JP4332163B2 - Ｍｐｌ受容体に結合し血小板生成活性を有する二量体トロンボポエチンペプチド模倣体 - Google Patents

Ｍｐｌ受容体に結合し血小板生成活性を有する二量体トロンボポエチンペプチド模倣体 Download PDF

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Description

本発明は、一般には、血小板生成活性を有する化合物（特にペプチドおよびポリペプチド）の分野に関する。本発明の化合物は、哺乳動物における血小板または血小板前駆体（例えば、巨核球）の産生を増加させるために使用することができる。
本発明は、血小板およびその前駆体細胞（例えば、巨核球）のインビトロおよびインビボ産生を刺激する能力を有する化合物、特にペプチドに関する。本発明の化合物の性質を論じる前に、血小板生成活性を有する2つのタンパク質 [トロンボポエチン（TPO）および巨核球成長・発生因子（megakaryocyte growth and development factor）（MGDF）]に関する背景として、以下を説明する。
内因性トロンボポエチン（TPO）のクローニング（Lokら, Nature 369:568-571 (1994);
Bartleyら, Cell 77:1117-1124 (1994); Kuterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11104-11108 (1994); de Sauvageら, Nature 369:533-538 (1994); Katoら, Journal of Biochemistry 119:229-236 (1995); Changら, Journal of Biological Chemistry 270:511-514 (1995)）は、巨核球生成（巨核球の産生）および血小板生成（血小板の産生）についての我々の理解を急速に深めた。
主として肝臓および腎臓において産生される60〜70kDaのグリコシル化タンパク質である内因性ヒトTPOは、332アミノ酸よりなる（Bartleyら, Cell 77:1117-1124 (1994); Changら, Journal of Biological Chemistry 270:511-514 (1995)）。該タンパク質は、種々の種間で高度に保存されており、ヒトエリトロポエチン（Gurneyら, Blood 85:981-988 (1995)）に対してアミノ末端（アミノ酸1〜172）において23％の相同性を有する（Bartleyら, Cell 77:1117-1124 (1994)）。内因性TPOは、血小板生成の鍵となる生物学的調節因子の特性のすべてを有することが示されている。そのインビトロ作用には、精製されたマウス造血幹細胞（Zeiglerら, Blood 84:4045-4052 (1994)）およびヒトCD34+細胞（Lokら, Nature 369:568-571 (1994); Raskoら, Stem Cells 15:33-42 (1997)）の両方からの巨核球コロニーの特異的誘導、増加した倍数性を有する巨核球の生成（Broudyら, Blood 85:402-413 (1995)）、および最終的な巨核球成熟および血小板産生の誘導（Zeiglerら, Blood 84:4045-4052 (1994)）が含まれる。逆に、TPO受容体（c-Mpl）に対する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、巨核球前駆体のコロニー形成能を有意に抑制する（Methiaら, Blood 82:1395-1401 (1993)）。さらに、c-Mplノックアウトマウスは重篤な血小板減少症および巨核球の欠損を示す（Alexanderら, Blood 87:2162-2170 (1996)）。
組換えヒトMGDF（rHuMGDF, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA）は、TPOに関連したもう1つの血小板生成性ポリペプチドである。それは、ヒトTPOのアミノ末端受容体結合ドメインを含むトランケート化タンパク質をコードするcDNAを含有するプラスミドで形質転換された大腸菌（E. coli）を使用して産生される（Ulichら, Blood 86:971-976 (1995)）。該ポリペプチドは抽出され、リフォールディングされ、精製され、そのアミノ末端にポリ[エチレングリコール]（PEG）部分が共有結合されている。得られた分子は、本発明では、PEG-rHuMGDFまたは単にMGDFと称される。
動物モデルを用いた種々の研究（Ulich, T.R.ら, Blood 86:971-976 (1995); Hokom, M.M.ら, Blood 86:4486-4492 (1995)）は、骨髄移植における及び血小板減少症（これは化学療法または放射線療法からしばしば生じる状態である）の治療におけるTPOおよびMGDF
の治療的有効性を明らかに示している。ヒトにおける予備的データは、種々の場面で血小板数を上昇させるのにMGDFが有用であることを証明している（Basserら, Lancet 348:1279-81 (1996); Katoら, Journal of Biochemistry 119:229-236 (1995); Ulichら, Blood 86:971-976 (1995)）。血小板供与過程を促進させるために、MGDFを使用することが可能であろう。なぜなら、MGDFの投与は、健康な血小板提供者において、循環血小板数を元の値の約3倍にまで増加させるからである。
TPOおよびMGDFは、主として或る造血細胞（例えば、巨核球、血小板、CD34+細胞および原始前駆細胞）の表面上で発現されるc-Mpl受容体への結合を介してそれらの作用を発揮する（Debili, Nら, Blood 85:391-401 (1995); de Sauvage, F.J.ら, Nature 369:533-538 (1994); Bartley, T.D.ら, Cell 77:1117-1124 (1994); Lok, Sら, Nature 369:565-8
(1994)）。インターロイキンおよびタンパク質ホルモンに対するほとんどの受容体と同様に、c-Mplは、クラスIサイトカイン受容体スーパーファミリーに属する（Vigon, Iら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5640-5644 (1992)）。このクラスの受容体の活性化は、リガンドの結合により誘発される受容体のホモ二量体形成を含み、そして今度はそれがシグナル伝達事象のカスケードを誘発する。
一般に、タンパク質リガンドとその受容体との相互作用は、比較的大きな接触面で生じることが多い。しかしながら、対応受容体に結合したヒト成長ホルモンの場合に示されるとおり、結合エネルギーの大部分に実際に寄与するのは、該接触面の僅か数個の鍵残基だけである（Clackson, Tら, Science 267:383-386 (1995)）。このことと、残りのタンパク質リガンド部分が適切な位相幾何学で結合エピトープを提示するためだけに働くこととから、それよりはるかに小さなサイズの活性リガンドを見出すことが可能となる。
これに向けた検討の過程で、大きなタンパク質リガンドの小さなペプチド模倣体（mimetics）を同定する有力な技術として、ファージペプチドライブラリー提示系が得られた（Scott, J.K.ら, Science 249:386 (1990); Devlin, J.J.ら, Science 249:404 (1990)）。この技術を用いることにより、c-Mpl受容体のアゴニストとして作用する小さなペプチド分子が見出された（Cwirla, S.E.ら, Science 276:1696-1699 (1997)）。
そのような研究において、線維状ファージのコートタンパク質との融合体として提示されたランダムな小さなペプチド配列が、c-Mplの抗体固定化細胞外ドメインに対してアフィニティー溶出され、保持されたファージが第2ラウンドのアフィニティー精製のために富化された。より強固な結合体のプールを富化するために、この結合選択および再増殖方法が何度も繰返された。その結果、配列上は互いに無関係なc-Mpl結合ペプチドの2つのファミリーが最初に同定された。ついで突然変異誘発ライブラリーの作製により最良の結合体が更に最適化され、それにより最終的に、IC50=2nMおよびEC50=400nMを有する非常に活性なペプチドの単離がもたらされた（Cwirla, S.E.ら, Science 276:1696-1699 (1997)）。TMP（TPO模倣ペプチド）と称されるこの14残基のペプチドは、TPOに対してもMGDFに対しても明らかな配列類似性を有さない。このTMP化合物の構造は以下のとおりである：Ile
Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala（配列番号1）またはIEGPTLRQWLAARA（1文字アミノ酸略号を用いた場合）。
これまでに、EPO模倣ペプチドに関する同様の研究において、同じ技術を用いてEPO模倣ペプチド（EMP）が見出されており（Wrighton, N.C.ら, Science 273:458-463 (1996)）、EPO受容体（EPOR）への結合においてそれが二量体として作用することが判明した。このようにして生成した(リガンド)2/(受容体)2複合体は、X線結晶学的データではC2対称を有していた（Livnah, O.ら, Science 273:464-471 (1996)）。この構造情報に基づき、2つのEMP単量体のC末端が柔軟なスペーサーで架橋されたEMPの共有結合二量体が設計され、それは、著しく増強された結合およびインビトロ／インビボ生物活性を有することが判
明した（Wrighton, N.C.ら, Nature Biotechnology 15:1261-1265 (1997)）。
同様のC末端二量体形成方法がTPO模倣ペプチド（TMP）に適用された（Cwirla, S.E.ら,
Science 276:1696-1699 (1997)）。TMPのC末端連結二量体（C-C連結体）は、0.5nMの改善された結合アフィニティーおよび著しく増加したインビトロ活性（EC50=0.1nM）（細胞増殖アッセイにおけるもの）を有することが判明した（Cwirla, S.E.ら, Science 276:1696-1699 (1997)）。このTMP C-C二量体の構造を以下に示す。
Figure 0004332163
本発明のもう1つの態様においては、該縦列二量体を更に、免疫グロブリンのFc領域と総称される免疫グロブリンタンパク質由来の1以上の部分に結合させることができる。得られた化合物は、TMP縦列二量体のFc融合体と称される。
以下は、本化合物のいくつかに関して有用な抗体のFc領域に関する簡潔な背景の部である。
抗体は、機能的に独立した2つの部分、すなわち、抗原に結合する「Fab」として公知の可変ドメイン、およびエフェクター機能（例えば、補体結合または食作用）との連結をもたらす「Fc」として公知の定常ドメインを含む。免疫グロブリンのFc部分は、長い血漿半減期を有し、一方、Fabは短寿命である（Caponら, Nature 337:525-531 (1989)）。
より長い半減期を得る又はFc受容体結合、プロテインA結合、補体結合および経胎盤伝達（これらはすべて、免疫グロブリンのFc領域が担う）などの機能を加えることを試みるために、Fcドメインを使用して治療用タンパク質産物が構築されている（Caponら, Nature 337:525-531 (1989)）。例えば、IgG1抗体のFc領域が、CD30-L（これは、ホジキン病腫瘍細胞、未分化リンパ腫細胞、T細胞白血病細胞および他の悪性細胞型上で発現されるCD30受容体に結合する分子である）に融合されている（米国特許第5,480,981号を参照されたい）。サイトカインの短い循環半減期を増加させるために、抗炎症性および抗拒絶性因子であるIL-10がマウスFcγ2aに融合されている（Zheng, Xら, The Journal of Immunology
15:5590-5600 (1995)）。また、いくつかの研究は、敗血症性ショックの患者を治療するための、ヒトIgG1のFcタンパク質と連結した腫瘍壊死因子受容体の使用を評価している（Fisher, C.ら, N. Engl. J. Med., 334:1697-1702 (1996); Van Zee, K.ら, The Journal
of Immunology, 156:2221-2230 (1996)）。また、エイズの治療のための治療用タンパク質を得るために、FcがCD4受容体に融合されている（Caponら, Nature 337:525-531 (1989)を参照されたい）。また、インターロイキン2の短い半減期およびその全身毒性を克服するために、インターロイキン2がIgG1またはIgG3のFc部分に融合されている（Harvillら, Immunotechnology, 1:95-105 (1995)を参照されたい）。
TPOおよびMGDFが利用可能であるにもかかわらず、血小板の産生を刺激する生物活性（血小板生成活性）および／または血小板前駆細胞（特に巨核球）を刺激する生物活性（巨核球生成活性）を有する追加的な化合物を得ることが依然として必要とされている。本発明は、そのような活性を有する新規化合物および関連態様を提供する。
本発明は、内因性トロンボポエチン（TPO）の活性を媒介する同じ受容体であるc-Mpl受容体に結合しそれを介した膜貫通シグナルを誘発しうる（すなわち、c-Mpl受容体を活性化しうる）化合物の一群を提供する。したがって、本発明の化合物は、血小板生成活性（すなわち、血小板の産生をインビボおよびインビトロで刺激する能力）および／または巨核球生成活性（すなわち、血小板前駆体の産生をインビボおよびインビトロで刺激する能力）を有する。
第1の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、一般構造： TMP1-(L1)n-TMP2[式中、TMP1およびTMP2は、それぞれ独立して、コア構造： X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10（式中、 X2は、Glu、Asp、LysおよびValよりなる群から選ばれる；
X3は、GlyおよびAlaよりなる群から選ばれる；
X4は、Proである；
X5は、ThrおよびSerよりなる群から選ばれる；
X6は、Leu、Ile、Val、AlaおよびPheよりなる群から選ばれる；
X7は、ArgおよびLysよりなる群から選ばれる；
X8は、Gln、AsnおよびGluよりなる群から選ばれる；
X9は、Trp、TyrおよびPheよりなる群から選ばれる；
X10は、Leu、Ile、Val、Ala、Phe、MetおよびLysよりなる群から選ばれる）を含む化合物の群から選ばれる；
L1は、本明細書に記載のとおりのリンカーである；および nは、0または1である]およびその生理的に許容される塩を含む。
1つの実施形態においては、L1は(Gly)y（式中、yは1〜20であり、yが1より大きい場合は、該Gly残基の半分までが、残りの19個の天然アミノ酸またはそれらの立体異性体から選ばれる別のアミノ酸で置換されていてもよい）を含む。
TMP1およびTMP2に関して前記したコア構造X2-X10に加えて、以下の1以上がTMP1および／またはTMP2コア構造に加えられた他の関連構造も可能である：X1がN末端に結合しており、および／または、X11、X12、X13および／またはX14がC末端に結合している（その場合のX1、X12、X13およびX14は以下のとおりである： X1は、Ile、Ala、Val、Leu、SerおよびArgよりなる群から選ばれる；
X11は、Ala、Ile、Val、Leu、Phe、Ser、Thr、Lys、HisおよびGluよりなる群から選ばれる；
X12は、Ala、Ile、Val、Leu、Phe、Gly、SerおよびGlnよりなる群から選ばれる；
