[0172] 本揭露提供誘導具有血友病之人類之免疫耐受性的方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白或包含凝結因子及Fc區之組成物，其中該人類已發展針對該凝結因子之抑制劑且未能對一或多種針對該凝結因子之先前免疫耐受性療法起反應。在一些實施例中，該凝結因子係選自由以下所組成之群組：因子VII(FVII)、因子VIIa(FVIIa)、FVIII、FIX、因子X(FX)、馮威里因子(VWF)及其任何組合。 I.定義
[0173] 應注意，術語「一(個/種)」實體係指一或多個(種)該實體；例如，「一個核苷酸序列」應理解為表示一或多個核苷酸序列。因此，術語「一個(種)」、「一或多個(種)」及「至少一個(種)」在本文中可互換使用。 [0174] 此外，「及/或」在本文中使用時應視為對兩個指定特徵或組分中之各者在存在或不存在另一者之情況下的具體揭示內容。因此，如本文中在諸如「A及/或B」之片語中使用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣，如諸如「A、B及/或C」之片語中使用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。 [0175] 應理解，當在本文中用語言「包含」描述各態樣時，亦提供以「由...組成」及/或「實質上由...組成」之術語描述之其他相似態樣。 [0176] 除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與本揭露所屬領域之一般技術人員通常所理解相同的含義。例如，the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 第2版, 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 第3版, 1999, Academic Press；及theOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press，其向技術人員提供本揭露所使用之許多術語的大體解釋。 [0177] 單位、前綴及符號皆以其國際單位制(Système International de Unites，(SI))公認形式表示。數字範圍包括界定該範圍之數字。除非另外指明，否則胺基酸序列係自左至右以胺基至羧基取向書寫。本文中提供之標題不限制本揭露之各種態樣，該等態樣可藉由參考整個說明書得出。因此，即將在下文定義之術語藉由參照說明書全文進行更充分地定義。 [0178] 術語「約」在本文中用於意謂近似、大致、大約或在...左右。當術語「約」與數字範圍結合使用時，其藉由使邊界擴展高於及低於所陳述之數值來修飾該範圍。因此，「約10-20」意謂「約10至約20」。一般而言，術語「約」可藉由例如向上或向下(升高或降低)10百分比之變化修飾高於或低於所述值之數值。 [0179] 如本文所用之「投與」意謂經由醫藥學上可接受之途徑向受試者給予本文所揭示之例如包含嵌合蛋白之醫藥學上可接受之組成物。投與途徑可為靜脈內，例如靜脈內注射及靜脈內輸注。其他投與途徑包括例如皮下、肌肉內、經口、經鼻及肺部投與。嵌合蛋白及雜交蛋白可作為包含至少一種賦形劑之醫藥組成物之一部分投與。在一些實施例中，該凝結因子及/或Fc(例如
，該嵌合蛋白)係透過基因療法向人類投與，例如
，其中將一或多種編碼該凝結因子及/或Fc(例如
，該嵌合蛋白)之多核苷酸向人類投與，且該凝結因子及/或Fc(例如
，該嵌合蛋白)在該人類中表現。 [0180] 如本文所用之「治療」係指例如
減輕疾病或病狀之嚴重性；減少病狀病程之持續時間；改善或消除與疾病或病狀相關聯之一或多種症狀；向具有疾病或病狀之受試者提供有益效應，未必治癒該疾病或病狀。在一些實施例中，術語「治療」意謂減少或消除對凝結因子(例如
，FVIII)之抑制免疫反應。 [0181] 如本文所用之術語「誘導免疫耐受性」意謂在受試者中引發當投與特定刺激物(例如，投與凝結因子(例如，FVIII))時受試者不具有免疫反應的狀況。此狀況(免疫耐受性)可為暫時的，使得該受試者對該刺激物耐受達一定時間，為長時間的，使得該受試者無限期地對該刺激物耐受。在某些實施例中，只要向該受試者投與刺激物，該受試者便對該刺激物保持耐受。例如，在一些實施例中，只要以給定給藥間隔向該受試者投與包含該凝結因子及Fc區之該嵌合蛋白，該受試者便對該凝結因子保持耐受。在其他實施例中，甚至在投與包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白終止之後，該受試者仍保持對該凝結因子耐受。 [0182] 在一些實施例中，免疫反應係「抑制」免疫反應。抑制免疫反應係阻斷或減小刺激物之效應(例如
，投與凝結因子(例如
，FVIII))的免疫反應。在某些實施例中，抑制免疫反應包含產生針對刺激物之抑制抗體，例如，抑制抗FVIII抗體。如本文所用之術語「抑制抗體」係指阻斷或減小抗體所識別之抗原之功能的抗體。例如，針對FVIII之抑制抗體阻斷或減小FVIII之活性。在一些實施例中，抑制抗體結合抗原(例如，FVIII)並加速抗原自人類血清之清除。當該抗體加速該抗原之清除時，該抗體減少該抗原之半衰期。 [0183] 抑制免疫反應可使用實驗室測試諸如畢氏達測試或畢氏達測試之Nijmegan修改進行確定。至少0.6個畢氏達單位(BU)之水準可指示存在抑制免疫反應。至少5 BU之水準可指示存在高效價抑制劑。亦可使用測量推注凝結因子輸注之體內回復率及半衰期。在某些實施例中，當人類之抑制抗體之效價小於約5 BU、小於約4 BU、小於約3 BU、小於約2 BU、小於約1 BU、小於約0.9 BU、小於約0.8 BU、小於約0.7 BU、小於約0.6 BU、小於約0.5 BU、小於約0.4 BU、小於約0.3 BU、小於約0.2 BU、小於約0.1 BU或為約0 BU時，觀察到免疫耐受性。在一個特定實施例中，當人類之抑制抗體之效價小於約0.6 BU時，觀察到免疫耐受性。 [0184] 在其他實施例中，免疫反應包含細胞介導之免疫反應。在一些實施例中，該細胞介導免疫反應包含細胞介素之釋放。在某些實施例中，呈細胞介導之免疫反應之一部分釋放的細胞介素可選自由以下所組成之群組：IL-12、IL-4、IL-17、TNF-α及其任何組合。 [0185] 在其他實施例中，該免疫反應包含選自由以下所組成之群組之臨床症狀：出血傾向增加、凝結因子消耗高、缺乏對凝結因子療法之反應、凝結因子療法之功效減小、凝結因子之半衰期縮短及其任何組合。 [0186] 在其他實施例中，免疫耐受性係藉由在向人類投與之後凝結因子之半衰期增加來測量。在一些實施例中，相較於在免疫耐受性誘導之前向人類投與之凝結因子之半衰期，一旦凝結因子之半衰期增加至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約75%、至少約100%、至少約150%、至少約200%、至少約300%、至少約400%、至少約500%或至少約1000%，便誘導免疫耐受性。在某些實施例中，在免疫耐受性誘導之後，凝結因子之半衰期係至少約3小時、至少約4小時、至少約5小時、至少約6小時、至少約7小時、至少約8小時、至少約9小時、至少約10小時、至少約11小時、至少約12小時、至少約13小時、至少約14小時或至少約15小時。 [0187] 如本文所用之術語「相當」意謂由例如
使用嵌合蛋白引起之比較速率或水準等於、實質上等於或類似於參考速率或水準。如本文所用之術語「類似」意謂比較速率或水準與參考速率或水準(例如
，基本上由兩個Fc部分及經加工FVIII組成之嵌合蛋白之FXa產生速率，其中經加工FVIII融合至兩個Fc部分之一個Fc)相差不大於10%或不大於15%。術語「實質上相等」意謂比較速率或水準與參考速率或水準相差不大於0.01%、0.5%或1%。 [0188] 如本文所用之止血障礙意謂特徵在於由於形成纖維蛋白凝塊之能力受損或不能形成纖維蛋白凝塊而有自發出血或由於創傷而出血之傾向的基因遺傳性或獲得性病狀。此等病症之實例包括血友病。三種主要形式為A型血友病(因子VIII缺乏症)、B型血友病(因子IX缺乏症或「克雷司馬斯病(Christmas disease)」)及C型血友病(因子XI缺乏症，輕度出血傾向)。其他止血障礙包括例如範威爾邦德病；因子XI缺乏症(PTA缺乏症)；因子XII缺乏症；纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII缺乏症或結構異常；伯納德-蘇里爾症候群(Bernard-Soulier syndrome)，其為一種GPIb缺陷症或缺乏症。VWF之受體GPIb可為有缺陷的且導致缺乏初級凝塊形成(初級止血)及流血傾向增加、以及格蘭茨曼(Glanzman)及內格利(Naegeli)血小板無力症(thrombasthenia)(格蘭茨曼血小板無力症)。在肝衰竭(急性及慢性形式)中，由肝產生之凝血因子存在不足；此可增加流血風險。 [0189] 如本文所用之「血漿濃度-時間曲線下面積(AUC)」係與藥理學領域之術語相同，且係基於投與之後FVIII吸收之速率及程度。AUC係在指定時間段內投與，諸如12、18、24、36、48或72小時，或基於曲線之斜率使用外推無限地投與。除非本文另外指定，否則AUC係無限地投與。AUC之確定可在單一受試者中進行，或在受試者群體中進行，然後計算平均值。 [0190] 術語「促凝血活性」意謂本發明凝血因子(例如，FVIII)能夠替代原生凝血因子(例如，原生FVIII)參與血液中之凝結級聯。若干分析可用於測量因子VIII活性，其包括一級凝結分析(活性部分凝血激酶時間；aPTT)、凝血酶產生時間(TGA)及旋轉血栓彈力儀(ROTEM®)。 [0191] 對免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或區之胺基酸編號所進行之參考全部係基於Kabat等人 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 美國公共衛生部(U. S. Department of Public Health), Bethesda; MD，其以全文引用方式併入本文。(已自包括人類之若干哺乳動物物種分離出FcRn受體。已知人類FcRn、大鼠FcRn及小鼠FcRn之序列(Story等人
, J. Exp. Med. 180
: 2377 (1994)，其以全文引用方式併入本文。)Fc可包含免疫球蛋白中具有或不具有免疫球蛋白鉸鏈區之CH2域及CH3域。WO 2004/101740及WO 2006/074199中提供示範性Fc變異體，該等案以全文引用方式併入本文。 [0192] 如本文所用之「雜交」多肽及蛋白意謂嵌合蛋白與第二多肽之組合。雜交物中之嵌合蛋白與第二多肽可經由蛋白質-蛋白質相互作用(諸如電荷-電荷或疏水性相互作用)彼此締合。雜交物中之嵌合蛋白及第二多肽可經由二硫鍵或其他共價鍵彼此締合。雜交物描述於WO 2004/101740及WO 2006/074199中，該等案中之各者均以全文引用方式併入本文。亦參見美國專利第7,404,956號及第7,348,004號，該等案中之各者均以全文引用方式併入本文。第二多肽可為相同嵌合蛋白之第二複本或其可為不相同的嵌合蛋白。 [0193] 如本文所用，在蛋白質序列中「對應於...之胺基酸」、「對應於...之位點」或「等效胺基酸」係藉由對準以使第一蛋白質序列(例如，FVIII序列)與第二蛋白質序列(例如，第二FVIII序列)之間的一致性或相似性最大來識別。用於識別第二蛋白質序列中之等效胺基酸之編號係基於用於識別第一蛋白質序列中之對應胺基酸之編號。 [0194] 如本文所用，術語「插入位點」係指多肽(通常為成熟多肽，例如
，成熟FVIII多肽)或其片段、變異體或衍生物中緊靠可插入異源部分之位置之上游的位置。以編號指定「插入位點」，該編號為指定蛋白質序列中由插入位點所對應之胺基酸的編號，該胺基酸緊靠插入位置之N末端。例如，片語「FVIII在對應於給定序列之胺基酸745之插入位點處包含異源部分」指示異源部分位於對應於該序列之胺基酸745及胺基酸746之兩個胺基酸之間。然而，熟習此項技術者將能夠容易地識別本文所指出之任何變異體中之對應位置，且本揭露不局限於僅在本文具體揭示之變異體中進行之插入。相反，本文所揭示之插入可在任何相關變異體或其具有活性之片段中對應於本文所揭示之變異體之位置處進行。 [0195] 如本文所用之片語「緊靠胺基酸之下游」係指緊接於胺基酸之末端羧基之位置。類似地，片語「緊靠胺基酸之上游」係指緊接於胺基酸之末端胺基之位置。因此，如本文所用之片語「在插入位點之兩個胺基酸之間」係指異源部分(例如，半衰期延長部分)插入在兩個相鄰胺基酸之間所處之位置。 [0196] 如本文所用之術語「插入」、「經插入」、「插入至...中」或語法相關術語係指相對於指定蛋白質(例如
，FVIII蛋白)中相似位置，異源部分(例如
，半衰期延長部分)在融合多肽中的位置。本領域技術人員應理解如何識別與其他多肽序列(例如
，其他FVIII變異體)對應之插入位置。如本文所用，該等術語係指本文所揭示之重組多肽之特徵，且不指示、暗示或意指製備融合多肽之任何方法或過程。例如，對於本文所提供之融合多肽，片語「將異源部分插入緊鄰FVIII多肽之殘基745之下游」意謂該融合多肽在緊鄰對應於特定FVIII變異體中胺基酸745的胺基酸之下游包含異源部分，其例如
由對應於FVIII變異體之胺基酸745及746之胺基酸所界定。 [0197] 「融合」或「嵌合」蛋白包含第一胺基酸序列連接於在自然界中其未天然連接之第二胺基酸序列。通常存在於各別蛋白質中之胺基酸序列可集合在一起形成融合多肽，或通常存在於相同蛋白質中之胺基酸序列可以新排列安置在融合多肽中，該融合多肽例如為本發明之FVIII域與Ig Fc域之融合物。融合蛋白係例如藉由化學合成，或藉由產生並轉譯肽區域以所需關係編碼之聚核苷酸來產生。融合蛋白可進一步包含藉由共價非肽鍵或非共價鍵與第一胺基酸序列締合之第二胺基酸序列。 [0198] 術語「異源」及「異源部分」意謂聚核苷酸、多肽或其他部分源於與其所比較之實體不同之實體。例如，異源多肽可為合成多肽，或源於不同物種、個體之不同細胞類型或不同個體之相同或不同類型之細胞。在一個態樣中，異源部分係與另一多肽融合以產生融合多肽或蛋白質之多肽。在另一態樣中，異源部分係與多肽或蛋白質結合之非多肽諸如PEG。 [0199] 如本文所用之術語「連接」及「融合」係指第一胺基酸序列或核苷酸序列分別共價或非共價接合至第二胺基酸序列或核苷酸序列。第一胺基酸或核苷酸序列可直接接合或相鄰於第二胺基酸或核苷酸序列，或者介入序列可將第一序列共價接合於第二序列。術語「連接」不僅意謂第一胺基酸序列在C末端或N末端融合於第二胺基酸序列，而且亦包括將整個第一胺基酸序列(或第二胺基酸序列)插入第二胺基酸序列(或相應地第一胺基酸序列)中之任何兩個胺基酸中。在一個實施例中，第一胺基酸序列係藉由肽鍵或連接子連接至第二胺基酸序列。第一核苷酸序列可藉由磷酸二酯鍵或連接子連接於第二核苷酸序列。連接子可為肽或多肽(用於多肽鏈)或核苷酸或核苷酸鏈(用於核苷酸鏈)或任何化學部分(用於多肽與聚核苷酸鏈兩者)。術語「連接」亦藉由連字符(-)加以指示。 [0200] 如本文所用，術語「與…締合」係指第一條胺基酸鏈與第二條胺基酸鏈之間形成的共價鍵或非共價鍵。在一個實施例中，術語「與…締合」意謂共價非肽鍵或非共價鍵。此締合可由冒號，亦即(:)指示。在另一實施例中，其意謂除肽鍵之外的共價鍵。例如，胺基酸半胱胺酸包含可與第二半胱胺酸殘基上之硫醇基形成二硫鍵或二硫橋之硫醇基。在大多數天然存在之IgG分子中，CH1區與CL區藉由二硫鍵締合且兩個重鏈藉由兩個二硫鍵在對應於239及242之位置處締合，該等位置係使用Kabat編號系統(位置226或229，EU編號系統)。共價鍵之實例包括(但不限於)肽鍵、金屬鍵、氫鍵、二硫鍵、ζ鍵、π鍵、δ鍵、糖苷鍵、抓氫鍵、彎曲鍵、偶極鍵、π反向鍵、雙鍵、參鍵、四鍵、五鍵、六鍵、結合、超結合、芳香性、哈普托數(hapticity)或反鍵結。非共價鍵之非限制性實例包括離子鍵(例如
陽離子π鍵或鹽鍵)、金屬鍵、氫鍵(例如
二氫鍵、二氫複合物、低障壁氫鍵或對稱氫鍵)、凡得瓦力(van der Walls force)、倫敦分散力(London dispersion force)、機械鍵(mechanical bond)、鹵素鍵、親金作用(aurophilicity)、嵌入、堆積作用、熵力(entropic force)或化學極性。 [0201] 如本文所用，術語「裂解位點」或「酶促裂解位點」係指由酶識別之位點。某些酶促裂解位點包含細胞內加工位點。在一個實施例中，多肽具有由在凝結級聯期間活化之酶裂解之酶促裂解位點，因此此等位點之裂解發生在凝塊形成之部位處。示範性此類位點包括例如由凝血酶、因子XIa或因子Xa識別者。其他酶促裂解位點在此項技術中為已知的。 [0202] 如本文所用，術語「加工位點」或「細胞內加工位點」係指多肽中一種類型之酶促裂解位點，其為在該多肽轉譯之後起作用之酶的目標。在一個實施例中，此等酶在自高爾基體腔(Golgi lumen)轉運至反面高爾基體(trans-Golgi)區室期間起作用。細胞內加工酶在蛋白質自細胞分泌之前裂解多肽。此等加工位點之實例包括例如由內肽酶之PACE/弗林蛋白酶(furin)(其中PACE為成對鹼性胺基酸裂解酶(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)之頭字語)家族所靶向者。此等酶定位於高爾基體膜且在序列基元Arg-[任何殘基]-(Lys或Arg)-Arg之羧基端側上裂解蛋白質。如本文所用，「弗林蛋白酶」酶家族包括例如PCSK1(亦稱為PC1/PC3)、PCSK2(亦稱為PC2)、PCSK3(亦稱為弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4(亦稱為PC4)、PCSK5(亦稱為PC5或PC6)、PCSK6(亦稱為PACE4)、或PCSK7(亦稱為PC7/LPC、PC8或SPC7)。其他加工位點係此項技術中已知的。 [0203] 在包括一個以上加工或裂解位點之構築體中，應瞭解此等位點可相同或不同。 [0204] 如本文所用，「可加工連接子」係指包含至少一個在本文中其他地方描述之細胞內加工位點的連接子。 [0205] 如本文所用之「基線」係在投與劑量之前受試者中給定分析物(例如，凝結因子(例如，FVIII)或抗體(例如，抗FVIII抗體))之最低測量血漿水準。血漿水準可在給藥之前的兩個時間點測量：在篩檢訪視時及即將給藥之前。 [0206] 如本文所用之「等效劑量」意謂與用國際單位表述相同之凝結因子活性(例如
，FVIII活性)之劑量，其與所述多肽之分子量無關。例如，一個國際單位(IU)之FVIII活性近似對應於一毫升正常人類血漿中FVIII之量。若干分析可用於測量凝結因子活性，包括歐洲藥典顯色受質分析及單級凝結分析。 [0207] 如本文所用之「給藥間隔」意謂投與受試者之多次劑量之間逝去的時間量。給藥間隔之比較可在單一受試者中進行，或在受試者群體中進行，然後可計算群體中所獲得之平均值。 [0208] 如本文所用之「受試者」意謂人類個體。受試者可為當前正罹患出血病症或預期有此一治療需要之患者。在一些實施例中，受試者先前從未用凝結因子進行治療(亦即
，該受試者係先前未治療受試者或先前未治療患者)。在一些實施例中，受試者係胎兒，且該等方法包含向胎兒之母親投與該組成物或該嵌合蛋白，且向受試者投與係跨過胎盤自母親發生。在一些實施例中，受試者係兒童或成人。在一些實施例中，受試者係小於一歲、小於兩歲、小於三歲、小於四歲、小於五歲、小於六歲、小於七歲、小於八歲、小於九歲、小於十歲、小於十一歲或小於十二歲的兒童。在一些實施例中，兒童小於一歲。在一些實施例中，兒童或成人受試者發展出血病症，其中出血病症之症狀之發作係在一歲之後。在一些實施例中，向受試者投與組成物或嵌合蛋白足以預防、抑制或減小選自以下之免疫反應之發展：針對凝結因子之體液免疫反應、細胞介導之免疫反應或體液免疫反應及細胞介導之免疫反應兩者。在一些實施例中，受試者係人類，且受試者先前已發展對凝結因子之免疫反應。在一些實施例中，人類先前無法對免疫耐受性療法起反應。在一些實施例中，先前免疫耐受性療法包含投與高劑量凝結因子。在其他實施例中，先前免疫耐受性療法包含投與一或多種免疫抑制劑。在一個實施例中，先前免疫耐受性療法係Malmo方案。在另一實施例中，先前免疫耐受性療法係Bonn方案。 [0209] 如本文所用(可互換)之「治療劑量」、「劑量」、「有效劑量」或「給藥量」意謂如達成如本文所述之治療目標之劑量。在一些實施例中，「治療劑量」意謂誘導受試者之免疫耐受性的劑量。在某些實施例中，「治療劑量」意謂在指定耐受時間期間內(例如
，在投與第一劑量之12週內)誘導受試者之免疫耐受性的劑量。 [0210] 本發明中亦包括多肽之片段或變異體及其任何組合。術語「片段」或「變異體」當指代本揭露之方法中所用之多肽時包括保留參考多肽之至少一些特性(例如
，對FcRn結合域或Fc變異體之FcRn結合親和力或FVIII之凝血活性)之任何多肽。除在本文中其他地方論述之特定抗體片段之外，多肽之片段亦包括蛋白水解片段以及缺失片段，但不包括天然存在之全長多肽(或成熟多肽)。本揭露之方法中所用之多肽結合域或結合分子之變異體包括如上所述之片段，且亦包括胺基酸序列歸因於胺基酸取代、缺失或插入而改變之多肽。變異體可為天然存在的或非天然存在的。非天然存在之變異體可使用此項技術已知之突變誘發技術來產生。變異多肽可包含保守或非保守胺基酸取代、缺失或添加。 [0211] 「保守胺基酸取代」為用具有相似側鏈之胺基酸殘基置換胺基酸殘基的取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族已在此項技術中加以定義，包括鹼性側鏈(例如
