ES2695166T3

ES2695166T3 - Anticuerpos antihepcidina y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2695166T3
Application number: ES14771150T
Authority: ES
Inventors: Mark Westerman; Vaughn Ostland; Huiling Han; Patrick Gutschow; Keith Westerman; Gordana Olbina
Original assignee: Intrinsic LifeSciences LLC
Current assignee: Intrinsic LifeSciences LLC
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2019-01-02
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: WO2014152006A2; US20170283495A1; WO2014152006A3; IL261547B; CA2904357A1; MX359794B; AU2018214008A1; BR112015022123A2; DK2968503T3; AU2018214008B2; BR112015022123A8; IL241079A0; KR102218494B1; CN105263514B; CN105263514A; US9657098B2; HK1220379A1; AU2014236677B2; EP2968503A2; US20180057586A1

Abstract

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a hepcidina (Hep) o un péptido de hepcidina con una constante de disociación de menos de 500 pM, comprendiendo dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 44, y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 50.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos antihepcidina y usos de los mismos.

Campo tecnico de la invencion

La presente invencion pertenece al campo de la medicina, particularmente al campo de anticuerpos contra hepcidina.

Antecedentes de la invencion

El hierro es un oligoelemento esencial necesario para el crecimiento y desarrollo de los organismos vivos. En mairnferos, el contenido de hierro esta regulado por el control de la absorcion de hierro, el reciclaje de hierro y la liberacion de hierro desde las celulas en que se almacena. El hierro se absorbe predominantemente en el duodeno y el yeyuno superior por los enterocitos. El hierro se recicla de los globulos rojos degradados por los macrofagos reticuloendoteliales en la medula osea, las celulas hepaticas de Kupffer y el bazo. La liberacion de hierro esta controlada por la ferroportina, una protema de exportacion de hierro principal ubicada en la superficie celular de los enterocitos, macrofagos y hepatocitos, las celulas principales que pueden liberar hierro en el plasma. La hepcidina se une a ferroportina y disminuye su actividad funcional causando que se internalice desde la superficie celular y se degrade. (Nemeth et al., Science, 306:2090-3, 2004).

La publicacion internacional WO 2010/017070 A1 (Eli Lilly and Company) describe anticuerpos monoclonales que se unen al extremo N de hepcidina 25 humana y se caracterizan por tener alta afinidad y selectividad por el polipeptido. Los anticuerpos de la invencion son utiles para aumentar los niveles de hierro en suero, el recuento de reticulocitos, el recuento de globulos rojos, la hemoglobina y/o el hematocrito en un ser humano y para el tratamiento de diversos trastornos, tales como anemia, en un sujeto humano.

La publicacion internacional US 2007/224186 A1 (Kulaksiz et al.) describe anticuerpos espedficos para el extremo C de hepcidina humana, y metodos relacionados para tratar una afeccion patologica caracterizada por niveles no fisiologicos de protema hepcidina, incluyendo prohepcidina y fragmentos de la misma.

La publicacion internacion WO 2009/139822 A1 (Amgen Inc.) se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen a hepcidina y a metodos de generacion y uso de dichos anticuerpos. Tambien se describen metodos de tratamiento de trastornos relacionados con hepcidina.

La publicacion internacional WO 2008/097461 A2 (Amgen Inc.) se refiere a anticuerpos purificados contra hepcidina plegada correctamente que se unen a hepcidina, y a metodos de generacion y uso de dichos materiales. Tambien se describen metodos de tratamiento de trastornos relacionados con hepcidina.

La publicacion internacion WO 2010/065815 A2 (Los regentes de la Universidad de California) describe peptidos que muestran actividad hepcidina y metodos de generacion y uso de los mismos.

Compendio de la invencion

La presente invencion se refiere a un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, una molecula de acido nucleico aislada, un vector de expresion, una celula hospedante y una composicion, como se define en las reivindicaciones. La presente invencion tambien se refiere a un metodo de uso de la celula hospedante, y a usos del anticuerpo mencionado, fragmentos de los mismos y la composicion que los comprende, en metodos de tratamiento por terapia, como se define por las reivindicaciones.

En la presente memoria se describen anticuerpos y fragmento de union a antfgeno de los mismos que se unen a hepcidina (Hep) o un peptido de hepcidina. En un aspecto, en la presente memoria se describe un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que se une espedficamente al extremo N de hepcidina o un peptido de hepcidina y neutraliza la actividad de hepcidina in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, en la presente memoria se describe un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que se une espedficamente a hepcidina o un peptido de hepcidina, que comprenden una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera,

en el que dicha region variable de cadena pesada comprende:

(i) una CDR1 que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-57,

(ii) una CDR2 que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60, y

(iii) una CDR3 que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-63;

y dicha region variable de cadena ligera comprende:

(i) una CDR1 que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 64-66,

(ii) una CDR2 que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 67-69, y (iii) una CDR3 que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72.

En un aspecto, en la presente memoria se describe un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que se une espedficamente a hepcidina o un peptido de hepcidina, que comprende una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera,

en el que dicha region variable de cadena pesada comprende:

(i) una CDR1 que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por una cualquier de las SEQ ID NO: 1-3, (ii) una CDR2 que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-6, y (iii) una CDR3 que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 7-9; y dicha region variable de cadena ligera comprende:

(i) una CDR1 que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 10-12, (ii) una CDR2 que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 13-15, y (iii) una CDR3 que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 16-18. En un aspecto, un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, descrito en la presente memoria comprende la cadena pesada variable y la cadena ligera variable de IgG1 o IgG4.

En un aspecto, en la presente memoria se describe un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que se une espedficamente a hepcidina o un peptido de hepcidina, que se prepara inyectando a un roedor (es decir, raton, rata o conejo) un peptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 19-27. En otra realizacion, el peptido se conjuga a un vedculo (por ejemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH)) o se administra con un adyuvante (adyuvante completo de Freund (CFA) o adyuvante incompleto de Freund (IFA)). En otra realizacion el peptido se conjuga a un hapteno (por ejemplo, dinitrofenol [DNP]) y un vedculo.

Un peptido de hepcidina al que se une un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, puede tener, en algunos casos, una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 19.

En la presente memoria se describe un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que se une espedficamente a un epftopo que comprende la secuencia de aminoacidos de uno cualquiera de Hep-5, Hep-9, Hep-20, Hep 22 y Hep25.

En una realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, se une espedficamente a un epftopo que comprende una secuencia de aminoacidos de Hep-20 (SEQ ID NO: 22), Hep 22 (SEQ ID NO: 23) y Hep25 (SEQ ID NO: 19).

En una realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, se une espedficamente a un epftopo que comprende Hep-5 (SEQ ID NO: 25) o Hep-9 (SEQ ID NO: 24). En otra realizacion, en la presente memoria se describe un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que se une espedficamente a un epftopo que compren los restos de aminoacido 1-9 de hepcidina. En otra realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, se une espedficamente a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 restos de aminoacido de un epftopo que comprende los restos de aminoacido 1-9 de hepcidina.

En otra realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal que comprende un CDR1 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 55, una CDR2 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 58, una CDr 3 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 61, una CDR1 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 64, una CDR2 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 67 y una CDR3 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 70.

En otra realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal que comprende una CDR1 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 56, una CDR2 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 59, una CDR3 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 62, una CDR1 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 65, una CDR2 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 68 y una CDR3 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 71.

En otra realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal que comprende una CDR1 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 57, una CDR2 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 60, una CDR3 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 63, una CDR1 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 66, una CDR2 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 69 y una CDR3 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 72.

El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. En una realizacion, una cadena pesada variable humanizada comprende una secuencia de aminoacidos expuesta como en la SEQ ID NO: 40. En otra realizacion, una cadena ligera variable humanizada comprende una secuencia de aminoacidos expuesta como en la SEQ ID NO: 38.

En un aspecto, en la presente memoria se describe un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, que comprende una region flanqueante de la region variable de cadena pesada; y una region flanqueante de la region variable de cadena ligera expuesta en el listado de secuencias a continuacion donde las CDR identificadas en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-18 se insertan en la region flanqueante utilizando la numeracion de Kabat.

El fragmento de union a antfgeno puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmente Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento scFv, un polipeptido de union de cadena sencilla, un fragmento Fd, una cadena pesada variable, una cadena ligera variable o un fragmente dAb. Un fragmente de union a antfgeno puede ser, por ejemplo, un AVIMER, un diacuerpo o un dfmero de cadena pesada. Un dfmero de cadena pesada puede ser, por ejemplo, una construccion de cadena pesada de camelido o tiburon.

Un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria puede tener una constante de disociacion (Kd) de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 pM, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 29 pM, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 pM, de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 pM o de aproximadamente 20 a aproximadamente 500 pM.

Un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria puede tener una constante de disociacion (Kd) de menos de aproximadamente 500 pM, menos de aproximadamente 400 pM, menos de aproximadamente 300 pM, menos de aproximadamente 200 pM, menos de aproximadamente 100 pM, menos de aproximadamente 75 pM, menos de aproximadamente 50 pM, menos de aproximadamente 30 pM, menos de aproximadamente 25 pM, menos de aproximadamente 20 pM, menos de aproximadamente 18 pM, menos de aproximadamente 15 pM, menos de aproximadamente 10 pM, menos de aproximadamente 7,5 pM, menos de aproximadamente 5 pM, menos de aproximadamente 2.5 pM o menos de aproximadamente 1 pM.

Un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria puede tener una afinidad por hepcidina o un peptido de hepcidina de aproximadamente 10^"9a aproximadamente 10^"14, de aproximadamente 10^"10a aproximadamente 10^"14, de aproximadamente 10^"11a aproximadamente 10^"14, de ap ¹roximadamente 10^{1 2}a ^*aproximadamente 10¹, ⁴de ^*aproximadamente 10^{1 3}a ^*aproximadamente 10¹⁴, de ap ¹roximadamente 10^{1 0}a a ^*proximadamente 10¹, ¹de ap ^*roximadamente 10¹a ¹ap ^*roximadamente 1¹0², de ^{1 14 1}aproximadamente 10¹a ²ap ^*roximadamente 10¹³o de 10^13*a aproximadamente 10 .

En la presente memoria se describe una composicion, que comprende un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno, descrito en la presente memoria y un vehfculo o excipiente aceptable.

Tambien se describe en la presente memoria una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria. Tambien se describe en la presente memoria un vector de expresion que comprende la molecula de acido nucleico, unida de forma funcional a una secuencia de control reguladora. Tambien se describe en la presente memoria una celula hospedante que comprende un vector o una molecula de acido nucleico descrita en la presente memoria. Tambien se describe en la presente memoria un metodo de uso de la celula hospedante para producir un anticuerpo, que comprende cultivar la celula hospedante en condiciones adecuadas de modo que el acido nucleico se exprese para producir el anticuerpo.

En la presente memoria se describen metodos terapeuticos que utilizan un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria. En un aspecto, se describe en la presente memoria un metodo de tratamiento de un trastorno de la homeostasis del hierro en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de modulacion de la actividad de hepcidina en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo para tratar un trastorno de la homeostasis del hierro en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de la hemocromatosis en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de un sujeto con niveles patologica o inapropiadamente elevados de hepcidina (elevados inapropiadamente respecto a las reservas de hierro corporales y en plasma), que comprende administrar a dicho sujeto una composicion farmaceutica descrita en la presente memoria. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de la anemia en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento o reduccion de la inflamacion en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. En una realizacion, la inflamacion que tiene que tratarse o reducirse es inflamacion cronica. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de una infeccion en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. Una infeccion puede ser, por ejemplo, una infeccion bacteriana, fungica o vmca. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de la anemia por deficiencia de hierro resistente al hierro (IRIDA). En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de la anemia de inflamacion (AI) y anemia de enfermedad cronica (ACD). En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de enfermedad renal cronica (CKD). En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento del cancer y la anemia inducida por quimioterapia (CCIA) que esta asociada con hepcidina elevada. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de enfermedades neuroinflamatorias que estan asociadas con hepcidina elevada.

Cualquiera de dichos metodos, en algunos casos, puede comprender ademas administrar a dicho sujeto uno o mas estimuladores de la eritrocitopoyesis. Los estimuladores de la eritrocitopoyesis incluyen, aunque sin limitacion, eritropoyetina, una variante de eritropoyetina, un agente estimulador de la eritrocitopoyesis (ESA; tal como, por ejemplo, epoetina alfa [por ejemplo, Procrit®, Epogen®, etc.], epoetina beta [por ejemplo, NeoRecormon, etc.], darbepoetina alfa [por ejemplo, Aranesp®, etc.], metoxi polietilenglicol-epoetina beta [por ejemplo, Mircera®, etc.], un inhibidor del factor inducible por hipoxia (HIF) prolil hidroxilasa, un factor eritroide derivado de medula osea (por ejemplo, eritroferrona), un minipeptido de hepcidina (vease, por ejemplo, la publicacion de Estados Unidos n.° 20120040894, de Ganz et al.), un inhibidor de antisentido de hepcidina (vease, por ejemplo, la publicacion de estados unidos n.° 20100136015, de Lin y Babitt.), un inhibidor de ARNip de hepcidina (Id.), inhibidor de miARN de hepcidina (Id.), un anticuerpo anti-BMP-2 (Id.), un anticuerpo anti-BMP-4 (Id.), un anticuerpo anti-BMP-6 (Id.), un inhibidor de molecula pequena (Id.), un anticuerpo anti-IL-6 (vease, por ejemplo, la publicacion de Estados Unidos n.° 20110059080, de Cornfeld et al.), un anticuerpo anti-TNF-alfa, metotrexato, un agente antiinflamatorio (por ejemplo, un esteroide [por ejemplo, un corticoesteroide, etc.]; un farmaco antiinflamatorio no esteroideo [AINE; por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, naproxeno, un inhibidor de la enzima ciclooxigenasa (COX) etc.], una hormona (por ejemplo, testosterona) o un derivado antiinflamatorio inmunoselectivo (AIEin; por ejemplo, tripeptido FEG (Phe-Glu-Gly) y su isomero D feG]), hemojuvelina, un anticuerpo que se une a eritropoyetina y combinaciones de los mismos. En una realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que se une espedficamente a hepcidina y el estimulador de la eritrocitopoyesis se administran simultanea o secuencialmente.

La administracion de una composicion de la presente memoria puede ser por cualquier medio adecuado incluyendo, aunque sin limitacion, inyeccion. En una realizacion, la inyeccion puede ser, por ejemplo, inyeccion intravenosa, subcutanea, intramuscular o inyeccion medular en el lfquido cefalorraqrndeo (LCR).

En la presente memoria se describe un medio de recipiente que comprende una composicion descrita en la presente memoria. El medio de recipiente puede ser cualquier recipiente adecuado que pueda alojar una composicion lfquida o liofilizada incluyendo, aunque sin limitacion, un vial, jeringa, frasco, una bolsa intravenosa (IV) o ampolla. Una jeringa puede tener la capacidad de alojar cualquier volumen de lfquido adecuado para inyeccion en un sujeto incluyendo, aunque sin limitacion, 0,5 cc, 1 cc, 2 cc, 5 cc, 10 cc o mas.

En la presente memoria se describen kits, que comprenden una composicion o composiciones descritas en la presente memoria. En un aspecto, en la presente memoria se describe un kit para tratar un trastorno asociado con niveles elevados de hepcidina o un trastorno de la homeostasis del hierro, que comprende un anticuerpo, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, como se describe en la presente memoria y un estimulador de la eritrocitopoyesis. Se entendena, en algunos casos, que la hepcidina puede estar en el intervalo normal, pero elevado inapropiadamente respecto a las reservas de hierro.

En otro aspecto, en la presente memoria se describe un kit para tratar un trastorno asociado con niveles elevados de hepcidina o un trastorno de la homeostasis del hierro, que comprende un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, como se describe en la presente memoria, y una etiqueta adherida a o envasada con el recipiente, describiendo la etiqueta el uso del anticuerpo, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, con un estimulador de la eritrocitopoyesis.

En otro aspecto, en la presente memoria se describe un kit para tratar un trastorno asociado con niveles elevados de hepcidina, que comprende un estimulador de la eritrocitopoyesis y una etiqueta adherida a o envasada con el recipiente, describiendo la etiqueta el uso del estimulador de la eritrocitopoyesis con un anticuerpo, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, como se describe en la presente memoria.

Breve descripcion de los dibujos

Las caractensticas novedosas de la invencion se exponen con particularidad en las reivindicaciones anejas. Una mejor comprension de las caractensticas y ventajas de la presente invencion se obtendra por referencia a la siguiente descripcion detallada que expone realizaciones ilustrativas, en que se utilizan los principios de la invencion, y los dibujos adjuntos de los que:

Figura 1. Ejemplos de secuencias de antigeno peptidico de hepcidina usadas para inmunizar ratones BALB/c para la produccion de hibridoma y el descubrimiento de MAb H32, 583 y 1B1.

Figura 2. Ejemplo de una primera ronda de cribado de hibridomas aislados usando placas recubiertas con neutravidina recubiertas con K18-biotina-hepcidina-25 y detectadas por anticuerpo anti-IgG de raton (H+L) conjugado con HRP. Se presentan las densidades opticas (DO) a 450 nm despues del desarrollo de HRP y la adicion de disolucion de parada. Observense las senales positivas (>2,0 DO) en la columna 9 filas D-F. Los pocillos de control positivo y negativo son G12 y H12, respectivamente.

Figura 3. Ejemplo de una segunda ronda de cribado de hibridomas aislados de la primera ronda de cribado determinada como positiva (figura 2) usando placas recubiertas con anticuerpo de conejo anti-Fc de raton para capturar IgG de raton de sobrenadantes de hibridoma. Las IgG de raton unidas entonces se criban para la union a K18-biotina-hepcidina-25 usando estreptavidina conjugada a HRP. Se presentan las densidades opticas (DO) a 450 nm despues del desarrollo de HRP y la adicion de disolucion de parada. Observense las senales positivas (>2,0 DO) en la columna 9 fila D. Los pocillos de control positivo y negativo son G12 y H12, respectivamente.

Figura 4. Cribado para la actividad funcional de hibridomas positivos para la union antihepcidina. Los pocillos se recubren con anticuerpos anti-Fc de raton y se bloquean. En pocillos duplicados, se anadio cada sobrenadante de hibridoma indicado a tampon de union que contema 1 ng de radiomarcador NT-biotina-hepcidina-25 con o sin 100 ng de hepcidina-25 sintetica. La union de la NT-biotina-hepcidina-25 se detecto con SA-HRP como DO a 450 nm despues de la adicion de disolucion de para a los pocillos. El anticuerpo 5A3 (igual que 4B1 y 5A4) mostro excelente union en tampon sin hepcidina-25 y se bloqueo completamente por hepcidina-25 en el tampon de union, lo que indica que el hibridoma 5A3 contema un anticuerpo que se uma a NT-biotina-hepcidina-25 y tambien a hepcidina-25 sintetica en disolucion. El clon derivado finalmente del hibridoma 5A3 se renombro posteriormente MAb 583; por tanto, los datos para MAb 583 se muestran en los pocillos 5A3. Los clones 4B1 y 5A4, aunque aparentemente positivos en este cribado, no lograron producir anticuerpos antihepcidina funcionales cuando se ensayaban despues de expansion adicional, cribado de funcionalidad y de isotipo.

Figura 5. Caractensticas de MAb 583, 1B1 y H32, incluyendo antigenos, tttulos en suero de ratones BALB/c inmunizados, sitios de inyeccion, frecuencia de inyeccion, tejido o tejidos usados para la produccion de hibridoma y tasas de exito a traves de cada ronda de cribado, que da lugar a estos anticuerpos monoclonales antihepcidina funcionales aislados.

Figura 6. Tasas de exito globales para MAb antihepcidina-25 funcionales mediante 8 campanas de desarrollo de MAb. Se cribo un total de 11,845 hibridomas para el descubrimiento de los MAb H32, 583 y 1B1.

Figura 7. Analisis de SDS-PAGE reductor de la purificacion de MAb 583 en una columna de protema A. Las preparaciones en bruto de sobrenadantes de hibridoma diluidos, fracciones de flujo directo recogidas durante el lavado de la columna y el MAb 583 (lote de purificacion 003) altamente purificado y el 1B1 (lote de purificacion 003) se analizaron por tincion de Coomassie. Las descripciones de los carriles se describen a la derecha del diagrama.

Figura 8. Analisis de ELISA de la neutralizacion del MAb 583 en disolucion por hepcidina-25. Este cribado basado en disolucion ensayo la capacidad de 0,0 y 0,1-8,0 ng de hepcidina-25 sintetica (eje de abscisas) de bloquear (neutralizar) la union de 20 ng de MAb 583 en disolucion. La hepcidina sintetica (0,1-8,0 ng) se anadio a 20 ng de MAb 583 durante dos horas en tampon de union. Se anadieron las disoluciones de MAb 583 tratado con hepcidina-25 a pocillos duplicados con hepcidina-25 (200 ng/pocillo) unida de forma covalente a placas de micropocillos activados con anhfdrido maleico. La union a hepcidina-25 por el MAb 583 se detecto usando anticuerpo de conejo anti-IgG de raton (H+L) conjugado con HRP con TMB como sustrato. La union del MAb 583 a hepcidina-25 unida se cuantifica por espectrometna despues de la adicion de disolucion de parada midiendo la DO (densidad optica) a 450 nm.

Figura 9. Gel de SDS-PAGE con tricina no reductor (panel de la izquierda) tenido con Coomassie y transferencia de Western (panel de la derecha) de hepcidina-25, hepcidina-22, hepcidina-20 y protegrina (1,5 pg/carril) sondeado con MAb 583. Las descripciones de los carriles se describen en la leyenda debajo del diagrama.

Figura 10. SDS-PAGE es reductor tenido con Coomassie y transferencia de Western de la actividad de union de MAb 583 y MAb 1B1 contra hepcidina-25, hepcidina-20, K18-biotina-hepcidina-25, K24-biotina-hepcidina-25 y NT-biotina-hepcidina-25. Las descripciones del carril se describen en la leyenda debajo del diagrama.

Figura 11. Analisis Biacore de las afinidades de union de MAb 583 a 24 pg/ml, por K18-biotina-hepcidina-25, NT-biotina-hepcidina-25 y K24-biotina-hepcidina-25 unida a un chip Biacore recubierto con estreptavidina. Los datos muestran alta afinidad y constantes de disociacion picomolares para MAb 583 por NT-biotina-hepcidina-25, y constantes de afinidad disminuidas en aproximadamente un logaritmo para K18-biotina-hepcidina-25 y K24-biotinahepcidina-25, respectivamente.

Figura 12. Analisis Biacore de las afinidades de union de MAb 583 a 5 pg/ml, por K18-biotina-hepcidina-25 y NT-biotina-hepcidina-25 unida a un chip Biacore recubierto con estreptavidina. Hay un pequeno cambio en la pendiente del trazado de Biacore durante 1200 segundos (20 minutos), que indica bajas constantes de disociacion para MAb 583 por K18-biotina-hepcidina-25 y NT-biotina-hepcidina-25.

Figura 13. Resultados de afinidad de union de experimentos Biacore mostrados en la figura 12. Los datos muestran afinidad mayor y asociacion picomolar (KA) y constantes de disociacion menores (KD) para MAb 583 por K18-biotina-hepcidina-25 que NT-biotina-hepcidina-25, que cuando se evaluaba a 24 pg/ml.

Figura 14. Datos Biacore que muestran la afinidad de union de MAb 1B1 a 24 pg/ml, por K18-biotina-hepcidina-25, NT-biotina-hepcidina-25 y K24-biotina-hepcidina-25. Estos datos muestran que el MAb 1B1 tiene fuerte afinidad de union por K24-biotina-hepcidina-25, afinidad inferior por K18-biotina-hepcidina-25 y ninguna afinidad por NT-biotinahepcidina-25. Este experimento se realizo durante 500 segundos y no se observo disociacion de 1B1 o no fue calculable por el instrumento Biacore despues de la union a hepcidina-25 K24 y K18-biotina-hepcidina-25 durante 500 segundos.

Figura 15. Datos Biacore que muestran la afinidad de union del MAb 1B1 a 24 pg/ml por K24-biotina-hepcidina-25. Estos datos muestran fuerte afinidad de 1B1 por K24-biotina-hepcidina-25 y ninguna disociacion de MAb 1B1 de K24-biotina-hepcidina-25 durante 500 segundos, lo que sugiere que es posible una baja constante de disociacion de picomolar a fentomolar para 1B1 por hepcidina-25.

Figura 16. Analisis de la curva patron de ELISA de la union de hepcidina-25, hepcidina-22 y hepcidina-20 al anticuerpo MAb 583 recubierto a 100 ng/ml por pocillo. La union relativa del radiomarcador NT-biotina-hepcidina-25 (1 ng/pocillo) respecto a hepcidina-25, hepcidina-22 y hepcidina-20 se midio por ELISA. Se realizo un analisis de regresion logfstica de cuatro parametros usando el programa informatico GraphPad Prism para producir las curvas mostradas. Un desplazamiento en la curva demuestra afinidad consecutivamente inferior de MAb 583 por hepcidina-22 y hepcidina-20, que la que tiene MAb 583 por hepcidina-25.

Figura 17. Analisis ELISA de union a hepcidina-1 murina (hepcidina-25 de raton), protegrina y peptido de hepcidina-(10-25) a MAb 583 en comparacion con NT-biotina-hepcidina-25. Estos datos muestran que no hay union del MAb 583 a hepcidina-1 murina, protegrina o un peptido de hepcidina-(10-25) oxidado y replegado que contiene los enlaces de cistema apropiados para esta region de hepcidina-25 a concentraciones de hasta 2000 ng/ml.

Figura 18. Analisis ELISA de la union del peptido de hepcidina-(10-25) a MAb 1B1. Los resultados indican que el MAb 1B1 no tiene afinidad de union por un peptido de hepcidina-(10-25) oxidado y replegado que contiene los enlaces de cistema apropiados para esta region en comparacion con hepcidina-25. Se uso K18-biotina-hepcidina-25 para la deteccion. Observese que no hay union del peptido de hepcidina-(10-25) al MAb 1B1 a concentraciones de hasta 2000 ng/ml.

Figura 19. Analisis ELISA de la union de hepcidina-(10-25) a MAb 1B1. Los resultados indican que el MAb 1B1 no tiene afinidad de union por un peptido de hepcidina-(10-25) oxidado y replegado que contiene los enlaces de cistema apropiados para esta region en comparacion con hepcidina-25. Se uso NT-biotina-hepcidina-25 para la deteccion. Observese que no hay union de hepcidina-(10-25) al MAb 1B1 a concentraciones de hasta 2000 ng/ml del peptido de hepcidina-(10-25).

Figura 20. Citometna de flujo de celulas Fpn-GFP tratadas con MAb 583. Las celulas se indujeron durante una noche con ponasterona para inducir la expresion de Fpn-GFP murino. El siguiente dfa, se elimino la ponasterona por lavado y se anadio hepcidina-25 y anticuerpos MAb 583 durante 24 horas. Se uso hepcidina-25 a concentracion de 100 ng/ml (37 nM). El MAb 583 se anadio a 10 veces, 2 veces o 1/3 de la concentracion de hepcidina (370 nM, 74 nM y 10 nM). El MAb de control era un anticuerpo monoclonal antihepcidina fallido cuando se cribaba in vitro por ELISA y se uso a la concentracion maxima (370 nM). Observese que el MAb 58310 nM neutralizaba completamente hepcidina-2537 nM y su actividad biologica da lugar a degradacion de FPN-GFP.

Figura 21. Porcentaje (%) de cambio en la fluorescencia de FPN-GFP en celulas HEK tratadas con MAb 583 a concentraciones de 10-370 nM en presencia de hepcidina-2537 nM.

Figura 22. Citometna de flujo de celulas Fpn-GFP tratadas con MAb 583. Las celulas se indujeron durante una noche con ponasterona para inducir la expresion de Fpn-GFP murino. El siguiente dfa, se elimino la ponasterona por lavado y se anadio hepcidina-25 y anticuerpos MAb 583 durante 24 horas. Se uso hepcidina-25 a concentracion de 100 ng/ml (37 nM) el MAb 583 se anadio a 1/3, 1/6, 1/12 y 1/24 de la concentracion molar de hepcidina-25 en estos ensayos basados en celulas de actividad biologica de MAb 583. El MAb de control era un anticuerpo monoclonal antihepcidina fallido cuando se cribaba in vitro por ELISA y se uso a la maxima concentracion (370 nM). Observese que el MAb 5832,5 nM neutralizaba significativamente (disminucion de ~23 %) hepcidina-25 37 nM y su actividad biologica da lugar a degradacion de FPN-GFP a 1/12 de la relacion molar in vitro.

Figura 23. Porcentaje (%) de cambio de la fluorescencia de FPN-GFP en celulas HEK tratadas con MAb 583 a concentraciones de 0,62-10 nM en presencia de hepcidina-2537 nM como se describe en la figura 22.

Figura 24. Ensayo de ferritina de celulas Fpn-GFP tratadas con MAb 583. Las celulas HEK se indujeron durante una noche con ponasterona para inducir la expresion de Fpn-GFP murino y el transporte de hierro en el medio. El siguiente dfa, se elimino la ponasterona por lavado y se anadio hepcidina-25 y anticuerpos MAb 583 durante 24 horas. Se uso hepcidina-25 a concentracion de 100 ng/ml (37 nM). El MAb 583 se anadio a 10 veces, 2 veces o 1/3 de la concentracion de hepcidina (370 nM), 74 nM y 10 nM). El MAb de control era un anticuerpo monoclonal antihepcidina fallido cuando se cribaba in vitro por ELISA y se uso a la concentracion maxima (370 nM). Observese que el MAb 583 10 nM neutralizaba significativamente hepcidina-25 37 nM y su actividad biologica da lugar a degradacion de FPN-GFP y retencion de hierro unido a ferritina intracelular. Las protemas se extrajeron usando tampon RIPA y las concentraciones de ferritina intracelular se determinaron usando ELISA de ferritina (Ramco). Figura 25. Ensayo de ferritina de celulas Fpn-GFP tratadas con MAb 583. Las celulas HEK se indujeron durante una noche con ponasterona para inducir la expresion de Fpn-GFP murino y el transporte de hierro en el medio. El siguiente dfa, se elimino la ponasterona por lavado y se anadio hepcidina-25 y anticuerpos MAb 583 durante 24 horas. Se uso hepcidina-25 a concentracion de 100 ng/ml (37 nM) y anticuerpo MAb 583 a 1/3, 1/6, 1/12 y 1/24 de la concentracion molar de hepcidina-25 en este ensayo basado en celulas de actividad biologica de MAb 583. El MAb de control (MAb simulado) era un anticuerpo monoclonal antihepcidina fallido cuando se cribaba en vitro por ELISA y se uso a la maxima concentracion (370 nM). Observese que el 583 2,5-5 nM neutralizaba significativamente hepcidina-25 37 nM y su actividad biologica da lugar a degradacion de FPN-GFP y retencion de hierro unido a ferritina intracelular. Las protemas se extrajeron usando tampon RIPA y las concentraciones de ferritina intracelular se determinaron usando ELISA de ferritina (Ramco).

Figura 26. Porcentaje (%) de cambio de concentracion de ferritina intracelular en celulas HEK tratadas con MAb 583 a concentraciones de 0,62-10 nM en presencia de hepcidina-2537 nM como se describe en la figura 25.

Figura 27. Efecto de inyeccion de MAb 583 y hepcidina-25 humana in vivo sobre la concentracion de hierro en suero en ratones C57B1/6 macho. A cinco grupos de ratones (n=8/grupo) se les inyecto por via intraperitoneal PBS (grupo 1, H-PBS y grupo 5, PBS), 1 mg de MAb 583 (grupo 2, H-Mab), 0,5 mg de MAb 583 (grupo 3, H-2Mab) o 0,5 mg de Mab de control (grupo 4, Mab H-simulado). El siguiente dfa todos los ratones del grupo 3 recibieron 0,5 mg adicionales de MAb 583 y 24 horas despues los grupos 1-4 recibieron una unica inyeccion de 50 |jg de hepcidina-25 humana y el grupo 5 recibio PBS. Todos los ratones se sacrificaron 2 horas despues y se midio el hierro en suero. El analisis estadfstico (vease la figura 28 para los detalles) indico una diferencia significativa entre PBS y PBS mas hepcidina-25 (H-PBS, P=0,001), y entre PBS mas hepcidina-25 (H-PBS) y los ratones que recibieron dos dosis de 0.5 mg de MAb 583 y hepcidina-25 (H-2Mab, P=0,004).

Figura 28. Estadfstica descriptiva (media, desviacion tfpica, ETM) y resultados del ANOVA unidireccional de las concentraciones de hierro en suero de cinco grupos de ratones C57BL/6 macho del estudio in vivo del MAb 583 mostrado en la figura 27. Multiples comparaciones frente al grupo de control (metodo de Holm-Sidak) con un nivel de significacion global de P=0,05 dio valores P no ajustados dependientes de comparacion que vanan de 0,001 a 0,253.

Figura 29. Comparacion de la quimera MAb 583 con el MAb 583 murino para la union a una placa de ELISA recubierta con hepcidina-25. Se unieron covalentemente 100 ng de hepcidina-25 a los pocillos de una microplaca de 96 pocillos activada con anhfdrido maleico. Se anadieron cantidades crecientes de quimera MAb 583 (BAP070-01; 3650 ng/ml; cuadrados vacfos) y MAb 583 murino (MAb de control positivo; triangulos vacfos) a la placa de micropocillos y se dejo que se unieran durante una hora. Se detecto la union de la quimera MAb 583 por anticuerpo de conejo anti-IgG1 humana (H+L)-HRP. El anticuerpo MAb 583 murino unido se detecto con anticuerpo anti-IgG1 de raton (H+L) conjugado con HRP. Las reacciones se detuvieron con HCl 1N a los 5 minutos despues de anadir TMB a los pocillos y se leyeron inmediatamente. La union se cuantifico como DO en un espectrofotometro a 450 nm despues de la adicion de disolucion de parada. Eje de abscisas: concentracion de anticuerpo en ng/ml; y eje de ordenadas: valores de DO 450 nm.