X13は、Arg、Lys、Thr、Val、Asn、GlnおよびGlyよりなる群から選ばれる；およびX14は、Ala、Ile、Val、Leu、Phe、Thr、Arg、GluおよびGlyよりなる群から選ばれる）。
第２の好ましい実施形態においては、本発明の化合物は、一般式： (Fc)m-(L2)q- TMP1-(L1)n- TMP2-(L3)r-(Fc)p[式中、TMP1、TMP2およびnはそれぞれ、前記と同意義である；L1、L2およびL3は、それぞれ独立して、本明細書に記載のリンカー基から選ばれるリンカー基である；Fcは、本明細書に後記する免疫グロブリンのFc領域である；m、p、qおよびr
は、それぞれ独立して、0および1よりなる群から選ばれる（この場合、mまたはpの少なくとも1つは1である。さらに、mが0の場合にはqは0であり、pが0の場合にはrは0である）]およびその生理的に許容される塩を有する。1つの実施形態においては、L1、L2およびL3は、独立して、(Gly)y（式中、yは1〜20であり、yが1より大きい場合には、該Gly残基の半分までが、残りの19個の天然アミノ酸またはそれらの立体異性体から選ばれる別のアミノ酸で置換されていてもよい）を含む。
前記化合物の誘導体（後記のもの）も本発明に含まれる。
本発明の化合物は、好ましくはペプチドであり、それらは、標準的な合成方法または他の任意のペプチド製造方法により製造することができる。非ペプチド部分を含む本発明の化合物は、適用可能な標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応により合成することができる。
本発明の化合物は、それらを適当な医薬担体物質と混合し、ヒト（または他の哺乳動物）などの対象に有効量を投与することにより、治療または予防目的に使用することができる。他の関連態様も本発明に含まれる。
したがって、以下の図面を参照して以下の詳細な説明を考慮すれば、本発明の多数の他の態様および利点が明らかとなるであろう。
図１は、本発明のFc融合化合物中で使用しうるヒトIgG1の典型的なFcポリヌクレオチドおよびタンパク質配列（配列番号3は、5'から3'に読取られるコード鎖であり、配列番号4は、3'から5'に読取られる相補鎖であり、配列番号5はコード化アミノ酸配列である）を示す。
図２は、ペジル化（pegylated）ペプチド19（配列番号17）の製造のための合成スキームを示す。
図３は、ペジル化ペプチド20（配列番号18）の製造のための合成スキームを示す。
図４は、以下の種々の化合物の1回の100μg/kgボーラス注射で処理された正常な雌BDF1マウスにおいてインビボで生成した血小板の数を示す。PEGF-MGDFは、大腸菌（E. coli）内で発現された（したがってグリコシル化されていない）天然ヒトTPOのアミノ酸1〜163の還元的アミノ化によりN末端アミノ基に結合した20kDの平均分子量のPEGを意味する（WO
95/26746（題名: "Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation"）を参照されたい）。TMPは配列番号1の化合物を意味する。TMP-TMPは配列番号21の化合物を意味する。PEG-TMP-TMPは配列番号18の化合物を意味し、そのPEG基は、図３に示すとおりに結合した5kDの平均分子量のPEGである。TMP-TMP-Fcは、本明細書中に後記で定義されており、Fc-TMP-TMPは、該TMP-TMPペプチドのC末端ではなくN末端にFc基が結合していること以外はTMP-TMP-Fcと同じである。
図５は、7日間にわたり移植浸透ポンプを介して運搬された種々の化合物で処理された正常なBDF1マウスにおいてインビボで生成した血小板の数を示す。該化合物は、図４に関して前記したのと同様に定義される。
図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、本発明の好ましい化合物の概要図を示す。図６Ａは、Fc部分がTMP二量体のN末端で融合している及びFc部分が単量体（一本鎖）形態であるFc融合化合物を示す。図６Ｂは、Fc領域がTMP二量体のN末端で融合している及びFc部分が二量体であり一方のFc単量体がTMP二量体に結合しているFc融合化合物を示す。図６Ｃは、Fc部分
がTMP二量体のN末端で融合している及びFc部分が二量体であり各Fc単量体がTMP二量体に結合しているFc融合化合物を示す。
より望ましい特性を有する治療剤の開発におけるリード化合物としての小さな構造体を見出すために、1つのTMPペプチドのC末端がもう1つのTMPペプチドのN末端に直接的に又はリンカーを介して結合した異なるタイプのTMP二量体および関連構造体を設計し、ついで、得られた二量体分子の生物活性に対するこの二量体形成方法の効果を調べた。いくつかの場合には、2つの単量体の間にリンカー（該リンカーは、好ましくは、天然アミノ酸を含み、したがってそれらの合成に組換え技術が利用可能となる）を有する、これらのいわゆる縦列二量体（C-N連結体）を設計した。
本発明は、血小板生成活性を有し内因性TPO受容体c-Mplへの結合により活性を現す化合物の一群を見出したことに基づく。
化合物および誘導体 第1の好ましい実施形態においては、本発明の化合物は、一般構造： TMP1-(L1)n-TMP2[式中、TMP1およびTMP2は、それぞれ独立して、コア構造： X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10（式中、X2は、Glu、Asp、LysおよびValよりなる群から選ばれる；
X3は、GlyおよびAlaよりなる群から選ばれる；
X4は、Proである；
X5は、ThrおよびSerよりなる群から選ばれる；
X6は、Leu、Ile、Val、AlaおよびPheよりなる群から選ばれる；
X7は、ArgおよびLysよりなる群から選ばれる；
X8は、Gln、AsnおよびGluよりなる群から選ばれる；
X9は、Trp、TyrおよびPheよりなる群から選ばれる；
X10は、Leu、Ile、Val、Ala、Phe、MetおよびLysよりなる群から選ばれる）を含む化合物の群から選ばれる；
L1は、本明細書に記載のとおりのリンカーである；および nは、0または1である]およびその生理的に許容される塩を含む。
1つの実施形態においては、L1は(Gly)y（式中、yは1〜20であり、yが1より大きい場合には、該Gly残基の半分までが、残りの19個の天然アミノ酸またはそれらの立体異性体から選ばれる別のアミノ酸で置換されていてもよい）を含む。
TMP1およびTMP2に関して前記したコア構造X2-X10に加えて、以下の1以上がTMP1および／またはTMP2コア構造に加えられた他の関連構造も可能である：X1がN末端に結合しており、および／または、X11、X12、X13および／またはX14がC末端に結合している（その場合のX1、X11、X12、X13およびX14は以下のとおりである： X1は、Ile、Ala、Val、Leu、SerおよびArgよりなる群から選ばれる；
X11は、Ala、Ile、Val、Leu、Phe、Ser、Thr、Lys、HisおよびGluよりなる群から選ばれる；
X12は、Ala、Ile、Val、Leu、Phe、Gly、SerおよびGlnよりなる群から選ばれる；
X13は、Arg、Lys、Thr、Val、Asn、GlnおよびGlyよりなる群から選ばれる；およびX14は、Ala、Ile、Val、Leu、Phe、Thr、Arg、GluおよびGlyよりなる群から選ばれる）。
「TMP」なる語は、少なくとも9個のサブユニット（X2-X10）（該X2-X10は、該コア構造を含む）から構成された（すなわち、それらを含む）部分を意味するものとして用いられる。好ましくは、該X2-X14サブユニットは、独立して、20個の天然に存在するアミノ酸から選ばれるアミノ酸であるが、本発明は、X2-X14が、独立して、当技術分野でよく知られた非典型的な天然に存在しないアミノ酸の群から選ばれる化合物を含む。具体的な好まし
いアミノ酸は、各位置ごとに定められる。例えば、X2は、Glu、Asp、LysまたはValであってもよい。本発明においては、アミノ酸に関する三文字および一文字の両方の略号を用いる。どちらの場合にも、それらの略号は、20個の天然に存在するアミノ酸またはよく知られたそれらの変異体に関して用いられる標準的なものである。これらのアミノ酸は、LまたはD立体化学を有していてもよく（ただし、Glyは、LでもDでもないため、例外である）、該TMPは、種々の立体化学の組合せを含んでいてもよい。しかしながら、該TMP鎖内のすべてのアミノ酸に関して、L立体化学が好ましい。本発明はまた、該アミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端への配列が逆転した逆TMP分子を提供する。例えば、通常の配列X1-X2-X3を有する分子の逆は、X3-X2-X1である。本発明はまた、逆TMPと同様にアミノ末端からカルボキシ末端へのアミノ酸配列が逆転しておりTMP中の通常は「L」エナンチオマーである残基が「D」立体異性体に変化したレトロ-逆（retro-reverse）TMP分子を提供する。
また、TMPの生理的に許容される塩も含まれる。「生理的に許容される塩」は、医薬上許容されることが公知であるか又は後に見出される任意の塩を意味する。いくつかの特定の好ましい具体例としては、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、シュウ酸塩が挙げられる。
また、前記のTMPの代わりに該TMPの「誘導体」が用いられうると意図される。そのような誘導体TMPには、以下の修飾の1以上が施された部分が含まれる： ペプチジル[-C(O)NR-]結合の1以上が、-CH2-カルバマート結合[-CH2-OC(O)NR-]、ホスホナート結合、-CH2-スルホンアミド[-CH2-S(O)2NR-]結合、尿素[-NHC(O)NH-]結合、-CH2-二級アミン結合、またはアルキル化ペプチジル結合[-C(O)NR6-（式中、R6は低級アルキルである）]などの非ペプチジル結合で置換されている；
N末端が-NR R1基、-NRC(O)R基、-NRC(O)OR基、-NRS(O)2R基、-NHC(O)NHR基（式中、RおよびR1は、水素または低級アルキルである。ただし、RおよびR1の両方が水素となることはない）、スクシンイミド基、ベンジルオキシカルボニル-NH-(CBZ-NH-)基、またはベンジルオキシカルボニル-NH-基（低級アルキル、低級アルコキシ、クロロおよびブロモよりなる群から選ばれる1〜3個の置換基を該フェニル環上に有するもの）に誘導体化されたペプチド；および 遊離C末端が-C(O)R2 [式中、R2は、低級アルコキシおよび-NR3R4（式中、R3およびR4は、独立して、水素および低級アルキルよりなる群から選ばれる）よりなる群から選ばれる] に誘導体化されたペプチド。「低級」は、1〜6個の炭素原子を有する基を意味する。
また、選択された側鎖または末端残基と反応しうる有機誘導体化剤と該ペプチドの標的アミノ酸残基とを反応させることにより、個々のアミノ酸の修飾をTMP分子内に導入することができる。以下に典型例を挙げる。
リシニルおよびアミノ末端残基を、コハク酸または他のカルボキシル酸無水物と反応させることができる。これらの物質での誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。αアミノ含有残基を誘導体化するための他の適当な試薬には、イミドエステル（例えばメチルピコリンイミダート）、ピリドキサルリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソ尿素、2,4ペンタンジオン、およびグリオキシラートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
アルギニル残基は、1個または数個の通常の試薬（例えば、フェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンが挙げられる）との反応により修飾することができる。グアニジン官能基のpKaが高いため、アルギニン残基の誘導体化の際には、該反応をアルカリ条件中で行う必要がある。さらに、これらの試薬を、リシンのいくつかの基およびアルギニングアニジノ基と反応させることができる。
チロシル残基自体の具体的な修飾は広範に研究されており、特に、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシン残基内へのスペクトル標識の導入に関心がもたれている。ごく一般には、N-アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、それぞれO-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体を形成させることができる。
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（R1-N=C=N-R1）（例えば、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミド）との反応により選択的に修飾することができる。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換することができる。
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸条件下で脱アミド化されうる。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。
二官能性物質での誘導体化は、ペプチドまたはそれらの機能的誘導体を水溶性支持マトリックスまたは他の高分子担体に架橋するのに有用である。一般に用いられる架橋剤には、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル、例えばジスクシンイミジルエステル、例えば3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)、および二官能性マレイミド、例えばビス-N-マレイミド-1,8-オクタンが含まれる。メチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミダートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成しうる光活性化中間体を与える。あるいは、反応性の水不溶性マトリックス、例えば、臭化シアンで活性化される炭水化物、および米国特許第3,969,287号、第3,691,016号、第4,195,128号、第4,247,642号、第4,229,537号および第4,330,440号に記載の反応性基質を、タンパク質の固定化に使用することができる。
他の可能な修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化が、Cys中の硫黄原子の酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化（Creighton, T.E, Proteins: Structure and Moleclule Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)）、N末端アミンのアセチル化、そしていくつかの場合には、C末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
そのような誘導体化された部分は、好ましくは、本発明の化合物の血小板生成活性、溶解度、吸収性、生物学的半減期などを含む1以上の特徴を改善する。あるいは、誘導体化された部分は、誘導体化されていない化合物と同じ又は実質的に同じ特徴および／または特性を有する化合物を与える。あるいは該部分は、該化合物の望ましくない副作用などを消失または減弱させる。
前記のコア構造X2-X10に加えて、特に意図される他の構造として、1以上の追加的なX基が該コア構造に結合しているものが挙げられる。したがってX1、および／またはX11、X12、X13およびX14を該コア構造に結合させることができる。いくつかの典型的な追加的な構造としては、以下のものが挙げられる。
Figure 0004332163
