BG66190B1

BG66190B1 - Пептидни миметици на тромбопоетина, които се свързват към мр1 рецептор с тромбопоетично действие

Info

Publication number: BG66190B1
Application number: BG10110221A
Authority: BG
Inventors: Chuan -Fa LIU; Ulrich Feige; Janet Cheetham
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 2008-09-16
Publication date: 2011-12-30
Also published as: JP3820105B2; AU773891B2; MY126795A; DK1783222T3; US6835809B1; NO2012005I2; PT2319928E; NL300398I1; EP2319928A1; BG105401A; US20120034657A1; WO2000024770A9; NO20011962L; BR9914698A; PT1124961E; BRPI9914698B8; SI2319928T1; ME00238B; US20090186822A1; WO2000024770A2

Abstract

Изобретението се отнася до съединения, по-специално пептиди и полипетиди, които имат тромбопоетично действие и могат да се използват за увеличаване произвеждането на тромбоцити или на техните предшественици (например мегакариоцити) в бозайник.

Description

Изобретението се отнася до областта на съединенията, по-специално пептиди и полипептиди, които имат тромбопоетично действие. Съединенията от изобретението могат да се използват за увеличаване произвеждането на тромбоцити или на техните предшественици (например мегакариоцити) в бозайник.

Предшестващо състояние на техниката

Изобретението се отнася до съединенията, особено до пептидите, които имат способността да стимулират ин витро и ин виво произвеждането на тромбоцити и на техните предшественици, като например мегакариоцитите. Преди да разгледаме естеството на съединенията от изобретението, ще се спрем на следната история на два протеина, които имат тромбопоетично действие: тромбопоетин (ТРО) и факторът на мегакариоцитния растеж и развитие (MGDF).

Клонирането на ендогенния тромбопоетин (ТРО) (Лок и др., Природа 369: 568-571 (1994 г.); Бартли и др., Клетката 77: 1117-1124 (1994 г.); Кутер и др., Национално академично издание на САЩ 91:11104-11108 (1994 г.); Дьо Соваж и др., Природа 369: 533-538 (1994 г.); Като и др., Журнал по Биохимия 119:229-236 (1995 г.); Чанг и др., Журнал по Биологична химия 270: 511-514 (1995 г.) доведе до бързо увеличаване на нашето разбиране на мегакариопоезиса (произвеждането на мегакариоцити) и на тромбопоезиса (произвеждането на тромбоцити).

Ендогенният човешки ТРО, 60 до 70 kDa гликозилиран протеин, получен първоначално в черния дроб и бъбреците, се състои от 332 аминокиселини (Бартли и др., Клетката 77:1117-1124 (1994 г.); Чанг и др., Журнал по Биологична химия 270:511-514 (1995 г.)). Протеинът се запазва силно в различните видове и има 23% хомология в човешкия еритропоетин (Гърни и др., Кръв 85: 981-988 (1995 г.)) в амино-терминалите (аминокиселини от 1 до 172) (Бартли и др., Клетката 77: 1117-1124 (1994 г.). Ендогенният

ТРО е показал, че притежава всички характеристики на ключовия биологичен регулатор на тромбопоезиса. Неговото действие ин витро включва специфично индуциране на мегакариоцитни колонии от пречистени миши хематопоетични клетки от ствола (Зайглер и др., Кръв 84: 4045-4052 (1994 г.)) и от човешки клетки CD34⁺(Лок и др., Природа 369:568-571 (1994 г.); Раско и др., Клетки от ствола 15:33-42 (1997 г.)), поколението на мегакариоцитите с увеличена плоидност (Брауди и др., Кръв 85: 402-413 (1995)), и индуциране на съзряването на терминални мегакариоцити и произвеждане на тромбоцити (Зайглер и др., Кръв 84: 4045-4052 (1994); Хои и др., Кръв 85: 402-413 (1995)). Обратно, синтетичните антисенс олигодеоксинуклеотиди към ТРО рецептор (с-MpI) значително инхибира способността за образуване на колонии от мегакариоцитните прогенитори (родоначалници) (Метия и др., Кръв 82:1395-1401 (1995 г.)). Още повече, че с-MpI зашеметени мишки са силно тромбоцитопенични и имат дефицит на мегакариоцити (Александър и др., Кръв 87: 2162-2170 (1996)).

Рекомбинантният човешки MGDF (rHuMGDF, Amgen Inc., Thousand Oaks, Калифорния) е другтромбоетичен полипептид, отнасящ се към ТРО. Той се получава като се използва Ешерихия Коли, трансформирана с плазмид, съдържащ cDNA, кодираща скъсен протеин, съдържащ амино-терминален рецептор - свързващ домен от човешки ТРО (Улих и др., Кръв 86: 971-976 (1995 г.)). Полипептидът е екстрахиран, пренагънат и пречистен; към амино-терминала е прикачена ковалентно група полиетилен гликол] (PEG). Получената в резултат молекула се нарича в това описание за краткост PEG-rHuMGDF или MGDF.

Различни изследвания, използващи животински модели (Улих, Т. Р. и др., Кръв 86: 971976 (1995 г.); Хоком, Μ. М. и др., Кръв 86:44864492 (1995)) са показали ясно терапевтичната ефикасност на ТРО и MGDF при трансплантация на костен мозък и при лечението на тромбоцитопения, заболяване, което често се получава в резултат на хемотерапия или лъчева терапия. Предварителните данни при хората са потвърдили полезността на MGDF при повишаване броя на тромбоцитите в различни случаи. (Басер и др., Лансет 348:1279-81 (1006); Като и др., Журнал по Биохимия 119:229-236 (1995 г.);

66190 Bl

Улих и др., Кръв 86: 971-976 (1995)). MGDF може да се използва, за да усили донорния процес на тромбоцитите, защото предписването на MGDF увеличава броя на циркулиращите тромбоцити около три пъти повече от първоначалната стойност в здрави донори.

ТРО и MGDF упражняват своето действие чрез свързване към рецептора с-MpI, който се намира първоначално на повърхността на определени хематопоетични клетки, като мегакариоцити, тромбоцити, CD34⁺ клетки и примитивните клетки - родоначалници (Дебили, Н. и др., Кръв 85: 391-401 (1995 г.); дьо Соваж Ф. Ж. и др., Природа 369: 533-538 (1994 г.); Бартли, Т. Д. и др., Клетка 77: 1117-1124 (1994 г.); Лок, С. и др., Природа 369: 565-8 (1994 г.). Както повечето рецептори за интерлевкини и протеинови хормони, с-MpI принадлежи към суперфамилията на клас I цитокини - рецептори (Вигон, И и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 897 5640-5644 (1992)). Активирането на този клас рецептори включва индуциран хомодимеризационен рецептор с лигандна връзка, който на свой ред задейства каскадата от сигнални преобразуващи събития.

Изобщо, взаимодействието на протеиновия лиганд с неговия рецептор често става при относително голям интерфейс. Обаче, както е показано в случая с човешки хормон, свързан към неговия рецептор, само няколко ключови остатъци допринасят фактически в интерфейса за поголямата част от свързващата енергия (Клаксън, Т. и др., Наука 267: 383-386 (1995 г.)). Това и фактът, че масата на останалия протеинов лиганд служи само, за да покаже свързващите епитопи в правилната топология, прави възможно да се намерят по-малки активни лиганди.

В един опит към това, фаговият дисплей се проявява като мощна методика при идентифицирането на малки пептидни миметици на големите протеинови лиганди (Скот, Дж. К. и др., Наука 249: 386 (1990 г.); Девлин. Дж. Дж. и др., Наука 249:404 (1990 г.)). С тази методика бяха открити малките пептидни молекули, които действат като антагонисти от с-MpI рецептор (Суирла, С. Е. и др., Наука 276: 1696-1699 (1997 г.)).

В такова едно проучване, случайните малки пептидни последователности, показани като прилепени към повърхностните протеини на нишковия фаг, бяха афинно отмити срещу антитяло то - имобилизиран извънклетъчен домен на сМр1 и заловените фаги бяха обогатени при втория кръг на афинитетно пречистване. Този свързващ избор и процес на ново разпространение беше повторен много пъти, за да се обогатят наличните по-здрави биндери. В резултат бяха идентифицирани първо две семейства от с-Мр1свързващи пептиди, несвързани един с друг в техните последователности. След това бяха създадени мутагенезисна материя за по-нататъшно оптимизиране на най-добрите биндери, което доведе накрая до изолирането на силно активния пептид с IC₅₀ — 2 пМ и ЕС₅₀ = 400 пМ (Суирла, С. Е. и др., Наука 276:1696-1699 (1997 г.)). Този 14-остатъчен пептид, предвиден като ТПЗ (за ТРО мимичен пептид), няма видима хомоложна последователност към ТРО или MGDF. Структурата на това съединение ТМР е както следва: lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala SEQ ID No 1 или

IEGPTLRQWLAARA като използваме единични букви за обозначаване на аминокиселините.

Преди, в подобно проучване на ЕРО мимични пептиди със същия метод беше открит ЕРО мимичен пептид (ЕМР) (Райтън, Н. С. и др., Наука 273-458-463 (1996)), и беше установено, че действа като димер при само няколко ключови остатъци допринасят фактически в интерфейса за по-голямата част от свързващата енергия (Клаксън, Т. и др., Наука 267:383-386 (1995 г.)). Това и фактът, че масата на останалия протеинов лиганд служи само, за да покаже свързващите епитопи в правилната топология, прави възможно да се намерят по-малки активни лиганди.

В един опит към това, фаговият дисплей се проявява като мощна методика при идентифицирането на малки пептидни миметици на големите протеинови лиганди (Скот, Дж. К. и др,, Наука 249: 386 (1990 г.); Девлин. Дж. Дж. и др., Наука 249:404 (1990 г.)). С тази методика бяха открити малките пептидни молекули, които действат като антагонисти от с-MpI рецептор (Суирла, С. Е. и др., Наука 276: 1696-1699 (1997 г.)).

В такова едно проучване, случайните малки пептидни последователности, показани като прилепени към повърхностните протеини на нишковия фаг, бяха афинно отмити срещу антитялото - имобилизиран извънклетъчен домен на сМр! и заловените фаги бяха обогатени при вто66190 Bl рия кръг на афинитетно пречистване. Този свързващ избор и процес на ново разпространение беше повторен много пъти, за да се обогатят наличните по-здрави биндери. В резултат бяха идентифицирани първо две семейства от с-Мр1-свър- 5 зващи пептиди, несвързани един с друг в техните последователности. След това бяха създадени мутагенезисна материя за по-нататъшно оптимизиране на най-добрите биндери, което доведе накрая до изолирането на силно активния пептид с 10 1С₅₀ = 2 пМ и ЕС₅₀ = 400 пМ (Суирла, С. Е. и др., Наука 276:1696-1699 (1997 г.)). Този 14-остатъчен пептид, предвиден като ТПЗ (за ТРО миметичен пептид), няма видима хомоложна последователност към ТРО или MGDF. Структурата 15 на това съединение ТМР е както следва: lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala SEQ ID No 1 или

IEGPTLRQWLAARA като използваме единични букви за обоз- 20 начаване на аминокиселините.

Преди, в подобно проучване на ЕРО миметични пептиди със същия метод беше открит ЕРО миметичен пептид (ЕМР) (Райтън, Н.С. и др., Наука 273-458-463 (1996)), и беше 25 установено, че действа като димер при свързването към ЕРО рецептора (EPOR). Така полученият комплекс (лиганд)₂/(рецептор)₂ имаше С 2 симетрия, според Ru - кристалографски данни (Ливнах, Д. и др., Наука 273: 464-471 (1996 г.)). Въз основа на тази структурна информация, за ковалентно-свързания димер на ЕМР, в който С-терминалите на два ЕМР мономера са свързани напречно с гъвкав спейсър, беше предвидено и установено, че има много здраво свързване, както и биоактивност ин витро и ин виво. (Райтън, Н.С. и др., Природна биотехнология 15: 1261-1265 (1997)).

Подобна С-терминална димеризационна стратегия беше приложена към ТРО мимичен пептид (ТМР) (Суирла, С. Е. и др., Наука 276: 1696-1699 (1997)). Беше установено, че С-терминално свързаният димер (С-С връзка) на ТМР има подобрен свързващ афинитет от 0.5 пМ и забележимо увеличена активност ин витро (ЕС₅₀= 0.1 пМ в клетъчни богати проби (Суирла, С. Е. и др., Наука 276: 1696-1699 (1997)). Структурата на този ТМР С-С димер е показана по-долу:

В друг аспект на настоящото изобретение, 4θ двойката димери може да се прикачи след това към една или две групи, получени от имуноглобулинови протеини, наричани общо област Fc на такива имуноглобулини. Получените съединения се наричат Fc свързвания на двойката димери 45 ТМР.

По-долу е дадено кратко описание на раздела, който се отнася до областите Fc на антителата, които са полезни при свързване с някои от настоящите съединения, сл

Антителата включват две функционално независими части, променлив домен, известен като “Fab”, който свързва антиген, и постоянен домен, известен като “Fc”, който осигурява връзката за осъществяване на функции, като допълнително фиксиране или фагоцитоза. Частта Fc на имуноглобулина има дълъг плазмен период на полуразпад, докато Fab съществува кратко време (Кейпън и др., Природа 337:525-531 (1989 г.)).

Терапевтичните протеинови продукти са

66190 Bl били конструирани с използване на домена Fc, за да се направи опит за удължаване на периода на полуразпад или за да се вградят функции като свързване на рецептора Fc, на протеина А, допълнително фиксиране и плацентарен трансфер, всички намиращи се в областта Fc на имуноглобулините (Кейпън и др., Природа 337:525-531 (1989 г.)). Например, областта Fc на антитялото IgGl е било присъединено към CD30-L, молекула, която свързва рецептори CD30, намиращи се върху туморните клетки при болестта на Ходжкин, анапластичните клетки (присадки) на лимфом, Т-клетката от клетките на левкемията и други видове злокачествени клетки. Вижте: Патент US No 5,480,981. П-10, агент против възпаление и повръщане, е бил прикачен към миши FcU2a, за да бъде увеличен краткия циркулационен период на полуразпад на цитокините (Зенг, Кс и др., Журнал по имунология, 154: 5590-5600 (1995)).

Проучванията посочват също и използването на туморния некротизиращ фактор, рецептор, свързан с Fc протеина на човешкия IgGl за лекуване на пациенти със септичен шок (фишер и др., Нова Англия, Журнал по медицина, 334: 16971702 (1996 г.); Ван Зее, К. и др.

Журнал по имунология, 156: 2221-2230 (1996 г.)). Fc е бил присъединен също и към рецептора CD4, за да се получи терапевтичен протеин за лечение на СПИН. Вижте: Кейпън и др., Природа, 337:525-531 (1989 г.). Освен това, интерлевкин 2 е бил присъединен към частта Fc на IgGl или IgG3, за да се преодолее краткия период на полуразпад на интерлевкин 2 и неговата обща токсичност. Вижте: Харвил и др., Имунотехнология, 1:95-105(1995).

Въпреки, наличието на ТРО и MGDF, остава необходимостта да се осигурят допълнителни съединения, които имат биологична активност за стимулиране произвеждането на тромбоцити (тромбопоетична активност) и/или клетки - предшественици на тромбоцитите, по-специално на мегакариоцитите (мегакариопоетична активност). Настоящото изобретение предоставя нови съединения с такава активност (активности) и в съответните аспекти.

Техническа същност на изобретението

Настоящото изобретение осигурява група съединения, които могат да се свързват към рецептора с-MpI и да задействат трансмембранния сигнал, т.е. да активират рецептора, същият; който посредничи на активността на ендогенния тромбопоетин (ТРО). Така, изобретените съединения имат тромбопоетична активност, т.е. способност да стимулират ин виво и ин витро произвеждането на тромбоцити и/или на мегакариоцитопоетичната активност, т.е., способност да стимулират ин виво и ин витро произвеждането на предшествениците на тромбоцитите.