Figura 30. Union de la quimera MAb 583 a una placa de ELISA recubierta con hepcidina-25. Se unieron covalentemente 100 ng de hepcidina-25 a los pocillos de una microplaca de 96 pocillos activada con anhfdrido maleico. Se transfectaron cantidades crecientes de la quimera MAb 583 (BAP070-01; 3650 ng/ml; drculos rellenos) y sobrenadante de celulas transfectadas con vector vacfo (BAP070; cuadrados rellenos) a la placa de micropocillos y se dejo que se unieron durante 2 horas. La union de la quimera MAb 583 se detecto por anticuerpo de conejo anti-IgG1 humana (H+L)-HRP con TMB como sustrato. La union se cuantifico en un espectrofotometro a 450 nm despues de la adicion de disolucion de parada.

Figura 31. Curva patron de hepcidina-25 producida usando la quimera MAb 583 BAP070-01. Los pocillos en la placa de micropocillos se recubrieron con 150 ng/ml de protema G y se bloquearon. La quimera MAb 583 (BAP070-01) se anadio a los pocillos a 150 ng/pocillo y se permitio que se uniera durante una hora. Se anadieron concentraciones conocidas de hepcidina-25 sintetica al tampon de ensayo que contema NT-biotina-hepcidina-25 (1 ng/pocillo), se mezclaron y se anadieron a 8 pocillos duplicados y se permitio que compitieran durante dos horas. Los pocillos se lavaron y se uso SA-HRP con sustrato TMB para detectar la union del radiomarcador NT-biotina-hepcidina-25. La union se cuantifico en un espectrofotometro a 450 nm despues de la adicion de disolucion de parada. La curva patron se genero usando el programa informatico Graphpad Prism (San Diego, CA) usando una regresion logfstica de 4 parametros.

Figura 32. Union de la quimera MAb 583 a NT-biotina-hepcidina-25 en placas de micropocillos recubiertas con neutravidina. Los pocillos en la placa de micropocillos se recubrieron con 150 ng/ml de neutravidina y se bloquearon. Se anadio el radiomarcador NT-biotina-hepcidina-25 a los pocillos a 1 ng/pocillo y se permitio que se uniera durante una hora. La quimera MAb 583 (BAP070-01) se anadio a los pocillos a 150 ng/pocillo junto con hepcidina-25 sintetica a concentraciones conocidas y se permitio que compitiera por la union a NT-biotina-hepcidina-25 durante una hora. La union de la quimera MAb 583 se detecto usando anticuerpo de conejo anti-IgG1 humana (H+L)-HRP con TMB como sustrato. La union se cuantifico por espectroscopia a 450 nm despues de la adicion de disolucion de parada. Los puntos representan los dos duplicados (rombos y cuadrados rellenos) y la media (triangulos rellenos. Descripcion detallada de la invencion

De acuerdo con la presente solicitud, pueden emplearse tecnicas convencionales de biologfa molecular, microbiologfa y ADN recombinante dentro de las habilidades de la tecnica. Dichas tecnicas se explican completamente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumenes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumenes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumenes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

Terminologfa de anticuerpos

Como se usan en la presente memoria, el termino "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina (Ig) sea natural o producida de forma parcial o completamente sintetica. El termino tambien cubre cualquier polipeptido o protema que tenga un dominio de union que es, o es homologo a, un dominio de union a antfgeno. El termino incluye ademas "fragmentos de union a antfgeno" y otros terminos intercambiables para fragmentos de union similares tal como se describe a continuacion. Los anticuerpos con region determinante de complementariedad (CDR) injertada y otros anticuerpos humanizados (que incluyen modificaciones de CDR y modificaciones de la region flanqueante) tambien se contemplan por este termino.

Los anticuerpos nativos e inmunoglobulinas nativas habitualmente son glucoprotemas heterotetramericas de aproximadamente 150000 Dalton, compuestas de dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera tfpicamente se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, aunque la cantidad de enlaces disulfuro vana entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina, cada cadena pesada y ligera tambien tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados de forma regular. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable ("V^h") seguido por varios dominios constantes ("C^h"). Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo ("V^l") y un dominio constante ("C^l") en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera esta alineado con el domino variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoacido particulares forman una superficie de contacto entre los dominios variables de cadena ligera y pesada. Las expresiones "polinucleotido sintetico", "gen sintetico" o "polipeptido sintetico", como se usan en la presente memoria, significan que la secuencia polinucleotfdica correspondiente o parte de la misma, o secuencia de aminoacidos o parte de la misma, se obtiene de una secuencia que se ha disenado o sintetizado de novo o modificado, en comparacion con una secuencia de origen natural equivalente. Los polinucleotidos sinteticos (anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno) o genes sinteticos pueden prepararse por metodos conocidos en la tecnica, incluyendo, aunque sin limitacion, la smtesis qmmica de secuencias de acido nucleico o aminoacidos. Los genes sinteticos tfpicamente son diferentes de los genes de origen natural, a nivel de aminoacidos o de polinucleotido (o ambos) y estan tfpicamente ubicados dentro del contexto de secuencias de control de la expresion sinteticas. Por ejemplo, las secuencias genicas sinteticas pueden incluir secuencias de aminoacidos o polinucleotfdicas que se han cambiado, por ejemplo, mediante el reemplazo, eliminacion o adicion de uno o mas aminoacidos o nucleotidos, proporcionando de ese modo una secuencia de aminoacidos del anticuerpo, o un polinucleotido que codifica la secuencia que es diferente de la secuencia fuente. Las secuencias polinucleotfdicas de genes sinteticos puede que no codifiquen necesariamente protemas con diferentes aminoacidos, en comparacion con el gen natural; por ejemplo, tambien pueden abarcar secuencias polinucleotfdicas sinteticas que incorporan diferentes codones, pero que codifican el mismo aminoacido (es decir, los cambios nucleotfdicos representan mutaciones silenciosas a nivel de aminoacidos).

Con respecto a los anticuerpos, la expresion "dominio variable" se refiere a los dominios variables de anticuerpos que se usan en la union y especificidad de cada anticuerpo particular para su antfgeno particular. Sin embargo, la variabilidad no esta distribuida uniformemente por todos los dominios variables de los anticuerpos. En su lugar, se concentran tres segmentos llamados regiones hipervariables (tambien conocidas como CDR) en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las partes mas altamente conservadas de los dominios variables se llaman las "regiones flanqueantes" o "FR". Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras no modificadas contienen cada uno cuatro FR (FR1, FR2, FR3 y FR4), que adoptan en gran medida una configuracion de lamina p intercalada con tres CDR que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lamina p. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en cercana proximidad por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union a antfgeno de los anticuerpos (vease, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), paginas 647-669).

Las expresiones "region hipervariable" y "CDR" cuando se usan en la presente memoria, se refieren a los restos de aminoacido de un anticuerpo que son responsables de la union al antigeno. Las CDR comprenden restos de aminoacido de tres regiones de secuencia que se unen de una manera complementaria a un antigeno y se conocen como CDR1, CDR2 y CDR3 para cada una de las cadenas V^hy V^l. En el dominio variable de cadena ligera, las CDR tipicamente corresponden a aproximadamente los restos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) y 89-97 (CDRL3), y en el dominio variable de cadena pesada las CDR tipicamente corresponden a aproximadamente los restos 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) y 95-102 (CDRH3) de acuerdo con Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Se entiende que las CDR de diferentes anticuerpos pueden contener inserciones, por tanto, la numeracion de aminoacidos puede diferir. El sistema de numeracion de Kabat justifica dichas inserciones con un esquema de numeracion que utiliza letras unidas a restos espedficos (por ejemplo, 27A, 27B, 27C, 27D, 27E, y 27F de CDRL1 en la cadena ligera) para reflejar cualquier insercion en las numeraciones entre diferentes anticuerpos. Como alternativa, en el dominio variable de cadena ligera, las CDR tfpicamente corresponden a aproximadamente los restos 26-32 (CDRL1), 50-52 (CDRL2) y 91-96 (CDRL3), y en el dominio variable de cadena pesada, las CDR tfpicamente corresponden a aproximadamente los restos 26-32 (CDRH1), 53-55 (CDRH2) y 96-101 (CDRH3) de acuerdo con Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).

Como se usa en la presente memoria, "region flanqueante" o "FR" se refiere a los restos de aminoacido flanqueantes que forman parte del bolsillo o surco de union a antfgeno. En algunas realizaciones, los restos flanqueantes forman un bucle que es una parte del bolsillo o surco de union a antfgeno y los restos de aminoacido en el bucle pueden entrar en contacto o no con el antfgeno. Las regiones flanqueantes generalmente comprenden las regiones entre las CDR en el dominio variable de cadena ligera, las FR tfpicamente corresponden a aproximadamente los restos 0-23 (FRL1), 35-49 (FRL2), 57-88 (FRL3) y 98-109 y en el dominio variable de cadena pesada las FR tfpicamente corresponden a aproximadamente los restos 0-30 (FRH1), 36-49 (FRH2), 66-94 (FRH3) y 103-133 de acuerdo con Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Como se analiza anteriormente con la numeracion de Kabat para la cadena ligera, la cadena pesada tambien justifica inserciones de una manera similar (por ejemplo, 35A, 35B de CDRH1 en la cadena pesada). Como alternativa, en el dominio variable de cadena ligera, las f R tfpicamente corresponden a aproximadamente los restos 0-25 (FRL1), 33-49 (FRL2) 53-90 (FRL3) y 97-109 (FRL4), y en el dominio variable de cadena pesada, las FR tfpicamente corresponden a aproximadamente los restos 0-25 (FRH1), 33-52 (FRH2), 56-95 (FRH3) y 102-113 (FRH4) de acuerdo con Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).

Los aminoacidos del bucle de una FR pueden evaluarse y determinarse por inspeccion de la estructura tridimensional de una cadena pesada de anticuerpo y/o cadena ligera de anticuerpo. La estructura tridimensional puede analizarse para las posiciones de aminoacido accesibles al disolvente ya que dichas posiciones probablemente formaran un bucle y/o proporcionaran contacto con el antfgeno en un domino variable de anticuerpo. Algunas de las posiciones accesibles al disolvente pueden tolerar diversidad de secuencia de aminoacidos y otras (por ejemplo, posiciones estructurales) estan, en general, menos diversificadas. La estructura tridimensional del domino variable de anticuerpo puede obtenerse de un estructura cristalina o modelado de protemas.

Los dominios constantes (Fc) de los anticuerpos no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo a un antfgeno, pero en su lugar, muestran diversas funciones efectoras, tales como participacion del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos mediante interacciones con, por ejemplo, receptores Fc (FcR). Los dominios Fc tambien pueden aumentar la biodisponibilidad de un anticuerpo en circulacion despues de su administracion a un sujeto.

Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesada, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA IgD IgE IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse ademas en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada (Fc) que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 8, £, y y M, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa o ("k") y lambda o ("A"), basandose en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes.

Las expresiones "parte de union a antfgeno de un anticuerpo", "fragmento de union a antigeno", "dominio de union a antigeno", "fragmento de anticuerpo" o un "fragmento funcional de un anticuerpo" se usan indistintamente en la presente memoria para hacer referencia a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse espedficamente a un antfgeno. Los ejemplos no limitantes de fragmentos de anticuerpo incluidos dentro de dichas expresiones incluyen, aunque sin limitacion, (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V^l, V^h, C^ly Cm; (ii) un fragmento F(ab')^2,un fragmento bivalente que contiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios V^hy C^hi; (iv) un fragmento Fv que contiene los dominios V^ly V^hde un unico brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544 546), que contiene un domino V^h; y (vi) una CDR aislada. Se incluyen adicionalmente en esta definicion los anticuerpos "de una mitad" que comprenden una unica cadena pesada y una unica cadena ligera. Otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como los diacuerpos, tambien estan incluidos en la presente memoria.

Los restos "F(ab')2" y "Fab'" pueden producirse tratando una Ig con una proteasa tal como pepsina y papama, e incluyen fragmentos de anticuerpo generados por hidrolisis de inmunoglobulina cerca de los enlaces disulfuro que existen entre las regiones de bisagra en cada una de las dos cadenas pesadas. Por ejemplo, la papama escinde la IgG por encima de los enlaces disulfuro que existen entre las regiones de bisagra en cada una de las dos cadenas pesadas para generar dos fragmentos de anticuerpo homologos en que una cadena ligera compuesta de V^ly C^l(region constante de cadena ligera) y un fragmento de cadena pesada compuesto de V^hy la region C^hyi(y1) en la region constante de la cadena pesada) estan conectadas en sus regiones del extremo C mediante un enlace disulfuro. Cada uno de estos dos fragmentos de anticuerpo homologos se llama Fab'. La pepsina tambien escinde IgG por debajo de los enlaces disulfuro que existen entre las regiones de bisagra en cada una de las dos cadenas pesadas para generar un fragmento de anticuerpo ligeramente mas grande que el fragmento en que los dos Fab' mencionados anteriormente estan conectados en la region de bisagra. Este fragmento de anticuerpo se llama F(ab')2.

El fragmento Fab tambien contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer domino constante (C^h1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adicion de unos pocos restos en el extremo carboxilo del domino C^h1 de cadena pesada que incluyen una o mas cistemas de la region de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominacion en la presente memoria para Fab' en que el resto o restos de cistema de los dominios constantes albergan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como parejas de fragmentos Fab' que tienen cistemas de la bisagra entre ellos. Tambien se conocen otros acoplamientos qmmicos de fragmentos de anticuerpo.

"Fv" se refiere a un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antfgeno y de union a antfgeno. Esta region consiste en un dfmero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociacion covalente o no covalente estrecha (se han descrito en la tecnica Fv unidos por disulfuro, Reiter et al. (1996) Nature Biotechnology 14:1239-1245). Es en esta configuracion que las tres CDR de cada dominio variable interactuan para definir un sitio de union a antfgeno sobre la superficie del dfmero V^h-V^l. De forma colectiva, una combinacion de una o mas de las CDR de cada una de las cadenas V^hy V^lconfiere especificidad de union a antfgeno al anticuerpo. Por ejemplo, se entenderia que, por ejemplo, la CDRH3 y la CDRL3 pudieran ser suficientes para conferir especificidad de union a antfgeno a un anticuerpo cuando se transfieren a cadenas V^hy V^lde un anticuerpo destinatario o fragmento de union a antfgeno del mismo y esta combinacion de CDR puede ensayarse para la union, afinidad, etc. usando cualquiera de las tecnicas descritas en la presente memoria. Incluso un unico dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende unicamente tres CDR espedficas para un antfgeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antfgeno, aunque probablemente a una afinidad inferior que cuando se combina con un segundo dominio variable. Ademas, aunque los dos dominios de un fragmento Fv (V^ly V^h), estan codificados por genes diferentes, pueden unirse usando metodos recombinantes mediante un conector sintetico que posibilite que se generen como una unica cadena protemica en que la pareja de regiones V^ly V^hforme moleculas monovalentes (conocido como Fv de cadena sencilla (scFv); Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Osbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:778). Se pretende que dichos scFv tambien esten incluidos dentro de la expresion "parte de union a antfgeno" de un anticuerpo. Cualquier secuencia de V^hy V^lde scFv espedfico puede unirse a un ADNc o secuencias genomicas de la region Fc, para generar vectores de expresion que codifican moleculas Ig completas (por ejemplo, IgG) u otros isotipos. Tambien puede usarse V^hy V^len la generacion de fragmentos Fab, Fv u otros fragmentos de Ig usando qmmica de protemas o tecnologfa de ADN recombinante.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "sFv" comprenden los dominios V^hy V^lde un anticuerpo, en los que estos dominios estan presentes en una unica cadena polipeptfdica. En algunas realizaciones el polipeptido Fv comprende ademas un conector polipeptfdico entre los dominios V^hy V^lque posibilita que el sFv forme la estructura deseada para la union al antfgeno. Para una revision de los sFv, vease, por ejemplo, Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pag. 269-315 (1994).

El termino "AVIMER®" se refiere a una clase de protemas terapeuticas de origen humano, que no estan relacionadas con anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, y estan compuestas de varios dominios de union modulares y reutilizables, mencionados como dominios A (tambien mencionado como modulo de clase A, repeticion de tipo complemento o dominio de clase A de receptor LDL). Se desarrollaron a partir de dominios de receptores extracelulares humanos por reordenamiento de exones in vitro y presentacion en fagos (Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:1493-1494; Silverman et al., 2006, Nat. Biotechnol. 24:220). Las protemas resultantes pueden contener multiples dominios de union independientes que pueden mostrar afinidad mejorada (en algunos casos, subnanomolar) y especificidad mejorada en comparacion con protemas de union a un unico epftopo. Vease, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos numeros 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0053973 y 2005/0089932, 2005/0048512 y 2004/0175756.

Cada uno de los 217 dominios A humanos conocidos comprende ~35 aminoacidos (~4 kDa); y estos dominios estan separados por conectores que tienen cinco aminoacidos de longitud de promedio. Los dominios A nativos se pliegan rapidamente y de forma eficaz en una estructura estable uniforme mediada principalmente por union de calcio y formacion de disulfuro. Un motivo estructural conservado de unicamente 12 aminoacidos es necesario para esta estructura comun. El resultado final es una unica cadena protemica que contiene multiples dominios, cada uno de los cuales representa una funcion diferente. Cada dominio de las protemas se une independientemente y las contribuciones energeticas de cada dominio son aditivas. Estas protemas se llamaron "AVIMER®" de multfmeros de avidez.

El termino "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequenos con dos sitios de union a antfgeno, que son fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (V^h) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V^l) en la misma cadena polipeptfdica (V^h-V^l). Mediante el uso de un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza a que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de union a antigeno. Los diacuerpos se describen mas completamente en, por ejemplo, el documento EP 404097; la publicacion internacional WO 93/11161; y Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:64446448 (1993).

Los polipeptidos de union a antigeno tambien incluyen dfmeros de cadena pesada tales como, por ejemplo, anticuerpos de camelidos y tiburones. Los anticuerpos de camelido y tiburon comprenden una pareja homodimerica de dos cadenas de dominios de tipo V y de tipo C (ninguno tiene una cadena ligera). Como la region V^hde una IgG de dfmero de cadena pesada en un camelido no tiene que generar interacciones hidrofobas con una cadena ligera, la region en la cadena pesada que normalmente entra en contacto con una cadena ligera se cambia a restos de aminoacido hidrofilos en un camelido. Los dominios V^hde IgG de dfmero de cadena pesada se llaman dominios V^hh. Los Ig-NAR de tiburon comprenden un homodfmero de un dominio variable (llamado dominio V-NAR) y cinco dominios constantes de tipo C (dominios C-NAR). En camelidos, la diversidad del repertorio de anticuerpos se determina por las CDR 1, 2 y 3 en las regiones V^ho V^hh.La CDR3 en la region V^hhde camelido se caracteriza por su longitud relativamente larga, que promedia 16 aminoacidos (Muyldermans et al., 1994, Protein Engineering 7(9):1129). Esto esta en contraste con las regiones CDR3 de anticuerpos de muchas otras especies. Por ejemplo, la CDR3 de V^hde raton tiene un promedio de 9 aminoacidos. Las colecciones de regiones variables de anticuerpo derivadas de camelido, que mantienen la diversidad in vivo de las regiones variables de un camelido, pueden generarse por, por ejemplo, los metodos divulgados en la solicitud de patente de Estados Unidos con n.° de serie 20050037421.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) incluyen anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada de una Ig no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son IgG humanas (anticuerpo destinatario) en que una o mas de las CDR del destinatario se reemplazan por CDR de un anticuerpo de especie no humana (anticuerpo donador) tal como raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y funcion de union deseadas. En algunos casos, uno o mas restos de aminoacido de FR de la Ig humana se reemplazan por los correspondientes restos de aminoacido no humanos. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden contener restos que no se encuentran en el anticuerpo destinatario o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones pueden hacerse para refinar el rendimiento del anticuerpo, si fuera necesario. Un anticuerpo humanizado puede comprender sustancialmente todo de al menos uno y, en algunos casos dos, dominios variables en que todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien puede incluir al menos una parte de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tfpicamente la de una inmunoglobulina humana. Para los detalles, vease Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Un anticuerpo humanizado tambien incluye anticuerpos en que parte, o todas las CDR de la cadena pesada y ligera se obtienen de un anticuerpo monoclonal no humano, sustancialmente todas las demas partes de las regiones variables se obtienen de la region variable humana (tanto la cadena pesada como la cadena ligera) y las regiones constantes se obtiene de una region constante humana. En una realizacion, las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de las cadenas pesadas y ligeras se obtienen de un anticuerpo no humano. En otra realizacion mas, al menos una CDR (por ejemplo, una ^cDR3) de las cadenas pesadas y ligeras se obtiene de un anticuerpo no humano. Pueden obtenerse diversas combinaciones de CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo no humano y se contemplan en la presente memoria. En un ejemplo no limitante, una o mas de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cada una de las cadenas pesadas y ligeras se obtienen de las secuencias descritas en la presente memoria.

La expresion "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades mmimas. Los anticuerpos monoclonales son muy espedficos, estando dirigidos contra un unico sitio antigenico. Ademas, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que pueden incluir diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epttopos), cada anticuerpo monoclonal esta dirigido contra un unico determinate en el antfgeno. El modificador "monoclonal" indica el caracter del anticuerpo como obtenido de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no debe interpretarse como requiriendo la produccion del anticuerpo por ningun metodo particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden generarse por el metodo de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975) o pueden generarse por metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4816567). En determinadas realizaciones, los anticuerpos monoclonales pueden aislarse de colecciones de anticuerpos en fagos usando las tecnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos pueden aislarse y purificarse del sobrenadante de cultivo o lfquido asdtico mencionado anteriormente por precipitacion con sulfato de amonio saturado, el metodo de precipitacion de euglobulina, el metodo de acido caproico, el metodo de acido capnlico, cromatograffa de intercambio ionico (DEAE o DE52) o cromatograffa de afinidad usando columna anti-Ig o una columna de protema A, G o L tal como se describe en mas detalle a continuacion.

Los anticuerpos ejemplares para su uso en las composiciones y metodos descritos en la presente memoria son moleculas de inmunoglobulina intactas tales como, por ejemplo, un anticuerpo humanizado o aquellas partes de una molecula de Ig humanizada que contiene el sitio de union a antfgeno (es decir, paratopo) o una unica cadena pesada y una unica cadena ligera, incluyendo aquellas partes conocidas en la tecnica como Fab, Fab', F(ab)', F(ab')², Fd, scFv, un dominio pesado variable, un dominio ligero variable, un dominio NAR variable, scFv biespedfico, un Fab²biespedfico, un Fab³triespedfico y polipeptidos de union de cadena sencilla y otros tambien mencionados como fragmentos de union a antigeno. Cuando se construye una molecula de inmunoglobulina o fragmentos de la misma, las regiones variables o partes de las mismas pueden fusionarse, conectarse o unirse de otro modo a una o mas regiones constantes o partes de las mismas para producir cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de los mismos descritos en la presente memoria. Esto puede conseguirse de una diversidad de maneras conocidas en la tecnica, incluyendo, aunque sin limitacion, tecnicas de clonacion molecular o smtesis directa de los acidos nucleicos que codifican las moleculas. Los metodos no limitantes ejemplares de construccion de estas moleculas tambien pueden encontrarse en los ejemplos descritos en la presente memoria.

Los metodos para generar anticuerpos biespedficos u otros anticuerpos multiespedficos son conocidos en la tecnica e incluyen reticulacion qrnmica, uso de cremalleras de leucina (Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992); tecnologfa de diacuerpos (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993); dfmeros de scFv [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368, 1994], anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-62, 1995); y anticuerpos recombinantes quelantes (Neri et al., J Mol Biol. 246:367-73, 1995).

Los "anticuerpos lineales" comprenden una pareja de segmentos Fd en tandem (V^h-C^h1-V^h-C^h1) que forma una pareja de regiones de union a antfgeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespedficos o monoespedficos (Zapata et al. Protein Eng. 8:1057-62 (1995)).

Adicionalmente, los anticuerpos antihepcidina divulgados en la presente memoria tambien pueden construirse para que se plieguen en formas multivalentes, que pueden mejorar la afinidad de union, la especificidad y/o la semivida aumentada en sangre. Las formas multivalentes de anticuerpos antihepcidina pueden prepararse por tecnicas conocidas en la tecnica.

Los anticuerpos biespedficos y multiespedficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconjugados pueden generarse usando cualquier metodo de reticulacion conveniente. Los agentes de reticulacion adecuados son bien conocidos en la tecnica y se divulgan en la patente de Estados Unidos n.° 4676980, junto con varias tecnicas de reticulacion. Otro metodo esta disenado para generar tetrameros anadiendo una secuencia codificante de estreptavidina en el extremo C del scFv. La estreptavidina esta compuesta de cuatro subunidades, de modo que cuando se pliega el scFv-estreptavidina, cuatro subunidades se asocian para formar un tetramero (Kipriyanov et al., Hum Antibodies Hybridomas 6(3): 93-101 (1995).

De acuerdo con otra estrategia para generar anticuerpos biespedficos, la superficie de contacto entre una pareja de moleculas de anticuerpo puede manipularse para maximizar el porcentaje de heterodfmeros que se recuperan de cultivo celular recombinante. Una superficie de contacto comprende al menos una parte del dominio C^h3 de un dominio constante de anticuerpo. En este metodo, una o mas cadenas laterales de aminoacido pequeno de la superficie de contacto de la primera molecula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales mas grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano). Se crean "cavidades" de compensacion de tamano identico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes sobre la superficie de contacto de la segunda molecula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoacido grandes con las pequenas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodfmero sobre otros productos finales indeseados tales como homodfmeros. Vease la publicacion internacional WO 96/27011 publicada el 6 de septiembre de 1996.

Las tecnicas para generar anticuerpos biespedficos o multiespedficos a partir de fragmentos de anticuerpo son convencionalmente conocidas en la tecnica. Por ejemplo, los anticuerpos biespedficos o triespedficos pueden prepararse usando union qrnmica. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinden proteolfticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmented se reducen en presencia del agente que forma complejos ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinales y evitan la formacion de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados entonces se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB entonces se vuelve a convertir en Fab'-tiol por reduccion con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespedfico. Los anticuerpos biespedficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilizacion selectiva de enzimas. Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) divulgan la secrecion de fragmentos de anticuerpo funcionales a partir de bacterias (vease, por ejemplo, Better et al., Skerra et al. Science 240:1038-1041 (1988)). Por ejemplo, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse qmmicamente para formar anticuerpos biespedficos (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)).

Se han conocidos convencionalmente en la tecnica diversas tecnicas para generar y aislar fragmentos de anticuerpo biespedficos o multiespedficos directamente de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespedficos usando cremalleras de leucina, por ejemplo, GCN4. (Vease en lmeas generales Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992).) Los peptidos de cremallera de leucina de las protemas Fos y Jun se unieron a las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusion genica. Los homodfmeros de anticuerpo se redujeron en la region de bisagra para formar monomeros y despues se reoxidaron para formar los heterodfmeros de anticuerpo. Este metodo tambien puede utilizarse para la produccion de homodfmeros de anticuerpo.

Como se usa en la presente memoria, un "minicuerpo" se refiere a un scFv fusionado a CH3 mediante un conector peptfdico (sin bisagra) o mediante una bisagra de IgG, que se ha descrito en Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. Abril de 2004; 17(4):315-23.

Como se usa en la presente memoria, un "maxicuerpo" se refiere a un scFv bivalente unido covalentemente a la region Fc de una inmunoglobulina, vease, por ejemplo, Fredericks et al., Protein Engineering, Design & Selection, 17:95-106 (2004) y Powers et al., Journal of Immunological Methods, 251:123-135 (2001).

Como se usa en la presente memoria, un "intracuerpo" se refiere a un anticuerpo de cadena sencilla que demuestra expresion intracelular y puede manipular la funcion protemica intracelular (Biocca, et al., EMBO J. 9:101-108, 1990; Colby et al., Proc Natl Acad Sci ^uS^a. 101:17616-21, 2004). Los intracuerpos, que comprenden secuencias senal celulares que retienen la construccion del anticuerpo en regiones intracelulares, pueden producirse como se describe en Mhashilkar et al., (EMBO J 14:1542-51, 1995) y Wheeler et al. (FASEB J. 17:1733-5. 2003). Los transcuerpos son anticuerpos con capacidad de infiltracion en las celulas en que un dominio de transduccion de protema (PTD) se fusiona con anticuerpos de fragmento variable de cadena sencilla (scFv), Heng et al., (Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005).

En la presente memoria se contemplan adicionalmente anticuerpos que son SMIP o protemas de fusion de inmunoglobulina de dominio de union espedficas para la protema diana. Estas construcciones son polipeptidos de cadena sencilla que comprenden dominios de union a antfgeno fusionados a dominios de inmunoglobulina necesarios para realizar las funciones efectoras del anticuerpo. Vease, por ejemplo, la publicacion internacional WO 03/041600, la publicacion de patente de Estados Unidos 20030133939 y la publicacion de patente de Estados Unidos 20030118592.

La humanizacion de anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno de los mismos puede conseguirse mediante una diversidad de metodos conocidos en la tecnica y descritos en la presente memoria. Asimismo, la produccion de anticuerpos humanizados tambien puede conseguirse mediante metodos conocidos en la tecnica y descritos en la presente memoria.

En una realizacion ejemplar, la solicitud contempla un polipeptido de union de cadena sencilla que tiene una region variable de cadena pesada y/o una region variable de cadena ligera que se une a un epftopo descrito en la presente memoria y tiene, opcionalmente, una region Fc de inmunoglobulina. Dicha molecula es un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) que tiene opcionalmente funcion efectora o semivida aumentada mediante la presencia de la region Fc de inmunoglobulina. Los metodos de preparacion de polipeptidos de union de cadena sencilla son conocidos en la tecnica (por ejemplo, solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2005/0238646).

Las expresiones "segmented genicos de la lmea germinal" o "secuencias de la lmea germinal" se refieren a los genes de la lmea germinal (los gametos haploides o aquellas celulas diploides a partir de las que se forman). El ADN de la lmea germinal contiene multiples segmentos genicos que codifican una unica cadena pesada o ligera de Ig. Estos segmentos genicos se transportan en las celulas germinales, pero no pueden transcribirse y traducirse en cadenas pesadas y ligeras hasta que se disponen en genes funcionales. Durante la diferenciacion de los linfocitos B en la medula osea, estos segmentos genicos se reordenan aleatoriamente por un sistema genetico dinamico que puede generar mas de 108 especificidades. La mayona de estos segmentos genicos estan publicados y recogidos por la base de datos de la lmea germinal.

La afinidad de union y/o avidez de los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos puede mejorarse modificando las regiones flanqueantes. Los metodos para las modificaciones de las regiones flanqueantes son conocidos en la tecnica y se contemplan en la presente memoria. La seleccion de una o mas posiciones de aminoacido de la region flanqueante relevante para alterarlas depende de una diversidad de criterios. Un criterio para seleccionar aminoacidos flanqueantes relevantes para su cambio puede ser las diferencias relativas en los restos flanqueantes de aminoacido entre las moleculas donadoras y aceptadoras. La seleccion de posiciones flanqueantes relevantes para alterarlas usando esta estrategia tiene la ventaja de evitar cualquier desviacion subjetiva en la determinacion de los restos o cualquier desviacion en la contribucion de la afinidad de union de CDR por el resto.

Como se usa en la presente memoria, "inmunorreactivo" se refiere a anticuerpos o fragmentos de union a anftgeno de los mismos que son espedficos para una secuencia de restos de aminoacido ("sitio de union" o "epftopo"), aunque si tienen reactividad cruzada con otros peptidos/protemas, son no toxicos a los niveles a los que se formulan para su administracion para uso humano. El termino "union" se refiere a una asociacion directa entre dos moleculas debido a, por ejemplo, interacciones covalentes, electrostaticas, hidrofobas e ionicas y/o de enlace de hidrogeno en condiciones fisiologicas, y que incluyen interacciones tales como puentes salinos y puentes acuosos y cualquier otro medio de union convencional. La expresion "se une preferentemente" significa que el agente de union se une al sitio de union con mayor afinidad de lo que se une a secuencias de aminoacidos no relacionadas. Preferiblemente, dicha afinidad es al menos 1 vez mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 6 veces mayor, al menos 7 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 9 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 20 veces mayor, al menos 30 veces mayor, al menos 40 veces mayor, al menos 50 veces mayor, al menos 60 veces mayor, al menos 70 veces mayor, al menos 80 veces mayor, al menos 90 veces mayor, al menos 100 veces mayor o al menos 1000 veces mayor que la afinidad del agente de union por las secuencias de aminoacidos no relacionadas. Los terminos "inmunorreactivo" y "se une preferentemente" se usan indistintamente en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el termino "afinidad" se refiere a la constante en equilibrio para la union reversible de dos agentes y se expresa como Kd. En una realizacion, los anticuerpos, o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, muestran caractensticas deseables tales como afinidad de union medida por Kd (constante de disociacion en equilibrio) para hepcidina en el intervalo de 1 * 10-6 M o menos, o que vana hasta 10-16 M o menor, (por ejemplo, aproximadamente 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16M o menos). La constante de disociacion en equilibrio puede determinarse en ensayo de equilibrio en disolucion usando BIAcore y/o KinExA. Como se usa en la presente memoria, el termino "avidez" se refiere a la resistencia de un complejo de dos o mas agentes a la disociacion despues de dilucion. Las afinidades aparentes pueden determinarse por metodos tales como ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (ELISA) o cualquier otra tecnica habitual para un experto en la materia. Las avideces pueden determinarse por metodos tales como analisis de Scatchard o cualquier otra tecnica habitual para un experto en la materia.

"Epftopo" se refiere a esa parte de un anftgeno u otra macromolecula que puede formar una interaccion de union con el bolsillo de union de la region variable de un anticuerpo. Dichas interacciones de union pueden manifestarse como un contacto intermolecular con uno o mas restos de aminoacido de una o mas CDR. La union a anftgeno puede implicar, por ejemplo, una CDR3 o una pareja de CDR3 o, en algunos casos, interacciones de hasta las seis CDR de las cadenas Vh y Vl. Un epftopo puede ser una secuencia pepftdica lineal (es decir, "continua") o puede estar compuesto de secuencias de aminoacidos no contiguas (es decir, "conformacional" o "discontinuo"). Un anticuerpo puede reconocer una o mas secuencias de aminoacidos; por lo tanto, un epftopo puede definir mas de una secuencia de aminoacidos distinta. Los epftopos reconocidos por anticuerpos pueden determinarse por cartografiado pepftdico y tecnicas de analisis de secuencia bien conocidas para los expertos en la materia. Las interacciones de union se manifiestan como contactos intermoleculares con uno o mas restos de aminoacido de una CDR.

