ES2899848T3 - Reducción de la inmunogenicidad contra el factor VIII en individuos sometidos a una terapia con factor VIII - Google Patents

Reducción de la inmunogenicidad contra el factor VIII en individuos sometidos a una terapia con factor VIII Download PDF

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Abstract

Un polipéptido quimérico que comprende factor VIII y un Fc para uso en la inducción de tolerancia inmunitaria al factor VIII en un sujeto humano.

Description

DESCRIPCIÓN
Reducción de la inmunogenicidad contra el factor VIII en individuos sometidos a una terapia con factor VIII
Campo de la Divulgación
La presente divulgación se refiere, en general, al campo de agentes terapéuticos para trastornos hemostáticos.
Antecedentes de la Técnica
La hemofilia A es un trastorno hemorrágico ligado al cromosoma X provocado por mutaciones y/o deleciones en el gen del factor VIII (FVIII) que resulta en una deficiencia de la actividad del FVIII (Peyvandi, F. et al. Haemophilia 1282-89 (2006)). La enfermedad se caracteriza por hemorragia espontánea y sangrado excesivo después de un traumatismo. Con el tiempo, el sangrado repetido en músculos y articulaciones, que a menudo comienza en la primera infancia, resulta en una artropatía hemofílica y en un daño articular irreversible. Este daño es progresivo y puede conducir a movilidad seriamente limitada de las articulaciones, atrofia muscular y dolor crónico ( Rodríguez-Merchan, E.C., Semin. Thromb. Hemost. 29:87-96 (2003), que se incorpora en esta memoria como referencia en su totalidad).
El dominio A2 es necesario para la actividad procoagulante de la molécula de FVIII. Estudios demuestran que el FVIII porcino tiene una actividad procoagulante seis veces mayor que el FVIII humano (Lollar y Parker, J. Biol Chem.
266:12481-12486 (1991)), y que la diferencia en la actividad coagulante entre el FVIII humano y el porcino parece basarse en una diferencia en la secuencia de aminoácidos entre uno o más residuos en los dominios A2 humano y porcino (Lollar, P., et al., J. Biol. Chem. 267:23652-23657 (1992)), que se incorpora en esta memoria como referencia en su totalidad.
El tratamiento de la hemofilia A es mediante terapia de reemplazo que fija como objetivo la restauración de la actividad del FVIII a 1 hasta 5% de los niveles normales para prevenir el sangrado espontáneo (Mannucci, P.M., et al., N. Engl. J. Med. 344:1773-1779 (2001), que se incorpora en esta memoria como referencia en su totalidad). p.ej.
Productos de FVIII derivado de plasma (pdFVIII) y FVIII humano recombinante (rFVIII) se utilizan para el tratamiento (terapia a-demanda) y la prevención (terapia de profilaxis) de episodios de sangrado. El rFVIII se desarrolló para reducir el riesgo de transmisión de patógenos transmitidos por la sangre después de la contaminación generalizada de los productos del plasma con el VIH y los virus de la hepatitis, y para asegurar un suministro adecuado de producto de FVIII. Sin embargo, la protección hemostática con los productos actuales de FVIII está temporalmente limitada debido a una corta semivida (t1/2) de aproximadamente 8-12 horas, lo que requiere inyecciones profilácticas tres veces por semana o en días alternos para la mayoría de los pacientes con el fin de mantener los niveles de FVIII por encima del 1%, un nivel que se ha establecido como protector contra la mayoría de los episodios de sangrado espontáneo. Manco-Johnson et al., New Engl J Med. 357(6):535-44 (2007).
Muchos estudios han demostrado que, incluso en dosis altas, la terapia a demanda no es eficaz para la prevención de la artropatía. Aledort L. et al., J Intern Med. 236: 391 -399 (1994); Petrini P. et al., Am J Pediatr Hematol Oncol. 13: 280-287 (1991). Los beneficios de la terapia profiláctica se han demostrado en numerosos estudios clínicos. Aznar J. et al., Haemophilia 6(3): 170-176 (2000), Feldman B. et al., J Thromb Haemost. 4:1228-1236 (2006), Kreuz W. et al., Haemophilia 4:413-417 (1998), Liesner R. et al., B.J. Haem. 92: 973-978 (1996), Ljung R., Haemophilia. 4(4): 409­ 412 (1998), Lofquist T, et al., J Intern Med 241:395-400 (1997), Nilsson I, et al., B. J Int Med 232:25-32 (1992), Risebrough N. et al., Haemophilia. 14:743-752 (2008), Van Den Berg H. et al., Haemophilia 9 (Supl. 1): 27-31 (2003), Van Den Berg H. et al., Haematologica 89(6):645-650 (2004) y Manco-Johnson et al. supra, establecieron que los niños que comenzaron con la profilaxis primaria después de su primera hemorragia articular tuvieron significativamente menos hemorragias y menos daño articular que los niños tratados a demanda.
En comparación con el tratamiento a demanda, la terapia profiláctica también disminuye la discapacidad, la tasa de hospitalización y el tiempo perdido en la escuela o el trabajo; Aznar J. et al., Haemophilia 6(3):170-176 (2000), Molho P. et al., Haemophilia 6(1): 23-32 (2000) y mejora la calidad de vida de los pacientes y sus familias. Coppola A. et al., Blood Transfus. 6(2):4-11 (2008). Sin embargo, la terapia profiláctica requiere a menudo el uso de dispositivos de acceso venoso central en los niños y los riesgos concomitantes de infección, sepsis y trombosis. Además, a pesar de los beneficios, la aceptación y el cumplimiento de la profilaxis disminuye con la edad, en parte debido a las molestias y la invasividad. Geraghty S. et al., Haemophilia 12:75-81 (2006), Hacker M. et al., Haemophilia 7(4):392-396 (2001). Por lo tanto, un producto de rFVIII con una t1/2 plasmática prolongada sería potencialmente beneficioso. Lillicrap D., Current Opinion in Hematology 17:393-397 (2010).
La reducción de la mortalidad, la prevención del daño articular y la mejora de la calidad de vida han sido logros importantes debido al desarrollo de pdFVIII y rFVIII. La protección prolongada contra el sangrado representaría otro avance clave en el tratamiento de los pacientes con hemofilia A. Sin embargo, hasta la fecha, no se han desarrollado productos que permitan una protección hemostática prolongada. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de métodos mejorados para tratar la hemofilia debido a la deficiencia de FVIII que sean más tolerables, más duraderos y más efectivos que las terapias actuales.
Además, el 15-30% de pacientes no tratados previamente desarrolla anticuerpos anti-FVIII neutralizantes (inhibidores) después de la transfusión con productos de FVIII. Se han considerado diversas técnicas para evitar respuestas inmunes de este tipo. Estas técnicas incluyen protocolos de tolerancia a dosis altas, uso de señuelos peptídicos que imitan el anticuerpo anti-FVIII, evitando el reconocimiento inmune con moléculas híbridas de FVIII humano/porcino, neutralizando células T CD4 reactivas con FVIII con anticuerpos anticlonotípicos, utilizando epítopos CD4 universales y bloqueando la coestimulación de CTLA-4-Ig o anti-CD40L. Véase, p. ej. , Lei et al., Transfusión Medicine 105: 4865-4870 (2005). También se ha estudiado la presentación de FVIII por parte de células inmunes para inducir tolerancia. Por ejemplo, Lei et al. encontraron que la presentación de dominios de FVIII en una cadena principal de Ig en células B impedía o disminuía los anticuerpos. Id. Además, Qadura et al. encontraron que la presentación tolerogénica de FVIII utilizando células dendríticas inmaduras puede reducir la inmunogenicidad. Journal of Thrombosis and Haemostatis 6: 2095-2104 (2008). Sin embargo, métodos de este tipo son costosos, complicados (p. ej., al requerir la co-administración de otros agentes terapéuticos en combinación con FVIII o la administración de células enteras en lugar de proteínas relativamente simples), probablemente darán como resultado efectos secundarios no deseados y/o ineficaces. Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de métodos sencillos para tratar la hemofilia debida a la deficiencia de FVIII que sean eficaces en pacientes que desarrollan respuestas inhibidoras. Dumont Jennifer et al. (Blood, vol. 119, n° 13, 2012, pp 3024-3030) y Peters et al. (Blood, 51st Annual Meeting of the American Society of Hematology, American Society of Hematology vol. 114, n° 22, 2009, p. 228) describen que polipéptidos quiméricos de FVIII-Fc tienen una semivida incrementada in vivo y proporcionan una protección prolongada contra el sangrado en determinados modelos. El documento US 2011/182896 A1 describe una terapia para trastornos hemostáticos con riesgo reducido, en comparación con las terapias actuales, de desarrollar anticuerpos inhibidores contra un factor de coagulación, así como FVIII-Fc para tratar la hemofilia. Allí no se describe el uso para inducir tolerancia inmunitaria.
BREVE SUMARIO
La presente divulgación proporciona un polipéptido quimérico que comprende factor VIII y un Fc para uso en la inducción de la tolerancia inmune al factor VIII en un sujeto humano. El uso comprende administrar el polipéptido quimérico a un sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria de FVIII inhibitoria. En algunas realizaciones, el sujeto desarrollaría una respuesta inmunitaria inhibidora si se le administrara una dosis equivalente de un polipéptido que consiste en la porción de FVIII. En algunas realizaciones, el sujeto ha desarrollado una respuesta inmunitaria inhibitoria o una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII. La administración de un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción de Fc puede ser suficiente para tratar una afección hemorrágica e inducir tolerancia inmunitaria al FVIII. La administración puede ser profiláctica. En algunas realizaciones, la administración disminuye la incidencia de sangrado espontáneo o previene el sangrado.
La respuesta inmunitaria puede comprender anticuerpos anti-FVIII inhibitorios. El título de anticuerpos es de al menos 0,6 Unidades Bethesda (UB), al menos 1,0 UB o al menos 5,0 UB. La respuesta inmunitaria también puede comprender una respuesta inmunitaria mediada por células, por ejemplo, la liberación de una citoquina. La citoquina puede ser IL-12, IL-4 o TNF-a, por ejemplo. La respuesta inmunitaria también puede resultar en síntomas clínicos tales como una tendencia incrementada al sangrado, alto consumo de FVIII, falta de respuesta a la terapia con FVIII, menor eficacia de la terapia con FVIII y/o semivida acortada del FVIII.
Sujetos con riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria incluyen aquellos con una mutación, deleción o reordenamiento en un gen del FVIII. En algunas realizaciones, el sujeto no produce una proteína de FVIII. En algunas realizaciones, el sujeto tiene hemofilia grave. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un pariente (p. ej., un padre (madre), primo, tía, tío, abuelo (abuela), hijo (hija) o nieto (nieta)) que ha desarrollado una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII u otra proteína terapéutica. En algunas realizaciones, el sujeto está recibiendo simultáneamente o recibió previamente una terapia que aumenta la función inmunológica cuando se administra el FVIII. En algunas realizaciones, el sujeto está recibiendo terapia con interferón o terapia anti-viral en combinación con FVIII. En algunas realizaciones, el sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria tiene un polimorfismo genético asociado con un nivel de citoquinas incrementado, tal como TNF-a incrementado o IL10 incrementada. En algunas realizaciones, el sujeto con riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria tiene un polimorfismo TNF-a-308G>A o alelo 134 del microsatélite IL10G.
En algunas realizaciones, el sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII no ha sido previamente expuesto a FVIII. En algunas realizaciones, el sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII ha estado expuesto a FVIII. En algunas realizaciones, el sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII ha tenido menos de 150, menos de 50 o menos de 20 días de exposición a FVIII.
En algunas realizaciones, el sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria a FVIII inhibitoria no ha desarrollado previamente una respuesta inmunitaria a FVIII u otra proteína terapéutica. En algunas realizaciones, el sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria a FVIII inhibitoria ha desarrollado previamente una respuesta inmunitaria a FVIII (pdFVIII o rFVIII) u otra proteína terapéutica. En algunas realizaciones, el sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria a FVIII inhibitoria ha desarrollado previamente una respuesta inmunitaria a un producto de FVIII, tal como ADVATE®, RECOMBINATE®, KOGENATE FS®, HELIXATE FS®, XYNTHA®/REFACTO AB®, HEMOFIL-M®, MONARC-M®, MONOCLATE-P®, HUMATE-P®, ALPHANATE®, KOATE-DVI® o HYATE:C®. En algunas realizaciones, los productos de FVIII son un FVIII de longitud completa, un FVIII maduro o un FVIII con dominio B suprimido.
El uso del polipéptido quimérico proporcionada en esta memoria puede inducir tolerancia inmunitaria. En algunas realizaciones, la administración reduce el número de anticuerpos anti-FVIII en el sujeto, el título de anticuerpos anti-FVIII en el sujeto y/o el nivel de una citoquina (p. e j, IL-12, IL-4 o TNF) en el sujeto en comparación con el número, título o nivel antes de la administración. En algunas realizaciones, la administración reduce el número de anticuerpos anti-FVIII en el sujeto, el título de anticuerpos anti-FVIII en el sujeto y/o el nivel de una citoquina (p. e j, IL-12, IL-4 o un TNF) en el sujeto en comparación con el número, título o nivel que resultó de un tratamiento previo con un polipéptido que consiste en un polipéptido de FVIII. En algunas realizaciones, la administración reduce el número de anticuerpos anti-FVIII en el sujeto, el título de anticuerpos anti-FVIII en el sujeto y/o el nivel de una citoquina (p. ej., IL-12, IL-4 o TNF) en el sujeto en comparación con el número, título o nivel que resultaría de la administración de un polipéptido que consiste en un polipéptido de FVIII al sujeto.
El uso comprende la administración de un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción Fc. La porción de FVIII puede ser FVIII humano, FVIII de longitud completa o FVIII que contiene una deleción, total o parcial, del dominio B. La porción de FVIII puede ser un polipéptido biológicamente activo, p. ej., un polipéptido de FVIII con actividad de coagulación. La porción de FVIII puede ser al menos 90% idéntica, 95% idéntica o idéntica a una secuencia de aminoácidos de FVIII mostrada en la TABLA 2 sin una secuencia señal (aminoácidos 20 a 1457 de SEQ ID NO: 2; aminoácidos 20 a 2351 de SEQ ID NO: 6). La porción de FVIII también puede ser al menos 90% idéntica, 95% idéntica o idéntica a una secuencia de aminoácidos de FVIII mostrada en la TABLA 2 con una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1457 de SEQ ID NO: 2 o aminoácidos 1 a 2351 de SEQ ID NO: 6). La porción Fc puede ser idéntica a la secuencia de aminoácidos de Fc mostrada en la TABLA 2 (aminoácidos 1458 a 1684 de SEQ ID NO: 2 o aminoácidos 2352 a 2578 de SEQ ID NO: 6).
El polipéptido quimérico puede estar en forma de un híbrido que comprende un segundo polipéptido en asociación con el polipéptido quimérico. El segundo polipéptido puede consistir esencialmente o consistir en un Fc.
En algunas realizaciones, el uso comprende la administración de un polipéptido quimérico a una dosis particular. La dosis puede ser, por ejemplo, una dosis de 10-100 UI/kg, una dosis de 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, o 90-100 UI/kg, o una dosis de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 UI/kg.
En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico se administra a un sujeto con una afección de sangrado. La afección de sangrado puede ser, por ejemplo, un trastorno hemorrágico de la coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia oral, trauma, trauma capitis, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intratorácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal o sangrado en la vaina del psoas ilíaco. En algunas realizaciones, el trastorno de sangrado de la coagulación es la hemofilia A.
En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano y el uso es para tratar una afección de sangrado en dicho sujeto. En algunas realizaciones, la afección de sangrado está provocada por un trastorno de la coagulación sanguínea. En algunas realizaciones, el trastorno de la coagulación sanguínea es hemofilia o la enfermedad de von Willebrand. En algunas realizaciones, el trastorno de la coagulación sanguínea es la hemofilia A. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una afección que requiere tratamiento profiláctico o a demanda tal como un episodio hemorrágico. En algunas realizaciones, el sujeto es un paciente que padece un trastorno de sangrado o se espera que necesite dicho tratamiento.
La presente divulgación también proporciona un kit que comprende: (a) una composición farmacéutica que comprende un polipéptido quimérico que comprende una porción de factor de coagulación y una porción Fc y un soporte farmacéuticamente aceptable, e instrucciones (b) para administrar la composición a un sujeto que necesita tolerancia inmune al factor de coagulación. El polipéptido quimérico comprende una porción de FVIII. En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico es un híbrido de monómero y dímero de FVIII. En algunas realizaciones, las instrucciones incluyen, además, al menos una etapa para identificar a un sujeto que necesita tolerancia inmunitaria al factor de coagulación. En algunas realizaciones, la etapa para identificar a los sujetos que necesitan tolerancia inmunitaria incluye uno o más del grupo que consiste en: (a) identificar un sujeto que tiene una mutación o deleción en el gen del factor de coagulación; (b) identificar un sujeto que tiene un reordenamiento en el gen del factor de coagulación; (c) identificar un sujeto que tiene un pariente que ha desarrollado previamente una respuesta inmunitaria inhibitoria contra el factor de coagulación; (d) identificar un sujeto que recibe terapia con interferón; (e) identificar un sujeto que recibe terapia antiviral; (f) identificar un sujeto que tiene una mutación genética en un gen distinto del gen que codifica el factor de coagulación que está ligado con un riesgo incrementado de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria; y (g) dos o más combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la mutación genética en un gen distinto del gen que codifica el factor de coagulación comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: (a) un polimorfismo genético asociado con un TNF-a incrementado; (b) un polimorfismo genético asociado con una IL10 incrementada; (c) un polimorfismo genético asociado con un CTLA-4 disminuido; (d) una mutación en moléculas DR15 o DQB0602 MHC Clase II; y (e) tiene dos o más combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el uso de la presente divulgación comprende, además, medir el nivel de una respuesta inmunitaria inhibitoria después de la administración. En algunas realizaciones, el uso de la presente divulgación comprende, además, comparar el nivel de la respuesta inmunitaria inhibitoria después de la administración con el nivel de la respuesta inmunitaria inhibitoria antes de la administración. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inhibitoria es el desarrollo de anticuerpos contra el FVIII. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inhibitoria es la secreción de citoquinas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS
La FIG. 1 muestra una representación esquemática del monómero rFVIIIFc.
Las FIGS. 2A y 2B muestran análisis SDS-PAGE reductores y no reductores de rFVIIIFc (procesado o de cadena sencilla). La FIG. 2C muestra la estructura de rFVIIIFc analizada por LC/UV y LC/MS.
Las FIGS. 3A, 3B y 3C muestran la caracterización bioquímica de rFVIII-Fc. La FIG. 3A muestra la activación de Factor X (FX) en función de la concentración de vesículas de fosfolípidos. La FIG. 3B muestra la activación de FX en función de la concentración de FX. La FIG. 3C muestra la activación de FX en función de la concentración de FIX activado (FIXa).
La FIG. 4 muestra la activación de FX después de la escisión por la Proteína C activada.
Las FIGS. 5A, 5B, 5C y 5D muestran la actividad media de FVIII del grupo observado (± ET) frente a los perfiles de tiempo. Los perfiles se ordenan por nivel de dosis, agrupados por compuesto en función del tiempo. La FIG. 5A corresponde a un ensayo de una etapa con una dosis de 25 UI/kg. La FIG. 5B corresponde a un ensayo de una etapa con una dosis de 65 UI/kg. La FIG. 5C corresponde a un ensayo cromogénico con una dosis de 25 UI/kg. La FIG. 5D corresponde a un ensayo cromogénico con una dosis de 65 UI/kg.
Las FIGS. 6A y 6B muestran la actividad media de FVIII del grupo observado (± ET) frente a perfiles de tiempo, agrupados por nivel de dosis y compuesto frente al tiempo. La FIG. 6A corresponde a un ensayo de una etapa. La FIG. 6B corresponde a un ensayo cromogénico.
Las FIGS. 7A, 7B y 7C muestran la eficacia in vivo de FVIIIFc de cadena sencilla (SC rFVIIIFc) en el modelo de transección de la vena de la cola de ratón con hemofilia A (HemA). La FIG. 7A muestra la relación entre la dosis de FVIII y la protección. Las dosis de rFVIIIFc de cadena sencilla se muestran como cuadrados y las dosis de rFVIIIFc procesadas se muestran como círculos. La FIG. 7B muestra el porcentaje de supervivencia después de la transección de la vena de la cola después de la administración de 4,6 gg/kg, 1,38 gg/kg y 0,46 gg/kg de rFVIIIFc o SC rFVIIIFc. La FIG. 7C muestra el porcentaje de ratones que no sangran después de la transección de la vena de la cola, después de la administración de 4,6 gg/kg (círculo negro o triángulo invertido), 1,38 gg/kg (triángulo o rombo) y 0,46 gg/kg (cuadrado y círculo gris) de rFVIIIFc o SC rFVIIIFc, respectivamente.
La FIG. 8 representa el diseño del estudio de fase 1/2a, que fue un diseño secuencial de escalada de dosis para evaluar la seguridad y la PK de rFVIIIFc en comparación con ADVATE® después de una dosis intravenosa única de 25 UI/kg (cohorte A de dosis baja) o 65 UI/kg (cohorte B de dosis alta).
La FIG. 9 muestra la correlación de la actividad de rFVIII mediante ensayos de una etapa (aPTT) y cromogénicos. Los resultados miden la actividad del FVIII (UI/ml) después de la inyección de ADVATE® (♦ ) y rFVIIIFc (□).
Las FIGS. 10A y 10B muestran los perfiles farmacocinéticos de la actividad plasmática media del FVIII del grupo para cohortes de dosis baja y alta. Las actividades plasmáticas del FVIII (ensayo aPTT de una etapa) frente a la curva de tiempo después de una única inyección intravenosa de rFVIIIFc o ADVATE® se muestran para 25 UI/kg (cohorte de dosis baja, n = 6) (FIG. 10A); y 65 UI/kg (cohorte de dosis alta, n = 10 [ADVATE®]; n = 9 [rFVIIIFc]) (FIG.
10B). Los resultados presentados son la media del grupo ± error típico de la media (ETM).
Las FIGS. 11A y 11B muestran el efecto de los niveles de antígeno de VWF sobre Cl y t1/2 de la actividad de FVIII después de la inyección de ADVATE® o rFVIIIFc. La correlación entre los niveles de antígeno VWF y el Cl ajustado por peso de ADVATE® (R2 = 0,5415 y p = 0,0012) y rFVIIIFc (R2 = 0,5492 y p = 0,0016) (FIG. 11A); y se muestran la ti/2 de ADVATE® (R2 = 0,7923 y p < 0,0001) y rFVIIIFc (R2 = 0,6403 y p = 0,0003) (FIG. 11B). Cada uno de los puntos representa un sujeto individual.
Las FIGS. 12A y 12B muestran resultados de ROTEM® de sangre entera ex vivo para sujetos individuales después de la inyección de ADVATE® o rFVIIIFc. Se tomaron muestras de sangre de los sujetos antes y después del tratamiento a dosis de 25 UI/kg de ADVATE® y rFVIIIFc (FIG. 12A); y 65 UI/kg de ADVa Te® y rFVIIIFc en intervalos de tiempo especificados (FIG. 12B). El tiempo de coagulación se determinó mediante NATEM iniciado con Ca++ en un instrumento ROTEM®. Los resultados presentados son la media ± error típico de la media (ETM) de las lecturas de canal por triplicado para cada una de las muestras individuales.
Las FIGS. 13A y 13B comparan la actividad de rFVIIIFc y SC rFVIIIFc en un ensayo de generación de trombina (TGA). La FIG. 13A comparó el potencial de trombina endógena (ETP) para rFVIIIFc, SC rFVIIIFc, rFVIIIFc completamente procesado y FVIII estándar de la OMS. La FIG. 13B compara el pico de trombina para rFVIIIFc, SC rFVIIIFc, rFVIIIFc completamente procesado y FVIII estándar de la OMS.
La FIG. 14 muestra una representación esquemática del monómero rFVIIIFc. El rFVIIIFc es una fusión recombinante de FVIII con deleción del dominio B humano con Fc de IgG1 humana, sin secuencia enlazadora intermedia.
Las FIGS. 15A, 15B, 15C y 15D muestran perfiles farmacocinéticos (PK) que comparan rFVIIIFc y rFVIII en ratones HemA (FIG. 15A), ratones C57BL/6 (FIG. 15B), ratones FcRn recombinantes (FIG. 15C) y ratones Tg32B transgénico con FcRn humano (FIG. 15D) después de una inyección en la vena de la cola de 125 UI/kg. Los resultados mostrados son la media ± DE de 4 ratones por tratamiento en cada intervalo de tiempo. Las estimaciones de los parámetros PK se resumen en la TABLA 12.
La FIG. 16 compara la actividad aguda de rFVIIIFc y rFVIII en un modelo de sangrado por corte de la punta de la cola de ratón HemA. Ratones macho HemA recibieron una inyección en la vena de la cola de 24 UI/kg, 72 UI/kg o 216 UI/kg de rFVIIIFc o rFVIII seguido de un corte de la punta de la cola de 10 mm 5 minutos después de la dosificación. Los resultados presentados son la pérdida de sangre individual y mediana durante 30 minutos después del corte de la punta de la cola de 20 ratones en cada uno de los grupos de tratamiento. P < 0,05 para Vehículo frente a todos los demás tratamientos, y P > 0,05 para ratones C57B1/6 frente a ratones HemA tratados con 72 o 216 UI/kg de rFVIIIFc, o 216 UI/kg de rFVIII.
Las FIGS. 17A y 17B muestran la eficacia profiláctica de rFVIIIFc con relación a rFVIII en el modelo de sangrado por transección de la vena de la cola (TVT). Ratones macho HemA fueron lesionados por TVT 24 horas después del tratamiento con vehículo, rFVIII o rFVIIIFc, o 48 horas después del tratamiento con rFVIIIFc. La FIG. 17A muestra la supervivencia después de TVT. P < 0,001 mediante la prueba Log-Rank de las curvas de supervivencia de animales que recibieron 12 UI/kg de rFVIIIFc frente a rFVIII 24 horas antes de TVT. La FIG. 17B muestra un nuevo sangrado dentro de las 24 horas posteriores a la TVT. P = 0,002 mediante la prueba Log-Rank de las curvas sin nuevo sangrado de animales que recibieron 12 UI/kg de rFVIIIFc frente a rFVIII 24 horas antes de TVT.
Las FIGS. 18A y 18B muestran el tiempo de coagulación de la sangre entera (WBCT) de rFVIIIFc y rFVIII en perros con hemofilia A. El intervalo normal de WBCT en perros se muestra mediante líneas discontinuas grandes. El área por encima de las pequeñas líneas discontinuas (20 minutos) indica el punto en el que se espera que la actividad del FVIII en plasma sea inferior al 1% de lo normal. La FIG. 18A muestra el WBCT después de la administración de rFVIIIFc. La FIG. 18B muestra el WBCT después de la administración de rFVIII seguida de la administración de rFVIIIFc en un estudio cruzado.
Las FIGS. 19A y 19B presentan datos de farmacocinética (PK) para rFVIIIFc en comparación con rFVIII en perros con hemofilia A después de una dosis i.v. La FIG. 19A muestra la concentración de antígeno en plasma medida por ELISA. La FIG. 19B muestra que la actividad del FVIII en plasma se midió mediante un ensayo cromogénico. N = 4 para rFVIIIFc y N = 2 para rFVIII.
La FIG. 20 muestra el diseño de un estudio para evaluar la inmunogenicidad de FVIII en ratones HemA. La dosificación intravenosa (i.v.) con rFVIIIFc; Fc murino de FVIII humano quimérico; BDD-FVIII (XYNTHA®); rFVIII de longitud completa (ADVATE®); y el control del vehículo tuvieron lugar el día 0, el día 7, el día 14, el día 21 y el día 35. Se recogieron muestras de sangre el día 14, el día 21, el día 28, el día 35 y el día 42.
Las FIGS. 21A, 21B y 21C muestran recuentos de anticuerpos totales anti-FVIII en experimentos de inmunogenicidad realizados en ratones HemA de acuerdo con el estudio de diseño mostrado en la FIG. 20. La FIG.
21A corresponde a las mediciones totales de anticuerpos anti-FVIII después de la dosificación i.v. repetida de 50 UI/kg de rFVIIIFc; FVIII humano-Fc murino quimérico; BDD-FVIII (XYNTHA®); o rFVIII de longitud completa (ADVATE®). La FIG. 21B corresponde a las mediciones totales de anticuerpos anti-FVIII después de la dosificación i.v. repetida de 100 UI/kg de rFVIIIFc; FVIII humano-Fc murino quimérico; BDD-FVIII (XYNt Ha ®); rFVIII de longitud completa (ADVATE®). La FIG. 21C corresponde a las mediciones totales de anticuerpos anti-FVIII después de la dosificación i.v. repetida de 250 Ul/kg de rFVIIIFc; FVIII humano- Fc murino-quimérico; BDD-FVIII (XYNTHA®); rFVIII de longitud completa (ADVATE®).
Las FIGS. 22A, 22B, 22C y 22D muestran mediciones de anticuerpos anti-FVIII en diferentes intervalos de tiempo después de la administración de dosis de 50 UI/kg, 100 UI/kg y 250 UI/kg de rFVIIIFc; FVIII humano-Fc murino quimérico; BDD-FVIII (XYNTHA®); rFVIII de longitud completa (ADVATE®). La FIG. 22A muestra los datos correspondientes a las muestras recogidas el día 14. La FIG. 22B muestra los datos correspondientes a las muestras recogidas el día 21. La FIG. 22C muestra los datos correspondientes a las muestras recogidas el día 28. La FIG. 22D muestra los datos correspondientes a las muestras recogidas el día 42.
La FIG. 23 muestra la correlación entre anticuerpos totales y neutralizantes del FVIII.
La FIG. 24 muestra el desarrollo de anticuerpos anti-hFc después del tratamiento con dosis de 50 UI/kg y 250 UI/kg de rFVIIIFc (rFVIII con Fc humano).
La FIG. 25 es un diagrama que muestra los procesos experimentales para el aislamiento y análisis de esplenocitos de ratones HemA en un estudio para medir la respuesta de los linfocitos esplénicos a rFVIIIFc en comparación con el FVIII disponible comercialmente.
La FIG. 26 es un diagrama que muestra el proceso para la tinción de citoquinas intracelulares utilizando FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia). El proceso utiliza cinco colores, uno para el marcador de linfocitos CD4 y otros cuatro colores para las citoquinas IL2, IL-4, IL-10 y TNF-a.
Las FIGS. 27A y 27B muestran un diagrama de puntos FACS representativo. La FIG. 27A corresponde a la tinción de citoquinas intracelulares del control de isotipo. La FIG. 27 corresponde a la tinción de citoquinas intracelulares de células doble positivas que contienen marcadores CD4 y TNF-a.
La FIG. 28 muestra la tinción de citoquinas intracelulares por encima del control (vehículo) para CD4 e interleuquina-2 (IL-2). Los porcentajes de células dobles positivas se determinaron a partir de gráficos de puntos FACS de todos los tratamientos con FVIII y vehículo. El porcentaje de células doble positivas en ratones tratados con FVIII se obtuvo comparando con el grupo tratado con vehículo. Las muestras corresponden a rFVIIIFc con un Fc humano (hFc) o Fc de ratón (mFc), Xy Nt HA® (Xyn) y ADVATE® (Adv). Los tratamientos con FVIII se administraron a dosis de 50 UI/kg y 250 UI/kg.
La FIG. 29 muestra la tinción de citoquinas intracelulares por encima del control (vehículo) para CD4 y TNF-a. Los porcentajes de células dobles positivas se determinaron a partir de gráficos de puntos FACS de todos los tratamientos con FVIII y vehículo. El porcentaje de células doble positivas en ratones tratados con FVIII se obtuvo comparando con el grupo tratado con vehículo. Las muestras corresponden a rFVIIIFc con un Fc humano (hFc) o Fc de ratón (mFc), XYNt Ha ® (Xyn) y ADVATE® (Adv). Los tratamientos con FVIII se administraron a dosis de 50 UI/kg y 250 UI/kg.
La FIG. 30 muestra la tinción de citoquinas intracelulares por encima del control (vehículo) para CD4 e interleuquina-4 (IL-4). Los porcentajes de células doble positivas se determinaron a partir de gráficos de puntos FACS de todos los tratamientos con FVIII y vehículo. El porcentaje de células doble positivas en ratones tratados con FVIII se obtuvo comparando con el grupo tratado con vehículo. Las muestras corresponden a rFVIIIFc con un Fc humano (hFc) o Fc de ratón (mFc), XYNt Ha ® (Xyn) y ADVATE® (Adv). Los tratamientos con FVIII se administraron a dosis de 50 UI/kg y 250 UI/kg.
La FIG. 31 muestra la tinción de citoquinas intracelulares por encima del control (vehículo) para CD4 e interleuquina-10 (IL-10). Los porcentajes de células doble positivas se determinaron a partir de gráficos de puntos FACS de todos los tratamientos con FVI11 y vehículo. El porcentaje de células doble positivas en ratones tratados con FVIII se obtuvo comparando con el grupo tratado con vehículo. Las muestras corresponden a rFVIIIFc con un Fc humano (hFc) o Fc de ratón (mFc), Xy Nt HA® (Xyn) y ADVATE® (Adv). Los tratamientos con FVIII se administraron a dosis de 50 UI/kg y 250 UI/kg.
La FIG. 32 muestra la tinción de citoquinas intracelulares por encima del control (vehículo) para CD4 y el marcador de células dendríticas PD-L1 (CD274). Los porcentajes de células doble positivas se determinaron a partir de gráficos de puntos FACS de todos los tratamientos con FVIII y vehículo. El porcentaje de células doble positivas en ratones tratados con FVIII se obtuvo comparando con el grupo tratado con vehículo. Las muestras corresponden a rFVIIIFc con un Fc humano (hFc) o Fc de ratón (mFc), Xy Nt HA® (Xyn) y ADVATE® (Adv). Los tratamientos con FVIII se administraron a dosis de 50 UI/kg y 250 UI/kg.
La FIG. 33 muestra la tinción de citoquinas intracelulares por encima del control (vehículo) para CD4 y el marcador de células dendríticas CD80. Los porcentajes de células doble positivas se determinaron a partir de gráficos de puntos FACS de todos los tratamientos con FVIII y vehículo. El porcentaje de células doble positivas en ratones tratados con FVIII se obtuvo comparando con el grupo tratado con vehículo. Las muestras corresponden a rFVIIIFc con un Fc humano (hFc) o Fc de ratón (mFc), Xy Nt HA® (Xyn) y ADVATE® (Adv). Los tratamientos con FVIII se administraron a dosis de 50 UI/kg y 250 UI/kg.
La FIG. 34 muestra la tinción de citoquinas intracelulares por encima del control (vehículo) para CD4 y marcador de Treg Foxp3. Los porcentajes de células doble positivas se determinaron a partir de gráficos de puntos FACS de todos los tratamientos con FVIII y vehículo. El porcentaje de células doble positivas en ratones tratados con FVIII se obtuvo comparando con el grupo tratado con vehículo. Las muestras corresponden a rFVIIIFc con un Fc humano (hFc) o Fc de ratón (mFc), Xy Nt HA® (Xyn) y ADVATE® (Adv). Los tratamientos con FVIII se administraron a dosis de 50 UI/kg y 250 UI/kg.
La FIG. 35 muestra la tinción de citoquinas intracelulares por encima del control (vehículo) para CD4 y la molécula inhibitoria de Th Tim3. Los porcentajes de células doble positivas se determinaron a partir de gráficos de puntos FACS de todos los tratamientos con FVIII y vehículo. El porcentaje de células doble positivas en ratones tratados con FVIII se obtuvo comparando con el grupo tratado con vehículo. Las muestras corresponden a rFVIIIFc con un Fc humano (hFc) o Fc de ratón (mFc), XYNTHA® (Xyn) y ADVATE® (Adv). Los tratamientos con FVIII se administraron a dosis de 50 UI/kg y 250 UI/kg.
La FIG. 36 muestra la tinción de citoquinas intracelulares por encima del control (vehículo) para CD4 y la molécula inhibitoria de Th CD279 (PD-1). Los porcentajes de células doble positivas se determinaron a partir de gráficos de puntos FACS de todos los tratamientos con FVIII y vehículo. El porcentaje de células doble positivas en ratones tratados con FVIII se obtuvo comparando con el grupo tratado con vehículo. Las muestras corresponden a rFVIIIFc con un Fc humano (hFc) o Fc de ratón (mFc), Xy Nt HA® (Xyn) y ADVATE® (Adv). Los tratamientos con FVIII se administraron a dosis de 50 UI/kg y 250 UI/kg.
La FIG. 37 es un diagrama que muestra el diseño del estudio de inmunogenicidad presentado en el Ejemplo 13. Se administraron FVIII (rFVIIIFc, XYNTHA®, ADVATE®) y el control de vehículo a ratones HemA el día 0, el día 7, el día 14, el día 21, el día 35 y día 53. Se extrajo sangre el día 0, el día 14, el día 21, el día 28 y el día 42. Los bazos se recogieron el día 56. FVIII se administró en dosis de 50 UI/kg, 100 UI/kg y 250 UI/kg.
La FIG. 38 muestra la metodología utilizada para el análisis de esplenocitos de ratón y el perfil de respuesta de células T en el Ejemplo 13.
La FIG. 39 muestra los niveles totales de anticuerpos anti-FVIII en muestras de sangre recogidas el día 42. Se administraron rFVIIIFc, BDD-rFVIII (XYNTHA®) y fl-rFVIII (ADVATE®) en dosis de 50 UI/kg, 100 UI/kg y 250 UI/kg.
Las FIGS. 40A, 40B y 40C muestran la tinción de citoquinas intracelulares de células T CD4+ esplénicas de ratones HemA tratados con diferentes dosis de FVIII (rFVIIIFc, BDD-rFVIII (XYNTHA®) o fl-rFVIII (ADVATE®)). Cada una de las figuras muestra resultados para IL-2 (panel izquierdo) y para TNF-a (panel derecho). La FIG. 4A corresponde a ratones HemA (N = 4) a los que se inyectaron dosis de 50 UI/kg de FVIII. La FIG. 4B corresponde a ratones HemA (N = 10) a los que se inyectaron dosis de 100 UI/kg de FVIII. La FIG. 4C corresponde a ratones HemA (N = 4) a los que se inyectaron dosis de 250 UI/kg de FVIII.
La FIG. 41 muestra la tinción de citoquinas intracelulares para esplenocitos CD4/CD25/Foxp3 triple positivos aislados de ratones HemA tratados con dosis de 100 UI/kg de rFVIIIFc, BDD-rFVIII (Xy Nt HA®) o fl-rFVIII (ADVATE®).
Las FIGS. 42A-H muestran la PCR en tiempo real para citoquinas relacionadas con la tolerancia inmunitaria en ratones HemA tratados con 100 UI/kg. La FIG. 42A muestra los resultados para TGF-p, la FIG. 42B muestra los resultados para la interleuquina-10, la FIG. 42C muestra los resultados para la subunidad IL-12a de IL-35 y la FIG.
42D muestra los resultados para la subunidad EBI-3 de IL-35. La FIG. 42E muestra los resultados para Foxp3. La FIG. 42F muestra los resultados para IL2ra/CD25. La FIG. 42G muestra los resultados para CTLA4. La FIG. 42H muestra los resultados para IDO-1.
La FIG. 43 muestra el análisis FACS de células implicadas en la vía PD-L1 -PD-1 en ratones tratados con 100 UI/kg. Los esplenocitos se tiñeron para CD11c y PD-L1 de superficie (FIG. 43A) o CD4 y PD-1 (FIG. 43B). Las barras representan el porcentaje sobre el vehículo (* p < 0,05 frente al vehículo; p < 0,05 entre tratamientos; prueba T).
La FIG. 44 es un diagrama que muestra el diseño de un estudio de comparación de la inmunogenicidad para rFVIIIFc, XYNTHA® y ADVATE® en ratones HemA. Dosis de FVIII se administraron a ratones HemA el día 0, el día 7, el día 14, el día 21 y el día 35. Se extrajo sangre el día 0, el día 14, el día 21, el día 28 y el día 42. El FVIII se administró en dosis de 50 UI/kg, 100 UI/kg y 250 UI/kg.
La FIG. 45 muestra mediciones de anticuerpos anti-FVIII los días 14, 21, 28 y 42 después de la administración de dosis de 50 UI/kg de rFVIIIFc; BDD-FVIII (XYNTHA®); rFVIII de longitud completa (ADVATE®), así como niveles de anticuerpos inhibitorios el día 42.
La FIG. 46. muestra las mediciones de anticuerpos anti-FVIII los días 14, 21, 28 y 42 después de la administración de dosis de 100 UI/kg de rFVIIIFc; BDD-FVIII (XYNTHA®); rFVIII de longitud completa (ADVATE®), así como los niveles de anticuerpos inhibitorios el día 42.
La FIG. 47 muestra mediciones de anticuerpos anti-FVIII los días 14, 21, 28 y 42 después de la administración de dosis de 250 UI/kg de rFVIIIFc; BDD-FVIII (XYNTHA®); rFVIII de longitud completa (ADVATE®), así como los niveles de anticuerpos inhibitorios el día 42.
La FIG. 48 muestra la correlación entre los títulos de anticuerpos neutralizantes de FVIII y los niveles de anticuerpos de unión totales después de la administración de rFVIII y rFVIIIFc.
La FIG. 49 es un diagrama que muestra el componente de perfil de respuesta de células T del estudio de comparación de la inmunogenicidad para rFVIIIFc, XYNTHA® y ADVATE® en ratones HemA mostrado en la FIG. 44. Se administraron dosis adicionales de FVIII a ratones HemA el día 53 y se recogió el bazo el día 56.
La FIG. 50 (panel derecho) muestra la tinción de citoquinas intracelulares para esplenocitos CD4/CD25/Foxp3 triple positivos aislados de ratones HemA tratados con dosis de 100 UI/kg de rFVIIIFc, BDD-rFVIII (XYNTHA®) o fl-rFVII I (ADVATE®). La FIG. 50 (panel izquierdo) es un diagrama que muestra el mecanismo de acción de las células T reguladoras.
La FIG. 51 es un diagrama que muestra el diseño de un estudio de tolerancia inmunitaria a rFVIIIFc. Se administraron i.v. dosis de 50 UI/kg de rFVIIIFc a ratones HemA el día 0, el día 7, el día 14, el día 21 y el día 35. Se extrajo sangre el día 0, el día 14, el día 21, el día 28 y el día 42, seguido de un período de reposo de 1 semana. A continuación, los ratones se volvieron a estimular con dosis de 250 UI/kg de rFVIIIFc el día 49 (día 0 de nueva estimulación), el día 56 (día 7 de nueva estimulación), el día 63 (día 14 de nueva estimulación) y el día 70 (día 21 de nueva estimulación). Se extrajo sangre durante la nueva estimulación el día 63 (día 14 de nueva estimulación), el día 70 (día 21 de nueva estimulación) y el día 77 (día 28 de nueva estimulación).
La FIG. 52 muestra las mediciones totales de anticuerpos anti-FVIII los días 14, 21 y 28 después de la nueva estimulación con dosis de 250 UI/kg de rFVIIIFc. Se pretrataron ratones HemA con 50 UI/kg de rFVIIIFc o vehículo control. Los resultados indican que rFVIIIFc induce tolerancia inmune en ratones HemA.
La FIG. 53 es un diagrama que muestra el reciclaje de IgG y rFVIIIFc por parte de FcRn.
La FIG. 54 es un diagrama que muestra los tipos de células y la arquitectura celular que rodea un sinusoide hepático.
La FIG. 55 es un diagrama que muestra el diseño de un ensayo de aclaramiento en el que los macrófagos y Kupffer se agotan con CLODROSOME® (ENCAPSOME® administrado como control) antes de la inyección i.v. de FVIII o rFVIIIFc. Se utilizaron tres modelos de ratón inactivado: HemA, DKO y FcRn-KO. Las muestras de sangre se recogieron en el intervalo de tiempo especificado (4 muestras por cada intervalo de tiempo).
La FIG. 56 muestra una tinción representativa de la sección de hígado de ratón HemA con un anticuerpo contra Iba-1, un marcador de macrófagos específico. Los paneles A y A' muestran el tratamiento con ENCAPSOME® de control de ratones HemA. Los paneles B y B' muestran el tratamiento con CLODROSOME® de ratones HemA. Los paneles A' y B' muestran máscaras de cuantificación destacando las células de Kupffer teñidas, el área total del tejido y las áreas vacías.
La FIG. 57 muestra un análisis cuantitativo inmunohistoquímico (IHC) de áreas teñidas positivamente con un anticuerpo marcado para F4/80 después del tratamiento con CLODROSOME® o ENCAPSOME®, y un análisis de clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) que identifica células monocíticas circulantes en células de la sangre teñidas con el mismo anticuerpo marcado para F4/80.
La FIG. 58 muestra un análisis de RT-PCR de la expresión del receptor 1 (Emr1) (F4/80) del factor de crecimiento epidérmico marcador de macrófagos que contiene el receptor similar a mucina en el hígado, el bazo y el pulmón de ratones HemA tratados con ENCAPSOME® o CLODROSOME®.
La FIG. 59 muestra el aclaramiento de rFVIII y rFVIIIFc en ratones HemA de control y ratones HemA agotados en macrófagos/células de Kupffer.
La FIG. 60 muestra el aclaramiento de rFVIII y rFVIIIFc en ratones DKO de control (ratones que carecen de FVIII y VWF) y ratones DKO agotados en macrófagos/células de Kupffer.
La FIG. 61 muestra el aclaramiento de rFVIII y rFVIIIFc en ratones FcRn-KO de control (ratones que carecen del receptor de reciclaje de FcRn) y ratones FcRn-KO agotados en macrófagos/células de Kupffer.
La FIG. 62 muestra títulos de Bethesda de ratones nacidos de madres inmunizadas el día 16 de gestación con la sustancia farmacológica de FVIII indicada o Control (no tratados). El panel A muestra el diseño experimental, que representa los tiempos de tratamiento y la dosis de rFVIIIFc o XYNTHA® (BDD-FVIII) para ratones preñados y cachorros nacidos de ellos. Los paneles B y C muestran títulos de Bethesda para rFVIIIFc de crías nacidas de ratones tratados con rFVIIIFc, tratados con XYNTHA® o Control (no tratados), agrupados según la cohorte de tratamiento (Panel B) o agrupados por madres individuales (Panel C).
La FIG. 63 muestra los títulos de Bethesda de ratones nacidos de madres inmunizadas los días 15-17 de gestación con la sustancia farmacológica de FVIII indicada o Control (no tratados). El panel A muestra el diseño experimental, que representa los tiempos de tratamiento y la dosis de rFVIIIFc o XYNTHA® (BDD-FVIII) para ratones preñados y cachorros nacidos de ellos. Los paneles B y C muestran títulos de Bethesda para rFVIIIFc de cachorros nacidos de ratones tratados con rFVIIIFc, tratados con XYNTHA® o Control (no tratados), agrupados según la cohorte de tratamiento (Panel B) o agrupados por madres individuales (Panel C).
Las FIGS. 64A y 64B muestran la expresión de CD80 y CD274 en la superficie de las células dendríticas, respectivamente, determinada por tinción de esplenocitos de ratones tratados con 100 UI/kg de rFVIIIFc, FVIII agotado en dominio B (BDD-FVIII; XYNTHA®) o FVIII de longitud completa (fl-FVIII; ADVATE®) para estos dos antígenos junto con CD11c y MHC Clase II. Los resultados muestran el porcentaje de esplenocitos ± EMT (n = 7-9; *p < 0,05 frente a vehículo; fp < 0,05 frente a rFVIIIFc; prueba T). Las FIGS. 64C y 64D muestran niveles de expresión de ARNm de CD274 e IDO1, respectivamente, determinados por PCR en tiempo real a partir de esplenocitos normalizados a niveles de GAPDH. Las barras representan niveles de expresión relativa (2-ñCt) ± EMT (n = 4-9; *p < 0,05 frente a vehículo; fp < 0,05 frente a rFVIIIFc; prueba T).
La FIG. 65 muestra un mapa de calor que representa los perfiles de expresión de todos los genes en una matriz de PCR en tiempo real entre los tres grupos testados, es decir, esplenocitos de vehículo, ratones HemA tratados con 50 UI/kg y 250 UI/kg de rFVIIIFc. Se utilizó ADNc de cada una de las muestras para vigilar la expresión de genes individuales utilizando una matriz de PCR en tiempo real que consiste en genes enfocados en la tolerancia y moléculas asociadas a anergia.
La FIG. 66 muestra un perfil de expresión de genes candidatos que se identificaron como regulados al alza o a la baja por los esplenocitos de ratones HemA tratados con 50 UI/kg de rFVIIIFc y comparación con el grupo tratado con rFVIIIFc de 250 UI/kg. Los resultados ilustran el cambio en la expresión de genes por encima del grupo de vehículo. El corte para el cambio de veces en la regulación se tomó como 2, es decir, el cambio de veces por encima de 2 se consideró como regulación al alza y por debajo de 0,5 como regulación a la baja. Todos los genes candidatos que pertenecen al grupo de 50 UI/kg aquí mostrados estaban significativamente regulados (p < 0,05 frente al vehículo, así como el grupo de 250 UI/kg; n = 8-11).
La FIG. 67 muestra una comparación del perfil de proliferación de células T entre ratones HemA que recibieron dos inyecciones semanales de 50 UI/kg o 250 UI/kg de rFVIIIFc. Las barras representan la disminución en MFI de CFSE con respecto al control en células T ± EMT (*p < 0.05, prueba T, n = 3-5) de los grupos de 250 UI/kg y 50 UI/kg.