В едно първо предпочитано приложение изобретените съединения имат следната обща структура:

Съединение, което свързва mpl рецептор, съдържащ структурата

TMPj iLj^TMP.,, където TMPj и ТМР₂са независимо избрани от групата на вътрешните съединения, съдържащи структурата, избрана от групата, състояща се от:

а) Х₂_МА-V,-W^x.o където

Х₂ е избран от групата, състояща се от Glu, Lys и Val;

Х₃ е избран от групата, състояща се от Glu и Ala;

Х₄ е Pro;

Х₅ е избран от групата, състояща се от Thr и Ser;

Х₆ е избран от групата, състояща се от Leu, lie, Val, Ala и Phe;

Х₇ е избран от групата, състояща се от Arg и Lys;

Х₈ е избран от групата, състояща се от Gin, Asn и Glu;

Х₉ е избран от групата, състояща се от Тгр, Tyr, Cys, Ala и Phe;

Х_]0 е избран от групата, състояща се от Leu, Пе, Val, Ala, Phe, Met и Lys:

б) X^J^X^X,_νχ^χ₁₀където

Х₂ е избран от групата, състояща се от Glu, Asp, Lys и Val;

Х₃еА1а;

X₄ePro;

Х₆е избран от групата, състояща се от Leu, lie, Val, Ala и Phe;

66190 Bl

X₇ е избран от групата, състояща се от Arg и Lys;

Х₁₀ е избран от групата, състояща се от Leu, lie, Val, Ala, Phe, Met и Lys:

Β)Χ^Χ₄_Χ₅_Χ_ά_Χ₇_Χ₈_Χ^Χ₁₀ където

Х₃ е избран от групата, състояща се от Gly иА1а;

Х₄ е Pro;

Х₅ е Ser;

Х₆е избран от групата, състояща се от Leu, He, Val, Ala и Phe;

Х₁₀е избран от групата, състояща се от Leu, He, Val, Ala, Phe, Met и Lys:

οχ^χ^χ^ς,χ^χ,ο където

Х₃ е избран от групата, състояща се от Gly и Ala;

Х₄ е Pro;

Х₆е избран от групата, състояща се от Пе, Val, Ala и Phe;

X_ge избран от групата, състояща се от Gin, Asn и Glu;

Х₉е избран от групата, състояща се от Тгр, Tyr, Cys, Ala и Phe;

където

X₂ е избран от групата, състояща се от Glu, Asp, Lys и Val;

Х₄ е Pro;

Х₇ е Lys;

Х₁₀ е избран от групата, състояща се от Leu, He, Val, Ala, Phe, Met и Lys:

е) ХЛ_Х₁₀където

Х₄ е Pro;

Х₈ е избран от групата, състояща се от Gin и Asn;

Х₉ е избран от групата, състояща се от Trp, Tyr, Cys, Ala и Phe;

Х_]0 е избран от групата, състояща се от Leu, He, Val, Ala, Phe, Met и Lys:

ж) Х^Х₄_Х^Х₇_Х₈_Х₉_Х₁₀където

Х₄ е Pro;

Х₆ е избран от групата, състояща се от Leu, He, Val, Ala и Phe;

Х₉ е избран от групата, състояща се от Туг, Cys, Ala и Phe;

Х₁₀е избран от групата, състояща се от

66190 Bl

Leu, He, Val, Ala, Phe, Met и Lys; и

3) w където

Х₄ е Pro;

Х_б е избран от групата, състояща се от Leu, lie, Val, Ala и Phe;

Х₇е избран от групата, състояща се от Arg и Lys;

Х₁₀ е избран от групата, състояща се от Leu, Val, Ala, Phe, Met и Lys; и където Lj е свръзка; и η е 0 или 1; и физиологично приемливите соли от него.

В едно приложение L₃ съдържа (Gly)_n, къ- дето η е от 1 до 20, и когато η е по-голямо от 1, до половината от остатъците на Gly могат да бъдат заместени от друга аминокиселина, избрана от останалите 19 природни аминокиселини или 10 от стереоизомер на същата.

При по-нататъшното обединение на настоящото изобретение ТМР1 и ТМР2 х са независимо избрани от групата, състояща се от:

Съединение, съгласно претенция 1, къде15 то споменатите ТМР] и ТМР₂ са независимо избрани от групата, съдържаща се от:

Xi Хг_Хз_ Хд_ Χ5_Χβ_Χ7_Χβ_ Χβ_Χιο__Χιπ

Xi Хг_Хз_ Х<_ Χδ_Χ6_Χ7__Χβ_ Хв^Хю Х|1_Х|2»

Xi Х2__Хз_ Хд_ X5_Xe_.X7_.X8_ Χβ_Χ(Ο Х|1_Х|2 Х|3» И Xi Хг_Хз_ Х<_ Χδ__Χβ_Χ7_Χβ_ Х9_Хю Х|1_Х|2 Х|3 Х|4, където Х₂ и Х₁₀ са като формулирани и X] и Х_п-Х₁₄ са избрани от групата, състояща се от:

а) X] е избран от групата, състояща се от He, Val, Leu, Ser и Arg;

X] j е избран от групата, състояща се от Ala, lie, Val, Leu, Ser, Thr, Lys, His и Glu;

X_J2 е избран от групата, състояща се от Ala, lie, Val, Leu, Phe, Gly, Ser и Gin;

X₁₃ е избран от групата, състояща се от Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin и Gly; и

X₁₄ е избран от групата, състояща се от Ala, lie, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu и Gly;

б) X] е избран от групата, състояща се от lie, Val, Leu, Ser и Arg;

Χ]! е избран от групата, състояща се от Ala, lie, Val, Leu, Phe, Thr, Lys, His и Glu;

X_]2 е избран от групата, състояща се от

Ala, He, Val, Leu, Phe, Gly, Ser и Gin;

X_]3 е избран от групата, състояща се от Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin и Gly; и

X₁₄ е избран от групата, състояща се от Ala, He, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu и Gly; и

в) X] е избран от групата, състояща се от lie, Val, Leu, Ser и Arg;

X]] е избран от групата, състояща се от Ala, He, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His и Glu;

X_]2 е избран от групата, състояща се от Ala, He, Val, Leu, Gly, Ser и Gin;

X₁₃ е избран от групата, състояща се от

Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin и Gly; и

X_]4 е избран от групата, състояща се от

Ala, lie, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu и Gly.

Производни на горните съединения (описани по-долу) също се обхващат от изобретението.

66190 Bl

Съединенията на това изобретение са преди всичко пептиди, които могат да се получат чрез стандартните методи на синтез или чрез други методи за получаване на пептиди. Съединенията на това изобретение, които включват непептидни части, могат да бъдат синтезирани чрез стандартни реакции на органичната химия, в допълнение към стандартните химически реакции за пептиди, които могат да се приложат.

Съединенията на това изобретение могат да се използват за терапевтични или профилактични цели, като се включат към съответни фармацевтически носители и на пациента - човек или бозайник - се предпише необходимото количество. В това изобретение са включени и други съответни аспекти.

Пояснение на приложените фигури

Многобройни други аспекти и предимства на настоящото изобретение ще станат очевидни, след като читателят се запознае със следващото негово подробно описание, и с обясненията върху приложените диаграми.

На Фигура 1 са показани примерен Fc полинуклеотид и протеинова последователност (SEQ ID No: 3 е кодиращият нишката символ 5' 3', SEQ ID No: 4 е допълнителен символ за нишката 3'- 5'; и SEQ ID No: 5 е кодираната аминокиселинна последователност) на човешки IgGl, който може да се използва в Fc свързаните съединения от това изобретение.

На фигура 2 е показана схемата на синтез за получаване на пегилиран пептид 19 (SEQ ID No: 17).

На фигура 3 е показана схемата на синтез за получаване на пегилиран пептид 20 (SEQ ID No: 19).

На фигура 4 е показан броят на генерираните тромбоцити ин виво в нормална женска мишка BDF1, третирана с една болусна инжекция 100 mg/kg с различни съединения, както следва: PEG-MGDF - 20 kD средно молекулно тегло, PEG прикачен към аминогрупата в N-терминала с внасяне на аминокиселини 1 -163 от естествен човешки ТРО, който е експресиран върху Ешерия Коли (така че той не е гликозилиран) (Вижте WO 1995/026746, наречен “Съединения и методи за стимулиране растежа на мегакариоцити и диференциация”); ТМР означава съединението от SEQ

ID No: 1; ТМР - ТМР означава съединението от SEQ ID No: 18, където групата PEG е с 5 kD средно молекулно тегло, PEG е прикрепен, както е показано на фиг. 3; ТМР - ТМР - Fc е дефинирано по-долу; Fc - ТМР - ТМР е същият като ТМР - ТМР - Fc, като разликата е, че групата Fc е прикачена към N-терминала, вместо към С-терминала на пептид ТМР - ТМР.

На фигура 5 е показан броят на генерираните тромбоцити ин виво в нормална мишка BDF 1, третирана с различни съединения, внесени чрез имплантирани осмотични помпи през 7дневния период. Съединенията са дефинирани по същия начин, както са описани горе във фиг. 4.

На фигури 6А, 6В и 6С са показани диаграмите с предпочитаните съединения от настоящото изобретение. Фиг. 6А показва съединение Fc, където групата Fc е присъединена към N-терминала на димера ТМР, като частта Fc е мономерна форма (единична верига). Фиг. 6В показва Fc съединение, присъединено към Nтерминала на димера ТМР, където Fc частта е димерна и един мономер Fc е присъединен към димера ТМР. На фиг. 6С е показано съединение Fc, където групата Fc е присъединена към Nтерминал на димера ТМР, и частта Fee димерна, а всеки мономер Fc е присъединен към димер ТМР.

Приложение на изобретението

При опит да се търсят малки структури, като оловните съединения в развитието на терапевтичните агенти с повече желани свойства, беше проектиран различен вид димер ТМР и подобни структури, в които С-терминалът на един ТМР пептид беше свързан директно или посредством свързващ агент към N-терминала на втори ТМР пептид, и след това беше изследвано влиянието на тази димеризационна стратегия върху биоактивността на получените молекули на димера. В някои случаи, така наречените двойки димери (С-N връзка) бяха проектирани да имат свързващи агенти между двата мономера, като свързващите агенти са съставени предимно от естествени аминокиселини, правейки по този начин техният синтез достъпен за рекомбинантни технологии.

Настоящото изобретение се основава вър50

66190 Bl xy откриването на група съединения, които имат тромбопоетична активност и са предвидени да упражняват своята активност чрез свързване към ендогенния ТРО рецептор, с-Мр1.

Съединения и производни

В първото предпочитано приложение, изобретените съединения имат следната обща структура:

TMP₁-(L₁)_n-TMP₂

В едно приложение Ц съдържа (Gly)_n, къ дето η е от 1 до 20, и когато η е по-голямо от 1, до половината от остатъците на Gly могат да бъдат заместени от друга аминокиселина, избрана от останалите 19 природни аминокиселини или от стереоизомер на същата.

Съединение съгласно претенция 1, където споменатите ТМР_] и ТМР₂ са независимо избрани от групата, състояща се от:

Хг_Хз_ х*_ Х₅_Хв_Хт_Х8_ Х»_Хю X»;

Хг_Хз_ Хч_ Χ₅_Χβ_Χτ_Χ8_ Хб_Хю Хм_Хв;

Xg_ Ха Хч_ X5_.Xe_X7_.Xe__ Хв_Х|0 Х|1_Х|2 Х|3»

Xg Ха Хч_ Χδ_Χβ_Χ7_Χβ_ Хв_Х|О Х|1_Х|2 Х|3 Х|4>

Xi Хг_Хз_ Хд_ X₅_XeJ<7_X8_ Хв_Хю;

Xi Хг_Хз_ Хч_ Xs_Xe_X₇_X8_ Хе_Хю_Хи;

Xi Х2_Хз_ Хч_ Х₅_Хе_Х7_Х^ XiL-Xio Х|1_Х|2;

Xi Хг_Хз_ Х<_ Xs_Xe_X7_Хв_ Хб_Хю Χιι_Χβ Χΐ3ί и Xi Хг_Хз_ Хч_ Х5_Хе_Х7_Х₈_ Х₉_Хю Х|1_Х|2 Х|3 Хи, където Х₂ и Х₁₀ са като формулирани и X, и Х_п-Х₁₄ са избрани от групата, състояща се от:

а) X, е избран от групата, състояща се от lie, Val, Leu, Ser и Arg;

Х_н е избран от групата, състояща се от Ala, He, Val, Leu, Ser, Thr, Lys, His и Glu;

X₁₂ е избран от групата, състояща се от Ala, lie, Val, Leu, Phe, Gly, Ser и Gin;

X₁₄ е избран от групата, състояща се от Ala, He, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu и Gly;

б) X] е избран от групата, състояща се от He, Val, Leu, Ser и Arg;

X_n е избран от групата, състояща се от Ala, He, Val, Leu, Phe, Thr, Lys, His и Glu;

X₁₂ е избран от групата, състояща се от Ala, He, Val, Leu, Phe, Gly, Ser и Gin;

в) Х₁ е избран от групата, състояща се от lie, Val, Leu, Ser и Arg;

Х_и е избран от групата, състояща се от Ala, He, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His и Glu;

X₁₂ е избран от групата, състояща се от

Ala, He, Val, Leu, Gly, Ser и Gin;

X₁₄ е избран от групата, състояща се от Ala, lie, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu и Gly.

Терминът “TMP” се използва, за да обозначи група, изградена, т.е. съдържаща поне 9 подгрупи (Х₂ - Х₁₀), където Х₂ - Х₁₀ обхващат сърцевинна структура. Подгрупите Х₂ - Х₎₄ са предимно аминокиселини, избрани независимо всред 20 природно съществуващи аминокиселини. Обаче, изобретението обхваща съединения, където Х₂ - Х₁₄ са избрани независимо от група нетипични аминокиселини, които не съществуват в природата и са добре известни на специалистите. За всяка позиция се идентифицират специфични аминокиселини. Например, Х₂може да бъде Glu, Asp, Lys или Val. В тази работа са използвани трибуквени и еднобуквени означения за аминокиселини; във всеки случай означенията са стандартни за 20 природно съществуващи аминокиселини или за добре познати техни варианти. Тези аминокиселини могат да имат L или D стереохимия (с изключение на Gly, който не е нито L нито D), и ТМР могат да съдържат комбинация от стереохимии. Стереохимия L обаче се предпочита при всички аминокисели

66190 Bl ни във веригата на ТМР. Изобретението осигурява също и обратни ТМР молекули, където амино-терминалът към карбокси-терминала на поредицата от аминокиселини е обратен. Например, обърната молекула на нормална поредица X] - Х₂- Х₃ще бъде Х₃ - Х₂- X,. Изобретението осигурява също ретро-обратни ТМР молекули, където, както при обратната ТМР, амино-терминалът към карбокси-терминала на поредицата от аминокиселини е обърнат и остатъците, които обикновено са “L” енантиомери в ТМР, са променени на “D” стереоизомерни форми.

Освен това, също се съдържат и физиологично приемливи соли на ТМР. “Физиологично приемливи соли” означава всички соли, известни или открити по-късно, които са фармацевтично приемливи. Някои специфични предпочитани примери са: ацетат, трифлуороацетат, хлороводород, бромоводород, сулфат, цитрат, тартрат, гликолат, оксалат.

Планира се също “производните” на ТМР да могат да заместят гореописаните ТМР. Такива производни на ТМР включват групи, където са били направени една или повече от следните модификации:

една или повече пептидилови [-C(O)NR-] връзки са били заменени с непептидилови, като -СН₂-карбаматна връзка [CH₂-OC(O)NR-]; фосфонатна връзка; -СН₂-сулфонамидна [СН₂OS(O)NR-] връзка; Урея [-NHC(O)NH-] връзка; -СН₂ - вторична аминовръзка; или алкилирана пептидилова връзка [-C(O)NR⁶ - където R⁶ е нисш алкил];

пептиди, където N-терминалът е променен на -NRR¹ група; на NRC(O)R група; на NRC(O)OR група; на NRS(O)₂R група; на -NHC(O)NHR група, където R и R¹ са водород или нисш алкил, при условие, че R и R¹ не са водород; на сукцинамидна група; на бензилоксикарбонилна -NH-(CBZ-NH-) група или на бензилоксикарбонил-NH- група от 1 до 3 заместителя на фенилния пръстен, избран от групата, състояща се от нисш алкил, нисш алкокси, хлоро и бромо; и пептиди, където свободният С терминал е променен на -C(O)R², където R² е избран от групата, състояща се от нисш алкокси и -NR³R⁴, където R³ и R⁴ са независимо избрани от групата, състояща се от водород и нисш алкил. “Нисш” означава група, имаща от 1 до 6 въглеродни атома.

Освен това, модификации на отделните аминокиселини могат да се внесат в молекулата ТМР като се въздейства на набелязаните аминокиселинни остатъци на пептида с органичен производен агент, който може да взаимодейства с избраните страни на веригите или с терминалните остатъци. По-долу следват примери.

Остатъци на лизинил и амино-терминала могат да реагират със сукцинови или други карбоксилни киселинни анхидриди. Получаването на производни с тези агенти има за резултат обръщането на заряда на лизиновите остатъци. Други подходящи реагенти за получаване на алфа-амино-съ държащи остатъци саимидоестери, като метиловият пиколинимидат; пиридоксалов фосфат; пиридоксал; хлороборохидрид; тринитробензилсулфонова киселина; О-метилисурея; 2,4 пентанедион; и трансаминаза - катализирана реакция с глиоксилат.

Аргиниловите остатъци могат да бъдат модифицирани чрез реакция с един или няколко конвенционални реагенти, сред които са фенилглиоксал, 2,3-бутандион, 1,2-циклохександион и нинхидрин. Получаването на аргининови остатъци изисква реакцията да се извършва при алкални условия поради високата стойност на рКа на гванидин-функционалната група. По-нататък, тези реагенти могат да реагират с групите на лизин, както и с аргинингуанидинова група.

Специфичната модификация на тирозилните остатъци са били изучени обстойно, с особен интерес върху внасянето на спектрални линии в тирозилните остатъци чрез реакция с ароматни диазонови съединения или тетранитрометан. Още по-общо казано, могат да се използват N-ацетилимидизол и тетранитрометан, за да се образуват О-ацетил тирозилови видове и съответно 3-нитро производни.

Карбоксилните странични групи (аспартил или глутамил) могат да бъдат модифицирани селективно с реакция с карбодиимиди (R’N=C=N-R’), като 1-циклохексил-3-(2-морфолинил-(4-етил)карбодиимид или 1-етил-3-(4-азония-4,4-диметилпентил)-карбодиимид. Освен това, остатъците на аспартил и глутамил могат да се преобразуват в остатъци на аспаригинил и глутаминил с реакция с амониеви йони.

Глутаминиловите и аспарагинилови остатъци често се дезамидират до съответните глу66190 Bl тамилови и аспартилови остатъци. Обратно, тези остатъци могат да бъдат дезамидирани при помеки киселинни условия. Всяка форма на тези остатъци попада в обхвата на това изобретение.

