JP2017149784A - 第ｖｉｉｉ因子療法を受けている個体における第ｖｉｉｉ因子に対する免疫原性を低下させる方法 - Google Patents

第ｖｉｉｉ因子療法を受けている個体における第ｖｉｉｉ因子に対する免疫原性を低下させる方法 Download PDF

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Abstract

【課題】第ＶＩＩＩ因子療法を受けている個体における第ＶＩＩＩ因子に対する免疫原性を低下させる方法を提供すること。
【解決手段】本開示は、阻害性のFVIII免疫応答（抗ＦＶＩＩＩ抗体および／または細胞媒介性免疫を含む）を発症する危険性のある対象に対し、ＦＶＩＩＩとＦｃとを含むキメラ性のハイブリッド第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを投与する方法を提供する。この投与は、凝固を促進しＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘導するのに十分である。このキメラポリペプチドは、全長ＦＶＩＩＩ、または欠失（例えばＢドメインの完全欠失もしくは部分欠失）を含むＦＶＩＩＩポリペプチドを含んでよい。
【選択図】図１

Description

本開示は、概して止血障害治療法の分野に関する。
血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子における突然変異および／または欠失に起因してＦＶＩＩＩ活性欠乏となることにより引き起こされる、Ｘ染色体連鎖性の出血性障害である（Peyvandi,F. et al. Haemophilia 12:82-89 (2006)）。この疾患は、
特発性出血と外傷後の出血多量を特徴とする。繰り返し筋肉内および関節内に徐々に出血する（この事象は幼児期に開始することが多い）結果、血友病性関節症および不可逆性関節損傷が生じる。この損傷は進行性であり、重度の関節可動域制限、筋萎縮症、および慢性疼痛を引き起こすことがある（Rodriguez-Merchan,E.C., Semin. Thromb. Hemost. 29:87-96 (2003)）（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
ＦＶＩＩＩ分子の凝血促進活性には、Ａ２ドメインが必要である。研究が示すところでは、ブタＦＶＩＩＩの凝血促進活性はヒトＦＶＩＩＩの６倍であり（Lollar& Parker, J. Biol. Chem. 266:12481-12486 (1991)）、ヒトＦＶＩＩＩとブタＦＶＩＩＩで凝血促進活性が異なる根拠は、ヒトとブタでは、Ａ２ドメインの１つ以上の残基間でアミノ酸配列が異なることにあると見られる（Lollar,P., et al., J. Biol. Chem. 267:23652-23657
(1992)）（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
血友病Ａの治療は、特発性出血を予防するためにＦＶＩＩＩ活性を正常レベルの１〜５％に回復することを目標とする補充療法により行われている（Mannucci,P.M., et al., N. Engl. J. Med. 344:1773-1779 (2001)）（参照により、この文献の全体が本明細書に
組み込まれる）。
出血の発症の治療（オンデマンド治療）と予防（予防治療）には、血漿由来ＦＶＩＩＩ（ｐｄＦＶＩＩＩ）製剤および組換えヒトＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）製剤が利用されている。ｒＦＶＩＩＩは、血漿製剤が広範にＨＩＶおよび肝炎ウイルスに汚染されたことを受けて、血液媒介病原体が伝播するリスクを低減し、ＦＶＩＩＩ製剤の十分な供給を確保する目的で開発された。しかしながら、現在のＦＶＩＩＩ製剤は、半減期（ｔ１／２）が約８〜１２時間と短いため、止血保護は時間的に制限されている。このため、大部分の特発性出血発症を保護するレベルとして確立している１％超にＦＶＩＩＩレベルを維持するには、大部分の患者は１週間に３回または１日おきに予防注射を受ける必要がある。Manco-Johnsonet al., New Engl J Med. 357(6):535-44 (2007)。
多くの研究が示すところによれば、オンデマンド治療は、高用量であっても関節症の予防には効果的でない。Aledort L. et al., J InternMed. 236:391-399 (1994); Petrini
P. etal., Am J Pediatr Hematol Oncol.13:280-287 (1991)。多くの臨床研究で、予防
的処置の利点が実証されている。Aznar J. et al., Haemophilia 6(3):170-176 (2000), Feldman B. etal.,J Thromb Haemost. 4:1228-1236 (2006), Kreuz W. et al., Haemophilia4:413-417(1998), Liesner R. et al., B J Haem. 92:973-978 (1996), Ljung R.,Haemophilia.4(4):409-412 (1998), Loefquist T, et al., J Intern Med 241:395-400(1997),Nilsson I, et al., B. J Int Med 232:25-32 (1992), Risebrough N. etal.,Haemophilia. 14:743-752 (2008), Van Den Berg H. et al., Haemophilia 9(Suppl.1):27-31 (2003), Van Den Berg H. et al., Haematologica 89(6):645-650(2004)および上記Manco-Johnson et al.は、オンデマンドで治療した小児と比べて、最初の関節出血後に一次予防を開始した小児の方が、出血と関節損傷が有意に少ないことを立証した。
また、オンデマンド治療と比べて、予防治療の方が能力障害および入院率が低下し、学校または仕事を休む時間が減少し（Aznar J. et al.,Haemophilia 6(3):170-176 (2000), Molho P. et al.,Haemophilia 6(1):23-32 (2000)）、患者と家族の生活の質が改善さ
れる（CoppolaA. et al., Blood Transfus. 6(2): 4-11 (2008)）。しかしながら、予防
治療の場合、小児に中心静脈アクセスデバイスの使用を要求することが多く、介添人は感染、敗血症、および血栓症の危険にさらされる。加えて、このような利点にもかかわらず、不便さと侵襲性が一因となり、年齢と共に予防治療の受け入れとコンプライアンスが低下する（GeraghtyS. et al., Haemophilia 12:75-81 (2006), Hacker M. et al.,Haemophilia7(4):392-396 (2001)）。こうしたことから、長期の血漿中ｔ１／２を有するｒＦ
ＶＩＩＩ製剤が潜在的に有益であると考えられる（Lillicrap D., Current Opinion in Hematology 17:393-397(2010)）。
ｐｄＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩの開発により実現した重要な成果は、死亡率の低下、関節損傷の予防、および生活の質の改善である。出血防止を長期化することができれば、血友病Ａ患者の治療において、さらなる重要な進歩となる。しかしながら、今のところ、止血保護を長期化できる製品は開発されていない。したがって、ＦＶＩＩＩ欠損に起因する血友病を治療するための、現在の治療法より耐性が高く、持続時間が長く、かつ効果の高い改善された治療方法が依然として必要とされている。
加えて、治療歴のない患者の１５〜３０％で、ＦＶＩＩＩ製剤の注入後に中和抗ＦＶＩＩＩ抗体（阻害物質）が発生する。このような免疫応答を回避するための種々の方法が検討されている。例えば、高用量寛容プロトコル、抗ＦＶＩＩＩ抗体を模倣するペプチドデコイの使用、ヒト／ブタＦＶＩＩＩハイブリッド分子を用いた免疫認識バイパス、抗クロノタイプ抗体を用いたＦＶＩＩＩ反応性ＣＤ４Ｔ細胞の中和、普遍的ＣＤ４エピトープの使用、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇまたは抗ＣＤ４０Ｌの同時刺激の遮断等の手法が挙げられる。例えばLeiet al., Transfusion Medicine 105: 4865-4870 (2005)を参照のこと。寛容誘導を目的とした、免疫細胞によるＦＶＩＩＩの提示も研究されている。例えばLeiらは、
Ｂ細胞のＩｇバックボーン上にＦＶＩＩＩドメインを提示すると、抗体の抑制または減少が生じることを見出した（同文献）。加えて、Qaduraらは、未成熟樹状細胞を用いてＦＶＩＩＩを寛容誘発提示すると、免疫原性が低下し得ることを見出した（Journalof Thrombosis and Haemostatis 6:2095-2104 (2008)）。しかしながら、このような方法は高コストで複雑であり（例えば、ＦＶＩＩＩを併用した他の治療法の同時実施や、比較的単純なタンパク質でなく全細胞の投与が必要とされる）、不要な副作用および／または無能率をもたらす可能性がある。
Peyvandi, F. et al. Haemophilia(2006)12:82〜89 Rodriguez-Merchan, E.C., Semin. Thromb.Hemost.(2003)29:87〜96 Lollar & Parker, J. Biol.Chem.(1991)266:12481〜12486
こうしたことから、抑制的応答を発症する患者において効果的な、ＦＶＩＩＩ欠損に起因する血友病を治療するための簡便な方法が依然として必要とされている。
本開示は、免疫寛容を改善する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の投与方法を提供する。この方法は、ＦＶＩＩＩ部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチド（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発症する危険性のある対象に投与することを含む。いくかの実施形態では、対象は、ＦＶＩＩＩ部分からなる同等投与量のポリペプチドを投与された場合、阻害性免疫応答を発症することになる。いくつかの実施形態では、対象は、阻害性免疫応答または阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発症したことがある。ＦＶＩＩＩ部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを投与することは、出血状態を治療し、ＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘導するのに十分であり得る。この投与は予防的であり得る。いくつかの実施形態では、この投与により、特発性出血の発生率が低下し、または出血が防止される。
この免疫応答は、抑制性の抗ＦＶＩＩＩ抗体を含み得る。抗体力価は、少なくとも０．６ベセスダ単位（ＢＵ）、少なくとも１．０ＢＵ、または少なくとも５．０ＢＵである。この免疫応答は、細胞媒介性の免疫応答（例えばサイトカインの放出）も含み得る。サイトカインは、例えばＩＬ−１２、ＩＬ−４、またはＴＮＦ−αであり得る。この免疫応答の結果として、出血傾向の増加、高ＦＶＩＩＩ消費、ＦＶＩＩＩ療法への無反応、ＦＶＩＩＩ療法の効力低下、および／またはＦＶＩＩＩ半減期の減少といった臨床症状が生じることもある。
阻害性免疫応答を発症する危険性のある対象には、ＦＶＩＩＩ遺伝子における突然変異、欠失、または再構成を有する対象が含まれる。いくつかの実施形態では、対象は、ＦＶＩＩＩタンパク質を産生しない。いくつかの実施形態では、対象は、重度の血友病を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ＦＶＩＩＩまたは別の治療用タンパク質に対する阻害性免疫応答が発症したことのある親族（例えば親、いとこ、叔母、叔父、祖父母、子、孫）を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ＦＶＩＩＩが投与されたときに免疫機能を増加させる療法を同時的に受けているか、以前に受けていた。いくつかの実施形態では、対象は、ＦＶＩＩＩと併用してインターフェロン療法または抗ウイルス療法を受けている。いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答を発症する危険性のある対象は、サイトカインレベルの上昇（例えばＴＮＦ−αまたはＩＬ１０の増加）に関連する遺伝子多型を有する。いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答を発症する危険性のある対象は、ＴＮＦ−α−３０８Ｇ＞Ａ多型またはＩＬ１０Ｇマイクロサテライトの対立遺伝子１３４を有する。
いくつかの実施形態では、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発症する危険性のある対象は、以前にＦＶＩＩＩに曝露したことがない。いくつかの実施形態では、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発症する危険性のある対象は、ＦＶＩＩＩに曝露したことがある。いくつかの実施形態では、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発症する危険性のある対象は、１５０日未満、５０日未満、または２０日未満のＦＶＩＩＩ曝露日数を有する。
いくつかの実施形態では、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発症する危険性のある対象は、以前にＦＶＩＩＩまたは別の治療用タンパク質に対する免疫応答を発症したことがない。いくつかの実施形態では、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発症する危険性のある対象は、以前にＦＶＩＩＩ（ｐｄＦＶＩＩＩもしくはｒＦＶＩＩＩ）または別の治療用タンパク質に対する免疫応答を発症したことがある。いくつかの実施形態では、阻害性のFVIII免
疫応答を発症する危険性のある対象は、以前に、ＦＶＩＩＩ製剤、例えばＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥＦＳ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥＦＳ（登録商標）、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）／ＲＥＦＡＣＴＯ ＡＢ（登録商標）、ＨＥＭＯＦＩＬ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＡＲＣ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＯＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＡＴＥ−ＤＶＩ（登録商標）、またはＨＹＡＴＥ：Ｃ（登録商標）に対する免疫応答を発症したことがある。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ製剤は全長ＦＶＩＩＩ、成熟ＦＶＩＩＩ、またはＢドメイン欠損ＦＶＩＩＩである。
本明細書で提供するＦＶＩＩＩの投与方法は、免疫寛容を誘導し得る。いくつかの実施形態では、この投与により、対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の数、対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価、および／または対象におけるサイトカイン（例えばＩＬ−１２、ＩＬ−４、またはＴＮＦ）のレベルが、投与前の数、力価、またはレベルと比べて減少する。いくつかの実施形態では、この投与により、対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の数、対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価、および／または対象におけるサイトカイン（例えばＩＬ−１２、ＩＬ−４、またはＴＮＦ）のレベルが、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドを用いた以前の治療に起因して生じた数、力価、またはレベルと比べて減少する。いくつかの実施形態では、この投与により、対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の数、対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価、および／または対象におけるサイトカイン（例えばＩＬ−１２、ＩＬ−４、またはＴＮＦ）のレベルが、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドを対象に投与する結果として生じることになるであろう数、力価、またはレベルと比べて減少する。
上記方法は、ＦＶＩＩＩ部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドの投与を含む。ＦＶＩＩＩ部分は、ヒトＦＶＩＩＩ、全長ＦＶＩＩＩ、またはＢドメインの完全欠失もしくは部分欠失を含むＦＶＩＩＩであってよい。ＦＶＩＩＩ部分は、生物活性のあるポリペプチド（例えば、凝固活性を有するＦＶＩＩＩポリペプチド）であってよい。ＦＶＩＩＩ部分は、表２に示すシグナル配列を含まないアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７；配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と少なくとも９０％同一、９５％同一、または同一であってよい。また、ＦＶＩＩＩ部分は、表２に示すシグナル配列を含むアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７、または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と少なくとも９０％同一、９５％同一、または同一であってもよい。Ｆｃ部分は、表２に示すＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４、または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と同一であってよい。
キメラポリペプチドは、キメラポリペプチドと会合した第２ポリペプチドを含むハイブリッドの形態であってよい。この第２ポリペプチドは、本質的にＦｃからなるか、またはＦｃからなっていてよい。
いくつかの実施形態では、上記方法は、キメラポリペプチドを特定用量で投与することを含む。この用量は、例えば１０〜１００ＩＵ／ｋｇの用量、または１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、もしくは９０〜１００ＩＵ／ｋｇの用量、または１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ＩＵ／ｋｇの用量であってよい。
いくつかの実施形態では、出血状態の対象に上記キメラポリペプチドを投与する。出血状態とは、例えば、出血凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉内出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内の出血、腹膜後隙内の出血、または腸腰筋鞘内の出血であり得る。いくつかの実施形態では、出血凝固障害は血友病Ａである。
また、本開示は、凝固因子に対して阻害性免疫応答を発症する危険性のある対象に凝固因子を投与する方法も提供する。この方法は、凝固因子部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを対象に投与することを含む。さらに、胎児である対象において、凝固因子に対する免疫寛容を誘発する方法も提供する。この方法は、凝固因子部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを含むポリペプチドを、胎児の母親に投与することを含む。いくつかの実施形態では、凝固因子は、ＦＶＩＩ酵素前駆体、活性化ＦＶＩＩ、活性化可能ＦＶＩＩ、またはＦＩＸである。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの投与により、特発性出血の発生率が低下し、または出血が防止される。
また、本開示は、ＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を必要とする対象において、ＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘発する方法も提供する。この方法は、ＦＶＩＩＩ部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発症する危険性がある。他の実施形態では、対象は、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発症したことがある。
さらに、ＦＶＩＩＩに対する阻害物質の発生を防止または抑制する方法も提供する。この方法は、免疫寛容を必要とする対象に、ＦＶＩＩＩ部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを投与することを含む。
また、本開示は、凝固因子に対する免疫寛容を必要とする対象において、凝固因子に対する免疫寛容を誘発する方法も提供する。この方法は、凝固因子部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、抑制性の凝固因子免疫応答を発症する危険性がある。他の実施形態では、対象は、抑制性の凝固因子免疫応答を発症したことがある。いくつかの実施形態では、凝固因子部分は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、またはフォンウィルブランド因子を含む。
さらに、凝固因子に対する阻害物質の発生を防止または抑制する方法も提供する。この方法は、これを必要とする対象に、凝固因子部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを投与することを含む。いくつかの実施形態では、凝固因子部分は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、またはフォンウィルブランド因子である。
いくつかの実施形態では、対象はヒトであり、ＦＶＩＩＩの投与方法は、当該対象における出血状態を治療するための方法である。いくつかの実施形態では、出血状態は血液凝固障害により引き起こされる。いくつかの実施形態では、血液凝固障害は血友病またはフォンウィルブランド病である。いくつかの実施形態では、血液凝固障害は血友病Ａである。いくつかの実施形態では、対象は、予防治療またはオンデマンド治療を必要とする状態（例えば出血の発症）を有する。いくつかの実施形態では、対象は、出血性障害に罹患しているか、または上記治療が必要になると予想される患者である。
本開示はキットも提供する。このキットは、（ａ）凝固因子部分と、Ｆｃ部分もしくはＦｃＲｎ結合パートナー部分と、薬学的に許容される担体と、を含むキメラポリペプチドを含む医薬組成物と、（ｂ）凝固因子に対する免疫寛容を必要とする対象に上記組成物を投与するための指示と、を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ部分、ＦＶＩＩ部分、またはＦＩＸ部分を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ単量体二量体ハイブリッド、ＦＶＩＩ単量体二量体ハイブリッド、またはＦＩＸ単量体二量体ハイブリッドである。いくつかの実施形態では、上記の指示は、凝固因子に対する免疫寛容を必要とする対象を特定するための少なくとも１つのステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫寛容を必要とする対象を特定するための上記ステップは、以下からなる群より選ばれる１つ以上を含む：（ａ）凝固因子遺伝子における突然変異または欠失を有する対象を特定すること、（ｂ）凝固因子遺伝子における再構成を有する対象を特定すること、（ｃ）以前に凝固因子に対する阻害性免疫応答が発症したことのある親族を有する対象を特定すること、（ｄ）インターフェロン療法を受けている対象を特定すること、（ｅ）抗ウイルス療法を受けている対象を特定すること、（ｆ）凝固因子をコードする遺伝子以外で、阻害性免疫応答を発症する危険性の上昇に関連する遺伝子における遺伝子突然変異を有する対象を特定すること、および（ｇ）これらの２つ以上の組み合わせ。いくつかの実施形態では、凝固因子をコードする遺伝子以外の遺伝子の遺伝子突然変異は、以下からなる群より選ばれる１つ以上の突然変異を含む：（ａ）ＴＮＦ−αの増加に関連する遺伝子多型、（ｂ）ＩＬ１０の増加に関連する遺伝子多型、（ｃ）ＣＴＬＡ−４の減少に関連する遺伝子多型、（ｄ）ＤＲ１５またはＤＱＢ０６０２ＭＨＣクラスＩＩ分子の突然変異、および（ｅ）これらの２つ以上の組み合わせ。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、投与後に、阻害性免疫応答のレベルを測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、投与後の阻害性免疫応答レベルを、投与前の阻害性免疫応答レベルと比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答とは、ＦＶＩＩＩに対する抗体の発生である。いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答とは、サイトカインの分泌である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
阻害性のFVIII免疫応答を発症する危険性のある対象に第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）
を投与する方法であって、ＦＶＩＩＩ部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを該対象に投与することを含む、方法。
（項目２）
前記対象は、前記ＦＶＩＩＩ部分からなる同等投与量のポリペプチドを投与された場合、阻害性のFVIII免疫応答を発症することになる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記対象は、阻害性のFVIII免疫応答を発症したことがある、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記投与は、出血状態を治療するのに十分である、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
対象においてＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘発する方法であって、該対象は胎児であり、該方法は、ＦＶＩＩＩ部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを含むポリペプチドを該胎児の母親に投与することを含む、方法。
（項目６）
前記投与は予防的である、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記免疫応答は抑制性の抗ＦＶＩＩＩ抗体を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記抗体の濃度は少なくとも０．６ベセスダ単位（ＢＵ）である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記抗体の濃度は少なくとも５ベセスダ単位（ＢＵ）である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記免疫応答は細胞媒介性の免疫応答を含む、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞媒介性の免疫応答は、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、およびＴＮＦ−αからなる群より選ばれるサイトカインの放出を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記免疫応答は、出血傾向の増加、高ＦＶＩＩＩ消費、ＦＶＩＩＩ療法への無反応、ＦＶＩＩＩ療法の効力低下、およびＦＶＩＩＩ半減期の減少からなる群より選ばれる臨床症状を含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記対象はＦＶＩＩＩ遺伝子における突然変異または欠失を有する、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記対象はＦＶＩＩＩ遺伝子における再構成を有する、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記対象は重度の血友病を有する、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記対象は、以前に阻害性のFVIII免疫応答を発症したことがある親族を有する、請求
項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記対象はインターフェロン療法を受けている、項目１〜１６のいずれか一項に記載
の方法。
（項目１８）
前記対象は抗ウイルス療法を受けている、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。（項目１９）
前記対象はＴＮＦ−αの増加に関連する遺伝子多型を有する、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記多型はＴＮＦ−３０８Ｇ＞Ａである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記対象はＩＬ１０の増加に関連する遺伝子多型を有する、項目１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記多型はＩＬ１０Ｇマイクロサテライトの対立遺伝子１３４である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記対象は１５０日未満のＦＶＩＩＩ曝露日数（ＥＤ）を有したことがある、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記対象は５０日未満のＥＤを有したことがある、項目２３に一項に記載の方法。
（項目２５）
前記対象は２０日未満のＥＤを有したことがある、項目２４に一項に記載の方法。
（項目２６）
前記対象は、ＦＶＩＩＩ以外の治療用タンパク質に対する阻害性免疫応答を発症したことがある、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記阻害性のFVIII免疫応答は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ
（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥＦＳ（登録商標
）、ＸＹＮＴＨＡ／ＲＥＦＡＣＴＯ ＡＢ（登録商標）、ＨＥＭＯＦＩＬ−Ｍ（登録商標
）、ＭＯＮＡＲＣ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＯＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＡＴＥ−ＤＶＩ（登録商標）、およびＨＹＡＴＥ：Ｃ（登録商標）からなる群より選ばれるＦＶＩＩＩ製剤に応答して発症した、項目３に記載の方法。
（項目２８）
前記阻害性のFVIII免疫応答は、組換えＦＶＩＩＩ製剤に応答して発症する、項目３
に記載の方法。
（項目２９）
前記投与は、前記対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の数を、投与前の数と比べて減少させる、項目１〜４または６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記投与は、前記対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価を、投与前の力価と比べて減少させる、項目１〜４または６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記投与は、前記対象におけるサイトカインのレベルを、投与前のレベルと比べて減少させる、項目１〜４または６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記投与は、前記対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の数を、以前にＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドで治療した後の該対象における数と比べて減少させる、項目１〜４または６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記投与は、前記対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価を、以前にＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドで治療した後の該対象における力価と比べて減少させる、項目１〜４または６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記投与は、前記対象におけるサイトカインのレベルを、以前にＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドで治療した後の該対象におけるレベルと比べて減少させる、項目１〜４または６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記投与は、前記対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の数を、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドを該対象に投与する結果として生じることになるであろう数と比べて減少させる、項目２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記投与は、前記対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価を、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドを該対象に投与する結果として生じることになるであろう力価と比べて減少させる、項目２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記投与は、前記対象におけるサイトカインのレベルを、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドを該対象に投与する結果として生じることになるであろうサイトカインのレベルと比べて減少させる、項目２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、およびＴＮＦ−αからなる群より選ばれる、項目３１、３４、または３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ＦＶＩＩＩ部分はＦＶＩＩＩＡ３ドメインを含む、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記ＦＶＩＩＩ部分はヒトＦＶＩＩＩを含む、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記ＦＶＩＩＩ部分はＢドメインの完全欠失または部分欠失を有する、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、表２に示されるシグナル配列を含まないＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７；配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、表２に示されるシグナル配列を含まないＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７または配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と同一である、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、表２に示されるシグナル配列を含むＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、表２に示されるシグナル配列を含むＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と同一である、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記ＦＶＩＩＩ部分は凝固活性を有する、項目１〜４５のいずれか一項に記載の方法。（項目４７）
前記Ｆｃ部分は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と同一である、項目１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記キメラポリペプチドは、前記キメラポリペプチドと会合する第２ポリペプチドを含むハイブリッドの形態であり、該第２ポリペプチドは本質的にＦｃからなる、項目１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記キメラポリペプチドは１０〜１００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される、項目１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記用量は１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００ＩＵ／ｋｇである、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記用量は１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ＩＵ／ｋｇである、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
前記対象は、出血凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉内出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内の出血、腹膜後隙内の出血、および腸腰筋鞘内の出血からなる群より選ばれる出血状態を有する、項目１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記出血凝固障害は血友病Ａである、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記ＦＶＩＩＩポリペプチドは全長ＦＶＩＩＩである、項目３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記ＦＶＩＩＩポリペプチドはＢドメインの完全欠失または部分欠失を含む、項目３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記投与はＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘導する、項目１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
凝固因子に対する阻害性免疫応答を発症する危険性のある対象に凝固因子を投与する方法であって、凝固因子部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを該対象に投与することを含む、方法。
（項目５８）
対象において凝固因子に対する免疫応答を誘発する方法であって、該対象は胎児であり、該方法は、凝固因子部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを含むポリペプチドを該胎児の母親に投与することを含む、方法。
（項目５９）
前記凝固因子は、ＦＶＩＩ酵素前駆体、活性化ＦＶＩＩ、活性化可能ＦＶＩＩ、またはＦＩＸである、項目５７または５８に記載の方法。
（項目６０）
前記投与は、特発性出血の発生率を低下させるか、または出血を防止する、項目１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
ＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を、該免疫寛容を必要とする対象において誘発する方法であって、ＦＶＩＩＩ部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを該対象に投与することを含む、方法。
（項目６２）
前記対象は、阻害性のFVIII免疫応答を発症する危険性がある、項目６１に記載の方
法。
（項目６３）
前記対象は、抑制性の第ＶＩＩＩ因子免疫応答を発症したことがある、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
ＦＶＩＩＩに対する阻害物質の発生を防止または抑制する方法であって、免疫寛容を必要とする対象に、ＦＶＩＩＩ部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを投与することを含む、方法。
（項目６５）
凝固因子に対する免疫寛容を、該免疫寛容を必要とする対象において誘発する方法であって、凝固因子部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを該対象に投与することを含む、方法。
（項目６６）
前記対象は、抑制性の凝固因子免疫応答を発症する危険性がある、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記対象は、抑制性の凝固因子免疫応答を発症したことがある、項目６５に記載の方法。
（項目６８）
前記凝固因子部分は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、またはフォンウィルブランド因子を含む、項目６５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
凝固因子に対する阻害物質の発生を防止または抑制する方法であって、該防止または抑制を必要とする対象に、凝固因子部分とＦｃ部分とを含むキメラポリペプチドを投与することを含む、方法。
（項目７０）
前記凝固因子部分は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、またはフォンウィルブランド因子である、項目６9に記載の方法。
（項目７１）
前記対象はヒトであり、前記ＦＶＩＩＩの投与方法は、該対象における出血状態を治療するための方法である、項目１〜４、６〜５７、および５９〜７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記出血状態は血液凝固障害により引き起こされる、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記血液凝固障害は血友病またはフォンウィルブランド病である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記血液凝固障害は血友病Ａである、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
前記対象は、予防治療またはオンデマンド治療を必要とする状態（例えば出血の発症）を有する、項目１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
前記対象は、出血性障害に罹患しているか、または前記治療が必要になると予想される患者である、項目１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
（ａ）凝固因子部分と、Ｆｃ部分もしくはＦｃＲｎ結合パートナー部分とを含むキメラポリペプチド、および薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物と、
（ｂ）前記凝固因子に対する免疫寛容を必要とする対象に前記組成物を投与するための指示と、を含む、
キット。
（項目７８）
前記キメラポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ部分、ＦＶＩＩ部分、またはＦＩＸ部分を含む、方法７７に記載のキット。
（項目７９）
前記キメラポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ単量体二量体ハイブリッド、ＦＶＩＩ単量体二量体ハイブリッド、またはＦＩＸ単量体二量体ハイブリッドである、項目７８に記載のキット。
（項目８０）
前記指示は、前記凝固因子に対する免疫寛容を必要とする対象を特定するための少なくとも１つのステップをさらに含む、項目７７〜７９のいずれか一項に記載のキット。
（項目８１）
免疫寛容を必要とする対象を特定するための前記ステップは、以下からなる群のうちの１つ以上を含む、項目８０に記載のキット：
（ａ）前記凝固因子の遺伝子における突然変異または欠失を有する対象を特定すること、
（ｂ）前記凝固因子の遺伝子における再構成を有する対象を特定すること、
（ｃ）以前に前記凝固因子に対する阻害性免疫応答が発症したことのある親族を有する対象を特定すること、
（ｄ）インターフェロン療法を受けている対象を特定すること、
（ｅ）抗ウイルス療法を受けている対象を特定すること、
（ｆ）前記凝固因子をコードする前記遺伝子以外で、阻害性免疫応答を発症する危険性の上昇に関連する遺伝子における遺伝子突然変異を有する対象を特定すること、および
（ｇ）これらの２つ以上の組み合わせ。
（項目８２）
前記凝固因子をコードする前記遺伝子以外の遺伝子における前記遺伝子突然変異は、以下からなる群より選ばれる１つ以上の突然変異を含む、項目８１に記載のキット：
（ａ）ＴＮＦ−αの増加に関連する遺伝子多型、
（ｂ）ＩＬ１０の増加に関連する遺伝子多型、
（ｃ）ＣＴＬＡ−４の減少に関連する遺伝子多型、
（ｄ）ＤＲ１５またはＤＱＢ０６０２ＭＨＣクラスＩＩ分子における突然変異、および
（ｅ）これらの２つ以上の組み合わせ。
（項目８３）
前記投与の後に、阻害性免疫応答のレベルを測定することをさらに含む、項目１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
前記投与の後の前記阻害性免疫応答レベルを、前記投与の前の前記阻害性免疫応答レベルとさらに比較する、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記阻害性免疫応答は、ＦＶＩＩＩに対する抗体の発生である、項目８４または８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記阻害性免疫応答はサイトカインの分泌である、項目８３または８４のいずれか一項に記載の方法。
