TWI777994B

TWI777994B - 使用嵌合凝結因子治療血友病性關節病之方法

Info

Publication number: TWI777994B
Application number: TW106142352A
Authority: TW
Inventors: 珍妮佛杜蒙特; 尼夏詹恩; 戴西盧葛雷茲布
Original assignee: 美商百歐維拉提夫治療公司
Priority date: 2016-12-02
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2022-09-21
Also published as: CN110520150A; US20190381149A1; MA46967A; IL266972A; IL266972B2; MX2019006444A; KR20240069834A; CA3045660A1; WO2018102743A1; IL308416A; BR112019011115A2; IL266972B1; EP3548066A1; TW201827072A; JP2020500874A; JP2023027301A; AU2017366709A1; KR20190090827A

Abstract

本揭露提供治療患有血友病之人類關節之可逆性血友病性關節病之方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白或組成物。

Description

使用嵌合凝結因子治療血友病性關節病之方法

[0002] 本揭露大體上係關於用於止血障礙之治療劑的領域。

[0003] 血友病係由編碼凝血蛋白之基因特別是因子VIII(FVIII)基因(其導致缺乏FVIII活性(A型血友病))或因子IX基因(其導致缺乏FIX活性(B型血友病))之突變及/或缺失造成之X性聯性出血病症(參見，例如 ，Peyvandi, F.等人 Haemophilia 12 :82-89 (2006))。該疾病之特徵在於自發性流血及創傷後過量出血。血友病之治療係藉由使FVIII及/或FIX活性恢復以防止自發性出血為目標之替代療法(參見，例如 ，Mannucci, P.M.,等人 , N. Engl. J. Med. 344 :1773-1779 (2001)。　　[0004] 隨時間流逝，常開始於童年早期之向肌肉及關節中之反復出血會導致血友病性關節病及關節損傷。血友病性關節病一種與血友病相關聯之常見且重度併發症，其常導致疼痛、畸形及能力喪失。罹患血友病性關節病的最常見的患者係3歲與15歲之間的年輕男性。儘管膝蓋係最可能受到影響的關節，但是血友病性關節病亦可存在於肘關節、踝關節、肩關節及脊柱關節。已知血友病性關節病係不可逆的。因此當前可供使用之針對血友病性關節病的治療係有限的。　　[0005] 據此，需要發展新的治療血友病性關節病的方式。

[0006] 本揭露之一個態樣提供一種治療患有血友病之人類關節之可逆性血友病性關節病之方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白或包含該嵌合蛋白之組成物。在一些實施例中，該可逆性血友病性關節病包含滑膜炎。在某些實施例中，該可逆性血友病性關節病包含微出血或亞臨床出血。　　[0007] 本揭露之另一態樣提供一種治療患有血友病之人類之滑膜炎之方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白或包含凝結因子及Fc區之組成物。在一些實施例中，該滑膜炎與血友病性關節病相關聯。　　[0008] 本揭露之另一態樣提供一種減少患有血友病之人類關節之血管重塑之發生，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白。本揭露之另一態樣提供患有血友病之人類關節之血管重塑之預防性治療，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白或包含凝結因子及Fc區之組成物。　　[0009] 本揭露之另一態樣提供一種改良患有血友病之人類關節之周圍軟組織之方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白或包含凝結因子及Fc區之組成物。　　[0010] 在一些實施例中，投與改良該人類之關節健康計分(HJHS)。在一些實施例中，投與減少該人類之關節疼痛。　　[0011] 在某些實施例中，該Fc區特異性結合至低親和力免疫球蛋白γFc區受體II-b(FcγRIIB)。在一些實施例中，該Fc區特異性結合至樹狀細胞特異性細胞內黏附分子-3-抓取型非整聯蛋白(DC-SIGN)。　　[0012] 在一些態樣中，該方法進一步包含識別需要該治療的人類。在一些實施例中，該識別包含使用成像系統。在某些實施例中，該成像系統包含放射線攝影術、磁共振成像、超音波檢查術、能量多普勒音波檢查術(power Doppler sonography)或其任何組合。在一些實施例中，該人類表現一或多個與關節發炎相關聯之生物標記物。　　[0013] 在一些態樣中，該凝結因子係選自由以下所組成之群組：因子VII(FVII)、因子VIIa(FVIIa)、因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)、因子X(FX)、馮威里因子(VWF)、其特異性結合至FIX及FX的抗原結合部分或其任何組合。在一些實施例中，該嵌合蛋白包含FVIII-Fc。在其他實施例中，該嵌合蛋白包含FIX-Fc。在一個實施例中，該嵌合蛋白包含因子VIII部分及VWF部分，其中該FVIII部分包含FVIII多肽或其片段，其中該VWF部分包含VWF多肽或其片段，其中該FVIII部分連接至第一Fc區，其中該VWF部分連接至第二Fc區，且其中該第一Fc區及該第二Fc區係彼此締合。　　[0014] 在一些實施例中，該嵌合蛋白進一步包含半衰期延長部分。在某些實施例中，該半衰期延長部分包含白蛋白或其片段、白蛋白結合部分、PAS序列、HAP序列、運鐵蛋白或其片段、聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸、羥乙基澱粉(HES)、其衍生物或其任何組合。　　[0015] 在一些態樣中，包含FVIII及Fc區之該組成物(例如，該嵌合蛋白)之有效量係約20 IU/kg至約300 IU/kg。在一些實施例中，包含FVIII-Fc之該嵌合蛋白係以以下給藥間隔投與：約兩日、約三日、約四日、約五日、約六日、約七日、約八日、約九日、約十日、約11日、約12日、約13日、約14日、約15日、約16日、約17日、約18日、約19日、約20日、約21日、約22日、約23日或約24日。　　[0016] 在其他態樣中，包含FIX-Fc之該嵌合蛋白之有效量係約20 IU/kg至約100 IU/kg。在一些實施例中，包含FIX-Fc之該嵌合蛋白係以以下給藥間隔投與：約三日、四日、五日、六日、七日、八日、九日、十日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日或28日。　　[0017] 在一個特定實施例中，該嵌合蛋白包含FVIII部分、VWF部分、第一Fc區及第二Fc區；其中該FVIII部分包含FVIII多肽或其片段；其中該VWF部分包含VWF多肽或其片段；其中該FVIII部分連接至該第一Fc區；其中該VWF部分連接至該第二Fc區；且其中該第一Fc區及該第二Fc區係彼此締合。實施例　　[0018] E1.一種治療患有血友病之人類關節之可逆性血友病性關節病之方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白。　　[0019] E2.如E1之方法，其中該可逆性血友病性關節病包含滑膜炎。　　[0020] E3.如E1或E2之方法，其中該可逆性血友病性關節病包含微出血。　　[0021] E4.一種治療患有血友病之人類之滑膜炎之方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白。　　[0022] E5.如E4之方法，其中該滑膜炎係與血友病性關節病相關聯。　　[0023] E6.一種預防或減少患有血友病之人類關節之血管重塑之發生，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白。　　[0024] E7.一種改良患有血友病之人類關節之周圍軟組織之方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白。　　[0025] E8.如E1至E7中任一項之方法，其中投與改良該人類之關節健康計分(HJHS)。　　[0026] E9.如E8之方法，其中該關節健康計分係關節總計及整體步態計分之和。　　[0027] E10.如E9之方法，其中該等關節總計係基於腫脹、腫脹持續時間、肌肉萎縮、活動時撚發聲、屈曲喪失、伸展喪失、關節疼痛及強度進行測量。　　[0028] E11.如E9之方法，其中該整體步態計分係基於走路、走樓梯、跑步或單腿跳進行測量。　　[0029] E12.如E1至E11中任一項之方法，其中投與減少該人類之關節疼痛。　　[0030] E13.如E1至E12中任一項之方法，其中該關節係選自由以下所組成之群組：一或兩個肘關節、一或兩個膝關節、一或兩個踝關節、一或兩個肩關節、一或兩個髖關節、一或兩個腕關節、一或兩個手部關節、一或兩個足部關節及其任何組合。　　[0031] E14.如E1至E13中任一項之方法，其中該關節係肘關節。　　[0032] E15.如E1至E13中任一項之方法，其中該關節係膝關節。　　[0033] E16.如E1至E13中任一項之方法，其中該關節係踝關節。　　[0034] E17.如E1至E16中任一項之方法，其中該Fc區特異性結合至低親和力免疫球蛋白γFc區受體II-b(FcγRIIB)。　　[0035] E18.如E1至E17中任一項之方法，其中該Fc區特異性結合至樹狀細胞特異性細胞內黏附分子-3-抓取型非整聯蛋白(DC-SIGN)。　　[0036] E19.如E1至E18中任一項之方法，其進一步包含識別需要該治療的人類。　　[0037] E20.如E19之方法，其中該識別包含使用成像系統。　　[0038] E21.如E20之方法，其中該成像系統包含放射線攝影術、磁共振成像、超音波檢查術、能量多普勒音波檢查術或其任何組合。　　[0039] E22.如E21之方法，其中該人類表現一或多個與關節發炎相關聯之生物標記物。　　[0040] E23.如E1至E22中任一項之方法，其中該凝結因子係選自由以下所組成之群組：因子VII(FVII)、因子VIIa(FVIIa)、因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)、因子X(FX)、馮威里因子(VWF)、其特異性結合至FIX及FX的抗原結合部分或其任何組合。　　[0041] E24.如E1至E23中任一項之方法，其中該嵌合蛋白包含FVIII-Fc。　　[0042] E25.如E1至E23中任一項之方法，其中該嵌合蛋白包含FIX-Fc。　　[0043] E26.如E1至E24中任一項之方法，其中該嵌合蛋白包含因子VIII部分及VWF部分，其中該FVIII部分包含FVIII多肽或其片段，其中該VWF部分包含VWF多肽或其片段，其中該FVIII部分連接至第一Fc區，其中該VWF部分連接至第二Fc區，且其中該第一Fc區及該第二Fc區係彼此締合。　　[0044] E27.如E23、E24及E26中任一項之方法，其中該FVIII多肽包含全長成熟FVIII。　　[0045] E28.如E23、E24及E26中任一項之方法，其中該FVIII多肽包含FVIII之所有或部分B域之缺失。　　[0046] E29.如E28之方法，其中該B域缺失FVIII包含FVIII之所有或部分該B域之缺失。　　[0047] E30.如E28或E29之方法，其中該B域缺失FVIII包含成熟FVIII之胺基酸殘基746至1648之缺失。　　[0048] E31.如E23、E24及E25至E30中任一項之方法，其中該VWF多肽包含有包含VWF之D'域及D3域之VWF片段。　　[0049] E32.如E1至E31中任一項之方法，其中該嵌合蛋白進一步包含半衰期延長部分。　　[0050] E33.如E32之方法，其中該半衰期延長部分包含白蛋白或其片段、白蛋白結合部分、PAS序列、HAP序列、運鐵蛋白或其片段、聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸、羥乙基澱粉(HES)、其衍生物或其任何組合。　　[0051] E34.如E32或E33之方法，其中該半衰期延長部分係插入在該凝結因子內。　　[0052] E35.如E32或E33之方法，其中該半衰期延長部分係插入在該凝結因子與該Fc區之間。　　[0053] E36.如E24及E26至E35中任一項之方法，其中包含FVIII及Fc區之該嵌合蛋白之有效量係約20 IU/kg至約300 IU/kg。　　[0054] E37.如E36之方法，其中包含FVIII-Fc之該嵌合蛋白之有效量係約20 IU/kg至約275 IU/kg、約20 IU/kg至約250 IU/kg、約20 IU/kg至約200 IU/kg、約20 IU/kg至約175 IU/kg、約20 IU/kg至約150 IU/kg、約20 IU/kg至約125 IU/kg、約20 IU/kg至約100 IU/kg、約20 IU/kg至約90 IU/kg、約20 IU/kg至約80 IU/kg、約20 IU/kg至約70 IU/kg、約20 IU/kg至約60 IU/kg、約20 IU/kg至約50 IU/kg、約20 IU/kg至約40 IU/kg、約20 IU/kg至約30 IU/kg、約30 IU/kg至約100 IU/kg、約40 IU/kg至約100 IU/kg、約50 IU/kg至約100 IU/kg、約60 IU/kg至約100 IU/kg、約70 IU/kg至約100 IU/kg、約80 IU/kg至約100 IU/kg、約90 IU/kg至約100 IU/kg、約100 IU/kg至約200 IU/kg、約150 IU/kg至約200 IU/kg、約200 IU/kg至約300 IU/kg、約225 IU/kg至約300 IU/kg、約250 IU/kg至約300 IU/kg、約275 IU/kg至約300 IU/kg或約25 IU/kg至約75 IU/kg。　　[0055] E38.如E36或E37之方法，其中包含FVIII-Fc之該嵌合蛋白之有效量係約25 IU/kg至約65 IU/kg。　　[0056] E39.如E24及E26至E38中任一項之方法，其中包含FVIII-Fc之該嵌合蛋白係以以下給藥間隔投與：約兩日、約三日、約四日、約五日、約六日、約七日、約八日、約九日、約十日、約11日、約12日、約13日、約14日、約15日、約16日、約17日、約18日、約19日、約20日、約21日、約22日、約23日或約24日。　　[0057] E40.如E24及E26至E38中任一項之方法，其中包含FVIII-Fc之該嵌合蛋白係以以下給藥間隔投與：約1至約14日、約1至約13日、約1至約12日、約1至約11日、約1至約10日、約1至約9日、約1至約8日、約1至約7日、約1至約6日、約1至約5日、約1至約4日、約1至約3日、約1至約2日、約2至約14日、約3至約14日、約4至約14日、約5至約14日、約6至約14日、約7至約14日、約8至約14日、約9至約14日、約10至約14日、約11至約14日、約12至約14日、約13至約14日或約5至約10日。　　[0058] E41.如E24及E26至E40中任一項之方法，其中包含FVIII-Fc之該嵌合蛋白係以約3日至約5日之給藥間隔投與。　　[0059] E42.如E25之方法，其中包含FIX-Fc之該嵌合蛋白之有效量係約20 IU/kg至約100 IU/kg。　　[0060] E43.如E25或E42之方法，其中包含FIX-Fc之該嵌合蛋白之有效量係約20 IU/kg至約100 IU/kg、約30 IU/kg至約100 IU/kg、約40 IU/kg至約100 IU/kg、約50 IU/kg至約100 IU/kg、約60 IU/kg至約100 IU/kg、約70 IU/kg至約100 IU/kg、約80 IU/kg至約100 IU/kg、約90 IU/kg至約100 IU/kg、約20 IU/kg至約90 IU/kg、約20 IU/kg至約80 IU/kg、約20 IU/kg至約70 IU/kg、約20 IU/kg至約60 IU/kg、約20 IU/kg至約50 IU/kg、約20 IU/kg至約40 IU/kg或約20 IU/kg至約30 IU/kg。　　[0061] E44.如E25及E42至E44中任一項之方法，其中包含FIX-Fc之該嵌合蛋白之有效量係約50 IU/kg至E100 IU/kg。　　[0062] E45.如E25及E42至E44中任一項之方法，其中包含FIX-Fc之該嵌合蛋白係以以下給藥間隔投與：約三日、四日、五日、六日、七日、八日、九日、十日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日或E28日。　　[0063] E46.如E25及E42至E45中任一項之方法，其中包含FIX-Fc之該嵌合蛋白係以以下給藥間隔投與：約1至約21日、約1至約20日、約1至約19日、約1至約18日、約1至約17日、約1至約16日、約1至約15日、約1至約14日、約1至約13日、約1至約12日、約1至約11日、約1至約10日、約1至約9日、約1至約8日、約1至約7日、約1至約6日、約1至約5日、約1至約4日、約1至約3日、約1至約2日、約2至約21日、約3至約21日、約4至約21日、約5至約21日、約6至約21日、約7至約21日、約8至約21日、約9至約21日、約10至約21日、約11至約21日、約12至約21日、約13至約21日、約14至約21日、約15至約21日、約16至約21日、約17至約21日、約18至約21日、約19至約21日、約20至約21日、約5至約10日、約10至約15日、約15至約20日。　　[0064] E47.如E25及E42至E46中任一項之方法，其中包含FIX-Fc之該嵌合蛋白係以以下給藥間隔投與：約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日或約14日。　　[0065] E48.如E1至E32中任一項之方法，其中該嵌合蛋白包含FVIII部分、VWF部分、第一Fc區及第二Fc區；其中該FVIII部分包含FVIII多肽或其片段；其中該VWF部分包含VWF多肽或其片段；其中該FVIII部分連接至該第一Fc區；其中該VWF部分連接至該第二Fc區；且其中該第一Fc區及該第二Fc區係彼此締合。　　[0066] E49.如E1至E47中任一項之方法，其中該嵌合蛋白之該Fc區有助於該嵌合蛋白定位至該關節。　　[0067] E50.如E1至E49中任一項之方法，其中該人類小於6歲。　　[0068] E51.如E1至E49中任一項之方法，其中該人類係6歲至小於12歲。　　[0069] E52.如E1至E49中任一項之方法，其中該人類係12歲或更大年齡。　　[0070] E53.如E1至E52中任一項之方法，其中該凝結因子分佈至血漿區室外以及血漿區室中的組織。

