KR20170062490A

KR20170062490A - 안정화된 아드레노메둘린 유도체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20170062490A
Application number: KR1020177010819A
Authority: KR
Inventors: 도날드 비어러; 인고 플라메; 요하네스 쾨베를링; 베른트 라이들; 아네테 베크-지킹어; 리아 쇠나우어; 얀-패트릭 피셔
Original assignee: 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2015-09-24
Publication date: 2017-06-07
Also published as: NI201700036A; JP2018500272A; AP2017009826A0; CN107001440A; ECSP17018513A; US20180022780A1; PE20170702A1; ZA201702901B; DOP2017000085A; SG11201701803XA; AU2015323769A1; PH12017500563A1; CU20170038A7; TN2017000109A1; CR20170110A; EP3197481A1; WO2016046301A1; CA2962486A1; MX2017003897A; CO2017002813A2

Abstract

본 발명은 신규하며, 생물학적 활성이며, 안정화된 아드레노메둘린 (ADM) 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 질환, 특히 심혈관, 부종성 및/또는 염증성 장애의 치료 및/또는 예방 방법 및, 심혈관, 부종성 및/또는 염증성 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 화합물을 포함하는 의약에 관한 것이다.

Description

안정화된 아드레노메둘린 유도체 및 그의 용도{STABILIZED ADRENOMEDULLIN DERIVATIVES AND USE THEREOF}

본 발명은 신규하며, 생물학적 활성이며, 안정화된 아드레노메둘린 (ADM) 펩티드 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 분자내 디술피드 결합의 치환 및, 임의로 천연 또는 비천연 아미노산에 의한 아미노산의 대체, 펩티드 유도체의 중합체, Fc, FcRn 결합 리간드, 알부민 및 알부민-결합 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 모이어티로의 공유 연결 및, 적어도 하나의 아미드 결합의 N-메틸화로부터 선택된 하나 이상의 추가의 변형에 의하여 안정화된다. 본 발명은 추가로 질환, 특히 심혈관, 부종성 및/또는 염증성 장애의 치료 및/또는 예방 방법 및, 심혈관, 부종성 및/또는 염증성 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 화합물을 포함하는 의약에 관한 것이다.

52 아미노산 펩티드 호르몬 아드레노메둘린 (ADM)은 부신, 폐, 신장, 심근 및 기타 장기에서 생성된다. ADM의 혈장 농도는 피코몰 아래 범위로 존재한다. ADM은 펩티드의 칼시토닌 유전자-관련된 펩티드 (CGRP) 패밀리의 일원이며, 그리하여 CRLR 및 RAMP 2 또는 3 (칼시토닌-수용체-유사 수용체 및 수용체 활성 변형 단백질 2 또는 3)으로 이루어진 이종이량체 G-단백질 커플링된 수용체에 결합된다. ADM 수용체의 활성화는 수용체-보유 세포에서 아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트 (cAMP)의 세포내 증가를 초래한다. ADM 수용체는 내피 세포를 포함한 거의 모든 장기에서 상이한 세포 타입들에 존재한다. ADM은 중성 엔도펩티다제에 의하여 대사되며, ADM-수용체가 대부분 발현되는 폐에서 주로 제거되는 것으로 판단된다 [검토를 위하여 (Gibbons C, Dackor R, Dunworth W, Fritz-Six K, Caron KM, Mol Endocrinol 21(4), 783-796 (2007))를 참조한다].

문헌으로부터의 실험 데이터는 ADM이 무엇보다도 혈압 조절, 기관지확장, 신장 기능, 호르몬 분비, 세포 성장, 분화, 신경전달 및 면역 반응의 조정을 포함한 각종 기능적 역할에 관련되어 있다는 것을 시사한다. 게다가, ADM은 내피 세포의 증식 및 재생 중 자가분비 인자로서 중요한 역할을 한다 [검토를 위하여 (Garcia M.A., Martin-Santamaria S., de Pascual-Teresa B., Ramos A., Julian M., Martinez A., Expert Opin Ther Targets, 10(2), 303-317 (2006))를 참조한다].

ADM이 무손상 내피 장벽 기능에 대하여 필수적이며, 초-생리학적 농도로 ADM를 투여하면 동물 실험에서 패혈증, 급성 폐 손상 및 장의 염증을 비롯한 각종 염증성 병태에서 강력한 항-부종성 및 항-염증성 기능을 나타낸다는 것을 제시하는 문헌으로부터의 광범위한 증거 실체가 존재한다 [검토를 위하여 (Temmesfeld-Wollbrueck B, Hocke A., Suttorp N, Hippenstiel S, Thromb Haemost; 98, 944-951 (2007))을 참조한다].

지금까지 ADM의 임상 시험은 측정 가능한 혈류역학적 종점을 갖는 심혈관 적응증, 예컨대 폐동맥 고혈압, 고혈압, 심부전 및 급성 심근 경색증에서 수행되었다. ADM은 전술한 병태를 앓고 있는 환자에서의 수개의 시험에서 혈류역학적 효과를 나타냈다. 그러나, 그러한 효과는 단지 짧은 기간 지속하였으며, 투여의 종료후 즉시 중지되었다. 그러한 발견은 ADM의 공지된 약물동력학 프로파일과 상관관계가 크다. 약물력학 효과는 무엇보다도 전신 및 폐 동맥 혈압의 저하 및 심장 박출량의 증가를 포함한다 [Troughton RW, Lewis LK, Yandle TG, Richards AM, Nicholls MG, Hypertension, 36(4), 588-93 (2000); Nagaya N, Kangawa K, Peptides,. 25(11), 2013-8 (2004); Kataoka Y, Miyazaki S, Yasuda S, Nagaya N, Noguchi T, Yamada N, Morii I., Kawamura A, Doi K, Miyatake K, Tomoike H, Kangawa K, J Cardiovasc Pharmacol, 56(4), 413-9 (2010)].

요컨대, 동물에서의 풍부한 실험 데이터 및 인간에서의 1차 임상 시험으로부터의 증거에 기초하여 ADM의 초생리학적 레벨로의 증가는 인간 및 동물에서 각종 질환 병태의 치료를 위한 표적 기전으로서 간주될 수 있다. 그러나, 치료제로서의 ADM 사용에 대한 주요한 제한요인은 대부분의 잠재적 적응증에 대한 그의 사용을 배제시키는 연속 주입 요법의 불편한 적용능 및 ADM의 볼루스 투여로부터 발생할 수 있는 저혈압에 관련한 잠재적으로 제한된 안전성 한도이다.

본 발명의 목적은 질환, 특히 심혈관, 부종성 및 염증성 장애의 치료에 사용될 수 있는 신규하며, 생물학적 활성이며, 안정화된 ADM 펩티드 유도체를 제공하고자 한다.

다수의 치료적 활성 펩티드 또는 단백질은 생체내에서 높은 청소율을 겪는다. 디술피드 결합의 변형, 아미드 결합의 N-메틸화 및 이종 모이어티, 예컨대 중합체 및 단백질과의 접합을 포함한, 치료적 활성 펩티드 또는 단백질의 안정성을 증가시키며, 그의 청소율을 감소시키는 수개의 접근법이 존재한다.

디술피드 결합을 함유하는 펩티드 치료법은 그의 생체내 적용에서 문제가 될 수 있다. 디술피드 가교는 환원제 및 디술피드 이소머라제에 대하여 불안정하다. 디술피드 결합의 환원은 구조적 재배열 및 활성 손실을 초래한다. 단백질-디술피드 이소머라제 (PDI)는 세포질 세망의 효소이다. 단백질 폴딩 경로는 비-자연 디술피드 가교를 갖는 중간체를 함유한다. 필수 PDI 기능은 이들 중간체를 재배열시켜 최종 입체형태에 도달하도록 한다 [Laboissiere MC, Sturley SL, Raines RT, The essential function of protein-disulfide isomerase is to unscramble non-native disulfide bonds, J Biol Chem ., 270(47), 28006-28009, 1995]. 글루타티온 (GSH)은 소마토스타틴과 반응하여 혼합된 디술피드를 형성하며, 제2의 GSH 분자와의 추가의 반응은 소마토스타틴 및 GSSG의 환원된 디티올 형태를 초래한다. 티올/디술피드 교환은 쉽게 발생되지만, 형성된 혼합 디술피드는 분자내 디술피드 결합의 재형성을 겪는다 [Rabenstein DL, Weaver KH, Kinetics and equilibria of the thiol/disulfide exchange reactions of somatostatin with glutathione, J Org Chem., 61(21), 7391-7397, 1996]. 펩티드의 구조적 안정성에서의 디술피드 결합의 역할은 문헌 (Gehrmann J, Alewood PF, Craik DJ, Structure determination of the three disulfide bond isomers of α-conotoxin GI: a model for the role of disulfide bonds in structural stability, J Mol Biol ., 278(2), 401-415, 1998)에 기재되어 있다.

시스타티온은 티올 환원에 대하여 내성을 갖는다. 그러므로, 디술피드의 티오에테르로의 치환은 구조가 단지 최소한으로 동요되면서 환원에 대하여서는 보호를 제공하므로 신약 개발에서 중요하다. 보체 억제제 펩티드 콤프스타틴의 티오에테르 유사체가 합성되었다. 억제 잠재성은 대부분 유지되는 한편, 환원에 대한 안정성은 개선되었다 [Knerr PJ, Tzekou A, Ricklin D, Qu H, Chen H, van der Donk WA, Lambris JD, Synthesis and activity of thioether-containing analogues of the complement inhibitor compstatin, ACS Chem Biol ., 6(7), 753-760, 2011]. 디아미노이산에 기초한 펩티드 디술피드 결합 모방체는 예를 들면 문헌 (Cui HK, Guo Y, He Y, Wang FL, Chang HN, Wang YJ, Wu FM, Tian CL, Liu L, Diaminodiacid-based solid-phase synthesis of peptide disulfide bond mimics, Angew Chem, 125, 9737-9741, 2013)에 기재되어 있다. 티오에테르 및 비스카르바 디아미노이산은 타키플레신 I 유사체의 펩티드 디술피드 결합 모방체의 합성에 적용되었다. 유도체는 감소된 항균 활성을 나타내지만, 개선된 혈청 안정성을 나타냈다.

문헌 (Kowalczyk R, Harris PW, Brimble MA, Callon KE, Watson M, Cornish J, Synthesis and evaluation of disulfide bond mimetics of amylin-(1-8) as agents to treat osteoporosis, Bioorg Med Chem., 20(8), 2661-2668, 2012)는 옥타펩티드 아밀린에 관한 것이다. 천연 펩티드 (1-8)는 6 개월 동안 단지 -80℃에서 아르곤 대기 하에서 안정하다. 디술피드 가교가 상이한 성질의 링커 또는 가교의 삽입에 의하여 변형된 펩티드의 유사체가 합성되었다. 모든 유사체는 벤치 안정성을 지녀서 개선된 안정성을 나타냈다. 문헌 (Muttenthaler M, Andersson A, de Araujo AD, Dekan Z, Lewis RJ, Alewood PF, Modulating oxytocin activity and plasma stability by disulfide bond engineering, J Med Chem ., 53(24), 8585-8596, 2010)에는 시스테인-함유 펩티드의 대사 반감기를 개선시키기 위하여 디술피드 결합 대체 (티오에테르, 셀레노술피드, 디셀레니드 및 디텔루리드 가교)를 사용한 옥시토신 유사체의 합성에 관한 것이다. 옥시토신에 비하여, 일부 유사체는 친화성 및 기능적 효능을 보유하였고, 모든 모방체는 혈장 안정성에서의 증가 (1.5-3 배)를 나타냈다. 문헌 (Pakkala M, Weisell J, Hekim C, Vepsaelaeinen J, Wallen EA, Stenman UH, Koistinen H, Naervaenen A, Mimetics of the disulfide bridge between the N- and C-terminal cysteines of the KLK3-stimulating peptide B-2, Amino Acids., 39(1), 233-242, 2010)는 칼리크레인-관련된 펩티다제 3 (KLK3)에 관한 것이다. 칼리크레인-관련된 펩티다제 3 (KLK3)의 단백분해 활성은 합성 시클릭, 디술피드-가교된 펩티드 B-2에 의하여 촉진된다. γ-부티르산 및 아스파르트산 사이의 락탐 가교로 디술피드의 대체를 실시하였다. 생성된 펩티드는 혈장에서 및 KLK3에 의한 분해에 대한 개선된 안정성뿐 아니라, 고 농도에서 B-2보다 더 높은 활성을 가졌다. 문헌 (Watkins HA, Rathbone DL, Barwell J, Hay DL, Poyner DR, Structure-activity relationships for α-calcitonin gene-related peptide, Br J Pharmacol., 170(7), 1308-1322, 2013)은 아드레노메둘린의 가장 근접한 유사체인 α-칼시토닌 유전자-관련된 펩티드 (CGRP)로 수행한 SAR 시험을 요약한다. 문헌 (Dennis T, Fournier A, St Pierre S, Quirion R, Structure-activity profile of calcitonin gene-related peptide in peripheral and brain tissues)에 최초로 기재되어 있는 치환체 (시클로 [Asp², Lys⁷]-CGRP)로서 락탐을 갖는 디술피드 모방체가 언급되어 있다. 수용체 다중성에 대한 증거. (J Pharmacol Exp Ther., 251(2), 718-725, 1989). 이러한 펩티드는 래트 비장 막에서 수용체에 대한 친화성에서의 50% 감소를 나타냈다. 기니 피그 심방에서의 생물학적 활성의 측정은 효능제 기능의 손실을 나타낸다.

추가로, 거대분자의 사용을 수반하는 상기 의약의 주사 가능한 데포를 형성하는 수개의 접근법이 존재한다.

비공유 결합된 상태로 약물 분자를 함유하는 중합체 매트릭스가 공지되어 있다. 이들은 또한 하이드로 겔, 미세입자 또는 미셀로서 주사 가능하다. 그러한 약물 생성물의 방출 동역학은 높은 환자간 변동성으로 비신뢰성이 클 수 있다. 그러한 중합체의 생성은 민감성 약물 물질에 해로울 수 있거나 또는 그의 분해 중에 중합체와의 부반응을 겪을 수 있다 [D.H. Lee et al., J. Contr . Rel ., 92, 291-299, 2003].

용해도의 향상, 면역원성의 감소 및 신장 청소율의 감소에 의한 반감기의 증가를 위한 펩티드 또는 단백질의 영구 PEG화는 초기 1980년대 이후로 널리 공지된 개념이다 [Caliceti P.,Veronese F.M., Adv . Drug Deliv . Rev., 55, 1261-1277, 2003]. 수개의 약물의 경우, 이는 성공적으로 사용되어 왔으나, 다수의 예에서는 그러한 개념이 더 이상 적절하지 않은 정도로 PEG화가 약물 물질의 효능을 감소시킨다 [T. Peleg-Shulman et al., J. Med. Chem., 47, 4897-4904, 2004].

적절한 대안은 중합체 기반 전구약물이다. IUPAC에 의한 전구약물에 대한 통상의 정의는 하기 용어를 명시한다 [International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry: GLOSSARY OF TERMS USED IN MEDICINAL CHEMISTRY (Recommendations 1998); in Pure & Appl. Chem. Vol 70, No. 5, p. 1129-1143, 1998]:

전구약물: 전구약물은 그의 약리적 효능을 나타내기 전 생체내변환을 겪는 임의의 화합물이다. 그래서, 전구약물은 모 분자에서 바람직하지 않은 성질을 변형 또는 배제시키는 일시적인 방식으로 사용된 특수 비독성 보호기를 함유하는 약물로서 판단될 수 있다.

담체-연결된 전구약물 (담체 전구물질): 담체-연결된 전구약물은 개선된 물리화학적 또는 약물동력학적 성질을 생성하는 일시적 담체 기와 주어진 활성 물질의 일시적 결합을 함유하며, 일반적으로 가수분해성 절단에 의하여 생체내에서 쉽게 제거될 수 있는 전구약물이다.

캐스케이드 전구약물: 캐스케이드 전구약물은 담체 기의 절단이 활성화기를 노출시킨 후에만 유효하게 되는 전구약물이다.

PEG계 담체 전구약물의 수개의 예는 그의 대부분이 활성 약물 및 담체 사이의 링커의 효소 활성화에 대한 필요성으로 존재하며, 대부분 효소 가수분해에 의하여 개시된다. 에스테르는 매우 쉽게 및 생체내 예측 불가하게 절단되므로, 담체 전구약물에 대한 직접 에스테르 링커는 그의 유용성으로의 한계를 갖는다 [J. Rautio et al., Nature Reviews Drug discovery, 7, 255-270, 2008].

통상적으로 사용된 대안의 접근법은 펩티드 또는 단백질의 아민 작용기에 결합된 링커를 캐스케이딩하는 것이다. 링커의 캐스케이딩에서, 차폐기는 캐스케이드에서 속도 제한 단계로서 제거되어야 한다. 이는 링커를 활성화시켜 제2의 위치에서 분해되어 펩티드 또는 단백질을 방출한다. 통상적으로 차폐기는 효소 기전에 의하여 제거될 수 있다 [R.B.Greenwald et al., WO 2002/089789, Greenwald, et al., J. Med . Chem . 1999, 42, 3657-3667, F.M.H. DeGroot et al., WO 2002/083180 and WO 2004/043493, and D. Shabat et al., WO 2004/019993].

효소 활성화에 의존하지 않는 대안은 U. Hersel et al., WO 2005/099768의 개념이다. 그의 접근법에서, 페놀 상의 차폐기는 내부 친핵체의 공격에 의하여 순수하게 pH 의존성 방식으로 제거된다. 이는 추가의 분해를 위하여 링커를 활성화시킨다.

U. Hersel et al., WO 2005/099768에 의하여 언급된 바와 같이, "Greenwald, DeGroot 및 Shabat에 의하여 기재된 전술한 전구약물계에서의 단점은 일시적 연결의 절단 후 퀴논 메티드와 같은 잠재적 독성 방향족 소분자 부생성물의 방출이다. 잠재적 독성 실체는 약물과의 1:1 화학량론으로 방출되며, 높은 생체내 농도를 추정할 수 있다". 동일한 문제가 Hersel et al.에 의하여 상기 계에 대하여서도 마찬가지로 적용된다.

작은 유기 분자의 경우, 다수의 상이한 전구약물 접근법이 존재한다 [J. Rautio et al., Nature Reviews Drug discovery, 7, 255-270, 2008]. 그의 차폐기에 대한 방출 기전으로서 U. Hersel et al.에 의하여 사용된 접근법은 1980년대 후반부 이래로 소 분자의 페놀성 기에 대한 전구약물 접근법으로서 사용되어 왔다 [W.S. Saari in EP 0 296 811 and W.S. Saari et al., J. Med . Chem ., Vol 33, No 1, p 97-101, 1990].

대안의 아민계 전구약물계는 캐스케이딩 전구약물로서 비스-히드록시에틸 글리신의 느린 가수분해에 기초한다. 비스-히드록시에틸 글리신의 히드록시 기는 에스테라제에 의하여 가수분해되기 쉬운 에스테르에 의하여 차폐된다 [R. Greenwald et al., J. Med . Chem., 47, 726-734, 2004, and D. Vetter et al., WO 2006/136586].

그래서, 링커의 순수하게 pH 의존성인 절단은 생체계에서 변동될 수 있는 효소 농도에 의존하지 않으므로 링커의 신뢰성이 큰 효소 절단이 된다.

pH 의존성으로 절단되는 링커에 대한 한 개념은 Santi et al., US 8,680,315에 의하여 기재된 바와 같은 조절 가능한 분해 속도를 갖는 베타 제거에 기초한 전구약물이다. 거대분자를 펩티드 및 소 분자에 가역적으로 결합시키는 기재된 링커 기술은 방출된 약물 중의 수개의 작용기에 적용 가능하다. 아민, 알콜, 카르복실산 및 티올은 어댑터계를 경유하여 베타 제거 모이어티에 결합 가능하다. pH 분해 유발시 CO₂ 및, 거대분자에 부착된 불포화 분절이 방출되어 약물이 방출된다.

펩티드에서 페놀, 이른바 티로신에 대하여 최적화된 또 다른 접근법은 Flamme I. et al., WO 2013/064455에 의하여 기재된 바와 같이 페놀의 방출 및 거대분자에 결합된 시클릭 우레아의 생성 하에서 친핵성 아민에 의하여 pH 의존하여 공격되는 카르바메이트에 기초한다.

펩티드의 약물동력학 성질의 조절에 대하여 확립된 추가의 이종 모이어티는 선형 또는 분지형 C₃-C₁₀₀ 카르복실산 (지질화), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 모이어티, 폴리프로필렌글리콜 (PPG) 모이어티, PAS 모이어티 (주로 알라닌 및 세린 잔기를 포함하거나 또는 주로 알라닌, 세린 및 프롤린 잔기를 포함하는 아미노산 서열이며, 아미노산 서열은 생리학적 조건 하에서 랜덤 코일 입체형태를 형성함 [US No. 2010/0292130 및 WO 2008/155134]), 및 히드록시에틸스타치 (HES) 모이어티 [WO 02/080979]를 비롯한 중합체, Fc, FcRn 결합 리간드, 알부민 및 알부민-결합 리간드를 포함한다.

지질화에 의한 펩티드의 약물동력학 성질의 조절은 잘 개발된 방법이다. 지질화는 펩티드 서열에서 N-말단에 또는 아미노산의 측쇄 작용기에 발생될 수 있다. 지질화는 하기 보고에서 예시되는 바와 같이 다수의 공보 및 특허에 기재되어 있다: (Zhang L, Bulaj G, Converting peptides into drug leads by lipidation, Curr Med Chem.;19(11):1602-18, 2012, or M. Gerauer, S. Koch, H. Waldmann, L. Brunsveld, Lipidated peptide synthesis: Wiley Encyclopedia of Chemical Biology, Volume 2, 520-530, 2009, (Hrsg. Begley, T. P.). John Wiley & Sons, Hoboken, NJ). 말단절단된 ADM 분절의 지질화는 WO 2012/138867에 기재되어 있다.

영상화 및 또한 치료제로서 사용하기 위한 표지된 아드레노메둘린 유도체는 공지되어 있다 [J. Depuis et al., CA 2567478 and WO 2008/138141]. 이들 ADM 유도체에서 방사성 동위원소를 결합시킬 수 있는 분자 구조와 같은 착체형성 케이지는 직접적인 방식으로 또는 짧은 PEG 스페이서를 또한 잠재적으로 포함하는 스페이서 단위를 경유하여 ADM의 N 말단에 부착되었다. 이들 약물의 진단적 또는 치료적 중요성은 방사성 분자의 표적화된 전달로부터 기인한다.

모두 아민 작용기를 차폐시키는 것에 기초한 상기 제시된 전구약물 접근법과는 대조적으로, WO 2013/064508에 기재된 또 다른 접근법은 ADM에서 티로신의 페놀성 기의 차폐에 기초한다. 담체-연결된 전구약물은 그러한 페놀성 기에서 카르바메이트의 내부 친핵성 보조된 절단에 기초하여 사용된다. 전술한 기타 전구약물 유형에 대한 핵심 잇점은 담체에 영구적으로 부착된 시클릭 우레아인 링커 분해 산물의 독성학적 무해성이다. 게다가, 전구약물의 분해는 절단 동역학의 높은 환자간 변동성을 야기할 수 있는 효소 기전에 의존하지는 않는다. 절단 기전은 산성 pH에서 양성자화되는 내부 아민이 더 높은 (중성) pH에서 활성화되어 티로신에 기초한 페놀성 카르바메이트를 공격하는 친핵체로서 작용하므로 오로지 pH 의존성이 된다.

본 발명의 문맥에서, 안정화된, 생물학적 활성인 ADM 펩티드 유도체의 디술피드 가교를 교체하는 ADM 펩티드 유도체를 기재한다. 임의로, 이들 변형된 ADM 펩티드 유도체는 중합체, Fc, FcRn 결합 리간드, 알부민 및 알부민-결합 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 모이어티에 펩티드 유도체를 공유 연결시키거나 또는 N-메틸화에 의하여 추가로 변형되었다. 펩티드 유도체에 공유 연결된 중합체는 임의로 치환된, 포화되거나 또는 모노- 또는 디-불포화된, 선형 또는 분지형 C₃-C₁₀₀ 카르복실산, 바람직하게는 C₄-C₃₀ 카르복실산, PEG 모이어티, PPG 모이어티, PAS 모이어티 및 HES 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다. 유사체는 활성 및 안정성에 의하여 조사되었다. wt ADM에 비하여 ADM 유도체의 활성이 보유되는 것으로 나타났다. 추가로, 안정화된 ADM 펩티드 유도체는 혈청 및 간 균질화물 중의 안정성 검정에 의하여 나타날 수 있는 바와 같이, 혈액 및 간에서의 증가된 반감기를 나타낸다. 안정화된 ADM 펩티드는 ADM에 비하여 및 그러한 특정한 작용 메카니즘에 기초하여 약리적 작용의 연장된 기간을 나타내며 - 비경구 투여 후 - 생체내 지속 항염증성 및 혈류역학적 효과, 예컨대 내피 장벽 기능의 안정화 및 혈압의 감소 각각을 나타낸다.

