JP2008538506A - 延長された血液半減期を有するトキシンペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生物化学の分野に関し、具体的には、治療用ペプチド及び抱合体に関する。
イオンチャンネルは、膜を横切って、小さな無機イオンの交換を可能とする分子の多様な群である。全ての細胞は、機能のためにイオンチャンネルを必要とするが、神経系及び心臓中に存在する興奮性細胞などの興奮性細胞については、特にこのことが当てはまる。イオンチャンネルにより調整された電気信号は、考える脳、拍動する心臓及び収縮する筋肉を調節する。イオンチャンネルは、細胞容積を制御する役割を果たし、多様なシグナル伝達プロセスを調節する。
(X1)a−(F1)d−(X2)b−(F2)e−(X3)c
の組成物及びその多量体に関する。
(式中:
F1及びF2は半減期延長部分であり、並びにd及びeは、各々独立に、0又は1であり(但し、d及びeの少なくとも1つは1である。);
X1、X2及びX3は、各々独立に、−(L)f−P−(L)g−であり、並びにf及びgは、各々独立に、0又は1であり;
Pは、少なくとも2つのペプチド内ジスルフィド結合を含む、約80アミノ酸残基長以下のトキシンペプチドであり;
Lは、場合によって存在するリンカーであり(f=1及び/又はg=1の場合に存在する。);並びに
a、b及びcは、各々独立に、0又は1である(但し、a、b及びcの少なくとも1つは、1である。)。)
従って、本発明は、慣用的に、ペプチドのN末端を左側に記載すると、式:
(II)P−(L)g−F1(すなわち、b、c及びeは、0に等しい。);
(III)F1−(L)f−P(すなわち、a、c及びeは、0に等しい。);
(IV)P−(L)g−F1−(L)f−P又は(X1)a−F1−(X2)b(すなわち、c及びeは、0に等しい。);
(V)F1−(L)f−P−(L)g−F2(すなわち、a及びcは、0に等しい。);
(VI)F1−(L)f−P−(L)g−F2−(L)f−Pすなわち、aは、0に等しい。);
(VII)F1−F2−(L)f−P(すなわち、a及びbは、0に等しい。);
(VIII)P−(L)g−F1−F2(すなわち、b及びcは、0に等しい。);
(IX)P−(L)g−F1−F2−(L)f−Pすなわち、bは、0に等しい。);
及びこれらの何れかのあらゆる多量体など、式1に対する変形を有する分子に関する。式II−IXのこのような分子の全てが、構造式Iの意味に属する。式Iの意味の範疇において、トキシンペプチド(P)が2以上存在する場合、トキシンペプチド(P)は、本発明の組成物中に存在する他の何れものトキシンペプチドと独立に同一又は別異であることができ、リンカー部分が存在する場合、リンカー部分((L)f及び/又は(L)g)は、本発明の組成物中に存在し得る他の何れものリンカーと独立に同一又は別異であることができる。半減期延長部分へのトキシンペプチドの抱合は、トキシンペプチドのN末端及び/又はC末端を介することが可能であり、又はその一次アミノ酸配列に対して中間であることが可能である(F1は、連結されるF2より、トキシンペプチドのN末端により近く連結されている。)。有用な半減期延長部分(F1又はF2)の例には、免疫グロブリンFcドメイン、ヒト血清アルブミン(HSA)又はポリエチレングリコール(PEG)が含まれる。本明細書に記載されているこれら及びその他の半減期延長部分は、個別に又は組み合わせて有用である。
表2に記載されている配列番号88、89、92、148〜200、548〜561、884〜949若しくは1295〜1300;又は
表7に記載されている配列番号980〜1274、1303若しくは1308;又は
表13に記載されている配列番号330〜337、341、1301、1302、1304〜1307、1309、1311、1312及び1315〜1336;又は
表14に記載されている配列番号36、59、344−346若しくは1369〜1390の何れかから選択されるアミノ酸配列を含む。
表3に記されている配列番号201〜225;又は
表4に記されている配列番号242〜248若しくは250〜260;又は
表5に記されている配列番号261〜275;又は
表6に記されている配列番号276〜293;又は
表8に記されている配列番号299〜315;又は
表9に記されている配列番号316〜318;又は
表10に記されている配列番号319;又は
表11に記されている配列番号327若しくは328;又は
表13に記されている配列番号330〜337、341、1301、1302、1304〜1307、1309、1311、1312又は1315〜1336;
表14に記されている配列番号1369〜1390;又は
表16に記されている配列番号348〜353;又は
表19に記されている配列番号357〜362、364〜368、370、372〜385若しくは387〜398;又は
表20に記されている配列番号399〜408;又は
表22に記されている配列番号410〜421;又は
表23に記されている配列番号422、424、426若しくは428;又は
表24に記されている配列番号430〜437;又は
表25に記されている配列番号438〜445;又は
表26に記されている配列番号447、449、451、453、455若しくは457;又は
表28に記されている配列番号470〜482若しくは484〜493;又は
表29に記されている配列番号495〜506;又は
表30に記されている配列番号507〜518;
から選択されるアミノ酸配列を含む他のトキシンペプチド類縁体にも関する。
本明細書を通じて使用される用語は、具体的な事例において別段の限定がなければ、以下のとおり定義される。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されている単数形(「a」、「an」及び「the」)には、文脈から別段の意味であることが明らかである場合を除き、複数表記も含まれる。
a)C1−C3及びC2−C4ジスルフィド結合(C1、C2、C3及びC4は、ペプチドのN末端が左側に配置された慣用表記のトキシンペプチドの一次配列中にシステイン残基が現れる順序を表しており、アミノ酸配列中の第一及び第三のシステインがジスルフィド結合を形成し、並びに第二及び第四のシステインがジスルフィド結合を形成する。)。このようなC1−C3、C2−C4ジスルフィド結合パターンを有するトキシンペプチドの例には、アパミンペプチド、α−コノペプチド、PnlAペプチドPnlBペプチド及びMIIペプチド並びに前記の何れかの類縁体が含まれるが、これらに限定されない。
を含む分子に関する。
総論。組換えタンパク質は、数ある手段のうちとりわけ、半減期延長部分への共有結合を通じて、治療剤として開発されてきた。このような部分には、Enbrel(R)(エタネルセプト)で使用されるような、抗体の「Fc」ドメイン及びNeulasta(R)(ペグフィルグラスチム)で使用されるような、生物学的に適切なポリマー(例えば、ポリエチレングリコール又は「PEG」)が含まれる。Feigeらは、2003年12月9日に付与された米国特許第6,660,843号(参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。)において、このような半減期延長物質をペプチドとともに使用することを記載した。
20KPEG−トキシンペプチド−FcCH2ドメイン、式[(F1)1−(X2)1−(F2)1]と合致;
20KPEG−トキシンペプチド−HSAドメイン、式[(F1)1−(X2)1−(F2)1]と合致;
20KPEG−Fcドメイン−トキシンペプチド、式[(F1)1−(X2)1−(X3)1]と合致;
20KPEG−FcCH2ドメイン−トキシンペプチド、式[(F1)1−(F2)1−(X3)1]と合致;及び
20KPEG−HSA−トキシンペプチド、式[(F1)1−(X2)1−(X3)1]と合致。
X−O(CH2CH2O)n−1CH2CH2OH (X)
(nは20〜2300であり、Xは、H又は末端修飾、例えばC1−4アルキルである。)
によって表される。
(PEG)−(A) (Xl)
(PEG(上で定義されている。)は、活性化部分(A)の炭素分子に共有結合して、エーテル結合、アミン結合又はアミド結合を形成し、(A)は、ペプチドのアミノ酸残基上のアミノ、イミノ若しくはチオール基又はペプチドに共有結合されたリンカー部分と反応することが可能な反応性基を含有する。)
によって表すことができる。
典型的には、トキシンペプチド又はトキシンペプチドを含む融合タンパク質は、チオール活性化されたPEG化合物、ジオール活性化されたPEG化合物、PEGヒドラジド化合物、PEG−オキシアミン化合物又はPEG−ブロモアセチル化合物など(但し、これらに限定されない。)などの活性化されたPEG化合物と、公知の化学的技術によって反応される。(例えば、S.Herman,Poly(ethylene glycol) with Reactive Endgroups:I.Modification of Proteins,J.Bioactive and Compatible Polymers,10:145−187(1995);S.Zalipsky,Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules,Advanced Drug Delivery Reviews,16:157−182(1995);R.Greenwald et al.,Poly(ethylene glycol) conjugated drugs and prodrugs:a comprehensive review,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,17:101−161(2000)を参照されたい。)。
a)標的エピトープに特異的に結合する少なくとも1つの無作為化されたペプチドを選択すること、並びに
b)(i)少なくとも1つの半減期延長部分(Fcドメインが好ましい。)、(ii)選択されたペプチドの少なくとも1つのアミノ酸配列及び(iii)エフェクター分子を含む薬剤を調製すること、
を含む方法である。
本発明は、本発明のポリペプチドを作製する上で有用な核酸、発現ベクター及び宿主細胞にも関する。宿主細胞は、真核細胞とすることが可能であり、哺乳動物細胞が好ましく、CHO細胞が最も好ましい。宿主細胞は、原核細胞とすることも可能であり,E.コリ細胞が最も好ましい。
総論。本発明の化合物は、このような対象タンパク質の固有リガンドのアゴニスト、模倣物又はアンタゴニストとして、対象タンパク質に結合するそれらの能力に起因する薬理学的活性を有する。イオンチャンネルへの公知の関連を有する遺伝病(「チャンネル症(channelopathy)」)は、医薬の様々な分野を包含し、その幾つかには、神経学、腎臓学、筋肉学及び心臓学が含まれる。イオンチャンネルを原因とする遺伝疾患のリストには、以下のものが含まれる。
・デント病(タンパク質尿及び高カルシウム尿症;Cl−チャンネル;CLCN5)、
・骨粗鬆症(Cl−チャンネル;CLCN7)、
・家族性高インシュリン血症(SUR1;KCNJ11;Kチャンネル)、
・糖尿病(KATP/SURチャンネル)、
・アンデルセン症候群(KCNJ2、Kir2.1Kチャンネル)、
・バーター症候群(KCNJ1;Kir1.1/ROMK;Kチャンネル)、
・遺伝性難聴(KCNQ4;Kチャンネル)、
・遺伝成高血圧(リドル症候群);SCNN1;上皮Naチャンネル)、
・拡張型心筋症(SUR2、Kチャンネル)、
・QT延長症候群又は心不整脈(心臓のカリウム及びナトリウムチャンネル)、
・ティモシー症候群(CACNA1C、Cav1.2)、
・筋無力症(CHRNA、CHRNB、CNRNE;nAChR)及び他の様々なミオパシー、
・高カリウム性周期性四肢麻痺(Na及びKチャンネル)、
・てんかん(Na+及びK+チャンネル)、
・方麻痺性偏頭痛(CACNA1A、Cav2.1Ca2+チャンネル及びATP1A2)、
・セントラルコア病(RYR1、RyR1;Ca2+チャンネル)、及び
・パラミオトニア及びミオトニア(Na+、Cl−チャンネル)。
先述のリストは遺伝性の疾患に関するが、これらの疾患中に引用されているチャンネルを標的とする分子も、他の起源又は起源が不明な関連疾患を治療する上でも有用であり得る。
・乾癬(Kv、KCa)、
・関節炎(Kv、KCa)、
・喘息(KCa、Kv)、
・アレルギー(KCa、Kv)、
・COPD(KCa、Kv、Ca)
・アレルギー性鼻炎(KCa、Kv)、
・肺繊維症、
・狼瘡(IKCa1、Kv)、
・移植、GvHD(KCa、Kv)、
・炎症性骨吸収(KCa、Kv)、
・歯周病(KCa、Kv)、
・糖尿病、I型(Kv)−I型糖尿病は、異常なグルコース、タンパク質及び脂質代謝を特徴とする自己免疫疾患であり、インシュリン欠乏又は耐性を伴う。本疾患では、Kv1.3発現Tリンパ球が、膵島を攻撃及び破壊し、β細胞の喪失をもたらす。Kv1.3の遮断は、炎症性サイトカインを減少させる。さらに、Kv1.3の遮断は、形質膜へのGLUT4の転位を促進し、これにより、インシュリン感受性を増加させる。
・偏頭痛を含む疼痛(Nav、TRP[一過性受容体電位チャンネル]。P2X、Ca2+、N型電圧開口型カルシウムチャンネルは、脊髄中の侵害受容神経伝達の中心的制御物質である。ジコノチド(N型カルシウムチャンネルのペプチド遮断剤)は、侵害受容神経伝達を低下させ、ヒトにおける重度の慢性痛の症状の緩和について、世界で広く承認されている。侵害受容特異的N型カルシウムチャンネルの新規遮断剤は、減少した副作用特性を有する鎮痛剤で改善される。
・アルツハイマー病、
・パーキンソン病(nACHR、Nav)
双極性疾患(Nav、Cav)
・癌、多くのカリウムチャンネル遺伝子が増幅され、タンパク質サブユニットが多くの癌性症状において上方制御されている。カリウムチャンネル上方制御のための病態生理学的役割と合致して、カリウムチャンネル遮断剤は、おそらくは、カルシウム流入の阻害及びカルシウム依存性遺伝子発現に対する効果を通じて、子宮癌細胞及び肝細胞癌細胞の増殖を抑制することが示されている。
運動的症候、不全麻痺、不全単麻痺、不全対麻痺、不全片麻痺、四肢不全麻痺(筋衰弱−部分的な又は穏やかな麻痺);麻痺、対麻痺、片麻痺、四肢麻痺(tetraplegia)、四肢麻痺(quadraplegia)(麻痺−筋力の完全な喪失又はほぼ完全な喪失);痙性(剛直、疼痛を引き起こし、罹患した四肢の自由な運動を制限する筋緊張の喪失);構音障害(不明瞭な発語及び関連する発語上の問題);筋萎縮(使用の欠如による筋肉の萎縮);痙攣、こむら返り(筋肉の不随意的収縮);緊張低下、間代性痙攣(姿勢に伴う問題);間代性筋痙攣、筋波動症(痙動及び単収縮する筋肉、チック);下肢静止不能症候群(特に、夜間に厄介な問題となる、不随意的な下肢の運動);下垂足(歩行時に床に沿って足を引きずる);反射機能不全(MSR、バビンスキー反射、ホフマン反射、チャドック反射)など;
感覚性の症候、知覚異常(部分的な無感覚、刺痛、耳鳴り及び振動感覚);知覚麻痺(完全な無感覚/感覚の喪失);神経痛、神経病及び神経性の疼痛(明確な原因のない疼痛、灼熱感、掻痒感及び電気ショック感覚);レルミッテ症候(頭を動かしているときの電気ショック及び耳鳴り感覚)など;
固有感覚機能不全(身体部分の位置感覚の喪失);三叉神経痛(顔面痛);
協調及び平衡の症候、運動失調(協調運動障害);企図振戦(細かい運動を行うときの震え);測定障害(恒常的な過少又は過剰な四肢運動);前庭運動失調(内耳中の異常な平衡機能);めまい(前庭運動失調に由来する悪心/嘔吐/乗り物酔いに対する感覚);会話運動失調(協調した会話の困難、吃音);ジストニア(四肢位置フィードバックの遅延);反復拮抗運動不全(素早く交互運動(例えば、リズムに合わせて運動する)を行う能力の喪失)など;
腸、膀胱及び性的症候、頻尿、膀胱痙性(尿意逼迫及び失禁);弛緩性膀胱、排尿筋・括約筋筋失調(排尿困難及び尿閉);勃起障害(男性及び女性の性的不能);オルガズム障害(オルガズムに達することができない);逆行性射精(膀胱内への射精);冷感症(性的に興奮した状態になることができない);便秘(低頻度又は不定期な腸運動);便意逼迫(腸の逼迫);便失禁(腸失禁)など;
認知症候、うつ病;認知機能障害(短期及び長期記憶障害、健忘症、言葉を思い出す速度の遅延);認知症;気分変動、情動不安定、多幸感;躁鬱症候群;不安;失語症、不全失語症(会話の理解及び発語の障害)など;並びに
その他の症候、疲労、ウートホフ症候群(熱を伴う症候の重度の増加);胃食道逆流(胃酸逆流);味覚及び嗅覚の障害;てんかん発作;嚥下困難、呼吸困難;並びに睡眠障害など。
総論。本発明は、本発明の組成物と、及び医薬として許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。このような医薬組成物は、多様な送達経路、例えば、注射若しくは注入によるなどの血管内送達経路、皮下、筋肉内、腹腔内、硬膜外又は髄腔内送達経路、又は経口、腸内、経肺(例えば、吸入)、鼻内、経粘膜(例えば、舌下投与)、経皮又はその他の送達経路及び/又は本分野において公知の投与の形態によって、患者に投与するように設定することが可能である。本発明の医薬組成物は、液体形態で調製することができ、又は凍結乾燥された形態などの乾燥された粉末形態であり得る。経口又は経腸用途の場合、医薬組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性若しくは油性懸濁液剤、分散性散剤又は顆粒剤、エマルジョン、硬若しくは軟カプセル剤、シロップ、エリキシル、経腸処方として、設定することが可能である。
