JP2019536794A - 凝固因子に対する免疫寛容を誘導する方法 - Google Patents

凝固因子に対する免疫寛容を誘導する方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質の有効量をヒトに投与する工程を含む、ヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その各々の全体を参照によって本明細書に組み入れる、２０１６年１２月２日に提出された米国特許仮出願第６２／４２９，５１６号、２０１７年３月３日に提出された同第６２／４６６，９３７号、２０１７年７月７日に提出された同第６２／５２９，８６６号、２０１７年９月１４日に提出された同第６２／５５８，７９０号、および２０１７年１１月７日に提出された同第６２／５８２，８２９号の恩典を主張する。
本開示は、全般的に止血障害の治療薬の分野に関する。
血友病は、凝固タンパク質をコードする遺伝子、特にＦＶＩＩＩ活性の欠乏を引き起こす（血友病Ａ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子の変異および／もしくは欠失、またはＦＩＸ活性の欠乏を引き起こす（血友病Ｂ）第ＩＸ因子遺伝子の変異および／もしくは欠失によって引き起こされるＸ連鎖出血障害である（例えば、非特許文献１を参照されたい）。疾患は、特発性出血および外傷後の過剰な出血を特徴とする。血友病の処置は、特発性出血を予防するためにＦＶＩＩＩおよび／またはＦＩＸ活性の回復を標的とする代替治療による（例えば、非特許文献２を参照されたい）。
凝固因子補充療法は、血友病の主要な処置である。しかし、重度の血友病Ａを有する患者のほぼ３０％を含むかなりの割合の血友病患者が、凝固因子産物に対するインヒビターを発生させることから、これらの患者におけるその効能は大きく低減する。免疫応答は、輸注された凝固因子、例えばＦＶＩＩＩ補充療法に向けられるＴ細胞依存性またはＢ細胞媒介性免疫応答である。
重度の血友病を有する人は、インヒビターを発生させる可能性がより高いが、軽度または中等度の血友病Ａを有する人のおよそ５〜８％がインヒビターを発生させる。凝固因子インヒビターの発生は、抗体が、輸注された凝固因子濃縮物のみならず、体が天然に産生しているいかなる少量の凝固因子タンパク質も阻害し得ることから、致命的であり得る。したがって、現にインヒビターを発生させている軽度または中等度の血友病を有する人は、実際には重度の血友病を有する（＜１％循環因子）。
血友病Ｂを有する人のおよそ２〜３％がインヒビターを発生させる。血友病Ｂを有する人におけるインヒビターは、血友病Ａより一般的ではないが、血友病Ｂインヒビターを有する患者の約半数が、輸注した第ＩＸ因子に対して生命を脅かし得るアナフィラキシー反応を発生させることからさらにより難題であり得る。
したがって、１つまたは複数の凝固因子に対して既に免疫応答を発生させた人、および過去の免疫寛容療法に反応しなかった人において、免疫寛容を誘導する方法がなおも必要である。
Ｐｅｙｖａｎｄｉ，Ｆ．ら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １２：８２〜８９頁（２００６年） Ｍａｎｎｕｃｃｉ，Ｐ．Ｍ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１７７３〜１７７９頁（２００１年）
本開示は、血友病を有する人において免疫寛容を誘導する方法であって、凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質、または凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物の有効量をヒトに投与する工程を含み、ヒトが、凝固因子に対するインヒビターを発生させており、凝固因子に対する１つまたは複数の過去の免疫寛容療法に反応することができない、方法を提供する。一部の態様では、方法は、投与前の阻害性免疫応答レベルを測定する工程、および投与後の阻害性免疫応答レベルを測定する工程をさらに含む。一部の態様では、方法は、投与前の阻害性免疫応答レベルを、投与後の阻害性免疫応答レベルと比較する工程をさらに含む。
本発明は、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、（１）凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質、または凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物の有効量をヒトに投与する工程であって、キメラタンパク質の有効量がヒトにおいて免疫寛容を誘導する工程と、（２）免疫寛容の誘導後、キメラタンパク質の漸減レジメンをヒトに投与する工程とを含む方法をさらに提供する。ある特定の態様では、免疫寛容の誘導は、ヒトにおける阻害性抗体の力価が約０．６ＢＵ未満である場合に起こる。ある特定の態様では、方法は、（３）漸減レジメン後に、凝固因子の予防用量をヒトに投与する工程をさらに含む。ある特定の態様では、ヒトは、過去に凝固因子に対する免疫寛容療法によって処置されていない。
一部の態様では、ヒトは、凝固因子に対する阻害性免疫応答を発生させている。一部の実施形態では、阻害性免疫応答は、凝固因子に対する阻害性抗体の産生を含む。一部の実施形態では、投与前の阻害性抗体の力価は、少なくとも約０．６ベセスダ単位（ＢＵ）である。一部の実施形態では、投与後の阻害性抗体の力価は、約０．６ＢＵ未満である。
一部の態様では、免疫応答は細胞性免疫応答を含む。一部の実施形態では、細胞性免疫応答は、サイトカインの放出を含む。一部の実施形態では、投与により、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドによる過去の処置後のヒトにおけるレベルと比較して、ヒトにおけるサイトカインレベルが低減する。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、およびその任意の組合せからなる群から選択される。
ある特定の態様では、１つまたは複数の寛容原性分子の発現は、投与前の１つまたは複数の寛容原性分子の発現レベルと比較して、投与後に増加している。一部の実施形態では、１つまたは複数の寛容原性分子は、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＩＬ−３５、ＩＤＯ−１、およびその任意の組合せから選択される。他の実施形態では、免疫応答は、出血傾向の増加、高い凝固因子消費、凝固因子療法に対する反応の欠如、凝固因子療法の効能の減少、および凝固因子の半減期の短縮からなる群から選択される臨床症状を含む。
一部の実施形態では、ヒトは、投与の少なくとも約１カ月前、少なくとも約２カ月前、少なくとも約３カ月前、少なくとも約６カ月前、少なくとも約１２カ月前、少なくとも約１８カ月前、少なくとも約２４カ月前、少なくとも約３０カ月前、少なくとも約３６カ月前、少なくとも約４２カ月前、少なくとも約４８カ月前、少なくとも約５４カ月前、少なくとも約６０カ月前、少なくとも約６年前、少なくとも約７年前、少なくとも約８年前、または少なくとも約１０年前に、凝固因子に対する阻害性免疫応答を発生させていると過去に診断された。一部の実施形態では、寛容が起こるまでの期間は、約１〜約２４週間、約１〜約２３週間、約１〜約２２週間、約１〜約２１週間、約２〜約２０週間、約２〜約１９週間、約２〜約１８週間、約２〜約１７週間、約３〜約１６週間、約３〜約１５週間、約３〜約１４週間、約３〜約１３週間、約４〜約１２週間、約４〜約１１週間、約４〜約１０週間、約４〜約９週間、約５〜約８週間、約５〜約７週間、約５〜約６週間、約１〜約１２週間、約１〜約１１週間、約１〜約１０週間、約１〜約９週間、約１〜約８週間、約１〜約７週間、約１〜約６週間、約１〜約５週間、または約１〜約４週間である。
一部の態様では、凝固因子は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含む。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩ部分とＶＷＦ部分とを含み、ＦＶＩＩＩ部分はＦＶＩＩＩポリペプチドまたはその断片を含み、ＶＷＦ部分はＶＷＦポリペプチドまたはその断片を含み、ＦＶＩＩＩ部分は第１のＦｃ領域に連結され、ＶＷＦ部分は第２のＦｃ領域に連結され、および第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域は互いに会合している。
一部の態様では、キメラタンパク質は、半減期延長部分をさらに含む。ある特定の実施形態では、半減期延長部分は、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、その誘導体、またはその任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩとＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効量は、約２０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含むキメラタンパク質は、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、または約２４日間の投与間隔で投与される。
ある特定の態様では、ヒトは、ＦＶＩＩＩ阻害性免疫応答を過去に発生させた。一部の実施形態では、ヒトは、出血性凝固障害、血友病性関節症、筋肉出血、口腔内出血、出血、筋肉への出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹部内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙の出血、腹膜後腔の出血、および腸腰筋膜の出血からなる群から選択される出血状態を有する。
実施形態
Ｅ１．血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効量をヒトに投与する工程を含み、ヒトが、凝固因子に対するインヒビターを発生させており、凝固因子に対する１つまたは複数の過去の免疫寛容療法に反応していない方法。
Ｅ２．投与前の阻害性免疫応答レベルを測定する工程と、投与後の阻害性免疫応答レベルを測定する工程とをさらに含む、Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３．投与前の阻害性免疫応答レベルを、投与後の阻害性免疫応答レベルと比較する工程をさらに含む、Ｅ２に記載の方法。
Ｅ４．ヒトが、凝固因子に対する阻害性免疫応答を発生させている、Ｅ１〜Ｅ３のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ５．阻害性免疫応答が、凝固因子に対する阻害性抗体の産生を含む、Ｅ４に記載の方法。
Ｅ６．投与前の阻害性抗体の力価が、少なくとも約０．６ベセスダ単位（ＢＵ）である、Ｅ５に記載の方法。
Ｅ７．投与前の阻害性抗体の力価が、少なくとも約１ＢＵ、少なくとも約２ＢＵ、少なくとも約３ＢＵ、少なくとも約４ＢＵ、少なくとも約５ＢＵ、少なくとも約６ＢＵ、少なくとも約７ＢＵ、少なくとも約１０ＢＵ、少なくとも約２０ＢＵ、少なくとも約３０ＢＵ、少なくとも約４０ＢＵ、少なくとも約５０ＢＵ、少なくとも約１００ＢＵ、少なくとも約１５０ＢＵ、または少なくとも約２００ＢＵである、Ｅ５またはＥ６に記載の方法。
Ｅ８．投与前の阻害性抗体の力価が、少なくとも約５ＢＵである、Ｅ５〜Ｅ７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ９．投与後の阻害抗体の力価が、約０．６ＢＵ未満である、Ｅ５〜Ｅ８のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１０．投与後の阻害性抗体の力価が、０ＢＵである、Ｅ５〜Ｅ９のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１１．免疫応答が、細胞性免疫応答を含む、Ｅ１〜Ｅ１０のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１２．細胞性免疫応答が、サイトカインの放出を含む、Ｅ１１に記載の方法。
Ｅ１３．投与により、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドによる過去の処置後のヒトにおけるレベルと比較して、ヒトにおけるサイトカインレベルが低減する、Ｅ１２に記載の方法。
Ｅ１４．サイトカインが、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、およびその任意の組合せからなる群から選択される、Ｅ１２またはＥ１３に記載の方法。
Ｅ１５．１つまたは複数の寛容原性分子の発現が、投与前の１つまたは複数の寛容原性分子の発現レベルと比較して、投与後に増加している、Ｅ１〜Ｅ１４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１６．１つまたは複数の寛容原性分子が、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＩＬ−３５、ＩＤＯ−１、およびその任意の組合せから選択される、Ｅ１５に記載の方法。
Ｅ１７．免疫応答が、出血傾向の増加、高い凝固因子消費、凝固因子療法に対する反応の欠如、凝固因子療法の効能の減少、および凝固因子の半減期の短縮からなる群から選択される臨床症状を含む、Ｅ１〜Ｅ１４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１８．ヒトが、投与の少なくとも約３カ月前、少なくとも約６カ月前、少なくとも約１２カ月前、少なくとも約１８カ月前、少なくとも約２４カ月前、少なくとも約３０カ月前、少なくとも約３６カ月前、少なくとも約４２カ月前、少なくとも約４８カ月前、少なくとも約５４カ月前、少なくとも約６０カ月前、少なくとも約６年前、少なくとも約７年前、少なくとも約８年前、または少なくとも約１０年前に、凝固因子に対する阻害性免疫応答を発生させていると過去に診断された、Ｅ１〜Ｅ１７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１９．ヒトが、投与の少なくとも約５年前に、凝固因子に対する阻害性免疫応答を発生させていると過去に診断された、Ｅ１〜Ｅ１８のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２０．寛容が起こるまでの期間が、約１〜約２４週間、約１〜約２３週間、約１〜約２２週間、約１〜約２１週間、約２〜約２０週間、約２〜約１９週間、約２〜約１８週間、約２〜約１７週間、約３〜約１６週間、約３〜約１５週間、約３〜約１４週間、約３〜約１３週間、約４〜約１２週間、約４〜約１１週間、約４〜約１０週間、約４〜約９週間、約５〜約８週間、約５〜約７週間、約５〜約６週間、約１〜約１２週間、約１〜約１１週間、約１〜約１０週間、約１〜約９週間、約１〜約８週間、約１〜約７週間、約１〜約６週間、約１〜約５週間、または約１〜約４週間である、Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２１．寛容が起こるまでの期間が、約２４週間未満、約２３週間未満、約２２週間未満、約２１週間未満、約２０週間未満、約１９週間未満、約１８週間未満、約１７週間未満、約１６週間未満、約１５週間未満、約１４週間未満、約１３週間未満、約１２週間未満、約１１週間未満、約１０週間未満、約９週間未満、約８週間未満、約７週間未満、約６週間未満、約５週間未満、約４週間未満、約３週間未満、約２週間未満、または約１週間未満である、Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２２．寛容が起こるまでの期間が、約４〜約１２週間である、Ｅ１〜Ｅ２１のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２３．寛容が起こるまでの期間が、約４週間である、Ｅ１〜Ｅ２２のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２４．ヒトがインターフェロン治療を受けている、Ｅ１〜Ｅ２３のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２５．ヒトが抗ウイルス療法を受けている、Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２６．ヒトがＴＮＦ−αの増加に関連する遺伝子多型を有する、Ｅ１〜Ｅ２５のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２７．多型がＴＮＦ−３０８Ｇ＞Ａである、Ｅ２６に記載の方法。
Ｅ２８．ヒトが、ＩＬ１０の増加に関連する遺伝子多型を有する、Ｅ１〜Ｅ２７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２９．多型が、ＩＬ１０Ｇマイクロサテライトのアレル１３４である、Ｅ２８に記載の方法。
Ｅ３０．ヒトが、凝固因子に対して１５０未満の曝露日数（ＥＤ）を有している、Ｅ１〜Ｅ２９のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ３１．ヒトが５０未満のＥＤを有する、Ｅ３０に記載の方法。
Ｅ３２．ヒトが２０未満のＥＤを有する、Ｅ３１に記載の方法。
Ｅ３３．凝固因子が第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である、Ｅ１〜Ｅ３２のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ３４．キメラタンパク質が、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含む、Ｅ１〜Ｅ３３のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ３５．キメラタンパク質がＦＶＩＩＩ部分とＶＷＦ部分とを含み、ＦＶＩＩＩ部分がＦＶＩＩＩポリペプチドまたはその断片を含み、ＶＷＦ部分がＶＷＦポリペプチドまたはその断片を含み、ＦＶＩＩＩ部分が第１のＦｃ領域に連結され、ＶＷＦ部分が第２のＦｃ領域に連結され、および第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域が互いに会合している、Ｅ１〜Ｅ３４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ３６．ＦＶＩＩＩポリペプチドが成熟ＦＶＩＩＩを含む、Ｅ３３〜Ｅ３５のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ３７．ＦＶＩＩＩポリペプチドがＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩを含む、Ｅ３３〜Ｅ３５のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ３８．Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩが、ＦＶＩＩＩのＢドメインの全てまたは一部の欠失を含む、Ｅ３７に記載の方法。
Ｅ３９．Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩが、成熟ＦＶＩＩＩのアミノ酸残基７４６〜１６４８の欠失を含む、Ｅ３７またはＥ３８に記載の方法。
Ｅ４０．ＶＷＦポリペプチドが、ＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片を含む、Ｅ３３〜Ｅ３９のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ４１．キメラタンパク質が半減期延長部分をさらに含む、Ｅ１〜Ｅ４０のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ４２．半減期延長部分が、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、その誘導体、またはその任意の組合せを含む、Ｅ４１に記載の方法。
Ｅ４３．半減期延長部分が、凝固因子内に挿入される、Ｅ４１またはＥ４２に記載の方法。
Ｅ４４．半減期延長部分が、凝固因子とＦｃ領域の間に挿入される、Ｅ４１またはＥ４２に記載の方法。
Ｅ４５．ＦＶＩＩＩとＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効量が、約２０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇである、Ｅ３３〜Ｅ４４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ４６．ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含むキメラタンパク質の有効量が、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２００ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２９０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２４０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２３０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２２０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２１０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２９０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２４０ＩＵ／ｋｇ、約１４０ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約１３０ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約１２０ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約１１０ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２９０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２４０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２３０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２２０ＩＵ／ｋｇ、または約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２１０ＩＵ／ｋｇである、Ｅ４５に記載の方法。
Ｅ４７．ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含むキメラタンパク質の有効量が、約１００ＩＵ／ｋｇ、約１０５ＩＵ／ｋｇ、約１１０ＩＵ／ｋｇ、約１１５ＩＵ／ｋｇ、約１２０ＩＵ／ｋｇ、約１２５ＩＵ／ｋｇ、約１３０ＩＵ／ｋｇ、約１３５ＩＵ／ｋｇ、約１４０ＩＵ／ｋｇ、約１４５ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ、約１５５ＩＵ／ｋｇ、約１６０ＩＵ／ｋｇ、約１６５ＩＵ／ｋｇ、約１７０ＩＵ／ｋｇ、約１７５ＩＵ／ｋｇ、約１８０ＩＵ／ｋｇ、約１８５ＩＵ／ｋｇ、約１９０ＩＵ／ｋｇ、約１９５ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ、約２２５ＩＵ／ｋｇ、約２５０ＩＵ／ｋｇ、約２７５ＩＵ／ｋｇ、または約３００ＩＵ／ｋｇである、Ｅ４５またはＥ４６に記載の方法。
Ｅ４８．ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含むキメラタンパク質が、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、または約２４日間の投与間隔で投与される、Ｅ３３〜Ｅ４７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ４９．ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含むキメラタンパク質が、約１〜約１４日間、約１〜約１３日間、約１〜約１２日間、約１〜約１１日間、約１〜約１０日間、約１〜約９日間、約１〜約８日間、約１〜約７日間、約１〜約６日間、約１〜約５日間、約１〜約４日間、約１〜約３日間、約１〜約２日間、約２〜約１４日間、約３〜約１４日間、約４〜約１４日間、約５〜約１４日間、約６〜約１４日間、約７〜約１４日間、約８〜約１４日間、約９〜約１４日間、約１０〜約１４日間、約１１〜約１４日間、約１２〜約１４日間、約１３〜約１４日間、または約５〜約１０日間の投与間隔で投与される、Ｅ３３〜Ｅ４７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ５０．ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含むキメラタンパク質が、約３日間〜約５日間の投与間隔で投与される、Ｅ３３〜Ｅ４９のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ５１．キメラタンパク質が、ＦＶＩＩＩ部分、ＶＷＦ部分、第１のＦｃ領域、および第２のＦｃ領域を含み、ＦＶＩＩＩ部分がＦＶＩＩＩポリペプチドまたはその断片を含み、ＶＷＦ部分がＶＷＦポリペプチドまたはその断片を含み、ＦＶＩＩＩ部分が第１のＦｃ領域に連結され、ＶＷＦ部分が第２のＦｃ領域に連結され、および第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域が互いに会合している、Ｅ１〜Ｅ３３のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ５２．ヒトがＦＶＩＩＩ阻害性免疫応答を過去に発生させた、Ｅ１〜Ｅ５１のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ５３．阻害性ＦＶＩＩＩ免疫応答が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥＦＳ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥＦＳ（登録商標）、ＸＹＮＴＨＡ／ＲＥＦＡＣＴＯＡＢ（登録商標）、ＨＥＭＯＦＩＬ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＡＲＣ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＯＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＡＴＥ−ＤＶＩ（登録商標）、ＡＦＳＴＹＬＡ（登録商標）、およびＨＹＡＴＥ：Ｃ（登録商標）からなる群から選択されるＦＶＩＩＩ産物に反応して発生した、Ｅ５２に記載の方法。
Ｅ５４．阻害性ＦＶＩＩＩ免疫応答が、組換えＦＶＩＩＩ産物に反応して発生する、Ｅ５２に記載の方法。
Ｅ５５．ヒトが、出血性凝固障害、血友病性関節症、筋肉出血、口腔内出血、出血、筋肉への出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹部内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙の出血、腹膜後腔の出血、および腸腰筋膜の出血からなる群から選択される出血状態を有する、Ｅ１〜Ｅ５４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ５６．出血性凝固障害が、血友病Ａである、Ｅ５５に記載の方法。
Ｅ５７．ＦＶＩＩＩとＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効量が、約５０ＩＵ／ｋ〜約３００ＩＵ／ｋｇである、Ｅ３３〜Ｅ５６のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ５８．ＦＶＩＩＩとＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効量が、約５０ＩＵ／ｋｇ、約６０ＩＵ／ｋｇ、約７０ＩＵ／ｋｇ、約８０ＩＵ／ｋｇ、約９０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ、約１１０ＩＵ／ｋｇ、約１２０ＩＵ／ｋｇ、約１３０ＩＵ／ｋｇ、約１４０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ、約１６０ＩＵ／ｋｇ、約１７０ＩＵ／ｋｇ、約１８０ＩＵ／ｋｇ、約１９０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ、約２２５ＩＵ／ｋｇ、約２５０ＩＵ／ｋｇ、約２７５ＩＵ／ｋｇ、または約３００ＩＵ／ｋｇである、Ｅ５７に記載の方法。
Ｅ５９．キメラタンパク質の有効量が約２００ＩＵ／ｋｇであり、毎日投与される、Ｅ５７またはＥ５８に記載の方法。
Ｅ６０．キメラタンパク質の有効量が約５０ＩＵ／ｋｇであり、１週間に約３回投与される、Ｅ５７またはＥ５８に記載の方法。
Ｅ６１．キメラタンパク質の有効量が１日を通して２回またはそれより多い用量で投与される、Ｅ５７〜Ｅ６０のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ６２．キメラタンパク質が、免疫寛容が観察されるまで投与され、ヒトにおける阻害性抗体の力価が約０．６ＢＵ未満である場合に免疫寛容が観察される、Ｅ５７〜Ｅ６１のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ６３．免疫寛容後、ＦＶＩＩＩとＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の漸減レジメンをヒトに投与する、Ｅ６２に記載の方法。
Ｅ６４．漸減レジメンが、ＦＶＩＩＩとＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇ〜約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を投与する工程を含む、Ｅ６３に記載の方法。
Ｅ６５．漸減用量が、１日１回または２日毎に１回投与される、Ｅ６３またはＥ６４に記載の方法。
Ｅ６６．漸減用量が、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１３週間、少なくとも約１４週間、少なくとも約１５週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約１７週間、少なくとも約１８週間、少なくとも約１９週間、少なくとも約２０週間、少なくとも約２１週間、少なくとも約２２週間、少なくとも約２３週間、少なくとも約２４週間、少なくとも約２５週間、少なくとも約２６週間、少なくとも約２７週間、少なくとも約２８週間、少なくとも約２９週間、少なくとも約３０週間、少なくとも約３１週間、または少なくとも約３２週間投与される。Ｅ６３〜Ｅ６５のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ６７．漸減レジメンが、キメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇまたは約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を投与する工程を含む、Ｅ６３〜Ｅ６６のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ６８．漸減レジメンが、キメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇの漸減用量を、免疫寛容後１週目から６週目まで１日１回投与する工程を含む、Ｅ６３〜Ｅ６７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ６９．漸減レジメンが、キメラタンパク質の約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を、免疫寛容後１週目から６週目まで１日１回投与する工程を含む、Ｅ６３〜Ｅ６７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ７０．漸減レジメンが、キメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇまたは約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を、免疫寛容後６週目から１２週目まで２日毎に１回投与する工程をさらに含む、Ｅ６８またはＥ６９に記載の方法。
Ｅ７１．漸減レジメンが、キメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇまたは約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を、１２週目から１６週目まで２日毎に１回投与する工程をさらに含む、Ｅ７０に記載の方法。
Ｅ７２．漸減レジメン後に凝固因子の予防用量を投与する工程をさらに含む、Ｅ６６〜Ｅ７１のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ７３．予防用量が、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約１００ＩＵ／ｋｇを含む、Ｅ７２に記載の方法。
Ｅ７４．予防用量が、１週間に約１回、１週間に約２回、１週間に約３回、または約３〜５日毎に１回投与される、Ｅ７２またはＥ７３に記載の方法。
Ｅ７５．血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、
（１）凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効量をヒトに投与する工程であって、凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効量がヒトにおいて免疫寛容を誘導する工程と、
（２）免疫寛容の誘導後、キメラタンパク質の漸減レジメンをヒトに投与する工程とを含む方法。
Ｅ７６．免疫寛容の誘導が、ヒトにおける阻害性抗体の力価が約０．６ＢＵ未満である場合に起こる、Ｅ７５に記載の方法。
Ｅ７７．（３）漸減レジメン後に、凝固因子の予防用量をヒトに投与する工程をさらに含む、Ｅ７５またはＥ７７に記載の方法。
Ｅ７８．ヒトが、凝固因子に対する過去の免疫寛容療法によって処置されていない、Ｅ７５〜Ｅ７７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ７９．投与前の阻害性免疫応答レベルを測定する工程と、投与後の阻害性免疫応答レベルを測定する工程とをさらに含む、Ｅ７５〜Ｅ７８のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ８０．投与前の阻害性免疫応答レベルを、投与後の阻害性免疫応答レベルと比較する工程をさらに含む、Ｅ７９に記載の方法。
Ｅ８１．ヒトが、凝固因子に対する阻害性免疫応答を発生させている、Ｅ７５〜Ｅ８０のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ８２．阻害性免疫応答が、凝固因子に対する阻害性抗体の産生を含む、Ｅ８１に記載の方法。
Ｅ８３．投与前の阻害性抗体の力価が、少なくとも約０．６ベセスダ単位（ＢＵ）である、Ｅ８２に記載の方法。
Ｅ８４．投与前の阻害性抗体の力価が、少なくとも約１ＢＵ、少なくとも約２ＢＵ、少なくとも約３ＢＵ、少なくとも約４ＢＵ、少なくとも約５ＢＵ、少なくとも約６ＢＵ、少なくとも約７ＢＵ、少なくとも約１０ＢＵ、少なくとも約２０ＢＵ、少なくとも約３０ＢＵ、少なくとも約４０ＢＵ、少なくとも約５０ＢＵ、少なくとも約１００ＢＵ、少なくとも約１５０ＢＵ、または少なくとも約２００ＢＵである、Ｅ８２またはＥ８３に記載の方法。
Ｅ８５．投与前の阻害性抗体の力価が、少なくとも約５ＢＵである、Ｅ８２〜Ｅ８４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ８６．投与後の阻害抗体の力価が、約０．６ＢＵ未満である、Ｅ８２〜Ｅ８５のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ８７．投与後の阻害性抗体の力価が、０ＢＵである、Ｅ８２〜Ｅ８６のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ８８．免疫応答が、細胞性免疫応答を含む、Ｅ７９〜Ｅ８７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ８９．細胞性免疫応答が、サイトカインの放出を含む、Ｅ８８に記載の方法。
Ｅ９０．投与により、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドによる過去の処置後のヒトにおけるレベルと比較して、ヒトにおけるサイトカインレベルが低減する、Ｅ８８に記載の方法。