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물을 제공한다:

<화학식 I>

(상기 식에서,

X¹은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:

^*-(CH₂)_m1-S-^# (여기서 m1은 0-6임);

^#-(CH₂)_m2-S-^* (여기서 m2는 0-6임);

^*-(CH₂)_m3-^# (여기서 m3은 1-8임);

^*-(CH₂)_m4-(CH₂=CH₂)-(CH₂)_n1-^# (여기서 m4는 0-6이며, n1은 0-6이되, 단 m4+n1=0-6임);

^*-(CH₂)_m5-(CH≡CH)-(CH₂)_n2-^# (여기서 m5는 0-6이며, n2는 0-6이되, 단 m5+n2=0-6임);

^*-(CH₂)_m6-CO-NH-(CH₂)_n3-^# (여기서 m6은 0-4이며, n3은 0-4이되, 단 m6+n3=0-6임);

^#-(CH₂)_m7-CO-NH-(CH₂)_n4-^* (여기서 m7은 0-4이며, n4는 0-4이되, 단 m7+n4=0-6임);

^*-SO-(CH₂)_m8-^# (여기서 m8은 0-6임);

^#-SO-(CH₂)_m9-^* (여기서 m9는 0-6임);

^*-SO₂-(CH₂)_m10-^# (여기서 m10은 0-6임);

^#-SO₂-(CH₂)_m11-^* (여기서 m11은 0-6임);

^*-5-6 원 헤테로아릴-^#;

^*-O-(CH₂)_m12-^# (여기서 m12는 0-6임);

^#-O-(CH₂)_m13-^* (여기서 m13은 0-6임);

^*-CH₂-S-(CH₂)_m14-^# (여기서 m14는 0-6임);

^#-CH₂-S-(CH₂)_m15-^* (여기서 m15는 0-6임);

^*-CH₂-O-(CH₂)_m16-^# (여기서 m16은 0-6임);

^#-CH₂-O-(CH₂)_m17-^* (여기서 m17은 0-6임);

^*-(CH₂)_m18-NH-CO-CH₂-NH-CO-(CH₂)_n5-^# (여기서 m18은 0-3이며, n5는 0 또는 1이되, 단 m18+n5=0-3임);

^#-(CH₂)_m19-NH-CO-CH₂-NH-CO-(CH₂)_n6-^* (여기서 m19는 0-3이며, n6은 0 또는 1이되, 단 m19+n6=0-3임);

^*-(CH₂)_m20-NH-CO-CH(CH₃)-NH-CO-(CH₂)_n7-^# (여기서 m20은 0-3이며, n7은 0 또는 1이되, 단 m20+n7=0-3임);

^#-(CH₂)_m21-NH-CO-CH(CH₃)-NH-CO-(CH₂)_n8-^* (여기서 m21은 0-3이며, n8은 0 또는 1이되, 단 m21+n8=0-3임);

^*-(CH₂)_m22-NH-CO-CH(CH₂-C(CH₃)₂)-NH-CO-(CH₂)_n9-^# (여기서 m22는 0-3이며, n9는 0 또는 1이되, 단 m22+n9=0-3임);

^#-(CH₂)_m23-NH-CO-CH(CH₂-C(CH₃)₂)-NH-CO-(CH₂)_n10-^* (여기서 m23은 0-3이며, n10은 0 또는 1이되, 단 m23+n10=0-3임);

^*-(CH₂)_m24-NH-CO-CH(CH(CH₃)C₂H₅)-NH-CO-(CH₂)_n11-^# (여기서 m24는 0-3이며, n11은 0 또는 1이되, 단 m24+n11=0-3임);

^#-(CH₂)_m25-NH-CO-CH(CH(CH₃)C₂H₅)-NH-CO-(CH₂)_n12-^* (여기서 m25는 0-3이며, n12는 0 또는 1이되, 단 m25+n12=0-3임);

^*-(CH₂)_m26-NH-CO-CH(CH₂(C₆H₅))-NH-CO-(CH₂)_n13-^# (여기서 m26은 0-3이며, n13은 0 또는 1이되, 단 m26+n13=0-3임);

^#-(CH₂)_m27-NH-CO-CH(CH₂(C₆H₅))-NH-CO-(CH₂)_n14-^* (여기서 m27은 0-3이며, n14는 0 또는 1이되, 단 m27+n14=0-3임);

^*-(CH₂)_m28-NH-CO-(CH₂)₃-NH-CO-(CH₂)_n15-^# (여기서 m28은 0 또는 1이며, n15는 0 또는 1이되, 단 m28+n15=0-1이며;

^#-(CH₂)_m29-NH-CO-(CH₂)₃-NH-CO-(CH₂)_n16-^* (여기서 m29는 0 또는 1이며, n16은 0 또는 1이되, 단 m29+n16=0-1임);

^*-(CH₂)_m30-NH-CO-NH-(CH₂)_n17-^# (여기서 m30은 0-5이며, n17은 0-5이되, 단 m30+n17=0-5임);

^#-(CH₂)_m31-NH-CO-NH-(CH₂)_n18-^* (여기서 m31은 0-5이며, n18은 0-5이되, 단 m31+n18=0-5임);

^*-(CH₂)_m32-O-CO-NH-(CH₂)_n19-^# (여기서 m32는 0-5이며, n19는 0-5이되, 단 m32+n19=0-5임);

^#-(CH₂)_m33-O-CO-NH-(CH₂)_n20-^* (여기서 m33은 0-5이며, n20은 0-5이되, 단 m33+n20=0-5임);

^*-(CH₂)_m34-O-CO-O-(CH₂)_n21-^# (여기서 m34는 0-5이며, n21은 0-5이되, 단 m34+n21=0-5임);

^*-(CH₂)_m35-NH-CO-(CH₂)_n22-NH-(CH₂)_p1- (여기서 m35는 0-4이며, n22는 0-4이며, p1은 0-4이되, 단 m35+n22+p1=0-4임); 및

^*-(CH₂)_m36-NH-CO-(CH=CH)-CO-NH-(CH₂)_n23-^# (여기서 m36은 0-2이며, n23은 0-2이되, 단 m36+n23=0-2임);

여기서 ^* 및 ^#은 X¹이 고리 구조 내에 결합된 위치를 반영하고;

X²는 존재하지 않거나, 수소이거나 또는, 화학식 I의 아미노산 서열의 N-말단 G¹⁵에 아미드 결합에 의하여 공유 연결된, G¹⁴, K¹⁴, F¹⁴, 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 [Y¹RQSMNNFQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 2 [R²QSMNNFQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 3 [Q³SMNNFQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 4 [S⁴MNNFQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 5 [M⁵NNFQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 6 [N⁶NFQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 7 [N⁷FQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 8 [F⁸QGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 9 [Q⁹GLRSF¹⁴], 서열식별번호: 10 [G¹⁰LRSF¹⁴], 서열식별번호: 11 [L¹¹RSF¹⁴], 서열식별번호: 12 [R¹²SF¹⁴] 및 서열식별번호: 13 [S¹³F¹⁴]로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 아미노산이며, 여기서 X²의 임의의 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산에 의하여 임의로 대체될 수 있으며;

여기서 A는 L-알라닌이며; R은 L-아르기닌이며; N은 L-아스파라긴이며; D는 L-아스파르트산이며; Q는 L-글루타민이며; G는 L-글리신이며; H는 L-히스티딘이며; I는 L-이소류신이며; L은 L-류신이며; K는 L-리신이며; M은 L-메티오닌이며; F는 L-페닐알라닌이며; P는 L-프롤린이며; S는 L-세린이며; T는 L-트레오닌이며; Y는 L-티로신이며; V는 L-발린이며;

여기서 화학식 I에서 및 X²의 정의에서의 아미노산의 넘버링은 대응 인간 ADM 서열을 지칭하고;

X³은 존재하지 않거나 또는, X²의 임의의 아미노산의 N-말단에 또는 측쇄의 작용기에, G¹⁵의 N-말단에, 또는 Z에 공유 연결된 이종 모이어티이고;

Z는 존재하지 않거나 또는, X²의 임의의 아미노산 또는 G¹⁵의 N-말단과 X³ 사이에 또는, X²의 임의의 아미노산의 측쇄의 작용기와 X³ 사이에 공유 결합된 절단 가능한 링커이며;

여기서 X³이 존재하지 않을 경우, Z는 또한 존재하지 않으며, X²는 수소이거나 또는 상기 정의된 바와 같은 아미노산 또는 아미노산 서열이며;

여기서 X³이 이종 모이어티인 경우, X²는 존재하지 않거나 또는, 상기 정의된 바와 같은 아미노산 또는 아미노산 서열이며; Z는 존재하지 않거나 또는, X²의 임의의 아미노산 또는 G¹⁵의 N-말단과 X³ 사이에 또는, X²의 임의의 아미노산의 측쇄의 작용기와 X³ 사이에 공유 결합된 절단 가능한 링커이다.

디술피드 결합의 락탐 가교로의 치환뿐 아니라, N-메틸화의 도입 및 팔미토일화는 생물학적 활성을 보유하면서 펩티드의 대사 안정성을 증가시킬 수 있다는 보고가 있다. 그러나, 예를 들면 문헌 (Watkins HA, Rathbone DL, Barwell J, Hay DL, Poyner DR, Structure-activity relationships for α-calcitonin gene-related peptide, Br J Pharmacol. 2013, 170(7), 1308-1322 and Dennis T, Fournier A, St Pierre S, Quirion R, Structure-activity profile of calcitonin gene-related peptide in peripheral and brain tissues. Evidence for receptor multiplicity. J.Pharmacol Exp Ther. 1989, 251(2), 718-725)에 의하여 보고된 바와 같이, 펩티드의 칼시토닌의 상과의 성분에서 디술피드 가교의 대체는 보유된 활성과 상관관계를 갖지 않는다. 또한, 펩티드 구조의 단일 변화가 기재되어 있으나, 예를 들면 디술피드 결합 모방체의 조합, N-메틸화 및/또는 팔미토일화의 조합은 구조-활성 관계에 관하여 예측 가능하지 않다.

ADM 및, 칼시토닌 관련 펩티드의 다른 성분은 디술피드 가교의 절단에 의해 급속 불활성화하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기 디술피드 가교의 활성 보유 및 동시에 반감기 연장 치환은 -분자내 고리의 크기의 변형으로조차도- 관련 기술분야에 알려져 있지 않으며, 예상하지 못한 것이다.

본 발명에 의한 화합물은 화학식 I의 화합물 및 그의 염, 그의 용매화물 및 그의 염의 용매화물, 화학식 I에 의하여 포함되며 하기 명시된 화학식의 화합물, 그의 염, 그의 용매화물 및 그의 염의 용매화물, 화학식 I에 의하여 포함되며 작업 실시예로서 하기 명시된 화합물 및 그의 염, 그의 용매화물 및 그의 염의 용매화물 (화학식 I에 의하여 포함되며 하기 명시된 화합물이 아직 염, 용매화물 및 염의 용매화물이 아닌 경우)이다.

그의 구조에 의존하여, 본 발명에 의한 화합물은 입체이성질체 형태 (거울상이성질체, 부분입체이성질체)로 존재할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 거울상이성질체 또는 부분이체이성질체 및 그의 특정한 혼합물을 포함한다. 입체이성질체적으로 균질한 성분은 거울상이성질체 및/또는 부분입체이성질체의 혼합물로부터 공지의 방식으로 단리될 수 있다.

본 발명에 의한 화합물이 호변이성질체 형태로 존재할 수 있을 경우, 본 발명은 모든 호변이성질체 형태를 포함한다.

본 발명에 의한 화학식 I의 화합물의 입체이성질체 형태의 예는 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물이며, 여기서 모든 아미노산은 L-배위를 갖는다:

본 발명은 또한 입체이성질체를 표시하지 않은 경우 모든 가능한 입체이성질체 형태를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 의한 화학식 I의 화합물의 모든 적절한 동위원소 변형체를 포함한다. 본 발명에 의한 화합물의 동위원소 변형체는 본 발명에 의한 화합물에서 적어도 하나의 원자가 동일한 원자 번호를 갖지만 일반적으로 또는 주로 자연에서 발견되는 원자 질량과는 상이한 원자 질량을 갖는 또 다른 원자로 교환된 화합물을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 본 발명에 의한 화합물에 혼입될 수 있는 동위원소의 예는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 플루오린, 염소, 브로민 및 아이오딘, 예컨대 ²H (중수소), ³H (삼중수소), ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ³²P, ³³P, ³³S, ³⁴S, ³⁵S, ³⁶S, ¹⁸F, ³⁶Cl, ⁸²Br, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁹I 및 ¹³¹I의 것이다. 본 발명에 의한 화합물의 특정한 동위원소 변형체, 특히 하나 이상의 방사성 동위원소가 혼입된 것은 예를 들면 작용의 기전 또는 체내에서의 활성 화합물 분포의 조사에 이로울 수 있으며; 비교적 용이한 제조 가능성 및 검출 가능성으로 인하여, 특히 ³H 또는 ¹⁴C 동위원소로 표지된 화합물은 이러한 목적에 적절하다. 게다가, 동위원소, 예를 들면 중수소의 혼입은 화합물의 더 큰 대사 안정성의 결과로서 특정한 치료적 잇점, 예를 들면 체내에서의 반감기의 연장 또는 요구되는 활성 투여량에서의 감소를 초래할 수 있으며; 그러므로 본 발명에 의한 화학식 I의 화합물의 상기 변형은 몇몇 경우에서 또한 본 발명의 바람직한 실시양태를 구성할 수 있다. 본 발명에 의한 화학식 I의 화합물의 동위원소 변형체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의하여, 예를 들면 하기 기재된 방법 및 작업예에 기재된 방법에 의하여, 특정한 시약 및/또는 본원의 출발 화합물의 해당 동위원소 변형을 사용하여 생성될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 의한 화학식 I의 화합물의 전구약물을 포함한다. 본원에서 용어 "전구약물"은 그 자체가 생물학적으로 활성 또는 불활성일 수 있으나, 체내에서 그의 체류 시간 중에 본 발명에 의한 화학식 I의 화합물로 (예를 들면 대사에 의하여 또는 가수분해에 의하여) 전환될 수 있는 화합물을 지정한다. 본 발명의 문맥에서, 바람직한 염은 본 발명에 의한 화합물의 생리학상 허용되는 염이다. 또한, 제약 적용예에 대하여 그 자체가 적합하지 않은 염도 포함되나, 예를 들면 본 발명에 의한 화합물의 단리 또는 정제에 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 화합물의 생리학상 허용되는 염은 미네랄 산, 카르복실산 및 술폰산의 산 부가 염, 예를 들면 염산, 브로민화수소산, 황산, 인산, 메탄 술폰산, 에탄 술폰산, 톨루엔 술폰산, 벤젠술폰산, 나프탈렌 디술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 락트산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 푸마르산, 말레산 및 벤조산의 염을 포함한다.

본 발명에 의한 화합물의 생리학상 허용되는 염은 또한 통상의 염기의 염을 포함하며, 예를 들면 바람직하게는 알칼리 금속 염 (예, 나트륨 및 칼륨 염), 알칼리 토 금속 염 (예, 칼슘 및 마그네슘 염) 및 암모니아로부터 유래한 암모늄 염 또는 1 내지 16개의 탄소 원자를 갖는 유기 아민, 예를 들면 바람직하게는 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 에틸디이소프로필아민, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 디시클로헥실아민, 디메틸아미노에탄올, 프로카인, 디벤질아민, N-메틸모르폴린, 아르기닌, 리신, 에틸렌디아민 및 N-메틸피페리딘을 포함한다.

본 발명의 문맥에서, 용매화물은 고체 또는 액체 상태로 용매 분자와 배위결합에 의한 착체를 형성하는 본 발명에 의한 화합물의 형태를 지칭한다. 수화물은 배위가 물과 함께 형성되는 용매화물의 특정한 형태이다. 본 발명의 문맥에서 바람직한 용매화물은 수화물이다.

라디칼의 특정한 조합 또는 바람직한 조합에서 제시된 구체적인 라디칼 정의는 명시된 라디칼의 특정한 조합과는 무관하게 기타 조합의 임의의 라디칼 정의에 의하여 대체된다.

전술한 바람직한 범위 중 2개 이상의 조합이 매우 특히 바람직하다.

본 발명은 추가로 화학식 I 및 Ia의 화합물 또는 그의 염, 그의 용매화물 또는 그의 염의 용매화물의 제조 방법이 제공되며, 여기서 화학식 II의 화합물.

본 발명의 실시양태에 의하면, 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물은 하기와 같이 정의된다:

X¹은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:

^*-(CH₂)_m1-S-^# (여기서 m1은 0-6임);

^#-(CH₂)_m2-S-^* (여기서 m2는 0-6임);

^*-(CH₂)_m3-^# (여기서 m3은 1-8임);

^*-SO-(CH₂)_m8-^# (여기서 m8은 0-6임);

^#-SO-(CH₂)_m9-^* (여기서 m9는 0-6임);

^*-SO₂-(CH₂)_m10-^# (여기서 m10은 0-6임);

^#-SO₂-(CH₂)_m11-^* (여기서 m11은 0-6임);

;

여기서 ^* 및 ^#은 각각 고리 내에서 결합 방향을 나타내며,

X², X³ 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.

X¹은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:

^*-(CH₂)_m1-S-^# (여기서 m1은 0-4임);

^#-(CH₂)_m2-S-^* (여기서 m2는 0-4임);

^*-(CH₂)_m3-^# (여기서 m3은 1-6임);

^*-(CH₂)_m4-(CH₂=CH₂)-(CH₂)_n1-^# (여기서 m4는 0-4이며, n1은 0-4이되, 단 m4+n1=0-4임);

^*-(CH₂)_m5-(CH≡CH)-(CH₂)_n2-^# (여기서 m5는 0-4이며, n2는 0-4이되, 단 m5+n2=0-4임);

^*-(CH₂)_m6-CO-NH-(CH₂)_n3-^# (여기서 m6은 0-4이며, n3은 0-4이되, 단 m6+n3=0-4임);

^#-(CH₂)_m7-CO-NH-(CH₂)_n4-^* (여기서 m7은 0-4이며, n4는 0-4이되, 단 m7+n4=0-4임);

^*-SO-(CH₂)_m8-^# (여기서 m8은 0-4임);

^#-SO-(CH₂)_m9-^* (여기서 m9는 0-4임);

^*-SO₂-(CH₂)_m10-^# (여기서 m10은 0-4임);

^#-SO₂-(CH₂)_m11-^* (여기서 m11은 0-4임);

;

여기서 ^* 및 ^#은 각각 고리 내에서 결합 방향을 나타내며,

X², X³ 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.

X¹은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:

^*-(CH₂)_m1-S-^# (여기서 m1은 0-6임);

^#-(CH₂)_m2-S-^* (여기서 m2는 0-6임);

^*-(CH₂)_m3-^# (여기서 m3은 1-8임);

X²는 화학식 I의 화합물의 N-말단 G¹⁵에 아미드 결합에 의하여 공유 연결된 G¹⁴ 또는 K¹⁴이며;

X³은 존재하지 않거나 또는, G¹⁴ 또는 K¹⁴의 N-말단에 또는 K¹⁴의 측쇄의 작용기에 또는 Z에 공유 연결된 이종 모이어티이며;

Z는 존재하지 않거나 또는, G¹⁴ 또는 K¹⁴의 N-말단과 X³ 사이에 또는, K¹⁴의 측쇄의 작용기와 X³ 사이에 공유 결합된 절단 가능한 링커이며;

여기서 X³이 존재하지 않을 경우, Z는 또한 존재하지 않으며;

여기서 X³이 이종 모이어티인 경우, Z는 존재하지 않거나 또는, G¹⁴ 또는 K¹⁴의 N-말단과 X³ 사이에 또는, K¹⁴의 측쇄의 작용기와 X³ 사이에 공유 결합된 절단 가능한 링커이다.

X¹은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:

^*-CH₂-S-^#;

^#-CH₂-S-^*;

^*-(CH₂)₂-^#;

^*-(CH₂)_m6-CO-NH-(CH₂)_n3-^# (여기서 m6은 0 또는 1이며, n3은 0, 1, 2, 3으로부터 선택됨);

^#-(CH₂)_m7-CO-NH-(CH₂)_n4-^* (여기서 m7은 0 또는 1이며, n4는 0, 1, 2, 3으로부터 선택됨);

여기서 ^* 및 ^#은 각각 고리 내에서 결합 방향을 나타내며, X², X³ 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.

X¹은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:

^*-CH₂-S-^#;

^#-CH₂-S-^*;

^*-(CH₂)₂-^#;

^*-(CH₂)_m6-CO-NH-(CH₂)_n3-^# (여기서 m6은 1이며, n3은 0, 1 및 3으로부터 선택되거나 또는 m6은 0이며, n3은 0, 1 및 2로부터 선택됨);

^#-(CH₂)_m7-CO-NH-(CH₂)_n4-^* (여기서 m7은 1이며, n4는 0, 1 및 3으로부터 선택되거나; 또는 m7은 0이며, n4는 0, 1 및 2로부터 선택됨);

X¹은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:

^*-CH₂-S-^#;

^#-CH₂-S-^*;

^*-CO-NH-CH₂-^#;

^*-CO-NH-(CH₂)₂-^#;

^*-CH₂-CO-NH-(CH₂)₃-^#;

^*-CH₂-CO-NH-CH₂-^#;

^#-CH₂-CO-NH^*;

여기서 ^* 및 ^#은 각각 고리 내에서 결합 방향을 나타내며;

X²는 상기 정의된 바와 같으며;

X³은 존재하지 않거나 또는 팔미트산이며;

Z는 존재하지 않는다.

X¹은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:

^*-(CH₂)_m1-S-^# (여기서 m1은 0-6임);

^#-(CH₂)_m2-S-^* (여기서 m2는 0-6임);

^*-(CH₂)_m3-^# (여기서 m3은 1-8임);

X², X³ 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.

X¹은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:

^*-(CH₂)_m1-S-^# (여기서 m1은 0-4임);

^#-(CH₂)_m2-S-^* (여기서 m2는 0-4임);

X¹은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:

^*-(CH₂)-S-^#;

^#-(CH₂)-S-^*;

^*-(CH₂)_m6-CO-NH-(CH₂)_n3-^# (여기서 m6은 0 또는 1이며, n3은 1, 2 및 3으로부터 선택됨);

X¹은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:

^*-(CH₂)-S-^#;

^#-(CH₂)-S-^*;

X³은 G¹⁴ 또는 K¹⁴의 N-말단 또는 K¹⁴의 측쇄의 작용기에 공유 연결된 팔미트산이며;

Z는 존재하지 않는다.

X¹은 상기 정의된 바와 같으며;

X³ 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.

X¹ 및 X²는 상기 정의된 바와 같으며;

X³은 중합체이며, 중합체는 할로, 히드록시, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 술페이트 또는 포스페이트로 임의로 치환되며, 포화되거나, 또는 모노- 또는 디-불포화될 수 있는, 선형 또는 분지형 C₃-C₁₀₀ 카르복실산, 바람직하게는 C₄-C₃₀ 카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Z는 상기 정의된 바와 같다.

X¹ 및 X²는 상기 정의된 바와 같으며;

X³은 중합체이며, 중합체는 PEG 모이어티이며;

Z는 상기 정의된 바와 같다.

X¹ 및 X²는 상기 정의된 바와 같으며;

X³은 이종 모이어티이며;

Z는 X²의 임의의 아미노산 또는 G¹⁵의 N-말단과 X³ 사이에 또는, X²의 임의의 아미노산의 측쇄의 작용기와 X³ 사이에 공유 결합된 절단 가능한 링커이다.

X²의 아미노산 중 적어도 하나는 천연 또는 비천연 아미노산에 의하여 대체되며;

X¹, X³ 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.

본 발명의 의미 내에서, 천연 아미노산은 펩티도게닉 아미노산으로서 정의된다. 본 발명의 의미내에서, 비천연 아미노산은 하기를 포함한, 본 발명에 의한 펩티드에 삽입된 비-펩티도게닉 아미노산으로서 정의된다:

2개의 아미노 및 2개의 카르복실 기를 갖는 아미노산으로서 정의된 본 발명의 의미 내에 포함되는 디아미노이산. 디아미노이산은 2개의 추가의 아미노산과 함께 아미드 결합을 형성할 수 있다. 디아미노이산의 예는 시스타티오닌 및 2,7-디아미노수베르산이며;

2급 아미노 기를 갖는 아미노산으로서 정의된 본 발명의 의미에 포함되는 디아미노산. 디아미노산에 대한 예는 3-아미노알라닌 (Dpr), 2,4-디아미노부티르산 (Dab), 알파, 감마 디아미노 부티르산 (Dbu) 및 2,5 디아미노펜탄산 (Orn); D-아미노산, 페닐알라닌에 대한 대체물로서 사용되는 헤테로시클릭 치환된 알라닌 및 할로겐화 아미노산이다.

본 발명의 실시양태에 의하면, 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물은 하기 정의된 바와 같다:

X³은 중합체, Fc, FcRn 결합 리간드, 알부민 및 알부민-결합 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 모이어티이며;

X¹, X² 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.

본 발명의 의미 내에서, 용어 "이종 모이어티"는 중합체, Fc, FcRn 결합 리간드, 알부민 및 알부민-결합 리간드를 포함한다.

X³은 중합체이며, 중합체는 선형 또는 분지형 C₃-C₁₀₀ 카르복실산, 바람직하게는 C₄-C₃₀ 카르복실산 (임의로 할로, 히드록시, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 술페이트 또는 포스페이트로 치환되며, 포화되거나, 또는 모노- 또는 디-불포화될 수 있음), PEG 모이어티, PPG 모이어티, PAS 모이어티 및 HES 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되며;

X¹, X² 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.

