SK287737B6

SK287737B6 - Peptidová zlúčenina, spôsob jej výroby a použitie, farmaceutický prostriedok, polynukleotid, vektor a hostiteľská bunka

Info

Publication number: SK287737B6
Application number: SK496-2001A
Authority: SK
Inventors: Chuan-Fa Liu; Ulrich Feige; Janet Cheetham
Original assignee: Kirin-Amgen Inc.
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-22
Publication date: 2011-08-04
Also published as: JP3820105B2; AU773891B2; MY126795A; DK1783222T3; US6835809B1; NO2012005I2; PT2319928E; NL300398I1; EP2319928A1; BG105401A; US20120034657A1; WO2000024770A9; NO20011962L; BR9914698A; PT1124961E; BRPI9914698B8; SI2319928T1; ME00238B; US20090186822A1; WO2000024770A2

Abstract

Je opísaná peptidová zlúčenina všeobecného vzorca TMP1-(L1)n-TMP2, kde TMP1 a TMP2 sú každý nezávisle vybratý zo súboru základných zlúčenín obsahujúcich štruktúru X2-X3-X4-X5-X6- X7-X8-X9-X10, kde X2 je vybratý z Glu, Lys a Val; X3 je vybratý z Gly a Ala; X4 je Pro; X5 je vybratý z Tr a Ser; X6 je vybratý z Leu, Ile, Val, Ala a Phe; X7 je vybratý z Arg a Lys; X8 je vybratý z Gln, Asn a Glu; X9 je vybratý z Trp, Tyr, Cys, Ala a Phe; X10 je vybratý z Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met a Lys; L1 je spájacia skupina; a n je 0 alebo 1; a jej fyziologicky prijateľné soli. Táto zlúčenina je trombopoetická a viaže sa na mpl receptor. Spôsob jej výroby a použitie na zvýšenie megakaryocytov alebo doštičiek, farmaceutický prostriedok s jej obsahom. Je opísaný tiež polynukleotid, ktorý ju kóduje, vektor s obsahom tohto nukleotidu a hostiteľská bunka, ktorá obsahuje tento vektor.

Description

Vynález sa týka peptidovej zlúčeniny, spôsobu jej výroby a použitia, farmaceutického prostriedku, polynukleotidu, vektoru a hostiteľskej bunky. Táto zlúčenina je trombopoetická a viaže sa na mpl receptor. Môže byť použitá na zvýšenie produkcie trombocytov alebo ich prekurzorov, napríklad megakaryocytov u cicavcov.

Doterajší stav techniky

Boli známe dva proteíny majúce trombopoetickú aktivitu: trombopoetín (TPO) a megakaryocytámy rastový a diferenciačný faktor (MGDF).

Klonovanie endogénneho trombopoetínu (TPO) (Lok et al., Náture 369:568571 (1994); Bartley et al., Celí 77:1117-1124 (1994); Kuter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11104-11108 (1994); de Sauvage et al., Náture 369:533-538 (1994); Kato et al., Journal of Biochemistry 119: 229-236 (1995); Chang et al., Journal of Biological Chemístry 270:511-514 (1995) rýchlo zlepšilo naše znalosti o megakaryopoéze (tvorbe megakaryocytov) a trombopoéze (tvorbe trombocytov).

Endogénny ľudský TPO, 60 až 70 kDa glykosylovaný proteín primárne produkovaný v pečienke a ľadvinách, sa skladá z 332 aminokyselín (Bartley et al., Celí 77: 1117-1124 (1994); Chang et al., Journal of Biological Chemístry 270: 511-514 (1995). Proteín je veľmi konzervovaný medzi rôznymi druhmi a má 23 % homológiu s ľudským erytropoetínom (Gumey et al., Blood 85: 981-988 (1995)) na amino konci (aminokyseliny 1 až 172) (Bartley et al., Celí 77: 1117-1124 (1994)). Bolo dokázané, že endogénny TPO má všetky charakteristiky kľúčového biologického regulátora trombopoézy. Medzi jeho účinky in vitro patrí špecifická indukcia megakaryocytových kolónií tak z prečistených myších hematopoetických kmeňových buniek (Zeigler et al., Blood 84:4045-4052 (1994)), ako z ľudských CD34+ buniek (Lok et al., Náture 369:568571 (1994); Rasko et al., Stem Cells 15: 33-42 (1997)), tvorba megakaryocytov s vyššou ploidiou (Broudy et al., Blood 85: 402-413 (1995)), a indukcia konečného vyzrievania megakaryocytov a produkcia trombocytov (Zeigler et al., Blood 84: 4045-4052 (1994); Choi et al., Blood 85: 402-413 (1995)). Naopak, syntetické protizmyslové oligodeoxynukleotidy k TPO receptoru (c-Mpl) štatisticky významne inhibujú schopnosť megakaryocytárnych progénitórov tvoriť kolónie (Methia et al., Blood 82: 1395- 1401 (1993)). Ďalej, myši s vyradením cMpl génu majú závažnú trombocytopéniu a deficit megakaryocytov (Alexander et al., Blood 87: 21622170 (1996)).

Rekombinantný ľudský MGDF (rHuMGDF, Amgén Inc., Thousand Oaks, CA) je ďalším trombopoetickým peptidom príbuzným s TPO. Je produkovaný v E. coli transformovaných plazmidom obsahujúcim cDNA bodujúci skrátený proteín zahŕňajúci amino-koncovú doménu pre väzbu na receptor ľudského TPO (Ulich et al., Blood 86: 971-976 (1995)). Polypeptid sa extrahuje, zloží a prečistí a na amino-koniec sa kovalentne naviaže poly[etylenglykolová] (PEG) skupina. Výsledná molekula sa tu potom označuje PEG-rHuMGDF alebo krátko MGDF.

Rôzne štúdie na zvieracích modeloch (Ulich, T.R. et al., Blood 86: 971-976 (1995); Hokom, M.M. et al., Blood 86: 4486- 4492 (1995)) jasne preukázali terapeutickú účinnosť TPO a MGDF pri transplantácii kostnej drene a pri liečbe trombocytopénie, ktorá je často dôsledkom chemoterapie alebo aktinoterapie. Predbežné dáta na ľuďoch potvrdili použiteľnosť MGDF na zvýšenie počtu trombocytov v rôznych situáciách (Basser et al., Lancet 348: 1279-81 (1996); Kato et al., Journal of Biochemistry 119: 229-236 (1995); Ulich et al., Blood 86:971-976 (1995)). MGDF môže byť použitý na zvýšenie výťažku trombocytov pri darcovstve krvi, pretože podanie MGDF zvyšuje počet cirkulujúcich trombocytov zdravých darcov približne 3-krát.

TPO a MGDF pôsobí prostredníctvom väzby na c-Mpl receptor, ktorý je exprímovaný primáme na povrchu niektorých hematopoetických buniek, ako sú megakaryocyty, trombocyty, CD34+ bunky a primitívne progénitorové bunky (Debili, N. et al., Blood 85:391-401 (1995); de Sauvage, F. J. et al, Náture 369:533-538 (1994); Bartley, T .D., et al., Celí 77: 1117- 1124 (1994); Lok, S. et al., Náture 369: 565-8 (1994). Ako väčšina receptorov pre interleukíny a proteínové hormóny prislúcha cMPl k triede I superrodiny cytokínových receptorov (Vigon, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:56405644 (1992)). Aktivácia tejto triedy receptorov zahŕňa homodimerizáciu indukovanú väzbou ligandu, ktorá spúšťa kaskádu prenosu signálu.

Všeobecne, interakcia proteínového ligandu s jeho receptorom prebieha na relatívne veľkom rozhraní. Ako je ale preukázané v prípade ľudského rastového hormónu naviazaného na svoj receptor, väčšina väzbovej energie je získaná od niekoľkých kľúčových zostatkov (Clackson, T. et al., Science 267: 383-386 (1995). Toto a skutočnosť, že zostatok proteínového ligandu slúži len na dosiahnutie správnej homológie väzbových epitopov, umožňuje prípravu aktívnych ligandov s oveľa menšou veľkosťou.

Na uskutočnenie tejto prípravy sa systém fágovej peptidovej zobrazovacej knižnice ukázal ako účinný systém na identifikáciu malých peptidových mimetík väčších proteínových ligandov (Scott, J.K. et al., Science 249: 386 (1990); Devlin, J. J. et al., Science 249: 404 (1990). Pomocou tejto techniky boli objavené malé peptidové molekuly, ktoré pôsobia ako agonisty c-MPl receptora (Cwirla, S.E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)).

V takých technikách sú malé peptidové sekvencie zobrazené ako fúzie s obalovými proteínmi filamentosného fágu afinitne eluované proti protilátkou imobilizovanej extracelulámej doméne c-MPl a zachytené fágy sa spracujú v ďalšom kole afinitného prečistenia. Táto väzbová selekcia a proces repropagácie môžu byť opakované veľakrát za získania súboru peptidových sekvencií so silnou väzbou. Takto boli najprv identifikované dve rodiny c-Mpl-väzbových peptidov, navzájom nepríbuzných v sekvencií. Potom boli pripravené mutagénne knižnice, ktoré slúžili na ďalšiu optimalizáciu najlepších väzbových činidiel, čo nakoniec viedlo na izoláciu veľmi aktívneho peptidu s IC₅₀= 2 nm a EC₅₀ = 400 nM (Cwirla, S.E. et al., Science 276:1696-1699 (1997)). Tento 14 aminokyselinový peptid, označený ako TMP (TPO Mimetic Peptide), nemal zrejmú homológiu sekvencie k TPO alebo MGDF. Vzorec tejto TMP zlúčeniny je:

íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala SEQ ID NO: 1; alebo

IEGPTLRQWLAARA pri použití j ednopísmenových aminokyselinových skratiek.

Skôr bol v podobnej štúdii zameranej na EPO mimetické peptidy objavený EPO mimetický peptid (EMP), ktorý bol objavený s použitím rovnakej techniky (Wrighton, N.C. et al., Science 273:458-463 (1996)) a bolo zistené, že pôsobí ako dimér vo väzbe na EPO receptor (EPOR). Takto vytvorený komplex ligand/receptor má podľa rôntgenovej kryštalografie C2 symetriu (Livnah, 0. et al., Science 273:464-471 (1996)). Podľa tejto informácie o štruktúre bol navrhnutý =kovalentne viazaný dimér EMP, v ktorom boli C-konce dvoch EMP monomérov zosietené flexibilnou oddeľujúcou skupinou a bolo zistené, že táto zlúčenina má oveľa vyššiu väzbu, rovnako ako biologickú aktivitu in vitro aj in vivo (Wrighton, N.C., et al., Náture Biotechnology 15:1261-1265 (1997).

Podobná stratégia dimerizácie na C-konci bola použitá na TPO mimetický peptid (TMP) (Cwirla, S.E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)). Bolo zistené, že C-koncovo viazaný dimér (C-C väzba) TMP má lepšiu väzbovú afinitu 0,5 nM a zreteľne vyššiu aktivitu in vitro (EC50 = 0,1 nM) v testoch proliferácie buniek (Cwirla, S.E. et al., Science 276:1696- 1699 (1997)). Štruktúra tohto TMP C-C diméru je uvedená ďalej:

H₂N-IEGPTLRQWLAARA-CO-HN

H₂N-IEGPTLRQWLAARA-CC (SEQ ID NO: 2)

V inom aspekte predkladaného vynálezu môžu byť tandémové diméry ďalej naviazané na jednu alebo viac skupín, ktoré sú odvodené od imunoglobulínových proteínov a ktoré sú všeobecne označované ako Fc regióny imunoglobulínov. Výsledné zlúčeniny sú tu označované ako Fc fúzie TMP tandémových dimérov.

Ďalej je uvedená krátka časť týkajúca sa Fc regiónov protilátok, ktoré sú použiteľné v súvislosti so zlúčeninami podľa predkladaného vynálezu.

Protilátky obsahujú dve funkčné nezávislé časti, variabilnú doménu, známu ako „Fab“, ktorá viaže antigén, a konštantnú doménu, známu ako „Fc“, ktorá umožňuje napojenie na efektorové funkcie, ako je fixácia komplementu alebo fagocytóza. Fc časť imunoglobulínu má dlhý plazmatický polčas, zatiaľ čo Fab má krátky (Caponet al., Náture 337: 525-531 (1989)).

Terapeutické proteínové produkty boli pripravené s Fc doménou na účely predĺženia polčasu alebo vloženia funkcií, ako je väzba na Fc receptor, väzba na proteín A, fixácia komplementu a placentámy prenos, kde tieto funkcie sú všetky vlastné Fc regiónu imunoglobulínov (Capon et al., Náture 337: 525-531 (1989)). Napríklad, Fc región IgGl protilátky bol fúzovaný na CD30-L, molekulu, ktorá sa viaže na CD30 receptory exprimované na bunkách Hodgkinovho lymfómu, anaplastického lymfómu, T-lymfocytámej leukémie a iných typoch malignít. Pozri US Patent č. 5480981. IL10, protizápalové a antirejekčné činidlo, bol fúzovaný na myšej Fcy2a na predĺženie krátkého polčasu cytokínu v cirkulácii (Zheng, X- et al., The Journal of Immunology, 154: 5590-5600 (1995)). Štúdie tiež hodnotili použitie receptora pre faktor nekrózy nádorov naviazaného na F c proteín ľudského IgGl v liečbe pacientov so septickým šokom (Fisher, C. et al., N- Engl. J. Med. 334: 1697-1702 (1996); VanZee, K. et al., The Journal of Immunology 156: 2221-2230 (1996)). Fc bol tiež fuzo3 vaný s CD4 receptorom za zisku terapeutického proteínu na liečbu AIDS. Pozri Capon et al., Náture 337: 525-531 (1989). Ďalej bol interleukín 2 fuzovaný na Fc časť IgGl alebo IgG3 na predĺženie krátkeho polčasu interleukínu 2 a na prekonanie jeho systémovej toxicity. Pozri Harvill et al., Immunotechnology 1: 95-105 (1995).

Aj napriek dostupnosti TPO a MGDF preto existuje potreba ďalších zlúčenín, ktoré stimulujú produkciu trombocytov (majú trombopoetickú aktivitu) a/alebo prekurzorových buniek trombocytov, najmä megakaryocytov (majú megakaryopoetickú aktivitu). Predkladaný vynález poskytuje nové zlúčeniny majúce tieto aktivity a súvisiace aspekty.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje skupinu zlúčenín, ktoré sú schopné väzby c-Mpl receptor a spustenie signálu prostredníctvom c-Mpl receptora, čo je rovnaký receptor, ktorý sprostredkuje aktivitu endogénneho trombopoetínu (TPO). Preto majú zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu trombopoetickú aktivitu, t. j. schopnosť stimulovať, in vivo a in vitro, produkciu trombocytov, a/alebo megakaryopoetickú aktivitu, t. j. schopnosť stimulovať, in vivo a in vitro, produkciu prekurzorov trombocytov.

V prvom výhodnom uskutočnení majú zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu nasledujúci všeobecný vzorec:

TMP,-(L₁)„-TMP₂, kde TMP] a TMP₂ sú každý nezávisle vybraté zo skupiny zlúčenín obsahujúcich základnú štruktúru:

X₂-X₃-X₄-X5-X6-X7-X8-X₉-X 11 kde

X₂ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Glu, Asp, Lys, a Val; X₃ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Gly a Ala;

X₄je Pro;

X₅ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Thr a Ser;

X₆ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Leu, íle,Val, Ala, a Phe;

Xe je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Arg a Lys;

X₈ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Gin, Asn, a Glu;

X₉ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Trp, Tyr, Cys, Ala a Phe;

Xio je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Leu, ale, Val, Ala, Phe, Met a Lys;

L! je spájacia skupina, ako je tu definovaná; a n je 0 alebo 1;

a patria medzi ne tiež fyziologicky prijateľné soli takých zlúčenín.

V jednom uskutočnení je Li (Gly)_n, kde n je 1 až 20 a kde keď je n väčšie ako 1, tak môže byť až polovica Gly zostatkov substituovaná inou aminokyselinou vybratou zo zostávajúcich 19 prirodzených aminokyselín alebo ich stereoizomérov.

Okrem základnej štruktúry X₂-Xio uvedenej skôr pre TMP, a TMP₂ sú tiež možné iné základné štruktúry, v ktorých je jedna alebo viac nasledujúcich skupín pridaných k základnej štruktúre TMP) a/alebo TMP₂: Xi je naviazaný na N-koniec a/alebo sú X_n, X₁₂, X_J3 a/alebo X_]4 naviazané na C-koniec, kde X_b X₁₂, X₎₃ a X_I4majú nasledujúce významy:

X, vybratý zo skupiny zahŕňajúcej íle, Ala, Val, Leu, Ser a Arg;

Xn je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Ala, íle, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His a Glu;

X₁₂ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Ala, íle, Val, Leu, Phe, Gly, Ser a Gin;

X₁₃ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin a Gly; a

X]₄ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Ala, íle, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu a Gly.

V druhom výhodnom uskutočnení majú zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu nasledujúci všeobecný vzorec:

(Fc)_m- (L₂)_q-TMP,- (L,)_n-TMP₂- (L₃)_r- (Fc)_p, kde TMP_b TMP₂ a n sú rovnaké, ako boli opísané; L_b L₂ a L₃ sú spájacie skupiny, ktoré sú vybraté nezávisle z tu definovaných spájacích skupín; Fc je Fc región imunoglobulínu (ako je definovaný ďalej); m, p, q a r sú každý nezávislo 0 alebo 1, keď aspoň jeden z m alebo p je 1 a ďalej, keď - pokiaľ mje 0, tak q je 0, a pokiaľ p je 0, tak r je 0; a zahŕňajú tiež farmaceutický prijateľné soli takých zlúčenín.

V jednom uskutoční sú L_b L₂ a L₃ (Gly)_n, kde n je 1 až 20 a kde keď je n väčšie ako 1, tak môže byť až polovica Gly zostatkov substituovaná inou aminokyselinou vybratou zo zostávajúcich 19 prirodzených aminokyselín alebo ich stereoizomérov.

Deriváty uvedených zlúčenín (opísané ďalej) spadajú tiež do rozsahu predkladaného vynálezu.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú výhodne peptidy a môžu byť pripravené štandardnými spôsobmi syntézy alebo inými spôsobmi na prípravu peptidov. Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu, ktoré obsahujú nepeptidové časti, môžu byť syntetizované štandardnými reakciami organickej chémie, okrem štandardných reakcií peptidovej syntézy, pokiaľ sú použiteľné.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť použité na terapeutické alebo profylaktické účely po príprave s vhodnými farmaceutickými nosičmi a môžu byť podané v účinnej dávke jedincovi, ako je človek (alebo iný cicavec). Ďalšie súvisiace aspekty sú tiež súčasťou predkladaného vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Veľa ďalších aspektov a výhod predkladaného vynálezu budú jasné po preštudovaní nasledujúceho podrobného opisu, v ktorom sú uvedené odkazy na nasledujúce obrázky, kde:

Obr. 1 znázorňuje príkladné Fc polynukleotidové a proteínové sekvencie (SEQ ID NO: 3 je bodujúci reťazec čítaný 5^1->3’, SEQ ID NO: 4 je komplementárny reťazec čítaný 3'·>5’;

a SEQ ID NO: 5 je kódovaná aminokyselinová sekvencia), ktoré môžu byť použité vo Fc fúznych zlúčeninách podľa predkladaného vynálezu.

Obr. 2 znázorňuje schému syntézy na prípravu pegylovaného peptidu 19 (SEQ ID NO: 17).

Obr. 3 znázorňuje schému syntézy na prípravu pegylovaného peptidu 20 (SEQ ID NO: 18).

Obr. 4 ukazuje počet trombocytov generovaných in vivo v normálnej samici BDF1 myši ošetrenej jednou 100 pg/kg bolusovou injekciou rôznych zlúčenín: PEG-MGDF označuje PEG s priemernou molekulovou hmotnosťou 20 kDa naviazaný na N-koncovú aminoskupinu redukčnou amináciou na aminokyseliny 1-163 prirodzeného ľudského TPO, ktorý je exprimovaný v E. coli (takže nie je glykosylovaný) (pozri WO 95/26746 nazvaná „Prostriedky a spôsoby na stimuláciu rastu a diferenciácie megakaryocytov“); TMP označuje zlúčeninu SEQ ID NO: 1; TMP- TMP označuje zlúčeninu SEQ ID NO: 21; PEG-TMP-TMP označuje zlúčeninu SEQ ID NO: 18, kde PEG skupinou je PEG s priemernou molekulovou hmotnosťou 5 kDa naviazaný spôsobom podľa obr. 3; TMP-TMP-Fc je definovaný ďalej a Fc-TMP-TMP je rovnaký ako TMP-TMP -Fc s tým rozdielom, že Fc skupina je naviazaná na N-koniec miesto C-konca TMP-TMP peptidu.

