用である
。
制御配列に作用結合させることができ、かつこれを各種
の哺乳動物またはその他の真核もしくは原核宿主細胞に
使用して、これらによりコードされたＭＩｓ用ポリペプ
チドを産生させることができる。さらに、本発明のＣＤ
ＮＡ配列もしくはゲノムＤＮＡ配列は、Ｍ Ｉ Ｓ用ポ
リペプチドをコードする他の配列につきヒトｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングする試料として有用である
。
上記ヒトゲノムＤＮＡ配列は数個のイントロンを有する
。これらイントロンの１個もしくはそれ以上または全部
が欠失しているＤＮＡ配列および組換ＤＮＡ分子も本発
明の範囲内に入ると考えられる。
。これらイントロンの１個もしくはそれ以上または全部
が欠失しているＤＮＡ配列および組換ＤＮＡ分子も本発
明の範囲内に入ると考えられる。
本発明のウシおよびヒ）ＭＩＳ一様ポリペプチド（好ま
しくは、ヒトＭＩｓ一様ポリペプチド）は抗癌剤として
有用である。たとえば、この種の組成物は抗癌上有効量
の本発明にょるＭＩＳ一様ポリペプチドと医薬上許容し
うるキャリヤとから構成することができる。この種の治
療は一般にこれら組成物により医薬上許容しうる方法で
患者を処置する方法がらなっている。
しくは、ヒトＭＩｓ一様ポリペプチド）は抗癌剤として
有用である。たとえば、この種の組成物は抗癌上有効量
の本発明にょるＭＩＳ一様ポリペプチドと医薬上許容し
うるキャリヤとから構成することができる。この種の治
療は一般にこれら組成物により医薬上許容しうる方法で
患者を処置する方法がらなっている。
一般に、本発明の医薬組成物は、他の医薬上重要なポリ
ペプチド（たとえばα−インクフェロン）について使用
すると同様な方法を用いて処方しかつ投与することがで
きる。たとえば、これらポリペプチドを凍結乾燥型で貯
蔵し、投与直前に減菌水で再編成しかつ静脈投与するこ
とができる。好ましくは、本発明の医薬組成物は、米国
特許第４，５１０．１３１号公報に開示されたＭＩＳ蛋
白につき使用されているものと同様な投与量および投与
方式で投与され、前記米国特許の開示を参考のためここ
に引用する。
ペプチド（たとえばα−インクフェロン）について使用
すると同様な方法を用いて処方しかつ投与することがで
きる。たとえば、これらポリペプチドを凍結乾燥型で貯
蔵し、投与直前に減菌水で再編成しかつ静脈投与するこ
とができる。好ましくは、本発明の医薬組成物は、米国
特許第４，５１０．１３１号公報に開示されたＭＩＳ蛋
白につき使用されているものと同様な投与量および投与
方式で投与され、前記米国特許の開示を参考のためここ
に引用する。
広範な種類の宿主／クローン化ベヒクル組合せ物を、本
発明により作成されたＭｉｓ一様ポリペプチドＤＮＡ配
列をクローン化しまたは発現させるのに使用することが
できる。たとえば、有用なりローン化もしくは発現−・
ヒクルは染色体、非染色体および合成りＮＡ配列の断片
、たとえば各種公知のＳ Ｖ ４０の誘導体および公知
の細菌プラスミド、たとえばｑｔｉｌＥｌ、ｐｃＲｌ。
発明により作成されたＭｉｓ一様ポリペプチドＤＮＡ配
列をクローン化しまたは発現させるのに使用することが
できる。たとえば、有用なりローン化もしくは発現−・
ヒクルは染色体、非染色体および合成りＮＡ配列の断片
、たとえば各種公知のＳ Ｖ ４０の誘導体および公知
の細菌プラスミド、たとえばｑｔｉｌＥｌ、ｐｃＲｌ。
ｐＢＲ３２２，ｐＭＢ９おＪ、びその誘導体を含むイー
・コリからのブラスミｔ’、広範な宿主範囲のプラスミ
ド、たとえばＲＰ４、ファージＤＮＡ％たとえばファー
ジλの多数の誘導体、たとえばＮＭ９８９およびその他
のＤＮＡファージ、たとえばＭ１３およびフィラメント
状一本１１ＤＮＡフアージおよびプラスミドとファージ
ＤＮＡとの組合せ物から誘導されるベクター、たとえば
ファージＤＮＡもしくはその他の発現制御配列を用いる
よう改変したプラスミド、或いは酵母プラスミド、たと
えば２μプラスミドもしくはその誘導体で構成すること
ができる。
・コリからのブラスミｔ’、広範な宿主範囲のプラスミ
ド、たとえばＲＰ４、ファージＤＮＡ％たとえばファー
ジλの多数の誘導体、たとえばＮＭ９８９およびその他
のＤＮＡファージ、たとえばＭ１３およびフィラメント
状一本１１ＤＮＡフアージおよびプラスミドとファージ
ＤＮＡとの組合せ物から誘導されるベクター、たとえば
ファージＤＮＡもしくはその他の発現制御配列を用いる
よう改変したプラスミド、或いは酵母プラスミド、たと
えば２μプラスミドもしくはその誘導体で構成すること
ができる。
ｃＤＮＡクローン化のための好適な発現ベクターは、λ
ｇｔｌＯであり、好適宿主はイー・コ！ＪＢＮＮ１０２
である。動物細胞の発現には、好適発現ベクターは支那
ハムスター卵細胞（ＣＨＯ）におけるｐＢＧ３１１およ
びｐＢｃ３１２である。
ｇｔｌＯであり、好適宿主はイー・コ！ＪＢＮＮ１０２
である。動物細胞の発現には、好適発現ベクターは支那
ハムスター卵細胞（ＣＨＯ）におけるｐＢＧ３１１およ
びｐＢｃ３１２である。
各特異性クローン化もしくは発現ベヒクルの内部には、
本発明のＭ Ｉ Ｓ一様ポリペプチドＤＮＡ配列を挿入
するための各種の部位を選択することができる。一般に
これらの部位はこれを切断する制限エンドヌクレアーゼ
により命名され、当業者に充分認識されている。ＤＮＡ
配列を、これらの部位に挿入して組換ＤＮＡ分子を生成
させるための各種の方法も周知されている。たとえば、
これらはｄＧ−ｄＣもしくはｄＡ−ｄＴ処理、直接結合
１合成リンカ、エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ
結合修復反応に続く結合、或いはＤＮＡポリメラーゼお
よび適当な一本鎖雛型によるＤＮＡｆｌｌの延長に続く
結合を包含する。勿論、本発明に有用なりローン化もし
くは発現ベヒクルは、選択ＤＮＡ断片を挿入するための
制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必要がないことを
了解すべきである。
本発明のＭ Ｉ Ｓ一様ポリペプチドＤＮＡ配列を挿入
するための各種の部位を選択することができる。一般に
これらの部位はこれを切断する制限エンドヌクレアーゼ
により命名され、当業者に充分認識されている。ＤＮＡ
配列を、これらの部位に挿入して組換ＤＮＡ分子を生成
させるための各種の方法も周知されている。たとえば、
これらはｄＧ−ｄＣもしくはｄＡ−ｄＴ処理、直接結合
１合成リンカ、エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ
結合修復反応に続く結合、或いはＤＮＡポリメラーゼお
よび適当な一本鎖雛型によるＤＮＡｆｌｌの延長に続く
結合を包含する。勿論、本発明に有用なりローン化もし
くは発現ベヒクルは、選択ＤＮＡ断片を挿入するための
制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必要がないことを
了解すべきである。
寧ろ、このベヒクルは、他の手段によって断片に結合す
ることができる。
ることができる。
各種の発現制御配列を選択して、本発明のＤＮＡ配列の
発現を行なうことができる。これらの発現制御配列はた
とえばＩａｃ系、β−ラクタマーゼ系、Ｌｒｐ系、ＴＡ
Ｃ系、ＴＲＣ系、ファージλの主オペレータおよびプロ
モータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、３−ホスホグ
リセレートキナーゼもしくはその他の糖分解酵素のプロ
モータ、酸ホスファターゼのプロモータ（たとえばＰｂ
ｏ２）２．９母α−交配因子のプロモータ、哺乳動物細
胞のプロモータ、たとえばＳＶ４０の早期プロモータ、
アデノウィルス後期プロモータおよびメタロチオニンプ
ロモータ、並びに原核もしくは真核細胞またはその？）
イルスの遺伝子の発現を制御することが知られたその他
の配列、およびその各種組合せを包含する。哺乳動物細
胞においては、さらに遺伝子をジヒドロホレートレダク
ターゼに結合しかつ宿主支那ハムスター卵細胞に対し選
択を行なって発現単位を増幅することもでき？）。
発現を行なうことができる。これらの発現制御配列はた
とえばＩａｃ系、β−ラクタマーゼ系、Ｌｒｐ系、ＴＡ
Ｃ系、ＴＲＣ系、ファージλの主オペレータおよびプロ
モータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、３−ホスホグ
リセレートキナーゼもしくはその他の糖分解酵素のプロ
モータ、酸ホスファターゼのプロモータ（たとえばＰｂ
ｏ２）２．９母α−交配因子のプロモータ、哺乳動物細
胞のプロモータ、たとえばＳＶ４０の早期プロモータ、
アデノウィルス後期プロモータおよびメタロチオニンプ
ロモータ、並びに原核もしくは真核細胞またはその？）
イルスの遺伝子の発現を制御することが知られたその他
の配列、およびその各種組合せを包含する。哺乳動物細
胞においては、さらに遺伝子をジヒドロホレートレダク
ターゼに結合しかつ宿主支那ハムスター卵細胞に対し選
択を行なって発現単位を増幅することもでき？）。
本発明のＤＮＡ配列を発現させるには、これ；、 Ｄ
ＮＡ配列を発現ベクターにおけるヒ記発現制御配列の１
種もしバはそれＱＪ、上に作用粘合さ・ピる。選択しだ
ＭＩＳ一様ポリペブナＦ ｒ） Ｎ Ａ配列がクローン
化−・、ヒクル中にｌｉｌ’ｉ人さね？）前または挿入
された後に行ないうろこの種の作用粘合は、発現制御配
列がＤＮＡ配列の発現を制御しかつ促進することを可能
にする。
ＮＡ配列を発現ベクターにおけるヒ記発現制御配列の１
種もしバはそれＱＪ、上に作用粘合さ・ピる。選択しだ
ＭＩＳ一様ポリペブナＦ ｒ） Ｎ Ａ配列がクローン
化−・、ヒクル中にｌｉｌ’ｉ人さね？）前または挿入
された後に行ないうろこの種の作用粘合は、発現制御配
列がＤＮＡ配列の発現を制御しかつ促進することを可能
にする。
本発明に使用する選択ＤＮＡ断片および発現制御配列を
挿入するためここで選択したベクターもしくは発現ベヒ
クルおよび特に部位は各種の因子、たとえば特定制限酵
素に感受性である部位の個数、発現すべき蛋白の大きさ
、たとえばベクター配列に対する開始および停止コドン
の位置などの発現特性、並びに当業者に認識されたその
他の因子によって決定される。ベクター、発現制御配列
および特定のＭＩＳ一様ポリペプチド配列の挿入部位の
選択はこれら因子のバランスによって決定され、必ずし
も全ての選択が所定の場合に同等に有効であるとは限ら
ない。
挿入するためここで選択したベクターもしくは発現ベヒ
クルおよび特に部位は各種の因子、たとえば特定制限酵
素に感受性である部位の個数、発現すべき蛋白の大きさ
、たとえばベクター配列に対する開始および停止コドン
の位置などの発現特性、並びに当業者に認識されたその
他の因子によって決定される。ベクター、発現制御配列
および特定のＭＩＳ一様ポリペプチド配列の挿入部位の
選択はこれら因子のバランスによって決定され、必ずし
も全ての選択が所定の場合に同等に有効であるとは限ら
ない。
さらに、クローン化もしくは発現ベヒクルの選択部位に
挿入される本発明によるＭＩＳ一様ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列は、ＭＴＳ一様ポリペプチドをコード
する実際の遺伝子の１部でないヌクレオチドを包含する
ことができ、或いはこのポリペプチドを全遺伝子の断片
のみを包含しうろことも了解すべきである。唯一の必要
なことは、いかなるＤＮＡ配列を使用しても、形質転換
宿主がＭＩＳ一様ポリペプチドを産生ずることである。
挿入される本発明によるＭＩＳ一様ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列は、ＭＴＳ一様ポリペプチドをコード
する実際の遺伝子の１部でないヌクレオチドを包含する
ことができ、或いはこのポリペプチドを全遺伝子の断片
のみを包含しうろことも了解すべきである。唯一の必要
なことは、いかなるＤＮＡ配列を使用しても、形質転換
宿主がＭＩＳ一様ポリペプチドを産生ずることである。
たとえば、本発明のＭＩＳ一様ポリペプチド関連ＤＮＡ