ｒＦＶＩＩＩＦｃ単量体を表す概略図である。 図２Ａ、２Ｂは、ｒＦＶＩＩＩＦｃの非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す（プロセシング済みまたは単鎖）図である。図２Ｃは、ＬＣ／ＵＶおよびＬＣ／ＭＳで分析したｒＦＶＩＩＩＦｃ構造を示す図である。 ｒＦＶＩＩＩ−Ｆｃの生化学的特性解析を示す図である。図３Ａは、第Ｘ因子（ＦＸ）の活性化をリン脂質小胞濃度の関数として示す。図３Ｂは、ＦＸの活性化をＦＸ濃度の関数として示す。図３Ｃは、ＦＸの活性化を活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）濃度の関数として示す。 活性化プロテインＣによる切断の後のＦＸの活性化を示す図である。 観察された群平均ＦＶＩＩＩ活性（±標準誤差）対時間のプロファイルを示す図である。プロファイル群は用量で分類され、化合物対時間でグループ化されている。図５Ａは、用量２５ＩＵ／ｋｇを用いた一段法アッセイに対応する。図５Ｂは、用量６５ＩＵ／ｋｇを用いた一段法アッセイに対応する。図５Ｃは、用量２５ＩＵ／ｋｇを用いた発色アッセイに対応する。図５Ｄは、用量６５ＩＵ／ｋｇを用いた発色アッセイに対応する。 観察された群平均ＦＶＩＩＩ活性（±標準誤差）対時間のプロファイルを、用量レベルと化合物対時間でグループ化して表示した図である。図６Ａは、一段法アッセイに対応する。図６Ｂは、発色アッセイに対応する。 血友病Ａ（ＨｅｍＡ）マウス尾静脈離断モデルにおける、単鎖ＦＶＩＩＩＦｃ（ＳＣｒＦＶＩＩＩＦｃ）のインビボの効力を示す図である。図７Ａは、ＦＶＩＩＩ用量と保護の間の関係を示す。単鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃの用量を四角、プロセシング済みｒＦＶＩＩＩＦｃの用量を丸で表示している。図７Ｂは、４．６μｇ／ｋｇ、１．３８μｇ／ｋｇ、０．４６μｇ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃまたはＳＣｒＦＶＩＩＩＦｃを投与した後の、尾静脈離断後の生存率（％）を示す。図７Ｃは、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＳＣｒＦＶＩＩＩＦｃをそれぞれ４．６μｇ／ｋｇ（黒丸、逆三角形）、１．３８μｇ／ｋｇ（三角形、菱形）、０．４６μｇ／ｋｇ（四角、グレーの丸）の用量で投与した後の、尾静脈離断後の非出血個体の割合（％）を示す。 第１／２ａ相試験の試験デザインを示す図である。この試験デザインは、２５ＩＵ／ｋｇ（低用量コホートＡ）、６５ＩＵ／ｋｇ（高用量コホートＢ）のどちらかを単回静脈内投与した後のｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性およびＰＫをＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較することを目的とした、用量増加逐次デザインである。 一段法によるｒＦＶＩＩＩ活性（ａＰＴＴ）と発色アッセイの相関を示す図である。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）（◆）とｒＦＶＩＩＩＦｃ（□）を注射した後の、ＦＶＩＩＩ活性（ＩＵ／ｍＬ）の測定結果を示す。 低用量コホートと高用量コホートの、群平均血漿ＦＶＩＩＩ活性薬物動態プロファイルを示す図である。ｒＦＶＩＩＩＦｃまたはＡｄｖａｔｅ（登録商標）を単回静脈内投与した後の血漿ＦＶＩＩＩ活性（一段法ａＰＴＴアッセイ）対時間曲線を、２５ＩＵ／ｋｇ（低用量コホート、ｎ＝６）（図１０Ａ）、６５ＩＵ／ｋｇ（高用量コホート、ｎ＝１０［Ａｄｖａｔｅ（登録商標）］；ｎ＝９［ｒＦＶＩＩＩＦｃ］）（図１０Ｂ）のそれぞれについて示す。表示されている結果は、群平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。 Ａｄｖａｔｅ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの注射後のＦＶＩＩＩ活性のＣｌおよびｔ１／２に対するＶＷＦ抗原レベルの影響を示す図である。ＶＷＦ抗原レベルと、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）（Ｒ２＝０．５４１５、ｐ＝０．００１２）およびｒＦＶＩＩＩＦｃ（Ｒ２＝０．５４９２、ｐ＝０．００１６）の体重により調節されたＣｌとの相関関係（図１１Ａ）、ならびにＶＷＦ抗原レベルと、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）（Ｒ２＝０．７９２３、ｐ＜０．０００１）およびｒＦＶＩＩＩＦｃ（Ｒ２＝０．６４０３、ｐ＝０．０００３）のｔ１／２との相関関係（図１１Ｂ）を示す。各ドットは個々の対象を表す。 Ａｄｖａｔｅ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃを注射した後のエキソビボの全血ＲＯＴＥＭ（登録商標）結果を、個々の対象について示した図である。２５ＩＵ／ｋｇ用量のＡｄｖａｔｅ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃ（図１２Ａ）、６５ＩＵ／ｋｇ用量のＡｄｖａｔｅ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃ（図１２Ｂ）で処置する前と後に、対象から血液サンプルを採取した。凝固時間の測定は、Ｃａ＋＋で開始したＮＡＴＥＭによりＲＯＴＥＭ（登録商標）測定器で行った。表示されている結果は、各個別サンプルに対する３回のチャンネル読み取り値からの平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。 トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）におけるｒＦＶＩＩＩＦｃとＳＣｒＦＶＩＩＩＦｃの活性を比較する図である。図１３Ａは、内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ）を、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＳＣｒＦＶＩＩＩＦｃ、完全プロセシング済みｒＦＶＩＩＩＦｃ、およびＷＨＯ標準ＦＶＩＩＩ間で比較したものである。図１３Ｂは、ピークトロンビンを、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＳＣｒＦＶＩＩＩＦｃ、完全プロセシング済みｒＦＶＩＩＩＦｃ、およびＷＨＯ標準ＦＶＩＩＩ間で比較したものである。 ｒＦＶＩＩＩＦｃ単量体を表す概略図である。ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ヒトＢドメイン欠損ＦＶＩＩＩと、ヒトＩｇＧ１由来Ｆｃとの組換え融合であり、介在リンカー配列を持たない。 ＨｅｍＡマウス（図１５Ａ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（図１５Ｂ）、ＦｃＲｎＫＯマウス（図１５Ｃ）、およびヒトＦｃＲｎトランスジェニックＴｇ３２Ｂマウス（図１５Ｄ）において、１２５ＩＵ／ｋｇを尾静脈注射した後のｒＦＶＩＩＩＦｃとｒＦＶＩＩＩを比較した薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示す図である。表示されている結果は、各時点の処置１回あたりマウス４匹から得た平均±標準偏差である。ＰＫパラメータの概算値一覧を表１２に示す。 ＨｅｍＡマウス尾切断出血モデルにおける、ｒＦＶＩＩＩＦｃとｒＦＶＩＩＩの急性活性を比較した図である。雄性ＨｅｍＡマウスに２４ＩＵ／ｋｇ、７２ＩＵ／ｋｇ、または２１６ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩを尾静脈注射し、投与から５分後に１０ｍｍの尾切断を行った。表示されている結果は、尾切断後３０分間に渡る、各処置群２０匹のマウスからの個別の中央値失血量である。ビヒクル対他の全処置群はＰ＜０．０５、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス対７２ＩＵ／ｋｇもしくは２１６ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、または２１６ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩで処置したＨｅｍＡマウスはＰ＞０．０５であった。 尾静脈離断（ＴＶＴ）出血モデルにおける、ｒＦＶＩＩＩＦｃとｒＦＶＩＩＩの予防効果の比較を示す図である。ビヒクル、ｒＦＶＩＩＩ、もしくはｒＦＶＩＩＩＦｃの処置から２４時間後、またはｒＦＶＩＩＩＦｃ処置から４８時間後に、雄性ＨｅｍＡマウスをＴＶＴで負傷させた。図１７Ａは、ＴＶＴ後の生存率を示す。ＴＶＴの２４時間前に１２ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩを与えられた動物から得た生存曲線は、ログランク検定によりＰ＜０．００１であった。図１７Ｂは、ＴＶＴ後２４時間以内の再出血を示す。ＴＶＴの２４時間前に１２ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩを与えられた動物から得た非再出血曲線は、ログランク検定によりＰ＝０．００２であった。 血友病Ａのイヌにおける、ｒＦＶＩＩＩＦｃとｒＦＶＩＩＩの全血凝固時間（ＷＢＣＴ）を示す図である。イヌの正常ＷＢＣＴ範囲を大破線で示す。小破線（２０分）より上の領域は、血漿ＦＶＩＩＩ活性が正常の１％未満になると予想される時点を表す。図１８Ａは、ｒＦＶＩＩＩＦ投与後のＷＢＣＴを示す。図１８Ｂは、クロスオーバー試験においてｒＦＶＩＩＩ投与に続きｒＦＶＩＩＩＦｃを投与した後のＷＢＣＴを示す。 血友病Ａのイヌにおいて、静脈内投与後の薬物動態（ＰＫ）データをｒＦＶＩＩＩＦｃとｒＦＶＩＩＩで比較した図である。図１９Ａは、ＥＬＩＳＡで測定した血漿中抗原濃度を示す。図１９Ｂは、発色アッセイで測定した血漿中ＦＶＩＩＩ活性を示す。ｒＦＶＩＩＩＦｃはＮ＝４、ｒＦＶＩＩＩはＮ＝２である。 ＨｅｍＡマウスのＦＶＩＩＩ免疫原性を評価するための試験デザインを示す図である。０日目、７日目、１４日目、２１日目、および３５日目に、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、キメラヒトＦＶＩＩＩ−マウスＦｃ、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、全長ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））、およびビヒクル対照の静脈内（ｉ．ｖ．）投与を行った。１４日目、２１日目、２８日目、３５日目、および４２日目に血液サンプルを収集した。 図２０の試験デザインに従ってＨｅｍＡマウスで実施した免疫原性実験における、抗ＦＶＩＩＩトータル抗体個数を示す図である。図２１Ａは、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、キメラヒトＦＶＩＩＩ−マウスＦｃ、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、または全長ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））を繰り返し静脈内投与した後の、トータル抗ＦＶＩＩＩ抗体測定値に対応する。図２１Ｂは、１００ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、キメラヒトＦＶＩＩＩ−マウスＦｃ、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、または全長ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））を繰り返し静脈内投与した後の、トータル抗ＦＶＩＩＩ抗体測定値に対応する。図２１Ｃは、２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、キメラヒトＦＶＩＩＩ−マウスＦｃ、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、または全長ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））を繰り返し静脈内投与した後の、トータル抗ＦＶＩＩＩ抗体測定値に対応する。 用量５０ＩＵ／ｋｇ、１００ＩＵ／ｋｇ、および２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、キメラヒトＦＶＩＩＩ−マウスＦｃ、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、全長ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））を投与した後の、様々な時点の抗ＦＶＩＩＩ抗体測定値を示す図である。図２２Ａは、１４日目に収集したサンプルに対応するデータを示す。図２２Ｂは、２１日目に収集したサンプルに対応するデータを示す。図２２Ｃは、２８日目に収集したサンプルに対応するデータを示す。図２２Ｄは、４２日目に収集したサンプルに対応するデータを示す。 ＦＶＩＩＩに対するトータル抗体と中和抗体の間の相関関係を示す図である。 用量５０ＩＵ／ｋｇ、２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ（ヒトＦｃを有するｒＦＶＩＩＩ）で処置した後の抗ｈＦｃ抗体の発生を示す図である。 市販のＦＶＩＩＩと比較してｒＦＶＩＩＩＦｃに対する脾臓リンパ細胞応答を測定する試験において、ＨｅｍＡマウスから脾細胞を分離して分析する実験手順を示す図である。 ＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）を用いて細胞内サイトカイン染色を行う手順を示す図である。この手順は５色を使用する。１色はＣＤ４リンパ球マーカー用、他の４色はＩＬ２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−αの各サイトカイン用である。 代表的なＦＡＣＳドットプロット図である。図２７Ａは、アイソタイプ対照の細胞内サイトカイン染色に対応する。図２７は、ＣＤ４マーカーとＴＮＦ−αマーカーを含有する二重陽性細胞の細胞内サイトカイン染色に対応する。 ＣＤ４およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）に対する、対照（ビヒクル）を超える細胞内サイトカイン染色を示す図である。全ＦＶＩＩＩ処置群およびビヒクルから得たＦＡＣＳドットプロットから、二重陽性細胞の割合（％）を決定した。ビヒクル処置群と比較することにより、ＦＶＩＩＩで処置したマウスの二重陽性細胞の割合（％）を得た。表示されているサンプルは、ヒトＦｃ（ｈＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、マウスＦｃ（ｍＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（Ｘｙｎ）、およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（Ａｄｖ）に対応する。５０ＩＵ／ｋｇと２５０ＩＵ／ｋｇの用量でＦＶＩＩＩ処置を施した。 ＣＤ４およびＴＮＦ−αに対する、対照（ビヒクル）を超える細胞内サイトカイン染色を示す図である。全ＦＶＩＩＩ処置群およびビヒクルから得たＦＡＣＳドットプロットから、二重陽性細胞の割合（％）を決定した。ビヒクル処置群と比較することにより、ＦＶＩＩＩで処置したマウスの二重陽性細胞の割合（％）を得た。表示されているサンプルは、ヒトＦｃ（ｈＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、マウスＦｃ（ｍＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（Ｘｙｎ）、およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（Ａｄｖ）に対応する。５０ＩＵ／ｋｇと２５０ＩＵ／ｋｇの用量でＦＶＩＩＩ処置を施した。 ＣＤ４およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）に対する、対照（ビヒクル）を超える細胞内サイトカイン染色を示す図である。全ＦＶＩＩＩ処置群およびビヒクルから得たＦＡＣＳドットプロットから、二重陽性細胞の割合（％）を決定した。ビヒクル処置群と比較することにより、ＦＶＩＩＩで処置したマウスの二重陽性細胞の割合（％）を得た。表示されているサンプルは、ヒトＦｃ（ｈＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、マウスＦｃ（ｍＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（Ｘｙｎ）、およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（Ａｄｖ）に対応する。５０ＩＵ／ｋｇと２５０ＩＵ／ｋｇの用量でＦＶＩＩＩ処置を施した。 ＣＤ４およびインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に対する、対照（ビヒクル）を超える細胞内サイトカイン染色を示す図である。全ＦＶＩＩＩ処置群およびビヒクルから得たＦＡＣＳドットプロットから、二重陽性細胞の割合（％）を決定した。ビヒクル処置群と比較することにより、ＦＶＩＩＩで処置したマウスの二重陽性細胞の割合（％）を得た。表示されているサンプルは、ヒトＦｃ（ｈＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、マウスＦｃ（ｍＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（Ｘｙｎ）、およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（Ａｄｖ）に対応する。５０ＩＵ／ｋｇと２５０ ＩＵ／ｋｇの用量でＦＶＩＩＩ処置を施した。 ＣＤ４および樹状細胞マーカーＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４）に対する、対照（ビヒクル）を超える細胞内サイトカイン染色を示す図である。全ＦＶＩＩＩ処置群およびビヒクルから得たＦＡＣＳドットプロットから、二重陽性細胞の割合（％）を決定した。ビヒクル処置群と比較することにより、ＦＶＩＩＩで処置したマウスの二重陽性細胞の割合（％）を得た。表示されているサンプルは、ヒトＦｃ（ｈＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、マウスＦｃ（ｍＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（Ｘｙｎ）、およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（Ａｄｖ）に対応する。５０ＩＵ／ｋｇと２５０ＩＵ／ｋｇの用量でＦＶＩＩＩ処置を施した。 ＣＤ４および樹状細胞マーカーＣＤ８０に対する、対照（ビヒクル）を超える細胞内サイトカイン染色を示す図である。全ＦＶＩＩＩ処置群およびビヒクルから得たＦＡＣＳドットプロットから、二重陽性細胞の割合（％）を決定した。ビヒクル処置群と比較することにより、ＦＶＩＩＩで処置したマウスの二重陽性細胞の割合（％）を得た。表示されているサンプルは、ヒトＦｃ（ｈＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、マウスＦｃ（ｍＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（Ｘｙｎ）、およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（Ａｄｖ）に対応する。５０ＩＵ／ｋｇと２５０ ＩＵ／ｋｇの用量でＦＶＩＩＩ処置を施した。 ＣＤ４およびＴｒｅｇマーカーＦｏｘｐ３に対する、対照（ビヒクル）を超える細胞内サイトカイン染色を示す図である。全ＦＶＩＩＩ処置群およびビヒクルから得たＦＡＣＳドットプロットから、二重陽性細胞の割合（％）を決定した。ビヒクル処置群と比較することにより、ＦＶＩＩＩで処置したマウスの二重陽性細胞の割合（％）を得た。表示されているサンプルは、ヒトＦｃ（ｈＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、マウスＦｃ（ｍＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（Ｘｙｎ）、およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（Ａｄｖ）に対応する。５０ＩＵ／ｋｇと２５０ＩＵ／ｋｇの用量でＦＶＩＩＩ処置を施した。 ＣＤ４およびＴｈ阻害分子Ｔｉｍ３に対する、対照（ビヒクル）を超える細胞内サイトカイン染色を示す図である。全ＦＶＩＩＩ処置群およびビヒクルから得たＦＡＣＳドットプロットから、二重陽性細胞の割合（％）を決定した。ビヒクル処置群と比較することにより、ＦＶＩＩＩで処置したマウスの二重陽性細胞の割合（％）を得た。表示されているサンプルは、ヒトＦｃ（ｈＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、マウスＦｃ（ｍＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（Ｘｙｎ）、およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（Ａｄｖ）に対応する。５０ＩＵ／ｋｇと２５０ＩＵ／ｋｇの用量でＦＶＩＩＩ処置を施した。 ＣＤ４およびＴｈ阻害分子ＣＤ２７９（ＰＤ−１）に対する、対照（ビヒクル）を超える細胞内サイトカイン染色を示す図である。全ＦＶＩＩＩ処置群およびビヒクルから得たＦＡＣＳドットプロットから、二重陽性細胞の割合（％）を決定した。ビヒクル処置群と比較することにより、ＦＶＩＩＩで処置したマウスの二重陽性細胞の割合（％）を得た。表示されているサンプルは、ヒトＦｃ（ｈＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、マウスＦｃ（ｍＦｃ）を有するｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（Ｘｙｎ）、およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（Ａｄｖ）に対応する。５０ＩＵ／ｋｇと２５０ＩＵ／ｋｇの用量でＦＶＩＩＩ処置を施した。 実施例１３に提示されている免疫原性試験のデザインを示す図である。０日目、７日目、１４日目、２１日目、３５日目、および５３日目に、ＨｅｍＡマウス群にＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））およびビヒクル対照を投与した。０日目、１４日目、２１日目、２８日目、および４２日目に採血した。５６日目に脾臓を採取した。ＦＶＩＩＩは５０ＩＵ／ｋｇ、１００ＩＵ／ｋｇ、２５０ＩＵ／ｋｇの用量で投与した。 実施例１３のマウス脾細胞の分析およびＴ細胞応答プロファイリングに用いた手法を示す図である。 ４２日目に採取した血液サンプル中の総抗ＦＶＩＩＩ抗体レベルを示す図である。５０ＩＵ／ｋｇ、１００ＩＵ／ｋｇ、２５０ＩＵ／ｋｇの用量でｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、およびｆｌ−ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））を投与した。 様々な用量のＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、ｆｌ−ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））で処置したＨｅｍＡマウス群から取得した脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色を示す図である。どの図もＩＬ−２（左パネル）とＴＮＦ−α（右パネル）の結果を示す。図４Ａは、用量５０ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩＩが注射されたＨｅｍＡマウス群（Ｎ＝４）に対応する。図４Ｂは、用量１００ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩＩが注射されたＨｅｍＡマウス群（Ｎ＝１０）に対応する。図４Ｃは、用量２５０ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩＩが注射されたＨｅｍＡマウス群（Ｎ＝４）に対応する。 用量１００ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、またはｆｌ−ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））で処置したＨｅｍＡマウス群から分離したＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３三重陽性脾細胞の細胞内サイトカイン染色を示す図である。 １００ＩＵ／ｋｇで処置したＨｅｍＡマウス群の免疫寛容関連サイトカインに対するリアルタイムＰＣＲを示す図である。図４２ＡはＴＧＦ−βの結果を示し、図４２Ｂはインターロイキン−１０の結果を示し、図４２ＣはＩＬ−３５のＩＬ−１２ａサブユニットの結果を示し、図４２ＤはＩＬ−３５のＥＢＩ−３サブユニットの結果を示す。図４２ＥはＦｏｘｐ３の結果を示す。図４２ＦはＩＬ２ｒａ／ＣＤ２５の結果を示す。図４２ＧはＣＴＬＡ４の結果を示す。図４２ＨはＩＤＯ−１の結果を示す。 １００ＩＵ／ｋｇで処置したマウス群のＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１経路に関与する細胞のＦＡＣＳ分析を示す図である。脾細胞を染色して表面のＣＤ１１ｃとＰＤ−Ｌ１（図４３Ａ）、あるいはＣＤ４とＰＤ−１（図４３Ｂ）を分析した。グラフの棒は、ビヒクルを超える割合を表す（＊ｐ＜０．０５対ビヒクル、＋ｐ＜０．０５処置間、ｔ検定）。 ＨｅｍＡマウス群におけるｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の免疫原性比較試験のデザインを示す図である。０日目、７日目、１４日目、２１日目、および３５日目に、ＨｅｍＡマウス群に各ＦＶＩＩＩ用量を投与した。０日目、１４日目、２１日目、２８日目、および４２日目に採血した。ＦＶＩＩＩは５０ＩＵ／ｋｇ、１００ＩＵ／ｋｇ、２５０ＩＵ／ｋｇの用量で投与した。 ５０ＩＵ／ｋｇ用量のｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、全長ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））を投与後１４日目、２１日目、２８日目、および４２日目の抗ＦＶＩＩＩ抗体の測定値、ならびに４２日目の抑制抗体のレベルを示す図である。 １００ＩＵ／ｋｇ用量のｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、全長ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））を投与後１４日目、２１日目、２８日目、および４２日目の抗ＦＶＩＩＩ抗体の測定値、ならびに４２日目の抑制抗体のレベルを示す図である。 ２５０ＩＵ／ｋｇ用量のｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、全長ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））を投与後１４日目、２１日目、２８日目、および４２日目の抗ＦＶＩＩＩ抗体の測定値、ならびに４２日目の抑制抗体のレベルを示す図である。 ｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩＦｃを投与した後の、ＦＶＩＩＩ中和抗体力価とトータル結合抗体レベルの相関関係を示す図である。 図４４のＨｅｍＡマウス群におけるｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の免疫原性比較試験の、Ｔ細胞応答プロファイリング要素を示す図である。５３日目に追加のＦＶＩＩＩ用量をＨｅｍＡマウス群に投与し、５６日目に脾臓を採取した。 図５０（右パネル）は、用量１００ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、またはｆｌ−ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））で処置したＨｅｍＡマウス群から分離したＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３三重陽性脾細胞の細胞内サイトカイン染色を示す図である。図５０（左パネル）は、調節性Ｔ細胞の作用機構を示す図である。 ｒＦＶＩＩＩＦｃ免疫寛容化試験のデザインを示す図である。０日目、７日目、日目、２１日目、および３５日目に、５０ＩＵ／ｋｇ用量のｒＦＶＩＩＩＦｃをＨｅｍＡマウス群に投与した。０日目、１４日目、２１日目、２８日目、および４２日目に採血した後、１週間の休息期間を与えた。次いで、４９日目（再投与から０日目）、５６日目（再投与から７日目）、６３日目（再投与から１４日目）、および７０日目（再投与から２１日目）に、２５０ ＩＵ／ｋｇ用量のｒＦＶＩＩＩＦｃを再投与した。再投与中の６３日目（再投与から１４日目）、７０日目（再投与から２１日目）、および７７日目（再投与から２８日目）に採血した。 ２５０ＩＵ／ｋｇ用量のｒＦＶＩＩＩＦｃを再投与してから１４日目、２１日目、および２８日目のトータル抗ＦＶＩＩＩ抗体の測定値を示す図である。ＨｅｍＡマウス群を５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃまたはビヒクル対照で前処置した。この結果は、ＨｅｍＡマウス群においてｒＦＶＩＩＩＦｃが免疫寛容を誘導することを示している。 ＦｃＲｎによるＩｇＧとｒＦＶＩＩＩＦｃのリサイクルを示す図である。 肝洞様毛細血管を囲む細胞型および細胞構造を示す図である。 ＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩＦｃを静脈内注射する前にマクロファージとクッパーをＣＬＯＤＲＯＳＯＭＥ（登録商標）で枯渇させる（対照としてＥＮＣＡＰＳＯＭＥ（登録商標）を投与）クリアランスアッセイのデザインを示す図である。ＨｅｍＡ、ＤＫＯ、ＦｃＲｎ−ＫＯの３つのノックアウトマウスモデルを使用した。指定の時点に血液サンプルを採取した（１時点あたり４サンプル）。 ＨｅｍＡマウス肝切片に対する、マクロファージ特異マーカーの１つであるＩｂａ−１抗体を用いた代表的な染色を示す図である。パネルＡとＡ’は、対照のＥＮＣＡＰＳＯＭＥ（登録商標）で処置したＨｅｍＡマウスを示す。パネルＢとＢ’は、ＣＬＯＤＲＯＳＯＭＥ（登録商標）で処置したＨｅｍＡマウスを示す。パネルＡ’とＢ’は、染色されたクッパー細胞、総組織領域、および空領域を強調表示する定量化マスクを示す。 ＣＬＯＤＲＯＳＯＭＥ（登録商標）またはＥＮＣＡＰＳＯＭＥ（登録商標）で処置した後の、標識Ｆ４／８０抗体で陽性染色された領域の免疫組織化学（ＩＨＣ）定量分析と、同じ標識Ｆ４／８０抗体で染色された血液細胞内の循環単球細胞を特定する蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。 ＥＮＣＡＰＳＯＭＥ（登録商標）またはＣＬＯＤＲＯＳＯＭＥ（登録商標）で処置したＨｅｍＡマウス群の肝臓、脾臓、および肺において、マクロファージマーカー上皮増殖因子モジュール含有ムチン様受容体１（Ｅｍｒ１）（Ｆ４／８０）の発現をＲＴ−ＰＣＲで分析した結果を示す図である。 対照ＨｅｍＡマウス群およびマクロファージ／クッパー細胞枯渇ＨｅｍＡマウス群における、ｒＦＶＩＩＩとｒＦＶＩＩＩＦｃのクリアランスを示す図である。 対照ＤＫＯマウス群（ＦＶＩＩＩとＶＷＦが欠乏しているマウス群）およびマクロファージ／クッパー細胞枯渇ＤＫＯマウス群における、ｒＦＶＩＩＩとｒＦＶＩＩＩＦｃのクリアランスを示す図である。 対照ＦｃＲｎ−ＫＯマウス群（ＦｃＲｎリサイクリング受容体が欠乏しているマウス群）およびマクロファージ／クッパー細胞枯渇ＦｃＲｎ−ＫＯマウス群における、ｒＦＶＩＩＩとｒＦＶＩＩＩＦｃのクリアランスを示す図である。 表示されているＦＶＩＩＩ原体または対照（未処置）で妊娠１６日目に免疫された母親から産まれたマウス群のベセスダ力価を示す図である。パネルＡは実験デザインを示し、処置時期、妊娠中のマウスに投与するｒＦＶＩＩＩＦｃまたはＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）の用量、これらのマウスから産まれる子を表示している。パネルＢ、Ｃは、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置マウス、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）処置マウス、対照（未処置）マウスから産まれた子から取得したｒＦＶＩＩＩＦｃのベセスダ力価を、処置コホート別にグループ化（パネルＢ）、または個別母親別にグループ化（パネルＣ）して表示している。 表示されているＦＶＩＩＩ原体または対照（未処置）で妊娠１５〜１７日目に免疫された母親から産まれたマウス群のベセスダ力価を示す図である。パネルＡは実験デザインを示し、処置時期、妊娠中のマウスに投与するｒＦＶＩＩＩＦｃまたはＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）の用量、これらのマウスから産まれる子を表示している。パネルＢ、Ｃは、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置マウス、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）処置マウス、対照（未処置）マウスから産まれた子から取得したｒＦＶＩＩＩＦｃのベセスダ力価を、処置コホート別にグループ化（パネルＢ）、または個別母親別にグループ化（パネルＣ）して表示している。 図６４Ａと６４Ｂは、それぞれＣＤ８０とＣＤ２７４の樹状細胞表面発現を示したものである。１００ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、Ｂドメイン欠損ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ；ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、全長ＦＶＩＩＩ（ｆｌ−ＦＶＩＩＩ；ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））で処置したマウス群から取得した脾細胞を染色することにより、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣクラスＩＩと共にこれらの２つの抗原の発現を測定した。表示されている結果は、脾細胞数の割合（％）±標準誤差である（ｎ＝７〜９、＊ｐ＜０．０５対ビヒクル、†ｐ＜０．０５対ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｔ検定）。図６４Ｃと６４Ｄは、それぞれＣＤ２７４とＩＤＯ１のｍＲＮＡ発現レベルを示す。ＧＡＰＤＨレベルに正規化された脾細胞からのリアルタイムＰＣＲにより測定した。グラフの棒は、相対的発現レベル（２−ΔＣｔ）±標準誤差を表す（ｎ＝４〜９、＊ｐ＜０．０５対ビヒクル、†ｐ＜０．０５対ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｔ検定）。 ３つの試験グループ（すなわち、ビヒクル、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃで処置したＨｅｍＡマウス群の脾細胞）間のリアルタイムＰＣＲアレイにおいて全遺伝子の発現プロファイルを表すヒートマップである。耐性に焦点を置く遺伝子とアネルギー関連分子からなるリアルタイムＰＣＲアレイを使用することにより、各サンプルから得たｃＤＮＡを用いて個々の遺伝子の発現をモニターした。 ５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃで処置したＨｅｍＡマウス群の脾細胞により上方調節または下方調節されていると特定された候補遺伝子の発現プロファイル、および２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃで処置した群との比較を示す図である。結果は、ビヒクル群を超えた遺伝子発現の変化を示す。調節の倍率変化のカットオフは２とした。すなわち、２を超える倍率変化を上方調節とみなし、０．５を下回る倍率変化は下方調節とみなした。ここに示す５０ＩＵ／ｋｇ群に属する候補遺伝子はすべて、有意に調節されていた（ｐ＜０．０５対ビヒクルおよび２５０ＩＵ／ｋｇ群、ｎ＝８〜１１）。 ５０ＩＵ／ｋｇまたは２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを２週間おきに注射したＨｅｍＡマウスのＴ細胞増殖プロファイル比較を示す図である。グラフの棒は、２５０ＩＵ／ｋｇ群と５０ＩＵ／ｋｇ群から得たＴ細胞の、対照と比較した場合のＣＦＳＥのＭＦＩの減少±標準誤差（＊ｐ＜０．０５、ｔ検定、ｎ＝３〜５）を表す。 ２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ（図６８Ａ）、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ（図６８Ｂ）、２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ−Ｎ２９７Ａ（図６８Ｃ）、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ−Ｎ２９７Ａ（図６８Ｄ）のいずれかを２週間おきに注射したＨｅｍＡマウス群から得たＴ細胞のＩＦＮγ分泌プロファイルを示す図である。グラフの棒は、ＩＦＮγ分泌の対ビヒクル倍率±標準誤差を表す（＊ｐ＜０．０５、ｔ検定、ｎ＝３〜５）。
本開示は、既知のＦＶＩＩＩ製品により可能であるものよりも長い投与間隔および／またはより大きなＡＵＣを用いる第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（加工処理されたもの、単鎖、またはその組み合わせ）により、血友病Ａを治療する方法を提供する。また、本開示は、ＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘導する方法を提供する。また、本開示は、改良されたＦＶＩＩＩキメラポリペプチドおよび産生方法を提供する。
また、本明細書に開示される、免疫寛容を誘導する方法および改良されたキメラポリペプチドの産生方法は、一般的に、１つまたはそれ以上の凝固因子、例えば、ＦＶＩＩおよびＦＩＸに適用可能である。従って、ＦＶＩＩＩキメラポリペプチド（例えば、ＦＶＩＩＩＦｃ）およびこれらの使用に関する本開示は、同様に、凝固因子部分およびＦｃ部分を含む他のキメラポリペプチドに適用可能である。いくつかの特定の実施例では、キメラポリペプチドの凝固因子部分は、ＦＶＩＩまたはＦＩＸである。この点で、本開示は、概して、凝固因子部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチドを対象に投与することを含む、それを必要とする対象において凝固因子に対する免疫寛容を誘導する方法を提供する。また、キメラポリペプチドの凝固因子に対する免疫寛容を必要とする対象に投与することを含み、キメラポリペプチドは凝固因子部分およびＦｃ部分を含む、凝固因子に対する阻害物質の発生の防止または阻害する方法も提供される。
血友病Ａの治療は、特発性出血を防止するために、１〜５％の正常レベルにＦＶＩＩＩ活性の回復を目的とする補充療法によるものである（その全体において参照により本明細書に組み込まれる、Mannucci, P.M. et al., N. Engl. J. Med. 344:1773-9 (2001)）。
出血の発症をオンデマンドで治療すること、または、予防的な治療により出血の発症が生じるのを防止するために用いることができる、血漿由来および組換えＦＶＩＩＩ製品がある。これらの製品の短い半減期に基づいて（８〜１２時間）（WhiteG.C., et al., Thromb. Haemost. 77:660-7 (1997); Morfini, M.,Haemophilia 9(suppl 1):94-99; discussion 100 (2003)）、治療レジメンは、通常、予防のために週に２〜３回、および、オンデマンドでの治療に関して１日に１〜３回の頻繁な静脈内投与を必要とし（Manco-Johnson,
M.J., et al., N. Engl. J. Med. 357:535-544 (2007)）、それぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる。このような頻繁な投与は、苦痛を伴うものであり、不便である。現在入手可能なＦＶＩＩＩ製品に関する他の主要な課題は、ＦＶＩＩＩ治療を受けている患者における、中和する抗ＦＶＩＩＩ抗体の発生である。阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答は、抗第ＶＩＩＩ因子抗体および／または細胞媒介性の免疫応答を含み得る。
本開示は、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発生するリスクがある、それを必要とするヒト対象（例えば、ヒト患者）に、ＦＶＩＩＩを投与する方法を提供する。本方法は、ＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチドの投与を含む。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの投与は、投与前の数と比較して、対象における、ＦＶＩＩＩに対する抗体の数を減少させる。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を有する対象に投与され、投与は、阻害性免疫応答を減少させ得る。阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答は、阻害性抗体免疫応答および／または細胞媒介性の免疫応答であり得る。本方法に係る、本明細書で提供されるキメラポリペプチドの投与は、阻害性免疫応答を減少または中和させ得る。このように、いくつかの実施形態では、抗ＦＶＩＩＩ抗体は、ＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチドの投与後に、対象において減少または除去される。減少は、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の減少であり得る。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの投与は、投与前の力価と比較して、対象における、ＦＶＩＩＩに対する抗体の力価を減少させる。いくつかの実施形態では、抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価は、ＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチド投与後の対象において減少する。従って、ＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチドの投与は、ベセスダ単位（ＢＵ）で２０未満、１０未満、５未満、４未満、３未満、２未満、１未満、または０．６未満に阻害物質を減少させ得る。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの投与は、投与前のレベルと比較して、対象における、サイトカインのレベルを減少させる。いくつかの実施形態では、サイトカインのレベルは、ＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチドの投与後の対象において減少する。サイトカインは、例えば、Ｉｌ−１２、ＩＬ−４、および／またはＴＮＦ−αであり得る。減少は、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の減少であり得る。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、すでに阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発生した対象に投与される。本明細書で提供される方法による、このような対象へのキメラポリペプチドの投与は、以前の反応と比較して、免疫応答の減少をもたらし得る。このように、いくつかの実施形態では、本方法に係るキメラポリペプチドの投与後には、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドの投与後に産生されるよりも、より少ない抗ＦＶＩＩＩ抗体が、対象において産生される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの投与は、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドによる以前の治療後の対象における数と比較して、対象におけるＦＶＩＩＩに対する抗体の数を減少させる。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの投与は、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドによる以前の治療後の対象における力価と比較して、対象におけるＦＶＩＩＩに対する抗体の力価を減少させる。いくつかの実施形態では、抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価は、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドの投与後に産生されるよりも、ＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチド投与後の対象において低くなる。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの投与は、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドによる以前の治療後の対象におけるレベルと比較して、対象におけるサイトカインのレベルを減少させる。いくつかの実施形態では、サイトカインのレベル（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、および／またはＴＮＦ−α）は、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチド投与後のレベルよりも、ＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチド投与後の対象において低くなる。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの投与は、凝固因子部分からなるポリペプチドまたは凝固因子部分を含むがＦｃ部分を含まないポリペプチドの対象への投与からもたらされる数と比較して、対象における抗凝固因子抗体の数を減少させる。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドが、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答をこれまでに発生していない対象に投与される。このような対象に対するキメラポリペプチドの投与は、本明細書で提供される方法によれば、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドの投与からもたらされるよりも低い免疫応答をもたらし得る。このように、いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドの投与により産生されるよりもわずかな抗ＦＶＩＩＩ抗体が、本方法によるキメラポリペプチド投与後の対象において産生される。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの投与は、凝固因子部分からなるポリペプチドまたは凝固因子部分を含むがＦｃ部分を含まないポリペプチドの対象への投与からもたらされる力価と比較して、対象における抗凝固因子抗体の力価を減少させる。いくつかの実施形態では、抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価は、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドの投与により産生されるよりも、ＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチド投与後の対象において低くなる。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの投与は、凝固因子部分からなるポリペプチドまたは凝固因子部分を含むがＦｃ部分を含まないポリペプチドの対象への投与からもたらされるレベルと比較して、対象におけるサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、および／またはＴＮＦ−α）のレベルを減少させる。いくつかの実施形態では、サイトカインレベル（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、および／またはＴＮＦ−α）は、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドの投与後よりも、ＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチドの投与後の対象において低くなる。
本開示の方法は、キメラポリペプチドの投与前に、（ａ）凝固因子をコードする遺伝子における突然変異または欠失を有する；（ｂ）凝固因子をコードする遺伝子における再構成を有する；（ｃ）これまでに凝固因子に対して阻害性免疫応答を発生したことがある親族を有する；（ｄ）インターフェロン治療を受けている；（ｅ）抗ウイルス療法を受けている；（ｆ）阻害性免疫応答を発生するリスクの増加に関連する凝固因子をコードする遺伝子以外の遺伝子における遺伝子突然変異を有する；および（ｇ）これらの２つまたはそれ以上の組み合わせを有する、からなる群から選択される１つまたはそれ以上の特性を対象が有するということを識別することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、対象は、（ｉ）ＴＮＦ−αの増加に関連する遺伝子多型；（ｉｉ）ＩＬ１０の増加に関連する遺伝子多型；（ｉｉｉ）ＣＴＬＡ−４の減少に関連する遺伝子多型；（ｉｖ）ＤＲ１５またはＤＱＢ０６０２ ＭＨＣクラスＩＩ分子における突然変異；および（ｖ）これらの２つまたはそれ以上の組み合わせ、からなる群から選択される、１つまたはそれ以上の突然変異を含む、凝固因子をコードする遺伝子以外の遺伝子に遺伝子突然変異を有する。いくつかの実施形態では、多型は、ＴＮＦ−αの増加に関連し、３０８Ｇ＞Ａである。いくつかの実施形態では、ＩＬ１０の増加に関連する多型は、ＩＬ１０Ｇマイクロサテライトの対立遺伝子１３４である。
また、本開示は、治療量のキメラＦＶＩＩＩポリペプチド、例えば、キメラＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチドまたはこのようなポリペプチドのハイブリッドを、非ＦＶＩＩＩ部分（上記ＦＶＩＩＩ部分からなるポリペプチド）がない、例えばＦｃ部分がない、上記ＦＶＩＩＩの同等投与量で必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５倍長い投与間隔で、対象に投与することを含む、それを必要とするヒト対象（例えば、ヒト患者）にＦＶＩＩＩを投与する方法を提供する。また、本開示は、キメラＦＶＩＩＩポリペプチドを投与することを含む、それを必要とするヒト対象における、ＦＶＩＩＩ投与の投与間隔を増加させる方法に関する。
投与間隔は、非ＦＶＩＩＩ部分（上記ＦＶＩＩＩ部分からなるポリペプチド）がない、例えばＦｃ部分がない、上記ＦＶＩＩＩの同等投与量で必要とされる投与間隔よりも、少なくとも、約１．５から６倍長く、約１．５から５倍長く、約１．５から４倍長く、約１．５から３倍長く、または、約１．５から２倍長くすることができる。投与間隔は、非ＦＶＩＩＩ部分（上記ＦＶＩＩＩ部分からなるポリペプチド）がない、例えばＦｃ部分がない、上記ＦＶＩＩＩの同等投与量で必要とされる投与間隔よりも、少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、または６倍長くすることができる。投与間隔は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日ごと、またはこれらより長くすることができる。
投与間隔は、少なくとも約１．５から５、１．５、２、３、４、もしくは５日、またはこれらより長くすることができる。