上記の組成物は以下の記載に従って調製することができる。これらの実施例は、いかなる場合においても、本願の特許請求の範囲を限定するものと解釈してはならない。
Fc−LIO−ShK[I−35]は、Tc−2xL−ShK[1−35]とも呼ばれ、Kvl.3の阻害剤である。リンカー配列及びKvl.3阻害剤ペプチドShK[I−35]の単量体へインフレームに融合されたヒトIgG1のFc領域をコードするDNA配列を後述のように構築した。哺乳類細胞(HEK293及びチャイニーズハムスター卵巣細胞)からペプチボディ(peptibody)を発現及び精製するための方法は、本明細書に開示されている。
標準的なPCR技術を使用して、Kv1.3阻害剤ペプチドShK[2−35]の単量体へ、インフレームで融合されたヒトIgG1のFc領域をコードするDNA配列を構築した。ShK[2−35]及び前記分子の5、10又は25アミノ酸リンカー部分を、pcDNA3.1(+)CMVi中の固有Fc−2xL−ShK[1−35]をテンプレートとして使用するPCR反応において生成させた(実施例1、図14)。全てのShKコンストラクトは、以下のアミノ酸配列
室温、水槽中で、培養上清約1Lを解凍した。5mLのAmersham HiTrapタンパク質Aカラムへ、7℃、5mL/分で、培地を負荷し、二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液(PBS)の数カラム容積で前記カラムを洗浄し、100mMグリシン、pH3.0への工程で、試料を溶出した。タンパク質A溶出プール(約8.5mL)を、3M酢酸ナトリウム71μLと組み合わせた後、50mLになるように水で希釈した。次に、7℃、5mL/分で、S−緩衝液A(20mMNaH2PO4、pH7.0)中の5mLのAmersham HiTrap SP−HPカラムへと、希釈した材料を負荷した。次に、S−緩衝液Aの数カラム容積で、カラムを洗浄した後、0%から75%までのS−緩衝液B(20mMNaH2PO4、1M NaCl、pH7.0)の直線勾配を5mL/分で使用して展開した後、7℃で100%S−緩衝液Bにする工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス−グリシン4ないし20%SDS−PAGEを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした。次に、プールした材料を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過し、Pall Life Sciences Macrosep 10K Omega遠心限外ろ過装置を使用して、約3.9mLまで濃縮した。次に、室温、2mL/分で、0.22μm、25mmのMustang Eメンブレンを有するPall Life Sciences Acrodiscを用いて、濃縮した材料をろ過した。次に、Hewlett Packard 8453分光光度計を使用して、700μLのPBS中に希釈したろ過済み材料10μLに対して、スペクトル走査を実施した(図27E)。30,008g/molの算出された分子量及び36,900M−1cm−1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が2.76mg/mLであることを決定した。透過液中に材料が認められたため、新しいMacrosepカートリッジを使用して、透過液に対して濃縮工程を反復した。次に、室温、2mL/分で、0.22μm、25mmのMustang Eメンブレンを有するPall Life Sciences Acrodiscを通して、濃縮された材料の新たなバッチをろ過した。濃縮された材料の両ロットを1つのプールへと組み合わせた。
5mLのAmersham HiTrapタンパク質Aカラムへ、7℃、5mL/分で、培養上清約1Lを負荷し、二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液(PBS)の数カラム容積で前記カラムを洗浄し、100mMグリシン、pH3.0への工程で試料を溶出した。タンパク質A溶出プール(約9mL)を1MトリスHCl、pH8.5の450μLと組み合わせた後、2M酢酸230μLと組み合わせ、次に水で50mLに希釈した。次に、pH調整した材料を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過し、7℃、5mL/分でS−緩衝液A(20mMNaH2PO4、pH7.0)中の5mLのAmersham HiTrap SP−HPカラムへ負荷した。次に、S−緩衝液Aの数カラム容積でカラムを洗浄した後、0%から75%までのS−緩衝液B(20mMNaH2PO4、1M NaCl、pH7.0)の直線勾配を5mL/分で使用して展開した後、7℃で100%S−緩衝液Bへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス−グリシン4ないし20%SDS−PAGEを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした。次に、Pall Life Sciences Macrosep 10K Omega遠心限外ろ過装置を使用して、プールした材料を約5.5mLまで濃縮した。次に、濃縮した材料を室温で2mL/分で、0.22μm、25mmのMustang Eメンブレンを有するPall Life Sciences Acrodiscでろ過した。
7℃、5mL/分で、5mLのAmersham HiTrap Protein Aカラムへ、培養上清約1Lを負荷し、前記カラムを二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液(PBS)の数カラム容積で洗浄し、100mMグリシン、pH3.0への工程で試料を溶出した。タンパク質A溶出プール(約9.5mL)を3M酢酸ナトリウム119μLと組み合わせた後、水で50mLに希釈した。次に、7℃、5mL/分でS−緩衝液A(20mMNaH2PO4、pH7.0)中の5mLのAmersham HiTrap SP−HPカラムへと、pH調整した材料を負荷した。次に、カラムをS−緩衝液Aの数カラム容積で洗浄した後、0%から75%までのS−緩衝液B(20mMNaH2PO4、1M NaCl、pH7.0)の直線勾配を5mL/分で使用して展開した後、7℃で100%S−緩衝液Bへの工程で溶出した。クロマトグラムからの主要ピークを含有する画分をプールし、0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過した。
細菌のペプチボディ発現ベクター並びにペプチボディのクローニング及び発現に関する手法の記載
細菌発現に使用されるクローニングベクター(実施例3ないし30)は、(米国特許第2004/0044188号に元来記載される)pAMG21に基づいている。ベクターのユニークなBstBI部位とNsiI部位の間でDNAを切り出し、アンピシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子のテンプレート源としてのpUC19DNAとともに、PCRプライマー
は下線が付されている。
細菌中で、ペプチボディをクローニング及び発現させるための方法は上述されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−ShK[1−35]の細菌中でのクローニング及び発現のために二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−ShK[2−35]の細菌での発現
細菌中で、ペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−ShK[2−35]の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−HmKの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−HmKの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−KTX1の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−KTX1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
凍結したE.コリペースト(28g)を室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH8.0の21mLと組み合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置(microfluidizer)へ12,000PSIで2回通過させた。次に、細胞可溶化液を4℃、22,000gで20分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを200mLの1%デオキシコール酸中に再懸濁した後、4℃、22,000gで20分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを200mLの水中に再懸濁した後、4℃、22,000gで20分間遠心分離した。次に、ペレット(4.8g)を48mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に溶解した。次に、30μLの1Mジチオスレイトールを前記溶液3mLへ添加し、37℃で30分間温置することによって、溶解したペレットを還元した。次に、還元したペレット溶液を室温、14,000gで5分間遠心分離した後、上清2.5mLを、再折りたたみ緩衝液(2M尿素、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、5mMEDTA、1mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH8.5)250mLへ、4℃で激しく撹拌しながら転移させた。次に、撹拌速度を低下させ、4℃で2日間、温置を継続した。次に、0.22μm酢酸セルロースフィルターで再折りたたみ溶液をろ過し、4℃で3日間保存した。
Fc−L−HsT1の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−HsTx1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−MgTxの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−MgTxの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−AgTx2の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−AgTx2の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
冷凍したE.コリペースト(15g)を、室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH8.0の120mLと合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ、12,000PSIで2回通過させた。次に、4℃、22,000gで20分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、1%デオキシコール酸200mL中にペレットを再懸濁した後、4℃、22,000gで20分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、200mLの水中にペレットを再懸濁した後、4℃、22,000gで20分間遠心分離した。次に、ペレット(4.6g)を46mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に溶解した。次に、30μLの1Mジチオスレイトールを前記溶液3mLへ添加し、37℃で30分間温置することによって、溶解したペレットを還元した。次に、還元されたペレット溶液を、室温、14,000gで5分間遠心分離した後、上清2.5mLを、再折りたたみ緩衝液(2M尿素、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、5mMEDTA、1mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH9.5)250mLへ、4℃で激しく撹拌しながら転移させた。次に、撹拌速度を低下させ、温置を4℃で2日間続行した。次に、再折りたたみ溶液を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過し、−70℃で保存した。
Fc−L−OSK1の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−OSK1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−OSK1(E16K,K20D)の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−OSK1(E16K,K20D)の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−アニュロクトキシンの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−アニュロクトキシンの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−ノキシウストキシン又はFc−L−NTXの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記述される。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−NTXの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−Pi2の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−Pi2の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
ShK[1−35]−L−Fcの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Pep−Fcであり、ShK[1−35]−L−Fcの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
ShK[2−35]−L−Fcの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Pep−Fcであり、ShK[2−35]−L−Fcの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−ChTxの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−ChTxの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−MTXの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させるための方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターはpAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−MTXの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−ChTx(K32E)の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−ChTx(K32E)の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−アパミンの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−アパミンの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−スキラトキシン又はFc−L−ScyTxの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現する方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−ScyTxの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−IbTXの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−IbTxの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−HaTx1の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−HaTx1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