La FIG. 68A-D muestra perfiles de secreción de IFNy de células T de ratones HemA que recibieron dos inyecciones semanales de 250 UI/kg de rFVIIIFc (FIG. 68A), 50 UI/kg de rFVIIIFc (FIG. 68B), 250 UI/kg de rFVIIIFc-N297A (FIG.
68C) o 50 UI/kg de rFVIIIFc-N297A (FIG. 68D). Las barras representan veces por encima del vehículo de secreción de iFny ± EMT (*p <0,05, prueba T; n = 3-5).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente divulgación proporciona un polipéptido quimérico para inducir tolerancia inmunitaria a FVIII.
El tratamiento de la hemofilia A es mediante terapia de reemplazo que fija como objetivo la restauración de la actividad del FVIII a 1 hasta 5% de los niveles normales para prevenir un sangrado espontáneo (Mannucci, P.M. et al., N. Engl. J. Med, 344:1773-9 (2001). Hay disponibles productos de FVIII derivados de plasma y recombinantes para tratar episodios de sangrado a demanda o para prevenir que ocurran episodios de sangrado mediante un tratamiento profiláctico. Basado en la corta semivida de estos productos (8-12 horas) (White G.C., et al., Thromb. Haemost. 77:660-7 (1997); Morfini, M., Haemophilia 9 (supl. 1):94-99; discusión 100 (2003)), los regímenes de tratamiento requieren una administración intravenosa frecuente, comúnmente dos a tres veces por semana para la profilaxis y de una a tres veces al día para el tratamiento a demanda (Manco-Johnson, M.J., et al., N. Engl. J. Med.
357:535-544 (2007)). Una administración frecuente de este tipo es dolorosa e inconveniente. Otro desafío importante asociado con los productos de FVIII actualmente disponibles es el desarrollo de anticuerpos anti-FVIII neutralizantes en pacientes que reciben terapias con FVIII. Las respuestas inmunitarias inhibitorias de FVIII pueden comprender anticuerpos anti-Factor VIII y/o respuestas inmunitarias mediadas por células.
La presente divulgación proporciona un método de administración de FVIII a un sujeto humano en necesidad del mismo (p. e j, paciente humano) que está en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria de FVIII inhibitoria. El método comprende la administración de un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción de Fc.
En algunas realizaciones, la administración del polipéptido quimérico reduce el número de anticuerpos contra FVIII en el sujeto en comparación con el número antes de la administración. En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico se administra a un sujeto con una respuesta inmunitaria de FVIII inhibitoria, y la administración puede reducir la respuesta inmunitaria inhibitoria. La respuesta inmunitaria de FVIII inhibitoria puede ser una respuesta inmunitaria de un anticuerpo inhibitorio y/o una respuesta inmunitaria mediada por células. La administración de un polipéptido quimérico de acuerdo con los métodos proporcionados en esta memoria puede disminuir o neutralizar la respuesta inmunitaria inhibitoria. Por lo tanto, en algunas realizaciones, anticuerpos anti-FVIII disminuyen o se eliminan en un sujeto después de la administración de un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción de Fc. La disminución puede ser, por ejemplo, una reducción del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%.
En algunas realizaciones, la administración del polipéptido quimérico reduce el título de los anticuerpos contra FVIII en el sujeto en comparación con el título antes de la administración. En algunas realizaciones, el título de anticuerpos anti-FVIII disminuye en un sujeto después de la administración de un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción de Fc. Por consiguiente, la administración de un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción de Fc puede reducir los inhibidores a menos de 20, menos de 10, menos de 5, menos de 4, menos de 3, menos de 2, menos de 1 o menos de 0,6 Unidades Bethesda (UB).
En algunas realizaciones, la administración del polipéptido quimérico reduce el nivel de una citoquina en el sujeto en comparación con el nivel de antes de la administración. En algunas realizaciones, los niveles de citoquinas disminuyen en un sujeto después de la administración de un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción de Fc. La citoquina puede ser, por ejemplo, IL-12, IL-4 y/o TNF-a. La disminución puede ser, por ejemplo, una reducción del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%.
En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico se administra a un sujeto que previamente desarrolló una respuesta inmunitaria de FVIII inhibitorio. La administración de un polipéptido quimérico a sujetos de este tipo, de acuerdo con los métodos proporcionados en esta memoria, puede dar como resultado una respuesta inmunitaria disminuida en comparación con la respuesta previa. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se producen menos anticuerpos anti-FVIII en un sujeto después de la administración de un polipéptido quimérico de acuerdo con los presentes métodos que los que se produjeron después de la administración de un polipéptido que consiste en un polipéptido de FVIII. En algunas realizaciones, la administración del polipéptido quimérico reduce el número de anticuerpos contra FVIII en el sujeto en comparación con el número en el sujeto después de un tratamiento previo con un polipéptido que consiste en un polipéptido de FVIII.
En algunas realizaciones, la administración del polipéptido quimérico que reduce el título de anticuerpos frente a FVIII en el sujeto en comparación con el título en el sujeto después de un tratamiento previo con un polipéptido que consiste en un polipéptido de FVIII. En algunas realizaciones, el título de anticuerpos anti-FVIII es menor en un sujeto después de la administración de un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción de Fc que el que se produjo después de la administración de un polipéptido que consiste en un polipéptido de FVIII. En algunas realizaciones, la administración del polipéptido quimérico reduce el nivel de una citoquina en el sujeto en comparación con el nivel en el sujeto después de un tratamiento previo con un polipéptido que consiste en un polipéptido de FVIII. En algunas realizaciones, los niveles de citoquinas (p. ej., IL-12, IL-4 y/o TNF-a) son más bajos en un sujeto después de la administración de un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción de Fc que los niveles después de la administración de un polipéptido que consiste en un polipéptido de FVIII.
En algunas realizaciones, la administración del polipéptido quimérico que reduce el número de anticuerpos anti­ factor de coagulación en el sujeto en comparación con el número que resultaría de la administración de un polipéptido que consiste en la porción de factor de coagulación o un polipéptido que comprende la porción de factor de coagulación, pero que no comprende la porción de Fc para el sujeto. En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico se administra a un sujeto que no ha desarrollado previamente una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII. La administración de un polipéptido quimérico a sujetos de este tipo, de acuerdo con los métodos proporcionados en esta memoria, puede dar como resultado una respuesta inmunitaria más baja que la que resultaría de la administración de un polipéptido que consiste en un polipéptido de FVIII. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se producen menos anticuerpos anti-FVIII en un sujeto después de la administración de un polipéptido quimérico de acuerdo con los presentes métodos que los que se producirían mediante la administración de un polipéptido que consiste en un polipéptido de FVIII.
En algunas realizaciones, la administración del polipéptido quimérico reduce el título de anticuerpos anti-factor de coagulación en el sujeto en comparación con el título que resultaría de la administración de un polipéptido que consiste en la porción de factor de coagulación o un polipéptido que comprende la porción de factor de coagulación, pero que no comprende la porción de Fc para el sujeto. En algunas realizaciones, el título de anticuerpos anti-FVIII es menor en un sujeto después de la administración de un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción de Fc que el que se produciría mediante la administración de un polipéptido que consiste en un polipéptido de FVIII. En algunas realizaciones, la administración del polipéptido quimérico reduce el nivel de una citoquina (p. ej., IL-12, IL-4 y/o TNF-a) en el sujeto en comparación con el nivel que resultaría de la administración de un polipéptido que consiste en la porción de factor de coagulación o un polipéptido que comprende la porción de factor de coagulación, pero que no comprende la porción de Fc para el sujeto. En algunas realizaciones, los niveles de citoquinas (p. ej., IL-12, IL-4 y/o TNF-a) son más bajos en un sujeto después de la administración de un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción de Fc de lo que serían después de la administración de un polipéptido que consiste en un polipéptido de FVIII.
Los métodos de la presente divulgación pueden comprender, además, antes de la administración del polipéptido quimérico, identificar que el sujeto tiene una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: (a) tiene una mutación o deleción en el gen que codifica la factor de coagulación; (b) tiene un reordenamiento en el gen que codifica el factor de coagulación; (c) tiene un pariente que ha desarrollado previamente una respuesta inmunitaria inhibitoria contra el factor de coagulación; (d) está recibiendo terapia con interferón; (e) está recibiendo terapia anti­ viral; (f) tiene una mutación genética en un gen distinto del gen que codifica el factor de coagulación que está relacionado con un mayor riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria; y (g) tiene dos o más combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación genética en un gen distinto del gen que codifica el factor de coagulación que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: (i) un polimorfismo genético asociado con un TNF-a incrementado; (ii) un polimorfismo genético asociado con una IL10 incrementada; (iii) un polimorfismo genético asociado con una CTLA-4 disminuida; (iv) una mutación en moléculas DR15 o DQB0602 MHC Clase II; y (v) dos o más combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el polimorfismo que está asociado con un TNF-a incrementado es 308G>A. En algunas realizaciones, el polimorfismo asociado con la IL10 incrementada es el alelo 134 del microsatélite IL10G.
La presente divulgación también proporciona un método de administrar FVIII a un sujeto humano en necesidad del mismo (p. ej., paciente humano), que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido FVIII-Fc quimérico, en un intervalo de dosificación al menos aproximadamente una vez y media más largo que el intervalo de dosificación requerido para una dosis equivalente de dicho FVIII sin la porción Fc (un polipéptido que consiste en dicha porción de FVIII). La presente divulgación también está dirigida a un método para aumentar el intervalo de dosificación de la administración de FVIII en un sujeto humano que lo necesite, que comprende administrar el polipéptido quimérico de FVIII.
El intervalo de dosificación puede ser al menos aproximadamente una y media a seis veces más largo, una y media a cinco veces más largo, una y media a cuatro veces más largo, una y media a tres veces más largo o una y media a dos veces más largo que el intervalo de dosificación requerido para una dosis equivalente de dicho FVIII sin la porción Fc (un polipéptido que consiste en dicha porción de FVIII). El intervalo de dosificación puede ser al menos aproximadamente una y media, dos, dos y media, tres, tres y media, cuatro, cuatro y media, cinco, cinco y media o seis veces más largo que el intervalo de dosificación requerido para una dosis equivalente de dicho FVIII sin la porción Fc (un polipéptido que consiste en dicha porción de FVIII). El intervalo de dosificación puede ser aproximadamente cada tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días o más.
El intervalo de dosificación puede ser de al menos aproximadamente uno y medio a 5, uno y medio, 2, 3, 4 o 5 días o más.
La presente divulgación también proporciona un método de administrar FVIII a un sujeto humano que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido quimérico de FVIII-Fc, o un híbrido de un polipéptido de este tipo para obtener un área bajo el curva de concentración plasmática frente al tiempo (AUC) al menos aproximadamente una vez y un cuarto mayor que la AUC obtenida por una dosis equivalente de dicho FVIII sin la porción de Fc (un polipéptido que consiste en dicha porción de FVIII). Por lo tanto, la presente divulgación incluye un método para aumentar o extender la AUC de la actividad del FVIII en un paciente humano que lo necesite, que comprende administrar el polipéptido quimérico de FVIII.
La presente divulgación también proporciona un método de administrar FVIII a un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una dosis terapéutica de un polipéptido que comprende un FVIII y un Fc o un híbrido de un polipéptido de este tipo en un intervalo de dosificación de aproximadamente cada tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días o más.
Los métodos descritos en esta memoria se pueden poner en práctica en un sujeto en necesidad de tratamiento profiláctico o tratamiento a demanda.
"Administrar", tal como se utiliza en esta memoria, significa dar un polipéptido de FVIII farmacéuticamente aceptable descrito en esta memoria a un sujeto a través de una vía farmacéuticamente aceptable. Las vías de administración pueden ser intravenosa, p. ej., inyección intravenosa e infusión intravenosa. Vías de administración adicionales incluyen, p. ej., administración subcutánea, intramuscular, oral, nasal y pulmonar. Polipéptidos quiméricos y proteínas híbridas se pueden administrar como parte de una composición farmacéutica que comprende al menos un excipiente.
"Área bajo la curva de concentración plasmática frente al tiempo (AUC)", tal como se utiliza en esta memoria, es el mismo que el término de la técnica en farmacología, y se basa en la velocidad y el grado de absorción de FVIII después de la administración. El AUC se determina a lo largo de un período de tiempo específico, tal como 12, 18, 24, 36, 48 o 72 horas, o para el infinito mediante extrapolación basada en la pendiente de la curva. A menos que se especifique lo contrario en esta memoria, el AUC se determina para infinito. La determinación del AUC se puede llevar a cabo en un solo sujeto, o en una población de sujetos para los que se calcula el promedio.
Un "dominio B" de FVIII, tal como se utiliza en esta memoria, es el mismo que el dominio B conocido en la técnica que se define por identidad interna de la secuencia de aminoácidos y los sitios de escisión proteolítica por parte de la trombina, p. ej., los residuos Ser741-Arg1648 de FVIII humano de longitud completa. Los otros dominios del FVIII humano están definidos por los siguientes residuos de aminoácidos: A1, residuos Ala1-Arg372; A2, residuos Ser373-Arg740; A3, residuos Ser1690-Ile2032; C1, residuos Arg2033-Asn2172; C2, residuos Ser2173-Tyr2332. La secuencia A3-C1-C2 incluye los residuos Ser1690-Tyr2332. A la secuencia restante, los residuos Glu1649-Arg1689, se la alude habitualmente como el péptido de activación de la cadena ligera de FVIII. Las ubicaciones de los límites para todos los dominios, incluyendo los dominios B, para el FVIII porcino, de ratón y canino también se conocen en la técnica. En una realización, el dominio B para el FVIII se elimina ("FVIII agotado en dominio B" o "BDD FVIII").
Un ejemplo de un BDD FVIII es REFACTO® (BDD FVIII recombinante), que tiene la misma secuencia que la porción de FVIII de la secuencia en la TABLA 2A(i) (aminoácidos 1 a 1457 o 20 a 1457 de SEQ ID NO: 2). En otra realización, el FVIII agotado en dominio B contiene un sitio de procesamiento intracelular intacto, que corresponde a Arginina en el residuo 754 del FVIII agotado en dominio B, que corresponde al residuo 773 de Arginina de SEQ ID NO: 2, o el residuo 1648 de FVIII de longitud completa, que corresponde al residuo Arginina 1667 de SEQ ID NO: 6. Los números de residuo de secuencia utilizados en esta memoria sin hacer referencia a cualesquiera SEQ ID Números corresponden a la secuencia de FVIII sin la secuencia del péptido señal (19 aminoácidos) a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo, S743/Q1638 de FVIII de longitud completa corresponde a S762/Q1657 de SEQ ID NO: 6 debido a la secuencia del péptido señal de 19 aminoácidos.
Un "FVIII agotado en dominio B " puede tener las deleciones completas o parciales descritas en las patentes de EE.UU. N°s 6.316.226, 6.346.513, 7.041.635, 5.789.203, 6.060.447, 5.595.886, 6.228.620, 5.972.885, 6.048.720, 5.543.502, 5.610.278, 5.171.844, 5.112.950, 4.868.112 y 6.458.563, cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad en esta memoria como referencia. En algunas realizaciones, una secuencia de FVIII agotada en el dominio B comprende una cualquiera de las deleciones descritas en la col. 4, línea 4 hasta la col. 5, línea 28 y los Ejemplos 1-5 de la patente de e E.UU. N° 6.316.226 (también en la patente de EE.UU. 6.346.513). En algunas realizaciones, un FVIII agotado en el dominio B tiene una deleción descrita en la col. 2, líneas 26-51 y los Ejemplos 5-8 de la Patente de EE.UU. N25.789.203 (también en las patentes de EE.UU. 6.060.447, US 5.595.886 y US 6.228.620).
En algunas realizaciones, un FVIII agotado en el dominio B tiene una deleción descrita en la col. 1, líneas 25 a la col.
2, línea 40 de la Patente de EE.UU. N° 5.972.885; col. 6, líneas 1-22 y el Ejemplo 1 de la patente de EE.UU. N° 6.048.720; col. 2, líneas 17-46 de la Patente de EE.UU. N° 5.543.502; col. 4, línea 22 a col. 5, línea 36 de la patente de EE.UU. N° 5.171.844; col. 2, líneas 55-68, Figura 2 y Ejemplo 1 de la patente de EE.UU. N° 5.112.950; col. 2, línea 2 a col. 19, línea 21 y tabla 2 de la patente de EE.u U. N° 4.868.112; col. 2, línea 1 a col. 3, línea 19, col. 3, línea 40 a col. 4, línea 67, col. 7, línea 43 a col. 8, línea 26 y col. 11, línea 5 a col. 13, línea 39 de la patente de EE.UU. N° 7.041.635; o col. 4, líneas 25-53, de la patente de EE.UU. N° 6.458.563. En algunas realizaciones, un FVIII agotado en el dominio B tiene una deleción de la mayor parte del dominio B, pero aún contiene secuencias amino-terminales del dominio B que son esenciales para el procesamiento proteolítico in vivo del producto de traducción primario en dos cadenas polipeptídicas (es decir, sitio de procesamiento intracelular), como se describe en el documento WO 91/09122.
En algunas realizaciones, un FVIII agotado en el dominio B se construye con una deleción de los aminoácidos 747­ 1638, es decir, virtualmente una deleción completa del dominio B. Hoeben R.C. et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318­ 7323 (1990). FVIII agotado en el dominio A B también puede contener una deleción de los aminoácidos 771-1666 o los aminoácidos 868-1562 de FVIII. Meulien P. et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Deleciones adicionales del dominio B que forman parte de la presente divulgación incluyen, p. ej.: deleción de los aminoácidos 982 a 1562 o 760 a 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 5939-5942 (1986)), 797 a 1562 (Eaton et al., Biochemistry 25:8343-8347 (1986)), 741 a 1646 (Kaufman (solicitud PCT publicada N2 WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver et al., DNA 6:553-564 (1987)), 741 a 1648 (Pasek (solicitud PCT N288/00831)), 816 a 1598 o 741 a 1689 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) N° 82:16-25, documento Ep 295597)). Cada una de las deleciones anteriores se puede realizar en cualquier secuencia del FVIII.
En una realización, la porción de FVIII agotada en dominio B en el polipéptido quimérico se procesa en dos cadenas conectadas (o asociadas) por un enlace de metal, comprendiendo la primera cadena una cadena pesada (A1-A2-parcial B) y una segunda cadena que comprende una cadena ligera (A3-C1-C2). En otra realización, la porción de FVIII agotada en el dominio B es un FVIII de cadena sencilla. El FVIII de cadena sencilla puede comprender un sitio de procesamiento intracelular, que corresponde a Arginina en el residuo 754 del FVIII agotado en el dominio B (residuo 773 de SEQ ID NO: 2) o en el residuo 1648 de FVIII de longitud completa (residuo 1657 de SEQ ID NO: 6).
El enlace de metal entre la cadena pesada y la cadena ligera puede ser cualquier metal conocido en la técnica. Por ejemplo, el metal puede ser un ión metálico divalente. Los metales que pueden utilizarse para asociar la cadena pesada y la cadena ligera incluyen, pero no se limitan a, Ca2+, Mn2+ o Cu2+. Fatouros et al., Intern. J. Pharm. 155(1): 121-131 (1997); Wakabayashi et al., JBC. 279 (13): 12677-12684 (2004).
En algunas realizaciones, la porción de FVIII en el polipéptido quimérico comprende el dominio A1 de FVIII. En algunas realizaciones, la porción de FVIII en el polipéptido quimérico comprende el dominio A2 de FVIII. En algunas realizaciones, la porción de FVIII en el polipéptido quimérico comprende el dominio A3 de FVIII. En algunas realizaciones, la porción de FVIII en el polipéptido quimérico comprende el dominio C1 de FVIII. En algunas realizaciones, la porción de FVIII en el polipéptido quimérico comprende el dominio C2 de FVIII.
"Polipéptido quimérico", tal como se utiliza en esta memoria, significa un polipéptido que incluye dentro del mismo al menos dos polipéptidos (o subsecuencias o péptidos) de diferentes fuentes. Los polipéptidos quiméricos pueden incluir, p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más polipéptidos de diferentes fuentes, tales como diferentes genes, diferentes ADNc o diferentes animales u otras especies. Los polipéptidos quiméricos pueden incluir, p. ej., uno o más enlazadores que unen a las diferentes subsecuencias. Por lo tanto, las subsecuencias pueden unirse directamente o pueden unirse indirectamente, mediante enlazadores, o ambos, dentro de un único polipéptido quimérico. Los polipéptidos quiméricos pueden incluir, p. ej., péptidos adicionales tales como secuencias señal y secuencias tales como 6His y FLAG que ayudan en la purificación o detección de proteínas. Además, los polipéptidos quiméricos pueden tener adiciones de aminoácidos o péptidos a los extremos N y/o C.
Polipéptidos quiméricos de FVIII-Fc ejemplares incluyen, p. ej., SEQ ID NOs: 2 o 6 (TABLA 2), con o sin sus secuencias señal y el polipéptido Fc quimérico de SEQ ID NO: 4 (TABLA 2).
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "porción", cuando se aplica a un polipéptido quimérico se refiere a uno de los componentes o restos de un polipéptido quimérico de este tipo (p. ej., "un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción de Fc", o "la porción de FVIII del polipéptido quimérico"). En otras palabras, el término "porción" se utiliza para indicar la fuente de diferentes componentes en el polipéptido quimérico, pero no se utiliza para indicar un fragmento de la proteína FVIII o un fragmento de una región Fc.
El polipéptido quimérico puede comprender una secuencia al menos 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de FVIII y de Fc mostrada en la Tabla 2A(i) sin una secuencia señal (aminoácidos 20 a 1684 de la SEQ ID NO: 2) o al menos 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de FVIII y de Fc mostrada en la TABLA 2A(i) con una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1684 de SEQ ID NO: 2), en donde la secuencia tiene actividad de FVIII. La actividad de FVIII se puede medir mediante un ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activado (aPPT), un ensayo cromogénico u otros métodos conocidos. El polipéptido quimérico puede comprender una secuencia idéntica a la secuencia de aminoácidos de FVIII y de Fc mostrada en la TABLA 2A(i) sin una secuencia señal (aminoácidos 20 a 1684 de SEQ ID NO: 2) o idéntica a la secuencia de aminoácidos de FVIII y Fc mostrado en la TABLA 2A(i) con una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1684 de SEQ ID NO: 2).
En algunas realizaciones, la porción de FVIII comprende un dominio A3 de FVIII. En algunas realizaciones, la porción de FVIII comprende FVIII humano. En algunas realizaciones, la porción de FVIII tiene una deleción total o parcial del dominio B. En algunas realizaciones, la porción de FVIII es al menos 90% o 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de FVIII mostrada en la TABLA 2 sin una secuencia señal (aminoácidos 20 a 1457 de la SEQ ID NO: 2; aminoácidos 20 a 2351 de la SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones, la porción de FVIII es idéntica a una secuencia de aminoácidos de FVIII mostrada en la TABLA 2 sin una secuencia señal (aminoácidos 20 a 1457 de SEQ ID NO: 2 o aminoácidos 20 a 2351 de SEQ ID NO: 6). La porción de FVIII es al menos 90% o 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de FVIII mostrada en la TABLA 2 con una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1457 de SEQ ID NO: 2 o aminoácidos 1 a 2351 de SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones, la porción de FVIII es idéntica a una secuencia de aminoácidos de FVIII mostrada en la TABLA 2 con una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1457 de SEQ ID NO: 2 o aminoácidos 1 a 2351 de SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones, la porción de FVIII tiene actividad de coagulación.
En algunas realizaciones, la porción de Fc es idéntica a la secuencia de aminoácidos de Fc mostrada en la TABLA 2 (aminoácidos 1458 a 1684 de la SEQ ID NO: 2 o aminoácidos 2352 a 2578 de la SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico está en forma de un híbrido que comprende un segundo polipéptido en asociación con el polipéptido quimérico, donde el segundo polipéptido consiste esencialmente en o consiste en la porción de Fc o el participante en la unión de FcRn.
En algunas realizaciones, un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII tiene una semivida (t1/2) incrementada con respecto a un polipéptido que consiste en la misma porción de FVIII sin la porción no FVIII. A un polipéptido de FVIII quimérico con una t1/2 incrementada se le puede aludir en esta memoria como un FVIII de acción prolongada. Los polipéptidos de FVIII quiméricos de acción prolongada incluyen, p. ej., FVIII condensado a Fc (incluyendo, p. ej., polipéptidos de FVIII quiméricos en forma de un híbrido tal como un híbrido de monómero y dímero de FVI11 Fc; véase el Ejemplo 1, Fig. 1 y la Tabla 2A; y las Patentes de EE.UU. N°s 7.404.956 y 7.348.004), y FVIII condensado a albúmina.
"Cultivo", "cultivar" y "cultivando", tal como se utiliza en esta memoria, significa incubar células bajo condiciones in vitro que permitan el crecimiento celular o la división o mantener las células en un estado vivo. "Células cultivadas", tal como se utiliza en esta memoria, significa células que se propagan in vitro.
"Factor VIII", abreviado a lo largo de toda la presente solicitud como "FVIII", tal como se utiliza en esta memoria, significa un polipéptido FVIII funcional en su papel normal en la coagulación, a menos que se especifique lo contrario. Por lo tanto, el término FVIII incluye variantes de polipéptidos que son funcionales. Las proteínas FVIII pueden ser las proteínas FVIII humana, porcina, canina y murina. Como se describe en la sección de Antecedentes de la Técnica, se conocen las secuencias de polipéptidos y polinucleótidos de longitud completa, al igual que muchos fragmentos funcionales, mutantes y versiones modificadas. Ejemplos de secuencias de FVIII humano se muestran como subsecuencias en SEQ ID NOs: 2 o 6 (TABLA 2). Los polipéptidos de FVIII incluyen, p. ej., FVIII de longitud completa, FVIII de longitud completa menos Met en el extremo N, FVIII maduro (menos la secuencia señal), FVIII maduro con un Met adicional en el extremo N y/o FVIII con una deleción total o parcial del dominio B. Variantes de FVIII incluyen deleciones del dominio B, ya sean deleciones parciales o totales.
Se conoce un gran número de variantes de FVIII funcionales, tal como se discute arriba y más adelante. Además, se han identificado cientos de mutaciones no funcionales en el FVIII en pacientes con hemofilia, y se ha determinado que el efecto de estas mutaciones en la función del FVIII se debe más a dónde se encuentran dentro de la estructura tridimensional del FVIII que a la naturaleza de la sustitución (Cutler etal., Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)). Además, las comparaciones entre FVIII de seres humanos y otras especies han identificado residuos conservados que probablemente sean necesarios para la función (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); documento US 6.251.632).
El gen FVIII humano fue aislado y expresado en células de mamífero (Toole, J.J., et al, Nature 312: 342-347 (1984); Gitschier, J., et al, Nature 312:326-330 (1984); Wood, W.I., et al., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G.A., et a l, Nature 312: 337-342 (1984); documentos WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; Pat. de EE.UU. N2 4.757.006), y la secuencia de aminoácidos se dedujo del ADNc. Capon et al., Pat. de EE.UU. 4.965.199, describe un método de ADN recombinante para producir FVIII en células huésped de mamífero y la purificación de FVIII humano. Se ha informado de la expresión de FVIII humano en células CHO (ovario de hámster chino) y BHKC (células de riñón de hámster bebé). Se ha modificado el FVIII humano para eliminar parte o todo el dominio B (Pat. de EE.UU. N°s 4.994.371 y 4.868.112, y se ha realizado la sustitución del dominio B de FVIII humano con el dominio B del factor V humano (Pat. de EE.UU. N° 5.004.803). La secuencia de ADNc que codifica el FVIII humano y la secuencia de aminoácidos predicha se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, de la Publ. de Solicitud de EE.UU. N22005/0100990.
La Pat. de EE.UU. N° 5.859.204, Lollar, J.S. , informa mutantes funcionales de FVIII que tienen antigenicidad reducida e inmunorreactividad reducida. La Pat. de EE.UU. N° 6.376.463, Lollar, J.S., también informa de mutantes de FVIII que tienen inmunorreactividad reducida. Publ. de Solicitud de EE.UU. N° 2005/0100990, Saenko et al., informa de mutaciones funcionales en el dominio A2 del FVIII.
Un cierto número de moléculas de FVIII funcionales, incluyendo deleciones en el dominio B, se describen en las siguientes patentes de EE.UU. 6.316.226 y EE.UU. 6.346.513, ambas otorgadas a Baxter; patente de EE.UU.
7.041.635 otorgada a In2Gen; patentes de EE.UU. 5.789.203, EE.UU. 6.060.447, EE.UU. 5.595.886 y EE.UU.
6.228.620 otorgadas a Chiron; patentes de EE.UU. 5.972.885 y EE.UU. 6.048.720 otorgadas a Biovitrum, patentes de EE.UU. 5.543.502 y EE.UU. 5.610.278 otorgadas a Novo Nordisk; patente de EE.UU. 5.171.844 otorgada a Immuno Ag; patente de EE.UU. 5.112.950 otorgada a Transgene S.A.; patente de EE.UU. 4.868.112 otorgada a Genetics Institute.
La secuencia de FVIII porcino está publicada (Toole, J.J., et al, Proc Natl Acad Sci USA 93:5939-5942 (1986)), y la secuencia completa de ADNc porcino se obtuvo de la amplificación por PCR de secuencias de FVIII de una colección de ADNc de bazo de cerdo (Healey, J.F. et al., Blood 55:4209-4214 (1996)). En la Pat. de EE.UU. N° 5.364.771 de Lollar y Runge y en el documento WO 93/20093 se describió FVIII humano/porcino híbrido con sustituciones de todos los dominios, todas las subunidades y secuencias de aminoácidos específicos. Más recientemente, las secuencias de nucleótidos y las correspondientes secuencias de aminoácidos de los dominios A1 y A2 del FVIII porcino y un FVIII quimérico con los dominios A1 y/o A2 porcinos sustituidos con los correspondientes dominios humanos se reseñaron en el documento WO 94/11503. La patente de EE.UU. N° 5.859.204, Lollar, J.S., también describe el ADNc porcino y secuencias de aminoácidos deducidas. La Pat. de EE.UU. 6.458.563, otorgada a Emory, describe un FVIII porcino agotado en el dominio B.
El FVIII (o porción de FVIII de un polipéptido quimérico) puede ser al menos 90% o 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de FVIII mostrada en la TABLA 2 sin una secuencia señal (aminoácidos 20 a 1457 de la SEQ ID NO: 2 y aminoácidos 20 a 2351 de la SEQ ID NO: 6), en donde dicha porción de FVIII tiene actividad de FVIII. El FVIII (o la porción de FVIII de un polipéptido quimérico) puede ser idéntico a una secuencia de aminoácidos de FVIII mostrada en la TABLA 2 sin una secuencia señal (aminoácidos 20 a 1457 de la SEQ ID NO: 2; y aminoácidos 20 a 2351 de la SEQ ID NO: 6).
El FVIII (o porción de FVIII de un polipéptido quimérico) puede ser al menos 90% o 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de FVIII mostrada en la Tabla 2 con una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1457 SEQ ID NO: 2 y aminoácidos 1 a 2351 de SEQ ID NO: 6), en donde dicha porción de FVIII tiene actividad de FVIII. El FVIII (o la porción de FVIII de un polipéptido quimérico) puede ser idéntico a una secuencia de aminoácidos de FVIII mostrada en la TABLA 2 con una secuencia señal (aminoácidos 1 a 1457 de la SEQ ID NO: 2 y aminoácidos 1 a 2351 de la SEQ ID NO: 6).
El Factor VII (FVII, F7; también denominado Factor 7, factor de coagulación VII, factor VII sérico, acelerador de la conversión de protrombina sérica, SPCA, proconvertina y eptacog alfa) es una serina proteasa que es parte de la cascada de la coagulación. El FVII incluye un dominio Gla, dos dominios EGF (EGF-1 y EGF-2) y un dominio de serina proteasa (o dominio de peptidasa S1) que está altamente conservado entre todos los miembros de la familia de serina proteasas de la peptidasa S1, tales como, por ejemplo, con quimotripsina. El FVII se presenta como un zimógeno de cadena sencilla, un polipéptido de doble cadenas similar al zimógeno activado y una forma de doble cadena completamente activada. Tal como se utiliza en esta memoria, una proteína o polipéptido "similar a un zimógeno" se refiere a una proteína que ha sido activada por escisión proteolítica, pero que aún exhibe propiedades que están asociadas con un zimógeno, tal como, por ejemplo, baja o nula actividad, o una conformación que se asemeja a la conformación de la forma zimógena de la proteína. Por ejemplo, cuando no está unido al factor tisular, la forma activada de doble cadena de FVII es una proteína de tipo zimógeno; conserva una conformación similar al zimógeno de FVII no escindido y, por lo tanto, exhibe una actividad muy baja. Al unirse al factor tisular, la forma activada de doble cadena del FVII sufre un cambio conformacional y adquiere toda su actividad como un factor de coagulación. Variantes de FVII ejemplares incluyen aquellas con actividad específica incrementada, p. ej., mutaciones que aumentan la actividad de FVII aumentando su actividad enzimática (Kcat o Km). Variantes de este tipo se han descrito en la técnica e incluyen, p. ej., formas mutantes de la molécula tal como se describe, por ejemplo, en Persson et al. 2001. PNAS 98:13583; Petrovan y Ruf. 2001. J. Biol. Chem. 276:6616; Persson et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:29195; Soejima et al. 2001. J. Biol. Chem. 276:17229; Soejima et al. 2002. J. Biol. Chem.
247:49027. En una realización, una forma variante de FVII incluye las mutaciones. Mutaciones ejemplares incluyen V158D-E296V-M298Q. En otra realización, una forma variante de FVII incluye un reemplazo de los aminoácidos 608-619 (LQQSRKVGDSPN, correspondiente al bucle 170) de la secuencia madura de FVII con los aminoácidos EASYPGK del bucle 170 de tripsina. También se conocen en la técnica variantes de alta actividad específica de FIX. Por ejemplo, Simioni et al. (2009 N.E. Journal of Medicine 361:1671) describen una mutación R338L. Chang et al. (1988 JBC 273:12089) y Pierri et al. (2009 Human Gene Therapy 20:479) describen una mutación R338A. Se conocen otras mutaciones en la técnica e incluyen las descritas, p. ej., en Zogg y Brandstetter. 2009 Structure 17:1669; Sichler et al. 2003. J. Biol. Chem. 278:4121; y Sturzebecher et al. 1997. FEBS Lett 412:295. La activación completa, que se produce tras el cambio conformacional de una forma similar a un zimógeno, se produce tras la unión a su cofactor tisular. Además, se pueden introducir mutaciones que den como resultado el cambio de conformación en ausencia de factor tisular. Por lo tanto, la referencia a FVIIa incluye una forma similar a un zimógeno, una forma de doble cadena completamente activada o una forma activable. Un "Factor VII activable" es Factor VII en una forma inactiva (p. ej., en su forma de zimógeno) que es capaz de convertirse en una forma activa.
El Factor IX circula como un zimógeno plasmático de cadena sencilla, de 415 aminoácidos (A. Vysotchin et al., J. Biol. Chem. 268, 8436 (1993)). El zimógeno de FIX es activado por FXIa o por el complejo de factor tisular/FVIIa. Escisiones específicas entre arginina-alanina 145-146 y arginina-valina 180-181 dan como resultado una cadena ligera y una cadena pesada enlazadas por un solo enlace disulfuro entre la cisteína 132 y la cisteína 289 (S. Bajaj et al., Biochemistry 22, 4047 (1983)).
La organización estructural del FIX es similar a la de las proteínas FVII, FX y la proteína C de coagulación de la sangre dependiente de la vitamina K (B. Furie y B. Furie, supra). Los aproximadamente 45 aminoácidos del extremo amino comprenden el dominio del ácido gamma-carboxiglutámico o Gla. A éste le siguen dos dominios de homología del factor de crecimiento epidérmico (EGF), un péptido de activación y la "cadena pesada" catalítica que es un miembro de la familia de las serina proteasas (A. Vysotchin et al., J. Biol. Chem. 268, 8436 (1993); S. Spitzer et al., Biochemical Journal 265, 219 (1990); H. Brandstetter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 92, 9796 (1995)).
"Dosis equivalente", tal como se utiliza en esta memoria, significa la misma dosis de la actividad de FVIII tal como se expresa en Unidades Internacionales, que es independiente del peso molecular del polipéptido en cuestión. Una Unidad Internacional (UI) de actividad de FVIII corresponde aproximadamente a la cantidad de FVIII en un mililitro de plasma humano normal. Hay disponibles varios ensayos para medir la actividad del FVIII, incluyendo el ensayo de sustrato cromogénico de la Farmacopea Europea y un ensayo de coagulación de una etapa.
"Fc", tal como se utiliza en esta memoria, significa participantes en la unión del receptor Fc neonatal funcional (FcRn), a menos que se especifique lo contrario. Un participante en la unión del FcRn es cualquier molécula que pueda unirse específicamente al receptor de FcRn con el consiguiente transporte activo por el receptor FcRn del participante en la unión de FcRn. Por lo tanto, el término Fc incluye cualquier variante de IgG Fc que sea funcional. La región de la porción Fc de la IgG que se une al receptor FcRn ha sido descrita basándose en cristalografía de rayos X (Burmeister et al., Nature 372: 379 (1994)). El área de contacto principal del Fc con el FcRn está cerca de la unión de los dominios CH2 y CH3. Los contactos Fc-FcRn están todos dentro de una única cadena pesada de Ig. Los participantes en la unión de FcRn incluyen, p. ej., IgG completa, el fragmento Fc de IgG y otros fragmentos de IgG que incluyen la región de unión completa de FcRn. Los principales sitios de contacto incluyen los residuos de aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 del dominio CH2 y los residuos de aminoácidos 385-387, 428 y 433-436 del dominio CH3.
Las referencias hechas a la numeración de los aminoácidos de inmunoglobulinas o fragmentos o regiones de inmunoglobulinas se basan todas en Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud Pública de EE.UU., Bethesda; MD, incorporadas en esta memoria en su totalidad como referencia. (El receptor FcRn ha sido aislado de varias especies de mamíferos, incluyendo los seres humanos. Se conocen las secuencias del FcRn humano, FcRn de rata y FcRn de ratón (Story et al., J. Exp. Med. 180:2377 (1994)). Un Fc puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina con o sin la región bisagra de la inmunoglobulina Se proporcionan variantes de Fc ejemplares en los documentos WO 2004/101740 y WO 2006/074199.
Un Fc (o porción Fc de un polipéptido quimérico) puede contener una o más mutaciones y combinaciones de mutaciones. P. ej., un Fc (o porción Fc de un polipéptido quimérico) puede contener mutaciones que confieren una semivida incrementada, tales como M252Y, S254T, T256E y combinaciones de las mismas, tasl como se describe en Oganesyan et al., Mol. Immunol. 46: 1750 (2009); H433K, N434F y combinaciones de las mismas tal como se describe en Vaccaro et al., Nat. Biotechnol. 23:1283 (2005), los mutantes descritos en las páginas 1-2, párrafo [0012], y los Ejemplos 9 y 10 de la Publ. de Solicitud de EE.u U. N° 2009/0264627 A1, y los mutantes descritos en la página 2, párrafos [0014] a [0021] de la Publ. de Solicitud de EE.UU. N° 20090163699 A 1.
Fc (o la porción Fc de un polipéptido quimérico) también puede incluir, p. ej., las siguientes mutaciones: la región Fc de IgG puede modificarse de acuerdo con procesos bien reconocidos tales como mutagénesis dirigida al sitio y similares para producir IgG modificada o fragmentos Fc o porciones de los mismos que se unirán a FcRn. Modificaciones de este tipo incluyen, p. ej., modificaciones alejadas de los sitios de contacto de FcRn, así como modificaciones dentro de los sitios de contacto que preservan o incluso mejoran la unión al FcRn. Por ejemplo, los siguientes residuos de aminoácidos individuales en IgG1 humana Fc (Fcy1) pueden sustituirse sin una pérdida significativa de la afinidad de unión de Fc por FcRn: P238A, S239A, K246A, k 248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, A330S, P331A, P331S, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A y K447A, en que, por ejemplo, P238A representa prolina de tipo salvaje sustituida con alanina en la posición 238. Además de alanina otros aminoácidos pueden ser sustituidos con los aminoácidos de tipo salvaje en las posiciones arriba especificadas.
Las mutaciones se pueden introducir por separado en Fc, dando lugar a más de un centenar de participantes en la unión de FcRn distintos de Fc nativo. Adicionalmente, las combinaciones de dos, tres o más de estas mutaciones individuales pueden introducirse juntas, dando lugar a cientos de participantes en la unión de FcRn más. Determinadas de estas mutaciones pueden conferir una nueva funcionalidad al participante en la unión de FcRn. Por ejemplo, una realización incorpora N297A, eliminando un sitio de N-glicosilación altamente conservado. El efecto de esta mutación es reducir la inmunogenicidad, potenciando con ello la semivida circulante del participante en la unión de FcRn, y hacer que el participante en la unión de FcRn sea incapaz de unirse a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA, sin comprometer la afinidad por FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847, Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591).
Adicionalmente, al menos tres receptores Fc gamma humano parecen reconocer un sitio de unión en IgG dentro de la región bisagra inferior, generalmente los aminoácidos 234-237. Por lo tanto, puede surgir otro ejemplo de nueva funcionalidad y potencial inmunogenicidad disminuida a partir de mutaciones de esta región, tal como, por ejemplo, al reemplazar los aminoácidos 233-236 de la IgG1 humana "ELLG" por la secuencia correspondiente de IgG2 "PVA" (con una deleción de un aminoácido). Se ha demostrado que FcyRI, FcyRII y FcyRIII, que median en diversas funciones efectoras, no se unirán a IgG1 cuando se hayan introducido mutaciones de este tipo (Ward y Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77 (1995); y Armor et al., Eur. J Immunol. 29: 2613 (1999)). Como un ejemplo adicional de nueva funcionalidad que surge de las mutaciones arriba descritas, la afinidad por FcRn puede incrementarse más allá de la del tipo salvaje en algunos casos. Esta afinidad incrementada puede reflejar una tasa de "encendido" incrementada, una tasa de "apagado" disminuida o tanto una tasa de "encendido" incrementada como una tasa de "apagado" disminuida. Mutaciones que se cree que imparten una afinidad incrementada por FcRn incluyen, p. e j, T256A, T307A, E380A y N434A (Shields et a l, J. Biol. Chem. 276:6591 (2001)).
El Fc (o porción Fc de un polipéptido quimérico) puede ser al menos 90% o 95% idéntica al Fc de la secuencia de aminoácidos mostrada en la TABLA 2 (aminoácidos 1458 a 1684 de la SEQ ID NO: 2 o aminoácidos 2352 a 2578 de SEQ ID NO: 6). El Fc (o porción Fc de un polipéptido quimérico) puede ser idéntico a la secuencia de aminoácidos Fc mostrada en la TABLA 2 (aminoácidos 1458 a 1684 de SEQ ID NO: 2 y aminoácidos 2352 a 2578 de SEQ ID NO: 6).
Polipéptidos y proteínas "híbridos", tal como se utiliza en esta memoria, significa una combinación de un polipéptido quimérico con un segundo polipéptido. El polipéptido quimérico y el segundo polipéptido en un híbrido pueden asociarse entre sí mediante interacciones proteína-proteína, tales como interacciones carga-carga o hidrófobas. El polipéptido quimérico y el segundo polipéptido en un híbrido pueden asociarse entre sí mediante enlace o enlaces disulfuro u otro(s) enlace(s) covalente(s). Los híbridos se describen en los documentos WO 2004/101740 y WO 2006/074199. Véanse también las Patentes de EE.UU. N°s 7.404.956 y 7.348.004. El segundo polipéptido puede ser una segunda copia del mismo polipéptido quimérico o puede ser un polipéptido quimérico no idéntico. Véase, p. ej., la FIG. 1, el Ejemplo 1 y la TABLA 2.
En una realización, el segundo polipéptido es un polipéptido que comprende un Fc. En otra realización, el polipéptido quimérico es un polipéptido quimérico de FVIII-Fc y el segundo polipéptido consiste esencialmente en Fc, p. ej., el polipéptido híbrido del Ejemplo 1, que es una proteína de fusión recombinante de rFVIIIFc que consiste en una sola molécula de FVIII humano eliminado el dominio B, recombinante (BDD-rFVIII) condensada al dominio Fc dimérico de la IgG1 humana, sin secuencia enlazadora intermedia. A este polipéptido híbrido se le alude en esta memoria como proteína de fusión de Fc monomérica FVIIIFc, híbrido de monómero de FVIIIFc, híbrido de FVIIIIFc monomérico y monómero-dímero de FVIIIFc. Véase el Ejemplo 1, la Fig. 1 y la TABLA 2A. Los Ejemplos proporcionan datos preclínicos y clínicos para este polipéptido híbrido.
El segundo polipéptido en un híbrido puede comprender o consistir esencialmente en una secuencia al menos 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2A(ii) sin una secuencia señal (aminoácidos 21 a 247 de la SEQ ID NO: 4) o al menos 90% o 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la TABLA 2A(ii) con una secuencia señal (aminoácidos 1 a 247 de SEQ ID NO: 4). El segundo polipéptido puede comprender o consistir esencialmente en una secuencia idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la TABLA 2A(ii) sin una secuencia señal (aminoácidos 21 a 247 de SEQ ID NO: 4) o idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la TABLA 2A(ii) con una secuencia señal (aminoácidos 1 a 247 de SEQ ID NO: 4).
La FIG. 1 es un esquema que muestra la estructura de un polipéptido quimérico de FVIII-Fc con el dominio B suprimido, y su asociación con un segundo polipéptido que es un polipéptido Fc. Para obtener este híbrido, se obtuvo la secuencia codificante del FVIII con el dominio B recombinante humano suprimido mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) a partir de ARN poli A de hígado humano (Clontech) utilizando cebadores específicos para FVIII. La secuencia de FVIII incluye la secuencia señal nativa para FVIII. La deleción del dominio B fue de la serina 743 (S743; 2287 pb) a la glutamina 1638 (Q1638; 4969 pb) para una deleción total de 2682 pb. A continuación, se obtuvo la secuencia codificante de Fc recombinante humano mediante RT-PCR a partir de una colección de ADNc de leucocitos humanos (Clontech) utilizando cebadores específicos para Fc. Los cebadores se diseñaron de manera que la secuencia de FVIII con el dominio B suprimido se condensara directamente con el extremo N de la secuencia de Fc sin un enlazador intermedio. La secuencia de ADN de FVIIIFc se clonó en el vector de expresión dual de mamífero pBUDCE4.1 (Invitrogen) bajo el control del promotor de CMV. Se obtuvo una segunda secuencia Fc idéntica que incluía la secuencia señal de Igk de ratón mediante RT-PCR y se clonó aguas abajo del segundo promotor, EF1a, en el vector de expresión pBUDCE4.1.
El vector de expresión rFVIIIFc se transfectó en células 293 de riñón embrionario humano (HEK293H; Invitrogen) utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Se generaron líneas celulares clonales estables mediante selección con Zeocin (Invitrogen). Se utilizó una línea celular clonal, 3C4-22, para generar FVIIIFc
para la caracterización in vivo. Se produjo y purificó FVIIIFc recombinante (McCue et al. 2009) en Biogen Idec
(Cambridge, MA). Se esperaba que la estrategia de transfección arriba descrita proporcionara tres productos, es
decir, híbridos de rFVIIIFc monoméricos, híbridos de rFVIIIFc diméricos y Fc dimérico. Sin embargo, no se detectó
esencialmente rFVIIIFc dimérico en el medio acondicionado de estas células. Más bien, el medio acondicionado
contenía Fc y rFVIIIFc monomérico. Es posible que el tamaño del rFVIIIFc dimérico fuera demasiado grande e
impidiera una secreción eficaz de la célula. Este resultado fue beneficioso, ya que hizo que la purificación del
monómero fuera menos complicada que si las tres proteínas hubieran estado presentes. El material utilizado en
estos estudios tuvo una actividad específica de aproximadamente 9000 UI/mg.
"Intervalo de dosificación", tal como se utiliza en esta memoria, significa la dosis de tiempo que transcurre entre
múltiples dosis que se administran a un sujeto. La comparación del intervalo de dosificación se puede realizar en un
solo sujeto o en una población de sujetos y luego se puede calcular el promedio obtenido en la población.
El intervalo de dosificación cuando se administra un polipéptido FVIII-Fc quimérico (o un híbrido) de la presente
divulgación puede ser al menos aproximadamente una y media veces más largo que el intervalo de dosificación
requerido para una dosis equivalente de dicho FVIII sin la porción Fc (un polipéptido que consiste en dicho FVIII). El
intervalo de dosificación puede ser al menos aproximadamente una y media a seis veces más largo, una y media a
cinco veces más largo, una y media a cuatro veces más largo, una y media a tres veces más largo o una y media a
dos veces más largo que el intervalo de dosificación requerido para una dosis equivalente de dicho FVIII sin la
porción de Fc (un polipéptido que consiste en dicho FVIII).
El intervalo de dosificación puede ser al menos aproximadamente una y media, dos, dos y media, tres, tres y media,
cuatro, cuatro y media, cinco, cinco y media o seis veces más largo que el intervalo de dosificación requerido para
una dosis equivalente de dicho FVIII sin la porción de Fc (un polipéptido que consiste en dicho FVIII). El intervalo de
dosificación puede ser aproximadamente cada tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o
catorce días o más. El intervalo de dosificación puede ser de al menos aproximadamente uno y medio a 5, uno y
medio, 2, 3, 4 o 5 días o más. Para el tratamiento a demanda, el intervalo de dosificación de dicho polipéptido
quimérico o híbrido es aproximadamente una vez cada 24-36, 24-48, 24-72, 24-96, 24-120, 24-144, 24-168, 24, 25,
26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 o 72 horas o más.