El termino "espedfico" se refiere a una situacion en que un anticuerpo no mostrara ninguna union significativa a moleculas diferentes del anftgeno que contiene el epftopo reconocido por el anticuerpo. El termino tambien es aplicable cuando, por ejemplo, un dominio de union a anftgeno es espedfico para un epftopo particular que portan varios anftgenos, en cuyo caso el anticuerpo o fragmento de union a anftgeno del mismo que porta el dominio de union a anftgeno podra unirse a los diversos anftgenos que portan el epftopo. Las expresiones "se une preferentemente" o "se une espedficamente" significan que los anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen a un epftopo con mayor afinidad de lo que se une a secuencias de aminoacidos no relacionadas y, si tienen reactividad cruzada con otros polipeptidos que contiene el epftopo, son no toxicos a los niveles a los que se formulan para su administracion para uso humano. En un aspecto, dicha afinidad es al menos 1 vez mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 6 veces mayor, al menos 7 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 9 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 20 veces mayor, al menos 30 veces mayor, al menos 40 veces mayor, al menos 50 veces mayor, al menos 60 veces mayor, al menos 70 veces mayor, al menos 80 veces mayor, al menos 90 veces mayor, al menos 100 veces mayor o al menos 1000 veces mayor que la afinidad del anticuerpo o fragmento del mismo por secuencias de aminoacidos no relacionadas. Las expresiones "inmunorreactivo", "se une", "se une preferentemente" y "se une espedficamente" se usan indistintamente en la presente memoria. El termino "union" se refiere a una asociacion directa entre dos moleculas debido a, por ejemplo, interacciones covalentes, electrostaticas, hidrofobas e ionicas y/o de enlace de hidrogeno en condiciones fisiologicas, e incluye interacciones tales como puentes salinos y puentes acuosos, asf como cualquier otro medio convencional de union.

Los anticuerpos pueden cribarse para la afinidad de union por metodos conocidos en la tecnica incluyendo, aunque sin limitacion, ensayos de desplazamiento en gel, transferencias de Western, ensayo de competicion con radiomarcaje, cofraccionamiento por cromatograffa, coprecipitacion, reticulacion, ELISA y similares, que se describen en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NY.

Los anticuerpos que se unen al epftopo deseado en el antigeno diana pueden cribarse en un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988), que puede llevarse a cabo. Tambien pueden usarse ensayos de union competitiva rutinarios, en que un anticuerpo desconocido se caracteriza por su capacidad de inhibir la union de una diana a un anticuerpo espedfico de diana de la invencion. Puede usarse antigeno intacto, fragmentos del mismo tal como el dominio extracelular o epftopos lineales. El cartografiado de epttopos se describe en Champe et al., J. Biol. Chem.

270:1388-1394 (1995).

Los anticuerpos que inhiben o neutralizan la actividad hepcidina humana pueden identificarse poniendo en contacto hepcidina con un anticuerpo, comparando la actividad hepcidina en presencia y ausencia del anticuerpo de ensayo y determinando si la presencia del anticuerpo disminuye la actividad de la hepcidina. La actividad biologica de un anticuerpo particular, o combinacion de anticuerpos, puede evaluar in vivo usando un modelo animal adecuado, incluyendo cualquiera de los descritos en la presente memoria.

En una realizacion, en la presente memoria se describen ensayos de cribado de alto rendimiento (HTS) para identificar anticuerpos que interaction con o inhiben la actividad biologica de hepcidina diana. Los ensayos HTS permiten el cribado de grandes cantidades de compuestos de una manera eficaz.

La expresion "sustitucion de aminoacido conservativa" se refiere al agrupamiento de aminoacidos basandose en determinadas propiedades comunes. Una manera funcional de definir las propiedades comunes entre aminoacidos individuales es analizar las frecuencias normalizadas de cambios de aminoacidos entre proternas correspondientes de organismos homologos (Schulz, G. E. y R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). De acuerdo con dichos analisis, los grupos de aminoacidos pueden definirse cuando los aminoacidos dentro de un grupo se intercambian preferentemente entre sf y, por lo tanto, se parecen entre sf mucho en su impacto sobre la estructura de la proterna global (Schulz, G. E. y R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Los ejemplos de grupos de aminoacidos definidos de esta manera incluyen:

(i) un grupo cargado, que consiste en Glu y Asp, Lys, Arg y His,

(ii) un grupo cargado positivamente, que consiste en Lys, Arg y His,

(iii) un grupo cargado negativamente, que consiste en Glu y Asp,

(iv) un grupo aromatico, que consiste en Phe, Tyr y Trp,

(v) un grupo con anillo de nitrogeno, que consiste en His y Trp,

(vi) un grupo apolar alifatico grande, que consiste en Val, Leu e Ile,

(vii) un grupo ligeramente polar, que consiste en Met y Cys,

(viii) un grupo de resto pequeno, que consiste en Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln y Pro,

(ix) un grupo alifatico que consiste en Val, Leu, Ile, Met y Cys, y

(x) un grupo hidroxilo pequeno que consiste en Ser y Thr.

Ademas de los grupos presentados anteriormente, cada resto de aminoacido puede formar su propio grupo, y el grupo formado por un aminoacido individual puede mencionarse simplemente por la abreviatura de una y/o tres letras para ese aminoacido habitualmente usada en la tecnica como se describe anteriormente.

Un "resto conservado" es un aminoacido que es relativamente invariable entre una serie de proternas similares. A menudo los restos conservados variaran unicamente por el reemplazo con un aminoacido similar, como se describe anteriormente para "sustitucion de aminoacido conservativa".

La letra "x" o "xaa" como se usa en las secuencias de aminoacidos en la presente memoria pretende indicar que cualquiera de los veinte aminoacidos convencionales puede reemplazarse en esta posicion salvo que se indique espedficamente de otro modo.

"Homologfa" o "identidad" o "similitud" se refieren a la similitud de secuencia entre dos peptidos o entre dos moleculas de acido nucleico. La homologfa y la identidad pueden determinarse cada una comparando una posicion en cada secuencia que puede alinearse con fines de comparacion. Cuando una posicion equivalente en las secuencias comparadas esta ocupada por la misma base o aminoacido, entonces las moleculas son identicas en esa posicion; cuando el sitio equivalente ocupado por el mismo resto de aminoacido o uno similar (por ejemplo, similar en naturaleza esterica y/o electronica), entonces las moleculas pueden mencionarse como homologas (similares) en esa posicion. La expresion como un porcentaje de homolog^a/similitud o identidad se refiere a una funcion del numero de aminoacidos identicos o similares en posiciones compartidas por las secuencias comparadas. Una secuencia que "no esta relacionada" o "no es homologa" comparte menos de un 40 % de identidad, aunque preferiblemente menos de un 25 % de identidad con una secuencia de la presente invencion. En la comparacion de dos secuencias, la ausencia de restos (aminoacidos o acidos nucleicos) o la presencia de restos adicionales tambien disminuye la identidad y homologfa/similitud.

El termino "homologfa" describe una comparacion de base matematica de similitudes de secuencia que se usa para identificar genes o protemas con funciones o motivos similares. Las secuencias de acido nucleico (nucleotido, oligonucleotido) y aminoacidos (protema) de la presente invencion pueden usarse como una "secuencia de consulta" para realizar una busqueda frente a bases de datos publicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia, secuencias relacionadas u homologos. Dichas busquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (version 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las busquedas de nucleotidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, valor=100, longitud de palabra=12 para obtener secuencias de nucleotidos homologas a moleculas de acido nucleico de la invencion. Las busquedas de aminoacidos BLAST puede realizarse con el programa XBLAST, valor=50, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoacidos homologas a moleculas protemicas de la invencion. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparacion, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res.

25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y BLAST) (vease, www.ncbi.nlm.nih.gov).

Como se usa en la presente memoria, "identidad" significa el porcentaje de restos nucleotfdicos o aminoaddicos identicos en posiciones correspondientes en dos o mas secuencias cuando las secuencias se alinean para maximizar el acoplamiento de secuencias, es decir, teniendo en cuenta huecos e inserciones. La identidad puede calcularse facilmente por metodos conocidos, incluyendo aunque sin limitacion los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Los metodos para determinar la identidad estan disenados para dar la maxima coincidencia entre las secuencias ensayadas. Ademas, los metodos para determinar la identidad estan codificados en programas informaticos disponibles al publico. Los metodos de programa informatico para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, aunque sin limitacion, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990) y Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). El programa BLAST X esta disponible al publico en N^cBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Tambien puede usarse el algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la identidad.

"Aislado" (usado indistintamente con "sustancialmente puro" o "purificado") cuando se aplica a polipeptidos significa un polipeptido a una parte del mismo que, en virtud de su origen o manipulacion: (i) esta presente en una celula hospedante como el producto de expresion de una parte de un vector de expresion; o (ii) esta unido a una protema u otro resto qmmico diferente del que esta unido en la naturaleza o (iii) no existe en la naturaleza, por ejemplo, una protema que se manipula qmmicamente adjuntando o anadiendo al menos un resto hidrofobo a la protema de modo que la protema este en una forma no encontrada en la naturaleza. Por "aislado" se entiendo ademas una protema que: (i) se sintetiza qmmicamente; o (ii) se expresa en una celula hospedante y se purifica de las protemas asociadas y contaminantes. El termino generalmente significa un polipeptido que se ha separado de otras protemas y acidos nucleicos con que se produce de forma natural. Preferiblemente, el polipeptido tambien se separa de sustancias tales como anticuerpos o matrices de gel (poliacrilamida) que se usan para purificarlo.

"Inducir una respuesta inmunitaria del hospedador" significa que un sujeto experimenta alivio o reduccion de los signos o smtomas de una enfermedad, y espedficamente incluye, sin limitacion, prolongacion de la supervivencia. Las inmunoglobulinas humanizadas, incluyendo los anticuerpos humanizados, se han construido mediante ingeniena genetica. La mayona de las inmunoglobulinas humanizadas que se han descrito previamente han comprendido una region flanqueante que es identica a la region flanqueante de una cadena de inmunoglobulina humana particular (es decir, una aceptadora o destinataria) y tres CDR de una cadena inmunoglobulina no humana (es decir, donadora). Como se describe en la presente memoria, la humanizacion tambien puede incluir criterios por los que se identifica una cantidad limitada de aminoacidos en la region flanqueante de una cadena de inmunoglobulina humanizada y se eligen para que sean iguales a los aminoacidos de esas posiciones en el donador en lugar de en el aceptador, para aumentar la afinidad de un anticuerpo que comprende la cadena de inmunoglobulina humanizada.

Cuando se desea afinidad aumentada de un anticuerpo humanizado, pueden sustituirse ademas los restos dentro de las CDR de un anticuerpo convertido con otros aminoacidos. Tfpicamente, no se cambian mas de cuatro restos de aminoacido en una CDR, y muy tfpicamente no se cambiaran mas de dos restos en la CDR, excepto por la CDR2 de cadena pesada, donde pueden cambiar tantos como 10 restos. Lo cambios en la afinidad pueden medirse por metodos convencionales tales como los descritos en la presente memoria (por ejemplo, Biacore).

Se describen metodos de "superhumanizacion" de anticuerpos en mas detalle en la patente de Estados Unidos n.° 6881557.

Los anticuerpos humanizados y fragmentos de union a antigeno pueden construirse y producirse usando tecnicas convencionales conocidas en la tecnica. Ademas, a menudo pueden producirse anticuerpos preparados de forma recombinante en grandes cantidades, particularmente cuando se utilizan vectores de expresion de alto nivel.

Los anticuerpos pueden secuenciarse usando tecnicas convencionales conocidas en la tecnica. En un aspecto, las secuencias de aminoacidos de una o mas de las CDR se insertan en una secuencia sintetica de, por ejemplo, una region flanqueante de anticuerpo humano (o fragmento de union a antigeno del mismo) para crear un anticuerpo humano que podna limitar las reacciones secundarias adversas de tratar a un sujeto humano con un anticuerpo no humano. Las secuencias de aminoacidos de una o mas de las CDR tambien pueden insertarse en una secuencia sintetica de, por ejemplo, una protema de union tal como un AVIMER® para crear una construccion para su administracion a un sujeto humano. Dichas tecnicas pueden modificarse dependiendo de la especie de animal a tratar. Por ejemplo, para usos veterinarios, puede sintetizarse un anticuerpo, fragmento de union a antigeno o protema de union para su administracion a un animal no humano (por ejemplo, un primate, una vaca, un caballo, etc.).

En otro aspecto, usando tecnicas reconocidas en la tecnica tales como las descritas en la presente memoria, pueden insertarse nucleotidos que codifican secuencias de aminoacidos de una o mas de las CDR, por ejemplo, por tecnicas recombinantes en sitios de endonucleasa de restriccion de un polinucleotido existente que codifica un anticuerpo, fragmento de union a antigeno o protema de union.

Para la expresion, un sistema de expresion es uno que utiliza el sistema GS (Lonza) usando un gen de glutamina sintetasa como marcador de seleccion. En resumen, se realiza una transfeccion en celulas CHO por electroporacion (250 V) usando el sistema GS (Lonza) usando el gen de la glutamina sintetasa como marcador de seleccion. Las celulas CHO de tipo silvestre se cultivan en DMEN (Sigma) que contiene un 10 % de suero fetal de ternera (FCS) dializado al 10% con glutamina 2 nM. Se transfectan 6x107 celulas CHO con 300 pg de ADN linealizado por electroporacion. Despues de la electroporacion, las celulas se resuspenden en DMEM con glutamina y se siembran en 36 placas de 96 pocillos (50 pl/pocillos) y se incuban a 37 °C en CO2 al 5 %. El siguiente dfa, se anaden 150 pl/pocillo de medio selectivo (DMEM sin glutamina). Despues de aproximadamente 3 semanas, las colonias se criban por ELISA (vease a continuacion) usando un anticuerpo irrelevante como control negativo. Todas las colonias que producen >20 pg/ml se expanden en placas de 24 pocillos y despues en matraces T25 duplicados.

Para la produccion de alto nivel, el sistema de expresion de mairnfero mas ampliamente usado es uno que utiliza el procedimiento de amplificacion genica ofrecido por celulas de ovario de hamster chino deficientes en deshidrofolato reductasa ("dhfr"). El sistema es bien conocido para los expertos en la materia. El sistema se basa en el gen de la deshidrofolato reductasa "dhfr', que codifica la enzima DHFR, que cataliza la conversion de deshidrofolato en tetrahidrofolato. Para conseguir una alta produccion, se transfectan celulas CHO dhfr- con un vector de expresion que contiene un gen de DHFR funcional, junto con un gen que codifica una protema deseada. En este caso, la protema deseada es la cadena pesada y/o la cadena ligera de anticuerpo recombinante.

Aumentando la cantidad del inhibidor de DHFR competitivo metotrexato (MTX), las celulas recombinantes desarrollan resistencia por amplificacion del gen dhfr. En casos convencionales, la unidad de amplificacion empleada es mucho mas grande que el tamano del gen dhfr, y como resultado, se coamplifica la cadena pesada del anticuerpo.

Cuando se desea produccion a gran escala de la protema, tal como la cadena del anticuerpo, tanto el nivel de expresion como la estabilidad de las celulas que se estan empleando se tienen en cuenta. En cultivo a largo plazo, las poblaciones de celulas CHO recombinantes pierden homogeneidad con respecto a su productividad de anticuerpo espedfico durante la amplificacion, aunque derivan de un unico clon precursor.

La presente solicitud proporciona un polinucleotido aislado (acido nucleico) que codifica un anticuerpo fragmento de union a antfgeno como se describe en la presente memoria, vectores que contienen dichos polinucleotidos y celulas hospedantes y sistemas de expresion para transcribir y traducir dichos polinucleotidos en polipeptidos.

La presente solicitud tambien proporciona construcciones en forma de plasmidos, vectores, casetes de transcripcion o expresion que comprenden al menos un polinucleotido como anteriormente.

La presente solicitud tambien proporciona una celula hospedante recombinante que comprende una o mas construcciones como anteriormente. Un acido nucleico que codifica cualquier anticuerpo o fragmentos de union a antfgeno del mismo descritos en la presente memoria como se describe, forma por sf mismo un aspecto de la presente solicitud, asf como un metodo de produccion del anticuerpo o fragmentos de union a antfgeno del mismo descritos en la presente memoria, comprendiendo dicho metodo la expresion a partir de un acido nucleico codificante del mismo. La expresion puede conseguirse convenientemente cultivando en condiciones apropiadas celulas hospedantes recombinantes que contienen el acido nucleico. Despues de la produccion mediante la expresion, puede aislarse y/o purificarse un anticuerpo o fragmento de union a antigeno usando cualquier tecnica adecuada, y despues usarse segun lo apropiado.

Los anticuerpos espedficos, fragmentos de union a antigeno y moleculas de acido nucleico codificantes y vectores descritos en la presente memoria pueden describirse aislados y/o purificados, por ejemplo, de su entorno natural, en forma sustancialmente pura u homogenea. En el caso de acido nucleico, libres o sustancialmente libres de acido nucleico o genes de origen diferente de la secuencia codificante de un polipeptido con la funcion requerida. El acido nucleico puede comprender ADN o ARN y puede ser completa o parcialmente sintetico. Los metodos de purificacion son bien conocidos en la tecnica.

Los sistemas para clonacion y expresion de un polipeptido en una diversidad de celulas hospedantes diferentes son bien conocidos. Las celulas hospedantes adecuadas incluyen, aunque sin limitacion, celulas bacterianas, celulas de mairnfero, celulas de levadura y sistemas de baculovirus. Las lmeas celulares de mairnfero disponibles en la tecnica para la expresion de un polipeptido heterologo incluyen celulas de ovario de hamster chino, celulas HeLa, celulas renales de cna de hamster, celulas de mieloma de raton NS0 y muchas otras. Un hospedador bacteriano habitual es E. coli.

La expresion de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en celulas procariotas tales como E. coli esta bien establecida en la tecnica. Para una revision, vease, por ejemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991). La expresion en celulas eucariotas en cultivo tambien esta disponible para los expertos en la materia como una opcion para la produccion de los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno descritos en la presente memoria, vease para revisiones recientes, por ejemplo, Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4:573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6:553-560.

Pueden elegirse o construirse vectores adecuados, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilacion, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias segun lo apropiado. Los vectores pueden ser plasmidos, vmcos, por ejemplo, fagos o fagomidos, segun lo apropiado. Para detalles adicionales vease, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2.a edicion, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Se describen muchas tecnicas y protocolos conocidos para la manipulacion de acido nucleico, por ejemplo, en la preparacion de construcciones de acido nucleico, mutagenesis, secuenciacion, introduccion de ADN en celulas y expresion genica, y analisis de protemas, en detalle en Short Protocols in Molecular Biology, segunda edicion, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. Los metodos divulgados de Sambrook et al. y Ausubel et al. son bien conocidos en la tecnica.

Por tanto, un aspecto adicional proporciona una celula hospedante que contiene acido nucleico como se divulga en la presente memoria. Un aspecto adicional mas proporciona un metodo que comprende introducir dicho acido nucleico en una celula hospedante. La introduccion puede emplear cualquier tecnica disponible. Para celulas eucariotas, las tecnicas adecuadas pueden incluir, por ejemplo, transfeccion con fosfato de calcio, DEAE dextrano, electroporacion, transfeccion mediada por liposomas y transduccion usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, para celulas de insecto, baculovirus. Para celulas bacterianas las tecnicas adecuadas pueden incluir, por ejemplo, transformacion con cloruro de calcio, electroporacion y transfeccion usando bacteriofagos.

Puede hacerse un seguimiento de la introduccion causando o permitiendo la expresion a partir del acido nucleico como, por ejemplo, cultivando las celulas hospedantes en condiciones para la expresion del gen.

En una realizacion, el acido nucleico se integra en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la celula hospedante. La integracion puede promoverse por inclusion de secuencias que promueven la recombinacion con el genoma, de acuerdo con tecnicas convencionales. Las mejoras de Ig pueden inicializarse segun lo necesario para maximizar la expresion.

La presente solicitud tambien proporciona un metodo que comprende usar una construccion como se indica anteriormente en un sistema de expresion para expresar los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos como anteriormente.

La presente solicitud tambien se refiere a acidos nucleicos aislados, tales como moleculas de ADN recombinantes o genes clonados, o variantes degeneradas de los mismos, mutantes, analogos o fragmentos de los mismos, que codifican un anticuerpo o secuencias de union a antfgeno descrito en la presente memoria.

En un aspecto, la presente solicitud proporciona un acido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo como se describe en la presente memoria.

En una realizacion adicional, la secuencia de ADN completa de la molecula de ADN recombinante o gen clonado de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno descrito en la presente memoria puede unirse de forma funcional a una secuencia de control de la expresion que puede introducirse en un hospedador apropiado. La solicitud, por consiguiente, incluye hospedadores unicelulares transformados con el gen clonado o molecula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la V^hy/o V^l, o partes de las mismas, del anticuerpo.

Otra caractenstica es la expresion de las secuencias de ADN divulgadas en la presente memoria. Como es bien sabido en la tecnica, las secuencias de ADN pueden expresarse uniendolas de forma funcional a una secuencia de control de la expresion en un vector de expresion apropiado y empleando ese vector de expresion para transformer un hospedador unicelular apropiado.

Dicha union funcional de una secuencia de ADN a una secuencia de control de la expresion incluye, por supuesto, si no forma parte de la secuencia de ADN de por sf, proporcionar un codon de inicio, ATG en la fase de lectura correcta en direccion 5' de la secuencia de ADN.

Los polinucleotidos y vectores pueden describirse en una forma aislada y/o purificada (por ejemplo, libre o sustancialmente libre de polinucleotidos de origen diferente al polinucleotido que codifica un polipeptido con la funcion requerida). Como se usa en la presente memoria, "sustancialmente puro" y "sustancialmente libre" se refieren a una disolucion o suspension que contiene menos de, por ejemplo, aproximadamente un 20 % o menos material exogeno, aproximadamente un 10% o menos material exogeno, aproximadamente un 5% o menos material exogeno, aproximadamente un 4 % o menos material exogeno, aproximadamente un 3 % o menos material exogeno, aproximadamente un 2 % o menos material exogeno o aproximadamente un 1 % o menos material exogeno.

Puede emplearse una amplia diversidad de combinaciones de hospedador/vector de expresion en la expresion de las secuencias de ADN de esta invencion. Los vectores de expresion utiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosomicas, no cromosomicas y sinteticas. Los vectores adecuados incluyen, aunque sin limitacion, derivados de SV40 y plasmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, plasmidos de E. coli col E1, Pcr1, Pbr322, Pmb9 y sus derivados, plasmidos tales como RP4; ADN fagicos, por ejemplo, los numerosos derivados del fago A, por ejemplo NM989 y otro ADN fagico, por ejemplo, M13 y ADN de fago monocatenario filamentoso; plasmidos de levadura tales como el plasmido 2u o derivados del mismo; vectores utiles en celulas eucariotas, tales como vectores utiles en celulas de insecto o de mairnfero; vectores derivados de combinaciones de plasmidos y ADN fagicos, tales como plasmidos que se han modificado para emplear ADN fagico u otras secuencias de control de la expresion; y similares.

Tambien se describe en la presente memoria una celula hospedante recombinante que comprende una o mas construcciones polinucleotidicas. Un polinucleotido que codifica un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno como se describe en la presente memoria forma un aspecto de la presente solicitud, asf como un metodo de produccion del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno, comprendiendo dicho metodo la expresion a partir del polinucleotido. La expresion puede conseguirse, por ejemplo, cultivando en condiciones apropiadas celulas hospedantes recombinantes que contienen el polinucleotido. Un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno entonces puede aislarse y/o purificarse usando cualquier tecnica adecuada y usarse segun lo apropiado.

Puede usarse cualquiera de una amplia diversidad de secuencias de control de la expresion - secuencias que controlan la expresion de una secuencia de ADN unida de forma funcional a las mismas - en estos vectores para expresar las secuencias de ADN. Dichas secuencias de control de la expresion utiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano o tardfo de SV40, CMV, vaccinia, poliomavirus o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el sistema LTR, las regiones principales de operador y promotor del fago A, las regiones de control de la protema de la cubierta fd, el promotor para la 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolfticas, los promotores de la fosfatasa acida (por ejemplo, Pho5), los promotores de los factores de acoplamiento alfa de levadura y otras secuencias que se sabe que controlan la expresion de genes de celulas procariotas o eucariotas o sus virus, y diversas combinaciones de las mismas.

Los sistemas para la clonacion y expresion de un polipeptido en una diversidad de celulas hospedantes diferentes son bien conocidos. Las celulas hospedantes adecuadas incluyen bacterias, celulas de marnffero, sistemas de levadura y baculovirus. Las lmeas celulares de mamffero disponibles en la tecnica para la expresion de un polipeptido heterologo incluyen celulas de ovario de hamster chino (CHO) celulas HeLa, celulas renales de cna de hamster, celulas de mieloma de raton NS0 y muchas otras. Un hospedador bacteriano habitual puede ser, por ejemplo, E. coli.

La expresion de anticuerpos o fragmento de union a antfgeno en celulas procariotas, tales como E. coli, esta bien establecida en la tecnica. Para una revision, vease, por ejemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991). La expresion en celulas eucariotas en cultivo tambien esta disponible para los expertos en la materia (Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4:573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6:553-560).

Tambien es util una amplia diversidad de celulas hospedantes unicelulares en la expresion de las secuencias de ADN. Estos hospedadores incluyen hospedadores eucariotas y procariotas bien conocidos, tales como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos tales como levaduras y celulas animales, tales como celulas CHO, YB/20, NS0, SP2/0, R1.1, B-W y L-M, celulas renales de mono verde africano (por ejemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, y BMT10), celulas de insecto (por ejemplo Sf9) y celulas humanas y celulas vegetales en cultivo tisular.

Se entendera que no todos los vectores, secuencias de control de la expresion y hospedadores funcionaran igual de bien para expresar las secuencias de ADN. Ni todos los hospedadores funcionaran igual de bien con el mismo sistema de expresion. Sin embargo, un experto en la materia sera capaz de seleccionar los vectores, secuencias de control de la expresion y hospedadores adecuados sin experimentacion excesiva para conseguir la expresion deseada sin alejarse del alcance de esta solicitud. Por ejemplo, en la seleccion de un vector, el hospedador debe considerarse porque el vector debe funcionar en el mismo. El numero de copias del vector, la capacidad de controlar ese numero de copias y la expresion de cualquier otra protema codificada por el vector, tal como marcadores antibioticos, tambien se consideraran. Un experto en la materia puede seleccionar los vectores, secuencias de control de la expresion y hospedadores apropiados para conseguir la expresion deseada sin alejarse del alcance de esta solicitud. Por ejemplo, en la seleccion de un vector, el hospedador se considera porque el vector funciona en el mismo. El numero de copias del vector, la capacidad de controlar ese numero de copias y la expresion de cualquier otra protema codificada por el vector, tal como marcadores antibioticos, tambien pueden considerarse.

La presente solicitud tambien proporciona construcciones en forma de plasmidos, vectores, casetes de transcripcion o expresion como se describe en otra parte en la presente memoria, que comprenden al menos un polinucleotido como anteriormente. Pueden elegirse o construirse vectores adecuados, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilacion, secuencias potenciadoras, marcadores de seleccion y otras secuencias segun lo apropiado. Los vectores pueden ser plasmidos, vmcos, por ejemplo, fagos, fagomidos, etc., segun lo apropiado. Para detalles adicionales vease, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2.a edicion, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Se describen muchas tecnicas y protocolos conocidos para la manipulacion de acido nucleico, por ejemplo, en la preparacion de construcciones de acido nucleico, mutagenesis, secuenciacion, introduccion de ADN en celulas y expresion genica, y analisis de protemas, en detalle en Short Protocols in Molecular Biology, segunda edicion, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

En la seleccion de una secuencia de control de la expresion, normalmente se considerara una diversidad de factores. Estos incluyen, por ejemplo, la potencia relativa del sistema, su controlabilidad y su compatibilidad con la secuencia de ADN o gen particular a expresar, particularmente respecto a las posibles estructuras secundarias. Los hospedadores unicelulares adecuados se seleccionaran considerando, por ejemplo, su compatibilidad con el vector elegido, sus caractensticas de secrecion, su capacidad de plegar las protemas correctamente y sus necesidades de fermentacion, asf como la toxicidad al hospedador del producto codificado por las secuencias de ADN a expresar, y la facilidad de purificacion de los productos de expresion.

Un aspecto adicional proporciona una celula hospedante que contiene uno o mas polinucleotidos como se divulga en la presente memoria. Un aspecto adicional mas proporciona un metodo de introduccion de dicho uno o mas polinucleotidos en una celula hospedante, cualquier tecnica disponible. Para celulas eucariotas, las tecnicas adecuadas pueden incluir, por ejemplo, transfeccion con fosfato de calcio, DEAE dextrano, electroporacion, transfeccion mediada por liposomas y transduccion usando retrovirus u otros virus (por ejemplo, vaccinia) o, para celulas de insecto, baculovirus. Para celulas bacterianas, las tecnicas adecuadas pueden incluir, por ejemplo, transformacion con cloruro de calcio, electroporacion y transfeccion usando bacteriofagos.

Puede hacerse un seguimiento de la introduccion causando o permitiendo la expresion a partir del uno o mas polinucleotidos, por ejemplo, cultivando las celulas hospedantes en condiciones para la expresion de uno o mas polipeptidos a partir del uno o mas polinucleotidos. Pueden usarse sistemas inducibles y puede inducirse la expresion por la adicion de un activador.

En una realizacion, los polinucleotidos pueden integrarse en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la celula hospedante. La integracion puede promoverse mediante la inclusion de secuencias que promueven la recombinacion con el genoma, de acuerdo con tecnicas convencionales. En otra realizacion, el acido nucleico se mantiene en un vector episomico en la celula hospedante.

En la presente memoria se describen metodos que incluyen usar una construccion como se indica anteriormente en un sistema de expresion para expresar un polipeptido espedfico.

Considerando estos y otros factores, un experto en la materia sera capaz de construir una diversidad de combinaciones de vector/secuencia de control de la expresion/hospedador que expresara las secuencias de ADN en fermentacion o en cultivo de origen animal a gran escala.

Un polinucleotido que codifica un anticuerpo, fragmento de union a antfgeno o una protema de union puede prepararse de forma recombinante/sintetica ademas de, o en lugar de, clonarse. El polinucleotido puede disenarse con los codones apropiados para el anticuerpo, fragmento de union a antfgeno o protema de union. En general, se seleccionaran codones preferidos para un hospedador pretendido si la secuencia se usa para expresion. El polinucleotido completo puede ensamblarse a partir de oligonucleotidos solapantes preparados por metodos convencionales y ensamblarse en una secuencia codificante completa. Vease, por ejemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al., Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).

Un metodo general para incorporacion espedfica de sitio de aminoacidos no naturales en protemas se describe en Noren et al., Science, 244:182-188 (abril de 1989). Este metodo puede usarse para crear analogos con aminoacidos no naturales.

Como se menciona anteriormente, una secuencia de ADN que codifica un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo puede prepararse de forma sintetica en lugar de clonarse. La secuencia de ADN puede disenarse con los codones apropiados para la secuencia de aminoacidos del anticuerpo o fragmento de union a antigeno. En general, se seleccionaran codones preferidos para el hospedador pretendido si la secuencia se usa para expresion. La secuencia completa se ensambla a partir de oligonucleotidos solapantes preparados por metodos convencionales y se ensambla en una secuencia codificante completa.

Los anticuerpos, o fragmentos de union a antigeno de los mismos, pueden modificarse usando tecnicas conocidas en la tecnica con diversos fines tales como, por ejemplo, mediante la adicion de polietilenglicol (PEG). La modificacion con PEG (PEGilacion) puede dar lugar a uno o mas de tiempo de circulacion mejorado, solubilidad mejorada, resistencia mejorada a proteolisis, antigenicidad e inmunogenicidad reducidas, biodisponibilidad mejorada, toxicidad reducida, estabilidad mejorada y mayor facilidad de formulacion (para una revision vease, Francis et al., International Journal of Hematology 68:1-18, 1998).

En el caso de un fragmento de union a antfgeno que no contiene una parte Fc, puede anadirse una parte Fc (por ejemplo, de forma recombinante) al fragmento, por ejemplo, para aumentar la semivida del fragmento de union a antfgeno en circulacion en sangre cuando se administra a un sujeto. La eleccion de una region Fc apropiada y los metodos para incorporar dichos fragmentos son conocidos en la tecnica. La incorporacion de una region Fc de una IgG en un polipeptido de interes para aumentar su semivida en circulacion, pero tambien para no perder su actividad biologica puede conseguirse usando tecnicas convencionales conocidas en la tecnica tal como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 6096871. Las partes Fc de los anticuerpos pueden modificarse adicionalmente para aumentar la semivida de un fragmento de union a antfgeno en circulacion en sangre cuando se administra a un sujeto. Las modificaciones pueden determinarse usando medios convencionales en la tecnica tal como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 7217798.

Tambien se conocen otros metodos de mejora de la semivida de protemas de fusion basadas en anticuerpo en circulacion tal como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.° 7091321 y 6737056.

Adicionalmente, los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno de los mismos pueden producirse o expresarse de modo que no contengan fucosa en sus cadenas de azucar ligadas a N-glucosido complejas. Se sabe que la eliminacion de la fucosa de las cadenas de azucar ligadas a N-glucosido complejas aumenta las funciones efectoras de los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno, incluyendo, aunque sin limitacion, la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Asimismo, los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos que pueden unirse a un epttopo pueden adherirse en su extremo C a todo o parte de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgD e IgM y cualquiera de las subclases de isotipo, particularmente IgG1, IgG2b, IgG2a, IgG3 e IgG4.

Adicionalmente, los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno descritos en la presente memoria tambien pueden modificarse de modo que puedan cruzar la barrena hematoencefalica. Dicha modificacion de los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno descritos en la presente memoria permite el tratamiento de enfermedades cerebrales tales como glioblastoma multiforme (GBM). Las modificaciones ejemplares para permitir que protemas, tales como anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno, crucen la barrena hematoencefalica se describen en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos 2007/0082380.