凍結したE.コリペースト(13g)を、室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH8.0の100mLと合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ、12,000PSIで2回通過させた。次に、4℃、22,000gで20分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、200mLの1%デオキシコール酸中にペレットを再懸濁した後、4℃、22,000gで20分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを200mLの水中に再懸濁した後、4℃、22,000gで20分間遠心分離した。次に、ペレット(2.6g)を26mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に溶解した。次に、30μLの1Mジチオスレイトールを前記溶液3mLへ添加し、37℃で30分間温置することによって、溶解したペレットを還元した。次に、還元されたペレット溶液を室温、14,000gで5分間遠心分離した後、上清2.5mLを、再折りたたみ緩衝液(2M尿素、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、5mMEDTA、1mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH8.5)250mLへ、4℃で激しく撹拌しながら転移させた。次に、撹拌速度を低下させ、温置を4℃で2日間続行した。次に、再折りたたみ溶液を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過し、−70℃で保存した。
Fc−L−PaTx2の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−PaTx2の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−wGVIAの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−wGVIAの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−ωMVIIAの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−ωMVIIAの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−Ptu1の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−Ptu1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−ProTx1の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−ProTx1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−BeKM1の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−BeKM1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
Fc−L−CTXの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR−Fc−Pepであり、Fc−L−CTXの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
還元型Des−Arg1−ShKのペプチド合成
Tentagel(商標)−S PHB Fmoc−Cys(Trt)樹脂上にて、0.1mmol当量の樹脂スケールで、ヘキサフルオロリン酸2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム(HBTU)/N−メチルモルフォリン(NMM)/N,N−ジメチル−ホルムアミド(DMF)カップリング化学反応を使用する固相ペプチド合成(SPPS)によって、Symphony(商標)多重ペプチド合成装置上で、段階的な様式で、配列
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC
(ペプチド1、配列番号92)
を有するDes−Arg1−ShKを合成した。N−アルファ−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニル)−及び側鎖保護されたアミノ酸は、Midwest Biotech Incorporatedから購入した。Fmoc−Cys(Trt)−Tentagel(商標)樹脂は、Flukaから購入した。以下の側鎖保護戦略、すなわち、Asp(OtBu)、Arg(Pbf)、Cys(Trt)、Gln(Trt)、His(Trt)、Lys(Nε−Boc)、Ser(OtBu)、Thr(OtBu)及びTyr(OtBu)を使用した。2つのオキサゾリジンジペプチド、すなわちFmoc−Gly−Thr(ΨMe,MePro)−OH及びFmoc−Leu−Ser(ΨMe,MePro)−OHを鎖重合に使用し、NovaBiochemから入手し、配列の合成に使用した。保護されたアミノ酸誘導体(20mmol)をDMF中の20%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)100mL中に溶解した。DMF中の20%DMSO中の20mMHBTU、400mMNMMで、保護されたアミノ酸を活性化し、20%DMF/DMSO中の0.5mmolの保護されたアミノ酸、0.5mmolのHBTU、1mmolのNMMで、25分間、次いで40分間の2回の処理を使用して、カップリングを実施した。DMF中の20%(v/v)ピペリジンの溶液を使用する、10分間、次いで15分間の2回の処理で、Fmoc脱保護反応を実施した。合成の後、次に、樹脂を排水し、DCM、DMF、DCMで洗浄した後、真空で乾燥した。TFA/EDT/TIS/H2O(92.5:2.5:2.5:2.5(v/v))溶液で、室温で1時間処理することによって、ペプチド−樹脂を脱保護し、樹脂から放出した。次に、揮発性物質を窒素ガス流で除去し、粗ペプチドを冷ジエチルエーテルで2回沈殿させ、遠心分離により回収した。次に、Jupiter 4μmProteo(商標)90Åカラム上での直線勾配(0ないし60%緩衝液B、12分、A:水中の0.1%TFA、B:アセトニトリル中の0.1%TFA)を使用するWaters2795分析用RP−HPLCシステムで、粗ペプチドを分析した。正確なペプチド生成量を確認するために、PE−Sciex(商標)API電気スプレー質量分析計を使用した。分析用RP−HPLC分析によって概算されるもの基づいて約70%純度で、粗ペプチドを143mg収量で入手した。還元型Des−Arg1−ShK(ペプチド1)の保持時間(室温)=5.31分、算出された分子量=3904.6917Da(平均)、実験的に観察された分子量3907.0Daであった。
TFA開裂及びペプチド沈殿の後、ペプチドを折りたたむため、還元型Des−Arg1−ShKを、空気で酸化した。水中の20%AcOH(v/v)を使用して、開裂した粗ペプチドを抽出した後、約0.15mg/mLの還元型Des−Arg1−ShKの濃度まで水で希釈し、NH4OH(28ないし30%)を使用してpHを約8.0に調整し、室温で36時間静かに撹拌した。LC−MS分析により、折りたたみ工程をモニターした。この後、0ないし40%の直線勾配の緩衝液Bで120分間(A=水中0.1%TFA、B=アセトニトリル中0.1%TFA)1”Luna 5μm C18 100Å Proteo(商標)カラムを使用する逆相HPLCを使用して、折りたたまれたDes−Arg1−ShKペプチドを精製した。折りたたまれた粗Des−Arg1−ShKペプチドを、約25%の緩衝液Bで(その還元型における溶出時間と比較して)早期に溶出した。分析用RP−HPLC分析によって概算されるように、97%超の純度で、折りたたまれたDes−Arg1−ShK(ペプチド2)を23.2mgの収量で入手した(図20)。算出された分子量=3895.7693(モノアイソトピック)、実験的に観察された分子量=3896.5Da(Waters LCT Premier Micromass MS Technologiesで分析)であった。Des−Arg1−ShKジスルフィドの結合性は、C1−C6、C2−C4、C3−C5であった。
折りたたまれたDes−Arg1−ShK(ペプチド2)を、1mg/mLの濃度で水中に溶解した。50mMNaOAc、pH4.5中の2M MeO−PEG−アルデヒド、CH3O−[CH2CH2O]n−CH2CH2CHO(平均分子量20kDa)溶液、及び別途のNaCNBH3の1M溶液を新たに調製した。次に、ペプチド溶液をMeO−PEG−アルデヒド含有溶液へ添加した後、NaCNBH3溶液を添加した。反応化学量論はそれぞれ、ペプチド:PEG:NaCNBH3(1:2:0.02)であった。反応を48時間放置し、直線勾配(16分中6ないし60%B、A:水中0.1%TFA、B:水中0.1%TFA/90%ACN)で、40℃でZorbax(商標)300SB−C8 5μmカラムを使用するAgilent1100RP−HPLCシステムで分析した。モノPEG化された、折りたたまれたDes−Arg1−ShKは、分析用RP−HPLCによって粗生成物の約58%を構成した。次に、25カラム容積中の0ないし50%Bの勾配を使用して、4℃、1mL/分でAKTA FPLCシステムにおいてHiTrap(商標)5mL SP HP陽イオン交換カラムを使用して、モノPEG化されたDes−Arg1−ShKを単離した(緩衝液:A=20mM酢酸ナトリウム、pH4.0、B=1M NaCl、20mM酢酸ナトリウム、pH4.0)。(粗生成物に関して記載されるとおり)4ないし20のトリス−Gly SDS−PAGEゲル及びRP−HPLCを使用して、画分を分析した。SDS−PAGEゲルを125V、35mA、5Wで1.5時間使用した。次に、プールした生成物を4℃で、A4S緩衝液(10mMNaOAc、5%ソルビトール、pH4.0)1Lの3回の交換で透析した。次に、透析した生成物を10Kの微量遠心フィルター中で2mL容積まで濃縮し、最終生成物を付与するため、0.2μMシリンジフィルターを使用してろ過滅菌した。N末端がPEG化されたDes−Atg1−ShK(ペプチド3)を、分析用RP−HPLC分析によって85%純度と概算された1.7mg収量で単離した(図23)。
作働する本実施例の実験的手法は、図17に示される結果に対応する。
Tentagel(商標)−S PHB Fmoc−Cys(Trt)樹脂上、0.1mmol当量の樹脂規模で、ヘキサフルオロリン酸2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3−3−テトラメチルウロニウム(HBTU)/N−メチルモルフォリン(NMM)/N,N−ジメチル−ホルムアミド(DMF)カップリング化学反応を使用する固相ペプチド合成(SPPF)によるSymphony(商標)多重ペプチド合成装置での段階的な方法で、アミノ酸配列
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC
(ペプチド4、配列番号5)
を有するShKを合成した。N−アルファ−9−フルオレニルメチルオキシカルボニル及び側鎖保護されたアミノ酸は、Midwest Biotech Incorporatedから購入した。Fmoc−Cys(Trt)−Tentagel(商標)樹脂は、Flukaから購入した。以下の側鎖保護戦略を採用した。すなわち、Asp(OtBu)、Arg(Pbf)、Cys(Trt)、Gln(Trt)、His(Trt)、Lys(Nε−Boc)、Ser(OtBu)、Thr(OtBu)及びTyr(OtBu)であった。2つのオキサゾリジンジペプチドであるFmoc−Gly−Thr(ΨMe,MePro)−OH及びFmoc−Leu−Ser(ΨMe,MePro)−OHを鎖重合に使用し、NovaBiochemから得、配列の合成に使用した。保護されたアミノ酸誘導体(20mmol)をDMF中の20%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)100mL中に溶解した。保護されたアミノ酸をDMF中の20%DMSO中の200mMHBTU、400mMNMMで活性化し、20%DMF/DMSO中の0.5mmolの保護されたアミノ酸、0.5mmolのHBTU、1mmolのNMMで25分間、次いで40分間の2回の処理を使用して、カップリングを実施した。DMF中の20%(v/v)ピペリジンの溶液を10分間、次いで15分間使用する2回の処理で、Fmoc脱保護反応を実施した。合成の後、次に、樹脂を排水し、DCM、DMF、DCMで洗浄した後、真空で乾燥した。室温で1時間TFA/EDT/TIS/H2O(92.5:2.5:2.5:2.5(v/v))溶液による処理によって、ペプチド−樹脂を脱保護し、樹脂から放出した。次に、揮発性物質を窒素ガス流で除去し、粗ペプチドを冷ジエチルエーテルで2回沈殿させ、遠心分離により回収した。次に、Jupiter 4μmProteo(商標)90Åカラム上での直線勾配(0ないし60%緩衝液B、12分、A:水中の0.1%TFA、B:アセトニトリル中の0.1%TFA)を使用するWaters2795分析用RP−HPLCシステムで、粗ペプチドを分析した。正確なペプチド生成量を確認するため、PE−Sciex API電気スプレー質量分析計を使用した。分析用RP−HPLC分析によって約45%純度と概算される約170mgの収量の粗ペプチドを入手した。還元型Des−Arg4−ShK(ペプチド1)の保持時間(室温)=5.054分、算出された分子量=4060.8793Da(平均)、実験的に観察された分子量4063.0Daであった。
TFA開裂及びペプチド沈殿の後、ペプチドを折りたたむため、還元型ShKを空気で酸化した。水中の20%AcOH(v/v)を使用して、開裂した粗ペプチドを抽出した後、約0.15mg/mLの還元型ShKの濃度まで水で希釈し、NH4OH(28ないし30%)を使用してpHを約8.0に調整し、室温で36時間静かに撹拌した。LC−MS分析により、折りたたみ工程をモニターした。この後、0ないし40%の直線勾配の緩衝液Bで120分間(A=水中0.1%TFA、B=アセトニトリル中0.1%TFA)1”Luna 5μm C18 100Å Proteo(商標)カラムを使用する逆相HPLCによって、折りたたまれたShKペプチドを精製した。折りたたまれた粗ShKペプチドを、約25%の緩衝液Bで(その還元型における溶出時間と比較して)早期に溶出した。分析用RP−HPLC分析によって概算されるように、97%超の純度で、折りたたまれたShK(ペプチド5)を25.5mgの収量で入手した。図60を参照されたい。算出された分子量=4051.8764Da(モノアイソトピック)、実験的に観察される分子量=4052.5Da(Waters LCT Premier Micromass MS Technologiesで分析)であった。ShKジスルフィドの結合性は、C1−C6、C2−C4、C3−C5であった。
還元型ShKのペプチド合成
配列
調製用逆相高速液体クロマトグラフィーを、C18(5μm、2.2cm×25cm)カラムで実施できる。クロマトグラフィー分離は、15mL/分で90分にわたって、典型的には5ないし95%のA中の緩衝液の直線勾配(A=0.1%TFA水溶液、B=0.09%TFA及び0.1%アミノオキシ酢酸を含有する90%ACN水溶液)を使用して達成できる。調製用HPLC画分は、ESMS及び光ダイオードアレイ(PDA)HPLCによって性質決定でき、合わせて、凍結乾燥できる。
凍結乾燥したアミノオキシShk(ペプチド7)は、50%HPLC緩衝液A/B(5mg/mL)中に溶解でき、MeO−PEG−アルデヒド、CH3O−[CH2CH2O]n−CH2CH2CHO(平均分子量20kDa)の2倍モル過剰量へ添加できる。反応を24時間放置でき、直線勾配(16分中6ないし60%B、A:水中0.1%TFA、B:水中0.1%TFA/90%ACN)で、40℃でZorbax(商標)300SB−C8 5μmカラムを使用するAgilent(商標)1100RP−HPLCシステムで分析できる。モノPEG化された還元型ShKは、分析用RP−HPLCによって粗生成物の約58%を占めた。次に、25カラム容積中の0ないし50%Bの勾配を使用して、4℃、1mL/分でAKTA FPLCシステムにおいてHiTrap(商標)5mL SP HP陽イオン交換カラムを使用して、モノPEG化されたShKを単離できる(緩衝液:A=20mM酢酸ナトリウム、pH4.0、B=1M NaCl、20mM酢酸ナトリウム、pH4.0)。4ないし20のトリス−Gly SDS−PAGEゲル及びRP−HPLCを使用して、画分を分析できる。SDS−PAGEゲルを、125V、35mA、5Wで1.5時間使用できる。次に、プールした生成物を4℃で、A4S緩衝液(10mMNaOAc、5%ソルビトール、pH4.0)1Lの3回の交換で透析できる。次に、透析した生成物を、10Kの微量遠心フィルター中で2mL容積まで濃縮でき、最終生成物を付与するため、0.2μMシリンジフィルターを使用してろ過滅菌できる。