En una realización, la dosis efectiva es 25-65 UI/kg (25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,
42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 o 65 UI/kg) y el intervalo de
dosificación es una vez cada 3-5, 3-6, 3-7, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 o más días, o tres veces por semana, o no más de tres
veces por semana. En otra realización, la dosis eficaz es 65 UI/kg y el intervalo de dosificación es una vez a la
semana o una vez cada 6-7 días. Las dosis se pueden administrar repetidamente siempre que sean necesarias (p.
e j, al menos 10, 20, 28, 30, 40, 50, 52 o 57 semanas, al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 años).
En determinadas realizaciones, la dosis eficaz para el tratamiento a demanda es 20-50 UI/kg (20, 21, 22, 23, 24, 25,
26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 UI/kg). El tratamiento
a demanda puede ser una dosificación única o una dosificación repetida. Para la dosificación repetida, el intervalo de
dosificación puede ser cada 12-24 horas, cada 24-36 horas, cada 24-48 horas, cada 36-48 horas o cada 48-72
horas. Por consiguiente, la expresión "dosificación repetida" se refiere a la administración de más de una dosis a lo
largo de un período de tiempo. Las dosis administradas bajo un régimen de "dosificación repetida" se denominan
"dosis repetidas". En algunas realizaciones, cada una de las dosis repetidas está separada de otra por al menos
aproximadamente 12 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente dos días, al menos
aproximadamente tres días, al menos aproximadamente cuatro días, al menos aproximadamente cinco días, al
menos aproximadamente seis días, al menos aproximadamente siete días, al menos aproximadamente ocho días, al
menos aproximadamente nueve días, al menos aproximadamente diez días, al menos aproximadamente 11 días, al
menos aproximadamente 12 días, al menos aproximadamente 13 días, al menos aproximadamente 14 días o al
menos aproximadamente 15 días. En algunas realizaciones, las dosis repetidas comprenden al menos
aproximadamente dos dosis, al menos aproximadamente cinco dosis, al menos aproximadamente 10 dosis, al
menos aproximadamente 20 dosis, al menos aproximadamente 25 dosis, al menos aproximadamente 30 dosis, al
menos aproximadamente 35 dosis, al menos aproximadamente 40 dosis, al menos aproximadamente 45 dosis, al
menos aproximadamente 50 dosis, al menos aproximadamente 55 dosis, al menos aproximadamente 60 dosis, al
menos aproximadamente 65 dosis o al menos aproximadamente 70 dosis. Las dosis repetidas comprenden de
aproximadamente dos dosis hasta aproximadamente 100 dosis, de aproximadamente cinco dosis hasta
aproximadamente 80 dosis, de aproximadamente 10 dosis hasta aproximadamente 70 dosis, de aproximadamente
10 dosis hasta aproximadamente 60 dosis, de aproximadamente 10 dosis hasta aproximadamente 50 dosis, de
aproximadamente 15 dosis hasta aproximadamente 40 dosis, de aproximadamente 15 dosis hasta
aproximadamente 30 dosis, de aproximadamente 20 dosis hasta aproximadamente 30 dosis o de aproximadamente
20 dosis hasta aproximadamente 40 dosis. Las dosis repetidas comprenden aproximadamente dos dosis,
aproximadamente cinco dosis, aproximadamente 10 dosis, aproximadamente 15 dosis, aproximadamente 20 dosis, aproximadamente 25 dosis, aproximadamente 30 dosis, aproximadamente 35 dosis, aproximadamente 40 dosis, aproximadamente 45 dosis, aproximadamente 50 dosis, aproximadamente 55 dosis, aproximadamente 60 dosis, aproximadamente 65 dosis, aproximadamente 70 dosis, aproximadamente 75 dosis, aproximadamente 80 dosis, aproximadamente 90 dosis o aproximadamente 100 dosis.
En algunas realizaciones, se administra al sujeto además, después de las repetidas dosis, una composición farmacéutica que comprende una proteína de factor de coagulación que comprende el factor de coagulación, pero no comprende una porción Fc. Este factor de coagulación puede ser un factor de coagulación de longitud completa o maduro. En algunas realizaciones, dicho factor de coagulación puede ser ADVATE®, RECOMBINATE®, KOGENATE FS®, HELIXATE FS®, XYNTHA®/REFACTO AB®, HEMOFIL-M®, MONARC-M®, MONOCLATE-P®, HUMATE-P®, ALPHANATE®, KOATE-DVI® y HYATE: C®.
Las expresiones "acción prolongada" y "larga duración" se utilizan indistintamente en esta memoria. "Factores de coagulación de larga duración" o "factores de coagulación de acción prolongada" (p. ej., FVII de acción prolongada, FVIII de acción prolongada y FIX de acción prolongada) son factores de coagulación, p. e /, FVII, FVIII o FIX, que tienen una semivida incrementada (a la que también se alude en esta memoria como t1/2 , t 1/2 beta, semivida de eliminación y HL) sobre un factor de coagulación de referencia, p. e j, FVII, FVIII o FIX. La actividad “más larga” de FVIII se puede medir por cualquier método conocido en la técnica, p. ej., el ensayo de aPTT, ensayo cromogénico, ROTEM, TGA y etc. En una realización, la actividad “larga” de FVIII puede mostrarse por la (actividad) T1/2 beta. En otra realización, la actividad "larga" de FVIII puede mostrarse por el nivel de antígeno de FVIII presente en el plasma, p. ej., por el (antígeno) T1/2 beta. En otras realizaciones, el polipéptido de FVIII de acción prolongada o de larga duración funciona durante más tiempo en una cascada de coagulación, p. ej., es activo durante un período más largo en comparación con un polipéptido de FVIII de tipo salvaje, REFACTO® o ADVATE®.
La semivida incrementada de un factor de coagulación de acción prolongada, p. ej., un FVIII de acción prolongada, puede deberse a la fusión con uno o más polipéptidos del factor de no coagulación, tales como, p. ej., Fc. La semivida incrementada puede deberse a una o más modificaciones, tales como, p. ej., pegilación. Factores de coagulación de acción prolongada ejemplares (p. ej., polipéptidos de FVIII de acción prolongada) incluyen, p. ej., factores de coagulación quiméricos (p. ej., polipéptidos de FVIII quiméricos que comprenden Fc) y factores de coagulación quiméricos que comprenden albúmina (p. ej., polipéptidos de FVIII quiméricos que comprenden albúmina). Factores de coagulación de acción prolongada ejemplares adicionales (p. ej., polipéptidos de FVIII de acción prolongada) incluyen, p. ej., factores de coagulación pegilados (p. ej., FVIII pegilado).
El polipéptido de "referencia", p. ej., en el caso de un factor de coagulación quimérico de acción prolongada (p. ej., un polipéptido FVIII quimérico de acción prolongada), es un polipéptido que consiste esencialmente en la porción de factor de coagulación del polipéptido quimérico. Por ejemplo, en el caso de un FVIII de acción prolongada, el polipéptido de referencia es la porción de FVIII del polipéptido quimérico, p. ej., la misma porción de FVIII sin la porción de Fc o sin la porción de albúmina. Asimismo, el polipéptido de referencia en el caso de un FVIII modificado es el mismo FVIII sin la modificación, p. ej., un FVIII sin la pegilación.
En algunas realizaciones, el FVIII de acción prolongada tiene una o más de las siguientes propiedades cuando se administra a un sujeto:
un tiempo medio de permanencia (MRT) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 14-41,3 horas; un aclaramiento (CL) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 1,22-5,19 mL/hora/kg o menos; un t 1/2 beta (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 11-26,4 horas;
una recuperación incremental (valor K) (actividad; observada) en dicho sujeto de aproximadamente 1,38­ 2,88 UI/dL por UI/kg;
una Vss (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 37,7-79,4 mL/kg; y
un AUC/dosis en dicho sujeto de aproximadamente 19,2-81,7 UI*h/dL por UI/kg.
En algunas realizaciones, el FVIII de acción prolongada tiene una o más de las siguientes propiedades cuando se administra a una población de pacientes:
una recuperación incremental media (Valor K) (actividad; observada) superior a 1,38 UI/dL por UI/kg; una recuperación incremental media (Valor K) (actividad; observada) de al menos aproximadamente 1,5, al menos aproximadamente 1,85 o al menos aproximadamente 2,46 UI/dL por UI/kg.
un aclaramiento medio (CL) (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 2,33 ± 1,08 mL/hora/kg o menos;
un aclaramiento medio (CL) (actividad) en dicha población de pacientes de aproximadamente 1,8-2,69 mL/hora/kg;
un aclaramiento medio (CL) (actividad) en dicha población de pacientes que es aproximadamente el 65% del aclaramiento de un polipéptido que comprende dicho FVIII sin modificación;
un tiempo medio de permanencia (MRT) (actividad) en dicha población de pacientes de al menos aproximadamente 26,3 ± 8,33 horas;
un MRT (actividad) medio en dicha población de pacientes de aproximadamente 25,9 - 26,5 horas; un MRT (actividad) medio en dicha población de pacientes que es aproximadamente 1,5 veces más largo que el MRT medio de un polipéptido que comprende dicho FVIII sin modificación;
una t1/2beta (actividad) media en dicha población de pacientes de aproximadamente 18,3 ± 5,79 horas;
una t1/2beta (actividad) media en dicha población de pacientes que es de aproximadamente 18 - 18,4 horas;
una t1/2beta (actividad) media en dicha población de pacientes que es aproximadamente 1,5 veces más larga que la t1/2beta media de un polipéptido que comprende dicho FVIII sin modificación;
una recuperación incremental media (valor K) (actividad; observada) en dicha población de pacientes de aproximadamente 2,01 ± 0,44 UI/dL por UI/kg;
una recuperación incremental media (valor K) (actividad; observada) en dicha población de pacientes de aproximadamente 1,85 - 2,46 UI/dL por UI/kg;
una recuperación incremental media (valor K) (actividad; observada) en dicha población de pacientes que es aproximadamente el 90% de la recuperación incremental media de un polipéptido que comprende dicho
FVIII sin modificación;
una Vss (actividad) media en dicha población de pacientes de aproximadamente 55,1 ± 12,3 mL/kg;
una Vss (actividad) media en dicha población de pacientes de aproximadamente 45,3 - 56,1 mL/kg;
una AUC/dosis (actividad) media en dicha población de pacientes de aproximadamente 49,9 ± 18,2 UI*h/dL por UI/kg.
una AUC/dosis (actividad) media en dicha población de pacientes de aproximadamente 44,8 - 57,6 UI*h/dL por UI/kg.
En otras realizaciones, el FVIII de acción prolongada tiene una o más de las siguientes propiedades cuando se administra a una población de pacientes:
una Cmax_OBS en dicho sujeto al que se ha administrado el polipéptido quimérico que es equiparable a la Cmax_OBS en un sujeto al que se ha administrado la misma cantidad de un polipéptido que consiste en el FVIII maduro de longitud completa cuando se mide mediante un ensayo de una etapa (aPTT) o un ensayo de dos etapas (cromogénico);
una Cmax_OBS en dicho sujeto de aproximadamente 60,5 UI/dL, aproximadamente 60,5 ± 1 UI/dL, aproximadamente 60,5 ± 2 UI/dL, aproximadamente 60,5 ± 3 UI/dL, aproximadamente 60,5 ± 4 UI/dL, aproximadamente 60,5 ± 5 UI/dL, aproximadamente 60,5 ± 6 UI/dL, aproximadamente 60,5 ± 7 UI/dL, aproximadamente 60,5 ± 8 UI/dL, aproximadamente 60,5 ± 9 UI/dL o aproximadamente 60,5 ± 10 UI/dL medida por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
una Cmax_OBS en dicho sujeto de aproximadamente 53,1 - 69 UI/dL medida por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 25 UI / kg del polipéptido quimérico;
una Cmax_OBS en dicho sujeto de aproximadamente 119 UI/dL, aproximadamente 119 ± 1 UI/dL, aproximadamente 119 ± 2 UI/dL, aproximadamente 119 ± 3 UI/dL, aproximadamente 119 ± 4 UI/dL, aproximadamente 119 ± 5 UI/dL, aproximadamente 119 ± 6 UI/dL, aproximadamente 119 ± 7 UI/dL, aproximadamente 119 ± 8 UI/dL, aproximadamente 119 ± 9 UI/dL, aproximadamente 119 ± 10 UI/dL, aproximadamente 119 ± 11 UI/dL, aproximadamente 119 ± 12 UI/dL, aproximadamente 119 ± 13 UI/dL, aproximadamente 119 ± 14 UI/dL, aproximadamente 119 ± 15 UI/dL, aproximadamente 119 ± 16 UI/dL, aproximadamente 119 ± 17 UI/dL o aproximadamente 119 ± 18 UI / dL, medida por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico;
una Cmax_OBS en dicho sujeto de aproximadamente 103-136 UI/dl, medida por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico;
una Cmax_OBS en dicho sujeto de aproximadamente 76,5 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 1 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 2 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 3 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 4 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 5 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 6 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 7 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 8 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 9 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 10 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 11 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 12 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 13 UI/dL, aproximadamente 76,5 ± 14 UI/dL o aproximadamente 76,5 ± 15 UI/dL, medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
una Cmax_OBS en dicho sujeto de aproximadamente 64,9 - 90,1 UI/dL medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
una Cmax_ OBS en dicho sujeto de aproximadamente 182 UI/dL, aproximadamente 182 ± 2 UI/dL, aproximadamente 182 ± 4 UI/dL, aproximadamente 182 ± 6 UI/dL, aproximadamente 182 ± 8 UI/dL, aproximadamente 182 ± 10 UI/dL, aproximadamente 182 ± 12 UI/dL, aproximadamente 182 ± 14 UI/dL, aproximadamente 182 ± 16 UI/dL, aproximadamente 182 ± 18 UI/dL o aproximadamente 182 ± 20 UI/dL medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico; o
una Cmax_OBS en dicho sujeto de aproximadamente 146 - 227 UI/dL, aproximadamente 146 ± 5 UI/dL, aproximadamente 146 ± 10 UI/dL, aproximadamente 227 ± 5 UI/dL o aproximadamente 146 ± 10 UI/dL medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico.
En determinadas realizaciones, el FVIII de acción prolongada tiene una o más de las siguientes propiedades cuando se administra a una población de pacientes:
una t1/2beta (actividad) en dicho sujeto que es al menos 1,48, 1,49, 1,50, 1,51, 1,52, 1,53, 1,54, 1,55, 1,56, 1.57, 1,58, 1,59, 1,60, 1,61, 1,62, 1,63, 1,64, 1,65, 1,66, 1,67, 1,68, 1,69, 1,70, 1,71, 1,72, 1,73, 1,74, 1,75, 1,76, 1.77, 1,78, 1,79, 1,80, 1,81, 1,82, 1,83, 1,84, 1,85, 1,86, 1,87, 1,88, 1,89 o 1,90 veces mayor que la t 1/2beta (actividad) en un sujeto al que se le administró la misma cantidad de un polipéptido que consiste en el FVIII maduro de longitud completa cuando se mide mediante un ensayo de una etapa (aPTT) o un ensayo de dos etapas (cromogénico);
una t 1/2beta (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 18,8 horas, 18,8 ± 1 hora, 18,8 ± 1 hora, 18,8 ± 2 horas, 18,8 ± 3 horas, 18,8 ± 4 horas, 18,8 ± 5 horas, 18,8 ± 6 horas, 18,8 ± 7 horas, 18,8 ± 8 horas, 18,8 ± 9 horas, 18,8 ± 10 horas o 18,8 ± 11 horas, medida por un ensayo de una etapa (aPTT);
una t 1/2beta (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 14,3 - 24,5 horas, medida por un ensayo de una etapa (aPTT);
una t1/2 beta (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 16,7 horas, 16,7 ± 1 horas, 16,7 ± 2 horas, 16.7 ± 3 horas, 16,7 ± 4 horas, 16,7 ± 5 horas, 16,7 ± 6 horas, 16,7 ± 7 horas, 16,7 ± 8 horas, 16,7 ± 9 horas, 16,7 ± 10 horas o 16,7 ± 11 horas, medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico);
una t 1/2beta (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 13,8 - 20,1 horas, medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico);
una t1/2beta (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 19,8 horas, 19,8 ± 1 horas, 19,8 ± 2 horas, 19.8 ± 3 horas, 19,8 ± 4 horas, 19,8 ± 5 horas, 19,8 ± 6 horas, 19,8 ± 7 horas, 19,8 ± 8 horas, 19,8 ± 9 horas, 19,8 ± 10 horas o 19,8 ± 11 horas, medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico); o
una t 1/2beta (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 14,3 - 27,5 horas, medida mediante un ensayo de dos etapas (cromogénico).
En determinadas realizaciones, el FVIII de acción prolongada tiene una o más de las siguientes propiedades cuando se administra a una población de pacientes:
un aclaramiento (CL) (actividad) en dicho sujeto es 0,51,0,52, 0,53, 0,54, 0,55, 0,56, 0,57, 0,58, 0,59, 0,60, 0,61, 0,62, 0,63, 0,64, 0,65, 0,66, 0,67, 0,68, 0,69 o 0,70 veces menor que el aclaramiento en un sujeto al que se le administró la misma cantidad de un polipéptido que consiste en el FVIII maduro de longitud completa cuando se mide mediante un ensayo de una etapa (aPTT) o un ensayo de dos etapas (cromogénico);
un aclaramiento (CL) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 1,68 mL/hora/kg, 1,68 ± 0,1 mL/hora/kg, 1,68 ± 0,2 mL/hora/kg, 1,68 ± 0,3 mL/hora/kg, 1,68 ± 0,4 mL/hora/kg, 1,68 ± 0,5 mL/hora/kg, 1,68 ± 0,6 mL/hora/kg o 1,68 ± 0,7 mL/hora/kg, medido por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se adiministran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
un aclaramiento (CL) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 1,31 - 2,15 mL/hora/kg medido por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 25 UI / kg del polipéptido quimérico;
un aclaramiento (CL) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 2,32 mL/hora/kg, 2,32 ± 0,1 mL/hora/kg, 2,32 ± 0,2 mL/hora/kg, 2,32 ± 0,3 mL/hora/kg, 2,32 ± 0,4 mL/hora/kg, 2,32 ± 0,5 mL/hora/kg, 2,32 ± 0,6 mL/hora/kg o 2,32 ± 0,7 mL/hora/kg, medido por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico;
un aclaramiento (CL) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 1,64 - 3,29 mL/hora/kg medido por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico;
un aclaramiento (CL) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 1,49 mL/hora/kg, 1,49 ± 0,1 mL/hora/kg, 1,49 ± 0,2 mL/hora/kg, 1,49 ± 0,3 mL/hora/kg, 1,49 ± 0,4 mL/hora/kg, 1,49 ± 0,5 mL/hora/kg, 1,49 ± 0,6 mL/hora/kg o 1,49 ± 0,7 mL/hora/kg, medido por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
un aclaramiento (CL) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 1,16 - 1,92 mL/hora/kg medido por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
un aclaramiento (CL) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 1,52 mL/hora/kg, 1,52 ± 0,1 mL/hora/kg, 1,52 ± 0,2 mL/hora/kg, 1,52 ± 0,3 mL/hora/kg, 1,52 ± 0,4 mL/hora/kg, 1,52 ± 0,5 mL/hora/kg, 1,52 ± 0,6 mL/hora/kg o 1,52 ± 0,7 mL/hora/kg, medido por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico; o
un aclaramiento (CL) (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 1,05-2,20 mL/hora/kg medido por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico.
En algunas realizaciones, el FVIII de acción prolongada tiene una o más de las siguientes propiedades cuando se administra a una población de pacientes:
un MRT en dicho sujeto es de al menos 1,46, 1,47, 1,48, 1,49, 1,50, 1,51, 1,52, 1,53, 1,54, 1,55, 1,56, 1,57, 1.58, 1,59, 1,60, 1,61, 1,62, 1,63, 1,64, 1,65, 1,66, 1,67, 1,68, 1,69, 1,70, 1,71, 1,72, 1,73, 1,74, 1,75, 1,76, 1,77, 1.78, 1,79, 1,80, 1,81, 1,82, 1,83, 1,84, 1,85, 1,86, 1,87, 1,88, 1,89, 1,90, 1,91, 1,92 o 1,93 veces mayor que el MRT en un sujeto al que se le administró la misma cantidad de un polipéptido que consiste en el FVIII maduro de longitud completa cuando se mide por un ensayo de una etapa (aPTT) o un ensayo de dos etapas (cromogénico); un MRT (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 27 horas, 27 ± 1 horas, 27 ± 2 horas, 27 ± 3 horas, 27 ± 4 horas, 27 ± 5 horas, 27 ± 6 horas, 27 ± 7 horas, 27 ± 8 horas, 27 ± 9 horas o 27 ± 10 horas cuando se mide por un ensayo de una etapa (aPTT);
un MRT (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 20,6 - 35,3 horas, medido por un ensayo de una etapa (aPTT);
un MRT (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 23,9 - 28.5 horas, medido por un ensayo de dos etapas (cromogénico);
un MRT (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 19,8 - 28,9 horas, medido por un ensayo de dos etapas (cromogénico); o
un MRT (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 20,5 - 39.6 horas, medido por un ensayo de dos etapas (cromogénico).
En otras realizaciones, el FVIII de acción prolongada tiene una o más de las siguientes propiedades cuando se administra a una población de pacientes:
una recuperación incremental en dicho sujeto que es equiparable a la recuperación incremental en un sujeto al que se le administra la misma cantidad de un polipéptido que consiste en el FVIII maduro de longitud completa cuando se mide mediante un ensayo de una etapa (aPTT) o un ensayo de dos etapas (cromogénico); una recuperación incremental en dicho sujeto de aproximadamente 2,44 UI/dL por UI/kg, 2,44 ± 0,1 UI/dL por UI/kg, 2,44 ± 0,2 UI/dL por UI/kg, 2,44 ± 0,3 UI/dL por UI/kg, 2,44 ± 0,4 UI/dL por UI/kg, 2,44 ± 0,5 UI/dL por UI/kg, 2,44 ± 0,6 UI/dL por UI/kg, 2,44 ± 0,7 UI/dL por UI/kg, 2,44 ± 0,8 UI/dL por UI/kg, 2,44 ± 0,9 UI/dL por UI/kg, 2,44 ± 1,0 UI/dL por UI/kg, 2,44 ± 1,1 UI/dL por UI/kg o 2,44 ± 1,2 UI/dL por UI/kg medido por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
una recuperación incremental en dicho sujeto de aproximadamente 2,12 - 2,81 UI/dL por UI/kg, medida por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
una recuperación incremental en dicho sujeto de aproximadamente 1,83 UI/dL por UI/kg, 1,83 ± 0,1 UI/dL por UI/kg, 1,83 ± 0,2 UI/dL por UI/kg, 1,83 ± 0,3 UI/dL por UI/kg, 1,83 ± 0,4 UI/dL por UI/kg, 1,83 ± 0,5 UI/dL por UI/kg, 1,83 ± 0,6 UI/dL por UI/kg, 1,83 ± 0,7 UI/dL por UI/kg, 1,83 ± 0,8 UI/dL por UI/kg, 1,83 ± 0,9 UI/dL por UI/kg, 1,83 ± 1,0 UI/dL por UI/kg o 1,83 ± 1,1 UI/dL por UI/kg medida por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico;
una recuperación incremental en dicho sujeto de aproximadamente 1,59 - 2,10 UI/dL por UI/kg, medida mediante un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico;
una recuperación incremental en dicho sujeto de aproximadamente 3,09 UI/dL por UI/kg, 3,09 ± 0,1 UI/dL por UI/kg, 3,09 ± 0,2 UI/dL por UI/kg, 3,09 ± 0,3 UI/dL por UI/kg, 3,09 ± 0,4 UI/dL por UI/kg, 3,09 ± 0,5 UI/dL por UI/kg, 3,09 ± 0,6 UI/dL por UI/kg, 3,09 ± 0,7 UI/dL por UI/kg, 3,09 ± 0,8 UI/dL por UI/kg, 3,09 ± 0,9 UI/dL por UI/kg, 3,09 ± 1,0 UI/dL por UI/kg, 3,09 ± 1,1 UI/dL por UI/kg, 3,09 ± 1,2 UI/dL por UI/kg o 3,09 ± 1,3 UI/dL por UI/kg, medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
una recuperación incremental en dicho sujeto de aproximadamente 2,80 UI/dL por UI/kg, 2,80 ± 0,1 UI/dL por UI/kg, 2,80 ± 0,2 UI/dL por UI/kg, 2,80 ± 0,3 UI/dL por UI/kg, 2,80 ± 0,4 UI/dL por UI/kg, 2,80 ± 0,5 UI/dL por UI/kg, 2,80 ± 0,6 UI/dL por UI/kg, 2,80 ± 0,7 UI/dL por UI/kg, 2,80 ± 0,8 UI/dL por UI/kg, 2,80 ± 0,9 UI/dL por UI/kg, 2,80 ± 1,0 UI/dL por UI/kg, 2,80 ± 1,1 UI/dL por UI/kg o 2,80 ± 1,2 UI/dL por UI/kg, medido por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico;
una recuperación incremental en dicho sujeto de aproximadamente 2,61-3,66 UI/dL por UI/kg medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico; o una recuperación incremental en dicho sujeto de aproximadamente 2,24-3,50 UI/dL por UI/kg medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico.
En aún otras realizaciones, el FVIII de acción prolongada tiene una o más de las siguientes propiedades cuando se administra a una población de pacientes:
una Vss (actividad) en dicho sujeto que es equiparable a la Vss (actividad) en un sujeto al que se le administra la misma cantidad de un polipéptido que consiste en el FVIII maduro de longitud completa cuando se mide por un ensayo de una etapa (aPTT) o un ensayo de dos etapas (cromogénico);
una Vss (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 45,5 mL/kg, 45,5 ± 1 mL/kg, 45,5 ± 2 mL/kg, 45,5 ± 3 mL/kg, 45,5 ± 4 mL/kg, 45,5 ± 5 mL/kg, 45,5 ± 6 mL/kg, 45,5 ± 7 mL/kg, 45,5 ± 8 mL/kg, 45,5 ± 9 mL/kg, 45,5 ± 10 mL/kg o 45,5 ± 11 mL/kg, medida por una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
una Vss (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 39,3 - 52,5 mL/kg, medida por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
una Vss (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 62,8 mL/kg, 62,8 ± 1 mL/kg, 62,8 ± 2 mL/kg, 62,8 ± 3 mL/kg, 62,8 ± 4 mL/kg, 62,8 ± 5 mL/kg, 62,8 ± 6 mL/kg, 62,8 ± 7 mL/kg, 62,8 ± 8 mL/kg, 62,8 ± 9 mL/kg, 62,8 ± 10 mL/kg, 62,8 ± 11 mL/kg, 62,8 ± 12 mL/kg, 62,8 ± 13 mL/kg, 62,8 ± 14 mL/kg, 62,8 ± 15 mL/kg o 62,8 ± 16 mL/kg, medida por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico;
una Vss (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 55,2 - 71,5 mL/kg medida por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico;
una Vss (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 35,9 mL/kg, 35,9 ± 1 mL/kg, 35,9 ± 2 mL/kg, 35,9 ± 3 mL/kg, 35,9 ± 4 mL/kg, 35,9 ± 5 mL/kg, 35,9 ± 6 mL/kg, 35,9 ± 7 mL/kg, 35,9 ± 8 mL/kg, 35,9 ± 9 mL/kg, 35,9 ± 10 mL/kg, 35,9 ± 11 mL/kg, 35,9 ± 12 mL/kg o 35,9 ± 13 mL/kg, medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
una Vss (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 30,4-42,3 mL/kg medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
una Vss (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 43,4 mL/kg, 43,4 ± 1 mL/kg, 43,4 ± 2 mL/kg, 43,4 ± 3 mL/kg, 43,4 ± 4 mL/kg, 43,4 ± 5 mL/kg, 43,4 ± 6 mL/kg, 43,4 ± 7 mL/kg, 43,4 ± 8 mL/kg, 43,4 ± 9 mL/kg, 43,4 ± 10 mL/kg, 43,4 ± 11 mL/kg, 43,4 ± 12 mL/kg, 43,4 ± 13 mL/kg, 43,4 ± 14 mL/kg, 43,4 ± 15 mL/kg o 43,4 ± 16 mL/kg, medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico; o una Vss (actividad) en dicho sujeto de aproximadamente 38,2-49,2 mL/kg, medida por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico.
En aún otras realizaciones, el FVIII de acción prolongada tiene una o más de las siguientes propiedades cuando se administra a una población de pacientes:
un AUCinf en dicho sujeto que es al menos 1,45 1,46, 1,47, 1,48, 1,49, 1,50, 1,51, 1,52, 1,53, 1,54, 1,55, 1,56, 1,57, 1,58, 1,59, 1,60, 1,61, 1,62, 1,63, 1,64, 1,65, 1,66, 1,67, 1,68, 1,69, 1,70, 1,71, 1,72, 1,73, 1,74, 1,75, 1,76, 1,77, 1,78, 1,79, 1,80, 1,81, 1,82, 1,83, 1,84, 1,85, 1,86, 1,87, 1,88, 1,89, 1,90 veces mayor que el AUCinf en un sujeto al que se le administra la misma cantidad de un polipéptido que consiste en el FVIII maduro de longitud completa cuando se mide mediante un ensayo de una etapa (aPTT) o un ensayo de dos etapas (cromogénico);
un AUCinf en dicho sujeto de aproximadamente 1440 ± 316 h* UI/dL por UI/kg medido por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
un AUCinf en dicho sujeto de aproximadamente 1160-1880 h* UI/dL por UI/kg medido por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
un AUCinf en dicho sujeto de aproximadamente 1480 h* UI/dL por UI/kg, 1480 ± 100 h* UI/dL por UI/kg, 1480 ± 200 h* UI/dL por UI/kg, 1480 ± 300 h* UI/dL por UI/kg, 1480 ± 400 h* UI/dL por UI/kg, 1480 ± 500 h* UI/dL por UI/kg, 1480 ± 600 h* UI/dL por UI/kg, 1480 ± 700 h* UI/dL por UI/kg, 1480 ± 800 h* UI/dL por UI/kg, 1480 ± 900 h* UI/dL por UI/kg o 1480 ± 1000 h* UI/dL por UI/kg, medido por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
un AUCinf en dicho sujeto de aproximadamente 2910 ± 1320 h* UI/dL por UI/kg, medido por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico;
un AUCinf en dicho sujeto de aproximadamente 1980 - 3970 h* UI/dL por UI/kg, medido por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico;
un AUCinf en dicho sujeto de aproximadamente 2800 h* UI/dL por UI/kg, 2800 ± 100 h* UI/dL por UI/kg, 2800 ± 200 h* UI/dL por UI/kg, 2800 ± 300 h* UI/dL por UI/kg, 2800 ± 400 h* UI/dL por UI/kg, 2800 ± 500 h* UI/dL por UI/kg, 2800 ± 600 h* UI/dL por UI/kg, 2800 ± 700 h* UI/dL por UI/kg, 2800 ± 800 h* UI/dL por UI/kg, 2800 ± 900 h* UI/dL por UI/kg o 2800 ± 1000 h* UI/dL por UI/kg, medido por un ensayo de una etapa (aPTT) cuando se administran aproximadamente 65 UI/kg del polipéptido quimérico;
un AUCinf en dicho sujeto de aproximadamente 1660 h* UI/dL por UI/kg, 1660 ± 100 h* UI/dL por UI/kg, 1660 ± 200 h* UI/dL por UI/kg, 1660 ± 300 h* UI/dL por UI/kg, 1660 ± 400 h* UI/dL por UI/kg, 1660 ± 500 h* UI/dL por UI/kg, 1660 ± 600 h* UI/dL por UI/kg, 1660 ± 700 h* UI/dL por UI/kg, 1660 ± 800 h* UI/dL por UI/kg, 1660 ± 900 h* UI/dL por UI/kg o 1660 ± 1000 h* UI/dL por UI/kg, medido por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
un AUCinf en dicho sujeto de aproximadamente 1300 - 2120 h* UI/dL por UI/kg medido por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 25 UI/kg del polipéptido quimérico;
un AUCinf en dicho sujeto de aproximadamente 4280 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 100 h* UI/dL por UI/kg, 4280 ± 200 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 300 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 400 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 500 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 600 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 700 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 800 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 900 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 1000 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 1100 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 1200 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 1300 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 1400 h* UI/dL por Ul/kg, 4280 ± 1500 h* UI/dL por Ul/kg o 4280 ± 1600 h* UI/dL por Ul/kg, medido por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 65 Ul/kg del polipéptido quimérico; o un AUCinf en dicho sujeto de aproximadamente 2960 - 6190 h* UI/dL por Ul/kg, medido por un ensayo de dos etapas (cromogénico) cuando se administran aproximadamente 65 Ul/kg del polipéptido quimérico.
"Tratamiento a demanda", tal como se utiliza en esta memoria, significa un tratamiento que está destinado a tener lugar a lo largo de un período corto de tiempo y es en respuesta a una afección existente, tal como un episodio de hemorragia, o una necesidad percibida como cirugía planificada. Las expresiones "tratamiento a demanda" y "tratamiento episódico" se utilizan indistintamente. Las condiciones que pueden requerir tratamiento a demanda (episódico) incluyen, p. ej., un episodio hemorrágico, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia oral, traumatismo, traumatismo capitis, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal o sangrado en la vaina del psoas ilíaco. El sujeto puede necesitar profilaxis quirúrgica, gestión perioperatoria o tratamiento para cirugía. Cirugías de este tipo incluyen, p. ej., cirugía menor, cirugía mayor, extracción de dientes, amigdalectomía, herniotomía inguinal, sinovectomía, reemplazo total de rodilla, craneotomía, osteosíntesis, cirugía del trauma, cirugía intracraneal, cirugía intra-abdominal, cirugía intratorácica o cirugía de reemplazo articular.
En una realización, el tratamiento a demanda (episódico) resuelve más del 80% (más del 80%, más del 81%, más del
82%, más del 83%, más del 84%, más del 85%, más del 86%, más del 87%, más del 88%, más del 89%, más del 90%, más del 91%, más del 92%, más del 93%, más del 94%, más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98%, más del 99% o el 100%) u 80-100%, 80-90%, 85-90%, 90-100%, 90-95% o 95-100% de hemorragias (p. ej., hemorragias espontáneas) en una sola dosis. En otra realización, más del 80% (m ás del 81%, más del 82%, más del 83%, más del
84%, más del 85%, más del 86%, más del 87%, más del 88%, más del 89%, más del 90%, más del 91%, más del 92%, más del 93%, más del 94%, más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o el 100%) u 80-100%, 80-90%, 85-90%, 90-100%, 90-95% o 95-100% de los episodios hemorrágicos son calificados como excelentes o buenos por los médicos después de un tratamiento a demanda (episódico). En otras realizaciones, más del 5% (más del 6%, más del
7%, más del 8%, más del 9%, más del 10%, más del 11 %, más del 12%, más del 13%, más del 14%, más del 15%, más del 16%, más del 17%, más del 18%, más del 19%, más del 20%), o 5-20%, 5-15%, 5-10%, 10-20% o 10-15% de los episodios de sangrado son calificados como regulares por los médicos después del tratamiento a demanda (episódico).
"Polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente y se refieren a un compuesto polimérico que comprende residuos de aminoácidos enlazados de forma covalente.
"Polinucleótido" y "ácido nucleico" se utilizan indistintamente y se refieren a un compuesto polimérico que comprende residuos de nucleótidos enlazados de forma covalente. Los polinucleótidos pueden ser vectores, plásmidos, fagos o virus de ADN, ADNc, ARN, de cadena sencilla o de doble cadena. Los polinucleótidos incluyen, p. ej., los de la TABLA 1, que codifican los polipéptidos de la TABLA 2 (véase la TABLA 1). Los polinucleótidos también incluyen, p. ej., fragmentos de los polinucleótidos de la TABLA 1, p. ej., aquellos que codifican fragmentos de los polipéptidos de la TABLA 2, tales como FVIII, Fc, secuencia señal, 6His y otros fragmentos de los polipéptidos de la TABLA 2.
"Tratamiento profiláctico", tal como se utiliza en esta memoria, significa administrar un polipéptido de FVIII en múltiples dosis a un sujeto a lo largo de un periodo de tiempo para aumentar el nivel de actividad de FVIII en el plasma de un sujeto. El nivel incrementado puede ser suficiente para disminuir la incidencia de sangrado espontáneo o para prevenir sangrados, p. ej., en el caso de una lesión imprevista. Durante el tratamiento profiláctico, el nivel de proteína plasmática en el sujeto no puede caer por debajo del nivel de referencia para ese sujeto, o por debajo del nivel de referencia de FVIII que caracteriza a la hemofilia grave (<1 UI/dl [1%]).
En una realización, el régimen de profilaxis se "elabora a medida" para el paciente individual, por ejemplo, mediante la determinación de los datos PK para cada uno de los pacientes y la administración de FVIII de la presente divulgación en un intervalo de dosificación que mantiene un nivel valle de 1-3% de actividad de FVIII. Se pueden hacer ajustes cuando un sujeto experimenta episodios de sangrado inaceptables definidos como > 2 episodios de sangrado espontáneos a lo largo de un período continuo de dos meses. En este caso, el ajuste fijará como objetivo niveles valle de 3-5%. En otra realización, el tratamiento profiláctico da como resultado la prevención y el control del sangrado, el control sostenido del sangrado, la protección sostenida frente al sangrado y/o el beneficio sostenido. La profilaxis, p. ej., la protección sostenida se puede demostrar mediante un AUC incrementado hasta el último intervalo de tiempo medido (AUC-ÚLTIMO) y un aclaramiento reducido, lo que da como resultado una t1/2 terminal incrementada en comparación con el
FVIII de acción corta. La profilaxis puede demostrarse mediante una mejor Cmax, una mejor Tmax y/o un mayor tiempo medio de permanencia en comparación con el FVIII de acción corta. En algunas realizaciones, la profilaxis no resulta en episodios de sangrado espontáneo en el espacio de aproximadamente 24, 36, 48, 72 o 96 horas (p. ej., 25, 26, 27, 28,
29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 93, 94, 95 o 96 horas) después de la inyección (p. ej., la última inyección). En determinadas realizaciones, la profilaxis da como resultado más del 30% (p. ej, más del 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,
51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 7 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 o 90%, por ejemplo, más del 50%) de reducción media en episodios hemorrágicos anualizados con una dosis semanal (p. ej, a 65 UI/kg).
"Sujeto", tal como se utiliza en esta memoria, significa un individuo humano. El sujeto puede ser un paciente que padece actualmente un trastorno de sangrado o se espera que necesite un tratamiento de este tipo. En algunas realizaciones, el sujeto nunca ha sido tratado previamente con el factor de coagulación (es decir, el sujeto es un sujeto no tratado previamente o un paciente no tratado previamente). En algunas realizaciones, el sujeto es un feto y los métodos comprenden administrar el polipéptido quimérico a la madre del feto y la administración al sujeto se produce de la madre a través de la placenta. En algunas realizaciones, el sujeto es un niño o un adulto. En algunas realizaciones, el sujeto es un niño menor de un año, menor de dos años, menor de tres años, menor de cuatro años, menor de cinco años, menor menor de seis años, menor de siete años, menor de ocho años, menor de nueve años, menor de diez años, menor de once años o menor de doce años. En algunas realizaciones, el niño tiene menos de un año. En algunas realizaciones, el
sujeto niño o adulto desarrolla un trastorno de sangrado, en el que el inicio de los síntomas del trastorno de sangrado es después de la edad de un año. En algunas realizaciones, la administración del polipéptido quimérico al sujeto es suficiente para prevenir, inhibir o reducir el desarrollo de una respuesta inmunitaria seleccionada de una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria mediada por células o tanto una respuesta inmunitaria humoral como una respuesta inmunitaria mediada por células contra el factor de coagulación.
En algunas realizaciones descritas en esta memoria, el sujeto está en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII. Un sujeto puede estar en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII porque, por ejemplo, el sujeto desarrolló previamente una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII o tiene actualmente una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII. En algunas realizaciones, el sujeto desarrolló una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII después del tratamiento con un producto de FVIII derivado de plasma. En algunas realizaciones, el sujeto desarrolló una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII después del tratamiento con un producto de FVIII recombinante. En algunas realizaciones, el sujeto desarrolló una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII después del tratamiento con una proteína FVIII de longitud completa. En algunas realizaciones, el sujeto desarrolló una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII después del tratamiento con proteína FVIII que contiene una deleción, p. ej., una deleción total o parcial del dominio B.
En algunas realizaciones, el sujeto desarrolló una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII después del tratamiento con un producto de FVIII seleccionado del grupo que consiste en ADVATE®, RECOMBINATE®, KOGENATE FS®, HELIXATE FS®, XYNTHA®/REFACTO AB®, HEMOFIL-M®, MONARC-M®, MONOCLATE-P®, HUMATE-P®, ALPHANATE®, KOATE-DVI® y HYATE:C®.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria después del tratamiento con un factor de coagulación, p. ej., FVIII, comprende la producción de anticuerpos inhibitorios contra el factor de coagulación. En algunas realizaciones, la concentración de anticuerpos inhibitorios es de al menos 0,6 Unidades Bethesda (UB). En algunas realizaciones, la concentración de anticuerpo inhibitorio es de al menos 5 UB. En algunas realizaciones, la concentración de anticuerpos inhibitorios es al menos 0,5, al menos 0,6, al menos 0,7, al menos 0,8, al menos 0,9, al menos 1,0, al menos 1,5, al menos 2,0, al menos 3,0, al menos 4,0, al menos 5,0, al menos 6,0, al menos 7,0, al menos 8,0, al menos 9,0 o al menos 10,0 UB.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria después del tratamiento con un factor de coagulación, p. ej., FVIII, comprende una respuesta inmunitaria mediada por células. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria mediada por células. La respuesta inmunitaria mediada por células puede comprender la liberación de una citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-12, IL-4 y TNF-a.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria después del tratamiento con un factor de coagulación, p. ej., FVIII, comprende un síntoma clínico seleccionado del grupo que consiste en: un tendencia incrementada al sangrado, un alto consumo de factores de coagulación, la falta de respuesta a la terapia con factor de coagulación, una eficacia disminuida de la terapia con factor de coagulación y una semivida reducida del factor de coagulación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación o deleción en el gen del factor de coagulación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un reordenamiento en el gen del factor de coagulación. En algunas realizaciones, el sujeto padece hemofilia grave. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un pariente que ha desarrollado previamente una respuesta inmunitaria inhibitoria contra el factor de coagulación. En algunas realizaciones, el sujeto está recibiendo terapia con interferón. En algunas realizaciones, el sujeto está recibiendo terapia antiviral.
En algunas realizaciones, el sujeto en riesgo ha desarrollado previamente una respuesta inmunitaria inhibitoria a una proteína terapéutica distinta de FVIII.
Además, el sujeto puede también estar en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII como resultado de un cierto número de factores medioambientales o genéticos que aumentan la probabilidad de que el sujeto desarrolle una respuesta inmunitaria inhibitoria. Se conocen factores que aumentan la probabilidad de que un sujeto desarrolle una respuesta inmunitaria inhibitoria. Véase, p. ej., Kasper, C. "Diagnosis and Management of Inhibitors to Factors VIII and IX - An Introductory Discussion for Physicians” Treatment of Hemophilia 34 (2004). Por ejemplo, los inhibidores surgen con más frecuencia en la hemofilia grave (p. ej., nivel de referencia de FVIII de menos del 1%) que en la hemofilia leve o moderada. Véase Report of Expert Meeting on FVIII Products and Inhibitor Development, Agencia Europea del Medicamento (28 de febrero de 2006 - 2 de marzo de 2006).
Como resultado del hecho de que los factores genéticos pueden aumentar la probabilidad de que un sujeto desarrolle una respuesta inmunitaria inhibitoria, un sujeto con al menos un miembro de la familia (p. ej., un hermano, padre, niño, abuelo, abuela, tía, tío o primo) que ha desarrollado una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII u otra proteína terapéutica puede estar en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII.
Los inhibidores son comunes en pacientes con mutaciones genéticas que evitan la expresión de FVIII tales como grandes deleciones genéticas, mutaciones sin sentido que provocan codones de parada prematuros y grandes inversiones en el gen FVIII. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII comprende una mutación, deleción o un reordenamiento en un gen FVIII. En algunas realizaciones, un sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII comprende una mutación en el FVIII que evita que el FVIII se una a células T. Se ha observado una asociación de inhibidores con grandes reordenamientos de genes FVIII. Véase Astermark et al., Blood 107:3167-3172 (2006). Por lo tanto, en algunas realizaciones, se administra una proteína de fusión de FVIII-Fc a un sujeto con un gran reordenamiento en un gen FVIII, por ejemplo, una inversión del intrón 22 o una inversión del intrón 1. En algunas realizaciones, FVIII-Fc se administra a un sujeto con dos grandes reordenamientos en FVIII. También se ha observado una asociación de inhibidores con mutaciones nulas. Astermark et al., Blood 108:3739-3745 (2006). Por lo tanto, en algunas realizaciones, se administra una proteína de fusión FVIII-Fc a un sujeto con una mutación nula.
Inhibidores también surgen más comúnmente después del tratamiento con factores de coagulación exógenos solo en unas pocas ocasiones. Por tanto, en algunas realizaciones, un sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria ha tenido menos de 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10 o 5 días de exposición. En algunas realizaciones, un sujeto con riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria no ha sido previamente expuesto al tratamiento con FVIII.
En algunas realizaciones, el sujeto es un feto. La tolerancia inmunitaria se puede inducir en un feto administrando a la madre del feto un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción de Fc.
Inhibidores también surgen más comúnmente en la ascendencia africana negra. Véase, p. e j, Kasper, C. "Diagnosis and Management of Inhibitors to Factors VIII and IX - An Introductory Discussion for Physicians” Treatment of Hemophilia 34 (2004). Por lo tanto, en algunas realizaciones, un sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria es de ascendencia africana negra.
Mutaciones genéticas en genes distintos de FVIII también se han relacionado con un riesgo incrementado de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria. Por ejemplo, el polimorfismo TNF-a -308G>A dentro de Hap2, que se asocia con niveles incrementados de transcripción constitutiva e inducible de TNF, se ha relacionado con un riesgo incrementado de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria. Véase Astermark et al., Blood 108: 3739-3745 (2006). Por lo tanto, en algunas realizaciones, un sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria tiene un polimorfismo genético asociado con un aumento de TNF-a. En algunas realizaciones, el polimorfismo es el polimorfismo TNF-a -308G>A. En algunas realizaciones, un sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria tiene un polimorfismo en un gen IL10, p. ej, un polimorfismo asociado con una secreción incrementada de IL10. En algunas realizaciones, FVIII-Fc se administra a un sujeto con el alelo 134 del microsatélite IL10G en la región promotora del gen IL10. Véase Astermark et al. Hemostatis, Thrombosis, and Vascular Biology 108: 3739-3745 (2006).
En algunas realizaciones, un sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria tiene un polimorfismo genético asociado con una expresión disminuida de CTLA-4 (antígeno 4 del linfocito T citotóxico). En algunas realizaciones, un sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria tiene una mutación en las moléculas DR15 (HLA-DR15) o DQB0602 MHC (Complejo principal de histocompatibilidad) de Clase II. Otras moléculas de MHC de Clase II asociadas con el desarrollo de una respuesta inmunitaria inhibitoria en sujetos con hemofilia son A3, B7, C7, DQA0102, C2, DQA0103, DQB0603 y DR13 (véase Inhibitors in Patients with Hemophilia, E.C. Rodriguez-Merchan y C.A. Lee, Eds., Blackwell Science, Ltd,, 2002).
En algunas realizaciones, el sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria no ha sido previamente expuesto al factor de coagulación, p. ej., FVIII. En algunas realizaciones, el sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria a un factor de coagulación, p. ej., FVIII, ha estado expuesto a FVIII. En algunas realizaciones, el sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria a un factor de coagulación, p. e j, FVIII, ha tenido menos de 150, menos de 50 o menos de 20 días de exposición a FVIII. En algunas realizaciones, el sujeto ha tenido al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 días de exposición al factor de coagulación. En algunas realizaciones, el sujeto ha tenido al menos 25, 30, 35, 40, 45 o 50 días de exposición al factor de coagulación. En algunas realizaciones, el sujeto ha tenido al menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 o 150 días de exposición al factor de coagulación.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inhibitoria es una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII se desarrolló en respuesta a un producto de FVIII seleccionado del grupo que consiste en: ADVATE®, RECOMBINATE®, KOGENATE FS®, HELIXATE FS®, XYNTHA®/REFACTO AB®, HEMOFIL-M®, MONARC-M®, MONOCLATE-P®, HUMATE-P®, ALPHANATE®, KOATE-DVI® y HYATE:C®. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inhibitoria es una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII desarrollada en respuesta a un producto de FVIII recombinante.
En algunas realizaciones, un sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria está recibiendo o ha recibido recientemente una terapia inmunoestimulante. Por ejemplo, también se ha informado de inhibidores en pacientes con hemofilia A positiva al VHC sometidos a tratamiento con interferón, así como en pacientes con hemofilia A VIH positivos que tienen un síndrome inflamatorio de reconstitución inmune asociado con la terapia antirretroviral. Véase Report of Expert Meeting on FVIII Products and Inhibitor Development, Agencia Europea del Medicamento (28 de febrero de 2006 - 2 de marzo de 2006). Por lo tanto, en algunas realizaciones, un sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria está recibiendo terapia con interferón. En algunas realizaciones, un sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria está recibiendo una terapia antirretroviral y tiene un síndrome inflamatorio de reconstitución inmune.