La glucosilacion de inmunoglobulinas ha demostrado tener efectos significativos sobre sus funciones efectoras, la estabilidad estructural y la tasa de secrecion a partir de celulas productoras de anticuerpos (Leatherbarrow et al., Mol. Immunol. 22:407 (1985)). Los grupos carbohidrato responsables de estas propiedades generalmente se adhieren a las regiones constantes (C) de los anticuerpos. Por ejemplo, la glucosilacion de IgG en la asparagina 297 en el dominio Ch 2 es necesaria para la capacidad completa de IgG de activar la ruta clasica de citolisis dependiente del complemento (Tao y Morrison, J. Immunol. 143:2595 (1989)). La glucosilacion de IgM en la asparagina 402 en el dominio Ch 3 es necesaria para el ensamblaje apropiado y la actividad citolttica del anticuerpo (Muraoka y Shulman, J. Immunol. 142:695 (1989)). La eliminacion de sitios de glucosilacion como las posiciones 162 y 419 en los dominios Ch 1 y Ch 3 de un anticuerpo IgA dio lugar a degradacion intracelular y al menos un 90 % de inhibicion de la secrecion (Taylor y Wall, Mol. Cell. Biol. 8:4197 (1988)). Adicionalmente, los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno de los mismos pueden producirse o expresarse de modo que no contengan fucosa en sus cadenas de azucar ligadas a N-glucosido complejas. Se sabe que la eliminacion de la fucosa de las cadenas de azucar ligadas a N-glucosido aumenta las funciones efectoras de los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno incluyendo, aunque sin limitacion, citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Estos anticuerpos y fragmento de union a antfgeno "desfucosilados" pueden producirse mediante una diversidad de sistemas utilizando tecnicas de clonacion molecular conocidas en la tecnica incluyendo, aunque sin limitacion, animales transgenicos, plantas transgenicas o lmeas celulares que se han manipulado geneticamente de modo que ya no contienen las enzimas y rutas bioqmmicas necesarias para la inclusion de una fucosa en las cadenas de azucar ligadas a N-glucosido complejas (tambien conocidos como animales, plantas o celulas con inactivacion de fucosiltransferasa). Los ejemplos no limitantes de celulas que pueden manipularse para que sean celulas con inactivacion de fucosiltransferasa incluyen celulas CHO, celulas SP2/0, celulas NS0 y celulas YB2/0.

Tambien se ha observado glucosilacion de inmunoglobulinas en la region variable (V). Sox y Hood informaron de que aproximadamente un 20 % de los anticuerpos humanos se glucosilan en la region V (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66:975 (1970)). Se cree que la glucosilacion del dominio V surge de la aparicion fortuita de la senal de glucosilacion ligada a N Asn-Xaa-Ser/Thr en la secuencia de la region V y no se ha reconocido en la tecnica que desempene una tarea en la funcion de la inmunoglobulina.

La glucosilacion en un resto flanqueante del dominio variable puede alterar la interaccion de union del anticuerpo con el antigeno. La presente invencion incluye criterios por los que una cantidad limitada de aminoacidos en la region flanqueantes o las CDR de una cadena de inmunoglobulina humanizada se eligen para mutarse (por ejemplo, por sustitucion, eliminacion o adicion de restos) para aumentar la afinidad de un anticuerpo.

Puede retirarse o introducirse uno o mas restos de cistema en la region Fc de un anticuerpo o polipeptido que contiene Fc, eliminando o aumentando de ese modo la formacion de enlaces disulfuro intercatenarios en esta region. Un agente de union o anticuerpo espedfico homodimerico generado usando dichos metodos puede mostrar capacidad de internalizacion mejorada y/o eliminacion celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (AdCc ) aumentadas. (vease, Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992).

Se ha demostrado que secuencias dentro de la CDR pueden causar que un anticuerpo se una a MHC de clase II y active una respuesta de linfocitos T auxiliares indeseada. Una sustitucion conservativa puede permitir que el anticuerpo retenga la actividad de union, aunque reduciendo su capacidad de activar una respuesta de linfocitos T indeseada. En una realizacion, puede retirarse uno o mas de los 20 aminoacidos del extremo N de la cadena pesada o ligera.

En algunas realizaciones, las moleculas de anticuerpo pueden producirse con estructura de carbohidrato alterada que provoca una actividad efectora alterada, incluyendo moleculas de anticuerpo con fucosilacion ausente o reducida que muestra actividad ADCC mejorada. En la tecnica se conoce una diversidad de maneras para conseguir esto. Por ejemplo, la actividad efectora ADCC esta mediada por la union de la molecula de anticuerpo al receptor FcyRIII, que ha demostrado ser dependiente de la estructura del carbohidrato de la glucosilacion ligada a N en la Asn-297 del dominio CH2. Los anticuerpos no fucosilados se unen a este receptor con afinidad aumentada y activan las funciones efectoras mediadas por F^cyRIII de forma mas eficaz que los anticuerpos fucosilados nativos. Algunas cepas de celulas hospedantes, por ejemplo, la lmea celular Lec 13 o YB2/0 de hibridoma de rata producen de forma natural anticuerpos con niveles de fucosilacion inferiores. Shields et al., J Biol Chem. 26 de julio de 2002; 277(30):26733-40; Shinkawa et al., J Biol Chem. 31 de enero de 2003; 278(5):3466-73. Tambien se ha determinado que un aumento en el nivel de carbohidrato bisegmentado, por ejemplo, mediante produccion recombinante de anticuerpos en celulas que sobreexpresan la enzima GnTIII, aumenta la actividad ADCC. Umana et al., Nat Biotechnol. febrero de 1999;17(2):176-80. Se ha predicho que la ausencia de unicamente uno de los dos restos de fucosa puede ser suficiente para aumentar la actividad ADCC. (Ferrara et al., J Biol Chem. 5 de diciembre de 2005). Tambien se incluyen en la presente memoria modificaciones covalentes de un anticuerpo. Pueden hacerse por smtesis qmmica o por escision enzimatica o qmmica del anticuerpo, si fuera aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes pueden introducirse haciendo reaccionar los restos de aminoacido diana con un agente de derivatizacion organico que puede reaccionar con cadena laterales seleccionadas o los restos del extremo N o C.

Muy habitualmente se hacen reaccionar restos cisteinilo con alfa-haloacetatos (y las correspondientes aminas), tales como acido cloroacetico o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los restos cisteinilo tambien se derivatizan por reaccion con bromotrifluoroacetona, acido alfa-bromo-beta-(5-imidozoil)propionico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil 2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los restos histidilo pueden derivatizarse por reaccion con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0, porque este agente es relativamente espedfico para la cadena lateral histidilo. Tambien es util el bromuro de para-bromofenacilo; la reaccion puede realizarse en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Los restos lisinilo y del extremo amino pueden hacerse reaccionar con anhfdrido de acido sucdnico u otros anhfdridos de acidos carboxflico. La derivatizacion con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los restos lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar restos que contienen alfa-amino incluyen imidoesteres tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, acido trinitrobencenosulfonico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona y reaccion catalizada portransaminasa con glioxilato.

Los restos arginilo pueden modificase por reaccion con uno o varios reactivos convencionales, tales como fenilglioxal, 2,3 butanodiona, 1,2 ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatizacion de restos de arginina requiere que la reaccion se realice en condiciones alcalinas a causa del elevado pKa del grupo funcional guanidina. Ademas, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, asf como el grupo epsilon-amino de arginina.

La modificacion espedfica de restos tirosilo puede hacerse, con interes particular en la introduccion de marcadores espectrales en restos tirosilo por reaccion con compuestos de diazonio aromaticos o tetranitrometano. Mas habitualmente, puede usarse N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los restos tirosilo se yodan utilizando 125I o 131I para preparar protemas marcadas para su uso en radioinmunoensayo.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por reaccion con carbodiimidas (R-N=C=N-R'), donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilfpentil)carbodiimida. Ademas, los restos aspartilo y glutamilo se convierten en restos asparaginilo y glutaminilo por reaccion con iones amonio.

Los restos glutaminilo y asparaginilo pueden desamidarse en los correspondientes restos glutamilo y aspartilo, respectivamente. Estos restos se desamidan en condiciones neutras o basicas.

Otras modificaciones incluyen hidroxilacion de prolina y lisina, fosforilacion de grupo hidroxilo de restos serilo o treonilo, metilacion de los grupos alfa-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pag. 79-86 (1983)), acetilacion de la amina del extremo N y amidacion de cualquier grupo carboxilo del extremo C.

Otro tipo de modificacion covalente implica el acoplamiento qmmico o enzimatico de glucosidos en el agente de union o anticuerpo espedfico. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la produccion del polipeptido o anticuerpo en una celula hospedante que tenga capacidades de glucosilacion para glucosilacion ligada a N u O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el azucar o azucares pueden adherirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cistema, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) restos aromaticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptofano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos metodos se describen en la publicacion internacional WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pag. 259-306 (1981).

La eliminacion de cualquier resto de carbohidrato presente en el polipeptido o anticuerpo puede conseguirse de forma qrnmica o enzimatica. La desglucosilacion qrnmica implica la exposicion del anticuerpo al compuesto acido trifluorometanosulfonico o un compuesto equivalente. Este tratamiento provoca la escision de la mayona o todos los azucares excepto el azucar de union (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando al mismo tiempo el anticuerpo intacto. La desglucosilacion qrnmica se describe por Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) y por Edge et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981). La escision enzimatica de restos de carbohidrato en un anticuerpo puede conseguirse mediante el uso de una diversidad de endo- y exoglucosidasas como se describe por Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138:350 (1987).

Otro tipo de modificacion covalente de la actividad hepcidina comprende la union de un anticuerpo a uno de una diversidad de polfmeros no protemicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioles polioxietilados, sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado, polioxialquilenos, o polfmeros de polisacarido tales como dextrano. Dichos metodos son conocidos en la tecnica, veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192; 4179337; 4766106, 4179337, 4495285, 4609546 o el documento EP 315456.

La afinidad para la union de un antfgeno polipeptfdico predeterminado puede modularse, en lmeas generales, introduciendo una o mas mutaciones en la region flanqueante de la region V, tipicamente en areas adyacentes a una o mas CDR y/o en una o mas regiones flanqueantes. Tfpicamente, dichas mutaciones implican la introduccion de sustituciones de aminoacido conservativas que destruyen o crean las secuencias de sitio de glucosilacion, pero no afectan sustancialmente a las propiedades estructurales hidropaticas del polipeptido. Tfpicamente, se evitan las mutaciones que introducen un resto de prolina. La glucosilacion de anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno de los mismos se describe adicionalmente en la patente de Estados Unidos n.° 6350861.

Anticuerpos antihepcidina

En la presente memoria se describen anticuerpos humanizados y fragmentos de union a antfgeno de los mismos que se unen a hepcidina.

La hepcidina esta implicada en la regulacion de la homeostasis del hierro. La hepcidina se une a ferroportina y disminuye su actividad funcional causando que se internalice desde la superficie celular y se degrade.

Altos niveles de hepcidina humana pueden provocar niveles de hierro reducidos y viceversa. Las mutaciones en el gen de hepcidina que provocan la ausencia de actividad hepcidina estan asociadas con hemocromatosis juvenil, una enfermedad de sobrecarga de hierro grave. Los estudios en ratones han demostrado una funcion de la hepcidina en el control de la homeostasis normal del hierro.

La hepcidina tambien puede estar implicada en el secuestro de hierro durante la inflamacion. Se ha observado que la expresion del gen de hepcidina esta regulada por aumento fuertemente despues de estfmulos inflamatorios, tales como infecciones, que inducen la respuesta de fase aguda de los sistemas inmunitarios innatos de los vertebrados.

La expresion del gen de hepcidina puede estar regulada por aumento por lipopolisacarido (LPS), turpentina, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto, infecciones adenovmcas y la citocina inflamatoria interleucina-6 (lL-6). Tambien se encontro una fuerte correlacion entre la expresion de hepcidina y la anemia de inflamacion en pacientes con enfermedades inflamatorias cronicas, incluyendo infecciones bacterianas, fungicas y vmcas.

La hepcidina humana es un peptido de 25 aminoacidos con actividad antimicrobiana y reguladora del hierro. Tambien se ha mencionado como LEAP-1 (peptido antimicrobiano expresado en Idgado). Posteriormente se identifico un ADNc de hepcidina que codifica un prepropeptido de 83 aminoacidos en ratones y un prepropeptido de 84 aminoacidos en rata y ser humano, en una investigacion de genes espedficos de Idgado que estaban regulados por hierro. El peptido senal del extremo N de 24 restos se escinde en primer lugar para producir prohepcidina, que despues se procesa adicionalmente para producir hepcidina madura, encontrada tanto en sangre como en orina. En orina humana, la forma predominante contiene 25 aminoacidos, aunque tambien hay peptidos mas cortos de 22 y 20 aminoacidos presentes en concentraciones indetectables o muy bajas en determinadas enfermedades.

Se han generado anticuerpos monoclonales (MAb) contra hepcidina que modulan la actividad hepcidina y regulan de ese modo la homeostasis del hierro. A partir de ahora en la presente memoria, una referencia a los terminos "anticuerpo" y "anticuerpos" tiene que considerarse incluyendo cualquiera de los fragmentos de union a andgeno descritos en la presente memoria y los terminos deben ser intercambiables cuando sea aplicable.

Estos anticuerpos, y fragmentos de union a andgeno de los mismos, son utiles para el diagnostico y tratamiento de diversas afecciones y enfermedades, asf como para la purificacion y deteccion de hepcidina.

La union de un anticuerpo o fragmento de union a andgeno a hepcidina puede modular parcial (por ejemplo, un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o cualquier cantidad en los mismos) o completamente la hepcidina. La actividad de un anticuerpo o fragmento de union a andgeno puede determinarse usando un ensayo in vitro y/o in vivo usando ensayos reconocidos en la tecnica tales como los descritos en la presente memoria o conocidos de otro modo en la tecnica.

En un aspecto, el fragmento de union a andgeno de uno cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente es un fragmento Fab, Fab', Fd, F(ab')2, Fv scFv, un polipeptido de union de cadena sencilla (por ejemplo, un scFv con la parte Fc) o cualquier otro fragmento funcional de los mismos como se describe en la presente memoria.

Los anticuerpos, o fragmentos de union a andgeno de los mismos, descritos en la presente memoria pueden modificarse ademas para alterar las propiedades espedficas del anticuerpo reteniendo al mismo tiempo la funcionalidad deseada, si fuera necesario. Por ejemplo, en una realizacion, el compuesto puede modificarse para alterar una propiedad farmacocinetica del compuesto, tal como estabilidad in vivo, solubilidad, biodisponibilidad o semivida.

Los anticuerpos, o fragmentos de union a andgeno de los mismos, pueden formularse para cualquier via adecuada de administracion a un sujeto incluyendo, aunque sin limitacion, inyeccion. La inyeccion incluye, por ejemplo, inyeccion subcutanea, peritoneal o intravenosa. La administracion puede ser en uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o mas sitios de inyeccion. En una realizacion, la administracion es mediante seis sitios de inyeccion.

Los anticuerpos, o fragmentos de union a andgeno, y protemas de union que se unen a hepcidina generados usando dichos metodos pueden ensayarse para una o mas de su afinidad de union, avidez y capacidades de modulacion. Los anticuerpos y fragmentos de union a andgeno utiles pueden administrarse a un sujeto para prevenir, inhibir, controlar o tratar una enfermedad patologica o trastorno como se describe en mas detalle a continuacion.

Pueden utilizarse metodos convencionales para identificar anticuerpos o fragmentos de union a andgeno de los mismos que se unen a hepcidina. Los anticuerpos y fragmentos de union a andgeno pueden evaluarse para una o mas de la afinidad de union, las tasas de asociacion, las tasas de disociacion y la avidez. En un aspecto, los anticuerpos pueden evaluarse para su capacidad de modular la actividad de hepcidina o un polipeptido en que esta presente la secuencia de union a hepcidina (epftopo). La medicion de la afinidad de union, las tasas de asociacion, las tasas de disociacion y la avidez puede conseguirse usando ensayos reconocidos en la tecnica incluyendo (resonancia de plasmones superficiales), aunque sin limitacion, un ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (ELISA), analisis de Scatchard, analisis BIACORE, etc., asf como otros ensayos habitualmente usados y conocidos para los expertos en la materia.

La medicion de la union de los anticuerpos a hepcidina y/o la capacidad de los anticuerpos y fragmentos de union a andgeno de los mismos, puede determinarse usando, por ejemplo, un ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (ELISA), un ensayo de union competitiva, un ensayo ELISPOT o cualquier otro ensayo util conocido en la tecnica. Estos ensayos se usan habitualmente y son bien conocidos para los expertos en la materia.

En una realizacion no limitante, puede usarse un ensayo ELISA para medir la capacidad de union de anticuerpos o fragmentos de union a andgeno espedficos que se unen a hepcidina.

Tambien pueden usarse ensayos, tales como un ELISA, para identificar anticuerpos o fragmentos de union a antigeno de los mismos que muestren especificidad aumentada por hepcidina en comparacion con otros anticuerpos o fragmented de union a antigeno de los mismos. Tambien pueden usarse ensayos, tal como un ELISA, para identificar anticuerpos o fragmentos de union a antigeno de los mismos que se unen a epftopos en uno o mas polipeptidos y en una o mas especies de hepcidina. El ensayo de especificidad puede realizarse ejecutando ELISA paralelos en que se criban anticuerpos o fragmentos de union a antigeno de los mismos de ensayo simultaneamente en camaras de ensayo diferentes para su capacidad de unirse a uno o mas epftopos en diferentes especies del polipeptido que contiene los epftopos de hepcidina para identificar anticuerpos o fragmentos de union a antigeno de los mismos que se unen a hepcidina. Otra tecnica para medir la afinidad de union aparente conocida para los expertos en la materia es una tecnica de resonancia de plasmones superficiales (analizada en un sistema BIACORE 2000) (Liljeblad, et al., Glyco. J. 2000, 17:323-329). Se describen mediciones convencionales y ensayos de union tradicionales por Heeley, R. P., Endocr. Res. 2002, 28:217-229.

Los anticuerpos y fragmentos y union a antigeno de los mismos pueden ensayarse para una diversidad de funciones usando una diversidad de metodos in vitro e in vivo incluyendo, aunque sin limitacion, los conocidos en la tecnica y los descritos en la presente memoria.

En la presente memoria se describen anticuerpos y fragmentos de union a antigeno de los mismos que se unen a hepcidina. En un aspecto, en la presente memoria se describen anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo, que se une espedficamente a hepcidina, que comprende una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera,

en el que dicha region variable de cadena pesada comprende:

y dicha region variable de cadena ligera comprende:

(ii) una CDR2 que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 67-69, y

(iii) una CDR3 que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72.

en el que dicha region variable de cadena pesada comprende:

(i) una CDR1 que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3, (ii) una CDR2 que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-6, y (iii) una CDR3 que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 7-9; y dicha region variable de cadena ligera comprende:

(i) una CDR1 que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 10-12, (ii) una CDR2 que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 13-15, y (iii) una CDR3 que tiene una secuencia de aminoacidos codificada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 16-18. En un aspecto, en la presente memoria se describe un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que comprende una region flanqueante de la region variable de cadena pesada; y una region flanqueante de la region variable de cadena ligera expuesta en el listado de secuencias a continuacion donde las CDR identificadas en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-18 o 55-72 se insertan en la region flanqueante utilizando la numeracion de Kabat. En un aspecto, en la presente memoria se describe un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, que se une espedficamente a hepcidina, preparado por inyeccion en un roedor (es decir, raton, rata o conejo) de un peptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 19-27. En otra realizacion, el peptido se conjuga a un vehteulo (por ejemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH) o un adyuvante (adyuvante completo de Freund (CFA) o adyuvante incompleto de Freund (IFA)). En una realizacion, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, se une espedficamente a los restos de aminoacido 1-9 de hepcidina. En otra realizacion, en la presente memoria se describe un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo que se une espedficamente a los restos de aminoacido 1-7 de hepcidina.

Un peptido de hepcidina al que se une un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, puede tener una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 19.

En la presente memoria se describe un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, que se une espedficamente a un epftopo que comprende la secuencia de aminoacidos de uno cualquiera Hep-5, Hep-9, Hep-20, Hep 22 y Hep-25 donde las secuencias de los peptidos se describen en el listado de secuencias.

En una realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, se une espedficamente a un epftopo que comprende una secuencia de aminoacidos de Hep-20 (SEQ ID NO: 22), Hep-22 (SEQ ID NO: 23) y Hep-25 (SEQ ID NO: 19).

En una realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, se une espedficamente a un epftopo que comprende Hep-5 (SEQ ID NO: 25) o Hep-9 (SEQ ID NO: 24). En otra realizacion, en la presente memoria se describe un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo, que se une espedficamente a un epftopo que comprende los restos de aminoacido 1-9 de hepcidina. En otra realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, se une espedficamente a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 restos de aminoacido de un epftopo que comprende los restos de aminoacido 1-9 de hepcidina.

En otra realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, es el anticuerpo monoclonal que comprende una CDR1 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 55, una CDR2 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 58, una CDR3 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 61, una CDR1 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 64, una CDR2 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 67 y una CDR3 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 70.

En otra realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, es el anticuerpo monoclonal que comprende una CDR1 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 56, una CDR2 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 59, una CDR3 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 62, una CDR1 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 65, una CDR2 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 68 y una CDR3 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 71.

En otra realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, es el anticuerpo monoclonal que comprende una CDR1 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 57, una CDR2 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 60, una CDR3 de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 63, una CDR1 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 66, una CDR2 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 69 y una CDR3 de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 72.

El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. En una realizacion, una cadena pesada variable humanizada comprende una secuencia de aminoacidos expuesta como la SEQ ID NO: 40. En otra realizacion, una cadena ligera variable humanizada comprende una secuencia de aminoacidos expuesta como la SEQ ID NO: 38.

En un aspecto, en la presente memoria se describe un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que comprende una region flanqueante de la region variable de cadena pesada; y una region flanqueante de la region variable de cadena ligera como se expone en el listado de secuencias a continuacion donde las CDR identificadas en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-18 de 55-72 se insertan en la region flanqueante utilizando la numeracion de Kabat.

El fragmento de union a antfgeno puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')², un fragmento Fv, un fragmento scFv, un polipeptido de union de cadena sencilla, un fragmento Fd, una cadena pesada variable, una cadena ligera variable, un fragmento dAb o cualquier otro tipo de fragmento descrito en la presente memoria. Un fragmento de union a antfgeno puede ser, por ejemplo, un AVIMER, un diacuerpo o un dfmero de cadena pesada. Un dfmero de cadena pesada puede ser, por ejemplo, una construccion de cadena pesada de camelido o de tiburon.

Un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria puede tener una constante de disociacion (Kd) de menos de aproximadamente 500 pM, menos de aproximadamente 400 pM, menos de aproximadamente 300 pM, menos de aproximadamente 200 pM, menos de aproximadamente 100 pM, menos de aproximadamente 75 pM, menos de aproximadamente 50 pM, menos de aproximadamente 30 pM, menos de aproximadamente 25 pM, menos de aproximadamente 20 pM, menos de aproximadamente 18 pM, menos de aproximadamente 15 pM, menos de aproximadamente 10 pM, menos de aproximadamente 75. pM, menos de aproximadamente 5 pM, menos de aproximadamente 2.5 pM o menos de aproximadamente 1 pM.

Un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, descrito en la presente memoria puede tener una afinidad por hepcidina o un peptido de hepcidina de aproximadamente 10^-9a aproximadamente 10^-14, de aproximadamente 10^-10a aproximadamente 10^-14, de aproximadamente 10^-11a aproximadamente 10^-14, de ap ¹roximadamente ^{1 2 *}10 a aproximadamente 10 ¹, d ^{^}e ^'aproximadamente 10 a aproximad ¹am ^{^}en ^'te 10 ¹⁴, de ap ¹ro ¹x⁰ima ^*damente 10 a ap ^{1^}roxim ^'adamente 10 , de aproximadamente 10 a aproximada ^{1^}men ^'te 10¹², de ¹aproximadamente 10¹a ²ap ^*roximadamente 10^{13 14 1}o de 10^13*a aproximadamente 10 .

En la presente memoria se describe una composicion, que comprende un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno, y un vehmulo o excipiente aceptable. Las composiciones se describen en mas detalle a continuacion. Tambien se describe en la presente memoria una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, descrito en la presente memoria. Tambien se describe en la presente memoria un vector de expresion que comprende la molecula de acido nucleico, unida de forma funcional a una secuencia de control reguladora. Tambien se describe en la presente memoria una celula hospedante que comprende un vector o una molecula de acido nucleico descrita en la presente memoria. Tambien se describe en la presente memoria un metodo de uso de la celula hospedante para producir un anticuerpo, que comprende cultivar la celula hospedante en condiciones adecuadas de modo que el acido nucleico se exprese para producir el anticuerpo.

Composiciones

Cada uno de los compuestos descritos en la presente memoria puede usarse como una composicion cuando se combina con un vehmulo o excipiente aceptable. Dichas composiciones son utiles para analisis in vitro o in vivo o para la administracion a un sujeto in vivo o ex vivo para tratar a un sujeto con los compuestos divulgados.

Por tanto, las composiciones farmaceuticas pueden incluir, ademas del ingrediente activo, un excipiente, vehmulo, tampon, estabilizante u otros materiales farmaceuticamente aceptables bien conocidos para los expertos en la materia. Dichos materiales no deben de ser toxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehmulo u otro material dependera de la via de administracion.

Las formulaciones farmaceuticas que comprenden una protema de interes, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno, identificada por los metodos descritos en la presente memoria pueden prepararse parar su almacenamiento mezclando la protema que tiene el grado deseado de pureza con vehmulos, excipientes o estabilizantes fisiologicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edicion, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehmulos, excipientes o estabilizantes aceptables son aquellos que no son toxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butflico o bendlico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipeptidos de baja masa molecular (menos de aproximadamente 10 restos); protemas, tales como seroalbumina, gelatina o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones que forman sales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de Zn-protema); y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG).

Los vehmulos aceptables son fisiologicamente aceptables para el sujeto al que se han administrado y retienen las propiedades terapeuticas de los compuestos con/en que se administra. Los vehmulos aceptables y sus formulaciones se describen, y en lmeas generales en, por ejemplo, Remington' pharmaceutical Sciences (18.a edicion, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990). Un vehmulo ejemplar es disolucion salina fisiologica. La expresion "vehmulo farmaceuticamente aceptable", como se usa en la presente memoria, significa un material, composicion o vehmulo farmaceuticamente aceptable, tal como una carga, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulacion lfquido o solido, implicado en el traslado o transporte de los presentes compuestos desde el sito de administracion de un organo, o parte del organismo, a otro organo o parte del organismo, o en un sistema de ensayo in vitro. Cada vehmulo es aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulacion y no perjudicial para un sujeto al que se administra. Un vehmulo aceptable tampoco debe alterar la actividad espedfica de los presentes compuestos.

En un aspecto, en la presente memoria se describen composiciones farmaceuticamente aceptables o fisiologicamente aceptables que incluyen disolventes (acuosos o no acuosos), disoluciones, emulsiones, medios de dispersion, recubrimientos, agentes isotonicos y de promocion o retardo de la absorcion, compatibles con la administracion farmaceutica. Las composiciones farmaceuticas o formulaciones farmaceuticas, por lo tanto, se refieren a una composicion adecuada para uso farmaceutico en un sujeto. Las composiciones farmaceuticas y formulaciones incluyen una cantidad de un compuesto descrito en la presente memoria y un vehmulo farmaceutica o fisiologicamente aceptable.

Las composiciones pueden formularse para sean compatibles con una via particular de administracion, (es decir sistemica o local). Por tanto, las composiciones incluyen veldculos, diluyentes o excipientes adecuados para su administracion por diversas v^as.

En otra realizacion, las composiciones pueden comprender, ademas, si fuera necesario, un aditivo aceptable para mejorar la estabilidad de los compuestos en composicion y/o para controlar la tasa de liberacion de la composicion. Los aditivos aceptables no alteran la actividad espedfica de los presente compuestos. Los aditivos aceptables ejemplares incluyen, aunque sin limitacion, un azucar tal como manitol, sorbitol, glucosa, xilitol, trehalosa, sorbosa, sacarosa, galactosa, dextrano, dextrosa, fructosa, lactosa y mezclas de los mismos. Los aditivos aceptables pueden combinarse con veldculos y/o excipientes aceptables tales como dextrosa. Como alternativa, los aditivos aceptables ejemplares incluyen, aunque sin limitacion, un tensioactivo tal como polisorbato 20 o polisorbato 80 para aumentar la estabilidad del peptido y disminuir la gelificacion de la disolucion. El tensioactivo puede anadirse a la composicion en una cantidad de un 0,01 % a un 5 % de la disolucion. Ademas, dichos aditivos aceptables aumentan la estabilidad y semivida de la composicion en almacenamiento.

En una realizacion, una composicion puede contener un tampon isotonico tal como un tampon fosfato, acetato o TRIS en combinacion con un agente de tonicidad tal como un poliol, sorbitol, sacarosa o cloruro de sodio, que aporta tonicidad y estabiliza. Un agente de tonicidad puede estar presente en la composicion en una cantidad de aproximadamente un 5 %.

En otra realizacion, la composicion puede incluir un tensioactivo tal como para prevenir la agregacion y para la estabilizacion a un 0,01 hasta un 0,02 %p/vol.

En otra realizacion, el pH de composicion puede variar de 4,5-6,5 o 4,5-5,5.

Otras descripciones ejemplares de composiciones farmaceuticas para anticuerpos pueden encontrarse en, por ejemplo, el documento US 2003/0113316 y la patente de Estados Unidos n.° 6171586.

Una composicion de la presente memoria tambien puede contener mas de un compuesto activo segun lo necesario para la indicacion particular que se este tratando, tal como aquellos con actividades complementarias que no se afectan de forma adversa entre sf Por ejemplo, un metodo de tratamiento puede proporcionar ademas un agente inmunodepresor. Dichas moleculas estan adecuadamente presentes en combinacion en cantidades que son eficaces para el proposito pretendido.

Los ingredientes activos pueden atraparse en una microcapsula preparada, por ejemplo, por tecnicas de coacervacion o por polimerizacion interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcapsula de gelatina y microcapsula de poli(metilmetacrilato) respectivamente, en sistemas de suministro de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartfculas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Dichas tecnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edicion, Osol, A. Ed. (1980).

Tambien se contemplan en la presente memoria suspensiones y formas cristalinas de los anticuerpos; los expertos en la materia conocen metodos para generar suspensiones y formas cristalinas.

Una composicion a usar para administracion in vivo debe ser esteril. En algunas realizaciones, las composiciones de la invencion pueden esterilizarse por tecnicas de esterilizacion bien conocidas convencionales. Por ejemplo, la esterilizacion puede conseguirse facilmente por filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles. Las disoluciones resultantes pueden envasarse para su uso o filtrarse en condiciones asepticas y liofilizarse, combinandose la preparacion liofilizada con una disolucion esteril antes de su administracion.

Puede emplearse secado por congelacion para estabilizar los polipeptidos para almacenamiento a largo plazo, tal como cuando un polipeptido es relativamente inestable en composiciones lfquidas. Un ciclo de liofilizacion esta habitualmente compuesto de tres etapas: congelacion, secado principal y secado secundario; Williams y Polli, Journal of Parenteral Science and Technology, Volumen 38, Numero 2, paginas 48-59 (1984). En la etapa de congelacion, la disolucion se enfna hasta que se congela adecuadamente. El agua a granel en la disolucion forma hielo en esta fase. El hielo sublima en la fase de secado principal, que se realiza reduciendo la presion de la camara por debajo de la presion de vapor del hielo, usando vado. Finalmente, el agua absorbida o unida se elimina en la fase de secado secundario a presion reducida de la camara y una elevada temperatura de almacenamiento. El proceso produce un material conocido como torta liofilizada. Despues de ello, la torta puede reconstituirse antes de su uso. La practica de reconstitucion convencional para material liofilizado es anadir de nuevo un volumen de agua pura (tfpicamente equivalente al volumen retirado durante la liofilizacion), aunque a veces se usan disoluciones diluidas de agentes antibacterianos en la produccion de agentes farmaceuticos para administracion parenteral; Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, Volumen 18, Numeros 11 y 12, paginas 1311-1354 (1992).

Algunos excipientes tales como, por ejemplo, polioles (incluyendo manitol, sorbitol y glicerol); azucares (incluyendo glucosa y sacarosa); y aminoacidos (incluyendo alanina, glicina y acido glutamico), pueden actuar como estabilizantes para productos secados por congelacion; vease, por ejemplo, Carpenter et al., Developments in Biological Standardization, Volumen 74, paginas 225-239 (1991). Los polioles y azucares tambien pueden usarse para proteger a los polipeptidos del dano inducido por congelacion y secado y para potenciar la estabilidad durante el almacenamiento en estado seco. Los azucares pueden ser eficaces tanto en el proceso de secado por congelacion como durante el almacenamiento. Otras clases de moleculas, incluyendo mono- y disacaridos y poKmeros tales como PVP, tambien se han presentado como estabilizantes de productos liofilizados.

Para inyeccion, una composicion y/o medicamento puede ser un polvo adecuado para su reconstitucion con una disolucion apropiada como se describe anteriormente. Los ejemplos de estos incluyen, aunque sin limitacion, polvos secados por congelacion, secados por rotacion o secados por pulverizacion, polvos amorfos, granulos, precipitados o en partfculas. Para inyeccion, las composiciones opcionalmente pueden contener estabilizantes, modificadores del pH, tensioactivos, modificadores de la biodisponibilidad y combinaciones de estos.

Pueden prepararse preparaciones de liberacion sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polfmeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, que son matrices en forma de artfculos conformados, por ejemplo, pelfculas o microcapsulas. Los ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vimlico), polilactidos (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 3773919), copolfmeros de acido L-glutamico e y etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolfmeros de acido lactico-acido glicolico degradables tales como Lupron Depot® (microesferas inyectables compuestas de copolfmero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolida) y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutmco. Aunque los polfmeros tales como acetato de etilenvinilo y acido lactico-acido glicolico posibilitan la liberacion de moleculas durante mas de 100 dfas, determinados hidrogeles liberan las protemas durante periodos de tiempos mas cortos. Aunque los anticuerpos encapsulados permanecen en el organismo durante un tiempo largo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposicion a humedad a 37 °C, provocando una perdida de actividad biologica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales para la estabilizacion dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregacion es la formacion de enlaces S-S intermoleculares mediante intercambio de tiodisulfuro, la estabilizacion puede conseguirse modificando los restos sulfhidrilo, liofilizando en disoluciones acidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones espedficas de matriz polimerica.