モノPEG化された(オキシム化された)ShKは、水中の20%AcOH(v/v)中に溶解でき、次に約0.15mgペプチドmLの濃度まで水で希釈し、NH4OH(28ないし30%)を使用してpHを約8.0に調整し、室温で36時間静かに撹拌することができる。LC−MS分析により、折りたたみ工程をモニターすることができる。この後、0ないし40%の直線勾配の緩衝液Bで120分間(A=水中0.1%TFA、B=アセトニトリル中0.1%TFA)1”Luna 5μm C18 100Å Proteo(商標)カラムを使用する逆相HPLCを使用することによって、折りたたまれたモノPEG化された(オキシム化された)ShK(ペプチド9)を精製できる。モノPEG化された(オキシム化された)ShKジスルフィドの結合性は、C1−C6、C2−C4、及びC3−C5であり得る。
本実施例の実験的手法は、図18に示される結果に対応する。
Shkに対するmPEG−SPA1.5モル濃度過剰量を使用して、室温で20kDa PEGプロピオン酸(mPEG−SPA;CH3O−[CH2CH2O]n−CH2CH2CO−NHS)の固体サクシニミジルエステルへ、100mMビシン、pH8.0中の折りたたまれたShK(ぺプチド5)の10mg/mL溶液を添加できる。静かに撹拌した1時間後、混合物を水で2mg/mLへ希釈でき、pHを希HClで4.0へ調整できる。1mL/分で0.05M NaH2PO4、0.05M Na2HPO4、0.15M NaCl、0.01M NaN3、pH6.8で溶出したSuperdex(商標)75HR10/30カラム(Amersham)を使用するSEC HPLCによって、モノPEG化されたShk(ペプチド10)、幾つかのジPEG化されたShk又はトリPEG化されたShk、修飾されていないShk及びサクシニミジルエステル加水分解の程度を測定できる。4ないし20のトリス−Gly SDS−PAGEゲル及びRP−HPLCを使用して、画分を分析できる。SDS−PAGEゲルを125V、35mA、5Wで1.5時間使用できる。次に、4℃で、A4S緩衝液(10mMNaOAc、5%ソルビトール、pH4.0)1Lの3回の交換で、プールした生成物を透析できる。次に、透析したN末端PEG化(アミド化)ShK(ペプチド10)を、10Kの微量遠心フィルター中で2mL容積まで濃縮でき、最終生成物を付与するため、0.2μMシリンジフィルターを使用してろ過滅菌できる。
Fc−SmIIIA発現ベクター
部分的リンカー配列及びヒト高頻度コドンでコードされるSmIIIAペプチドを含有する104bpのBamHI−NotI断片を、重複プライマー3654−50及び3654−51を使用するPCRによって重合し、実施例1に記載されているpcDNA3.1(+)CMVi−hFc−SmIIIAを作製するために、7.1kbのNotI−BamHI主鎖中にクローニングした。
毒素ペプチドFc融合コンストラクトpcDNA3.1(+)CMVi−hFc−SmIIIA7.5μgを、形質移入剤FuGENE6を有する10cm組織培養プレート中の293−T細胞に形質移入した。形質移入から24時間後、培地を無血清培地と交換し、形質移入の5日目に培養上清を回収した。抗hFc抗体で標識したウェスタンブロットによって、293−T細胞からのFc−SmIIIAの一過性発現を分析した(図25A及び図25B)。概算された分子量を有する発現されたタンパク質の単一バンドが、還元型及び非還元型試料の両者において示された。さらに、Fc−SmIIIAの一過性発現レベルが、ELISAによると、73.4μg/mLであることを決定した。
細胞培養ヒトKv1.3チャネルを発現する安定な細胞系が、Biofocusから使用許諾された。5%CO2環境中、37℃で、細胞を維持した。培地は、GlutaMax(商標)(Invitrogen)、1×非必須アミノ酸、10%ウシ胎仔血清及び500μg/mLジェネテシンを有するDMEMを含有する。電気生理学実験の少なくとも24時間前に、細胞を播種し、35mm培養皿上で低集密度で増殖させた。
パッチクランプ技術の密封配置を使用することによって、全細胞電流を単一細胞から記録した。135mMNaCl、5mMKCl、1.8mMCaCl2、10mMHEPES及び5mMグルコースを含有する記録緩衝液を有する培地ですすぎ、交換した後、35mm培養皿を記録ステージへと移した。NaOHで、pHを7.4になるように調整し、モル浸透圧濃度を300mOsmに設定した。平行に配置され、電動ロッド(電動ロッドは、記録されている細胞の上に、ガラス毛細管を直接配置する。)に装着されたガラス毛細管の1つを介して、細胞に、記録緩衝液を連続的に灌流した。記録ピペット溶液は、90mMK−グルコン酸塩、20mMKF、10mMNaCl、1mMMgCl2−6H2O、10mMEGTA、5mMK2−ATP及び10mMHEPESを含有した。内部溶液に対するpHを、KOHで7.4に調整し、モル浸透圧濃度を280mOsmに設定した。実験は室温(20ないし22℃)で実施し、Multiclamp(商標)700A増幅装置(Molecular Devices Inc.)を使用して記録した。ピペットの抵抗は、典型的には、2ないし3MΩであった。
ヒトKv1.3チャネルを安定して発現するHEK293細胞を、−80mV保持電位で電位固定した。−80mVの保持電位から+30mVへの200ミリ秒長の脱分極工程を付与することによって、外向きのKv1.3電流を活性化し、3kHzでフィルターにかけた。各脱分極工程は、その後の脱分極工程から10秒間間隔で分離した。類縁体信号をDigidata(商標)1322Aデジタイザー(Molecular Devices)によってデジタル化した後、Clampfit(商標)9(Molecular Devices Inc.)を使用するオフライン分析のために、コンピュータディスクに保存した。全ての研究において、漸増濃度のタンパク質毒素の灌流を開始する4分間前に、安定したベースラインKv1.3電流振幅を確立した。タンパク質毒素のその後の濃度の灌流を開始する前に、定常状態の遮断を常に達成した。
対照の百分率(POC)を次式に基づいて算出する。すなわち(タンパク質毒素添加後のKv1.3電流/対照におけるKv1.3電流)×100である。IC50値を算出するため、タンパク質毒素の少なくとも5つの濃度(例えば、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、100nM)を使用した。XLfitソフトウェア(Microsoft Corp.)の4つのパラメータロジスティック適合を使用して、IC50値及び曲線適合を概算した。IC50値を平均値±s.e.m.(平均の標準誤差)として表す。
タンパク質毒素(典型的には10ないし100μM)を蒸留水中に溶解し、−80℃で冷凍保存した。タンパク質毒素原液の連続希釈物を、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有する記録緩衝液中へ混合した後、ガラス灌流貯蔵器へと転移させた。電子挟みバルブは、貯蔵器から記録される細胞へのタンパク質毒素の流量を調節した。
PBMCのPMA及び抗CD3抗体刺激後のT細胞サイトカイン生成の阻害。正常ヒトドナーLeulophoresisパックから、PBMCを予め単離し、密度勾配遠心(Ficoll Hypaque)によって精製し、CPZ Cryopreservation Medium Complete(INCELL, MCPZF−100プラス最終濃度10%DMSO)中で冷凍保存さした。PBMCを解凍し(95%生存率)、洗浄し、96ウェル平底組織培養プレート中の10%ウシ胎仔血清、100U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、2mML−グルタミン、100μM非必須アミン酸及び20μM2−MEを補充した培地(RPMI培地1640、GIBCO)中に、2×105細胞/ウェルで播種した。200μLの最終アッセイ容積中のPMA/抗CD3(それぞれ1ng/mL及び50ng/mL)で48時間刺激する前の90分間、連続希釈した(最終濃度100nMないし0.001nM)ShK[1−35]、Fc−L10−ShK[1−35]又はfc対照とともに、細胞をあらかじめ温置した。電気化学発光(ECL)を利用することによってIL−2及びIFNgのタンパク質レベルを測定するため、Meso Scale Discovery(MSD)SECTOR(商標)Imager6000(Meso Scale Discovery, Gaithersbury, MD)を使用して、アッセイ試料の分析を実施した。培養上清(50μL)をMSD多重スポット96ウェルプレートへ添加した(各ウェルは、3つの捕捉抗体すなわちIL−2、TNF,IFNγを含有した)。プレートを密封し、スズ箔で包み、プレート振とう器上、室温で2時間温置した。ウェルを200μLのPBST(BIOTEK、Elx405Auto Plate Washer)で1回洗浄した。各ウェルに対して、ルテニウム標識した検出抗体(抗体希釈緩衝液中の終濃度1μg/mL、IL−1、TNF、IFNγ)20μL及び2×MSD Read Buffer130μLを添加し、終容積150μLとした。プレートを密封し、スズ箔で包み、プレート振とう器上、室温で1時間温置した。次に、プレートをSECTOR(商標)Imager6000で読み取った。図35A及び35Bは、CHO由来のFc−L10−ShK[1−35]ペプチボディが、T細胞由来のIL−2及びIFNg生成を用量依存的な様式で有力に阻害することを示す。固有のShK[1−35]ペプチドと比較して、ペプチボディは、阻害の程度がより大きい(阻害剤の不在下での反応のPOC=対照の百分率)。
正常ヒトドナーLeukopheresisパックから、PBMCをあらかじめ単離し、密度勾配遠心(Ficoll Hypaque)により精製し、INCELL Freezing Mediumを使用して冷凍保存した。PBMCを解凍し(95%生存率)、洗浄し、(血清交換物PSGを含有するRPMI完全培地中で)2×105細胞/ウェルで96ウェル平底プレートへ播種した。200mLの最終アッセイ容積でaCD3及びaCD28の添加(それぞれ2.5ng/mL及び100ng/mL)の前の1時間、連続希釈した(終濃度100nMないし0.003nM)ShK[1−35]、Fc−L10−ShK[1−35]、又はFc対照とともに、細胞をあらかじめ温置した。MSD多重スポット96ウェルプレートへ上清20mLを添加した(各ウェルは、IL−2、TNFα及びIFNg捕捉抗体を含有した)。プレートを密封し、プレート振とう器上、室温で1時間温置した。次に、ルテニウム標識した検出抗体(抗体希釈緩衝液中のIL−2、TNFα及びIFNγの終濃度1μg/mL)20mL及び2×MSD Read Buffer110mLを添加した。プレートを密封し、スズ箔で包み、プレート振とう器上、室温で1時間温置した。次に、プレートをSECTOR(商標)Imager6000で読み取った。図37A及び37Bは、CHO由来のFc−L10−ShK[1−35]ペプチボディが、T細胞由来のIL−2及びIFNg生成を用量依存的な様式で有力に阻害することを示す。部分的な阻害のみを示す固有のShK[1−35]ペプチドと比較して、ペプチボディは、炎症性サイトカイン反応をほぼ完全に阻害する。(阻害剤の不在下での反応のPOC=対照の百分率)。
正常ヒトドナーLeukopheresisパックから、PBMCをあらかじめ単離し、密度勾配遠心(Ficoll Hypaque)により精製し、CPZ Cryopreservation Medium Complete(INCELL, MCPZF−100プラス終濃度10%DMSO)を使用して冷凍保存した。PBMCを解凍し(95%生存率)、洗浄し、96ウェル平底組織培養プレート中の10%ウシ胎仔血清、100U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、2mML−グルタミン、100μM非必須アミン酸及び20μM2−MEを補充した培地(RPMI培地1640、GIBCO)中で2×105細胞/ウェルで播種した。抗ヒトCD32(FcyRII)ブロッキング抗体(製造者の使用説明書EASY SEP Human Biotin Selection Kit18553番、StemCell Technologies Vancouver, BCに従った。)又はFc−L10−ShK(終濃度100nMないし0.001nM)のいずれかとともに、細胞を45分間予め温置した。次に、Fc−L10−ShK(終濃度100nMないし0.001nM)を、抗ヒトCD32ブロッキング抗体を含有する細胞へ添加する一方で、Fc−L10−ShLを含有する細胞へ培地を添加した。aCD3/aCD28(それぞれ0.2ng/mL及び100ng/mL)で48時間刺激する前のさらなる45分間に両セットを温置した。最終的なアッセイ容積は200μLであった。[3H]TdR(1μCi/ウェル)を添加し、プレートをさらに16時間温置した。次に、細胞をガラスファイバーフィルターへと回収し、放射能をBシンチレーションカウンタで測定した。図36A及び36Bは、CHO由来のFc−L10−ShK[1−35]ペプチボディが、T細胞の増殖を用量依存的な様式で有力に阻害することを示す。抗CD32(FcR)ブロッキング抗体による前ブロッキングは、T細胞増殖を阻害するペプチボディの能力にほとんど効果を及ぼさず、FcR結合ではなくKv1.3阻害が、観察される阻害に関するメカニズムであることを示唆する(阻害剤の不在下での反応のPOC=対照の百分率)。
ヒトKv1.3を過剰発現するHEK293細胞(HEK Kv1.3)をBioFocus plc(Cambridge、UK)から入手し、製造者の推奨に従って維持した。親HEK293細胞系を対照として使用した。ポリ−D−リジン24ウェルプレート(35−4414番、Becton−Dickinson、Bedford、MA)上に細胞を播種し、約70%の集密状態まで増殖させた。培地1mL/ウェル中に、HEK KV1.3を、0.5×105細胞/ウェルで播種した。HEK293細胞を、培地1mL/ウェル中に、1.5×105細胞/ウェルの密度で播種した。染色前、細胞増殖培地を除去し、0.2mL/ウェルのホルマリン溶液(Sigma HT50−1−1ホルマリン溶液、PBS/0.5%BSAで使用前に1:1希釈)を添加し、室温で10分間温置することによって、細胞をホルマリンで固定した。PBS/BSA中の5μg/mLのFc−L10−ShK[1−35]0.2mL/ウェルとともに温置することによって細胞を染色した。Fc−L10−ShK[1−35]を吸引した後、細胞をPBS/0.5%BSAで1回洗浄した。検出抗体(ヤギF(ab)2抗ヒトIgGフィコエリスリン、Southem Biotech Associates,Birmingham、AL)をPBS/0.5%BSA中で5μg/mLでウェルへ添加し、室温で30分間温置した。PBS/0.5%BSAで、細胞を1回洗浄し、共焦点顕微鏡(LSM510Meta Confocal Microscope、Carl Zeiss AG、Germany)を使用して検査した。図33Bは、Fc−L10−ShK[1−35]ペプチボディが、HEK293細胞を過剰発現するKv1.3に対する結合を保持することを示すが、形質移入されていない細胞に対する結合はほとんど示さず(図33A)、Fc−L10−ShK[1−35]ペプチボディが、Kv1.3チャネルを過剰発現する細胞を検出するための試薬として使用できることを示す。活性化されたTエフェクターメモリ細胞がKv1.3を過剰生成することが報告されている疾病状況において、この試薬は、これらの細胞をターゲットにする上でも、それらの検出においても有用性を見出せる。
図34Aは、Kv1.3を過剰発現する固定された細胞に対するペプチボディ結合の用量依存的な増加を示し、前記ペプチボディがその標的に対する高親和性結合及び、チャネルを発現する細胞の検出におけるFc−L10−ShK[1−35]の有用性を示す。多発性硬化症患者において疾病を発症させる抗原特異的T細胞は、困難なアプローチであるホールセルパッチクランプ電気生理学によって、Kv1.3を過剰発現することが示されてきた。本ペプチボディ試薬は、患者におけるKv1.3チャネル発現をモニターするための有用かつ簡便なツールであり得、診断適用において有用である。図34A及び図34Bに示される手法は、以下のとおりである。
Fc−L10−ShK[1−35]の発現は、本明細書の上述の実施例3において記載されているとおりであった。凍結したE.コリペースト(18g)を室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH8.0の200mLと組み合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ、12,000PSIで2回通過させた。次に、細胞可溶化液を、4℃、22,000gで15分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを1%デオキシコール酸200mL中に再懸濁した後、4℃、22,000gで15分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、200mLの水中にペレットを再懸濁した後、4℃、22,000gで15分間遠心分離した。次に、32mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に、ペレット(3.2g)を溶解した。次に、室温、27,000gで15分間、ペレット溶液を遠心分離した後、再折りたたみ緩衝液(3M尿素、20%グリセロール、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、5mMEDTA、1mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH9.5)500mLへ、4℃で激しく撹拌しながら、上清5mLを移動させた。次に、撹拌速度を低下させ、4℃で2日間、温置を続行した。次に、再折りたたみ溶液を−70℃で保存した。