X³은 아라키드산, 아라키돈산, 베헨산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 세로플라스트산, 세로트산, 도코사헥사엔산, 에이코사펜타엔산, 엘라이드산, 에난트산, 에루스산, 게드산, 헤나트리아콘틸산, 헤네이코실산, 헵타코실산, 헥사트리아콘틸산, 락세로산, 라우르산, 리그노세르산, 리노엘라이드산, 리놀레산, 마르가르산, 멜리스산, 몬탄산, 미리스트산, 미리스톨레산, 노나코실산, 노나데실산, 올레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 판토텐산, 펠라르곤산, 펜타코실산, 펜타데실산, 프실산, 사피엔산, 스테아르산, 트리코실산, 트리데실산, 운데실산, 바센산, 발레르산, α-리놀렌산 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 카르복실산이며;

X¹, X² 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.

본 발명의 추가의 실시양태에 의하면, 이종 모이어티는 관련 기술분야에 공지된 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜 (PPG) 모이어티이다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 분지형 또는 비분지형일 수 있다.

폴리에틸렌 글리콜의 경우, 한 실시양태에서, 분자량은 취급 및 제조에서의 용이성을 위하여 약 1 kDa 내지 약 100 kDa이다. 원하는 프로파일 (예, 원하는 지속 방출의 기간, 효과, 필요하다면 생물학적 활성, 취급시 용이성, 폴리에틸렌 글리콜의 펩티드 또는 유사체로의 항원성의 정도 또는 결여 및 기타 공지된 효과에 의존하여 기타 크기도 사용될 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 약 200, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 5,500, 6,000, 6,500, 7,000, 7,500, 8,000, 8,500, 9,000, 9,500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000 또는 100,000 kDa의 평균 분자량을 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 분지형 구조를 가질 수 있다. 분지형 폴리에틸렌 글리콜은 예를 들면 미국 특허 제5,643,575호; (Morpurgo et al., Appl . Biochem . Biotechnol . 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); and Caliceti et al., Bioconjug . Chem. 10:638-646 (1999))에 기재되어 있다.

기타 실시양태에서, 이종 모이어티는 PAS 서열이다. 본원에 사용된 바와 같은 PAS 서열은 주로 알라닌 및 세린 잔기를 포함하거나 또는 주로 알라닌, 세린 및 프롤린 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 의미하며, 아미노산 서열은 생리학적 조건 하에서 랜덤 코일 입체형태를 형성한다. 따라서, PAS 서열은 응고촉진 화합물에서 이종 모이어티의 일부로서 사용될 수 있는 알라닌, 세린 및 프롤린을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 빌딩 블록, 아미노산 중합체 또는 서열 카세트이다. 그렇지만, 통상의 기술자는 알라닌, 세린 및 프롤린을 제외한 잔기가 PAS 서열에서 소수의 성분으로서 첨가될 때 아미노산 중합체가 랜덤 코일 입체형태를 형성할 수 있다는 것을 숙지한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "소수의 성분"은 알라닌, 세린 및 프롤린을 제외한 아미노산이 PAS 서열에서 특정한 정도로, 예를 들면 약 12%, 즉 PAS 서열의 100개의 아미노산 중 약 12개 이하, 약 10%, 즉 PAS 서열의 100개의 아미노산 중 약 10개 이하, 약 9%>, 즉 100개의 아미노산 중 약 9개 이하, 약 8%>, 즉 100개의 아미노산 중 약 8개 이하, 약 6%>, 즉 100개의 아미노산 중 약 6개, 약 5%>, 즉 100개의 아미노산 중 약 5개, 약 4%>, 즉 100개의 아미노산 중 약 4개, 약 3%>, 즉 100개의 아미노산 중 약 3개, 약 2%>, 즉 100개의 아미노산 중 약 2개, 약 1%>, 즉 100개의 아미노산 중 약 1개로 첨가될 수 있다는 것을 의미한다. 알라닌, 세린 및 프롤린과는 상이한 아미노산은 Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 생리학적 조건 하에서, PAS 서열 신장은 랜덤 코일 입체형태를 형성하며, 그리하여 응고촉진 화합물에 증가된 생체내 및/또는 시험관내 안정성을 매개할 수 있다. 랜덤 코일 도메인은 안정한 구조 또는 기능을 저절로 채택하지 않으므로, 응고촉진 화합물 중의 Pep1 및/또는 Pep2 폴리펩티드에 의하여 매개된 생물학적 활성은 본질적으로 보존된다. 기타 실시양태에서, 랜덤 코일 도메인을 형성하는 PAS 서열은 특히 혈장 중의 단백질분해, 면역원성, 등전점/정전 양상, 세포 표면 수용체로의 결합 또는 내재화에 대하여 생물학적으로 불활성이지만, 여전히 생분해성이며, 이는 PEG와 같은 합성 중합체에 비하여 뚜렷한 잇점을 제공한다.

랜덤 코일 입체형태를 형성하는 PAS 서열의 비제한적인 예는 ASPAAPAPASPAAPAPSAPA, AAPASPAPAAPSAPAPAAPS, APSSPSPSAPSSPSPASPSS, APSSPSPSAPSSPSPASPS, SSPSAPSPSSPASPSPSSPA, AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA 및 AS AAAP AAAS AAAS AP S AAA 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. PAS 서열의 추가의 예는 미국 특허 공개 번호 2010/0292130 A1 및 PCT 출원 공개 번호 WO 2008/155134 A1로부터 공지되어 있다.

특정한 실시양태에서, 이종 모이어티는 히드록시에틸 스타치 (HES) 또는 그의 유도체이다. 히드록시에틸 스타치 (HES)는 천연 발생 아밀로펙틴의 유도체이며, 체내에서 알파-아밀라제에 의하여 분해된다. HES는 옥수수 전분 중에서 95 중량% 이하의 농도로 존재하는 탄수화물 중합체 아밀로펜틴의 치환된 유도체이다. HES는 이로운 생물학적 성질을 나타내며, 병원에서 혈액량 대체제로서 및 혈액희석 요법에서 사용된다 (Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987); and Weidler et al., Arzneim .- Forschung /Drug Res., 41, 494-498 (1991)).

아밀로펙틴은 주쇄에서 알파-1,4-글리코시드 결합이 존재하며, 분지 부위에서 알파-1,6-글리코시드 결합이 존재하는 글루코스 모이어티를 함유한다. 그러한 분자의 물리-화학적 성질은 주로 글리코시드 결합의 유형에 의하여 결정된다. 닉킹된 알파-1,4-글리코시드 결합으로 인하여, 회전당 약 6개의 글루코스-단량체를 갖는 나선형 구조가 생성된다. 중합체의 물리-화학적뿐 아니라 생화학적 성질은 치환에 의하여 변형될 수 있다. 히드록시에틸 기의 도입은 알칼리성 히드록시에틸화에 의하여 달성될 수 있다. 반응 조건을 채택함으로써 히드록시에틸화에 관하여 비치환된 글루코스 단량체에서 각각의 히드록시 기의 상이한 반응성을 나타낼 수 있다. 이러한 사실로 인하여, 통상의 기술자는 치환 패턴이 제한된 정도로 영향을 미칠 수 있다.

HES는 주로 분자량 분포 및 치환도를 특징으로 한다. DS로 나타낸 치환도는 몰 치환에 관한 것이며, 관련 기술분야에 공지되어 있다. (Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987), 상기 언급된 바와 같음, 특히 p. 273)을 참조한다.

한 실시양태에서, 히드록시에틸 스타치는 1 내지 300 kD, 2 내지 200 kD, 3 내지 100 kD 또는 4 내지 70 kD의 평균 분자량 (중량 평균)을 갖는다. 히드록시에틸 스타치는 추가로 0.1 내지 3, 바람직하게는 0.1 내지 2, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.9, 바람직하게는 0.1 내지 0.8의 몰 치환도 및 히드록시에틸 기에 대하여 2 내지 20 범위내로 C2:C6 치환비를 나타낼 수 있다. 약 130 kD의 평균 분자량을 갖는 HES의 비제한적인 예는 0.2 내지 0.8, 예컨대 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8, 바람직하게는 0.4 내지 0.7, 예컨대 0.4, 0.5, 0.6 또는 0.7의 치환도를 갖는 HES이다. 구체적인 실시양태에서, 약 130 kD의 평균 분자량을 갖는 HES는 프레세니우스(Fresenius)로부터의 볼루벤(VOLUVEN)®이다. 볼루벤®은 예를 들면 요법에 대한 치료적 징후 및 혈량저하증의 예방에 사용된 부피 대체를 위하여 사용되는 인공 콜로이드이다. 볼루벤®의 특징은 130,000+/-20,000 D의 평균 분자량, 0.4의 몰 치환도, 약 9:1의 C2:C6 비이다. 기타 실시양태에서, 히드록시에틸 스타치의 평균 분자량의 범위는 예를 들면 4 내지 70 kD 또는 10 내지 70 kD 또는 12 내지 70 kD 또는 18 내지 70 kD 또는 50 내지 70 kD 또는 4 내지 50 kD 또는 10 내지 50 kD 또는 12 내지 50 kD 또는 18 내지 50 kD 또는 4 내지 18 kD 또는 10 내지 18 kD 또는 12 내지 18 kD 또는 4 내지 12 kD 또는 10 내지 12 kD 또는 4 내지 10 kD이다. 기타 실시양태에서, 사용된 히드록시에틸 스타치의 평균 분자량은 4 kD 초과 및 70 kD 미만, 예컨대 약 10 kD의 범위내이거나 또는 9 내지 10 kD 또는 10 내지 11 kD 또는 9 내지 11 kD 또는 약 12 kD 범위내이거나 또는 11 내지 12 kD 또는 12 내지 13 kD 또는 11 내지 13 kD 또는 약 18 kD의 범위내이거나 또는 17 내지 18 kD 또는 18 내지 19 kD 또는 17 내지 19 kD 또는 약 30 kD의 범위내이거나 또는 29 내지 30 또는 30 내지 31 kD 또는 약 50 kD의 범위내이거나 또는 49 내지 50 kD 또는 50 내지 51 kD 또는 49 내지 51 kD의 범위내이다.

특정한 실시양태에서, 이종 모이어티는 상이한 평균 분자량 및/또는 상이한 치환도 및/또는 상이한 C2:C6 치환의 비를 갖는 히드록시에틸 스타치의 혼합물일 수 있다. 그러므로, 상이한 평균 분자량 및 상이한 치환도 및 상이한 C2:C6의 치환비를 갖는 또는, 상이한 평균 분자량 및 상이한 치환도 및 동일하거나 또는 대략 동일한 C2:C6 치환의 비를 갖거나 또는, 상이한 평균 분자량 및 동일하거나 또는 대략 동일한 치환도 및 상이한 C2:C6 치환의 비를 갖거나 또는, 동일하거나 또는 대략 동일한 평균 분자량 및 상이한 치환도 및 상이한 C2:C6 치환의 비를 갖거나 또는, 상이한 평균 분자량 및 동일하거나 또는 대략 동일한 치환도 및 동일하거나 또는 대략 동일한 C2:C6 치환의 비를 갖거나 또는, 동일하거나 또는 대략 동일한 평균 분자량 및 상이한 치환도 및 동일하거나 또는 대략 동일한 C2:C6 치환의 비를 갖거나 또는, 동일하거나 또는 대략 동일한 평균 분자량 및 동일하거나 또는 대략 동일한 치환도 및 상이한 C2:C6 치환의 비를 갖거나 또는, 대략 동일한 평균 분자량 및 대략 동일한 치환도 및 대략 동일한 C2:C6 치환의 비를 갖는 히드록시에틸 스타치의 혼합물을 사용할 수 있다.

특정한 실시양태에서, 이종 모이어티는 폴리시알산 (PSA) 또는 그의 유도체이다. 폴리시알산 (PSA)은 특정 세포에서의 포유동물에서 및 특정한 박테리아 균주에 의하여 생성된 시알산의 자연 발생 비분지형 중합체이다 (Roth J., et al., (1993) in Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland), pp 335-348). 이들은 제한된 산 가수분해에 의하여 또는 뉴라미니다제를 사용한 소화에 의하여 또는 중합체의 천연 박테리아 유도된 형태의 분별에 의하여 n=약 80 이상의 시알산 잔기 내지는 n=2까지의 다양한 중합도로 생성될 수 있다. 또한, 신경 세포 부착 분자 (N-CAM)의 배아 형태로 존재하는 그룹-B 뇌척수막염균 및 이. 콜리(E. coli) 균주 Kl의 피막 다당류를 포함하는 호모중합체 형태, 즉 알파-2,8-연결된 폴리시알산이 존재하도록 상이한 폴리시알산의 조성은 변동된다. 헤테로중합체 형태는 또한 예컨대 이. 콜리 균주 K92의 교호 알파-2,8 알파-2,9 폴리시알산 및 수막염균(N. meningitidis)의 그룹 C 다당류로서 존재한다. 시알산은 또한 수막염균의 그룹 W 135 또는 그룹 Y와 같은 시알산을 제외한 단량체와의 교호 공중합체 중에서 발견될 수 있다. 포유동물에서 폴리시알산에 대한 공지의 수용체가 존재하지 않기는 하나, 폴리시알산은 병원성 세균에 의한 면역 및 보체 계의 회피 및 태아 발달 중에 미성숙 뉴런의 아교세포 유착성의 조절을 포함한 중요한 생물학적 기능을 갖는다 (여기서 중합체는 항-유착 기능을 갖는다) (Cho and Troy, P.N.A.S., USA, 91 (1994) 11427-11431). 이. 콜리 균주 Kl의 알파-2,8-연결된 폴리시알산은 또한 '콜로민산'으로 공지되어 있으며, 본 발명을 예시하기 위하여 (다양한 길이로) 사용된다. 폴리시알산을 펩티드 또는 폴리펩티드로 부착 또는 접합시키는 다양한 방법이 기재되어 있다 (예를 들면, 미국 특허 제5,846,951호; WO-A-0187922 및 US 2007/0191597 A1을 참조한다).

특정한 실시양태에서, 이종 모이어티는 글리신-풍부 호모-아미노산 중합체 (HAP)이다. HAP 서열은 적어도 50개의 아미노산, 적어도 100개의 아미노산, 120개의 아미노산, 140개의 아미노산, 160개의 아미노산, 180개의 아미노산, 200개의 아미노산, 250개의 아미노산, 300개의 아미노산, 350개의 아미노산, 400개의 아미노산, 450개의 아미노산 또는 500개의 아미노산의 길이를 갖는 글리신의 반복 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, HAP 서열은 HAP 서열에 융합 또는 연결된 모이어티의 반감기를 연장시킬 수 있다. HAP 서열의 비제한적인 예는 (Gly)n, (Gly4Ser)n 또는 S(Gly4Ser)n을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 한 실시양태에서, n은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40이다. 또 다른 실시양태에서, n은 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200이다.

특정한 측면에서, 본 발명의 화합물은 XTEN 폴리펩티드 또는 그의 분절, 변형체 또는 유도체이거나 또는 이를 포함하는 적어도 하나의 이종 모이어티에 공유 연결된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "XTEN 폴리펩티드"는 주로 작은 친수성 아미노산으로 이루어진 비-자연 발생, 실질적으로 비-반복 서열을 갖는 연장된 길이의 폴리펩티드를 지칭하며, 상기 서열은 생리학적 조건 하에서 낮은 정도의 구조를 갖거나 또는 2급 또는 3급 구조를 갖지 않는다. 이종 모이어티로서, XTEN은 반감기 연장 모이어티로서 작용될 수 있다. 게다가, XTEN은 향상된 약물동력학 파라미터 및 용해도 특징을 포함하나 이에 제한되지는 않는 바람직한 성질을 제공할 수 있다.

본 발명의 접합물로의 XTEN 서열을 포함하는 이종 모이어티의 혼입은 생성된 접합물에 하기의 이로운 성질 중 하나 이상을 부여할 수 있다: 입체형태 유연성, 향상된 수용해도, 높은 정도의 프로테아제 내성, 낮은 면역원성, 포유동물 수용체로의 낮은 결합 또는 증가된 수력학적 (또는 스토크스(Stokes)) 반경.

특정한 측면에서, 본 발명의 화합물 또는 접합물이 생체내에 체류되며, XTEN 이종 모이어티가 없는 것을 제외하고 동일한 화합물 또는 접합물에 비하여 증가된 시간 기간 동안 응고촉진 활성을 갖도록 XTEN 모이어티는 약물동력학 성질을 증가시킬 수 있으며, 예컨대 더 긴 생체내 반감기 또는 증가된 곡선 아래 면적 (AUC)을 갖는다.

본 발명의 응고촉진 접합물에서의 이종 모이어티로서 사용될 수 있는 XTEN 모이어티의 예는 예를 들면 미국 특허 공개 번호 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1 또는 2011/0172146 A1 또는 국제 특허 공개 번호 WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1 또는 WO 2011028344 A2에 개시되어 있다.

본 발명의 의미 내에서, 용어 "Fc"는 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 부분, 예컨대 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너로서 이해되어야 한다. 특정한 실시양태에서, 화합물 또는 접합물은 그럼에도 불구하고 Fc 수용체 (FcR) 결합 성질을 Fc 영역에 부여하기에 충분한 하나 이상의 말단절단된 Fc 영역에 연결된다. 예를 들면, FcRn에 결합되는 Fc 영역의 부분 (즉 FcRn 결합 부분)은 IgG1의 대략 아미노산 282-438을 포함한다. EU 넘버링 (1차 접촉 부위는 CH₂ 도메인의 아미노산 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 및 314 및, CH₃ 도메인의 아미노산 잔기 385-387, 428 및 433-436임). 그래서, 본 발명의 생물학적 활성 ADM 펩티드 유도체의 Fc 영역은 FcRn 결합 부분을 포함하거나 또는 이로써 이루어질 수 있다. FcRn 결합 부분은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한 임의의 아이소형의 중쇄로부터 유래할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 아이소형 IgG1의 항체로부터의 FcRn 결합 부분을 사용한다. 또 다른 실시양태에서, 인간 아이소형 IgG4의 항체로부터의 FcRn 결합 부분을 사용한다.

특정한 실시양태에서, Fc 영역은 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 힌지 (예를 들면 상부, 중부 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인 (EU 넘버링에 의한 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 216-230), CH₂ 도메인 (EU 넘버링에 의한 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 231-340), CH₃ 도메인 (EU 넘버링에 의한 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 341-438), CH₄ 도메인 또는 그의 변형체, 부분 또는 분절. 기타 실시양태에서, Fc 영역은 완전 Fc 도메인 (즉 힌지 도메인, CH₂ 도메인 및 CH₃ 도메인)을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, Fc 영역은 CH₃ 도메인 (또는 그의 부분)에 융합된 힌지 도메인 (또는 그의 부분), CH₂ 도메인 (또는 그의 부분)에 융합된 힌지 도메인 (또는 그의 부분), CH₃ 도메인 (또는 그의 부분)에 융합된 CH₂ 도메인 (또는 그의 부분), 힌지 도메인 (또는 그의 부분) 및 CH₃ 도메인 (또는 그의 부분) 둘다에 융합된 CH₂ 도메인 (또는 그의 부분)을 포함하거나, 본질적으로 이로써 이루어지거나 또는 이로써 이루어진다. 기타 실시양태에서, Fc 영역은 CH₂ 도메인의 적어도 일부 (예를 들면 CH₂ 도메인의 전부 또는 일부)가 결여되어 있다. 특정한 실시양태에서, Fc 영역은 EU 넘버 221 내지 447에 해당하는 아미노산을 포함하거나 또는 이로써 이루어진다.

본 발명의 생물학적 활성 ADM 펩티드 유도체에서의 Fc는 예를 들면 국제 PCT 공개 번호 WO88/07089A1, W096/14339A1, WO98/05787A1, W098/23289A1, W099/51642A1, W099/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2 및 WO06/085967A2; 미국 특허 공개 번호 2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US2007/0248603, US2007/0286859, US2008/0057056; 또는 미국 특허 번호 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 7,404,956 및 7,317,091에 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서 변화 (예를 들면 치환)를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 특정한 변화 (예를 들면 관련 기술분야에 개시된 하나 이상의 아미노산의 특정한 치환)는 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서 이루어질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서의 상이한 변화 (예를 들면 관련 기술분야에 개시된 하나 이상의 아미노산 위치의 상이한 치환)가 이루어질 수 있다.

본 발명에 사용된 Fc 영역은 또한 그의 글리코실화를 변경시키는 관련 기술분야에 인지된 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, Fc는 감소된 글리코실화 (예를 들면 N- 또는 O-연결된 글리코실화)를 초래하는 변이를 갖거나 또는 야생형 Fc 모이어티 (예를 들면 저 프룩토스 또는 무-프룩토스 글리칸)의 변형된 글리코포름을 포함할 수 있다.

특정한 실시양태에서, 본 발명의 화합물 또는 접합물은 알부민 또는 그의 기능적 분절을 포함하는 이종 모이어티에 연결된다. 그의 전장 형태의 609 아미노산인 인간 혈청 알부민 (HSA 또는 HA)은 혈청의 삼투압의 상당한 부분의 원인이 되며, 또한 내인성 및 외인성 리간드의 담체로서 기능하다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "알부민"은 전장 알부민 또는 그의 기능적 분절, 변형체, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 알부민 또는 그의 분절 또는 변형체의 예는 미국 특허 공개 번호 2008/0194481A1, 2008/0004206 A1, 2008/0161243 A1, 2008/0261877 A1 또는 2008/0153751 A1 또는 PCT 출원 공개 번호 2008/033413 A2, 2009/058322 A1 또는 2007/021494 A2에 개시되어 있다.

한 실시양태에서, 이종 모이어티는 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 부분 (예를 들면 Fc 영역), PAS 서열, HES 및 PEG로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 모이어티에 추가로 연결된 알부민, 그의 분절 또는 변형체이다.

특정한 실시양태에서, 이종 모이어티는 알부민 결합 펩티드, 박테리아 알부민 결합 도메인, 알부민-결합 항체 분절 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 알부민 결합 모이어티이다.

예를 들면, 알부민 결합 단백질은 박테리아 알부민 결합 단백질, 항체 또는, 도메인 항체를 포함한 항체 분절일 수 있다 (미국 특허 제6,696,245호 참조). 예를 들면 알부민 결합 단백질은 박테리아 알부민 결합 도메인, 예컨대 연쇄구균성 단백질 G 중 하나일 수 있다 (Konig, T. and Skerra, A. (1998) J. Immunol . Methods 218, 73-83). 미국 특허 출원 2003/0069395 또는 Dennis et al. (Dennis et al., (2002) J. Biol . Chem . 277, 35035-35043)에 개시된 바와 같이, 접합 파트너로서 사용될 수 있는 알부민 결합 펩티드의 기타 예는 예를 들면 Cys-Xaa i -Xaa 2 - Xaa 3 -Xaa 4 -Cys 공통서열 서열을 갖는 것이며, 여기서 Xaa i는 Asp, Asn, Ser, Thr 또는 Trp이며; Xaa 2는 Asn, Gin, His, He, Leu 또는 Lys이며; Xaa 3은 Ala, Asp, Phe, Trp 또는 Tyr이며; Xaa 4는 Asp, Gly, Leu, Phe, Ser 또는 Thr이다. (Kraulis et al., FEBS Lett. 378: 190-194 (1996) and Linhult et al., Protein Sci. 11:206-213 (2002))에 개시된 바와 같은 연쇄구균성 단백질 G로부터 도메인 3은 박테리아 알부민-결합 도메인의 일례이다. 알부민-결합 펩티드의 예는 코어 서열 DICLPRWGCLW (서열식별번호: 45)을 갖는 일련의 펩티드를 포함한다. 예를 들면 (Dennis et al., J. Biol . Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002))를 참조한다. 알부민-결합 항체 분절의 예는 (Muller and Kontermann, Curr . Opin . Mol . Ther. 9:319-326 (2007); Rooverset al., Cancer Immunol . Immunother . 56:303-317 (2007), and Holt et al., Prot . Eng . Design Sci ., 21:283-288 (2008))에 개시되어 있으며, 이들은 본원에 그 전문이 참조로 포함된다. 상기 알부민 결합 모이어티의 일례는 (Trussel et al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009))에 개시된 바와 같은 2-(3-말레이미도프로판아미도)-6-(4-(4-아이오도페닐)부탄아미도) 헥사노에이트 ("Albu" 태그)이다.

본 발명의 실시양태에 의하면, 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물은 Z가 존재하지 않으며, X¹, X² 및 X³은 상기 정의된 바와 같은 것으로 정의된다.

본 실시양태에 의하면, 상기 정의된 바와 같은 이종 모이어티 X³은 X²에 영구 방식으로 공유 연결된다. 본 발명의 의미 내에서, 용어 모이어티가 "펩티드에 영구 방식으로 공유 연결된다"는 링커 Z를 사용하지 않고 모이어티가 펩티드에 공유 연결되는 것으로 이해하여야 한다. 일례는 화학식 I의 펩티드의 서열 중 임의의 아미노산의 N 말단 또는 적절한 측쇄 작용기를, 할로, 히드록시, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 술페이트 또는 포스페이트로 임의로 치환되며 포화되거나 또는 모노- 또는 디-불포화될 수 있는 선형 또는 분지형 C₃-C₁₀₀ 카르복실산, 바람직하게는 C₄-C₃₀ 카르복실산에 의해 작용화하는 것이다.

본 발명의 실시양태에 의하면, 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물은 Z가 상기 정의된 바와 같은 절단 가능한 링커이며; X¹, X² 및 X³이 상기 정의된 바와 같은 것으로 정의된다.

본 발명의 의미 내에서, 용어 "절단 가능한 링커"는 효소 과정에 의하여 또는 pH-의존성 친핵성 과정에 의하여 또는 가수분해에 의하여 또는 그의 임의의 조합에 의하여 이종 모이어티가 X²로부터 방출되는 X² 및 X³ 사이의 링커로서 이해하여야 한다.

