JP2003512011A - 治療薬としての修飾ペプチド - Google Patents

治療薬としての修飾ペプチド

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｆｃドメインと生物学的活性なペプチドの融合及び生物学的に活性なペプチドを使用して薬剤を製造するための方法に関する。本発明では、ａ）対象とするタンパク質の活性を変化させる少なくとも１個のペプチドを選択し、そしてｂ）選択したペプチドの少なくとも１個のアミノ酸に共有結合されたＦｃドメインを含む薬理学的物質を調製する、ことを含む工程によって薬理学的活性な化合物を製造する。ビヒクルへの結合は、さもなければインビボで速やかに分解されるであろうペプチドの半減期を高める。好ましいビヒクルはＦｃドメインである。ペプチドは、好ましくはファージディスプレイ、大腸菌ディスプレイ、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、又は化学物質−ペプチドスクリーニングによって選択される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 組換えタンパク質は最近出現してきた治療薬のクラスのひとつである。かかる
組換え治療は、タンパク質の生成と化学修飾における進歩をもたらした。そのよ
うな修飾は、主としてタンパク質分解酵素への接触を遮断することにより、治療
タンパク質を保護することができる。タンパク質の修飾はまた、治療タンパク質
の安定性、循環時間及び生物活性を高めることもできる。タンパク質修飾と融合
タンパク質を述べた総説論文が、参照してここに組み込まれる、Ｆｒａｎｃｉｓ
（１９９２）、成長因子への注目（Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔ
ｏｒｓ）、３：４−１０（Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ，Ｌｏｎｄｏｎ）である。
【０００２】 １つの有用な修飾は、抗体の「Ｆｃ」ドメインとの組合せである。抗体は２つ
の機能的に独立した部分、すなわち抗原に結合する、「Ｆａｂ」として知られる
可変領域と、食細胞による補体活性化と攻撃の際にそのようなエフェクター機能
と結合する、「Ｆｃ」として知られる定常領域を含む。Ｆｃは長い血清半減期を
持つのに対し、Ｆａｂは短命である。Ｃａｐｏｎら（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ
３３７：５２５−３１。治療タンパク質と共に構築すると、Ｆｃドメインはよ
り長い半減期を提供する、若しくはＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体固
定、さらにはおそらく胎盤移動のような機能も組み込むことができる。同上。表
１は当技術において既知のＦｃ融合の使用をまとめたものである。
【０００３】
【表１】
【０００４】 治療薬の開発のための全く異なるアプローチがペプチドライブラリーのスクリ
ーニングである。タンパク質リガンドとその受容体の相互作用はしばしば比較的
大きな界面で起こる。しかし、ヒト成長ホルモンとその受容体に関して明らかに
されたように、界面のいくつかの鍵となる残基だけが結合エネルギーの大半に寄
与する、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：３８３−
６。タンパク質リガンドのバルクは単に正しいトポロジーで結合エピトープを発
現するか、若しくは結合には関係しない機能として働く。それ故、「ペプチド」
の長さ（２−４０個のアミノ酸）の分子だけが一定の大きなタンパク質リガンド
の受容体タンパク質に結合することができる。そのようなペプチドは、大タンパ
ク質リガンドの生物活性を擬似する（「ペプチド作用物質」）、若しくは競合的
結合を通して、大タンパク質リガンドの生物活性を阻害する（「ペプチド拮抗物
質」）ことができる。
【０００５】 ファージディスプレイペプチドライブラリーは、そのようなペプチド作用物質
と拮抗物質を同定する強力な方法として出現した。例えば、Ｓｃｏｔｔら（１９
９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０），Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４９：４０４；１９９３年６月２９日発行の米国特許第５，２２
３，４０９号；１９９８年３月３１日発行の米国特許第５，７３３，７３１号；
１９９６年３月１２日発行の米国特許第５，４９８，５３０号；１９９５年７月
１１日発行の米国特許第５，４３２，０１８号；１９９４年８月１６日発行の米
国特許第５，３３，６６５号；１９９９年７月１３日発行の米国特許第５，９２
２，５４５号；１９９６年１２月１９日公開のＷＯ ９６／４０９８７号；及び
１９９８年４月１６日公開のＷＯ ９８／１５８３３号（その各々が参照してこ
こに組み込まれる）参照。そのようなライブラリーにおいては、任意のペプチド
配列が線状ファージのコートタンパク質との融合によって発現される。典型的に
は、発現されたペプチドを受容体の抗体固定された細胞外ドメインに対して親和
溶出する。残ったファージを連続的な親和精製と再増殖によって濃縮してもよい
。最良の結合ペプチドを配列決定して、１つ又はそれ以上の構造的に関連するペ
プチドのファミリー内でキー残基を同定することができる。例えば、２つの異な
るファミリーが同定された、Ｃｗｉｒｌａら（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７６：１６９６−９参照。ペプチド配列はまた、どの残基がアラニンスキャニン
グによって若しくはＤＮＡレベルでの突然変異誘発によって安全に置換できるか
を示唆しうる。突然変異誘発ライブラリーを創造し、スクリーニングして、最良
のバインダーの配列をさらに至適化することができる。Ｌｏｗｍａｎ（１９９７
），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４
０１−２４。
【０００６】 タンパク質−タンパク質相互作用の構造分析も、大タンパク質リガンドの結合
活性を擬似するペプチドを示唆するために使用しうる。そのような分析では、結
晶構造が、ペプチドが設計される大タンパク質リガンドの決定的残基の同一性と
相対的方向性を示唆すると考えられる。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉら（１９９７
），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１２６６−７０参照。これらの分析
法は、結合親和性を高めるためのペプチドのさらなる修飾を示唆しうる、受容体
タンパク質とファージディスプレイによって選択したペプチド間の相互作用を検
討するためにも使用できる。
【０００７】 その他にもペプチド研究においてファージディスプレイに匹敵する方法がある
。ペプチドライブラリーをｌａｃリプレッサーのカルボキシル末端に融合し、大
腸菌において発現することができる。もうひとつの大腸菌に基づく方法は、ペプ
チドグリカン結合リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合により細胞の外膜に発現さ
せる。本文中以下では、これら及び関連する方法を集合的に「大腸菌ディスプレ
イ」と称する。もうひとつの方法では、ランダムＲＮＡの翻訳をリボソーム放出
の前に停止させ、関連ＲＮＡがまだ結合しているポリペプチドのライブラリーを
作製する。本文中以下では、この方法及び関連する方法を集合的に「リボソーム
ディスプレイ」と称する。他の方法は、ＲＮＡへのペプチドの化学結合を用いる
ものである：例えば、ＲｏｂｅｒｔｓとＳｚｏｓｔａｋ（１９９７），Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２２９７−３０３参照。本文
中以下では、この方法及び関連する方法を集合的に「ＲＮＡ−ペプチドスクリー
ニング」と称する。ペプチドがポリエチレンロッド又は溶媒透過性樹脂のような
安定な非生物学的物質上に固定されている、化学的に誘導されたペプチドライブ
ラリーが開発されている。もうひとつの化学的に誘導されるペプチドライブラリ
ーは、写真平板印刷を用いてガラススライド上に固定されたペプチドを走査する
。本文中以下では、これら及び関連する方法を集合的に「化学物質−ペプチドス
クリーニング」と称する。化学物質−ペプチドスクリーニングは、Ｄアミノ酸及
び他の非天然類似体、ならびに非ペプチド要素を使用できるという点で有利であ
ると考えられる。生物学的方法と化学的方法の両方が、ＷｅｌｌｓとＬｏｗｍａ
ｎ（１９９２），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３５５−６
２の中で考察されている。
【０００８】 概念的には、ファージディスプレイや上述したその他の方法を用いてどのよう
なタンパク質のペプチド擬似も発見しうる。これらの方法は、エピトープマッピ
ングのため、タンパク質−タンパク質相互作用における決定的アミノ酸の同定の
ため、そして新しい治療薬発見のための先導役（ｌｅａｄ）として使用されてき
た。例えばＣｏｒｔｅｓｅら（１９９６），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ．７：６１６−２１。現在、エピトープマッピングのような免疫学的試験にお
いてはペプチドライブラリーが最も多く用いられている。Ｋｒｅｅｇｅｒ（１９
９６），Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ １０（１３）：１９−２０。
【０００９】 ここで特に興味深いのは、薬理学的に活性なペプチドの発見におけるペプチド
ライブラリー及びその他の手法の使用である。当技術において同定されたそのよ
うなペプチドのいくつかを表２に要約する。ペプチドは列挙した公表文献中に記
載されており、その各々が参照してここに組み込まれる。ペプチドの薬理学的活
性を記述し、且つ多くの場合括弧内にその略語を示している。これらのペプチド
の一部は修飾されている（例えば、Ｃ末端架橋二量体を形成するため）。典型的
には、薬理学的に活性なタンパク質の受容体（例えばＥＰＯ受容体）への結合に
関してペプチドライブラリーをスクリーニングした。少なくとも１つの場合には
、モノクローナル抗体への結合に関してペプチドライブラリーをスクリーニング
した。
【００１０】
【表２】
【００１１】 ペプチドライブラリーのスクリーニングによって同定されたペプチドは治療薬
そのものではなく、治療薬の開発における「先導役（ｌｅａｄ）」とみなされて
きた。他のタンパク質やペプチドと同様に、それらは腎濾過、細網内皮系におけ
る細胞クリアランス機序、又はタンパク質分解のいずれかによってインビボで速
やかに除去されるであろう。Ｆｒａｎｃｉｓ（１９９２）、成長因子への注目（
Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ） ３：４−１１。結果とし
て、当技術は現在、同定されたペプチドを、薬剤標的を確認するため、又は化学
的ライブラリースクリーニングではそれほど容易に又はそれほど速やかに同定さ
れなかったであろう有機化合物の設計のための足場として使用している。Ｌｏｗ
ｍａｎ（１９９７），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒ
ｕｃｔ．２６：４０１−２４；Ｋａｙら（１９９８），Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔ
ｏｄａｙ ３：３７０−８。当技術は、そのようなペプチドが治療薬をより速や
かに生み出すことができる方法から恩恵を受けるであろう。
【００１２】 発明の要旨 本発明は、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）との融合により、１つ又はそれ以上の
生物学的に活性なペプチドのインビボ半減期を延長させる方法に関する。本発明
では、薬理学的に活性な化合物を： ａ）対象とするタンパク質の活性を変化させる少なくとも１個のペプチドを選
択し、そして ｂ）選択したペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列に共有結合された少な
くとも１つのビヒクルを含む薬理学的物質を調製する ことを含む方法によって調製する。好ましいビヒクルはＦｃドメインである。ス
テップ（ａ）でスクリーニングしたペプチドを、好ましくはファージディスプレ
イライブラリーにおいて発現させる。ビヒクルとペプチドは、下記でさらに述べ
るように、ペプチド又はビヒクルのＮ又はＣ末端を通して結合しうる。上記化合
物の誘導体（下記に述べる）も本発明に包含される。
【００１３】 本発明の化合物は、標準的合成法、組換えＤＮＡ手法、又はペプチド及び融合
タンパク質を調製する他のなんらかの方法によって調製しうる。非ペプチド部分
を含む本発明の化合物は、適用しうる場合は標準的なペプチド化学反応に加えて
、標準的有機化学反応によって合成しうる。
【００１４】 期待される主たる用途は治療又は予防薬としてである。ビヒクル結合ペプチド
は、ペプチドによって擬似される天然リガンドと同等、あるいはさらにそれ以上
の活性を持つと考えられる。さらに、一部の天然リガンドベースの治療薬は患者
自身の内因性リガンドに対する抗体を誘導しうる；ビヒクル結合ペプチドは、天
然リガンドとほとんど又は典型的には全く配列同一性を持たないため、この問題
を回避する。
【００１５】 主に治療薬として想定されるが、本発明の化合物はまた、そのような薬剤のス
クリーニングにおいても有用であると考えられる。例えば、抗Ｆｃ被覆プレート
を用いるアッセイにおいてＦｃペプチド（例えば、Ｆｃ−ＳＨ２ドメインペプチ
ド）が使用できるであろう。ビヒクル、特にＦｃは、不溶性ペプチドを可溶性に
することができ、それ故多くのアッセイにおいて有用である。
【００１６】 本発明の化合物は、適当な製薬上のキャリア物質と共に製剤し、その必要のあ
るヒト（あるいは他の哺乳類）などの患者に有効量を投与することにより、治療
又は予防目的に使用しうる。他の関連する態様も本発明に包含される。
【００１７】 図面と発明の詳細な説明を検討することにより、本発明の数多くの追加的態様
と利点が明らかになるであろう。
【００１８】 図面の簡単な説明 図１は、本発明の例示的方法の概要図を示す。この好ましい方法では、ビヒク
ルはＦｃドメインであり、それがＦｃドメインとペプチドの両方をコードするＤ
ＮＡ構築物からの発現によってペプチドに共有結合する。図１に示すように、Ｆ
ｃドメインはこの方法において自発的に二量体を形成する。
【００１９】 図２は、ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ
」は、ここでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体
を表わす。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリン
カー−ペプチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである： Ａ、Ｄ：一重ジスルフィド結合二量体。ＩｇＧ１抗体は、典型的には定常領域
と可変領域の間のちょうつがい部位に２個のジスルフィド結合を持つ。図２Ａと
２ＤにおけるＦｃドメインは、２個のジスルフィド結合部位間の切断によって、
若しくは非反応性残基（例えばアラニル）によるシステイニル残基の置換によっ
て形成されうる。図２ＡではＦｃドメインはペプチドのアミノ末端で結合してお
り、２Ｄではカルボキシル末端で結合している。
【００２０】 Ｂ、Ｅ：二重ジスルフィド結合二量体。このＦｃドメインは、Ｆｃドメイン鎖
中の両方のシステイニル残基を保持するように親抗体を切断することによって、
若しくはそのようなＦｃドメインをコードする配列を含む構築物からの発現によ
って形成されうる。図２ＢではＦｃドメインはペプチドのアミノ末端で結合して
おり、２Ｅではカルボキシル末端で結合している。
【００２１】 Ｃ、Ｆ：非共有結合二量体。このＦｃドメインは、切断又は置換によるシステ
イニル残基の除去によって形成されうる。当該システイニル残基と宿主細胞中に
存在する他のタンパク質のシステイニル残基の反応によって不純物が形成される
のを避けるため、システイニル残基を除去することが所望される場合がある。Ｆ
ｃドメインの非共有結合は二量体を結びつけるのに十分である。異なる種類の抗
体（例えばＩｇＧ２、ＩｇＭ）から誘導したＦｃドメインを使用することにより
、他の二量体を形成することができる。
【００２２】 図３は、薬理学的に活性なペプチドのタンデムリピートを特徴とする、本発明
の好ましい化合物の構造を示す。図３Ａは一本鎖の分子を示し、またかかる分子
に関するＤＮＡ構築物も表わしうる。図３Ｂは、リンカー−ペプチド部分が二量
体の１本の鎖にだけ存在する二量体を示す。図３Ｃは、両方の鎖上にペプチド部
分を持つ二量体を示す。図３Ｃの二量体は、図３Ａに示す一本鎖をコードするＤ
ＮＡ構築物の発現の際に一部の宿主細胞において自発的に形成される。他の宿主
細胞では、細胞を二量体の形成を促進する条件下に置くか、若しくは二量体をイ
ンビトロで形成することができる。
【００２３】 図４は、本発明において使用しうるヒトＩｇＧ１ Ｆｃの例示的核酸及びアミ
ノ酸配列（それぞれ配列番号１及び２）を示す。
【００２４】 図５は、ＰＥＧ化ペプチド１９（配列番号３）の製造のための合成概要図を示
す。
【００２５】 図６は、ＰＥＧ化ペプチド２０（配列番号４）の製造のための合成概要図を示
す。
【００２６】 図７は、下記の実施例２において「Ｆｃ−ＴＭＰ」として同定される分子のヌ
クレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号５及び６）を示す。
【００２７】 図８は、下記の実施例２において「Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰ」として同定される
分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号７及び８）を示す。
【００２８】 図９は、下記の実施例２において「ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃ」として同定される
分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号９及び１０）を示す。
【００２９】 図１０は、下記の実施例２において「ＴＭＰ−Ｆｃ」として同定される分子の
ヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１１及び１２）を示す。
【００３０】 図１１は、次のように定義される条件下で、種々の化合物の１００μｇ／ｋｇ
の単回ボーラス注射によって処置した正常雌性ＢＤＦ１マウスにおいてインビボ
で生成される血小板数を示す。
【００３１】 ＰＥＧ−ＭＧＤＦ：大腸菌において発現される（従ってグリコシル化されてい
ない）、還元的アミノ化によって天然ヒトＴＰＯのアミノ酸１−１６３のＮ末端
アミノ基に連結した平均分子量２０ｋＤのＰＥＧ、 ＴＭＰ：アミノ酸配列、ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ（配列番号１３）を持
つＴＰＯ擬似ペプチド、 ＴＭＰ−ＴＭＰ：アミノ酸配列、ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ−ＧＧＧＧＧ
ＧＧＧ−ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ（配列番号１４）を持つＴＰＯ擬似ペプ
チド、 ＰＥＧ−ＴＭＰ−ＴＭＰ：ＰＥＧ基が図６に示すような平均分子量５ｋＤのＰ
ＥＧである、配列番号１４のペプチド、 Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰ：同一の第二モノマーで二量体化された（すなわち、図
２に示すように、Ｃｙｓ残基７と１０が第二モノマー中の対応するＣｙｓ残基に
結合して二量体を形成する）配列番号８（図８）の化合物、そして ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃは、ＦｃドメインがＴＭＰ−ＴＭＰペプチドのＮ末端で
はなくＣ末端で結合していることを除いて、ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃと同じように
二量体化された配列番号１０（図９）の化合物である。
【００３２】 図１２は、移植した浸透圧ポンプを通して送達される種々の化合物で７日間に
わたって処置した正常ＢＤＦ１マウスにおいて、インビボで生成された血小板の
数を示す。化合物は図７について定義されたとおりである。
【００３３】 図１３は、下記の実施例３において「Ｆｃ−ＥＭＰ」として同定される分子の
ヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１５及び１６）を示す。
【００３４】 図１４は、下記の実施例３において「ＥＭＰ−Ｆｃ」として同定される分子の
ヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１７及び１８）を示す。
【００３５】 図１５は、下記の実施例３において「ＥＭＰ−ＥＭＰ−Ｆｃ」として同定され
る分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１９及び２０）を示
す。
【００３６】 図１６は、下記の実施例３において「Ｆｃ−ＥＭＰ−ＥＭＰ」として同定され
る分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号２１及び２２）を示
す。
【００３７】 図１７Ａと１７Ｂは、発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣアクセス番号９
８１１３）を形成するためにユニークＡａｔＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６中４３６４
位）とＳａｃＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６中４５８５位）制限部位の間に挿入される
ＤＮＡ配列（配列番号２３）を示す。
【００３８】 図１８Ａは、種々の化合物の１００μｇ／ｋｇの単回ボーラス注射によって処
置した正常雌性ＢＤＦ１マウスにおいてインビボで生成されるヘモグロビン、赤
血球及びヘマトクリットを示す。図１８Ｂは、ＥＭＰに関しては１００μｇ／ｋ
ｇ、ｒｈＥＰＯに関しては３０Ｕ／マウスで送達される微小浸透圧ポンプにより
７日間にわたって１００μｇ／ｋｇ／日で処置したマウスについての同じ結果を
示す。（両方の実験において、好中球、リンパ球及び血小板は影響を受けなかっ
た。）これらの図において、用語は次のように定義される。
【００３９】 Ｆｃ−ＥＭＰ：同一の第二モノマーで二量体化された（すなわち、図２に示す
ように、Ｃｙｓ残基７と１０が第二モノマー中の対応するＣｙｓ残基に結合して
二量体を形成する）配列番号１６（図１３）の化合物、 ＥＭＰ−Ｆｃは、ＦｃドメインがＥＭＰペプチドのＮ末端ではなくＣ末端で結
合していることを除いて、Ｆｃ−ＥＭＰと同じように二量体化された配列番号１
８（図１４）の化合物。
【００４０】 「ＥＭＰ−ＥＭＰ−Ｆｃ」は、ペプチドのカルボキシル末端により同じＦｃド
メインに結合された同じペプチド（配列番号２０）のタンデムリピートを指す。
「Ｆｃ−ＥＭＰ−ＥＭＰ」は、同じペプチドのタンデムリピートであるが、同じ
Ｆｃドメインがタンデムリピートのアミノ末端で結合しているものを指す。すべ
ての分子は大腸菌において発現され、従ってグリコシル化されていない。
【００４１】 図１９Ａと１９Ｂは、下記の実施例４で述べるＦｃ−ＴＮＦ−α阻害因子融合
分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０５５及び１０５６）を示す
。
【００４２】 図２０Ａと２０Ｂは、下記の実施例４で述べるＴＮＦ−α阻害因子−Ｆｃ融合
分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０５７及び１０５８）を示す
。
【００４３】 図２１Ａと２１Ｂは、下記の実施例５で述べるＦｃ−ＩＬ−１拮抗物質融合分
子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０５９及び１０６０）を示す。
【００４４】 図２２Ａと２２Ｂは、下記の実施例５で述べるＩＬ−１拮抗物質−Ｆｃ融合分
子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６１及び１０６２）を示す。
【００４５】 図２３Ａ、２３Ｂ及び２３Ｃは、下記の実施例６で述べるＦｃ−ＶＥＧＦ拮抗
物質融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６３及び１０６４
）を示す。
【００４６】 図２４Ａと２４Ｂは、下記の実施例６で述べるＶＥＧＦ拮抗物質−Ｆｃ融合分
子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６５及び１０６６）を示す。
【００４７】 図２５Ａと２５Ｂは、下記の実施例７で述べるＦｃ−ＭＭＰ阻害因子融合分子
のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６７及び１０６８）を示す。
【００４８】 図２６Ａと２６Ｂは、下記の実施例７で述べるＭＭＰ阻害因子−Ｆｃ融合分子
のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６９及び１０７０）を示す。
【００４９】 発明の詳細な説明 用語の定義 この明細書を通じて使用される用語は、特定の場合に限って異なる記載がない
かぎり、下記のように定義される。
【００５０】 「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、化合物が所与の配列のＮ又
はＣ末端のいずれか又は両方に付加的なアミノ酸を含みうることを意味する。言
うまでもなく、これらの付加的なアミノ酸は化合物の活性に有意に干渉してはな
らない。
【００５１】 「ビヒクル」（ｖｅｈｉｃｌｅ）という用語は、治療タンパク質の分解を妨げ
る及び／又は半減期を延長させる、毒性を低下させる、免疫原性を低下させる、
若しくは生物活性を高める分子を指す。例示的なビヒクルは、Ｆｃドメイン（好
ましい）ならびに線状ポリマー（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポ
リリシン、デキストラン等）；分枝ポリマー（例えば、１９８１年９月１５日発
行のＤｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒらへの米国特許第４，２８９，８７２号；１９９