Una composicion descrita en la presente memoria puede disenarse para que sea de accion corta, de liberacion rapida, de accion duradera o de liberacion sostenida como se describe en la presente memoria. En una realizacion, la composicion puede formularse para liberacion controlada o para liberacion lenta.

La composicion farmaceutica puede administrarse, por ejemplo, por inyeccion, incluyendo, aunque sin limitacion, inyeccion subcutanea, intravftrea, intradermica, intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, intracefalorraqrndea o intramuscular. Los excipientes y vehfculos para su uso en la formulacion de composiciones para cada tipo de inyeccion se contemplan en la presente memoria. Las siguientes descripciones son a modo de ejemplo unicamente y no pretende limitar el alcance de las composiciones. Las composiciones para inyeccion incluyen, aunque sin limitacion, disoluciones acuosas (cuando son solubles en agua) o dispersiones, asf como polvos esteriles para la preparacion improvisada de disoluciones inyectables esteriles o dispersion. Para administracion intravenosa, los vehfculos adecuados incluyen disolucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, N.J.) o disolucion salida tamponada con fosfato (PBS). El vehfculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula necesario en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. Los agentes antibacterianos y antifungicos incluyen, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico y timerosal. Pueden incluirse agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio en la composicion. Las disoluciones resultantes pueden envasarse para su uso tal cual o liofilizadas; la preparacion liofilizada despues puede combinarse con una disolucion esteril antes de su administracion. Para inyeccion intravenosa o inyeccion en el sitio afectado, el ingrediente activo estara en forma de una disolucion acuosa parenteralmente aceptable que es apirogena y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la materia seran capaces de preparar disoluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehfculos isotonicos tales como inyeccion de cloruro de sodio, inyeccion de Ringer, inyeccion de Ringer con lactato. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos segun lo necesario. Las disoluciones inyectables esteriles pueden prepararse incorporando un ingrediente activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido por esterilizacion por filtracion. En general, las dispersiones se preparan incorporando el ingrediente activo en un vehfculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son secado al vacfo y secado por congelacion que produce un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una disolucion filtrada a esterilidad previamente del mismo.

Las composiciones pueden administrarse convencionalmente por via intravftrea, subcutanea o mediante implante intravftreo.

Las composiciones pueden administrarse convencionalmente por via intravenosa, tal como por inyeccion de una dosis unitaria, por ejemplo. Para inyeccion, un ingrediente activo puede estar en forma de una disolucion acuosa parenteralmente aceptable que es sustancialmente apirogena y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Se pueden preparar disoluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehtulos isotonicos tales como inyeccion de cloruro de sodio, inyeccion de Ringer, inyeccion de Ringer con lactato. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, segun se requiera. Adicionalmente, las composiciones pueden administrate mediante formacion de aerosol. (Lahn et al., Aerosolized Anti-T-cell-Receptor Antibodies Are Effective against Airway Inflammation and Hyperreactivity, Int. Arch. Allergy Immuno., 134:49-55 (2004)).

En una realizacion, la composicion se liofiliza, por ejemplo, para aumentar la vida util en almacenamiento. Cuando las composiciones se consideran para su uso en medicamentos o cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, se contempla que la composicion pueda estar sustancialmente libre de pirogenos de modo que la composicion no cause una reaccion inflamatoria o una reaccion alergica peligrosa cuando se administra a un sujeto humano. El ensayo de las composiciones para los pirogenos y la preparacion de las composiciones sustancialmente sin pirogenos son bien comprendidas para los expertos en la materia y pueden conseguirse usando kits disponibles en el mercado.

Los vetuculos aceptables pueden contener un compuesto que estabiliza, aumenta o retarda la absorcion o eliminacion. Dichos compuestos incluyen, por ejemplo, carbohidratos tales como glucosa, sacarosa o dextranos; protemas de baja masa molecular; composiciones que reducen la eliminacion o hidrolisis de los peptidos; o excipientes u otros estabilizantes y/o tampones. Los agentes que retardan a absorcion incluyen, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Tambien pueden usarse detergentes para estabilizar o aumentar o disminuir la absorcion de la composicion farmaceutica, incluyendo vetuculos liposomicos. Para protegerlo de la digestion, el compuesto puede formar complejos con una composicion para hacerla resistente a hidrolisis acida y enzimatica, o el compuesto puede ponerse en complejo con un vetuculo apropiadamente resistente tal como un liposoma. Los medios de proteccion de los compuestos contra la digestion son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Fix (1996) Pharm Res. 13:1760 1764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119 135; y la patente de Estados Unidos n.° 5391377, que describe composiciones lipfdicas para suministro oral de agentes terapeuticos).

La expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiologicamente tolerables y tfpicamente no producen una reaccion alergica o similar indeseada, tal como malestar gastrico, mareos y similares, cuando se administran a un ser humano.

La expresion "dosis unitaria" cuando se usa en referencia a una composicion terapeutica se refiere a unidades ffsicamente concretas adecuadas como dosificaciones unitarias para seres humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el diluyente requerido; es decir, vetuculo o excipiente.

Las composiciones pueden administrase de una manera compatible con la formulacion galenica y en una cantidad terapeuticamente eficaz. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto de utilizar el ingrediente activo y el grado de capacidad de union deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo que se requiere administrar dependen del criterio del facultativo y son peculiares para cada individuo. Los regfmenes adecuados para administracion inicial y las dosis de refuerzo tambien son variables, pero estan tipificados por una administracion inicial seguida por dosis repetidas a intervalos de una o mas horas por una inyeccion posterior u otra administracion. Como alternativa, se contempla infusion intravenosa continua que es suficiente para mantener las concentraciones en la sangre.

Una realizacion contempla el uso de las composiciones descritas en la presente memoria para fabricar un medicamente para tratar una afeccion, enfermedad o trastorno descrito en la presente memoria. Los medicamentos pueden formularse basandose en las caractensticas ffsicas del sujeto que necesita tratamiento, y pueden formularse en formulaciones individuales o multiples basandose en la fase de la afeccion, enfermedad o trastorno. Los medicamentos pueden envasarse en un envase adecuado con etiquetas apropiadas para la distribucion a hospitales y clmicas, en el que la etiqueta es para la indicacion del tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad descrita en la presente memoria. Los medicamentos pueden envasarse como una unica unidad o multiples unidades. Pueden incluirse instrucciones para la dosificacion y administracion de las composiciones con los envases como se describe a continuacion. La invencion se refiere ademas a medicamentos de un anticuerpo antihepcidina o fragmento de union a antfgeno del mismo descrito anteriormente en la presente memoria y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

En la presente memoria se describen composiciones de anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno de los mismos que se unen a hepcidina e incluyen aquellos, tales como los descritos en otra parte en la presente memoria. Los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno de los mismos que se unen a hepcidina como se describen en la presente memoria pueden usarse para el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones asociadas con la homeostasis del hierro.

Una composicion (un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno descrito en la presente memoria) puede administrarse en solitario o en combinacion con una segunda composicion de forma simultanea o secuencial dependiendo de la afeccion a tratar. En una realizacion, un segundo tratamiento terapeutico es un estimulador de la eritrocitopoyesis. Cuando se administran dos o mas composiciones, las composiciones pueden administrarse en combinacion (de forma secuencial o simultanea). Una composicion puede administrase en una unica dosis o multiples dosis.

Cuando se formulan para su administracion a sujetos humanos, las composiciones pueden formularse para que sean apirogenas. El ensayo de las composiciones para los pirogenos y la preparacion de las composiciones farmaceuticas sin pirogenos son bien comprendidas para los expertos en la materia.

Una realizacion contempla el uso de cualquiera de las composiciones de la presente invencion para fabrica un medicamente para tratar un trastorno de la presente invencion. Los medicamentos pueden formularse basandose en las caractensticas ffsicas del sujeto que necesita tratamiento y pueden formularse en formulaciones individuales o multiples basandose en el trastorno. Los medicamentos de la presente invencion pueden envasarse en un envase farmaceutico adecuado con etiquetas apropiadas para la distribucion a hospitales y clmicas, en las que la etiqueta es para la indicacion del tratamiento de un trastorno como se describe en la presente memoria en un sujeto. Los medicamentos pueden envasarse como una unica unidad o multiples unidades. Pueden incluirse instrucciones para la dosificacion y administracion de las composiciones farmaceuticas de la presente invencion con los envases farmaceuticos.

Diagnostico

En la presente memoria se describe un metodo de diagnostico de un trastorno relacionado con hepcidina, que comprende: (a) poner en contacto una muestra biologica de un sujeto sospechoso de tener dicho trastorno con un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, descrito en la presente memoria en condicione que permiten la union del anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo a hepcidina; y (b) detectar y/o cuantificar la hepcidina unida al anticuerpo fragmento de union a antfgeno del mismo, en la que la cantidad de hepcidina en la muestra, cuantificada en (b) por encima de un nivel umbral indica la presencia de trastorno relacionado con hepcidina y por debajo del nivel umbral indica la ausencia de trastorno relacionado con hepcidina.

Un metodo de diferenciacion de una enfermedad inflamatoria de una enfermedad no inflamatoria, que comprende: (a) poner en contacto una muestra biologica de un ser humano sospechoso de tener dicho trastorno con un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo descrito en la presente memoria en condiciones que permiten la union del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo a hepcidina; y (b) detectar y/o cuantificar la hepcidina unida al anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, en la que la cantidad de hepcidina cuantificada en (b) por encima de un nivel umbral indica la presencia de enfermedad inflamatoria y por debajo del nivel umbral indica la ausencia de enfermedad inflamatoria.

En una realizacion, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno comprende, ademas, un resto detectable. La deteccion puede producirse in vitro, in vivo o ex vivo. Los ensayos in vitro para la deteccion y/o determinacion (cuantificacion, cualidades, etc.) de hepcidina con los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos incluyen, aunque sin limitacion, por ejemplo, ELISA, RIA y transferencias de Western. La deteccion in vitro, el diagnostico o el control de hepcidina puede producirse obteniendo una muestra (por ejemplo, una muestra de sangre) de un sujeto y ensayando la muestra en, por ejemplo, un ensayo ELISA convencional. Por ejemplo, puede recubrirse una placa de microvaloracion de 96 pocillos con un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo descrito en la presente memoria, lavarse y recubrirse con PBS-Tween/BSA para inhibir la union no espedfica. La muestra de sangre puede diluirse en serie y colocarse en pocillos individuales o duplicados en comparacion con una curva patron diluida en serie de hepcidina. Despues de incubar y lavar los pocillos, puede anadirse un anticuerpo antihepcidina marcado con biotina, seguido por la adicion de estreptavidina-fosfatasa alcalina. Los pocillos pueden lavarse y puede anadirse un sustrato (peroxidasa de rabano rusticano) para revelar la placa. La placa puede leerse usando un lector de placa y programa informatico convencionales.

Cuando se produce la deteccion in vivo, el contacto se produce mediante la administracion del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno usando cualquier medio convencional tal como los descritos en otra parte en la presente memoria. En dichos metodos, la deteccion de hepcidina en una muestra o sujeto puede usarse para diagnosticar una enfermedad o trastorno asociado con o correlacionado con la actividad de la misma, tales como aquellas enfermedades y trastornos descritos en la presente memoria.

En la deteccion, diagnostico o control in vivo, de hepcidina, a un sujeto se le administra un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que se une a hepcidina, estando unido dicho anticuerpo o fragmento de union a antfgeno a un resto detectable. El resto detectable puede visualizarse usando metodos reconocidos en la tecnica tales como, aunque sin limitacion, imagenes de resonancia magnetica (RM), fluorescencia, radioimagenes, fuentes de luz aplicadas por endoscopios, laparoscopios o cateter intravascular (es decir, mediante deteccion de agentes fotoactivos), fotobarrido, barrido por tomograffa de emision de positrones (PET), resonancia magnetica nuclear (RMN) de todo el organismo, radiocentelleograffa, tomograffa de emision de monofotonica (SPECT), barrido de la region del infrarrojo cercano (NIR) diana, rayos-X, ultrasonidos, etc., tal como se describe, por ejemplo, en la patente de estos unidos n.° 6096289, la patente de Estados Unidos n.° 7115716, la patente de Estados Unidos n.° 7112412, la solicitud patente de Estados Unidos n.° 20030003048 y la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20060147379. Los marcadores para detectar los compuestos usando dichos metodos son tambien conocidos en la tecnica y se describen en dichas patentes y solicitudes. La visualizacion del resto detectable puede permitir la deteccion, diagnostico y/o control de una afeccion o enfermedad asociada con hepcidina.

Se conocen en la tecnica ensayos de diagnostico adicionales que utilizan anticuerpos espedficos para la protema diana deseada, es decir, hepcidina, y tambien se contemplan en la presente memoria.

Para los metodos de deteccion in vitro, las muestras a obtener de un sujeto incluyen, aunque sin limitacion, sangre, muestras de biopsia tisular y lfquido de las mismas.

Por tanto, la presente invencion proporciona anticuerpos humanizados y fragmentos de union a antigeno de los mismos contra hepcidina que son utiles para detectar o diagnosticar los niveles de hepcidina asociados con una enfermedad o trastorno, que indican potencialmente la necesidad de tratamiento terapeutico. En determinadas realizaciones, los anticuerpos comprenden un anticuerpo humanizado antihepcidina descrito en la presente memoria. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende ademas un segundo agente. Dicho agente puede ser una molecula o resto tal como, por ejemplo, una molecula indicadora o un marcador detectable. Los marcadores detectables/restos para dichos metodos de deteccion son conocidos en la tecnica y se describen en mas detalle a continuacion. Las moleculas indicadoras son cualquier resto que pueda detectarse usando un ensayo. Los ejemplos no limitantes de moleculas indicadoras que se han conjugado con polipeptidos incluyen enzimas, radiomarcadores, haptenos, marcadores fluorescentes, moleculas fosforescentes, moleculas quimioluminiscentes, cromoforos, moleculas luminiscentes, moleculas de fotoafinidad, partmulas coloreadas o ligandos, tales como biotina. Los marcadores detectables incluyen compuestos y/o elementos que pueden detectarse debido a sus propiedades funcionales espedficas, y/o a sus caractensticas qrnmicas, cuyo uso permite que el polipeptido al que se adhieren se detecte, y/o se cuantifique ademas si se desea. Muchos agentes detectables (de imagenes) apropiados son conocidos en la tecnica, asf como los metodos para su adhesion a los polipeptidos (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5021236; 4938948 y 4472509.

Los metodos de union de los polipeptidos tales como anticuerpos con restos detectables son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, tecnologfa de ADN recombinante para formar protemas de fusion y conjugacion (por ejemplo, conjugacion qmmica). Los metodos para preparar protemas de fusion por conjugacion qrnmica o ingeniena recombinante son bien conocidos en la tecnica. Los metodos de union covalente y no covalente de los componentes tambien son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Williams (1995) Biochemistry 34:17871797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414; y Kroll (1993) DNA Cell. Biol. 12: 441-453.

Puede ser necesario, en algunos casos, introducir una region conectora polipeptfdica no estructurada entre un marcador o un resto y una o mas partes de los anticuerpos, fragmentos de union a antfgeno o protemas de union descritos en la presente memoria. Un conector puede facilitar la flexibilidad potenciada y/o reducir la impedancia esterica entre dos fragmentos cualesquiera. El conector tambien puede facilitar que se produzca el plegamiento apropiado de cada fragmento. El conector puede ser de origen natural, tal como una secuencia que se ha determinado que existe en enrollamientos aleatorios entre dos dominios de una protema. Una secuencia conectora es el conector encontrado entre los dominios del extremo C y el extremo N de la subunidad A de la ARN polimerasa. Otros ejemplos de conectores de origen natural incluyen conectores encontrados en las protemas 1CI y LexA.

Dentro de un conector, una secuencia de aminoacidos puede variarse basandose en las caractensticas del conector determinadas empmcamente o como se revela por modelado. Las consideraciones en la eleccion de un conector incluyen la flexibilidad del conector, la carga del conector y la presencia de algunos aminoacidos del conector en las subunidades de origen naturales. El conector tambien puede disenarse de modo que los restos en el conector entren en contacto con acido nucleico de desoxirribosa (ADN), influyendo de ese modo en la afinidad o especificidad de union, o para que entre en contacto con otras protemas. En algunos casos, tal como cuando es necesario abarcar una distancia mas larga entre subunidades o cuando los dominios deben mantenerse en una configuracion particular, el conector puede contener, opcionalmente, un dominio plegado adicional. En algunas realizaciones, el diseno de un conector puede implicar una disposicion de dominios que requiere que el conector abarque una distancia relativamente corta, por ejemplo, menos de aproximadamente 10 angstrom (A). Sin embargo, en determinadas realizaciones, los conectores abarcan una distancia de hasta aproximadamente 50 angstrom.

Dentro del conector, la secuencia de aminoacidos puede variarse basandose en las caractensticas del conector determinadas empmcamente o como se revela por modelado. Las consideraciones en la eleccion de un conector incluyen la flexibilidad del conector, la carga del conector y la presencia de algunos aminoacidos del conector en las subunidades de origen natural. El conector tambien puede disenarse de modo que los restos en el conector entren en contacto con ADN, influyendo de ese modo en la afinidad o especificidad de union, o para que interactuen con otras protemas. En algunos casos, cuando es necesario abarcar una distancia mas larga entre subunidades o cuando los dominios deben mantenerse en una configuracion particular, el conector puede contener opcionalmente un dominio plegado adicional.

Los metodos para acoplar polipeptidos (libres o unidos a celulas) a microesferas son conocidos en la tecnica. Los metodos para seleccionar polipeptidos acoplados o celulas que presentan un polipeptido tambien son conocidos en la tecnica. En resumen, hay micropartmulas de poliestireno paramagneticas disponibles en el mercado (Spherotech, Inc., Libertyville, IL; Invitrogen, Carlsbad, CA) que acoplan peptidos a superficies de las micropartmulas que se han modificado con grupos funcionales o se han recubierto con diversos anticuerpos o ligandos tales como, por ejemplo, avidina, estreptavidina o biotina.

La propiedad paramagnetica de las micropartmulas les permite separarse de la disolucion usando un iman. Las micropartmulas pueden resuspenderse facilmente cuando se retiran del iman. Los polipeptidos pueden acoplarse a micropartmulas de poliestireno paramagneticas recubiertas con una capa de poliuretano en un tubo. Los grupos hidroxi en la superficie de la micropartmula se activan por reaccion con cloruro de p-toluenosulfonilo (Nilsson K y Mosbach K. "p-Toluenesulfonyl chloride as an activating agent of agarose for the preparation of immobilized affinity ligands and proteins." Eur. J. Biochem. 1980:112:397-402). Como alternativa, las micropartfculas de poliestireno paramagneticas que contienen acido carboxflico en la superficie pueden activarse con una carbodiimida seguido por acoplamiento con un polipeptido, produciendo un enlace amida estable entre un grupo amino primario del polipeptido y los grupos acido carboxflico en la superficie de las micropartfculas (Nakajima N y Ikade Y, Mechanism of amide formation by carbodiimide for bioconjugation in aqueous media, Bioconjugate Chem. 1995, 6(1):123-130; Gilles MA, Hudson AQ y Borders CL Jr, Stability of water-soluble carbodiimides in aqueous solution, Anal Biochem. 1 de febrero de 1990;184(2):244-248; Sehgal D y Vijay IK, a method for the high efficiency of water-soluble carbodiimidemediated amidation, Anal Biochem. abril de 1994; 218(1):87-91; Szajani B et al., Effects of carbodiimide structure on the immobilization of enzymes, Appl Biochem Biotechnol. agosto de 1991; 30(2):225-231). Otra opcion es acoplar polipeptidos biotinilados a micropartmulas de poliestireno paramagneticas cuya superficie se han unido covalentemente a una monocapa de estreptavidina. (Argarana CE, Kuntz ID, Birken S, Axel R, Cantor CR. Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene. Nucleic Acids Res. 1986; 14(4):1871-82; Pahler A, Hendrickson WA, Gawinowicz Kolks MA, Aragana CE, Cantor CR. Characterization and crystallization of core streptavidin. J Biol Chem 1987:262(29):13933-13937).

Los polipeptidos pueden conjugarse a una amplia diversidad de tintes fluorescentes, inactivadores y haptenos tales como fluorescema, R-ficoeritrina y biotina. La conjugacion puede producirse durante la smtesis del polipeptido o despues de que el polipeptido se haya sintetizado y purificado. La biotina es una vitamina pequena (244 kDa) que se une con alta afinidad a las protemas avidina y estreptavidina y puede conjugarse a la mayona de peptidos sin alterar sus actividades biologicas. Los polipeptidos marcados con biotina se purifican facilmente de polipeptidos no marcados usando geles de afinidad por estreptavidina y avidina inmovilizada, y pueden usarse sondas conjugadas a estreptavidina o avidina para detectar polipeptidos biotinilados en, por ejemplo, aplicaciones de ELISA, inmunotransferencia por puntos o transferencia de Western. Los esteres de N-hidroxisuccinimida de biotina son el tipo mas habitualmente usado de agente de biotinilacion. Las biotinas activadas con N-hidroxisuccinimida reaccionan de forma eficaz con grupos amino primarios en tampones fisiologicos para formar enlaces amida estables. Los polipeptidos tienen aminas primarias en el extremo N y tambien pueden tener varias aminas primarias en la cadena lateral de restos de lisina que estan disponibles como dianas para el marcaje con reactivos de biotina activados con N-hidroxisuccinimida. Varios esteres de N-hidroxisuccinimida de biotina diferentes estan disponibles, con propiedades y longitudes del brazo espaciador variables (Pierce, Rockford, IL). Los reactivos de ester de sulfo-N-hidroxisuccinimida son solubles en agua, lo que posibilita que se realicen reacciones en ausencia de disolventes organicos.

La relacion mol a mol de biotina a polipeptido puede estimarse usando un ensayo de acido 2-(4'-hidroxiazobenceno-2-carboxflico) usando tecnica reconocidas en la tecnica (Green, NM, (1975) "Avidin. In Advances in Protein Chemistry." Academic Press, Nueva York. 29, 85-133; Green, NM, (1971) "The use of bifunctional biotinyl compounds to determine the arrangement of subunits in avidin." Biochem J. 125, 781-791; Green, NM., (1965) "A spectrophotometric assay for avidin and biotin based on binding of dyes by avidin." Biochem. J. 94: 23c-24c). Pueden conjugarse varias moleculas de biotina con un polipeptido y cada molecula de biotina puede unirse a una molecula de avidina. La formacion de enlace de biotina-avidina es muy rapida y estable en disolventes organicos, pH extremo y reactivos desnaturalizantes. Para cuantificar la biotinilacion, se anade una disolucion que contiene el polipeptido biotinilado a una mezcla de acido 2-(4'-hidroxiazobenceno-2-carboxflico) y avidina. Como la biotina tiene una mayor afinidad por avidina, desplaza el acido 2-(4'-hidroxiazobenceno-2-carboxflico) y la absorbancia a 500 nanometros disminuye proporcionalmente. La cantidad de biotina en una disolucion puede cuantificarse en una unica cubeta midiendo la absorbancia de la disolucion de acido 2-(4'-hidroxiazobenceno-2-carboxflico)-avidina antes y despues de la adicion del peptido que contiene biotina. El cambio en la absorbancia esta relacionado con la cantidad de biotina en la muestra por el coeficiente de extincion del complejo de acido 2-(4'-hidroxiazobenceno-2-carboxflico)-avidina. Como alternativa, un anticuerpo, fragmento de union a antfgeno a protema de union puede conjugarse con un resto fluorescente. Los polipeptidos de conjugacion con restos fluorescentes (por ejemplo, R-ficoeritrina, isotiocianato de fluorescema (FITC), etc.) puede conseguirse usando tecnicas reconocidas en la tecnica descritas en, por ejemplo, Glazer, AN y Stryer L. (1984). Trends Biochem. Sci. 9:423-7; Kronick, MN y Grossman, PD (1983) Clin. Chem.

29:1582-6; Lanier, LL y Loken, MR (1984) J. Immunol., 132:151-156; Parks, DR et al. (1984) Cytometry 5:159-68; Hardy, RR et al. (1983) Nature 306:270-2; Hardy RR et al. (1984) J. Exp. Med. 159:1169-88; Kronick, MN (1986) J. Immuno. Meth. 92:1-13; Der-Balian G, Kameda, N y Rowley, G. (1988) Anal. Biochem. 173:59-63.

En una realizacion no limitante, un fragmento de union a antfgeno de anticuerpo puede asociarse con (conjugarse con) un marcador detectable, tal como un radionuclido, compuesto relacionado con hierro, un tinte, un agente de imagenes o un agente fluorescente para la inmunodeteccion de hepcidina, que puede usarse para visualizar la union de los anticuerpos a hepcidina in vitro y/o in vivo.

Los ejemplos no limitantes de radiomarcadores incluyen, por ejemplo, 32P, 33P, 43K, 52Fe, 57Co, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 77Br, 81Rb/81MKr, 17MSr, 90Y, 97Ru, 99Tc, 100Pd, 101Rh, 1tfePb, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 111In, 113In, 119Sb, 121Sn, 123I, 125I, 127Cs, 128Ba, 129Cs, 131I, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169Eu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 191Os, 193Pt, 194Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb, 211At, 212Pb, 212Bi y 213Bi. Los radiomarcadores pueden adherirse a los compuestos usando qmmica convencional conocida en la tecnica de imagenes de anticuerpos. Los compuestos radiomarcados son utiles en tecnicas de diagnostico in vitro y en tecnicas de radioimagenes in vivo y en radioinmunoterapia.

En una realizacion, el anticuerpo o fragmento de union del mismo puede conjugarse tanto a un resto terapeutico como a un resto detectable. Un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo puede conjugarse con, o manipularse de forma recombinante con, una marca de afinidad (por ejemplo, una marca de purificacion). Las marcas de afinidad tales como, por ejemplo, marcas His6 (SEQ ID NO: 28) son convencionales en la tecnica.

Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno de los mismos descritos en la presente memoria son de tal manera que pueden conjugarse o unirse a un resto terapeutico y/o un resto de imagenes o detectable y/o una marca de afinidad. Los metodos para conjugar o unir polipeptidos son bien conocidos en la tecnica. Las asociaciones (union) entre compuestos y marcadores incluyen cualquier medio conocido en la tecnica incluyendo, aunque sin limitacion, interacciones covalentes y no covalentes, conjugacion qmmica, asf como tecnicas recombinantes.

Metodos de tratamiento

En la presente memoria se describe un metodo de induccion de una respuesta en un sujeto (humano o no humano) administrando al sujeto una composicion de un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que se une a hepcidina. El sitio de union al que se une el anticuerpo puede ser un epftopo continuo o conformacional/discontinuo. En una realizacion, un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, se une espedficamente a un epftopo que comprende los restos de aminoacido 1-9 de hepcidina. En otra realizacion, un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, se une espedficamente a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 restos de aminoacido de un epftopo que comprende los restos de aminoacido 1-9 de hepcidina. En otra realizacion mas, un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, se une espedficamente a Hep-20, Hep-22 y Hep-25.

La hepcidina puede tener una secuencia de aminoacidos de, por ejemplo, la SEQ ID NO: 19. Un peptido de hepcidina puede tener una secuencia de aminoacidos de, por ejemplo, una cualquiera de las SEQ ID NO: 20-25. En otra realizacion mas, un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, se une a una secuencia de aminoacidos expuesta en uno cualquiera de los peptidos de las SEQ ID NO: descritas en la presente memoria incluyendo, por ejemplo, la SEQ ID NO: 19-27.

Una respuesta eficaz de la presente invencion se consigue cuando el sujeto experimenta alivio o reduccion parcial o total de los signos o smtomas de la enfermedad, e incluye espedficamente, sin limitacion, prolongacion de la supervivencia. Los tiempos de supervivencia sin progresion esperados pueden medirse en meses a anos, dependiendo de los factores pronosticos incluyendo la cantidad de recidivas, la fase de la enfermedad y otros factores. La prolongacion de la supervivencia incluye, sin limitacion, tiempos de al menos 1 mes, aproximadamente al menos 2 meses, aproximadamente al menos 3 meses, aproximadamente al menos 4 meses, aproximadamente al menos 6 meses, aproximadamente al menos 1 ano, aproximadamente al menos 2 anos, aproximadamente al menos 3 anos, etc. La supervivencia global tambien puede medirse en meses a anos. Como alternativa, una respuesta eficaz puede ser que los smtomas de un sujeto permanezcan estaticos. Indicaciones adicionales de tratamiento de indicaciones se describen en mas detalle a continuacion.

Las composiciones de anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno descritos en la presente memoria pueden usarse como agentes no terapeuticos (por ejemplo, como agentes de purificacion por afinidad). En general, en una de dichas realizaciones, una protema de interes se inmoviliza en una fase solida tal como resina Sephadex o papel de filtro, usando metodos convencionales conocidos en la tecnica. La protema inmovilizada se pone en contacto con una muestra que contiene la diana de interes (o fragmento de la misma) a purificar, y despues de ello el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminara sustancialmente todo el material en la muestra excepto la protema diana, que esta unida al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal como tampon glicina, pH 5,0, que liberara la protema diana. Ademas de la purificacion, las composiciones pueden usarse para la deteccion, diagnostico y tratamiento de enfermedades y trastornos descritos en la presente memoria. El termino "contacto", como se usa en la presente memoria se refiere a anadir junto a una disolucion o composicion de un compuesto un medio ftquido que bana los polipeptidos, celulas, tejido u organo de un organismo. Como alternativa, "contacto" se refiere a mezclar junto con una disolucion o composicion de un compuesto, un ftquido tal como sangre, suero o plasma obtenido de un organismo. Para aplicaciones in vitro, una composicion tambien puede comprender otro componente, tal como dimetilsulfoxido (DMSO). El DMSO facilita la captacion de los compuestos o la solubilidad de los compuestos. La disolucion que comprende el compuesto de ensayo puede anadirse al medio que bana las celulas, tejidos u organos, o mezclarse con otro ftquido tal como sangre, utilizando un aparato de suministro, tal como un dispositivo basado en pipeta o dispositivo basado en jeringa. Para aplicaciones in vivo, el contacto puede producirse, por ejemplo, mediante la administracion de una composicion a un sujeto mediante cualquier medio adecuado; las composiciones con excipientes y vetftculos farmaceuticamente aceptables se han descrito en mas detalle anteriormente.

Un "sujeto" (por ejemplo, un mairnfero tal como un ser humano o un animal no humano tal como un primate, roedor, vaca, caballo, cerdo, oveja, etc.) de acuerdo con una realizacion de la presente solicitud, es un m ai^ero que muestra una o mas manifestaciones clmicas y/o smtomas de una enfermedad o trastorno descrito en la presente memoria.

Una composicion descrita en la presente memoria puede administrarse a un sujeto en una cantidad terapeuticamente eficaz que es eficaz para producir algun efecto terapeutico deseado inhibiendo una enfermedad o trastorno tal como se describe en la presente memoria, que puede estar asociado con hepcidina, a una relacion razonable de beneficio/riesgo aplicable a cualquier tratamiento medico. Para la administracion de las presentes composiciones a sujetos humanos, las composiciones pueden formularse por metodologfa conocida por un experto en la materia. Una cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad que consigue al menos parcialmente un efecto terapeutico o profilactico deseado en un organo o tejido. La cantidad de un anticuerpo antihepcidina o fragmento de union a antfgeno del mismo necesaria para conseguir la prevencion y/o tratamiento terapeutico de una enfermedad o trastorno no es fija per se. La cantidad de anticuerpo antihepcidina o fragmento de union a antfgeno del mismo administrada puede variar con el tipo de enfermedad, la extension de la enfermedad y el tamano del m ai^ero que padece la enfermedad o trastorno. En una realizacion, se administran dos o mas anticuerpos antihepcidina descritos en la presente memoria a un sujeto en combinacion. La combinacion incluye la administracion concomitante o posterior de los anticuerpos.

"Administrar" se define en la presente memoria como un medio que proporciona la composicion al sujeto de una manera que provoca que la composicion este dentro del organismo del sujeto. Dicha administracion puede ser por cualquier via incluyendo sin limitacion, local, regional o sistemica por administracion (por ejemplo, inyeccion) subcutanea, intravttrea, intradermica, intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, intracefalorraqmdea o intramuscular. "Administracion concurrente" significa administracion en un periodo de tiempo relativamente corto entre sf; dicho periodo de tiempo puede ser de menos de 2 semanas, menos de 7 dfas, menos de 1 dfa y puede incluso administrarse simultaneamente.

Los niveles de dosificacion reales de los ingredientes activos en las composiciones pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapeutica deseada para un sujeto, composicion y modo de administracion particulares, sin ser toxicos para el sujeto. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto particular empleado, la via de administracion, el tiempo de administracion, la tasa de excrecion del compuesto particular que esta empleando, la duracion del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales usados en combinacion con la composicion particular empleada, la edad, genero, peso, estado, salud general e historial medico previo del sujeto que se esta tratando, y factores similares bien conocidos en las tecnicas medicas.

Los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno descritos en la presente memoria pueden administrase a un sujeto en diversas cantidades de dosificacion y durante diversos tramos de tiempo. Las dosis no limitantes incluyen aproximadamente 0,01 mg/kg, aproximadamente 0,05 mg/kg, aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 60 mg/kg, aproximadamente 70 mg/kg, aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 90 mg/kg, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 125 mg/kg, aproximadamente 150 mg/kg, aproximadamente 175 mg/kg, aproximadamente 200 mg/kg o cualquier numero entero entremedias. Adicionalmente, la o las dosis de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno pueden administrarse 2 veces a la semana, semanalmente, cada dos semanas, cada tres semanas, cada 4 semanas, cada 6 semanas, cada 8 semanas, cada 12 semanas o cualquier combinacion de semanas entre las mismas. Tambien se contemplan ciclos de dosificacion tales como, por ejemplo, administracion de anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos una vez o dos veces a la semana durante 4 semanas, seguido por dos semanas sin tratamiento. Tambien se contemplan ciclos de dosificacion adicionales incluyendo, por ejemplo, diferentes combinaciones de las dosis y ciclos semanales descritos en la presente memoria dentro de la invencion.