また、本開示は、治療量のキメラＦＶＩＩＩポリペプチド、例えば、キメラＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチドまたはこのようなポリペプチドのハイブリッドを対象に投与して、非ＦＶＩＩＩ部分（上記ＦＶＩＩＩ部分からなるポリペプチド）がない、例えばＦｃ部分がない、上記ＦＶＩＩＩの同等投与量により得られるＡＵＣよりも少なくとも約１．２５倍大きい血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）を得ることを含む、それを必要とするヒト対象にＦＶＩＩＩを投与する方法を提供する。このように、本開示は、キメラＦＶＩＩＩポリペプチドを投与することを含む、それを必要とするヒト患者におけるＦＶＩＩＩ活性のＡＵＣを増加または拡張する方法を含む。
また、本開示は、ＦＶＩＩＩおよびＦｃを含む治療量のポリペプチドまたはこのようなポリペプチドのハイブリッドを、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日ごと、または、これらより長い投与間隔で、対象に対し投与することを含む、それを必要とする対象に対してＦＶＩＩＩを投与する方法を提供する。
本明細書に開示される方法は、予防的処置またはオンデマンドでの治療を必要とする対象で実施され得る。
本明細書で使用される「投与する」とは、薬学的に許容される経路を介して、対象に、本明細書に開示される薬学的に許容されるＦＶＩＩＩポリペプチドを与えることを意味する。投与の経路は、例えば、静脈内注射および静脈内注入のような静脈内であり得る。投与の追加の経路は、例えば、皮下、筋肉内、経口、経鼻、および肺内投与を含む。キメラポリペプチドおよびハイブリッドタンパク質は、少なくとも１つの賦形剤を含む、医薬組成物の一部として投与され得る。
本明細書で使用される「血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）」は、薬理学の分野における用語と同じであり、投与後のＦＶＩＩＩ吸収の速度と程度に基づく。ＡＵＣは、１２、１８、２４、３６、４８、もしくは７２時間のような特定の期間にわたって、または、曲線の傾斜に基づく外挿法を用いて無限に測定される。本明細書で特に指定がない限り、ＡＵＣは無限に測定される。ＡＵＣの測定は、単一の対象、または、平均を算出する対象の個体群で行われ得る。
本明細書で使用されるＦＶＩＩＩの「Ｂドメイン」は、内部アミノ酸配列の同一性およびトロンビンによるタンパク質切断の部位により定義される、当該技術分野で知られるＢドメインと同じであり、例えば、全長ヒトＦＶＩＩＩの残基Ｓｅｒ７４１〜Ａｒｇ１６４８である。他のヒトＦＶＩＩＩドメインは、以下のアミノ酸残基により定義される：Ａ１，残基Ａｌａ１〜Ａｒｇ３７２；Ａ２，残基Ｓｅｒ３７３〜Ａｒｇ７４０；Ａ３，残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｉｌｅ２０３２；Ｃ１，残基Ａｒｇ２０３３〜Ａｓｎ２１７２；Ｃ２，残基Ｓｅｒ２１７３〜Ｔｙｒ２３３２。Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列、残基Ｇｌｕ１６４９〜Ａｒｇ１６８９は、通常、ＦＶＩＩＩ軽鎖活性化ペプチドと称される。また、ブタ、マウス、およびイヌＦＶＩＩＩに関するＢドメインを含む、全てのドメインの境界の位置は、当該技術分野で知られている。一実施形態では、ＦＶＩＩＩのＢドメインは欠失している（「Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」または「ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ」）。
ＢＤＤ ＦＶＩＩＩの例は、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）（組換えＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）であり、表２Ａ（ｉ）におけるＦＶＩＩＩ部分の配列と同じ配列を有する（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または２０〜１４５７）。他の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、配列番号２のアルギニン残基７７３に対応する、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩの残基７５４のアルギニンに対応する、未変化の細胞内プロセシング部位、または、配列番号６のアルギニン残基１６６７に対応する全長ＦＶＩＩＩの残基１６４８を含む。本明細書で、配列番号を参照することなく用いられる配列残基数は、本明細書にて明示されない限り、シグナルペプチド配列（１９のアミノ酸）を有しないＦＶＩＩＩ配列に対応する。例えば、全長ＦＶＩＩＩのＳ７４３／Ｑ１６３８は、１９のアミノ酸シグナルペプチド配列に起因して、配列番号６のＳ７６２／Ｑ１６５７に対応する。
「Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」は、その全体が参照により本明細書にそれぞれ組み込まれる、米国特許第６，３１６，２２６号、第６，３４６，５１３号、第７，０４１，６３５号、第５，７８９，２０３号、第６，０６０，４４７号、第５，５９５，８８６号、第６，２２８，６２０号、第５，９７２，８８５号、第６，０４８，７２０号、第５，５４３，５０２号、第５，６１０，２７８号、第５，１７１，８４４号、第５，１１２，９５０号、第４，８６８，１１２号、および第６，４５８，５６３号に開示される、全部または部分的な欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列は、米国特許第６，３１６，２２６号（また、米国特許第６，３４６，５１３号）の第４欄４行目〜第５欄２８行目および実施例１〜５に開示されるいずれか１つの欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、米国特許第５，７８９，２０３号（また、米国特許第６，０６０，４４７号、第５，５９５，８８６号、第６，２２８，６２０号）の第２欄、２６〜５１行目および実施例５〜８に開示される欠失を有する。
いくつかの実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、米国特許第５，９７２，８８５号の第１欄２５行目〜第２欄４０行目；米国特許第６，０４８，７２０号の第６欄１〜２２行目および実施例１；米国特許第５，５４３，５０２号の第２欄１７〜４６行目；米国特許第５，１７１，８４４号の第４欄２２行目〜第５欄３６行目；米国特許第５，１１２，９５０号の第２欄５５〜６８行目、図２、および実施例１；米国特許第４，８６８，１１２号の第２欄２行目〜第１９欄２１行目および表２；米国特許第７，０４１，６３５号の第２欄１行目〜第３欄１９行目、第３欄４０行目〜第４欄６７行目、第７欄４３行目〜第８欄２６行目、および第１１欄５行目〜第１３欄３９行目；または米国特許第６，４５８，５６３号の第４欄２５〜５３行目に記載の欠失を有する。いくつかの実施形態では、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第９１／０９１２２号に開示されるように、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、ほとんどのＢドメインの欠失を有するが、２つのポリペプチド鎖内（つまり、細胞内プロセシング部位）での一次翻訳産物のｉｎ ｖｉｖｏタンパク質プロセシングに不可欠であるＢドメインのアミノ末端配列をまだ含んでいる。
いくつかの実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、アミノ酸７４７〜１６３８の欠失、つまり、実質的にＢドメインの完全な欠失により構築される。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、HoebenR.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323
(1990)。また、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩのアミノ酸７７１〜１６６６
またはアミノ酸８６８〜１５６２の欠失を含み得る。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Meulien P., et al. Protein Eng.2(4): 301-6 (1988)。本開示の一部である更なるＢドメイン欠失は、例えば、９８２〜１５６２または７６０〜１６３９(Toole et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:5939-5942 (1986))、７９７〜１５６２(Eaton et al.,Biochemistry 25:8343-8347 (1986))、７４１〜１６４６(Kaufman (国際公開
第８７／０４１８７号))、７４７〜１５６０(Sarver et al., DNA 6:553-564 (1987))、
７４１〜１６４８(Pasek (国際出願第８８／００８３１号))、８１６〜１５９８または７４１〜１６８９(Lagner (Behring Inst.Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597))のアミノ酸の欠失を含み、それぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる。上述の欠失のそれぞれは、あらゆるＦＶＩＩＩ配列で作成され得る。
一実施形態では、キメラポリペプチドにおけるＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ部分は、金属結合、重鎖を含む第１の鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂの一部）および軽鎖を含む第２の鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）により結合される（または、関連する）、２つの鎖に加工される。他の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ部分は、単鎖ＦＶＩＩＩである。単鎖ＦＶＩＩＩは、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩの残基７５４のアルギニンに対応する細胞内プロセシング部位（配列番号２の残基７７３）または全長ＦＶＩＩＩの残基１６４８（配列番号６の残基１６５７）を含み得る。
重鎖と軽鎖間の金属結合は、当該技術分野で知られるあらゆる金属であり得る。例えば、金属は、二価金属イオンであり得る。重鎖と軽鎖を結合するために使用され得る金属は、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣｕ２＋を含むが、これらに限定されない。Fatouroset al., Intern. J. Pharm. 155(1): 121-131 (1997);Wakabayashi et al., JBC.279(13): 12677-12684 (2004)。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドにおけるＦＶＩＩＩ部分は、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドにおけるＦＶＩＩＩ部分は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドにおけるＦＶＩＩＩ部分は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドにおけるＦＶＩＩＩ部分は、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドにおけるＦＶＩＩＩ部分は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインを含む。
本明細書で使用される「キメラポリペプチド」は、異なる供給源由来の少なくとも２つのポリペプチド（または、サブシーケンスもしくはペプチド）をその中に含むポリペプチドを意味する。キメラポリペプチドは、異なる遺伝子、異なるｃＤＮＡ、または異なる動物もしくは他の種、のような異なる供給源からの、例えば、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のポリペプチドを含み得る。キメラポリペプチドは、例えば、異なるサブシーケンスを結合する１つまたはそれ以上のリンカーを含み得る。このように、単一のキメラポリペプチド内で、サブシーケンスは直接結合され得、もしくは、サブシーケンスは間接的にリンカーを介して結合され得、または両方である。キメラポリペプチドは、例えば、シグナル配列のような追加のポリペプチド、および、タンパク質の精製または検出において補助する６ＨｉｓおよびＦＬＡＧのような配列を含み得る。また、キメラポリペプチドは、Ｎ−および／またはＣ−末端にアミノ酸またはペプチドの追加を有し得る。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、凝固因子部分（例えば、ＦＶＩＩＩ部分）および非凝固因子部分（例えば、非ＦＶＩＩＩ部分）を含む。例となる非凝固因子部分（例えば、非ＦＶＩＩＩ部分）は、例えば、Ｆｃを含む。例となるキメラＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチドは、例えば、シグナル配列および配列番号４（表２）のキメラＦｃポリペプチドを有しまたは有しないで、配列番号２または６（表２）を含む。
本明細書で使用される場合、キメラポリペプチドに適用されるときの「部分」という用語は、このようなキメラポリペプチド（例えば、「ＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチド」または「キメラポリペプチドのＦＶＩＩＩ部分」）の成分または部分の１つを指す。つまり、「部分」という用語は、キメラポリペプチドの異なる成分の供給源を示すために用いられるが、ＦＶＩＩＩタンパク質の断片またはＦｃ領域の断片を示すためには用いられない。
キメラポリペプチドは、シグナル配列を有しない表２Ａ（ｉ）に示されるＦＶＩＩＩおよびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と少なくとも９０％または９５％同一の配列、または、シグナル配列を有する表２Ａ（ｉ）に示されるＦＶＩＩＩおよびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と少なくとも９０％または９５％同一の配列を含み得、配列はＦＶＩＩＩ活性を有する。ＦＶＩＩＩ活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＰＴ）分析、発色アッセイ（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙ）、または他の既知の方法により測定され得る。キメラポリペプチドは、シグナル配列を有しない表２Ａ（ｉ）に示されるＦＶＩＩＩおよびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と同じ配列、または、シグナル配列を有する表２Ａ（ｉ）に示されるＦＶＩＩＩおよびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と同じ配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ部分は、ＦＶＩＩＩ Ａ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ部分は、ヒトＦＶＩＩＩを含む。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ部分は、Ｂドメインの全部または部分的な欠失を有する。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ部分は、シグナル配列を有しない表２に示されるＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７；配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ部分は、シグナル配列を有しない表２に示されるＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７または配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と同一である。ＦＶＩＩＩ部分は、シグナル配列を有する表２に示されるＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ部分は、シグナル配列）を有する表２に示されるＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１と同一である。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ部分は、凝固活性を有する。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列と同一である（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、キメラポリペプチドに伴って第２のポリペプチドを含むハイブリッドの形態であり、第２のポリペプチドは、実質的にＦｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーからなり、または、Ｆｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーからなる。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの凝固因子部分は、第ＩＸ因子を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの第ＩＸ因子部分は、シグナル配列を有しない表２に示されるＦＩＸアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７；配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と少なくとも９０％、９５％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＦＩＸ部分およびＦｃ部分を含む第１の鎖と、実質的にＦｃ部分からなるまたはＦｃ部分からなる第２の鎖とを含む単量体と二量体のハイブリッドである。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、第ＶＩＩ因子部分を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＦＶＩＩ部分およびＦｃ部分を含む第１の鎖と、実質的にＦｃ部分からなるまたはＦｃ部分からなる第２の鎖とを含む単量体と二量体のハイブリッドである。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩ部分は、不活性のＦＶＩＩ、活性化したＦＶＩＩ、または活性化可能なＦＶＩＩである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキメラポリペプチドは、例えば、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａ、またはＦＩＸのような、ＦＶＩＩＩ以外の凝固因子を含む。一例では、ＦＶＩＩは、第ＶＩＩ因子酵素前駆体（ＦＶＩＩの不活性の形態）、活性化したＦＶＩＩ、または活性化可能なＦＶＩＩである。他の例では、ＦＩＸは、ＦＩＸ酵素前駆体または活性化したＦＩＸである。ポリペプチドの半減期を増加させることができる種々の非凝固因子部分が、当該技術分野で知られている。
いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ部分を含むキメラポリペプチドは、非ＦＶＩＩＩ部分を有しない同じＦＶＩＩＩ部分からなるポリペプチドを超えて増加した半減期（ｔ１／２）を有する。増加したｔ１／２を有するキメラＦＶＩＩＩポリペプチドは、長時間作用性のＦＶＩＩＩとして本明細書で言及され得る。長時間作用性のキメラＦＶＩＩＩポリペプチドは、例えば、Ｆｃに融合したＦＶＩＩＩ（例えば、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体と二量体のハイブリッドのようなハイブリッドの形態のキメラＦＶＩＩＩポリペプチドを含む；実施例１、図１、および表２Ａ；並びに米国特許第７，４０４，９５６号および米国特許第７，３４８，００４号参照）と、アルブミンに融合したＦＶＩＩＩを含む。
本明細書で使用される「培養」、「培養すること」、「培養している」は、細胞の増殖もしくは分裂を可能にするために、または、生きている状態で細胞を維持するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で細胞をインキュベートすることを意味する。本明細書で使用される「培養細胞」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた細胞を意味する。
本明細書で使用される、「ＦＶＩＩＩ」として本出願にわたって略記されている「第ＶＩＩＩ因子」は、特に指定がない限り、凝固時のその通常の役割における、機能的なＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。このように、ＦＶＩＩＩという用語は、機能的である変異体ポリペプチドを含む。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、およびネズミＦＶＩＩＩタンパク質であり得る。背景技術の欄に記載されているように、全長のポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列、および多くの機能的な断片、突然変異体、および修飾されたバージョンが知られている。ヒトＦＶＩＩＩの例は、配列番号２または６（表２）におけるサブシーケンスとして示される。ＦＶＩＩＩポリペプチドは、例えば、全長ＦＶＩＩＩ、Ｎ末端にＭｅｔがない全長ＦＶＩＩＩ、成熟したＦＶＩＩＩ（シグナル配列がない）、Ｎ末端に追加のＭｅｔを有する成熟したＦＶＩＩＩ、および／またはＢドメインの全部もしくは部分欠失を有するＦＶＩＩＩを含む。ＦＶＩＩＩ変異体は、部分的または全部のＢドメイン欠失を含む。
上述または後述されるように、非常に多くの機能的なＦＶＩＩＩ変異体が知られる。さらに、ＦＶＩＩＩにおける、数百の非機能的突然変異が血友病患者で確認され、これらの突然変異のＦＶＩＩＩ機能への影響は、置換の性質上のものよりも、ＦＶＩＩＩの三次元構造内でそれらが位置するところに、より起因することが特定され（Cutleret al., Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、ヒト由来のＦＶＩＩＩおよび他の種間の比較は、機能のために必要とされそうな保存残基を特定し（Cameronet al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632）、参
照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子は分離され、哺乳類細胞で発現され（Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984);Gitschier, J., etal., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., et al., Nature312:330-337 (1984);Vehar, G. A., et al., Nature 312:337-342 (1984); 国際公開第８７／０４１８７号；国際公開第８８／０８０３５号；国際公開第８８／０３５５８号；米国特許第４，７５７，００６号）、それぞれが参照によりその全体において本明細書に組み込まれ、アミノ酸配列がｃＤＮＡから推定された。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Caponet al.、米国特許第４，９６５，１９９号は、哺乳類宿主細胞におけるＦＶＩＩＩの産生およびヒトＦＶＩＩＩの精製のための、組換えＤＮＡの方法を開示する。ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞およびＢＨＫＣ（ベビーハムスター腎臓細胞）における、ヒトＦＶＩＩＩの発現が報告されている。ヒトＦＶＩＩＩが、Ｂドメインの一部または全部を欠失させるために修飾され（それぞれが参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９９４，３７１号および米国特許第４，８６８，１１２号）、ヒト第Ｖ因子のＢドメインによるヒトＦＶＩＩＩのＢドメインの置換が行われている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，００４，８０３号）。ヒトＦＶＩＩＩをコードするｃＤＮＡ配列および予測されるアミノ酸配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０１００９９０号の配列番号１および２にそれぞれ示される。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８５９，２０４号、Lollar, J. S.は、低減された抗原性および低減された免疫活性を有するＦＶＩＩＩの機能
的な突然変異体を報告する。また、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３７６，４６３号、Lollar, J. S.は、低減された免疫活性を有するＦＶＩＩ
Ｉの突然変異体を報告する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０１００９９０号、Saenko et al.は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに
おける機能的な突然変異を報告する。
いくつかの機能的なＦＶＩＩＩ分子は、Ｂドメイン欠失を含み、以下の特許、ともにＢａｘｔｅｒに譲渡された米国特許第６，３１６，２２６号および米国特許第６，３４６，５１３号；Ｉｎ２Ｇｅｎに譲渡された米国特許第７，０４１，６３５号；Ｃｈｉｒｏｎに譲渡された米国特許第５，７８９，２０３号、米国特許第６，０６０，４４７号、米国特許第５，５９５，８８６号、および米国特許第６，２２８，６２０号；Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍに譲渡された米国特許第５，９７２，８８５号および米国特許第６，０４８，７２０号、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋに譲渡された米国特許第５，５４３，５０２号および米国特許第５，６１０，２７８号；Ｉｍｍｕｎｏ Ａｇに譲渡された米国特許第５，１７１，８４４号；Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｓ．Ａ．に譲渡された米国特許第５，１１２，９５０号；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに譲渡された米国特許第４，８６８，１１２号に開示され、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ブタＦＶＩＩＩ配列が公表され、（Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942(1986)）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、ブタ脾臓ｃＤＮＡライブラリーからＦＶＩＩＩ配列のＰＣＲ増幅により得られた完全なブタｃＤＮＡ配列が報告されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Healey,J. F. et
al., Blood 88:4209-4214 (1996)）。全てのドメイン、全てのサブユニット、および特
定のアミノ酸配列の置換を有するハイブリッドヒト／ブタＦＶＩＩＩは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、LollaおよびRungeによる米国特許第５，３６４，７７１号および国際公開９３／２００９３号に開示された。最近では、ヌクレオチド、並びに、ブタＦＶＩＩＩのＡ１およびＡ２ドメインの対応するアミノ酸配列、および、対応するヒトドメインに置換されたブタＡ１および／またはＡ２ドメインを有するキメラＦＶＩＩＩが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第９４／１１５０３号で報告された。また、米国特許第５，８５９，２０４号、Lollar,J. S.は、ブタｃＤＮＡお
よび推定されるアミノ酸配列を開示する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｅｍｏｒｙに譲渡された米国特許第６，４５８，５６３号は、Ｂドメイン欠失ブタＦＶＩＩＩを開示する。
ＦＶＩＩＩ（または、キメラポリペプチドのＦＶＩＩＩ部分）は、シグナル配列を有しない表２に示されるＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７；および配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一であり得、上記ＦＶＩＩＩ部分は、ＦＶＩＩＩ活性を有する。ＦＶＩＩＩ（またはキメラポリペプチドのＦＶＩＩＩ部分）は、シグナル配列を有しない表２に示されるＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７；および配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と同一であり得る。
ＦＶＩＩＩ（または、キメラポリペプチドのＦＶＩＩＩ部分）は、シグナル配列を有する表２に示されるＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７および配列番号６アミノ酸１〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一であり得、上記ＦＶＩＩＩ部分はＦＶＩＩＩ活性を有する。ＦＶＩＩＩ（または、キメラポリペプチドのＦＶＩＩＩ部分）は、シグナル配列を有する表２に示されるＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７および配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と同じであり得る。
いくつかの実施形態では、凝固因子は、第ＶＩＩ因子酵素前駆体、活性化したＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）、もしくは活性化可能なＦＶＩＩ、またはその変異体の成熟した形態である。第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ、Ｆ７；第７因子としても言及される、凝固第ＶＩＩ因子、血清第ＶＩＩ因子、血清プロトロンビン転化促進因子、ＳＰＣＡ、プロコンベルチンおよびエプタコグアルファ）は、凝固カスケードの一部であるセリンプロテアーゼである。ＦＶＩＩは、Ｇｌａドメイン、２つのＥＧＦドメイン（ＥＧＦ−１およびＥＧＦ−２）、並びに、例えばキモトリプシンを有するような、セリンプロテアーゼのペプチダーゼＳ１ファミリーの全てのメンバーの中で高度に保存されるセリンプロテアーゼドメイン（またはペプチダーゼＳ１ドメイン）を含む。ＦＶＩＩは、単鎖酵素前駆体、活性化された酵素前駆体様二本鎖ポリペプチド、および十分に活性化された二本鎖形態として発生する。本明細書で使用される、「酵素前駆体様」タンパク質またはポリペプチドは、タンパク質切断により活性化されているが、例えば、活性が低いもしくは活性がないような酵素前駆体に関連する特性を示したままのタンパク質、または、タンパク質の酵素前駆体形態の立体構造に類似する立体構造を指す。例えば、組織因子に結合しない場合、２本鎖の活性化形態のＦＶＩＩは、酵素前駆体様タンパク質であり、それは、非切断ＦＶＩＩ酵素前駆体に似ている立体構造を保持し、これにより、非常に低い活性を示す。組織因子への結合時に、２本鎖の活性化形態のＦＶＩＩは、立体構造の変化が起こり、凝固因子としてのその十分な活性を得る。例となるＦＶＩＩ変異体は、例えば、その酵素活性（ＫｃａｔまたはＫｍ）の増加によりＦＶＩＩの活性を増加させる突然変異のような、比活性が増加したものを含む。このような変異体は当該分野で記載されており、例えば、Perssonet al. 2001. PNAS 98:13583; Petrovan and Ruf. 2001. J. Biol.Chem. 276:6616;Persson et al. 2001 J. Biol. Chem. 276:29195; Soejima et al.2001. J. Biol.Chem. 276:17229; Soejima et al. 2002. J. Biol. Chem. 247:49027に記載されるように、例えば、分子の突然変
異体の形態を含む。一実施形態では、ＦＶＩＩの変異体形態は、突然変異を含む。例となる突然変異は、Ｖ１５８Ｄ−Ｅ２９６Ｖ−Ｍ２９８Ｑを含む。他の実施形態では、ＦＶＩＩの変異体形態は、トリプシンの１７０ループ由来のアミノ酸ＥＡＳＹＰＧＫを有するＦＶＩＩ成熟シーケンス由来のアミノ酸６０８〜６１９（１７０ループに対応するＬＱＱＳＲＫＶＧＤＳＰＮ）の置換を含む。ＦＩＸの高い比活性変異体も、当該技術分野で知られる。例えば、Simioniet al.（2009 N.E. Journal of Medicine361:1671）は、Ｒ３３８
Ｌ突然変異について記載している。Chang et al.（1988 JBC 273:12089）およびPierri et al.（2009 HumanGene Therapy 20:479）は、Ｒ３３８Ａ突然変異について記載してい
る。他の突然変異は当該技術分野で知られ、例えば、Zogg and Brandstetter. 2009 Structure 17:1669; Sichleretl al. 2003.J. Biol. Chem. 278:4121;およびSturzebecher et al. 1997.FEBS Lett412:295に開示されているものを含む。これらの参照文献の内容は、参照により本明細書において組み込まれる。酵素前駆体様形態から立体構造が変化したときに生じる完全な活性化は、結合時に発生し、補助因子組織因子となる。また、組織因子の欠損における立体構造変化をもたらす突然変異を導入し得る。従って、ＦＶＩＩａへの言及は、酵素前駆体様形態、十分に活性化した二本鎖形態、または、活性化可能な形態を含む。「活性化可能な第ＶＩＩ因子」は、活性化形態に変換され得る不活性形態（例えば、その酵素前駆体形態）における第ＶＩＩ因子である。
いくつかの実施形態では、凝固因子は、第ＩＸ因子またはその変異体の成熟した形態である。第ＩＸ因子は４１５アミノ酸、単鎖血漿酵素前駆体として循環する（A.Vysotchin
et al., J. Biol. Chem. 268, 8436 (1993)）。ＦＩＸの酵素前駆体は、ＦＸＩａにより、または、組織因子／ＦＶＩＩａ複合体により活性化される。アルギニン−アラニン１４５〜１４６およびアルギニン−バリン１８０〜１８１間の特定の切断は、システイン１３２およびシステイン２８９間の単一のジスルフィド結合により結合される軽鎖および重鎖をもたらす（S.Bajaj et al., Biochemistry 22, 4047 (1983)）。
ＦＩＸの構造構成は、ビタミンＫ依存性血液凝固タンパクＦＶＩＩ、ＦＸおよびプロテインＣ（前述のB. FurieおよびB. Furie）の構造構成に類似する。そのアミノ末端の約４５のアミノ酸は、ガンマカルボキシグルタミン酸、またはＧｌａ、ドメインを含む。これに、２つの表皮成長因子相同ドメイン（ＥＧＦ）、活性化ペプチド、およびセリンプロテアーゼファミリーのメンバーである触媒性の「重鎖」が続く（A.Vysotchin et al., J. Biol. Chem. 268, 8436 (1993); S. Spitzer etal.,Biochemical Journal 265, 219 (1990); H. Brandstetter et al., Proc. Natl.AcadSci. USA 92, 9796 (1995)）。
本明細書で使用される「同等投与量」は、当該ポリペプチドの分子量からは独立している、国際単位で表されるＦＶＩＩＩ活性の同一の投与量を意味する。ＦＶＩＩＩ活性の１つの国際単位（ＩＵ）は、正常なヒト血漿１ミリリットル中のＦＶＩＩＩの量と略対応している。ヨーロッパ薬局方の発色基質分析およびワンステージ凝固分析（ｏｎｅ ｓｔａｇｅ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙ）を含む、ＦＶＩＩＩ活性を測定するための、いくつかの分析が可能である。
本明細書で使用される「Ｆｃ」は、特に指定がない限り、機能的な新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合パートナーを意味する。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎ結合パートナーのＦｃＲｎ受容体により結果として生じる能動輸送で、ＦｃＲｎ受容体により特異的に結合され得るあらゆる分子である。したがって、Ｆｃという用語は、機能的であるＩｇＧ Ｆｃのあらゆる変異体を含む。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶構造解析に基づいて記載されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Burmeisteret al., Nature 372:379 (1994)）。ＦｃのＦｃＲｎとの主要な接触域は、ＣＨ２とＣＨ３ドメインの接合部の近くである。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触は全て単一のＩｇ重鎖内である。ＦｃＲｎ結合パートナーは、例えば、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲｎの完全な結合領域を含むＩｇＧの他の断片を含む。主要な接触部位は、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、および３１４、並びに、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、および４３３〜４３６を含む。
免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン断片、または領域のアミノ酸番号への言及は、全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kabat et al.1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest,U. S. Department ofPublic Health, Bethesda; MDに基づく。（ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含むいくつかの哺乳類の種から分離されている。ヒトＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎの配列が知られる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Storyet al., J. Exp. Med. 180: 2377 (1994)
）。Ｆｃは、免疫グロブリンのヒンジ領域を有するまたは有しない、免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み得る。例となるＦｃ変異体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２００４／１０１７４０号および国際公開第２００６／０７４１９９号で提供される。
Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、１つまたはそれ以上の突然変異および突然変異の組み合わせを含み得る。例えば、Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるOganesyanet al., Mol. Immunol. 46:1750 (2009)に開示される、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組み合わせ；参照によりその全体が本明細書に組み込まれるVaccaroet al., Nat. Biotechnol. 23:1283 (2005)に開示されるＨ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ、およびこれらの組み合わ
せ；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０２６４６２７号の１〜２ページ目、段落［００１２］、並びに実施例９および実施例１０に開示される突然変異体；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９０１６３６９９号の２ページ目、段落［００１４］〜［００２１］に開示される突然変異体のような、増加した半減期を付与する突然変異を含み得る。
また、Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、例えば、以下の突然変異をも含み得る：ＩｇＧのＦｃ領域が、ＦｃＲｎにより結合されるであろう、修飾されたＩｇＧもしくはＦｃ断片またはその部分を産生するための突然変異誘発等に関する場所のような、よく認識された手順に従って修飾され得る。このような修飾は、例えば、ＦｃＲｎ接触部位から遠く離れている修飾、並びに、ＦｃＲｎに結合を保持するまたはさらに高める接触部位内の修飾を含む。例えば、以下の、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｆｃｙ１）における単一アミノ酸残基は、ＦｃＲｎに関するＦｃ結合親和性が著しく減少することなく置換され得る：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４Ａ、およびＫ４４７Ａ。ここで、例えば、Ｐ２３８Ａは、配置番号２３８のアラニンにより置換された野生型プロリンを表す。アラニンに加えて、他のアミノ酸は、上記の特定の位置で、野生型のアミノ酸を置換し得る。
突然変異は、天然のＦｃとは異なる、１００以上のＦｃＲｎ結合パートナーを発生するＦｃ内に単独で導入され得る。さらに、２、３、またはそれ以上の個々の突然変異の組み合わせがともに導入されて、何百ものさらなるＦｃＲｎ結合パートナーをもたらす。これらの突然変異のいくつかは、ＦｃＲｎ結合パートナーに新たな機能性を付与し得る。例えば、一実施形態は、高度に保存されるＮ−グリコシル化部位を取り除く、Ｎ２９７Ａを組み入れる。この突然変異の効果は、免疫原性を低減し、これによりＦｃＲｎ結合パートナーの循環半減期を高めること、および、ＦｃＲｎに関する親和性を損なうことなく、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩＡ、ＦｃｙＲＩＩＢ、およびＦｃｙＲＩＩＩＡに対して結合できないＦｃＲｎ結合パートナーを付与することである（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Routledgeet al. 1995, Transplantation 60:847；参照によりその全体が本
明細書に組み込まれる、Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632；参照によりそ
の全体が本明細書に組み込まれる、Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591）。
さらに、少なくとも３つのヒトＦｃガンマ受容体が、低ヒンジ領域、一般的にはアミノ酸２３４〜２３７内でのＩｇＧ上の結合部位を認識すると思われる。よって、新たな機能性および潜在的に低減された免疫原性の他の例は、例えば、ヒトＩｇＧ１「ＥＬＬＧ」アミノ酸２３３〜２３６を、ＩｇＧ２「ＰＶＡ」由来の対応する配列（１つのアミノ酸欠失を有する）に置換することによる、この領域の突然変異から生じ得る。このような突然変異が導入された場合に、種々のエフェクター機能を媒介するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩは、ＩｇＧ１に結合しないであろうということが示されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Wardand Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77 (1995)；および参照によりその全体が本明細書に組み込まれるArmouret al., Eur. J. Immunol. 29:2613 (1999)）。上記突然変異から生じる新たな機能性の更なる例と
して、ＦｃＲｎに関する親和性が、いくつかの場合には、野生型の親和性を超えて増加し得る。この増加した親和性は、増加した「オン」（結合）速度、減少した「オフ」（解離）速度、または増加した「オン」速度および減少した「オフ」速度の両方を反映し得る。ＦｃＲｎに関する増加した親和性を付与すると考えられる突然変異は、例えば、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａを含む（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Shieldset al., J. Biol. Chem. 276:6591 (2001)）。
Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列と少なくとも９０％または９５％同一であり得る（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）。Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列と同一であり得る（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４および配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）。
本明細書で使用される、「ハイブリッド」ポリペプチドおよびタンパク質は、キメラポリペプチドの、第２のポリペプチドとの組み合わせを意味する。ハイブリッドにおける第２のポリペプチドおよびキメラポリペプチドは、電荷―電荷または疎水性相互作用のような、タンパク質間相互作用を介して互いに関連し得る。ハイブリッドにおける第２のポリペプチドおよびキメラポリペプチドは、ジスルフィドまたは他の共有結合（複数を含む）を介して互いに関連し得る。ハイブリッドは、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２００４／１０１７４０号および国際公開第２００６／０７４１９９号に記載される。また、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４０４，９５６号および米国特許第７，３４８，００４号参照。第２のポリペプチドは、同じキメラポリペプチドの第２の複製であり得、または、それは非同一のキメラポリペプチドであり得る。例えば、図１、実施例１、および表２参照。
一実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｆｃを含むポリペプチドである。他の実施形態では、キメラポリペプチドは、キメラＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチド、および、例えば、介在性のリンカー配列を有しないヒトＩｇＧ１の二量体Ｆｃドメインに融合した組換えＢドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ）の単一分子からなるｒＦＶＩＩＩＦｃ組換え融合タンパク質である実施例１のハイブリッドポリペプチドのような、実質的にＦｃからなる第２のポリペプチドである。このハイブリッドポリペプチドは、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体のＦｃ融合タンパク質、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体のハイブリッド、単量体ＦＶＩＩＩＩＦｃハイブリッド、およびＦＶＩＩＩＦｃ単量体−二量体として本明細書で言及される。実施例１、図１、および表２Ａ参照。実施例は、このハイブリッドポリペプチドに関する臨床前および臨床データを提供する。
ハイブリッドにおける第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と少なくとも９０％または９５％同一の配列、または、シグナル配列を含む表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と少なくとも９０％または９５％同一の配列、を含み、または、実質的にその配列からなり得る。第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と同一の配列、または、シグナル配列を含む表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と同一の配列、を含み、または、実質的にその配列からなり得る。
図１は、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ−Ｆｃキメラポリペプチドの構造、および、Ｆｃポリペプチドである第２のポリペプチドとのその関連を示す概略図である。このハイブリッドを得るために、ヒト組換えＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩのコード配列が、ＦＶＩＩＩ特異的ポリマーを用いて、ヒト肝臓ポリＡ ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により得られた。ＦＶＩＩＩ配列は、ＦＶＩＩＩに関する天然のシグナル配列を含む。Ｂドメイン欠失は、全体で２６８２ｂｐの欠失に関する、セリン７４３（Ｓ７４３；２２８７ｂｐ）からグルタミン１６３８（Ｑ１６３８；４９６９ｂｐ））までであった。次いで、ヒト組換えＦｃに関するコード配列が、Ｆｃ特異的プライマーを用いて、ヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＲＴ−ＰＣＲにより得られた。プライマーは、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列が、介在性のリンカーを用いずＦｃ配列のＮ末端に直接融合されるように設計された。ＦＶＩＩＩＦｃＤＮＡ配列が、ＣＭＶプロモーターのコントロール下で、哺乳類の重発現ベクター（ｄｕａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ベクター）ｐＢＵＤＣＥ４．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングされた。マウスＩｇｋシグナル配列を含む第２の同じＦｃ配列がＲＴ−ＰＣＲにより得られ、発現ベクターｐＢＵＤＣＥ４．１における、第２のプロモーター、ＥＦ１αの下流でクローニングされた。