３年７月２０日発行のＴａｍへの同第５，２２９，４９０号；１９９３年１０月
２８日公開のＦｒｅｃｈｅｔらによるＷＯ ９３／２１２５９号参照）；脂質；
コレステロール群（ステロイドなど）；炭水化物又はオリゴ糖；あるいはサルベ
ージ受容体に結合する天然又は合成タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを含
む。ビヒクルは下記でさらに詳述する。
【００５２】 「天然Ｆｃ」という用語は、モノマー又はマルチマーの形態の、全抗体の消化
から生じる非抗原結合断片の配列を含む分子又は配列を指す。天然Ｆｃの最初の
免疫グロブリンソースは好ましくはヒト由来であり、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好
ましいが、どのような免疫グロブリンであってもよい。天然Ｆｃは、共有（すな
わちジスルフィド結合）及び非共有結合によって二量体又はマルチマーに連結さ
れうるモノマーポリペプチドから作製される。天然Ｆｃ分子のモノマーサブユニ
ット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｅ）又はサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）
によって１から４の範囲である。天然Ｆｃの１つの例は、ＩｇＧのパパイン消化
から生じるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２），Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１−９参照）。ここで使用す
る「天然Ｆｃ」という用語は、モノマー、二量体及びマルチマー形態の総称名で
ある。
【００５３】 「Ｆｃ変異体」という用語は、天然Ｆｃから改変されているが、まだサルベー
ジ受容体、ＦｃＲｎについての結合部位を含んでいる分子又は配列を指す。国際
特許願ＷＯ ９７／３４６３１号（１９９７年９月２５日公開）及びＷＯ ９６
／３２４７８号は例示的なＦｃ変異体ならびにサルベージ受容体との相互作用を
述べており、参照してここに組み込まれる。従って、「Ｆｃ変異体」という用語
は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）分子又は配列を含
む。さらに、天然Ｆｃは、本発明の融合分子には必要とされない構造的特徴又は
生物活性を提供するので、除去しうる部位を含んでいる。それ故、「Ｆｃ変異体
」という用語は、（１）ジスルフィド結合の形成、（２）選択した宿主細胞との
不適合性、（３）選択宿主細胞において発現される際のＮ末端の異質性、（４）
グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受
容体への結合、あるいは（７）抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に影響する又は
関与する１つ又はそれ以上の天然Ｆｃ部位又は残基を欠く分子又は配列を含む。
Ｆｃ変異体は下記でさらに詳述する。
【００５４】 「Ｆｃドメイン」という用語は、上記で定義したような天然Ｆｃ及びＦｃ変異
体分子及び配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃの場合と同様に、「Ｆｃド
メイン」という用語は、全抗体から消化されるか若しくは他の手段によって産生
される、モノマー又はマルチマー形態の分子を含む。
【００５５】 Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に適用されるとき「マルチマー（多
量体）」という用語は、共有結合、非共有結合、又は共有結合と非共有結合の相
互作用によって連結された２本又はそれ以上のポリペプチド鎖を持つ分子を指す
。ＩｇＧ分子は典型的には二量体を形成する；ＩｇＭはペンタマー（五量体）；
ＩｇＤは二量体；ＩｇＡはモノマー、二量体、トリマー（三量体）又はテトラマ
ー（四量体）を形成する。マルチマーは、Ｆｃの天然Ｉｇソースの配列と生じる
活性を利用することにより、若しくはそのような天然Ｆｃを誘導体化する（下記
に定義する）ことにより、形成されうる。
【００５６】 Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に適用されるとき「二量体」という
用語は、共有結合又は非共有結合によって連結された２本のポリペプチド鎖を持
つ分子を指す。それ故、本発明の範囲内に含まれる例示的二量体は図２に示すと
おりである。
【００５７】 「誘導体化する」及び「誘導体」又は「誘導体化された」という用語は、それ
ぞれ（１）化合物が環状部分を持つ；例えば、化合物内でのシステイニル残基間
の架橋；（２）化合物が架橋結合している又は架橋部位を持つ；例えば、化合物
がシステイニル残基を持ち、従って培養又はインビボにおいて架橋二量体を形成
する；（３）１つ又はそれ以上のペプチジル結合が非ペプチジル結合によって置
換されている；（４）Ｎ末端が−ＮＲＲ１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）
ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシニミド基、ある
いは置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−、［式
中、ＲとＲ１及び環置換基は下記で定義するとおりである］によって置換されて
いる；（５）Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ２又は−ＮＲ３Ｒ４［式中、Ｒ２、Ｒ３及び
Ｒ４は下記で定義するとおりである］によって置換されている；そして（６）個
々のアミノ酸部分が、選択された側鎖又は末端残基と反応することができる物質
での処理を通して修飾されている化合物であるような方法及び生じる化合物を含
む。誘導体は下記でさらに詳述する。
【００５８】 「ペプチド」という用語は、２から４０個のアミノ酸の分子を指し、３から２
０個のアミノ酸の分子が好ましく、６から１５個のアミノ酸の分子が最も好まし
い。例示的ペプチドは、ペプチドライブラリー（例えばファージディスプレイラ
イブラリー）において実施される、上記に引用した方法のいずれかによってラン
ダムに生成するか、若しくはタンパク質の消化によって誘導されうる。
【００５９】 ペプチド配列を指すために使用するときの「ランダム化された」という用語は
、完全にランダムな配列（例えばファージディスプレイライブラリーによって選
択される）及び天然に生じる分子の１個又はそれ以上の残基が、天然に生じる分
子ではその位置に出現しないアミノ酸残基によって置換されている配列を指す。
ペプチド配列を同定するための例示的方法は、ファージディスプレイ、大腸菌（
Ｅ．ｃｏｌｉ）ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＲＮＡ−ペプチドスク
リーニング、化学的スクリーニング等を含む。
【００６０】 「薬理学的に活性な」という用語は、そのように説明される物質が、医学的パ
ラメータ（例えば血圧、血球数、コレステロールレベル）又は疾患状態（例えば
癌、自己免疫疾患）に影響を及ぼす活性を持つことが明らかにされていることを
意味する。従って、薬理学的に活性なペプチドは、下記に定義するような作用性
又は擬似及び拮抗性ペプチドを含む。
【００６１】 「−擬似ペプチド」及び「−作用物質ペプチド」という用語は、対象とするタ
ンパク質と相互作用するタンパク質（例えばＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ）と同
等の生物活性を持つペプチドを指す。これらの語はさらに、対象とするタンパク
質の天然リガンドの作用を増強することによるような、対象タンパク質の活性を
間接的に擬似するペプチドを含む；例えば、表２及び７に列挙したＧ−ＣＳＦ擬
似ペプチド参照。従って、「ＥＰＯ擬似ペプチド」という用語は、Ｗｒｉｇｈｔ
ｏｎら（１９９６），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：４５８−６３，Ｎａｒａｎｄａ
ら（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：７５
６９−７４、若しくはＥＰＯ擬似を取り上げていると同定された表２の他の参考
文献に記述されているように同定する又は誘導することができるいかなるペプチ
ドも含む。当業者には、これらの参考文献の各々により、種々のペプチドライブ
ラリーに関して開示されている手順に従ってその中で実際に開示されている以外
の異なるペプチドを選択しうることは明白である。
【００６２】 「ＴＰＯ擬似ペプチド」という用語は、Ｃｗｉｒｌａら（１９９７），Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７６：１６９６−９、米国特許第５，８６９，４５１号、同第５，
９３２，９４６号、及びＴＰＯ擬似を取り上げていると同定された表２の他の参
考文献、ならびに本願と同日に出願され、参照してここに組み込まれる米国特許
願、「血小板形成性化合物（Ｔｈｒｏｍｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）
に記述されているように同定する又は誘導することができるペプチドを含む。当
業者には、これらの参考文献の各々により、種々のペプチドライブラリーに関し
て開示されている手順に従ってその中で実際に開示されている以外の異なるペプ
チドを選択しうることは明白である。
【００６３】 「Ｇ−ＣＳＦ擬似ペプチド」という用語は、Ｐａｕｋｏｖｉｔｓら（１９８４
），Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６５：３
０３−１１又はＧ−ＣＳＦ擬似を取り上げていると同定された表２の参考文献の
いずれかにおいて同定されうる又は説明されうるペプチドを指す。当業者には、
これらの参考文献の各々により、種々のペプチドライブラリーに関して開示され
ている手順に従ってその中で実際に開示されている以外の異なるペプチドを選択
しうることは明白である。
【００６４】 「ＣＴＬＡ４擬似ペプチド」という用語は、Ｆｕｋｕｍｏｔｏら（１９９８）
，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：２６７−７０において記述されている
ように同定する又は誘導することができるペプチドを指す。当業者には、これら
の参考文献の各々により、種々のペプチドライブラリーに関して開示されている
手順に従ってその中で実際に開示されている以外の異なるペプチドを選択しうる
ことは明白である。
【００６５】 「−拮抗物質ペプチド」又は「阻害因子ペプチド」という用語は、対象とする
関連タンパク質の生物活性を遮断する又はなんらかの方法で生物活性に干渉する
、若しくは対象とする関連タンパク質の既知の拮抗物質又は阻害因子と同等の生
物活性を持つペプチドを指す。従って、「ＴＮＦ拮抗物質ペプチド」という用語
は、Ｔａｋａｓａｋｉら（１９９７），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：
１２６６−７０又はＴＮＦ拮抗物質を取り上げている同定された表２の参考文献
のいずれかにおいて記述されているように同定する又は誘導することができるペ
プチドを含む。当業者には、これらの参考文献の各々により、種々のペプチドラ
イブラリーに関して開示されている手順に従ってその中で実際に開示されている
以外の異なるペプチドを選択しうることは明白である。
【００６６】 「ＩＬ−１拮抗物質」及び「ＩＬ−１ｒａ擬似ペプチド」という用語は、ＩＬ
−１によるＩＬ−１受容体の活性化を阻害する又は下方調節するペプチドを含む
。ＩＬ−１受容体の活性化は、ＩＬ−１、ＩＬ−１受容体及びＩＬ−１受容体補
助タンパク質の間で複合体が形成されることから生じる。ＩＬ−１拮抗物質又は
ＩＬ−１ｒａ擬似ペプチドは、ＩＬ−１、ＩＬ−１受容体又はＩＬ−１受容体補
助タンパク質に結合して、複合体の２つ又は３つの成分間での複合体形成を妨げ
る。例示的なＩＬ−１拮抗物質又はＩＬ−１ｒａ擬似ペプチドは、米国特許第５
，６０８，０３５号、同第５，７８６，３３１号、同第５，８８０，０９６号、
又はＩＬ−１ｒａ擬似又はＩＬ−１拮抗物質ペプチドを取り上げている同定され
た表２の参考文献のいずれかにおいて記述されているように同定する又は誘導す
ることができる。当業者には、これらの参考文献の各々により、種々のペプチド
ライブラリーに関して開示されている手順に従ってその中で実際に開示されてい
る以外の異なるペプチドを選択しうることは明白である。
【００６７】 「ＶＥＧＦ拮抗物質ペプチド」という用語は、Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ（１９
９８），Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：１７７５４−６４、及びＶＥＧＦ拮抗物質ペプ
チドを取り上げていると同定された表２の参考文献のいずれかにおいて記述され
ているように同定する又は誘導することができるペプチドを含む。当業者には、
これらの参考文献の各々により、種々のペプチドライブラリーに関して開示され
ている手順に従ってその中で実際に開示されている以外の異なるペプチドを選択
しうることは明白である。
【００６８】 「ＭＭＰ阻害因子ペプチド」という用語は、Ｋｏｉｖｕｎｅｎ（１９９９），
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：７６８−７４、及びＭＭＰ阻害因子ペプ
チドを取り上げていると同定された表２の参考文献のいずれかにおいて記述され
ているように同定する又は誘導することができるペプチドを含む。当業者には、
これらの参考文献の各々により、種々のペプチドライブラリーに関して開示され
ている手順に従ってその中で実際に開示されている以外の異なるペプチドを選択
しうることは明白である。
【００６９】 さらに、本発明の化合物の生理的に許容される塩もここに包含される。「生理
的に許容される塩」とは、製薬上許容されることが知られている又は今後発見さ
れる、いかなる塩も意味する。一部の特定例は：酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；
塩酸塩及び臭化水素酸塩のようなヒドロハロゲン化物；硫酸塩；クエン酸塩；酒
石酸塩；グリコール酸塩；及びシュウ酸塩である。
【００７０】 化合物の構造 全般。本発明に従って製造される物質の組成物においては、ペプチドのＮ末端
又はＣ末端を通してペプチドをビヒクルに連結することができる。従って、本発
明のビヒクル−ペプチド分子は次の式Ｉ： （Ｘ１）ａ−Ｆ１（Ｘ２）ｂ ［式中、Ｆ１はビヒクル（好ましくはＦｃドメイン）であり、 Ｘ１及びＸ２は、各々独立に−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ ２ ）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３、及
び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ ４ から選択され、 Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は各々独立に薬理学的に活性なペプチドの配列であ
り、 Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は各々独立にリンカーであり、そして ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、ａとｂの少なくとも一方が１であることを条件
として、各々独立に０又は１である］ によって表わすことができる。
【００７１】 従って、化合物Ｉは式ＩＩ： Ｘ１−Ｆ１ 及びそのマルチマー［式中、Ｆ１はＦｃドメインであり、Ｘ１のＣ末端で結合し
ている］、式ＩＩＩ： Ｆ１−Ｘ２ 及びそのマルチマー［式中、Ｆ１はＦｃドメインであり、Ｘ２のＮ末端で結合し
ている］、式ＩＶ： Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１ 及びそのマルチマー［式中、Ｆ１はＦｃドメインであり、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１の
Ｎ末端で結合している］、式Ｖ Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２ 及びそのマルチマー［式中、Ｆ１はＦｃドメインであり、−Ｌ１−Ｐ１−Ｌ２−
Ｐ２のＮ末端で結合している］ の好ましい化合物を含む。
【００７２】 ペプチド。本発明と組み合わせてどのような数のペプチドも使用しうる。特に
興味深いのは、ＥＰＯ、ＴＰＯ、成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ
Ｌ−１ｒａ、レプチン、ＣＴＬＡ４、ＴＲＡＩＬ、ＴＧＦ−α、及びＴＧＦ−β
の活性を擬似するペプチドである。ペプチド拮抗物質、特にＴＮＦ、レプチン、
インターロイキンのいずれか（ＩＬ−１、２、３、…）、及び補体活性化に関与
するタンパク質（例えばＣ３ｂ）の活性に拮抗するものも興味深い。腫瘍誘導（
ｔｕｍｏｒ−ｈｏｍｉｎｇ）ペプチド、膜輸送ペプチド等を含めた標的ペプチド
も興味深い。これらのクラスのペプチドすべてが本明細書で引用する参考文献及
び他の参考文献において記述されている方法によって発見されうる。
【００７３】 ファージディスプレイは、特に、本発明において使用するためのペプチドを生
成するのに有用である。ランダムペプチドのライブラリーからのアフィニティー
選択を使用して、遺伝子産物の部位に関するペプチドリガンドを同定できること
が記述されている。Ｄｅｄｍａｎら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６８：２３０２５−３０。ファージディスプレイは、細胞表面受容体のような対
象タンパク質又は線状エピトープを持つなんらかのタンパク質に結合するペプチ
ドを同定するために特に適している。Ｗｉｌｓｏｎら（１９９８），Ｃａｎ．Ｊ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３１３−２９；Ｋａｙら（１９９８），Ｄｒｕｇ
Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ ３：３７０−８。そのようなタンパク質は、参照して
ここに組み込まれる、Ｈｅｉｚら（１９９７），Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＆ Ｓ
ｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｒｅｓ．１７（５）：６７１−７７６
の中で広汎に検討されている。そのような対象タンパク質は本発明における使用
のために好ましい。
【００７４】 特に好ましいペプチド群は、サイトカイン受容体に結合するものである。サイ
トカインは最近それらの受容体コードに従って分類された。参照してここに組み
込まれる、Ｉｎｇｌｏｔ（１９９７），Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉａｅ ｅｔ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ ４５：３
５３−７参照。これらの受容体の中で、最も好ましいのはＣＫＲｓ（表３のＩフ
ァミリー）である。受容体分類を表３に示す。
【００７５】
【表３】
【００７６】 本発明に関する例示的ペプチドを下記の表４から２０に示す。これらのペプチ
ドは当技術において開示されている方法によって調製しうる。１文字のアミノ酸
略語を使用している。これらの配列中（及び特定の場合に異なる記載がないかぎ
り、本明細書全体を通じて）のＸは、２０個の天然に生じるアミノ酸残基のいず
れかが存在することを意味する。これらのペプチドにいずれも、リンカーにより
又はリンカーなしで、タンデムに（すなわち連続的に）連結することができ、い
くつかのタンデム結合例を表に示している。リンカーは「Λ」として列挙してお
り、ここで述べるリンカーのいずれでもよい。タンデムリピートとリンカーは、
明瞭化のためダッシュで分けて示している。システイニル残基を含むいずれのペ
プチドも、もうひとつのＣｙｓ含有ペプチドと架橋することができ、ペプチドの
一方又は両方がビヒクルに連結されていてもよい。いくつかの架橋例を表に示し
ている。１個以上のＣｙｓ残基を持つペプチドは、ペプチド内ジスルフィド結合
を形成することもできる；例えば、表５のＥＰＯ擬似ペプチド参照。ペプチド内
ジスルフィド結合したペプチドのいくつかの例が表に記載されている。これらの
ペプチドのいずれもがここで述べたように誘導体化することができ、いくつかの
誘導体化した例を表に示している。関連する非誘導体化ペプチドも本発明におい
て使用できるので、表中の誘導体化ペプチドは限定ではなく例示である。カルボ
キシル末端をアミノ基でキャップすることができる誘導体に関しては、キャップ
アミノ基を−ＮＨ２として示している。アミノ酸残基がアミノ酸残基以外の成分
で置換されている誘導体については、置換基をσで表わしており、σは、参照し
てここに組み込まれる、Ｂｈａｔｎａｇａｒら（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈ
ｅｍ．３９：３８１４−９及びＣｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎら（１９９７），Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：２８７６−８２に述べられている成分のいずれかを意味
する。Ｊ置換基とＺ置換基（Ｚ５、Ｚ６、…Ｚ４０）は、参照してここに組み込
まれる米国特許第５，６０８，０３５号、同第５，７８６，３３１号及び同第５
，８８０，０９６号で定義されているとおりである。ＥＰＯ擬似配列（表５）に
関しては、置換基Ｘ２からＸ１１まで及び整数「ｎ」は、参照してここに組み込
まれるＷＯ ９６／４０７７２号に定義されているとおりである。置換基「Ψ」
、「Θ」、及び「＋」は、参照してここに組み込まれる、Ｓｐａｒｋｓら（１９
９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１５４０−４に定義さ
れているとおりである。Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、インテグリン結合ペプチ
ドに関して、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７及びＸ８が、参照して
ここに組み込まれる１９９５年６月１日公開の国際特許願ＷＯ ９５／１４７１
４号及び１９９７年３月６日公開のＷＯ ９７／０８２０３号に定義されている
とおりであり、ＶＩＰ擬似ペプチドに関して、Ｘ１、Ｘ１’、Ｘ１”、Ｘ２、Ｘ ３ 、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＺならびに整数ｍとｎが、参照してここに組み込まれ
る１９９７年１０月３０日公開のＷＯ ９７／４００７０号に定義されていると
おりであることを除いて、やはり参照してここに組み込まれる米国特許第５，７
７３，５６９号に定義されているとおりである。下記のＸａａ及びＹａａは、参
照してここに組み込まれる１９９８年３月１２日公開のＷＯ ９８／０９９８５
号に定義されているとおりである。ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＢ１、ＡＢ２、及びＡＣ
は、参照してここに組み込まれる１９９８年１２月３日公開の国際特許願ＷＯ
９８／５３８４２号に定義されているとおりである。表１７中のＸ１、Ｘ２、Ｘ ３ 及びＸ４は、１９９９年４月２８日公開の欧州特許願ＥＰ ０ ９１１ ３９
３号に定義されているとおりである。太字で表示されている残基はＤ−アミノ酸
である。特に異なる記載がないかぎり、すべてのペプチドはペプチド結合を通し
て連結されている。略語は本明細書の末尾に列挙している。「配列番号」の欄に
おいて、「ＮＲ」は、所与の配列に関して配列リストの記載を必要としないこと
を意味する。
【００７７】
【表４】
【００７８】
【表５】
【００７９】
【表６】
【００８０】
【表７】
【００８１】
【表８】
【００８２】
【表９】
【００８３】
【表１０】
【００８４】
【表１１】
【００８５】
【表１２】
【００８６】
【表１３】
【００８７】
【表１４】
【００８８】
【表１５】
【００８９】
【表１６】
【００９０】
【表１７】
【００９１】
【表１８】
【００９２】
【表１９】
【００９３】
【表２０】
【００９４】 本発明はまた、次の治療において活性を持つペプチドに関して特に有用である
： ・ペプチドがＶＥＧＦ擬似又はＶＥＧＦ受容体拮抗物質、ＨＥＲ２作用物質又は
拮抗物質、ＣＤ２０拮抗物質等である場合には、癌、 ・対象とするタンパク質がＣＫＲ３拮抗物質、ＩＬ−５受容体拮抗物質等である
場合には、喘息、 ・対象とするタンパク質がＧＰＩＩｂ拮抗物質、ＧＰＩＩＩａ拮抗物質等である
場合には、血栓症、 ・対象とするタンパク質がＩＬ−２受容体拮抗物質、ＣＤ４０作用物質又は拮抗
物質、ＣＤ４０Ｌ作用物質又は拮抗物質、サイモポイエチン擬似等である場合に
は、自己免疫疾患及び免疫調節に関わる他の状態。
【００９５】 ビヒクル。本発明は、アミノ酸残基の１つのＮ末端、Ｃ末端又は側鎖を通して
ペプチドに結合された少なくとも１つのビヒクル（Ｆ１、Ｆ２）の存在を必要と
する。多数のビヒクルも使用しうる；例えば、各々の末端のＦｃ、又は一方の末
端のＦｃと他方の末端又は側鎖のＰＥＧ基。
【００９６】 Ｆｃドメインは好ましいビヒクルである。ＦｃドメインはペプチドのＮ又はＣ
末端に、又はＮ末端とＣ末端の両方に融合することができる。ＴＰＯ擬似ペプチ
ドに関しては、分子のペプチド部分のＮ末端に融合されたＦｃドメインを持つ分
子は他のそのような融合よりも生物活性であり、従ってＮ末端への融合が好まし
い。
【００９７】 上述したように、Ｆｃ変異体は本発明の範囲内での適切なビヒクルである。天
然Ｆｃを、サルベージ受容体への結合が保持されることを条件として、本発明に
従ったＦｃ変異体を形成するために広汎に改変することができる；例えば、ＷＯ
９７／３４６３１号及びＷＯ ９６／３２４７８号参照。そのようなＦｃ変異
体では、本発明の融合分子が必要としない構造的特徴又は機能的活性を提供する
天然Ｆｃの１つ又はそれ以上の部位を除去しうる。例えば、残基を置換する又は
欠失させる、残基を当該部位に挿入する、若しくは当該部位を含む部分を切断す
ることによってそれらの部位を除去することができる。挿入される又は置換され
る残基は、ペプチド擬似又はＤ−アミノ酸のような改変されたアミノ酸であって