，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如
，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷極性側鏈(例如
，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如
，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如
，酥胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如
，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸用來自同一側鏈家族之另一胺基酸置換，則將取代視為保守的。在另一實施例中，可將一連串胺基酸用側鏈家族成員之順序及/或組成不同的結構上相似的胺基酸串保守地置換。 [0212] 兩個多核苷酸或多肽序列之間使用的術語「序列一致性百分比」係指在比較窗口上由該等序列共用的一致匹配位置數，其考慮到為進行兩個序列之最佳比對必須引入的添加或缺失(亦即
，間隙)。匹配位置為靶序列及參考序列二者中存在相同核苷酸或胺基酸的任何位置。靶序列中存在的間隙不做計數，因為間隙不為核苷酸或胺基酸。同樣，參考序列中存在的間隙不做計數，因為對靶序列核苷酸或胺基酸計數，而不對來自參考序列之核苷酸或胺基酸計數。 [0213] 藉由以下方式來計算序列一致性百分比：測定兩個序列中存在相同胺基酸殘基或核酸鹼基之位置的數目以產生匹配位置之數目，用匹配位置之數目除以比較窗中位置之總數且將結果乘以100以產生序列一致性百分比。兩個序列之間序列之比較及序列一致性百分比的測定可使用供線上使用與下載兩者之可易於得到之軟體完成。適合軟體程式可自各種來源獲得，且可用於比對蛋白質及核苷酸序列。一種適於測定序列一致性百分比之程式為bl2seq，其為可自美國政府之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)BLAST網站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)獲得之BLAST程式套件之一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法進行兩個序列之間的比較。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。其他適合程式為例如
Needle、Stretcher、Water或Matcher，其為生物資訊程式之EMBOSS套件之部分，且亦可獲自歐洲生物資訊研究所(EBI)之www.ebi.ac.uk/Tools/psa。 [0214] 與聚核苷酸或多肽參考序列比對的單個聚核苷酸或多肽靶序列內的不同區可各自具有其自身的序列一致性百分比。應注意，將序列一致性百分比值捨入至最接近的十分位。例如，將80.11、80.12、80.13及80.14向下捨入至80.1，而將80.15、80.16、80.17、80.18及80.19向上捨入至80.2。亦注意，長度值將始終為整數。 [0215] 熟習此項技術者將理解，產生用於計算序列一致性百分比的序列比對不限於唯一地由原始序列資料驅動之二進制序列-序列比較。序列比對可來源於多重序列比對。一種產生多序列比對之適合程式為ClustalW2，可獲自www.clustal.org。另一適合程式為MUSCLE，可獲自www.drive5.com/muscle/。ClustalW2及MUSCLE或者獲自例如EBI。 [0216] 亦應理解，序列比對可藉由序列資料與異質來源之資料的整合產生，該等異質來源之資料諸如結構資料(例如，結晶蛋白結構)、功能資料(例如，突變位置)或譜系學資料。整合異質資料以產生多重序列比對的適合程式為T-Coffee，其獲自www.tcoffee.org且或者獲自例如
EBI。亦應瞭解用於計算序列一致性百分比之最終比對可自動或手動策劃。 [0217] 多核苷酸變異體可在編碼區、非編碼區或兩者中含有改變。在一個實施例中，多核苷酸變異體含有產生沉默取代、添加或缺失，但不改變所編碼多肽之性質或活性的改變。在另一實施例中，核苷酸變異體因遺傳密碼之簡併性而由沉默取代產生。在其他實施例中，以任何組合取代、缺失或添加5-10、1-5、或1-2個胺基酸之變異體。多核苷酸變異體可出於多種原因，例如為了使特定宿主之密碼子表現最佳化(使人類mRNA中之密碼子變成例如細菌宿主諸如大腸桿菌
(E. coli)之其他密碼子)而產生。 [0218] 天然存在之變異體稱為「對偶基因變異體」且係指佔據生物體之染色體上既定基因座之基因的若干替代形式之一(Genes II, Lewin, B.編, John Wiley & Sons, New York (1985))。此等對偶基因變異體可在多核苷酸及/或多肽層面上變化且包括在本揭露中。或者，非天然存在之變異體可藉由突變誘發技術或藉由直接合成來產生。 [0219] 使用蛋白質工程改造及重組DNA技術之已知方法，可產生變異體以改良或改變多肽之特徵。例如，可自分泌蛋白質之N末端或C末端缺失一或多個胺基酸而不實質性損失生物功能。以全文引用方式併入本文之Ron等人
,J. Biol. Chem
. 268: 2984-2988 (1993)報導甚至在缺失3、8或27個胺基端胺基酸殘基之後仍具有肝素結合活性之變異KGF蛋白。類似地，在自干擾素γ之羧基末端缺失8-10個胺基酸殘基之後，此蛋白質展現活性增高多達十倍。(Dobeli等人 , J. Biotechnology 7
:199-216 (1988)，其以全文引用方式併入本文。) [0220] 此外，充足證據顯示變異體常保留與天然存在之蛋白質之生物活性類似的生物活性。例如，Gayle及同事(J. Biol.Chem. 268
:22105-22111 (1993)，其以全文引用方式併入本文)對人類細胞激素IL-1a進行了廣泛的突變分析。其使用隨機突變誘發來產生超過3,500種個別IL-1a突變體，每個變異體在分子總長度上具有平均2.5個胺基酸變化。檢查每個可能胺基酸位置處之多個突變。研究者發現「[大多數]分子可在對[結合或生物活性]之影響極小下進行改變」。(參見摘要。)實際上，在檢查之3,500個以上核苷酸序列中，僅23個獨特胺基酸序列產生活性顯著不同於野生型之蛋白質。 [0221] 如上文所述，多肽變異體包括例如經修飾多肽。修飾包括例如
乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、共價連接黃素、共價連接原血紅素(heme)部分、共價連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價連接脂質或脂質衍生物、共價連接磷脂醯肌醇、交聯、環化、二硫鍵形成、去甲基、形成共價交聯、形成半胱胺酸、形成焦麩胺酸、甲醯化、γ-羧化、醣化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻醯化、氧化、聚乙二醇化(Mei等人 , Blood 116:
270-79 (2010)，其以全文引用之方式併入本文中)、蛋白水解處理、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、轉移-RNA介導之向蛋白質添加胺基酸(諸如精胺醯化)及泛素化。在一些實施例中，在任何便利的位置處對FVIII進行修飾，例如
聚乙二醇化。在一些實施例中，在FVIII之表面暴露之胺基酸(例如
表面暴露半胱胺酸)處將FVIII聚乙二醇化，其可為經改造之半胱胺酸。同上。在一些實施例中，經修飾FVIII(例如
，聚乙二醇化FVIII)係嵌合或融合FVIII。 [0222] 術語「下游」係指位於參考核苷酸序列之3'方向之核苷酸序列。「下游」亦可指位於參考肽序列之C末端的肽序列。 [0223] 術語「上游」係指位於參考核苷酸序列之5'方向之核苷酸序列。「上游」亦可指位於參考肽序列之N末端的肽序列。 [0224] 如本文所用，術語「調控區」係指位於編碼區之上游(5'非編碼序列)、內部或下游(3'非編碼序列)，且影響所締合之編碼區之轉錄、
RNA加工、穩定性或轉譯之核苷酸序列。調控區可包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應物結合位點及莖-環結構。若編碼區意欲在真核細胞中表現，則聚腺苷酸化信號及轉錄終止序列通常將位於編碼序列之3'方向。 [0225] 編碼基因產物(例如，多肽)之聚核苷酸可包括與一或多個編碼區可操作地締合之啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件。除啟動子之外的其他轉錄控制元件，例如增強子、操縱子、阻遏子及轉錄終止信號，亦可與編碼區可操作地締合以引導基因產物表現。 [0226] 熟習此項技術者已知多個轉錄控制區。該等轉錄控制區包括(但不限於)，在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區，諸如但不限於，來自細胞巨大病毒(立即早期啟動子與內含子A之組合)、猿猴病毒40(早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒)之啟動子及增強子區段。其他轉錄控制區包括源於脊椎動物基因，諸如肌動蛋白(actin)、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-球蛋白之彼等控制區，以及能夠控制真核細胞中之基因表現之其他序列。其他適合的轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子，以及淋巴因子(lymphokine)誘導性啟動子(例如
，可由干擾素或介白素誘導之啟動子)。 [0227] 類似地，一般熟習此項技術者已知多種轉譯控制元件。該等元件包括(但不限於)，核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，及源自於細小核糖核酸病毒之元件(特別是內部核糖體進入位點，或IRES，又稱為CITE序列)。 [0228] 如本文所用，術語「表現」係指聚核苷酸藉以產生基因產物(例如RNA或多肽)之過程。 [0229] 「載體」係指用於將核酸選殖及/或轉移至宿主細胞中之任何媒介物。載體可為可與另一核酸區段連接以使所連接區段複製之複製子。「複製子」係指在活體內充當自主複製單元，亦即，能夠在自身控制下複製之任何遺傳元件(例如
質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒)。術語「載體」包括用於在體外
、離體
或體內將核酸引入細胞中之病毒載體與非病毒媒介物。此項技術中已知且使用許多載體，包括例如質體、經修飾真核病毒或經修飾細菌病毒。將聚核苷酸插入適合載體中可藉由將適當聚核苷酸片段連接至具有互補黏性末端之所選載體中來達成。 [0230] 術語「質體」係指染色體外元件，其常攜帶不為細胞之重要代謝之部分的基因，且通常呈環狀雙股DNA分子形式。此等元件可為源於任何來源之具有單股或雙股DNA或RNA之線性、環狀或超螺旋自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中許聚核苷酸序列已接合或重組成能夠將啟動子片段及所選基因產物之DNA序列連同適當3'未轉譯序列一起引入細胞中之獨特構造。 [0231] 可使用之真核病毒載體包括但不限於腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺相關病毒載體及痘病毒(例如牛痘病毒)載體、桿狀病毒載體或皰疹病毒載體。非病毒載體包括質體、脂質體、帶電荷脂質(細胞轉染劑)、DNA-蛋白質複合物及生物聚合物。 [0232] 「選殖載體」係指一種「複製子」，其為依序複製且包含複製起點的單位長度之核酸(諸如質體、噬菌體或黏質體)，另一核酸區段可與其連接以達成所連接區段之複製。某些選殖載體能夠在一個細胞類型(例如細菌)中複製且在另一細胞類型(例如真核細胞)中表現。選殖載體通常包含一或多種可用於選擇包含載體之細胞之序列及/或一或多個用於插入相關核酸序列之多選殖位點。 [0233] 術語「表現載體」係指設計成使插入之核酸序列能夠在插入宿主細胞中之後表現之媒介物。插入之核酸序列係以與如上所述之調控區可操作締合之方式置放。 [0234] 藉由此項技術中熟知之方法將載體引入宿主細胞中，該等方法例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、脂質體轉染(溶酶體融合)、使用基因槍、或DNA載體轉運體(transporter)。 [0235] 「經分離」多肽或其片段、變異體或衍生物係指不在天然環境中之多肽。不要求特定純化程度。例如，經分離多肽可僅自其原生或天然環境移除。出於本發明之目的，在寄主細胞中表現的重組產生之多肽及蛋白質視為分離的，已藉由任何適合技術分離、分餾或部分地或實質上純化之天然或重組多肽亦視為分離的。 [0236] 如本文所用，術語「宿主細胞」係指帶有或能夠帶有重組核酸之細胞或細胞群體。宿主細胞可為原核細胞(例如
，大腸桿菌
)，或者，宿主細胞可為真核細胞，例如真菌細胞(例如
，酵母細胞，諸如釀酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母(Pichia pastoris)
或粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)
)，及各種動物細胞，諸如昆蟲細胞(例如
，Sf-9)或哺乳動物細胞(例如
，HEK293F、CHO、COS-7、NIH-3T3)。 [0237] 如本文所用之「穩定狀態分佈體積(Vss)」具有與藥理學中所用之術語相同含義，其係藥物分佈於其中的外觀空間(體積)。Vss = 穩定狀態時體內藥物之量除以血漿濃度。 II.本發明之方法
[0238] 本揭露係基於發現融合至Fc區之凝結因子可用於誘導具有血友病之人類之免疫耐受性，其中該人類已發展針對凝結因子之抑制劑且尚未通過一或多個先前免疫耐受性療法。儘管先前相信，用FVIII-Fc嵌合蛋白進行治療可預防對FVIII治療的免疫反應，但是本揭露中意外地發現，用凝結因子-Fc嵌合蛋白進行治療可減少尚對先前免疫耐受性療法無反應的人類之先前發展之免疫反應。因此，本揭露提供用於誘導人類之免疫耐受性的方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc之組成物或包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白或編碼其之多核苷酸。 [0239] 本揭露之另一態樣係關於一種誘導具有血友病之人類之免疫耐受性的方法，其包含(1)向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc之組成物或包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白，其中該有效量該組成物或嵌合蛋白誘導該人類之免疫耐受性；及(2)在誘導免疫耐受性之後，向該人類投與該組成物或嵌合蛋白之減量方案。在某些實施例中，當人類之抑制抗體之效價小於約0.6 BU時發生免疫耐受性之誘導。在某些實施例中，當人類之抑制抗體之效價小於約0.6 BU時發生免疫耐受性之誘導，且如在血漿中所監測，凝結因子活性之回復率係60%。在本揭露之一些實施例中，該方法進一步包含(3)在該減量方案之後，向該人類投與預防劑量該凝結因子。在某些態樣中，該人類尚未用針對該凝結因子之先前免疫耐受性療法治療。可在已確定人類已發展抑制劑免疫反應的任何時間向人類投與包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合的蛋白，例如
，在測量人類之抑制免疫反應之水準之後。在其他實施例中，可向尚未發展一或多個抑制劑免疫反應的人類投與該組成物或該嵌合蛋白以預防抑制劑免疫反應之發展。在一些實施例中，向發展抑制劑免疫反應之可能性高(例如
，家族病史、遺傳傾向或生物標記物之顯示)的人類投與該組成物或該嵌合蛋白。在一些實施例中，該方法進一步包含在投與之前測量抑制免疫反應之水準或發展抑制劑免疫反應之可能性。在一些實施例中，在已確定人類已發展抑制劑免疫反應或人類有可能發展抑制劑免疫反應之後，例如，在測量人類之抑制免疫反應之水準或發展抑制劑免疫反應之可能性之後，小於約1日、小於約2日、小於約3日、小於約4日、小於約5日、小於約6日、小於約7日、小於約2週、小於約3週、小於約4週、小於約2個月、小於約3個月、小於約4個月、小於約5個月、小於約6個月、小於約1年、小於約2年、小於約3年、小於約4年或小於約5年向該人類投與包含凝結因子及Fc區之該組成物或該嵌合蛋白。在某些實施例中，在已確定人類已發展抑制劑免疫反應或人類有可能發展抑制劑免疫反應之後，例如，在測量人類之抑制免疫反應之水準或發展抑制劑免疫反應之可能性之後，立即向該人類投與包含凝結因子及Fc區之該組成物或該嵌合蛋白。在特定實施例中，在已確定人類已發展抑制劑免疫反應或人類有可能發展抑制劑免疫反應之後，例如，在測量人類之抑制免疫反應之水準或發展抑制劑免疫反應之可能性之後，小於約5分鐘、小於約10分鐘、小於約15分鐘、小於約20分鐘、小於約30分鐘、小於約45分鐘、小於約1小時小於約2小時、小於約3小時、小於約4小時、小於約5小時、小於約6小時、小於約7小時、小於約8小時、小於約9小時、小於約10小時、小於約11小時、小於約12小時、約18小時或小於約24小時向該人類投與包含凝結因子及Fc區之該組成物或該嵌合蛋白。在特定實施例中，在已確定人類已發展抑制劑免疫反應或人類有可能發展抑制劑免疫反應之後，例如，在測量人類之抑制免疫反應之水準或發展抑制劑免疫反應之可能性之後，約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約18小時或約24小時向該人類投與包含凝結因子及Fc區之該組成物或該嵌合蛋白。在某些實施例中，在已確定人類已發展抑制劑免疫反應或人類有可能發展抑制劑免疫反應之後，例如，在測量人類之抑制免疫反應之水準或發展抑制劑免疫反應之可能性之後，小於約1日向該人類投與包含凝結因子及Fc區之該組成物或該嵌合蛋白。 [0240] 免疫反應之誘導可繼續，直至抑制劑之水準低於某一水準，或直至抑制劑不可偵測。在某些實施例中，誘導期可延續達至少約24週、至少約26週、至少約28週、至少約30週、至少約32週、至少約34週、至少約36週、至少約38週、至少約40週、至少約42週、至少約44週、至少約46週、至少約48週、至少約50週、至少約52週、至少約54週、至少約56週、至少約58週、至少約60週、至少約62週、至少約64週、至少約66週、至少約68週、至少約70週。在一特定實施例中，誘導期小於60週。 [0241] 藉由本發明之方法治療之抑制免疫反應可包括人體內負面影響凝結因子治療之一或多種效應的任何反應。在一些實施例中，抑制免疫反應包含產生針對凝結因子之抑制抗體，例如，抑制抗FVIII抗體。在某些實施例中，本揭露之方法進一步包含在投與有效量包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白或編碼其之多核苷酸之前(例如
，基線時)及之後測量一或多種抑制抗體之效價。在一些實施例中，該等抑制抗體之效價在投與之前(例如
，基線時)係至少約0.6個畢氏達單位(BU)。在某些實施例中，該等抑制抗體之效價在該投與之前(例如