Obr. 5 ukazuje počet trombocytov generovaných in vivo v normálnej BDF1 myši liečenej rôznymi zlúčeninami podanými implantovanou ozmotickou pumpou počas 7 dní. Zlúčeniny sú rovnaké, ako na obr. 4.

Obr. 6A, 6B a 6C sú schematické diagramy výhodných zlúčenín podľa predkladaného vynálezu. Obr. 6A ukazuje Fc fuznu zlúčeninu, v ktorej je Fc skupina fúzovaná na N-koniec TMP diméru a v ktorej je Fc časť v monomémej (jednoreťazcovej) forme. Obr. 6B ukazuje Fc fúznu zlúčeninu, v ktorej je Fc skupina fúzovaná na N-koniec TMP diméru a v ktorej je Fc časť dimérna a jeden Fc monomér je naviazaný na TMP dimér. Obr. 6C ukazuje Fc fúznu zlúčeninu, v ktorej je Fc skupina fúzovaná na N-koniec TMP diméru a v ktorej je Fc časť dimérna a obidva Fc monoméry sú naviazané na TMP dimér.

Podrobný opis výhodných uskutočnení

Pri vyhľadávaní malých štruktúr ako vedúcich zlúčenín pri vývoji terapeutických činidel s výhodnejšími vlastnosťami boli navrhnuté rôzne typy diméru TMP a príbuzných štruktúr, v ktorých bol C-koniec jedného TMP peptidu naviazaný na N-koniec druhého TMP peptidu, buď priamo, alebo prostredníctvom spájacej skupiny, a potom bol skúmaný vplyv tejto dimerizácie na biologickú aktivitu vzniknutých dimérov. V niektorých prípadoch boli navrhnuté takzvané tandemové diméry (C-N väzba) obsahujúce spájacie skupiny medzi dvoma monomérmi, kde tieto spájacie skupiny boli výhodne tvorené prirodzenými aminokyselinami, takže ich syntéza bola možná pomocou rekombinantných techník.

Predkladaný vynález je založený na objave skupiny zlúčenín, ktoré majú trombopoetickú aktivitu a o ktorých sa predpokladá, že sprostredkujú svoju aktivitu prostredníctvom väzby na endogénny TPO receptor, c-Mpl. Zlúčeniny a deriváty

TMP.-ÍLOh-TMPz, kde TMP) a TMP₂ sú každý nezávislo vybraté zo skupiny zlúčenín obsahujúcich základnú štruktúru:

X₂-X3-X4X5^_N6^_X7-X8'X9-XlO, kde

X₂ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Glu, Asp, Lys a Val;

X₃ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Gly a Ala;

X₄jePro;

X₅ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Thr a Ser;

Xé je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Leu, ale, Val, Ala a Phe;

X₇ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Arg a Lys;

X₈ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Gin, Asn a Glu;

X₉ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Trp, Tyr, Cys, Ala a Phe;

Xio je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Leu, ale, Val, Ala, Phe, Met a Lys;

L¹ je spájacia skupina, ako je tu definovaná; a n je 0 alebo 1;

a patria medzi ne tiež fyziologicky prijateľné soli takých zlúčenín.

V jednom uskutočnení je L! (Gly)_n, kde n je 1 až 20 a kde, keď je n väčšie ako 1, tak môže byť až polovica Gly zostatkov substituovaná inou aminokyselinou vybratou zo zostávajúcich 19 prirodzených aminokyselín alebo ich stereoizomérov.

Okrem základnej štruktúry X₂-Xio uvedenej skôr pre TMP, a TMP₂ sú tiež možné iné základné štruktúry, v ktorých je jedna alebo viac nasledujúcich skupín pridaných k základnej štruktúre TMPi a/alebo TMP₂: Xj je naviazaný na N-koniec a/alebo sú Xu, X₁₂, X₎₃ a/alebo X₁₄ naviazané na C-koniec, kde Xu, X₁₂, Xi₃ a X₁₄majú nasledujúce významy:

X] vybratý zo skupiny zahŕňajúcej íle, Ala, Val, Leu, Ser a Arg;

Xi₂ je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Ala, íle, Val, Leu, Phe, Gly, Ser a Gin;

X_u je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej Ala, íle, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu a Gly.

Termín „TMP“ označuje skupinu tvorenú, t. j. obsahujúcu, aspoň 9 podjednotiek (X₂-Xi₀), kde X₂-Xi₀tvorí základnú štruktúru. Podjednotky X₂-X]₄ sú výhodne aminokyseliny nezávislo vybraté z 20 prirodzených aminokyselín; vynález ale tiež zahŕňa zlúčeniny, v ktorých sú X₂-Xi₄ nezávislo vybraté zo skupiny atypických, prirodzene sa nevyskytujúcich aminokyselín dobre známych v odbore. Pre každú pozíciu sú uvedené výhodné aminokyseliny. Napríklad, X₂ môže byť Glu, Asp, Lys alebo Val. Sú použité tak trojpísmenové, ako jednopísmenové skratky aminokyselín; v každom prípade sú skratky štandardnými skratkami používanými pre 20 prirodzených aminokyselín alebo ich dobre známe variácie. Tieto aminokyseliny majú L alebo D stereochemickú konfiguráciu (okrem Gly, ktorý nie je ani L, ani D), a TMP môže obsahovať kombináciu stereochemických konfigurácií. L konfigurácia je ale výhodná pre všetky aminokyseliny v TMP reťazci. Vynález tiež poskytuje reverzné TMP molekuly, v ktorých je amino-koncová až karboxy-koncová sekvencia aminokyselín obrátená. Napríklad, reverzná molekula k molekule majúcej sekvenciu X_rX₂-X₃ bude mať sekvenciu X₃-X₂-X). Vynález tiež poskytuje retro-reverzné TMP molekuly, v ktorých je - podobne ako v reverznej TMP molekule - sekvencia aminokyselín obrátená a v ktorej sú ďalej zostatky, ktoré sú normálne L-enantioméry, zmenené na D-stereoizomerické formy.

Vynález tiež zahŕňa fyziologicky prijateľné soli TMP. Termín „fyziologicky prijateľná soľ“ označuje soli, o ktorých je alebo bude známe, že sú farmaceutický prijateľné. Niektorými konkrétnymi príkladmi sú octan, trifluóracetát, hydrochlorid, hydrobromid, síran, citrát, vínan, glykolát, šťaveľan.

Tiež sa predpokladá, že za opísané TMP môžu byť substituované deriváty TMP. Také deriváty TMP obsahujú skupiny, v ktorých bola uskutočnená jedna z nasledujúcich modifikácií:

jedna alebo viac peptidylových väzieb [-C(O)NR-] bola nahradená nepeptidylovou väzbou, ako je -CH₂-karbamátová väzba [-CH₂-OC(O)NR-]; fosfonátovou väzbou; -CH₂-sulfonamidovou [-CH₂-S(O)₂NR-] väzbou; močovinovou [NHC(O)NH-] väzbou; -CH₂- sekundárnou amín- väzbou; alebo alkylovanou peptidylovou väzbou [-C(O)NR⁶-, kde R⁶ je nižší alkyi];

peptidy, v ktorých je N-koniec derivatizovaný na -NRR¹ skupinu; na -NRC(O)R skupinu; na -NRC(O)ORskupinu; na - NRS(O)₂R skupinu; na -NHC(O)NHR skupinu, kde R a R¹ sú vodík alebo nižší alkyi, s podmienkou, že R a R¹ nie sú oba vodík; na sukcínimídovú skupinu; na benzyloxykarbonyl-NH-(CBZ-NH-) skupinu; alebo na benzyloxykarbonyl-NH-skupinu obsahujúcu 1 až 3 substituenty na fenylovom kruhu vybraté zo skupiny zahŕňajúcej nižší alkyi, nižší alkoxy, chlór a bróm; a peptidy, v ktorých je voľný C-koniec derivatizovaný na -C(O)R², kde R² je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej nižší alkoxy a -NR³R⁴, kde R³ a R⁴ sú nezávisle vybraté zo skupiny zahŕňajúcej vodík a nižší alkyi. Termín „nižší“ označuje skupinu obsahujúcu od 1 do 6 atómov uhlíka.

Ďalej, modifikácie jednotlivých aminokyselín môžu byť vložené do TMP molekuly reakciou cieľových aminokyselinových zostatkov peptidu s organickým derivatizačným činidlom, ktoré môže reagovať s vybratými vedľajšími reťazcami alebo koncovými zostatkami. Príklady sú nasledujúce:

Lysinyl a aminokoncové zostatky môžu reagovať s anhydridom kyseliny jantárovej alebo inej karboxylovej kyseliny. Derivatizácia s týmito činidlami vedie na obrátenie náboja lysínových zostatkov. Ďalšími vhodnými činidlami na derivatizáciu zostatkov obsahujúcich alfa-amino skupinu sú imidoestery, ako je metylpi6 kolinimidát; pyridoxalfosfát; pyridoxal; chlórborohydrid; kyselina trinitrobenzénsulfónová; O-metylizomočovina; 2,4-pentandión; a môže byť uskutočnená reakcia s glyoxalátom katalyzovaná transaminázou.

Arginylové zostatky môžu byť modifikované reakciou s jedným alebo viacerými bežnými činidlami, ako je fenylglyoxal, 2,3-butandion, 1,2-cyklohexandion a ninhydrin. Derivatizácia arginínových zostatkov vyžaduje, aby bola uskutočnená za alkalických podmienok z dôvodu vysokej pKa guanidínovej funkčnej skupiny. Ďalej môžu tieto činidlá reagovať so skupinami lysinu, rovnako ako s guanidíno skupinami arginínu.

Špecifické modifikácie tyrosylových zostatkov boli dôkladne študované, najmä s ohľadom na vkladanie spektrálnych značkovacích činidiel do tyrosylových zostatkov reakciou s aromatickými diazoniovými zlúčeninami alebo tetranitrometanom. Najčastejšie sú N-acetylimidazol a tetranitrometan použité na prípravu O-acetylovaných tyrosylových zostatkov a 3-nitro-derivátov, v príslušnom poradí.

Karboxylové vedľajšie skupiny (aspartylu alebo glutamylu) môžu byť selektívne modifikované reakciou s karbodiimidmi (R'-N=C=N-R'), ako je l-cyklohexyl-3-(2-morfolinyl-(4-etyl)karbodiimid alebo l-etyl-3-(4-azonia-4,4-dimetylfenyl)karbodiimid. Ďalej, aspartylové a glutamylové zostatky môžu byť premenené na asparaginylové a glutaminylové zostatky reakciou s ammóniovými iontami.

Glutaminylové a asparaginylové zostatky sú často deaminované na príslušné glutamylové a aspartylové zostatky. Alternatívne môžu byť tieto zostatky deaminované za mierne kyslých podmienok. Všetky formy týchto zostatkov spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu.

Derivatizácia s bifunkčnými činidlami je použiteľná na zosietenie peptidov alebo ich fúnkčných derivátov na matrici nerozpustnej vo vode alebo na iných makromolekulových nosičoch. Medzi bežne používané zosieťovacie činidlá patrí napríklad l,l-bis(diazoacetyl)-2-fenyletan, glutaraldehyd, N-hydroxysukcínimidové estery, napríklad estery s kyselinou 4-azidosalicylovou, homobifunkčné imidoestery, vrátane disukcínimidylových esterov, ako je 3,3'-ditiobis(sukcínimidylpropionát), a bifúnkčné maleimidy, ako je bis-N-maleimido-1,8-oktan. Derivatizačné činidlá ako je metyl-3-[(p-azidofenyl)ditio]propioimidát vedú na zisk fotoaktivovateľných medziproduktov, ktoré môžu vytvárať zosietenie za prítomnosti svetla. Alternatívne môžu byť na imobilizáciu proteínu použité reaktívne matrice nerozpustné vo vode, ako sú karbohydráty aktivované brómkyanom a reaktívne substráty opísané v U.S. patentoch č. 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 a 4330440.

Ďalšími možnými modifikáciami sú hydroxylácia prolinu a lysinu, fosforylácia hydroxylových skupín serylových a treonylových zostatkov, oxidácia atómu síry v Cys, metylácia alfa-amino skupín vedľajších reťazcov lysinu, argininu a histidinu (Creighton, T.E.: Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman and Co., San Francisko, str. 79-86 (1983)), acetylácia N-koncového amínu a, v niektorých prípadoch, amidácia C-koncových karboxylových skupín.

Také derivatizované skupiny výhodne zlepšujú jednu alebo viac charakteristík, vrátane trombopoetickej aktivity, rozpustnosti, absorpcie, biologického polčasu a podobne, zlúčenín podľa predkladaného vynálezu. Alternatívne vedú derivatizované skupiny na vznik zlúčenín, ktoré majú rovnaké alebo v podstate rovnaké - charakteristiky a/alebo vlastnosti ako nederivatizované zlúčeniny. Skupiny môžu alternatívne eliminovať alebo oslabovať akékoľvek nežiaduce účinky zlúčenín a podobne.

Okrem základnej štruktúry X₂-X₁₀ uvedenej skôr sú vhodnými štruktúrami tie, ktoré majú ďalšie X skupiny naviazané na základnú štruktúru. Na základnú štruktúru môže tak byť naviazaný X) a/alebo Xn, X₎₂, X₎₂ a Xi4. Niektorými príkladmi ďalších štruktúr sú:

X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-Xg-XlO-Xl 1;

X₂-X₃-X₄-X5-X(,-X7-Xg-Xg-X 10-X] 1 -X 12;

X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X_g-X 10-X11 X 12’X 13!

X₂-X₃-X₄-X5-X6-X₇-X₈-Xg-X 10-X11 -Xl ₂-X13-X14;

Xl-X2-X₃-X₄-X5’X6’X7’X8‘Xg*Xl0;

X.-Xz-Xj-X^Xs-Xô-Xy-Xs-Xg-Xio-Xn;

X ,-X₂-X₃-X₄-X5-X6-X7-X8-Xg-X 10-X 11 -X 12!

Χ,-Χ₂-Χ₃-Χ₄-Χ5-Χ₆-Χ7-Χ8-Χ8-Χιο-Χιι-Χ,2-Χΐ3;

X₁-X₂-X₃-X₄-X5-X6-X7-X8-Xg-Xl0-Xll-Xl2-Xl3-Xl4;

kde X) až X;₄ sú rovnaké, ako boli opísané. Každý z TMP! a TMP₂ môže byť rovnaký alebo rôzny v sekvencii a/alebo dĺžke. V niektorých výhodných uskutočneniach sú TMP] a TMP₂ rovnaké.

Najmä výhodný TMP je:

Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO: 1).

Termín „obsahujúci“, ako je tu použitý, znamená, okrem iného, že zlúčenina môže obsahovať ďalšie aminokyseliny na N- a/alebo C-konci danej sekvencie. Pretože je ale prítomná štruktúra ako napríklad X₂ až X₁₀, Xi až X₁₄ a podobne, je ostatná chemická štruktúra relatívne menej významná. Je samozrejmé, že akákoľvek vonkajšia štruktúra okrem X₂-Xk> alebo X1-X14 by nemala významnejšie interferovať s trombopoetickou aktivitou zlúčeniny. Napríklad, N-koncový Met zostatok spadá do rozsahu predkladaného vynálezu. Ďalej, aj keď je veľa výhodných zlúčenín podľa predkladaného vynálezu tandemovými dimérmi, pretože obsahujú dve

TMP skupiny, sú iné zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu tandemovými multimermi TMP, t. j. zlúčeninami majúcimi nasledujúce štruktúry:

TMP,-L-TMP₂-L-TMP₃;

TMP,-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄;

TMP,-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄-L-TMP₅;

kde TMPi, TMP₂, TMP₃, TMP₄ a TMP₅ môžu byť rovnaké alebo odlišné a kde TMP a L sú rovnaké, ako je tu definované a spájacie skupiny L sú voliteľné. Výhodne obsahujú zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu od 2 do 5 TMP skupín, lepšie 2 - 3 a najlepšie 2. Zlúčeniny podľa prvého uskutočnenia predkladaného vynálezu budú výhodne obsahovať celkom menej ako 60, lepšie menej ako 40 aminokyselín (t. j. pôjde o peptidy).

Ako bolo uvedené, zlúčeniny podľa prvého uskutočnenia predkladaného vynálezu sú výhodne TMP diméry, ktoré sú naviazané buď priamo, alebo prostredníctvom spájacej skupiny. Monomérne TMP skupiny sú uvedené v bežnej orientácii od N k C-koncu a čítajú sa zľava doprava. Tak je vidieť, že všetky zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú orientované tak, že C-koniec TMPi je naviazaný buď priamo, alebo prostredníctvom spájacej skupiny, na N-koniec TMP₂. Toto usporiadanie sa označuje ako tandemové usporiadanie a zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť označované ako „tandemové diméry“. Tieto zlúčeniny sú označované ako diméry aj vtedy, keď sú TMP] a TMP₂ štrukturálne odlišné. Vynález teda zahŕňa tak homodiméry, ako heterodiméry.

„Spájacia“ skupina („Li“) je voliteľná. Pokiaľ je prítomná, tak nie je jej chemická štruktúra zásadná, pretože slúži primáme ako oddeľovacia skupina. Spájacia skupina by mala byť vybratá tak, aby neinterferovala s biologickou aktivitou konečnej zlúčeniny a tiež aby významne nezvyšovala imunogenicitu konečnej zlúčeniny. Spájacia skupina je výhodne tvorená aminokyselinami viazanými navzájom peptidovou väzbou. Vo výhodných uskutočneniach je teda spájacia skupina tvorená Y„, kde Y je prirodzená aminokyselina alebo jej stereoizomér a „n“ je 1 až 20. Spájacia skupina je tak tvorená 1 až 20 aminokyselinami viazanými peptidovými väzbami, kde tieto aminokyseliny sú vybraté z 20 prirodzených aminokyselín. Vo výhodnom uskutočnení je 1 až 20 aminokyselín vybratých z Gly, Ala, Pro, Asn, Gin, Cys, Lys. Ešte lepšie je spájacia skupina tvorená z väčšiny aminokyselinami bez stérického obmedzenia, ako je Gly, Gly-Gly-[(Gly)₂], Gly-Gly-Gly-[(Gly)₃], Ala, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala atď. Inými konkrétnymi príkladmi spájacích skupín sú: (Gly)₃Lys(Gly)₄ (SEQ ID NO: 6);

(Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂ (SEQ ID NO: 7);

(táto zlúčenina poskytuje miesta na glykosyláciu, keď je produkovaná rekombinantne v savčom bunkovom systéme, ktorý môže glykosylovať také miesta);

(Gly)₃Cys(Gly)₄ (SEQ ID NO: 8) a

GlyProAsnGly (SEQ ID NO: 9).

Na vysvetlenie uvedeného názvoslovia napríklad (Gly)₃Lys(Gly)₄ označuje Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. Výhodné sú tiež kombinácie Gly a Ala.

Je tiež možné použiť nepeptidové spájacie skupiny. Môžu byť použité napríklad alkylové spájacie skupiny, ako je -HN-(CH₂)₄-CO-, kde s = 2-20. Tieto alkylové spájacie skupiny môžu byť ďalej substituované ktoroukoľvek skupinou bez stérického obmedzenia, ako je nižší alkyl (napríklad Ci-C₆), nižší acyl, halogén (napríklad Cl, Br), CN, NH₂, fenyl atď.

Iným typom nepeptidovej spájacej skupiny je polyetylénglykolová skupina, ako je: -HN-CE1₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂)n-O-CH₂-CO-, kde n je také, že celková molekulová hmotnosť spájacej skupiny je v rozsahu od približne 101 do 5000, lepšie 101 až 500.

Všeobecne bolo zistené, že pre trombopoetické zlúčeniny podľa prvého uskutočnenia predkladaného vynálezu sú výhodné spájacie skupiny tvorené 0-14 podjednotkami (napríklad aminokyselinami).

Peptidové spájacie skupiny môžu byť premenené za vzniku derivátov rovnakým spôsobom, ako bolo uvedené pre TMP.