본 발명의 실시양태에 의하면, 화학식 I의 화합물은 적어도 하나의 아미드 결합의 N-메틸화에 의하여 추가로 변형된다.

펩티드의 대사 안정성에 대한 N-메틸화의 영향은 각종 펩티드에 대하여 기재되어 있다. 예를 들면, 시클로스포린은 우수한 약물동력학 프로파일을 나타내는 자연 발생, 시클릭, 복수의 N-메틸화 펩티드이다. 일반적으로 N-메틸화는 N-메틸화 펩티드 결합을 절단시킬 수 없으므로 프로테아제에 의한 효소 분해를 차단한다. 복수의 N-메틸화는 펩티드의 대사 안정성 및 장 투과성을 개선시키는 것으로 나타났다 [Chatterjee J, Gilon C, Hoffman A, Kessler H, N-methylation of peptides: a new perspective in medicinal chemistry, Acc Chem Res., 41(10), 1331-1342, 2008]. N-메틸화와 조합된 고리화는 대사 안정성, 막 투과성 및 경구 생체이용률을 포함한 펩티드의 물리화학적 성질을 조정하는데 사용하였다 [Chatterjee J, Laufer B, Kessler H, Synthesis of N-methylated cyclic peptides, Nat Protoc ., 7(3), 432-444, 2012]. (Dong QG, Zhang Y, Wang MS, Feng J, Zhang HH, Wu YG, Gu TJ, Yu XH, Jiang CL, Chen Y, Li W, Kong W, Improvement of enzymatic stability and intestinal permeability of deuterohemin-peptide conjugates by specific multi-site N-methylation, Amino Acids., 43(6), 2431-2441, 2012)에는 선택된 부위에서의 N-메틸화가 단백분해 분해에 대한 높은 내성을 나타냈다는 것이 기재되어 있다. 희석된 혈청 및 장 제제에서, 50- 내지 140-배 더 높은 반감기 값이 관찰되었다. 그러나, (Linde Y, Ovadia O, Safrai E, Xiang Z, Portillo FP, Shalev DE, Haskell-Luevano C, Hoffman A, Gilon C, Structure-activity relationship and metabolic stability studies of backbone cyclization and N-methylation of melanocortin peptides, Biopolymers ., 90(5), 671-682, 2008)에는 α-멜라닌세포 자극 호르몬의 시클릭 N-메틸화 유사체는 모 펩티드보다 더 안정하지만, 생물학적 활성은 더 적은 것으로 기재되어 있다.

본 발명에 의한 화합물은 예측 불가한 유용한 스펙트럼의 약리적 활성을 나타낸다.

따라서, 이들은 인간 및 동물에서 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약로서의 사용에 적절하다.

본 발명은 장애, 특히 심혈관, 부종성 및/또는 염증성 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 의한 화합물의 용도가 추가로 제공된다.

본 발명의 경우, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질환, 장애, 병태 또는 상태, 그의 발생 및/또는 진행 및/또는 그의 증상의 억제, 지연, 완화, 경감, 정지, 감소 또는 회귀의 유발을 포함한다. 용어 "예방" 또는 "예방하는"은 질환, 장애, 병태 또는 상태, 그의 발생 및/또는 진행 및/또는 그의 증상을 갖거나, 걸리거나 또는 경험할 위험성을 감소시키는 것을 포함한다. 용어 예방은 예방(prophylaxis)을 포함한다. 질환, 장애, 병태 또는 상태의 치료 또는 예방은 부분적이거나 또는 완전할 수 있다.

그의 약리적 성질에 기초하여, 본 발명에 의한 화합물은 심혈관 질환, 특히 심부전, 특히 만성 및 급성 심부전, 악화 중인 심부전, 확장기 및 수축기 (울혈성) 심부전, 급성 대상부전 심부전, 심장 기능부전, 관상 동맥성 심장 질환, 협심증, 심근 경색증, 허혈성 재관류 손상, 허혈성 및 출혈성 졸중, 동맥경화증, 죽상경화증, 고혈압, 특히 본태성 고혈압, 악성 본태성 고혈압, 이차 고혈압, 신장혈관 고혈압 및 신장 및 내분비 장애에 대하여 2차인 고혈압, 고혈압성 심장 질환, 고혈압성 신장 질환, 폐동맥 고혈압, 특히 이차 폐동맥 고혈압, 급성 폐심장증을 갖거나 또는 갖지 않는 폐 색전증 후의 폐동맥 고혈압, 원발성 폐동맥 고혈압 및 말초 동맥 폐쇄성 질환의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.

게다가, 본 발명에 의한 화합물은 고혈압 (전자간증)과 함께 또는 없이 임신성 [임신-유발된] 부종 및 단백뇨의 치료 및/또는 예방에 적절하다.

게다가, 본 발명에 의한 화합물은 폐 장애, 예컨대 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 급성 및 만성 폐 부종, 흡입된 유기 분진 및 진균, 방선균 또는 다른 기원의 입자로 인한 알레르기성 폐포염 및 폐렴, 급성 화학성 기관지염, 급성 및 만성 화학적 폐 부종 (예, 포스겐, 산화질소의 흡입 후), 신경원성 폐 부종, 방사선으로 인한 급성 및 만성 폐 증상, 급성 및 만성 간질성 폐 장애 (예컨대 약물-유발된 간질성 폐 장애, 예를 들면 블레오마이신 처치에 대하여 2차적인 것이지만, 이에 제한되지는 않음), 성인 또는 신생아를 포함한 어린이에서의 급성 폐 손상/급성 호흡 곤란 증후군 (ALI/ARDS), 폐렴 및 패혈증에 대한 2차 ALI/ARDS, 흡인 폐렴 및 흡인에 대한 2차 ALI/ARDS (예컨대 역류된 위 내용물로 인한 흡인 폐렴이지만, 이에 제한되지는 않음), 연기 가스 흡입에 대한 2차 ALI/ARDS, 수혈-관련 급성 폐 손상 (TRALI), 수술, 외상 또는 화상후 ALI/ARDS 또는 급성 폐 기능부전, 인공호흡기 유발된 폐 손상 (VILI), 태변 흡인후 폐 손상, 폐 섬유증 및 고산병의 치료 및/또는 예방에 적절하다.

본 발명에 의한 화합물은 만성 신장 질환 (단계 1-5), 신부전, 당뇨병성 신장병증, 고혈압성 만성 신장 질환, 사구체신염, 급속 진행 및 만성 신장염 증후군, 불특정 신장염 증후군, 신증후군, 유전성 신경병증, 급성 및 만성 요세관간질 신장염, 급성 신장 손상, 급성 신부전, 외상후 신부전, 외상 및 처치후 신장 손상, 심장콩팥 증후군의 치료 및/또는 예방 및 신장 이식의 보호 및 기능적 개선에 적절하다.

게다가, 화합물은 당뇨병 및 그의 연속적인 증상, 예컨대 당뇨병성 대혈관병증 및 미세혈관병증, 당뇨병성 신장병증 및 신경병증의 치료 및/또는 예방에 적절하다.

게다가, 본 발명에 의한 화합물은 중추 및 말초 신경계의 장애, 예컨대 바이러스 및 박테리아 수막염 및 뇌염 (예, 대상포진성 뇌염), 외상 및 독성 뇌 손상, 뇌 및 척수의 원발성 또는 속발성 [전이] 악성 신생물, 신경근염 및 다발신경근염, 길랭-바레 증후군 [급성 (후-)감염성 다발신경염, 밀러 피셔 증후군], 근위축 측삭 경화중 [진행성 척수성 근육 위축증], 파킨슨병, 급성 및 만성 다발성 신경병증, 통증, 대뇌 부종, 알츠하이머병, 신경계의 퇴행성 질환 및 중추 신경계의 탈수초병, 예컨대 다발성 경화증이지만 이에 제한되지는 않는 것의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.

게다가, 본 발명에 의한 화합물은 문맥 고혈압 및 간 섬유증 [경화증] 및 그의 후유증, 예컨대 식도 정맥류 및 복수의 치료 및/또는 예방, 악성종양 또는 염증에 대하여 2차인 흉막삼출의 치료 및/또는 예방 및 림프부종 및 정맥류에 대하여 2차인 부종의 치료 및/또는 예방에 적절하다.

게다가, 본 발명에 의한 화합물은 위장관의 염증성 장애, 예컨대 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염 및 장의 독성 및 혈관성 장애의 치료 및/또는 예방에 적절하다.

게다가, 본 발명에 의한 화합물은 패혈증, 패혈성 쇼크, 비-감염성 기원의 전신 염증성 반응 증후군 (SIRS), 출혈성 쇼크, 기관 기능장애 또는 다중 기관 부전 (MOF)을 갖는 패혈증 또는 SIRS, 외상성 쇼크, 독성 쇼크, 아나필락시스 쇼크, 두드러기, 곤충 쏘임 및 물림-관련된 알러지, 혈관신경성 부종 [거대 두드러기, 퀸케 부종], 급성 후두염 및 기관염 및 급성 폐쇄성 후두염 [상기도막힘증] 및 후두개염의 치료 및/또는 예방에 적절하다.

게다가, 화합물은 류마티스 타입의 질환 및 자가면역 질환으로서 간주되는 기타 질환 형태, 예컨대 다발성관절염, 홍반 루푸스, 공피증, 자색반증 및 혈관염 (이에 제한되지는 않음)의 치료 및/또는 예방에 적절하다.

게다가, 본 발명에 의한 화합물은 부종성 눈 장애 또는, 노년기 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증, 특히 당뇨병성 황반 부종 (DME), 망막하 부종 및 망막내 부종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 교란된 혈관 기능과 관련된 눈 장애의 치료에 적절하다. 본 발명의 문맥에서, 용어 노년기 황반 변성 (AMD)은 AMD의 습식 (또는 삼출성, 신생혈관) 및 건식 (또는 비-삼출성, 비신생혈관) 징후 모두를 포함한다.

게다가, 본 발명에 의한 화합물은 눈 고혈압 (녹내장)의 치료에 적절하다.

또한, 본 발명에 의한 화합물은 수술 인터벤션, 특히 심장-폐 기기 (예, 바이패스 수술, 심장 판막 이식체)를 사용한 심장에서의 특정 인터벤션, 경동맥에 대한 인터벤션, 대동맥에 대한 인터벤션 및 기계적 개방 또는 두개골의 관통과의 인터벤션 후 허혈증 및 그의 연속적 증상의 수술-관련된 상태의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.

게다가, 화합물은 상처 치유의 촉진 및 회복 시간의 단축을 목적으로 수술 인터벤션의 사례에서의 일반적인 치료 및/또는 예방에 적절하다. 이들은 상처 치유의 촉진에 적합하다.

게다가, 화합물은 골 밀도 및 구조의 장애, 예컨대 골다공증, 골연화증 및 부갑상선항진증-관련된 골 장애 (이에 제한되지는 않음)의 치료 및/또는 예방에 적절하다.

게다가, 화합물은 성기능 장애, 특히 남성 발기 부전의 치료 및/또는 예방에 적절하다.

바람직하게는 화합물은 심부전, 만성 심부전, 악화 중인 심부전, 급성 심부전, 급성 대상부전 심부전, 확장기 및 수축기 (울혈성) 심부전, 관상 동맥성 심장 질환, 허혈성 및/또는 출혈성 졸중, 고혈압, 폐동맥 고혈압, 말초 동맥 폐쇄성 질환, 전자간증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 급성 및/또는 만성 폐 부종, 흡입된 유기 분진 및 진균, 방선균 또는 다른 기원의 입자로 인한 알레르기성 폐포염 및/또는 폐장염, 및/또는 급성 화학성 기관지염, 급성 및/또는 만성 화학적 폐 부종, 신경원성 폐 부종, 방사선으로 인한 급성 및/또는 만성 폐 증상, 급성 및/또는 만성 간질성 폐 장애, 성인 또는 신생아를 포함한 어린이에서의 급성 폐 손상/급성 호흡 곤란 증후군 (ALI/ARDS), 폐렴 및 패혈증에 대한 2차 ALI/ARDS, 흡인 폐렴 및 흡인에 대한 2차 ALI/ARDS, 연기 가스 흡입에 대한 2차 ALI/ARDS, 수혈-관련 급성 폐 손상 (TRALI), 수술, 외상 및/또는 화상 후 ALI/ARDS 및/또는 급성 폐 기능부전, 및/또는 인공호흡기 유발된 폐 손상 (VILI), 태변 흡인후 폐 손상, 폐 섬유증, 고산병, 만성 신장 질환, 사구체신염, 급성 신장 손상, 심장콩팥 증후군, 림프부종, 염증성 장 질환, 패혈증, 패혈성 쇼크, 비-감염성 기원의 전신 염증성 반응 증후군 (SIRS), 아나필락시스 쇼크, 염증성 장 질환 및/또는 두드러기의 치료 및/또는 예방에 적절하다.

더욱 바람직하게는, 화합물은 심부전, 만성 심부전, 악화 중인 심부전, 급성 심부전, 급성 대상부전 심부전, 확장기 및 수축기 (울혈성) 심부전, 고혈압, 폐동맥 고혈압, 천식, 급성 및/또는 만성 화학적 폐 부종, 성인 또는 신생아를 포함한 어린이에서의 급성 폐 손상/급성 호흡 곤란 증후군 (ALI/ARDS), 폐렴 및 패혈증에 대한 2차 ALI/ARDS, 흡인 폐렴 및 흡인에 대한 2차 ALI/ARDS, 연기 가스 흡입에 대한 2차 ALI/ARDS, 수혈-관련 급성 폐 손상 (TRALI), 수술, 외상 및/또는 화상 후 ALI/ARDS 및/또는 급성 폐 기능부전, 및/또는 인공호흡기 유발된 폐 손상 (VILI), 태변 흡인후 폐 손상, 패혈증, 패혈성 쇼크, 비-감염성 기원의 전신 염증성 반응 증후군 (SIRS), 아나필락시스 쇼크, 염증성 장 질환 및/또는 두드러기의 치료 및/또는 예방에 적절하다.

본 발명은 추가로 장애, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 의한 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명은 추가로 장애, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명에 의한 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명은 추가로 본 발명에 의한 화합물의 활성량을 사용하는 장애, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 의한 화합물 및 하나 이상의 추가의 활성 성분을 포함하는 의약을 제공한다. 예시의 바람직한 활성 성분 조합은 ACE 억제제, 안지오텐신 수용체 길항제, 베타-2 수용체 효능제, 포스포디에스테라제 억제제, 글루코코르티코이드 수용체 효능제, 이뇨제 또는 재조합 안지오텐신 전환 효소-2 또는 아세틸살리실산 (아스피린)이다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 의한 화합물은 ACE 억제제, 예컨대 바람직하게는 에날라프릴, 퀴나프릴, 캅토프릴, 리시노프릴, 라미프릴, 델라프릴, 포시노프릴, 페린도프릴, 실라자프릴, 이미다프릴, 베나제프릴, 모엑시프릴, 시피라프릴 또는 트랜도프릴과 조합하여 투여된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 의한 화합물은 안지오텐신 수용체 길항제, 예컨대 바람직하게는, 로사르탄, 칸덴사르탄, 발사르탄, 텔미사르탄 또는 엠부사르탄과 조합하여 투여된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 의한 화합물은 베타-2 수용체 효능제, 예를 들면 바람직하게는 살부타몰, 피르부테롤, 살메테롤, 테르부탈린, 페노테롤, 툴로부테롤, 클렌부테롤, 레프로테롤 또는 포르모테롤과 조합하여 투여된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 의한 화합물은 포스포디에스테라제 (PDE) 억제제, 예를 들면 바람직하게는 밀리논, 암리논, 피모벤단, 실로스타졸, 실데나필, 바르데나필 또는 타달라필과 조합하여 투여된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 의한 화합물은 글루코코르티코이드 수용체 효능제, 예를 들면 바람직하게는 코르티오솔, 코르티손, 히드로코르티손, 프레드니손, 메틸-프리드니솔론, 프레드닐리덴, 데플라자코르트, 플루오코르톨론, 트리암시놀론, 덱사메타손 또는 베타메타손과 조합하여 투여된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 의한 화합물은 이뇨제, 예를 들면 바람직하게는 푸로세마이드, 토라세미드 및 히드로클로로티아지드와 조합하여 투여된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 의한 화합물은 나트륨이뇨 펩티드, 예컨대 네시리티드 (인간 B-타입 나트륨이뇨 펩티드 (hBNP)) 및 카르페리티드 (알파-인간 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드 (hANP))와 조합하여 투여된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 의한 화합물은 급성 심부전을 위한 개발 하에서 ANP의 유도체인 우로딜라틴과 조합하여 투여된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 의한 화합물은 LCZ696 (엔트레스토(Entresto)), 네프릴리신 (엔케팔리나제, 중성 엔도펩티다제, NEP, 또한 ADM의 대사에 포함됨) 억제제와 조합하여 투여된다.

본 발명은 추가로 본 발명에 의한 적어도 하나의 화합물을 통상적으로 하나 이상의 불활성, 비독성, 제약상 적합한 부형제와 함께 포함하는 의약 및 전술한 목적을 위한 그의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 의한 화합물은 전신 및/또는 국소 작용할 수 있다. 이를 위하여, 이들은 적절한 방식으로, 예를 들면 비경구, 폐, 코, 설하, 설측, 협측, 피부, 경피, 결막, 시각 경로에 의하여 또는 이식체 또는 스텐트로서 투여될 수 있다.

본 발명에 의한 화합물은 그러한 투여 경로에 적절한 투여 형태로 투여될 수 있다.

비경구 투여는 흡수 단계의 회피로 (예, 정맥내, 동맥내, 심장내, 척수내 또는 요추내) 또는 흡수를 포함하여 (예, 근육내, 피하, 피내, 경피 또는 복강내) 실시될 수 있다. 비경구 투여에 적절한 투여 형태는 액제, 현탁액, 에멀젼, 동결건조물 또는 무균 분말의 형태로 주사 및 주입을 위한 제제를 포함한다.

기타 투여 경로에 대하여서는 예를 들면 흡입을 위한 제약 형태 (분말 흡입기, 분무기 포함), 점비제, 점안제, 액제 또는 스프레이; 필름/웨이퍼 또는 수성 현탁액 (로션, 진탕 혼합물), 친유성 현탁액, 연고, 크림, 경피 치료계 (예, 패취), 밀크, 페이스트, 포옴, 더스팅 분말, 이식체 또는 스텐트가 적절하다.

비경구 투여는 특히 정맥내 투여가 바람직하다. 예를 들면 분말 흡입기 또는 분무기에 의한 흡입 투여도 또한 바람직하다.

본 발명에 의한 화합물은 표준 투여 형태로 전환될 수 있다. 이는 그 자체로 공지된 방식으로 불활성, 비독성, 제약상 적합한 부형제와 혼합하여 실시될 수 있다. 그러한 부형제는 담체 (예를 들면 미정질 셀룰로스, 락토스, 만니톨), 용매 (예, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 유화제 및 분산제 또는 습윤제 (예를 들면 소듐 도데실술페이트, 폴리옥시소르비탄 올레에이트), 결합제 (예를 들면 폴리비닐피롤리돈), 합성 및 천연 중합체 (예를 들면 알부민), 안정화제 (예, 항산화제, 예를 들면 아스코르브산), 착색제 (예, 무기 안료, 예를 들면 산화철) 및 풍미 및/또는 악취 차폐제를 포함한다.

일반적으로 비경구 투여의 경우 유효한 결과를 달성하기 위하여 약 0.001 내지 5 ㎎/㎏, 바람직하게는 약 0.01 내지 1 ㎎/㎏ 체중의 양을 투여하는 것이 이로운 것으로 밝혀졌다.

그럼에도 불구하고, 일부 경우에서는 특히 체중, 투여 경로, 활성 성분에 대한 개개의 반응, 제제의 성질 및, 투여가 실시되는 간격에 대하여 명시된 양으로부터 벗어나는 것이 필요할 수 있다. 예를 들면, 전술한 최소량 미만이 몇몇 경우에서는 충분할 수 있는 반면, 기타 경우에서는 명시된 상위 한계를 초과하여야 한다. 더 큰 양의 투여의 경우, 1일에 걸쳐 이를 복수의 개개의 투여량으로 분할하는 것이 권장할 만하다.

하기 작업예는 본 발명을 예시한다. 본 발명은 그러한 실시예에 제한되지 않는다.

하기 테스트 및 실시예에서의 퍼센트는 다른 의미로 명시되지 않는다면 중량%이며; 부는 중량부이다. 액체/액체 용액에 대한 용매비, 희석비 및 농도 데이터는 각각 부피를 기준으로 한다.

도면의 설명:
도 1: 내피 세포에서의 세포횡단 전기 저항 검정 (1b). 실시예 16을 사용한 처치는 ≥1 ㎚ol/ℓ의 농도에서 의존적으로 및 상당하게 트롬빈 투여량을 사용한 자극 후 HUVEC 단층의 전기 저항의 파괴(break down)를 감소시켰다. 수치를 4 데이터 포인트의 평균±SEM으로서 플롯하였다.
도 2: 내피 세포에서 시험관내 투과성 검정 (1c). 실시예 18을 사용한 처치는 ≥0.3 ㎚ol/ℓ의 농도에서 의존적으로 및 상당하게 트롬빈 투여량을 사용한 자극 후 FITC-덱스트란에 대한 HUVEC 단층의 투과성을 감소시켰다. 수치를 적어도 4 데이터 포인트의 평균±SEM으로서 플롯하였다.
도 3: 반감기 (느림)의 측정을 위한 2 상 붕괴 분석을 사용한 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software))로 계산한 혈장 중 펩티드 안정성 (테스트 1e). 대조군: TAM[G¹⁴]ADM(14-52); 실시예 18: TAM[K¹⁴(PAM), (Dpr¹⁶, E²¹)_lac]ADM(14-52); 및 실시예 27: TAM[K¹⁴(PAM), (Dpr¹⁶, E²¹)_lac, Nα-Me-K⁴⁶]ADM(14-52)의 N-말단 6-카르복시테트라메틸로다민-(TAM)-표지된 유사체.
도 4: 과립구 이행(transmigration) 검정 (테스트 1f). 실시예 18을 사용한 처치는 농도 1 ≥nmol/ℓ에서 상당하게 TNF-α 자극된 HUVEC를 통한 PMNS의 이행이 감소되었다. 수치는 7회 반복, 비히클 대조군 n=12의 평균±SEM으로서 플롯하였다. 항 ICAM-1 항체는 양성 대조군, n=6으로서 작용한다.
도 5: 원격측정된, 정상압 위스타(Wistar) 래트에서 혈압 및 심박수의 측정. (테스트 2a) 평균 동맥 혈압 (MABP)의 24 시간 프로파일은 제시된 바와 같은 투여량에서 실시예 18 또는 비히클의 피하 투여 후 원격측정된, 정상압 암컷 위스타 래트로부터 기록하였다 (점선). 데이터 포인트는 군당 6 마리 동물로부터 평균 30 분 간격의 평균±SEM으로서 플롯하였다. 실시예 18의 100 ㎍/㎏의 투여량에서의 투여는 투여후 3.5 시간이 될 때까지 MABP를 약 20 내지 25% 감소시켰다 (검은색 원). 투여 후 4 시간 및 8 시간 사이에서 MABP는 기준선 값으로 서서히 돌아갔으며, 최종적으로 비히클 처치된 동물의 범위내에 포함되었다.

야생형 아드레노메둘린 (바켐(Bachem), H-2932)은 본 테스트에서 ≤300 ㎍/㎏ 체중의 투여량에서 테스트시 ≤4 h의 지속기간으로 혈압 강하를 유발하였다 (참조 WO 2013/064508 A1, 도 1). 본 발명에 의한 물질은 ≤200 ㎍/㎏ 체중의 투여량에서 8 시간까지의 혈압 강하를 유발하였다 (펩티드 성분으로 지칭한 바와 같음).

A. 실시예

아드레노메둘린 -유사체

약어

아미노산 및 펩티드 서열의 명명법은 하기를 따른다:

(International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry: Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (Recommendations 1983). In: Pure & Appl . Chem . 56, Vol. 5, 1984, p. 595-624)

실시예 리스트:

- 괄호 안에서 쉼표로 분리된 아미노산 (…)_lac은 해당 아미노산 16 및 21의 측쇄 사이의 락탐-가교를 나타냄;

- 괄호 안에서 화살표로 분리된 아미노산 (…→…)은 해당 아미노산 16 및 21의 디술피드 결합 모방체의 혼입을 나타냄;

- (PAM)은 해당 아미노산의 측쇄로의 팔미트산의 부착을 나타냄;

- PAM-은 펩티드의 N-말단으로의 팔미트산의 부착을 나타냄.

방법

일반적인 정보:

모든 반응 및 절차는 실온에서 수행하였다. 각각의 커플링 및 탈보호 단계 후, 수지를 용매로 세정하여 과잉의 시약을 제거하였다.

펩티드 합성에 대한 일반적인 방법:

노바신(NovaSyn)®TGR R 수지 (노바바이오켐(Novabiochem)) 상에서 자동화 펩티드 합성기 (시로(SYRO) I, 멀티신테크(MultiSynTech))를 사용하여 ADM 유사체를 단계적으로 합성하였다. 반응 용기에 15 μmol 노바신®TGR R 수지를 로딩하였다. 각각의 아미노산 및 시약 옥시마(Oxyma) 및 DIC를 8-배 몰 과잉 (120 μmol)으로 첨가하였다. 다른 의미로 나타내지 않는다면, 아미노산을 N-α-Fmoc-보호하고; 하기 제시된 보호기를 측쇄 작용기에 사용하였다. 모든 반응은 DMF 중에서 수행하였다. 각각의 커플링 단계는 40 분의 반응 시간으로 2회 수행하였다. Fmoc 보호기의 절단은 각각의 커플링 단계 후 DMF 중의 40% 피페리딘 (v/v)을 사용하여 3 분 동안 및 DMF 중의 20% 피페리딘 (v/v)을 사용하여 10 분 동안 달성하였다.

