JP2012067142A - 免疫グロブリンキメラ単量体−二量体ハイブリッド - Google Patents

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Adam R Mezo
アール． メゾ アダム
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エス． リベラ ダニエル
Alan J Bitonti
ジェイ． ビトンティ アラン
James M Stattel
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Abstract

【課題】免疫グロブリンキメラ単量体−二量体ハイブリッドの提供。
【解決手段】本発明はキメラ単量体−二量体ハイブリッド蛋白に関し、ここで該蛋白は第１および第２のポリペプチド鎖を含み、該第１のポリペプチド鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および生物学的に活性な分子を含み、そして該第２のポリペプチド鎖は第１の鎖の生物学的に活性な分子を結う差なり免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含む上記蛋白に関する。本発明はまた、本発明のキメラ単量体−二量体ハイブリッドの使用方法および作成方法に関する。
【選択図】なし

Description

本出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２００３年５月６日に出願された米国暫定特許出願６０／４６９，６００、２００３年７月１７日に出願された米国暫定特許出願６０／４８７，９６４、および、２００４年１月２６日に出願された米国暫定特許出願６０／５３９，２０７の優先権を主張する。２００４年５月６日に同時に出願された免疫グロブリンキメラ蛋白の化学合成方法と題された米国非暫定特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本発明は一般的に治療用キメラ蛋白に関し、これは２つのポリペプチド鎖を含み、ここで第１の鎖は治療用の生物学的に活性な分子を含み、そして第２の鎖は第１の鎖の治療用の生物学的に活性な分子を含まない。より詳しくは、本発明はポリペプチド鎖２つを含むキメラ蛋白に関し、ここで両方の鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、ここで第１の鎖は生物学的に活性な分子を含むように更に修飾され、そして、第２の鎖はそのように修飾されない。即ち本発明は、単量体−二量体ハイブリッドであるキメラ蛋白、即ち二量体の特徴と単量体の特徴を有するキメラ蛋白に関し、ここで、二量体の特徴は免疫グロブリン定常領域の部分を各々が含む２つのポリペプチド鎖を含むという事実に関し、そして単量体の特徴は２つの鎖の１つのみが治療用の生物学的に活性な分子を含むという事実に関する。図１は単量体−二量体ハイブリッドの一例を説明するものであり、ここで生物学的に活性な分子はエリスロポエチン（ＥＰＯ）であり、そして免疫グロブリン定常領域の部分はＩｇＧＦｃ領域である。
（背景技術）
免疫グロブリンはポリペプチド鎖４つ、即ちジスルフィド結合を介して会合することにより４量体を形成する重鎖２つおよび軽鎖２つを含む。各鎖は更に可変領域１つおよび定常領域１つを含む。可変領域は抗原認識および結合を媒介し、定常領域、特に重鎖定常領域は種々のエフェクター機能、例えば相補結合およびＦｃ受容体結合を媒介する（例えば米国特許６，０８６，８７５；５，６２４，８２１；５，１１６，９６４参照）。
定常領域は更にＣＨ（定常重）ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２等）と称されるドメインを含む。アイソタイプ（即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）に応じて、定常領域は３または４種のＣＨドメインを含むことができる。一部のアイソタイプ（例えばＩｇＧ）の定常領域はまたヒンジ領域を含有する（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＮＹ，ＮＹ）。
目的の蛋白またはそのフラグメントに連結した免疫グロブリン定常領域を含むキメラ蛋白の作成が報告されている（例えば米国特許５，４８０，９８１および５，８０８，０２９：Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２９３６；Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ ９：３４７；Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６６７；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：１６４；Ａｒｕｆｆｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ ６１：１３０３；Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ
ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１；Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ
ａｌ．，１９９１，Ｃｅｌｌ ６６：１１３３；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３；Ｐｅｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３０６０；Ｋｕｒｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９３５４；Ｃｈａｌｕｐｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０３６０；Ｒｉｄｇｗａｙ ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ，１９９１，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１４４８；Ｚｈｅｎｇ
ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５４：５５９０参照）。これらの分子は通常は目的の連結された分子に関わる生物学的活性並びにエフェクター機能または免疫グロブリン定常領域に関わる何らかの別の所望の特徴（例えば生物学的安定性、細胞分泌）の両方を有している。
免疫グロブリン定常領域のＦｃ部分は免疫グロブリンアイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン並びにヒンジ領域を含むことができる。免疫グロブリンのＦｃ部分を含むキメラ蛋白は数種の所望の特性、例えば増強された安定性、延長された血清中半減期（Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５参照）並びに新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）のようなＦｃ受容体への結合（米国特許６，０８６，８７５、６，４８５，７２６、６，０３０，６１３；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１）をキメラ蛋白に対し与えている。
ＦｃＲｎは成人上皮組織において活性であり、そして腸、肺気道、鼻表面、膣表面、結腸および直腸の表面において発現される（米国特許６，４８５，７２６）。ＦｃＲｎ結合相手（例えばＩｇＧ、Ｆｃフラグメント）を含むキメラ蛋白はＦｃＲｎによる上皮バリアを通過する効果的な移動が可能であり、これにより所望の治療用分子を全身投与するための非侵襲的な手段を与える。更にまたＦｃＲｎ結合相手を含むキメラ蛋白はＦｃＲｎを発現する細胞によるエンドサートーシスに付される。しかしながら分解のためにマークされる代わりにこれらのキメラ蛋白は循環に戻されて再利用されるため、これらの蛋白のインビボの半減期が延長される。
免疫グロブリン定常領域の部分、例えばＦｃＲｎ結合相手は典型的にはジスルフィド結合および他の非特異的相互作用を介して、相互に会合し、二量体またはそれより高次の多量体を形成する。本発明はＦｃＲｎ結合相手を含むキメラ蛋白のトランスサイトーシスがキメラ蛋白の分子量により制限され、より高分子量の物質種がより低効率で輸送されるという意外な発見に部分的に基づいている。
生物学的に活性な分子を含むキメラ蛋白は投与されると典型的には標的分子または細胞と相互作用する。本発明は更に１つの生物学的に活性な分子であるが免疫グロブリン定常領域の２つの部分、例えば２つのＦｃＲｎ結合相手を有する単量体−二量体ハイブリッドが機能し、そして生物学的に活性な分子の２つ以上のコピーを有する本明細書においては単に「二量体」と称するホモ二量体またはより高次の多量体よりも高効率で輸送できるという意外な発見に部分的に基づいている。これは部分的には二量体およびより高次の多量体として存在する２つ以上の生物学的に活性な分子を含むキメラ蛋白は、相互に近接する２つ以上の生物学的に活性な分子の存在のために、その標的分子または細胞との相互作用が妨げられるように立体的に遮蔽される可能性があるという事実によるものである。
従って、本発明の１つの特徴は上皮バリアを経由して輸送される生物学的に活性な分子を含むキメラ蛋白を提供する。本発明の別の特徴は立体障害または自己凝集を殆どまたは全く伴わずに標的分子または細胞と相互作用することができる生物学的に活性な分子少なくとも１つを含むキメラ蛋白を提供する。
本発明の特徴は第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白を提供し、第１の鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、ここで免疫グロブリン定常領域の部分は生物学的に活性な分子を含むように修飾されており、そして、第１の鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、ここで免疫グロブリン定常領域の部分は第２の鎖の生物学的に活性な分子を含むようには修飾されていない。
（発明の要旨）
本発明は生物学的に活性な分子１つおよび免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分の２分子を含むキメラ蛋白に関する。キメラ蛋白は生物学的に活性な分子少なくとも２つおよび免疫グロブリン定常領域２つの少なくとも部分を含むキメラ蛋白と比較してより小さい立体障害で標的分子または細胞と相互作用することができる。本発明はまた相当するホモ二量体、即ち両方の鎖が同じ生物学的に活性な分子に連結しているものよりも効率的に上皮バリアを経由して輸送される生物学的に活性な分子少なくとも１つおよび免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分の２分子を含むキメラ蛋白に関する。即ち本発明は共に連結された第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白に関し、ここで該第１の鎖は生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域少なくとも部分を含み、そして該第２の鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含むが、免疫グロブリン可変領域は含まず、そして、結合した如何なる生物学的に活性な分子も伴っていない。
本発明は共に連結された第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白に関し、ここで該第１の鎖は生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域少なくとも部分を含み、そして該第２の鎖は免疫グロブリン可変領域または如何なる生物学的に活性な分子も有さない免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、そしてここで該第２の鎖は１ｋＤ、２ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤまたは２０ｋＤより大きい分子量を有する如何なる分子にも共有結合していない。１つの実施形態において、第２の鎖は０〜２ｋＤより大きい分子量を有する如何なる分子のも共有結合していない。１つの実施形態において、第２の鎖は５〜１０ｋＤより大きい分子量を有する如何なる分子のも共有結合していない。１つの実施形態において、第２の鎖は１５〜２０ｋＤより大きい分子量を有する如何なる分子のも共有結合していない。
本発明は共に連結された第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白に関し、ここで該第１の鎖は生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域少なくとも部分を含み、そして該第２の鎖は該第１のポリペプチド鎖の免疫グロブリンの部分を除く如何なる他の分子にも共有結合していない免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含む。
本発明は共に連結された第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白に関し、ここで該第１の鎖は生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域少なくとも部分を含み、そして該第２の鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および場合によりアフィニティータグを含む。
本発明は共に連結された第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白に関し、ここで該第１の鎖は生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域少なくとも部分を含み、そして該第２の鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および場合によりアフィニティータグより本質的になる。
本発明は共に連結された第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白に関し、ここで該第１の鎖は生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域少なくとも部分を含み、そして該第２の鎖は免疫グロブリン可変領域または如何なる生物学的に活性な分子も有さない免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および場合により１０ｋＤ、５ｋＤ、２ｋＤまたは１ｋＤより小さい分子量を有する分子を含む。１つの実施形態において、第２の鎖は１５〜２０ｋＤより小さい分子を含む。１つの実施形態において、第２の鎖は５〜１０ｋＤより小さい分子を含む。１つの実施形態において、第２の鎖は１〜２ｋＤより小さい分子を含む。
本発明は第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、該第１の鎖が生物学的に活性な分子、免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および少なくとも第１のドメインを含み、該第１のドメインは特異的な結合相手少なくとも１つを有し、そして、該第２の鎖は免疫グロブリンの少なくとも部分および少なくとも第２のドメインを含み、ここで該第２のドメインは該第１のドメインの特異的結合相手であり、免疫グロブリンの可変領域または生物学的に活性な分子を伴わない。
本発明は第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白の作成方法に関し、ここで第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は同じではなく、該方法は、生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および場合によりリンカーを含む第１のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子を含む第１のＤＮＡコンストラクトおよび生物学的に活性な分子または免疫グロブリン可変領域を有さない免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および場合によりリンカーを含む第２のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子を含む第２のＤＮＡコンストラクトで細胞をトランスフェクトすること、第１のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖が発現され、そして、第２のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖が発現されるような条件下に細胞を培養するおよびこと、および、第１のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖および第２のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖を含む単量体−二量体ハイブリッドを単離することを含む。
本発明は第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白の作成方法に関し、ここで第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は同じではなく、そしてここで該第１のポリペプチド鎖は生物学的に活性な分子、免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および少なくとも第１のドメインを含み、該第１のドメインは特異的な結合相手少なくとも１つを有し、そしてここで該第２のポリペプチド鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および第２のドメインを含み、ここで該第２のドメインは該第１のドメインの特異的結合相手であり、そして生物学的に活性な分子または免疫グロブリンの可変領域を伴わず、該方法は、該第１のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子を含む第１のＤＮＡコンストラクトおよび該第２のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子を含む第２のＤＮＡコンストラクトで細胞をトランスフェクトすること、第１のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖が発現され、そして、第２のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖が発現されるような条件下に細胞を培養するおよびこと、および、第１のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖および第２のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖を含む単量体−二量体ハイブリッドを単離することを含む。
本発明は本発明のキメラ蛋白の作成方法に関し、該方法は、生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および場合によりリンカーを含む第１のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子を含む第１のＤＮＡコンストラクトで細胞をトランスフェクトすること、第１のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖が発現されるような条件下に細胞を培養すること、第１のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖を単離すること、および、生物学的に活性な分子または免疫グロブリン可変領域を有さない免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含む第２のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子を含む第２のＤＮＡコンストラクトで細胞をトランスフェクトすること、第２のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖が発現されるような条件下に細胞を培養すること、第２のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖を単離すること、第１のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖および第２のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖を含む単量体−二量体ハイブリッドが形成されるような条件下に第１のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖および第２のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖を合わせること、および該単量体−二量体ハイブリッドを単離することを含む。
本発明は第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白の作成方法に関し、ここで第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は同じではなく、該方法は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含むポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子を含むＤＮＡコンストラクトで細胞をトランスフェクトすること、ポリペプチド鎖の二量体が形成されるようにＮ末端システインを伴ってＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖が発現されるような条件下で細胞を培養すること、および、ＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖のコピー２つを含む二量体を単離すること、および、生物学的に活性な分子が１つ以上に二量体の一方のポリペプチド鎖のみと反応するような条件下で生物学的に活性な分子に単離された二量体を化学反応させることにより単量体−二量体ハイブリッドを形成すること、ここで該生物学的に活性な分子はＣ末端チオエステルを有するものであること、を含む。
本発明は第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白の作成方法に関し、ここで第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は同じではなく、該方法は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含むポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子を含むＤＮＡコンストラクトで細胞をトランスフェクトすること、ポリペプチド鎖の二量体が形成されるようにＮ末端システインを伴ってＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖が発現されるような条件下で細胞を培養すること、および、ＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖のコピー２つを含む二量体を単離すること、および、生物学的に活性な分子が二量体の各鎖に連結されるように生物学的に活性な分子に単離された二量体を化学反応させること、ここで該生物学的に活性な分子はＣ末端チオエステルを有するものであること、単量体鎖が形成されるように生物学的に活性な分子に連結した免疫グロブリンの部分を含む二量体を変性すること、単量体−二量体ハイブリッドが形成されるように自身に連結された生物学的に活性な分子を有さない免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含むポリペプチド鎖に単量体鎖を合わせること、および、単量体−二量体ハイブリッドを単離することを含む。
本発明は第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白の作成方法に関し、ここで第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は同じではなく、該方法は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含むポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子を含むＤＮＡコンストラクトで細胞をトランスフェクトすること、ポリペプチド２つの混合物としてＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖が発現されるような条件下に細胞を培養すること、ここで混合物はＮ末端システインを有するポリペプチドおよびＮ末端に近接してシステインを有するポリペプチドを含むものであること、ＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチド鎖の混合物を含む二量体を単離すること、および、少なくとも何らかの単量体−二量体ハイブリッドが形成されるように生物学的に活性な分子をニ単離された二量体を化学反応させること、ここで該生物学的に活性な分子は活性チオエステルを有するものであること、および、該混合物から単量体−二量体ハイブリッドを単離することを含む。
本発明は本発明のキメラ蛋白を投与することにより疾患または状態を治療することを含む疾患または状態の治療方法に関する。
本発明の別の目的および利点は以下の説明において一部は述べられ、そして説明から一部は自明であり、或は、本発明の実施により学習されるものである。本発明の目的および利点は添付する請求項において特に指摘する要素および組み合わせにより実現達成されるものである。
上記した一般的説明および後述する詳細な説明は例示であり説明を目的とするのみであり、請求される本発明を限定するものではない。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、該第１の鎖が、生物学的に活性な分子および免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分を含み、そして該第２の鎖が、生物学的に活性な分子も免疫グロブリンの可変領域も有さない免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含む、キメラ蛋白。
（項目２）
該第２の鎖が更にアフィニティータグを含む、項目１に記載のキメラ蛋白。
（項目３）
アフィニティータグがＦＬＡＧタグである、項目２に記載のキメラ蛋白。
（項目４）
免疫グロブリンの部分がＦｃフラグメントである、項目１に記載のキメラ蛋白。
（項目５）
免疫グロブリンの部分がＦｃＲｎ結合相手である、項目４に記載のキメラ蛋白。
（項目６）
ＦｃＲｎ結合相手が免疫グロブリンのＦｃフラグメントのペプチド模倣物である、項目５に記載のキメラ蛋白。
（項目７）
免疫グロブリンがＩｇＧである、項目１または５に記載のキメラ蛋白。
（項目８）
生物学的に活性な分子がポリペプチドである、項目１または５に記載のキメラ蛋白。
（項目９）
ＩｇＧがＩｇＧ１またはＩｇＧ２である、項目７に記載のキメラ蛋白。
（項目１０）
生物学的に活性な分子がウィルス融合抑制剤である、項目１または５に記載のキメラ蛋白。
（項目１１）
ウィルス融合抑制剤がＨＩＶ融合抑制剤である、項目１０に記載のキメラ蛋白。
（項目１２）
ＨＩＶ融合抑制剤がＴ２０（配列番号１）、Ｔ２１（配列番号２）またはＴ１２４９（配列番号３）である、項目１１に記載のキメラ蛋白。
（項目１３）
生物学的に活性な分子が凝固因子である、項目１または５に記載のキメラ蛋白。
（項目１４）
凝固因子が第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子である、項目１３に記載のキメラ蛋白。
（項目１５）
凝固因子が第ＩＸ因子である、項目１３に記載のキメラ蛋白。
（項目１６）
生物学的に活性な分子が低分子である、項目１または５に記載のキメラ蛋白。
（項目１７）
生物学的に活性な分子がロイプロリドである、項目１６に記載のキメラ蛋白。
（項目１８）
生物学的に活性な分子がインターフェロンである、項目１または５に記載のキメラ蛋白。
（項目１９）
インターフェロンがインターフェロンαであり、１５〜２５アミノ酸のリンカーを有する、項目１８に記載のキメラ蛋白。
（項目２０）
インターフェロンαが１５〜２０アミノ酸のリンカーを有する、項目１９に記載のキメラ蛋白。
（項目２１）
生物学的に活性な分子が核酸である、項目１または５に記載のキメラ蛋白。
（項目２２）
核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、項目２１に記載のキメラ蛋白。
（項目２３）
核酸がアンチセンス分子である、項目２１に記載のキメラ蛋白。
（項目２４）
核酸がリボザイムである、項目２１に記載のキメラ蛋白。
（項目２５）
生物学的に活性な分子が成長因子である、項目１または５に記載のキメラ蛋白。
（項目２６）
成長因子がエリスロポエチンである、項目２５に記載のキメラ蛋白。
（項目２７）
低分子がＶＬＡ４拮抗剤である、項目１６に記載のキメラ蛋白。
（項目２８）
第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、該第１の鎖が、生物学的に活性な分子および免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分を含み、そして該第２の鎖が、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分および必要に応じてアフィニティータグよりなる、キメラ蛋白。
（項目２９）
アフィニティータグがＦＬＡＧタグである、項目２８に記載のキメラ蛋白。
（項目３０）
第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、該第１の鎖が、生物学的に活性な分子および免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分を含み、そして該第２の鎖が、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分および必要に応じてアフィニティータグより本質的になる、キメラ蛋白。
（項目３１）
アフィニティータグがＦＬＡＧタグである、項目３０に記載のキメラ蛋白。
（項目３２）
第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、
ａ）該第１の鎖が、生物学的に活性な分子、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、および少なくとも１つの特異的な結合相手を有する第１のドメインを含み；そして、
ｂ）該第２の鎖が、生物学的に活性な分子も免疫グロブリンの可変領域も有さない免疫グロブリンの少なくとも一部分を含み、そして更に第２のドメインを含み、該第２のドメインは、該第１のドメインの特異的結合相手である、キメラ蛋白。
（項目３３）
該第２の鎖が更にアフィニティータグを含む、項目３２に記載のキメラ蛋白。
（項目３４）
アフィニティータグがＦＬＡＧタグである、項目３３に記載のキメラ蛋白。
（項目３５）
免疫グロブリンの部分がＦｃフラグメントである、項目３２に記載のキメラ蛋白。
（項目３６）
免疫グロブリンがＩｇＧである、項目３２または３５に記載のキメラ蛋白。
（項目３７）
免疫グロブリンの部分がＦｃＲｎ結合相手である、項目３５に記載のキメラ蛋白。
（項目３８）
ＦｃＲｎ結合相手が免疫グロブリンのＦｃフラグメントのペプチド模倣物である、項目３７に記載のキメラ蛋白。
（項目３９）
第１のドメインが非共有結合的に第２のドメインに結合する、項目３２または３７に記載のキメラ蛋白。
（項目４０）
第１のドメインがロイシンジッパーコイルドコイルの半分であり、そして該第２のドメインが該ロイシンジッパーコイルドコイルの相補的な結合相手である、項目３２または３７に記載のキメラ蛋白。
（項目４１）
生物学的に活性な分子がペプチドである、項目３２または３７に記載のキメラ蛋白。
（項目４２）
生物学的に活性な分子がインターフェロンである、項目３２または３７に記載のキメラ蛋白。
（項目４３）
インターフェロンがインターフェロンαであり、１５〜２５アミノ酸のリンカーを有する、項目４２に記載のキメラ蛋白。
（項目４４）
インターフェロンαが１５〜２０アミノ酸のリンカーを有する、項目４３に記載のキメラ蛋白。
（項目４５）
生物学的に活性な分子がロイプロリドである、項目４１に記載のキメラ蛋白。
（項目４６）
生物学的に活性な分子がウィルス融合抑制剤である、項目３２または３７に記載のキメラ蛋白。
（項目４７）
ウィルス融合抑制剤がＨＩＶ融合抑制剤である、項目４６に記載のキメラ蛋白。
（項目４８）
ＨＩＶ融合抑制剤がＴ２０（配列番号１）、Ｔ２１（配列番号２）またはＴ１２４９（配列番号３）である、項目４７に記載のキメラ蛋白。
（項目４９）
生物学的に活性な分子が凝固因子である、項目３２または３７に記載のキメラ蛋白。
（項目５０）
凝固因子が第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子である、項目４９に記載のキメラ蛋白。
（項目５１）
凝固因子が第ＩＸ因子である、項目４９に記載のキメラ蛋白。
（項目５２）
生物学的に活性な分子が低分子である、項目３２または３７に記載のキメラ蛋白。
（項目５３）
低分子がＶＬＡ４拮抗剤である、項目５２に記載のキメラ蛋白。
（項目５４）
生物学的に活性な分子が核酸を含む、項目３２または３７に記載のキメラ蛋白。
（項目５５）
核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、項目５４に記載のキメラ蛋白。
（項目５６）
核酸がアンチセンス核酸である、項目５４に記載のキメラ蛋白。
（項目５７）
核酸がリボザイムである、項目５４に記載のキメラ蛋白。
（項目５８）
生物学的に活性な分子が成長因子またはホルモンである、項目３２または３７に記載のキメラ蛋白。
（項目５９）
成長因子がエリスロポエチンである、項目５８に記載のキメラ蛋白。
（項目６０）
項目１、５、３２または３７に記載のキメラ蛋白、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目６１）
第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、
ａ）該第１の鎖が、生物学的に活性な分子、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、および少なくとも１つの特異的な結合相手を有する第１のドメインを含み；そして、
ｂ）該第２の鎖が、免疫グロブリンの少なくとも一部分、第２のドメインおよび必要に応じてアフィニティータグよりなり、該第２のドメインは、該第１のドメインの特異的結合相手である、キメラ蛋白。
（項目６２）
アフィニティータグがＦＬＡＧタグである、項目６１に記載のキメラ蛋白。
（項目６３）
第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、
ａ）該第１の鎖が、生物学的に活性な分子、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分および少なくとも１つの特異的な結合相手を有する第１のドメインを含み；そして、
ｂ）該第２の鎖が、免疫グロブリンの少なくとも一部分、第２のドメイン、および必要に応じてアフィニティータグより本質的になり、該第２のドメインは、該第１のドメインの特異的結合相手である、キメラ蛋白。
（項目６４）
アフィニティータグがＦＬＡＧタグである、項目６３に記載のキメラ蛋白。
（項目６５）
生物学的に活性なキメラ蛋白の製造方法であって、該方法が、下記工程：
ａ）免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分をコードする第２のＤＮＡ分子に作動可能に連結した生物学的に活性な分子を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む第１のＤＮＡコンストラクトで、第１の細胞をトランスフェクトすること；
ｂ）生物学的に活性な分子も免疫グロブリンの可変領域も有さない免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む第２のＤＮＡコンストラクトで、第２の細胞をトランスフェクトすること；
ｃ）該第１のＤＮＡコンストラクトおよび該第２のＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチドが発現されるような条件下で、ａ）およびｂ）の細胞を培養すること；ならびに、
ｄ）該トランスフェクトされた細胞からａ）およびｂ）の二量体を単離すること、
を含む、方法。
（項目６６）
免疫グロブリン定常領域の該部分がＦｃＲｎ結合相手である、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
生物学的に活性な分子がポリペプチドである、項目６５または６６に記載の方法。
（項目６８）
生物学的に活性な分子がインターフェロンである、項目６５または６６に記載の方法。
（項目６９）
インターフェロンがインターフェロンαであり、１５〜２５アミノ酸のリンカーを有する、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
インターフェロンαが１５〜２０アミノ酸のリンカーを有する、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
生物学的に活性な分子がペプチドである、項目６５または６６に記載の方法。
（項目７２）
生物学的に活性な分子がウィルス融合抑制剤である、項目６５または６６に記載の方法。
（項目７３）
ウィルス融合抑制剤がＨＩＶウイルス融合抑制剤である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
ＨＩＶウイルス融合抑制剤がＴ２０（配列番号１）、Ｔ２１（配列番号２）またはＴ１２４９（配列番号３）である、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
生物学的に活性な分子が凝固因子である、項目６５または６６に記載の方法。
（項目７６）
凝固因子が第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子である、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
凝固因子が第ＩＸ因子である、項目７５に記載の方法。
（項目７８）
生物学的に活性な分子が低分子である、項目６５または６６に記載の方法。
（項目７９）
生物学的に活性な分子が核酸を含む、項目６５または６６に記載の方法。
（項目８０）
核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
核酸がアンチセンス分子である、項目７９に記載の方法。
（項目８２）
核酸がリボザイムである、項目７９に記載の方法。
（項目８３）
生物学的に活性な分子が成長因子またはホルモンを含む、項目６５または６６に記載の方法。
（項目８４）
成長因子がエリスロポエチンである、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
二量体がクロマトグラフィーにより単離される、項目６５または６６に記載の方法。
（項目８６）
細胞が真核細胞である、項目６５または６６に記載の方法。
（項目８７）
真核細胞がＣＨＯ細胞である、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
細胞が原核細胞である、項目６５または６６に記載の方法。
（項目８９）
原核細胞がＥ．ｃｏｌｉである、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
疾患または状態が治療されるように対象にキメラ蛋白を投与することを含む、該疾患または状態を有する試験対象の治療方法であって、該キメラ蛋白は第１および第２のポリペプチド鎖を含み、
ａ）該第１の鎖は、ＦｃＲｎ結合相手および生物学的に活性な分子を含み、そして
ｂ）該第２の鎖は、生物学的に活性な分子も免疫グロブリンの可変領域も有さないＦｃＲｎ結合相手を含む、方法。
（項目９１）
該キメラ蛋白が静脈内、皮下、経口、口内、舌下、経鼻、非経腸、直腸内、膣内または肺経路を介して投与される、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
該疾患または状態がウィルス感染である、項目９０に記載の方法。
（項目９３）
生物学的に活性な分子がインターフェロンである、項目９０に記載の方法。
（項目９４）
インターフェロンがインターフェロンαであり、そして１５〜２５アミノ酸のリンカーを有する、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
インターフェロンαが１５〜２０アミノ酸のリンカーを有する、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
該疾患または状態がＨＩＶである、項目９０に記載の方法。
（項目９７）
該生物学的に活性な分子がウィルス融合抑制剤である、項目９０に記載の方法。
（項目９８）
該ウィルス融合抑制剤がＴ２０、Ｔ２１またはＴ１２４９である、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
該疾患または状態が止血障害である、項目９０に記載の方法。
（項目１００）
該疾患または状態が血友病Ａである、項目９０に記載の方法。
（項目１０１）
該疾患または状態が血友病Ｂである、項目９０に記載の方法。
（項目１０２）
該生物学的に活性な分子が第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子である、項目９０に記載の方法。
（項目１０３）
該生物学的に活性な分子が第ＩＸ因子である、項目９０に記載の方法。
（項目１０４）
該疾患または状態が貧血である、項目９０に記載の方法。
（項目１０５）
該生物学的に活性な分子がエリスロポエチンである、項目９０に記載の方法。
（項目１０６）
下記式のキメラ蛋白：
Ｘ−Ｌａ−Ｆ：ＦまたはＦ：Ｆ−Ｌａ−Ｘ
式中、Ｘは生物学的に活性な分子であり、Ｌはリンカーであり、Ｆは免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分であり、そして、ａは任意の整数またはゼロである、キメラ蛋白。
（項目１０７）
ＦがＦｃＲｎ結合相手である、項目１０６に記載のキメラ蛋白。
（項目１０８）
ＦｃＲｎが免疫グロブリンのＦｃフラグメントのペプチド模倣物である、項目１０６に記載のキメラ蛋白。
（項目１０９）
各Ｆが他のＦと化学的に会合している、項目１０６または１０７に記載のキメラ蛋白。
（項目１１０）
化学的会合が非共有結合性の相互作用である、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
化学的結合が共有結合である、項目１０９に記載の方法。
（項目１１２）
化学的結合がジスルフィド結合である、項目１０９に記載の方法。
（項目１１３）
Ｆがジスルフィド結合ではない結合によりＦに連結されている、項目１０６または１０７に記載のキメラ蛋白。
（項目１１４）
ＦがＩｇＧ免疫グロブリン定常領域である、項目１０６に記載のキメラ蛋白。
（項目１１５）
ＦがＩｇＧ１である、項目１０６に記載のキメラ蛋白。
（項目１１６）
ＦがＦｃフラグメントである、項目１０６に記載のキメラ蛋白。
（項目１１７）
Ｘがポリペプチドである、項目１０６に記載のキメラ蛋白。
（項目１１８）
Ｘがロイプロリドである、項目１０６に記載のキメラ蛋白。
（項目１１９）
Ｘが低分子である、項目１０６に記載のキメラ蛋白。
（項目１２０）
低分子がＶＬＡ４拮抗剤である、項目１１９に記載のキメラ蛋白。
（項目１２１）
Ｘがウィルス融合抑制剤である、項目１０６に記載のキメラ蛋白。
（項目１２２）
ウィルス融合抑制剤がＨＩＶ融合抑制剤である、項目１２１に記載のキメラ蛋白。
（項目１２３）
ＨＩＶ融合抑制剤がＴ２０（配列番号１）、Ｔ２１（配列番号２）またはＴ１２４９（配列番号３）である、項目１２２に記載のキメラ蛋白。
（項目１２４）
Ｘが凝固因子である、項目１０６または１０７に記載のキメラ蛋白。
（項目１２５）
凝固因子が第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子である、項目１２４に記載のキメラ蛋白。
（項目１２６）
凝固因子が第ＩＸ因子である、項目１２４に記載のキメラ蛋白。
（項目１２７）
Ｘが核酸である、項目１０６または１０７に記載のキメラ蛋白。
（項目１２８）
核酸がＤＮＡまたはＲＮＡ分子である、項目１２７に記載のキメラ蛋白。
（項目１２９）
Ｘが成長因子である、項目１０６または１０７に記載のキメラ蛋白。
（項目１３０）
成長因子がエリスロポエチンである、項目１２９に記載のキメラ蛋白。
（項目１３１）
項目１、５、３２、３７、１０６または１０７のキメラ蛋白を対象に投与することを含む、該対象における疾患または状態の治療方法。
（項目１３２）
疾患または状態がウィルス感染である、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
生物学的に活性な分子がインターフェロンである、項目１３１に記載の方法。
（項目１３４）
インターフェロンがインターフェロンαであり、そして１５〜２５アミノ酸のリンカーを有する、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
インターフェロンαが１５〜２０アミノ酸のリンカーを有する、項目１３４に記載の方法。
（項目１３６）
ウィルス感染がＨＩＶである、項目１３２に記載の方法。
（項目１３７）
疾患または状態が出血障害である、項目１３１に記載の方法。
（項目１３８）
出血障害が血友病Ａである、項目１３７に記載の方法。
（項目１３９）
出血障害が血友病Ｂである、項目１３７に記載の方法。
（項目１４０）
疾患または状態が貧血である、項目１３１に記載の方法。
（項目１４１）
キメラ蛋白が静脈内、筋肉内、皮下、経口、口内、舌下、経鼻、直腸内、膣内、エアロゾルを介して、または肺経路を介して投与される、項目１３１に記載の方法。
（項目１４２）
キメラ蛋白が肺経路を介して投与される、項目１４１に記載の方法。
（項目１４３）
キメラ蛋白が経口投与される、項目１４１に記載の方法。
（項目１４４）
免疫グロブリンがＩｇＧである、項目１３１に記載の方法。
（項目１４５）
免疫グロブリンの部分がＦｃフラグメントである、項目１３１に記載の方法。
（項目１４６）
共に連結された第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、該第１の鎖が生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、そして該第２の鎖が第１の鎖の生物学的に活性な分子を有さない免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、そして、該第２の鎖が２ｋＤより大きい分子量を有する如何なる分子にも共有結合していない、キメラ蛋白。
（項目１４７）
免疫グロブリン定常領域の部分がＦｃＲｎ結合相手である、項目１４６に記載のキメラ蛋白。
（項目１４８）
共に連結された第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、該第１の鎖が生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、そして該第２の鎖が該第１のポリペプチド鎖の免疫グロブリンの部分を除き如何なる他の分子にも共有結合的に連結していない免疫グロブリンの定常領域の少なくとも部分を含む、キメラ蛋白。
（項目１４９）
免疫グロブリン定常領域の部分がＦｃＲｎ結合相手である、項目１４８に記載のキメラ蛋白。
（項目１５０）
共に連結された第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、該第１の鎖が生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、そして該第２の鎖が免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分よりなる、キメラ蛋白。
（項目１５１）
免疫グロブリン定常領域の部分がＦｃＲｎ結合相手である、項目１５０に記載のキメラ蛋白。
（項目１５２）
共に連結された第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、該第１の鎖が生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、そして該第２の鎖が第１の鎖の生物学的に活性な分子を有さない免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および共有結合した２ｋＤ未満の分子量を有する分子を含む、キメラ蛋白。
（項目１５３）
免疫グロブリン定常領域の部分がＦｃＲｎ結合相手である、項目１５２に記載のキメラ蛋白。
（項目１５４）
生物学的に活性な分子に連結された免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含むキメラ蛋白の製造方法であって、該方法が、下記工程：
ａ）免疫グロブリンのＦｃフラグメントをコードするＤＮＡ配列およびインテインをコードする第２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトで細胞をトランスフェクトすること；
ｂ）Ｆｃフラグメントおよびインテインが発現される条件下で該細胞を培養すること；
ｃ）該細胞から該Ｆｃフラグメントおよびインテインを単離すること；
ｄ）Ｎ末端Ｃｙｓを有する生物学的に活性な分子を化学合成すること；
ｅ）ｃ）の単離されたインテインＦｃをＭＥＳＮＡと反応させることによりＣ末端チオエステルを発生させること；
ｆ）ｄ）の生物学的に活性な分子をｅ）のＦｃと反応させることにより生物学的に活性な分子に連結したＦｃを含むキメラ蛋白を作成すること；
を含む、方法。
（項目１５５）
生物学的に活性な分子に連結された免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含むキメラ蛋白の製造方法であって、該方法が、下記工程：
ａ）免疫グロブリンのＦｃフラグメントをコードするＤＮＡ配列およびシグナルペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトで細胞をトランスフェクトすること、ここで該シグナルペプチドはＦｃフラグメントシステインに隣接するものである；
ｂ）Ｆｃフラグメントおよびシグナルペプチドが発現され、そして、Ｆｃフラグメントがシグナルペプチドを有さずＮ末端システインを伴って細胞から分泌されるような条件下で該細胞を培養すること；
ｃ）該細胞からＮ末端システインを有する該Ｆｃフラグメントの二量体を単離すること；ｄ）チオエステルを有する生物学的に活性な分子を化学合成すること；
ｅ）生物学的に活性な分子がｃ）の二量体の１つの鎖に連結できるような条件下でｃ）のＦｃにｄ）の生物学的に活性な分子を反応させることにより生物学的に活性な分子に連結されたＦｃを含むキメラ蛋白を作成すること；
を含む、方法。
（項目１５６）
チオエステルがＣ末端チオエステルである、項目１５５に記載の方法。
（項目１５７）
生物学的に活性な分子に連結された免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含むキメラ蛋白の製造方法であって、該方法が、下記工程：
ａ）免疫グロブリンのＦｃフラグメントをコードするＤＮＡ配列およびシグナルペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトで細胞をトランスフェクトすること、ここで該シグナルペプチドはＦｃフラグメントシステインに隣接するものである；