，基線時)係至少約1 BU、至少約2 BU、至少約3 BU、至少約4 BU、至少約5 BU、至少約6 BU、至少約7 BU、至少約10 BU、至少約20 BU、至少約30 BU、至少約40 BU、至少約50 BU、至少約100 BU、至少約150 BU或至少約200 BU。在一個特定實施例中，該等抑制抗體之效價在投與之前(例如，基線時)係至少約5 BU。 [0242] 在一些實施例中，相對於投與之前抑制抗體之效價，本發明之方法減小人類受試者之抑制抗體之效價。在某些實施例中，該等抑制抗體之效價在投與之後係小於約0.6 BU。在一些實施例中，該等抑制抗體之效價在投與之後係小於約0.5 BU、小於約0.4 BU、小於約0.3 BU、小於約0.2 BU或小於約0.1 BU。在一個特定實施例中，該等抑制抗體之效價在投與之後係0 BU。在其他實施例中，該等抑制抗體之效價在投與之後係小於5 BU、小於4 BU、小於3 BU、小於2 BU、小於1 BU、小於0.9 BU、小於0.8 BU、小於0.7 BU或小於0.6 BU。 [0243] 在一些實施例中，相較於未治療之對照及單獨用凝結因子治療之人類中巨噬細胞分化，該投與增加人類中巨噬細胞朝向類M2表現型的分化。在一些實施例中，類M2表現型包含NRF2途徑、PPAR γ途徑或NRF2途徑及PPAR γ途徑兩者之上調。在一些實施例中，類M2表現型包含CD206(MRC1)之上調。在一些實施例中，類M2表現型包含ARG1之上調。在一些實施例中，類M2表現型包含CD206(MRC1)及ARG1之上調。 [0244] 在一些實施例中，相對於未治療之受試者或單獨用凝結因子治療之受試者中一或多個基因之表現，該投與導致人類中一或多個基因之較大表現。在一些實施例中，該投與導致選自由以下所組成之群組之一或多個基因之較大表現：Hmox1、PPAR γ、LPL、EGR2、SLCO4A1、血基質氧化酶1(HO-1)、氧化壓力誘導之生長抑制劑1(OSGIN1)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、二硫化麩胱甘肽還原酶(GSR)、麩胺酸-半胱胺酸連接酶催化次單元(GCLC)、麩胺酸-半胱胺酸連接酶修飾次單元(GCLM)、NAD(P)H醌去氫酶1(NQO1)、脂肪酸結合蛋白5(FABP5)、B7-H3(CD276)、SLAM家族成員3(SLAMF3；淋巴球抗原9；LY9)、SLAM家族成員7(SLAMF7)、甘露糖受體C型1(MRC1)、溶質攜帶物家族12成員4(SLC12A)、神經纖毛蛋白1(NRP1)及其任何組合。在一些實施例中，該投與導致NRF2途徑之一或多個基因之較大表現。在某些實施例中，該NRF2途徑之該一或多個基因係選自由以下所組成之群組：HO-1、OSGIN1、SOD1、GSR、GCLC、GCLM、NQO1及其任何組合。在一些實施例中，該投與導致PPAR γ途徑之一或多個基因之較大表現。在一些實施例中，該PPAR γ途徑之該一或多個基因係選自由以下所組成之群組：PPAR γ、LPL、FABP5、EGR2及其任何組合。在一些實施例中，該投與導致選自由以下所組成之群組之一或多個基因之較大表現：B7-H3(CD276)、SLAMF3、SLAMF7、MRC1、SLC12A、NRP1及其任何組合。在特定實施例中，相對於未治療之人類或單獨投與凝結因子之人類中該一或多個基因之表現，該投與導致該一或多個基因之較大表現，其中該表現大至少約1.5倍、大至少約2倍、大至少約2.5倍、大至少約3倍、大至少約3.5倍、大至少約4倍、大至少約4.5倍或大至少約5倍。 [0245] 在一些實施例中，在投與之後小於6小時觀察到該一或多個基因之差異性表現。在一些實施例中，在投與之後小於12小時觀察到差異性表現。在一些實施例中，在投與之後小於18小時觀察到差異性表現。在一些實施例中，在投與之後小於24小時觀察到差異性表現。 [0246] 在一些實施例中，抑制免疫反應包含細胞介導之免疫反應。在某些實施例中，該細胞介導免疫反應包含細胞介素之釋放。在一些實施例中，細胞介素係與免疫反應增加相關聯之任何細胞介素。在一些實施例中，細胞介素係選自由以下所組成之群組：IL-1、IL-6、IL-16、IL-12、IL-4、IL-17、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素α、干擾素γ及其任何組合。在一個實施例中，細胞介導之免疫反應包含IL-12之血清水準增加。在另一實施例中，細胞介導之免疫反應包含IL-4之血清水準增加。在另一實施例中，細胞介導之免疫反應包含IL-17之血清水準增加。在另一實施例中，細胞介導之免疫反應包含TNF-α之血清水準增加。 [0247] 已將各種基因突變與發展抑制免疫反應之風險增加聯繫起來。例如，已將Hap2內之TNF-α -308G＞A多型性(其與TNF之組成性且誘導性轉錄水準增加相關聯)與發展抑制免疫反應之風險增加聯繫起來。參見Astermark等人
, Blood 108: 3739-3745 (2006)，其以全文引用方式併入本文。因此，在一些實施例中，人類具有與TNF-α增加相關聯之遺傳多型性。在一些實施例中，多型性係TNF-α -308G＞A 多型性。在一些實施例中，人類具有在IL10基因中之多型性，例如
與IL10之分泌增加相關聯之多型性。在一些實施例中，將FVIII-Fc投與至在IL10基因之啟動子區中具有IL10G微衛星之對偶基因134的受試者。參見Astermark等人
Hemostatis, Thrombosis, and Vascular Biology 108: 3739-3745 (2006)，其以全文引用方式併入本文。 [0248] 在一些實施例中，該人類具有與CTLA-4(細胞毒性T淋巴球抗原4)表現下降相關聯之遺傳多型性。在一些實施例中，該人類具有在DR15(HLA-DR15)或DQB0602 MHC(主要組織相容性基因複合體)II類分子中之突變。與具有血友病之受試者中抑制免疫反應之發展相關聯之其他MHC II類分子係A3、B7、C7、DQA0102、C2、DQA0103、DQB0603及DR13(參見Inhibitors in Patients with Hemophilia, E.C. Rodriguez-Merchan & C.A. Lee, 編, Blackwell Science, Ltd,, 2002)。 [0249] 在一些實施例中，相較於利用由FVIII多肽組成之多肽的先前治療之後受試者之一或多種細胞介素之水準，本揭露之方法減小受試者之該一或多種細胞介素之水準。在另一實施例中，相較於投與之前受試者之一或多種細胞介素之水準，本揭露之方法減小受試者之該一或多種細胞介素之水準。在其他實施例中，相對於投與之前一或多種致耐受性分子之表現水準，該一或多種致耐受性分子之表現在本揭露之方法之投與之後增加。在某些實施例中，該一或多種致耐受性分子係選自：IL-10、TGF-β、IL-35、IDO-1及其任何組合。 [0250] 在其他實施例中，該免疫反應包含選自由以下所組成之群組之臨床症狀：出血傾向增加、凝結因子消耗高、缺乏對凝結因子療法之反應、凝結因子療法之功效減小、凝結因子之半衰期縮短及其任何組合。在某些實施例中，免疫反應包含選自由以下所組成之群組之臨床症狀：出血傾向增加、凝結因子消耗高、缺乏對凝結因子療法之反應、凝結因子療法之功效減小、如在血漿中監測之凝結因子活性之回復率減小、凝結因子之半衰期縮短及其任何組合。 [0251] 在某些實施例中，人類先前診斷為患有抑制免疫反應。此一診斷可使用此項技術中已知的任何方法進行。例如，若人類具有以下之一或多者，則該人類可表徵為具有對凝結因子(例如
，FVIII)之免疫反應：(a)抑制抗體對凝結因子之效價大於或等於0.6 BU；(b)選自由IL-12、IL-4、IL-17及TNF-α所組成之群組之一或多種細胞介素之血清水準增加；(c)出血傾向增加；(d)凝結因子消耗高；(e)缺乏對凝結因子療法之反應；(f)凝結因子療法之功效減小；(g)凝結因子之半衰期縮短及其任何組合。在一個特定實施例中，若人類具有大於或等於0.6 BU之抑制抗體對凝結因子之效價，則該人類表徵為具有對凝結因子之免疫反應。 [0252] 在一些實施例中，人類先前診斷為在投與之前至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、至少約12個月、至少約13個月、至少約14個月、至少約15個月、至少約16個月、至少約17個月、至少約18個月、至少約19個月、至少約20個月、至少約21個月、至少約22個月、至少約23個月、至少約24個月、至少約27個月、至少約30個月、至少約33個月、至少約36個月、至少約39個月、至少約42個月、至少約45個月、至少約48年、至少約51個月、至少約54個月、至少約57個月、至少約60個月、至少約6年、至少約7年、至少約8年、至少約10年、至少約15年或至少約20年已發展對凝結因子之抑制免疫反應。在一個實施例中，該人類先前被診斷為在該投與之前至少約5年已發展對該凝結因子之抑制免疫反應。 [0253] 在一些實施例中，相較於誘導免疫耐受性之護理標準方法，本揭露之方法提供耐受性時間改良。如本文所用之術語「耐受性時間」係指投與第一劑量包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白與發展人類之免疫耐受性之間的時間之量。減少耐受性時間可對人類相當有益，包括但不限於減少達成耐受性所需的總經濟負擔。在一些實施例中，耐受性時間係約1至約24週、約1至約23週、約1至約22週、約1至約21週、約2至約20週、約2至約19週、約2至約18週、約2至約17週、約3至約16週、約3至約15週、約3至約14週、約3至約13週、約4至約12週、約4至約11週、約4至約10週、約4至約9週、約5至約8週、約5至約7週、約5至約6週、約1至約12週、約1至約11週、約1至約10週、約1至約9週、約1至約8週、約1至約7週、約1至約6週、約1至約5週或約1至約4週。在一些實施例中，耐受性時間係小於約70週、小於約65週、小於約60週、小於約58週、小於約56週、小於約54週、小於約52週、小於約50週、小於約48週、小於約46週、小於約44週、小於約42週、小於約40週、小於約38週、小於約36週、小於約34週、小於約32週、小於約30週、小於約28週、小於約26週、小於約24週、小於約23週、小於約22週、小於約21週、小於約20週、小於約19週、小於約18週、小於約17週、小於約16週、小於約15週、小於約14週、小於約13週、小於約12週、小於約11週、小於約10週、小於約9週、小於約8週、小於約7週、小於約6週、小於約5週、小於約4週、小於約3週、小於約2週或小於約1週。在某些實施例中，耐受性時間係約4至約12週。在一個實施例中，耐受性時間係約4週。在另一實施例中，耐受性時間係約12週。在一些實施例中，耐受性時間係小於約10個月。在一些實施例中，耐受性時間係小於約9個月。在一些實施例中，耐受性時間係小於約8個月。在一些實施例中，耐受性時間係小於約7個月。在一些實施例中，耐受性時間係小於約6個月。在一些實施例中，耐受性時間係小於約5個月。在一些實施例中，耐受性時間係小於約4個月。在一些實施例中，相較於單獨用凝結因子治療之後的耐受性時間，本揭露之方法導致用包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白治療之後人類之耐受性時間較短。 [0254] 在一些實施例中，免疫耐受性之發展之特徵在於抑制抗體對凝結因子之效價小於約0.6 BU。在一些實施例中，免疫耐受性之發展之特徵在於抑制抗體對凝結因子之效價小於約0.5 BU。在一些實施例中，免疫耐受性之發展之特徵在於抑制抗體對凝結因子之效價小於約0.4 BU。在一些實施例中，免疫耐受性之發展之特徵在於抑制抗體對凝結因子之效價小於約0.3 BU。在一些實施例中，免疫耐受性之發展之特徵在於抑制抗體對凝結因子之效價小於約0.2 BU。在一些實施例中，免疫耐受性之發展之特徵在於抑制抗體對凝結因子之效價小於約0.1 BU。在一些實施例中，免疫耐受性之發展之特徵在於抑制抗體對凝結因子之效價係0.0 BU。在某些實施例中，在連續的兩次測量下(例如
，在四週時期內的連續兩週中)觀察到抑制免疫抗體之效價。 [0255] 在一些實施例中，免疫耐受性之發展之特徵在於增量回復率＞66%(例如
，增量回復率係約67%、約68%、約69%、約70%、約71%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%)。如本文所用，「增量回復率」係指輸注之後15-30分鐘的峰值FVIII水準。 [0256] 在誘導期及減量期完成之後，受試者可然後進行嵌合蛋白之預防治療。示範性預防給藥方案可為每四日約50 IU/kg嵌合蛋白或在三至五日間隔下約25 IU/kg至約65 IU/kg嵌合蛋白。對於小於6歲的兒童，可給予每週兩次約50 IU/kg嵌合蛋白或在三至五日間隔下約25 IU/kg至約65IU/kg嵌合蛋白。參見可在worldwideweb.eloctate.com /_assets/pdf/ELOCTATE_PI_January2017.pdf獲得之Eloctate®藥品說明書。 [0257] 在一些實施例中，使用本揭露之方法治療之人類正接受或最近已接受免疫刺激療法。例如，抑制劑亦報導於經歷利用干擾素之治療的HCV陽性A型血友病患者中以及患有與抗逆轉錄病毒療法相關聯之免疫重建發炎症候群之HIV陽性A型血友病患者中。參見歐洲藥品管理局之FVIII產品及抑制劑發展專家會議報告(2006年2月28日-2006年3月2日)。因此，在一些實施例中，人類正接受干擾素療法。在一些實施例中，人類正接受抗病毒療法。在一些實施例中，人類正接受抗逆轉錄病毒療法且患有免疫重建發炎症候群。 [0258] 在某些實施例中，人類對凝結因子(例如，FVIII)已有小於150個暴露日(ED)。在一個實施例中，人類已有小於50 ED。在另一實施例中，人類已有小於20 ED。 [0259] 本揭露之一些態樣係關於減小有需要之受試者之對凝結因子之過敏或過敏性反應之嚴重性或發生率的方法，其包含向該受試者投與包含該凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。在一些實施例中，該組成物或該嵌合蛋白之投與減小對該凝結因子之類過敏反應之嚴重性。在一些實施例中，該組成物或該嵌合蛋白之投與減小對該凝結因子之過敏反應之嚴重性。II.A. 嵌合蛋白
[0260] 本文所揭示之誘導免疫耐受性之方法一般可適用於包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白，其中該凝結因子可為任何已知的凝結因子、其片段或其變異體，且其中該Fc區可為任何已知的Fc區、其片段或其變異體。在一些實施例中，凝結因子係選自由以下所組成之群組：因子VII(FVII)、因子VIIa(FVIIa)、因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)、因子X(FX)、馮威里因子(VWF)或其任何組合。據此，關於FVIIIFc嵌合蛋白及其用途之本揭露同樣適用於包含凝結因子部分及Fc區之其他嵌合蛋白。任何凝結因子、或其任何片段、或其任何變異體均可用於本揭露之方法。類似地，任何Fc因子、或其任何片段、或其任何變異體均可用於本揭露之方法。在一些具體實例中，嵌合蛋白之凝結因子部分係FVIII。 [0261] 在一些實施例中，凝結因子及Fc存在於分開的多肽鏈上。在一些實施例中，凝結因子及Fc非係連接的或彼此藉由共價鍵締合。 [0262] 在其他實施例中，凝結因子可為凝結因子模擬物。凝結因子模擬物可顯示一或多個凝結因子活性。例如，抗體或其抗體結合部分可藉由結合至因子IX及因子X起類似FVIII之作用。若抗體或其抗原結合部分含有Fc區，則此類抗體或其抗原結合部分可用於本方法。在另一實施例中，凝結因子係具有FVIII活性之肽。 [0263] 在此方面，本揭露大體上提供一種誘導人類之免疫耐受性之方法，其包含向該受試者投與包含凝結因子部分及Fc部分之組成物或嵌合蛋白。II.A.1. 因子 VIII
[0264] 除非另外規定，否則如本文所用之「因子VIII」，在本申請書通篇縮寫為「FVIII」，意謂在凝血中發揮正常作用之功能性FVIII多肽。因此，術語FVIII包括具有功能性之變異體多肽。「FVIII蛋白」可與FVIII多肽(或蛋白)或FVIII互換使用。FVIII功能之實例包括但不限於能夠活化凝血、能夠充當因子IX之輔因子、或能夠在Ca2+
及磷脂存在下與因子IX形成因子X酶(tenase)複合物，其然後將因子X轉化成活化形式之Xa。FVIII蛋白可為人類、豬、犬、大鼠或鼠類FVIII蛋白。此外，來自人類與其他物種之FVIII之間的比較已鑒別可能為功能所需之保守殘基(Cameron等人 , Thromb
.Haemost
. 79:317-22 (1998)；US 6,251,632)。已知全長多肽及多核苷酸序列，亦已知許多功能性片段、突變體及修飾形式。各種FVIII胺基酸及核苷酸序列揭示於例如
美國公開案第2015/0158929 A1號、第2014/0308280 A1號及第2014/0370035 A1號以及國際公開案第WO 2015/106052 A1號中。FVIII多肽包括例如
全長FVIII、全長FVIII減去N末端Met、成熟FVIII(減去信號序列)、在N末端具有另一Met之成熟FVIII及/或B域全部或部分缺失之FVIII。FVIII變異體包括B域缺失，無論是部分還是全部缺失。 [0265] 本文所用之凝結因子或嵌合蛋白中之FVIII部分具有FVIII活性。FVIII活性可藉由此項技術中任何已知方法測量。許多測試可用於評估凝血系統之功能：活化部分凝血激素時間(aPTT)測試、顯色分析、ROTEM分析、凝血酶原時間(PT)測試(亦用於確定INR)、纖維蛋白原測試(常藉由克勞斯(Clauss)方法)、血小板計數、血小板功能測試(常藉由PFA-100)、TCT、出血時間、混合測試(若患者之血漿與正常血漿混合，則是否進行異常校正)、凝血因子分析、抗磷脂抗體、D二聚體、遺傳測試(例如
，因子V Leiden、凝血酶原突變G20210A)、稀釋魯塞爾氏蝰毒液時間(Russell's viper venom time，dRVVT)、雜項血小板功能測試、凝血彈性描記術(TEG或Sonoclot)、凝血彈性量測術(TEM®
，例如
，ROTEM®
)或優球蛋白(euglobulin)溶解時間(ELT)。 [0266] aPTT測試為量度「內在」凝血途徑(亦稱為接觸活化途徑)與共同凝血途徑兩者之功效之性能指標。此測試通常用於測量可商購之重組凝結因子(例如
，FVIII)之凝結活性。其結合測量外在途徑之凝血酶原時間(PT)使用。 [0267] ROTEM分析提供關於以下整個止血動力學之資訊：凝結時間、凝塊形成、凝塊穩定性及溶解。凝血彈性測量術中之不同參數取決於血漿凝血系統之活性、血小板功能、纖維蛋白溶解或影響此等相互作用之許多因素。此分析可提供對次級止血之完全綜覽。 [0268] 顯色分析機制係基於凝血級聯之原理，其中活化FVIII在活化因子IX、磷脂及鈣離子之存在下加速因子X轉化成因子Xa。藉由使針對因子Xa具有特異性之對硝基醯苯胺(pNA)受質水解來評估因子Xa活性。在405 nM下量測之對硝基苯胺之初始釋放速率與因子Xa活性成正比且因此與樣品中之FVIII活性成正比。 [0269] 顯色分析由國際血栓暨止血學會(ISTH)之科學及標準化委員會(SSC)之FVIII及因子IX小組委員會所推薦。自1994年起，顯色分析亦已成為歐洲藥典對FVIII濃縮效力(FVIII concentrate potency)之分配的參考方法。因此，在一個實施例中，包含FVIII之嵌合蛋白具有可與包含成熟FVIII或BDD FVIII之嵌合蛋白(例如
，ADVATE®
、REFACTO®
或ELOCTATE®
)相當的FVIII活性。 [0270] 在另一實施例中，本揭露之包含FVIII之嵌合蛋白具有可與包含成熟FVIII或BDD FVIII之嵌合蛋白(例如，
ADVATE®
、REFACTO®
或ELOCTATE®
)相當的因子Xa產生率。 [0271] 為了將因子X活化成因子Xa，活化因子IX(因子IXa)在Ca2+
、膜磷脂及FVIII因子之存在下水解因子X中之一個精胺酸-異白胺酸鍵以形成因子Xa。因此，FVIII與因子IX之相互作用在凝血途徑中係關鍵的。在某些實施例中，包含FVIII之嵌合蛋白可在與包含成熟FVIII序列或BDD FVIII之嵌合蛋白(例如，
ADVATE®
、REFACTO®
或ELOCTATE®
)相當的速率下與因子IXa相互作用。 [0272] 此外，FVIII結合至馮威里因子，同時在循環中係非活性的。FVIII當未結合至VWF時快速降解，且藉由凝血酶之作用自VWF釋放。在一些實施例中，包含FVIII之嵌合蛋白在可與包含成熟FVIII序列或BDD FVIII之嵌合蛋白(例如，
ADVATE®
、REFACTO®
或ELOCTATE®
)相當的水準下結合至馮威里因子。 [0273] FVIII可在鈣及磷脂之存在下由活化蛋白C經不活化。活化蛋白C裂解A1域中精胺酸336之後的FVIII重鏈，其破壞因子X受質相互作用位點，且在A2域中精胺酸562之後進行裂解，其增強A2域之解離以及破壞與因子IXa之相互作用位點。此裂解亦將A2域(43 kDa)分成兩部分且產生A2-N(18 kDa)及A2-C(25 kDa)域。因此，活化蛋白C可催化重鏈中之多個裂解位點。在一個實施例中，包含FVIII之嵌合蛋白在可與包含成熟FVIII序列或BDD FVIII之嵌合蛋白(例如，
ADVATE®
、REFACTO®
或ELOCTATE®
)相當的水準下由活化蛋白C經非活化。 [0274] 在其他實施例中，包含FVIII之嵌合蛋白具有可與包含成熟FVIII序列或BDD FVIII之嵌合蛋白(例如，
ADVATE®
、REFACTO®
或ELOCTATE®
)相當的體內FVIII活性。在一特定實施例中，包含FVIII之嵌合蛋白能夠在HemA小鼠尾靜脈橫切模型中在可與包含成熟FVIII序列或BDD FVIII之嵌合蛋白(例如，
ADVATE®
、REFACTO®
或ELOCTATE®
)相當的水準下保護HemA小鼠。 [0275] 如本文所用之FVIII之「B域」與此項技術中已知之藉由內部胺基酸序列一致性及凝血酶之蛋白水解裂解位點定義之B域相同，例如，成熟人類FVIII之殘基Ser741-Arg1648。至於成熟人類FVIII，其他人類FVIII域由以下胺基酸殘基定義：A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；A3，殘基Ser1690-Ile2032；C1，殘基Arg2033-Asn2172；C2，成熟FVIII之殘基Ser2173-Tyr2332。除非另外指出，否則如本文所用之不指代任何SEQ ID數值之序列殘基數值對應於無信號肽序列(19個胺基酸)之FVIII序列。A3-C1-C2序列(亦稱為FVIII重鏈)包括殘基Ser1690-Tyr2332。剩餘序列(殘基Glu1649-Arg1689)通常指代為FVIII輕鏈活化肽。豬、小鼠及犬FVIII之包括B域之所有域的邊界位置在此項技術中亦為已知的。在一個實施例中，缺失FVIII之B域(「B域缺失FVIII」或「BDD FVIII」)。BDD FVIII之實例係REFACTO®