Ｅ９１．１つまたは複数の寛容原性分子の発現が、投与前の１つまたは複数の寛容原性分子の発現レベルと比較して、投与後に増加している、Ｅ７５〜Ｅ９０のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ９２．ヒトが、投与の少なくとも約３カ月前、少なくとも約６カ月前、少なくとも約１２カ月前、少なくとも約１８カ月前、少なくとも約２４カ月前、少なくとも約３０カ月前、少なくとも約３６カ月前、少なくとも約４２カ月前、少なくとも約４８カ月前、少なくとも約５４カ月前、少なくとも約６０カ月前、少なくとも約６年前、少なくとも約７年前、少なくとも約８年前、または少なくとも約１０年前に、凝固因子に対する阻害性免疫応答を発生させていると過去に診断された、Ｅ７５〜Ｅ９１のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ９３．ヒトが、投与の少なくとも約５年前に、凝固因子に対する阻害性免疫応答を発生させていると過去に診断された、Ｅ７５〜Ｅ９２のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ９４．寛容が起こるまでの期間が、約１〜約２４週間、約１〜約２３週間、約１〜約２２週間、約１〜約２１週間、約２〜約２０週間、約２〜約１９週間、約２〜約１８週間、約２〜約１７週間、約３〜約１６週間、約３〜約１５週間、約３〜約１４週間、約３〜約１３週間、約４〜約１２週間、約４〜約１１週間、約４〜約１０週間、約４〜約９週間、約５〜約８週間、約５〜約７週間、約５〜約６週間、約１〜約１２週間、約１〜約１１週間、約１〜約１０週間、約１〜約９週間、約１〜約８週間、約１〜約７週間、約１〜約６週間、約１〜約５週間、または約１〜約４週間である、Ｅ７５〜Ｅ９３のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ９５．寛容が起こるまでの期間が、約２４週間未満、約２３週間未満、約２２週間未満、約２１週間未満、約２０週間未満、約１９週間未満、約１８週間未満、約１７週間未満、約１６週間未満、約１５週間未満、約１４週間未満、約１３週間未満、約１２週間未満、約１１週間未満、約１０週間未満、約９週間未満、約８週間未満、約７週間未満、約６週間未満、約５週間未満、約４週間未満、約３週間未満、約２週間未満、または約１週間未満である、Ｅ７５〜Ｅ９４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ９６．寛容が起こるまでの期間が、約４〜約１２週間である。Ｅ７５〜Ｅ９５のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ９７．寛容が起こるまでの期間が、約４週間である、Ｅ７５〜Ｅ９６のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ９８．ヒトが、インターフェロン治療を受けている、Ｅ７５〜Ｅ９７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ９９．ヒトが、抗ウイルス療法を受けている、Ｅ７５〜Ｅ９８のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１００．ヒトが、ＴＮＦ−αの増加に関連する遺伝子多型を有する、Ｅ７５〜Ｅ９１のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１０１．多型がＴＮＦ−３０８Ｇ＞Ａである、Ｅ１００に記載の方法。
Ｅ１０２．ヒトが、ＩＬ１０の増加に関連する遺伝子多型を有する、Ｅ７５〜Ｅ１０１のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１０３．多型が、ＩＬ１０Ｇマイクロサテライトのアレル１３４である、Ｅ１０２に記載の方法。
Ｅ１０４．ヒトが、凝固因子に対して１５０未満の曝露日数（ＥＤ）を有している、Ｅ７５〜Ｅ１０３のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１０５．ヒトが５０未満のＥＤを有する、Ｅ１０４に記載の方法。
Ｅ１０６．ヒトが２０未満のＥＤを有する、Ｅ１０５に記載の方法。
Ｅ１０７．凝固因子が第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である、Ｅ７５〜Ｅ１０６のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１０８．キメラタンパク質が、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含む、Ｅ７５〜Ｅ１０７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１０９．キメラタンパク質がＦＶＩＩＩ部分とＶＷＦ部分とを含み、ＦＶＩＩＩ部分がＦＶＩＩＩポリペプチドまたはその断片を含み、ＶＷＦ部分がＶＷＦポリペプチドまたはその断片を含み、ＦＶＩＩＩ部分が第１のＦｃ領域に連結され、ＶＷＦ部分が第２のＦｃ領域に連結され、および第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域が互いに会合している、Ｅ７５〜Ｅ１０８のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１１０．ＦＶＩＩＩポリペプチドが成熟ＦＶＩＩＩを含む、Ｅ７５〜Ｅ１０９のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１１１．ＦＶＩＩＩポリペプチドがＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩを含む、Ｅ７５〜Ｅ１０９のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１１２．Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩが、ＦＶＩＩＩのＢドメインの全てまたは一部の欠失を含む、Ｅ１１０に記載の方法。
Ｅ１１３．Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩが、成熟ＦＶＩＩＩのアミノ酸残基７４６〜１６４８の欠失を含む、Ｅ１１０またはＥ１１１に記載の方法。
Ｅ１１４．ＶＷＦポリペプチドがＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片を含む、Ｅ１０９〜Ｅ１１３のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１１５．キメラタンパク質が半減期延長部分をさらに含む、Ｅ７５〜Ｅ１１４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１１６．半減期延長部分が、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、その誘導体、またはその任意の組合せを含む、Ｅ１１５に記載の方法。
Ｅ１１６．半減期延長部分が、凝固因子内に挿入される、Ｅ１１５またはＥ１１６に記載の方法。
Ｅ１１７．半減期延長部分が、凝固因子とＦｃ領域の間に挿入される、Ｅ１１５またはＥ１１６に記載の方法。
Ｅ１１８．ＦＶＩＩＩとＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効量が、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇである、Ｅ７５〜Ｅ１１８のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１２０．ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含むキメラタンパク質の有効量が、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２００ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２９０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２４０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２３０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２２０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２１０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２９０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２４０ＩＵ／ｋｇ、約１４０ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約１３０ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約１２０ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約１１０ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２９０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２４０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２３０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２２０ＩＵ／ｋｇ、または約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２１０ＩＵ／ｋｇである、Ｅ１１９に記載の方法。
Ｅ１２１．ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含むキメラタンパク質の有効量が、約５０ＩＵ／ｋｇ、約６０ＩＵ／ｋｇ、約７０ＩＵ／ｋｇ、約８０ＩＵ／ｋｇ、約９０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ、約１１０ＩＵ／ｋｇ、約１２０ＩＵ／ｋｇ、約１３０ＩＵ／ｋｇ、約１４０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ、約１６０ＩＵ／ｋｇ、約１７０ＩＵ／ｋｇ、約１８０ＩＵ／ｋｇ、約１９０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ、約２２５ＩＵ／ｋｇ、約２５０ＩＵ／ｋｇ、約２７５ＩＵ／ｋｇ、または約３００ＩＵ／ｋｇである、Ｅ１１９またはＥ１２０に記載の方法。
Ｅ１２２．キメラタンパク質の有効量が約２００ＩＵ／ｋｇであり、毎日投与される、Ｅ７５〜Ｅ１２１のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１２３．ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含むキメラタンパク質が、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、または約２４日間の投与間隔で投与される、Ｅ７５〜Ｅ１２２のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１２４．ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含むキメラタンパク質が、約１〜約１４日間、約１〜約１３日間、約１〜約１２日間、約１〜約１１日間、約１〜約１０日間、約１〜約９日間、約１〜約８日間、約１〜約７日間、約１〜約６日間、約１〜約５日間、約１〜約４日間、約１〜約３日間、約１〜約２日間、約２〜約１４日間、約３〜約１４日間、約４〜約１４日間、約５〜約１４日間、約６〜約１４日間、約７〜約１４日間、約８〜約１４日間、約９〜約１４日間、約１０〜約１４日間、約１１〜約１４日間、約１２〜約１４日間、約１３〜約１４日間、または約５〜約１０日間の投与間隔で投与される、Ｅ７５〜Ｅ１２１のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１２５．ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを含むキメラタンパク質が、約３日間〜約５日間の投与間隔で投与される、Ｅ７５〜Ｅ１２２のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１２６．キメラタンパク質が、ＦＶＩＩＩ部分、ＶＷＦ部分、第１のＦｃ領域、および第２のＦｃ領域を含み、ＦＶＩＩＩ部分がＦＶＩＩＩポリペプチドまたはその断片を含み、ＶＷＦ部分がＶＷＦポリペプチドまたはその断片を含み、ＦＶＩＩＩ部分が第１のＦｃ領域に連結され、ＶＷＦ部分が第２のＦｃ領域に連結され、および第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域が互いに会合している、Ｅ７５〜Ｅ１２５のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１２７．ヒトがＦＶＩＩＩ阻害性免疫応答を過去に発生させた、Ｅ７５〜Ｅ１２６のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１２８．阻害性ＦＶＩＩＩ免疫応答が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥＦＳ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥＦＳ（登録商標）、ＸＹＮＴＨＡ／ＲＥＦＡＣＴＯＡＢ（登録商標）、ＨＥＭＯＦＩＬ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＡＲＣ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＯＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＡＴＥ−ＤＶＩ（登録商標）、ＡＦＳＴＹＬＡ（登録商標）、およびＨＹＡＴＥ：Ｃ（登録商標）からなる群から選択されるＦＶＩＩＩ産物に反応して発生した、Ｅ１２７に記載の方法。
Ｅ１２９．阻害性ＦＶＩＩＩ免疫応答が、組換えＦＶＩＩＩ産物に反応して発生する、Ｅ１２８に記載の方法。
Ｅ１３０．ヒトが、出血性凝固障害、血友病性関節症、筋肉出血、口腔内出血、出血、筋肉への出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹部内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙の出血、腹膜後腔の出血、および腸腰筋膜の出血からなる群から選択される出血状態を有する、Ｅ７５〜Ｅ１２９のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１３１．出血性凝固障害が、血友病Ａである、Ｅ１３０に記載の方法。
Ｅ１３２．キメラタンパク質の有効量が、１日を通して２回またはそれより多い用量で投与される、Ｅ７５〜Ｅ１３１に記載の方法。
Ｅ１３３．漸減レジメンが、キメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇ〜約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を投与する工程を含む、Ｅ７５〜Ｅ１３２のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１３４．漸減用量が、１日１回、２日毎に１回、または週に３回投与される、Ｅ７５〜Ｅ１３３のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１３５．漸減用量が、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１３週間、少なくとも約１４週間、少なくとも約１５週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約１７週間、少なくとも約１８週間、少なくとも約１９週間、少なくとも約２０週間、少なくとも約２１週間、少なくとも約２２週間、少なくとも約２３週間、少なくとも約２４週間、少なくとも約２５週間、少なくとも約２６週間、少なくとも約２７週間、少なくとも約２８週間、少なくとも約２９週間、少なくとも約３０週間、少なくとも約３１週間、または少なくとも約３２週間投与される、Ｅ７５〜Ｅ１３４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１３６．漸減レジメンが、キメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇまたは約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を投与する工程を含む、Ｅ７４〜Ｅ１３５のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１３７．漸減レジメンが、キメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇの漸減用量を、免疫寛容後１週目から６週目まで１日１回投与する工程を含む、Ｅ７５〜Ｅ１３６のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１３８．漸減レジメンが、キメラタンパク質の約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を、免疫寛容後１週目から６週目まで１日１回投与する工程を含む、Ｅ７５〜Ｅ１３６のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１３９．漸減レジメンが、キメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇまたは約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を、免疫寛容後６週目から１２週目まで２日毎に１回投与する工程をさらに含む、Ｅ１３７またはＥ１３８に記載の方法。
Ｅ１４０．漸減レジメンが、キメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇまたは約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を、１２週目から１６週目まで２日毎に１回投与する工程をさらに含む、Ｅ１３９に記載の方法。
Ｅ１４１．予防用量が、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約１００ＩＵ／ｋｇを含む、Ｅ７７〜Ｅ１４０のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１４２．予防用量が、１週間に約１回、１週間に約２回、１週間に約３回または１週間に約３回投与される、Ｅ７７〜Ｅ１４１のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１４３．凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質が、ヒトにおける阻害性免疫応答レベルの測定後、約１日未満、約２日未満、約３日未満、約４日未満、約５日未満、約６日未満、約７日未満、約２週間未満、約３週間未満、約４週間未満、約２カ月未満、約３カ月未満、約４カ月未満、約５カ月未満、約６カ月未満、または約１年未満でヒトに投与される、Ｅ７９〜Ｅ９１および９４〜Ｅ１４２のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１４４．凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質が、ヒトにおける阻害性免疫応答レベルの測定後、約１日未満でヒトに投与される、Ｅ７９〜Ｅ９１および９４〜Ｅ１４３のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１４５．凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質が、ヒトにおける阻害性免疫応答レベルの測定後、約１２時間未満でヒトに投与される、Ｅ７９〜Ｅ９１および９４〜Ｅ１４４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１４６．キメラタンパク質の投与によって、凝固因子単独による処置後のヒトにおける寛容が起こるまでの期間と比較して、ヒトにおいて寛容が起こるまでの期間が短縮される、Ｅ１〜Ｅ１４５のいずれか一項に記載の方法。
図１は、ＦｃγＲ結合に対するｒＦＶＩＩＩＦｃの効果、内在化、シグナル伝達およびサイトカイン産生、および遺伝子発現変化、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでのその後の相互作用およびＴ細胞に対する効果を調査するために使用される方法を概略する流れ図である。 図２Ａ〜２Ｃは、西洋わさびペルオキシダーゼ免疫複合体（ＨＲＰ−ＩＣ；陽性対照）、ＩｇＧ１、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）、またはｒＦＶＩＩＩ Ｆｃ融合タンパク質（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を用いる処理後のＦｃγ受容体ＣＤ１６（図２Ａ）、ＣＤ３２（図２Ｂ）、およびＣＤ６４（図２Ｃ）の相対的なマクロファージおよび樹状細胞上での表面発現レベルのグラフ表示である。星印（＊）は、有意性の程度を示す（ｎ＝３；＊＊＝Ｐ≦０．０１、＊＊＊＝Ｐ≦０．００５、他の処理と比較したＨＲＰ−ＩＣの有意性は示さない）。 図３Ａ〜３Ｃは、ｒＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩＦｃを用いる処理後の相対的シグナル伝達を示すグラフ表示である。図３Ａは、ＨＲＰ−ＩＣ、ＩｇＧ１、ｒＦＶＩＩＩまたはｆＲＶＩＩＩＦｃで１５分間処理したＴＨＰ−１単球株（「ＴＨＰ−１」）、単球、末梢血単球由来マクロファージ（「マクロファージ」）、および末梢血単球由来樹状細胞中での、Ｓｙｋリン酸化によって測定されたシグナル伝達を示す。図３Ｂは、ｒＦＶＩＩＩＦｃ（「ＷＴ」）、新生児Ｆｃ受容体に結合することができないｒＦＶＩＩＩＦｃ変異体（「ＦｃＲｎ変異体」）、またはＦｃγＲに結合することができないｒＦＶＩＩＩＦｃ変異体（「ＦｃｇＲ変異体」）で処理したマクロファージ中での相対的Ｓｙｋリン酸化を示す。図３Ｃは、ＨＲＰ−ＩＣ、ＩｇＧ１、ｒＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩＦｃで処理した２４時間後のマクロファージ中での炎症性サイトカインであるインターロイキン１ｂ（ＩＬ−１ｂ）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）の相対的産生を示す。 図３−１の続き。 図４は、ｒＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩＦｃで処理した１分後、５分後、および３０分後の、Ｓｒｃ相同性領域２ドメイン含有ホスファターゼ−１（ＳＨＰ１）、ｐＳＨＰ２、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸５−ホスファターゼ１（ＳＨＩＰ１）、およびｐＳＨＩＰ２の相対的リン酸化状態を示す。星印（＊）は、有意性の程度を示す（ｎ＝３；＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００５）。 図５Ａ〜５Ｍは、ｒＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩＦｃで処理した後の寛容原性マクロファージの遺伝子発現パターンのグラフ表示である。図５Ａ〜５Ｂは、ＩｇＧ１、ｒＦＶＩＩＩｃで６時間処理した単球由来マクロファージ（ｎ＝３）中で、有意に下方調節された遺伝子の分布（図５Ａ）および有意に上方調節された遺伝子の分布（図５Ｂ）を示すベン図である。図５Ｃ〜５Ｇは、ｒＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩＦｃで処理した後に、定量的ＰＣＲによって測定された、様々なＮＲＦ２ならびにヘムオキシゲナーゼ１（Ｈｍｏｘ１；図５Ｃ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ；図５Ｄ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ；図５Ｅ）、初期増殖応答タンパク質２（ＥＧＲ２；図５Ｆ）、および溶質運搬有機アニオン輸送体ファミリーメンバー４Ａ１（ＳＬＣＯ４Ａ１；図５Ｇ）などの脂質代謝経路遺伝子；処理後６時間（図５Ｉ）および１２時間（図５Ｊ）でのＣＤ２０６；ならびにアルギナーゼ１（ＡＲＧ１；図５Ｌ）の相対的発現を示すグラフである。星印（＊）は、有意性の程度を示す（ｎ＝８；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００５；図５Ｃ〜５Ｇ）。図５Ｋおよび５Ｍは、ＣＤ２０６を発現するフローサイトメトリーによって収集された細胞数を示すグラフである。さらに、ｒＦＶＩＩＩＦｃにより教育されたマクロファージは、特徴的なＭ２様表現型を示すことがわかった（図５Ｉ〜５Ｍ）。特に、ｒＦＶＩＩＩＦｃで処理したマクロファージは、６時間後（図５Ｉ）および２４時間後（図５Ｊ）に、ｒＦＶＩＩＩで処理した細胞よりも高い相対的ＣＤ２０６（マンノース受容体Ｃ−１型；ＭＲＣ１としても知られる）発現を有し、ｒＦＶＩＩＩＦｃで処理したマクロファージは、２４時間後にｒＦＶＩＩＩで処理した細胞よりも高い相対的ＡＲＧ１発現を有していた（図５Ｍ）。 図５−１の続き。 図５−２の続き。 図５−３の続き。 図５−４の続き。 図５−５の続き。 図６Ａは、Ｔ細胞分化に対するｒＦＶＩＩＩＦｃ処理の効果を決定するために使用される方法を示す流れ図である。 図６Ｂは、マクロファージまたは樹状細胞をＩｇＧ１（対照）、ｒＦＶＩＩＩ、またはｒＦＶＩＩＩＦｃで２４時間処理した後、ナイーブなＣＤ４陽性Ｔ細胞との同時培養物中に入れた６日後の調節性Ｔ細胞のパーセントのグラフ表示である。 図６Ｃは、ＩｇＧ１、ｒＦＶＩＩＩ、またはｒＦＶＩＩＩＦｃで予備処理されたマクロファージまたは樹状細胞の条件化培地中でのナイーブなＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養後の調節性Ｔ細胞のパーセントを示すグラフ表示である。 図７は、ｒＦＶＩＩＩＦｃ調節性Ｔ細胞分化の提唱される機構を示す図である。 図８は、マクロファージに対するｒＦＩＸＦｃの提唱される効果を示す図である。
本開示は、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質、または凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物の有効量をヒトに投与する工程を含み、ヒトが、凝固因子に対するインヒビターを発生させており、凝固因子に対する１つまたは複数の過去の免疫寛容療法に反応しなかった方法を提供する。一部の実施形態では、凝固因子は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、第Ｘ因子（ＦＸ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、およびその任意の組合せからなる群から選択される。
Ｉ．定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体は、その実体の１つまたは複数を指す；例えば、「１つのヌクレオチド配列（a nucleotide sequence）」は、１つまたは複数のヌクレオチド配列を表すと理解される。そのため、用語「１つ（ａ）」（または「１つ（ａｎ）」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。
さらに、本明細書で使用される場合の「および／または」は、他の特色または構成要素の存在下または非存在下で、明記された２つの特色または構成要素の各々の具体的な開示として解釈すべきである。このため、本明細書における「Ａおよび／またはＢ」などの語句で使用される場合の用語「および／または」は、「ＡとＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むと意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句で使用される場合の用語「および／または」は、以下の態様の各々を包含すると意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
態様が本明細書において「含む」という言語と共に記載される場合は常に、「からなる」および／または「本質的にからなる」に関して記載される類似の態様も同様に提供されると理解される。
それ以外であると定義していない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が関連する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｏ、Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ、第２版、２００２、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、１９９９、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、改訂版、２０００、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、および記号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）が承認した書式で記される。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。それ以外であると示していない限り、アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシ方向に書かれている。本明細書に提供する見出しは、開示の様々な態様の制限ではなく、本明細書を全体として参照することによって得ることができる。したがって、以下に定義する用語は、本明細書をその全体で参照することによってより十分に定義される。
用語「約」は、本明細書において、およそ、ほぼ、おおよそ、またはその領域を意味するために使用される。用語「約」を数値範囲と共に使用する場合、これは記載の数値より上および下に境界を伸長させることによってその範囲を修飾する。このように、「約１０〜２０」は、「約１０〜約２０」を意味する。一般的に、用語「約」は、例えば１０パーセント上または下の（高いまたは低い）分散によって、記載の数値の上および下の数値を修飾することができる。
本明細書で使用される場合の「投与する」は、例えば本明細書に開示されるキメラタンパク質を含む薬学的に許容される組成物を、薬学的に許容される経路を介して対象に与えることを意味する。投与経路は、静脈内、例えば静脈内注射および静脈内輸注であり得る。さらなる投与経路には、例えば、皮下、筋肉内、経口、鼻、および肺投与が挙げられる。キメラタンパク質およびハイブリッドタンパク質を、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物の一部として投与することができる。一部の実施形態では、凝固因子および／またはＦｃ、例えばキメラタンパク質を、遺伝子治療を通してヒトに投与し、例えば凝固因子および／またはＦｃ、例えばキメラタンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドをヒトに投与し、凝固因子および／またはＦｃ、例えばキメラタンパク質をヒトにおいて発現させる。
本明細書で使用される場合の「処置する」、「処置」、または「処置している」は、例えば、疾患または状態の重症度の低減；状態の経過期間の低減；疾患また状態に関連する１つまたは複数の症状の改善または消失；疾患または状態を必ずしも治癒する必要なく疾患または状態を有する対象に対する有益な効果の提供を指す。一部の実施形態では、用語「処置する」または「処置している」は、凝固因子、例えばＦＶＩＩＩに対する阻害性免疫応答を低減または消失させることを意味する。
本明細書で使用される場合の用語「免疫寛容を誘導する」は、特定の刺激を投与した場合に、例えば凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ）を投与した場合に、対象が免疫応答を有しない状態を対象において誘発することを意味する。この状態、免疫寛容は、対象が刺激に対して有限の期間寛容である一過性であり得るか、または対象が刺激に対して無限に寛容である長期間であり得る。ある特定の実施形態では、対象は、刺激が対象に投与される限り、刺激に対して寛容であり続ける。例えば、一部の実施形態では、対象は、凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質が所定の投与間隔で対象に投与される限り、凝固因子に対して寛容であり続ける。他の実施形態では、対象は、凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の投与が終了した後であっても、凝固因子に対して寛容であり続ける。
一部の実施形態では、免疫応答は、「阻害性」免疫応答である。阻害性免疫応答は、刺激、例えば凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ）の投与の効果を遮断するかまたは減損させる免疫応答である。ある特定の実施形態では、阻害性免疫応答は、刺激に対する阻害性抗体、例えば阻害性抗ＦＶＩＩＩ抗体の産生を含む。本明細書で使用される場合の用語「阻害性抗体」または「複数の阻害性抗体」は、抗体によって認識される抗原の機能を遮断または減損する抗体を指す。例えば、ＦＶＩＩＩに対する阻害性抗体は、ＦＶＩＩＩの活性を遮断するかまたは減損させる。一部の実施形態では、阻害性抗体は、抗原、例えばＦＶＩＩＩに結合し、ヒトの血清からの抗原のクリアランスを加速する。抗体が、抗原のクリアランスを加速すると、抗体は、抗原の半減期を低減させる。
阻害性免疫応答は、ベセスダ法またはベセスダ法のナイメゲン変法などの臨床検査を使用して決定することができる。少なくとも０．６ベセスダ単位（ＢＵ）のレベルは、阻害性免疫応答の存在を示し得る。少なくとも５ＢＵのレベルは、高力価インヒビターの存在を示し得る。凝固因子のボーラス輸注の生体内回収率および半減期の測定も同様に使用することができる。ある特定の実施形態では、免疫寛容は、ヒトにおける阻害性抗体の力価が、約５ＢＵ未満、約４ＢＵ未満、約３ＢＵ未満、約２ＢＵ未満、約１ＢＵ未満、約０．９ＢＵ未満、約０．８ＢＵ未満、約０．７ＢＵ未満、約０．６ＢＵ未満、約０．５ＢＵ未満、約０．４ＢＵ未満、約０．３ＢＵ未満、約０．２ＢＵ未満、約０．１ＢＵ未満、または約０ＢＵである場合に観察される。１つの特定の実施形態では、免疫寛容は、ヒトにおける阻害性抗体の力価が、約０．６ＢＵ未満である場合に観察される。
他の実施形態では、免疫応答は、細胞性免疫応答を含む。一部の実施形態では、細胞性免疫応答は、サイトカインの放出を含む。ある特定の実施形態では、細胞性免疫応答の一部として放出されるサイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、およびその任意の組合せからなる群から選択することができる。
他の実施形態では、免疫応答は、出血傾向の増加、高い凝固因子消費、凝固因子療法に対する反応の欠如、凝固因子療法の効能の減少、凝固因子の半減期の短縮、およびその任意の組合せからなる群から選択される臨床症状を含む。
他の実施形態では、免疫寛容は、ヒトに投与後の凝固因子の半減期の増加によって測定される。一部の実施形態では、免疫寛容の誘導前のヒトに投与した凝固因子の半減期と比較して、凝固因子の半減期が、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、または少なくとも約１０００％増加すれば、免疫寛容は誘導されている。ある特定の実施形態では、凝固因子の半減期は、免疫寛容の誘導後、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、または少なくとも約１５時間である。
本明細書で使用される場合の用語「比較可能な」は、例えば、キメラタンパク質を使用することに起因する比較される速度またはレベルが、基準の速度またはレベルと等しい、実質的に等しい、または類似であることを意味する。本明細書で使用される場合の用語「類似」は、比較される速度またはレベルが、基準の速度またはレベルから１０％以下または１５％以下の差を有することを意味する（例えば、２つのＦｃ部分とプロセシングされたＦＶＩＩＩから本質的になるまたはからなるキメラタンパク質であって、プロセシングされたＦＶＩＩＩが２つのＦｃ部分のうちの１つのＦｃに融合しているキメラタンパク質によるＦＸａ生成速度）。用語「実質的に等しい」は、基準の速度またはレベルから０．０１％、０．５％、または１％以下の差を有することを意味する。
本明細書で使用される場合の止血障害は、フィブリンクロット形成能の障害または形成不全による自然発生または外傷の結果としての出血傾向を特徴とする遺伝性または後天性状態を意味する。そのような障害の例には、血友病が挙げられる。３つの主な型は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠乏）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠乏、または「クリスマス病」）、および血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠乏、軽度の出血傾向）である。他の止血障害には、例えば、フォンヴィレブランド病、第ＸＩ因子欠乏（ＰＴＡ欠乏）、第ＸＩＩ因子欠乏、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、または第ＸＩＩＩ因子の欠乏または構造異常、ＧＰＩｂの欠損または欠乏であるベルナールスーリエ症候群が挙げられる。ＶＷＦの受容体であるＧＰＩｂは、正常に機能しない場合があり、一次クロット形成（一次止血）の欠如および出血傾向の増加、ならびにグランツマン−ネーゲリ血小板無力症（グランツマン血小板無力症）が起こり得る。肝不全（急性および慢性型）では、肝臓による凝固因子の産生が不十分であり、このことが出血リスクを増加させ得る。
本明細書で使用される場合の「血漿中濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）」は、薬理学の技術分野の用語と同じであり、投与後のＦＶＩＩＩの吸収の速度および程度に基づく。ＡＵＣは、１２、１８、２４、３６、４８、もしくは７２時間などの明記された期間に対して、または曲線の勾配に基づく外挿を使用して無限大で決定される。本明細書において特に明記していない限り、ＡＵＣは、無限大で決定される。ＡＵＣの決定は、単一の対象について実行することができ、または平均を計算するために対象の集団について実行することができる。
用語「凝固促進活性」は、本発明の凝固因子、例えばＦＶＩＩＩが、本来の凝固因子、例えば本来のＦＶＩＩＩの代わりに、血液中の凝固カスケードに関与する能力を意味する。凝固１段法（one stage clotting assay）（活性化部分トロンボプラスチン時間；ａＰＴＴ）、トロンビン生成時間（ＴＧＡ）、およびトロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ（登録商標））を含む、第ＶＩＩＩ活性を測定するためのいくつかのアッセイが利用可能である。