ｂ）Ｆｃフラグメントおよびシグナルペプチドが共に連結されて発現され、そして該シグナルペプチドがシステインに隣接する第１の位置またはバリンに隣接する第２の位置において細胞によりＦｃフラグメントから脱離されるような条件下で該細胞を培養すること；ｃ）Ｎ末端システイン２つまたはＮ末端バリン２つまたはＮ末端システインとＮ末端バリンを有する該Ｆｃフラグメントの二量体を該細胞から単離すること；
ｄ）チオエステルを有する生物学的に活性な分子を化学合成すること；
ｅ）ｃ）の二量体にｄ）の生物学的に活性な分子を反応させることにより、生物学的に活性な分子に連結したＦｃを含む第１の鎖および如何なる生物学的に活性な分子にも免疫グロブリンの可変領域にも連結していないＦｃを含む第２の鎖を含むキメラ蛋白を作成すること、
を含む、方法。
（項目１５８）
チオエステルがＣ末端チオエステルである、項目１５７に記載の方法。
（項目１５９）
リンカーが（ＧＧＧＧＳ） ３ である、項目２０に記載のキメラ蛋白。
（項目１６０）
混合物から単量体−二量体ハイブリッドを単離する方法であって、混合物が下記成分：
ａ）第１および第２のポリペプチド鎖を含む単量体−二量体ハイブリッドであって、ここで第１の鎖は生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、そして第２の鎖は生物学的に活性な分子を有さない免疫グロブリン定常領域または免疫グロブリン可変領域の少なくとも部分を含むもの；
ｂ）第１および第２のポリペプチド鎖を含む二量体であって、ここで第１および第２の鎖は両方とも生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含むもの；
ｃ）免疫グロブリン定常領域の部分；
を含み；該方法は
１）単量体−二量体ハイブリッドおよび二量体の両方が固体支持体に連結した染料リガンドに結合するような適当な条件下で染料リガンドに混合物を接触させること；
２）免疫グロブリン定常領域の未結合の部分を除去すること：
３）単量体−二量体ハイブリッドと固体支持体に連結した染料リガンドとの間の結合が破壊されるように１）の適当な条件を改変すること；
４）単量体−二量体ハイブリッドを単離すること；
を含む、方法。
（項目１６１）
免疫グロブリンの部分がＦｃフラグメントである、項目１６０に記載の方法。
（項目１６２）
染料リガンドがバイオ模倣物分子である、項目１６０に記載の方法。
（項目１６３）
染料リガンドがＭｉｍｅｔｉｃ Ｒｅｄ １ ＴＭ 、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｒｅｄ ２ ＴＭ 、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｏｒａｎｇｅ １ ＴＭ 、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｏｒａｎｇｅ ２ ＴＭ 、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｏｒａｎｇｅ ３ ＴＭ 、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｙｅｌｌｏｗ １ ＴＭ 、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｙｅｌｌｏｗ ２ ＴＭ 、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｇｒｅｅｎ １ ＴＭ 、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅ １ ＴＭ およびＭｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅ ２ ＴＭ から選択される、項目１６０に記載の方法。
（項目１６４）
キメラ蛋白がＥｐｏを含む、項目１６０に記載の方法。
（項目１６５）
染料リガンドがＭｉｍｅｔｉｃ Ｒｅｄ ２ ＴＭ である、項目１６３または１６４に記載の方法。
（項目１６６）
キメラ蛋白が第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子を含む、項目１６０に記載の方法。
（項目１６７）
キメラ蛋白が第ＩＸ因子を含む、項目１６０に記載の方法。
（項目１６８）
キメラ蛋白がインターフェロンを含む、項目１６０に記載の方法。
（項目１６９）
キメラ蛋白がＨＩＶ融合抑制剤を含む、項目１６０に記載の方法。
（項目１７０）
染料リガンドがＭｉｍｅｔｉｃ Ｇｒｅｅｎ １ ＴＭ である、項目１６３または１６７に記載の方法。
（項目１７１）
適当な条件が４〜９の範囲のｐＨを有する緩衝液を含む、項目１６０に記載の方法。
（項目１７２）
適当な条件を改変することが、染料リガンドへの単量体−二量体ハイブリッドの結合を破壊することにより単量体−二量体ハイブリッドを単離するのに十分な濃度で緩衝液に塩少なくとも１つを添加することを含む、項目１７１に記載の方法。
（項目１７３）
少なくとも１つの塩がＮａＣｌである、項目１７２に記載の方法。
（項目１７４）
緩衝液がｐＨ８を有する、項目１７１に記載の方法。
（項目１７５）
塩濃度が４００ｍＭであり、そしてキメラ蛋白がＥｐｏを含む、項目１７４に記載の方法。
（項目１７６）
より高濃度の塩が染料リガンドへの二量体の結合を破壊することにより二量体を単離するように、染料リガンドへの単量体−二量体ハイブリッドの結合を破壊する塩の濃度と比較してより高い濃度の塩を添加することを更に含む、項目１７２に記載の方法。
（項目１７７）
生物学的に活性な分子がインターフェロンαである、項目１８に記載のキメラ蛋白。
（項目１７８）
生物学的に活性な分子がインターフェロンβである、項目１８に記載のキメラ蛋白。
（項目１７９）
生物学的に活性な分子がインターフェロンαである、項目４２に記載のキメラ蛋白。
（項目１８０）
生物学的に活性な分子がインターフェロンβである、項目４２に記載のキメラ蛋白。
（項目１８１）
生物学的に活性な分子がインターフェロンαである、項目６８に記載の方法。
（項目１８２）
生物学的に活性な分子がインターフェロンβである、項目６８に記載の方法。
（項目１８３）
生物学的に活性な分子がインターフェロンαである、項目９３に記載の方法。
（項目１８４）
生物学的に活性な分子がインターフェロンβである、項目９３に記載の方法。
（項目１８５）
生物学的に活性な分子がインターフェロンαである、項目１３３に記載の方法。
（項目１８６）
生物学的に活性な分子がインターフェロンβである、項目１３３に記載の方法。
（項目１８７）
生物学的に活性な分子がインターフェロンαである、項目１６８に記載の方法。
（項目１８８）
生物学的に活性な分子がインターフェロンβである、項目１６８に記載の方法。
（項目１８９）
第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、該第１の鎖はＥＰＯ、アミノ酸配列ＥＦＡＧＡＡＡＶを有する８アミノ酸リンカー、および、２９７位にアスパラギンからアラニンへの突然変異を含む免疫グロブリン定常領域のＦｃフラグメントを含み；そして、
該第２の鎖は２９７位にアスパラギンからアラニンへの突然変異を含む免疫グロブリン定常領域のＦｃフラグメントを含む、キメラ蛋白。
（項目１９０）
アフィニティータグを更に含む、項目１８９に記載のキメラ蛋白。
（項目１９１）
第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、該第１の鎖はＩＦＮβ、アミノ酸配列ＥＦＡＧＡＡＡＶを有する８アミノ酸リンカー、および、２９７位にアスパラギンからアラニンへの突然変異を含む免疫グロブリン定常領域のＦｃフラグメントを含み；そして、
該第２の鎖は２９７位にアスパラギンからアラニンへの突然変異を含む免疫グロブリン定常領域のＦｃフラグメントを含む、キメラ蛋白。
（項目１９２）
アフィニティータグを更に含む、項目１９１に記載のキメラ蛋白。
（項目１９３）
第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白であって、該第１の鎖は第ＩＸ因子、アミノ酸配列ＥＦＡＧＡＡＡＶを有する８アミノ酸リンカー、および、２９７位にアスパラギンからアラニンへの突然変異を含む免疫グロブリン定常領域のＦｃフラグメントを含み；そして、
該第２の鎖は２９７位にアスパラギンからアラニンへの突然変異を含む免疫グロブリン定常領域のＦｃフラグメントを含む、キメラ蛋白。
（項目１９４）
アフィニティータグを更に含む、項目１９３に記載のキメラ蛋白。
図１はＥＰＯ−Ｆｃホモ二量体または二量体の構造およびＥｐｏ−ＦＣ単量体−二量体ハイブリッドの構造を比較する模式的ダイアグラムである。 図２ａはキメラ蛋白第ＶＩＩ因子−Ｆｃのアミノ酸配列である。配列に含まれるものは細胞により切断されるシグナルペプチド（下線）および第ＶＩＩ因子を修飾するビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼにより認識されて全活性を達成するプロペプチド（太線）である。配列はその後ＰＡＣＥにより切断され第ＶＩＩ因子−Ｆｃを与える。図２ｂはキメラ蛋白第ＩＸ因子−Ｆｃのアミノ酸配列である。配列に含まれるものは細胞により切断されるシグナルペプチド（下線）および第ＩＸ因子を修飾するビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼにより認識されて全活性を達成するプロペプチド（太線）である。配列はその後ＰＡＣＥにより切断され第ＩＸ因子−Ｆｃを与える。 図２ｃはキメラ蛋白ＩＦＮα−Ｆｃのアミノ酸配列である。配列に含まれるものは細胞により切断されて成熟ＩＦＮα−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。図２ｄはキメラ蛋白ＩＦＮα−ＦｃΔリンカーのアミノ酸配列である。配列に含まれるものは細胞により切断されて成熟ＩＦＮα−ＦｃΔリンカーとなるシグナルペプチド（下線）である。図２ｅはキメラ蛋白Ｆｌａｇ−Ｆｃのアミノ酸配列である。配列に含まれるものは細胞により切断されて成熟Ｆｌａｇ−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。 図２ｆはキメラ蛋白Ｅｐｏ−ＣＣＡ−Ｆｃのアミノ酸配列である。配列に含まれるものは細胞により切断されて成熟Ｅｐｏ−ＣＣＡ−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。太線で示されるものは酸性のコイルドコイルドメインである。図２ｇはキメラ蛋白ＣＣＢ−Ｆｃのアミノ酸配列である。配列に含まれるものは細胞により切断されて成熟ＣＣＢ−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。太線で示されるものは塩基性のコイルドコイルドメインである。図２ｈははキメラ蛋白Ｃｙｓ−Ｆｃのアミノ酸配列である。配列に含まれるものは細胞により切断されて成熟Ｃｙｓ−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。この配列がＣＨＯ細胞内で生産されると、分子の一部はシグナルペプチダーゼにより非性格に切断されて２つの余分なアミノ酸がＮ末端に残存するようになり、これによりＣ末端チオエステルとの生物学的に活性な分子の連結（例えばネイティブのライゲーションを介する）が妨げられる。これらの不適切に切断された物質種が適切に切断されたＣｙｓ−Ｆｃと二量体化してその後Ｃ末端チオエステルを有する生物学的に活性な分子と反応すれば、単量体−二量体ハイブリッドが形成する。 図２ｉはキメラ蛋白ＩＦＮα−ＧＳ１５−Ｆｃのアミノ酸配列である。配列に含まれるものは細胞により切断されて成熟ＩＦＮα−ＧＳ１５−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。図２ｊはキメラ蛋白Ｅｐｏ−Ｆｃのアミノ酸配列である。配列に含まれるものは細胞により切断されて成熟Ｅｐｏ−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。太線で示されるものは８アミノ酸リンカーである。 図３ａはキメラ蛋白第ＶＩＩ因子−Ｆｃのアミノ酸配列である。配列に含まれるものはシグナルペプチド（下線）および第ＶＩＩ因子を修飾するビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼにより認識されて全活性を達成するプロペプチド（太線）である。翻訳された配列はその後ＰＡＣＥにより切断されて成熟した第ＶＩＩ因子−Ｆｃを与える。 図３ｂはキメラ蛋白第ＩＸ因子−Ｆｃのアミノ酸配列である。配列に含まれるものはシグナルペプチド（下線）および第ＩＸ因子を修飾するビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼにより認識されて全活性を達成するプロペプチド（太線）である。翻訳された配列はその後ＰＡＣＥにより切断されて成熟した第ＩＸ因子−Ｆｃを与える。 図３ｃはキメラ蛋白ＩＦＮα−Ｆｃのアミノ酸配列である。配列に含まれるものは翻訳後に細胞により切断されて成熟ＦＩＮα−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。 図３ｄはキメラ蛋白ＩＦＮα−ＦｃΔリンカーのアミノ酸配列である。配列に含まれるものは翻訳後に細胞により切断されて成熟ＦＩＮα−ＦｃΔリンカーとなるシグナルペプチド（下線）である。図３ｅはキメラ蛋白Ｆｌａｇ−Ｆｃのアミノ酸配列である。配列に含まれるものは翻訳後に細胞により切断されて成熟Ｆｌａｇ−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。 図３ｆはキメラ蛋白Ｅｐｏ−ＣＣＡ−Ｆｃの核酸酸配列である。配列に含まれるものは翻訳後に細胞により切断されて成熟Ｅｐｏ−ＣＣＡ−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。太線で示されるものは酸性のコイルドコイルドメインである。図３ｇはキメラ蛋白ＣＣＢ−Ｆｃの核酸酸配列である。配列に含まれるものは翻訳後に細胞により切断されて成熟ＣＣＢ−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。太線で示されるものは塩基性のコイルドコイルドメインである。 図３ｈはキメラ蛋白Ｃｙｓ−Ｆｃの核酸酸配列である。配列に含まれるものは翻訳後に細胞により切断されて成熟Ｃｙｓ−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。図３ｉはキメラ蛋白ＩＦＮα−ＧＳ１５−Ｆｃの核酸酸配列である。配列に含まれるものは翻訳後に細胞により切断されて成熟ＩＦＮα−ＧＳ１５−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。 図３ｊはキメラ蛋白Ｅｐｏ−Ｆｃの核酸配列である。配列に含まれるものは翻訳後に細胞により切断されて成熟Ｅｐｏ−Ｆｃとなるシグナルペプチド（下線）である。太線で示すものは８アミノ酸リンカーをコードする核酸配列である。 図４はネイティブのライゲーションを介した単量体−二量体ハイブリッドの形成方法を示す。 図５ａはＦｃＭＥＳＮＡのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。図５ｂはＦｃＭＥＳＮＡのＤＮＡ酸配列（配列番号５）を示す。 図６はＩＦＮαホモ二量体（即ち２つのＩＦＮαを含む）の抗ウィルス活性をＩＦＮα単量体−二量体ハイブリッド（即ち１つのＩＦＮα分子を含む）と比較するものである。 図７はキメラ単量体−二量体ハイブリッド第ＶＩＩａ因子−Ｆｃ（１つの第ＶＩＩ因子）の凝固活性とキメラホモ二量体第ＶＩＩａ因子−Ｆｃ（２つの第ＶＩＩ分子）を比較するものである。 図８はキメラ単量体−二量体ハイブリッド第ＶＩＩａ因子−Ｆｃ（１つの第ＶＩＩ因子）の新生仔ラットにおける経口投与をキメラホモ二量体第ＶＩＩａ因子−Ｆｃ（２つの第ＶＩＩ分子）と比較するものである。 図９はキメラ単量体−二量体ハイブリッド第ＩＸ因子−Ｆｃ（１つの第ＩＸ分子）の新生仔ラットにおける経口投与をキメラホモ二量体と比較している。 図１０は新生仔ラットに経口投与されたキメラ単量体−二量体ハイブリッド第ＩＸ因子−Ｆｃ（１つの第ＩＸ分子）を経口投与キメラホモ二量体と比較している。 図１１は単回肺投与後のカニクイザルにおけるＥｐｏ−Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドと比較した場合のＥｐｏ−Ｆｃ二量体の薬物動態である。 図１２は皮下投与Ｅｐｏ−Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドのカニクイザルにおける血清中濃度を皮下投与Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダーベポエチンアルファ）と比較したものである。 図１３は静脈内投与Ｅｐｏ−Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドのカニクイザルにおける血清中濃度を静脈内投与Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダーベポエチンアルファ）およびＥｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチンアルファ）と比較したものである。 図１４はＭｉｍｅｔｉｃ Ｒｅｄ２ＴＭカラム（ＰｒｏＭｅｔｉｃ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ）由来の痕跡物およびＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッド、ＥｐｏＦｃ二量体およびＦｃを含有するカラム由来の画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドは画分１１、１２、１３および１４中に存在している。ＥｐｏＦｃ二量体は画分１８中に存在している。Ｆｃは画分１／２中に存在している。 図１５は単回肺投与後のカニクイザルにおける８アミノ酸リンカーを有するＩＦＮβＦｃの薬物動態を示す。 図１６はカニクイザルにおけるＩＦＮβ−Ｆｃホモ二量体およびＩＦＮβ−ＦｃＮ２９７Ａ単量体−二量体ハイブリッドに応答したネオプテリン刺激を示す。 図１７ａはインターフェロンβ−Ｆｃのヌクレオチド配列を示し；図１７ｂはインターフェロンβ−Ｆｃのアミノ酸配列を示す。 図１８はＴ（２０）ａ；Ｔ２１（ｂ）およびＴ１２４９（ｃ）のアミノ酸配列を示す。
（発明の詳細な説明）
Ａ．定義
アフィニティータグとは、本明細書においては、目的の第２の分子に結合し、該目的の第２の分子を単離または識別するという目的のための特定の結合相手と相互作用することができる分子を意味する。
本発明のキメラ蛋白、または、本発明のキメラ蛋白と実質的に同一である蛋白またはペプチドの類縁体とは、本明細書においては、蛋白またはペプチドの該当するアミノ酸配列が少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％所定の配列と同一であることを意味する。例えば、このような配列は種々の種から誘導された変異体であってよく、或は、それらはトランケーション、欠失、アミノ酸置換または付加により所定の配列から誘導してよい。２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は標準的なアライメントアルゴリズム、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０に記載されているＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３のアルゴリズム；Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７のアルゴリズム；またはＴａｔｕｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７−２５０等により決定する。このようなアルゴリズムはＢＬＡＳＴＩＮ、ＢＬＡＳＴＰおよび「ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」プログラムに組み込まれている（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ参照）。このようなプログラムを使用する場合、デフォルトパラメーターを使用できる。例えばヌクレオチド配列については、以下のセッティング、即ち、プログラムＢＬＡＳＴＮ、マッチに対するリワード２、ミスマッチに対するペナルティー−２、オープンギャップおよびエクステンションギャップのペナルティーそれぞれ５および２、ギャップｘ＿ドロップオフ５０、エクスペクト１０、ワードサイズ１１、フィルターＯＮを「ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」に対して使用できる。アミノ酸配列については、以下のセッティング、即ち、プログラムＢＬＡＳＴＰ、マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、オープンギャップおよびエクステンションギャップのペナルティーそれぞれ１１および１、ギャップｘ＿ドロップオフ５０、エクスペクト１０、ワードサイズ３、フィルターＯＮを「ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」に対して使用できる。
生体利用性とは、本明細書においては、物質が生命体系内に吸収されるか、または、生理学的活性の部位において使用可能となる範囲および割合を意味する。
生物学的に活性な分子とは、本明細書においては、生物学的な範囲において（例えば生物、細胞またはそのインビトロのモデルにおいて）機能または作用を発揮することによるか、または、機能、作用または反応を刺激するかまたはそれに応答することにより、身体内部において、疾患または状態を治療すること、または、疾患または状態の部位に分子を局在化またはターゲティングすることができる、非免疫グロブリン分子またはそのフラグメントを意味する。生物学的に活性な分子は少なくとも１つのペプチド、核酸、低分子、例えば小型有機または無機分子を含んでよい。
キメラ蛋白とは、本明細書においては、第２の原料から誘導した第２のアミノ酸配列に共有結合または非共有結合により結合している第１の原料から誘導した第１のアミノ酸配列を含む何れかの蛋白を指し、ここで第１および第２の原料は同じではない。同じではない第１の原料および第２の原料は２種の異なる生物学的実態、または、同じ生物学的実体に由来する２種の異なる蛋白、または、生物学的実態および非西部何時額的実体を包含する。キメラ蛋白は例えば少なくとも２種の異なる生物学的原料から誘導した蛋白を包含することができる。生物学的原料は何れかの非合成により生産された核酸またはアミノ酸配列（例えばゲノムまたはｃＤＮＡ配列、プラスミドまたはウィルスベクター、ネイティブのビリオンまたは突然変異体または上記した何れかの本明細書において更に記載する類縁体）を包含する。合成原料は化学的に生産され、生物学的系によらない（例えばアミノ酸配列の固相合成）蛋白または核酸配列を包含する。キメラ蛋白はまた少なくとも２種の異なる合成原料から誘導された蛋白、または、少なくとも１つの生物学的原料および少なくとも１つの合成原料から誘導した蛋白を含むことができる。キメラ蛋白は何れかの原料から誘導された核酸または何れかの原料から誘導された小型の有機または無機の分子に共有結合または非共有結合的に連結した第１の原料から誘導された第１のアミノ酸配列を含んでよい。キメラ蛋白は第１および第２のアミノ酸配列の間、または、第１のアミノ酸配列および核酸の間、または、第１のアミノ酸配列および小型の有機または無機の分子の間にリンカー分子を含んでいてよい。
凝固因子とは、本明細書においては、止血障害を有する対象における出血エピソードを防止またはその期間を低減する天然に存在するか、または組み換え生産された何れかの分子またはその類縁体を意味する。換言すればこれは凝固活性を有する何れかの分子を意味する。
凝固活性とは、本明細書においては、フィブリンクロットの形成が最大となる生化学的反応のカスケードに参加する、および／または、出血または出血エピソードの重症度、持続時間または頻度を低減する能力を意味する。
二量体とは、本明細書においては、第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白を指し、ここで第１および第２の鎖は両方とも生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含む。ホモ二量体とは、両方の生物学的に活性な分子が同じである二量体を指す。
二量体的に連結された単量体−二量体ハイブリッドとは、免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分、例えば免疫グロブリンのＦｃフラグメント、生物学的に活性な分子、および、生物学的に活性な分子が各々免疫グロブリン定常領域の部分を含む２つのポリペプチド鎖に結合するように二者を共に連結するリンカーを含むキメラ蛋白を指す。図４は二量体的に連結された単量体−二量体ハイブリッドの一例である。
ＤＮＡコンストラクトとは、本明細書においては、天然界には他の状態では全体として存在しない態様において組み合わせられたＤＮＡセグメントを含むようにヒトの介入により修飾されている１本鎖または２本鎖のＤＮＡ分子またはそのような分子のクローンを意味する。ＤＮＡコンストラクトは目的のポリペプチドの発現を指向するために必要な情報を含む。ＤＮＡコンストラクトはプロモーター、エンハンサーおよび転写ターミネーターを含むことができる。ポリペプチドの分泌を指向するために必要な情報を含むＤＮＡコンストラクトはまた、少なくとも１つの分泌シグナル配列を含有する。
ドメインとは、本明細書においては、何らかの弁別的な物理的特徴または役割、例えばポリペプチド鎖の１セクションの個別に折りたたまれた構造を有するポリペプチド（用語の定義に従って蛋白も含む）の領域を意味する。ドメインはポリペプチドの弁別的な物理的特徴の配列を含むか、または、その結合特性（即ち第２のドメインに結合できること）を保持している物理的特徴のフラグメントを含有してよい。ドメインは別のドメインと会合していてよい。換言すれば、第１のドメインは本来、第２のドメインに結合してよい。
フラグメントとは、本明細書においては、少なくとも２連続アミノ酸残基少なくとも５連続アミノ酸残基、少なくとも１０連続アミノ酸残基、少なくとも１５連続アミノ酸残基、少なくとも２０連続アミノ酸残基、少なくとも２５連続アミノ酸残基、少なくとも４０連続アミノ酸残基、少なくとも５０連続アミノ酸残基、少なくとも１００連続アミノ酸残基、少なくとも２００連続アミノ酸残基のアミノ酸配列、または、蛋白、ペプチドまたはポリペプチドの何れかの欠失またはトランケーションを含むペプチドまたはポリペプチドを指す。
止血とは、本明細書においては、出血または放血の停止；または血管または身体の部分を経由する血流の停止を意味する、
止血障害とは、本明細書においては、フィブリンクロットを形成する能力が損なわれているか、その能力が無いために自発的に、または、外傷の結果として、出血する傾向を特徴とする、遺伝的に受け継がれた、または、後天的に獲得され状態である。
連結されたとは、本明細書においては、第２の核酸配列に共有結合した第１の核酸配列を指す。第１の核酸配列は第２の核酸配列に対し直接結合するか、または、並置されることができ、または、介在配列が第１の配列を第２の配列に共有結合させることもできる。連結されたとは本明細書においてはまた、第２のアミノ酸配列に共有結合または非共有結合的に結合した第１のアミノ酸配列を指すこともできる。第１のアミノ酸配列は第２のアミノ酸配列に対し直接結合するか、または、並置されることができ、または、介在配列が第１のアミノ酸配列を第２のアミノ酸配列に共有結合させることもできる。
作動可能に連結されたとは、本明細書においては、両方の配列が生物学的に活性な蛋白またはペプチドとして発現されることができるように第２の核酸配列に連結された第１の核酸配列を意味する。
ポリペプチドとは、本明細書においては、アミノ酸の重合体を指し、そして生成物の特定の長さを指すものではなく；即ち、ペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白がポリペプチドの定義内に包含される。この用語はポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化、ペギル化、脂質部分の付加または何れかの有機または無機の分子の付加を排除するものではない。この定義に包含されるものは、例えば、アミノ酸の類縁体１つ以上（例えば非天然アミノ酸）を含むポリペプチド、および、置換結合を有するポリペプチド、並びに、天然に存在するおよび非天然に存在するものの両方の当該分野で知られた他の修飾である。
高ストリンジェンシーとは、本明細書においては、例えばＤＮＡの長さに基づいて当業者が容易に決定できる条件である。一般的に、このような条件はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｅｄ．Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１．１０１−１０４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されており、そしてニトロセルロースフィルター用の予備洗浄溶液５ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、ハイブリダイゼーション条件５０％ホルムアミド、６ＸＳＳＣ、４２℃（または他の同様のハイブリダイゼーション溶液、例えばＳｔａｒｋ’ｓ溶液、５０％ホルムアミド中、４２℃、および、洗浄約６８℃、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの使用を包含する。当業者の知るとおり、温度および洗浄溶液の塩濃度はプローブの長さのような要因に応じて適宜調節できる。
中ストリンジェンシーとは、本明細書においては、例えばＤＮＡの長さに基づいて当業者が容易に決定できる条件である。基本的な条件はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｅｄ．Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１．１０１−１０４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されており、そしてニトロセルロースフィルター用の予備洗浄溶液５ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、ハイブリダイゼーション条件５０％ホルムアミド、６ＸＳＳＣ、４２℃（または他の同様のハイブリダイゼーション溶液、例えばＳｔａｒｋ’ｓ溶液、５０％ホルムアミド中、４２℃）、および、洗浄条件６０℃、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの使用を包含する。
小型無機分子とは、本明細書においては、炭素原子を含まず５０ｋＤより大きくない分子を意味する。
小型有機分子とは、本明細書においては、炭素原子少なくとも１つを含み５０ｋＤより大きくない分子を意味する。
治療する、治療、治療することとは、本明細書においては、以下のもの、即ち、疾患または状態の重症度の低減；疾患または状態に伴う症状１つ以上の緩解；疾患または状態の治癒を必ずしも伴わない疾患または状態を有する対象への有利な作用の提供、疾患または状態に伴う症状１つ以上の予防、のいずれかを意味する。
Ｂ．本発明の特定の実施形態により与えられる向上点
本発明は第１および第２のポリペプチド鎖を含むキメラ蛋白（単量体−二量体ハイブリッド）を提供し、ここで該第１の鎖は生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、そして該第２の鎖は生物学的に活性な分子または免疫グロブリンの可変領域を有さない免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含む。図１は伝統的な融合蛋白二量体を本発明の単量体−二量体ハイブリッドの一例と対照させたものである。本例においては、生物学的に活性な分子はＥＰＯであり、そして、免疫グロブリンの部分はＩｇＧＦｃ領域である。
免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含む他のキメラ蛋白と同様、本発明は生物学的に活性な分子単独と比較してキメラ蛋白の増強された安定性および増大した生体利用性を与えるキメラ蛋白を提供する。しかしながら更に、２つの鎖の一方のみが生物学的に活性な分子を含むため、キメラ蛋白は、全ての鎖が生物学的に活性な分子を含むキメラ蛋白よりも小さい分子量を有し、そして、理論に制約されないが、これにより、例えばＦｃＲｎ受容体への結合により上皮変異体を経由してより容易にトランスサイトーシスされることができるためキメラ蛋白の半減期が延長されたキメラ蛋白がもたらされる。即ち１つの実施形態において、本発明は本発明の治療用キメラ蛋白を投与する進歩した非侵襲的な方法（例えば何れかの粘膜表面を経由、例えば経口、口内、舌下、経鼻、直腸内、膣内または肺または眼の経路を経由）を提供する。即ち本発明は以前に報告されているキメラ蛋白（例えばキメラ蛋白の全ての鎖が生物学的に活性な分子を含んでいるような免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および生物学的に活性な分子を含むキメラ蛋白）と比較して低い頻度および低い用量を用いながら本発明のキメラ蛋白の治療水準を達成する方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は本発明の治療用のキメラ蛋白を投与する、例えば皮下、静脈内投与による侵襲的方法を提供する。本発明の治療用キメラ蛋白の侵襲的投与は以前に報告されているキメラ蛋白（例えばキメラ蛋白の全ての鎖が生物学的に活性な分子を含んでいるような免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および生物学的に活性な分子を含むキメラ蛋白）と比較して低い頻度および低い用量を用いることを可能にする治療用キメラ蛋白の延長された半減期をもたらす。
鎖の一方のみが生物学的に活性な分子を含むキメラ蛋白の更に別の利点は、キメラ蛋白の全ての鎖が生物学的に活性な分子を含んでいるキメラ蛋白と比較した場合の低減された立体障害、低減された疎水相互作用、低減されたイオン相互作用または低減された分子量に起因する、その標的細胞または運氏に対する生物学的に活性な分子の増強された到達接触能力である。
Ｃ．キメラ蛋白
本発明は生物学的に活性な分子１つ、免疫グロブリン定常領域少なくとも部分および場合によりリンカー少なくとも１つを含むキメラ蛋白に関する。免疫グロブリンの部分はＮ即ちアミノ末端およびＣ即ちカルボキシ末端の両方を有する。キメラ蛋白は免疫グロブリンの部分のＮ末端に連結した生物学的に活性な分子を有してよい。或は、生物学的に活性な分子は免疫グロブリンの部分のＣ末端に連結してよい。１つの実施形態においては、連結は共有結合である。別の実施形態においては、連結は非共有結合である。
キメラ蛋白は場合によりリンカー少なくとも１つを含むことができ；即ち、生物学的に活性な分子は免疫グロブリン定常領域の部分に直接連結している必要はない。リンカーは生物学的に活性な分子と免疫グロブリン定常領域の部分との間に介在していることができる。リンカーは免疫グロブリン定常領域の部分のＮ末端または免疫グロブリン定常領域の部分のＣ末端に連結することができる。生物学的に活性な分子がアミノ酸１つ以上を含む場合は、生物学的に活性な分子はＮ末端およびＣ末端を有し、そしてリンカーは生物学的に活性な分子のＮ末端または生物学的に活性な分子のＣ末端に連結することができる。
本発明は式Ｘ−Ｌａ−Ｆ：ＦまたはＦ：Ｆ−Ｌａ−Ｘのキメラ蛋白に関し、ここでＸは生物学的に活性な分子であり、Ｌは任意のリンカーであり、Ｆは免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分であり、そして、ａは何れかの整数またはゼロである。本発明はまた、式Ｔａ−Ｘ−Ｌａ−Ｆ：ＦまたはＴａ−Ｆ：Ｆ−Ｌａ−Ｘのキメラ蛋白に関し、ここでＸは生物学的に活性な分子であり、Ｌは任意のリンカーであり、Ｆは免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分であり、そして、ａは何れかの整数またはゼロであり、Ｔは第２のリンカーであるか、または、キメラ蛋白の精製を容易にするために使用できるタグ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合蛋白タグであり、そして（：）は化学的会合、例えば少なくとも１つのペプチド結合である。特定の実施形態においては、化学的会合、即ち（：）は共有結合である。他の実施形態においては、化学的会合、即ち（：）は非共有結合的相互作用、例えばイオン相互作用、疎水相互作用、浸水相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合である。当業者の知るとおり、ａがゼロに等しい場合は、ＸはＦに直接連結している。即ち、ａは０、１、２、３、４、５または５より大きい値であってよい。
１つの実施形態においては、本発明のキメラ蛋白は図２ａのアミノ酸配列（配列番号６）を含む。１つの実施形態においては、本発明のキメラ蛋白は図２ｂのアミノ酸配列（配列番号８）を含む。１つの実施形態においては、本発明のキメラ蛋白は図２ｃのアミノ酸配列（配列番号１０）を含む。１つの実施形態においては、本発明のキメラ蛋白は図２ｄのアミノ酸配列（配列番号１２）を含む。１つの実施形態においては、本発明のキメラ蛋白は図２ｅのアミノ酸配列（配列番号１４）を含む。１つの実施形態においては、本発明のキメラ蛋白は図２ｆのアミノ酸配列（配列番号１６）を含む。１つの実施形態においては、本発明のキメラ蛋白は図２ｇのアミノ酸配列（配列番号１８）を含む。１つの実施形態においては、本発明のキメラ蛋白は図２ｈのアミノ酸配列（配列番号２０）を含む。１つの実施形態においては、本発明のキメラ蛋白は図２ｉのアミノ酸配列（配列番号２２）を含む。１つの実施形態においては、本発明のキメラ蛋白は図２ｊのアミノ酸配列（配列番号２４）を含む。１つの実施形態においては、本発明のキメラ蛋白は図１７ｂのアミノ酸配列（配列番号２７）を含む。
１．キメラ蛋白変異体
本発明のキメラ蛋白の誘導体、本発明のキメラ蛋白に対する抗体、および、本発明のキメラ蛋白の結合相手に対する抗体は全て意図され、そして置換、付加および／または欠失／トランケーションによりそのアミノ酸配列を改変することにより、または機能的に等価な分子をもたらす化学修飾を導入することにより、製造できる。当業者の知るとおり、何れかの蛋白の配列内の特定のアミノ酸は蛋白の活性に悪影響を与えることなく他のアミノ酸に置換してよい。
本発明のキメラ蛋白のアミノ酸配列またはそれをコードするＤＮＡ配列は、その生物学的活性、機能または利用性を殆ど損失することなく種々の変化を加えてよい。そのような変化から生じる誘導体、類縁体または突然変異体およびそのような誘導体の使用は本発明の範囲に包含される。特定の実施形態において、誘導体は機能的に活性であり、即ち、本発明のキメラ蛋白に関わる１つ以上の活性、例えばＦｃＲｎ結合、ウィルス抑制、止血、赤血球の生産を示すことができる。生物学的に活性な分子を含むキメラ蛋白の活性を試験することができる多くの試験法が当該分野で知られている。生物学的に活性な分子がＨＩＶ抑制剤である場合は、活性は知られた方法を使用して逆転写酵素活性を測定することにより試験できる（例えばＢａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：８６８；Ｇａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：５００参照）。或は、活性は融合誘導活性を測定することにより測定することができる（例えばＮｕｓｓｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｖｉｏｌ．６８（９）：５４１１参照）。生物学的活性が止血である場合は、ＳｔａＣＬｏｔＦＶＩＩａ−ｒＴＦ試験を実施することにより第ＶＩＩａ因子誘導体の活性を評価できる（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ １１：Ｓ１５９）。
配列内のアミノ酸の置換はアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択してよい（表１）。更に種々のアミノ酸が中性のアミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンにより共通して置換されている（例えばＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４）。
Figure 2012067142
２．生物学的に活性な分子
本発明は本発明の治療用分子としての何れかの生物学的に活性な分子の使用を意図する。生物学的に活性な分子はポリペプチドであることができる。生物学的に活性な分子は単一のアミノ酸であることができる。生物学的に活性な分子は修飾されたポリペプチドを含むことができる。
生物学的に活性な分子は脂質分子（例えばステロイドまたはコレステロール、脂肪酸、トリアシルグリセロール、グリセロリン脂質またはスフィンゴリピド）を包含することができる。生物学的に活性な分子は糖分子（例えばグルコース、スクロース、マンノース）を包含することができる。生物学的に活性な分子は核酸分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）を包含することができる。生物学的に活性な分子は小型有機分子または小型無機分子を包含することができる。
ａ．サイトカインおよび成長因子
１つの実施形態において、生物学的に活性な分子は成長因子、ホルモンまたはサイトカインまたはこれらの類縁体またはフラグメントである。生物学的に活性な分子は細胞の成育および増殖を誘導することができる何れかの薬剤であることができる。特定の実施形態においては、生物学的に活性な分子は赤血球の増殖を誘導できる何れかの薬剤である。即ち本発明により意図される生物学的に活性な分子の一例はＥＰＯである。生物学的に活性な分子はまた例えばＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、成長ホルモン、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦαまたはβ）を包含する。
生物学的に活性な分子は合成または組み換えにより生産されたインターフェロンα、例えば約２５の構造的に関連するサブタイプ、例えばインターフェロン−α２ａ、即ち現在は臨床用途として市販されているもの（ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）およびやはり臨床用途を許可されているインターフェロン−α２ｂ（ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）並びに種々のサブタイプの遺伝子工学型、例えば市販のコンセンサスインターフェロンα（ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）、Ｉｎｔｅｒｍｕｎｅ，Ａｍｇｅｎ開発）およびコンセンサスヒト白血球インターフェロン、例えば米国特許４，６９５，６２３；４，８９７，４７１参照、インターフェロンβ、表皮成長因子、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ロイプロリド、卵胞刺激ホルモン、プロゲステロン、エストロゲンまたはテストステロンを包含する。
本発明のキメラ蛋白において使用してよいサイトカインおよび成長因子のリストは以前に記載されている（例えば米国特許６，０８６，８７５、６，４８５，７２６、６，０３０，６１３；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１参照）。
ｂ．抗ウィルス剤
１つの実施形態において、生物学的に活性な分子は抗ウィルス剤、そのフラグメントおよび類縁体である。抗ウィルス剤はウィルスの複製を抑制または防止するか、または、ウィルスの細胞への進入を抑制または防止するか、または、細胞からのウィルスの漏出を抑制または防止する何れかの分子を包含する。１つの実施形態において、抗ウィルス剤は融合抑制剤である。１つの実施形態において抗ウィルス剤は複製を抑制するサイトカインである。別の実施形態においては、抗ウィルス剤はインターフェロンαである。
キメラ蛋白において使用するためのウィルス融合抑制剤は標的細胞の細胞膜のウィルスの貫通を低減または防止する何れかの分子であることができる。ウィルス融合抑制剤は感受性細胞少なくとも２種の間のシンシチウム形成を低減または防止する何れかの分子である。ウィルス融合抑制剤は真核細胞の脂質２層膜およびエンベロープを有するウィルスの脂質２層の結着を低減または防止する何れかの分子であることができる。エンベロープを有するウィルスの例は、例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、エプスタインー・バーウィルス、ＣＭＶ、単純疱疹１、単純疱疹２および呼吸器シンシチウムウィルスを包含する。
ウィルス融合抑制剤はウィルスの融合を低減または防止する何れかの分子、例えばポリペプチド、小型有機分子または小型無機分子であることができる。１つの実施形態において、融合抑制剤はポリペプチドである。１つの実施形態において、ウィルス融合抑制剤は３〜３６アミノ酸のポリペプチドである。別の実施形態においては、ウィルス融合抑制剤は３〜５０アミノ酸、１０〜６５アミノ酸、１０〜７５アミノ酸のポリペプチドである。ポリペプチドは天然に存在するアミノ酸配列（例えばｇｐ４１のフラグメント）、その類縁体および突然変異体を包含でき、また、ポリペプチドはポリペプチドがウィルス融合抑制活性を示す限り、天然には存在しないアミノ酸配列を含むことができる。
１つの実施形態において、ウィルス融合抑制剤はコンピューターアルゴリズムの少なくとも１つ、例えばＡＬＬＭＯＴＩ５、１０７ｘ１７８ｘ４およびＰＬＺＩＰを用いてウィルス融合抑制剤であるとして識別されるポリペプチドである（例えば米国特許６，０１３，２６３、６，０１５，８８１、６，０１７，５３６、６，０２０，４５９、６，０６０，０６５、６，０６８，９７３、６，０９３，７９９および６，２２８，９８３参照）。
１つの実施形態において、ウィルス融合抑制剤はＨＩＶ融合抑制剤である。１つの実施形態において、ＨＩＶはＨＩＶ−１である。別の実施形態においては、ＨＩＶはＨＩＶ−２である。１つの実施形態において、ＨＩＶ融合抑制剤はＨＩＶ−１のｇｐ４１エンベロープ蛋白のフラグメントを含むポリペプチドである。ＨＩＶ融合抑制剤は例えばＴ２０（配列番号１）またはその類縁体、Ｔ２１（配列番号２）またはその類縁体、または、Ｔ１２４９（配列番号３）またはその類縁体ＮＣＣＧｇｐ４１（Ｌｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ。２７６：（３１）２９４８５）またはその類縁体、または５ヘリックス（Ｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：８８４）を含むことができる。
当該分野で知られた試験法を用いてポリペプチド、小型有機分子または小型無機分子のウィルス融合抑制活性を試験することができる。これらの試験法は逆転写酵素試験、ｐ２４試験またはシンシチウム形成試験を包含する（例えば米国特許５，４６４，９３３参照）。
本発明のキメラ蛋白において使用してよい抗ウィルス剤のリストは以前に記載されている（例えば米国特許６，０８６，８７５、６，４８５，７２６、６，０３０，６１３；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１参照）。
ｃ．止血剤
１つの実施形態においては、生物学的に活性な分子は凝固因子、または、止血を促進する他の薬剤、またはそのフラグメントまたは類縁体である。凝固因子は凝固活性を有するか、または凝固活性を有する分子を活性化する何れかの分子を包含する。凝固因子はポリペプチドを含むことができる。凝固因子は例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子またはフォン・ビルブラント因子であることができる。１つの実施形態においては、凝固因子は第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子である。凝固因子は外来性の経路に関与する因子であることができる。凝固因子は内因性の経路に関与する因子であることができる。或は、凝固因子は外因性または内因性の経路の両方に関与する因子であることができる。
凝固因子はヒト凝固因子または例えば非ヒト霊長類、ブタまたは何れかの哺乳類から誘導された非ヒトの凝固因子であることができる。凝固因子はキメラ凝固因子であることができ、例えば凝固因子はヒト凝固因子の部分およびブタ凝固因子の部分または第１の非ヒト凝固因子の部分および第２の非ヒト凝固因子の部分を含むことができる。
凝固因子は活性化された凝固因子であることができる。或は、凝固因子は凝固因子の不活性型、例えばチモゲンであることができる。不活性凝固因子は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分に連結された後に活性化を起こすことができる。不活性凝固因子は対象への投与の後に活性化されることができる。或は、不活性凝固因子は投与の前に活性化することができる。
特定の実施形態においては、エンドペプチダーゼ、例えば対塩基性アミノ酸切断酵素（ＰＡＣＥ）または何れかのＰＡＣＥファミリーのメンバー、例えばＰＣＳＫ１−９、例えばそのトランケーション型、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のそのコウボ等価体Ｋｅｘ２およびＫｅｘ２のトランケーション型（Ｋｅｘ２１−６７５）（例えば米国特許５，０７７，２０４；５，１６２，２２０；５，２３４，８３０；５，８８５，８２１；６，３２９，１７６参照）を用いてプロペプチドを切断し、本発明の成熟キメラ蛋白（例えば第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子）を形成してよい。
ｄ．他の蛋白様の生物学的に活性な分子
１つの実施形態において生物学的に活性な分子は受容体またはそのフラグメントまたは類縁体である。受容体は細胞表面上に発現することができ、または、受容体は細胞の内部に発現させることができる、受容体はウィルス受容体、例えばＣＤ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＤ２１、ＣＤ４６であることができる。生物学的に活性な分子は細菌受容体であることができる。生物学的に活性な分子は細菌のコロニー形成および感染において重要である細胞外マトリックス蛋白またはそのフラグメントまたは類縁体（例えば米国特許５，６４８，２４０；５，１８９，０１５；５，１７５，０９６参照）または接着および感染において重要な細菌表面蛋白（例えば米国特許５，６４８，２４０参照）であることができる。生物学的に活性な分子は成長因子、ホルモンまたはサイトカイン受容体またはそのフラグメントまたは類縁体、例えばＴＮＦα受容体、エリスロポエチン受容体、ＣＤ２５、ＣＤ１２２またはＣＤ１３２であることができる。
本発明のキメラ蛋白において使用してよい他の蛋白様分子のリストは以前に記載されている（例えば米国特許６，０８６，８７５、６，４８５，７２６、６，０３０，６１３；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１参照）。
ｅ．核酸
１つの実施形態において、生物学的に活性な分子は核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡである。１つの特定の実施形態においては、生物学的に活性な分子はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において使用できる核酸である。核酸分子は例えばアンチセンス分子またはリボザイムまたはアプタマーであることができる。
アンチセンスＲＮＡおよびＤＡＮ分子はターゲティングされたｍＲＮＡにハイブリダイズし、蛋白の翻訳を防止することによりｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックする作用を有する。アンチセンス方法では、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドの設計を行う。アンチセンスオリゴヌクレオチドは相補的な標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を防止する。絶対的な相補性は必要ではない。