(重組BDD FVIII)。在一個特定實施例中，該B域缺失FVIII變異體包含成熟FVIII之胺基酸殘基746至1648之缺失。 [0276] 「B域缺失FVIII」可具有揭示於美國專利第6,316,226號、第6,346,513號、第7,041,635號、第5,789,203號、第6,060,447號、第5,595,886號、第6,228,620號、第5,972,885號、第6,048,720號、第5,543,502號、第5,610,278號、第5,171,844號、第5,112,950號、第4,868,112號及第6,458,563號以及國際公開案第WO 2015106052 A1號(PCT/US2015/010738)中之全部或部分缺失。在一些實施例中，本揭露之方法中所用之B域缺失FVIII序列包含在美國專利第6,316,226號(亦在US 6,346,513中)之第4欄第4行至第5欄第28行及實例1-5處揭示之任一缺失。在另一實施例中，B域缺失因子VIII為S743/Q1638 B域缺失因子VIII(SQ BDD FVIII)(例如
，具有自胺基酸744至胺基酸1637之缺失之因子VIII，例如
，具有成熟FVIII之胺基酸1-743及胺基酸1638-2332之因子VIII)。在一些實施例中，本揭示之方法中所用之B域缺失FVIII具有在美國專利第5,789,203號(以及US 6,060,447、US 5,595,886及US 6,228,620)之第2欄第26-51行及實例5-8處揭示之缺失。在一些實施例中，B域缺失因子VIII具有以下文獻中描述之缺失：美國專利第5,972,885號之第1欄第25行至第2欄第40行；美國專利第6,048,720號之第6欄第1-22行及實例1；美國專利第5,543,502號之第2欄第17-46行；美國專利第5,171,844號之第4欄第22行至第5欄第36行；美國專利第5,112,950號之第2欄第55-68行，圖2及實例1；美國專利第4,868,112號之第2欄第2行至第19欄第21行及表2；美國專利第7,041,635號之第2欄第1行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄第67行、第7欄第43行至第8欄第26行、及第11欄第5行至第13欄第39行；或美國專利第6,458,563號之第4欄第25-53行。在一些實施例中，B域缺失FVIII缺失大部分B域，但仍然含有體內
將初級轉譯產物蛋白水解加工成兩條多肽鏈所必需的B域胺基末端序列，如WO 91/09122中所揭示。在一些實施例中，在缺失胺基酸747-1638，亦即
實際上完全缺失B域下構築B域缺失FVIII。Hoeben R.C.等人 J. Biol. Chem.
265 (13): 7318-7323 (1990)。B域缺失因子VIII亦可含有FVIII之胺基酸771-1666或胺基酸868-1562之缺失。Meulien P.等人 Protein Eng.
2(4): 301-6 (1988)。作為本發明之一部分之其他B域缺失包括以下缺失：胺基酸982至1562或760至1639(Toole等人 , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
(1986)83, 5939-5942))、797至1562(Eaton等人 Biochemistry
(1986)25:8343-8347))、741至1646(Kaufman(PCT公開申請案第WO 87/04187號))、747-1560(Sarver等人 , DNA
(1987)6:553-564))、741至1648(Pasek(PCT申請案第88/00831號))、或816至1598或741至1648(Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) 第82期:16-25, EP 295597))。在一個特定實施例中，該B域缺失FVIII包含成熟FVIII之胺基酸殘基746至1648之缺失。在另一特定實施例中，該B域缺失FVIII包含成熟FVIII之胺基酸殘基745至1648之缺失。 [0277] 在其他實施例中，BDD FVIII包括含有B域之保留一或多個N-連接醣化位點之片段的FVIII多肽，該等位點例如對應於全長FVIII序列之胺基酸序列之殘基757、784、828、900、963或視情況943。B域片段之實例包括如Miao, H.Z.等人 , Blood
103(a): 3412-3419 (2004)、Kasuda, A等人 , J
.Thromb.
Haemost. 6: 1352-1359 (2008)及Pipe, S.W.等人
, J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)中揭示之B域之226個胺基酸或163個胺基酸(亦即保留B域之前226個胺基酸或163個胺基酸)。在其他實施例中，BDD FVIII進一步包含在殘基309處之點突變(自Phe至Ser)以改良BDD FVIII蛋白之表現。參見
Miao, H.Z.等人, Blood 103(a): 3412-3419 (2004)。在其他實施例中，BDD FVIII包括含有一部分B域，但不含有一或多個弗林蛋白酶裂解位點(例如
Arg1313及Arg 1648)之FVIII多肽。參見
Pipe, S.W.等人 , J. Thromb. Haemost
. 9: 2235-2242 (2011)。在一些實施例中，BDD FVIII包含含有在對應於成熟全長FVIII之胺基酸765至1652中之缺失的單鏈FVIII(亦稱為rVIII-單鏈及AFSTYLA®)。參見
美國專利第7,041,635號。可在任何FVIII序列中進行各前述缺失。 [0278] 已知大量功能性FVIII變異體，亦如上文及下文所論述。此外，已在血友病患者中識別出FVIII之數百個非功能性突變，且已確定，與取代基之性質相比，FVIII功能之此等突變之效果更多係由於其處於FVIII之3維結構內(Cutler等人 , Hum. Mutat. 19
:274-8 (2002))，該參考文獻以全文引用之方式併入本文中。此外，來自人類與其他物種之FVIII之間的比較已識別出可能為功能所需之保守殘基(Cameron等人
, Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998)；US 6,251,632)，該參考文獻以全文引用之方式併入本文中。 [0279] 在一些實施例中，包含FVIII及Fc區之嵌合蛋白之有效量等效於無Fc區之FVIII之有效量。在某些實施例中，該有效量係約20 IU/Kg至約400 IU/kg。在某些實施例中，該有效量係約20 IU/Kg至約300 IU/kg。在一些實施例中，該有效量係約50 IU/Kg至約300 IU/kg。在一些實施例中，該有效量係約50 IU/kg至約200 IU/kg。在一些實施例中，該有效量係約100 IU/kg至約300 IU/kg、約100 IU/kg至約200 IU/kg、約100 IU/kg至約290 IU/kg、約100 IU/kg至約280 IU/kg、約100 IU/kg至約270 IU/kg、約100 IU/kg至約260 IU/kg、約100 IU/kg至約250 IU/kg、約100 IU/kg至約240 IU/kg、約100 IU/kg至約230 IU/kg、約100 IU/kg至約220 IU/kg、約100 IU/kg至約210 IU/kg、約150 IU/kg至約300 IU/kg、約150 IU/kg至約290 IU/kg、約150 IU/kg至約280 IU/kg、約150 IU/kg至約270 IU/kg、約150 IU/kg至約260 IU/kg、約150 IU/kg至約250 IU/kg、約150 IU/kg至約240 IU/kg、約140 IU/kg至約250 IU/kg、約130 IU/kg至約260 IU/kg、約120 IU/kg至約270 IU/kg、約110 IU/kg至約280 IU/kg。在一個特定實施例中，該有效量係約200 IU/kg至約300 IU/kg。在另一實施例中，該有效量係約200 IU/kg至約290 IU/kg。在其他實施例中，該有效量係約200 IU/kg至約280 IU/kg、約200 IU/kg至約270 IU/kg、約200 IU/kg至約260 IU/kg、約200 IU/kg至約250 IU/kg、約200 IU/kg至約240 IU/kg、約200 IU/kg至約230 IU/kg、約200 IU/kg至約220 IU/kg或約200 IU/kg至約210 IU/kg。 [0280] 在一些實施例中，該有效量係約50 IU/kg、約60 IU/kg、約70 IU/kg、約80 IU/kg、約90 IU/kg、約100 IU/kg、約105 IU/kg、約110 IU/kg、約115 IU/kg、約120 IU/kg、約125 IU/kg、約130 IU/kg、約135 IU/kg、約140 IU/kg、約145 IU/kg、約150 IU/kg、約155 IU/kg、約160 IU/kg、約165 IU/kg、約170 IU/kg、約175 IU/kg、約180 IU/kg、約185 IU/kg、約190 IU/kg、約195 IU/kg、約200 IU/kg、約225 IU/kg、約250 IU/kg、約275 IU/kg或約300 IU/kg。在一個特定實施例中，該有效量係約150 IU/kg。在另一實施例中，該有效量係約200 IU/kg。在另一實施例中，該有效量係約250 IU/kg。在另一實施例中，該有效量係約50 IU/kg。在另一實施例中，該有效量係約100 IU/kg。 [0281] 投與包含FVIII及Fc區或其片段之嵌合蛋白時的給藥間隔可比等效劑量無Fc區之凝結因子所需之給藥間隔長至少約一倍半。給藥間隔可比等效劑量無Fc域之FVIII所需之給藥間隔長至少約一倍半至六倍、長一倍半至五倍、長一倍半至四倍、長一倍半至三倍或長一倍半至兩倍。 [0282] 在一些實施例中，有效劑量包含FVIII及Fc區之嵌合蛋白係以以下給藥間隔向人類投與：約一日、約兩日、約三日、約四日、約五日、約六日、約七日、約八日、約九日、約十日、約11日、約12日、約13日、約14日、約15日、約16日、約17日、約18日、約19日、約20日、約21日、約22日、約23日或約24日。在一些實施例中，有效劑量包含FVIII及Fc區之嵌合蛋白係以以下給藥間隔向人類投與：約25日、約26日、約27日、約28日、約29日、約30日、約45日或約60日。 [0283] 在一些實施例中，包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以以下給藥間隔投與：約1至約14日、約1至約13日、約1至約12日、約1至約11日、約1至約10日、約1至約9日、約1至約8日、約1至約7日、約1至約6日、約1至約5日、約1至約4日、約1至約3日、約1至約2日、約2至約14日、約3至約14日、約4至約14日、約5至約14日、約6至約14日、約7至約14日、約8至約14日、約9至約14日、約10至約14日、約11至約14日、約12至約14日、約13至約14日或約5至約10日。在其他實施例中，包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以以下給藥劑量投與：約1至約21日、約1至約20日、約1至約19日、約1至約18日、約1至約17日、約1至約16日、約1至約15日、約1至約14日、約1至約13日、約1至約12日、約1至約11日、約1至約10日、約1至約9日、約1至約8日、約1至約7日、約1至約6日、約1至約5日、約1至約4日、約1至約3日、約1至約2日、約2至約21日、約3至約21日、約4至約21日、約5至約21日、約6至約21日、約7至約21日、約8至約21日、約9至約21日、約10至約21日、約11至約21日、約12至約21日、約13至約21日、約14至約21日、約15至約21日、約16至約21日、約17至約21日、約18至約21日、約19至約21日、約20至約21日、約5至約10日、約10至約15日、約15至約20日。在某些實施例中，包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以約2至約6日之給藥間隔投與。在另一實施例中，包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以約3至約5日之給藥間隔投與。 [0284] 在一個實施例中，該有效劑量係25-65 IU/kg(25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、62、64或65 IU/kg)，且該給藥間隔係每3-5、3-6、3-7、3、4、5、6、7或8或更多日一次、或每週三次、或每週不多於三次。在另一實施例中，該有效劑量係65 IU/kg，且該給藥間隔係每週一次、或每6-7日一次。只要是必要的，該等劑量可重複投與(例如
，至少10、20、28、30、40、50、52、或57週，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年)。在一個特定實施例中，該有效劑量係約25-65 IU/kg，且該給藥間隔係每3-5日一次。 [0285] 在一個實施例中，該有效量係約200 IU/kg，且該有效量係每日投與。在另一實施例中，該有效量係約50 IU/kg，且該有效量係投與一週約三次。 [0286] 在某些實施例中，該有效量或該有效劑量係以單一劑量投與。在一些實施例中，該有效量或該有效劑量係以全天二或更多個劑量投與。 [0287] 在一些實施例中，包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以約200 IU/kg之劑量每日一次投與，直至獲得免疫耐受作用。在一些實施例中，免疫耐受作用期延續約4週至約36個月。在一些實施例中，免疫耐受作用期延續約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約10週、約11週、約12週、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約13個月、約14個月、約15個月、約16個月、約17個月、約18個月、約19個月、約20個月、約21個月、約22個月、約23個月、約24個月、約25個月、約26個月、約27個月、約28個月、約29個月、約30個月、約31個月、約32個月、約33個月、約34個月、約35個月或約36個月。 [0288] 在某些實施例中，一旦達成免疫耐受性，人類便應經受減量期。如本文所用，術語「減量期」及「減量方案」可互換用於指代投與一或多個減量劑量的給藥方案。在一些實施例中，該減量期包含投與約20 IU/Kg至約400 IU/kg。在某些實施例中，該減量期包含投與約20 IU/Kg至約300 IU/kg。在一些實施例中，該減量期包含投與約50 IU/Kg至約300 IU/kg。在一些實施例中，該減量期包含投與約50 IU/Kg至約100 IU/kg。在一些實施例中，該減量期包含投與約100 IU/kg至約300 IU/kg、約100 IU/kg至約200 IU/kg、約100 IU/kg至約290 IU/kg、約100 IU/kg至約280 IU/kg、約100 IU/kg至約270 IU/kg、約100 IU/kg至約260 IU/kg、約100 IU/kg至約250 IU/kg、約100 IU/kg至約240 IU/kg、約100 IU/kg至約230 IU/kg、約100 IU/kg至約220 IU/kg、約100 IU/kg至約210 IU/kg、約150 IU/kg至約300 IU/kg、約150 IU/kg至約290 IU/kg、約150 IU/kg至約280 IU/kg、約150 IU/kg至約270 IU/kg、約150 IU/kg至約260 IU/kg、約150 IU/kg至約250 IU/kg、約150 IU/kg至約240 IU/kg、約140 IU/kg至約250 IU/kg、約130 IU/kg至約260 IU/kg、約120 IU/kg至約270 IU/kg、約110 IU/kg至約280 IU/kg。在一個特定實施例中，該減量期包含投與約200 IU/kg至約300 IU/kg。在另一實施例中，該減量期包含投與約200 IU/kg至約290 IU/kg。在其他實施例中，該減量期包含投與約200 IU/kg至約280 IU/kg、約200 IU/kg至約270 IU/kg、約200 IU/kg至約260 IU/kg、約200 IU/kg至約250 IU/kg、約200 IU/kg至約240 IU/kg、約200 IU/kg至約230 IU/kg、約200 IU/kg至約220 IU/kg或約200 IU/kg至約210 IU/kg。在另一實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約50 IU/kg至約100 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在一個特定實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約50 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在另一實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約150 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在另一實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約125 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在另一特定實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約100 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在另一實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約90 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在另一實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約80 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在另一實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約75 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在另一實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約70 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在另一實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約60 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在另一實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約40 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在另一實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約30 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在另一實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約25 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在另一實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約20 IU/kg組成物或嵌合蛋白。在另一實施例中，該減量方案包含投與減量劑量約10 IU/kg組成物或嵌合蛋白。 [0289] 在一些實施例中，該減量期包含每日投與組成物或嵌合蛋白。在其他實施例中，該減量期包含投與組成物或嵌合蛋白約每兩日一次、約每三日一次、約每四日一次、約每五日一次、約每六日一次、約每七日一次、約每八日一次、約每九日一次、約每十日一次、約每十一日一次、約每十二日一次、約每十三日一次、或約每十四日一次。 [0290] 在某些實施例中，該減量劑量係一日一次、每隔一日一次或每週三次投與。在一些實施例中，該減量劑量係投與達至少約1週、至少約2週、至少約3週、至少約4週、至少約5週、至少約6週、至少約7週、至少約8週、至少約9週、至少約10週、至少約11週、至少約12週、至少約13週、至少約14週、至少約15週、至少約16週、至少約17週、至少約18週、至少約19週、至少約20週、至少約21週、至少約22週、至少約23週、至少約24週、至少約25週、至少約26週、至少約27週、至少約28週、至少約29週、至少約30週、至少約31週或至少約32週。在一特定實施例中，該減量劑量係投與達約16週或更短時間。 [0291] 在某些實施例中，組成物或嵌合蛋白之劑量在減量期期間逐漸減小，且給藥間隔保持相同。在其他實施例中，給藥間隔在減量期期間增加，且組成物或嵌合蛋白之劑量保持相同。在一些實施例中，組成物或嵌合蛋白之劑量在減量期期間逐漸減少，且給藥間隔逐漸增加。 [0292] 在一個特定實施例中，該減量期包含每隔一日投與約200 IU/kg嵌合凝結因子，接著進一步減小劑量及給藥間隔。在其他實施例中，一日所需之嵌合蛋白之劑量可分成兩個劑量、三個劑量或更多劑量。例如，約200 IU/kg嵌合蛋白可分成約100 IU/kg一日兩次、約70 IU/kg一日三次或約50 IU/kg一日四次。 [0293] 在一些實施例中，減量期延續約1個月至約6個月。在某些實施例中，減量期延續約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月或約6個月。在一個特定實施例中，減量期延續約4個月。 [0294] 在某些實施例中，該減量方案包含在免疫耐受性之後從第1週至第6週一日一次投與減量劑量約100 IU/kg該嵌合蛋白。在某些實施例中，該減量方案進一步包含在免疫耐受性之後從第6週至第12週每隔一日一次投與減量劑量約100 IU/kg該嵌合蛋白。在某些實施例中，該減量方案進一步包含從第12週至第16週每隔一日一次投與減量劑量約50 IU/kg該嵌合蛋白。 [0295] 在一些實施例中，減量期係在追蹤期之前。在一些實施例中，追蹤期包含用組成物或嵌合蛋白進行預防治療。在一些實施例中，追蹤期包含用凝結因子進行預防治療。追蹤期中所用之凝結因子可選自免疫耐受作用期及減量期中所用之凝結因子(有或無Fc區)及其任何變異體。凝結因子可包括但不限於原生凝結因子、本文所述之任何變異體(例如