配列を、本発明の発現ベクターにおける同じ読枠中で、
少なくとも１種の真核もしくは原核信号配列をコードす
る少なくとも１種の真核もしくは原核キャリヤ蛋白もし
くはＤＮＡ配列或いはその組合せをコードするＤＮＡ配
列の少なくとも１部に融合させることができる。この種
の作成は、所望のＭＩＳ一様ポリペプチド聞達ＤＮＡ配
列の発現を助け、精製を同上させ、または宿主細胞から
のＭＩＳ一様ポリペプチドの分泌、好ましくは熟成を可
能にする。或いは、ＭＩＳ一様ポリペプチド関連ＤＮＡ
配列は、ＡＴＣ開始コドンを単独で或いは他のコドンと
一緒に含むことができ、または天然の成熟ＭＩＳ一様ポ
リペプチドの第１アミノ酸をコードする配列に直接融合
させることもできる。この種の作成は、たとえばメチオ
ニルもしくはその他のペプチジル−ＭＩＳ一様ポリペプ
チドの産生をも可能にし、これも本発明の１部である。
配列を、本発明の発現ベクターにおける同じ読枠中で、
少なくとも１種の真核もしくは原核信号配列をコードす
る少なくとも１種の真核もしくは原核キャリヤ蛋白もし
くはＤＮＡ配列或いはその組合せをコードするＤＮＡ配
列の少なくとも１部に融合させることができる。この種
の作成は、所望のＭＩＳ一様ポリペプチド聞達ＤＮＡ配
列の発現を助け、精製を同上させ、または宿主細胞から
のＭＩＳ一様ポリペプチドの分泌、好ましくは熟成を可
能にする。或いは、ＭＩＳ一様ポリペプチド関連ＤＮＡ
配列は、ＡＴＣ開始コドンを単独で或いは他のコドンと
一緒に含むことができ、または天然の成熟ＭＩＳ一様ポ
リペプチドの第１アミノ酸をコードする配列に直接融合
させることもできる。この種の作成は、たとえばメチオ
ニルもしくはその他のペプチジル−ＭＩＳ一様ポリペプ
チドの産生をも可能にし、これも本発明の１部である。
次いで、このＮ−末端メチオニンもしくはペプチドを各
種の公知方法により細胞内でまたは細胞外で切断するこ
とができ、或いはメチオニンもしくはペプチドが結合し
たＭＩＳ一様ポリペプチドを未切断のまま医薬組成物お
よび本発明の方法に使用することもできる。
種の公知方法により細胞内でまたは細胞外で切断するこ
とができ、或いはメチオニンもしくはペプチドが結合し
たＭＩＳ一様ポリペプチドを未切断のまま医薬組成物お
よび本発明の方法に使用することもできる。
本発明のｔｌｓ一様ポリペプチドコード配列を含むクロ
ーン化ベヒクルまたは発現ベクターを本発明にしたがっ
て使用し、適当な宿主を形質転換させて、この宿主がＤ
ＮＡ配列のコードするＭＩＳ一様ポリペプチドを発現す
るのを可能にする。
ーン化ベヒクルまたは発現ベクターを本発明にしたがっ
て使用し、適当な宿主を形質転換させて、この宿主がＤ
ＮＡ配列のコードするＭＩＳ一様ポリペプチドを発現す
るのを可能にする。
有用なりローン化もしくは発現宿主はイー・コリ、たと
えばイー・コリＣ６００，イー・コリＥＤ８７６７．イ
ー・コリＤＨ１，イー・コリＬＥ３９２． イー・コリ
ＨＢ １０１．イー・コリＸ１７７６、イー・コリＸ２
２８２．イー・コリＭＲＣＩ、イー・コリＢＮＮ１０２
．イー・コリＪＭ８３．イー・コリＪＡ２２１．並びに
シュードモナス、バチルスおよびストレプトミセス、酵
母およびその他の真菌類の菌株、動物宿主、たとえばＣ
ＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞もしくはネズミ細胞、その他の動
物（ヒトを含む）宿主、培養中の植物細胞またはその他
の宿主を包含する。
えばイー・コリＣ６００，イー・コリＥＤ８７６７．イ
ー・コリＤＨ１，イー・コリＬＥ３９２． イー・コリ
ＨＢ １０１．イー・コリＸ１７７６、イー・コリＸ２
２８２．イー・コリＭＲＣＩ、イー・コリＢＮＮ１０２
．イー・コリＪＭ８３．イー・コリＪＡ２２１．並びに
シュードモナス、バチルスおよびストレプトミセス、酵
母およびその他の真菌類の菌株、動物宿主、たとえばＣ
ＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞もしくはネズミ細胞、その他の動
物（ヒトを含む）宿主、培養中の植物細胞またはその他
の宿主を包含する。
通する宿主の選択も、当業界で認識された多数の因子に
よって管理される。これらは、たとえば選択ベクターと
の適合性、ハイブリッドプラスミドによりコードされる
蛋白の毒性、宿主細胞酵素による蛋白分解減成に対する
所望蛋白の感受性、精製の際に除去するのが困難な宿主
細胞蛋白による発現蛋白の汚染もしくは結合。
よって管理される。これらは、たとえば選択ベクターと
の適合性、ハイブリッドプラスミドによりコードされる
蛋白の毒性、宿主細胞酵素による蛋白分解減成に対する
所望蛋白の感受性、精製の際に除去するのが困難な宿主
細胞蛋白による発現蛋白の汚染もしくは結合。
所望蛋白の回収容易性５発現特性、生物安全性およびコ
ストなどを包含する。これら因子のバランスは、必ずし
も全ての宿主ヘククー組合せが特定組換ＤＮＡ分子のク
ローン化もしくは発現のいずれに対しても同等には有効
ではないという理解に立脚せねばならない。
ストなどを包含する。これら因子のバランスは、必ずし
も全ての宿主ヘククー組合せが特定組換ＤＮＡ分子のク
ローン化もしくは発現のいずれに対しても同等には有効
ではないという理解に立脚せねばならない。
ＭｆＳ一様ポリペプチド（前記宿主で本発明により作成
される）は、融合蛋白の形態のポリペプチド（たとえば
原核、真核もしくは組合せＮ−末端断片に結合して分泌
を指令し、安定性を向上さ廿、精製を改善し、またはＮ
−末端断片の可能な切断を向上させる） 、Ｍｉｓ一様
ポリペプチドの先駆体の形態゛（たとえば、ＭＴＳ一様
ポリペプチド信号配列またはその他の真核もしくは原核
信号配列の全部または部分から出発する）、成熟Ｍ’ｌ
Ｓ一様ポリペプチドの形態、またはｆｍｅｔ−Ｍｉｓ
一様ポリペプチドの形態のポリペプチドを包含する。上
記したように、本明細書中に使用する「誘導されるＭＩ
Ｓ一様ポリペプチド」という用語は、この種のＭＩＳ一
様ポリペプチドを包含すると理解すべきである。
される）は、融合蛋白の形態のポリペプチド（たとえば
原核、真核もしくは組合せＮ−末端断片に結合して分泌
を指令し、安定性を向上さ廿、精製を改善し、またはＮ
−末端断片の可能な切断を向上させる） 、Ｍｉｓ一様
ポリペプチドの先駆体の形態゛（たとえば、ＭＴＳ一様
ポリペプチド信号配列またはその他の真核もしくは原核
信号配列の全部または部分から出発する）、成熟Ｍ’ｌ
Ｓ一様ポリペプチドの形態、またはｆｍｅｔ−Ｍｉｓ
一様ポリペプチドの形態のポリペプチドを包含する。上
記したように、本明細書中に使用する「誘導されるＭＩ
Ｓ一様ポリペプチド」という用語は、この種のＭＩＳ一
様ポリペプチドを包含すると理解すべきである。
本発明によるポリペプチド、または少なくともその先駆
体の１種の特に有用な形態は、容易に切断されるアミノ
酸もしくはアミノ酸シリーズがアミノ末端に結合した成
熟ＭＩＳ一様ポリペプチドである。この種の作成は、適
当な宿主におけるポリペプチドの合成を可能にし、成熟
ポリペプチドに存在してはならない開始信号を必要とし
、さらに余分なアミノ酸のインビボもしくはインビトロ
の切断を可能にして成熟ＭＩＳ一様ポリペプチドを産生
ずる。この種の方法は当業界で既に存在する（たとえば
、米国特許第４．３３２，８９２号、第４，３３８，３
９７号および第４，４２５，４３７号各公報参照）。さ
らに、これらポリペプチドは、天然ＭＩＳ−蛋白と同様
にグリコジル化されていても或いはグリコジル化されて
いなくてもよく、または天然ＭＩＳ−蛋白のパターンと
は異なるグリコツル化パターンを有することもできる。
体の１種の特に有用な形態は、容易に切断されるアミノ
酸もしくはアミノ酸シリーズがアミノ末端に結合した成
熟ＭＩＳ一様ポリペプチドである。この種の作成は、適
当な宿主におけるポリペプチドの合成を可能にし、成熟
ポリペプチドに存在してはならない開始信号を必要とし
、さらに余分なアミノ酸のインビボもしくはインビトロ
の切断を可能にして成熟ＭＩＳ一様ポリペプチドを産生
ずる。この種の方法は当業界で既に存在する（たとえば
、米国特許第４．３３２，８９２号、第４，３３８，３
９７号および第４，４２５，４３７号各公報参照）。さ
らに、これらポリペプチドは、天然ＭＩＳ−蛋白と同様
にグリコジル化されていても或いはグリコジル化されて
いなくてもよく、または天然ＭＩＳ−蛋白のパターンと
は異なるグリコツル化パターンを有することもできる。
この種のグリコジル化は宿主ｍ胞の選択、或いは特定Ｍ
ＴＳ一様ポリペプチドにつき選択した発現後の処理によ
って生ずる。さらに、本発明のポリペプチドは、本発明
のＤＮＡ配列におけるコドンの幾つかまたは全部につき
異なるコドンを特徴とするＤＮＡ配列によ−２て発現に
際しコーＩ゛されるＭＩＳ一様ポリペブチ！゛をも包含
する。これらの置換コ）°ンは、置換されたコ１゛ンに
Ｊリフ−１さね、で、ものさ同一のアミノ酸をコードし
うるが、より高収率のポリペプチドをもたらす。代案と
して、アミノ酸置換をもたらす、或いはより長いもしく
はより短いＭＩＳ一様ポリペブチ１′をもたらすコドン
の１個もしくは組合せの置換は、その性質を通常のよう
に変化させるこ２ができる（たとえば安定１ｔ１・を増
大させ、溶解度を増大させ、または治療活性を増大させ
る）。
ＴＳ一様ポリペプチドにつき選択した発現後の処理によ
って生ずる。さらに、本発明のポリペプチドは、本発明
のＤＮＡ配列におけるコドンの幾つかまたは全部につき
異なるコドンを特徴とするＤＮＡ配列によ−２て発現に
際しコーＩ゛されるＭＩＳ一様ポリペブチ！゛をも包含
する。これらの置換コ）°ンは、置換されたコ１゛ンに
Ｊリフ−１さね、で、ものさ同一のアミノ酸をコードし
うるが、より高収率のポリペプチドをもたらす。代案と
して、アミノ酸置換をもたらす、或いはより長いもしく
はより短いＭＩＳ一様ポリペブチ１′をもたらすコドン
の１個もしくは組合せの置換は、その性質を通常のよう
に変化させるこ２ができる（たとえば安定１ｔ１・を増
大させ、溶解度を増大させ、または治療活性を増大させ
る）。
本発明をより良く理解するＪう、以下の実施例により本
発明を説明する。これらの実施例！−り説明の目的であ
って、本発明の範囲を決して限定するものでないと理解
すべきてん？、。
発明を説明する。これらの実施例！−り説明の目的であ
って、本発明の範囲を決して限定するものでないと理解
すべきてん？、。
（実施例）
実施例１
１゛ノ −、ＭＩＳ 蛋白Ｃノｆ＝ピ列ブ１′ウツ、ｆ
り等（Ｃｅｌｌ、第３４％、第３０７〜３１４頁（１９
８３））の方法によって新生のウシ筆太からウシＭＩＳ
ｉ白を分離した。マトリックスゲルグリーンＡカラムか
ら０．５Ｍ ＮａＣ１で熔出した後、ウシＭＩＳ画分
（グリーン−３）を濃縮し、ＰＢＳ緩衝液と０．０１％
ノニデッ）−Ｐ２Ｏで透析し一７０℃で保存した。
り等（Ｃｅｌｌ、第３４％、第３０７〜３１４頁（１９
８３））の方法によって新生のウシ筆太からウシＭＩＳ
ｉ白を分離した。マトリックスゲルグリーンＡカラムか
ら０．５Ｍ ＮａＣ１で熔出した後、ウシＭＩＳ画分
（グリーン−３）を濃縮し、ＰＢＳ緩衝液と０．０１％
ノニデッ）−Ｐ２Ｏで透析し一７０℃で保存した。
分析的５ＤＳ−ＰＡＧＥ還元によるとＭｉｓ（グリーン
−３画分）は７４Ｋｄと７０Ｋｄとの主なポリペプチド
、並びに１４０に近い種と９５Ｋｄを含む幾つかの小量
成分を含んでいた。
−３画分）は７４Ｋｄと７０Ｋｄとの主なポリペプチド
、並びに１４０に近い種と９５Ｋｄを含む幾つかの小量
成分を含んでいた。
７４Ｋｄと７０Ｋｄ種の高精製試料を半調製５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの組合わせに続く？８離により得ることが出来た
。これらの各々を末端分析に付した。７０Ｋｄと７４Ｋ
ｄポリペプチドの両方とも同じＮ−末端（ＡｒｇＧｌｕ
ＧｌｕＶａ ＋ｐｈｅｓｅｒ）を有していた。
ＡＧＥの組合わせに続く？８離により得ることが出来た
。これらの各々を末端分析に付した。７０Ｋｄと７４Ｋ
ｄポリペプチドの両方とも同じＮ−末端（ＡｒｇＧｌｕ
ＧｌｕＶａ ＋ｐｈｅｓｅｒ）を有していた。
還元しかつカルボキシメチル化した７４Ｋｄと７０Ｋｄ