ＲＮＡの部分に対して「相補的な」配列とは、本明細書においては、ＲＮＡとハイブリダイズすることが可能であるために十分な相補性を有し、安定な二重らせんを形成する配列を意味し；２本鎖アンチセンス核酸の場合は二重らせんＤＮＡの１本鎖を試験するか、または、三重らせんの形成を試験してよい。ハイブリダイズする能力は相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存している。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それはＲＮＡとの塩基ミスマッチをより多く含み、そしてなお安定な二重らせん（または適宜、三重らせん）を形成する。ハイブリダイズした複合体の融点を測定するための標準的な操作法を用いることにより、当業者はミスマッチの認容できる程度を確認することができる。
アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチド長であり、そして好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の特徴においては、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物またはその誘導体または修飾された型、１本鎖または２本鎖であることができる。オリゴヌクレオチドは例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を向上させるために塩基部分、糖部分またはホスフェート骨格において修飾することができる。オリゴヌクレオチドは他の付随的基、例えばポリペプチド（例えばインビボで宿主細胞受容体をターゲティングするため）、または、細胞膜（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６５５３；Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：６４８；ＷＯ８８／０９８１０）または血液脳関門（例えばＷＯ８９／１０１３４参照）を経由する輸送を促進するための薬剤、、ハイブリダイゼーショントリガー切断剤（例えばＫｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８）またはインターカレーション剤（例えばＺｏｎ １９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９）を含んでよい。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えばポリペプチド、ハイブリダイゼーショントリガー交差結合剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーショントリガー切断剤とコンジュゲートしてよい。
標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子もまた標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を防止するため、従って標的遺伝子産物の発現を防止するために使用することができる（例えばＷＯ９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７，１２２２−１２２５参照）。
リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である（Ｒｏｓｓｉ １９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ４：４６９参照）。リボザイムの作用機序には相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションとその後のエンドヌクレオリシスによる切断現象が関与している。リボザイム分子の組成は標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列１つ以上を含んでいなければならず、そして、ｍＲＮＡ切断に関わるよく知られた触媒性の配列を含んでいなければならない。この配列に関しては例えば米国特許５，０９３，２４６を参照できる。
１つの実施形態において、部位特異的認識配列においてｍＲＮＡを切断するリボザイムを用いて標的遺伝子ｍＲＮＡを破壊することができる。別の実施形態においては、ハンマーヘッドリボザイムの使用を意図する。ハンマーヘッドリボザイムは標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する領域とフランキングすることにより所定の位置においてｍＲＮＡを切断する。唯一の条件は標的ｍＲＮＡが以下の２塩基配列、即ち５’−ＵＧ−３’を有する点である。ハンマーヘッドリボザイムの構築および製造は当該分野でよく知られており、Ｍｙｅｒｓ １９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ ＹｏｒｋおよびＨａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ １９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５により詳細に説明されている。
ｆ．低分子
本発明は本発明のキメラ蛋白における生物学的に活性な分子としての何れかの治療用低分子または薬剤の使用を意図する。本発明のキメラ蛋白において使用してよい低分子および薬剤のリストは以前に記載されている（例えば米国特許６，０８６，８７５、６，４８５，７２６、６，０３０，６１３；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１参照）。
２．免疫グロブリン
本発明のキメラ蛋白は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含む。免疫グロブリンは共有結合的に会合している蛋白鎖４つ、即ち重鎖２つおよび軽鎖２つを含む。各鎖は更に可変領域１つおよび定常領域１つを含む。免疫グロブリンアイソタイプに応じて、重鎖定常領域は３または４つの定常領域ドメイン（例えばＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）を含む。一部のアイソタイプは更にヒンジ領域を含む。
免疫グロブリン定常領域の部分は何れかの哺乳類から得ることができる。免疫グロブリン定常領域の部分はヒト免疫グロブリン定常領域、非ヒト霊長類免疫グロブリン定常領域、ウシ免疫グロブリン定常領域、ブタ免疫グロブリン定常領域、ネズミ免疫グロブリンジ定常領域、ヒツジ免疫グロブリン定常領域、または、ラット免疫グロブリン定常領域の部分を包含する。
免疫グロブリン定常領域の部分は組み換えにより、または、合成により製造できる。免疫グロブリンはｃＤＮＡライブラリから単離できる。免疫グロブリン定常領域の部分はファージライブラリから単離できる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２，Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４３６３；ＥＰ０５８９８７７Ｂ１参照）。免疫グロブリン定常領域の部分は既知配列の遺伝子シャフリングにより得ることができる（Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９）。免疫グロブリン定常領域の部分はインビボ組み換えにより単離できる（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２１：２２６５）。免疫グロブリンはヒト化免疫グロブリンであることができる（米国特許５，５８５，０８９、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３）。
免疫グロブリン定常領域の部分はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥの部分を含むことができる。１つの実施形態において、免疫グロブリンはＩｇＧである。別の実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧ１である。別の実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧ２である。
免疫グロブリン定常領域の部分は全体の重鎖定常領域またはそのフラグメントまたは類縁体を含むことができる。１つの実施形態において、重鎖定常領域はＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび／またはヒンジ領域を含むことができる。別の実施形態においては、重鎖定常領域はＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび／またはＣＨ４ドメインを含むことができる。
免疫グロブリン定常領域の部分はＦｃフラグメントを含むことができる。Ｆｃフラグメントは免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインおよび免疫グロブリンのヒンジ領域を含むことができる。ＦｃフラグメントはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃフラグメントであることができる。１つの特定の実施形態においては、免疫グロブリン定常領域の部分はＩｇＧ１のＦｃフラグメントである。別の実施形態においては、免疫グロブリン定常領域の部分はＩｇＧ２のＦｃフラグメントである。
別の実施形態においては、免疫グロブリン定常領域の部分はＦｃ新生児受容体（ＦｃＲｎ）結合相手である。ＦｃＲｎ結合相手はＦｃＲｎ受容体により特異的に結合されることができ、その結果、ＦｃＲｎ結合相手のＦｃＲｎ受容体による能動輸送がもたらされる何れかの分子である。特異的結合とは生理学的条件下で比較的安定である複合体を形成する２分子を指す。特異的結合は、通常は低親和性と中等度〜高度な容量を有する非特異的結合とは弁別される高親和性と低〜中等度の容量を特徴としている。典型的には、結合は、親和性定数ＫＡが１０６Ｍ−１より高値、または、より好ましくは１０８Ｍ−１より高値である場合に特異的とみなされる。必要に応じて、非特異的結合は結合条件を変更することにより特異的結合に実質的に影響することなく低減することができる。分子の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合時間、ブロッキング剤の濃度（例えば血清アルブミン、乳カゼイン）等のような適切な結合条件は日常的手法を使用して当業者が旨適化してよい。
ＦｃＲｎ受容体はヒトを含む数種の哺乳類動物種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、サルＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎおよびマウスＦｃＲｎの配列は知られている（Ｓｔｏｒｙ
ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３７７）。ＦｃＲｎ受容体は比較的低ｐＨでＩｇＧに結合し（ただしＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような他の免疫グロブリンクラスには結合しない）、管腔から漿膜方向に細胞経由してＩｇＧを能動輸送し、そしてその後、間質液中の比較的高ｐＨにおいてＩｇＧを放出する。これは成人上皮組織（米国特許６，４８５，７２６、６，０３０，６１３、６，０８６，８７５；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１）、例えば肺および腸の上皮（Ｉｓｒａｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９２：６９）、腎近位尿細管上皮（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａ，．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２：Ｆ３５８）並びに鼻上皮、膣表面および胆管分岐部表面において発現される。
本発明のＦｃＲｎ結合相手は全ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃフラグメント、およびＦｃＲｎ受容体の完全な結合領域を含む他のフラグメントを含むＦｃＲｎ受容体により特異的に結合され得る如何なる分子も包含する。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域はＸ線結晶分析に基づいて説明されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３７９）。ＦｃＲｎに対するＦｃの主要な接触領域はＣＨ２およびＣＨ３ドメインの連結部近傍である。Ｆｃ−ＦｃＲｎの接触は全て単一のＩｇ重鎖内である。ＦｃＲｎ結合相手は全ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃフラグメントおよびＦｃＲｎの完全な結合領域を含むＩｇＧの他のフラグメントを包含する。主要な接触部位は、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１および３１４、および、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８および４３３〜４３６を包含する。免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントまたは領域のアミノ酸のナンバリングに関しては、全て、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤに基づいている。
ＩｇＧのＦｃ領域は部位指向性突然変異誘発のようなよく知られた操作法に従って修飾することによりＦｃＲｎにより結合され得る修飾されたＩｇＧまたはＦｃフラグメントまたはその部分を得ることができる。このような修飾はＦｃＲｎ接触部位からは遠隔の修飾、並びに、ＦｃＲｎへの結合を温存するか、むしろ増強さえするような接触部位内の修飾を包含する。例えば、ＦｃＲｎに対するＦｃ結合親和性の実質的損失を伴うことなくヒトＩｇＧ１Ｆｃ（Ｆｃγ１）内野以下の単一のアミノ酸残基、即ち、Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｆ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ｐ３３１Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４ＡおよびＫ４４７Ａを置換することができ、ここで例えばＰ２３８Ａとは、２３８位におけるアラニンにより置換された野生型のプロリンを表す。一例として、１つの特定の実施形態は、Ｎ２９７Ａ突然変異を取り込み、高度に保存されたＮグリコシル化部位を除去している。アラニンのほかに、他のアミノ酸を上記した特定の位置において野生型アミノ酸と置換してよい。突然変異をＦｃに単独で導入することによりネイティブのＦｃとは異なる１００超のＦｃＲｎ結合相手を生じさせてよい。更にまた２、３またはそれ以上のこれらの個々の突然変異の組み合わせをともに導入することにより、更に数百のＦｃＲｎ結合相手を生じさせてよい。更にまた、単量体−二量体ハイブリッドのＦｃＲｎ結合相手の１つを突然変異指せ、もう一方のＦｃＲｎ結合相手を全く突然変異させないか、または、両者を共に突然変異させるが、異なる突然変異としてもよい。Ｎ２９７Ａを含む本明細書に記載した突然変異の何れも、生物学的に活性な分子（例えばＥＰＯ、ＩＦＮ、第ＩＸ因子、Ｔ２０）とは無関係にＦｃの修飾のために使用してよい。
上記した突然変異の特定のものはＦｃＲｎ結合相手に対して新しい機能を付与する場合がある。例えば１つの実施形態はＮ２９７Ａを導入し、高度に保存されたＮグリコシル化部位を除去する。この突然変異の作用は免疫原性を低減し、これによりＦｃＲｎ結合相手の循環半減期を増大させること、および、ＲｃＲｎに対する親和性について妥協することなくＦｃＲｎ結合相手をＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＩＡに結合不能とすることである（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６０：８７４；Ｆｒｉｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６８：１６３２；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１）。上記した突然変異から生じる新しい機能の別の例として、ＦｃＲｎに対する親和性は、一部の例においては野生型のものを超えて増大させてよい。この増大した親和性は増大した「ｏｎ」速度、低減した「ｏｆｆ」速度、または増大した「ｏｎ」速度と低減した「ｏｆｆ」速度の両者を反映する。ＦｃＲｎに対する増大した親和性を付与すると考えられる突然変異にはＴ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａが包含される（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１）。
更にまた、少なくとも３種のヒトＦｃ受容体がより低いヒンジ領域内、一般的にはアミノ酸２３４〜２３７のＩｇＧ上の結合部位を認識すると考えられる。従って、新しい機能の別の例および潜在的に低減された免疫原性は、例えばヒトＩｇＧ１「ＥＬＬＧ」のアミノ酸２３３〜２３６からＩｇＧ２「ＰＶＡ」由来の相当する配列に置き換えること（１アミノ酸欠失）による、この領域の突然変異から生じると考えられる。種々のエフェクター機能を媒介するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩは、このような突然変異が導入されればＩｇＧ１に結合しなくなることがわかっている。Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ １９９５，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：７７およびＡｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒ．Ｋ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３。
１つの実施形態において、ＦｃＲｎ結合相手は配列ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号２６）を含み、そして場合により更に、ＨＱＳＬＧＴＱ（配列番号２７）、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号２８）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号２９）またはＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号３０）から選択される配列を含むポリペプチドである（米国特許５，７３９，２７７）。
ＦｃＲｎ結合相手２つが単一のＦｃ分子に結合できる。結晶分析データによれば、各ＦｃＲｎ分子はＦｃホモ二量体の単一のポリペプチドに結合することが示唆されている。１つの実施形態において、ＦｃＲｎ結合相手、例えばＩｇＧのＦｃフラグメントの生物学的に活性な分子への連結は、経口、口内、舌下、直腸内、膣内、鼻内投与用のエアロゾルまたは肺経路または眼経路により生物学的に活性な分子を送達する手段を与える。別の実施形態においては、キメラ蛋白は侵襲的に、例えば皮下、静脈内に投与できる。
当業者の知るとおり、本発明のキメラ蛋白において使用するための免疫グロブリン定常領域の部分はその突然変異体および類縁体を包含でき、または、化学修飾された免疫グロブリン定常領域（例えばペギル化）またはそのフラグメントを包含できる（例えばＡｓｌａｍ ａｎｄ Ｄｅｎｔ １９９８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍａｃｍｉｌａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ参照）。一例においては、突然変異体はＦｃＲｎに対するＦｃＲｎ結合相手の増強した結合をもたらす場合がある。更にまた、本発明のキメラ蛋白において使用を意図するものは、免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分のペプチド模倣物、例えばＦｃフラグメントのペプチド模倣物、または、ＦｃＲｎ結合相手のペプチド模倣物である。１つの実施形態において、ペプチド模倣物はファージディスプレイを使用して、または、化学ライブラリスクリーニングを介して識別することができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２，Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４３６３；ＥＰ０５８９８７７Ｂ１参照）。
３．任意のリンカー
本発明のキメラ蛋白は場合によりリンカー分子少なくとも１つを含むことができる。リンカーは何れかの有機分子を含むことができる。１つの実施形態においては、リンカーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。別の実施形態においてはリンカーはアミノ酸を含む。リンカーは１〜５アミノ酸、１〜１０アミノ酸、１〜２０アミノ酸、１０〜５０アミノ酸、５０〜１００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸を含むことができる。１つの実施形態において、リンカーは８アミノ酸リンカーＥＦＡＧＡＡＡＶ（配列番号３１）である。本明細書に記載したリンカーの何れも、生物学的に活性な分子（例えばＥＰＯ、ＩＦＮ、第ＩＸ因子）とは無関係に、ＥＦＡＧＡＡＡＶを含めて、本発明のキメラ蛋白、例えば単量体−二量体ハイブリッドにおいて使用してよい。
リンカーは配列Ｇｎを含むことができる。リンカーは配列（ＧＡ）ｎ（配列番号３２）を含むことができる。リンカーは配列（ＧＧＳ）ｎ（配列３３）を含むことができる。リンカーは配列（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３４）を含むことができる。これらの場合において、ｎは１〜１０の整数、即ち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０であってよい。リンカーの例は、ＧＧＧ（配列番号３５）、ＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３６）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号３７）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３９）を包含する。リンカーはキメラ蛋白の生物学的活性を消失または低減しない。場合により、リンカーは、例えば立体障害の作用を更に低減することにより、そして、生物学的に活性な分子をその標的結合部位に対してより到達接触可能とすることにより、キメラ蛋白の生物学的活性を増強する。
１つの特定の実施形態においては、インターフェロンαのリンカーは１５〜２５アミノ酸長である。別の特定の実施形態においては、インターフェロンαのリンカーは１５〜２０アミノ酸長である。別の特定の実施形態においては、インターフェロンαのリンカーは１０〜２５アミノ酸長である。別の特定の実施形態においては、インターフェロンαのリンカーは１５アミノ酸長である。１つの実施形態において、インターフェロンαのためのリンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０）であり、ここでＧはグリシン、Ｓはセリンであり、ｎは１〜１０の整数である。特定の実施形態においてはｎは３である。
リンカーはまた、Ｆｃ部分から生物学的に活性な分子を放出させるために、化学的（例えばエステル結合の加水分解）、酵素的（即ちプロテアーゼ切断配列の取り込み）または光化学的（例えば発色団、例えば３−アミノ−３−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸（ＡＮＰ））に切断されルことができる部分を取り込んでいてよい。
４．特定の結合相手を用いたキメラ蛋白の２量化
１つの実施形態において、本発明のキメラ蛋白は少なくとも第１のドメインを含む第２のポリペプチド鎖、ここで該第１のドメインは少なくとも１つの特異的結合相手を有するもの、および、少なくとも第２のドメインを含む第２のポリペプチド鎖、ここで該第２のドメインは該第１のドメインの特異的結合相手であるもの、を含む。即ちキメラ蛋白は第１のドメインおよび第２のドメインの相互作用により別のポリペプチドと２量化することができるポリペプチドを含む。非相同のドメインを用いた抗体の２量化の方法は当該分野で知られている（うそ５，８０７，７０６および５，９１０，５７３；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７）。
２量化は共有結合の形成により、または非共有結合、例えば疎水相互作用、ファンデルワールス力、両親媒性ペプチド勘合により、例えばアルファらせんの勘合、反対の電荷を有するアミノ酸、例えばリジンとアスパラギン酸、アルギニンとグルタミン酸の電荷−電荷相互作用により行える。１つの実施形態において、ドメインはらせん、折り返し部および別のらせんを含むらせん束である。別の実施形態においては、ドメインは、７番目おきにアミノ酸がロイシン残基となっている数回反復するアミノ酸を有するペプチドを含むロイシンジッパーである。１つの実施形態において、特異的結合相手はｆｏｓ／ｊｕｎである（Ｂｒａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。
別の実施形態において、結合は化学結合により媒介される（例えばＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１参照）。この実施形態においては、未損傷の免疫グロブリンまたは免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含むキメラ蛋白を切断して重鎖フラグメントを発生させる。これらのフラグメントをジチオール複合体形成剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下に還元することにより隣接するジチオールを安定化させ、分子内ジスルフィド結合の形成を防止する。次にフラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次にメルカプトエチルアミンを用いた還元によりＴＮＢ誘導体の１つを重鎖フラグメントに再変換し、そして次に等モル量の別のＴＮＢ誘導体と混合してキメラ二量体を形成する。
Ｄ．核酸
本発明は本発明のキメラ蛋白の少なくとも部分をコードする核酸配列を各々が含んでいる第１の核酸コンストラクトおよび第２の核コンストラクトに関する。１つの実施形態において、第１の核酸コンストラクトは生物学的に活性な分子をコードする第２のＤＮＡ配列に作動可能に連結した免疫グロブリン定常領域の部分をコードする核酸配列を含み、そして、該第２のＤＮＡコンストラクトは生物学的に活性な分子をコードする第２のＤＮＡ配列を有さない免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む。
生物学的に活性な分子は例えばウィルス融合抑制剤、凝固因子、成長因子またはホルモンまたは受容体、または、これらの何れかの類縁体またはフラグメントを包含する。核酸配列はまた当該分野で知られている別の配列またはエレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、ポリＡ配列、アフィニティータグ）も包含できる。１つの実施形態において、第２のコンストラクトの核酸配列は場合により生物学的に活性な分子をコードする核酸配列と免疫グロブリン定常領域の部分との間に配置されたリンカーをコードする核酸配列を含むことができる。第２のＤＮＡコンストラクトの核酸配列は場合により、生物学的に活性な分子および／または免疫グロブリン定常領域の部分をコードする核酸配列の前後に配置されたリンカーを含むことができる。
１つの実施形態において、核酸コンストラクトはＤＮＡを含む。別の実施形態において、核酸コンストラクトはＲＮＡを含む。核酸コンストラクトはベクター、例えばウィルスベクターまたはプラスミドであることができる。ウィルスベクターの例は、アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクターまたはネズミ白血病ウィルスベクターを包含する。プラスミドの例はｐＵＣ、ｐＧＥＭおよびｐＧＥＸを包含する。
１つの実施形態において、核酸コンストラクトは図３ａの核酸配列（配列番号７）を含む。１つの実施形態において、核酸コンストラクトは図３ｂの核酸配列（配列番号９）を含む。１つの実施形態において、核酸コンストラクトは図３ｃの核酸配列（配列番号１１）を含む。１つの実施形態において、核酸コンストラクトは図３ｄの核酸配列（配列番号１３）を含む。１つの実施形態において、核酸コンストラクトは図３ｅの核酸配列（配列番号１５）を含む。１つの実施形態において、核酸コンストラクトは図３ｆの核酸配列（配列番号１７）を含む。１つの実施形態において、核酸コンストラクトは図３ｇの核酸配列（配列番号１９）を含む。１つの実施形態において、核酸コンストラクトは図３ｈの核酸配列（配列番号２１）を含む。１つの実施形態において、核酸コンストラクトは図３ｉの核酸配列（配列番号２３）を含む。１つの実施形態において、核酸コンストラクトは図３ｊの核酸配列（配列番号２５）を含む。１つの実施形態において、核酸コンストラクトは図１７ａの核酸配列（配列番号２７）を含む。
コドン１つ以上が同じアミノ酸をコードできるという遺伝子コードの知られた縮重により、ＤＮＡ配列は配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に示したものから変動することができ、そしてなお、それぞれ、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６の相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。このような変異体ＤＮＡ配列はサイレントな突然変異（例えばＰＣＲ増幅中に生じる）に起因するか、または、ネイティブの配列の意図的な突然変異誘発の産物であることができる。即ち本発明は、（ａ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；（ｂ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｃ）中ストリンジェンシーの条件下に（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとハイブリダイズすることができ、そして本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ；（ｄ）高ストリンジェンシーの条件下に（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとハイブリダイズすることができ、そして本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ；（ｅ）遺伝子コードの結果として（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）において定義したＤＮＡに変性しており、そして本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ、から選択される本発明のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡを提供する。当然ながら、このようなＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドは本発明に包含される。
別の実施形態においては、本発明のキメラ蛋白をコードする配列を含む核酸分子はまた、ネイティブの配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。更に意図される実施形態は、本発明のキメラ蛋白をコードする配列を含む核酸分子がネイティブの配列と少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、少なくとも９８％同一である、少なくとも９９％同一である、少なくとも９９．９％同一である配列を含むものである。ネイティブの配列は人間の手により改変されていない何れかのＤＮＡ配列を含む。％同一性は目視による検査および数学的計算により求めてよい。或は、２つの核酸配列の％同一性はＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７に記載されており、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０を用いて配列情報を比較することにより求めることもできる。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターは、（１）ヌクレオチドに対する１要素比較マトリックス（同一に対して１、非同一に対して０の数値を含む）、および、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ． １９７９， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８に記載されているＧｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ １９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５の加重比較マトリックス；（２）各ギャップにつき３．０のペナルティーおよび各ギャップにおける各シンボルにつき更に０．１０ペナルティー；および（３）エンドギャップに対してペナルティーなしとする。配列比較の分野で当業者が使用する他のプログラムも使用してよい。
Ｅ．キメラ蛋白の合成 免疫グロブリン定常領域少なくとも部分および生物学的に活性な分子を含むキメラ蛋白は当該分野でよく知られた手法を用いて合成できる。例えば本発明のキメラ蛋白は細胞内で組み換えにより合成できる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｎ．Ｙ．参照）。或は、本発明のキメラ蛋白は固相合成のような知られた合成方法を用いて合成できる。合成方法は当該分野でよく知られている（例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９７３，Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ， （Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ ａｎｄ Ｐａｎａｙｏｔｉｓ ｅｄｓ．）ｐｐ．３３５−６１；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ １９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４；Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９７６，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （３ｄ ｅｄ．）２：１０５；Ｅｒｉｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７６，Ｔｈｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （３ｒｄ ｅｄ．），２：２５７；米国特許３，９４１，７６３参照）。或は、本発明のキメラ蛋白は組み換えおよび合成の方法の組み合わせを用いて合成できる。特定の用途においては、組み換え法または組み換えと合成の方法の組み合わせのいずれかを使用することが好都合である場合がある。
生物学的に活性な分子をコードする核酸は当該分野で知られた組み換え手法を用いて容易に合成できる。或は、ペプチド自体を化学合成することができる。本発明の核酸は当該分野で知られた標準的な方法により、例えば自動ＤＮＡシンセサイザー（例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等より入手可能なもの）の使用により合成してよい。一例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをＳｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９の方法により合成してよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドはＳａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：７４４８に記載の制御細孔ガラス重合体支持体の使用により製造できる。核酸合成の別の方法は当該分野で知られている（例えば米国特許６，０１５，８８１；６，２８１，３３１；６，４６９，１３６参照）。
免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントは当該分野で知られた種々のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリからクローニングしてよい。プローブ系の方法を用いたこのようなＤＮＡ配列の単離のための手法は従来技術であり、当該分野で知られたものである。このようなＤＮＡ配列を単離するためのプローブは公開されたＤＮＡ配列に基づいている（例えばＨｉｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：１９７−２０７参照）。Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許４，６８３，１９５）およびＭｕｌｌｉｓ（米国特許４，６８３，２０２）により開示されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いてよい。このようなＤＮＡ配列の単離のためのライブラリの選択およびプローブの選択は当該分野で知られたものである。或は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列は免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含有することが当該分野で知られているベクターから得ることができる。
組み換え製造のためには、本発明のキメラ蛋白の部分（例えば免疫グロブリン定常領域の部分）をコードする第１のポリヌクレオチド配列および本発明のキメラ蛋白の部分（例えば免疫グロブリン定常領域の部分および生物学的に活性な分子）をコードする第２のポリヌクレオチド配列を適切な発現ベクター、即ち挿入されたコーディング配列の転写および翻訳のための必要なエレメント、または、ＲＮＡウィルスベクターの場合は複製および翻訳に必要なエレメントを含有しているベクターに挿入する。キメラ蛋白をコードする核酸は適切な読み枠内においてベクター内に挿入される。
次に発現ベクターをポリペプチドを発現する適当な標的細胞のトランスフェクトまたはコトランスフェクトする。当該分野で知られたトランスフェクション法には、例えばリン酸カルシウム沈殿（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｃｅｌｌ １４：７２５）およびエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，ＥＭＢＯ，Ｊ．１：８４１）およびリポソーム系試薬が包含される。原核生物および真核生物を含む種々の宿主発現ベクター系を利用して本明細書に記載したキメラ蛋白を発現してよい。これらには例えば適切なコーディング配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）のような微生物；適切なコーディング配列を含有する組み換えコウボまたはカビの発現ベクターにより形質転換された公募または糸状カビ；適切なコーディング配列を含有する組み換えウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）を感染させた昆虫細胞系；適切なコーディング配列を含有する、組み換えウィルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウィルスまたはタバコモザイクウィルス）を感染させた、または、組み換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された、植物細胞系；または、哺乳類細胞を含む動物細胞系（例えばＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ細胞）が包含される。
本発明のキメラ蛋白を原核細胞において組み換え合成する場合は、キメラ蛋白を再折りたたみすることが望ましい場合がある。この方法により製造されたキメラ蛋白は当該分野で知られた条件、例えば還元条件下の変性とその後のＰＢＳ中への緩徐な透析を用いて、生物学的に活性なコンホーメーションに再折りたたみすることができる。
使用する発現系に応じて、発現されたキメラ蛋白をその後、当該分野で知られた操作法で単離する（例えばアフィニティークロマトグラフィー、サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）。
発現ベクターは組み換え製造されたキメラ蛋白の容易な精製を可能とするタグについてコードできる。例としては、ハイブリッド蛋白が製造されるようにｌａｃｚコーディング領域とインフレームとなるように本明細書に記載したキメラ蛋白のコーディング配列をベクターにライゲーションしたベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３、ＥＭＢＯＪ．２：１７９１）が包含され；ｐＧＥＸベクターはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを伴って本発明のキメラ蛋白を発現するために使用してよい。これらの蛋白は通常は窩要請であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着とその後の遊離グルタチオン存在下の溶離により細胞から容易に精製できる。ベクターは精製後のタグの除去を容易にするため切断部位（トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼまたはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＰｒｏｔｅａｓｅＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，Ｎ．Ｊ．））を含む。
製造効率を高めるため、ポリヌクレオチドは酵素切断部位により分断された本発明のキメラ蛋白の複数の単位をコードするように設計することができる。得られるポリペプチドは、ポリペプチド単位が回収できるように切断（例えば適切な酵素による処理による）できる。これにより単一のプロモーターにより駆動されるポリペプチドの収量を増大できる。適切なウィルス発現系で使用される場合、ｍＲＮＡによりコードされる各ポリペプチドの翻訳は例えば内部リボソーム進入部位ＩＲＥＳにより、転写物中に内在するように指向される。即ち、ポリペプチドコンストラクトは単一の大型のポリシストロンのｍＲＮＡの転写を指向し、次にこれが複数の個々のポリペプチドの翻訳を指向する。この手法によればポリ蛋白の製造および酵素的プロセシングが排除され、そして、単一のプロモーターにより駆動されるポリペプチドの収量が顕著に増大する。
形質転換に使用するベクターは通常は形質転換体を識別するために使用される選択可能なマーカーを含む。細菌の系においては、これはアンピシリンまたはカナマイシンのような抗生物質への耐性の遺伝子を包含する。培養哺乳類細胞において使用するための選択可能なマーカーはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を付与する遺伝子を包含する。選択可能なマーカーは増幅可能な選択可能なマーカーであってよい。増幅可能な選択可能なマーカーの一例はＤＨＦＲ遺伝子である。別の増幅可能なマーカーはＤＨＦＲｃＤＮＡである（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ １９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２４９５）。選択可能なマーカーはＴｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｓｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ、ＭＡ）により検討されており、選択可能なマーカーの選択は当業者の知るとおりである。
選択可能なマーカーは目的の遺伝子と同時に個別のプラスミド上で細胞に導入するか、または、それらは同じプラスミド上で導入してよい。同じプラスミド上の場合は、選択可能なマーカーおよび目的の遺伝子は異なるプロモーターまたは同じプロモーターの制御下にあり、後者の設定では異なるメッセージが生じる。この種のコンストラクトは当該分野で知られている（例えば米国特許４，７１３，３３９）。
発現系の発現エレメントはその長さと特異性において様々である。使用する宿主／ベクター系に応じて、構成性および誘導性のプロモーターのを含む多くの適当な転写および翻訳のエレメントのいずれかを発現ベクターにおいて使用してよい。例えば細菌系においてクローニングする場合は、誘導プロモーター、例えばバクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）等を使用してよく；昆虫細胞系においてクローニングする場合は、バキュロウィルスポリヘドロンプロモーターのようなプロモーターを使用してよく；植物細胞系においてクローニングする場合は植物細胞のゲノムから誘導したプロモーター（例えば熱ショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小型サブユニットのプロモーター；クロロフィルａ／ｂ結合蛋白のプロモーター）から、または、植物ウィルスからのもの（例えばＣａＭＶの３５ＳＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコート蛋白プロモーター）を使用してよく；哺乳類細胞系においてクローニングする場合は、哺乳類細胞のゲノムから誘導したプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウィルスからのもの（例えばアデノウィルス後期プロモーター；ワクシニアウィルス７．５Ｋプロモーター）を使用してよく；発現産物の複数のコピーを含む細胞系統を発生させる場合は、ＳＶ４０、ＢＰＶおよびＥＢＶ系のベクターを適切な選択可能なマーカーと共に使用してよい。
植物発現ベクターを使用する場合は、本発明のキメラ蛋白の線状または非環状の形態をコードする配列の発現は、多くのプロモーターの何れかにより駆動される。例えば、ウィルスプロモーター、例えばＣａＭＶの３５ＳＲＮＡおよび１９ＳＲＮＡプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１−５１４）またはＴＭＶのコート蛋白プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７−３１１）を使用してよく；或は、植物プロモーター、例えばＲＵＢＩＳＣＯの小型サブユニットのプロモーター（Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３）または熱ショックプロモーター、例えば大豆ｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５）を使用してよい。これらのコンストラクトはＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウィルスベクター、直接のＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等を用いて植物細胞内に導入できる。このような手法については、例えばＷｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ １９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３；およびＧｒｉｅｒｓｏｎ＆Ｃｏｒｅｙ １９８８，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｉｅ， Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈ．７−９を参照できる。
本発明のキメラ蛋白を製造するために使用してよい１つの昆虫発現系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの核多水症ウィルス（ＡｃＮＰＶ）を外来遺伝子の発現のためのベクターとして使用する。ウィルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞内で生育する。コーディング配列はウィルスの非必須領域（例えばポリヘドロン遺伝子）内にクローニングされてＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドロンプロモーター）の制御下におかれる。コーディング配列の挿入が良好に行えれば、ポリヘドロン遺伝子の不活性化および非閉塞組み換えウィルス（即ちポリヘドロン遺伝子によりコードされる蛋白様コートを欠いたウィルス）の生産がもたらされる。次にこれらの組み換えウィルスを用いて、挿入された遺伝子が発現されるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞を感染させる（例えばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４；米国特許４，２１５，０５１参照）。この発現系の別の例はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載されている。
本発明のキメラ蛋白を発現するために使用できる別の系は「ＧＳ発現系」とも称されているグルタミン合成遺伝子発現系である（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＰＬＣ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ ＵＫ）。この発現系は米国特許５，９８１，２１６に詳述されている。
哺乳類宿主細胞においては、多くのウィルス系発現系を利用してよい。アデノウィルスを発現ベクターとして使用する場合は、コーディング配列をアデノウィルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３部分リーダー配列にライゲーションしてよい。次にこのキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボの組み換えによりアデノウィルスゲノムに挿入してよい。ウィルスゲノムの非本質的領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）の挿入は感染した宿主において生存性を示しペプチドを発現することができる組み換えウィルスをもたらす（例えばＬｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ １９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３６５５参照）。或は、ワクシニア７．５Ｋプロモーターを使用してよい（例えばＭａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：７４１５；Ｍａｃｊｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７；Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：４９２７参照）。