Una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII puede determinarse en base a las respuestas clínicas al tratamiento con FVIII. Presentaciones clínicas de inhibidores de FVIII son conocidas y se describen, por ejemplo, en Kasper, C. "Diagnosis and Management of Inhibitors to Factors VIII and IX - An Introductory Discussion for Physicians” Treatment of Hemophilia 34 (2004). Por ejemplo, la presencia de un inhibidor dificulta el control de las hemorragias, por lo que las respuestas inmunitarias al FVIII se señalan por una tendencia incrementada al sangrado, un alto consumo de FVIII, falta de respuesta a la terapia con FVIII, una eficacia disminuida de la terapia con FVIII y/o una semivida acortada de FVIII.
Respuestas inmunitarias inhibitorias al FVIIII también se pueden determinar utilizando tests de laboratorio, tales como el test de Bethesda o la modificación de Nijmegan del test de Bethesda. Un nivel de al menos 0,6 Unidades Bethesda (UB) puede indicar la presencia de una respuesta inmunitaria inhibitoria. Un nivel de al menos 5 UB puede indicar la presencia de un inhibidor de título alto. También se pueden utilizar mediciones de la recuperación in vivo y la semivida de la infusión en bolo de FVIII.
En algunas realizaciones, un sujeto en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria ha tenido anteriormente una respuesta inmunitaria inhibitoria con un título pico de al menos 0,5, al menos 0,6, al menos 0,7, al menos 0,8, al menos 0,9, al menos 1,0, al menos 1,5, al menos 2,0, al menos 3,0, al menos 4,0, al menos 5,0, al menos 6,0, al menos 7,0, al menos 8,0, al menos 9,0 o al menos 10,0 UB.
En algunas realizaciones proporcionadas en esta memoria, los métodos comprenden determinar si un sujeto está en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII y administrar al sujeto un polipéptido quimérico que comprende una porción de FVIII y una porción de Fc si el sujeto está en riesgo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los métodos comprenden determinar si el sujeto tiene una mutación, deleción o transposición en el FVIII y administrar un polipéptido quimérico si el sujeto la tiene. En algunas realizaciones, los métodos comprenden determinar si el sujeto produce proteína FVIII y administrar un polipéptido quimérico si el sujeto no la produce. En algunas realizaciones, los métodos comprenden determinar si el sujeto tiene hemofilia leve, moderada o grave y administrar un polipéptido quimérico si el sujeto tiene hemofilia grave. En algunas realizaciones, los métodos comprenden determinar si el sujeto tiene una respuesta inmunitaria inhibitoria al FVIII, p. ej, evaluando las manifestaciones clínicas de una respuesta inmunitaria, midiendo los niveles, títulos o actividades de anticuerpos anti-FVIII o midiendo la respuesta inmunitaria mediada por células (p. ej., midiendo los niveles de citoquinas) y administrando un polipéptido quimérico si el sujeto tiene al menos uno de estos indicadores.
"Dosis terapéutica", tal como se utiliza en esta memoria, significa una dosis que logra un objetivo terapéutico, tal como se describe en esta memoria. El cálculo de la dosis requerida de FVIII se basa en el hallazgo empírico de que, en promedio, 1 UI de FVIII por kg de peso corporal aumenta la actividad plasmática de FVIII en aproximadamente 2 UI/dL. La dosis requerida se determina utilizando la siguiente fórmula:
Unidades requeridas = peso corporal (kg) x aumento deseado de FVIII (UI/dL o % de lo normal) x 0,5 (UI/kg por UI/dL)
Las dosis terapéuticas que pueden utilizarse en los métodos de la presente divulgación son aproximadamente 10-100 UI/kg, más específicamente 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90 o 90-100 UI/kg, y más específicamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 UI/kg.
Dosis terapéuticas adicionales que se pueden utilizar en los métodos de la presente divulgación son aproximadamente 10 a aproximadamente 150 UI/kg, más específicamente, aproximadamente 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140­ 150 UI/kg, y más específicamente, aproximadamente 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 o 150 UI/kg.
"Variante", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere del polinucleótido o polipéptido original, pero que conserva las propiedades esenciales del mismo, p. ej., la actividad coagulante de FVIII o la actividad de Fc (unión de FcRn). Generalmente, las variantes son, en general, muy similares y, en muchas regiones, idénticas al polinucleótido o polipéptido original. Variantes incluyen, p. ej., polipéptidos y fragmentos de polinucleótidos, deleciones, inserciones y versiones modificadas de polipéptidos originales.
Polinucleótidos variantes pueden comprender o, alternativamente, consistir en una secuencia de nucleótidos que es al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a, por ejemplo, la secuencia codificante de nucleótidos. en SEQ ID NO: 1,3 o 5 (la porción de FVIII, la porción de Fc, individualmente o juntas) o la cadena complementaria a la misma, la secuencia codificante de nucleótidos de FVIII o Fc mutante y recombinante conocida, tal como las descritas en las publicaciones y patentes citadas en esta memoria o la cadena complementaria de las mismas, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2, 4 o 6 (la porción de FVIII, la porción de Fc, individualmente o juntas) y/o fragmentos de polinucleótidos de cualquiera de estas moléculas de ácido (p. ej., los fragmentos descritos en esta memoria). Polinucleótidos que se hibridan con estas moléculas de ácido nucleico en condiciones rigurosas de hibridación o condiciones rigurosas más bajas también se incluyen como variantes, al igual que los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos, siempre que sean funcionales.
Polipéptidos variantes pueden comprender o, alternativamente, consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica a, por ejemplo, la secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID NOS: 2, 4 o 6 (la porción de FVIII, la porción de Fc, individualmente o juntas) y/o fragmentos de polipéptidos de cualquiera de estos polipéptidos (p. ej, los fragmentos descritos en esta memoria).
Por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia, se pretende que la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico sea idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de nucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un ácido nucleico que tenga una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia se pueden eliminar o sustituir con otro nucleótido, o un cierto número de nucleótidos hasta el 5% del total de nucleótidos en la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia. La secuencia de consulta puede ser, por ejemplo, la secuencia completa mostrada en SEQ ID NO: 1 o 3, el ORF (marco de lectura abierto) o cualquier fragmento especificado como se describe en esta memoria.
Como cuestión práctica, si cualquier molécula de ácido nucleico o polipéptido particular es al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos o polipéptido de la presente divulgación puede determinarse convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos. En una realización, se puede determinar un método para determinar la mejor coincidencia general entre una secuencia de consulta (secuencia de referencia u original) y una secuencia objeto, también denominado alineamiento de secuencia global, utilizando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). En un alineamiento de secuencia, las secuencias de consulta y objeto son ambas secuencias de ADN. Una secuencia de ARN se puede comparar convirtiendo U en T. El resultado de dicho alineamiento de secuencia global está en porcentaje de identidad. En otra realización, los parámetros utilizados en un alineamiento FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz = Unitaria, k-tupla = 4, Penalización por desajuste = 1, Penalización por unión = 30, Longitud del grupo de aleatorización = 0, Puntuación de corte = 1, Penalización de hueco = 5, Penalización de tamaño de hueco 0.05, Tamaño de ventana = 500 o la longitud de la secuencia de nucleótidos en cuestión, lo que sea más corto.
Si la secuencia objeto es más corta que la secuencia de consulta debido a deleciones 5' o 3', no debido a deleciones internas, se debe hacer una corrección manual a los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no tiene en cuenta los truncamientos 5' y 3' de la secuencia objeto al calcular el porcentaje de identidad. Para las secuencias objeto truncadas en los extremos 5' o 3', en relación con la secuencia de consulta, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de bases de la secuencia de consulta que están en 5' y 3' de la secuencia objeto, que no están emparejadas/alineadas, como porcentaje del total de bases de la secuencia de consulta. El hecho de que un nucleótido esté emparejado/alineado se determina mediante los resultados del alineamiento de la secuencia FASTDB. A continuación, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior utilizando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación de porcentaje de identidad final. Esta puntuación corregida es la que se utiliza para los fines de la presente divulgación. Solo las bases fuera de las bases 5' y 3' de la secuencia objeto, tal como se muestra en el alineamiento FASTDB, que no están emparejadas/alineadas con la secuencia de consulta, se calculan con el fin de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad.
Por ejemplo, una secuencia objeto de 90 bases se alinea con una secuencia de consulta de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las deleciones se producen en el extremo 5' de la secuencia objeto y, por lo tanto, el alineamiento FASTDB no muestra un emparejamiento/alineamiento de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 bases no apareadas representan el 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' no emparejadas/número total de bases en la secuencia de consulta) por lo que se resta el 10% de la puntuación del porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. Si las 90 bases restantes estuvieran perfectamente emparejadas, el porcentaje de identidad final sería del 90%. En otro ejemplo, una secuencia sujeto de 90 bases se compara con una secuencia de consulta de 100 bases. Esta vez, las deleciones son deleciones internas, de modo que no hay bases en 5' o 3' de la secuencia del sujeto que no estén emparejadas/alineadas con la consulta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, solo se corrigen manualmente las bases 5' y 3' de la secuencia objeto que no están emparejadas/alineadas con la secuencia de consulta. No se realizan otras correcciones manuales para los propósitos de la presente divulgación.
Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos consulta de la presente divulgación, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido objeto sea idéntica a la secuencia de consulta, excepto que la secuencia polipeptídica objeto puede incluir hasta alteraciones de cinco aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la consulta. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos en un 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de consulta, hasta un 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia objeto pueden insertarse, eliminarse (indeles) o sustituirse con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los residuos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Como cuestión práctica, el que cualquier polipéptido particular sea al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (la porción de FVIII, la porción de Fc, individualmente o juntas) o 4, o una secuencia polipeptídica de FVIII o Fc conocida, puede determinarse convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos. En una realización, se puede determinar un método para determinar la mejor coincidencia global entre una secuencia de consulta (secuencia de referencia u original) y una secuencia objeto, a la que también se alude como un alineamiento de secuencia global, utilizando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). En un alineamiento de secuencia, las secuencias de consulta y objeto son ambas secuencias de nucleótidos o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicho alineamiento de secuencia global está en porcentaje de identidad. En otra realización, los parámetros utilizados en un alineamiento de aminoácidos FASTDB son: Matriz = PAM 0, k-tupla = 2, Penalización por desajuste = 1, Penalización por unión = 20, Longitud del grupo de aleatorización = 0, Puntuación de corte = 1, Tamaño de ventana = longitud de la secuencia, penalización por hueco = 5, penalización por tamaño de hueco = 0,05, tamaño de ventana = 500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos objeto, lo que sea más corto.
Si la secuencia objeto es más corta que la secuencia de consulta debido a deleciones N- o C-terminales, no debido a deleciones internas, se debe realizar una corrección manual a los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no tiene en cuenta los truncamientos N- y C-terminales de la secuencia objeto cuando se calcula el porcentaje de identidad global. Para las secuencias objeto truncadas en los extremos N y C, con relación a la secuencia de consulta, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de residuos de la secuencia de consulta que son N- y C-terminales de la secuencia objeto, que no están emparejados/alineados con un residuo objeto correspondiente, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia de consulta. El que un residuo esté emparejado/alineado se determina mediante los resultados del alineamiento de la secuencia FASTDB. A continuación, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior utilizando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación de porcentaje de identidad final. Esta puntuación de porcentaje de identidad final es la que se utiliza para los fines de la presente divulgación. Solo los residuos de los extremos N y C de la secuencia objeto, que no están emparejados/alineados con la secuencia de consulta, se consideran con el propósito de ajustar manualmente la puntuación del porcentaje de identidad. Es decir, solo las posiciones de los residuos de consulta fuera de los residuos N-y C-terminales más lejanos de la secuencia objeto.
Por ejemplo, una secuencia objeto residuo de 90 residuos de aminoácidos está alineada con una secuencia de consulta de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La deleción se produce en el extremo N de la secuencia objeto y, por lo tanto, el alineamiento FASTDB no muestra un emparejamiento/alineamiento de los primeros 10 residuos en el extremo N. Los 10 residuos no emparejados representan el 10% de la secuencia (número de residuos en los extremos N y C no emparejados/número total de residuos en la secuencia de consulta), por lo que se resta el 10% de la puntuación del porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. Si los 90 residuos restantes coincidieran perfectamente, el porcentaje de identidad final sería del 90%. En otro ejemplo, una secuencia objeto de 90 residuos se compara con una secuencia de consulta de 100 residuos. Esta vez, las deleciones son deleciones internas, por lo que no hay residuos en los extremos N o C de la secuencia objeto que no estén emparejados/alineados con la consulta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, solo las posiciones de residuos fuera de los extremos N- y C-terminales de la secuencia objeto, como se muestra en el alineamiento FASTDB, que no están emparejadas/alineadas con la secuencia de consulta, se corrigen manualmente. No se realizan otras correcciones manuales para los propósitos de la presente divulgación.
Las variantes de polinucleótidos pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, regiones no codificantes, o ambas. En una realización, las variantes de polinucleótidos contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones silenciosas, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En otra realización, se producen variantes de nucleótidos mediante sustituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético. En otras realizaciones, variantes en las que se sustituyen, eliminan o añaden 5-10, 1-5 o 1-2 aminoácidos en cualquier combinación. Las variantes de polinucleótidos pueden producirse por una diversidad de razones, p. ej., para optimizar la expresión de codones para un huésped particular (cambiar codones en el ARNm humano por otros, p. ej., un huésped bacteriano tal como E. coli).
Variantes que se producen de forma natural se denominan "variantes alélicas'', y se refieren a una de varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1985)). Estas variantes alélicas pueden variar a nivel de polinucleótidos y/o polipéptidos y se incluyen en la presente divulgación. Alternativamente, se pueden producir variantes que no se producen de forma natural mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.
Utilizando métodos conocidos de ingeniería de proteínas y tecnología de ADN recombinante se pueden generar variantes para mejorar o alterar las características de los polipéptidos. Por ejemplo, se pueden eliminar uno o más aminoácidos del extremo N o del extremo C de la proteína secretada sin una pérdida sustancial de la función biológica. Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993) informaron de proteínas KGF variantes que tienen actividad de unión a heparina incluso después de eliminar 3, 8 o 27 residuos de aminoácidos amino terminales. De manera similar, el interferón gamma exhibió una actividad hasta diez veces mayor después de eliminar 8-10 residuos de aminoácidos del extremo carboxi de esta proteína. (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)).
Por otra parte, amplia evidencia demuestra que las variantes a menudo conservan una actividad biológica similar a la de la proteína que se produce de forma natural. Por ejemplo, Gayle y colaboradores (J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993)) llevaron a cabo un análisis mutacional extenso de la citoquina IL-1 a humana. Utilizaron mutagénesis aleatoria para generar más de 3.500 mutantes de IL-1 a individuales que promediaron 2,5 cambios de aminoácidos por variante a lo largo de toda la longitud de la molécula. Se examinaron múltiples mutaciones en cada posible posición de los aminoácidos. Los investigadores encontraron que "[la] mayor parte de la molécula podría alterarse con poco efecto sobre [la unión o la actividad biológica]". (Véase el Resumen). De hecho, solo 23 secuencias de aminoácidos únicas, de más de 3.500 secuencias de nucleótidos examinadas, produjeron una proteína que difería significativamente en actividad de la del tipo salvaje.
Como se ha indicado arriba, variantes de polipéptido incluyen, p. e j, polipéptidos modificados. Las modificaciones incluyen, p. ej., acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación ( Mei et al., Blood 116:270-79 (2010)), procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas, tales como arginilación y ubiquitinación. En algunas realizaciones, el FVIII se modifica, p. ej., se pegila, en cualquier ubicación conveniente. En algunas realizaciones, el FVIII se pegila en un aminoácido de FVIII expuesto a la superficie, p. ej., una cisteína expuesta a la superficie, que puede ser una cisteína modificada por ingeniería genética. Id. En algunas realizaciones, el FVIII modificado, p. ej., el FVIII pegilado, es un FVIII de acción prolongada.
"Volumen de distribución en estado estacionario (Vss)", tal como se utiliza en esta memoria, tiene el mismo significado que la expresión utilizada en farmacología, que es el espacio aparente (volumen) en el que se distribuye un fármaco. Vss = la cantidad de fármaco en el cuerpo, dividida por la concentración plasmática en estado de equilibrio.
"Aproximadamente", tal como se utiliza en esta memoria para un intervalo, modifica ambos extremos del intervalo. Por lo tanto, "aproximadamente 10-20" significa "aproximadamente 10 a aproximadamente 20."
El polipéptido quimérico utilizado en esta memoria puede comprender FVIII procesado o FVIII de cadena sencilla o una combinación de los mismos. "FVIII procesado", tal como se utiliza en esta memoria, significa FVIII que ha sido escindido en Arginina 1648 (para FVIII de longitud completa) o en Arginina 754 (para FVIII con dominio B suprimido), es decir, sitio de procesamiento intracelular. Debido a la escisión en el sitio de procesamiento intracelular, el FVIII procesado comprende dos cadenas polipeptídicas, siendo la primera cadena una cadena pesada y siendo la segunda cadena una cadena ligera. Por ejemplo, la proteína de fusión FVIII-Fc procesada (es decir, cadena pesada y cadena ligera condensadas a Fc) se ejecuta a aproximadamente 90 kDa y 130 kDa en una SDS-PAGE no reductora, respectivamente, y a 90 kDa y 105 kDa en una SDS-PAGE no reductora, respectivamente. Por lo tanto, en una realización, al menos aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% de la porción de FVIII en el polipéptido quimérico es FVIII procesado.
En otra realización, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% de la porción de FVIII en el polipéptido quimérico es FVIII procesado. En una realización particular, el polipéptido quimérico que comprende FVIII procesado se purifica (o aísla) del polipéptido quimérico que comprende FVIII de cadena sencilla, y al menos aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% de la porción de FVIII en el polipéptido quimérico es FVIII procesado.
Las expresiones "FVIII de cadena sencilla" o "SC FVIII", tal como se utilizan en esta memoria significan que FVIII no ha sido escindido en el sitio de Arginina (residuo 1648 para FVIII de longitud completa (es decir, residuo 1667 de la SEQ ID NO: 6) o residuo 754 para FVIII con dominio B suprimido (es decir, residuo 773 de SEQ ID NO: 2). Por lo tanto, el FVIII de cadena sencilla en el polipéptido quimérico utilizado en esta memoria comprende una cadena sencilla. En una realización, el FVIII de cadena sencilla contiene un sitio de procesamiento intracelular La proteína de fusión FVIII-Fc de cadena sencilla puede funcionar a aproximadamente 220 kDa en una SDS-PAGE no reductora y a aproximadamente 195 kDa en una SDS-PAGE reductora.
En una realización, el polipéptido quimérico que comprende FVIII de cadena sencilla se purifica (o aísla) del polipéptido quimérico que comprende FVIII procesado, y al menos aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico utilizado en esta memoria es FVIII de cadena sencilla. En otra realización, al menos aproximadamente el 1%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20% o aproximadamente el 25% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII de cadena sencilla. En otras realizaciones, aproximadamente el 1%-aproximadamente el 10%, aproximadamente el 5%-aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%-aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%-aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%-aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%-aproximadamente el 35%, aproximadamente el 30%-aproximadamente el 40% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico utilizado en esta memoria es FVIII de cadena sencilla.
En una realización particular, aproximadamente el 1%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20% o aproximadamente el 25% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico utilizado en esta memoria es FVIII de cadena sencilla. En otras realizaciones, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%. % o aproximadamente el 100% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico utilizado en esta memoria es FVIII de cadena sencilla. En algunas realizaciones, la relación del FVIII de cadena sencilla al FVIII procesado del polipéptido quimérico es (a) aproximadamente el 25% del FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 75% del FVIII procesado; (b) aproximadamente el 20% de FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 80% del FVIII procesado; (c) aproximadamente el 15% del FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 85% del FVIII procesado; (d) aproximadamente el 10% del FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 90% del FVIII procesado; (e) aproximadamente el 5% del FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 95% del FVIII procesado; (f) aproximadamente el 1% de FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 99% del FVIII procesado; o (g) aproximadamente el 100% del FVIII procesado.
En otras realizaciones, la relación del FVIII de cadena sencilla al FVIII procesado del polipéptido quimérico es (a) aproximadamente el 30% de FVIII de cadena sencilla y aproximadamente 70% del FVIII procesada; (b) aproximadamente el 40% de FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 60% del FVIII procesado; (c) aproximadamente el 50% del FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 50% del FVIII procesado; (d) aproximadamente el 60% del FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 40% del FVIII procesado; (e) aproximadamente el 70% del FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 30% del FVIII procesado; (f) aproximadamente el 80% del FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 20% del FVIII procesado; (g) aproximadamente el 90% del FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 10% del FVIII procesado; (h) aproximadamente el 95% del FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 5% del FVIII procesado; (i) aproximadamente el 99% del FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 1% del FVIII procesado; o (j) aproximadamente el 100% del FVIII de cadena sencilla.
La porción de FVIII en el polipéptido quimérico utilizado en esta memoria tiene la actividad de FVIII. La actividad del FVIII se puede medir mediante cualesquiera métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, uno de esos métodos puede ser un ensayo cromogénico. El mecanismo del ensayo cromogénico se basa en los principios de la cascada de coagulación sanguínea, en que el FVIII activado acelera la conversión de Factor X en Factor Xa en presencia de Factor IX activado, fosfolípidos e iones calcio. La actividad del Factor Xa se evalúa mediante la hidrólisis de un sustrato de p-nitroanilida (pNA) específico para el Factor Xa. La velocidad inicial de liberación de p-nitroanilina medida a 405 nM es directamente proporcional a la actividad del factor Xa y, por lo tanto, a la actividad del FVIII en la muestra.
El ensayo cromogénico es recomendado por el Comité Científico de Estandarización (SSC) de la Sociedad Internacional de Hemostasis y Trombosis (iSTH) para FVIII y Factor IX. Desde 1994, el ensayo cromogénico también ha sido el método de referencia de la Farmacopea Europea para la asignación de la potencia del concentrado de FVIII. Por lo tanto, en una realización, el polipéptido quimérico que comprende FVIII de cadena sencilla tiene una actividad de FVIII equiparable a un polipéptido quimérico que comprende FVIII procesado (p. ej., un polipéptido quimérico que consiste esencialmente o que consiste en dos porciones de Fc y FVIII procesado, en donde dicho FVIII procesado está condensado con una de las dos porciones de Fc), cuando la actividad de FVIII se mide in vitro mediante un ensayo cromogénico.
En otra realización, el polipéptido quimérico que comprende FVIII de cadena sencilla de esta divulgación tiene una tasa de generación de Factor Xa equiparable a un polipéptido quimérico que comprende FVIII procesado (p. ej,, un polipéptido quimérico que consiste esencialmente o que consiste en dos porciones Fc y FVIII procesado, en donde el FVIII procesado se condensa con un Fc de las dos porciones de Fc).
Con el fin de activar el Factor X en Factor Xa, Factor IX activado (Factor IXa) hidroliza un enlace arginina-isoleucina en el Factor X para formar el Factor Xa en presencia de Ca2+, los fosfolípidos de membrana y un cofactor FVIII. Por lo tanto, la interacción de FVIII con Factor IX es fundamental en la vía de coagulación. En determinadas realizaciones, el polipéptido quimérico que comprende FVIII de cadena sencilla puede interactuar con el Factor IXa a una velocidad equiparable a un polipéptido quimérico que comprende FVIII procesado (p. ej., un polipéptido quimérico que consiste esencialmente o que consiste en dos porciones de Fc y FVIII procesado, en donde el FVIII procesado se condensa con un Fc de las dos porciones de Fc).
Además, el FVIII está unido a Factor von Willebrand mientras es inactivo en circulación. El FVIII se degrada rápidamente cuando no está unido al vWF y se libera del vWF por la acción de trombina. En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico que comprende FVIII de cadena sencilla se une al factor von Willebrand a un nivel equiparable a un polipéptido quimérico que comprende FVIII procesado (p. ej., un polipéptido quimérico que consiste esencialmente o que consiste en dos porciones de Fc y FVIII procesado, en donde el FVIII procesado se condensa con una Fc de las dos porciones Fc).
El FVIII puede inactivarse mediante la proteína C activada en presencia de calcio y fosfolípidos. La proteína C activada escinde la cadena pesada del FVIII después de Arginina 336 en el dominio A1, lo que interrumpe un sitio de interacción del sustrato del Factor X, y escinde después la Arginina 562 en el dominio A2, lo que potencia la disociación del dominio A2, así como interrumpe un sitio de interacción con el Factor IXa. Esta escisión también biseca el dominio A2 (43 kDa) y genera dominios A2-N (18 kDa) y A2-C (25 kDa). Por lo tanto, la proteína C activada puede catalizar múltiples sitios de escisión en la cadena pesada. En una realización, el polipéptido quimérico que comprende FVIII de cadena sencilla es inactivado por la Proteína C activada a un nivel equiparable a un polipéptido quimérico que comprende FVIII procesado (p. ej., un polipéptido quimérico que consiste esencialmente o que consiste en dos porciones de Fc y FVIII procesado, en donde el FVIII procesado se condensa con un Fc de las dos porciones de Fc).
En otras realizaciones, el polipéptido quimérico que comprende FVIII de cadena sencilla tiene actividad de FVIII in vivo equiparable a un polipéptido quimérico que comprende FVIII procesado (p. ej., un polipéptido quimérico que consiste esencialmente en o que consiste en dos porciones Fc y FVIII procesado, en donde el FVIII procesado se condensa con un Fc de las dos porciones de Fc). En una realización particular, el polipéptido quimérico que comprende FVIII de cadena sencilla es capaz de proteger un ratón HemA a un nivel equiparable al de un polipéptido quimérico que comprende FVIII procesado (p. ej., un polipéptido quimérico que consiste esencialmente o que consiste en dos porciones de Fc y FVIII procesado, en donde dicho FVIII procesado se condensa con un Fc de las dos porciones de Fc) en un modelo de transección de la vena de la cola de ratón HemA.
El término "equiparable", tal como se utiliza en esta memoria significa una tasa o un nivel comparado que resulta de utilizar el polipéptido quimérico es igual a, sustancialmente igual a o similar a la tasa o nivel de referencia. El término "similar", tal como se utiliza en esta memoria significa que una tasa o un nivel comparado tiene una diferencia de no más del 10% o no más del 15% de la tasa o nivel de referencia (p. ej., tasa de generación de FXa por un polipéptido quimérico que consiste esencialmente o que consiste en dos porciones de Fc y FVIII procesado, en donde dicho FVIII procesado se condensa con un Fc de las dos porciones de Fc). La expresión "sustancialmente igual" significa que una tasa o un nivel comparado tiene una diferencia no superior al 0,01%, 0,5% o 1% de la tasa o nivel de referencia.
La presente divulgación incluye, además, una composición que comprende un polipéptido quimérico que tiene actividad de FVIII, en donde al menos aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95% o aproximadamente el 99% del polipéptido quimérico comprende una porción de FVIII, que es FVIII de cadena sencilla y una segunda porción. En otra realización, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98% o aproximadamente el 99% del polipéptido quimérico en la composición es FVIII de cadena sencilla. En otras realizaciones, la segunda porción es un Fc. En aún otras realizaciones, el polipéptido quimérico comprende otro resto que prolonga la semivida, p. ej., albúmina.
En aún otras realizaciones, la composición de la presente divulgación comprende una combinación de un polipéptido quimérico que comprende FVIII procesado y un polipéptido quimérico que comprende FVIII de cadena sencilla, (a) en donde aproximadamente el 30% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 70% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII procesado; (b) en donde aproximadamente el 40% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 60% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII procesado; (c) en donde aproximadamente el 50% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 50% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII procesado; (d) en donde aproximadamente el 60% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 40% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII procesado; (e) en donde aproximadamente el 70% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 30% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII procesado; (f) en donde aproximadamente el 80% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 20% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII procesado; (g) en donde aproximadamente el 90% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 10% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII procesado; (h) en donde aproximadamente el 95% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 5% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII procesado; (i) en donde aproximadamente el 99% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII de cadena sencilla y aproximadamente el 1% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII procesado; o (j) en donde aproximadamente el 100% de la porción de FVIII del polipéptido quimérico es FVIII de cadena sencilla.
En determinadas realizaciones, la composición de la presente divulgación tiene actividad de FVIII equiparable a la composición que comprende FVIII procesado (p. ej, una composición que comprende un polipéptido quimérico que consiste esencialmente o consiste en dos porciones Fc y FVIII procesado, en donde dicho FVIII procesado está condensado con una de las dos porciones de Fc), cuando la actividad del FVIII se mide in vitro mediante un ensayo cromogénico.
En otras realizaciones, la composición de la divulgación tiene una tasa de generación de Factor Xa equiparable a una composición que comprende FVIII procesado (p. ej., una composición que comprende un polipéptido quimérico que consiste esencialmente o consiste en dos porciones de Fc y FVIII procesado, en donde el FVIII procesado está condensado con un Fc de las dos porciones de Fc). En aún otras realizaciones, la composición que comprende FVIII de cadena sencilla puede interactuar con el Factor IXa a una velocidad equiparable a una composición que comprende FVIII procesado (p. ej., una composición que comprende un polipéptido quimérico que consiste esencialmente o consiste en dos porciones de Fc y FVIII procesado, en donde el FVIII procesado está condensado con un Fc).
En realizaciones adicionales, el FVIII de cadena sencilla en el polipéptido quimérico de la presente composición es inactivado por Proteína C activada en un nivel equiparable al FVIII procesado en un polipéptido quimérico de una composición (p. ej., una composición que comprende un polipéptido quimérico que consiste esencialmente o consiste en dos porciones de Fc y FVIII procesado, en donde el FVIII procesado está condensado con un Fc de las dos porciones de Fc). En una realización particular, la composición que comprende FVIII de cadena sencilla tiene actividad de FVIII in vivo equiparable a la composición que comprende FVIII procesado (p. ej., una composición que comprende un polipéptido quimérico que consiste esencialmente o consiste en dos porciones de Fc y FVIII procesado, en donde el FVIII procesado está condensado con un Fc de las dos porciones de Fc). En algunas realizaciones, la composición que comprende FVIII de cadena sencilla de la presente divulgación es capaz de proteger al ratón HemA a un nivel equiparable al de la composición que comprende FVIII procesado (p. ej,, una composición que comprende un polipéptido quimérico que consiste esencialmente o consiste en dos porciones de Fc y FVIII procesado, en donde dicho FVIII procesado está condensado con un Fc de las dos porciones de Fc) en el modelo de transección de la vena de la cola de ratón HemA.
La presente divulgación proporciona, además, un método para tratar una afección de sangrado en un sujeto humano utilizando las composiciones descritas en esta memoria. Un método ejemplar comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición/formulación farmacéutica que comprende un polipéptido quimérico que tiene actividad de FVIII, en donde al menos aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95% o aproximadamente el 99% del polipéptido quimérico comprende una porción de FVIII que es FVIII de cadena sencilla, y una segunda porción.
La afección de sangrado puede ser provocada por un trastorno de la coagulación sanguínea. A un trastorno de la coagulación sanguínea también se le puede aludir como coagulopatía. En un ejemplo, el trastorno de la coagulación sanguínea, que puede tratarse con una composición farmacéutica de la presente divulgación, es hemofilia o enfermedad de von Willebrand (vWD). En otro ejemplo, el trastorno de la coagulación sanguínea, que puede tratarse con una composición farmacéutica de la presente divulgación, es la hemofilia A.
En algunas realizaciones, el tipo de sangrado asociado con la afección de sangrado se selecciona de hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia bucal, trauma, trauma capitis, sangrado gastrointestinal, sangrado intracraneal, sangrado intra-abdominal, sangrado intratorácico, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal y sangrado en la vaina del psoas ilíaco.
En otras realizaciones, el sujeto que sufre la afección de sangrado está en necesidad de tratamiento para la cirugía, incluyendo, p. e j, la profilaxis quirúrgica o la gestión peri-operatoria. En un ejemplo, la cirugía se selecciona de cirugía menor y cirugía mayor. Procesos quirúrgicos ejemplares incluyen extracción de dientes, amigdalectomía, herniotomía inguinal, sinovectomía, craneotomía, osteosíntesis, cirugía de trauma, cirugía intracraneal, cirugía intra-abdominal, cirugía intratorácica, cirugía de reemplazo de articulaciones (p. ej, reemplazo total de rodilla, reemplazo de cadera y similares), cirugía cardíaca y sección cesárea.
En otro ejemplo, el sujeto es tratado de forma concomitante con FIX. Debido a que los compuestos de la presente divulgación son capaces de activar FIXa, podrían utilizarse para preactivar el polipéptido FIXa antes de la administración del FIXa al sujeto.
Los métodos descritos en esta memoria se pueden practicar en un sujeto en necesidad de tratamiento profiláctico o tratamiento a demanda.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos 30% de FVIII de cadena sencilla se pueden formular para cualquier manera apropiada de administración, incluyendo, por ejemplo, la administración tópica (p. ej., transdérmica u ocular), oral, bucal, nasal, vaginal, rectal o parenteral.
El término parenteral, tal como se utiliza en esta memoria, incluye inyección subcutánea, intradérmica, intravascular (p. ej., inyección intravenosa), intramuscular, espinal, intracraneal, intratecal, intraocular, periocular, intraorbital, intrasinovial e intraperitoneal, así como cualquier técnica de inyección o infusión similar. La composición también puede ser, por ejemplo, una suspensión, emulsión, formulación de liberación sostenida, crema, gel o polvo. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y soportes tradicionales tales como triglicéridos.
En un ejemplo, la formulación farmacéutica es una formulación líquida, p. ej., una solución tamponada, isotónica, acuosa. En otro ejemplo, la composición farmacéutica tiene un pH fisiológico o cercano al fisiológico. En otros ejemplos, la formulación acuosa tiene una osmolaridad y salinidad fisiológicas o cercanas a las fisiológicas. Puede contener cloruro sódico y/o acetato de sodio. En algunos ejemplos, la composición de la presente divulgación está liofilizada. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica no comprende una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica no comprende una célula.
La presente divulgación también proporciona un kit que comprende que comprende (a) una composición farmacéutica que comprende un polipéptido quimérico que comprende una porción de factor de coagulación y una porción de Fc y un soporte farmacéuticamente aceptable y (b) instrucciones para administrar la composición a un sujeto en necesidad de tolerancia inmunitaria al factor de coagulación. El polipéptido quimérico en el kit comprende una porción de FVIII. En otras realizaciones, el polipéptido quimérico en el kit es un híbrido de dímero de monómero de FVIII, un híbrido de dímero de monómero de FVII o un híbrido de monómero y dímero de FIX. En algunas realizaciones, las instrucciones incluyen, además, al menos una etapa para identificar a un sujeto que necesita tolerancia inmunitaria al factor de coagulación. En algunas realizaciones, la etapa para identificar a los sujetos que necesitan tolerancia inmunitaria incluye uno o más del grupo que consiste en:
(i) identificar un sujeto que tiene una mutación o deleción en el gen del factor de coagulación;
(ii) identificar un sujeto que tiene un reordenamiento en el gen del factor de coagulación;
(iii) identificar un sujeto que tiene un pariente que ha desarrollado previamente una respuesta inmunitaria inhibitoria contra el factor de coagulación;
(iv) identificar un sujeto que recibe terapia con interferón;
(v) identificar un sujeto que recibe terapia antiviral;
(vi) identificar un sujeto que tiene una mutación genética en un gen distinto del gen que codifica el factor de coagulación que está relacionado con un riesgo incrementado de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria; y
(vii) dos o más combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la mutación genética en un gen distinto del gen que codifica el factor de coagulación comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(i) un polimorfismo genético asociado con TNF-a incrementada;
(ii) un polimorfismo genético asociado con IL10 incrementada;
(iii) un polimorfismo genético asociado con CTLA-4 disminuida;
(iv) una mutación en moléculas DR15 o DQB0602 MHC Clase II; y
(v) tiene dos o más combinaciones de los mismos.
Opcionalmente asociado con el o los recipientes del kit puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuyo aviso refleja la aprobación de la agencia de fabricación, el uso o la venta para administración humana.
Ejemplos
Ejemplo 1
Clonación, expresión y purificación de rFVIIIFc
Se llevaron a cabo procedimientos de biología molecular siguiendo técnicas estándares. La secuencia codificante del FVIII humano (número de acceso de Genbank NM_000132), incluyendo su secuencia señal nativa, se obtuvo mediante reacciones en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) a partir de poli A de ARN de hígado humano. Debido al gran tamaño del FVIII, la secuencia codificante se obtuvo en varias secciones de reacciones RT-PCR separadas y se ensambló a través de una serie de reacciones PCR, digestiones de restricción y ligamientos en un vector de clonación intermedio que contiene una región codificante de FVIII con dominio B suprimido (BDD) con una fusión de serina 743 (S743) a glutamina 1638 (Q1638), eliminando 2682 pb del dominio B del FVIII de longitud completa. La secuencia de Fc de IgG1 humana (p. e j, número de acceso de GenBank Y14735) se obtuvo mediante PCR a partir de una colección de ADNc de leucocitos, y el casete de expresión final se preparó de tal manera que la secuencia de FVIII BDD se condensó directamente con el extremo N de la secuencia de Fc (bisagra, dominios CH2 y CH3, comenzando en D221 de la secuencia de IgG1, numeración EU) sin enlazador intermedio. Para la expresión de la cadena Fc sola, se creó la secuencia señal de la cadena ligera de IgK (kappa) de ratón con oligonucleótidos sintéticos y se añadió a la secuencia codificante de Fc utilizando una PCR para permitir la secreción de este producto proteico. Las secuencias codificantes de las cadenas de FVIIIFc y Fc se clonaron en un vector de expresión dual, pBudCE4.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Células HEK 293H (Invitrogen, Carlsbad, CA) se transfectaron con el plásmido pSYN-FVIII-013 utilizando reactivo de transfección Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA)), y una línea celular estable se seleccionó con zeocina. Las células se cultivaron en un cultivo en suspensión libre de suero y la proteína rFVIIIFc se purificó a partir de medios de recolección clarificados utilizando un proceso de purificación de cuatro columnas, que incluía una etapa de purificación por afinidad específica de FVi Ii (McCue J. et al., J. Chromatogr. A., 1216(45):7824-30 (2009)), seguido de una combinación de columnas de intercambio aniónico y una columna de interacción hidrófoba.
Ejemplo 2
Caracterización de rFVIIIFc
(a) Caracterización bioquímica
FVIII-Fc recombinante (rFVIIIFc) procesado se sintetizó como dos cadenas de polipéptidos, consistiendo una cadena en BDD-FVIII (fusión S743-Q1638, 1438 aminoácidos) condensado con el dominio Fc (bisagra, dominios CH2 y CH3) de IgG1 (226 aminoácidos, que se extienden desde D221 a G456, numeración EU), para una longitud total de la cadena de 1664 aminoácidos, consistiendo la otra cadena en la misma región Fc sola (226 aminoácidos). Aunque se esperaba que las células transfectadas con el plásmido de expresión dual de FVIIIFc/Fc secretaran tres productos (dímero de FVIIIFc, monómero de FVIIIFc y dímero de Fc), solo se detectaron el monómero de FVIIIFc y el dímero de Fc en el medio acondicionado. El FVIIIFc purificado se analizó mediante análisis SDS-PAGE reductor y no reductor (FIG. 2A y 2B). Para la SDS-PAGE no reducida, se encontraron bandas que migraban a aproximadamente 90 kDa y 130 kDa, de acuerdo con los pesos moleculares predichos de la cadena pesada (HC) de FVIIIFc y la fusión de Fc dimérico de cadena ligera (LCFc2) (FIG. 2A, pista 3). También se detectó una tercera banda a aproximadamente 220 kDa, consistente con el peso molecular predicho para FVIIIFc de cadena sencilla (SC FVIIIFc; HC+LCFc2), en el que el residuo arginina en la posición 754 (1648 con respecto a la secuencia de longitud completa) no es escindido durante la secreción. Para el análisis de SDS-PAGE reducido se observaron bandas principales migrando a aproximadamente 25 kDa, 90 kDa, 105 kDa y 195 kDa, de acuerdo con los pesos moleculares predichos para Fc, HC, LCFc y SC FVIIIFc (FIG. 2B, pista 3). La cotransfección con PC5 humana, un miembro de las proteasas de tipo proproteína convertasa subtlisina/kexina (PCSK), dio como resultado el procesamiento completo del producto rFVIIIFc (FIG. 2A, 2B, pista 2).
El análisis de densitometría de varios lotes de rFVIIIFc después de SDS-PAGE indicó una pureza superior al 98% de las bandas esperadas. También se utilizó la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para evaluar el grado de agregación presente, y se encontró que todos los lotes tenían niveles de agregados de 0,5% o menos.
La estructura de rFVIIIFc se analizó adicionalmente mediante escisión, reducción y análisis de trombina por LC/UV y LC/MS. Los cuatro fragmentos de FVIII generados por trombina (por escisiones en tres residuos arginina, en las posiciones 372, 740 y 795 (795 corresponde a 1689 con respecto a la secuencia de FVIII de longitud completa), pueden detectarse por absorbancia UV (FIG. 2C), correspondiente a los siguientes segmentos de la proteína: Fc (pico 1), cadena ligera-Fc (pico 2); el dominio A1 de la cadena pesada (pico 3) y el dominio A2 de la cadena pesada (pico 4). El enlazador del dominio B del aminoácido 14 y los péptidos relacionados con a3 de ~ 6 kDa no se detectan por absorbancia UV debido a su pequeño tamaño.
El polipéptido rFVIIIFc producido sin enzimas de procesamiento cotransfectadas exhibió 15-25% de FVIIIFc de cadena sencilla (SC FVIIIFc), que difiere de rFVIIIFc procesado por un solo enlace peptídico entre R754 y E755 (R1648/E1649 con respecto al FVIII de longitud completa). Esta isoforma se purificó y caracterizó en todos los ensayos bioquímicos descritos anteriormente, y se encontró que era equiparable a rFVIIIFc como se muestra más adelante. Se encontró que la actividad de FVIIIFc de cadena sencilla purificado era similar a rFVIIIFc en un ensayo cromogénico, así como en los diversos ensayos funcionales descritos más adelante.
(b) Medición de la Actividad del FVIII mediante Ensayos Cromogénicos y de aPTT de Una Etapa
La actividad de FVIII se midió mediante un ensayo cromogénico de FVIII. Se encontró que la actividad específica promedio de cuatro lotes separados de rFVIIIFc era 9762 ± 449 UI/mg por el ensayo cromogénico, correspondiente a 2148 ± 99 UI/nmol. La actividad de FVIII de FVIII de cadena sencilla:Fc también se midió mediante el ensayo cromogénico y se comparó con el rFVIIIFc o rFVIIIFc DS completamente procesado (que contenía aproximadamente 25% de rFVIIIFc de cadena sencilla). Como muestra la TABLA 3A, el rFVIIIFc de cadena sencilla no mostró diferencias significativas en la actividad del FVIII en comparación con la actividad del FVIII del FVIIIFc o rFVIIIFc DS completamente procesado mediante el ensayo cromogénico, tanto en presencia como en ausencia del factor von Willebrand (VWF). La TABLA 3B muestra que la actividad completa de SCrFVIIIFc, medida por el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada en una etapa (aPTT), se observó en ausencia de VWF.
TABLA 3A: Actividad de FVIII por Ensayo Cromogénico
Figure imgf000037_0001
TABLA 3B: Actividad de FVIII por ensayo aPTT
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(c) Actividad en el Complejo Xase
La actividad de FVIII también se midió en el contexto del complejo Xase, incubando FIX activado y proteína REFACTO® o rFVIIIFc activada por trombina en una superficie de fosfolípidos en presencia de calcio, y vigilando la conversión de FX en FXa medida por la escisión de un sustrato cromogénico o fluorogénico, a partir del cual se determinaron las tasas de generación de FXa. A continuación, este ensayo se modificó variando un componente del ensayo mientras se mantenían constantes los demás para examinar las interacciones con cada uno de los componentes individuales.
La tasa de generación de FXa se determinó como una función de las concentraciones variables de fosfolípidos para rFVIIIFc DS, rBDD FVIII, y rFVIIIFc de cadena sencilla (Fig. 3A), utilizando vesículas de fosfolípidos sintéticos (25% de fosfatidil serina/75% de fosfatidil colina). Se encontró que ambas proteínas tenían un perfil de actividad similar, con un pico de actividad a aproximadamente 156 pM de fosfolípidos.
La tasa de generación de FXa se determinó entonces como una función de concentraciones variables de FX, y valores calculados Km y Vmax (FIG. 3B). Se encontró que los perfiles de actividad para rFVIIIFc DS, rBDD FVIII y rFVIIIFc de cadena sencilla eran similares, con Km y Vmax similares (TABLA 4). Finalmente, la tasa de generación de FXa se determinó en función de las concentraciones variables de FIX (FIG. 3C). Los perfiles de actividad parecían similares, con Kd y Vmax similares (TABLA 5). Se obtuvieron resultados similares utilizando plaquetas como fuente de fosfolípidos (datos no publicados, junio de 2009).
TABLA 4. Parámetros de Generación de FXa para Proteínas de FVIII en Fosfolípidos
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TABLA 5. Interacciones de FIXa con Proteínas FVIII
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(d) Inactivación por APC
Una vez activo, el FVIII se inactiva mediante escisión por la proteína C activada (APC), así como por la disociación del dominio A2. Tanto rFVIIIFc como rBDD FVIII se activaron mediante trombina, luego se incubaron con APC durante diferentes tiempos y se determinó la actividad en un ensayo de generación de FXa (FIG. 4). En ausencia de activación de trombina, se detectó poca generación de FXa, y ésta se incrementó significativamente con la digestión de trombina. El tratamiento con APC durante 90 minutos condujo a una disminución significativa en las tasas de generación de FXa, similar a las muestras no activadas, y estos resultados fueron similares para rFVIIIFc DS, rBDD FVIII y rFVIIIFc de cadena sencilla.
(e) Afinidad por vWF
Interacciones de FVIII con el factor de von Willebrand (vWF) se midieron mediante análisis de interacción biomolecular en tiempo real (BIAcore), basado en la tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR), para determinar la cinética de unión de rFVIIIFc y rBDD FVIII hacia vWF (TABLA 6). Los parámetros de velocidad cinética de Ka (velocidad activa) y Kd (velocidad inactiva), y la afinidad Kd (Kd/Ka), se determinaron para cada interacción de FVIII en condiciones idénticas. Se encontró que tanto rFVIIIFc como rBDD FVIII tenían una afinidad de unión (Kd) de baja nM para vWF, de 1,64 ± 0,37 y 0,846 ± 0,181 nM, respectivamente. Las proteínas tenían velocidades de desactivación similares, con una diferencia de dos veces en la velocidad de activación que da como resultado una diferencia de dos veces en la afinidad.
TABLA 6. Análisis de Unión Biacore de Proteínas FVIII a vWF
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Como se muestra en la TABLA 6, se encontró que la afinidad de rFVIIIFc DS o de rFVIIIFc de cadena sencilla con vWF estaba en el intervalo de baja nM, aproximadamente dos veces mayor que la de BDD FVIII solo. A concentraciones fisiológicas, esto daría como resultado una ligera disminución en el porcentaje de rFVIIIFc (procesado o de cadena sencilla) complejado con vWF en comparación con el FVIII libre; sin embargo, los estudios in vivo han indicado que la semivida de rFVIIIFc se prolonga significativamente en toda su longitud o BDD FVIII a pesar de esta afinidad ligeramente menor y, por lo tanto, esto no parece comprometer la semivida de la molécula. El rFVIIIFc libre puede reciclarse de manera más eficiente a través de la vía de FcRn y, por lo tanto, contribuir a una mayor prolongación de la semivida.
Ejemplo 3
Ensayo Clínico de Fase I/IIa de rFVIIIFc
Se diseñó un estudio de fase I/IIa, de etiqueta abierta, cruzado, de escalada de dosis, multicéntrico y primero en seres humanos para evaluar la seguridad, tolerabilidad y farmacocinética de una dosis única de rFVIIIFc en sujetos con hemofilia A grave (definida como <1 UI/dL [1%] de FVIII endógeno [FVIII]). Se inscribió un total de aproximadamente 12 pacientes tratados previamente y se les dosificó 25 o 65 UI/kg de rFVIIIFc. Después de la selección (programada dentro de los 28 días anteriores a la primera dosis de ADVATE® [rFVIII], el agente comparador de referencia) y transcurrido un mínimo de 4 días (96 horas) sin tratamiento con FVIII antes de la primera inyección, aproximadamente 6 sujetos recibieron una dosis única de 25 UI/kg de ADVATE® seguida de un perfil farmacocinético (PK) de 3 días (72 horas), luego se cruzaron y recibieron una dosis única de etiqueta abierta de rFVIIIFc de 25 UI/kg para un perfil PK de 7 días (168 horas). Los primeros 3 sujetos fueron dosificados secuencialmente. Para los primeros tres (3) sujetos a los que se les administró 25 UI/kg de rFVIIIFc, cada uno de los sujetos fue sometido a una evaluación del inhibidor a los 14 días (336 horas) después de la inyección de rFVIIIFc. La dosificación del siguiente sujeto (solo para los primeros tres sujetos) ocurrió una vez que se completó la prueba del inhibidor. Después de que el 3er sujeto completara la evaluación del inhibidor de 14 días, los tres sujetos restantes a 25 UI/kg y los seis sujetos a 65 UI/kg comenzaron la inscripción secuencialmente con al menos 1 día de diferencia dentro de cada uno de los grupos de dosis.