[0094] 本揭露提供治療患有血友病之人類關節之可逆性血友病性關節病之方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白或包含凝結因子及Fc區之組成物。本文所揭示之嵌合蛋白亦可用於治療患有血友病之人類之關節之滑膜炎、微出血、一或多個關節發炎、血管重塑或其任何組合。在某些實施例中，本發明方法改良患有血友病之人類關節之周圍軟組織。I. 定義 [0095] 應注意，術語「一(個/種)」實體係指一或多個(種)該實體；例如，「一個核苷酸序列」應理解為表示一或多個核苷酸序列。因此，術語「一個(種)」、「一或多個(種)」及「至少一個(種)」在本文中可互換使用。　　[0096] 此外，「及/或」在本文中使用時應視為對兩個指定特徵或組分中之各者在存在或不存在另一者之情況下的具體揭示。因此，如本文中在諸如「A及/或B」之片語中使用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣，如諸如「A、B及/或C」之片語中使用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。　　[0097] 應理解，當在本文中用語言「包含」描述各態樣時，亦提供以「由...組成」及/或「實質上由...組成」之術語描述之其他相似態樣。　　[0098] 除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語皆具有與本發明所屬領域之一般技術人員通常所理解相同的含義。例如，the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 第2版, 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 第3版, 1999, Academic Press；及the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press，其向技術人員提供本揭露所使用之許多術語的大體解釋。　　[0099] 單位、前綴及符號皆以其國際單位制(Système International de Unites，(SI))公認形式表示。數字範圍包括界定該範圍之數字在內。除非另外指明，否則胺基酸序列係自左至右以胺基至羧基取向書寫。本文中提供之標題不限制本發明之各種態樣，該等態樣可藉由參考整個說明書得出。因此，即將在下文定義之術語藉由參照說明書全文進行更完整地定義。　　[0100] 術語「約」在本文中用於意謂近似、大致、大約或在...左右。當術語「約」與數字範圍結合使用時，其藉由使邊界擴展高於及低於所陳述之數字來修飾該範圍。因此，「約10-20」意謂「約10至約20」。一般而言，術語「約」可藉由例如向上或向下(升高或降低)10%之變化修飾高於或低於所述值之數值。　　[0101] 如本文所用之「投與」意謂經由醫藥學上可接受之途徑向受試者給予醫藥學上可接受之組成物，例如本文所揭示之嵌合蛋白。投與途徑可為靜脈內，例如靜脈內注射及靜脈內輸注。其他投與途徑包括例如皮下、肌肉內、經口、經鼻及肺部投與。嵌合蛋白及雜交蛋白可作為包含至少一種賦形劑之醫藥組成物之一部分投與。在一些實施例中，該組成物(例如，該嵌合蛋白)係透過基因療法向人類投與，例如，其中將一或多種編碼該凝結因子及/或該Fc之多核苷酸向人類投與，且該凝結因子及/或該Fc區在該人類中表現。　　[0102] 如本文所用之「治療」係指例如減輕疾病或病狀之嚴重性；減少疾病病程之持續時間；改善或消除與疾病或病狀相關聯之一或多種症狀；向具有疾病或病狀之受試者提供有益效應，未必治癒該疾病或病狀，不包括防治或預防血友病性關節病或其症狀。在一個實施例中，術語「治療」意謂改良受試者之血友病關節健康計分(HJHS)或修改之HJHS (mHJHS)。在一些實施例中，總體HJHS或mHJHS經改良。在一些實施例中，一或多個目標關節之個別計分經改良。在一些實施例中，術語「治療」意謂改良受試者之生活品質(QoL)。在某些實施例中，QoL計分分析關於以下的受試者之安排：運動及休閒、身體健康、處理血友病、計劃生育、感覺(關於血友病)未來、伴侶及性欲、治療、(自己的)觀點、工作及學習或其任何組合。在其他實施例中，術語「治療」意謂減輕一或多種微出血之效應及/或嚴重性。在另一實施例中，術語「治療」意謂減輕一或多個目標關節之腫脹及/或發炎及/或疼痛。在另一實施例中，術語「治療」意謂減輕一或多個目標關節之血管重塑。　　[0103] 如本文所用之「預防」係指減少或減輕特定結果之發生或嚴重性。在一些實施例中，預防結果係透過預防性治療達成。　　[0104] 如本文所用之術語「相當」意謂藉由使用例如嵌合多肽產生之比較速率或水準等於、實質上等於或類似於參考速率或水準。如本文所用之術語「類似」意謂比較速率或水準與參考速率或水準(例如，基本上由兩個Fc部分及經加工FVIII組成之嵌合多肽之FXa產生速率，其中該經加工FVIII融合至兩個Fc部分之一個Fc)相差不大於10%或不大於15%。術語「實質上相等」意謂比較速率或水準與參考速率或水準相差不大於0.01%、0.5%或1%。　　[0105] 如本文所用之止血障礙意謂特徵在於由於形成纖維蛋白凝塊之能力受損或不能形成纖維蛋白凝塊而有自發出血或由於創傷而出血之傾向的基因遺傳性或獲得性病狀。此等病症之實例包括血友病。三種主要形式為A型血友病(因子VIII缺乏症)、B型血友病(因子IX缺乏症或「克雷司馬斯病(Christmas disease)」)及C型血友病(因子XI缺乏症，輕度出血傾向)。其他止血障礙包括例如範威爾邦德病；因子XI缺乏症(PTA缺乏症)；因子XII缺乏症；纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII缺乏症或結構異常；伯納德-蘇里爾症候群(Bernard-Soulier syndrome)，其為一種GPIb缺陷症或缺乏症。VWF之受體GPIb可為有缺陷的且導致缺乏初級凝塊形成(初級止血)及流血傾向增加、以及格蘭茨曼(Glanzman)及內格利(Naegeli)血小板無力症(thrombasthenia)(格蘭茨曼血小板無力症)。在肝衰竭(急性及慢性形式)中，由肝產生之凝血因子存在不足；此可增加流血風險。　　[0106] 如本文所用之「血漿濃度對時間曲線下面積(AUC)」與藥理學技術之術語相同，且係基於投與之後FVIII吸收之速率及程度。AUC係在指定時間段(諸如12、18、24、36、48或72小時)內投與，或使用基於曲線斜率外推來無限投與。除非本文另外指定，否則AUC係無限投與。AUC之確定可在單一受試者中進行，或在受試者群體中進行，其後計算平均值。　　[0107] 術語「促凝血活性」意謂本發明凝血因子(例如，FVIII或FIX蛋白)能夠替代原生凝血因子(例如，原生FVIII或FIX)參與血液中之凝結級聯。例如，當本發明之重組FIX蛋白在因子VIII(FVIII)存在下將因子X(FX)轉化成活化因子X(FXa)時具有促凝血活性，如例如在顯色分析中所測試。在另一實施例中，FIX活性係產生因子X酶(tenase)複合物的能力。在其他實施例中，FIX活性係產生凝血酶(或凝塊)的能力。　　[0108] 對免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或區之胺基酸編號所進行之參考全部係基於Kabat等人 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 美國公共衛生部(U. S. Department of Public Health), Bethesda; MD，其以全文引用之方式併入本文中。(已自包括人類之若干哺乳動物物種分離出FcRn受體。已知人類FcRn、大鼠FcRn及小鼠FcRn之序列(Story等人 , J. Exp. Med. 180 : 2377 (1994)，其以全文引用方式併入本文。)Fc可包含免疫球蛋白中具有或不具有免疫球蛋白鉸鏈區之CH2域及CH3域。WO 2004/101740及WO 2006/074199中提供示範性Fc變異體，該等案以全文引用的方式併入本文中。　　[0109] 如本文所用之「雜交」多肽及蛋白意謂嵌合多肽與第二多肽之組合。雜交物中之嵌合多肽及第二多肽可經由蛋白質-蛋白質相互作用(諸如電荷-電荷或疏水性相互作用)彼此締合。雜交物中之嵌合多肽及第二多肽可經由二硫鍵或其他共價鍵彼此締合。雜交物描述於WO 2004/101740及WO 2006/074199中，該等案中之各者均以全文引用之方式併入本文中。亦參見美國專利第7,404,956號及第7,348,004號，該等案中之各者均以全文引用之方式併入本文中。第二多肽可為同一嵌合多肽之第二複本或其可為不相同的嵌合多肽。　　[0110] 如本文所用，在蛋白質序列中「對應於...之胺基酸」、「對應於...之位點」或「等效胺基酸」係藉由對準以使第一蛋白質序列(例如，FVIII或FIX序列)與第二蛋白質序列(例如，第二FVIII或第二FIX序列)之間的一致性或相似性最大來識別。用於識別第二蛋白質序列中之等效胺基酸之編號係基於用於識別第一蛋白質序列中之對應胺基酸之編號。　　[0111] 如本文所用，術語「插入位點」係指多肽(通常為成熟多肽；例如成熟FVIII或成熟FIX多肽)或其片段、變異體或衍生物中緊靠可插入異源部分之位置之上游的位置。以編號指定「插入位點」，該編號為指定蛋白序列中由插入位點所對應之胺基酸的編號，該胺基酸緊靠插入位置之N末端方向。例如，片語「EGF2域在對應於給定序列之胺基酸105之插入位點處包含異源部分」指示異源部分位於對應於該序列之胺基酸105及胺基酸106之兩個胺基酸之間。然而，熟習此項技術者將能夠容易地識別本文所指出之任何變異體中之對應位置，且本揭露不局限於僅在本文具體揭示之變異體中進行之插入。相反，本文所揭示之插入可在任何相關變異體或其具有活性之片段中對應於本文所揭示之變異體之位置處進行。　　[0112] 如本文所用，片語「緊靠胺基酸之下游」係指緊接於胺基酸之末端羧基之位置。類似地，片語「緊靠胺基酸之上游」係指緊接於胺基酸之末端胺基之位置。因此，如本文所用之片語「在插入位點之兩個胺基酸之間」係指異源部分(例如，半衰期延長部分)插入在兩個相鄰胺基酸之間所處之位置。　　[0113] 如本文所用之術語「插入」、「經插入」、「插入至...中」或語法相關術語係指相對於指定蛋白質(例如，FVIII或FIX蛋白)中相似位置，異源部分(例如，半衰期延長部分)在融合多肽中的位置。本領域技術人員應理解如何識別與其他多肽序列(例如，其他FVIII及FIX變異體)對應之插入位置。如本文所用，該等術語係指本文所揭示之重組多肽之特徵，且不指示、暗示或意指製備融合多肽之任何方法或過程。例如，對於本文提供之融合多肽，片語「將異源部分插入緊鄰FIX多肽之殘基105下游之EGF2結構域中」意謂該融合多肽在緊鄰對應於特定FIX變異體中之胺基酸105之胺基酸的下游包含異源部分，其例如由對應於FIX變異體之胺基酸105及106之胺基酸所界定。　　[0114] 「融合」或「嵌合」蛋白包含第一胺基酸序列連接於在自然界中其未天然連接之第二胺基酸序列。通常存在於各別蛋白質中之胺基酸序列可集合在一起形成融合多肽，或通常存在於同一蛋白質中之胺基酸序列可以新排列安置在融合多肽中，該融合多肽例如為本發明之FVIII域或FIX域與Ig Fc域之融合。融合蛋白係例如藉由化學合成，或藉由產生並轉譯肽區以所需關係編碼之聚核苷酸來產生。融合蛋白可進一步包含藉由共價非肽鍵或非共價鍵與第一胺基酸序列締合之第二胺基酸序列。　　[0115] 術語「異源」及「異源部分」意謂聚核苷酸、多肽或其他部分源於與其所比較之實體不同之實體。例如，異源多肽可為合成多肽，或源於不同物種、個體之不同細胞類型或不同個體之相同或不同類型之細胞。在一個態樣中，異源部分係與另一多肽融合以產生融合多肽或蛋白質之多肽。在另一態樣中，異源部分係與多肽或蛋白質結合之非多肽，諸如PEG。　　[0116] 如本文所用，術語「連接」及「融合」係指第一胺基酸序列或核苷酸序列分別共價或非共價接合至第二胺基酸序列或核苷酸序列。第一胺基酸或核苷酸序列可直接接合或相鄰於第二胺基酸或核苷酸序列，或者介入序列可將第一序列共價接合於第二序列。術語「連接」不僅意謂第一胺基酸序列在C末端或N末端融合於第二胺基酸序列，而且亦包括將整個第一胺基酸序列(或第二胺基酸序列)插入第二胺基酸序列(或相應地第一胺基酸序列)中之任何兩個胺基酸中。在一個實施例中，第一胺基酸序列係藉由肽鍵或連接子連接至第二胺基酸序列。第一核苷酸序列可藉由磷酸二酯鍵或連接子連接於第二核苷酸序列。連接子可為肽或多肽(用於多肽鏈)或核苷酸或核苷酸鏈(用於核苷酸鏈)或任何化學部分(用於多肽與聚核苷酸鏈兩者)。術語「連接」亦藉由連字符(-)加以指示。　　[0117] 如本文所用，術語「與…締合」係指第一條胺基酸鏈與第二條胺基酸鏈之間形成的共價鍵或非共價鍵。在一個實施例中，術語「與…締合」意謂共價非肽鍵或非共價鍵。此締合可由冒號，亦即 (：)指示。在另一實施例中，其意謂除肽鍵之外的共價鍵。例如，胺基酸半胱胺酸包含可與第二半胱胺酸殘基上之硫醇基形成二硫鍵或二硫橋之硫醇基。在大多數天然存在之IgG分子中，CH1區與CL區藉由二硫鍵締合且兩個重鏈藉由兩個二硫鍵在對應於239及242之位置處締合，該等位置係使用Kabat編號系統(位置226或229，EU編號系統)。共價鍵之實例包括但不限於肽鍵、金屬鍵、氫鍵、二硫鍵、ζ鍵、π鍵、δ鍵、糖苷鍵、抓氫鍵、彎曲鍵、偶極鍵、π反向鍵、雙鍵、參鍵、四鍵、五鍵、六鍵、結合、超結合、芳香性、哈普托數(hapticity)或反鍵結。非共價鍵之非限制性實例包括離子鍵(例如陽離子π鍵或鹽鍵)、金屬鍵、氫鍵(例如二氫鍵、二氫複合物、低障壁氫鍵或對稱氫鍵)、凡得瓦力(van der Walls force)、倫敦分散力(London dispersion force)、機械鍵(mechanical bond)、鹵素鍵、親金作用(aurophilicity)、嵌入、堆積作用、熵力(entropic force)或化學極性。　　[0118] 如本文所用，術語「裂解位點」或「酶促裂解位點」係指由酶識別之位點。某些酶促裂解位點包含細胞內加工位點。在一個實施例中，多肽具有由在凝結級聯期間活化之酶裂解之酶促裂解位點，因此此等位點之裂解發生在凝塊形成之部位處。示範性此類位點包括例如由凝血酶、因子XIa或因子Xa識別者。其他酶促裂解位點在此項技術中為已知的。　　[0119] 如本文所用，術語「加工位點」或「細胞內加工位點」係指多肽中一種類型之酶促裂解位點，其為在該多肽轉譯之後起作用之酶的目標。在一個實施例中，此等酶在自高爾基體腔(Golgi lumen)轉運至反面高爾基體(trans-Golgi)區室期間起作用。細胞內加工酶在蛋白質自細胞分泌之前裂解多肽。此等加工位點之實例包括例如由內肽酶之PACE/弗林蛋白酶(furin)(其中PACE為成對鹼性胺基酸裂解酶(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)之頭字語)家族所靶向者。此等酶定位於高爾基體膜且在序列基元Arg-[任何殘基]-(Lys或Arg)-Arg之羧基末端側上裂解蛋白質。如本文所用，「弗林蛋白酶」酶家族包括例如PCSK1(亦稱為PC1/Pc3)、PCSK2(亦稱為PC2)、PCSK3 (亦稱為弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4(亦稱為PC4)、PCSK5(亦稱為PC5或PC6)、PCSK6(亦稱為PACE4)、或PCSK7(亦稱為PC7/LPC、PC8或SPC7)。其他加工位點係此項技術中已知的。　　[0120] 在包括多於一個加工或裂解位點之構築體中，應瞭解此等位點可相同或不同。　　[0121] 如本文所用，「可加工連接子」係指包含至少一個在本文中其他地方描述之細胞內加工位點的連接子。　　[0122] 如本文所用之「基線」係在投與劑量之前受試者中給定分析物(例如，凝結因子(例如，FVIII或FIX))之最低測量血漿水準。血漿水準可在給藥之前之兩個時間點量測：在篩檢訪視時及即將給藥之前。或者，(a)治療前凝結因子活性＜1%、不具有可偵測凝結因子抗原且具有無意義基因型之受試者之基線可定義為0%，(b)治療前凝結因子活性＜1%且具有可偵測凝結因子抗原之受試者之基線可設置為0.5%，(c)治療前凝結因子活性在1-2%之間的受試者之基線為C_min (在整個PK研究期間之最低活性)，及(d)治療前凝結因子活性≥2%之受試者之基線可設置為2%。　　[0123] 如本文所用之「等效劑量」意謂與用國際單位表述相同之凝結因子活性(例如，FVIII活性或FIX活性)之劑量，其與所述多肽之分子量無關。例如，一國際單位(IU)之FVIII活性大致對應於一毫升正常人類血漿中之FVIII之量。若干分析可用於測量凝結因子活性，包括歐洲藥典顯色受質分析及單級凝結分析。　　[0124] 如本文所用，「給藥間隔」意謂投與受試者之多次劑量之間逝去的時間量。給藥間隔之比較可在單一受試者中或在受試者群體中進行，且接著可計算在該群體中獲得之平均值。　　[0125] 如本文所用之「受試者」意謂人類個體。受試者可為當前正罹患出血病症或預期有此一治療需要之患者。在一些實施例中，受試者先前從未用凝結因子進行治療(亦即，該受試者係先前未治療受試者或先前未治療患者)。在一些實施例中，該受試者係胎兒，且該等方法包含向胎兒之母親投與組成物(例如，嵌合多肽)，且向受試者之投與自母親跨胎盤發生。在一些實施例中，受試者為兒童或成人。在一些實施例中，受試者為小於一歲、小於兩歲、小於三歲、小於四歲、小於五歲、小於六歲、小於七歲、小於八歲、小於九歲、小於十歲、小於十一歲或小於十二歲的兒童。在一些實施例中，兒童小於一歲。在某些實施例中，受試者小於6歲。在其他實施例中，受試者係6歲與小於12歲之間。在其他實施例中，受試者係12歲或更大年齡。在一些實施例中，兒童或成人受試者發展出血病症，其中出血病症之症狀係在一歲之後發作。在一些實施例中，向受試者投與組成物(例如，嵌合多肽)足以預防、抑制或減少針對凝結因子的選自以下之免疫反應之發展：體液免疫反應、細胞介導之免疫反應、或體液免疫反應及細胞介導之免疫反應兩者。　　[0126] 如本文所用(可互換)之「治療劑量」、「劑量」、「有效劑量」或「給藥量」意謂如達成如本文所述之治療目標之劑量。在一些實施例中，「治療劑量」意謂相較於治療之前的HJHS、mHJHS或QoL計分，改良HJHS、mHJHS或QoL計分之劑量。在一些實施例中，「治療劑量」意謂相較於治療之前關節之腫脹、發炎及/或疼痛水準，減輕受試者之一或多個關節之腫脹、發炎及/或疼痛的劑量。在一些實施例中，「治療劑量」意謂相較於治療之前微出血之效應及/或嚴重性，減輕一或多種微出血之效應及/或嚴重性的劑量。在另一實施例中，「治療劑量」意謂相較於治療之前的血管重塑，減輕一或多個目標關節之血管重塑的劑量。　　[0127] 本發明中亦包括多肽之片段或變異體及其任何組合。術語「片段」或「變異體」當指代本揭露之方法中所用之多肽時包括保留參考多肽之至少一些特性(例如，對FVIII或FIX變體之Fc變異體或凝血活性)之任何多肽。除在本文中其他地方論述之特定抗體片段之外，多肽之片段亦包括蛋白水解片段以及缺失片段，但不包括天然存在之全長多肽(或成熟多肽)。本揭露之方法中使用之多肽結合域或結合分子之變異體包括如上所述之片段以及胺基酸序列歸因於胺基酸取代、缺失或插入而改變之多肽。變異體可為天然存在的或非天然存在的。非天然存在之變異體可使用此項技術已知之突變誘發技術來產生。變異多肽可包含保守或非保守胺基酸取代、缺失或添加。本文所揭示之一個特定FIX變異體為R338L FIX (Padua)變異體。參見例如 ，Simioni, P.等人 ,「X-Linked Thrombophilia with a Mutant Factor IX (Factor IX Padua),」NEJM 361 :1671-75 (2009年10月)，其以全文引用之方式併入本文中。　　[0128] 「保守胺基酸取代」為用具有相似側鏈之胺基酸殘基置換胺基酸殘基的取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族已在此項技術中加以定義，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸用來自同一側鏈家族之另一胺基酸置換，則將取代視為保守的。在另一實施例中，可將一連串胺基酸用側鏈家族成員之順序及/或組成不同的結構上相似的胺基酸串保守地置換。　　[0129] 兩個聚核苷酸或多肽序列之間使用的術語「序列一致性百分比」係指在比較窗口上由該等序列共用的一致匹配位置數，其考慮到為進行兩個序列之最佳比對必須引入的添加或缺失(亦即間隙)。匹配位置為靶序列及參考序列二者中存在相同核苷酸或胺基酸的任何位置。靶序列中存在的間隙不做計數，因為間隙不為核苷酸或胺基酸。同樣，參考序列中存在的間隙不做計數，因為對靶序列核苷酸或胺基酸計數，而不對來自參考序列之核苷酸或胺基酸計數。　　[0130] 藉由以下方式來計算序列一致性百分比：測定兩個序列中存在相同胺基酸殘基或核酸鹼基之位置的數目以產生匹配位置之數目，用匹配位置之數目除以比較窗中位置之總數且將結果乘以100以產生序列一致性百分比。兩個序列之間序列之比較及序列一致性百分比的測定可使用供線上使用與下載兩者之可易於得到之軟體完成。適合軟體程式可自各種來源獲得，且可用於比對蛋白質及核苷酸序列。一種適於測定序列一致性百分比之程式為bl2seq，其為可自美國政府之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)BLAST網站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)獲得之BLAST程式套件之一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法進行兩個序列之間的比較。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。其他適合程式為例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其為生物資訊程式之EMBOSS套件之部分，且亦可獲自歐洲生物資訊研究所(EBI)之www.ebi.ac.uk/Tools/psa。　　[0131] 與聚核苷酸或多肽參考序列比對的單個聚核苷酸或多肽靶序列內的不同區可各自具有其自身的序列一致性百分比。應注意，將序列一致性百分比值捨入至最接近的十分位。舉例而言，將80.11、80.12、80.13及80.14向下捨入至80.1，而將80.15、80.16、80.17、80.18及80.19向上捨入至80.2。亦注意，長度值將始終為整數。　　[0132] 熟習此項技術者將理解，產生用於計算序列一致性百分比的序列比對不限於唯一地由原始序列資料驅動之二進制序列-序列比較。序列比對可來源於多重序列比對。一種產生多序列比對之適合程式為ClustalW2，可獲自www.clustal.org。另一適合程式為MUSCLE，可獲自www.drive5.com/muscle/。ClustalW2及MUSCLE可替代地獲自例如EBI。　　[0133] 亦應理解，序列比對可藉由序列資料與異質來源之資料的整合產生，該等異質來源之資料諸如結構資料(例如，結晶蛋白結構)、功能資料(例如，突變位置)或譜系學資料。整合異質資料以產生多重序列比對的適合程式為T-Coffee，其獲自www.tcoffee.org且可替代地獲自例如EBI。亦應瞭解用於計算序列一致性百分比之最終比對可自動或手動策劃。　　[0134] 多核苷酸變異體可在編碼區、非編碼區或兩者中含有改變。在一個實施例中，多核苷酸變異體含有產生沉默取代、添加或缺失，但不改變所編碼多肽之性質或活性的改變。在另一實施例中，核苷酸變異體因遺傳密碼之簡併性而由沉默取代產生。在其他實施例中，以任何組合取代、缺失或添加5-10、1-5、或1-2個胺基酸之變異體。多核苷酸變異體可出於多種原因，例如為了使特定宿主之密碼子表現最佳化(使人類mRNA中之密碼子變成其他密碼子，例如細菌宿主諸如大腸桿菌(E. coli))而產生。　　[0135] 天然存在之變異體稱為「對偶基因變異體」且係指佔據生物體之染色體上既定基因座之基因的若干替代形式之一(Genes II, Lewin, B.編, John Wiley & Sons, New York (1985))。此等對偶基因變異體可在多核苷酸及/或多肽層面上變化且包括在本揭露中。或者，非天然存在之變異體可藉由突變誘發技術或藉由直接合成來產生。　　[0136] 使用蛋白質工程改造及重組DNA技術之已知方法，可產生變異體以改良或改變多肽之特徵。例如，可自分泌蛋白質之N端或C端缺失一或多個胺基酸而不實質性損失生物功能。以全文引用方式併入本文之Ron等人 ,J. Biol. Chem . 268: 2984-2988 (1993)報導甚至在缺失3、8或27個胺基端胺基酸殘基之後仍具有肝素結合活性之變異KGF蛋白。類似地，在自干擾素γ之羧基末端缺失8-10個胺基酸殘基之後，此蛋白質展現活性增高多達十倍。(Dobeli等人 , J. Biotechnology 7 :199-216 (1988)，其以全文引用方式併入本文。) 　　[0137] 此外，充足證據顯示變異體常保留與天然存在之蛋白質之生物活性類似的生物活性。例如，Gayle及同事(J. Biol. Chem. 268 :22105-22111 (1993)，其以全文引用方式併入本文)對人類細胞激素IL-1a進行了廣泛的突變分析。其使用隨機突變誘發來產生超過3,500種個別IL-1a突變體，每個變異體在分子總長度上具有平均2.5個胺基酸變化。檢查每個可能胺基酸位置處之多個突變。研究者發現「[大多數]分子可在對[結合或生物活性]之影響極小下進行改變」。(參見摘要。)實際上，在檢查之3,500個以上核苷酸序列中，僅23個獨特胺基酸序列產生活性顯著不同於野生型之蛋白質。　　[0138] 如上文所述，多肽變異體包括例如經修飾多肽。修飾包括例如乙醯化、醯化、ADP-核醣化、醯胺化、共價連接黃素、共價連接血基質部分、共價連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價連接脂質或脂質衍生物、共價連接磷脂醯肌醇、交聯、環化、二硫鍵形成、去甲基、形成共價交聯、形成半胱胺酸、形成焦麩胺酸、甲醯化、γ-羧化、醣化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻醯化、氧化、聚乙二醇化(Mei等人 , Blood 116: 270-79 (2010)，其以全文引用之方式併入本文中)、蛋白水解處理、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、轉移-RNA介導之向蛋白質添加胺基酸(諸如精胺醯化)及泛素化。在一些實施例中，在任何方便位置處修飾FVIII，聚乙二醇化。在一些實施例中，在FVIII之表面暴露之胺基酸(例如表面暴露半胱胺酸)處將FVIII聚乙二醇化，其可為經改造之半胱胺酸。同上。在一些實施例中，經修飾FVIII(例如，聚乙二醇化FVIII)係嵌合或融合FVIII。　　[0139] 術語「下游」係指位於參考核苷酸序列之3'方向之核苷酸序列。「下游」亦可指位於參考肽序列之C末端的肽序列。　　[0140] 術語「上游」係指位於參考核苷酸序列之5'方向之核苷酸序列。「上游」亦可指位於參考肽序列之N末端的肽序列。　　[0141] 如本文所用，術語「調控區」係指位於編碼區之上游(5'非編碼序列)、內部或下游(3'非編碼序列)，且影響所締合之編碼區之轉錄、RNA加工、穩定性或轉譯之核苷酸序列。調控區可包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應物結合位點及莖-環結構。若編碼區意欲在真核細胞中表現，則聚腺苷酸化信號及轉錄終止序列通常將位於編碼序列之3'方向。　　[0142] 編碼基因產物(例如多肽)之聚核苷酸可包括與一或多個編碼區可操作地締合之啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件。除啟動子之外的其他轉錄控制元件，例如增強子、操縱子、阻遏子及轉錄終止信號，亦可與編碼區可操作地締合以引導基因產物表現。　　[0143] 熟習此項技術者已知多個轉錄控制區。該等轉錄控制區包括(但不限於)，在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區，諸如但不限於，來自細胞巨大病毒(立即早期啟動子與內含子A之組合)、猿猴病毒40(早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒)之啟動子及增強子區段。其他轉錄控制區包括源於脊椎動物基因，諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-球蛋白之彼等控制區，以及能夠控制真核細胞中之基因表現之其他序列。其他適合的轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子，以及淋巴因子(lymphokine)誘導性啟動子(例如，可由干擾素或介白素誘導之啟動子)。　　[0144] 類似地，一般熟習此項技術者已知多種轉譯控制元件。該等元件包括但不限於，核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，及源自於細小核糖核酸病毒之元件(特別是內部核糖體進入位點，或IRES，又稱為CITE序列)。　　[0145] 如本文所用，術語「表現」係指聚核苷酸藉以產生基因產物(例如RNA或多肽)之過程。　　[0146] 「載體」係指用於將核酸選殖及/或轉移至宿主細胞中之任何媒介物。載體可為可與另一核酸區段連接以使所連接區段複製之複製子。「複製子」係指在活體內充當自主複製單元，亦即，能夠在自身控制下複製之任何遺傳元件(例如質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒)。術語「載體」包括用於體外、離體或體內將核酸引入細胞中之病毒載體與非病毒載體。此項技術中已知且使用許多載體，包括例如質體、經修飾真核病毒或經修飾細菌病毒。將聚核苷酸插入適合載體中可藉由將適當聚核苷酸片段連接至具有互補黏性末端之所選載體中來達成。　　[0147] 術語「質體」係指染色體外元件，其常攜帶不為細胞之重要代謝之部分的基因，且通常呈環狀雙股DNA分子形式。此等元件可為源於任何來源之具有單股或雙股DNA或RNA之線性、環狀或超螺旋自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中許聚核苷酸序列已接合或重組成能夠將啟動子片段及所選基因產物之DNA序列連同適當3'未轉譯序列一起引入細胞中之獨特構造。　　[0148] 可使用之真核病毒載體包括但不限於腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺相關病毒載體及痘病毒(例如牛痘病毒)載體、桿狀病毒載體或皰疹病毒載體。非病毒載體包括質體、脂質體、帶電荷脂質(細胞轉染劑)、DNA-蛋白質複合物及生物聚合物。　　[0149] 「選殖載體」係指一種「複製子」，其為依序複製且包含複製起點的單位長度之核酸(諸如質體、噬菌體或黏質體)，另一核酸區段可與其連接以達成所連接區段之複製。某些選殖載體能夠在一個細胞類型(例如細菌)中複製且在另一細胞類型(例如真核細胞)中表現。選殖載體通常包含一或多種可用於選擇包含載體之細胞之序列及/或一或多個用於插入相關核酸序列之多選殖位點。　　[0150] 術語「表現載體」係指設計成使插入之核酸序列能夠在插入宿主細胞中之後表現之載體。插入之核酸序列係以與如上所述之調控區可操作締合之方式置放。　　[0151] 藉由此項技術中熟知之方法將載體引入宿主細胞中，該等方法例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、脂質體轉染(溶酶體融合)、使用基因槍、或DNA載體轉運體。　　[0152] 「經分離」多肽或其片段、變異體或衍生物係指不在天然環境中之多肽。不要求特定純化程度。例如，經分離多肽可僅自其原生或天然環境移除。出於本發明之目的，在寄主細胞中表現的重組產生之多肽及蛋白質視為分離的，已藉由任何適合技術分離、分餾或部分地或實質上純化之天然或重組多肽亦視為分離的。　　[0153] 如本文所用，術語「宿主細胞」係指帶有或能夠帶有重組核酸之細胞或細胞群體。宿主細胞可為原核細胞(例如，大腸桿菌 (E. coli) )，或者，宿主細胞可為真核細胞，例如真菌細胞(例如，酵母細胞，諸如釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 、畢赤酵母 (Pichia pastoris) 或粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe) )及各種動物細胞，諸如昆蟲細胞(例如，Sf-9)或哺乳動物細胞(例如，HEK293F、CHO、COS-7、NIH-3T3)。　　[0154] 如本文所用之「穩定狀態分佈體積(Vss)」具有與藥理學中所用之術語相同含義，其係藥物分佈於其中的外觀空間(體積)。Vss=在穩定狀態下體內藥物之量除以血漿濃度。II. 本發明之方法 [0155] 本揭露係基於發現融合至Fc區之凝結因子可用於逆轉血友病性關節病。先前已知血友病性關節病一旦發展便為不可逆的，因為軟組織變化僅可藉由MRI顯現。當前已知的針對罹患血友病性關節病之個體的選擇包括手術或硬化劑以去除肥大滑膜。硬化劑(放射性或化學材料)可阻礙進一步軟骨及骨衰退；但是，其不能逆轉血友病性關節病。當控制滑膜肥大的其他努力失敗時，膝關節及髖關節之關節造形術已成功地減輕了活動疼痛及活動喪失。Hilgartner M., Current Opinion in Pediatrics: February 2002, V14, 第1期, 第46-49頁。　　[0156] 因此本揭露提供治療患有血友病之人類關節之血友病性關節病之方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之組成物(例如，嵌合蛋白)或編碼該嵌合蛋白之多核苷酸。血友病性關節病之治療可(部分地或完全地)逆轉血友病性關節病(例如，血友病性關節病之一或多個症狀)。因此，在一個實施例中，本揭露提供一種治療患有血友病之人類之方法，該人類已經發展了血友病性關節病，例如，滑膜炎。　　[0157] 一般而言，血友病性關節病係指發生於罹患血友病之人類受試者中呈長期結果或反復出血至受試者關節中的關節疾病。自發性出血至一或多個關節中在血友病患者中係常見的。在6個月時期內若干次連續出血的關節常稱為「目標關節」，且此等關節常進展成血友病性關節病。　　[0158] 血友病性關節病可呈現有各種症狀，包括但不限於滑膜增生、慢性發炎(包括滑膜炎)、纖維化、含鐵血紅素沉積症、關節下囊腫形成、疼痛、活動範圍減小、肌肉萎縮、關節僵直、骨質疏鬆、軟骨退化伴關節空間塌陷及其任何組合。血友病性關節病包括各種階段：(i)第I階段，包括軟組織腫脹，但無骨骼異常；(ii)第II階段，包括骨骺之過度生長及骨質疏鬆，維持關節完整性。不存在骨囊腫，且不存在關節軟骨空間狹窄。放射學第II階段平行於亞急性血友病性關節病之臨床階段；(iii)第III階段，包括最小至中度關節空間狹窄伴軟骨下囊腫。擴大至膝蓋之髁間切跡及尺骨滑車切跡。在膝蓋中可有髕骨變方。關節軟骨仍保留且血友病性關節病仍為可逆的；(iv)第IV階段，包括關節軟骨破壞伴重度關節空間狹窄。第III階段中可見的其他骨性變化更明顯；及(v)第V階段，包括關節空間全部喪失伴關節之纖維性關節僵直。關節結構與重度骨骺不規則肥大有顯著的不一致。　　[0159] 本揭露提供以包含凝結因子及Fc區之組成物(例如，嵌合蛋白)之治療能夠減輕及/或改善可逆性血友病性關節病之症狀。在一些實施例中，組成物(例如，嵌合蛋白)可治療血友病性關節病之一或多個階段，例如，第I、II及/或III階段。如本文所用，「可逆性」血友病性關節病係血友病性關節病之可在治療之後部分或完全回復為其原始的健康狀態的表現。相反，「不可逆性」血友病性關節病係血友病性關節病之永久的且在治療之後將不改良的表現。因此，本發明方法可改良、減輕或改善(或部分地或完全地逆轉)血友病性關節病之一或多個症狀，例如，滑膜增生、慢性發炎(包括滑膜炎)、含鐵血紅素沉積症、關節下囊腫形成、疼痛、活動範圍減小、腫脹、血管重塑或其任何組合。　　[0160] 使用本揭露之方法治療之血友病性關節病(可逆性)可影響體內之任何關節。在一些實施例中，關節係載荷關節，例如，選自由以下所組成之群組的關節：一或兩個膝關節、一或兩個踝關節、一或兩個髖關節、足部之一或多個關節及其任何組合。在另一實施例中，關節係非載荷關節，例如，選自由以下所組成之群組的關節：一或兩個肘關節、一或兩個肩關節、一或兩個腕關節、手部之一或多個關節或其任何組合。在另一實施例中，關節係膝關節。　　[0161] 在一些實施例中，該可逆性血友病性關節病包含滑膜炎。滑膜炎係指關節周圍的滑膜發炎。在一些實施例中，滑膜炎係體內任何關節的滑膜炎。在一些實施例中，滑膜炎呈現為關節腫脹，且本揭露之方法減輕關節腫脹。在一些實施例中，滑膜炎呈現為關節疼痛，且本揭露之方法減輕關節疼痛。在其他實施例中，滑膜炎呈現為關節之活動範圍減小，且本發明之方法增加關節之活動範圍。　　[0162] 在其他實施例中，可逆性血友病性關節病包含關節中微出血。在一些實施例中，可逆性血友病性關節病係由微出血導致。微出血係指一或多個關節中非常少量的出血，其可在反復發生之後引起血友病性關節病。在一些實施例中，可逆性血友病性關節病包含急性關節出血。在一些實施例中，可逆性血友病性關節病係由急性關節出血導致。急性關節出血係指一或多個關節中更大量的出血事件。　　[0163] 在某些實施例中，可逆性血友病性關節病包含一或多個關節發炎。在一些實施例中，發炎係在體內任何關節中。在一些實施例中，發炎呈現為關節腫脹，且本揭露之方法減輕關節腫脹。在一些實施例中，發炎呈現為關節疼痛，且本揭露之方法減輕關節疼痛。在其他實施例中，發炎呈現為關節之活動範圍減小，且本發明之方法增加關節之活動範圍。在某些實施例中，該方法進一步提供在投與有效量包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白之前測量一或多個關節中之發炎。在一些實施例中，該方法進一步提供在投與有效量包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白之後測量一或多個關節中之發炎。　　[0164] 在其他實施例中，血友病性關節病係藉由與關節發炎及/或關節損傷相關聯之一或多個生物標記物之表現來證明。在一些實施例中，人類中一或多個生物標記物上調，指示關節發炎及/或關節損傷增加。在一些實施例中，人類中一或多個生物標記物下調，指示關節發炎及/或關節損傷增加。在一些實施例中，需要治療的人類係基於與對使用本揭露之方法治療之反應性增加相關聯之一或多個生物標記物之表現來識別。　　[0165] 在一些實施例中，本發明方法增加凝結因子至一或多個目標關節的定位。在某些實施例中，包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白在投與之後定位至目標關節比單獨投與凝結因子多。在某些實施例中，包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白在投與之後維持定位至一或多個目標關節所達時間比單獨投與凝結因子長。　　[0166] 在其他實施例中，本發明方法進一步包含識別展現可逆血友病性關節病之一或多個標記物的受試者，然後投與包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。　　[0167] 在一些實施例中，本發明方法預防或減少患有血友病之人類關節之血管重塑之發生。與血友病性關節病相關聯之常見要素係關節(尤其是目標關節)周圍血管之重塑。血管重塑可特徵在於血管生成增加及微出血至關節中之發生增加。在一些實施例中，本揭露提供一種預防性治療或減少患有血友病之人類關節之血管重塑之發生的方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。在其他實施例中，本揭露提供一種逆轉現存的與患有血友病之人類關節之血友病性關節病相關聯之血管重塑的方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白。在一些實施例中，血管重塑係在體內任何關節中。在某些實施例中，血管重塑係在目標關節中。在其他實施例中，血管重塑係在除目標關節之外的關節中。在某些實施例中，血管重塑係在載荷關節中，例如，選自由以下所組成之群組的關節：一或兩個膝關節、一或兩個踝關節、一或兩個髖關節、足部之一或多個關節及其任何組合。在另一實施例中，血管重塑係在非載荷關節中，例如，選自由以下所組成之群組的關節：一或兩個肘關節、一或兩個肩關節、一或兩個腕關節、手部之一或多個關節或其任何組合。在另一實施例中，血管重塑係在膝關節中。在一些實施例中，血管重塑係在肌肉中。在一些實施例中，血管重塑係在脾及/或肝中。　　[0168] 在某些實施例中，本發明方法改良患有血友病之人類關節之周圍軟組織。血友病性關節病之另一常見病理學係關節軟組織之過度增殖。在一些實施例中，藉由本揭露之方法改良之軟組織係在體內任何關節中。在某些實施例中，藉由本揭露之方法改良之軟組織係在目標關節中。在其他實施例中，藉由本揭露之方法改良之軟組織係在除目標關節之外的關節中。　　[0169] 在一些實施例中，本發明之方法減輕與關節軟組織之過度增殖相關聯之一或多個症狀之嚴重性。在一些實施例中，關節軟組織之過度增殖呈現為關節腫脹，且本揭露之方法減輕關節腫脹。在一些實施例中，關節軟組織之過度增殖呈現為關節疼痛，且本揭露之方法減輕關節疼痛。在其他實施例中，關節軟組織之過度增殖呈現為關節之活動範圍減小，且本發明之方法增加關節之活動範圍。　　[0170] 本文所揭示之方法可對已得到治療且已顯示血友病性關節病減輕的受試者進行實踐以預防一或多個關節之血友病性關節病之進一步發展。在一些實施例中，本揭露之方法應用於受試者以治療現存的一或多個關節之血友病性關節病並預防一個相同或不同關節之進一步血友病性關節病之發展。　　[0171] 在一些實施例中，本揭露之方法允許凝結因子分佈至血漿區室外以及血漿區室中的組織。　　[0172] 本揭露之方法改良患有血友病之人類一或多個關節之關節健康。關節健康可使用此項技術中已知的任何衡量法測量。在一些實施例中，關節健康係使用血友病關節健康計分(HJHS)系統測量(參見 Feldman等人, 「Hemophilia Joint Health Score (HJHS) 2.1」，可在http://www.wfh.org/en/page.aspx?pid=885(2016年11月18日最後一次訪問)獲得，其以全文引用之方式併入本文)。HJHS測量最常受血友病之出血影響的關節(膝關節、踝關節及肘關節)之關節健康(在身體結構及功能(即損害)領域中)。儘管其主要設計用於具有輕度關節損害的4-18歲具有血友病之兒童(例如，在預防之情況治療)，但是其可應用於任何群體。在一些實施例中，HJHS測量患有血友病之人類之左及右肘關節、左及右膝關節以及左及右踝關節中之各者之腫脹、(腫脹之)持續時間、肌肉萎縮、活動時撚發聲、屈曲喪失、伸展喪失、關節疼痛及強度。在一些實施例中，各參數經分配數值計分。在一個特定實施例中，標準HJHS 2.1版用於測量關節健康。在一些實施例中，腫脹計分為0至3，其中0係無腫脹，且3係重度腫脹。在一些實施例中，腫脹之持續時間計分為0至1，其中0係無腫脹或腫脹達少於6個月，且1係腫脹達多於或等於6個月。在一些實施例中，肌肉萎縮計分為0至2，0係無萎縮，且2係重度萎縮。在一些實施例中，活動時撚發聲計分為0至2，0係無活動時撚發聲，且2係重度活動時撚發聲。在一些實施例中，屈曲喪失計分為0至3，0係小於5°屈曲喪失，且3係大於20°屈曲喪失。在一些實施例中，伸展喪失計分為0至3，0係小於5°伸展喪失，且3係大於20°伸展喪失。在一些實施例中，關節疼痛計分為0至2，其中0係透過活動之有效範圍無疼痛，且2係透過活動之有效範圍疼痛。在一些實施例中，整體步態經計分，其中0反映出所有技能均在正常限度內；1、2及3反映出分別1、2及3個技能不在正常限度內；且4反映出所有技能均不在正常限度內。在某些實施例中，整體步態計分係基於走路、走樓梯、跑步及/或單腿跳進行測量。在一些實施例中，該等計分經組合以產生總計分。在其他實施例中，一或多個關節之個別計分評估為一或多個關節之健康之指示。　　[0173] 在其他實施例中，經修改HJHS系統用於測量關節健康。在一些實施例中，mHJHS與標準HJHS 2.1版之不同之處在於，相較於標準HJHS(範圍，0-124)，關節疼痛及步態之反應選擇被壓縮成較少類別，增加了不穩定性評定，且總計分較小(範圍，0-116；0指示正常關節功能，116指示重度疾病)。排除在2週內出血之後的計分。最後觀察值推估(last observation carry forward)輸入經歷手術介入的關節之計分。為了評估逐年變化，事後分析中包括在4個時間點(rFVIIIFc 關鍵3期試驗基線、rFVIIIFc延伸研究基線、rFVIIIFc延伸研究第1年及延伸研究第2年)具有mHJHS資料的rFVIIIFc延伸研究受試者。使用描述統計學概述從rFVIIIFc關鍵3期試驗基線至rFVIIIFc延伸研究第2年的mHJHS計分變化(負值指示改良)。針對以下概述從rFVIIIFc關鍵3期試驗基線至追蹤訪視的mHJHS計分變化：(1)總計分(範圍，0-116；藉由研究前方案(預防期對發病期)；初始mHJHS藉由功能損害之嚴重性；且藉由基線時目標關節之存在；(2)目標關節(範圍，0-19：單一目標關節之所有問題之總和)；(3)承重(例如，踝及膝)及非承重(例如，肘)關節(範圍，0-38：單一位置右及左關節之總和)；及(4)個別分量(活動範圍(範圍，0-36；所有關節之問題「伸展喪失[踝背屈]」及「屈曲喪失[踝蹠屈]」之組合)；腫脹(範圍，0-24：所有關節之問題「腫脹」及「腫脹持續時間」之組合)；及強度(範圍，0-6：所有關節之總和))。　　[0174] 在一些實施例中，對6個關節單獨進行關節計分(左踝-LA、右踝-RA、左肘-LE、右肘-RE、左膝-LK、右膝-RK)。在一些實施例中，腫脹係根據以下計分：0=無；1=輕度；2=中度；3=重度。在一些實施例中，腫脹持續時間係根據以下計分：0=無腫脹或≤6個月；1=＞6個月。在一些實施例中，肌肉萎縮係根據以下計分：0=無；1=輕度；2=重度。在一些實施例中，活動時撚發聲係根據以下計分：0=不存在；1=存在。在一些實施例中，屈曲喪失(包括踝蹠屈喪失)係根據以下計分：0=無；1=輕度；2=中度；3=重度。在一些實施例中，伸展喪失(包括踝背屈喪失)係根據以下計分：0=無；1=輕度；2=中度；3=重度。在一些實施例中，不穩定性係根據以下計分：0=無；1=顯著病理性關節鬆弛。在一些實施例中，關節疼痛係根據以下計分：0=不疼痛，貫穿活動範圍或活動範圍端部；1=存在。在一些實施例中，強度係根據以下計分：0=正常(抵抗重力及最大抵抗力保持位置)；1=最小下降(抵抗重力及中等抵抗力而不是最大抵抗力保持位置)；2=輕度下降(抵抗重力或最小抵抗力保持位置)；3=中度下降(消除重力時能夠移動關節)；4=重度下降(痕量或無肌肉收縮)。在某些實施例中，對於在膝關節及肘關節計分屈曲喪失及伸展喪失，以下適用：無=近似0-5度；輕度=近似5-10度；中度=近似11-20度；及重度=近似＞20度。　　[0175] 在一些實施例中，步態經計分一次(範圍係0-2)，其中0=走路或走上/下樓梯不困難；1=走路不困難，但走樓梯困難；及2=走路及走樓梯均困難。　　[0176] 在某些實施例中，根據以下類別及標度對6個關節(左踝-LA、右踝-RA、左肘-LE、右肘-RE、左膝-LK、右膝-RK)單獨進行關節計分(各關節之範圍為0-19且所有六個關節之範圍為0-114)：腫脹(0=無；1=輕度；2=中度；3=重度)；腫脹持續時間(0=無腫脹或≤6個月；1= ＞6個月)；肌肉萎縮(0=無；1=輕度；2=重度)；活動時撚發聲(0=不存在；1=存在)；屈曲喪失，包括踝蹠屈喪失(0=無；1=輕度；2=中度；3=重度)；伸展喪失，包括踝背屈喪失(0=無；1=輕度；2=中度；3=重度)；不穩定性(0=無；1=顯著病理性關節鬆弛)；關節疼痛(0=不疼痛，貫穿活動範圍或活動範圍端部；1=存在)；強度(0=正常(抵抗重力及最大抵抗力保持位置)；1=最小下降(抵抗重力及中等抵抗力而不是最大抵抗力保持位置)；2=輕度下降(抵抗重力或最小抵抗力保持位置)；3=中度下降(消除中立時能夠移動關節)；4=重度下降(痕量或無肌肉收縮)；其中，對於計分膝關節及肘關節之屈曲喪失及伸展喪失，以下適用：無=近似0-5度；輕度=近似5-10度；中度=近似11-20度；及重度=近似＞20度。　　[0177] 在一些實施例中，本揭露提供一種治療患有血友病之人類關節之可逆性血友病性關節病之方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白，其中該投與相對於該投與之前HJHS計分改良該人類之HJHS計分。在一些實施例中，HJHS計分係總HJHS計分，其包括測量值所有關節計分加整體步態計分之和。在一些實施例中，HJHS計分係總HJHS計分，其包括測量值所有關節計分但無整體步態計分之和。在其他實施例中，HJHS計分係針對一或兩個肘關節、一或兩個膝關節、一或兩個踝關節或其任何組合。在一個特定實施例中，HJHS計分係針對肘關節。在另一實施例中，HJHS計分係針對膝關節。在另一實施例中，HJHS計分係針對踝關節。在另一實施例中，HJHS計分反映整體步態。　　[0178] 在一些實施例中，本揭露提供一種治療患有血友病之人類關節之可逆性血友病性關節病之方法，其包含向該人類投與有效量包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白，其中該投與減輕該人類之關節疼痛。在一些實施例中，相對於投與之前的關節疼痛，關節疼痛減輕。在某些實施例中，該方法進一步提供在投與有效量包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白之前測量一或多個關節中之關節疼痛。在一些實施例中，該方法進一步提供在投與有效量包含凝結因子及Fc區之組成物或嵌合蛋白之後測量一或多個關節中之關節疼痛。　　[0179] 在某些實施例中，在人類之一或多個關節中觀察到本發明方法之效應。在一些實施例中，在至少一個關節中觀察到本發明方法之效應。在一些實施例中，在至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個關節中觀察到本發明方法之效應。　　[0180] 在一些實施例中，本揭露之方法進一步包含識別需要治療之人類，例如，識別患有血友病性關節病之受試者。血友病性關節病可使用此項技術中已知的任何方法偵測及/或監測。在一些實施例中，成像系統用於偵測及/或監測受試者之血友病性關節病。在一些實施例中，成像系統包含此項技術中已知用於表徵關節的任何成像系統。例如，在某些實施例中，該成像系統包含放射線攝影術、磁共振成像、超音波檢查術、能量多普勒音波檢查術或其任何組合。　　[0181] 在一些實施例中，受試者先前經未融合至Fc部分之凝結因子蛋白治療。此凝結因子可為全長或成熟凝結因子。在一些實施例中，此一凝結因子可為ADVATE®、RECOMBINATE®、KOGENATE FS®、HELIXATE FS®、XYNTHA®/REFACTO AB®、HEMOFIL-M®、MONARC-M®、MONOCLATE-P®、HUMATE-P®、ALPHANATE®、KOATE-DVI®、AFSTYLA®及HYATE:C®、IDELVION®。 II.A. 嵌合蛋白 [0182] 本文揭示之治療可逆性血友病性關節病之方法一般可適用於包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白或組成物，其中該凝結因子可為任何已知的凝結因子、其片段或其變異體，且其中該Fc區可為任何已知的Fc區、其片段或其變異體。在一些實施例中，該組成物包含包含有凝結因子及Fc區之嵌合蛋白。在一些實施例中，凝結因子係選自由以下所組成之群組：因子VII(FVII)、因子VIIa(FVIIa)、因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)、因子(FX)、馮威里因子(VWF)或其任何組合。據此，關於FVIIIFc及FIXFc嵌合多肽及其用途之本揭露同樣適用於包含凝結因子部分及Fc區之其他嵌合多肽。任何凝結因子、或其任何片段、或其任何變異體均可用於本揭露之方法。　　[0183] 不受理論約束，據信融合至凝結因子之Fc區實用於治療可逆性血友病性關節病。血友病之發炎在出血至關節中期間發生。已顯示，TNF-α(涉及血友病性關節病之炎性細胞介素)誘導NF-κB信號傳導，從而上調人類單核球中之FcRn表現(Liu 等人,J Immunol , 2007. 179(5): 第2999-3011頁)。FcRn因此可在發炎部位經上調，使含Fc蛋白透過結合至受體Fc受體定位於發炎部位作為調控炎性過程之一部分。融合至凝結因子之Fc區亦可與抑制Fc受體相互作用，抑制Fc受體可造成免疫調節劑炎性途徑之下調。例如，rFVIIIFc可阻斷Fc新生受體(FcRn)並活化Fcγ受體(FcγR)，引起促炎性及抗炎性分子之水準改變。因此，在一些實施例中，嵌合蛋白之Fc區有助於嵌合蛋白定位於關節，例如，發炎及/或傷害及/或損傷部位。　　[0184] 在其他實施例中，凝結因子可為凝結因子模擬物。凝結因子模擬物可顯示一或多個凝結因子活性。例如，抗體或其抗體結合部分可藉由結合至因子IX及因子X起類似FVIII之作用。若抗體或其抗原結合部分含有Fc區，則此類抗體或其抗原結合部分可用於本方法。在另一實施例中，凝結因子係具有FVIII活性之肽。　　[0185] 在此方面，本揭露大體上提供一種治療有需要之受試者之可逆性血友病性關節病之方法，其包含向該受試者投與包含凝結因子部分及Fc部分之嵌合多肽。 II.A.1. 因子 VIII [0186] 除非另外規定，否則如本文所用之「因子VIII」，在本申請書通篇縮寫為「FVIII」，意謂在凝血中發揮正常作用之功能性FVIII多肽。因此，術語FVIII包括具有功能性之變異體多肽。「FVIII蛋白」可與FVIII多肽(或蛋白)或FVIII互換使用。FVIII功能之實例包括但不限於能夠活化凝血、能夠充當因子IX之輔因子、或能夠在Ca²⁺ 及磷脂存在下與因子IX形成因子X酶(tenase)複合物，其然後將因子X轉化成活化形式之Xa。FVIII蛋白可為人類、豬、犬、大鼠或鼠類FVIII蛋白。此外，來自人類與其他物種之FVIII之間的比較已鑒別可能為功能所需之保守殘基(Cameron 等人 , Thromb .Haemost . 79:317-22 (1998)；US 6,251,632)。已知全長多肽及多核苷酸序列，亦已知許多功能性片段、突變體及修飾形式。各種FVIII胺基酸及核苷酸序列揭示於例如美國公開案第2015/0158929 A1號、第2014/0308280 A1號及第2014/0370035 A1號以及國際公開案第WO 2015/106052 A1號中，該等公開案以全文引用之方法併入本文。FVIII多肽包括例如全長FVIII、全長FVIII減去N末端Met、成熟FVIII(減去信號序列)、在N末端具有另一Met之成熟FVIII及/或B域全部或部分缺失之FVIII。FVIII變異體包括B域缺失，無論是部分還是全部缺失。　　[0187] 在一些實施例中，本揭露之嵌合蛋白或組成物之FVIII包含B域缺失FVIII。如本文所用之FVIII之「B域」與此項技術中已知之藉由內部胺基酸序列一致性及凝血酶之蛋白水解裂解位點定義之B域相同，例如，成熟人類FVIII之殘基Ser741-Arg1648。至於成熟人類FVIII，其他人類FVIII域由以下胺基酸殘基定義：A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；A3，殘基Ser1690-Ile2032；C1，殘基Arg2033-Asn2172；C2，成熟FVIII之殘基Ser2173-Tyr2332。除非另外指出，否則如本文所用之不指代任何SEQ ID數值之序列殘基數值對應於無信號肽序列(19個胺基酸)之FVIII序列。A3-C1-C2序列(亦稱為FVIII重鏈)包括殘基Ser1690-Tyr2332。剩餘序列(殘基Glu1649-Arg1689)通常指代為FVIII輕鏈活化肽。豬、小鼠及犬FVIII之包括B域之所有域的邊界位置在此項技術中亦為已知的。在一個實施例中，缺失FVIII之B域(「B域缺失FVIII」或「BDD FVIII」)。BDD FVIII之實例係REFACTO^® (重組BDD FVIII)。在一個特定實施例中，該B域缺失FVIII變異體包含成熟FVIII之胺基酸殘基746至1648之缺失。　　[0188] 「B域缺失FVIII」可具有揭示於美國專利第6,316,226號、第6,346,513號、第7,041,635號、第5,789,203號、第6,060,447號、第5,595,886號、第6,228,620號、第5,972,885號、第6,048,720號、第5,543,502號、第5,610,278號、第5,171,844號、第5,112,950號、第4,868,112號及第6,458,563號以及國際公開案第WO 2015106052 A1號(PCT/US2015/010738)中之全部或部分缺失。在一些實施例中，本揭露之方法中所用之B域缺失FVIII序列包含在美國專利第6,316,226號(亦在US 6,346,513中)之第4欄第4行至第5欄第28行及實例1-5處揭示之任一缺失。在另一實施例中，B域缺失因子VIII為S743/Q1638 B域缺失因子VIII(SQ BDD FVIII)(例如，具有自胺基酸744至胺基酸1637之缺失之因子VIII，例如，具有成熟FVIII之胺基酸1-743及胺基酸1638-2332之因子VIII)。在一些實施例中，本揭示之方法中所用之B域缺失FVIII具有在美國專利第5,789,203號(以及US 6,060,447、US 5,595,886及US 6,228,620)之第2欄第26-51行及實例5-8處揭示之缺失。在一些實施例中，B域缺失因子VIII具有以下文獻中描述之缺失：美國專利第5,972,885號之第1欄第25行至第2欄第40行；美國專利第6,048,720號之第6欄第1-22行及實例1；美國專利第5,543,502號之第2欄第17-46行；美國專利第5,171,844號之第4欄第22行至第5欄第36行；美國專利第5,112,950號之第2欄第55-68行，圖2及實例1；美國專利第4,868,112號之第2欄第2行至第19欄第21行及表2；美國專利第7,041,635號之第2欄第1行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄第67行、第7欄第43行至第8欄第26行、及第11欄第5行至第13欄第39行；或美國專利第6,458,563號之第4欄第25-53行。在一些實施例中，B域缺失FVIII缺失大部分B域，但仍然含有體內將初級轉譯產物蛋白水解加工成兩條多肽鏈所必需的B域胺基末端序列，如WO 91/09122中所揭示。在一些實施例中，在缺失胺基酸747-1638，亦即實際上完全缺失B域下構築B域缺失FVIII。Hoeben R.C.等人 J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990)。B域缺失因子VIII亦可含有FVIII之胺基酸771-1666或胺基酸868-1562之缺失。Meulien P.等人 Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988)。作為本發明之一部分之其他B域缺失包括以下缺失：胺基酸982至1562或760至1639(Toole等人 , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986)83, 5939-5942))、797至1562(Eaton等人 Biochemistry (1986) 25:8343-8347))、741至1646(Kaufman(PCT公開申請案第WO 87/04187號))、747-1560(Sarver等人 , DNA (1987) 6:553-564))、741至1648(Pasek(PCT申請案第88/00831號))、或816至1598或741至1648(Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) 第82期: 16-25, EP 295597))。在一個特定實施例中，該B域缺失FVIII包含成熟FVIII之胺基酸殘基746至1648之缺失。在另一特定實施例中，該B域缺失FVIII包含成熟FVIII之胺基酸殘基745至1648之缺失。　　[0189] 在其他實施例中，BDD FVIII包括含有B域之保留一或多個N-連接醣化位點之片段的FVIII多肽，該等位點例如對應於全長FVIII序列之胺基酸序列之殘基757、784、828、900、963或視情況943。B域片段之實例包括如Miao, H.Z.等人 , Blood 103(a): 3412-3419 (2004)、Kasuda, A等人 , J .Thromb. Haemost . 6: 1352-1359 (2008)及Pipe, S.W.等人 , J. Thromb. Haemost . 9: 2235-2242 (2011)中揭露的B域之226個胺基酸或163個胺基酸(亦即保留B域之前226個胺基酸或163個胺基酸)。在其他實施例中，BDD FVIII進一步包含在殘基309處之點突變(自Phe至Ser)以改良BDD FVIII蛋白之表現。參見 Miao, H.Z.等人, Blood 103(a): 3412-3419 (2004)。在其他實施例中，BDD FVIII包括含有一部分B域，但不含有一或多個弗林蛋白酶裂解位點(例如 Arg1313及Arg 1648)之FVIII多肽。參見 Pipe, S.W.等人 , J. Thromb. Haemost . 9: 2235-2242 (2011)。在一些實施例中，BDD FVIII包含含有在對應於成熟全長FVIII之胺基酸765至1652中之缺失的單鏈FVIII(亦稱為rVIII-單鏈及AFSTYLA®)。參見美國專利第7,041,635號。可在任何FVIII序列中進行各前述缺失。　　[0190] 已知大量功能性FVIII變異體，亦如上文及下文所論述。此外，已在血友病患者中識別出出FVIII之數百個非功能性突變，且已確定，與取代基之性質相比，FVIII功能之此等突變之效果更多係由於其處於FVIII之3維結構內(Cutler等人 , Hum. Mutat. 19 :274-8 (2002))，該參考文獻以全文引用之方式併入本文中。此外，來自人類與其他物種之FVIII之間的比較已識別出可能為功能所需之保守殘基(Cameron等人 , Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998)；US 6,251,632)，該參考文獻以全文引用之方式併入本文中。　　[0191] 在一些實施例中，包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白之有效量等效於無Fc區之FVIII之有效量。在某些實施例中，該有效量係約10 IU/Kg至約300 IU/kg。在一些實施例中，該有效量係約20 IU/Kg至約300 IU/kg。在一些實施例中，該有效量係約20 IU/kg至約250 IU/kg、約20 IU/kg至約200 IU/kg、約20 IU/kg至約190 IU/kg、約20 IU/kg至約180 IU/kg、約20 IU/kg至約170 IU/kg、約20 IU/kg至約160 IU/kg、約20 IU/kg至約150 IU/kg、約20 IU/kg至約140 IU/kg、約20 IU/kg至約130 IU/kg、約20 IU/kg至約120 IU/kg、約20 IU/kg至約110 IU/kg、約20 IU/kg至約100 IU/kg、約20 IU/kg至約90 IU/kg、約20 IU/kg至約80 IU/kg、約20 IU/kg至約70 IU/kg、約20 IU/kg至約60 IU/kg、約25 IU/kg至約100 IU/kg、約25 IU/kg至約90 IU/kg、約25 IU/kg至約80 IU/kg、約25 IU/kg至約70 IU/kg、約25 IU/kg至約65 IU/kg。在一個特定實施例中，該有效量係約20 IU/kg至約100 IU/kg。在另一實施例中，該有效量係約25 IU/kg至約65 IU/kg。在其他實施例中，該有效量係約20 IU/kg至約100 IU/kg、約30 IU/kg至約100 IU/kg、約40 IU/kg至約100 IU/kg、約50 IU/kg至約100 IU/kg、約60 IU/kg至約100 IU/kg、約70 IU/kg至約100 IU/kg、約80 IU/kg至約100 IU/kg、約90 IU/kg至約100 IU/kg、約20 IU/kg至約90 IU/kg、約20 IU/kg至約80 IU/kg、約20 IU/kg至約70 IU/kg、約20 IU/kg至約60 IU/kg、約20 IU/kg至約50 IU/kg、約20 IU/kg至約40 IU/kg或約20 IU/kg至約30 IU/kg。　　[0192] 在一些實施例中，該有效量係約10 IU/kg、約15 IU/kg、約20 IU/kg、約25 IU/kg、約30 IU/kg、約35 IU/kg、約40 IU/kg、約45 IU/kg、約50 IU/kg、約55 IU/kg、約60 IU/kg、約65 IU/kg、約70 IU/kg、約75 IU/kg、約80 IU/kg、約85 IU/kg、約90 IU/kg、約95 IU/kg、約100 IU/kg、約105 IU/kg、約110 IU/kg、約115 IU/kg、約120 IU/kg、約125 IU/kg、約130 IU/kg、約135 IU/kg、約140 IU/kg、約145 IU/kg、約150 IU/kg、約155 IU/kg、約160 IU/kg、約165 IU/kg、約170 IU/kg、約175 IU/kg、約180 IU/kg、約185 IU/kg、約190 IU/kg、約195 IU/kg、約200 IU/kg、約225 IU/kg、約250 IU/kg、約275 IU/kg或約300 IU/kg。在一個特定實施例中，該有效量係約50 IU/kg。在另一實施例中，該有效量係約100 IU/kg。在另一實施例中，該有效量係約200 IU/kg。　　[0193] 投與包含FVIII及Fc區或其片段之組成物或嵌合蛋白時的給藥間隔可比等效劑量無Fc區之該凝結因子所需之給藥間隔長至少約一倍半。給藥間隔可比等效劑量無Fc域之該FVIII所需之給藥間隔長至少約一倍半至六倍、長一倍半至五倍、長一倍半至四倍、長一倍半至三倍或長一倍半至兩倍。　　[0194] 在一些實施例中，有效劑量包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以以下給藥間隔向人類投與：約兩日、約三日、約四日、約五日、約六日、約七日、約八日、約九日、約十日、約11日、約12日、約13日、約14日、約15日、約16日、約17日、約18日、約19日、約20日、約21日、約22日、約23日或約24日。在一些實施例中，有效劑量包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以以下給藥間隔向人類投與：約25日、約26日、約27日、約28日、約29日、約30日、約45日或約60日。　　[0195] 在一些實施例中，包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以以下給藥間隔投與：約1至約14日、約1至約13日、約1至約12日、約1至約11日、約1至約10日、約1至約9日、約1至約8日、約1至約7日、約1至約6日、約1至約5日、約1至約4日、約1至約3日、約1至約2日、約2至約14日、約3至約14日、約4至約14日、約5至約14日、約6至約14日、約7至約14日、約8至約14日、約9至約14日、約10至約14日、約11至約14日、約12至約14日、約13至約14日或約5至約10日。