アデノウィルスを発現ベクターとして使用する場合は、コーディング配列をアデノウィルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３部分リーダー配列にライゲーションしてよい。次にこのキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボの組み換えによりアデノウィルスゲノムに挿入してよい。ウィルスゲノムの非本質的領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）の挿入は、感染した宿主において生存性を示しペプチドを発現することができる組み換えウィルスをもたらす（例えばＬｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ １９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３６５５参照）。或は、ワクシニア７．５Ｋプロモーターを使用してよい（例えばＭａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：７４１５；Ｍａｃｊｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７；Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：４９２７参照）。
キメラ蛋白のＤＮＡコンストラクトを含有する宿主細胞は適切な生育倍地中で生育させる。本明細書においては、「適切な生育培地」という用語は細胞の成育のために必要な栄養を含有する培地を意味する。細胞の成育に必要な培地は、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび成長因子を包含する。場合により、培地はウシ血清またはウシ胎児血清を含有してよい。１つの実施形態において、培地は実質的にＩｇＧを含有しない。生育培地は一般的には、例えば薬剤の選択またはＤＮＡコンストラクト上またはＤＮＡコンストラクトとコトランスフェクトされた選択可能なマーカーにより補われる必須栄養の欠損によりＤＮＡコンストラクトを含有する細胞を選択する。培養された哺乳類細胞は一般的には市販の血清含有または血清非含有の培地（例えばＭＥＭ、ＤＭＥＭ）中で生育させる。使用する特定の細胞系統のために適切である培地の選択は当業者の知るとおりである。
組み換えにより生産された本発明のキメラ蛋白は培地から単離することができる。適切に生育した形質転換された、またはトランスフェクトされた宿主細胞の培地を細胞材料から分離し、キメラ蛋白の存在を明らかにする。例えばキメラ蛋白を検出する１つの方法は、本発明のキメラ蛋白を認識する特定の抗体へのキメラ蛋白またはキメラ蛋白の部分の結合により行える。抗キメラ蛋白抗体は目的のキメラ蛋白に対して作成されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体であってよい。例えばキメラ蛋白は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含む。多くの免疫グロブリンの定常領域を認識する抗体は当該分野で知られており、市販されている。抗体を用いてＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットを行うことにより本発明のキメラ蛋白の存在を検出できる。
本発明のキメラ蛋白はトランスジェニック動物、例えばげっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジまたはヤギにおいて合成できる。「トランスジェニック動物」という用語はそのゲノムに外来遺伝子を取り込んでいる非ヒト動物を指す。この遺伝子は生殖細胞組織に存在するため、親から新生仔に継代される。外来性遺伝子は単細胞胚内に導入する（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４４３８）。トランスジェニック動物の製造方法は当該分野で知られ手織り、例えば免疫グロブリン分子を生産するトランスジェニック体を包含する（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：６３７６；ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｃｅｌｌ ３４：３５５；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０６：３３２；Ｒｉｔｃｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：５１７；Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５９：８３１；Ｒｏｂｌ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５９：１０７；Ｍａｌａｓｓａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １０（３）：２６７）。
本発明のキメラ蛋白はまた合成化学と組み換え手法の組み合わせにより製造できる。例えば免疫グロブリン定常領域の部分は上記した通り組み換えにより発現できる。生物学的に活性な分子は知られた化学合成法を用いて製造できる（例えば固相合成）。
免疫グロブリン定常領域の部分は適切なライゲーション化学を用いて生物学的に活性な分子にライゲーションすることができ、そして、次に生物学的に活性な分子にライゲーションされていない免疫グロブリン定常領域の部分と組み合わせて本発明のキメラ蛋白を形成する。１つの実施形態において、免疫グロブリン定常領域の部分はＦｃフラグメントである。Ｆｃフラグメントは組み換えにより作成してＣｙｓ−Ｆｃを形成し、チオエステルを発現する生物学的に活性な分子と反応させて単量体−二量体ハイブリッドを形成する。別の実施形態においては、Ｆｃ−チオエステルを作成し、Ｎ末端システインを発現する生物学的に活性な分子と反応させる（図４）。
１つの実施形態において、生物学的に活性な分子にライゲーションされている免疫グロブリン定常領域の部分はホモ二量体を形成する。ホモ二量体はホモ二量体を変性および還元条件（例えばベータ−メルカプトエタノールおよび８Ｍ尿素）に曝露することにより破壊することができ、その後、生物学的に活性な分子に連結していない免疫グロブリン定常領域の部分と組み合わせて単量体−二量体ハイブリッドを形成する。次に単量体−二量体ハイブリッドをＰＢＳに透析することにより復元して再折りたたみを行い、そして、サイズエクスクルージョンまたはアフィニティークロマトグラフィーにより単離する。
別の実施形態においては、免疫グロブリン定常領域の部分をホモ二量体とした後に、生物学的に活性な分子に連結する。この実施形態においては、生物学的に活性な分子をホモ二量体に連結するための反応条件は、ホモ二量体の１鎖のみへの生物学的に活性な分子の連結が優先するように（例えば各反応体のモル当量を調節することにより）調節できる。
生物学的に活性な分子はＮ末端システインを有するように化学合成できる。免疫グロブリン定常領域の部分をコードする配列は、キチン結合止めに連結されたインテインをコードするベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）内にサブクローニングできる。インテインは免疫グロブリン定常領域の部分のＣ末端に連結できる。１つの実施形態において、自身のＣ末端に連結されたインテインを有する免疫グロブリンの部分は原核細胞において発現できる。別の実施形態においては、自身のＣ末端に連結されたインテインを有する免疫グロブリンの部分は真核細胞において発現できる。インテインに連結された免疫グロブリン定常領域の部分はＭＥＳＮＡと反応できる。１つの実施形態において、インテインに連結した免疫グロブリン定常領域の部分は、カラム、例えばキチンカラムに結合させ、次にＭＥＳＮＡで溶離する。生物学的に活性な分子および免疫グロブリンの部分は、親核置換が起こり、生物学的に活性な分子がアミド結合を介して免疫グロブリンの部分に共有結合するように、共に反応させることができる（Ｄａｗｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：９２３）。このようにして合成されたキメラ蛋白は場合により免疫グロブリンの部分と生物学的に活性な分子の間にリンカーペプチドを含むことができる。リンカーは例えば生物学的に活性な分子のＮ末端上で合成できる。リンカーはペプチドおよび／または有機分子（例えばポリエチレングリコールおよび／または短いアミノ酸配列）を含むことができる。この複合的な組み換えおよび化学合成により、生物学的に活性な分子およびリンカーの迅速なスクリーニングが可能となり、本発明のキメラ蛋白の所望の特性、例えばウィルス抑制、止血、赤血球の生産、生物学的半減期、安定性、血清蛋白への結合またはキメラ蛋白の何らかの別の特性を旨適化する。方法はまた本発明のキメラ蛋白の所望の特性を旨適化するために有用な本発明のキメラ蛋白への非天然アミノ酸の取り込みを可能にする。所望により、本方法により製造されるキメラ蛋白は当該分野で知られた方法、例えば還元条件とその後のＰＢＳへの緩徐な透析により、生物学的に活性なコンホーメーションとなるように再折りたたみを行うことができる。
或は、Ｎ末端システインは免疫グロブリン定常領域の部分、例えばＦｃフラグメント上に存在できる。Ｆｃフラグメントは、ネイティブのＦｃが２２６位にシステインを有するという事実を利用してＮ末端システインを有するように発生させることができる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ参照）。
末端システインを曝露するためには、Ｆｃフラグメントを組み換えにより発現させる。１つの実施形態において、Ｆｃフラグメントは原核細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉにおいて発現される。Ｃｙｓ２２６（ＥＵナンバリング）で始まるＦｃ部分をコードする配列はシグナルペプチド、例えばＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＳＴＩＩをコードする配列の直後に位置することができる。原核細胞は浸透圧ショックにふすことにより組み換えＦｃフラグメントを放出させることができる。別の実施形態においては、Ｆｃフラグメントは真核細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞において生産される。組み換えキメラ蛋白が親核細胞により合成される際にシグナル配列が切断され、Ｎ末端システインが脱離し、これをその後単離してチオエステル（例えば分子がアミノ酸を含む場合はＣ末端チオエステル）を担持する分子と化学反応させることができるように、Ｆｃ部分のフラグメントをコードする配列はシグナルペプチドをコードする配列、例えばマウスＩｇκ軽鎖またはＭＨＣクラスＩＫｂのシグナル配列の直後に配置させることができる。
ＦｃフラグメントのＮ末端システインはまた基質をそのＮ末端において切断する酵素、例えば第Ｘａ因子エンテロキナーゼを用いて発生させることもでき、そして生成物を単離してチオエステルを有する分子と反応させる。
組み換えにより発現されたＦｃフラグメントを用いてホモ二量体または単量体−二量体ハイブリッドを作成できる。
特定の実施形態においては、Ｆｃフラグメントは２２６位のＣｙｓに隣接するヒトαインターフェロンシグナルペプチドと共に発現される。このポリペプチドをコードするコンストラクトをＣＨＯ細胞において発現させれば、ＣＨＯ細胞は２つの異なる位置（Ｃｙｓ２２６およびＮ末端方向上流のシグナルペプチド２アミノ酸内のＶａｌ）においてシグナルペプチドを切断する。これによりＦｃフラグメント２種の混合物が生じる（１つはＮ末端Ｖａｌを有し、１つはＮ末端Ｃｙｓを有するもの）。これが次に二量体物質種の混合物を与える（末端Ｖａｌを有するホモ二量体、末端Ｃｙｓを有するホモ二量体、および、１つの鎖が末端Ｃｙｓ、もう１つの鎖が末端Ｖａｌを有するヘテロ二量体）。ＦｃフラグメントはＣ末端チオエステルを有する生物学的に活性な分子と反応させることができ、そして得られる単量体−二量体ハイブリッドを混合物から単離できる（例えばサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーによる）。他のシグナルペプチド配列をＣＨＯ細胞においてＦｃフラグメントの発現のために使用する場合は、少なくとも２つの異なるＮ末端を有するＦｃフラグメント種の混合物が発生する。
別の実施形態においては、組み換え生産されたＣｙｓ−Ｆｃはホモ二量体を形成できる。ホモ二量体はＣ末端に分枝リンカーを有するペプチドと反応させることができ、ここで分枝リンカーはＣｙｓ−Ｆｃと反応できるＣ末端チオエステル２つを有する。別の実施形態においては、生物学的に活性な分子はＣｙｓ−Ｆｃと反応できる単一の非末端チオエステルを有する。或は、分枝リンカーはＦｃチオエステルと反応できるＣ末端システイン２つを有することができる。別の実施形態においては、分枝リンカーはＦｃチオエステルと反応できる官能基、例えば２−メルカプトアミンを２つ有する。生物学的に活性な分子はアミノ酸を含んでよい。生物学的に活性な分子は小型有機分子または小型無機分子を含んでよい。
Ｆ．キメラ蛋白の使用方法
本発明のキメラ蛋白は当業者が知るとおり多くの用途があり、例えば疾患または状態を有する対象の治療方法を挙げることができる。疾患または状態としてはウィルス感染症、止血障害、貧血、癌、白血病、炎症状態または自己免疫疾患（例えば関節炎、乾癬、全身エリテマトーデス、多発性硬化症）または細菌感染症を挙げることができる（例えば米国特許６，０８６，８７５、６，０３０，６１３、６，４８５，７２６；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１参照）。
１．赤血球不全を有する対象の治療方法
本発明はキメラ蛋白少なくとも１つの治療有効量を投与することを含む、赤血球不全、例えば貧血を有する対象の治療方法に関し、ここでキメラ蛋白は第１のよい第２のポリペプチド鎖を含み、ここで第１の鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および赤血球の増殖を誘導することができる薬剤、例えばＥＰＯ少なくとも１つを含み、そして、第２のポリペプチド鎖は免疫グロブリンの少なくとも部分を含み、第１の鎖の赤血球増殖を誘導することができる薬剤は有さない。
２．ウィルス感染を有する対象の治療方法。
本発明はキメラ蛋白少なくとも１つの治療有効量を投与することを含む、ウィルス感染を有するか、ウィルスに曝露された対象の治療方法に関し、ここでキメラ蛋白は第１のよい第２のポリペプチド鎖を含み、ここで第１の鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および抗ウィルス剤、例えば融合抑制剤またはインターフェロンα少なくとも１つを含み、そして、第２のポリペプチド鎖は免疫グロブリンの少なくとも部分を含み、第１の鎖の抗ウィルス剤は有さない。１つの実施形態において、対象はＩＦＮαで治療できるウィルス、例えばＣ型肝炎ウィルスに感染している。１つの実施形態においては、対象はＨＩＶ、例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に感染している。
１つの実施形態においては、本発明のキメラ蛋白はウィルス複製を抑制する。１つの実施形態において、本発明のキメラ蛋白は標的細胞へのウィルスの進入を抑制し、これにより対象におけるウィルスの感染の拡大を停止、防止または制限し、そして感染対象におけるウィルス負荷を低減する。免疫グロブリンの部分をウィルス融合抑制剤と連結させることにより、本発明は、例えばＴ２０、Ｔ２１、Ｔ１２４９のようなウィルス融合抑制剤単独の場合と比較して、より大きい安定性およびより大きい生体利用性を有するウィルス融合抑制活性を有するキメラ蛋白を提供する。即ち、１つの実施形態においては、ウィルス融合抑制剤は標的細胞のＨＩＶ感染、例えばＨＩＶ−１を低減または防止する。
ａ．治療してよい状態
本発明のキメラ蛋白は肝炎ウィルス、例えばＣ型肝炎ウィルスによる標的細胞の感染を抑制または防止するために使用できる。キメラ蛋白はウィルス複製を抑制する抗ウィルス剤を含んでよい。
１つの実施形態において、本発明のキメラ蛋白は融合抑制剤を含む。本発明のキメラ蛋白は何れかのウィルスによる何れかの標的細胞の感染を抑制または防止するために使用できる（例えば米国特許６，０８６，８７５、６，０３０，６１３、６，４８５，７２６；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１参照）。１つの実施形態においては、ウィルスはエンベロープを有するウィルス、例えばＨＩＶ、ＳＩＶ、麻疹、インフルエンザ、エプスタインー・バーウィルス、呼吸器シンシチウムウィルスまたはパラインフルエンザウィルスである。別の実施形態においては、ウィルスは非エンベロープウィルス、例えばライノウィルスまたはポリオウィルスである。
本発明のキメラ蛋白はウィルスに既に感染した対象を治療するために使用できる。対象はウィルスにより急性に感染していることができる。或は、対象はウィルスに慢性的に感染している。本発明のキメラ蛋白はまたウィルス感染に罹患する危険性がある対象、例えばウィルスと緊密に接触したことがわかっているかそのように考えられる対象、または、ウィルスに感染するか、保有していると考えられる対象を予防的に治療するためにも使用できる。本発明のキメラ蛋白はウィルスに曝露されたが陽性であるとはまだ診断されていない対象を治療するために使用できる。
１つの実施形態においては、本発明はキメラ蛋白の治療有効量を対象に投与することを含むＨＣＶに感染した対象の治療方法に関し、ここで、キメラ蛋白はＩｇＧのＦｃフラグメントおよびサイトカイン、例えばＩＦＮαを含む。
１つの実施形態においては、本発明はキメラ蛋白の治療有効量を対象に投与することを含むＨＩＶに感染した患者の治療法方に関し、ここでキメラ蛋白はＩｇＧのＦｃフラグメントを含み、そしてウィルス融合抑制剤はＴ２０を含む。
３．止血障害を有する対象の治療方法
本発明はキメラ蛋白少なくとも１つの治療有効量を投与することを含む止血障害を有する対象の治療方法に関し、ここでキメラ蛋白は第１および第２の鎖を含み、ここで第１の鎖は凝固因子少なくとも１つおよび免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、そして第２の鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含む。
本発明のキメラ蛋白はフィブリンクロットの形成を誘発することにより止血障害を治療または防止する。本発明のキメラ蛋白は凝固カスケードの何れかのメンバーを活性化することができる。凝固因子は外因性の経路、内因性の経路または両方に関与している可能性がある。１つの実施形態において、凝固因子は第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子である。第ＶＩＩａ因子は第Ｘ因子を活性化し、これが第Ｖａ因子と相互作用してプロトロンビンを分解してトロンビンとし、これが次にフィブリノーゲンを分解してフィブリンとする。別の実施形態においては、凝固因子は第ＩＸ因子または第ＩＸａ因子である。更に別の実施形態においては、凝固因子は第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩａ因子である。更に別の実施形態においては、凝固因子はフォン・ビルブラント因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子である。
ａ．治療してよい上体
本発明のキメラ蛋白は何れかの止血障害を治療するために使用できる。本発明のキメラ蛋白の投与により治療してよい止血障害は、例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ビルブラント症、第ＸＩ因子不全（ＰＴＡ不全）、第ＸＩＩ因子不全並びにフィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の不全または構造的以上である。
１つの実施形態において、止血障害は遺伝障害である。１つの実施形態において、対象は血友病Ａを有し、そしてキメラ蛋白は第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩａ因子を含む。別の実施形態においては、対象は血友病Ａを有し、そしてキメラ蛋白は第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子を含む。別の実施形態においては、対象は血友病Ｂを有し、そしてキメラ蛋白は第ＩＸ因子または第ＩＸａ因子を含む。別の実施形態においては、対象は血友病Ｂを有し、そしてキメラ蛋白は第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子を含む。別の実施形態においては、対象は第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩａ因子に対する抑制抗体を有し、そして、キメラ蛋白は第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子を含む。別の実施形態においては、対象は第ＩＸ因子または第ＩＸａ因子に対する抑制抗体を有し、そして、キメラ蛋白は第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子を含む。
本発明のキメラ蛋白は止血障害を有する患者を予防的に治療するために使用できる。本発明のキメラ蛋白は止血障害を有する対象における急性の出血エピソードを治療するために使用できる。
１つの実施形態において、止血障害は凝固因子、例えば第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子の不全の結果である。別の実施形態においては止血障害は欠損した凝固因子、例えばフォン・ビルブラント因子の結果である。
別の実施形態において、止血障害は後天性の障害である。後天性の障害は伏在する二次的疾患または状態に起因する。無関係の状態は、例えば癌、自己免疫疾患、または妊娠である。後天性障害は高齢に起因するか、または、伏在する二次的障害を治療するための医薬に起因する（例えば癌の化学療法）。
４．全身止血剤を必要とする対象の治療方法
本発明はまた止血障害または止血障害の獲得をもたらす二次的な疾患または状態を有さない対象の治療方法に関する。即ち本発明はキメラ蛋白少なくとも１つの治療有効量を投与することを含む全身止血剤の必要な患者の治療方法に関し、ここでキメラ蛋白は第１および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで第１のポリペプチド鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分および凝固因子少なくとも１つを含み、そして第２の鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、第１のポリペプチド鎖の凝固因子は有さない。
ａ．治療してよい状態
１つの実施形態において、全身止血剤を必要とする対象は手術を受けているか受ける予定のあるものである。本発明のキメラ蛋白は手術の前後に予防的に投与できる。本発明のキメラ蛋白は急性の出血エピソードを制御するために手術中または手術後に投与できる。手術は、例えば肝臓移植、肝臓摘出または幹細胞移植を包含する。
本発明のキメラ蛋白は止血障害を有さない急性の出血エピソードを有する対象を治療するために使用できる。急性の出血エピソードは重度の外傷、例えば手術、交通事故、創傷、裂傷、被弾または制御不能な出血をもたらす他の外傷性の事象から生じる。
５．治療の様式
本発明のキメラ蛋白は静脈内、皮下、筋肉内、または何れかの粘膜表面、例えば、経口、舌下、口内、舌下、鼻内、直腸内、膣内または肺経路で投与できる。キメラ蛋白は所望の部位へのキメラ蛋白の緩徐な放出を可能にするバイオポリマーの固相に移植または連結することができる。
本発明のキメラ蛋白の用量は対象により変動し、そして使用する特定の投与経路により変動する。用量は０．１〜１００，０００μｇ／ｋｇ体重の範囲であることができる。１つの実施形態においては、用量範囲は０．１〜１，０００μｇ／ｋｇである。蛋白は連続して、または、特定の時間間隔を置いて投与できる。インビトロ試験を用いて旨適な用量範囲および／または投与スケジュールを決定してよい。ウィルス感染性を測定する多くのインビトロの試験法が当該分野で知られている。例えば逆転写酵素試験、または、ｒｔＰＣＲ試験または分枝ＤＮＡ試験を用いてＨＩＶ濃度を測定できる。ＳｔａＣｌｏｔ試験を用いて凝固活性を測定できる。更に、有効用量は動物モデルから得られた用量応答曲線から外挿してよい。
本発明はまたウィルス融合抑制剤、免疫グロブリンの少なくとも部分および薬学的に受容可能な担体または賦形剤を含む医薬組成物に関する。適当な製薬用担体の例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎのＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅに記載されている。賦形剤の例は、澱粉、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、白墨、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、感想スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を包含する。組成物はまたｐＨ干渉試薬および水和剤または乳化剤を含有できる。
経口投与のためには、医薬組成物は従来の手段で製造された錠剤またはカプセルの形態であることができる。組成物はなたシロップまたは懸濁液のような液体として製造できる。液体は懸濁剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水添食用油）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性のベヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）および保存料（例えばメチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を含有できる。製造にはフレーバー剤、着色料および甘味料を用いることができる。或は、組成物は水または他の適当なベヒクルで希釈再調製するための乾燥品として提示できる。
口内および舌下の投与のためには、組成物は、従来のプロトコルに従って、錠剤、ロゼンジ剤または急速溶解フィルムの形態であってよい。
吸入による投与のためには、本発明により使用するための化合物は、適当な高圧ガス、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の適当なガスを用いた加圧パックまたはネブライザー（例えばＰＢＳ中）からエアロゾルスプレーの形態で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合は、用量単位は計量された量を送達する弁を配備することにより測定できる。例えば吸入器または吸引器において使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物と適当な粉末基剤、例えば乳糖または澱粉の粉末混合物を含むように処方できる。
医薬組成物は単回注射による非経腸投与（即ち静脈内または筋肉内）のために製剤できる。注射用製剤は例えば保存料を添加しながらアンプルまたは多用量の容器内に、単位剤型として提示できる。組成物は油性または水性のベヒクル中の懸濁液、溶液または乳液としてエマルジョンのような形態をとることができ、そして、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤補助剤を含有する。或は、活性成分は安定なベヒクル、例えば発熱物質非含有水を用いて希釈再調製するための粉末形態であることができる。
医薬組成物はまた例えばカカオ脂または他のグリセリドのような従来の座剤基剤を含有する座剤または保持型浣腸のような直腸投与のために処方できる。
６．複合療法
本発明のキメラ蛋白は疾患または状態を治療するための他の知られた薬剤少なくとも１つと組み合わせて該疾患または状態を有する対象を治療するために使用できる。
１つの実施形態においては、本発明は、他の抗ＨＩＶ剤少なくとも１つと組み合わせて、第１および第２の鎖を含むキメラ蛋白少なくとも１つの治療有効量を投与することを含むＨＩＶに感染した対象の治療方法に関し、ここで、第１の鎖はＨＩＶ融合抑制剤および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、そして、第２の鎖は免疫グロブリンの少なくとも部分を含み、第１の鎖のＨＩＶ融合抑制剤は有さない。該他の抗ＨＩＶ剤は明らかにされた抗ＨＩＶ活性を有する何れかの治療薬であることができる。該他の抗ＨＩＶ剤は例えば、プロテアーゼ阻害剤（例えばＡｍｐｒｅｎａｖｉｒ（登録商標）、Ｃｒｉｘｉｖａｎ（登録商標）、Ｒｉｔｏｎｉｖｉｒ（登録商標））、逆転写酵素ヌクレオシド類縁体（例えばＡＺＴ、ＤＤＩ、Ｄ４Ｔ、３ＴＣ、Ｚｉａｇｅｎ（登録商標））、非ヌクレオシド類縁体逆転写酵素阻害剤（例えばＳｕｓｔｉｖａ（登録商標））、別のＨＩＶ融合抑制剤、ＨＩＶに特異的な中和抗体、ＣＤ４に特異的な抗体、ＣＤ４ミミック物質、例えばＣＤ４−ＩｇＧ２融合蛋白（米国特許出願０９／９１２，８２４）またはＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４に特異的な抗体、または、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４の特異的結合相手を包含する。
別の実施形態において、本発明は、別の凝固因子または止血を誘発する薬剤少なくとも１つと組み合わせて、第１および第２の鎖を含むキメラ蛋白少なくとも１つの治療有効量を投与することを含む止血障害を有する対象の治療方法に関し、ここで、第１の鎖は凝固因子少なくとも１つおよび免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、そして、第２の鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、第１の鎖の凝固因子は有さない。該他の凝固因子または止血を誘発する薬剤は明らかにされた凝固活性を有する何れかの治療薬であることができる。例えば凝固因子または止血剤は第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビンまたはフィブリノーゲンいまたはこれらの何れかの活性化された形態を包含する。止血剤の凝固因子はまた抗線溶剤、例えばイプシロン−アミノ−カプロン酸、トラネキサム酸を包含する。
７．標的細胞とのウィルスの融合を抑制する方法
本発明はまたキメラ蛋白少なくとも１つに哺乳類細胞を組み合わせることを含む哺乳類細胞とのＨＩＶの融合を抑制するインビトロの方法に関し、ここでキメラ蛋白は第１および第２の鎖を含み、ここで第１の鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分およびＨＩＶ抑制剤を含み、そして第２の鎖は免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、第１の鎖のＨＩＶ抑制剤を有さない。哺乳類細胞はＨＩＶの感染に対して感受性の何れかの細胞または細胞系統、例えば一時ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞またはマクロファージ、ＭＯＬＴ−４細胞、ＣＥＭ細胞、ＡＡ５細胞またはＨｅＬａ細胞のような細胞表面上にＣＤ４を発現するものを包含する。
Ｇ．キメラ蛋白の単離方法
典型的には、本発明のキメラ蛋白を生産する場合、それらは他の蛋白または蛋白フラグメントのような他の分子との混合物中に含有される。即ち本発明は、キメラ蛋白を含有する混合物から上記したキメラ蛋白のいずれかを単離する方法を提供する。本発明のキメラ蛋白は適当な条件下で染料リガンドに結合すること、および、結合後にこれらの状態を改変することにより染料リガンドとキメラ蛋白との間の結合を破壊できるということが明らかにされており、したがって、キメラ蛋白を単離する方法が提供される。一部の実施形態においては、混合物は単量体−二量体ハイブリッド、二量体および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分、例えばＦｃを含む。即ち、１つの実施形態において、本発明は単量体−二量体ハイブリッドの単離方法を提供する。別の実施形態においては、本発明は二量体の単離方法を提供する。
従って、１つの実施形態において本発明は、混合物から単量体−二量体ハイブリッドを単離する方法であって、混合物が下記成分：
ａ）第１および第２のポリペプチド鎖を含む単量体−二量体ハイブリッド、ここで第１の鎖は生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含み、そして第２の鎖は生物学的に活性な分子を有さない免疫グロブリン定常領域または免疫グロブリン可変領域の少なくとも部分を含むもの；
ｂ）第１および第２のポリペプチド鎖を含む二量体、ここで第１および第２の鎖は両方とも生物学的に活性な分子および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含むもの；
ｃ）免疫グロブリン定常領域の部分；
を含み；該方法は
１）単量体−二量体ハイブリッドおよび二量体の両方が固体支持体に連結した染料リガンドに結合するような適当な条件下に染料リガンドに混合物を接触させること；
２）免疫グロブリン定常領域の未結合の部分を序世すること：
３）単量体−二量体ハイブリッドおよび固体支持体に連結した染料リガンドの間の結合が破壊されるように１）の適当な条件を改変すること；
４）単量体−二量体ハイブリッドを単離すること；
を含む上記方法を提供する。一部の実施形態においては、染料リガンドに混合物を接触させる前に、混合物をプロテインＡセファロース等のようなクロマトグラフィー物質に接触させてよい。混合物は適切な溶離緩衝液（例えば低ｐＨ緩衝液）を用いてクロマトグラフィー物質から溶離させ、そして次に混合物を含有する溶出液を染料リガンドと接触させる。
染料リガンドに混合物を接触させる適当な条件は、適切なｐＨに混合物を維持するための緩衝液を含んでよい。適切なｐＨは３〜１０、４〜９、５〜８のｐＨを包含する。１つの実施形態において、適切なｐＨは８．０である。ｐＨを適切な範囲に維持できる限り、当該分野で知られた何れかの緩衝剤、例えばトリス、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳを使用してよい。適当な条件はまた、染料リガンドから未結合の物質種を溶出させるための洗浄緩衝液を含んでよい。例えば、線状緩衝液は接触工程で使用した緩衝液と同じものであることができる。
キメラ蛋白を染料リガンドに結合させた後、適当な条件を改変することによりキメラ蛋白を単離する。適当な条件の改変は緩衝液への塩の添加を含んでよい。ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの何れかの塩を使用してよい。塩は染料リガンドと所望の物質種、例えば単量体−二量体ハイブリッドとの間の結合を破壊するために十分高濃度で添加しなければならない。
一部の実施形態においては、混合物がＦｃ、単量体−二量体ハイブリッドおよび二量体を含む場合、Ｆｃは染料リガンドに結合せず、従って流出物と共に溶離することがわかっている。二量体は単量体−二量体ハイブリッドよりも強固に染料リガンドに結合する。即ち、染料リガンドと単量体−二量体ハイブリッドの間の結合を破壊するために必要な塩濃度と比較して、二量体と染料リガンドとの間の結合を破壊する（例えば溶出させる）ためにはより高濃度の塩が必要である。
一部の実施形態においては、、ＮａＣｌを用いて単量体−二量体ハイブリッドを混合物から単離してよい。一部の実施形態においては、染料リガンドと単量体−二量体ハイブリッドとの間の結合を破壊する塩の適切な濃度は２００〜７００ｍＭ、３００〜６００ｍＭ、４００〜５００ｍＭである。１つの実施形態においては、染料リガンドと単量体−二量体ハイブリッドとの間の結合を破壊するために必要なＮａＣｌの濃度は４００ｍＭである。
ＮａＣｌは混合物から二量体を単離するためにも使用してよい。典型的には、単量体−二量体ハイブリッドは二量体より前に混合物から単離される。二量体は緩衝液に適切な濃度の塩を添加して染料リガンドと二量体との間の結合を破壊することにより単離される。一部の実施形態においては、染料リガンドと二量体との間の結合を破壊する塩の適切な濃度は８００ｍＭ〜２Ｍ、９００ｍＭ〜１．５Ｍ、９５０ｍＭ〜１．２Ｍである。１つの実施形態において、１ＭＮａＣｌを用いて染料リガンドと二量体との間の結合を破壊する。
染料リガンドはバイオ模倣物であってよい。バイオ模倣物は自然物を模倣した人造の物質、装置または系である。即ち、一部の実施形態においては、染料リガンドは分子の天然にそんざいするリガンドを模倣している。染料リガンドはＭｉｍｅｔｉｃ Ｒｅｄ １ＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｒｅｄ ２ＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｏｒａｎｇｅ １ＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｏｒａｎｇｅ ２ＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｏｒａｎｇｅ ３ＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｙｅｌｌｏｗ １ＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｙｅｌｌｏｗ ２ＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ
Ｇｒｅｅｎ １ＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅ １ＴＭおよびＭｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅ ２ＴＭ（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）Ｉｎｃ．，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ）から選択してよい。１つの特定の実施形態においては、染料リガンドはＭｉｍｅｔｉｃ Ｒｅｄ ２ＴＭ（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）Ｉｎｃ．，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ）である。特定の実施形態においては、染料リガンドはＭｉｍｅｔｉｃ Ｒｅｄ １Ａ６ＸＬＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｒｅｄ ２Ａ６ＸＬＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｏｒａｎｇｅ １Ａ６ＸＬＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｏｒａｎｇｅ ２Ａ６ＸＬＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｏｒａｎｇｅ ３Ａ６ＸＬＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｙｅｌｌｏｗ
１Ａ６ＸＬＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｙｅｌｌｏｗ ２Ａ６ＸＬＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｇｒｅｅｎ １Ａ６ＸＬＴＭ、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅ １Ａ６ＸＬＴＭおよびＭｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅ ２Ａ６ＸＬＴＭ（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）Ｉｎｃ．，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ）から選択される固体支持体に連結される。
染料リガンドは固体支持体に連結してよい。固体支持体は当該分野で知られた何れかの固体支持体であってよい（例えばｗｗｗ．ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓＮＯＷ．ｃｏｍ参照）。固体支持体の例は、ビーズ、ゲル、膜、ナノ粒子またはマイクロスフェアを包含してよい。固体支持体は染料リガンドに連結できる何れかの物質（例えばアガロース、ポリスチレン、セファロース、セファデックス）を含んでよい。固体支持体は何れかの合成の有機重合体、例えばポリアクリル、ビニル重合体、アクリレート、ポリメタクリレートおよびポリアクリルアミドを含んでよい。固体支持体はまた、炭水化物重合体、例えばアガロース、セルロースまたはデキストランを含んでよい。固体支持体はまた向きの酸化物、例えばシリカ、ジルコニア、チタニア、セリア、アルミナ、マグネシア（即ち酸化マグネシウム）または酸化カルシウムを含んでよい。固体支持体はまたデキストラン−アクリルアミドのような上記した支持体の一部の組み合わせを含んでよい。
実施例１：分子量はＦｃＲｎ媒介トランスサイトーシスに影響する。
目的の種々の蛋白およびＩｇＧＦｃを含むキメラ蛋白を組み換え生産（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９））するか、または、コンタクチン−Ｆｃの場合は、ＭＡＢ−β−ｇａｌ（β−ｇａｌに結合したモノクローナル抗体の複合体）（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｃｏ，ＭＥ）およびＭＡＢ−ＧＨ（モノクローナル抗体と成長ホルモンの複合体）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）を購入した。慨すれば、目的の蛋白をコードする遺伝子をＰＣＲによりクローニングし、次にＦｃ融合発現プラスミド内にサブクローニングした。プラスミドをＤＧ４４ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、安定なトランスフェクション体を選択し、メトトレキセートで増幅した。キメラ蛋白ホモ二量体はプロテインＡカラム上で精製した。試験した蛋白にはインターフェロンα、成長ホルモン、エリスロポエチン、卵胞刺激ホルモン、第ＩＸ因子、ベータ−ガラクトシダーゼ、コンタクチンおよび第ＶＩＩＩ因子であった包含した。免疫グロブリンの部分、例えばＦｃＲｎ受容体結合相手への蛋白の連結、または、市販の全抗体（ＦｃＲｎ結合領域を含む）−抗原複合体の使用により、分子量の関数としてのトランスサイトーシスの検査が可能となった（米国特許６，０３０，６１３参照）。キメラ蛋白をラットに経口投与し、血清中濃度を投与後２〜４時間に渡り、組み換え生産されたキメラ蛋白についてＥＬＩＳＡにより、そして市販の抗体複合体およびキメラ蛋白についてはウエスタンブロットとＥＬＩＳＡの両方により測定した。更に、全ての市販品の蛋白または複合体並びに第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃ、第ＩＸ因子−ＦｃおよびＥｐｏ−Ｆｃの対照群をＩＯＤＯビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｅ，ＰＡ）を用いてヨウ素化した。結果はラットに経口投与されたＦｃおよびモノクローナル抗体キメラ蛋白の血清中濃度が蛋白の大きさに直接関係していることを示していた。経口投与Ｆｃキメラ蛋白の見かけのカットオフ点は２００〜２８５ｋＤである（表２）。
Figure 2012067142
実施例２：ｐｃＤＮＡ３．１−Ｆｌａｇ−Ｆｃのクローニング
蛋白の識別または精製に使用されている一般的なアフィニティータグであるＦｌａｇペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）の配列をマウスＩｇκシグナル配列とその後のヒトＩｇＧ１Ｆｃフラグメント（アミノ酸２２１〜４４７、ＥＵナンバリング）を含有するｐｃＤＮＡ３．１−Ｆｃプラスミド内にクローニングした。コンストラクトは以下のプライマーを使用しながらオーバーラッピングＰＣＲにより創生した。
Figure 2012067142
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Figure 2012067142
Figure 2012067142
次にｐｃＤＮＡ３．１−Ｆｃ鋳型を、以下のサイクル、即ち９５℃２分；（９５℃３０秒、５２℃３０秒、７２℃４５秒）を３０サイクル、その後７２℃１０分を用いながら、ＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中、製造元の標準的プロトコルに従ってＰｆｕＵｌｔｒａＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）を用いながら、５０μｌの反応液中プライマー対ＦｌａｇＦｃ−Ｆ１／Ｒ１またはＦｌａｇＦｃ−Ｆ２／Ｒ２の各々５０ｐｍｏｌを含有する２つの個別のＰＣＲ反応液に添加した。次にこれらの２反応の生成物を、以下のサイクル、即ち９５℃２分；（９５℃３０秒、５２℃３０秒、７２℃４５秒）を３０サイクル、その後７２℃１０分を用いながら、ＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中、製造元の標準的プロトコルに従ってＰｆｕＵｌｔｒａＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）を用いながら、５０μｌの反応液中ＦｌａｇＦｃ−Ｆ１およびＦｌａｇＦｃ−Ｒ２プライマーの５０ｐｍｏｌ用いて別のＰＣＲ反応（各々２μｌ）中で混合した。得られたフラグメントをゲル精製し、消化し、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦｃプラスミドのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩに挿入した。得られたプラスミドはＦｌａｇＦｃ蛋白を生産するマウスＩｇκシグナル配列を含んでいる。
実施例３：第ＶＩＩ因子−Ｆｃコンストラクトのクローニング
第ＶＩＩ因子のコーディング配列はヒト胎児肝ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）からＲＴ−ＰＣＲにより得られた。クローニングされた領域は終止コドンの直前で終わるｂｐ３６〜ｂｐ１４３０のｃＤＮＡ配列を含んでいる。ＳｂｆＩ部位をＮ末端上に導入した。ＢｓｐＥＩ部位をＣ末端上に導入した。コンストラクトは以下のプライマー：
Figure 2012067142
Figure 2012067142
および以下の条件、即ち９５℃５分、その後、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分４５秒を３０サイクル、そして７２℃１０分の最終伸長サイクルを用いながらＰＣＲによりクローニングした。
フラグメントはＳｂｆＩ−ＢｓｐＥＩで消化し、ＩｇＧ１のＦｃフラグメントをコードするｐＥＤ．ｄＣ−Ｆｃプラスミドに挿入した。
実施例４：第ＩＸ因子−Ｆｃコンストラクトのクローニング
プレプロペプチド配列を含むヒト第ＩＸ因子コーディング配列は、以下のプライマーを用いて成人肝ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得られた。
Figure 2012067142
Figure 2012067142
成人肝ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）２０ｎｇおよび各プライマー２５ｐｍｏｌを、製造元のプロトコルに従って、ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ＴａｑシステムによるＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＯｎｅ−ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いたＲＴ−ＰＣＲ反応液に添加した。反応は以下のサイクル、即ち５０℃３０分；９４℃２分；（９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃１分）を３５サイクル、そして最終７２℃１０分を用いながら、ＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中で実施した。フラグメントをＱｉａｇｅｎＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製し、そして、ｐＥＤ．ｄＣ．ＸＦｃプラスミドの相当する消化物にクローニングした。
実施例５：ＰＡＣＥコンストラクトのクローニング
エンドプロテアーゼであるヒトＰＡＣＥ（対塩基性アミノ酸切断酵素）をＲＴ−ＰＣＲにより得た。以下のプライマーを使用した。
Figure 2012067142
Figure 2012067142
Figure 2012067142
Figure 2012067142
ＰＡＣＥ−Ｆ１プライマーは開始コドンの前３ヌクレオチドで始まるＰＡＣＥ配列の５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加し、ＰＡＣＥ−Ｒ２プライマーはＰＡＣＥの細胞外ドメインの末端に存在するアミノ酸７１５の後に終止コドンを付加し、また、終止コドンの３’末端にＥｃｏＲＩ部位を付加する。ＰＡＣＥ−Ｒ１およびＦ２プライマーはそれぞれ内部ＢａｍＨＩ部位の３’および５’側にアニーリングする。次に製造元のプロトコルに従って、ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ＴａｑシステムによるＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＯｎｅ−ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いたＲＴ−ＰＣＲ反応液５０μ中、成人肝ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）２０ｎｇと共にプライマー対ＰＡＣＥ−Ｆ１／Ｒ１またはＰＡＣＥ−Ｆ２／Ｒ２の各々２５ｐｍｏｌを用いて２つのＲＴ−ＰＣＲ反応を設定した。反応は以下のサイクル、即ち５０℃３０分；９４℃２分；（９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃２分）を３０サイクル、その後７２℃１０分を用いながら、ＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中で実施した。これらのフラグメントを各々ベクターｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内にライゲーションした。次にＦ２−Ｒ２フラグメントをＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位を用いてｐｃＤＮＡ６Ｖ５／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングし、そして次にＦ１−Ｒ１フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位を用いてこのコンストラクトにクローニングした。最終プラスミドであるｐｃＤＮＡ６−ＰＡＣＥは膜貫通領域が欠失しているため、ＰＡＣＥ（アミノ酸１〜７１５）の可溶性形態を生産する。ｐｃＤＮＡ６−ＰＡＣＥ内のＰＡＣＥの配列は本質的にＨａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３５：４に記載されている。
実施例６：ＩＦＮα−Ｆｃ８アミノ酸リンカーコンストラクトのクローニング
シグナル配列を含むヒトインターフェロンα２ｂ（ｈＩＦＮα）配列は以下のプライマー：
Figure 2012067142
Figure 2012067142
を用いてヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲにより得た。
ゲノムＤＮＡは標準的な方法に従って３７３ＭＧヒト星状細胞腫の細胞系統から製造した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。慨すれば約２ｘ１０５個の細胞を遠心分離によりペレット化し、リン酸塩緩衝食塩水ｐＨ７．４に再懸濁し、次に等量の溶解緩衝液（１００ｍＭトリスｐＨ８．０／２００ｍＭＮａＣｌ／２％ＳＤＳ／５ｍＭＥＤＴＡ）と混合した。プロテイナーゼＫを終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加し、試料を度々穏やかに混合しながら４時間３７℃で消化した。次に試料をフェノール：クロロホルムで２回抽出し、酢酸ナトリウムｐＨ７．０を１００ｍＭとなるまで、そして等量のイソプロパノールを添加することによりＤＮＡを沈殿させ、そして室温で１０分間遠心分離することによりペレット化した。上澄みを除去し、ペレットを冷７０％エタノールで１回洗浄し、そして風乾した後にＴＥ（１０ｍＭトリスｐＨ８．０／１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁した。