ＭＩＳポリペプチドの夫々の約１ノナモルをＴＰＣＫ−
１−リプシンで別々に消化した。カルボキシメチル化後
、精製ポリペプチドを０．１ Ｍ ＮＨ，ＨＣＯ３と
０．１ｍＭ ＣａＣ１゜中に再分散して精製し、次い
でＴＰＣＫ−）リブシンで１６時間３７℃下に培養した
。この培養中、トリプシンを３回に分けて添加し、初回
に全蛋白に対し最終濃度２．０％、４時間後に４．０％
、１２時間後に６．０％である。
ＭＩＳポリペプチドの夫々の約１ノナモルをＴＰＣＫ−
１−リプシンで別々に消化した。カルボキシメチル化後
、精製ポリペプチドを０．１ Ｍ ＮＨ，ＨＣＯ３と
０．１ｍＭ ＣａＣ１゜中に再分散して精製し、次い
でＴＰＣＫ−）リブシンで１６時間３７℃下に培養した
。この培養中、トリプシンを３回に分けて添加し、初回
に全蛋白に対し最終濃度２．０％、４時間後に４．０％
、１２時間後に６．０％である。
これら培養による開裂フラグメントを０．１％トリフロ
ロ酢酸中の０〜７５％勾配のアセトニトリルを使用して
高圧液体クロマトグラフィーにより分解して、Ｃ１Ｂカ
ラムに結合のペプチドを溶出した。２つのトリブチル地
図は極めて近似しており、同じ一次構造を示し、かつ７
０Ｋｄポリペプチドは７４Ｋｄポリペプチドに由来する
ことが推定された。従って、各々の培養からの選択保存
ピークを組合せ、次いでガス相配列解析搬（アプライド
バイオシステムス４７０Ａ）を使用して配列分析をした
。５μｍシアノカラム（ハイパーシル）により、０．０
２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｔ１５．７ ）中の１５〜５５
％勾配のア七トニトリル：メタノール（４： １）を使
用して高圧液体クロマトグラフィーによりＰＴＨ−アミ
ノ酸を分析した。
ロ酢酸中の０〜７５％勾配のアセトニトリルを使用して
高圧液体クロマトグラフィーにより分解して、Ｃ１Ｂカ
ラムに結合のペプチドを溶出した。２つのトリブチル地
図は極めて近似しており、同じ一次構造を示し、かつ７
０Ｋｄポリペプチドは７４Ｋｄポリペプチドに由来する
ことが推定された。従って、各々の培養からの選択保存
ピークを組合せ、次いでガス相配列解析搬（アプライド
バイオシステムス４７０Ａ）を使用して配列分析をした
。５μｍシアノカラム（ハイパーシル）により、０．０
２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｔ１５．７ ）中の１５〜５５
％勾配のア七トニトリル：メタノール（４： １）を使
用して高圧液体クロマトグラフィーによりＰＴＨ−アミ
ノ酸を分析した。
１リプチル培養は２０以上のピークをＬｌｆｆｌした。
この内の６つは蛋白配列を与えた。一つのトリブチルペ
プチド、＃Ｔ１０５−１０６の配列を第】図に示す。
プチド、＃Ｔ１０５−１０６の配列を第】図に示す。
トリプシン又はＳ、アウレウス■８プロテアイ２５
−ゼによる Ｉ−標識付け７４Ｋｄ及び７０ＫｄＭＩＳ
の分析的培養によると、生成ペプチドの大部分は１０Ｋ
ｄより大きく、かつＣＩ８カラムによる高性能液体クロ
マトグラフィーで低収率で回収した。５ＤＳ−尿素ＰＡ
ＧＥ及び高性能液体クロマトグラフィー分析の両方を使
用し７て、保存開裂生成物は７０Ｋｄと７４ＫｄＭＩＳ
の間に住起することが再び観察され１．２つのポリペプ
チドは関係があることをＲＥ’Ｒしだ。
の分析的培養によると、生成ペプチドの大部分は１０Ｋ
ｄより大きく、かつＣＩ８カラムによる高性能液体クロ
マトグラフィーで低収率で回収した。５ＤＳ−尿素ＰＡ
ＧＥ及び高性能液体クロマトグラフィー分析の両方を使
用し７て、保存開裂生成物は７０Ｋｄと７４ＫｄＭＩＳ
の間に住起することが再び観察され１．２つのポリペプ
チドは関係があることをＲＥ’Ｒしだ。
基本ｐｌ＋におけるＴｒ’Ｃ）（−）リブシンによ／：
）培ｆ：ｆ１１！度を増大するため、培養の前に１ノナ
モルのＭＩＳをこはく酸付加体とし、次いで得られたペ
プチドを０８カラムで分離した（９０％収率）。５〜１
６残直に亘る６つのペプチド配列を更に得た。この内の
２つは前に得た配Ｊｌであることを！認した。トリブチ
ルペプチド＃Ｔ８１の配列を第１図に示す。
）培ｆ：ｆ１１！度を増大するため、培養の前に１ノナ
モルのＭＩＳをこはく酸付加体とし、次いで得られたペ
プチドを０８カラムで分離した（９０％収率）。５〜１
６残直に亘る６つのペプチド配列を更に得た。この内の
２つは前に得た配Ｊｌであることを！認した。トリブチ
ルペプチド＃Ｔ８１の配列を第１図に示す。
培養に際し、２Ｍ尿素を含ませることにより、ＴＰＣＫ
−）リプシンによるＭＩＳの培養効率が更に向上した。
−）リプシンによるＭＩＳの培養効率が更に向上した。
このようにして得たペプチドを使用して、更に１１個の
ペプチド配列を得た。
ペプチド配列を得た。
総計して、２３個のペプチド配列を得、その内の２つを
第１ｒｙＪに示す。
第１ｒｙＪに示す。
実施例２
オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブの合成ウシＭＴＳ蛋
白の各種範囲のアミノ酸配列を決定した後（第１図参照
）。これら蛋白配列の幾つかに対しコードされた抗認識
オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブの２つのプールを化
学的に合成した（第２図参照）、これらは最小核酸縮退
を有するＭＩＳ蛋白の範囲に相当するため第２図に示す
２つのプール（１−４及び９−１２）を合成した。各ア
ミノ酸配列に対し、総てのコードンに相補のプローブ混
合物を合成した。プローブはアミノ酸配列にコードする
ＤＮＡ配列に相補で、即ち、プローブは抗認識であって
プローブがＤＮＡ並びにｍＲＮＡ中の対応する配列を認
識するのを可能とされる。ＭＩＳ蛋白の２つの選択され
た範囲のアミノ酸配列及びこれらにコードする総ての可
能なヌクレオチドコードン組み合わせとを第２図に示す
、コードする縮退を次ぎに示す：Ｎ−Ｃ，Ｔ、Ａ又はＧ
；Ｒ＝Ａ又はｃ；ｙ−ｃ又はＴ；及びＨ−Ａ。
白の各種範囲のアミノ酸配列を決定した後（第１図参照
）。これら蛋白配列の幾つかに対しコードされた抗認識
オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブの２つのプールを化
学的に合成した（第２図参照）、これらは最小核酸縮退
を有するＭＩＳ蛋白の範囲に相当するため第２図に示す
２つのプール（１−４及び９−１２）を合成した。各ア
ミノ酸配列に対し、総てのコードンに相補のプローブ混
合物を合成した。プローブはアミノ酸配列にコードする
ＤＮＡ配列に相補で、即ち、プローブは抗認識であって
プローブがＤＮＡ並びにｍＲＮＡ中の対応する配列を認
識するのを可能とされる。ＭＩＳ蛋白の２つの選択され
た範囲のアミノ酸配列及びこれらにコードする総ての可
能なヌクレオチドコードン組み合わせとを第２図に示す
、コードする縮退を次ぎに示す：Ｎ−Ｃ，Ｔ、Ａ又はＧ
；Ｒ＝Ａ又はｃ；ｙ−ｃ又はＴ；及びＨ−Ａ。
Ｃ１又はＴ。
第１図のトリブチルフラグメン１−Ｔ１０５−１０６及
びＴ８１の配列から誘導したプローブの２つのプールは
夫々２５６倍縮退を有する１７量体又は５１２倍縮退を
有する２０量体であった。プールの中央の縮退コードン
にて開裂することにより、４群中の各プールを合成した
。かくして、６４の４つのサブプール（１−４）中のＴ
１０５−１０６の２５６倍縮退１７量体及び１２８の４
つのサブプール［９−１２）中の５１２倍縮退２０量体
とを調製した。これにより正しい配列を含むサブプール
を区別するためノーザンブロートによりこれらを別々に
使用して縮退を減少することが出来た（下記参照）。
びＴ８１の配列から誘導したプローブの２つのプールは
夫々２５６倍縮退を有する１７量体又は５１２倍縮退を
有する２０量体であった。プールの中央の縮退コードン
にて開裂することにより、４群中の各プールを合成した
。かくして、６４の４つのサブプール（１−４）中のＴ
１０５−１０６の２５６倍縮退１７量体及び１２８の４
つのサブプール［９−１２）中の５１２倍縮退２０量体
とを調製した。これにより正しい配列を含むサブプール
を区別するためノーザンブロートによりこれらを別々に
使用して縮退を減少することが出来た（下記参照）。
アプライドバイオシステム３８０Ａ ＤＮＡ合成機に
よりプローブを合成し、次いでこれらをゲル電気泳動に
より精製した。このプローブを〔γ−３２Ｐ）−ＡＴＰ
及びポリヌクレオチド助酵素を使用して標識付けした（
マフク号ムとギルバート Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、５ｃｉｓ第７４巻、第５６０頁（１９７７））。
よりプローブを合成し、次いでこれらをゲル電気泳動に
より精製した。このプローブを〔γ−３２Ｐ）−ＡＴＰ
及びポリヌクレオチド助酵素を使用して標識付けした（
マフク号ムとギルバート Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、５ｃｉｓ第７４巻、第５６０頁（１９７７））。
ノーザン分析を使用して１−４及び９−１２の２つのプ
ローブの縮退を減少した。生後２週間及び３箇月のウシ
筆先、並びに成体ウシ腎臓からのＲＮＡを有するノーザ
ンブロートのためプローブ各々にハイブリッド形成した
。生１２週間つシ筆先のみが生物学的に活性ＭＩＳを含
んでいたので、ノーザン分析はどの群内のプローブが正
しいＭＩＳ配列を含むか区別するであろうとη月ｊ寺さ
れた。それでｃ ＤＮＡライフ゛ラリをスクリーンする
ためにより少量の縮退プローブを使用した。ＭＩＳプロ
ーブ１−４を有するノーザンブロートはプローブ２が正
しいオリゴマー配列を含むことを暗示し、一方ＭＩＳプ
ローブ９−１２を有するノーザンプロートはプローブ１
２は正しいオリゴマー配列を含むことを示した０両方の
場合、２０００ヌクレオチド転写が生ｆ＆ ２ ；！Ｉ
間のウシ筆先からのＲＮＡに観察されたが、他のＲＮＡ
には観察されなかった。
ローブの縮退を減少した。生後２週間及び３箇月のウシ
筆先、並びに成体ウシ腎臓からのＲＮＡを有するノーザ
ンブロートのためプローブ各々にハイブリッド形成した
。生１２週間つシ筆先のみが生物学的に活性ＭＩＳを含
んでいたので、ノーザン分析はどの群内のプローブが正
しいＭＩＳ配列を含むか区別するであろうとη月ｊ寺さ
れた。それでｃ ＤＮＡライフ゛ラリをスクリーンする
ためにより少量の縮退プローブを使用した。ＭＩＳプロ
ーブ１−４を有するノーザンブロートはプローブ２が正
しいオリゴマー配列を含むことを暗示し、一方ＭＩＳプ
ローブ９−１２を有するノーザンプロートはプローブ１
２は正しいオリゴマー配列を含むことを示した０両方の
場合、２０００ヌクレオチド転写が生ｆ＆ ２ ；！Ｉ
間のウシ筆先からのＲＮＡに観察されたが、他のＲＮＡ
には観察されなかった。
サブプール２を１６倍縮退の４つのサブプール（１３−
１６）に切断し、“一方プローブ１２を３２倍縮退の４
つのサブプール（１７−２０）に切断した。生後２週間
のウシ裟丸ＲＮ１八に２０００ヌクレオチ１転写ヘハイ
プリ７・１°形成されたというプローブの、ｒ ４ン
分析により、正しい選択がなされたこと力曜Ｃ証された
。転写＋ｉ ？！Ｆ、 ｉｋ ３ｍ月ノウ：□ ＠丸Ｖ
：＋ 腎瓜Ｘ ニ’；！： 存ｆｆ ） 、、ｔ、・
：かった。
１６）に切断し、“一方プローブ１２を３２倍縮退の４
つのサブプール（１７−２０）に切断した。生後２週間
のウシ裟丸ＲＮ１八に２０００ヌクレオチ１転写ヘハイ
プリ７・１°形成されたというプローブの、ｒ ４ン
分析により、正しい選択がなされたこと力曜Ｃ証された
。転写＋ｉ ？！Ｆ、 ｉｋ ３ｍ月ノウ：□ ＠丸Ｖ
：＋ 腎瓜Ｘ ニ’；！： 存ｆｆ ） 、、ｔ、・
：かった。
実施例３
ウシ４１九のｃ Ｄ Ｎ Ａライブラリの構成ＩＩＶび
につ５ノ率九かｔｅ１分離し、たポリ△”ｒｎ ＲＮ△
のウシｒ、 Ｄ Ｎ Ａ ’７ □（プラ１１を構成し
た。ｃＤ製△今、！（５ｔ ｌ Ｑに挿入じ、かつＥ、
コリＢＮＮ１０２細胞の配列を増幅した。
につ５ノ率九かｔｅ１分離し、たポリ△”ｒｎ ＲＮ△
のウシｒ、 Ｄ Ｎ Ａ ’７ □（プラ１１を構成し
た。ｃＤ製△今、！（５ｔ ｌ Ｑに挿入じ、かつＥ、