（式中、X1〜X14は前記と同意義を有する）。TMP1およびTMP2のそれぞれは、配列および／または長さにおいて同一であっても異なっていてもよい。いくつかの好ましい実施形態においては、TMP1およびTMP2は同一である。
特に好ましいTMPとしては以下のものが挙げられる：Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala（配列番号1）。
本発明で用いる「含む」は、とりわけ、ある化合物が、与えられた配列の-またはC末端の一方または両方において追加的なアミノ酸を含みうることを意味する。しかしながら、X2〜X10、X1〜X14などの構造またはその他の典型的な構造の1つが存在する限り、残りの化学構造はそれほど重要ではない。もちろん、X2〜X10のコア構造またはX1〜X14の構造以外のいずれの構造も、該化合物の血小板生成活性を有意に妨げるものであるべきではない。例えば、N末端Met残基は本発明の範囲内に含まれると考えられる。また、本発明の好ましい化合物の多くは、それらが2つのTMP部分を有する点で縦列二量体であるが、本発明の他の化合物は、TMPの縦列多量体、すなわち、以下の典型的構造の化合物である。
Figure 0004332163
（式中、TMP1、TMP2、TMP3、TMP4およびTMP5は同一または異なる構造を有していてもよく、各TMPおよびLは本明細書に記載と同意義であり、該リンカーはそれぞれ、所望により用いられる）。好ましくは、本発明の化合物は、2〜5個、特に好ましくは2〜3個、最も好ましくは2個のTMP部分を有する。本発明の第1の実施形態の化合物は、好ましくは、合計約60個未満、より好ましくは、合計約40個未満のアミノ酸を有する（すなわち、それらはペプチドである）。
前記のとおり、本発明の第1の実施形態の化合物は、好ましくは、直接的に結合した又はリンカー基により連結されたTMP二量体である。単量体TMP部分は、左から右へ読取られるN末端からC末端への通常の配向で示されている。したがって、本発明の化合物はすべて、TMP1のC末端が直接的にまたはリンカーを介してTMP2のN末端に結合するように配向していると理解されうる。この配向は縦列配向と称され、本発明の化合物は「縦列二量体」と
総称される。TMP1とTMP2とが構造上異なっていたとしても、これらの化合物は二量体と称される。すなわち、ホモ二量体およびヘテロ二量体の両方が意図される。
「リンカー」基（「L1」）は、所望により用いられる。それが存在する場合、その化学構造がどのようなものであるかは重要でない。なぜなら、それは主にスペーサーとして働くからである。該リンカーは、それが最終的な化合物の生物活性を妨げないように及び最終的な化合物の免疫原性が有意に増強されないように、選択されるべきである。該リンカーは、好ましくは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸から構成される。したがって、好ましい実施形態においては、該リンカーは、Yx（この場合、Yは、天然に存在するアミノ酸またはその立体異性体であり、「x」は1〜20の任意のものである）を含む。したがって、該リンカーは、ペプチド結合により連結された1〜20個のアミノ酸から構成され、それらのアミノ酸は、20個の天然に存在するアミノ酸から選ばれる。より好ましい実施形態においては、それらの1〜20個のアミノ酸は、Gly、Ala、Pro、Asn、Gln、Cys、Lysから選ばれる。より一層好ましくは、該リンカーは、立体障害のないアミノ酸（例えば、Gly、Gly-Gly [(Gly)2]、Gly-Gly-Gly [(Gly)3]...(Gly)20、Ala、Gly-Ala、Ala-Gly、Ala-Alaなど）の大多数から構成される。リンカーの他の具体例としては、以下のものが挙げられる：(Gly)3Lys(Gly)4（配列番号6）、(Gly)3AsnGlySer(Gly)2（配列番号7）（この構造はグリコシル化のための部位を、それがそのような部位をグリコシル化しうる哺乳類細胞系において組換え的に産生された場合に与える）、(Gly)3Cys(Gly)4（配列番号8）、およびGlyProAsnGly（配列番号9）。
前記の記号体系を説明すると、例えば、(Gly)3Lys(Gly)4は、Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Glyを意味する。GlyとAlaとの組合せも好ましい。
非ペプチドリンカーも可能である。例えば、-HN-(CH2)s-CO-（式中、s=2〜20）などのアルキルリンカーが用いられうる。これらのアルキルリンカーは更に、立体障害を与えない任意の基、例えば、低級アルキル（例えば、C1-C6）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Cl、Br）、CN、NH2、フェニルなどで置換されていてもよい。
もう1つのタイプの非ペプチドリンカーとしては、ポリエチレングリコール基、例えば、-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)t-O-CH2-CO-（式中、tは、該リンカーの総分子量が約101〜5000、好ましくは101〜500となる数である）が挙げられる。
一般に、本発明の第1の実施形態の血小板生成性化合物には約0〜14サブユニット（例えば、アミノ酸）の長さのリンカーが好ましいことが見出された。
該ペプチドリンカーを、TMPに関して前記したのと同様に改変して、誘導体を得ることができる。
この第1群の化合物は更に、直鎖状または環状であることが可能である。「環状」は、該分子の、少なくとも2つの分離した（すなわち非連続的な）部分が、互いに連結していることを意味する。例えば、該分子のアミノ末端およびカルボキシ末端が共有結合して環状分子を形成しうるであろう。あるいは、該分子は、ジスルフィド結合形成により環化しうる2以上のCys残基（例えば、該リンカー内）を含有しうるであろう。さらに、2以上の縦列ペプチド二量体が連結して二量体の二量体を形成しうると意図される。したがって、例えば、Cys残基を含有する縦列二量体は、別のそのような二量体のCysと分子間ジスルフィド結合を形成しうる。例えば、後記の配列番号20の化合物を参照されたい。
本発明の化合物は、担体分子、例えば、直鎖状重合体（例えば、ポリエチレングリコール、ポリリシン、デキストランなど）、分枝重合体（例えば、1981年9月15日付け発行のDenkenwalterらの米国特許第4,289,872号、1993年7月20日付け発行のTamらの米国特許第5,
229,490号、1993年10月28日付け公開のFrechetらのWO 93/21259を参照されたい）、脂質、コレステロール基（例えば、ステロイド）、または炭水化物またはオリゴ糖と共有的または非共有的に結合していてもよい。他の可能な担体には、1以上の水溶性重合体、例えば、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコール、例えば、米国特許第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号および第4,179,337号に記載されているものが含まれる。当技術分野で公知のその他の有用な重合体には、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースまたは他の炭水化物に基づく重合体、ポリ-(N-ビニルピロリドン)-ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモ重合体、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、ならびにこれらの重合体の混合物が含まれる。
好ましいそのような担体としては、ポリエチレングリコール（PEG）が挙げられる。PEG基は、簡便な任意の分子量のものであってもよく、直鎖状または分枝状であることが可能である。該PEGの平均分子量は、好ましくは、約2kDa〜約100kDa、より好ましくは約5kDa〜約50kDa、最も好ましくは約5kDa〜約10kDaである。
該PEG基は、一般には、該PEG部分上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α-ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基）を介した標的化合物の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α-ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基）へのアシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化または他の化学選択的共役／連結方法により、本発明の化合物に結合させる。
炭水化物（オリゴ糖）基は、タンパク質中のグリコシル化部位であることが知られている部位に簡便に結合させることができる。一般には、それらが配列Asn-X-Ser/Thr（式中、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸でありうる）の一部である場合には、O-結合オリゴ糖はセリン（Ser）またはトレオニン（Thr）残基に、N結合オリゴ糖はアスパラギン（Asn）残基に結合させる。Xは、好ましくは、プロリンを除く19個の天然に存在するアミノ酸の1つである。N結合およびO-結合オリゴ糖ならびに各タイプに存在する糖残基の構造は様々である。それらの両方に一般に存在する1つのタイプの糖は、N-アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される）である。シアル酸は、通常、N-結合およびO-結合オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷のため、グリコシル化化合物に酸性特性を付与する。そのような部位を本発明の化合物のリンカー内に含めることが可能であり、該部位は、好ましくは、該ポリペプチド化合物の組換え産生中に細胞によりグリコシル化される（例えば、CHO、BHK、COSなどの哺乳類細胞の場合）。しかしながら、そのような部位は、当技術分野で公知の合成または半合成方法により更にグリコシル化することができる。
本発明のいくつかの典型的なペプチドを以下に示す。一文字のアミノ酸の略号が用いられており、該リンカーは明瞭化のためにダッシュにより区切られている。追加的な略号：BrAcはブロモアセチル(BrCH2C(O))、PEGはポリエチレングリコールである。
Figure 0004332163
前記化合物のそれぞれにおいて、N末端のMet（または、一文字の記号を用いるとM残基）も意図される。前記化合物の多量体（例えば、共有結合および非共有結合した縦列および非縦列体）も意図される。
本発明の第2の実施形態においては、前記化合物を更に、直接的にまたはリンカー基を介して1以上のFc基に融合させることができる。一般に、この第2群の化合物の式は、
(Fc)m-(L2)q-TMP1-(L1)n-TMP2-(L3)r-(Fc)p
（式中、TMP1、TMP2およびnはそれぞれ前記と同意義を有し、L1、L2およびL3は、それぞれ独立して、前記のリンカー基から選ばれるリンカー基であり、Fcは免疫グロブリンのFc領域であり、m、p、qおよびrは、それぞれ独立して、0および1よりなる群から選ばれ、この場合、mまたはpの少なくとも1つは1であり、さらに、mが0である場合にはqは0であり、pが0である場合にはrは0である）およびその生理的に許容される塩である。
したがって、この第2の化合物群は、前記の第1の化合物群で定義したのと同じ構造を有するが、これらの化合物は更に、直接的に又は1以上のリンカー基を介して少なくとも1つのFc基に融合している。
前記化合物のFc配列は、ヒト免疫グロブリンIgG-1重鎖（Ellison, J.W.ら, Nucleic Acids Res. 10:4071-4079 (1982)を参照されたい）または当技術分野で公知の他の任意のFc配列（例えば、IgG-2、IgG-3およびIgG-4を含む（これらに限定されるものではない）他のIgGクラスまたは他の免疫グロブリン）から選ばれうる。
抗体のFc領域が、ジスルフィド結合または非共有結合により連結して二量体または多量体形態となりうる単量体ポリペプチドセグメントから構成されることは、よく知られている。天然Fc分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、関与する抗体のクラス（例えば、IgG、IgA、IgE）またはサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2）に応じて、1〜4である。本明細書で用いる「Fc」なる語は、Fc分子の単量体、二量体および多量体形態のすべてに対して用いられる。適当なCys残基が存在する場合には、ジスルフィド結合形成による二量体形成を妨げる特定の条件が存在しない限り、Fc単量体は自発的に二量体形成することに注意すべきである。Fc二量体においてジスルフィド結合を通常は形成するCys残基を除去したり又は他の残基で置換したとしても、該単量体鎖は、一般には、非共有相互作用により二量体形成するであろう。本明細書中の「Fc」なる語は、これらの任意の形態、すなわち天然単量体、天然二量体（ジスルフィド結合で連結されたもの）、修飾された二量体（ジスルフィド結合により及び／又は非共有的に連結されたもの）および修飾された単量体（すなわち誘導体）を意味するものとして用いられる。
Fc部分の変異体、類似体または誘導体は、例えば、残基または配列の種々の置換を行うことにより構築することができる。
変異体（または類似体）ポリペプチドには挿入変異体が含まれ、この場合、1以上のアミノ酸残基がFcアミノ酸配列に付加している。挿入は、該タンパク質の一方または両方の末端に位置していても、あるいはFcアミノ酸配列の内部領域内に位置していてもよい。一方または両方の末端に追加的な残基を有する挿入変異体には、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは標識を含むタンパク質が含まれうる。例えば、Fc分子は、所望によりN末端Metを含有していてもよく、該分子を大腸菌（E. coli）などの細菌細胞内で組換え的に産生させる場合には特にそうである。
Fc欠失変異体においては、Fcポリペプチド内の1以上のアミノ酸残基を除去する。欠失は、Fcポリペプチドの一方または両方の末端において又はFcアミノ酸配列内に1以上の残基の除去により行うことができる。したがって欠失変異体は、Fcポリペプチド配列のすべての断片を含む。
Fc置換変異体においては、Fcポリペプチドのアミノ酸残基の1以上を除去し、別の残基で置換する。1つの態様においては、該置換は本質的には同類的であるが、本発明は非同類的な置換も含む。
例えば、Fc配列のジスルフィド架橋のいくつか又はすべての形成を妨げるために、システイン残基を欠失させたり、他のアミノ酸で置換することができる。特に、配列番号5の7および10位のアミノ酸はシステイン残基である。これらのシステイン残基のそれぞれを除去したり、そのような1以上のシステイン残基を他のアミノ酸（例えば、AlaまたはSer）で置換することができる。もう1つの具体例としては、（1）Fc受容体結合部位を除去するために、（2）補体（C1q）結合部位を除去するために、および／または（3）抗体依存性細胞傷害（ADCC）部位を除去するためにアミノ酸置換を導入するために、修飾を行うことができる。そのような部位は当技術分野において公知であり、公知の任意の置換が、本発明で用いるFcの範囲内に含まれる。例えば、IgG1内のADCC部位に関しては、Molecular Immunology, Vol.29, No.5, 633-639 (1992)を参照されたい。
同様に、1以上のチロシン残基をフェニルアラニン残基で置換することも可能である。また、他の変異的なアミノ酸の挿入、欠失（例えば、1〜25アミノ酸）および／または置換も意図され、本発明の範囲内に含まれる。同類アミノ酸置換が一般に好ましい。さらに、改変は、ペプチド模倣体またはD-アミノ酸などの改変アミノ酸の形態におけるものであってもよい。