Una semana después de que el último sujeto recibiera la dosis de 25 UI/kg del rFVIIIFc, aproximadamente 6 sujetos únicos fueron reclutados para el cohorte de 65 UI/kg. Cada uno de los sujetos del cohorte de 65 UI/kg recibió una dosis única de 65 UI/kg de ADVATE®, seguida de un perfil farmacocinético de 4 días (96 horas), luego se cruzó y recibió una dosis única de etiqueta abierta de rFVIIIFc de 65 UI/kg para un perfil de 10 días (240 horas). Si se producía un episodio de hemorragia antes de la primera inyección de rFVIIIFc en cualquier cohorte, se utilizó el producto de FVIII previo al estudio del sujeto para el tratamiento y debía transcurrir un intervalo de al menos 4 días antes de recibir la primera inyección de rFVIIIFc para el perfil PK.
Todos los sujetos fueron seguidos durante un período de evaluación de la seguridad de 14 días (336 horas) y de 28 días después de la administración de 25 UI/kg o 65 UI/kg de rFVIIIFc para la seguridad. Todos los sujetos se sometieron a un muestreo farmacocinético antes y después de la dosificación junto con muestras de sangre para el análisis de la actividad del FVIII en intervalos de tiempo designados.
Los datos farmacocinéticos para el ensayo clínico de Fase I/IIa demostraron los siguientes resultados para FVIIIFc. El FVIIIFc tuvo aproximadamente un 50% de incremento en la exposición sistémica (AUCinf), aproximadamente un 50% de reducción en el aclaramiento (Cl) y aproximadamente un 50-70% de incremento en la semivida de eliminación y MRT en comparación con ADVATE® (rFVIII de longitud completa). Además, FVIIIFc mostró valores incrementados de C168, TBLP1, TBLP3 y TBLP5 en comparación con ADVATE®.
Los parámetros PK medidos fueron:
AUCinf Área bajo la curva concentración-tiempo de cero a infinito
Beta HL Semivida de la fase de eliminación; a la que también se alude como t1/2p
C168 Actividad estimada de FVIIIFc por encima del valor de referencia aproximadamente 168 h después de la dosis
Cl Aclaramento
MRT Tiempo medio de permanencia
TBLP1 Tiempo predicho por el modelo después de la dosis cuando la actividad de FVIIIFc ha disminuido a aproximadamente 1 UI/dL por encima del valor de referencia
TBLP3 Tiempo predicho por el modelo después de la dosis cuando la actividad de FVIIIFc ha disminuido a aproximadamente 3 UI/dL por encima del valor de referencia
TBLP5 Tiempo predicho por el modelo después de la dosis cuando la actividad de FVIIIFc ha disminuido a aproximadamente 5 UI/dL por encima del valor de referencia
Ejemplo 4
Farmacocinética (PK) de rFVIIIFc
Se ha creado una proteína de fusión recombinante FVIII-Fc (rFVIIIFc) suprimido el dominio B como un enfoque para extender la semivida de FVIII. La farmacocinética (PK) de rFVIIIFc se comparó con rFVIII en ratones con hemofilia A. La semivida terminal fue dos veces más larga para rFVIIIFc en comparación con rFVIII. Con el fin de confirmar que el mecanismo subyacente para la extensión de la semivida se debía a la protección de rFVIIIFc por FcRn, las PK se evaluaron en ratones FcRn recombinantes y transgénicos con FcRn humano.
Se administró una dosis intravenosa única (125 UI/kg) y la concentración plasmática se midió utilizando un ensayo de actividad cromogénico. La Cmáx fue similar entre rFVIIIFc y rFVIII (XYNTHA®) en ambas cepas de ratón. Sin embargo, mientras que la semivida de rFVIIIFc fue equiparable a la de rFVIII en los ratones recombinantes para FcRn, la semivida de rFVIIIFc se prolongó aproximadamente dos veces más que la de rFVIII en los ratones transgénicos con hFcRn. Estos resultados confirmaron que FcRn mediaba o era responsable de la semivida prolongada de rFVIIIFc en comparación con rFVIII. Dado que se ha demostrado que la hemostasis en sangre entera medida por tromboelastometría de rotación (ROTEM®) se correlaciona con la eficacia de los factores de coagulación en modelos de sangrado de ratones con hemofilia, así como en aplicaciones clínicas, los autores de la invención buscaron evaluar la eficacia ex vivo de rFVIIIFc en los ratones con hemofilia A que utilizan ROTEM®.
A los ratones con hemofilia A se les administró una sola dosis intravenosa de 50 UI/kg de rFVIIIFc, Xyntha® (FVIII) o Advate® (FVIII). 5 minutos después de la dosis, la formación de coágulos fue similar con respecto al tiempo de coagulación (CT), el tiempo de formación de coágulos (CFT) y el ángulo a. Sin embargo, rFVIIIFc mostró una TC significativamente mejorada a las 72 y 96 horas después de la dosis, y el CFT y el ángulo a también mejoraron a las 96 horas en comparación con XYNTHA® (FVIII) y ADVATE® (FVIII), consistente con la PK prolongada de rFVIIIFc. Estos resultados indicaron que rFVIIIFC tiene un mecanismo de acción definido que da como resultado una semivida incrementada y el potencial de proporcionar una protección prolongada contra el sangrado.
Ejemplo 5
Resultados del Ensayo Clínico de Fase I/IIa de rFVIIIFc
Este Ejemplo presenta los resultados finales del análisis para la actividad de FVIII de 16 pacientes tratados con 25 y 65 UI/kg de productos de FVIII. Véase el Ejemplo 3. El rFVIIIFc es una proteína de fusión recombinante compuesta por una única molécula de FVIII humano recombinante con dominio B suprimido (BDD-rFVIII) condensado al dominio Fc dimérico de la IgG1 humana, sin secuencia de enlazador intermedia. A esta construcción proteica también se la alude en esta memoria como proteína híbrida heterodimérica de rFVIIIFc, proteína de fusión de Fc monomérica de FVIIIFc, híbrido de monómero de FVIIIFc, híbrido de FVIIIFc monomérico y monómero-dímero de FVIIIFc. Véase el Ejemplo 1, la FIG. 1 y la TABLA 2A.
Estudios preclínicos con rFVIIIFc demostraron una prolongación de aproximadamente 2 veces de la semivida de la actividad de rFVIII en comparación con productos de rFVIII disponibles comercialmente. El fundamento de este estudio fue evaluar la seguridad y tolerabilidad de una dosis única de rFVIIIFc en una formulación líquida congelada y proporcionar datos sobre la PK en sujetos con hemofilia A grave. Para este estudio, se dispuso de 16 sujetos evaluables para la evaluación PK. La administración única de dos dosis tanto de rFVIIIFc como de ADVATE® a una dosis nominal de 25 (n = 6) y 65 UI/kg de peso corporal (n = 10) se infundieron por vía intravenosa durante aproximadamente 10 minutos. Se obtuvieron muestras de sangre para las evaluaciones de la PK plasmática antes de la infusión, así como hasta 10 días después de la dosificación. La PK de la actividad de FVIII para ADVATE® y rFVIIIFc se caracterizó en este estudio utilizando un método dependiente del modelo.
Objetivos
El objetivo principal de este estudio fue evaluar la seguridad y tolerabilidad de la administración única de dos dosis de rFVIIIFc (25 y 65 UI/kg) en pacientes tratados previamente (PTPs) de 12 años de edad y superior con hemofilia A grave. El objetivo secundario fue determinar los parámetros farmacocinéticos (PK) determinados por la actividad farmacodinámica (PD) del FVIII a lo largo del tiempo después de una sola administración de 25 o 65 UI/kg de rFVIIIFc en comparación con ADVATE® en ensayos de coagulación y cromogénicos en una etapa.
Diseño del Estudio (véase el Ejemplo 3)
Se recogieron muestras de sangre para evaluaciones PK de la actividad de FVIII en la visita de selección (dentro de los 28 días antes de la dosificación de ADVATE®); el Día 0 (inyección de ADVATE®) antes de la inyección y a los 10 y 30 minutos y 1, 3, 6 y 9 horas después de la inyección; el Día 1, a las 24 horas después de la inyección de ADVATE®; el Día 2, a las 48 horas después de la inyección de ADVATE®; el Día 3 a las 72 horas después de la inyección de ADVATE®; y el Día 4 a las 96 horas después de la inyección de una dosis alta de ADVATE® (solo Cohorte B).
Se recogieron muestras de sangre para evaluaciones PK de la actividad de FVIII en el día de la inyección de rFVIIIFc justo antes de la administración de rFVIIIFc, a los 10 y 30 minutos y 1, 3, 6, y 9 horas después de la inyección de rFVIIIFc; el Día 1 a las 24 horas después de la inyección de rFVIIIFc; los Días 2 a 5 a las 48, 72, 96 y 120 horas después de la inyección de rFVIIIFc; el Día 7 a las 168 horas después de la inyección de rFVIIIFc; los Días 8, 9 y 10 a las 192, 216 y 240 horas después de la inyección de una dosis alta de rFVIIIFc (solo Cohorte B). La actividad de FVIII también se midió en la visita final del estudio (28 días después de la inyección de rFVIIIFc) a las 672 horas después de la inyección de rFVIIIFc.
Modelo Farmacocinético
Abreviaturas
TBLP1 Tiempo predicho por el modelo después de la dosis cuando la actividad de FVIII ha disminuido a aproximadamente 1 UI/dL por encima del valor de referencia
TBLP3 Tiempo predicho por el modelo después de la dosis cuando la actividad de FVIII ha disminuido a aproximadamente 3 UI/dL por encima del valor de referencia
Cálculos
KV_M = Cmáx_M/Dosis Real (UI/kg)
KV_OB = Cmáx_OB/Dosis Real (UI/kg)
IVR_M = 100 x Cmáx_M x Volumen Plasma (dL) / Dosis Total en UI, en que
volumen de plasma en mL = (23,7 x Altura en cm) (9,0 x Peso en kg) - 1709.
IVR_OB = 100 x Cmáx_OB x Volumen Plasma (dL) / Dosis Total en UI, en que
volumen de plasma en mL = (23,7 x Altura en cm) (9,0 x Peso en kg) - 1709.
Resultados
(a) Farmacocinética de Dosis Única (Ensayo de Una Etapa)
La actividad de FVIII observada aumentó bruscamente después de la infusión IV corta de ADVATE® o rFVIIIFc, con valores de Cmáx predichos por el modelo medios (± DE) de 56,6 ± 4,74 y 121 ± 28,2 UI/dL para ADVATE® y 55,6 ± 8,18 y 108 ± 16,9 UI/dL para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Todos los pacientes tratados con ADVATE® y rFVIIIFc tuvieron aumentos relacionados con la dosis en la actividad del FVIII. El aumento observado tanto en Cmáx como en AUCinf fue ligeramente menor que proporcional a la dosis en el intervalo de dosis evaluado.
Después del final de la infusión, la disminución de la actividad de FVIII observada exhibió características de desintegración monoexponenciales hasta que se alcanzó el nivel de referencia. La velocidad de disminución en la actividad del FVIII fue más lenta para rFVIIIFc que para ADVATE® con valores de semivida de eliminación medios (± DE) pronosticados por el modelo de 11,9 ± 2,98 y 10,4 ± 3,03 h para ADVATE® y 18,0 ± 3,88 y 18,4 ± 6,99 h para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores de la semivida de eliminación parecieron ser independientes de la dosis en el intervalo de dosis evaluado para ambos productos de FVIII.
La exposición total sistémica de FVIII (evaluada por AUCinf) fue ~ 48% y 61% mayores después de la administración de rFVIIIFc que ADVATE® a niveles de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores medios (± DE) de AUCinf predichos por el modelo fueron 974 ± 259 y 1810 ± 606 h*UI/dL para ADVATE® y 1440 ± 316 y 2910 ± 1320 h*UI/dL para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente.
De manera similar a la semivida de eliminación, el MRT se prolongó para rFVIIIFc con respecto a ADVATE®. Los valores medios (± DE) de MRT predichos por el modelo fueron 17,1 ± 4,29 y 14,9 ± 4,38 h para ADVATE® y 25,9 ± 5,60 y 26,5 ± 10,1 h para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores de MRT parecían ser independientes de la dosis en el intervalo de dosis evaluado para ambos productos de FVIII.
Además, se determinaron valores de los parámetros PK primarios para CL y V. Los valores de CL para rFVIIIFc solo representaron ~ 66% de los observados para ADVATE® en dosis equivalentes. Los valores medios (± DE) de CL predichos por el modelo fueron 2,70 ± 0,729 y 4,08 ± 1,69 mL/h/kg para ADVATE® y 1,80 ± 0,409 y 2,69 ± 1,25 mL/h/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores de V fueron equiparables entre ADVATE® y rFVIIIFc con valores de V medios (± DE) predichos por el modelo de 43,9 ± 4,27 y 56,1 ± 13,4 mL/kg para ADVa Te® y 45,3 ± 7,23 y 61,6 ± 10,6 mL/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Se observaron ligeros incrementos en los valores medios de CL y V con el aumento de la dosis de ADVATE® y rFVIIIFc; sin embargo, el incremento de las desviaciones estándares a la dosis de 65 UI/kg, junto con los niveles de dosis limitados, confundió la evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros. Por ejemplo, el valor de CL medio geométrico del CV% para el grupo de tratamiento con rFVIIIFc aumentó de 23,0% (25 UI/kg) a 48,6% (65 UI/kg).
Además de los parámetros PK primarios, se determinaron los parámetros PK secundarios (p. e j, valores K, IVR, etc.) para evaluar la duración del efecto de FVIII. También se observó evidencia de la diferencia PK con rFVIIIFc que demuestra valores incrementados de TBLP1 y TBLP3 en comparación con ADVATE® en dosis equivalentes. Los valores K e IVR para ADVATE® y rFVIIIFc parecían ser equiparables. Se observó un ligero incremento en los valores de TBLP1 y TBLP3 con el incremento de la dosis de ADVATE® y rFVIIIFc. Por el contrario, se observaron ligeras disminuciones en los valores medios de IVR y K con el aumento de la dosis de ADVATE® y rFVIIIFc. Como se indicó previamente, una evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros se confunde por niveles de dosis limitados.
El TBLP1 medio (± DE) observado fue 2,88 ± 0,733 y 2,93 ± 0,848 UI/dL por UI/kg para ADVATE® y 4,28 ± 0,873 y 5,16 ± 2,02 UI/dL por UI/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. El Tb Lp3 medio (± DE) observado fue 2,06 ± 0,527 y 2,26 ± 0,666 UI/dL por UI/kg para ADVATE® y 3,09 ± 0,623 y 3,93 ± 1,59 UI/dL por UI/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente.
Los valores medios de IVR y K calculados utilizando valores Cmáx observados (restado con el fármaco de referencia y residual dentro del modelo) fueron generalmente mayores que los valores determinados utilizando valores Cmáx pronosticados por el modelo; consistente con una ligera subestimación de la actividad pico observada utilizando el modelo de un compartimiento. Los valores de K medios (± DE) observados fueron 2,57 ± 0,198 y 2,13 ± 0,598 UI/dL por UI/kg para A dVa TE® y 2,46 ± 0,330 y 1,85 ± 0,332 UI/dL por UI/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores medios (± DE) de IVR observados fueron 94,1 ± 15,6 y 85,8 ± 16,5 % para ADVATE® y 89,5 ± 11,9 y 74,8 ± 6,72 % para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente,
(b) Farmacocinética de Dosis Única (Ensayo Cromogénico)
La actividad de FVIII observada aumentó bruscamente después de la infusión IV corta de ADVATE® o rFVIIIFc, con valores de Cmáx predichos por el modelo medios (± DE) de 70,2 ± 9,60 y 157 ± 38,6 UI/dL para ADVATE® y 70,3 ± 10,0 y 158 ± 34,7 UI/dL para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente.
Todos los pacientes tratados con ADVATE® y rFVIIIFc tuvieron incrementos relacionados con la dosis en la actividad de FVIII. El incremento observado tanto en Cmáx como en AUCinf fue ligeramente menor que proporcional a la dosis a lo largo del intervalo de dosis evaluado.
Después del final de la infusión, la disminución de la actividad de FVIII observada exhibieron características de desintegración monoexponenciales hasta que se alcanzó el nivel de referencia. La tasa de disminución en la actividad del FVIII fue más lenta para rFVIIIFc que para ADVATE® con valores de semivida de eliminación promedio (± DE) pronosticados por el modelo de 10,7 ± 1,98 y 10,3 ± 3,27 h para ADVATE® y 16,2 ± 2,92 y 19,0 ± 7,94 h para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores de la semivida de eliminación parecieron ser independientes de la dosis en el intervalo de dosis evaluado para ambos productos de FVIII.
La exposición total sistémica FVIII (evaluada por AUCinf) fue ~ 53% y 84% mayor después de la administración de rFVIIIFc que de ADVATE® a niveles de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores medios (± DE) de AUCinf predichos por el modelo fueron 1080 ± 236 y 2320 ± 784 h*UI/dL para ADVATE® y 1650 ± 408 y 4280 ± 1860 h*UI/dL para rFVIIIFc para los grupos de dosis DE 25 y 65 UI/kg, respectivamente.
De manera similar a la semivida de eliminación, el MRT se prolongó para rFVIIIFc con respecto a ADVATE®. Los valores medios (± DE) de MRT predichos por el modelo fueron 15,3 ± 2,86 y 14,8 ± 4,72 h para ADVATE® y 23,4 ± 4,22 y 27,3 ± 11,4 h para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 Ul/kg, respectivamente. Los valores de MRT parecían ser independientes de la dosis a lo largo del intervalo de dosis evaluado para ambos productos de FVIII.
Además, se determinaron valores de los parámetros PK primarios para CL y V. Los valores de CL para rFVIIIFc solo representaron ~ 58-66% de los observados para ADVATE® en dosis equivalentes. Los valores medios (± DE) de CL predichos por el modelo fueron 2,39 ± 0,527 y 3,21 ± 1,40 mL/h/kg para ADVATE® y 1,57 ± 0,349 y 1,86 ± 0,970 mL/h/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores de V fueron equiparables entre ADVATE® y rFVIIIFc con valores de V medios (± DE) predichos por el modelo de 35,8 ± 5,52 y 43,6 ± 11,2 mL/kg para ADVa Te® y 35,9 ± 6,65 y 42,7 ± 8,91 mL/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Se observaron incrementos en los valores medios de CL y V con el incremento de la dosis de ADVATE® y rFVIIIFc; sin embargo, el incremento en las desviaciones estándares a 65 UI/kg, junto con niveles de dosis limitados, confundió la evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros.
Además de los parámetros PK primarios, se determinaron los parámetros PK secundarios (p. e j, valores K, IVR, etc.) para evaluar la duración del efecto de FVIII. También se observó evidencia de diferencia PK con rFVIIIFc que demuestra valores incrementados de TBLP1 y TBLP3 en comparación con ADVATE® en dosis equivalentes y los valores de IVR y K para ADVATE® y rFVIIIFc parecían ser equiparables.
Se observó un ligero incremento en los valores de TBLP1 y TBLP3 al aumentar la dosis de ADVATE® y rFVIIIFc. Por el contrario, se observaron ligeras disminuciones en los valores medios de IVR y K con el aumento de la dosis de ADVATE® y rFVIIIFc. Como se indicó anteriormente, una evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros se confunde por niveles de dosis limitados.
La media (± DE) de TBLP1 observada fue 2,70 ± 0,511 y 3,09 ± 0,978 UI/dL por UI/kg para ADVATE® y 4,06 ± 0,798 y 5,66 ± 2,38 UI/dL por UI/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. La media (± DE) de TBLP3 observada fue 1,98 ± 0,377 y 2,39 ± 0,718 UI/dL por UI/kg para ADVATE® y 3,04 ± 0,598 y 4,44 ± 1,84 UI/dL por UI/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente.
Los valores de IVR y K medios calculados utilizando los valores observados para Cmáx (restados con el fármaco de referencia y residual dentro del modelo) fueron generalmente mayores que los valores determinados utilizando los valores de Cmáx pronosticados por el modelo; consistente con una ligera subestimación de la actividad máxima observada utilizando el modelo de un compartimiento. Los valores de K medios (± DE) observados fueron 3,08 ± 0,429 y 2,85 ± 0,721 UI/dL por UI/kg para ADVATE® y 3,12 ± 0,451 y 2,92 ± 0,985 UI/dL por UI/kg para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente. Los valores medios (± DE) de IVR observados fueron 112 ± 14,5 y 116 ± 26,9% para ADVATE® y 113 ± 16,3 y 117 ± 33,6% para rFVIIIFc para los grupos de dosis de 25 y 65 UI/kg, respectivamente.
Conclusiones
Todos los pacientes tratados con ADVATE® y rFVIIIFc tuvieron incrementos relacionados con las dosis equiparables en Cmáx y AUCinf a lo largo del intervalo de dosis evaluado. Los niveles plasmáticos picos de actividad de ADVATE® y rFVIIIFc se observaron generalmente dentro de la primera hora después del final de la infusión y permanecieron siendo detectables durante varios días después de la dosificación. Después del final de la infusión, la disminución en la actividad de FVIII corregida del valor de referencia mostró una disminución monoexponencial hasta que se alcanzó el valor de referencia para ambos productos. Los valores de los parámetros para la semivida media de eliminación y el MRT parecieron ser independientes de la dosis en el intervalo de dosis evaluado para ambos productos de FVIII. Se observaron ligeros incrementos en los valores medios de CL y V con el incremento de la dosis de ADVATE® y rFVIIIFc; sin embargo, una variabilidad incrementada entre sujetos a 65 Ul/kg, junto con niveles de dosis limitados, confundió la evaluación de la dependencia de la dosis de estos parámetros.
La comparación de la actividad PK de rFVIIIFc y ADVATE® reveló un incremento aproximado del 48-61% (Ensayo de Una Etapa) o del 53-84% (Ensayo Cromogénico) en la exposición sistémica, una reducción aproximada del 30-40% en el aclaramiento y un incremento aproximado del 50-80% tanto en la semivida de eliminación como en el MRT para rFVIIIFc con respecto a ADVATE® en dosis equiparables. También se observó evidencia de diferencia PK con rFVIIIFc que demuestra valores incrementados de TBLP1 y TBLP3 en comparación con ADVATE® en dosis equivalentes. Los valores de IVR y K para ADVATE® y rFVIIIFc parecían ser equiparables.
Los parámetros PK obtenidos a partir de los resultados del Ensayo Cromogénico estuvieron generalmente de acuerdo con los del Ensayo de Una Etapa, excepto que el Ensayo Cromogénico produjo una estimación más alta de parámetros de exposición (p. ej., Cmáx , AUCinf, etc.).
Las mejoras observadas en PK indican que rFVIIIFc puede proporcionar protección prolongada de sangrado, lo que permite inyecciones menos frecuentes, para individuos con hemofilia A.
Ejemplo 6
Estudio Clínico de fase 3 rFVIIIFc A-LONG
Sobre la base del análisis PK provisional desde el primer estudio en seres humanos de rFVIIIFc (véase el Ejemplo 3), se diseñó el estudio A-LONG. A-LONG fue una evaluación de Fase 3 de etiqueta abierta, global, multicéntrico, de la seguridad, farmacocinética y eficacia de la fusión Fc de FVIII recombinante (FVIII:Fc) en la prevención y el tratamiento de hemorragia en sujetos previamente tratados con hemofilia A grave (definido como <1 UI/dL [<1%] de FVIII endógeno).
Los objetivos primarios del estudio A-LONG fueron (i) evaluar la seguridad y tolerabilidad de rFVIIIFc administrada como profilaxis, semanal, a demanda y regímenes de tratamiento quirúrgico y (ii) evaluar la eficacia de rFVIIIFc administrado como profilaxis personalizada, a demanda y regímenes de tratamiento quirúrgico. El objetivo secundario del estudio A-LONG fue (i) caracterizar el perfil PK de rFVIIIFc y comparar la PK de rFVIIIFc con el producto actualmente comercializado, ADVATE®, (ii) evaluar las respuestas individuales con rFVIIIFc, (iii) caracterizar el intervalo de dosis y programas requeridos para prevenir adecuadamente el sangrado en un régimen de profilaxis, mantener la homeostasis en un entorno quirúrgico o tratar episodios de sangrado en un entorno de profilaxis o tratamiento semanal a demanda y (iv) evaluar el consumo de rFVIIIFc (p. ej., el consumo de rFVIIIFc anualizada total por sujeto).
165 sujetos fueron incluidos en uno de tres regímenes: un régimen de profilaxis personalizado (Arm 1), un régimen semanal de dosificación (Arm 2) y un régimen a demanda (Arm 3). Además, rFVIIIFc se evaluó en un subgrupo de gestión perioperatorio.
Criterios de inclusión clave: (i) hombre, (ii) >12 años de edad y al menos 40 kg, (iii) diagnóstico de hemofilia A grave definida como <1% (<1 UI/dL) de actividad endógena de FVIII y (iv) historial de > 150 días de exposición previa documentada con cualquier producto de FVIII actualmente comercializado.
Brazo 1: Régimen de Profilaxis Personalizado
El brazo 1 incluyó un grupo general y un subgrupo PK. El régimen inicial fue dos veces semanalmente a 25 UI/kg el primer día, seguido de 50 UI/kg el cuarto día de la semana (Día 4). A los sujetos se les administró rFVIIIFc en este régimen de profilaxis semanal hasta que estuvieron disponibles los resultados PK para rFVIIIFc. En base a estos resultados, se estableció un régimen de profilaxis personalizado para cada uno de los individuos, en el que se determinó la dosis y el intervalo para mantener un nivel valle de 1-3% de actividad de FVIII. Luego, a cada uno de los sujetos se le administró su régimen de profilaxis personalizado individualmente durante todo el estudio.
Los sujetos fueron monitorizados durante todo el estudio y la dosis en curso y se hicieron ajustes a intervalos. Solo se hicieron ajustes cuando un sujeto experimentó episodios de sangrado inaceptables definidos como > 2 episodios de sangrado espontáneos durante un período continuo de dos meses. En este caso, el ajuste fijó como objetivo niveles mínimos de 3-5%.
Brazo 2: Régimen de Dosificación Semanal
Se sometio a sujetos a un perfil de PK de rFVIIIFc abreviado como sigue: lavado de al menos 96 horas; una dosis única de rFVIIIFc 65 UI/kg; muestreo abreviado que comienza el Día 0 de rFVIIIFc, incluyendo la pre-inyección y 10 (± 2) minutos, 3 horas (± 15 minutos), 72 (± 2) horas [Día 3] y 96 (± 2) horas [Día 4] desde el inicio de la inyección. Después del perfil PK abreviado, a los sujetos se les administró una dosis fija de 65 UI/kg de rFVIIIFc cada 7 días al menos durante 28 semanas y hasta 52 semanas.
Brazo 3: Tratamiento Episódico (A Demanda)
Los sujetos recibieron tratamiento episódico de rFVIIIFc según fuera necesario para el sangrado. Los sujetos fueron reclutados y asignados al azar y se sometieron a un perfil PK de rFVIIIFc abreviado de la siguiente manera:
(i) Lavado: al menos 96 horas.
(ii) Dosificación de rFVIIIFc Día 0: Una dosis única de rFVIIIFc 50 UI/kg administrada bajo supervisión médica. (iii) Muestreo abreviado comenzando en rFVIIIFc Día 0: Preinyección y 30 (± 3) minutos, 3 horas (± 15 minutos), 72 (± 2) horas [Día 3] y 96 (± 2) horas [Día 4] desde el inicio de la inyección.
En los sitios de selección, el muestreo por TGA se realizó coincidente con todos los intervalos de tiempo de perfiles de PL. Para el subconjunto de sujetos sometidos a muestreo para ROTEM/TEG, las recolecciones se realizaron en los siguientes intervalos de tiempo: Preinyección y 3 horas (± 15 minutos), 72 (± 2) horas [Día 3] y 96 (± 2) horas [Día 4] desde el inicio de la inyección.
Entre las visitas programadas, los sujetos fueron tratados de episodios de sangrado en dosis de rFVIIIFc de entre 10 y 50 UI/kg, dependiendo de la gravedad del sangrado.
Subgrupo de Gestión Perioperatorio
rFVIIIFc se administró antes de una cirugía posterior en el subconjunto de pacientes que requieren un procedimiento quirúrgico principal durante el estudio. La cirugía mayor se define como cualquier proceso quirúrgico (electivo o emergente) que implique anestesia general y/o asistencia respiratoria en el que se atraviesa y expone una cavidad corporal mayor, o por el cual se produce un deterioro sustancial de las funciones físicas o fisiológicas (p. ej., laparotomía, toracotomía, craneotomía, reemplazo de articulaciones y amputación de extremidades).
Para la profilaxis durante la cirugía, los sujetos se trataron con 20 a 50 UI/kg de rFVIIIFc cada 12 a 24 horas. Antes de la cirugía, el médico revisó el perfil PK de rFVIIIFc del sujeto y evaluó el régimen de dosis de reemplazo de FVIII generalmente requerido para el tipo de cirugía planificada y el estado clínico del sujeto. La recomendación para la dosificación adecuada de rFVIIIFc en el período de tratamiento quirúrgico, incluido cualquier tiempo de rehabilitación, tuvo en cuenta estos factores.
Evaluación Farmacocinética (PK): Todos los sujetos en todos los brazos tenían una evaluación inicial de PK después de su primera dosis de rFVIIIFc. Se asignó un subconjunto de sujetos del Brazo 1 a un subgrupo secuencial de PK especificado por el protocolo para comparar la PK de rFVIIIFc con el factor VIII recombinante (rFVIII, ADVATE® [método sin albúmina/plasma anti-factor hemofílico (recombinante)]) de la siguiente manera:
(i) Antes del tratamiento en el Brazo 1, se evaluó la PK después de una dosis única de ADVATE® de 50 UI/kg.
A continuación, se evaluó la farmacocinética en estos mismos sujetos después de una dosis única de rFVIIIFc de 50 UI/kg.
(ii) Se repitió la PK de rFVIIIFc a las 12 a 24 semanas.
Medidas claves de resultado de eficacia (incluidos en la lectura inicial): (i) tasa de sangrado anualizada (ABR) en el Brazo 1 frente al Brazo 3 (brazo de profilaxis individualizado comparado con brazo de tratamiento episódico), (ii) el número de inyecciones requeridas para resolver un episodio hemorrágico, (iii) tratar las evaluaciones de los médicos de la respuesta de los sujetos a la cirugía con rFVIIIFc utilizando una escala de 4 puntos.
Medidas de resultado de PK: PK de rFVIIIFc y ADVATE®.
Medidas clave de resultado de seguridad: (i) Incidencia del desarrollo de inhibidores; y (ii) incidencia de eventos adversos (AEs) que ocurren fuera del período de gestión perioperatorio.
Resultados:
Sujetos: Un total de 165 sujetos se inscribieron en el estudio. Brazo 1 (profilaxis individualizada), n = 118; Brazo 2 (profilaxis semanal), n = 24; Brazo 3 (tratamiento episódico), n = 23; Subgrupo de gestión perioperatorio, n = 9, 9 cirugías (8 sujetos del Brazo 1 y 1 del Brazo 2). El 92,7% de los sujetos completaron el estudio.
Eficacia: ABR mediana (brazo de profilaxis individualizado: 1,6; brazo de profilaxis semanales: 3,6; brazo de tratamiento episódico: 33,6). En el brazo de profilaxis individualizada, el intervalo de dosificación mediana fue de 3,5 días durante los últimos 3 meses del estudio. El 30 por ciento de los pacientes del brazo de profilaxis individualizada alcanzó un intervalo de dosificación medio de al menos 5 días. El 98% de los episodios de sangrado se controlaron con una o dos inyecciones de rFVIIIFc. En la gestión perioperatoria, los médicos tratantes calificaron la eficacia hemostática de rFVIIIFc como excelente o buena en el 100% de las cirugías.
PK: La semivida terminal media geométrica de rFVIIIFc fue de aproximadamente 19,0 horas, que es 1,53 veces mayor que la de ADVATE® (aproximadamente 12,4 horas).
Seguridad: No se detectaron inhibidores de rFVIIIFc, y no se reseñaron casos de anafilaxis. En general, el rFVIIIFc se toleró bien. Los AEs más comunes, independientemente de la causalidad (incidencia > 5%) que ocurrieron fuera del período de gestión perioperatorio fueron nasofaringitis, artralgia, cefalea e infección del tracto respiratorio superior. 12 sujetos (7,3%) experimentaron al menos un EA grave (SAE) fuera del período de gestión perioperatorio. El investigador no evaluó SAEs como relacionado con el fármaco.
Sumario
Regímenes profilácticos individualizados y semanales resultaron en tasas de sangrado anualizadas medianas bajas de un solo dígito. En el brazo de profilaxis individualizada, el intervalo de dosificación mediano fue de 3,5 días. Durante los últimos 3 meses del estudio, el 30 por ciento de los pacientes del brazo de profilaxis individualizada logró un intervalo de dosificación medio de al menos 5 días. El 98% de los episodios de sangrado se controlaron con una o dos inyecciones de rFVIIIFc. La eficacia hemostática de rFVIIIFc durante la cirugía fue calificada por los médicos tratantes como excelente o buena en el 100% de las cirugías. La semivida de rFVIIIFc fue de aproximadamente 19,0 horas en comparación con las 12,4 horas de ADVATE®. Ningún sujeto desarrolló un inhibidor ni experimentó una reacción anafiláctica al rFVIIIFc. En general, el FVIIIFc recombinante fue bien tolerado.
Ejemplo 7
Evaluación Clínica ROTEM®
Además de la medición de la actividad de FVIII en plasma por un ensayo del tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) de una etapa, tromboelastometría rotacional (ROTEM®) en sangre entera también se ha explorado para evaluar la mejora en la hemostasia global mediante rFVIIIFc y ADVATE® en 2 sujetos, específicamente, 1 en la cohorte de dosis baja y 1 en la cohorte de dosis alta.
rFVIIIFc y ADVATE® parecen ser comparativamente activos en la formación de coágulos cuando se agregan a la sangre de los sujetos antes del tratamiento con rFVIIIFc. El tiempo de coagulación (CT) fue lineal con respecto a la dosis de rFVIIIFc y ADVATE® en el intervalo de aproximadamente el 1% del 100% de lo normal, y la respuesta a la dosis fue equiparable entre rFVIIIFc y ADVATE® en el mismo sujeto.
Después de la dosificación con ADVATE® y posteriormente rFVIIIFc, se tomaron muestras de sangre entera citrada en diversos intervalos de tiempo y se vigiló por ROTEM® la formación de coágulos después de recalcificación. A pesar del CT basal variable debido a los niveles de FVIII residual antes de la dosificación de ADVATE® o rFVIIIFc, ambos productos corrigieron eficazmente el CT a niveles equiparables 30 minutos después de la inyección. Además, la mejora en el CT se mantuvo mejor en y después de 3 horas después de la inyección de 25 UI/kg de rFVIIIFc con respecto a ADVATE® en el sujeto dosificado a esta dosis baja. Sin embargo, la mejora diferencial de rFVIIIFc frente a ADVATE® fue mucho menos apreciable a la dosis de 65 UI/kg.
Ejemplo 8
Eficacia in v ivo de rFVIIIFc y rFVIII de Cadena Sencilla (SC) en Ratones HemA
El Factor VIIIFc recombinante (rFVIIIFc) se compone de una proteína rFVIII con dominio B suprimido (BDD) genéticamente condensada al dominio Fc de la inmunoglobulina G1 humana (IgG1). Antes de la secreción de las células HEK 293, la mayor parte del rFVIIIFc se procesa en una cadena pesada (HC) y una cadena ligera (LC+Fc) de FVIII. En circulación, el rFVIIIFc forma un complejo con el factor von Willebrand (VWF) y se libera tras la activación de una manera que es indistinguible del FVIII nativo. Se cree que la disociación espontánea de la HC y la LC contribuye a la pérdida de actividad del FVIII en el plasma y durante el almacenamiento de los fármacos con FVIII. Aquí, los autores de la invención describen una isoforma no procesada de cadena sencilla de rFVIIIFc (SC rFVIIIFc), que puede proporcionar una capacidad de fabricación superior y una estabilidad mejorada en comparación con el FVIII nativo.
SC rFVIIIFc se purificó a partir de rFVIIIFc, que contiene una fracción de la isoforma no procesada. Comparado con rFVIIIFc, SC rFVIIIFc mostró una actividad cromogénica equivalente, pero aproximadamente un 60% de actividad reducida por el ensayo (aPTT) de una etapa, (TABLAS 3A y 3B). El ensayo de generación de trombina (TGA) se realizó utilizando un trombograma automatizado calibrado (de Thrombinoscope®). En un ensayo de generación de trombina (TGA), SC rFVIIIFc también mostró un potencial de trombina reducido (FIG. 13A) y un pico de trombina (FIG. 13B) en comparación con rFVIIIFc. Sin embargo, como se muestra en la TABLA 3B, se observó la actividad completa de SC rFVIIIFc por aPTT en ausencia de vWF, lo que sugiere que la liberación de vWF puede retrasarse debido al enlace covalente de la región ácida a3 a la HC después de la escisión de Arg 1680 en SC rFVIIIFc, en contraste con la liberación de a3 y la disociación de FVIII completamente procesado. La disociación retardada del vWF puede explicar la actividad reducida observada en el ensayo aPTT y TGA, mientras que la actividad completa se observó en el ensayo cromogénico de dos etapas. Se confirmó una tasa reducida de activación en presencia de vWF en un ensayo de sustrato cromogénico modificado con trombina limitante como activador de FVIII.
La función in vivo de SC rFVIIIFc se evaluó en el modelo de transección de la vena de la cola de ratón HemA (TVT). Los ratones fueron anestesiados primero y luego se les inyectaron 4,6 pg/kg, 1,38 pg/kg o 0,46 pg/kg de rFVIIIFc procesado (Sustancia Farmacológica, que contiene aproximadamente 75%-85% de rFVIIIFc procesado) y rFVIIIFc de cadena sencilla (SC) purificado 48 horas antes de la TVT. Se cortó la cola de la punta y se colocó inmediatamente en un tubo para recoger sangre. Se midió el porcentaje de protección sobre la supervivencia para el rFVIIIFc procesado (sustancia farmacológica) y el FVIIIFc de cadena sencilla (SC) como se muestra en la TABLA 7 y las FIGS. 7A, 7B y 7C.
TABLA 7. Eficacia in vivo de rFVIIIFc DS y rFVIIIFc de cadena única (SC)
Figure imgf000047_0001
Se controlaron el re-sangrado de la cola in vivo y la supervivencia cada hora hasta 12 horas después de la TVT con la observación final realizada a las 24 horas después de la TVT. SC rFVIIIFc y rFVIIIFc demostraron una eficacia in vivo equivalente en este modelo, con una DE50 de 1,17 qg/kg y 1,23 qg/kg, respectivamente cuando se realizó la TVT 48 horas después de la infusión (FIG. 7A). Se observaron curvas de supervivencia de 24 horas post TVT equiparables (p > 0,65) (FIG. 7B) y tasas de re-sangrado (FIG. 7C) en ratones HemA para SC rFVIIIFc y rFVIIIFc en cada uno de los niveles de dosis testados, lo que indica que SC rFVIIIFc fue igualmente eficaz que rFVIIIFc a pesar de su menor actividad aparente de aPTT. Por lo tanto, la activación retardada in vitro de SC rFVIIIFc en presencia de vWF no pareció tener un impacto significativo sobre su eficacia in vivo. Estas observaciones indicaron que SC rFVIIIFc representa una nueva y eficaz isoforma de rFVIIIFc con posibles aplicaciones clínicas.
Ejemplo 9
Estudio de Ensayo Clínico de Fase 1/2a
rFVIIIFc es una proteína de fusión recombinante compuesta por una única molécula de FVIII enlazada covalentemente al dominio Fc de la IgG1 humana para prolongar la semivida del rFVIII circulante. Este primer estudio en seres humanos en sujetos masculinos previamente tratados con hemofilia A grave investigó la seguridad y la farmacocinética de rFVIIIFc. Dieciséis sujetos recibieron una dosis única de ADVATE® a razón de 25 o 65 UI/kg, seguida de una dosis igual de rFVIIIFc. La mayoría de los eventos adversos no estaban relacionados con el fármaco del estudio. Ninguno de los sujetos del estudio desarrolló anticuerpos anti-FVI 1 Fc o inhibidores. A través de niveles de dosis, en comparación con ADVATE®, rFVIIIFc mostró 1,54-1,71 veces más larga ty2 de eliminación y el tiempo medio de permanencia, 1,49 a 1,56 veces menor aclaramiento y 1,48 a 1,56 veces la exposición sistémica más alta total. ADVATE® y rFVIIIFc tuvieron concentraciones plasmáticas máximas y recuperaciones dependientes de la dosis equiparable. El tiempo hasta la actividad del FVIII al 1% por encima del valor de referencia fue aproximadamente de 1,53 a 1,68 veces mayor que el de ADVATE® en todos los niveles de dosis. Por lo tanto, rFVIIIFc puede ofrecer un enfoque terapéutico viable para lograr una protección hemostática prolongada y una dosificación menos frecuente en pacientes con hemofilia A.
rFVIIIFc es una proteína de fusión recombinante compuesta por una única molécula de rFVIII con dominio B suprimido, enlazada covalentemente al dominio Fc de IgG1 humana. Las ventajas potenciales de las proteínas de fusión Fc incluyen una mejor tolerabilidad y una protección hemostática prolongada, y el dominio Fc representa una molécula natural sin toxicidad inherente conocida. Dumont J.A. et al., BioDrugs 20(3): 151-60 (2006), Dumont J.A. et al., "Monomeric Fc fusion technology: an approach to create longlasting clotting factors," en: Kontermann R., ed., Therapeutic Proteins-Strategies to Modulate Half-Life, Capítulo 11, editor Wiley VCH; pre-publicado en línea, DOI: 10.1002/9783527644827.ch10. La unión al dominio Fc de IgG1 permite la unión al receptor Fc neonatal (FcRn), que se expresa en muchos tipos de células, incluyendo las células endoteliales. La expresión de FcRn permanece estable durante toda la vida y es responsable de proteger las proteínas de fusión IgG1 y Fc de la degradación lisosomal, prolongando así la t1/2 de la proteína. Dumont J.A. et al., BioDrugs 20(3): 151 -60 (2006), Roopenian D.C. et al., Nat Rev Immunol. 7(9):715-25 (Pub. electrónica del 17 de agosto de 2007). Numerosas proteínas dentro de la circulación se internalizan en las células que recubren la vasculatura a través de una pinocitosis inespecífica y se transportan a las vías de degradación endosomal y lisosomal.
Las proteínas Fc interactúan con FcRn, residente dentro de los endosomas. Los endosomas que contienen FcRn dirigen las proteínas de fusión Fc de regreso a la membrana plasmática, liberándolas a la circulación de una manera dependiente del pH, Lencer W.I. y Blumberg R.S., Trends Cell Biol. 15(1):5-9 (2005), evitando así la degradación lisosomal. Este enfoque de reciclaje se ha utilizado con éxito para prolongar la t 1/2 de las biologías terapéuticas; se ha aprobado un cierto número de fármacos basados en la fusión de Fc para uso clínico (p. ej., etanercept, romiplostim) y otros están en desarrollo. Huang C., Curr Opin Biotechnol 20(6)692-9. (Pub. electrónica del 4 de noviembre de 2009), Schmidt S.R., Curr Opin Drug Discov Devel. 12(2): 284-295 (2009).
Los datos preclínicos para rFVIIIFc indican que FVIII puede ser rescatado de la degradación por una vía protectora natural mediada por FcRn, prolongando así la t 1/2. En ratones y perros con hemofilia A, la t 1/2 plasmática terminal para rFVIIIFc fue aproximadamente 2 veces mayor que con rFVIII. Dumont J. et al., Blood. 116 (21) Resumen 545 (2009), Liu T. et al., J Thromb Haemost. 9(S2):561 (2011). Basándose en estos datos, los autores de la invención realizaron un primer estudio clínico en seres humanos para investigar la seguridad y la PK de una proteína de fusión rFVIIIFc de larga duración en sujetos con hemofilia A.
Diseño del Estudio
Este estudio de etiqueta abierta, de dosis escalada, multicéntrico de fase 1/2a en pacientes tratados previamente con hemofilia A grave investigó la seguridad de rFVIIIFc y su farmacocinética (PK) en comparación con ADVATE® (factor antihemofílico [recombinante], plasma/método sin albúmina, octocog alfa, Baxter Healthcare). Este estudio se realizó de acuerdo con las Directrices sobre Buenas Prácticas Clínicas de la CFR de EE.UU. y la ICH. Antes de cualquier prueba, se obtuvo la aprobación de las Juntas de Revisión Institucional participantes y los consentimientos informados por escrito de todos los sujetos. El diseño del estudio fue secuencial; se administró una dosis única de ADVATE® a razón de 25 o 65 UI/kg seguida de una dosis igual de rFVIIIFc (Figura 8). Ambos fármacos se inyectaron por vía intravenosa durante aproximadamente 10 minutos. Se esperaba que los dos niveles de dosis comprendieran los intervalos de dosis terapéuticas típicos. Los sujetos fueron seguidos durante 28 días después de recibir rFVIIIFc para el análisis de seguridad, incluyendo la prueba de anticuerpos anti-FVIII e inhibidores a los 14 y 28 días después de la inyección. La actividad plasmática de FVIII se midió en los sujetos antes de la inyección, 10 y 30 minutos, 1, 3, 6, 9, 24, 48, 72, 96, 120 y 168 horas (7 días) después de la inyección de rFVIIIFc, con muestras adicionales a las 192, 216 y 240 horas (10 días) para sujetos a los que se les administró una dosis de 65 UI/kg de rFVIIIFc. La actividad plasmática del FVIII se midió en los mismos intervalos de tiempo después del tratamiento con ADVATE®, durante 72 horas para el grupo de 25 UI/kg y 96 horas para el grupo de 65 UI/kg.
(a) Sujetos
Los sujetos masculinos eran al menos de 12 años de edad con hemofilia A grave (definida como el nivel de actividad de FVIII < 1%) y tenían al menos 100 días de exposición anterior documentada para concentrados de FVIII (pdFVIII o rFVIII). Se excluyeron sujetos con hipersensibilidad conocida a la proteína de ratón o hámster, historial de inhibidor o título de inhibidor detectable en la selección, o que estaban tomando cualquier medicación que pudiera afectar la hemostasis o fármacos inmunosupresores sistémicos, o que experimentaron una infección bacteriana o viral activa (distinta de la hepatitis o el VIH) dentro de los 30 días posteriores a la selección. El genotipo de los sujetos se registró al ingresar al estudio, cuando se conoció.
(b) Producto de Tratamiento
La rFVIIIFc humana y transgenes Fc se transfectaron de forma estable en células HEK293 y la línea celular se testó extensivamente en cuanto a la estabilidad, esterilidad y contaminación viral para garantizar la seguridad. El producto farmacéutico purificado está compuesto por un FVIII monomérico con dominio B suprimido enlazado covalentemente a través de su extremo carboxi al extremo N de un monómero Fc, que forma un enlace disulfuro con un segundo monómero Fc durante la síntesis y secreción de las células. El rFVIIIFc se purificó mediante cromatografía y nanofiltración y era completamente activo en ensayos de coagulación de una etapa y cromogénica con respecto a las preparaciones de rFVIII disponibles comercialmente. Se suministró como un líquido congelado que contenía 1000 UI por 2 mL de solución y se formuló con L-histidina (pH 7), cloruro sódico, cloruro de calcio, sacarosa, manitol y polisorbato 20. Para inyección, el producto se diluyó con solución salina. (NaCl al 0,9%).
(c) Medidas de Resultado
El principal objetivo del estudio fue la seguridad, evaluada mediante el examen físico, la presentación de informes de eventos adversos (AEs) emergentes del tratamiento, el desarrollo de anticuerpos y el seguimiento en laboratorio a lo largo del tiempo. Los objetivos secundarios incluyeron parámetros derivados de análisis de PK. Las evaluaciones de laboratorio incluyeron tiempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), índice internacional normalizado, niveles de dímero D, antígeno del factor von Willebrand (vWF), pruebas estándares de hematología y química sanguínea y análisis de orina.
La actividad de FVIII se midió mediante el ensayo de coagulación de una etapa (aPTT) en un analizador Siemens BCS-XP utilizando reactivos comerciales (Dade Actin FSL) con calibración frente a un plasma de referencia normal (Precision Biologics CRYOcheck™) trazable a la Organización Mundial de la Salud (OMS) 5° Patrón Internacional (IS) para el plasma humano. Además del ensayo aPTT, la actividad del FVIII se midió mediante un ensayo de sustrato cromogénico Rosen S., Scand J Haematol Suppl. 33 (Supl 40): 139-45 (1984) utilizando un kit disponible comercialmente (Aniara BIOPHEN FVI11 :C) que cumple con las recomendaciones de la Farmacopea Europea. El ensayo cromogénico se calibró frente a plasma humano normal de referencia (Instrumentation Laboratories ORKE45), que también tenía una potencia asignada frente al patrón de plasma humano 5° IS de la OMS.
El límite inferior de cuantificación (LLOQ) para los ensayos de una etapa y cromogénico fue de 0,5 UI/dL y 0,4 UI/dL, respectivamente. Los inhibidores de FVIII se midieron mediante el ensayo Bethesda modificado con Nijmegen y menos de 0,6 UB/mL se consideró negativo. Anticuerpos anti-rFVII I Fc se evaluaron utilizando un inmunoensayo electroquimioluminiscente de puenteo específico que utiliza biotina y rFVIIIFc sulfo-marcado. Se determinó que la sensibilidad del ensayo era de 89 ng/mL utilizando un anticuerpo monoclonal anti-FVIII humano como control sustituto. Se realizó una tromboelastometría de rotación de sangre entera (ROTEM®) exploratoria en dos sujetos, uno de cada uno de los niveles de dosis, en diversos intervalos de tiempo para evaluar la mejora en la hemostasia global después de inyección de ADVATE® y rFVMIFc.