もよい。Ｆｃ変異体は多くの理由から望ましいと考えられ、その内のいくつかを
下記に述べる。例示的なＦｃ変異体は、次のような分子及び配列を含む： １．ジスルフィド結合の形成に関わる部位が除去されている。そのような除去は
、本発明の分子を生成するために使用する宿主細胞中に存在する他のシステイン
含有タンパク質との反応を回避することができる。このために、Ｎ末端のシステ
イン含有セグメントを切断するか、若しくはシステイン残基を欠失させる又は他
のアミノ酸（例えばアラニル、セリル）で置換することができる。特に、配列番
号２のＮ末端の２０アミノ酸セグメントを切断する、若しくは配列番号２の７及
び１０位のシステイン残基を欠失させる又は置換することができる。システイン
残基を除去したときでも、一本鎖Ｆｃドメインはまだ、非共有結合で結ばれた二
量体Ｆｃドメインを形成することができる。 ２．選択した宿主細胞とより適合性にするために天然Ｆｃが修飾されている。例
えば、プロリンイミノペプチダーゼのような大腸菌の消化酵素によって認識され
うる、典型的天然ＦｃのＮ末端近くのＰＡ配列を除去することができる。また、
特に分子が大腸菌のような細菌細胞において組換え発現されるときには、Ｎ末端
のメチオニン残基を付加することもできる。配列番号２のＦｃドメイン（図４）
はそのようなＦｃ変異体の１つである。 ３．選択した宿主細胞において発現されたときのＮ末端の異質性を防ぐために、
天然ＦｃのＮ末端の一部が除去されている。このために、Ｎ末端の最初の２０個
のアミノ酸残基のいずれか、特に１、２、３、４及び５位のアミノ酸残基を欠失
させることができる。 ４．１つ又はそれ以上のグリコシル化部位が除去されている。典型的には、グリ
コシル化されている残基（例えばアスパラギン）は細胞溶解反応をもたらすと考
えられる。そのような残基を欠失させる又はグリコシル化されていない残基（例
えばアラニン）で置換することができる。 ５．Ｃ１ｑ結合部位のような補体との相互作用に関わる部位が除去されている。
例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失させる又は置換することができる。補
体の集積は本発明の分子にとって有利ではないと考えられ、それ故かかるＦｃ変
異体によって回避することができる。 ６．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響を及ぼす部位が除去され
ている。天然Ｆｃは、本発明の融合分子にとって必要ではない特定の白血球と相
互作用するための部位を持つと考えられ、それ故かかる部位を除去することがで
きる。 ７．ＡＤＣＣ部位が除去されている。ＡＤＣＣ部位は当技術分野において既知で
ある；ＩｇＧ１のＡＤＣＣ部位に関しては、例えばＭｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．２９（５）：６３３−９（１９９２）参照。これらの部位も本発明の融合分子
には必要なく、従って除去されうる。 ８．天然Ｆｃがヒト以外の抗体から誘導されるときには、天然Ｆｃをヒト化する
ことができる。典型的には、天然Ｆｃをヒト化するために、ヒト以外の天然Ｆｃ
中の選択した残基をヒト天然Ｆｃにおいて通常認められる残基で置換する。抗体
のヒト化のための手法は当技術において周知である。
【００９８】 好ましいＦｃ変異体は次のものを含む。配列番号２（図４）において、１５位
のロイシンがグルタメートで置換されうる；９９位のグルタメートがアラニンで
、１０１位と１０３位のリシンがアラニンで置換されうる。さらに、１個又はそ
れ以上のチロシン残基をフェニルアラニン残基に置き換えることができる。
【００９９】 代替的なビヒクルは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体フラ
グメント、又はサルベージ受容体に結合することができる小分子（例えばペプチ
ド擬似化合物）であろう。例えば、Ｐｒｅｓｔａらへの１９９８年４月１４日発
行の米国特許第５，７３９，２７７号に述べられているようなポリペプチドがビ
ヒクルとして使用できるであろう。ペプチドはまた、ＦｃＲｎサルベージ受容体
への結合に関するファージディスプレイによって選択することもできる。そのよ
うなサルベージ受容体結合化合物も「ビヒクル」の意味するものの中に含まれ、
本発明の範囲内である。そのようなビヒクルは、半減期を高め（例えば、プロテ
アーゼによって認識される配列を避けることにより）、且つ免疫原性を低下させ
る（例えば、抗体のヒト化において発見されるような、非免疫原性配列を促進す
ることにより）ように選択すべきである。
【０１００】 上述したように、ポリマービヒクルもＦ１及びＦ２に関して使用しうる。現在
、ビヒクルとして有用な化学成分を結合するために様々な手段が使用でき、例え
ば、その全体が参照してここに組み込まれる、「Ｎ末端で化学修飾されたタンパ
ク質組成物及び方法（Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ）」と題されたＰａｔｅｎｔ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒｅａｔｙ（
「ＰＣＴ」）の国際特許公開ＷＯ ９６／１１９５３号参照。このＰＣＴ特許公
開は、特にタンパク質のＮ末端への水溶性ポリマーの選択的結合を開示している
。
【０１０１】 好ましいポリマービヒクルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥ
Ｇ基は好都合な分子量を持つことができ、線状又は分枝のいずれでもよい。ＰＥ
Ｇの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン（「ｋＤ」）から約１００ｋＤ
ａ、より好ましくは約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａか
ら約１０ｋＤａの範囲である。ＰＥＧ基は一般に、ＰＥＧ成分上の反応基（例え
ばアルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基）を通して本発明の化合物上の
反応基（例えばアルデヒド、アミノ又はエステル基）にアシル化又は還元的アル
キル化することにより、本発明の化合物に結合される。
【０１０２】 合成ペプチドのＰＥＧ化のための有用な戦略は、溶液中で共役結合を形成する
ことを通して、各々が他方に対して相互に反応性である特殊な官能性を担う、ペ
プチドとＰＥＧ成分を結合することから成る。ペプチドは従来の固相合成を用い
て容易に調製できる（例えば、図５及び６と本文中の付随する説明参照）。ペプ
チドは、特定部位において適切な官能基で「前活性化」されている。ＰＥＧ成分
と反応させる前に、前駆物質を精製し、十分に特性付ける。ペプチドとＰＥＧの
ライゲーションは通常水相で起こり、逆相分析ＨＰＬＣによって容易にモニター
することができる。ＰＥＧ化ペプチドは分取ＨＰＬＣによって容易に精製でき、
分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱着質量分析によって特徴付けること
ができる。
【０１０３】 多糖類ポリマーはタンパク質修飾に使用できるもうひとつのタイプの水溶性ポ
リマーである。デキストランは、主としてα１−６結合によって連結されたグル
コースの個々のサブユニットから成る多糖類ポリマーである。デキストラン自体
は多くの分子量範囲で入手可能であり、約１ｋＤから約７０ｋＤの分子量のもの
が容易に入手できる。デキストランは、それ自体でビヒクルとして若しくはもう
ひとつ別のビヒクル（例えばＦｃ）との組合せで、本発明における使用に適した
水溶性ポリマーである。例えば、ＷＯ ９６／１１９５３号及びＷＯ ９６／０
５３０９号参照。治療用又は診断用免疫グロブリンに複合したデキストランの使
用が報告されている；例えば、参照してここに組み込まれる欧州特許公開０ ３
１５ ４５６号参照。デキストランを本発明に従ってビヒクルとして使用すると
きには、約１ｋＤから約２０ｋＤのデキストランが好ましい。
【０１０４】 リンカー。どのような「リンカー」基も任意である。存在するときには、主と
してスペーサーとして働くため、その化学構造は絶対条件ではない。リンカーは
、好ましくはペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸で作製される。従
って、好ましい実施態様では、リンカーはペプチド結合によって連結された１か
ら２０個のアミノ酸から作られ、かかるアミノ酸は２０個の天然に生じるアミノ
酸から選択される。当業者には明らかに理解されるように、これらのアミノ酸の
一部はグリコシル化されている場合もある。より好ましい実施態様では、１から
２０個のアミノ酸はグリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン
、及びリシンから選択される。さらに一層好ましくは、リンカーは、その大半が
グリシンとアラニンのように立体障害とならないアミノ酸で作製される。それ故
、好ましいリンカーはポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５）、ポリ
（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、及びポリアラニンである。リンカーの他の特定例は次のも
のである： （Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号３３３）、 （Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号３３４）、 （Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号３３５）、及び ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号３３６）。 上記の表記法を説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４はＧｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。Ｇｌ
ｙとＡｌａの組合せも好ましい。ここに示すリンカーは例示である；本発明の範
囲内のリンカーははるかに長い場合もあり、また他の残基を含みうる。
【０１０５】 非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）５−Ｃ（Ｏ）
−、［式中、ｓ＝２−２０］のようなアルキルリンカーが使用できるであろう。
これらのアルキルリンカーはさらに、低級アルキル（例えばＣ１−Ｃ６）、低級
アシル、ハロゲン（例えばＣｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等のような立
体障害とならない基によって置換されていてもよい。例示的な非ペプチドリンカ
ーはＰＥＧリンカー、
【０１０６】
【化１】 ［式中、ｎは、リンカーが１００から５０００ｋＤ、好ましくは１００から５０
０ｋＤの分子量を持つ数である］ である。ペプチドリンカーは、上述したのと同じようにして誘導体を形成するよ
うに改変することができる。
【０１０７】 誘導体。本発明者はまた、化合物のペプチド及び／又はビヒクル部分を誘導体
化することを考慮している。そのような誘導体は、化合物の溶解度、吸収、生物
学的半減期等を改善すると考えられる。当該物質は、その代わりに、化合物の好
ましくない副作用等を排除する又は軽減する場合もある。例示的な誘導体は次の
ような化合物を含む： １．化合物又はその一部が環状である。例えばペプチド部分が、ジスルフィド
結合の形成によって環化しうる２個又はそれ以上のＣｙｓ残基を含む（例えばリ
ンカー中に）ように修飾することができる。環化誘導体の調製に関する参考文献
の引用については表２参照。
【０１０８】 ２．化合物が架橋している又は分子間で架橋できるようになっている。例えば
、ペプチド部分を１個のＣｙｓ残基を含むように改変し、それによって同様の分
子と分子間ジスルフィド結合を形成することができる。化合物はまた、下記に示
す分子のように、そのＣ末端を通して架橋されていてもよい。
【０１０９】
【化２】
【０１１０】 ３．
【０１１１】 ４．１つ又はそれ以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］結合が非ペプチジル
結合によって置換されている。例示的非ペプチジル結合は、−ＣＨ２−カルバメ
ート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート、−ＣＨ２−スルホンアミ
ド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２ −第二アミン、及びアルキル化ペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−、式中、Ｒ６は低
級アルキルである］である。
【０１１２】 ５．Ｎ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｎ末端をアシル化するか又は
置換アミンに改変することができる。例示的なＮ末端誘導体基は、−ＮＲＲ１（
−ＮＨ２−以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ
）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシニミド、又はベンジルオキシカルボ
ニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）、［式中、ＲとＲ１は各々独立に水素又は低級
アルキルであり、フェニル環はＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ク
ロロ、及びブロモから成る群から選択される１から３個の置換基で置換されてい
てもよい］を含む。
【０１１３】 ６．遊離Ｃ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｃ末端がエステル化又は
アミド化されている。例えば、当技術において記述されている方法を用いて、Ｃ
末端に配列番号５０４から５０８のいずれかを持つ本発明の化合物に（ＮＨ−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ２−ＮＨ２）２を付加することができる。同様に、当技術において記
述されている方法を用いて、Ｃ末端に配列番号９２４から９５５、９６３から９
７２、１００５から１０１３、又は１０１８から１０２３のいずれかを持つ本発
明の化合物に−ＮＨ２を付加することができる。例示的なＣ末端誘導体基は、例
えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２［式中、Ｒ２は低級アルコキシである］、又は−ＮＲ３Ｒ ４ ［式中、Ｒ３とＲ４は各々独立に水素又はＣ１−Ｃ８アルキル（好ましくはＣ １ −Ｃ４アルキル）である］を含む。
【０１１４】 ７．ジスルフィド結合がもうひとつ別の、好ましくはより安定な、架橋成分（
例えばアルキレン）で置換されている。例えば。Ｂｈａｔｎａｇａｒら（１９９
６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９９
３），Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ａｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．３５７−９参照。
【０１１５】 ８．１個又はそれ以上の個々のアミノ酸残基が修飾されている。下記に詳述す
るように、様々な誘導体化物質が選択された側鎖又は末端残基と特異的に反応す
ることが知られている。
【０１１６】 リシニル残基とアミノ末端残基は、リシニル残基の電荷を逆転させる無水コハ
ク酸又は他の無水カルボン酸と反応しうる。α−アミノ含有残基を誘導体化する
ための他の適当な試薬は、メチルピコリンイミデートのようなイミドエステル、
ピリドキサルホスフェート、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベ
ンゼンスルホン酸、Ｏ−メチリソ尿素、２，４ペンタンジオン、及びトランスア
ミナーゼが触媒するグリオキシレートとの反応を含む。
【０１１７】 アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２
−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンを含めた、従来の試薬のいずれか１
つ又はいくつかの組合せとの反応によって修飾しうる。アルギニル残基の誘導体
化は、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、反応がアルカリ条件下で行われる
ことを必要とする。さらに、これらの試薬はリシンのグループならびにアルギニ
ンイプシロンアミノ基と反応しうる。
【０１１８】 チロシル残基の特異的修飾は広汎に検討されており、特に芳香族ジアゾニウム
化合物又はテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識
を導入することに関心が寄せられている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダ
ゾール及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種と
３−ニトロ誘導体を形成する。
【０１１９】 カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）は、１−シクロヘキシル
−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３
−（４−アゾニア−４，４−ジメチルフェニル）カルボジイミドのようなカルボ
ジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾しうる。さ
らに、アスパルチル及びグルタミル残基をアンモニウムイオンとの反応によって
アスパラギニル及びグルタミニル残基に転換することができる。
【０１２０】 グルタミニル及びアスパラギニル残基は対応するグルタミル及びアスパルチル
残基に脱アミノ化することができる。代替的には、これらの残基は弱い酸性条件
下で脱アミノ化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれ
る。
【０１２１】 システイニル残基は、ジスルフィド結合を取り除くため、あるいは逆に架橋を
安定させるために、アミノ酸残基又は他の成分によって置換することができる。
例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒら（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３
８１４−９参照。
【０１２２】 二官能物質による誘導体化は、ペプチド又はそれらの官能基誘導体を水不溶性
支持体基質又は他の高分子ビヒクルに架橋結合するために有用である。一般に使
用される架橋剤は、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタ
ン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、例えば４−ア
ジドサリチル酸とのエステル、３，３−ジチオビス（スクシニミジルプロピオネ
ート）のようなジスクシニミジルエステルを含めたホモ二官能性イミドエステル
、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドを
含む。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデータのよ
うな誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を
生成する。その代わりに、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性水不溶性基
質及び米国特許第３，９６９，２８７号、同第３，６９１，０１６号、同第４，
１９５，１２８号、同第４，２４７，６４２号、同第４，２２９，５３７号及び
同第４，３３０，４４０号に述べられている反応性基質がタンパク質の固定に使
用される。
【０１２３】 炭水化物（オリゴ糖）基は、タンパク質におけるグリコシル化部位であること
が知られている部位に好都合に結合しうる。一般に、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／
Ｔｈｒ［Ｘはプロリン以外のどのようなアミノ酸でもよい］の一部であるときに
は、Ｏ結合オリゴ糖をセリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）残基に連結し
、Ｎ結合オリゴ糖をアスパラギン（Ａｓｎ）残基に連結する。Ｘは、好ましくは
プロリン以外の１９の天然に生じるアミノ酸の１つである。Ｎ結合及びＯ結合オ
リゴ糖の構造及び各々の種類で認められる糖残基は異なる。両方で一般的に認め
られる糖の１つの種類はＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される）であ
る。シアル酸は通常、Ｎ結合及びＯ結合オリゴ糖の両方の末端残基であり、その
負の電荷により、グリコシル化化合物に酸性特性を与えうる。そのような部位は
本発明の化合物のリンカーに組み込むことができ、好ましくはポリペプチド化合
物の組換え産生（例えばＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳのような哺乳類細胞において）
の際に細胞によってグリコシル化される。しかしながら、そのような部位は、当
技術において既知の合成又は半合成手順によってさらにグリコシル化されうる。
【０１２４】 他の可能な修飾は、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオ
ニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リシン、ア
ルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化を含む。Ｃｒｅｉｇｈｔ
ｏｎ，タンパク質：構造と分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ
＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐ．７９−８６（１９８３）。
【０１２５】 本発明の化合物は、ＤＮＡレベルでも変化しうる。化合物のいずれかの部分の
ＤＮＡ配列を、選択した宿主細胞とより適合性のあるコドンに変えることができ
る。好ましい宿主細胞である大腸菌に関しては、至適化されたコドンが当技術に
おいて既知である。制限部位を取り除くように、又は選択宿主細胞におけるＤＮ
Ａのプロセシングを助けるサイレント制限部位を含むように、コドンを置換する
ことができる。上記の配列変更のいずれかを含むようにビヒクル、リンカー及び
ペプチドＤＮＡ配列を修飾することができる。
【０１２６】 作製方法 本発明の化合物は、主として組換えＤＮＡ手法を用いて形質転換宿主細胞にお
いて作製されうる。そのために、当該ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を
調製する。そのようなＤＮＡ分子を調製する方法は当技術において周知である。
例えば、適当な制限酵素を使用して当該ペプチドをコードする配列をＤＮＡから
切り出すことができる。その代わりには、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏ
ｒａｍｉｄａｔｅ）法のような化学合成手法を用いてＤＮＡ分子を合成すること
ができる。また、これらの手法の組合せも使用できる。
【０１２７】 本発明はまた、適当な宿主において当該ペプチドを発現することができるベク
ターを含む。ベクターは、適当な発現制御配列に操作的に連結されたペプチドを
コードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子をベクターに挿入する前又は挿入後の
いずれかに、この操作的結合を生じさせる方法は周知である。発現制御配列は、
プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合
部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナ
ル、及び転写又は翻訳の制御にかかわる他のシグナルを含む。
【０１２８】 生じたＤＮＡ分子を持つベクターを使用して適当な宿主を形質転換する。この
形質転換は、当技術において周知の方法を用いて実施しうる。
【０１２９】 本発明の実施にあたって、数多くの入手可能な周知の宿主細胞が使用できる。
個々の宿主細胞の選択は当技術において認識されている多くの因子に依存する。
これらは、例えば、選択される発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコ
ードされるペプチドの毒性、形質転換の速度、ペプチドの回収の容易さ、発現特
性、生体安全性及びコストを含む。必ずしもすべての宿主が特定のＤＮＡ配列の
発現のために等しく有効ではないとの理解を持って、これらの因子のバランスを
決定しなければならない。これらの一般的ガイドラインの中で、有用な微生物宿
主は、細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｓｐ．など）、酵母（サッカロミセス（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．など）及び他の真菌、昆虫、植物、培養中の
哺乳類（ヒトを含む）細胞、又は当技術において既知の他の宿主を含む。
【０１３０】 次に、形質転換した宿主を培養し、精製する。宿主細胞は、所望する化合物が
発現されるように従来の発酵条件下で培養されうる。そのような発酵条件は当技
術において周知である。最後に、当技術において周知の方法によってペプチドを
培養から精製する。
【０１３１】 当該化合物はまた、合成方法によって作製することもできる。例えば、固相合
成手法が使用できる。適当な手法は当技術において周知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉ
ｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐ．３３５−６１
（ＫａｔｓｏｙａｎｎｉｓとＰａｎａｙｏｔｉｓ編集）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ
（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓら（
１９８５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４；Ｓｔｅｗａｒ