このゲノムＤＮＡ１００ｎｇを次に、以下のサイクル、即ち９４℃２分；（９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃４５秒）を３０サイクル、そして最終７２℃１０分を用いながら、ＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中、製造元の標準的プロトコルに従ってＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて各プライマー２５ｐｍｏｌを用いた２５μｌのＰＣＲ反応において使用した。予測されたサイズのバンド（〜５５０ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、再度ゲル精製し、そしてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域が後続する８アミノ酸リンカー（ＥＦＡＧＡＡＡＶ）を含むｐＥＤ．ｄＣ．ＸＦｃのＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
実施例７：ＩＦＮαＦｃΔリンカーコンストラクトのクローニング
次にプライマーＩＦＮａ−Ｓｉｇ−Ｆおよび以下のプライマー：
Figure 2012067142
の各々２５ｐｍｏｌを用いて２５μｌＰＣＲ中で鋳型として実施例６の精製ｐＥＤ．ｄＣ．ネイティブヒトＩＦＮαＦｃＤＮＡ１μｇを用いた。
ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間変性し、その後９５℃１５秒、５５℃０秒および７２℃１分を傾き６で１８サイクル、その後７２℃で１０分間、ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳａｌｔＬａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）中、製造元の標準的プロトコルに従って、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて実施した。正確なサイズ（〜５２５ｂｐ）のＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ＰｓｔＩおよびＢｓｐＥＩで消化し、ゲル精製し、そして、Ｆｃ領域のアミノ酸２３１〜２３３が遺伝子コードの縮重を用いて改変され、ＢｓｐＥＩ部位は取り込まれているが野生型アミノ酸配列が維持されている修飾されたｐＥＤ．ｄＣ．ＸＦｃプラスミドの相当する部位にサブクローニングした。
実施例８：ＩＦＮαＦｃＧＳ１５リンカーコンストラクトのクローニング
新しい骨格ベクターは、Δリンカーコンストラクト（アミノ酸配列を維持するように遺伝子コードの縮重を用いて５’末端にＢｓｐＥＩおよびＲｓｒＩＩを含むようにしたもの）中に存在するＦｃを用いながら、下記のプライマーを使用するＰＣＲ反応用の鋳型としてこのＤＮＡを用いて創生した。
Figure 2012067142
Figure 2012067142
ＰＣＲ反応は以下の方法、即ち９５℃２分；（９５℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃２分）を３０サイクル、７２℃１０分を用いながら、ＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中、製造元の標準的プロトコルに従ってＰｆｕＴｕｒｂｏ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いながら、各プライマー２５ｐｍｏｌを用いて実施した。予測されたサイズのバンド（〜７３０ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで消化し、再度ゲル精製し、そしてＮｏｔＩ／ＸｂａＩ部位に挿入されたＩＲＥＳ配列およびｄｈｆｔ遺伝子を有するｐｃＤＮＡ６の型であるｐｃＤＮＡ６ＩＤのＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ消化ベクターにクローニングした。
次に、以下のプライマーを用いた２５μｌＰＣＲ反応において精製ｐＥＤ．ｄＣ．ネイティブヒトＩＦＮαＦｃＤＮＡ５００ｎｇを鋳型として使用した。
Figure 2012067142
Figure 2012067142
ＰＣＲ反応は、以下のサイクル、即ち９５℃２分；（９４℃３０秒、４８℃３０秒、７２℃１分）を１４サイクル、そして７２℃１０分を用いながら、ＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中、製造元の標準的プロトコルに従ってＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて各プライマー２５ｐｍｏｌを用いて行った。予測されたサイズのバンド（〜６００ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、再度ゲル精製し、上記したｐｃＤＮＡ６ＩＤ／ＦｃベクターのＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ部位内にクローニングし、１０アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（２ｘＧＧＧＧＳ）を有するＩＦＮαＦｃ融合体、ｐｃＤＮＡ６ＩＤ／ＩＦＮα−ＧＳ１０−Ｆｃを創生した。
次にこのｐｃＤＮＡ６ＩＤ／ＩＦＮα−ＧＳ１０−Ｆｃ５００ｎｇを以下のプライマーと共に使用してＰＣＲ反応を実施した。
Figure 2012067142
Figure 2012067142
Figure 2012067142
ＰＣＲ反応は、以下のサイクル、即ち９５℃２分；（９４℃３０秒、４８℃３０秒、７２℃１分）を１４サイクル、そして７２℃１０分を用いながら、ＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中、製造元の標準的プロトコルに従ってＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて各プライマー２５ｐｍｏｌを用いて行った。予測されたサイズのバンド（５０４ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ＢａｍＨＩ／ＢｓｐＥＩで消化し、６８ｂｐバンドをゲル精製し、上記したｐｃＤＮＡ６ＩＤ／ＩＦＮα−ＧＳ１０−ＦｃベクターのＢａｍＨＩ／ＢｓｐＥＩ部位内にクローニングし、１５アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（３ｘＧＧＧＧＳ）を有するＩＦＮαＦｃ融合体、ｐｃＤＮＡ６ＩＤ／ＩＦＮα−ＧＳ１５−Ｆｃを創生した。
実施例９：塩基性ペプチドコンストラクトのクローニング
アミノ酸２２１〜２２９（ＥＵナンバリング）由来のヒトＩｇＧ１Ｆｃフラグメントのヒンジ領域を塩基性ペプチド（ＣＣＢ）と置き換えた。４種のオーバラッピングオリゴを使用した（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）：
１．ＣＣＢ−Ｆｃセンス１：
Figure 2012067142
２．ＣＣＢ−Ｆｃセンス２：
Figure 2012067142
３．ＣＣＢ−Ｆｃアンチセンス１：
Figure 2012067142
４．ＣＣＢ−Ｆｃアンチセンス２：
Figure 2012067142
オリゴをｄＨ２Ｏで５０μＭの濃度に希釈再調製した。薄壁ＰＣＲ試験管内で制限緩衝液＃２（即ち終濃度で１０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．９、１０ｍＭＭｇＣｌ２、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトール）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）２．２μｌと混合するより各オリゴ５μｌを相互にアニーリングし、そして３０秒間９５℃に加熱し、次に２５℃まで２時間緩徐に冷却することによりアニーリングさせた。この時点でアニーリングしたオリゴ５ｐｍｏｌをキットマニュアルに記載の通りｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクター内にライゲーションした（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。ライゲーション混合物を２分間氷上でＤＨ５αコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５０μｌに添加し、５分間３７℃でインキュベートし、２分間氷上でインキュベートし、次にＬＢ＋１００μｇ／Ｌアンピシリン寒天プレート上にプレーティングし、１４時間３７℃においた。個々の細菌コロニーを釣菌し、ＬＢ＋１００μｇ／Ｌアンピシリン５ｍｌ中に入れ、１４時間生育させた。試験管を２０００ｘｇ、４℃で１５分間遠沈させ、ベクターＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてキットマニュアルに記載の通り単離した。ＤＮＡ２μｇをＮｏｇＭＩＶ−Ｒｓｒ−ＩＩで消化した。フラグメントをＱｉａｑｕｉｃｋ法（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によりキットマニュアルに記載の通り精製し、ＮｇｏＭＩＶ／ＲｓｒＩＩを用いてｐＥＤ．ｄｃＥｐｏＦｃにライゲーションした。ライゲーションはＤＨ５αコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターに関して記載した通りＤＮＡを製造した。実施例１０：エリスロポエチン−酸性ペプチドＦｃコンストラクトのクローニング
アミノ酸２２１〜２２９（ＥＵナンバリング）由来のＥＰＯ−ＦｃにおけるヒトＩｇＧ１Ｆｃフラグメントのヒンジ領域を酸性ペプチド（ＣＣＡ）と置き換えた。４種のオーバラッピングオリゴを使用した（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）：
１．Ｅｐｏ−ＣＣＡ−Ｆｃセンス１：
Figure 2012067142
２．Ｅｐｏ−ＣＣＡ−Ｆｃセンス２：
Figure 2012067142
３．Ｅｐｏ−ＣＣＡ−Ｆｃアンチセンス１：
Figure 2012067142
４．Ｅｐｏ−ＣＣＡ−Ｆｃアンチセンス２：
Figure 2012067142
オリゴをｄＨ２Ｏで５０μＭの濃度に希釈再調製した。薄壁ＰＣＲ試験管内で制限緩衝液Ｎｏ．２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）２．２μｌと混合するより各オリゴ５μｌを相互にアニーリングし、そして３０秒間９５℃に加熱し、次に２５℃まで２時間緩徐に冷却した。この時点でアニーリングしたオリゴ５ｐｍｏｌをキットマニュアルに記載の通りｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクター内にライゲーションした（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。ライゲーション混合物を２分間氷上でＤＨ５αコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５０μｌに添加し、５分間３７℃でインキュベートし、２分間氷上でインキュベートし、次にＬＢ＋１００μｇ／Ｌアンピシリン寒天プレート上にプレーティングし、１４時間３７℃においた。個々の細菌コロニーを釣菌し、ＬＢ＋１００μｇ／Ｌアンピシリン５ｍｌ中に入れ、１４時間生育させた。試験管を２０００ｘｇ、４℃で１５分間遠沈させ、ベクターＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてキットマニュアルに記載の通り調製した。ＤＮＡ２μｇをＡｇｅＩ−Ｒｓｒ−ＩＩで消化した。フラグメントをＱｉａｑｕｉｃｋ法（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によりキットマニュアルに記載の通り精製し、ｐＥＤ．ＥｐｏＦｃ１ＡｇｅＩ−ＲｓｒＩＩにライゲーションした。ライゲーションはＤＨ５αコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、上記した通りＤＮＡを製造した。
実施例１１：Ｃｙｓ−Ｆｃコンストラクトのクローニング
ＰＣＲおよび標準的な分子生物学の手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を用いながら、ヒトＩＦＮαシグナルペプチドのコーディング配列が第１のシステイン残基（Ｃｙｓ２２６，ＥＵナンバリング）で始まるＦｃのコーディング配列に対して直接隣接するように、哺乳類発現コンストラクトを作成した。シグナルペプチダーゼ切断および哺乳類細胞からの分泌により、Ｎ末端システイン残基を有するＦｃ蛋白を作成した。慨すれば、以下のプライマー：
ＩＦＮａ−Ｓｉｇ−Ｆ（ＩＦＮａ−Ｓｉｇ−Ｆ：５‘−ＧＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＡＣ−３’）（配列番号７１）およびＣｙｓ−Ｆｃ−Ｒ（５’−ＣＡＧＴＴＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＣＧＧＡＧＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧ−３’）（配列番号７２）をＰＣＲ反応において使用することにより、Ｃｙｓ２２６で始まるＦｃのＮ末端にＩＦＮαシグナル配列を連結したフラグメントを創生した。ｐＥＤ．ｄＣ．ネイティブｈＩＦＮαΔリンカー５００ｎｇを製造元の標準的プロトコルに従ってＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いたＰＣＲ反応において各プライマー２５ｐｍｏｌに添加した。反応は以下のサイクル、９４℃２分；（９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃４５秒）を３０サイクル、そして最終７２℃１０分を用いながら、ＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中で実施した。予測されたサイズのバンド（〜１１２ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ＰｓｔＩおよびＢｓｐＥＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、ｐＥＤ．ｄＣ．ネイティブｈＩＦＮαΔリンカー野相当する部位にサブクローニングしてｐＥＤ．ｄＣ．Ｃｙｓ−Ｆｃを作成した（図５）。
実施例１２：蛋白発現およびＦｃ−ＭＥＳＮＡの製造
Ｆｃのコーディング配列（ヒトＩｇＧ１の定常領域）をＦｃコーディング配列Ｎｄｅｌ／ＳａｐＩをサブクローニングするための製造元の推奨する操作用に従って標準的な条件および試薬を用いながら、Ｆｃ含有プラスミドからのＰＣＲ増幅により得た。慨すればプライマー５’−ＧＴＧＧＴＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＴＧｃＧＧＴＣＧ−３’（配列番号７３）および５’−ＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴＴＣＴＧＣＧ−３’（配列番号７４）を用いて、９５℃２分、ついで９５℃０秒、５５℃０秒、および７２℃１分を傾き４で１８サイクル、その後７２℃の伸長を１０分間で変性しながら、ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳａｌｔＬａｋｅ
Ｃｉｔｙ，ＵＴ）中、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｂａｓｅｌ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてプラスミドｐＥＤ．ｄＣ．Ｅｐｏ−Ｆｃ５００ｎｇからＦｃ配列を増幅した。ＰＣＲ産物を中間クローニングベクターにサブクローニングして配列決定し、次に標準的な操作法であるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに従ってｐＴＷＩＮ１ベクターのＮｄｅＩおよびＳａｐＩ部位を用いてサブクローニングした。このプラスミドを次に標準的な操作法を用いてＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換した。細胞培養物１Ｌを３７℃で０．８ＡＵの吸光度値となるまで生育させ、１ｍＭイソプロピルベータ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドで誘導し、２５℃で一夜生育させた。細胞を遠心分離によりペレット化し、２０ｍＭトリス８．８／１％ＮＰ４０／０．１ｍＭフェニルメタンスルホニルフロリド／１μｇ／ｍｌベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中で溶解し、そして、４℃で一夜キチンビーズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に結合させた。次にビーズを数カラム容量の２０ｍＭトリス８．５／５００ｍＭＮａＣｌ／１ｍＭＥＤＴＡで洗浄し、次に−８０℃で保存した。精製Ｆｃ−ＭＥＳＮＡは２０ｍＭトリス８．５／５００ｍＭＮａＣｌ／１ｍＭＥＤＴＡ／５００ｍＭ２−メルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳＮＡ）中でビーズから蛋白を溶出することにより生成させ、そして溶離液を以下のカップリング反応に直接使用した。実施例１３：第ＶＩＩ因子−Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドの発現および精製
第ＶＩＩ因子−Ｆｃを発現するＣＨＯＤＧ−４４細胞を樹立した。ＣＨＯＤＧ−４４細胞はヌクレオシド、リボヌクレオシドおよび５％熱不活性化ウシ胎児血清添加のＭＥＭ Ａｌｐｈａ中、トランスフェクションまで３７℃、５％ＣＯ２下に生育させた。
ＤＧ４４細胞を１００ｍｍの組織培養ペトリ皿にプレーティングし、５０〜６０％コンフルエントとなるまで生育させた。合計１０μｇのＤＮＡを使用して１個の１００ｍｍ皿、即ち７．５μｇのｐＥＤ．ｄＣ．ＦＶＩＩ−Ｆｃ＋１．５μｇのｐｃＤＮＡ３／Ｆｌａｇ−Ｆｃ＋１μｇのｐｃＤＮＡ６−ＰＡＣＥをトランスフェクトした。細胞はＳｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬マニュアル（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に記載されるとおりトランスフェクトした。４８時間後トランスフェクションから培地を除去し、５％透析ウシ胎児血清および１０μｇ／ｍｌのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および０．２ｍｇ／ｍｌゲネチシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加したヌクレオシドを含有しないＭＥＭＡｌｐｈａに交換した。１０日後、０．２５％トリプシンを用いて細胞をプレートから遊離させ、Ｔ２５組織培養フラスコに移し、安定な細胞系統が樹立されるに従い細胞が良好に成育し始めるまで１０〜１４日間選択を継続した。蛋白の発現はその後２５ｎＭメトトレキセートを添加することにより増幅した。
約２ｘ１０７細胞を用いて５μｇ／ｍｌのビタミンＫ３（メナジオン重亜硫酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した１７００ｃｍ２ローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中の生育培地３００ｍｌ接種した。ローラーボトルは７２時間３７℃で５％ＣＯ２中にインキュベートした。次に生育培地を５μｇ／ＬのビタミンＫ３を添加した血清非含有生産培地（５μｇ／ｍｌウシインスリンおよび１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２）３００ｍｌと交換した。生産培地（コンディショニングされた培地）を１０日間に渡り毎日採取し、４℃で保存した。各採取の後にローラーボトルには新しい生産培地を添加し、ボトルをインキュベーターに戻した。合わせた培地をまずＳａｒｔｏｃｌｅａｎガラス繊維フィルター（３．０μｍ＋０．２μｍ）（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ Ｃｏｒｐ．Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ついでＡｃｒｏｐａｃｋ５００フィルター（０．８μｍ＋０．２μｍ）（Ｐａｌｌ ＣＯｒｐ。、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）で清浄化した。清浄化した培地を次にＰｅｌｌｉｃｏｎ Ｂｉｏｍａｘタンジェンシャルフロー濾過カセット（１０ｋＤａＭＷＣＯ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて約２０倍となるまで濃縮した。
次にプロテインＡセファロース４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｃｏｌｕｍｎ（ＡＰ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を通過させることにより濃縮された培地からＦｃキメラを捕獲した。５ｘ５ｃｍ（１００ｍｌ）カラムに１００ｃｍ／時の一次流量でカラム容量ｍｌ当たり≦５ｍのＦｃ蛋白をロードすることにより≧３分の滞留時間を得た。次にカラムを＞５カラム容量の１ｘＤＰＢＳで洗浄することにより非特異的結合の蛋白を除去した。結合蛋白は１００ｍＭグリシンｐＨ３．０で溶出させた。次に蛋白ピークを含有する溶出画分を、１０部の溶出画分当たり１部の１Ｍトリス塩酸ｐＨ８を添加することにより、中和した。
ＦＬＡＧ−Ｆｃホモ二量体（即ち両方のＦｃ分子との融合として発現されたＦＬＡＧペプチドを有するキメラＦｃ二量体）を調製物から除去するために、プロテインＡセファロース４Ｆａｓｔ ＦｌｏｗのプールをＵｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｓカチオン交換カラム（ＢｉｏＲａｄ Ｃｏｒｐ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を通過させた。カラムの操作条件下において、ＦＬＡＧ−Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドは未変化（ＦＬＡＧ−Ｆｃ理論値ｐＩ＝６．１９）であり、カラムを通過するのに対し、ｈＦＶＩＩ−Ｆｃコンストラクトは正荷電しており、従ってカラムに結合し、より高いイオン強度で溶出する、プロテインＡセファロース４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのプールをまず２０ｍＭＭＥＳ、２０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．１に透析した。次に透析した物質を１５０ｃｍ／時で１．１ｘ１１ｃｍ（９．９ｍｌ）カラムにロードした。洗浄および溶出の間、流量を５００ｃｍ／時に増大させた。カラムを順次８カラム容量の２０ｍＭＭＥＳ、２０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．１および８カラム容量の２０ｍＭＭＥＳ、４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．１で洗浄した。結合した蛋白を２０ｍＭＭＥＳ、７５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．１で溶離した。蛋白ピークを含有する溶出した画分を合わせ、０．２μｍフィルターディスクを通して滅菌濾過した後、−８０℃で保存した。
抗ＦＬＡＧＭＡＢアフィニティーカラムを用いて、両方のＦｃ分子の融合したｈＦＶＩＩを有するキメラＦｃ二量体を１つのＦＬＡＧペプチドおよび１つのｈＦＶＩＩ融合物を有するものから分離した。Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｓ溶出液を合わせたものを２０ｍＭトリス、５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ８で１：１希釈し、そして６０ｃｍ／時の一次流量で１．６ｘ５ｃｍＭ２抗ＦＬＡＧセファロースカラム（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上にロードした。ローディングは＜２．５ｍｇの単量体−二量体ハイブリッド／ｍｌカラム容量を目標とした。ローディングの後、５カラム容量の２０ｍＭトリス、５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ８．０でカラムを洗浄し、次に単量体−二量体ハイブリッドを１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出させた。次に蛋白ピークを含有する溶出画分を１０部の溶出画分当たり１部の１Ｍトリス塩酸ｐＨ８を添加することにより、中和した。プール物は−８０℃で保存した。
実施例１４：第ＩＸ因子−Ｆｃホモ二量体および単量体−二量体ハイブリッドの発現および精製
第ＩＸ因子−Ｆｃを発現するＣＨＯＤＧ−４４細胞を樹立した。ＤＧ４４細胞を１００ｍｍの組織培養ペトリ皿にプレーティングし、５０〜６０％コンフルエントとなるまで生育させた。合計１０μｇのＤＮＡを使用して１個の１００ｍｍ皿、即ち、ホモ二量体のトランスフェクションについては８μｇのｐＥＤ．ｄＣ．第ＩＸ因子−Ｆｃ＋２μｇのｐｃＤＮＡ６−ＰＡＣＥを使用し；単量体−二量体ハイブリッドのトランスフェクションについては、８μｇのｐＥＤ．ｄＣ．第ＩＸ因子−Ｆｃ＋１μｇのｐｃＤＮＡ３−ＦｌａｇＦｃ＋１μｇのｐｃＤＮＡ６−ＰＡＣＥを使用した。細胞はＳｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬マニュアル（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に記載されるとおりトランスフェクトした。４８時間後トランスフェクションから培地を除去し、両方のトランスフェクションに対しては５％透析ウシ胎児血清および１０μｇ／ｍｌのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加したヌクレオシドを含有しないＭＥＭＡｌｐｈａに交換し、単量体−二量体ハイブリッドトランスフェクションでは更に０．２ｍｇ／ｍｌゲネチシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加した。３日後、０．２５％トリプシンを用いて細胞をプレートから遊離させ、Ｔ２５組織培養フラスコに移し、安定な細胞系統が樹立されるに従い細胞が良好に成育し始めるまで１０〜１４日間選択を継続した。蛋白の発現はその後、ホモ二量体または単量体−二量体ハイブリッドに対してそれぞれ１０ｎＭまたは１００ｎＭメトトレキセートを添加することにより増幅した。
両方の細胞系統に対し、約２ｘ１０７細胞を用いて５μｇ／ｍｌのビタミンＫ３（メナジオン重亜硫酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した１７００ｃｍ２ローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中の生育培地３００ｍｌ接種した。ローラーボトルは７２時間３７℃で５％ＣＯ２中にインキュベートした。次に生育培地を５μｇ／ＬのビタミンＫ３を添加した血清非含有生産培地（５μｇ／ｍｌウシインスリンおよび１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２）３００ｍｌと交換した。生産培地（コンディショニングされた培地）を１０日間に渡り毎日採取し、４℃で保存した。各採取の後にローラーボトルには新しい生産培地を添加し、ボトルをインキュベーターに戻した。クロマトグラフィーの前に、ＳｕｐｅｒＣａｐ−１００（０．８／０．２μｍ）フィルター（Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて培地を清浄化した。以下の全ての工程は４℃で実施した。清浄化した培地をプロテインＡセファロースに適用し、５カラム容量の１ｘＰＢＳ（１０ｍＭホスフェート、ｐＨ７．４、２．７ｍＭＫＣｌおよび１３７ｍＭＮａＣｌ）で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶離し、次に１／１０容量の１Ｍトリス塩酸、ｐＨ９．０を用いて中和した。次に蛋白をＰＢＳ中に透析した。
単量体−二量体ハイブリッドトランスフェクション蛋白試料は、それがＦＩＸ−Ｆｃ：ＦＩＸ−Ｆｃホモ二量体、ＦＩＸ−Ｆｃ：Ｆｌａｇ−Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドおよびＦｌａｇ−Ｆｃ：Ｆｌａｇ−Ｆｃホモ二量体の混合物を含有していたため、更に精製した。物質を濃縮し、流量４ｍｌ／分（３６ｃｍ／時）で２．６ｘ６０ｃｍ（３１８ｍｌ）のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅカラムに適用し、次に３カラム容量の１ｘＰＢＳで溶離した。ＵＶ検出器で２つのピークに相当する画分を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。第１のピークの画分はＦＩＸ−Ｆｃ：ＦＩＸ−Ｆｃホモ二量体またはＦＩＸ−Ｆｃ：Ｆｌａｇ−Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドのいずれかを含有し、第２のピークはＦｌａｇ−Ｆｃ：Ｆｌａｇ−Ｆｃホモ二量体を含有していた。単量体−二量体ハイブリッドを含有するがＦｌａｇＦｃホモ二量体は含有しない画分全てを合わせ、６０ｃｍ／時の一次流量で１．６ｘ５ｃｍＭ２抗ＦＬＡＧセファロースカラム（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上に直接適用した。ローディングの後、５カラム容量のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に単量体−二量体ハイブリッドを１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出させた。次に蛋白ピークを含有する溶出画分を１／１０容量の１Ｍトリス塩酸を添加して中和し、還元型および非還元型のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。画分はＰＢＳ中に透析し、１〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、−８０℃で保存した。
実施例１５：ＩＦＮαホモ二量体および単量体−二量体ハイブリッドの発現および精製
ＩＦＮαを発現するＣＨＯＤＧ−４４細胞を樹立した。ＤＧ４４細胞を１００ｍｍの組織培養ペトリ皿にプレーティングし、５０〜６０％コンフルエントとなるまで生育させた。合計１０μｇのＤＮＡを使用して１個の１００ｍｍ皿、即ち、ホモ二量体のトランスフェクションについては１０μｇのｈＩＦＮαＦｃコンストラクト；単量体−二量体ハイブリッドのトランスフェクションについては、８μｇのｈＩＦＮαＦｃコンストラクト＋２μｇのｐｃＤＮＡ３−ＦｌａｇＦｃを使用した。細胞はＳｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬マニュアル（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に記載されるとおりトランスフェクトした。４８時間後トランスフェクションから培地を除去し、５％透析ウシ胎児血清を添加したヌクレオシドを含有しないＭＥＭＡｌｐｈａに交換し、単量体−二量体ハイブリッドトランスフェクションでは更に０．２ｍｇ／ｍｌゲネチシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加した。３日後、０．２５％トリプシンを用いて細胞をプレートから遊離させ、Ｔ２５組織培養フラスコに移し、安定な細胞系統が樹立されるに従い細胞が良好に成育し始めるまで１０〜１４日間選択を継続した。蛋白の発現はその後、１０〜５０ｎＭメトトレキセートを添加することにより増幅した。
全ての細胞系統に対し、約２ｘ１０７細胞を用いて１７００ｃｍ２ローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中の生育培地３００ｍｌ接種した。ローラーボトルは７２時間３７℃で５％ＣＯ２中にインキュベートした。次に生育培地を血清非含有生産培地（５μｇ／ｍｌウシインスリンおよび１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２）３００ｍｌと交換した。生産培地（コンディショニングされた培地）を１０日間に渡り毎日採取し、４℃で保存した。各採取の後にローラーボトルには新しい生産培地を添加し、ボトルをインキュベーターに戻した。クロマトグラフィーの前に、Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）製のＳｕｐｅｒＣａｐ−１００（０．８／０．２μｍ）フィルターを用いて培地を清浄化した。以下の全ての工程は４℃で実施した。清浄化した培地をプロテインＡセファロースに適用し、５カラム容量の１ｘＰＢＳ（１０ｍＭホスフェート、ｐＨ７．４、２．７ｍＭＫＣｌおよび１３７ｍＭＮａＣｌ）で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶離し、次に１／１０容量の１Ｍトリス塩酸、ｐＨ９．０を用いて中和した。次に蛋白をＰＢＳ中に透析した。
単量体−二量体ハイブリッドトランスフェクション蛋白試料は、それがＩＦＮαＦｃ：ＩＦＮαＦｃホモ二量体、ＩＦＮαＦｃ：Ｆｌａｇ−Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドおよびＦｌａｇ−Ｆｃ：Ｆｌａｇ−Ｆｃホモ二量体（または△リンカー、あるいはＧＳ１５リンカー）の混合物を含有していたため、更に精製した。物質を濃縮し、流量４ｍｌ／分（３６ｃｍ／時）で２．６ｘ６０ｃｍ（３１８ｍｌ）のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｐｒｅｐ
Ｇｒａｄｅカラムに適用し、次に３カラム容量の１ｘＰＢＳで溶離した。ＵＶ検出器で２つのピークに相当する画分を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。第１のピークの画分はＩＦＮαＦｃ：ＩＦＮαＦｃホモ二量体またはＩＦＮαＦｃ：Ｆｌａｇ−Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドのいずれかを含有し、第２のピークはＦｌａｇ−Ｆｃ：Ｆｌａｇ−Ｆｃホモ二量体を含有していた。単量体−二量体ハイブリッドを含有するがＦｌａｇＦｃホモ二量体は含有しない画分全てを合わせ、６０ｃｍ／時の一次流量で１．６ｘ５ｃｍＭ２抗ＦＬＡＧセファロースカラム（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上に直接適用した。ローディングの後、５カラム容量のＰＢＳでカラムを洗浄し、次に単量体−二量体ハイブリッドを１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出させた。次に蛋白ピークを含有する溶出画分を１／１０容量の１Ｍトリス塩酸を添加して中和し、還元型および非還元型のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。画分はＰＢＳ中に透析し、１〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、−８０℃で保存した。
実施例１６：コイルドコイル蛋白の発現および精製
プラスミドｐＥＤ．ｄＣＥｐｏ−ＣＣＡ−ＦｃおよびｐＥＤ．ｄＣＣＣＢ−Ｆｃを単独または１：１の比でＣＨＯＤＧ４４細胞にトランスフェクトする。細胞はＳｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬マニュアル（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に記載されるとおりトランスフェクトする。４８時間後培地を除去し、５％透析ウシ胎児血清を添加したヌクレオシドを含有しないＭＥＭＡｌｐｈａに交換する。精製は当該分野で知られた方法に従ってプロテインＡ上のアフィニティークロマトグラフィーにより行う。或は、精製はサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーにより行うことができる。
実施例１７：Ｃｙｓ−Ｆｃの発現および精製
Ｃｙｓ−Ｆｃを発現するＣＨＯＤＧ−４４細胞を樹立した。ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を含有するｐＥＤ．ｄＣ．Ｃｙｓ−Ｆｃ発現プラスミドを製造元のプロトコルに従ってＳｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてＣＨＯＤＧ４４（ｄｈｆｒ欠損）細胞内にトランスフェクトし、その後、１０日間、５％透析ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加したαＭＥＭ（ヌクレオシド非含有）組織培養培地中で安定なトランスフェクション体を選択した。得られた安定トランスフェクション細胞プール物を次に５０ｎＭメトトレキセートで増幅し、発現を増大させた。約２ｘ１０７細胞を用いて１７００ｃｍ２ローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中の生育培地３００ｍｌ接種した。ローラーボトルは７２時間３７℃で５％ＣＯ２中にインキュベートした。生育培地を血清非含有生産培地（５μｇ／ｍｌウシインスリンおよび１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２）３００ｍｌと交換した。生産培地（コンディショニングされた培地）を１０日間に渡り毎日採取し、４℃で保存した。各採取の後にローラーボトルには新しい生産培地を添加し、ボトルをインキュベーターに戻した。クロマトグラフィーの前に、Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）製のＳｕｐｅｒＣａｐ−１００（０．８／０．２μｍ）フィルターを用いて培地を清浄化した。以下の全ての工程は４℃で実施した。清浄化した培地をプロテインＡセファロースに適用し、５カラム容量の１ｘＰＢＳ（１０ｍＭホスフェート、ｐＨ７．４、２．７ｍＭＫＣｌおよび１３７ｍＭＮａＣｌ）で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶離し、次に１／１０容量の１Ｍトリス塩酸、ｐＨ９．０を用いて中和した。次に蛋白をＰＢＳ中に透析し，直接コンジュゲート反応に使用した。
実施例１８：Ｔ２０−チオエステルのＣｙｓ−Ｆｃへのカップリング
Ｃｙｓ−Ｆｃ（４ｍｇ、３．２ｍｇ／ｍｌ終濃度）およびＴ２０−チオエステルまたはＴ２０−ＰＥＧ−チオエステル（２ｍｇ、約５モル等量）のいずれかを０．１Ｍトリス８／１０ｍＭＭＥＳＮＡ中室温で１６時間インキュベートした。還元試料緩衝液を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（トリス−Ｇｌｙゲル）による分析によればＦｃ対照より約５ｋＤａ大きい新しいバンドの存在が示された（コンジュゲートへの変換＞４０〜５０％）。Ｃｙｓ−Ｆｃおよび未反応のＣｙｓ−Ｆｃの以前のＮ末端配列決定によれば、シグナルペプチドは分子の画分中で不正確にプロセシングされており、ネイティブのライゲーションを介してペプチド−チオエステルと反応する（Ｃｙｓ）−Ｆｃとそのような反応をしない（Ｖａｌ）−（Ｇｌｙ）−（Ｃｙｓ）−Ｆｃの混合物が生じていた。反応条件がＣｙｓ−Ｆｃ分子の２量化を破壊するためには不十分であったため、この反応によりＴ２０−Ｃｙｓ−Ｆｃ：Ｔ２０−Ｃｙｓ−Ｆｃホモ二量体、Ｔ２０−Ｃｙｓ−Ｆｃ：Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッド、および、Ｃｙｓ−Ｆｃ：Ｃｙｓ−ＦｃＦｃ二量体の混合物が生成した。この蛋白は上記した通りサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーにより精製し、３種の物質を分離した。結果は非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で確認した。
実施例１９：ＩＦＮα活性に関する抗ウィルス試験
ＩＦＮα融合蛋白の抗ウィルス活性（ＩＵ／ｍｌ）をＣＰＥ（細胞障害作用）試験を用いて測定した。Ａ５４９細胞を３７℃５％ＣＯ２下に２時間、生育培地（１０％ウシ胎児結成（ＦＢＳ）および２ｍＭＬ−グルタミン添加ＲＰＭＩ１６４０）中９６穴の組織培養プレートにプレーティングした。ＩＦＮα標準物質およびＩＦＮα融合蛋白を生育倍地中に希釈し、３７℃５％ＣＯ２下２０時間３連で細胞に添加した。インキュベートの後、全培地をウェルから除去し、脳心筋炎（ＥＭＣ）ウィルスを生育倍地中に希釈し、対照ウェルを除く各ウェルに添加した（３０００ｐｆｕ／ウェル）。プレートを２８時間３７℃５％ＣＯ２下にインキュベートした。生細胞を１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）中に固定し、次に公開されているプロトコル（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９０，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２，１１１３）に従ってスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）で染色した。ＳＲＢ染料を１０ｍＭトリスｐＨ１０．５で歌謡化し、分光光度計上で４９０ｎｍで読み取った。試料は５〜０．０１１ＩＵ／ｍｌの範囲の既知の標準曲線であるＷＨＯのＩＦＮα２ｂインターナショナルスタンダードに活性を比較することにより分析した。結果は以下の表３および図６に示すとおりであり、単量体−二量体ハイブリッドの増大した抗ウィルス活性を示している。
Figure 2012067142
実施例２０：ＦＶＩＩａ凝固活性分析
ＳｔＣｌｏｔＦＶＩＩａ−ｒＴＦ試験キットをＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）より購入し、Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｂｌｏｏｄ ＣＯａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ １１：Ｓ１５９に記載の通り変更した。標準曲線はＦＶＩＩａＷＨＯ標準８９／６８８により行った。試験を用いてホモ二量体と比較した場合の単量体−二量体ハイブリッドの凝固活性を比較した。結果は単量体−二量体ハイブリッドがホモ二量体と比較して４倍高値の凝固活性を有することを示していた（図７）。
実施例２１：１０日齢ラットにおけるＦＶＩＩａ−Ｆｃの経口投与
体重２５グラムの９日齢の新生仔Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入し、２４時間馴化させた。ラットにＦＶＩＩａＦｃホモ二量体、単量体−二量体ハイブリッドまたは二者の５０：５０混合物を経口投与した。用量１ｍｇ／ｋｇにつきＦＶＩＩａＦｃ溶液２００μｌの容量を投与した。溶液はトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４および５ｍｇ／ｍｌ大豆トリプシン阻害剤を含有した。ラットは数時点においてＣＯ２安楽死させ、血液２００μｌを心穿刺により採取した。３．８％クエン酸ナトリウム溶液を添加することにより血漿を採取し、１２６８ｘｇの速度で室温で遠心分離した。血漿試料は新鮮時に試験に付すか、２０℃において凍結した。経口投与した単量体−二量体ハイブリッドはホモ二量体第ＶＩＩ因子と比較して有意に高値の最大（Ｃｍａｘ）血清中濃度を示した（図８）。
実施例２２：新生仔ラットの第ＩＸ因子−Ｆｃ経口投与
１０日齢の新生仔Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、５ｍｇ／ｍｌ大豆トリプシン阻害剤および０．９％ＮａＣｌを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５中１０ｎｍｏｌ／ｋｇの概ね等しい用量において、２００μｌのＦＩＸ−Ｆｃホモ二量体またはＦＩＸ−ＦＣ：ＦｌａｇＦｃ単量体−二量体ハイブリッドを投与した。注入後薬１、２、４、８、２４、４８および７２時間後、動物をＣＯ２安楽死させ、心穿刺により採血し、３．８％クエン酸ナトリウム溶液を添加することにより血漿を採取し、１２６８ｘｇの速度で室温で遠心分離した。次に試料を遠心分離により沈降させ、血清を採取し、ＥＬＩＳＡによる融合蛋白の分析時まで−２０℃で凍結した。
実施例２３：第ＩＸ因子−ＦｃＥＬＩＳＡ
９６穴のＩｍｍｕｌｏｎ４ＨＢＸＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ，Ｖａｎｔａａ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ９．６中１：１００に希釈したヤギ抗第ＩＸ因子ＩｇＧ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ａｎｃａｓｔｅｒ，Ｃａｎａｄａ）１００μｌ／ウェルとなるようにコーティングした。プレートを２時間周囲温度、または、４℃一夜、プラスチックフィルムで密封してインキュベートした。ウェルをＴＥＣＡＮプレート洗浄機を用いてＰＢＳＴ３００μ／ウェルで４回洗浄した。ＰＢＳＴ＋６％ＢＳＡ、２００μｌ／ウェルでウェルをブロックし、周囲温度で９０分間インキュベートした。ウェルをＴＥＣＡＮプレート洗浄機を用いてＰＢＳＴ３００μ／ウェルで４回洗浄した。標準物質および実施例１８に記載したラットの血液試料をウェルに添加し（１００μｌ／ウェル）、周囲温度で９０分間インキュベートした。試料および標準物質をＨＢＥＴ緩衝液（ＨＢＥＴ：５．９５ｇＨＥＰＥＳ，１．４６ｇＮａＣｌ、０．９３ｇＮａ２ＥＤＴＡ、２．５ｇウシ血清アルブミン、０．２５ｍｌＴｗｅｅｎ−２０、ｄＨ２Ｏで２５０ｍｌ定容、ｐＨ７．２に調節）中に希釈した。標準曲線の範囲は２倍希釈により２００ｎｇ／ｍｌ〜０．７８ｎｇ／ｍｌとした。ウェルをＴＥＣＡＮプレート洗浄機を用いてＰＢＳＴ３００μ／ウェルで４回洗浄した。１００μｌ／ウェルをＨＢＥＴ１：２５，０００中に希釈したコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＡＲＰ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を各ウェルに添加した。プレートを周囲温度で９０分間インキュベートした。ウェルをＴＥＣＡＮプレート洗浄機を用いてＰＢＳＴ３００μ／ウェルで４回洗浄した。ウェルを製造元の指示に従って添加した１００μｌ／ウェルのテトラメチルベンジジンパーオキシダーゼ基質（ＴＭＢ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｌｄ，ＩＬ）で発色させた。発色するまで暗所室温で５分間プレートをインキュベートした。２Ｍ硫酸１００μｌ／ウェルで反応を停止させた。吸光度はＳｐｅｃｔｒａＭａｃパルスプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で４５０ｎｍで読み取った。４時間目採血の分析は第ＩＸ因子−Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドと第ＩＸ因子Ｆｃホモ二量体との間には血清中濃度に１０倍超の相違があることを示していた（図９）。結果は第ＩＸ因子−Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドの濃度は第ＩＸ因子−Ｆｃホモ二量体よりも一貫して高値であることを示していた（図１０）。
実施例２４：Ｅｐｏ−Ｆｃのクローニング
ＲＴ−ＰＣＲによってＨｅｐＧ２ｍＲＮＡおよび以下に記載するプライマーｈｅｐｏｘｂａ−Ｆおよびｈｅｐｏｅｃｏ−Ｒより元々得られた成熟エリスロポエチンコーディング配列をコードするプラスミドからＰＣＲ増幅により成熟Ｅｐｏコーディング領域を得た。プライマーｈｅｐｏｘｂａ−ＦはＸｂａＩ部位を含み、プライマーｈｅｐｏｅｃｏ−ＲはＥｃｏＲＩ部位を含む。ＰＣＲはＩｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ中、Ｖｅｎｔポリメラーゼを用いながら、９５℃１５秒、その後傾き６．０で９５℃０秒、５５℃０秒および７２℃１分２０秒を２８サイクル、その後７２℃の伸長３分間で変性しながら実施した。約５１４ｂｐの産物をゲル精製し、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、再度ゲル精製し、上記したＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ消化ゲル精製ｐＥＤ．ｄＣ．ＸＦｃベクター内に直接サブクローニングした。このコンストラクトはｐＥＤ．ｄＣ．ＥｐｏＦｃと命名した。
内因性シグナルペプチドおよび成熟配列の両方を含有するＥｐｏ配列は、鋳型としての成人腎ＱＵＩＣＫ−クローンｃＤＮＡ調製物および以下に示すプライマーＥｐｏ＋Ｐｅｐ−Ｓｂｆ−ＦおよびＥｐｏ＋Ｐｅｐ−Ｓｂｆ−Ｒを用いてＰＣＲ増幅により得た。プライマーＥｐｏ＋Ｐｅｐ−Ｓｂｆ−ＦはＳｂｆＩ部位を開始コドンの上流に含有し、プライマーＥｐｏ＋Ｐｅｐ−Ｓｂｆ−ＲはＥｐｏ配列の内因性ＳｂｆＩ部位の下流でアニーリングする。ＰＣＲ反応は、９４℃２分間、その後９４℃３０秒、５７℃３０秒および７２℃４５秒を３２サイクル、その後７２℃の伸長１０分間で変性しながらＥｘｐａｎｄポリメラーゼを用いてＰＴＣ−２００ＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ中において実施した。約６０３ｂｐの産物をゲル単離し、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクター中にサブクローニングした。正しいコーディング配列をＳｂｆＩ消化により切り出し、ゲル精製し、ＰｓｔＩ消化エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）−処理ゲル精製ｐＥＤ．ｄＣ．ＥＰＯＦｃプラスミドにクローニングした。正しい方向にインサートを有するプラスミドをまずＫｐｎＩ消化により決定した。このコンストラクトのＸｍｎＩおよびＰｖｕＩＩ消化物をｐＥＤ．ｄＣ．ＥｐｏＦｃと比較し、正しい方向であることを確認した。配列を決定し、コンストラクトをｐＥＤ．ｄＣ．ｎａｔＥｐｏＦｃと命名した。
ＰＣＲプライマー：
Figure 2012067142
Figure 2012067142
Figure 2012067142
Figure 2012067142
実施例２５：Ｅｐｏ−Ｆｃのクローニング
ＥＰＯ−Ｆｃのクローニングの別法を記載する。プライマーをまず消化して完全長のＥｐｏコーディング配列、即ち以下に示すネイティブのシグナル配列を含むものを増幅する。
Figure 2012067142
Figure 2012067142