TMP化合物のFc配列を誘導体化すること（すなわち、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換以外の修飾を施すこと）も可能である。好ましくは、該修飾は本質的には共有結合によるものであり、例えば、重合体、脂質、他の有機および無機部分との化学結合を含む。本発明の誘導体は、循環半減期を増加させるために製造することができ、あるいは該ポリペプチドが所望の細胞、組織または器官に標的化される可能性が改善されるように設計することができる。
また、無傷Fc分子のサルベージ（salvage）受容体結合ドメインを本発明化合物のFc部分として使用することも可能である（例えば、WO 96/32478, 発明の名称: "Altered Polypeptides with Increased Half-Life"に記載されている）。本発明においてFcと称される分子のクラスの追加的なメンバーとしては、WO 97/34631（発明の名称: "Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives"）ものが挙げられる。この段落で引用した公開されたPCT出願の両方を、参照により本明細書に組み入れることとする。
Fc融合体は、TMP1またはTMP2のN末端またはC末端に、あるいはTMPのN末端およびC末端の両方に位置しうる。驚くべきことに、Fc部分をTMP基のN末端に連結させたペプチドが、他の可能なものより生物学的に活性であることが見出された。したがって、TMP1のN末端にFcドメインを有する融合体（すなわち、一般式において、rおよびpが共に0であり、mおよびqが共に1であるもの）が好ましい。該Fc鎖をTMPまたはリンカーのN末端に融合させる場合には、そのような融合体は一般には該Fc鎖のC末端に生じ、その逆も成り立つ。
また、前記一般式に記載の化合物の二量体（例えば、縦列および非縦列）である化合物も好ましい。そのような場合には、それぞれのFc鎖を、TMPペプチドの縦列二量体に連結させる。そのような化合物の具体例を図６Ｃに図示する。このタイプの化合物の好ましい具体例は、図６Ｃに基づくものであり、この場合、Fcは配列番号5の化合物の二量体であり、各L2は(Gly)5であり、TMP1またはTMP2はそれぞれ配列番号1の化合物であり、各L1は(Gly)8である。この化合物はまた、本発明においては「Fc-TMP1-L-TMP2」と称される。それはまた、配列番号34の二量体（Fc部分を介したもの）として表される。Fc基がリンカーを介して図６ＣのTMP2基のC末端に結合した類似化合物も意図され、本発明においては「TMP1-L-TMP2-Fc」と称される。
第2群からの化合物の具体例のいくつかを以下に示す。
Figure 0004332163
前記化合物のそれぞれにおいて、追加的なN末端Met（または、一文字の記号を用いた場合にはM残基）も意図される。Fc基がTMPのN末端に結合している場合には、該Met残基はFc基のN末端に結合していてもよい。Fc基がTMPのC末端に結合している場合には、該Met残基は該TMP基のN末端に結合しうるであろう。
前記の場合のそれぞれにおいて、Fcは、好ましくは、ヒト免疫グロブリンIgG1重鎖のFc領域またはその生物学的に活性な断片、誘導体若しくは二量体である。Ellison, J.W.ら,
Nucleic Acids Res. 10:4071-4079 (1982)を参照されたい。配列番号5に示すFc配列が、前記化合物に最も好ましいFcである。また、Fcが配列番号5の二量体形態であり各Fc鎖がTMP縦列二量体に結合した前記化合物も好ましい。
また、第2の実施形態の好ましい化合物の多くは、それらが2個の連結TMP部分を有する点で1以上の縦列二量体を含むが、本発明の他の化合物は、TMPの縦列多量体、すなわち、以下の典型的な構造の化合物を含む。
Figure 0004332163
（式中、TMP1、TMP2、TMP3、TMP4およびTMP5は同一または異なる構造を有することが可能であり、Fcおよび各TMPおよびLは前記と同意義を有し、該リンカーはそれぞれ、所望により用いられる）。前記の各場合において、Fc基は単量体または二量体であってもよく、Fcが二量体である場合には、1以上のTMP多量体を各Fc鎖に結合させることができる。また、TMP二量体または多量体が一方または両方のFc鎖のN末端およびC末端の両方に結合した他の例（TMP二量体または多量体が2つのFc鎖の4つ全ての末端に結合している場合を含む）も意図される。
好ましくは、本発明のこの第2の実施形態の化合物は、合計約200〜400アミノ酸を有する（すなわち、それらはポリペプチドである）。
製造方法 本発明の化合物は種々の方法で製造することができる。該化合物の多くはペプチドであるか又はペプチドを含むため、この場合にはペプチドの合成方法が特に適している。例えば、固相合成技術を用いることができる。適当な技術は当技術分野でよく知られており、それらには、Merrifield, Chem. Polypeptides, pp.335-61 (KatsoyannisおよびPanayotis編, 1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963); Davisら, Biochem. Intl. 10:394-414 (1985); StewartおよびYoung, Solid Phase Peptide Sythesis (1969); 米国特許第3,941,763号; Finnら, The Proteins, 第3版, vol.2, pp.105-253 (1976); ならびにEricksonら, The Proteins, 第3版, vol.2, pp.257-527 (1976)）に記載されているものが含まれる。固相合成は、小さなペプチドを製造するための最も費用効果的な方法であるため、個々のペプチドを合成するための好ましい技術である。
また、該ペプチドは、組換えDNA技術を用いて形質転換宿主細胞内で製造することができる。これを行うためには、該ペプチドをコードする組換えDNA分子を調製する。そのようなDNAおよび／またはRNA分子の調製方法は当技術分野でよく知られている。例えば、適当な制限酵素を使用して、該ペプチドをコードする配列をDNAから切り出すことが可能であろう。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、後続のクローニングのための有用な制限部位を含む関連配列を作製することができる。あるいは、ホスホロアミダイト法などの化学合成技術を用いて、該DNA/RNA分子を合成することが可能であろう。また、これらの技術の組合せを用いることが可能であろう。
本発明はまた、適当な宿主内の該ペプチドをコードするベクターを含む。該ベクターは、適当な発現制御配列に作動的に結合したペプチドをコードするDNA分子を含む。該ペプチドコード化DNA分子を該ベクター内に挿入する前または後にこの作動的結合を行う方法は、よく知られている。発現制御配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、終結シグナル、capシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルが含まれ
る。
該ペプチドコード化DNA分子を含む得られたベクターを使用して、適当な宿主を形質転換する。この形質転換は、当技術分野でよく知られた方法を用いて行うことができる。
入手可能でよく知られた多数の宿主細胞のいずれかを、本発明の実施において使用することができる。個々の宿主の選択は、当技術分野で認識されている多数の因子に左右される。これらの因子には、例えば、選択した発現ベクターの和合性、該DNA分子にコードされるペプチドの、該宿主細胞への毒性、形質転換の比率、該ペプチドの回収し易さ、発現特性、生物安全性およびコストが含まれる。ある特定のDNA配列の発現のためには全ての宿主が同等に有効であるわけではないという認識により、これらの因子のバランスをとらなければならない。
これらの一般的な指針においては、有用な微生物宿主には、細菌（例えば、大腸菌（E.
coli））、酵母（サッカロミセス種（Saccharomyces sp.）およびピチア・パストリス（Pichia pastoris））および他の真菌、昆虫、植物、哺乳類（ヒトを含む）細胞（培養内のもの）または当技術分野で公知の他の宿主細胞が含まれる。
つぎに、所望のペプチドが発現されるよう通常の発酵条件下で該形質転換細胞を培養する。そのような発酵条件は当技術分野においてよく知られている。
最後に、該ペプチドを、それらが発現された宿主細胞または発酵培養から精製する。これらの精製方法もまた、当技術分野においてよく知られている。
誘導体化ペプチドを含有する又は非ペプチド群を含有する化合物は、よく知られた有機化学技術により合成することができる。
化合物の用途 本発明の化合物は、c-Mpl受容体に結合しそれを活性化する能力、および／または（インビボおよびインビトロの両方で）血小板の産生を刺激する能力（「血小板生成活性」）および血小板前駆体の産生を刺激する能力（「巨核球生成活性」）を有する。これらの化合物の活性を測定するためには、標準的なアッセイ、例えばWO95/26746（発明の名称: "Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation"）に記載されているものを用いることができる。インビボアッセイについては本明細書中の実施例において更に詳しく説明する。
本発明の方法および組成物により治療される状態は、一般には、存在する巨核球／血小板の欠乏または将来において予期または予想される巨核球／血小板の欠乏（例えば、計画されている手術または血小板供与によるもの）を伴う状態である。そのような状態は、インビボにおける活性Mplリガンドの（一時的または永久的な）欠乏により生じうる。血小板欠乏（症）の一般的用語は血小板減少（症）であり、したがって本発明の方法および組成物は、一般には、血小板減少症の治療を要する患者において血小板減少症を予防的または治療的な治療するために利用可能である。
世界保健機関は、個体内の循環血小板の数に基づいて血小板減少症の程度を分類している（Millerら, Cancer 47:210-211 (1981)）。例えば、血小板減少症の徴候を示さない個体（等級0）は、一般には、少なくとも100,000個/mm3の血小板を有する。軽度の血小板減少症（等級1）は、79,000〜99,000個/mm3の血小板の循環レベルを示す。中等度の血小板減少症（等級2）は、50,000〜74,000個/mm3の血小板を示し、重度の血小板減少症は25,000〜49,000個/mm3の血小板により特徴づけられる。生命を脅かす又は衰弱を引き起こす血小板減少症は、25,000個/mm3未満の血小板の循環濃度により特徴づけられる。
血小板減少症（血小板欠乏症）は、化学療法および種々の薬物での他の療法、放射線療法、手術、不慮の出血、および他の具体的な病態を含む種々の理由により生じうる。血小板減少症を伴い本発明に従い治療されうる典型的な具体的な病態としては以下のものが挙げられる：無形成貧血；特発性または免疫血小板減少症（ITP）、例えば乳癌に伴う特発性血小板減少性紫斑病；HIVに伴うITPおよびHIVに関連した血栓性血小板減少性紫斑病；血小板減少症を引き起こす転移性腫瘍；全身性エリテマトーデス、例えば新生児ループス症候群脾腫；ファンコーニ症候群；ビタミンB12欠乏症；葉酸欠乏症；メイ-ヘグリンの異常；ウィスコット-アルドリッチ症候群；慢性肝疾患；血小板減少症に関連した骨髄形成異常症候群；発作性夜間ヘモグロビン尿症；C7E3 Fab（Abciximab）療法後の急性深部血小板減少症；同種免疫血小板減少症、例えば母性同種免疫血小板減少症；抗リン脂質抗体および血栓症に関連した血小板減少症；自己免疫血小板減少症；薬物により誘発された免疫血小板減少症、例えばカルボプラチンにより誘発された血小板減少症、ヘパリンにより誘発された血小板減少症；胎児血小板減少症；妊娠血小板減少症；ヒュージー症候群；ルポイド血小板減少症；不慮の及び／又は大量の失血；骨髄増殖性異常症；悪性疾患を有する患者における血小板減少症；血栓性血小板減少紫斑病、例えば癌患者において血栓性血小板減少性紫斑病／溶血性尿毒症性症候群として現れる血栓性細小血管症；自己免疫性溶血性貧血；潜在性空腸憩室穿孔；真正赤血球系無形成症；自己免疫血小板減少症；流行性（epidemica）腎障害；ラファンピシンに関連した急性腎不全；Paris-Trousseau血小板減少症；新生児同種免疫血小板減少症；発作性夜間ヘモグロビン尿症；胃癌における血液学的変化；小児における溶血性尿毒症性症候群；A型関連ウイルスを含むウイルス感染に関連した血液学的徴候およびCMVに関連した血小板減少症。また、ある種のエイズ治療は血小板減少症を引き起こす（例えば、AZT）。また、ある種の創傷治癒障害は、血小板数の増加が有益であろう。
予想される血小板の欠乏（例えば、将来の手術によるもの）に対して、血小板が必要となる前に数日から数時間にわたり本発明の化合物を投与することが可能であろう。緊急の状況（例えば、不慮の及び大量の失血）では、血液または精製血小板と共に本発明の化合物を投与することが可能であろう。
また、巨核球以外の或る細胞型の細胞がMpl受容体を発現することが判明している場合には、本発明の化合物は該細胞型を刺激するのに有用であり得る。Mplリガンドによる刺激に応答するMpl受容体を発現するそのような細胞に関連した状態も、本発明の範囲内に含まれる。
本発明の化合物は、血小板または血小板前駆細胞の産生が望まれる又はc-Mpl受容体の刺激が望まれる任意の状況において使用することができる。したがって、例えば、本発明の化合物は、血小板、巨核球などを必要とする哺乳動物における任意の状態を治療するために使用することができる。そのような状態は、代表的文献WO95/26746、WO95/21919、WO95/18858、WO95/21920に詳しく記載されており、本明細書に組み入れられる。
本発明の化合物はまた、血小板および／または巨核球および関連細胞の生存能または保存寿命を維持するのに有用で有り得る。したがって、そのような細胞を含有する組成物中に1以上のそのような化合物の有効量を含有させるのが有用であろう。
「哺乳動物」なる語は、ヒト、家畜（イヌおよびネコを含む）、外来の及び動物園の動物（サルを含む）、実験用動物（マウス、ラットおよびモルモットを含む）、農場の動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギおよびブタを含む）などを含む任意の哺乳動物を意味する。好ましい哺乳動物はヒトである。
医薬組成物 本発明はまた、本発明化合物の医薬組成物の使用方法を提供する。そのような医薬組成物は、注射用または経口、鼻、経皮または他の投与形態用の投与のためのものであってもよい。それらには、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、鞘内、眼内、延髄後方、肺内（例えば、エアゾール化薬）または皮下注射（長期にわたる放出のためのデポ投与を含む）、舌下、肛門、膣または外科的移植、例えば脾漿膜下、脳または角膜内の埋め込みによる投与が含まれる。該治療は、単回投与または一定期間にわたる複数回の投与よりなるものであってもよい。一般には、本発明の化合物の有効量と医薬上許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、佐剤および／または担体とを含む医薬組成物が本発明に含まれる。そのような組成物は、種々のバッファー含有物（例えば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩）、pHおよびイオン強度の希釈剤；添加物、例えば界面活性剤および可溶化剤（例えば、Tween 80、Polysorbate 80）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、Thimersol、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの重合体化合物の粒子状製剤内またはリポソーム内に該物質が封入されたものを含む。また、ヒアルロン酸を使用することも可能であり、これは、循環における持続化を促進する効果を有するかもしれない。該医薬組成物は、所望により、医薬ビヒクル、賦形剤または媒体として働く更に他の医薬上許容される液体、半固体または固体希釈剤を含んでいてもよい。それらには、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ステアリン酸マグネシウム、メチル-およびプロピルヒドロキシベンゾアート、デンプン、スクロース、デキストロース、アラビアゴム、リン酸カルシウム、鉱油、カカオ脂およびテオブロマの油が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような組成物は、本タンパク質および誘導体の物理学的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼしうる。例えば、参照により本明細書に組入れるRemington's Pharmaceutical Sciences, 第18版 (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), p.1435〜1712頁を参照されたい。該組成物は、液体形態または乾燥粉末（例えば、凍結乾燥形態）として製造することができる。移植可能な徐放製剤、および経皮製剤も意図される。