在其他實施例中，包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以以下給藥劑量投與：約1至約21日、約1至約20日、約1至約19日、約1至約18日、約1至約17日、約1至約16日、約1至約15日、約1至約14日、約1至約13日、約1至約12日、約1至約11日、約1至約10日、約1至約9日、約1至約8日、約1至約7日、約1至約6日、約1至約5日、約1至約4日、約1至約3日、約1至約2日、約2至約21日、約3至約21日、約4至約21日、約5至約21日、約6至約21日、約7至約21日、約8至約21日、約9至約21日、約10至約21日、約11至約21日、約12至約21日、約13至約21日、約14至約21日、約15至約21日、約16至約21日、約17至約21日、約18至約21日、約19至約21日、約20至約21日、約5至約10日、約10至約15日、約15至約20日。在某些實施例中，包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以約2至約6日之給藥間隔投與。在另一實施例中，包含FVIII及Fc區之嵌合蛋白係以約3至約5日之給藥間隔投與。　　[0196] 在一個實施例中，該有效劑量係25-65 IU/kg (25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、62、64或65 IU/kg)，且該給藥間隔係每3-5、3-6、3-7、3、4、5、6、7或8或更多日一次、或每週三次、或每週不多於三次。在另一實施例中，該有效劑量係65 IU/kg，且該給藥間隔係每週一次、或每6-7日一次。只要是必要的，該等劑量可重複投與(例如，至少10、20、28、30、40、50、52、或57週，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年)。在一個特定實施例中，該有效劑量係約25-65 IU/kg，且該給藥間隔係每3-5日一次。　　[0197] 包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白可經調配以供任何適當投與方式，包括例如，局部(例如，經皮或眼部)、經口、經頰、經鼻、經陰道、經直腸或非經腸投與。　　[0198] 如本文所用之術語非經腸包括皮下、皮內、血管內(例如，靜脈內)、肌肉內、經脊椎、顱內、鞘內、眼內、眼周、眶內、滑膜內及腹膜內注射以及任何類似注射或輸注技術。組成物亦可為例如懸浮液、乳液、持續釋放調配物、乳膏、凝膠或散劑。組成物可用傳統黏合劑及載劑(諸如三酸甘油酯)調配成栓劑。　　[0199] 在一個實例中，醫藥調配物為液體調配物，例如緩衝等張水溶液。在另一實例中，醫藥組成物具有生理性或接近於生理性之pH值。在其他實例中，水性調配物具有生理性或接近於生理性之容積滲透濃度及鹽度。其可含有氯化鈉及/或乙酸鈉。　　[0200] 在一些實施例中，本發明之方法中所用之包含FVIII及Fc區之嵌合蛋白係調配於包含以下之醫藥組成物中：(a)嵌合多肽；(b)一或多種選自蔗糖、海藻糖、棉子糖、精胺酸或其混合物之穩定劑；(c)氯化鈉(NaCl)；(d)L-組胺酸；(e)氯化鈣；及(f)聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在某些實施例中，該醫藥組成物包含：(a)50 IU/ml至2500 IU/ml嵌合多肽；(b)10 mg/ml至25 mg/ml蔗糖；(c)8.8 mg/ml至14.6 mg/ml氯化鈉(NaCl)；(d)0.75 mg/ml至2.25 mg/ml L-組胺酸；(e)0.75 mg/ml至1.5 mg/ml二水合氯化鈣；及(f)0.08 mg/ml至0.25 mg/ml聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實例中，本揭露之方法中所用之醫藥組成物係經凍乾。　　[0201] 在一些實施例中，該醫藥組成物不包含免疫細胞。在一些實施例中，該醫藥組成物不包含細胞。 II.A.2. 因子 IX [0202] 人類因子IX(FIX)係一種絲胺酸蛋白酶，其為凝血級聯之固有路徑中的重要組分。如本文所用，「因子IX」或「FIX」係指凝血因子蛋白及其物種及序列變異體，且包括但不限於人類FIX前驅多肽之具有461個胺基酸之單鏈序列(「前原」)、成熟人類FIX之具有415個胺基酸之單鏈序列及R338L FIX (Padua)變異體。FIX包括具有凝血FIX之典型特徵的任何形式之FIX分子。如本文所用，「因子IX」及「FIX」意欲涵蓋包含域Gla(含有γ-羧基麩胺酸殘基之區域)、EGF1及EGF2(含有與人表皮生長因子同源之序列的區域)、活化肽(「AP」，由成熟FIX之殘基R136-R180形成)及C末端蛋白酶域(「Pro」)，或此項技術中已知的該等域之同義詞，或可為保持原生蛋白質之至少一部分生物活性的截短片段或序列變異體。　　[0203] FIX或序列變異體已經選殖，如美國專利第4,770,999號及第7,700,734號中所描述，且編碼人類因子IX之cDNA已經分離，表徵且被選殖至表現載體中(參見例如 ，Choo等人, Nature 299:178-180 (1982)；Fair等人, Blood 64:194-204 (1984)；及Kurachi等人, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 79:6461-6464 (1982))。一個特定FIX變異體為由Simioni等人, 2009表徵之R338L FIX (Padua)變異體，其包含功能獲得突變，該突變與Padua變異體活性相對於原生FIX有近8倍增加相關。FIX變異體亦可包括具有一或多個保守胺基酸取代之任何FIX多肽，該一或多個取代不會影響FIX多肽之FIX活性。　　[0204] 在一些實施例中，FIX包含凝血因子IX(重組)，白蛋白融合蛋白(亦稱為rIX-FP及IDELVION®)。　　[0205] FIX多肽為55 kDa，以由以下三個區構成之前體多肽原鏈形式合成：具有28個胺基酸之信號肽(胺基酸1至28)、麩胺酸殘基γ-羧基化所需的具有18個胺基酸之前肽(胺基酸29至46)及具有415個胺基酸之成熟因子IX。前肽係在γ-羧基麩胺酸域N末端之具有18個胺基酸殘基之序列。前肽結合維生素K依賴性γ羧化酶，且接著經內源蛋白酶，最可能是PACE(成對鹼性胺基酸裂解酶，又稱為弗林蛋白酶(furin)或PCSK3)自FIX之前驅多肽裂解。若不發生γ羧基化，則Gla域無法結合鈣以呈現將蛋白質錨定於帶負電之磷脂表面所需之正確構形，由此使因子IX沒有功能。即使其經羧基化，Gla域亦取決於前肽之裂解而獲得適當功能，因為保留之前肽干擾Gla域與鈣及磷脂最佳結合所需之構形變化。在人體中，所得成熟因子IX係由肝細胞以無活性酶原形式分泌至血流中，該酶原為以重量計含有約17%碳水化合物的具有415個胺基酸殘基之單鏈蛋白質(Schmidt, A. E.等人(2003) Trends Cardiovasc Med, 13: 39)。　　[0206] 成熟FIX係由若干域構成，該等域以N末端至C末端配置為：GLA域、EGF1域、EGF2域、活化肽(AP)域及蛋白酶(催化)域。短連接子將EGF2域與AP域相連接。FIX含有分別由R145-A146及R180-V181形成之兩個活化肽。活化後，單鏈FIX變為具有2條鏈之分子，其中該兩條鏈係藉由二硫鍵連接。凝結因子可藉由置換其活化肽引起活化特異性之改變來進行工程改造。在哺乳動物中，成熟FIX必須由活化因子XI活化以得到因子IXa。在FIX活化成FIXa之後，蛋白酶域提供FIX之催化活性。活化因子VIII(FVIIIa)係完整表現FIXa活性之特定輔因子。　　[0207] 在其他實施例中，FIX多肽包含血漿源性因子IX之Thr148等位基因形式且具有與內源因子IX類似之結構及功能特徵。　　[0208] 已知許多功能性FIX變異體。國際公開案第WO 02/040544 A3號在第4頁第9-30行及第15頁第6-31列揭示了對肝素抑制作用之展現較高抗性的突變體。國際公開案第WO 03/020764 A2號在表2及表3(第14-24頁)中及在第12頁第1-27行揭示T細胞免疫原性降低之FIX突變體。國際公開案第WO 2007/149406 A2號在第4頁第1行至第19頁第11列揭示展現較高蛋白質穩定性、較長活體內及活體外半衰期及較高的對蛋白酶之抗性的功能性突變FIX分子。WO 2007/149406 A2亦在第19頁第12行至第20頁第9行揭示嵌合及其他變異體FIX分子。國際公開案第WO 08/118507 A2號在第5頁第14行至第6頁第5行揭示展現較高凝血活性之FIX突變體。國際公開案第WO 09/051717 A2號在第9頁第11行至第20頁第2行揭示具有使半衰期及/或回收率增加之增加數目之N-連接及/或O-連接醣化位點的FIX突變體。國際公開案第WO 09/137254 A2號亦在第2頁第[006]段至第5頁第[011]段及第16頁第[044]段至第24頁第[057]段揭示醣化位點數增加之因子IX突變體。國際公開案第WO 09/130198 A2號在第4頁第26行至第12頁第6行揭示具有使半衰期增加之增加數目之醣化位點的功能性突變FIX分子。國際公開案第WO 09/140015 A2號在第11頁第[0043]段至第13頁第[0053]段揭示可用於聚合物(例如PEG)偶聯之Cys殘基之數目增加的功能性FIX突變體。2011年7月11日申請且在2012年1月12日以WO 2012/006624公開之國際申請案第PCT/US2011/043569號中所述之FIX多肽亦以全文引用的方式併入本文中。　　[0209] 此外，已在血友病受試者中識別出數百種FIX非功能性突變，其中許多揭示於國際公開案第WO 09/137254 A2號第11-14頁之表5中。此等非功能性突變不包括在本發明中，但提供有關哪些突變很可能或不太可能產生功能性FIX多肽之額外指導。　　[0210] 因子IX凝血活性係以國際單位(IU)表示。一個IU之FIX活性近似對應於一毫升正常人類血漿中FIX之量。若干分析可用於量測因子IX活性，包括單級凝結分析(部分活化凝血激酶時間；aPTT)、凝血酶產生時間(TGA)及旋轉式血栓彈力分析儀(ROTEM^® )。本發明涵蓋與FIX序列具有同源性之序列、天然序列片段(諸如來自人類；非人類靈長類動物；哺乳動物，包括家養動物)，及保持FIX之至少一部分生物活性或生物功能及/或可用於預防、治療、介導或改善凝血因子相關疾病、缺乏、病症或病狀(例如與外傷、手術或凝血因子缺乏相關之出血事件)的非天然序列變異體。與人FIX同源之序列可藉由標準同源性搜索技術，諸如NCBI BLAST發現。　　[0211] 在一些實施例中，包含FIX及Fc區之組成物或嵌合蛋白之有效量等效於無Fc區之FIX之有效量。在某些實施例中，該有效量係約0.1 IU/kg至約500 IU/kg。在一些實施例中，該有效量係約10 IU/Kg至約400 IU/kg。在一些實施例中，該有效量係約20 IU/Kg至約300 IU/kg。在一些實施例中，該有效量係約20 IU/kg至約275 IU/kg、約20 IU/kg至約250 IU/kg、約20 IU/kg至約225 IU/kg、約20 IU/kg至約200 IU/kg、約20 IU/kg至約175 IU/kg、約20 IU/kg至約150 IU/kg、約20 IU/kg至約100 IU/kg、約20 IU/kg至約90 IU/kg、約20 IU/kg至約80 IU/kg、約20 IU/kg至約70 IU/kg、約20 IU/kg至約60 IU/kg、約20 IU/kg至約50 IU/kg、約20 IU/kg至約40 IU/kg、約20 IU/kg至約30 IU/kg、約30 IU/kg至約100 IU/kg、約40 IU/kg至約100 IU/kg、約50 IU/kg至約100 IU/kg、約60 IU/kg至約100 IU/kg、約70 IU/kg至約100 IU/kg、約80 IU/kg至約100 IU/kg、約90 IU/kg至約100 IU/kg、約100 IU/kg至約200 IU/kg、約150 IU/kg至約200 IU/kg或約25 IU/kg至約75 IU/kg。在一個特定實施例中，該有效量係約20 IU/kg至約100 IU/kg。　　[0212] 在一些實施例中，該有效量係約10 IU/kg、約15 IU/kg、約20 IU/kg、約25 IU/kg、約30 IU/kg、約35 IU/kg、約40 IU/kg、約45 IU/kg、約50 IU/kg、約55 IU/kg、約60 IU/kg、約65 IU/kg、約70 IU/kg、約75 IU/kg、約80 IU/kg、約85 IU/kg、約90 IU/kg、約95 IU/kg、約100 IU/kg、約105 IU/kg、約110 IU/kg、約115 IU/kg、約120 IU/kg、約125 IU/kg、約130 IU/kg、約135 IU/kg、約140 IU/kg、約145 IU/kg、約150 IU/kg、約155 IU/kg、約160 IU/kg、約165 IU/kg、約170 IU/kg、約175 IU/kg、約180 IU/kg、約185 IU/kg、約190 IU/kg、約195 IU/kg或約200 IU/kg。在一個特定實施例中，該有效量係約50 IU/kg。在另一實施例中，該有效量係約100 IU/kg。　　[0213] 投與包含FIX及Fc區或其片段之組成物或嵌合蛋白時的給藥間隔可比等效劑量無Fc區之該FIX所需之給藥間隔長至少約一倍半。給藥間隔可比等效劑量無Fc域之該FIX所需之給藥間隔長至少約一倍半至六倍、長一倍半至五倍、長一倍半至四倍、長一倍半至三倍或長一倍半至兩倍。在一些實施例中，給藥間隔比等效劑量之無Fc域之FIX所需之給藥間隔長至少約一倍半、兩倍、兩倍半、三倍、三倍半、四倍、四倍半、五倍、五倍半或六倍。給藥間隔可為約每三日、四日、五日、六日、七日、八日、九日、十日、十一日、十二日、十三日或十四日或更長時間。給藥間隔可為至少約一日半至五日、一日半、2日、3日、4日或5日或更長時間。對於按需治療，該嵌合多肽或雜交物之給藥間隔為約每24-36、24-48、24-72、24-96、24-120、24-144、24-168、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小時或更長時間一次。　　[0214] 在一些實施例中，有效劑量包含FIX及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以以下給藥間隔向人類投與：約兩日、約三日、約四日、約五日、約六日、約七日、約八日、約九日、約十日、約11日、約12日、約13日、約14日、約15日、約16日、約17日、約18日、約19日、約20日、約21日、約22日、約23日或約24日。在一些實施例中，有效劑量包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以以下給藥間隔向人類投與：約25日、約26日、約27日、約28日、約29日、約30日、約45日或約60日。在某些實施例中，有效劑量包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以以下給藥間隔向人類投與：約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日或約14日。在一個特定實施例中，有效劑量包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以約2日(例如，約48小時)之給藥間隔向人類投與。在另一實施例中，有效劑量包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以約7日之給藥間隔向人類投與。在另一實施例中，有效劑量包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以約10日之給藥間隔向人類投與。在一些實施例中，有效劑量包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以每6-10小時之給藥間隔向人類投與。在某些實施例中，有效劑量包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以每日之給藥間隔向人類投與。　　[0215] 在一些實施例中，包含FVIII及Fc區之組成物或嵌合蛋白係以以下給藥劑量投與：約1至約21日、約1至約20日、約1至約19日、約1至約18日、約1至約17日、約1至約16日、約1至約15日、約1至約14日、約1至約13日、約1至約12日、約1至約11日、約1至約10日、約1至約9日、約1至約8日、約1至約7日、約1至約6日、約1至約5日、約1至約4日、約1至約3日、約1至約2日、約2至約21日、約3至約21日、約4至約21日、約5至約21日、約6至約21日、約7至約21日、約8至約21日、約9至約21日、約10至約21日、約11至約21日、約12至約21日、約13至約21日、約14至約21日、約15至約21日、約16至約21日、約17至約21日、約18至約21日、約19至約21日、約20至約21日、約5至約10日、約10至約15日、約15至約20日。　　[0216] 在一個實施例中，有效劑量係可維持1-50 IU/dL(例如，至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 IU/dL)循環FIX之劑量。在另一實施例中，有效劑量係50 IU/kg，且給藥間隔係每週一次。在另一實施例中，給藥間隔係100 IU/kg，且給藥間隔係每10日一次。只要是必要的，該等劑量可重複投與(例如，至少10、20、28、30、40、50、52、或57週，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年)。　　[0217] 包含FIX及Fc區之組成物或嵌合蛋白可經調配以供任何適當投與方式，包括例如，局部(例如，經皮或眼部)、經口、經頰、經鼻、經陰道、經直腸或非經腸投與。　　[0218] 如本文所用之術語非經腸包括皮下、皮內、血管內(例如，靜脈內)、肌肉內、經脊椎、顱內、鞘內、眼內、眼周、眶內、滑膜內及腹膜內注射以及任何類似注射或輸注技術。組成物亦可為例如懸浮液、乳液、持續釋放調配物、乳膏、凝膠或散劑。組成物可用傳統黏合劑及載劑(諸如三酸甘油酯)調配成栓劑。　　[0219] 在一個實例中，醫藥調配物為液體調配物，例如緩衝等張水溶液。在另一實例中，醫藥組成物具有生理性或接近於生理性之pH值。在其他實例中，水性調配物具有生理性或接近於生理性之容積滲透濃度及鹽度。其可含有氯化鈉及/或乙酸鈉。　　[0220] 在一些實施例中，本發明之方法中所用之包含FIX及Fc區之嵌合蛋白係調配於包含以下之醫藥組成物中：(a)嵌合多肽；(b)包含蔗糖及甘露糖醇之碳水化合物混合物；(c)氯化鈉(NaCl)；(d)L-組胺酸；及(e)聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在某些實施例中，該醫藥組成物包含：(a)約25 IU/ml與約700 IU/ml之間的因子IX多肽；(b)約10 mg/ml與約20 mg/ml之間的蔗糖；(c)約20 mg/ml與約40 mg/ml之間的甘露糖醇；(d)約3 mg/ml與約4 mg/ml之間的NaCl；(e)約3 mg/ml與約6 mg/ml之間的L-組胺酸；(f)約0.08 mg/ml與約0.2 mg/ml之間的聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；或(g)其任何組合。在一些實例中，本揭露之方法中所用之醫藥組成物係經凍乾。　　[0221] 在一些實施例中，該醫藥組成物不包含免疫細胞。在一些實施例中，該醫藥組成物不包含細胞。 II.A.3 Fc [0222] 本揭露之組成物或嵌合蛋白包括結合至FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN之Fc域或其部分。在一些實施例中，Fc域融合至凝結因子，例如，作為包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白之一部分。在其他實施例中，Fc域融合至除凝結因子之外的多肽，其中該組成物包含(1)凝結因子及(2)包含Fc域及另一多肽之嵌合蛋白。在一些實施例中，Fc域係與凝結因子共投與。Fc域或其一部分可改良嵌合蛋白之藥物動力學或藥效動力學性質。在某些實施例中，Fc域或其一部分延長融合至該Fc域或其一部分之分子之半衰期。在一些實施例中，嵌合蛋白之Fc區有助於嵌合蛋白定位至關節。　　[0223] 如本文所用，如本文所用之術語「Fc域」或「Fc區」意謂多肽中對應於原生Ig之Fc域的功能性部分，亦即，如藉由其兩條重鏈之各別Fc域之二聚締合所形成。原生Fc域與另一Fc域形成均二聚體。相反，如本文所用之術語「遺傳融合Fc區」或「單鏈Fc區」(scFc區)係指合成二聚Fc區，其包含在單一多肽鏈內遺傳連接之Fc域(亦即，在單一鄰接遺傳序列中編碼)。　　[0224] 在一個實施例中，「Fc區」係指單一Ig重鏈之一部分，其在恰好在木瓜蛋白酶(papain)裂解位點(亦即 IgG中之殘基216，將重鏈恆定區之第一殘基看作114)上游之鉸鏈區中開始且在抗體之C末端處結束。據此，完全Fc域至少包含鉸鏈域、CH2域及CH3域。　　[0225] 視Ig同型而定，Ig恆定區之Fc區可包括CH2、CH3及CH4域以及鉸鏈區。包含Ig之Fc區之嵌合蛋白對嵌合蛋白賦予若干合乎需要之性質，包括增強之穩定性、增加之血清半衰期(參見Capon等人 , 1989,Nature 337:525)以及結合至Fc受體，諸如新生兒Fc受體(FcRn)(美國專利第6,086,875號、第6,485,726號、第6,030,613號；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，其等以全文引用的方式併入本文中。　　[0226] 在一些實施例中，Fc區特異性結合至FcRn。已自包括人類之若干哺乳動物物種分離FcRn受體。已知人類FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn及小鼠FcRn之序列(Story等人1994, J. Exp. Med. 180:2377)。FcRn受體在相對較低之pH值下結合IgG(但不結合其他Ig類別，諸如IgA、IgM、IgD及IgE)，以內腔至漿膜方向跨細胞主動轉運IgG，然後在間隙液中存在之相對較高pH值下釋放IgG。其表現在成人上皮組織(美國專利第6,485,726號、第6,030,613號、第6,086,875號；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，包括肺及腸上皮(Israel等人1997, Immunology 92:69)、腎近端管狀上皮(Kobayashi等人2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358)以及鼻上皮；陰道表面；及膽系表面中。　　[0227] 實用於本發明中之Fc區涵蓋可特異性結合FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN之分子，包括完整IgG、IgG之Fc片段、及包括FcRn受體之完全結合區之其他片段。已描述IgG之Fc部分之結合至FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN的區。　　[0228] 在一個特定實施例中，該Fc區特異性結合至低親和力免疫球蛋白γFc區受體II-b(FcγRIIB)。FcγRIIB係抑制Fc受體，其控制炎性反應之態樣。具體而言，FcγRIIB之活化抑制引起發炎的活化信號。因此，實際上，FcγRIIB之活化抑制發炎。　　[0229] 在另一實施例中，該Fc區特異性結合至樹狀細胞特異性細胞內黏附分子-3-抓取型非整聯蛋白(DC-SIGN)。DC-SIGN(亦稱為CD209)係多數骨髓來源細胞(包括某些單核球、樹狀細胞及巨噬細胞)表現之C型凝集素受體。小鼠中的研究已透露DC-SIGN之活化可抑制發炎。參見 Nimerjahn, 第5章, Molecular and Cellular Pathways Involved in the Anti-inflammatory Activity of IgG, Molecular Mechanisms of Antibody Activity, New York, NY 2013: 113-138。　　[0230] 特異性結合係指兩個分子在生理條件下形成相對穩定之複合物。特異性結合之特徵在於親和力較高且能力較低至中等，如與通常親和力較低且能力中等至較高之非特異性結合相區分。通常，當親和力常數KA高於10⁶ M^-1 或高於10⁸ M^-1 時，結合被視為特異性結合。必要時，可藉由改變結合條件來降低非特異性結合而不實質上影響特異性結合。諸如分子濃度、溶液之離子強度、溫度、允許結合時間、阻斷劑(例如血清白蛋白、乳酪蛋白)濃度等之適當結合條件可由熟練技術人員使用常規技術加以最佳化。　　[0231] 在某些實施例中，本發明之嵌合蛋白包含一或多個截短Fc區，儘管如此，該等Fc區仍然足以對Fc區賦予FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN結合性質。例如，Fc區之結合FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN之部分(亦即 FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN結合部分)包含IgG1之約胺基酸282-438(EU編號)，其中主要接觸位點為CH2域之胺基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314及CH3域之胺基酸殘基385-387、428及433-436。因此，本發明之Fc區可包含FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN結合部分或由FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN結合部分組成。FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN結合部分可源於包括IgGl、IgG2、IgG3及IgG4之任何同型之重鏈。在一個實施例中，使用來自具有人類同型IgG1之抗體之FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN結合部分。在另一實施例中，使用來自具有人類同型IgG4之抗體之FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN結合部分。　　[0232] 在另一實施例中，「Fc區」包括Fc域或源於Fc域之胺基酸序列。在某些實施例中，Fc區包含以下至少一者：鉸鏈(例如上、中及/或下鉸鏈區)域(抗體Fc區之約胺基酸216-230，根據EU編號)、CH2域(抗體Fc區之約胺基酸231-340，根據EU編號)、CH3域(抗體Fc區之約胺基酸341-438，根據EU編號)、CH4域、或其變異體、部分或片段。在其他實施例中，Fc區包含完全Fc域(亦即鉸鏈域、CH2域及CH3域)。在一些實施例中，Fc區包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成：融合於CH3域(或其部分)之鉸鏈域(或其部分)、融合於CH2域(或其部分)之鉸鏈域(或其部分)、融合於CH3域(或其部分)之CH2域(或其部分)、融合於鉸鏈域(或其部分)與CH3域(或其部分)兩者之CH2域(或其部分)。在其他實施例中，Fc區缺乏CH2域之至少一部分(例如 CH2域之全部或一部分)。在一特定實施例中，Fc區包含以下或由以下組成：對應於EU編號221至447之胺基酸。　　[0233] 在本文中表示為F、F1或F2之Fc區可自許多不同來源獲得。在一個實施例中，多肽之Fc區源於人類Ig。然而，應瞭解Fc區可源於另一哺乳動物物種之Ig，物種包括例如齧齒動物(例如小鼠、大鼠、兔或天竺鼠)或非人類靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種。此外，Fc域或其部分之多肽可源於任何Ig類別(包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE)及任何Ig同型(包括IgGl、IgG2、IgG3及IgG4)。在另一實施例中，使用人類同型IgG1。　　[0234] 在某些實施例中，Fc變異體賦予由包含該野生型Fc域之Fc區賦予之至少一種效應功能的變化(例如，Fc區結合至Fc受體(例如，結合至FcγRI或FcγRIII之降低或結合至FcRn或FcγRII之改良)、補體蛋白(例如 C1q)或其他Fc結合搭配物(例如，結合至DC-SIGN之改良)，或觸發抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、吞噬作用或補體依賴性細胞毒性(CDCC)之能力改良或降低)。在其他實施例中，Fc變異體提供工程改造之半胱胺酸殘基。　　[0235] 本發明之Fc區可採用此項技術認可之已知會賦予效應功能及/或FcR結合變化(例如增強或降低)之Fc變異體。具體而言，本發明之結合分子可包括例如在以下揭示之一或多個胺基酸位置處之變化(例如，取代)：國際PCT公開案WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2及WO06/085967A2；美國專利公開案第US2007/0231329號、第US2007/0231329號、第US2007/0237765號、第US2007/0237766號、第US2007/0237767號、第US2007/0243188號、第US2007/0248603號、第US2007/0286859號、第US20080057056號；或美國專利5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；7,404,956及7,317,091，其以引用方式併入本文。在一個實施例中，可在一或多個揭示之胺基酸位置處進行具體變化(例如具體取代此項技術中揭示之一或多個胺基酸)。在另一實施例中，可在一或多個揭示之胺基酸位置處進行不同變化(例如此項技術中揭示之一或多個胺基酸位置之不同取代)。　　[0236] Fc區可根據充分認可之程序(諸如定點突變誘發及其類似程序)加以修飾以產生將由FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN結合之經修飾Fc片段或部分。此等修飾包括保持或甚至增強與FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN結合的遠離FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN接觸位點之修飾以及在接觸位點內之修飾。例如，可取代人類IgG1 Fc(Fc γ1)中之以下單一胺基酸殘基而不顯著損失Fc對FcRn、FcγRIIB及/或DC-SIGN之結合親和力：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A及K447A，其中例如P238A表示在位置編號238處野生型脯胺酸經丙胺酸取代。　　[0237] 例如，一具體實施例併有N297A突變，從而移除高度保守之N-醣化位點。除丙胺酸之外，其他胺基酸亦可在以上指定之位置處取代野生型胺基酸。突變可逐一引入Fc中，從而產生多於一百個不同於原生Fc之Fc區。另外，兩個、三個或更多個此等個別突變之組合可一起引入，從而產生數百個以上Fc區。此外，本發明之構築體之一個Fc區可經突變且該構築體之另一Fc區完全不突變，或其兩者均可經突變，但突變不同。　　[0238] 在一個實施例中，Fc域或其部分係多肽，包括美國專利第5,739,277號之SEQ ID NO: 3且視情況進一步包括選自美國專利第5,739,277號之SEQ ID NO: 11、1、2及31之序列。　　[0239] 在某些實施例中，Fc域或其部分經半醣化。例如，包含兩個Fc區之嵌合蛋白可含有第一醣化Fc區(例如醣化CH2區)及第二無醣化Fc區(例如無醣化CH2區)。在一個實施例中，連接子可插入在醣化Fc區與無醣化Fc區之間。在另一實施例中，Fc區經完全醣化，亦即所有Fc區皆經醣化。在其他實施例中，Fc區可為無醣化的，亦即無Fc部分經醣化。　　[0240] 在某些實施例中，本發明之嵌合蛋白包含對Fc域或其部分之胺基酸取代(例如 Fc變異體)，其改變Fc域之抗原非依賴性效應功能，特定言之改變蛋白質之循環半衰期。　　[0241] 本發明中使用之Fc區亦可包含此項技術認可之改變嵌合蛋白之醣化之胺基酸取代。例如，嵌合蛋白之連接於FVIII蛋白或FIX蛋白之Fc區可包含具有導致醣化(例如 N-連接或O-連接醣化)降低之突變之Fc區，或可包含野生型Fc部分之改變的糖形式(例如低海藻糖(fucose)或無海藻糖聚醣)。　　[0242] 在一個實施例中，本發明之未加工嵌合蛋白可包含遺傳學融合之Fc區(亦即 scFc區)，該Fc區具有二或更多個獨立地選自本文所述之Ig恆定區或其部分之其組成Ig恆定區或其部分。在一個實施例中，二聚Fc區之Fc區為相同的。在另一實施例中，至少兩個Fc區為不同的。例如，本發明蛋白質之Fc區包含相同數目之胺基酸殘基，或其可在長度方面相差一或多個胺基酸殘基(例如約5個胺基酸殘基(例如 1、2、3、4或5個胺基酸殘基)、約10個殘基、約15個殘基、約20個殘基、約30個殘基、約40個殘基或約50個殘基)。在其他實施例中，本發明蛋白質之Fc區可在序列方面在一或多個胺基酸位置處不同。例如，至少兩個Fc區可在約5個胺基酸位置(例如 1、2、3、4或5個胺基酸位置)、約10個位置、約15個位置、約20個位置、約30個位置、約40個位置、或約50個位置處不同。　　[0243] 在一些實施例中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含多於一條多肽鏈。在一些實施例中，嵌合蛋白包含兩條多肽鏈。在某些實施例中，第一多肽鏈包含凝結因子及第一Fc區，且第二多肽鏈包含第二Fc區。在某些實施例中，第一Fc區及第二Fc區藉由共價鍵締合。在一個實施例中，第一Fc區及第二Fc區藉由肽鍵締合。在另一實施例中，第一Fc區及第二Fc區藉由二硫鍵締合。　　[0244] 在一個特定實施例中，嵌合蛋白包含因子VIII部分及馮威里因子(VWF)部分，其中該FVIII部分包含FVIII多肽或其片段，其中該VWF部分包含VWF多肽或其片段，其中該FVIII部分連接至第一Fc區，其中該VWF部分連接至第二Fc區，且其中該第一Fc區及該第二Fc區係彼此締合。在某些實施例中，VWF部分包含VWF之D'及D3域。在一個實施例中，第一多肽、第二多肽或第一多肽及第二多肽兩者進一步包含一或多個半衰期延長部分。　　[0245] 本揭露之方法中使用之用於產生嵌合蛋白的Fc區或其部分可自許多不同來源獲得。在一些實施例中，Fc區或其部分源於人類Ig。然而，應瞭解Fc區或其部分可源於另一哺乳動物物種之Ig，物種包括例如齧齒動物(例如小鼠、大鼠、兔、天竺鼠)或非人類靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種。此外，Fc區或其部分可源於任何Ig類別(包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE)及任何Ig同型(包括IgGl、IgG2、IgG3及IgG4)。在一個實施例中，使用人類同型IgG1。　　[0246] 多種Fc區基因序列(例如人類Fc基因序列)可以公開可得之寄存物形式獲得。可選擇具有特定效應功能(或缺乏特定效應功能)或具有用以降低免疫原性之特定修飾之Fc序列。許多抗體及抗體編碼基因序列已經公開且可使用此項技術認可之技術自此等序列獲得適合Fc區序列。使用任一前述方法獲得之遺傳物質可然後經改變或合成以獲得本揭露之方法中使用之嵌合蛋白。應進一步瞭解本發明之範疇涵蓋恆定區DNA序列之對偶基因、變異體及突變。　　[0247] Fc或其部分之序列可例如使用選用於擴增相關域之聚合酶鏈反應及引子來選殖。為自抗體選殖Fc區或其部分之序列，可自融合瘤、脾或淋巴細胞分離mRNA，逆轉錄成DNA，且藉由PCR擴增抗體基因。PCR擴增方法詳述於美國專利第4,683,195號；第4,683,202號；第4,800,159號；第4,965,188號中；及例如「PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications」 Innis等人編, Academic Press, San Diego, CA(1990)；Ho等人1989. Gene 77:51；Horton等人1993. Methods Enzymol. 217:270中。PCR可藉由共同恆定區引子或藉由基於公開之重鏈及輕鏈DNA及胺基酸序列之更特異性引子來啟始。如上所論述，PCR亦可用於分離編碼抗體輕鏈及重鏈之DNA純系。在此情況下，可藉由共同引子或較大同源探針(諸如小鼠恆定區探針)來篩檢文庫。適於擴增抗體基因之眾多引子組在此項技術中為已知的，例如基於純化抗體之N末端序列(Benhar及Pastan. 1994. Protein Engineering7:1509)；cDNA末端之快速擴增物(Ruberti, F.等人1994. J. Immunol. Methods 173:33)；抗體前導序列(Larrick等人1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250)之5'引子。抗體序列之選殖進一步描述於Newman等人, 1995年1月25日申請之美國專利第5,658,570號中，該專利以引用的方式併入本文中。 II.B. 半衰期延長部分 [0248] 在一些實施例中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白進一步包含一或多個半衰期延長部分。凝結因子之半衰期可藉由熟習此項技術者已知之任何方法來確定，例如偵測血漿FVIII活性水準之FVIII活性分析(顯色分析或單級凝結aPTT分析)或偵測血漿FVIII/FIX抗原水準之FVIII/FIX ELISA。在一特定實施例中，凝結因子之凝結活性之半衰期係藉由單級凝結分析確定。在一更特定實施例中，在小鼠(HemA小鼠或FVIII及馮威里因子雙重剔除(DKO)小鼠)中確定凝結因子之凝結活性之半衰期。　　[0249] 在某些態樣中，使本發明之凝結因子之半衰期增加的異源部分包含但不限於異源多肽諸如白蛋白、免疫球蛋白Fc區、XTEN序列、人類絨毛膜促性腺素之β次單位之C末端肽(CTP)、PAS序列、HAP序列、運鐵蛋白、白蛋白結合部分或此等多肽之任何片段、衍生物、變異體或組合。在其他相關態樣中，半衰期延長部分可包括諸如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、聚唾液酸或此等部分之任何衍生物、變異體或組合之非多肽部分的連接位點。在某些實施例中，該半衰期延長部分包含白蛋白或其片段、白蛋白結合部分、PAS序列、HAP序列、運鐵蛋白或其片段、聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸、羥乙基澱粉(HES)、其衍生物或其任何組合。在一些實施例中，半衰期延長部分不包含XTEN。在其他實施例中，半衰期延長部分包含XTEN。　　[0250] 在其他實施例中，本發明之嵌合蛋白與一或多種聚合物結合。聚合物可為水溶性的或非水溶性的。聚合物可共價或非共價連接至凝結因子、Fc或與凝結因子或Fc結合之其他部分。聚合物之非限制性實例可為聚(氧化烯)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉或聚(丙烯醯基嗎啉)。其他類型之例如聚合物結合FVIII揭示於美國專利第7,199,223號中，該專利以全文引用的方式加以揭示。　　[0251] 在某些態樣中，本發明之嵌合蛋白可包含一個、兩個、三個或更多個各自可為相同或不同分子的半衰期延長部分。　　[0252] 在一些實施例中，半衰期延長部分融合至嵌合多肽之N末端或C末端。在一些實施例中，半衰期延長部分融合至凝結因子之N末端或C末端。在一些實施例中，半衰期延長部分融合至Fc之N末端或C末端。在某些實施例中，半衰期延長部分插入在嵌合蛋白之凝結因子內。　　[0253] 在一些實施例中，嵌合蛋白包含FVIII或其部分，且半衰期延長部分在美國專利公開案第2015-0158929 A1號及/或國際公開案第WO 2015106052 A1號中所揭示之一或多個位置處插入在FVIII內，該等公開案以全文引用之方式併入本文中。在一個特定實施例中，半衰期延長部分插入在FVIII之B域(或其片段)內。在一個特定實施例中，半衰期延長部分緊靠成熟FVIII之胺基酸殘基745之下游插入在FVIII內。　　[0254] 在其他實施例中，嵌合蛋白包含FIX或其部分，且半衰期延長部分插入在FIX內國際申請案第PCT/US16/045401號中所揭示之一或多個位置處。在一個特定實施例中，半衰期延長部分插入在FIX內緊鄰選自由以下所組成之群組的胺基酸下游的插入位點處：成熟Padua FIX之胺基酸103、胺基酸105、胺基酸142、胺基酸149、胺基酸162、胺基酸166、胺基酸174、胺基酸224、胺基酸226、胺基酸228、胺基酸413。在一個實施例中，嵌合蛋白包含FIX及Fc區，其中FIX包含插入在FIX之活化多肽(AP)域內的半衰期延長部分。在一個特定實施例中，嵌合蛋白包含FIX及Fc區，其中FIX包含插入在FIX內緊鄰成熟Padua FIX之胺基酸殘基166下游的半衰期延長部分。 II.B.1. 白蛋白 [0255] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種白蛋白多肽或其片段、變異體或衍生物。人血清白蛋白(HAS或HA)係呈全長形式時具有609個胺基酸之蛋白質，其負責顯著比例的血清滲透壓且亦充當內源性及外源性配位體之攜帶物。如本文所用之術語「白蛋白」包括全長白蛋白或其功能性片段、變異體、衍生物或類似物。白蛋白或其片段或變異體之實例揭示於美國專利公開案第2008/0194481A1號、第2008/0004206 A1號、第2008/0161243 A1號、第2008/0261877 A1號或第2008/0153751 A1號或PCT申請公開案第2008/033413 A2號、第2009/058322 A1號或第2007/021494 A2號中，該等公開案以全文引用的方式併入本文中。　　[0256] 白蛋白結合多肽(ABP)可包含但不限於可結合白蛋白之細菌白蛋白結合域、白蛋白結合肽或白蛋白結合抗體片段。如Kraulis等人 , FEBS Lett. 378:190-194 (1996)及Linhult等人 , Protein Sci. 11:206-213 (2002)所揭示，來自鏈球菌蛋白G之域3為細菌白蛋白結合域之實例。白蛋白結合肽之實例揭示於Dennis 等人, J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043(2002)。白蛋白結合抗體片段之實例揭露於Muller及Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326(2007)；Roovers等人 , Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317(2007)；及Holt等人 , Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288(2008)中，該等參考文獻以全文引用的方式併入本文中。　　[0257] 在某些態樣中，本揭示之方法中使用之嵌合蛋白包含非多肽小分子、其可結合白蛋白之變異體或衍生物之至少一個連接位點。例如，嵌合蛋白可包括一或多個有機白蛋白結合部分。此等白蛋白結合部分之一實例為如由Trussel等人 , Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009)揭示之2-(3-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁醯胺基)己酸酯(「Albu」標籤)。 II.B.2. XTEN [0258] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種XTEN多肽或其片段、變異體或衍生物。如此處所用，「XTEN序列」係指具有非天然存在、實質上非重複、主要包含小親水性胺基酸之序列的長度延長之多肽，該序列在生理條件下具有較低程度之二級或三級結構或無二級或三級結構。作為嵌合蛋白搭配物，XTEN可充當攜帶物，從而例如當與嵌合蛋白之凝結因子融合或插入至其中時，賦予某些合乎需要之藥物動力學、物理化學及醫藥性質。該等合乎需要之性質包括但不限於增強的藥物動力學參數及可溶性特徵。 [0259] 與本揭露之方法中使用之嵌合蛋白之凝結因子融合或插入至其中的XTEN序列可賦予重組蛋白一或多種以下有利性質：構形可撓性、增強之水溶性、高度蛋白酶抗性、低免疫原性、與哺乳動物受體之低結合作用或增加之流體動力學(或斯托克斯(Stokes))半徑。在某些態樣中，XTEN序列可增加藥物動力學性質，諸如較長的半衰期(例如，體內 半衰期)或增加曲線下面積(AUC)，以使嵌合蛋白相較於無XTEN之嵌合蛋白體內停留且具有促凝血活性達增加之時段。　　[0260] 可插入至本發明之重組FVIII蛋白中之XTEN序列的實例揭示於例如美國專利公開案第2010/0239554 A1號、第2010/0323956 A1號、第2011/0046060 A1號、第2011/0046061 A1號、第2011/0077199 A1號或第2011/0172146 A1號，或國際專利公開案第WO 2010091122 A1號、第WO 2010144502 A2號、第WO 2010144508 A1號、第WO 2011028228 A1號、第WO 2011028229 A1號、第WO 2011028344 A2號或第WO 2015106052 A1號中，該等公開案各自以全文引用的方式併入本文中。 II.B.3. VWF 或其片段 [0261] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種VWF多肽或其片段、變異體或衍生物。VWF(亦稱為F8VWF)為一種存在於血漿中且在內皮(在懷布爾-帕拉德體(Weibel-Palade body)中)、巨核細胞(血小板之α-顆粒)及內皮下結締組織中組成性產生之大型多聚醣蛋白。基本VWF單體為具有2813個胺基酸之蛋白質。每個單體含有多個具有特定功能之特定域，亦即D'/D3域(其結合因子VIII)、A1域(其結合血小板GPIb受體、肝素及/或可能膠原蛋白)、A3域(其結合膠原蛋白)、C1域(其中RGD域在此域活化時結合血小板整聯蛋白αIIbβ3)、及在蛋白質之C末端之「半胱胺酸結(cysteine knot)」域(該VWF與血小板源性生長因子(PDGF)、轉型生長因子-β(TGFβ)及β-人類絨毛膜促性腺素(βHCG)共有該域)。　　[0262] 在一個實施例中，VWF多肽係VWF片段。如本文所用之術語「VWF片段」包括但不限於能夠抑制內源性VWF結合FVIII之包含D'域及D3域之功能性VWF片段。在一個實施例中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含凝結因子、Fc區及VWF片段，其中該凝結因子包含FVIII，且其中該VWF片段結合FVIII蛋白。在另一實施例中，VWF片段阻斷FVIII蛋白上之VWF結合位點，藉此抑制FVIII蛋白與內源性VWF之相互作用。VWF片段包括保留VWF之此等活性之衍生物、變異體、突變體或類似物。在某些實施例中，VWF片段包含VWF之D'域及D3域。　　[0263] 人類VWF之2813單體胺基酸序列在基因庫中報導為登錄號NP_000543.2。編碼人類VWF之核苷酸序列在基因庫中報導為登錄號NM_000552.3。　　[0264] 在某些實施例中，本文實用之VWF蛋白可進一步經修飾以改良其與FVIII之相互作用，例如改良對FVIII之結合親和力。在其他實施例中，實用於本發明之VWF蛋白可具有其他修飾，例如蛋白質可經聚乙二醇化、醣化、羥乙基澱粉化或聚唾液酸化。實用於本揭露之實例性VWF序列提供於例如美國公開案第US 2015/0023959 Al號、第US 2015/0266943 A1號及第US 2015/0158929號中。在某些實施例中，VWF蛋白或其片段融合至FcRn結合搭配物或與FcRn結合搭配物共同投與。在一些實施例中，VWF蛋白或其片段融合至Fc或與Fc或包含Fc之多肽共同投與。在一些實施例中，VWF蛋白或其片段融合至白蛋白或與白蛋白或包含白蛋白之多肽共同投與。 II.B.4. CTP [0265] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含人類絨毛膜促性腺素之β次單位之至少一個C末端肽(CTP)或其片段、變異體或衍生物。已知CTP肽增加該蛋白之半衰期。參見，例如，美國專利第5,712,122號，其以全文引用之方式併入本文中。非限制性示範性CTP肽揭示於美國專利申請公開案第US 2009/0087411 A1號中，其以引用方式併入。 II.B.5. PAS [0266] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種PAS肽或其片段、變異體或衍生物。如本文所用之PAS肽或PAS序列意謂主要包含丙胺酸及絲胺酸殘基或主要包含丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸殘基之胺基酸序列，該胺基酸序列在生理條件下形成無規捲曲構形。因此，PAS序列為包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成之可用作嵌合蛋白中之異源部分之一部分的構築嵌段、胺基酸聚合物或序列基因盒：丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸。當除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸以外之殘基作為次要組分添加於PAS序列中時，胺基酸聚合物亦可形成無規捲曲構形。「次要組分」意謂除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸以外之胺基酸可在某種程度上添加於PAS序列中，例如胺基酸之至多約12%，亦即 PAS序列之100個胺基酸中有約12個彼等胺基酸；至多約10%；至多約9%；至多約8%；約6%；約5%；約4%；約3%；亦即約2%或約1%。不同於丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸之胺基酸可選自由以下組成之群：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr及Val。在生理條件下，PAS肽形成無規捲曲構形且藉此可介導本發明重組蛋白之體內及/或體外穩定性增強，且具有促凝血活性。　　[0267] PAS肽之非限制性實例揭示於例如美國專利公開案第2010/0292130 A1號；PCT申請公開案第WO 2008/155134 A1號；及歐洲頒佈專利EP2173890。 II.B.6. HAP [0268] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種均胺基酸聚合物(HAP)肽或其片段、變異體或衍生物。HAP肽可包含甘胺酸重複序列，其長度為至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、120個胺基酸、140個胺基酸、160個胺基酸、180個胺基酸、200個胺基酸、250個胺基酸、300個胺基酸、350個胺基酸、400個胺基酸、450個胺基酸或500個胺基酸。HAP序列能夠延長融合於或連接至HAP序列之部分的半衰期。HAP序列之非限制性實例包括但不限於(Gly)_n 、(Gly₄ Ser)_n 或S(Gly₄ Ser)_n ，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一個實施例中，n為20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一實施例中，n為50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。參見，例如 ，Schlapschy M等人 , Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007)。 II.B.7. 運鐵蛋白 [0269] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種運鐵蛋白肽或其片段、變異體或衍生物。任何運鐵蛋白均可與本揭露之方法中使用之嵌合蛋白融合。舉例而言，野生型人類Tf(Tf)為一種具有679個胺基酸之大致75 KDa(不考慮醣化)之蛋白質，具有似乎由基因複製產生之兩個主要域N(約330個胺基酸)及C(約340個胺基酸)。參見基因庫登錄號NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM 039847及S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov)，其全部以全文引用的方式併入本文中。 [0270] 運鐵蛋白經由運鐵蛋白質受體(TfR)介導之胞吞作用來轉運鐵。在鐵釋放至內體區室(endosomal compartment)中且Tf-TfR複合物再循環至細胞表面之後，Tf釋放回細胞外空間以進行下一鐵轉運循環。Tf擁有超過14-17天的長半衰期(Li等人 , Trends Pharmacol. Sci. 23:206-209 (2002))。已對運鐵融合蛋白之半衰期延長進行研究，目標為用於癌症治療之遞送、經口遞送及胰島素原之持續活化(Brandsma等人 , Biotechnol. Adv., 29: 230-238 (2011)；Bai等人 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:7292-7296 (2005)；Kim等人 , J. Pharmacol. Exp. Ther., 334:682-692 (2010)；Wang等人 , J. Controlled Release 155:386-392 (2011))。 II.B.8. PEG [0271] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含非多肽異源部分之至少一個連接位點或其片段、變異體或衍生物。例如，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白可包括連接至凝結因子及/或Fc區中一或多個胺基酸殘基的一或多個聚乙二醇(PEG)部分。　　[0272] 蛋白質之聚乙二醇化可指代在蛋白質與至少一個聚乙二醇(PEG)分子之間形成結合物。可購得在多種分子量及平均分子量範圍內的PEG。PEG平均分子量範圍之典型實例包括但不限於約200、約300、約400、約600、約1000、約1300-1600、約1450、約2000、約3000、約3000-3750、約3350、約3000-7000、約3500-4500、約5000-7000、約7000-9000、約8000、約10000、約8500-11500、約16000-24000、約35000、約40000、約60000及約80000道爾頓。此等平均分子量僅作為實例提供且不意欲以任何方式具有限制性。　　[0273] 本揭露之方法中使用之嵌合蛋白可經聚乙二醇化以包括單個或多個(例如，2-4個)PEG部分。聚乙二醇化可藉由此項技術中已知之聚乙二醇化反應中之任一種進行。製備聚乙二醇化蛋白質產物之方法一般將包括(i)使多肽與聚乙二醇(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使本發明之肽連接至一或多個PEG基團之條件下反應；及(ii)獲得反應產物。一般而言，反應之最佳反應條件將基於已知參數及所需結果根據具體情況來確定。　　[0274] 存在許多可為熟習此項技術者可利用的PEG連接方法，例如Malik F等人 ,Exp. Hematol . 20:1028-35 (1992)；Francis,Focus on Growth Factors 3(2):4-10 (1992)；歐洲專利公開案第EP0401384號、第EP0154316號及第EP0401384號；及國際專利申請公開案第WO92/16221號及第WO95/34326號。作為非限制性實例，FVIII變異體可含有半胱胺酸取代，且半胱胺酸可進一步結合於PEG聚合物。參見Mei等人 , Blood 116:270-279 (2010)及美國專利第7,632,921號，其以全文引用的方式併入本文中。 II.B.9. HES [0275] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種羥乙基澱粉(HES)聚合物。HES為天然存在之支鏈澱粉之衍生物並由體內之α-澱粉酶降解。HES展現有利生物性質且在臨床上用作血容量補充劑並用於血液稀釋療法中。參見例如 Sommermeyer等人 ,Krankenhauspharmazie 8:271-278 (1987)；及Weidler等人 ,Arzneim.-Forschung/Drug Res . 41: 494-498 (1991)。　　[0276] HES主要藉由分子量分佈及取代度來表徵。HES之平均分子量(重量平均分子量)為1至300 kD、2至200 kD、3至100 kD或4至70 kD。對於羥乙基，羥乙基澱粉可進一步展現0.1至3、0.1至2、0.1至0.9或0.1至0.8之莫耳取代度，以及2至20之範圍內的C2:C6取代比率。平均分子量為約130 kD之HES為來自Fresenius之Voluven^® 。Voluven^® 為一種例如用於容量置換之人工膠體，容量置換用於血容量過低(hypovolaemia)之治療及預防之治療適應症中。存在許多可為熟習此項技術者所用之HES連接方法，例如上述相同PEG連接方法。 II.B.10. PSA [0277] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白包含至少一種聚唾液酸(PSA)聚合物。PSA為由某些細菌菌株及在哺乳動物中於某些細胞中產生之唾液酸之天然存在之未分支聚合物。參見例如 Roth J.等人 , (1993),Polysialic Acid: From Microbes to Man , Roth J., Rutishauser U., Troy F. A.編(BirkhäuserVerlag, Basel, Switzerland), 第335-348頁。PSA可藉由有限酸水解或藉由用神經胺糖酸苷酶(neuraminidase)消化或藉由份化聚合物之天然細菌源性形式來以自n=約80個或80個以上唾液酸殘基至n=2之各種聚合度產生。存在許多可為熟習此項技術者所用之PSA連接方法，例如上述相同PEG連接方法。在某些態樣中，活化PSA亦可連接至凝結因子內(例如，FVIII或FIX上)或Fc區內之半胱胺酸胺基酸殘基。參見例如 美國專利第5846951號。 II.B.11. 清除受體 [0278] 在某些態樣中，本揭露之方法中使用之嵌合蛋白之半衰期可經延長，其中該嵌合蛋白之凝結因子包含FVIII、及FVIII清除受體之至少一個片段、或FVIII結合片段、其變異體或衍生物。插入諸如低密度脂蛋白相關蛋白受體LRP1之清除受體或其片段之可溶性形式可阻斷FVIII結合清除受體且藉此延長其半衰期，例如體內 半衰期。LRP1為一種牽涉於多種蛋白質(包括FVIII)之由受體介導之清除中之600 kDa膜主體蛋白。參見例如 Lenting等人 , Haemophilia 16:6-16 (2010)。其他合適之FVIII清除受體為例如 LDLR(低密度脂蛋白受體)、VLDLR(極低密度脂蛋白受體)及巨蛋白(megalin)(LRP-2)或其片段。參見例如 Bovenschen等人 , Blood 106:906-912 (2005)；Bovenschen, Blood 116:5439-5440 (2010)；Martinelli等人 , Blood 116:5688-5697 (2010)。 III. 多核苷酸、載體及宿主細胞 [0279] 在一些態樣中，本揭露提供一種治療患有血友病之人類關節之可逆性血友病性關節病之方法，其包含向該人類投與有效量編碼凝結因子及/或Fc區(例如，編碼包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白)之多核苷酸或多核苷酸組。在一些實施例中，該多核苷酸或該多核苷酸組在表現載體或表現載體組內。在某些實施例中，表現載體或表現載體組在一或多個宿主細胞內。　　[0280] 本揭露之方法中使用之編碼凝結因子及/或Fc區(例如，編碼包含凝結因子及Fc區之嵌合蛋白)之多核苷酸可為單條核苷酸序列、兩條核苷酸序列、三條核苷酸序列或更多條核苷酸序列。在一個實施例中，單條核苷酸序列編碼包含凝結因子(例如，FVIII或FIX多肽)及Fc區之嵌合蛋白。在另一實施例中，多核苷酸包含兩條核苷酸序列，第一核苷酸序列編碼凝結因子(例如，FVIII)且第二核苷酸序列編碼Fc區。在另一實施例中，多核苷酸包含兩條核苷酸序列，第一核苷酸序列編碼凝結因子(例如，FVIII或FIX)及Fc區且第二核苷酸序列編碼第二Fc區。在某些實施例中，編碼的Fc可在表現後形成共價鍵。　　[0281] 在一些實施例中，多核苷酸經密碼子最佳化。　　[0282] 如本文所用，表現載體係指含有在引入適當宿主細胞中時插入之編碼序列轉錄及轉譯所必需之元件，或在RNA病毒載體之情況下複製及轉譯所必需之元件的任何核酸構築體。表現載體可包括質體、噬菌粒、病毒及其衍生物。　　[0283] 如本文所用之基因表現控制序列為有助於可操作地連接之編碼核酸之高效轉錄及轉譯的任何調控性核苷酸序列，諸如啟動子序列或啟動子-增強子組合。基因表現控制序列可例如為哺乳動物或病毒啟動子，諸如組成性或誘導性啟動子。組成性哺乳動物啟動子包括但不限於以下基因之啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子及其他組成性啟動子。在真核細胞中組成性起作用之示範性病毒啟動子包括例如來自細胞巨大病毒(CMV)、猿猴病毒(例如SV40)、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、細胞巨大病毒、莫洛尼白血病病毒(Moloney leukemia virus)之長末端重複序列(LTR)及其他反轉錄病毒之啟動子、及單純性皰疹病毒之胸苷激酶啟動子。一般熟習此項技術者已知其他組成性啟動子。可用作本發明之基因表現序列之啟動子亦包括誘導性啟動子。誘導性啟動子在誘導劑存在下表現。例如，誘導金屬硫蛋白啟動子以促進在某些金屬離子存在下之轉錄及轉譯。其他誘導性啟動子為一般熟習此項技術者所知。　　[0284] 出於本發明之目的，可採用眾多表現載體系統。此等表現載體典型地在宿主生物體中可複製，呈游離基因體或作為宿主染色體DNA之整體部分。表現載體可包括表現控制序列，包括但不限於，啟動子(例如天然締合或異源啟動子)、增強子、信號序列、剪接信號、增強子元件及轉錄終止序列。較佳的是，表現控制序列為在能夠轉型或轉染真核宿主細胞之載體中的真核啟動子。表現載體亦可利用來源於動物病毒，諸如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)、細胞巨大病毒(CMV)或SV40病毒之DNA元件。其他表現載體涉及使用具有內部核糖體結合位點的多順反子系統。　　[0285] 通常，表現載體含有選擇標記物(例如胺苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性或新黴素抗性)以容許偵測經所需DNA序列轉型之細胞(參見例如 ，Itakura等人，美國專利第4,704,362號)。將DNA整合至染色體中之細胞可藉由引入一或多個允許選擇經轉染宿主細胞之標記物來進行選擇。標記物可向具有生物殺滅劑抗性(例如抗生素)或對諸如銅之重金屬具有抗性的營養缺陷型宿主提供原營養。可選擇標記物基因可直接連接至欲表現之DNA序列，或藉由共轉型引入該細胞中。　　[0286] 實用於本揭露之方法中使用之嵌合蛋白之最佳化表現的載體之實例係NEOSPLA(美國專利第6,159,730號)。該載體含有細胞巨大病毒啟動子/增強子、小鼠β球蛋白主要啟動子、SV40複製起點、牛生長激素聚腺苷酸化序列、新黴素磷酸轉移酶外顯子1及外顯子2、二氫葉酸還原酶基因及前導序列。已發現，該載體在併入可變區及恆定區基因、在細胞中轉染隨後在含G418之培養基中選擇並進行甲胺喋呤擴增後以極高水準表現抗體。載體系統亦於美國專利第5,736,137號及第5,658,570號中教示，其各自以全文引用之方式併入本文中。此系統提供高的表現水準，例如＞30 pg/細胞/日。其他示範性載體系統揭示於例如美國專利第6,413,777號中。　　[0287] 在其他實施例中，本發明之多肽係使用多順反子構築體表現。在此等表現系統中，可自單個多順反子構築體產生多個所關注基因產物，諸如多聚體結合蛋白質之多個多肽。此等系統有利地使用內部核糖體入口位點(IRES)以在真核宿主細胞中提供相對較高水準之多肽。適用IRES序列揭示於美國專利第6,193,980號，該案亦併入本文中。　　[0288] 更一般而言，一旦製備出編碼多肽之載體或DNA序列，即可將該表現載體引入適當宿主細胞中。亦即，宿主細胞可經轉型。將質體引入宿主細胞中可藉由如以上所論述的熟習此項技術者熟知之各種技術實現。轉型之細胞在適於產生嵌合蛋白之條件下生長，且針對嵌合蛋白合成進行分析。示範性分析技術包括酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或螢光活化細胞分選器分析(FACS)、免疫組織化學及其類似技術。　　[0289] 現已詳細描述本發明，藉由參考以下實例將更明確地瞭解本發明，該等實例係僅出於說明目的包括於此且不意欲限制本發明。實例 1 rFVIIIFc 預防在具有目標關節及重度 A 型血友病的小兒、青少年及成人受試者中的長期功效 [0290] 對於具有血友病的人來說，頻繁出血至同一關節(目標關節)中可導致血友病性關節病(慢性關節疾病)。rFVIIIFc經開發相較於習知FVIII產品延長因子VIII (FVIII)之半衰期(Peters等人,J. Thromb. Haemost. 11(1) :132-41 (2013))。完成的rFVIIIFc關鍵3期試驗(ClinicalTrials.gov識別符：NCT01181128；Mahlangu, 等人,Blood123(3) :317-25 (2014))及兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗(NCT01458106；Young等人,J. Thromb. Haemost. 13(6) :967-77 (2015))研究分別確立了rFVIIIFc在具有重度A型血友病之成人/青少年(12歲或更大年齡的患者)及兒童(小於12歲的患者)中的安全性及功效。rFVIIIFc之長期安全性及功效評估於正在進行的rFVIIIFc延伸研究(NCT01454739；Nolan等人,Haemophilia 22(1) :72-80 (2016))。　　[0291] 此研究之目標係報導至第二rFVIIIFc延伸研究中期資料截止為止(2014年12月8日)，進入rFVIIIFc關鍵3期試驗及兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗時rFVIIIFc及QOL在具有目標關節之受試者中的持久功效的累積資料。方法　　[0292] 對在進入親代研究(亦即，rFVIIIFc關鍵3期試驗或兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗)時具有≥1個目標關節(在6個月時期中具有≥3個出血事件的主要關節(參見 World Federation of Hemophilia, Guidelines for the Management of Hemophilia 第2版, Blackwell Publishing: Montréal, Canada (2012)))、具有可供使用之研究前(亦即，親代研究前)及研究中資料(目標關節，具體的及整體的)的受試者進行研究。rFVIIIFc延伸研究中有4個治療組(表1)。表 1 ： rFVIIIFc延伸研究治療方案