，FVIII之B域缺失變異體)及本文所述之任何嵌合凝結因子(例如
，FVIII-Fc、FVIII-白蛋白等)。在某些實施例中，預防治療包含投與經批准預防劑量例如重組FVIIIFc。在一些實施例中，該預防治療包含25-65 IU/kg(25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、62、64或65 IU/kg)，且該給藥間隔係每3-5、3-6、3-7、3、4、5、6、7或8或更多日一次、或每週三次、或每週不多於三次。在另一實施例中，該預防治療包含65 IU/kg，且該給藥間隔係每週一次或每6-7日一次。在另一實施例中，該預防治療包含投與劑量50 IU/kg凝結因子。在另一實施例中，該預防治療包含投與劑量50 IU/kg凝結因子，且該給藥間隔係每週約三次。在一個特定實施例中，該預防治療包含約25-65 IU/kg，且該給藥間隔係每3-5日一次。在某些實施例中，追蹤期延續約8個月。 [0296] 在一個特定實施例中，嵌合蛋白(例如，FVIIIFc)係以約200 IU/kg/日投與直至觀察到免疫耐受性，例如
，當人類之抑制抗體之效價小於約0.6 BU時；然後，在免疫耐受性之後，投與減量方案，其中該減量方案包含在免疫耐受性之後第1週至第6週投與減量劑量約100 IU/kg嵌合蛋白(例如
，FVIIIFc)一日一次，在免疫耐受性之後第6週至第12週投與減量劑量約100 IU/kg嵌合蛋白(例如
，FVIIIFc)每隔一日一次，且在第12週至第16週投與減量劑量約50 IU/kg嵌合蛋白(例如
，FVIIIFc)每隔一日一次；然後，在減量方案之後，投與預防劑量約50 IU/kg凝結因子每週約三次。 [0297] 包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白可經調配以供任何適當投與方式，包括例如，局部(例如，經皮或眼部)、經口、經頰、經鼻、經陰道、經直腸或非經腸投與。 [0298] 如本文所用之術語非經腸包括皮下、皮內、血管內(例如，靜脈內)、肌肉內、經脊椎、顱內、鞘內、眼內、眼周、眶內、滑膜內及腹膜內注射以及任何類似注射或輸注技術。組成物亦可為例如懸浮液、乳液、持續釋放調配物、乳膏、凝膠或散劑。組成物可用傳統黏合劑及載劑(諸如三酸甘油酯)調配成栓劑。 [0299] 在一個實例中，醫藥調配物為液體調配物，例如
緩衝等張水溶液。在另一實例中，醫藥組成物具有生理性或接近於生理性之pH值。在其他實例中，水性調配物具有生理性或接近於生理性之容積滲透濃度及鹽度。其可含有氯化鈉及/或乙酸鈉。 [0300] 在一些實施例中，本發明之方法中所用之包含FVIII及Fc區之嵌合蛋白係調配於包含以下之醫藥組成物中：(a)嵌合蛋白；(b)一或多種選自蔗糖、海藻糖、棉子糖、精胺酸或其混合物之穩定劑；(c)氯化鈉(NaCl)；(d)L-組胺酸；(e)氯化鈣；及(f)聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在某些實施例中，該醫藥組成物包含：(a)50 IU/ml至2500 IU/ml嵌合蛋白；(b)10 mg/ml至25 mg/ml蔗糖；(c)8.8 mg/ml至14.6 mg/ml氯化鈉(NaCl)；(d)0.75 mg/ml至2.25 mg/ml L-組胺酸；(e)0.75 mg/ml至1.5 mg/ml二水合氯化鈣；及(f)0.08 mg/ml至0.25 mg/ml聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實例中，本揭露之方法中所用之醫藥組成物係經凍乾。 [0301] 在一些實施例中，該醫藥組成物不包含免疫細胞。在一些實施例中，該醫藥組成物不包含細胞。 [0302] 在某些實施例中，使用本揭露之方法治療之人類發展FVIII抑制免疫反應。在一些實施例中，先前發展之FVIII抑制反應回應於重組FVIII而發展。在一些實施例中，先前發展之FVIII抑制反應回應於選自由以下所組成之群組的FVIII產品而發展：ADVATE®
、RECOMBINATE®
、KOGENATE FS®
、HELIXATE FS®
、XYNTHA/REFACTO AB®
、HEMOFIL-M®
、MONARC-M®
、MONOCLATE-P®
、HUMATE-P®
、ALPHANATE®
、KOATE-DVI®
、AFSTYLA®
及HYATE:C®
。 [0303] 在一些實施例中，一旦根據抑制抗體之效價達到免疫耐受作用，便使凝結因子之血清水準維持在約100 IU/dL至約200 IU/dL。在一些實施例中，在開始減量方案之前將組成物或嵌合蛋白之有效量減小，以使凝結因子之血清水準維持在約100 IU/dL至約200 IU/dL。在某些實施例中，若凝結因子之血清水準大於或等於200 IU/dL，則將組成物或嵌合蛋白之有效量減小至約175 IU/kg/日。在某些實施例中，若凝結因子之血清水準大於或等於200 IU/dL，則將組成物或嵌合蛋白之有效量減小至約150 IU/kg/日。在某些實施例中，若凝結因子之血清水準大於或等於200 IU/dL，則將組成物或嵌合蛋白之有效量減小至約125 IU/kg/日。在某些實施例中，若凝結因子之血清水準大於或等於200 IU/dL，則將組成物或嵌合蛋白之有效量減小至約100 IU/kg/日。在某些實施例中，若凝結因子之血清水準大於或等於200 IU/dL，則將組成物或嵌合蛋白之有效量減小至約75 IU/kg/日。在某些實施例中，若凝結因子之血清水準大於或等於200 IU/dL，則將組成物或嵌合蛋白之有效量減小至約50 IU/kg/日。在某些實施例中，若凝結因子之血清水準大於或等於200 IU/dL，則將組成物或嵌合蛋白之有效量減小至約25 IU/kg/日。 [0304] 本揭露之某些態樣係關於誘導具有血友病之人類之免疫耐受性之方法，其包含向該人類投與約200 IU/kg包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。在某些實施例中，組成物或嵌合蛋白係每隔一日投與。在其他實施例中，組成物或嵌合蛋白係每日投與。 [0305] 在其他態樣中，本揭露係關於誘導具有血友病之人類之免疫耐受性之方法，其包含向該人類投與約202 IU/kg包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。在某些實施例中，組成物或嵌合蛋白係每日投與。 [0306] 在其他態樣中，本揭露係關於誘導具有血友病之人類之免疫耐受性之方法，其包含向該人類投與約150 IU/kg包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。在某些實施例中，組成物或嵌合蛋白係每日投與。 [0307] 在其他態樣中，本揭露係關於誘導具有血友病之人類之免疫耐受性之方法，其包含向該人類投與約130 IU/kg包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。在某些實施例中，組成物或嵌合蛋白係每日投與。 [0308] 在其他態樣中，本揭露係關於誘導具有血友病之人類之免疫耐受性之方法，其包含向該人類投與約115 IU/kg包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。在某些實施例中，組成物或嵌合蛋白係每隔一日投與。 [0309] 在其他態樣中，本揭露係關於誘導具有血友病之人類之免疫耐受性之方法，其包含向該人類投與約100 IU/kg包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。在某些實施例中，組成物或嵌合蛋白係每日投與。在其他實施例中，組成物或嵌合蛋白係每週三次投與。 [0310] 在其他態樣中，本揭露係關於誘導具有血友病之人類之免疫耐受性之方法，其包含向該人類投與約102 IU/kg包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。在某些實施例中，組成物或嵌合蛋白係每隔一日投與。 [0311] 在其他態樣中，本揭露係關於誘導具有血友病之人類之免疫耐受性之方法，其包含向該人類投與約96 IU/kg包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。在某些實施例中，組成物或嵌合蛋白係每日投與。 [0312] 在其他態樣中，本揭露係關於誘導具有血友病之人類之免疫耐受性之方法，其包含向該人類投與約85 IU/kg包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。在某些實施例中，組成物或嵌合蛋白係每日投與。 [0313] 在其他態樣中，本揭露係關於誘導具有血友病之人類之免疫耐受性之方法，其包含向該人類投與約50 IU/kg包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。在某些實施例中，組成物或嵌合蛋白係每週三次投與。 [0314] 本揭露之某些態樣係關於誘導具有血友病之人類之免疫耐受性之方法，其包含(1)向該人類投與約200 IU/kg包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白，其中該組成物或該嵌合蛋白誘導該人類之免疫耐受性；及(2)在誘導免疫耐受性之後，向該人類投與減量方案該組成物或該嵌合蛋白。II.A.2 Fc
[0315] 在一些實施例中，本揭露之組成物、嵌合蛋白及/或凝結因子包括結合至Fc受體(FcR；例如，FcRn)之Fc域或其一部分。在一些實施例中，Fc域融合至凝結因子，例如
，作為包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白之一部分。在其他實施例中，Fc域融合至除凝結因子之外的多肽，其中該組成物包含(1)凝結因子及(2)包含Fc域及另一多肽之嵌合蛋白。Fc域或其一部分可改良嵌合蛋白之藥物動力學或藥效動力學性質。在某些實施例中，Fc域或其一部分延長融合至該Fc域或其一部分之分子之半衰期。 [0316] 除非另外規定，否則如本文所用，如本文所用之術語「Fc區」之「Fc域」意謂功能性FcR(例如，FcRn)結合搭配物。Fc域係多肽中對應於原生Ig之Fc域的部分，亦即
，如藉由其兩條重鏈之各別Fc域之二聚締合所形成。原生Fc域與另一Fc域形成均二聚體。相反，如本文所用之術語「遺傳融合Fc區」或「單鏈Fc區」(scFc區)係指合成二聚Fc區，其包含在單一多肽鏈內遺傳連接之Fc域(亦即
，在單一鄰接遺傳序列中編碼)。 [0317] 在一個實施例中，「Fc區」係指單一Ig重鏈之一部分，其在恰好在木瓜蛋白酶(papain)裂解位點(亦即
IgG中之殘基216，將重鏈恆定區之第一殘基看作114)上游之鉸鏈區中開始且在抗體之C末端處結束。據此，完全Fc域至少包含鉸鏈域、CH2域及CH3域。 [0318] 視Ig同型而定，Ig恆定區之Fc區可包括CH2、CH3及CH4域以及鉸鏈區。包含Ig之Fc區之嵌合蛋白對嵌合蛋白賦予若干合乎需要之性質，包括增強之穩定性、增加之血清半衰期(參見Capon等人
, 1989, Nature 337:525)以及結合至Fc受體，諸如新生Fc受體(FcRn)(美國專利第6,086,875號、第6,485,726號、第6,030,613號；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，其等以全文引用的方式併入本文中。 [0319] 已自包括人類之若干哺乳動物物種分離FcRn受體。已知人類FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn及小鼠FcRn之序列(Story等人 1994, J. Exp. Med. 180:2377)。FcRn受體在相對較低之pH值下結合IgG(但不結合其他Ig類別，諸如IgA、IgM、IgD及IgE)，以內腔至漿膜方向跨細胞主動轉運IgG，然後在間隙液中存在之相對較高pH值下釋放IgG。其表現在成人上皮組織(美國專利第6,485,726號、第6,030,613號、第6,086,875號；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，包括肺及腸上皮(Israel等人1997, Immunology 92:69)、腎近端管狀上皮(Kobayashi等人2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358)以及鼻上皮；陰道表面；及膽系表面中。 [0320] 實用於本發明中之Fc區涵蓋可特異性結合FcR之分子，包括完整IgG、IgG之Fc片段、及包括FcR之完全結合區之其他片段。與例如FcRn受體結合之IgG之Fc部分的區已基於X-射線晶體衍射得以描述(Burmeister等，1994，Nature 372:379)。Fc與FcRn之主要接觸區域接近CH2域與CH3域之接合點。Fc-FcRn接觸區全部在單一Ig重鏈內。Fc區包括完整IgG、IgG之Fc片段及IgG中包括FcRn之完整結合區之其他片段。主要接觸位點包括CH2域之胺基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314，及CH3域之胺基酸殘基385-387、428及433-436。對Ig或Ig片段之胺基酸編號的提及皆基於Kabat等人 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md。 [0321] 特異性結合係指兩個分子在生理條件下形成相對穩定之複合物。特異性結合之特徵在於親和力較高且能力較低至中等，如與通常親和力較低且能力中等至較高之非特異性結合相區分。通常，當親和力常數KA高於106
M-1
或高於108
M-1
時，結合被視為特異性結合。必要時，可藉由改變結合條件來降低非特異性結合而不實質上影響特異性結合。諸如分子濃度、溶液之離子強度、溫度、允許結合時間、阻斷劑(例如
血清白蛋白、乳酪蛋白)濃度等之適當結合條件可由熟練技術人員使用常規技術加以最佳化。 [0322] 在某些實施例中，本發明之嵌合蛋白包含一或多個截短Fc區，儘管如此，該等Fc區仍然足以對Fc區賦予FcR結合性質。例如，Fc區之結合FcRn之部分(亦即
FcRn結合部分)包含IgG1之約胺基酸282-438(EU編號)，其中主要接觸位點為CH2域之胺基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314及CH3域之胺基酸殘基385-387、428及433-436。因此，本發明之Fc區可包含FcRn結合部分或由FcRn結合部分組成。 [0323] FcR結合部分可源於包括IgGl、IgG2、IgG3及IgG4之任何同型之重鏈。在一個實施例中，使用來自具有人類同型IgG1之抗體之FcR結合部分。在另一實施例中，使用來自具有人類同型IgG4之抗體之FcR結合部分。 [0324] 在另一實施例中，「Fc區」包括Fc域或源於Fc域之胺基酸序列。在某些實施例中，Fc區包含以下至少一者：鉸鏈(例如
上、中及/或下鉸鏈區)域(抗體Fc區之約胺基酸216-230，根據EU編號)、CH2域(抗體Fc區之約胺基酸231-340，根據EU編號)、CH3域(抗體Fc區之約胺基酸341-438，根據EU編號)、CH4域、或其變異體、部分或片段。在其他實施例中，Fc區包含完全Fc域(亦即
鉸鏈域、CH2域及CH3域)。在一些實施例中，Fc區包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成：融合於CH3域(或其部分)之鉸鏈域(或其部分)、融合於CH2域(或其部分)之鉸鏈域(或其部分)、融合於CH3域(或其部分)之CH2域(或其部分)、融合於鉸鏈域(或其部分)與CH3域(或其部分)兩者之CH2域(或其部分)。在其他實施例中，Fc區缺乏CH2域之至少一部分(例如
CH2域之全部或一部分)。在一特定實施例中，Fc區包含以下或由以下組成：對應於EU編號221至447之胺基酸。 [0325] 在本文中表示為F、F1或F2之Fc區可自許多不同來源獲得。在一個實施例中，多肽之Fc區源於人類Ig。然而，應瞭解Fc區可源於另一哺乳動物物種之Ig，物種包括例如齧齒動物(例如
小鼠、大鼠、兔或天竺鼠)或非人類靈長類動物(例如
黑猩猩、獼猴)物種。此外，Fc域或其部分之多肽可源於任何Ig類別(包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE)及任何Ig同型(包括IgGl、IgG2、IgG3及IgG4)。在另一實施例中，使用人類同型IgG1。 [0326] 在某些實施例中，Fc變異體賦予由包含該野生型Fc域之Fc區賦予之至少一種效應功能的變化(例如，Fc區結合至Fc受體(例如，結合至FcγRI、FcγRII或FcγRIII之改良或降低)、補體蛋白(例如C1q)或其他Fc結合搭配物（例如，DC-SIGN），或觸發抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、吞噬作用或補體依賴性細胞毒性(CDCC)之能力改良或降低)。在其他實施例中，Fc變異體提供工程改造之半胱胺酸殘基。 [0327] 本發明之Fc區可採用此項技術認可之已知會賦予效應功能及/或FcR或FcRn結合變化(例如增強或降低)之Fc變異體。具體而言，本發明之結合分子可包括例如在以下揭示之一或多個胺基酸位置處之變化(例如