ｔとＹｏｕｎｇ（１９６９），固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉ
ｎｎら（１９７６），タンパク質（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（第３版）２：
１０５−２５３；及びＥｒｉｃｋｓｏｎら（１９７６），タンパク質（Ｔｈｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（第３版）２：２５７−５２７に述べられているものを含む
。固相合成は小ペプチドを作製する最もコスト効果的方法であるので、個々のペ
プチドを作製する好ましい手法である。
【０１３２】 誘導体化されたペプチドを含む若しくは非ペプチド基を含む化合物は、周知の
有機化学手法によって合成することができる。
【０１３３】 化合物の使用 概説。本発明の化合物は、対象とするタンパク質の作用物質、擬似又は拮抗物
質としてかかる対象タンパク質に結合するそれらの能力から生じる薬理学的活性
を持つ。特定化合物の有用性を表２に示す。これらの化合物の活性は、当技術に
おいて既知のアッセイによって測定することができる。ＴＰＯ擬似及びＥＰＯ擬
似化合物に関しては、本文中の実施例の章でさらに説明する。
【０１３４】 治療用途に加えて、本発明の化合物は、対象とするそれらの関連タンパク質の
機能障害を特徴とする疾患を診断する上で有用である。１つの実施態様では、（
ａ）サンプルを本発明の化合物に接触させ、そして（ｂ）当該化合物による対象
タンパク質の活性化を検出するステップを含む、活性化されうる対象タンパク質
（例えば受容体）を生物学的サンプルにおいて検出する方法。生物学的サンプル
は、組織標本、無傷細胞、又はそれらの抽出物を含む。本発明の化合物は、生物
学的サンプルにおいて対象とするそれらの関連タンパク質の存在を検出するため
の診断キットの一部として使用しうる。そのようなキットは、検出を可能にする
結合標識を持つ本発明の化合物を用いる。当該化合物は、対象とする正常又は異
常タンパク質を同定するために有用である。ＥＰＯ擬似化合物に関しては、例え
ば、生物学的サンプル中に対象とする異常タンパク質が存在することは、ＥＰＯ
受容体が機能不全であると考えられるダイアモンド−ブラックファン貧血（Ｄｉ
ａｍｏｎｄ Ｂｌａｃｋｆａｎ ａｎｅｍｉａ）のような疾患を表わすと考えら
れる。
【０１３５】 ＥＰＯ擬似化合物の治療用途。本発明のＥＰＯ擬似化合物は、赤血球レベルが
低いことを特徴とする疾患を治療するために有用である。哺乳類においてＥＰＯ
受容体の内因性活性を調節する方法、好ましくはＥＰＯ受容体の活性を上昇させ
る方法は本発明に包含される。一般に、貧血のような、エリトロポイエチンによ
って治療しうるいかなる状態も、本発明のＥＰＯ擬似化合物によって治療されう
る。これらの化合物を、治療する状態の性質と重症度に適した、当業者が探知し
うる量と送達経路によって投与する。好ましくは、投与は皮下、筋肉内、又は静
脈内のいずれかの注入による。
【０１３６】 ＴＰＯ擬似化合物の治療用途。ＴＰＯ擬似化合物については、「巨核球の増殖
と分化を刺激するための組成物及び方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔ
ｅ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」と題されたＷ
Ｏ ９５／２６７４６号に記述されているもののような標準的アッセイが利用で
きる。下記の実施例においてもインビボアッセイを示す。
【０１３７】 治療される状態は、一般に既存の巨核球／血小板欠損又は予想される巨核球／
血小板欠損（例えば、手術又は血小板供与が予定されているため）に関わるもの
である。そのような状態は通常、インビボでの活性Ｍｐ１リガンドの欠損（一過
性又は永続的）の結果である。血小板欠損の一般名は血小板減少症（ｔｈｒｏｍ
ｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）であり、従って本発明の方法及び組成物は一般に、そ
の必要のある患者において血小板減少症を治療するために使用しうる。
【０１３８】 血小板減少症（血小板欠損）は、化学療法及び様々な薬剤による他の治療、放
射線療法、手術、偶発的血液損失、ならびに他の特異疾患状態を含めて、様々な
理由から存在しうる。血小板減少症に関わる、本発明に従って治療しうる例示的
な特異疾患状態は：再生不良性貧血、特発性血小板減少症、血小板減少症をもた
らす転移性腫瘍、全身性エリテマトーデス、巨脾腫、ファンコーニ症候群（Ｆａ
ｎｃｏｎｉ‘ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、メ
イ−ヘグリン異常（Ｍａｙ-Ｈｅｇｇｌｉｎ ａｎｏｍａｌｙ）、ヴィスコット
−オールドリッチ症候群（Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅ
）、ならびに発作性夜間血色素尿症である。また、ＡＩＤＳに関する一部の治療
は血小板減少症を生じさせる（例えばＡＺＴ）。一部の創傷治癒障害も血小板数
の増加から恩恵を受けるであろう。
【０１３９】 例えば後日の手術による、予想される血小板欠損に関しては、本発明の化合物
を血小板が必要とされる数日前から数時間前に投与することができる。急性状況
、例えば偶発的な大量失血に関しては、本発明の化合物を血液又は精製血小板と
共に投与することができる。
【０１４０】 本発明のＴＰＯ擬似化合物はまた、当該細胞がＭｐ１受容体を発現することが
認められれば、巨核球以外の一部の細胞型を刺激する上で有用であると考えられ
る。Ｍｐ１リガンドによる刺激に対しての応答である、Ｍｐ１受容体を発現する
そのような細胞に関連する状態も、本発明の範囲内である。
【０１４１】 本発明のＴＰＯ擬似化合物は、血小板又は血小板前駆細胞の産生が所望される
、若しくはｃＭｐ１受容体の刺激が所望されるいかなる状況においても使用でき
る。従って、例えば、本発明の化合物は、血小板、巨核球等が必要とされる哺乳
類での状態を治療するために使用しうる。そのような状態は次の例示的ソースに
詳述されており、ここに組み込まれる：ＷＯ９５／２６７４６号；ＷＯ９５／２
１９１９号；ＷＯ９５／１８８５８号；ＷＯ９５／２１９２０号。
【０１４２】 本発明のＴＰＯ擬似化合物はまた、血小板及び／又は巨核球及び関連細胞の生
存率又は貯蔵寿命を維持する上でも有用であると考えられる。それ故、そのよう
な細胞を含む組成物中に１つ又はそれ以上のそのような化合物の有効量を含むこ
とは有用であろう。
【０１４３】 本発明の治療方法、組成物及び化合物はまた、血小板欠損だけでなく他の症状
によっても特徴付けられる疾患状態の治療において、単独で若しくは他のサイト
カイン、可溶性Ｍｐ１受容体、造血因子、インターロイキン、成長因子又は抗体
と組み合わせて用いることができる。本発明の化合物は、ＩＬ−３又はＧＭ−Ｃ
ＳＦのような一般的な造血刺激物質との組合わせで一部の形態の血小板減少症を
治療するのに有用であることが明らかにされると予想される。他の巨核球刺激因
子、すなわちｍｅｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ
）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、又は巨核球刺激活性を持つ他の分子も、Ｍｐ
１リガンドと共に用いることができる。そのような同時投与のためのさらなる例
示的サイトカイン又は造血因子は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−
３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳ
Ｆ−１）、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、Ｅ
ＰＯ、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、コンセンサスインターフェロン、
ＩＦＮ−β、又はＩＦＮ−γを含む。さらに、ひとたび巨核球が成熟形態に達す
れば、巨核球を血小板へと切断する作用を持つと思われる可溶性哺乳類Ｍｐ１受
容体の有効量を同時に又は連続的に投与することは有用であると考えられる。そ
れ故、本発明の化合物の投与（成熟巨核球の数を高めるため）に続いて可溶性Ｍ
ｐ１受容体を投与することは（リガンドを不活性化し、成熟巨核球に血小板を産
生させるため）、血小板産生を刺激する特に有効な手段であると予想される。上
記に引用した用量は、治療組成物中のそのような追加成分を補うように調節する
。治療した患者の経過は従来の方法によってモニターすることができる。
【０１４４】 本発明の化合物を血小板及び／又は巨核球及び関連細胞の組成物に加える場合
、含有される量は、一般に当技術において既知の手法及びアッセイによって実験
的に探知されるであろう。そのような量の例示的範囲は、１０６細胞につき本発
明の化合物０．１μｇ−１ｍｇである。
【０１４５】 製薬組成物 概説。本発明はまた、本発明の化合物の製薬組成物を使用する方法を提供する
。そのような製薬組成物は、注入による投与、経口、肺、経鼻、経皮又は他の形
態の投与用でありうる。一般に、本発明は、製薬上許容される希釈剤、防腐剤、
溶解補助剤、乳化剤、アジュバント及び／又はキャリアと共に本発明の化合物の
有効量を含む製薬組成物を包含する。そのような組成物は、様々な緩衝剤含量（
例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤、
界面活性剤及び溶解補助剤（例えばＴｗｅｅｎ ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ
８０）のような添加物、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナト
リウム）、防腐剤（例えばＴｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）及び充填
剤（例えばラクトース、マンニトール）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のよう
なポリマー化合物の微粒子製剤又はリポソームへの物質の組込みを含む。ヒアル
ロン酸も使用でき、これは循環中に存在する時間の延長を促進する作用を持つと
考えられる。そのような組成物は、本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態
、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響を
及ぼしうる。例えば、参照してここに組込まれる、レミントンの製薬化学（Ｒｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１
８版（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐ
Ａ１８０４２）ｐ．１４３５−１７１２参照。当該組成物は液体形態、若しくは
凍結乾燥形態のような乾燥粉末で調製することができる。経皮製剤と同様に、移
植可能な持続放出性製剤も考慮される。
【０１４６】 経口投与形態。参照してここに組込まれるレミントンの製薬化学（Ｒｅｍｉｎ
ｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１９９０
），第１８版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ
１８０４２）の８９章に概説されている経口固形投与形態が、ここでの使用のた
めに考慮される。固形投与形態は、錠剤、カプセル、丸剤、トローチ又はロゼン
ジ、カシェ剤又はペレット剤を含む。同様に、リポソーム又はプロテイノイド被
包も本発明の組成物を製剤するために使用しうる（例えば、米国特許第４，９２
５，６７３号に報告されているプロテイノイドミクロスフェアとして）。リポソ
ーム被包も使用でき、様々なポリマーでリポソームを誘導体化することができる
（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療のための可能な固形投与形
態の説明は、参照してここに組込まれる、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．，近代的製薬
学（Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）（１９７９），Ｇ．Ｓ．Ｂａ
ｎｋｅｒとＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｓ編集に述べられている。一般に、製剤は、本発明
の化合物、及び胃環境に対する保護と腸における生物活性物質の放出を可能にす
る不活性成分を含む。
【０１４７】 また明細には、上記の本発明の化合物の経口投与形態も考慮される。必要に応
じて、経口送達が有効であるように当該化合物を化学修飾することができる。一
般に、考慮される化学修飾は、（ａ）タンパク質分解の阻害、及び（ｂ）胃又は
腸からの血流への取込みを可能にする少なくとも１つの成分を、化合物の分子そ
のものに結合することである。また化合物の全体的安定性の上昇及び体内での循
環時間の上昇も望ましい。本発明における共有結合ビヒクルとして有用な成分が
この目的にも使用できる。そのような成分の例は、ＰＥＧ、エチレングリコール
とプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキスト
ラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンを含む。
例えば、ＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉとＤａｖｉｓ，可溶性ポリマー−酵素付加物、薬
剤としての酵素（Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ Ａｄｄｕｃ
ｔｓ，Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ）（１９８１），Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ
とＲｏｂｅｒｔｓ編集，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，ＮＹ，ｐ．３６７−８３；Ｎｅｗｍａｒｋら（１９８２），Ｊ．Ａｐｐｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−９参照。使用できる他のポリマーは、ポリ−１
，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカンである。上述したよう
な製薬用途にはＰＥＧ成分が好ましい。
【０１４８】 経口送達投与形態に関しては、本発明の治療化合物の吸収を高めるためのキャ
リアとして、Ｎ−（８［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリ
ウム（ＳＮＡＣ）のような修飾脂肪族アミノ酸の塩を使用することも可能である
。ＳＮＡＣを使用したヘパリン製剤の臨床効果は、Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって実施された第ＩＩ相試験において明らかにされた。
米国特許第５，７９２，４５１号、「経口薬剤送達組成物及び方法（Ｏｒａｌ
ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ
ｓ）」参照。
【０１４９】 本発明の化合物を、粒径約１ｍｍの顆粒又はペレットの形態の微細多粒子とし
て製剤中の含めることができる。カプセル投与用物質の製剤は、粉末、軽度圧縮
プラグ、またさらには錠剤であってもよい。圧縮によって治療薬を調製すること
ができる。
【０１５０】 着色剤及び着香剤もすべて含めることができる。例えば、タンパク質（又は誘
導体）を製剤し（リポソーム又はミクロスフェア被包などによって）、さらに着
色剤及び着香剤を含む冷却飲料のような食品の中に含めることができる。
【０１５１】 不活性物質で本発明の化合物の容量を希釈する又は増加させることもできる。
これらの希釈剤は、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクト
ース、セルロース、スクロース、変性デキストラン及びデンプンを含みうる。一
部の無機塩も、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムを含
めて、充填剤として使用しうる。市販の希釈剤の一部として、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ
、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ １５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ及びＡｖｉｃｅ
ｌｌがある。
【０１５２】 崩壊剤も、固形投与形態の治療製剤中に含めることができる。崩壊剤として使
用される物質は、デンプンをベースとする市販の崩壊剤、Ｅｘｐｌｏｔａｂを含
めて、デンプンを含むがそれに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム
、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロ
ペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシ
メチルセルロース、天然海面及びベントナイトはすべて使用しうる。もうひとつ
の形態の崩壊剤は不溶性陽イオン交換樹脂である。粉末ゴムは崩壊剤及び結合剤
として使用でき、それらは寒天、カラヤゴム又はトラガカントのような粉末ゴム
を含みうる。アルギン酸及びそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
【０１５３】 結合剤は、硬錠剤を形成するために治療薬と結合して用いることができ、アカ
シア、トラガカント、デンプン及びゼラチンのような天然産物からの材料を含む
。その他にはメチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボ
キシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）
及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）はいずれも、治療薬を顆
粒化するためのアルコール溶液中で使用できる。
【０１５４】 減摩剤（潤滑剤）は、製剤工程中の粘着を防ぐために治療薬の製剤に含めるこ
とができる。潤滑剤は治療薬と鋳型壁の間の層として使用でき、それらは、マグ
ネシウム塩及びカルシウム塩を含めたステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレ
ン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油及びろうを含みうるが、これらに限定
されない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量
のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ ４０００及び６０００のような
可溶性潤滑剤も使用できる。
【０１５５】 製剤中の薬剤の流動特性を高めることができ、圧縮の際の再配列を助けるすべ
り剤（ｇｌｉｄａｎｔ）を添加してもよい。すべり剤は、デンプン、滑石、発熱
性シリカ及び水和ケイアルミネートを含みうる。
【０１５６】 水性環境への本発明の化合物の溶解を助けるために、界面活性剤を湿潤剤とし
て添加してもよい。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジ
オクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムのような陰イオン界面
活性剤を含みうる。陽イオン界面活性剤も使用でき、塩化ベンズアルコニウム又
は塩化ベンゼトニウムを含みうる。界面活性剤として製剤中に含めることができ
る潜在的な非イオン性界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ポリ
オキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６
０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０
、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロー
スである。これらの界面活性剤は、単独で若しくは種々の比率での混合物として
、タンパク質又は誘導体の製剤中に存在しうる。
【０１５７】 添加物も化合物の吸収を高めるために製剤中に含めることができる。潜在的に
この特性を持つ添加物は、例えばオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸のよう
な脂肪酸である。
【０１５８】 制御放出製剤は望ましいと考えられる。本発明の化合物を、拡散又は浸出機序
による放出を可能にする不活性マトリックス、例えばゴムに組み込むことができ
る。緩やかに変性するマトリックス、例えばアルギン酸塩、多糖類を製剤中に組
み込むこともできる。本発明の化合物の制御放出のもうひとつの形態は、Ｏｒｏ
ｓ治療系（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）に基づく方法によるものであり、すなわち、
浸透圧作用によって１個の小さな開口部を通して水が侵入し、薬剤を押し出す半
透過性膜の中に薬剤が納められている。一部の腸溶剤皮も緩徐放出作用を持つ。
【０１５９】 他の剤皮は製剤のために使用しうる。それらは、コーティングパンに適用する
ことができる様々な糖類を含む。治療薬はまた薄膜被覆錠剤として提供すること
もでき、この場合にしようする材料は２つの群に分けられる。最初は非腸溶物質
であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、
メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロ
キシプロピル−メチルセルロース、カルボキシ−メチルセルロースナトリウム、
プロビドン及びポリエチレングリコールを含む。第二の群は、一般にはフタル酸
のエステルである腸溶物質から成る。
【０１６０】 至適薄膜被覆を提供するために材料の混合物も使用しうる。薄膜被覆は、パン
コーター又は流動床において、若しくは圧縮コーティングによって実施できる。
【０１６１】 肺送達形態。本発明のタンパク質（又はその誘導体）の肺送達も考慮される。
タンパク質（又はその誘導体）は吸入の際に哺乳類の肺に送達され、肺上皮内層
を通って血流に入る。（これについての他の報告は、Ａｄｊｅｉら，Ｐｈａｒｍ
ａ．Ｒｅｓ．（１９９０）７：５６５−９；Ａｄｊｅｉら（１９９０），Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ６３：１３５−４４（酢酸ロ
イプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら（１９８９），Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ．１３（補遺５）：ｓ．１４３−１４６（エンドセリン−１）
；Ｈｕｂｂａｒｄら（１９８９），Ａｎｎａｌｓ Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．３：２０６
−１２（α１−抗トリプシン）；Ｓｍｉｔｈら（１９８９），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−６（α１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら（
１９９０年３月）、「タンパク質のエーロゾル化（Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｓｐ．Ｄｒｕｇ
Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ（組換えヒト成
長ホルモン）；Ｄｅｂｓら（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８
２−８（インターフェロン−γ及び腫瘍壊死因子α）、及びＰｌａｔｚら、米国
特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）を含む。） そのすべてが当業者には熟知のものである、ネブライザ、定量吸入器、及び粉
末吸入器を含むがこれらに限定されない、治療薬剤の肺送達用に設計された広い
範囲の機械的装置が、本発明を実施する際の使用に関して考慮される。本発明の
実施に適した市販の装置のいくつかの特定例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉ
ｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉが製造しているＵｌｔｒａｖｉｏ
ｌｅｔネブライザ、Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅ
ｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏが製造しているＡｃｏｒｎ ＩＩネブライ
ザ、Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，
Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａが製造しているＶｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器、及
びＦｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓが
製造しているＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。
【０１６２】 そのような装置はすべて、本発明の化合物を投薬するのに適した製剤を使用す
る必要がある。典型的には、各々の製剤は用いる装置の種類に特異的であり、治
療において有用な希釈剤、アジュバント及び／又はキャリアに加えて、適切な推
進物質の使用を含む。
【０１６３】 本発明の化合物は、遠位肺への最も有効な送達のために、平均粒径１０μｍ（
又はミクロン）未満、最も好ましくは０．５から５μｍの微粒子形態として最も
好都合に製剤されるはずである。