락탐- 가교된 아드레노메둘린 -유사체 실시예 1 및 2

합성:

실시예 1 및 2는 상기 기재된 일반적인 방법을 사용하여 합성하였다.

커플링 서열은 하기와 같다:

서열 ADM(15-52)의 자동화된 합성 후, 실시예 1의 경우 아미노산 Fmoc-Glu(OPp) (AA 16) 및 Fmoc-Gly-OH (AA 15)뿐 아니라 실시예 1 및 2의 경우 N-말단 아미노산 Boc-Gly-OH를 수동으로 HOBt 및 DIC로 5-배 몰 과잉으로 커플링시켰다. 반응은 용매로서 DMF 중에서 24 시간 동안 수행하였다.

OPp 및 Mmt 보호기의 제거는 TFA/TIS/DCM (1:5:94, v/v/v)로 이루어진 절단 칵테일로 수지 (20×2 min)를 처리하여 달성하였다. 그 후, 수지를 DMF 중의 5% DIPEA로 세정하였다 (2×5 min).

락탐-가교는 AA 16 및 AA 21의 측쇄들 사이에서 아미드 결합의 형성에 의하여 도입하였다. 반응은 용매로서 DMF 중의 10-배 과잉 (150 μmol)의 HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 수행하였다.

수지로부터 펩티드의 절단 및 동시 측쇄 탈보호는 TFA/TIS/H₂O (90:3.5:3.5, v/v/v)를 사용하여 3 시간 동안 달성하였다. 펩티드를 침전시키고, 빙냉 디에틸 에테르로 세정한 후, 동결건조시켰다.

미정제 펩티드의 정제는 정제용 RP-HPLC를 사용하여 C18-컬럼 (페노메넥스 주피터(Phenomenex Jupiter) 10u 프로테오(Proteo) 90 Å: 250 ㎜×21.2 ㎜, 10 ㎛, 90 Å) 상에서 수행하였다. 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배를 적용하였다 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA). 유량은 10 ㎖/min이었으며, UV 검출은 λ=220 ㎚에서 측정하였다.

분석:

펩티드의 정체는 분석적 RP-HPLC, MALDI-MS (울트라플렉스(Ultraflex) III, 브루커(Bruker)) 및 ESI-MS (HCT, 브루커)에 의하여 확인하였다. 순도는 분석적 RP-HPLC를 사용하여 분석하였다.

실시예 1: [G¹⁴, (E¹⁶,K²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,23S)-23-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,20,24-헥사옥소-1,4,7,10,13,19-헥사아자시클로테트라코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₅H₃₀₆N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4388.278 Da

분자량: 4,390.94 g/mol

실시예 1은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 6.0 ㎎ (이론치의 9.0%)이었다.

실시예 1은 분석적 RP-HPLC에 의하여 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배를 적용하는 주피터 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=30.4 min, 순도 ≥90%.

게다가, 60 분에 걸친 A 중의 10% 내지 100% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하였다. R_t=21.7 min, 순도 ≥90%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1098.5 [M+4H]⁴⁺, 879.1 [M+5H]⁵⁺, 732.8 [M+6H]⁶⁺, 628.4 [M+7H]⁷⁺, 550.1 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4389.4 [M+H]⁺, 2195.1 [M+2H]²⁺.

실시예 2: [G¹⁴, (K¹⁶,E²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,23S)-23-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,17,24-헥사옥소-1,4,7,10,13,18-헥사아자시클로테트라코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₅H₃₀₆N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4388.278 Da

분자량: 4390.94 g/mol

실시예 2는 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 3.8 ㎎ (이론치의 5.8%)이다.

실시예 2는 분석적 RP-HPLC에 의하여 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 0.6 ㎖/min의 유량)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=30.1 min, 순도 ≥90%.

게다가, 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=1.25 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 키네텍스(Kinetex)® 5 ㎛ XB-C18 컬럼 (페노메넥스, 250×4.6 ㎜, 5 ㎛, 100 Å)을 사용하였다. R_t=23.0 min, 순도 ≥90%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1098.5 [M+4H]⁴⁺, 879.1 [M+5H]⁵⁺, 732.8 [M+6H]⁶⁺, 628.4 [M+7H]⁷⁺, 547.9 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4389.4 [M+H]⁺, 2195.0 [M+2H]²⁺, 1464.0 [M+3H]³⁺.

락탐- 가교된 아드레노메둘린 -유사체 실시예 3-11, 19-22 및 26

합성:

실시예 3-8, 10, 11 및 19-22의 합성은 일반적인 방법에서 기재된 바와 같이 서열 ADM(22-52)의 자동화 펩티드 합성을 사용하여 수행하였다. 그 후, 위치 21 내지 14를 수동으로 혼입하였다. 실시예 9의 서열 [G¹⁴, Orn¹⁶(ivDde), D²¹(OPp)]ADM(14-52) 및 실시예 26의 [G¹⁴, D¹⁶(OPp), Dpr²¹(Mtt)]ADM(14-52)은 일반적인 방법에 기재된 바와 같이 자동화 방식으로 합성하였다. 모든 화합물의 N-말단은 Boc Gly-OH를 말단 아미노산으로서 혼입한 실시예 9 및 26의 경우를 제외하고 Fmoc로 보호하였다.

ADM(22-52)의 커플링 서열은 하기와 같다:

화합물 9 및 26의 커플링 서열은 하기와 같다:

화합물 3-8, 10, 11 및 19-22의 아미노산 21 (하기 표 참조)은 용매로서 DMF 중의 5-배 몰 과잉의 아미노산, HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 수동으로 커플링시켰다. 차후의 Fmoc-탈보호는 수지를 DMF 중의 20% 피페리딘 (v/v)으로 10 분 동안 2회 처리하여 달성하였다.

화합물 3-8, 10, 11 및 19-22의 하기 4종의 아미노산은 용매로서 DMF 중의 5-배 과잉의 아미노산, HOBt 및 DIC을 사용하여 약 24 시간 동안 수동으로 커플링시켰다. 처음 3개의 커플링 후 Fmoc-탈보호는 수지를 DMF 중의 20% 피페리딘 (v/v)으로 10 분 동안 2회 처리하여 수행하였다.

커플링 서열은 하기와 같다:

실시예 3-8, 10, 11 및 19-22의 아미노산 16 (하기 표 참조)을 용매로서 DMF 중의 5-배 몰 과잉의 아미노산, HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 수동으로 커플링시켰다. 차후의 Fmoc-탈보호는 수지를 DMF 중의 20% 피페리딘 (v/v)으로 10 분 동안 2회 처리하여 달성하였다.

화합물 3-8, 10, 11 및 19-22의 하기 2종의 아미노산은 용매로서 DMF 중의 5-배 몰 과잉의 아미노산, HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 수동으로 커플링시켰다. 제1의 커플링 후 Fmoc-탈보호는 수지를 DMF 중의 20% 피페리딘 (v/v)으로 5 분 동안 2회 처리하여 달성하였다.

커플링 서열은 하기와 같다:

Dde/ivDde 탈보호기의 동시 제거의 경우 화합물 4-6 및 8-11, 19 및 20의 수지를 DMF 중의 3% 히드라진 일수화물 (v/v) (15×10 min, 1 ㎖)로 처리하였다.

하기 단계는 화합물 3-11, 19-22 및 26의 합성에 적용하였다.

Mmt/OPp 탈보호기의 동시 제거의 경우 수지를 TFA/TIS/DCM (2:5:93, v/v/v) (15×2 min, 1 ㎖)으로 처리하였다. 그 후, 수지를 DMF 중의 2% DIPEA (v/v) (1 ㎖)로 10 분 동안 2회 세정하였다.

고리화는 용매로서 DMF 중의 HOBt 및 DIC의 6배 과잉을 사용하여 약 24 시간 동안 수행하였다.

수지로부터 펩티드의 절단 및 동시 측쇄 탈보호는 TFA/TA/EDT (90:7:3, v/v/v)를 사용하여 약 3 시간 동안 달성하였다. 펩티드를 침전시키고, 빙냉 디에틸 에테르/n-헥산 (4/1; v/v)으로 세정한 후, 동결건조시켰다.

화합물 3-11, 19 및 20의 정제는 정제용 RP-HPLC를 사용하여 C18-컬럼 (엑스브릿지(XBridge) BEH130 Prep C18 10 ㎛ OBD: 250 ㎜×19 ㎜, 10 ㎛) 상에서 수행하였다. 30 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 45% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA)를 적용하였다. 유량은 20 ㎖/min이었으며, UV 검출은 λ=220 ㎚에서 측정하였다.

화합물 21, 22 및 26의 정제는 C18-컬럼 (키네텍스® 5 ㎛ XB-C18 100Å: 250 ㎜×21.2 ㎜, 5 ㎛) 상에서 정제용 RP-HPLC를 사용하여 수행하였다. 30 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 45% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA)를 적용하였다. 유량은 20 ㎖/min이었으며, UV 검출은 λ=220 ㎚에서 측정하였다.

분석:

펩티드의 정체는 MALDI-MS (울트라플렉스III, 브루커) 및 ESI-MS (HCT, 브루커)에 의하여 확인하였다. 순도는 분석적 RP-HPLC를 사용하여 분석하였다.

실시예 3: [G¹⁴, (Dpr¹⁶, D²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,19S)-19-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,16,20-헥사옥소-1,4,7,10,13,17-헥사아자시클로이코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₁H₂₉₈N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4332.215 Da

분자량: 4334.83 g/mol

실시예 3은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 1.9 ㎎ (이론치의 2.9%)이었다.

실시예 3은 분석적 RP-HPLC에 의하여 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=27.8 min, 순도 ≥95%.

게다가, 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하였다. R_t=31.3 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1084.5 [M+4H]⁴⁺, 867.8 [M+5H]⁵⁺, 723.5 [M+6H]⁶⁺, 620.3 [M+7H]⁷⁺, 542.8 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4333.2 [M+H]⁺, 2167.1 [M+2H]²⁺.

실시예 4: [G¹⁴, (D¹⁶, Dab²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,20S)-20-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,18,21-헥사옥소-1,4,7,10,13,17-헥사아자시클로헤니코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₂H₃₀₀N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4346.231 Da

분자량: 4348.86 g/mol

실시예 4는 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 1.8 ㎎ (이론치의 2.6%)이었다.

실시예 4는 분석적 RP-HPLC에 의하여 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=26.3 min, 순도 ≥95%.

게다가, 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하였다. R_t=29.5 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1088.3 [M+4H]⁴⁺, 870.7 [M+5H]⁵⁺, 725.9 [M+6H]⁶⁺, 622.2 [M+7H]⁷⁺, 544.5 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4347.2 [M+H]⁺, 2174.1[M+2H]²⁺.

실시예 5: [G¹⁴, (Dab¹⁶, D²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,20S)-20-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,16,21-헥사옥소-1,4,7,10,13,17-헥사아자시클로헤니코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₂H₃₀₀N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4346.231 Da

분자량: 4348.86 g/mol

실시예 5는 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 1.4 ㎎ (이론치의 1.9%)이었다.

실시예 5는 분석적 RP-HPLC에 의하여 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=26.1 min, 순도 ≥90%.

게다가, 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하였다. R_t=29.1 min, 순도 ≥90%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1088.1 [M+4H]⁴⁺, 870.7 [M+5H]⁵⁺, 725.8 [M+6H]⁶⁺, 622.2 [M+7H]⁷⁺, 544.5 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4347.2 [M+H]⁺, 2174.1[M+2H]²⁺.

실시예 6: [G¹⁴, (E¹⁶, Dpr²¹)_lac]ADM(14-52)

((3S,6S,12S,15S,18S)-18-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-12-벤질-15-(3-구아니디노프로필)-6-((R)-1-히드록시에틸)-5,8,11,14,17,21-헥사옥소-1,4,7,10,13,16-헥사아자시클로헤니코산-3-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₂H₃₀₀N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4346.231 Da

분자량: 4348.86 g/mol

실시예 6은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 1.2 ㎎ (이론치의 1.7%)이었다.

실시예 6은 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)의 선형 구배를 적용하여 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=22.9 min, 순도 ≥95%.

게다가, 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=22.6 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량 ESI 이온-트랩에 해당한다: m/z = 1088.3 [M+4H]⁴⁺, 870.6 [M+5H]⁵⁺, 725.7 [M+6H]⁶⁺, 622.2 [M+7H]⁷⁺, 544.5 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4347.2 [M+H]⁺, 2174.1[M+2H]²⁺.

실시예 7: [G¹⁴, (Dpr¹⁶, E²¹)_lac]ADM(14-52)

((3S,9S,12S,15S,21S)-15-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-9-벤질-12-(3-구아니디노프로필)-3-((R)-1-히드록시에틸)-2,5,8,11,14,18-헥사옥소-1,4,7,10,13,17-헥사아자시클로헤니코산-21-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₂H₃₀₀N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4346.231 Da

분자량: 4348.86 g/mol

실시예 7은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 1.8 ㎎ (이론치의 2.7%)이었다.

실시예 7은 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=23.4 min, 순도 ≥95%.

게다가, 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하였다. R_t=23.2 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량 ESI 이온-트랩에 해당한다: m/z = 1088.6 [M+4H]⁴⁺, 870.6 [M+5H]⁵⁺, 725.7 [M+6H]⁶⁺, 622.2 [M+7H]⁷⁺, 544.5 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4347.2 [M+H]⁺, 2174.0[M+2H]²⁺.

실시예 8: [G¹⁴, (D¹⁶, Orn²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,21S)-21-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,19,22-헥사옥소-1,4,7,10,13,18-헥사아자시클로도코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₃H₃₀₂N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4360.247 Da

분자량: 4362.89 g/mol

실시예 8은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 2.4 ㎎ (이론치의 3.7%, 순도 ≥95%)이다.

실시예 8은 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=23.1 min, 순도 ≥95%.

게다가, 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하였다. R_t=22.8 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량 ESI 이온-트랩에 해당한다: m/z = 1091.5 [M+4H]⁴⁺, 873.8 [M+5H]⁵⁺, 728.1 [M+6H]⁶⁺, 624.3 [M+7H]⁷⁺, 546.3 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4361.3 [M+H]⁺, 2181.1 [M+2H]²⁺.

실시예 9: [G¹⁴, (Orn¹⁶, D²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,21S)-21-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,16,22-헥사옥소-1,4,7,10,13,17-헥사아자시클로도코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₃H₃₀₂N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4360.247 Da

분자량: 4362.89 g/mol

실시예 9는 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 7.9 ㎎ (이론치의 12.1%)이었다.

실시예 9는 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=23.1 min, 순도 ≥95%.

게다가, 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하였다. R_t=22.9 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량 ESI 이온-트랩에 해당한다: m/z = 1091.7 [M+4H]⁴⁺, 873.5 [M+5H]⁵⁺, 728.1 [M+6H]⁶⁺, 624.3 [M+7H]⁷⁺, 546.3 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4361.2 [M+H]⁺, 2181.0 [M+2H]²⁺.

실시예 10: [G¹⁴, (E¹⁶, Dab²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,21S)-21-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,18,22-헥사옥소-1,4,7,10,13,17-헥사아자시클로도코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₃H₃₀₂N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4360.247 u

분자량: 4362.89 g/mol

실시예 10은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 1.9 ㎎ (이론치의 3.0%)이었다.

실시예 10은 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=22.5 min, 순도 ≥95%.

게다가, 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하였다. R_t=22.3 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량 ESI 이온-트랩에 해당한다: m/z = 1091.7 [M+4H]⁴⁺, 873.6 [M+5H]⁵⁺, 728.1 [M+6H]⁶⁺, 624.3 [M+7H]⁷⁺, 546.3 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4361.2 [M+H]⁺, 2181.0 [M+2H]²⁺.

실시예 11: [G¹⁴, (Dab¹⁶,E²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,21S)-21-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,17,22-헥사옥소-1,4,7,10,13,18-헥사아자시클로도코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₃H₃₀₂N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4360.247 Da

분자량: 4362.89 g/mol

실시예 11은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 1.5 ㎎ (이론치의 2.3%)이었다.

실시예 11은 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=22.8 min, 순도 ≥95%.

게다가, 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하였다. R_t=22.6 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량 ESI 이온-트랩에 해당한다: m/z = 1091.9 [M+4H]⁴⁺, 873.5 [M+5H]⁵⁺, 728.1 [M+6H]⁶⁺, 624.3 [M+7H]⁷⁺, 546.3 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4361.2 [M+H]⁺, 2181.0 [M+2H]²⁺.

실시예 19: [G¹⁴,(E¹⁶,Orn²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,22S)-22-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,19,23-헥사옥소-1,4,7,10,13,18-헥사아자시클로트리코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₄H₃₀₄N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4374.26 Da

분자량: 4376.91 g/mol

실시예 19는 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 1.6 ㎎ (이론치의 2.4%)이었다.

실시예 19는 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=23.2 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량 ESI 이온-트랩에 해당한다: m/z = 1095.4 [M+4H]⁴⁺, 876.4 [M+5H]⁵⁺, 730.5 [M+6H]⁶⁺, 626.3 [M+7H]⁷⁺, 548.1 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4375.3 [M+H]⁺, 2188.0 [M+2H]²⁺.

실시예 20: [G¹⁴, (Orn¹⁶,E²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,22S)-22-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,17,23-헥사옥소-1,4,7,10,13,18-헥사아자시클로트리코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₄H₃₀₄N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4374.26 Da

분자량: 4376.91 g/mol

실시예 20은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 1.7 ㎎ (이론치의 2.6%)이었다.

실시예 20은 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=22.8 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량 ESI 이온-트랩에 해당한다: m/z = 1095.4 [M+4H]⁴⁺, 876.3 [M+5H]⁵⁺, 730.5 [M+6H]⁶⁺, 626.3 [M+7H]⁷⁺, 548.1 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4375.2 [M+H]⁺, 2188.0 [M+2H]²⁺.

실시예 21: [G¹⁴, (K¹⁶,D²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,22S)-22-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,16,23-헥사옥소-1,4,7,10,13,17-헥사아자시클로트리코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₄H₃₀₄N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4374.26 Da

분자량: 4376.91 g/mol

실시예 21은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 0.3 ㎎ (이론치의 0.5%)이었다.

실시예 21은 분석적 RP-HPLC에 의하여 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=26.1 min, 순도 ≥95%.

게다가, 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하였다. R_t=25.9 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량 ESI 이온-트랩에 해당한다: m/z = 1095.5 [M+4H]⁴⁺, 876.3 [M+5H]⁵⁺, 730.5 [M+6H]⁶⁺, 626.3 [M+7H]⁷⁺, 548.1 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4375.2 [M+H]⁺, 2188.1 [M+2H]²⁺, 1459.1 [M+3H]³⁺.

실시예 22: [G¹⁴, (D¹⁶,K²¹)_lac]ADM(14-52)

((3S,9S,12S,15S,23S)-15-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-9-벤질-12-(3-구아니디노프로필)-3-((R)-1-히드록시에틸)-2,5,8,11,14,17-헥사옥소-1,4,7,10,13,18-헥사아자시클로트리코산-23-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₄H₃₀₄N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4374.26 Da

분자량: 4376.91 g/mol

실시예 22는 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 0.8 ㎎ (이론치의 1.2%)이었다.

실시예 22는 분석적 RP-HPLC에 의하여 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=25.9 min, 순도 ≥95%.

게다가, 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하였다. R_t=25.8 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량 ESI 이온-트랩에 해당한다: m/z = 1095.0 [M+4H]⁴⁺, 876.3 [M+5H]⁵⁺, 730.5 [M+6H]⁶⁺, 626.3 [M+7H]⁷⁺, 548.1 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4375.2 [M+H]⁺, 2188.1 [M+2H]²⁺, 1459.1 [M+3H]³⁺.

실시예 26: [G¹⁴, (D¹⁶, Dpr²¹)_lac]ADM(14-52)

((3S,6S,12S,15S,18S)-18-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-12-벤질-15-(3-구아니디노프로필)-6-((R)-1-히드록시에틸)-5,8,11,14,17,20-헥사옥소-1,4,7,10,13,16-헥사아자시클로이코산-3-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₁H₂₉₈N₅₈O₅₈

정확한 질량: 4332.215 Da

분자량: 4334.83 g/mol

실시예 26은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 3.8 ㎎ (이론치의 5.8%)이었다.

실시예 26은 분석적 RP-HPLC에 의하여 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=26.1 min, 순도 ≥90%.

게다가, 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하였다. R_t=26.1 min, 순도 ≥90%.

관찰된 질량은 계산된 질량 ESI 이온-트랩에 해당한다: m/z = 1084.5 [M+4H]⁴⁺, 867.9 [M+5H]⁵⁺, 723.5 [M+6H]⁶⁺, 620.3 [M+7H]⁷⁺, 542.9 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4333.2 [M+H]⁺, 2167.1 [M+2H]²⁺.

팔미토일화된 락탐- 가교된 아드레노메둘린 -유사체 12, 13 및 18

합성:

실시예 12, 13 및 18은 상기 기재된 일반적인 방법을 사용하여 합성하였다.

커플링 서열은 하기와 같다:

서열 ADM(15-52)의 자동화 합성 후, 실시예 12 및 13의 경우 N-말단 아미노산 Boc-Lys(Fmoc)-OH를 HOBt 및 DIC로 5-배 몰 과잉 (75 μmol)으로 수동 커플링시켰다. 반응은 용매로서 DMF 중에서 24 시간 동안 수행하였다.

실시예 18의 경우, Fmoc-Glu(OPp)-OH (AA 21)는 용매로서 DMF 중의 5-배 몰 과잉의 아미노산, HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 수동으로 커플링시켰다. Fmoc-탈보호 후, 펩티드 서열은 상기 기재된 일반적인 방법을 사용하여 자동 신장시켰다.

커플링 서열은 하기와 같다:

실시예 18의 경우, Fmoc-Dpr(Mtt)-OH (AA 16)는 용매로서 DMF 중의 5-배 몰 과잉의 아미노산, HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 수동으로 커플링시켰다.

OPp, Mmt 및 Mtt 보호기의 제거는 수지 (20×2 min)를 실시예 12 및 13의 경우 TFA/TIS/DCM (1:5:94, v/v/v) 및 실시예 18의 경우 TFA/TIS/DCM (2:5:93, v/v/v)으로 이루어진 절단 칵테일로 처리하여 달성하였다. 그 후, 수지를 실시예 12 및 13의 경우 DMF 중의 5% DIPEA 및 실시예 16의 경우 DMF 중의 2% DIPEA로 세정하였다 (2×5 min).

락탐-가교를 AA 16 및 AA 21의 측쇄 사이의 아미드 결합의 형성에 의하여 도입하였다. 반응을 용매로서 DMF 중의 실시예 12 및 13의 경우 10-배 과잉 (150 μmol) 및 실시예 18의 경우 6-배 과잉의 (90 μmol)의 HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 실온에서 수행하였다.

실시예 18의 경우 아미노산 Fmoc-Gly-OH (AA 15) 및 Boc-Lys(Fmoc)-OH (AA 14)를 HOBt 및 DIC로 5-배 몰 과잉 (75 μmol)으로 수동으로 커플링시켰다. 반응은 용매로서 DMF 중에서 24 시간 동안 수행하였다.

그 후, Fmoc를 N-말단 리신으로부터 DMF 중의 30% 피페리딘 (v/v)을 사용하여 10 분 동안 2회 제거하였다.

유리 리신 측쇄의 팔미토일화는 용매로서 DMF 중의 5-배 과잉 (75 μmol)의 팔미트산, HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 달성하였다.

수지로부터 펩티드의 절단 및 동시 측쇄 탈보호는 실시예 12 및 13의 경우 TFA/TIS/H₂O (90:5:5, v/v/v) 및 실시예 18의 경우 TFA/TA/EDT (90:7:3, v/v/v)를 사용하여 3 시간 동안 달성하였다. 펩티드를 침전시키고, 빙냉 디에틸 에테르로 세정한 후, 동결건조시켰다.

미정제 펩티드의 정제는 C18-컬럼 (페노메넥스 주피터 10u 프로테오 90 Å: 250 ㎜×21.2 ㎜, 10 ㎛, 90 Å) 상의 정제용 RP-HPLC를 사용하여 수행하였다. 실시예 12의 경우 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배, 실시예 13의 경우 50 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA)를 적용하였다. 유량은 실시예 12의 경우 10 ㎖/min 및 실시예 13의 경우 15 ㎖/min이었으며, UV 검출은 λ=220 ㎚에서 측정하였다.

실시예 18의 정제는 정제용 RP-HPLC를 사용하여 C18 컬럼 (키네텍스® 5 ㎛ XB-C18 100Å: 250 ㎜×21.2 ㎜, 5 ㎛) 상에서 수행하였다. 50 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA)를 적용하였다. 유량은 20 ㎖/min이었으며, UV 검출은 λ=220 ㎚에서 측정하였다.

분석:

실시예 12: [K¹⁴(PAM), (E¹⁶,K²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,23S)-23-(2-((S)-2-아미노-6-팔미타미도헥산아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,20,24-헥사옥소-1,4,7,10,13,19-헥사아자시클로테트라코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₂₁₅H₃₄₅N₅₉O₅₉

정확한 질량: 4697.58 Da

분자량: 4700.47 g/mol

실시예 12는 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 5.3 ㎎ (이론치의 7.6%)이었다.