免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または領域のアミノ酸ナンバリングに対する参照は全て、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ；ＭＤに基づく。ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含むいくつかの動物種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎ配列は公知である（その全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｓｔｏｒｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３７７（１９９４））。Ｆｃは、免疫グロブリンのヒンジ領域を伴ってまたは伴わずに、免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み得る。例示的なＦｃバリアントは、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２００４／１０１７４０号および国際公開第２００６／０７４１９９号に提供される。
本明細書で使用される場合の「ハイブリッド」ポリペプチドおよびタンパク質は、キメラタンパク質と第２のポリペプチドとの組合せを意味する。ハイブリッド中のキメラタンパク質と第２のポリペプチドは、タンパク質−タンパク質相互作用、例えば電荷−電荷または疎水性相互作用を介して互いに会合することができる。ハイブリッド中のキメラタンパク質と第２のポリペプチドは、ジスルフィド結合または他の共有結合を介して互いに会合することができる。ハイブリッドは、その各々の全体を参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２００４／１０１７４０号および国際公開第２００６／０７４１９９号に記載されている。同様に、その各々の全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第７，４０４，９５６号および第７，３４８，００４号も参照されたい。第２のポリペプチドは、同じキメラタンパク質の第２のコピーであり得るか、または非同一のキメラタンパク質であり得る。
本明細書で使用される場合、タンパク質配列における「に対応するアミノ酸」、「に対応する部位」、または「同等のアミノ酸」は、第１のタンパク質配列、例えばＦＶＩＩＩ配列と、第２のタンパク質配列、例えば第２のＦＶＩＩＩ配列との間の同一性または類似性を最大限にするためのアライメントによって同定される。第２のタンパク質配列における同等のアミノ酸を同定するために使用される番号は、第１のタンパク質配列における対応するアミノ酸を同定するために使用される番号に基づく。
本明細書で使用される場合の用語「挿入部位」は、異種部分を挿入することができる位置の直ちに上流であるポリペプチド（典型的に成熟ポリペプチド、例えば成熟ＦＶＩＩＩポリペプチド）、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体におけるアミノ酸残基の番号を指す。「挿入部位」は、番号として明記され、番号は、挿入位置の直ちにＮ−末端である挿入部位が対応する、アミノ酸が明記されたタンパク質配列の番号である。例えば、語句「ＦＶＩＩＩは、所定の配列のアミノ酸７４５に対応する挿入位置で異種部分を含む」とは、異種部分が配列のアミノ酸７４５とアミノ酸７４６に対応する２つのアミノ酸の間に位置することを示している。しかし、当業者は、表記のタンパク質の任意のバリアントにおける対応する位置を容易に同定することができ、本開示は、本開示に具体的に開示されたバリアントのみになされた挿入に限定されない。むしろ、本明細書に開示される挿入は、本明細書に開示されるバリアントの位置に対応する位置で活性を有する任意の関連するバリアントまたはその断片に行うことができる。
本明細書に使用される場合の語句「アミノ酸の直ちに下流」は、アミノ酸の末端カルボキシル基の右隣の位置を指す。同様に、語句「アミノ酸の直ちに上流」は、アミノ酸の末端アミン基の右隣の位置を指す。したがって、本明細書で使用される場合の「挿入部位の２つのアミノ酸の間」という語句は、２つの隣接するアミノ酸の間に異種部分（例えば、半減期延長部分）が挿入されている位置を指す。
本明細書で使用される場合、用語「挿入された」、「挿入される」、「〜に挿入された」、またはその文法的に関連する用語は、明記されたタンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質）における類似の位置と比較した、融合ポリペプチドにおける異種部分（例えば、半減期延長部分）の位置を指す。当業者は、他のポリペプチド配列、例えば他のＦＶＩＩＩバリアントに関して対応する挿入位置を同定する方法を理解するであろう。本明細書で使用される場合、用語は、本明細書に開示される組換えポリペプチドの特徴を指し、融合ポリペプチドが作製される任意の方法または過程を示す、暗示する、または推論するものではない。例えば、本明細書に提供される融合ポリペプチドを参照して、語句「異種部分を、ＦＶＩＩＩポリペプチドの残基７４５の直ちに下流に挿入する」という語句は、融合ポリペプチドが、例えばＦＶＩＩＩバリアントのアミノ酸７４５と７４６に対応するアミノ酸に接している、特定のＦＶＩＩＩバリアントにおけるアミノ酸７４５に対応するアミノ酸の直ちに下流で異種部分を含むことを意味する。
「融合体」または「キメラ」タンパク質は、自然界で天然に連結されていない第２のアミノ酸配列に連結された第１のアミノ酸配列を含む。異なるタンパク質に通常存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチドにおいて共に結合させることができ、または同じタンパク質に通常存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチド、例えば本発明のＦＶＩＩＩドメインとＩｇ Ｆｃドメインとの融合体において新しい配置に置くことができる。融合タンパク質は、例えば化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作成および翻訳することによって作成される。融合タンパク質は、共有性の非ペプチド結合または非共有結合によって第１のアミノ酸配列に会合した第２のアミノ酸配列をさらに含み得る。
用語「異種」および「異種部分」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の部分が、それが比較される実体の部分とは別個の実体に由来することを意味する。例として、異種ポリペプチドは、合成であり得るか、または異なる種、個体の異なる細胞タイプ、または別個の個体の同じもしくは異なるタイプの細胞に由来し得る。一態様では、異種部分は、融合ポリペプチドまたはタンパク質を産生するために、別のポリペプチドに融合したポリペプチドである。別の態様では、異種部分は、ポリペプチドまたはタンパク質にコンジュゲートしたＰＥＧなどの非ポリペプチドである。
本明細書に使用される場合の用語「連結した」および「融合した」は、第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列にそれぞれ、共有結合または非共有結合した第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列を、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に直接結合させるか、または並置することができ、あるいは介在配列によって、第１の配列と第２の配列とを共有結合させることができる。用語「連結された」は、Ｃ末端またはＮ末端での第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列の融合体のみならず、第２のアミノ酸配列（または第１のアミノ酸配列、それぞれ）における任意の２つのアミノ酸への第１のアミノ酸配列（または第２のアミノ酸配列）全体の挿入を含む。一実施形態では、第１のアミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーによって第２のアミノ酸配列に連結される。第１のヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーによって第２のヌクレオチド配列に連結することができる。リンカーは、ペプチドもしくはポリペプチド（例えば、ポリペプチド鎖の場合）、またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖の場合）、または任意の化学部分（ポリペプチドとポリヌクレオチド鎖の両方の場合）であり得る。用語「連結された」はまた、ハイフン（−）によって示される。
本明細書で使用される場合、用語「会合する」は、第１のアミノ酸鎖と第２のアミノ酸鎖との間で形成された共有結合または非共有結合を指す。一実施形態では、用語「会合する」は、共有性の非ペプチド結合または非共有結合を意味する。この会合は、コロン、すなわち（：）によって示すことができる。別の実施形態では、これはペプチド結合を除く共有結合を意味する。例えば、アミノ酸システインは、第２のシステイン残基上のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１およびＣＬ領域は、ジスルフィド結合によって会合し、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用して２３９および２４２に対応する位置（ＥＵナンバリングシステム２２６または２２９位、）で２つのジスルフィド結合によって会合している。共有結合の例には、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、パイ結合、デルタ結合、グリコシド結合、アゴニスト結合、曲がった結合、配位結合、π逆供与、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、コンジュゲーション、ハイパーコンジュゲーション、芳香族性、ハプト数、または反結合が挙げられるがこれらに限定されない。非共有結合の非制限的な例には、イオン結合（例えば、カチオンπ結合または塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素複合体、低障壁水素結合、または対称性水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械的結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー力、または化学極性が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「切断部位」または「酵素切断部位」は、酵素によって認識される部位を指す。ある特定の酵素切断部位は、細胞内プロセシング部位を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、そのような部位の切断が、クロット形成部位で起こるように、凝固カスケードの際に活性化される酵素によって切断される酵素切断部位を有する。例示的なそのような部位には、例えばトロンビン、第ＸＩａ因子、または第Ｘａ因子によって認識される部位が挙げられる。他の酵素切断部位は、当技術分野で公知である。
本明細書で使用される場合、用語「プロセシング部位」または「細胞内プロセシング部位」は、ポリペプチドの翻訳後に機能する酵素の標的であるポリペプチドにおける酵素切断部位の一種を指す。一実施形態では、そのような酵素は、ゴルジ体のルーメン側からトランスゴルジ区画に輸送される際に機能する。細胞内プロセシング酵素は、細胞からタンパク質が分泌される前にポリペプチドを切断する。そのようなプロセシング部位の例には、例えば、ＰＡＣＥ／フューリン（ＰＡＣＥは、Ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅの頭字語である）ファミリーエンドペプチダーゼによって標的とされる部位が挙げられる。これらの酵素は、ゴルジ膜に局在し、配列モチーフＡｒｇ−［任意の残基］−（ＬｙｓまたはＡｒｇ）−Ａｒｇのカルボキシ末端側でタンパク質を切断する。本明細書で使用される場合、「フューリン」ファミリー酵素には、例えばＰＣＳＫ１（ＰＣ１／ＰＣ３としても知られる）、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２としても知られる）、ＰＣＳＫ３（フューリンまたはＰＡＣＥとしても知られる）、ＰＣＳＫ４（ＰＣ４としても知られる）、ＰＣＳＫ５（ＰＣ５またはＰＣ６としても知られる）、ＰＣＳＫ６（ＰＡＣＥ４としても知られる）、またはＰＣＳＫ７（ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８、またはＳＰＣ７としても知られる）が挙げられる。他のプロセシング部位は当技術分野で公知である。
１つより多くのプロセシングまたは切断部位を含む構築物では、そのような部位は同じまたは異なり得ると理解される。
本明細書で使用される「プロセシング可能なリンカー」は、本明細書において他所で記載される少なくとも１つの細胞内プロセシング部位を含むリンカーを指す。
本明細書で使用される場合の「ベースライン」は、用量を投与前の対象において所定の検体、例えば凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ）または抗体（例えば、抗ＦＶＩＩＩ抗体）について測定された最低の血漿中レベルである。血漿中レベルは、投与前の２回の時点：スクリーニング診察時、および投与直前で測定することができる。
本明細書で使用される場合の「同等量」は、当該ポリペプチドの分子量とは無関係な国際単位で表記される凝固因子活性、例えばＦＶＩＩＩ活性の同じ用量を意味する。例えば、ＦＶＩＩＩ活性の１国際単位（ＩＵ）は、通常のヒト血漿１ミリリットル中のＦＶＩＩＩの量にほぼ対応する。欧州薬局方色素生成基質アッセイおよび凝固１段法を含む、凝固因子活性を測定するためのいくつかのアッセイが利用可能である。
本明細書で使用する場合の「投与間隔」は、対象に投与される複数の用量間で経過する投与の時間を意味する。投与間隔の比較は、単一の対象または対象集団で行うことができ、集団で得られた平均値を計算することができる。
本明細書で使用する場合の「対象」は、ヒト個体を意味する。対象は、出血性障害に現在罹患しているか、またはそのような処置を必要とすると予想される患者であり得る。一部の実施形態では、対象は、凝固因子によって過去に処置されていない（すなわち、対象は、過去に無処置の対象であるか、または過去に無処置の患者である）。一部の実施形態では、対象は胎児であり、方法は、組成物またはキメラタンパク質を胎児の母親に投与する工程を含み、対象への投与は、母体から胎盤を通して起こる。一部の実施形態では、対象は小児または成人である。一部の実施形態では、対象は、１歳未満、２歳未満、３歳未満、４歳未満、５歳未満、６歳未満、７歳未満、８歳未満、９歳未満、１０歳未満、１１歳未満、または１２歳未満の小児である。一部の実施形態では、小児は１歳未満である。一部の実施形態では、小児または成人は、出血性障害を発症しており、出血性障害の症状の開始は、１歳以降に起こる。一部の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質の対象への投与は、凝固因子に対する液性免疫応答、細胞性免疫応答、または液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方から選択される免疫応答の発生を予防、阻害、または低減させるために十分である。一部の実施形態では、対象はヒトであり、対象は、凝固因子に対する免疫応答を過去に発生させている。一部の実施形態では、ヒトは、免疫寛容療法に対して過去に反応しなかった。一部の実施形態では、過去の免疫寛容療法は、高用量の凝固因子の投与を含む。他の実施形態では、過去の免疫寛容療法は、１つまたは複数の免疫抑制剤の投与を含む。一実施形態では、過去の免疫寛容療法は、Ｍａｌｍｏレジメンであった。別の実施形態では、過去の免疫寛容療法はＢｏｎｎプロトコールであった。
本明細書で（互換的に）使用される場合の、「治療用量」、「用量」、「有効量」、または「投与量」は、本明細書に記載される治療目標を達成する用量を意味する。一部の実施形態では、「治療用量」は、対象において免疫寛容を誘導する用量を意味する。ある特定の実施形態では、「治療用量」は、明記された寛容が起こるまでの期間内に、例えば第１の用量の投与の１２週間以内に対象において免疫寛容を誘導する用量を意味する。
同様に、ポリペプチドの断片またはバリアント、およびその任意の組合せも本発明に含まれる。本開示の方法に使用されるポリペプチドについて言及する場合の用語「断片」または「バリアント」は、基準ポリペプチドの少なくとも一部の特性（例えば、ＦｃＲｎ結合ドメインもしくはＦｃバリアントのＦｃＲｎ結合親和性、またはＦＶＩＩＩの凝固活性）を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片は、本明細書において他所で考察する特異的抗体断片に加えて、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片を含むが、天然に存在する完全長のポリペプチド（または成熟ポリペプチド）を含まない。本開示の方法で使用されるポリペプチド結合ドメインまたは結合分子のバリアントは、上記の断片を含み、同様にアミノ酸の置換、欠失、または挿入により変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。バリアントは、天然に存在する、または天然に存在しないバリアントであり得る。天然に存在しないバリアントを、当技術分野で公知の変異誘発技術を使用して産生することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に交換されている置換である。塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されている。このように、ポリペプチド中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸に交換されている場合、置換は保存的であると考えられる。別の実施形態では、一連のアミノ酸を、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似の一連のアミノ酸に保存的に交換することができる。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の用語「パーセント配列同一性」は、２つの配列の最適なアライメントのために導入しなければならない付加または欠失（すなわち、ギャップ）を考慮に入れて、比較ウィンドウにわたって配列が共有する同一のマッチした位置の数を指す。マッチした位置は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が標的および基準配列の両方に存在する任意の位置である。標的配列に存在するギャップは、ギャップがヌクレオチドまたはアミノ酸ではないことから計数されない。同様に、基準配列に存在するギャップは、標的配列のヌクレオチドもしくはアミノ酸が計数されない、または基準配列のヌクレオチドもしくはアミノ酸ではないことから、計数されない。
配列同一性のパーセンテージは、同一のアミノ酸残基または核酸塩基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得る工程、マッチした位置の数を、比較ウィンドウにおける位置の総数で除算する工程、および結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得る工程によって計算される。２つの配列間の配列の比較およびパーセント配列同一性の決定は、オンライン使用およびダウンロードの両方で容易に入手可能なソフトウェアを使用して行ってもよい。タンパク質およびヌクレオチド配列のアライメントのための適したソフトウェアプログラムは、様々な起源から入手可能である。パーセント配列同一性を決定するための１つの適したプログラムは、米国政府の国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＢＬＡＳＴ）のウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なＢＬＡＳＴプログラムスイートの一部であるｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して２つの配列間の比較を実行する。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の適したプログラムは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒであり、これらはバイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳスイートの一部であり、同様に欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）のｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａから入手可能である。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド基準配列と整列する単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、各々が、自身のパーセント配列同一性を有し得る。パーセント配列同一性の値は、最も近い十の位の値に四捨五入されることに注意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、および８０．１４は、８０．１に切り捨てられるが、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、および８０．１９は、８０．２に切り上げられる。同様に長さの値は常に整数であることにも注意されたい。
当業者は、パーセント配列同一性の計算のための配列アライメントの生成が、一次配列データのみによって促進されるバイナリ配列−配列比較に限定されないことを認識する。配列アライメントは、複数の配列アライメントから誘導することができる。複数の配列アライメントを生成するための１つの適したプログラムは、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手可能なＣｌｕｓｔａｌＷ２である。別の適したプログラムは、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から入手可能なＭＵＳＣＬＥである。ＣｌｕｓｔａｌＷ２およびＭＵＳＣＬＥは、あるいは、例えばＥＢＩからも入手可能である。
配列アライメントは、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば、変異の位置）、または系統発生学データなどの異成分からなる起源からのデータと統合することによって生成することができることも認識されたい。異成分からなるデータを統合して複数の配列アライメントを生成する適したプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇ、あるいはＥＢＩからも入手可能なＴ−Ｃｏｆｆｅｅである。同様に、パーセント配列同一性を計算するために使用される最終的なアライメントを、自動または手動のいずれかで精選してもよいと認識されたい。
ポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域、またはその両方で変化を含み得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加、または欠失を産生するが、コードされるポリペプチドの特性または活性を変化させない変化を含む。別の実施形態では、ヌクレオチドバリアントは、遺伝子コードの縮重によるサイレント置換によって産生される。他の実施形態では、バリアントは、５〜１０、１〜５、または１〜２個のアミノ酸が、任意の組合せで置換、欠失、または付加されている。ポリヌクレオチドバリアントは、多様な理由から、例えば特定の宿主に関してコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、他の宿主、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌宿主のコドンに変化させる）ために産生することができる。
天然に存在するバリアントは、「アレルバリアント」と呼ばれ、生物の染色体上の所定の座を占有する遺伝子のいくつかの代替型の１つを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらのアレルバリアントは、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドレベルで変化することができ、本開示に含まれる。あるいは、天然に存在しないバリアントを、変異誘発技術または直接合成によって産生することができる。
タンパク質操作および組換えＤＮＡ技術に関する公知の方法を使用して、ポリペプチドの特徴を改善または変化させるためにバリアントを生成することができる。例として、生物機能を実質的に失うことなく、分泌されたタンパク質のＮ末端またはＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸を欠失させることができる。その全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４〜２９８８頁（１９９３年）は、３、８、または２７個のアミノ末端アミノ酸残基を欠失させた後でもヘパリン結合活性を有するバリアントＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させた後でも最大１０倍高い活性を示した（その全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９〜２１６頁（１９８８年））。
その上、バリアントがしばしば、天然に存在するタンパク質と類似の生物活性を保持することは、十分な証拠により証明されている。例えば、Ｇａｙｌｅとその共同研究者（その全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５〜２２１１１頁（１９９３年））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範な変異解析を実施した。彼らは、ランダム変異誘発を使用して、分子の全長にわたってバリアントあたり平均で２．５個のアミノ酸変化を有する３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変異体を生成した。複数の変異を起こり得るあらゆるアミノ酸位置で調べた。研究者らは、「［結合または生物活性］のいずれにもほとんど影響を及ぼすことなく、分子のほとんどを変化させることができる」ことを見出した。（要約書を参照されたい）。実際に、野生型と活性が有意に異なるタンパク質を産生したのは、調べた３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうちわずか２３個のユニークアミノ酸配列に過ぎなかった。
上記のように、ポリペプチドバリアントは、例えば改変ポリペプチドを含む。改変には、例えばアセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（その全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｍｅｉら、Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０〜７９頁（２０１０年））、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸のタンパク質への転移−ＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩは、任意の簡便な位置で改変され、例えばペグ化される。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩの表面露出アミノ酸、例えば操作されたシステインであり得る表面露出システインでペグ化される。同上。一部の実施形態では、改変ＦＶＩＩＩ、例えばペグ化ＦＶＩＩＩは、キメラまたは融合ＦＶＩＩＩである。
用語「下流」は、基準ヌクレオチド配列の３’に位置するヌクレオチド配列を指す。「下流」はまた、基準ペプチド配列のＣ末端に位置するペプチド配列も指し得る。
用語「上流」は、基準ヌクレオチド配列の５’に位置するヌクレオチド配列を指す。「上流」はまた、基準ペプチド配列のＮ末端に位置するペプチド配列も指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「調節領域」は、コード領域の上流（５’非コード配列）、領域内、または下流（３’非コード配列）に位置し、会合するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節領域には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造が挙げられ得る。コード領域が、真核細胞での発現を意図する場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は通常、コード配列の３’に位置する。
遺伝子産物、例えばポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数のコード領域に作動可能に会合したプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含み得る。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終止シグナルもまた、コード領域に作動可能に会合して、遺伝子産物の発現を指示することができる。
多様な転写制御領域が当業者に公知である。これらには、サイトメガロウイルス（イントロンＡと共に前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）のプロモーターおよびエンハンサーセグメントなどの、しかしこれらに限定されない脊椎動物細胞において機能する転写制御領域が挙げられるがこれらに限定されない。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来する領域、ならびに真核細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。さらに適した転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンフォカイン誘導可能プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
同様に、多様な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ならびにピコルナウイルス由来のエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位またはＩＲＥＳ、同様にＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合の用語「発現」は、それによってポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを産生する過程を指す。
「ベクター」は、核酸を宿主細胞にクローニングおよび／または移入するための任意の媒体を指す。ベクターは、結合したセグメントの複製をもたらすために別の核酸セグメントを結合させてもよいレプリコンであり得る。「レプリコン」は、ｉｎ ｖｉｖｏで自律複製単位として機能する、すなわち、自身の制御下で複製することができる任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。用語「ベクター」は、核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入するためのウイルスおよび非ウイルス媒体の両方を含む。例えばプラスミド、改変真核生物ウイルス、または改変細菌ウイルスを含む、多数のベクターが公知であり、当技術分野で使用される。ポリヌクレオチドの適したベクターへの挿入は、相補的付着末端を有する適切なポリヌクレオチド断片を選択したベクターにライゲートすることによって行うことができる。
用語「プラスミド」は、細胞の中心代謝の一部ではなく、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子をしばしば有する染色体外エレメントを指す。そのようなエレメントは、複数のヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物に関するプロモーター断片およびＤＮＡ配列を、適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる独自の構成に結合または組換えされている、任意の起源に由来する、自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直線、環状、もしくはスーパーコイルの一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
使用することができる真核生物ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびポックスウイルス、例えばワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。非ウイルスベクターには、プラスミド、リポソーム、帯電した脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体、およびバイオポリマーが挙げられる。
「クローニングベクター」は、結合したセグメントの複製をもたらすために別の核酸セグメントを結合させてもよい、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどの、連続的に複製し、複製開始点を含む単位長さの核酸である「レプリコン」を指す。ある特定のクローニングベクターは、１つの細胞タイプ、例えば細菌において複製することができ、別の細胞、例えば真核細胞において発現することができる。クローニングベクターは典型的に、ベクターおよび／または目的の核酸配列を挿入するための１つもしくは複数のマルチクローニングサイトを含む細胞を選択するために使用することができる１つまたは複数の配列を含む。
用語「発現ベクター」は、宿主細胞への挿入後に、挿入された核酸配列を発現させることができるように設計された媒体を指す。挿入された核酸配列は、上記の調節領域に作動可能に会合して配置される。
ベクターは、当技術分野で周知の方法、例えばトランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体によって宿主細胞に導入される。
「単離された」ポリペプチド、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、その天然の環境に存在していないポリペプチドを指す。特定の精製レベルは必要ではない。例えば、単離されたポリペプチドは、単純にその本来のまたは天然の環境から除去することができる。宿主細胞において発現された組換えによって産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適した技術によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製されている本来のまたは組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的に関して単離されたと考えられる。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、組換え核酸を有する、または有することができる細胞または細胞集団を指す。宿主細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））であり得るか、あるいは宿主細胞は真核細胞、例えば真菌細胞（例えば、サッカロミセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉ）、またはシゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などの酵母細胞）、および様々な動物細胞、例えば昆虫細胞（例えば、Ｓｆ−９）、または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７、ＮＩＨ−３Ｔ３）であり得る。
本明細書で使用される場合の「定常状態での分布容積（Ｖｓｓ）」は、薬理学で使用される用語と同じ意味を有し、薬物が分布する見かけの空間（容積）である。Ｖｓｓ＝定常状態での血漿中濃度によって除算した体における薬物量。
ＩＩ．本発明の方法
本開示は、凝固因子に対するインヒビターを生じ、１またはそれ以上の以前の免疫寛容療法に失敗した、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導するために、Ｆｃ領域に融合された凝固因子を使用することができるという発見に基づくものである。以前は、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃキメラタンパク質を用いる処置が、ＦＶＩＩＩ処置に対する免疫応答を防止することができると考えられていたが、驚くべきことに、凝固因子−Ｆｃキメラタンパク質を用いる処置が、以前の免疫寛容療法に反応しなかったヒトにおいて以前に生じた免疫応答を軽減することができることが本開示において発見された。かくして、本開示は、ヒトにおける免疫寛容を誘導するための方法であって、ヒトに、凝固因子と、Ｆｃとを含む組成物または凝固因子と、Ｆｃ領域もしくはそれをコードするポリヌクレオチドとを含むキメラタンパク質の有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。