，取代)：國際PCT公開案WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2及WO06/085967A2；美國專利公開案第US2007/0231329號、第US2007/0231329號、第US2007/0237765號、第US2007/0237766號、第US2007/0237767號、第US2007/0243188號、第US2007/0248603號、第US2007/0286859號、第US2008/0057056號；或美國專利5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；7,404,956及7,317,091。在一個實施例中，可在一或多個揭示之胺基酸位置處進行具體變化(例如具體取代此項技術中揭示之一或多個胺基酸)。在另一實施例中，可在一或多個揭示之胺基酸位置處進行不同變化(例如此項技術中揭示之一或多個胺基酸位置之不同取代)。 [0328] Fc區可根據充分認可之程序(諸如定點突變誘發及其類似程序)加以修飾以產生將由FcγRIIB及/或DC-SIGN結合之經修飾Fc片段或部分。此等修飾包括保持或甚至增強與FcγRIIB及/或DC-SIGN結合的遠離FcγRIIB及/或DC-SIGN接觸位點之修飾以及在接觸位點內之修飾。例如，可取代人類IgG1 Fc(Fc γ1)中之以下單一胺基酸殘基而不顯著損失Fc對FcγRIIB及/或DC-SIGN之結合親和力：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A及K447A，其中例如P238A表示在位置編號238處野生型脯胺酸經丙胺酸取代。例如，一具體實施例併有N297A突變，從而移除高度保守之N-醣化位點。除丙胺酸之外，其他胺基酸亦可在以上指定之位置處取代野生型胺基酸。突變可逐一引入Fc中，從而產生多於一百個不同於原生Fc之Fc區。另外，兩個、三個或更多個此等個別突變之組合可一起引入，從而產生數百個以上Fc區。此外，本發明之構築體之一個Fc區可經突變且該構築體之另一Fc區完全不突變，或其兩者均可經突變，但突變不同。 [0329] 某些以上突變可對Fc區或FcRn結合搭配物賦予新功能性。例如，一個實施例併有N297A，從而移除高度保守之N-醣化位點。此突變之作用在於降低免疫原性，藉此增強Fc區之循環半衰期，及在不損害對FcRn之親和力下致使Fc區不能結合FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB及FcγRIIIA(Routledge等人 1995, Transplantation 60:847；Friend等人 1999, Transplantation 68:1632；Shields等人 1995, J. Biol. Chem. 276:6591)。作為由於上述突變而產生之新功能性之另一實例，對FcRn之親和力在一些情況下可增加超過野生型對FcRn之親和力。此親和力增加可反映「締合」速率增加、「解離」速率降低、或「締合」速率增加與「解離」速率降低兩者。咸信會賦予對FcRn之親和力增加之突變的實例包括但不限於T256A、T307A、E380A及N434A(Shields等人 2001, J. Biol. Chem. 276:6591)。 [0330] 另外，至少三種人類Fcγ受體似乎識別IgG上在下鉸鏈區內之結合位點，通常為胺基酸234-237。因此，新功能性及潛在免疫原性降低之另一實例可由於此區域之突變而產生，如例如藉由將人類IgG1之胺基酸233-236「ELLG」置換成來自IgG2之相應序列「PVA」(其中有一個胺基酸缺失)。已顯示當已引入此等突變時，介導各種效應功能之FcγRI、FcγRII及FcγRIII將不結合IgG1。Ward及Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77及Armour等人 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613。 [0331] 在一個實施例中，Fc域或其部分係多肽，包括美國專利第5,739,277號之SEQ ID NO: 3且視情況進一步包括選自美國專利第5,739,277號之SEQ ID NO: 11、1、2及31之序列。 [0332] 在某些實施例中，Fc域或其部分經半醣化。例如，包含兩個Fc區之嵌合蛋白可含有第一醣化Fc區(例如
醣化CH2區)及第二無醣化Fc區(例如
無醣化CH2區)。在一個實施例中，連接子可插入在醣化Fc區與無醣化Fc區之間。在另一實施例中，Fc區經完全醣化，亦即
所有Fc區皆經醣化。在其他實施例中，Fc區可為無醣化的，亦即無Fc部分經醣化。 [0333] 在某些實施例中，本發明之嵌合蛋白包含對Fc域或其部分之胺基酸取代(例如Fc變異體)，其改變Fc域之抗原非依賴性效應功能，特定言之改變蛋白質之循環半衰期。 [0334] 當相較於缺乏此等取代之蛋白質時，此等蛋白質展現與FcR之結合增加或降低，且因此在血清中之半衰期分別增加或降低。預期對FcR之親和力提高之Fc變異體會具有較長血清半衰期，且此等分子適合應用於治療哺乳動物之方法(其中需要投與之多肽之半衰期較長例如
以治療慢性疾病或病症)中(參見例如
美國專利7,348,004、7,404,956及7,862,820)。相反，預期FcR結合親和力降低之Fc變異體會具有較短半衰期，且此等分子亦例如適用於向哺乳動物投與，其中縮短循環時間可為有利的，例如適用於活體內診斷成像或起始多肽當持續延長時期存在於循環中時具有毒性副作用之情形下。FcRn結合親和力降低之Fc變異體亦較不可能跨越胎盤，且因此亦適用於治療懷孕婦女之疾病或病症。此外，可能需要FcRn結合親和力降低之其他應用包括需要定位於腦、腎及/或肝之彼等應用。在一個示範性實施例中，本發明之嵌合蛋白展現自血管結構跨越腎小球之上皮之轉運降低。在另一實施例中，本發明之嵌合蛋白展現自腦跨越血腦障壁(BBB)進入血管間隙中之轉運降低。在一個實施例中，FcR結合改變之蛋白質包含至少一個在Ig恆定區之「FcR結合環」內具有一或多個胺基酸取代之Fc區(例如
一或兩個Fc區)。在一個實施例中，FcR結合環包含野生型全長Fc區之胺基酸殘基280-299(根據EU編號)。在其他實施例中，本發明嵌合蛋白中之具有改變之FcR結合親和力的Ig恆定區或其部分包含至少一個在15 Ǻ FcR「接觸區」內具有一或多個胺基酸取代之Fc區。如本文所用，術語15 Ǻ FcRn「接觸區」包括野生型全長Fc部分之以下位置處之殘基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424、425-440(EU編號)。在其他實施例中，本發明之具有改變的FcR結合親和力之Fc域或其部分包含至少一個在對應於任一以下EU位置之胺基酸位置處具有一或多個胺基酸取代之Fc區：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如
N434A或N434K)及438。改變FcR結合活性之示範性胺基酸取代揭露於國際PCT公開案第WO05/047327號中，該公開案以引用的方式併入本文中。 [0335] 本發明中使用之Fc區亦可包含此項技術認可之改變嵌合蛋白之醣化之胺基酸取代。例如，嵌合蛋白之連接於FVIII蛋白之Fc區可包含具有導致醣化(例如
N-連接或O-連接醣化)降低之突變之Fc區，或可包含野生型Fc部分之改變的糖形式(例如
低海藻糖(fucose)或無海藻糖聚醣)。 [0336] 在一個實施例中，本發明之未加工嵌合蛋白可包含遺傳學融合之Fc區(亦即scFc區)，該Fc區具有二或更多個獨立地選自本文所述之Ig恆定區或其部分之其組成Ig恆定區或其部分。在一個實施例中，二聚Fc區之Fc區為相同的。在另一實施例中，至少兩個Fc區為不同的。例如，本發明蛋白質之Fc區包含相同數目之胺基酸殘基，或其可在長度方面相差一或多個胺基酸殘基(例如
約5個胺基酸殘基(例如
1、2、3、4或5個胺基酸殘基)、約10個殘基、約15個殘基、約20個殘基、約30個殘基、約40個殘基或約50個殘基)。在其他實施例中，本發明蛋白質之Fc區可在序列方面在一或多個胺基酸位置處不同。例如，至少兩個Fc區可在約5個胺基酸位置(例如
1、2、3、4或5個胺基酸位置)、約10個位置、約15個位置、約20個位置、約30個位置、約40個位置、或約50個位置處不同。 [0337] 在一些實施例中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含多於一條多肽鏈。在一些實施例中，嵌合蛋白包含兩條多肽鏈。在某些實施例中，第一多肽鏈包含凝結因子及第一Fc區，且第二多肽鏈包含第二Fc區。在某些實施例中，第一Fc區及第二Fc區藉由共價鍵締合。在一個實施例中，第一Fc區及第二Fc區藉由肽鍵締合。在另一實施例中，第一Fc區及第二Fc區藉由二硫鍵締合。 [0338] 在一個特定實施例中，嵌合蛋白包含因子VIII部分及馮威里因子(VWF)部分，其中該FVIII部分包含FVIII多肽或其片段，其中該VWF部分包含VWF多肽或其片段，其中該FVIII部分連接至第一Fc區，其中該VWF部分連接至第二Fc區，且其中該第一Fc區及該第二Fc區係彼此締合。在某些實施例中，VWF部分包含VWF之D'及D3域。在一個實施例中，第一多肽、第二多肽或第一多肽及第二多肽兩者進一步包含一或多個半衰期延長部分。 [0339] 本揭露之方法中使用之用於產生嵌合蛋白的Fc區或其部分可自許多不同來源獲得。在一些實施例中，Fc區或其部分源於人類Ig。然而，應瞭解Fc區或其部分可源於另一哺乳動物物種之Ig，物種包括例如齧齒動物(例如
小鼠、大鼠、兔、天竺鼠)或非人類靈長類動物(例如
黑猩猩、獼猴)物種。此外，Fc區或其部分可源於任何Ig類別(包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE)及任何Ig同型(包括IgGl、IgG2、IgG3及IgG4)。在一個實施例中，使用人類同型IgG1。 [0340] 多種Fc區基因序列(例如人類Fc基因序列)可以公開可得之寄存物形式獲得。可選擇具有特定效應功能(或缺乏特定效應功能)或具有用以降低免疫原性之特定修飾之Fc序列。許多抗體及抗體編碼基因序列已經公開且可使用此項技術認可之技術自此等序列獲得適合Fc區序列。使用任一前述方法獲得之遺傳物質可然後經改變或合成以獲得本揭露之方法中使用之嵌合蛋白。應進一步瞭解本發明之範疇涵蓋恆定區DNA序列之對偶基因、變異體及突變。 [0341] Fc或其部分之序列可例如使用選用於擴增相關域之聚合酶鏈反應及引子來選殖。為自抗體選殖Fc區或其部分之序列，可自融合瘤、脾或淋巴細胞分離mRNA，逆轉錄成DNA，且藉由PCR擴增抗體基因。PCR擴增方法詳述於美國專利第4,683,195號；第4,683,202號；第4,800,159號；第4,965,188號中；及例如
「PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications」 Innis等人編, Academic Press, San Diego, CA(1990)；Ho等人 1989. Gene 77:51；Horton等人 1993.Methods Enzymol. 217:270中。PCR可藉由共同恆定區引子或藉由基於公開之重鏈及輕鏈DNA及胺基酸序列之更特異性引子來啟始。如上所論述，PCR亦可用於分離編碼抗體輕鏈及重鏈之DNA純系。在此情況下，可藉由共同引子或較大同源探針(諸如小鼠恆定區探針)來篩檢文庫。適於擴增抗體基因之眾多引子組在此項技術中為已知的，例如基於純化抗體之N末端序列(Benhar及Pastan. 1994. Protein Engineering7:1509)；cDNA末端之快速擴增物(Ruberti, F.等人 1994. J. Immunol. Methods 173:33)；抗體前導序列(Larrick等人 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250)之5'引子。抗體序列之選殖進一步描述於Newman等人, 1995年1月25日申請之美國專利第5,658,570號中，該專利以引用的方式併入本文中。II.B. 半衰期延長部分
[0342] 在一些實施例中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白進一步包含一或多個半衰期延長部分。凝結因子之半衰期可藉由熟習此項技術者已知之任何方法來確定，例如偵測血漿FVIII活性水準之FVIII活性分析(顯色分析或單級凝結aPTT分析)或偵測血漿FVIII抗原水準之FVIII ELISA。在一特定實施例中，凝結因子之凝結活性之半衰期係藉由單級凝結分析確定。在一更特定實施例中，在小鼠(HemA小鼠或FVIII及馮威里因子雙重剔除(DKO)小鼠)中確定凝結因子之凝結活性之半衰期。 [0343] 在某些態樣中，使本發明之凝結因子之半衰期增加的異源部分包含但不限於異源多肽諸如白蛋白、免疫球蛋白Fc區、XTEN序列、人類絨毛膜促性腺素之β次單位之C末端肽(CTP)、PAS序列、HAP序列、運鐵蛋白、白蛋白結合部分或此等多肽之任何片段、衍生物、變異體或組合。在其他相關態樣中，半衰期延長部分可包括諸如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、聚唾液酸或此等部分之任何衍生物、變異體或組合之非多肽部分的連接位點。在某些實施例中，該半衰期延長部分包含白蛋白或其片段、白蛋白結合部分、PAS序列、HAP序列、運鐵蛋白或其片段、聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸、羥乙基澱粉(HES)、其衍生物或其任何組合。在一些實施例中，半衰期延長部分不包含XTEN。在其他實施例中，半衰期延長部分包含XTEN。 [0344] 在其他實施例中，本發明之嵌合蛋白與一或多種聚合物結合。聚合物可為水溶性的或非水溶性的。聚合物可共價或非共價連接至凝結因子、Fc或與凝結因子或Fc結合之其他部分。聚合物之非限制性實例可為聚(氧化烯)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉或聚(丙烯醯基嗎啉)。其他類型之例如
聚合物結合FVIII揭示於美國專利第7,199,223號中，該專利以全文引用的方式加以揭示。 [0345] 在某些態樣中，本發明之嵌合蛋白可包含一個、兩個、三個或更多個各自可為相同或不同分子的半衰期延長部分。 [0346] 在一些實施例中，半衰期延長部分融合至嵌合蛋白之N末端或C末端。在一些實施例中，半衰期延長部分融合至凝結因子之N末端或C末端。在一些實施例中，半衰期延長部分融合至Fc之N末端或C末端。在某些實施例中，半衰期延長部分插入在嵌合蛋白之凝結因子內。 [0347] 在一些實施例中，嵌合蛋白包含FVIII或其部分，且半衰期延長部分在美國專利公開案第2015-0158929 A1號及/或國際公開案第No. WO 2015106052 A1中所揭示之一或多個位置處插入在FVIII內，該等公開案以全文引用之方式併入本文中。在一個特定實施例中，半衰期延長部分插入在FVIII之B域(或其片段)內。在一個特定實施例中，半衰期延長部分緊靠成熟FVIII之胺基酸殘基745之下游插入在FVIII內。II.B.1.
白蛋白 [0348] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種白蛋白多肽或其片段、變異體或衍生物。人血清白蛋白(HAS或HA)係呈全長形式時具有609個胺基酸之蛋白質，其負責顯著比例的血清滲透壓且亦充當內源性及外源性配位體之攜帶物。如本文所用之術語「白蛋白」包括全長白蛋白或其功能性片段、變異體、衍生物或類似物。白蛋白或其片段或變異體之實例揭示於美國專利公開案第2008/0194481A1號、第2008/0004206 A1號、第2008/0161243 A1號、第2008/0261877 A1號或第2008/0153751 A1號或PCT申請公開案第2008/033413 A2號、第2009/058322 A1號或第2007/021494 A2號中，該等公開案以全文引用的方式併入本文中。 [0349] 白蛋白結合多肽(ABP)可包含但不限於可結合白蛋白之細菌白蛋白結合域、白蛋白結合肽或白蛋白結合抗體片段。如Kraulis等人
, FEBS Lett. 378:190-194 (1996)及Linhult等人
, Protein Sci. 11:206-213 (2002)所揭示，來自鏈球菌蛋白G之域3為細菌白蛋白結合域之實例。白蛋白結合肽之實例揭示於Dennis 等人, J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043(2002)。白蛋白結合抗體片段之實例揭露於Muller及Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326(2007)；Roovers等人
, Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317(2007)；及Holt等人
, Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288(2008)中，該等參考文獻以全文引用的方式併入本文中。 [0350] 在某些態樣中，本揭示之方法中使用之嵌合蛋白包含非多肽小分子、其可結合白蛋白之變異體或衍生物之至少一個連接位點。例如，嵌合蛋白可包括一或多個有機白蛋白結合部分。此等白蛋白結合部分之一實例為如由Trussel等人
, Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009)揭示之2-(3-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁醯胺基)己酸酯(「Albu」標籤)。II.B.2.
XTEN [0351] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種XTEN多肽或其片段、變異體或衍生物。如此處所用，「XTEN序列」係指具有非天然存在、實質上非重複、主要包含小親水性胺基酸之序列的長度延長之多肽，該序列在生理條件下具有較低程度之二級或三級結構或無二級或三級結構。作為嵌合蛋白搭配物，XTEN可充當攜帶物，從而例如
當與嵌合蛋白之凝結因子融合或插入至其中時，賦予某些合乎需要之藥物動力學、物理化學及醫藥性質。該等合乎需要之性質包括但不限於增強的藥物動力學參數及可溶性特徵。 [0352] 與本揭露之方法中使用之嵌合蛋白之凝結因子融合或插入至其中的XTEN序列可賦予重組蛋白一或多種以下有利性質：構形可撓性、增強之水溶性、高度蛋白酶抗性、低免疫原性、與哺乳動物受體之低結合作用或增加之流體動力學(或斯托克斯(Stokes))半徑。在某些態樣中，XTEN序列可增加藥物動力學性質，諸如較長的半衰期(例如，體內半衰期)或增加曲線下面積(AUC)，以使嵌合蛋白相較於無XTEN之嵌合蛋白體內停留且具有促凝血活性達增加之時段。 [0353] 可插入至本發明之重組FVIII蛋白中之XTEN序列的實例揭示於例如美國專利公開案第2010/0239554 A1號、第2010/0323956 A1號、第2011/0046060 A1號、第2011/0046061 A1號、第2011/0077199 A1號或第2011/0172146 A1號，或國際專利公開案第WO 2010091122 A1號、第WO 2010144502 A2號、第WO 2010144508 A1號、第WO 2011028228 A1號、第WO 2011028229 A1號、第WO 2011028344 A2號或第WO 2015106052 A1號中，該等公開案各自以全文引用的方式併入本文中。II.B.3. VWF 或其片段
[0354] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種VWF多肽或其片段、變異體或衍生物。VWF(亦稱為F8VWF)為一種存在於血漿中且在內皮(在懷布爾-帕拉德體(Weibel-Palade body)中)、巨核細胞(血小板之α-顆粒)及內皮下結締組織中組成性產生之大型多聚醣蛋白。基本VWF單體為具有2813個胺基酸之蛋白質。每個單體含有多個具有特定功能之特定域，亦即D'/D3域(其結合因子VIII)、A1域(其結合血小板GPIb受體、肝素及/或可能膠原蛋白)、A3域(其結合膠原蛋白)、C1域(其中RGD域在此域活化時結合血小板整聯蛋白αIIbβ3)、及在蛋白質之C末端之「半胱胺酸結(cysteine knot)」域(該VWF與血小板源性生長因子(PDGF)、轉型生長因子-β(TGFβ)及β-人類絨毛膜促性腺素(βHCG)共有該域)。 [0355] 在一個實施例中，VWF多肽係VWF片段。如本文所用之術語「VWF片段」包括但不限於能夠抑制內源性VWF結合FVIII之包含D'域及D3域之功能性VWF片段。在一個實施例中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含凝結因子、Fc區及VWF片段，其中該凝結因子包含FVIII，且其中該VWF片段結合FVIII蛋白。在另一實施例中，VWF片段阻斷FVIII蛋白上之VWF結合位點，藉此抑制FVIII蛋白與內源性VWF之相互作用。VWF片段包括保留VWF之此等活性之衍生物、變異體、突變體或類似物。在某些實施例中，VWF片段包含VWF之D'域及D3域。 [0356] 人類VWF之2813單體胺基酸序列在基因庫中報導為登錄號NP_000543.2。編碼人類VWF之核苷酸序列在基因庫中報導為登錄號NM_000552.3。 [0357] 在某些實施例中，本文實用之VWF蛋白可進一步經修飾以改良其與FVIII之相互作用，例如改良對FVIII之結合親和力。在其他實施例中，實用於本發明之VWF蛋白可具有其他修飾，例如
蛋白質可經聚乙二醇化、醣化、羥乙基澱粉化或聚唾液酸化。實用於本揭露之實例性VWF序列提供於例如
美國公開案第US 2015/0023959 Al號、第US 2015/0266943 A1號及第US 2015/0158929號中。在某些實施例中，VWF蛋白或其片段融合至FcRn結合搭配物或與FcRn結合搭配物共同投與。在一些實施例中，VWF蛋白或其片段融合至Fc或與Fc或包含Fc之多肽共同投與。在一些實施例中，VWF蛋白或其片段融合至白蛋白或與白蛋白或包含白蛋白之多肽共同投與。II.B.4.