Zlúčeniny tejto prvej skupiny môžu byť lineárne alebo cyklické. „Cyklické“ označuje to, že aspoň dve samostatné, t. j. nekontinuálne, časti molekuly sú viazané jedna na druhú. Napríklad môžu byť amino- a karboxylový koniec molekuly naviazané na seba kovalentnou väzbou za vzniku cyklickej molekuly. Alternatívne môže molekula obsahovať dva alebo viac Cys zostatkov (napríklad v spájacej skupine), ktoré môžu cyklizovať prostredníctvom tvorby disulfidových mostíkov. Ďalej sa predpokladá, že viac ako jeden tandemový peptidový dimér sa môže viazať za vzniku diméru dimérov. Napríklad, tandemový dimér obsahujúci Cys zostatok môže tvoriť disulfidovú väzbu s Cys iného diméru. Pozri, napríklad, zlúčeninu SEQ ID NO: 20 uvedenú ďalej.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť tiež kovalentne alebo nekovalentne asociované s molekulou nosiča, ako je lineárny polymér (napríklad polyetylénglykol, polylysín, dextran atď.), polymér s rozvetveným reťazcom (pozri napríklad US patent 4289872, Denkenwalter et al., udelený 15.9.1981; 5229490, Tam, udelený 20.1.1993; WO 93/21259, Frechet et al., publikovaný 28.10.1993); lipid; cholesterolová skupina (ako je steroid); alebo karbohydrát, alebo oligosacharid. Ďalšími možnými nosičmi sú polyméry rozpustné vo vode, ako je polyoxyetylénglykol alebo propylénglykol, ako sú opísané v US patentoch č. 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 a 4179337. Ešte inými použiteľnými polymérmi známymi v odbore sú monometoxypolyetylénglykol, dextran, celulóza alebo iné polyméry na báze karbohydrátov, poly-(N-vinylpyrrolidonj-polyetylénglykol, homopolyméry propylénglykolu, kopolymér polypropylénoxid/etylénoxid, polyoxyetylované polyoly (napríklad glycerol) a polyvinylalkohol, rovnako ako zmesi týchto polymérov.

Výhodným nosičom je polyetylénglykol (PEG). PEG skupina môže mať akúkoľvek vhodnú molekulovú hmotnosť a môže byť priama alebo rozvetvená. Priemerná molekulová hmotnosť PEG je výhodne v rozmedzí od približne 2 kDa do približne 100 kDa, lepšie od približne 5 kDa do približne 50 kDa, nejlepšie od približne 5 kDa do približne 10 kDa.

PEG skupiny sú obvykle naviazané na zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu acyláciou, redukčnou alkyláciou, Michaelovou adíciou, tiólovou aikyláeiou alebo inými chemoselektívnymi konjugačnými/ligačnými metódami prostredníctvom reaktívnej skupiny na PEG molekule (napríklad aldehydovej skupine, amino-skupine, esterovej skupine, tiólu, α-halogénacetylovej, maleimido-skupine alebo hydrazino- skupine) a reaktívne skupiny na cieľovej zlúčenine (napríklad aldehydovej skupine, amino-skupine, esterovej skupine, tiólovej skupine, α-halogénacetylovej, maleimido- skupine alebo hydrazino- skupine).

Karbohydrátové (oligosacharidové) skupiny môžu byť výhodne naviazané na miesta, ktoré sú známe ako glykosylačné miesta proteínov. Všeobecne, O-viazané oligosacharidy sú naviazané na serínové (Ser) alebo treonínové (Thr) zostatky, zatiaľ čo N-viazané oligosacharidy sú naviazané na asparagínové (Asn) zostatky, keď sú súčasťou sekvencie Asn-X-Der/Thr, kde X môže byť akákoľvek aminokyselina s výnimkou prolinu. X je výhodne jedna z 19 prirodzených aminokyselín okrem prolinu. Štruktúry N-viazaných a O-viazaných oligosacharidov a cukrových zostatkov v každom type sú rôzne. Jedným bežným typom sacharidu je kyselina N-acetylneuraminová (tu označovaná ako kyselina sialová). Kyselina sialová je obvykle koncovým zostatkom N-viazaných aj O-viazaných oligosacharidov a môže - vďaka svojmu negatívnemu náboju - spôsobovať kyslé vlastnosti glykosylovanej zlúčeniny. Také miesta môžu byť obsiahnuté v spájacej skupine zlúčenín podľa predkladaného vynálezu a sú výhodne glykosylované bunkami počas rekombinantnej produkcie polypeptidových zlúčenín (napríklad cicavčími bunkami ako sú CHO, BHK, COS). Takéto miesta ale môžu byť glykosylované tiež počas syntetických alebo semisyntetických postupov známych v odbore.

Niektoré príklady peptidov podľa predkladaného vynálezu sú uvedené. Sú použité jednopísmenové skratky pre aminokyseliny a spájacie skupiny sú oddelené pomlčkami na jasný opis. Ďalšie skratky: BrAc znamená bromacetyl BrCH₂C(0)) a PEG znamená polyetylénglykol.

IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA

IEG PTLRQCLAARA-GGGGGGGG-1EGPTLRQCLAARA (cyklický) (SEQ ID NO: 10)

IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (lineárny)

IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGK(BrAc)GGGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGK(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGC(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQIDNO: 11) (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14) (SEQIDNO: 15) (SEQIDNO: 16) (SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 19)

IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 20)

IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 21)

V každej uvedenej zlúčenine sa tiež predpokladá N-koncový Met (alebo M- v jednopísmenovom kóde).

Multiméry (napríklad tandem a netandem, kovalentne viazaný a nekovalentne viazaný) uvedených zlúčenín sú tiež možné.

V druhom uskutočnení predkladaného vynálezu môžu byť zlúčeniny opísané skôr ďalej ťúzované na jednu alebo viac Fc skupín, buď priamo, alebo prostredníctvom spájacích skupín. Všeobecný vzorec pre túto druhú skupinu zlúčenín je:

(Fc)_m-(L₂)_q-TMP₁-(L,)_n-TMP₂-(L₃)_r-(Fc)_p, kde TMP), TMP₂ a n sú rovnaké, ako boli opísané; L_b L₂ a L₃ sú spájacie skupiny, ktoré sú vybraté nezávisle z definovaných spájacích skupín; Fc je Fc región imunoglobulínu; m, p, q a r sú každý nezávisle 0 alebo 1, kde aspoň jeden z m alebo p je 1 a ďalej kde pokiaľ m je 0, tak q je 0, a pokiaľ p je 0, tak r je 0; a medzi tieto zlúčeniny patria tiež farmaceutický prijateľné soli takých zlúčenín.

Zlúčeniny tejto druhej skupiny majú štruktúry definované pre prvú skupinu zlúčenín, ako bola opísaná, ale tieto zlúčeniny sú ďalej fúzované aspoň na jednu Fc skupinu buď priamo, alebo nepriamo prostredníctvom spájacích skupín.

Fc sekvencia uvedených zlúčenín môže byť vybratá z ľudského ťažkého reťazca imunoglobulínu IgGl, pozri Ellison, J.W. et al., Nucleic Acids Res. 10: 4071-4079 (1982), alebo akákoľvek iná Fc sekvencia známa v odbore (napríklad iná trieda IgG vrátane napríklad IgG2, IgG3 a IgG4, alebo iných imunoglo-bulínov).

Je dobre známe, že Fc regióny protilátok sú tvorené monomémymi polypeptidovými segmentmi, ktoré môžu byť viazané do dimémych alebo multimémych foriem disulfidovými väzbami alebo nekovalentnými asociáciami. Počet intermolekulových disulfidových väzieb medzi monomémymi podjednotkami prirodzených Fc molekúl je v rozsahu od 1 do 4 podľa triedy (napríklad IgA, IgG, IgE) alebo podtriedy (napríklad IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgA2) použitej protilátky. Termín „Fc“, ako je tu použitý, označuje monoméme, diméme a multiméme formy Fc molekúl. Je treba si uvedomiť, že Fc monoméry budú spontánne dimerizovať, keď sú prítomné vhodné Cys zostatky, pokiaľ okolité podmienky nebránia dimerizácii prostredníctvom tvorby disulfidových mostíkov. Aj keď sú Cys zostatky, ktoré normálne vytvárajú disulfidové väzby v Fc diméru, odstránené alebo nahradené inými zostatkami, môžu monoméme reťazce dimerizovať prostredníctvom nekovalentných interakcií. Termín „Fc“, ako je tu použitý, označuje akúkoľvek z týchto foriem: prirodzený monomér, prirodzený dimér (viazaný disulfidovými väzbami), modifikované diméry (disulfidovo a/alebo nekovalentne viazané) a modifikované monoméry (t. j. deriváty).

Varianty, analógy alebo deriváty Fc časti môžu byť pripravené, napríklad, vytvorením rôznych substitúcií zostatkov alebo sekvencií.

Variantné (alebo analogické) polypeptidy zahŕňajú inzerčné varianty, v ktorých jeden alebo viac aminokyselinových zostatkov dopĺňa aminokyselinovú sekvenciu Fc. Inzercie môžu byť lokalizované na jednom alebo na oboch koncoch proteínu, alebo môžu byť umiestnené vo vnútorných regiónoch aminokyselinovej sekvencie Fc. Inzerčné varianty s ďalšími zostatkami na jednom alebo oboch koncoch môžu zahŕňať, napríklad, fúzne proteíny a proteíny obsahujúce aminokyselinové koncovky alebo značkovacie skupiny. Napríklad, Fc molekula môže voliteľne obsahovať N-koncový Met, najmä vtedy, keď je molekula exprimovaná rekombinantne v bakteriálnych bunkách, ako je E. coli.

V delečných variantoch Fc je jeden alebo viac aminokyselinových zostatkov vo Fc polypeptide odstránených. Delécie môžu byť uskutočnené na jednom alebo na oboch koncoch Fc polypeptidu, alebo môžu byť odstránené jeden alebo viac zostatkov v aminokyselinovej sekvencií Fc. Delečné varianty preto zahŕňajú všetky fragmenty sekvencie Fc polypeptidu.

Vo Fc substitučných variantoch je jeden alebo viac aminokyselinových zostatkov Fc polypeptidu odstránených a nahradených alternatívnym zostatkom. V jednom aspekte sú substitúcie konzervatívne, vynález ale zahŕňa tiež substitúcie, ktoré sú nekonzervatívne.

Napríklad, cysteinové zostatky môžu byť deletované alebo nahradené inými aminokyselinami na zabránenie tvorby niektorých alebo všetkých disulfidových mostíkov vo Fc sekvencií. Konkrétne, aminokyseliny v pozíciách 7 a 10 SEQ ID NO: 5 sú cysteinové zostatky. Je možné odstrániť každý z týchto cysteinových zostatkov alebo substituovať jeden alebo viac takých cysteinových zostatkov inou aminokyselinou, ako je Ala alebo Ser. V inom prípade je možné uskutočniť substitúcie na (1) odstránenie väzbového miesta na Fc receptor; (2) odstránenie väzbového miesta na komplement (Clq); a/alebo na (3) odstránenie miesta na bunkovú cytotoxicitu závislú od protilátok (ADCC). Také miesta sú známe v odbore a akékoľvek substitúcie známe v odbore je možné použiť na Fc v predkladanom vynáleze. Pozri, napríklad, Molecular Immunology, zväzok 29, č. 5, 633-639 (1992), s ohľadom na ADCC miesta v IgGl.

Podobne môže byť jeden alebo viac tyrosínových zostatkov nahradený fenylalaninovým zostatkom. Do rozsahu predkladaného vynálezu tiež spadajú ďalšie aminokyselinové inzercie, delécie (napríklad v rozsahu 1-25 aminokyselín) a/alebo substitúcie. Všeobecne sú výhodnejšie konzervatívne aminokyselinové substitúcie. Ďalej, alterácie môžu byť vo forme alterovaných aminokyselín, ako sú peptidomimetiká alebo D-aminokyseliny.

Fc sekvencie TMP zlúčenín môžu byť tiež derivatizované, t. j. môžu obsahovať modifikácie iné ako inzercie, delécie alebo substitúcie aminokyselinových zostatkov. Výhodné sú modifikácie kovalentného charakteru a zahŕňajú napríklad chemické naviazanie polymérov, lipidov a iných organických a anorganických skupín. Deriváty podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené na účely predĺženia cirkulujúceho polčasu, alebo môžu byť navrhnuté na zlepšenie špecificity polypeptidu pre cieľové bunky, tkanivá alebo orgányJe tiež možné použiť väzbovú doménu pre receptor intaktnej Fc molekuly ako Fc časť zlúčenín podľa predkladaného vynálezu, ako je opísané vo WO 96/32478, nazvanej „Altered Polypeptides with Increased Half-Life“. Ďalšími členmi triedy molekúl označovanej ako Fc sú tie, ktoré sú opísané vo WO 97/34631, nazvanej „Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives“. Obidve publikované PCT prihlášky citované v tomto odseku sú tu uvedené ako odkazy.

Fúzia s Fc môže byť uskutočnená na N alebo na C konci TMP) alebo TMP₂, alebo na oboch koncoch TMP. Prekvapivo bolo zistené, že peptidy, v ktorých je Fc skupina ligovaná na N-koniec TMP skupiny, sú biologicky aktívnejšie ako ostatné, takže sú prednostne tvorené fúzie obsahujúce Fc doménu na N-konci TMP) (t. j. r a p sú vo všeobecnom vzorci obidva 0 a m a q sú obidva 1). Keď je Fc reťazec fuzovaný na N-koniec TMP alebo spájacej skupiny, tak sú také fúzie obvykle uskutočnené na C-konci Fc reťazca a naopak.

Výhodné sú tiež zlúčeniny, ktoré sú diméry (napríklad tandemové a netandemové) zlúčenín podľa všeobecného vzorca uvedeného skôr. V takých prípadoch je každý Fc reťazec naviazaný na tandemový dimér TMP peptidov. Schematický príklad takých zlúčenín je uvedený na obr. 6C. Výhodný príklad takých zlúčenín je uvedený na obr. 6C, kde Fc je dimér zlúčeniny SEQ ID NO: 5, každý L₂ je (Gly)₅, TMP] a TMP₂ sú každý zlúčenina SEQ ID NO: 1 a každý L| je (Gly)₈. Táto zlúčenina je tu tiež označovaná ako „FC-TMP_r-L-TMP₂“. Je tiež reprezentovaná ako dimér (prostredníctvom Fc časti) SEQ ID NO: 34. Analogická zlúčenina, v ktorej je Fc skupina naviazaná prostredníctvom spájacej skupiny na C-koniec TMP₂ skupín na obr. 6C, je tiež možná a je tu označovaná ako TMP_rL- TMP₂-Fc.

Niektoré konkrétne príklady zlúčenín z druhej skupiny sú uvedené ďalej:

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA-Fc IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cyklický) |_| (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO: 23) (SEQ ID NO: 24) (SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 26)

Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA

Fc-IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (lineárny) (SEQ ID NO: 28) (SEQ ID NO: 29) (SEQ ID NO: 30) (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 32)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 33)

Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 34)

V každej uvedenej zlúčenine sa tiež predpokladá N- koncový Met (alebo M- v jednopísmenovom kóde). Met zostatok môže byť naviazaný na N-koniec Fc skupiny v tých prípadoch, keď je Fc skupina naviazaná na N-koniec TMP. V tých prípadoch, keď je Fc skupina naviazaná na C-koniec TMP, môže byť Met zostatok naviazaný na N koniec TMP skupiny.

V každom z uvedených prípadov je Fc výhodne Fc región ťažkého reťazca ľudského imunoglobulínu IgGl alebo jeho biologicky aktívny fragment, derivát alebo dimér, pozri Ellison, J.W. et al., Nucleic Acids Res. 10: 4071-4079 (1982). Fc sekvencia uvedená v SEQ ID NO: 5 je najvýhodnejším Fc pre uvedené zlúčeniny. Tiež výhodné sú uvedené zlúčeniny, v ktorých je Fc dimémou formou sekvencia SEQ ID NO: 5 a Fc reťazec je naviazaný na TMP tandemový dimér.

Ďalej, aj keď veľa výhodných zlúčenín druhého uskutočnenia obsahuje jeden alebo viac tandemových dimérov v tom zmysle, že obsahujú dve naviazané TMP skupiny, obsahujú iné zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu tandemové multimery TMP, t. j. ide o zlúčeniny nasledujúcich príkladných vzorcov: Fc-TMP_rL-TMP₂-L-TMP₃;

Fc-TMP,-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄;

Fc-TMP_rL-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄-L-TMP₅;

TMP ,-L-TMP₂-L-TMP₃-Fc;

TMP,-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄-Fc;

TMP,-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄-L-TMP5-Fc;

kde TMP_b TMP₂, TMP₃, TMP₄ a TMP₅ majú rovnaké alebo rôzne štruktúry a kde Fc a každý TMP a L sú rovnaké, ako sú definované a spájacie skupiny sú voliteľné. V každom uvedenom prípade môže byť Fc skupina monoméma alebo diméma a v prípadoch, keď je Fc skupina diméma, môže byť na každý Fc reťazec naviazaný jeden alebo viac TMP multimérov. Tiež sú možné iné príklady, v ktorých sú TMP diméry alebo multiméry naviazané na N aj C koniec jedného alebo oboch Fc reťazcov, vrátane prípadov, keď sú TMP diméry a multiméry naviazané na všetky štyri konce dvoch Fc reťazcov.

Výhodne majú zlúčeniny tohto druhého uskutočnenia vynálezu celkovú dĺžku približne 200 až 400 aminokyselín (t. j. ide o polypeptidy).

Spôsoby prípravy

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené rôznymi spôsobmi. Pretože veľa týchto zlúčenín sú peptidy, alebo obsahujú peptidy, sú najmä relevantné spôsoby peptidovej syntézy. Napríklad môžu byť použité techniky syntézy na pevnej fáze. Vhodné techniky sú dobre známe v odbore a zahŕňajú tie, ktoré sú opísané v Merrifield, v Chem. Polypeptides, str. 335-61 (Katspyannis and Panayotis, vyd., 1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963); Davis et al., Biochem Intl. 10: 394-414 (1985); Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1969); US patent č. 3941763; Finn et al., The Proteins, 3. vydanie, zväzok 2, str. 105-253 (1976); a Erickson et al., the Proteins, 3. vydanie, zväzok 2, str. 257-527 (1976). Syntéza na pevnej fáze je výhodnou technikou na prípravu jednotlivých peptidov, pretože je najlacnejšou technikou na prípravu malých peptidov.

Peptidy môžu byť tiež vyrábané transformovanými hostiteľskými bunkami s použitím rekombinantných DNA techník. Pri takej výrobe sa pripraví rekomhinantná molekula DNA kódujúca peptid. Spôsoby na prípravu takých molekúl DNA a/alebo RNA sú dobre známe v odbore. Napríklad, sekvencia kódujúca peptid môže byť excidovaná z DNA s použitím vhodných reštrikčných enzýmov. Relevantná sekvencia môže byť pripravená polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s použitím vhodných reštrikčných miest na následné klonovanie. Alternatívne môže byť molekula DNA/RNA syntetizovaná s použitím techník chemickej syntézy, ako je fosforoamiditová technika. Tiež môže byť použitá kombinácia týchto techník.

Vynález tiež zahŕňa vektor kódujúci peptidy vo vhodnom hostiteľovi. Vektor obsahuje molekulu DNA, ktorá kóduje peptidy, operatívne naviazanú na kontrolné sekvencie na expresiu. Spôsoby na uskutočnenie tejto operatívnej väzby, buď po, alebo pred inzerciou molekuly DNA kódujúcej peptid do vektoru, sú dobre známe. Medzi kontrolné sekvencie na expresiu patria promótory, aktivátory, zosilňovače, operátory, väzbové miesta na ribosomy, štartovacie signály, stop signály, signály na naviazanie koncovky, polyadenylačné signály a iné signály zúčastňujúce sa kontroly transkripcie alebo translácie.

Výsledný vektor obsahujúci molekulu DNA kódujúcu peptid je použitý na transformáciu vhodného hostiteľa. Táto transformácia môže byť uskutočnená s použitím metód dobre známych v odbore.