≥12歲的受試者可參與rFVIIIFc延伸研究中之任何治療方案，而＜12歲的受試者僅可參與個別化預防及經修改預防治療方案。　　[0293] 此後在親代研究之累積持續時間內至第二rFVIIIFc延伸研究中期資料截止對具有目標關節之受試者之結果進行分析。結果包括ABR、目標關節出血事件之數目及解決以及預防劑量及給藥頻率。對連續追蹤時間≥12個月且自從開始追蹤期尚未經歷目標關節之重大手術(亦即，置換或去除)的受試者進行目標關節解決之分析。若在連續12個月時期期間目標關節有≤2個自發性出血時間，則臨床上認為目標關節經解決(Blanchette 等人,J Thromb Haemost. 12(11) :1935-39 (2014))。　　[0294] 在≥17歲、在研究期間具有≥1個經解決目標關節且在rFVIIIFc關鍵3期試驗基線及rFVIIIFc延伸研究第2年具有Haem-A-QOL計分的受試者中藉由Haem-A-QOL指數評定QOL測量。在兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗的受試者中，QOL係藉由加拿大學血友病結果-兒童生活評定工具(Canadian Hemophilia Outcomes-Kids Life Assessment Tool，CHO-KLAT)測量。結果研究群體　　[0295] 在rFVIIIFc關鍵3期試驗之在基線時具有目標關節的113名受試者中，具有研究前預防或發病期方案及研究中資料的111名受試者在基線時具有287個目標關節(中值年齡，31.0歲；四分位數間距(IQR)，24.0-44.0歲；表2)。兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗之十三名受試者在基線時具有15個目標關節且具有研究前及研究中資料(中值年齡，6.0歲；IQR，5.0-8.0歲；表2)。表 2 ：人口統計學及基線特徵^a