参照により本明細書に組入れるRemington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, 1990（Mack Publishing Co., Easton, PA 18042）第89章に全般的に記載されている経口固体剤形の使用が、本発明で意図される。固体剤形には、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤またはロゼンジ、カシェ剤またはペレット剤が含まれる。また、リポソームまたはプロテイノイド封入により、本組成物を製剤化することができる（例えば、米国特許第4,925,673号で報告されているプロテイノイドミクロスフェアとして）。リポソーム封入を利用することが可能であり、また、種々の重合体で該リポソームを誘導体化することが可能である（例えば、米国特許第5,013,556号）。治療用の可能な固体剤形の説明は、参照により本明細書に組入れるMarshall, K., Modern Pharmaceutics, G.S. BankerおよびC.T. Rhodes編, 第10章, 1979に記載されている。一般には、該製剤は、本発明化合物と、胃環境に対する保護および生物学的に活性な物質の腸内放出を許容する不活性成分とを含む。
また、前記の本発明化合物の経口剤形が特に意図される。必要に応じて、経口運搬が有効となるように該化合物を化学修飾することができる。一般には、意図される化学修飾は、少なくとも1つの部分を該化合物分子自体に結合させることであり、この場合、該部分は、（a）タンパク質分解の抑制、および（b）胃または腸から血流中への取込みを許容する。また、該化合物の全安定度を増加させること、および体内循環時間を増加させることが望ましい。そのような部分の具体例には、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンが含まれる（AbuchowskiおよびDavis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, HocenbergおよびRoberts編, Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), pp 367-383; Newmarkら, J. Appl. Biochem. 4:185-189 (1982)）。使用しうる他の重合体としては、ポリ-1,3-ジオキ
ソランおよびポリ-1,3,6-チオキソカン（tioxocane）が挙げられる。前記のとおり、医薬的な使用に好ましいのは、ポリエチレングリコール部分である。
該経口運搬剤形の場合、本発明の治療用化合物の吸収を増加させるための担体として、修飾脂肪族アミノ酸の塩、例えばナトリウムN-(8-[2-ヒドロキシベンゾイル]アミノ)カプリラート（SNAC）を使用することも可能である。SNACを使用するヘパリン製剤の臨床的効力は、Emisphere Technologiesにより行われた第II相試験において証明されている。米国特許第5,792,451号, "Oral drug delivery composition and methods"を参照されたい。
該治療剤は、粒径約1mmの顆粒剤またはペレット剤の形態の細かい多粒子（multiparticulate）として製剤中に含有させることができる。また、カプセル剤で投与するための該物質の製剤は、粉末剤、軽く圧縮されたプラグとして又は更には錠剤としての製剤でありうる。該治療剤は、圧縮により調製することができるであろう。
着色剤および香味剤のすべてを含有させることができる。例えば、該タンパク質（または誘導体）を製剤化し（例えば、リポソームまたはミクロスフェア封入により）、ついで更に、食用品（例えば、着色剤および香味剤を含有する冷却された飲料）中に含有させることができる。
該治療剤の容積を不活性物質で希釈または増加させることができる。これらの希釈剤には、炭水化物、特にマンニトール、α-ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンが含まれうる。また、ある種の無機塩、例えば三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどを、充填剤として使用することができる。いくつかの商業的に入手可能な希釈剤としては、Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、EmcompressおよびAvicellが挙げられる。
該治療剤を固体剤形に製剤化する場合には、崩壊剤を加えることができる。崩壊剤として使用する物質には、デンプンをベースとした市販の崩壊剤であるExplotabなどのデンプンが含まれるが、これらに限定されるものではない。デンプングリコール酸ナトリウム、Amberlite、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジの皮、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトがすべて使用可能である。崩壊剤のもう1つの形態は、不溶性陽イオン交換樹脂である。崩壊剤および結合剤として粉末ガムを使用することが可能であり、これらには、寒天、Karaya、トラガカントなどの粉末ガムが含まれうる。アルギン酸およびそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。
該治療剤を互いに結合させて硬質の錠剤を形成させるためには、結合剤を使用することができ、結合剤には、アカシア、トラガカント、デンプン、ゼラチンなどの天然物由来の物質が含まれる。その他には、メチルセルロース（MC）、エチルセルロース（EC）およびカルボキシメチルセルロース（CMC）が含まれる。ポリビニルピロリドン（PVP）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）は共に、該治療剤を顆粒化するためにアルコール性溶液中で使用することができるであろう。
製剤化工程中の固着を防ぐために、該治療剤の製剤化において減摩剤を加えることができる。該治療剤とダイ壁との間の層として滑沢剤を使用することが可能であり、これらには、ステアリン酸（そのマグネシウム塩およびカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、流動パラフィン、植物油およびワックスが含まれうるが、これらに限定されるものではない。また、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Carbowax 4000および6000などの可溶性滑沢剤を使用することができる。
製剤化中の薬物の流動特性を改善することが可能で圧縮中の再配列を補助する滑り剤（glidant）を加えてもよい。該滑り剤には、デンプン、タルク、発熱性シリカ、水化ケイ酸アルミニウム（hydrated silicoaluminate）が含まれうる。
該治療剤が水性環境中に溶解するのを補助するために、湿潤剤として界面活性剤を加えることができる。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、スルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン界面活性剤が含まれうる。陽イオン界面活性剤を使用することも可能であり、これらには、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが含まれうる。界面活性剤として製剤中に加えうる可能な非イオン界面活性剤としては、ラウロマクロゴール400、ポリオキシル40ステアラート、ポリオキシエチレン水素化ひまし油10、50および60、グリセロールモノステアラート、ポリソルベート40、60、65および80、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらの界面活性剤は、該タンパク質または誘導体の製剤中に単独でまたは種々の比率の混合物として存在することが可能であろう。
該化合物の取込みを潜在的に増強する添加剤としては、例えば、脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸が挙げられる。
放出制御製剤が望ましいかもしれない。該薬物は、拡散または浸出のいずれかのメカニズムによる放出を許容する不活性マトリックス（例えば、ガム）中に封入することが可能であろう。また、徐々に変性するマトリックス（例えば、アルギナート、多糖類）を製剤中に封入することも可能である。この治療剤の放出制御のもう1つの形態は、Oros治療系（Alza Corp.）に基づく方法によるものである。すなわち、この場合、浸透作用により単一の小さな開口から水が浸入し薬物を押し出すのを可能にする半透膜中に、該薬物を封入する。また、いくつかの腸溶性コーティングは徐放効果を有する。
他のコーティングを製剤化に用いることも可能である。これらには、コーティングパン内で適用されうる種々の糖が含まれる。また、該治療剤は、フィルムコーティングされた錠剤として提供されることも可能であり、この場合に用いる物質は、2つのグループに分類される。第1のグループは、非腸溶性物質であり、これらには、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドンおよびポリエチレングリコールが含まれる。第2のグループは、一般にはフタル酸のエステルである腸溶性物質よりなる。
最適なフィルムコーティングを得るために、物質の混合物を使用することができるであろう。フィルムコーティングは、パンコーター内または流動床内で、または圧縮コーティングにより行なうことができる。
また、本タンパク質（またはその誘導体）の肺運搬も本発明で意図される。該タンパク質（または誘導体）は、吸入されて哺乳動物の肺に運搬され、肺上皮内層（lung epithelial lining）を越えて血流に入る。（これに関する他の報告には、Adjeiら, Pharmaceutical Research 7:565-569 (1990); Adjeiら, International Journal of Pharmaceutics 63:135-144 (1990) (酢酸ロイプロリド); Braquetら, Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (増刊5): s. 143-146 (1989) (エンドセリン-１); Hubbardら, Annals of Internal Medicine 3:206-212 (1989) (α1-アンチトリプシン); Smithら, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (1989) (α1-プロテイナーゼ); Osweinら, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, 1990年3月 (組換えヒト成長ホルモン); Debsら, The Journal of Immunology 140:3482
-3488 (1988) (インターフェロン-γおよび腫瘍壊死因子α)およびPlatzら, 米国特許第5,284,656号 (顆粒球コロニー刺激因子)が含まれる）。
該治療用産物の肺運搬用に設計された多種多様な機械装置（例えば、噴霧器、定量吸入器、粉末吸入器などの、いずれも当業者によく知られたものが含まれるが、これらに限定されるものではない）を、本発明の実施で使用することが意図される。
本発明の実施に適した商業的に入手可能な装置のいくつかの具体例としては、Mallinckrodt, Inc.（St. Louis, Missouri）製のUltravent噴霧器、Marquest Medical Products（Englewood, Colorado）製のAcorn II噴霧器、Glaxo Inc.（Research Triangle Park, North Carolina）製のVentolin定量吸入器およびFisons Corp.（Bedford, Massachusetts）製のSpinhaler粉末吸入器が挙げられる。
そのようないずれの装置においても、本発明化合物の投薬に適した製剤を使用することが必要である。典型的には、各製剤は、用いる装置のタイプに特有のものであり、治療に有用な希釈剤、佐剤および／または担体に加えて適当な噴射物質の使用を伴いうる。
遠位の肺への最も有効な運搬のためには、本発明化合物は、10μm（またはミクロン）未満、最も好ましくは0.5〜5μmの平均粒径を有する粒子形態で製造されるのが最も有利なはずである。
担体には、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、ソルビトールなどの炭水化物が含まれる。製剤中で使用する他の成分には、DPPC、DOPE、DSPCおよびDOPCが含まれうる。天然または合成界面活性剤を使用することができる。ポリエチレングリコールを使用することができる（これは、該タンパク質または類似体の誘導体化におけるその使用と独立して使用することさえ可能である）。シクロデキストランなどのデキストランを使用することができる。胆汁酸塩および他の関連した増強剤を使用することができる。セルロースおよびセルロース誘導体を使用することができる。アミノ酸を使用することができる（例えば、バッファー製剤中での使用）。
また、リポソーム、マイクロカプセルまたはミクロスフェア、包接複合体、または他のタイプの担体の使用も意図される。
噴霧器（ジェット式または超音波式のいずれか）と併用するのに適した製剤は、典型的には、溶液1mL当たり生物学的活性タンパク質約0.1〜25mgの濃度で水に溶解された本発明化合物を含む。また、該製剤は、バッファーおよび単糖（例えば、タンパク質の安定化および浸透圧の調節用のもの）を含みうる。また、エーロゾルの形成において該溶液の噴霧により生じる該タンパク質の界面誘導凝集を抑制または予防するために、該噴霧製剤は界面活性剤を含有していてもよい。
定量吸入装置と併用する製剤は、一般に、界面活性剤の補助により噴射剤に懸濁された本発明化合物を含有する微細化粉末を含む。該噴射剤は、この目的に用いる通常の任意の物質（クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、または炭化水素、例えばトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、1,1,1,2-テトラフルオロエタンなど、またはそれらの組合せ）であってもよい。適当な界面活性剤には、ソルビタントリオレアートおよび大豆レシチンが含まれる。オレイン酸も界面活性剤として有用かもしれない。
粉末吸入装置からの投薬のための製剤は、本発明化合物を含有する微細化乾燥粉末を含む。また、該製剤は、その装置からの該粉末の分散を促進する量（例えば、該製剤の50〜