CTP [0358] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含人類絨毛膜促性腺素之β次單位之至少一個C末端肽(CTP)或其片段、變異體或衍生物。已知CTP肽增加該蛋白之半衰期。參見，例如
，美國專利第5,712,122號，其以全文引用之方式併入本文中。非限制性示範性CTP肽揭示於美國專利申請公開案第US 2009/0087411 A1號中，其以引用方式併入。II.B.5.
PAS [0359] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種PAS肽或其片段、變異體或衍生物。如本文所用之PAS肽或PAS序列意謂主要包含丙胺酸及絲胺酸殘基或主要包含丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸殘基之胺基酸序列，該胺基酸序列在生理條件下形成無規捲曲構形。因此，PAS序列為包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成之可用作嵌合蛋白中之異源部分之一部分的構築嵌段、胺基酸聚合物或序列基因盒：丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸。當除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸以外之殘基作為次要組分添加於PAS序列中時，胺基酸聚合物亦可形成無規捲曲構形。「次要組分」意謂除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸以外之胺基酸可在某種程度上添加於PAS序列中，例如
胺基酸之至多約12%，亦即
PAS序列之100個胺基酸中有約12個彼等胺基酸；至多約10%；至多約9%；至多約8%；約6%；約5%；約4%；約3%；亦即
約2%或約1%。不同於丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸之胺基酸可選自由以下組成之群：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr及Val。在生理條件下，PAS肽形成無規捲曲構形且藉此可介導本發明重組蛋白之體內及/或體外
穩定性增強，且具有促凝血活性。 [0360] PAS肽之非限制性實例揭示於例如美國專利公開案第2010/0292130 A1號；PCT申請公開案第WO 2008/155134 A1號；及歐洲頒佈專利EP2173890。II.B.6.
HAP [0361] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種均胺基酸聚合物(HAP)肽或其片段、變異體或衍生物。HAP肽可包含甘胺酸重複序列，其長度為至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、120個胺基酸、140個胺基酸、160個胺基酸、180個胺基酸、200個胺基酸、250個胺基酸、300個胺基酸、350個胺基酸、400個胺基酸、450個胺基酸或500個胺基酸。HAP序列能夠延長融合於或連接至HAP序列之部分的半衰期。HAP序列之非限制性實例包括但不限於(Gly)n
、(Gly4
Ser)n
或S(Gly4
Ser)n
，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一個實施例中，n為20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一實施例中，n為50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。參見，例如
，Schlapschy M等人
, Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007)。II.B.7.
運鐵蛋白 [0362] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種運鐵蛋白肽或其片段、變異體或衍生物。任何運鐵蛋白均可與本揭露之方法中使用之嵌合蛋白融合。舉例而言，野生型人類Tf(Tf)為一種具有679個胺基酸之大致75 kDa(不考慮醣化)之蛋白質，具有似乎由基因複製產生之兩個主要域N(約330個胺基酸)及C(約340個胺基酸)。參見
基因庫登錄號NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM 039847及S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov)，其全部以全文引用的方式併入本文中。 [0363] 運鐵蛋白經由運鐵蛋白質受體(TfR)介導之胞吞作用來轉運鐵。在鐵釋放至內體區室(endosomal compartment)中且Tf-TfR複合物再循環至細胞表面之後，Tf釋放回細胞外空間以進行下一鐵轉運循環。Tf擁有超過14-17日的長半衰期(Li等人, Trends Pharmacol. Sci. 23:206-209 (2002))。已對運鐵融合蛋白之半衰期延長進行研究，目標為用於癌症治療之遞送、經口遞送及胰島素原之持續活化(Brandsma等人
, Biotechnol. Adv., 29: 230-238 (2011)；Bai等人
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:7292-7296 (2005)；Kim等人, J. Pharmacol. Exp. Ther., 334:682-692 (2010)；Wang等人, J. Controlled Release 155:386-392 (2011))。II.B.8.
PEG [0364] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含非多肽異源部分之至少一個連接位點或其片段、變異體或衍生物。例如，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白可包括連接至凝結因子及/或Fc區中一或多個胺基酸殘基的一或多個聚乙二醇(PEG)部分。 [0365] 蛋白質之聚乙二醇化可指代在蛋白質與至少一個聚乙二醇(PEG)分子之間形成結合物。可購得在多種分子量及平均分子量範圍內的PEG。PEG平均分子量範圍之典型實例包括但不限於約200、約300、約400、約600、約1000、約1300-1600、約1450、約2000、約3000、約3000-3750、約3350、約3000-7000、約3500-4500、約5000-7000、約7000-9000、約8000、約10000、約8500-11500、約16000-24000、約35000、約40000、約60000及約80000道爾頓。此等平均分子量僅作為實例提供且不意欲以任何方式具有限制性。 [0366] 本揭露之方法中使用之嵌合蛋白可經聚乙二醇化以包括單個或多個(例如，2-4個)PEG部分。聚乙二醇化可藉由此項技術中已知之聚乙二醇化反應中之任一種進行。製備聚乙二醇化蛋白質產物之方法一般將包括(i)使多肽與聚乙二醇(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使本發明之肽連接至一或多個PEG基團之條件下反應；及(ii)獲得反應產物。一般而言，反應之最佳反應條件將基於已知參數及所需結果根據具體情況來確定。 [0367] 存在許多可為熟習此項技術者可利用的PEG連接方法，例如Malik F等人,Exp. Hematol
. 20:1028-35 (1992)；Francis,Focus on Growth Factors
3(2):4-10 (1992)；歐洲專利公開案第EP0401384號、第EP0154316號及第EP0401384號；及國際專利申請公開案第WO92/16221號及第WO95/34326號。作為非限制性實例，FVIII變異體可含有半胱胺酸取代，且半胱胺酸可進一步結合於PEG聚合物。參見Mei等人 , Blood
116:270-279 (2010)及美國專利第7,632,921號，其以全文引用的方式併入本文中。II.B.9.
HES [0368] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種羥乙基澱粉(HES)聚合物。HES為天然存在之支鏈澱粉之衍生物並由體內之α-澱粉酶降解。HES展現有利生物性質且在臨床上用作血容量補充劑並用於血液稀釋療法中。參見例如Sommermeyer等人
,Krankenhauspharmazie
8:271-278 (1987)；及Weidler等人
,Arzneim.-Forschung/Drug Res
. 41: 494-498 (1991)。 [0369] HES主要藉由分子量分佈及取代度來表徵。HES之平均分子量(重量平均分子量)為1至300 kD、2至200 kD、3至100 kD或4至70 kD。對於羥乙基，羥乙基澱粉可進一步展現0.1至3、0.1至2、0.1至0.9或0.1至0.8之莫耳取代度，以及2至20之範圍內的C2:C6取代比率。平均分子量為約130 kD之HES為來自Fresenius之VOLUVEN®
。VOLUVEN®
為一種例如
用於容量置換之人工膠體，容量置換用於血容量過低(hypovolaemia)之治療及預防之治療適應症中。存在許多可為熟習此項技術者所用之HES連接方法，例如
上述相同PEG連接方法。II.B.10.
PSA [0370] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種聚唾液酸(PSA)聚合物。PSA為由某些細菌菌株及在哺乳動物中於某些細胞中產生之唾液酸之天然存在之未分支聚合物。參見例如Roth J.等人
,(1993), Polysialic Acid: From Microbes to Man, Roth J., Rutishauser U., Troy F. A.編(BirkhäuserVerlag, Basel, Switzerland), 第335-348頁。PSA可藉由有限酸水解或藉由用神經胺糖酸苷酶(neuraminidase)消化或藉由份化聚合物之天然細菌源性形式來以自n=約80個或80個以上唾液酸殘基至n=2之各種聚合度產生。存在許多可為熟習此項技術者所用之PSA連接方法，例如
上述相同PEG連接方法。在某些態樣中，活化PSA亦可連接至凝結因子內(例如
，FVIII上)或Fc區內之半胱胺酸胺基酸殘基。參見例如
美國專利第5846951號。II.B.11.
清除受體 [0371] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白之半衰期可經延長，其中該嵌合蛋白之凝結因子包含FVIII、及FVIII清除受體之至少一個片段、或FVIII結合片段、其變異體或衍生物。插入諸如低密度脂蛋白相關蛋白受體LRP1之清除受體或其片段之可溶性形式可阻斷FVIII結合清除受體且藉此延長其半衰期，例如體內
半衰期。LRP1為一種牽涉於多種蛋白質(包括FVIII)之由受體介導之清除中之600 kDa膜主體蛋白。參見例如
Lenting等人
, Haemophilia 16:6-16 (2010)。其他合適之FVIII清除受體為例如
LDLR(低密度脂蛋白受體)、VLDLR(極低密度脂蛋白受體)及巨蛋白(megalin)(LRP-2)或其片段。參見例如
Bovenschen等人
, Blood 106:906-912 (2005)；Bovenschen, Blood 116:5439-5440 (2010)；Martinelli等人
, Blood 116:5688-5697 (2010)。 III. 多核苷酸、載體及宿主細胞 [0372] 在一些態樣中，本揭露提供一種人類之免疫耐受性之方法，其包含向該人類投與有效量編碼凝結因子及/或Fc區(例如
，編碼包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白)之多核苷酸或多核苷酸組，其中該人類無法對一或多種先前免疫耐受性療法起反應。在一些實施例中，該多核苷酸或該多核苷酸組在表現載體或表現載體組內。在某些實施例中，表現載體或表現載體組在一或多個宿主細胞內。 [0373] 本揭露之方法中使用之編碼凝結因子及/或Fc區(例如
，編碼包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白)之多核苷酸可為單條核苷酸序列、兩條核苷酸序列、三條核苷酸序列或更多條核苷酸序列。在一個實施例中，單條核苷酸序列編碼包含凝結因子(例如
，FVIII多肽)及Fc區之嵌合蛋白。在另一實施例中，多核苷酸包含兩條核苷酸序列，第一核苷酸序列編碼凝結因子(例如
，FVIII)且第二核苷酸序列編碼Fc區。在另一實施例中，多核苷酸包含兩條核苷酸序列，第一核苷酸序列編碼凝結因子(例如
，FVIII)及Fc區且第二核苷酸序列編碼第二Fc區。在某些實施例中，編碼的Fc可在表現後形成共價鍵。 [0374] 在一些實施例中，多核苷酸經密碼子最佳化。 [0375] 如本文所用，表現載體係指含有在引入適當宿主細胞中時插入之編碼序列轉錄及轉譯所必需之元件，或在RNA病毒載體之情況下複製及轉譯所必需之元件的任何核酸構築體。表現載體可包括質體、噬菌粒、病毒及其衍生物。 [0376] 如本文所用之基因表現控制序列為有助於可操作地連接之編碼核酸之高效轉錄及轉譯的任何調控性核苷酸序列，諸如啟動子序列或啟動子-增強子組合。基因表現控制序列可例如為哺乳動物或病毒啟動子，諸如組成性或誘導性啟動子。組成性哺乳動物啟動子包括但不限於以下基因之啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子及其他組成性啟動子。在真核細胞中組成性起作用之示範性病毒啟動子包括例如來自細胞巨大病毒(CMV)、猿猴病毒(例如SV40)、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、細胞巨大病毒、莫洛尼白血病病毒(Moloney leukemia virus)之長末端重複序列(LTR)及其他反轉錄病毒之啟動子、及單純性皰疹病毒之胸苷激酶啟動子。一般熟習此項技術者已知其他組成性啟動子。可用作本發明之基因表現序列之啟動子亦包括誘導性啟動子。誘導性啟動子在誘導劑存在下表現。例如，誘導金屬硫蛋白啟動子以促進在某些金屬離子存在下之轉錄及轉譯。其他誘導性啟動子為一般熟習此項技術者所知。 [0377] 出於本發明之目的，可採用眾多表現載體系統。此等表現載體典型地在宿主生物體中可複製，呈游離基因體或作為宿主染色體DNA之整體部分。表現載體可包括表現控制序列，包括但不限於，啟動子(例如
天然締合或異源啟動子)、增強子、信號序列、剪接信號、增強子元件及轉錄終止序列。較佳的是，表現控制序列為在能夠轉型或轉染真核宿主細胞之載體中的真核啟動子。表現載體亦可利用來源於動物病毒，諸如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)、細胞巨大病毒(CMV)或SV40病毒之DNA元件。其他表現載體涉及使用具有內部核糖體結合位點的多順反子系統。 [0378] 通常，表現載體含有選擇標記物(例如胺苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性或新黴素抗性)以容許偵測經所需DNA序列轉型之細胞(參見例如，Itakura等人, 美國專利第4,704,362號)。將DNA整合至染色體中之細胞可藉由引入一或多個允許選擇經轉染宿主細胞之標記物來進行選擇。標記物可向具有生物殺滅劑抗性(例如
抗生素)或對諸如銅之重金屬具有抗性的營養缺陷型宿主提供原營養。可選擇標記物基因可直接連接至欲表現之DNA序列，或藉由共轉型引入該細胞中。 [0379] 實用於本揭露之方法中使用之嵌合蛋白之最佳化表現的載體之實例係NEOSPLA(美國專利第6,159,730號)。該載體含有細胞巨大病毒啟動子/增強子、小鼠β球蛋白主要啟動子、SV40複製起點、牛生長激素聚腺苷酸化序列、新黴素磷酸轉移酶外顯子1及外顯子2、二氫葉酸還原酶基因及前導序列。已發現，該載體在併入可變區及恆定區基因、在細胞中轉染隨後在含G418之培養基中選擇並進行甲胺喋呤擴增後以極高水準表現抗體。載體系統亦於美國專利第5,736,137號及第5,658,570號中教示，其各自以全文引用之方式併入本文中。此系統提供高的表現水準，例如＞ 30 pg/細胞/日。其他示範性載體系統揭示於例如
美國專利第6,413,777號中。 [0380] 在其他實施例中，本發明之多肽係使用多順反子構築體表現。在此等表現系統中，可自單個多順反子構築體產生多個所關注基因產物，諸如多聚體結合蛋白質之多個多肽。此等系統有利地使用內部核糖體入口位點(IRES)以在真核宿主細胞中提供相對較高水準之多肽。適用IRES序列揭示於美國專利第6,193,980號，該案亦併入本文中。 [0381] 更一般而言，一旦製備出編碼多肽之載體或DNA序列，即可將該表現載體引入適當宿主細胞中。亦即，宿主細胞可經轉型。將質體引入宿主細胞中可藉由如以上所論述的熟習此項技術者熟知之各種技術實現。轉型之細胞在適於產生嵌合蛋白之條件下生長，且針對嵌合蛋白合成進行分析。示範性分析技術包括酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或螢光活化細胞分選器分析(FACS)、免疫組織化學及其類似技術。 [0382] 現已詳細描述本發明，藉由參考以下實例將更明確地瞭解本發明，該等實例係僅出於說明目的包括於此且不意欲限制本發明。 實例 實例1 [0383] A型血友病(「因子VIII [FVIII]缺乏症)係一種罕見的出血病症且係最常見類型的血友病。具有A型血友病之患者之最嚴重得多治療併發症係發展對FVIII之抑制IgG抗體。抑制劑導致輸注FVIII之快速清除及功效大大減小或無功效。FVIII抑制劑繞過劑用於治療具有抑制劑之患者之急性出血，但抑制劑根除才是長期管理之目標。 [0384] 使用頻繁投與高劑量FVIII之免疫耐受性誘導(「ITI」)療法係已顯示達成抗原特異性耐受性之唯一策略。ITI通常試圖消除高反應FVIII抑制劑(≥5 BU效價)。若干研究已研究不同FVIII產品在以不同劑量及注射頻率達成成功ITI中的功效，國際共識建議已經頒佈在臨床實踐中支持ITI方法。在國際ITI研究中，高劑量組(「HD」)(200 IU/Kg/日)之患者達成陰性效價及正常回復率，該回復率比低劑量組(「LD」)之患者顯著更快。Hay及DiMichele, Blood 119(6):1335-44 (2012)。HD患者亦經歷比LD患者顯著更少的出血，且出於此原因，資料安全監測委員會(data safety monitoring board，「DSMB」)建議研究終止，因為其將出血識別為安全問題。高劑量200 IU/Kg/日係「高風險」患者(定義為峰值歷史效價＞200 BU、ITI前效價＞10 BU及/或自抑制劑診斷以來＞5年的患者)之建議劑量。研究延長半衰期(「EHL」)rFVIIIFc在ITI中之使用越來越受到關注。rFVIIIFc已在2014年於USA以名稱ELOCTATE®且在2015於歐洲以名稱ELOCTA®經批准。 [0385] rFVIIIFc係於人類細胞株(「HEK293」)中呈融合至人類IgG之Fc域的重組B域缺失(「BDD」)因子VIII產生。HEK產生之蛋白質具有與原生人類蛋白質類似的轉譯後修飾，與來自其他物種之細胞株(例如
，CHO細胞)中產生的蛋白質不同。在此類蛋白質中，由轉譯後修飾產生之非人類聚醣(諸如N-羥乙醯基神經胺酸(NGNA)及半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal))可具有潛在免疫原性。NGNA及α-Gal均不在rFVIIIFc中。小鼠模型已顯示rFVIIIFc誘導對FVIII之調控T細胞反應(參見