Las cantidades terapeuticamente eficaces de una composicion pueden variar y dependen de la gravedad de la enfermedad y el peso y estado general del sujeto que se esta tratando, pero generalmente vanan de aproximadamente 1,0|jg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 10|jg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, o de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg por aplicacion. La administracion puede ser diaria, en dfas alternos, semanal, dos veces al mes, mensual o mas o menos frecuentemente, segun la necesario dependiendo de la respuesta al trastorno o afeccion y la tolerancia del sujeto al tratamiento. Se puede necesitar dosificaciones de mantenimiento durante un periodo mas largo de tiempo, tal como 4, 5, 6, 7, 8, 10 o 12 semanas o mas, hasta que se produzca una supresion deseada de los smtomas del trastorno, y las dosificaciones pueden ajustarse segun lo necesario. El progreso de este tratamiento se controla facilmente por tecnicas y ensayos convencionales.

Las dosificaciones espedficas pueden ajustarse dependiendo de las condiciones de enfermedad, edad, peso corporal, estado de salud general, genero y dieta del sujeto, intervalos de dosis, vfas de administracion, tasa de excrecion y combinaciones de farmacos. Cualquiera de las formas galenicas anteriores que contienen cantidades eficaces estan dentro de los Smites de la experimentacion rutinaria y, por lo tanto, dentro del alcance de la presente invencion.

En algunas realizaciones, el agente de union espedfico o anticuerpo de la invencion se administra por via intravenosa en una disolucion fisiologica a una dosis que vana entre 0,01 mg/kg y 100 mg/kg a una frecuencia que vana de diariamente a semanalmente a mensualmente (por ejemplo, cada d^ a, en d^as alternos, cada tres dfas, o 2, 3, 4, 5, o 6 veces a la semana), preferiblemente una dosis que vana de 0,1 a 45 mg/kg, de 0,1 a 15 mg/kg o de 0,1 a 10 mg/kg a una frecuencia de 2 o 3 veces por semana, o hasta 45 mg/kg una vez al mes.

"Contacto" se define en la presente memoria como un medio de poner una composicion descrita en la presente memoria en proximidad ffsica con una celula, organo, tejido o lfquido como se describe en la presente memoria. El contacto abarca administracion sistemica o local de cualquiera de las composiciones descritas en la presente memoria e incluye, sin limitacion, procedimientos y metodos in vitro, in vivo y/o ex vivo. "Combinacion" y "contacto" se usan indistintamente en la presente memoria y se entienden definidas de la misma manera.

Un anticuerpo descrito en la presente memoria puede administrarse por cualquier medio adecuado, de forma sistemica o local, incluyendo mediante administracion parenteral, subcutanea, intraperitoneal, intracefalorraqmdea, intrapulmonar e intranasal y, si se desea, para tratamiento local, administracion intralesional. Las vfas parenterales incluyen administracion intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, epidural, intratecal. Ademas, el agente de union espedfico o anticuerpo se administra adecuadamente por infusion en impulsos, particularmente con dosis en disminucion del agente de union espedfico o anticuerpo. En una realizacion, las composiciones pueden administrarse por inyeccion dependiendo, en parte, de si la administracion es breve o cronica. Otros modos de metodos de administracion se contemplan, incluyendo administracion topica, particularmente transdermica, transmucosa, rectal, oral o local, por ejemplo, mediante un cateter ubicado cerca del sitio deseado.

Una respuesta se consigue cuando el sujeto experimenta alivio parcial o total, o reduccion de los signos o smtomas de la enfermedad, y espedficamente incluye sin limitacion, prolongacion de la supervivencia. Los tiempos de supervivencia sin progresion esperados pueden medirse en meses a anos, dependiendo de los factores pronosticos incluyendo la cantidad de recidivas, la fase de la enfermedad y otros factores. La prolongacion de la supervivencia incluye, sin limitacion, tiempos de al menos 1 mes, aproximadamente al menos 2 meses, aproximadamente al menos 3 meses, aproximadamente al menos 4 meses, aproximadamente al menos 6 meses, aproximadamente al menos 1 ano, aproximadamente al menos 2 anos, aproximadamente al menos 3 anos o mas. La supervivencia global tambien puede medirse en meses a anos. Los smtomas del sujeto pueden permanecer estaticos o pueden disminuir.

Un medico o veterinario experto en la materia puede determinar facilmente y prescribir la cantidad eficaz (DE50) de la composicion requerida. Por ejemplo, el medico o veterinario podna empezar las dosis de los compuestos empleados en la composicion a niveles inferiores a los requeridos para conseguir el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosificacion hasta que se consiga el efecto deseado. Como alternativa, una dosis puede permanecer constante.

Las composiciones pueden administrarse a un sujeto por cualquier via conveniente, tal como se describe anteriormente. Independientemente de la via de administracion seleccionada, los compuestos de la presente invencion, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada y/o las composiciones, se formulan en formas galenicas aceptables tal como se describe a continuacion o por otros metodos convencionales conocidos para los expertos en la materia.

Los anticuerpos y/u otros agentes pueden combinarse en composiciones diferentes para administracion simultanea o secuencial. En una realizacion, la administracion simultanea comprende una o mas composiciones que se administran al mismo tiempo, o en 30 minutos entre sf. La administracion puede producirse en el mismo sitio o en diferentes sitios.

La toxicidad y eficacia terapeutica de dicho ingrediente pueden determinarse por procedimientos farmaceuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para un 50 % de la poblacion) y la DE50 (la dosis terapeuticamente eficaz en un 50 % de la poblacion). La relacion de dosis entre efectos toxicos y terapeuticos es el mdice terapeutico y puede expresarse como la relacion de DL50/DE50. Aunque pueden usarse compuestos que muestran efectos secundarios toxicos, debe tenerse cuidado en disenar un sistema de suministro que dirija dichos compuestos al sitio de tejido afectado para minimizar el dano potencial a las celulas sanas y, de ese modo, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse en la formulacion de un intervalo de dosificacion para su uso en seres humanos. La dosificacion de dichos compuestos esta preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulacion que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificacion puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma galenica empleada y la via de administracion utilizada. Para cualquier compuesto usado en el metodo de la invencion, la dosis terapeuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir una disposicion de concentracion en plasma en circulacion que incluya la CI50 (es dedr, la concentracion del compuesto de ensayo que consigue una inhibicion la mitad de la maxima) como se determina en cultivo celular. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatograffa de Kquidos de alto rendimiento. Dicha informacion puede usarse para determinar de forma mas precisa las dosis utiles en seres humanos.

Como se usa en la presente memoria, un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno, puede ser un antagonista de la actividad hepcidina, que mide una sustancia que inhibe la actividad reguladora del hierro de hepcidina.

En un aspecto, el antagonista de la actividad hepcidina puede ser una sustancia que inhibe la funcion de hepcidina, por ejemplo, inhibiendo la union entre hepcidina y ferroportina, inhibiendo la retencion de hierro celular controlada por hepcidina o facilitando el transporte de hierro dependiente de ferroportina. Los antagonistas de la actividad de hepcidina incluyen anticuerpos, o fragmentos de union a antigeno de los mismos, que se unen a hepcidina e inhiben su actividad. Un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, en algunos casos puede unirse a ferroportina, pero no activa el transporte de hierro por ferroportina.

En otras realizaciones mas, un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria puede inhibir (o neutralizar) la actividad reguladora de hierro de hepcidina, in vitro y/o tambien in vivo. Dichos anticuerpos neutralizantes de hepcidina son terapeuticamente utiles para trastornos relacionados con hepcidina o trastornos de la homeostasis del hierro. La actividad neutralizante de hepcidina puede medirse, por ejemplo, mediante varios marcadores tales como los niveles de ferritina/hierro, recuento de globulos rojos, caractensticas de globulos rojos (contenido de hemoglobina y/o volumen celular), caractensticas de globulos rojos tempranos (cantidades de reticulocitos, contenido de hemoglobina o volumen celular), internalizacion de ferroportina o transporte de hierro. En una realizacion no limitante, un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria disminuye la concentracion de hierro intracelular a una CE50 de aproximadamente 10-8 M o menos y/o aumenta la concentracion de hierro en circulacion.

Un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria puede antagonizar el efecto de hepcidina humana o inhibir la actividad reguladora de hierro de hepcidina. En algunas realizaciones, un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria ejerce un efecto a una CE50 de aproximadamente 1*10-8M o menos, o de aproximadamente 1*10-7M o menos. Por ejemplo, un anticuerpo puede disminuir el nivel de hierro intracelular en una celula a una CE50 de aproximadamente 1*10-8M o menos, o puede reducir la expresion de ferritina a una CE50 de aproximadamente 1*10-8M o menos, determinada por un ensayo de ferritina. En otras realizaciones, un anticuerpo como se describe en la presente memoria puede reducir los niveles de hepcidina en suero libre en al menos aproximadamente un 20 %, en al menos aproximadamente un 30 %, en al menos aproximadamente un 40 %, en al menos aproximadamente un 50 %, en al menos aproximadamente un 60 %, en al menos aproximadamente un 70 %, en al menos aproximadamente un 80 % o en al menos aproximadamente un 90 % en comparacion con un anticuerpo de control o en comparacion con un placebo. En otras realizaciones, un anticuerpo como se describe en la presente memoria puede aumentar el recuento (numero) de globulos, el volumen celular medio de globulos rojos o el contenido de hemoglobina en globulos rojos, puede aumentar la hemoglobina, puede aumentar el hematocrito, puede aumentar el % de Tsat, puede aumentar los niveles de hierro en circulacion (o suero) y/o puede aumentar o normalizar el recuento de reticulocitos, el volumen celular medio de reticulocitos, el contenidos de hemoglobina en reticulocitos o los numeros de reticulocitos.

En la presente memoria se describen metodos de diagnostico que utilizan un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo. Un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria, tambien puede usarse con fines de purificacion.

Tambien se describen en la presente memoria metodos terapeuticos que utilizan un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo. Dichos anticuerpos, o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, pueden usarse para tratar un trastorno relacionado con hepcidina. Los trastornos relacionados con hepcidina, enfermedades inflamatorias y enfermedades o trastornos de la homeostasis del hierro para los que pueden aplicarse los metodos incluyen, aunque sin limitacion, sobrecarga de hierro de tipo africano, alfa talasemia, enfermedad de Alzheimer, anemia, anemia por cancer, anemia por enfermedad cronica, anemia por inflamacion, arteriosclerosis o ateroesclerosis (incluyendo arteriopatfa coronaria, enfermedad cerebrovascular o enfermedad arterial oclusiva periferica), ataxias, ataxias relacionadas con el hierro, atransferrinemia, cancer, deficiencia de ceruloplasmina, anemia inducida por quimioterapia, enfermedad renal/del rinon cronica (fase I, II, III, IV o V), incluyendo enfermedad renal en fase final o insuficiencia renal/del rinon cronica, lesion aguda de rinon (AKI), cirrosis hepatica, hemocromatosis clasica, artritis inducida por colageno (CIA), afecciones con exceso de hepcidina (hepcidina elevada), anemia diseritropoyetica congenita, insuficiencia cardfaca congestiva, enfermedad de Crohn, enfermedad celfaca, enfermedad inflamatoria del intestino, (IBD), diabetes, trastornos de la biodistribucion del hierro, trastornos de la homeostasis del hierro, trastornos del metabolismo del hierro, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis por mutacion de ferroportina, deficiencia de folato, ataxia de Friedrich, mielosis funicular, smdrome de Gracile, infeccion por H. pylori u otras infecciones bacterianas, enfermedad de Hallervordan Spatz, hemocromatosis, hemocromatosis provocada por mutaciones en el receptor 2 de transferrina, hemoglobinopatias, hepatitis, hepatitis (Brock), hepatitis C, carcinoma hepatocelular, deficiencia de hepcidina, hemocromatosis hereditaria, VIH u otra enfermedad vmca, enfermedad de Huntington, hiperferritinemia, anemia microdtica hipocromica, hipoferremia, resistencia a insulina, anemia por deficiencia de hierro, trastornos por deficiencia de hierro, trastornos por sobrecarga de hierro, afecciones de deficiencia de hierro con exceso de hepcidina, hemocromatosis juvenil (HFE2), esclerosis multiple, mutacion en el receptor 2 de transferrina, HFE, hemojuvelina, ferroportina, TMPRSS6 (IRIDA) u otros genes del metabolismo del hierro, hemocromatosis neonatal, enfermedades neurodegenerativas relacionada con el hierro, osteopenia, pancreatitis por osteoporosis, neurodegeneracion asociada a pantotenato cinasa, enfermedad de Parkinson, pelagra, pica, porfiria, porfiria cutanea tardfa, seudoencefalitis, hemosiderosis pulmonar, trastornos de los globulos rojos, artritis reumatoide, septicemia, anemia sideroblastica, lupus eritematoso diseminado, talasemia, talasemia intermedia, sobrecarga de hierro por transfusion, tumores, vasculitis, deficiencia de vitamina B6, deficiencia de vitamina B12 y/o enfermedad de Wilson.

Como se usa en la presente memoria "tratamiento" o "tratar" se refiere tanto a tratamiento profilactico de un sujeto en riesgo de, o que tiene una predisposicion a, una enfermedad o trastorno, como a un tratamiento terapeutico de un sujeto que padece una enfermedad o trastorno.

La administracion de un agente terapeutico en un metodo profilactico puede producirse antes de la manifestacion de los smtomas de una enfermedad o trastorno indeseado, de modo que la enfermedad o trastorno se prevenga o, como alternativa, se retarde su progresion. Por tanto, cuando se usa junto con metodos profilacticos, la expresion "terapeuticamente eficaz" significa que, despues del tratamiento, una cantidad menor de sujetos (de promedio) desarrollan la enfermedad o trastorno indeseado o el progreso de la gravedad de los smtomas.

Cuando se usa junto con metodos terapeutico que implican la administracion de un agente terapeutico despues de que el sujeto manifieste los smtomas de una enfermedad o trastorno, la expresion "terapeuticamente eficaz" significa que, despues del tratamiento, uno o mas signos o smtomas de la enfermedad o trastorno se mejoran o eliminan. Como se usa en la presente memoria, un "trastorno relacionado con hepcidina" se refiere a una afeccion causada por asociada con un nivel anomalo de hepcidina (por ejemplo, exceso de hepcidina o deficiencia de hepcidina respecto al grado de anemia o hierro almacenado) que altera la homeostasis del hierro. Una alteracion en la homeostasis del hierro puede provocar, a su vez, enfermedades secundarias tales como anemia. Las afecciones inflamatorias agudas o cronicas pueden provocar regulacion por aumento de la expresion de hepcidina, que puede provocar niveles de hierro en circulacion disminuidos, que pueden causar anemia o empeorar la anemia existente. Las enfermedades inflamatorias relacionadas con hepcidina ejemplares incluyen anemia por cancer, anemia por enfermedad cronica, anemia por inflamacion, anemia inducida por quimioterapia, enfermedad renal cronica (fase I, II, III, IV o V), enfermedad renal en fase final, insuficiencia renal cronica, insuficiencia cardfaca congestiva, cancer, artritis reumatoide, lupus eritematoso diseminado, enfermedad de Crohn, infeccion por H. pylori y otros infecciones bacterianas, hepatitis C, VIH u otras enfermedades vmicas, arteriosclerosis, aterosclerosis, cirrosis hepatica, pancreatitis, septicemia, vasculitis, deficiencia de hierro, anemia microdtica hipocromica y afecciones con exceso de hepcidina.

Como se usa en la presente memoria, la expresion "enfermedad (o trastorno) de la homeostasis del hierro" se refiere a una afeccion en que los niveles de hierro de un sujeto requieren modulacion. Incluye trastornos relacionados con hepcidina; afecciones no asociadas con niveles elevados de hepcidina que, no obstante, se beneficianan de la inhibicion de la actividad hepcidina, tal como una alteracion en la homeostasis del hierro no causada por hepcidina; enfermedades en las que una absorcion, reciclado, metabolismo o excrecion aberrante de hierro causa una alteracion en los niveles sangumeos o distribucion tisular normal del hierro; enfermedades donde la mala regulacion del hierro es una consecuencia de otra enfermedad o afeccion, tal como inflamacion, cancer o quimioterapia, enfermedades o trastornos provocados por niveles sangumeos o distribucion tisular anomalos de hierro; y enfermedades o trastornos que pueden tratarse modulando los niveles o la distribucion del hierro. Los ejemplos no limitantes de dichas enfermedades o trastornos de la homeostasis del hierro, trastornos relacionados con hepcidina y afecciones inflamatorias que pueden provocar exceso de hepcidina incluyen sobrecarga de hierro de tipo africano, anemia por deficiencia de hierro resistente al hierro (IRIDA), alfa talasemia, enfermedad de Alzheimer, anemia, anemia por cancer, anemia por enfermedad cronica, anemia por inflamacion, arteriosclerosis o aterosclerosis (incluyendo arteriopatfa coronaria, enfermedad cerebrovascular o arteriopatfa oclusiva periferica), ataxias, ataxias relacionadas con hierro, atransferrinemia, cancer, deficiencia de ceruloplasmina, anemia inducida por quimioterapia, enfermedad renal/de rinon cronica (fase I, II, III, IV o V), incluyendo enfermedad renal en fase final o insuficiencia renal/de rinon cronica, lesion renal aguda (AKI), AKI asociada por derivacion cardiopulmonar, AKI asociada a farmacos o toxinas, cirrosis hepatica, hemocromatosis clasica, artritis inducida por colageno (CIA), afecciones con exceso de hepcidina (hepcidina elevada), anemia diseritropoyetica congenita, insuficiencia cardfaca congestiva, enfermedad de Crohn, enfermedad celfaca, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), diabetes, trastornos de la biodistribucion del hierro, trastornos de la homeostasis del hierro, trastornos del metabolismo del hierro, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis por mutacion de ferroportina, deficiencia de folato, ataxia de Friedrich, mielosis funicular, smdrome de Gracile, infeccion por H. pylori u otras infecciones bacterianas, enfermedad de Hallervordan Spatz, hemocromatosis hereditaria, hemocromatosis adquirida, hemocromatosis provocada por mutaciones en el receptor 2 de transferrina, hemoglobinopatfas, hepatitis, hepatitis (Brock), hepatitis C, carcinoma hepatocelular, VIH u otras enfermedades vmcas, enfermedad de Huntington, hiperferritinemia, anemia microcftica hipocromica, hipoferremia, resistencia a insulina, anemia por deficiencia de hierro, trastornos por deficiencia de hierro, trastornos por sobrecarga de hierro, afecciones por deficiencia de hierro con exceso de hepcidina, hemocromatosis juvenil (HFE2), esclerosis multiple, mutacion en el receptor 2 de transferrina, HFE, hemojuvelina, ferroportina u otros genes del metabolismo del hierro, hemocromatosis neonatal, enfermedades neurodegenerativas relacionadas con el hierro, osteopenia, pancreatitis por osteoporosis, neurodegeneracion asociada a pantotenato cinasa, enfermedad de Parkinson, pelagra, pica, porfiria, porfiria cutanea ta ^ a , seudoencefalitis, hemosiderosis pulmonar, trastornos de globulos rojos, artritis reumatoide, septicemia, anemia sideroblastica, lupus eritematoso diseminado, talasemia, talasemia intermedia, sobrecarga de hierro por transfusion, tumores, vasculitis, deficiencia de vitamina B6, deficiencia de vitamina B12 y/o enfermedad de Wilson.

Las afecciones no inflamatorias que estan implicadas en una alteracion de la regulacion del hierro incluyen, aunque sin limitacion, deficiencia de vitamina B6, deficiencia de vitamina B12, deficiencia de folato, pelagra, mielosis funicular, seudoencefalitis, enfermedad de Parkinson (Fasano et al., J. Neurochem. 96:909 (2006) y Kaur et al., Ageing Res. Rev., 3:327 (2004)), enfermedad de Alzheimer, cardiopatfa coronaria, osteopenia y osteoporosis (Guggenbuhl et al., Osteoporos. Int. 16:1809 (2005)), hemoglobinopatias y trastornos del metabolismo de los globulos rojos (Papanikolaou et al., Blood 105:4103 (2005)) y arteriopatfa oclusiva periferica.

En un aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de un trastorno de la homeostasis del hierro en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de modulacion de la actividad hepcidina en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo para tratar un trastorno de la homeostasis del hierro en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de la hemocromatosis en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de un sujeto con un nivel elevado de hepcidina, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion farmaceutica descrita en la presente memoria. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de la anemia en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. En otro aspecto mas, en la presente memoria se describe un metodo de tratamiento de una infeccion en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion descrita en la presente memoria. Una infeccion puede ser, por ejemplo, una infeccion bacteriana, fungica o vmca.

Cualquiera de dichos metodos puede comprender, ademas, en algunos casos, administrar a dicho sujeto un estimulador de la eritrocitopoyesis, en el que dicho estimulador de la eritrocitopoyesis se selecciona del grupo que consiste en eritropoyetina, una variante de eritropoyetina y un anticuerpo que se une a eritropoyetina. En una realizacion, el anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que se une espedficamente a hepcidina y dicho estimulador de la eritrocitopoyesis se administran simultanea o secuencialmente. Como se usa en la presente memoria, la expresion "actividad eritropoyetica" significa la actividad de estimular la eritrocitopoyesis como se demuestra en un ensayo in vivo, por ejemplo, el ensayo en raton policitemico exhipoxico. Vease, por ejemplo, Cotes y Bangham, Nature 191:1065 (1961).

En una realizacion, un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria y un estimulador de la eritrocitopoyesis pueden usarse para mejorar el tratamiento de un paciente con anemia. En otra realizacion, pacientes que son hiposensibles a, incluyendo insensibles a, tratamiento con estimulador de la eritrocitopoyesis, tal como eritropoyetina o analogos de la misma (epoetina alfa, epoetina beta, darbepoetina alfa), entre otros, pueden beneficiarse del cotratamiento con un antagonista de la actividad hepcidina o inhibidor de la expresion de hepcidina. En otra realizacion, un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria y un estimulador de la eritrocitopoyesis pueden usarse para mejorar el tratamiento de un paciente con un trastorno de carga de hierro posterior a sobrecarga de hierro dependiente de transfusion, o que tiene un trastorno de mala distribucion de hierro tal como ataxia de Friedreich.

Como se usa en la presente memoria, "estimulador de la eritrocitopoyesis" se refiere a un compuesto qmmico que causa directa o indirectamente la activacion de receptor de eritropoyetina, por ejemplo, mediante la union a y causando la dimerizacion del receptor o estimulando la expresion de eritropoyetina endogena. Los estimuladores de la eritrocitopoyesis incluyen eritropoyetina y variantes, analogos o derivados de la misma que se unen a y activan el receptor de eritropoyetina; anticuerpos que se unen al receptor de eritropoyetina y activan el receptor; o peptidos que se unen a y activan el receptor de eritropoyetina; o compuestos qmmicos organicos pequenos, opcionalmente de menos de aproximadamente 1000 Dalton de masa molecular, que se unen a y activan el receptor de eritropoyetina. Los estimuladores de la eritrocitopoyesis incluyen, aunque sin limitacion, epoetina alfa, epoetina beta, epoetina delta, epoetina omega, epoetina iota, epoetina zeta y analogos de las mismas, eritropoyetina pegilada, eritropoyetina carbamilada, peptidos mimeticos (incluyendo EMP1/hematide), anticuerpos mimeticos e inhibidores de HIF (vease la publicacion de patente de Estados Unidos n.° 2005/0020487). Los estimuladores de la eritrocitopoyesis ejemplares incluyen eritropoyetina, darbepoetina, variantes del agonista de eritropoyetina y peptidos o anticuerpos que se unen a y activan el receptor de eritropoyetina (e incluyen compuestos presentados en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2003/0215444 y 2006/0040858), asf como moleculas de eritropoyetina o variantes o analogos de las mismas como se divulga en las siguientes patente o solicitudes de patente: patentes de Estados Unidos n.° 4703008; 5441868; 5547933; 5618698; 5621080; 5756349; 5767078 5773569; 5955422; 5830851; 5856298; 5986047; 6030086; 6310078; 6391633; 6583272; 6586398; 6900292 6750369; 7030226; 7084245; 7217689; publicaciones PCT n.° WO 91/05867; WO 95/05465; WO 99/66054 WO 00/24893; WO 01/81405; WO 00/61637; WO 01/36489; WO 02/014356; WO 02/19963; WO 02/20034 WO 02/49673; WO 02/085940; WO 03/029291; WO 2003/055526; WO 2003/084477; WO 2003/094858 WO 2004/002417 WO 2004/002424; WO 2004/009627 WO 2004/024761 WO 2004/033651 WO 2004/035603 WO 2004/043382 WO 2004/101600; WO 2004/101606 WO 2004/101611 WO 2004/106373 WO 2004/018667 WO 2005/001025 WO 2005/001136; WO 2005/021579 WO 2005/025606 WO 2005/032460 WO 2005/051327 WO 2005/063808 WO 2005/063809; WO 2005/070451 WO 2005/081687 WO 2005/084711 WO 2005/103076 WO 2005/100403 WO 2005/092369; WO 2006/50959; WO 2006/02646; WO 2006/29094; y publicaciones de Estados Unidos n. US 2002/0155998; US 2003/0077753; US 2003/0082749; US 2003/0143202 US 2004/0009902 US 2004/0071694 US 2004/0091961 US 2004/0143857 US 2004/0157293; US 2004/0175379 US 2004/0175824 US 2004/0229318 US 2004/0248815 US 2004/0266690 US 2005/0019914; US 2005/0026834 US 2005/0096461 US 2005/0107297 US 2005/0107591 US 2005/0124045 US 2005/0124564; US 2005/0137329 US 2005/0142642 US 2005/0143292 US 2005/0153879 US 2005/0158822 US 2005/0158832; US 2005/0170457 US 2005/0181359 US 2005/0181482 US 2005/0192211 US 2005/0202538 US 2005/0227289; US 2005/0244409 US 2006/0088906 US 2006/0111279

En una realizacion, tambien se contempla un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, descrito en la presente memoria y un quelante de hierro para redistribuir los almacenes de hierro en el organismo. Un quelante de hierro es un agente que puede unirse a hierro y eliminarlo de un tejido o de la circulacion. Los ejemplos incluyen deferoxamina (Desferal®) y deferasirox (Exjade®), y deferiprona (1,2-dimetil-3-hidroxipiridin-4-ona).

La administracion de una composicion de la presente memoria puede ser por cualquier medio adecuado incluyendo, aunque sin limitacion, inyeccion. En una realizacion, la inyeccion puede ser, por ejemplo, inyeccion intravenosa, subcutanea o intramuscular.

Envases, kits, y recipientes prellenados

Tambien se describen en la presente memoria kits que contienen uno o mas compuestos descritos anteriormente, el kit puede comprender un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo que se une a hepcidina en medios de recipiente adecuados.

Los medios de recipiente de los kits generalmente incluiran al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, frasco, ampolla, jeringa, bolsa intravenosa (IV) y/u otros medios de recipiente, en que pueden colocarse, y/o preferiblemente dividirse en alfcuotas adecuadamente el al menos un polipeptido. En la presente memoria se describe un medio de recipiente que comprende una composicion descrita en la presente memoria.

Los kits pueden incluir un medio para contener al menos una protema de fusion, resto detectable, molecula indicadora y/o cualquier otro recipiente de reactivo en confinamiento cerrado para venta comercial. Dichos recipientes pueden incluir recipientes de plastico moldeados por inyeccion y/o soplado en que se retienen los viales deseados. Los kits tambien pueden incluir material impreso para el uso de los materiales del kit.

Los envases y kits pueden incluir ademas un agente tamponante, un conservante y/o un agente estabilizante en una formulacion farmaceutica. Cada componente del kit puede encerrarse dentro de un recipiente individual o todos los diversos recipientes pueden estar dentro de un unico envase. Los kits de la invencion pueden disenarse para almacenamiento en frio o almacenamiento a temperatura ambiente.

Adicionalmente, las preparaciones pueden contener estabilizantes para aumentar la vida util de los kits e incluyen, por ejemplo, seroalbumina bovina (BSA). Cuando las composiciones se liofilizan, el kit puede contener preparaciones adicionales de disoluciones para reconstituir las preparaciones liofilizadas. Las disoluciones de reconstitucion aceptables son bien conocidas en la tecnica e incluyen, por ejemplo, disolucion salina tamponada con fosfato (PBS) farmaceuticamente aceptable.

Los envases y kits pueden incluir ademas uno o mas componentes para un ensayo, tal como, por ejemplo, un ensayo ELISA. Las muestras a ensayar en esta aplicacion incluyen, por ejemplo, sangre, plasma y secciones tisulares y secreciones, orina, linfa y productos de la misma. Los envases y kits pueden incluir ademas uno o mas componentes para la recogida de una muestra (por ejemplo, una jeringa, una cubeta, un hisopo, etc.).

Los envases y kits pueden incluir ademas una etiqueta que espedfica, por ejemplo, la descripcion de un producto, el modo de administracion y/o la indicacion de tratamiento. Los envases descritos en la presente memoria pueden incluir cualquiera de las composiciones descritas en la presente memoria. Enfermedad (por ejemplo, IBD), artritis reumatoide, osteoartritis, una forma de cancer y sus metastasis.

La expresion "material de envasado" se refiere a una estructura ffsica que aloja los componentes del kit. El material de envasado puede mantener los componentes de forma esteril y puede estar hecho de material habitualmente usado para dichos fines (por ejemplo, papel, fibra corrugada, vidrio, plastico, hoja de aluminio, ampollas, etc.). La etiqueta o prospecto puede incluir instrucciones apropiadas por escrito. Los kits, por lo tanto, pueden incluir adicionalmente etiquetas o instrucciones para usar los componentes del kit en cualquier metodo de la invencion. Un kit puede incluir un compuesto en un envase, o dispensador junto con instrucciones para administrar el compuesto en un metodo descrito en la presente memoria.

En mas realizaciones adicionales, un kit puede comprender ademas un medio de recipiente para un estimulador de la eritrocitopoyesis.

Las instrucciones pueden incluir instrucciones para poner en practica cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, incluyendo metodos de tratamiento. Las instrucciones pueden incluir adicionalmente indicaciones de un criterio de valoracion clmico satisfactorio o cualquier smtoma adverso que pueda producirse, o informacion adicional requerida por las agencias reguladoras tales como la Food and Drug Administration para su uso en un sujeto humano.

Las instrucciones pueden estar en "material impreso”, por ejemplo, en papel o carton dentro de o fijado al kit, o en una etiqueta fijada al kit o material de envasado, o adherido a un vial o tubo que contiene un componente del kit. Las instrucciones pueden incluirse adicionalmente en un medio legible por ordenador, tal como una unidad instantanea/nube, disco (disco flexible o disco duro), CD optico tal como CD- o DVD-ROM/RAM, cinta magnetica, medio de almacenamiento electrico tal como RAM y ROM, punta IC e tnbridos de estos, tales como medios de almacenamiento magneticos/opticos.

En la presente memoria se describen kits que comprende una composicion como se describe en la presente memoria. En un aspecto, en la presente memoria se describe un kit para tratar un trastorno asociado con niveles de hepcidina elevados o un trastorno de la homeostasis del hierro, que comprende un anticuerpo, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, como se describe en la presente memoria y un estimulador de la eritrocitopoyesis.

En otro aspecto, en la presente memoria se describe un kit para tratar un trastorno asociado con niveles de hepcidina elevados o un trastorno de la homeostasis del hierro, que comprende un anticuerpo, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, como se describe en la presente memoria, y una etiqueta adherida a o envasada con el recipiente, describiendo la etiqueta el uso del anticuerpo, o un fragmento de union a antigeno del mismo, con un estimulador de la eritrocitopoyesis.

En otro aspecto, en la presente memoria se describe un kit para tratar un trastorno asociado con niveles de hepcidina elevados, que comprende un estimulador de la eritrocitopoyesis y una etiqueta adherida a o envasada con el recipiente, describiendo la etiqueta el uso del estimulador de la eritrocitopoyesis con un anticuerpo, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, como se describe en la presente memoria.

Ejemplos

La solicitud puede entenderse mejor por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que se describen como realizaciones ejemplares de la solicitud. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar mas completamente las realizaciones y no deben interpretarse de ninguna manera, sin embargo, como limitantes del amplio alcance de la solicitud.

Ejemplo 1. Desarrollo de anticuerpo monoclonal y diseno de andgeno para hepcidina humana

Antecedentes

La hepcidina es una hormona peptfdica de 25 aminoacidos que regula la homeostasis de hierro. La deficiencia o exceso de hepcidina genetico o adquirido es la causa principal o contribuyente de enfermedades importantes de regulacion del hierro. En otras enfermedades donde la homeostasis del hierro esta alterada por la deficiencia o exceso primario de los almacenes de hierro en el organismo, las concentraciones de hepcidina en sangre reflejan las respuestas fisiologicas a la alteracion primaria. A pesar de la importancia potencial de los tratamientos dirigidos a hepcidina-25 en medicina clmica, unicamente un anticuerpo monoclonal humanizado ha entrado en estudios clmicos en fase I preliminares.

La secuencia de aminoacidos de hepcidinas maduras esta muy conservada entre mairnferos, particularmente el extremo N. Las hepcidinas de raton y rata son un 76 % y 64 % identicas a la hepcidina humana, respectivamente. La estructura distintiva de la hepcidina esta muy conservada evolutivamente, y los 5 aminoacidos del extremo N son absolutamente necesarios para la bioactividad in vitro ya que los aminoacidos del extremo N estan directamente implicados en la union de Fpn y que dan lugar a la internalizacion y degradacion en lisozimas (Nemeth et al., 2006). A nivel molecular, sucede que la hepcidina causa la degradacion de su receptor, ferroportina, el unico canal de hierro humano, y atrapa hierro dentro de las celulas hepaticas, macrofagos y celulas que revisten el intestino donde se expresa la ferroportina. Segun disminuyen los niveles de hierro en plasma, disminuyen los niveles de hepcidina, y se produce ferroportina y se transporta a la membrana celular. Esto permite que se produzca una absorcion y reciclado del hierro normal y proporciona el hierro requerido para la produccion de sangre. El eje regulador de hierro de hepcidina-ferroportina es la diana de varios esfuerzos de desarrollo de farmacos terapeuticos novedosos actualmente en ensayos preclmicos y en fase I. Sin embargo, unicamente un MAb. Humanizado dirigido contra hepcidina se esta evaluando actualmente en estudios en fase I preliminares.

Se han transfectado de forma estable celulas de rinon embrionario humano (HEK 293) con un promotor inducible por ponesterona que promueve altos niveles de expresion de la protema de fusion de ferroportina murina-GFP (denominada Ec:R50-GFP) para estudiar la biologfa de ferroportina en ensayo basado en celulas in vitro.