Получаване на производни с бифункционални агенти е полезно при напречно свързване на пептиди или техните функционални производни до водонеразтворима поддържаща матрица или до други макромолекулни носители. Обикновено използваните напречно-свързващи агенти включват, например, 1,1-би-(диазоацетил)-2-фенилетан, глутаралтехид, N-хидроксисукцинимидови естери, например, естери с 4азидо-салицилова киселина, хомобифункционални имидоестери, включително дисукцин-имидилови естери, като 3,3'-дитиобис(сукциминидилпропионат), и бифункционални малеимиди, като ди-М-малеимидо-118-окган. Дериватизационните агенти като метил-3-[(п-азидофенил)-дитио]пропиоимидат дават добив фотоактивируеми посредници, които са в състояние да образуват напречни връзки при наличие на светлина. Обратно, реактивно-водонеразтворимите матрици като цианоген бромид-активирани въглеводороди и реактивните субстрати, описани в US Патенти с номера 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 и 4,330,440 могат да се използват за протеинова имобилизация.

Други възможни модификации включват хидроксилиране на пролин и лизин, фосфорилизиране на хидроксилни групи на остатъци от серил или треонил, оксидиране на серния атом в Cys, метилиране на алфа-аминогрупите на лизин, аргинин и хистидинови странични вериги (Крейтьн, Т. Е., Протеини: Структурни и мо5 лекулни свойства, У. X. Фриймън & Со; Сан Франциско, стр. 79-86 (1983 г.)), ацетилиране на N терминален амин и в някои случаи, амидиране на С-терминалните групи.

Такива дериватизационни групи подобря- ват предпочитано една или повече характеристики, включващи тромбопоетична активност, разтворимост, абсорбция, биологически период на полуразпадане и подобни на съединенията от изобретението.

Обратно, дериватизираните групи имат в резултат съединения, които имат същите или необходимо същите характеристики и/или свойства на съединението, което не е дериватизирано. Групите могат да елиминират алтернативно или 20 да намалят всякакъв нежелан страничен ефект на съединенията и подобните им.

В допълнение на сърцевинната структура, изложена по-горе, други предвидени структури Х₂ - Х_]0 са онези, в които една или повече до25 пълнителни X групи са прикачени към сърцевидната структура. Така, Х[ и/или Х_н, Х_]2, Х₁₃ и Х₁₄ могат да се прикачат към сърцевинната структура.

По-долу следват някои примерни допъл30 нителни структури:

Х₂ - Х₃- Х< - Х₅ - Х« - X? · X» - X# - Х₁₀ - Х_я; Х₂ - Х₃- Х₄ - Хе - Χ_β - Х₇ - Х_в - X, - X_w - Х_п- Х«;

Х₂ - Х₃- Х₄ - Х_в - Хе - Х₇ - Х_в - Х_в - Х₁₀ - Х_п - х₁₂ - х₁₃;

Х₂ - х_з- Х₄ - Х₅ - X. - Х₇ - х. - х₈ - Х,_о - Х_1Г Х₁₂ - х₁₃ - х₁₄; х< · х₂ Х₃- Х₄ - Х₈ - Хе - Х₇ - Χ_β - X. - Х₁₀ ;

Xi · Хг - Х₃- Х< - Х₈ - Х« Х₇ - Х₃ Χ_β · Χίο - Хи;

Xi - Х₂ - Х₃-х₄ - Х₈ - Хе - Х₇ - Хе - Хо - Хю - Хи- х«

X, - Х₂ - Х₃- Х₄ - х₈ - х_з - Х₇ - Х₃ - Х₃ - X_w - Х_й . Х₁₂. Х₁₃ .

Xi - х₂ - х₃ - х₄ - Хе - Х₈ - Х₇ - Х_в - Х₃ - Х₁₀ - Х„ - Х₁₂. х₁₃. х_м;

където Xj до Х₁₄ са описани по-горе. Всяко едно ТМР] и ТМР₂ може да бъде същото или различно в поредица и/или в дължина. В някои предпочитани приложения, TMPj и ТМР₂ са същите.

Особено предпочитан ТМР е следният:

Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-LeuAla-Ala-Arg-Ala (SEQ ID N0:1).

66190 Bl

Както е използвано тук понятието “обхваща” означава между другото, че съединението може да съдържа допълнителни аминокиселини от/или от двата вида терминали “минус” или “С” от дадена поредица. Колкото е по-дълга 5 структурата, обаче, както е случаят Х₂ до Х₁₀, Xj до Х₁₄, или ако присъства друга примерна структура, останалата химическа структура е относително по-малко важна. Разбира се, всяка структура извън сърцевинната структура Х₂ до 10

Х_]0 или структурата X, до Х₁₄ не би трябвало да влияе значително върху тромбопоетичната активност на съединението. Счита се, например, че N-терминалният остатък Met попада в това изобретение. Освен това, въпреки че много от предпочитаните съединения от изобретението са двойки димери, тъй като притежават две групи ТМР, други съединения от това изобретение са двойки мултимери от видовете ТМР, т.е. съединения от следните примерни структури:

TMP_rL-TMP₂-L-TMP₃;

ТМР,- L -ТМР₂ - L - ТМР₃- L -ТМР₄

ТМР,- L -ТМР₂ - L - ТМР₃- L -ТМР₄- L - ТМР₅;

където ТМР_р ТМР₂, ТМР₃ - ТМР₄ и ТМР₅могат да имат същите или различни структури и 2θ където всяко ТМР и L и където всяко ТМР и L се дефинира както е изложено тук, като всеки от свързващите агенти е по избор. Предпочита се съединенията от това изобретение да имат от 2 до 5 групи ТМР, особено се предпочита от 2 до 3 25 групи, а най-предпочитани са 2 групи. Съединенията от първото приложение на това изобретение ще имат предпочитани по-малко от около 60, по-предпочитани - общо по-малко от около 40 аминокиселини (т.е. те ще бъдат ₃θ пептиди).

Както е отбелязано по-горе, съединенията от първото приложение на това изобретение са преди всичко ТМР димери, които са свързани или директно, или посредством свързваща гру- ₃$ па (линкер). Мономерните ТМР групи са показани в конвенционалната ориентация от N до С терминали, четено от ляво на дясно. Може да се види съответно, че всички съединения от изобретението са ориентирани така, че С-терминалът на TMPj е прикачен или директно, или чрез линкер към N-терминала на ТМР₂. Тази ориентация се нарича двойна ориентация, а съединенията от изобретението могат да бъдат наричани общо “двойки димери”. Тези съединения се спомена- 45 ват като димери дори ако ТМР₁ и ТМР₂ са различни по структура. Т.е., взети са предвид и двата вида хомодимери и хетеродимери.

Групата “линкер” (“L”) е по избор. Когато тя присъства, нейната химична структура не е от съществена важност, тъй като тя служи предимно като спейсър. Линкерът трябва да бъде избран така, че да не влияе на биологическата активност на крайното съединение и също така върху имуногенността на крайното съединение не е увеличена значително. Линкерът се състои предимно от аминокиселини, свързани заедно с пептидни връзки. Така, в предпочитаните приложения, линкерът съдържа Υ_η, който е природно съществуваща аминокиселина или стереоизомер на същата, където “п” варира от 1 до 20. Следователно, линкерът се състои от 1 до 20 аминокиселини, свързани с пептидни връзки, като аминокиселините са избрани от 20 природно съществуващи такива. В по-предпочитано приложение, аминокиселините от 1 до 20 са избрани от Gly, Ala, Pro, Asn, Gin, Cys, Lys. Дори е още по за предпочитане, когато линкерът се състои в по-голямата си част от аминокиселини, които не са пространствено свързани, от рода на Gly, Gly-Gly[(Gly)₂], Gly-Gly-Gly[(Gly)₃] ........(Gly),₀, Ala, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala и др.

Други специфични примери за линкери саследните:

(Gly)₃Lys(Gly)₄ (SEQ ID N0:6); (Gly)3AsnGlySer(Gly)₂ (SEQ ID No: 7) (Тази структура осигурява сайт за гликозилиране, когато тя се получава рекомбинантно в система от клетки на бозайник, които могат да гликозилират тези сайтове);

(Gly)₃Cys(Gly)₄ (SEQ ID N0:8); GlyProAsnGly (SEQ ID No: 9)

66190 Bl

За да обясним горната номенклатура, например, (Gly)₃Lys(Gly)₄ означава Gly-Gly-GlyLys-Gly-Gly-Gly-Gly. Комбинации от Gly и Ala също са предпочитани.

Възможни са също така и непептидни линкери. Например, могат да се използват алкилните линкери като -HN-(CH₂)_s-C-, където s=220. Тези алкилни линкери могат да се заместят по-нататък от някои свързани непространствено групи, като нисш алкил (т.е. Cj-Cj), нисш ацил, халоген (например, Cl, Br) CN, NH₂, фенил и други.

Друг вид непептиден линкер е полиетилен-гликолова група, като:

-Н^СН^СН^О-СН^СНД-О-СН^СОкъдето η е такова, че цялото молекулно тегло на линкера варира от приблизително 101 до 5000, предпочитано от 101 до 500.

Изобщо, установено е, че линкерът с дължина около 0-14 подгрупи (например, аминокиселини) се предпочита за тромбопоетичните съединения от първото приложение на това изобретение. Пептидните линкери могат да се видоизменят за да образуват производни по същия начин, както описаните по-горе за ТМР видове.

Съединенията от тази първа група могат по-нататък да бъдат линейни или циклични. Понятието “цикличен” означава, че най-малко 2 отделени части на молекулата (т.е. не непрекъснати) са свързани една към друга. Например, амино- и карбокси-терминалите на краищата на молекулата могат да бъдат свързани ковалентно за да образуват циклична молекула. Обратно, молекулата може да съдържа две или повече Cys-остатька (например, в линкера), които могат да образуват циклична форма чрез дисулфидна връзка.

По-нататък се счита, че могат да се свържат повече от една двойка пептидни димери, за да образуват димер от димери. Така например, двойният димер, съдържащ остатък Cys, може да образува междумолекулна бисулфидна връзка с Cys от друг такъв димер. Вижте, например, съединението от SEQ ID No: 20 по-долу.

Съединенията от изобретението могат също да бъдат ковалентно или нековалентно свързани с молекулата на носителя, както е при линейния полимер (например, полиетилен гликол, полилизин, декстран, и др), полимер с разклонена верига (вижте, например, US Патент

4,289,872 на Денкенвалтер и др., издаден на 15.09.1981 година; 5,229,490 на Там, издаден на 20.07.1993 година; WOW 1993/021259 от Фречет и др.; публикуван на 28.10.1993 година); липид; холестеролна група (като стероидна); или въглехидрат или олигозахарид. Други възможни носители представляват един или повече водоразтворими полимерни присъединявания, като полиоксиетилен гликол, или полипропилен гликол, както е описано в US патенти с No. No.: 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 и 4,179,337. И други полезни полимери, известни на специалистите, включват монометокси-полиетилен гликол, декстран, целулоза или други въглеводороди, на основа полимери, поли-(Ъ1-винил пиролидон)-полиетилен гликол, пропилен гликол хомополимери, полипропилен оксид/етилен оксид ко-полимер, полиоксиетилирани полиоли (например, глицерин) и поливинил алкохол, както и смеси от тези полимери.

Такъв предпочитан носител е полиетилен гликол (PEG). Групата PEG може да бъде с всяко подходящо молекулно тегло и с права или разклонена верига. Средното молекулно тегло на този PEG ще варира преференциално от приблизително 2 kDa до приблизително 100 kDa, попредпочитано от приблизително 5 kDa до приблизително 50 kDa, като се предпочита най-вече от приблизително 5 kDa до приблизително 10 kDa.

Групите PEG ще се присъединяват главно към съединенията от изобретението чрез ацилиране, редукционно алкилиране, добавка на Майкъл, тиолово алкилиране или други хемоизбирателни конюгиращи/лигатурни методи чрез реактивната група върху групата на PEG (например, алдехид, амино, естер, тиол, а-халоацетил, малеимидова или хидрацинова група) до реактивна група на целевото съединение (например, алдехид, амино, естер, тиол, а-халоацетил, малеимидова или хидрацинова група).

Въглеводородни (олигозахаридни) групи могат да бъдат присъединени удобно към сайтовете, които са известни като гликозилирани сайтове в протеините. Изобщо, О-свързаните олигозахариди са прикачени към остатъците серин (Ser) или треонин (Thr), докато N-свързаните олигозахариди са прикачени към аспарагиновите остатъци (Asn), когато те са част от поредица

66190 Bl та Asn-X-Ser/Thr, където X може да бъде всяка аминокиселина с изключение на пролин. X е една предпочитана от 19-те природно съществуващи аминокиселини, без да броим пролина. Различни са структурите на N-свързаните и 0- 5 свързаните олигозахариди и захарни остатъци, намерени във всеки вид. Един вид захар, който обикновено се намира и в двата, е N-ацетилнеураминова киселина (споменавана като сиалова). Сиаловата киселина обикновено е терминален ос- 10 татък от N-свързани и О-свързани олигозахариди и поради нейния отрицателен заряд, може да предава киселинни свойства на гликозилираното съединение. Такъв сайт (сайтове) могат да бъдат внесени в линкера на съединенията от това изоб- 15 ретение и са предимно гликозилирани чрез клетка по време на рекомбинантното получаване на полипептидните съединения (например, в клетки на бозайници, като СНО, ВНК, COS). Тези сайтове, обаче, могат впоследствие да бъдат гликозилирани чрез синтетични или полусинтетични процедури, известни на специалистите от бранша. Някои примерни пептиди от това изобретение са показани по-долу. Използвани са съкращения, означени с една буква, а линкерът е показан отделно с помощта на тирета за поголяма яснота. Допълнителни съкращения: ВгАс означава бромацетил (BrCH₂C(O)), a PEG е полиетилен гликол.

EGPTTRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 10)

EGPTLRQCIAARAXKJGGGGGG-EGPIULQCIAARA (цикличен)

I ____________________· I (SEQ ID NO: 11)

EGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (линеен) (SEQ ID NO: 12)

I .

EGPTLRQAIAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ ID N0:13)

IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 14)

EGPTIAQWLAARA-GGGK(BrAc)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 15)

EGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 16)

EGP1LRQWLAARA-GGGK(PEG)GGGG-EGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 17)

IEGPTbRQWI^ARA-GGGC(PEG)GGGG-EGPTLRQWLAARA (SEQ JD NO: 18)

EGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 20)

EGPTLRQWIAARA<KjGGGGGG-EGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 21)

66190 Bl

Във всяко от горните съединения е включен също и N-терминален Met (или остатък М, означен според кода с една буква). Взети са също предвид мултимери от горните съединения (например, двойка и не двойка, ковалентносвързани и не ковалентно-свързани).

Методи за получаване

Съединенията от това изобретение могат да се получат по различни начини. Тъй като много от съединенията ще бъдат пептиди, или ще съдържат пептид, методите за синтезиране на пептиди ще бъдат от особено значение тук. Например, може да се използва методиката за синтез на твърдата фаза. Подходящи методики са добре познати на специалистите в тази област и включват описаните в Мерифийлд, Химически полипептиди, стр. 335-61 (Кацоянис и Паньотис, издание 1973 година); Мерифийлд, Журнал на Американското химическо дружество 85:2149 (1963 година); Дейвис и др.; Биохимически инт. 10:394-414 (1985 г.); Стюарт и Янг, Синтез на пептиди в твърдо състояние (1969 година); US Патент No. 3,941,763; Фин и др.; Протеините, 3то издание, том 2, стр. 105-253 (1976 година); и Ериксън и др. Протеините, 3-то издание, том 2, стр. 257-527 (1976 година). Синтезът в твърда фаза е предпочитан метод за получаване на отделни пептиди, тъй като това е най-ефективният по разходи метод за получаване на малки пептиди.

Пептидите могат да се получават в трансформирани клетки-домакини, използвайки методиката за рекомбинантните DNA. За да се направи това се приготвя кодиране за пептид на рекомбинантна DNA молекула. Методите за получаване на такива DNA и/или RNA молекули са добре известни на специалистите. Например, кодирането на поредиците за пептиди може да се направи от DNA, като се използват подходящи ограничителни ензими. Могат да се създадат съответни поредици, като се използва полимеразна реакция (PCR) с включване на полезни ограничителни сайтове за следващото клониране. Обратно, молекулите DNA/RNA могат да се синтезират като се използват методики за химичен синтез, като например, методът за фосфорамидит. Също така може да се използва комбинация от тези два метода.

Изобретението също включва вектор, кодиращ пептидите в подходящ домакин. Векторът съдържа молекула DNA, която кодира пептидите, свързани оперативно към съответните експресивни контролни поредици. Методите за извършване на това оперативно свързване са добре познати, било преди или след внасянето във вектора на пептидно кодираща DNA молекула. Поредиците за експресивен контрол съдържат промотори, активатори, енхансери, оперони, рибозом свързващи сайтове, стартови кодони, стоп кодони, сар-кодони, полиаденилиращи сигнали и други сигнали, участващи в контрола на транскрибирането или транслацията.

Полученият вектор, съдържащ пептидно кодираща DNA молекула, се използва за трансформиране на съответния домакин. Тази трансформация може да се направи с методи, добре познати на специалистите в тази област.