本開示の別の態様は、血友病を有するヒトにおける免疫寛容を誘導する方法であって、（１）ヒトに、凝固因子と、Ｆｃとを含む組成物または凝固因子と、Ｆｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効量であって、ヒトにおける免疫寛容を誘導する、組成物またはキメラタンパク質の前記有効量を投与すること；および（２）免疫寛容の誘導後に、ヒトに、組成物またはキメラタンパク質の漸減レジメンを投与することを含む、前記方法に関する。ある特定の実施形態では、免疫寛容の誘導は、ヒトにおける阻害抗体の力価が約０．６ＢＵ未満である場合に生じる。ある特定の実施形態では、免疫寛容の誘導は、ヒトにおける阻害抗体の力価が約０．６ＢＵ未満であり、血漿中でモニタリングされる凝固因子活性が６０％の回復率である場合に生じる。本開示の一部の実施形態では、方法は、（３）漸減レジメンの後、ヒトに、予防用量の凝固因子を投与することをさらに含む。ある特定の態様では、ヒトは、凝固因子に対する以前の免疫寛容療法を用いて処置されていない。凝固因子と、Ｆｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を、ヒトがインヒビター免疫応答を生じたと決定された任意の時間に、例えば、ヒトにおける阻害免疫応答のレベルを測定した後に、ヒトに投与することができる。他の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質を、インヒビター免疫応答の発生を防止するために１つまたはそれ以上のインヒビター免疫応答を未だ生じていないヒトに投与することができる。一部の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質を、インヒビター免疫応答を生じる可能性が高いヒト（例えば、家族歴、遺伝的素因、またはバイオマーカーの指示）に投与する。一部の実施形態では、方法は、阻害免疫応答のレベルまたは投与前にインヒビター免疫応答を生じる可能性を測定することをさらに含む。一部の実施形態では、凝固因子と、Ｆｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を、ヒトがインヒビター免疫応答を生じたか、またはヒトがインヒビター免疫応答を生じる可能性を有すると決定された後、例えば、ヒトにおける阻害免疫応答のレベルまたはインヒビター免疫応答を生じる可能性を測定した後、約１日未満、約２日未満、約３日未満、約４日未満、約５日未満、約６日未満、約７日未満、約２週未満、約３週未満、約４週未満、約２カ月未満、約３カ月未満、約４カ月未満、約５カ月未満、約６カ月未満、約１年未満、約２年未満、約３年未満、約４年未満、または約５年未満でヒトに投与する。ある特定の実施形態では、凝固因子と、Ｆｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を、ヒトがインヒビター免疫応答を生じたか、またはヒトがインヒビター免疫応答を生じる可能性を有すると決定された直後に、例えば、ヒトにおける阻害免疫応答のレベルまたはインヒビター免疫応答を生じる可能性を測定した後に、ヒトに投与する。特定の実施形態では、凝固因子と、Ｆｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を、ヒトがインヒビター免疫応答を生じたか、またはヒトがインヒビター免疫応答を生じる可能性を有すると決定された後、例えば、ヒトにおける阻害免疫応答のレベルまたはインヒビター免疫応答を生じる可能性を測定した後、約５分未満、約１０分未満、約１５分未満、約２０分未満、約３０分未満、約４５分未満、約１時間未満、約２時間未満、約３時間未満、約４時間未満、約５時間未満、約６時間未満、約７時間未満、約８時間未満、約９時間未満、約１０時間未満、約１１時間未満、約１２時間未満、約１８時間未満、または約２４時間未満でヒトに投与する。特定の実施形態では、凝固因子と、Ｆｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を、ヒトがインヒビター免疫応答を生じたか、またはヒトがインヒビター免疫応答を生じる可能性を有すると決定された後、例えば、ヒトにおける阻害免疫応答のレベルまたはインヒビター免疫応答を生じる可能性を測定した後、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約３０分、約４５分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１８時間、または約２４時間でヒトに投与する。ある特定の実施形態では、凝固因子と、Ｆｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を、ヒトがインヒビター免疫応答を生じたか、またはヒトがインヒビター免疫応答を生じる可能性を有すると決定された後、例えば、ヒトにおける阻害免疫応答のレベルまたはインヒビター免疫応答を生じる可能性を測定した後、約１日未満でヒトに投与する。
インヒビターのレベルがある特定のレベルよりも低くなるまで、またはインヒビターが検出可能でなくなるまで、免疫応答の誘導を継続することができる。ある特定の実施形態では、誘導期間は、少なくとも約２４週、少なくとも約２６週、少なくとも約２８週、少なくとも約３０週、少なくとも約３２週、少なくとも約３４週、少なくとも約３６週、少なくとも約３８週、少なくとも約４０週、少なくとも約４２週、少なくとも約４４週、少なくとも約４６週、少なくとも約４８週、少なくとも約５０週、少なくとも約５２週、少なくとも約５４週、少なくとも約５６週、少なくとも約５８週、少なくとも約６０週、少なくとも約６２週、少なくとも約６４週、少なくとも約６６週、少なくとも約６８週、少なくとも約７０週にわたって継続してもよい。特定の実施形態では、誘導期間は、６０週未満である。
本発明の方法によって処置される阻害免疫応答は、凝固因子処置の１つまたはそれ以上の効果に負に影響するヒトにおける任意の応答を含んでもよい。一部の実施形態では、阻害免疫応答は、凝固因子に対する阻害抗体、例えば、阻害抗ＦＶＩＩＩ抗体の産生を含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、凝固因子と、Ｆｃ領域またはそれをコードするポリヌクレオチドとを含む組成物またはキメラタンパク質の有効量を投与する前（例えば、ベースライン時）および後に、ヒトにおいて１つまたはそれ以上の阻害抗体の力価を測定することをさらに含む。一部の実施形態では、投与前（例えば、ベースライン時）の阻害抗体の力価は、少なくとも約０．６ベセスダ単位（ＢＵ）である。ある特定の実施形態では、投与前（例えば、ベースライン時）の阻害抗体の力価は、少なくとも約１ＢＵ、少なくとも約２ＢＵ、少なくとも約３ＢＵ、少なくとも約４ＢＵ、少なくとも約５ＢＵ、少なくとも約６ＢＵ、少なくとも約７ＢＵ、少なくとも約１０ＢＵ、少なくとも約２０ＢＵ、少なくとも約３０ＢＵ、少なくとも約４０ＢＵ、少なくとも約５０ＢＵ、少なくとも約１００ＢＵ、少なくとも約１５０ＢＵ、または少なくとも約２００ＢＵである。１つの特定の実施形態では、投与前（例えば、ベースライン時）の阻害抗体の力価は、少なくとも約５ＢＵである。
一部の実施形態では、本発明の方法は、投与前の阻害抗体の力価と比較して、ヒト対象における阻害抗体の力価を低下させる。ある特定の実施形態では、投与後の阻害抗体の力価は、約０．６ＢＵ未満である。一部の実施形態では、投与後の阻害抗体の力価は、約０．５ＢＵ未満、約０．４ＢＵ未満、約０．３ＢＵ未満、約０．２ＢＵ未満、または約０．１ＢＵ未満である。１つの特定の実施形態では、投与後の阻害抗体の力価は、０ＢＵである。他の実施形態では、投与後の阻害抗体の力価は、５ＢＵ未満、４ＢＵ未満、３ＢＵ未満、２ＢＵ未満、１ＢＵ未満、０．９ＢＵ未満、０．８ＢＵ未満、０．７ＢＵ未満、または０．６ＢＵ未満である。
一部の実施形態では、投与は、未処置の対照および凝固因子のみで処置されたヒトにおけるマクロファージ分化と比較して、Ｍ２様表現型に向かうヒトにおけるマクロファージの分化を増加させる。一部の実施形態では、Ｍ２様表現型は、ＮＲＦ２経路、ＰＰＡＲガンマ経路、またはＮＲＦ２経路とＰＰＡＲガンマ経路との両方の上方調節を含む。一部の実施形態では、Ｍ２様表現型は、ＣＤ２０６（ＭＲＣ１）の上方調節を含む。一部の実施形態では、Ｍ２様表現型は、ＡＲＧ１の上方調節を含む。一部の実施形態では、Ｍ２様表現型は、ＣＤ２０６（ＭＲＣ１）とＡＲＧ１の上方調節を含む。
一部の実施形態では、投与は、未処置の対象または凝固因子のみで処置された対象における１つまたはそれ以上の遺伝子の発現と比較して、ヒトにおける１つまたはそれ以上の遺伝子のより高い発現をもたらす。一部の実施形態では、投与は、Ｈｍｏｘ１、ＰＰＡＲガンマ、ＬＰＬ、ＥＧＲ２、ＳＬＣＯ４Ａ１、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）、酸化ストレス誘導増殖インヒビター１（ＯＳＧＩＮ１）、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、グルタチオン−ジスルフィドリダクターゼ（ＧＳＲ）、グルタミン酸−システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）、グルタミン酸−システインリガーゼ改変剤サブユニット（ＧＣＬＭ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンデヒドロゲナーゼ１（ＮＱＯ１）、脂肪酸結合タンパク質５（ＦＡＢＰ５）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＳＬＡＭファミリーメンバー３（ＳＬＡＭＦ３；リンパ球抗原９；ＬＹ９）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、マンノース受容体Ｃ−１型（ＭＲＣ１）、溶質運搬ファミリー１２メンバー４（ＳＬＣ１２Ａ）、ニューロピリン１（ＮＲＰ１）、およびその任意の組合せからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子のより高い発現をもたらす。一部の実施形態では、投与は、ＮＲＦ２経路の１つまたはそれ以上の遺伝子のより高い発現をもたらす。ある特定の実施形態では、ＮＲＦ２経路の１つまたはそれ以上の遺伝子は、ＨＯ−１、ＯＳＧＩＮ１、ＳＯＤ１、ＧＳＲ、ＧＣＬＣ、ＧＣＬＭ、ＮＱＯ１、およびその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、投与は、ＰＰＡＲガンマ経路の１つまたはそれ以上の遺伝子のより高い発現をもたらす。一部の実施形態では、ＰＰＡＲガンマ経路の１つまたはそれ以上の遺伝子は、ＰＰＡＲガンマ、ＬＰＬ、ＦＡＢＰ５、ＥＧＲ２、およびその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、投与は、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＳＬＡＭＦ３、ＳＬＡＭ７、ＭＲＣ１、ＳＬＣ１２Ａ、ＮＲＰ１、およびその任意の組合せからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子のより高い発現をもたらす。特定の実施形態では、投与は、未処置のヒトまたは凝固因子のみを投与されたヒトにおける１つまたはそれ以上の遺伝子の発現と比較して、１つまたはそれ以上の遺伝子のより高い発現をもたらし、ここで、その発現は、少なくとも約１．５倍高い、少なくとも約２倍高い、少なくとも約２．５倍高い、少なくとも約３倍高い、少なくとも約３．５倍高い、少なくとも約４倍高い、少なくとも約４．５倍高い、または少なくとも約５倍高い。
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の遺伝子の示差的発現は、投与後６時間未満で観察される。一部の実施形態では、示差的発現は、投与後１２時間未満で観察される。一部の実施形態では、示差的発現は、投与後１８時間未満で観察される。一部の実施形態では、示差的発現は、投与後２４時間未満で観察される。
一部の実施形態では、阻害免疫応答は、細胞媒介性免疫応答を含む。ある特定の実施形態では、細胞媒介性免疫応答は、サイトカインの放出を含む。一部の実施形態では、サイトカインは、免疫応答の増加と関連する任意のサイトカインである。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１６、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−１７、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロンα、インターフェロンγおよびその任意の組合せからなる群から選択される。一実施形態では、細胞媒介性免疫応答は、ＩＬ−１２の血清レベルの増加を含む。別の実施形態では、細胞媒介性免疫応答は、ＩＬ−４の血清レベルの増加を含む。別の実施形態では、細胞媒介性免疫応答は、ＩＬ−１７の血清レベルの増加を含む。別の実施形態では、細胞媒介性免疫応答は、ＴＮＦ−αの血清レベルの増加を含む。
様々な遺伝子変異が、阻害免疫応答を生じるリスクの増大と関連付けられている。例えば、ＴＮＦの構成的および誘導的転写レベルの増加と関連する、Ｈａｐ２内のＴＮＦ−α−３０８Ｇ＞Ａ多型は、阻害免疫応答を生じるリスクの増大と関連付けられている。全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ａｓｔｅｒｍａｒｋら、Ｂｌｏｏｄ １０８：３７３９〜３７４５頁（２００６）を参照されたい。かくして、一部の実施形態では、ヒトは、ＴＮＦ−αの増加と関連する遺伝的多型を有する。一部の実施形態では、多型は、ＴＮＦ−α−３０８Ｇ＞Ａ多型である。一部の実施形態では、ヒトは、ＩＬ１０遺伝子における多型、例えば、ＩＬ１０の分泌の増加と関連する多型を有する。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃを、ＩＬ１０遺伝子のプロモーター領域中のＩＬ１０Ｇマイクロサテライトの対立遺伝子１３４と共に対象に投与する。全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ａｓｔｅｒｍａｒｋら、Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０８：３７３９〜３７４５頁（２００６）を参照されたい。
一部の実施形態では、ヒトは、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）発現の低下と関連する遺伝的多型を有する。一部の実施形態では、ヒトは、ＤＲ１５（ＨＬＡ−ＤＲ１５）またはＤＱＢ０６０２ ＭＨＣ（主要組織適合複合体）クラスＩＩ分子に変異を有する。血友病を有する対象における阻害免疫応答の発生と関連する他のＭＨＣクラスＩＩ分子は、Ａ３、Ｂ７、Ｃ７、ＤＱＡ０１０２、Ｃ２、ＤＱＡ０１０３、ＤＱＢ０６０３、およびＤＲ１３である（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｅ．Ｃ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍｅｒｃｈａｎ ＆ Ｃ．Ａ．Ｌｅｅ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｔｄ．、２００２を参照されたい）。
一部の実施形態では、本開示の方法は、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドを用いた以前の処置後の対象における１つまたはそれ以上のサイトカインのレベルと比較して、対象における１つまたはそれ以上のサイトカインのレベルを低下させる。別の実施形態では、本開示の方法は、投与前の対象における１つまたはそれ以上のサイトカインのレベルと比較して、対象における１つまたはそれ以上のサイトカインのレベルを低下させる。他の実施形態では、１つまたはそれ以上の寛容原性分子の発現は、投与前の１つまたはそれ以上の寛容原性分子の発現レベルと比較して、本開示の方法の投与後に増加する。ある特定の実施形態では、１つまたはそれ以上の寛容原性分子は、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＩＬ−３５、ＩＤＯ−１、およびその任意の組合せから選択される。
他の実施形態では、免疫応答は、出血傾向の増大、高い凝固因子消費、凝固因子療法に対する反応の欠如、凝固因子療法の効能の低下、凝固因子の半減期の短縮、およびその任意の組合せからなる群から選択される臨床症状を含む。ある特定の実施形態では、免疫応答は、出血傾向の増大、高い凝固因子消費、凝固因子療法に対する反応の欠如、凝固因子療法の効能の低下、血漿中でモニタリングされる凝固因子活性の回復の低下、凝固因子の半減期の短縮、およびその任意の組合せからなる群から選択される臨床症状を含む。
ある特定の実施形態では、ヒトは、阻害免疫応答を有すると以前に診断されている。そのような診断を、当業界で公知の任意の方法を使用して行うことができる。例えば、ヒトが、以下の１つまたはそれ以上：（ａ）０．６ＢＵより高いか、またはそれと等しい凝固因子に対する阻害抗体の力価；（ｂ）ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−１７、およびＴＮＦ−αからなる群から選択される１つまたはそれ以上のサイトカインの血清レベルの増加；（ｃ）出血傾向の増大；（ｄ）高い凝固因子消費；（ｅ）凝固因子療法に対する反応の欠如；（ｆ）凝固因子療法の効能の低下；（ｇ）凝固因子の半減期の短縮、ならびにその任意の組合せを有する場合、ヒトを、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩに対する免疫応答を有すると特徴付けることができる。１つの特定の実施形態では、ヒトが０．６ＢＵより高いか、またはそれと等しい凝固因子に対する阻害抗体の力価を有する場合、ヒトは凝固因子に対する免疫応答を有すると特徴付けられる。
一部の実施形態では、ヒトは、投与の少なくとも約１カ月前、少なくとも約２カ月前、少なくとも約３カ月前、少なくとも約４カ月前、少なくとも約５カ月前、少なくとも約６カ月前、少なくとも約７カ月前、少なくとも約８カ月前、少なくとも約９カ月前、少なくとも約１０カ月前、少なくとも約１１カ月前、少なくとも約１２カ月前、少なくとも約１３カ月前、少なくとも約１４カ月前、少なくとも約１５カ月前、少なくとも約１６カ月前、少なくとも約１７カ月前、少なくとも約１８カ月前、少なくとも約１９カ月前、少なくとも約２０カ月前、少なくとも約２１カ月前、少なくとも約２２カ月前、少なくとも約２３カ月前、少なくとも約２４カ月前、少なくとも約２７カ月前、少なくとも約３０カ月前、少なくとも約３３カ月前、少なくとも約３６カ月前、少なくとも約３９カ月前、少なくとも約４２カ月前、少なくとも約４５カ月前、少なくとも約４８カ月前、少なくとも約５１カ月前、少なくとも約５４カ月前、少なくとも約５７カ月前、少なくとも約６０カ月前、少なくとも約６年前、少なくとも約７年前、少なくとも約８年前、少なくとも約１０年前、少なくとも約１５年前、または少なくとも約２０年前に凝固因子に対する阻害免疫応答を生じていたと以前に診断されている。一実施形態では、ヒトは、投与の少なくとも約５年前に凝固因子に対する阻害免疫応答を生じていたと以前に診断されている。
一部の実施形態では、本開示の方法は、免疫寛容を誘導する標準治療方法と比較して改善された寛容までの時間を提供する。本明細書で使用される用語「寛容までの時間」とは、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質の第１の用量の投与と、ヒトにおける免疫寛容の発生との間の時間量を指す。寛容までの時間の減少は、限定されるものではないが、寛容を達成するのに必要とされる総経済的負担の軽減などの、ヒトに対する有意な利益を有してもよい。一部の実施形態では、寛容までの時間は、約１〜約２４週、約１〜約２３週、約１〜約２２週、約１〜約２１週、約２〜約２０週、約２〜約１９週、約２〜約１８週、約２〜約１７週、約３〜約１６週、約３〜約１５週、約３〜約１４週、約３〜約１３週、約４〜約１２週、約４〜約１１週、約４〜約１０週、約４〜約９週、約５〜約８週、約５〜約７週、約５〜約６週、約１〜約１２週、約１〜約１１週、約１〜約１０週、約１〜約９週、約１〜約８週、約１〜約７週、約１〜約６週、約１〜約５週、または約１〜約４週である。一部の実施形態では、寛容までの時間は、約７０週未満、約６５週未満、約６０週未満、約５８週未満、約５６週未満、約５４週未満、約５２週未満、約５０週未満、約４８週未満、約４６週未満、約４４週未満、約４２週未満、約４０週未満、約３８週未満、約３６週未満、約３４週未満、約３２週未満、約３０週未満、約２８週未満、約２６週未満、約２４週未満、約２３週未満、約２２週未満、約２１週未満、約２０週未満、約１９週未満、約１８週未満、約１７週未満、約１６週未満、約１５週未満、約１４週未満、約１３週未満、約１２週未満、約１１週未満、約１０週未満、約９週未満、約８週未満、約７週未満、約６週未満、約５週未満、約４週未満、約３週未満、約２週未満、または約１週未満である。ある特定の実施形態では、寛容までの時間は、約４〜約１２週である。一実施形態では、寛容までの時間は、約４週である。別の実施形態では、寛容までの時間は、約１２週である。一部の実施形態では、寛容までの時間は、約１０カ月未満である。一部の実施形態では、寛容までの時間は、約９カ月未満である。一部の実施形態では、寛容までの時間は、約８カ月未満である。一部の実施形態では、寛容までの時間は、約７カ月未満である。一部の実施形態では、寛容までの時間は、約６カ月未満である。一部の実施形態では、寛容までの時間は、約５カ月未満である。一部の実施形態では、寛容までの時間は、約４カ月未満である。一部の実施形態では、本開示の方法は、凝固因子のみを用いる処置後の寛容までの時間と比較して、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を用いる処置後にヒトにおけるより短い寛容までの時間をもたらす。
一部の実施形態では、免疫寛容の発生は、約０．６ＢＵ未満の凝固因子に対する阻害抗体の力価を特徴とする。一部の実施形態では、免疫寛容の発生は、約０．５ＢＵ未満の凝固因子に対する阻害抗体の力価を特徴とする。一部の実施形態では、免疫寛容の発生は、約０．４ＢＵ未満の凝固因子に対する阻害抗体の力価を特徴とする。一部の実施形態では、免疫寛容の発生は、約０．３ＢＵ未満の凝固因子に対する阻害抗体の力価を特徴とする。一部の実施形態では、免疫寛容の発生は、約０．２ＢＵ未満の凝固因子に対する阻害抗体の力価を特徴とする。一部の実施形態では、免疫寛容の発生は、約０．１ＢＵ未満の凝固因子に対する阻害抗体の力価を特徴とする。一部の実施形態では、免疫寛容の発生は、約０．０ＢＵの凝固因子に対する阻害抗体の力価を特徴とする。ある特定の実施形態では、阻害免疫抗体の力価は、２回の連続する測定において、例えば、４週間以内の２つの連続する週において観察される。
一部の実施形態では、免疫寛容の発生は、６６％を超える増分回復（例えば、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の増分回復）を特徴とする。本明細書で使用される場合、「増分回復」とは、輸注の１５〜３０分後のピークＦＶＩＩＩレベルを指す。
誘導期間および漸減期間が完了した後、対象を、キメラタンパク質の予防的処置に置くことができる。例示的な予防投薬レジメンは、４日毎に約５０ＩＵ／ｋｇのキメラタンパク質または３〜５日間隔で約２５ＩＵ／ｋｇ〜約６５ＩＵ／ｋｇのキメラタンパク質であってもよい。６歳未満の小児については、週２回、約５０ＩＵ／ｋｇのキメラタンパク質または３〜５日間隔で約２５ＩＵ／ｋｇ〜約６５ＩＵ／ｋｇのキメラタンパク質を与えることができる。ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｅｌｏｃｔａｔｅ．ｃｏｍ／＿ａｓｓｅｔｓ／ｐｄｆ／ＥＬＯＣＴＡＴＥ＿ｐｅｉ＿Ｊａｎｕａｒｙ２０１７．ｐｄｆで入手可能なＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標）の添付文書を参照されたい。
一部の実施形態では、本開示の方法を用いて処置されるヒトは、免疫刺激療法を受けているか、または最近受けたことがある。例えば、インヒビターは、インターフェロンによる処置を受けているＨＣＶ陽性血友病Ａ患者ならびに抗レトロウイルス療法と関連する免疫再構築症候群を有するＨＩＶ陽性血友病Ａ患者においても報告されている。Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｔ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ ＦＶＩＩＩ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ（２００６年２月２８日〜２００６年３月２日）を参照されたい。かくして、一部の実施形態では、ヒトは、インターフェロン療法を受けている。一部の実施形態では、ヒトは、抗ウイルス療法を受けている。一部の実施形態では、ヒトは、抗レトロウイルス療法を受けており、免疫再構築症候群を有している。
ある特定の実施形態では、ヒトは、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩに対する１５０曝露日（ＥＤ）未満を有していた。一実施形態では、ヒトは、５０ＥＤ未満を有していた。別の実施形態では、ヒトは、２０ＥＤ未満を有していた。
本開示の一部の態様は、それを必要とする対象における凝固因子に対するアレルギー反応またはアナフィラキシー反応の重症度または発生を低減する方法であって、対象に、凝固因子と、Ｆｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を投与することを含む、前記方法に関する。一部の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質の投与は、凝固因子に対するアナフィラキシー様反応の重症度を低減する。一部の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質の投与は、凝固因子に対するアレルギー反応の重症度を低減する。
ＩＩ．Ａ．キメラタンパク質
本明細書に開示される免疫寛容を誘導する方法は、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質に一般に適用可能であり、ここで、凝固因子は、任意の公知の凝固因子、その断片、またはそのバリアントであってよく、Ｆｃ領域は、任意の公知のＦｃ領域、その断片、またはそのバリアントであってよい。一部の実施形態では、凝固因子は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、またはその任意の組合せからなる群から選択される。したがって、ＦＶＩＩＩＦｃキメラタンパク質、およびその使用に関する本開示は、凝固因子部分と、Ｆｃ部分とを含む他のキメラタンパク質にも同等に適用可能である。任意の凝固因子または任意のその断片または任意のそのバリアントを、本開示の方法において使用することができる。同様に、任意のＦｃまたは任意のその断片または任意のそのバリアントを、本開示の方法において使用することができる。一部の特定例では、キメラタンパク質の凝固因子部分は、ＦＶＩＩＩである。
一部の実施形態では、凝固因子と、Ｆｃとは、別々のポリペプチド鎖上に存在する。一部の実施形態では、凝固因子と、Ｆｃとは、連結されていないか、または共有結合によって互いに結合している。
他の実施形態では、凝固因子は、凝固因子模倣体であってよい。凝固因子模倣体は、１つまたはそれ以上の凝固因子活性を示すことができる。例えば、抗体またはその抗原結合部分は、第ＩＸ因子と第Ｘ因子との両方に結合することによって、ＦＶＩＩＩのように作用することができる。抗体またはその抗原結合部分がＦｃ領域を含有する場合、そのような抗体またはその抗原結合部分を本発明の方法のために使用することができる。別の実施形態では、凝固因子は、ＦＶＩＩＩ活性を有するペプチドである。
これに関して、本開示は、一般に、ヒトにおける免疫寛容を誘導する方法であって、対象に、凝固因子とＦｃ部分とを含む組成物またはキメラタンパク質を投与することを含む、前記方法を提供する。
ＩＩ．Ａ．１．第ＶＩＩＩ因子
本明細書で使用される場合、本出願を通して「ＦＶＩＩＩ」と省略される「第ＶＩＩＩ因子」は、別途特定しない限り、凝固におけるその通常の役割において機能的なＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。かくして、ＦＶＩＩＩという用語は、機能的であるポリペプチドバリアントを含む。「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、ＦＶＩＩＩポリペプチド（もしくはタンパク質）またはＦＶＩＩＩと互換的に使用される。ＦＶＩＩＩ機能の例としては、限定されるものではないが、凝固を活性化する能力、第ＩＸ因子のためのコファクターとして作用する能力、またはＣａ２＋およびリン脂質の存在下で第ＩＸ因子とのテンナーゼ複合体を形成した後、第Ｘ因子を活性化型Ｘａに変換する能力が挙げられる。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスＦＶＩＩＩタンパク質であってもよい。さらに、ヒトおよび他の種に由来するＦＶＩＩＩ間の比較により、機能にとって必要とされる可能性がある保存された残基が同定された（Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：３１７〜２２頁（１９９８）；米国特許第６，２５１，６３２号）。多くの機能的断片、変異体および改変型と同様、完全長ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列が公知である。様々なＦＶＩＩＩアミノ酸およびヌクレオチド配列が、例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１５８９２９号Ａ１、第２０１４／０３０８２３０号Ａ１、および第２０１４／０３７００３５号Ａ１ならびに国際公開第ＷＯ２０１５／１０６０５２号Ａ１に開示されている。ＦＶＩＩＩポリペプチドとしては、例えば、完全長ＦＶＩＩＩ、完全長ＦＶＩＩＩ−Ｎ末端のＭｅｔ、成熟ＦＶＩＩＩ（−シグナル配列）、Ｎ末端に追加のＭｅｔを有する成熟ＦＶＩＩＩ、および／またはＢドメインが完全もしくは部分的に欠失したＦＶＩＩＩが挙げられる。ＦＶＩＩＩバリアントは、部分的欠失であるにしろ、完全な欠失であるにしろ、Ｂドメインの欠失を含む。
本明細書で使用される凝固因子またはキメラタンパク質中のＦＶＩＩＩ部分は、ＦＶＩＩＩ活性を有する。ＦＶＩＩＩ活性を、当業界で公知の任意の方法によって測定することができる。凝固系の機能を評価するためのいくつかの試験：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭアッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験（ＩＮＲを決定するためにも使用される）、フィブリノゲン試験（Ｃｌａｕｓｓ法によることが多い）、血小板数、血小板機能試験（ＰＦＡ−１００によることが多い）、ＴＣＴ、出血時間、混合試験（患者の血漿を正常な血漿と混合した場合に異常が是正されるかどうか）、凝固因子アッセイ、抗リン脂質抗体、Ｄ−二量体、遺伝子試験（例えば、第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ、プロトロンビン変異Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセル蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）、雑多な血小板機能試験、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧもしくはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリー（ＴＥＭ（登録商標）、例えば、ＲＯＴＥＭ（登録商標））、またはオイグロブリン溶解時間（ＥＬＴ）が利用可能である。
ａＰＴＴ試験は、「内因性」（接触活性化経路とも呼ばれる）経路と、共通凝固経路との両方の効能を測定する性能指標である。この試験は、市販の組換え凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの凝固活性を測定するために一般的に使用される。それは、外因性経路を測定する、プロトロンビン時間（ＰＴ）と共に使用される。
ＲＯＴＥＭ分析は、止血の全動力学：凝固時間、クロット形成、クロット安定性および溶解に関する情報を提供する。トロンボエラストメトリーにおける様々なパラメータは、血漿凝固系、血小板機能、線維素溶解、またはこれらの相互作用に影響する多くの因子の活性に依存する。このアッセイは、二次止血の完全な見解を提供することができる。
発色アッセイ機構は、活性化されたＦＶＩＩＩが、活性化された第ＩＸ因子、リン脂質およびカルシウムイオンの存在下で第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換を促進する、血液凝固カスケードの原理に基づく。第Ｘａ因子活性は、第Ｘａ因子に特異的なｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）基質の加水分解によって評価される。４０５ｎＭで測定されたｐ−ニトロアニリンの初期放出速度は、第Ｘａ因子活性に正比例し、かくして、試料中のＦＶＩＩＩ活性に正比例する。
発色アッセイは、ＦＶＩＩＩ ａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＳＳＣ） ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｔｓｉｓ（ＩＳＴＨ）によって推奨されている。１９９４年以来、発色アッセイは、ＦＶＩＩＩ濃縮液効力の割り当てのための欧州薬局方の参考方法でもあった。かくして、一実施形態では、ＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は、成熟ＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩ（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、もしくはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））と同等のＦＶＩＩＩ活性を有する。
別の実施形態では、本開示のＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は、成熟ＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩ（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、もしくはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））と同等の第Ｘａ因子生成速度を有する。
第Ｘ因子または第Ｘａ因子を活性化するために、活性化された第ＩＸ因子（第ＩＸａ因子）は、第Ｘ因子中の１個のアルギニン−イソロイシン結合を加水分解して、Ｃａ２＋、膜リン脂質、およびＦＶＩＩＩコファクターの存在下で第Ｘａ因子を形成する。したがって、ＦＶＩＩＩと第ＩＸ因子との相互作用は、凝固経路において重要である。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は、成熟ＦＶＩＩＩ配列を含むキメラタンパク質またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩ（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、もしくはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））と同等の速度で第ＩＸａ因子と相互作用することができる。
さらに、ＦＶＩＩＩは、フォンヴィレブランド因子に結合するが、循環中では不活性である。ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦに結合していない場合、急速に分解し、トロンビンの作用によってＶＷＦから放出される。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は、成熟ＦＶＩＩＩ配列を含むキメラタンパク質またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩ（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、もしくはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））と同等のレベルでフォンヴィレブランド因子に結合する。
ＦＶＩＩＩを、カルシウムおよびリン脂質の存在下で活性化されたプロテインＣによって不活化することができる。活性化されたプロテインＣは、Ａ１ドメイン中のアルギニン３３６の後で、ＦＶＩＩＩ重鎖を切断し、第Ｘ因子基質相互作用部位を破壊し、Ａ２ドメイン中のアルギニン５６２の後で切断し、Ａ２ドメインの解離を増強し、ならびに第ＩＸａ因子との相互作用部位を破壊する。この切断はまた、Ａ２ドメイン（４３ｋＤａ）を両断し、Ａ２−Ｎ（１８ｋＤａ）とＡ２−Ｃ（２５ｋＤａ）ドメインを生成する。かくして、活性化されたプロテインＣは、重鎖中の複数の切断部位を触媒することができる。一実施形態では、ＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は、成熟ＦＶＩＩＩ配列を含むキメラタンパク質またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩ（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、もしくはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））と同等のレベルで活性化されたプロテインＣによって不活化される。
他の実施形態では、ＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は、成熟ＦＶＩＩＩ配列を含むキメラタンパク質またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩ（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、もしくはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））と同等のｉｎ ｖｉｖｏでのＦＶＩＩＩ活性を有する。特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は、ＨｅｍＡマウス尾静脈離断モデルにおいて、成熟ＦＶＩＩＩ配列を含むキメラタンパク質またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩ（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、もしくはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））と同等のレベルでＨｅｍＡマウスを保護することができる。