ｒＦＶＩＩＩＦｃ発現ベクターが、リポフェクタミン２０００遺伝子導入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３Ｈ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に遺伝子導入された。安定したクローン細胞株が、Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる選択により生成された。１つのクローン細胞株、３Ｃ４−２２を、ｉｎ ｖｉｖｏでの特徴づけに関するＦＶＩＩＩＦｃを生成するために使用した。組換えＦＶＩＩＩＦｃが、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で産生され、精製された（McCueet al. 2009）。上記遺伝子導入ストラテジーは、３つの製品、つま
り、単量体ｒＦＶＩＩＩＦｃハイブリッド、二量体ｒＦＶＩＩＩＦｃハイブリッド、および二量体Ｆｃを産出することが期待された。しかしながら、これらの細胞からの馴化培地で二量体ｒＦＶＩＩＩＦｃは実質的に検出されなかった。そうではなく、馴化培地は、Ｆｃおよび単量体ｒＦＶＩＩＩＦｃを含んでいた。二量体ｒＦＶＩＩＩＦｃのサイズはあまりに大きく、細胞からの効率的分泌が妨げられたかもしれない。全ての３つのタンパク質が存在する場合よりも複雑はでない単量体の精製を付与したため、この結果は有益であった。これらの研究で使用された材料は、約９０００ＩＵ／ｍｇの比活性を有した。
本明細書で使用される「投与間隔」は、対象に投与された複数回投与の間に経過する時間の量を意味する。投与間隔の比較は、単一の対象または対象の個体群で行われ得、その後、個体群から得られた平均が算出され得る。
キメラＦＶＩＩＩポリペプチド、例えば、本開示のキメラＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチド（ＦＶＩＩＩまたはハイブリッドを含むポリペプチド）を投与する際の投与間隔は、非ＦＶＩＩＩ部分を有しない、例えば、Ｆｃ部分を有しない（上記ＦＶＩＩＩからなるポリペプチド）、上記ＦＶＩＩＩの同等投与量に関して必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５倍長くなり得る。非ＦＶＩＩＩ部分を有しない、例えば、Ｆｃ部分を有しない（上記ＦＶＩＩＩからなるポリペプチド）、上記ＦＶＩＩＩの同等投与量に関して必要とされる投与間隔よりも、投与間隔を少なくとも約１．５〜６倍長く、約１．５〜５倍長く、約１．５〜４倍長く、約１．５〜３倍長く、または約１．５〜２倍長くすることができる。
非ＦＶＩＩＩ部分を有しない、例えば、Ｆｃ部分を有しない（上記ＦＶＩＩＩからなるポリペプチド）、上記ＦＶＩＩＩの同等投与量に関して必要とされる投与間隔よりも、投与間隔を少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、または６倍長くすることができる。投与間隔を、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日ごと、またはこれらより長くすることができる。投与間隔を、少なくとも約１．５〜５、１．５、２、３、４、もしくは５日、またはこれらより長くすることができる。オンデマンドでの治療に関し、上記キメラポリペプチドまたはハイブリッドの投与間隔は、約２４〜３６、２４〜４８、２４〜７２、２４〜９６、２４〜１２０、２４〜１４４、２４〜１６８、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間ごとに１回、または、これらより長い。
一実施形態では、有効量は、２５〜６５ＩＵ／ｋｇ（２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６２、６４、または６５ＩＵ／ｋｇ）であり、投与間隔は、３〜５、３〜６、３〜７、３、４、５、６、７、もしくは８日、またはそれ以上の日ごとに１回、または週に３回、または週に３回以下である。他の実施形態では、有効量は６５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は１週間に１回、または６〜７日ごとに１回である。投与量は、必要とされる限り、繰り返し投与され得る（例えば、少なくとも１０、２０、２８、３０、４０、５０、５２、または５７週、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０年）。
ある実施形態では、オンデマンドでの治療に関する有効量は、２０〜５０ＩＵ／Ｋｇ（２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ＩＵ／ｋｇ）である。オンデマンドでの治療は、１回の投与または繰り返し投与であり得る。繰り返し投与に関し、投与間隔は、１２〜２４時間ごと、２４〜３６時間ごと、２４〜４８時間ごと、３６〜４８時間ごと、または４８〜７２時間ごとであり得る。よって、「繰り返し投与」という用語は、ある期間にわたって１回の投与よりも多い投与を指す。「繰り返し投与」計画下で投与された投与量は、「繰り返す投与」を指す。いくつかの実施形態では、繰り返す投与のそれぞれは、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、または少なくとも約１５日により、他から隔てられている。いくつかの実施形態では、繰り返す投与は、少なくとも約２回の投与、少なくとも約５回の投与、少なくとも約１０回の投与、少なくとも約２０回の投与、少なくとも約２５回の投与、少なくとも約３０回の投与、少なくとも約３５回の投与、少なくとも約４０回の投与、少なくとも約４５回の投与、少なくとも約５０回の投与、少なくとも約５５回の投与、少なくとも約６０回の投与、少なくとも約６５回の投与、または少なくとも約７０回の投与、を含む。繰り返す投与は、約２回の投与〜約１００回の投与、約５回の投与〜約８０回の投与、約１０回の投与〜約７０回の投与、約１０回の投与〜約６０回の投与、約１０回の投与〜約５０回の投与、約１５回の投与〜約４０回の投与、約１５回の投与〜約３０回の投与、約２０回の投与〜約３０回の投与、または約２０回の投与〜約４０回の投与、を含む。繰り返す投与は、約２回の投与、約５回の投与、約１０回の投与、約１５回の投与、約２０回の投与、約２５回の投与、約３０回の投与、約３５回の投与、約４０回の投与、約４５回の投与、約５０回の投与、約５５回の投与、約６０回の投与、約６５回の投与、約７０回の投与、約７５回の投与、約８０回の投与、約９０回の投与、または約１００回の投与を含む。
いくつかの実施形態では、繰り返す投与の後に、対象は、さらに、凝固因子を含むがＦｃ部分を含まない、凝固因子タンパク質を含む医薬組成物を投与される。この凝固因子は、全長または成熟した凝固因子であり得る。いくつかの実施形態では、このような凝固因子は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）／ＲＥＦＡＣＴＯ ＡＢ（登録商標）、ＨＥＭＯＦＩＬ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＡＲＣ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＯＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＡＴＥ−ＤＶＩ（登録商標）、およびＨＹＡＴＥ：Ｃ（登録商標）であり得る。
「長時間作用性の」および「持続性の」という用語は、本明細書で互換的に用いられる。「持続性の凝固因子」または「長時間作用性の凝固因子」（例えば、長時間作用性のＦＶＩＩ、長時間作用性のＦＶＩＩＩ、および長時間作用性のＦＩＸ）は、例えばＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、またはＦＩＸのような参照凝固因子を超える、増加した半減期（また、本明細書でｔ１／２、ｔ１／２ベータ、排泄半減期、およびＨＬとして言及される）を有するＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、またはＦＩＸのような凝固因子である。「より長い」ＦＶＩＩＩ活性は、当該技術分野におけるあらゆる既知の方法、例えば、ａＰＴＴ分析、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭ、ＴＧＡ等により測定され得る。一実施形態では、「より長い」ＦＶＩＩＩ活性は、Ｔ１／２ベータ（活性）により示され得る。他の実施形態では、「より長い」ＦＶＩＩＩ活性は、血漿中に存在するＦＶＩＩＩ抗原のレベルにより、例えば、Ｔ１／２ベータ（抗原）により示され得る。他の実施形態では、長時間作用性のまたは持続性のＦＶＩＩＩポリペプチドは、野生型ＦＶＩＩＩポリペプチド、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、またはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、凝固カスケードにおいてより長く機能し、例えば、より長い期間作用している。長時間作用性凝固因子、例えば、長時間作用性のＦＶＩＩＩの増加した半減期は、例えば、Ｆｃのような、１つまたはそれ以上の非凝固因子ポリペプチドへの融合に起因し得る。増加した半減期は、例えば、ペグ化のような、１つまたはそれ以上の修飾に起因し得る。例となる長時間作用性凝固因子（例えば、長時間作用性のＦＶＩＩＩポリペプチド）は、例えば、キメラ凝固因子（例えば、Ｆｃを含むキメラＦＶＩＩＩポリペプチド）、およびアルブミンを含むキメラ凝固因子（例えば、アルブミンを含むキメラＦＶＩＩＩポリペプチド）を含む。追加的な例示の長時間作用性の凝固因子（例えば、長時間作用性のＦＶＩＩＩポリペプチド）は、例えば、ペグ化凝固因子を含む（例えば、ペグ化ＦＶＩＩＩ）。
「参照」ポリペプチドは、例えば、長時間作用性のキメラ凝固因子（例えば、長時間作用性キメラＦＶＩＩＩポリペプチド）の場合、実質的にキメラポリペプチドの凝固因子部分からなるポリペプチドである。例えば、長時間作用性ＦＶＩＩＩの場合、参照ポリペプチドは、キメラポリペプチドのＦＶＩＩＩ部分、例えば、Ｆｃ部分を有しないまたはアルブミンを有しない、同じＦＶＩＩＩ部分である。同様に、修飾されたＦＶＩＩＩの場合における参照ポリペプチドは、修飾がない同じＦＶＩＩＩ、例えば、ペグ化を有しないＦＶＩＩＩである。
いくつかの実施形態では、長時間作用性ＦＶＩＩＩは、対象に投与した場合に、１つまたはそれ以上の以下の特性を有する：
上記対象における、約１４〜４１．３時間の平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）；
上記対象における、約１．２２〜５．１９ｍＬ／時間／ｋｇまたはそれ未満のクリアランス（ＣＬ）（活性）；
上記対象における、約１１〜２６．４時間のｔ１／２ベータ（活性）；
上記対象における、ＩＵ／ｋｇあたり約１．３８〜２．８８ＩＵ／ｄＬの増分回収率（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）（Ｋ値）（活性；観察値）；
上記対象における、約３７．７〜７９．４ｍＬ／ｋｇのＶｓｓ（活性）；
上記対象における、ＩＵ／ｋｇあたり約１９．２〜８１．７ＩＵ＊ｈ／ｄＬ ＡＵＣ／投与。
いくつかの実施形態では、長時間作用性のＦＶＩＩＩは、患者の個体群に投与した場合に、１つまたはそれ以上の以下の特性を有する：
ＩＵ／ｋｇあたり１．３８ＩＵ／ｄＬより高い平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）；
ＩＵ／ｋｇあたり、少なくとも約１．５、少なくとも約１．８５、または少なくとも約２．４６ＩＵ／ｄＬの平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）；
上記患者の個体群における、約２．３３±１．０８ｍＬ／時間／ｋｇまたはそれ未満の平均クリアランス（ＣＬ）（活性）；
上記患者の個体群における、約１．８〜２．６９ｍＬ／時間／ｋｇの平均クリアランス（ＣＬ）（活性）；
上記患者の個体群における、修飾がない上記ＦＶＩＩＩを含むポリペプチドの約６５％のクリアランスである平均クリアランス（ＣＬ）（活性）；
上記患者の個体群における、少なくとも約２６．３±８．３３時間の平均の平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）；
上記患者の個体群における、約２５．９〜２６．５時間の平均（ＭＲＴ）（活性）；
上記患者の個体群における、修飾がない上記ＦＶＩＩＩを含むポリペプチドの平均ＭＲＴよりも約１．５倍長い平均（ＭＲＴ）（活性）；
上記患者の個体群における、約１８．３±５．７９時間の平均ｔ１／２ベータ（活性）；
上記患者の個体群における、約１８〜１８．４時間である平均ｔ１／２ベータ（活性）；
上記患者の個体群における、修飾がない上記ＦＶＩＩＩを含むポリペプチドの平均ｔ１／２ベータよりも約１．５倍長い平均ｔ１／２ベータ（活性）；
上記患者の個体群における、ＩＵ／ｋｇあたりの約２．０１±０．４４ＩＵ／ｄＬ平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）；
上記患者の個体群における、ＩＵ／ｋｇあたり約１．８５〜２．４６ＩＵ／ｄＬの平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）；
上記患者の個体群における、修飾がない上記ＦＶＩＩＩを含むポリペプチドの平均増分回収率の約９０％である平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）；
上記患者の個体群における、約５５．１±１２．３ｍＬ／ｋｇの平均Ｖｓｓ（活性）；
上記患者の個体群における、約４５．３〜５６．１ｍＬ／ｋｇの平均Ｖｓｓ（活性）；
上記患者の個体群における、ＩＵ／ｋｇあたりの約４９．９±１８．２ＩＵ＊ｈ／ｄＬの平均ＡＵＣ／投与量（活性）；
上記患者の個体群における、ＩＵ／ｋｇあたりの約４４．８〜５７．６ＩＵ＊ｈ／ｄＬの平均ＡＵＣ／投与量（活性）。
他の実施形態では、長時間作用性のＦＶＩＩＩは、患者の個体群に投与した場合に、１つまたはそれ以上の以下の特性を有する：
キメラポリペプチドで投与された上記対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳは、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析またはツーステージ（ｔｗｏ ｓｔａｇｅ）（色素生産性）分析により測定した際、全長の、成熟したＦＶＩＩＩからなる、同じ量のポリペプチドで投与された対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳと同等である；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定して、約６０．５ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±１ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±２ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±３ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±４ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±５ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±６ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±７ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±８ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±９ＩＵ／ｄＬ、もしくは約６０．５±１０ＩＵ／ｄＬの対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定して、約５３．１〜６９ＩＵ／ｄＬの対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定して、約１１９ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１ＩＵ／ｄＬ、約１１９±２ＩＵ／ｄＬ、約１１９±３ＩＵ／ｄＬ、約１１９±４ＩＵ／ｄＬ、約１１９±５ＩＵ／ｄＬ、約１１９±６ＩＵ／ｄＬ、約１１９±７ＩＵ／ｄＬ、約１１９±８ＩＵ／ｄＬ、約１１９±９ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１０ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１１ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１２ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１３ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１４ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１５ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１６ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１７ＩＵ／ｄＬ、もしくは約１１９±１８ＩＵ／ｄＬの対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定して、約１０３〜１３６ＩＵ／ｄＬの対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定して、約７６．５ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±１ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±２ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±３ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±４ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±５ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±６ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±７ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±８ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±９ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±１０ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±１１ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±１２ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±１３ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±１４ＩＵ／ｄＬ、もしくは約７６．５±１５ＩＵ／ｄＬの対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定して、約６４．９〜９０．１ＩＵ／ｄＬの対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定して、約１８２ＩＵ／ｄＬ、約１８２±２ＩＵ／ｄＬ、約１８２±４ＩＵ／ｄＬ、約１８２±６ＩＵ／ｄＬ、約１８２±８ＩＵ／ｄＬ、約１８２±１０ＩＵ／ｄＬ、約１８２±１２ＩＵ／ｄＬ、約１８２±１４ＩＵ／ｄＬ、約１８２±１６ＩＵ／ｄＬ、約１８２±１８ＩＵ／ｄＬ、もしくは約１８２±２０ＩＵ／ｄＬの対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ；または
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定して、約１４６〜２２７ＩＵ／ｄＬ、約１４６±５ＩＵ／ｄＬ、約１４６±１０ＩＵ／ｄＬ、約２２７±５ＩＵ／ｄＬ、もしくは約１４６±１０ＩＵ／ｄＬの対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ。
ある実施形態では、長時間作用性のＦＶＩＩＩは、患者の個体群に投与した場合に、１つまたはそれ以上の以下の特性を有する：
ワンステージ（ａＰＴＴ）分析またはツーステージ（色素生産性）分析により測定した場合に、全長の、成熟したＦＶＩＩＩからなる、同じ量のポリペプチドで投与された対象におけるｔ１／２ベータ（活性）より、少なくとも１．４８、１．４９、１．５０、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６０、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７０、１．７１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８０、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、または１．９０倍高い、上記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）；
ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定して、約１８．８時間、１８．８±１時間、１８．８±１時間、１８．８±２時間、１８．８±３時間、１８．８±４時間、１８．８±５時間、１８．８±６時間、１８．８±７時間、１８．８±８時間、１８．８±９時間、１８．８±１０時間、もしくは１８．８±１１時間の上記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）；
ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、約１４．３〜２４．５時間の上記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）；
ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約１６．７時間、１６．７±１時間、１６．７±２時間、１６．７±３時間、１６．７±４時間、１６．７±５時間、１６．７±６時間、１６．７±７時間、１６．７±８時間、１６．７±９時間、１６．７±１０時間、もしくは１６．７±１１時間の上記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）；
ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約１３．８〜２０．１時間の上記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）；
ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約１９．８時間、１９．８±１時間、１９．８±２時間、１９．８±３時間、１９．８±４時間、１９．８±５時間、１９．８±６時間、１９．８±７時間、１９．８±８時間、１９．８±９時間、１９．８±１０時間、もしくは１９．８±１１時間の上記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）；または
ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約１４．３〜２７．５時間の上記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）。
ある実施形態では、長時間作用性のＦＶＩＩＩは、患者の個体群に投与した場合に、１つまたはそれ以上の以下の特性を有する：
ワンステージ（ａＰＴＴ）分析またはツーステージ（色素生産性）分析により測定した場合に、全長の、成熟したＦＶＩＩＩからなる、同じ量のポリペプチドで投与された対象におけるクリアランスより、０．５１、０．５２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６０、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６６、０．６７、０．６８、０．６９、もしくは０．７０倍低い、上記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、約１．６８ｍＬ／時間／ｋｇ、１．６８±０．１ｍＬ／時間／ｋｇ、１．６８±０．２ｍＬ／時間／ｋｇ、１．６８±０．３ｍＬ／時間／ｋｇ、１．６８±０．４ｍＬ／時間／ｋｇ、１．６８±０．５ｍＬ／時間／ｋｇ、１．６８±０．６ｍＬ／時間／ｋｇ、もしくは１．６８±０．７ｍＬ／時間／ｋｇの上記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、約１．３１〜２．１５ｍＬ／時間／ｋｇの上記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、約２．３２ｍＬ／時間／ｋｇ、２．３２±０．１ｍＬ／時間／ｋｇ、２．３２±０．２ｍＬ／時間／ｋｇ、２．３２±０．３ｍＬ／時間／ｋｇ、２．３２±０．４ｍＬ／時間／ｋｇ、２．３２±０．５ｍＬ／時間／ｋｇ、２．３２±０．６ｍＬ／時間／ｋｇ、もしくは２．３２±０．７ｍＬ／時間／ｋｇの上記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、約１．６４〜３．２９ｍＬ／時間／ｋｇの上記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約１．４９ｍＬ／時間／ｋｇ、１．４９±０．１ｍＬ／時間／ｋｇ、１．４９±０．２ｍＬ／時間／ｋｇ、１．４９±０．３ｍＬ／時間／ｋｇ、１．４９±０．４ｍＬ／時間／ｋｇ、１．４９±０．５ｍＬ／時間／ｋｇ、１．４９±０．６ｍＬ／時間／ｋｇ、もしくは１．４９±０．７ｍＬ／時間／ｋｇの上記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約１．１６〜１．９２ｍＬ／時間／ｋｇの上記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約１．５２ｍＬ／時間／ｋｇ、１．５２±０．１ｍＬ／時間／ｋｇ、１．５２±０．２ｍＬ／時間／ｋｇ、１．５２±０．３ｍＬ／時間／ｋｇ、１．５２±０．４ｍＬ／時間／ｋｇ、１．５２±０．５ｍＬ／時間／ｋｇ、１．５２±０．６ｍＬ／時間／ｋｇ、もしくは１．５２±０．７ｍＬ／時間／ｋｇの上記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）；または
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約１．０５〜２．２０ｍＬ／時間／ｋｇの上記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）。
いくつかの実施形態では、長時間作用性のＦＶＩＩＩは、患者の個体群に投与した場合に、１つまたはそれ以上の以下の特性を有する：
ワンステージ（ａＰＴＴ）分析またはツーステージ（色素生産性）分析により測定した場合に、全長の、成熟したＦＶＩＩＩからなる、同じ量のポリペプチドで投与された対象におけるＭＲＴより、少なくとも１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５０、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６０、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７０、１．７１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８０、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、１．９０、１．９１、１．９２、もしくは１．９３倍高い、上記対象におけるＭＲＴ；
ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、約２７時間、２７±１時間、２７±２時間、２７±３時間、２７±４時間、２７±５時間、２７±６時間、２７±７時間、２７±８時間、２７±９時間、もしくは２７±１０時間の上記対象におけるＭＲＴ（活性）；
ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、約２０．６〜３５．３時間の上記対象におけるＭＲＴ（活性）；
ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約２３．９〜２８．５時間の上記対象におけるＭＲＴ（活性）；
ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約１９．８〜２８．９時間の上記対象におけるＭＲＴ（活性）；または
ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約２０．５〜３９．６時間の上記対象におけるＭＲＴ（活性）。
他の実施形態では、長時間作用性のＦＶＩＩＩは、患者の個体群に投与した場合に、１つまたはそれ以上の以下の特性を有する：
ワンステージ（ａＰＴＴ）分析またはツーステージ（色素生産性）分析により測定した場合に、全長の、成熟したＦＶＩＩＩからなる、同じ量のポリペプチドで投与された対象における増分回収率と同等である、上記対象における増分回収率；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約２．４４ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．４４±０．１ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．４４±０．２ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．４４±０．３ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．４４±０．４ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．４４±０．５ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．４４±０．６ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．４４±０．７ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．４４±０．８ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．４４±０．９ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．４４±１．０ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．４４±１．１ＩＵ／ｄＬ、もしくはＩＵ／ｋｇあたり２．４４±１．２ＩＵ／ｄＬの上記対象における増分回収率；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約２．１２〜２．８１ＩＵ／ｄＬの上記対象における増分回収率；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約１．８３ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１．８３±０．１ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１．８３±０．２ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１．８３±０．３ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１．８３±０．４ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１．８３±０．５ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１．８３±０．６ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１．８３±０．７ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１．８３±０．８ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１．８３±０．９ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１．８３±１．０ＩＵ／ｄＬ、もしくはＩＵ／ｋｇあたり１．８３±１．１ＩＵ／ｄＬの上記対象における増分回収率；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約１．５９〜２．１０ＩＵ／ｄＬの上記対象における増分回収率；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約３．０９ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり３．０９±０．１ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり３．０９±０．２ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり３．０９±０．３ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり３．０９±０．４ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり３．０９±０．５ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり３．０９±０．６ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり３．０９±０．７ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり３．０９±０．８ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり３．０９±０．９ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり３．０９±１．０ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり３．０９±１．１ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり３．０９±１．２ＩＵ／ｄＬ、もしくはＩＵ／ｋｇあたり３．０９±１．３ＩＵ／ｄＬの上記対象における増分回収率；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約２．８０ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．８０±０．１ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．８０±０．２ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．８０±０．３ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．８０±０．４ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．８０±０．５ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．８０±０．６ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．８０±０．７ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．８０±０．８ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．８０±０．９ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．８０±１．０ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２．８０±１．１ＩＵ／ｄＬ、もしくはＩＵ／ｋｇあたり２．８０±１．２ＩＵ／ｄＬの上記対象における増分回収率；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約２．６１〜３．６６ＩＵ／ｄＬの上記対象における増分回収率；または
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約２．２４〜３．５０ＩＵ／ｄＬの上記対象における増分回収率。
さらに他の実施形態では、長時間作用性のＦＶＩＩＩは、患者の個体群に投与した場合に、１つまたはそれ以上の以下の特性を有する：
ワンステージ（ａＰＴＴ）分析またはツーステージ（色素生産性）分析により測定した場合に、全長の、成熟したＦＶＩＩＩからなる、同じ量のポリペプチドで投与された対象におけるＶｓｓ（活性）と同等である、上記対象におけるＶｓｓ（活性）；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、約４５．５ｍＬ／ｋｇ、４５．５±１ｍＬ／ｋｇ、４５．５±２ｍＬ／ｋｇ、４５．５±３ｍＬ／ｋｇ、４５．５±４ｍＬ／ｋｇ、４５．５±５ｍＬ／ｋｇ、４５．５±６ｍＬ／ｋｇ、４５．５±７ｍＬ／ｋｇ、４５．５±８ｍＬ／ｋｇ、４５．５±９ｍＬ／ｋｇ、４５．５±１０ｍＬ／ｋｇ、もしくは４５．５±１１ｍＬ／ｋｇの上記対象におけるＶｓｓ（活性）；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、約３９．３〜５２．５ｍＬ／ｋｇの上記対象におけるＶｓｓ（活性）；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、約６２．８ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１ｍＬ／ｋｇ、６２．８±２ｍＬ／ｋｇ、６２．８±３ｍＬ／ｋｇ、６２．８±４ｍＬ／ｋｇ、６２．８±５ｍＬ／ｋｇ、６２．８±６ｍＬ／ｋｇ、６２．８±７ｍＬ／ｋｇ、６２．８±８ｍＬ／ｋｇ、６２．８±９ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１０ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１１ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１２ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１３ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１４ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１５ｍＬ／ｋｇ、もしくは６２．８±１６ｍＬ／ｋｇの上記対象におけるＶｓｓ（活性）；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、約５５．２〜７１．５ｍＬ／ｋｇの上記対象におけるＶｓｓ（活性）；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約３５．９ｍＬ／ｋｇ、３５．９±１ｍＬ／ｋｇ、３５．９±２ｍＬ／ｋｇ、３５．９±３ｍＬ／ｋｇ、３５．９±４ｍＬ／ｋｇ、３５．９±５ｍＬ／ｋｇ、３５．９±６ｍＬ／ｋｇ、３５．９±７ｍＬ／ｋｇ、３５．９±８ｍＬ／ｋｇ、３５．９±９ｍＬ／ｋｇ、３５．９±１０ｍＬ／ｋｇ、３５．９±１１ｍＬ／ｋｇ、３５．９±１２ｍＬ／ｋｇ、もしくは３５．９±１３ｍＬ／ｋｇの上記対象におけるＶｓｓ（活性）；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約３０．４〜４２．３ｍＬ／ｋｇの上記対象におけるＶｓｓ（活性）；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約４３．４ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１ｍＬ／ｋｇ、４３．４±２ｍＬ／ｋｇ、４３．４±３ｍＬ／ｋｇ、４３．４±４ｍＬ／ｋｇ、４３．４±５ｍＬ／ｋｇ、４３．４±６ｍＬ／ｋｇ、４３．４±７ｍＬ／ｋｇ、４３．４±８ｍＬ／ｋｇ、４３．４±９ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１０ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１１ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１２ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１３ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１４ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１５ｍＬ／ｋｇ、もしくは４３．４±１６ｍＬ／ｋｇの上記対象におけるＶｓｓ（活性）；または
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、約３８．２〜４９．２ｍＬ／ｋｇの上記対象におけるＶｓｓ（活性）。
さらなる他の実施例では、長時間作用性のＦＶＩＩＩは、患者の個体群に投与した場合に、１つまたはそれ以上の以下の特性を有する：
ワンステージ（ａＰＴＴ）分析またはツーステージ（色素生産性）分析により測定した場合に、全長の、成熟したＦＶＩＩＩからなる、同じ量のポリペプチドで投与された対象におけるＡＵＣＩＮＦよりも少なくとも１．４５ １．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５０、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６０、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７０、１．７１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８０、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、１．９０倍高い、上記対象におけるＡＵＣＩＮＦ；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約１４４０±３１６ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬの上記対象におけるＡＵＣＩＮＦ；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約１１６０〜１８８０ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬの上記対象におけるＡＵＣＩＮＦ；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約１４８０ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１４８０±１００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１４８０±２００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１４８０±３００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１４８０±４００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１４８０±５００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１４８０±６００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１４８０±７００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１４８０±８００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１４８０±９００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、もしくはＩＵ／ｋｇあたり１４８０±１０００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬの上記対象におけるＡＵＣＩＮＦ；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約２９１０±１３２０ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬの上記対象におけるＡＵＣＩＮＦ；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約１９８０〜３９７０ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬの上記対象におけるＡＵＣＩＮＦ；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ワンステージ（ａＰＴＴ）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約２８００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２８００±１００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２８００±２００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２８００±３００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２８００±４００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２８００±５００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２８００±６００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２８００±７００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２８００±８００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり２８００±９００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、もしくはＩＵ／ｋｇあたり２８００±１０００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬの上記対象におけるＡＵＣＩＮＦ；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約１６６０ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１６６０±１００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１６６０±２００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１６６０±３００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１６６０±４００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１６６０±５００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１６６０±６００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１６６０±７００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１６６０±８００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり１６６０±９００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、もしくはＩＵ／ｋｇあたり１６６０±１０００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬの上記対象におけるＡＵＣＩＮＦ；
約２５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約１３００〜２１２０ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬの上記対象におけるＡＵＣＩＮＦ；