Akákoľvek z mnohých dostupných a dobre známych hostiteľských buniek môže byť použitá pri uskutočňovaní predkladaného vynálezu. Výber určitého hostiteľa je závislý od mnohých faktorov známych v odbore. Medzi tieto faktory patrí, napríklad, kompatibilita s vybraným expresným vektorom, toxicita peptidov kódovaných molekulou DNA pre hostiteľa, rýchlosť transformácie, možnosť ľahkého získania peptidov, charakteristiky expresie, biologická bezpečnosť a náklady. Medzi týmito faktormi musí byť rovnováha a je treba si uvedomiť, že nie všetci hostitelia sú rovnako účinní pri expresii určitej DNA sekvencie.

Pri dodržaní týchto všeobecných pravidiel patria medzi použiteľných mikrobiálnych hostiteľov baktérie (ako je E. coli), kvasnice (ako je Saccharomyces spp. a Pichia pastoris) a iné huby, hmyzie, rastlinné, savčie (vrátane ľudských) bunky v kultúre a iní hostitelia známi v odbore.

Potom sa transformovaný hostiteľ kultivuje za bežných fermentačných podmienok tak, aby boli exprimované požadované peptidy. Také fermentačné podmienky sú dobre známe v odbore.

Nakoniec sa peptidy prečistia z fermentačnej kultúry alebo z hostiteľských buniek, ktoré ich exprimujú. Tieto metódy na prečistenie sú dobre známe v odbore.

Zlúčeniny, ktoré obsahujú derivatizované peptidy, alebo ktoré obsahujú nepeptidové skupiny, môžu byť syntetizované technikami dobre známymi v organickej chémii.

Použitie zlúčenín

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu majú schopnosť viazať sa na a aktivovať c-Mpl receptor, a/alebo majú schopnosť stimulovať produkciu (in vitro a in vivo) trombocytov (majú „trombopoetickú aktivitu“) a prekurzorov trombocytov (majú „megakaryocytopoetickú aktivitu“). Na meranie aktivity týchto zlúčenín je možné použiť štandardné testy, ako sú testy opísané vo WO 95/26746 nazvané „Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation“. Testy in vivo sú ďalej opísané v časti „Príklady uskutočnenia vynálezu“.

Stavy, ktoré môžu byť liečené spôsobmi a prostriedkami podľa predkladaného vynálezu, sú všeobecne tie stavy, pri ktorých existuje deficit megakaryocytov/trombocytov, alebo stavy, pri ktorých sa predpokladá deficit megakaryocytov/trombocytov v budúcnosti (napríklad na plánovaný chirurgický výkon alebo pri darcovstve trombocytov). Také stavy môžu byť dôsledkom deficitu (dočasného alebo trvalého) aktívneho Mpl ligandu in vivo. Generický termín pre deficit trombocytov je trombocytopénia a tak sú spôsoby a prostriedky podľa predkladaného vynálezu všeobecne vhodné na profylaktickú alebo terapeutickú liečbu trombocytopénie pacientov.

Svetová zdravotnícka organizácia klasifikuje stupeň trombocytopénie podľa počtu cirkulujúcich trombocytov jedinca (Miller et al., Cancer 47: 210-211 (1981)). Napríklad, jedinec nevykazujúci žiadne známky trombocytopénie (stupeň 0) bude mať aspoň 100 000 trombocytov/mm³. Mierna trombocytopénia (stupeň 1) označuje počet cirkulujúcich trombocytov medzi 79 000 a 99 000/mm³. Stredne ťažká trombocytopénia (stupeň 2) označuje počet cirkulujúcich trombocytov medzi 50 000 a 74 000/mm³ a ťažká trombocytopénia označuje počet cirkulujúcich trombocytov medzi 25 000 a 49 000/mm³. Život ohrozujúca trombocytopénia je charakterizovaná počtom cirkulujúcich trombocytov menším ako 25 000/mm³.

Trombocytopénia (deficit trombocytov) môže byť prítomná z rôznych dôvodov, vrátane chemoterapie a inej terapie rôznymi liekmi, aktinoterapie, chirurgického výkonu, strate krvi pri poranení a špecifických ochorení. Príklady špecifických ochorení, ktoré môžu zahŕňať trombocytopéniu a ktoré môžu byť liečené spôsobom podľa predkladaného vynálezu, sú: aplastická anémia; idiopatická alebo autoimúnna trombocytopénia (ITP), vrátane idiopatickej trombocytopenickej purpury asociovanej s karcinomom prsníka; ITP asociovaná s HIV a trombotická trombocytopenická purpura spojená s HIV; metastatické nádory spôsobujúce trombocytopéniu; systémový lupus erytematodes, vrátane neonatálneho lupusového syndrómu spojeného so splenomegáliou; Fanconiho syndróm; deficit vitamínu B12; deficit kyseliny listovej; May-Hegglinova anomália; Wiskott-Aldrichov syndróm; chronické pečeňové ochorenie; myelodysplastický syndróm spojený s trombocytopéniou; paroxysmálna nočná hemoglobinúria; akútna významná trombocytopénia po terapii C7E3 Fab (Abciximab); alloimúnna trombocytopénia, vrátane matemálnej alloimúnnej trombocytopénii; trombocytopénia asociovaná s antifosfolipidovými protilátkami a trombózou; autoimúnna trombocytopénia; trombocytopénia indukovaná liekmi, vrátane trombocytopénie indukovanej karboplatinou, trombocytopénie indukovanej heparinom; fetálna trombocytopénia; gestačná trombocytopénia; Hughesov syndróm; lupoidná trombocytopénia; strata krvi pri masívnom krvácaní a/alebo krvácanie pri nehode; myeloproliferatívne ochorenie; trombocytopénia pacientov s malignitami; trombotická trombocytopenická purpura, vrátane trombotickej mikroangiopatie manifestujúca sa ako trombotická trombocytopenická purpura/hemolyticko-uremický syndróm pacientov s nádorovými ochoreniami; autoimúnna hemolytická anémia; okultná perforácia divertikla v jejune; čistá aplazia červeného radu; autoimúnna trombocytopénia; nefropatia epidemica; akútne renálne zlyhanie spojené s rifampicínom; Paris-Trousseauova trombocytopénia; neonatálna alloimúnna trombocytopénia; paroxysmálna nočná hemoglobinúria; hematologické zmeny spojené s karcinomom žalúdka; hemolyticko uremické syndrómy v detstve; hematologické prejavy súvisiace s vírusovými infekciami ako je trombocytopénia spojená s infekciou vírusom hepatitídy A a CMV. Tiež niektoré liečby AIDS vedú na trombocytopéniu (napríklad AZT). Niektoré procesy hojenia rán môžu byť tiež zlepšené v dôsledku vyššieho počtu trombocytov.

Pri predpokladanom deficite trombocytov, napríklad pri plánovanom chirurgickom výkone, môžu byť zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu podané niekoľko dní až niekoľko hodín pred potrebou trombocytov. Pri akútnych stavoch, ako sú úrazy a masívne straty krvi, môžu byť zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu podané súčasne s krvou alebo prečistenými doštičkami.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť tiež užitočné na stimuláciu iných typov buniek ako megakaryocytov, pokiaľ tieto bunky exprimujú Mpl receptor. Stavy asociované s takými bunkami exprimujúcimi Mpl receptor, ktoré reagujú na stimuláciu Mpl ligandom, spadajú tiež do rozsahu predkladaného vynálezu.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť použité v akejkoľvek situácii, v ktorej je žiaduca produkcia trombocytov alebo prekurzorových buniek trombocytov, alebo keď je žiaduca stimulácia c-Mpl receptora. Tak môžu byť zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu použité na liečbu akéhokoľvek stavu cicavca, pri ktorom existuje potreba trombocytov, megakaryocytov a podobne. Také stavy sú podrobne opísané napríklad vo WO: 95/26746, WO 95/21919, WO 95/18858, WO 95/21920, ktoré sú tu uvedené ako odkazy.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť tiež použité na zachovanie životaschopnosti alebo pri skladovaní trombocytov a/alebo megakaryocytov a príbuzných buniek. Preto môže byť vhodné použiť účinné množstvo jednej alebo viacerých zlúčenín v prostriedkoch obsahujúcich také bunky.

Termín „cicavec“ označuje akéhokoľvek cicavca, vrátane človeka, domácich zvierat, ako sú psy a mačky, exotických zvierat, ako sú opice, laboratórnych zvierat, ako sú myši, potkany a morčatá, poľnohospodárskych zvierat, ako sú kone, kravy, ovce, kozy a prasce, a podobne. Výhodným cicavcom je človek. Farmaceutické prostriedky

Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsoby na použitie farmaceutických prostriedkov obsahujúcich zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu. Také farmaceutické prostriedky môžu byť určené na injekčné podanie, orálne, nazálne, transdermálne alebo iné podanie, vrátane, napríklad, intravenózneho, intradermálneho, intramuskulámeho, intramammámeho, intraperitoneálneho, intratekálneho, vnútroočného, retrobulbámeho, intrapulmonálneho (napríklad aerosólové prostriedky) alebo podkožného injekčného podania (vrátane depotného podania na dlhodobé uvoľňovanie); a ďalej vrátane sublinguálneho, análneho, vaginálneho podania alebo chirurgickej implantácie, napríklad v splenickej kapsule, do mozgu alebo do rohovky. Liečba môže spočívať v jednej dávke alebo vo viacerých dávkach za určitú dobu. Všeobecne, vynález zahŕňa farmaceutické prostriedky obsahujúce účinné množstvo zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu spoločne s farmaceutický prijateľným riedidlom, konzervačnými činidlami, solubilizačnými činidlami, emulgačnými činidlami, pomocnými činidlami a/alebo nosičmi. Také prostriedky obsahujú riedidlá s rôznym obsahom pufŕa (napríklad Tris-HCl, acetát, fosfát), pH a iontovou silou; prísady ako sú detergenčné činidlá a solubilizačné činidlá (na13 príklad Tween 80, Polysorbat 80); antioxidačné činidlá (ako je kyselina askorbová, metahydrogénsiričitan sodný); konzervačné činidlá (napríklad Thimersol, benzylalkohol); a činidlá upravujúce objem (napríklad laktózu, manitol); tieto materiály sa môžu zapracovať do časticových prípravkov polymémych zlúčenín, ako je kyselina polymliečna, kyselina polyglykolová atd’., alebo do liposomov. Môže sa použiť kyselina hyalurónová a tá môže predĺžiť dobu prítomnosti aktívnej zložky v cirkulácii. Farmaceutické prostriedky môžu voliteľne obsahovať ešte ďalšie farmaceutický prijateľné kvapalné, semisolidné alebo solidné riedidlo, ktoré slúži ako farmaceutické vehikulum, prísada alebo médium, vrátane napríklad polyoxyetylénsorbitanmonolaurátu, stearanu horečnatého, metyl- a propylhydroxybenzoátu, škrobov, sacharózy, dextrózy, arabskej gumy, fosforečnanu vápenatého, minerálneho oleja, kakaového masla a kakaový olej. Také zloženie môže ovplyvňovať fyzikálny stav, stabilitu, rýchlosť uvoľňovania in vivo a rýchlosť klírens in vivo proteínov a derivátov podľa predkladaného vynálezu. Pozri napríklad Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydanie (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA18042), str. 1435-1712, ktoré sú tu uvedené ako odkaz. Prostriedky môžu byť v kvapalnej forme alebo vo forme sušeného prášku, ako je napríklad lyofilizovaná forma. Vynález zahŕňa tiež implantovateľné prostriedky so spomaleným uvoľňovaním, rovnako ako transdermálne prostriedky.

Predpokladá sa použitie orálnych pevných dávkových foriem, ktoré sú všeobecne opísané v napríklad Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydanie (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA18042) v kapitole 89, ktorá je tu uvedená ako odkaz. Medzi pevné dávkové formy patria tablety, kapsuly, pilulky, pastilky alebo medicinálne oblátky alebo pelety. Na prípravu prostriedkov podľa predkladaného vynálezu môže byť tiež použitá liposomálna alebo proteínoidná enkapsulácia (ako je to napríklad pri proteínoidných mikrosférach opísaných v US patente č. 4925673. Môže byť použitá enkapsulácia v liposómoch a liposómy môžu byť derivatizované rôznymi polymérmi (napríklad U.S. patent č. 5013556). Opis možných dávkových foriem pre terapeutiká je uvedený v Marshall, K., Modem Pharmaceutics, vyd. G.S. Banker and C.T. Rhodes, kapitola 10, 1979, ktorá je tu uvedená ako odkaz. Všeobecne, prostriedok bude obsahovať zlúčeninu podľa predkladaného vynálezu a inertné prísady chrániace zlúčeninu pred žalúdočným prostredím a uvoľňujú biologicky aktívny materiál v tenkom čreve.

Vynález tiež špecificky zahŕňa orálne dávkové formy zlúčenín podľa predkladaného vynálezu. Pokiaľ je to nutné, môžu byť zlúčeniny chemicky modifikované tak, aby bolo podanie účinné. Všeobecne, možnou chemickou modifikáciou je naviazanie aspoň jednej skupiny na molekulu zlúčeniny samotnej, kde uvedená skupina (a) inhibuje proteolýzu; a (b) umožňuje prechod zlúčeniny zo žalúdka alebo čreva do krvného obehu. Žiaduce je tiež zvýšenie celkovej stability zlúčeniny a predĺženie doby cirkulácie v tele. Príklady takých skupín sú: polyetylénglykol, kopolyméry etylénglykolu a propylénglykolu, karboxymetylcelulóza, dextrán, poíyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon apolyprolín (Abuchowski and Davis; Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, vyd., Wiley- Interscience, New York, NY, (1981), str. 367-383; Newmark et al., J. Appl. Biochem. 4:185-189 (1982)). Ďalšími polymérmi, ktoré môžu byť použité, sú poly-l,3-dioxolan a poly-l,3,6-tioxocan. Na uvedené farmaceutické použitie sú výhodné polyetylénglykolové skupiny.

Na orálne dávkové formy je tiež možné použiť soli modifikovanej alifatickej aminokyseliny, ako je N-(8[2-hydroxybenzoyl]amino)kaprylát sodný (SNAC), ako nosič na zlepšenie absorpcie terapeutických zlúčenín podľa predkladaného vynálezu. Klinická účinnosť heparínového prostriedku využívajúceho SNAC bola preukázaná vo fáze II štúdie uskutočnenej Emispher Technologies. Pozri US Patent 5792451 „Oral drug delivery composition and methods“.

Terapeutikum môže byť obsiahnuté v prostriedku ako jemné mikročastice vo forme granúl alebo peliet s veľkosťou približne 1 mm. Materiál na prípravu kapsúl môže byť vo forme prášku, mierne lisovaných materiálov alebo aj tabliet. Terapeutikum môže byť pripravené lisovaním.

Môžu byť použité farvivá a chuťové korigens. Napríklad, proteín (alebo derivát) môže byť pripravený (napríklad enkapsulovaný v liposómoch alebo mikrosférach) a potom môže byť vložený do potravinárskeho výrobku, ako sú chladené nápoje obsahujúce farbivá a chuťové korigens.

Je možné nariediť alebo zvýšiť objem terapeutika inertným materiálom. Medzi tieto inertné materiály patria karbohydráty, najmä manitol, α-laktóza, bezvodová laktóza, celulóza, sacharóza, modifikované dextrany a škrob. Niektoré anorganické soli môžu byť tiež použité ako plnivá, vrátane fosforečnanu vápenatého, uhličitanu horečnatého a chloridu sodného. Niektorými komerčne dostupnými riedidlami sú Fast- Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcomprcss a Avicell.

V pevnej dávkovej forme farmaceutického prostriedku obsahujúceho terapeuticky aktívne činidlo môže byť obsiahnuté činidlo podporujúce rozpadavosť. Činidlom podporujúcim rozpadavosť môže byť napríklad škrob, vrátane komerčne dostupného činidla podporujúceho rozpadavosť na báze škrobu, ktorým je Explotab. Tiež môže byť použitý glykolát, škrob sodný, Amberlite, karboxymetylcelulóza sodná, ultramylopektín, alginat sodný, želatína, pomarančová kôra, kyslá karboxymetylcelulóza, prirodzená morská huba a bentonit. Inou formou činidiel podporujúcich rozpadavosť sú nerozpustné kationtomeničové živice. Práškové arabské gumy môžu byť použité ako činidlá podporujúce rozpadavosť a ako spojivá a medzi tieto práškové arabské gumy patrí agar, Karaya a tragant. Kyselina alginová a jej sodná soľ sú tiež vhodnými činidlami podporujúcimi rozpadavosť.

Spojivá môžu byť použité na súdržnosť terapeutického činidla vo forme kapsuly a patria medzi ne materiály z prirodzených produktov, ako je arabská guma, tragant, škrob a želatína. Ďalšími spojivami sú metylcelulóza (MC), etylcelulóza (EC) a karboxymetylcelulóza (CMC).

Polyvinylpyrrolidón (PVP) a hydroxypropylmetylcelulóza (HPMC) môžu byť použité v alkoholových roztokoch na granulovanie terapeutického činidla.

Protitrecie činidlá môžu byť použité pri príprave farmaceutických prostriedkov na prevenciu lepenia počas prípravy. Klzné činidlá môžu byť použité ako vrstva medzi terapeutikom a stenou lisovacieho nástroja a medzi také Činidlá patrí napríklad kyselina stearová a jej horečnaté a vápenaté soli, polytetrafluóretylén (PTFE), kvapalný parafín, rastlinné oleje a vosky. Môže byť použité rozpustné klzné činidlo, ako je laurylsíran sodný, laurylsíran horečnatý, polyetylénglykoly s rôznou molekulovou hmotnosťou, Carbowax 4000 a Carbowax 6000.

Mazadlo, ktoré môže zlepšiť tekutosť lieku počas prípravy a ktoré môže pomôcť umiestneniu pri lisovaní, môže byť tiež pridané. Medzi také činidlá patrí škrob, mastenec, vulkanický oxid kremičitý a hydratovaný silikoaluminát.

Na zjednodušenie rozpustenia terapeutického činidla vo vodnom prostredí môže byť pridaný surfaktant ako zmáčavé činidlo. Medzi surfaktanty patria aniontové detergenčné činidlá, ako je laurylsíran sodný, dioktylsukcinát sodný a dioktylsulfonát sodný. Môžu byť použité tiež kationtové detergenčné činidlá a medzi ne patrí benzalkoniumchlorid a benzetoniumchlorid. Zoznam potenciálnych neiontových detergentných činidel, ktoré môžu byť použité ako surfaktanty, zahŕňa lauromakrogol 400, polyoxyl 40 stearát, polyoxyetylénový hydrogenovaný ricínový olej 10, 50 a 60, glycerol monostearát, polysorbát 40, 60, 65 a 80, ester sacharózy s mastnými kyselinami, metylcelulóza a karboxymetylcelulóza. Tieto surfaktanty môžu byť prítomné v prostriedku obsahujúcom proteín alebo derivát samostatne alebo v zmesi v rôznych pomeroch.

Aditívami, ktoré zvyšujú vychytávanie zlúčeniny, sú napríklad mastné kyseliny, kyselina olejová, kyselina linoleová a kyselina linolenová.

Môžu byť žiaduce prostriedky s riadeným uvoľňovaním. Aktívna zložka môže byť obsiahnutá v inertnej matrici, ktorá umožňuje uvoľňovanie buď difúziou, alebo odplavovaním, ako je to napríklad pri arabských gumách. Prostriedok môže rovnako obsahovať pomaly sa rozkladajúce matrice, ako sú algináty a polysacharidy. Iná forma riadeného uvoľňovania tohto terapeutika je spôsob na báze Oros terapeutického systému (Alza Corp.), t. j., liek je zatvorený v polopriepustnej membráne, ktorá umožňuje prienik vody a vytláčanie lieku jedným malým otvorom v dôsledku ozmotického efektu. Niektoré enterálne poťahy tiež oddiaľujú uvoľňovanie liečiva.

V prostriedku môžu byť použité tiež iné poťahy. Medzi tieto poťahy patria rôzne sacharidy, ktoré môžu byť nanesené v poťahovacej piecke. Terapeutické činidlo môže byť tiež podané vo forme tablety potiahnutej filmom a materiály použité v tomto prípade sa delia do 2 skupín. Prvé sú neenterálne materiály a patrí medzi ne metylcelulóza, etylcelulóza, hydroxyetylcelulóza, metylhydroxy-etylcelulóza, hydroxypropylcelulóza, hydroxypropyl-metylcelulóza, karboxymetylcelulóza sodná, povidon a polyetylénglykoly. Druhou skupinou sú enterálne materiály a patria sem bežné estery kyseliny ftálovej.