90重量％）の増量剤（例えば、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはキシリトール）を含んでいてもよい。
また、本発明化合物の鼻内運搬も意図される。鼻内運搬においては、該治療用産物を鼻へ投与した後、該産物の肺内での析出を要することなく、該タンパク質を直接血流へ通過させることが可能である。鼻内運搬用の製剤には、デキストランまたはシクロデキストランを含有する製剤が含まれる。他の粘膜を通過する輸送を介した運搬も意図される。
投与 前記の状態の治療方法にかかわる投与計画は、薬物の作用を改変する種々の要因（例えば、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、いずれかの感染の重症度、投与時間ならびに他の臨床的要因）を考慮して担当医師により決定されるであろう。一般には、該用量は、1日当たり本発明化合物0.1μg〜100mg/kg体重、好ましくは0.1〜1000μg/kg、より好ましくは0.1〜150μg/kgであり、これらを、1日量で、あるいはより長い又はより短い間隔で（例えば、1日おき、1週間に2回、毎週、または毎日2回または3回）同等量で投与する。
本発明化合物は、初期ボーラスおよびそれに続く連続的注入（薬物産物の治療循環レベルを維持するためのもの）により投与することができる。もう1つの例としては、本発明化合物を1回量で投与することができる。当業者は、優れた医学的実施および個々の患者の臨床的状態により定められる有効な用量および投与計画を容易に最適化するであろう。投与の頻度は、該物質の薬物動態学的パラメーターおよび投与経路に左右されるであろう。最適な医薬製剤は、投与経路および所望の用量に応じて当業者により決定されるであろう。例えば、参照により本明細書に組入れるRemington's Pharmaceutical Sciences, 第18版 (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), p.1435〜1712頁を参照されたい。そのような組成物は、投与する物質の物理学的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼしうる。投与経路に応じて、適当な用量を、体重、体表面積または器官のサイズに基づき計算することができる。前記製剤のそれぞれを含む治療の場合の適当な用量を決定するのに必要な更に厳密な計算は、特に本明細書に開示している用量に関する情報およびアッセイならびに前記のヒト臨床治験において認められた薬物動態学的データを考慮して、過度な実験を行うことなく当業者により日常的に行なわれているものである。適当な用量は、適当な用量反応データと共に血中レベル用量の決定のための確立されたアッセイを用いることにより確認することができる。最終的な投与計画は、薬物の作用を改変する種々の要因（例えば、薬物の比活性、損傷の重症度および患者の応答性、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、いずれかの感染の重症度、投与時間ならびに他の臨床的要因）を考慮して、担当医師により決定されるであろう。研究が行われるにつれて、種々の疾患および状態の治療の適当な用量レベルおよび持続時間に関する更なる情報が得られるであろう。
また、本発明の治療方法、組成物および化合物は、単独で又は他のサイトカイン、可溶性Mpl受容体、造血因子、インターロイキン、増殖因子または抗体と組合せて、血小板の欠乏および他の症状により特徴づけられる病態の治療において使用することができる。本発明化合物は、造血の一般的な刺激因子（例えば、IL-3またはGM-CSF）と組合せて、いくつかの形態の血小板減少症を治療するのに有用であると予想される。また、他の巨核球刺激因子、すなわちmeg-CSF、幹細胞因子（SCF）、白血病阻害因子（LIF）、オンコスタチンM（OSM）または巨核球刺激活性を有する他の分子を、Mplリガンドと共に使用することができる。そのような共投与のための追加的な代表的なサイトカインまたは造血因子には、IL-1アルファ、IL-1ベータ、IL-2、IL-3、IL-4、IL5、IL-6、IL-11、コロニー刺激因子-1（CSF-1）、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、EPO、インターフェロン-アルファ（IFN-アルファ）、コンセンサスインターフェロン、IFN-ベータ、IFN-ガンマ、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-1
8、トロンボポエチン（TPO）、アンジオポエチン、例えばAng-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4、Ang-Y、ヒトアンジオポエチン様ポリペプチド、血管内皮増殖因子（VEGF）、アンジオゲニン、骨形成因子（bone morphogenic protein）-1、骨形成因子-2、骨形成因子-3、骨形成因子-4、骨形成因子-5、骨形成因子-6、骨形成因子-7、骨形成因子-8、骨形成因子-9、骨形成因子-10、骨形成因子-11、骨形成因子-12、骨形成因子-13、骨形成因子-14、骨形成因子-15、骨形成因子受容体IA、骨形成因子受容体IB、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子α、サイトカイン誘導性好中球走化因子1、サイトカイン誘導性好中球走化因子2α、サイトカイン誘導性好中球走化因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、上皮由来好中球誘引物質、繊維芽細胞増殖因子4、繊維芽細胞増殖因子5、繊維芽細胞増殖因子6、繊維芽細胞増殖因子7、繊維芽細胞増殖因子8、繊維芽細胞増殖因子8b、繊維芽細胞増殖因子8c、繊維芽細胞増殖因子9、繊維芽細胞増殖因子10、酸性繊維芽細胞増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α1、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α2、成長関連タンパク質（growth related protein）、成長関連タンパク質α、成長関連タンパク質β、成長関連タンパク質γ、ヘパリン結合性上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II,インスリン様増殖因子結合タンパク質、角質細胞増殖因子、白血病阻害因子、白血病阻害因子受容体α、神経成長因子、神経成長因子受容体、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子受容体、TNF（TFN0、TNF1、TNF2を含む）、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、トランスフォーミング増殖因子β1、トランスフォーミング増殖因子β1.2、トランスフォーミング増殖因子β2、トランスフォーミング増殖因子β3、トランスフォーミング増殖因子β5、潜在（latent）トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質I、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質II、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質III、腫瘍壊死因子受容体I型、腫瘍壊死因子受容体II型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体、血管内皮増殖因子、ならびにそれらのキメラタンパク質および生物学的または免疫学的に活性な断片が含まれる。さらに、巨核球が成熟形態に達したら巨核球を血小板に断片化させる効果を有するらしい可溶性哺乳動物Mpl受容体の有効量を、同時または連続的に投与することが有用かもしれない。したがって、本発明化合物の投与（成熟巨核球の数を増加させるためのもの）およびそれに続く該可溶性Mpl受容体の投与（該リガンドを不活性化し、成熟巨核球に血小板を産生させるためのもの）は、血小板の産生を刺激する特に有効な手段であると予想される。前記で列挙した用量は、該治療用組成物中のそのような追加的な成分を補償するように調節されるであろう。治療された患者の経過は、通常の方法によりモニターすることができる。
本発明化合物を血小板および／または巨核球および関連細胞の組成物に加える場合、加える量は、一般には、当技術分野で公知の技術およびアッセイにより実験的に確認されるであろう。典型的な量の範囲は、106個の細胞当たり本発明化合物0.1μg〜1mgである。
本発明の教示を具体的な問題または状況に適用することは、本明細書中に含まれる教示を考慮すれば当業者の能力の範囲内であると理解される。本発明の産物、およびそれらの単離、使用および製造のための代表的な方法についての実施例を以下に記載する。
（実施例）
I．以下においては、本発明で開示する第1群の化合物のいくつかの典型的な製造方法を記載する。
A．材料および方法 ペプチド合成において使用するすべてのアミノ酸誘導体（すべて、L-立体配置のもの）および樹脂はNovabiochemから購入した。ペプチド合成試薬（DCC, HOBtなど）は溶液形態でApplied Biosystems, Inc.から購入した。2つのPEG誘導体はShearwater Polymers, Inc.からのものである。すべての溶媒（ジクロロメタン、N-メチルピロリジノン、メタノール、アセトニトリル）はEM Sciencesからのものである。分析用HPLCは、Vydacカラム（0.46cm X 25cm, C18逆相, 5mm）を使用するBeckman系上、流速1ml/分、220および280nmでの二重UV検出により行った。すべてのHPLC操作には、2つの移動相 [バッファーA- H2O（0.1％ TFA）およびバッファーB-アセトニトリル（0.1％ TFA）]での直線勾配を用いた。実施例中で言及される番号が付されたペプチド（例えば、17b、18、19および20）は、表1を参照して番号づけされており、それらのいくつかは更に、図２および３に例示されている。
ペプチド合成：すべてのペプチドは、十分に確立された逐次固相合成法により製造した。ABI Peptide Synthesizerを使用して、Fmoc化学による固相合成を行った。典型的には、0.1mmolスケールの予めローディングされたWang樹脂でペプチド合成を開始した。標準的なピペリジンプロトコールでFmocの脱保護を行った。DCC/HOBtを使用してカップリングを行った。側鎖の保護基は、Glu(O-t-Bu)、Thr(t-Bu)、Arg(Pbf)、Gln(Trt)、Trp(t-Boc)およびCys(Trt)であった。ペジル化用の第1ペプチド前駆体の場合には、リンカー上のLysの側鎖保護にDdeを使用し、最後のカップリングにBoc-Ile-OHを使用した。無水ヒドラジン（NMP中2％、3 X 2分）を使用することによりDdeを除去し、ついでDCCの作用により予め生成した無水ブロモ酢酸でカップリングさせた。ペプチド18の場合には、該リンカー上のシステイン側鎖をトリチル基で保護した。2.5％ H2O、5％フェノール、2.5％トリイソプロピルシランおよび2.5％チオアニソールを含有するトリフルオロ酢酸（TFA）を使用して、すべてのペプチジル-樹脂の最後の脱保護および切断を室温で4時間行った。TFAの除去後、その切断されたペプチドを冷無水エーテルで沈殿させた。H2O（pH7.5）中の15％ DMSOを使用することにより該粗物質上で直接、該環状ペプチドのジスルフィド形成を行った。分取逆相HPLCによりすべての粗ペプチドを精製し、ESI-MSおよびアミノ酸分析により構造を確認した。
あるいは、t-Boc化学を用いることにより、前記のすべてのペプチドを製造することも可能であろう。この場合、出発樹脂は古典的なMerrifieldまたはPam樹脂であり、側鎖保護基はGlu(OBzl)、Thr(Bzl)、Arg(Tos)、Trp(CHO)、Cys(p-MeBzl)となろう。該ペプチジル樹脂の最終的な切断には、フッ化水素（HF）が使用されるであろう。
天然アミノ酸を含むリンカーを有するこの研究において記載する縦列二量体ペプチドはすべて、組換えDNA技術によっても製造することができる。
ペジル化．溶液中の共役連結によるペプチドおよびPEG部分（それらのそれぞれは、相互に相手に対して反応性である特別の官能性を有する）の合体よりなる、合成ペプチドのペジル化のための新規の収斂型方法を開発した。該前駆体ペプチドは、前記の通常の固相合成により容易に製造することができる。後記のとおり、これらのペプチドを特定部位の適当な官能基で「前活性化」させる。該前駆体を精製し、十分に特徴づけた後で、PEG部分と反応させる。該ペプチドとPEGとの連結は、通常、水相中で生じ、逆相分析用HPLCにより容易にモニターすることができる。該ペジル化ペプチドは、分取HPLCにより容易に精製することができ、分析用HPLC、アミノ酸分析およびレーザー脱離質量分析により特徴づけることができる。
ペプチド19の製造．ペプチド17b（12mg）およびMeO-PEG-SH5000（30mg、2当量）を1mlの水性バッファー（pH8）に溶解した。該混合物を室温で約30分間インキュベートし、該反応を分析用HPLCにより調べたところ、該反応の>80％の完了が示された。該ペジル化物
質を分取HPLCにより単離した。
ペプチド20の製造．ペプチド18（14mg）およびMeO-PEG-マレイミド（25mg）を約1.5mlの水性バッファー（pH8）に溶解した。該混合物を室温で約30分間インキュベートし、その時点で、サンプルのアリコートをHPLCカラムにアプライすることによる分析HPLCでのモニターでは、〜70％の変換が完了していた。該ペジル化物質を分取HPLCにより精製した。
生物活性アッセイ．TPOインビトロバイオアッセイは、ヒトMpl受容体でトランスフェクトされたマウス32D細胞のIL-3依存性クローンを使用する分裂誘発性アッセイである。このアッセイはWO 95/26746に更に詳しく記載されている。10％ Fetal Clone IIおよび1ng/ml mIL-3を含有するMEM培地内に、細胞を維持する。サンプルの添加前に、mIL-3を欠く増殖培地で2回リンスすることにより細胞を調製する。3333〜39pg/mlの範囲の、伸長された12点TPO標準曲線を作成する。該標準曲線の直線部分に含まれると推定される4個の希釈液（1000〜125pg/ml）を各サンプルに関して調製し、三重に使用した。サンプルまたは標準物の希釈液（容積100μl）を、10,000細胞/ウェルを含有する96ウェルマイクロタイタープレートの適当なウェルに加えた。37℃で10％ CO2において44時間後、MTS（細胞によりフォルマザンへと生化学的に還元されたテトラゾリウム化合物）を各ウェルに加える。約6時間後、490nmでプレートリーダー上で光学密度を読取る。用量反応曲線（log TPO濃度対O.D.-バックグラウンド）を作成し、該標準曲線の直線部分に含まれる点の線形回帰分析を行う。得られた一次方程式および補正（希釈係数に関するもの）を用いて、未知試験サンプルの濃度を測定する。
略語．HPLC：高速液体クロマトグラフィー；ESI-MS：エレクトロスプレーイオン化質量分析；MALDI-MS：マトリックス介助レーザーデソープションイオン化質量分析；PEG：ポリ(エチレングリコール)。すべてのアミノ酸は、標準的な三文字または一文字の記号により表されている。t-Boc：tert-ブトキシカルボニル；tBu：tert-ブチル；Bzl：ベンジル；DCC：ジシクロヘキシルカルボジイミド；HOBt：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール；NMP：N-メチル-2-ピロリジノン；Pbf：2,2,4,6,7-ペンダメチルジヒドロ-ベンゾフラン-5-スルホニル；Trt：トリチル；Dde:1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソ-シクロヘキシリデン)エチル。