Всяка от големия брой налични и добре познати клетки-домакини може да се използва в практиката на това изобретение. Изборът на определен домакин зависи от броя на факторите, признати от специалистите в тази област. Тези фактори включват например: съвместимост с избрания експресивен вектор, токсичност за клетката-домакин на пептидите, кодирани с DNA молекула, скоростта на трансформацията, лесна възстановимост на пептидите, експресивни характеристики, биологическа сигурност и разходи. Трябва да се направи баланс на тези фактори като се има предвид, че не всички клетки-домакини могат да бъдат еднакво ефективни за експресия на определена DNA последователност (поредица).

В смисъла на тези общи указания, полезни микробни домакини съдържат бактерии (като Ешерихия Коли), дрожди (като захаромицея и Пичия Пасторис) и други гъбички, насекоми, растения, животински клетки в култура (включително и човешки клетки), или други домакини, известни на специалистите в тази област.

След това трансформираният домакин се култивира при обикновени ферментационни условия, така че се експресират желаните пептиди. Тези ферментационни условия са известни на специалистите.

Накрая, пептидите се пречистват от ферментационната култура или от клетките домакини, в които са експресирани. Тези методи на пречистване също са добре известни на специалистите от тази област.

66190 Bl

Съединенията, които съдържат производни пептиди или които съдържат непептидни групи, могат да бъдат синтезирани с добре познатите методи на органичната химия.

Използване на съединенията

Съединенията от това изобретение имат способността да се свързват и активират рецептора с-MpI и/или да стимулират продукцията (ин виво и ин витро) натромбоцити (“тромбопоетична активност”) и на предшествениците на тромбоцитите (“мегакариоцитопоетична активност”). За да се измери активността (активностите) на тези съединения могат да се използват стандартни проби, като тези, описани в WO1995/026746, озаглавено “Състави и методи за стимулиране на растежа и диференциацията на мегакариоцити”. Пробите ин виво са описани по-нататък в раздела с примерите в този материал.

Условията, които ще се използват в методите и съставите на настоящото изобретение изобщо са онези, които имат отношение към съществуващата мегакариоцитна/тромбоцитна недостатъчност или очакваната мегагариоцитна/тромбоцитна недостатъчност в бъдеще (например, при планирана операция или внасяне на тромбоцити). Тези условия могат да бъдат в резултат на недостиг (временен или постоянен) на активна Мр1 връзка ин виво. Общото понятие затромбоцитна недостатъчност е тромбоцитопения и оттук методите и съставите в настоящото изобретение са общо налични за профилактично и терапевтично лечение на тромбоцитопенията в пациентите, които се нуждаят от това.

Световната здравна организация е класифицирала степента на тромбоцитопенията според броя на циркулиращите тромбоцити в пациента (Милер и др.; Рак 47:210-211 (1981 г.)). Например, лице, което няма признаци на тромбоцитопения (степен 0) ще има общо поне 100,000 тромбоцити/mm³. Лекият тип тромбоцитопения (степен 1) показва циркулиращо ниво на тромбоцити между 79,000 и 99,000/mm³. Средната тромбоцитопения (степен 2) показва между 50,000 и 74,000 тромбоцити/mm³ и остра тромбоцитопения, която варира между 25,000 и 49,000 тромбоцити/mm³. Животозастрашаваща или омаломощаваща тромбоцитопения се характеризира с циркулационна концентрация на тромбоцитите с по-малко от 25,000/mm³.

Тромбоцитопенията (недостатъчност на тромбоцити) може да се появи поради различни причини, включително химиотерапия или друга терапия с множество лекарства, радиационна терапия, операция, внезапна загуба на кръв и други специфични болестни състояния. Примерни специфични болестни състояния, които включват тромбоцитопения и могат да се лекуват съгласно това изобретение, са следните: апластична анемия; идиопатична или имунна тромбоцитопения (ITP), включително идиопатична тромбоцитопенична пурпура, свързана с белодробен рак, HIV, свързан с ПР и HIV, свързан със стромботична тромбоцитопенична пурпура; метастазни тумори, които имат в резултат тромбоцитопения, общо заболяване кожна туберкулоза - еритематозис; включително кожни възпаления у новороденото - синдром на спленомегалия; синдром на Фанкони; недостатъчност на витобин В 12; недостиг на фолиева киселина; аномалия наМей-Хеглин; синдром на Уискот-Олдрих; хронична болест на черния дроб; миелодиспластичен синдром, свързан с тромбоцитопения; пароксизмална нощна хемоглобинурия; остра тежка тромбоцитопения след терапия С7ЕЗ Fab (Abciximab); алоимунна тромбоцитопения, включително майчина алоимунна тромбоцитопения; тромбоцитопения свързана с антифосфолипидни антитела и тромбоза; автоимунна тромбоцитопения; имунна тромбоцитопения, породена от лекарства, включително тромбоцитопения в резултат на карбоплатин, тромбоцитопения в резултат на хепарин; ембрионална тромбоцитопения; тромбоцитопения при бременност; синдром на Хюджис; люпоидна тромбоцитопения; внезапна и/или масивна загуба на кръв; миелопролиферативни нарушения; тромбоцитопения у пациенти със злокачествени заболявания; тромботична тромбоцитопения пурпура, включително тромботична микроангиопатия, проявяваща се като тромботична тромбоцитопенична пурпура/хемолитичен уремичен синдром у пациенти с рак; автоимунна хемолитична анемия; окултивна неюнална дивертикулна перфорация; чиста червена клетка аплазия; автоимунна тромбоцитопения; нефропатия епидемика; остро бъбречно заболяване, свързано с рифанпицин; тромбоцитопения наПарис-Трусо; послеродова алоимунна тромбоцитопения; пароксизмална нощта хемоглобинурия; хематологични промени в сто

66190 Bl машния рак; хемолитични уремични синдроми в детската възраст; хематологични прояви, свързани с вирусна инфекция, включително вирус на хепатит А и тромбоцитопения, свързана с CMV. Също така, определени лечения на СПИН имат за резултат тромбоцитопения (например, DZT). При някои лечения на рани могат да се появят смущения от нарастване на броя на тромбоцитите.

По отношение на очакваните тромбоцитни недостатьчности, например, поради бъдеща операция, може да се предпише съединение от настоящото изобретение за няколко дни до няколко часа преди нужда от тромбоцити. При спешни случаи, например, внезапна и масивна загуба на кръв, съединение от това изобретение може да бъде предписано заедно с кръвни или пречистени тромбоцити.

Съединенията от това изобретение могат да бъдат полезни също и при стимулиране на определени видове клетки, различни от мегакариоцити, ако се установи, че тези клетки експресират Мр1 рецептора.

В обхвата на настоящото изобретение са включени и условия, свързани с клетки, които експресират Мр1 рецептора и са причина за стимулиране чрез връзката Мр1.

Съединенията от това изобретение могат да бъдат използвани във всяка ситуация, при която се цели получаване на тромбоцити или на клетки-предшественици или при които се цели стимулиране на рецептора Мр1. Така например, съединенията от това изобретение могат да бъдат използвани за лечение на всякакво заболяване у бозайниците, където има необходимост от тромбоцити, мегакариоцити и други подобни. Заболяванията от този вид са описани подробно в следните примерни източници: WO 1995/ 026746; WO1995/021919; WO1995/018858; WO 1995/021920 и са използвани в тази работа.

Съединенията от това изобретение могат също да бъдат полезни при поддържане на жизнеността или съхраняването на тромбоцити и/или мегакариоцити и свързани клетки. Във връзка с това може да е полезно използването на ефективно количество от едно или повече такива съединения в състава, съдържащ такива клетки.

Понятието “бозайник” означава всеки бозайник, включително и човека, домашните животни, включително кучета и котки, екзотич ни и/или зоологически животни, включително маймуни; лабораторни животни са мишки, плъхове и морски свинчета; селскостопански животни, включително коне, рогат добитък, овци, кози, свине и подобни. Предпочитаният бозайник е човекът.

Фармацевтични състави

Настоящото изобретение осигурява също така и методи за използване на фармацевтичните състави на изобретените съединения. Тези фармацевтични състави могат да бъдат предписвани за инжекция, чрез орално приемане, през носа, трансдермално или други форми на назначение, включително, например, с интравенозна, подкожна, интрамускулна, интрамамиларна, интраперитонеална, в гръбначно-мозъчния канал, вътреочна, ретробулбарна, интрапулмонална (например, аерозолни лекарства) или подкожна инжекция (включително предписване на лекарства - депо за отделяне продължително време); чрез прилагане под езика, анално, вагинално или чрез хирургическо инплантиране, например, вложени в капсули в далака, мозъка или в корнеята. Лечението може да се състои от единична доза или множество дози за определен период от време. Изобщо, в изобретението са разработени детайлно фармацевтични състави, съдържащи ефективни количества от съединението на изобретението, заедно с фармацевтични приемливи разредители, консерванти, разтворители, емулгатори, спомагателни вещества и/или носители. Тези състави включват разредители на различни буферни съставки (например, Tris-HCl, ацетат, фосфат), pH и йонен усилвател; добавки като детергенти и солюбилизиращи агенти (например, Туин 80, Полисорбат 80), антиоксиданти (например, аскорбинова киселина, натриев метабисулфит), консерванти (например, Тимерсол, бензилов алкохол) и набухватели (например, лактоза, манитол); внасяне на веществото в определени препарати на полимерни съединения, като полиактинова киселина, полигликолова киселина и други или в липозоми. Хиалуронова киселина също може да се използва и това може да има въздействие за стимулиране на поддържаната прод ължителност на циркулацията. Фармацевтичните състави могат да съдържат по избор и други фармацевтични приемливи течности, полутвърди или твърди разредители, които служат за

66190 Bl фармацевтични носители, инертни пълнители или посредници, включително, но неограничено до полиоксиетиленов сорбитан моно лаурат, магнезиев стеарат, метил и пропилхидроксибензоат, скорбяла, захароза, декстроза, гуми арабика, калциев фосфат, минерално масло, кокосово масло и какаово масло. Тези състави могат да повлияят на физическото състояние, стабилността, скоростта на отделяне ин виво и скоростта на изхвърляне ин виво на настоящите протеини и производни. Вижте, например, Фармацевтически науки на Ремингтон, 18-то издание (1990 г., Издателска компания Мак, Истън, Филаделфия 18042) стр. 1435-1712, които са дадени тук за справка. Съставите могат да бъдат приготвени като течност, суха пудра, или лиофилизирана форма. Разгледани са също състави с поддържано отделяне, каквито са съставите за подкожни инжекции.

В това изобретение са разгледани препарати в твърди дози за приемане през устата, които са описани общо във Фармацевтически науки на Ремингтон, 18-то издание, 1990 г., Издателска компания Мак, Истън, Филаделфия 18042 в Глава 89, които са дадени тук за справка. Твърдите дозировки са във форма на таблетки, капсули, хапчета, гранули и други. Тези състави могат да се капсулират също и липозомно или протеинно (като например, микросфери с протеини, описани в US Патент No. 4,295,673). Може да се използва и липозомно капсулиране, като липозомите могат да бъдат получени като производни с различни полимери (например, US Патент No. 5,013,556). Описание на възможна дозировка в твърда форма за лечение е дадено от Маршал, К., Модерна фармацевтика, издание на Г. С. Банкер и С. Т. Родее, Глава 10,1979 година, дадени тук за справка. Изобщо, формулирането ще включва изобретените съединения и инертни съставки, които служат за протекция на стените на стомаха, и освобождават биологически активно вещество в червата.

Също така специално са разгледани за приемане през устата дози от съединенията на изобретението. Ако е необходимо, съединенията могат да се модифицират химически, за да бъде ефикасно приемането им през устата. Общо, химическата модификация, разгледана тук, се състои в присъединяване на поне една група към молекулата на съединението, като въпросната гру па позволява:

(a) инхибиране на протеолизиса; и (b) поемане в кръвния поток от стомаха или червата.

Цели се също така увеличаване на общата стабилност на съединението и на циркулационното време в тялото. Примери за такива групи са дадени по-долу:

Полиетилен гликол, кополимери на етилен гликол и пропилея гликол, карбоксиметилцелулоза, декстран, поливинил алкохол, поливинил пиролидон и полипролин (Абушовски и Дейвис, Разтворими полимер-ензимни добавки, Ензимите като лекарства, Хосенберг и Робърте, издания на УилиИнтерсайънс, Ню Йорк, NY, (1981 г.), стр. 367383; Нюмарк и д р.; Журнал Приложна биохимия, 4:185-189 (1982 г.)). Други полимери, които могат да се използват, са поли-1,3-диоксолан и поли-1,3,6-тиоксокан. Предпочитани за фармацевтично приложение са групите полиетилен гликол, както е показано погоре.

За дози за приемане през устата е възможно да се използва също сол на модифицирана алифатна аминокиселина, като натрий N(8-[2-хидроксибензоил]амино) каприлат (SNAC), като носител, за да се увеличи абсорбцията на терапевтическите съединения в това изобретение. Клиничната ефикасност на състава хепарин, в който е използван SNAC беше демонстрирано във П-рата фаза на опита, проведен от Емисфиър Текнолоджийс. Вижте US Патент 5,792,451, “Орален медикамент и методи”.

Лекарственото средство може да се включи в състава като фини частици под формата на гранули или сферички с размер около 1 mm. Изготвянето на състава за предписване на капсули може да бъде във вид на пудра, лекоком пресована материя или дори таблетки. Медикаментът може да се изготви чрез компресиране.

Могат да се включат и оцветители и вкусови агенти. Например, протеинът (или производната) може да се формулира (като капсулиране с липозон или микросфери) и след това да му се прибави хранителен продукт, като охладена напитка, съдържаща оцветители и вкусови агенти.

66190 Bl

Лекарственото средство може да се разреди или увеличи обема си с инертно вещество. Тези разредители могат да бъдат въглехидрати, особено манитол, а-лактоза, анхидридна лактоза, целулоза, захароза, модифицирани декстрани и скорбяла. Определени неорганични соли могат да се използват също като пълнители, например калциев трифосфат, магнезиев карбонат и натриев хлорид. Някои разтворители от търговската мрежа са Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Емкомпрес и Авицел.

В изготвянето на медикамента може да се включат дезинтегратори в твърда дозировка. Материалите, използвани като дезинтегратори включват, но не са ограничени до скорбяла, включително и търговски дезинтегратори на основата на скорбяла, Експлотаб. Могат да се използват скорбяла, натриев гликолат, Амберлит, натриева карбоксиметилцелулоза, ултрамилопектин, натриев алгинат, желатин, обелки от портокал, кисела карбоксиметил целулоза, естествена гъба и бентонит. Друга форма дезинтегратори са неразтворимите катионни обменни смоли. Като дезинтегратори и свързващи агенти могат да се използват прахообразни смоли, които могат да бъдат агар, Карая или трагант. Алгинова киселина и нейната натриева сол също са полезни като дезинтегратори.

Могат да се използват свързващи вещества, за да задържат компактно лекарственото средство, да се образува твърда таблетка и да се използват материали от естествени продукти, като акация, трагант, скорбяла и желатин. При други се използва метилцелулоза (МС), етилцелулоза (ЕС) и карбоксиметил целулоза (СМС). Могат да се използват поливинилов пиролидон (PVP) и хидроксипропилметил целулоза (НРМС) в алкохолни разтвори за гранулиране на лекарството.

В състава на лекарственото средство може да се включи антифрикционен агент за предотвратяване на прилепването по време на процеса на изготвяне. Лубриканти могат да се използват като слой между лекарството и обвивката, които могат да включват, но не ограничено, стеаринова киселина, нейните магнезиеви и калциеви соли, политетрафлуор етил (PTFE), течен парафин, растителни масла и восък. Разтворими лубриканти могат да се използват също като натриев лаурил сулфат, магнезиев лаурил сулфат, полиетилен гликол с различно молекулно тегло, Carbowax 4000 и 6000.

Могат да се добавят агенти, които да подобрят плъзгането и течливостта на лекарството по време на изготвянето му и да помогнат за прегрупирането по време на компресията. Тези агенти могат да бъдат скорбяла, талк, пирогенен силициев двуокис и хидратиран силикоалуминат.

За да се подпомогне разтварянето на лекарството в течна среда, може да се добави и повърхностно активно вещество като мокрещ агент. Повърхностно активните вещества могат да бъдат анионни детергенти като натриев лаурил сулфат, диоктилов натриев сулфосукцинат и диоктилов натриев сулфонат. Могат да се използват катионни детергенти, като бензалкониум хлорид или бензетониум хлорид. Списъкът на възможните нейонни детергенти, които могат да се използват при изготвяне на повърхностно активните вещества са лауромакрогол 400, полиоксил 40 стеарат, полиоксиетиленово хидрогенирано рициново масло 10, 50 и 60, глицеринов моностеарат, полисорбат 40, 60, 65 и 80, естер на мастна киселина захароза, метилцелулоза и карбоксилметил целулоза. Тези повърхностни вещества биха могли да присъстват при изготвянето на протеина или производната му, било поотделно или като смес в различни съотношения.

Добавки с възможно ускорено поемане на съединението са например мастните киселини: олеинова, линолова и линоленова киселина.

Може да се желае контролирано отделяне на състава. Лекарството може да бъде внесено в инертна матрица, която позволява освобождаване на смоли чрез механизми на дифузия или проникване. Бавно разрушаващите се матрици могат също да се внесат в състава, например, алгинати, полизахариди. Друга форма на контролирано отделяне на това лекарствено средство е чрез метод, базиран на терапевтичната система Орос (Алзакорп), т.е., лекарството е затворено в полупропусклива мембрана, която позволява да навлезе вода и да избута лекарството навън през малък отвор поради осмотично действие. Някои ентерични обвивки също имат забавено действие на отделяне.