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約４２８０ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±１００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±２００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±３００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±４００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±５００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±６００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±７００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±８００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±９００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±１０００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±１１００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±１２００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±１３００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±１４００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、ＩＵ／ｋｇあたり４２８０±１５００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬ、もしくはＩＵ／ｋｇあたり４２８０±１６００ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬの上記対象におけるＡＵＣＩＮＦ；または
約６５ＩＵ／ｋｇキメラポリペプチドが投与される際、ツーステージ（色素生産性）分析により測定した、ＩＵ／ｋｇあたり約２９６０〜６１９０ｈｒ＊ＩＵ／ｄＬの上記対象におけるＡＵＣＩＮＦ。
本明細書で使用される「オンデマンドでの治療」は、短い時間にわたって行うことを意図しており、出血の発症のような現状にまたは予定した手術のような認識された必要性に応じた治療を意味する。「オンデマンドでの治療」および「発症時治療」という用語は、互換的に使用される。オンデマンドでの（突発的）治療を必要とし得る状況は、例えば、出血の発症、関節出血、筋肉出血、経口出血、出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、筋肉内出血、経口出血、外傷、頭部の外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙での出血、腹膜後隙での出血、または腸腰筋鞘（ｉｌｌｉｏｐｓｏａｓ ｓｈｅａｔｈ）での出血を含む。対象は、外科的予防、周術期管理、または外科的処置に関する治療を必要とし得る。そのような外科的処置は、例えば、小手術、大手術、抜歯、扁桃摘出術、鼠径部ヘルニア切開術、滑膜切除術、人工膝関節全置換、開頭術、骨接合術、外傷の手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、または関節置換術を含む。
一実施形態では、オンデマンドでの（突発的）治療は、単一用量で、出血（例えば、自然発症の出血）の８０％超（８０％超、８１％超、８２％超、８３％超、８４％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、もしくは１００％）または８０〜１００％、８０〜９０％、８５〜９０％、９０〜１００％、９０〜９５％、もしくは９５〜１００％を消散させる。他の実施形態では、８０％超（８１％超、８２％超、８３％超、８４％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、もしくは１００％）または、８０〜１００％、８０〜９０％、８５〜９０％、９０〜１００％、９０〜９５％、もしくは９５〜１００％の出血の発症は、オンデマンドでの（突発的）治療後に、医師により優または良であると評価される。他の実施形態では、出血の発症の５％超（６％超、７％超、８％超、９％超、１０％超、１１％超、１２％超、１３％超、１４％超、１５％超、１６％超、１７％超、１８％超、１９％超、２０％超）または５〜２０％、５〜１５％、５〜１０％、１０〜２０％、もしくは１０〜１５％が、オンデマンドでの（突発的）治療後に、医師により可であると評価される。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は互換的に使用され、共有結合したアミノ酸残基を含む高分子化合物を指す。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は互換的に使用され、共有結合したヌクレオチド残基からなる高分子化合物を指す。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖、ベクター、プラスミド、ファージ、またはウイルスであり得る。ポリヌクレオチドは、例えば、表２のポリペプチドをコードする表１のものを含む（表１参照）。また、ポリヌクレオチドは、表２のＦＶＩＩＩ、Ｆｃ、シグナル配列、６Ｈｉｓ、およびポリペプチドの他の断片のような、例えば表２のポリペプチドの断片をコードするもの、例えば表１のポリヌクレオチドの断片を含む。
本明細書で使用される「予防的処置」は、対象の血漿におけるＦＶＩＩＩ活性のレベルを増加させるために、ある時間にわたって、対象に複数回投与でＦＶＩＩＩポリペプチドを投与することを意味する。増加したレベルは、特発性出血の発生率を減少させるのに、または、例えば、不慮の負傷の場合に出血を防止するのに十分であり得る。予防的処置の間、対象における血漿タンパク質レベルは、その対象に関するベースラインレベル、または、重篤な血友病を特徴づけるＦＶＩＩＩのレベル（＜１ＩＵ／ｄｌ［１％］）を下回り得ない。
一実施形態では、予防計画は、例えば、各患者に関するＰＫデータを測定することおよび１〜３％ＦＶＩＩＩ活性のトラフレベルを維持する投与間隔で本開示のＦＶＩＩＩを投与することにより、個々の患者に対して「適合」されている。対象が経過（ｒｏｌｌｉｎｇ）２か月の期間にわたって、２以上の特発性出血発症として定義される、許容できない出血の発症を経験する場合に、調節がなされ得る。この場合、調節は、３〜５％のトラフレベルを目標とするであろう。他の実施形態では、予防的処置は、出血の防止および制御、出血の持続性の制御、出血からの持続する保護、および／または持続する利益をもたらす。予防、例えば、持続する保護は、最後に測定した時点（ＡＵＣ−ＬＡＳＴ）に対して増加したＡＵＣおよび減少したクリアランスにより示され得、短く作用するＦＶＩＩＩと比較して増加した終末ｔ１／２をもたらす。予防は、短期間作用のＦＶＩＩＩに対して、よりよいＣｍａｘ、よりよいＴｍａｘ、および／またはより長い平均滞留時間により示され得る。いくつかの実施形態では、予防は、注入後（例えば、最後の注入）約２４、３６、４８、７２、または９６時間（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、または９６時間）以内に特発性出血の発症をもたらさない。ある実施形態では、予防は、週に１度の投与（例えば、６５ＩＵ／ｋｇで）により、年率換算した出血の発症において、３０％超（例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９６、８７、８８、８９、または９０％以上、例えば、５０％超）の平均減少をもたらす。
本明細書で使用される「対象」は、ヒト個体を意味する。対象は、出血障害に現在苦しんでいる、または、そのような治療を必要とすることが予想される患者であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、これまでに凝固因子により治療を受けたことがない（つまり、対象はこれまでに治療を受けていない対象またはこれまでに治療を受けていない患者である）。いくつかの実施形態では、対象は胎児であり、本方法は、胎児の母親にキメラポリペプチドを投与すること、および、対象への投与は胎盤を介して母親から行うことを含む。いくつかの実施形態では、対象は子供または大人である。いくつかの実施形態では、対象は、１歳未満、２歳未満、３歳未満、４歳未満、５歳未満、６歳未満、７歳未満、８歳未満、９歳未満、１０歳未満、１１歳未満、または１２歳未満の子供である。いくつかの実施形態では、子供は１歳未満である。いくつかの実施形態では、子供または大人は出血障害を発生し、出血障害の徴候の始まりは１歳以降である。いくつかの実施形態では、対象へのキメラポリペプチドの投与は、体液性の免疫応答、細胞媒介性の免疫応答、または凝固因子に対する体液性の免疫応答および細胞媒介性の免疫応答の両方、から選択される免疫応答の発生を防止、阻害、または低減するのに十分である。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、対象は、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答の発生のリスクがある。例えば、対象はこれまでに阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発生し、または現在阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を有しているため、対象は阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答の発生のリスクがあり得る。いくつかの実施形態では、対象は、血漿由来ＦＶＩＩＩ製品による治療後に阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発生した。いくつかの実施形態では、対象は、組換えＦＶＩＩＩ製品による治療後に阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発生した。いくつかの実施形態では、対象は、全長ＦＶＩＩＩタンパク質による治療後に阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発生した。いくつかの実施形態では、対象は、欠失、例えば、Ｂドメインの全部または部分欠失を含むＦＶＩＩＩタンパク質による治療後に阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発生した。
いくつかの実施形態では、対象は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）／ＲＥＦＡＣＴＯ ＡＢ（登録商標）、ＨＥＭＯＦＩＬ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＡＲＣ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＯＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＡＴＥ−ＤＶＩ（登録商標）、およびＨＹＡＴＥ：Ｃ（登録商標）からなる群から選択されるＦＶＩＩＩ製品による治療後に阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発生した。
いくつかの実施形態では、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩによる治療後の免疫応答は、凝固因子に対する阻害抗体の産生を含む。いくつかの実施形態では、阻害抗体濃度は少なくとも０．６ベセスダ単位（ＢＵ）である。いくつかの実施形態では、阻害抗体濃度は少なくとも５ＢＵである。いくつかの実施形態では、阻害抗体濃度は、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．５、少なくとも２．０、少なくとも３．０、少なくとも４．０、少なくとも５．０、少なくとも６．０、少なくとも７．０、少なくとも８，０、少なくとも９．０または、少なくとも１０．０ＢＵである。
いくつかの実施形態では、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩによる治療後の免疫応答は、細胞媒介性の免疫応答を含む。いくつかの実施形態では、免疫応答は細胞媒介性の免疫応答を含む。細胞媒介性の免疫応答は、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、およびＴＮＦ−αからなる群から選択されるサイトカインの放出を含み得る。
いくつかの実施形態では、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩによる治療後の免疫応答は、増加した出血傾向、高い凝固因子の消費、凝固因子治療に対する反応の欠如、凝固因子治療の減少した効能、および凝固因子の短くなった半減期、からなる群から選択される臨床症状を含む。いくつかの実施形態では、対象は、凝固因子遺伝子における突然変異または欠失を有する。いくつかの実施形態では、対象は、凝固因子遺伝子における再配置を有する。いくつかの実施形態では、対象は重篤な血友病を有する。いくつかの実施形態では、対象は、凝固因子に対する阻害性免疫応答を以前発生したことがある親族を有する。いくつかの実施形態では、対象は、インターフェロン療法を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、抗ウイルス療法を受けている。
いくつかの実施形態では、リスクのある対象は、ＦＶＩＩＩ以外の治療タンパク質に対する阻害性免疫応答を以前発生している。
さらに、対象は、また、対象が阻害性免疫応答を発生する可能性を増加させる、多くの環境または遺伝因子の結果として、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答の発生のリスクを有し得る。対象が阻害性免疫応答を発生する可能性を増加させる因子が知られる。参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Kasper,C. "Diagnosis and Management of Inhibitors to FactorsVIII and IX〜 AnIntroductory Discussion forPhysicians," Treatment of Hemophilia 34 (2004)参照。例えば、阻害物質は、軽度または中程度の血友病
よりも、重篤な血友病（例えば、１％未満のＦＶＩＩＩベースラインレベル）において、より一般的に生じる。参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Reportof Expert Meeting on FVIII Products and InhibitorDevelopment, EuropeanMedicines Agency (February 28, 2006-March 2, 2006)参照。
対象が阻害性免疫応答を発生する可能性を遺伝因子が増加させ得るという事実の結果として、ＦＶＩＩＩまたは他の治療タンパク質に対する阻害性免疫応答を発生したことがある少なくとも１人の家族（例えば、兄弟、親、子供、祖父母、叔母、叔父、またはいとこ）を有する対象は、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答発生の危険性があり得る。
阻害物質は、大きな遺伝子欠失、未成熟終止コドンを生じさせるナンセンス突然変異、およびＦＶＩＩＩ遺伝子における大きな転移のような、ＦＶＩＩＩの発現を防止する遺伝子突然変異を有する患者において一般的である。このように、いくつかの実施形態では、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答の発生のリスクを有する対象は、ＦＶＩＩＩ遺伝子における突然変異、欠失、または再構成を含む。いくつかの実施形態では、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答の発生のリスクを有する対象は、ＦＶＩＩＩがＴ細胞に結合することを妨げる、ＦＶＩＩＩにおける突然変異を含む。ＦＶＩＩＩ遺伝子の大きな再構成を有する阻害物質の関連性が観察されている。参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Astermarket al., Blood 107:3167-3172 (2006)参照。したがって、いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＦＶＩＩＩ遺伝子における大きな再構成、例えば、イントロン２２転移またはイントロン１転移を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃが、ＦＶＩＩＩにおける２つの大きな再構成を有する対象に投与される。ヌル突然変異との阻害物質の関連性も、観察ている。Astermarket al., Blood 108:3739-3745 (2006)。したがって、いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、ヌル突然変異を有する対象に投与される。
また、阻害物質は、いくつかの場合のみにおいて、外因性の凝固因子による治療後により一般的に生じる。よって、いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答の発生のリスクを有する対象は、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、または５未満の暴露日を有している。いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答の発生のリスクを有する対象は、ＦＶＩＩＩによる治療にこれまで暴露されていない。
いくつかの実施形態では、対象は胎児である。免疫寛容は、胎児の母親にＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチドを投与することにより、胎児において誘導され得る。
また、阻害物質は、黒人のアフリカ系統でより一般的に生じる。参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Kasper, C."Diagnosis and Management of Inhibitors
to FactorsVIII and IX-An Introductory Discussion for Physicians,"Treatment ofHemophilia 34 (2004)参照。したがって、いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答の発
生のリスクを有する対象は、黒人のアフリカ系統である。
ＦＶＩＩＩ以外の遺伝子における遺伝子突然変異も、阻害性免疫応答を発生する増加したリスクと関連付けられている。例えば、ＴＮＦの増加した構成型および誘導転写レベルに関連する、Ｈａｐ２内のＴＮＦ−α−３０８Ｇ＞Ａ多型が、阻害性免疫応答の発生の増加したリスクと関連付けられている。参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Astermarket al., Blood 108: 3739-3745 (2006)参照。したがって、いくつかの実
施形態では、阻害性免疫応答の発生のリスクを有する対象は、増加したＴＮＦ−αに関連する遺伝子多型を有する。いくつかの実施形態では、多型は、ＴＮＦ−α−３０８Ｇ＞Ａ多型である。いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答の発生のリスクを有する対象は、ＩＬ１０遺伝子における多型、例えば、ＩＬ１０の増加した分泌に関連する多型を有する。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃは、ＩＬ１０遺伝子のプロモーター領域（ｐｒｏｍｏｔｅ ｒｅｇｉｏｎ）におけるＩＬ１０Ｇマイクロサテライトの対立遺伝子１３４により、対象に投与される。参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Astermarket al. Hemostatis, Thrombosis, and Vascular Biology 108:3739-3745 (2006)参照。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答の発生のリスクを有する対象は、減少したＣＴＬＡ−４（細胞毒性Ｔリンパ球抗原４）発現に関連する遺伝子多型を有する。いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答の発生のリスクを有する対象は、ＤＲ１５（ＨＬＡ−ＤＲ１５）またはＤＱＢ０６０２ ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩＩ分子における突然変異を有する。血友病を有する対象における阻害性免疫応答の発生に関連する他のＭＨＣクラスＩＩ分子は、Ａ３、Ｂ７、Ｃ７、ＤＱＡ０１０２、Ｃ２、ＤＱＡ０１０３、ＤＱＢ０６０３、およびＤＲ１３である（Inhibitorsin Patients with Hemophilia, E.C. Rodriguez-Merchan &C.A. Lee, Eds.,Blackwell Science, Ltd,, 2002参照）。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答の発生のリスクを有する対象は、これまでに凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩに暴露されていない。いくつかの実施形態では、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩに対する阻害性免疫応答の発生のリスクを有する対象は、ＦＶＩＩＩに暴露されている。いくつかの実施形態では、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩに対する阻害性免疫応答の発生のリスクを有する対象は、１５０未満、５０未満、または２０未満のＦＶＩＩＩの暴露日を有する。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日の凝固因子暴露を有している。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、または５０日の凝固因子暴露を有している。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０日の凝固因子暴露を有している。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答は阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答である。いくつかの実施形態では、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）／ＲＥＦＡＣＴＯ ＡＢ（登録商標）、ＨＥＭＯＦＩＬ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＡＲＣ−Ｍ（登録商標）、ＭＯＮＯＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、ＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＡＴＥ−ＤＶＩ（登録商標）、およびＨＹＡＴＥ：Ｃ（登録商標）からなる群から選択されるＦＶＩＩＩ製品に対する応答を発生した。いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答は、組換えＦＶＩＩＩ製品に応答して発生する阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答である。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答の発生のリスクを有する対象は、免疫賦活性の治療を受けているまたは最近受けた。例えば、阻害物質はまた、インターフェロンによる治療を受けているＨＣＶ陽性血友病Ａ患者において、並びに、抗レトロウイルス治療に関連する免疫再構築炎症反応症候群を有するＨＩＶ陽性血友病Ａ患者においても報告されている。参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Reportof Expert Meeting on FVIII Products and InhibitorDevelopment, EuropeanMedicines Agency (February 28, 2006-March 2, 2006)参照。したがって、いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答の発生のリスクを有する対象はインターフェロン療法を受けている。いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答の発生のリスクを有する対象は、抗レトロウイルス治療を受けており、免疫再構築炎症反応症候群を有している。
阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答は、ＦＶＩＩＩ治療に対する臨床反応に基づいて測定され得る。ＦＶＩＩＩ阻害物質の臨床症状は知られており、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Kasper,C. "Diagnosis and Management of Inhibitors to FactorsVIII and IX−AnIntroductory Discussion forPhysicians," Treatment of Hemophilia 34 (2004)に記載されている。例えば、阻害物質の存在は出血のコントロールを難しくし、そのため、ＦＶＩＩＩに対する免疫応答は、増加した出血傾向、高いＦＶＩＩＩ消費、ＦＶＩＩＩ治療に対する反応の欠如、ＦＶＩＩＩ治療の減少した効能、および／またはＦＶＩＩＩの短くなった半減期により特徴づけられる。
また、阻害ＦＶＩＩＩＩ免疫応答は、ベセスダ検査（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ｔｅｓｔ）またはベセスダ検査のナイメゲン変法（Ｎｉｊｍｅｇａｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のような臨床検査を用いて測定され得る。少なくとも０．６ベセスダ単位（ＢＵ）のレベルが、阻害性免疫応答の存在を示し得る。少なくとも５ベセスダ単位（ＢＵ）のレベルが、高い力価の阻害物質の存在を示し得る。また、ｉｎ ｖｉｖｏの急速投与ＦＶＩＩＩ注入の半減期および回収率の測定が用いられる。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫応答の発生のリスクを有する対象は、これまでに、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．５、少なくとも２．０、少なくとも３．０、少なくとも４．０、少なくとも５．０、少なくとも６．０、少なくとも７．０、少なくとも８．０、少なくとも９．０、または少なくとも１０．０ＢＵピーク力価の、阻害性免疫応答を発生している。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、本方法は、対象が阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を発生するリスクがあるかどうかを判定し、対象がリスクを有する場合にはＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチド対象に投与することを含む。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、対象がＦＶＩＩＩにおける突然変異、欠失、または再構成を有するかどうかを判定し、対象が有する場合にはキメラポリペプチドを投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象がＦＶＩＩＩタンパク質を産生しているかどうかを判定し、対象が産生していない場合にはキメラポリペプチドを投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象が軽度、中程度、または重篤な血友病であるかどうかを判定し、対象が重篤な血友病である場合にはキメラポリペプチドを投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象が阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答を有しているかどうかを、例えば、免疫応答の臨床症状を評価すること、抗ＦＶＩＩＩ抗体のレベル、力価、もしくは活性を測定すること、または細胞媒介性の免疫応答を計測することにより（例えば、サイトカインのレベルを計測することにより）判定し、対象がこれらの指標のうち少なくとも１つを有する場合にはキメラポリペプチドを投与することを含む。
本明細書で使用される「治療量」は、本明細書に記載されるように、治療目標を達成する投与量を意味する。ＦＶＩＩＩの必要な用量の算出は、経験的な発見に基づき、平均してｋｇ体重あたり１ＩＵのＦＶＩＩＩが血漿ＦＶＩＩＩ活性を約２ＩＵ／ｄＬまで上昇させる。必要とされる用量は、以下の式を用いて決定される。
必要とされる単位数＝体重（ｋｇ）×所望のＦＶＩＩＩ上昇（ＩＵ／ｄＬまたは正常時の％）×０．５（ＩＵ／ｄＬあたりＩＵ／ｋｇ）
本開示の方法において用いられ得る治療量は、約１０〜１００ＩＵ／ｋｇであり、より具体的には、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００ＩＵ／ｋｇであり、さらに具体的には、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ＩＵ／ｋｇである。
本開示の方法において使用され得る追加の治療量は約１０〜約１５０ＩＵ／ｋｇ、より具体的には、約１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０ＩＵ／ｋｇ、およびさらに具体的には、約１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０ＩＵ／ｋｇである。
本明細書で使用される「変異体」は、元のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、例えば、ＦＶＩＩＩ凝固活性またはＦｃ（ＦｃＲｎ結合）活性のような、その必須の特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。一般的に、変異体は、元のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、全体として密接に類似し、多くの領域で同じである。変異体は、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド断片、欠失、挿入、およびオリジナルのポリペプチドの修飾されたバージョンを含む。
変異体ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１、３、もしくは５（ＦＶＩＩＩ部分、Ｆｃ部分について、別個にまたはともに）における配列をコードするヌクレオチドと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖、本明細書で挙げている出版物および特許に開示されているもののような既知の突然変異体および組換えＦＶＩＩＩもしくはＦｃの配列をコードするヌクレオチドもしくはその相補鎖、配列番号２、４、もしくは６のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（ＦＶＩＩＩ部分、Ｆｃ部分について、別個にまたはともに）、ならびに／またはあらゆるこれらの核酸分子のポリヌクレオチド断片（例えば、本明細書に記載されるこれらの断片）を含み、または、代替的にこれらからなり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件または低ストリンジェントな条件下で、これらの核酸分子とハイブリダイズするポリヌクレオチドも、変異体として含められ、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドも、それらが機能的である限り含められる。
変異体ポリペプチドは、例えば、配列番号２、４、または６で示されるポリペプチド配列（ＦＶＩＩＩ部分、Ｆｃ部分について、別個にまたはともに）、および／または、これらのいずれかのポリペプチドのポリペプチド断片（例えば、本明細書に記載されるこれらの断片）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含み、または、代替的にこれらからなり得る。
参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも例えば９５％「同一」のヌクレオチド配列を有する核酸にとは、核酸のヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５か所までの突然変異をヌクレオチド配列が含み得ること以外、参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有する核酸を得るために、参照配列における５％までのヌクレオチドが、欠失され得もしくは他のヌクレオチドで置換され得、または、参照配列における全体のヌクレオチドのうち５％までのいくつかのヌクレオチドが、参照配列内に挿入され得る。問い合わせ配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、例えば、配列番号１または３に示される全体の配列、ＯＲＦ（読み取り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ））、または本明細書に記載されるように特定されるあらゆる断片であり得る。
実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本開示のヌクレオチド配列またはポリペプチドと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラムを用いて従来法で測定され得る。一実施形態では、問い合わせ配列（参照またはオリジナル配列）と全体的な配列アラインメントとも称される対象配列間の最良の全体的な適合を決定するための方法は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Brutlaget al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログ
ラムを用いて決定され得る。配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列および対象配列は、ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することにより比較され得る。上記全体的な配列アラインメントの結果は、同一性のパーセンテージで示される。他の実施形態では、同一性のパーセンテージを算出するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントで用いられるパラメータは以下の通りである：マトリクス＝単位（Ｕｎｉｔａｒｙ）、ｋ−タプル（ｔｕｐｌｅ）＝４、ミスマッチペナルティ（Ｍｉｓｍａｔｃｈ
Ｐｅｎａｌｔｙ）＝１、ジョイニングペナルティ（Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝３０、ランダム化グループ長さ（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ）＝０、足きりスコア（Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ）＝１、ギャップペナルティ（Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝５、ギャップサイズペナルティ（Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．０５、ウインドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さのうちの短い方。
対象配列が、内部欠失のためではなく、５’または３’欠失のために問い合わせ配列よりも短い場合、結果に対して手動修正がなされなければならない。これは、同一性のパーセンテージを算出する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’および３’トランケーションを考慮しないからである。問い合わせ配列に関連して、５’または３’末端で切断された対象配列に関し、同一性のパーセンテージが、問い合わせ配列の全体の塩基のパーセンテージとして、一致（ｍａｔｃｈｅｄ）／整列（ａｌｉｇｎｅｄ）されない、対象配列の５’および３’である問い合わせ配列の塩基の数を算出することにより修正される。ヌクレオチドが一致／整列されるかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。このパーセンテージは、その後、最終的な同一性のパーセンテージのスコアにたどり着くために、特定のパラメータを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムにより算出された同一性のパーセンテージから減算される。この修正されたスコアは、本開示の目的で使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢアラインメントにより表示されるように、問い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’の塩基の外側の塩基のみが、同一性のパーセンテージスコアをマニュアルで調節する目的のために算出される。
例えば、９０塩基の対象配列が、同一性のパーセンテージを測定するために１００塩基の問い合わせ配列に対して配置される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、よって、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端の最初の１０の塩基の一致／アラインメントを示さない。１０の非対の塩基は、配列の１０％を表し（問い合わせ配列における塩基の総数と適合しない、５’および３’末端の塩基の数）、そして、１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより算出された同一性のパーセンテージスコアから除算される。残りの９０塩基が完全に一致する場合には、最終的な同一性のパーセンテージは９０％である。他の例では、９０塩基の対象配列は、１００塩基の問い合わせ配列と比較される。このとき、欠失は内部欠失であるため、問い合わせと一致／整列されない対象配列の５’または３’の塩基を有しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより算出される同一性のパーセンテージは、マニュアルで修正されない。繰り返すと、問い合わせ配列と一致／整列されない対象配列の５’および３’の塩基のみがマニュアルで修正される。他のマニュアル修正は、本開示の目的のためにはなされない。
本開示の問い合わせアミノ酸配列に対して例えば少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が、対象ポリペプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり５つまでのアミノ酸変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列と同一であることが意図される。言い換えると、問い合わせアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列における５％までのアミノ酸残基が挿入され、欠失され（インデル）、他のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、または参照配列における残基のうち個々に分散されるこれらの末端位置間のどこかで、または参照配列内の１つまたはそれ以上の隣接する基（ｇｒｏｕｐ）において、生じ得る。
実際問題として、あらゆる特定のポリペプチドが、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、例えば、配列番号２（ＦＶＩＩＩ部分、Ｆｃ部分について、別個にまたはともに）もしくは４、または既知のＦＶＩＩＩもしくはＦｃポリペプチド配列のアミノ酸配列と同じであるかどうかが、既知のコンピュータプログラムを用いて従来法で測定され得る。一実施形態では、問い合わせ配列（参照またはオリジナル配列）と全体的な配列アラインメントとしても参照される対象配列間の最良の全体的な適合を測定するための方法は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Brutlaget al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)のアルゴリズムに基づくＦＡＳ
ＴＤＢコンピュータプログラムを用いて測定され得る。配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列および対象配列は、ともにヌクレオチド配列またはともにアミノ酸配列のいずれかである。上記全体的な配列アラインメントの結果は、同一性のパーセンテージで示される。他の実施形態では、ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで用いられるパラメータは以下の通りである：マトリクス＝ＰＡＭ０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、ジョイニングペナルティ＝２０、ランダム化グループ長さ＝０、足きりスコア＝１、ウインドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウインドウサイズ＝５００または対象アミノ酸配列の長さのうちの短い方。
内部欠失が原因ではなく、Ｎ−またはＣ−末端欠失に起因して対象配列が問い合わせ配列よりも短い場合には、結果に対して手動修正がなされなければならない。これは、全体的な同一性のパーセンテージを算出する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列のＮ−およびＣ−末端トランケーションを考慮しないからである。問い合わせ配列に関連して、Ｎ−およびＣ−末端で切断された対象配列に関し、同一性のパーセンテージが、問い合わせ配列の全体の塩基のパーセンテージとして、対応する対象の残基と一致／整列されない、対象配列のＮ−およびＣ−末端である問い合わせ配列の残基の数を算出することにより修正される。残基が一致／整列されるかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。このパーセンテージは、その後、最終的な同一性のパーセンテージのスコアにたどり着くために、特定のパラメータを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムにより算出された同一性のパーセンテージから減算される。この最終的な同一性のパーセンテージのスコアは、本開示の目的で使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列のＮ−およびＣ−末端に対する残基のみが、同一性のパーセンテージスコアをマニュアルで調節する目的のために考慮される。つまり、対象配列の最も遠いＮ−およびＣ−末端の残基の外側の問い合わせ残基位置のみである。
例えば、９０のアミノ酸残基対象配列は、同一性のパーセンテージを測定するために、１００の残基の問い合わせ配列と整列される。欠失は、対象配列のＮ末端で生じ、よって、ＦＡＳＴＤＢアラインメントはＮ末端における最初の１０の残基の一致／整列を示さない。１０の非対の残基は、配列の１０％を表し（問い合わせ配列における残基の総数と適合しない、Ｎ−およびＣ−末端の残基の数）、そして、１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより算出された同一性のパーセンテージスコアから除算される。残りの９０残基が完全に一致する場合には、最終的な同一性のパーセンテージは９０％になるであろう。他の例では、９０の残基の対象配列は、１００残基の問い合わせ配列と比較される。このとき、欠失は内部欠失であるため、問い合わせと一致／整列されない対象配列のＮ−またはＣ−末端の残基を有しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより算出される同一性のパーセンテージは、マニュアルで修正されない。繰り返すと、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにより表示されるように、問い合わせ配列と一致／整列されない対象配列のＮ−およびＣ−末端の外側の残基位置のみがマニュアルで修正される。他のマニュアル修正は、本開示の目的のためにはなされない。
ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、または両方において変更を含み得る。一実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、または欠失を生じさせる変更を含むが、コードされたポリペプチドの特性または活性を修飾しない。他の実施形態では、ヌクレオチド変異体は、遺伝子コードの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）に起因して、サイレント置換により産生される。他の実施形態では、変異体において５〜１０、１〜５、または１〜２のアミノ酸が、任意の組み合わせで置換され、欠失され、または付加される。ポリヌクレオチド変異体は、例えば、特定の宿主に関するコドンの発現を最適化するため（他への、例えば、大腸菌のような細菌宿主へのヒトｍＲＮＡにおける変化コドン（ｃｈａｎｇｅ ｃｏｄｏｎ））、のような種々の理由のために産生され得る。
天然起源の変異体は、「対立遺伝子変異体」と呼ばれ、生物の染色体上の所与の座を占める遺伝子のいくつかの代替的な形態の１つを指す（Genes II,Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)）。これらの対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドレベルのいずれかを変化させ得、本開示に含まれる。代替的に、非天然起源の変異体は、突然変異誘発技術により、または、直接合成により産生され得る。
プロテインエンジニアリングおよび組換えＤＮＡ技術の既知の方法を用いて、変異体は、ポリペプチドの特性を向上または変化させるために生成され得る。例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸は、生物学的な機能が実質的に欠如することなく、分泌されたタンパク質のＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ronet al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993）は、３、８、または２７アミノ末端アミノ酸残基の欠失後であっても、ヘパリン結合活性を有する変異体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端からの８〜１０アミノ酸残基の欠失後に、１０倍までの高い活性を示した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Dobeliet al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)）。
さらに、変異体は、天然起源のタンパク質に生物活性に類似する生物活性を保持する場合が多い、ということを十分な証拠が示している。例えば、Gayle andcoworkers（参照
によりその全体が本明細書に組み込まれる、J.Biol. Chem 268:22105-22111 (1993)）は
、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる突然変異分析を行った。分子の全長にわたって、変異体ごとに平均して２．５のアミノ酸が変化している、３，５００を超える個々のＩＬ−１ａ突然変異体を生成するために、ランダム化した突然変異誘発を用いた。複数の突然変異が、可能性のあるアミノ酸位置ごとに試験された。研究者は、「分子のほとんどが「結合または生物活性」のいずれにも影響を及ぼさずに変更され得た」ということを見出した（要約参照。）。実際に、試験された３，５００を超えるヌクレオチド配列の中からわずか２３の固有のアミノ酸配列が、野生型とは活性において著しく異なるタンパク質を産生した。
上記のように、ポリペプチド変異体は、例えば、修飾されたポリペプチドを含む。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Meiet al., Blood 116:270-79 (2010)）、タンパク質プロセシング、リン酸化、
プレニル化、ラセミ化、セレン化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニン化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）のようなタンパク質へのアミノ酸の追加を媒介するトランスファーＲＮＡ、およびユビキチン化を含む。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは、あらゆる都合のよい位置で修飾され、例えば、ペグ化されている。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩの露出したアミノ酸の表面、例えば、操作されたシステインであり得る、システインが露出された表面でペグ化される（同上）。いくつかの実施形態では、修飾されたＦＶＩＩＩ、例えば、ペグ化ＦＶＩＩＩは、長時間作用性のＦＶＩＩＩである。