B．結果 ポリグリシンリンカーを有するTMP縦列二量体．逐次連結したTMP二量体の設計は、TMPの二量体形態がc-Mpl（TPO受容体）とのその有効な相互作用に必要であるという仮定、およびそれらが該受容体環境中でお互いに対して巻き上げられる様態に応じて、全体的な二量体コンホメーションを混乱させない様態でそれらの2つのTMP分子がC末端からN末端への立体配置で互いに結合するという仮定に基づくものであった。明らかに、該縦列連結二量体の活性はまた、それらの2つの逐次整列TMP単量体のC末端および末端を連結するリンカーの長さおよび組成の適切な選択に左右されうる。c-Mplに結合したTMPの構造情報が入手不能であったため、0〜10個および14個のグリシン残基を含むリンカーを有する一連の二量体ペプチド（表1）を合成した。グリシンを選択したのは、その単純さ及び柔軟性による。柔軟なポリグリシンペプチド鎖は、必要とされるコンホメーションへのそれらの2つの連結TMP反復の自由なフォールディングを可能にするが、より大きな立体障害を有するアミノ酸配列は、該受容体環境中の二量体ペプチドの適切なパッキングを妨げうる強固さを有する、より望ましくない二次構造をとりうると推論された。
得られたペプチドは、Fmocまたはt-Boc化学を用いる通常の固相ペプチド合成法（Merrifiled, R.B., Journal of the American Chemical Society 85:2149 (1963)）により容易に入手されうる。2つのペプチド鎖を偽対称的に構築するために最初の分枝点における直交型（orthogonally）保護リシン残基の使用を要するC末端連結平行二量体（配列番号2）の合成とは異なり（Cwirla, S.E.ら, Science 276:1696-1699 (1997)）、本発明者らの縦
列二量体の合成はC末端からN末端への連続的ペプチド鎖の直接的逐次集合であった。TMPの二量体形成は、結合アフィニティーより増殖活性に対して劇的な効果を及ぼすことが該C末端二量体に関して示されたため（Cwirla, S.E.ら, Science 276:1696-1699 (1997)）、完全長c-Mplでトランスフェクトされたマウス32D細胞のIL-3依存性クローンを使用するTPO依存性細胞増殖アッセイ（Palacios, Rら, Cell 41:727 (1985)）において生物学的活性に関して該合成ペプチドを直接試験した。該ポリグリシン連結縦列二量体のすべては、該単量体と比較して効力において>1000倍の増加を示し、この細胞増殖アッセイにおいて、該C末端二量体より一層強力であったことが、その試験の結果から示された（後記表1を参照されたい）。本発明者らのアッセイにおける該C末端二量体の絶対活性は、天然TPOタンパク質のものより低かった。これは、該C末端二量体が該天然リガンドと同等に活性であることが判明したという従来報告されている知見（Cwirla, S.E.ら, Science 276:1696-1699 (1997)）とは異なる。これは、それらの2つのアッセイで用いた条件の相違によるものであろう。それにもかかわらず、同一アッセイにおける縦列二量体（第1単量体のC末端は第2単量体のN末端に連結している）と並列二量体（第1単量体のC末端は第2二量体のC末端に連結している）との間の活性の相違は、並列二量体産物と比較した場合の縦列二量体化産物の優位性を明らかに示した。該リンカーにより広範な長さが許容されることが認められることは興味深いことである。選択されたTMP単量体（配列番号1）に対する最適なリンカーは、8個のグリシンから構成されるようである。
他の縦列二量体．この第1の一連のTMP縦列二量体に続いて、異なるリンカーを有する又は該単量体自体に修飾を含有するいくつかの他の分子を設計した。これらのうちの第1の分子（ペプチド13）は、GPNG（βターン型二次構造を形成する傾向が高いことが知られている配列）から構成されるリンカーを有する。このペプチドは、該単量体よりは尚も約100倍強力であるが、GGGG連結類似体より>10倍低い活性を有することが判明した。したがって、該リンカー領域における比較的強固なβターンの導入は、この短いリンカー形態における最適アゴニストコンホメーションの若干の歪みを引き起こすようであった。
該TMP配列中のTrp9は、ランダムペプチドライブラリーから単離された活性ペプチド間で高度に保存された残基である。また、EPO模倣ペプチドのコンセンサス配列中に高度に保存されたTrpが存在し、このTrp残基は、それらの2つのEPO模倣ペプチド（EMP）の間の疎水性コアの形成に関与し、EPO受容体との疎水性相互作用に寄与することが判明した（Livnah, Oら, Science 273:464-471 (1996)）。類推により、TMP中のTrp9残基は該ペプチドリガンドの二量体形成において同様の機能を有する可能性があると考えられた。そして、2つのインドール環により奏される非共有疎水性力の効果を改変し推定するために、Trpにおける突然変異から生じるいくつかの類似体を構築した。したがって、ペプチド14においては、2つのTMP単量体のそれぞれのTrp残基をCysで置換し、酸化によりそれらの2つのシステインの間で分子内ジスルフィド結合を形成させた。それは、ペプチド二量体形成におけるそれらの2つのTrp残基間の疎水性相互作用を模倣すると予想された。ペプチド15は、ペプチド14の還元形態である。ペプチド16においては、2つのTrp残基をAlaで置換した。3つすべての類似体は不活性であったことが、該アッセイデータから示された。これらのデータは更に、Trpが、二量体形成だけではなくTPO模倣ペプチドの活性にも重要であることを示した。
つぎの2つのペプチド（ペプチド17aおよび18）はそれぞれ、それらの8アミノ酸リンカー内にLysまたはCys残基を含有する。これらの2つの化合物は、LysまたはCysの側鎖がポリエチレングリコール（PEG）部分により修飾された2つのペジル化ペプチド（ペプチド19および20）の前駆体である。大きなPEG成分（5kDa）が該ペプチド分子内の重要な結合部位から十分に遠くなるよう、比較的長いリンカーの中央部にPEG部分を導入することに決定した。PEGは、ペプチドおよびタンパク質に基づく治療剤の薬物動態学的プロフィールを改善するための共有結合性修飾剤として益々使用されるようになりつつある公知の生体
適合性重合体である。
合成または組換えペプチドの簡便なペジル化のために、モジュール式（modular）の溶液に基づく方法を案出した。該方法は、一対の相互反応性官能性の特異的反応を利用する今や十分に確立された化学選択的連結方法に基づく。したがって、ペジル化されたペプチド19の場合、該リシン側鎖をブロモアセチル基で予め活性化してペプチド17bを得て、チオール誘導体化PEGとの反応に適応させた。それを行うために、リシンε-アミンの直交型（orthogonal）保護基Ddeを使用した。全ペプチド鎖を集合させたら、N末端アミンをt-Bocで再び保護した。ついでDdeを除去して、ブロモアセチル化に備えた。この方法は、通常の逆相HPLCを用いて容易に精製される高品質の粗ペプチドを与えた。チオールで修飾されたPEGと該ペプチドとの連結は、pH8の水性バッファー中で行った。該反応は30分以内に完了した。該精製ペジル化物質のMALDI-MS分析は、隣接ピーク間で44kDaの増加分を有する特徴的な釣鐘型のスペクトルを示した。PEG-ペプチド20の場合には、システイン残基がリンカー領域内に配置され、その側鎖チオール基はマレイミド含有PEGの結合部位として働くであろう。このペプチドのペジル化に、同様の条件を用いた。これらの2つのペジル化ペプチドは、それらの非ペジル化対応物より一層高いインビトロ生物活性を有することが、該アッセイデータから示された。
ペプチド21は、その8アミノ酸リンカー内に、潜在的グリコシル化モチーフNGSを有する。典型的な縦列二量体は、ペプチド結合により連結された天然アミノ酸から構成されるため、適当な真核細胞系内でのそのような分子の発現は、Asnの側鎖カルボキシアミド上に炭水化物部分が付加された糖ペプチドを産生するはずである。グリコシル化は、ある与えられたタンパク質の水溶性およびインビボ安定性を増加させることにより、該タンパク質の生物学的活性に対して多数の正の影響を及ぼす一般的な翻訳後修飾過程である。該リンカー内へのこのグリコシル化モチーフの取込みは高い生物活性を維持したことを、該アッセイデータは示している。該潜在的糖ペプチドの合成前駆体は、事実上、-(Gly)8-連結類似体の活性に匹敵する活性を有する。一旦グリコシル化されれば、このペプチドは該ペジル化ペプチドと同じオーダーの活性を有すると予想される。なぜなら、同様の化学物理学的特性がPEGおよび炭水化物部分により示されるからである。
最後のペプチドは二量体の二量体である。ペプチド18を酸化して、該リンカーに位置する2つのシステイン残基間で分子間ジスルフィド結合を形成させることにより、それを製造した。TMPが四量体として活性である可能性について検討するために、このペプチドを設計した。該アッセイデータは、このペプチドが、補正されたモルに基づいた場合に、平均的な縦列二量体ほどには活性でないことを示した。このことは、TMPの活性形態が実際に二量体であるという見解を間接的に支持している。さもなければ、縦列二量体の二量体形成は該生物活性に更なる影響を及ぼすであろう。
以下の表１に、前記のインビトロアッセイに基づくEC50に関する前記化合物の相対活性を要約する。
Figure 0004332163
II．以下においては、本発明で開示する第2群の化合物のいくつかの典型的な製造方法を記載する。
A．図６Ｃに示すタイプのFc融合化合物の製造 TPO模倣ペプチド（配列番号34）の二量体にインフレームで融合したヒトIgG1のFc領域をコードするDNA配列を、以下のとおりにプラスミド発現ベクターpAMG21中のluxPRプロモーターの制御下に配置した。
標準的なPCR技術を用いて、該融合遺伝子を構築した。PCR反応用の鋳型は、該Fc配列と配列番号34の化合物の残部をコードする合成遺伝子とを含有する融合ベクターであった。以下に示す4つの重複オリゴヌクレオチドから該合成遺伝子を構築した。
Figure 0004332163
それらの4つのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせて、以下に示す二本鎖を形成させた。
Figure 0004332163
配列番号39[同一直線上のオリゴヌクレオチド1830-52および1830-54]、配列番号40[同一直線上のオリゴヌクレオチド1830-53および1830-55]、および配列番号41[コードされたアミノ酸配列]。
この二本鎖を、センスおよびアンチセンスプライマーとして1830-52および1830-55を使用するPCR反応において増幅した。
該分子のFc部分は、以下のプライマーを使用してFc DNAによるPCR反応において作製した。
Figure 0004332163
オリゴヌクレオチド1830-51および1830-52は24ヌクレオチドの重複を含有し、外部プライマー1216-52および1830-55を使用する第3反応における前記PCR産物の合体によりそれらの2つの遺伝子が適切なリーディングフレームで互いに融合するのを可能にする。
最終的なPCR遺伝子産物（完全長融合遺伝子）を制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびBamHIで消化し、ついで、同様にXbaIおよびBamHIで消化されたベクターpAMG21（後記を参照されたい）内に連結させる。連結DNAを大腸菌（E. coli）株2596（後記のGM221）のコンピテント宿主細胞内に形質転換する。組換えタンパク質産物を産生する能力に関して、および正しいヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を有する能力に関して、クローンをスクリーニングした。タンパク質発現レベルを、50ml振とうフラスコ研究から測定した。クーマシー染色PAGEゲルにより、該融合体の発現に関して全細胞ライセートを分析した。
該融合タンパク質のアミノ酸配列を、対応するヌクレオチド配列の下に示す。
Figure 0004332163
配列番号44[前記において5'→3'で読取られる一本鎖]、配列番号45[前記において3'→5'で読取られる一本鎖]および配列番号46[コードされるアミノ酸配列]。
pAMG21 発現プラスミドpAMG21は、受託番号98113でATCCから入手可能である（1996年7月24日に受託されている）。
GM221（Amgen宿主株#2596） Amgen宿主株#2596は、初期ebg領域内の温度感受性ラムダリプレッサーcI857s7と後記ebg領域内のlacIQリプレッサー（68分）との両方を含有するように修飾された大腸菌（E. coli）K-12株である。これらの2つのリプレッサー遺伝子の存在は、種々の発現系でのこの宿主の使用を可能にするが、これらのリプレッサーは共に、luxPRからの発現には無関係である。該未形質転換宿主は、抗生物質耐性を有さない。
cI857s7遺伝子のリボソーム結合部位は、増強されたRBSを含むように修飾されている。それは、介入ebg配列の欠失を伴うGenbank受託番号M64441Gb_Baの番号づけでヌクレオチド部位1170と1411との間のebgオペロン内に挿入されている。
F'tet/393内へのMMebg-cI857s7増強RBS#4と称される組換えファージを使用して、該構築物を染色体に運搬した。組換えおよび切開の後、前記の染色体インサートだけが該細胞内に残存する。それをF'tet/GM101と改名した。
ついで、介在ebg配列の欠失を伴うGenbank受託番号M64441Gb_Baの番号づけでヌクレオチド2493位と2937位との間のebgオペロン内へのlacIQ構築物の運搬により、F'tet/GM101を修飾した。
F'tet/GM101内へのAGebg-LacIQ#5と称される組換えファージを使用して、該構築物を染色体に運搬した。組換えおよび切開の後、前記の染色体インサートだけが該細胞内に残存する。それをF'tet/GM221と改名した。LB中で25μg/mlの濃度のアクリジンオレンジを使用して該F'tetエピソームを該株から除去した。その除去された株をテトラサイクリン感受性と同定し、GM221として保存した。
プラスミドpAMG21中に含まれ従って宿主株GM221に含まれるFc融合構築物（本発明ではpAMG21-Fc-TMP-TMPと称される）は、ATCCに受託番号98957で1998年10月22日付けで寄託されている。
発現．50μg/mlカナマイシンを含有するルリアブロス培地内の大腸菌（E. coli）GM221におけるpAMG21-Fc-TMP-TMPの培養物を、誘導前に37℃でインキュベートした。luxPRプロモーターからのFc-TMP-TMP遺伝子産物の発現の誘導は、該培地に合成自己誘導物質N-(3-オキソヘキサノイル)-DL-ホモセリンラクトンを最終濃度20ng/mlまで加えた後に達成され、培養を37℃で更に3時間インキュベートした。3時間後、該細菌培養を封入体の存在に関して顕微鏡検査し、ついで遠心分離により集めた。誘導された培養内で光屈折封入体が観察された。このことは、Fc-TMP-TMPが、十中八九、大腸菌（E. coli）中の不溶性画分中で産生されたことを示している。細胞ペレットを、10％β-メルカプトエタノールを含有するLaemmliサンプルバッファーへの再懸濁により直接的に溶菌し、SDS-PAGEにより分析した。約30kDaの強いクーマシー染色バンドがSDS-PAGEゲル上で観察された。予想される遺伝子産物は269アミノ酸長であり、約29.5kDaの推定分子量を有する。また、10Lスケールの標準的なバッチ条件下で発酵を行ったところ、ベンチスケールの場合と同様のFc-TMP-TMPの発現レベルが得られた。