IQR - 四分位數間距。^a 在進入親代研究時具有≥1個目標關節及具有效率期的受試者。目標關節定義為發生重複出血(在連續6個月時期內向同一關節≥3次出血事件之頻率)之主要關節(例如，肘關節、踝關節、膝關節、肩關節、腕關節及髖關節)。^b 百分比可能由於捨入而總計非為100.0%。^c 受試者之平均年齡為39.9歲。出血率　　[0296] 對於成人/青少年及12歲或更年幼的兒童而言，以rFVIIIFc預防之中值(IQR)研究中總體ABR低於研究前預防之出血率(圖1A-1D)。兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗藉由患者年齡經進一步分層，且中值研究前及研究中ABR顯示於圖1E及1F中。研究前，小於6歲的患者具有比6歲至＜12歲的患者低的中值(IQR)ABR(圖1E)。研究中，小於6歲的患者具有比6歲至＜12歲的患者高的總體研究中ABR、總體目標關節ABR及目標關節自發性ABR(圖1F)。　　[0297] 在rFVIIIFc關鍵3期試驗中，46.3%個別化預防、40.7%每週預防及21.4%經修改預防受試者不具有目標關節出血事件，然而兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗中53.8%個別化預防受試者不具有目標關節出血事件。臨床目標關節解決　　[0298] 在進行預防的在基線及12個月追蹤時具有目標關節的受試者中，100%(93/93)rFVIIIFc關鍵3期試驗及100%(7/7)兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗受試者有≥1個目標關節經解決(亦即，在連續12個月期間≤2個自發性出血事件)；且rFVIIIFc關鍵3期試驗及兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗受試者中分別98.3%(231/235)及100%(9/9)目標關節(基於所有出血)經解決。預防性因子消耗 [0299] 基線時具有目標關節的rFVIIIFc關鍵3期試驗(n=105)及兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗(n=13)預防受試者中之中值(IQR)每週預防性因子消耗分別為76.0 (68.0-90.9) IU/kg及83.5 (79.9-111.6) IU/kg。　　[0300] 親代研究中在rFVIIIFc關鍵3期試驗/兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗之前及rFVIIIFc關鍵3期試驗/兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗及rFVIIIFc延伸研究期間進行預防且具有可供使用的研究前及研究中給藥資料的受試者(rFVIIIFc關鍵3期試驗，n=79, 75.0 [70.0-113.8] IU/kg；兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗，n=54, 95.0 [75.0-113.0] IU/kg)之消耗類似。　　[0301] 對於兩個患者群體，在基線時具有目標關節的預防受試者(rFVIIIFc關鍵3期試驗，n=105, 3.8 [3.5-5.6]日；兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗，n=13, 3.5 [3.5-3.5]日)與親代研究中具有可供使用之研究前及研究中給藥資料的預防受試者(rFVIIIFc關鍵3期試驗，n=79, 3.5 [3.0-5.0]日；兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗，n=54, 3.5 [3.5-3.5]日)之間中值(IQR)給藥間隔亦類似。　　[0302] 兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗資料藉由患者年齡經進一步分層。小於6歲的受試者之平均每週消耗係在給藥間隔3.5 (3.5-3.5)日下89.6 (75.3-97.5；n=6) IU/kg。對於6歲至小於12歲的患者，平均每週消耗為在給藥間隔3.5 (3.0-3.6)日下82.2 (79.4-113.2) IU/kg。生活品質　　[0303] 相較於rFVIIIFc關鍵3期試驗基線，成人/青少年(n=48)中在rFVIIIFc延伸研究第2年時，QOL改良18%(表3)。在兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗基線及rFVIIIFc延伸研究第1年自己報導CHO-KLAT計分的兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗受試者(n=6)中，平均(標準偏差[SD])基線計分為85.5 (12.1)；在rFVIIIFc延伸研究第1年，CHO-KLAT計分改良28%(平均[SD]改良為24.1 [15.3])。表 3 ：基線時具有目標關節的受試者之Haem-A-QOL分析