【０１６４】 製薬上許容されるキャリアは、トレハロース、マンニトール、キシリトール、
スクロース、ラクトース、及びソルビトールのような炭水化物を含む。製剤にお
いて使用するための他の成分は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＣを
含みうる。天然又は合成界面活性剤も使用できる。ＰＥＧも使用しうる（タンパ
ク質又は類似体を誘導体化する上での使用とは別に）。シクロテキストランのよ
うなデキストランも使用できる。胆汁酸塩及び他の関連増強剤も使用できる。セ
ルロース及びセルロース誘導体も使用できる。アミノ酸も、緩衝剤製剤における
使用のように、使用することができる。
【０１６５】 またリポソーム、マイクロカプセル又はミクロスフェア、包接複合体、あるい
は他の種類のキャリアの使用も考慮される。
【０１６６】 ジェット噴霧器又は超音波噴霧器による使用に適した製剤は、典型的には、溶
液ｍＬにつき生物活性タンパク質約０．１から２５ｍｇの濃度で水に溶解した本
発明の化合物を含む。製剤はまた、緩衝剤及び単糖も含みうる（例えば、タンパ
ク質の安定化及び浸透圧の調節のため）。ネブライザ製剤はまた、エーロゾルを
形成する際の溶液の噴霧化によって生じるタンパク質の表面誘導凝集を低減する
又は予防するために、界面活性剤を含みうる。
【０１６７】 定量吸入装置に関して使用するための製剤は、一般に界面活性剤の助けを得て
推進剤に懸濁した本発明の化合物を含む微細分割粉末を含有する。推進剤は、ク
ロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボ
ン、又はトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテト
ラフルオロエタノール、及び１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含めた炭
化水素、若しくはそれらの組合せのような、このために使用される従来のいかな
る物質でもよい。適当な界面活性剤は、トリオレイン酸ソルビタン及びダイズレ
シチンを含む。オレイン酸も界面活性剤として有用であると考えられる。
【０１６８】 粉末吸入装置から投薬するための製剤は、本発明の化合物を含む微細分割乾燥
粉末を含有し、同時に、装置からの粉末の散布を促進する量、例えば製剤の５０
から９０重量％の量の、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール
、トレハロース、又はキシリトールのような充填剤も含みうる。
【０１６９】 経鼻送達形態。本発明の化合物の経鼻送達も考慮される。経鼻送達は、薬剤が
肺に沈着することを必要とせずに、治療薬剤を鼻に投与したあとタンパク質が直
接血流へと通過することを可能にする。経鼻送達のための製剤は、デキストラン
又はシクロデキストランを含有するものを含む。他の粘膜を通しての輸送による
送達も考慮される。
【０１７０】 投与量。上述した状態を治療するための方法に関わる用量レジメンは、薬剤の
作用を変化させる様々な因子、例えば患者の年齢、状態、体重、性別及び食生活
、感染の重症度、投与の時間、ならびに他の臨床的因子を考慮して、主治医によ
って決定されるであろう。一般に、１日量は体重キログラム当り本発明の化合物
０．１−１０００マイクログラム、好ましくはキログラム当り０．１−１５０マ
イクログラムの範囲とすべきである。
【０１７１】 特定の好ましい態様 発明者は多くの異なる種類の活性を有する分子の好ましいペプチド配列を決定
した。発明者はさらに、好ましいリンカーおよびビヒクルと結合するこれらの好
ましいペプチドの好ましい構造を決定した。これらの好ましいペプチドの好まし
い構造を以下の表２１に列挙する。
【０１７２】
【表２１】
【０１７３】 実施例 前記の化合物を以下に記載するように調製できる。これらの実施例は本発明の
好ましい態様を含んでなり、本発明を説明するが、これを限定するものではない
。
【０１７４】 実施例１ ＴＰＯ−擬似物質 以下の実施例では本明細書に後記する表Ａに示す数字で同定されたペプチドを
使用する。
【０１７５】 ペプチド１９の調製 ペプチド１７ｂ（１２ｍｇ）およびＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨ５０００（３０ｍｇ
、２当量）を水性緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌに溶解した。混合物を室温で約３０分
インキュベートし、分析用ＨＰＬＣにより反応を確認し、＞８０％の反応が完了
したことが示された。調製用ＨＰＬＣによりＰＥＧ化物質を単離した。
【０１７６】 ペプチド２０の調製 ペプチド１８（１４ｍｇ）およびＭｅＯ−ＰＥＧマレイミド（２５ｍｇ）を水
性緩衝液（ｐＨ８）約１．５ｍｌに溶解した。混合物を室温で約３０分間インキ
ュベートし、そのときサンプルのアリコートをＨＰＬＣカラムに供して分析用Ｈ
ＰＬＣでモニター観察し、約７０％の形質転換が完了していた。調製用ＨＰＬＣ
によりＰＥＧ化物質を精製した。
【０１７７】 生物活性検定 ＴＰＯインビトロ生物検定はヒトｍｐｌ受容体でトランスフェクトしたマウス
３２Ｄ細胞のＩＬ−３依存性クローンを利用する細胞分裂誘起検定である。この
検定に関してはＷＯ９５／２６７４６により詳細に記載されている。細胞を１０
％胎児クローンＩＩおよび１ｎｇ／ｍｌ ｍＩＬ−３を含有するＭＥＭ培地中に
保持する。サンプルを添加する前にｍＩＬ−３不含成長培地で２回すすいで細胞
を調製する。拡張１２点ＴＰＯ検量線を作成し、３３ないし３９ｐｇ／ｍｌの範
囲になる。各サンプルに関して４希釈（検量線の直線部分内に入ると推測される
、１００ないし１２５ｐｇ／ｍｌ）を調製し、三重に実施する。１００００セル
／ウェルを含有する９６ウェル・マイクロタイタープレートの適当なウェルに１
００μｌの容量のサンプルの各希釈物または標準物質を加える。３７℃および１
０％ ＣＯ２で４４時間後、ＭＴＳ（細胞によりホルマザンに生物還元されるテ
トラゾリウム化合物）を各ウェルに加える。約６時間後、プレート・リーダーで
４９０ｎｍにおける光学密度を読み取る。用量依存性曲線（ｌｏｇＴＰＯ濃度対
Ｏ．Ｄ．バックグランド）を作成し、検量線の直線部分に入る点の直線回帰分析
を行う。得られた直線の方程式および希釈因子の補正を用いて未知の試験サンプ
ルの濃度を決定する。
【０１７８】 ポリグリシン・リンカーを有するＴＭＰ縦列反復 連続して連結するＴＭＰ反復の設計は、ｃ−Ｍｐｌ（ＴＰＯ受容体）と効果的
に相互作用するためにＴＭＰの二量体形態が要求され、受容体との関係において
それらが互いにどのように巻きついているかに依存して、全体的な二量体立体配
座を乱さないように２個のＴＭＰ分子がＣからＮ末端への立体配置で一緒につな
ぎとめられているという仮定に基づいている。明らかに、縦列連結した反復の設
計の成功は、２個の連続し、整列したＴＭＰ単量体のＣおよびＮ末端に結合する
リンカーの長さおよび組成の適切な選別に依存するものである。ｃ−Ｍｐｌに結
合するＴＭＰの構造に関する情報を利用できないので、０ないし１０および１４
個のグリシン残基（表Ａ）からなるリンカーを有する一連の反復ペプチドを合成
した。融通性のあるポリグリシンペプチド鎖により２個のつなぎとめられたＴＭ
Ｐ反復の自由な折りたたみが可能になり、要求される立体配座にでき、一方その
他のアミノ酸配列は、その剛性により受容体との関係において反復ペプチドの正
常なパッキングが崩壊する望ましくない二次構造をとるという理論に基づいて、
平易性および融通性の故にグリシンを選択した。
【０１７９】 そのペプチドはすでにＦｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃのいずれかの化学を用いる慣
用的な固相ペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３））により入手できる。擬似対称的に２個
のペプチド鎖を作る最初の分岐点として直交する保護リジン残基を使用すること
が要求される、Ｃ末端に連結した平行二量体の合成（Ｃｗｉｒｌａら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２７６：１６９６−９９（１９９７））とは異なり、これらの縦列反復
をＣからＮ末端に向かって連続したペプチド鎖の集合体を直線的に、段階的に合
成する。ＴＭＰの二量体形成はＣ末端二量体で認められるような結合親和性より
も増殖活性に、より劇的に効果があるので（Ｃｗｉｒｌａら、（１９９７））、
ｃ−Ｍｐｌ全長でトランスフェクトしたマウス３２Ｄ細胞のＩＬ−３依存的クロ
ーンを用いてＴＰＯ依存的細胞増殖検定で生物学的活性に関して合成ペプチドを
直接的に試験した（Ｐａｌａｃｉｏｓら、Ｃｅｌｌ，４１：７２７（１９８５）
）。試験結果が示すように、全てのポリグリシン連結縦列反復は単量体と比して
強度において＞１００倍の増強が示され、細胞増殖検定においてはＣ末端二量体
よりも強力でさえあった。我々の検定においてはＣ末端の絶対活性は元来のＴＰ
Ｏタンパク質の活性より低く、これはＣ末端二量体が天然リガンドのように活性
であることが見出されたという依然に報告された知見（Ｃｗｉｒｌａら、（１９
９７））と異なる。これは二つの検定において使用した条件の相違によるであろ
う。それにもかかわらず、同一検定における縦列（第２の単量体のＮ末端に連結
した第１の単量体のＣ末端）およびＣ末端（第２の単量体のＣ末端に連結した第
１の単量体のＣ末端、平行とも称する）二量体間の活性の相違により、縦列反復
ストラテジーが平行ペプチド二量体形成よりも優れていることが明らかに示され
た。リンカーとして広範な長さが許容されることは興味深く留意されるところで
ある。選択されたＴＭＰ単量体を用いる縦列ペプチド間の最適なリンカーは明ら
かに８個のグリシンから成る。
【０１８０】 その他の縦列ペプチド この最初の一連のＴＭＰ縦列反復に続いて、異なるリンカーと共にかまたは単量
体そのもの中に修飾を含んでいくつかのその他の分子を設計した。これらの分子
の第１のものはペプチド１３であり、βターン型２次構造を形成する傾向が高い
ことで知られている配列であるＧＰＮＧから成るリンカーを有する。単量体より
も約１００倍以上強力であるが、このペプチドは等価のＧＧＧＧ連結アナログよ
りも＞１０倍以下の活性であることが見出されている。このように、比較的堅固
なβターンをリンカー領域で導入することにより、この短いリンカー形態におい
て最適な作用物質立体配座にわずかな歪を生じるようである。
【０１８１】 ＴＭＰ配列におけるＴｒｐ９はランダムペプチドライブラリーから単離された
活性なペプチドのなかで高度に保存された残基である。またＥＰＯ擬似ペプチド
のコンセンサス配列にも高度に保存されたＴｒｐがあり、このＴｒｐ残基が２個
のＥＭＰ間の疎水性コアの形成に関与し、ＥＰＯ受容体との疎水性相互作用に寄
与することが見出された。Ｌｉｖｎａｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：４６４−
７１（１９９６）。類推によって、ＴＭＰにおけるＴｒｐ９残基はペプチドリガ
ンドの二量体形成に類似の機能を有し、２個のインドール環により非共有結合性
疎水力の影響を変調し、評価する試みとして、Ｔｒｐにおける変異から数種のア
ナログを作った。そしてペプチド１４では２個のＴＭＰ単量体の各々においてＴ
ｒｐ残基をＣｙｓと置換し、酸化により２個のシステインの間で分子内ジスルフ
ィド結合を形成し、これはペプチド二量体形成における２個のＴｒｐ残基間の疎
水性相互作用を擬似することが想定される。ペプチド１５はペプチド１４の還元
体である。ペプチド１６では２個のＴｒｐ残基がＡｌａにより置換された。検定
データに示されるように、３個のアナログは全て不活性であった。これらのデー
タによりさらにＴｒｐが二量体形成に関してのみではなく、ＴＰＯ擬似ペプチド
の活性に関して必須であることを示された。
【０１８２】 次の２個のペプチド（ペプチド１７ａおよび１８）の各々はその８アミノ酸リ
ンカーにＬｙｓまたはＣｙｓ残基を含む。これらの２個の化合物は、ＰＥＧ部分
でＬｙｓまたはＣｙｓの側鎖が修飾されている２個のＰＥＧ化ペプチド（ペプチ
ド１９および２０）の前駆体である。ＰＥＧ部分が比較的長いリンカーの中央に
導入され、そのために大きなＰＥＧ構成要素（５ｋＤ）がペプチド分子内の臨界
結合部位から十分離れている。ＰＥＧは生物適合性を有する重合体であることが
知られており、共有結合性の改変剤としてペプチドおよびタンパク質基盤の治療
の薬物動態プロファイルを改善するのに使用されることが増えてきている。
【０１８３】 合成または組換えペプチドを都合よくＰＥＧ化するために、モジュラー、ソル
ーション基盤の方法が考案された。この方法は現在ではよく確立された相互反応
性官能基対間の特異的反応を利用する化学選択的ライゲーション・ストラテジー
に基づいている。そして、ＰＥＧ化ペプチド１９では、リジン側鎖をあらかじめ
ブロモアセチル基で活性化し、ペプチド１７ｂをチオール誘導したＰＥＧとの反
応に順応させた。そうするために、直交する保護基Ｄｄｅをリジンεアミンの保
護に用いた。一度全ペプチド鎖を集合させると、Ｎ末端アミンをｔ−Ｂｏｃで再
度保護した。次いでＤｄｅを除去してブロモアセチル化した。このストラテジー
により慣用的な逆相ＨＰＬＣを用いて容易に精製し、高品質の粗ペプチドを得た
。ｐＨ８の水性緩衝液中でペプチドとチオール修飾したＰＥＧとライゲートし、
反応は３０分間以内に完了した。精製し、ＰＥＧ化した物質のＭＡＬＤＩ−ＭＳ
分析により隣接するピーク間で４４Ｄａの増加を伴う特徴的なベル型のスペクト
ラムが示された。ＰＥＧ−ペプチド２０では、システイン残基がリンカー領域に
在り、その側鎖チオール基をマレイミド含有ＰＥＧの結合部位として提供する。
このペプチドのＰＥＧ化に類似の条件を用いた。検定データが示すように、これ
らの２個のＰＥＧ化ペプチドはこれらのＰＥＧ化していない相当物と比較してイ
ンビトロ生物活性はより高い。
【０１８４】 ペプチド２１はその８−アミノ酸リンカーにおいてグリコシル化され得るモチ
ーフＮＧＳを有する。例示した縦列反復がペプチド結合により連結される天然ア
ミノ酸から成るので、適当な真核細胞系におけるかかる分子の発現によりＡｓｎ
の側鎖カルボキシアミドに糖質基が加えられたグリコペプチドが作られるはずで
ある。グリコシル化は水溶性およびインビボ安定性を増強することにより規定の
タンパク質の生物学的活性に多くの肯定的な影響を与えることができる一般的な
翻訳後修飾方法である。検定データが示すように、このグリコシル化モチーフの
リンカーへの組み込みにより高い生物学的活性が維持された。潜在的グリコペプ
チドの合成前駆体は−（Ｇ）８−連結アナログのものに比べて有効な活性を有し
た。一度グリコシル化されると、ＰＥＧおよび糖質基が呈する類似の物理化学的
特性のために、このペプチドはＰＥＧ化ペプチドと同一の活性オーダーを有する
と考えられる。
【０１８５】 最後のペプチドは縦列反復の二量体である。これはペプチド１８を酸化するこ
とにより調製され、リンカーに位置する２個のシステイン残基の間で分子内ジス
ルフィド結合を形成する。このペプチドはＴＭＰが四量体として活性である可能
性に注意を向けるために設計された。検定データによりこのペプチドがモル調整
に基づいて平均的な縦列反復ほど活性ではないことが示され、これはＴＭＰの活
性体はまさしく二量体であり、そうでなければ縦列反復の二量体形成は生物学的
活性により影響を与えるであろうということを間接的に支持している。
【０１８６】 動物におけるインビトロデータを確認するために１個のＰＥＧ化ＴＭＰ縦列反
復（表Ａの化合物２０）を浸透圧ポンプを介して正常マウスに皮下投与した。処
理期間中血小板の時間および用量依存的増加が認められた。８日には血小板レベ
ルが基底値の４倍を越えた。ＰＥＧ化ＴＭＰ反復１０μｇ／ｋｇ／日の用量で、
同一経路により投与したｒＨｕＭＧＤＦ（ＰＥＧ化していない）１００μｇ／ｋ
ｇ／日に類似の応答が得られた。
【０１８７】
【表２２】
【０１８８】 論考 ＭＧＤＦがｈＧＨに類似の方法で作用する、すなわち活性化のためにタンパク
質リガンドの１個の分子が受容体の２個の分子に結合することは周知である。Ｗ
ｅｌｌｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：６０９−３４（１９９６
）。現在、この相互作用はもっと小さいペプチドであるＴＭＰの作用により擬似
される。しかしながら、本研究は、Ｃ−Ｃ平行またはＣ−Ｎ連続のいずれかの様
式のＴＭＰの共有結合性二量体形成が１０３以上の因子で元来の単量体のインビ
トロ生物学的能力を増強するので、この擬似が２個のＴＭＰ分子の協奏作用を要
求することを示唆している。単量体の生物学的能力が相対的に低いのは恐らく非
共有結合性二量体の形成の効率が悪いためである。あらかじめ形成された共有結
合性反復は非共有結合性二量体形成のためにエントロピーバリヤを排除する能力
を有し、これは小型の１４−残基ペプチドの２個の分子間の弱い非共有結合性相
互作用により排他的にもたらされる。
【０１８９】 報告された二量体形成が興味深いように、この縦列反復の研究が生物学的活性
の増強に類似の影響を及ぼすのは興味深い。これらの二つのストラテジーにより
二つの非常に異なった分子立体配置が得られた。Ｃ−Ｃ二量体は擬似対称性分子
であり、一方縦列反復ではその直線構造にかかる対称性はない。１次構造におけ
る差異にかかわらず、これらの二つの型の分子は類似の生物学的に活性な立体配
座に効果的に折り畳まれ、ｃ−Ｍｐｌの二量体形成および活性化を引き起こすこ
とができるようである。これらの実験観察により、２個のＴＭＰ分子がｃ−Ｍｐ
ｌに対する結合においてどのように互いに相互作用を示すことができるかという
ことに多くの洞察が得られた。Ｃ末端二量体に関するデータに示唆されるように
、第１に２個の結合ＴＭＰ分子の２個のＣ末端が相対的に互いに非常に接近して
いなければならない。第２に、受容体複合体において２個のＴＭＰ分子のＮおよ
びＣ末端の各々もまた互いに非常に近接して並んでいなければならず、これらを
１個のペプチド結合と一緒に直接つなぎとめて、縦列反復ストラテジーにより得
られるほぼ最大の活性増強効果を認めることができるようにする。接合点での１
個またはそれ以上（１４個まで）のグリシン残基を挿入しても活性をさらに有意
に増大（または減少）させることはなかった。これは柔軟なポリグリシンペプチ
ド鎖が立体配座全体においていかなる有意な変化をも引き起こさずに接合部から
容易にループ形成できるという事実のためであろう。この柔軟性によりＴＭＰペ
プチド鎖の配向性が自由になり、受容体との相互作用において要求される立体配
座に折り畳まれ、それが修飾部位として確認されるようである。これを支持する
間接的な証拠はペプチド１３に関する研究から得られ、そこではリンカーとして
より堅固なβターン形成配列がリンカーの周囲でバックボーンの並びに明らかに
偏りを生じさせ、結果的に光学的立体配座のわずかな歪を生じ、その結果４−Ｇ
ｌｙリンカーを有する類似の化合物と比較して活性が穏やかに（１０倍）低下し
た。第３に、ＴＭＰにおけるＴｒｐ９はＥＭＰにおけるＴｒｐ１３と類似の役割
を果たし、これは二量体形成に関するペプチド：ペプチド相互作用に関係するの
みならず、ペプチド：受容体相互作用における疎水力の寄与に関しても重要であ
る。ＷからＣへの変異アナログであるペプチド１４で得られた結果により、共有
結合性ジスルフィド連結はＴｒｐペアにより提供される疎水性相互作用に近似す
るのに十分ではなく、結合が短いので２個のＴＭＰ単量体が接近しすぎ、そのた
めに光学二量体構造の立体配座全体を乱すことが示唆される。
【０１９０】 ＴＭＰペプチドの可能な２次構造を分析することにより、ＴＭＰとｃ−Ｍｐｌ
との相互作用に関してより理解を深めることができる。報告されたＥＰＯ擬似ペ
プチドの構造を参考にすることにより容易に理解できるようになる。Ｌｉｖｎａ
ｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：４６４−７５（１９９６）。受容体結合ＥＭＰ
は配列の中央で高度なコンセンサスＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒにより形成
されるβターンを伴うβヘアピン構造を有する。ＧＰＬＴの代りに、ＴＭＰが高
度に選択されたＧＰＴＬ配列を有し、これは類似のターンを形成する可能性があ
る。しかしながら、このターン様のモチーフはＴＭＰのＮ末端部分の近くに位置
する。チャウ・ファスマン法を用いる２次構造の予測により、ペプチドのＣ末端
の半分はらせん状の立体配座をとる傾向があることが示唆される。９位置で高度
に保存されたＴｒｐと一緒にこのＣ末端ヘリックスは二量体構造の安定性に寄与
できる。ほとんどの縦列反復がＣ末端平行二量体よりも強力であることは興味深
く留意されるところである。縦列反復はＣ−Ｃ平行二量体形成よりもよりよく適
合する立体配座を分子に提供するようである。縦列反復の見かけの非対称的様相
のために、それは非対称性分子として２個の異なる部位を用いて２個の同等の受
容体分子に結合する天然リガンドに近くなる。
【０１９１】 ＰＥＧ部分の導入によりタンパク質溶解性の分解に対して保護することにより
、および腎臓濾過によるそのクリアランスを減速させることにより、修飾ペプチ
ドのインビボ活性が増強されることが確認された。細胞基盤の増殖検定において
ＰＥＧ化により縦列反復しているＴＭＰペプチドのインビトロ生物活性がより増
強されるということは予想されなかった。
【０１９２】 実施例２ Ｆｃ−ＴＭＰ融合 ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とのＮ末端かまたはＣ末端のいずれかの融合体として
単量体または二量体のいずれかの形態でＴＭＰ（および実施例３に記載のＥＭＰ
）を発現した。全ての場合においてケースで発現ベクターｐＡＭＧ２１にてｌｕ
ｘＰＲプロモーター・プロモーターを用いて発現を構築した。
【０１９３】 Ｆｃ−ＴＭＰ ＴＰＯ擬似ペプチドの単量体にイン・フレーム融合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領
域をコードするＤＮＡ配列を標準的なＰＣＲ技術を用いて構築した。ＰＣＲ反応
の鋳型はｐＦｃ−Ａ３ベクターおよび合成ＴＭＰ遺伝子であった。合成遺伝子を
以下に示す３個の重複オリゴヌクレオチドから構築し（各々配列番号３６４、３
６５および３６６）：
【０１９４】
【表２３】 これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングしてアミノ酸配列をコードする二本
鎖を形成し（各々配列番号３６７および３６８）、以下に示す：
【０１９５】
【表２４】 センスおよびアンチセンスプライマーとして１８４２−９８および１８４２−９
７を用いてＰＣＲ反応でこの二本鎖を増幅した。
【０１９６】 以下に示すプライマー（配列番号３６９および３７０）を用いてｐＦｃ−Ａ３
とのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った：
【０１９７】
【表２５】 オリゴヌクレオチド１８３０−５１および１８４２−９８は２４個のヌクレオチ
ドの重複を含有し、アウトサイド・プライマー１２１６−５２および１８４２−
９７を用いて第３の反応において前記のＰＣＲ生成物を組合わせることにより、
２個の遺伝子が正確な読み枠で一緒に融合されるようになる。
【０１９８】 本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載されるように、最終的なＰＣＲ遺伝子生
成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで
消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（
Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造
し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクロ
ーンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃３７２８
株と称した。
【０１９９】 融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号５および６）を
図７に示す。
【０２００】 Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰ 標準的なＰＣＲ技術を用いてＴＰＯ擬似ペプチドの二量体にイン・フレーム融
合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応
の鋳型はｐＦｃ−Ａ３ベクターおよび合成ＴＭＰ−ＴＭＰ遺伝子であった。４個
の重複オリゴヌクレオチドから合成遺伝子を構築し（各々配列番号３７１ないし
３７４）以下に示す：
【０２０１】
【表２６】 ４個のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、アミノ酸配列をコードする二本鎖
を形成し（各々配列番号３７５および３７６）、以下に示す：
【０２０２】
【表２７】 センスおよびアンチセンスプライマーとして１８３０−５２および１８３０−５
５を用い、ＰＣＲ反応で二本鎖を増幅した。
【０２０３】 Ｆｃ−ＴＭＰに関して前記したように、プライマー１２１６−５２および１８
３０−５１を用いてｐＦｃ−Ａ３とのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った。ア
ウトサイド・プライマー１２１６−５２および１８３０−５５を用いて第３のＰ
ＣＲ反応から融合体遺伝子全長を得た。
【０２０４】 実施例１に記載するように、最終的なＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）
を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクター
ｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６
株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド
配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングし
た。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃３７２７株と称した。
【０２０５】 融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号７および８）を
図８に示す ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃ 標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合し
たＴＰＯ擬似ペプチドの縦列反復をコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反