실시예 12는 분석적 RP-HPLC에 의하여 50 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=39.7 min, 순도 ≥95%.

게다가, 60 분에 걸친 A 중의 10% 내지 100% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하였다. R_t=30.7 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1175.9 [M+4H]⁴⁺, 941.0 [M+5H]⁵⁺, 784.4 [M+6H]⁶⁺, 672.6 [M+7H]⁷⁺, 588.8 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4698.8 [M+H]⁺, 2349.7 [M+2H]²⁺.

실시예 13: [K¹⁴(PAM), (K¹⁶,E²¹)_lac]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,23S)-23-(2-((S)-2-아미노-6-팔미타미도헥산아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,17,24-헥사옥소-1,4,7,10,13,18-헥사아자시클로테트라코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₂₁₅H₃₄₅N₅₉O₅₉

정확한 질량: 4697.58 Da

분자량: 4700.47 g/mol

실시예 13은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 3.5 ㎎ (이론치의 5.0%)이었다.

실시예 13은 분석적 RP-HPLC에 의하여 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=41.2 min, 순도 ≥95%.

또한, 60 분에 걸친 A 중의 10% 내지 100% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 사용하였다. R_t=30.8 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1175.9 [M+4H]⁴⁺, 941.0 [M+5H]⁵⁺, 784.4 [M+6H]⁶⁺, 672.6 [M+7H]⁷⁺, 588.8 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4698.7 [M+H]⁺, 2349.75 [M+2H]²⁺.

실시예 18: [K¹⁴(PAM), (Dpr¹⁶,E²¹)_lac]ADM(14-52)

((3S,9S,12S,15S,21S)-15-(2-((S)-2-아미노-6-팔미타미도헥산아미도)아세트아미도)-9-벤질-12-(3-구아니디노프로필)-3-((R)-1-히드록시에틸)-2,5,8,11,14,18-헥사옥소-1,4,7,10,13,17-헥사아자시클로헤니코산-21-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₂₁₂H₃₃₉N₅₉O₅₉

정확한 질량: 4655.53 Da

분자량: 4658.40 g/mol

실시예 18은 15μmol 규모로 합성하였다. 수율은 2.4 ㎎ (이론치의 3.4%)이었다.

실시예 18은 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=34.1 min, 순도 ≥95%.

게다가, 50 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하였다. R_t=29.4 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1165.5 [M+4H]⁴⁺, 932.7 [M+5H]⁵⁺, 777.3 [M+6H]⁶⁺, 666.5 [M+7H]⁷⁺, 583.3 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4656.6 [M+H]⁺, 2328.7 [M+2H]²⁺.

N-메틸화된 이소류신 ⁴⁷ 을 갖는 아드레노메둘린 -유사체 14

합성:

서열 ADM(48-52)은 상기 기재된 일반적인 방법을 사용하여 합성하였다. 커플링 서열은 하기와 같다:

서열 ADM(48-52)의 자동화된 합성 후, Fmoc-보호된 N-메틸화된 이소류신을 HOBt 및 DIC로 5-배 몰 과잉으로 수동으로 커플링시켰다. 반응은 용매로서 DMF 중에서 24 시간 동안 수행하였다.

Fmoc 보호기의 제거 후, Fmoc-Lys(Boc)-OH를 DMF/DCM/NMP (1:1:1, v/v/v) 중의 5-배 몰 과잉의 아미노산 및 10-배 몰 과잉 (150 μmol)의 HOBt 및 DIC로 수동으로 커플링시켰다. 1,300 rpm으로 (써모믹서(Thermomixer), 에펜도르프(Eppendorf)) 24 시간 동안 진탕시키면서 반응을 50℃에서 수행하였다.

그 후, 펩티드 쇄의 신장은 상기 기재된 일반적인 방법을 사용하여 수행하였다. 커플링 서열은 하기와 같다:

신장 후 N-말단 아미노산 Boc-Lys(Fmoc)-OH을 용매로서 DMF 중의 5-배 몰 과잉 (75 μmol)으로 약 24 시간 동안 HOBt 및 DIC로 수동으로 커플링시켰다.

OPp 및 Mmt 보호기의 제거는 수지 (15×2 min)를 TFA/TIS/DCM (2:5:93, v/v/v)으로 이루어진 절단 칵테일로 처리하여 달성하였다. 그 후, 수지를 DMF 중의 5% DIPEA로 세정하였다 (2×5 min).

락탐-가교는 AA 16 및 AA 21의 측쇄들 사이에서 아미드 결합의 형성에 의하여 도입되었다. 반응은 용매로서 DMF 중의 HOBt 및 DIC의 10-배 과잉 (150 μmol)을 사용하여 약 24 시간 동안 수행하였다.

그 후, Fmoc는 N-말단 리신으로부터 DMF 중의 30% 피페리딘 (v/v)을 사용하여 10 분 동안 2회 제거하였다.

유리 리신 측쇄의 팔미토일화는 용매로서 DMF 중의 팔미트산, HOBt 및 DIC의 5-배 과잉 (75 μmol)을 사용하여 약 24 시간 동안 달성하였다.

수지로부터 펩티드의 절단 및 동시 측쇄 탈보호는 TFA/TA/EDT (90:7:3, v/v/v)를 사용하여 약 3 시간 동안 달성하였다. 펩티드를 침전시키고, 빙냉 디에틸 에테르로 세정한 후, 동결건조시켰다.

미정제 펩티드의 정제는 정제용 RP-HPLC를 사용하여 C18-컬럼 (페노메넥스 주피터 10u 프로테오 90 Å: 250 ㎜×21.2 ㎜, 10 ㎛, 90 Å) 상에서 수행하였다. 50 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA)를 적용하였다. 유량은 10 ㎖/min이었으며, UV 검출은 λ=220 ㎚에서 측정하였다.

분석:

실시예 14: [K¹⁴(PAM), (E¹⁶,K²¹)_lac, N-Me-I⁴⁷]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,23S)-23-(2-((S)-2-아미노-6-팔미타미도헥산아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,20,24-헥사옥소-1,4,7,10,13,19-헥사아자시클로테트라코산-14-카르보닐)-L-트레오닐-[N-Me-I⁴⁷]ADM(22-52)

화학식: C₂₁₆H₃₄₇N₅₉O₅₉

정확한 질량: 4711.60 Da

분자량: 4714.49 g/mol

실시예 14는 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 0.6 ㎎ (이론치의 0.9%)이었다.

실시예 14는 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=34.3 min, 순도 ≥90%.

게다가, 40 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 바이닥(Vydac) 218TP C18 컬럼 (그레이스 바이닥(Grace Vydac), 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하였다. R_t=30.9 min, 순도 ≥90%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1179.6 [M+4H]⁴⁺, 943.8 [M+5H]⁵⁺, 786.8 [M+6H]⁶⁺, 674.5 [M+7H]⁷⁺, 590.3 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4712.74 [M+H]⁺, 2356.7 [M+2H]²⁺.

N-메틸화된 리신 ⁴⁶ 을 갖는 아드레노메둘린 -유사체 27

합성:

서열 ADM(47-52)은 상기 기재된 일반적인 방법을 사용하여 합성하였다. 커플링 서열은 하기와 같다:

서열 ADM(47-52)의 자동화된 합성 후, Fmoc-보호된 N-메틸화된 리신을 HOBt 및 DIC로 5-배 몰 과잉 (75 μmol)으로 수동 커플링시켰다. 반응을 용매로서 DMF 중의 24 시간 동안 수행하였다.

Fmoc 보호기의 제거 후, Fmoc-Ser(tBu)-OH를 DMF/DCM/NMP (1:1:1, v/v/v) 중의 5-배 몰 과잉 (75 μmol)의 아미노산 및 10-배 몰 과잉 (150 μmol)의 HOBt 및 DIC로 수동으로 커플링시켰다. 1,300 rpm (써모믹서, 에펜도르프)으로 24 시간 동안 진탕하면서 반응을 50℃에서 수행하였다.

Fmoc-Glu(OPp)-OH는 HOBt 및 DIC로 5-배 몰 과잉 (75 μmol)으로 수동으로 커플링시켰다. 반응은 용매로서 DMF 중에서 24 시간 동안 수행하였다.

펩티드 쇄는 상기 기재된 일반적인 방법을 사용하여 자동으로 신장시켰다. 커플링 서열은 하기와 같다:

Fmoc-Dpr(Mtt)-OH는 HOBt 및 DIC로 5-배 몰 과잉 (75 μmol)으로 수동으로 커플링시켰다. 반응은 용매로서 DMF 중에서 24 시간 동안 수행하였다.

OPp 및 Mtt 보호기의 제거는 수지를 TFA/TIS/DCM (2:5:93, v/v/v)로 이루어진 절단 칵테일로 처리하여 달성하였다 (12×2 min). 그 후, 수지를 DMF 중 2% DIPEA로 세정하였다 (2×5 min).

락탐-가교는 AA 16 및 AA 21의 측쇄들 사이에서 아미드 결합의 형성에 의하여 도입하였다. 반응은 용매로서 DMF 중의 6-배 과잉 (90 μmol)의 HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 수행하였다.

그 후, Fmoc-Gly-OH 및 Boc-Lys(Fmoc)-OH는 HOBt 및 DIC로 DMF 중의 5-배 몰 과잉 (75 μmol)으로 약 24 시간 동안 수동으로 커플링시켰다. 각각의 커플링 단계 전 및 유리 리신 측쇄를 생성하는 합성의 완료 후 Fmoc를 DMF 중의 30% 피페리딘 (v/v)으로 10 분 동안 2회 제거하였다.

미정제 펩티드의 정제는 정제용 RP-HPLC를 사용하여 C18-컬럼 (엑스브릿지 BEH130 Prep C18 10 ㎛ OBD: 250 ㎜×19 ㎜, 10 ㎛) 상에서 수행하였다. 60 분에 걸친 A 중의 10% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA)를 적용하였다. 유량은 20 ㎖/min이었으며, UV 검출은 λ=220 ㎚에서 측정하였다.

분석:

실시예 27: [K¹⁴(PAM),(Dpr¹⁶,E²¹)_lac, N-Me-K⁴⁶]ADM(14-52)

((3S,9S,12S,15S,21S)-15-(2-((S)-2-아미노-6-팔미타미도헥산아미도)아세트아미도)-9-벤질-12-(3-구아니디노프로필)-3-((R)-1-히드록시에틸)-2,5,8,11,14,18-헥사옥소-1,4,7,10,13,17-헥사아자시클로헤니코산-21-카르보닐)-L-트레오닐-[N-Me-K⁴⁶]ADM(22-52)

화학식: C₂₁₃H₃₄₁N₅₉O₅₉

정확한 질량: 4669.55 Da

분자량: 4672.43 g/mol

실시예 27은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 0.6 ㎎ (이론치의 0.9%)이었다.

실시예 27은 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=34.5 min, 순도 ≥95%.

게다가, 60 분에 걸친 A 중의 10% 내지 100% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하였다. R_t=29.6 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1168.7 [M+4H]⁴⁺, 935.5 [M+5H]⁵⁺, 779.6 [M+6H]⁶⁺, 668.5 [M+7H]⁷⁺, 584.9 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4670.5 [M+H]⁺, 2336.6 [M+2H]²⁺.

디술피드 결합- 모방체를 갖는 아드레노메둘린 -유사체 15-17

합성:

화합물 15-17의 합성은 일반적인 방법에 기재된 바와 같은 서열 ADM(22-52)의 자동화된 펩티드 합성을 사용하여 수행하였다. 그 후, 위치 21 내지 14를 수동으로 혼입하였다. ADM(22-52)의 커플링 서열은 비-단백질구성원성 아미노산을 갖는 락탐-가교된 유사체 3-11에 대하여 이미 제시되었다.

하기 제시된 디술피드 결합 모방체는 디술피드 결합 모방체로서 사용되었다. 이들은 ADM-C²¹ 및 NAlloc를 대체하는 위치의 N-말단에서 Fmoc-보호되며, ADM-C¹⁶을 대체하는 위치의 N- 및 C-말단에서 OAll-보호되었다.

모방체는 용매로서 DMF 중의 5-배 몰 과잉의 아미노산, HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 커플링시켰다. Fmoc-절단은 DMF 중의 20% 피페리딘 (v/v)을 사용하여 5 분 동안 2회 수행하였다.

A: Fmoc-[C¹⁶→U²¹](NAlloc, OAll)-OH; N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-S-[(2R)-3-옥소-3-(프로프-2-엔-1-일옥시)-2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}프로필]-L-호모시스테인

화합물은 문헌 절차에 따라 생성하였다 (P. J. Knerr, A. Tzekou, D. Ricklin, H. Qu, H. Chen, W. A. van der Donk, J. D. Lambris, ACS Chem . Biol. 2011, 6, 753-760 and H.-K. Cui, Y. Guo, Y. He, F.-L. Wang, H.-N. Chang, Y.-J. Wang, F.-M. Wu, C.-L. Tian, L. Liu, Angew . Chem . Int . Ed. 2013, 52, 9558 -9562).

B: Fmoc-[U¹⁶→C²¹](NAlloc, OAll)-OH; N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-3-{[(3S)-4-옥소-4-(프로프-2-엔-1-일옥시)-3-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}부틸]술파닐}-L-알라닌

화합물은 문헌 절차에 따라 생성하였다 (P. J. Knerr, A. Tzekou, D. Ricklin, H. Qu, H. Chen, W. A. van der Donk, J. D. Lambris, ACS Chem . Biol . 2011, 6, 753-760 and H.-K. Cui, Y. Guo, Y. He, F.-L. Wang, H.-N. Chang, Y.-J. Wang, F.-M. Wu, C.-L. Tian, L. Liu, Angew . Chem . Int . Ed. 2013, 52, 9558 -9562).

C: Fmoc-[U¹⁶→U²¹](NAlloc, OAll)-OH; (2S,7S)-2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}-8-옥소-8-(프로프-2-엔-1-일옥시)-7-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}옥타노산

화합물은 문헌 절차에 따라 생성하였다 (H.-K. Cui, Y. Guo, Y. He, F.-L. Wang, H.-N. Chang, Y.-J. Wang, F.-M. Wu, C.-L. Tian, L. Liu, Angew . Chem . Int. Ed. 2013, 52, 9558 -9562).

화합물 15-17의 하기 4종의 아미노산은 용매로서 DMF 중의 5-배 몰 과잉의 아미노산, HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 수동으로 커플링시켰다. 처음 3개의 커플링 후 Fmoc-탈보호는 수지를 DMF 중의 20% 피페리딘 (v/v)으로 5 분 동안 2회 처리하여 수행하였다.

커플링 서열은 하기와 같다:

40℃에서 진공 하에서 수지를 건조시키면 알릴- 및 Alloc 탈보호기는 CHCl₃/AcOH/NMM (37:2:1, v/v/v, 1.5 ㎖) 중의 TPP-Pd의 1.5-배 몰 과잉을 사용하여 제거하였다. 혼합물을 아르곤 대기 하에서 2 시간 동안 교반하였다. 수지를 10 분 동안 각각 DMF 중의 0.5% DIPEA 및 DMF 중의 0.5% DDTC (w/w)로 2회 세정하였다. Fmoc-탈보호는 수지를 DMF 중의 20% 피페리딘 (v/v)으로 5 분 동안 2회 처리하여 달성하였다.

락탐화는 5-배 몰 과잉의 HOBt 및 DIC를 사용하고, 용매로서 DMF를 사용하여 약 24 시간 동안 수행하였다.

화합물 15-17의 하기 2종의 아미노산은 용매로서 DMF 중의 5-배 몰 과잉의 아미노산, HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 수동으로 커플링시켰다. 제1의 커플링 후 Fmoc-탈보호는 수지를 DMF 중의 20% 피페리딘 (v/v)으로 5 분 동안 2회 처리하여 달성하였다.

커플링 서열은 하기와 같다:

수지로부터 펩티드의 절단 및 동시 측쇄 탈보호는 TFA/TA/EDT (90:7:3, v/v/v)로 약 3 시간 동안 달성하였다. 펩티드를 침전시키고, 빙냉 디에틸 에테르로 세정한 후, 동결건조시켰다.

미정제 펩티드의 정제는 정제용 RP-HPLC를 사용하여 C18-컬럼 (엑스브릿지 BEH130 Prep C18 10 ㎛ OBD: 250 ㎜×19 ㎜, 10 ㎛) 상에서 달성하였다. 50 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA)를 적용하였다. 유량은 15 ㎖/min이었으며, UV 검출은 λ=220 ㎚에서 측정하였다.

분석:

실시예 15: [G¹⁴, C¹⁶→U²¹]ADM(14-52)

((4S,7S,13S,16S,19R)-19-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-13-벤질-16-(3-구아니디노프로필)-7-((R)-1-히드록시에틸)-6,9,12,15,18-펜타옥소-1-티아-5,8,11,14,17-펜타아자시클로이코산-4-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₁H₂₉₉N₅₇O₅₇S

정확한 질량: 4335.197 Da

분자량: 4337.90 g/mol

실시예 15는 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 1.6 ㎎ (이론치의 2.5%)이었다.

실시예 15는 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=25.3 min, 순도 ≥90%.

게다가, 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å). R_t=26.0 min, 순도 ≥90%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1085.4 [M+4H]⁴⁺, 868.5 [M+5H]⁵⁺, 723.9 [M+6H]⁶⁺, 602.7 [M+7H]⁷⁺, 543.3 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4336.2 [M+H]⁺, 2168.6 [M+2H]²⁺.

실시예 16: [G¹⁴, U¹⁶→C²¹]ADM(14-52)

((3R,6S,12S,15S,18S)-18-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-12-벤질-15-(3-구아니디노프로필)-6-((R)-1-히드록시에틸)-5,8,11,14,17-펜타옥소-1-티아-4,7,10,13,16-펜타아자시클로이코산-3-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₁H₂₉₉N₅₇O₅₇S

정확한 질량: 4335.197 Da

분자량: 4337.90 g/mol

실시예 16은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 2.2 ㎎ (이론치의 3.4%)이었다.

실시예 16은 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배를 적용하는 페노메넥스 주피터 4u 프로테오 90 Å (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å) 및 0.6 ㎖/min의 유량을 사용하여 분석하였다. R_t=25.2 min.

게다가, 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배를 적용하는 페노메넥스 주피터 5u 프로테오 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å) 및 0.6 ㎖/min의 유량을 사용하였다. R_t=29.8 min.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1085.6 [M+4H]⁴⁺, 868.5 [M+5H]⁵⁺, 723.9 [M+6H]⁶⁺, 602.7 [M+7H]⁷⁺, 543.2 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4336.3 [M+H]⁺, 2168.6 [M+2H]²⁺.

실시예 17: [G¹⁴, U¹⁶→U²¹]ADM(14-52)

((2S,5S,11S,14S,19S)-19-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)-5-벤질-2-(3-구아니디노프로필)-11-((R)-1-히드록시에틸)-3,6,9,12,20-펜타옥소-1,4,7,10,13-펜타아자시클로이코산-14-카르보닐)-L -트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₁₉₂H₃₀₁N₅₇O₅₇

정확한 질량: 4317.241 Da

분자량: 4319.86 g/mol

실시예 17은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 2.6 ㎎ (이론치의 4.0%)이었다.

실시예 17은 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=23.2 min, 순도 ≥95%.

게다가, 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å). R_t=23.4 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1080.9 [M+4H]⁴⁺, 864.9 [M+5H]⁵⁺, 721.0 [M+6H]⁶⁺, 618.2 [M+7H]⁷⁺, 540.9 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4318.4 [M+H]⁺, 2159.7 [M+2H]²⁺.

디술피드 결합- 모방체를 갖는 팔미토일화된 아드레노메둘린 -유사체 23-25

합성:

실시예 23-25의 합성은 일반적인 방법에 기재된 바와 같은 서열 ADM(22-52)의 자동화된 펩티드 합성을 사용하여 수행하였다. 그 후, 위치 21 내지 14 및 팔미토일화는 수동으로 혼입하였다. ADM(22-52)의 커플링 서열은 락탐-가교된 유사체 3-11, 19-22 및 26에 대하여 이미 제시되어 있다.

화합물 A, B 및 및 C (상기 제시함)는 디술피드 결합 모방체로서 사용하였다. 이들은 ADM-C²¹ 및 NAlloc를 대체하는 위치의 N-말단에서 Fmoc-보호되며, ADM-C¹⁶을 대체하는 위치의 N- 및 C-말단에서 OAll-보호된다.

그 후, 아미노산 17-20의 신장은 상기 기재된 일반적인 방법을 사용하여 수행하였다. 커플링 서열은 하기와 같다:

수지를 40℃에서 진공 하에서 건조시키면 알릴- 및 Alloc 탈보호기는 CHCl₃/AcOH/NMM (37:2:1, v/v/v, 1.5 ㎖) 중의 1.5-배 몰 과잉의 TPP-Pd를 사용하여 제거하였다. 혼합물을 아르곤 대기 하에서 2 시간 동안 교반하였다. 수지를 10 분 동안 각각 DMF 중의 0.5% DIPEA (v/v), DMF 중의 0.5% DDTC (w/w)로 2회 세정하였다. Fmoc-탈보호는 수지를 DMF 중의 30% 피페리딘 (v/v)으로 10 분 동안 2회 처리하여 달성하였다.

락탐화는 용매로서 DMF 중의 15-배 몰 과잉의 HOBt 및 10-배 몰 과잉의 DIC를 사용하여 6-8 시간 동안 수행하였다.

실시예 23-25의 하기 2종의 아미노산은 용매로서 DMF 중의 5-배 몰 과잉의 아미노산, HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 수동으로 커플링시켰다. 제1의 커플링 후 Fmoc-탈보호는 수지를 DMF 중의 30% 피페리딘 (v/v)으로 10 분 동안 2회 처리하여 달성하였다.

커플링 서열은 하기와 같다:

그 후, Fmoc는 N-말단 아미노산으로부터 DMF 중의 30% 피페리딘 (v/v)를 사용하여 10 분 동안 2회 제거하였다.

N-말단 (실시예 23 및 24) 또는 유리 리신 측쇄 (실시예 25)의 팔미토일화는 용매로서 DMF 중의 5-배 과잉 (75 μmol)의 팔미트산, HOBt 및 DIC를 사용하여 약 24 시간 동안 달성하였다.

미정제 펩티드의 정제는 정제용 RP-HPLC를 사용하여 C18-컬럼 (키네텍스® 5 ㎛ XB-C18 100Å: 250 ㎜×21.2 ㎜, 5 ㎛) 상에서 수행하였다. 60 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA)를 적용하였다. 유량은 20 ㎖/min이었으며, UV 검출은 λ=220 ㎚에서 측정하였다.

분석:

펩티드의 정체는 MALDI-MS (울트라플렉스III, 브루커) 및 ESI-MS (HCT, 브루커)를 사용하여 확인하였다. 순도는 분석적 RP-HPLC를 사용하여 분석하였다.

실시예 23: PAM[G¹⁴, C¹⁶→U²¹]ADM(14-52)

((4S,7S,13S,16S,19R)-13-벤질-16-(3-구아니디노프로필)-7-(히드록시메틸)-6,9,12,15,18-펜타옥소-19-(2-(2-팔미타미도아세트아미도)아세트아미도)-1-티아-5,8,11,14,17-펜타아자시클로이코산-4-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₂₀₇H₃₂₉N₅₇O₅₈S

정확한 질량: 4573.43 Da

분자량: 4576.31 g/mol

실시예 23은 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 2.0 ㎎ (이론치의 2.9%)이었다.

실시예 23은 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=34.1 min, 순도 ≥95%.

게다가, 40 분에 걸쳐 A 중의 10% 내지 60% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å). R_t=34.1 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 916.4 [M+5H]⁵⁺, 763.7 [M+6H]⁶⁺, 654.8 [M+7H]⁷⁺; MALDI-TOF: m/z = 4574.9 [M+H]⁺, 2287.1[M+2H]²⁺.

실시예 24: PAM[K¹⁴, C¹⁶→U²¹]ADM(14-52)

((4S,7S,13S,16S,19R)-19-(2-(6-아미노-2-팔미타미도헥산아미도)아세트아미도)-13-벤질-16-(3-구아니디노프로필)-7-((R)-1-히드록시에틸)-6,9,12,15,18-펜타옥소-1-티아-5,8,11,14,17-펜타아자시클로이코산-4-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₂₁₁H₃₃₈N₅₈O₅₈S

정확한 질량: 4644.50 Da

분자량: 4647.43 g/mol

실시예 24는 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 1.3 ㎎ (이론치의 1.9%)이었다.

실시예 24는 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=23.7 min, 순도 ≥95%.

게다가, 40 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å). R_t=31.0 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1163.0 [M+4H]⁴⁺, 930.3 [M+5H]⁵⁺, 775.5 [M+6H]⁶⁺, 664.8 [M+7H]⁷⁺, 581.9 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4645.5 [M+H]⁺, 2323.1 [M+2H]²⁺.

실시예 25: [K¹⁴(PAM), C¹⁶→U²¹]ADM(14-52)

((4S,7S,13S,16S,19R)-19-(2-((S)-2-아미노-6-팔미타미도헥산아미도)아세트아미도)-13-벤질-16-(3-구아니디노프로필)-7-((R)-1-히드록시에틸)-6,9,12,15,18-펜타옥소-1-티아-5,8,11,14,17-펜타아자시클로이코산-4-카르보닐)-L-트레오닐-ADM(22-52)

화학식: C₂₁₁H₃₃₈N₅₈O₅₈S

정확한 질량: 4644.50 Da

분자량: 4647.43 g/mol

실시예 25는 15 μmol 규모로 합성하였다. 수율은 2.0 ㎎ (이론치의 2.9%)이었다.