本明細書で使用される場合、ＦＶＩＩＩの「Ｂドメイン」は、内部アミノ酸配列同一性およびトロンビンによるタンパク質分解的切断部位によって定義される、当業界で公知のＢドメインと同じであり、例えば、成熟ヒトＦＶＩＩＩの残基Ｓｅｒ７４１〜Ａｒｇ１６４８である。他のヒトＦＶＩＩＩドメインは、成熟ヒトＦＶＩＩＩと比較した、以下のアミノ酸残基：成熟ＦＶＩＩＩのＡ１、残基Ａｌａ１〜Ａｒｇ３７２；Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３〜Ａｒｇ７４０；Ａ３、残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｉｌｅ２０３２；Ｃ１、残基Ａｒｇ２０３３〜Ａｓｎ２１７２；Ｃ２、残基Ｓｅｒ２１７３〜Ｔｙｒ２３３２によって定義される。配列番号を参照せずに本明細書で使用される配列の残基番号は、別途指摘しない限り、シグナルペプチド配列（１９アミノ酸）を含まないＦＶＩＩＩ配列に一致する。ＦＶＩＩＩ重鎖としても知られる、Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列、残基Ｇｌｕ１６４９〜Ａｒｇ１６８９は、通常、ＦＶＩＩＩ軽鎖活性化ペプチドと呼ばれる。ブタ、マウスおよびイヌＦＶＩＩＩに関する、Ｂドメインを含む、全てのドメインの境界の位置も、当業界で公知である。一実施形態では、ＦＶＩＩＩのＢドメインは欠失している（「Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」または「ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ」）。ＢＤＤ ＦＶＩＩＩの例は、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）（組換えＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）である。１つの特定の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩバリアントは、成熟ＦＶＩＩＩのアミノ酸残基７４６〜１６４８の欠失を含む。
「Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」は、米国特許第６，３１６，２２６号、第６，３４６，５１３号、第７，０４１，６３５号、第５，７８９，２０３号、第６，０６０，４４７号、第５，５９５，８８６号、第６，２２８，６２０号、第５，９７２，８８５号、第６，０４８，７２０号、第５，５４３，５０２号、第５，６１０，２７８号、第５，１７１，８４４号、第５，１１２，９５０号、第４，８６８，１１２号、および第６，４５８，５６３号ならびに国際公開第ＷＯ２０１５１０６０５２号Ａ１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１０７３８）に開示された完全な、または部分的な欠失を有してもよい。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列は、米国特許第６，３１６，２２６号（米国特許第６，３４６，５１３号にも）の４列目、第４行〜５列目、第２８行および実施例１〜５に開示された欠失のいずれか１つを含む。別の実施形態では、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、Ｓ７４３／Ｑ１６３８ Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（ＳＱ ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）（例えば、アミノ酸７４４〜アミノ酸１６３７の欠失を有する第ＶＩＩＩ因子、例えば、成熟ＦＶＩＩＩのアミノ酸１〜７４３およびアミノ酸１６３８〜２３３２を有する第ＶＩＩＩ因子）である。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、米国特許第５，７８９，２０３号（米国特許第６，０６０，４４７号、米国特許第５，５９５，８８６号、および米国特許第６，２２８，６２０号）の２列目、第２６〜５１行および実施例５〜８に開示された欠失を有する。一部の実施形態では、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、米国特許第５，９７２，８８５号の１列目、第２５行〜第２列、第４０行；米国特許第６，０４８，７２０号の６列目、第１〜２２行および実施例１；米国特許第５，５４３，５０２号の２列目、第１７〜４６行；米国特許第５，１７１，８４４号の４列目、第２２行〜５列目、第３６行；米国特許第５，１１２，９５０号の２列目、第５５〜６８行、図２、および実施例１；米国特許第４，８６８，１１２号の２列目、第２行〜１９列目、第２１行および表２；米国特許第７，０４１，６３５号の２列目、第１行〜３列目、第１９行、３列目、第４０行〜４列目、第６７行、７列目、第４３行〜８列目、第２６行、および１１列目、第５行〜１３列目、第３９行；または米国特許第６，４５８，５６３号の４列目、第２５〜５３行に記載された欠失を有する。一部の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、ＷＯ９１／０９１２２に記載されたように、Ｂドメインの多くの欠失を有するが、２つのポリペプチド鎖への一次翻訳産物のｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解的プロセッシングにとって必須であるＢドメインのアミノ末端配列を依然として含有する。一部の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、アミノ酸７４７〜１６３８の欠失、すなわち、実質的にＢドメインの完全な欠失を用いて構築される。Ｈｏｅｂｅｎ Ｒ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１３）：７３１８〜７３２３頁（１９９０）。Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子はまた、ＦＶＩＩＩのアミノ酸７７１〜１６６６またはアミノ酸８６８〜１５６２の欠失を含有してもよい。Ｍｅｕｌｉｅｎ Ｐ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２（４）：３０１〜６頁（１９８８）。本発明の一部であるさらなるＢドメイン欠失としては、アミノ酸９８２〜１５６２または７６０〜１６３９（Ｔｏｏｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８６）８３、５９３９〜５９４２頁））、７９７〜１５６２（Ｅａｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）２５：８３４３〜８３４７頁））、７４１〜１６４６（Ｋａｕｆｍａｎ（ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４１８７））、７４７〜１５６０（Ｓａｒｖｅｒら、ＤＮＡ（１９８７）６：５５３〜５６４頁））、７４１〜１６４８（Ｐａｓｅｋ（ＰＣＴ公開８８／００８３１））、または８１６〜１５９８または７４１〜１６４８（Ｌａｇｎｅｒ（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．（１９８８）８２：１６〜２５頁、ＥＰ２９５５９７））の欠失が挙げられる。１つの特定の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、成熟ＦＶＩＩＩのアミノ酸残基７４６〜１６４８の欠失を含む。別の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、成熟ＦＶＩＩＩのアミノ酸残基７４５〜１６４８の欠失を含む。
他の実施形態では、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、１つまたはそれ以上のＮ結合グリコシル化部位、例えば、完全長ＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸配列に対応する、残基７５７、７８４、８２８、９００、９６３、または場合により、９４３を保持するＢドメインの断片を含有するＦＶＩＩＩポリペプチドを含む。Ｂドメイン断片の例は、Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｚ．ら、Ｂｌｏｏｄ １０３（ａ）：３４１２〜３４１９頁（２００４）、Ｋａｓｕｄａ，Ａら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６：１３５２〜１３５９頁（２００８）、およびＰｉｐｅ，Ｓ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９：２２３５〜２２４２頁（２０１１）に開示されたＢドメインの２２６アミノ酸または１６３アミノ酸を含む（すなわち、Ｂドメインの最初の２２６アミノ酸または１６３アミノ酸が保持される）。さらに他の実施形態では、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩタンパク質の発現を改善するために残基３０９に点突然変異（ＰｈｅからＳｅｒへの）をさらに含む。さらに他の実施形態では、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインの一部を含有するが、１つまたはそれ以上のフリン切断部位（例えば、Ａｒｇ１３１３およびＡｒｇ１６４８）を含有しないＦＶＩＩＩポリペプチドを含む。Ｐｉｐｅ，Ｓ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９：２２３５〜２２４２頁（２０１１）を参照されたい。一部の実施形態では、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、成熟完全長ＦＶＩＩＩに対応するアミノ酸７６５〜１６５２中に欠失を含有する一本鎖ＦＶＩＩＩを含む（ｒＶＩＩＩ−ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎおよびＡＦＳＴＹＬＡ（登録商標）としても知られる）。米国特許第７，０４１，６３５号を参照されたい。前記欠失のそれぞれを、任意のＦＶＩＩＩ配列中で作製することができる。
上記および下記に考察されるように、多くの機能的ＦＶＩＩＩバリアントが公知である。さらに、ＦＶＩＩＩにおける数百個の非機能的変異が血友病患者において同定されており、ＦＶＩＩＩ機能に対するこれらの変異の効果が、それらが、置換の性質というよりはむしろ、ＦＶＩＩＩの３次元構造内にあることにより多く起因することが決定された（全体が参照により本明細書に組み入れられるＣｕｔｌｅｒら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９：２７４〜８頁（２００２））。さらに、ヒトと他の種に由来するＦＶＩＩＩ間の比較により、機能にとって必要とされる可能性がある保存された残基が同定された（全体が参照により本明細書に組み入れられるＣａｍｅｒｏｎら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：３１７〜２２頁（１９９８）；米国特許第６，２５１，６３２号）。
一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩとＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効量は、Ｆｃ領域を含まないＦＶＩＩＩの有効量と同等である。ある特定の実施形態では、有効量は、約２０ＩＵ／ｋｇ〜約４００ＩＵ／ｋｇである。ある特定の実施形態では、有効量は、約２０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、有効量は、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、有効量は、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約２００ＩＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、有効量は、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２００ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２９０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２４０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２３０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２２０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２１０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２９０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２４０ＩＵ／ｋｇ、約１４０ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約１３０ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約１２０ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約１１０ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇである。１つの特定の実施形態では、有効量は、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇである。別の実施形態では、有効量は、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２９０ＩＵ／ｋｇである。他の実施形態では、有効量は、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２４０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２３０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２２０ＩＵ／ｋｇ、または約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２１０ＩＵ／ｋｇである。
一部の実施形態では、有効量は、約５０ＩＵ／ｋｇ、約６０ＩＵ／ｋｇ、約７０ＩＵ／ｋｇ、約８０ＩＵ／ｋｇ、約９０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ、約１０５ＩＵ／ｋｇ、約１１０ＩＵ／ｋｇ、約１１５ＩＵ／ｋｇ、約１２０ＩＵ／ｋｇ、約１２５ＩＵ／ｋｇ、約１３０ＩＵ／ｋｇ、約１３５ＩＵ／ｋｇ、約１４０ＩＵ／ｋｇ、約１４５ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ、約１５５ＩＵ／ｋｇ、約１６０ＩＵ／ｋｇ、約１６５ＩＵ／ｋｇ、約１７０ＩＵ／ｋｇ、約１７５ＩＵ／ｋｇ、約１８０ＩＵ／ｋｇ、約１８５ＩＵ／ｋｇ、約１９０ＩＵ／ｋｇ、約１９５ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ、約２２５ＩＵ／ｋｇ、約２５０ＩＵ／ｋｇ、約２７５ＩＵ／ｋｇ、または約２００ＩＵ／ｋｇである。１つの特定の実施形態では、有効量は、約１５０ＩＵ／ｋｇ／ｋｇである。別の実施形態では、有効量は、約２００ＩＵ／ｋｇである。別の実施形態では、有効量は、約２５０ＩＵ／ｋｇである。別の実施形態では、有効量は、約５０ＩＵ／ｋｇである。別の実施形態では、有効量は、約１００ＩＵ／ｋｇである。
ＦＶＩＩＩと、Ｆｃ領域またはその断片とを含むキメラタンパク質を投与する場合の投薬間隔は、Ｆｃドメインを含まない凝固因子の等量にとって必要とされる投薬間隔よりも少なくとも約１．５倍長いものであってもよい。投薬間隔は、Ｆｃドメインを含まないＦＶＩＩＩの等量にとって必要とされる投薬間隔よりも、少なくとも約１．５〜６倍長い、１．５倍〜５倍長い、１．５倍〜４倍長い、１．５倍〜３倍長い、または１．５倍〜２倍長いものであってもよい。
一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩとＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効用量は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、または約２４日の投薬間隔でヒトに投与される。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩとＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効用量は、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、約３０日、約４５日、または約６０日の投薬間隔でヒトに投与される。
一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩと、Ｆｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質は、約１〜約１４日、約１〜約１３日、約１〜約１２日、約１〜約１１日、約１〜約１０日、約１〜約９日、約１〜約８日、約１〜約７日、約１〜約６日、約１〜約５日、約１〜約４日、約１〜約３日、約１〜約２日、約２〜約１４日、約３〜約１４日、約４〜約１４日、約５〜約１４日、約６〜約１４日、約７〜約１４日、約８〜約１４日、約９〜約１４日、約１０〜約１４日、約１１〜約１４日、約１２〜約１４日、約１３〜約１４日、または約５〜約１０日の投薬間隔で投与される。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩと、Ｆｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質は、約１〜約２１日、約１〜約２０日、約１〜約１９日、約１〜約１８日、約１〜約１７日、約１〜約１６日、約１〜約１５日、約１〜約１４日、約１〜約１３日、約１〜約１２日、約１〜約１１日、約１〜約１０日、約１〜約９日、約１〜約８日、約１〜約７日、約１〜約６日、約１〜約５日、約１〜約４日、約１〜約３日、約１〜約２日、約２〜約２１日、約３〜約２１日、約４〜約２１日、約５〜約２１日、約６〜約２１日、約７〜約２１日、約８〜約２１日、約９〜約２１日、約１０〜約２１日、約１１〜約２１日、約１２〜約２１日、約１３〜約２１日、約１４〜約２１日、約１５〜約２１日、約１６〜約２１日、約１７〜約２１日、約１８〜約２１日、約１９〜約２１日、約２０〜約２１日、約５〜約１０日、約１０〜約１５日、約１５〜約２０日の投薬間隔で投与される。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩと、Ｆｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質は、約２〜約６日の投薬間隔で投与される。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩと、Ｆｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質は、約３〜約５日の投薬間隔で投与される。
一実施形態では、有効量は、２５〜６５ＩＵ／ｋｇ（２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６２、６４、または６５ＩＵ／ｋｇ）であり、投薬間隔は、３〜５、３〜６、３〜７、３、４、５、６、７、または８日もしくはそれ以上の日数毎に１回、または週に３回、または週に３回以下である。別の実施形態では、有効量は、６５ＩＵ／ｋｇであり、投薬間隔は週に１回、または６〜７日毎に１回である。用量は、それらが必要である限り、反復的に投与することができる（例えば、少なくとも１０、２０、２８、３０、４０、５０、５２、または５７週、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０年）。１つの特定の実施形態では、有効用量は、約２５〜６５ＩＵ／ｋｇであり、投薬間隔は、３〜５日毎に１回である。
一実施形態では、有効量は、約２００ＩＵ／ｋｇであり、有効量は毎日投与される。別の実施形態では、有効量は約５０ＩＵ／ｋｇであり、有効量は週に約３回投与される。
ある特定の実施形態では、有効量または有効用量は、単回用量として投与される。一部の実施形態では、有効量または有効用量は、１日を通して２回またはそれ以上の用量で投与される。
一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩと、Ｆｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質は、寛容化が観察されるまで、１日１回、約２００ＩＵ／ｋｇの用量でヒトに投与される。一部の実施形態では、寛容化期間は、約４週〜約３６カ月延びる。一部の実施形態では、寛容化期間は、約４週、約５週、約６週、約７週、約８週、約９週、約１０週、約１１週、約１２週、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、約１２カ月、約１３カ月、約１４カ月、約１５カ月、約１６カ月、約１７カ月、約１８カ月、約１９カ月、約２０カ月、約２１カ月、約２２カ月、約２３カ月、約２４カ月、約２５カ月、約２６カ月、約２７カ月、約２８カ月、約２９カ月、約３０カ月、約３１カ月、約３２カ月、約３３カ月、約３４カ月、約３５カ月、または約３６カ月延びる。
ある特定の実施形態では、一度、免疫寛容が達成されたら、ヒトを漸減期間にかける。本明細書で使用される用語「漸減期間」および「漸減レジメン」は、１またはそれ以上の漸減用量が投与される投薬レジメンと指すように互換的に使用される。一部の実施形態では、漸減期間は、約２０ＩＵ／ｋｇ〜約４００ＩＵ／ｋｇの投与を含む。ある特定の実施形態では、漸減期間は、約２０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇの投与を含む。一部の実施形態では、漸減期間は、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇの投与を含む。一部の実施形態では、漸減期間は、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約１００ＩＵ／ｋｇの投与を含む。一部の実施形態では、漸減期間は、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２００ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２９０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２４０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２３０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２２０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２１０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２９０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２４０ＩＵ／ｋｇ、約１４０ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約１３０ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約１２０ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約１１０ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇの投与を含む。１つの特定の実施形態では、漸減期間は、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇの投与を含む。別の実施形態では、漸減期間は、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２９０ＩＵ／ｋｇの投与を含む。他の実施形態では、漸減期間は、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２８０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２７０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２６０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２４０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２３０ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２２０ＩＵ／ｋｇ、または約２００ＩＵ／ｋｇ〜約２１０ＩＵ／ｋｇの投与を含む。別の実施形態では、漸減レジメンは、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約１００ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。１つの特定の実施形態では、漸減レジメンは、約５０ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。別の実施形態では、漸減レジメンは、約１５０ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。別の実施形態では、漸減レジメンは、約１２５ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。別の特定の実施形態では、漸減レジメンは、約１００ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。別の実施形態では、漸減レジメンは、約９０Ｕ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。別の実施形態では、漸減レジメンは、約８０ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。別の実施形態では、漸減レジメンは、約７５ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。別の実施形態では、漸減レジメンは、約７０ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。別の実施形態では、漸減レジメンは、約６０ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。別の実施形態では、漸減レジメンは、約４０ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。別の実施形態では、漸減レジメンは、約３０ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。別の実施形態では、漸減レジメンは、約２５ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。別の実施形態では、漸減レジメンは、約２０ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。別の実施形態では、漸減レジメンは、約１０ＩＵ／ｋｇの組成物またはキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。
一部の実施形態では、漸減期間は、組成物またはキメラタンパク質の毎日の投与を含む。他の実施形態では、漸減期間は、約２日毎に１回、約３日毎に１回、約４日毎に１回、約５日毎に１回、約６日毎に１回、約７日毎に１回、約８日毎に１回、約９日毎に１回、約１０日毎に１回、約１１日毎に１回、約１２日毎に１回、約１３日毎に１回、または約１４日毎に１回の組成物またはキメラタンパク質の投与を含む。
ある特定の実施形態では、漸減用量は、１日１回、１日おきに１回、または毎週３回投与される。一部の実施形態では、漸減用量は、少なくとも約１週、少なくとも約２週、少なくとも約３週、少なくとも約４週、少なくとも約５週、少なくとも約６週、少なくとも約７週、少なくとも約８週、少なくとも約９週、少なくとも約１０週、少なくとも約１１週、少なくとも約１２週、少なくとも約１３週、少なくとも約１４週、少なくとも約１５週、少なくとも約１６週、少なくとも約１７週、少なくとも約１８週、少なくとも約１９週、少なくとも約２０週、少なくとも約２１週、少なくとも約２２週、少なくとも約２３週、少なくとも約２４週、少なくとも約２５週、少なくとも約２６週、少なくとも約２７週、少なくとも約２８週、少なくとも約２９週、少なくとも約３０週、少なくとも約３１週、または少なくとも約３２週にわたって投与される。特定の実施形態では、漸減用量は、約１６週またはそれ以下にわたって投与される。
ある特定の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質の用量は、漸減期間に徐々に減少し、投薬間隔は同じままである。他の実施形態では、投薬間隔は、漸減期間に増大し、組成物またはキメラタンパク質の用量は同じままである。一部の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質の用量は漸減期間に徐々に減少し、投薬間隔は徐々に増大する。
１つの特定の実施形態では、漸減期間は、１日おきに約２００ＩＵ／ｋｇのキメラ凝固因子の投与、次いで、用量および投薬間隔のさらなる減少を含む。他の実施形態では、１日に必要とされるキメラタンパク質の用量を、２用量、３用量、またはそれ以上の用量に分割することができる。例えば、約２００ＩＵ／ｋｇのキメラタンパク質を、１日２回、約１００ＩＵ／ｋｇ、１日３回の約７０ＩＵ／ｋｇ、または１日４回の約５０ＩＵ／ｋｇに分割することができる。
一部の実施形態では、漸減期間は、約１カ月〜約６カ月延びる。ある特定の実施形態では、漸減期間は、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、または約６カ月延びる。１つの特定の実施形態では、漸減期間は、約４カ月延びる。
ある特定の実施形態では、漸減レジメンは、免疫寛容後、第１週から第６週まで、１日１回、約１００ＩＵ／ｋｇのキメラタンパク質の漸減用量を投与することを含む。ある特定の実施形態では、漸減レジメンは、免疫寛容後、第６週から第１２週まで、１日おきに１回、約１００ＩＵ／ｋｇのキメラタンパク質の漸減用量を投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、漸減レジメンは、第１２週から第１６週まで、１日おきに１回、約５０ＩＵ／ｋｇのキメラタンパク質の漸減用量を投与することをさらに含む。
一部の実施形態では、漸減期間の後、フォローアップ期間がある。一部の実施形態では、フォローアップ期間は、組成物またはキメラタンパク質を用いる予防的処置を含む。一部の実施形態では、フォローアップ期間は、凝固因子を用いる予防的処置を含む。フォローアップ期間において使用される凝固因子を、Ｆｃ領域、およびその任意のバリアントを含む、または含まない、寛容化および漸減期間において使用される凝固因子から選択することができる。凝固因子としては、限定されるものではないが、天然の凝固因子、本明細書に記載の任意のバリアント（例えば、ＦＶＩＩＩのＢドメイン欠失バリアント）、および本明細書に記載の任意のキメラ凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ、ＦＶＩＩＩ−アルブミンなど）が挙げられる。ある特定の実施形態では、予防的処置は、例えば、組換えＦＶＩＩＩＦｃの認可された予防用量の投与を含む。一部の実施形態では、予防的処置は、２５〜６５ＩＵ／ｋｇ（２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６２、６４、または６５ＩＵ／ｋｇ）を含み、投薬間隔は、３〜５日、３〜６日、３〜７日、３日、４日、５日、６日、７日、もしくは８日もしくはそれ以上の日数毎に１回、または週に３回、または週に３回以下である。別の実施形態では、予防的処置は、６５ＩＵ／ｋｇを含み、投薬間隔は、週に１回、または６〜７日毎に１回である。別の実施形態では、予防的処置は、５０ＩＵ／ｋｇの凝固因子の用量を投与することを含む。別の実施形態では、予防的処置は、５０ＩＵ／ｋｇの凝固因子の用量を投与することを含み、投薬間隔は、週に約３回である。１つの特定の実施形態では、予防的処置は、約２５〜６５ＩＵ／ｋｇを含み、投薬間隔は、３〜５日毎に１回である。ある特定の実施形態では、フォローアップ期間は、約８カ月延びる。
１つの特定の実施形態では、キメラタンパク質、例えば、ＦＶＩＩＩＦｃは、免疫寛容が観察されるまで、例えば、ヒトにおける阻害抗体の力価が約０．６ＢＵ未満となるまで、約２００ＩＵ／ｋｇ／日で投与される；次いで、免疫寛容後、第１週から第６週までは１日１回、約１００ＩＵ／ｋｇのキメラタンパク質、例えば、ＦＶＩＩＩＦｃの漸減用量を投与すること、免疫寛容後、第６週から第１２週までは１日おきに１回、約１００ＩＵ／ｋｇのキメラタンパク質、例えば、ＦＶＩＩＩＦｃの漸減用量を投与すること、および第１２週から第１６週までは１日おきに１回、約５０ＩＵ／ｋｇのキメラタンパク質、例えば、ＦＶＩＩＩＦｃの漸減用量を投与することを含む、漸減レジメンが、免疫寛容後に投与される；次いで、漸減レジメンの後、約５０ＩＵ／ｋｇの凝固因子の予防用量が週に約３回投与される。
ＦＶＩＩＩとＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を、例えば、局所（例えば、経皮もしくは眼内）、経口、頬、経鼻、経膣、直腸または非経口投与を含む、任意の適切な投与様式のために製剤化することができる。
本明細書で使用される非経口という用語は、皮下、皮内、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、髄腔内、眼内、眼周囲、眼窩内、滑液嚢内および腹腔内注射、ならびに任意の類似する注射または輸注技術を含む。組成物はまた、例えば、懸濁液、エマルジョン、持続放出製剤、クリーム、ゲルまたは粉末であってもよい。組成物を、伝統的な結合剤およびトリグリセリドなどの担体と共に、坐剤として製剤化することができる。
一例では、医薬製剤は、液体製剤、例えば、緩衝化された等張性の水性溶液である。別の例では、医薬組成物は、生理的であるか、または生理条件に近いｐＨを有する。他の例では、水性製剤は、生理的であるか、または生理状態に近い浸透圧および塩分濃度を有する。それは、塩化ナトリウムおよび／または酢酸ナトリウムを含有してもよい。
一部の実施形態では、本発明の方法において使用されるＦＶＩＩＩとＦｃ領域とを含むキメラタンパク質は、（ａ）キメラタンパク質；（ｂ）スクロース、トレハロース、ラフィノース、アルギニン、またはその混合物から選択される１つまたはそれ以上の安定化剤；（ｃ）塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；（ｄ）Ｌ−ヒスチジン；（ｅ）塩化カルシウム；および（ｆ）ポリソルベート２０またはポリソルベート８０を含む医薬組成物中で製剤化される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、（ａ）５０ＩＵ／ｍｌ〜２５００ＩＵ／ｍｌのキメラタンパク質；（ｂ）１０ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのスクロース；（ｃ）８．８ｍｇ／ｍｌ〜１４．６ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；（ｄ）０．７５ｍｇ／ｍｌ〜２．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン；（ｅ）０．７５ｍｇ／ｍｌ〜１．５ｍｇ／ｍｌの塩化カルシウム二水和物；および（ｆ）０．０８ｍｇ／ｍｌ〜０．２５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０またはポリソルベート８０を含む。一部の例では、本開示の方法において使用される医薬組成物は、凍結乾燥される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、免疫細胞を含まない。一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞を含まない。
ある特定の実施形態では、本開示の方法を使用して処置されるヒトは、ＦＶＩＩＩ阻害免疫応答を以前に生じた。一部の実施形態では、以前の生じたＦＶＩＩＩ阻害応答は、組換えＦＶＩＩＩに応答して生じた。一部の実施形態では、以前に生じたＦＶＩＩＩ阻害応答は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＸＹＮＴＨＡ／ＲＥＦＡＣＴＯ ＡＢ（登録商標）、ＨＥＭＯＦＩＬ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＡＲＣ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＯＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＡＴＥ−ＤＶＩ（登録商標）、ＡＦＳＴＹＬＡ（登録商標）、およびＨＹＡＴＥ：Ｃ（登録商標）からなる群から選択されるＦＶＩＩＩ産物に応答して生じた。
一部の実施形態では、一度、阻害抗体の力価の低下に応じて寛容化に達したら、凝固因子の血清レベルを、約１００ＩＵ／ｄＬ〜約２００ＩＵ／ｄＬに維持する。一部の実施形態では、凝固因子の血清レベルが２００ＩＵ／ｄＬよりも高いか、またはそれと等しい場合、組成物またはキメラタンパク質の有効量を約１７５ＩＵ／ｋｇ／日に減少させる。ある特定の実施形態では、凝固因子の血清レベルが２００ＩＵ／ｄＬよりも高いか、またはそれと等しい場合、組成物またはキメラタンパク質の有効量を約１５０ＩＵ／ｋｇ／日に減少させる。ある特定の実施形態では、凝固因子の血清レベルが２００ＩＵ／ｄＬよりも高いか、またはそれと等しい場合、組成物またはキメラタンパク質の有効量を約１２５ＩＵ／ｋｇ／日に減少させる。ある特定の実施形態では、凝固因子の血清レベルが２００ＩＵ／ｄＬよりも高いか、またはそれと等しい場合、組成物またはキメラタンパク質の有効量を約１００ＩＵ／ｋｇ／日に減少させる。ある特定の実施形態では、凝固因子の血清レベルが２００ＩＵ／ｄＬよりも高いか、またはそれと等しい場合、組成物またはキメラタンパク質の有効量を約７５ＩＵ／ｋｇ／日に減少させる。ある特定の実施形態では、凝固因子の血清レベルが２００ＩＵ／ｄＬよりも高いか、またはそれと等しい場合、組成物またはキメラタンパク質の有効量を約５０ＩＵ／ｋｇ／日に減少させる。ある特定の実施形態では、凝固因子の血清レベルが２００ＩＵ／ｄＬよりも高いか、またはそれと等しい場合、組成物またはキメラタンパク質の有効量を約２５ＩＵ／ｋｇ／日に減少させる。