本明細書で使用される「定常状態での分布の量（Ｖｓｓ）」は、内部で薬物が分散する明白な空間（量）である、薬理学で用いられる用語と同じ意味を有する。Ｖｓｓ＝定常状態での、体内における薬物の量を血漿濃度で除した値。
範囲に関する、本明細書で使用される「約」は、範囲の両端を修飾する。よって、「約１０〜２０」は「約１０〜約２０」を意味する。
本明細書で用いられるキメラポリペプチドは、加工されたＦＶＩＩＩもしくは単鎖ＦＶＩＩＩまたはその組み合わせを含み得る。本明細書で使用される「加工されたＦＶＩＩＩ」は、アルギニン１６４８（全長ＦＶＩＩＩに関する）またはアルギニン７５４（Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩに関する）、つまり、細胞内プロセシング部位で切断されているＦＶＩＩＩを意味する。細胞内プロセシング部位での切断に起因して、加工されたＦＶＩＩＩは、２つのポリペプチド鎖、すなわち重鎖である第１の鎖、および軽鎖である第２の鎖を含む。例えば、加工されたＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質（つまり、Ｆｃに融合した重鎖および軽鎖）は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上をそれぞれ約９０ｋＤａおよび１３０ｋＤａ、および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上をそれぞれ９０ｋＤａおよび１０５ｋＤａで流れる。よって、一実施形態では、キメラポリペプチドにおけるＦＶＩＩＩ部分の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％が加工されたＦＶＩＩＩである。
他の実施形態では、キメラポリペプチドにおけるＦＶＩＩＩ部分の約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％が加工されたＦＶＩＩＩである。特定の実施形態では、加工されたＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、単鎖ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドから精製され（または分離され）、キメラポリペプチドにおけるＦＶＩＩＩ部分の少なくとも少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％が加工されたＦＶＩＩＩである。
本明細書で使用される「単鎖ＦＶＩＩＩ」または「ＳＣ ＦＶＩＩＩ」という用語は、アルギニン部位（全長ＦＶＩＩＩに関する残基１６４８（つまり、配列番号６の残基１６６７）、または、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩに関する残基７５４（つまり、配列番号２の残基７７３）で切断されていないＦＶＩＩＩを意味する。よって、本明細書で用いられるキメラポリペプチドにおける単鎖ＦＶＩＩＩは、単鎖を含む。一実施形態では、単鎖ＦＶＩＩＩは、未変化の細胞内プロセシング部位を含む。単鎖ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を約２２０ｋＤａで、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を約１９５ｋＤａで流れ得る。
一実施形態では、単鎖ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、加工されたＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドから精製され（または分離され）、本明細書で用いられるキメラポリペプチドのＦＶＩＩＩ部分の少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％が、単鎖ＦＶＩＩＩである。他の実施形態では、キメラポリペプチドのＦＶＩＩＩ部分の少なくとも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、または約２５％が、単鎖ＦＶＩＩＩである。他の実施形態では、本明細書で使用されるキメラポリペプチドのＦＶＩＩＩ部分の約１％〜約１０％、約５％〜約１５％、約１０％〜約２０％、約１５％〜約２５％、約２０％〜約３０％、約２５％〜約３５％、約３０％〜約４０％が単鎖ＦＶＩＩＩである。
特定の実施形態では、本明細書で使用されるキメラポリペプチドのＦＶＩＩＩ部分の約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、または約２５％が単鎖ＦＶＩＩＩである。他の実施形態では、本明細書で使用されるキメラポリペプチドのＦＶＩＩＩ部分の約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％が単鎖ＦＶＩＩＩである。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの加工されたＦＶＩＩＩに対する単鎖ＦＶＩＩＩの比率は、（ａ）約２５％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約７５％の加工されたＦＶＩＩＩ；（ｂ）約２０％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約８０％の加工されたＦＶＩＩＩ；（ｃ）約１５％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約８５％の加工されたＦＶＩＩＩ；（ｄ）約１０％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約９０％の加工されたＦＶＩＩＩ；（ｅ）約５％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約９５％の加工されたＦＶＩＩＩ；（ｆ）約１％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約９９％の加工されたＦＶＩＩＩ；または（ｇ）約１００％の加工されたＦＶＩＩＩである。
他の実施形態では、キメラポリペプチドの加工されたＦＶＩＩＩに対する単鎖ＦＶＩＩＩの比率は、（ａ）約３０％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約７０％の加工されたＦＶＩＩＩ；（ｂ）約４０％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約６０％の加工されたＦＶＩＩＩ；（ｃ）約５０％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約５０％の加工されたＦＶＩＩＩ；（ｄ）約６０％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約４０％の加工されたＦＶＩＩＩ；（ｅ）約７０％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび加工された約３０％のＦＶＩＩＩ；（ｆ）約８０％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約２０％の加工されたＦＶＩＩＩ；（ｇ）約９０％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約１０％の加工されたＦＶＩＩＩ；（ｈ）約９５％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約５％の加工されたＦＶＩＩＩ；（ｉ）約９９％の単鎖ＦＶＩＩＩおよび約１％の加工されたＦＶＩＩＩ；または（ｊ）約１００％の単鎖ＦＶＩＩＩである。
本明細書で用いられるキメラポリペプチドにおけるＦＶＩＩＩ部分は、ＦＶＩＩＩ活性を有する。ＦＶＩＩＩ活性は、当該技術分野で知られるあらゆる方法により測定され得る。例えば、これらの方法の１つは、発色アッセイであり得る。発色アッセイのメカニズムは、活性化第ＩＸ因子、リン脂質、およびカルシウムイオンの存在下で、活性化したＦＶＩＩＩが第Ｘａ因子への第Ｘ因子の変換を加速させる血液凝固カスケードの原理に基づく。第Ｘａ因子活性は、第Ｘａ因子に特異的なｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）基質の加水分解により評価される。４０５ｎＭで測定されるｐ−ニトロアニリンの放出の初速度は、第Ｘａ因子活性と直接的に比例し、よってサンプル中のＦＶＩＩＩ活性と比例する。
国際血栓止血学会（the International Society on Thrombosis and Hemostatsis (ISTH)）の学術標準化委員会（theScientific and Standardization Committee (SSC)）の分科委員会により、ＦＶＩＩＩおよび第ＩＸ因子による発色アッセイが推奨されている。１９９４年以来、発色アッセイは、ＦＶＩＩＩの濃度の力価（ｐｏｔｅｎｃｙ）の決定に関する、ヨーロッパ薬局方の参照法となっている。よって、一実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性が発色アッセイによりｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される場合、単鎖ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、加工されたＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチド（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドであって、上記加工されたＦＶＩＩＩは２つのＦｃ部分のうち１つのＦｃに融合されている）と同等のＦＶＩＩＩ活性を有する。
他の実施形態では、本開示の単鎖ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、加工されたＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチド（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドであって、上記加工されたＦＶＩＩＩは２つのＦｃ部分のうち１つのＦｃに融合されている）と同等の第Ｘａ因子の生成比率を有する。
第Ｘ因子を第Ｘａ因子へと活性化させるために、活性化した第ＩＸ因子（第ＩＸａ因子）は、Ｃａ２＋、膜リン脂質、およびＦＶＩＩＩ補助因子の存在下で、第Ｘａ因子を形成するために、第Ｘ因子における１つのアルギニン−イソロイシン結合を加水分解する。よって、ＦＶＩＩＩの第ＩＸ因子との相互作用は、凝固経路において決定的である。ある特定の実施形態では、単鎖ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、加工されたＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチド（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドであって、上記加工されたＦＶＩＩＩは２つのＦｃ部分のうち１つのＦｃに融合されている）と同等の速度で第ＩＸ因子と相互に作用し得る。
さらに、ＦＶＩＩＩは、循環時に不活性であり、フォンウィルブランドフォンウィルブランド因子に結合されている。ＦＶＩＩＩはｖＷＦに結合していない場合、急速に分解され、トロンビンの作用によりｖＷＦから放出される。いくつかの実施形態では、単鎖ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、加工されたＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチド（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドであって、上記加工されたＦＶＩＩＩは２つのＦｃ部分のうち１つのＦｃに融合されている）と同等のレベルでフォンウィルブランド因子に結合する。
ＦＶＩＩＩは、カルシウムおよびリン脂質の存在下で、活性化したプロテインＣにより不活化され得る。活性化したプロテインＣはＡ１ドメインにおけるアルギニン３３６の後ろのＦＶＩＩＩ重鎖を切断して第Ｘ因子基質の相互作用部位を攪乱させ、Ａ２ドメインにおけるアルギニン５６２の後ろを切断してＡ２ドメインの解離を高め、並びに、第ＩＸａ因子を有する相互作用部位を攪乱させる。また、この切断は、Ａ２ドメイン（４３ｋＤａ）を二分し、Ａ２−Ｎ（１８ｋＤａ）およびＡ２−Ｃ（２５ｋＤａ）ドメインを生成する。このように、活性化したプロテインＣは、重鎖における複数の切断部位を触媒し得る。一実施形態では、単鎖ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、加工されたＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチド（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドであって、上記加工されたＦＶＩＩＩは２つのＦｃ部分のうち１つのＦｃに融合されている）と同等のレベルで活性化したプロテインＣにより不活化される。
他の実施形態では、単鎖ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、加工されたＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチド（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドであって、上記加工されたＦＶＩＩＩは２つのＦｃ部分のうち１つのＦｃに融合されている）と同等のｉｎ ｖｉｖｏでのＦＶＩＩＩ活性を有する。特定の実施形態では、単鎖ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、ＨｅｍＡマウス尾静脈切断モデルにおいて、加工されたＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチド（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドであって、上記加工されたＦＶＩＩＩは２つのＦｃ部分のうち１つのＦｃに融合されている）と同等のレベルでＨｅｍＡマウスを保護することができる。
本明細書で使用される用語「同等」は、キメラポリペプチドの使用から得られる、比較した速度またはレベルが、参照比率またはレベルと、同じ、実質的に同じ、または類似であることを意味する。本明細書で使用される用語「類似」は、比較した速度またはレベルが、参照速度またはレベル（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドによるＦＸａ生成速度であって、上記加工されたＦＶＩＩＩは２つのＦｃ部分のうち１つのＦｃに融合されている）と、１０％を超えないまたは１５％を超えない差異を有することを意味する。「実質的に同一」という用語は、比較した速度またはレベルが、参照速度またはレベルと、０．０１％、０．５％、または１％を超えない差異を有することを意味する。
本開示は、さらに、ＦＶＩＩＩ活性を有するキメラポリペプチドを含み、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のキメラポリペプチドが、（単鎖ＦＶＩＩＩである）ＦＶＩＩＩ部分、および第２の部分を含む、組成物を含む。他の実施形態では、組成物におけるキメラポリペプチドの約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が単鎖ＦＶＩＩＩである。他の実施形態では、第２の部分はＦｃである。さらなる他の実施形態では、キメラポリペプチドは、他の半減期拡張部分、例えばアルブミンを含む。
さらに他の実施形態では、本開示の組成物は、加工されたＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドと単鎖ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドとの組み合わせを含み、（ａ）キメラポリペプチドの約３０％のＦＶＩＩＩ部分が単鎖ＦＶＩＩＩであり、キメラポリペプチドの約７０％のＦＶＩＩＩ部分が加工されたＦＶＩＩＩである；（ｂ）キメラポリペプチドの約４０％のＦＶＩＩＩ部分が単鎖ＦＶＩＩＩであり、キメラポリペプチドの約６０％のＦＶＩＩＩ部分が加工されたＦＶＩＩＩである；（ｃ）キメラポリペプチドの約５０％のＦＶＩＩＩ部分が単鎖ＦＶＩＩＩであり、キメラポリペプチドの約５０％のＦＶＩＩＩ部分が加工されたＦＶＩＩＩである；（ｄ）キメラポリペプチドの約６０％のＦＶＩＩＩ部分が単鎖ＦＶＩＩＩであり、キメラポリペプチドの約４０％のＦＶＩＩＩ部分が加工されたＦＶＩＩＩである；（ｅ）キメラポリペプチドの約７０％のＦＶＩＩＩ部分が単鎖ＦＶＩＩＩであり、キメラポリペプチドの約３０％のＦＶＩＩＩ部分が加工されたＦＶＩＩＩである；（ｆ）キメラポリペプチドの約８０％のＦＶＩＩＩ部分が単鎖ＦＶＩＩＩであり、キメラポリペプチドの約２０％のＦＶＩＩＩ部分が加工されたＦＶＩＩＩである；（ｇ）キメラポリペプチドの約９０％のＦＶＩＩＩ部分が単鎖ＦＶＩＩＩであり、キメラポリペプチドの約１０％のＦＶＩＩＩ部分が加工されたＦＶＩＩＩである；（ｈ）キメラポリペプチドの約９５％のＦＶＩＩＩ部分が単鎖ＦＶＩＩＩであり、キメラポリペプチドの約５％のＦＶＩＩＩ部分が加工されたＦＶＩＩＩである；（ｉ）キメラポリペプチドの約９９％のＦＶＩＩＩ部分が単鎖ＦＶＩＩＩであり、キメラポリペプチドの約１％のＦＶＩＩＩ部分が加工されたＦＶＩＩＩである；または（ｊ）キメラポリペプチドの約１００％のＦＶＩＩＩ部分が単鎖ＦＶＩＩＩである。
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、ＦＶＩＩＩ活性が発色アッセイによりｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される場合、加工されたＦＶＩＩＩを含む組成物（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドを含む組成物であって、上記加工されたＦＶＩＩＩは２つのＦｃ部分のうち１つに融合されている）と同等のＦＶＩＩＩ活性を有する。
他の実施形態では、本開示の組成物は、加工されたＦＶＩＩＩを含む組成物（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドを含む組成物であって、上記加工されたＦＶＩＩＩは２つのＦｃ部分のうち１つのＦｃに融合されている）と同等の第Ｘａ因子生成速度を有する。さらに他の実施形態では、単鎖ＦＶＩＩＩを含む組成物は、加工されたＦＶＩＩＩを含む組成物（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドを含む組成物であって、上記加工されたＦＶＩＩＩは１つのＦｃに融合されている）と同等の速度で第ＩＸａ因子と相互に作用し得る。
さらなる実施形態では、本組成物のキメラポリペプチドにおける単鎖ＦＶＩＩＩは、組成物のキメラポリペプチドにおける加工されたＦＶＩＩＩ（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドを含む組成物であって、上記加工されたＦＶＩＩＩは２つのＦｃ部分のうち１つのＦｃに融合されている）と同等のレベルで、活性化されたプロテインＣにより不活化される。特定の実施形態では、単鎖ＦＶＩＩＩを含む組成物は、加工されたＦＶＩＩＩを含む組成物（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドを含む組成物であって、上記加工されたＦＶＩＩＩは２つのＦｃ部分のうち１つのＦｃに融合されている）と同等のｉｎ ｖｉｖｏでのＦＶＩＩＩ活性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の単鎖ＦＶＩＩＩを含む組成物は、ＨｅｍＡマウス尾静脈切断モデルにおいて、加工されたＦＶＩＩＩを含む組成物と同等のレベルでＨｅｍＡマウスを保護することができる（例えば、実質的に２つのＦｃ部分および加工されたＦＶＩＩＩからなる、または、これらからなるキメラポリペプチドを含む組成物であって、上記加工されたＦＶＩＩＩは２つのＦｃ部分のうち１つのＦｃに融合されている）。
本開示は、本明細書に開示される組成物を用いて、ヒト対象における出血状態を治療するための方法をさらに提供する。例となる方法は、ＦＶＩＩＩ活性を有するキメラポリペプチドを含む、治療に有効な量の医薬組成物/製剤を、それを必要とする対象に投与する
ことを含み、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のキメラポリペプチドが、（単鎖ＦＶＩＩＩである）ＦＶＩＩＩ部分および第２の部分を含む。
出血状態は、血液凝固障害により生じ得る。また、血液凝固障害は、凝固障害と称することができる。一例では、本開示の医薬組成物により治療され得る血液凝固障害は、血友病またはフォンウィルブランド病（ｖＷＤ）である。他の例では、本開示の医薬組成物により治療され得る血液凝固障害は、血友病Ａである。
いくつかの実施形態では、出血状態に伴う出血のタイプは、関節出血、筋肉出血、経口出血、出血、筋肉内出血、経口出血、外傷、頭部の外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙での出血、腹膜後隙での出血、および腸腰筋鞘での出血から選択される。
他の実施形態では、出血状態に苦しむ対象は、例えば、外科的予防または周術期管理を含む外科的処置に関する治療を必要とする。一例では、手術は、小手術および大手術から選択される。例となる外科手術は、抜歯、扁桃摘出術、鼠径部ヘルニア切開術、滑膜切除術、開頭術、骨接合術、外傷の手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、関節置換術（例えば、人工膝関節全置換、人工股関節置換術等）、心臓手術、および帝王切開術を含む。
他の例では、対象は、ＦＩＸにより同時に治療される。本開示の化合物はＦＩＸａの活性化を可能とするため、それらは、対象へのＦＩＸａの投与前に、ＦＩＸａポリペプチドを予備活性化（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅ）するために使用され得る。
本明細書に開示される方法は、予防的処置またはオンデマンドでの治療を必要とする対象に実施され得る。
少なくとも３０％の単鎖ＦＶＩＩＩを含む医薬組成物は、例えば、局所的（例えば、経皮または目）、経口、頬側、経鼻、膣、直腸、または非経口投与を含む、あらゆる適切な投与の手段のために処方され得る。
本明細書で使用される用語、非経口は、皮下、皮内、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、髄腔内、眼内、眼球周囲、眼窩内、腱滑液鞘内、および腹腔内注入、並びにあらゆる類似の注入または注射技術を含む。また、組成物は、例えば、懸濁液、乳濁液、持続性の放出製剤、クリーム、ゲル、またはパウダーであり得る。組成物は、従来の結合剤および担体、例えばトリグリセリドを有する坐剤として処方され得る。
一例では、薬学的製剤は、液体の製剤、例えば、緩衝、等張、水溶液である。他の例では、医薬組成物は、生理的なまたは生理的に近いｐＨを有する。他の例では、水性製剤は、生理的なまたは生理的に近いモル浸透圧濃度および塩分を有する。それは、塩化ナトリウムおよび／または酢酸ナトリウムを含み得る。いくつかの例では、本開示の組成物は凍結乾燥されている。いくつかの実施形態では、医薬組成物は免疫細胞を含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は細胞を含まない。
また、本開示は、（ａ）凝固因子部分およびＦｃ部分を含むキメラポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、並びに（ｂ）凝固因子に対する免疫寛容を必要とする対象に組成物を投与するための指示、を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットにおけるキメラポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ部分、ＦＶＩＩ部分、またはＦＩＸ部分を含む。他の実施形態では、キットにおけるキメラポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ単量体と二量体のハイブリッド、ＦＶＩＩ単量体と二量体のハイブリッド、またはＦＩＸ単量体と二量体のハイブリッドである。いくつかの実施形態では、上記指示は、凝固因子に対する免疫寛容を必要とする対象を特定するための少なくとも１つのステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫寛容を必要とする対象を特定するためのステップは：
（ｉ）凝固因子遺伝子における突然変異または欠失を有する対象を特定すること；
（ｉｉ）凝固因子遺伝子における再構成を有する対象を特定すること；
（ｉｉｉ）凝固因子に対する阻害性免疫応答をこれまでに発生したことがある親族を有する対象を特定すること；
（ｉｖ）インターフェロン療法を受けている対象を特定すること；
（ｖ）抗ウイルス療法を受けている対象を特定すること；
（ｖｉ）阻害性免疫応答の発生のリスクの増加に関連する、凝固因子をコードする遺伝子以外の遺伝子における遺伝子突然変異を有する対象を特定すること；および
（ｖｉｉ）これらのうち２つまたはそれ以上の組み合わせ、
からなる群のうち１つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、凝固因子をコードする遺伝子以外の遺伝子における遺伝子突然変異は、
（ｉ）ＴＮＦ−αの増加に関連する遺伝子多型；
（ｉｉ）ＩＬ１０の増加に関連する遺伝子多型；
（ｉｉｉ）ＣＴＬＡ−４の減少に関連する遺伝子多型；
（ｉｖ）ＤＲ１５またはＤＱＢ０６０２ ＭＨＣクラスＩＩ分子における突然変異；および
（ｖ）これらのうち２つまたはそれ以上の組み合わせを有する、
からなる群から選択される１つまたはそれ以上の突然変異を含む。
任意に、キットの包装に伴い、薬学的または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形態での注記（ｎｏｔｉｃｅ）であり得、その注記は、ヒトへの投与に関する製造、使用、または販売の機関による認可を示す。
実施形態
Ｅ１． 凝固因子に対する免疫寛容を誘導することを、それを必要とする対象において行う方法であって、キメラポリペプチドを当該対象に投与することを含み、キメラポリペプチドは凝固因子部分およびＦｃ部分を含む、方法。
Ｅ２． 凝固因子に対する阻害物質の発生を防止または阻害する方法であって、凝固因子に対する免疫寛容を必要とする対象にキメラポリペプチドを投与することを含み、キメラポリペプチドは凝固因子部分およびＦｃ部分を含む、方法。
Ｅ３． 実施形態Ｅ１またはＥ２の方法であって、対象は、同等投与量の、凝固因子からなるポリペプチドを投与された場合に、凝固因子に対する阻害性免疫応答を発生する、方法。
Ｅ４． 実施形態Ｅ１からＥ３のいずれかの方法であって、対象は、凝固因子に対する阻害性免疫応答を発生している、方法。
Ｅ５． 実施形態Ｅ１からＥ４のいずれかの方法であって、対象は、これまで凝固因子による治療を行ったことがない、方法。
Ｅ６． 実施形態Ｅ１からＥ５のいずれかの方法であって、凝固因子部分は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、フォンウィルブランド因子、またはその断片を含む、方法。
Ｅ７． 実施形態Ｅ１からＥ５のいずれかの方法であって、対象は胎児であり、方法は、キメラポリペプチドを胎児の母親に投与することをさらに含み、対象への投与は胎盤を介して母親から行う、方法。
Ｅ８． 実施形態Ｅ７の方法であって、凝固因子部分は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、フォンウィルブランド因子、またはその断片を含む、方法。
Ｅ９． 実施形態Ｅ１からＥ６のいずれかの方法であって、対象は子供または大人である、方法。
Ｅ１０． 実施形態Ｅ９の方法であって、対象は、１歳未満、２歳未満、３歳未満、４歳未満、５歳未満、６歳未満、７歳未満、８歳未満、９歳未満、１０歳未満、１１歳未満、または１２歳未満の子供である、方法。
Ｅ１１． 実施形態Ｅ１０の方法であって、子供は１歳未満である、方法。
Ｅ１２． 実施形態Ｅ１１の方法であって、子供または大人は出血障害を発症し、出血障害の徴候の始まりは１歳以降である、方法。
Ｅ１３． 実施形態Ｅ１からＥ１２のいずれかの方法であって、投与は、体液性の免疫応答、細胞媒介性の免疫応答、または凝固因子に対する体液性の免疫応答および細胞媒介性の免疫応答の両方、から選択される免疫応答の発生を防止、阻害、または低減するのに十分である、方法。
Ｅ１４． 実施形態Ｅ１からＥ１３のいずれかの方法であって、組成物は繰り返す投与にて投与される、方法。
Ｅ１５． 実施形態Ｅ１４の方法であって、繰り返す投与のそれぞれは、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、または少なくとも約１５日により、他から隔てられている、方法。
Ｅ１６． 実施形態Ｅ１４またはＥ１５の方法であって、繰り返す投与は、少なくとも約２回の投与、少なくとも約５回の投与、少なくとも約１０回の投与、少なくとも約２０回の投与、少なくとも約２５回の投与、少なくとも約３０回の投与、少なくとも約３５回の投与、少なくとも約４０回の投与、少なくとも約４５回の投与、少なくとも約５０回の投与、少なくとも約５５回の投与、少なくとも約６０回の投与、少なくとも約６５回の投与、または少なくとも約７０回の投与を含む、方法。
Ｅ１７． 実施形態Ｅ１６の方法であって、繰り返す投与は、約２回の投与〜約１００回の投与、約５回の投与〜約８０回の投与、約１０回の投与〜約７０回の投与、約１０回の投与〜約６０回の投与、約１０回の投与〜約５０回の投与、約１５回の投与〜約４０回の投与、約１５回の投与〜約３０回の投与、約２０回の投与〜約３０回の投与、または約２０回の投与〜約４０回の投与、を含む、方法。
Ｅ１８． 実施形態Ｅ１６またはＥ１７の方法であって、繰り返す投与は、約２回の投与、約５回の投与、約１０回の投与、約１５回の投与、約２０回の投与、約２５回の投与、約３０回の投与、約３５回の投与、約４０回の投与、約４５回の投与、約５０回の投与、約５５回の投与、約６０回の投与、約６５回の投与、約７０回の投与、約７５回の投与、約８０回の投与、約９０回の投与、または約１００回の投与を含む、方法。
Ｅ１９． 実施形態Ｅ１４からＥ１８のいずれかの方法であって、繰り返す投与の後に、対象は、凝固因子を含むがＦｃ部分を含まない、凝固因子タンパク質を含む医薬組成物をさらに投与される、方法。
Ｅ２０． 実施形態Ｅ１９の方法であって、凝固因子タンパク質は、全長または成熟した凝固因子である、方法。
Ｅ２１． 実施形態Ｅ１９の方法であって、凝固因子タンパク質は、Ｆｃ部分以外の、１つまたはそれ以上の半減期を延長する部分を含む、方法。
Ｅ２２． 実施形態Ｅ１からＥ２１のいずれかの方法であって、投与が１つまたはそれ以上の出血の発症を治療する、方法。
Ｅ２３． 実施形態Ｅ１からＥ２2のいずれかの方法であって、投与が１つまたはそれ
以上の出血の発症を防止する、方法。
Ｅ２４． 実施形態Ｅ１からＥ２３のいずれかの方法であって、投与が１つまたはそれ以上の出血の発症の発症時治療である、方法。
Ｅ２５． 実施形態Ｅ１からＥ２３のいずれかの方法であって、対象は、外科的予防、周術期管理、または外科的処置に関する治療を必要とする、方法。
Ｅ２６． 実施形態Ｅ２５の方法であって、外科的処置は、小手術、大手術、抜歯、扁桃摘出術、鼠径部ヘルニア切開術、滑膜切除術、人工膝関節全置換、開頭術、骨接合術、外傷の手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、または関節置換術を含む、方法。
Ｅ２７． 実施形態Ｅ１３からＥ２６のいずれかの方法であって、免疫応答は、凝固因子に対する阻害抗体の生成を含む、方法。
Ｅ２８． 実施形態Ｅ２７の方法であって、抗体濃度は少なくとも０．６ベセスダ単位（ＢＵ）である、方法。
Ｅ２９． 実施形態Ｅ２８の方法であって、抗体濃度は少なくとも５ＢＵである、方法。
Ｅ３０． 実施形態Ｅ１３からＥ２６のいずれかの方法であって、免疫応答は、細胞媒介性の免疫応答を含む、方法。
Ｅ３１． 実施形態Ｅ３０の方法であって、細胞媒介性の免疫応答は、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、およびＴＮＦ−αからなる群から選択されるサイトカインの放出を含む、方法。
Ｅ３２． 実施形態Ｅ１３からＥ３１のいずれかの方法であって、免疫応答は、増加した出血傾向、高い凝固因子の消費、凝固因子治療に対する反応の欠如、凝固因子治療の減少した効能、および凝固因子の短くなった半減期、からなる群から選択される臨床症状を含む、方法。
Ｅ３３． 実施形態Ｅ１からＥ３２のいずれかの方法であって、対象は、凝固因子遺伝子における突然変異または欠失を含む、方法。
Ｅ３４． 実施形態Ｅ１からＥ３２のいずれかの方法であって、対象は、凝固因子遺伝子における再構成を有する、方法。
Ｅ３５． 実施形態Ｅ１からＥ３４のいずれかの方法であって、対象は、重篤な血友病を有する、方法。
Ｅ３６． 実施形態Ｅ１からＥ３４のいずれかの方法であって、対象は、これまでに凝固因子に対して阻害性免疫応答を発生したことがある親族を有する、方法。
Ｅ３７． 実施形態Ｅ１からＥ３６のいずれかの方法であって、対象は、インターフェロン療法を受けている、方法。
Ｅ３８． 実施形態Ｅ１からＥ３７のいずれかの方法であって、対象は、抗ウイルス療法を受けている、方法。
Ｅ３９． 実施形態Ｅ１からＥ３８のいずれかの方法であって、対象は、ＴＮＦ−αの増加に関連する遺伝子多型を有する、方法。
Ｅ４０． 実施形態Ｅ３９の方法であって、多型はＴＮＦ−α３０８Ｇ＞Ａである、方法。
Ｅ４１． 実施形態Ｅ１からＥ４０のいずれかの方法であって、対象は、ＩＬ１０の増加に関連する遺伝子多型を有する、方法。
Ｅ４２． 実施形態Ｅ４１の方法であって、多型はＩＬ１０Ｇマイクロサテライトの対立遺伝子１３４である、方法。
Ｅ４３． 実施形態Ｅ１からＥ４２のいずれかの方法であって、対象は、ＣＴＬＡ−４発現の減少に関する遺伝子多型を有する、方法。
Ｅ４４． 実施形態Ｅ１からＥ４３のいずれかの方法であって、対象は、ＤＲ１５またはＤＱＢ０６０２ ＭＨＣクラスＩＩ分子における突然変異を有する、方法。
Ｅ４５． 実施形態Ｅ１からＥ４４のいずれかの方法であって、対象は、１５０凝固因子暴露日（ＥＤ）未満である、方法。
Ｅ４６． 実施形態Ｅ４５の方法であって、対象は、５０ＥＤ未満である、方法。
Ｅ４７． 実施形態Ｅ４６の方法であって、対象は、２０ＥＤ未満である、方法。
Ｅ４８． 実施形態Ｅ３からＥ４７のいずれかの方法であって、阻害性のＦＶＩＩＩ免疫応答が、全長または成熟したＦＶＩＩＩ凝固因子に応答して発生した、方法。
Ｅ４９． 実施形態Ｅ３からＥ４８のいずれかの方法であって、阻害性免疫応答は、組換えＦＶＩＩＩ製品に対する応答を発生させる、阻害物質ＦＶＩＩＩ応答である、方法。
Ｅ５０． 実施形態Ｅ１からＥ４９のいずれかの方法であって、投与は、投与前の数と比較して、対象におけるＦＶＩＩＩに対する抗体の数を減少させる、方法。
Ｅ５１． 実施形態Ｅ１からＥ５０のいずれかの方法であって、投与は、投与前の力価と比較して、対象におけるＦＶＩＩＩに対する抗体の力価を減少させる、方法。
Ｅ５２． 実施形態Ｅ１からＥ５１のいずれかの方法であって、投与は、投与前のレベルと比較して、対象におけるサイトカインのレベルを減少させる、方法。
Ｅ５３． 実施形態Ｅ１からＥ５２のいずれかの方法であって、投与は、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドによるこれまでの治療後の対象における数と比較して、対象におけるＦＶＩＩＩに対する抗体の数を減少させる、方法。
Ｅ５４． 実施形態Ｅ１からＥ５３のいずれかの方法であって、投与は、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドによるこれまでの治療後の対象における力価と比較して、対象におけるＦＶＩＩＩに対する抗体の力価を減少させる、方法。
Ｅ５５． 実施形態Ｅ１からＥ５４のいずれかの方法であって、投与は、ＦＶＩＩＩポリペプチドからなるポリペプチドによるこれまでの治療後の対象におけるレベルと比較して、対象におけるサイトカインのレベルを減少させる、方法。
Ｅ５６． 実施形態Ｅ１からＥ５５のいずれかの方法であって、投与は、対象への凝固因子部分からなるポリペプチドの投与からもたらされる数と比較して、対象における抗凝固因子抗体の数を減少させる、方法。
Ｅ５７． 実施形態Ｅ１からＥ５６のいずれかの方法であって、投与は、対象への凝固因子部分からなるポリペプチドの投与からもたらされるであろう力価と比較して、対象における抗凝固因子抗体の力価を減少させる、方法。
Ｅ５８． 実施形態Ｅ１からＥ５７のいずれかの方法であって、投与は、対象への凝固因子部分からなるポリペプチドの投与からもたらされるであろうレベルと比較して、対象におけるサイトカインのレベルを減少させる、方法。
Ｅ５９． 実施形態Ｅ５２、Ｅ５５、またはＥ５８の方法であって、サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、およびＴＮＦ‐αからなる群から選択される、方法。
Ｅ６０． 実施形態Ｅ１からＥ５９のいずれかの方法であって、キメラポリペプチドの投与前に、
（ａ）凝固因子をコードする遺伝子における突然変異または欠失を有する；
（ｂ）凝固因子をコードする遺伝子における再構成を有する；
（ｃ）これまでに凝固因子に対して阻害性免疫応答を発生したことがある親族を有する；
（ｄ）インターフェロン治療を受けている；
（ｅ）抗ウイルス療法を受けている；
（ｆ）阻害性免疫応答を発生するリスクの増加に関連する凝固因子をコードする遺伝子以外の遺伝子における遺伝子突然変異を有する；および
（ｇ）これらの２つまたはそれ以上の組み合わせを有する、
からなる群から選択される１つまたはそれ以上の特性を対象が有するということを特定することをさらに含む、方法。
Ｅ６１． 実施形態Ｅ６０の方法であって、凝固因子をコードする遺伝子以外の遺伝子における遺伝子突然変異が、
（ｉ）ＴＮＦ−αの増加に関連する遺伝子多型；
（ｉｉ）ＩＬ１０の増加に関連する遺伝子多型；
（ｉｉｉ）ＣＴＬＡ−４の減少に関連する遺伝子多型；
（ｉｖ）ＤＲ１５またはＤＱＢ０６０２ ＭＨＣクラスＩＩ分子における突然変異；および
（ｖ）これらの２つまたはそれ以上の組み合わせを有する、
からなる群から選択される１つまたはそれ以上の突然変異を含む、方法。
Ｅ６２． 実施形態Ｅ６１の方法であって、ＴＮＦ−αの増加に関連する多型は、３０８Ｇ＞Ａである、方法。
Ｅ６３． 実施形態Ｅ６１の方法であって、ＩＬ１０の増加に関連する多型は、ＩＬ１０Ｇマイクロサテライトの対立遺伝子１３４である、方法。
Ｅ６４． 実施形態Ｅ６、Ｅ８からＥ６２のいずれかの方法であって、ＦＶＩＩＩ部分はＦＶＩＩＩ Ａ３ドメインを含む、方法。
Ｅ６５． 実施形態Ｅ６、Ｅ８からＥ６３のいずれかの方法であって、ＦＶＩＩＩ部分はヒトＦＶＩＩＩを含む、方法。
Ｅ６６． 実施形態Ｅ６、Ｅ８からＥ６４のいずれかの方法であって、ＦＶＩＩＩ部分はＢドメインの全部または部分的な欠失を有する、方法。
Ｅ６７． 実施形態Ｅ６、Ｅ８からＥ６６のいずれかの方法であって、ＦＶＩＩＩ部分は、シグナル配列を有しない表２に示されるＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７；配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である、方法。
Ｅ６８． 実施形態Ｅ６、Ｅ８からＥ６６のいずれかの方法であって、ＦＶＩＩＩ部分は、シグナル配列を有しない表２に示されるＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７；配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と同一である、方法。
Ｅ６９． 実施形態Ｅ６、Ｅ８からＥ６６のいずれかの方法であって、ＦＶＩＩＩ部分は、シグナル配列を有する表２に示されるＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である、方法。
Ｅ７０． 実施形態Ｅ６、Ｅ８からＥ６６のいずれかの方法であって、ＦＶＩＩＩ部分は、シグナル配列を有する表２に示されるＦＶＩＩＩアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と同一である、方法。
Ｅ７１． 実施形態Ｅ６、Ｅ８からＥ７０のいずれかの方法であって、ＦＶＩＩＩ部分は凝固活性を有する、方法。
Ｅ７２． 実施形態Ｅ１からＥ７１のいずれかの方法であって、Ｆｃ部分は、表２に示される（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）Ｆｃアミノ酸配列と同一である、方法。
Ｅ７３． 実施形態Ｅ１からＥ７２のいずれかの方法であって、キメラポリペプチドは、キメラポリペプチドに関する第２のポリペプチドを含むハイブリッドの形態であり、第２のポリペプチドは、実質的にＦｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーからなり、または、Ｆｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーからなる、方法。
Ｅ７４． 実施形態Ｅ１からＥ７３のいずれかの方法であって、キメラポリペプチドは、１０〜１００ＩＵ／ｋｇの各投与量で投与される、方法。
Ｅ７５． 実施形態Ｅ７４の方法であって、投与量は、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００ＩＵ／ｋｇである、方法。
Ｅ７６． 実施形態Ｅ７５の方法であって、投与量は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ＩＵ／ｋｇである、方法。
Ｅ７７． 実施形態Ｅ１からＥ７６のいずれかの方法であって、対象は、出血凝固疾患、関節出血、筋肉出血、経口出血、出血、筋肉内出血、経口出血、外傷、頭部の外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙での出血、腹膜後隙での出血、および腸腰筋鞘での出血からなる群から選択される出血状態を有する、方法。
Ｅ７８． 実施形態Ｅ７７の方法であって、出血凝固疾患は血友病Ａである、方法。
Ｅ７９． 実施形態Ｅ６、Ｅ８からＥ６３のいずれかの方法であって、凝固因子部分が第ＩＸ因子を含む、方法。
Ｅ８０． 実施形態Ｅ７９の方法であって、第ＩＸ因子タンパク質は、シグナル配列を有しない表２に示されるＦＩＸアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７；配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と少なくとも９０％、９５％、または１００％同一である、方法。
Ｅ８１． 実施形態Ｅ６、Ｅ８からＥ６３のいずれかの方法であって、キメラポリペプチドは、ＦＩＸ部分およびＦｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む第１の鎖と、実質的にＦｃ部分からなるまたはＦｃ部分からなる第２の鎖とを含む単量体と二量体のハイブリッドである、方法。
Ｅ８２． 実施形態Ｅ６、Ｅ８からＥ６３のいずれかの方法であって、キメラポリペプチドが第ＶＩＩ因子部分を含む、方法。
Ｅ８３． 実施形態Ｅ８２の方法であって、キメラポリペプチドは、ＦＶＩＩ部分およびＦｃ部分を含む第１の鎖と、実質的にＦｃ部分からなるまたはＦｃ部分からなる第２の鎖とを含む単量体と二量体のハイブリッドである、方法。
Ｅ８４． 実施形態Ｅ８２またはＥ８３の方法であって、ＦＶＩＩ部分は、不活性のＦＶＩＩ、活性化したＦＶＩＩ、または活性化可能なＦＶＩＩである、方法。
Ｅ８５． （ａ）凝固因子部分およびＦｃ部分またはＦｃＲｎ結合パートナー部分を含むキメラポリペプチド、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、並びに（ｂ）凝固因子に対する免疫寛容を必要とする対象に組成物を投与するための指示、を含むキット。
Ｅ８６． 実施形態Ｅ８５のキットであって、キメラポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ部分、ＦＶＩＩ部分、またはＦＩＸ部分を含む、キット。
Ｅ８７． 実施形態Ｅ８６のキットであって、キメラポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ単量体と二量体のハイブリッド、ＦＶＩＩ単量体と二量体のハイブリッド、またはＦＩＸ単量体と二量体のハイブリッドである、キット。
Ｅ８８． 実施形態Ｅ８５からＥ８７のいずれかのキットであって、指示は、凝固因子に対する免疫寛容を必要とする対象を特定するための少なくとも１つのステップをさらに含む、キット。
Ｅ８９． 実施形態Ｅ８８のキットであって、免疫寛容を必要とする対象を識別するためのステップは、
（ａ）凝固因子遺伝子における突然変異または欠失を有する対象を特定すること；
（ｂ）凝固因子遺伝子における再構成を有する対象を特定すること；
（ｃ）これまでに凝固因子に対して阻害性免疫応答を発生したことがある親族を有する対象を特定すること；
（ｄ）インターフェロン治療を受けている対象を識別すること；
（ｅ）抗ウイルス療法を受けている対象を特定すること；
（ｆ）阻害性免疫応答を発生するリスクの増加に関連する凝固因子をコードする遺伝子以外の遺伝子における遺伝子突然変異を有する対象を特定すること；および
（ｇ）これらの２つまたはそれ以上の組み合わせを有する、
からなる群からの１つまたはそれ以上を含む、キット。
Ｅ９０． 実施形態Ｅ８９のキットであって、凝固因子をコードする遺伝子以外の遺伝子における遺伝子突然変異が、
（ｉ）ＴＮＦ−αの増加に関連する遺伝子多型；
（ｉｉ）ＩＬ１０の増加に関連する遺伝子多型；
（ｉｉｉ）ＣＴＬＡ−４の減少に関連する遺伝子多型；
（ｉｖ）ＤＲ１５またはＤＱＢ０６０２ ＭＨＣクラスＩＩ分子における突然変異；および
（ｖ）これらの２つまたはそれ以上の組み合わせを有する、
からなる群から選択される１つまたはそれ以上の突然変異を含む、キット。
Ｅ９１． 実施形態Ｅ１からＥ８４のいずれかの方法であって、投与後に、阻害性免疫応答のレベルを測定することをさらに含む、方法。
Ｅ９２． 実施形態Ｅ９１の方法であって、投与後の阻害性免疫応答のレベルを、投与前の阻害性免疫応答のレベルと比較することをさらに含む、方法。
Ｅ９３． 実施形態Ｅ９１またはＥ９２の方法であって、阻害性免疫応答は、ＦＶＩＩＩに対する抗体の発生である、方法。
Ｅ９４． 実施形態Ｅ９１またはＥ９２の方法であって、阻害性免疫応答はサイトカインの分泌である、方法。
詳細に本発明をここに記載したが、同記載は、例示のみの目的でこれにより含まれ、本発明の限定を意図としない、以下の実施例の参照により、より明確に理解されるであろう。本明細書で言及される全ての特許および出版物は、参照により明示的に組み込まれる。
［実施例１］
ｒＦＶＩＩＩＦｃのクローニング、発現および精製
分子生物学手順は全て標準的な技術に従って行った。天然シグナル配列を含む、ヒトＦＶＩＩＩのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１３２）を、ヒト肝臓ポリＡ ＲＮＡからの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）によって得た
。ＦＶＩＩＩのサイズが大きいことから、コード配列を別々のＲＴ-ＰＣＲ反応からのい
くつかの部分の状態で得て、一連のＰＣＲ反応、制限酵素消化（restriction digest）およびライゲーションを通して、セリン７４３（Ｓ７４３）をグルタミン１６３８（Ｑ１６３８）に融合して、完全長ＦＶＩＩＩのＢドメインから２６８２ｂｐを除去したＢドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩコード領域を含有する中間体クローニングベクターに構築した。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｙ１４７３５）を、白血球ｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲによって得て、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ配列が介在リンカー無しでＦｃ配列のＮ末端（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ＩｇＧ１配列のＤ２２１から開始、ＥＵ番号付け）に直接融合されるように、最終的な発現カセットを作製した。Ｆｃ鎖のみを発現させるために、マウスＩｇκ（カッパ）軽鎖シグナル配列を合成オリゴヌクレオチドを用いて作製し、ＰＣＲを用いてＦｃコード配列に付加して、このタンパク質産物の分泌を可能にさせた。ＦＶＩＩＩＦｃおよびＦｃ鎖コード配列をデュアル発現ベクターであるｐＢｕｄＣＥ４．１（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）にクローニングした。
リポフェクタミントランスフェクション試薬（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド））を用いて、ＨＥＫ２９３Ｈ細胞（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）にｐＳＹＮ-ＦＶＩＩＩ-０１３プラスミドをトランスフェクションし、安定な細胞株をｚｅｏｃｉｎを用いて選択した。細胞を無血清浮遊培養で増殖させ、ＦＶＩＩＩ特異的親和性精製ステップ（McCueJ. et al., J. Chromatogr. A., 1216(45): 7824-30 (2009)）、その後のイオン交換カラムおよび疎水性相互作用カラムの組み合わせを含む４つのカラム精製プロセスを用いて、不純物を取り除いた（clarified）回収培
地からｒＦＶＩＩＩＦｃタンパク質を精製した。
［実施例２］
ｒＦＶＩＩＩＦｃの特徴付け
（ａ） 生化学的な特徴付け
プロセシングされた組換えＦＶＩＩＩ-Ｆｃ（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を２つのポリペプチ