Fc−L10−ShK[2−35]の発現は、本明細書の上述の実施例4において記載されているとおりであった。冷凍したE.コリペースト(16.5g)を室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH8.0の200mLと組み合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ12,000PSIで2回通過させた。次に、4℃、22,000gで15分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、200mLの1%デオキシコール酸中にペレットを再懸濁した後、4℃、22,000gで15分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、200mLの水中にペレットを再懸濁した後、4℃、22,000gで15分間遠心分離した。次に、39mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に、ペレット(3.9g)を溶解した。次に、室温、27,000gで15分間、ペレット溶液を遠心分離した後、再折りたたみ緩衝液(3M尿素、20%グリセロール、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、5mMEDTA、1mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH9.5)500mLへ、4℃で激しく撹拌しながら、上清5mLを移動させた。次に、撹拌速度を低下させ、4℃で2日間、温置を続行した。次に、再折りたたみ溶液を−70℃で保存した。
冷凍したE.コリペースト(129g、実施例10参照)を室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH7.8の1290mLと組み合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ12,000PSIで2回通過させた。次に、4℃、17,700gで15分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、1%デオキシコール酸1290mL中にペレットを再懸濁し、4℃、17,700gで15分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、1290mLの水中にペレットを再懸濁した後、4℃、17,700gで15分間遠心分離した。次に、160mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に、ペレット8g(合計16.3g)を溶解した。次に、ペレット溶液100mLを1M DTT1mLとともに、37℃で60分間温置した。再折りたたみ緩衝液(1M尿素、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、2.5mMEDTA、1.2mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH10.5)5000mLへ、激しく撹拌しながら4℃、2mL/分で、還元した材料を移した。次に、撹拌速度を低下させ、温置を4℃で3日間続行した。
Kv1.3の阻害剤であるFc−L10−OSK1、Fc−L10−OSK1[K7S]、Fc−L10−OSK1[E16K,K20D]、及びFc−L10−OSK1[K7S,E16K,K20D]を、哺乳類細胞中で発現させた。リンカー配列及びKvl.3阻害剤ペプチドShK[I−35]の単量体へ、インフレームで融合されるヒトIgG1のFc領域をコードするDNA配列を後述のように構築した。哺乳類細胞(HEK293及びチャイニーズハムスター卵巣細胞)からペプチボディを発現及び精製するための方法は、本明細書に開示されている。
Fc−L10−OSK1の精製
CHO(AM1 CHOd−)細胞培養上清約6L(上述の実施例41参照)を、35mLのモノクローナル抗体選択カラム(GE Healthcare)へ、7℃、10mL/分で負荷し、二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液(PBS)の数カラム容積で前記カラムを洗浄し、100mMグリシン、pH3.0にする工程で試料を溶出した。S−緩衝液A(20mMNaH2PO4、pH7.0)中の室内の65mLのSP−HPカラム(GE Healthcare)へ、7℃、10mL/分で、モノクローナル抗体選択溶出液を直接負荷した。モノクローナル抗体選択カラムをはずした後、数カラム容積のS−緩衝液Aで、SP−HPカラムを洗浄した後、5%から60%までのS−緩衝液B(20mMNaH2PO4、1M NaCl、pH7.0)の直線勾配を10mL/分で使用して展開した後、7℃で100%S−緩衝液Bへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス−グリシン4ないし20%SDS−PAGEを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした。次に、Pall Life Sciences Jumbosep 10K Omega遠心限外ろ過装置を使用して、プールした材料を約20mLに濃縮した。次に、20mMNaH2PO4、pH7.0の20mLで希釈することによって、濃縮した材料を緩衝液交換し、Jumbosep 10K Omegaフィルターを使用して20mLに再濃縮した。次に、20mMNaH2PO4、200mMNaCl、pH7.0の20mLで材料を希釈した後、22mLに再濃縮した。次に、緩衝液交換した材料を、室温、1mL/分で、0.22μm、25mmのMustang Eメンブレンを有するPall Life Sciences Acrodiscでろ過した。次に、Hewlett Packard 8453分光光度計を使用して、700μLのPBS中に希釈したろ過済み材料50μLに対して、スペクトルの走査を実施した(図49A、黒のトレース)。30,371g/molの算出された分子量及び35,410M−1cm−1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が4.96mg/mLであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン4ないし20%SDS−PAGEを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した(図49B)。次に、Charles Riversエンドトキシン特異的緩衝液中に試料を30倍希釈したものを使用して、Charles River Laboratories Endosafe−PTSシステム(0.05ないし5EU/mL感度)を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、1.8EU/タンパク質mgであった。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9でPhenomenex BioSep SEC3000カラム(7.8×300mm)へ、1mL/分で注入された生成物149μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した(図49C)。次に、試料1μLをシナピン酸10μL(0.05%トリフルオロ酢酸、50%アセトニトリル中10mg/mL)へと希釈することによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液1mLをMALDI試料プレート上に点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたVoyager DE−RP飛行時間質量分析装置を使用して分析した(337nm、3ナノ秒パルス)。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した(図49D)。次に、生成物を−80℃で保存した。
形質移入されたHEK−293による培養上清約500mL(上述の実施例41参照)を、モノクローナル抗体選択樹脂(1.5mL)(GE Healthcare)の65%スラリー及び500μLの20%NaN3と合わせた。次に、スラリーを4℃で3日間静かに撹拌した後、ブレーキを使用せずに4℃、1000gで5分間遠心分離した。次に、上清の大部分を吸引し、ペレット中に残存するスラリーを14mLのコニカルチューブへ転移させ、二価の陽イオンを含まないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液(PBS)12mLと組み合わせた。低ブレーキを使用しながら、前記スラリーを4℃、2000gで1分間遠心分離し、上清を吸引した。PBS洗浄周期をさらに3回反復した。次に、100mMグリシン、pH3.0の1mLを添加し、室温で静かに5分間撹拌することによって、結合されたタンパク質を溶出した。次に、低ブレーキを使用しながら、前記スラリーを4℃、2000gで1分間遠心分離し、上清を第一溶出液として吸引した。溶出周期をさらに2回反復し、3つの全上清を合わせて単一プールとした。pHを上昇させるために、酢酸ナトリウム(3M溶液37.5μL)を溶出プールへ添加した後、10kDa SlideAlyzer(Pierce)を使用して、10mM酢酸、5%ソルビトール、pH5.0に対して室温で2時間透析した。透析緩衝液を交換し、透析を4℃で一晩続行した。次に、0.22μm酢酸セルロースフィルターシリンジフィルターで、透析した材料をろ過した。次に、30,330の算出された分子量及び35,410M−1cm−1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が1.27mg/mLであると測定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン4ないし20%SDS−PAGEを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した(図50B)。次に、Charles Riversエンドトキシン特異的緩衝液中に試料を25倍希釈したものを使用して、Charles River Laboratories Endosafe−PTSシステム(0.05ないし5EU/mL感度)を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、1EU/タンパク質mg未満であった。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9でPhenomenex BioSep SEC3000カラム(7.8×300mm)へと1mL/分で注入された生成物50μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した(図50C)。次に、試料1μLをシナピン酸10μL(0.05%トリフルオロ酢酸、50%アセトニトリル中10mg/mL)中に希釈することによって、生成物を質量スペクトル分析へ供した。得られた溶液1mLをMALDI試料プレート上に点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたVoyager DE−RP飛行時間質量分析装置を使用して分析した(337nm、3ナノ秒パルス)。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した(図50D)。次に、生成物を−80℃で保存した。
カリウムチャネルファミリーのサブタイプであるヒトKv1.1及びKv1.3チャネルに及ぼす影響を評価するために、アジアサソリであるオルトキルススクロビキュロサス(Orthochirus Scrobiculosus)の毒液の38残基ペプチド毒素(OSK1)を合成した(実施例41参照)。HEK293細胞発現系及び電気生理学の使用によって、ヒトKv1.1及びKv1.3チャネルを阻害する上での合成OSK1の有効性及び選択性を評価した(図53)。安定して発現したKv1.3チャネルのホールセルパッチクランプ記録によって、合成OSK1ペプチドは、Kv1.1と比較したとき、ヒトKv1.3を阻害する上でより有力であることが明らかとなった(表33)。
血漿半減期を改善し、OSK1ペプチド毒素が中枢神経系を貫通するのを防止するため、本明細書の実施例41に記載されるとおり、10個のアミノ酸残基のリンカー鎖長を介して、ヒト抗体IgG1のFc断片へOSK1ペプチド毒素を融合した。この融合によって、合成OSK1ペプチドと比較すると、Kv1.3の有効性は5倍まで低下した。しかしながら、合成ペプチド単独のもの(4倍、表33及び図54)と比較すると、OSK1のKv1.1に対する選択性は210倍まで有意に改善した。
OSK1は、集合的にα−KTx3と呼ばれるサソリ毒素の他のメンバーと60ないし80%の配列相同性を共有する。OSK1及びα−KTx3ファミリーの他のメンバーの配列アラインメントによって、位置12、16、20及び36における4つの異なる構造的な差異が明らかとなった。OSK1のこれらの構造的な差異は、他のカリウムチャネルに対するそれらの多様な活性において重要な役割を果たしているものと推測され、これは、α−KTx3ファミリーの他のメンバーでは観察されない。従って、Kv1.2とのヘテロ四量体として、主に中枢神経系中に見出されるKv1.1などの他のカリウムチャネルに対する選択性に及ぼす影響を評価するために、位置16及び20に存在する2つのアミノ酸残基を、OSK1配列内のより保存されたアミノ酸残基へと回復させた。それぞれ保存されたリジン及びアスパラギン酸残基を、位置16のグルタミン酸、及び位置20のリジンと置換することによって(すなわち、Fc−L10−OSK1[E16K,K20D])、Fc−L10−OSK1の効力と比較したとき、効力に有意な変化は観察されなかった(1.3倍差、図56及び表33)。しかしながら、この二重変異によって、Kv1.1に対する遮断活性が排除された。Kv1.1/Kv1.3の選択性の比は403倍であり、Fc−L10−OSK1に関する選択比(210倍)に比べて有意に向上した。位置7のリジンからセリンへの単一アミノ酸突然変異(Fc−L10−OSK1[K7S])は、Fc−L10−OSK1の有効性及び選択性と比較すると、有効性及び選択性が、それぞれ2倍及び1.3倍までわずかに変化した(図55及び表33)。Fc−L10−OSK1[K7S,E16K,K20D]を作製させるために、3つの残基全てを突然変異させると、有効性が著しく低下した(図57及び表33)。
約24kDaの20K PEG−ShK[1−35]分子及び約4kDaの小固有ShKペプチドの静脈内(IV)薬物動態学的特性を、スプラーグドーリー系ラットで測定した。固有ShKペプチド及び新規の本発明の20K PEG−ShK[1−35]分子に関するIV用量は、1mg/kgであった。この用量は、これら2つの分子の等しいモル量を表した。ラットの平均体重は約0.3kgであり、用量及び分子に関して各2匹のラットを使用した。IV注射後の多様な時点で採血し、血清約0.1mLを回収した。分析時まで、血清試料を−80℃で冷凍保存した。
薬物動態学的研究由来の20K PEG−ShK[1−35]分子又は固有ShKペプチドを含有するラット血清試料を凍結した。実験前に、各試料を室温で解凍し、一定分量(70ないし80μL)を96ウェルポリプロピレンプレート中の1ウェルへ転移させた。アッセイプレートを調製するため、検査溶液を付与するために、薬物動態学的血清試料から何回も希釈した。薬物動態学的研究由来の血清試料を、10%リン酸緩衝塩類溶液(PBS、Ca2+及びMg2+含有)へと希釈した。薬物動態学的研究から得られた血清試料中の新規の本発明の20K PEG−ShK[1−35]分子の量を測定する場合、検査溶液中の血清最終濃度は、90%、30%、10%、3.3%及び1.1%であった。精製された20K PEG−Shk[1−35]標準阻害曲線も、Assay Plate中に調製した。これを実施するため、精製された20K PEG−ShK[1−35]分子(標準物質)の8点連続希釈液を、90%、30%、10%、3.3%又は1.1%のラット血清に調製し、標準物質の最終濃度は、50、16.7、5.5、1.85、0.62、0.21、0.068及び0.023nMであった。
電位により活性化されるK+チャネルであるKv1.3を安定的に発現するCHO細胞を、実験の2日前に、T−175組織培養フラスコ中に(5×106個の密度で)播種し、約95%の集密状態まで生育させた。実験の直前に、PBSで細胞を洗浄した後、トリプシン(0.25%)及びベルセン(1:5000)の2mL混合物(1:1容積比)を使用して、37℃で(3分間)剥離させた。その後、フラスコ中で、10%FBS、1×NEAA及G418の750μg/mLを有する組織培地(Glutamax含有HAMのF−12、InVitrogen、カタログ番号31765)10mL中に細胞を再懸濁し、約1000rpmで1.5分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを、PBS中に、3ないし5×106細胞/mLで再懸濁した。