本開示のある特定の態様は、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、ヒトに、約２００ＩＵ／ｋｇの、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を投与することを含む、前記方法に関する。ある特定の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質は、１日おきに投与される。他の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質は、毎日投与される。
他の態様では、本開示は、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、ヒトに、約２０２ＩＵ／ｋｇの、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を投与することを含む、前記方法に関する。ある特定の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質は、毎日投与される。
他の態様では、本開示は、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、ヒトに、約１５０ＩＵ／ｋｇの、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を投与することを含む、前記方法に関する。ある特定の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質は、毎日投与される。
他の態様では、本開示は、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、ヒトに、約１３０ＩＵ／ｋｇの、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を投与することを含む、前記方法に関する。ある特定の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質は、毎日投与される。
他の態様では、本開示は、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、ヒトに、約１１５ＩＵ／ｋｇの、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を投与することを含む、前記方法に関する。ある特定の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質は、１日おきに投与される。
他の態様では、本開示は、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、ヒトに、約１００ＩＵ／ｋｇの、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を投与することを含む、前記方法に関する。ある特定の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質は、毎日投与される。他の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質は、週に３回投与される。
他の態様では、本開示は、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、ヒトに、約１０２ＩＵ／ｋｇの、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を投与することを含む、前記方法に関する。ある特定の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質は、１日おきに投与される。
他の態様では、本開示は、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、ヒトに、約９６ＩＵ／ｋｇの、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を投与することを含む、前記方法に関する。ある特定の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質は、毎日投与される。
他の態様では、本開示は、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、ヒトに、約８５ＩＵ／ｋｇの、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を投与することを含む、前記方法に関する。ある特定の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質は、毎日投与される。
他の態様では、本開示は、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、ヒトに、約５０ＩＵ／ｋｇの、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質を投与することを含む、前記方法に関する。ある特定の実施形態では、組成物またはキメラタンパク質は、週に３回投与される。
本開示のある特定の態様は、血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法であって、（１）ヒトに、約２００ＩＵ／ｋｇの、凝固因子とＦｃ領域とを含む組成物またはキメラタンパク質であって、ヒトにおいて免疫寛容を誘導する、前記組成物またはキメラタンパク質を投与すること；および（２）免疫寛容の誘導後、ヒトに、組成物またはキメラタンパク質の漸減レジメンを投与することを含む、前記方法に関する。
ＩＩ．Ａ．２ Ｆｃ
一部の実施形態では、本開示の組成物、キメラタンパク質、および／または凝固因子は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ；例えば、ＦｃＲｎ）に結合する、Ｆｃドメインまたはその一部を含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、例えば、凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の部分として、凝固因子に融合される。他の実施形態では、Ｆｃドメインは、凝固因子以外のポリペプチドに融合され、ここで、組成物は、（１）凝固因子および（２）Ｆｃドメインとさらなるポリペプチドとを含むキメラタンパク質を含む。Ｆｃドメインまたはその一部は、キメラタンパク質の薬物動態または薬力学特性を改善することができる。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインまたはその一部は、Ｆｃドメインまたはその一部に融合された分子の半減期を延長させる。
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」の、本明細書で使用される用語「Ｆｃドメイン」とは、別途特定しない限り、機能的ＦｃＲ（例えば、ＦｃＲｎ）結合パートナーを意味する。Ｆｃドメインは、天然のＩｇのＦｃドメインに対応する、すなわち、その２つの重鎖のそれぞれのＦｃドメインの二量体結合によって形成される、ポリペプチドの部分である。天然のＦｃドメインは、別のＦｃドメインとホモ二量体を形成する。対照的に、本明細書で使用される場合、用語「遺伝的に融合されたＦｃ領域」または「一本鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｖ領域）とは、単一のポリペプチド鎖内に遺伝的に連結された（すなわち、単一の連続する遺伝子配列中にコードされた）Ｆｃドメインを含む合成二量体Ｆｃ領域を指す。
一実施形態では、「Ｆｃ領域」とは、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基が１１４であるとした場合、ＩｇＧ中の残基２１６）で始まり、抗体のＣ末端で終わる単一のＩｇＧ重鎖の部分を指す。したがって、完全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。
Ｉｇ定常領域のＦｃ領域は、Ｉｇアイソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメイン、ならびにヒンジ領域を含んでもよい。ＩｇのＦｃ領域を含むキメラタンパク質は、安定性の増大、血清半減期の増大（Ｃａｐｏｎら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５頁）ならびに新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）などのＦｃ受容体への結合（米国特許第６，０８６，８７５号、第６，４８５，７２６号、第６，０３０，６１３号；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１）を含む、キメラタンパク質上でのいくつかの望ましい特性を付与する（これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、サルＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎの配列が公知である（Ｓｔｏｒｙら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３７７頁）。ＦｃＲｎ受容体は、比較的低いｐＨでＩｇＧに結合し（ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥなどの他のＩｇクラスではなく）、内腔中のＩｇＧを漿膜方向に活発に細胞間輸送し、次いで、間質液中に見出される比較的高いｐＨでＩｇＧを放出する。それは、肺および腸上皮（Ｉｓｒａｅｌら、１９９７、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９２：６９頁）、腎近位尿細管上皮（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２００２、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２：Ｆ３５８頁）ならびに鼻上皮、膣表面、および胆道系表面を含む、成体上皮組織（米国特許第６，４８５，７２６号、第６，０３０，６１３号、第６，０８６，８７５号；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１）中で発現される。
本発明において有用なＦｃ領域は、全ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲの完全な結合領域を含む他の断片を含む、ＦｃＲに特異的に結合することができる分子を包含する。例えば、ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶学に基づいて記載されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３７９頁）。ＦｃとＦｃＲｎとの主な接触領域は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの接続部に近い。Ｆｃ−ＦｃＲｎは全て、単一のＩｇ重鎖内にある。Ｆｃ領域は、全ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲｎの完全な結合領域を含むＩｇＧの他の断片を含む。主な接触部位は、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、および３１４ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、および４３３〜４３６を含む。ＩｇもしくはＩｇ断片、または領域のアミノ酸番号に対する参照は全て、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄに基づくものである。
特異的結合とは、生理的条件下で比較的安定的である複合体を形成する２つの分子を指す。特異的結合は、通常は中程度から高い能力と共に低い親和性を有する非特異的結合から区別されるように、高い親和性および低いから中程度の能力を特徴とする。典型的には、結合は、親和性定数ＫＡが１０６Ｍ−１より高いか、または１０８Ｍ−１より高い場合、特異的であると考えられる。必要に応じて、結合条件を変化させることにより、特異的結合に実質的に影響することなく、非特異的結合を減少させることができる。当業者であれば、日常的な技術を使用して、分子の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、ブロッキング剤（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などの適切な結合条件を最適化することができる。
ある特定の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、それにも拘わらずＦｃ領域に対してＦｃ結合特性を付与するのに十分である１つまたはそれ以上のトランケートされたＦｃ領域を含む。例えば、ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域の部分（すなわち、ＦｃＲｎ結合部分）は、ＥＵナンバリングによる、ＩｇＧ１のおよそアミノ酸２８２〜４３８を含む（主な接触部位は、ＣＨ２ドメインのアミノ酸２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、および３１４ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、および４３３〜４３６である）。かくして、本発明のＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合部分を含むか、またはそれからなってもよい。
ＦｃＲ結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプの重鎖に由来してもよい。一実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の抗体に由来するＦｃＲ結合部分が使用される。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ４の抗体に由来するＦｃＲ結合部分が使用される。
別の実施形態では、「Ｆｃ領域」は、Ｆｃドメインの、またはＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒンジ（例えば、上、中央、および／もしくは下ヒンジ領域）ドメイン（ＥＵナンバリングによる抗体Ｆｃ領域のおよそアミノ酸２１６〜２３０）、ＣＨ２ドメイン（ＥＵナンバリングによる抗体Ｆｃ領域のおよそアミノ酸２３１〜３４０）、ＣＨ３ドメイン（ＥＵナンバリングによる抗体Ｆｃ領域のおよそアミノ酸３４１〜４３８）、ＣＨ４ドメイン、またはそのバリアント、部分、もしくは断片のうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、完全なＦｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したヒンジドメイン（またはその一部）、ＣＨ２ドメイン（またはその一部）に融合したヒンジドメイン（またはその一部）、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したＣＨ２ドメイン（またはその一部）、ヒンジドメイン（またはその一部）とＣＨ３ドメイン（またはその一部）の両方に融合したＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。さらに他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または部分）を欠く。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵ番号２２１〜４４７に対応するアミノ酸を含むか、またはそれからなる。
本明細書でＦ、Ｆ１、またはＦ２と示されるＦｃ領域を、いくつかの異なる供給源から取得することができる。一実施形態では、ポリペプチドのＦｃ領域は、ヒトＩｇに由来する。しかしながら、Ｆｃ領域は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、もしくはモルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク）種を含む、別の哺乳動物種のＩｇに由来してもよいことが理解される。さらに、Ｆｃドメインまたはその部分のポリペプチドは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意のＩｇクラスならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のＩｇアイソタイプに由来してもよい。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。
ある特定の実施形態では、Ｆｃバリアントは、野生型Ｆｃドメインを含むＦｃ領域によって与えられる少なくとも１つのエフェクター機能の変化（例えば、Ｆｃ領域がＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、もしくはＦｃγＲＩＩＩへの結合の改善または低下）、完全なタンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）、もしくは他のＦｃ結合パートナー（例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮ）に結合する能力、またはＦｃ領域が抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、もしくは補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣＣ）を誘発する能力の改善または低下）を付与する。他の実施形態では、Ｆｃバリアントは、操作されたシステイン残基を提供する。
本発明のＦｃ領域は、エフェクター機能および／またはＦｃＲもしくはＦｃＲｎ結合の変化（例えば、増強または低下）を与えることが知られる当業界で認識されたＦｃバリアントを用いてもよい。具体的には、本発明の結合分子は、例えば、国際ＰＣＴ公開ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、ＷＯ９６／１４３３９Ａ１、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、ＷＯ９８／２３２８９Ａ１、ＷＯ９９／５１６４２Ａ１、ＷＯ９９／５８５７２Ａ１、ＷＯ００／０９５６０Ａ２、ＷＯ００／３２７６７Ａ１、ＷＯ００／４２０７２Ａ２、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、ＷＯ０４／０４４８５９、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２、およびＷＯ０６／０８５９６７Ａ２；米国特許出願公開第２００７／０２３１３２９号、第２００７／０２３１３２９号、第２００７／０２３７７６５号、第２００７／０２３７７６６号、第２００７／０２３７７６７号、第２００７／０２４３１８８号、第２００７／０２４８６０３号、第２００７／０２８６８５９号、第２００８／００５７０５６号；または米国特許第５，６４８，２６０号；第５，７３９，２７７号；第５，８３４，２５０号；第５，８６９，０４６号；第６，０９６，８７１号；第６，１２１，０２２号；第６，１９４，５５１号；第６，２４２，１９５号；第６，２７７，３７５号；第６，５２８，６２４号；第６，５３８，１２４号；第６，７３７，０５６号；第６，８２１，５０５号；第６，９９８，２５３号；第７，０８３，７８４号；第７，４０４，９５６号、および第７，３１７，０９１号に開示された１つまたはそれ以上のアミノ酸位置に変化（例えば、置換）を含んでもよい。一実施形態では、特異的変化（例えば、当業界で開示された１つまたはそれ以上のアミノ酸の特異的置換）を、１つまたはそれ以上の開示されたアミノ酸位置に作製することができる。別の実施形態では、１つまたはそれ以上の開示されたアミノ酸位置での異なる変化（例えば、１つまたはそれ以上の当業界で開示されたアミノ酸位置の異なる置換）を作製することができる。
Ｆｃ領域を、部位特異的突然変異誘発などのよく認識された手順に従って改変して、ＦｃγＲＩＩＢおよび／またはＤＣ−ＳＩＧＮが結合する改変されたＦｃ断片またはその部分を得ることができる。そのような改変は、ＦｃγＲＩＩＢおよび／またはＤＣ−ＳＩＧＮ接触部位から離れた改変ならびにＦｃγＲＩＩＢおよび／またはＤＣ−ＳＩＧＮへの結合を保存する、またはさらには増強する接触部位内の改変を含む。例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｆｃγ１）中の以下の単一のアミノ酸残基：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ｐ３３１Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４Ａ、およびＫ４４７Ａを、ＦｃγＲＩＩＢおよび／またはＤＣ−ＳＩＧＮに対するＦｃ結合親和性の有意な喪失なく置換することができ、ここで、例えば、Ｐ２３８Ａは、位置番号２３８でアラニンによって置換された野生型プロリンを表す。例として、特定の実施形態は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除く、Ｎ２９７Ａ変異を含む。アラニンに加えて、他のアミノ酸を、上記で特定された位置で野生型アミノ酸に置換することができる。変異を、Ｆｃ中に単一に導入して、天然のＦｃと異なる１００個を超えるＦｃ領域を生じさせることができる。さらに、２個、３個、またはそれ以上のこれらの個々の変異の組合せを一緒に導入して、さらに数百個のＦｃ領域を生じさせることができる。さらに、本発明の構築物のＦｃ領域の１つを変異させ、構築部の他のＦｃ領域を全く変異させないか、またはその両方を、異なる変異を用いるが変異させることができる。
ある特定の上記変異は、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーに対して新しい機能を付与することができる。例えば、一実施形態は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除く、Ｎ２９７Ａを含む。この変異の効果は、免疫原性を低下させることによってＦｃ領域の循環半減期を増強すること、およびＦｃＲｎに対する親和性を損なうことなく、Ｆｃ領域がＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＩＡに結合できなくすることである（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら、１９９５、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６０：８４７頁；Ｆｒｉｅｎｄら、１９９９、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８：１６３２頁；Ｓｈｉｅｌｄｓら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１頁）。上記の変異から生じる新しい機能のさらなる例として、ＦｃＲｎに対する親和性を、一部の例では、野生型のものを超えて増加させることができる。この親和性の増加は、「オン」レートの増加、「オフ」レートの減少または「オン」レートの増加と「オフ」レートの減少の両方を反映してもよい。ＦｃＲｎに対する親和性の増加を与えると考えられる変異の例としては、限定されるものではないが、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａが挙げられる（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１頁）。
さらに、少なくとも３つのヒトＦｃガンマ受容体が、下ヒンジ領域内のＩｇＧ上の結合部位、一般的には、アミノ酸２３４〜２３７を認識すると考えられる。したがって、新しい機能および潜在的な免疫原性の減少の別の例は、例えば、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸２３３〜２３６「ＥＬＬＧ」を、ＩｇＧ２に由来する対応する配列「ＰＶＡ」に置き換えることによるような（１個のアミノ酸欠失を含む）、この領域の変異から生じてもよい。様々なエフェクター機能を媒介する、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩは、そのような変異が導入された場合、ＩｇＧ１に結合しないことが示されている。ＷａｒｄおよびＧｈｅｔｉｅ １９９５、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：７７頁およびＡｒｍｏｕｒら、１９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３頁。
一実施形態では、Ｆｃドメインまたはその一部は、米国特許第５，７３９，２７７号の配列番号３を含み、場合により、米国特許第５，７３９，２７７号の配列番号１１、１、２および３１から選択される配列をさらに含むポリペプチドである。
ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインまたはその一部は、ヘミグリコシル化される。例えば、２つのＦｃ領域を含むキメラタンパク質は、第１の、グリコシル化されたＦｃ領域（例えば、グリコシル化されたＣＨ２領域）と、第２の、無グリコシル化されたＦｃ領域（例えば、無グリコシル化されたＣＨ２領域）とを含有してもよい。一実施形態では、グリコシル化されたＦｃ領域と無グリコシル化されたＦｃ領域との間に、リンカーを置くことができる。別の実施形態では、Ｆｃ領域は完全にグリコシル化される、すなわち、Ｆｃ領域の全てがグリコシル化される。他の実施形態では、Ｆｃ領域は無グリコシル化されてもよい、すなわち、Ｆｃ部分はいずれもグリコシル化されない。
ある特定の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、Ｆｃドメインの抗原非依存的エフェクター機能、特に、タンパク質の循環半減期を変化させる、Ｆｃドメインまたはその一部（例えば、Ｆｃバリアント）に対するアミノ酸置換を含む。
そのようなタンパク質は、これらの置換を欠くタンパク質と比較した場合、ＦｃＲに対する結合の増加または減少を示し、したがって、それぞれ、血清中での半減期が増加または減少している。ＦｃＲに対する親和性が改善されたＦｃバリアントは、より長い血清半減期を有すると予想され、そのような分子は、投与されるポリペプチドの長い半減期が、例えば、慢性疾患または障害を処置するために望ましい哺乳動物を処置する方法における有用な適用を有する（例えば、米国特許第７，３４８，００４号、第７，４０４，９５６号、および第７，８６２，８２０号を参照されたい）。対照的に、ＦｃＲ結合親和性が減少したＦｃバリアントは、より短い半減期を有すると予想され、そのような分子も、例えば、短縮された循環時間が、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの診断的イメージングにとって有利である場合、または出発ポリペプチドが長期間にわたって循環中に存在する場合に毒性副作用を有する状況での哺乳動物への投与にとって有用である。ＦｃＲｎ結合親和性が減少したＦｃバリアントはまた、胎盤を通過する可能性が低く、かくして、妊娠女性における疾患または障害の処置においても有用である。さらに、ＦｃＲｎ結合親和性の減少が望ましい他の適用としては、脳、腎臓、および／または肝臓における局在化が望ましい適用が挙げられる。１つの例示的な実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、血管系から腎臓糸球体の上皮を通過する輸送の減少を示す。別の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、脳から血管腔への血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する輸送の減少を示す。一実施形態では、ＦｃＲ結合が変化したタンパク質は、Ｉｇ定常領域の「ＦｃＲ結合ループ」内に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ領域（例えば、１つまたは２つのＦｃ領域）を含む。ＦｃＲ結合ループは、一実施形態では、野生型、完全長Ｆｃ領域のアミノ酸残基２８０〜２９９（ＥＵナンバリングによる）を含む。他の実施形態では、ＦｃＲ結合親和性が変化した本発明のキメラタンパク質中のＩｇ定常領域またはその一部は、１５ÅのＦｃＲ「接触ゾーン」内に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ領域を含む。本明細書で使用される場合、１５ÅのＦｃＲｎ「接触ゾーン」という用語は、野生型、完全長Ｆｃ部分の以下の位置：２４３〜２６１、２７５〜２８０、２８２〜２９３、３０２〜３１９、３３６〜３４８、３６７、３６９、３７２〜３８９、３９１、３９３、４０８、４２４、４２５〜４４０（ＥＵナンバリング）の残基を含む。他の実施形態では、ＦｃＲ結合親和性が変化した本発明のＦｃドメインまたはその一部は、以下のＥＵ位置：２５６、２７７〜２８１、２８３〜２８８、３０３〜３０９、３１３、３３８、３４２、３７６、３８１、３８４、３８５、３８７、４３４（例えば、Ｎ４３４ＡまたはＮ４３４Ｋ）、および４３８のいずれか１つに対応するアミノ酸位置に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ領域を含む。ＦｃＲ結合活性が変化した例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み入れられる国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／０４７３２７号に開示されている。
本発明において使用されるＦｃ領域はまた、キメラタンパク質のグリコシル化を変化させる当業界で認識されたアミノ酸置換を含んでもよい。例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結されたキメラタンパク質のＦｃ領域は、グリコシル化（例えば、Ｎ−もしくはＯ−結合グリコシル化）の減少をもたらす変異を有するＦｃ領域を含んでもよいか、または野生型Ｆｃ部分の糖型の変化（例えば、低フコースもしくは無フコースグリカン）を含んでもよい。
一実施形態では、本発明のプロセッシングされていないキメラタンパク質は、本明細書に記載のＩｇ定常領域またはその一部から独立に選択される、２つまたはそれ以上のその構成要素Ｉｇ定常領域またはその一部を有する遺伝的に融合されたＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）を含んでもよい。一実施形態では、二量体Ｆｃ領域のＦｃ領域は同じである。別の実施形態では、少なくとも２つのＦｃ領域は異なる。例えば、本発明のタンパク質のＦｃ領域は、同じ数のアミノ酸残基を含むか、またはそれらは１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基（例えば、約５個のアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸残基）、約１０個の残基、約１５個の残基、約２０個の残基、約３０個の残基、約４０個の残基、もしくは約５０個の残基）によって長さが異なってもよい。さらに他の実施形態では、本発明のタンパク質のＦｃ領域は、１つまたはそれ以上のアミノ酸位置において配列が異なっていてもよい。例えば、少なくとも２つのＦｃ領域は、約５個のアミノ酸位置（例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸位置）、約１０個の位置、約１５個の位置、約２０個の位置、約３０個の位置、約４０個の位置、または約５０個の位置で異なっていてもよい。
一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、１個より多いポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、２個のポリペプチド鎖を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、凝固因子と第１のＦｃ領域とを含み、第２のポリペプチド鎖は、第２のＦｃ領域を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域は、共有結合によって結合する。一実施形態では、第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域は、ペプチド結合によって結合する。別の実施形態では、第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域は、ジスルフィド結合によって結合する。
１つの特定の実施形態では、キメラタンパク質は、第ＶＩＩＩ因子部分およびフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）部分を含み、ここで、ＦＶＩＩＩ部分は、ＦＶＩＩＩポリペプチドまたはその断片を含み、ＶＷＦ部分は、ＶＷＦポリペプチドまたはその断片を含み、ＦＶＩＩＩ部分は、第１のＦｃ領域に連結され、ＶＷＦ部分は、第２のＦｃ領域に連結され、第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域は、互いに結合する。ある特定の実施形態では、ＶＷＦ部分は、ＶＷＦのＤ’およびＤ３ドメインを含む。一実施形態では、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第１のポリペプチドと第２のポリペプチドの両方は、１つまたはそれ以上の半減期延長部分をさらに含む。
本開示の方法において使用されるキメラタンパク質を産生するためのＦｃ領域またはその一部を、いくつかの異なる供給源から取得することができる。一部の実施形態では、Ｆｃ領域またはその一部は、ヒトＩｇに由来する。しかしながら、Ｆｃ領域またはその一部は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、もしくはモルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク）種を含む、別の哺乳動物種のＩｇに由来してもよいことが理解される。さらに、Ｆｃ領域またはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意のＩｇクラスならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のＩｇアイソタイプに由来してもよい。一実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。
様々なＦｃ領域遺伝子配列（例えば、ヒトＦｃ遺伝子配列）が、公共的にアクセス可能な寄託物の形態で利用可能である。特定のエフェクター機能を有する（もしくは特定のエフェクター機能を欠く）、または免疫原性を低下させる特定の改変を有するＦｃ配列を選択することができる。抗体および抗体コード遺伝子の多くの配列が公開されており、好適なＦｃ領域配列を、当業界で認識された技術を使用してこれらの配列から誘導することができる。次いで、前記方法のいずれかを使用して得られた遺伝子材料を変化させるか、または合成して、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質を取得することができる。さらに、本発明の範囲は、定常領域ＤＮＡ配列の対立遺伝子、バリアントおよび変異を包含することが理解される。
Ｆｃまたはその一部の配列を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応および目的のドメインを増幅するように選択されるプライマーを使用してクローニングすることができる。抗体に由来するＦｃ領域またはその一部の配列をクローニングするために、ｍＲＮＡをハイブリドーマ、脾臓、またはリンパ細胞から単離し、ＤＮＡに逆転写し、抗体遺伝子をＰＣＲによって増幅することができる。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号；第４，９６５，１８８号；および例えば、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｉｎｎｉｓら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｈｏら、１９８９．Ｇｅｎｅ ７７：５１頁；Ｈｏｒｔｏｎら、１９９３．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０頁に詳細に記載されている。コンセンサス定常領域プライマーによって、または公開された重鎖および軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって、ＰＣＲを開始することができる。上記で考察された通り、ＰＣＲを使用して、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離することもできる。この場合、コンセンサスプライマーまたはマウス定常領域プローブなどのより大きい相同なプローブによってライブラリーをスクリーニングすることができる。抗体遺伝子の増幅にとって好適ないくつかのプライマーセットが当業界で公知である（例えば、精製された抗体のＮ末端配列に基づく５’プライマー（ＢｅｎｈａｒおよびＰａｓｔａｎ、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：１５０９頁）；ｃＤＮＡ末端の急速増幅（Ｒｕｂｅｒｔｉ，Ｆ．ら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７３：３３頁）；抗体リーダー配列（Ｌａｒｒｉｃｋら、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０：１２５０頁））。抗体配列のクローニングは、参照により本明細書に組み入れられる、１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号にさらに記載されている。
ＩＩ．Ｂ．半減期延長部分