Na dosiahnutie optimálneho poťahu filmom môže byť použitá zmes materiálov. Potiahnutie filmom môže byť uskutočnené v piecke alebo vo fluidnom lôžku, alebo tlakovo.

Tiež je možné uskutočniť pľúcne podanie proteínu (alebo jeho derivátu) podľa predkladaného vynálezu. Proteín (alebo derivát) je podaný do pľúc inhalačné a prechádza cez pľúcny epitel do krvného riečiska (ďalej pozri Adjei et al., Pharmaceutical Research 7: 565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63: 135-144 (1990) (leuprolid acetat); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl. 5): str. 143-146 (1989) (endotelin- 1); Hubbard et al., Annals of Intemal Medicíne 3: 206-212 (1989) (ccl-antitrypsin); Smith et al., J. Clin. Invest. 84: 1145-1146 (1989) (al-proteinasa); Pswein et al. „Aerosolization of Proteins“, Proceedings of Symposium on Respirátory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990 (rekombinantný ľudský rastový hormón); Debs et al., the Journal of Immunology 140: 3482-3488 (1988) (interferon-γ a faktor nekrózy nádorov a) a Platz et al., US patent č. 5284656 (faktor stimulujúci kolónie granulocytov).

Pri uskutočňovaní predkladaného vynálezu je možné použiť rôzne mechanické prostriedky na pľúcne podanie terapeutík, vrátane nebulizátorov, inhalátorov s merateľnou dávkou a inhalačných prostriedkov na prášky, ktoré sú všetky dobre známe v odbore.

Niektoré príklady komerčne dostupných prostriedkov vhodných na uskutočnenie tohto vynálezu sú Ultravent nebulizátor, vyrábaný Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; Acom II nebulizátor, vyrábaný Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin inhalátor s odmerateľnou dávkou, vyrábaný Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; a Spinhaler práškový inhalátor, vyrábaný Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Všetky také prostriedky vyžadujú použitie prípravkov vhodných na podanie zlúčeniny podlá predkladaného vynálezu. Obvykle je každý prípravok špecifický na určitý typ prostriedku a môže byť nutné použitie vhodného hnacieho plynu, okrem riedidiel, adjuvans a/alebo nosičov užitočných v terapii.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu budú najlepšie pripravené vo forme častíc s priemernou veľkosťou častíc menšou ako 10 pm (alebo mikrónov), najlepšie 0,5 až 5 pm, na umožnenie čo najúčinnejšieho podania do dištálnych častí pľúc.

Medzi nosiče patria karbohydráty, ako je trehalóza, mannitol, xylitol, sacharóza, laktóza a sorbitol. Ďalšími prísadami sú DPPC, DOPE, DSPC a DOPC. Môžu byť použité prirodzené alebo syntetické surfaktanty. Môže byť použitý polyetylénglykol, okrem jeho použitia pri derivatizácii proteínu alebo analógu. Môže byť použitý dextrán, ako je cyklodextrán. Môžu byť použité žlčové soli alebo iné príbuzné zosilňovače absorpcie. Môže byť použitá celulóza alebo deriváty celulózy. Môžu byť použité aminokyseliny, napríklad v pufiovacích prostriedkoch.

Vynález tiež zahŕňa použitie liposómov, mikrokapsúl alebo mikrosfér, inkluzných komplexov alebo iných typov nosičov.

Prostriedky vhodné na použitie v nebulizátore, či dýzovom, alebo ultrazvukovom, budú obvykle obsahovať zlúčeninu podľa predkladaného vynálezu rozpustenú vo vode v koncentrácii od približne 0,1 do 25 mg biologicky aktívneho proteínu na ml roztoku. Prostriedok môže tiež obsahovať pufor a jednoduchý cukor (napríklad na stabilizáciu proteínu a reguláciu ozmotického tlaku). Nebulizačný prostriedok môže tiež obsahovať surfaktant, na redukciu alebo prevenciu agregácie proteínu indukovanej povrchovo aktívnymi silami, ktorá je spôsobená atomizácou roztoku pri príprave aerosólu.

Prostriedky na použitie v inhalačnom prostriedku s odmerateľnou dávkou budú obvykle obsahovať jemne delený prášok obsahujúci zlúčeninu podľa predkladaného vynálezu suspendovanú v hnacom plyne pomocou surfaktantu. Hnacím plynom môže byť akýkoľvek materiál bežne používaný na tento účel, ako je chlórfluórkarbon, hydrofluórchlórkarbon, hydrofluórkarbon alebo hydrokarbon, vrátane trichlórfluórmetanu, dichlórdifluórmetanu, dichlórtetrafluóretanolu a 1,1,1,2-tetrafluóretanu alebo ich kombinácií. Vhodnými surfaktantmi sú sorbitantrioleát a sójový lecitín. Ako surfaktant môže byť použitá tiež kyselina olejová.

Prostriedky na podanie inhalačným prostriedkom na podanie prášku budú obsahovať jemne delený suchý prášok obsahujúci zlúčeninu podľa predkladaného vynálezu a môžu tiež obsahovať činidlo zvyšujúce objem, ako je laktóza, sorbitol, sacharóza, manitol, trehalóza alebo xylitol, v množstve, ktoré zjednodušuje podanie prášku z prostriedku, kde toto množstvo je napríklad 50 až 90 % hmotnosti prostriedku.

Je možné tiež nazálne podanie zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu. Nazálne podanie umožňuje prienik proteínu do krvného riečiska priamo po podaní terapeutického prostriedku do nosa, bez potreby podania prostriedku do pľúc. Prostriedky na nazálne podanie zahŕňajú prostriedky s dextránom alebo cyklodextránom. Tiež je možné podanie cez iné sliznice.

Dávkovanie

Dávkovanie použité v spôsobe liečby ochorení uvedených skôr bude určené ošetrujúcim lekárom po zvážení rôznych faktorov, ktoré modifikujú pôsobenie liekov, ako je vek, zdravotný stav, telesná hmotnosť, pohlavie a diétne zvyklosti pacienta, závažnosť akejkoľvek infekcie, doba podania a iné klinické faktory. Všeobecne by dávka mala byť v rozsahu 0,1 pg až 100 mg zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu na kg telesnej hmotnosti a deň, lepšie 0,1 až 1 000 pg/kg; a najlepšie 0,1 až 150 pg/kg, v denných dávkach alebo v ekvivalentných v dlhších alebo kratších intervaloch, napríklad každý druhý deň, dvakrát týždenne, raz týždenne alebo dvakrát, alebo trikrát denne.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť podané počiatočnou bolusovou dávkou a potom kontinuálnou infúziou na udržiavanie terapeutických koncentrácií lieku v cirkulácii. Alternatívne môže byť zlúčenina podľa predkladaného vynálezu podaná ako jediná dávka. Odborníci v odbore ľahko optimalizujú účinné dávky a režimy podania podľa štandardnej lekárskej praxe a klinického stavu konkrétneho pacienta. Frekvencia podávania bude závisieť od farmakokinetických parametrov činidel a od spôsobu podania. Optimálny farmaceutický prostriedok bude vybratý odborníkom v odbore podľa spôsobu podania a požadovanej dávky. Pozri, napríklad, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydanie (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA18042), str. 1435-1712, ktoré sú tu uvedené ako odkaz. Také prostriedky môžu ovplyvňovať fyzikálny stav, stabilitu, rýchlosť uvoľňovania in vivo a rýchlosť klirens in vivo podaného činidla. V závislosti od spôsobu podania môže byť vhodná dávka vypočítaná podľa telesnej hmotnosti, telesného povrchu a veľkosti orgánu. Ďalšie úpravy výpočtov nutných na stanovenie vhodnej dávky na liečbu každým z prostriedkov uvedených skôr sú rutinné pre odborníkov v odbore bez zbytočného experimentovania, najmä v svetle tu opísaných informácií o dávkach a testoch, rovnako ako farmakokinetických dát z klinických štúdií na ľuďoch opísaných skôr. Vhodné dávky môžu byť určené známymi testami na stanovenie koncentrácií liečiv v krvi, spoločne s dátami dávka-odpoveď. Konečný dávkový režim bude určený ošetrujúcim lekárom po zvážení rôznych faktorov, ktoré modifikujú pôsobenie liekov, ako je napríklad špecifická aktivita lieku, závažnosť ochorenia a reaktivita pacienta, vek, zdravotný stav, telesná hmotnosť, pohlavie a diétne zvyklosti pacienta, zá16 vážnosť akejkoľvek infekcie, doba podania a iné klinické faktory. Pretože sú uskutočňované štúdie, objavia sa ďalšie informácie týkajúce sa vhodných dávok a trvania liečby pre rôzne ochorenia a stavy.

Terapeutické spôsoby, prostriedky a zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť použité, samostatne alebo v kombinácii s inými cytokínmi, solubilným Mpl receptorom, hematopoetickými faktormi, interleukínmi, rastovými faktormi alebo protilátkami, v liečbe ochorení charakterizovaných inými príznakmi, rovnako ako deficitom trombocytov. Predpokladá sa, že zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu budú užitočné na liečbu niektorých foriem trombocytopénie v kombinácii so všeobecnými stimulátormi hematopoézy, ako je IL-3 alebo GM-CSF. Spoločne s Mpl ligandom môžu byť použité tiež ďalšie faktory stimulujúce megakaryocyty, ako je napríklad meg-CSF, faktor kmeňových buniek (SCF), leukemický inhibičný faktor (LIF), onkostatin M (OSM) alebo iné molekuly s megakaryocytámou stimulačnou aktivitou. Medzi ďalšie príkladné cytokíny alebo hematopoetické faktory na také spoločné podanie patria IL-la, IL-β, IL-2, IL-3, IL-4, IF-5, IL-6, IL-11, faktor stimulujúci kolónie 1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, faktor stimulujúci kolónie granulocytov (G-CSF), EPO, interferon a (IFN-a), spoločný interferon, IFN-β, IFN-γ, IL-7, IL-8, IL-9, IF-10, IL-12, IF-13, IL-14, IF-15, IL-16, IL-17, IL-18, trombopoetín (TPO), angiopoetíny, napríklad Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ľudský peptid podobný angiopoetínu, vaskulámy endotelový rastový faktor (VEGF), angiogenin, kostný morfogénny proteín-1, kostný morfogénny proteín-2, kostný morfogénny proteín-3, kostný morfogénny proteín-4, kostný morfogénny proteín-5, kostný morfogénny proteín-6, kostný morfogénny proteín-7, kostný morfogénny proteín-8, kostný morfogénny proteín-9, kostný morfogénny proteín-10, kostný morfogénny proteín-11, kostný morfogénny proteín-12, kostný morfogénny proteín-13, kostný morfogénny proteín-14, kostný morfogénny proteín-15, receptor pre kostný morfogénny proteín IA, receptor pre kostný morfogénny proteín IB, mozgové neurotroíné faktory, receptor a pre ciliámy neurotrofný faktor, cytokínmi indukovaný chemotaktický faktor pre neutrofily 1, cytokínmi indukovaný chemotaktický faktor pre neutrofily 2a, cytokínmi indukovaný chemotaktický faktor pre neutrofily 2β, rastový faktor β endotelových buniek, endotelín 1, epidermálny rastový faktor, epitelový atraktant pre neutrofily, fibroblastový rastový faktor 4, fibroblastový rastový faktor 5, fibroblastový rastový faktor 6, fibroblastový rastový faktor 7, fibroblastový rastový faktor 8, fibroblastový rastový faktor 8b, fibroblastový rastový faktor 8c, fibroblastový rastový faktor 9, fibroblastový rastový faktor 10, kyslý fibroblastový rastový faktor, alkalický fibroblastový rastový faktor, receptor al pre neurotrofný rastový faktor odvodený od gliálnej bunkovej línie, receptor a2 pre neurotrofný rastový faktor odvodený od gliálnej bunkovej línie, proteín súvisiaci s rastom, proteín súvisiaci s rastom a, proteín súvisiaci s rastom P, proteín súvisiaci s rastom γ, epidermálny rastový faktor viažuci sa na heparín, hepatocytámy rastový faktor, receptor pre hepatocytámy rastový faktor, inzulínu podobný rastový faktor I, receptor pre inzulínu podobný rastový faktor I, inzulínu podobný rastový faktor II, väzbový proteín pre inzulínu podobný rastový faktor II, keratinocytámy rastový faktor, leukemický inhibičný faktor, receptor a pre leukemický inhibičný faktor, nervový rastový faktor, receptor pre nervový rastový faktor, neurotrofín 3, neurotrofín 4, placentámy rastový faktor, placentámy rastový faktor 2, trombocytámy endotelový rastový faktor, trombocytámy rastový faktor, A reťazec trombocytámeho rastového faktora, trombocytámy rastový faktor AA, trombocytámy rastový faktor AB, β reťazec trombocytámeho rastového faktora, trombocytámy rastový faktor BB, receptor a pre trombocytámy rastový faktor, receptor β pre trombocytámy rastový faktor, rastový faktor pre pre-B lymfocyty, receptor pre faktor kmeňových buniek, TNF, vrátane TNF0, TNF1, TNF2, transformujúci rastový faktor a, transformujúci rastový faktor β, transformujúci rastový faktor βΐ, transformujúci rastový faktor βΐ .2, transformujúci rastový faktor β2, transformujúci rastový faktor β3, transformujúci rastový faktor β5, latentný transformujúci rastový faktor β 1, väzbový proteín I pre transformujúci rastový faktor β, väzbový proteín II pre transformujúci rastový faktor β, väzbový proteín III pre transformujúci rastový faktor β, receptor typu I pre faktor nekrózy nádorov, receptor typu II pre faktor nekrózy nádorov, receptor pre plazminogénový aktivátor urokinázového typu, cievny endotelový rastový faktor, a chimerické proteíny a ich biologicky alebo imunologický aktívne fragmenty. Ďalej môže byť vhodné podať, simultánne alebo sekvenčne, účinné množstvo solubilného cicavčieho Mpl receptora, ktorý, ako sa zdá, spôsobuje fragmentáciu megakaryocytov na trombocyty po dozrení megakaryocytov. Tak sa predpokládá, že podanie zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu (na zvýšenie počtu zrelých megakaryocytov) a potom podanie solubilného Mpl receptora (na inaktiváciu ligandu a na produkciu trombocytov zo zrelých megakaryocytov) je najmä účinným postupom na stimuláciu produkcie trombocytov. Dávky uvedené skôr sa upravujú s ohľadom na také ďalšie zložky v terapeutických prostriedkoch. Vývoj stavu liečeného pacienta môže byť sledovaný bežnými spôsobmi.

V prípade, že sú zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu pridané k trombocytámym a/alebo megakaryocytámym prípravkom, alebo prípravkom príbuzných buniek, tak sa použité množstvo určí experimentálne s použitím techník a testov známych v odbore. Napríklad je možné použiť dávky od 0,1 pg do 1 mg zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu na 10⁶ buniek.

Je potrebné si uvedomiť, že použitie spôsobov podľa predkladaného vynálezu pre určitý problém alebo situáciu, je schopný odborník v odbore uskutočniť podľa opisu vynálezu. Príklady prostriedkov podľa predkladaného vynálezu a reprezentatívnych spôsobov na ich izoláciu, použitie a výrobu, sú uvedené ďalej.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Tento príklad opisuje spôsoby na prípravu niektorých zlúčenín prvej skupiny.

A. Materiály a metódy

Všetky aminokyselinové deriváty (všetky v L-konfigurácii) a živice použité pri syntéze peptidov boli kúpené od Novabiochem. Činidlá na peptidovú syntézu (DCC, HOBt. atď.) boli kúpené vo forme roztokov od Applied Biosystems, Inc. Dva PEG deriváty boli od Shearwater Polymers, Inc. Všetky rozpúšťadlá (dichlórmetan, N-metylpyrrolidon, metanol, acetonitril) boli od EM Sciences. Analytická HPLC bola uskutočnená na Beckman systéme s Vydac kolónou (0,46 cm x 25 cm, 08 reverzná fáza, 5 mm) pri prietoku 1 ml/min. a pri duálnej UV detekcii pri 220 a 280 nm. Pre všetky HPLC kroky boli použité lineárne gradienty s dvoma mobilnými fázami: pufor A - H₂O (0,1 % TFA) a pufor B - acetonitril (0,1 % TFA). Použité číslovanie peptidov, napríklad 17b, 18, 19 a 20, sa vzťahuje na tabuľku 1 a niektoré z týchto peptidov sú ďalej ilustrované na obr. 2 a 3.

Syntéza peptidov: Všetky peptidy boli pripravené dobre známou metódou syntézy na pevnej fáze. Syntéza na pevnej fáze s Fmoc činidlami bola uskutočnená s použitím ABI Peptide Synthetiser. Obvykle začala syntéza peptidu s dopredu naplnenou Wangovou živicou v 0,1 mmol mierke. Fmoc odstránenie chrániacich skupín bolo uskutočnené podľa štandardného piperidínového protokolu. Kopulácia bola uskutočnená s použitím DCC/HOBt. Chrániace skupiny pre vedľajšie reťazce boli: Glu (O-t-Bu), Thr (t-Bu), Arg (PBF), Gin (Tri), Trp (t-Boc) a Cys (Tri). Pre prvý peptidový prekurzor na pegyláciu bol na chránenie vedľajšieho reťazca Lys na spájacej skupine použitý Dde a Boc-Ile-OH bol použitý na poslednú kopuláciu. Kde bol odstránený s použitím bezvodového hydrazínu (2 % v NMP, 3x2 minúty) a potom sa uskutočnila kopulácia s anhydridom kyseliny brómoctovej pôsobením DCC. Pre peptid 18 bol vedľajší reťazec cysteínu v spájacej skupine chránený tritylovou skupinou. Konečné odstránenie chrániacich skupín a štiepenie všetkých peptidylových živíc bolo uskutočnené pri teplote okolia počas 4 hodín s použitím kyseliny trifluóroctovej (TFA) obsahujúcej 2,5 % H₂O, 5 % fenol, 2,5 % triizopropylsilán a 2,5 % tioanisol. Po odstránení TFA sa odštiepený peptid vyzrážal chladným bezvodovým éterom. Tvorba disulfidových väzieb v cyklickom peptide bola uskutočnená priamo na surovom materiáli s použitím 15 % DMSO v H₂O (pH 7,5). Všetky surové peptidy boli prečištené preparatívnou HPLC s reverznou fázou a ich štruktúry boli potvrdené ESI-MS a aminokyselinovou analýzou.

Alternatívne môžu byť opísané peptidy pripravené s použitím t-Boc postupu. V tomto prípade je východiskovou živicou klasická Merrifieldova alebo Pam živica a chrániacimi skupinami pre vedľajšie reťazce sú: Glu (Obzl), Thr(Bzl), Arg(Tos), Trp (CHO), Cys(p-MeBzl). Fluorovodík (HF) môže byť použitý na konečné štiepenie peptidylových živíc.

Všetky tandemové diméme peptidy opísané v tomto príklade, ktoré obsahujú spájacie skupiny zložené z prirodzených aminokyselín, môžu byť tiež pripravené rekombinantnou DNA technikou.

PEGylácia. Bola vyvinutá nová, konvergentná stratégia na pegyláciu syntetických peptidov, ktorá zahŕňa kombinovanie - prostredníctvom vytvorenia konjugačnej väzby v roztoku peptidu a PEG skupiny, ktoré obsahujú každá špeciálnu funkciu, ktorá je reaktívna s funkciou druhej skupiny. Prekurzorové peptidy môžu byť ľahko pripravené technikou syntézy na pevnej fáze, ako bola opísaná. Ako bolo opísané, tieto peptidy sú „preaktivované“ vhodnou funkčnou skupinou na špecifickom mieste. Prekurzory môžu byť prečistené a plno charakterizované pred reakciou s PEG skupinou. Ligácia peptidu s PEG obvykle prebieha vo vodnej fáze a môže byť ľahko sledovaná analytickou HPLC s reverznou fázou. Pegylované peptidy môžu byť ľahko prečištené preparatívnou HPLC a charakterizované analytickou HPLC, aminokyselinovou analýzou a hmotnostnou spektrometriou s desorpciou laserom.

Príprava peptidu 19. Peptid 17b (12 mg) a MeO-PEG-SH5000 (30 mg, 2 ekv.) sa rozpustí v 1 ml vodného pufra (pH 8). Zmes sa inkubuje pri teplote okolia počas približne 30 minút a reakcia sa sleduje analytickou HPLC, ktorá ukáže viac ako 80 % dokončenie reakcie. Pegylovaný materiál sa izoluje preparatívnou HPLC.