При изготвяне на лекарството могат да се използват и други обвивки. Те представляват разнообразни захари, които могат да се прибавят към обвивката. Лекарството може да се при66190 Bl готви във вид на таблетка с обвивка, която да съдържа терапевтичния агент. Веществата, които са използвани в този случаи са разделени на 2 групи.

Първата група се състои от неентерични вещества и обхваща метилцелулоза, етилцелулоза, хидроксиетилцелулоза, метилхидрокси етилцелулоза, хидроксипропилцелулоза, хидроксипропил-метилцелулоза, натриева карбоксиметилцелулоза, провидон и полиетилен гликоли. Втората група се състои от ентерични вещества, които обикновено са естери на фталова киселина.

Може да се използва смес от вещества, за да се получи оптимално филмово покритие. Филмовото покритие може да се направи в съд за нанасяне на филма или във флуид или с компресия.

В тази разработка е разгледано внасянето на настоящия протеин в белите дробове (или на производна на същия). Протеинът (или неговата производна) се внася в белите дробове на бозайника чрез вдишване и преминава през епителната обвивка на дробовете в кръвния ток. (Други доклади по този въпрос са дадени от Аджей и др., Фармацевтическо изследване 7:565569 (1999 г.); Аджей и др., Международен журнал по фармацевтика 63:135-144 (1990 г.) (леупролид ацетат); Бракет и др., Журнал по Сърдечносъдова фармакология 13 (допълнение 5): 143-146 (1989 г.) (ендотелин-1); Хубард и др., Анали на вътрешната медицина 3:206-212 (1989 г.) (al-антитрипсин); Смит и др., Журнал по клинични изследвания 84:1145-1146 (1989 г.) (alпротеиназа); Осуейн и др., “Аеролизация на протеините”, Заседания на Симпозиума по лекарствени средства за белите дробове, П-ра фаза, Кийстьн, Колорадо, март 1990 г. (рекомбинантен хормон на растежа у човека); Дебс и др., Журнал по имунология 140: 3482-3488 (1988 г.) (интерферон-g и туморен некротизиращ фактор а) и Плац и др., US Патент No 5,284,656 (гранулоцитен стимулиращ колонията фактор).

Разгледани са множество прибори за приложение в практиката на това изобретение за внасяне на терапевтични продукти в белите дробове, включително, но не ограничено до пулверизатори, инхалатори за измерена доза, инхалатори за пудра, всички те са добре познати на специалистите в тази област.

Някои специфични примери за устройства, които са в наличност в търговската мрежа и са удобни за това изобретение, са: инхалатор Ултравент, произведен от Малинкродт, Инк., Сейнт Луис, Мисури; инхалатор Акорн II, произведен от Маркест Медикъл Продаете, Енгълууд, Колорадо; инхалатор за измерване доза Вентолин, произведен от Глаксо Инк., Изследователски център Triandle Park, Северна Каролина; и инхалатор за пудра Спинхейлър, произведен от Физонс Корпорейшън, Бедфорд, Масачузетс.

Всички тези устройства използват подходящи състави за прилагане на съединението от изобретението. Обикновено даден състав е специфичен за определен вид устройство, което се прилага и може да се наложи да се използва съответен реактивен материал, освен полезните за терапията разредители, спомагателни вещества и/или носители.

Съединението от изобретението би трябвало да се приготвя най-приемливо в подходящата форма със средно големи частици, по-малки от 10 mm (или микрона), най-предпочитано от 0,5 до 5 mm, за най-ефективно внасяне в целия бял дроб.

Носителите представляват въглехидрати, като трехалоза, манитол, ксилитол, захароза, лактоза и сорбитол. Други съставки за внасяне в композицията могат да бъдат DPPC, DOPE, DSPC u DOPC. Могат се използват естествени или синтетични повърхностно активни вещества. Полиетилен гликолът може да се използва (дори и без неговото участие при получаване на производна на протеин или аналог). Могат да се използват декстрани, като например, циклодекстран. Могат да се използват соли “бил” и други свързани ускорители. Могат да се използват целулоза и целулозни производни. Могат да се използват киселини, както е при буферния състав.

Разгледано е също така приложението на липозоми, микрокапсули или микросферички, включително комплексни състави или други видове носители.

Състави, които са подходящи за прилагане с помощта на струен или ултразвуков инхалатор, обикновено представляват съединение от изобретението, разтворено във вода при концентрация около 0.1 до 25 mg от биологически активен протеин, за ml от разтвора.

Съставът може да съдържа също и буфер и прос66190 Bl та захар (например, за протеиново стабилизиране и регулиране на осмотичното налягане). Съставът на диспергиращия агент може да съдържа и повърхностно активно вещество за намаляване или предотвратяване на предизвикана повърхностна агрегация на протеина, причинена от атомизирането на разтвора при образуване на аерозол.

Съставите за използване на инхалатор за измерване на доза обикновено ще съдържат фино разпратена пудра, съдържаща съединението от изобретението, суспендирано в реактивен агент при помощта на повърхностно активно вещество. Реактивен агент може да бъде всяко удобно вещество, използвано за тази цел, като хлорофлуорокарбон, хидрохлорофлуорокарбон, хидрофлуорокарбон, или въглеводород, включително трихлорфлуорметан, дихлордифлуорометан, дихлородифлуорметан, дихлоротетрафлуороетанол, и 1,1,1,2-тетрафлуороетан, или комбинация на същите. Подходящи повърхностно активни вещества включват сорбитан триолеат и соев лецитин. Олеиновата киселина може да бъде също полезно повърхностно активно вещество.

Състави за диспергиране чрез прахов инхалатор ще съдържат фино разпратена суха пудра, съдържаща съединението от изобретението, а може и набухвател, като лактоза, сорбитол, захароза, манитол, трехалоза или ксилитол в количества, които улесняват разпръскването на пудрата от уреда, например, 50 до 90% от теглото на състава.

Разгледано е и приложение на съединението от изобретението в носа. Такова внасяне през носа позволява протеинът да попадне директно в кръвния ток след предписването му като лечебно средство, без да става отлагане на продукта в белия дроб. Състави за впръскване през носа включват използване на декстран или циклодекстран. Внасянето на лекарството през други слизести ципи също е разгледано в този труд.

Дози

Дозата, която ще бъде предписана за лечение на гореописаните болестни състояния, ще се определя от лекар, като се преценят различните фактори, които модифицират действието на лекарствата, например: възраст, състояние, тегло на тялото, пол и диета на пациента, сериозна инфекция, времето за предписване на лекарството и други клинични фактори. Обикновено, дозата трябва да бъде в границите от 0.1 mg до 100 mg от изобретеното съединение за килограм от телесното тегло дневно, препоръчително е дозата да бъде от 0,1 до 1000 mg/kg; но най-предпочитано е тя да бъде от 0.1 до 150 mg/kg, дадено в дневни или еквивалентни дози, за по-дълги или по-къси интервали от време, например, през ден, два пъти седмично, веднъж седмично или два - три пъти дневно.

Изобретеното съединение може да се предписва с начално по-голямо количество, след което да бъде последвано от продължително приемане, за да се поддържат лечебните циркулационни нива на лекарствения продукт. Като друг пример, изобретеното съединение може да се предпише като еднократна доза. Специалистите в тази област могат лесно да оптимизират ефективните дози и предписаните количества, както се прави в добрата медицинска практика и клиничното заболяване на отделния пациент. Честотата на дозировката ще зависи от фармакокинетичните параметри на агентите и начина на предписване. Оптималното фармацевтично лечебно средство ще се определя от специалистите в областта, в зависимост от начина на назначаване и желаната доза. Вижте, например, Фармацевтически науки, Ремингтън, 18-то издание (1990 година, издателска компания Мак, Истън, Филаделфия 18042), стр. 14351712, изложеното в които е дадено тук за справка. Тези състави могат да повлияят на физическото състояние, стабилността, скоростта на отделяне ин виво и скоростта на изхвърляне ин виво на предписаните агенти. В зависимост от начина на предписване, подходящата доза може да бъде пресметната според телесното тегло, повърхността тялото и големината на органа. По-нататъшното подобряване на изчисленията, необходими за определяне на съответната доза за лечение, включващо всеки от гореспоменатите състави се прави рутинно от обикновените специалисти в тази област без излишно експериментиране, особено в светлината на информацията за дозите и разгледаните тук проби, както и фармакокинетични данни, наблюдавани при клинични опити с хора, разгледани по-горе. Съответните дози могат да се установят чрез използване на утвърдени проби за определяне дозите на кръв

66190 Bl ните нива във връзка със съответните данни за реакция. Окончателната доза ще се определя от лекуващия лекар, като се вземат предвид различни фактори, които променят действието на лекарството, например, специфичната активност на лекарството, сериозността на заболяването и реакцията на пациента, възрастта, състоянието, телесното тегло, пола и диетата на пациента, сериозността на всяка инфекция, времето на предписване на лекарството и други клинични фактори. Проведените изследвания ще представят допълнителна информация относно съответните нива на дозите и продължителността на лечението за различни болести и заболявания.

Лечебните методи, състави и съединения от настоящото изобретение могат да се прилагат индивидуално или в комбинация с други цитокини, разтворимия рецептор Мр1, хематопоетични фактори, интерлевкини, фактори на растежа или антитела при лечение на болестни състояния, на характеризирани с други симптоми, както и недостатъчност на тромбоцити. Очаква се, че съединението от изобретението ще се окаже полезно при лечението на някои форми на тромбоцитопения в комбинация с общи стимулатори на хематопоезиса, като IL-3 или GM-CSF. Други мегакариоцитни стимулиращи фактори, т.е. meg-CSF, фактора на стволовата клетка (SCF), инхибиращият фактор на левкемията, онкостатин М (OSM) или други молекули с мегакариоцитна стимулираща активност могат да бъдат използвани също с лиганда Мр1. Допълнителни примерни цитокини или хематопоетични фактори за така нареченото ко-назначение включват IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, стимулиращия колония фактор-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, стимулиращ гранулоцитна колония фактор (G-CSF), ЕРО, интерферон-алфа (IFN-alpha), консенсус интерферон, IFN-beta, IFN-gamma, И-7, IL-8, IL9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL17, IL-18, тромбопоетин (ТРО), ангиопоетини, например, Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, човешки ангиопоетино-образен полипептид, васкуларен ендотелен фактор на растежа (VEGF), ангиогенин, костен морфогенен протеин -1, костен морфогенен протеин - 2, костен морфогенен протеин - 3, костен морфогенен протеин - 4, костен морфогенен протеин - 5, костен морфогенен протеин - 6, костен морфогенен протеин - 7, кос тен морфогенен протеин - 8, костен морфогенен протеин - 9, костен морфогенен протеин - 10, костен морфогенен протеин -11, костен морфогенен протеин -12, костен морфогенен протеин -13, костен морфогенен протеин - 14, костен морфогенен протеин - 15, костен морфогенен протеин рецептор IA, костен морфогенен протеин - IB, мозъчен производен невротропичен фактор, цилиарен неутрофичен фактор, цилиарен неотрофичен фактор рецептор а, цитокино-индуциран неутрофил хемотактичен фактор 1, цитокино-индуциран неутрофил, хемотактичен фактор 2алфа, цитокино-индуциран неутрофил хемотактичен фактор 2бета, бета ендотелна клетка фактор на растежа, ендотелин 1, епидермен фактор на растежа, епително-производна неутрофил атрактант, фибробластен фактор на растежа 5, фибробластен фактор на растежа 6, фибробластен фактор на растежа 7, фибробластен фактор на растежа 8, фибробластен фактор на растежа 8Ь, фибробластен фактор на растежа 8с, фибробластен фактор на растежа 9, фибробластен фактор на растежа 10, фибробластен фактор на растежа киселинен, фибробластен фактор на растежа основен, тонална клетъчна линия - производна неутропичен фактор рецептор al, тонална клетъчна линия - производна неутропичен фактор рецептор а2, протеин свързан с растежа, протеин а свързан с растежа, протеин b свързан с растежа, протеин g свързан с растежа, хепаринов свързващ епидермален фактор на растежа, хепатоцитен фактор на растежа, хепатоцитен фактор на растежа рецептор, инсулиноподобен фактор на растежа I, инсулино-подобен фактор на растежа рецептор, инсулино-подобен фактор на растежа II, инсулино-подобен фактор на растежа свързващ протеин, кератиноцитен фактор на растежа, левкемия инхибитор фактор, левкемия инхибиторен фактор рецептор а, нервен фактор на растежа, нервен фактор на растежа рецептор, неутропин - 3, неутропин - 4, плацентен фактор на растежа, плацентен фактор на растежа 2, тромбоцитна производна ендотелна клетка фактор на растежа, тромбоцитно-производен фактор на растежа, тромбоцитно-производен фактор на растежа на А-верига, тромбоцитно-производен фактор на растежа АА, тромбоцитно-производен фактор на растежа АВ, тромбоцитно-производен фактор на растежа В верига, тромбоцитно-производен фак

66190 Bl тор на растежа ВВ, тромбоцитно-производен фактор на растежа рецептор а, тромбоцитно-производен фактор на растежа Ь, пре-В клетка стимулиращ фактор на растежа, клетка от ствола фактор рецептор, TNF, включително TNFO, TNF1, TNF2, трансформиращ фактор на растежа а, трансформиращ фактор на растежа Ь, трансформиращ фактор на растежа bl, трансформиращ фактор на растежа b 1,2, трансформиращ фактор на растежа Ь2, трансформиращ фактор на растежа ЬЗ, трансформиращ фактор на растежа Ь5, латентен трансформиращ фактор на растежа b 1, трансформиращ фактор на растежа b свързващ протеин I, трансформиращ фактор на растежа b свързващ протеин II, трансформиращ фактор на растежа b свързващ протеин III, туморен некротизиращ фактор рецептор вид I, туморен некротизиращ фактор рецептор вид И, урокиназа вид плазминогенен активатор рецептор, васкуларен ендотелен фактор на растежа, и шимерни протеини и биологически или имунологически активни фрагменти на същите. Може да е полезно по-нататък да се предпише било едновременно или последователно ефективно количество от разтворим рецептор Мр1 на бозайник, който изглежда, че предизвиква мегакариоцитите да се делят на части тромбоцити, щом мегакариоцитите достигнат зрелост. Така предписването на съединението от изобретението (за увеличаване броя на зрелите мегакариоцити), последвано от назначение на разтворим рецептор Мр1 (за да деактивира свързващия агент и да позволи на зрелите мегакариоцити да произведат тромбоцити) се очаква да бъде особено ефективно за стимулиране произвеждането на тромбоцити. Цитираната по-горе доза може да се уточни, за да компенсира допълнителните компоненти в терапевтичния състав. С помощта на конвенционални методи може да се проследи процеса на лечение на даден пациент.

В случаите, когато изобретените съединения се добавят към състава на тромбоцитите и/ или мегакариоцитите и свързаните клетки, количеството, което трябва да се включи, обикновено се установява експериментално чрез методики и проби, известни на специалистите. Примерната област на количествата е 0.1 mg -1 mg изобретено съединение на 10⁶ клетки.

Подразбира се, че обучението по настоящото изобретение по специфичен проблем или ситуация, ще бъде във възможностите на човек с обикновени познания в специалната област, в светлината на инструкциите, които се съдържат тук. Примери за продуктите на настоящото изобретение и представителните процеси за тяхното изолиране, използване и получаване следват подолу.

Примери

I. По-долу са представени примерни методи за получаване на някои от съединенията от първата група, разглеждана в тази публикация.

А. Материали и методи

Всички производни на аминокиселините (всички от L-конфигурация) и смоли, използвани при пептидния синтез, са закупени от Новабиохим. Реагентите за пептиден синтез (DCC, HOBt, и т.н.) са закупени във вид на разтвори от Приложни биосистеми Инкорпорейтид.

Двете PEG производни са доставени от Шиъруотьр полимери, Инкорпорейтид. Всички разтворители (дихлорметан, N-метил-пиролидинон, метанол, ацетонитрил), са на Е-ем сайънсиз.

Аналитичният HPLC беше тестван на система Бекмън, с колона на Вайдак (0.46 cm х 25 cm, реверсивна фаза С18, 5 mm), при скорост на потока от 1 ml/min, и двойна ултравиолетова детекция на 220 нм и 280 нм. За всички HPLC операции бяха използвани линейни градиенти с две мобилни фази: Буфер А-Н₂О (0.1% TFA) и Буфер В - ацетонитрил (0.1% TFA).

Индексираните пептиди, посочени в този материал, сред които са 17b, 18,19 и 20, са обозначени в съответствие с Табл.1, като някои от тях са илюстрирани по-нататък на фиг. 2 и 3.

Пептиден синтез

Всички пептиди се приготвят чрез добре познатия и често използван метод на синтез на твърда фаза. Синтезът на твърда фаза на база Fmoc химикал, се извършва при използване на ABI пептиден синтезатор.

В общия случай пептидният синтез започва с предварително нанесена смола на Уанг върху скала с деления от 0.1 mmol. Регистрацията на Fmoc защитата се извършва със стандартен протокол за пиперидин. Свързването се извършва при използване на връзката DCC/HOBt.

Защитните групи на страничната верига са: Glu(O-t-Bu), Thr(t-Bu), Arg(Pbf), Gln(Trt), Trp(tBoc) и Cys(Trt). За първия пептиден предшест66190 Bl веник за пегилация се използва Dde за защита на страничната верига на Lys от базата на свързване, като за последното свързване се използва Вос-11е-ОН.