一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、１つまたはそれ以上の半減期延長部分をさらに含む。凝固因子の半減期を、当業者には公知の任意の方法、例えば、血漿ＦＶＩＩＩ活性を検出するためのＦＶＩＩＩ活性アッセイ（発色アッセイもしくは１段階凝固ａＰＴＴアッセイ）または血漿ＦＶＩＩＩ抗原レベルを検出するためのＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡによって決定することができる。特定の実施形態では、凝固因子の凝固活性の半減期は、凝固１段法によって決定される。より特定の実施形態では、凝固因子の凝固活性の半減期は、ＨｅｍＡマウスまたはＦＶＩＩＩとフォンヴィレブランド因子二重ノックアウト（ＤＫＯ）マウスにおいて決定される。
ある特定の態様では、本発明の凝固因子の半減期を増加させる異種部分は、限定されるものではないが、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、ＸＴＥＮ配列、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリン、アルブミン結合部分などの異種ポリペプチド、またはこれらのペプチドの任意の断片、誘導体、バリアント、もしくは組合せを含む。他の関連する態様では、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、ポリシアル酸などの非ポリペプチド部分、またはこれらの部分の任意の誘導体、バリアント、もしくは組合せのための結合部位を含んでもよい。ある特定の実施形態では、半減期延長部分は、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンもしくはその断片、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、半減期延長部分は、ＸＴＥＮを含まない。他の実施形態では、半減期延長部分は、ＸＴＥＮを含む。
他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、１つまたはそれ以上のポリマーにコンジュゲートされる。ポリマーは、水溶性または非水溶性であってもよい。ポリマーを、凝固因子、Ｆｃまたは凝固因子もしくはＦｃにコンジュゲートされた他の部分に共有的または非共有的に結合することができる。ポリマーの非限定例は、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、またはポリ（アクリロイルモルホリン）であってもよい。例えば、ポリマーにコンジュゲートしたＦＶＩＩＩのさらなる型は、その全体が参照により開示される、米国得特許第７，１９９，２２３号に開示されている。
ある特定の態様では、本発明のキメラタンパク質は、それぞれ同じか、または異なる分子であってもよい、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の半減期延長部分を含んでもよい。
一部の実施形態では、半減期延長部分は、キメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、半減期延長部分は、凝固因子のＮ末端またはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、半減期延長部分は、ＦｃのＮ末端またはＣ末端に融合される。ある特定の実施形態では、半減期延長部分は、キメラタンパク質の凝固因子内に挿入される。
一部の実施形態では、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩまたはその一部を含み、半減期延長部分は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１５−０１５８９２９号Ａ１および／または国際公開第ＷＯ２０１５１０６０５２号Ａ１に開示された１つまたはそれ以上の位置でＦＶＩＩＩ内に挿入される。１つの特定の実施形態では、半減期延長部分は、ＦＶＩＩＩのＢドメイン（またはその断片）内に挿入される。１つの特定の実施形態では、半減期延長部分は、成熟ＦＶＩＩＩのアミノ酸残基７４５のすぐ下流でＦＶＩＩＩ内に挿入される。
ＩＩ．Ｂ．１．アルブミン
ある特定の態様では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、少なくとも１つのアルブミンポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、またはＨＡ）、その完全長形態で６０９アミノ酸のタンパク質は、血清の浸透圧の有意な割合を占め、内因性および外因性リガンドの担体としても機能する。本明細書で使用される用語「アルブミン」は、完全長アルブミンまたはその機能的断片、バリアント、誘導体、もしくは類似体を含む。アルブミンまたはその断片もしくはバリアントの例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許公開第２００８／０１９４４８１号Ａ１、第２００８／０００４２０６号Ａ１、第２００８／０１６１２４３号Ａ１、第２００８／０２６１８７７号Ａ１、もしくは第２００８／０１５３７５１号Ａ１またはＰＣＴ出願公開第２００８／０３３４１３号Ａ２、第２００９／０５８３２２号Ａ１、もしくは第２００７／０２１４９４号Ａ２に開示されている。
アルブミン結合ポリペプチド（ＡＢＰ）は、限定されるものではないが、アルブミンに結合することができる、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合抗体断片を含んでもよい。Ｋｒａｕｌｉｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３７８：１９０〜１９４頁（１９９６）およびＬｉｎｈｕｌｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１：２０６〜２１３頁（２００２）によって開示された、連鎖球菌プロテインＧに由来するドメイン３は、細菌アルブミン結合ドメインの例である。アルブミン結合ペプチドの例は、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７：３５０３５〜３５０４３頁（２００２）に開示されている。アルブミン結合抗体断片の例は、ＭｕｌｌｅｒおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：３１９〜３２６頁（２００７）；Ｒｏｏｖｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：３０３〜３１７頁（２００７）、およびＨｏｌｔら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｃｉ．、２１：２８３〜２８８頁（２００８）に開示されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
ある特定の態様では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、非ポリペプチド低分子、アルブミンに結合することができるそのバリアント、または誘導体のための少なくとも１個の結合部位を含む。例えば、キメラタンパク質は、１つまたはそれ以上の有機アルブミン結合部分を含んでもよい。そのようなアルブミン結合部分の例は、Ｔｒｕｓｓｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０：２２８６〜２２９２頁（２００９）によって開示されたような、２−（３−マレイミドプロパンアミド）−６−（４−（４−ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサノエート（「Ａｌｂｕ」タグ）である。
ＩＩ．Ｂ．２．ＸＴＥＮ
ある特定の態様では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、少なくとも１つのＸＴＥＮポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。本明細書で使用される場合、「ＸＴＥＮ配列」とは、生理的条件下で低い程度の構造を有するか、または二次もしくは三次構造を有さない配列と共に、主に小さい親水性のアミノ酸を含む、天然には存在しない、実質的に非反復的な配列を有する伸長した長さのポリペプチドを指す。キメラタンパク質パートナーと同様、ＸＴＥＮは、例えば、キメラタンパク質の凝固因子と融合した場合、またはその中に挿入された場合、ある特定の望ましい薬物動態特性、物理化学特性および薬学特性を提供する担体として働くことができる。そのような望ましい特性としては、限定されるものではないが、薬物動態パラメータおよび溶解度特性の増強が挙げられる。
本開示の方法において有用なキメラタンパク質の凝固因子と融合した、またはその中に挿入されたＸＴＥＮ配列は、キメラタンパク質に、１つまたはそれ以上の以下の有意な特性：コンフォメーションの可撓性、水性溶解度の増強、高い程度のプロテアーゼ耐性、低い免疫原性、哺乳動物受容体への低い結合、または水力学（またはＳｔｏｋｅｓ）半径の増大を提供することができる。ある特定の態様では、ＸＴＥＮ配列は、キメラタンパク質がｉｎ ｖｉｖｏに留まり、ＸＴＥＮを含まないキメラタンパク質と比較して長期間にわたって凝血促進活性を有するように、より長い半減期（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期）または曲線下面積（ＡＵＣ）の増大などの薬物動態特性を増大させることができる。
本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質中に挿入することができるＸＴＥＮ配列の例は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４号Ａ１、第２０１０／０３２３９５６号Ａ１、第２０１１／００４６０６０号Ａ１、第２０１１／００４６０６１号Ａ１、第２０１１／００７７１９９号Ａ１、もしくは第２０１１／０１７２１４６号Ａ１、または国際特許出願公開第ＷＯ２０１００９１１２２号Ａ１、第ＷＯ２０１０１４４５０２号Ａ２、第ＷＯ２０１０１４４５０８号Ａ１、第ＷＯ２０１１０２８２２８号Ａ１、第ＷＯ２０１１０２８２２９号Ａ１、第ＷＯ２０１１０２８３４４号Ａ２、もしくは第ＷＯ２０１５１０６０５２号Ａ１に開示されており、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
ＩＩ．Ｂ．３．ＶＷＦまたはその断片
ある特定の態様では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、少なくとも１つのＶＷＦポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。ＶＷＦ（Ｆ８ＶＷＦとしても公知である）は、血漿中に存在する大きい、多量体糖タンパク質であり、内皮（バイベル−パラーデ小体）、巨核球（血小板のα−顆粒）、および内皮下結合組織中で構成的に産生される。塩基性ＶＷＦ単量体は、２８１３アミノ酸のタンパク質である。全ての単量体は、特異的機能を有するいくつかの特異的ドメイン、Ｄ’／Ｄ３ドメイン（第ＶＩＩＩ因子に結合する）、Ａ１ドメイン（血小板ＧＰＩｂ−受容体、ヘパリン、および／またはおそらくコラーゲンに結合する）、Ａ３ドメイン（コラーゲンに結合する）、Ｃ１ドメイン（ＲＧＤドメインが、血小板インテグリンαＩＩｂβ３が活性化された場合にこれに結合する）、およびタンパク質のＣ末端の「システインノット」ドメイン（ＶＷＦが血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）およびβ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）と共有する）を含有する。
一実施形態では、ＶＷＦポリペプチドは、ＶＷＦ断片である。本明細書で使用される用語「ＶＷＦ断片」としては、限定されるものではないが、内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの結合を阻害することができる、Ｄ’ドメインとＤ３ドメインとを含む機能的ＶＷＦ断片が挙げられる。一実施形態では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、凝固因子、Ｆｃ領域、およびＶＷＦ断片を含み、ここで、凝固因子はＦＶＩＩＩを含み、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質に結合する。別の実施形態では、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質上のＶＷＦ結合部位を遮断することによって、ＦＶＩＩＩタンパク質と、内因性ＶＷＦとの相互作用を阻害する。ＶＷＦ断片は、ＶＷＦのこれらの活性を保持する誘導体、バリアント、変異体、または類似体を含む。ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片は、ＶＷＦのＤ’ドメインとＤ３ドメインとを含む。
ヒトＶＷＦの２８１３個の単量体アミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに受託番号ＮＰ＿０００５４３．２として報告されている。ヒトＶＷＦをコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎｂａｎｋにＮＭ＿０００５５２．３として報告されている。
ある特定の実施形態では、本明細書において有用なＶＷＦタンパク質をさらに改変して、ＦＶＩＩＩとのその相互作用を改善する、例えば、ＦＶＩＩＩに対する結合親和性を改善することができる。他の実施形態では、本発明にとって有用なＶＷＦタンパク質は、他の改変を有してもよく、例えば、タンパク質をペグ化、グリコシル化、ヘシル化、またはポリシアル化することができる。本開示の方法において有用な例示的なＶＷＦ配列は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／００２３９５９号Ａ１、第ＵＳ２０１５／０２６６９４３号Ａ１、および第ＵＳ２０１５／０１５８９２９号に提供されている。ある特定の実施形態では、ＶＷＦタンパク質またはその断片は、ＦｃＲｎ結合パートナーに融合されるか、またはそれと同時投与される。一部の実施形態では、ＶＷＦタンパク質またはその断片は、Ｆｃに融合されるか、またはＦｃもしくはＦｃを含むポリペプチドと同時投与される。一部の実施形態では、ＶＷＦタンパク質またはその断片は、アルブミンに融合されるか、またはアルブミンもしくはアルブミンを含むポリペプチドと同時投与される。
ＩＩ．Ｂ．４．ＣＴＰ
ある特定の態様では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットの少なくとも１つのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）またはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。ＣＴＰペプチドは、そのタンパク質の半減期を増加させることが公知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，７１２，１２２号を参照されたい。非限定的なＣＴＰペプチドは、参照により組み入れられる、米国特許出願公開第ＵＳ２００９／００８７４１１号Ａ１に開示されている。
ＩＩ．Ｂ．５．ＰＡＳ
ある特定の態様では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、少なくとも１つのＰＡＳペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。本明細書で使用される場合、ＰＡＳペプチドまたはＰＡＳ配列は、主にアラニンおよびセリン残基を含むか、または主にアラニン、セリン、およびプロリン残基を含むアミノ酸配列を意味し、そのアミノ酸配列は、生理的条件下でランダムコイルコンフォメーションを形成する。したがって、ＰＡＳ配列は、キメラタンパク質において異種部分の一部として使用することができる、アラニン、セリン、およびプロリンを含む、それから本質的になる、またはそれからなる構成要素、アミノ酸ポリマー、または配列カセットである。アミノ酸ポリマーはまた、アラニン、セリン、およびプロリン以外の残基がＰＡＳ配列中のマイナーな構成要素として付加された場合、ランダムコイルコンフォメーションを形成することもできる。「マイナーな構成要素」とは、アラニン、セリン、およびプロリン以外のアミノ酸を、ある特定の程度まで、例えば、約１２％まで、すなわち、ＰＡＳ配列の１００アミノ酸のうちの約１２個まで、約１０％まで、約９％まで、約８％まで、約６％、約５％、約４％、約３％、すなわち、約２％、または約１％のアミノ酸まで、ＰＡＳ配列中に付加することができることを意味する。アラニン、セリンおよびプロリンとは異なるアミノ酸を、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択することができる。生理的条件下で、ＰＡＳペプチドは、ランダムコイルコンフォメーションを形成し、それによって、本発明の組換えタンパク質に対するｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性の増大を媒介し、凝固促進活性を有する。
ＰＡＳペプチドの非限定例は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２９２１３０号Ａ１；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００８／１５５１３４号Ａ１；および欧州特許第ＥＰ２１７３８９０号に開示されている。
ＩＩ．Ｂ．６．ＨＡＰ
ある特定の態様では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、少なくとも１つのホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）ペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。ＨＡＰペプチドは、少なくとも５０アミノ酸長、少なくとも１００アミノ酸長、１２０アミノ酸長、１４０アミノ酸長、１６０アミノ酸長、１８０アミノ酸長、２００アミノ酸長、２５０アミノ酸長、３００アミノ酸長、３５０アミノ酸長、４００アミノ酸長、４５０アミノ酸長、または５００アミノ酸長を有する、グリシンの反復配列を含んでもよい。ＨＡＰ配列は、ＨＡＰ配列に融合された、または連結された部分の半減期を延長することができる。ＨＡＰＰＹ配列の非限定例としては、限定されるものではないが、（Ｇｌｙ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である）が挙げられる。一実施形態では、ｎは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。別の実施形態では、ｎは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００である。例えば、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ Ｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２０：２７３〜２８４頁（２００７）を参照されたい。
ＩＩ．Ｂ．７．トランスフェリン
ある特定の態様では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、少なくとも１つのトランスフェリンペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。任意のトランスフェリンを、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質と融合することができる。例として、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は、遺伝子複製の結果生じると考えられる、２個の主なドメイン、Ｎ（約３３０アミノ酸）およびＣ（約３４０アミノ酸）を有する、約７５ｋＤａ（グリコシル化を占めない）の６７９アミノ酸タンパク質である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ０３９８４７およびＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を参照されたい（これらは全てその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
トランスフェリンは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）媒介性エンドサイトーシスを介して鉄を輸送する。鉄がエンドソーム区画中に放出され、Ｔｆ−ＴｆＲ複合体が細胞表面に再循環した後、Ｔｆは鉄輸送の次のサイクルのために細胞外空間に放出し戻される。Ｔｆは、１４〜１７日を上回る長い半減期を有する（Ｌｉら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２３：２０６〜２０９頁（２００２））。トランスフェリン融合タンパク質は、半減期延長、がん療法のための標的送達、経口送達およびプロインスリンの持続的活性化について研究されている（Ｂｒａｎｄｓｍａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．、２９：２３０〜２３８頁（２０１１）；Ｂａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：７２９２〜７２９６頁（２００５）；Ｋｉｍら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、３３４：６８２〜６９２頁（２０１０）；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １５５：３８６〜３９２頁（２０１１））。
ＩＩ．Ｂ．８．ＰＥＧ
ある特定の態様では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、非ポリペプチド異種部分のための少なくとも１つの結合部位またはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。例えば、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、凝固因子および／またはＦｃ領域中の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に結合した１つまたはそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含んでもよい。
タンパク質のＰＥＧ化は、タンパク質と、少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子との間に形成されるコンジュゲートを指してもよい。ＰＥＧは、様々な分子量および平均分子量範囲で商業的に入手可能である。ＰＥＧ平均分子量範囲の典型例としては、限定されるものではないが、約２００、約３００、約４００、約６００、約１０００、約１３００〜１６００、約１４５０、約２０００、約３０００、約３０００〜３７５０、約３３５０、約３０００〜７０００、約３５００〜４５００、約５０００〜７０００、約７０００〜９０００、約８０００、約１００００、約８５００〜１１５００、約１６０００〜２４０００、約３５０００、約４００００、約６００００、および約８００００ダルトンが挙げられる。これらの平均分子量は、単に例として提供されるものであり、いかなる意味でも限定を意味するものではない。
本開示の方法において使用されるキメラタンパク質を、モノ−またはポリ−（例えば、２〜４個）ＰＥＧ部分を含むようにＰＥＧ化することができる。ＰＥＧ化は、当業界で公知の任意のＰＥＧ化反応によって実行することができる。ＰＥＧ化されたタンパク質産物を調製するための方法は、一般に、（ｉ）本発明のペプチドが１つまたはそれ以上のＰＥＧ基に結合するようになる条件下で、ポリペプチドと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と反応させること；および（ｉｉ）反応生成物を取得することを含むであろう。一般に、反応のための最適な反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、個別的に決定されるであろう。
当業者には利用可能ないくつかのＰＥＧ結合法が存在し、例えば、Ｍａｌｉｋ Ｆら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８〜３５頁（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３（２）：４〜１０頁（１９９２）；欧州特許公開第ＥＰ０４０１３８４号、第ＥＰ０１５４３１６号、および第ＥＰ０４０１３８４号；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ９２／１６２２１号および第ＷＯ９５／３４３２６号を参照されたい。非限定例として、ＦＶＩＩＩバリアントは、システイン置換を含有してもよく、システインをＰＥＧポリマーにさらにコンジュゲートすることができる。全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｍｅｉら、Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０〜２７９頁（２０１０）および米国特許第７，６３２，９２１号を参照されたい。
ＩＩ．Ｂ．９．ＨＥＳ
ある特定の態様では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、少なくとも１つのヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）ポリマーを含む。ＨＥＳは、天然に存在するアミロペクチンの誘導体であり、体内でアルファ−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳは、有意な生物学的特性を示し、診療所において血液量交換剤として、および血液希釈療法において使用される。例えば、Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒら、Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ ８：２７１〜２７８頁（１９８７）；およびＷｅｉｄｌｅｒら、Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４１：４９４〜４９８頁（１９９１）を参照されたい。
ＨＥＳは、分子量分布および置換度によって主に特徴付けられる。ＨＥＳは、１〜３００ｋＤ、２〜２００ｋＤ、３〜１００ｋＤ、または４〜７０ｋＤの平均分子量（重量平均）を有する。ヒドロキシエチルスターチはさらに、０．１〜３、０．１〜２、０．１〜０．９、または０．１〜０．８のモル置換度、およびヒドロキシエチル基に関して２〜２０の範囲のＣ２：Ｃ６置換比を示してもよい。約１３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳは、ＦｒｅｓｅｎｉｕｓからのＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）である。ＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）は、例えば、血液量減少の療法および予防のための治療適応において使用される体積交換のために用いられる、人工コロイドである。当業者に利用可能ないくつかのＨＥＳ結合法、例えば、上記の同じＰＥＧ結合法が存在する。
ＩＩ．Ｂ．１０．ＰＳＡ
ある特定の態様では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質は、少なくとも１つのポリシアル酸（ＰＳＡ）ポリマーを含む。ＰＳＡは、ある特定の細菌株によって、および哺乳動物において、ある特定の細胞中で産生されるシアル酸の天然に存在する非分枝ポリマーである。例えば、Ｒｏｔｈ Ｊ．ら（１９９３）Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ：Ｆｒｏｍ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｔｏ Ｍａｎ編、Ｒｏｔｈ Ｊ．，Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ Ｕ．、Ｔｒｏｙ Ｆ．Ａ．（ＢｉｒｋｈａｕｓｅｒＶｅｒｌａｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、３３５〜３４８頁を参照されたい。ＰＳＡを、限定的酸加水分解またはノイラミニダーゼを用いた消化、または天然の細菌由来型のポリマーの分画によって、ｎ＝約８０またはそれ以上のシアル酸残基からｎ＝２までの様々な重合度で産生することができる。ある特定の態様では、活性化されたＰＳＡを、凝固因子内、例えば、ＦＶＩＩＩ上、またはＦｃ領域内のシステインアミノ酸残基に結合させることもできる。例えば、米国特許第５，８４６，９５１号を参照されたい。
ＩＩ．Ｂ．１１．クリアランス受容体
ある特定の態様では、本開示の方法において使用されるキメラタンパク質の半減期を、キメラタンパク質の凝固因子がＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩクリアランス受容体の少なくとも１つの断片またはそのＦＶＩＩＩ結合断片、バリアント、もしくは誘導体を含む場合、延長することができる。低密度リポタンパク質関連タンパク質受容体ＬＲＰ１、またはその断片などの可溶型のクリアランス受容体の挿入は、ＦＶＩＩＩのクリアランス受容体への結合を遮断し、それによって、その半減期、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延長することができる。ＬＲＰ１は、ＦＶＩＩＩを含む、様々なタンパク質の受容体媒介性クリアランスに関与する６００ｋＤａの内在性膜タンパク質である。例えば、Ｌｅｎｔｉｎｇら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １６：６〜１６頁（２０１０）を参照されたい。他の好適なＦＶＩＩＩクリアランス受容体は、例えば、ＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体）、ＶＬＤＬＲ（超低密度リポタンパク質受容体）、およびメガリン（ＬＲＰ−２）、またはその断片である。例えば、Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎら、Ｂｌｏｏｄ １０６：９０６〜９１２頁（２００５）；Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎ、Ｂｌｏｏｄ １１６：５４３９〜５４４０頁（２０１０）；Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉら、Ｂｌｏｏｄ １１６：５６８８〜５６９７頁（２０１０）を参照されたい。
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
一部の態様では、本開示は、ヒトにおける免疫寛容の方法であって、ヒトに、凝固因子および／またはＦｃ領域をコードする、例えば、凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットの有効量を投与することを含み、ヒトが１つまたはそれ以上の以前の免疫寛容療法に反応しなかった、前記方法を提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットは、発現ベクターまたは発現ベクターのセットの中にある。ある特定の実施形態では、発現ベクターまたは発現ベクターのセットは、１つまたはそれ以上の宿主細胞の中にある。
本開示の方法において使用される、凝固因子および／またはＦｃ領域をコードする、例えば、凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単一のヌクレオチド配列、２つのヌクレオチド配列、３つのヌクレオチド配列、またはそれ以上であってもよい。一実施形態では、単一のヌクレオチド配列は、凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩポリペプチド）とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質をコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つのヌクレオチド配列、凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ）をコードする第１のヌクレオチド配列と、Ｆｃ領域をコードする第２のヌクレオチド配列とを含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つのヌクレオチド、凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ）とＦｃ領域とをコードする第１のヌクレオチド配列と、第２のＦｃ領域をコードする第２のヌクレオチド配列とを含む。ある特定の実施形態では、コードされたＦｃドメインは、発現後に共有結合を形成する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化される。
本明細書で使用される場合、発現ベクターとは、適切な宿主細胞中に導入された場合、挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必須エレメント、またはＲＮＡウイルスベクターの場合、複製および翻訳のための必須エレメントを含有する任意の核酸構築物を指す。発現ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、およびその誘導体を含んでもよい。
本明細書で使用される遺伝子発現制御配列は、それが作動可能に連結されたコード核酸の効率的な転写および翻訳を容易にする、プロモーター配列またはプロモーター−エンハンサー組合せなどの、任意の調節ヌクレオチド配列である。遺伝子発現制御配列は、例えば、構成的または誘導的プロモーターなどの、哺乳動物またはウイルスプロモーターであってもよい。構成的哺乳動物プロモーターとしては、限定されるものではないが、以下の遺伝子のためのプロモーター：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータ−アクチンプロモーター、および他の構成的プロモーターが挙げられる。真核細胞中で構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、および他のレトロウイルスに由来するプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。他の構成的プロモーターは、当業者には公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターは、誘導的プロモーターも含む。誘導的プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下での転写および翻訳を促進するために誘導される。他の誘導的プロモーターは、当業者には公知である。
本発明の目的のために、いくつかの発現ベクター系を用いることができる。これらの発現ベクターは、典型的には、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの完全な部分として宿主細胞中で複製可能である。発現ベクターは、限定されるものではないが、プロモーター（例えば、天然で関連する、または異種性のプロモーター）、エンハンサー、シグナル配列、スプライスシグナル、エンハンサーエレメント、および転写終結配列を含む、発現制御配列を含んでもよい。好ましくは、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換するか、またはトランスフェクトすることができるベクター中の真核プロモーター系である。発現ベクターはまた、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶもしくはＭＯＭＬＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用することもできる。その他は、内部リボソーム結合部位を有する多シストロン系の使用を含む。
一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列をトランスフェクトされた細胞の検出を可能にするための選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性）を含有する（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号）。トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つまたはそれ以上のマーカーを導入することによって、ＤＮＡをその染色体中に組み込んだ細胞を選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）または銅などの重金属に対する耐性を提供することができる。選択マーカー遺伝子を、発現させようとするＤＮＡ配列に直接連結するか、または同時形質転換によって同じ細胞中に導入することができる。
本開示の方法において使用されるキメラタンパク質の最適化された発現にとって有用なベクターの例は、ＮＥＯＳＰＬＡである（米国特許第６，１５９，７３０号）。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子およびリーダー配列を含有する。このベクターは、可変および定常領域遺伝子の組込み、細胞中へのトランスフェクション、次いで、Ｇ４１８含有培地中での選択およびメトトレキサート増幅の際に、抗体の非常に高レベルの発現をもたらすことがわかっている。ベクター系は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，７３６，１３７号および第５，６５８，５７０号にも教示されている。この系は、高い発現レベル、例えば、３０ｐｇ／細胞／日を超える発現レベルを提供する。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