(d) Análisis Farmacocinéticos
Un modelo de disposición de un compartimiento, definido por el usuario, que estima automáticamente el nivel de FVIII endógeno y la subsiguiente decadencia residual, se utilizó en WINNONLIN® para el análisis de los datos de actividad frente al tiempo de FVIII en plasma del sujeto individual después de una sola administración de ADVATE® o rFVIIIFc. Los tiempos de muestreo reales, las dosis y la duración de la inyección se utilizaron para calcular los parámetros que incluyen la actividad máxima (Cmáx), t 1/2, aclaramiento (CL), volumen de distribución en estado estacionario (Vss), área bajo la curva (tiempo cero extrapolado al infinito [AUCinf]), tiempo medio de permanencia (MRT) y recuperación incremental.
Simulación de Montecarlo del Perfil de Actividad de rFVIIIFc Frente al Tiempo: Para construir perfiles de actividad-tiempo de FVIII siguiendo regímenes de dosificación de 25 UI/kg o 65 UI/kg, se llevó a cabo una simulación de Montecarlo utilizando el modelo PK de población de ADVATE® y rFVIIIFc. Las estimaciones medias de los parámetros del modelo (CL, volumen de distribución) en la población testada, la varianza interindividual y la variabilidad residual se estimaron en función de los datos de la actividad del ensayo de coagulación de una etapa (aPTT) de ADVATE® y rFVIIIFc de 16 sujetos en este estudio de Fase 1/2a. Se estimularon quinientos sujetos con 15 puntos de muestreo para cada uno de los sujetos para cada régimen de dosificación. Se estimó el porcentaje de población con actividad de FVIII superior o igual a 1% y a 3% en diferentes intervalos de tiempo siguiendo diferentes regímenes de dosificación de ADVATE® o rFVIIIFc.
Análisis Estadísticos: Parámetros PK seleccionados para rFVIIIFc y ADVATE® se compararon utilizando un análisis de modelo de varianza. Los parámetros PK se transformaron logarítmicamente para estos análisis y las medias estimadas, las diferencias de medias y los intervalos de confianza en la escala logarítmica se transformaron para obtener estimaciones de las medias geométricas, las relaciones de medias geométricas (GMR) y los intervalos de confianza, respectivamente, en la escala original. La GMR es la media geométrica de la relación intra-individual del valor del parámetro PK rFVIIIFc al valor del parámetro PK ADVATE®.
Resultados
Disposición de Sujetos: Diecinueve sujetos fueron incluidos en el estudio; 16 se sometieron a evaluación PK tanto para ADVATE® como para rFVIIIFc. Un sujeto se auto-administró su producto anterior antes de completar el período de lavado después de la dosis con ADVATE® y, por lo tanto, fue excluido del análisis PK, pero se incluyó en el análisis de seguridad. Tres sujetos se retiraron del estudio antes de recibir cualquiera de los fármacos del estudio: uno se retiró voluntariamente; un segundo fue retirado por el investigador por incumplimiento; y uno fue retirado a solicitud del Patrocinador debido a la finalización de la inscripción al estudio. De los sujetos dosificados, seis sujetos recibieron 25 UI/kg y 10 sujetos recibieron 65 UI/kg tanto de ADVATE® como de rFVIIIFc. La edad media fue de 40,3 años (23 a 61 años). Se recogió la identificación genotípica de siete sujetos; la inversión del intrón 22 se reseñó en seis sujetos; y se reseñó un defecto de desplazamiento de marco en un sujeto. El genotipo fue desconocido para nueve sujetos. Trece sujetos tenían anticuerpos contra la hepatitis C, cuatro de los cuales también fueron positivos para el VIH.
Seguridad: Cuarenta y cuatro AEs emergentes del tratamiento fueron reseñados por 11 (69%) sujetos durante el tratamiento y los períodos de seguimiento. Esto incluyó el día de la dosificación con ADVATE® o rFVIIIFc durante un período de observación de 28 días después de la dosificación. La mayoría de los eventos se consideraron leves y ninguno provocó la retirada del estudio. Un evento, disgeusia, ocurrió transitoriamente en un sujeto mientras recibía una dosis de 65 UI/kg de rFVIIIFc y se consideró relacionado con rFVIIIFc. Un sujeto experimentó un ataque de ansiedad después de recibir 65 UI/kg de rFVIIIFc que resultó en 21 AEs, 19 de los cuales fueron calificados como leves y dos de los cuales (dolor de cabeza y fotofobia) fueron calificados como moderados. El investigador no consideró que ninguno de los dos estuviera relacionado con rFVIIIFc. No se informó de episodios de sangrado graves. No se detectó evidencia de reacciones alérgicas a la inyección. Todas las muestras de plasma resultaron negativas para inhibidores de FVIII y anticuerpos anti-rFVI 1 Fc. No se observaron signos de reacciones en el lugar de la inyección. No se informaron cambios clínicamente significativos en los valores anormales de laboratorio.
Farmacocinética:
Correlación entre aPTT y Actividad Cromogénica para rFVIIIFc en Plasma : Actividades de ADVATE® y rFVIIIFc se determinaron en los mismos ensayos utilizando reactivos comercialmente disponibles y calibración frente a patrones de plasma humano normal. Hubo una fuerte correlación entre los resultados obtenidos por el ensayo de coagulación de una etapa y el ensayo cromogénico en muestras que tenían una actividad por encima del LLOQ. Se observaron coeficientes de correlación (Pearson R2) de 0,94 y 0,95 entre los dos resultados del ensayo para 151 muestras después de la dosificación de ADVATE® y 185 muestras después de la dosificación de rFVIIIFc, respectivamente. En comparación con los resultados de aPTT, las actividades cromogénicas del FVIII fueron, en promedio, un 21% más altas para ADVATE® y un 32% más altas para rFVIIIFc, no estadísticamente significativas (FIG. 9). Esta observación condujo a una estimación ligeramente superior de los parámetros de exposición mediante la evaluación cromogénica de ambos fármacos. Las recuperaciones aparentemente más altas de FVIII mediante el ensayo cromogénico son típicas de los productos de FVIII recombinante testados en ensayos clínicos, y están de acuerdo con la mayoría de los otros productos de FVIII comercializados. Lee C.A. et al., Thromb Haemost.
82(6)1644-7 (diciembre de 1999), Mikaelsson M. y Oswaldsson U., Semin Thromb Hemost. 28(3)257-64 (junio de 2002), Stroobants A.K. et al., J Thromb Haemost. 9 (Supl 2) (2011).
Farmacocinética Mejorada para rFVIIIFc: Las estimaciones de la PK primaria se obtuvieron a partir de datos de actividad del ensayo de coagulación de una etapa (aPTT). En sujetos que recibieron 25 o 65 UI/kg de ADVATE®, seguido de una dosis igual de rFVIIIFc, la actividad plasmática del FVIII aumentó bruscamente y alcanzó la Cmáx dentro de la primera hora después de la dosificación. La posterior disminución de la actividad de FVIII observada exhibió características de desintegración monoexponencial hasta que se alcanzó la actividad de FVIII del valor de referencia (FIGs. 10A y 10B). La Cmáx aumentó proporcionalmente a la dosis, pero fue equiparable entre dosis iguales de ADVATE® y rFVIIIFc (TABLA 8). La exposición total (AUCinf) también aumentó proporcionalmente a la dosis. Sin embargo, el AUCinf de rFVIIIFc fue 1,48 y 1,56 veces mayor que el de ADVATE® a 25 UI/kg (p = 0,002) y 65 UI/kg (p < 0,001), respectivamente (TABLA 8).
TABLA 8. Parámetros de PK por Ensayo de Una Etapa (aPTT) para rFVIIIFc y ADVATE® Por Grupo de Dosis
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La t 1/2, el MRT, el CL y la Vss parecieron ser independiente de la dosis (TABLA 8). La media geométrica t1/2 de rFVIIIFc fue de 18,8 horas para los grupos de dosis de 25 UI/kg y 65 UI/kg. Esto representa una mejora de 1,54 y 1,70 veces con respecto a la de ADVATE® (12,2 horas y 11,0 horas) a dosis equivalentes (p < 0,001), respectivamente (TABLA 8). Se observó la misma mejora intra-individual en el MRT de rFVIIIFc (27,0 horas para ambos grupos de dosis) en comparación con ADVATE® (17,5 horas para las 25 UI/kg y 15,8 horas para las 65 UI/kg) (p <0,001). De acuerdo con la mejora en la t1/2 y el MRT, hubo una reducción correspondiente de 1,49 y 1,56 veces en el CL intra-individual a dosis de 25 UI/kg (p = 0,002) y 65 UI/kg (p <0,001), respectivamente. No hubo diferencias significativas en la Vss y recuperación incremental entre ADVATE® y rFVIIIFc. Por lo tanto, en cada uno de los sujetos, rFVIIIFc demostró un perfil PK mejorado en comparación con ADVATE®.
El perfil PK mejorado de rFVIIIFc resultó en un tiempo incrementado después de la dosificación de 1% de la actividad de FVIII que era 1,53 y 1,68 veces más largo, respectivamente, que con ADVATE® a 25 UI/kg (p < 0,001) y 65 UI/kg (p < 0,001) (datos no mostrados), lo que sugiere una duración terapéutica potencialmente más prolongada para rFVIIIFc. El perfil PK favorable de rFVIIIFc en relación con ADVATE® también se demostró mediante la actividad de FVIII medida en el ensayo cromogénico (TABLA 9), que era equiparable a los datos derivados de los ensayos de aPTT. Sin embargo, la estimación de la exposición, es decir, Cmáx y AUCinf, fue ligeramente mayor basada en el ensayo cromogénico que en el ensayo de coagulación de una etapa (aPTT) tanto para ADVATE® como para rFVIIIFc.
TABLA 9
Parámetros PK por Ensayo de Dos Etapas (Cromogénico) para rFVIIIFc y ADVATE® por Grupo de Dosis
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Correlación Entre Factor von Willebrand y Disposición de rFVIIIFc: Debido a que la mayoría de FVIII en la circulación se encuentra en complejo con VWF, Lenting P.J. et al, J Thromb Haemost. 5 : 1353-60 (2007) y debido a que el estudio de asociación de todo el genoma ha identificado que los determinantes genéticos de los niveles de FVIII dependen principalmente de los niveles de VWF, Smith N.L. et al., Circulation 121:1382-1392 (2010) examinaron la asociación entre VWF y rFVIIIFc. Se observó una fuerte correlación entre los niveles de VWF y CL y t1/2 tanto para rFVIIIFc como para ADVATE®. Como se muestra en las FIGs. 11A y 11B, a medida que aumentaba el nivel de Vw F, disminuía el CL de rFVIIIFc (p = 0,0016) y de ADVATE® (p = 0,0012).
Se observó la relación opuesta entre el nivel de VWF y t1/2. A medida que aumentaba el nivel de VWF, aumentaba la t1/2 de rFVIIIFc (p = 0,0003) y de ADVATE® (p < 0,0001). Esta correlación indica que el resto Fc de rFVlIIFc no altera el papel del VWF en la protección del FVIII del aclaramiento.
Efectos de la PK prolongada de rFVIIIFc en Sangre Entera ROTEM ®: Antes de la administración del fármaco del estudio, la sangre de un sujeto en cada uno de los grupos de dosis se añadió con una dosis igual de rFVIIIFc o ADVATE® y se analizó por ROTEM® de sangre entera. El tiempo de coagulación (CT) fue lineal con respecto a la dosis en el intervalo de aproximadamente 1% a 100% de lo normal, y la respuesta a la dosis fue equiparable entre rFVIIIFc y ADVATE® en el mismo sujeto (datos no mostrados), lo que indica una potencia equiparable de rFVIIIFc y ADVATE® en la formación de coágulos.
A pesar del CT del valor de referencia variable debido a los niveles de FVIII residuales antes de la administración de ADVATE® o rFVIIIFc, ambos productos corrigen efectivamente el CT a niveles equiparables de 30 minutos después de la dosificación (véanse las FIGs. 12A y 12B). La mejora en el CT se mantuvo mejor con rFVIIIFc que con ADVATE® después de 3 horas después de una dosis de 25 UI/kg (FIG. 12A), y después de 24 horas después de una dosis de 65 UI/kg (FIG. 12B).
rFVIIIFc fue bien tolerado por los sujetos en ambas dosis. No se observaron cambios clínicamente significativos en la hematología, la química de la sangre o los parámetros del análisis de orina. La mayoría de los AEs fueron leves, no relacionados con rFVIIIFc y se resolvieron sin secuelas. No se produjeron AEs graves ni muertes durante el estudio y ningún sujeto con ninguna de las dosis desarrolló anticuerpos neutralizantes o de unión a rFVIIIFc.
rFVIIIFc demostró un perfil PK de actividad de FVIII significativamente mejorado en relación con ADVATE®, con t 1/22 y MRT en los niveles de dosis de 1,54 a 1,71 veces más largos, medidos por el ensayo de coagulación de una etapa (aPTT) y de 1,59 a 1,84 veces más largos mediante el ensayo cromogénico de dos etapas. La actividad prolongada de rFVIIIFc predice una posible eficacia prolongada, lo que permite un régimen de dosificación menos frecuente en el tratamiento profiláctico de pacientes con hemofilia A.
La adopción de los parámetros PK derivados de este estudio, la simulación Montecarlo predijo que un mayor porcentaje de pacientes que reciben rFVIIIFc sostendrá niveles de FVIII por encima de 1% o 3% en comparación con los pacientes que recibieron dosis iguales de ADVATE® (TABLA 10). Por ejemplo, a una dosis de 25 UI/kg, se predijo que el 12,2% de los pacientes con ADVATE® frente al 71,2% de los pacientes con rFVIIIFc tendrían niveles valle de FVIII por encima del 1% el Día 4; a una dosis de 65 UI/kg, se prevé que el 11,0% de los pacientes con ADVATE® frente al 66,4% de los pacientes con rFVIIIFc tengan niveles de FVIII superiores al 3% el Día 4. Se planean ensayos clínicos en un mayor número de pacientes para confirmar los resultados de este estudio de Fase 1/2a y de las predicciones de simulación de Montecarlo.
TABLA 10. Porcentaje Previsto de Sujetos que Alcanzan Niveles Valle de FVIII Superiores al 1% y al 3% de lo Normal con un Régimen de Dosis Especificado de ADVATE® o rFVIIIFc
Figure imgf000052_0001
Ensayos de coagulación in vitro demuestran ninguna pérdida de actividad específica para rFVIIIFc, en comparación con FVIII con dominio B suprimido o nativo, ya sea por ensayos de coagulación o cromogénicos, utilizando reactivos comercialmente disponibles y patrones de referencia FVIII comúnmente utilizados (Dumont et al., Blood (2012), prepublicado en línea DOI:10.1182/blood-2011-08-367813). Además, estos resultados indican que rFVIIIFc se puede analizar de forma fiable en un entorno clínico mediante el ensayo de una etapa o el método cromogénico.
Resumiendo, este ensayo clínico de Fase 1/2a ha demostrado la seguridad y la t 1/2 prolongada de rFVIIIFc en pacientes con hemofilia A grave. Un estudio de Fase 3 pivotal está en curso con rFVIIIFc para establecer regímenes de dosificación de profilaxis eficaces para individuos con hemofilia A.
Ejemplo 10
Farmacocinética y Eficacia de rFVIIIFc en Modelos de Ratón y Perro con Hemofilia A
La farmacocinética y la eficacia de rFVIIIFc en comparación con rFVIII se evaluaron en modelos de ratón y perro de la hemofilia A, en apoyo de los estudios en seres humanos. rFVIIIFc es una proteína heterodimérica que comprende un FVIII con un solo dominio B suprimido (BDD) enlazado de forma recombinante al dominio Fc de la inmunoglobulina humana G1 (IgG1). Las fusiones de Fc diméricas tradicionales, creadas a través de la fusión de la proteína efectora monomérica con un monómero de Fc y luego acopladas a través de un enlace disulfuro para crear un dímero, no fueron eficaces para proteínas de coagulación grandes tales como el FVIII. Por lo tanto, los autores de la invención han desarrollado métodos para crear nuevas construcciones de proteínas de fusión Fc en las que una sola molécula efectora (monomérica) está fijada a Fc ( Dumont J.A., e t al., B ioDrugs 20 (3 ):151 -60 (2006)), (Dumont J.A., e t al., Journal o f aerosol m edicine. 18 (3):294-303 (2005)), (Bitonti, e t al., Proc N atl A cad Sci U.S.A .
101 (26 )9763 -9768 (2004)). Los autores de la invención han aplicado este enfoque a un cierto número de proteínas, incluyendo rFIX humana (Peters, R.T., e t al., Blood. 115(10):2057-2064 (2010)), rFVIIa (Salas, J., et al., J Thromb Haem ost. 9(s2): O -T U -026. d o i:10.1111/j. 1538 -78362011.04380 _ 2.x (2011)), y BDD rFVIII.
Métodos y Materiales
Proteína de fusión FVIII-Fc recombinante (rFVIIIFc): el plásmido de expresión de rFVIIIFc pBUDCE4.1 (Invitrogen) contenía dos casetes de expresión. Uno expresó, bajo el control del promotor CMV, la secuencia señal de FVIII humano nativo seguida de BDD FVIII (fusión S743 a Q1638) directamente enlazada a la región Fc de IgG1 humana (aminoácidos D221 a K457, numeración EU) sin secuencia intermedia. El otro utilizó el promotor EF1a para expresar la región Fc sola con una secuencia señal IgKB de ratón heteróloga. Se transfectaron células 293 de riñón embrionario humano (HEK293H, Invitrogen) con este plásmido, y se generó una línea celular en suspensión clonal estable que expresaba rFVIIIFc. La proteína se purificó a partir de un medio de recolección de cultivo celular definido utilizando un proceso de purificación de tres columnas, incluyendo una etapa de purificación por afinidad específica para FVIII (McCue J. e t al., J. Chrom atogr. A., 1216(45): 7824-30 (2009)) seguido de una combinación de etapas cromatográficas de intercambio aniónico e interacción hidrófoba.
FVIII recombinante (rFVIII): FVIII BDD recombinante (REFACTO® y XYNTHA®) y FVIII de longitud completa (ADVATE®) se adquirieron de Novis Pharmaceuticals (Miami, FL) y se reconstituyeron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Animales: Ratones con hemofilia A (HemA) que portan un FVIII exón 16 inactivado en un fondo 129 x B6 se obtuvieron del Dr. H. Kazazian en la Universidad de Pensilvania (Bi, L., et al., N a t G enet . 10(1):119-121 (1995)) y criados en Biogen Idec Hemophilia. Los ratones con inactivación de FcRn murino (FcRn KO) y transgénicos con FcRn humano (Tg32B) se derivaron de ratones C57BL/6J y se obtuvieron del Dr. Derry Roopenian de The Jackson Laboratory en Bar Harbor, ME. Los genotipos para ratones FcRn KO son mFcRn (-/-) y mp2m (-/-), y para Tg32B son mFcRn (-/-), mp2m (-/-), hFcRn (+/+) y hp2m (+/+). Los ratones C57BL/6 se adquirieron de The Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Todas las actividades con animales fueron aprobadas por los Comités Institucionales de Cuidado de Animales y se realizaron de acuerdo con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio".
Perros con hemofilia A eran de la colonia endogámica mantenida en el Francis Owen Blood Research Laboratory en la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill . Estos perros tienen un fenotipo hemofílico severo equiparable a la forma severa de la enfermedad humana (Graham, J.B. y Buckwalter, J.A., e t al., The Journal o f Exp. M ed. 90 (2 )97 - 111 (1949)), (Lozier, J.N. e t al ., Proc N atl A c ad Sci U .S .A .99(20):12991-12996 (2002)).
Estudios farmacocinéticos (PK) en ratones: Se evaluó la PK de rFVIIIFc y rFVIII (XYNTHA®) en ratones HemA, C57BL/6, FcRn KO y Tg32B después de una dosis intravenosa de 125 UI/kg. Se extrajo sangre de la vena cava en una décima parte del volumen de citrato de sodio al 4% a los 5 minutos y a las 4, 8, 16, 24, 32, 48, 54 y 72 horas después de la dosificación de rFVIIIFc y a los 5 minutos y a las 1, 4, 8, 16, 20, 24, 32 y 48 horas después de la dosificación de rFVIII (4 ratones/intervalo de tiempo/tratamiento). El plasma se congeló instantáneamente en un baño de etanol/hielo seco y se almacenó a -80°C hasta el análisis de la actividad de FVIII utilizando un ensayo cromogénico específico para FVIII humano (kit FVIII Coatest SP de DiaPharma [West Chester, OH]). Los parámetros farmacocinéticos se estimaron mediante modelos no compartimentales utilizando WINNONLIN® versión 5.2 (Pharsight, Mountain View, CA).
Estudios de eficacia en ratones HemA: Todos los estudios de eficacia se realizaron en ciego. Se estudió la eficacia aguda en el modelo de sangrado con clip de cola. Se anestesiaron ratones macho HemA (8-12 semanas de edad) con un cóctel de 50 mg/kg de ketamina y 0,5 mg/kg de dexmedetomidina. A continuación, se sumergió la cola en solución salina a 37°C durante 10 minutos para dilatar la vena lateral, seguido de una inyección en la vena de la cola de rFVIIIFc, rFVIII (ADVATE®) o vehículo. Cinco minutos más tarde, se cortó el 1 cm distal de la cola y se recogió la sangre derramada en 13 mL de solución salina tibia durante 30 minutos. La pérdida de sangre se cuantificó gravimétricamente.
La eficacia profiláctica se estudió en el modelo de sangrado de la transección de la vena de la cola (TVT) tal como se describe previamente (Pan, J. y Kim, J.Y., Blood 114 (13):2802-2811 (2009)), excepto que los ratones HemA recibieron una sola administración intravenosa de 12 UI/kg de rFVIIIFc, rFVIII (ADVATE®) o vehículo a las 24 o 48 horas antes de la transección de la vena lateral de la cola. La dosis de 12 UI/kg se identificó a partir de un experimento de respuesta a la dosis anterior con rFVIII, en el que 12 Ul/kg lograron un 50% de protección de los ratones HemA de una lesión de TVT infligida 24 horas después de la dosificación (datos no mostrados).
Estudios en Perros con Hemofilia A: En un estudio PK/PD de dosis única de rFVIIIFc, dos perros con hemofilia A, sin tratamiento previo (M10 y M11) recibieron una dosis intravenosa de 125 UI/kg. Se recogieron muestras de sangre antes y después de la dosificación a los 5 y 30 min y a las 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48, 72, 96, 144 y 168 horas durante el tiempo de coagulación de la sangre total (WBCT). Las recogidas de sangre para la actividad de FVIII (ensayo aPTT y cromogénico), antígeno rFVIIIFc (ELISA), hematología y química de la sangre incluyeron los intervalos de tiempo enumerados arriba para el WBCT, así como 15 minutos y 3, 6 y 12 horas después de la dosificación.
En el siguiente estudio de diseño secuencial, rFVIII (REFACTO®) se administró por vía intravenosa a razón de 114 UI/kg al perro M12 y a razón de 120 UI/kg al perro M38. Se midió el WBCT hasta que los tiempos de coagulación fueron > 20 minutos (el tiempo consistente con FVIII:C < 1%), y también se recolectaron muestras en los intervalos de tiempo especificados para los ensayos de actividad del FVIII (ensayo aPTT y cromogénico), de antígenos (ELISA). y de hematología. A continuación, se administraron por vía intravenosa 125 UI/kg de rFVIIIFc a los mismos perros y se recogieron muestras de sangre para el WBCT, aPTT, ELISA, hematología y química del suero. Los intervalos de tiempo para WBCT incluyeron la pre-dosificación y 5 y 30 minutos y 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48 y 72 horas después de la dosificación de rFVIII y rFVIIIFc. También se recogió sangre a las 96, 120, 144 y 168 horas después de la dosificación con FVIIIFc. Las recogidas de sangre para la actividad de FVIII y los antígenos incluyeron los intervalos de tiempo arriba enumerados para el WBCT, así como 15 minutos y 3, 6, 12 horas después de la dosificación. El WBCT y el aPTT se realizaron como se describió previamente (Herzog, et al., Nat Med. 5(1)56-63 (1999)).
Ensayos cromogénicos de FVIII: La actividad de FVIII en plasma de perro con hemofilia A se testó mediante un ensayo cromogénico automatizado en un instrumento Sysmex CA1500 (Sysmex, IL) con reactivos de Siemens Healthcare Diagnostics (Dallas, TX). La curva estándar se generó con el 7° Concentrado de FVIII Estándar Internacional de (código NIBSC 99/678) añadido al plasma humano agotado en FVIII (Stago, EE.UU.) en concentraciones que oscilan entre 1,5 - 0,016 UI/mL.
La actividad de FVIII en plasma de ratón HemA se midió utilizando el ensayo Coatest SP FVIII de Chromogenix (DiaPharma, Lexington, MA), siguiendo las instrucciones del fabricante. La curva estándar se generó utilizando rFVIIIFc o rFVIII diluido en serie de 100 mU/mL a 0,78 mU/mL en tampón que contenía plasma de ratón HemA sin tratamiento previo. Para medir la actividad del FVIII humano en plasma de ratón C57BL/6, FcRn KO y Tg32B, el rFVIIIFc o rFVIII infundido en plasma de ratón se capturó primero mediante el mAb GMA8016 (Green Mountain Antibodies, VT) específico para el FVIII humano, seguido del ensayo Coatest estándar.
ELISA espec ífico para rFVIII y rFVIIIFc: Los niveles de antígeno de rFVIII y rFVIIIFc en plasma de perro con hemofilia A se midieron por ELISA siguiendo el protocolo estándar. El mAb específico para el dominio de FVIII A1 GMA-8002 (Green Mountain Antibodies, Burlington, VT) se utilizó como anticuerpo de captura. Se utilizó el Ab anti-FVIII policlonal conjugado con HRP F8C-EIA-D (Affinity Biologicals) para detectar rFVIII. Se utilizó (F(ab)’2) anti­ humano de burro conjugado con HRP 709-036-098 (Jackson Immunologicals) para detectar rFVIIIFc.
Análisis SPR de interacciones rFVIIIFc-FcRn : Se realizaron experimentos de resonancia de plasmón de superficie (SPR) con un instrumento Biacore T100. Chips de sensor CM5, tampones y reactivos de inmovilización de calidad de investigación se adquirieron de Biacore (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se inmovilizaron preparaciones de FcRn de cadena sencilla humano, canino y murino utilizando acoplamiento de aminas estándar en celdas de flujo adyacentes de un solo chip a una densidad de aproximadamente 370 unidades de resonancia (RU), seguido de bloqueo con etanolamina. La asociación en estado estacionario de analitos que contienen Fc (FVIIIFc e IgG) con FcRn inmovilizado de diferentes especies se evaluó mediante la inyección secuencial de analitos a 16 concentraciones (0,0625-2000 nM) en tampón de desarrollo de pH 6,0 (MES [ácido 4-morfolinaetanosulfónico] 50 mM, cloruro sódico 250 mM, cloruro de calcio 2 mM, Tween 20 al 0,01% [monolaurato de polietilenglicol sorbitán]). Cada uno de los ciclos se realizó por duplicado y comprendía una fase de asociación de 45 minutos y una fase de disociación de 15 minutos, ambas a un caudal de 5 pL/min, seguido de regeneración con dos inyecciones de 60 s de Tris-HCl 1 M a razón de 25 pL/min. Después de doble referencia-resta (celda de flujo en blanco y tampón de desarrollo solo), las respuestas de unión grabadas cerca del final de la fase de asociación se representaron gráficamente como una función de la concentración de analito, y valores de CE50 (50% de Rmáx) se derivaron mediante el análisis de regresión no lineal.
Análisis estadísticos: test-t no apareado, ANOVA de una vía, test de Mann-Whitney, test de Kruskal-Wallis con test posterior de Dunn, curvas de supervivencia y test de log-rank asociado se realizaron en GraphPad Prism 5 (Graph-Pad Software Inc., La Jolla, CA). Se consideró estadísticamente significativo un valor de P de 2 colas menor que 0,05.
Resultados
Proteína de fusión FVIII Fc recombinante (rFVIIIFc): rFVIIIFc es una fusión recombinante de FVIII humano con dominio B suprimido con Fc de IgG1 humana, sin la secuencia de enlazador intermedia (FIG. 14), que se produjo en células HEK 293H bien caracterizadas. El rFVIIIFc se escinde proteolíticamente intracelularmente para producir una cadena pesada de ~ 90 kDa y una cadena ligera de Fc de ~ 130 kDa que se unen entre sí de forma no covalente a través de una interacción de enlace metálico mediada por los dominios A1 y A3 del FVIII.
La actividad media específica de rFVIIIFc de catorce lotes separados era 8460 ± 699 UI/mg por el ensayo de coagulación de una etapa (aPTT), y 9348 ± 1.353 UI/mg mediante el ensayo cromogénico, correspondiente a 1861 ± 154 y 2057 ± 298 UI/nmol, respectivamente. La actividad específica de rFVIIIFc es equiparable a la del FVIII humano de tipo salvaje en plasma (1429 UI/nmol) (Butenas, S. y Mann, K.G., Biochemistry (Mosc). 67(1):3-12 (2002)). Por lo tanto, la actividad de FVIII de rFVIIIFc no se ve afectada por la fusión del extremo C del FVIII humano con el extremo N del Fc humano, y los resultados obtenidos con los ensayos aPTT y cromogénico están dentro de aproximadamente un 10% entre sí.
Unión de rFVIIIFc a FcRn : La afinidad de rFVIIIFc para el FcRn de cadena sencilla de ratón, canino y humano se evaluó mediante resonancia de plasmón de superficie. Las tasas de asociación y disociación para el complejo entre rFVIIIFc y FcRn de ratón fueron mucho más lentas que las de FcRn canino y humano. La unión media máxima (CE50) de rFVIIIFc a FcRn humano era aproximadamente 4 veces más débil que a FcRn canino, y más de 20 veces más débil que aquella a FcRn de ratón (TABLA 11). De manera similar, la IgG1 humana también mostró la mayor afinidad por el FcRn murino, mientras que la afinidad de unión al FcRn canino fue menor en comparación con el FcRn murino, pero mayor en comparación con el FcRn humano (TABLA 11).
TABLA 11.Análisis de resonancia de plasmón de superficie de FcRn murino,
canino y humano con rFVIIIFc e IgG1 humana
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Mejora dependiente de FcRn en la farmacocinética de rFVIIIFc en ratones : La interacción de Fc con FcRn se considera el mecanismo subyacente para prolongar la semivida de las proteínas de IgG y Fc-fusión. Para confirmar que este mecanismo de acción también es responsable de prolongar la semivida de rFVIIIFc, los autores de la invención compararon los perfiles farmacocinéticos (PK) de rFVIIIFc con rFVIII en ratones deficientes en FVIII (HemA) (FIG. 15A), ratones normales (C57BL/6) (FIG. 15b), ratones deficientes en FcRn (FcRn KO) (FIG. 15C) y ratones transgénicos con FcRn humano (Tg32B) (FIG. 15D) después de una única administración intravenosa de 125 UI/kg.
Los parámetros PK (TABLA 12) se determinaron mediante la medición cromogénica de la actividad del FVIII humano en plasma de ratón. La t1/2 de rFVIIIFc era 1,8 - 2,2 veces más larga que rFVIII en ratones de HemA (13,7 frente a 7,6 horas) y ratones normales (9,6 frente a 4,3 horas). La prolongación de la t1/2 de rFVIIIFc en relación con rFVIII se abolió en ratones FcRn KO (6,4 frente a 6,9 horas) y se restauró en ratones Tg32B transgénicos con FcRn humano (9,6 frente a 4,1 horas). Por lo tanto, los resultados confirman que la interacción de rFVIIIFc con el receptor FcRn es responsable de su t1/2 prolongada. Además, de acuerdo con la t1/2 mejorada , rFVIIIFc también mostró un MRT de 1,6 - 2,4 veces más largo y una exposición sistémica (AUC) 1,2 - 1,8 veces incrementada en comparación con rFVIII en ratones que expresan FcRn (HemA, C57BI/6 y Tg32B), pero no en ratones FcRn KO.
TABLA 12. Sumario de los parámetros PK para rFVIIIFc y rFVIII en diferentes cepas de ratón
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rFVIIIFc es completamente activo en el tratamiento de sangrados agudos en ratones HemA : Para evaluar la eficacia aguda de rFVIIIFc en comparación con rFVIII, ratones HemA (16-20 ratones/grupo) se trataron con dosis crecientes (24, 72, y 216 UI/kg) de rFVIIIFc o rFVIII y se lesionaron mediante corte de la cola 5 minutos después de la dosificación. En comparación con los ratones tratados con vehículo (n = 18) que tenían una pérdida de sangre mediana de 1 mL, ambos tratamientos con rFVIIIFc y rFVIII dieron como resultado una protección significativamente mejorada (P < 0,05, test de Kruskal-Wallis con test posterior de Dunn) (FIG. 16). La mediana de la pérdida de sangre disminuyó progresivamente con las dosis crecientes, alcanzando una reducción máxima de 0,23 mL a 72 UI/kg de rFVIIIFc y 0,20 mL a 216 UI/kg de rFVIII. En general, la pérdida de sangre fue equiparable en animales tratados con dosis iguales de rFVIIIFc o rFVIII, lo que indica que ambos agentes terapéuticos son comparativamente activos en la resolución de sangrados arteriales agudos.
Eficacia prolongada profiláctica de rFVIIIFc en ratones HemA: Para determinar si la PK prolongada conduce a una protección prolongada frente a una lesión, los autores de la invención compararon la eficacia profiláctica de rFVIIIFc y rFVIII en ratones HemA. Veinticuatro horas después de una dosis intravenosa de 12 UI/kg, se seccionó una vena lateral de la cola en ratones HemA. Después de la lesión, el 49% de los ratones tratados con rFVIII (n = 39) sobrevivieron, en comparación con el 100% de supervivencia de los ratones tratados con rFVIIIFc (n = 19) (P < 0,001, test de Log-Rank) (FIG. 17A). Para demostrar además que rFVIIIFc mantiene una duración más prolongada de eficacia, los ratones HemA se lesionaron 48 horas después de la dosificación con 12 UI/kg de rFVIIIFc. No obstante, el 58% de los ratones tratados con rFVIIIFc (n = 40) sobrevivieron, lo que es similar a lo logrado en los ratones tratados con rFVIII (49%) lesionados 24 horas después de la dosificación (FIG. 17A). Ambos tratamientos con rFVIIIFc y rFVIII son significativamente mejores que el grupo de vehículo-cotitrol de HemA (n = 30) en el que solo el 3% de los ratones sobrevivieron a la lesión (P < 0,0001) (FIG. 17A). La eficacia profiláctica mejorada y prolongada de rFVIIIFc también es evidente mediante la medición del resangrado posterior a la lesión (FIG. 17B). Mientras que el 100% de los ratones HemA tratados con vehículo volvieron a sangrar dentro de las 10 horas siguientes a la transección de la vena de la cola, el 87% de los ratones tratados con rFVIII y el 47% de los ratones tratados con rFVIIIFc volvieron a sangrar después de la lesión infligida 24 horas después de la dosificación, respectivamente (P = 0,002, rFVIIIFc frente a rFVIII) (FIG. 17B). El perfil de resangrado para los ratones tratados con rFVIIIFc lesionados a las 48 horas es en gran medida equiparable al de los ratones tratados con rFVIII lesionados 24 horas después de la dosificación. Por el contrario, tanto el perfil de supervivencia como de resangrado para los ratones tratados con rFVIII lesionados a las 48 horas son indistinguibles del perfil para el grupo de control con vehículo (datos no mostrados). Por lo tanto, los resultados indican que rFVIIIFc protege a los ratones HemA frente a la lesión de la vena de la cola dos veces más que la lograda con la misma dosis de rFVIII.
PKPD Mejorada de rFVIIIFc en perros con Hemofilia A: La PK y la farmacodinámica (PD) de rFVIIIFc También se estudiaron en perros con hemofilia A. Después de una dosis intravenosa de 125 UI/kg de rFVIIIFc, el WBCT se corrigió inmediatamente a la normalidad, que está en el intervalo de 8 - 12 minutos en perros normales (FIGs. 18A y B). El WBCT permaneció por debajo de 20 min, lo que indica una actividad de FVIII > 1%, durante aproximadamente 4 días en 3 de los 4 perros tratados con rFVIIIFc y 3 días en el perro restante (FIG. 18A). En el perro M12 tratado con 114 UI/kg de rFVIII y el perro M38 con 120 Ul/kg de rFVIII, el WBCT también se corrigió a la normalidad inmediatamente después de la dosificación. Sin embargo, el WBCT permaneció por debajo de 20 minutos durante 2 días en M12 y 3 días en M38, aproximadamente 1,5-2 veces más corto que el alcanzado por rFVIIIFc (FIG. 18B). Además, tanto el tratamiento con rFVIIIFc como con rFVIII también mejoraron el tiempo de coagulación del aPTT de manera similar a los 5 minutos después de la dosificación.
La PK de antígeno rFVIIIFc (FIG. 19A) se determinó midiendo la concentración de rFVIIIFc en plasma con un ELISA específico para rFVIIIFc que detecta tanto las porciones de FVIII como de Fc de la molécula. La t1/2 del antígeno rFVIIIFc es 15,7 ± 1,7 h (FIG. 19A), similar a la t1/2 de la actividad de rFVIIIFc (FIG. 19B), medida por el ensayo cromogénico: 15,4 ± 0,3 h (TABLA 13). Existe una buena correlación entre la actividad del FVIII y los datos del antígeno rFVIIIFc, lo que demuestra que la proteína rFVIIIFc era completamente activa in vivo.
TABLA 13. Sumario de los parámetros PK de rFVIIIFc y rFVIII en perros con hemofilia A
PK por medición de la actividad de FVIII
Tratamiento Cmáx (UI/mL) AUC (h*UI/mL) T1/2 CL Vss (mL/kg)
(h) (mL/h/kg)
rFVIII Fc * 2,0 ± 0,54 25,9 ± 6,47 15,4 ± 0,3 5,1 ± 1,4 86,4 ± 14,0
rFVIII t 2,0 18,2 7,4 6,5 64,0
PK por medición de antígenos de rFVIII y rFVIIIFc
Tratamiento Cmáx AUC T1/2 (h) CL Vss
(ng/mL) (h* ng/mL) (mL/h/kg) (mL/kg)
rFVIIIFc * 210 ± 33 2481 ± 970 15,7 ± 1,7 6,2 ± 3,0 86,1 ± 19,2
rFVIII t 211 1545 6,9 8,7 80,7
* Los resultados presentados son la media ± DE de 4 perros.
f Los resultados presentados son la media. No se informó de la DE, ya que se utilizaron dos
perros.
En dos de los perros (M12 y M38) que también recibieron una dosis única de rFVIII 72 horas antes de la dosificación con rFVIIIFc, se determinó que la t1/2 de antígeno rFVIII era 6,9 horas y la actividad de rFVIII de 7,4 horas. Por lo tanto, la semivida plasmática de rFVIIIFc fue aproximadamente el doble en comparación con la del rFVIII mediante las mediciones de antígeno y actividad.
Además, el recuento de plaquetas y el fibrinógeno se evaluaron para servir como tests preliminares para la trombogenicidad. Después de la dosificación con rFVIIIFc o rFVIII, el número de plaquetas y la concentración plasmática de fibrinógeno no cambiaron con respecto a los valores previos a la dosis (datos no mostrados).
Discusión
Estos estudios han demostrado que rFVIIIFc es completamente activo en el tratamiento de sangrados agudos en ratones HemA, además de conservar una actividad específica normal. Otros estudios, que no se reseñan aquí, han demostrado que rFVIIIFc también es completamente funcional al interactuar con FIXa, FX y fosfolípidos en la formación del complejo Xase ( Peters et al., J. Thromb Haemost. DOI: 10.1111/jth.12076 (2012)). Además, la afinidad de unión al factor von Willebrand (VWF) fue equiparable entre rFVIIIFc y rFVIII, con una Kd de aproximadamente 1,4 y 0,8 nM para rFVIIIFc y rFVIII, respectivamente (Peters et al., J. Thromb Haemost. DOI: 10.1111/jth.12076 (2012)).
La actividad de rFVIIIFc no se vio afectada por fusión del extremo C de FVIII con el extremo N de Fc, dado que los dominios C1 y C2 del FVIII estaban implicados en la unión de fosfolípidos que es esencial para la formación del complejo de protrombinasa en superficies de plaquetas activadas (Foster, P.A,. et al, Blood. 75(10): 1999-2004 (1990)). Sin embargo, este hallazgo fue consistente con la observación de que los residuos que se cree que se unen a los fosfolípidos, p. ej, K2092/F2093 en C1, M2199/F2200 y L2251/L2252 en C2, parecen formar una superficie distante de los residuos C-terminales de FVIII (Shen, B.W., et a l, Blood (2007); Ngo, J.C., et a l, Structure 16(4)597-606 (2008)).
La semivida de rFVIIIFc se duplicó solo en ratones que expresan FcRn murino endógeno o transgénico con FcRn humano, pero no en ratones FcRn KO (véase la FIG. 15 y la TABLA 12), lo que demuestra que el mecanismo de la prolongación de la semivida de rFVIIIFc está mediado por FcRn. Si bien se sabe que tanto las células endoteliales como las hematopoyéticas contribuyen igualmente a reciclar la IgG internalizada a la superficie celular para facilitar la longevidad de la IgG y la protección contra la degradación (Borvak, J., et al., Int Immunol. 10(9): 1289 -1298 (1998)), (Akilesh, S., et al., J Immunol. 179(7):4580-4588 (2007)) no se sabe específicamente qué tipo o tipos de células que expresan FcRn son los responsables de la captación y el reciclaje de rFVIIIFc. El FcRn se expresa ampliamente en el endotelio vascular, el epitelio del riñón, el hígado, el bazo, así como en las APCs derivadas de la médula ósea, incluyendo macrófagos (Borvak, J., et al, Int Immunol. 10(9):1289-1298 (1998)), (Akilesh, S., et a l, J Immunol.
179(7):4580-4588 (2007)), (Yoshida, M., et a l, Immunity. 20(6)769-783 (2004)). Dado que el FVIII circula en gran parte (~ 98%) en complejo con VWF (Lenting, P.J., et al., J Thromb Haemost. 5(7):1353-1360 (2007)), y ambas proteínas se colocalizaron en los macrófagos en el hígado y bazo cuando el FVIII recombinante y el vWF se co-inyectaron en ratones deficientes en VWF (van Schooten, C.J., et al., Blood. 112(5): 1704-1712 (2008)), los macrófagos pueden desempeñar un papel en el rescate de rFVIIIFc de degradación y prolongación de la semivida. Sin embargo, los resultados también pueden ser indicativos de una ruta previamente no reconocida para el catabolismo del FVIII y el rescate de la proteína permitido por la fusión de Fc.
Enfoques en desarrollo para prolongar la semivida de los factores de coagulación incluyen pegilación (Rostin, J., et al., Bioconjug Chem. 11(3):387-396 (2000)), ( Mei, B., et al. al., Blood. 116(2)270-279 (2010)), glicopegilación (Moss, J., et al., J Thromb Haemost. 9(7):1368-1374 (2 0 1 1 )), (Negrier, C., et al., Blood. (2 0 1 1 )) y conjugación con albúmina (Metzner, H.J., et al., Thromb Haemost. 102(4):634-644 (2009)), (Weimer, T., et al., Thromb Haemost. 99(4):659-667 (2008)). Independientemente de la ingeniería de proteínas utilizada, la semivida de las variantes de rFVIII modificado parece ser como máximo dos veces más larga que la del FVIII de tipo salvaje en una diversidad de modelos animales preclínicos (Liu, T., et al., Blood. 112:511 (2008)), (Karpf, D.M., et al., 16 (Supl. S4):40 (2010)). Se han demostrado resultados consistentes en seres humanos, p. ej., se informó que rFVIIIFc mejora la semivida aproximadamente 1,7 veces en comparación con ADVATE® en pacientes con hemofilia A (Powell, J.S., et al., Blood. (2012) prepublicado en línea. DOI:10.1182/blood-2011-09-382846). Esta limitación de prolongar la semivida del FVIII parece estar relacionada con el VWF. En ratones inactivados para FVIII y VWF, los experimentos preliminares observaron un aumento de 5 veces en la semivida de rFVIIIFc en comparación con rFVIII (Liu, T et al., resultados no publicados). Se informaron previamente hallazgos similares en ratones con inactivación del VWF que utilizaban FVIII pegilado (Mei, B., et al., Blood. 116(2): 270­ 279 (2010)). Tomados en conjunto, estos resultados indican que el VWF puede ser un factor limitante para prolongar aún más la semivida del FVIII.
Más allá de prolongar la semivida, rFVIIIFc proporciona beneficios adicionales. Un desafío importante con la terapia de reemplazo de FVIII es el desarrollo de anticuerpos (inhibidores) anti-FVIII neutralizantes. Esto ocurre en el 15-30% de los pacientes no tratados previamente. rFVIIIFc tiene el potencial de inducir tolerancia inmunitaria y, por lo tanto, prevenir el desarrollo de anticuerpos neutralizantes. Se ha informado que las células B transducidas con vectores retrovirales, que presentan dominios de FVIII como proteínas de fusión de Ig, previenen o disminuyen específicamente los anticuerpos de FVIII existentes en ratones HemA (Lei, T.C. y Scott, D.W., Blood. 105(12):4865-4870 (2005)). También se encontró que Fc contiene epítopos de células T reguladores capaces de inducir la expansión de Treg y la supresión de respuestas inmunitarias específicas para el antígeno in vitro (De Groot, et al., Blood. 112(8)3303-3311 (2008)). Además, la transferencia mediada por FcRn de proteínas de fusión IgG y Fc maternas a través de la placenta a la circulación fetal (Simister, N.E., Vaccine. 21(24):3365-3369 (2003)), Grubb, J.H., et a l, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105(24)3375-8380 (2008)) podría inducir tolerancia neonatal a rFVIIIFc al tiempo que proporcionar también la protección necesaria en el recién nacido contra sangrados durante el parto.
En conclusión, los autores de la invención han demostrado que rFVIIIFc, proporciona una duración de eficacia aproximadamente 2 veces más larga con respecto a rFVIII en la protección de ratones de HemA de una lesión por transección de la vena de la cola y la mejora del WBCT en perros HemA. La eficacia prolongada se correlaciona bien con una t1/2 prolongada 2 veces de rFVIIIFc, un resultado del reciclaje de la proteína de fusión Fc a través de una ruta intracelular específica y bien establecida.
Ejemplo 11
Inmunogenicidad de rFVIIIFc en Ratones
130 ratones macho con Hemofilia A, edad 7-9 semanas de edad al comienzo del estudio, se asignaron al azar en 13 grupos de tratamiento basándose en la edad y el peso corporal (n = 10/grupo). Los ratones se trataron con dosificación intravenosa repetida de rFVIIIFc, rFVIII-mFc, Xy Nt HA® o ADVATE® a 50, 100 y 250 UI/kg, una mezcla de los tres tampones de formulación para FVIIIFc. Se utilizó XYNTHA® y ADVATE® para el grupo de control del vehículo. Los tiempos de administración IV fueron el día 0, el día 7, el día 14, el día 21, el día 35 después de la primera inyección IV y las muestras de sangre se recogieron mediante extracción de sangre retroorbital el día (-1), el día 14, el día 21, el día 28 y el día 42 después del primer tratamiento (FIG. 20).
Inmediatamente después de la extracción de sangre, las muestras de plasma se aislaron mediante centrifugación y se inactivaron mediante un tratamiento con calor durante 30 minutos a 56°C para asegurar la medición precisa de los anticuerpos anti-FVIII. El desarrollo de anticuerpo anti-FVIII total (FIGs. 21A, 21B y 21C), anticuerpo neutralizante anti-FVIII (FIG. 23) y anticuerpo anti-Fc total (FIG. 24) se investigó utilizando las muestras de plasma.
Cuando se trata con 50 UI/kg de FVIII, 28 días después de la primera inyección, solo 1 de los 10 ratones en el grupo de tratamiento con rFVIIIFc, 2 de los 10 ratones en el grupo de tratamiento con rFVIII-mFc desarrollaron anticuerpo anti-FVIII detectable, comparado con 5 de los 10 ratones y 7 de los 10 ratones para los ratones tratados con XYNTHA® y ADVATE® (FIG. 22C). A 100 UI/kg, el número de ratones que tenían anticuerpos anti-FVIII detectables en el día 28 fueron 2, 5, 8 y 9 en el grupo de tratamiento con rFVIIIFc, rFVIII-mFc, XYNTHA® y ADVATE®, respectivamente (FIG.
22C). A 250 Ul/kg, una dosis suprafisiológica, el número de ratones que tenían anticuerpos anti-FVIII detectables en el día 28 fueron 10, 10, 7 y 7 en el grupo de tratamiento con rFVIIIFc, rFVIII-mFc, XYNTHA® y ADVATE®, respectivamente (FIG. 22C). Los datos correspondientes al día 14, día 21 y día 42 se muestran en las FIGs. 22A, 22B y 22D, respectivamente.
En general, se observó una buena correlación entre los anticuerpos totales y neutralizantes a FVIII (R2 = 0,7452), y los títulos de ambos aumentaron con el tiempo (FIG. 23). Dentro del intervalo de dosis terapéuticas (50 y 100 UI/kg), el número de ratones que desarrollaron anticuerpos específicos para FVIII, así como los títulos de anticuerpos en los grupos de tratamiento con rFVIIIFc, fueron significativamente más bajos en comparación con ADVATE® (p < 0,05), y marginalmente más bajos frente a XYNTHA® (p = 0,05). Los resultados indican una inmunogenicidad potencialmente baja de rFVIIIFc.