NS，不顯著^a Haem-A-QOL計分範圍為0至100，其中較高計分表示QOL中各子計分及總計分之較高損害。^b 基於雙尾成對t檢驗。^c 可評估48名患者之除運動及休閒(n=33)、計劃生育(n=30)、伴侶及性欲(n=45)以及工作及學習(n=44)之外的所有結果。結論　　[0304] 3期rFVIIIFc關鍵3期試驗及兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗研究及正在進行的rFVIIIFc延伸研究之功效資料顯示在進行長期rFVIIIFc預防的具有重度A型血友病之小兒、青少年及成人受試者中有持續低的目標關節年度化出血率(ABR)及有效的目標關節解決。此分析中基線時具有目標關節之受試者之每週預防性因子消耗與先前公開之rFVIIIFc關鍵3期試驗及兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗研究之總體群體中之消耗一致。在以rFVIIIFc預防之目標關節解決的受試者中看到生活品質改良(QOL)，而預防性因子消耗或給藥間隔無變化。實例 2 具有重度 A 型血友病之受試者中以重組因子 VIII Fc 融合蛋白 (rFVIIIFc) 預防之縱向經修改血友病關節健康計分 (mHJHS) 結果 [0305] 血友病性關節病在血友病之管理方面仍有挑戰(Knobe等人,J Comorbidity . 2011;1(1):51-59；Simpson 等人,Expert Rev Hematol . 2012;5(4):459-68)。血友病關節健康計分(HJHS)係可用於偵測血友病性關節病之發展的第一線工具(Oymak等人J Pediatr Hematol Oncol. 2015; 37(2):e80-5)。肌肉骨骼結果之改良係預防治療A型血友病之重要量度(Blanchette等人血友病 . 2004;10 (增刊S4):97-104)。分別完成rFVIIIFc關鍵3期試驗(Mahlangu等人Blood . 2014;123(3):317-325)及兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗研究(Young等人J Thromb Haemost . 2015;13(6):967-977)之成人/青少年及兒童中rFVIIIFc之長期安全性及功效已使用正在進行的rFVIIIFc延伸研究之中期資料經確立(Nolan等人血友病 . 2016;22(1):72-80)。確定rFVIIIFc對肌肉骨骼結果之長期影響將需要進一步研究。　　[0306] 此研究之目標係使用經修改血友病關節健康計分(mHJHS)報導rFVIIIFc關鍵3期試驗及rFVIIIFc延伸研究之縱向關節健康資料。研究參與者及設計　　[0307] 分析群體包括完成rFVIIIFc關鍵3期試驗且招募於rFVIIIFc延伸研究中達2年的成人/青少年(≥12歲)。患者可已進行研究前預防或發病期治療。關節健康係使用mHJHS在rFVIIIFc關鍵3期試驗篩檢(方案修正之後)及基線時經評定，然後其後每年經評定用於rFVIIIFc延伸研究。　　[0308] mHJHS與標準HJHS 2.1版之不同之處在於，相較於標準HJHS(範圍，0-124)，關節疼痛及步態之反應選擇被壓縮成較少類別，增加了不穩定性評定，且總計分較小(範圍，0-116；0指示正常關節功能，116指示重度疾病)(參見表4)。排除在2週內出血之後的計分。最後觀察值推估(last observation carry forward)輸入經歷手術介入的關節之計分。為了評估逐年變化，事後分析中包括在4個時間點(rFVIIIFc 關鍵3期試驗基線、rFVIIIFc延伸研究基線、rFVIIIFc延伸研究第1年及延伸研究第2年)具有mHJHS資料的rFVIIIFc延伸研究受試者。使用描述統計學概述從rFVIIIFc關鍵3期試驗基線至rFVIIIFc延伸研究第2年的mHJHS計分變化(負值指示改良)。針對以下概述從rFVIIIFc關鍵3期試驗基線至追蹤訪視的mHJHS計分變化：(1)總計分(範圍，0-116；藉由研究前方案(預防期對發病期)；初始mHJHS藉由功能損害之嚴重性；且藉由基線時目標關節之存在；(2)目標關節(範圍，0-19：單一目標關節之所有問題之總和)；(3)承重(例如，踝及膝)及非承重(例如，肘)關節(範圍，0-38：單一位置右及左關節之總和)；及(4)個別分量(活動範圍(範圍，0-36；所有關節之問題「伸展喪失[踝背屈]」及「屈曲喪失[踝蹠屈]」之組合)；腫脹(範圍，0-24：所有關節之問題「腫脹」及「腫脹持續時間」之組合)；及強度(範圍，0-6：所有關節之總和))。表 4 -HJHS 與 mHJHS 之間的差異