Dde се отстранява при използване на анхидриден хидразин (2% в NMP, 3x2 min), след което се извършва куплиране с бромацетен анхидрид, предварително образуван от реакцията на DCC. За пептид 18, цистинната странична верига на базата на свързване се защитава от тритилната група.

Окончателната депротекция и разделяне на всички връзки пептидил-смола се извършва при RT в продължение на 4 h, като се използва трифлуорооцетна киселина (TFA), която съдържа 2.5% Н₂0,5% фенол, 2.5% триизопропил-силан, и 2.5% тио-анизол.

След отстраняването на TFA, така разделеният пептид се утаява със студен анхидриден етер. Дисулфидното образувание на цикличния пептид се образува предварително върху суровия материал, при използване на 15% от DMSO във Н₂О (pH 7.5). Всички сурови пептиди се прочистват с помощта на подготвителна реверсивна фаза HPLC, като структурите се потвърждават с ESI-MS и амино-киселинен анализ.

В противен случай, всички пептиди, описани тук по-горе могат да бъдат приготвени чрез използване на t-Boc химия. В този случай, като начални смоли трябва да бъдат използвани класическите смоли на Мерифийлд или Пам, а групите за защита на страничните вериги ще бъдат: Glu(OBzl), Thr(Bzl), Aig(Tos), Trp(CHO), Cys(pMeBzl). За окончателно разделяне на пептидилните смоли се използва флуороводород (HF).

Всички двойки димерни пептиди, описани в това изследване, които имат групи за връзка (линкери), съставени от естествени аминокиселини, могат да бъдат приготвени също и по рекомбинантната ДНК технология.

ПЕГилация

Беше разработена новаторска, конвергентна стратегия за пегилацията на синтетичните пептиди, която се състои от комбиниране, с помощта на образуване на конюнктивна връзка в разтвора, на пептид и PEG група, като всеки от тях носи специфична функционалност, които са взаимно реактивни една спрямо друга.

Предшестващите пептиди могат лесно да бъдат приготвени с помощта на конвенционален синтез на твърда фаза, както е описан по-горе. Както е описано по-долу, тези пептиди са “предактивирани” с подходяща функционална група, на конкретно място. Предшествениците се пречистват и описват напълно, преди да реагират с PEG. Свързването на пептида с PEG обикновено се извършва във водна фаза, като процесът лесно може да бъде наблюдаван с помощта на обратната фаза на аналитична HPLC.

Пегилираните пептиди лесно могат да бъдат пречистени с препарат от HPLC и да бъдат описани с аналитична HPLC, аминокиселинен анализ, и лазерна интра-десорпционна спектрометрия.

Приготвяне на пептид 19

Пептид 17Ь (12 mg) и MeO-PEG-SH 5000 (30 mg, 2 eq) се разтварят в 1 ml воден буферен разтвор (pH 8). Сместа се инкубира при RT в продължение на около 30 min, след което реакцията се проверява с аналитична HPLC, която трябва да покаже повече от 80% извършване на реакцията. Пегилираният материал се разделя с помощта на препарат от HPLC.

Приготвяне на пептид 20

Пептид 18 (14 mg) и MeO-PEG-малемид (25 mg) се разтварят в около 1.5 ml воден буфериращ разтвор (pH 8). Сместа се инкубира при RT в продължение на около 30 min, след което реакцията се проверява ок. 70% от трансформацията трябва да е приключила, което се проверява с аналитична HPLC, при използване на аликвота от проба за HPLC колоната. Пегилираният материал се пречиства с помощта на препарат от HPLC.

Биокативна заготовка

Биозаготовката ТРО, in vitro (в епруветка) представлява митогенна проба, използваща IL3 зависимия клон на миши 32D клетки, които са били транфектирани от човешки Мр1 рецептор. Тази проба е описана подробно в WO 1995/026746. Клетките се поддържат в МЕМ среда, съдържаща 10% фетален клон II, и 1 ng/ ml mIL-3.

Преди добавянето на пробата, клетките се подготвят чрез двукратно изплакване с подхранваща среда, в която няма mIL-З. Съставя се разширена дванадесет-точкова ТРО стандартна крива, която започва от 3333 и достига до pg/ml.

За всяка от пробите се приготвят четири

66190 Bl разредителя, изчислени да попадат в линейната част на стандартната крива, (1000 до 125 pg/ml), и същите се репликират три пъти. За стандартно разреждане на всяка от пробите се добавя по 100 ml от разредителите за подходящите чашки от 96-чашкова микротитруваща плака, съдържаща 10,000 клетки/чашка.

След 44 h при 37°С и 10% СО₂, към всяка от чашките се добавя MTS (тетразолово съединение, което е биоредуцирано от клетките до формазан). Приблизително 6 h по-късно, се отчита оптичната плътност върху скалата на плаката, при дължина на вълната от 490 mm.

Генерира се крива на дозата на реакция (концентрацията logTPO като функция на O.D.основата), при което се извършва и линеен регресионен анализ на точките, които попадат в линейната част на стандартната крива. Концентрациите на неизвестните проби за тестване се определят при използване на полученото линейно уравнение, след вземане предвид на корекцията за коефициента на разреждане.

Съкращения

HPLC - високоскоростна хроматография на течности; ESI-MS - електронно разпръскваща йонизационна спектрометрия на масата; MALDI-MS: Матрично-организирана лазерно десорбционна йонизационна спектрометрия на маса; PEG - поли(етилен гликол).

Всички аминокиселини са обозначени със стандартните трибуквени или еднобуквени символи: t-Boc: терт-бутоксикарбонил; tBu: тертбутил; Bzl: бензил; DCC: дициклохексил карбодимид; HOBt: 1-хидроксибензотриазол; NMP: М-метил-2-пиролидинон; Pbf: 2,2,4,6,7пентаметилдихидро-бензофуран-5-сулфонил; Trt: тритил; Dde: 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклохексилидин) етил.

В. Резултати

Двойка ΊΜΡ димери с полиглицинни бази за свързване.

Проектирането на последователно свързани ТМР димери се основава на предположението, че са необходими димерни форми на ТМР за тяхното ефективно взаимодействие с c-MpI (ТРО рецептора), и че в зависимост от това как са били усукани една с друга в контекста на рецептора, двете ТМР молекули могат да бъдат титрувани заедно с С- до N-кратна конфигурация по начин, който няма да наруши общата конфигурация на димера.

Ясно е, че активността на двойно свързаните димери може да зависи също и от подходящия избор на дължината и разположението на базата за свързване, която свързва С- и N-кратните краища на двата последователно свързани ТМР мономера.

Тъй като не разполагаме с никаква структурна информация за ТМР връзката към с-Мр1, бяха синтезирани серия от димерни пептиди с бази за свързване, състоящи се от 0 до 10 и 14 глицинни остатъци (Таблица 1).

Глицинът беше избран поради неговата простота и гъвкавост. От анализа беше установено, че гъвкавата полиглицинна пептидна верига може да осигури свободното нагъване на двете тотерни ТМР повторения в исканата конфигурация, като в същото време по-стерилно забавените аминокиселинни поредици могат да придобият нежелателни вторични структури, чиято твърдост може да разруши правилното подреждане във веригата на димерния пептид, в контекста на рецептора.

Така получените пептиди могат да се получат непосредствено чрез конвенционалните методи на пептиден синтез на твърда фаза (Мерифийлд, Ер.Би., Списание на Американското дружество по химия 85:2149 (1963 г.)) както с помощта на Fmoc, така и на t-Boc химия.

За разлика от синтеза на С-терминално свързани паралелни димера (SEQ ID No.: 2), които налагат използването на ортогонално защитен лизинен остатък като начална точка на разклонение за изграждането надве пептидни вериги по псевдосиметричния метод (Суирла С. Е. и д р., сп. Наука 276:1696-1699 (1997 г.)), синтезът на нашите комбинирани полимери е непосредствено, постъпково сглобяване на непрекъснатите пептидни вериги от С- и N-окончания. Тъй като димеризацията на ТМР оказва по-силен ефект върху активност за разклонение, отколкото афинитет на свързване, както е показано за димера с С-окончание (Суирла, С. Е. и др., сп. Наука276:1696-1699 (1997 г.)), синтетичните пептиди бяха тествани непосредствено за биологична активност в ТРО-зависима, заготовка от растящи клетки при използване на IL-З зависим клон от миши 32D клетки трансфектирани при пълна дължина на с-MpI (Палаций, Р. и др., Биоклетка 41:727 (1985 г.)).

66190 Bl

Както показват резултатите от тестването (вж. Табл. 1 тук по-долу), всички полиглицинно свързани комплексни димери показват > 1000кратно увеличение на потенцията при сравнение с мономера, и са дори с по-голяма потенция от димера със С-терминал в тази заготовка за растеж на клетки.

Абсолютната активност на димера с С-терминал в нашата заготовка е по-ниска от тази на родствения ТРО протеин, който е различен от преди установените открития, при които за димера с С-терминал беше установено, че е толкова активен, колкото и естествения лиганд (Суирла,

С. Е. и др., сп. Наука 276:1696-1699 (1997 г.)). Това може да се дължи на различията в условията, използвани при двете заготовки. Независимо от това, различието в активността между двойките димери (с окончания от първия мономер, свързан към N-терминала на втория мономер) и паралелните димери (окончание от първия мономер, свързано към С-терминала на втория мономер) в същата заготовка ясно показва превъзходството на двойния димеризиран продукт в сравнение с паралелните димерни продукти.

Интересно е да се отбележи, че широк обхват от дължината се толерира от базата на свързване. Оптималната база на свързване с така подбраните ТМР мономери (SEQ ID No.: 1) очевидно е съставена от 8 глицина.

Други двойки димери

Непосредствено след тази първа серия от IMP двойки димери се проектират няколко други молекули, които имат или различни линкери, или съдържат модификации на самия мономер.

Първата от тези молекули, пептид 13, притежава линкер, съставен от GPNG, представляваща поредица, за която е известно, че притежава голяма склонност към образуване на бетаспин по тип вторична структура. Макар, че е все още 100-кратно по-активен от мономера, за този пептид беше установено, че е >10 пъти по-слабо активен от GGGG свързания аналог.

По този начин въвеждането на сравнително здрав бета-спин в областта на линкера изглежда, че причинява леко изкривяване на оптималната конфигурация в тази форма с къс линкер.

Тгр9 в IMP поредицата представлява силно консервативен остатък сред активните пептиди, получени от случайните пептидни набори.

Съществува също и силно консервативен Тгр в еднородната поредица от ЕРО миметични пептиди, като за този Тгр остатък беше установено, че се използва при образуването на хидрофобна сърцевина между двата ЕРО миметични пептида (ЕМР), и допринася за хидрофобното взаимодействие с ЕРО рецептора (Ливна, О., и др., сп. Наука 273: 464-471 (1996 г.).

По аналогия се е считало, че Тгр9 остатъкът в ТМР може да има подобна функция при димеризацията на пептидния лиганд, и в опита да модулира и оцени ефекта от нековалентните хидрофобни сили, които упражняват двата приемни пръстена, като няколко аналога са били конструирани в резултат на мутации на Тгр.

По този начин при пептид 14, Тгр остатъка във всеки от двата ТМР мономера бе заместен с Cys, като беше формирана интрамолекулна дисулфидна връзка от оксидацията между двата цистина, за която се предвиждаше да имитира хидрофобните взаимодействия между двата Тгр остатъка при пептидната димеризация.

Пептид 15 представлява редуцираната форма на пептид 14. При пептид 16, двата Тгр остатъка са заменени от Ala. Както показват данните от заготовката, всичките три аналога остават дезактивирани. Тези данни по-нататък показват, че Тгр е важен за активността и на ТРО миметичния пептид, а не само за димерното образувание.

Всеки от следващите два пептида (пептид 17а, и 18) съдържа в себе си 8-аминокиселинна база на свързване, Lys или Cys остатък. Тези две съединения са предшественици на двата пегилирани пептида (пептид 19 и 20), при които страничната верига на Lys или Cys е модифицирана от полиетилен гликол (REG) група.

По средата на сравнително дългия линкер бе решено да се въведе PEG група, така че големият PEG компонент (5 kDa) е достатъчно по-далеч от важните места на свързване в пептидната молекула. PEG представлява известен, биосъвместим полимер, който все по-често се използва като ковалентен модификатор за подобряване нафармакокинетичните профайлове на основаната на пептиди и на протеини терапевтика.

Беше създаден модулен, основан на разтвора метод за улеснение на пегилацията на син

66190 Bl тетични или рекомбинантни пептиди. Методът се основава на днес добре разпространената стратегия на хемо-селективно свързване, което използва специфичната реакция между двойка от взаимно реактивни функции. И така, за пегилиран пептид 19, лизинната странична верига се активира предварително с бромацетилна група, за получаването на пептид 17Ь, който да установи реакция с производния на тиола PEG.

За да се извърши това, се използва ортогонална защитна група Dde за защита на лизин е-амина. След като веднъж цялата пептидна верига бъде сглобена, аминът с N-терминал се защитава повторно с t-Boc. След което се отстранява Dde, за да се даде възможност за бромацетилация. При така използваната стратегия се получава висококачествен суров пептид, който лесно се пречиства при използване на обратната фаза на традиционна HPLC.

Свързването на пептида с тиол-модифициран PEG се извършва във воден буфер при рН=8, като реакцията се извършва за около 30 min. MALDI-MS анализът на пречистения, пегилиран материал дава характеристика, със спектър тип “камбана”, с нарастване от 44 Da между отделните пикове.

За пептида PEG 20, цистиновият остатък се разполага в областта на базата за свързване, като тиоловата група на неговата странична верига служи като място за захващане за малемид-съдържащия PEG. Подобни условия бяха използвани и за пегилацията на този пептид. Както показват данните от заготовката, тези два пегилирани пептида притежават дори по-висока in vitro активност при сравнението им с непегилираните им контрагенти.

Пептид 21 притежава в своя 8-аминокиселинен линкер потенциален гликозиден компонент, NGS. Тъй като примерните двойки димери са съставени от естествени аминокисеТаблииа 1 лини, свързани с пептидни връзки, изразяването на тази молекула в подходяща еукариотно клетъчна система води до произвеждането на гликопептид с въглехидратна група, добавена към страничната верига от карбоксиамид на Asn.

Гликозилацията е често срещан процес на пост-транслационна модификация, който може да има много положителни въздействия върху биологичната активност на даден протеин посредством увеличаване на неговата разтворимост във вода, както и стабилност in vivo.

Както сочат данните от пробата, включването на този елемент на гликозилация в линкера води до поддържане на висока биоактивност. Синтетичният предшественик на потенциалния гликопептид проявява активност, която е сравнима с тази на -(О1у)₈-свързания аналог. След като веднъж бъде гликозилиран, за този пептид се очаква да има същия ред на активност както пегилираните пептиди, поради сходните химикофизични свойства, които има PEG във въглехидратната група.

Последният пептид представлява димер на димера. Той е приготвен чрез оксидация на пептид 18, който образува интермолекулна дисулфидна връзка между два цистинови остатъка, разположени върху линкера. Този пептид има предназначение да разгледа възможността на активността на ТМР като тетраметър. Данните от пробата сочат, че този пептид не е по-активен от средния двоен димер върху настроената моларна база, която непряко потвърждава идеята, че активната форма на ТМР в действителност представлява димер, защото в противен случай димеризацията на двойния димер би оказал по-нататъшно въздействие върху биоактивността.

Представената по-долу Таблица 1 обобщава релативните реакции на посочените по-горе съединения при сравнение с ЕС50 in vitro проба, както са описани по-горе.

Compound И)____________

СВСвй

ΊΡΟ/3)

ТМР monomer (SEQ ID NO: 1) (Ч) ТМР С-С dimer (SEQ ID NO: 2) ТМРЧОуХ-ТМР:

4.0

1.0

3.5

66190 Bl

1	п = 0	4.5
2	η- 1	4.0
3	п-2	4.0
4	п-3	4.0
5	п-4	4.0
6	η »5	4.0
7	п-б	4.0
8	п-7	4.0
9	п-8	4.5
10	п-9	4.0
11	η “10	4.0
12	п-14	4.0
13	TMP-GPNG-TMP (SEQ ED N0.10)	3.0
14	EBC^TLRQQLAARA.-GGGGGGGG-IEGPTLRQQLAARA	0.5

I_________________________________________________________________________________________________I (SEQIDNO.il)

EGPTLRQGLAARA-GGGGGGGG-EGPTLRQCLAARA (SEQ ID NO. 12)

EGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ ID NO. 13)

17a TMP-GGGKGGGG-TMP (SEQ ID NO. 14)

17b TMP-GGGK(BrAc)GGGG-TMP (SEQ ID NO. 15)

TMP-GGGCGGGG-TMP (SEQ ED NO. 16)

TMP-GGGK(PEG)GGGG-TMP (SEQ ED NO. 17)

TMP-GGGC(PEG)GGGG-TMP (SEQ ID NO. 18)

TMP-GGGNGSGG-TMP (SEQ ID NO. 19)

TMP-GGGCGGGG-TMP (SEQ ID NO. 20)

ITMP-GGGCGGGG-TMP

0.5

4.0 ND

4.0

5.0

4.0

В Табл.I - (l) е съединение, (2) е релатнвна сила, (3) е мономер и (4) е днмер.