Ejemplo 12
Respuesta de Linfocitos Esplénicos al rFVIIIFc en Comparación con el rFVIII Disponible Comercialmente
Se determinó la respuesta de linfocitos esplénicos al Factor VIII recombinante (rFVIII) cuando se enlaza a cualquiera de Fc humano (hFc, IgG1) o Fc de ratón (mFc, IgG2a) y se comparó con la respuesta de linfocitos esplénicos a rFVIII comercialmente disponible [FVIII de longitud completa (ADVATE®) y FVIII con dominio B suprimido (XYNTHA®/REFACTO AF®)].
A ratones HemA se les inyectaron una vez por semana durante seis semanas, 50 o 250 UI/kg de las moléculas testadas. El día 56, se sacrificaron cuatro ratones de cada uno de los grupos y se aislaron los esplenocitos (FIG. 25). La mitad de los esplenocitos se utilizó para determinar el perfil de inmunogenicidad esplénica mediante tinción para citoquinas intracelulares, marcadores para células T reguladoras y células dendríticas utilizando citometría de flujo (FACS) (FIG.
26). La otra mitad de las células se utilizó para aislar ARN y realizar el perfil de la ruta utilizando matrices basadas en PCR en tiempo real. La FIG. 27A muestra un perfil de gráfico de puntos FACS del control de isotipo. La FIG. 27B muestra un perfil de gráfico de puntos FACS de una muestra que contiene esplenocitos positivos tanto para CD4 como para TNF-a. El porcentaje de células dobles positivas se determinó a partir de gráficos de puntos de todos los tratamientos y el vehículo. El porcentaje de células doble positivas en ratones tratados con FVIII se obtuvo comparando con el grupo tratado con vehículo.
La tinción intracelular de citoquinas se realizó por co-tinción para el marcador de células T auxiliares CD4 y citoquinas, tales como IL-2 (FIG. 28), IL-4 (FIG. 30) y TNF-a (FIG. 29). IL-2 es un mitógeno de células T implicado en la proliferación de células T, que es secretado por células T activadas en respuesta al FVIII en ratones HemA. IL-4 se ha identificado como una citoquina secretada por células T activadas en respuesta al FVIII en ratones HemA. El TNF-a es una citoquina pro-inflamatoria responsable de una mayor producción de anticuerpos en pacientes con hemofilia. Las intensidades de fluorescencia de cada una de las tinciones se midieron utilizando la citometría de flujo.
De manera similar, la proporción de células dendríticas tolerogénicas e inmunogénicas se determinó mediante tinción de la superficie y el análisis de citometría de flujo de marcadores tales como PD-L1 (CD274) (FIG. 32) y CD80 (FIG. 33). PD-L1 es un ligando inhibidor que se acopla al receptor PD-1 en las células T activadas bloqueando con ello la producción de IL-2 mediada por el Receptor de células T (TCR) y la proliferación. Una mayor expresión de DC de PD-L1 es un factor crítico que puede inhibir la inmunogenicidad y fomentar la tolerancia. CD80 es un marcador de superficie que habitualmente se ve en las células dendríticas al fagocitar el antígeno y durante la maduración para presentar el antígeno a las células T. CD80 pertenece a un panel de co-receptores en la activación de células T para la proliferación. Más tinción de superficie de CD80 indica indirectamente una mejor maduración y presentación de antígeno por las células dendríticas.
Además, el porcentaje de células reguladoras (Treg) en el bazo se evaluó mediante la co-tinción de CD4 y Foxp3 (FIG.
34), un marcador para estas células. Foxp3 es un marcador intracelular de células T reguladoras. Células T Foxp3+ están implicadas en el establecimiento, mantenimiento y la transferencia adoptiva de la tolerancia periférica mediada por células T.
También se evaluó la presencia de células que expresan tanto CD4 como los marcadores Tim3 (FIG. 35) o CD279 (PD-1) (FIG. 36). Tim3 (dominio de inmunoglobulina de células T y dominio de mucina 3) como regulador negativo de las respuestas de las células T auxiliares 1 (Th1). Tim3 también es expresado por células inmunes innatas y puede fomentar una respuesta pro-inflamatoria. Tim3 inhibe las respuestas auto- y alo-inmunes mediadas por Th1 y actúa a través de su ligando, galectina-9, para inducir la muerte celular en las células Th1 pero no en las Th2. CD279 (PD-1) es un miembro de la familia CD28/CTLA-4 ampliada de reguladores de células T. PD-1 se expresa en la superficie de las células T activadas, las células B y los macrófagos, lo que sugiere que, en comparación con CTLA-4, PD-1 regula negativamente las respuestas inmunitarias de manera más amplia.
Entre las citoquinas testadas que son responsables de la inmunogenicidad y la formación de inhibidores, en ratones a los que se inyectaron 50 UI/kg de rFVIII-hFc o rFVIII-mFc, hubo una inhibición significativa en los niveles de IL-4 y TNF-a y los niveles de IL-2 no cambiaron en comparación con el grupo al que se inyectó vehículo. Por el contrario, los niveles de estas citoquinas fueron más altos en los grupos que recibieron 250 UI/kg de estas moléculas. Los ratones a los que se inyectaron 50 UI/kg de XYNTHA® o ADVATE® no mostraron inhibición alguna, mientras que el grupo de 250 UI/kg mostró un aumento en el contenido intracelular de IL-2, IL-4 y TNF-a. Además, hubo un mayor porcentaje de células T foxp3 positivas en ratones a los que se inyectaron 50 UI/kg de rFVIII-mFc en comparación con otros tratamientos. Ratones que recibieron 50 UI/kg de rFVIII-hFc y rFVIII-mFc tuvieron un mayor porcentaje de células dendríticas esplénicas positivas para PD-L1 (CD274), una señal inhibitoria de la activación y proliferación de células T. Estos grupos también tenían un mayor porcentaje de células dendríticas inmaduras, como lo ilustra una disminución en la tinción de CD80.
Estos resultados indicaron que rFVIIIFc a razón de 50 UI/kg en ratones HemA exhibió una inmunogenicidad más baja que rFVIII [FVIII de longitud completa (ADVATE®) disponible comercialmente y FVIII con dominio B suprimido (XYNTHA®/ REFACTO AF®)]. Por consiguiente, rFVIIIFc puede fomentar una menor producción de anticuerpos e inducir tolerancia inmunitaria.
Ejemplo 13
Biodistribución y aclaramiento de rFVIIIFc en ratones
La fusión recombinante de una sola molécula de FVIII a la región constante de IgG1 Fc (rFVIIIFc) ha demostrado disminuir el aclaramiento en comparación con rFVIII de una manera dependiente de FcRn (Powell et al., 2012 Blood), utilizando una vía natural que hace recircular anticuerpos en el torrente sanguíneo. Además, como se describió arriba, un ensayo clínico de fase 1/2a en sujetos con hemofilia A demostró que el rFVIIIFc tiene una semivida de 1,5 a 1,7 veces más larga que el FVIII recombinante de longitud completa (ADVATE®). Por consiguiente, se realizó un estudio (i) para identificar los tipos de células y órganos que contribuyen a la protección de rFVIIIFc y (ii) para evaluar las contribuciones relativas de los dominios FVIII y Fc a la biodistribución y el aclaramiento de rFVIIIFc en ratones.
El aclaramiento de rFVIIIFc a rFVIII se comparó en modelos de ingeniería genética de ratón KO deficiente en FVIII (HemA) o Factor de von Willebrand (VWF). Se utilizaron vesículas lipídicas que contenían clodronato dosificadas por vía intravenosa para agotar las células de Kupffer y los monocitos/macrófagos en estos modelos de ratón. La eficacia del agotamiento se cuantificó mediante inmunohistoquímica y análisis FACS. El análisis farmacocinético se realizó con un ensayo Coatest específico para FVIII después de la inyección intravenosa de rFVIIIFc o rFVIII.
El agotamiento de las células de Kupffer en ratones HemA aumentó el aclaramiento de rFVIIIFc. Además, en ausencia de VWF (ratones con doble inactivación HemA/VWF), el agotamiento de las células de Kupffer y los macrófagos aumentó el aclaramiento de rFVIIIFc a niveles similares a los del rFVIII, lo que indica que estas células son las responsables de la mayor parte de la diferencia en el aclaramiento entre rFVIII y rFVIIIFc en este modelo.
Estos estudios sugieren que las células de Kupffer pueden contribuir al reciclaje mediado por FcRn de rFVIIIFc. Se están realizando estudios que utilizan trasplantes de médula ósea con ratones KO con FcRn para verificar este mecanismo. Estos estudios, combinados con experimentos de captación celular in vitro, intentarán distinguir la contribución de las células de Kupffer de otros tipos de células que expresan FcRn, incluyendo las células endoteliales.
Ejemplo 14
Respuesta Inmunitaria Mediada por Células a rFVIIIFc en Ratones con Hemofilia A
El objetivo del presente estudio fue identificar las respuestas inmunitarias mediadas por células a FVIII recombinante, que es de interés en el diseño de una mejor gestión terapéutica de la hemofilia A. Por lo tanto, los autores de la invención investigaron la respuesta de los linfocitos esplénicos a FVIII recombinante (rFVIII) cuando se enlazó a Fc humano (rFVIIIFc; IgG1) en comparación con el rFVIII de longitud completa disponible comercialmente (ADVATE®) y el rFVIII con dominio B suprimido (XYNTHA®/REFACTO AF®). Se inyectaron a los ratones HemA 4 dosis semanales seguidas de 2 dosis cada dos semanas de 50 100 o 250 UI/kg. Al final de las 8 semanas, los ratones de cada uno de los grupos se sacrificaron y se determinó su perfil de inmunogenicidad de leucocitos esplénicos mediante pruebas de citoquinas intracelulares, marcadores de células T reguladores y células dendríticas utilizando la citometría de flujo y perfiles de ARN. En ratones a los que se inyectaron 50 UI/kg de rFVIIIFc, hubo una inhibición significativa en los niveles de IL-2, IL-4 y TNF-a (citoquinas que fomentan la inmunogenicidad). Los niveles de estas citoquinas fueron mayores en ratones que recibieron 250 UI/kg de esta molécula. Los ratones a los que inyectaron 50 UI/kg de XYNTHa® o ADVATE® no exhibieron inhibición alguna, mientras que el grupo de 250 UI/kg mostró un aumento en el contenido intracelular de IL-2, IL-4 y TNF-a. Además, hubo un mayor porcentaje de células T foxp3 positivas en ratones a los que se inyectaron 50 y 100 UI/kg de rFVIIIFc en comparación con otros tratamientos. Los ratones que recibieron 50 y 100 UI/kg de rFVIIIFc tuvieron un mayor porcentaje de células dendríticas esplénicas PD-L1 positivas (CD279), una señal inhibitoria de la activación y proliferación de las células T. Estos grupos también tenían un mayor porcentaje de células dendríticas inmaduras, como lo ilustra una disminución en la tinción de CD80. Por lo tanto, tanto las dosis de 50 como de 100 Ul/kg de rFVIIIFc mostraron una menor inmunogenicidad y producción de anticuerpos en este modelo.
Introducción
El desarrollo de inhibidores del FVIII se reconoce como una complicación grave en la gestión de la hemofilia A. Se estima que la incidencia de la formación de inhibidores está en el intervalo del 20% al 30% en toda la hemofilia A a 30 - 40% en la enfermedad grave. (Green, Haemophilia 17:831-838 (2011); Eckhardt et al., J. Thromb. Haemost. 9:1948-58 (2011)). La enfermedad con inhibidores positivos se gestiona actualmente mediante la inducción de tolerancia inmunitaria que implica la administración frecuente de altas dosis de FVIII. Los mecanismos de formación de inhibidores en pacientes son en gran parte desconocidos y dependen de una multitud de factores de riesgo y células y moléculas del sistema inmunológico.
El desarrollo de inhibidores en la hemofilia implica una interacción compleja de múltiples tipos de células, moléculas de superficie y proteínas secretadas del sistema inmunológico que incluyen linfocitos T, linfocitos B, células presentadoras de antígenos (APC; células dendríticas y macrófagos), citoquinas y componentes reguladores de estos tipos de células. La producción de anticuerpos por las células B depende de la ayuda óptima de células T, que se activan mediante la presentación de antígenos de las APC.
La tolerancia a péptidos y proteínas terapéuticos inyectados, incluyendo el FVIII recombinante, está mediada por una clase de células T denominadas células T reguladoras (Treg) (Cao et al., J. Thromb. Haemost. 7(S1):88-91 (2009)). Se han identificado varias moléculas clave que se correlacionan con la formación de inhibidores en pacientes con hemofilia. Estos incluyen la citoquina pro-inflamatoria TNF-a, la citoquina antiinflamatoria interleuquina (IL)-10 y el marcador Treg CTLA4, por nombrar unos pocos (Astermark et al., J. Thromb. Haemost. 5:263-5 (2007); Pavlova et al. J. Thromb. Haemost. 7:2006-15 (2009)).
En este estudio, los autores de la invención investigaron la respuesta de linfocitos esplénicos a la proteína de fusión de factor VIII-Fc recombinante (rFVIIIFc) en comparación con rFVIII de longitud completa (fl-rFVIII; ADVATE®) disponible comercialmente y rFVIII con dominio B suprimido (BDD-rFVI 11; XYNTHA®/REFACTO AF®).
Materiales y Métodos
Materiales: Ratones deficientes en Factor FVIII (Bi et al. Nat Genet 10:119-21 (1995)) se adquirieron originalmente del Dr. Kazazian (Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA) y se mantuvieron como colonias de cría en Biogen Idec Hemofilia o en Charles River Laboratory.
Los anticuerpos utilizados para la tinción y los análisis FACS se obtuvieron de BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) o de eBioscience (San Diego, CA, EE.UU.). Los anticuerpos utilizados se dirigieron contra marcadores de superficie murinos tales como CD4 (células T auxiliares), CD11c y CD80 (células dendríticas), PD-1, PD-L1, CD25 (células Treg), citoquinas intracelulares (IL-2, IL-4, TNF-a) y factores de transcripción (Foxp3).
Diseño del Estudio de Inmunogenicidad: Tres grupos de tratamiento recibieron dosis intravenosas de 50, 100, o 250 UI/kg, que se administraron en días (FIG. 37). Cada uno de los tratamientos y nivel de dosis se administró a 10 ratones. Los animales se sacrificaron el día 56 mediante inhalación de CO2 y los bazos se disecaron en PBS estéril.
Los esplenocitos se separaron utilizando el kit de disociación del bazo de ratón y un disociador MACS suave (Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania). Las suspensiones de células individuales de esplenocitos se fijaron en formalina al 3% para la tinción FACS o se almacenaron en tampón de disociación para el aislamiento de ARN (Roche).
Evaluaciones: Los anticuerpos anti-FVIII se determinaron utilizando un ELISA desarrollado internamente. Brevemente, FVIII se recubrió en placas de 96 pocillos y se utilizó para capturar anticuerpos del plasma de ratón recolectado en intervalos de tiempo específicos. Los anticuerpos específicos para FVIII se detectaron utilizando un anticuerpo secundario IgG anti-ratón. El perfil de respuesta de células T se realizó en esplenocitos de ratón aislados (FIG. 38). Se tiñeron linfocitos y células dendríticas en el bazo para objetivos de superficies e intracelulares.
Para la tinción de la superficie, 1 x 106 esplenocitos totales se incubaron con los anticuerpos en las concentraciones adecuadas. Para la tinción intracelular, las células se permeabilizaron con solución BD Fix-Perm (BD Biosciences) seguido de incubación con anticuerpos contra citoquinas en el mismo tampón. La tinción con Foxp3 se llevó a cabo utilizando anticuerpo en tampón de tinción Foxp3 (BD Biosciences). La intensidad de la fluorescencia se registró con un BD FACS Canto II y el análisis se realizó con el software FLOWJO®.
Los linfocitos se tiñeron conjuntamente con CD4 y marcadores intracelulares IL-2, TNF-a e IL-4. Las células Treg se tiñeron para los marcadores de superficie CD4 y CD25, seguido de Foxp3 intracelular. Los esplenocitos se tiñeron para CD11c y PD-L1 (células dendríticas) o CD4 y PD-1 (células T CD4+) para identificar las células implicadas en la vía PDL1-PD-1. Se aisló el ARN total (Roche) y se sometió a transcripción inversa a ADNc (Qiagen, Hilden, Alemania). Los cebadores para TGF-p, IL-10, IL-12a y EBI-3 se adquirieron de IDT Technologies. La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) basada en SYBR verde se llevó a cabo utilizando el sistema Quantitect (Qiagen) utilizando una máquina de PCR en tiempo real ABI 7900 Fast Block. Los datos se analizaron utilizando el software 7500 versión 2.0.5.
Resultados
Niveles T o ta le s d e A n ticu erp o s an ti-F V III e l D ía 42 : Se analizaron los niveles totales de IgG anti-FVIII el día 42 a partir de plasma de ratones con hemofilia A a los que se inyectaron 50, 100 o 250 UI/kg de rFVIIIFc, BDD-FVIII (XYNThA®) o FVIII de longitud completa (fl-rFVIII) (ADVATE®) utilizando ELISA. Tanto a 50 como a 100 UI/kg, el grupo de rFVIIIFc tenía niveles de anticuerpos significativamente más bajos en comparación con BDD-rFVI 1 y fl-FVIII de longitud completa, lo que indicó una antigenicidad más baja para el FVIII impartida por inyecciones de rFVIIIFc. A 250 UI/kg, los grupos no eran significativamente diferentes entre sí y tenían niveles altos de anticuerpos (FIG. 39).
C ito q u in a s in tra c e lu la re s (IL -2 y T N F -a ) en c é lu la s C D 4 : Los ratones que recibieron 50 UI/kg en cada uno de los grupos de tratamiento no respondieron según los niveles de anticuerpos al FVIII, mientras que los ratones que recibieron 250 UI/kg en cada uno de los grupos de tratamiento respondieron con los niveles más altos de anticuerpos (datos no mostrados). El rFVIIIFc a dosis de 50 y 100 UI/kg (FIG. 40A y FIG. 40B) redujo el porcentaje de células CD4+ positivas para IL-2 y TNF-a, lo que indicó una inmunogenicidad más baja, mientras que el rFVIII BDD y el rFVIII de longitud completa mostraron células positivas para citoquinas más altas. Los 3 tratamientos a la dosis de 250 UI/kg (FIG. 40C) elevaron el porcentaje de células positivas para citoquinas, lo que indicó una mayor inmunogenicidad a esta dosis. Se obtuvieron resultados similares para IL-4.
C é lu la s C D 4 /C D 25 /F o x p 3 T rip le P o s itiv a s (M a rc a d o re s d e C é lu la s T re g ): En la dosis de 100 UI/kg, el porcentaje de aumento de células Treg frente al vehículo fue significativamente mayor en el grupo de rFVIIIFc (P < 0,05) en comparación con los grupos BDD-rFVIII y fl-rFVIII (FIG. 41). Se obtuvieron resultados similares para 50 UI/kg de rFVIIIFc, lo que indica que tanto los tratamientos de 50 como de 100 UI/kg de rFVIIIFc pueden fomentar el predominio de células Treg y suprimir las respuestas inmunitarias al FVIII.
R e a c c ió n en C a d e n a d e la P o lim e ra s a en T ie m p o R e a l p a ra C ito q u in a s R e la c io n a d a s co n la T o le ra n c ia : El análisis por PCR en tiempo real para las citoquinas relacionadas con la tolerancia inmunitaria, a saber, TGF-p (FIG.
42A), IL-10 (FIG. 42B) e IL-35 (subunidades IL-12a y EBI-3, mostradas respectivamente en las FIGs. 42C y 42D) se llevó a cabo utilizando ARN aislado de ratones pertenecientes al grupo de tratamiento de 100 UI/kg. Los niveles de ARNm se regularon al alza para las citoquinas testadas en el grupo rFVIIIFc (P < 0,05) en comparación con los otros tratamientos a 100 UI/kg, lo que indicó la presencia de esplenocitos que expresan activamente citoquinas tolerogénicas, fomentando con ello un microentorno inmunosupresor. Los marcadores de inmunotolerancia de expresión de ARNm Foxp3 (FIG. 42E), CD25 (FIG. 42F), CTLA-4 (FIG. 42G) e Indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO-1) (FIG. 42H) fueron mayores en los esplenocitos totales del grupo de 100 UI/kg.
A n á lis is F A C S d e la V ía P D -L 1 -P D -1 : PD-L1 (CD274) en células dendríticas se acopla a PD-1 (CD279) en células T para fomentar vías inhibitorias que suprimen la activación y proliferación de células T, conduciendo con ello a la supresión de respuestas inmunitarias. Esplenocitos del grupo de 100 UI/kg se tiñeron para CD11c de superficie y PD-L1 (FIG. 43A), o CD4 y PD-1 (FIG. 43B). A la dosis de 100 UI/kg, el porcentaje de células dendríticas positivas para PD-L1 y el porcentaje de células T positivas para PD-1 fueron mayores en los animales que recibieron rFVIIIFc (P 0,05) en comparación con los que recibieron BDD- FVIII y tl-rFVIII. Esto indicó una regulación positiva de las vías inmunosupresoras tanto en las células dendríticas como en las células T por parte de rFVIIIFc.
Discusión
Los resultados experimentales arriba mostrados indicaron que rFVIIIFc a dosis de 50 y 100 UI/kg tuvo una baja inmunogenicidad y fomentó tolerancia al FVIII, tal como se demuestra por:
(a) Un nivel más bajo de citoquinas pro-inmunogénicas (IL-2 y TNF-a) en las células T CD4+ en comparación con otras moléculas de FVIII;
(b) Una regulación al alza de células T reguladoras y los marcadores (Foxp3, CD25, PD-1, CTLA4) que son responsables de la tolerancia inmunitaria en ratones a los que se inyectó rFVIIIFc. La importancia de Foxp3+ Treg y el papel de CTLA4 en fomentar la tolerancia al FVIII en la hemofilia se han descrito previamente (Cao et al., J. Thromb. Haemost. 7(S1):88-91 (2009); Astermark et al. J. Thromb. Haemost. 5:263-5 (2007)).
(c) Un nivel más alto de citoquinas tolerogénicas (IL-10, TGF-p, IL-35) en esplenocitos de ratones a los que se inyectó rFVIII. Se ha demostrado en varios estudios que estos marcadores son citoquinas inmunorreguladoras clave y determinantes principales de la tolerancia inmunitaria (Bi et al., Nat. Genet. 10:119-21 (1995)).
(d) Una elevación de la población de células dendríticas tolerogénicas (PD-L1, IDO-1 y CD80 disminuida) en ratones después de la inyección con rFVIIIFc.
Al mismo tiempo, los ratones tratados con rFVIIIFc también mostraron anticuerpos más bajos o nulos contra el FVIII a dosis de 50 y 100 UI/kg (Liu et al., WFH Abstract n° FB-WE-04.2-5 (2012)) y resistieron el desafío con 250 UI/kg una vez tolerado con 50 UI/kg de rFVIIIFc.
Conclusiones: Ratones tratados con rFVIIIFc mostraron menores o ningún anticuerpo contra FVIII a dosis de 50 y 100 UI/kg en comparación con las terapias de FVIII tradicionales. En base a estudios de células T y células dendríticas en ratones, se encontró que rFVIIIFc era menos inmunogénico que las terapias tradicionales de FVIII y fomentó vías tolerogénicas. El rFVIIIFc reguló al alza las citoquinas inmunorreguladoras clave en esplenocitos de ratones con hemofilia A que son indicativas de inmunotolerancia. Tomados en conjunto, estos hallazgos indican la existencia de un microentorno tolerogénico en el bazo de ratones a los que se inyectó rFVIIIFc a dosis bajas (50 y 100 UI/kg).
Estos estudios han demostrado por primera vez que rFVIIIFc activa la señalización de células dendríticas, que es un determinante crucial de la tolerancia inmunitaria. Estos hallazgos indican la existencia de tolerancia inmunitaria funcional al FVIII impartida por rFVIIIFc en ratones con hemofilia A.
Ejemplo 15
Evaluación de las Respuestas de Anticuerpos a rFVIIIFc en Comparación con XYNTHA® y ADVATE® en Ratones con Hemofilia A
El desarrollo de anticuerpos inhibidores del FVIII de reemplazo se produce en el 20-30% de los pacientes no tratados previamente, siendo la complicación más grave del tratamiento de la hemofilia. La inducción de inmunotolerancia (ITI), que implica la administración frecuente de FVIII, se utiliza actualmente para tratar a pacientes que desarrollan inhibidores. Sin embargo, un subconjunto de estos pacientes no responde a la ITI. Véase, p. e j, Green, Haemophilia 17:831-838 (2011); Eckhardt et al. J. Thromb. Haemost. 9:1948-58 (2011); Cao et al., J. Thromb. Haemost. 7(S1):88 - 91 (2009). El FVIIIFc recombinante tiene una semivida aproximadamente 1,6 veces mayor que la semivida del rFVIII y actualmente se encuentra en fase 2/3 del desarrollo clínico. Los experimentos descritos en esta memoria evalúan las propiedades de inmunogenicidad y tolerancia inmunitaria de rFVIIIFc en comparación con otras proteínas de reemplazo de rFVIII en ratones con hemofilia A (HemA).
(a) Comparación de la Inmunogenicidad para rFVIIIFc, XYNTHA® y ADVATE® en Ratones HemA: Respuesta de Anticuerpos: Se trataron cuatro grupos de ratones HemA, con 9-12 ratones HemA por grupo, con 50 UI/kg, 100 UI/kg y 250 UI/kg de dosis de rFVIIIFc, XYNTHA®, ADVATE® y control de vehículo. Las dosis se administraron el día 0, el día 7, el día 14, el día 21 y el día 35. Se extrajo sangre el día 0, el día 14, el día 21, el día 28 y el día 42 (FIG.
44).
rFVIIIFc indujo una respuesta de anticuerpos significativamente menor a 50 UI/kg (FIG. 45) y a 100 UI/kg (FIG. 46) en comparación con XYNTHA® y ADVATE®. Sin embargo, todas las proteínas FVIII mostraron una respuesta de anticuerpos similar a 250 UI/kg (FIG. 47). Los títulos de anticuerpos neutralizantes se correlacionaron con los niveles totales de anticuerpos de unión (FIG. 48).
(b) Comparación de inmunogenicidad para rFVIIIFc, XYNTHA® y ADVATE® en Ratones HemA: Perfil de Respuesta de Células T: Para el perfil de respuesta de células T en esplenocitos se administró una dosis adicional de rFVIIIFc, XYNTHA®, ADVATE® y el control de vehículo el día 53. Se recogieron los bazos el día 56 (FIG. 49). Los resultados indicaron que rFVIIIFc fomenta el predominio de células Treg positivas para CD4/CD25/Foxp3 (FIG. 50, panel derecho).
Sumario: La administración de rFVIIIFc resultó en una respuesta de anticuerpos significativamente menor en comparación con XYNTHA® y ADVATE® en dosis de 50 y 100 UI/kg. El perfil tolerogénico después de dosis de 50 y 100 UI/kg de rFVIIIFc indicó que rFVIIIFc puede fomentar el predominio de células Treg y suprimir la respuesta inmunitaria al FVIII.
(c) Estudio de toleración inmunitaria de rFVIII: Para testar si la administración repetida de rFVIIIFc puede inducir tolerancia funcional in vivo, se adoptó el siguiente régimen de dosificación. Se inyectaron a ratones HemA (8-10 semanas de edad) 50 UI/kg de rFVIIIFc o vehículo cada semana durante 4 semanas (los días 0, 7, 14, 21) seguido de una inyección el día 35. A partir del día 49, estos ratones fueron enfrentados a 250 UI/kg semanales de rFVIIIFc para determinar si los animales pueden tolerar dosis altas de rFVIIIFc. Las dosis de estimulación se administraron los días 0, 7, 14 y 21 a partir del día 49 del estudio (véase la FIG. 51). Se recogieron muestras de sangre en intervalos de tiempo específicos para verificar la presencia de anticuerpos anti-FVIII utilizando ELISA. Como se muestra en la FIG. 52, la dosificación repetida de rFVIIIFc condujo a una reducción estadísticamente significativa de anticuerpos frente a rFVIIIFc cuando se expusieron a dosis altas de 250 UI/kg, mientras que los animales que recibieron vehículo tuvieron niveles más altos de anticuerpos tras la estimulación. Esto indica claramente que la administración repetida de rFVIIIFc a razón de 50 UI/kg basado en el esquema de dosificación seguido puede inducir tolerancia a dosis más altas de rFVIIIFc (250 UI/kg).
Conclusión: A dosis terapéuticas, se encontró que rFVIIIFc era (1) menos inmunogénico en comparación con XYNTHA® y ADVATE®, y (2) capaz de inducir tolerancia inmunitaria a FVIII en ratones HemA.
En la actualidad, se está determinando si dosis incluso inferiores de rFVIIIFc pueden conducir a la inducción de tolerancia inmunitaria a dosis más altas de rFVIIIFc. En el presente estudio, se están utilizando dosis más bajas de rFVIIIFc, a saber, 25 UI/kg y 10 UI/kg, durante la fase de inducción de tolerancia. A esto le seguirá el desafío con 250 UI/kg de rFVIIIFc y la medición de anticuerpos contra el FVIII como se llevó a cabo para el estudio anterior.
Ejemplo 16
Vías de Aclaramiento de rFVIIIFc en Ratones con Hemofilia A
La proteína de fusión FVIII Fc de coagulación recombinante (rFVIIIFc) de larga duración se encuentra actualmente en un estudio clínico de fase 3 para el tratamiento episódico y profiláctico de individuos con hemofilia A. En comparación con el FVIII recombinante de longitud completa (ADVATE®, Baxter Healthcare Corporation), rFVIIIFc tiene una semivida prolongada 1,7 veces y un aclaramiento significativamente reducido en pacientes con hemofilia A. Véase, Powell et al., Blood 119:3031-7 (2012). Este perfil farmacocinético (PK) mejorado es mediado a través de la interacción de Fc con el receptor de Fc neonatal (FcRn). Véase Dumont et al, Blood 119:3024-30 (2012). El rFVIIIFc está compuesto por un único FVIII de coagulación humano con el dominio B suprimido unido directamente al dominio Fc de la inmunoglobulina humana G1, que se recicla de forma natural tras la absorción celular (endocitosis o pinocitosis) a través de la interacción con FcRn (FIG. 53). Las células monocíticas (macrófagos y células dendríticas), incluyendo macrófagos residentes en el hígado (células de Kupffer), están implicadas en el aclaramiento del factor von Willebrand (VWF) y FVIII (FIG. 54). Véase van Schooten et al., Blood 112(5):1704-12 (2008).
Con el fin de dilucidar los tipos de células implicados en la absorción de rFVIIIFc, el aclaramiento y el reciclaje mediada por FcRn, los autores de la invención estudiaron el impacto de los macrófagos y el agotamiento de las células de Kupffer en el aclaramiento de rFVIIIFc en modelos de ratones genéticamente modificados.
Materiales y métodos
El aclaramiento de rFVIIIFc y rFVIII (BDD) se comparó en 3 modelos de ratón inactivados (KO): (1) de hemofilia A (FVIII KO), deficiente en FVIII; (2) doble KO (DKO) de FVIII y VWF, que carece de expresión tanto de FVIII como de VWF; y (3) FcRn-KO, que carece de expresión de FcRn. En los 3 modelos, los macrófagos y las células de Kupffer se agotaron con CLODROSOME® (Encapsula NanoSciences, Inc), que es un análogo de ATP tóxico (clodronato) encapsulado en liposomas que es fagocitado específicamente por macrófagos y desencadena la apoptosis. Véase van Rooijen y Hendrikx, Methods Mol. Biol. 605:189-203 (2010).
Ratones de control de cada uno de los grupos se trataron con liposomas no tóxicos ENCAPOSOME® (FIG. 55). Se inyectó una única dosis intravenosa de FVIII o rFVIIIFc (125 o 250 UI/kg) 24 horas después del tratamiento con liposomas. Las muestras de sangre se recogieron mediante recogida de sangre retroorbital o de la vena cava en intervalos de tiempo especificados (4 muestras por intervalo de tiempo).
A continuación se midió la actividad del FVIII humano en muestras de plasma mediante un ensayo cromogénico de FVIII y se estimaron los parámetros de PK con el software WINNONLIN® (Pharsight Corp.) utilizando un modelo de análisis no compartimental.
El agotamiento de células de Kupffer y macrófagos se evaluó por tinción inmunohistoquímica y se cuantificó utilizando el software Visiopharm (Hoersholm, Dinamarca) o por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR).
Resultados
(a) Agotamientos de macrófagos y células de Kupffer: La FIG. 56 muestra una tinción representativa de secciones de hígado con un anticuerpo contra Iba-1, un marcador de macrófagos específico, 24 horas después del tratamiento de control con ENCAPSo Me® (A, A') o CLODROSOME® (B. B') de ratones con hemofilia A. A' y B' muestran las máscaras de cuantificación que destacan las células de Kupffer teñidas (azul), el área total del tejido (azul marino) y las áreas vacías (gris). Se obtuvieron perfiles de agotamiento similares en otras cepas de ratón. El análisis cuantitativo de las áreas teñidas positivamente demostró que > 90% de las células de Kupffer del hígado se agotaron y se mantuvieron bajas durante > 3 días después del tratamiento con CLODROSOME® (n = 4) en comparación con los animales de control tratados con ENCAPSOME® (FIG. 57). Las células monocíticas circulantes también se redujeron en > 50% dentro de las 24 horas del tratamiento con CLODROSOME®, evaluado mediante análisis de citometría de flujo de células de la sangre teñidas con un anticuerpo marcado contra F4/80+ (n = 4). En el espacio de 48 horas se recuperaron las células de la sangre agotadas (FIG. 57). En consonancia con el agotamiento observado de macrófagos en el hígado, el análisis por RT-PCR de la expresión del receptor tipo mucina 1 (Emr1) que contiene el módulo del factor de crecimiento epidérmico marcador de macrófagos (F4/80) demostró que el tratamiento con CLODROSOME® disminuyó la expresión del ARNm de Emr1 en > 95% en el hígado y el pulmón en ratones con hemofilia A (FIG. 58). Emr1 es la denominación utilizada para la proteína humana. El homólogo de ratón se conoce como F4/80. Emr1 es una proteína transmembrana presente en la superficie celular de macrófagos maduros.
(b) Aclaram iento de FVIII en modelos de ratón: En contraste con los resultados previamente reseñados que sugieren que las células de Kupffer juegan un papel en el aclaramiento tanto de FVIII como de VWF (van Schooten CJ, e t al. Blood. 112(5): 1704-12 (2008)), el agotamiento de las células de Kupffer no provocó la disminución esperada en el aclaramiento de FVIII en ratones con hemofilia A (FIG. 59). Por el contrario, el agotamiento de las células de Kupffer en ratones con hemofilia A aumentó significativamente el aclaramiento de rFVIIIFc (FIG. 59). De manera similar, en ratones DKO, el agotamiento de las células de Kupffer no disminuyó el aclaramiento de FVIII e incrementó significativamente el aclaramiento de rFVIIIFc (FIG. 60). En ratones FcRn-KO, el agotamiento de las células de Kupffer no afectó al aclaramiento de FVIII o rFVIIIFc (FIG. 61).
Conclusiones: El agotamiento de macrófagos y de células de Kupffer en ratones con hemofilia A y DKO (deficientes en FVIII y VWF) incrementó el aclaramiento de rFVIIIFc, pero no disminuyó el aclaramiento de FVIII, lo que indica que los macrófagos y las células de Kupffer justifican buena parte de la diferencia en el aclaramiento entre FVIII y rFVIIIFc en estos ratones. En ausencia tanto de VWF como de FVIII (ratones DKO), el agotamiento de macrófagos y células de Kupffer aumentó el aclaramiento de rFVIIIFc a niveles cercanos a los de FVIII.
La falta de efecto del agotamiento de las células de Kupffer en el aclaramiento de FVIII en ratones con hemofilia A o DKO contrastó con estudios publicados previamente. Véase van Rooijen & Hendrikx, Methods Mol. Biol. 605:189-203 (2010). El agotamiento de macrófagos y células de Kupffer en ratones FcRn-KO no dio como resultado diferencias de aclaramiento significativas entre FVIII y rFVIIIFc, lo que indica un papel potencial de FcRn en el reciclaje de rFVIIIFc mediado por macrófagos.
En conjunto, estos estudios indicaron que rFVIIIFc fue protegido de una forma dependiente de macrófagos y/o células de Kupffer y que una vía natural en estas células puede contribuir al reciclaje de rFVIIIFc mediado por FcRn.
Ejemplo 17
Tolerancia Inmunitaria a Anticuerpos Pre-Existentes contra el Factor VIII
Es muy probable que pacientes que reciben rFVIIIFc estaban previamente en una terapia diferente de rFVIII. Aproximadamente el 30% de los pacientes con hemofilia A desarrollan anticuerpos contra el FVIII, lo cual es un problema importante en la terapia de reemplazo de FVIII actual. Actualmente, el único enfoque aprobado para tolerar a los pacientes que tienen inhibidores de FVIII es administrarles dosis altas de FVIII durante un período de tiempo indefinido, es decir, hasta que el paciente se vuelva tolerante. Por lo tanto, es de interés determinar si una dosis baja de rFVIIIFc puede revertir la inmunogenicidad del FVIII inhibiendo las vías de señalización de las células T y B y sesgando hacia la tolerancia.
En este estudio, a ratones HemA (8-10 semanas de edad) se les inyectará una vez a la semana durante 5 semanas BDD-FVIII (XYNTHA®) o fl-FVIII (ADVATE®) a razón de 50 UI/kg. Los niveles de anticuerpos anti-FVIII se determinarán en muestras de sangre tomadas de estos animales en días específicos como se indica en el esquema. Después de la inducción de anticuerpos inhibidores, los animales se cambiarán a inyecciones con 50 UI/kg de rFVIIIFc semanalmente durante 5 semanas. Esta será la fase de tolerancia. Los niveles de anticuerpos anti-FVIII se determinarán nuevamente a partir de muestras de sangre tomadas como se indica. Después de la fase de tolerancia, a los animales se les inyectará nuevamente XYNTHA® o ADVATE® a razón de 50 UI/kg en otras cuatro inyecciones y las muestras de sangre extraídas serán testadas para detectar anticuerpos anti-FVIII. En el caso de una tolerancia exitosa, la segunda estimulación con XYNTHA® o ADVATE® no debería producir anticuerpo alguno contra el FVIII, lo cual pueda indicar la capacidad del rFVIIIFc de inducir inmunotolerancia al FVIII.
Ejemplo 18
Inmunoterapia Adoptiva de Células T y Transferencia de Tolerancia Inmunitaria
Células T reguladoras (Tregs) son los jugadores principales en la inducción y el mantenimiento de la tolerancia periférica a FVIII y otros agentes terapéuticos peptídicos. Uno de los estudios clave utilizados para determinar la presencia de tolerancia inmunitaria funcional es mediante la transferencia de células Treg aisladas de animales tolerizados a receptores, que luego son enfrentados a dosis más altas de FVIII. La presencia de transferencia funcional de tolerancia se evidencia por la falta o menor producción de anticuerpos en los ratones receptores enfrentados.
En este estudio, ratones HemA (8-10 semanas de edad) serán tolerizados mediante la inyección de 50 Ul/kg de rFVIIIFc o vehículo cada semana durante 4 semanas (los días 0, 7, 14, 21), seguido de dos inyecciones en días 35 y 53. Se recogerán muestras de plasma para la determinación de los niveles de anticuerpos anti-FVIII utilizando ELISA. El día 56, los ratones sin anticuerpos serán sacrificados y se aislarán sus bazos. Los esplenocitos de estos ratones se recolectarán y convertirán en suspensiones de células individuales utilizando el kit de aislamiento de esplenocitos (Miltenyi Biotec). Las Tregs de los esplenocitos totales se aislarán utilizando el kit de aislamiento basado en perlas magnéticas Treg murinas CD4 CD25 (Miltenyi Biotec). Las Tregs aisladas se enumerarán utilizando un contador de células. Se fijará una parte alícuota de la suspensión celular utilizando formalina al 3% para el análisis fenotípico por FACS para determinar la pureza del material aislado. Las Tregs serán entonces inyectadas IV en ratones receptores en el día 0 a razón de 1 x 106 células/ratón en 200 gL de solución salina.
A partir de día 1 los animales serán estimulados con 250 UI/kg de rFVIIIFc, seguido de inyecciones repetidas semanalmente una vez los días 8, 15, 22 y 29. Las muestras de sangre se recogerán los días 15, 22, 29 y 36 para el análisis mediante ELISA de anticuerpos anti-FVIII en el plasma. En el caso de una transferencia exitosa de tolerancia, los ratones que reciben Tregs de animales tolerizados con rFVIIIFc no desarrollarán anticuerpos contra FVIII, mientras que los ratones a los que se inyectaron Tregs aisladas de ratones donantes a los que se inyectó vehículo muestran la presencia de anticuerpos anti-FVIII.
Ejemplo 19
Identificación de Mecanismos de Inducción de Tolerancia Inmunitaria por rFVIIIFc: Estudios con Células Dendríticas y Macrófagos
Una de las características clave que distingue rFVIIIFc de otros productos farmacológicos de FVIII es la presencia del resto Fc que es un constituyente de origen natural. Este podría ser un factor responsable que suprime la respuesta inmunitaria e impulsa una reacción de tolerancia inmunitaria. Las moléculas Fc presentes en IgG y en rFVIIIFc son capaces de interactuar con los receptores Fc de IgG clásicos y FcRn. Entre los receptores Fc, el subtipo FcYRIIb (FcYR2b) es un receptor inhibidor y emite señales supresoras que frenan la activación de los tipos de células que albergan ese receptor. Los receptores Fc que incluyen FcRn se localizan principalmente en células presentadoras de antígenos (APC - células dendríticas, macrófagos y células B), pero no en células T. Por lo tanto, es posible que el rFVIIIFc pueda acoplarse a FcR2b y/o FcRn en estas células para inclinarse hacia un fenotipo tolerogénico.
Para comprobar si rFVIIIFc se acopla a FcR2b y/o FcRn en células dendríticas y macrófagos para desarrollar un fenotipo tolerogénico, se llevarán a cabo los siguientes experimentos:
1. Identificación de marcadores a los niveles de ARNm y de superficie celular (proteína) en líneas celulares de macrófagos murinos, macrófagos esplénicos y células dendríticas esplénicas que están reguladas por rFVIIIFc en comparación con FVIII solo o un mutante de FVIIIFc (N297A) que no interactúa con receptores Fc.
2. Sobreexpresión e inactivación de FcgR2b o FcRn en la línea celular de macrófagos murinos RAW 264.7 e investigación de los efectos de rFVIIIFc en estos receptores mediante el estudio de objetivos posteriores.
3. Identificación de la posible participación de otras vías de importancia, tales como la señalización mediada por TLR en la respuesta de ApC a rFVIIIFc.
Ejemplo 20
Vías Alternativas para la Inducción de la Tolerancia
La tolerancia inmunitaria a rFVIIIFc puede conseguirse también por vía mucosa. Dos posibles sitios para inducir tolerancia son la mucosa gastrointestinal y la mucosa respiratoria. La tolerancia oral al rFVIIIFc puede inducirse alimentando los animales o utiilizando sondajes orales para administrar la molécula a la mucosa intestinal. La mucosa intestinal tiene órganos linfoides secundarios especializados, a saber, los parches de Peyer que contienen células presentadoras de antígenos (APC) que son importantes en las respuestas inmunitarias reguladoras. Estas APCs pueden procesar antígenos y activar subconjuntos específicos para células dendríticas y Tregs que pueden viajar a otros sitios del cuerpo y programar otras células del sistema inmunológico para suprimir una respuesta inmunitaria en presencia de antígeno, en este caso FVIII suministrado por vía exógena. Este fenómeno podría estar mediado por interacciones de Fc con FcRn y/o FcgR2b presentes en la APC del sistema inmunológico de la mucosa intestinal. La mucosa respiratoria se puede tolerizar mediante la inhalación de aerosoles de rFVIIIFc que pueden funcionar según el mismo mecanismo que para el intestino.
Para comprobar si se puede lograr la tolerancia inmunitaria por vía mucosa, se administrará XYNTHA® o ADVATE® por vía oral o mediante aerosol a ratones HemA. Tras la inducción de anticuerpos inhibidores, los animales se cambiarán a rFVIIIFc. Esta será la fase de tolerización. Los niveles de anticuerpos anti-FVIII se determinarán a partir de muestras de sangre tomadas como se indica. Después de la fase de tolerización, a los animales les serán inyectados nuevamente XYNTHA® o ADVATE® y las muestras de sangre tomadas se analizarán para detectar anticuerpos anti-FVIII. En el caso de una tolerización satisfactoria, la segunda estimulación con XYNTHA® no debería producir anticuerpo alguno contra el FVIII, lo cual puede indicar la capacidad de rFVIIIFc de inducir inmunotolerancia al FVIII después de la administración a través de la mucosa.
Ejemplo 21
Inmunotolerancia a Otros Factores de Coagulación
Para determinar si puede conferirse inmunotolerancia por Fc a cargas útiles del factor de coagulación distintos de FVIII, se generan polipéptidos quiméricos que comprenden el factor de coagulación FVIIa condensado a Fc (rFVIIaFc), o el factor de coagulación FIX condensado a Fc (rFIXFc). La clonación, expresión y purificación de rFVIIaFc y rFIXFc se realizan de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. La caracterización bioquímica, biofísica y farmacocinética de rFVIIaFc y rFIXFc se realiza como se describe en los ejemplos anteriores y/o utilizando métodos conocidos en la técnica. La evaluación de las respuestas de anticuerpos a rFVIIaFc y rFIXFc en comparación con factores de coagulación comerciales y estudios de inmunotolerancia se realizan como se describe en los Ejemplos anteriores. Los polipéptidos quiméricos que comprenden una carga útil de factor de coagulación y un resto Fc, tales como rFIXFc o FVIIaFc, pueden inducir eficazmente inmunotolerancia al factor de coagulación no modificado ( es decir , FIX o FVII sin una porción Fc).
Ejemplo 22
Transferencia Transplacentaria de Tolerancia Inmunitaria al FVIII utilizando rFVIIIFc
El objetivo de este estudio fue determinar si la administración de rFVIIIFc a ratones preñados podría transferir la molécula al feto a través de la placenta (debido a la interacción de la porción de Fc con el receptor FcRn en células de la placenta), y si la exposición del sistema inmunológico fetal al rFVIIIFc en una fase temprana podría conducir a tolerancia al programar el timo para que reconozca al FVIII como un auto-antígeno y no desarrolle una reacción inmunitaria hacia él.
Se infundió a ratones preñados una dosis (6U) de rFVIIIFc o XYNTHA® por vía intravenosa mediante inyección retroorbital el día 16 de gestación o dos dosis (6U cada una) mediante inyección en la vena de la cola los días 15 y 17 de gestación. Se evaluó la inmunogenicidad de XYNTHA® en las crías nacidas de las madres inmunizadas, después de que las crías hubieran alcanzado la madurez (de 6-9 semanas de edad). Se eligió el día 16 del embarazo porque coincidía con el desarrollo de la molécula reguladora autoinmune, AIRE, que juega un papel crucial en la eliminación de las células T autorreactivas del timo. Los resultados demostraron que en el primer experimento, que testó la dosificación de ratones preñados con una sola infusión de rFVIIIFc o XYNTHA® el día 16 de gestación, las crías nacidas de ratones preñados tratados con rFVIIIFc tenían títulos de Bethesda significativamente más bajos que los de XYNTHA®, en comparación con crías nacidas de ratones preñados tratados con XYNTHA® (FIG. 62). En el segundo experimento, que testó la dosificación de ratones preñados los días 15 y 17 de gestación, las crías nacidas de ratones preñados tratados con rFVIIIFc tenían títulos de Bethesda significativamente más bajos que los de XYNTHA®, en comparación con las crías nacidas de madres de control y una tendencia a disminuir títulos en comparación con las crías nacidas de madres tratadas con XYNTHA® (FIG. 63).
La transferencia transplacentaria de proteína (rFVIIIFc) desde la madre a la circulación fetal se evaluará mediante la detección de la actividad del FVIII en las crías nacidas de ratones inmunizados. Las acciones a nivel de células T se evaluarán mediante estudios de perfiles de células T y transferencia de Treg de crías tolerizadas con rFVIIIFc.
Ejemplo 23
rFVIIIFc Regula los Marcadores Tolerógenos en Células Presentadoras de Antígenos
Materiales y Métodos:
Ratones: Ratones con hemofilia A (HemA) (C57BL/6) portadores de una inactivación en el exón 16 de FVIII en un fondo 129 x B6 (Bi, L., Lawler, A.M., Antonarakis, S.E., High, K.A., Gearhart, J.D. y Kazazian, H.H., Jr. 1995. Targeted disruption of the mouse factor VIII gerne produces a model of hemophilia A. N a t G en e t 10:119-121) se obtuvieron del Dr. H. Kazazian (Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA, EE.UU.) y se mantuvieron como colonias reproductoras en Biogen Idec Hemophilia o Charles River Laboratory o Jackson Laboratories. Todos los procedimientos con animales utilizados fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) y se realizaron de acuerdo con las directrices de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
Anticuerpos y Reactivos: Los anticuerpos utilizados para la tinción y citometría de flujo se obtuvieron de BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) o de eBioscience (San Diego, CA, EE.UU.). Los anticuerpos utilizados se dirigieron contra marcadores de superficie murinos tales como CD4 y PD-1 (células T auxiliares), CD11c, CD80 y PD-L1 (células dendríticas) y CD25 (células Treg), citoquinas intracelulares (IL-2, IL -4, TNF-a) y factores de transcripción (Foxp3). Los reactivos para la tinción intracelular de citoquinas y factores de transcripción se adquirieron de BD Biosciences. Se sintetizaron FVIIIFc recombinante con dominio B suprimido (rFVIIIFc) y FVIII recombinante con dominio B suprimido (rFVIII) como en Peters e ta l. (Peters, R.T., Toby, G., Lu, Q., Liu, T., Kulman, J.D., Low, S.C., Bitonti, A.J. y Pierce, G.F. 2012. Biochemical and functional characterization of a recombinant monomeric Factor VIII-Fc fusión protein. J. Throm b Haem ost. DOI: 10.1111/jth.12076).