IonWorks電気生理学及びデータ分析
CHO−Kv1.3細胞中のK+電流を阻害するための血清中の検査溶液又は標準物質の能力を、自動電気生理学システムIonWorks Quattroを使用して研究した。細胞を再懸濁し、Assay Plate、Population Patch Clamp(PPC)PatchPlate並びに適切な細胞内緩衝液(90mMグルコン酸K、20mMKF、2mMNaCl、1mMMgCl2、10mMEGTA、10mMHEPES、pH7.35)及び細胞外緩衝液(Ca2+及びMg2+含有PBS)をIonWorks Quattroに配置した。アンフォテリシンベースの穿孔パッチクランプ法を使用して、CHO−Kv1.3細胞からの電気生理学記録を実施した。IonWorks Quattroの電位クランプ回路素子を使用して、細胞を−80mVの膜電位に保持し、+30mVへ400ミリ秒、膜電位を停止させることによって電位活性型K+電流を惹起させた。対照条件下、すなわち、実験開始時阻害剤の不存在下で、及び検査溶液又は標準物質の存在下での10分間の温置の後に、K+電流を惹起させた。430ミリ秒と440ミリ秒との間に、平均K+電流振幅を測定し、Microsoft Excelスプレッドシートへ、データを転送した。検査溶液又は標準物質の各濃度の存在下でのK+電流の振幅を、同一ウェル中の対照条件下でのK+電流の百分率として表した。
Kv1.3の20K PEG−ShK阻害剤は、ラットにおける重度の自己免疫性能脊髄炎を抑制する上で改善された有効性を示す。以前に記載された多発性硬化症の適応性転移型実験的自己免疫性脳脊髄炎(AT−EAE)モデル[C.Beeton et al.(2001)J.Immunol.166,936]を使用して、本発明者は、本発明の新規20K PEG−ShK分子のインビボでの活性を検討し、その有効性をShK毒素ペプチド単独の有効性と比較した。研究デザインを図61に図示する。本インビボ研究からの結果を図62及び図63に示す。第1日から第3日まで10μg/kgで毎日皮下送達される20K PEG−ShK分子は、疾病の重度を有意に低下させ、生存性を亢進したのに対し、小さなShKペプチドの等モル投与量(10μg/kg)で処理した動物は、重度の疾病を発症し、死亡した。
IL−2及びIFN−gの分泌に及ぼすKv1.3阻害剤の影響を検討するためのエクスビボアッセイ
健常で、投薬を受けていないドナーから、ヘパリンバキュテナー(vacutainer)中にヒト全血を取得した。DMEM完全培地は、0.1%ヒトアルブミン(Bayer68471番)、55μM2−メルカプトエタノール(Gibco)及び1×Pen−Strep−Gln(PSG、Gibco、カタログ番号10378−016)を含有する(L−グルタミン及び25mMHepes緩衝液を有する)イスコブDMEMであった。タプシガルジンは、Alomone Labs(Israel)から入手した。カルシウム動員のための4×タプシガルジンの刺激を与えるために、100%DMEM中のタプシガルジンの10mMストック溶液をDMEM完全培地で40μM、4×溶液に希釈した。Kv1.3阻害剤であるペプチドShK(スティコダシトラ・ヘリアンサス(Stichodacytla helianthus)毒素、カタログ番号H2358)及びBKCa1阻害剤であるペプチドIbTx(イベリオトキシン、カタログ番号H9940)はBachem Biosciencesから購入し、Kv1.1阻害剤であるペプチドDTX−k(デンドロトキシン−K)はAlomone Labs(Israel)製であった。Kv1.3のCHO由来のFc−L10−ShK[2−35]ペプチド阻害剤は、実施例4及び実施例39で本明細書に記載されているとおりに入手した。カルシウム阻害剤であるシクロスポリンAをAmgen試料バンクから入手したが、多様な売主からも市販されている。阻害剤の10個の3倍連続希釈を、4倍濃度の最終濃度で、DMEM完全培地中に調製し、96ウェルFalcon3075平底マイクロタイタープレートのウェルに各々50μLを添加した。マイクロタイタープレートの列1ないし5及び7ないし11は阻害剤を含有した(各行は個別の阻害剤の希釈の連続を有した)のに対し、列6中の8個のウェルには、DMEM完全培地単独50μLを添加し、列12の8ウェルには、DMEM完全培地単独100μLを添加した。実験を開始するために、マイクロタイタープレートの各ウェルへ、全血100μLを添加した。次に、プレートを37℃、5%CO2で1時間温置した。1時間後、プレートを取り外し、8ウェルであった列12を除き、4倍濃度のタプシガルジン刺激(40μM)50μLを、プレートの全ウェルへ添加した。37℃、5%CO2に、プレートを48時間再配置した。全血中に分泌されたIL−2及びIFN−gの量を測定するため、96ウェルプレートの各ウェルからの上清(培養上清)100μLを保存プレートに移した。サイトカイン産生のMSD電気化学発光分析のため、MSD Multi−Spot Custom Coatedプレート(www.meso−scale.com)へ、上清(馴化培地)20μLを添加した。これらのプレート上の作業電極を、4つの捕捉抗体(hIL−5、hIL−2、hIFNg及びhIL−4)であらかじめコーティングした。馴化培地20μLをMSDプレートへ添加した後、検出抗体及びP4緩衝液の混合物150μLを各ウェルへ添加した。150μL混合物は、各1μg/mLの4つの検出抗体(hIL−5、hIL−2、hIFNg及びhIL−4)20μL及び2×P4緩衝液130μLを含有した。プレートを覆い、振とうプラットフォーム上に一晩(暗所に)配置した。翌朝、MSD Sector Imagerで、プレートを読み取った。各プレートの列6中の8ウェルには、タプシガルジン刺激のみのみが与えられ、阻害剤が与えられなかったので、プレートに対して「高い」値を算出するために、ここでは、平均MSD反応を使用した。プレートに対して算出された「低い」値は、タプシガルジン刺激及び阻害剤を含有しない列12の8ウェルから得られた平均MSD反応から求められた。対照の百分率(POC)は、刺激されていない対照と刺激された対照に対する反応の測定結果であり、100POCは、タプシガルジン刺激単独の平均反応又は「高い」値と等しい。それ故、100POCは、反応の0%阻害を表す。対照的に、0POCは、反応の100%阻害を表し、刺激が付与されない反応又は「低」値と等価である。対照の百分率(POC)を算出するため、次式:[(ウェルのMSD反応)−(「低い値」)]/[(「高い値」)−(「低い値」)]×100を使用する。カーブフィッティングの後、全血中の分子の有効性を阻害曲線(IC)から算出し、IC50は標準的なカーブフィッティングソフトウェアを使用して求めた。本発明者らは、ここに、高処理量のMSD電気化学発光アッセイを用いたサイトカイン産生の測定を記載しているが、当業者は、サイトカイン産生を測定するために、より小さな処理量のELISAアッセイを等しく適用できることに容易に想到する。
健常で、投薬を受けていないドナーから、ヘパリンバキュテナー中に、ヒト全血を入手した。DMEM完全培地は、0.1%ヒトアルブミン(Bayer68471番)、55μM2−メルカプトエタノール(Gibco)及び1×Pen−Strep−Gln(PSG、Gibco、カタログ番号10378−016)を含有する(L−グルタミン及び25mMHepes緩衝液を有する)イスコブDMEMであった。タプシガルジンは、Alomone Labs(Israel)より入手した。カルシウム動員のための4×タプシガルジンの刺激を与えるために、100%DMEM中のタプシガルジンの10mMストック溶液をDMEM完全培地で40μM、4×溶液に希釈した。Kv1.3阻害剤であるペプチドShK(スティコダシトラ・ヘリアンサス毒素、カタログ番号H2358)及びBKCa1阻害剤であるペプチドIbTx(イベリオトキシン、カタログ番号H9940)は、Bachem Biosciencesから購入し、Kv1.1阻害剤であるペプチドDTX−k(デンドロトキシン−K)はAlomone Labs(Israel)製であった。Kv1.3のCHO由来のFc−L10−ShK[2−35]ペプチボディ阻害剤を、実施例4及び実施例39に記載されているとおりに入手した。カルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンAはAmgen試料バンクから入手したが、多様な売主から市販されている。イオンチャネル阻害剤であるShK、IbTx又はDTK−kを、DMEM完全培地中に、望ましい最終濃度の4×となるように希釈した(終濃度=50又は100nM)。カルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンAも、DMEM完全培地中に、4×最終濃度となるように希釈した(最終濃度=10μM)。96ウェルFalcon3075平底マイクロタイタープレートの適切なウェルへ、DMEM完全培地又は4×阻害剤溶液のいずれか50μLを添加した。次に、ヒト全血100μLを添加し、プレートを、37℃、5%CO2で1時間温置した。1時間後、プレートを取り外し、阻害剤を含有するプレートの全ウェルへ、4×タプシガルジン刺激(40μM)50μLを添加した。阻害剤を含有しないが、DMEM完全培地のみを含有する幾つかのウェルにタプシガルジンも添加したのに対し、DMEM完全培地のみを有する他のウェルには、DMEM完全培地をさらに50μL添加した。阻害剤及びタプシガルジン刺激を有しないウェルは、処理されていない「低」対照を相当した。阻害剤を有しないが、タプシガルジン刺激を与えられたウェルは、最大刺激のための対照又は「高」対照に相当した。プレートを、37℃、5%CO2に24時間再配置した。24時間後、プレートを取り出し、ウェルをFACS分析のために処理した。細胞をウェルから摘出し、染色緩衝液(熱失活済みの2%ウシ胎仔血清を含有するリン酸緩衝塩類溶液)中で洗浄した。製造者の指示に従って、1.5%ホルムアルデヒド(BD Biosciences)を含有するBD FACS Lysing Solutionを使用して、赤血球細胞を溶解した。チューブあたり染色緩衝液100μLあたり100万個の細胞の濃度で細胞を分配した。まず、ビオチン標識した抗ヒトCD4の1μLで、細胞を染色し、洗浄した後、1μLのストレプトアビジン−APC、FITC標識した抗ヒトCD45RA、及びフィコエリトリン(PE)標識した抗ヒトCD25(IL−2Ra)又はPE標識した抗ヒトCD40Lで同時に染色した。抗体添加工程の間に、細胞を染色緩衝液で洗浄した。全ての抗体は、BD Biosciences(San Diego、CA)から入手した。各試料に対して、2万ないし5万の生存事象を、Becton Dickinson FACSCaliber(Mountain View、CA)フローサイトメーターで回収し、FlowJoソフトウェア(Tree Star Inc.、San Carlos、CA)を使用して分析した。前方向及び側部の散乱特性に基づいて、死滅した細胞、単球及び顆粒球を分析から排除した。
実施例を通じて、本発明のPEG化したペプチボディを以下の方法によって作製した。CHOにより発現された、19.2mLのA5S、20mMのNaBH3CN、pH5中のFcL10−OsK1(19.2mg、分子量30,371Da、0.63μmol)を、38mgのPEGアルデヒド(分子量20kDa、3×、ロット104086)で処理した。密閉した反応混合物を冷温室で一晩撹拌した。Superrose 6 HR 10/30カラム(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、0.4mL/分で0.05Mリン酸塩緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0で溶出したSEC HPLCにより、反応の経過中のタンパク質修飾度をモニターした。反応混合物をA5S、pH5で一晩透析した。次に、透析した材料をA5S、pH5中のSP HP FPLCカラム(16/10)へ負荷し、1M NaCl勾配で溶出した。回収した画分をSEC HPLCにより分析し、3つのプール中にプールし、DPBS中へと交換し、濃縮し、官能基検査に供した(表34)。
ShK及びOsk−1のPEG化、精製及び分析
合成ShK又はOSK1−1毒素ペプチドのN末端での還元的アルキル化によって、ペプチドを選択的にPEG化した。20mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム及び20kDaのモノメトキシ−PEG−アルデヒド(Nektar Therapeutics、Huntsville、AL)の2モル過剰量を含有する50mMNaH2PO4、pH4.5反応緩衝液中の2mg/mLで、Shk又はOSK−1のいずれかの毒素ペプチドを使用して、結合を達成した。結合反応物を室温で一晩撹拌し、その進行をRP−HPLCによってモニターした。完了した反応を、20mMNaOAc、pH4による4倍希釈により停止し、pH3.5に調整し、4℃に冷却した。次に、4℃で、SPセファロースHPカラム(GE Healthcare、Piscataway、NJ)を使用して、20mMNaOAc、pH4.0中の直線的な0ないし1MのNaCl勾配で溶出して、PEG−ペプチドをクロマトグラフィー精製した(図68A及び図68B)。溶出したピーク画分をSDS−PAGE及びRP−HPLCにより分析し、プールしたものを測定したところ、純度97%超であった。観察される主な夾雑物質は、ジPEG化した毒素ペプチド及び修飾されていない毒素ペプチドであった。3kDa MWCO膜に対する遠心ろ過によって、選択されたプールを2ないし5mg/mLに濃縮し、5%ソルビトールを有する10mMNaOAc、pH4中へと透析した。次に、透析したプールを0.2ミクロンフィルターでろ過滅菌し、SDS−PAGE及びRP−HPLCによって純度が97%超であることを決定した(図69A及び図69B)。0.1%TFA/H2O中のZorbax5μm 300SB−C8 4.6×50mmカラム(Phenomenex)を1mL/分で稼動させ、カラム温度を40℃に維持したAgilent1100モデルHPLCで、逆相HPLCを実施した。PEG−ペプチドの試料(20μg)を注入し、直線的な6ないし60%勾配中に溶出する間、215nm及び280nmの波長でモニターした。
図70、図71、図72及び図73に例示されているように、Gegg et al.,Modified Fc molecules、WO2006/036834 A2[PCT/US2005/034273]中の実施例1に公開されている方法に従って、配列D137E138L139T140K141として定義されるヒトIgG1Fc−ループドメイン中にジスルフィドにより抑制される毒素ペプチドを挿入した。3つの連結されたドメインを有する典型的なFcループ−L2−OsK1−L2、Fcループ−L2−ShK−L2、Fcループ−L2−ShK−L4及びFcループ−L4−OsK1−L2を調製した。これらを回収、精製し、官能基検査へ供した。
本明細書の上述の実施例16に記載されるように入手された冷凍したE.コリペースト(117g)を、室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH7.5の1200mLと組み合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。冷却した懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置に12,000PSIで2回通過させた。次に、4℃、17,700gで30分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを1%デオキシコール酸1200mL中に再懸濁した後、4℃、17,700gで30分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを1200mLの水中に再懸濁した後、4℃、17,700gで30分間遠心分離した。次に、ペレット6.4g(合計14.2g)を128mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に溶解した。次に、ペレット溶液を1MのDTT0.67mLとともに、37℃で60分間温置した。還元した材料を4℃、2mL/分で再折りたたみ緩衝液(3M尿素、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、2.5mMEDTA、2.5mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH9.5)5500mLへと、激しく撹拌しながら移した。次に、撹拌速度を低下させ、温置を4℃で3日間続行した。