コリＢＮＮ１０２細胞の配列を増幅した。
△、ウシ畢来光らｒ？ＮＡの抽出
屠殺直後の住ｔ＆２週間の仔ウシからの豪丸を入手した
。自模から精液生成の細管を除去し、これらを液体窒素
中で急速冷凍した。冷凍組織の約１０ｇを粉砕し、これ
を抽出緩衝液（４Ｍグアニジンチオサイアネート、０．
５％ＳＤＳ。
。自模から精液生成の細管を除去し、これらを液体窒素
中で急速冷凍した。冷凍組織の約１０ｇを粉砕し、これ
を抽出緩衝液（４Ｍグアニジンチオサイアネート、０．
５％ＳＤＳ。
２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１％シグマ泡止め剤
）１００＋ｓｌ中でポリトロンを使用して２分間高速で
均質化した。ホモジネートをツルバールＲＣ２Ｂ遠心機
で４℃、２０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離した。７
５ｍ１の上澄み液を回収し、それをＣｓＣｌ緩衝液（５
，７Ｍ Ｃｓ Ｃｌ、２５ｍＭ ＮＡＯＡｃ ｐ
ｌ＋５．０．１ｍＭＥＤＴＡ）の３０ｍ１（各々１ｏｃ
ＡＩ含有の３管）にとり、次いでＳＷ２８０−タ中で２
２００Ｏｒｐｍ 。
）１００＋ｓｌ中でポリトロンを使用して２分間高速で
均質化した。ホモジネートをツルバールＲＣ２Ｂ遠心機
で４℃、２０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離した。７
５ｍ１の上澄み液を回収し、それをＣｓＣｌ緩衝液（５
，７Ｍ Ｃｓ Ｃｌ、２５ｍＭ ＮＡＯＡｃ ｐ
ｌ＋５．０．１ｍＭＥＤＴＡ）の３０ｍ１（各々１ｏｃ
ＡＩ含有の３管）にとり、次いでＳＷ２８０−タ中で２
２００Ｏｒｐｍ 。
１６時間遠心分離した。ベレットを１０ｍＭトリス−Ｍ
ＣＩ （ｐＨ７，４）１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１
％ＳＤＳの１０−１に再分散した。 ０．３ Ｍ酢酸ナ
トリウム中−２０℃で一晩Ｉ亥酸をエタノール沈澱させ
、これをツルバールＲＣ２Ｂ遠心機（ＳＳ３４ｔ）−タ
）で１４Ｋｒｐｍ、４℃、２０分間でベレット化した。
ＣＩ （ｐＨ７，４）１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１
％ＳＤＳの１０−１に再分散した。 ０．３ Ｍ酢酸ナ
トリウム中−２０℃で一晩Ｉ亥酸をエタノール沈澱させ
、これをツルバールＲＣ２Ｂ遠心機（ＳＳ３４ｔ）−タ
）で１４Ｋｒｐｍ、４℃、２０分間でベレット化した。
ペレ７）を５ｍｌの０．３Ｍｉ￥酸ナトリウム中に再分
散し、再び上記のようにして核酸をエタノール沈澱させ
た。最終ペレットを３００μｌのＨ２Ｏ中に再分散し、
−２０℃で保存した。ポリ （Ａ）” ＲＮＡ用のＲＮ
Ａ１［製品をオリゴ（ｄＴ）−セルローズカラム（ＰＬ
バイオケム）に通して濃縮した。
散し、再び上記のようにして核酸をエタノール沈澱させ
た。最終ペレットを３００μｌのＨ２Ｏ中に再分散し、
−２０℃で保存した。ポリ （Ａ）” ＲＮＡ用のＲＮ
Ａ１［製品をオリゴ（ｄＴ）−セルローズカラム（ＰＬ
バイオケム）に通して濃縮した。
構成
１、ｃＤＮＡの合成
上記のようにして生ｆ１２週間のウシ冨丸から分離した
本発明Ａ′″ｍＲＮ八２５μｇからｃＤＮＡを合成した
。ｍＲＮＡをＨ２０中５５μｇ／ｍ＋！：稀釈し、水酸
化メチル−マーキュリ（ＣＨｔＨｇＯＨ）で処理するこ
とにより変性した９次いで５０ｍＭにＩＭ （ｊｌ、
Ｈｇ○ＩＩ（アルファベネトロン）を添加した。５μ！
の５０ｍＭ ＣＨ，ＨｇＯＨを５０ｔｔｌのＨ２Ｏ中
のｍＲＮ）１２５μｇに添加し、室温で１０分間温１し
た。 １．４ Ｍのβ−メルカプトエタノール弓０μｌ
を添加することにより反応を停止した。
本発明Ａ′″ｍＲＮ八２５μｇからｃＤＮＡを合成した
。ｍＲＮＡをＨ２０中５５μｇ／ｍ＋！：稀釈し、水酸
化メチル−マーキュリ（ＣＨｔＨｇＯＨ）で処理するこ
とにより変性した９次いで５０ｍＭにＩＭ （ｊｌ、
Ｈｇ○ＩＩ（アルファベネトロン）を添加した。５μ！
の５０ｍＭ ＣＨ，ＨｇＯＨを５０ｔｔｌのＨ２Ｏ中
のｍＲＮ）１２５μｇに添加し、室温で１０分間温１し
た。 １．４ Ｍのβ−メルカプトエタノール弓０μｌ
を添加することにより反応を停止した。
変性ｍＲＮＡ混合物を、４２℃の０．１Ｍトリス−ＨＣ
Ｌ ０．ＯＩＭ ＭｇＣＩ、 、０．ＯＩＭｒ’）Ｔ
Ｔ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰと５
０１ｔＣｉ’ Ｈ−ｄ ＣＴＰ （２５，７Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌ。
Ｌ ０．ＯＩＭ ＭｇＣＩ、 、０．ＯＩＭｒ’）Ｔ
Ｔ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰと５
０１ｔＣｉ’ Ｈ−ｄ ＣＴＰ （２５，７Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌ。
ニュー イングランド ヌクレア）、１ｍＭｄＣ，ＴＰ
、１ｍＭ ｄＴＴＰ、２−５ ｍ Ｍ ／Ｎナジルリ
ボヌクＬ・オシ１複合体（ヘテスグリサー千ラプス）
２０μｇオリゴｄＴｌ ２ ＋ １’！ （１’
ＬビメケＪ・）、及び１９６ｔｊ ＡＭＶ逆転写醇＃
（セ・イカガク アメリカ）からなる反応混合物へ添加
した。混合物の最終容量は２００μ！であった。混合物
を３分間室温で、４４℃で３時間培養し、次いで０．５
Ｍ Ｎａ２ＥＤＴＡ１／２０容量添加することによ
り反応を停止した（ｐｌ＋８．０ ）。
、１ｍＭ ｄＴＴＰ、２−５ ｍ Ｍ ／Ｎナジルリ
ボヌクＬ・オシ１複合体（ヘテスグリサー千ラプス）
２０μｇオリゴｄＴｌ ２ ＋ １’！ （１’
ＬビメケＪ・）、及び１９６ｔｊ ＡＭＶ逆転写醇＃
（セ・イカガク アメリカ）からなる反応混合物へ添加
した。混合物の最終容量は２００μ！であった。混合物
を３分間室温で、４４℃で３時間培養し、次いで０．５
Ｍ Ｎａ２ＥＤＴＡ１／２０容量添加することによ
り反応を停止した（ｐｌ＋８．０ ）。
反応混合物をＴＥ飽和フェノールとクロロホルム（５０
：５０）の混合物で抽出した。（ＴＥ緩衝液は１０ｍＭ
）リス−ＨＣｌ 、 ｐＨ７，０，１ｍＭ Ｎａ
２−ＥＤＴＡ）、次いで有機相をＴＥ緩衝液で再抽出し
、混合液相を、０．ＯＩＭ トリス−ＨＣｌ （ｐＨ
７，４）、０．１Ｍ ＮａＣ１゜０、ＯＩＭ Ｎａ
２ ＥＤＴＡ、 ０．０５％ＳＤＳを含有する５ｍｌの
殺菌ピペットを介してクロマトグラフィに付した。ＬＫ
ＢＩ体シンチレーションカウンター中の各両分のアリコ
ートをカウントした。前ピークから尾部を差し引してプ
ールし、ｃ Ｄ Ｎ Ａを９５％エタノール２．５容量
を使用して一２０℃で沈澱した。ｃＤＮＡの収量はｃＤ
ＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドとして得られた８、１Ｍｇ
であった。
：５０）の混合物で抽出した。（ＴＥ緩衝液は１０ｍＭ
）リス−ＨＣｌ 、 ｐＨ７，０，１ｍＭ Ｎａ
２−ＥＤＴＡ）、次いで有機相をＴＥ緩衝液で再抽出し
、混合液相を、０．ＯＩＭ トリス−ＨＣｌ （ｐＨ
７，４）、０．１Ｍ ＮａＣ１゜０、ＯＩＭ Ｎａ
２ ＥＤＴＡ、 ０．０５％ＳＤＳを含有する５ｍｌの
殺菌ピペットを介してクロマトグラフィに付した。ＬＫ
ＢＩ体シンチレーションカウンター中の各両分のアリコ
ートをカウントした。前ピークから尾部を差し引してプ
ールし、ｃ Ｄ Ｎ Ａを９５％エタノール２．５容量
を使用して一２０℃で沈澱した。ｃＤＮＡの収量はｃＤ
ＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドとして得られた８、１Ｍｇ
であった。
２、二本鎖合成
ｃＤＮＡをＨ２Ｏに再分散し、各々４μｇのｃＤＮＡを
含む重複二次鎮反応物を設定した。
含む重複二次鎮反応物を設定した。
各４００μｌの反応物は０．０２Ｍ ）リス−ＭＣＩ、
ｐＨ７，５，０，１Ｍ ＭＣＩ、０．００５Ｍ Ｍ
ｇＣｌ２．０．５ｍＭ ｄＡＴＰ＋１０（ｌｃｒｃｉ
α−ｄＡＴＰ”（３０００Ｃｉ／ｍｍｏ １．ニーｓ−
イングランド ヌクレア）、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍ
ＭｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ｕＤＮＡＰｏ
ｌｌクレノー画分（ボーリンゲル マンハイム）、及び
４ｕＲナーゼＨ（Ｐ、 Ｌ、ビオケム）を含有した０反
応物を１２℃で１時間、室温で１．５時間培養し、次い
でｐ）１Ｂ１０で０．５Ｍ Ｎａ２ＥＤＴＡを１／２
０容量添加して反応を停止した。次いで前節に記載した
ｃＤＮＡ合成工程におけるようにフェノール：クロロホ
ルムで反応混合物を抽出し、抽出物を０．２容量の１０
Ｍ酢酸アンモニウムと２．５容量の９５％エタノールを
一７０℃、２０分間にて添加して沈澱させた。得られた
混合物を室温に加温し、次いでエンベンドルフ遠心機で
１５分間回転して二本鎖ｃＤＮＡをペレットとした。ペ
レットをＴＥｇ街液に再分散し、酢酸アンモニウムで沈
澱を繰り返しく最終濃度２Ｍ）、エタノールで２回沈澱
させた。
ｐＨ７，５，０，１Ｍ ＭＣＩ、０．００５Ｍ Ｍ
ｇＣｌ２．０．５ｍＭ ｄＡＴＰ＋１０（ｌｃｒｃｉ
α−ｄＡＴＰ”（３０００Ｃｉ／ｍｍｏ １．ニーｓ−
イングランド ヌクレア）、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍ
ＭｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１００ｕＤＮＡＰｏ
ｌｌクレノー画分（ボーリンゲル マンハイム）、及び
４ｕＲナーゼＨ（Ｐ、 Ｌ、ビオケム）を含有した０反
応物を１２℃で１時間、室温で１．５時間培養し、次い
でｐ）１Ｂ１０で０．５Ｍ Ｎａ２ＥＤＴＡを１／２
０容量添加して反応を停止した。次いで前節に記載した
ｃＤＮＡ合成工程におけるようにフェノール：クロロホ
ルムで反応混合物を抽出し、抽出物を０．２容量の１０
Ｍ酢酸アンモニウムと２．５容量の９５％エタノールを
一７０℃、２０分間にて添加して沈澱させた。得られた
混合物を室温に加温し、次いでエンベンドルフ遠心機で
１５分間回転して二本鎖ｃＤＮＡをペレットとした。ペ
レットをＴＥｇ街液に再分散し、酢酸アンモニウムで沈
澱を繰り返しく最終濃度２Ｍ）、エタノールで２回沈澱
させた。
ペレットを高速真空で乾燥し、ＴＥ緩衝液１００μ！中
に再分散した０次いで２５Ｍｇの煮沸ＲナーゼＡ（シグ
マ）を添加し、混合物を３７℃で３０分間培養し、フェ
ノール：クロロホルムで抽出し、ｃＤＮＡ合成工程に対
し上記したようにセファデックスＧ１５０を介してクロ
マトグラフに付した。
に再分散した０次いで２５Ｍｇの煮沸ＲナーゼＡ（シグ
マ）を添加し、混合物を３７℃で３０分間培養し、フェ
ノール：クロロホルムで抽出し、ｃＤＮＡ合成工程に対
し上記したようにセファデックスＧ１５０を介してクロ
マトグラフに付した。
鈍い端部を確認するため、二本鎖ｃＤＮＡをＨ２Ｏに再
分散し、それを０．００１ Ｍ酢酸マグネシウム、０．
１７ｍＭ ＤＴＴ、８８．Ｅｒｇ ＢＳＡ。
分散し、それを０．００１ Ｍ酢酸マグネシウム、０．
１７ｍＭ ＤＴＴ、８８．Ｅｒｇ ＢＳＡ。
０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰＳｄＧＴＰ。
ｄＴＴＰ、及び１８ｕＴ、ＤＮＡポリメラーゼにニー
イングランド ビオラプス）を含む反応混合物へ添加し
た。最終反応物の容量は３００μｌであった。反応物を
３７℃１時間培養し、次いで抽出し、２次鎖合成工程に
対して記載したように２Ｍ酢酸アンモニウムと２．５容
量の９５％エタノールで２回沈澱させた。
イングランド ビオラプス）を含む反応混合物へ添加し
た。最終反応物の容量は３００μｌであった。反応物を
３７℃１時間培養し、次いで抽出し、２次鎖合成工程に
対して記載したように２Ｍ酢酸アンモニウムと２．５容
量の９５％エタノールで２回沈澱させた。
鈍い端部化ｃＤＮＡの２μｇを独特なオリゴマリンカ−
に結合させた。このリンカ−はリンカ−２７、配列５’