Otras sustancias farmacológicas de Factor VIII, a saber, rBDD FVIII XYNTHA® (Wyeth Pharmaceuticals, Filadelfia, PA, EE.UU.) y FVIII de longitud completa ADv At E® (Baxter Healthcare Corporation, Westlake Village, CA, EE.UU.) fueron adquiridos y reconstituido de acuerdo con las directrices de los fabricantes.
In d u cc ió n d e Inm un izac ió n /T o le ran c ia en R atones: Tres grupos de tratamiento que consisten en ratones HemA machos de 8 - 10 semanas de edad recibieron dosis intravenosas de 50, 100 o 250 UI/kg, se administraron los días 0, 7, 14, 21, 35 y 53. Cada uno de los tratamientos y niveles de dosis se administró a 10 ratones. Se tomaron muestras de sangre mediante sangrado retro-orbital los días 0 (pre-sangrado), 14, 21,28 y 42, y se utilizaron para separar el plasma y determinar mediante ELISA los niveles de anticuerpos anti-FVIII. A los animales se les inyectó una vez más el día 53, se sacrificaron el día 56 por inhalación de CO 2 y los bazos fueron disecados en PBS estéril. Los esplenocitos se separaron utilizando el kit de disociación del bazo de ratón y un disociador MACS suave (Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania). Suspensiones de células individuales de esplenocitos se fijaron en formalina al 3% (Boston BioProducts) para la tinción FACS o se almacenaron en tampón de disociación para el aislamiento de ARN (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Para los estudios de ensayo de la inmunotolerancia, a los ratones se les inyectaron inicialmente 50 UI/kg los días 0, 7, 14, 21 y 35. Después de confirmar la ausencia de anticuerpos contra el FVIII el día 42, a estos ratones se les administrarton 250 UI/kg de rFVIIIFc una vez a la semana; es decir, los días 49, 56, 63 y 70 (días 0, 7, 14 y 21 de re­ estimulación). Se analizaron los niveles de anticuerpos anti-FVIII de los animales re-estimulados en los sangrados recogidos los días 14, 21 y 28.
E L IS A d e l an ticu erp o anti-FV III: El protocolo seguido fue diseñado internamente en Biogen Idec Hemophilia. Antes del ensayo, todas las muestras de plasma se calentaron a 56°C en un baño de agua para inactivar los factores de coagulación residuales introducidos por los tratamientos y las enzimas anticoagulantes que podrían romper los patrones recubiertos en la placa. El día 1 se revistió una placa de microtitulación de alta unión de 96 pocillos (Thermo Immulon 2HB) con 1 pg/ml (100 pl/pocillo) de FVIII con dominio B suprimido en carbonato de sodio 0,05 M, pH 9,6 y se incubó durante la noche (de 12 a 18 horas) a 4°C. Al día siguiente, se eliminó el sobrenadante y la placa se lavó 4 veces con PBST (solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 al 0,05%). Después, la placa se bloqueó con 200 pl por pocillo de PBST que contenía suero de caballo inactivado por calor al 10%, pH 7,4 durante 60 minutos a temperatura ambiente. El patrón utilizado para la IgG de ratón fue una agrupación policlonal de anticuerpos monoclonales anti-FVIII preparados mezclando cantidades iguales de GMA8002 (A1), GMA8008 (C2), GMA8011 (C1 ), GMA8015 (A2), GMA8016 (A2), GMA8005 (A1/A3). Todos los anticuerpos monoclonales eran de Green Mountain Antibodies, Inc, Burlington, VT, mostrándose entre paréntesis los epítopos del dominio FVIII. Las muestras de ensayo de plasma de ratón se diluyeron en tampón de bloqueo y contenían la misma concentración de plasma calentado que los patrones. A continuación, se eliminó el tampón de bloqueo y se añadieron los patrones diluidos y las muestras a razón de 100 pl/pocillo por duplicado. La placa se incubó durante 2 horas a 37°C con agitación en un agitador orbital. Después de lavar 4 veces con PBST, se añadieron 100 pl/pocillo de IgG-HRP de anti-ratón de cabra, diluido 1:20000 en tampón de bloqueo y se incubó durante 60 minutos a 37°C con agitación en un agitador orbital. La placa se lavó de nuevo 4 veces con PBST y luego se añadieron 100 pl/pocillo de TMB y se incubó a TA durante 5 a 10 minutos. Los resultados se leyeron a una DO 650 con un lector de placas.
E n sa yo B e th e s d a p a ra D e te rm in a r A n ticu erp o s N e u tra liza n te s T ítu los : Este ensayo determinó el título de anticuerpos neutralizantes anti-FVIII en una muestra de plasma dada. Brevemente, el ensayo se realizó mezclando muestras de plasma con concentraciones conocidas de FVIII recombinante e incubación durante 2 horas a 37°C. A continuación, se ensayó la actividad residual del FVIII en la mezcla utilizando un kit Coatest FVIII SP, en presencia de Factor IXa, Factor X, fosfolípidos y CaCl2. La actividad de FVIII se calculó utilizando una curva estándar para la actividad de FVIII representada utilizando rFVIII en ausencia de inhibidores.
T inción FA C S : El perfilado de respuesta de células T y células dendríticas se realizó en esplenocitos aislados de ratón. Se tiñeron linfocitos esplénicos y células dendríticas para objetivos de superficie e intracelulares. Para la tinción de la superficie, 1 x 106 esplenocitos totales se incubaron con los anticuerpos en las concentraciones adecuadas. Para la tinción intracelular, las células se permeabilizaron con solución BD Fix-Perm (BD Biosciences) seguido de incubación con anticuerpos contra citoquinas en el mismo tampón. La tinción de Foxp3 se llevó a cabo utilizando anticuerpo en tampón de tinción Foxp3 (BD Biosciences). La intensidad de la fluorescencia se registró utilizando un BD FACS Canto II y el análisis se realizó utilizando el software FLOWJO. Los linfocitos se combinaron con CD4 y marcadores intracelulares IL-2, TNF-a e IL-4. Células T reguladoras (Treg) se tiñeron para los marcadores de superficie CD4 y CD25 seguido de Foxp3 intracelular. Los esplenocitos se tiñeron para CD11c y PD-L1 (células dendríticas) o CD4 y PD-1 (células T CD4+) para identificar las células implicadas en la vía PD-L1 - PD-1.
P C R en T iem po R e a l y A n á lis is d e M a tr iz b asa d o en P C R en tiem p o R e a l : El ARN total se aisló utilizando un kit de aislamiento de ARN (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) y transcripción inversa en ADNc (Qiagen, Hilden, Alemania). Los cebadores de PCR en tiempo real para los genes probados se diseñaron utilizando el algoritmo en línea disponible en el sitio web de IDT technologies (www.idtdna.com) y se adquirieron en IDT technologies (Coralville, IA). La PCR en tiempo real basada en SYBR green se llevó a cabo utilizando el sistema Quantitect (Qiagen, Hilden, Alemania) en una máquina de PCR en tiempo real ABI 7900 Fast Block (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para las matrices basadas en PCR en tiempo real, se mezclaron 500 ng de ADNc total con la mezcla maestra de qPCR basada en SYBR green y se dividieron en partes alícuotas en una matriz de placas de 96 pocillos (PAMM047Z, T-cell Anergy and Immune Tolerance PCR Array; SA Biosciences, Frederick, MD, EE.UU.). Las reacciones se llevaron a cabo con una máquina de PCR en tiempo real ABI 7900 Fast Block (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los resultados se analizaron utilizando el software 7500 versión 2.0.5 y los niveles relativos de transcripciones de genes se midieron con genes de referencia endógenos como control utilizando el método de cuantificación relativa 2-ACt (Livak, K.J. y Schmittgen, T.D. 2001. Análisis de los datos de expresión génica relativa utilizando PCR cuantitativa en tiempo real y el método 2(-Delta Delta C(T)). Methods 25:402-408.). Los genes de referencia utilizados para la normalización fueron GAPDH, HPRT, Hsp90ab, beta-actina y GusB. Para cada una de las muestras, los valores de Ct promedio para los genes de referencia se tomaron juntos y se utilizaron para calcular el ACt. Los ARNm que mostraban ciclos de umbral (Ct) > 35 se excluyeron del análisis.
P ro life rac ión d e cé lu las T y D e term inac ión d e los n iv e le s d e in te rfe rón -y (IF N -y ) : A ratones HemA (8-10 semanas de edad) se les inyectaron sustancias farmacológicas de FVIII una vez a la semana durante 2 semanas. Setenta y dos horas después de la segunda inyección, se sacrificó a los ratones y los macrófagos peritoneales se recogieron mediante lavado utilizando PBS estéril. Se aislaron células T esplénicas utilizando un kit de aislamiento de células T CD4+ murinas basado en perlas magnéticas (Miltenyi Biotec, Alemania). Las células T se marcaron con CFSE 10 pM (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 15 minutos en PBS caliente y se sembraron en placas de adhesión ultra-bajas de 96 pocillos (Corning), junto con los macrófagos peritoneales a una densidad de 1 x 106 células por ml para cada una. A continuación, las células se incubaron con 0,1, 1 y 10 nM de rFVIII o vehículo o microperlas CD3/CD28 (control positivo; Miltenyi Biotec) en medio X-VIVO 15 (Lonza) que contenía anticuerpos coestimuladores, a saber, anti-CD28 y anti-CD49d (BD Biosciences), durante 96 horas a 37°C. Al final de la incubación, se midieron los niveles de IFNy en el sobrenadante del cultivo utilizando un kit ELISA de Meso Scale Devices (MSD). La proliferación de células T se determinó midiendo la intensidad de fluorescencia de CFSE (MFI) en células T ligadas en función de las dispersiones directas y laterales, utilizando FACS (BD FACS CANTO II).
A n á lis is E s ta d ís tic o : El análisis estadístico de los resultados se llevó a cabo ya sea utilizando el test-t de Student para datos no apareadoa o test-t de Mann-Whitney. Los valores de p < 0,05 se consideraron significativos.
Resultados: Las células dendríticas son células profesionales presentadoras de antígenos y albergan moléculas clave y enzimas que son fundamentales en sesgar una respuesta inmunitaria hacia la tolerancia. Esplenocitos de ratones HemA a los que se inyectaron sustancias farmacológicas de FVIII o vehículo se tiñeron para detectar moléculas de CD11c y MHC de Clase II para ligaar las células dendríticas. La composición esplénica de células dendríticas que expresan marcadores tales como CD80, un marcador de superficie regulado positivamente en células dendríticas maduras que indica una mayor presentación de antígeno y CD274 (PD-L1), el ligando para el receptor PD-1, se identificaron mediante tinción conjunta con anticuerpos específicos contra estas moléculas. Como se muestra en la FIG. 63A, los esplenocitos de ratones HemA a los que se inyectaron 100 UI/kg de rFVIIIFc o BDD-FVIII mostraron una disminución significativa en el porcentaje de células dendríticas que expresan CD80, lo que sugiere una abundancia de células dendríticas inmaduras.
Aunque los ratones que recibieron fl-FVIII mostraron una disminución en el porcentaje de células dendríticas CD80+ en comparación con vehículo, la misma no alcanzó significación estadística (FIG. 64A). La tendencia fue similar para los ratones que recibieron la dosis de 50 UI/kg de rFVIIIFc. A 250 UI/kg, los tres tratamientos no mostraron alteraciones en el porcentaje de células dendríticas CD80+ entre los esplenocitos.
Los resultados del análisis FACS para células dendríticas esplénicas que expresan CD274 (PD-L1) revelaron que rFVIIIFc a 100 UI/kg potenció el porcentaje de estas células en comparación con el vehículo y otros tratamientos con FVIII (FIG. 64B). Esta molécula también fue regulada a nivel del ARNm por rFVIIIFc como se ilustra por el análisis de PCR en tiempo real (FIG. 64C). Esto sugiere que el rFVIIIFc regula la vía PD-L1 :PD-1, una de las vías inmunosupresoras clave, reduciendo con ello la inmunogenicidad del FVIII. Además de CD274, rFVIIIFc también regula al alza los niveles de ARNm de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), una enzima clave que regula la proliferación y activación de células T al afectar el metabolismo del triptófano (FIG. 64D).
Ejemplo 24
rFVIIIFc en Dosis Bajas Potencia la Expresión de Marcadores de Tolerancia Inmunitaria y Anergia en Esplenocitos
Los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con los materiales y métodos descritos en el Ejemplo 23.
Con el fin de identificar marcadores de tolerancia inmunitaria inducida por rFVIIIFc, se emplearon matrices basadas en PCR en tiempo real centradas en genes específicos para la tolerancia inmunitaria y la anergia (SA Biosciences). Se utilizó ARNm aislado de esplenocitos obtenidos de ratones a los que se inyectaron 50 y 250 UI/kg de rFVIIIFc y vehículo para identificar nuevos elementos de respuesta activados por esta sustancia farmacológica.
Los candidatos se identificaron basándose en su nivel de expresión (2 veces por encima o por debajo del vehículo) y el valor p basado en el test-t de Student (< 0,05). La expresión relativa de cada uno de los genes se determinó utilizando el método 2-ACt (Livak, K.J. y Schmittgen, T.D. 2001. (Livak, K.J. y Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta
Delta C(T)) Method. Methods 25:402-408) después de normalizar a los valores medios de Ct de un conjunto de 5 genes de referencia (véase el Ejemplo 23, Materiales y Métodos).
En base a estos criterios, el análisis de matriz realizado reveló candidatos que estaban regulados preferentemente por rFVIIIFc a 50 UI/kg al nivel de esplenocitos, en comparación con el vehículo y los ratones a los que se inyectaron 250 UI/kg (FIG. 65 y FIG. 66). Estos incluyeron una regulación al alza estadísticamente significativa de genes específicos de tolerancia tales como Foxp3, CTLA-4 y CD25; genes asociados a anergia, tales como Egr2, Dgka y CBL-B; genes pertenecientes a la Superfamilia del Factor de Necrosis Tumoral (TNFRSF); prostaglandina sintasa 2 (PTGS2) y receptor de prostaglandina E2 (PTGER2) (véase la FIG. 66). Por el contrario, algunos de los genes regulados a la baja identificados utilizando esta matriz son moléculas pro-inflamatorias conocidas, tales como CCL3 y STAT3 (FIG. 66).
Estos resultados indicaron la presencia de vías tolerogénicos y un microentorno tolerogénico dentro de los esplenocitos de los animales que recibieron 50 UI/kg de rFVIIIFc. Los perfiles de expresión génica determinados utilizando la matriz se validarán mediante PCR en tiempo real con pares de cebadores individuales para los candidatos identificados.
Ejemplo 25
Los Esplenocitos CD4+ de 250 UI/kg del Grupo de Ratones Proliferan y Producen Altos Niveles de IFN-y
Los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con los Materiales y Métodos descritos en el Ejemplo 23.
Se emplearon los estudios de proliferación de células T para investigar las respuestas de células T específicas para el factor VIII ex vivo. Células T CD4+ aisladas de ratones que recibieron dos inyecciones semanales de 50 o 250 UI/kg de rFVIIIFc se marcaron con CFSE y se reconstituyeron con macrófagos peritoneales (células presentadoras de antígenos; APC) y se incubaron en presencia de rFVIII con dominio B suprimido en tres concentraciones, 0,1, 1 y 10 nM.
El análisis FACS para la proliferación basado en señales de dilución de CFSE reveló que las células T del grupo tratado con 250 UI/kg de rFVIIIFc mostraron un aumento de la proliferación dependiente de la dosis, que fue estadísticamente significativo a 10 nM (FIG. 67). Paralelamente, las células T de ratones tratados con 50 UI/kg de rFVIIIFc no mostraron un incremento significativo en la proliferación con concentraciones crecientes de rFVIII ex vivo en comparación con el vehículo (FIG. 67).
Los niveles de IFN medidos a partir de los sobrenadantes de cultivo de estas incubaciones revelaron un perfil similar que coincidía con el patrón de proliferación de células T, es decir, un incremento dependiente de la dosis en la secreción de células T derivadas de ratones tratados con 250 UI/kg de rFVIIIFc (FIG. 68A), mientras que no hubo cambios en los niveles de células T de ratones tratados con 50 UI/kg de rFVIIIFc (FIG. 68B).
Con el fin de diseccionar el o los mecanismos de acción de rFVIIIFc en la supresión de la respuesta inmunitaria al FVIII, los autores de la invención emplearon dos construcciones mutantes - una que no se une al receptor Fcy (denominada rFVIIIFc-N297A) y la otra que carece de la unión al receptor FcRn (denominada rFVIIIFc-IHH). Estas construcciones se utilizaron para identificar las interacciones del rFVIIIFc con uno de estos receptores para provocar la acción inmunosupresora. Con este fin, los autores de la invención probaron el perfil de secreción de IFN y de células T derivadas de ratones que recibieron dos inyecciones semanales de rFVIIIFc-N297A a dosis de 250 UI/kg (FIG. 68C) y dosis de 50 UI/kg (FIG. 68D).
Las comparaciones conjuntas de la secreción de IFNy de células T derivadas de 250 UI/kg de rFVIIIFc y rFVIIIFc-N297A revelaron que el nivel de la citoquina estaba muy reducido en las células T de animales que recibieron el mutante, aunque niveles significativamente más altos en comparación con el vehículo. Sin embargo, los niveles de IFNy del grupo de 50 UI/kg de la proteína mutante no mostraron una diferencia significativa con los de 50 UI/kg de rFVIIIFc. Esto sugiere que la mayor producción de anticuerpos y la proliferación de células T observadas a dosis más altas de rFVIIIFc podrían ser el resultado de la interacción del Fc con los receptores Fe que es abolida por el mutante que no se une a Fcy.
La descripción anterior de las realizaciones específicas revelará de la manera más completa posible la naturaleza general de la invención que otros, aplicando el conocimiento dentro de la experiencia de la técnica, pueden fácilmente modificar y/o adaptar para diversas aplicaciones de realizaciones específicas, sin experimentación excesiva, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, se pretende que tales adaptaciones y modificaciones estén dentro del significado y gama de equivalentes de las realizaciones descritas, en base a las enseñanzas y guías presentadas en esta memoria. Debe entenderse que la fraseología o terminología en esta memoria tiene el propósito de descripción y no de limitación, de modo que la terminología o fraseología de la presente memoria descriptiva debe ser interpretada por el experto en la materia a la vista de las enseñanzas y guías.
TABLA 1: Secuencias de polinucleótidos
A. FVIIIFc con dominio B suprimido
(i) Secuencia de ADN de la Cadena de FVIIIFc con dominio B suprimido (péptido señal de FVIII subrayado, región Fe en negrita) (SEQ ID NO: 1, que codifica SEQ ID NO: 2)
661 A TGCAAATAGA GCTCTCCACC TGCTTCTTTC
721 TGTGCCTTTT GCGATTCTGC TTTAGTGCCA CCAGAAGATA CTACCTGGGT GCAGTGGAAC
781 TGTCATGGGA CTATATGCAA AGTGATCTCG GTGAGCTGCC TGTGGACGCA AGATTTCCTC
841 CTAGAGTGCC AAAATCTTTT CCATTCAACA CCTCAGTCGT GTACAAAAAG ACTCTGTTTG
901 TAGAATTCAC GGATCACCTT TTCAACATCG CTAAGCCAAG GCCACCCTGG ATGGGTCTGC
961 TAGGTCCTAC CATCCAGGCT GAGGTTTATG ATACAGTGGT CATTACACTT AAGAACATGG
1021 CTTCCCATCC TGTCAGTCTT CATGCTGTTG GTGTATCCTA CTGGAAAGCT TCTGAGGGAG
1081 CTGAATATGA TGATCAGACC AGTCAAAGGG AGAAAGAAGA TGATAAAGTC TTCCCTGGTG
1141 GAAGCCATAC ATATGTCTGG CAGGTCCTGA AAGAGAATGG TCCAATGGCC TCTGACCCAC
1201 TGTGCCTTAC CTACTCATAT CTTTCTCATG TGGACCTGGT AAAAGACTTG AATTCAGGCC
1261 TCATTGGAGC CCTACTAGTA TGTAGAGAAG GGAGTCTGGC CAAGGAAAAG ACACAGACCT
1321 TGCACAAATT TATACTACTT TTTGCTGTAT TTGATGAAGG GAAAAGTTGG CACTCAGAAA
1381 CAAAGAACTC CTTGATGCAG GATAGGGATG CTGCATCTGC TCGGGCCTGG CCTAAAATGC
1441 ACACAGTCAA TGGTTATGTA AACAGGTCTC TGCCAGGTCT GATTGGATGC CACAGGAAAT
1501 CAGTCTATTG GCATGTGATT GGAATGGGCA CCACTCCTGA AGTGCACTCA ATATTCCTCG
1561 AAGGTCACAC ATTTCTTGTG AGGAACCATC GCCAGGCGTC CTTGGAAATC TCGCCAATAA
1621 CTTTCCTTAC TGCTCAAACA CTCTTGATGG ACCTTGGACA GTTTCTACTG TTTTGTCATA
1681 TCTCTTCCCA CCAACATGAT GGCATGGAAG CTTATGTCAA AGTAGACAGC TGTCCAGAGG
1741 AACCCCAACT ACGAATGAAA AATAATGAAG AAGCGGAAGA CTATGATGAT GATCTTACTG
1801 ATTCTGAAAT GGATGTGGTC AGGTTTGATG ATGACAACTC TCCTTCCTTT ATCCAAATTC
1861 GCTCAGTTGC CAAGAAGCAT CCTAAAACTT GGGTACATTA CATTGCTGCT GAAGAGGAGG
1921 ACTGGGACTA TGCTCCCTTA GTCCTCGCCC CCGATGACAG AÁGTTATAAA AGTCAATATT
1981 TGAACAATGG CCCTCAGCGG ATTGGTAGGA AGTACAAAAA AGTCCGATTT ATGGCATACA
2041 CAGATGAAAC CTTTAAGACT CGTGAAGCTA TTCAGCATGA ATCAGGAATC TTGGGACCTT
2101 TACTTÍATGG GGAAGTTGGA GACACACTGT TGATTATATT TAAGAATCAA GCAAGCAGAC
2161 CATATAACAT CTACCCTCAC GGAATCACTG ATGTCCGTCC TTTGTATTCA AGGAGATTAC
2221 CAAAAGGTGT AAAACATTTG AAGGATTTTC CAATTCTGCC AGGAGAAATA TTCAAATATA
2281 AATGGACAGT GACTGTAGAA GATGGGCCAA CTAAATCAGA TCCTCGGTGC CTGACCCGCT
2341 ATTACTCTAG TTTCGTTAAT ATGGAGAGAG ATCTAGCTTC AGGACTCATT GGCCCTCTCC
2401 TCATCTGCTA CAAAGAATCT GTAGATCAAA GAGGAAACCA GATAATGTCA GACAAGAGGA
2461 ATGTCATCCT GTTTTCTGTA TTTGATGAGA ACCGAAGCTG GTACCTCACA GAGAATATAC
2521 AACGCTTTCT CCCCAATCCA GCTGGAGTGC AGCTTGAGGA TCCAGÁGTtC CAAGCCTCCA
2581 ACATCATGCA CAGCATCAAT GGCTATGTTT TTGATAGTTT GGAGTTGTCA GTTTGTTTGC
2641 ATGAGGTGGC ATACTGGTAC ATTCTAAGCA TTGGAGCACÁ GACTGACTTC CTTTCTGTCT
2701 TCTTCTCTGG ATATACCTTC AAACACAAAA TGGTCTATGA AGACACACTC ACCCTATTCC
2761 CATTCTCAGG AGAAACTGTC TTCAtGTCGA TGGAAAACCC AGGXCTATGG ÁTTCTGGGGT
2821 GCCACAACTC AGACTTTCGG AAGAGAGGCA TGACGGCCTT ACTGAAGGTT TCTAGTTGTG
2881 AGAAGAACÁC TGGTGATTAT TACGAGGACA GTTATGAAGA TATTTCAGCA TACTTGCTGA
2941 GTAAAAACAA TGCCATTGAA CCAAGAAGCT TCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC
3001 ATCAACGGGA AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG
3061 ATACCATATC AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGÁG GaTGAAAATC
3121 AGAGCCGCCG CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC
3181 TCTGGGATTA TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA
3241 GTGTCCCTCA GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC
3301 CCTTATACCG TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG
3361 AAGTTGAAGA TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT
3421 ATTCTAGCCT TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT
3481 TTGTCAAGCC TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA
3541 CTAAAGATGA GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG
3601: ATGTGCACTC AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG
3661 CTCATGGGAG ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA
3721 CCAAAAGCTG GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC
3781 AGATGGAAGA TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA
3841 TGGATACACT ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA
3901 GCATGGGCAG CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC
3961 GAAAAAAAGA GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG :
4021 TGGAAATGTT ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC 4081 TACATGCTGG GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG 4141 GAATGGCTTC TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT 4201 GGGCCCCAAA GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG 4261 AGCCCTTTTC TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA 4321 CCCAGGGTGC CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA 4381 GTCTTGATGG GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT 4441 TCTTTGGCAA TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAÁCCCT CCAATTATTG 4501 CTCGATACAT CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT 4561 TGATGGGCTG TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT 4621 CAGATGCACA GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT 4681 CAAAAGCTCG ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC 4741 CAAAAGAGTG GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC 4801 AGGGAGTAAA ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC 4861 AAGATGGCCA TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA 4921 ATCAAGACTC CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC 4981 TTCGAATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT 5041 GCGAGGCACA GGACCTCTAC GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GCTCCAGAAC 5101 TCCTGGGCGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC CTCATGATCT 5161 CCCGGACCCC TGAGGTCACA TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC CCTGAGGTCA 5221 AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG 5281 AGCAGTACAA CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC 5341 TGAATGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC CCCATCGAGA 5401 AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT 5461 CCCGGGATGA GCTGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC 5521 CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA 5581 Cgcctcccgt gttGgactcc GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA 5641 AGAGCAGGTG GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA 5701 ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A
(ii) Secuencia de ADN de Fc (subrayado el péptido señal IgK de ratón) (SEQ ID NO: 3, que codifica SEQ ID NO: 4)
: 7981 ATGGA GACAGACACA
8041 CTCCTGCTAT GGGTACTGCT GCTCTGGGTT CCAGGTTCCA CTGGTGACAA.AACTCACACA 8101 TGCCCACCGT GCCCAGCAGC TGAACTCCTG GGAGGACCGT CAGTCTTCGT CTTCCCCGCA 8161 AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC 8221 GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT GGAGGTGCAT 8281 AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC 8341 CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC 8401 AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA 8461 CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGC GATGAGCTGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG 8521 ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG 8581 CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGTTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC 8641 CTCTACAGCA AGCTCACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGT CTTCICATGC 8701 TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG 8761 GGTAAA
B. FVIIIFc de Longitud Completa
(i) Secuencia de ADN de FVIIIFc de Longitud Completa (subrayado el péptido señal de FVIII, región Fc en negrita) (SEQ ID NO: 5, que codifica SEQ ID NO: 6)
661 ATG CAAATAGAGC TCTCCACCTG
721 CTTCTTTCTG TGCCTTTTGC GATTCTGCTT TAGTGCCACC AGAAGATACT ACCTGGGTGC 781 AGTGGAACTG TCATGGGACT ATATGCAAAG TGATCTCGGT GAGCTGCCTG TGGACGCAAG 841 ATTTCCTCCT AGAGTGCCAA AATCTTTTCC ATTCAACACC TCAGTCGTGT ACAAAAAGAC 901 TCTGTTTGTA GAATTCACGG ATCACCTTTT CAACATCGCT AAGCCAAGGC CACCCTGGAT 961 GGGTCTGCTA GGTCCTACCA TCCAGGCTGA GGTTTATGAT ACAGTGGTCA TTACACTTAA 1021 GAACATGGCT TCCCATCCTG TCAGTCTTCA TGCTGTTGGT GTATCCTACT GGAAAGCTTC 1081 TGAGGGAGCT GAATATGATG ATCAGACCAG TCAAAGGGAG AAAGAAGATG ATAAAGTCTT 1141 CCCTGGTGGA AGCCATACAT ATGTCTGGCA GGTCCTGAAA GAGAATGGTC CAATGGCCTC 1201 TGACCCACTG XGCCXXACCX ACTCATATCT XXCXCAXGXG GACCTGGTAA AAGACTTGAA 1261 TTCAGGCCTC ATTGGAGCCC TACTAGTATG TAGAGAAGGG AGTCTGGCCA AGGAAAAGAC 1321 ACAGACCTTG CACAAATTTA TACTACTTTT TGCTGTATTT GATGAAGGGA AAAGTTGGCA 1381 CTCAGAAACA AAGAACTCCT TGATGCAGGA TAGGGATGCT GCATCTGCTC GGGCCTGGCC 1441 TAAAATGCAC ACAGTCAATG GTTATGTAAA CAGGTCTCTG CCAGGTCTGA TTGGATGCCA 1501 CAGGAAATCA GTCTATTGGC ATGTGATTGG AATGGGCACC ACTCCTGAAG TGCACTCAAT 1561 ATTCCTCGAA GGTCACACAT TTCTTGTGAG GAACCATCGC CAGGCGTCCT TGGAAATCTC-1621 GCCAATAACT TTCCTTACTG CTCAAACACT CTTGATGGAC CTTGGACAGT TTCTACTGTT 1681 TTGTCATATC TCTTCCCACC AACATGATGG CATGGAAGCT TATGTCAAAG TAGACAGCTG 1741 TCCAGAGGAA CCCCAACTAC GAATGAAAAA TAATGAAGAA GCGGAAGACT ATGATGATGA 1801 TCTTACTGAT TCTGAAATGG ATGTGGTCAG GTTTGATGAT GACAACTCTC CTTCCTTTAT 1861 CCAAATTCGC TCAGTTGCCA AGAAGCATCC TAAAACTTGG GTACATTACA TTGCTGCTGA 1921 AGAGGAGGAC TGGGACTATG CTCCCTTAGT CCTCGCCCCC GATGACAGAA GTTATAAAAG 1981 TCAATATTTG AACAATGGCC CXCAGCGGAX TGGTAGGAAG TACAAAAAAG TCCGATTTAT 2041 GGCATACACA GATGAAACCT TTAAGACTCG TGAAGCTATT CAGCATGAAT CAGGAATCTT 2101 GGGACCTTTA CTTTATGGGG AAGTTGGAGA CACACTGTTG ATTATATTTA AGAATCAAGC 2161 AAGCAGACCA TATAACATCT ACCCTCACGG AATCACTGAT GTCCGTCCTT TGTATTCAAG 2221 GAGATTACCA AAAGGTGTAA AACATTTGAA GGATTTTCCA AXXCXGCCAG GAGAAATATT 2281 CAAATATAAA TGGACAGTGA CTGTAGAAGA TGGGCCAACT AAAXCAGAXC CTCGGTGCCT 2341 GACCCGCTAT XACXCXAGXX TCGTTAATAT GGAGAGAGAT CTAGCTTCAG GACTCATTGG 2401 CCCTCTCCTC ATCTGCTACA AAGAATCTGT AGATCAAAGA GGAAACCAGA TAATGTCAGA 2461 CAAGAGGAAT GTCATCCTGT TTTCTGTATT TGATGAGAAC CGAAGCTGGT ACCTCACAGA 2521 GAATATACAA CGCTTTCTCC CCAATCCAGC TGGAGTGCAG CTTGAGGATC CAGAGTTCCA 2581 AGCCXCCAAC ATCATGCACA GCATCAATGG CXAXGXXXXX GATAGTTTGC AGTTGTCAGT 2641 TTGTTTGCAT GAGGTGGCAT ACXGGXACAX TCTAAGCATT GGAGCACAGA CTGACTTCCT 2701 TTCTGTCTTC TTCTCTGGAT ATACCTTCAA ACACAAAATG GTCTATGAAG ACACACTCAC 2761 CCTAXTCCCA TTCTCAGGAG AAACTGTCTT CAXGXCGAXG GAAAACCCAG GTCTATGGAT 2821 TCTGGGGTGC CACAACTCAG ACTTTCGGAA CAGAGGCATG ACCGCCTTAC TGAAGGTTTC 2881 TAGTTGTGAC AAGAACACTG GTGATTATTA CGAGGACAGT XAXGAAGATA TTTCAGCATA 2941 CTTGCTGAGT AAAAACAATG CCATTGAACC AAGAAGCTTC TCCCAGAATT CAAGACACCC 3001 TAGCACTAGG CAAAAGCAAT TTAATGCCAC CACAATTCCA GAAAATGACA TAGAGAAGAC 3061 TGACCCTTGG TTTGCACACA GAACACCTAT GCCTAAAATA CAAAATGTCT CCTCTAGTGA 3121 TTTGTTGATG CTCTTGCGAC AGAGTCCTAC TCCACATGGG CTATCCTTAT CTGATCTCCA 3181 AGAAGCCAAA XAXGAGACXX TTTCTGATGA TCCATCACCT GGAGCAATAG ACAGTAATAA 3241 CAGCCTGTCT GAAATGACAC ACTTCAGGCC ACAGCTCCAT CACAGTGGGG ACATGGTATT 3301 TACCCCTGAG TCAGGCCTCC AATTAAGATT AAATGAGAAA CTGGGGACAA CTGCAGCAAC 3361 AGAGTTGAAG AAACTTGATT TCAAAGTTTC TAGTACATCA AATAATCTGA TTTCAACAAT 3421 TCCATCAGAC AATTTGGCAG CAGGTACTGA TAATACAAGT TCCTTAGGAC CCCCAAGTAT 3481 GCCAGTTCAT TATGATAGTC AATTAGATAC CACTCTATTT GGCAAAAAGT CATCTCCCCT 3541 TACTGAGTCT GGTGGACCTC TGAGCTTGAG TGAAGAAAAT AATGATTCAA AGTTGTTAGA 3601 ATCAGGTTTA ATGAATAGCC AAGAAAGTTC ATGGGGAAAA AATGTATCGT CAACAGAGAG 3661 TGGTAGGTTA TTTAAAGGGA AAAGAGCTCA TGGACCTGCT TTGTTGACTA AAGATAATGC 3721 CTTATTCAAA GTTAGCATCT CTTTGTTAAA GACAAACAAA ACTTCCAATA ATTCAGCAAC 3781 TAATAGAAAG ACTCACATTG ATGGCCCATC ATTATTAATT GAGAATAGTC CATCAGTCTG 3841 GCAAAATATA TTAGAAAGTG ACACTGAGTT TAAAAAAGTG ACACCTTTGA TTCATGACAG 3901 AATGCTTATG GACAAAAATG CTACAGCTTT GAGGCTAAAT CATATGTCAA ATAAAACTAC 3961 TTCATCAAAA AACATGGAAA TGGTCCAACA GAAAAAAGAG GGCCCCATTC CACCAGATGC 4021 ACAAAATCCA GATATGTCGT TCTTTAAGAT GCTATTCTTG CCAGAAXCAG CAAGGXGGAX 4081 ACAAAGGACX CAXGGAAAGA ACXCXCXGAA CXCXGGGCAA GGCCCCAGXC CAAAGCAAXX 4141 AGXAXCCXXA GGACCAGAAA AAXCXGXGGA AGGXCAGAAX XXCXXGXCXG AGAAAAACAA 4201 AGXGGXAGXA GGAAAGGGXG AAXXXACAAA GGACGXAGGA CXCAAAGAGA XGGXXXXXCC 4261 AAGCAGCAGA AACCXAXXXC XXACXAACXX GGAXAAXXXA CAXGAAAAXA AXACACACAA 4321 XGAAGAAAAA AAAAXXCAGG AAGAAAXAGA AAAGAAGGAA ACAXXAAXCC AAGAGAAXGX 4381 AGXXXXGCCX CAGAXACAXA CAGXGACXGG CACXAAGAAX XXCAXGAAGA ACCXXXXCXX 4441 AGXGAGCACX AGGCAAAAXG XAGAAGGXXC AXAXGACGGG GCAXAXGCXC CAGXACXXCA 4501 AGAXXXXAGG XCAXXAAAXG AXXCAACAAA XAGAACAAAG AAACACACAG CXCAXXXCXC 4561 AAAAAAAGGG GAGGAAGAAA ACXXGGAAGG CXXGGGAAAX CAAACCAAGC AAAXXGXAGA 4621 GAAAXAXGCA XGCACCACAA GGAXAXCXCC XAAXACAAGC CAGCAGAAXX XXGXCACGCA 4681 ACGXAGXAAG AGAGCXXXGA AACAAXXCAG ACXCCCACXA GAAGAAACAG AACXXGAAAA 4741 AAGGAXAAXX GXGGAXGACA CCXCAACCCA GXGGXCCAAA AACAXGAAAC AXXXGACCCC 4801 GAGCACCCXC ACACAGAXAG ACXACAAXGA GAAGGAGAAA GGGGCCATXA CTCAGTCXCC 4861 CXXAXCAGAX XGCCXXACGA GGAGXCAXAG CAXCCCXCAA GCAAAXAGAX CXCCAXXACC 4921 CAXXGCAAAG GXAXCAXCAX XXCCAXCXAX XAGACCXAXA XAXCXGACCA GGGXCCXAXX 4981 CCAAGACAAC XCXXCXCAXC XXCCAGCAGC AXCXXAXAGA AAGAAAGAXX CXGGGGXCCA 5041 AGAAAGCAGX CAXXXCXXAC AAGGAGCCAA AAAAAAXAAC CXXXCXXXAG CCAXXCXAAC 5101 CXXGGAGAXG ACXGGXGAXC AAAGAGAGGX XGGCXCCCXG GGGACAAGXG CCACAAAXXC 5161 AGTCACATAC AAGAAAGTXG AGAACACTGT TCXCCCGAAA CCAGACTTGC CCAAAACATC
5221 TGGCAAAGTT GAATTGCTTC CÜAAAGTTCA CATTTATCAG AAGGACCTAT TCCCTACGGA
5281 AACTAGCAAT GGGTCTCCTG GCCATCTGGA TCTCGTGGAA GGGAGCCTTC TTCAGGGAAC:-5341 AGAGGGAGCG ATTAAGTGGA ATGAAGCAAA CAGACCTGGA AAAGTTCCCT TTCTGAGftGT
5401 AGCAACAGAA AGCTCTGCAA AGACTCCCTC CAAGCTATTG GATCC1CTTG CTTGGGATAA
5461 CCACTATGGT ACTCAGATAC CAAAAGAAGA GTGGAAATCC CAAGAGAAGT CÁGCAGAAAA
5521 AACAGCTTTT AAGAAAAAGG ATACCATTTT GTCCCTGAAC GCTTGTGAAA GCAATCATGC
5581 AATAGCAGCA ATAAATGAGG GACAAAATAA GCCCGAAATA GAAGTCACCT GGGCAAAGCA
5641 AGGTAGGACT GAAAGGCTGT GCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC ATCAACGGGA GACTATGATG ATÁGGÁTAT'G';
■(5 761; AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TXATGATGAG GATGAAAATC AGAGCCCCCG
5821 CAGCTTTCAA AÁGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC TCTGGGATTA
5881 TGGGATGAGT:AGCTCCGCAC ATGTTCTAAG: AAACAGGGCT CAGAGTGGCA GTGTCCCTGA
5341 GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTGC TTTACTCAGC CCTTATACCG
6001 TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG AAGTTGAAGA A160.$1:11V'ÍAATATCATG:;GÍAAGÍTTGa';GAAATCAGGC CTCTCGTGGGlllW^GTÍGIlAETSSítóéGíi
6121 TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT TTGTCAAGCC
618.1 TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA CTAAAGATGA
6241 GTXXGACXGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGAXGTTGAC CTGGAAAAAG AXGTGCACXC
6301 AGGCCTGATT GGACGCCTTC TGGTCTGCCA CACTAAGAGA CTGAACCCTG CTCATGGGAG
6361 ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTGÍGT'P: TTTCACGATC TTTGATGAGA CCAAAAGCTG
6421 GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC AGATGGAAGA
6481 XCCCACTXIT AAAGAGAATT ATCGCXXCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA TGGATACACT
6541 ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA GCATGGGCAG
6601 CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC GAAAAAAAGA
6661 : GGAGTATAAA AIGGCACTGX ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG TGGAAATGTT
6721 ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTACTiSGCGAGCAfe TAGATGCTGG
6781 GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG GAATGGCTTC
6841 TGGAGACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT GGGCCCCAAA
6901 GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG AGCCCTTTTC
6961 ITGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA CCCAGGGTGC
7021 c cgtcagaag ttctccagcc tctacatctc TCAGTTTATC atcatgtata CTCTTGATGG
7081 GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTG CACTGGAACC TTAATGGTCT TCTTTGGCAA
7141 TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCfi&TTATTG CTCGÁTACAX
7201 CCGTXTGCAC CCAACTCATT ATAGCAXTCG CAGCACXCTT CGCATGGAGT XGATGGGCTG
7261 XGAXTTAAAT AGTTGCAGCA XGCCAXTGGG AAXGGAGAGT AAAGCAATAT CAGATGCACA TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT CAAAAGCTCG
7381 ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC CAAAAGAGTG
7441 GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC AGGGAGTAAA
7501 ATCTCTGCTT ACCAGCATGX ATGTGAAGGA GTXCCTCATC TCCAGCAGTC AAGAXGGCCA
7561 TGAGXGGACT CTCTTTÍTXC ÁGAATGGCAA ÁGTAAAGGTT TTTCAGGGAA ATCAAGACTC
7621 GTTCACACCT gtggtgaact ctctagaccc ACCGTTACTG ACTCGCTACC ttcgaattca
7681 CCCCCAGAGT XGGGXGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT GCGAGGCACA
7741 GGACCTCTAC GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GCTCCAGAAC TCCTGGGCGG
7801 ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC CTCATGATCT CCCGGACCCC
7861 TGAGGTCACA TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC CCTGAGGTCA AGTTCAACTG
7921 GTACGTGGAC GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTACAA
7981 CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC TGAATGGCAA
8041 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC CCCATCGAGA AAACCATCTC
8101 CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCGGGATGA
8161 GCTGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC CCAGCGACAT
8221 CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT
8281 GTTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG
8341 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA ACCACTACAC
8401 GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A
(¡i) Fe (la misma secuencia que A (ii) (SEQ ID NO:3))]
TABLA 2: Secuencias de polipéptidos
A. Híbrido de Monómero de FVIII-Fc con dominio B suprimido (monómero dímero de BDD FVIIIFc): creado mediante la coexpresión de las cadenas de BDD FVIIIFc y Fc.
Construcción = fusión HC-LC-Fc. Se cotransfecta un casete de expresión de Fc con BDDFVIII-Fc para generar el monómero BDD FVIIIFc-. Para la cadena BDD FVIIIFc, la secuencia Fc se muestra en negrita; la secuencia de HC se muestra en doble subrayado; la secuencia del dominio B restante se muestra en cursiva. Los péptidos señal están subrayados.
(i) Cadena de FVIII-Fc con dominio B suprimido (secuencia señal de 19 aminoácidos subrayada) (SEQ ID NO: 2)
MQIELSTCFFLCX.LRFCFS ATRRYYLGAVELSWDYMOSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFHTSWYKKTLFVEFTDHLFHIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTWI TLKM'lASHPVSLHAVGVSYwKASEGAEYDDOTSOREKEDDKY'FPGGSHTYVWOVLKEHGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLHSGL IGALLVCREGSXAKEKTOTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKI-TSLMODRDAASARAWPKMHTVHGYVHRSLPGLIGCHRKSVYWHVI GMGTTPEVHSXFLEGHTFLVRlIHROAGLEISPITFLTAOTLLMDLGOFLLFCHXSSHOHDGMEAYVKVDSCPEEPOLRMKimEEAE DYDDDLTDSEMDWRFDDDHSPSFIOIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDPRSYKSOYLHHGPORIGRKYKKVRFMA YTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKHQASRPYHIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVT VEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVUMERDLASGLIGPLX.ICYKESVDORGnOIMSDKRHVILFSVFDEHRSWYLTEHIORFLPnPAGVO I,EDPEFOASniMHSIHGYVFDSLOLSVCLHEVAYWYILSIGAOTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMEIlPGLK ILGCHnSDFRnRGMTALLKVSSCDKUTGDYYEDSYEDISAYLLSKlTHAIEPR.SFSONPPyLKRHOREITRTTIjOSDOEEIDYDDTI SVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNE HLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRK17FVKPHETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSD VDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKEHYRFHAIMGYIM DTLPGLVMAQDQRXRWYLLSMGSNENIHSXHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMST LFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSIHAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYI SQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGKVDSSGXKHHIFNPPIXARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKA ISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSITAWRPQVriHPKEMLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQ WTLFFQNGKVKVFQGWQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLYDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSfiEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVlTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ii) Cadena Fc (péptido señal heterólogo de 20 aminoácidos de la cadena IgK de ratón subrayado) (SEQ ID NO: 4)
METPTLLLWVLLLWVPGSTG DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNvvYVDGVEVHtJAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKWQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESMGQPE1TMYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGIJVFSCSVMHEALHHHYTQKSLSLSPGK
B. Híbrido de monómero de FVIIIFc de longitud completa (monómero dímero de FVIIIFc de longitud completa): creado mediante la coexpresión de las cadenas de FVIIIFc y Fc.
Construcción = fusión HC-B-LC-Fc. Se cotransfecta un casete de expresión de Fc con FVIII-Fc de longitud completa para generar el monómero FVIIIFc de longitud completa. Para la cadena FVIIIFc, la secuencia Fc se muestra en negrita; la secuencia de HC se muestra en doble subrayado; la secuencia del dominio B se muestra en cursiva. Los péptidos señal están subrayados.
i) Cadena de FVIIIFc de longitud completa (péptido señal de FVIII subrayado (SEQ ID NO: 6)

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido quimérico que comprende factor VIII y un Fc para uso en la inducción de tolerancia inmunitaria al factor VIII en un sujeto humano.
2. El polipéptido quimérico para uso de la reivindicación 1, en donde el sujeto tiene riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria del factor VIII.
3. El polipéptido quimérico para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el factor VIII comprende factor VIII procesado o factor VIII de cadena sencilla o una combinación de los mismos.
4. El polipéptido quimérico para uso de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde la respuesta inmunitaria inhibitoria del factor VIII comprende la producción de anticuerpos anti-factor VIII inhibitorios, una respuesta inmunitaria mediada por células o un síntoma clínico seleccionado del grupo que consiste en tendencia al sangrado incrementada, alto consumo de factor VIII, falta de respuesta a la terapia con factor VIII, eficacia disminuida de la terapia con factor VIII, semivida acortada del factor VIII.
5. El polipéptido quimérico para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la concentración de los anticuerpos anti-factor VIII es al menos 0,6 Unidades Bethesda (UB).
6. El polipéptido quimérico para uso de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en donde la concentración de los anticuerpos anti-factor VIII es al menos 1,0 UB.
7. El polipéptido quimérico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el sujeto es un feto.
8. El polipéptido quimérico para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el polipéptido quimérico se ha de administrar a la madre del feto.
9. El polipéptido quimérico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde la respuesta inmunitaria inhibitoria del factor VIII se selecciona del grupo que consiste en:
a) la liberación de IL-12;
b) la liberación de IL-4; y
c) la liberación de TNF-a.
10. Polipéptido quimérico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que
(a) reduce el número de anticuerpos anti-factor VIII en el sujeto en comparación con el número antes de la administración del polipéptido quimérico;
(b) reduce el título de anticuerpos anti-factor VIII en el sujeto en comparación con el título antes de la administración del polipéptido quimérico; y/o
(c) reduce el nivel de una citoquina en el sujeto en comparación con el nivel antes de la administración del polipéptido quimérico.
11. El polipéptido quimérico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde se identifica que el sujeto tiene una o más características seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) tiene una mutación o deleción en el gen que codifica el factor VIII;
(b) tiene un reordenamiento en el gen que codifica el factor VIII;
(c) tiene un pariente que ha desarrollado previamente una respuesta inmunitaria inhibitoria contra el factor VIII;
(d) está recibiendo terapia con interferón;
(e) está recibiendo terapia anti-viral; y
(f) tiene una mutación genética en un gen distinto del gen que codifica el factor VIII que está relacionada con un riesgo incrementado de desarrollar una respuesta inmunitaria inhibitoria.
12. El polipéptido quimérico para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la mutación genética en un gen distinto del gen que codifica el factor VIII comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en:
a) un polimorfismo genético asociado con un aumento de TNF-a; y
b) un polimorfismo genético asociado con un aumento de IL10.
13. El polipéptido quimérico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el factor VIII comprende los aminoácidos 20 a 1457 de SEQ ID NO: 2, y en donde el Fc comprende los aminoácidos 1458 a 1684 de SEQ ID NO: 2.
14. El polipéptido quimérico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que es un híbrido de monómero-dímero que comprende un primer polipéptido que comprende el factor VIII y el Fc y un segundo polipéptido que consiste en un Fc.
15. El polipéptido quimérico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que es adecuado para tratar la hemofilia A.
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