フォワードプライマーはＫｏｚａｋ配列の上流にＳｂｆＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を取り込み、リバースプライマーは内部ＳｂｆＩ部位を除去し、８アミノ酸リンカーをコーディング配列（ＥＦＡＧＡＡＡＶ）（配列番号８１）の３’末端に、そしてＳａＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を付加する。Ｅｐｏコーディング配列を次に、以下のサイクル、即ち９４℃２分；（９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃４５秒）を３０サイクル、その後７２℃１０分を用いながら、ＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中、製造元の標準的プロトコルに従ってＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて２５μｌＰＣＲ反応中各プライマー２５ｐｍｏｌを用いながら腎ｃＤＮＡライブラリ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から増幅した。予測されたサイズのバンド（６４１ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、中間クローニングベクターｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内にライゲーションした。ＤＮＡはＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、そして共に製造元の標準的プロトコルに従ってミニプレップ培養物を生育させ、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。配列を確認した後、このインサートを同様の方法でＳｂｆＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、哺乳類発現ベクターｐＥＤ，ｄＣのＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
プライマーは以下に示すヒトＩｇＧの定常領域に関するコーディング配列を増幅するように設計した（Ｆｃ領域、ＥＵナンバリング２２１〜４４７）。
Figure 2012067142
Figure 2012067142
フォワードプライマーはリンカー−ＦｃジャンクションにＳａｌＩ部位を取り込み、Ｆｃ領域にＢｓｐＥＩおよびＲｓｒＩＩ部位を導入するがコーディング配列には影響せず、そしてリバースプライマーは終止コドンの後にＥｃｏＲＩ部位を付加する。Ｆｃコーディング配列を次に、以下のサイクル、即ち９４℃２分；（９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃４５秒）を３０サイクル、その後７２℃１０分を用いながら、ＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中、製造元の標準的プロトコルに従ってＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて２５μｌＰＣＲ反応中各プライマー２５ｐｍｏｌを用いながら白血球ｃＤＮＡライブラリ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から増幅した。予測されたサイズのバンド（６９６ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、中間クローニングベクターｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内にライゲーションした。ＤＮＡはＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、そして共に製造元の標準的プロトコルに従ってミニプレップ培養物を生育させ、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。配列を確認した後、このインサートを同様の方法でＳａＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、プラスミドｐＥＤ．ｄＣ．Ｅｐｏ（上記）のＳａＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、哺乳類発現プラスミドｐＥＤ．ｄＣ．ＥｐｏＦｃを作成した。別の実験において、このプラスミドを更にＲｓｒＩＩ／Ｘｍａｌｄ消化し、そしてＡｓｎ２９７Ａｌａ突然変異（ＥＵナンバリング）を含むｐＳＹＮ−Ｆｃ−００２の相当するフラグメントをクローニングしてｐＥＤ，ｄＣ，ＥＰＯ−ＦｃＮ２９７Ａ（ｐＳＹＮ−ＥＰＯ−００４）を作成した。哺乳類細胞における発現は実施例２６に記載するとおりである。８アミノ酸リンカーを有するＥｐｏＦｃのアミノ酸配列は図２ｊに示す。この別法のクローニング方法の過程において、厳密なＥｐｏＦｃのアミノ酸配列は温存された（図２Ｊ）が、多くの非コーディング変化がヌクレオチドレベルで生じた（図３Ｊ）。これらはＧ６Ａ（ヌクレオチド６におけるＧがＡに変化）（プライマーにおいてありえる二次構造を除去）、Ｇ５６７Ａ（Ｅｐｏからの内因性ＳｂｆＩ部位の除去）、Ａ５８２Ｇ（リンカーからのＥｃｏＲＩ部位の除去）、Ａ６３６ＴおよびＴ６３９Ｇ（ユニークＢｓｐＥＩ部位のＦｃへの付加）およびＧ６５１Ｃ（ユニークＲｓｒＩＩ部位のＦｃへの添加）である。図３Ｊにおけるヌクレオチド配列は、実施例２４のコンストラクトの配列とのこれらの相違点が組み込まれている実施例２５において作成したコンストラクトに由来している。
実施例２６：ＥＰＯ−Ｆｃホモ二量体および単量体−二量体ハイブリッドの発現および精製
ＤＧ４４細胞を１００ｍｍの組織培養ペトリ皿にプレーティングし、５０〜６０％コンフルエントとなるまで生育させた。合計１０μｇのＤＮＡを使用して１個の１００ｍｍ皿、即ち、ホモ二量体のトランスフェクションについては８μｇのｐＥＤ．ｄＣ．Ｅｐｏ−Ｆｃ；単量体−二量体ハイブリッドのトランスフェクションについては、８μｇのｐＥＤ．ｄＣ．Ｅｐｏ−Ｆｃ＋２μｇのｐｃＤＮＡ３−ＦｌａｇＦｃを使用した。コンストラクトは実施例２４に記載の通りクローニングした。実施例２５に記載のクローニング方法もこの実施例において使用するためのコンストラクトを得るために使用できる。細胞はＳｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬マニュアル（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に記載されるとおりトランスフェクトした。或は、ｐＥＤ．ｄＣ．Ｅｐｏ−ＦｃをｐＳＹＮ−Ｆｃ−０１６とコトランスフェクトして未タグの単量体を作成した。４８時間後トランスフェクションから培地を除去し、両方のトランスフェクションについては５％透析ウシ胎児血清を添加したヌクレオシドを含有しないＭＥＭＡｌｐｈａに交換し、単量体−二量体ハイブリッドトランスフェクションでは更に０．２ｍｇ／ｍｌゲネチシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加した。３日後、０．２５％トリプシンを用いて細胞をプレートから遊離させ、Ｔ２５組織培養フラスコに移し、安定な細胞系統が樹立されるに従い細胞が良好に成育し始めるまで１０〜１４日間選択を継続した。蛋白の発現はその後、メトトレキセートを添加することにより増幅した。
両方の細胞系統に対し、約２ｘ１０７細胞を用いて１７００ｃｍ２ローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中の生育培地３００ｍｌ接種した。ローラーボトルは７２時間３７℃で５％ＣＯ２中にインキュベートした。次に生育培地を血清非含有生産培地（５μｇ／ｍｌウシインスリンおよび１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２）３００ｍｌと交換した。生産培地（コンディショニングされた培地）を１０日間に渡り毎日採取し、４℃で保存した。各採取の後にローラーボトルには新しい生産培地を添加し、ボトルをインキュベーターに戻した。クロマトグラフィーの前に、Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）製のＳｕｐｅｒＣａｐ−１００（０．８／０．２μｍ）フィルターを用いて培地を清浄化した。以下の全ての工程は４℃で実施した。清浄化した培地をプロテインＡセファロースに適用し、５カラム容量の１ｘＰＢＳ（１０ｍＭホスフェート、ｐＨ７．４、２．７ｍＭＫＣｌおよび１３７ｍＭＮａＣｌ）で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶離し、次に１／１０容量の１Ｍトリス塩酸、ｐＨ９．０を用いて中和した。次に蛋白をＰＢＳ中に透析した。
単量体−二量体ハイブリッドトランスフェクション蛋白試料は、それがＥＰＯ−Ｆｃ：ＥＰＯ−Ｆｃホモ二量体、ＥＰＯ−Ｆｃ：Ｆｌａｇ−Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドおよびＦｌａｇ−Ｆｃ：Ｆｌａｇ−Ｆｃホモ二量体の混合物を含有していたため、更に精製した。物質を濃縮し、流量４ｍｌ／分（３６ｃｍ／時）で２．６ｘ６０ｃｍ（３１８ｍｌ）のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅカラムに適用し、次に３カラム容量の１ｘＰＢＳで溶離した。ＵＶ検出器で２つのピークに相当する画分を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。第１のピークの画分はＥＰＯ−Ｆｃ：ＥＰＯ−Ｆｃホモ二量体またはＥＰＯ−Ｆｃ：Ｆｌａｇ−Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドのいずれかを含有し、第２のピークはＦｌａｇ−Ｆｃ：Ｆｌａｇ−Ｆｃホモ二量体を含有していた。単量体−二量体ハイブリッドを含有するがＦｌａｇＦｃホモ二量体は含有しない画分全てを合わせ、６０ｃｍ／時の一次流量で１．６ｘ５ｃｍＭ２抗ＦＬＡＧセファロースカラム（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．）上に直接適用した。ローディングの後、５カラム容量のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に単量体−二量体ハイブリッドを１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出させた。次に蛋白ピークを含有する溶出画分を１／１０容量の１Ｍトリス塩酸を添加して中和し、還元型および非還元型のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。画分はＰＢＳ中に透析し、１〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、−８０℃で保存した。
或は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００の最初のピークの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、そして大部分のＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドおよび少量のＦｐｏＦｃホモ二量体を含有する画分のみを合わせた。単量体−二量体ハイブリッドがリッチ化されているこのプール物を次にＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに再度適用し、次にＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドを含有する画分を合わせ、透析し、精製蛋白として保存した。この大体精製方法は非タグ単量体−二量体ハイブリッドの精製にも使用できる。
実施例２７：カニクイザルへの８アミノ酸リンカーを有するＥｐｏＦｃ二量体および単量体−二量体ハイブリッドの投与
肺投与のために、ＰＢＳｐＨ７．４中のＥｐｏＦｃ二量体またはＥｐｏＦｃの単量体−二量体ハイブリッド（共に８アミノ酸リンカーを有する）の何れかのエアロゾルをＡｅｒｏｎｅｂＰｒｏＴＭ（ＡｅｒｏＧｅｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）ネブライザーを用いてＢｉｒｄ Ｍａｒｋ ７Ａ呼吸器にインラインに作成し、気管内チューブを介して麻酔したナイーブのカニクイザルに投与した（概ね正常な１回呼吸量）。両方の蛋白はまた静脈内注射によりナイーブのカニクイザルに投与した。試料を種々の時点で採取し、得られた血清中のＥｐｏ含有蛋白の量をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＩＶＤＨｕｍａｎＥｐｏＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて定量した。薬物動態パラメーターはソフトウエアＷｉｎＮｏｎＬｉｎを用いて計算した。表４はＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドまたはＥｐｏＦｃ二量体を投与したカニクイザルの生体利用性の結果を示している。
Figure 2012067142
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カニクイザルに投与した８アミノ酸リンカーを有するＦｐｏＦｃの薬物動態を図１１に示す。図は単回肺投与後のサルにおけるＥｐｏＦｃ二量体をＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドと比較している。モル基準で比較すれば、二量体よりも単量体−二量体ハイブリッドを投与したサルにおいて有意に高値の血清中濃度が得られた。
実施例２８：ＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドの皮下投与
既知のエリスロポエチン剤とＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドの血清中濃度を比較するために、ＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドとキメラ融合蛋白ではないＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチンアルファ）の両方を種々のサルに皮下投与し、両者の血清中濃度を経時的に測定した。
カニクイザル（群当たりｎ＝３）に０．０２５ｍｇ／ｋｇＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドを皮下注射した。血液試料を用量前および用量後１４４時間まで採取した。血清試料は血液から調製し、ＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｏ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）による分析まで凍結保存した。薬物動態パラメーターはＷｉｎＮＯｎＬｉｎaソフトウエア
（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて測定した。
結果はＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドおよびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチンアルファ）の両方とも血清中濃度は、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチンアルファ）の
投与されたモル用量がわずかに高かったにも関わらず、長時間等しいことを示していた。（表６）（図１２）。
Figure 2012067142
実施例２９：ＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドの静脈投与
既知のエリスロポエチン剤とＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドの血清中濃度を比較するために、いずれもキメラ融合蛋白ではないＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッド、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチンアルファ）およびＥｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチンアルファ）を種々のサルに皮下投与し、両者の血清中濃度を経時的に測定した。
カニクイザル（群当たりｎ＝３）に０．０２５ｍｇ／ｋｇＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドを皮下注射した。血液試料を用量前および用量後１４４時間まで採取した。血清試料は血液から調製し、ＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｏ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）による分析まで凍結保存した。薬物動態パラメーターはＷｉｎＮＯｎＬｉｎaソフトウエア
（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて測定した。
結果はＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドの血清中濃度ｖｓ時間（ＡＵＣ）は、Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチンアルファ）およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチンアルファ）の両方ともより高モル用量でサルに投与したにも関わらず、Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチンアルファ）またはＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチンアルファ）のいずれの濃度よりも高値であることを示していた（表７）（図１３）。
Figure 2012067142
実施例３０：ＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドの別法の精製
Ｅｐｏ−Ｆｃを精製するための更に別の方法を記載する。Ｆｃ、ＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドおよびＥｐｏＦｃ二量体を含有する混合物をプロテインＡセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に適用した。混合物を製造元の指示に従って溶離した。混合物を含有するプロテインＡセファロース溶離液は５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）中に緩衝液交換した。蛋白混合物を５０ｍＭトリスＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化しておいた８ｍＬＭｉｍｅｔｉｃＲｅｄ２ＸＬカラム（ＰｒｏＭｅｔｉｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ）にロードした。次にカラムを５０ｍＭトリスＣｌ（ｐＨ８．０）；５０ｍＭＮａＣｌで洗浄した。この工程によりＦｃの大部分が除去された。ＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドを５０ｍＭトリスＣｌ（ｐＨ８．０）；４００ｍＭＮａＣｌで特異的に溶離した。ＥｐｏＦｃ二量体を溶離させ、５カラム容量の１ＭＮａＯＨでカラムを再生した。カラムからの溶出画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図１４）。
実施例３１：未タグＦｃ単独の作成のためのＩｇκシグナル配列−Ｆｃコンストラクトのクローニング
ＩｇＧ１の定常領域のコーディング配列（ＥＵ＃２２１−４４７；Ｆｃ領域）を以下のプライマーを用いて白血球ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）からＰＣＲ増幅により得た。
Figure 2012067142
Figure 2012067142
フォワードプライマーは３アミノ酸（ＡＡＶ）およびＳａｌＩクローニング部位をＦｃ領域の開始点より前に付加し、そして更に正しいアミノ酸配列（ＥＵナンバリング）を温存するために遺伝子コードの縮重を用いてアミノ酸２３１〜２３３においてＢｓｐＥＩ制限部位およびアミノ酸２３６〜２３８においてＲｓｒＩＩ制限部位を取り込む。リバースプライマーはＦｃの終止コドンより後にＥｃｏＲＩクローニング部位を付加する。２５μＰＣＲを以下のサイクル、即ち９４℃２分；（９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃４５秒）を３０サイクル、７２℃１０分を用いながら、ＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中、製造元の標準的プロトコルに従ってＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて各プライマー２５ｐｍｏｌを用いながら実施した。予測されたサイズのバンド（〜６９６ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内にクローニングし、中間プラスミドｐＳＹＮ−Ｆｃ−００１（ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ／Ｆｃ）を作成した。
マウスＩｇκシグナル配列を以下のプライマーを用いてＦｃＣＤＳに付加した。
Figure 2012067142
Figure 2012067142
Figure 2012067142
ｒｃ−Ｉｇκシグナル配列−Ｆプライマーは分子の５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を、その後にＫｏｚａｋ配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）（配列番号８９）を、その後にマウスＩｇκ軽鎖のシグナル配列を、直接Ｆｃ配列開始部に隣接させて付加する（ＥＵ＃２２１）。Ｆｃ−ｎｏＸｍａ−ＧＳ−Ｆおよび−Ｒプライマーは正しいアミノ酸配列を温存するための遺伝子コードの縮重を用いてＦｃコーディング配列から内部ＸｍａＩ部位を除去する。２回の２５μＰＣＲ反応をＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中、製造元の標準的プロトコルに従ってＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてｒｃ−Ｉｇκシグナル配列−ＦおよびＦｃ−ｎｏＸｍａ−ＧＳ−ＲまたはＦｃ−ｎｏＸｍａ−ＧＳ−ＦおよびｒｃＦｃ−Ｒのいずれか２５ｐｍｏｌを用いて実施した。第１の反応は以下のサイクル、即ち９４℃２分；（９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃４５秒）を３０サイクル、７２℃１０分を用いながら鋳型として白血球ｃＤＮＡライブラリ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）５００ｎｇを用いて実施した。第２の反応は以下のサイクル、即ち９４℃２分；（９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃４５秒）を１６サイクル、７２℃１０分を用いながら鋳型（上記）としてｐＳＹＮ−Ｆｃ−００１５００ｎｇを用いて実施した。予測されたサイズのバンド（〜４９５および２９９ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、次にＰＣＲ反応においてｒｃ−Ｉｇκシグナル配列−ＦおよびｒｃＦｃ−Ｒプライマーと混合し、前述の通り操作し、５８℃でアニーリングし、１６サイクル継続した。予測されたサイズのバンド（〜７７２ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内にクローニングし、中間プラスミドｐＳＹＮ−Ｆｃ−００７（ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ／Ｉｇκｓｉｇ ｓｅｑ−Ｆｃ）を作成した。次に全Ｉｇκシグナル配列−Ｆｃカセットを使用する系に応じてｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）またはｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）哺乳類発現ベクターのいずれかにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を用いてサブクローニングし、ｐＳＹＮ−Ｆｃ−００９（ｐＥＥ６．４／Ｉｇκｓｉｇ ｓｅｑ−Ｆｃ）およびｐＳＹＮ−Ｆｃ−０１５（ｐｃＤＮＡ３／Ｉｇκｓｉｇ ｓｅｑ−Ｆｃ）を作成した。
実施例３２：未タグＦｃＮ２９７Ａ単独の作成のためのＩｇκシグナル配列−ＦｃＮ２９７Ａコンストラクトのクローニング
ＦｃのＡｓｎ２９７（ＥＵナンバリング）をＡｌａ残基に突然変異させるために以下のプライマーを使用した。
Figure 2012067142
Figure 2012067142
２回のＰＣＲ反応をＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中、製造元の標準的プロトコルに従ってＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてｒｃ−Ｉｇκシグナル配列−ＦおよびＮ２９７Ａ−ＲまたはＮ２９７Ａ−ＦおよびｒｃＦｃ−Ｒのいずれか２５ｐｍｏｌを用いて実施した。両方の反応とも以下のサイクル、即ち９４℃２分；（９４℃３０秒、４８℃３０秒、７２℃４５秒）を１６サイクル、７２℃１０分を用いながら鋳型として５００ｎｇのｐＳＹＮ−Ｆｃ−００７を用いて実施した。予測されたサイズのバンド（〜３１９および４７５ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、次にＰＣＲ反応においてｒｃ−Ｉｇκシグナル配列−ＦおよびｒｃＦｃ−Ｒプライマーと混合し、前述の通り操作し、５８℃でアニーリングし、１６サイクル継続した。予測されたサイズのバンド（〜７７２ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内にクローニングし、中間プラスミドｐＳＹＮ−Ｆｃ−００８（ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ／Ｉｇκｓｉｇ ｓｅｑ−ＦｃＮ２９７Ａ）を作成した。次に全Ｉｇκシグナル配列−Ｆｃ単独カセットを使用する系に応じてｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）またはｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）哺乳類発現ベクターのいずれかにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を用いてサブクローニングし、ｐＳＹＮ−Ｆｃ−００１０（ｐＥＥ６．４／Ｉｇκｓｉｇ ｓｅｑ−ＦｃＮ２９７Ａ）およびｐＳＹＮ−Ｆｃ−０１６（ｐｃＤＮＡ３／Ｉｇκｓｉｇ ｓｅｑ−ＦｃＮ２９７Ａ）を作成した。
これらの同じＮ２９７プライマーをｒｃＦｃ−ＦおよびｒｃＦｃ−Ｒプライマーおよび鋳型としてのｐＳＹＮ−Ｆｃ−００１と共にＰＣＲ反応において使用し、その後上記の通りサブクローニングしてｐＳＹＮ−Ｆｃ−００２（ｐＧＥＭＴＥあｓｙ・ＦｃＮ２９７Ａ）を作成した。
実施例３３：ＥｐｏＦｃ野生型またはＮ２９７Ａ単量体−二量体ハイブリッドを作成するための二重遺伝子ベクターのための単一のプラスミドへのＥｐｏＦｃおよびＦｃのクローニングおよび発現
別々のプラスミド上にＥｐｏＦｃおよびＦｃコンストラクトをトランスフェクトすることの代替法は、それらを１つのプラスミドにクローニングすることであり、これは、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）において使用されているもののように、二重遺伝子ベクターとも称されている。ｐＳＹＮ−Ｆｃ−００２由来のＲｓｒＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを標準的な操作法に従ってｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）内の相当する部位にサブクローニングし、ｐＳＹＮ−Ｆｃ−００６を作成した（ｐＥＥ１２．４／ＦｃＮ２９７Ａフラグメント）。ｐＳＹＮ−ＥＰＯ−００４プラスミドをＰＣＲ反応の鋳型として、そして、実施例２５のＥｐｏ−Ｆプライマーおよび以下のプライマーを使用した。
Figure 2012067142
ＰＣＲ反応を１６サイクル５５℃のアニーリング温度でＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中、製造元の標準的プロトコルに従ってＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて上記の通り実施した。予測されたサイズのバンド（〜６８９ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＲｓｒＩＩ制限部位を用いてｐＳＹＮ−Ｆｃ−００６にクローニングし、ｐＳＹＢ−ＥＰＯ−００５（ｐＥＥ１２．４／ＥｐｏＦｃＮ２９７Ａ）を作成した。次にＥｐｏＦｃＮ２９７Ａ単量体−二量体ハイブリッドのための二重遺伝子ベクターを、ｐＳＹＮ−Ｆｃ−０１０由来のＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＹＮ−ＥＰＯ−００５の相当する部位にクローニングすることにより構築し、ｐＳＹＮ−ＥＰＯ−００８（ｐＥＥ１２．４−６．４／ＥｐｏＦｃＮ２９７Ａ／ＦｃＮ２９７Ａ）を作成した。
野生型コンストラクトもまた、ＲｓｒＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を用いてｐＳＹＮ−ＥＰＯ−００５内にｐＳＹＮ−Ｆｃ−００１由来の野生型Ｆｃ配列をサブクローニングすることによりｐＳＹＮ−ＥＰＯ−００６（ｐＥＥ．１２．４／ＥｐｏＦｃ）を作成した。次にＥｐｏＦｃ単量体−二量体ハイブリッドのための二重遺伝子ベクターを、ｐＳＹＮ−ＥＰＯ−００６中の相当する部位にｐＳＹＮ−Ｆｃ−００９由来のＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをクローニングすることにより構築し、ｐＳＹＮ−ＥＰＯ−００７（ｐＥＥ１２．４−６．４／ＥｐｏＦｃ／Ｆｃ）を作成した。
各プラスミドをＣＨＯＫ１ＳＶ細胞のトランスフェクトし、陽性のクローンを識別し、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ操作法（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）の指示に従って血清非含有懸濁液に適合させ、他の単量体−二量体コンストラクトの場合と同様に精製した。
実施例３４：ヒトＩＦＮβＦｃ、８アミノ酸リンカーを有するＩＦＮβ−ＦｃＮ２９７ＡおよびＩｇκ−Ｆｃ−６Ｈｉｓコンストラクトのクローニング
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）より入手したヒトゲノムｃＤＮＡライブラリ１０ｎｇを鋳型として使用しながら下記のプライマーを用いてそのネイティブのシグナル配列を有するヒトＩＦＮβを単離した。
Figure 2012067142
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リバースプライマーはヒトＩＦＮβ配列の３’末端上に８アミノ酸リンカー配列（ＥＦＡＧＡＡＡＶ）（配列番号９４）を作成するために使用した。ＰＣＲ反応はＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳａｌｔＬａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）中、製造元の標準的プロトコルに従って、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて実施した。正確なサイズ（〜６０７ｂｐ）のＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ＴＡクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングし、配列決定した。このコンストラクトをｐＳＹＮ−ＩＦＮβ−００２と命名した。ｐＳＹＮ−ＩＦＮβ−００２をＳｂｆＩおよびＳａＩＩで消化し、ＰｓｔＩおよびＳａＩＩ部位においてｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングしてｐＳＹＮ−ＩＦＮβ−００５を得た。
精製したｐＳＹＮ−Ｆｃ−００１（０．６μｇ）をＳａＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＳＹＮ−ＩＦＮβ−００５の相当する部位にクローニングし、８アミノ酸リンカーを介してヒトＦｃに連結したヒトＩＦＮβを含むプラスミドｐＳＹＮ−ＩＦＮβ−００６を作成した。次にｐＳＹＮ−ＩＦＮβ−００６をＳｂｆＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、完全長のＩＦＮβ−Ｆｃ配列をｐＥＤｄＣ．ｓｉｇのＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＳＹＮ−ＩＦＮβ−００８を作成した。
２９７位においてアスパラギンからアラニンへの１アミノ酸変化（Ｎ２９７Ａ：ＥＵナンバリング）を有するヒトＦｃＤＮＡを含有するｐＳＹＮ−Ｆｃ−００２をＢｓｐＥＩおよびＸｍａｌで消化してＮ２９７Ａ突然変異を含む〜３６５ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離した。このＤＮＡフラグメントをｐＳＹＮ−ＩＦＮβ−００８の相当する部位にクローニングし、発現ベクターｐＥＤ．ｄＣ中に８アミノ酸リンカーを有するＩＦＮβ−Ｆｃ配列およびＦｃ中のＮ２９７Ａ突然変異を含有するプラスミドｐＳＹＮ−ＩＦＮβ−００９を作成した。
Ｉｇκシグナル配列−ＦｃＮ２９７Ａ−６Ｈｉｓのクローニング。以下のプライマーを使用してＦｃＮ２９７Ａコーディング配列のＣ末端に６ｘＨｉｓタグを付加した。
Figure 2012067142
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Figure 2012067142
２回のＰＣＲ反応をＭＪＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｏｅｒ中、製造元の標準的プロトコルに従ってＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてＦｃＧｓ−ＦおよびＦｃ．６Ｈｉｓ−ＲまたはＦｃ．６Ｈｉｓ−ＦおよびＳｐ６＋Ｔ−Ｒのいずれか５０ｐｍｏｌを用いて実施した。両方の反応とも標準的条件を使用して５０μｌの反応中鋳型として５００ｎｇのｐＳＹＮ−Ｆｃ−００８を用いて実施した。予測されたサイズのバンド（〜７８０および１３８ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、次にＦｃＧＳ−ＦおよびＳｐ６＋Ｔ−Ｒプライマー５０ｐｍｏｌを用いた５０μｌＰＣＲ中で混合し、標準的なサイクリング条件を用いて前述の通り操作した。予測されたサイズのバンド（〜８９１ｂｐ）をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を用いてｐｃＤＮＡ６Ｖ５−ＨｉｓＢにクローニングしてｐＳＹＮ−Ｆｃ−０１４（ｐｃＤＮＡ６／Ｉｇκｓｉｇ ｓｅｑ−ＦｃＮ２９７Ａ−６Ｈｉｓ）を作成した。
実施例３５：ＩＦＮβＦｃ、ＩＦＮβ−ＦｃＮ２９７Ａホモ二量体およびＩＦＮβ−ＦｃＮ２９７Ａ単量体−二量体ハイブリッドの発現および精製
ＣＨＯＤＧ４４細胞を１００ｍｍの組織培養ペトリ皿にプレーティングし、５０〜６０％コンフルエントとなるまで生育させた。合計１０μｇのＤＮＡを使用して１個の１００ｍｍ皿、即ち、ホモ二量体のトランスフェクションについては１０μｇのｐＳＹＮ−ＩＦＮβ−００８またはｐＳＹＮ−ＩＦＮβ−００９コンストラクトを使用し；単量体−二量体ハイブリッドのトランスフェクションについては、８μｇのｐＳＹＮ−ＩＦＮβ−００９＋２μｇのｐＳＹＮ−Ｆｃ−０１４コンストラクトを使用した。細胞はＳｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造元の指示に従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後４８〜７２時間に生育培地を除去し、細胞を０．２５％トリプシンでプレートから遊離させ、選択培地（５％透析ウシ胎児血清を添加したヌクレオシドを含有しないＭＥＭＡｌｐｈａ）中Ｔ７５組織培養フラスコに移した。単量体−二量体ハイブリッドトランスフェクション用の選択培地には５μｇ／ｍｌのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加した。選択は細胞が良好に成育し始め、安定な細胞系統が樹立されるまで１０〜１４日間継続した。蛋白の発現はその後１０〜５０ｎＭの範囲のメトトレキセートを添加することにより増幅した。
全ての細胞系統に対し、約２ｘ１０７細胞を用いて１７００ｃｍ２ローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中の生育培地３００ｍｌ接種した。ローラーボトルは７２時間３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。次に生育培地を血清非含有生産培地（５μｇ／ｍｌヒトインスリン添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２）３００ｍｌと交換した。生産培地（コンディショニングされた培地）を１０日間に渡り毎日採取し、４℃で保存した。各採取の後にローラーボトルには新しい生産培地を添加し、ボトルをインキュベーターに戻した。クロマトグラフィーの前に、Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）製のＳｕｐｅｒＣａｐ−１００（０．８／０．２μｍ）フィルターを用いて培地を清浄化した。以下の全ての工程は４℃で実施した。清浄化した培地をプロテインＡセファロースに適用し、５カラム容量の１ｘＰＢＳ（１０ｍＭホスフェート、ｐＨ７．４、２．７ｍＭＫＣｌおよび１３７ｍＭＮａＣｌ）で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶離し、次に１／１０容量の１Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．０、５ＭＮａＣｌを用いて中和した。ホモ二量体蛋白は更にＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅサイジングカラム上で精製し、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、５００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロールで溶離した。
単量体−二量体ハイブリッド蛋白はＩＦＮβＦｃＮ２９７Ａ：ＩＦＮβＦｃＮ２９７Ａホモ二量体、ＩＦＮβＦｃＮ２９７Ａ：ＦｃＮ２９７ＡＨｉｓ単量体−二量体ハイブリッド、および、ＦｃＮ２９７ＡＨｉｓ：ＦｃＮ２９７ＡＨｉｓホモ二量体の混合物を含有していたため更に精製した。物質を５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５，５００ｍＭＮａＣｌ中、Ｎｉｃｋｅｌキレートカラムに適用した。ローディング後、カラムを５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、５００ｍＭＮａＣｌ中の５０ｍＭイミダゾールで洗浄し、蛋白を５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、５００ｍＭＮａＣｌ中の５０〜５００ｍＭイミダゾールの勾配で溶離した。ＵＶ検出器で溶離ピークに相当する画分を採取し、ＳＤ−ＰＡＧＥで分析した。第１のピークの画分はＩＦＮβＦｃＮ２９７Ａ：ＦｃＮ２９７ＡＨｉｓ単量体−二量体ハイブリッドを含有しており、第２のピークはＦｃＮ２９７ＡＨｉｓ：ＦｃＮ２９７ＡＨｉｓホモ二量体を含有していた。単量体−二量体ハイブリッドを含有するがＦｃホモ二量体は含有しない画分全てを合わせ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅサイジングカラムに直接適用し、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、５００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロールで溶離した。ＩＦＮβ−ＦｃＮ２９７Ａ：ＦｃＮ２９７ＡＨｉｓ単量体−二量体ハイブリッドを含有する画分を合わせ−８０℃で保存した。実施例３６：ＩＦＮβ活性に関する抗ウィルス試験
ＩＦＮβ融合蛋白の抗ウィルス活性（ＩＵ／ｍｌ）をＣＰＥ（細胞障害作用）試験を用いて測定した。Ａ５４９細胞を３７℃５％ＣＯ２下に２時間、生育培地（１０％ウシ胎児結成（ＦＢＳ）および２ｍＭＬ−グルタミン添加ＲＰＭＩ１６４０）中９６穴の組織培養プレートにプレーティングした。ＩＦＮβ標準物質およびＩＦＮβ融合蛋白を生育倍地中に希釈し、３７℃５％ＣＯ２下２０時間３連で細胞に添加した。インキュベートの後、全培地をウェルから除去し、脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）を生育倍地中に希釈し、対照ウェルを除く各ウェルに添加した（３０００ｐｆｕ／ウェル）。プレートを２８時間３７℃５％ＣＯ２下にインキュベートした。生細胞を１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）中に固定し、次に公開されているプロトコル（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２，１１１３）に従ってスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）で染色した。ＳＲＢ染料を１０ｍＭトリスｐＨ１０．５で歌謡化し、分光光度計上で４９０ｎｍで読み取った。試料は１０〜０．１９９Ｕ／ｍｌの範囲の既知の標準曲線に活性を比較することにより分析した。結果は以下の表８に示すとおりであり、単量体−二量体ハイブリッドの増大した抗ウィルス活性を示している。
Figure 2012067142
実施例３７：カニクイザルへの８アミノ酸リンカーを有するＩＦＮβＦｃホモ二量体および単量体−二量体ハイブリッドの投与
肺投与のために、ＰＢＳｐＨ７．４、０．２５％ＨＳＡ中のＩＦＮβＦｃホモ二量体またはＩＦＮβＦｃＮ２９７Ａの単量体−二量体ハイブリッド（共に８アミノ酸リンカーを有する）の何れかのエアロゾルをＡｅｒｏｎｅｂＰｒｏＴＭ（ＡｅｒｏＧｅｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）ネブライザーを用いてＢｉｒｄ Ｍａｒｋ ７Ａ呼吸器にインラインに作成し、気管内チューブを介して麻酔したナイーブのカニクイザルに投与した（概ね正常な１回呼吸量）。血液試料を種々の時点で採取し、得られた血清中のＩＮＨβ含有蛋白の量をヒトＩＦＮβＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を用いて定量した。薬物動態パラメーターはソフトウエアＷｉｎＮｏｎＬｉｎを用いて計算した。表９はＩＦＮβＦｃＮ２９７Ａ単量体−二量体ハイブリッドまたはＩＦＮβＦｃホモ二量体を投与したカニクイザルの結果を示している。
Figure 2012067142
カニクイザルに投与した８アミノ酸リンカーを有するＩＦＮβＦｃの薬物動態を図１５に示す。図は単回肺投与後のサルにおけるＩＦＮβＦｃ二量体をＩＦＮβＦｃＮ２９７Ａ単量体−二量体ハイブリッドと比較している。ホモ二量体と比較して単量体−二量体ハイブリッドを投与したサルでは有意に高値の血清中濃度が得られた。
血清試料は更にネオプテリンイムノアッセイ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ，ＮＹ）を用いてネオプテリン濃度（ＩＦＮβ活性のバイオマーカー）について分析した。この分析の結果を図１６に示す。図はＩＦＮβ−Ｆｃホモ二量体およびＩＦＮβ−ＦｃＮ２９７Ａ単量体−二量体ハイブリッドに応答したネオプテリン刺激を比較している。ＩＦＮβ−Ｆｃホモ二量体と比較してＩＦＮβ−ＦｃＮ２９７Ａ単量体−二量体ハイブリッドを投与したサルにおいては有意に高値のネオプテリン濃度が検出されたことがわかる。
本明細書および請求項において成分の量、反応条件等を示す全ての数値は全ての場合において「約」という用語で修飾できる。従って、特段の記載が無い限り明細書および請求項において示した数的パラメーターは概数であり、本発明により得られる所望の特性に応じて変動してよい。最低限、そして請求項の範囲と等しい教義の適用に限定することなく、各数的パラメーターは有意な桁数および通常の四捨五入法が適用されるものとする。
本明細書において引用した全ての参考文献は全ての目的のために個々のものが参照によりその全体が本明細書に組み込まれるがごとく参照により本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれる出版物および特許が明細書に含まれる開示内容と矛盾する場合は、明細書はそのような矛盾は排除し、超越するものとする。
本発明の多くの改変または変更を本発明の範囲から外れることなく行えることは当業者の知るとおりである。本明細書に記載した特定の実施形態は例示に過ぎず、限定を意図しない。明細書および実施例は例示に過ぎず、本発明の真の範囲および精神は請求項に示すとおりである。

Claims (1)

  1. 本願明細書に記載された発明。
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Families Citing this family (381)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5992710A (ja) * 1982-11-16 1984-05-29 関西電力株式会社 直接水冷線路の立坑部の布設方法
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8093357B2 (en) 2002-03-01 2012-01-10 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES2558102T3 (es) * 2003-05-06 2016-02-02 Biogen Hemophilia Inc. Proteínas quiméricas del factor de coagulación para el tratamiento de un trastorno hemostático
CA2522690A1 (en) * 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US8007805B2 (en) 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
US7736653B2 (en) 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin Fc region as a carrier
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US20150010550A1 (en) 2004-07-15 2015-01-08 Xencor, Inc. OPTIMIZED Fc VARIANTS
US20080176790A1 (en) 2004-10-29 2008-07-24 Defrees Shawn Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf)
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
CA2587617C (en) 2004-11-12 2011-02-01 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
MX2007008229A (es) 2005-01-10 2007-09-11 Neose Technologies Inc Factor estimulador de colonias de granulocitos glicopegilado.
US9187546B2 (en) 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US7833979B2 (en) * 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
JP2008545409A (ja) * 2005-05-26 2008-12-18 シェーリング コーポレイション インターフェロン−ＩｇＧ融合体
JP5335422B2 (ja) 2005-06-17 2013-11-06 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
RS57549B1 (sr) 2005-08-26 2018-10-31 Ares Trading Sa Proces za pripremu glikoziliranog interferona beta
DK1931709T3 (en) 2005-10-03 2017-03-13 Xencor Inc FC VARIETIES WITH OPTIMIZED FC RECEPTOR BINDING PROPERTIES
EP1951757B1 (en) 2005-10-06 2014-05-14 Xencor, Inc. Optimized anti-cd30 antibodies
US8153598B2 (en) * 2005-10-19 2012-04-10 Intrexon Corporation PKD ligands and polynucleotides encoding PKD ligands
JP5368798B2 (ja) * 2005-10-31 2013-12-18 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 癌を診断し処置するための組成物および方法
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
CA2625978A1 (en) 2005-12-09 2007-06-14 Ares Trading S.A. Method for purifying fsh or a fsh mutant
US7625564B2 (en) * 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
TW200745163A (en) * 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
EP2650305B1 (en) 2006-03-24 2024-05-08 Bioverativ Therapeutics Inc. PC5 as a factor IX propeptide processing enzyme
DE602007007923D1 (de) * 2006-04-11 2010-09-02 Csl Behring Gmbh Verfahren zur erhöhung der in-vivo-gewinnung therapeutischer polypeptide
RU2008145084A (ru) 2006-05-24 2010-06-27 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг (Ch) Аналоги фактора ix, имеющие пролонгированное время полужизни in vivo
ES2889920T3 (es) * 2006-06-14 2022-01-14 Csl Behring Gmbh Proteínas de fusión escindibles proteolíticamente con alta actividad específica molar
EP1867660A1 (en) * 2006-06-14 2007-12-19 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
AU2013202566C1 (en) * 2006-06-14 2018-07-12 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