他の実施形態では、本発明のポリペプチドを、多シストロン性構築物を使用して発現させる。これらの発現系では、多量体結合タンパク質の複数のポリペプチドなどの目的の複数の遺伝子産物を、単一の多シストロン性構築物から産生させることができる。これらの系は、真核宿主細胞中での比較的高いレベルのポリペプチドを提供するために、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有利に使用する。適合性のＩＲＥＳ配列は、本明細書にも組み入れられる米国特許第６，１９３，９８０号に開示される。
より一般には、一度、ポリペプチドをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されたら、発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入することができる。すなわち、宿主細胞を形質転換することができる。プラスミドの宿主細胞中への導入を、上記で考察されたような、当業者には周知の様々な技術によって達成することができる。形質転換された細胞を、キメラタンパク質の産生にとって適切な条件下で増殖させ、キメラタンパク質合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞選別分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
ここで本発明を詳細に説明してきたが、同じことは、例示のみのために本明細書に含まれ、本発明の限定を意図するものではない、以下の実施例を参照することによってより明確に理解されるであろう。
血友病Ａ（「第ＶＩＩＩ因子［ＦＶＩＩＩ］欠損」）は、稀な出血障害であり、最も一般的な型の血友病である。血友病Ａを有する患者の最も重篤な処置合併症は、ＦＶＩＩＩに対する阻害ＩｇＧ抗体の発生である。インヒビターは、輸注されたＦＶＩＩＩの急速なクリアランスおよび効能の顕著な低下または非存在をもたらす。ＦＶＩＩＩインヒビターバイパス剤が、インヒビターを有する患者における急性出血を処置するために使用されるが、インヒビターの根絶が長期的管理の目標である。
高用量のＦＶＩＩＩの頻繁な投与を使用する免疫寛容誘導（「ＩＴＩ」）療法は、抗原特異的寛容を達成することが示されている唯一の戦略である。ＩＴＩは通常、高応答性ＦＶＩＩＩインヒビター（≧５ＢＵ力価）を除去するために試みられる。いくつかの研究が、様々な用量および注射頻度を用いてＩＴＩの成功を達成する際の様々なＦＶＩＩＩ産物の効能を精査し、臨床実務においてＩＴＩ手法を支援するための国際コンセンサス推奨が発行されている。国際ＩＴＩ研究では、高用量群（「ＨＤ」）（２００ＩＵ／Ｋｇ／日）の患者は、低用量群（「ＬＤ」）の患者よりも有意に迅速に陰性力価および正常回復を達成した。ＨａｙおよびＤｉＭｉｃｈｅｌｅ、Ｂｌｏｏｄ １１９（６）：１３３５〜４４頁（２０１２）。ＨＤ患者はまた、ＬＤ患者よりも有意に少ない出血を経験し、この理由から、データ安全性モニタリング委員会（「ＤＳＭＢ」）は、彼らが安全性問題として出血を同定したため、試験終結を推奨した。高用量の２００ＩＵ／Ｋｇ／日は、「高リスク」患者（ピーク履歴力価＞２００ＢＵ、プレＩＴＩ力価＞１０ＢＵおよび／またはインヒビター診断以来５年を超えるものと定義される）における推奨用量である。ＩＴＩにおける延長半減期（「ＥＨＬ」）ｒＦＶＩＩＩＦｃの使用の精査にますます関心が高まっている。ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標）の名称で２０１４年に米国で、また、ＥＬＯＣＴＡ（登録商標）の名称で２０１５年に欧州で認可された。
ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合された組換えＢドメイン欠失（「ＢＤＤ」）第ＶＩＩＩ因子としてヒト細胞株（「ＨＥ２９３」）中で産生される。ＨＥＫにより産生されたタンパク質は、ハムスター（例えば、ＣＨＯ細胞）などの他の種に由来する細胞株において産生されたタンパク質とは対照的に、天然のヒトタンパク質と類似する翻訳後改変を有する。そのようなタンパク質では、翻訳後改変の結果生じる非ヒトグリカン（Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＧＮＡおよびガラクトース−アルファ−１，３−ガラクトース、アルファ−Ｇａｌなど）は、潜在的に免疫原性であり得る。ＮＧＮＡも、アルファ−Ｇａｌも、ｒＦＶＩＩＩＦｃ中には認められない。マウスモデルにより、ｒＦＶＩＩＩＦｃがＦＶＩＩＩに対する調節性Ｔ細胞応答を誘導することが示された（Ｂａｔｓｕｌｉ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ（２０１６）、２２（Ｓｕｐｐｌ．５）、３１〜３５頁を参照されたい）が、これは、一部の調査者に、ｒＦＶＩＩＩＦｃが、ｒＦＶＩＩＩよりも有効なＩＴＩ、具体的には、ＩＴＩの短縮を提供することができたことを示唆している。
目的
本試験の主な目的は、ＩＴＩ処置後の患者におけるｒＦＶＩＩＩＦｃを用いた寛容までの時間を記述することである。本試験はまた、ＩＴＩ処置の転帰を記述すること；ｒＦＶＩＩＩＦｃを用いて実施されたＩＴＩの成功後の一定期間にわたる再発率を記述すること；ＩＴＩの間およびｒＦＶＩＩＩＦｃを用いて実施されたＩＴＩの成功後の期間の間の併発出血を記述すること；ＩＴＩのために使用した場合のｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性および寛容性を記述すること；特定の生活の質（ＱｏＬ）問題を記述すること；およびｒＦＶＩＩＩＦｃ消費を証明することも目的とする。
本試験は、以前のＩＴＩ療法に失敗したインヒビターを用いて重篤な血友病Ａを有する患者におけるＩＴＩのためのｒＦＶＩＩＩＦｃの使用を記述することを目的とする。具体的には、本試験の主な目的は、ＩＴＩ処置後の免疫抑制剤の使用などの、寛容化の以前の試みに失敗した患者における、ｒＦＶＩＩＩＦｃを用いて実施されたＩＴＩ処置の転帰を記述することである。第２の目的およびその評価項目は、（１）ＩＴＩの成功までの時間の評価項目と共に、免疫抑制剤の使用などの、寛容化の以前の試みに失敗した患者における、ｒＦＶＩＩＩＦｃを用いて実施されたＩＴＩの寛容化までの時間を記述すること；（２）再発の発生の評価項目と共に、ｒＦＶＩＩＩＦｃを用いて実施されたＩＴＩの成功後の再発率を記述すること；（３）ＩＴＩの間およびｒＦＶＩＩＩＦｃを用いて実施されたＩＴＩの成功後の期間の間の併発出血を記述すること；（４）有害事象および／または注射部位反応の評価項目と共に、ＩＴＩのために使用した場合、ｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性および寛容性を記述すること；ならびに（５）ｒＦＶＩＩＩＦｃの評価項目と共に、ＥＬＯＣＴＡ（登録商標）を用いて実施されたＩＴＩにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃの消費を記述することを含む。
本試験では、重篤な血友病Ａおよび高力価のインヒビター（履歴ピーク≧５ベセスダ単位［ＢＵ］／ｍＬ）を有する全年齢の男性対象は、抗凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）同種抗体を根絶および中和するために、第１回の免疫寛容誘導（ＩＴＩ）療法を受けるための、組換え凝固因子ＦＶＩＩＩ Ｆｃ融合タンパク質（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を受ける。
参加者は、ベースライン訪問時に開始して、ＩＴＩ期間に最大４８週まで、１日１回の注射として、または調査者の裁量で１日あたり数回の注射に分割して、２００国際単位（ＩＵ）／キログラム（ｋｇ）の用量のｒＦＶＩＩＩＦｃを受けた。免疫寛容誘導（ＩＴＩ）の成功の基準を満たす参加者は、漸減期間に入り、第１週から第６週までは１日１回、その後、第１６週までは１日おきに１回、調査者の判断に従って調整された用量（５０または１００ＩＵ／ｋｇ）のｒＦＶＩＩＩＦｃ（静脈内投与される注射用粉末として）を受ける。
本試験の主要転帰尺度は、１２カ月までの時間枠でｒＦＶＩＩＩＦｃによる寛容化までの時間を記述することである。寛容化は、＜０．６ＶＵ／ｍｌのインヒビター力価、ＦＶＩＩＩ回復率＞６６％、および７時間以上のｔ１／２と定義される。
副次的転帰尺度は、免疫寛容誘導（ＩＴＩ）が成功した参加者の数である。ＩＴＩの成功は、ナイメゲン変法型ベセスダアッセイによる０．６ＢＵ／ｍＬ未満のインヒビターに関する陰性力価；ＩＵ／ｋｇあたり予想されるＩＲ ２ＩＵ／ｄＬの６６％を表す、２回の連続する決定におけるＩＵ／ｋｇあたり１．３国際単位／デシリットル（ＩＵ／ｄＬ）を超えるＦＶＩＩＩ増分回復（ＩＲ）；７時間以上の半減期（ｔ１／２）と定義される。ＩＴＩの成功を、４８週までの時間枠にわたってモニタリングする。
別の副次的転帰尺度は、再発を経験する参加者の数である。再発の基準（０．６ＢＵ／ｍＬを超えるインヒビター力価または寛容後の異常回復が達成されることと定義される）に達するＩＴＩが成功した参加者のパーセンテージを評価する。再発を、４８週までの時間枠にわたってモニタリングする。
別の副次的転帰尺度は、出血エピソードの数である。７２時間未満またはそれに等しい時間をおいた同じ位置または注射での出血の任意の症状の中で、出血の最初の兆候から開始して、出血のための最後の処置後７２時間以内に終了した出血エピソードを、同じ出血エピソードと考えた。出血エピソードを、１０４週までの時間枠にわたってモニタリングする。
別の副次的転帰尺度は、処置中に発生した有害反応（ＡＥ）および処置中に発生した重大な有害反応（ＳＡＥ）を示した参加者の数である。ＡＥは、この処置との因果関係を必ずしも有しない任意の望ましくない医学的出来事である。ＳＡＥは、任意の用量で：死をもたらす；調査者の所見において、参加者を死の差し迫ったリスクに置く（生命を脅かす事象）；入院患者の入院または現行の入院の延長を要する；持続的または有意な身体障害／無能力をもたらす；先天性異常／出生異常をもたらす、任意の望ましくない医学的出来事；調査者の見解において、参加者を危険にさらし得る、または定義に列挙された他の転帰の１つを防止するために介入を必要とし得る、任意の他の医学的に重要な事象である。ＡＥおよびＳＡＥを、約２年の時間枠にわたって測定する。
別の副次的転帰尺度は、仕事または学校から離れた日数である。学校または仕事を欠席した日数を、１０４週までの時間枠にわたって、記述的にまとめる。
別の副次的転帰尺度は、入院日数である。入院日数を、１０４週までの時間枠にわたって、記述的にまとめ、モニタリングする。
別の副次的転帰尺度は、計画された用量に対する投与された用量のパーセンテージとして定義される、処置レジメンの順守であり、１０４週までの時間枠にわたってモニタリングする。
別の副次的転帰尺度は、ｒＦＶＩＩＩＦｃの消費量である。消費量を、投与された試験処置の量に基づいて評価し、消費量を、１０４週までの時間枠にわたってモニタリングする。
本試験は、重篤な血友病Ａと診断された（医療記録から確認された）任意の年齢の男性参加者に向けられたものである。対象は、高力価のインヒビター（医療記録により、５生物学的単位／ミリリットル（ＢＵ／ｍＬ）より高いか、またはそれと等しい履歴ピーク）と診断され、対象は、任意の血漿由来または組換えの従来の、または半減期が延長されたＦＶＩＩＩで以前に処置されている。除外基準は、血友病Ａに加えて、任意の他の凝固障害；任意の以前のＩＴＩ療法；任意の組換え凝固因子ＶＩＩＩ Ｆｃ（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）投与と関連する過敏症もしくはアナフィラキシーの履歴；ローカルラボにより評価された、任意の腎機能異常（２．０ミリグラム／デシリットル［ｍｇ／ｄＬ］より高い血清クレアチニン）；および／またはローカルラボにより評価された、正常値上限（ＵＬＮ）の５倍を超える血清アラニンアミノトランスフェラーゼもしくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを有する対象を含む。
重篤な血友病Ａおよび高力価のインヒビター（ＨＴＩ；≧５ＢＵ）を有する患者における、ｒＦＶＩＩＩＦｃを用いたＩＴＩの非介入性遡及的カルテ審査を、２０１４年７月１日と２０１７年６月１日の間に米国およびカナダにおける１０箇所にわたって行った。一次療法または救援療法として、ＩＴＩのためにｒＦＶＩＩＩＦｃを用いた処置を開始した、ＨＴＩと共に重篤な血友病Ａを有する全年齢の男性患者を、反応に関係なく、含有させた。
規制当局の承認後、非特定化された臨床情報を、電子調査を介して収集した。ＩＴＩで初めて処置された患者を、以前に列挙した基準に従ってＩＴＩ失敗の高いリスクがあると考えた。陰性のベセスダ力価を、０．６ＢＵ／ｍＬ以下と定義した。寛容化を、陰性のベセスダ力価および正常なＦＶＩＩＩ回復（≧６６％）および半減期（≧６時間）と定義した。本試験の主要な目的は、ｒＦＶＩＩＩＦｃを使用するＩＴＩの臨床特性および転帰を報告することであった。結果を、記述統計学を使用してまとめる；推測統計分析は行わなかった。
結果
試験集団
１９人の患者を同定した。これらのうち、７人は、ＩＴＩを初めて受け、１２人は救援ＩＴＩを受けていた（表１および表２）。ｒＦＶＩＩＩＦｃＩＴＩの開始時の年齢中央値は、初めてのＩＴＩについては１．３歳（範囲：０．８〜４．３歳）であり、救援ＩＴＩ患者については６．４歳（範囲：１．６〜１２．６歳）であった。
初回ＩＴＩ患者は、１５１ＢＵの中央ピーク履歴インヒビター（ＩＴＩ前）力価（範囲：１１〜１１２６ＢＵ）を有していた；ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＩＴＩの開始時の中央インヒビター力価は、５２ＢＵであった（範囲：３〜１１２６ＢＵ）。ＩＴＩの開始時に、７人の初回ＩＴＩ患者のうちの６人は、１０ＢＵを超える力価を有していた；これらの６人のうちの４人は、５０ＢＵを超える力価を有していた。インヒビター診断からｒＦＶＩＩＩＦｃ ＩＴＩの開始までの中央時間は、４．４週（範囲：０〜４１週）であった。
救援ＩＴＩ患者については、他のＦＶＩＩＩ産物を用いた以前のＩＴＩ経過の平均数は、２．６（範囲：１〜５）であり、インヒビター診断からｒＦＶＩＩＩＦｃ ＩＴＩの開始までの中央時間は、５．５年（範囲：０．８〜１２年）であった。１９人の患者のうちの１８人に関するＦＶＩＩＩ遺伝子型を、表１および表２に示す。
初回ＩＴＩ患者の転帰
データ収集の時間で、初回ＩＴＩを受けている７人の患者のうちの４人（表１）が寛容化され、ｒＦＶＩＩＩＦｃを用いる予防に移行した。これらの４人の患者のうちの３人は、陰性のベセスダ力価および正常なＦＶＩＩＩの回復および半減期を達成した；そのようなものとして、彼らは、５、７、および９カ月で寛容化の標準的な定義を満たした。４番目の患者は、患者がｒＦＶＩＩＩＦｃ ＩＴＩの完了後１３カ月であり、彼がｒＦＶＩＩＩＦｃ予防上で陰性のインヒビターを継続的に有していたデータ収集の時点で、陰性のインヒビター力価および予防に移行したことに基づいて１４．８カ月で処置する医師によって寛容化されたと考えられた。正常な半減期もその時点で報告された。
Figure 2019536794
４人の患者のうち、陰性のベセスダ力価を達成する中央時間は、２７．７週（範囲：４．１〜６４週）であった。４人の寛容化された患者のうちの３人に関するＩＴＩレジメンは、４番目の患者に関する週３回の投薬（５０ＩＵ／ｋｇ）と比較して、毎日のｒＦＶＩＩＩＦｃ（８５〜２００ＩＵ／ｋｇ）からなっていた（表１）。寛容化の報告までの中央時間は、４人全ての患者について３３．９週（７．８カ月；範囲：２１〜６４週）であった。毎日のｒＦＶＩＩＩＦｃ（８５〜２００ＩＵ／ｋｇ）で処置された３人の患者について、寛容化は２９週（６．７カ月；範囲：２０．６〜３８週）かかったが、週あたり３回、５０ＩＵ／ｋｇで処置された４番目の患者は、６４週（１４．８カ月）で寛容化した。
残りの患者（ｎ＝３）のうち、２人は、ベセスダ力価が低下した（それぞれ、ＩＴＩの１８および５８週後に、３２ＢＵから１８ＢＵへの低下、および３７８ＢＵから２３ＢＵへの低下）。この評価の時点で、１人の患者は、ベセスダ力価が増加した（ＩＴＩの１５週後に３ＢＵから１６ＢＵに増加した）；この患者は、処置する医師の報告に従って、ＩＴＩを行ったか、中止し、ｒＦＶＩＩＩＦｃを中断し、コンプライアンスが低かった（表１）。７人全ての初回ＩＴＩ患者が、ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＩＴＩまたは予防を継続する。
救援ＩＴＩ患者の転帰
救援ＩＴＩを受けている１２人の患者のうちの７人（表２）が、ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＩＴＩに関してベセスダ陰性を最初に達成した。陰性力価を達成する中央時間は、１４．１週（範囲：３〜６７．６週）であった。これらの７人の患者のうちの３人は、ベセスダ陰性のままであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＩＴＩを継続するか、またはｒＦＶＩＩＩＦｃをやめて予防に移行する。陰性力価を最初に達成した他の４人の患者は、後に０．６ＢＵを超える力価を生じた。これらのうち、２人は、ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＩＴＩを継続し、２人は他の因子を用いるＩＴＩに移行した（表２）。
Figure 2019536794
ベセスダ陰性を達成する７人の患者のうち、３人はまた、３、１４、および６５週で正常なＦＶＩＩＩの回復を達成し、４番目の患者は２７週で正常なＦＶＩＩＩ半減期に達した。回復および半減期は、他者においては利用可能ではなかった（表２）。残りの５人の患者のうち、１人はベセスダ力価が低下し（１０週後に３６ＢＵから２２ＢＵに低下した）、４人のベセスダ力価はＩＴＩにありながら未変化のままであるか、または増加した（表２）。これらの５人の患者のうち、４人はｒＦＶＩＩＩＦｃ ＩＴＩを継続し、１人はＩＴＩから除外され、バイパス療法のみに置かれた。
投薬の転帰、バイパス剤の使用、および現在の処置状態
本試験において評価された患者集団は、広範囲／広いタイミングの用量を受けた（表１および表２）。毎日投与した高用量については、急速な陰性インヒビター力価に向かう傾向が見られた。１３０ＩＵ／ｋｇ以上の１日のｒＦＶＩＩＩＦｃ用量を受けた５人の患者のうちの５人（１人の初回ＩＴＩおよび４人の救援ＩＴＩ）は、２８週の中央値で陰性ベセスダ力価を達成した。１９人の患者のうちの１８人は、ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＩＴＩと同時にバイパス剤を使用した；１４人は主に予防にあり（９人はａＰＣＣを使用し、５人はｒＦＶＩＩａを使用した）、４人は要求に応じてｒＦＶＩＩａを用いて処置した。
全体として、１９人の患者のうちの１６人は、依然としてデータ収集の時点でｒＦＶＩＩＩＦｃ（予防またはＩＴＩ）にあった（表１および表２）。
安全性
血栓塞栓症などの有害事象は報告されなかった。６回の手術を実施し、それらの全てにおいて、ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＩＴＩの中断はなかった（膝滑膜切除術、頭蓋内神経外科的除去、および４回の留置ポート交換）。全てにおいてバイパス療法を使用した。手術中のインヒビター力価は、本試験については収集しなかった。
結論
まとめると、これらの結果は、ｒＦＶＩＩＩＦｃを用いるＩＴＩが可能であり、初回ＩＴＩを受けている多くの（ＩＴＩの失敗について高リスクである）患者において、および救援ＩＴＩを受けている一部の患者において、インヒビター根絶およびＩＴＩの成功をもたらすことができることを示している。さらに、ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＩＴＩは、そのリスクプロファイルにも拘わらず、初回ＩＴＩを受けている患者の大部分において、ベセスダ力価の急速な低下および寛容化までの迅速な時間を示した。救援ＩＴＩについては、これらの患者の多くがデータ収集の時点でｒＦＶＩＩＩＦｃを用いるＩＴＩを依然として受けていたため、結論付けることがより困難である。しかしながら、救援処置を受けている一部の患者は、彼らがベセスダ陰性を達成したか、またはインヒビター力価の有意な低下を示したという点で、治療利益を誘導すると考えられた。これは、より高いｒＦＶＩＩＩＦｃ用量（≧１３０ＩＵ／ｋｇ）を毎日投与した場合に特に当てはまった。
血友病Ａにおける因子を用いた交換療法の主な合併症は、重篤な血友病Ａを有する患者の約３０％におけるインヒビター（中和抗第ＶＩＩＩ因子抗体）の形成である。インヒビターの発生は、処置の効能ならびに罹患した個体の生活の質に影響する。免疫系が組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）にどのように応答するかのさらなる理解は、インヒビターを効率的に根絶するための血友病研究における進行中の努力である。半減期が延長されたｒＦＶＩＩＩ Ｆｃ融合タンパク質（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）は、出血エピソードを防止し、制御するための有効かつ良好に許容された療法である。この分子のＦｃ領域は、前臨床動物モデル（Ｋｒｉｓｈｎａｍｏｏｒｔｈｙ Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０１：３０〜３９頁（２０１６））において示されたように、また、免疫寛容誘導症例報告（Ｇｒｏｏｍｅｓ ＣＬら、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ ６３（５）：９２２〜２４頁（２０１６）；Ｍａｌｅｃ ＬＭら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ２２（６）：ｅ５５２〜ｅ５５４頁（２０１６）；Ｒａｇｎｉ ＭＶら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ２２（５）：ｅ４６２〜ｅ４６４頁（２０１６））によって示唆されたように、ｒＦＶＩＩＩ半減期の増加の原因となるだけでなく、抗原特異的寛容も促進することができる。
方法
末梢血由来ヒトＡＰＣまたはＴＨＰ−１単球を使用して、ＦｃγＲ結合、内在化、シグナル伝達およびサイトカイン産生に対するｒＦＶＩＩＩＦｃの効果、および遺伝子発現変化、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでのその後の相互作用およびＴ細胞に対する効果を精査した（図１）。
結果
ＦｃγＲの細胞表面発現の減少は、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置の際の内在化を示す（図２Ａ〜２Ｃ）。単球由来マクロファージおよび樹状細胞を、陽性対照としての西洋わさびペルオキシダーゼ免疫複合体（ＨＲＰ−ＩＣ）、陰性対照としてのヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）、および等モル濃度（２００ｎＭ）の組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）またはｒＦＶＩＩＩ Ｆｃ融合タンパク質（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）で２４時間処理した。Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）ＣＤ１６（図２Ａ）、ＣＤ３２（図２Ｂ）、およびＣＤ６４（図２Ｃ）の細胞表面発現を、フローサイトメトリーにより測定した（ｎ＝３；＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００５、他の処理に対するＨＲＰ−ＩＣの有意性は示さない）。ｒＦＶＩＩＩＦｃによる処理は、ｒＦＶＩＩＩによる処理後の細胞表面と比較して、ＣＤ１６（図２Ａ）、ＣＤ３２（図２Ｂ）、およびＣＤ６４（図２Ｃ）の細胞表面発現の減少と相関していた。
ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＦｃγＲと係合し、その後の炎症性サイトカイン産生なしに、単球およびマクロファージにおけるシグナル伝達を誘導する（図３Ａ〜３Ｃ）。ＴＨＰ−１単球細胞株、単球、末梢血単球由来マクロファージ、および末梢血単球由来樹状細胞を、ＨＲＰ−ＩＣ、ＩｇＧ１、ｒＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩＦｃで１５分間処理した（図３Ａ）。Ｓｙｋリン酸化を、ＭＳＤプラットフォームを使用して、細胞溶解物中で測定した（ｎ＝３〜７、＊Ｐ≦０．０５）。Ｓｙｋリン酸化を、ｒＦＶＩＩＩＦｃ（ＷＴ）、新生児Ｆｃ受容体に結合することができないｒＦＶＩＩＩＦｃ変異体（ＦｃＲｎ変異体）、またはＦｃγＲに結合することができないｒＦＶＩＩＩＦｃ変異体（ＦｃγＲ変異体）でマクロファージを処理した後に測定した（ｎ＝４、＊Ｐ≦０．０５）（図３Ｂ）。２４時間処理したマクロファージの炎症性サイトカイン産生を、ＭＳＤ ＥＬＩＳＡによって測定した（ｎ＝４、有意性は示さない）（図３Ｃ）。
ｒＦＶＩＩＩＦｃは、活性化および炎症性サイトカイン産生において役割を果たしている分子よりもむしろ、免疫調節に関与する分子をリン酸化する（表３および図４）。ｒＦＶＩＩＩＦｃで１５分間処理した単球由来マクロファージに由来する溶解物中のリン酸化されたタンパク質を、プロテオームプロファイラーホスホキナーゼおよびホスホ免疫受容体アレイを使用して問い合わせた。プロテオームプロファイラーアレイによって同定されたｒＦＶＩＩＩＦｃで処理されたマクロファージ中のリン酸化された分子の一覧を、表３に示す。阻害的シグナル伝達を担うホスファターゼのリン酸化を、ＭＳＤプラットフォームを使用して測定した（ｎ＝３；＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００５）（図４）。
Figure 2019536794
ｒＦＶＩＩＩＦｃは、寛容原性マクロファージに特徴的な遺伝子発現パターンを誘導する（図５Ａ〜５Ｇ）。探索的ＲＮＡ配列決定を、有意に下方調節された遺伝子（図５Ａ）について、および有意に上方調節された遺伝子（図５Ｂ）について、ＩｇＧ１、ｒＦＶＩＩＩ、またはｒＦＶＩＩＩＦｃで６時間処理した単球由来マクロファージ上で実施し（ｎ＝３）、ｒＦＶＩＩＩで処理された細胞と比較した、これらの細胞中で選択性を示した分子経路を精査するために、ｒＦＶＩＩＩＦｃにより上方調節された遺伝子に対して経路分析を行った（表４）。ＮＲＦ２およびＰＰＡＲ−ガンマ経路の様々な遺伝子、ならびに様々な他の免疫調節因子が上方調節されることがわかった（図５Ｈ）。ＮＲＦ２および脂質代謝経路の選択された遺伝子を、Ｑ−ＰＣＲによって検証した（ｎ＝８；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００５）（図５Ｃ〜５Ｇ）。さらに、ｒＦＶＩＩＩＦｃにより教育されたマクロファージは、特徴的なＭ２様表現型を示すことがわかった（図５Ｉ〜５Ｍ）。特に、ｒＦＶＩＩＩＦｃで処理されたマクロファージは、６時間後（図５Ｉ）および２４時間後（図５Ｊ）にｒＦＶＩＩＩで処理された細胞よりも高い相対的ＣＤ２０６発現を有し、ｒＦＶＩＩＩＦｃで処理されたマクロファージは、２４時間後（図５Ｍ）にｒＦＶＩＩＩで処理された細胞よりも高い相対的ＡＲＧ１発現を有していた。
Figure 2019536794
ｒＦＶＩＩＩＦｃで処理された抗原提示細胞は、ＡＰＣ−Ｔ細胞の細胞接触を必要とする調節性Ｔ細胞分化に影響する（図６Ａ〜６Ｃ）。末梢血単球由来マクロファージを、ＩｇＧ１、ｒＦＶＩＩＩ、またはｒＦＶＩＩＩＦｃで処理した後、同じドナーに由来する末梢血から単離されたナイーブなＣＤ４陽性Ｔ細胞と共に同時培養物に入れた。同時培養物中で６日後（図６Ａ）、調節性Ｔ細胞のパーセント（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）を、フローサイトメトリーを使用して定量した（ｎ＝４）（図６Ｂ）。ナイーブなＴ細胞を、ＩｇＧ１、ｒＦＶＩＩＩ、またはｒＦＶＩＩＩＦｃで予備処理したＡＰＣの条件化培地中で培養した場合の調節性Ｔ細胞のパーセントも定量した（ｎ＝４）（図６Ｃ）。
結論
ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＡＰＣ上のＦｃγ受容体を介して結合し、内在化およびシグナル伝達を誘導すると考えられる。このシグナル伝達は、炎症性サイトカイン産生に変換されず、ＡＰＣを活性化しない（データは示さない）。ｒＦＶＩＩＩＦｃ処理の際に、免疫調節性シグナル伝達事象が開始される。これらの事象は、ＮＲＦ２およびＰＰＡＲγ経路の上方調節（図５Ｈ）ならびにＣＤ２０６およびアルギナーゼ１分子の上方調節を特徴とするＭ２様表現型に向かうマイクロファージ分化を駆動すると考えられる。様々な他の免疫調節因子も、発現の増加を示したが、少なくともグアニル酸シクラーゼ１可溶性サブユニットベータ（２ＧＵＣＹ１Ｂ２）、プロトポルフィリノゲンオキシダーゼ（ＰＰＯＸ）、およびサイトカインシグナル伝達の抑制因子３（ＳＯＣＳ３）は、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処理された細胞における発現の減少を示した（図５Ｈ）。これらのマクロファージは、調節性Ｔ細胞分化、ＦＶＩＩＩ寛容化、および抗ＦＶＩＩＩインヒビター減少などの、以前に報告された有益な免疫学的効果を実行することができる（図７）。
初期の前臨床および臨床データは、ｒＦＶＩＩＩＦｃが、おそらく分子のＦｃドメインに帰する免疫調節効果に起因して、ＩＴＩ処置のために使用された場合に陰性のインヒビター力価までの比較的短い時間を可能にすることを示している。よりロバストな臨床データを得るために、標準化されたプロトコールを開発した。ここで、試験設計を提示する。
ＲｅＩＴＩｒａｔｅ（ＮＣＴ０３１０３５４２）、予測、介入、多施設、非盲検試験は、以前のＩＴＩの試みに失敗した、全年齢の、２０人の重篤なＨＡインヒビター患者を登録することを目的とする。この試験の主な目的は、６０週の時間枠内でｒＦＶＩＩＩＦｃを用いて実施されたＩＴＩの転帰を記述することである。主要評価項目は、ＩＴＩの成功であり；ＩＴＩ処置中に評価された副次的評価項目は、ＩＴＩの成功までの時間、再発の発生、出血の回数、ｒＦＶＩＩＩＦｃの消費量、学校または仕事の欠席日数、入院および順守を含む。ＩＴＩ処置は、最大で６０週にわたる、ｒＦＶＩＩＩＦｃ ２００ＩＵ／ｋｇ／日（１日１回または２回日用量に分割）を含む。寛容が達成された後、１６週の漸減期間および予防的に与えられるｒＦＶＩＩＩＦｃを用いた３２週のフォローアップを行う。成功の基準は、陰性のインヒビター力価（＜０．６ベセスダ単位）、予想の６６％を超える増分回復、および７時間以上の終末半減期を含む。
図８は、マクロファージに対するｒＦＩＸＦｃの提唱される効果を示す。ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＡＰＣ上のＦｃγ受容体を介して結合し、内在化およびシグナル伝達を誘導すると考えられる。このシグナル伝達は、炎症性サイトカイン産生に変換されず、ＡＰＣを活性化しない。むしろ、免疫調節シグナル伝達事象は、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置の際に開始される。これらの事象は、ＮＲＦ２およびＰＰＡＲγ経路の上方調節を特徴とする「Ｍｏｘ／Ｍ２様」表現型に向かうマクロファージ分化を駆動すると考えられる。
特定の実施形態の前記記載は、他者が、当業界の技術の範囲内にある知識を適用することによって、過度の実験なく、本発明の一般的概念から逸脱することもなく、そのような特定の実施形態を容易に改変する、および／または様々な適用に適合させることができる、本発明の一般的性質を完全に示すものである。したがって、そのような適合化および改変は、本明細書に提示される教示および指針に基づいて、開示された実施形態の等価物の意味および範囲の中にあることが意図される。本明細書における表現または用語は、説明のためのものであり、限定するためのものではないことが理解されるべきであり、本明細書の用語または表現は、教示および指針を考慮して当業者によって解釈されるべきである。
本発明の他の実施形態は、本明細書および本明細書に開示された本発明の実施の考慮から当業者には明らかであろう。本明細書および実施例は、例示のみとして考慮され、本発明の真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
本明細書に開示される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み入れられると示されたのと同程度に、参照により組み入れられる。

Claims (15)

  1. 血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法における凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の使用であって、
    （１）該凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効量を、免疫寛容を誘導するために十分な期間、該ヒトに投与し、該凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効量は、該ヒトにおいて免疫寛容を誘導する；および
    （２）免疫寛容の誘導後、該凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の漸減レジメンを該ヒトに投与する、前記使用。
  2. ＦＶＩＩＩとＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の有効量は、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇである、請求項１に記載の使用。
  3. 血友病を有するヒトにおいて免疫寛容を誘導する方法における凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の使用であって、該キメラタンパク質の約２００ＩＵ／ｋｇを、免疫寛容を誘導するために十分な期間、該ヒトに投与し、該ヒトは、該凝固因子に対するインヒビターを発生させ、該凝固因子に対する１つまたは複数の過去の免疫寛容療法に反応していない、前記使用。
  4. 免疫寛容後、ヒトに凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の漸減レジメンを投与する、請求項３に記載の使用。
  5. 凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質は、第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃ（ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ）または第ＩＸ因子−Ｆｃ（ＦＩＸＦｃ）を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
  6. 凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質は、免疫寛容が観察されるまで投与され、ヒトにおける阻害性抗体の力価が約０．６ＢＵ未満である場合に免疫寛容が観察される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
  7. 漸減レジメンは、凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇ〜約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を投与する工程を含む、請求項１、２、および４〜６のいずれか１項に記載の使用。
  8. 漸減用量は、１日１回、２日毎に１回、または１週間に３回投与される、請求項１、２、および４〜７のいずれか１項に記載の使用。
  9. 漸減用量は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１３週間、少なくとも約１４週間、少なくとも約１５週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約１７週間、少なくとも約１８週間、少なくとも約１９週間、少なくとも約２０週間、少なくとも約２１週間、少なくとも約２２週間、少なくとも約２３週間、少なくとも約２４週間、少なくとも約２５週間、少なくとも約２６週間、少なくとも約２７週間、少なくとも約２８週間、少なくとも約２９週間、少なくとも約３０週間、少なくとも約３１週間、または少なくとも約３２週間投与される、請求項１、２、および４〜８のいずれか１項に記載の使用。
  10. 漸減レジメンは、凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇの漸減用量を、免疫寛容後１週目から６週目まで１日１回投与する工程、または該キメラタンパク質の約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を、免疫寛容後１週目から６週目まで１日１回投与する工程を含む、請求項１、２、および４〜９のいずれか１項に記載の使用。
  11. 漸減レジメンは、凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇもしくは約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を、免疫寛容後６週目から１２週目まで２日毎に１回投与する工程、または該キメラタンパク質の約５０ＩＵ／ｋｇもしくは約１００ＩＵ／ｋｇの漸減用量を、１２週目から１６週目まで２日毎に１回投与する工程をさらに含む、請求項１０に記載の使用。
  12. 凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の予防用量を、漸減レジメン後に投与する工程をさらに含む、請求項１、２、および４〜１１のいずれか１項に記載の使用。
  13. 寛容が起こるまでの期間が、約２４週間未満、約２３週間未満、約２２週間未満、約２１週間未満、約２０週間未満、約１９週間未満、約１８週間未満、約１７週間未満、約１６週間未満、約１５週間未満、約１４週間未満、約１３週間未満、約１２週間未満、約１１週間未満、約１０週間未満、約９週間未満、約８週間未満、約７週間未満、約６週間未満、約５週間未満、約４週間未満、約３週間未満、約２週間未満、または約１週間未満である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
  14. ＦＶＩＩＩが、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩを含む、請求項５〜１３のいずれか１項に記載の使用。
  15. 凝固因子とＦｃ領域とを含むキメラタンパク質の投与によって、凝固因子単独による処置後のヒトにおいて寛容が起こるまでの期間と比較して、ヒトにおいて寛容が起こるまでの期間が短縮される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
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