本明細書の上述の実施例15に記載されているように入手された、冷凍したE.コリペースト(65g)を、室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH7.5の660mLと合わせて、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ、12,000PSIで2回通過させた。次に、4℃、17,700gで30分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、660mLの1%デオキシコール酸中にペレットを再懸濁した後、4℃、17,700gで30分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、660mLの水中にペレットを再懸濁した後、4℃、17,700gで30分間遠心分離した。次に、ペレット13gを130mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に溶解した。次に、1MのDTT0.1mLとともに、ペレット溶液10mLを、37℃で60分間温置した。4℃、2mL/分で、激しく撹拌しながら、再折りたたみ緩衝液(2M尿素、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、2.5mMEDTA、2.5mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH8.5)1000mLへと、還元した材料を移した。次に、撹拌速度を低下させ、4℃で3日間、温置を続行した。
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されているとおりであった。使用されるベクターは、pAMG21amgR−pep−Fcであり、OsK1−L−Fcの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されているとおりであった。使用されるベクターは、pAMG21amgR−pep−Fcであり、Gly−ShK(1−35)−L−Fcの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖(以下参照)を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
本明細書を通じて使用される略語は、特異的な事情において別段の定義がなければ、以下に定義されるとおりである。
AcBpa アセチル化p−ベンゾイル−L−フェニルアラニン
ADCC 抗体依存的な細胞傷害性
Aib アミノイソブチル酸
bA β−アラニン
Bpa p−ベンゾイル−L−フェニルアラニン
BrAc ブロモアセチル(BrCH2C(O))
BSA ウシ血清アルブミン
Bzl ベンジル
Cap カプロン酸
COPD 慢性閉塞性肺疾患
CTL 細胞傷害性Tリンパ球
DCC ジシクロヘキシルカルボジイミド
Dde 1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソ−シクロヘキシリデン)エチル
ESI−MS 電子スプレーイオン化質量分析法
Fmoc フルオレニルメトキシカルボニル
HOBt 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
HSL ホモセリンラクトン
IB 封入体
KCa (ILCa、BKCa、SKCaを含む)カルシウム活性化カリウムチャネル
Kv 電位開口型カリウムチャネル
Lau ラウリン酸
LPS リポ多糖
LYMPH リンパ球
MALDI−MS マトリクス介助レーザーデソープションイオン化質量分析法
Me メチル
MeO メトキシ
MHC 主要組織適合遺伝子複合体
MMP マトリクスメタロプロテアーぜ
1−Nap 1−ナフチルアラニン
NEUT 好中球
Nle ノルロイシン
NMP N−メチル−2−ピロリジノン
PAGE ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBMC 末梢血単核細胞
PBS リン酸緩衝塩類溶液
Pbf 2,2,4,6,7−ペンダメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
Pec ピペコリン酸
PEG ポリ(エチレングリコール)
pGlu ピログルタミン酸
Pic ピコリン酸
pY ホスホチロシン
RBS リボソーム結合部位
RT 室温(25℃)
Sar サルコシン
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
STK セリン−トレオニンキナーゼ
t−Boc tert−ブトキシカルボニル
tBu tert−ブチル
THF 胸腺体液性因子
Trt トリチル
Claims (134)
- 式
(X1)a−(F1)d−(X2)b−(F2)e−(X3)c
の組成物及びその多量体。
(式中:
F1及びF2は半減期延長部分であり、並びにd及びeは、各々独立に、0又は1であり(但し、d及びeの少なくとも1つは1である。);
X1、X2及びX3は、各々独立に、−(L)f−P−(L)g−であり、並びにf及びgは、各々独立に、0又は1であり;
Pは、少なくとも2つのペプチド内ジスルフィド結合を含む、約80アミノ酸残基長以下のトキシンペプチドであり;
Lは、リンカーであり;並びに
a、b及びcは、各々独立に、0又は1である(但し、a、b及びcの少なくとも1つは、1である。)。) - 式P−(L)g−F1の、請求項1に記載の組成物。
- 式F1−(L)f−Pの、請求項1に記載の組成物。
- 式P−(L)g−F1−(L)f−Pの、請求項1に記載の組成物。
- 式F1−(L)f−P−(L)g−F2の、請求項1に記載の組成物。
- 式F1−(L)f−P−(L)g−F2−(L)f−Pの、請求項1に記載の組成物。
- 式F1−F2−(L)f−Pの、請求項1に記載の組成物。
- 式P−(L)g−F1−F2の、請求項1に記載の組成物。
- 式P−(L)g−F1−F2−(L)f−Pの、請求項1に記載の組成物。
- F1若しくはF2又は両方が、ポリエチレングリコール、エチレングリコールの共重合体、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/マレイン酸無水物共重合体、ポリアミノ酸、デキストランn−ビニルピロリドン、ポリn−ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモ重合体、プロピレンオキシドポリマー、エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチレン化されたポリオール、ポリビニルアルコール、直鎖若しくは分岐のグリコシル化された鎖、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族基、免疫グロブリンFcドメイン若しくはその一部、FcのCH2ドメイン、Fcドメインループ、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、トランスサイレチン、チロキシン結合グロブリン若しくは長い血清半減期の血清タンパク質に対して親和性を有し、ペプチドリガンド及び小分子リガンドからなる群から選択されるリガンド又はこれらの要素の何れかの組み合わせである、請求項1に記載の組成物。
- F1若しくはF2又は両方がヒトIgFcドメイン又はその一部を含む、請求項1に記載の組成物。
- ヒトIgGFcドメインがヒトIgG1Fcドメインを含む、請求項11に記載の組成物。
- ヒトIgGFcドメインがヒトIgG2Fcドメインを含む、請求項11に記載の組成物。
- F1及びF2が異なる半減期延長部分である、請求項1に記載の組成物。
- F1若しくはF2又は両方が、(図3、4、11A〜C、12A〜C及び12E〜F)に記載されているような配列番号:2、4、70、71、72、74、75、76、1340〜1342及び1359〜1363からなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- F1若しくはF2又は両方がヒト血清アルブミンタンパク質ドメインを含む、請求項1に記載の組成物。
- F1若しくはF2又は両方がトランスサイレチンタンパク質ドメインを含む、請求項1に記載の組成物。
- F1若しくはF2又は両方が生物学的に適切な重合体又は共重合体を含む、請求項1に記載の組成物。
- 生物学的に適切な重合体がポリエチレングリコール(PEG)である、請求項18に記載の組成物。
- PEGが5kD及び20kDのPEGからなる群から選択される、請求項19に記載の組成物。
- F1がヒトIgGFcドメイン又はHSAであり、及びF2がPEGである、請求項5、6、8又は9の何れか1項に記載の組成物。
- F2がヒトIgGFcドメイン又はHSAであり、及びF1がPEGである、請求項5、6、7又は9の何れか1項に記載の組成物。
- 非PEGF1若しくは非PEGF2に、又はPに、又はこれらの何れかのあらゆる組み合わせに抱合された1つ又はそれ以上のPEG部分をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- トキシンペプチドがヒトIgG1Fcドメインループ中に挿入されている、請求項1に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがKv1.3アンタゴニストペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- Kv1.3アンタゴニストペプチドが、ShK、HmK、MgTx、AgTx1、AgTx2、HsTx1、OSK1、アヌロクトキシン(Anuroctoxin)、ノキシウストキシン(Noxiustoxin)、ホンゴトキシン(Hongotoxin)、HsTx1、ChTx、チチストキシン(Titystoxin)、BgK、BmKTX、BmTx、Tc30、Tc32、Pi1、Pi2及びPi3トキシンペプチド又はこれらの何れかの類縁体からなる群から選択される、請求項25に記載の組成物。
- Kv1.3アンタゴニストペプチドが、表1に記されている配列番号21、17、18、19、61、23、85、25、62、30、27、36、86、9、26、40、87及び13からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項25に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがShKペプチド又はShKペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- ShKペプチド又はShKペプチド類縁体が、表2に記されている配列番号5、88〜200、548〜561、884〜950及び1295〜1300からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項28に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPが、HmKペプチド、BgKペプチド、AeKペプチド若しくはAsKSペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- HmKペプチド、BgKペプチド、AeKペプチド若しくはAsKsペプチド又はペプチド類縁体が、表3に記されている配列番号6〜9、201〜241からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項30に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがMgTxペプチド又はMgTxペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- MgTxペプチド、MgTxペプチド類縁体が、表4に記されている配列番号28及び242〜260からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項32に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがAgTx2ペプチド又はAgTx2ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- AgTx2ペプチド又はAgTx2ペプチド類縁体が、表5に記されている配列番号23及び261〜275からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項34に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがHsTx1ペプチド又はHsTx1ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- HsTx1ペプチド又はHsTx1ペプチド類縁体が、表6に記されている配列番号61及び276〜293からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項36に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがOSK1ペプチド又はOSK1ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- OSK1ペプチド又はOSK1ペプチド類縁体が、表7に記されている配列番号25、294〜298、562〜636、980〜1274及び1303〜1308からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項38に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがPi2ペプチド又はPi2ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- Pi2ペプチド又はPi2ペプチド類縁体が、表8に記されている配列番号17及び299〜315からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項40に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがAnTxペプチド又はAnTxペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- AnTxペプチド又はAnペプチド類縁体が、表9に記されている配列番号62及び316〜318からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項42に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがNTXペプチド又はNTXペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- NTXペプチド又はNTXペプチド類縁体が、表10に記されている配列番号30及び319〜325からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項44に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがKTX1ペプチド又はKTX1ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- KTX1ペプチド又はKTX1類縁体が、表11に記されている配列番号24及び326〜328からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項46に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがIKCa1アンタゴニストペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- IKCa1アンタゴニストペプチドが、MTxペプチド、ChTxペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む、請求項48に記載の組成物。
- MTxペプチド、ChTxペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体が、表12に記されている配列番号20、36及び329からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがMTXペプチド又はMTXペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- MTXペプチド又はMTXペプチド類縁体が、表13に記されている配列番号20、330〜343、及び1301、1302、1304〜1307、1309、1311、1312及び1315〜1336からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項51に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがChTXペプチド又はChTxペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- ChTxペプチド又はChTxペプチド類縁体が、表14に記されている配列番号36、59、344〜346及び1369〜1390からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項53に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがSKCaアンタゴニストペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- SKCaアンタゴニストペプチドが、アパミンペプチド、ScyTxペプチド、BmP05ペプチド、P05ペプチド、タマピンペプチド、P01ペプチド若しくはTsKペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む、請求項55に記載の組成物。