Príprava peptidu 20. Peptid 18 (14 mg) a MeO-PEG-mleimid (25 mg) sa rozpustí v 1,5 ml vodného pufra (pH 8). Zmes sa inkubuje pri teplote okolia počas približne 30 minút, keď je 70 % transformácie dokončené, ako je sledované analytickou HPLC pomocou aplikácie podielu vzorky do HPLC kolóny. Pegylovaný materiál sa izoluje preparatívnou HPLC.

Test biologickej aktivity

TPO in vitro biotest je mitogénny test využívajúci kloň myších 32D buniek závislých od IL-3, ktoré boli transfektované ľudským Mpl receptorom. Tento test je podrobne opísaný vo WO 95/26746. Bunky sa kultivujú v MEM médiu obsahujúcom 10 % Fetal Clone II a 1 ng/ml mIL-3. Pred pridaním vzorky sa bunky pripravia dvojakým prepláchnutím kultivačným médiom bez IL-3. Určí sa predĺžená dvanásťbodová TPO štandardná krivka v rozsahu od 3 333 do 39 pg/ml. Pre každú vzorku sa pripravia štyri riedenia spadajúce do lineárnej časti štandardnej krivky (1 000 až 125 pg/ml) a tieto sa spracujú trikrát. 100 pl každého riedenia vzorky alebo štandardu sa pridá do vhodných jamiek 96-jamkovej mikrotitračnej platni obsahujúcej 10 000 buniek/jamku. Po 44 hodinách pri 37 °C a 10 % CO₂ sa do každej jamky pridá MTS (tetrazoliová zlúčenina, ktorá je biologicky redukovaná bunkami na formazan). Približne o 6 hodín neskôr sa odpočíta optická densita na čítačke platní pri 490 nm. Vytvorí sa krivka dávka-odpoveď (log koncentrácia TPO vs. O.D. pozadie) a uskutoční sa lineárna regresná analýza bodov, ktoré spadajú do lineárnej časti štandardnej krivky. Koncentrácia neznámych testovaných vzoriek sa určí s použitím získanej lineárnej rovnice a s použitím korekcie na nariedenie.

Skratky: HPLC: vysokoúčinná kvapalinová chromatografia; ESI-MS: hmotnostná spektrometria s ionizáciou postrekom elektrónmi; MALDI-MS: hmotnostná spektrometria s ionizáciou desorpciou laserom na matrici; PEG: polyetylénglykol. Všetky aminokyseliny sú uvedené v štandardnom trojpísmenovom alebo jednopísmenovom kóde. t-Boc: terc-butoxykarbonyl; tBu: terc- butyl; Bzl: benzyl; DCC: dicyklohexylkarbodiimid; HOBt: 1-hydroxybenztriazol; NMP: N-metyl-2-pyrrolidon; Pbf: 2,2,4,6,7-pentametyldihydro-benzíúran-5-sulfonyl; Trt: trityl; Dde: l-(4,4-dimetyl-2,6-dioxo-cyklohexyliden)etyl.

B. Výsledky

TMP tandemové diméry s polyglycinovými spájacími skupinami. Vývoj sekvenčne viazaných TMP dimérov bol založený na predpoklade, že dimérne formy TMP sú nutné na účinnú interakciu s c-Mpl (TPO receptor) a na tom, že podľa toho, ako sú navzájom umiestnené vzhľadom na receptor, môžu byť dve MTP molekuly navzájom viazané na C- alebo N-konci tak, že nie je narušená celková dimemá konformácia. Je jasné, že aktivita tandemovo viazaných dimérov závisí tiež od správneho výberu dĺžky a zloženia spájacej skupiny spájajúcej C- a - konce dvoch sekvenčne umiestnených TMP monomérov. Pretože nie je dostupná žiadna informácia o štruktúre TMP naviazaného na c-Mpl, bola syntetizovaná séria dimemých peptidov so spájacími skupinami zloženými z 0 až 10 a 14 glycínových zostatkov (tabuľka 1). Glycín bol vybratý pre svoju jednoduchosť a flexibilitu. Predpokladalo sa, že flexibilný polyglycínový peptidový reťazec umožní voľné skladanie dvoch spojených TMP jednotiek do požadovanej konformácie. Zatiaľ čo viac stericky obmedzené aminokyselinové sekvencie môžu mať nežiaduce sekundárne štruktúry, ktorých rigidita by mohla narušiť správne skladanie dimémeho peptidu vo vzťahu k receptoru.

Výsledné peptidy je možné pripraviť bežnými technikami peptidovej syntézy na pevnej fáze (Merrifield, R.B., Journal of the American Chemical Society 85: 2149 (1963)), s použitím Fmoc alebo t-Boc techniky. Oproti syntéze C-koncovo viazaných paralelných dimérov (SEQ ID NO: 2), ktorá vyžaduje použitie ortogonálne chráneného lysínového zostatku ako počiatočného miesta vetvenia na prípravu dvoch peptidových reťazcov pseudosymetrickým spôsobom (Cwirla, S. E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)), je syntéza našich tandemových dimérov priame, postupné zostavovanie kontinuálneho peptidového reťazca od C- do N-konca. Pretože má dimerizácia TMP dramatickejší vplyv na proliferačnú aktivitu ako na väzbovú afinitu, ako je preukázané pre C-koncový dimér (Cwirla, S.E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)), boli syntetické peptidy testované priamo na biologickú aktivitu v teste proliferácie TPO dependentných buniek s použitím IL-3 dependentného klonu myších 32D buniek transfektovaných kompletným c-Mpl (Palacios, R. et al., Celí 41: 727 (1985)), ako ukazujú výsledky testu (pozri tabuľku 1), vykazovali všetky polyglycínom spojené tandemové diméry > 1000-násobné zvýšenie účinnosti v porovnaní s monomérom a boli v tomto proliferačnom teste účinnejšie ako C-koncový dimér. Absolutná aktivita C-koncového diméru v našom teste bola nižšia ako aktivita prirodzeného TPO proteínu, čo je odlišné od skorších zistení, v ktorých bol C-koncový dimér rovnako aktívny ako prirodzený ligand (Cwirla, S.E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)). Toto môže byť spôsobené odlišnými podmienkami použitými v obidvoch testoch. Rozdiely v aktivite medzi tandemovými dimérmi (C-koniec prvého monoméru je naviazaný na N-koniec druhého monoméru) a paralelnými dimérmi (C-koniec prvého monoméru je naviazaný na C-koniec druhého monoméru) v rovnakom teste ale jasne dokazujú lepšie vlastnosti tandemovo dimerizovanej zlúčeniny v porovnaní s paralelne dimenzovanou zlúčeninou. Je zaujímavé, že sú možné rôzne dĺžky spájacej skupiny. Optimálna spájacia skupina použitá s vybratými TMP monomérmi (SEQ ID NO: 1) je zložená z 8 glycínov.

Iné tandemové diméry. Po tejto prvej sérii TMP tandemových dimérov bolo navrhnutých niekoľko ďalších molekúl, buď s inými spájacími skupinami, alebo s modifikáciami monoméru. Prvá z týchto molekúl, peptid 13, má spájaciu skupinu zloženú z GPNG, čo je sekvencia, o ktorej je známe, že ľahko vytvára sekundárnu štruktúru typu β-skrutkovice. Aj keď je ešte stále asi 100-krát účinnejšia ako monomér, je tento peptid 10-krát menej aktívny ako GGGG-viazaný analóg. Preto sa zdá, že použitie relatívne rigidnej β-skrutkovice ako spájacej skupiny spôsobuje mierne narušenie optimálnej agonistickej konformácie v tejto forme s krátkou spájacou skupinou.

Trp 9 v TMP sekvencií je vysoko konzervovaný zostatok v aktívnych peptidoch izolovaných z knižníc náhodných peptidov. Existuje tiež vysoko konzervovaný Trp v konvenčných sekvenciách EPO mimetických peptidov a bolo zistené, že tento Trp zostatok sa zúčastňuje tvorby hydrofóbneho jadra medzi dvoma EPO mimetickými peptidmi (EMP) a prispieva na hydrofóbne interakcie s EPO receptorom (Livnah, 0. et al., Science 273: 464-471 (1996)). Analogicky sa predpokladá, že Trp9 zostatok v TMP môže mať podobnú funkciu v dimerizácii peptidového Ugandu a v pokuse o modulovanie a hodnotenie vplyvov nekovalentných hydrofóbnych síl vo dvoch indólových kruhoch sa konštruovalo niekoľko analógov vzniknutých mutáciou Trp. V peptide 14 bol Trp zostatok v každom z dvoch TMP monomérov nahradený Cys a oxidáciou bola vytvorená intramolekulová disulfidová väzba medzi dvoma cysteínmi, ktorá mala napodobňovať hydrofóbne interakcie medzi dvoma Trp zostatkami v dimerizácii peptidu. Peptid 15 je redukovanou formou peptidu 14. V peptide 16 boli dva Trp zostatky nahradené Ala. Ako ukazujú výsledky testov, boli všetky tri analógy inaktívne. Tieto dáta ďalej ukazujú, že Trp je významný pre aktivitu TPO mimetického peptidu a nielen na tvorbu diméru.

Ďalšie dva peptidy (peptid 17 a 18) obsahovali obidva vo svojej 8-aminokyselinovej spájacej skupine Lys alebo Cys zostatok. Tieto dve zlúčeniny sú prekurzormi dvoch pegylovaných peptidov (peptidu 19 a 20), v ktorých je vedľajší reťazec Lys alebo Cys modifikovaný polyetylénglykolovou (PEG) skupinou. PEG skupina bola vložená do stredu relatívne dlhej spájacej skupiny, takže bola veľká PEG zložka (5 kDa) dostatočne ďaleko od významných väzbových miest v molekule peptidu. PEG je známy biokompatibilný polymér, ktorý sa stále častejšie používa na kovalentnú modifikáciu na účely zlepšenia farmakokinetických profilov peptidových a proteínových terapeutických činidiel.

Na bežnú pegyláciu syntetických alebo rekombinantných peptidov bola použitá moduláma metóda v roztoku. Tento spôsob je založený na dobre známej chemoselektívnej ligačnej stratégii, ktorá využíva špecifické reakcie medzi párom navzájom reaktívnych skupín. Tak bol pre pegylovaný peptid 199 vedľajší reťazec lysinu preaktivovaný brómacetylovou skupinou za vzniku peptidu 17b, ktorý bol pripravený na reakciu s PEG derivatizovaným tiólom. Na chránenie ε-amínu lysinu bola použitá ortogonálna chrániaca skupina, Dde. Po zostavení celého peptidového reťazca bol N-koncový amín znovu chránený T-Boc. Dde skupina bola potom odstránená, aby bola umožnená bromacetylácia. Táto stratégia vedie na zisk surového peptidu vysokej kvality, ktorý môže byť ľahko prečistený s použitím bežnej HPLC s reverznou fázou. Ligácia peptidu s PEG modifikovaným tiólom prebieha v vodnom pufre pri pH 8 a reakcia je dokončená počas 30 minút. MALDIMS analýza prečisteného, pegylovaného materiálu ukázala charakteristické, zvonovité spektrum s krokmi 44 Da medzi susednými píkmi. Pre PEG-peptid 20 bol cysteínový zostatok umiestnený do spájacieho regiónu a jeho tiólová skupina vedľajšieho reťazca mohla slúžiť ako miesto naviazania pre PEG obsahujúci maleimid. Podobné podmienky boli použité na pegyláciu tohto peptidu. Ako ukázali výsledky testu, majú tieto dva pegylované peptidy ešte väčšiu biologickú aktivitu in vitro ako ich nepegylované náprotivky.

Peptid 21 obsahuje vo svojej 8-aminokyselinovej skupine potenciálny glykosylačný motív, NGS. Pretože sú tieto príkladné tandemové diméry tvorené prirodzenými aminokyselinami viazanými peptidovými väzbami, vedie expresia takej molekuly vo vhodnom eukaryotickom bunkovom systéme na produkciu glykopeptidu s karbohydrátovou skupinou pridanou na karboxamídový vedľajší reťazec Asn. Glykosylácia je bežnou posttranslačnou modifikáciou, ktorá môže mať veľa priaznivých účinkov na biologickú aktivitu daného proteínu, pretože zvyšuje jeho rozpustnosť vo vode a stabilitu in vivo. Ako ukazujú výsledky testov, viedla inkorporácia tohto glykosylačného motívu do spájacej skupiny na zachovanie vysokej biologickej aktivity. Syntetický prekurzor potenciálneho glykopeptidu mal aktivitu porovanteľnú s (Gly)g-viazaným analógom. Po glykosylácii sa predpokladá, že bude tento peptid mať rovnakú aktivitu ako pegylované peptidy, z dôvodu podobných chemicko-fyzikálnych vlastností PEG a karbohydrátovej skupiny.

Posledným peptidom je dimér dimérov. Tento peptid bol pripravený oxidáciou peptidu 18, ktorá viedla na vznik intermolekulovej disulfidovej väzby medzi dvoma cysteínovými zostatkami v tejto spájacej skupine. Tento peptid bol navrhnutý preto, aby bolo zistené, či je TMP aktívny ako tetramer. Výsledky testu ukázali, že tento peptid nebol aktívnejší ako priemerný tandemový dimér po úprave na molámej báze, čo nepriamo podporuje myšlienku, že aktívnou formou TMP je určite dimér, pretože inak by dimerizácia tandemového diméru mala ďalší vplyv na biologickú aktivitu.

Následujúca tabuľka zhŕňa relatívne účinnosti (relatívne sily) uvedených zlúčenín založené na opísaných in vitro testoch.

Tabuľka 1

	Relatívna
Zlúčenina	účinnosť
TPO		4.0
TMP monomér (SEQ ID NO: 1)	1.0
TMP C-C dimér (SEQ ID NO: 2)	3.5
TMP-(Gly)_n-TMP:
1	n=0	4.5
2	n=l	4.0
3	n=2	4.0
4	n=3	4.0
5	n=4	4.0

n=5 n=6 n=7 n=8 n=9 n=10 n=14

TMP-GPNG-TMP(SEQ ID NO. 10)

IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA

4.0

4.5

4.0

3.0

0.5 (SEQIDNO. 11)

IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA 0.5 (SEQ ID NO. 12)

IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA 0.5 (SEQ ID NO. 13)

17a TMP-GGGKGGGG-TMP (SEQIDNO. 14) 4.0

17b TMP-GGGK(BrAc)GGGG-TMP (SEQIDNO. 15) ND

TMP-GGGCGGGG-TMP (SEQIDNO. 16) 4.0

TMP-GGGK(PEG)GGGG-TMP (SEQIDNO. 17) 5.0

TMP-GGGC(PEG)GGGG-TMP (SEQ ID NO. 18) 5.0

TMP-GGGNGSGG-TMP (SEQIDNO. 19) 4.0

TMP-GGGCGGGG-TMP (SEQ ID NO.20) 4.0

TMP-GGGCGGGG-TMP

Poznámka: V tabuľke 1 označujú čísla približne 1 log aktivity, takže rozdiel medzi aktivitou „1“ a „4“ je približne 1 000-násobný. Zvýšenie o 0,5 je zvýšenie o strednú hodnotu, takže rozdiel medzi aktivitou „1“ a „3,5“ je približne 500-násobný. „ND“ - nie je stanovené.

Príklad 2

Nasledujúci príklad opisuje spôsoby prípravy niektorých zlúčenín druhej skupiny.

A. Príprava Fc fúznych zlúčenín typu uvedeného na obr. 6C.

DNA sekvencia kódujúca Fc región ľudského IgGl fuzovaná v čítacom rámci s dimérom TPO mimetického peptidu (SEQ ID NO: 34) sa umiestnila pod kontrolu luxPR promótora v plazmidovom vektore pAMG21 nasledujúcim spôsobom.

Fúzny gén bol pripravený štandardnou PCR technikou. Templáty na PCR reakcie boli fuzny vektor obsahujúci Fc sekvenciu a syntetický gén kódujúci zostatok zlúčeniny SEQ ID NO: 34. Syntetický gén bol konštruovaný zo 4 prekrývajúcich sa oligonukleotidov uvedených ďalej:

1830-52 AAA GGT GGA GGT GGT GGT ATC GAA GGT CCG ACT CTG CGT CAG TGG CTG GCT GCT CGT GCT (SEQ ID NO:35)

1830-53 CC TCC ACC ACC AGC ACG AGC AGC CAG CCA CTG ACG CAG AGT CGG ACC (SEQ ID NO:36)

1830-54 GGT GGT GGA GGT GGC GGC GGA GGT ATT GAG GGC CCA ACC CTT CGC CAA TGG CTT GCA GCA CGC GCA (SEQ ID NO:37)

1830-55 AAA AAA AGG ATC CTC GAG ATT ATG CGC GTG CTG CAA GCC ATT GGC GAA GGG TTG GGC CCT CAA TAC CTC CGC CGC C (SEQ ID NO:38) oligonukleotidy boli tepelne spracované za vzniku nasledujúceho duplexu:

AAAGGTGGAGGTGGTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCT 1---------r---------1-----------1----------+---------+---------+ 60

CCAGGCTGAGACGCAGTCACCGACCGACGAGCACGA

KGGGGGIEGPTLRQWLAARA

GTGGGTGGAGGTGGCGGCGGAGGTATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCA

---------+---------+---------+---------+---------+---------₊ i20

CCACCACCTCCACCGCCGCCTCCATTACTCCCGGGTTGGGAAGCGGTTACCGAACGTCGT

GGGGGGGGIEGPTLRQWLAA

CGCGCA

---------------------------148

GCGCGTATTAGAGCTCCTAGGAAAAAAA

SEQ ID NO: 39 (ko-lineárne oligonukleotidy 1830-52 a 1830-54)

SEQ ID NO: 40 (ko-lineárne oligonukleotidy 1830-53 a 1830-55) a

SEQ ID NO: 41 (kódovaná aminokyselinová sekvencia).

Tento duplex bol amplifikovaný PCR reakciou s použitím 1830-52 a 1830-55 ako kódujúcich a protizmyslových primárov.

Fc časť molekuly bola pripravená PCR reakciou s Fc DNA s použitím primárov:

1216-52 AAC ATA AGT ACC TGT AGG AT C G (SEQ ID NO: 42)

1830-51 TTCGATACCACCACCTCCACCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGC (SEQ ID NO:43)

Oligonukleotidy 1830-51 a 1830-52 obsahujúce prekrývajúcich sa 24 nukleotidov, čo umožňuje fuzovanie týchto dvoch génov dohromady v správnom čítacom rámci kombinovaním uvedených PCR produktov v tretej reakcii s použitím vonkajších primérov, 1216-52 a 1830-55.

Génový produkt poslednej PCR (kompletný fúzny gén) sa trávil reštrikčnými endonukleázami Xbal a BamHI a potom sa ligoval do vektora pAMG21 (pozri ďalej), tiež trávenom Xbal a BamHI. Ligovaná DNA sa transformovala do kompetentných hostiteľských buniek E. coli kmeňa 2596 (GM221, pozri ďalej). Klony sa vyšetrovali na schopnosť produkovať rekombinantný proteín a na prítomnosť génovej fúzie majúcej správnu nukleotidovú sekvenciu. Úroveň expresie proteínu bola stanovená z hodnotenia 50 ml skúmaviek. Lyzáty celých buniek boli analyzované na prítomnosť fuzneho proteínu na PAGE géloch farebných Coomasie modrosťou.

Aminokyselinová sekvencia fúzneho proteínu je uvedená pod zodpovedajúcou nukleotidovou sekvenciou.