La dificultad bien conocida en la produccion de anticuerpos contra hepcidina-25 se debe a su forma compacta y su alto grado de conservacion evolutiva, particularmente en la region del extremo N del peptido en mairnferos, incluyendo aquellos en uso para esfuerzos en desarrollo de MAb.

Otras empresas han dirigido sus anticuerpos contra peptidos lineales de la region del extremo C madura de hepcidina-25 (hepcidina (10-25)) [SEQ ID NO: 27], que no es util para la deteccion por ELISA de hepcidina-25 activa biologicamente y no se esperana que fuera eficaz en aplicaciones terapeuticas (vease, por ejemplo, Geacintov et al., documento US 2004/0096990 A1).

Anticuerpos desarrollados por los autores de la presente invencion

Usando los conocimientos de la importancia del extremo amino de hepcidina-25 y su mala inmunogenicidad, se diseno un conjunto de antfgenos y se inmunizaron grupos de ratones BALB/c para producir anticuerpos monoclonales contra hepcidina-25 biologicamente activa.

Nuestro diseno se centro en la produccion de MAb en el extremo N de hepcidina-25 y el peptido hepcidina-25 oxidado de longitud completa. Los ejemplos de antfgenos que se disenaron, que dan lugar a tres MAb funcionales descritos en la presente memoria se muestran en las figuras 1 y 6.

Se ensayaron varios antfgenos peptfdicos in vivo en ratones BALB/c para la inmunogenicidad y para producir MAb espedficos para hepcidina-25 usando varios metodos sinteticos para anadir haptenos (por ejemplo, DNP, PamCys) y protemas transportadoras inmunogenas (por ejemplo, KLH, mKLH, albumina o protema transportadora) y unos pocos demostraron ser antfgenos adecuados (figura 5 y 6).

Ejemplo 2: protocolo de hibridoma

Despues del calculo del tftulo de anticuerpo, se preparan hibridomas usando un kit de fusion disponible en el mercado (Hy-Clone) o por los metodos convencionales descritos por Kohler y Milstein (Id.).

El proposito de este ejemplo es describir la produccion de anticuerpos monoclonales por aislamiento de linfocitos de raton de ganglios linfaticos (LN) y/o bazo (S) despues de inmunizacion, la produccion de celulas de hibridoma y la produccion y seleccion de clones positivos que secretan los anticuerpos espedficos de antfgeno.

Procedimiento

Preparacion de celulas de mieloma

Dos semanas antes de la fusion, se propaga una lmea celular de mieloma Sp2/0 en medio DEME, con FCS al 10 %, 8-azaguanina y Pen-Strep. Una semana antes de la fusion celular, las celulas se cultivan sin 8-azaguanina y se dividen las celulas en dfas alternos. La densidad celular para la fusion es 2 x 105/ml y se requieren 100 ml de estas celulas. Las celulas se dividen el dfa antes de la fusion y se determina la viabilidad celular; se espera que la viabilidad sea mayor de un 95 %.

Las celulas SP2/0 se recogen por centrifugacion a 300 x g durante 10 minutos y se lavan 3 veces anadiendo 30 ml de medio B de fusion ClonaCell-HY. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 25 ml de medio B para que contuvieran 2 x 107 celulas viables. Despues de la resuspension, las celulas se mantuvieron a temperatura ambiente (TA). Esta etapa se realizo simultaneamente con, o despues de, la preparacion de linfocitos.

Aislamiento de ganglios linfaticos, bazo y linfocitos de raton

Se preparo PEG y medio (medio A, B, C) para la fusion precalentando hasta 37 °C.

Unicamente los ratones que respondieron a la inmunizacion, determinado por analisis convencional del tftulo en suero usando hepcidina-25 como antfgeno, se seleccionaron para la fusion de hibridoma. La fusion de hibridoma se realizo 3 dfas despues del ultimo refuerzo con el antfgeno seleccionado.

Cada raton se sacrifico usando asfixia y dislocacion cervical y se pulverizo con etanol al 75 %. El raton se coloco con su superficie ventral enfocando a una mesa de diseccion y todas las extremidades se fijaron a la mesa de diseccion. Todas las tecnicas de diseccion se realizaron usando tecnicas asepticas y se usaron diferentes conjuntos de instrumentos esteriles (tijeras, forceps) par cada etapa de la diseccion para retirar el bazo y los ganglios linfaticos (LN).

Los LN (y/o el bazo) se colocaron en un pocillo de placa de 6 pocillos que contema 2 ml de medio A y la grasa y el tejido conjuntivo se recortaron. Se establecio un filtro celular desechable en la parte superior de un tubo de centrifuga conico de 50 ml y se transfirio los LN (o bazo) al filtro y se corto los LN (o bazo) en pequenos trozos con tijeras esteriles y se molio el tejido usando el embolo de una jeringa esteril de 3 ml y pasando 5-l0 ml de medio B a traves del filtro. El tejido se molio una vez mas y se aclaro con 10 ml de medio B (unicamente la membrana debe permanecer en el cribado). Los linfocitos se pipetearon suavemente y se mezclaron por inversion y se centrifugaron a 400 x g durante 7 minutos. El sobrenadante se descarto y las celulas se resuspendieron en 10 ml de medio B. Despues se contaron las diluciones apropiadas de las celulas usando un hemocitometro.

Fusion

Los linfocitos y las celulas de mieloma se mezclaron a una relacion de 4:1 (aproximadamente 8 x 107 linfocitos con 2 x 107 celulas de mieloma) en un tubo de 50 ml. La relacion de linfocitos y celulas de mieloma puede estar en el intervalo de 10:1 a 1:1. Las celulas fusionadas se centrifugaron durante 10 minutos a 400 xg una vez y la mezcla celular se resuspendio en 30 ml de medio B y se centrifugo a 800 g durante 5 minutos para obtener una buena adherencia y promover la fusion de las celulas.

El medio se aspiro completamente del sedimento celular y el fondo del tubo se golpeo suavemente ya que el sedimento debe alterarse para la fusion optima. Se anadio lentamente un ml de disolucion de PEG al sedimento gota a gota usando una pipeta de un ml durante un periodo de un minuto sin agitacion. El fondo del tubo se golpeo con forma continua suavemente durante el siguiente minuto.

Se anadieron lentamente 4 ml de medio B a la mezcla de fusion con golpeteo continuo como anteriormente durante un periodo de 4 minutos.

Se anadieron lentamente 10 ml de medio B a las celulas, se incubaron durante 15 minutos en un bano de agua establecido a 37 °C.

Se anadieron lentamente 30 ml de medio A y las celulas se centrifugaron a 400 x g durante 7 minutos. El sobrenadante se descarto y las celulas se lavaron con 40 ml de medio A para asegurar que se eliminaba todo el PEG.

El sedimento celular se resuspendio lentamente en 10 ml de medio de recuperacion de hibridoma ClonaCell-HY (medio C) y se transfirio a un matraz de cultivo tisular T-75 cm2 que contema 20 ml de medio C (volumen total = 30 ml). Las celulas se incubaron durante una noche en una incubadora humidificada a 37 °C en atmosfera de CO2 al 5 %.

Seleccion y clonacion

En el dfa antes de la fusion, el medio de seleccion de hibridoma ClonaCell-HY (medio D) se puso a 2-8 °C y se descongelo durante una noche. En el dfa de la fusion, el medio D se agito vigorosamente para mezclar bien los contenidos y se permitio que se calentara hasta temperatura ambiente.

La suspension de celulas fusionadas entonces se transfirio a un tubo conico de 50 ml y se centrifugo dutante 10 minutos a 400 x g a TA y el sobrenadante se retiro y se descarto. Las celulas se resuspendieron en medio C hasta un volumen total de 10 ml.

Se transfirieron 10 ml de la suspension celular en 90 ml de medio D y se mezclaron minuciosamente invirtiendo suavemente el frasco varias veces. La suspension de celulas de hibridoma entonces se transfirio a un deposito de reactivo desechable y se permitio que reposara durante 15 minutos a TA para permitir que cualquier burbuja subiera hasta la parte superior y se dispersara.

Usando una pipeta de multiples canales y puntas de pipeta esteriles, se dispenso el medio D ClonaCell®-HY que contema las celulas de hibridoma en volumenes de 60-80 pl por pocillo en placas de 96 pocillos. Esto produjo tfpicamente entre 10-16 placas dependiendo del volumen sembrado en placa. Las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %, humidificada. Despues de 8 dfas de incubacion inalterada, los pocillos se examinaron para la presencia de colonias y se recubrieron suavemente con 150 pl de medio E ClonaCell®-HY precalentado en el medio semisolido de cada pocillo, independientemente de la presencia de colonias y se realizo el analisis en todos los pocillos.

Las placas se incubaron durante 2-4 dfas adicionales a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %, humidificada. El tiempo de incubacion del recubrimiento puede aumentarse ademas para asegurar la deteccion de hibridomas de baja expresion.

Se retiraron cuidadosamente 100 |jl del medio E ClonaCell®-HY recubierto sin alterar las colonias en el medio semisolido. Los sobrenadantes se ensayaron para anticuerpos espedficos usando un sistema de ensayo apropiado para el antigeno implicado, por ejemplo, ELISA de neutravidina, isotipado de Mab de raton, etc.

Los contenidos de los pocillos que dieron resultado positivo en el ensayo para los anticuerpos se resuspendieron suavemente y se transfirieron a pocillos de una placa de 24 pocillos que contema un ml de medio E ClonaCell®-HY para expandir los hibridomas. Cuando un pocillo positivo contema mas de una unica colonia, los clones se recogieron por separado y se transfirieron a pocillos individuales para su expansion y un nuevo ensayo para determinar el clon que produce el anticuerpo de interes.

Congelacion de hibridomas

Las celulas se crioconservaron a una concentracion de 2 x 106 celulas por vial.

Una disolucion de DMSO al 20 % en suero bovino fetal (FBS) se coloco en un tubo conico de 50 ml y se permitio que se enfriara en hielo. El volumen apropiado de DMSO se anadio lentamente y se mezclo bien y se esterilizo con filtro usando un filtro de 0,2 jm y se mantuvo en hielo.

Se recogen las celulas y se resuspenden en FBS fno a dos veces la concentracion celular final deseada (por ejemplo, se suspenden a 4 x 106 celulas/ml para celulas crioconservadas a 2 x 106 celulas por criovial).

Para la crioconservacion, la disolucion de FBS/DMSO al 20 % se anadio lentamente a una relacion de 1:1 al tubo que contema las celulas con mezcla continua durante la adicion. Se transfirio un ml de las celulas en medio de congelacion a cada criovial. La suspension celular final se calculo en FBS al 90 % que contema DMSO al 10 %. Los crioviales se colocaron inmediatamente en recipientes de congelacion y despues se movieron al congelador de -80 °C durante una noche. En el siguiente dfa, se retiran los viales congelados del recipiente de congelacion y se almacenan en nitrogeno lfquido.

Ejemplo 3: cribado de hibridomas para anticuerpos antihepcidina

Despues de ocho dfas de incubacion inalterada despues de la fusion, todos los pocillos se cribaron para identificar hibridomas murinos que secretaban anticuerpos antihepcidina humana. En resumen, un dfa antes del cribado, se colocaron 100 j l de neutravidina (200 ng/pocillo) preparada en tampon de recubrimiento de carbonato (pH 9,6) en cada pocillo de una placa de inmunoensayo enzimatico (EIA) y se incubaron durante una noche a 4 °C. Al siguiente dfa, la placa se lavo, se bloqueo con BSA al 1 % en tampon y se anadio 1 ng de radiomarcador K18-biotinahepcidina-25 a cada pocillo. Despues de una hora de incubacion, la placa se lavo, se combinaron 100 j l de sobrenadante de cultivo tisular de hibridoma con 50 j l de BSA al 1 %/TBSt en cada pocillo y la placa se incubo en un agitador giratorio (240 rpm) durante 1,5 horas. La placa se lavo y se anadio un anticuerpo de cabra de deteccion de cadena anti-IgG (H+L) de raton marcado con HRP y se continuo la incubacion durante otra hora. La placa se lavo, se aplico el sustrato, se revelo la reaccion durante 10 minutos antes de detenerla con H2SO41 N y se leyo la absorbancia a 450 nM. Un ejemplo de esta primera ronda de cribado produjo una matriz de 8x12 valores de DO como se representa en la figura 2. Los hibridomas que produjeron una Do > 2,0 se identificaron y propagaron adicionalmente antes de la segunda ronda de cribado.

La segunda ronda de cribado implicado ensayar la especificidad de cada hibridoma para hepcidina-25. En resumen, se recubrieron placas de EIA de 96 pocillos durante una noche con anticuerpo de cabra anti-IgG de raton espedfico de Fc (dilucion de 1/2,500), y el siguiente dfa la placa se laco, se bloqueo y se colocaron 100 j l de sobrenadante de cultivo tisular en cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La capacidad de los anticuerpos murinos presentes en el sobrenadante de cultivo tisular que se capturaron por la region Fc se ensayo por adicion de 1 ng de radiomarcador K18-biotina-hepcidina-25 a cada pocillo e incubando durante 1,5 horas en un agitador de placa giratoria. Despues del lavado, se anadio estreptavidina marcada con HRP (SA-HRP) a los pocillos, se incubo durante una hora, se lavo y se detecto la presencia de radiomarcador capturado por anticuerpo por la adicion de sustrato TMB durante 10 minutos. La reaccion se detuvo por la adicion de acido y se leyo la absorbancia a 450 nM. Como se representa en la figura 3, los hibridomas que producen una DO > 0,4 se identificaron y subclonaron para caracterizacion adicional. Nuestra experiencia ha demostrado que los hibridomas que producen una DO que excede 2,0 en esta segunda ronda de cribado son fuertes candidatos para caracterizacion adicional. Para ensayar la actividad funcional de los hibridomas, los clones identificados en la segunda ronda de cribado se subclonaron, se cultivaron hasta aproximadamente un 70 % de confluencia y se cribaron como se describe para la segunda ronda de cribado. En resumen, se recubren placas de 96 pocillos con anticuerpo de cabra anti-IgG de raton espedfico de Fc y el siguiente dfa las placas se lavan y bloquean y el sobrenadante de cultivo tisular se coloca en cada pocillo y se incuba durante 1 hora.

Para preparar una disolucion madre de hepcidina, se pesa aproximadamente 1 mg de hepcidina liofilizada y se reconstituye en 0,5 ml de HCl al 0,016 % (preparado en agua de calidad de cultivo tisular esteril) para generar una concentracion final de 2 mg/ml.

Para determinar de forma precisa la concentracion de hepcidina en la disolucion, se mide la absorbancia a 215 nm y a 225 nm en un espectrofotometro.

Para la medicion de la muestra, se genera una dilucion 1:20 de la disolucion (10 j l de la disolucion madre a 190 j l de agua esteril). Se prepara el blanco del espectrofotometro con un 10% de HCl al 0,016%. (10 j l de1HCl al 0,016 % a 190 j l de agua esteril). Se mide la absorbancia a 215 nm y a 225 nm y se calcula la concentracion de hepcidina usando la siguiente formula para la concentracion de peptido:

El calculo para la concentracion de hepcidina-25 en mg/ml es [mg/ml de hepcidina-25] = (A215 - A225) x 0,144 x 20 (20 es el factor de dilucion).

Para almacenar disoluciones madre de hepcidina-25, se recoge una almuota de la disolucion en volumenes de 100 j l en tubos de microcentnfuga de 0,5 ml esteriles y se almacenan a -80 °C. Para diluir adicionalmente la disolucion madre de hepcidina hasta una disolucion de trabajo conveniente, se diluye la disolucion madre concentrada hasta 500 jg/ml (disolucion de trabajo) con agua de calidad de cultivo tisular esteril.

Para confirmar la concentracion de peptido en la disolucion preparada, se me la absorbancia a 215 nm y a 225 nm. Para la medicion, se genera una dilucion 1:10 de la disolucion. Se toma una almuota en volumenes de 25 j l en tubos de microcentnfuga esteriles de 0,5 ml con un tapon de rosca.

La capacidad de hepcidina-25 humana sintetica de competir frente al radiomarcador de K18-biotina-hepcidina-25 por los sitios de union de MAb se ensayo mediante la adicion de 100 ng de hepcidina-25 preparada como anteriormente para la disolucion de radiomarcador y se anadieron 100 j l de esto a cada pocillo y se incubaron durante 1,5 horas. Despues del lavado, se anadio estreptavidina marcada con HRP, se incubo durante 1 hora, se lavo y se detecto la presencia de radiomarcador unido mediante la adicion de sustrato TMB. La reaccion se detuvo mediante la adicion de acido y se leyo la absorbancia a 450 nM. Se muestra un ejemplo del cribado de actividad funcional de sobrenadantes de hibridoma en la figura 4. Los hibridomas que presentan actividad funcional se identificaron mediante una reduccion en la DO en los pocillos de radiomarcador hepcidina-25, en comparacion con la DO producida por el radiomarcador unicamente (por ejemplo, hibridoma 5A3; la denominacion 5A3 se cambio posteriormente a "MAb 583").

Un ejemplo de la dificultad de producir MAb murinos se muestra en la figura 5. Una diversidad de antfgenos tfpicos y estrategias de inmunizacion puede producir cantidades variables de ratones que responden a inmunizacion (basandose en los tttulos en suero) y los tejidos que producen fusiones satisfactorias. Independientemente del antfgeno empleado, el porcentaje de MAb murinos espedficos de hepcidina-25 funcionales es constantemente menor de un 0,06 % (figura 5). Asimismo, como un ejemplo del esfuerzo requerido para el descubrimiento de 3 MAb murinos espedficos para hepcidina-25, se ensayaron ocho antfgenos y se cribaron 11.845 hibridomas con una tasa de exito de un 0,025 % (figura 6).

Ejemplo 4: purificacion de MAb murinos

Se produjeron grandes cantidades de MAb 583 y MAb 1B1 por cribado de biorreactores de fibra hueca CellMax disponibles en el mercado individuales (area superficial 10.000 cm2 (Spectrum Labs, Inc.)) que se incubaron despues a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 %. Se recogieron aproximadamente 2-3 litros de sobrenadante de cultivo celular total de cada MAb en lotes de aproximadamente 100 ml. Cada lote se centrifugo y congelo a -20 °C hasta su purificacion.

Para la purificacion, el sobrenadante se descongelo, se volvio a centrifugar y se purifico la inmunoglobulina por cromatograffa de afinidad usando una columna de protema G HiTrap de 5 ml (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) segun las instrucciones del fabricante. La purificacion se realizo usando un sistema de cromatograffa de presion media BioRad Biologic DuoFlow equipado con un BioLogic Maximizer, un detector QuadTec UV-VIS y un colector de fracciones BioFrac. Para el analisis de SDS-PAGE. Se combinaron fracciones del flujo directo de dos purificaciones previas de MAb 583 y MAb 1B1 que conteman inmunoglobulina y se realizo el intercambio de tampon usando una columna de desalado HiPrep 26/10 (GE Healthcare). La concentracion de protemas se determino usando acido bicinconmico (BCA, Thermo Scientific) y las almuotas se almacenaron congeladas a -20 °C.

Un ejemplo de la purificacion de MAb 581 y MAb 1B1 (lote 3) se confirmo usando geles de SDS-PAGE tenidos con Coomassie (acrilamida al 12%) procesados en condiciones reductoras convencionales (figura 7). Como se representa en la figura 7, se obtuvieron preparaciones purificadas de los MAb 583 e IgG 1B1 (carriles 8, 9) de sus sobrenadantes de cultivo de hibridoma respectivos (carriles 2-5) como se evidencia por la presencia de ambas protemas de cadena pesada y ligera de la masa molecular correcta (aproximadamente 50 y 25 kDa, respectivamente). Ademas, los MAb murinos purificados eran electroforeticamente equivalentes a la IgG de raton de control (carril 10). El medio de cultivo tisular sin suero (carril 6) sirvio como control negativo. Este metodo producina de forma coherente un MAb purificado que era adecuado para estudios adicionales de afinidad de union (por ejemplo, Biacore) y especificidad.

Para evaluar la consistencia de la produccion en biorreactor y rendimiento de purificacion se desarrollo un metodo de caracterizacion de actividad de MAb para evaluar la actividad de union de cada purificacion sucesiva del lote anticuerpo MAb 583 que se evaluo cada uno por electroforesis en gel como se muestra en la figura 7. Este mismo metodo se aplico a las purificaciones de MAb 1B1 (datos no mostrados).

Se uso un ELISA en placa de micropocillos para evaluar la actividad del anticuerpo. Se depositaron diluciones en serie de MAb 583 purificado de cada purificacion sucesiva de lote de sobrenadantes del biorreactor (aproximadamente 100 ml por lote) en placas (0-100 ng) y se bloquearon. El radiomarcador NT-biotina-hepcidina-25 se anadio en la placa a 1 ng/pocillo en TBST, pH 8) que contema Blotto al 0,25 %. Se permitio que el radiomarcador se uniera durante 2 horas y los pocillos se lavaron TBST, pH 8 sin Blotto. Se anadio SA-HRP a 1:2500 durante 30 minutos, los pocillos se lavaron en TBST y el sustrato TMB se anadio durante 10 minutos. Se anadio tampon de parada a la DO cuantificada en un espectrofotometro a 450 nm. La DO de 4 indica que la absorbancia esta mas alla del intervalo analftico del espectrofotometro.

La siguiente tabla es un ejemplo del metodo ELISA establecido para determinar las caractensticas de actividad de union para 5 purificaciones de MAb 583 sucesivas.

Los datos muestran que la actividad de union de MAb 583 purificado entre lotes aumentaba despues del lote 3 y fue coherente en los lotes 4-7 despues de que el protocolo de purificacion se optimizara sobre las cuatro primeras purificaciones realizadas. Los pocillos recubiertos con 6,25 ng de MAb 583 purificado demostraron que la densidad optica a 450 nm variaba de 2,7-4 en los lotes 4-7 y en la siguiente dilucion (3,12 ng/pocillo) las DO variaban de 1,5 2,3. Este ejemplo demuestra que un protocolo establecido y validado para la purificacion del anticuerpo MAb 583 de sobrenadantes de biorreactor se establece y demuestra ser coherente sobre docenas de lotes de purificacion de ambos MAb 583 y 1B1.

Ejemplo 5: caracterizacion de la especificidad de MAb para hepcidina-25 y peptidos de hepcidina

El MAb 583 demuestra especificidad exquisita y excelente por hepcidina-25 en un ensayo de especificidad basado en disolucion. Por ejemplo, se deposito hepcidina-25 sobre una placa de anhndrido maleico y los sitios de union no ocupados se inactivaron usando metodos convencionales. En paralelo, se mezclan 20 ng de MAb 583 con concentraciones crecientes de hepcidina-25 (de 0 a 8 ng/pocillo) en una placa de 96 pocillos de baja union de protema y se permitio que reaccionaran durante una hora. Esta mezcla de MAb entonces se transfiere a la placa de anhfdrido maleico y se permite que reaccione durante 2 horas, despues de lo cual se lava y se determina la presencia de MAb 583 unido a hepcidina-25 unido covalentemente a la placa usando anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de raton-HRP. Despues de incubacion adicional y lavado se anade el sustrato, se detiene el desarrollo usando acido y se determina la DO 450 nM. La figura 8 demuestra que hepcidina-25 puede bloquear los sitios de union en MAb 583 en disolucion de una manera dependiente de la dosis.

Otro ejemplo de la especificidad del MAb 583 por hepcidina-20, hepcidina-22 y hepcidina-25 y protegrina se demostro usando ensayos basados en membrana tales como, aunque sin limitacion, analisis de SDS-PAGE con tricina no reductor (10-20 % de acrilamida) usando electroforesis convencional y condiciones de inmunotransferencia (figura 9). Como se representa en la imagen tenida con Coomassie, hepcidina-20, 22 y 25 (carril 2, 3, 4) y protegrina (carril 5) tuvieron todos una masa molecular similar de aproximadamente 3 kDa. En contraste, la transferencia de Western sondeada con el MAb 583 indico que el MAb 583 reconoda espedficamente hepcidina-20, hepcidina-22 y hepcidina-25, pero no reconoda protegrina.

Para ejemplificar adicionalmente la especificidad de MAb 583 y MAb 1B1 por hepcidina-22 y hepcidina-25 y el radiomarcador NT-biotina-hepcidina-25, el radiomarcador K18-biotina-hepcidina-25 y el radiomarcador K24-biotinahepcidina-25, se realizo analisis de SDS-PAGE reductor (12 % de acrilamida) e inmunotransferencias de Western en metodos de electroforesis e inmunotransferencia convencionales (figura 10). El analisis de SDS-PAGE tenido con Coomassie indica que tanto hepcidina-20 como hepcidina-25 (carril 2, 3) y las tres formas de radiomarcador marcado con biotina (carril 4, 5, 6) tienen una masa molecular identica. Las transferencias de Western sondeadas con MAb 583 o MAb 1B1 indicaron que estos MAb reconodan espedficamente la hepcidina-20, la hepcidina-25 y las tres formas de peptidos radiomarcadores de hepcidina-25 marcados con biotina. Recogidos colectivamente, nuestros estudios basados en disolucion y basados en membrana demuestran que el MAb 583 y el MAb 1B1 poseen especificidad unica por las tres formas de las moleculas radiomarcadoras de hepcidina-25 humana biotiniladas. Ejemplo 6: analisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR) BIAcore de los MAb 583 y 1B1

Este ejemplo describe el analisis de la afinidad de union y las constantes de disociacion de la interaccion de los MAb 583 y 1B1 con hepcidina-25 usando SPR.

La SPR se realizo en un sistema Biacore 3000 (BIAcore, Piscataway, NJ) usando el chip detector CM5. La matriz del chip CM5 consiste en un dextrano carboximetilado adherido covalentemente a una superficie de oro. Todas las mediciones se realizaron a 25 °C.

Se inmovilizo neutravidina (Sigma, St. Louis, MO) en un chip detector CM5 (celdas de flujo 1 a 4) por el protocolo de acoplamiento de amina, a un nivel de 5000-10000 unidades de respuesta (UR). El protocolo de acoplamiento de amina incluye activacion de la matriz de dextrano en la superficie del chip detector con una mezcla 1:1 de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil carbodiimida (EDC) 0,4 M y N-hidroxisuccinimida (NHS) 0,1 M, seguido por inyeccion de neutravidina en tampon de acetato de sodio 10 mM, pH 4.

Despues de la inmovilizacion de neutravidina, se realizaron las etapas posteriores en tampon HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,005 %).

Los peptidos de hepcidina biotinilados (NT-biotina-hepcidina-25, K18-biotina-hepcidina-25 y K24-biotina-hepcidina-25) se inmovilizaron en las celdas de flujo 2-4 (una especie de peptido por celda de flujo) inyectando peptidos individuales a una concentracion de 200 pg/ml a un caudal de 5 pg/ml, durante 20 minutos.

Despues de que se capturaran los analogos de biotina-hepcidina-25 en el chip, se inyecto el MAb 583 o 1B1 antihepcidina en las celdas de flujo 1-4 a una concentracion de 24 pg/ml en tampon HBS-EP al caudal de 50 pl/min, durante 3 minutos. Despues de 3 minutos, la inyeccion se detuvo y se hizo un seguimiento de la disociacion durante 6 minutos. La regeneracion se realizo inyectando glicina HCl 10 mM, pH 1,5 a un caudal de 10 pl/min durante 1 minuto.

Las senales de resonancia se corrigieron para la union no espedfica sustrayendo la senal de la celda de flujo de control (celda I) y se analizo usando el programa informatico BlAevaluation 4.1 (Biacore).

En el primer experimento de SPR, el MAb 583 se aplico al chip Biacore preparado como se describe anteriormente a una concentracion de 24 pg/ml y se observo una rapida union y una tasa muy baja de disociacion del MAb 583 a los tres analogos de biotina-hepcidina-25 (figura 11). Los datos de los experimentos SPR mostrados en la figura 11 se muestran en la tabla a continuacion. Se observaron afinidad de union (Ka) y constantes de disociacion (Kd) excelentes para MAb 583 con NT-biotina-hepcidina-25 y una afinidad de union y constantes de disociacion aproximadamente 1 log inferior para K18-biotina-hepcidina-25 y K24-biotina-hepcidina-25, respectivamente.

Se repitio el experimento Biacore mostrado en la figura 11 con una concentracion de MAb 583 aproximadamente 5 veces inferior (5 pg/ml) para evaluar el MAb 583 a una relacion molar muy inferior de anticuerpo para los dos mejores antfgenos de hepcidina-25 biotinilados, NT-biotina-hepcidina-25 y K18-biotina-hepcidina-25 (figura 12). El diagrama Biacore muestra que el MAb 583 tiene excelente afinidad de union y una disociacion muy baja de ambos peptidos NT-biotina-hepcidina-25 y K18-biotina-hepcidina-25 evaluados en este experimento Biacore. Los resultados de Biacore de la figura 12 se muestran en la figura 13.

Los datos de Biacore indican que el MAb 583 se une a K18-biotina-hepcidina-25 con una alta afinidad y una baja constante de disociacion picomolar (Kd) = aproximadamente 7,5 pM). El MAb 583 tiene alta afinidad de union, pero ligeramente inferior y bajas constantes de disociacion picomolar para NT-biotina-hepcidina-25, con una Kd = aproximadamente 18 pM.

Estos experimented Biacore y resultados confirman que el MAb 583 se une a hepcidina-25 rapidamente y con alta afinidad y se disocia de hepcidina-25 lentamente con bajas constantes de disociacion pM. El epftopo para el MAb 583 los 9 aminoacidos del extremo N de los que los primeros 5 aminoacidos del extremo N (SEQ 25) son esenciales para la union de hepcidina-25 al transportador de hierro y al receptor, ferroportina, y su capacidad de internalizar y degradar la ferroportina. La excelente especificidad, afinidad, avidez y Kd pM del MAb 583 por el extremo N de hepcidina-25 indica que sera un anticuerpo neutralizante in vitro e in vivo, y adecuado para humanizacion para aplicaciones terapeuticas. Los ejemplos de experimentos Biacore con el MAb 1B1 se muestran en las figuras 14-15. Se hicieron dos intentos usando las mismas condiciones que se describen para el MAb 583 para realizar el analisis SPR con el MAb 1B1 y en cada caso la tasa de disociacion del 1B1 de los antigenos de hepcidina-25 fue tan baja que el programa informatico BIAevaluation 4.1 del instrumento Biacore 3000 usado no puedo detectar ninguna disociacion del 1B1 de los antigenos de hepcidina-25 durante el experimento de 20 minutos. Por esta razon, los experimentos no lograron producir informacion estadfstica como se muestra para el MAb 583 en la figura 13 para los experimentos Biacore mostrados en las figuras 14-15.

El analisis SPR en estas condiciones experimentales indica que el MAb 1B1 murino tiene afinidad extraordinaria por peptidos de hepcidina-25 y puede tener una constante de afinidad (K^d) de <10'12-10'13 M) y con estas caractensticas puede ser adecuado para inmunizacion y evaluacion preclrnica como un MAb espedfico para hepcidina-25.

Ejemplo 7: experimentos de especificidad y union a hepcidina con los MAb 583 y 1B1

Se evaluo la especificidad y las afinidades de union relativas del 583 y 1B1 en una serie de experimentos de competicion en placa de microvaloracion. Los ensayos se realizaron por duplicado o triplicado usando placas de microvaloracion de 96 pocillos recubiertas con MAb 583 o MAb 1B1.

El MAb 583 se diluyo 1:4000 en disolucion salina tamponada con Tris (TBS) que contema Tris-HCl 40 mM (pH 7,3), NaCl 100 mM, se pipeteo en las placas de microvaloracion.

Despues de 1 hora de incubacion a temperatura ambiente (TA), las placas de microvaloracion se lavaron con TBST (TBS con TWEEN® 20 al 0,05 %) y se anadieron 100 ml de muestras patron que conteman diversas cantidades de peptidos sinteticos y analogos de hepcidina-25 con biotina (1-2 ng/pocillo) a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a TA.

La competicion se detecto por estreptavidina-HRP con el sustrato tetrametilbenzidina; la reaccion de color se detuvo con H2SO40,5 N y la densidad optica de la disolucion se leyo a 450 nm de longitud de onda.

Analisis de union de hepcidina-25, hepcidina-22 y hepcidina-20 a anticuerpos MAb 583 recubiertos sobre una placa de microvaloracion. Se uso la union de analogos de hepcidina-25 biotinilados y la deteccion de NT-biotina-hepcidina-25 unida para detectar el grado relativo de union de cada uno de los peptidos de hepcidina respecto a hepcidina-25 (figura 16). Las curvas de competicion con NT-biotina-hepcidina-25 con los isomeros peptfdicos de hepcidina, hepcidina-22 y hepcidina-20, fueron similares, lo que indica que los isomeros de hepcidina se unen a MAb 583, pero con valores de c E50 (afinidad) decrecientes con tamano decreciente del isomero de hepcidina, como se demuestra por el desplazamiento a la derecha en la curva de regresion que va de hepcidina-25 a hepcidina-22 a hepcidina-20. Se uso el mismo metodo que anteriormente para investigar las afinidades de union relativas de los MAb 583 y 1B1 contra un peptido oxidado del extremo C, para evaluar la union de los epftopos en hepcidina para cada MAb. Los peptidos del extremo carboxi tales como hepcidina (10-25) se describen en las patentes de Estados Unidos n.° 7.320.894 y 7.411.048.

Como se muestra en la figura 17 y en la figura 18, no hubo union del peptido de hepcidina (10-25) al MAb 583 o 1B1, respectivamente, a ninguna concentracion ensayada hasta 2000 ng/ml con NT-biotina-hepcidina-25. Tampoco hubo union observada entre el MAb 583 y hepcidina-25 de raton (hepcidina-1 murina) o protegrina en comparacion con la excelente union competitiva por hepcidina-25 sintetica en este experimento ELISA (figura 17). Estos experimentos muestran claramente que los MAb 583 y 1B1 no se unen a ningun epftopo encontrado en los 16 aminoacidos del extremo C de hepcidina-25 (hepcidina (10-15) y, por tanto, se unen a epftopos del extremo N. El peptido antimicrobiano cationico, protegrina, y hepcidina-25 de raton, (hepcidina-1 murina) son estructuralmente similares, compartiendo la hepcidina-1 murina un 76 % de identidad de aminoacidos con hepcidina-25 humana. Se usaron los peptidos para ensayar la reactividad cruzada del MAb 583 con peptidos similares en el mismo ensayo con MAb 583. Como se muestra claramente en un experimento ELISA, no se descubrio union aparente de 583 a estos peptidos estructuralmente similares (figura 17).