^a 0 =正常關節功能；116 =重度疾病　　[0309] rFVIIIFc關鍵3期試驗基線與rFVIIIFc延伸研究第2年之間的差異係使用成對t檢驗分析。因為此分析是專設的，所以p 值未用於推斷統計學顯著性。對於亞群分析，僅提供描述統計學。結果基線特徵　　[0310] 在此分析中包括之完成者(completer)群體(n=47)與在rFVIIIFc關鍵3期試驗基線時收集mHJHS並招募於rFVIIIFc延伸研究中的患者群體(n=74)之間，基線特徵係類似的(表5)。表 5 ：基線特徵

^a 招募於rFVIIIFc關鍵3期試驗中進行rFVIIIFc預防的74名受試者具有mHJHS計分，且隨後進入rFVIIIFc延伸研究。^b 47名進行預防的患者在rFVIIIFc延伸研究中達到第2年，資料可在rFVIIIFc關鍵3期試驗基線、rFVIIIFc延伸研究基線及第1年與第2年供使用。縱向關節健康　　[0311] 從rFVIIIFc關鍵3期試驗基線至rFVIIIFc延伸研究第2年觀察到mHJHS計分之連續改良，其中總計分之平均降低為從23.4至19.3(圖2A)。在七十四名受試者中，二十四名受試者在延伸研究第3年經評估，且在延伸研究第3年看到mHJHS計分之此等改良，不管rFVIIIFc關鍵3期試驗基線時目標關節之存在(圖2B)。平均追蹤持續時間為2.8 (2.5-3.3)年。觀察到連續改良，不管患者之研究前治療(圖3)或rFVIIIFc關鍵3期試驗基線時目標關節之存在(圖4)。在延伸研究第3年評估之彼等患者中，以所有時間點之資料的成人/青少年之平均mHJHS總計分在基線時為25.0(平均之標準誤差[SEM]，2.9)。從基線之平均(SEM)變化在延伸研究基線時為-2.0 (1.2)，在延伸研究第1年為-3.8 (1.5)，在延伸研究第2年為-4.5 (1.6)，且在延伸研究第3年為-5.1 (1.5)(圖3B)。從基線至延伸研究第3年之變為係統計學顯著的(P＜0.002)。兒童rFVIIIFc關鍵3期試驗分析群體(n=24)亦顯示從基線至延伸研究第2年之統計學顯著的平均(SEM)改良(-1.2 [0.56]；P＜0.05)(圖3C)。rFVIIIFc關鍵3期試驗基線時mHJHS計分中具有最高四分位數損害的受試者顯示從基線至rFVIIIFc延伸研究第2年mHJHS總積分制最大改良(圖5)。從rFVIIIFc關鍵3期試驗基線至rFVIIIFc延伸研究第2年觀察到mHJHS目標關節計分之連續改良，其中改良為從基線時平均7.0至rFVIIIFc延伸研究第2年時平均5.3(圖6)。從rFVIIIFc關鍵3期試驗基線至rFVIIIFc延伸研究第2年，承重關節之mHJHS關節計分從平均8.0減小至平均6.8，且非承重關節之mHJHS關節計分從平均6.7減小至平均4.8(圖7)。對於承重(踝關節及膝關節)及非承重關節(肘關節)計分之計算，計分首先推導為一對右及左關節(踝關節、膝關節或肘關節)之每個關節計分之和。然後承重關節計算為踝關節及膝關節之計分之平均值，且非承重關節計分與肘關節之計分相同。此外，從rFVIIIFc關鍵3期試驗基線至rFVIIIFc延伸研究第2年亦觀察到腫脹、活動範圍及強度之具體改良，其表示mHJHS總計分中最重要的因素發生變化(圖8)。　　[0312] 在第3年承重及非承重關節均觀察到從rFVIIIFc關鍵3期試驗基線之統計學顯著的平均改良(分別為-1.1 [SEM, 0.5; P=0.036]及-3.0 [SEM, 0.8; P=0.001])。mHJHS之顯示從基線至第3年≥20%降低的個別分量為腫脹(-47%)、肌肉萎縮(-26%)、撚發聲(-20%)(所有3個分量均P＜0.05)及關節不穩定性(-89%)、關節疼痛(-31%)及強度(-26%)(圖9)。實例 3 具有 B 型血友病之成人及青少年中以 rFIXFc 預防的目標關節結果 [0313] 在具有重度B型血友病之患者中，反復出血至關節中而無充分治療可引起致殘性(crippling)慢性關節疾病、疼痛及生活品質降低(Djambas Khayat,J Blood Med. 7 :275-82 (2016))。以重組因子IX Fc融合蛋白(rFIXFc)之預防性治療導致具有重度B型血友病之青少年及成人中較低的年度化出血率(ABR)及較少的自發性/創傷性出血事件(Kavakli等人,Haemophilia 22(3) :381-88 (2016)；Powell等人N Engl J Med. 369(24) :2313-23 (2013)；Powell等人,Br J Haematol. 168(1) :124-34 (2015)；Powell等人,Br J Haematol. 168(1) :113-23 2015))。除預防關節損傷及減少出血事件之外，以習知及長效rFIX之預防性治療可導致較少缺工或缺課時間、較少住院、較不頻繁監測及生活品質改良(Kavakli等人,Haemophilia 22(3) :381-88 (2016)；Wyrwich等人,Haemophilia 22(6) :866-72 (2016))。生命早期起始的預防性治療減少出血並預防關節損傷。當生命後期起始時，一旦發生關節損傷，預防性治療仍可顯著減少出血數，包括向關節中的出血(Fischer等人,Haemophilia20(Suppl 4) :106-13 (2014))。完成rFIXFc關鍵3期試驗(NCT01027364)之具有重度B型血友病之成人/青少年可招募於長期延伸研究(NCT01425723；Pasi等人,Thromb Haemost. 117(3) :508-18 (2017))，該研究評估rFIXFc值安全性及功效。此處報導在整個長期延伸研究中在進入rFIXFc關鍵3期試驗時具有目標關節的受試者之縱向結果。　　[0314] 此研究之目標係呈現至延伸研究之第二中期資料截止為止(2015年9月11日)進入時具有目標關節之受試者之rFIXFc關鍵3期試驗縱向資料結果。方法研究設計及群體　　[0315] 完成rFIXFc關鍵3期試驗之具有重度B型血友病(≤2 IU/dL內源FIX)之受試者招募於延伸研究之以下4個治療組中之1個治療組：(1)每週預防(WP；20-100 IU/kg每7日)；(2)個別化間隔預防(IP；100 IU/kg每8-16日)；(3)經修改預防(MP；研究者可對以IP或WP未達成最佳給藥的受試者進行個人化)；及(4)發病期治療(ET；基於出血事件之類型及嚴重性按需給藥)。受試者可在招募於延伸研究及研究期間任何時間切換其治療組。切換治療組之受試者包括於各治療組之分析中達該治療方案花費的時期，所以個別受試者可在分析中多於1個治療組中經計數。對在關鍵3期試驗進入時具有≥1個目標關節(在3個月時期中具有≥3個出血事件的主要關節)之受試者進行評估。結果測量及統計分析　　[0316] 在rFIXFc關鍵3期試驗之累積持續時間內至第二B-YOND中期資料截止為止(2015年9月11日)對結果進行分析。執行目標關節解決之分析。目標關節解決定義為在連續12個月時期內目標關節中≤2次自發性出血(Blanchette等人,J Thromb Haemost. 12(11) :1935-39 (2014))。結果　　[0317] 具有目標關節之受試者之基線特徵顯示於表6。在具有研究中資料之117名rFIXFc關鍵3期試驗受試者中，六十名受試者在基線時具有總計166個目標關節。這些受試者接受rFIXFc達3.4(1.4-4.2)年之累積中值(四分位數間距[IQR])持續時間。表 6 ：基線特徵。

所有資料為n (%)。rFIXFc，重組因子IX Fc融合蛋白。包括在進入B-LONG時具有≥1個目標關節且具有功效期(定義為根據研究之治療方案以rFIXFc治療受試者的所有時間間隔之和，排除手術康復期)之受試者；目標關節定義為其中發生反復出血(頻率為在連續3個月時期中至同一關節中≥3個出血事件)的主要關節(例如，膝關節、踝關節、肘關節、髖關節、肩關節及腕關節)。預防性給藥　　[0318] 平均每週給藥及給藥間隔概述於表7。表 7 ：平均rFIXFc預防性給藥及給藥間隔之概述

所有資料均為中值(IQR)。IP，個別化間隔預防；MP，經修改預防；rFIXFc，重組因子IX Fc融合蛋白；WP，每週預防。僅具有可供使用之研究中劑量及給藥間隔資料的受試者包括於此分析中。受試者包括於其所參與之達方案之持續時間的各治療方案中，且因此可出現於多於一個治療方案中。出血率　　[0319] 研究前及研究中出血資料分別顯示於圖10A及10B中。接受rFIXFc預防、在研究中不具有目標關節再出血的受試者係如下：WP：40名中由15名(37.5%)；IP：12名中有1名(8.3%)；MP：12名中有4名(33.3%)；ET：14名中有0名(0%)。在基線時具有目標關節的受試者中，以rFIXFc預防之研究中總體積目標關節ABR低於以研究前治療之出血率(圖10A及10B)。