ド鎖として合成し、一方の鎖はＩｇＧ１のＦｃドメイン（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）（２２６アミノ酸、Ｄ２２１からＧ４５６まで伸長、ＥＵ番号付け）に融合したＢＤＤ-ＦＶＩＩＩ（Ｓ７４３-Ｑ１６３８融合、１４３８アミノ酸）から成り、全体の鎖の長さは１６６４アミノ酸であり、もう一方の鎖は同じＦｃ領域のみから成る（２２６アミノ酸）。ＦＶＩＩＩＦｃ／Ｆｃデュアル発現プラスミドをトランスフェクトされた細胞は３つの産物（ＦＶＩＩＩＦｃ二量体、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体、およびＦｃ二量体）を分泌することが予測されたが、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体およびＦｃ二量体のみが条件培地中で検出された。精製ＦＶＩＩＩＦｃを非還元および還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析（図２Ａおよ
び図２Ｂ）によって解析した。非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥにおいて、ＦＶＩＩＩＦｃの重鎖
（ＨＣ）および軽鎖-二量体Ｆｃ融合物（ＬＣＦｃ２）の予想分子量と一致する、およそ
９０ｋＤａおよび１３０ｋＤａに移動しているバンドが見出された（図２Ａ、レーン３）。また、３本目のバンドがおよそ２２０ｋＤａの位置に検出され、これは７５４位（完全長配列に対しては１６４８）のアルギニン残基が分泌中に切断されていない単鎖ＦＶＩＩＩＦｃ（ＳＣ ＦＶＩＩＩＦｃ；ＨＣ＋ＬＣＦｃ２）の予想分子量と一致する。還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析において、単鎖Ｆｃ、ＨＣ、ＬＣＦｃ、およびＳＣ ＦＶＩＩＩＦｃの
予想分子量と一致する、およそ２５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１０５ｋＤａ、および１９５ｋＤａに移動している主要なバンドが見られた（図２Ｂ、レーン３）。プロタンパク質転換酵素サブチリシン（subtlisin）／ケキシン（ＰＣＳＫ）型プロテアーゼのメンバーであ
るヒトＰＣ５の同時トランスフェクションは、ｒＦＶＩＩＩＦｃ産物の完全なプロセシングをもたらした（図２Ａ、２Ｂ、レーン２）。
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ後のいくつかのｒＦＶＩＩＩＦｃ群の濃度測定解析によって、予測バ
ンドが９８％超の純度であることが示された。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて存在する凝集の程度も評価したところ、全ての群が０．５％以下の凝集レベルを有することが判った。
ｒＦＶＩＩＩＦｃ構造をトロンビン切断、還元、およびＬＣ／ＵＶおよびＬＣ／ＭＳによる解析によってさらに解析した。トロンビンにより生成される４つのＦＶＩＩＩ断片（３７２位、７４０位および７９５位（７９５は完全長ＦＶＩＩＩ配列においての１６８９に一致）における３つのアルギニン残基での切断による）は、ＵＶ吸光度によって検出することができ（図２Ｃ）、タンパク質の以下の部分：Ｆｃ（ピーク１）、軽鎖-Ｆｃ（ピ
ーク２）；重鎖由来Ａ１ドメイン（ピーク３）および重鎖由来Ａ２ドメイン（ピーク４）に対応する。１４のアミノ酸Ｂドメインリンカーおよび約６ｋＤａのａ３関連ペプチドは、それらのサイズが小さいため、ＵＶ吸光度によって検出されない。
同時トランスフェクトされたプロセシング酵素無しで産生されたｒＦＶＩＩＩＦｃポリペプチドは、１５〜２５％の単鎖ＦＶＩＩＩＦｃ（ＳＣ ＦＶＩＩＩＦｃ）を示し、これは、Ｒ７５４およびＥ７５５（完全長ＦＶＩＩＩにおいてはＲ１６４８／Ｅ１６４９）の間の単一ペプチド結合によってプロセシングされたｒＦＶＩＩＩＦｃと異なる。このアイソフォームを精製し、上記全ての生化学分析において特徴付けしたところ、以下に示すように、ｒＦＶＩＩＩＦｃと遜色ないことが判った。精製単鎖ＦＶＩＩＩＦｃの活性は、発色アッセイにおいて、さらに下記の種々の機能分析によって、ｒＦＶＩＩＩＦｃと類似していることが判った。
（ｂ） 発色アッセイおよび一段階ａＰＴＴアッセイ（One-Stage aPTT Assay）によるＦＶＩＩＩ活性の測定
ＦＶＩＩＩ活性をＦＶＩＩＩ発色アッセイによって測定した。４つの別々のｒＦＶＩＩＩＦｃ群からの平均比活性は、発色アッセイにより、２１４８±９９ＩＵ／ｎｍｏｌに相当する、９７６２±４４９ＩＵ／ｍｇであることが判った。単鎖ＦＶＩＩＩ：ＦｃのＦＶＩＩＩ活性も発色アッセイによって測定し、完全にプロセシングされたｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩＦｃ ＤＳ（約２５％の単鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃを含有）と比較した。表３Ａに示す通り、単鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃは、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）の存在下および非存在下の両方で、発色アッセイによって完全にプロセシングされたＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩＦｃ ＤＳのＦＶＩＩＩ活性と比較されたＦＶＩＩＩ活性において、有意差を示さなかった。表３Ｂは、一段階活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイで測定されたＳＣｒＦＶＩＩＩＦｃの完全な活性がＶＷＦ非存在下で観察されたことを示している。
（ｃ） テナーゼ複合体（Xase Complex）の活性
テナーゼ複合体との関連で、ＦＶＩＩＩ活性も、カルシウム存在下でリン脂質表面上の活性化ＦＩＸおよびトロンビン活性化ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃタンパク質をインキュベートし、発色基質または蛍光発生基質の切断によって測定されるＦＸのＦｘａへの変換をモニターすることによって測定し、それからＦＸａ生成速度が決定される。このアッセイを次に、それぞれの個々の成分同士の相互作用を調べるために、アッセイの１構成要素を、その他は一定に保ちつつ変更することによって改変した。
ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＤＳ、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ、および単鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃについて、合成リン脂質小胞（２５％ホスファチジル（phosphotadyl）セリン／７５％ホスフォチジル（phosphotadyl）コリン）を用いて、ＦＸａ生成速度を、変動するリン脂質濃度の関数として決定した（図３Ａ）。両方のタンパク質が、およそ１５６μＭリン脂質においてピーク活性がある同様の活性プロファイルを有することが判った。
次に、ＦＸａ生成速度を、変動するＦＸ濃度の関数として決定し、ＫｍおよびＶｍａｘの値を算出した（図３Ｂ）。ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＤＳ、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ、および単鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃの活性プロファイルが同様であり、同様のＫｍおよびＶｍａｘを有することが判った（表４）。最後に、ＦＸａ生成速度を、変動するＦＩＸ濃度の関数として決定した（図３Ｃ）。活性プロファイルは同様であり、同様のＫｄおよびＶｍａｘを有するように思われた（表５）。同様の結果がリン脂質源として血小板を用いて得られた（未公開データ、２００９年６月）。
（ｄ） ＡＰＣによる不活性化
活性化すると、ＦＶＩＩＩは活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）による切断によって、およびＡ２ドメインの解離によって、不活化される。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩを共にトロンビンによって活性化させ、その後、ＡＰＣと一緒に様々な時間インキュベートし、ＦＸａ生成アッセイによって活性を決定した（図４）。トロンビン活性化が無い場合、ＦＸａ生成はほとんど検出されず、ＦＸａ生成は、トロンビン消化によって有意に増加した。９０分間のＡＰＣ処理によって、非活性化試料と同様の、ＦＸａ生成速度における有意な減少がもたらされ、これらの結果はｒＦＶＩＩＩＦｃ ＤＳ、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ、および単鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃと同様であった。
（ｅ） ｖＷＦ親和性
フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）とのＦＶＩＩＩの相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術に基づくリアルタイム生体分子相互作用解析（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって測定し、ｖＷＦに対するｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩの結合反応速度を決定した（表６）。Ｋａ（結合速度）およびＫｄ（解離速度）の反応速度パラメータ、並びに親和性ＫＤ（Ｋｄ／Ｋａ）を、同一の条件下でそれぞれのＦＶＩＩＩ相互作用について決定した。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩは共に、それぞれ１．６４±０．３７ｎＭおよび０．８４６±０．１８１ｎＭの、ｖＷＦに対する低ｎＭの結合親和性（ＫＤ）を有することが判った。前記タンパク質は同様の解離速度を有し、結合速度には２倍の差異があり、それにより、親和性において２倍の差異があった。
表６に示される通り、ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＤＳまたは単鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃのｖＷＦとの親和性は、低ｎＭ範囲であり、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ単独の親和性のおよそ２倍大きいことが判った。生理的濃度において、これは、遊離ＦＶＩＩＩと比較して、ｖＷＦと複合体形成したｒＦＶＩＩＩＦｃ（プロセシングを受けた、または単鎖）の割合におけるわずかな減少をもたらすであろうとされたが、インビボ研究によって、ｒＦＶＩＩＩＦｃの半減期がこのわずかに低い親和性にもかかわらず完全長またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩを超えて有意に延長されるため、これが前記分子の半減期を損なっていないように思われることが、示された。遊離ｒＦＶＩＩＩＦｃはＦｃＲｎ経路を介してより効率的に再利用され得ることから、半減期のより長い延長に寄与する。
［実施例３］
ｒＦＶＩＩＩＦｃ第Ｉ相／ＩＩａ相臨床試験
第Ｉ相／ＩＩａ相、非盲検、クロスオーバー、用量漸増、多施設、且つファースト・イン・ヒューマンの試験を設計し、重度の（１ＩＵ／ｄＬ［１％］未満の内在性ＦＶＩＩＩ［ＦＶＩＩＩ］と定義）血友病Ａを有する対象における単回投与量のｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性、忍容性、および薬物動態を評価した。全部でおよそ１２人の治療歴のある患者が登録され、２５または６５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを投与された。スクリーニング（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）［ｒＦＶＩＩＩ］、参照比較剤の初回投与に先立ち２８日間以内に予定）、および最初の注射に先立ってＦＶＩＩＩ処置無しで４日間（９６時間）以上経過した後、およそ６人の対象が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の単回２５ＩＵ／ｋｇ投与とその後の３日間（７２時間）の薬物動態学的（ＰＫ）プロファイルを受け、その後、クロスオーバーされ、７日間（１６８時間）のＰＫプロファイリングのために、ｒＦＶＩＩＩＦｃの２５ＩＵ／ｋｇの単回、非盲検投与を受けた。最初の３人の対象に順次投与を行った。２５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを投与したその最初の３人の対象について、それぞれの対象はｒＦＶＩＩＩＦｃの注射から１４日（３３６時間）後に阻害物質評価（inhibitorassessment）を受けた。阻害物質試験が完了した後に、次の対象の投与（最初の３人の対象に対してのみ）を行った。３番目の対象が１４日間の阻害物質評価を完了した後、残りの、３人の２５ＩＵ／ｋｇ対象および６人の６５ＩＵ／ｋｇ対象は、各投与群内で少なくとも１日離れて順次、登録を開始した。
最後の対象が２５ＩＵ／ｋｇ用量のｒＦＶＩＩＩＦｃを受けた１週間後に、およそ６人の個別の対象を６５ＩＵ／ｋｇコホートのために募集した。６５ＩＵ／ｋｇコホートの各対象は単回６５ＩＵ／ｋｇ用量のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、次に４日間（９６時間）のＰＫプロファイリングを受け、その後クロスオーバーし、６５ＩＵ／ｋｇ単回、非盲検用量のｒＦＶＩＩＩＦｃを受け、１０日間（２４０時間）のプロファイリングを受けた。いかなるコホートにおいてもｒＦＶＩＩＩＦｃの最初の注射の前に出血の発症が生じた場合は、対象の試験前ＦＶＩＩＩ産物を治療のために使用し、ＰＫプロファイルのために最初のｒＦＶＩＩＩＦｃ注射を受けさせる前に少なくとも４日間の期間を経過させる必要があった。
全ての対象は、安全性評価用に２５ＩＵ／ｋｇまたは６５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを投与された後に、１４日間（３３６時間）および２８日間の安全性評価期間を受けた。全ての対象は、所望の時点におけるＦＶＩＩＩ活性を解析するために、血液試料と共に、投与前および投与後に薬物動態学的サンプリングを受けた。
第Ｉ相／ＩＩａ相臨床試験の薬物動態データは、ＦＶＩＩＩＦｃについて以下の結果を示した。ＦＶＩＩＩＦｃは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（完全長ｒＦＶＩＩＩ）と比較して、全身暴露（ＡＵＣＩＮＦ）において約５０％の増加、クリアランス（Ｃｌ）において約５０％の減少、並びに排出半減期およびＭＲＴにおいて約５０〜７０％の増加を有した。さらに、ＦＶＩＩＩＦｃは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、Ｃ１６８、ＴＢＬＰ１、ＴＢＬＰ３、およびＴＢＬＰ５の値の増加を示した。
測定されたＰＫパラメーターは、以下の通りであった：
ＡＵＣＩＮＦ：ゼロから無限大までの濃度-時間曲線の下の領域
βＨＬ：排出相半減期；ｔ１／２βとも称される
Ｃ１６８：投与のおよそ１６８時間後のベースラインを超える推定ＦＶＩＩＩＦｃ活性
Ｃｌ：クリアランス
ＭＲＴ：平均滞留時間
ＴＢＬＰ１：ＦＶＩＩＩＦｃ活性がベースラインを越えておよそ１ＩＵ／ｄＬに低減した時の投与後時間のモデル予想
ＴＢＬＰ３：ＦＶＩＩＩＦｃ活性がベースラインを越えておよそ３ＩＵ／ｄＬに低減した時の投与後時間のモデル予想
ＴＢＬＰ５：ＦＶＩＩＩＦｃ活性がベースラインを越えておよそ５ＩＵ／ｄＬに低減した時の投与後時間のモデル予想。
［実施例４］
ｒＦＶＩＩＩＦｃの薬物動態（ＰＫ）
組換えＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ-Ｆｃ（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）融合タンパク質を、ＦＶ
ＩＩＩの半減期を延長させるためのアプローチとして作製した。ｒＦＶＩＩＩＦｃの薬物動態（ＰＫ）を、血友病Ａマウスにおいて、ｒＦＶＩＩＩと比較した。ｒＦＶＩＩＩと比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃの終末相半減期は２倍長かった。半減期延長の基となる機構がＦｃＲｎによるｒＦＶＩＩＩＦｃの保護によるものであることを確認するために、ＦｃＲｎノックアウトマウスおよびヒトＦｃＲｎ遺伝子導入マウスにおいてＰＫを評価した。
単回静脈内用量（１２５ＩＵ／ｋｇ）を投与し、色素生産活性アッセイを用いて血漿中濃度を測定した。Ｃｍａｘは、両方のマウス系統において、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））間で同様であった。しかし、ｒＦＶＩＩＩＦｃの半減期はＦｃＲｎノックアウトマウスにおいてはｒＦＶＩＩＩの半減期と同程度であったが、ｒＦＶＩＩＩＦｃの半減期はｈＦｃＲｎ遺伝子導入マウスにおいてｒＦＶＩＩＩの半減期よりもおよそ２倍に長く延長した。これらの結果により、ＦｃＲｎが、ｒＦＶＩＩＩと比較したｒＦＶＩＩＩＦｃの半減期の延長を仲介する、またはそれに関与することが確認された。回転式トロンボエラストメトリー（rotationthromboelastometry：ＲＯＴＥＭ（登録商標））により測定される全血における血流遮断が、血友病マウスの出血モデルにおける、および臨床応用における凝固因子の有効性と相関することが示されているため、ＲＯＴＥＭ（登録商標）を用いて、血友病ＡマウスにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃの生体外有効性の評価に努めた。
血友病Ａマウスに、単回静脈内用量５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（ＦＶＩＩＩ）またはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（ＦＶＩＩＩ）を投与した。投与の５分後、血餅形成は、凝固時間（ＣＴ）、血餅形成時間（ＣＦＴ）およびα角度に関して同様であった。しかし、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫ延長と一致して、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（ＦＶＩＩＩ）およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（ＦＶＩＩＩ）の両方と比較して、投与の７２時間後および９６時間後にＣＴの有意な向上を示し、ＣＦＴおよびα角度もまた９６時間の時点において向上した。これらの結果は、ｒＦＶＩＩＩＦＣが、半減期の延長、および出血からの長期保護を与える可能性をもたらす、明確な作用機序を有することを示した。
［実施例５］
ｒＦＶＩＩＩＦｃ第Ｉ相／ＩＩａ相臨床試験の結果
本実施例は、２５ＩＵ／ｋｇおよび６５ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩＩ産物で処置された１６人の患者から得られた、ＦＶＩＩＩ活性の最終的な解析結果を提供する。実施例３を参照されたい。ｒＦＶＩＩＩＦｃは組換え融合タンパク質は、組換えＢドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ-ｒＦＶＩＩＩ）が介在リンカー配列無しでヒトＩｇＧ１の二量体Ｆｃド
メインに融合した単一分子から成る。このタンパク質構築体は、ｒＦＶＩＩＩＦｃヘテロ二量体ハイブリッドタンパク質、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体Ｆｃ融合タンパク質、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体ハイブリッド、単量体ＦＶＩＩＩＦｃハイブリッド、およびＦＶＩＩＩＦｃ単量体-二量体とも称される。実施例１、図１、および表２Ａを参照されたい。
ｒＦＶＩＩＩＦｃを用いた前臨床試験によって、市販のｒＦＶＩＩＩ製品と比較して、ｒＦＶＩＩＩ活性の半減期のおよそ２倍の延長が示された。この試験の根拠は、凍結液剤中の単回投与量のｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性および忍容性を評価し、重度の血友病Ａ対象におけるＰＫについてのデータを提供することであった。この試験において、１６人の評価可能な対象をＰＫ評価に利用することができた。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）両方の２用量の単回投与を、２５ＩＵ／体重ｋｇ（ｎ＝６）および６５ＩＵ／体重ｋｇ（ｎ＝１０）の名目用量で、およそ１０分間にわたって静脈内注入した。血漿ＰＫ評価用の血液試料を、注入前、および投与後１０日目まで得た。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの両方のＦＶＩＩＩ活性のＰＫを、モデル依存的な方法を用いるこの試験において特徴付けした。
目的
この試験の主目的は、重度の血友病Ａを有する１２歳以上の前治療のある患者（ＰＴＰ）における、ｒＦＶＩＩＩＦｃ（２５および６５ＩＵ／ｋｇ）の２用量の単回投与の安全性および忍容性を評価することであった。二次目的は、一段階凝固アッセイおよび発色アッセイにおいて、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、２５ＩＵ／ｋｇまたは６５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃの単回投与後に、経時的なＦＶＩＩＩの薬力学的（ＰＤ）活性によって決定される、薬物動態（ＰＫ）パラメーターを決定することであった。
試験デザイン（実施例３参照）
血液試料を、スクリーニングのための来院時（２８日ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）投与前の２８日間以内）に；注射前、並びに注射の１０分後および３０分後並びに１、３、６、および９時間後の０日目（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の注射）に；ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）注射の２４時間後の１日目に；ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）注射の４８時間後の２日目に；ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の７２時間後の３日目に；並びに高用量ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）注射（コホートＢのみ）の９６時間後の４日目に、ＦＶＩＩＩ活性ＰＫ評価用に採集した。
血液試料を、ｒＦＶＩＩＩＦｃの投与直前、ｒＦＶＩＩＩＦｃ注射の１０分後および３０分後並びに１、３、６、および９時間後のｒＦＶＩＩＩＦｃ注入日に；ｒＦＶＩＩＩＦｃ注射の２４時間後の１日目に；ｒＦＶＩＩＩＦｃ注射の４８、７２、９６、および１２０時間後の２〜５日目に；ｒＦＶＩＩＩＦｃの１６８時間後の７日目に；高用量ｒＦＶＩＩＩＦｃ注射（コホートＢのみ）の１９２、２１６、および２４０時間後の８、９、および１０日目に、ＦＶＩＩＩ活性ＰＫ評価用に採集した。ｒＦＶＩＩＩＦｃ注射の６７２時間後の最後の試験のための来院時（ｒＦＶＩＩＩＦｃ注射の２８日後）に、ＦＶＩＩＩ活性も測定した。
薬物動態学的モデリング
略語
ＴＢＬＰ１：ＦＶＩＩＩ活性がベースラインを越えておよそ１ＩＵ／ｄＬに低減する投与後時間のモデル予想
ＴＢＬＰ３：ＦＶＩＩＩ活性がベースラインを越えておよそ３ＩＵ／ｄＬに低減する投与後時間のモデル予想
算出
ＫＶ＿Ｍ＝Ｃｍａｘ＿Ｍ／実際用量（ＩＵ／ｋｇ）
ＫＶ＿ＯＢ＝Ｃｍａｘ＿ＯＢ／実際用量（ＩＵ／ｋｇ）
ＩＶＲ＿Ｍ＝１００×Ｃｍａｘ＿Ｍ×血漿量（ｄＬ）／全量（ＩＵ）；ここで、血漿量（ｍＬ）＝（２３．７×Ｈｔ（ｃｍ））＋（９．０×Ｗｔ（ｋｇ））‐１７０９。
ＩＶＲ＿ＯＢ＝１００×Ｃｍａｘ＿ＯＢ×血漿量（ｄＬ）／全量（ＩＵ）；ここで、血漿量（ｍＬ）＝（２３．７×Ｈｔ（ｃｍ））＋（９．０×Ｗｔ（ｋｇ））‐１７０９。
結果
（ａ） 単回用量薬物動態（一段階アッセイ）
観察されたＦＶＩＩＩ活性は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃいずれかの短時間ＩＶ注入後に急激に増加し、平均（±標準偏差）モデル予測Ｃｍａｘ値は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で５６．６±４．７４ＩＵ／ｄＬおよび１２１±２８．２ＩＵ／ｄＬ、ｒＦＶＩＩＩＦｃで５５．６±８．１８ＩＵ／ｄＬおよび１０８±１６．９ＩＵ／ｄＬであった。全てのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）処置患者およびｒＦＶＩＩＩＦｃ処置患者は、ＦＶＩＩＩ活性において用量依存的に増加した。ＣｍａｘおよびＡＵＣＩＮＦの両方において観察された増加は、評価された用量範囲にわたって、用量比例にわずかに満たなかった。
注入終了後、観察されたＦＶＩＩＩ活性の低下は、ベースラインレベルに達するまで単一指数関数的な減衰特徴を示した。ＦＶＩＩＩ活性の低下速度はＡＤＶＡＴＥ（登録商標）よりもｒＦＶＩＩＩＦｃにおいてより遅く、排出半減期の平均（±標準偏差）モデル予想値は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で１１．９±２．９８時間および１０．４±３．０３時間、ｒＦＶＩＩＩＦｃで１８．０±３．８８時間および１８．４±６．９９時間であった。排出半減期の値は、両方のＦＶＩＩＩ産物について評価された用量範囲にわたって、用量依存的であるように思われた。
全身ＦＶＩＩＩ暴露（ＡＵＣＩＮＦで評価）は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）投与後よりもｒＦＶＩＩＩＦｃ投与後に、２５ＩＵ／ｋｇ服用レベルおよび６５ＩＵ／ｋｇ服用レベルのそれぞれにおいて、約４８％および６１％大きかった。平均（±標準偏差）モデル予想ＡＵＣＩＮＦ値は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）において９７４±２５９および１８１０±６０６時間＊ＩＵ／ｄＬ、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃにおいて１４４０±３１６および２９１０±１３２０時間＊ＩＵ／ｄＬであった。
排出半減期と同様、ＭＲＴはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較してｒＦＶＩＩＩＦｃにおいて延長した。ＭＲＴの平均（±標準偏差）モデル予想値は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）では１７．１±４．２９および１４．９±４．３８時間、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃでは２５．９±５．６０および２６．５±１０．１時間であった。ＭＲＴ値は、両方のＦＶＩＩＩ産物について評価された用量範囲にわたって用量非依存的であるように思われた。
さらに、ＣＬおよびＶの一次ＰＫパラメーター値を決定した。ｒＦＶＩＩＩＦｃのＣＬ値は、同等投与量でＡＤＶＡＴＥ（登録商標）において観察されたＣＬ値の約６６％しか占めなかった。平均（±標準偏差）モデル予想ＣＬ値は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で２．７０±０．７２９および４．０８±１．６９ｍＬ／時間／ｋｇ、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃで１．８０±０．４０９および２．６９±１．２５ｍＬ／時間／ｋｇであった。Ｖ値はＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの間で同等であり、平均（±標準偏差）モデル予想Ｖ値は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で４３．９±４．２７および５６．１±１３．４ｍＬ／ｋｇ、ｒＦＶＩＩＩＦｃで４５．３±７．２３および６１．６±１０．６ｍＬ／ｋｇであった。平均ＣＬ値および平均Ｖ値におけるわずかな増加が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの用量の増加と共に確認されたが；制限された服用レベルと相まった、６５ＩＵ／ｋｇ用量における標準偏差の増加によって、これらのパラメーターの用量依存性の評価は交絡した。例えば、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置群のＣＶ％幾何平均ＣＬ値は、２３．０％（２５ＩＵ／ｋｇ）から４８．６％（６５ＩＵ／ｋｇ）まで増加した。
一次ＰＫパラメーターに加えて、二次ＰＫパラメーター（例えばＫ値、ＩＶＲ等）を決定してＦＶＩＩＩ効果持続期間を評価した。また、ＰＫの相違を示す証拠がｒＦＶＩＩＩＦｃにおいて観察され、同等投与量のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較した場合にＴＢＬＰ１値およびＴＢＬＰ３値の増加を示した。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃのＩＶＲおよびＫ値は同等であるように思われた。ＴＢＬＰ１値およびＴＢＬＰ３値におけるわずかな増加が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃが用量が増加するにつれて観察された。対照的に、平均ＩＶＲおよびいＫ値におけるわずかな減少が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの用量が増加するについれて確認された。以前に示されたように、これらパラメーターの用量依存性の評価は、制限された投与レベルによって交絡した。
観察されたＴＢＬＰ１の平均（±標準偏差）は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で２．８８±０．７３３および２．９３±０．８４８ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇ、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃで４．２８±０．８７３および５．１６±２．０２ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇであった。観察されたＴＢＬＰ３の平均（±標準偏差）は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で２．０６±０．５２７および２．２６±０．６６６ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇ、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃで３．０９±０．６２３および３．９３±１．５９ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇであった。
観察されたＣｍａｘ値を用いて算出された平均ＩＶＲおよびＫ値（ベースラインおよびモデル内残留薬剤で減法）は、概して、モデル予想Ｃｍａｘ値を用いて決定された値よりも大きく；一区画モデルを用いた、観察されたピーク活性のわずかな過小推定と一致した。観察されたＫ値の平均（±標準偏差）は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で２．５７±０．１９８および２．１３±０．５９８ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇ、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃで２．４６±０．３３０および１．８５±０．３３２ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇであった。観察されたＩＶＲ値の平均（±標準偏差）は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で９４．１±１５．６および８５．８±１６．５％、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃで８９．５±１１．９および７４．８±６．７２％であった。
（ｂ） 単回用量薬物動態（発色アッセイ）
観察されたＦＶＩＩＩ活性は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃのいずれの短時間ＩＶ注入後にも急激に増加し、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、平均（±標準偏差）モデル予想Ｃｍａｘ値は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で７０．２±９．６０および１５７±３８．６ＩＵ／ｄＬ、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃで７０．３±１０．０および１５８±３４．７ＩＵ／ｄＬであった。
全てのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）処置患者およびｒＦＶＩＩＩＦｃ処置患者は、ＦＶＩＩＩ活性における用量依存的な増加を有した。ＣｍａｘおよびＡＵＣＩＮＦの両方において観察された増加は、評価された用量範囲にわたって、用量比例にわずかに満たなかった。
注入終了後、観察されたＦＶＩＩＩ活性の低下は、ベースラインレベルに達するまで単一指数関数的な減衰特徴を示した。ＦＶＩＩＩ活性の低下速度はＡＤＶＡＴＥ（登録商標）よりもｒＦＶＩＩＩＦｃにおいてより遅く、排出半減期の平均（±標準偏差）モデル予想値は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で１０．７±１．９８時間および１０．３±３．２７時間、ｒＦＶＩＩＩＦｃで１６．２±２．９２時間および１９．０±７．９４時間であった。排出半減期の値は、両方のＦＶＩＩＩ産物について評価された用量範囲にわたって、用量依存的であるように思われた。
全身ＦＶＩＩＩ暴露（ＡＵＣＩＮＦで評価）は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）投与後よりもｒＦＶＩＩＩＦｃ投与後に、２５ＩＵ／ｋｇ服用レベルおよび６５ＩＵ／ｋｇ服用レベルのそれぞれにおいて、約５３％および８４％大きかった。平均（±標準偏差）モデル予想ＡＵＣＩＮＦ値は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）において１０８０±２３６および２３２０±７８４時間＊ＩＵ／ｄＬ、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃにおいて１６５０±４０８および４２８０±１８６０時間＊ＩＵ／ｄＬであった。
排出半減期と同様、ＭＲＴはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較してｒＦＶＩＩＩＦｃにおいて延長した。ＭＲＴの平均（±標準偏差）モデル予想値は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）では１５．３±２．８６および１４．８±４．７２時間、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃでは２３．４±４．２２および２７．３±１１．４時間であった。ＭＲＴ値は、両方のＦＶＩＩＩ産物について評価された用量範囲にわたって用量非依存的であるように思われた。
さらに、ＣＬおよびＶの一次ＰＫパラメーター値を決定した。ｒＦＶＩＩＩＦｃのＣＬ値は、同等投与量でＡＤＶＡＴＥ（登録商標）において観察されたＣＬ値の約５８〜６６％しか占めなかった。平均（±標準偏差）モデル予想ＣＬ値は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で２．３９±０．５２７および３．２１±１．４０ｍＬ／時間／ｋｇ、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃで１．５７±０．３４９および１．８６±０．９７０ｍＬ／時間／ｋｇであった。Ｖ値はＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの間で同等であり、平均（±標準偏差）モデル予想Ｖ値は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で３５．８±５．５２および４３．６±１１．２ｍＬ／ｋｇ、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃで３５．９±６．６５および４２．７±８．９１ｍＬ／ｋｇであった。平均ＣＬ値および平均Ｖ値における増加が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの用量の増加と共に確認されたが；制限された服用レベルと相まった、６５ＩＵ／ｋｇにおける標準偏差の増加によって、これらのパラメーターの用量依存性の評価は交絡した。
一次ＰＫパラメーターに加えて、二次ＰＫパラメーター（例えばＫ値、ＩＶＲ等）を決定してＦＶＩＩＩ効果持続期間を評価した。また、ＰＫの相違を示す証拠がｒＦＶＩＩＩＦｃにおいて観察され、同等投与量のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較した場合にＴＢＬＰ１値およびＴＢＬＰ３値の増加を示した。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃのＩＶＲおよびＫ値は同等であるように思われた。
ＴＢＬＰ１値およびＴＢＬＰ３値におけるわずかな増加が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃが用量が増加するにつれて観察された。対照的に、平均ＩＶＲおよびいＫ値におけるわずかな減少が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの用量が増加するについれて確認された。以前に示されたように、これらパラメーターの用量依存性の評価は、制限された投与レベルによって交絡した。
観察されたＴＢＬＰ１の平均（±標準偏差）は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で２．７０±０．５１１および３．０９±０．９７８ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇ、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃで４．０６±０．７９８および５．６６±２．３８ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇであった。観察されたＴＢＬＰ３の平均（±標準偏差）は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で１．９８±０．３７７および２．３９±０．７１８ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇ、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃで３．０４±０．５９８および４．４４±１．８４ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇであった。
観察されたＣｍａｘ値を用いて算出された平均ＩＶＲおよびＫ値（ベースラインおよびモデル内残留薬剤で減法）は、概して、モデル予想Ｃｍａｘ値を用いて決定された値よりも大きく；一区画モデルを用いた、観察されたピーク活性のわずかな過小推定と一致した。観察されたＫ値の平均（±標準偏差）は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で３．０８±０．４２９および２．８５±０．７２１ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇ、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃで３．１２±０．４５１および２．９２±０．９８５ＩＵ／ｄＬ／ＩＵ／ｋｇであった。観察されたＩＶＲ値の平均（±標準偏差）は、それぞれ２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群について、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で１１２±１４．５および１１６±２６．９％、並びにｒＦＶＩＩＩＦｃで１１３±１６．３および１１７±３３．６％であった。
結論
全てのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）処置患者およびｒＦＶＩＩＩＦｃ処置患者は、評価された用量範囲にわたって、ＣｍａｘおよびＡＵＣＩＮＦにおいて同等の用量依存的な増加を有した。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃ活性のピーク血漿レベルは、概して、注入後１時間以内に観察され、投与後数日間検出可能なままであった。注入終了後、ベースライン補正ＦＶＩＩＩ活性における低下は、両産物においてベースラインに到達されるまで、単一指数関数的減衰を示した。排出半減期およびＭＲＴのパラメーター値は、両方のＦＶＩＩＩ産物について評価された用量範囲にわたって、用量非依存的であるように思われた。平均ＣＬ値および平均Ｖ値におけるわずかな増加が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの用量の増加と共に確認されたが；制限された服用レベルと相まった、６５ＩＵ／ｋｇにおける被験者間変動の増加によって、これらのパラメーターの用量依存性の評価は交絡した。
ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の活性ＰＫの比較は、比較可能な用量において、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃについて、全身暴露におけるおよそ４８〜６１％（一段階アッセイ）または５３〜８４％（発色アッセイ）の増加、クリアランスにおけるおよそ３０〜４０％の低下、および排出半減期およびＭＲＴの両方におけるおよそ５０〜８０％の増加を示した。また、ＰＫの相違を示す証拠がｒＦＶＩＩＩＦｃにおいて観察され、同等投与量のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較した場合にＴＢＬＰ１値およびＴＢＬＰ３値の増加を示した。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃのＩＶＲおよびＫ値は同等であるように思われた。
発色アッセイの結果から得られたＰＫパラメーターは、発色アッセイによって、暴露パラメーター（例えば、Ｃｍａｘ、ＡＵＣＩＮＦ等）のより高い推定が得られた以外は、一段階アッセイから得られたものと概して一致した。
観察されたＰＫにおける向上は、ｒＦＶＩＩＩＦｃが出血からの長期保護を提供することができ、血友病Ａを有する個体へのより少ない頻度の注射を可能にすることを示している。
［実施例６］
ｒＦＶＩＩＩＦｃの第３相Ａ-ＬＯＮＧ臨床試験
ｒＦＶＩＩＩＦｃのｆｉｒｓｔ ｉｎ−ｈｕｍａｎ ｓｔｕｄｙ試験による暫定のＰＫ解析（実施例３参照）に基づき、Ａ-ＬＯＮＧ試験を設計した。Ａ-ＬＯＮＧは、重度の血友病Ａ（１ＩＵ／ｄＬ未満［１％未満］の内在性ＦＶＩＩＩと定義）を有する前治療のある対象における出血の予防および治療においての、組換えＦＶＩＩＩ Ｆｃ融合物（ＦＶＩＩＩ：Ｆｃ）の安全性、薬物動態、および有効性の、世界的規模の非盲検多施設第３相評価であった。
Ａ-ＬＯＮＧ試験の主目的は、（ｉ）予防的な、週一回の、オンデマンドの、外科的な
治療レジメンとして投与されたｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性および忍容性を評価すること、並びに（ｉｉ）個々に適合させた予防的な、オンデマンドの、外科的な治療レジメンとして投与されたｒＦＶＩＩＩＦｃの有効性を評価すること、であった。Ａ-ＬＯＮＧ試験の
二次目的は、（ｉ）ｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫプロファイルを特徴付けし、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫを現在市販されている製品ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較すること、（ｉｉ）ｒＦＶＩＩＩＦｃとの個々の応答を評価すること、（ｉｉｉ）予防的投与計画において出血を適切に予防するため、外科的セッティングにおける恒常性を維持するため、またはオンデマンドの、週一回の処置、もしくは予防的なセッティングにおいて出血の発症を治療するために必要な用量範囲およびスケジュールを特徴付けすること、並びに（ｉｖ）ｒＦＶＩＩＩＦｃ消費（例えば、対象あたりの年間のｒＦＶＩＩＩＦｃ全消費）を評価することであった。
１６５人の対象を、３つの投与計画：個々に適合させた予防的投与計画（アーム１）、週一回の投与計画（アーム２）、およびオンデマンドの投与計画（アーム３）のうちの１つに登録した。さらに、ｒＦＶＩＩＩＦｃを周術期管理亜群において評価した。
重要な試験対象患者基準：（ｉ）男性、（ｉｉ）１２歳以上且つ少なくとも４０ｋｇ、（ｉｉｉ）１％未満（１ＩＵ／ｄＬ未満）の内在性ＦＶＩＩＩ活性と定義される重度の血友病Ａの診断、および（ｉｖ）現在市販されているＦＶＩＩＩ製品いずれかへの実証された１５０日以上の事前暴露日数の経緯。
Ａｒｍ １：個々に適合させた予防的投与計画
アーム１には、群全体およびＰＫ亜群が含まれた。初期の投与計画は、初日に２５ＩＵ／ｋｇ、次にその週の第４日（４日目）に５０ＩＵ／ｋｇで、週２回であった。対象には、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫ結果が利用可能になるまで、この週１回の予防的投与計画で、ｒＦＶＩＩＩＦｃを投与した。これらの結果に基づき、個々に適合させた予防的投与計画を個々人に対して確立し、その中で、用量および間隔を決定して、１〜３％のＦＶＩＩＩ活性のトラフレベルを維持した。次に、各対象に、試験全体を通じて、個々に適合させた予防的投与計画を施行した。
対象を試験全体を通じてモニターし、継続的に用量および間隔の調整を行った。調整は、対象が、進行中の２ヵ月間全体にわたって、２回以上の特発性出血の発症として定義される許容できない出血の発症を経験した場合にのみ行った。この場合、調整は３〜５％のトラフレベルを目標とした。
アーム２：週１回投与計画
対象は以下の通りの短縮されたｒＦＶＩＩＩＦｃ ＰＫプロファイリングを受けた：少なくとも９６時間の休薬；６５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃの単回投与；ｒＦＶＩＩＩＦｃの０日目に開始して、注射前、並びに注射開始から１０（±２）分、３時間（±１５分）、７２（±２）時間［３日目］、および９６（±２）時間［４日目］も含めて、短縮された試料採取。短縮されたＰＫプロファイリングに続いて、対象には次に、固定用量６５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを、７日毎に、少なくとも２８週間且つ最長で５２週まで、投与した。
アーム３：発症時（Episodic）（オンデマンドの）治療
対象は出血に対し必要に応じてｒＦＶＩＩＩＦｃ発症時治療を受けた。対象は登録および無作為割り当てされ、以下の通りの短縮されたｒＦＶＩＩＩＦｃ ＰＫプロファイリングを受けた。
（ｉ） 休薬：少なくとも９６時間。
（ｉｉ） ｒＦＶＩＩＩＦｃ０日目における投与：医療管理下での単回投与量５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃの投与。
（ｉｉｉ） ｒＦＶＩＩＩＦｃ０日目から開始される短縮された試料採取：注射前、および注射開始から３０（±３）分、３時間（±１５分）、７２（±２）時間［３日目］、および９６（±２）時間［４日目］。
選択場所において、全てのＰＬプロファイリング時点と同期して、ＴＧＡ用の試料採取を行った。ＲＯＴＥＭ／ＴＥＧ用の試料採取を受けている対象の一部において、以下の時点で採取が行われた：注射前、並びに注射開始から３時間（±１５分）、７２（±２）時間［３日目］、および９６（±２）時間［４日目］。
予定来院の間、対象らは、出血の重症度に応じて、１０〜５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ投与で出血の発症を処置された。
周術期管理亜群
試験中に大手術を必要とする患者の一部において、以下の外科手術の前にｒＦＶＩＩＩＦｃを投与した。大手術は、主要な体腔が穿通および暴露される、または身体機能または生理機能のかなりの機能障害が生じる（例えば、開腹術、開胸術、開頭術、関節置換、および肢の切断）全身麻酔および／または呼吸補助を含むあらゆる外科的処置（待期的または応急）と定義される。
外科手術中の予防のために、対象は２０〜５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃで１２〜２４時間毎に処置された。外科手術に先立ち、医師は対象のｒＦＶＩＩＩＦｃ ＰＫプロファイルを精査し、そのタイプの計画的外科手術および対象の臨床状態に一般的に必要とされるＦＶＩＩＩ補充の用法を決定した。あらゆるリハビリテーション時間を含む外科的治療期間における適切なｒＦＶＩＩＩＦｃ投与に関する推奨には、これらの要素が考慮に入れられた。
薬物動態学的（ＰＫ）評価：全アーム中の全ての対象はｒＦＶＩＩＩＦｃの初回投与の後に最初のＰＫ評価を受けた。アーム１の対象の一部は、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫを組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）［抗血友病因子（組換え）血漿／アルブミン不含有法］）と以下の通りに比較するために、プロトコール指定連続ＰＫ亜群に割り当てられた。