US20100021379A1 (en) * 2006-06-29 2010-01-28 The Regents Of The University Of California Chemical Antibodies for Immunotherapy and Imaging
EP2049144B8 (en) 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
GB0614780D0 (en) * 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
US8524867B2 (en) 2006-08-14 2013-09-03 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target CD19
KR101105610B1 (ko) * 2006-08-17 2012-01-18 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｃｃｒ５ 에 대한 항체 및 항푸소제닉 펩타이드의 컨쥬게이트
TW200817438A (en) 2006-08-17 2008-04-16 Hoffmann La Roche A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide
WO2008051326A2 (en) * 2006-08-21 2008-05-02 President And Fellows Of Harvard College Identification of contactins and l1- cams as ligands for the amyloid precursor protein
CN101541825B (zh) * 2006-08-28 2013-08-14 阿雷斯贸易股份有限公司 Fc融合蛋白的纯化方法
PL2061803T5 (pl) * 2006-08-28 2023-03-27 Ares Trading S.A. Proces oczyszczania białek zawierających fc
CA2660795C (en) 2006-09-18 2014-11-18 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target hm1.24
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
US7820623B2 (en) * 2006-10-25 2010-10-26 Amgen Inc. Conjugated toxin peptide therapeutic agents
KR20090105913A (ko) * 2006-11-02 2009-10-07 다니엘 제이 카폰 이동 부분을 갖는 하이브리드 면역글로불린
EP3231440A1 (en) 2006-12-22 2017-10-18 CSL Behring GmbH Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
WO2008098720A1 (en) 2007-02-12 2008-08-21 Csl Behring Gmbh Therapeutic application of kazal-type serine protease inhibitors
JP2010523582A (ja) 2007-04-03 2010-07-15 バイオジェネリクス アクチェンゲゼルシャフト グリコｐｅｇ化ｇ−ｃｓｆを用いた治療方法
JP5591691B2 (ja) * 2007-05-22 2014-09-17 アムジエン・インコーポレーテツド 生物活性を有する融合タンパク質を作製するための組成物及び方法
MX2009013259A (es) 2007-06-12 2010-01-25 Novo Nordisk As Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos.
CL2008002092A1 (es) * 2007-07-20 2009-05-29 Hoffmann La Roche Conjugado que contiene dos o mas peptidos antifusogenicos y un anticuerpo anti-cd-4; metodo de produccion; composicion farmaceutica que lo comprende; polipeptidos antifusogenicos y uso del conjugado para tratar infecciones viricas.
TWI554520B (zh) * 2007-07-20 2016-10-21 諾華健控股公司 在活體中具有延長之半生期以及提高之紅血球生成活性的重組人類紅血球生成素（ｅｐｏ）-ｆｃ融合蛋白
CA2720628A1 (en) 2007-07-26 2009-01-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region
AU2008284047A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
CA2701032C (en) 2007-09-27 2021-01-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP2205258B1 (en) * 2007-09-28 2017-05-24 Janssen Biotech, Inc. Methods and structural conformations of antibody preparations with increased resistance to proteases
WO2009053368A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Single ifn-beta fused to a mutated igg fc fragment
CA2701221A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying an fc-containing protein
JP2011500756A (ja) * 2007-10-22 2011-01-06 メルク セローノ ソシエテ アノニム Ｆｃ融合タンパク質を精製する方法
CA2702289A1 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds exhibiting glucagon antagonist and glp-1 agonist activity
EP2219602A1 (en) 2007-11-15 2010-08-25 Amgen, Inc Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
EP2235059B1 (en) 2007-12-26 2015-02-18 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
KR101749310B1 (ko) * 2008-01-24 2017-06-21 에스퍼란스 파마슈티컬스, 인코포레이티드 용해 도메인 융합 구성물 및 이를 제조하고 사용하는 방법
ES2500066T3 (es) 2008-01-25 2014-09-30 Amgen, Inc Anticuerpos frente a ferroportina y métodos de uso
CN103497247A (zh) 2008-02-27 2014-01-08 诺沃—诺迪斯克有限公司 缀合的因子viii分子
WO2009139822A1 (en) 2008-05-01 2009-11-19 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
CN103641907A (zh) 2008-06-17 2014-03-19 印第安纳大学研究及科技有限公司 胰高血糖素/glp-1受体共激动剂
JP5753779B2 (ja) 2008-06-17 2015-07-22 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 生理学的ｐＨの緩衝液中で向上した溶解性及び安定性を示すグルカゴン類縁体
EP2300035B1 (en) 2008-06-17 2015-08-12 Indiana University Research and Technology Corporation Gip-based mixed agonists for treatment of metabolic disorders and obesity
EP2291523B1 (en) 2008-06-24 2014-12-17 CSL Behring GmbH Factor viii, von willebrand factor or complexes thereof with prolonged in vivo half-life
WO2010014909A1 (en) * 2008-08-01 2010-02-04 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
US8551789B2 (en) 2010-04-01 2013-10-08 OncoMed Pharmaceuticals Frizzled-binding agents and their use in screening for WNT inhibitors
CA2738485A1 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Frizzled-binding agents and uses thereof
EP2365979A2 (en) * 2008-10-22 2011-09-21 Biogen Idec MA Inc. Recombinant fcrn and variants thereof for purification of fc-containing fusion proteins
AU2009313902B9 (en) 2008-11-13 2014-03-27 The General Hospital Corporation Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of BMP-6
JP5730211B2 (ja) 2008-11-20 2015-06-03 バイオジェン アイデック エムエー インコーポレイティドＢｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ． ウイルスのアルギニン不活化
CA2744558A1 (en) 2008-12-19 2010-07-15 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
WO2010111414A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 Bayer Healthcare Llc Factor viii variants and methods of use
WO2010111617A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Van Andel Research Institute Parathyroid hormone peptides and parathyroid hormone-related protein peptides and methods of use
KR101431318B1 (ko) 2009-04-02 2014-08-20 로슈 글리카트 아게 전장 항체 및 단일쇄 ｆａｂ 단편을 포함하는 다중특이성 항체
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
CA2759333A1 (en) * 2009-04-22 2010-10-28 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
PE20120914A1 (es) 2009-06-16 2012-08-22 Univ Indiana Res & Tech Corp Compuestos glucagon activo de receptor de gip
AU2010290131C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Amunix Operating Inc. Coagulation factor VII compositions and methods of making and using same
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
SG10201408401RA (en) 2009-09-16 2015-01-29 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
CA2778105C (en) 2009-10-23 2019-04-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
CN102648212B (zh) 2009-11-13 2014-12-03 基立福疗法公司 包含冯维勒布兰德因子(vWF)的制剂及其相关制备方法、试剂盒和用途
CA2782424C (en) 2009-12-06 2021-07-27 Biogen Idec Hemophilia Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
WO2011075393A2 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
MX2012008603A (es) 2010-01-27 2013-01-25 Univ Indiana Res & Tech Corp Conjugados de antagonista de glucagon-agonista de gip y composiciones para el tratamiento de desordenes metabolicos y obesidad.
DK2547359T3 (en) 2010-03-15 2016-06-06 The Board Of Trustees Of The Univ Of Illionis Inhibitors of beta integrin G-protein alpha subunit-BINDING INTERACTIONS
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
EP2371857A1 (en) 2010-04-01 2011-10-05 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for treating interstitial lung disease
BR112012028704A2 (pt) 2010-05-13 2019-09-24 Univ Indiana Res & Tech Corp composto de glugagon da superfamília de peptídeos exibindo atividade do receptor com hormônio nuclear, pró fármaco, dímero ou multímero, composição farmacêutica que o compreendem e método de administração do mesmo.
EA024052B1 (ru) 2010-06-07 2016-08-31 Эмджен Инк. Устройство для доставки лекарственного средства
CA2802485C (en) 2010-06-16 2019-09-17 Indiana University Research And Technology Corporation Single chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor
KR20130102470A (ko) 2010-06-24 2013-09-17 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 아미드계 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드 프로드러그
CA2803164C (en) 2010-06-24 2018-08-21 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
PT2591006T (pt) * 2010-07-09 2019-07-29 Bioverativ Therapeutics Inc Moléculas de cadeia simples processáveis e polipéptidos preparados utilizando as mesmas
CN103140237A (zh) 2010-07-09 2013-06-05 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 因子ix多肽及其使用方法
EP3508573A1 (en) 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
JP5758004B2 (ja) 2010-08-24 2015-08-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ジスルフィドによって安定化されたＦｖ断片を含む二重特異性抗体
DE19177059T1 (de) 2010-10-01 2021-10-07 Modernatx, Inc. N1-methyl-pseudouracile enthältendes ribonucleinsäuren sowie ihre verwendungen
US9029502B2 (en) 2010-12-20 2015-05-12 The Regents Of The University Of Michigan Inhibitors of the epidermal growth factor receptor-heat shock protein 90 binding interaction
MX2013006304A (es) 2010-12-22 2013-07-02 Univ Indiana Res & Tech Corp Analogos de glucagon que exhiben actividad del receptor gip.
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
WO2012097333A2 (en) 2011-01-14 2012-07-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged immunoglobulin polypeptides and method of use thereof
DK2673294T3 (en) * 2011-02-10 2016-05-30 Roche Glycart Ag MUTANT INTERLEUKIN-2 POLYPEPTIDES
RU2013141078A (ru) 2011-02-28 2015-04-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Одновалентные антигенсвязывающие белки
CN103502271B (zh) 2011-02-28 2016-10-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗原结合蛋白
CA2829037C (en) 2011-03-09 2022-05-17 Csl Behring Gmbh Factor xii inhibitors for the administration with medical procedures comprising contact with artificial surfaces
EP2497489A1 (en) 2011-03-09 2012-09-12 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for the treatment of silent brain ischemia and ischemia of other organs
WO2012135805A2 (en) 2011-03-31 2012-10-04 modeRNA Therapeutics Delivery and formulation of engineered nucleic acids
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
PT2699293T (pt) 2011-04-20 2019-05-21 Amgen Inc Aparelho de autoinjeção
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
RU2600067C2 (ru) 2011-05-06 2016-10-20 Дзе Гавермент Оф Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари Оф Дзе Депармент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Рекомбинантный иммунотоксин, нацеленный на мезотелин
PT2717898T (pt) 2011-06-10 2019-05-20 Bioverativ Therapeutics Inc Compostos pró-coagulantes e processos para a sua utilização
US9156902B2 (en) 2011-06-22 2015-10-13 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
PT3513804T (pt) 2011-07-08 2022-06-02 Bioverativ Therapeutics Inc Polipéptidos fator viii híbridos e quiméricos, e métodos de utilização dos mesmos
EP2734552A1 (en) 2011-07-22 2014-05-28 CSL Behring GmbH Inhibitory anti -factor xii/xiia monoclonal antibodies and their uses
EA028914B1 (ru) * 2011-07-25 2018-01-31 Байоджен Хемофилия Инк. Исследования для мониторинга нарушений свертываемости крови
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
LT3682905T (lt) 2011-10-03 2022-02-25 Modernatx, Inc. Modifikuoti nukleozidai, nukleotidai ir nukleorūgštys bei jų naudojimas
AR088267A1 (es) 2011-10-06 2014-05-21 Hanmi Science Co Ltd Derivados, de los factores de coagulacion sanguinea vii y viia, conjugados y complejos que comprenden a los mismos y sus usos
EA030868B1 (ru) 2011-10-14 2018-10-31 Эмджен Инк. Инжектор и способ его сборки
WO2013065343A1 (ja) * 2011-10-31 2013-05-10 株式会社 島津製作所 非ペプチドヒンジ部含有フレキシブル抗体様分子
KR20140097151A (ko) 2011-11-17 2014-08-06 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 글루코코르티코이드 수용체 활성을 나타내는 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드
PL2791160T3 (pl) 2011-12-16 2022-06-20 Modernatx, Inc. Kompozycje zmodyfikowanego mrna
US9573987B2 (en) 2011-12-20 2017-02-21 Indiana University Research And Technology Corporation CTP-based insulin analogs for treatment of diabetes
BR112014017165B1 (pt) 2012-01-12 2023-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica compreendendo uma proteína de fator viii, composição farmacêutica, e seus usos
CN108465106B (zh) 2012-01-12 2022-05-27 普吉特海湾血液中心 降低经受因子viii疗法的个体中针对因子viii的免疫原性的方法
EP2623110A1 (en) 2012-01-31 2013-08-07 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for the treatment of neurological inflammatory disorders
EP2812357B1 (en) 2012-02-10 2020-11-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Single-chain antibodies and other heteromultimers
ES2771208T3 (es) 2012-02-15 2020-07-06 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
EP2814502B1 (en) 2012-02-15 2017-09-13 CSL Behring GmbH Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity
DK2822577T3 (en) 2012-02-15 2019-04-01 Bioverativ Therapeutics Inc RECOMBINANT FACTOR VIII PROTEINS
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
DE18200782T1 (de) 2012-04-02 2021-10-21 Modernatx, Inc. Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
WO2013166297A2 (en) * 2012-05-03 2013-11-07 Medimmune, Llc Method for analyzing sample components
EP3693000B1 (en) 2012-06-08 2022-03-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Procoagulant compounds
US10202595B2 (en) 2012-06-08 2019-02-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
MX356000B (es) 2012-06-21 2018-05-08 Hoffmann La Roche Analogos de glucagon que exhiben actividad del receptor gip.
CA2877358A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting gip receptor activity
CN104582736A (zh) 2012-06-21 2015-04-29 印第安纳大学研究及科技有限公司 Fc效应子功能改变的肠降血糖素受体配体多肽Fc区融合多肽和缀合物
MX354862B (es) 2012-06-27 2018-03-23 Hoffmann La Roche Método para la producción de entidades dirigidas altamente selectivas hechas a la medida y biespecíficas que contienen dos entidades de unión diferentes.
CA2871882A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
US10023628B2 (en) 2012-07-06 2018-07-17 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor VIII polypeptides and uses thereof
CN104661674A (zh) 2012-07-11 2015-05-27 阿穆尼克斯运营公司 具有xten和血管性血友病因子蛋白的因子viii复合物、及其用途
EP2872170A4 (en) * 2012-07-13 2016-06-22 Zymeworks Inc BISPECIFIC ASYMMETRIC HETÉRODIMÈRES COMPRISING ANTI-CD3 RECOMBINANT PRODUCTS
WO2014018777A2 (en) 2012-07-25 2014-01-30 Biogen Idec Ma Inc. Blood factor monitoring assay and uses thereof
SG11201408536WA (en) 2012-08-02 2015-01-29 Hoffmann La Roche METHOD FOR PRODUCING SOLUBLE FcR AS Fc-FUSION WITH INERT IMMUNOGLOBULIN Fc-REGION AND USES THEREOF
EP3542861A1 (en) 2012-09-25 2019-09-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fix polypeptides
US10391152B2 (en) 2012-10-18 2019-08-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
EP2911691B1 (en) 2012-10-23 2018-10-10 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using wnt pathway-binding agents
EP3446700A1 (en) 2012-10-30 2019-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fviii polypeptide
JP2015535464A (ja) 2012-11-21 2015-12-14 アムジエン・インコーポレーテツド 薬剤送達装置
RS63237B1 (sr) 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx Inc Terminalno modifikovana rnk
US10717965B2 (en) 2013-01-10 2020-07-21 Gloriana Therapeutics, Inc. Mammalian cell culture-produced neublastin antibodies
CN105073195A (zh) 2013-02-04 2015-11-18 昂科梅德制药有限公司 使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法及对该治疗的监测
DK2956477T4 (da) 2013-02-15 2024-04-15 Bioverativ Therapeutics Inc Optimeret faktor viii-gen
CN105188750A (zh) 2013-03-08 2015-12-23 德国杰特贝林生物制品有限公司 治疗和预防远端缺血-再灌注损伤
WO2014139994A1 (en) 2013-03-11 2014-09-18 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormone compounds
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
JP6768501B2 (ja) 2013-03-15 2020-10-14 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入機、および自動注入機システム
BR112015022042B1 (pt) 2013-03-15 2023-01-10 Amgen Inc Injetor para injetar um produto terapêutico
ES2973257T3 (es) 2013-03-15 2024-06-19 Amgen Inc Casete de fármaco, autoinyector y sistema de autoinyector
EP4039281A1 (en) * 2013-03-15 2022-08-10 Biomolecular Holdings LLC Hybrid immunoglobulin containing non-peptidyl linkage
RS60003B1 (sr) 2013-03-15 2020-04-30 Bioverativ Therapeutics Inc Formulacije polipeptida faktora viii
TWI745671B (zh) 2013-03-15 2021-11-11 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｉｘ多肽調配物
ES2695166T3 (es) 2013-03-15 2019-01-02 Intrinsic Lifesciences Llc Anticuerpos antihepcidina y usos de los mismos
SG11201507878SA (en) 2013-03-22 2015-10-29 Amgen Inc Injector and method of assembly
DK2796145T3 (da) 2013-04-22 2018-01-29 Csl Ltd Et kovalent kompleks af von Willebrand-faktor og faktor VIII linket af en disulfidbro
KR20160026905A (ko) 2013-06-28 2016-03-09 체에스엘 베링 게엠베하 인자 ｘｉｉ 억제제 및 ｃ1-억제제를 이용한 병용 치료요법
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
EP3043813B1 (en) 2013-08-08 2021-01-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Purification of chimeric fviii molecules
WO2015023891A2 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
CN103599527A (zh) * 2013-08-16 2014-02-26 安源生物科技(上海)有限公司 包含改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白的药物组合物
CN103397009B (zh) * 2013-08-16 2015-06-03 安源生物科技(上海)有限公司 改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白及其制备方法与用途
US10611794B2 (en) 2013-09-25 2020-04-07 Bioverativ Therapeutics Inc. On-column viral inactivation methods
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EA201690675A1 (ru) 2013-10-03 2016-08-31 Модерна Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды, кодирующие рецептор липопротеинов низкой плотности
JP6422956B2 (ja) 2013-10-11 2018-11-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性ドメイン交換共通可変軽鎖抗体
ES2744837T3 (es) 2013-10-24 2020-02-26 Amgen Inc Inyector y procedimiento de ensamblaje
JP7051293B2 (ja) 2013-10-24 2022-04-11 アムジエン・インコーポレーテツド 温度感知制御を伴う薬剤送達システム
US10584147B2 (en) 2013-11-08 2020-03-10 Biovertiv Therapeutics Inc. Procoagulant fusion compound
PL3068797T3 (pl) 2013-11-11 2020-06-29 Wake Forest University Health Sciences Konstrukty wielowalentnego celowania w nowotwory
US10947319B2 (en) 2013-11-27 2021-03-16 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting HER2
WO2015085276A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Biogen Idec Ma Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
EP3083933A1 (en) 2013-12-20 2016-10-26 Biogen MA Inc. Use of perfusion seed cultures to improve biopharmaceutical fed-batch production capacity and product quality
CN106029087A (zh) 2013-12-20 2016-10-12 印第安纳大学研究及科技有限公司 脂质化肠降血糖素受体配体人免疫球蛋白fc区融合多肽
DK3091997T5 (da) 2014-01-10 2024-10-14 Bioverativ Therapeutics Inc Kimære faktor viii-proteiner og anvendelser deraf
KR102382402B1 (ko) 2014-02-04 2022-04-01 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온 교환 크로마토그래피의 용도
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
PT3116486T (pt) * 2014-03-14 2020-03-12 Biomolecular Holdings Llc Imunoglobulina híbrida que contém uma ligação não peptídica
WO2015148444A1 (en) * 2014-03-24 2015-10-01 Biogen Ma Inc. Lyophilized factor ix formulations
SI3129406T1 (sl) * 2014-04-11 2019-04-30 Medimmune, Llc Konjugirane spojine, ki vsebujejo cisteinsko konstruirana protitelesa
BR112016025852B1 (pt) 2014-05-07 2022-11-01 Amgen Inc Dispositivo de injeção para aplicação de fármaco
KR102416904B1 (ko) 2014-06-03 2022-07-04 암겐 인코포레이티드 약물 전달 디바이스에 의해 수집된 데이터를 원격으로 프로세싱하기 위한 시스템들 및 방법들
WO2015193457A1 (en) 2014-06-18 2015-12-23 Csl Behring Gmbh Therapy using a factor xii inhibitor in a neurotraumatic disorder
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
DK3164150T3 (da) 2014-07-02 2021-02-08 CSL Behring Lengnau AG Modificeret von willebrand-faktor
AU2015321462B2 (en) 2014-09-22 2020-04-30 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
KR20170062490A (ko) 2014-09-26 2017-06-07 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 안정화된 아드레노메둘린 유도체 및 그의 용도
WO2016061220A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
CA2964317C (en) 2014-10-14 2021-10-05 Halozyme, Inc. Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
ES2739289T3 (es) * 2014-11-27 2020-01-30 Novo Nordisk As Derivados de GLP-1 y sus usos
CN107001482B (zh) 2014-12-03 2021-06-15 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3250609A4 (en) 2015-01-26 2018-07-11 The University of Chicago Il13ra alpha 2 binding agents and use thereof in cancer treatment
US20180170992A1 (en) 2015-01-26 2018-06-21 The University Of Chicago CAR T CELLS RECOGNIZING CANCER-SPECIFIC IL 13Ra2
SG10201907215QA (en) 2015-02-05 2019-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibodies Comprising An Ion Concentration Dependent Antigen-Binding Domain, Fc Region Variants, Il-8-Binding Antibodies, And Uses Therof
CA3069716C (en) 2015-02-17 2021-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
EP3274457A4 (en) 2015-03-26 2018-08-08 Acceleron Pharma Inc. Follistatin-related fusion proteins and uses thereof
DK3298036T3 (da) 2015-05-22 2022-06-07 CSL Behring Lengnau AG Fremgangsmåder til forberedelse af modificeret von Willebrand faktor
CA2986626A1 (en) 2015-05-22 2016-12-01 Csl Behring Recombinant Facility Ag Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
EP3303380B1 (en) 2015-06-02 2020-01-15 Novo Nordisk A/S Insulins with polar recombinant extensions
WO2017024060A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Biogen Ma Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
CR20180217A (es) 2015-09-18 2018-05-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos
MA43348A (fr) 2015-10-01 2018-08-08 Novo Nordisk As Conjugués de protéines
WO2017070167A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for modified factor ix fusion proteins
WO2017100501A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
CN105384828B (zh) * 2015-12-18 2019-06-21 中国科学技术大学 长效干扰素-α及其改造方法
EP3184149A1 (en) 2015-12-23 2017-06-28 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Soluble glycoprotein v for treating thrombotic diseases
RU2647769C2 (ru) * 2015-12-30 2018-03-19 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Химерный улучшенный рекомбинантный фактор VIII
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
RU2018128582A (ru) 2016-01-07 2020-02-11 Цсл Беринг Ленгнау Аг Мутированный укороченный фактор фон виллебранда
AU2017205776B2 (en) 2016-01-07 2020-09-10 CSL Behring Lengnau AG Mutated von Willebrand factor
SG10201912405TA (en) 2016-01-11 2020-02-27 Inhibrx Inc Multivalent and multispecific 41bb-binding fusion proteins
US11753461B2 (en) 2016-02-01 2023-09-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor VIII genes
CN106397599B (zh) 2016-02-23 2020-08-07 上海交通大学 二价双特异性抗体杂交蛋白的表达和制备方法
CN106397598B (zh) * 2016-02-23 2020-07-14 上海交通大学 多价多特异性抗体及免疫杂合蛋白的表达和制备方法
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
AU2017247004B2 (en) 2016-04-06 2022-07-07 Csl Limited Method of treating atherosclerosis
US20190153119A1 (en) * 2016-04-14 2019-05-23 Iconic Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating disorders associated with neovascularization
AU2017257504A1 (en) 2016-04-26 2018-10-25 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017191817A1 (ja) 2016-05-02 2017-11-09 味の素株式会社 アジド基含有Ｆｃタンパク質
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
AU2017268198C1 (en) 2016-05-16 2020-11-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited Anti-Factor IX Padua antibodies
EP3465124A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
US11285266B2 (en) 2016-07-01 2022-03-29 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3519431A1 (en) 2016-09-28 2019-08-07 Cohbar Inc. Therapeutic mots-c related peptides
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
US11249082B2 (en) 2016-10-29 2022-02-15 University Of Miami Zika virus assay systems
EP3538133B1 (en) 2016-11-11 2021-02-17 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
CA3043397A1 (en) 2016-11-11 2018-05-17 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for extravascular administration in the treatment or prophylaxis of a blood coagulation disorder
JP2019536794A (ja) 2016-12-02 2019-12-19 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 凝固因子に対する免疫寛容を誘導する方法
EP3548066A1 (en) 2016-12-02 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilic arthropathy using chimeric clotting factors
MX2019008432A (es) 2017-01-17 2019-11-18 Amgen Inc Dispositivos de inyeccion y metodos relacionados de uso y ensamblaje.