ＡＡＴＴＧＡＧＣＴ ＣＧＡＧＣＧ ＣＧＧ Ｃ
ＣＧ Ｃで５′ホスホリル化リンカ−２８への２２量
体、配列、５’ＧＣＧＧＣＣＧＣＧ ＣＴＣＧＡＧ
ＣＴＣ３での１８量体を煮もどしすることにより
形成した。魚もどししたリンカ−は鈍い端部化ｃＤＮＡ
への結合に対するホスホリル化鈍い端部とλｇｔｌｏ培
養したＥＣ０ＲＩへの結合に対する非ホスホリル化５′
突出配列（ＡＡＴＴ）とを含有する。リンカ−は次ぎの
限定酵素に対して認識配列を含んでいた：Ａｌｕｌ、Ａ
ｖａ ｌ、Ｂａｎ２、Ｂｓｐ１２、Ｆｎｕ４Ｈ，Ｆｎｕ
Ｄ２、Ｈａ１３ 、 Ｈｇｉ Ａｌ 、 Ｈ
ｈａｌ 、 ＩＩ ｉ ｎ Ｐ １ 。
に結合させた。このリンカ−はリンカ−２７、配列５’
ＡＡＴＴＧＡＧＣＴ ＣＧＡＧＣＧ ＣＧＧ Ｃ
ＣＧ Ｃで５′ホスホリル化リンカ−２８への２２量
体、配列、５’ＧＣＧＧＣＣＧＣＧ ＣＴＣＧＡＧ
ＣＴＣ３での１８量体を煮もどしすることにより
形成した。魚もどししたリンカ−は鈍い端部化ｃＤＮＡ
への結合に対するホスホリル化鈍い端部とλｇｔｌｏ培
養したＥＣ０ＲＩへの結合に対する非ホスホリル化５′
突出配列（ＡＡＴＴ）とを含有する。リンカ−は次ぎの
限定酵素に対して認識配列を含んでいた：Ａｌｕｌ、Ａ
ｖａ ｌ、Ｂａｎ２、Ｂｓｐ１２、Ｆｎｕ４Ｈ，Ｆｎｕ
Ｄ２、Ｈａ１３ 、 Ｈｇｉ Ａｌ 、 Ｈ
ｈａｌ 、 ＩＩ ｉ ｎ Ｐ １ 。
Ｎｏｔｌ、５ｓｔｌ、Ｘｈｏｌ、Ｘｍａ３゜リンカ−２
７−２８の２μｇを０．０５Ｍ ）リス−ＨＣ１ｐＨ７
，８の２ ｐ ｇ ｃ ＤＮＡ、 ０．ＯＩＭＭｇ Ｃ
Ｉ２．０．０３Ｍ Ｎａ ｃ Ｉ、１ｍＭスペルミジ
ン、０．２ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、２ｍＭＤＴＴ、
１ ００Ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．４ ｍＭＡＴＰ
、及び１０００ ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにニー イ
ングランド バイオラプス）中の２ＭｇのｃＤＮＡへ４
℃で２４時間にて最終容量２６μ！中で結合した。過剰
リンカ−を除去し、かつｃＤＮＡの大きさを分割するた
め、ＴＥ飽和フェノールとクロロホルム混合物で結合反
応物を抽出した。有機層をＴＥＮ緩衝液（０，０１Ｍト
リス−ＨＣｌ ｐＨ７，５，０，１Ｍ ＮａＣｌ、
及び１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で再抽出し、混合水溶
液を、予めＴＥＮ緩衝液で平衡化されたｌＸ３０ｃｍバ
イオゲルＡ５０ゲルビオラフト）でクロマトグラフに付
した。ＴＨＥ緩衝液（０，０８９Ｍトリス−ＨＣＩ、０
．０８９はう酸及び２．５ｍＭＮａ２ ＥＤＴＡ）中の
１％アガロースゲルにカラム画分のアリコートを流し、
ゲルを乾燥し、それを−７０℃でコダックＸＡＲ−５フ
ィルムにさらした。５００ｂｐより大きなｃＤＮＡを含
む画分をプールし、次いでこれらをエタノール沈澱させ
た。大きな分離した二重鎖ＣＤＮＡの収率は９００ｎｇ
であった。
７−２８の２μｇを０．０５Ｍ ）リス−ＨＣ１ｐＨ７
，８の２ ｐ ｇ ｃ ＤＮＡ、 ０．ＯＩＭＭｇ Ｃ
Ｉ２．０．０３Ｍ Ｎａ ｃ Ｉ、１ｍＭスペルミジ
ン、０．２ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、２ｍＭＤＴＴ、
１ ００Ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．４ ｍＭＡＴＰ
、及び１０００ ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにニー イ
ングランド バイオラプス）中の２ＭｇのｃＤＮＡへ４
℃で２４時間にて最終容量２６μ！中で結合した。過剰
リンカ−を除去し、かつｃＤＮＡの大きさを分割するた
め、ＴＥ飽和フェノールとクロロホルム混合物で結合反
応物を抽出した。有機層をＴＥＮ緩衝液（０，０１Ｍト
リス−ＨＣｌ ｐＨ７，５，０，１Ｍ ＮａＣｌ、
及び１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で再抽出し、混合水溶
液を、予めＴＥＮ緩衝液で平衡化されたｌＸ３０ｃｍバ
イオゲルＡ５０ゲルビオラフト）でクロマトグラフに付
した。ＴＨＥ緩衝液（０，０８９Ｍトリス−ＨＣＩ、０
．０８９はう酸及び２．５ｍＭＮａ２ ＥＤＴＡ）中の
１％アガロースゲルにカラム画分のアリコートを流し、
ゲルを乾燥し、それを−７０℃でコダックＸＡＲ−５フ
ィルムにさらした。５００ｂｐより大きなｃＤＮＡを含
む画分をプールし、次いでこれらをエタノール沈澱させ
た。大きな分離した二重鎖ＣＤＮＡの収率は９００ｎｇ
であった。
３、ライブラリ構成
λＧＴ１０切断ＥｃｏＲ１の６Ｍｇを、０．０５Ｍトリ
ス−ＭＣＩ ｐＨ７，８，０，０１Ｍ ＭｇＣｌ２
．０．０３Ｍ ＮａＣ１，１ｍＭスペルミジン、０．
２ｍＭ Ｎａ２ ＥＤＴＡ、２ｍＭ 、ＤＴＴ、及
び３１．２ｐ ｌ中の１００μｇ／ｍ１ＢｓＡに混合し
た。
ス−ＭＣＩ ｐＨ７，８，０，０１Ｍ ＭｇＣｌ２
．０．０３Ｍ ＮａＣ１，１ｍＭスペルミジン、０．
２ｍＭ Ｎａ２ ＥＤＴＡ、２ｍＭ 、ＤＴＴ、及
び３１．２ｐ ｌ中の１００μｇ／ｍ１ＢｓＡに混合し
た。
これら成分を７０℃３分間、４５℃１５分間加熱し、氷
上で冷却し、次いでエフペンドルフ遠心機で５秒間回転
した０反応混合物を０．２５ｍ ＭＡＴＰと２０００ｕ
Ｔ、ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）へ調節し、次いで１６時
間１５℃で培養した。結合のアリコート３．４μｌをア
メルシャムによって供給される記録に従ってアメルシャ
ム包装混合物を使用するファージ粒子に詰め込み、包装
ＤＮＡを感染Ｅ、コリＢＮＮ １０２紺胞へ使用した。
上で冷却し、次いでエフペンドルフ遠心機で５秒間回転
した０反応混合物を０．２５ｍ ＭＡＴＰと２０００ｕ
Ｔ、ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）へ調節し、次いで１６時
間１５℃で培養した。結合のアリコート３．４μｌをア
メルシャムによって供給される記録に従ってアメルシャ
ム包装混合物を使用するファージ粒子に詰め込み、包装
ＤＮＡを感染Ｅ、コリＢＮＮ １０２紺胞へ使用した。
ライブラリのプラーク形成は増幅しかつＣ５ＣＬ結合し
たところの５．４Ｘ１０’の独立プラークを生成した。
たところの５．４Ｘ１０’の独立プラークを生成した。
プラークの４１％は２．２Ｘ１０’再結合のライブラリ
複雑度を示すインサートを有した。ファージ結合のＣｓ
ＣＬの力値は１．６Ｘ１０１″ＰＦＵ／ｅｅｌであっ
た。
複雑度を示すインサートを有した。ファージ結合のＣｓ
ＣＬの力値は１．６Ｘ１０１″ＰＦＵ／ｅｅｌであっ
た。
Ｃ，ライブラリのスクリーニング
ベントンとダビス（サイエンス、第１９６′４！５、第
１８０頁（１９７７））のプラークハイブリーノド形成
スクリーニング技術を使用してＭＩＳ蛋白配列のコード
したヌクレオチドに対し、標゛識付けしたオリゴヌクＬ
・オチドのプローブ１６でライブラリをスクリーンした
。
１８０頁（１９７７））のプラークハイブリーノド形成
スクリーニング技術を使用してＭＩＳ蛋白配列のコード
したヌクレオチドに対し、標゛識付けしたオリゴヌクＬ
・オチドのプローブ１６でライブラリをスクリーンした
。
Ｌブロスと０．２％マルトース中でＢＮＮ１０２細胞の
一晩培養物をペレット化し、それをＳＭｒＡｔＦｔ？皮
（５０ｍ Ｍ ト リ ）、−ＩＩ Ｃｌ 、
ｐＨ７，５，１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ
Ｍｇ５Ｏ１、及び０．０１％ゼラチン）の等寸に再分散
した。次いで、０．３…Ｉの細胞を室温で１５分間、５
ＸＩＯ’フア一ジ粒子で予備吸着した。次いでＬ １３
＋ １０ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，と０／７％アガロースの
８ｍｌに５５℃で分散物を稀釈した。このようなプレー
トを３０個作り、次いでプラークが殆んど接触するまで
約８時間３７℃でプレートを培養した０次いでプレート
を１時間４℃で冷却してアガロースを硬化させた。
一晩培養物をペレット化し、それをＳＭｒＡｔＦｔ？皮
（５０ｍ Ｍ ト リ ）、−ＩＩ Ｃｌ 、
ｐＨ７，５，１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ
Ｍｇ５Ｏ１、及び０．０１％ゼラチン）の等寸に再分散
した。次いで、０．３…Ｉの細胞を室温で１５分間、５
ＸＩＯ’フア一ジ粒子で予備吸着した。次いでＬ １３
＋ １０ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，と０／７％アガロースの
８ｍｌに５５℃で分散物を稀釈した。このようなプレー
トを３０個作り、次いでプラークが殆んど接触するまで
約８時間３７℃でプレートを培養した０次いでプレート
を１時間４℃で冷却してアガロースを硬化させた。
ニトロセルロースフィルターを再結合プラークを含むプ
レートの上に５分間置き、次いで持ち上げ、かつ０．５
Ｎ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣ１のプールの上に
５分間置くことによりフィルターを溶解し、次いで同じ
緩衝液に５分間浸漬した。フィルターを０．５Ｍトリス
−ＨＣｌ （ｐＨ７，４）、１．５Ｍ ＮａＣｌに
５分間ずつ２回浸漬することにより中和した。ＩＭＮＨ
，○Ａｃに２分間洗浄してそれを空気乾燥し、２時間８
０℃で加熱した。
レートの上に５分間置き、次いで持ち上げ、かつ０．５
Ｎ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣ１のプールの上に
５分間置くことによりフィルターを溶解し、次いで同じ
緩衝液に５分間浸漬した。フィルターを０．５Ｍトリス
−ＨＣｌ （ｐＨ７，４）、１．５Ｍ ＮａＣｌに
５分間ずつ２回浸漬することにより中和した。ＩＭＮＨ
，○Ａｃに２分間洗浄してそれを空気乾燥し、２時間８
０℃で加熱した。
０．２％ポリビニル−ピロリドン、０．２％フィコール
（ＭＷ４０００００） 、０．２％ウシ血清アルブミン
、０．０５Ｍ Ｉ−リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）
、Ｉ ＭＮａＣＩ、０．１％ピロリン酸す１−リウム、
１％ＳＤＳ、１０％デキストランサルフエイト（Ｍ Ｗ
５０００００）及び１００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ中
のオリゴヌクレオチドプローブ１６ヘフイル゛ ター
を予備ハイブリッド形成及びハイブリッド形成をした。
（ＭＷ４０００００） 、０．２％ウシ血清アルブミン
、０．０５Ｍ Ｉ−リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）
、Ｉ ＭＮａＣＩ、０．１％ピロリン酸す１−リウム、
１％ＳＤＳ、１０％デキストランサルフエイト（Ｍ Ｗ
５０００００）及び１００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ中
のオリゴヌクレオチドプローブ１６ヘフイル゛ ター
を予備ハイブリッド形成及びハイブリッド形成をした。
オートラジオグラフィーによってλ−ｃＤＮＡ配列がハ
イブリッド形成されたことを検出した。
イブリッド形成されたことを検出した。
この技術によって、同じプローブを使用して低密度で１
９正のプラークを取り上げかつスクリーンした。
９正のプラークを取り上げかつスクリーンした。
これらのクローンのＤＮＡを分離し、クーツルで消化し
、サザンブロート技術によってオリゴマープローブ１６
及び１８でそれをハイブリッド形成した（Ｅ、Ｍ、サザ
ン、ＪｏＭｏｌ。
、サザンブロート技術によってオリゴマープローブ１６
及び１８でそれをハイブリッド形成した（Ｅ、Ｍ、サザ
ン、ＪｏＭｏｌ。