目標關節解決　　[0320] 總而言之，100%(93/93)目標關節(37名受試者中)經解決，如指示十二個月時期內兩次或更少自發性出血(圖11)。結論　　[0321] 在具有重度B型血友病之成人/青少年中，長期rFIXFc預防導致100%在基線時具有可評估目標關節之受試者中目標關節解決且導致跨所有治療組之低目標關節ABR。當設計治療預防計劃時，臨床醫師應考慮到具有目標關節之患者以rFIXFc達成之顯著改良的長期結果。實例 4 藉由體內單光子發射斷層攝影術 (SPECT) 之 ¹²⁵ I 標記之 FIXFc 、 FIX 及糖聚乙二醇化 FIX 在 HemB 小鼠中之生物分佈 [0322] 藉由體內單光子發射斷層攝影術(SPECT)進行體內小鼠研究以評估給藥後多個時間點FIX蛋白之生物分佈。FIX蛋白係使用¹²⁵ I標記之SIB連接子在離胺酸殘基處經標記。藉由單一治療相關劑量將經標記之FIX蛋白投與至7-12月齡HemB小鼠。¹²⁵ I-SIB-FIX係呈單一劑量1 mg/kg投與(n=3)；¹²⁵ I-SIB-FIXFc係呈單一劑量2 mg/kg投與(n=3)，且¹²⁵ I-SIB-FIX-PEG係呈單一劑量1 mg/kg投與(n=3)。　　[0323] 在0.5 hr、2.5 hr、20 hr、48 hr、92 hr、120 hr、168 hr及/或216 hr對經標記之FIX蛋白之定位進行成像(圖10A-10C)。使用感興趣區域(ROI)安置分析關節區域(例如，右/左膝關節及右/左肩關節)、心臟(左心室)及肝之具體定位。左心室及肝ROI係安置在正確器官內的固定體積目標。膝關節ROI係藉由從距股骨往下近似一半至脛骨/腓骨往下一半安置圍繞骨之圓筒來定義。肩關節ROI係藉由在肩部中心處安置均勻的球形，然後對該球形內的骨取閾值，繼之以ROI之膨脹(dilation)來定義。　　[0324] 發現經標記之FIXFc在給藥後30分鐘(圖12D)及2.5 hr(圖12E)分佈至圍繞關節之區域，其持續達給藥後48-216 hr(圖12F-12G)，分別表示半衰期及五倍半衰期。膝關節(圖13A)及肩關節(圖13B)之FIXFc定位比FIX及糖聚乙二醇化FIX至相同關節區域之定位更明顯。　　[0325] 在向HemB小鼠投與之後，相較於未標記FIX蛋白，¹²⁵ I-SIB標記不影響經標記之FIX蛋白之FIX活性(圖14A)，且標記亦不影響FIX蛋白之藥物動力學性質(圖14B)。實例 5 基線關節評定 基線關節評定　　[0326] 六個關節(左踝-LA、右踝-RA、左肘-LE、右肘-RE、左膝-LK、右膝-RK)將根據以下標準以0至19之標度進行計分：腫脹、持續時間、肌肉萎縮、撚發聲、屈曲喪失、伸展喪失、不穩定性、關節疼痛及強度。步態將基於走路及走樓梯以0至2之標度進行計分。總計分為所有6個關節之計分加步態計分之和(範圍為0-116，其中0為正常，且116為最重度疾病)。篩檢訪視　　[0327] 篩檢時將對人體各側之肘關節、膝關節及踝關節之關節疾病進行評估。關節功能應在不存在主動性出血時間之情況下評估。關節計分為零反映正常狀態。計分細節　　[0328] 1. 根據這些類別及標度對6個關節(LA、RA、LE、RE、LK、RK)單獨進行關節計分(範圍對於各關節而言係0-19且對於所有六個關節而言係0-114)：腫脹(0=無；1=輕度；2=中度；3=重度)；腫脹持續時間(0=無腫脹或≤6個月；1= ＞6個月)；肌肉萎縮(0=無；1=輕度；2=重度)；活動時撚發聲(0=不存在；1=存在)；屈曲喪失，包括踝蹠屈喪失(0=無；1=輕度；2=中度；3=重度)；伸展喪失，包括踝背屈喪失(0=無；1=輕度；2=中度；3=重度)；不穩定性(0=無；1=顯著病理性關節鬆弛)；關節疼痛(0=不疼痛，貫穿活動範圍或活動範圍端部；1=存在)；強度(0=正常(抵抗重力及最大抵抗力保持位置)；1=最小下降(抵抗重力及中等抵抗力而不是最大抵抗力保持位置)；2=輕度下降(抵抗重力或最小抵抗力保持位置)；3=中度下降(消除中立時能夠移動關節)；4=重度下降(痕量或無肌肉收縮)。對於在膝關節及肘關節計分屈曲喪失及伸展喪失，以下適用：無=近似0-5度；輕度=近似5-10度；中度=近似11-20度；及重度=近似＞20度。　　[0329] 2. 步態將計分一次(範圍係0-2)，其中0=走路或走上/下樓梯不困難；1=走路不困難，但走樓梯困難；及2=走路及走樓梯均困難。　　[0330] 此經修改血友病關節健康計分(HJHS)係基於具有血友病之男孩中關節計分可靠性研究中使用之計分系統(Hilliard, Funk等人,Haemophilia 12(5) :518-525 (2006)，其以全文引用之方式併入本文)。其已用作在20名4-17歲男孩之群組中評估肌肉骨骼結果之工具(Saulyte Trakymiene, Ingerslev等人,Haemophilia 16(3) :479-486 (2010)，其以全文引用之方式併入本文)。為了使計分系統適於成人血友病群體且根據國際血友病預防研究小組之最近驗證研究中之注解(Feldman, Funk等人, Arthritis Care Res (Hoboken), 2010，其以全文引用之方式併入本文)進行修改。實例 6 [0331] 在A型血友病中以因子之替代療法之主要併發症係在約30%具有重度A型血友病之患者中抑制劑(其中和抗因子VIII抗體)之形成。抑制劑發展影響治療功效以及受影響之個體之生活品質。血友病研究正努力進一步理解免疫系統如何對重組因子III(rFVIII)起反應以有效根除抑制劑。延長半衰期rFVIII Fc融合蛋白(rFVIIIFc)係預防並控制出血事件的有效且經良好耐受的療法。此分子中之Fc區不僅負責增加rFVIII半衰期，還可促進抗原特異性耐受性，如臨床前動物模型中所示(Krishnamoorthy S, 等人,Cell Immunol.301 :30-39 (2016))及如免疫耐受性誘導病例報道所表明(Groomes CL, 等人,Pediatr Blood Cancer 63(5) :922-24 (2016)；Malec LM, 等人,Haemophilia 22(6) :e552-e554 (2016)；Ragni MV, 等人,Haemophilia 22(5) :e462-e464 (2016))。方法　　[0332] 外周血來源之人類APC或THP-1單核細胞用於研究rFVIIIFc對FcγR結合、內化、信號傳導及細胞介素產生之影響、及基因表現變化、以及隨後體外在T細胞上的相互作用及影響(圖16)。結果　　[0333] FcγR之細胞表面表現減小指示在rFVIIIFc處理時發生內化(圖17A-17C)。將單核球來源之巨噬細胞及樹狀細胞以等莫耳濃度(200 nM)經山葵過氧化酶免疫複合物(HRP-IC)(作為陽性對照)、人類免疫球蛋白G1(IgG1)(作為陰性對照)、及重組因子VIII(rFVIII)或rFVIII Fc融合蛋白(rFVIIIFc)處理達24小時。Fcγ受體(FcγR)CD16(圖17A)、CD32(圖17B)及CD64(圖17C)之細胞表面表現係藉由流動式細胞測量術測量(n=3；**P≤0.01，***P≤0.005，其他處理之HRP-IC之顯著性未示出)。相較於以rFVIII處理之後的表面表現，以rFVIIIFc處理與CD16(圖17A)、CD32(圖17B)及CD64(圖17C)之細胞表面表現減小相關。　　[0334] rFVIIIFc接合FcγR且誘導單核球及巨噬細胞之信號傳導，而隨後無促炎性細胞介素產生(圖18A-18C)。將THP-1單核細胞株、單核球、外周血單核球來源之巨噬細胞及外周血單核球來源之樹狀細胞經HRP-IC、IgG1、rFVIII或rFVIIIFc處理15分鐘(圖18A)。使用MSD平台測量細胞溶解產物中之Syk磷酸化(n=3-7，*P≤0.05)。在以rFVIIIFc(WT)、以突變rFVIIIFc(其不能結合至新生兒Fc受體(FcRn突變體))或以突變rFVIIIFc(其不能結合至FcγR(FcγR突變體))處理巨噬細胞之後測量Syk磷酸化(n=4，*P≤0.05)(圖18B)。藉由MSD ELISA測量經二十四小時處理之巨噬細胞之促炎性細胞介素產生(n=4，顯著性未示出)(圖18C)。　　[0335] rFVIIIFc磷酸化參與免疫調控之分子，而非在活化及促炎性細胞介素產生中起作用的分子(表9及圖19)。使用Proteome Profiler磷酸激酶及磷酸免疫受體陣列研究經rFVIIIFc處理十五分鐘的單核球來源之巨噬細胞之溶解產物中之磷酸化蛋白。藉由Proteome Profiler分析識別之rFVIIIFc處理之巨噬細胞中磷酸化分子之清單顯示於表9中。使用MSD平台測量負責抑制信號傳導之磷酸酶之磷酸化(n=3；**P≤0.01，***P≤0.005)(圖19)。表 9 ：藉由Proteome Profiler分析識別之rFVIIIFc處理之巨噬細胞中磷酸化分子。

[0336] rFVIIIFc誘導致耐受性巨噬細胞之基因表現模式特徵(圖20A-20G)。對經IgG1、rFVIII或rFVIIIFc處理六小時的單核球來源之巨噬細胞(n=3)執行顯著下調的基因(圖20A)及顯著上調的基因(圖20B)之探索性RNA定序，且對rFVIIIFc上調之基因進行途徑分析以研究這些細胞中選擇性表示之分子途徑，與rFVIII處理之細胞進行比較(表9)。發現NRF2及PPAR-γ途徑之各種基因以及各種其他免疫調控劑為上調(圖20H)。藉由Q-PCR驗證NRF2及脂質代謝途徑之經選擇基因(n=8；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.005)(圖20C-20G)。此外，發現rFVIIIFc處理之巨噬細胞展現特徵性類M2表現型(圖20I-20M)。具體而言，經rFVIIIFc處理之巨噬細胞具有比6小時(圖20I)之後及24小時(圖20J)之後經rFVIII處理之細胞高的相對CD206表現，且經rFVIIIFc處理之巨噬細胞具有比24小時之後經rFVIII處理之細胞高的相對ARG1表現(圖20M)。表 9 ：對rFVIIIFc上調之基因進行途徑分析以研究這些細胞中選擇性表示之分子途徑，與rFVIII處理之細胞進行比較。

[0337] 呈現rFVIIIFc處理之抗原的細胞影響需要APC-T細胞-細胞接觸的調控T細胞分化(圖21A-21C)。將外周血單核球來源之巨噬細胞經IgG1、rFVIII或rFVIIIFc處理，然後與自相同施體之外周血分離之純真(naïve)CD4陽性T細胞進行共培養。在共培養六日之後(圖21A)，使用流動式細胞測量術定量調控T細胞(CD4+ CD25+ FoxP3+)之百分比(n=4)(圖21B)。當將純真T細胞於經IgG1、rFVIII或rFVIIIFc預處理之APC之條件培養基中培養時亦定量調控T細胞之百分比(n=4)(圖21C)。結論　　[0338] rFVIIIFc似乎透過APC上之Fcγ受體結合並誘導內化及信號傳導。此信號傳導不轉譯成促炎性細胞介素產生且不活化APC(資料未示出)。免疫調節信號傳導事件在rFVIIIFc處理時起始。這些事件似乎驅使巨噬細胞朝向類M2表現型的分化，其特徵在於NRF2及PPARγ途徑(圖20H)之上調以及CD206及精胺酸酶1分子之上調。各種其他免疫調控劑亦顯示表現增加，同時至少尿苷酸環化酶1可溶性次單位β(2GUCY1B2)、原紫質氧化酶(PPOX)及細胞介素信號傳導之抑制劑3(SOCS3)顯示rFVIIIFc處理之細胞中之表現減小(圖20H)。這些巨噬細胞可執行先前報導之有益的免疫學效應，諸如調控T細胞分化、FVIII免疫耐受作用及抗FVIII抑制劑減少(圖22及23)。實例 7 [0339] 因子IX(FIX)之藥物動力學(PK)概況與二區室模型一致，其中FIX主要分佈至血漿區室外之空間(血管外空間)。吾等先前已使用SPECT成像顯示，B型血友病小鼠中rFIXFc及rFIX生物分佈概況與FIX可分佈至血漿區室外的組織，而糖聚乙二醇化rFIX由於PEG部分所施加之修飾而大部分維持在血漿區室中的假設一致。在此研究中，吾等評估了非人類靈長類動物(NHP)中rFIX及rFIXFc之分佈。　　[0340] rFIXFc及rFIX係使用124I-SIB(琥珀醯亞胺基碘代苯甲酸酯)在離胺酸殘基處經標記。食蟹獼猴接受約2 mCi痕量劑量124I-SIB-rFIXFc(2 mg/kg)或124I-SIB-rFIX(1 mg/kg)之單一IV推注注射。重建全身PET/CT掃描用於得到最大強度投射(maximum-intensity projection，MIP)影像，且確定感興趣區域(ROI)分析之體內生物分佈。　　[0341] NHP中PET成像顯示124I-SIB-rFIXFc及124I-SIB-rFIX在血池、心臟、肝及腎中之早期分佈。在稍後時間點，rFIXFc及rFIX均顯示至肩關節以及其他骨關節(腕關節、踝關節及顎關節)之分佈，其中rFIXFc顯示至此等區域之顯著較高的分佈，即使在FIX血漿水準低於偵測水準的時間點亦如此。體內及離體資料顯示rFIXFc及rFIX之血池清除。TCA沉澱資料顯示＞95%放射性與FIX相關聯。　　[0342] NHP之rFIXFc及rFIX生物分佈概況類似於在B型血友病小鼠中觀察之概況，且與FIX可分佈至血漿區室外的組織之假設一致。rFIXFc至關節區域之比rFIX顯著較高的分佈可藉由Fc介導之機制或改良PK反映出在這些組織處的保留。儘管血管外分佈在預防出血及總體保護關節健康方面之作用仍為研究領域，但此研究與小鼠中顯示FIX變異體之生物分佈差異的觀察一致，表明跨FIX變異體血漿水準可能不是可比的(或具有相同含義)。　　[0343] 具體實施例之前文描述將充分地揭露本發明之一般性質，以使得其他人藉由應用此項技術中之知識，在無不當實驗且不背離本發明之一般範疇的情況下，可輕易地針對各種應用對此等具體實施例進行修改及/或改變。因此，基於本文呈現之教示及指導，此等改變及修改意欲在所揭示實施例之等效物的含義及範圍內。應瞭解，本文之措辭或術語係出於描述而非限制之目的，以使得本說明書之術語或措辭應由熟習此項技術者根據教示及指導進行解釋。　　[0344] 自本文所揭示的本發明之說明書及實踐的考慮，本發明之其他實施例對熟習此項技術者而言將為顯而易見的。意欲將說明書及實例視為僅具示範性，且本發明之真實範疇及精神藉由以下申請專利範圍指示。　　[0345] 本文中揭示之所有出版物、專利及專利申請案均以引用之方式併入本文中，其引用程度就如同具體且個別地指示各個別出版物、專利或專利申請案以引用之方式併入本文中一般。

[0071] 圖1A-1F顯示FVIII-Fc研究(圖1A及1B)及基線時具有目標關節之兒童之FVIII-Fc研究(圖1C-1F)之受試者之研究前(圖1A、1C及1E)及研究中中值(圖1B、1D及1F)(IQR)年度化出血率(ABR)。圖1C-1D顯示兒童之FVIII-Fc研究之組合資料，而圖1E-1F顯示基於受試者之年齡分層(小於6歲及在6歲與小於12歲之間)之相同資料。　　[0072] 圖2A-2B顯示從FVIII-Fc研究基線至延伸研究第2年(圖2A；x軸)及至延伸研究第3年(圖2B；x軸)之總計經修改血友病關節健康計分(mHJHS；y軸)中之平均變化。圖2B將基線時存在(是；三角形)及不存在(否；圓形)目標關節區別開。　　[0073] 圖3A-3C顯示針對接受研究前預防性治療之受試者及接受研究前發病期(按需)治療之受試者的從FVIII-Fc研究基線至延伸研究第2年(圖3A；x軸)及延伸研究第3年(圖3B)以及從兒童之FVIII-Fc研究至延伸第2年(圖3C；x軸)之總mHJHS(y軸)之平均變化。　　[0074] 圖4顯示針對FVIII-Fc研究基線時具有目標關節之受試者(方形)及FVIII-Fc研究基線時不具有目標關節之受試者(菱形)的從FVIII-Fc研究基線至第2年(x軸)之總mHJHS(y軸)之平均變化。　　[0075] 圖5顯示針對以下受試者的從FVIII-Fc研究基線至第2年(x軸)之總mHJHS(y軸)之平均變化：FVIII-Fc研究基線時mHJHS計分之損害之四分位數最低(Q1；≥1-10)(菱形)，FVIII-Fc研究基線時mHJHS計分之損害之四分位數第二低(Q2；≥10-22)(方形)；FVIII-Fc研究基線時mHJHS計分之損害之四分位數第二高(Q3；≥22-34)(三角形)，及FVIII-Fc研究基線時mHJHS計分之損害之四分位數最高(Q4；≥34-37)(菱形)。　　[0076] 圖6顯示針對FVIII-Fc研究基線時具有目標關節之受試者的從FVIII-Fc研究基線至第2年(x軸)之總mHJHS(y軸)之平均變化。　　[0077] 圖7顯示針對承重關節(菱形)及非承重目標關節(方形)的從FVIII-Fc研究基線至第2年(x軸)之總mHJHS(y軸)之平均變化。　　[0078] 圖8顯示針對腫脹(菱形)、活動範圍(方形)及強度(三角形)的從FVIII-Fc研究基線至第2年(x軸)之mHJHS(y軸)之平均變化。　　[0079] 圖9顯示針對關節不穩定性(深灰色方形)、腫脹(黑色三角形)、肌肉萎縮(淺灰色方形)、關節疼痛(淺灰色菱形)、撚發聲(黑色方形)及強度(淺灰色圓形)的FVIII-Fc研究患者之mHJHS(y軸)之平均(SEM)變化。顯示了各mHJHS測量值之總基線(BL)計分。　　[0080] 圖10A-10B顯示rFIXFc研究之受試者之研究前(圖10A)及研究中中值(圖10B)(IQR)年度化出血率(ABR)。圖10B進一步顯示總體研究中ABR(深色圓形)、總體目標關節ABR(灰色菱形)及目標關節自發性ABR(灰色三角形)。WP=每週預防；IP=個別化間隔預防；及MP=經修改預防(圖10A-10B)。　　[0081] 圖11係顯示在至少十二個月的連續追蹤時間之情況下自開始追蹤起在十二個月內尚未經歷關節手術的彼等受試者(n=37)中經解決及未解決之可評估目標關節(踝關節、膝關節、肘關節、髖關節、腕關節及肩關節)之數目的圖形表示。各目標關節之數目(n)疊加在相關資料上，其中總計93個目標關節經評估。經解決(100%)及未解決(0%)之目標關節之百分比顯示於x軸下方。　　[0082] 圖12A-12C係投與¹²⁵ I-SIB標記之FIX(圖12A)、¹²⁵ I-SIB標記之FIXFc(圖12B)或¹²⁵ I-SIB標記之糖聚乙二醇化FIX(圖12C)之小鼠之單光子發射斷層攝影術(SPECT)影像。圖12D-12G顯示在各種時間點投與¹²⁵ I-SIB標記之FIX、¹²⁵ I-SIB標記之FIXFc或¹²⁵ I-SIB標記之糖聚乙二醇化FIX之小鼠之直接比較。熱圖指示各小鼠中¹²⁵ I-SIB標記之相對濃度(%ID/g)(圖12A-12G)。　　[0083] 圖13A-13B為繪示膝關節(圖13A)及肩關節(圖13B)中隨時間推移投與¹²⁵ I-SIB標記之FIX、¹²⁵ I-SIB標記之FIXFc或¹²⁵ I-SIB標記之糖聚乙二醇化FIX之後，圖12A-12G中所示之小鼠中¹²⁵ I-SIB標記定位之強度的圖。收集右及左膝以及右及左肩之資料，將其組合以得到所示之資料(分別為圖13A及13B)。　　[0084] 圖14A係繪示相較於未標記FIX及FIXFc且如藉由顯色分析或單級分析所測量，經標記FIX及經標記FIXFc之相對活性的圖。圖14B係繪示HemB小鼠中經標記及未標記FIX分子之藥物動力學的圖。　　[0085] 圖15A-15F係繪示肘關節(屈曲：圖15A；及伸展：圖15B)、膝關節(屈曲：圖15C；及伸展：圖15D)及踝關節(背屈：圖15E；及蹠屈：圖15F)之活動範圍之圖，其中經修改血友病關節健康計分(HJHS)及屈曲/伸展程度疊加。　　[0086] 圖16為流程圖，其概述研究rFVIIIFc對FcγR結合、內化、信號傳導及細胞介素產生之影響、及基因表現變化、以及隨後體外在T細胞上的相互作用及影響所用之方法。　　[0087] 圖17A-17C係在以山葵過氧化酶免疫複合物(HRP-IC；陽性對照)、IgG1、重組FVIII(rFVIII)或rFVIII Fc融合蛋白(rFVIIIFc)處理之後Fcγ受體CD16(圖17A)、CD32(圖17B)及CD64(圖17C)之相對巨噬細胞及樹狀細胞表面表現水準之圖形表示。星號(*)指示顯著性程度(n=3；*=P≤0.05，**=P≤0.01，***=P≤0.005，相較於其他處理的HRP-IC之顯著性未示出)。　　[0088] 圖18A-18C係繪示以rFVIII或rFVIIIFc處理之後相對信號傳導的圖形表示。圖18A顯示如藉由Syk磷酸化所測量，以HRP-IC、IgG1、rFVIII或rFVIIIFc處理15分鐘之THP-1單核細胞株(「THP-1」)、單核球、外周血單核球來源之巨噬細胞(「巨噬細胞」)及外周血單核球來源之樹狀細胞中的信號傳導。圖18B顯示以rFVIIIFc(「WT」)、突變rFVIIIFc(其不能結合至新生Fc受體)(「FcRn突變體」)或突變rFVIIIFc(其不能結合至FcγR)(「FcgR突變體」)處理之巨噬細胞中的相對Syk磷酸化。圖18C顯示在以HRP-IC、IgG1、rFVIII或rFVIIIFc處理之後二十四小時巨噬細胞中促炎性細胞介素介白素1b(IL-1b)、IL-6、IL-8、IL-10及腫瘤壞死因子α(TNFa)之相對產生。　　[0089] 圖19顯示在以rFVIII或rFVIIIFc處理之後一分鐘、五分鐘及三十分鐘含Src同源區2域之磷酸酶-1 (SHP1)、pSHP2、磷脂醯肌醇-3,4,5-參磷酸5-磷酸酶1 (SHIP1)及pSHIP2之相對磷酸化狀態。星號(*)指示顯著性程度(n=3；**P≤0.01，***P≤0.005)。　　[0090] 圖20A-20M係以rFVIII或rFVIIIFc處理之後致耐受性巨噬細胞之基因表現模式之圖形表示。圖20A-20B係汾恩圖，其繪示以IgG1、rFVIII或rFVIIIFc處理六小時之單核球來源之巨噬細胞(n=3)中顯著下調之基因之分佈(圖20A)及顯著上調之基因之分佈(圖20B)。圖20C-20G係顯示在以rFVIII或rFVIIIFc處理之後，如藉由定量PCR所測量，各種NRF2及脂質代謝途徑基因之相對表現的圖，基因諸如血基質氧化酶1(Hmox1；圖20C)、過氧化體增殖物活化受體γ (proliferator-activated receptor gamma，PPARγ；圖20D)、脂蛋白脂肪酶(LPL；圖20E)、早期生長反應2(EGR2；圖20F)及溶質攜帶物有機陰離子轉運體家族成員4A1(SLCO4A1；圖20G)；處理之後6小時(圖20I)及12小時(圖5J)之CD206；及精胺酸酶1(ARG1；圖20L)。星號(*)指示顯著性程度(n=8；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤ 0.005；圖20C-20G)。圖20K及20M係顯示藉由流動式細胞測量術收集之表現CD206之細胞數的圖。此外，發現rFVIIIFc處理之巨噬細胞展現特徵性類M2表現型(圖20I-20M)。具體而言，經rFVIIIFc處理之巨噬細胞具有比6小時(圖20I)之後及24小時(圖20J)之後經rFVIII處理之細胞高的相對CD206(亦稱為甘露糖受體C型1；MRC1)表現，且經rFVIIIFc處理之巨噬細胞具有比24小時之後經rFVIII處理之細胞高的相對ARG1表現(圖20M)。　　[0091] 圖21A係圖解確定rFVIIIFc處理對T細胞分化之作用所使用之方法的流程圖。圖21B係將巨噬細胞或樹狀細胞以IgG1(對照)、rFVIII或rFVIIIFc處理24小時然後與純真CD4陽性T細胞進行共培養之後六日調控T細胞之百分比的圖形表示。圖21C係將純真CD4陽性T細胞於經IgG1、rFVIII或rFVIIIFc預處理之巨噬細胞或樹狀細胞之條件培養基中培養之後調控T細胞之百分比的圖形表示。　　[0092] 圖22係提出之rFVIIIFc調控T細胞分化機制之圖解。　　[0093] 圖23係提出之rFIXFc對巨噬細胞之作用之圖解。

Claims

一種包含因子VIII(FVIII)及第一Fc區之嵌合蛋白之用途，其用於製備逆轉患有血友病之人類目標關節之血友病性關節病之藥物，其中該人類係12歲或更大年齡。
如申請專利範圍第1項之用途，其中該血友病性關節病包含滑膜炎、微出血或兩者。
一種包含因子VIII(FVIII)及第一Fc區之嵌合蛋白之用途，其用於製備逆轉患有血友病之人類關節之現存的血管重塑之藥物。
如申請專利範圍第3項之用途，其中該嵌合蛋白減少血管生成及關節中微出血之發生。
如申請專利範圍第3項之用途，其中該人類係12歲或更大年齡。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之用途，其中該嵌合蛋白係以20IU/kg至100IU/kg之劑型給藥。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之用途，其中該嵌合蛋白係以25IU/kg至65IU/kg之劑型給藥。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之用途，其中該嵌合蛋白係以50IU/kg至100IU/kg之劑型給藥。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之用途，其中投與改良該人類之關節健康計分。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之用途，其中投與減少該人類之關節疼痛。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之用途，其中該關節係選自由以下所組成之群組：一或兩個肘關節、一或兩個膝關節、一或兩個踝關節、一或兩個肩關節、一或兩個髖關節、一或兩個腕關節、一或兩個手部關節、一或兩個足部關節及其任何組合。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之用途，其中需要該治療之該人類使用選自由以下所組成之群組的成像系統識別：放射線攝影術、磁共振成像、超音波檢查術、能量多普勒音波檢查術、以及其任何組合。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之用途，其中該嵌合蛋白係以以下給藥間隔投與：約兩日、約三日、約四日、或約五日。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之用途，其中該嵌合蛋白係以以下給藥間隔投與：三日至五日。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之用途，其中該嵌合蛋白分佈至血漿區室外以及血漿區室中的組織。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之用途，其中該FVIII包括FVIII之B域全部或部分缺失。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之用途，其中該嵌合蛋白包括第二Fc區，其藉由二硫鍵締合該第一Fc區。