- SKCaアンタゴニストペプチドが、表15に記されている配列番号16、47、50〜53及び68からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項55に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがアパミンペプチド又はアパミンペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- アパミンペプチド又はアパミンペプチド類縁体が、表16に記されている配列番号68及び348〜353からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項58に記載の組成物。
- ScyTxペプチド、タマピンペプチド又はペプチド類縁体が、表17に記されている配列番号51、53及び354〜356からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項56に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがBKCaアンタゴニストペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- BKCaアンタゴニストペプチドが、表18に記されている配列番号29、35、38〜41からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項61に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがIbTxペプチド、ソロトキシンペプチド、BmTx1ペプチド若しくはBuTxペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む、請求項61に記載の組成物。
- IbTxペプチド、スロトキシンペプチド、BmTx1ペプチド、BuTxペプチド又はペプチド類縁体が、表19に記されている配列番号38及び357〜398からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項63に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがマルテントキシンペプチド又はマルテントキシンペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- マルテントキシンペプチド又はマルテントキシンペプチド類縁体が、表20に記されている配列番号35及び399〜408からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがN型カルシウムチャンネル阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- N型カルシウムチャンネル阻害剤ペプチドが、表21に記されている配列番号64〜66、347、409、1364〜1367からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項67に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがωMVIIAペプチド又はωMVIIAペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- ωMVIIAペプチド又はωMVIIAペプチド類縁体が、表22に記されている配列番号65及び410〜421からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項69に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがGVIAペプチド又はGVIAペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- GVIAペプチド又はGVIAペプチド類縁体が、表23に記されている配列番号64及び422〜429からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項71に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがPtu1ペプチド又はPtu1ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- Ptu1ペプチド又はPtu1ペプチド類縁体が、表24に記されている配列番号66及び430〜437からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項73に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがT型カルシウムチャンネル、P2X又はTRP阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがProTx1ペプチド又はProTx1ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- ProTx1が、表25に記されている配列番号56、438〜445からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項76に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがBeKMIペプチド又はBeKMIペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- BeKMIペプチド又はBeKMIペプチド類縁体が、表26に記されている配列番号63及び446〜458からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項78に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがナトリウムチャンネル阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- ナトリウムチャンネル阻害剤ペプチドが、表27に記されている配列番号459〜469からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項80に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPが塩化物チャンネル阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- 塩化物チャンネル阻害剤ペプチドが、表28に記されている配列番号67及び470〜493からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項82に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがKv2.1阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- Kv2.1阻害剤ペプチドが、表29に記されている配列番号494〜506からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項84に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがKv4.3ペプチド及びKv4.2の阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- Kv4.3及びKv4.2の阻害剤ペプチドが、表30に記されている配列番号57及び507〜518からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項86に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがnACHRチャンネル阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- nACHRチャンネル阻害剤ペプチドが、表31に記されている配列番号519〜541からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPがアガトキシンペプチド又はアガトキシンペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。
- 少なくとも1つのPが、表32に記されている配列番号959〜975、1275〜1287及び1368からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1に記載の組成物をコードするDNA。
- 請求項92に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項93に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 細胞が真核細胞である、請求項94に記載の宿主細胞。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項94に記載の宿主細胞。
- 細胞がCHO細胞である、請求項94に記載の宿主細胞。
- 細胞が原核細胞である、請求項94に記載の宿主細胞。
- 細胞がE.コリ細胞である、請求項94に記載の宿主細胞。
- 薬理学的に活性な、共有結合されたさらなるペプチドをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- さらなるペプチドがF1又はF2に結合されている、請求項100に記載の組成物。
- さらなるペプチドがPに結合されている、請求項100に記載の組成物。
- トキシンペプチドの活性に関してアゴニスト作用を示すペプチド若しくはアンタゴニスト作用を示すペプチド又は標的誘導ペプチドをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 表2に記されている配列番号88、89、92、148〜200、548〜561、884〜949及び1295〜1300からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表3に記されている配列番号201〜225からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表4に記されている配列番号242〜248及び250〜260からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表5に記されている配列番号261〜275からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表6に記されている配列番号276〜293からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表7に記されている配列番号980〜1274、1303及び1308からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表8に記されている配列番号299〜315からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表9に記されている配列番号316〜318からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表10に記されている配列番号319のアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表11に記されている配列番号327及び328からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表13に記されている配列番号330〜337、341、1301、1302、1304〜1307、1309、1311、1312及び1315〜1336からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表14に記されている配列番号1369〜1390からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表16に記されている配列番号348〜353からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表19に記されている配列番号357〜362、364〜368、370、372〜385及び387〜398からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表20に記されている配列番号399〜408からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表22に記されている配列番号410〜421からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表23に記されている配列番号422、424、426及び428からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表24に記されている配列番号430〜437からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表25に記されている配列番号438〜445からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表26に記されている配列番号447、449、451、453、455及び457からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表28に記されている配列番号470〜482及び484〜493からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表29に記されている配列番号495〜506からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 表30に記されている配列番号507〜518からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。
- 請求項1、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125又は126の何れか1項に記載の組成物と、及び医薬として許容される担体とを含む医薬組成物。
- 多発性硬化症の少なくとも1つの症候を以前に経験した患者に、多発性硬化症の少なくとも1つの症候の再発が予防され、又は多発性硬化症の少なくとも1つの症候が軽減されるように、請求項1、38、39、48、49、50、51、52、53、54、104、109、114又は115の何れか1項に記載の組成物の予防的有効量を投与することを含む、多発性硬化症の症候の再発を予防又は軽減する方法。
- 組成物がKv1.3アンタゴニストペプチドを含む、請求項128に記載の方法。
- 組成物が、ShKペプチド、OSK1ペプチド、ChTxペプチド若しくはマウロトキシンペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む、請求項128に記載の方法。
- 多発性硬化症、1型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄(restinosis)、全身性硬化症、繊維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶、移植片対宿主病及び狼瘡からなる群から選択される自己免疫疾患と診断された患者に、前記疾患の少なくとも1つの症候が前記患者において緩和されるように、請求項1、38、39、48、49、50、51、52,53、54、104、109、114又は115の何れかに記載の組成物の治療的有効量を投与することを含む、自己免疫疾患を治療する方法。
- 組成物がKv1.3アンタゴニストペプチド又はIKCa1アンタゴニストペプチドを含む、請求項131に記載の方法。
- 組成物が、ShKペプチド、OSK1ペプチド、ChTxペプチド若しくはマウロトキシンペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む、請求項131に記載の方法。
- 何れかのf又は何れかのgが1であり、並びにLが配列番号79、84及び637〜656からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーである、請求項1に記載の組成物。
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