Ｂ ｉ ｏ ｌ ％第９８巻、第５０３−１８頁（１９
７５））、クローンの９つは挿入ｃＤＮＡを含み、それ
はトリブチルペプチドＴ１０５−１０６にコードするプ
ローブ１６へのみならずトリブチルペプチドＴ８１にコ
ードするプローブ１８へもハイブリッド形成した。
７５））、クローンの９つは挿入ｃＤＮＡを含み、それ
はトリブチルペプチドＴ１０５−１０６にコードするプ
ローブ１６へのみならずトリブチルペプチドＴ８１にコ
ードするプローブ１８へもハイブリッド形成した。
クローンλ８．２工のＤＮＡを５ａｃｌで消化し、かつ
ｐｔＪｃｌＢのフラグメントをサブクローンして再結合
プラスミドｐＳ２１を構成した。クーツルを使用して、
クローンλ８，２１のインサー１、を除去もし、かつそ
れをｐ ＵＣ１Ｂにサブクｒ：１−ンして再結合プラス
ミドｐＸ２１を生成した０次いでこのプラスミドをマク
サムとギルバート（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５
ｃｉｓ第７４巻、第５６０頁（１９７１））の方法によ
って配列した。この分析はクローンｐＳ２１はウシＭ■
Ｓ蛋白のアミノ酸配列に相当するヌクレオチド配列を含
むことを実証した。このインナートの２０００ｂｐ内で
、成熟Ｎ−末端を含んで配列された総ての２３ペプチド
をコードするＤＮＡ配列であった（即ち、ＡｒｇＧＩｕ
ＧＩｕＶａ ＩＰｈｅＳｅｒ）ｅ クローンは推定上、
先行配列である１０アミノ酸を上流コードする配列の３
Ｑ ｂ ｌ）を含有Ｌ７だ。
ｐｔＪｃｌＢのフラグメントをサブクローンして再結合
プラスミドｐＳ２１を構成した。クーツルを使用して、
クローンλ８，２１のインサー１、を除去もし、かつそ
れをｐ ＵＣ１Ｂにサブクｒ：１−ンして再結合プラス
ミドｐＸ２１を生成した０次いでこのプラスミドをマク
サムとギルバート（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５
ｃｉｓ第７４巻、第５６０頁（１９７１））の方法によ
って配列した。この分析はクローンｐＳ２１はウシＭ■
Ｓ蛋白のアミノ酸配列に相当するヌクレオチド配列を含
むことを実証した。このインナートの２０００ｂｐ内で
、成熟Ｎ−末端を含んで配列された総ての２３ペプチド
をコードするＤＮＡ配列であった（即ち、ＡｒｇＧＩｕ
ＧＩｕＶａ ＩＰｈｅＳｅｒ）ｅ クローンは推定上、
先行配列である１０アミノ酸を上流コードする配列の３
Ｑ ｂ ｌ）を含有Ｌ７だ。
総ての成熟蛋白に対するｒｌＮｌＮ列配列Ｍらねたこと
を確認するため、コスミドライブラリからのウシＭＩＳ
（ｃｂｍｉ ｓ １５）に対するゲノムクローンを分
離しかつチャーチとギルバート （Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 第８１
Ｓ、第１９９１−９５頁（１９８４））の方法により５
′末端を配列した。このことはクローンｐｓ２１のイン
サートの５′端末から上流配列を付与した。ＡＴＧは成
熟蛋白配列と同じ先行フレーム、成熟Ｎ一端末のアルグ
残余の７２ｂｐ上流に位置していた。この７２ｂｐ先行
２４アミノ酸にコードしている。この先行の１６又は１
７アミノ酸は信号配列を構成しているように思われ、こ
れは蛋白が分泌されることを可能にする（ホンハイシネ
分析、Ｅｕｒ、Ｊ。
を確認するため、コスミドライブラリからのウシＭＩＳ
（ｃｂｍｉ ｓ １５）に対するゲノムクローンを分
離しかつチャーチとギルバート （Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 第８１
Ｓ、第１９９１−９５頁（１９８４））の方法により５
′末端を配列した。このことはクローンｐｓ２１のイン
サートの５′端末から上流配列を付与した。ＡＴＧは成
熟蛋白配列と同じ先行フレーム、成熟Ｎ一端末のアルグ
残余の７２ｂｐ上流に位置していた。この７２ｂｐ先行
２４アミノ酸にコードしている。この先行の１６又は１
７アミノ酸は信号配列を構成しているように思われ、こ
れは蛋白が分泌されることを可能にする（ホンハイシネ
分析、Ｅｕｒ、Ｊ。
ｒ３ｉｏｃｈｅｍ１、第１３３４！−１第１７−２１頁
（１９Ｂ ３）から推定した）、残留７又はアミノ酸は
引き続き開裂されて成熟蛋白を生成する（この開裂が蛋
白を活性化すｚｌのに必要かど−）か明らかでない）。
（１９Ｂ ３）から推定した）、残留７又はアミノ酸は
引き続き開裂されて成熟蛋白を生成する（この開裂が蛋
白を活性化すｚｌのに必要かど−）か明らかでない）。
プロモータ配列ＴＡＴＡは開始メチオニン（３４ｂ ｐ
）から上流に位置ｊ７、このことは５゛非翻訳′ｔ４３
ａか極めて短いことを暗示する。このことを次ぎの−・
次拡大実験により確認したが、これはＲＮＡ開始は開始
ＡＴＧの上流約１０ヌクレオチドに起こることを示した
。抗認識キナーゼ化オリゴマー（５′−Ａ＊ＧＴＣＣＣ
ＡＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＧＴＧＣＣＣ３
’ ）がウシ来光からのポリＡ” ＲＮＡヘハイブリッ
ド形成され、かつ逆転写酵素で拡大された。これは開始
ＡＴＧから上流のｍＲＮＡ１０または１１ヌクレオチド
の５′端末を配置した。この分析は、５８Ｋｄ蛋白に対
しコードするウシＭＩＳに対する総ての遺伝子が分離さ
れたことを証明した。ＤＮＡ配列を第３図に示す、最初
の１００ｂｐはプロモータと５′非転写範囲を含む、ウ
シＭＩＳ蛋白と３′非転写配列の５ｉｂｐをコードする
１８７５ｂｐがこれに続く。
）から上流に位置ｊ７、このことは５゛非翻訳′ｔ４３
ａか極めて短いことを暗示する。このことを次ぎの−・
次拡大実験により確認したが、これはＲＮＡ開始は開始
ＡＴＧの上流約１０ヌクレオチドに起こることを示した
。抗認識キナーゼ化オリゴマー（５′−Ａ＊ＧＴＣＣＣ
ＡＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＧＴＧＣＣＣ３
’ ）がウシ来光からのポリＡ” ＲＮＡヘハイブリッ
ド形成され、かつ逆転写酵素で拡大された。これは開始
ＡＴＧから上流のｍＲＮＡ１０または１１ヌクレオチド
の５′端末を配置した。この分析は、５８Ｋｄ蛋白に対
しコードするウシＭＩＳに対する総ての遺伝子が分離さ
れたことを証明した。ＤＮＡ配列を第３図に示す、最初
の１００ｂｐはプロモータと５′非転写範囲を含む、ウ
シＭＩＳ蛋白と３′非転写配列の５ｉｂｐをコードする
１８７５ｂｐがこれに続く。
実施例４
ヒトゲノムクローンの分離
ウシｃＤＮＡクローンｐＳ２１を使用して、ヒトコスミ
ドライブラリからヒトクローン（Ｃｈｍｉ ｓ ３３）
を分離した。総ての遺伝子を配列したが、この配列は２
．８Ｋｄの距離を測る５開のイクスオン中に含まれろ。
ドライブラリからヒトクローン（Ｃｈｍｉ ｓ ３３）
を分離した。総ての遺伝子を配列したが、この配列は２
．８Ｋｄの距離を測る５開のイクスオン中に含まれろ。
第５図は一般的ヒト遺伝子の構造を示し、一方第６図は
ヌクレオチド配列を示している。第６図において、最初
の］０Ｏｂｐはヒトプロモータと５′非転写範囲を含む
、範囲をコードする５個の蛋白を含む２６２２ｂｐがこ
れに続き、これはＤＮＡ配列の下に示されている。最後
の１１２ｂｐは３′非転写範囲である。
ヌクレオチド配列を示している。第６図において、最初
の］０Ｏｂｐはヒトプロモータと５′非転写範囲を含む
、範囲をコードする５個の蛋白を含む２６２２ｂｐがこ
れに続き、これはＤＮＡ配列の下に示されている。最後
の１１２ｂｐは３′非転写範囲である。
実施例５
完全な長さのヒトｃＤＮへの構成
次ぎの４つのフラグメントを使用して第８図に示す４つ
の結合方法を介してｐＢＧ３１２（ｐＤｌ）の完全な長
さのヒトｃ ＤＮＡを構成した； ］）ｐＧＡＰ＋、６
がらの２７］ｂｐＳｔｕｌ−Ｍｓｔｎフラグメント；２
）ｐＭＩｓｒ） ／ Ｆからの３２３ＬＩｐ Ｍｓｔ
ｌｌ−ＸｈｏｌフラグメンＩ・；３）ｐＢｃ３１２．ｈ
ｍｉｓからの１２’９９ｂｐ Ｘｈｏｌ−３ｔｕｌフ
ラグメント；及び４）ｐＢＧ３１２．ｈｍｉ ｓがらの
６２５１ｂｐ ５ｔｕｒフラグメント、ｐＢＧ３１２
、ｈｍｉｓの構成は実施例７に記載されている。ｐ Ｇ
Ａ Ｐ １．６とｐＭｒｓ Ｄ／Ｆの構成は以下に
記載される。
の結合方法を介してｐＢＧ３１２（ｐＤｌ）の完全な長
さのヒトｃ ＤＮＡを構成した； ］）ｐＧＡＰ＋、６
がらの２７］ｂｐＳｔｕｌ−Ｍｓｔｎフラグメント；２
）ｐＭＩｓｒ） ／ Ｆからの３２３ＬＩｐ Ｍｓｔ
ｌｌ−ＸｈｏｌフラグメンＩ・；３）ｐＢｃ３１２．ｈ
ｍｉｓからの１２’９９ｂｐ Ｘｈｏｌ−３ｔｕｌフ
ラグメント；及び４）ｐＢＧ３１２．ｈｍｉ ｓがらの
６２５１ｂｐ ５ｔｕｒフラグメント、ｐＢＧ３１２
、ｈｍｉｓの構成は実施例７に記載されている。ｐ Ｇ
Ａ Ｐ １．６とｐＭｒｓ Ｄ／Ｆの構成は以下に
記載される。
隙間のある変異誘発を介して最初のイントロンがないプ
ラスミドｐ Ｇ Ａ Ｐ １．６を生成した。
ラスミドｐ Ｇ Ａ Ｐ １．６を生成した。
Ｃｈｍｉｓ３３（第５図）からの１６００ｔ）ｐＰｖｕ
ＩＩフラグメントをｐＵｃｌＢのＳｍａ ｒ部位のサブ
クローン化してｐＵｃｌＢ、ＰＶ２を生成した。このプ
ラスミドはＳｓｐ Ｉで直線化し、変性し、次いで５ｔ
ｕｌとＭｓｔＩ［で消化した変性ｐＵｃ１Ｂ、ＰＶ２へ
需もどじした。
ＩＩフラグメントをｐＵｃｌＢのＳｍａ ｒ部位のサブ
クローン化してｐＵｃｌＢ、ＰＶ２を生成した。このプ
ラスミドはＳｓｐ Ｉで直線化し、変性し、次いで５ｔ
ｕｌとＭｓｔＩ［で消化した変性ｐＵｃ１Ｂ、ＰＶ２へ
需もどじした。
これにより消化５ｓｐｌとｐＵｃｌＢ、ＰＶ２Ｖ２Ｏ３
ｔｕｌとＭｓｔＩＩの間の２重ハイブリッドの形成が可
能となった。エクソン１の３′端末とエクソン２の５′
端末とからの配列を含むオリゴマを２重ハイブリッドへ
煮もどした（即ち、最初のイントロンをなくすこと）。
ｔｕｌとＭｓｔＩＩの間の２重ハイブリッドの形成が可
能となった。エクソン１の３′端末とエクソン２の５′
端末とからの配列を含むオリゴマを２重ハイブリッドへ
煮もどした（即ち、最初のイントロンをなくすこと）。
ＤＮＡポリメラーゼｌ−大フラグメントを使用して第１
次鏡を合成した。Ｅコリを転換しかつ” ｒ’ＰＪｉ付
けしたオリゴマでコロニーをスクリーンした。正クロー
ン、ｐＧＡＰｌ、６を同定し７、次いでそれを配列して
最初のイントロンが除去されたことを実証した。４つの
結合方法に対して２７１ｂｐ Ｓｔｕｌ−ＭｓｔＵ７
ラグメントを分離した（第８図）。
次鏡を合成した。Ｅコリを転換しかつ” ｒ’ＰＪｉ付
けしたオリゴマでコロニーをスクリーンした。正クロー
ン、ｐＧＡＰｌ、６を同定し７、次いでそれを配列して
最初のイントロンが除去されたことを実証した。４つの
結合方法に対して２７１ｂｐ Ｓｔｕｌ−ＭｓｔＵ７
ラグメントを分離した（第８図）。
イントロン２．３及び４を除いたｐＭＩＳＤ／Ｆの構成
は２工程を含んだ、第１工程において、ｐＢＧ３１２で
トランスフェクト化されたＣＯ８細胞から分離したＲＮ
Ａより作ったλｇｔｌＯｃＤＮＡライブラリからのラム
ダクローンλＭＴＳ２１を分離した（実施例７参ｐ！４
）。
は２工程を含んだ、第１工程において、ｐＢＧ３１２で
トランスフェクト化されたＣＯ８細胞から分離したＲＮ
Ａより作ったλｇｔｌＯｃＤＮＡライブラリからのラム
ダクローンλＭＴＳ２１を分離した（実施例７参ｐ！４
）。
このクローンのインサートを配列して、イントロン３及
び４が除かれたことを決定した。第２工程において、エ
クソン３からエクソン５の５′端末へ、隔てるλＭＩＳ
２］の２６９ ｂｐＡｖａ ＩＸ ｈ ｏ ｌフラグメ
ンｌを分離し７、かつそれをリンカ−とベクトルｐ ｃ
ＨＳ Ａ ３５のＸ ｋ＋ ｏ Ｉ−Ｈｉ ｎ ｄ
ｍフラグメントへ結合した。リンカ−はエクソン２のＭ
ｓｔ１１部位からエクソン３のＡｖａ １部位へのＤＮ
Ａ配列を含むが、イントロン２を除いた６３ヌクレオチ
ドの２つのオリゴマを合成することにより作られた。更
に、リンカ−は、５′端末のＨｉｎｄｌ１１部位をコー
ドするＤＮＡ配列を含んだ（Ｍｓｔ１１部位に調節）、
３つの結合方法はインドロン２．３及び４が除かれたプ
ラスミドｐＭＩｓ Ｄ／Ｆを生成した０次に３２３ｂ