실시예 25는 분석적 RP-HPLC에 의하여 40 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 4 ㎛ 프로테오 90 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 4 ㎛, 90 Å)을 사용하여 분석하였다. R_t=24.4 min, 순도 ≥95%.

게다가, 40 분에 걸쳐 A 중의 20% 내지 70% 용출제 B의 선형 구배 (용출제 A = 물 중의 0.1% TFA; 용출제 B = ACN 중의 0.08% TFA; 유량=0.6 ㎖/min; λ=220 ㎚)를 적용하는 주피터® 5 ㎛ C18 300 Å 컬럼 (페노메넥스, 250 ㎜×4.6 ㎜, 5 ㎛, 300 Å). R_t=33.5 min, 순도 ≥95%.

관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. ESI 이온-트랩: m/z = 1162.7 [M+4H]⁴⁺, 930.4 [M+5H]⁵⁺, 775.6 [M+6H]⁶⁺, 664.9 [M+7H]⁷⁺, 581.9 [M+8H]⁸⁺; MALDI-TOF: m/z = 4645.5 [M+H]⁺, 2323.1 [M+2H]²⁺.

B. 약리적 활성의 평가

하기 약어를 사용하였다:

질환의 치료를 위한 본 발명에 의한 화합물의 적합성은 하기 검정 시스템을 사용하여 입증될 수 있다:

1) 테스트 설명 ( 시험관내 )

1a) 재조합 아드레노메둘린 -수용체 리포터 세포에 대한 테스트

본 발명에 의한 화합물의 활성은 인간 아드레노메둘린-수용체를 지니는 재조합 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주의 도움으로 정량화하였다. 리간드에 의한 수용체의 활성화는 에쿼린 발광에 의하여 측정하였다. 세포주의 구축 및 측정 절차는 상세하게 기재되어 있다 [Wunder F., Rebmann A., Geerts A, and Kalthof B., Mol Pharmacol, 73, 1235-1243 (2008)]. 간략하게: 세포를 불투명 384-웰 미량역가 플레이트 상에서 4,000 세포/웰의 밀도로 씨딩하고, 24 시간 동안 성장시켰다. 배양 배지의 제거후, 세포를 3 시간 동안 0.2 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX)이 보충된 무-Ca² ⁺ 티로드(Tyrode) 용액 (130 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼륨, 20 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), 1 mM 염화마그네슘 및 4.8 mM 탄산수소나트륨, pH 7.4) 중의 0.6 ㎍/㎖ 코엘렌테라진으로 세포 배양 인큐베이터 내에서 로딩시켰다. 실시예를 6 분 동안 0.1% 소 혈청 알부민을 함유하는 무-칼슘² ⁺ 티로드 용액 중에 첨가하였다. 칼슘² ⁺을 3 mM의 최종 농도로 첨가하기 직전에 에쿼린 발광의 측정은 적절한 광도계를 사용하여 출발하였다. 발광은 60 초 동안 측정하였다. 통상의 실험에서 화합물은 1×10^-13 내지 3×10^-6 M의 농도 범위로 테스트하였다.

실시양태 실시예에 대한 대표적인 EC₅₀ 값은 하기 표 1에 제시한다:

<표 1>

wt ADM의 EC₅₀은 대부분 0.5 nM 내지 2.5 nM 범위내임.

1b) 내피 세포에서의 세포횡단 전기 저항 검정

본 발명에 의한 화합물의 활성은 인간 제대 정맥 세포 (HUVEC, 론자(Lonza))에서의 시험관내-투과성 검정을 특징으로 한다. ECIS 장치 (ECIS: 전기 세포-기질 임피던스 센싱; 어플라이드 바이오피직스 인코포레이티드(Applied Biophysics Inc.); 미국 뉴욕주 트로이 소재)의 사용에 의하여 내피 단층 상의 내피통과 전기 저항 (TEER)의 변화는 세포가 씨딩되어 있는 작은 금 전극의 사용에 의하여 연속적으로 측정된다. HUVEC는 96-웰 센서 전극 플레이트 (96W1E, 이비디 게엠베하(Ibidi GmbH), 마르틴스리에드(Martinsried) 소재) 상에서 전면생장 단층으로 성장시키고, 과투과성은 모두 내피 세포 접촉의 파괴 및 TEER의 감소를 야기하는 것으로 입증된 염증성 자극, 예컨대 트롬빈, TNF-α, IL-1β, VEGF, 히스타민 및 과산화수소에 의하여 유발될 수 있다. 트롬빈은 0.5 U/㎖의 최종 농도에서 사용된다. 트롬빈의 첨가 전 또는 후 테스트 화합물을 첨가할 수 있다. 통상의 실험에서, 화합물은 1×10^-10 내지 1×10^-6 M의 농도 범위에서 테스트하였다.

본 발명에 의한 물질은 의존적으로 >1 ㎚ol/ℓ의 농도에서 트롬빈 투여로 자극후 HUVEC 단층의 전기 저항의 파괴를 방지한다 [도 1].

1c) 내피 세포에서의 시험관내 -투과성 검정

내피 과투과성의 또 다른 시험관내 모델에서 본 발명에 의한 화합물의 활성은 거대분자 투과성의 조정에 관하여 조사하였다. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECS)를 상부 챔버의 바닥에서 성장하는 내피 세포와 함께 하부 조직 배양 챔버로부터 상부를 분리하는 피브로넥틴-코팅된 트랜스웰(Transwell)® 필터 멤브레인 (24-웰 플레이트, 0.4 μM 폴리카르보네이트 멤브레인을 사용한 6.5 ㎜-삽입물; 코스타(Costar) #3413) 상에서 전면생장률로 생장시킨다. 상부 챔버의 배지에 250 ㎍/㎖의 40 kDa FITC-덱스트란 (인비트로겐(Invitrogen), D1844)을 보충하였다. 단층의 과투과성은 트롬빈을 0.5 U/㎖의 최종 농도로 첨가하여 유도하였다. 배지 샘플을 하부 챔버로부터 매30 분마다 수집하고, 시간 경과에 대한 거대분자 투과성의 변화에 대한 파라미터로서 상대적 형광을 적절한 형광계로 측정하였다. 트롬빈 유발은 내피 단층을 가로지른 FITC-덱스트란 전이의 거의 2배화를 유도하였다. 통상의 실험에서, 화합물은 1×10^-10 내지 1×10^-6 M의 농도 범위에서 테스트하였다.

본 발명에 의한 물질은 의존적으로 ≥0.3 ㎚ol/ℓ의 농도에서 트롬빈 투여로 자극후 40 kDa FITC-덱스트란에 대한 HUVEC 단층의 투과성을 감소시켰다 [도 2].

1d) cAMP 검정

약어

공급업자

세포 배양

HEK-293 세포 (인간 배아 신장 세포)를 가습 대기 하에서 37℃ 및 5% CO₂에서 75 ㎠ 세포 배양 플라스크 내에서 15% FCS를 함유하는 햄(Ham) F-12/DMEM (1/1; v/v) 중에서 배양시켰다.

HEK293 세포의 일시적 동시- 트랜스펙션

세포를 75 ㎠ 플라스크 내에서 70-80% 전면생장률로 배양하였다. 45 ㎕ 메타펙텐(Metafectene)^R 프로(Pro)를 900 ㎕ 햄 F-12/DMEM (1/1; v/v) 중에 희석하고, 20 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. EYFP에 융합된 CLR의 DNA를 함유하는 9,000 ng 플라스미드 및 ECFP에 융합된 RAMP2의 DNA를 함유하는 3,000 ng 플라스미드를 900 ㎕ 햄 F-12/DMEM (1/1; v/v) 중에 용해시켰다. 플라스미드 용액을 메타펙텐^R 프로 용액과 혼합하고, 25 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 배지를 세포로부터 제거하고, 15% FCS를 함유하는 6 ㎖ 햄 F-12/DMEM (1/1; v/v)에 의하여 대체하였다. 트랜스펙션 용액의 첨가 후, 세포를 3 시간 동안 가습 대기 하에서 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다.

제2의 트랜스펙션의 경우 45 ㎕ 메타펙텐^® 프로를 900 ㎕ 햄 F-12/DMEM (1/1; v/v) 중에서 희석하고, 20 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 루시페라제 리포터 유전자 luc2P에 대한 DNA를 함유하는 12,000 ng의 pGL4.29[luc2P/CRE/히그로(Hygro)] 플라스미드 (CRE 프로모터 영역 가짐)를 900 ㎕ 햄 F-12/DMEM (1/1; v/v) 중에 용해시켰다. 플라스미드 용액을 메타펙텐^® 프로 용액과 혼합하고, 25 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 배지를 세포로부터 제거하고, 15% FCS를 함유하는 6 ㎖ 햄 F-12/DMEM (1/1; v/v)에 의하여 대체하였다. 트랜스펙션 용액의 첨가 후, 세포를 가습 대기하에서 37℃ 및 5% CO₂에서 밤새 인큐베이션하였다.

cAMP -검정

96-웰-플레이트 중에서 일시적으로 트랜스펙션 처리한 세포의 씨딩

96-웰-플레이트의 코팅의 경우 50 ㎕의 폴리-D-리신 용액 (폴리-D-리신-히드로브로마이드/10 ㎖ DPBS의 1 ㎖ 스톡 용액)을 각각의 웰에 피펫팅하고, 40 분 동안 인큐베이션하였다. 폴리-D-리신의 제거 후, 각각의 웰을 50 ㎕ DPBS로 세정하였다. 일시적으로 트랜스펙션 처리한 세포를 배지의 제거, 5 ㎖ DPBS를 사용한 2회 세정 및 15% FCS를 함유한 13 ㎖ 햄 F-12/DMEM (1/1; v/v) 중에서의 재현탁에 의하여 세포 배양 플라스크로부터 분리하였다. 웰당 15% FCS를 함유하는 150 ㎕ 햄 F-12/DMEM (1/1; v/v) 중의 90,000 내지 120,000개의 세포를 씨딩하고, 플레이트를 가습 대기 하에서 37℃ 및 5% CO₂에서 밤새 인큐베이션하였다.

세포 자극

각각의 리간드의 경우 8종의 상이한 농도를 산출하는 연속 희석은 햄 F-12/DMEM (1/1; v/v)을 사용하여 생성하였다. 자극 전, 세포 상의 배지를 100 ㎕ 햄 F-12/DMEM (1/1; v/v)에 의하여 대체하고, 플레이트를 1 시간 동안 가습 대기 하에서 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 자극의 경우, 배지를 다시 제거하고, 세포를 3 시간 동안 80 ㎕의 리간드-용액 중에서 가습 대기 하에서 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 게다가, 80 ㎕의 5 μM 포스콜린 용액 (햄 F-12/DMEM (1/1; v/v) 중의)을 양성 대조군으로서 사용하였으며, 80 ㎕의 햄 F-12/DMEM (1/1; v/v)을 음성 대조군으로서 사용하였다. 각각의 농도 및 대조군을 3회 테스트하였다.

발광 측정

투여 3 시간 후, 용액을 제거하고, 세포를 웰당 50 ㎕의 햄 F-12/DMEM (1/1; v/v)으로 세정하였다. 30 ㎕의 햄 F-12/DMEM (1/1; v/v) 중에서 실온에서 10 분 인큐베이션 후 30 ㎕의 루시페라제-용액 (원-글로(ONE-Glo)™ 루시페라제 검정 시스템)을 첨가하고, 발광을 인피니트(Infinite) M200 (테칸(Tecan))를 사용하여 직접 측정하였다.

데이터 분석

발광 측정의 데이터 분석은 그래프패드 프리즘 5로 실시하였다. 그러므로, 각각의 플레이트의 측정된 발광값은 포스콜린 자극의 각각의 평균의 기준에 대하여 교정하였다. 그 후, 매검정마다 표준 펩티드로서 사용된 [G¹⁴]ADM(14-52)에 대하여 정규화하였다. 교정 및 정규화 후, 데이터를 비-선형 회귀를 사용하여 분석하여 각각의 테스트한 리간드에 대한 용량-반응 곡선을 산출하였다.

<표 2>

cAMP 검정 결과

1e) 인간 혈장에서의 안정성

펩티드의 안정성은 N-말단 6-카르복시테트라메틸로다민-(TAM)-표지된 유사체를 사용하여 조사하였다.

형광 표지된 ADM 유사체는 상기 (펩티드 합성에 대한 일반적인 방법) 기재된 바와 같은 고체 상 펩티드 합성 (SPPS)을 사용하여 생성하였다. 펩티드의 N-말단으로의 6-카르복시테트라메틸로다민 (TAM)의 수동 커플링은 DMF 중의 3-배 몰 과잉의 형광 염료, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA) 및 최근 기재된 바와 같은 수지 (Boehme D., Beck-Sickinger A.G. Chem Med Chem 2015, 10: 804-14)를 24 시간 동안 일정한 진탕 하에서 수행하였다. 펩티드의 정체는 MALDI-MS (울트라플렉스III, 브루커) 및 ESI-MS (HCT, 브루커)를 사용한 질량 스펙트럼에 의하여 확인하였다. 관찰된 질량은 계산된 질량에 해당하였다. 모든 유사체의 순도는 분석 RP-HPLC에 의하여 입증되었으며, ≥90%이었다.

펩티드를 1.5 ㎖의 인간 혈장 중에 10E-5 M의 농도로 용해시키고, 37℃에서 일정한 진탕 하에서 인큐베이션하였다. 150 ㎕의 샘플을 300 ㎕ 에탄올/ACN (1:1)을 사용하여 뚜렷한 시점에서 적어도 1 시간 동안 -20℃에서 침전시켰다. 30 초 동안 12,000 rpm에서 원심분리한 후, 상청액을 코스타® 스핀(Spin)-X® 원심분리 시험관 필터 (0.22 ㎛)에 옮기고, 1 시간 동안 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 샘플을 RP-HPLC에 의하여 바리안 바리타이드(Varian VariTide) RPC 컬럼 (입자 크기 6 ㎛; 공극 크기 200 Å; 250×4.6 mm)을 사용하여 물 중의 0.1% TFA 및 ACN 중의 0.08% TFA의 선형 구배로 분석하고; 형광 발광을 λ=573 ㎚에서 검출하였다. 무손상 펩티드의 퍼센트는 피크 적분에 의하여 구하였다. 추가의 절단 분절을 함유하는 피크 값은 MALDI-MS 분석 (울트라플렉스III, 브루커)을 사용하여 절단 분절 및 무손상 펩티드의 강도를 비교하여 교정하였다. 펩티드의 안정성은 느린-붕괴 상 반감기 (ln(2)/K_느림; K_느림: 지수 붕괴의 느린 부분의 속도 상수)의 측정에 대하여 2 상 지수 붕괴 함수를 사용하는 그래프패드 프리즘 5 (그래프패드 소프트웨어)로 계산하였다 (하기 표 3 및 도 3).

<표 3>

인간 혈장에서의 안정성

1f) 과립구 이행 검정

계대접종 2의 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC, 론자)를 트랜스웰® 필터 트레이 (24-웰 플레이트, 6.5 mm-삽입물 5 ㎛ 공극 크기; 코스타 #3421, 피브로넥틴으로 코팅됨, 시그마(Sigma) F-1141) 상에 내피 세포 배지 (EBM2, 론자 CC-3156, 성장 보충물로 보충함, 론자 CC-4176)에서 트레이당 2×10⁴ 개의 세포의 밀도로 씨딩하고, 37℃ 및 5% CO₂에서 36 시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α, 0.5 nM)를 함유하는 새로운 완전 EBM2 배지로 대체하고, 세포를 추가의 7 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 MAM 배지 (20% FCS 및 25 mM HEPES가 보충된 배지 199) 중에서 세정하고, 테스트 화합물을 트레이에 첨가한 후, 30 분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 그 후, 트레이를 인터류킨(Interleukin) 8 (IL-8, 5 ng/㎖)을 갖는 MAM 배지를 함유하는 새로운 플레이트로 옮겼다. 인간 다형핵 과립구 (PMN, 50 ㎕ 중의 3.7×10⁵ 세포)를 삽입물에 첨가하였다. 30 분 후, 이행된 세포의 개수는 케이시(CASY)® TT 세포 계수기 (로슈 이노바티스 아게(Roche Innovatis AG))를 사용하여 웰로부터 500 ㎕ 배지 중에서 측정하였다. 100 ㎍/㎖의 농도에서의 항 ICAM-1 IgG (알앤디 시스템즈(R&D Systems), BBA4)는 양성 대조군으로서 작용하였다.

통지된 동의서를 받은 후 건강한 지원자에게서 수집한 15 ㎖ 말초 정맥 EDTA 혈액으로부터 인간 과립구 (PMN)를 새로이 단리시켰다. 간략하게, 혈액을 히스토파케(Histopaque)™ 1077/히스토파케™ 1119 (12 ㎖ 각각) 구배의 상부에 적층시키고, 30 분 동안 2,100×rcf에서 원심분리한 후 PMN을 수집하였다. 적혈구 세포의 분해 및 수회 세정 단계 후 MAM 완충액 중에서 PMN을 마지막으로 재현탁시켰다.

통상적인 실험에서, 화합물을 1×10^-9 내지 1×10^-6 M의 농도 범위로 테스트하였다.

본 발명에 의한 물질은 ≥1 ㎚ol/ℓ의 농도에서 PMN TNF-α 자극된 HUVEC의 이행을 감소시켰다 [도 4].

2. 테스트 설명 ( 생체내 )

2a) 원격측정된, 정상압 위스타 래트에서 혈압 및 심박수의 측정

본 발명에 의한 화합물에 의하여 유도된 심혈관 효과는 혈압 및 심박수의 무선원격 측정에 의하여 자유로이 이동하는 의식이 있는 위스타 래트 (체중 >200 g) 암컷에서 조사하였다. 간략하게, 원격측정계 (디에스아이 데이터 사이언스 인터내셔날(DSI Data Science International), 미국 미네소타주 소재)는 3개의 기본 부재로 이루어졌다: 이식 가능한 발신기 (TA11PA-C40), 수신기 (RA1010) 및 컴퓨터 기반의 획득 소프트웨어 (윈도우즈(Windows)용 데이터퀘스트(Dataquest)™ A.R.T. 4.1). 래트에게 실험 전 장기간 사용의 경우 적어도 14 일에 가압 이식체로 설치하였다. 센서 카테터를 4-0 봉합사로 수회 묶어서 카테터의 끝으로부터 0.5 ㎝에서 스토퍼를 생성하였다. 카테터 이식 중에 래트에게 펜토바르비탈로 마취하였다 (넴부탈(Nembutal), 사노피(Sanofi): 50 ㎎/㎏ i.p.). 복부 피부를 면도한 후, 정중선 복부 절개부를 만들고, 장골 갈림 및 신장 동맥 사이에서 노출된 하행 대동맥에 유체-채워진 센서 카테터를 상류 삽입하였다. 카테터를 수회 스토퍼에서 묶었다. 원격측정 카테터의 끝을 신장 동맥에 대하여 바로 꼬리에 배치하고, 조직 접착제에 의하여 고정시켰다. 송신기 바디를 복부 봉합전 내부 복강 벽면에 부착시켰다. 복막 및 근육벽의 개개의 봉합에 이어서 외부 피부의 봉합과 함께 복부 절개의 2층 봉합을 사용하였다. 감염 및 통증으로부터 수술후 보호를 위하여, 단일 투여량의 항생제 (옥시테트라사이클린 10% R, 5.0 ㎖/㎏ s.c., 베타-파마 게엠베하 운트 콤파니(Beta-pharma GmbH & Co), 독일 소재) 및 진통제 (리마딜(Rimadyl) R, 5.0 ㎖/㎏ s.c., 화이자(Pfizer), 독일)를 주사하였다. 하드웨어 배열을 24 마리의 동물에게 장착하였다. 각각의 래트 케이지를 개개의 수신기 플랫폼의 상부에 배치하였다. 이식된 송신기, 온라인 데이터 수집계, 샘플 데이터의 활성화 후, 원격측정 가압 시그날을 mmHg로 전환시켰다. 기압 기준은 주위 대기압에 대한 (진공에 대한) 절대압의 관계를 허용한다. 데이터 수집 소프트웨어는 매5 분마다 10 초 간격으로 샘플 혈류역학적 데이터에 대하여 사전정의하였다. 파일에 대한 데이터 수집은 테스트 화합물의 투여 전 2 시간에 개시하고, 24 시간 사이클의 완료 후 종료하였다. 통상의 실험에서, 테스트 화합물을 0.1 내지 1,000 ㎍/㎏ 체중의 투여량으로 볼루스로서 피하 또는 정맥내 투여한다 (펩티드 성분으로서 지칭한 바와 같음).

야생형 아드레노메둘린 (바켐, H-2932)은 본 테스트에서 ≤300 ㎍/㎏ 체중의 투여량으로 테스트시 ≤4 시간의 기간으로 혈압 강하를 유도하였다 [참조 WO 2013/064508 A1]. 본 발명에 의한 물질은 ≤200 ㎍/㎏ 체중의 투여량으로 8 시간 까지 혈압 강하를 유도하였다 (펩티드 성분으로서 지칭한 바와 같음) [도 5].

2b) 위스타 래트에서 피부 혈관 누출 검정

피내 히스타민 유발 테스트를 사용하여 건강한 동물에서 혈관 장벽 기능에 대한 본 발명에 의한 화합물의 효과를 평가하였다. 스프라그 돌리 래트 수컷 (체중 >200 g)을 이소플루란 (주위 공기 중에서 2%-3%)으로 마취시키고, 반듯이 누운 위치로 두었다. 복부를 면도하고, 카테터를 대퇴 정맥에 삽입하였다. 비히클 단독 (0.5 ㎖ PBS + 0.1% 소 혈청 알부민) 또는 테스트 화합물을 적절한 투여량으로 정맥내 볼루스 주사로서 투여하였다. 15 분 후, 100 ㎕/㎏ 2% 에반스(Evans) 블루 (시그마) 용액의 제2의 주사를 투여하고, 그 직후, 적절한 농도 (예를 들면 0-2.5-5-10-20-40 ㎍/㎖)의 100 ㎕의 히스타민 용액을 복부 피부에 피내 주사하였다. 에반스 블루는 크게 혈장 단백질 결합된 염료이며, 그리하여 단백질-풍부 유체 유출 및 혈관 누출에 대한 지시약으로서 사용하였다. 이러한 절차 후 30 분에 래트를 이소플루란의 과잉투여 및 차후의 경부 탈구에 의하여 죽인 후, 복부 피부를 절개하였다. 8 ㎜ 생검 펀치를 사용하여 두드러기를 절개하고, 조직 샘플의 중량을 계량하고, 48 시간 동안 포름아미드로 옮겨서 에반스 블루를 추출하였다. 샘플을 620 nM 및 750 nM 파장에서 적절한 광도계 상에서 측정하고, 샘플의 에반스 블루 함유량을 수학식 A620 (교정됨)=A620-(1.426×A750+0.030)에 따라 헴 색소에 대하여 교정하고, 표준 곡선에 대하여 계산하였다 [Wang L.F., Patel M., Razavi H.M., Weicker S., Joseph M.G., McCormack D.G., Mehta S., Am. Respir Crit Care Med, 165(12), 1634-9 (2002)로부터 채택된 방법].

2c) 마우스에서 LPS의 기관내 점적주입

지질다당류 (LPS)에 의한 기관내 유발을 사용하여 급성 폐 손상에 대한 본 발명에 의한 화합물의 효과를 조사하였다. BALB/c 마우스 수컷 (평균 동물 체중 20-23 g)을 이소플루란 (7%)으로 마취시키고, 이. 콜리로부터의 LPS (예, 혈청형 055:B5; 시그마)를 마이크로 피펫의 사용에 의하여 100 ㎕ 염수 중에 점적주입시켰다. 유발에 사용된 LPS의 통상의 투여량은 1 내지 10 ㎎/㎏ 체중 범위내이다. 점적주입 전 또는 후의 상이한 시점에서 테스트 화합물을 피하 경로에 의하여 투여하였다. 통상적인 투여량은 1 내지 300 ㎍/㎏ 체중 범위 내이다. 이러한 테스트에서, 테스트 화합물의 투여의 통상적인 시점은 LPS 유발(challenge) 전 15 분 또는 LPS 유발 후 1 시간이다. LPS 마우스의 점적주입후 48 시간에 이소플루란으로 깊게 마취시키고, 경부의 탈구에 의하여 죽였다. 기관에 관 삽입후, 0.5 ㎖ 빙냉 염수를 사용한 기관지폐포 공간의 세척을 수행하였다. 폐를 준비하고, 중량을 측정하였다. 기관지폐포 세척액 (BALF) 중의 세포를 세포 계수기 (셀 다인(Cell Dyn) 3700, 애보트(Abbott)) 상에서 계수하였다. 본 테스트에서, 폐 부종에 대한 특정치로서 폐 중량을 LPS 유발 후 48 시간에 샴 대조군에 비하여 약 50% 이상 증가된 것으로 재현 가능하게 밝혀졌다. 폐 중량은 군에서 매우 낮은 변동성만을 나타내므로, 절대 폐 중량을 파라미터로서 사용하였다. 백혈구 세포에 대한 계수는 항상 LPS 유발 후 BALF에서 대조군에 비하여 크게 증가된 것으로 밝혀졌다.