Fc-TMP-TMPの精製 細胞を高圧ホモジナイゼーション（14,000 PSIで2回）により水（1/10）中で破壊し、封入体を遠心分離（J-６B中、4200 RPMで1時間）により回収した。封入体を、6Mグアニジン、50mM Tris、8mM DTT（pH8.7）中、1/10の比率で1時間可溶化した。該可溶化混合物を2M尿素、50mM Tris、160mMアルギニン、3mMシステイン（pH8.5）中に20倍希釈した。該混合物を冷所で一晩攪拌した。該操作のこの時点で、該Fc-TMP-TMP単量体サブユニットは二量体形成して、図６Ｃに示す構造を有するジスルフィド連結化合物を与えた。ついでそれを限外濾過により約10倍濃縮した。ついでそれを10mM Tris、1.5M尿素（pH9）で3倍希釈した。ついでこの混合物のpHを酢酸でpH5に調節した。該沈殿物を遠心
分離により除去し、該上清を、20mM NaAc、100mM NaCl（pH5）で平衡化されたSP-Sepharose Fast Flowカラム上にローディングした（10mg/mlのタンパク質のローディング、室温）。100mM NaClから500mM NaClの範囲の同じバッファー中の20カラム容積の勾配を用いて、該タンパク質を溶出した。該カラムからのプールを3倍希釈し、20mM NaAc、100mM NaCl（pH5）中のSP-Sepharose HPカラム上にローディングした（10mg/mlのタンパク質のローディング、室温）。150mM NaClから400mM NaClの範囲の同じバッファー中の20カラム容積の勾配を用いて、該タンパク質を溶出した。該ピークをプールし、濾過した。
III．以下は、本発明の種々の化合物に関するマウスにおけるインビボデータの要約である。
マウス．約10〜12週齢の正常な雌BDF1。
採血スケジュール．10匹/群のマウスを第0日に処理した（合計20匹/群のマウスの2群について、それを4日間隔で開始した）。5匹のマウスから各時点で採血し、1週間につき少なくとも3回、マウスから採血した。マウスをイソフランで麻酔し、眼窩洞の穿刺により合計容積140〜160μlの血液を得た。マウス血液用のソフトウェアを処理するTechnicon H1E血液分析器上で、血液をカウントした。測定パラメーターは、白血球、赤血球、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板、好中球であった。
処理．マウスに、ボーラス処理用に皮下注射するか、または連続運搬用に7日間の微小浸透ポンプ（micro-osmotic pumps）を移植した。皮下注射は0.2mlの容積で行った。浸透ポンプは、麻酔したマウスの肩甲骨間の皮膚に施した皮下切開内に挿入した。化合物を、0.1％BSAを含有するPBS中で希釈した。すべての実験には、この希釈剤だけで処理した「担体」と表示される1つの対照群を含めた。該ポンプ内の試験物質の濃度は、該ポンプからの較正（calibrated）流量が、グラフに示される処理レベルを与えるように調節した。
化合物．一定用量力価の該化合物を、7日間の微小浸透ポンプ内のマウスに運搬した。マウスを7日間の浸透ポンプにおいて100μg/kgの1回量の種々の化合物で処理した。ついで、同じ化合物のいくつかを、単一のボーラス注射としてマウスに投与した。
活性試験の結果．該活性実験の結果を図４および５に示す。7日間の微小浸透ポンプを使用する用量反応アッセイにおいて（データは示していない）、配列番号18の化合物に関して100μg/kg/日で最大効果が認められ、10μg/kg/日の用量は最大活性の約50％であり、1μg/kg/日は、このアッセイ系で活性が認められた最低の用量であった。10μg/kg/日の用量の化合物は、同じ実験における100μg/kg/日の非ペジル化rHu-MGDFとほぼ同等に活性であった。
IV．考察 MGDFはヒト成長ホルモン（hGH）と同様に作用することが、十分に受け入れられている。すなわち、該タンパク質リガンドの1分子は該受容体の2分子に結合して、その活性化をもたらす（Well, J.A.ら, Ann. Rev. Biochem. 65:609-634 (1996)）。この相互作用は、それよりはるかに小さなTMPペプチドの作用により模倣される。しかしながら、本研究は、この模倣が2つのTMP分子の協奏作用を要すると示唆している。なぜなら、C-C平行的またはC-N逐次的なTMPの共有的二量体形成は、元の単量体のインビトロ生物学的効力を103倍以上増加させたからである。該単量体の比較的低い生物作用能は、おそらく、非共有性二量体の非効率的な形成によるものであろう。予め形成された共有性二量体は、小さな14残基のペプチドの2つの分子間の弱い非共有相互作用により専ら駆動される非共有性二量体の形成のためのエントロピー障壁を排除しうる。
縦列二量体のほとんどがC末端平行二量体より強力であることに注目することは興味深
いことである。縦列二量体形成は、C-C平行二量体形成の場合より良好な適合（fit）コンホメーションを該分子に与えるらしい。縦列二量体の見掛け上の非対称性が、それを、2つの同一受容体分子に結合するのに2つの異なる部位を非対称分子として利用する天然リガンドに、より近づけたのかもしれない。
PEG部分の導入は、該修飾ペプチドをタンパク質分解に対して防御することにより及び腎臓濾過によるそのクリアランスを減速することにより、該修飾ペプチドのインビボ活性を増強すると予想された。ペジル化が、細胞に基づく増殖アッセイにおける縦列二量体TMPペプチドのインビトロ生物活性を更に増加しうることは予想外であった。
V．以下は、本発明の種々の化合物に関するサルにおけるインビボデータの要約である。
皮下投与によるAMP2の投与に関連した雌アカゲザルにおける造血パラメーターを評価するために、以下のプロトコールを設計し、実施した。それぞれ3匹のサルの5群をつくった。第1群は対照として用い、AMP2もペジル化組換えヒトMGDF（PEG-rHuMGDF）も含有しない酢酸塩バッファー（20mM酢酸ナトリウム、0.25mM塩化ナトリウム、pH5）を該群に投与した。第2群には、AMP2を後記の間隔で1回以上投与した。第3群には、1000μg/kgのAMP2を後記の間隔で投与した。第4群には、5000μg/kgのAMP2を後記の間隔で投与した。第5群には、100μg/kgのPEG-rHuMGDFを後記の間隔で投与した。
最初の1回量を投与した日をサイクル1の第0日と定めた。サイクル2においては、第21、23、25、28、30および32日に投与を行った。サイクル3中には、第84日に1回量を投与し、サイクル４では第123日に1回量を投与した。順化期間中に1日1回、投与日に1日3回（投与前、投与の直後から30分後まで、投与の2〜3時間後）、および投与を行わなかった日は1日1回、臨床的徴候に関して動物を観察した。投与期間の開始の7日前から回復（recovery）期間の終わりまで、与えた食物片の数および各動物が食べ残した数に基づき、食物の消費を毎日計算した。各動物の体重を、投与計画の開始前に2回および投与および回復期間中に2回測定した。血液学的検査用の血液サンプルを、投与の開始前に1回、および第1、3、5、7、9、11、13、15、20、22、24、26、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、55、62、69、76、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、111、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、150日に1回、調製した。薬物動態学的分析のために、投与前に1回および投与の1、4および24時間後に1回、0.5mlの血清サンプルを集めた。サンプルを、第0、21、32、84および123日に集め、分析するまで約-70℃で保存した。抗体分析用に、2mlの血液サンプルを、1回の投与の1週間前および第0（投与前）、6、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、97、104、111、118、129、136、143および150日に集めた。分析するまで、サンプルを-70℃で保存した。
結果は、血小板の値がすべての処理群において増加したことを示しており、最大の増加はPEG-rHuMGDFおよび高用量AMP2群において認められた。サイクル1においては、血小板のピーク値は、PEG-rHuMGDF群（第9日）および5000μg/kgのAMP2群（第9日）においては、対照群の平均血小板数と比較してそれぞれ約3.3倍および3.1倍増加した。低用量AMP2の血小板値は、定められた同じ研究日において対照より約1.5倍高く増加した。同様の応答が他のすべてのサイクルにおいて認められた。
しかしながら、サイクル4においては、PEG-rHuMGDF群は、前のサイクルと同程度には大きな血小板数の増加を示さなかった。PEG-rHuMGDF群は、このサイクルの投与の9日後に、対照群の場合の約2倍の血小板数の増加を示している。比較のために、サイクル4の最高用量AMP2群における平均血小板数は対照群より3.3倍高かった。また、PEG-rHuMGDF動物は、サイクル4の開始時においては対照群の平均血小板数より53％低い平均血小板数を有し（1
回の投与当たり）、サイクル4の終了時（投与の27日後）における該群の平均血小板数は、対照群のものより79％低かった。すべてのAMP2動物において、サイクル4の開始および終了時の平均血小板数は対照群の血小板数の±15％であった。
サイクル1および2においては、全ての処理群で、対照と比較して赤血球（RBC）数の減少の傾向が認められた。該減少は第41〜43日で最も顕著であり、RBCの最大の減少はPEG-rHuMGDF群で認められた。これらの数は、早くも第47日に正常レベルに戻り始めた（対照との比較）。サイクル1および2中の白血球（WBC）レベルは、第35日に、対照と比較して劇的に増加（2.6倍）した。5000μg/kg AMP2群においては、第33日に、若干の増加が認められた。値は、第37日に、正常（対照）レベルに向かい始めた。サイクル3においては同様の応答が認められたが、サイクル4においては、いずれの処理群においても、WBCの見掛け上の変化は認められなかった。
サイクル3中、500μg/kg AMP2群を除くすべての処理群において、RBC数が第13日（サイクル3の1回の投与の後）までに若干減少した。RBC値は、第17日までに正常レベルに戻り始めた（対照との比較）。
サイクル4においては、500μg/kg AMP2群を除くすべての処理群において、対照と比較してRBC数が減少した。その他のサイクルとは異なり、このサイクルにおいては2以上のどん底状態が存在した。これらの減少は、投与の第1〜9日後に現われ、早くも第11日に回復し始めた。
これらの結果は、試験したすべてのサイクルにおけるすべての処理動物において、対照動物の血小板数を超える血小板数の増加が投与の7〜9日後に検出されうることを示した。反復投与期は、単回投与期と比較して、血小板産生における高い応答を引き起こすようであった。サイクル4では、PEG-rHuMGDF群により惹起された血小板応答は、先行するサイクルと比較して及び高用量AMP2応答の場合と比較して低かった。ほとんどの処理群において、サイクル1、2、3および4でRBC数の減少が認められたが、該研究の各サイクル中の或る時点において、投与を中止した後は、すべての血液学的パラメーターは正常レベルに戻った。
総合すると、これらの結果は、アカゲザルがAMP2での治療に十分に耐えること、およびAMP2が種々の治療サイクルの後に血小板数の増加をもたらすことを示した。血小板数の結果に基づけば、AMP2に対する生物学的に有意な免疫媒介応答は生じなかったようである。これとは対照的に、種々のサイクルにおけるPEG-rHuMGDFでの治療は、サイクル4までに血小板応答の抑制を示した。このことは、PEG-rHuMGDFに対する抗体が産生され、これらの抗MGDF抗体が内因性アカゲザルTPOと交差反応している可能性があることを示唆している。
以上で本発明は十分に説明されているが、本明細書に記載の本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に多数の変更および修飾を施しうることが当業者に明らかであろう。
独占的な所有権または特権が請求される本発明の実施形態が、特許請求の範囲に定められている。
ヒトIgG1の典型的なFcポリヌクレオチドおよびタンパク質配列を示す。 ペジル化（pegylated）ペプチド19（配列番号17）の製造のための合成スキームを示す。 ペジル化ペプチド20（配列番号18）の製造のための合成スキームを示す。 マウスにおいてインビボで生成した血小板の数を示す。 正常なBDF1マウスにおいてインビボで生成した血小板の数を示す。 本発明の好ましい化合物の概要図を示す。Fc部分がTMP二量体のN末端で融合している及びFc部分が単量体（一本鎖）形態であるFc融合化合物を示す。 本発明の好ましい化合物の概要図を示す。Fc領域がTMP二量体のN末端で融合している及びFc部分が二量体であり一方のFc単量体がTMP二量体に結合しているFc融合化合物を示す。 本発明の好ましい化合物の概要図を示す。Fc部分がTMP二量体のN末端で融合している及びFc部分が二量体であり各Fc単量体がTMP二量体に結合しているFc融合化合物を示す。

Claims (9)

  1. mpl受容体に結合する、以下の構造を含む化合物またはその生理的に許容される塩と、医薬上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
    TMP-L-TMP
    [式中、TMPは配列番号１に記載のアミノ酸配列からなり、
    Lは、以下の(a)〜(f)のいずれか一つからなる。
    (a) (Gly)y（式中、yは1〜14）
    (b) 配列番号６に記載のアミノ酸配列
    (c) 配列番号７に記載のアミノ酸配列
    (d) 配列番号８に記載のアミノ酸配列
    (e) (Gly)3Lys(PEG)(Gly)4
    (f) (Gly)3Cys(PEG)(Gly)4]
  2. TMP-L-TMPが配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. TMP-L-TMPのN末端側およびC末端側のいずれかに、リンカーを介して免疫グロブリンFc領域が結合しており、該リンカーは、Yx（式中、Yは、天然に存在するアミノ酸またはその立体異性体であり、xは1〜20である）、 (Gly)z（式中、zは1〜20であり、zが1より大きい場合は、該Gly残基の半分までが、残りの19個の天然アミノ酸またはそれらの立体異性体から選ばれる別のアミノ酸で置換されていてもよい）、 (Gly)3Lys(Gly)4（配列番号6）、 (Gly)3AsnGlySer(Gly)2（配列番号7）、 (Gly)3Cys(Gly)4（配列番号8）、 GlyProAsnGly（配列番号9）、 Cys残基、および (CH2)s（式中、sは1〜20である）よりなるリンカー群から選ばれるリンカー基である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 前記リンカーが、(Gly)z（式中、zは1〜20であり、zが1より大きい場合は、該Gly残基の半分までが、残りの19個の天然アミノ酸またはそれらの立体異性体から選ばれる別のアミノ酸で置換されていてもよい）である、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 前記リンカーが、１〜２０のグリシン残基からなるポリグリシンリンカーである、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. TMP-L-TMPのN末端側に、リンカーを介して免疫グロブリンFc領域が結合している、請求項３〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 前記化合物が、配列番号４６に記載のアミノ酸配列からなる化合物である、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 前記化合物が二量体を形成している、請求項３〜７のいずれか一項に記載
    の医薬組成物。
  9. 巨核球または血小板を増加させる必要がある患者において巨核球または血小板を増加させるための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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