Забележка: В таблица I цифрите указват приблизително 1 log на активността, така че разликата в активността между “1” и “4” е приблизително 1000 пъти. Увеличението с 0.5 представ- до лява междинна точка, така че разликата в активността между “1” и “3.5” е приблизително 500 пъти. “ND” означава неопределено.

II. По-долу са представени примерни методи за начина на приготвяне и структурата на дд някои от съединенията от втората група.

А. Приготвяне на свързващото вещество Fc от типа, показан на фиг. 6С

ДНК поредицата, кодирана за Fc областта на човешки IgGl, свързан в матрица с димер от

ТРО миметичен пептид (SEQ ID No.: 34) се поставя под контрола на luxPR промотъра на вектора за изразяване на плазмата pAMG21, както следва.

Генът на свързване е създаден при използване на стандартна PCR технология. Като схема за моделиране на PCR реакциите се използват векторът на свързване, съдържащ поредицата Fc, и синтетичен ген, кодиращ останалата част от съединението на поредицата SEQ ID No.: 34.

Синтетичният ген беше съставен от 4 припокриващи се олигонуклеотиди, показани тук по-долу:

66190 Bl

1830-52	AAA GGT GGA GGT GGT GGT ATC GAA GGT CCG ACT CTG CGT CAG TGG CTG GCT GCT CGT GCT (SEQ ID NO: 35)
1830-53	ACC TCC ACC ACC AGC ACG AGC AGC CAG CCA CTG ACG CAG AGT CGGACC (SEQ ID NO: 36)

1830-54	GGT GGT GGA GGT GGC GGC GGA GGT ATT GAG GGC CCA ACC CTTCGC CAA TGG CTT GCA GCA CGCGCA (SEQ ID NO: 37)
1830-55	AAA AAA AGG ATC CTC GAG ATT ATG CGC GTG CTG CAA GCC ATT GGC GAA GGG TTG GGC CCT CAA TAC CTC CGC CGC C (SEQ ID NO: 38)

Четирите олигонуклеотиди са закрепени, за да образуват двойната верига, посочена по-долу:

AAASGT6GR6GT6GTGGTATC<iAAGGTCCGACTCTGCGTCACTGGCTGGCT6CTCGTGCT 1“—+—-------+--------1---—ξφ ccag<xtgagrcgcacixaccgaiccgacgagcacga к G 6 G G G I EG FTLRQWLAA RA

GGTGGTGGAGGTGGCGGCGGACGTATTGAGGGCCaMCCCTrCGCCAATGGCTTGCAGCA

--------+_——--------------------₊ 120

CCACCACCTCCACCGCCGCCTCCATAKCTCCCGGGTTGGGAAGCGGnACCGAACGTCGT

G I Е G

CGCGCA

-------------------------—148

GCGCGTATTAGAGCTCCTAGGXAAAAAA R А ♦

Seq ID No.: 39 [колинеарни олигонуклеотиди 1830-52 и 1830-54]

Seq ID No.: 40 [колинеарни олигонуклеотиди 1830-53 и 1830-55] и Seq ID No.: 41 [кодирана поредица от аминокиселини]

PTLRQWLAA

Тази двойна верига се усилва в PCR реакцията при използване на 1830-52 и 1830-55 като сензорни и натисенсорни примери.

Fc частта от молекулата се генерира при PCR реакцията с Fc ДНК, при използване на праймерите:

1216-52 AAC ATAAGT ACCTGTAGGATCG. (SEQIDNO:42)

1830-51 TTCGATACCACCACCTCCACCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGC (SEQ ID NO: 43)

66190 Bl

Олигонуклеотидите 1830-51 и 1830-52 съдържат припокриване от 24 нуклеотида, което дава възможност на двата гена да бъдат свързани заедно в правилната схема на четене от комбинирането на горните PCR продукти при третата 5 реакция, използваща външните примери, 121652 и 1830-55.

Крайният PCR генетичен продукт (целият ген на свързване) се смила с рестриктивни ендонуклеази Xbal и BamHI, като след това се 10 свързва във вектора pAMG21 (вж. тук по-долу), който също се смила с Xbal и BamHI.

Свързаната ДНК се трансформира в компетентна клетка-домакин на Ешерихия Коли верига 2596 (GM221, описана тук по-долу).

Клоновете се сканират с оглед възможността за получаване на продукт от рекомбинантен протеин, и за задържане на сливането на гена с правилната нуклеотидна поредица.

Нивата за изразяване на протеина се определят от изследването на 50 ml разбит в колба тестов разтвор. Целите клетъчни лизати се анализират за изразяване на сливането чрез белязани по Кумаси PAGE гелове.

Аминокиселинната поредица от протеина на свързване е показана тук по-долу заедно със съответната нуклеотидна поредица:

Xbal тстлбАтттбттААстАМгтллмикиАМААСмжтсслслАлдстсАСАСАтстс aGATCTAAACAAAAITGATTAArTTCCTCCTTArTGTATACCTGTTTTGAGTGTGTACAG ИОКТНТСР со

120

CCAASGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA qffttC/CTGtGOGNStJ£YNiN!lGGCCYGGGGt£3CCN3TGXbCGCfi£CBC£&CCT(iCbCI

K DTbMXSRTFEVTCVVVDVS

4——---ь----------’—+ 240

CGGTGCTTCTGGGRCTCCAGTTCRAGTTGACCAtGCACCTGCCGCACCTCCACGTATTAC HEDPEVKFMWYVDGVEVHNA

241

CCAAfiRCARRCCCGCGGGRGGAGCRGTACARCAGOCGtACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA сеттететтгебсессе^стсетембттстсетсемссслсмскстс^лсаот

300

CCfSKCYGCMXNSl&CTOOCttM!KGCMGGNSt№MfftGCMBBtCttCfACMMS

301 __—_—_-4———+———-——+—————+—————-.—4———— + 360 оослвсмхя&ясскмзсхмятмхапсаскктсмхпссмзмспспк Vb.HQDWbMGKEYKCKVSKKA

CCCTCCCAtSCCCCCATCGMAARACCATCTCCARAGCCAMGGGCMiCCCCGAGAACCAC 3<1 ————+——————4—— ---♦————4—---——+— 420 gggrgggtcgggggxagctcttttggtagaggtttcggtttcccgtcggggctcttggtg lpapiektiskakgofr е FQ

AGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGXTGAGCTGACCAAGAACCAGCTCAGCCTGACCT

421 -------4------—4------+--4..-.....4 4g0

VYTLFPSRDELTKNQVS LTC GCCTGGTCAAAGGCTTCTAICCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGRGCAATGGGCAGC CGGRCCRGTTTCCGRRfiRZRGGGTCGCTGTAGCGGCACCTCACCCTCTCGTTACCCGTCG

LVKGFYPS DIAVEWE3 N G Q P

541

aCaCCabeCJCACeGMGRCAAfiAGCASGrGGCMCAGGGGAACGTCnCTCAIGCTCCG TCTCGTTCGRCTGGCACCTCHTCTCGTCCACCGTCGTCCCCTTGCAGNUiAGTACGAGGC SKITVDKSKWQQGNVFS CSV «00

601

66190 Bl

TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA

661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720

ACTACGTACTCCGAGACGTGTTGGTGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCAT MHEALHNHYTQKSLSI.S PGK

AAGGTGGAGGTGGTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCTG

721 ———+-———-+-———+-————+———+———.+ 7 jo

TTCCACCTCCACCACCAIAGCTTCCAGGCTGACACGCAjGTCACCGACCGACGAGCACGAC gggggiegptlrqwlaarag

781

GTGGTGGAGGTGGCGGCGGAGGTATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCAC —---:--1 —-----+---------4---------4---------+—-------+

GGGGGGGI E

PTLRQWLAAR

840

BatfHX I GCGCATAATCTCGAGGATCCG

841 861

CGCGTATTAfiAfiCTCCTAGGC A

Seq ID No.: 44 [отчет на единична нишка 5'-3' тук по-горе]

Seq ID No.: 45 [отчет на единична нишка 3'-5' тук по-горе], и

Seq ID No.: 46 [кодирана поредица от аминокиселини] [pAMG21]

Обособеният плазмид pAMG21 е достъпен от АТСС под номер за достъп 98113, който е депозиран на 24 юли, 1996 год. ^5

GM221 (Щам приемник на Амген, No. 2596)

Щамът приемник на Амген No. 2596 представлява щам от типа Е. coli К-12, който е бил модифициран да включва в себе си както термочувствителен ламбда репресор cI857s7 в ранната ebg област, така и lacl^Q репресор в късната ebg област (68 min).

Присъствието на тези два репресорни ге35 на дава възможност за използване на този приемник с широко разнообразие от системи на проявление, но и двата репресора обаче нямат отношение към израза от luxP_R. Нетрансформираният приемник няма антибиотична резистивност. Мястото за свързване на рибозома на cI857s7 гена бе модифицирано, за да включи разширено RBS. Същото беше включено в ebg операцията между позиции 1170 и 1411 на нуклеотида, съгласно индексацията в Генбанк, код за достъп M64441Gb-Ba, при изтриване на ^5 интервентната ebg поредица.

Структурата се доставя на хромозомата при използване на рекомбинантен фаг, наречен Mmebg-cI857s7, разширена RBS No. 4 в F’tet/

393. След рекомбинацията и обособяването в клетката остава само хромозомната вложка, посочена тук по-горе. Същата се преименува в F’tet/GMIOl.

След това F ’ tet/GM 101 се модифицира посредством доставянето на структурната единица lacl^Q в ebg нишата между нуклеотидни позиции 2493 и 2937, съгласно индексацията в Генбанк, код за достъп M64441Gb-Ba, при изтриване на интервентната ebg поредица.

Структурната единица се доставя на хромозомата при използване на рекомбинантен фаг, наречен Agebg-LaclQ No.5 в F’tet/GMIOl. След рекомбинацията и обособяването само хромозомната вложка, посочена тук по-горе, остава в клетката. Същата бе преименувана на F’tet/ GM221.

F’tet епизомата се кюртира от щама, при използване на акридин оранж с концентрация от 25 ug/ml в LB. За кюртирания щам бе установено, че е чувствителен към тетрацилин, и се съхранява във вид на GM221.

Съединителният елемент Fc, включен в плазмид pAMG21 (наричан тук по-долу като pAMG21-Fc-TMP-TMP), който на свой ред се съдържа в щама приемник GM221, беше утаен във вид на АТСС под код за достъп 98957, с дата на депозиране 22 окт., 1998 год.

Експресия (изразяване)

Култури от pAMG21 -Fc-TMP-TMP в Е. coli

GM221, в среда бульон на Лурия, съдържаща microg/ml канамицин бяха инкубирани при

37°С преди индукцията. Индукцията на генетичния израз на продукта Fc-TMP-TMP, изведен от

66190 Bl промотъра luxPR се получава чрез събиране на синтетичен автоиндуктор N-(3-oxohexanoyl)-DLхомосерен лактон в средата с културата, до получаване на окончателна концентрация от 20 ng/ ml, като по-нататък културите бяха инкубирани при 37°С в продължение на още 3 h.

След 3 h бактериалните култури се изследват с микроскоп за наличието на включени тела, като след това се събират чрез центрофугиране. При някои от индуцираните култури бяха наблюдавани рефрактивни включвания, които показват, че Fc-TMP-TMP най-вероятно е произведен във вид на неразтворима фракция от Е. coli. Клетъчните палети се лизират непосредствено в буфера за проба на Лемли, който съдържа 10% бета-меркаптоетанол, и се анализират от SDSPAGE.

Интензивна щамна фракция на Гу маси, от приблизително 30 kDa беше наблюдавана в SDSPAGE гела. Очакваният генен продукт ще бъде съставен от аминокиселини е дължина 269, като се очаква молекулното му тегло да бъде около 29.5 kDa.

Ферментацията бе проведена също при стандартни и общи за цялата група условия, при скала 10 L, като за нивата на Fc-TMP-TMP бяха получени подобни изрази на тези, които бяха получени при контролната скала.

Пречистване на Fc-TMP-TMP

Клетките бяха разкъсани във вода (1/10) под въздействие на хомогенизация под високо налягане (2 пасирания при 14,000 PSI), като включените тела бяха прибрани чрез центрофугиране (4200 RPM на J-6B в продължение на 1 h).

Включените тела бяха разтворени в 6 М гуанидин, 50 mM Tris, 8 mM DTT, pH 8.7 в продължение на 1 част, в съотношение 1/10. Сместа на разтвора бе разредена 20 пъти в 2 М урея, 50 mM Tris, 160 тМ аргинин, 3 тМ цистин, pH 8.5. Сместа беше разбъркана и оставена да престои в продължение на една нощ на студено.

При тази точка в процедурата на Fc-TMPTMP манометъра поделементите диверизираха до получаването на дисулфидно-свързано съединение, което има структурната формула, показана на фиг. 6С.

След това сместа бе подложена на концентрация чрез десетократна ултра-филтрация. След което препаратът бе разреден 3 пъти е помощта на 10 mM Tris, 1.5 М урея, pH 9.

След това pH на този разтвор бе докарана до нивото на pH 5 при използване на оцетна киселина. Утайката се отстранява с помощта на центрофугиране, и сепарираната проба се зарежда в SP-сефарозна колона за високоскоростен поток, настроена при 20 mM NaAc, 100 тМ NaCl, pH 5 (при работен протеин 10 mg/ml, при стайна температура).

Протеинът бе извлечен при използване на същия буфер и на градиент за колоната от 20 обема, като концентрацията на буферния разтвор варира от 100 mM NaCl до 500 mM NaCl.

След това съдържанието на колоната бе разредено 3 пъти, и заредено в SP-сефарозна HP колона, в разтвор от 20 mM NaAc, 150 тМ NaCl, pH (работен протеин 10 mg/ml, при стайна температура). Протеинът бе извлечен при използване на градиент от 20 колонни обема в същия буферен разтвор от 150 mM NaCl до 400 тМ NaCl. Горната част бе събрана и филтрирана.

III. По-долу е представено обобщение на данните при експериментиране in vitro е мишки на различни съставки от така синтезираните вериги

Мишки. Нормални, женски мишки, порода BDF1, на възраст приблизително 10-12 седмици.

Кръвна картина. На ден 0 бяха третирани по десет мишки от група, като четири дни покъсно започна третирането на две групи за изследване, при които се третираха по 20 мишки на група. Във всеки момент от програмата се вземаше кръв от пет мишки, като кръв от мишките се взема поне три пъти в седмицата. Мишките бяха анестезирани с изофлуран, при което беше получена обща кръвна проба от 140160 microl кръв посредством пункция на орбиталния синус. Кръвта беше изследвана в Н1Е кръвен анализатор Техникон, е използване на софтуер за миша кръв.

Измерваните параметри бяха бели кръвни телца, червени кръвни телца, хематокрити, хемоглобин, тромбоцити, нетрофил.

Третиране. Мишките бяха инжектирани или подкожно за болусно третиране, или с имплантирани в продължение на 7 дни микро-осмотични помпи, за непрекъснато вземане на проба.

Подкожните инжекции бяха доставени в ампули от по 0.2 ml. Осмотичните помпички се

66190 Bl вмъкваха в подкожен срез, направен в кожата между скапулите на анестезираните мишки.

Веществата бяха разредени в PBS с 0.1% BSA. Всички експерименти включваха една контролна група, обозначена като “носител”, която беше третирана само с този разреден препарат. Концентрацията на тестващите сонди в помпите беше така настроена, че калибрираният поток от помпите да осигурява нивата на третиране, посочени на графите.

Съединения. Титрувана доза от съединението беше дадена на мишките на 7-дневна микро-осмотична помпа. Мишките бяха третирани с различни съединения при единична доза от 100 ug/kg при 7-дневни осмотични помпи. Някои от същите съединения след това бяха дадени на мишките като единична болусна инжекция.

Тестови резултати от активността. Резултатите от експериментите с активността са показани на фиг. 4 и 5. В тези матрици на реакцията, използващи 7-дневни осмотични помпи (данните не са показани), максимален ефект се наблюдава при съединението SEQ ID No.: 18 при 100 microg/kg/ден; дозата 10 microg/kg/ден беше с около 50% по-активна, а 1 microg/kg/ден беше най-ниската доза, при която може да бъде наблюдавана активност в тази експериментална система.

Съединението при доза от 10 microg/kg/ ден беше почти толкова активно, колкото и пробите със 100 microg/kg/ден непегилиран rHuMGDF от същия експеримент.

IV. Анализ

Добре установено е, че MGDF действа по начин, който изключително много наподобява хормона на човешкия растеж (hGH), т.е. една молекула от протеинния лиганд се свързва с две молекули от рецептора за нейното активиране (Уелс, Джей. Ей. и др., Алманах по биохимия. 65:609-634 (1996)).

Това взаимодействие се имитира от действието на много по-малкия ТМР пептид. Съвременните изследвания, обаче предполагат, че тази мимикрия изисква съсредоточеното въздействие на две ТМР молекули, във вид на ковалентна димеризация на ТМР както при С-С паралелна, така и при С-N последователна поредица, с която in vitro е била увеличена биологичната сила на оригиналния мономер, с коефициент по-голям от 10³.

Сравнително ниската биопотентност на мономера най-вероятно се дължи на неефективното формиране на нековалентния мономер. Предварително формираният ковалентен димер има способността да елиминира ентропната бариера при образуването на нековалентен димер, който се задвижва изключително от слаби, нековалентни взаимодействия между две молекули на дребен пептид, с 14-кратен остатък.