2d) 미니 피그에서 급성 폐 손상의 유도

급성 폐 손상은 마취된 미니 피그에서 유발로서 지질다당류 (LPS) 또는 올레산의 사용에 의하여 유도되었다. 상세하게는: 약 3.5 내지 5.5 ㎏ 체중의 괴팅겐(Goettingen) 미니피그 암컷 (엘레가드(Ellegaard), 덴마크 소재)에게 케타베트(Ketavet)®/스트레스닐(Stresnil)®의 근육내 주사로 예비투약 후 케타베트®, 도르미쿰(Dormicum)® 및 판쿠로늄(Pancuronium)®의 연속 정맥내 주입에 의하여 마취 상태를 유지하였다. 기관 삽관 후 삽관 동물을 소아용 호흡기 (술라(Sulla) 808V; 드레가(Draeger), 독일 소재)를 사용하여 30 내지 50 ㎖의 일회 호흡량 및 25 min^-1의 일정 주파수에서 산소 공기 혼합물로 인공 환기시켰다. 산소 공기 혼합물의 비에 의하여 흡기된 산소 분율 (FiO₂)을 조절하여 동맥 PaCO₂를 약 40 mmHg로 조절하였다. 통상적으로 적절한 압력 변환기 및 기록 장치에 부착된 필수 프로브 및 카테터의 배치 후 하기 심혈관 및 호흡 파라미터를 측정하였다: 중심 정맥압 (좌측 경정맥 정맥에 의함), 동맥 혈압 및 심박수 (BP 및 HR; 좌측 목 동맥에 의함), 좌심실압 (LVP; 우측 목동맥을 경유하여 좌심실에 투입된 밀라(Millar) 카테터 [FMI, Mod.:SPC-340S, REF: 800-2019-1, 4F] 사용), 폐 동맥압 (PAP; 좌측 목정맥을 경유하여 폐 동맥에 배치된 ARROW 버만(Berman) 혈관조영용 벌룬 카테터 [REF.: AI-07134 4 Fr. 50 ㎝] 사용), 우측 대퇴 동맥에 배치된 풀젼 4F 열희석법(Thermodilution)-카테터 (PV2014L08N)에 연결된 PiCCO 시스템 (풀젼(Pulsion), 독일 소재)의 사용에 의한 심장 박출량 (CO) 및 혈관외 폐 수량 지수 (EVWLI). CVP, BP, HR, LVP 및 PAP의 측정을 한 카테터를 포네마(Ponemah) 기록계에 장착하였다. 동맥 혈액 기체 분석을 실시하여 PaO₂/FiO₂를 측정하였다. ARDS에 대한 미국-유럽 시민합의 회의(American-European Consensus Conference)에 의하면 PaO₂/FiO₂ <300 mmHg은 급성 폐 손상의 존재에 대하여 나타내는 것으로 간주된다. 적용된 프로토콜에 의존하여 실험의 기간은 폐 손상 유도 유발의 투여 후 4 및 5 시간 사이에서 변동되었다. 실험의 종료시 피그를 사혈에 의하여 죽이고, 기관지폐포 세척액 (BALF)을 폐로부터 수집하였다. BALF의 세포 함유량은 혈액 세포 계수기 (Cell DYN 3700)의 사용에 의하여 측정하였다.

통상의 설정에서, 급성 폐 손상은 기관내삽관 시험관에 의하여 각각의 폐에 염수 중의 지질다당류 (LPS; 이. 콜리 0111:B4; 시그마 L2630)의 기관삽관 점적주입에 의하여 유도하였다. PAP 및 EVWLI는 증가된 반면, PaO₂/FiO₂는 유발에 반응하여 감소되었다. BALF의 세포 함유량은 크게 증가되었다.

또 다른 프로토콜에서, 에탄올로 희석된 올레산 (OA; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), O1008) (1:1)을 15 분에 걸쳐 100 ㎎/㎏ 체중의 최종 투여량에서 정맥내 주입하였다. OA를 사용한 유발은 PAP 및 EVLWI의 증가 및 PaO₂/FiO₂의 감소를 초래하였다.

C. 제약 조성물의 예시적 실시양태

본 발명에 의한 화합물은 하기 방식으로 제약 제제로 전환될 수 있다:

정맥내 액제:

본 발명에 의한 화합물을 생리학상 허용되는 용매 (예를 들면 pH 4 내지 pH 7, 등장성 염화나트륨 용액, 글루코스 용액 5% 및/또는 PEG 400 용액 30%의 완충액) 중의 포화 용해도 미만의 농도에서 용해시켰다. 용액을 여과에 의하여 살균시키고, 살균 및 무-발열원 주사 용기에 충전시켰다.

피하 액제:

SEQUENCE LISTING <110> Bayer Pharma Aktiengesellschaft <120> Stabilized Adrenomedullin derivatives and use thereof <130> BHC141036 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (E16,K21)lac]ADM(14-52) <400> 1 Gly Gly Glu Arg Phe Gly Thr Lys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (K16,E21)lac]ADM(14-52) <400> 2 Gly Gly Lys Arg Phe Gly Thr Glu Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (Dpr16, D21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is N-beta-4-methyltrityl-L-diaminopropionic acid <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Dpr: N-beta-4-methyltrityl-L-diaminopropionic acid <400> 3 Gly Gly Xaa Arg Phe Gly Thr Asp Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (D16, Dab21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is 2,4-diaminobutyric acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Dab: 2,4-diaminobutyric acid <400> 4 Gly Gly Asp Arg Phe Gly Thr Xaa Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (Dab16, D21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 2,4-diaminobutyric acid <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Dab: 2,4-diaminobutyric acid <400> 5 Gly Gly Xaa Arg Phe Gly Thr Asp Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 6 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G14, (E16, Dpr21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Dpr: N-beta-4-methyltrityl-L-diaminopropionic acid <400> 6 Gly Gly Glu Arg Phe Gly Thr Xaa Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 7 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (Dpr16, E21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Dpr: N-beta-4-methyltrityl-L-diaminopropionic acid <400> 7 Gly Gly Xaa Arg Phe Gly Thr Glu Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 8 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (D16, Orn21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Orn: Ornithine <400> 8 Gly Gly Asp Arg Phe Gly Thr Xaa Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 9 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (Orn16, D21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Orn: Ornithine <400> 9 Gly Gly Xaa Arg Phe Gly Thr Asp Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 10 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G14, (E16, Dab21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Dab: 2,4-diaminobutyric acid <400> 10 Gly Gly Glu Arg Phe Gly Thr Xaa Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 11 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (Dab16, E21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Dab: 2,4-diaminobutyric acid <400> 11 Gly Gly Xaa Arg Phe Gly Thr Glu Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 12 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [K14(PAM), (E16,K21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is Lys Palmitic acid <400> 12 Xaa Gly Glu Arg Phe Gly Thr Lys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 13 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K14(PAM), (K16,E21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is Lys Palmitic acid <400> 13 Xaa Gly Lys Arg Phe Gly Thr Glu Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 14 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [K14(PAM), (E16, K21)lac, N-Me-I47]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is Lys Palmitic acid <220> <221> Xaa <222> (34)..(34) <223> Xaa is N-Me-I: N-methylated Isoleucin <400> 14 Xaa Gly Glu Arg Phe Gly Thr Lys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Xaa Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 15 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G14, (C16--U21)]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is U* <400> 15 Gly Gly Cys Arg Phe Gly Thr Xaa Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 16 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G14, (U16--C21)]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is U* <400> 16 Gly Gly Xaa Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 17 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (U16--U21)]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is U* <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is U* <400> 17 Gly Gly Xaa Arg Phe Gly Thr Xaa Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 18 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [K14(PAM), (Dpr16, E21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is Lys Palmitic acid <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Dpr: N-beta-4-methyltrityl-L-diaminopropionic acid <400> 18 Xaa Gly Xaa Arg Phe Gly Thr Glu Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 19 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (E16, Orn21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Orn: Ornithine <400> 19 Gly Gly Glu Arg Phe Gly Thr Xaa Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 20 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (Orn16, E21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Orn: Ornithine <400> 20 Gly Gly Xaa Arg Phe Gly Thr Glu Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 21 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (K16, D21)lac]ADM(14-52) <400> 21 Gly Gly Lys Arg Phe Gly Thr Asp Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 22 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (D16, K21)lac]ADM(14-52) <400> 22 Gly Gly Asp Arg Phe Gly Thr Lys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 23 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAM[G14, (C16--U21)]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is Gly Palmitic acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is U* <400> 23 Xaa Gly Cys Arg Phe Gly Thr Xaa Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 24 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAM[K14, (C16--U21)]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is Lys Palmitic acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is U* <400> 24 Xaa Gly Cys Arg Phe Gly Thr Xaa Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 25 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K14(PAM), (C16--U21)]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is Lys Palmitic acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is U* <400> 25 Xaa Gly Cys Arg Phe Gly Thr Xaa Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 26 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [G14, (D16, Dpr21)lac]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Dpr: N-beta-4-methyltrityl-L-diaminopropionic acid <400> 26 Gly Gly Asp Arg Phe Gly Thr Xaa Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 27 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K14(PAM), (Dpr16, E21)lac, N-Me-K46]ADM(14-52) <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is Lys Palmitic acid <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Dpr: N-beta-4-methyltrityl-L-diaminopropionic acid <220> <221> Xaa <222> (33)..(33) <223> Xaa is N-Me-K: N-methylated Lysine <400> 27 Xaa Gly Xaa Arg Phe Gly Thr Glu Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Xaa Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35

Claims

하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물.
<화학식 I>

상기 식에서,
X¹은
^*-(CH₂)_m1-S-^# (여기서 m1은 0-6임);
^#-(CH₂)_m2-S-^* (여기서 m2는 0-6임);
^*-(CH₂)_m3-^# (여기서 m3은 1-8임);
^*-(CH₂)_m4-(CH₂=CH₂)-(CH₂)_n1-^# (여기서 m4는 0-6이며, n1은 0-6이되, 단 m4+n1=0-6임);
^*-(CH₂)_m5-(CH≡CH)-(CH₂)_n2-^# (여기서 m5는 0-6이며, n2는 0-6이되, 단 m5+n2=0-6임);
^*-(CH₂)_m6-CO-NH-(CH₂)_n3-^# (여기서 m6은 0-4이며, n3은 0-4이되, 단 m6+n3=0-6임);
^#-(CH₂)_m7-CO-NH-(CH₂)_n4-^* (여기서 m7은 0-4이며, n4는 0-4이되, 단 m7+n4=0-6임);
^*-SO-(CH₂)_m8-^# (여기서 m8은 0-6임);
^#-SO-(CH₂)_m9-^* (여기서 m9는 0-6임);
^*-SO₂-(CH₂)_m10-^# (여기서 m10은 0-6임);
^#-SO₂-(CH₂)_m11-^* (여기서 m11은 0-6임);
^*-5-6 원 헤테로아릴-^#;
^*-O-(CH₂)_m12-^# (여기서 m12는 0-6임);
^#-O-(CH₂)_m13-^* (여기서 m13은 0-6임);
^*-CH₂-S-(CH₂)_m14-^# (여기서 m14는 0-6임);
^#-CH₂-S-(CH₂)_m15-^* (여기서 m15는 0-6임);
^*-CH₂-O-(CH₂)_m16-^# (여기서 m16은 0-6임);
^#-CH₂-O-(CH₂)_m17-^* (여기서 m17은 0-6임);
^*-(CH₂)_m18-NH-CO-CH₂-NH-CO-(CH₂)_n5-^# (여기서 m18은 0-3이며, n5는 0 또는 1이되, 단 m18+n5=0-3임);
^#-(CH₂)_m19-NH-CO-CH₂-NH-CO-(CH₂)_n6-^* (여기서 m19는 0-3이며, n6은 0 또는 1이되, 단 m19+n6=0-3임);
^*-(CH₂)_m20-NH-CO-CH(CH₃)-NH-CO-(CH₂)_n7-^# (여기서 m20은 0-3이며, n7은 0 또는 1이되, 단 m20+n7=0-3임);
^#-(CH₂)_m21-NH-CO-CH(CH₃)-NH-CO-(CH₂)_n8-^* (여기서 m21은 0-3이며, n8은 0 또는 1이되, 단 m21+n8=0-3임);
^*-(CH₂)_m22-NH-CO-CH(CH₂-C(CH₃)₂)-NH-CO-(CH₂)_n9-^# (여기서 m22는 0-3이며, n9는 0 또는 1이되, 단 m22+n9=0-3임);
^#-(CH₂)_m23-NH-CO-CH(CH₂-C(CH₃)₂)-NH-CO-(CH₂)_n10-^* (여기서 m23은 0-3이며, n10은 0 또는 1이되, 단 m23+n10=0-3임);
^*-(CH₂)_m24-NH-CO-CH(CH(CH₃)C₂H₅)-NH-CO-(CH₂)_n11-^# (여기서 m24는 0-3이며, n11은 0 또는 1이되, 단 m24+n11=0-3임);
^#-(CH₂)_m25-NH-CO-CH(CH(CH₃)C₂H₅)-NH-CO-(CH₂)_n12-^* (여기서 m25는 0-3이며, n12는 0 또는 1이되, 단 m25+n12=0-3임);
^*-(CH₂)_m26-NH-CO-CH(CH₂(C₆H₅))-NH-CO-(CH₂)_n13-^# (여기서 m26은 0-3이며, n13은 0 또는 1이되, 단 m26+n13=0-3임);
^#-(CH₂)_m27-NH-CO-CH(CH₂(C₆H₅))-NH-CO-(CH₂)_n14-^* (여기서 m27은 0-3이며, n14는 0 또는 1이되, 단 m27+n14=0-3임);
^*-(CH₂)_m28-NH-CO-(CH₂)₃-NH-CO-(CH₂)_n15-^# (여기서 m28은 0 또는 1이며, n15는 0 또는 1이되, 단 m28+n15=0-1임);
^#-(CH₂)_m29-NH-CO-(CH₂)₃-NH-CO-(CH₂)_n16-^* (여기서 m29는 0 또는 1이며, n16은 0 또는 1이되, 단 m29+n16=0-1임);
^*-(CH₂)_m30-NH-CO-NH-(CH₂)_n17-^# (여기서 m30은 0-5이며, n17은 0-5이되, 단 m30+n17=0-5임);
^#-(CH₂)_m31-NH-CO-NH-(CH₂)_n18-^* (여기서 m31은 0-5이며, n18은 0-5이되, 단 m31+n18=0-5임);
^*-(CH₂)_m32-O-CO-NH-(CH₂)_n19-^# (여기서 m32는 0-5이며, n19는 0-5이되, 단 m32+n19=0-5임);
^#-(CH₂)_m33-O-CO-NH-(CH₂)_n20-^* (여기서 m33은 0-5이며, n20은 0-5이되, 단 m33+n20=0-5임);
^*-(CH₂)_m34-O-CO-O-(CH₂)_n21-^# (여기서 m 34는 0-5이며, n21은 0-5이되, 단 m34+n21=0-5임);
^*-(CH₂)_m35-NH-CO-(CH₂)_n22-NH-(CH₂)_p1- (여기서 m35는 0-4이며, n22는 0-4이며, p1은 0-4이되, 단 m35+n22+p1=0-4임); 및
^*-(CH₂)_m36-NH-CO-(CH=CH)-CO-NH-(CH₂)_n23-^# (여기서 m36은 0-2이며, n23은 0-2이되, 단 m36+n23=0-2임)로 이루어진 군으로부터 선택되며;
여기서 ^* 및 ^#은 X¹이 고리 구조 내에 결합된 위치를 반영하고;
X²는 존재하지 않거나, 수소이거나 또는, 화학식 I의 아미노산 서열의 N-말단 G¹⁵에 아미드 결합에 의하여 공유 연결된, G¹⁴, K¹⁴, F¹⁴, 서열식별번호: 1 [Y¹RQSMNNFQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 2 [R²QSMNNFQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 3 [Q³SMNNFQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 4 [S⁴MNNFQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 5 [M⁵NNFQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 6 [N⁶NFQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 7 [N⁷FQGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 8 [F⁸QGLRSF¹⁴], 서열식별번호: 9 [Q⁹GLRSF¹⁴], 서열식별번호: 10 [G¹⁰LRSF¹⁴], 서열식별번호: 11 [L¹¹RSF¹⁴], 서열식별번호: 12 [R¹²SF¹⁴] 및 서열식별번호: 13 [S¹³F¹⁴]로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 아미노산이며, 여기서 X²의 임의의 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산에 의하여 임의로 대체될 수 있으며;
여기서 A는 L-알라닌이며; R은 L-아르기닌이며; N은 L-아스파라긴이며; D는 L-아스파르트산이며; Q는 L-글루타민이며; G는 L-글리신이며; H는 L-히스티딘이며; I는 L-이소류신이며; L은 L-류신이며; K는 L-리신이며; M은 L-메티오닌이며; F는 L-페닐알라닌이며; P는 L-프롤린이며; S는 L-세린이며; T는 L-트레오닌이며; Y는 L-티로신이며; V는 L-발린이며;
여기서 화학식 I에서 및 X²의 정의에서의 아미노산의 넘버링이 대응 인간 ADM 서열을 지칭하고;
X³은 존재하지 않거나 또는, X²의 임의의 아미노산의 N-말단에 또는 측쇄의 작용기에, G¹⁵의 N-말단에, 또는 Z에 공유 연결된 이종 모이어티이고;
Z는 존재하지 않거나 또는, X²의 임의의 아미노산 또는 G¹⁵의 N-말단과 X³ 사이에 또는, X²의 임의의 아미노산의 측쇄의 작용기와 X³ 사이에 공유 결합된 절단 가능한 링커이며;
여기서 X³이 존재하지 않을 경우,
Z는 또한 존재하지 않으며, X²는 수소이거나 또는 상기 정의된 바와 같은 아미노산 또는 아미노산 서열이며;
여기서 X³이 이종 모이어티인 경우,
X²는 존재하지 않거나 또는, 상기 정의된 바와 같은 아미노산 또는 아미노산 서열이고; Z는 존재하지 않거나 또는, X²의 임의의 아미노산 또는 G¹⁵의 N-말단과 X³ 사이에 또는, X²의 임의의 아미노산의 측쇄의 작용기와 X³ 사이에 공유 결합된 절단 가능한 링커이다.
제1항에 있어서,
X¹은
^*-(CH₂)_m1-S-^# (여기서 m1은 0-6임);
^#-(CH₂)_m2-S-^* (여기서 m2는 0-6임);
^*-(CH₂)_m3-^# (여기서 m3은 1-8임);
^*-(CH₂)_m6-CO-NH-(CH₂)_n3-^# (여기서 m6은 0-4이며, n3은 0-4이되, 단 m6+n3=0-6임);
^#-(CH₂)_m7-CO-NH-(CH₂)_n4-^* (여기서 m7은 0-4이며, n4는 0-4이되, 단 m7+n4=0-6임)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X²는 화학식 I의 화합물의 N-말단 G¹⁵에 아미드 결합에 의하여 공유 연결된 G¹⁴ 또는 K¹⁴이고;
X³은 존재하지 않거나 또는, G¹⁴ 또는 K¹⁴의 N-말단에 또는 K¹⁴의 측쇄의 작용기에, 또는 Z에 공유 연결된 이종 모이어티이고;
Z는 존재하지 않거나 또는, G¹⁴ 또는 K¹⁴의 N-말단과 X³ 사이에 또는, K¹⁴의 측쇄의 작용기와 X³ 사이에 공유 결합된 절단 가능한 링커이며;
여기서 X³이 존재하지 않을 경우, Z는 또한 존재하지 않으며;
여기서 X³이 이종 모이어티인 경우, Z는 존재하지 않거나 또는, G¹⁴ 또는 K¹⁴의 N-말단과 X³ 사이에 또는, K¹⁴의 측쇄의 작용기와 X³ 사이에 공유 결합된 절단 가능한 링커인 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
X³은 중합체, Fc, FcRn 결합 리간드, 알부민 및 알부민-결합 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 모이어티이고;
X¹, X² 및 Z는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물.
제3항에 있어서,
X³은 중합체이며, 중합체는 선형 또는 분지형 C₃-C₁₀₀ 카르복실산, 바람직하게는 C₄-C₃₀ 카르복실산 (할로, 히드록시, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 술페이트 또는 포스페이트로 임의로 치환되며, 포화되거나, 또는 모노- 또는 디-불포화될 수 있음), PEG 모이어티, PPG 모이어티, PAS 모이어티 및 HES 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X¹, X² 및 Z는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물.
제4항에 있어서, 카르복실산이 아라키드산, 아라키돈산, 베헨산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 세로플라스트산, 세로트산, 도코사헥사엔산, 에이코사펜타엔산, 엘라이드산, 에난트산, 에루스산, 게드산, 헤나트리아콘틸산, 헤네이코실산, 헵타코실산, 헥사트리아콘틸산, 락세로산, 라우르산, 리그노세르산, 리노엘라이드산, 리놀레산, 마르가르산, 멜리스산, 몬탄산, 미리스트산, 미리스톨레산, 노나코실산, 노나데실산, 올레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 판토텐산, 펠라르곤산, 펜타코실산, 펜타데실산, 프실산, 사피엔산, 스테아르산, 트리코실산, 트리데실산, 운데실산, 바센산, 발레르산, α-리놀렌산 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되며;
X¹, X² 및 Z는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 존재하지 않으며, X¹, X² 및 X³은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
Z는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 절단 가능한 링커이고;
X¹, X² 및 X³은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 적어도 하나의 아미드 결합의 N-메틸화에 의하여 추가로 변형되며, X¹, X², X³ 및 Z는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
X¹은
^*-(CH₂)_m1-S-^# (여기서 m1은 0-4임);
^#-(CH₂)_m2-S-^* (여기서 m2는 0-4임);
^*-(CH₂)_m6-CO-NH-(CH₂)_n3-^# (여기서 m6은 0-4이며, n3은 0-4이되, 단 m6+n3=0-6임)로 이루어진 군으로부터 선택되며;
X²는 화학식 I의 화합물의 N-말단 G¹⁵에 아미드 결합에 의하여 공유 연결된 G¹⁴ 또는 K¹⁴이며;
X³은 존재하지 않거나 또는, G¹⁴ 또는 K¹⁴의 N-말단에 또는 K¹⁴의 측쇄의 작용기에, 또는 Z에 공유 연결된 이종 모이어티이며;
Z는 존재하지 않거나 또는, G¹⁴ 또는 K¹⁴의 N-말단과 X³ 사이에 또는, K¹⁴의 측쇄의 작용기와 X³ 사이에 공유 결합된 절단 가능한 링커이며;
여기서 X³이 존재하지 않을 경우, Z는 또한 존재하지 않으며;
여기서 X³이 이종 모이어티인 경우, Z는 존재하지 않거나 또는, G¹⁴ 또는 K¹⁴의 N-말단과 X³ 사이에 또는, K¹⁴의 측쇄의 작용기와 X³ 사이에 공유 결합된 절단 가능한 링커인 화학식 I의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 용매화물 또는 염의 용매화물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 심혈관, 부종성 및/또는 염증성 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 사용하기 위한 화합물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 심부전, 만성 심부전, 악화 중인 심부전, 급성 심부전, 급성 대상부전 심부전, 확장기 및 수축기 (울혈성) 심부전, 관상 동맥성 심장 질환, 허혈성 및/또는 출혈성 졸중, 고혈압, 폐동맥 고혈압, 말초 동맥 폐쇄성 질환, 전자간증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 급성 및/또는 만성 폐 부종, 흡입된 유기 분진 및 진균, 방선균 또는 다른 기원의 입자로 인한 알레르기성 폐포염 및/또는 폐장염, 및/또는 급성 화학성 기관지염, 급성 및/또는 만성 화학적 폐 부종, 신경원성 폐 부종, 방사선으로 인한 급성 및/또는 만성 폐 증상, 급성 및/또는 만성 간질성 폐 장애, 성인 또는 신생아를 포함한 어린이에서의 급성 폐 손상/급성 호흡 곤란 증후군 (ALI/ARDS), 폐렴 및 패혈증에 대한 2차 ALI/ARDS, 흡인 폐렴 및 흡인에 대한 2차 ALI/ARDS, 연기 가스 흡입에 대한 2차 ALI/ARDS, 수혈-관련 급성 폐 손상 (TRALI), 수술, 외상 및/또는 화상 후 ALI/ARDS 및/또는 급성 폐 기능부전, 및/또는 인공호흡기 유발된 폐 손상 (VILI), 태변 흡인후 폐 손상, 폐 섬유증, 고산병, 만성 신장 질환, 사구체신염, 급성 신장 손상, 심장콩팥 증후군, 림프부종, 염증성 장 질환, 패혈증, 패혈성 쇼크, 비-감염성 기원의 전신 염증성 반응 증후군 (SIRS), 아나필락시스 쇼크, 염증성 장 질환, 두드러기 및/또는 부종성 눈 장애 또는 교란된 혈관 기능과 관련된 눈 장애, 예컨대 노년기 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증, 특히 당뇨병성 황반 부종 (DME), 망막하 부종 및 망막내 부종의 치료 및/또는 예방 방법에 사용하기 위한 화합물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 의한 화합물을 불활성 비독성 제약상 적합한 부형제와 조합하여 포함하는 의약.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 의한 화합물을 ACE 억제제, 안지오텐신 수용체 길항제, 베타-2 수용체 효능제, 포스포디에스테라제 (PDE) 억제제, 글루코코르티코이드 수용체 효능제, 이뇨제, 재조합 안지오텐신 전환 효소-2, 아세틸살리실산, 나트륨이뇨 펩티드 및 그의 유도체 및 네프릴리신 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 활성 성분과 조합하여 포함하는 의약.
제12항 또는 제13항에 있어서, 심혈관, 부종성 및/또는 염증성 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 의약.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 청구된 바와 같은 적어도 하나의 화합물 또는 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 의약의 유효량을 사용하여 인간 또는 동물에서 심혈관, 부종성 및/또는 염증성 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법.