Xbal l

TCTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAG<ÍAATAACATATGGACAAAACTCACACATGTC 1----------+---------+----------F---------4----------4----------+ 60 agatctaaacaaaattgattaatttcctcctiattgtatacctgttttgagtgtgtacag

MDKTHTCP

CACCTTGTCCAGCTCCGGAACTCCTGGCGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAC 61---------+---------+------------------m-----------¼---------+ 120 gtggaacaggtccagcccttgagsacccccctsgcagtcagaaggagaaggggggttttg

PCPA'PEI.I-GGPSVri.rpPKS»

CCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA

121---------+---------+----------!----------4-----------1----------+ ISO ggttcctgtgggagtactagagggcctggggactccagtgtacgcaccaccacctgcact

KDTEMISRTPBVTCVVVOVS

GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATG

181---------+---------+---------+--------------------+----------+ 240

CGOTGCTTCTGGGACTCCAGTTCAAGTTGACCATGCACCTGCCGCACCTCCACGTATTAC

H EDPEVKFNWYVDGVEVHNA ccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtacc.gtgtggtcagcgtcctca

241---------+---------4----------+---------4----------4— ·— ---+ 300

GGTTCTGTTTCGGCGCCCTCCTCGTCATGTTGTCGTGCATGGCACACCAGTCGCAGGAGT

KTKPREEQYNSTYRVVSV^T ccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaag

301 -------+-----------h----------1----------4-----------+----------»- 360

GGCAGGACGTGGTCCTGACCGACTTACCGTTCCTCATGTTCACGTTCCAGAGGTTGTTTC

V LKQDWLNGKEYKC KV S N K A

CCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCAC

361-------------------+·---------+---------⁺---------·♦---------+ 420 gggagggtcgggggtagctctíttggtagaggtttcggtttcccgtcggggctcttggtg lfapibkti skakgqprepq aggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctqacct

42i —---— ——4— —————— — — 4·---—————— + — — — —-------1----— — — — — — 4 — — ———+ 480

TCCACATCTGGGACGGGGGTAGGGCCCTACTCGACTGGTTCTTGGTCCAGTCGGACTGGA

VYTEPPSRDEETKKQVSLTC

SK 287737 Bó

GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC

431 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540

CGGACCAGTTTCCGAAGATAGGGTCGCTGTAGCGGCACCTCACCCTCTCGTTACCCGTCG

X V K G F Y P S DIAVEWESNGQP

CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT

541---------4-----------1 ;--------μ----------1------------1—— ----_F 600 gcctcttgttgktgttctggtgcggagggcacgacctgaggctgccgaggaagaaggaga ennykttppvldsdgsffxy

ACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG GO1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660

TGTCGTTCGAGTGGCACCTGTTCTCGTCCACCGTCGTCCCCTTGCAGAAGAGTACGAGGC SKLTVDKSRWOQGNVFSCS V

TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA 661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720

ACTACGTACTCCGAGACGTGTTGGTGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCAT

MHEAXKNHYTQKSXSLSPGK

AAGGTGGAGGTGGTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCTG 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780

TTCCACCTCCACCACCATAGCTTCCAGGCTGAGACGCAGTCACCGACCGACGAGCACGAC GG GGGIEGPTXRQWXAARAG

GTGGTGGAGGTGGCGGCGGAGGTATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCAC 781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840

CACCACCTCCACCGCCGCCTCCATAACTCCCGGGTTGGGAAGCGGTTACCGAACGTCGTG GGGGGGGI EGPTLRQWXAAR

BamHI

I

GCGCATAATCTCGAGGATCCG 841 ---------+---------+- 861

CGCGTATTAGAGCTCCTAGGC

A

SEQ ID NO: 44 (jeden reťazec čítaný 5'^->3’), SEQ ID NO: 45 (jeden reťazec čítaný 3'>5')# a

SEQ ID NO: 46 (kódovaná aminokyselinová sekvencia) pAMG21

Expresný plazmid pAMG21 je dostupný od ATCC pod prírastkovým číslom 98113 a bol uložený 24.7.1996.

GM221 (Amgén hostiteľský kmeň č. 2596)

Amgén hostiteľský kmeň č. 2596 je K-12 kmeň E. coli, ktorý bol modifikovaný tak, aby obsahoval tak lambda represor cI857s7 citlivý na teplotu vo včasnom ebg regióne, ako lacI^Q represor v pozdnom ebg regióne (68 minút). Prítomnosť týchto dvoch represorových génov umožňuje použitie tohto hostiteľa s mnohými expresnými systémami, ale, obidva tieto represory sú irelevantné pre expresiu z lucP_R. Netransformovaný hostiteľ nemá rezistenciu na antibiotiká.

Väzbové miesto pre ribosomy cI857s7 génu bolo modifikované tak, aby obsahovalo posilnené RBS. Bolo inzertované do ebg operónu medzi nukleotidmi 1170 a 1411, podľa číslovania v GenBank prírastkové číslo M64441Gb_Ba s deléciou vymedzerenej ebg sekvencie.

Konštrukt bol presunutý do chromozómu s použitím rekombinantného fágu nazvaného MMebg-cI857s7 s vloženým RBS č. 4 do F'tet/393. Po rekombinácii a rozdelení zostávali v bunkách len chromozomálne inzerty. Tieto boli označené F'tet/GMIOl.

F'tet/GMIOl boli potom modifikované vložením lacI^Q konštruktu do ebg operónu medzi nukleotidy 2493 a 2937, podľa číslovania v GenBank prírastkové číslo M64441Gb_Ba s deléciou vymedzenej ebg sekvencie.

Konštrukt bol presunutý do chromozómu s použitím rekombinantného fágu nazvaného AGebg-LacIQč. 5 do F'tet/393. Po rekombinácii a rozdelení zostávali v bunkách len chromozomálne inzerty. Tieto boli označené F'tet/GM221. F'tet epizom bol odstránený z kmeňa pomocou akridínovej oranžovosti v koncentrácii 25 pg/ml v LB. Takto spracovaný kmeň bol citlivý na tetracyklín a bol označený GM221.

Fc fuzny konštrukt obsiahnutý v plazmide pAMG21 (ktorý je tu označený ako pAMG21-Fc-TMP-TMP), ktorý bol potom vložený do hostiteľského kmeňa GM221, bol uložený v ATCC pod prírastkovým číslom 98957, 22.10.1998.

Expresia

Kultúry pAMG21-Fc-TMP-TMP v E. coli GM221 v Luria Broth médiu obsahujúcom 50 pg/ml kanamycínu boli inkubované pri 37 °C pred indukciou. Indukcia expresie Fc-TMP-TMP génu z luxPR promótora bola uskutočnená pridaním syntetického autoindukčného činidla N-(3-oxohexanoyl)-DL-homoserínlaktónu do kultivačného média v konečnej koncentrácii 20 ng/ml a kultúra bola inkubovaná pri 37 °C počas 3 hodín. Po troch hodinách sa bakteriálne kultúry znovu vyšetrovali mikroskopicky na prítomnosť inkluzných teliesok a potom sa odstredili. V indukovaných kultúrach boli pozorované refraktívne inkluzné telieska, čo naznačuje, že Fc-TMP-TMP bol najpravdepodobnejšie produkovaný v E. coli v nerozpustnej frakcii. Bunkové pelety boli lyzované priamo resuspendovaním v Laemmli vzorkovom pufri obsahujúcom 10 % p-merkaptoetanol a boli analyzované SDS-PAGE. Na SDS-PAGE géli bol pozorovaný 30 kD a pásik intenzívne zafarbený Coomasie farbivom. Predpokladaný génový produkt by mal mať dĺžku 269 aminokyselín a molekulovú hmotnosť 29,5 kDa. Tiež bola uskutočnená fermentácia za štandardných podmienok v 10 1, ktorá viedla na podobnú expresiu Fc-TMP-TMP ako pri produkcii v menšom množstve.

Prečistenie Fc-TMP-TMP

Bunky sa rozdrvili vo vode (1/10) homogenizáciou pri vysokom tlaku (2 kolá pri 14 000 psí) a inkluzné telieska sa získali odstredením (4200 rpm v J-6B počas 1 hodiny). Inkluzné telieska sa solubilizovali v 6M guanidíne, 50 mM Tris, 8 mM DTT, pH 8,7 počas 1 hodiny pri pomere 1/10.

Solubilizovaná zmes sa nariedila 20-násobne v 2 M močovine, 50 mM Tris, 160 mM arginíne, 3 mM cysteínu, pH 8,5. Zmes sa miesila cez noc v chlade. V tejto dobe Fc-TMP-TMP monoméry dimerizujú za vzniku disulfídovo viazaných zlúčenín majúcich štruktúru uvedenú na obr. 6C a potom sa zahustia približne 10-krát ultrafiltráciou. Potom sa nariedia 3-krát 10 mM Tris, 1,5 M močovinou, pH 9. pH tejto zmesi sa potom upraví na pH 5 kyselinou octovou. Zrazenina sa odstráni odstredením a supematant sa vnesie do SP-Separózi Fast Flow kolóny uvedenej do rovnováhy v 20 mM NaAc, 100 mM NaCl, pH 5 (10 mg/ml proteínová náplň, teplota okolia). Proteín sa eluuje s použitím 20 objemov kolóny gradientom 100 mM NaCl až 500 mM NaCl rovnakého pufra. Materiál získaný z kolóny sa nariedi 3- krát a vnesie sa do SP-Separózovej HP kolóny v 20 mM NaAc, 150 mM NaCl, pH 5 (10 mg/ml proteínová náplň, teplota okolia). Proteín sa eluuje s použitím 20 objemov kolóny gradientom 150 mM NaCl až 400 mM NaCl rovnakého pufra. Pík sa odeberie a prefiitruje

Príklad 3

Tento príklad zhŕňa výsledky získané pomocou myší in vivo pre rôzne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu.

Myši: Normálne samice BDF1 staré približne 10-12 týždňov.

Odbery krvi: Desať myší na skupinu bolo liečených v deň 0, dve skupiny začali o 4 dni pozdejšie (celkom 20 myší). V každú uvedenú dobu bol uskutočnený odber krvi 5 myší a odbery boli uskutočňované nejmenej trikrát týždenne. Myši boli uvedené do anestézie izofluranom a punkciou orbitálneho šínu sa získalo celkovo 140 - 160 μΐ krvi. Krv sa hodnotila na Technicon H1E analyzátore s použitím softvéru pre myšiu krv.

Meranými parametrami boli leukocyty, erytrocyty, hematokrit, hemoglobín, trombocyty a neutrofily.

Liečba: Myšiam boli podávané podkožné bolusové injekcie alebo im bola implantovaná 7 denná mikroozmotická pumpa na kontinuálne podanie. Ozmotické pumpy boli vložené do kožnej incisie medzi lopatkami anestézovaných myší. Zlúčeniny boli nariedené v PBS s 0,1 % BSA. Všetky pokusy zahŕňali jednu kontrolnú skupinu, ktorá bola liečená len nosičom. Koncentrácia testovaných zlúčenín v pumpách bola upravená tak, aby kalibrovaný tok z púmp viedol na dosiahnutie koncentrácií uvedených v grafoch.

Zlúčeniny: Dávka zlúčeniny bola podaná myšiam pomocou 7- dennej mikroozmotickej pumpy. Myši boli liečené rôznymi zlúčeninami v jednej dávke 100 pg/kg v 7-dennej ozmotickej pumpe. Niektoré z týchto zlúčenín boli myšiam podané vo forme jedinej bolusovej injekcie.

Výsledky testu aktivity. Výsledky testov aktivity sú uvedené na obr. 4 a 5. V testoch dávka-odpoveď uskutočnených s použitím 7-denných mikroozmotických púmp (dáta nie sú uvedené) bol maximálny účinok pozorovaný pre zlúčeninu SEQ ID NO: 18 pri 100 pg/kg/deň; dávka 10 pg/kg/deň dosahovala približne 50 % maximálnej aktivity a dávka 1 pg/kg/deň bola najnižšia dávka, pri ktorej mohla byť v tomto testovacom systéme pozorovaná aktivita. Dávka 10 pg/kg/deň zlúčeniny bola rovnako aktívna ako dávka 100 pg/kg/deň nepegylovaného rHu-MGDF v rovnakom pokuse.

Diskusia

Je dobre známe, že MGDF pôsobí podobným spôsobom ako ľudský rastový hormón (hGH), t. j. jedna molekula proteínového ligandu sa viaže na dve molekuly receptora, čo spôsobí aktiváciu receptora (Wells, J.A: et al., Ann. Rev. Biochem. 65: 609-634 (1996)). Táto interakcia je napodobňovaná pôsobením oveľa menšieho TMP peptidu. Predkladané štúdie ale naznačujú, že toto napodobnenie vyžaduje koordinované pôsobenie dvoch TMP molekúl, pretože kovalentná dimerizácia TMP buď C-C paralelne, alebo C-N sekvenčne, zvyšuje biologickú účinnosť pôvodného monoméru in vitro viac ako 1 OOO-krát. Relatívne nízka biologická účinnosť monoméru je pravdepodobne spôsobená neúčinnou tvorbou nekovalentného diméru. Výhodný kovalentný dimér môže eliminovať entropickú bariéru na tvorbu nekovalentného diméru, ktorý je tvorený výlučne slabými, nekovalentnými interakciami medzi dvoma molekulami malého peptidu tvoreného 14 zostatkami.

Je zaujímavé, že väčšina tandemových dimérov je účinnejšia ako C-koncové paralelné diméry. Zdá sa, že tandemová dimerizácia spôsobuje lepšiu konformácii molekuly ako C-C paralelná dimerizácia. Zdanlivo ne24 symetrický charakter tandemového diméru môže približovať tento dimér prirodzenému ligandu, ktorý, pretože je asymetrickou molekulou, využíva dve rôzne miesta pre väzbu na dve identické receptorové molekuly. Vloženie PEG molekuly bolo uskutočnené na účely zvýšenia aktivity modifikovaného peptidu in vivo tým, že bude brániť proteolytickej degradácii a spomalí jeho vylučovanie renálnou filtráciou. Nepredpokladalo sa, že pegylácia ďalej zvýši biologickú aktivitu tandemového dimerizovaného TMP peptidu in vitro v teste bunkovej proliferácie.

Príklad 5

Nasledujúci príklad zhŕňa výsledky testov in vivo na opiciach pre rôzne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu.

Na hodnotenie hematologických parametrov samíc opíc makak rhesus po podkožnom podaní TMP bol navrhnutý s uskutočnený nasledujúci protokol. Opice boli rozdelené do piatich skupín po troch. Skupina 1 slúžila ako kontrola a bol jej podaný acetátový pufor (20 mM octan sodný, 0,25 M chlorid sodný, pH 5) neobsahujúci ani AMP2, ani pegylovaný, rekombinantný ľudský MGDF (PEG-rHuMGDF). Skupine 2 bola podaná jedna alebo viac dávok TMP v uvedených intervaloch; skupine 3 bolo podané 1 000 pg/kg TMP v uvedených intervaloch; skupine 4 bolo podané 5 000 pg/kg TMP v uvedených intervaloch; a skupine 5 bolo podané 100 pg/kg PEG-rHuMGDF v uvedených intervaloch.

Deň, kedy bola podaná prvá dávka, bol označený ako deň 0 cyklu 1. V cykle 2 boli dávky podávané v dňoch 21, 23, 25, 28, 30 a 32. Počas cyklu 3 bola podaná jedna dávka v deň 84 a v cykle 4 bola podaná jedna dávka v deň 123. Pri zvieratách boli pozorované klinické príznaky raz denne počas aklimatizačného obdobia, trikrát denne (pred podaním dávky, 30 minút po podaní dávky a 2 až 3 hodiny po podaní dávky) v dňoch aplikácie dávok a raz denne v dňoch bez podania dávky. Príjem potravy bol počítaný denne podľa počtu podanej potravy a ponechanej potravy pre každé zviera 7 dní pred začiatkom liečby a na konci sledovania. Telesná hmotnosť každého zvieraťa bola meraná dvakrát pred liečbou a dvakrát počas liečby a rekonvalescencie. Vzorky na hematologické vyšetrenie boli odobrané raz pred liečbou a potom v dňoch 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 22, 24, 26, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 55, 62, 69, 76, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 111, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 150. Na analýzu farmakokinetiky boli 0,5 ml vzorky séra odobrané raz pred podaním dávky a 1, 4 a 24 hodín po podaní dávky. Vzorky boli odoberané v dňoch 0, 21, 32, 84 a 123 a boli uskladnené pri približne -70 °C do analýzy. Na analýzu protilátok boli 2 ml vzorky krvi odobrané jeden týždeň pred jednou dávkou a v dňoch 0 (pred podaním dávky), 6, 13, 20, 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69, 76, 83, 90, 97, 104, 111, 118, 129, 136, 143 a 150. Vzorky boli uskladnené pri -70 °C do analýzy.

Výsledky ukazujú, že hodnoty trombocytov sa zvýšili vo všetkých liečených skupinách s najvyšším zvýšením v skupine liečenej PEG-rHuMGDF a najvyššou dávkou TMP. V cykle 1 sa pikové hodnoty trombocytov zvýšili približne 3,3-násobne a 3,1-násobne v skupine liečenej PEG-rHuMGDF (deň 9) a TMP v dávke 5 000 pg/kg (deň 9), v príslušnom poradí, v porovnaní s priemerným počtom trombocytov v kontrolnej skupine. Najnižšia dávka AMP2 zvýšila hodnoty trombocytov približne 1,05-násobne v porovnaní s kontrolou v rovnakých dňoch testu. Podobné odpovede neboli zaznamenané v ďalších cykloch.

V cykle 4 ale nevykázala skupina liečená PEG-rHuMGDF také vysoké zvýšenie počtu trombocytov ako v predchádzajúcich cykloch. Skupina liečená PEG-rHuMGDF vykazovala približne 2-násobné zvýšenie počtu trombocytov v porovnaní s kontrolnou skupinou v deň 9 tohto cyklu. Na porovnanie, priemerný počet trombocytov v skupine liečenej najvyššou dávkou TMP v cykle 4 bol 3,3-násobne vyšší ako v kontrolnej skupine. Ďalej, zvieratá liečené PEG-rHuMGDF mali priemerný počet trombocytov o 53 % nižší ako bol priemerný počet trombocytov v kontrolnej skupine na začiatku 4 cyklu (na dávku) a priemerný počet trombocytov pre túto skupinu na konci cyklu 4 * (27 dní po podaní dávky) bol o 791 nižší ako v kontrolnej skupine. Pre všetky zvieratá liečené THP bol priemerný počet trombocytov na začiatku a na konci cyklu 4 ± ± 15 % počtu trombocytov v kontrolnej skupine.

V cykle 1 a 2 bol zaznamenaný trend smerom na zníženie erytrocytov (RBC) vo všetkých liečených skupinách. Pokles bol najvýraznejší v dňoch 41 až 43 a najvyšší pokles RBC bol zaznamenaný v skupine liečenej PEG-rHuMGDF. Počty sa vrátili k normálu (v porovnaní s kontrolou) už v deň 47. Počet leukocytov (WBC) počas cyklov 1 a 2 bol výrazne zvýšený (2,6-násobne) v porovnaní s kontrolou v deň 35. Mierne zvýšenie bolo zaznamenané v skupine liečenej 5 000 pg/ml TMP v deň 33. Hodnoty sa vrátili k normálnym (kontrolným) hodnotám na začiatku dňa 37. Podobná odpoveď bola pozorovaná v cykle 3 a žiadna zmena v leukocytoch nebola pozorovaná v žiadnej skupine v cykle 4.

Počas cyklu 3 bol počet erytrocytov mierne znížený v deň 13 (po jedinej dávke cyklu 3) vo všetkých liečených skupinách s výnimkou skupiny liečenej 500 pg/kg TMP. Hodnoty erytrocytov sa vrátili k normálnym (kontrolným) hodnotám na začiatku dňa 17.

Počas cyklu 4 bol počet erytrocytov znížený vo všetkých liečených skupinách s výnimkou skupiny liečenej 500 pg/kg AMP2. Oproti iným cyklom bol v tomto cykle prítomný viac ako jeden nadir. Toto zníženie sa vyskytovalo medzi dňami 1 - 9 po podaní dávky a upravovalo sa od dňa 11.

Výsledky ukazujú, že zvýšenie počtu trombocytov nad hodnoty pri kontrolných zvieratách môže byť detekované 7 až 9 dní po podaní dávok pri všetkých liečených zvieratách vo všetkých testovaných cykloch. Zdá sa, že opakovaná aplikácia vedie na vyššiu odpoveď v produkci trombocytov v porovnaní s jedinými dávkami. V cykle 4 bola trombocytáma odpoveď vyvolaná PEG-rHuMGDF nižšia v porovnaní s predchádzajúcimi cyklami a v porovnaní s odpoveďou na vysokú dávku TMP. Zníženie počtu erytrocytov bolo pozorované v cykloch 1, 2, 3 a 4 vo všetkých liečených skupinách počas každého cyklu štúdie, ale všetky hematologické parametre sa vrátili na normálne hodnoty (kontrolne) po ukončení dávkovania.