ｐ Ｍｓｔｎ−Ｘｈｏｌフラグメントを４つの結合方
法に対して分離した（第８図）。
び４が除かれたことを決定した。第２工程において、エ
クソン３からエクソン５の５′端末へ、隔てるλＭＩＳ
２］の２６９ ｂｐＡｖａ ＩＸ ｈ ｏ ｌフラグメ
ンｌを分離し７、かつそれをリンカ−とベクトルｐ ｃ
ＨＳ Ａ ３５のＸ ｋ＋ ｏ Ｉ−Ｈｉ ｎ ｄ
ｍフラグメントへ結合した。リンカ−はエクソン２のＭ
ｓｔ１１部位からエクソン３のＡｖａ １部位へのＤＮ
Ａ配列を含むが、イントロン２を除いた６３ヌクレオチ
ドの２つのオリゴマを合成することにより作られた。更
に、リンカ−は、５′端末のＨｉｎｄｌ１１部位をコー
ドするＤＮＡ配列を含んだ（Ｍｓｔ１１部位に調節）、
３つの結合方法はインドロン２．３及び４が除かれたプ
ラスミドｐＭＩｓ Ｄ／Ｆを生成した０次に３２３ｂ
ｐ Ｍｓｔｎ−Ｘｈｏｌフラグメントを４つの結合方
法に対して分離した（第８図）。
ｐｃＨＳＡ３５はプラスミドｐ ｃＨＳＡ３６から構成
された。ｐｃＨ３Ａ３６はロックビイル マリ−ランド
にあるアメリカ型培養収集の培養収築中に１９８２年１
２月９日に預けられ、そこにてＩ（Ｓ Ａ −Ｂとして
同定され、ＡＴＣＣ登ｔｉ番号３９２５３が割り当てら
れた。
された。ｐｃＨ３Ａ３６はロックビイル マリ−ランド
にあるアメリカ型培養収集の培養収築中に１９８２年１
２月９日に預けられ、そこにてＩ（Ｓ Ａ −Ｂとして
同定され、ＡＴＣＣ登ｔｉ番号３９２５３が割り当てら
れた。
ｐｃｔ（ＳＡ３６を限定酵素Ｂ ｓ Ｌ Ｅ Ｈで消化
して完成し、エクソンヌクレアーゼＢａ１３１で鈍い端
末とし、続いて限定酵素Ｂ ａ ｍ１１１で消化し、次
にＤＮＡポリメラーゼ１−大フラグメントで鈍い端末化
した粘性端末とした。得られた直線プラスミドを結合に
より環化し、単−Ｘｈｏｒ部位を含むプラスミドを分離
してｐｃ！（ＳＡ３５と命名した。
して完成し、エクソンヌクレアーゼＢａ１３１で鈍い端
末とし、続いて限定酵素Ｂ ａ ｍ１１１で消化し、次
にＤＮＡポリメラーゼ１−大フラグメントで鈍い端末化
した粘性端末とした。得られた直線プラスミドを結合に
より環化し、単−Ｘｈｏｒ部位を含むプラスミドを分離
してｐｃ！（ＳＡ３５と命名した。
実施例６
ウシ遺伝子の発現
ウシｃＤＮＡクローン（ＰＸ２１）からの配列とウシゲ
ノムコスミドクローン（ｃｂｍｉｓ。
ノムコスミドクローン（ｃｂｍｉｓ。
］５）からの配列とを動物細胞の発現べ久ターｐＢＧ３
１１において組合せるこ゛とにより、Ｃ０８ＩｌＩ胞お
よびＣＩＩＣ）ｔ、ｌ［Ｉ胞において全ウシ蛋白を発現
させた（第４図）０発現は、ノーザンおよび８１分析に
よりＲＮＡを分析して検出することができる。さらに、
組換ウシＭ１ｓは、１？ Ｉ Ａによりおよび器官培養
分析によ２っ検出することができる。プラスミドｐＢＧ
、’＋ １１゜１＋ｍｉｓを有するイー・コリ菌株、１
Ｍ８３をインビトロ・インターナシツナル・インコーポ
レーション寄託機関に受託番号第１ Ｘ’ ｌ １００
９０号として寄託した。
１１において組合せるこ゛とにより、Ｃ０８ＩｌＩ胞お
よびＣＩＩＣ）ｔ、ｌ［Ｉ胞において全ウシ蛋白を発現
させた（第４図）０発現は、ノーザンおよび８１分析に
よりＲＮＡを分析して検出することができる。さらに、
組換ウシＭ１ｓは、１？ Ｉ Ａによりおよび器官培養
分析によ２っ検出することができる。プラスミドｐＢＧ
、’＋ １１゜１＋ｍｉｓを有するイー・コリ菌株、１
Ｍ８３をインビトロ・インターナシツナル・インコーポ
レーション寄託機関に受託番号第１ Ｘ’ ｌ １００
９０号として寄託した。
実施例７
ヒ）ＭＩＳ遺伝子を動物細胞にて発現させるため、ｃ
ｈ ｍ ｉ ｓ ３３からの４．５ＫｂＡｆｌＩＩ断片
をケート等により記載されているように〔セル第４５巻
、第６８５〜６９８頁（１９８６） ）動物細胞発現ベ
クターｐＢＧ３１１およびｐＢＧ３１２中へ挿入して、
ｐＢＣ３１１，ｈｍｉ ｓとｐＢＣ；３１２．ｈｍｉｓ
とをそれぞれ生成させり（第７図）、ｐＢＧ３１１はＳ
Ｖ４０早期プロモータを用いる一方、ｐＢＣ３１２は発
現を始動させるためにアデノウィルス−２の主後期プロ
モータを使用した。これらの作成物をＣＯＳ細胞〔欠失
ＳＶ４０形質転換サル細胞、グルラマン、セル第２３巻
、第１７５〜１８２頁（１９８１））中に導入して一時
的に発現させ、次いで支那ハムスター卵細胞（ＣＨ○）
〔チェイシンおよびウルラウプ、Ｐ Ｎ Ａ Ｓ第７７
巻、第４２１６〜４２２０頁（１９８０））中に挿入し
て安定的に発現させた。
ｈ ｍ ｉ ｓ ３３からの４．５ＫｂＡｆｌＩＩ断片
をケート等により記載されているように〔セル第４５巻
、第６８５〜６９８頁（１９８６） ）動物細胞発現ベ
クターｐＢＧ３１１およびｐＢＧ３１２中へ挿入して、
ｐＢＣ３１１，ｈｍｉ ｓとｐＢＣ；３１２．ｈｍｉｓ
とをそれぞれ生成させり（第７図）、ｐＢＧ３１１はＳ
Ｖ４０早期プロモータを用いる一方、ｐＢＣ３１２は発
現を始動させるためにアデノウィルス−２の主後期プロ
モータを使用した。これらの作成物をＣＯＳ細胞〔欠失
ＳＶ４０形質転換サル細胞、グルラマン、セル第２３巻
、第１７５〜１８２頁（１９８１））中に導入して一時
的に発現させ、次いで支那ハムスター卵細胞（ＣＨ○）
〔チェイシンおよびウルラウプ、Ｐ Ｎ Ａ Ｓ第７７
巻、第４２１６〜４２２０頁（１９８０））中に挿入し
て安定的に発現させた。
ソムベイラフクおよびドンナのＤＥＡＥ／デキストラン
法（ＰＮＡＳ、第７８＠、第７５７５〜７５７８頁（１
９８１））を用１’てＣＯ３細胞にｐＢＣ；３１２．ｈ
ｍｉｓをトランスフェクトさせた。３１分析を使用して
、ヒ）ＭＩＳ遺伝子が転写されかつＲＮＡがスプライス
されることを示した。次いで、器官培養分析〔ドナ・ホ
ー工等、Ｊ、Ｓｕｒｇ、Ｒｅｓ、第２３Ｓ、第１４１〜
１４８頁（１９７？））を使用して、ヒトＭＩＳ遺伝子
をトランスフェクトさせたＣＯＳ細胞が生物学上活性な
ＭＩＳを分泌することを示した＊ ｐ ＢＧ ３１２．
ｈｍ Ｉ ＳをインフェクトさせたＣｏ５ＩＩＩ胞
からの状ｉｓ節した培地はこの分析においてミュレル管
の等級３の退行を生じたのに対し、ヒト組織プラスミノ
ーゲン活性化ｃＤＮＡをトランスフェクトさせたＣＯ８
細胞からの比較培地および状態調節培地は退行を生ぜし
めなかった。このことは、ヒトＭＩＳ遺伝子をトランス
フェクトさせたＣＯ８細胞が生物学上活性なＭＩＳを分
泌してラットのミュレル管の退行をインビトロで生せし
めることを示している。
法（ＰＮＡＳ、第７８＠、第７５７５〜７５７８頁（１
９８１））を用１’てＣＯ３細胞にｐＢＣ；３１２．ｈ
ｍｉｓをトランスフェクトさせた。３１分析を使用して
、ヒ）ＭＩＳ遺伝子が転写されかつＲＮＡがスプライス
されることを示した。次いで、器官培養分析〔ドナ・ホ
ー工等、Ｊ、Ｓｕｒｇ、Ｒｅｓ、第２３Ｓ、第１４１〜
１４８頁（１９７？））を使用して、ヒトＭＩＳ遺伝子
をトランスフェクトさせたＣＯＳ細胞が生物学上活性な
ＭＩＳを分泌することを示した＊ ｐ ＢＧ ３１２．
ｈｍ Ｉ ＳをインフェクトさせたＣｏ５ＩＩＩ胞
からの状ｉｓ節した培地はこの分析においてミュレル管
の等級３の退行を生じたのに対し、ヒト組織プラスミノ
ーゲン活性化ｃＤＮＡをトランスフェクトさせたＣＯ８
細胞からの比較培地および状態調節培地は退行を生ぜし
めなかった。このことは、ヒトＭＩＳ遺伝子をトランス
フェクトさせたＣＯ８細胞が生物学上活性なＭＩＳを分
泌してラットのミュレル管の退行をインビトロで生せし
めることを示している。
ＣＨＯ細胞にてヒトＭＩｓ遺伝子を発現させるため、プ
ラスミドｐＢＧ３１１．ｈｍｉｓおよびプラスミドＩ）
ＳＶ２ＤＨＦＲ（サブラマニ等、モレキュラ・セル・バ
イオロジー、第１巻、第８５４〜８６４頁（１９８１）
）をジヒドロホレートレダクターゼが欠失しているＣＨ
Ｏ細胞細胞中子シャイル方法（ＰＮＡＳ第８０巻、。
ラスミドｐＢＧ３１１．ｈｍｉｓおよびプラスミドＩ）
ＳＶ２ＤＨＦＲ（サブラマニ等、モレキュラ・セル・バ
イオロジー、第１巻、第８５４〜８６４頁（１９８１）
）をジヒドロホレートレダクターゼが欠失しているＣＨ
Ｏ細胞細胞中子シャイル方法（ＰＮＡＳ第８０巻、。
第４６５４〜４６５８頁（１９８３））により導入した
。ヌクレオシドを欠失している培地中で増殖した２５種
のクローンを選択し、これらを７７５フラストへ拡大さ
せた。これらのクローンから全ＲＮＡを分離し、かつＳ
１分析によりヒトＭＩ ＳｍＲＮＡの存在につき分析し
、これらクローンのうち１０種がヒトＭ Ｉ ＳｍＲＮ
Ａを含有していた。次いで、ＭＴ ＳｍＲＮＡにつき陽
性の１種の細胞ライン、３１１〜２２から得た状！３調
節培地を器官培養分析で試験した。
。ヌクレオシドを欠失している培地中で増殖した２５種
のクローンを選択し、これらを７７５フラストへ拡大さ
せた。これらのクローンから全ＲＮＡを分離し、かつＳ
１分析によりヒトＭＩ ＳｍＲＮＡの存在につき分析し
、これらクローンのうち１０種がヒトＭ Ｉ ＳｍＲＮ
Ａを含有していた。次いで、ＭＴ ＳｍＲＮＡにつき陽
性の１種の細胞ライン、３１１〜２２から得た状！３調
節培地を器官培養分析で試験した。
これは器官培養分析にてミュレル管の等級３〜４の退行
を生じたのに対し、比較細胞ラインＧ２からの状態調節
培地は退行を示さなかった。
を生じたのに対し、比較細胞ラインＧ２からの状態調節
培地は退行を示さなかった。
細胞ライン３１１〜２２の状！３ｍ節培地からのヒト組
換ＭＩＳをレンチル−レクチンクロマトグラフィーによ
って部分精製し、かつ２種の異なる抗体を用いてウェス
タンプロットで分析した〔トウビン等、ＰＮＡＳ、第７
６巻、第４３５０頁（１９７９））、一方の抗体は変性
ウシＭＩＳに対して生じたのに対し、他方はヒトＭＩＳ
のペプチドに対して生じた。両者の場合、これらの抗体
は分子量約７０，０００を有する３１１〜２２の状態調
節培地にて蛋白を識別した。比較ＣＨＯ１［Ｉ胞うイン
Ｇ２の状態調節培地には、検出しうる蛋白が存在しなか
った。このことは、ＣＨＯ８［１胞で作成されたヒトＭ
ＴＳが新生児亭丸から分離したウシＭＩＳと同しヘルも
しくはほぼ同Ｌ・ベルまでグリコジル化されていること
を示す。さらに、ＣＨＯｉｌ［ｌ胞を〔Ｈ３〕−グルコ
サミンの存在下で２４時間増殖させることにより、これ
らＣＨＯ細胞で産生されたＭＩＳを標識した。次いで、
グリコ蛋白を状態調節培地からレンチル−レクチン−セ
ファロースによりバッチ精製し、かつＭｒＳを変性ウシ
ＭＩＳに対する抗体で免疫沈澱させた。
換ＭＩＳをレンチル−レクチンクロマトグラフィーによ
って部分精製し、かつ２種の異なる抗体を用いてウェス
タンプロットで分析した〔トウビン等、ＰＮＡＳ、第７
６巻、第４３５０頁（１９７９））、一方の抗体は変性
ウシＭＩＳに対して生じたのに対し、他方はヒトＭＩＳ
のペプチドに対して生じた。両者の場合、これらの抗体
は分子量約７０，０００を有する３１１〜２２の状態調
節培地にて蛋白を識別した。比較ＣＨＯ１［Ｉ胞うイン
Ｇ２の状態調節培地には、検出しうる蛋白が存在しなか
った。このことは、ＣＨＯ８［１胞で作成されたヒトＭ
ＴＳが新生児亭丸から分離したウシＭＩＳと同しヘルも
しくはほぼ同Ｌ・ベルまでグリコジル化されていること
を示す。さらに、ＣＨＯｉｌ［ｌ胞を〔Ｈ３〕−グルコ
サミンの存在下で２４時間増殖させることにより、これ
らＣＨＯ細胞で産生されたＭＩＳを標識した。次いで、
グリコ蛋白を状態調節培地からレンチル−レクチン−セ
ファロースによりバッチ精製し、かつＭｒＳを変性ウシ
ＭＩＳに対する抗体で免疫沈澱させた。
組換ＭＩＳの性質および構造を確認した。クローン３１
１−２Ａ９Ｂ７ （３０ｎＭメソトレキセートで増幅）
からの状態調節された血清フリー培地を限外濾過によっ
て濃縮し、かつグリコ蛋白をレンチル−レクチンで抽出
した。７゜Ｋｄバンドを５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅ後のクーマ
シー染色により検出したが、これは陰性比較として作用
する細胞ラインの状態調節培地には存在しなかった。２
−Ｄゲル電気泳動（非減成−減成）を行なって、ヒト組
換ＭＴＳがジスルフィド減成二量体であることを示した
。蛋白のＣＮＢ ｒ地図は、ＭＩＳの公知メチオニン分