EP3573641A4 (en) * 2017-01-25 2020-11-11 Iconic Therapeutics, Inc. TREATMENT METHODS FOR DISORDERS ASSOCIATED WITH ANGIOGENESIS AND NEOVASCULARIZATION
CA3051481A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Phospholipid ether (ple) car t cell tumor targeting (ctct) agents
AU2018221351B2 (en) 2017-02-17 2023-02-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
US11752258B2 (en) 2017-02-17 2023-09-12 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
US11117930B2 (en) 2017-02-23 2021-09-14 Adrx, Inc. Peptide inhibitors of transcription factor aggregation
CN110582288B (zh) 2017-02-28 2024-09-20 恩多塞特公司 用于car t细胞疗法的组合物和方法
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
US11571511B2 (en) 2017-03-07 2023-02-07 Amgen Inc. Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device
AU2018230486B2 (en) 2017-03-09 2023-05-11 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
US11872194B2 (en) 2017-03-14 2024-01-16 Ohio State Innovation Foundation Methods and compositions related to a tissue factor-targeting IGG3 immunoconjugates
CN110446499A (zh) 2017-03-20 2019-11-12 豪夫迈·罗氏有限公司 一种体外糖基工程化红细胞生成刺激蛋白的方法
HUE063805T2 (hu) 2017-03-28 2024-01-28 Amgen Inc Dugattyúrúd és fecskendõ összeállító rendszer és eljárás
WO2018185131A2 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Novo Nordisk A/S Oligomer extended insulin-fc conjugates
KR20190141686A (ko) * 2017-04-21 2019-12-24 제넨테크, 인크. 질환 치료를 위한 klk5 길항제의 용도
EP3621649A2 (en) * 2017-05-10 2020-03-18 Albajuna Therapeutics, S.L. Fc-fusion protein derivatives with high dual hiv antiviral and immunomodulatory activity
US20230137562A1 (en) 2017-06-07 2023-05-04 Adrx, Inc. Tau aggregation inhibitors
JP7200134B2 (ja) 2017-06-08 2023-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド トルク駆動式薬物送達デバイス
EP3634539A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
PL3641800T3 (pl) 2017-06-22 2024-03-18 CSL Behring Lengnau AG Modulacja immunogenności fviii przez skrócony vwf
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
JP7475860B2 (ja) 2017-06-23 2024-04-30 アムジエン・インコーポレーテツド スイッチアセンブリにより起動されるキャップを含む電子薬物送達デバイス
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
EP3655063A1 (en) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
BR112020002394A2 (pt) 2017-08-09 2020-07-28 Bioverativ Therapeutics Inc. moléculas de ácidos nucleicos e usos das mesmas
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
AU2018318319A1 (en) 2017-08-18 2020-02-20 Adrx, Inc. Tau aggregation peptide inhibitors
MA49897A (fr) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc Injecteur sur-corps avec patch adhésif stérile
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
CN111132711B (zh) 2017-10-06 2022-07-01 安进公司 带有联锁组件的药物递送装置及相关组装方法
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
WO2019090079A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
CA3079197A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CN111225696B (zh) 2017-11-10 2023-07-18 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
AU2018368338B2 (en) 2017-11-16 2024-07-25 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
IL273638B2 (en) 2017-11-16 2024-10-01 Amgen Inc Door lock mechanism for drug delivery device
JP7002927B2 (ja) 2017-11-22 2022-01-20 本田技研工業株式会社 駆動軸配置構造
WO2019144095A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Methods of use for car t cells
TW201946929A (zh) 2018-02-01 2019-12-16 美商生物化學醫療公司 表現因子ｖｉｉｉ之慢病毒載體之使用
US20200040103A1 (en) 2018-03-14 2020-02-06 Genentech, Inc. Anti-klk5 antibodies and methods of use
MX2020009975A (es) 2018-03-28 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso.
CU24554B1 (es) 2018-05-07 2021-11-04 Ct Inmunologia Molecular Proteínas de fusión compuestas por una muteína de interleucina 2 e interferón tipo 1
NZ769677A (en) 2018-05-18 2024-07-05 Bioverativ Therapeutics Inc Methods of treating hemophilia a
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
US11830582B2 (en) 2018-06-14 2023-11-28 University Of Miami Methods of designing novel antibody mimetics for use in detecting antigens and as therapeutic agents
CN112601517A (zh) 2018-07-03 2021-04-02 百时美施贵宝公司 Fgf-21配制品
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
WO2020033863A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
EP3856283A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
WO2020072577A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
TWI824026B (zh) 2018-10-05 2023-12-01 美商安進公司 具有劑量指示器之藥物遞送裝置
CN109439679A (zh) * 2018-10-09 2019-03-08 上海市儿童医院 一种高活性重组人凝血因子ix融合蛋白及其制备方法
KR20210076935A (ko) 2018-10-15 2021-06-24 암젠 인크 댐핑 메커니즘을 갖는 약물 전달 장치
SG11202101824VA (en) 2018-10-15 2021-03-30 Amgen Inc Platform assembly process for drug delivery device
WO2020086408A1 (en) 2018-10-26 2020-04-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A high-yield perfusion-based transient gene expression bioprocess
CA3113076A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
WO2020091956A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
CN113518784A (zh) 2019-01-28 2021-10-19 科巴公司 治疗性肽
KR20210141608A (ko) 2019-03-19 2021-11-23 체에스엘 베링 렝나우 아게 치료요법에서 인자 ix 변이체 및 이의 용도
CA3136720A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 Codiak Biosciences, Inc. Compositions of exosomes and aav
WO2020219482A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
US20220211808A1 (en) 2019-05-17 2022-07-07 Universitaet Zuerich Haptoglobin for use in treating an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke
EP3986918A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 Bayer Aktiengesellschaft Adrenomedullin-analogues for long-term stabilization and their use
AU2020300820A1 (en) 2019-07-04 2022-03-03 CSL Behring Lengnau AG A truncated von willebrand factor (vWF) for increasing the in vitro stability of coagulation factor VIII
EP4017560A2 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Amgen, Inc Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
TW202126284A (zh) 2019-09-30 2021-07-16 美商百歐維拉提夫治療公司 慢病毒載體配製物
WO2021094344A1 (en) 2019-11-11 2021-05-20 CSL Behring Lengnau AG Polypeptides for inducing tolerance to factor viii
EP4058465A1 (en) 2019-11-14 2022-09-21 Cohbar Inc. Cxcr4 antagonist peptides
JP2023510115A (ja) 2019-12-20 2023-03-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規ｉｌ２アゴニストおよびそれらの使用方法
AU2020411480B2 (en) 2019-12-23 2023-12-21 Denali Therapeutics Inc. Progranulin variants
KR20220139915A (ko) 2020-02-06 2022-10-17 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Il-10 및 그의 용도
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
EP4247416A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 CSL Behring GmbH Method for treating antibody-mediated rejection
EP4284407A1 (en) 2021-02-01 2023-12-06 CSL Behring AG Method of treating or preventing an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke
KR20240005075A (ko) 2021-05-07 2024-01-11 체에스엘 베링 아게 재조합 합토글로빈 (hp) 베타 쇄를 생산하기 위한 발현 시스템
MX2023013640A (es) 2021-05-21 2023-11-30 Amgen Inc Metodo de optimizacion de una receta de llenado para un contenedor de medicamento.
CN118451096A (zh) 2021-10-20 2024-08-06 辛德凯因股份有限公司 异二聚体fc细胞因子及其用途
TW202423475A (zh) 2022-09-02 2024-06-16 瑞士商Ｃｓｌ貝林股份有限公司 用於治療或預防過度勃起反應或勃起功能障礙之血紅素結合蛋白
WO2024094457A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing glycoprotein compositions
CN118496347B (zh) * 2024-05-30 2024-10-25 北京航空航天大学杭州创新研究院 一种用于抗体寡核苷酸偶联的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001510807A (ja) * 1997-07-24 2001-08-07 ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド 治療剤の受容体特異的経上皮輸送
WO2001081376A2 (en) * 2000-04-21 2001-11-01 Amgen Inc. Apo-ai/aii peptide derivatives
WO2001081415A2 (en) * 2000-04-27 2001-11-01 Amgen Inc. Parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein antagonists
JP2002536960A (ja) * 1998-10-23 2002-11-05 アムジエン・インコーポレーテツド Ｍｐ１受容体に結合し血小板生成活性を有する二量体トロンボポエチンペプチド模倣体
JP2003512011A (ja) * 1998-10-23 2003-04-02 アムジエン・インコーポレーテツド 治療薬としての修飾ペプチド

Family Cites Families (307)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US660843A (en) * 1900-05-16 1900-10-30 Rebecca Coyle Nursing-gown.
US786376A (en) 1902-05-15 1905-04-04 Fischer Motor Vehicle Company Electrogasolene-vehicle.
US3941763A (en) * 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
US4456591A (en) 1981-06-25 1984-06-26 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Therapeutic method for activating factor VII
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
AU561343B2 (en) 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US4444878A (en) 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5189015A (en) 1984-05-30 1993-02-23 Alfa-Laval Agri International Ab Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability
US5077204A (en) 1984-06-21 1991-12-31 Chiron Corporation Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use
US4849407A (en) 1986-08-13 1989-07-18 Zymogenetics, Inc. Biologically active mosaic proteins
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
DK525384D0 (da) * 1984-11-05 1984-11-05 Nordisk Insulinlab Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat
US5157021A (en) 1985-03-15 1992-10-20 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
EP0218712B1 (en) 1985-04-12 1992-02-26 Genetics Institute, Inc. Novel procoagulant proteins
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4745055A (en) 1985-05-07 1988-05-17 California Biotechnology Inc. Fused protein for enzyme immunoassay system
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
US5180583A (en) 1985-11-26 1993-01-19 Hedner Ulla K E Method for the treatment of bleeding disorders
ATE87663T1 (de) 1986-01-03 1993-04-15 Genetics Inst Verfahren zur herstellung von faktor-viii:c-typ- proteinen.
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
IL78444A (en) 1986-04-08 1992-05-25 Yeda Res & Dev Human gamma interferon-specific receptor protein,antibody against said protein,and compositions containing said protein and antibody
US5543502A (en) 1986-06-24 1996-08-06 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
CA1340456C (en) 1986-07-07 1999-03-23 Hubert J.P. Schoemaker Chimeric rodent/human immunoglobulins specific for tumor-associated antigens
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
NO873164L (no) 1986-07-30 1988-02-01 Teijin Ltd Muse-humane kimaere antistoffer.
IL84285A (en) 1986-10-27 1993-03-15 Int Genetic Engineering Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen
GB8626412D0 (en) 1986-11-05 1986-12-03 Clark M R Antibodies
CA1339445C (en) 1986-11-12 1997-09-09 The General Hospital Corporation Recombinant hybrid immunoglobulin molecules and method of use
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5258498A (en) * 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
IE69026B1 (en) 1987-06-12 1996-08-07 Immuno Ag Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US6018026A (en) * 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
ZA89430B (en) * 1988-01-22 1989-10-25 Gen Hospital Corp Cloned genes encoding ig-cd4 fusion proteins and the use thereof
JP2643968B2 (ja) 1988-02-03 1997-08-25 サントリー株式会社 Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼ及びその製造方法
US5234830A (en) 1988-02-03 1993-08-10 Suntory Limited DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
AU643427B2 (en) 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FR2641468A1 (fr) * 1989-01-11 1990-07-13 Merieux Inst Anticorps chimeriques anti-recepteur de l'interleukine-2 humaine, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
SE8901687D0 (sv) 1989-05-11 1989-05-11 Alfa Laval Agri Int Fibronectin binding protein as well as its preparation
ES2057571T3 (es) 1989-05-22 1994-10-16 Zymogenetics Inc Receptor de pdgf-alfa.
US5061786A (en) 1989-05-25 1991-10-29 Genentech, Inc. Biologically active polypeptides based on transforming growth factor-β
US5194596A (en) 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
DE69005740T2 (de) 1989-08-21 1994-06-01 Ngk Insulators Ltd Aufzeichnungskopf, bestehend aus einem eine Elektrode tragenden Substrat mit einem dünnwandigen Kontaktendteil, und Schicht zur Verstärkung des Substrats.
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
JPH0396383A (ja) 1989-09-08 1991-04-22 Riso Kagaku Corp 画像形成装置
EP0417563B1 (de) 1989-09-12 2000-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US5935815A (en) 1989-10-25 1999-08-10 Katholieke Universiteit Leuven Process for micro biological production of proteins
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
US5648273A (en) 1989-12-27 1997-07-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Hepatic growth factor receptor is the MET proto-oncogene
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9009106D0 (en) 1990-04-23 1990-06-20 3I Res Expl Ltd Processes and intermediates for synthetic antibody derivatives
CA2040099A1 (en) 1990-05-01 1991-11-02 Mariano Barbacid Tyrosine kinase negative trkb
US20030064480A1 (en) 1990-06-28 2003-04-03 Leander Lauffer Fusion proteins with immunoglobulin portions, the preparation and use thereof
DK0464533T3 (da) 1990-06-28 1999-04-26 Gen Hospital Corp Fusionsproteiner med immunglobulindele, deres fremstilling og anvendelse
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5453491A (en) 1990-09-11 1995-09-26 Kiyoshi Takatsu Murine interleukin-5 receptor
JP4236698B2 (ja) 1990-11-26 2009-03-11 ジェネティックス インスティチュート，リミテッド ライアビリティ カンパニー 宿主細胞でのｐａｃｅの発現およびその使用法
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
EP0563214A4 (en) * 1990-12-04 1994-08-17 Wistar Inst Bifunctional antibodies and method of preparing same
US5374617A (en) 1992-05-13 1994-12-20 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of bleeding with modified tissue factor in combination with FVIIa
US5541063A (en) 1991-04-19 1996-07-30 Schering Corporation Human interleukin-3 receptor α subunit
ATE170559T1 (de) * 1991-05-31 1998-09-15 Genentech Inc Behandlung der hiv-assoziierten immun- thrombopenie purpura
US5227158A (en) 1991-06-10 1993-07-13 Genentech, Inc. Method of stimulating hepatocyte proliferation by administration of hepatocyte growth factor and gamma-interferon
US5346991A (en) 1991-06-13 1994-09-13 Genentech, Inc. Tissue factor mutants useful for the treatment of myocardial infarction and coagulopathic disorders
US5348856A (en) 1991-07-08 1994-09-20 E. R. Squibb & Sons, Inc. DNA encoding TRKC protein
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5116753A (en) * 1991-07-30 1992-05-26 The Salk Institute For Biological Studies Maintenance of pancreatic islets
US5932448A (en) * 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
US5454933A (en) * 1991-12-16 1995-10-03 Exxon Research And Engineering Company Deep desulfurization of distillate fuels
DK0654085T3 (da) * 1992-01-23 1997-09-22 Merck Patent Gmbh Monomere og dimere antistof-fragment-fusionsproteiner
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1993016177A1 (en) 1992-02-11 1993-08-19 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
ES2252732T3 (es) 1992-05-26 2006-05-16 Immunex Corporation Nueva citoquina que une cd30.
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
WO1994005328A1 (en) 1992-08-28 1994-03-17 The Scripps Research Institute Inhibition of tumor metastasis via neutralization of tissue factor function
GB2270845B (en) 1992-09-24 1996-07-10 Smiths Ind Med Syst Inc Suction catheter assemblies
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
DE69332859T2 (de) 1992-11-13 2003-12-18 Idec Pharmaceuticals Corp., San Diego Konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier-exprimierung
US5648446A (en) * 1993-02-24 1997-07-15 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Diguanamines and preparation process, derivatives and use thereof
WO1994028017A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 The Scripps Research Institute Human mutant tissue factor compositions useful as tissue factor antagonists
US6518013B1 (en) 1993-06-07 2003-02-11 Trimeris, Inc. Methods for the inhibition of epstein-barr virus transmission employing anti-viral peptides capable of abrogating viral fusion and transmission
US5464933A (en) 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6017536A (en) 1993-06-07 2000-01-25 Trimeris, Inc. Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
US6310180B1 (en) * 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
KR950003279A (ko) 1993-07-29 1995-02-16 고사이 아끼오 플루오로알칸 카르복사미드 유도체의 제조방법
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6740734B1 (en) 1994-01-14 2004-05-25 Biovitrum Ab Bacterial receptor structures
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5648240A (en) * 1994-05-24 1997-07-15 Texas A&M University MHC II analog from Staphylococcus aureus
HU220347B (hu) 1994-07-11 2001-12-28 Board Of Regents The University Of Texas System Készítmény az érrendszer specifikus koagulálásához
AU3559695A (en) * 1994-09-30 1996-04-26 Inex Pharmaceuticals Corp. Glycosylated protein-liposome conjugates and methods for their preparation
US5596080A (en) * 1994-10-03 1997-01-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Crosslinking processes/agents for zein
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
JP4026848B2 (ja) * 1995-01-17 2007-12-26 ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド 免疫原の受容体特異的経上皮輸送
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5591573A (en) 1995-04-10 1997-01-07 Alpha Therapeutic Corporation Method and system for testing blood samples
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) * 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5579277A (en) * 1995-05-01 1996-11-26 Apple Computer, Inc. System and method for interleaving memory banks
US6184344B1 (en) * 1995-05-04 2001-02-06 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
JPH11507632A (ja) 1995-06-07 1999-07-06 トリメリス，インコーポレーテッド 併用療法を用いたｈｉｖおよび他のウイルス感染の治療
US5840529A (en) 1995-08-02 1998-11-24 Clinical Research Institute Of Montreal Mammalian pro-hormone convertase
DK0848755T4 (da) 1995-09-08 2011-05-23 Genentech Inc VEGF relateret protein
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US20030026779A1 (en) 1999-10-15 2003-02-06 Liming Yu Treatment of tumors and viral infections with a hybrid conjugate of interferon and an immunoglobulin Fc
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
CA2198968C (en) * 1996-03-04 2010-02-09 Toyofumi Masuda Process for production of secretory kex2 derivatives
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
WO1998000543A1 (en) 1996-07-03 1998-01-08 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor agonists and uses thereof
CA2203745A1 (en) 1996-07-26 1998-01-26 Robert Day Pro-protein converting enzyme
CA2262405A1 (en) 1996-08-02 1998-02-12 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
US6159462A (en) 1996-08-16 2000-12-12 Genentech, Inc. Uses of Wnt polypeptides
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
EP2371962A3 (en) 1996-12-23 2011-12-21 Immunex Corporation Receptor activator of NF-KAPPA B, receptor is member of TNF receptor superfamily
US6271349B1 (en) 1996-12-23 2001-08-07 Immunex Corporation Receptor activator of NF-κB
BR9806793A (pt) 1997-01-22 2000-05-16 Univ Texas Processos e composições de fator tissular para coagulação e tratamento de tumores.
TW502011B (en) * 1997-02-05 2002-09-11 Ajinomoto Kk Process for producing n-long-chain acyl acidic amino acids or salts thereof
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
JP4128227B2 (ja) 1997-03-14 2008-07-30 バイオジェン・アイデック・インコーポレイテッド 哺乳類細胞内の特定部位に相同組換えによって遺伝子を組み込む方法とそれを実施するためのベクター
DK0985039T3 (da) 1997-06-12 2008-06-09 Novartis Int Pharm Ltd Kunstige antistof-polypeptider
WO1998056807A1 (en) * 1997-06-13 1998-12-17 Gryphon Sciences Solid phase native chemical ligation of unprotected or n-terminal cysteine protected peptides in aqueous solution
EP0885571B1 (de) * 1997-06-21 2003-08-27 Tesa AG Klebfolienstreifen-Verbund und seine Verwendung
US6310183B1 (en) * 1997-09-10 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Coagulation factor VIIa composition
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
CA2318482C (en) 1998-01-23 2010-04-13 Immunex Corporation Il-18 receptors
HUP0100813A3 (en) 1998-02-25 2003-08-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
US6008321A (en) 1998-03-16 1999-12-28 Pharmacopeia, Inc. Universal linker for combinatorial synthesis
US6281331B1 (en) 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP1082137A4 (en) 1998-05-06 2004-05-19 Univ Temple REVERSE OF PERCENTAL RESPONSE BY INTERRUPTING THE MACROPHAGE RECEPTOR FcSg (g) RI
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
AU4090299A (en) * 1998-05-20 1999-12-06 Sdg, Inc. Liposomal delivery complex
US6355782B1 (en) 1998-07-09 2002-03-12 Baylor College Of Medicine Hypohidrotic ectodermal dyplasia genes and proteins
US6596847B2 (en) 1998-07-15 2003-07-22 Genentech, Inc. Tissue factor protein variants
DK1100830T3 (da) * 1998-07-28 2004-01-19 Micromet Ag Heterominiantistoffer
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6927044B2 (en) 1998-09-25 2005-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-1 receptor based cytokine traps
EP1117693B1 (en) * 1998-09-30 2006-05-17 New England Biolabs, Inc. Intein mediated peptide ligation
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
JP4463988B2 (ja) 1998-11-06 2010-05-19 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト Ｖｉｉ因子の生産方法
US6280994B1 (en) 1998-11-25 2001-08-28 Zymogenetics, Inc. Zace 1: a human metalloenzyme
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
AU762047B2 (en) 1999-01-06 2003-06-19 Genentech Inc. Insulin-like growth factor (IGF) I mutant variants
JP3971108B2 (ja) 1999-01-06 2007-09-05 ジェネンテック・インコーポレーテッド インシュリン様成長因子（ｉｇｆ）ｉ突然変異体
EP1141024B1 (en) * 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
SE9901379D0 (sv) 1999-04-19 1999-04-19 Pharmacia & Upjohn Ab Receptor structures
US6602977B1 (en) 1999-04-19 2003-08-05 Biovitrum Ab Receptor structures
CA2270600A1 (en) * 1999-05-03 2000-11-03 Infectio Recherche Inc. Method and formulations for the treatment of diseases, particularly those caused by human immunodeficiency virus and leishmania
WO2000069913A1 (en) * 1999-05-19 2000-11-23 Lexigen Pharmaceuticals Corp. EXPRESSION AND EXPORT OF INTERFERON-ALPHA PROTEINS AS Fc FUSION PROTEINS
JP2003504315A (ja) 1999-07-01 2003-02-04 エール ユニバーシティ 血管新生標的免疫複合体
AU781618C (en) 1999-07-02 2006-03-16 Genentech Inc. FVIIa antagonists
IL147270A0 (en) 1999-07-02 2002-08-14 Genentech Inc Fusion peptides comprising a peptide ligand domain and a multimerization domain
US6469136B1 (en) 1999-07-07 2002-10-22 Trimeris, Inc. Methods and composition for peptide synthesis
ATE407697T1 (de) 1999-07-13 2008-09-15 Bolder Biotechnology Inc Erythropoietin immunglobulin fusionsproteine
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
CN1235911C (zh) * 1999-08-09 2006-01-11 利思进药品公司 多细胞因子－抗体复合物
CA2387545A1 (en) * 1999-10-14 2001-04-19 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating or preventing cell, tissue, and organ damage using human myeloid progenitor inhibitory factor-1 (mpif-1)
AU780693B2 (en) 1999-11-05 2005-04-14 Curis, Inc. Hedgehog fusion proteins and uses
WO2001036489A2 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gmbh Erythropoietin forms with improved properties
US6808902B1 (en) * 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
WO2001036637A1 (en) * 1999-11-17 2001-05-25 Immunex Corporation Receptor activator of nf-kappa b
DE19963859A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
ATE428445T1 (de) 2000-02-11 2009-05-15 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
AU4314801A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Lexigen Pharm Corp Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
AU2001249389A1 (en) 2000-03-22 2001-10-03 The Children's Hospital Of Philadelphia Modified blood clotting factors and methods of use
DE10020332A1 (de) 2000-04-26 2001-11-15 Henkel Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel
US20020090646A1 (en) * 2000-05-03 2002-07-11 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
JP2003533187A (ja) 2000-05-03 2003-11-11 アムジエン・インコーポレーテツド 治療薬としてのＦｃドメインを含む修飾ペプチド
AU2001274904B2 (en) 2000-05-26 2006-08-31 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neuroprotective peptides
AU2001270609A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
WO2002018417A1 (en) 2000-09-01 2002-03-07 Gryphon Therapeutics, Inc. Nucleophile-stable thioester generating compounds, methods of production and use
DK1332209T3 (da) 2000-09-08 2010-03-29 Univ Zuerich Samlinger af repeatproteiner indeholdende repeatmoduler
US7208151B2 (en) 2001-09-12 2007-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Tweak receptor agonists as anti-angiogenic agents
US7138119B2 (en) * 2000-09-15 2006-11-21 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of HIV-1 infection
US7615537B2 (en) 2000-10-25 2009-11-10 Genzyme Corporation Methods for treating blood coagulation disorders
EP1339427A4 (en) 2000-11-01 2004-09-15 Elusys Therapeutics Inc PROCESS FOR PRODUCING BISPECIFIC MOLECULES BY TRANSEPISSANCE OF PROTEINS
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
DE60143544D1 (de) 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
IL157142A0 (en) 2001-01-29 2004-02-08 Idec Pharma Corp Modified antibodies and methods of use
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
US20040132971A1 (en) * 2001-02-09 2004-07-08 Haaning Jesper Mortensen Rank ligand-binding polypeptides
HUP0303171A2 (hu) * 2001-02-19 2003-12-29 Merck Patent Gmbh Csökkentett immunogenitású mesterséges fehérjék
US7235638B2 (en) 2001-03-22 2007-06-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Coagulation factor VII derivatives
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
WO2002088171A2 (en) 2001-04-26 2002-11-07 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
WO2002089828A2 (en) 2001-05-04 2002-11-14 Institute Of Molecular And Cell Biology Interferons in the treatment of ischemia
US7419949B2 (en) 2001-07-16 2008-09-02 Novo Noridsk Healthcare A/G Single-dose administration of factor VIIa
US7144380B2 (en) * 2001-07-23 2006-12-05 Gilliam Larry A Traction method and device
DE60116091T2 (de) 2001-08-31 2006-08-31 Zeger De Lille Bohrvorrichtung
ATE364632T1 (de) 2001-10-05 2007-07-15 Affimed Therapeutics Ag Antikörper menschlichen ursprungs zur hemmung der thrombozytenaggregation
FR2831170B1 (fr) 2001-10-19 2004-03-19 Inst Nat Sante Rech Med Proteines c modifiees activables directement par la thrombine
US20030078180A1 (en) 2001-10-24 2003-04-24 Benchmark Research & Technology, Inc. Contaminant-tolerant foaming additive
ES2545090T3 (es) 2001-12-21 2015-09-08 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de albúmina y GCSF
US20040102440A1 (en) 2002-07-01 2004-05-27 Wong Erik Ho Fong Method of promoting smoking cessation
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
WO2003072060A2 (en) * 2002-02-27 2003-09-04 Immunex Corporation Polypeptide formulation
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
JP2006502091A (ja) 2002-03-01 2006-01-19 イミューノメディクス、インコーポレイテッド クリアランス速度を高めるための二重特異性抗体点変異
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
JP2005526769A (ja) 2002-03-15 2005-09-08 ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド 治療剤を全身搬送するための中央気道投与
MXPA05000063A (es) 2002-07-01 2005-04-08 Kenneth S Warren Inst Inc Citocinas recombinantes protectoras de tejido y acidos nucleicos que las codifican para la proteccion, restauracion y mejora de celulas, tejidos y organos respondedores.
WO2004004798A2 (en) 2002-07-03 2004-01-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
EP1523504A2 (en) 2002-07-12 2005-04-20 Novo Nordisk A/S A tissue factor binding immunoconjugate comprising factor viia
US20040110929A1 (en) 2002-07-12 2004-06-10 Bjorn Soren E. TF binding compound
JP4459810B2 (ja) 2002-08-14 2010-04-28 マクロジェニクス，インコーポレーテッド ＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体とその利用法
EP3502133A1 (en) 2002-09-27 2019-06-26 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
AU2003286467B2 (en) 2002-10-15 2009-10-01 Abbvie Biotherapeutics Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1587540B1 (en) 2003-01-09 2021-09-15 MacroGenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050281829A1 (en) 2003-05-06 2005-12-22 Hehir Cristina A T Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs
CA2522690A1 (en) 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
ES2558102T3 (es) 2003-05-06 2016-02-02 Biogen Hemophilia Inc. Proteínas quiméricas del factor de coagulación para el tratamiento de un trastorno hemostático
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ATE385806T1 (de) 2003-06-12 2008-03-15 Lilly Co Eli Fusionsproteine
AU2003264100A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
SG10202008722QA (en) 2003-11-05 2020-10-29 Roche Glycart Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
US7736653B2 (en) 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin Fc region as a carrier
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
US8263084B2 (en) 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
CA2546580A1 (en) 2003-11-18 2005-06-09 Iconic Therapeutics, Inc. Homogeneous preparations of chimeric proteins
US20050249723A1 (en) 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
UA86605C2 (ru) 2004-01-12 2009-05-12 Аплайд Молекьюлер Иволюшн, Инк. Антитело, которое содержит вариант исходного человеческого fс-участка
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2006083275A2 (en) 2004-05-21 2006-08-10 The Uab Research Foundation Variable lymphocyte receptors, related polypeptides and nucleic acids, and uses thereof
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
BRPI0510674A (pt) 2004-07-15 2007-12-26 Xencor Inc variantes fc otimizadas
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
WO2006055689A2 (en) 2004-11-16 2006-05-26 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
EP1868650B1 (en) 2005-04-15 2018-10-03 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US7427787B2 (en) 2005-07-08 2008-09-23 Texas Instruments Incorporated Guardringed SCR ESD protection
US7666622B2 (en) 2005-10-19 2010-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Monomeric self-associating fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
EP1820508A1 (en) 2006-02-21 2007-08-22 CSL Behring GmbH Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties
WO2007109254A2 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
EP2650305B1 (en) * 2006-03-24 2024-05-08 Bioverativ Therapeutics Inc. PC5 as a factor IX propeptide processing enzyme
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
ES2889920T3 (es) 2006-06-14 2022-01-14 Csl Behring Gmbh Proteínas de fusión escindibles proteolíticamente con alta actividad específica molar
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
EP1952822A1 (en) 2007-01-26 2008-08-06 Novo Nordisk A/S Factor VII polypeptides with increased affinity to platelets
CA2682605A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
EP2158318A2 (en) 2007-05-14 2010-03-03 Biogen Idec MA, Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
WO2009053368A1 (en) 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Single ifn-beta fused to a mutated igg fc fragment
TWI538916B (zh) 2008-04-11 2016-06-21 介控生化科技公司 經修飾的因子vii多肽和其用途
US20110077202A1 (en) 2008-05-16 2011-03-31 Bayer Healthcare Llc Targeted Coagulation Factors and Method of Using the Same
US20120093840A1 (en) 2009-04-06 2012-04-19 Novo Nordisk A/S Targeted delivery of factor viii proteins to platelets
JP5909180B2 (ja) 2009-06-25 2016-04-26 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル キメラ第ｖｉｉ因子分子
JP2013503140A (ja) 2009-08-27 2013-01-31 ノヴォ ノルディスク アー／エス 活性化血小板に対する組織因子の標的化
CA2782424C (en) 2009-12-06 2021-07-27 Biogen Idec Hemophilia Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
PT2591006T (pt) 2010-07-09 2019-07-29 Bioverativ Therapeutics Inc Moléculas de cadeia simples processáveis e polipéptidos preparados utilizando as mesmas
EP3508573A1 (en) * 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
CN103140237A (zh) * 2010-07-09 2013-06-05 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 因子ix多肽及其使用方法
JP6309273B2 (ja) 2011-03-02 2018-04-11 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 活性化血小板上のｔｌｔ−１に対する凝固因子の標的化

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001510807A (ja) * 1997-07-24 2001-08-07 ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド 治療剤の受容体特異的経上皮輸送
JP2002536960A (ja) * 1998-10-23 2002-11-05 アムジエン・インコーポレーテツド Ｍｐ１受容体に結合し血小板生成活性を有する二量体トロンボポエチンペプチド模倣体
JP2003512011A (ja) * 1998-10-23 2003-04-02 アムジエン・インコーポレーテツド 治療薬としての修飾ペプチド
WO2001081376A2 (en) * 2000-04-21 2001-11-01 Amgen Inc. Apo-ai/aii peptide derivatives
WO2001081415A2 (en) * 2000-04-27 2001-11-01 Amgen Inc. Parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein antagonists

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016537008A (ja) * 2013-09-06 2016-12-01 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ Ｃａｓ９バリアントおよびその使用

Also Published As

Publication number Publication date
CA2522590C (en) 2016-08-09
HK1161604A1 (zh) 2012-07-27
PL1625209T3 (pl) 2013-12-31
NO2017027I1 (no) 2017-06-23
AU2004252422B2 (en) 2011-10-27
US8932830B2 (en) 2015-01-13
SI1625209T1 (sl) 2013-12-31
NO20055773D0 (no) 2005-12-06
EP1625209A2 (en) 2006-02-15
WO2004101739A2 (en) 2004-11-25
LTPA2016007I1 (lt) 2021-07-12
US20200071385A1 (en) 2020-03-05
JP2018002737A (ja) 2018-01-11
BR122019011535B1 (pt) 2021-08-31
PT2361932T (pt) 2016-08-02
CY2016007I1 (el) 2016-08-31
EP2361932A1 (en) 2011-08-31
HUE030065T2 (en) 2017-04-28
EP1654378A2 (en) 2006-05-10
ES2579938T3 (es) 2016-08-17
BRPI0410345A8 (pt) 2017-10-10
NO20160483A1 (no) 2006-01-04
EP2174946B1 (en) 2016-07-06
UA95436C2 (uk) 2011-08-10
EA012566B1 (ru) 2009-10-30
JP5091480B2 (ja) 2012-12-05
US20110159540A1 (en) 2011-06-30
EP2357196B1 (en) 2016-05-04
NO339539B1 (no) 2016-12-27
CA2522590A1 (en) 2005-01-06
TWI353991B (en) 2011-12-11
US7404956B2 (en) 2008-07-29
NO2020016I1 (no) 2020-06-12
US20080249288A1 (en) 2008-10-09
US20230023927A1 (en) 2023-01-26
NO2017027I2 (no) 2017-06-23
US9725496B1 (en) 2017-08-08
WO2004101739A3 (en) 2005-04-14
US11168125B2 (en) 2021-11-09
HK1159649A1 (zh) 2012-08-03
CN1852736B (zh) 2011-06-08
US20110182919A1 (en) 2011-07-28
EP2361932B1 (en) 2016-05-04
JP2014139244A (ja) 2014-07-31
CN104448003B (zh) 2019-03-26
US7862820B2 (en) 2011-01-04
PL2361932T3 (pl) 2016-11-30
EP1654378A4 (en) 2006-09-13
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