応の鋳型は＃３６８８株のＥＭＰ−Ｆｃプラスミド（実施例３を参照のこと）お
よびＴＭＰ二量体をコードする合成遺伝子であった。７個の重複オリゴヌクレオ
チドから縦列反復の合成遺伝子を構築し（各々配列番号３７７ないし３８３）以
下に示す：
【０２０６】
【表２８】 これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングして二本鎖を形成しこれは以下に示
すアミノ酸配列をコードすることが示された（各々配列番号３８４および３８５
）：
【０２０７】
【表２９】 センスおよびアンチセンスプライマーとして１８８５−５２および１８８５−５
８を用い、ＰＣＲ反応で二本鎖を増幅した。
【０２０８】 プライマー１８８５−５４および１２００−５４を用いてＥＭＰ−Ｆｃ融合株
＃３６８８からのＤＮＡ（実施例３を参照のこと）とのＰＣＲ反応で分子のＦｃ
部分を作った。アウトサイド・プライマー１８８５−５２および１２００−５４
を用いて第３のＰＣＲ反応から融合体遺伝子全長を得た。
【０２０９】 本明細書でＦｃ−ＥＭＰに関して記載するように、最終的なＰＣＲ遺伝子生成
物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消
化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ
．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し
、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクロー
ンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃３７９８株
と称した。
【０２１０】 融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号９および１０）
を図９に示す ＴＭＰ−Ｆｃ ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合したＴＰＯ擬似ペプチドの単量
体をコードするＤＮＡ配列を偶然にもＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃのライゲーションで
得たが、これは恐らくプライマー１８８５−５４が１８８５−５３および１８８
５−５８にアニリーリングする能力によるものであろう。ＴＭＰ−Ｆｃ構築物に
関して正確なヌクレオチド配列を有する１個のクローンを選別し、アムゲン＃３
７８８株と称した。
【０２１１】 融合タンパク質のヌクレオトドおよびアミノ酸配列（配列番号１１および１２
）を図１０に示す。
【０２１２】 大腸菌における発現 大腸菌ＧＭ２２１におけるｐＡＭＧ２１−Ｆｃ融合構築物の各々の培養物を５
０ｍｇ／ｍｌカナマイシン含有ルリア・ブロス培地中３７℃で成長させた。合成
オートインデューサーＮ−（３−オクソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリン・ラ
クトンを培養培地に添加し、最終濃度２０ｎｇ／ｍｌにして、ｌｕｘＰＲプロモ
ーターからの遺伝子生成物の発現を誘導した。培養物を３７℃でさらに３時間イ
ンキュベートした。３時間後、封入体の存在に関して細菌培養物を顕微鏡で試験
し、次いで遠心により収集した。誘導した培養物中光屈折性の封入体が観察され
、これはＦｃ融合体が大腸菌の不溶性分画においてほとんど生成されていること
を示している。１０％β−メルカプトエタノールを含有するラエムリ・サンプル
緩衝液に細胞ペレットを再懸濁することにより直接的に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより分析した。各々の場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適当な分子量のクーマ
シー染色の強いバンドが観察された。
【０２１３】 ｐＡＭＧ２１ 発現プラスミドｐＡＭＧ２１はアムゲン発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴ
ＣＣ＃６９５７６）から誘導でき、これもまた米国特許第４７１０４７３号に記
載のアムゲン発現ベクター系から誘導した。ｐＣＦＭ１６５６プラスミドは： （ａ）Ｔ４ポリメラーゼ酵素で末端を埋め、次いで平滑末端ライゲーションを
行うことにより、２個の内在するＮｄｅＩ制限部位を崩壊させること； （ｂ）合成ＰＬプロモーターを含有する独自のＡａｔＩＩおよびＣｌａＩ制限
部位間のＤＮＡ配列を、ＰＬプロモーターを含有するｐＣＦＭ６３６（特許番号
第４７１０４７３号）から得られた類似のフラグメント（以下の配列番号３８６
を参照のこと）と置き換えること；および （ｃ）独自のＣｌａＩおよびＫｐｎＩ制限部位間の小型のＤＮＡ配列を配列番
号３８８の配列を有するオリゴヌクレオチドと置換すること； により記載したｐＣＦＭ８３６プラスミド（特許番号第４７１０４７３号）から
誘導できる。
【０２１４】
【表３０】
【０２１５】 次いでＰＣＲ重複オリゴ変異誘発およびＤＮＡ配列置換により一連の部位特異
的塩基変化を作ることによりｐＣＦＭ１６５６から発現プラスミドｐＡＭＧ２１
を誘導できる。ＢｇＩＩＩ部位（プラスミド塩基対＃１８０）すぐの５‘でプラ
スミド複製プロモーターＰｃｏｐＢに向かって出発し、プラスミド複製遺伝子に
向かって進んだときの、塩基対変化を以下の表Ｂに示す。
【０２１６】
【表３１】
【０２１７】 独自のＡａｔＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６の＃４３６４位置）およびＳａｃＩＩ（
ｐＣＦＭ１６５６の＃４５８５位置）制限部位間のＤＮＡ配列を図１７Ａおよび
１７Ｂで示すＤＮＡ配列（配列番号２３）で置換する。この置換ＤＮＡ配列の付
着端をライゲートしている間に外側のＡａｔＩＩおよびＳａｃＩＩ部位を崩壊す
る。置換されたＤＮＡには独自のＡａｔＩＩおよびＳａｃＩＩ部位が存在する。
【０２１８】 ＧＭ２２１（アムゲン＃２５９６） アムゲン＃２５９６宿主株はアムゲン＃３９３株から誘導した大腸菌Ｋ１２株
である。これを修飾し、初期ｅｂｇ領域に温度感受性ラムダレプレッサーｃＩ８
５７ｓ７、後期ｅｂｇ領域にｌａｃＩＱレプレッサーの両方を含むようにした（
６８分）。これらの２個のレプレッサー遺伝子の存在によりこの宿主が種々の発
現系と共に使用できるようになるが、しかしながらこれらの両方のレプレッサー
はｌｕｘＰＲからの発現には適切ではない。形質転換されなかった宿主は抗生物
質抵抗性がない。
【０２１９】 ｃＩ８５７ｓ７遺伝子のリボソーム結合部位を修飾して強化ＲＢＳを含むよう
にした。介在ｅｂｇ配列を欠失したジーンバンク受入番号Ｍ６４４４１Ｇｂ Ｂ
ａを付与されたヌクレオチド１１７０および１４１１位置間のｅｂｇオペロンに
これを挿入した。挿入配列を以下に示し、小文字は以下の挿入配列をフランキン
グするｅｂｇ配列を表している（配列番号３８８）。
【０２２０】
【表３２】
【０２２１】 ＭＭｅｂｇ−ｃＩ８５７ｓ７強化ＲＢＳ＃４と称する組換えファージを用いて
Ｆ‘ｔｅｔ／３９３の染色体に構築物を分配した。組換えおよび切開の後、前記
の染色体挿入物のみが細胞に残る。これを再度Ｆ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１と名付け
た。次いで介在ｅｂｇ配列を欠失したジーンバンク受入番号Ｍ６４４４１Ｇｂ
Ｂａを付与されたヌクレオチド位置２４９３および２９３７間のｅｂｇオペロン
にｌａｃＩＱ構築物を分配することによりＦ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１を修飾した。
挿入配列を以下に示し、小文字は以下の挿入配列をフランキングするｅｂｇ配列
を表している（配列番号３８９）。
【０２２２】
【表３３】
【０２２３】 ＡＧｅｂｇ−ＬａｃＩＱ＃５と称する組換えファージを用いてＦ’ｔｅｔ／Ｇ
Ｍ１０１の染色体に構築物を分配した。組換えおよび切開の後、前記の染色体挿
入物のみが細胞に残る。これを再度Ｆ’ｔｅｔ／ＧＭ２２１と名付けた。ＬＢ中
２５μｇ／ｍｌの濃度のアクリジン・オレンジを用いてＦ’ｔｅｔエピソームを
株からキュアリングした。キュアリングされた株はテトラサイクリン感受性であ
ると同定され、ＧＭ２２１として保存した。
【０２２４】 発現 誘導前に大腸菌ＧＭ２２１のｐＡＭＧ２１−Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰの培養物を
５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ルリア・ブロス培地中３７℃でインキュベート
した。最終濃度２０ｎｇ／ｍｌになるように培養培地に合成オートインデューサ
ーＮ−（３−オクソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリン・ラクトンを添加するこ
とによりｌｕｘＰＲプロモーターからＦｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰ遺伝子生成物発現を
誘導し、培養物を３７℃でさらに３時間インキュベートした。３時間後、封入体
の存在に関して細菌培養物を顕微鏡で試験し、次いで遠心により収集した。誘導
した培養物中光屈折性の封入体が観察され、これはＦｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰが大腸
菌の不溶性分画においてほとんどが生成されていることを示している。１０％β
−メルカプトエタノールを含有するラエムリ・サンプル緩衝液に再懸濁すること
により細胞ペレットを直接的に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルにおよそ３０ｋＤａのクーマシー染色の強いバンドが観察され
た。予測される遺伝子生成物は２６９個のアミノ酸の長さであり、予測される分
子量は約２９．５ｋＤａである。また１０ｌのスケールで標準バッチ条件下発酵
をも行い、ベンチスケールで得られた発現レベルに類似したＦｃ−ＴＭＰ−ＴＭ
Ｐの発現レベルが得られた。
【０２２５】 Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰの精製 高圧ホモジナイゼーション（１４０００ＰＳＩで２パス）により水中（１／１
０）で細胞を破壊し、遠心（Ｊ−６Ｂで４２００ＲＰＭで１時間）により封入体
を回収した。６Ｍ グアニジン、５０ｍＭ トリス、８ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ８．
７）中１時間１／１０の比率で封入体を可溶化する。可溶化した混合物を２Ｍ
尿素、５０ｍＭ トリス、１６０ｍＭ アルギニン、３ｍＭ システイン（ｐＨ
８．５）で２０倍希釈する。混合物を一晩冷却して攪拌し、次いで限外濾過によ
り約１０倍に濃縮する。次いで１０ｍＭ トリス、１．５Ｍ 尿素（ｐＨ９）で
３倍希釈する。次いでこの混合物のｐＨを酢酸でｐＨ５に調整する。沈殿物を遠
心により除去し、２０ｍＭ ＮａＡｃ、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５）で平衡
にしたＳＰ−セファロース・ファスト・フロー・カラムに上澄を装填する（１０
ｍｇ／ｍｌ タンパク質装填、室温）。１００ｍＭ ＮａＣｌないし５００ｍＭ
ＮａＣｌの範囲の同一緩衝液の２０カラム容量グラジエントを用いてタンパク
質を溶出する。カラムからのプールを３倍希釈し、２０ｍＭ ＮａＡｃ、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５）で平衡にしたＳＰ−セファロースＨＰカラムに装填す
る（１０ｍｇ／ｍｌ タンパク質装填、室温）。１５０ｍＭ ＮａＣｌないし４
００ｍＭ ＮａＣｌの範囲の同一緩衝液の２０カラム容量グラジエントを用いて
タンパク質を溶出する。ピークをプールし、濾過する。
【０２２６】 Ｆｃ−ＴＭＰ活性の特徴付け 以下は本発明の種々化合物を用いたマウスにおけるインビボデータの要旨であ
る。
【０２２７】 マウス：およそ１０ないし１２週齢の正常雌ＢＤＦ１。
【０２２８】 出血スケジュール：群あたり１０匹のマウスを０日に処置、４日後に２群で開
始、全部で群あたりマウス２０匹。各時間に５匹のマウスを出血させ、最低週３
回出血させた。イソフルランでマウスを麻酔し、眼窩洞の穿刺により血液全量で
１４０ないし１６０μｌを得た。ネズミ血液に関するソフトウェアを用いてテク
ニコンＨ１Ｅ血液アナライザーで血液をカウントした。測定したパラメーターは
白血球、赤血球、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板、好中球である。
【０２２９】 処置：マウスにボーラス処置用に皮下注射するかまたは連続投与用に７日用マ
イクロ浸透圧ポンプを埋めこんだ。０．２ｍｌの容量を皮下注射した。麻酔した
マウスの皮膚と肩甲骨の間で皮下切開し、浸透圧ポンプを挿入した。化合物を０
．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した。全実験には対照群が含まれ、この希釈
物のみで処置されたものには「キャリヤ」とラベル表示した。ポンプ中の試験物
質の濃度を調整し、ポンプからの測定流速から処置レベルが得られ、これをグラ
フに表示した。
【０２３０】 化合物：化合物の滴定用量を７日用マイクロ浸透圧ポンプでマウスに送達した
。７日用マイクロ浸透圧ポンプで１回用量１００μｇ／ｋｇの種々化合物でマウ
スを処置した。次いで同一化合物のいくつかを１回ボーラス注射してマウスに投
与した。
【０２３１】 活性試験結果：活性実験の結果を図１１および１２に示す。７日用マイクロ浸
透圧ポンプを用いる用量依存性検定では配列番号１８の化合物１００μｇ／ｋｇ
／日で最大効果が得られ；１０μｇ／ｋｇ／日の用量で最大活性の約５０％、お
よび１μｇ／ｋｇ／日はこの検定系で活性が認められる最低用量であった。化合
物は１０μｇ／ｋｇ／日の用量で同一実験におけるＰＥＧ化していないｒＨｕ−
ＭＧＤＦ１００μｇ／ｋｇ／日とほぼ同等の活性を示した。
【０２３２】 実施例３ Ｆｃ−ＥＭＰ融合 Ｆｃ−ＥＭＰ 標準ＰＣＲ技術を用いてＥＰＯ擬似ペプチドの単量体にイン・フレーム融合し
たヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳
型はＦｃ配列（ｐＦｃ−Ａ３、１９９７年７月３日公開の国際出願ＷＯ９７／２
３６１４に記載）を含有するベクターおよびＥＰＯ単量体をコードする合成遺伝
子であった。単量体の合成遺伝子は以下に示す４個の重複オリゴヌクレオチド（
各々配列番号３９０ないし３９３）から構築した：
【０２３３】
【表３４】 ４個のオリゴヌクレオチドをアニーリングして以下に示すアミノ酸配列をコード
する二本鎖を形成した（各々配列番号３９４および３９５）：
【０２３４】
【表３５】 センスおよびアンチセンスプライマーとして
【０２３５】
【表３６】 および
【０２３６】
【表３７】 （各々配列番号３９６および３９７）を用いてこの二本鎖をＰＣＲ反応で増幅し
た。
【０２３７】 プライマー：
【０２３８】
【表３８】 （配列番号３９８および３９９）を用いてｐＦｃ−Ａ３とのＰＣＲ反応で分子の
Ｆｃ領域を作った。オリゴヌクレオチド１７９８−１７および１７９８−１８は
６１個のヌクレオチドの重複を含有し、アウトサイド・プライマー１２１６−５
２および１７９８−１９を用いて第３の反応で前記のＰＣＲ生成物を組合わせる
ことにより、２個の遺伝子が正確な読み枠で一緒に融合できるようになる。
【０２３９】 最終的なＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＸ
ｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１（以下に記載）
にライゲートし、またＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化した。ライゲートしたＤ
ＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株のコンピテント宿主細胞（本明細書に
おいてＧＭ２２１と称する）に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し
、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクロー
ンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃３７１８株
と称した。
【０２４０】 得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１５お
よび１６）を図１３に示す。
【０２４１】 ＥＭＰ−Ｆｃ 標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合し
たＥＰＯ擬似ペプチドの単量体をコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応
の鋳型はｐＦｃ−Ａ３ａベクターおよびＥＰＯ単量体をコードする合成遺伝子で
あった。４個の重複オリゴヌクレオチド１７９８−４および１７９８−５（前記
）並びに１７９８−６および１７９８−７（各々配列番号４００および４０１）
から以下に示す単量体の合成遺伝子を構築した：
【０２４２】
【表３９】 ４個のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、アミノ酸配列をコードする二本鎖
を形成し（各々配列番号４０２および４０３）、以下に示す：
【０２４３】
【表４０】 センスおよびアンチセンスプライマーとして：
【０２４４】
【表４１】 および
【０２４５】
【表４２】 （各々配列番号４０４および４０５）を用い、ＰＣＲ反応で二本鎖を増幅した。
【０２４６】 プライマー
【０２４７】
【表４３】 （各々配列番号４０６および４０７）を用いてｐＦｃ−Ａ３とのＰＣＲ反応で分
子のＦｃ部分を作った。オリゴヌクレオチド１７９８−２２および１７９８−２
３は４３個のヌクレオチドの重複を含有し、アウトサイド・プライマー１７８７
−２１および１２００−５４を用いて第３のＰＣＲ反応で前記のＰＣＲ生成物を
組合わせることにより２個の遺伝子を正確な読み枠に一緒に融合できる。
【０２４８】 前記するように、最終的なＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エン
ドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２
１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形
質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有す
る遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかる
クローン１個を選別し、アムゲン＃３６８８株と称した。
【０２４９】 得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１７お
よび１８）を図１４に示す ＥＭＰ−ＥＭＰ−Ｆｃ 標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合し
たＥＰＯ擬似ペプチドの二量体をコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応
の鋳型は前記の＃３６８８株のＥＭＰ−ＦｃプラスミドおよびＥＰＯ二量体をコ
ードする合成遺伝子であった。８個の重複オリゴヌクレオチドから以下に示す二
量体の合成遺伝子を構築した（各々配列番号４０８ないし４１５）：
【０２５０】
【表４４】 ８個のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、アミノ酸配列（各々配列番号４１
６および４１７）をコードする以下に示す二本鎖を形成した：
【０２５１】
【表４５】 センスおよびアンチセンスプライマーとして１８６９−２３および１８７１−
７９（前記で示す）を用い、ＰＣＲ反応で二本鎖を増幅した。
【０２５２】 プライマー１７９８−２３および１２００−５４（前記で示す）を用いて＃３
６８８株ＤＮＡとのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った。
【０２５３】 オリゴヌクレオチド１８７２−７９および１７９８−２３３１個のヌクレオチ
ド重複を含有し、アウトサイド・プライマー１８６９−２３および１２００−５
４を用いて第３のＰＣＲ反応で前記のＰＣＲ生成物を組合わせることにより２個
の遺伝子を正確な読み枠に一緒に融合させる。
【０２５４】 Ｆｃ−ＥＭＰに関して記載するように、最終的なＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺
伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次い
でベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ
）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌ
クレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリ
ーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃３８１３株と称した。
【０２５５】 得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（各々配列番号１
９および２０）を図１５に示す。１４５位置にサイレント変異（ＡからＧ、太字
で示す）があり、最終構築物がそれを誘導したオリゴヌクレオチド１８７１−７
２とは異なるヌクレオチド配列を有するようになる。
【０２５６】 Ｆｃ−ＥＭＰ−ＥＭＰ 標準的なＰＣＲ技術を用いてＥＰＯ擬似ペプチドの二量体にイン・フレーム融
合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応
の鋳型は前記の３６８８および３８１３株からのプラスミドであった。
【０２５７】 プライマー１２１６−５２および１７９８−１７（前記で示す）を用いて＃３
６８８株ＤＮＡとのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った。分子のＥＭＰ二量体
部分はプライマー１７９８−１８（これも前記で示す）および以下に示す配列番
号４１８：
【０２５８】
【表４６】 を用いた＃３８１３株ＤＮＡとの第２のＰＣＲ反応の生成物であった。
【０２５９】 オリゴヌクレオチド１７９８−１７および１７９８−１８は６１個のヌクレオ
チド重複を含有し、アウトサイド・プライマー１２１６−５２および１７９８−
２０を用いて第３の反応で前記のＰＣＲ生成物を組合わせることにより２個の遺
伝子を正確な読み枠に一緒に融合させる。
【０２６０】 Ｆｃ−ＥＭＰに関して記載するように、最終的なＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺
伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次い
でベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ
）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌ
クレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリ
ーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃３８２２株と称した。
【０２６１】 融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（各々配列番号 および
）を図１６に示す。
【０２６２】 Ｆｃ−ＥＭＰ活性の特徴付け インビボでの特徴づけは以下のとおり実施した。
【０２６３】 マウス：およそ１０ないし１２週齢の正常雌ＢＤＦ１。
【０２６４】 出血スケジュール：群あたり１０匹のマウスを０日に処置、４日後に２群で開
始、全部で群あたりマウス２０匹。各時間に５匹のマウスを出血させ、最低週３
回出血させた。イソフルランでマウスを麻酔し、眼窩洞の穿刺により血液全量で
１４０ないし１６０μｌを得た。ネズミ血液に関するソフトウェアを用いてテク
ニコンＨ１Ｅ血液アナライザーで血液をカウントした。測定したパラメーターは
白血球、赤血球、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板、好中球、リンパ球で
ある。
【０２６５】 処置：マウスにボーラス処置用に皮下注射するかまたは連続投与用に７日用マ
イクロ浸透圧ポンプを埋めこんだ。０．２ｍｌの容量を皮下注射した。麻酔した
マウスの皮膚と肩甲骨の間で皮下切開し、浸透圧ポンプを挿入した。化合物を０
．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した。全実験には対照群が含まれ、この希釈
物のみで処置されたものには「キャリヤ」とラベル表示した。ポンプ中の試験物
質の濃度を調整し、ポンプからの測定流速から処置レベルが得られ、これをグラ
フに表示した。
【０２６６】 実験：種々のＦｃ結合ＥＰＯ擬似ペプチド（ＥＭＰ）を１００μｇ／ｋｇの用
量で１回ボーラス注射してマウスに投与した。Ｆｃ−ＥＭＰは７日用マイクロ浸
透圧ポンプでマウスに分配した。７日の終わりにポンプを取り替えなかった。マ
ウスを５１日まで出血させ、そのときヘモグロビンおよびヘマトクリットが基底
値に戻った。
【０２６７】 実施例４ ＴＮＦ−α阻害因子 Ｆｃ−ＴＮＦ−α阻害因子 標準的なＰＣＲ技術を用いてＴＮＦ−α阻害因子の単量体にイン・フレーム融
合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。センスプラ
イマー１２１６−５２およびアンチセンスプライマー２２９５−８９（各々配列
番号１１１２および１１１３）を用いてＦｃ−ＥＭＰ融合＃３７１８株（実施例
３を参照のこと）のＤＮＡとのＰＣＲ反応で分子のＦｃおよび５グリシンリンカ
ー部分を作った。以下に示すＰＣＲプライマー２２９５−８９によりＴＮＦ−α
阻害ペプチドをコードするヌクレオチドが提供される：
【０２６８】
【表４７】 オリゴヌクレオチド２２９５−８９は２２個のヌクレオチドにより鋳型のグリシ
ンリンカーおよびＦｃ部分を重複し、ＰＣＲで得られた２個の遺伝子を正確な読
み枠で一緒に融合した。
【０２６９】 本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合
遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次
いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確な
ヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスク
リーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５４４株と称した
。
【０２７０】 融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０５５および
１０５６）を図１９Ａおよび１９Ｂに示す。
【０２７１】 ＴＮＦ−α阻害因子−Ｆｃ 標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合し
たＴＮＦ−α阻害ペプチドをコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳
型は５個のグリシンリンカーを介してＦｃに融合した関連性のないペプチドを含
有するプラスミドであった。アンチセンスプライマーとして提供されるプライマ
ー１２００−５４とセンスＰＣＲプライマー２２９５−８８（各々配列番号１１
１７および４０７）によりＴＮＦ−α阻害ペプチドをコードするヌクレオチドが
提供された。プライマー配列を以下に示す：
【０２７２】
【表４８】 オリゴヌクレオチド２２９５−８８は２４個のヌクレオチドにより鋳型のグリシ
ンリンカーおよびＦｃ部分を重複し、ＰＣＲで得られた２個の遺伝子を正確な読
み枠で一緒に融合した。
【０２７３】 本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合
遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次
いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確な
ヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスク
リーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５４３株と称した
。
【０２７４】 融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０５７および
１０５８）を図２０Ａおよび２０Ｂに示す。
【０２７５】 大腸菌における発現 大腸菌ＧＭ２２１のｐＡＭＧ２１−Ｆｃ融合構築物の各々の培養物を５０ｍｇ
／ｍｌカナマイシン含有ルリア・ブロス培地中３７℃でインキュベートした。最
終濃度２０ｎｇ／ｍｌで培養培地に合成オートインデューサーＮ−（３−オクソ
ヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリン・ラクトンを添加することによりｌｕｘＰＲ
プロモーターから遺伝子生成物の発現を誘導した。培養物を３７℃でさらに３時
間インキュベートした。３時間後、封入体の存在に関して細菌培養物を顕微鏡で
試験し、次いで遠心により収集した。誘導した培養物中光屈折性の封入体が観察
され、これはＦｃ融合体が大腸菌の不溶性分画においてほとんどが生成されてい
ることを示している。１０％β−メルカプトエタノールを含有するラエムリ・サ
ンプル緩衝液に再懸濁することにより細胞ペレットを直接的に溶解し、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより分析した。各々の場合でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適当な分子量の
クーマシー染色の強いバンドが観察された。
【０２７６】 Ｆｃペプチド融合タンパク質の精製 高圧ホモジナイゼーション（１４０００ＰＳＩで２パス）により水中（１／１
０）で細胞を破壊し、遠心（Ｊ−６Ｂで４２００ＲＰＭで１時間）により封入体
を回収した。６Ｍ グアニジン、５０ｍＭ トリス、８ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ８．
７）中１時間１／１０の比率で封入体を可溶化する。可溶化した混合物を２Ｍ
尿素、５０ｍＭ トリス、１６０ｍＭ アルギニン、３ｍＭ システイン（ｐＨ
８．５）で２０倍希釈する。混合物を一晩冷却して攪拌し、次いで限外濾過によ
り約１０倍に濃縮する。次いで１０ｍＭ トリス、１．５Ｍ 尿素（ｐＨ９）で
３倍希釈する。次いでこの混合物のｐＨを酢酸でｐＨ５に調整する。沈殿物を遠
心により除去し、２０ｍＭ ＮａＡｃ、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５）で平衡
にしたＳＰ−セファロース・ファスト・フロー・カラムに上澄を装填する（１０
ｍｇ／ｍｌ タンパク質装填、室温）。１００ｍＭ ＮａＣｌないし５００ｍＭ
ＮａＣｌの範囲の同一緩衝液の２０カラム容量グラジエントを用いてカラムか
らタンパク質を溶出する。カラムからのプールを３倍希釈し、２０ｍＭ ＮａＡ
ｃ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５）で平衡にしたＳＰ−セファロースＨＰカラ
ムに装填する（１０ｍｇ／ｍｌ タンパク質装填、室温）。１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌないし４００ｍＭ ＮａＣｌの範囲の同一緩衝液の２０カラム容量グラジエン
トを用いてタンパク質を溶出する。ピークをプールし、濾過する。
【０２７７】 Ｆｃ−ＴＮＦα阻害因子およびＴＮＦ−α阻害因子−Ｆｃの活性の特徴付け 本明細書の教示を熟知する当業者に可能な方法によりＢＩＡコアによりこれら
のペプチド融合タンパク質のＴＮＦ−αへの結合を特徴付けできる。
【０２７８】 実施例５ ＩＬ−１拮抗物質 Ｆｃ−ＩＬ−１拮抗物質 標準的なＰＣＲ技術を用いてＩＬ−１拮抗物質ペプチドの単量体にイン・フレ
ーム融合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。セン
スプライマー１２１６−５２およびアンチセンスプライマー２２６９−７０（各
々配列番号１１１２および１１１８）を用いてＦｃ−ＥＭＰ融合＃３７１８株（
実施例３を参照のこと）のＤＮＡとのＰＣＲ反応で分子のＦｃおよび５グリシン
リンカー部分を作った。以下に示すＰＣＲプライマー２２６９−７０によりＩＬ
−１拮抗物質ペプチドをコードするヌクレオチドが提供される：
【０２７９】
【表４９】 オリゴヌクレオチド２２６９−７０は２２個のヌクレオチドにより鋳型のグリシ
ンリンカーおよびＦｃ部分を重複し、ＰＣＲで得られた２個の遺伝子が正確な読
み枠で一緒に融合される。
【０２８０】 本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合
遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次
いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）２５９６株細胞に形質転換し。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌ
クレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリ
ーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５０６株と称した。
【０２８１】 融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０５９および
１０６０）を図２１Ａおよび２１Ｂに示す。
【０２８２】 ＩＬ−１拮抗物質−Ｆｃ 標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合し
たＩＬ−１拮抗物質ペプチドをコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応の
鋳型は５個のグリシンリンカーを介してＦｃに融合した関連性のないペプチドを
含有するプラスミドであった。アンチセンスプライマーとして提供されるプライ
マー１２００−５４とセンスＰＣＲプライマー２２６９−６９により（各々配列
番号１１１９および４０７）ＩＬ−１拮抗物質ペプチドをコードするヌクレオチ
ドが提供された。プライマー配列を以下に示す：
【０２８３】
【表５０】 オリゴヌクレオチド２２６９−６９は２４個のヌクレオチドで鋳型のグリシンリ
ンカーおよびＦｃ部分を重複し、ＰＣＲで得られた２個の遺伝子が正確な読み枠
で一緒に融合される。
【０２８４】 本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合
遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次
いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確な
ヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスク
リーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５０５株と称した
。
【０２８５】 融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０６１および
１０６２）を図２２Ａおよび２２Ｂに示す。発現および精製は前記の実施例のと
おりに実施する。
【０２８６】 Ｆｃ−ＩＬ−１拮抗物質ペプチドおよびＩＬ−１拮抗物質ペプチド−Ｆｃの活
性の特徴付け ＩＧＥＮ系を用いてＩＬ−１β、Ｉｌ−１ＲＡおよびＦｃ−結合ＩＬ−１ペプ
チド配列間のＩＬ−１受容体結合競合検定を実施した。反応物は０．４ｎＭビオ
チン−ＩＬ−１Ｒ＋１５ｎＭ ＩＬ−１−ＴＡＧ＋３μＭ コペティター＋２０
μｇ／ｍｌストレプトビジン結合ビーズを含有し、ここでコンペティターはＩＬ
−１ＲＡ、Ｆｃ−ＩＬ−１拮抗物質、ＩＬ−１拮抗物質−Ｆｃである。コンペテ
ィター濃度３μＭないし１．５ｐＭの範囲で競合を検定した。結果を以下の表Ｃ
に示す：
【０２８７】
【表５１】
【０２８８】 実施例６ ＶＥＧＦ−拮抗物質 Ｆｃ−ＶＥＧＦ拮抗物質 標準的なＰＣＲ技術を用いてＶＥＧＦ擬似ペプチドの単量体にイン・フレーム
融合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードする配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳
型はｐＦｃ−Ａ３プラスミドおよび合成ＶＥＧＦ擬似ペプチド遺伝子であった。
以下の２個のオリゴヌクレオチドプライマー（各々配列番号１１２０および１１
２１）をアニーリングして合成遺伝子の集合体を形成した：
【０２８９】
【表５２】 ２個のオリゴヌクレオチドをアニーリングして以下に示すアミノ酸配列をコード
する二本鎖を形成した（配列番号１１２２）：
【０２９０】
【表５３】 センスおよびアンチセンスプライマーとして２２９３−０５および２２９３−０
６（各々配列番号１１２５および１１２６）を用いてこの二本鎖をＰＣＲ反応で
増幅した。
【０２９１】 センスおよびアンチセンスプライマーとしてプライマー２２９３−０３および
２２９３−０４（各々配列番号１１２３および１１２４）を用いてｐＦｃ−Ａ３
プラスミドとのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った。アウトサイド・プライマ
ー２２９３−０３および２２９３−０６を用いて第３のＰＣＲ反応で融合遺伝子
全長を得た。これらのプライマーを以下に示す：
【０２９２】
【表５４】
【０２９３】 本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合
遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次
いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確な
ヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスク
リーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５２３株と称した
。
【０２９４】 得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０６
３および１０６４）を図２３Ａおよび２３Ｂに示す。
【０２９５】 ＶＥＧＦ拮抗物質−Ｆｃ 標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合し
たＶＥＧＦ擬似ペプチドをコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳型
はｐＦｃ−Ａ３プラスミドおよび前記の合成ＶＥＧＦ擬似ペプチド遺伝子であっ
た。センスおよびアンチセンスプライマーとして２２９３−０７および２２９３
−０８（各々配列番号１１２７および１１２８）を用いてＰＣＲ反応で合成二本
鎖を増幅した。
【０２９６】 センスおよびアンチセンスプライマーとしてプライマー２２９３−０９および
２２９３−１０（各々配列番号１１２９および１１３０）を用いてｐＦｃＡ３プ
ラスミドとのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った。アウトサイド・プライマー
２２９３−０７および２２９３−１０を用いて第３のＰＣＲ反応で融合遺伝子全
長を得た。これらのプライマーを以下に示す：
【０２９７】
【表５５】
【０２９８】 本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合
遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次
いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）２５９６株に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌク
レオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリー
ニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５２４株と称した。
【０２９９】 得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０６
５および１０６６）を図２４Ａおよび２４Ｂに示す。発現および精製は前記の実
施例のとおり実施した。
【０３００】 実施例７ ＭＭＰ阻害因子 Ｆｃ−ＭＭＰ阻害因子 標準的なＰＣＲ技術を用いてＭＭＰ阻害ペプチドの単量体にイン・フレーム融
合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。センスプラ
イマー１２１６−５２およびアンチセンスプライマー２３０８−６７（各々配列
番号１１１２および１１３１）を用いてＦｃ−ＴＮＦ−α阻害因子融合株＃４５
４４（実施例４を参照のこと）からのＤＮＡとのＰＣＲ反応で分子のＦｃおよび
５グシリンリンカー部分を作った。ＭＭＰ阻害因子ペプチドをコードするヌクレ
オチドはＰＣＲプライマー２３０８−６７により提供され、以下に示す：
【０３０１】
【表５６】 オリゴヌクレオチド２３０８−６７は２２個のヌクレオチドにより鋳型のグリシ
ンリンカーおよびＦｃ部分を重複し、ＰＣＲにより２個の遺伝子が正確な読み枠
で一緒に融合される。
【０３０２】 本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合
遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次
いでベクターｐＡＭＧ２１）にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）２５９６株に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌ
クレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリ
ーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５９７株と称した。
【０３０３】 得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０６
７および１０６８）を図２５Ａおよび２５Ｂに示す。発現および精製は前記の実
施例のとおり実施した。
【０３０４】 ＭＭＰ阻害因子−Ｆｃ 標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合し
たＭＭＰ阻害ペプチドをコードするＤＮＡ配列を構築した。Ｆｃ−ＴＮＦ−α阻
害因子融合株＃４５４３（実施例４を参照のこと）からのＤＮＡとのＰＣＲ反応
で分子のＦｃおよび５グシリンリンカー部分を作った。ＭＭＰ阻害ペプチドをコ
ードするヌクレオチドはアンチセンスプライマーとして供されるプライマー１２
００−５４とセンスＰＣＲプライマー２３０８−６６により提供された。プライ
マー配列は以下に示す：
【０３０５】
【表５７】 オリゴヌクレオチド２２６９−６９は２４個のヌクレオチドで鋳型のグリシンリ
ンカーおよびＦｃ部分を重複し、ＰＣＲにより２個の遺伝子が正確な読み枠で一
緒に融合される。
【０３０６】 本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載されるように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融
合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、
次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）２５９６株に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌ
クレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリ
ーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５９８株と称した。
【０３０７】 得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０６
９および１０７０）を図２６Ａおよび２６Ｂに示す。
【０３０８】 本発明はここに十分に記載されるが、本明細書において前記した本発明の精神
および範囲から逸脱することなく当業者がそこに多くの変更および修飾を行うこ
とができるのは明らかであろう。
【０３０９】 略語 本明細書において使用した略語を特記しない限り以下のように定義する。 Ａｃ：アセチル（アセチル化残基に関して使用） ＡｃＢｐａ：アセチル化ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン ＡＤＣＣ：抗体依存性細胞毒性 Ａｉｂ：アミノイソブチル酸 βＡ：ベータ・アラニン Ｂｐａ：ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン ＢｒＡｃ：ブロモアセチル（ＢｒＣＨ２Ｃ（Ｏ）） ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン Ｂｚｌ：ベンジル Ｃａｐ：カプロン酸 ＣＴＬ：細胞毒性Ｔリンパ球 ＣＴＬＡ４：細胞毒性Ｔリンパ球抗原４ ＤＡＲＣ：ダッフィ式血液型抗原受容体 ＤＣＣ：ジシルコヘキシルカルボジイミド Ｄｄｅ：１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオクソ−シクロヘキシルジエン）
エチル ＥＭＰ：エリトロポエチン擬似ペプチド ＥＳＩ−ＭＳ：電子スプレイイオン化質量分析法 ＥＰＯ：エリトロポエチン Ｆｍｏｃ：フルオレニルメトキシカルボニル Ｇ−ＣＳＦ：顆粒球コロニー刺激因子 ＧＨ：成長ホルモン ＨＣＴ：ヘマトクリット ＨＧＢ：ヘモグロビン ｈＧＨ：ヒト成長ホルモン ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー ＩＬ：インターロイキン ＩＬ−Ｒ：インターロイキン受容体 ＩＬ−１Ｒ：インターロイキン−１受容体 ＩＬ−１ｒａ：インターロイキン−１受容体拮抗物質 Ｌａｕ：ラウリン酸 ＬＰＳ：リポ多糖類 ＬＹＭＰＨ：リンパ球 ＭＡＬＤＩ−ＭＳ：行列補助レーザー脱離イオン化質量分析法 Ｍｅ：メチル ＭｅＯ：メトキシ ＭＨＣ：主要組織適合複合体 ＭＭＰ：マトリックス・メタロプロテイナーゼ ＭＭＰＩ：マトリックス・メタロプロテイナーゼ・阻害因子 １−Ｎａｐ：１−ナフチルアラニン ＮＥＵＴ：好中球 ＮＧＦ：神経成長因子 Ｎｌｅ：ノルロイシン ＮＭＰ：Ｎ−メチル−２−ピロリジノン ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水 Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンダメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルフ
ォニル ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応 Ｐｅｃ：ピペコリン酸 ＰＥＧ：ポリ（エチレングリコール） ｐＧｌｕ：ピログルタミン酸 Ｐｉｃ：ピコリン酸 ＰＬＴ：血小板 ｐＹ：ホスフォチロシン ＲＢＣ：赤血球 ＲＢＳ：リボソーム結合部位 ＲＴ：室温（２５℃） Ｓａｒ：サルコシン ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム ＳＴＫ：セリン−スレオニン・キナーゼ ｔ−Ｂｏｃ：ターシャリー・ブトキシカルボニル ｔＢｕ：ターシャリー・ブチル ＴＧＦ：組織成長因子 ＴＨＦ：胸腺液性因子 ＴＫ：チロシン・キナーゼ ＴＭＰ：トロンボポエチン擬似ペプチド ＴＮＦ：組織壊死因子 ＴＰＯ：トロンボポエチン ＴＲＡＩＬ：ＴＮＦ関連アポトシス誘起リガンド Ｔｒｔ：トリチル ＵＫ：ウロキナーゼ ＵＫＲ：ウロキナーゼ受容体 ＶＥＧＦ：血管内皮細胞成長因子 ＶＩＰ：血管作用性小腸ペプチド ＷＢＣ：白血球
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の例示的方法の概要図を示す。この好ましい方法では、ビヒク
ルはＦｃドメインであり、それがＦｃドメインとペプチドの両方をコードするＤ
ＮＡ構築物からの発現によってペプチドに共有結合する。図１に示すように、Ｆ
ｃドメインはこの方法において自発的に二量体を形成する。
【図２Ａ】 ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、こ
こでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体を表わす
。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリンカー−ペ
プチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである： 一重ジスルフィド結合二量体。ＩｇＧ１抗体は、典型的には定常領域と可変領
域の間のちょうつがい部位に２個のジスルフィド結合を持つ。図２Ａと２Ｄにお
けるＦｃドメインは、２個のジスルフィド結合部位間の切断によって、若しくは
非反応性残基（例えばアラニル）によるシステイニル残基の置換によって形成さ
れうる。Ｆｃドメインはペプチドのアミノ末端で結合している。
【図２Ｂ】 ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、こ
こでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体を表わす
。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリンカー−ペ
プチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである： 二重ジスルフィド結合二量体。このＦｃドメインは、Ｆｃドメイン鎖中の両方
のシステイニル残基を保持するように親抗体を切断することによって、若しくは
そのようなＦｃドメインをコードする配列を含む構築物からの発現によって形成
されうる。Ｆｃドメインはペプチドのアミノ末端で結合している。
【図２Ｃ】 ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、こ
こでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体を表わす
。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリンカー−ペ
プチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである： 非共有結合二量体。このＦｃドメインは、切断又は置換によるシステイニル残
基の除去によって形成されうる。当該システイニル残基と宿主細胞中に存在する
他のタンパク質のシステイニル残基の反応によって不純物が形成されるのを避け
るため、システイニル残基を除去することが所望される場合がある。Ｆｃドメイ
ンの非共有結合は二量体を結びつけるのに十分である。異なる種類の抗体（例え
ばＩｇＧ２、ＩｇＭ）から誘導したＦｃドメインを使用することにより、他の二
量体を形成することができる。
【図２Ｄ】 ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、こ
こでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体を表わす
。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリンカー−ペ
プチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである： 一重ジスルフィド結合二量体。ＩｇＧ１抗体は、典型的には定常領域と可変領
域の間のちょうつがい部位に２個のジスルフィド結合を持つ。図２Ａと２Ｄにお
けるＦｃドメインは、２個のジスルフィド結合部位間の切断によって、若しくは
非反応性残基（例えばアラニル）によるシステイニル残基の置換によって形成さ
れうる。Ｆｃドメインはカルボキシル末端で結合している。
【図２Ｅ】 ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、こ
こでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体を表わす
。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリンカー−ペ
プチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである： 二重ジスルフィド結合二量体。このＦｃドメインは、Ｆｃドメイン鎖中の両方の
システイニル残基を保持するように親抗体を切断することによって、若しくはそ
のようなＦｃドメインをコードする配列を含む構築物からの発現によって形成さ
れうる。Ｆｃドメインはカルボキシル末端で結合している。
【図２Ｆ】 ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、こ
こでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体を表わす
。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリンカー−ペ
プチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである： 非共有結合二量体。このＦｃドメインは、切断又は置換によるシステイニル残
基の除去によって形成されうる。当該システイニル残基と宿主細胞中に存在する
他のタンパク質のシステイニル残基の反応によって不純物が形成されるのを避け
るため、システイニル残基を除去することが所望される場合がある。Ｆｃドメイ
ンの非共有結合は二量体を結びつけるのに十分である。異なる種類の抗体（例え
ばＩｇＧ２、ＩｇＭ）から誘導したＦｃドメインを使用することにより、他の二
量体を形成することができる。
【図３Ａ】 薬理学的に活性なペプチドのタンデムリピートを特徴とする、本発明の好まし
い化合物の構造を示す。本図面は、一本鎖の分子を示し、またかかる分子に関す
るＤＮＡ構築物も表わしうる。
【図３Ｂ】 薬理学的に活性なペプチドのタンデムリピートを特徴とする、本発明の好まし
い化合物の構造を示す。本図面は、リンカー−ペプチド部分が二量体の１本の鎖
にだけ存在する二量体を示す。
【図３Ｃ】 薬理学的に活性なペプチドのタンデムリピートを特徴とする、本発明の好まし
い化合物の構造を示す。本図面は、両方の鎖上にペプチド部分を持つ二量体を示
す。本図面の二量体は、図３Ａに示す一本鎖をコードするＤＮＡ構築物の発現の
際に一部の宿主細胞において自発的に形成される。他の宿主細胞では、細胞を二
量体の形成を促進する条件下に置くか、若しくは二量体をインビトロで形成する
ことができる。
【図４】 図４は、本発明において使用しうるヒトＩｇＧ１ Ｆｃの例示的核酸及びアミ
ノ酸配列（それぞれ配列番号１及び２）を示す。
【図５】 図５は、ＰＥＧ化ペプチド１９（配列番号３）の製造のための合成概要図を示
す。
【図６】 図６は、ＰＥＧ化ペプチド２０（配列番号４）の製造のための合成概要図を示
す。
【図７】 図７は、下記の実施例２において「Ｆｃ−ＴＭＰ」として同定される分子のヌ
クレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号５及び６）を示す。
【図８】 図８は、下記の実施例２において「Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰ」として同定される
分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号７及び８）を示す。
【図９】 図９は、下記の実施例２において「ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃ」として同定される
分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号９及び１０）を示す。
【図１０】 図１０は、下記の実施例２において「ＴＭＰ−Ｆｃ」として同定される分子の
ヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１１及び１２）を示す。
【図１１】 図１１は、次のように定義される条件下で、種々の化合物の１００μｇ／ｋｇ
の単回ボーラス注射によって処置した正常雌性ＢＤＦ１マウスにおいてインビボ
で生成される血小板数を示す。 ＰＥＧ−ＭＧＤＦ：大腸菌において発現される（従ってグリコシル化されてい
ない）、還元的アミノ化によって天然ヒトＴＰＯのアミノ酸１−１６３のＮ末端
アミノ基に連結した平均分子量２０ｋＤのＰＥＧ、 ＴＭＰ：アミノ酸配列、ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ（配列番号１３）を持
つＴＰＯ擬似ペプチド、 ＴＭＰ−ＴＭＰ：アミノ酸配列、ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ−ＧＧＧＧＧ
ＧＧＧ−ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ（配列番号１４）を持つＴＰＯ擬似ペプ
チド、 ＰＥＧ−ＴＭＰ−ＴＭＰ：ＰＥＧ基が図６に示すような平均分子量５ｋＤのＰ
ＥＧである、配列番号１４のペプチド、 Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰ：同一の第二モノマーで二量体化された（すなわち、図
２に示すように、Ｃｙｓ残基７と１０が第二モノマー中の対応するＣｙｓ残基に
結合して二量体を形成する）配列番号８（図８）の化合物、そして ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃは、ＦｃドメインがＴＭＰ−ＴＭＰペプチドのＮ末端で
はなくＣ末端で結合していることを除いて、ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃと同じように
二量体化された配列番号１０（図９）の化合物である。
【図１２】 図１２は、移植した浸透圧ポンプを通して送達される種々の化合物で７日間に
わたって処置した正常ＢＤＦ１マウスにおいて、インビボで生成された血小板の
数を示す。化合物は図７について定義されたとおりである。
【図１３】 図１３は、下記の実施例３において「Ｆｃ−ＥＭＰ」として同定される分子の
ヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１５及び１６）を示す。
【図１４】 図１４は、下記の実施例３において「ＥＭＰ−Ｆｃ」として同定される分子の
ヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１７及び１８）を示す。
【図１５】 図１５は、下記の実施例３において「ＥＭＰ−ＥＭＰ−Ｆｃ」として同定され
る分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１９及び２０）を示
す。
【図１６】 図１６は、下記の実施例３において「Ｆｃ−ＥＭＰ−ＥＭＰ」として同定され
る分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号２１及び２２）を示
す。
【図１７Ａ】 発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣアクセス番号９８１１３）を形成する
ためにユニークＡａｔＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６中４３６４位）とＳａｃＩＩ（ｐ
ＣＦＭ１６５６中４５８５位）制限部位の間に挿入されるＤＮＡ配列（配列番号
２３）を示す。
【図１７Ｂ】 発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣアクセス番号９８１１３）を形成する
ためにユニークＡａｔＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６中４３６４位）とＳａｃＩＩ（ｐ
ＣＦＭ１６５６中４５８５位）制限部位の間に挿入されるＤＮＡ配列（配列番号
２３）を示す。
【図１８Ａ−１】 種々の化合物の１００μｇ／ｋｇの単回ボーラス注射によって処置した正常雌
性ＢＤＦ１マウスにおいてインビボで生成されるヘモグロビンを示す。
【図１８Ａ−２】 種々の化合物の１００μｇ／ｋｇの単回ボーラス注射によって処置した正常雌
性ＢＤＦ１マウスにおいてインビボで生成される赤血球を示す。
【図１８Ａ−３】 種々の化合物の１００μｇ／ｋｇの単回ボーラス注射によって処置した正常雌
性ＢＤＦ１マウスにおいてインビボで生成されるヘマトクリットを示す。
【図１８Ｂ−１】 図１８Ｂは、ＥＭＰに関しては１００μｇ／ｋｇ、ｒｈＥＰＯに関しては３０
Ｕ／マウスで送達される微小浸透圧ポンプにより７日間にわたって１００μｇ／
ｋｇ／日で処置したマウスについてのヘモグロビンを示す。
【図１８Ｂ−２】 図１８Ｂは、ＥＭＰに関しては１００μｇ／ｋｇ、ｒｈＥＰＯに関しては３０
Ｕ／マウスで送達される微小浸透圧ポンプにより７日間にわたって１００μｇ／
ｋｇ／日で処置したマウスについての赤血球を示す。
【図１８Ｂ−３】 図１８Ｂは、ＥＭＰに関しては１００μｇ／ｋｇ、ｒｈＥＰＯに関しては３０
Ｕ／マウスで送達される微小浸透圧ポンプにより７日間にわたって１００μｇ／
ｋｇ／日で処置したマウスについてのヘマトクリットを示す。
【図１９Ａ】 下記の実施例４で述べるＦｃ−ＴＮＦ−α阻害因子融合分子のヌクレオチド及
びアミノ酸配列（配列番号１０５５及び１０５６）を示す。
【図１９Ｂ】 下記の実施例４で述べるＦｃ−ＴＮＦ−α阻害因子融合分子のヌクレオチド及
びアミノ酸配列（配列番号１０５５及び１０５６）を示す。
【図２０Ａ】 下記の実施例４で述べるＴＮＦ−α阻害因子−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及
びアミノ酸配列（配列番号１０５７及び１０５８）を示す。
【図２０Ｂ】 下記の実施例４で述べるＴＮＦ−α阻害因子−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及
びアミノ酸配列（配列番号１０５７及び１０５８）を示す。
【図２１Ａ】 下記の実施例５で述べるＦｃ−ＩＬ−１拮抗物質融合分子のヌクレオチド及び
アミノ酸配列（配列番号１０５９及び１０６０）を示す。
【図２１Ｂ】 下記の実施例５で述べるＦｃ−ＩＬ−１拮抗物質融合分子のヌクレオチド及び
アミノ酸配列（配列番号１０５９及び１０６０）を示す。
【図２２Ａ】 下記の実施例５で述べるＩＬ−１拮抗物質−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及び
アミノ酸配列（配列番号１０６１及び１０６２）を示す。
【図２２Ｂ】 下記の実施例５で述べるＩＬ−１拮抗物質−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及び
アミノ酸配列（配列番号１０６１及び１０６２）を示す。
【図２３Ａ】 下記の実施例６で述べるＦｃ−ＶＥＧＦ拮抗物質融合分子のヌクレオチド及び
アミノ酸配列（配列番号１０６３及び１０６４）を示す。
【図２３Ｂ】 下記の実施例６で述べるＦｃ−ＶＥＧＦ拮抗物質融合分子のヌクレオチド及び
アミノ酸配列（配列番号１０６３及び１０６４）を示す。
【図２３Ｃ】 下記の実施例６で述べるＦｃ−ＶＥＧＦ拮抗物質融合分子のヌクレオチド及び
アミノ酸配列（配列番号１０６３及び１０６４）を示す。
【図２４Ａ】 下記の実施例６で述べるＶＥＧＦ拮抗物質−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及び
アミノ酸配列（配列番号１０６５及び１０６６）を示す。
【図２４Ｂ】 下記の実施例６で述べるＶＥＧＦ拮抗物質−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及び
アミノ酸配列（配列番号１０６５及び１０６６）を示す。
【図２５Ａ】 下記の実施例７で述べるＦｃ−ＭＭＰ阻害因子融合分子のヌクレオチド及びア
ミノ酸配列（配列番号１０６７及び１０６８）を示す。
【図２５Ｂ】 下記の実施例７で述べるＦｃ−ＭＭＰ阻害因子融合分子のヌクレオチド及びア
ミノ酸配列（配列番号１０６７及び１０６８）を示す。
【図２６Ａ】 下記の実施例７で述べるＭＭＰ阻害因子−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びア
ミノ酸配列（配列番号１０６９及び１０７０）を示す。
【図２６Ｂ】 下記の実施例７で述べるＭＭＰ阻害因子−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びア
ミノ酸配列（配列番号１０６９及び１０７０）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ ４Ｈ０４５ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/566 33/566 Ａ６１Ｐ 3/04 // Ａ６１Ｋ 38/00 19/02 Ａ６１Ｐ 3/04 29/00 19/02 31/04 29/00 31/12 31/04 31/18 31/12 35/00 31/18 35/02 35/00 37/02 35/02 43/00 １１１ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:19 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 リウ，チユアン−フア アメリカ合衆国、コロラド・80503、ロン グモント、クローバー・クリーク・ドライ ブ・1425 (72)発明者 チータム，ジヤネツト アメリカ合衆国、カリフオルニア・93108、 モンテシト、イースト・バリー・ロード・ 1695 (72)発明者 ブーン，トーマス・チヤールズ アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、 ニユーベリー・パーク、デイア・バリー・ アベニュー・3010 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 CB21 DA13 DA36 FB01 FB02 4B024 AA01 BA21 BA44 CA04 CA07 DA06 EA03 EA04 GA11 HA06 4B064 AG02 AG26 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AB01 BA02 CA24 CA25 CA44 4C084 AA07 AA25 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 BA41 CA18 CA53 DA01 DA13 DA25 DA45 DA59 DB52 DB53 DB56 DC32 DC50 NA05 NA14 ZA701 ZA961 ZB051 ZB071 ZB111 ZB261 ZB271 ZB331 ZB351 ZC202 ZC412 ZC551 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 CA42 DA01 DA75 EA20 EA61 FA74

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式： （Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ ［式中、Ｆ１はＦｃドメインであり、 Ｘ１及びＸ２は、各々独立に−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ ２ ）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３、及
    び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ ４ から選択され、 Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は各々独立に薬理学的に活性なペプチドの配列であ
    り、 Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は各々独立にリンカーであり、そして ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、ａとｂの少なくとも一方が１であることを条件
    として、各々独立に０又は１である］ の物質及びその多量体の組成物。
  2. 【請求項２】 式： Ｘ１−Ｆ１ 又は Ｆ１−Ｘ２ の請求項１に記載の物質の組成物。
  3. 【請求項３】 式： Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１ の請求項１に記載の物質の組成物。
  4. 【請求項４】 式： Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２ の請求項１に記載の物質の組成物。
  5. 【請求項５】 Ｆ１がＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項１に記載の物質
    の組成物。
  6. 【請求項６】 Ｆ１がＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１に記載の物
    質の組成物。
  7. 【請求項７】 Ｆ１が配列番号２の配列を含む、請求項１に記載の物質の組
    成物。
  8. 【請求項８】 Ｘ１とＸ２がＩＬ−１拮抗物質ペプチド配列を含む、請求項
    １に記載の物質の組成物。
  9. 【請求項９】 ＩＬ−１拮抗物質ペプチド配列が配列番号２１２、９０７、
    ９０８、９０９、９１０、９１７及び９７９から選択される、請求項８に記載の
    物質の組成物。
  10. 【請求項１０】 ＩＬ−１拮抗物質ペプチド配列が配列番号２１３から２７
    １、６７１から９０６、９１１から９１６、及び９１８から１０２３までから選
    択される、請求項８に記載の物質の組成物。
  11. 【請求項１１】 Ｆ１が配列番号２の配列を含む、請求項８に記載の物質の
    組成物。
  12. 【請求項１２】 Ｘ１とＸ２がＥＰＯ擬似ペプチド配列を含む、請求項１に
    記載の物質の組成物。
  13. 【請求項１３】 ＥＰＯ擬似ペプチド配列が表５から選択される、請求項１
    ２に記載の物質の組成物。
  14. 【請求項１４】 Ｆ１が配列番号２の配列を含む、請求項１２に記載の物質
    の組成物。
  15. 【請求項１５】 配列番号８３、８４、８５、１２４、４１９、４２０、４
    ２１及び４６１から選択される配列を含む、請求項１２に記載の物質の組成物。
  16. 【請求項１６】 配列番号３３９及び３４０から選択される配列を含む、請
    求項１２に記載の物質の組成物。
  17. 【請求項１７】 配列番号２０及び２２から選択される配列を含む、請求項
    １２に記載の物質の組成物。
  18. 【請求項１８】 Ｐ１がＴＰＯ擬似ペプチド配列である、請求項３に記載の
    物質の組成物。
  19. 【請求項１９】 Ｐ１が表６から選択されるＴＰＯ擬似ペプチド配列である
    、請求項１８に記載の物質の組成物。
  20. 【請求項２０】 Ｆ１が配列番号２の配列を含む、請求項１８に記載の物質
    の組成物。
  21. 【請求項２１】 配列番号６及び１２から選択される配列を持つ、請求項１
    ８に記載の物質の組成物。
  22. 【請求項２２】 請求項１から２１のいずれかに記載の物質の組成物をコー
    ドするＤＮＡ。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  25. 【請求項２５】 細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項２４に
    記載の細胞。
  26. 【請求項２６】 ａ）対象とするタンパク質の活性を調節する少なくとも１
    個の任意のペプチドを選択し、そして ｂ）選択した１個又は複数のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列に共有
    結合された少なくとも１つのＦｃドメインを含む薬理学的物質を調製する ことを含む、薬理学的に活性な化合物を製造するための方法。
  27. 【請求項２７】 ペプチドが、ファージディスプレイライブラリー、大腸菌
    ディスプレイライブラリー、リボソームライブラリー、又は化学ペプチドライブ
    ラリーのスクリーニングを含む工程において選択される、請求項２６に記載の方
    法。
  28. 【請求項２８】 薬理学的物質の調製が、 ａ）選択したペプチドをコードする核酸配列及びＦｃドメインをコードする核
    酸配列を含む遺伝子構築物を調製し、そして ｂ）遺伝子構築物を発現する ことによって実施される、請求項２６に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 遺伝子構築物が大腸菌細胞において発現される、請求項２
    ６に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 対象とするタンパク質が細胞表面受容体である、請求項２
    ６に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 対象とするタンパク質が線状エピトープである、請求項２
    ６に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 対象とするタンパク質がサイトカイン受容体である、請求
    項２６に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 ペプチドがＥＰＯ擬似ペプチドである、請求項２６に記載
    の方法。
  34. 【請求項３４】 ペプチドがＴＰＯ擬似ペプチドである、請求項２６に記載
    の方法。
  35. 【請求項３５】 ペプチドがＩＬ−１拮抗物質ペプチドである、請求項２６
    に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 ペプチドがＭＭＰ阻害因子ペプチド又はＶＥＧＦ拮抗物質
    ペプチドである、請求項２６に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 ペプチドがＴＮＦ拮抗物質ペプチドである、請求項２６に
    記載の方法。
  38. 【請求項３８】 ペプチドがＣＴＬＡ４擬似ペプチドである、請求項２６に
    記載の方法。
  39. 【請求項３９】 ペプチドが表４から２０までから選択される、請求項２６
    に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 ペプチドの選択が、 ａ）第一選択ペプチドをコードする核酸配列及びＦｃドメインをコードする核
    酸配列を含む遺伝子構築物を調製し、そして ｂ）ｉ）第一突然変異誘発性プライマーが遺伝子構築物のコード鎖の５’末端
    の配列又は５’末端近くの配列に相補的な核酸配列を含み、そして ｉｉ）第二突然変異誘発性プライマーが遺伝子構築物の非コード鎖の３’
    末端に相補的な核酸配列を含む、 遺伝子構築物と突然変異誘発性プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を含む
    工程によって実施される、請求項２６に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 化合物が誘導体化されている、請求項２６に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 誘導体化された化合物が環状部位、架橋部位、非ペプチジ
    ル結合、Ｎ末端置換、Ｃ末端置換、又は修飾アミノ酸部位を含む、請求項２６に
    記載の方法。
  43. 【請求項４３】 ＦｃドメインがＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項２６
    に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 ビヒクルがＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項２６に
    記載の方法。
  45. 【請求項４５】 ビヒクルが配列番号２を含む、請求項２６に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 製造される化合物が、式： （Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ ［式中、Ｆ１はＦｃドメインであり、 Ｘ１及びＸ２は、各々独立に−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ ２ ）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３、及
    び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ ４ から選択され、 Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は各々独立に薬理学的に活性なペプチドの配列であ
    り、 Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は各々独立にリンカーであり、そして ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、ａとｂの少なくとも一方が１であることを条件
    として、各々独立に０又は１である］ の化合物及びその多量体である、請求項２６に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 製造される化合物が、式： Ｘ１−Ｆ１ 又は Ｆ１−Ｘ２ の化合物である、請求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 製造される化合物が、式： Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１ 又は Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２ の化合物である、請求項４６に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 Ｆ１がＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項４６に記載
    の方法。
  50. 【請求項５０】 Ｆ１がＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項４６に記載
    の方法。
  51. 【請求項５１】 Ｆ１が配列番号２の配列を含む、請求項４６に記載の方法
    。
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