布と一致する断片のパターンを示した。４００ｍ１の状
態調節された血清フリー培地からの７０Ｋｄパント２０
μｇ°のレンチル−レクチンとゲル濾過クロマトグラフ
ィーとの組合せにより部分精製した。
１−２Ａ９Ｂ７ （３０ｎＭメソトレキセートで増幅）
からの状態調節された血清フリー培地を限外濾過によっ
て濃縮し、かつグリコ蛋白をレンチル−レクチンで抽出
した。７゜Ｋｄバンドを５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅ後のクーマ
シー染色により検出したが、これは陰性比較として作用
する細胞ラインの状態調節培地には存在しなかった。２
−Ｄゲル電気泳動（非減成−減成）を行なって、ヒト組
換ＭＴＳがジスルフィド減成二量体であることを示した
。蛋白のＣＮＢ ｒ地図は、ＭＩＳの公知メチオニン分
布と一致する断片のパターンを示した。４００ｍ１の状
態調節された血清フリー培地からの７０Ｋｄパント２０
μｇ°のレンチル−レクチンとゲル濾過クロマトグラフ
ィーとの組合せにより部分精製した。
１ｌｉｌＮ用ＳＤＳゲルから蛋白を電気溶出させ、蛋白
の微小配列分析を行なった。組換蛋白のアミノ末端はＬ
ＲＡＥＥであって、ヒ）ＭｉｓがＣＨＯ細胞により正確
に処理されたことを示している。
の微小配列分析を行なった。組換蛋白のアミノ末端はＬ
ＲＡＥＥであって、ヒ）ＭｉｓがＣＨＯ細胞により正確
に処理されたことを示している。
ＣＨＯ細胞ラインにおけるＭＩＳの発現レベルは、メソ
トレキセート始動の遺伝子増幅により増大させることが
できる〔カウフマンおよびシャープ、Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉ
ｏｌ、第１５９巻、第６０１〜６２１頁（１９８２））
。
トレキセート始動の遺伝子増幅により増大させることが
できる〔カウフマンおよびシャープ、Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉ
ｏｌ、第１５９巻、第６０１〜６２１頁（１９８２））
。
プラスミドｐＢＧ３１２．ｈｍｉｓを有するイー・コリ
菌株ＪＡ２２１をインビトロ・インターナショナル・イ
ンコーポレーション寄託機関に受託番号箱１ＶＩ １０
０８９号として寄託した。
菌株ＪＡ２２１をインビトロ・インターナショナル・イ
ンコーポレーション寄託機関に受託番号箱１ＶＩ １０
０８９号として寄託した。
実施例８
ヒトｃＤＮＡの発現
実施例５に記載したプラスミドｐＤ１は、動物発現−・
フタ−ｐＢＣ；３１２における全長ＣＤＮＡ配列を含有
する。プラスミドｐＤ１は、ツムペイラックおよびドン
ナのＤＥＡＥ／デキストラン法（ＰＮＡＳ第７８巻、第
７５７５〜７５７８頁（１９８１））によりＣＯＳ細胞
中に導入してヒトＭＩＳを産生させることができる。全
長ＣＤＮＡ配列は、ＡｆｌＩＩを用いプラスミドｐＤ１
から除去してｐＢＧ３１１のＳｍａ １部位に挿入する
ことにより、ＣＨ○細胞にてヒトＣＤＮＡを発現させる
ことができる。
フタ−ｐＢＣ；３１２における全長ＣＤＮＡ配列を含有
する。プラスミドｐＤ１は、ツムペイラックおよびドン
ナのＤＥＡＥ／デキストラン法（ＰＮＡＳ第７８巻、第
７５７５〜７５７８頁（１９８１））によりＣＯＳ細胞
中に導入してヒトＭＩＳを産生させることができる。全
長ＣＤＮＡ配列は、ＡｆｌＩＩを用いプラスミドｐＤ１
から除去してｐＢＧ３１１のＳｍａ １部位に挿入する
ことにより、ＣＨ○細胞にてヒトＣＤＮＡを発現させる
ことができる。
全長ヒ）ｃＤＮＡ挿入物を含有するｐＤｌの挿入物を除
去してイー・コリおよび酵母ベクター中に挿入し、イー
・コリおよび酵母中でヒトＭＩＳを発現させることがで
きる。これらの作成物は、完全ヒトＭｒＳ蛋白をコード
するＤＮＡ配列または成熟ヒトＭＩＳ蛋白をコードする
ＤＮＡ配列を含有することができる。
去してイー・コリおよび酵母ベクター中に挿入し、イー
・コリおよび酵母中でヒトＭＩＳを発現させることがで
きる。これらの作成物は、完全ヒトＭｒＳ蛋白をコード
するＤＮＡ配列または成熟ヒトＭＩＳ蛋白をコードする
ＤＮＡ配列を含有することができる。
以上、本発明を多くの実施例につき説明したが、この基
本構成を改変して本発明の方法および組成物を用いる他
の実施態様を提供しうろことが了解されよう。
本構成を改変して本発明の方法および組成物を用いる他
の実施態様を提供しうろことが了解されよう。
第１図はウシＭＩＳのトリブチンペプチドの配列分析か
ら得られたアミノ酸配列を示し、得られた２Ｈｆの配列
のうち２種のみを示し、第２図はウシｃＤＮＡクローン
を分離するために使用した化学合成オリゴヌクレオチド
ＤＮＡ試料の１６種のプールを示し、 第３図は全長のｃＤＮＡ配列およびプロモータ領域を包
含するウシ遺伝子のヌクレオチド配列を示し、 第４図は本発明のウシＤＮＡ配列を発現させるために使
用しうるプラスミドｐＢ０３１１゜ｂｍｉｓの作成を示
し、 第５図はヒトゲノムクローンｃｈｍｉｓ３３を示しかつ
これをウシｃＤＮＡクローンｐｓ２１と比較し、実線ブ
ロックは蛋白コード化領域を含むエクソンであり、 第６図はコスミドクローンｃｈｍｉｓ３３におけるヒト
遺伝子のヌクレオチド配列を示し、蛋白配列をＤＮＡ配
列の下に示し、かつこれは４個所でイントロンにより中
断され、 第７図は本発明のヒトＤＮＡ配列を発現させるために使
用しうるプラスミドｐＢＧ３１１゜ｈｍｉｓおよびｐＢ
Ｇ３１２．ｈｍｉｓの作成を示し、 第８図は本発明のヒトＤＮＡ配列を発現させるために使
用しうる全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＤ１の作成を
示している。
ら得られたアミノ酸配列を示し、得られた２Ｈｆの配列
のうち２種のみを示し、第２図はウシｃＤＮＡクローン
を分離するために使用した化学合成オリゴヌクレオチド
ＤＮＡ試料の１６種のプールを示し、 第３図は全長のｃＤＮＡ配列およびプロモータ領域を包
含するウシ遺伝子のヌクレオチド配列を示し、 第４図は本発明のウシＤＮＡ配列を発現させるために使
用しうるプラスミドｐＢ０３１１゜ｂｍｉｓの作成を示
し、 第５図はヒトゲノムクローンｃｈｍｉｓ３３を示しかつ
これをウシｃＤＮＡクローンｐｓ２１と比較し、実線ブ
ロックは蛋白コード化領域を含むエクソンであり、 第６図はコスミドクローンｃｈｍｉｓ３３におけるヒト
遺伝子のヌクレオチド配列を示し、蛋白配列をＤＮＡ配
列の下に示し、かつこれは４個所でイントロンにより中
断され、 第７図は本発明のヒトＤＮＡ配列を発現させるために使
用しうるプラスミドｐＢＧ３１１゜ｈｍｉｓおよびｐＢ
Ｇ３１２．ｈｍｉｓの作成を示し、 第８図は本発明のヒトＤＮＡ配列を発現させるために使
用しうる全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＤ１の作成を
示している。
Claims (19)
- （１）式 【遺伝子配列があります】 ；および 【遺伝子配列があります】 のＤＮＡ配列よりなる群から選択されるＤＮＡ配列。
- （２）（ａ）特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列、
（ｂ）前記ＤＮＡ配列のいずれかにハイブリッド化しか
つヒトＭＩＳもしくはウシＭＩＳ を発現に際しコードするＤＮＡ配列、およ び （ｃ）前記ＤＮＡ配列のいずれかにより発現に際しコー
ドされたポリペプチドを発現に際 しコードするＤＮＡ配列 よりなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換ＤＮＡ
分子。 - （３）ＤＮＡ配列が組換ＤＮＡ分子中の発現制御配列に
作用結合される特許請求の範囲第２項記載の組換ＤＮＡ
分子。 - （４）発現制御配列が早期および後期プロモータＳＶ４
０、￥ｌａｃ￥系、￥ＴＡＣ￥系、￥ＴＲＣ￥系、￥ｔ
ｒｐ￥系、アデノウイルス主後期プロモータ、ファージ
λの主オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋
白の制御領域、３−ホスフォグリセレートキナーゼもし
くはその他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファター
ゼのプロモータ、酵母α−交配因子のプロモータ、並び
に原核もしくは真核細胞またはそのウイルスの遣伝子の
発現を制御するその他の配列よりなる群から選択される
特許請求の範囲第３項記載の組換ＤＮＡ分子。 - （５）ｐＢＧ３１１．ｂｍｉｓ、ｐＢＧ３１１．ｈｍｉ
ｓおよびｐＢＧ３１２．ｈｍｉｓよりなる群から選択さ
れる特許請求の範囲第３項記載の組換ＤＮＡ分子。 - （６）特許請求の範囲第２項記載の組換ＤＮＡ分子によ
り形質転換された宿主。 - （７）特許請求の範囲第３項記載の組換ＤＮＡ分子によ
り形質転換された宿主。 - （８）特許請求の範囲第４項記載の組換ＤＮＡ分子によ
り形質転換された宿主。 - （９）特許請求の範囲第５項記載の組換ＤＮＡ分子によ
り形質転換された宿主。 - （１０）宿主がイー・コリ、シュードモナス、バチルス
、酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞またはその他の真菌類
の菌株、ネズミ、ブタまたはその他の動物もしくは植物
宿主、およびヒト組織細胞よりなる群から選択される、
特許請求の範囲第２項記載の組換ＤＮＡ分子により形質
転換された宿主。 - （１１）特許請求の範囲第３項記載の組換ＤＮＡ分子に
より形質転換された宿主を培養することを特徴とするＭ
ＩＳ−様ポリペプチドの製造方法。 - （１２）組換ＤＮＡ分子をｐＢＧ３１１．ｂｍｉｓ、ｐ
ＢＧ３１１．ｈｍｉｓおよびｐＢＧ３１２．ｈｍｉｓよ
りなる群から選択する特許請求の範囲第１１項記載の方
法。 - （１３）宿主がイー・コリ、シュードモナス、バチルス
、酵母もしくはその他の真菌類の前株、ネズミ、ブタ、
ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞またはその他の動物もしくは植
物宿主およびヒト組織細胞からなる特許請求の範囲第１
１項記載の方法。 - （１４）式 【遺伝子配列があります】；および これらから誘導されるＭＩＳ−様ポリペプチドよりなる
群から選択されるＭＩＳ−様ポリペプチド。 - （１５）特許請求の範囲第１４項記載のポリペプチドの
いずれかのアミノ酸配列からなる合成もしくは半合成ポ
リペプチド。 - （１６）抗癌上有効量の特許請求の範囲第１４項記載の
少なくとも１種のポリペプチドと医薬上許容しうるキャ
リヤとからなる感受性癌を処置するための医薬組成物。 - （１７）抗癌上有効量の特許請求の範囲第１５項記載の
少なくとも１種のポリペプチドと医薬上許容しうるキャ
リヤとからなる感受性癌を処置するための医薬組成物。 - （１８）処置を必要とする患者に抗癌上有効量の特許請
求の範囲第１４項記載のポリペプチドを投与することを
特徴とする感受性癌の処置方法。 - （１９）処置を必要とする患者に抗癌上有効量の特許請
求の範囲第１５項記載のポリペプチドを投与することを
特徴とする感受性癌の処置方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US792880 | 1985-10-30 | ||
| US06/792,880 US5047336A (en) | 1985-10-30 | 1985-10-30 | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing mullerian inhibiting substance-like polypeptides |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5178268A Division JP2541761B2 (ja) | 1985-10-30 | 1993-07-19 | ミュレル管抑制物質様ポリペプチドおよびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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