En un experimento similar mostrado en la figura 18, no se observo union de hepcidina (10-25) al MAb 1B1 en un experimento similar realizado con K18-biotina-hepcidina-25 usado como radiomarcador en el experimento ELISA (figura 19), que confirma adicionalmente que los 9 aminoacidos del extremo N son el epftopo clave para 1B1. De forma importante, estos datos muestran que ambos MAb 583 y 1B1 tienen excelente afinidad y especificidad por el extremo N de hepcidina-25. Podnan preverse ambos como anticuerpos neutralizantes para la bioactividad de hepcidina contra el receptor ferroportina y el canal de hierro in vitro e in vivo y una vez humanizados, como candidatos para desarrollo terapeutico.

Ejemplo 8: analisis del MAb 583 para la actividad de neutralizacion contra hepcidina-25 in vitro en ensayos basados en celulas por analisis de fluorescencia de ferroportina-GFP

Ensayos basados en celulas in vitro

Se evaluo la actividad neutralizante del MAb 583 in vitro en un ensayo de fluorescencia basado en celulas usando el protocolo de citometna de flujo como se describe en Nemeth et al., (2006) para evaluar la actividad neutralizante del MAb 583 contra hepcidina-25 humana (SEQ ID NO. 19). Los cinco aminoacidos del extremo N [SEQ ID NO. 25] de hepcidina interaction con ferroportina y son necesarios para la actividad biologica de hepcidina, por lo que cada eliminacion de aminoacido individual del extremo N reduce la actividad biologica de hepcidina como se define por la actividad de degradacion de ferroportina (figuras 20-23).

Se incubaron celulas HEK humanas que conteman una construccion de ferroportina de raton inducible por ponasterona (Fpn-GFP) con o sin ponasterona 10 mM durante 24 horas. Despues de tres lavados con PBS de Dulbecco 1 x, las celulas se trataron secuencialmente con cantidades conocidas de anticuerpo MAb 583 purificado por afinidad por proterna A y concentraciones conocidas de hepcidina-25 humana sintetica biologicamente activa, o tampon de control durante otras 24 horas.

Las celulas se desprendieron usando TrypLE Express (Invitrogen) y se resuspendieron en medio a una concentracion de 1 x 106 celulas/ml. La intensidad de la fluorescencia se midio usando citometna de flujo.

Se usaron celulas que no expresan Fpn-GFP (sin ponasterona) para establecer una ventana de adquisicion (medida inicial) para excluir la fluorescencia de fondo. Los resultados se representaron como una fraccion de la intensidad de GFP de celulas no tratadas, de acuerdo con la formula (Fx - Fhep) / (Fnotratado - Fhep), donde F representa la media de la fluorescencia verde seleccionada.

Citometna de flujo de celulas Fpn-GFP tratadas con MAb 583

En el primer experimento, las celulas se indujeron durante una noche con ponasterona para inducir la expresion de Fpn-GFP murino. El siguiente dfa, se elimino la ponasterona por lavado y se anadieron hepcidina-25 y anticuerpos 583 durante 24 horas (figura 20 y figura 21).

Se uso hepcidina-25 a una concentracion de 100 ng/ml (37 nM). El MAb 583 se anadio a una concentracion molar relativa de 10 veces, 2 veces o 1/3 de la concentracion de hepcidina (370 nM, 74 nM y 10 nM).

El MAb de control fue un anticuerpo monoclonal antihepcidina fallido cuando se cribaba in vitro por ELISA y se uso a la concentracion mas elevada (370 nM). En este experimento, el MAb 583 10 nM neutralizo completamente hepcidina-2537 nM y suprimio la degradacion de hepcidina-25 de FPN-GFP.

Se repitio el experimento con MAb 583 anadido a 1/3, 1/6, 1/12 y 1/24 de la concentracion molar de hepcidina-25 en este ensayo basado en celulas de la actividad biologica de MAb 583 (figura 22 y figura 23).

En este experimento, 2,5 nM del MAb 583 neutralizo significativamente (~23 % de disminucion) la hepcidina-25 37 nM y su actividad biologica para FPN-GFP a 1/12 de la relacion molar de la hepcidina-25 biologicamente activa (figura 22, 23).

Tambien se evaluo la actividad neutralizante del MAb 583 obteniendo las mediciones de ferritina intracelular a partir de celulas Fpn-GFP de control y celulas tratadas con concentraciones variables de MAb 583 y hepcidina en dos experimentos adicionales usando los protocolos identicos, incluyendo la concentracion del anticuerpo MAb 583 y peptidos biotinilados de hepcidina-25, como en los ensayos de fluorescencia basados en celulas (figuras 24-26). Para obtener concentraciones de ferritina intracelulares, la proterna celular total se extrajo usando tampon RIPA (Boston BioProducts, Ashland, MA) con la adicion de un coctel inhibidor de proteasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche, Indianapolis, IN).

Los niveles de ferritina se determinaron usando un ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (ELISA; Ramco Laboratories, Stafford, TX) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con concentraciones de proterna total normalizadas en cada muestra. La concentracion de proterna total se determino usando el ensayo de acido bicinconrnico (BCA) (Pierce, Rockford, IL).

Las figuras 24-26 muestran los resultados de estos ensayos disenados para evaluar la capacidad del MAb 583 de neutralizar la actividad biologica de hepcidina-25 contra ferroportina.

Similar a los resultados observados en ensayos de fluorescencia descritos en la presente memoria, el MAb 5832,5 10 nM neutralizo significativamente hepcidina-25 37 nM y su actividad biologica in vitro, dando lugar a una degradacion disminuida de FPN-GFP y retencion de hierro unido a ferritina intracelular (figura 24-26).

Ejemplo 9. Actividad neutralizante in vivo del MAb 583 en ratones C57BL/6

Para evaluar las caractensticas neutralizantes in vivo del MAb 583, se realizo un estudio en animales simple, pero robusto, donde se examinaron dos pautas posologicas con anticuerpos MAb 583 purificados por afinidad para la capacidad de los anticuerpos 583 de bloquear la hepcidina-25 biologicamente activa in vivo. Se ensayo una unica dosis de MAb 583 y dos dosis al 50 % de MAb 583 aplicadas secuencialmente separadas por 24 horas mediante inyeccion intraperitoneal.

Para iniciar el experimento del MAb 583 in vivo, se alojaron cuarenta ratones macho C57BL/6 (6 semanas de edad) en un vivario comercial dentro de nuestro edificio y se les administro una dieta baja en hierro (20 ppm de hierro total, Teklad Custom Research Diet, Harlan Laboratories) durante 17 dfas. En el dfa 1, se asignaron aleatoriamente cuarenta ratones a cinco grupos experimentales de 8 y cada grupo se trato como se describe a continuacion. El grupo uno recibio PBS unicamente, los grupos 2 y 3 recibieron 1,0 mg y 0,5 mg del MAb 583, respectivamente, el grupo 4 recibio el MAb de control (MAb antihepcidina inadecuado para ELISA) y el grupo 5 recibio PBS. Veinticuatro horas despues, cada raton del grupo 3 recibio 0,5 mg adicionales del MAb 583. Despues de un periodo de incubacion adicional de 24 horas, los grupos 1 a 4 recibieron 50 |jg de hepcidina-25 en PBS y los ratones del grupo 5 (grupo de control) recibieron su segunda dosis de PBS (figura 27)

Se extrajo sangre de los ratones mediante puncion cardiaca 2 horas despues del tratamiento, se permitio que la sangre coagulara durante 30 minutos y se evaluaron sus niveles de hierro en suero usando un metodo espectrofotometrico comercial (Iron-SL Assay, Genzyme Diagnostics).

El analisis estadfstico de los datos muestra que los datos estaban distribuidos normalmente por el ensayo de normalidad de Shapiro-Wilk (P = 0,216).

El ensayo de varianza igual de los datos mostro varianzas equivalentes entre los grupos (P = 0,360).

Se realizo ANOVA e indico que habfa una diferencia estadfsticamente significativa (P = 0,008), diferencias en los valores medios de concentraciones de hierro en suero entre los grupos de tratamiento (figura 28). La figura 27 muestra estos resultados de forma grafica y las diferencias significativas entre los controles de PBS y los ratones tratados con hepcidina-25 en PBS en solitario o en combinacion con dos dosis de 0,5 mg de MAb 583 en PBS (figura 28).

Potencia del ensayo realizado con alfa = 0,050: 0,748.

Las comparaciones multiples frente al grupo de control (metodo de Holm-Sidak) produjeron un nivel de significacion global = 0,05.

Se observaron diferencias significativas en las concentraciones de hierro en plasma entre el grupo de control de PBS y el grupo de ratones al que se administro 50 |jg de hepcidina-25 en PBS o dos dosis de 0,5 mg doses del MAb 583 durante 24 horas. El grupo al que se administro 50 jg de hepcidina-25 en PBS seguido por 1,0 mg del MAb antihepcidina de control (MAb simulado) se aproximo a una diferencia significativa con el grupo de control de PBS mas hepcidina-25 (P = 0,054; figura 28).

Estos resultados son prometedores e indican que el MAb 583 tiene actividad neutralizante in vivo, que suprime la actividad biologica de hepcidina-25 cuando ambos se inyectan secuencialmente IP en ratones C57BL/6 macho. La dosis de 50 jg de hepcidina-25 humana usada en este experimento in vivo a demostrado previamente inducir hipoferrimia grave durante hasta 72 horas en ratones C57BL/6 y, por lo tanto, la dosis representa un ensayo riguroso de la actividad neutralizante del MAb 583 (Rivera et al., 2005).

Ejemplo 10. Anticuerpo quimerico humano-raton

Se sintetizaron los dominios variables de cadena ligera y pesada del MAB 583 murino antihepcidina y se clonaron en un vector de expresion de mairnfero patentado sin ninguna modificacion. El dominio variable de cadena ligera se clono en fase con una senal de secrecion y un dominio constante de cadena ligera kappa humana. El dominio variable de cadena pesada se clono en fase con una senal de secrecion y un dominio constante de IgG1 humana. Se verifico la secuencia del clon resultante, BAP070-01. Observese que la secuencia senal esta subrayada a continuacion.

BAP070-01-Secuencia de ADN de cadena ligera

AT GGACAT GAGGGTCCCCGCT C AGCTCCT GGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTC CC AGGTGCC A AGT GT G AC ATT GTGCT G ACCC A AT CT C CAGCTT CTTT GGCT GTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGT TGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGAC AGCCACCCAAACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAGAATCTGGGATCC CT GCC AGGTT CAGT GGC AGT GGGT CTAGGACAGACTT CACCCT CACCATTA ATCCTGTGGAGGCTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATG AGGATCTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTG GCTGC ACCATCT GTCTT CATCTT CCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CT GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC A AAGT AC AGT GGAAGGTGGAT AACGCCCTCCAAT CGGGTAACTC CC AGGA GAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGC ACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTG CGA AGTC ACCC ATC AGGGCCT GAGCT CGCCCGTC AC AAAG AGCTTC AACA GGGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 37)

Secuencia de aminoacidos de BAP070-01-protema de cadena ligera MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKCDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSY GNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESG1PARFSGSGSRTDFTLT1NPVEADD VATYYCQQSNEDLTFGQGTKVE1KRTVAAPSVF1FPPSDEQLK.SGTASVVCLLN NFYPREAK.VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKJTK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 38)

BAP070-01-Secuencia de ADN de cadena pesada ATGGCCACAACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTT TA A AAGGT GT CC AGT GT C AGAT CC AGTTGGT GC AGT CT GG ACCT GAGCT GA AGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCT TCACAAACT ATGGAATGAACTGGGTGAAGC AGGCTCCAGGA AAGGGTTT A AAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGAT GACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCT ATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTA CAACGTACGCTACTAGCTGGTACTGGGGCCAGGGAACGCTGGTCACCGTCA GCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT CCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGT GCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAA ATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCT GGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAA TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGG TCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCAGCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCT CCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTAC AGC AAGCT C ACCGT GGAC AAGAGCAGGTGGCAGC AGGGG AA CGTCTT CT C ATGCTCCGT GATGCAT GAGGCTCT GCAC AACCACTACACGCA GAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ ID NO: 39)

Secuencia de aminoacidos de BAP070-01-protema de cadena pesada MATTMEFGLSWLFLVAILKGVQCQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTN YGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQI NNLKNEDTATYFCTTYATSWYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLM1SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK.CK.VSNKALPAPIEK.TISK.AK.GQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 40) Secuencia de la region variable de cadena pesada del mAb 583 murino:

CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGAC AGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAAT GAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGA TAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGG TTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACA ACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTACAACGTACGCTACTA GCTGGTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 53)

Secuencia de la region variable de cadena ligera del mAb 583 murino:

GACATT GT GCTGACCCAAT CTCCAGCTTCTTT GGCTGTGT CTCT AGGGCAGA

GGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATA

GTTTTATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCA

TCTATCGTGCATCCAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAG

TGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAGGCTGATGAT

GTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCTGACGTTCGGTGGA

GGCACCAAGCTGGAAATCAAAC (SEQ ID NO: 54)

Se sembraron celulas CHO en placas de 6 pocillos, se transfectaron con BAP070-01 (quimera recombinante) o vector vado unicamente (BAP070) usando un protocolo de transfeccion patentado y se cultivaron a 37 °C en DMEM con suero al 10 %. Los sobrenadantes se recogieron a las 48 horas despues de la transfeccion. La concentracion de IgG en el sobrenadante se determino usando ELISA de cuantificacion de BioAtla. La concentracion del BAP070-01 recombinante se determino por ELISA de cuantificacion en 3650 ng/ml.

El primer experimento con la quimera del MAb 583 BAP070-01 se diseno para comparar la quimera del MAb 583 con el MAb 583 murino para la actividad de union a hepcidina-25. Se incubo una serie de dilucion de factor dos y despues de factor tres del sobrenadante de celulas CHO de BAP070-01 o el MAb 583 murino (lote 10, 0,5 mg/ml) partiendo en 600 ng/ml en placas de micropocillos con 100 ng de hepcidina-25 unida covalentemente a los pocillos activados con anhfdrido maleico. La union del anticuerpo se detecto con anticuerpo anti-IgG humana (H+L) conjugado con HRP (1:2500) para el sobrenadante de BAP070-01. La union del anticuerpo por el MAb 583 de control purificado se detecto usando anticuerpo de conejo anti-IgG de raton (H+L) a la misma dilucion. Las reacciones se detuvieron con HCl 1N a los 5 minutos despues de anadir TMB a los pocillos y se leyeron inmediatamente. Se medio el valor de DO 450 nm de las reacciones con el dispositivo molecular SPECTRAmax Plus (figura 29). Los resultados de DO mostrados en la tabla a continuacion en la figura 29 demuestran excelente union por el MAb 583 quimerico BAP070-01 y el MAb 583 de control purificado, que indica que el clon de la quimera BAP070-01 se construyo correctamente y que las CDR de cadena pesada y de cadena ligera murinas funcionaban correctamente en el contexto de la region flanqueante de IgG humana. Estos datos confirman que la clonacion, expresion del BAP070-01 en cultivo de celulas CHO y la actividad de union de la quimera son suficientemente robustas para continuar el protocolo de humanizacion. Se realizaron experimentos adicionales para confirmar la observacion inicial.

Los valores de DO 450 nm son los siguientes:

La quimera de MAb 583, BAP070-01, se unio claramente a hepcidina-25 a un grado mayor de lo que lo hada el MAb 583 murino purificado diluido en serie en este experimento, lo que confirma que la especificidad y funcionalidad de los anticuerpos quimericos son comparables con el MAb 583 murino precursor (figura 29).

Este ensayo de union inicial fue una evaluacion semicuantitativa de la quimera BAP070-01 ya que la comparacion implica un sobrenadante de cultivo celular de un MAb 583 quimerico humano-de raton con un MAb 583 murino purificado. La cuantificacion de la concentracion de anticuerpo quimerico en sobrenadantes de cultivo celular se realizo usando un metodo inmunologico patentado y el MAb 583 purificado usando BCA. El ensayo diferente puede dar lugar potencialmente a comparacion de cantidades desiguales de anticuerpo y, por tanto, la senal en una comparacion de ELISA. A pesar de estas salvedades, tanto el MAb 583 como la quimera BAP070-01 muestran una senal creciente con anticuerpo creciente como se predice para esta comparacion.

Titulacion de la quimera 583 por placa recubierta con hepcidina-25.

Para comparer la actividad de union de BAP070-01 y el vector vado, se determino BAP070 por ELISA. En resumen, la hepcidina-25 humana (100 ng/pocillo) se unio covalentemente a placas de micropocillos activadas con anddrido maleico durante una noche y los sitios activados no unidos restantes se bloquearon segun las instrucciones del fabricante. Se anadieron sobrenadantes de cultivo diluidos en serie que conternan la quimera del MAb 583, BAP070-01, o para el vector vado, BAP070, a la placa de micropocillos y se incubo a temperature ambiente (TA) durante 2 horas. El anticuerpo MAb 583 quimerico unido se detecto usando anticuerpo anti-IgG humana-HRP con TMB como sustrato. Los resultados se muestran en la figura 30.

Los datos indican claramente que el MAb quimerico humano-de raton BAP070-01 reconoce espedficamente hepcidina-25 humana con excelente afinidad, mientras que no hay union a hepcidina-25 por sobrenadante de CHO de BAP070 en este ensayo (figura 30). Los datos mostrados en las figuras 29 y 30 demuestran una comparacion muy positiva del MAb 583 purificado y el MAb 583 quimerico BAP070-01 y la union espedfica a hepcidina-25 de la quimera BAP070-01. Los resultados de ELISA esperados que comparan los sobrenadantes de la quimera BAP070-01 con el vector vado BAP070 de control negativo se demostraron usando placas recubiertas con hepcidina-25 para capturar anticuerpos IgG humanos funcionales y anticuerpos anti-IgG (H+L) humana para la deteccion (figura 30). C-ELISA recubierta con protena G para la quimera 583 BAP070-01

Para evaluar la union de la quimera BAP070-01 a protema G y el grado de neutralizacion del MAb 583 BAP070-01 por hepcidina-25 sintetica se realizo un ensayo de C-ELISA usando NT-biotina-hepcidina-25 como radiomarcador (figura 31). Este formato de C-ELISA tambien fue util para ensayar la union del radiomarcador NT-biotina-hepcidina-25 a la quimera BAP070-01 y competir con hepcidina-25 por la union al MAb 583 quimerico. Para capturar anticuerpos quimericos BAP070-01, se recubrieron placas de micropocillos con protema G (150 ng/pocillo) durante una noche en tampon de recubrimiento de carbonato.

La placa se lavo con TBST y se anadio sobrenadante de celulas CHO que conterna la quimera de MAb 583 BAP070-01 (150 ng/pocillo) y se permitio que se uniera a la protema G a TA durante 1 hora.

La placa se lavo con TBST y un (1) ng/pocillo de NT-biotina-hepcidina-25 se mezclo con diferentes cantidades (0 100 ng) del patron de hepcidina-25 sintetica en TBST, BLOTTO al 0,25% y se anadio a la placa para la union competitiva. La placa se lavo con TBST y se anadio SA-HRP (1:2500) y se permitio que se uniera durante 1 hora. La placa se lavo con TBST y se anadio sustrato TBS y la reaccion se detuvo despues de 10 minutos con disolucion de parada. Se midio la absorbancia a 450 nm en un espectrofotometro.

La absorbancia (DO450) para C-ELISA de BAP070-01 se muestra en la tabla a continuacion.

Los resultados de la tabla anterior y en la figura 31 demuestran que hepcidina-25 sintetica compite por los sitios de union de la quimera BAP070-10 de forma competitiva y que los anticuerpos MAb 583 quimericos son espedficos para hepcidina-25 y NT-biotina-hepcidina-25. La curva patron mostrada en la figura 3l se genero usando una regresion logfstica de cuatro parametros (Graphpad Prism; San Diego, CA). Se uso Prism para calcular la CE50 para la union de hepcidina-25 a BAP070-01 y se determino la CE50 = 54 ng/ml (figura 31). Esta CE50 es excelente considerando que se obtiene de un sobrenadante en bruto y no de un MAb 583 purificado donde la CE50 es <5,0 ng/ml (figura 16).

C-ELISA de neutravidina para la quimera 583 BAP070-01

Se realizo otra evaluacion del MAb 583 quimerico BAP070-01 por recubrimiento de placas de micropocillos con neutravidina (150 ng/pocillo) durante una noche en tampon de recubrimiento de carbonato. La placa se lavo con TBST. Se anadio el radiomarcador NT-biotina-hepcidina-25 a 1 ng/pocillo con diferentes concentraciones de hepcidina-25 (0-100 ng/pocillo) y se permitio que se uniera a TA durante 1 hora. Se uso anticuerpo anti-IgG (H+L) humana-HRP para detectar la quimera de MAb 583 BAP070-01 unida en este analisis de C-ELISA.

La tabla a continuacion muestra tanto los valores duplicados como medios de DO450 respecto a las concentraciones de hepcidina-25. Los resultados muestran que la hepcidina-25 humana neutraliza claramente los sitios de union en la quimera BAP070-01 y que el radiomarcador NT-biotina-hepcidina-25 (analogo de hepcidina) se une de forma eficaz.

La figura 32 proporciona datos graficos que ilustran los resultados presentados en la tabla anterior para la union competitiva de la quimera BAP070-01 a NT-biotina-hepcidina-25. Como se espera en cualquier ensayo competitivo, se observa una senal menor con concentracion creciente de antfgeno no marcado (por ejemplo, hepcidina-25). La figura 32 muestra los dos valores de DO450 duplicados y el valor de DO450 medio para cada concentracion creciente de hepcidina-25.

Acumulativamente, los datos que se presentan en el ejemplo 10 demuestran que el MAb 583 quimerico BAP070-01 retiene las caractensticas de alta afinidad y especificidad del anticuerpo MAb 583 murino precursor y que la humanizacion completa del anticuerpo MAb 583 murino nativo producira un anticuerpo terapeutico candidato adecuado para ensayo preclmico y clmico en seres humanos.

Aunque se han demostrado y descrito en la presente memoria determinadas realizaciones de las realizaciones, sera obvio para los expertos en la materia que dichas realizaciones se describen a modo de ejemplo unicamente. A los expertos en la materia se les ocurriran numerosas variaciones, cambios y sustituciones sin alejarse de las realizaciones. Debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas a las realizaciones de las realizaciones descritas en la presente memoria en la practica de las realizaciones. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de las reivindicaciones y que los metodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes esten cubiertos por las mismas.

Secuencias

Alineaciones de nucleotidos de las regiones CDR-1, CDR-2 y CDR-3 de las cadenas pesada y ligera variables de los MAb contra hepcidina H32, 583 y 1B1. Las CDR estan subrayadas. Las regiones flanqueantes no estan subrayadas. Cadena pesada variable

CDR-1

SEQ ID NO: 1 H32 GGTTCTGGCTACACATTCACTGATTATGCTATGCAC

SEQ ID NO: 2583 GCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAAC

SEQ ID NO: 31B1 GTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAAC

CDR-2

SEQ ID NO: 4 H32 GGAGTTATTAGTTCTTACTATGGTGATGCTAGCTAC

SEQ ID NO: 5583 GGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATAT

SEQ ID NO: 61B1 GGCTACATAAGCTACAGTAGTATCACTAACTAC

CDR-3

SEQ ID NO: 7 H32 TACTGTGCAAGATATAGGGGGCTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGC

SEQ ID NO: 8583 TTCTGTACAACGTACGCTACTAGCTGGTACTGGGGC

SEQ ID NO: 91B1 TACTGTGCTGGTCTTTACTATGTTATGGACCACTGGGGT

Cadena ligera variable

CDR-1

SEQ ID NO: 10 H32 TCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTAT

SEQ ID NO: 11583 GCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCAC

SEQ ID NO: 121B1 GCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTAC

CDR-2

SEQ ID NO: 13 H32 GTATATCGGATGTCCAACCTT

SEQ ID NO: 14583 ATCTATCGTGCATCCAACCTA

SEQ ID NO: 151B1 ATTTATCTCACATCCAACCTG

CDR-3

SEQ ID NO: 16 H32 TATTGTATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACGTTCGGT

SEQ ID NO: 17583 TACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCTGACGTTCGGT

SEQ ID NO: 181B1 TACTGCCAGCAGTGGAGTAGTGACCCTTTCACGTTCGGC

Peptido de hepcidina humana (hepcidina-25, hep-25, Hep-25, hHepcidina-25): SEQ ID NO: 19 (25aa) DTHFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT

Peptido de hepcidina-1 de raton (mhepcidina-1, mhep-1 , mHep-1, mHepcidina-1): SEQ ID NO: 20: (25aa) DTNFPICIFCCKCCNNSQCGICCKT

Peptido de hepcidina de rata (rhepcidina, rhep, rHep, rHepcidina): SEQ ID NO: 21: (25aa) DTNFPICLFCCKCCKNSSCGLCCIT

Peptido de hepcidina-20 humana (hepcidina-20, hep-20, Hep-25, hHepcidina-20): SEQ ID NO: 22: (20aa) ICIFCCGCCHRSKCGMCCKT

Peptido de hepcidina 22 humana (hepcidina-22 , hep-22, Hep-22, hHepcidina-22): SEQ ID NO: 23: (23aa) HFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT

Peptido de hepcidina-9 humana (hepcidina-9, hep-9, Hep-9, hHepcidina-9): SEQ ID NO: 24 (9aa) DTHFPICIF Peptido de hepcidina-5 humana (hepcidina-5, hep-5, Hep-5, hHepcidina-5): SEQ ID NO: 25 (5aa) DTHFP Peptido de hepcidina 10-25 humana (hepcidina 10-25, hep 10-25, Hep 10-25, hHepcidina 10-25): SEQ ID NO: 26 (16aa) CCGCCHRSKCGMCCKT

Peptido de DNP-hepcidina-9 humana-KLH (DNP-hepcidina-9-KLH, DNP-hep-9-KLH, DNP-Hep-9-KLH, DNP-hHepcidina-9-KLH): SEQ ID NO: 27 DNP-DTHFPIC(KLH-SMCC)-IF

Region variable de cadena pesada de IgG1 [Homo sapiens] GenBank: AAK62671.1

LLESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSMINYYWSWIRQPPGERPQWL

GHIIYGGTTKYNPSLESRITISRDISKSQFSLRLNSVTAADTAIYYCARVAIGVSGFLNYY YYMDVWGSGTAVTVSS (SEQ ID NO: 29)

Region variable de cadena pesada de IgG1 [Homo sapiens] GenBank: AAK19936.1

QVQLQQWGAGLLKPSETLSRTCAVYGGSFSDDYWSWIRQPPGKG

LEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVT1SVDTSEKQFSLICLSSVTAADTAVYYCARRNDWYP FDYWDEGILVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW (SEQ

ID NO: 30)

IgG1 [Mus musculus] GenBank: BAA23565.1

QVQLQQSGAELMKPGASVNISCKASGYIFSSYWIEWVKQRPGHGL

EW1GEILPGSGN1KYNEKFKGKAIFTVETSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAKTDYYASG YGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 31)

Region variable de cadena ligera kappa de inmunoglobulina [Mus musculus] GenBank: ABE03823.1

DIVMTQSPASLDVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMNWYQQKPG

QPPKLLIYLASSLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREPPPTFGGGT KLEIK.RAD(SEQIDNO:32)

Region variable de cadena ligera kappa de inmunoglobulina [Mus musculus] GenBank: ABE03821.1

DVVMTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLANNGRTYLNWLLQRPG

QSPKRL1YLVSTLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPLTFGA

GTKLELKRAD (SEQ ID NO: 33)

Region variable de cadena ligera de inmunoglobulina IgG1 [Homo sapiens] GenBank: AAK62672.1

LTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGRNLGWYQQKPGQAPRLLI

YDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSDWPRTFGQGTKVEIKR

(SEQ ID NO: 34)

VK de raton

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKP

WIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE LK (SEQ ID NO: 35)

VH de raton

EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEK

GLEWVAEIRSKASNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTRW RRFFDSWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 36)

Secuencias de acido nucleico y aminoacidos de cadena pesada y ligera variable de los MAb contra hepcidina H32, 583 and 1B1.

VH de H32

GGTT CTGGCTACAC ATTC ACT GATT ATGCT AT GC ACGGAGTTAT

TAGTTCTTACTATGGTGATGCTAGCTACTACTGTGCAAGATATAGGGGGCTCTGGTA CTTCGATGTCTGGGGC (SEQ ID NO: 41)

VH de H32

Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met FTis Gly Val Tie Ser Ser

Tyr Tyr Gly Asp Ala Ser Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Arg Gly Leu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

(SEQ ID NO: 42)

VH de 583

GCTTCT GGGT ATACCTTC AC AAACT AT GGAAT GAACGGCT GGA

TAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATTTCTGTACAACGTACGCTACTAGCTGGT ACTGGGGC (SEQ ID NO: 43)

VH de 583

Ala Scr Gly Tyr Thr Phc Thr Asn Tyr Gly Met Asn Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Phc Cys Thr Thr Tyr Ala Thr Scr Trp Tyr Trp Gly (SEQ ID NO:

44)

VH de 1B1

GTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAACGGCT

ACATAAGCTACAGT AGT ATC ACTA ACT ACTACT GTGCT GGTCTTTACTAT GTTAT GG ACCACTGGGGT (SEQ ID NO: 45)

VH de1B1

Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Gly Tyr Tie Ser Tyr Scr Scr lie Thr Asn Tyr Tyr Cys Ala Gly Leu Tyr Tyr Val Met Asp His Tip Gly (SEQ ID NO:

46)

VL de H32

TCTAGT AAGAGTCTCCT GCATAGT AATGGC AACACTT ACTT GTA

TGTATATCGGATGTCCAACCTTTATTGTATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACGTTC GGT (SEQ ID NO: 47)

VL de H32

Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Val Tyr Arg Met Ser Asn Leu Tyr Cys Met Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly (SEQ ID NO: 48)

VL de 583

GCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACA

TCTATCGTGCATCCAACCTATACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCTGACGTTCGGT

(SEQ ID NO: 49)

VL de 583

Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His lie Tyr Arg

Ala Ser Asn Leu Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Leu Thr Phe Gly (SEQ ID NO: 50)

VLde1B1

GCCAGCTC AAGTGT AAGTTACAT GTACATTTAT CT CAC ATCC A A

CCTGTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTGACCCTTTCACGTTCGGC (SEQ ID NO: 51)

VL de1B1

Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr He Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Tyr

Cys Gin Gin Trp Ser Ser Asp Pro Phe Thr Phe Gly (SEQ ID NO: 52)

Secuencias polinucleottdicas de CDR-1, CDR-2 y CDR-3 de las cadenas pesada y ligera variables de los MAb contra hepcidina H32, 583 y 1B1.

Cadena pesada variable

CDR-1

SEQ ID NO: 55 H32 GGCTACACATTCACTGATTATGCT

SEQ ID NO: 56583 GGGTATACCTTCACAAACTATGGA

SEQ ID NO: 571B1 GGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCC

CDR-2

SEQ ID NO: 58 H32 ATTAGTTCTTACTATGGTGATGCT

SEQ ID NO: 59583 ATAAACACCTACACTGGAGAGCCA

SEQ ID NO: 601B1 ATAAGCTACAGTAGTATCACT

CDR-3

SEQ ID NO: 61 H32 GCAAGATATAGGGGGCTCTGGTACTTCGATGTC

SEQ ID NO: 62583 ACAACGTACGCTACTAGCTGGTAC

SEQ ID NO: 631B1 GCTGGTCTTTACTATGTTATGGACCAC

Cadena ligera variable

CDR-1

SEQ ID NO: 64 H32 AAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTAC

SEQ ID NO: 65583 GAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTT

SEQ ID NO: 661B1 TCAAGTGTAAGTTAC

CDR-2

SEQ ID NO: 67 H32 CGGATGTCC

SEQ ID NO: 68583 CGTGCATCC

SEQ ID NO: 691B1 CTCACATCC

CDR-3

SEQ ID NO: 70 H32 ATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACG

SEQ ID NO: 71583 CAGCAAAGTAATGAGGATCTGACG

SEQ ID NO: 721B1 CAGCAGTGGAGTAGTGACCCTTTCACG

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, que se une espedficamente a hepcidina (Hep) o un peptido de hepcidina con una constante de disociacion de menos de 500 pM, comprendiendo dicho anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO: 44, y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO: 50.

2. Un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, que se une espedficamente a hepcidina (Hep) o un peptido de hepcidina con una constante de disociacion de menos de 500 pM, comprendiendo dicho anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO: 46, y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO: 52.

3. Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, de la reivindicacion 1 o 2.

4. Un vector de expresion que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 3, unida de forma funcional a una secuencia de control reguladora.

5. Una celula hospedante que comprende el vector de la reivindicacion 4 o una molecula de acido nucleico de la reivindicacion 3.

6. Un metodo de uso de la celula hospedante de la reivindicacion 5 para producir un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que comprende cultivar la celula hospedante en condiciones adecuadas de modo que el acido nucleico se exprese para producir el anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo.

7. Una composicion que comprende un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno, de la reivindicacion 1 o 2, y un vedculo o excipiente aceptable.

8. Un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno, de la reivindicacion 1 o 2, o una composicion de la reivindicacion 7, para su uso como medicamento; o para su uso en un metodo para tratar: un trastorno de la homeostasis de hierro; hemocromatosis; anemia por deficiencia de hierro resistente al hierro (IRIDA); anemia por inflamacion; una enfermedad inflamatoria; enfermedad de Alzheimer; una enfermedad renal cronica; enfermedad de Parkinson; talasemia intermedia; una infeccion bacteriana; una infeccion fungica; una infeccion vmca; anemia; o alfa talasemia.

9. El anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno, o la composicion para el uso de acuerdo con la reivindicacion 8, que comprende ademas administrar un estimulador de la eritrocitopoyesis, en el que dicho estimulador de la eritrocitopoyesis se selecciona del grupo que consiste en eritropoyetina, inhibidor del factor inducible por hipoxia prolil hidroxilasa, un agente estimulador de la eritrocitopoyesis y eritroferrona.

10. El anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, o una composicion de la reivindicacion 7, para los usos definidos en la reivindicacion 8 o 9, en el que dicho anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno, o composicion se administra por inyeccion intravenosa, inyeccion subcutanea, inyeccion intramuscular o por inyeccion medular en un lfquido cefalorraqrndeo.