Dohromady tieto výsledky ukazujú, že liečba TMP je dobre tolerovaná pri opiciach makak rhesus a že liečba AMP2 vedie na zvýšenie počtu trombocytov po rôznych cykloch liečby. Nezdá sa, podľa výsledných počtov trombocytov, že by existovala významná imunitná odpoveď na TMP. Naopak, liečba v rôznych cykloch PEG-rHuMGDF ukázala inhibíciu trombocytámej odpovede v cykle 4, čo naznačuje, že boli vytvorené protilátky k PEG-rHuMGDF a že tieto protilátky môžu byť skrížené reaktívne s endogénnym TPO makaka rhesus.

Je nutné si uvedomiť, že existujú rôzne zmeny a modifikácie predkladaného vynálezu, ktoré spadajú do rozsahu vynálezu.

Zoznam sekvencií <110> Liu, Chuan-Fa Feige, Ulrich Cheetam, Janet C.

< 120> Trombopoetické zlúčeniny <130> 01017/36263 <140>

<141>

<150> 60/105348 <151> 1998-10-23 <160> 46 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis artificiálnej sekvencie: peptid <400> 1 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 1 5 10 <210>2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis artificiálnej sekvencie: peptid <220>

<223> Peptid je podjednotka homodiméru: Podjednotky v homodimére sú kovalentne viazané na každom karboxylovom konci peptidovou väzbou s NH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH(CONH₂)-NH-CO-CH₂-CH₂-NH₂<400> 2 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 684 <212>DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis artificiálnej sekvencie: oligonukleotid atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgt ccagctccgg aactcctggg gggaccgtca 60 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660 agcctctccc tgtctccggg taaa 684 <210>4 <211>684 <212> DNA <213> Artificiálna sekvencia 10 <220>

<223> Opis artificiálnej sekvencie: oligonukleotid <400> 4 tacctgtttt gagtgtgtac aggtggaaca ggtcgaggcc ttgaggaccc ccctggcagt 60 cagaaggaga aggggggttt tgggttcctg tgggagtact agagggcctg gggactccag 120 tgtacgcacc accacctgca ctcggtgctt ctgggactcc agttcaagtt gaccatgcac 180 ctgccgcacc tccacgtatt acggttctgt ttcggcgccc tcctcgtcat gttgtcgtgc 240 atggcacacc agtcgcagga gtggcaggac gtggtcctga ccgacttacc gttcctcatg 300 ttcacgttcc agaggttgtt tcgggagggt cgggggtagc tcttttggta gaggtttcgg 360 tttcccgtcg gggctcttgg tgtccacatg tgggacgggg gtagggccct actcgactgg 420 ttcttggtcc agtcggactg gacggaccag tttccgaaga tagggtcgct gtagcggcac 480 ctcaccctct cgttacccgt cggcctcttg ttgatgttct ggtgcggagg gcacgacctg 540 aggctgccga ggaagaagga gatgtcgttc gagtggcacc tgttctcgtc caccgtcgtc 600 cccttgcaga agagtacgag gcactacgta ctccgagacg tgttggtgat gtgcgtcttc 660 tcggagaggg acagaggccc attt 684 <210>5 <211> 228 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia 20 <220>

<223> Opis artificiálnej sekvencie: peptid <400> 5

Met 1

Asp

Lys

Thr

His 5

Thr

Cys

Pro

Cys 10

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu 15

Leu

Gly

Pro

Ser 20

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 25

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 30

Thr

Leu

Met

íle

Ser 35

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 40

Thr

Cys

Val

Val 45

Asp

Val

Ser

His

Glu 50

Asp

Pro

Glu

Val

Lys 55

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 60

Asp

Gly

Val

Glu

Val 65

His

Asn Ala

Lys Thr 70

Lys

Pro

Arg

Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr

75

80

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

85

90

95

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

100

105

110

íle

Glu

Lys

Thr

íle

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

115

120

125

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

íle

Ala

Val

145

150

155

160

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

165

170

175

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

180

185

190

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

195

200

205

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

210

215

220

Ser Pro Gly Lys 225 <210>6 <211>8 <212>PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis artificiálnej sekvencie: peptid <400>6

Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 7 <211>8 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis artificiálnej sekvence: peptid <400> 7

Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Gly 1 5 <210>8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis artificiálnej sekvencie: peptid <400> 8

Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly 1 5 <210>9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis artificiálnej sekvencie: peptid <400> 9

Gly Pro Asn Gly 1 <210> 10 <211> 32 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400> 10 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Pro

5 10 15

Asn Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 20 25 30 <210> 11 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <220>

<223> Cyklický peptid: sekundárna štruktúra je udržiavaná disulfidovou väzbou medzi intramolekulovými Cys zostatkami v pozíciách 9 a 31 <400> 11 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 12 <211> 36 <212>PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400> 12 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Arg Leu Gin Cys Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 13 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400> 13 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Ala Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Ala Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 14 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400> 14 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Lys Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 15 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Lys zostatok v pozícii 18 je brómacetylovaný <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: derivatizovaný peptid <400> 15 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Lys Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 16 <211> 36 <212>PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400> 16 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 17 <211> 36 <212>PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Lys v pozícii 18 je pegylovaný <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: derivatizovaný peptid <400> 17 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Lys Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 18 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Cys v pozícii 18 je pegylovaný <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: derivatizovaný peptid <400> 18 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 19 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400> 19 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Asn Gly Ser Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 20 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Monoméma podjednotka homodiméru; podjednotky v homodiméri sú viazané disulfidovou väzbou medzi Cys zostatkami v pozícii 18 na každej podjednotke <400> 20 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 21 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400>21 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 22 <211> 32 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Peptid je derivatizovaný na amino-konci kovalentne naviazaným Fc regiónom imunoglobulínu <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400> 22 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Pro 15 10 15

Asn Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 20 25 30 <210> 23 <211> 32 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Peptid je kovalentne naviazaný na amino a karboxylovom konci na Fc región imunoglobulínu <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400> 23 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Pro 15 10 15

Asn Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 20 25 30 <210> 24 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Peptid je kovalentne naviazaný na amino- konci na Fc región imunoglobulínu <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400> 24 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 25 <211> 34 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Peptid je kovalentne naviazaný na amino konci na Fc región imunoglobulínu <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400> 25

Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 15 10 15

Gly Pro Asn Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala 20 25 30

Arg Ala <210> 26 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400> 26 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 27 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Cyklický peptid; sekundárna štruktúra je zachovávaná disulfidovou väzbou medzi intramolekulovými

Cys zostatkami v pozíciách 9 a 31 <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400> 27 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 28 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnei sekvencie: peptid <400> 28 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 29 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <220>

<223> Peptid je kovalentne naviazaný na amino konci na Fc región imunoglobulínu <400> 29 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Ala Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Ala Leu

25 30

Ala Ala Arg Ala <210> 30 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnei sekvencie: peptid <400> 30 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Lys Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 31 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Peptid je kovalentne naviazaný na amíno konci na Fc región imunoglobulínu <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400>31 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 32 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <220>

<223> Peptid je kovalentne naviazaný na amino konci na Fc región imunoglobulínu <400> 32 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Asn Gly Ser Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 33 <211> 36 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <220>

<223> Peptid je podjednoťkou homodiméru; podjednotky homodiméru sú kovalentne viazané disulfidovou väzbou medzi Cys zostatkami v pozícii 18 každej podjednotky <223> Peptid je kovalentne naviazaný na amino konci na Fc región imunoglobulínu <400> 33 íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 34 <211> 41 <212> PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <220>

<223> Peptid je kovalentne naviazaný na amino konci na Fc región imunoglobulínu <400> 34

Gly Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala 1 5 10 15

Ala Arg Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr

25 30

Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala

40 <210>35 <211> 60 <212>DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: oligonukleotid <400> 35 aaaggtggag gtggtggtat cgaaggtccg actctgcgtc agtggctggc tgctcgtgct 60 <210>36 <211> 48 <212>DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: oligonukleotid <400> 36 acctccacca ccagcacgag cagccagcca ctgacgcaga gtcggacc 48 <210>37 <211> 66 <212>DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: oligonukleotid <400> 37 ggtggtggag gtggcggcgg aggtattgag ggcccaaccc ttcgccaatg gcttgcagca 60 cgcgca66 <210> 38 <211>76 <212>DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: oligonukleotid <400> 38 aaaaaaagga tcctcgagat tatgcgcgtg ctgcaagcca ttggcgaagg gttgggccct 60 caatacctcc gccgcc 76 <210>39 <211> 126 <212>DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: oligonukleotid <400> 39 aaaggtggag gtggtggtat cgaaggtccg actctgcgtc agtggctggc tgctcgtgct 60 ggtggtggag gtggcggcgg aggtattgag ggcccaaccc ttcgccaatg gcttgcagca 12' cgcgca 12i <210> 40 <211>124 <212> DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: oligonukleotid <400> 40 ccaggctgag acgcagtcac cgaccgacga gcacgaccac cacctccacc gccgcctcca 60 taactcccgg gttgggaagc ggttaccgaa cgtcgtgcgc gtattagagc tcctaggaaa 120 aaaa 124 <210> 41 <211> 42 <212>PRT <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: peptid <400>41

Lys Gly Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

10 15

Ala Ala Arg Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly íle Glu Gly Pro 20 25 30

Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 35 40 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: oligonukleotid <400> 42 aacataagta cctgtaggat cg 22 <210> 43 <211> 52 <212>DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: oligonukleotid <400> 43 ttcgatacca ccacctccac ctttacccgg agacagggag aggctcttct gc 52 <210> 44 <211> 861 <212>DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnej sekvencie: oligonukleotid <400> 44 tctagatttg ttttaactaa ttaaaggagg aataacatat ggacaaaact cacacatgtc 60 caccttgtcc agctccggaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 120 ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 180 gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 240 ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 300 ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 360 ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac 420 aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 480 gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc 540 cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 600 acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg 660 tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta 720 aaggtggagg tggtggtatc gaaggtccga ctctgcgtca gtggctggct gctcgtgctg 780 gtggtggagg tggcggcgga ggtattgagg gcccaaccct tcgccaatgg cttgcagcac 840 gcgcataatc tcgaggatcc g 861 <210> 45 <211> 861 <212>DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis Artificiálnei sekvencie: oligonukleotid <400> 45 agatctaaac aaaattgatt aatttcctcc ttattgtata cctgttttga gtgtgtacag 60 gtggaacagg tcgaggcctt gaggaccccc ctggcagtca gaaggagaag gggggttttg 120 ggttcctgtg ggagtactag agggcctggg gactccagtg tacgcaccac cacctgcact 180 cggtgcttct gggactccag ttcaagttga ccatgcacct gccgcacctc cacgtattac 240 ggttctgttt cggcgccctc ctcgtcatgt tgtcgtgcat ggcacaccag tcgcaggagt 300 ggcaggacgt ggtcctgacc gacttaccgt tcctcatgtt cacgttccag aggttgtttc 360 gggagggtcg ggggtagctc ttttggtaga ggtttcggtt tcccgtcggg gctcttggtg 420 tccacatgtg ggacgggggt agggccctac tcgactggtt cttggtccag tcggactgga 480 cggaccagtt tccgaagata gggtcgctgt agcggcacct caccctctcg ttacccgtcg 540 gcctcttgtt gatgttctgg tgcggagggc acgacctgag gctgccgagg aagaaggaga 600 tgtcgttcga gtggcacctg ttctcgtcca ccgtcgtccc cttgcagaag agtacgaggc 660 actacgtact ccgagacgtg ttggtgatgt gcgtcttctc ggagagggac agaggcccat 720 ttccacctcc accaccatag cttccaggct gagacgcagt caccgaccga cgagcacgac 780 caccacctcc accgccgcct ccataactcc cgggttggga agcggttacc gaacgtcgtg 840 cgcgtattag agctcctagg c 861

Claims

5 PATENTOVÉ NÁROKY

1. Peptidová zlúčenina všeobecného vzorca (Fc)_m- (L₂)_q-TMPi-(L,)_n-TMP₂- (L₃) r(Fc)_p, kde

TMP[ a TMP₂ sú každý nezávisle vybratý zo súboru základných zlúčenín obsahujúcich štruktúru

X₂ -X₃-X₄ X₅ -X₆'X₇ -XíX₉ -x 10, kde

X₂ je vybratý zo súboru pozostávajúceho z Glu, Asp, Lys a Val;

X₃ je vybratý zo súboru pozostávajúceho z Gly a Ala;

X₄jePro;

20 X₅ je vybratý zo súboru pozostávajúceho z Thr a Ser;

X₆je vybratý zo súboru pozostávajúceho z Leu, íle, Val, Ala a Phe;

X? je vybratý zo súboru pozostávajúceho z Arg a Lys;

X₈ je vybratý zo súboru pozostávajúceho z Gin, Asn a Glu;

X₉ je vybratý zo súboru pozostávajúceho z Trp, Tyr, Cys, Ala a Phe;

X,o j^e vybratý zo súboru pozostávajúceho z Leu, íle, Val, Ala, Phe, Met a Lys; L_b L₂ a L₃ sú spájacie skupiny, ktoré sú vybraté nezávisle zo súboru pozostávajúceho z

Y„, kde Y je prírodná aminokyselina alebo jej stereoizomér a n je 1 až 20;

(Gly)_n, kde n je 1 až 20, pričom ak je n väčšie než 1, tak môže byť až polovina Gly zvyškov nahradená zvyškami inej aminokyseliny vybratej zo zvyšných 19 prírodných aminokyselín alebo ich stereoizomérov; (Gly)₃Lys(Gly)₄ (SEQ ID NO: 6);

(Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂ (SEQ ID NO: 7);

(Gly)₃Cys(Gly)₄ (SEQ ID NO: 8);

GlyProAsnGly (SEQ ID NO: 9);

Cys zvyšku; a (CH₂)_n, kde n je 1 až 20;

Fc je Fc región imunoglobulínu; n je 0 alebo 1;

m, p, q a r sú každý nezávisle 0 alebo 1, pričom aspoň jeden z m alebo p je 1 a ďalej ak m je 0, potom q je 0, a ak p je 0, potom r je 0; a jej fyziologicky prijateľné soli.
2. Zlúčenina podľa nároku 1, v ktorej sú TMP! a TMP₂ nezávisle vybraté zo súboru pozostávajúceho z

X₂-X₃ x₂-x₃

X₂-X₃ x₂-x₃ x,-x₂ x,-x₂

x.-x₂ x,-x₂ x,-x₂ μο-^λιι,

-X_g-X₁₀-Xi,-X,₂;

-X₄-X₅-X₆-X₇-X_s-X„-X i o-X i x₄-x₅-x₆-x₇-x₈

-X₄-X5-X₆-X₇-X₈-Xg-Xio-Xii-Xi₂-Xi₃;

X₄-X5-X₆-X₇-X₈-X_g-Xio-Xn-Xi₂-Xi₃-Xi₄; •X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X_g-X₁₀; X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X_g-X₁₀-X,,; X₃-X₄-X5-X₆-X₇-X₈-X_g-Xio-Xii-Xi₂;

X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈

-X₃-X₄-X5-Xg-X₇-X₈

Xg-Xio*XirXi₂-Xi₃j

-x_n-x₁₂-x₁₃-x

Xg-X„ kde

X₂ až Xio sú definované v nároku 1;

Xi je vybratý zo súboru pozostávajúceho z íle, Ala, Val, Leu, Ser a Arg;

Xn je vybratý zo súboru pozostávajúceho z Ala, íle, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His a Glu;

X_I2 je vybratý zo súboru pozostávajúceho z Ala, íle, Val, Leu, Phe, Gly, Ser a Gin;

X.₃ je vybratý zo súboru pozostávajúceho z Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin a Gly; a

X14 j^e vybratý zo súboru pozostávajúceho z Ala, íle, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu a Gly.
3. Zlúčenina podľa nároku 1, v ktorej sú TMPi a/alebo TMP₂ derivatizované jedným alebo viacerými z následujúcicn spôsobov:

jedna alebo viac peptidových väzieb [-C(O)NR-] je nahradená nepeptidovou väzbou zvolenou zo súboru pozostávajúceho z -CH₂-karbamátovej väzby [-CH₂-OC(O)NR-]; fosfonátovej väzby; - CH₂-sulfonamidovej väzby [-CH₂-S(O)₂NR-]; močovinovej väzby [-NHC(O)NH-]; -CH₂-sekundámej aminovej väzby; a alkylovanej peptidovej väzby [-C(O)NR⁶-, kde R⁶ je nižší alkyl];

N-koniec je derivatizovaný na -NRR¹ skupinu; -NRC(O)R skupinu; -NRC(O)OR- skupinu; -NRS(O)₂R skupinu; -NHC(O)NHR skupinu, kde R a R¹ sú vodík alebo nižší alkyl, s podmienkou, že R a R¹neznamenajú oba vodík; sukcinimídovú skupinu; benzyloxykarbonyl-NH-(CBZ-NH-)skupinu; alebo benzyloxykarbonyl-NH-skupinu obsahujúcu 1 až 3 substituenty na fenylovom kruhu vybraté zo súboru pozostávajúceho z nižšej alkylskupiny, nižšej alkoxyskupiny, chlóru a brómu; a

C-koniec je derivatizovaný na -C(O)R², kde R² je vybratý zo súboru pozostávajúceho z nižšej alkoxyskupiny a -NR³R⁴, kde R³ a R⁴ sú nezávisle vybraté zo súboru pozostávajúceho z vodíka a nižšej alkylskupiny.
4. Zlúčenina nároku 1, ktorá je cyklická.
5. Zlúčenina podľa nároku 1, kde TMP] a TMP₂ sú každý

Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO: 1).
6. Zlúčenina podľa nároku 1, kde L_b L₂ a L₃ sú vybraté nezávisle zo súboru pozostávajúceho z Y_n, kde Y je prírodná aminokyselina alebo jej stereoizomér a n je 1 až 20.
7. Zlúčenina podľa nároku 1, kde L,, L₂ a L₃ obsahuje (Gly)_n, kde n je 1 až 20, pričom ak je n väčšie než 1, tak môže byť až polovina Gly zvyškov nahradená zvyškami inej aminokyseliny vybratej zo zvyšných 19 prírodných aminokyselín alebo ich stereoizomérov.
8. Zlúčenina podľa nároku 1, kde L, je (Gly)₈ a L₂ je (Gly)₅.
9. Zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 obsahujúca aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:

46.
10. Zlúčenina podľa nároku 1, kde L!, L₂ a L₃(Gly)₃Lys(Gly)₄ (SEQ ID NO: 6);

sú vybraté nezávisle zo súboru pozostávajúceho z (SEQ ID NO: 7); (SEQ ID NO: 8) a (SEQ ID NO: 9).

(Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂ (Gly)₃Cys(Gly)₄

GlyProAsnGly
11. Zlúčenina podľa nároku 6, kde L_b L₂ alebo L₃ obsahuje Cys zvyšok.
12. Zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11 vo forme diméru.
13. Zlúčenina podľa nároku 1, kde L_b L₂ alebo L₃ obsahuje skupinu (CH₂)_n, kde n je číslo 1 až 20.
14. Zlúčenina podľa nároku 1 vybratá zo súboru pozostávajúceho z

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 22)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ. ID NO: 23)

IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ. ID NO: 24)

Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 25)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 26)

Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cyclic) |_| (SEQ. ID NO: 27)

Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (linear) (SEQ. ID NO: 28)

Fc-IEGPTLRQALAAŔA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ. ID NO: 29)

Fc-IEGPTLRQWLAARA.GGGKGGGG-ffiGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 30)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-EEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 31)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 32)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 33)

Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 34).
15. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 14 v zmesi s jej farmaceutický prijateľným nosičom.
16. Polynukleotid, ktorý kóduje zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 14.
17. Vektor, ktorý obsahuje polynukleotid podľa nároku 16.
18. Hostiteľská bunka, ktorá obsahuje vektor podľa nároku 17.
19. Spôsob výroby zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 14, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nároku 18 vo vhodnom živnom médiu a izoláciu zlúčeniny z buniek alebo živného média.
20. Zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 14 na použitie ako liečivo.
21. Použitie zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 14 na výrobu liečiva na zvýšenie megakaryocytov alebo krvných doštičiek u pacienta.
22. Použitie podľa nároku 21 na výrobu liečiva na liečenie trombocytopénie.
23. Použitie podľa nároku 22 na výrobu liečiva na liečenie idiopatickej alebo imunitnej trombocytopénie ITP.
24. Použitie podľa nároku 21 na výrobu liečiva na liečenie myelodysplastického syndrómu.