Интересно е да се отбележи, че повечето от двойките димери са по-силни от паралелните димери с С-терминал. Двойната димеризация изглежда предоставя на молекулата по-добри възможности за съвместимост, отколкото паралелната С-С димеризация.

Очевидно несиметричната характеристика на двойния димер го приближава още повече до естествения лиганд, който в качеството му на несиметрична молекула, използва две различни места за свързване на двете идентични рецепторни молекули.

С въвеждането на PEG група се предвиждаше да се подобри in vivo активността на модифицирания пептид, посредством осигуряване на защита срещу протеолитна деградация и чрез снижаване долната точка на реакция чрез ренална филтрация. Не се очакваше като резултат пегилацията да може по-нататък да увеличи in vitro биоактивността на сдвоения димеризиран ТМР пептид в пробата за растеж на клетките.

V. По-долу е дадено обобщение на данните in vivo при опити с маймуни, с различни съставки от този генетичен синтез

С оглед оценяване на хематологичните параметри при женски маймуни, макак, във връзка с назначението на АМР2 чрез подкожно третиране, беше съставен следният протокол за изпълнение.

Бяха формирани за изследване групи от по три маймуни.

Група 1 беше използвана като контролна група, и на нея беше назначен ацетатен буферен разтвор (20 шМ натриев ацетат, 0.25 М натриев хлорид, pH 5), които не съдържат нито АМР2, нито пегллиран, рекомбинантен човешки MGDF (PEG-rHuMGDF).

Група 2 получи единична или по-голяма доза от АМР2 през интервали, както са посочени тук по-долу;

Група 3 получи АМР2 1000 microg/kg,

66190 Bl през интервали, както е посочено тук по-долу;

Група 4 получи 5000 microg/kg от АМР2 през интервали, както е посочено по-долу; и

Група 5 получи 100 microg/kg от PEGrHuMGDF на интервали, както е посочено тук по-долу.

Денят, през който беше назначена първата единична доза, беше означен като ден 0 от цикъл 1.

През цикъл 2 дозите бяха назначени на 21,

23, 25, 28, 30 и 32 ден.

По време на цикъл 3 беше назначена единична доза на 84 ден, а при цикъл 4 единична доза на 123 ден.

Животните бяха наблюдавани за клинични симптоми веднъж на ден по време на периода на приспособяване, по три пъти на ден (преди даване на дозата, в рамките на 30 min непосредствено след даване на дозата, и 2 до 3 h след дозата) през дните с даване на доза, и по веднъж на ден през дните без назначена доза.

Консумацията на храна беше изчислена на дневна база, с отчет на броя хранителни порции, които се дават, и броят на останалите за всяко животно 7 дни преди започване на периода на дозиране до края на периода на възстановяване.

Телесното тегло на всяко от животните беше мерено по два пъти преди режима на дозиране, и по два пъти по време на назначение на дозата и на периодите на възстановяване.

Кръвните проби за хематология бяха подготвяни по една преди започване на дозите, и по една през дните 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 22,

24, 26, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 55, 62, 69, 76, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 111, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 150.

За целите на фармакокинетичния анализ, бе взета серумна проба от 0.5 ml веднъж преди даване на дозата, и по веднъж 1, 4 и 24 h след дозата. Пробите бяха взети на 0,21,32,84 и 123 ден, и съхранявани приблизително при -70°С до времето за анализ.

Анализ на антитела, се взема кръвна проба от 2 ml една седмица преди даването на единичната доза, и веднъж на ден 0 (преди даване на дозата), 6, 13, 20, 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69, 76, 83, 90, 97, 104,111,118, 129, 136, 143 и 150.

Пробите се съхраняват при -70°С до времето на анализ.

Получените резултати сочат, че нивото на тромбоцитите се е увеличило при всички третирани групи, като най-голямо увеличение се има при PEG-rHuMGDF и групите с назначена висока доза от АМР2.

На цикъл 1, пиковата стойност за тромбоцитите се увеличава приблизително 3.3-пъти, и 3.1 пъти за PEG-rHuMGDF групата (ден 9), а също и 5000 microg/kg за АМР2 групата (ден 9), съответно, в сравнение със средната стойност на тромбоцитите в контролната група.

Ниските дози от АМР2 увеличават стойностите затромбоцитите приблизително 1.5 пъти, отколкото при контролната група на същите посочени дни от изследването. Подобни реакции се наблюдават и при всички от останалите цикли.

При цикъл 4, обаче, PEG-rHuMGDF групата не показва толкова голямо увеличение на тромбоцитите както при предишните цикли. Тромбоцитите при PEG-rHuMGDF групата са се увеличили приблизително 2 пъти в сравнение с тези от контролната група 9 дни след даване на дозата на този цикъл.

За сравнение, средният брой на тромбоцитите при групата с най-висока доза АМР2 от цикъл 4 е била 3.3-пъти по-висока от контролната група.

Освен това, при започването на цикъл 4 животните от PEG-rHuMGDF групата имат среден брой (на доза) тромбоцити с 53% по-нисък от средния брой тромбоцити за контролната група, като средният брой тромбоцити за групата в края на цикъл 4* (27 дневна доза) беше със 79% по-нисък от този на контролната група. При всички АМР2 животни средният брой тромбоцити в началото и в края на цикъл 4 беше с ± 15% отклонение от броя на тромбоцитите в контролната група.

При цикъл 1 и 2, за всички от третираните групи се наблюдава тенденция към намаляване на червените кръвни телца (RBC - Red Blood Cells) при сравнение с контролната група. Това намаление е най-видно за дни 41 до 43, като най-голямо намаление на RBC се забелязва при PEG-rHuMGDF групата. Отчетите започват да възвръщат нормалните си стойности (при сравнение с контролната група) още от 47 ден.

Нивото на белите кръвни телца (WBC White Blood Cells) по време на цикли 1 и 2 зна66190 Bl чително и рязко се увеличава (2,6 пъти) при сравнение с контролната група на 35 ден. Леко увеличение се наблюдава също и при групата с 5000 microg/kg АМР2 на 33 ден. Стойностите клонят към нормалните нива (при контролната група) към началото на 37 ден.

Подобна реакция беше наблюдавана и на цикъл 3, при който нямаше явно изменение на WBC на цикъл 4 при коя да е от третираните групи.

По време на цикъл 3, стойностите за RBC леко намаляха към 13 ден (след единичната доза за цикъл 3) при всяка от третираните групи, с изключение на групата с 500 microg/kg АМР2. Стойностите на RBC започват да възвръщат нормалните си нива (при сравнение с контролната група) към 17 ден.

При цикъл 4, стойностите за RBC намаляват за всички от третираните групи при сравнение с контролната, с изключение на групата с 500 microg/kg AMP. За разлика от другите цикли, при този цикъл има представен повече от един спад. Стойностите започват да спадат от ден 1 -9 след дозата и започват да се възстановяват от началото на 11 ден.

Резултатите сочат, че при всички случаи на третирани животни, при всички цикли на тестване беше установено увеличение на тромбоцитите по отношение на нивото от контролната група за периода от 7 до 9 дни след назначение на дозата. Очевидно е, че повтарянето на фазата на дозиране предизвиква по-силна реакция на производство на тромбоцити при сравнение с фазите с единична доза.

При цикъл 4 броят на тромбоцитите, произведени при PEG-rHuMGDF групата е по-нисък в сравнение с предишните цикли на тази група с назначена висока доза АМР2.

Намаление на RBC се наблюдаваше също и при цикли 1,2,3 и 4 за повечето от третираните групи, в една и съща точка по време на всеки от циклите на изследването, като след прекратяване на назначената доза, обаче всички хематологични параметри се връщат към нормални нива (при сравнение с контролната група).

Като цяло, резултатите сочат, че третирането с АМР2 се толерира добре при маймуните макак, и че поемането на АМР2 води до увеличен брой тромбоцити след различните цикли на третиране. Не беше установено, обаче на база резултатите от преброяването на тромбоцитите, да има някакви биологично значими имунно-свързани реакции в организма срещу АМР2.

За разлика от това, третирането при различните цикли с PEG-rHuMGDF показа инхибиране от тромбоцитната реакция при цикъл 4, което предполага произвеждането на антитела срещу PEG-rHuMGDF, като тези анти-MGDF антитела могат да реагират кръстосана с ТРО ендогените при макака.

Claims

1. Съединение, което се свързва към mpl рецептор, съдържащо структурата TMPl_(L₁)_n_TMP₂, където ТМР₃ и ТМР₂ са всяко независимо избрани от групата основни съединения, съдържащи структурата, избрана от групата, състояща се от:

а) Х₂_VX^X^X₇_WXu където

Х₄еРго;

X е избран от групата, състояща се от Leu, Пе, Val, Ala, Phe, Met и Lys;

б) Wo където

Х₃еА1а;

Х₄ е Pro;

66190 Bl

X₈ е избран от групата, състояща се от Gin, Asn и Glu;

Х₁₀ е избран от групата, състояща се от Leu, lie, Val, Ala, Phe, Met и Lys;

в) където

Х₄ е Pro;

Х₅ е Ser;

Х₁₀ е избран рт групата, състояща се от Leu, lie, Val, Ala, Phe, Met и Lys;

rJWAWAAAo където

Х₄еРго;

Х₆ е избран от групата, състояща се от lie, Val, Ala и Phe;

Х_]0 е избран от групата, състояща се от Leu, lie, Val, Ala, Phe, Met и Lys;

д) X.-M4-W-W_o където

Х₄еРго;

X₇eLys;

X е избран от групата, състояща се от Leu, lie, Val, Ala, Phe, Met и Lys;

е) WWX,-XJA където

Х₄ е Pro;

Х₆ е избран от фупата, състояща се от Leu, lie, Val, Ala и Phe;

X_g е избран от групата, състояща се от Gin и Asn;

ж) където

Х₄еРго;

Х₉ е избран от групата, състояща се от Tyr, Cys, Ala и Phe;

Х₁₀ е избран от групата, състояща се от Leu, lie, Val, Ala, Phe, Met и Lys; и

з)

66190 Bl където

Х₃ е избран от групата, състояща се от Gly и Ala; 5

Х₄ е Pro;

Х₆ е избран от групата, състояща се от Leu, lie, Val, Ala и Phe; 10

X_g е избран от групата, състояща се от Gin, Asn и Glu;

Х₁₀ е избран от групата, състояща се от Leu, Val, Ala, Phe, Met и Lys; и където Lj е линкер;

и η е 0 или 1;

и физиологично приемливи негови соли.

2. Съединение съгласно претенция 1, където споменатите ТМР] и ТМР₂ са независимо избрани от групата, състояща се от:

Х2_Хз_ Хд_ Х5_Хв_Х₇_Х«_ Хв_Хю_ Хи;

Ха_Хз_ Хд_ Χδ_Χβ_Χ₇_Χβ_ Х»_Хю_ Хн._№;

Хг_Хз_ Хд_ Χβ_Χβ_Χ₇_Χβ_ Χ«_Χιο_ Хц._Хй_Х|з;

Хя_Хз_ Хд_ Х5_Хв_Х₇_Х8_ Хв_Хю_ Х|1.__Хй_Х|з_Хи; Xl_.X2_.X3_ Х<_ Х5_Хб_Х₇_Хз_ Хв_Х|0;

Х1_Хг_Хз_ Хд_ Ха1Хв_Х₇_Х8_ Хв_Хю_Хи: ^1-^2_Хз_ Хд_ Χί_Χβχ.Χ₇_Χ8_ Ха_Хю_ Хи_Хй: ^1_Хг_Хз_ Хд_ Х5_Хб^Х₇_Хв_ Χβ_Χιο_ Хи_Хй_ Χΐ3ί и Χι_Χ2_Χ3_ Х<_ Χ5_Χβ_Χ₇_’Χ8_ Xa_Xio_ Χιΐ__Χΐ2_ Х<з Хи, където Х₂ - Xj₀ са както са формулирани и X] и Х_п-Х₁₄ са избрани от групата, състояща се от.

а) X] е избран от групата, състояща се от lie, Val, Leu, Ser и Arg;

X]] е избран от групата, състояща се от Ala, lie, Val, Leu, Ser, Thr, Lys, His и Glu;

X_]4 е избран от групата, състояща се от Ala, He, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu и Gly;

Хи е избран от групата, състояща се от Ala, He, Val, Leu, Phe, Thr, Lys, His и Glu;

X_]2 е избран от групата, състояща се от Ala, He, Val, Leu, Phe, Gly, Ser и Gin;

X₁₄ е избран от групата, състояща се от Ala, lie, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu и Gly; и

в) X] е избран от групата, състояща се от He, Val, Leu, Ser и Arg;

X_n е избран от групата, състояща се от Ala, lie, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His и Glu;

X₁₂ е избран от групата, състояща се от Ala, He, Val, Leu, Gly, Ser и Gin;

X₁₄ е избран от групата, състояща се от Ala, He, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu и Gly.

3. Съединение съгласно претенция 1, където споменатите ТМР] и/или ТМР₂ са превърнати, както е споменато в една или повече от следните:

- една или повече от пептидни [-C(O)NR] връзки са заменени с непептидни връзки, избрани от групата, състояща се от: -СН₂-карбамитна връзка [-CH₂-OC(O)NR-]; фосфонатна връзка; -СН₂-сулфонамидна [-CH₂_S(O)₂NR-] връзка;

66190 Bl карбамидна [-NHC(O)NH-] връзка; -СН₂_вторична аминна връзка; или алкилирана пептидна връзка [-C(O)NR⁶', където R⁶ е нисш алкал];

- N-краят е -NRR¹ група; към -NRC(O)R група; към -NRC(O)OR група; към -NRS(O)₂R група; към -NHC(O)NHR група, където R и Rj са водород и нисш алкил с предпоставката, че R и R¹ не са и двата водород; към сукцинимидна група; към бензилоксикарбонилна-Ь1Н-(СВ2-Ь1Н) група; или към бензилоксикарбонилна-NHгрупа, която има от 1 до 3 заместителя във фениловия пръстен, избрани от групата, състояща се от нисш алкил, слаби алкокси, хлорни и бромни групи;

- С-краят е -C(O)R², където R² е избран от групата, състояща се от слаби алкокси групи и NR³R⁴, където R³ и R⁴ са независимо избрани от групата, състояща се от водород и нисш алкил.

4. Съединение съгласно претенция 1, което е циклично.

5. Съединение съгласно претенция 1, където L] съдържа пептид.

6. Съединение съгласно претенция 5, където L] съдържа Yn, където Υ е аминокиселина, намираща се в природата или стереоизомер от нея и η е от 1 до 20.

7. Съединение съгласно претенция 5, където Ц съдържа (Gly)n, където η е от 1 до 20, и когато η е по-голямо от единица, до половината от остатъци от Gly могат да бъдат заместени от друга аминокиселина, избрана от останалите 19 природни аминокиселини или стереоизомери от тях.

8. Съединение съгласно претенция 5, където L] е избрана от групата, състояща се от:

¹ I ’ ‘ (Gly)₃Ly»(Gly)4 (SEQ ED NO: 6); (GtyhAsnGlySerfGlyh (SEQ ED NO: 7); (Gly)₃CysiGly), (SEQ ID: NO: 8); и GlyProAsnGly (SEQ ID NO: 9).

9. Съединение съгласно претенция 5, където L] съдържа Cys остатък.

10. Димер на съединение съгласно претенция 9.

11. Димер съгласно претенция 10, който е

12. Съединение съгласно претенция 1, където L] съдържа (СН₂)п, където η е от 1 до 20.

13. Съединение съгласно претенция 1, което е избрано от групата, състояща се от:

66190 Bl

TMPi_Gly₃_Cys-Gly4_TMP₂ ' ’ ‘ I

TMP^GIys-Cys- Gly₄_TMP₂.

lEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 10)

IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (циклична)

I ’^; ' ¹ , , I (SEQ. ID NO: 11)

IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (линейна) ’ · · ¹ , (SEQ. ID NO: 12) lEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA . (SEQ. ID NO: 13)

IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 14)

IEGPTLRQWLAARA-GGGK(BrAc)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 15)

I

IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 16) • , t

IEGPTLRQWLAARA-GGGK(PEG)GGGG4EGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 17)

IEGPTLRQWLAARA-GGGC(PEG)GGGGMEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 18)

IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 19) lEGPTLRQVVLAARA-GGGCGGGG-IEGPtLRQWLAARA

I

IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA ’’ ¹ и

IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA * I ‘ ' (SEQ. ID NO: 20);

(SEQ. ID NO: 21).

66190 Bl

14. Съединение съгласно претенция 1 или 2, което съдържа последователността на аминокиселина, посочена в SEQ ID NO: 46.

15. Съединение съгласно претенция 14, което е димер. 5

16. Използване на съединение съгласно претенция 1 или 14 при производството на медикамент за използване в метод за повишаване на мегакариоцитите или тромбоцитите на пациент при нужда, където методът включва приемане от па- 10 циента на ефективна доза от споменатото съединение.

17. Използване съгласно претенция 16, където споменатата доза е от 1 microg/kg до 100 mg/kg. 15

18. Фармацевтичен състав, съдържащ съединение съгласно претенция 1 или 14 в смес с фармацевтично приемлив негов носител.

19. Полинуклетид, който кодира съединение съгласно претенция 1 или 14.

20. Вектор, който включва полинуклетода съгласно претенция 19.

21. Клетка-гостоприемник, която включва вектора съгласно претенция 20.

22. Метод за получаване на съединение, включващ нарастване на клетката-гостоприемник съгласно претенция 21 в подходяща хранителна среда и изолиране на споменатото съединение от споменатата клетка или хранителна среда.