Batsuli Hemophilia (2016), 22 (增刊5), 31-35)，其向一些研究者表明rFVIIIFc可提供比rFVIII更有效的ITI，具體而言縮短ITI。 目標 [0386] 本研究之主要目標是描述以rFVIIIFc在ITI治療之後患者之耐受性時間。研究亦目的在於：描述ITI治療之結果；描述以rFVIIIFc執行之成功ITI之後一段時間內的復發率；描述ITI期間及以rFVIIIFc執行之成功ITI之後時期期間的間發出血；描述當用於ITI時rFVIIIFc之安全性及可耐受性；描述具體生活品質(QoL)問題；及顯示rFVIIIFc消耗。 實例2
[0387] 本研究目的在於描述rFVIIIFc對於在先前ITI療法失敗的具有抑制劑之具有重度A型血友病之患者中ITI之使用。具體而言，此研究之主要目標係描述先前免疫耐受作用之嘗試(包括使用免疫抑制劑)失敗的患者中以rFVIIIFc執行之ITI治療在ITI治療之後的結果。次級目標及其終點包括：(1)描述在先前免疫耐受作用之嘗試(包括使用免疫抑制劑)失敗的患者中以rFVIIIFc執行之ITI之免疫耐受作用時間，終點為ITI成功時間；(2)描述以rFVIIIFc執行之成功ITI之後的復發率，終點為復發之發生；(3)描述在ITI期間及在以rFVIIIFc執行之成功ITI之後時期期間的間發出血，終點為出血率；(4)描述當用於ITI時rFVIIIFc之安全性及可耐受性，終點為不良事件及/或注射部位反應；及(5)描述以ELOCTA®執行之ITI中rFVIIIFc之消耗，終點為rFVIIIFc。 實例3
[0388] 在此研究中，具有重度A型血友病及高效價抑制劑(歷史峰值≥5個畢氏達單位[BU]/mL)之所有年齡的男性受試者將接受重組凝血因子VIII Fc融合蛋白(rFVIIIFc)以供經歷第一次免疫耐受性誘導(ITI)療法，以根除並中和抗凝血因子VIII(FVIII)同種異體抗體。 [0389] 參與者將接受劑量200個國際單位(IU)/公斤(kg)的rFVIIIFc，其按研究者之裁量每日一次注射或分成每日若干次注射，以基線起始至ITI期之最大48週。滿足免疫耐受性(ITI)成功之標準的參與者將進入減量期，且將接受rFVIIIFc(呈供靜脈內投與之注射的粉末)，其劑量根據研究者判斷經調整(50或100 IU/kg)從第1週至第6週每日一次且其後直至第16週每隔一日。 [0390] 此研究之主要結果量度係描述在多至12個月之時段期間以rFVIIIFc之免疫耐受作用時間。免疫耐受作用定義為抑制劑效價＜0.6 BU/ml、FVIII回復率＞ 66%及t1/2
≥ 7 hr。 [0391] 次要結果測量係免疫耐受性誘導(ITI)成功的參與者數目。ITI成功將定義為：藉由Nijmegen修改之畢氏達分析，抑制劑之陰性效價小於(＜)0.6 BU/mL；在2次連續確定中，FVIII增量回復率(IR)＞1.3個國際單位每分升(IU/dL)每IU/kg，表示66%預期IR 2 IU/dL每IU/kg；半衰期(t1/2
)≥7小時。ITI成功將在多至48週的時段內經監測。 [0392] 另一次要結果測量係經歷復發的參與者數目。將評估達到復發標準(定義為達成耐性性之後抑制劑效價＞ 0.6 BU/mL或回復率異常)的ITI成功的參與者之百分比。復發將在多至48週的時段內經監測。 [0393] 另一次要結果測量係出血事件數目。出血事件開始於第一出血徵象，且結束於最後一次治療出血之後不多於72小時，在此期間將位於同一位置之任何出血症狀或相距小於或等於72小時之注射認為係同一出血事件。出血事件將在多至第104週的時段內經監測。 [0394] 另一次要結果測量係具有治療緊急不良事件(AE)及治療緊急嚴重不良事件(SAE)的參與者數目。AE係與此治療不一定具有因果關係的任何不利醫療事件。SAE係以任何劑量發生以下情況的任何不利醫療事件：導致死亡；研究者認為參與者處於死亡之直接風險(威脅生命之事件)；需要住院或住院時間延長；導致永久或重大的能力喪失/無能力；導致先天性異常/出生缺陷；研究者認為可危害參與者或可需要介入以預防定義中所列之其他結果之一的任何其他醫學上重要的事件。AE及SAE將經測量達約2年的時段。 [0395] 另一次要結果測量係缺班或缺課的天數。缺課或缺班的天數將在直至第104週的時段內經描述性概述。 [0396] 另一次要結果測量係住院天數。住院天數將在多至第104週的時段內經描述性概述且監測。 [0397] 另一次要結果測量係對治療方案的依從性，其定義為投與劑量之於計劃劑量之百分比，且其在多至第104週的時段內徑監測。 [0398] 另一次要結果測量係rFVIIIFc之消耗。消耗將基於投與之研究治療之量經評定，且消耗將在多至第104週之時段內經監測。 [0399] 本研究將關於經診斷具有重度A型血友病(如根據醫療記錄所確認)之任何年齡的男性參與者。受試者將已診斷具有高效價抑制劑(歷史峰值大於或等於(≥)5個生物學單位每毫升(BU/mL)，根據醫學記錄)，且受試者將先前用任何血漿來源或重組習知或延長半衰期FVIII治療。排除標準包括：具有除A型血友病之外的其他任何凝血病症的受試者；任何先前ITI療法；與任何重組凝血因子VIII Fc(rFVIIIFc)投與相關聯之過敏症或過敏之病史；如當地實驗室所評定之任何異常腎功能(血清肌酸酐大於2.0毫克每分升[mg/dL])；及/或如藉由當地實驗室所評定之血清丙胺酸轉胺酶或天冬胺酸轉胺酶＞ 5 x正常值上限(ULN)。 實例4
[0400] 在2014年7月1日與2017年6月1日之間在美國及加拿大跨10個地點進行具有重度A型血友病及高效價抑制劑(HTI；≥5 BU)之患者中以rFVIIIFc之ITI的非介入性回溯性病歷回顧。包括了已起始以rFVIIIFc針對ITI之治療(呈主要療法或援救療法，不管是否有反應)、具有HTI、具有重度A型血友病之所有年齡的男性患者。 [0401] 在管理機構批准之後，經由電子問卷調查收集去識別之臨床資訊。根據較早期所列之標準，第一次經ITI治療之患者被視為處於ITI失敗之高風險。陰性畢氏達效價定義為≤0.6 BU。免疫耐受作用定義為陰性畢氏達效價以及正常FVIII回復率(≥66%)及半衰期(≥6小時)。此研究之主要目標是報導使用rFVIIIFc之ITI之臨床特徵及結果。結果係使用描述統計學進行概述；未進行推論統計分析。 結果 研究群體 [0402] 對十九名患者進行識別。在這些患者中，七名患者第一次接受ITI，且12名經歷援救ITI(表1及2)。起始rFVIIIFc ITI之中值年齡係第一次ITI為1.3歲(範圍：0.8-4.3歲)及援救ITI患者為6.4歲(範圍：1.6-12.6歲)。 [0403] 第一次ITI患者具有151 BU(範圍：11-1126 BU)之中值峰值歷史抑制劑(ITI前)效價；開始rFVIIIFc ITI時中值抑制劑效價為52 BU(範圍：3-1126 BU)。開始ITI時，七名第一次ITI患者中六名患者效價＞10 BU；這六名患者中四名患者效價＞50 BU。從抑制劑診斷至開始rFVIIIFc ITI的中值時間為4.4週(範圍：0-41週)。 [0404] 對於援救ITI患者，以其他FVIII產品之先前ITI病程之中值數為2.6(範圍：1-5)且從抑制劑診斷至開始rFVIIIFc ITI之中值時間為5.5年(範圍：0.8-12年)。19名患者中18名患者之FVIII基因型顯示於表1及2中。 第一次ITI 患者結果
[0405] 在資料收集時，經歷第一次ITI之七名患者中四名患者(表1)經耐受化且轉變成以rFVIIIFc預防。這四名患者中三名患者達成陰性畢氏達效價以及正常FVIII回復率及半衰期；因此，其滿足5、7及9個月之免疫耐受作用之標準定義。第四名患者被治療醫師基於陰性抑制劑效價視為在14.8個月時經耐受化且轉變成預防；在資料收集時，該患者完成rFVIIIFc ITI之後13個月且其在rFVIIIFc預防時繼續具有陰性抑制劑。此時亦報導正常半衰期。BU，畢氏達單位；EOD，每隔一日；I-22，第22內含子反轉；ITI，免疫耐受性誘導；NR，未報導；N/A，不適用；rFVIIIFc，重組因子VIII Fc融合蛋白。免疫耐受作用時間係基於醫師報導、解析之畢氏達效價、正常回復率及半衰期。第4名患者不具有可供使用之回復率及半衰期資訊，但經醫師報導為經耐受化且轉化成rFVIIIFc預防。a
接受利妥昔單抗。 [0406] 在四名患者中，獲得陰性畢氏達效價之中值時間係27.7週(範圍：4.1-64週)。四名經耐受化患者中三名患者之ITI方案由每日rFVIIIFc(85-200 IU/kg)組成，較之於第四名患者係每週三次給藥(50 IU/kg)(表1)。所有四名患者之經報導免疫耐受作用之中值時間係33.9週(7.8個月；範圍：21-64週)。對於經每日rFVIIIFc(85-200 IU/kg)治療之三名患者，免疫耐受作用需29週(6.7個月；範圍：20.6-38週)，然而經50 IU/kg每週三次治療之第四名患者在64週(14.8個月)內經耐受化。 [0407] 在剩餘患者(n=3)中，兩名患者之畢氏達效價減小(分別是，在ITI之18及58週之後，從32至18 BU及從378至23 BU)。在此回顧時，一名患者之畢氏達效價增加(ITI之15週之後，從3至16 BU)；此患者已進行並結束ITI且根據治療醫師報導具有rFVIIIFc中斷及不良順應性(表1)。所有七名第一次ITI患者繼續rFVIIIFc ITI或預防。 援救ITI 患者結果
[0408] 經歷援救ITI之12名患者(表2)中七名患者起初以rFVIIIFc ITI達成畢氏達陰性。獲得陰性效價之中值時間係14.1週(範圍：3-67.6週)。這七名患者中三名患者保持畢氏達陰性且繼續rFVIIIFc ITI或rFVIIIFc脫離而成預防。起初達成陰性效價的另外四名患者稍後發展＞0.6 BU之效價。在這些患者中，兩名繼續rFVIIIFc ITI且兩名轉變成以其他因子之ITI(表2)。BU，畢氏達單位；EOD，每隔一日；I-22，第22個內含子反轉；ITI，免疫耐受性誘導；rFVIIIFc，重組因子VIII Fc融合蛋白；wk，週。a
接受利妥昔單抗；b
陰性畢氏達效價之時間表示從開始rFVIIIFc ITI至首次報導陰性效價的時間；當前效價＞0.6 BU/mL可表示復發。 [0409] 在達成畢氏達陰性的七名患者中，三名患者亦在3、14及65週達成正常FVIII回復率，且第四名患者在27週達到正常FVIII半衰期。其他患者中不可獲得回復率及半衰期(表2)。在剩餘五名患者中，一名患者之畢氏達效價減小(10週後從36至22 BU)，且四名患者之畢氏達效價保持不變或在進行ITI時增加(表2)。在這五名患者中，四名繼續rFVIIIFc ITI，且一名從ITI離開並單獨進行繞過療法。 給藥結果、繞過劑使用及當前治療狀態 [0410] 此研究中評定之患者群體達成寬範圍/定時劑量(表1及2)。在每日投與較高劑量之情況下看到快速朝向陰性抑制劑效價的傾向。接受每日rFVIIIFc劑量≥130 IU/kg的五名患者(一名為第一次ITI且四名為援救ITI)中五名患者在中值28週達成陰性畢氏達效價。19名患者中十八名患者在rFVIIIFc ITI同時使用繞過劑；十四名患者主要進行預防(9名以aPCC且5名以rFVIIa)且四名患者按需要以rFVIIa治療。 [0411] 總而言之，在資料收集時，19名患者中16名患者保持進行rFVIIIFc(預防或ITI)(表1及2)。 安全性 [0412] 無不良事件(包括無血栓栓塞)經報導。執行了六個手術，其所有均無rFVIIIFc ITI中斷(膝蓋滑膜切除術、顱內神經外科清空及四個Port-A-Cath置換)。所有均使用繞過療法。未針對此研究收集手術期間的抑制劑效價。 結論 [0413] 總體而言，這些結果顯示，以rFVIIIFc之ITI係可能的且可在經歷第一次ITI之許多(ITI失敗之高風險)患者及經歷援救ITI之一些患者中導致抑制劑根除及成功ITI。此外，rFVIIIFc ITI顯示在接受第一次ITI之大部分患者(不管其風險情況如何)中畢氏達效價之快速見效及快速的免疫耐受作用時間。對於援救ITI，較難以得出結論，因為這些患者中大部分患者在資料收集時仍經歷以rFVIIIFc之ITI。然而，接收援救治療之一些患者似乎獲得治療益處，因為其達成畢氏達陰性或顯示抑制劑效價顯著降低。特別是當每日投與較高rFVIIIFc給藥(≥130 IU/kg)時。 實例5
[0414] 在A型血友病中以因子之替代療法之主要併發症係在約30%具有重度A型血友病之患者中抑制劑(其中和抗因子VIII抗體)之形成。抑制劑發展影響治療功效以及受影響之個體之生活品質。血友病研究正努力進一步理解免疫系統如何對重組因子III(rFVIII)起反應以有效根除抑制劑。延長半衰期rFVIII Fc融合蛋白(rFVIIIFc)係預防並控制出血事件的有效且經良好耐受的療法。此分子中之Fc區不僅負責增加rFVIII半衰期，還可促進抗原特異性耐受性，如臨床前動物模型中所示(Krishnamoorthy S, 等人,Cell Immunol.301
:30-39 (2016))及如免疫耐受性誘導病例報道所表明(Groomes CL, 等人,Pediatr Blood Cancer 63(5)
:922-24 (2016)；Malec LM, 等人,Haemophilia 22(6)
:e552-e554 (2016)；Ragni MV, 等人,Haemophilia 22(5)
:e462-e464 (2016))。 方法 [0415] 外周血來源之人類APC或THP-1單核細胞用於研究rFVIIIFc對FcγR結合、內化、信號傳導及細胞介素產生之影響、及基因表現變化、以及隨後體外在T細胞上的相互作用及影響(圖1)。 結果 [0416] FcγR之細胞表面表現減小指示在rFVIIIFc處理時發生內化(圖2A-2C)。將單核球來源之巨噬細胞及樹狀細胞以等莫耳濃度(200 nM)經山葵過氧化酶免疫複合物(HRP-IC)(作為陽性對照)、人類免疫球蛋白G1(IgG1)(作為陰性對照)、及重組因子VIII(rFVIII)或rFVIII Fc融合蛋白(rFVIIIFc)處理達24小時。Fcγ受體(FcγR)CD16(圖2A)、CD32(圖2B)及CD64(圖2C)之細胞表面表現係藉由流動式細胞測量術測量(n=3；**P≤0.01，***P≤0.005，其他處理之HRP-IC之顯著性未示出)。相較於以rFVIII處理之後的表面表現，以rFVIIIFc處理與CD16(圖2A)、CD32(圖2B)及CD64(圖2C)之細胞表面表現減小相關。 [0417] rFVIIIFc接合FcγR且誘導單核球及巨噬細胞之信號傳導，而隨後無促炎性細胞介素產生(圖3A-3C)。將THP-1單核細胞株、單核球、外周血單核球來源之巨噬細胞及外周血單核球來源之樹狀細胞經HRP-IC、IgG1、rFVIII或rFVIIIFc處理15分鐘(圖3A)。使用MSD平台測量細胞溶解產物中之Syk磷酸化(n=3-7，*P≤0.05)。在以rFVIIIFc(WT)、以突變rFVIIIFc(其不能結合至新生Fc受體(FcRn突變體))或以突變rFVIIIFc(其不能結合至FcγR(FcγR突變體))處理巨噬細胞之後測量Syk磷酸化(n=4，*P≤0.05)(圖3B)。藉由MSD ELISA測量經二十四小時處理之巨噬細胞之促炎性細胞介素產生(n=4，顯著性未示出)(圖3C)。 [0418] rFVIIIFc磷酸化參與免疫調控之分子，而非在活化及促炎性細胞介素產生中起作用的分子(表3及圖4)。使用Proteome Profiler磷酸激酶及磷酸免疫受體陣列研究經rFVIIIFc處理十五分鐘的單核球來源之巨噬細胞之溶解產物中之磷酸化蛋白。藉由Proteome Profiler分析識別之rFVIIIFc處理之巨噬細胞中磷酸化分子之清單顯示於表3中。使用MSD平台測量負責抑制信號傳導之磷酸酶之磷酸化(n=3；**P≤0.01，***P≤0.005)(圖4)。[0419] rFVIIIFc誘導致耐受性巨噬細胞之基因表現模式特徵(圖5A-5G)。對經IgG1、rFVIII或rFVIIIFc處理六小時的單核球來源之巨噬細胞(n=3)執行顯著下調的基因(圖5A)及顯著上調的基因(圖5B)之探索性RNA定序，且對rFVIIIFc上調之基因進行途徑分析以研究這些細胞中選擇性表示之分子途徑，與rFVIII處理之細胞進行比較(表4)。發現NRF2及PPAR-γ途徑之各種基因以及各種其他免疫調控劑為上調(圖5H)。藉由Q-PCR驗證NRF2及脂質代謝途徑之經選擇基因(n=8；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.005)(圖5C-5G)。此外，發現rFVIIIFc處理之巨噬細胞展現特徵性類M2表現型(圖5I-5M)。具體而言，經rFVIIIFc處理之巨噬細胞具有比6小時(圖5I)之後及24小時(圖5J)之後經rFVIII處理之細胞高的相對CD206表現，且經rFVIIIFc處理之巨噬細胞具有比24小時之後經rFVIII處理之細胞高的相對ARG1表現(圖5M)。[0420] 呈現rFVIIIFc處理之抗原的細胞影響需要APC-T細胞-細胞接觸的調控T細胞分化(圖6A-6C)。將外周血單核球來源之巨噬細胞經IgG1、rFVIII或rFVIIIFc處理，然後與自相同施體之外周血分離之純真(naïve)CD4陽性T細胞進行共培養。在共培養六日之後(圖6A)，使用流動式細胞測量術定量調控T細胞(CD4+ CD25+ FoxP3+)之百分比(n=4)(圖6B)。當將純真T細胞於經IgG1、rFVIII或rFVIIIFc預處理之APC之條件培養基中培養時亦定量調控T細胞之百分比(n=4)(圖6C)。 結論 [0421] rFVIIIFc似乎透過APC上之Fcγ受體結合並誘導內化及信號傳導。此信號傳導不轉譯成促炎性細胞介素產生且不活化APC(資料未示出)。免疫調節信號傳導事件在rFVIIIFc處理時起始。這些事件似乎驅使巨噬細胞朝向類M2表現型的分化，其特徵在於NRF2及PPARγ途徑(圖5H)之上調以及CD206及精胺酸酶1分子之上調。各種其他免疫調控劑亦顯示表現增加，同時至少尿苷酸環化酶1可溶性次單位β(2GUCY1B2)、原紫質氧化酶(PPOX)及細胞介素信號傳導之抑制劑3(SOCS3)顯示rFVIIIFc處理之細胞中之表現減小(圖5H)。這些巨噬細胞可執行先前報導之有益的免疫學效應，諸如調控T細胞分化、FVIII免疫耐受作用及抗FVIII抑制劑減少(圖7)。 實例6
[0422] 早期臨床前及臨床資料指示，rFVIIIFc當用於ITI治療時可允許相對短的陰性抑制劑效價時間，其可能歸因於由該分子之Fc域所致的免疫調節效應。為了獲得更穩健的臨床資料，發展標準化方案。此處呈現研究設計。 [0423] ReITIrate(NCT03103542)(前瞻性、介入性、多中心、開放式)研究目的在於招募20名先前ITI嘗試失敗的所有年齡段的重度HA抑制劑患者。研究之主要目的係描述60週之時段內以rFVIIIFc執行之ITI之結果。主要終點為ITI成功；且在ITI治療期間評定之次要終點將包括ITI成功之時間、發生復發、出血數、rFVIIIFc消耗、缺課或缺班的天數、住院及依從性。ITI治療將包含rFVIIIFc 200 IU/kg/日(每日一次或分成兩個每日劑量)達最多60週。在達成耐受性之後，繼之以以預防性給予之rFVIIIFc的16週及32週追踪的減量期。成功標準將包括陰性抑制劑效價(＜0.6個畢氏達單位)、預期＞66%之增量回復率及≥7小時之終末半衰期。 [0424] 圖8顯示提出之rFIXFc對巨噬細胞之作用。rFVIIIFc似乎透過APC上之Fcγ受體結合並誘導內化及信號傳導。此信號傳導不轉譯成促炎性細胞介素產生且不活化APC。相反，免疫調節信號傳導事件在rFVIIIFc處理時起始。這些事件似乎驅使巨噬細胞朝向『類Mox/M2』表現型的分化，其特徵在於NRF2及PPARγ途徑之上調。 [0425] 具體實施例之前文描述將充分地揭露本發明之一般性質，以使得其他人藉由應用此項技術中之知識，在無不當實驗且不背離本發明之一般範疇的情況下，可輕易地針對各種應用對此等具體實施例進行修改及/或改變。因此，基於本文呈現之教示及指導，此等改變及修改意欲在所揭示實施例之等效物的含義及範圍內。應瞭解，本文之措辭或術語係出於描述而非限制之目的，以使得本說明書之術語或措辭應由熟習此項技術者根據教示及指導進行解釋。 [0426] 自本文所揭示的本發明之說明書及實踐的考慮，本發明之其他實施例對熟習此項技術者而言將為顯而易見的。意欲將說明書及實例視為僅具示範性，且本發明之真實範疇及精神藉由以下申請專利範圍指示。 [0427] 本文中揭示之所有出版物、專利及專利申請案均以引用之方式併入本文中，其引用程度就如同具體且個別地指示各個別出版物、專利或專利申請案以引用之方式併入本文中一般。