（ｉ） アーム１における治療に先立って、５０ＩＵ／ｋｇのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の単回投与の後にＰＫを評価した。次に、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃの単回投与の後に、ＰＫをこれら同一対象において評価した。
（ｉｉ） ｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫを１２〜２４週間繰り返した。
主要有効性評価項目（最初の読み取りに含まれる）：（ｉ）アーム３に対するアーム１の年換算出血率（ＡＢＲ）（発症時治療アームと比較される個別に合わせた予防アーム）、（ｉｉ）出血の発症を回復するために必要な注射剤の数、（ｉｉｉ）ｒＦＶＩＩＩＦｃを用いた外科手術に対する対象の応答に関する、４点尺度を用いる治療医評価。
ＰＫ評価項目：ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）のＰＫ。
主要安全性評価項目：（ｉ）阻害物質発生の発生率；および、（ｉｉ）周術期管理期間外に発生する有害事象（ＡＥ）の発生率。
結果
対象：全１６５人の対象が試験に登録された。アーム１（個別に合わせた予防）、ｎ＝１１８；アーム２（週一回予防）、ｎ＝２４；アーム３（発症時治療）、ｎ＝２３；周術期管理亜群、ｎ＝９、９手術（アーム１から８対象、およびアーム２から１）。対象の９２．７％が試験を完了した。
有効性：ＡＢＲ中央値（個別に合わせた予防アーム：１．６；週１回予防アーム：３．６；発症時治療アーム：３３．６）。個別に合わせた予防アームにおいて、投与間隔中央値は、試験中の最後の３ヵ月の間、３．５日間であった。個別に合わせた予防アーム中の患者の３０％が、少なくとも５日間の平均投与間隔を達成した。出血の発症の９８％は１回または２回のｒＦＶＩＩＩＦｃ注射によって制御された。周術期管理において、治療医は、手術の１００％において、ｒＦＶＩＩＩＦｃの止血有効性を優または良と評価した。
ＰＫ：ｒＦＶＩＩＩＦｃの幾何平均終末相半減期はおよそ１９．０時間であったが、これはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（およそ１２．４時間）のそれよりも１．５３倍長い。
安全性：ｒＦＶＩＩＩＦｃに対する阻害物質は検出されず、アナフィラキシーの症例も報告されなかった。ｒＦＶＩＩＩＦｃは概して良好な忍容性であった。周術期管理期間外に発生している最も一般的なＡＥは、因果関係にかかわらず（５％以上の発生率）、上咽頭炎、関節痛、頭痛、および上気道感染であった。１２人の対象（７．３％）は、周術期管理期間外に少なくとも１回の重度ＡＥ（ＳＡＥ）を経験した。ＳＡＥは薬剤と無関連であることが調査員により判断された。
概要
個別に合わせた投与計画および週１回予防的投与計画は、低い一桁の年換算出血率中央値の結果となった。個別に合わせた予防アームでは、投与間隔中央値は３．５日間であった。試験中の最後の３ヵ月の間、個別に合わせた予防アーム中の患者の３０％が、少なくとも５日間の平均投与間隔を達成した。出血の発症の９８％は１回または２回のｒＦＶＩＩＩＦｃ注射によって制御された。手術中のｒＦＶＩＩＩＦｃの止血有効性は、手術の１００％において、治療医によって優または良と評価された。ｒＦＶＩＩＩＦｃの半減期は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の１２．４時間と比較して、およそ１９．０時間であった。いずれの対象も阻害物質を発生させず、またｒＦＶＩＩＩＦｃに対するアナフィラキシー反応も経験しなかった。組換えＦＶＩＩＩＦｃは概して良好な忍容性であった。
［実施例７］
臨床的ＲＯＴＥＭ（登録商標）評価
一段階活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイによる血漿ＦＶＩＩＩ活性の測定に加え、全血回転式トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ（登録商標））も調査して、２人の対象、具体的には、低用量コホートの１人および高用量コホートの１人における、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）による全（global）うっ血の改善を評価した。
ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）は、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置の前に対象の血液中に注入された場合、血餅形成において比較的活性であるように思われる。凝固時間（ＣＴ）は、標準である１００％のおよそ１％の範囲のｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の用量に対して直線性を有し、用量反応は同一対象においてｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）間で同程度であった。
ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびその後のｒＦＶＩＩＩＦｃの投与に続いて、種々の時点でクエン酸添加全血を採血し、カルシウム再添加後の血餅形成をＲＯＴＥＭ（登録商標）でモニターした。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの投与前の残余ＦＶＩＩＩレベルによる一様でないベースラインＣＴにもかかわらず、両生成物は注射の３０分後と同程度のレベルにまでＣＴを効率的に補正した。さらに、ＣＴにおける改善は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、この低用量で投与された対象において、２５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃの注射後３時間の時点およびそれ以降に良好に維持された。しかし、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に対するｒＦＶＩＩＩＦｃの改善の差は、６５ＩＵ／ｋｇ用量においてはそれほど大きなものではなかった。
［実施例８］
ＨｅｍＡマウスにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃおよび単鎖（ＳＣ）ｒＦＶＩＩＩのインビボ有効性
組換え第ＶＩＩＩ因子Ｆｃ（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）は、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃドメインに遺伝子工学的に融合されたＢドメイン欠失（ＢＤＤ）ｒＦＶＩＩＩタンパク質から成る。ＨＥＫ２９３細胞からの分泌の前に、ｒＦＶＩＩＩＦｃの大部分は、ＦＶＩＩＩ重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ＋Ｆｃ）にプロセシングされる。血流中で、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、天然ＦＶＩＩＩと区別されない様式でフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）と複合体化して活性化時には放出される。ＨＣおよびＬＣの自発的解離は、ＦＶＩＩＩ製剤の血漿中および保存中でのＦＶＩＩＩ活性の喪失に寄与していると考えられている。ここに、天然ＦＶＩＩＩと比較して優れた製造性および増強された安定性を得ることができる、ｒＦＶＩＩＩＦｃの単鎖非プロセシングアイソフォーム（ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃ）について記載する。
ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃを、ある割合の非プロセシング型アイソフォームを含有するｒＦＶＩＩＩＦｃから精製した。ｒＦＶＩＩＩＦｃと比較して、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃは、一段階（ａＰＴＴ）アッセイにより、同等の色素生産活性を示したが、およそ６０％の低減した活性を示した（表３Ａおよび表３Ｂ）。校正自動化トロンボグラム（Thrombinoscope（登録商標））を用いて、トロンビン産生アッセイ（ＴＧＡ）を行った。トロンビン産生アッセイ（ＴＧＡ）では、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ｒＦＶＩＩＩＦｃと比較して低減したトロンビン活性（図１３Ａ）およびピークトロンビン（図１３Ｂ）も示した。しかし、表３Ｂに示す通り、ａＰＴＴによるＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃの完全な活性がｖＷＦ非存在下で観察され、このことは、完全プロセシング型ＦＶＩＩＩからのａ３の遊離および解離とは対照的に、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃにおけるＡｒｇ１６８０切断後のａ３酸性領域のＨＣへの共有結合に起因して、ｖＷＦからの遊離が遅延し得ることを示している。ｖＷＦからの遅延した解離はａＰＴＴアッセイおよびＴＧＡで観察された活性の低減を説明し得るが、一方、完全な活性が二段階発色アッセイにおいて観察された。ｖＷＦ存在下での活性化速度の減少は、ＦＶＩＩＩ活性化因子としてのトロンビンを制限した修飾発色基質アッセイにおいて確認された。
ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃのインビボ機能を、ＨｅｍＡマウス尾静脈切断（ＴＶＴ）モデルにおいて評価した。マウスを最初に麻酔し、次にＴＶＴの４８時間前に、４．６μｇ／ｋｇ、１．３８μｇ／ｋｇ、または０．４６μｇ／ｋｇのプロセシング型ｒＦＶＩＩＩＦｃ（約７５％〜８５％のプロセシング型ｒＦＶＩＩＩＦｃを含有する医薬原体）および精製単鎖（ＳＣ）ｒＦＶＩＩＩＦｃのいずれかを注射した。尾を先端部から切断し、即座に管の中に入れて血液を集めた。生存に対する保護の割合（％）を、ｒＦＶＩＩＩＦｃプロセシング型（医薬原体）および単鎖（ＳＣ）ＦＶＩＩＩＦｃについて、表７および図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃに示されるように測定した。
ＴＶＴ後、インビボにおける尾の再出血および生存を毎時間１２時間目までモニターし、最後の観察をＴＶＴの２４時間後に行った。ＴＶＴを注入の４８時間後に行った場合、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩＦｃはこのモデルにおいて同等なインビボ有効性を示し、ＥＤ５０はそれぞれ１．１７μｇ／ｋｇおよび１．２３μｇ／ｋｇのであった（図７Ａ）。ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩＦｃの各試験服用レベルにおいて、ＨｅｍＡマウスにおける同程度のＴＶＴ後２４時間生存曲線（ｐ≧０．６５）（図７Ｂ）および再出血率（図７Ｃ）が観察され、このことは、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃがその低い見かけのａＰＴＴ活性にもかかわらずｒＦＶＩＩＩＦｃと同等に効果的であったことを示している。ｖＷＦ存在下でのＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃのインビトロ活性化の遅延は、従って、そのインビボ有効性に対して重大な影響は有していないように思われた。これらの知見により、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃが、臨床応用の可能性を有する新規の効果的なｒＦＶＩＩＩＦｃアイソフォームであることが示された。
［実施例９］
第１／２ａ相臨床試験
ｒＦＶＩＩＩＦｃは、循環ｒＦＶＩＩＩの半減期を延長させるためにヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに共有結合したＦＶＩＩＩの単一分子から成る組換え融合タンパク質である。
この、重度の血友病Ａを有する前治療のある男性対象においてのファースト・イン・ヒューマン試験により、ｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性および薬物動態が調べられた。１６人の対象が２５ＩＵ／ｋｇまたは６５ＩＵ／ｋｇのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、次に同等投与量のｒＦＶＩＩＩＦｃの単回投与を受けた。ほとんどの有害事象は試験薬と無関係であった。試験対象はいずれも抗ＦＶＩＩＩＦｃ抗体も阻害物質も発生させなかった。服用レベルの全体に渡って、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、１．５４〜１．７１倍長い排出半減期（elimination t1/2）および平均滞留時間、１．４９〜１．５６倍低いクリアランス、並びに１．４８〜１．５６倍高い全身暴露を示した。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃは、同程度の用量依存性ピーク血漿濃度および回復を有した。ベースラインを越えた１％ＦＶＩＩＩ活性までの時間は、服用レベルの全体において、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）よりもおよそ１．５３〜１．６８倍長かった。従って、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、血友病Ａを有する患者において延長された止血保護およびより低頻度の投与を達成するための、実行可能な治療方法を提供することができる。
ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに共有結合的に連結したＢドメイン欠失ｒＦＶＩＩＩの単一分子から成る組換え融合タンパク質である。Ｆｃ-融合タンパク
質の潜在的利点にはより良好な忍容性および延長された止血保護が含まれ、Ｆｃドメインは既知の固有の毒性を有さない天然分子である。Dumont J.A. etal., BioDrugs 20(3):151-60 (2006), DumontJ.A. et al., "Monomeric Fcfusiontechnology: an approach to create long-lasting clotting factors,"in:Kontermann R., ed., Therapeutic Proteins ‐ Strategies to Modulate Half-Life,Chapter 11, Wiley VCH publisher; prepublished online, DOI:10.1002/9783527644827.ch10。ＩｇＧ１のＦｃドメインへの結合は、内皮細胞を含む多くの細胞型で発現される新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を可能にする。ＦｃＲｎ発現は一生を通じて安定なままであり、ＩｇＧ１およびＦｃ-融合タン
パク質のリソソーム分解からの保護に関与し、したがってタンパク質のｔ１／２を延長する。Dumont J.A. et al.,BioDrugs 20(3): 151-60 (2006),Roopenian D.C. et al., Nat
Rev Immunol.7(9):715-25 (Epub 2007 Aug 17)。血行中の多数のタンパク質が、非特異
的ピノサイトーシスを介して脈管構造を裏打ちしている細胞内に取り入れられ、エンドソーム分解経路およびリソソーム分解経路に輸送される。
Ｆｃタンパク質はエンドソーム内に常在するＦｃＲｎと相互作用する。ＦｃＲｎを含有するエンドソームはＦｃ融合タンパク質を再び原形質膜へと向かわせ、ｐＨ依存的に血行中にそれらを放出し（LencerW.I. and Blumberg R.S., Trends CellBiol. 15(1):5-9 (2005)）、それによってリソソーム分解を回避させる。この再循環アプローチは、治療的生物学的製剤のｔ１／２を延長させるために上手く利用されており；いくつかのＦｃ融合物に基づく薬剤が臨床用に承認されており（例えば、エタネルセプト、ロミプロスチム）、他にも開発中のものがある。HuangC., Curr Opin Biotechnol. 20(6):692-9. (Epub 2009 Nov 4), Schmidt S.R., Curr OpinDrugDiscov Devel. 12(2):284-295 (2009)。
ｒＦＶＩＩＩＦｃに関する前臨床データは、ＦｃＲｎに媒介される天然の保護経路によりＦＶＩＩＩを分解から救済し、それによりｔ１／２を延長できることを示している。血友病Ａのマウスおよびイヌにおいて、ｒＦＶＩＩＩＦｃの最終的な血漿内ｔ１／２はｒＦＶＩＩＩよりもおよそ２倍長かった。DumontJ. et al., Blood. 116(21) Abstract 545 (2009), Liu T. et al., J Thromb Haemost.9(S2):561 (2011)。これらのデータに基づ
き、ファースト・イン・ヒューマン臨床試験を行って、血友病Ａを有する対象における持続性ｒＦＶＩＩＩＦｃ融合タンパク質の安全性およびＰＫを調べた。
試験デザイン
重度の血友病Ａを有する前治療のある患者における、この非盲検、用量漸増、多施設の第１／２ａ相試験によって、ｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性およびその薬物動態（ＰＫ）を、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（抗血友病因子［組換え］、血漿／アルブミン不含有法、オクトコグアルファ、バクスター・ヘルスケア社（BaxterHealthcare））と比較して調べた
。臨床試験実施基準に関するＵＳ ＣＦＲおよびＩＣＨのガイドラインに従ってこの試験を行った。いかなる試験の前にも、共同治験審査委員会のからの承認および全対象からの書面によるインフォームドコンセントを得た。試験デザインは逐次的であり；単回投与の２５ＩＵ／ｋｇまたは６５ＩＵ／ｋｇのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、続いて同用量のｒＦＶＩＩＩＦｃが投与された（図８）。両薬剤をおよそ１０分間かけて静脈内注射した。それら２つの服用レベルは、典型的な治療的用量範囲の幅を網羅するものと予期された。対象は安全性解析のために、ｒＦＶＩＩＩＦｃを与えられた後に２８日間、注射の１４日後および２８日後の抗ＦＶＩＩＩ抗体および阻害物質に関する試験を含む調査を受けた。対象における血漿内ＦＶＩＩＩ活性を、注射前、ｒＦＶＩＩＩＦｃ注射の１０分後および３０分後、１、３、６、９、２４、４８、７２、９６、１２０、および１６８時間（７日間）後に測定し、６５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを投与された対象については、１９２、２１６、および２４０時間（１０日間）における試料も追加した。血漿内ＦＶＩＩＩ活性を、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）処置後の同時点に、２５ＩＵ／ｋｇ群については７２時間にわたって、および６５ＩＵ／ｋｇ群については９６時間にわたって、測定した。
（ａ） 対象
男性対象は少なくとも１２歳で重度の血友病Ａ（１％未満のＦＶＩＩＩ活性レベルと定義）を有し、ＦＶＩＩＩ濃縮物（ｐｄＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩ）に対する少なくとも１００日間の実証された事前暴露日数を有した。マウスタンパク質またはハムスタータンパク質に対する既知の過敏症を有する対象、スクリーニングにおいて阻害物質または検出可能な阻害物質力価の履歴を有する対象、またはうっ血に影響を与え得るあらゆる薬物治療もしくは全身性免疫抑制剤を受けた対象、またはスクリーニングの３０日以内に活性細菌もしくはウイルスの感染（肝炎またはＨＩＶ以外）を経験した対象は除外した。対象の遺伝子型は、既知である場合、試験移行時に記録された。
（ｂ） 治療製品（treatment Product）
ヒトｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＦｃ導入遺伝子をＨＥＫ２９３細胞に安定にトランスフェクトし、その細胞株を安定性、無菌性、およびウイルス混入について広範に試験し、安全性を確実にした。精製製剤は、そのカルボキシ末端を介してＦｃ単量体のＮ末端に共有結合的に連結した単量体Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩから成り、該単量体Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、合成および細胞からの分泌中に第二のＦｃ単量体とのジスルフィド結合を形成する。ｒＦＶＩＩＩＦｃをクロマトグラフィーおよびナノ濾過で精製したところ、市販のｒＦＶＩＩＩ調製物と比較して、一段階アッセイおよび発色凝固アッセイにおいて完全に活性であった。２ｍＬの溶液あたり１０００ＩＵを含有し、Ｌ−ヒスチジン（ｐＨ７）、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、スクロース、マンニトール、およびポリソルベート２０と共に製剤化された凍結液として提供された。注射用に、その生成物を食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で希釈した。
（ｃ） 結果の測定事項
試験の主目的は、理学的検査を通して評価される安全性、治療により発現した有害事象（ＡＥ）の報告、抗体の発生、および長期の臨床検査モニタリングであった。二次目的には、ＰＫ解析から得られるパラメータが含まれた。臨床検査評価には、プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、国際標準比、Ｄ−二量体レベル、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）抗原レベル、標準的な血液学的検査および血液化学検査、並びに検尿が含まれた。
ＦＶＩＩＩ活性は、市販試薬（Dade Actin FSL）を用い、Ｓｉｅｍｅｎｓ ＢＣＳ−ＸＰ分析機器上で、一段階凝固（ａＰＴＴ）アッセイにより測定し、ヒト血漿に関する世界保健機関（ＷＨＯ）第５国際基準（ＩＳ）に帰属する、正常参照血漿（プレジション・バイオロジクス社（PrecisionBiologics）製ＣＲＹＯｃｈｅｃｋ（商標））に対して較正
した。ａＰＴＴアッセイに加えて、ＦＶＩＩＩ活性を、ヨーロッパ薬局方の推奨に従う市販のキット（Ａｎｉａｒａ ＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩＩ：Ｃ）を用いて、発色基質アッセイ（RosenS., Scand J Haematol Suppl. 33(Suppl 40):139-45 (1984)）によって測定した。発色アッセイは、正常ヒト参照血漿（インスツルメーション・ラボラトリーズ社（InstrumentationLaboratories） ＯＲＫＥ４５）に対して較正し、これはＷＨＯ ５ｔｈ ＩＳヒト血漿基準に帰属する作用強度も有した。
一段階アッセイおよび発色アッセイの定量下限値（lower limit ofquantification：ＬＬＯＱ）は、それぞれ、０．５ＩＵ／ｄＬおよび０．４ＩＵ／ｄＬであった。ＦＶＩＩＩ阻害物質をナイミーヘン修飾ベテスダアッセイ（Nijmegen‐modifiedBethesda assay）
によって測定し、０．６ＢＵ／ｍＬ未満は陰性と見なした。抗ｒＦＶＩＩＩＦｃ抗体を、ビオチンおよびスルホ標識化ｒＦＶＩＩＩＦｃを使用する特異ブリッジング電気化学発光免疫測定法を用いて評価した。アッセイ感度は、代理対照として抗ヒトＦＶＩＩＩモノクローナル抗体を用いて、８９ｎｇ／ｍＬであることが決定された。探索的全血回転式トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ（登録商標））を、種々の時点において、２人の対象（各服用レベルから１人）において行って、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの注射後の全身性うっ血の改善を評価した。
（ｄ） 薬物動態学的解析
内在性ＦＶＩＩＩレベルおよび後の残余減衰を自動的に評価するユーザー定義一区画配置モデル（user-definedone-compartmentdisposition model）を、ＡＤＶＡＴＥ（登録
商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの単回投与の後の個々の対象における血漿内ＦＶＩＩＩ活性−対−時間のデータの解析のために、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）において利用した。実際の試料採取時間、用量、および注射の期間を、最高活性（Ｃｍａｘ）、ｔ１／２、クリアランス（ＣＬ）、定常状態時の分布容積（Ｖｓｓ）、曲線下面積（０時間から無限大に補外［ＡＵＣＩＮＦ］）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、および増分回収率（incrementalrecovery）を含むパラメーターの計算に使用した。
ｒＦＶＩＩＩＦｃの活性−対−時間プロファイルのモンテカルロシミュレーション
２５ＩＵ／ｋｇまたは６５ＩＵ／ｋｇの投与計画に続くＦＶＩＩＩ活性−時間プロファイルを構築するため、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの母集団ＰＫモデルを用いてモンテカルロシミュレーションを行った。試験された母集団におけるモデルパラメーター（ＣＬ、分布容積）の平均推定値、個人間変動、および残差変動（residual
variability）を、この第１／２ａ相試験における１６人対象から得られたＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの一段階（ａＰＴＴ）凝固アッセイの活性データに基づいて、推定した。５００人の対象を、各投与計画に対して、各対象につき１５の試料採取点で、シミュレートした。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの異なる投与計画の後の異なる時点で、１％および３％を超える、またはそれらと等しいＦＶＩＩＩ活性を有する母集団の割合を、推定した。
統計解析
ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）について選択されたＰＫパラメーターを、分散モデル解析を用いて比較した。ＰＫパラメーターをこれらの解析用に対数変換し、推定平均値、平均値の差、および対数スケール上の信頼区間を変換して、それぞれ、オリジナルスケール上の幾何平均、幾何平均率（ＧＭＲ）、および信頼区間の推定値を得た。ＧＭＲは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）ＰＫパラメーター値に対するｒＦＶＩＩＩＦｃ
ＰＫパラメーター値の患者内比の幾何平均である。
結果
薬物消長（Subject Disposition）
１９人の対象を試験に登録し；１６人がＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの両方についてＰＫ評価を受けた。１人の対象は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の投与後のウォッシュアウト期間が完了する前に自身の以前の製品を自己投与したため、該対象をＰＫ解析から除外したが、安全性解析には含めた。３人の対象はいずれかの治験薬を与えられる前に試験を中断した：１人は自発的に中止し；２人目は不履行から調査員により中止され；１人は試験登録の完了のためにスポンサーの要求で中止された。投与を受けた対象のうち、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの両方について、６人の対象は２５ＩＵ／ｋｇを与えられ、１０人の対象は６５ＩＵ／ｋｇを与えられた。平均年齢は４０．３歳（２３〜６１歳）であった。遺伝子型特定を７人の対象について集めたところ；イントロン２２の逆位が６人の対象において報告され；フレームシフト異常が１人の対象において報告された。９人の対象については遺伝子型が不明であった。１３人の対象はＣ型肝炎抗体を有し、そのうち４人はＨＩＶ陽性でもあった。
安全性
治療中および追跡調査期間中に、４４例の処置により発現したＡＥが、１１人（６９％）の対象から報告された。これには、２８日間の投与後観察期間を通じてＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの投与日も含まれた。事象の大部分は軽度と見なされ、いずれも試験中止には繋がらなかった。１つの事象（味覚異常）が、６５ＩＵ／ｋｇ用量のｒＦＶＩＩＩＦｃを与えられている間に１人の対象において一過的に生じ、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関連していると見なされた。１人の対象が、６５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを与えられた後に不安発作を経験し、それが結果として２１例のＡＥを生じ、そのうち、１９例は軽症と等級付けられ、２例（頭痛および羞明）は中等症と見なされた。調査員によって、どちらもｒＦＶＩＩＩＦｃに関連していると見なされなかった。重大な出血の発症は報告されなかった。注射に対するアレルギー反応の証拠は検出されなかった。試験された全ての血漿試料はＦＶＩＩＩ阻害物質および抗ｒＦＶＩＩＩＦｃ抗体に対して陰性であった。注射部位反応の徴候は観察されなかった。異常な検査値における臨床的に意味のある変化は報告されなかった。
薬物動態
血漿中ｒＦＶＩＩＩＦｃに関する、ａＰＴＴおよび発色活性間の相関
ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの活性を、市販試薬および正常ヒト血漿基準に対する補正を用いる同一アッセイにおいて決定した。ＬＬＯＱを超える活性を有した試料において、一段階凝固アッセイによって得られた結果と発色アッセイによって得られた結果の間には強い相関関係があった。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）投与後の１５１試料およびｒＦＶＩＩＩＦｃ投与後の１８５試料のそれぞれについて、２つのアッセイ結果の間に、０．９４および０．９５の相関係数（ピアソンＲ２）が認められた。ａＰＴＴの結果と比較して、ＦＶＩＩＩ発色活性は、平均して、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）において２１％より高く、ｒＦＶＩＩＩＦｃにおいて３２％より高く、統計的に有意ではなかった（図９）。この知見は、両薬剤の発色評価による暴露パラメーターのわずかに高い推定をもたらした。発色アッセイによる見かけのより高いＦＶＩＩＩ回復は、臨床分析において試験される組換えＦＶＩＩＩ製品においては典型的であり、他のほとんどの市販ＦＶＩＩＩ製品と一致する。LeeC.A. et al., Thromb Haemost. 82(6):1644-7 (Dec. 1999), Mikaelsson M. andOswaldsson U., Semin ThrombHemost. 28(3):257-64 (June 2002), StroobantsA.K. etal., J ThrombHaemost. 9 (Suppl 2) (2011)。
ｒＦＶＩＩＩＦｃの向上した薬物動態
主要なＰＫ推定値は一段階（ａＰＴＴ）凝固アッセイの活性データから得た。２５または６５ＩＵ／ｋｇのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、続いて同等投与量のｒＦＶＩＩＩＦｃを与えられた対象において、血漿中ＦＶＩＩＩ活性は急激に上昇し、投与後１時間以内にＣｍａｘに達した。観察されたＦＶＩＩＩ活性の後の低下は、ベースラインＦＶＩＩＩ活性に達するまで、単一指数関数的減衰の特徴を示した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。Ｃｍａｘは用量に比例して増加したが、同等投与量のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの間では同程度であった（表８）。総暴露量（ＡＵＣＩＮＦ）も用量に比例して増加した。しかし、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＡＵＣＩＮＦは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）のＡＵＣＩＮＦよりも、２５ＩＵ／ｋｇ（ｐ＝０．００２）および６５ＩＵ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）において、それぞれ１．４８倍および１．５６倍大きかった（表８）。
ｔ１／２、ＭＲＴ、ＣＬ、およびＶｓｓは用量非依存的であるように思われた（表８）。ｒＦＶＩＩＩＦｃの幾何平均ｔ１／２は、２５ＩＵ／ｋｇ用量群および６５ＩＵ／ｋｇ用量群の両方において１８．８時間であった。これは、同等投与量のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の幾何平均（１２．２時間および１１．０時間）に対して、それぞれ１．５４倍および１．７０倍の向上を表す（ｐ＜０．００１）（表８）。同様の患者内向上が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（２５ＩＵ／ｋｇにおいて１７．５時間および６５ＩＵ／ｋｇにおいて１５．８時間）と比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＭＲＴ（両用量群において２７．０時間）において観察された（ｐ＜０．００１）。ｔ１／２およびＭＲＴにおける向上と一致して、２５ＩＵ／ｋｇ（ｐ＝０．００２）および６５ＩＵ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）のそれぞれの用量において、対応する患者内ＣＬにおける１．４９倍および１．５６倍の低減があった。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの間で、Ｖｓｓおよび増分回収率に有意差はなかった。従って、各対象内で、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して向上したＰＫプロファイルを示した。
ｒＦＶＩＩＩＦｃの改善されたＰＫプロファイルは、２５ＩＵ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）および６５ＩＵ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）においてＡＤＶＡＴＥ（登録商標）よりも１．５３倍および１．６８倍より長かった１％ＦＶＩＩＩ活性までの投与後時間の増加をもたらした（データ未記載）が、このことは、ｒＦＶＩＩＩＦｃのより長い治療期間となり得ることを示唆している。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較したｒＦＶＩＩＩＦｃの好ましいＰＫプロファイルは、発色アッセイ（表９）において測定されたＦＶＩＩＩ活性によっても示されたが、このＦＶＩＩＩ活性はａＰＴＴアッセイより得られたデータと同程度であった。しかし、発色アッセイに基づく暴露の推定値、すなわち、ＣｍａｘおよびＡＵＣＩＮＦは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの両方において、一段階（ａＰＴＴ）凝固アッセイでのものよりもわずかにより高かった。
フォンウィルブランド因子およびｒＦＶＩＩＩＦｃの性質の間の相関関係
血行中のＦＶＩＩＩの大部分はＶＷＦと複合体化していることから（Lenting P.J. et al., J Thromb Haemost. 5: 1353‐60(2007)）、さらにゲノムワイド関連研究によって
、ＦＶＩＩＩレベルの遺伝的決定因子が主にＶＷＦレベルに依存することが確認されていることから（Smith N.L. et al., Circulation121:1382-1392 (2010)）、ＶＷＦおよびｒＦＶＩＩＩＦｃの間の関連を調べた。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の両方において、ＶＷＦレベルと、ＣＬおよびｔ１／２との間に強い相関関係が観察された。図１１Ａおよび図１１Ｂに示される通り、ＶＷＦのレベルが上昇するにつれて、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＣＬ（ｐ＝０．００１６）およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（ｐ＝０．００１２）のＣＬは減少した。
逆の関係がＶＷＦのレベルおよびｔ１／２の間に観察された。ＶＷＦのレベルが増加するにつれて、ｒＦＶＩＩＩＦｃのｔ１／２（ｐ＝０．０００３）およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）のｔ１／２（ｐ＜０．０００１）は増加した。この相関関係は、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＦｃ部分が、ＦＶＩＩＩをクリアランスから保護する際のＶＷＦの役割を変化させないことを示している。
全血ＲＯＴＥＭ（登録商標）に対するｒＦＶＩＩＩＦｃの延長されたＰＫの影響
治験薬の投与の前に、各用量群中の１対象から得た血液を同等投与量のｒＦＶＩＩＩＦｃまたはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）でスパイクし、全血ＲＯＴＥＭ（登録商標）で解析した。凝固時間（ＣＴ）は、規定のおよそ１％〜１００％の範囲の用量に対して直線性を有し、用量反応は同一対象においてｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の間で同程度であったが（データ未記載）、このことは、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）が血餅形成において同程度の作用強度であることを示している。
ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの投与前の残余ＦＶＩＩＩレベルによる一様でないベースラインＣＴにもかかわらず、両生成物は投与の３０分後と同程度のレベルにまでＣＴを効率的に補正した(図１２Ａおよび図１２Ｂ)。ＣＴにおける改善は、２５ＩＵ／ｋｇ投与の３時間後に（図１２Ａ）、および６５ＩＵ／ｋｇ投与の２４時間後に（図１２Ｂ）、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）よりもｒＦＶＩＩＩＦｃによって良好に維持された。
ｒＦＶＩＩＩＦｃは両方の用量において対象によって良好に忍容された。血液学、血液化学、または検尿パラメーターにおいて観察される臨床的に有意な変化はなかった。ＡＥの大半は軽度であり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに無関係であり、続発症無しに回復した。重度のＡＥまたは死亡は試験中に生じず、いずれの用量における対象もｒＦＶＩＩＩＦｃに対する中和抗体または結合抗体を発生させなかった。
ｒＦＶＩＩＩＦｃはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して有意に向上したＦＶＩＩＩ活性のＰＫプロファイルを示し、一段階（ａＰＴＴ）凝固アッセイによって測定されるｔ１／２およびＭＲＴは服用レベル全体にわたって１．５４倍〜１．７１倍より長く、二段階発色アッセイによるものでは１．５９倍〜１．８４倍より長かった。ｒＦＶＩＩＩＦｃの活性延長は、有効性延長の可能性を予想させるものであり、血友病Ａを有する患者の予防的処置においてより低頻度な投与計画を可能にする。
この試験から得られたＰＫパラメーターを採用し、モンテカルロシミュレーションによって、同等投与量のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）を与えられている患者と比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃを与えられている患者がより高い割合で、ＦＶＩＩＩレベルを１％超または３％超に維持することが予測された（表１０）。例えば、２５ＩＵ／ｋｇの用量において、７１．２％のｒＦＶＩＩＩＦｃ患者に対して１２．２％のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）患者が、４日目に１％を超えるＦＶＩＩＩトラフレベルを有することが予測され；６５ＩＵ／ｋｇの用量においては、６６．４％のｒＦＶＩＩＩＦｃ患者に対して１１．０％のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）患者が、４日目に３％を超えるＦＶＩＩＩレベルを有することが予測された。この第１／２ａ相試験およびモンテカルロシミュレーション予測から得られた結果を確かめるために、より多数の患者での臨床試験が計画されている。
インビトロ凝固アッセイは、市販試薬および一般的に使用されるＦＶＩＩＩ標準品を用いる、凝固アッセイまたは発色アッセイによる、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩまたは天然ＦＶＩＩＩと対照して、ｒＦＶＩＩＩＦｃの比活性の減少を示さない（Dumontet al., Blood (2012), prepublished onlineDOI:10.1182/blood-2011-08-367813）。さらに、これらの結果は、ｒＦＶＩＩＩＦｃが、一段階アッセイまたは発色法によって臨床環境で信頼してアッセイされ得ることを示している。
要約すると、この第１／２ａ相臨床試験によって、重度の血友病Ａを有する患者においてｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性および延長されたｔ１／２が示された。血友病Ａを有する個々に効果的な予防的投与計画を確立するための重要な第３相試験が、ｒＦＶＩＩＩＦｃについて進行中である。
［実施例１０］
血友病ＡのマウスモデルおよびイヌモデルにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃの薬物動態および有効性
ｒＦＶＩＩＩと比較したｒＦＶＩＩＩＦｃの薬物動態および有効性を、ヒト試験の裏付けとして、血友病Ａのマウスモデルおよびイヌモデルにおいて評価した。ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃドメインに組み換え技術によって連結された単一Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩを含むヘテロ二量体タンパク質である。単量体エフェクタータンパク質のＦｃ単量体への融合、およびその後の、二量体を生成するためのジスルフィド結合を介した結合を通じて生成される、従来の二量体Ｆｃ融合物は、ＦＶＩＩＩ等の巨大凝固タンパク質に対しては効果的でなかった。従って、単一（単量体）エフェクター分子がＦｃに結合している新規のＦｃ融合タンパク質構築物を作製するための方法を開発した（DumontJ.A., et al., BioDrugs 20(3):151-60 (2006)）、（Dumont J.A., et al., Journal ofaerosol medicine. 18(3):294-303(2005)）、（Bitonti,
et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A.101(26):9763-9768 (2004)）。この手法を、ヒトｒＦＩＸ（Peters,R.T., etal., Blood. 115(10):2057-2064 (2010)）、ｒＦＶＩＩａ（Salas, J.,et al., J ThrombHaemost. 9(s2):O-TU-026. doi:10.1111/j.1538-7836.2011.04380_2.x (2011)）、およびＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩを含むいくつかのタンパク質に適用し
た。
方法および材料
組換えＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）
ｒＦＶＩＩＩＦｃ発現プラスミドｐＢＵＤＣＥ４．１（インビトロジェン社）は２つの発現カセットを含有した。１つは、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（アミノ酸Ｄ２２１〜Ｋ４５７、ＥＵ番号付け）に介在配列無しで直接連結している天然ヒトＦＶＩＩＩシグナル配列、続くＢＤＤ ＦＶＩＩＩ（Ｓ７４３〜Ｑ１６３８融合）を発現した。もう一方は、ＥＦ１αプロモーターを用いて、異種マウスＩｇκＢシグナル配列を有するＦｃ領域のみを発現した。ヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３Ｈ、インビトロジェン社）にこのプラスミドをトランスフェクトして、ｒＦＶＩＩＩＦｃを発現する安定なクローン懸濁細胞株（clonalsuspension cell line）を作製した。タンパク質
を、ＦＶＩＩＩ特異的親和性精製ステップ（McCue J. et al., J. Chromatogr. A., 1216(45): 7824-30(2009)）、続いてイオン交換クロマトグラフィーステップおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーステップの組み合わせを含む、３つのカラム精製プロセスを用いて、所定の細胞培養物回収培地から精製した。
組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）
組換えＢＤＤ ＦＶＩＩＩ（ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）およびＸＹＮＴＨＡ（登録商標））、および完全長ＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））を、ノビス・ファーマシューティカルズ社（フロリダ州マイアミ）から購入し、製造業者の取扱説明書に従って再構成した。
動物
１２９×Ｂ６バックグラウンド上でＦＶＩＩＩエクソン１６ノックアウトを有する血友病Ａ（ＨｅｍＡ）マウスを、ペンシルバニア大学のＨ．Ｋａｚａｚｉａｎ博士から入手し（Bi,L., et al., Nat Genet. 10(1):119-121 (1995)）、バイオジェン・アイデック・
ヘモフィリア（Biogen Idec Hemophilia）で飼育した。マウスＦｃＲｎノックアウト（ＦｃＲｎ ＫＯ）およびヒトＦｃＲｎ遺伝子導入（Ｔｇ３２Ｂ）マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスであり、メーン州バーハーバーのジャクソン研究所（JacksonLaboratory）のDerry Roopenian博士から入手した。ＦｃＲｎ ＫＯマウスの遺伝子型は、ｍＦｃＲｎ（−／
−）およびｍβ２ｍ（−／−）であり、Ｔｇ３２Ｂの遺伝子型はｍＦｃＲｎ（−／−）、ｍβ２ｍ（−／−）、ｈＦｃＲｎ（＋／＋）、およびｈβ２ｍ（＋／＋）である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスをジャクソン研究所（メーン州バーハーバー）から購入した。全ての動物行動は施設内動物飼育委員会（InstitutionalAnimal Care Committee）により承認され
、「Guide to the Care and Use of Laboratory Animals」に従って行われた。
血友病Ａのイヌは、ノースカロライナ大学（チャペルヒル）のフランシス・オーウェン血液学研究所（FrancisOwen Blood ResearchLaboratory）で維持される近交系コロニー
から得た。これらのイヌは、重度のヒト疾患と同程度の重度の血友病表現型を有する（Graham, J.B. and Buckwalter, J.A., etal., The Journal of Exp. Med.90(2):97-111 (1949)）、（Lozier, J.N., et al., ProcNatlAcad Sci U.S.A. 99(20):12991-12996 (2002)）。
マウスにおける薬物動態（ＰＫ）試験
ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））のＰＫを、１２５ＩＵ／ｋｇの静脈内投与の後に、ＨｅｍＡマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＦｃＲｎ ＫＯマウス、およびＴｇ３２Ｂマウスにおいて評価した。４％クエン酸ナトリウムの１／１０の体積の血液を、ｒＦＶＩＩＩＦｃについては投与の５分後、並びに４、８、１６、２４、３２、４８、５４、および７２時間後に、並びにｒＦＶＩＩＩについては投与の５分後、並びに１、４、８、１６、２０、２４、３２、および４８時間後に、大静脈から採血した（４匹のマウス／時点／処置）。血漿を、エタノール／ドライアイス浴中で瞬間凍結し、ヒトＦＶＩＩＩ特異的発色アッセイ（ディアファーマ（DiaPharma）［ウェストチェ
スター、ＯＨ］から入手したＦＶＩＩＩ Ｃｏａｔｅｓｔ ＳＰキット）を用いるＦＶＩＩＩ活性の解析まで−８０℃で保存した。薬物動態パラメータを、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）バージョン５．２（ファーサイト社（Pharsight）、カリフォルニア州マウン
テンヴュー）を用いる非コンパートメント・モデリング（non-compartmental modeling）によって評価した。
ＨｅｍＡマウスにおける有効性研究
全ての有効性研究は盲検法で行った。急性の効能（acute efficacy）は尾切断出血モデルにおいて研究した。雄ＨｅｍＡマウス（８〜１２週齢）を５０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび０．５ｍｇ／ｋｇのデクスメデトミジンの混合物で麻酔した。次に、尾を３７℃の食塩水に１０分間浸して外側静脈を拡張させ、その後ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））、またはビヒクルの尾静脈注射を行った。５分後、尾の遠位１ｃｍを切り落とし、流れた血液を１３ｍＬの温めた食塩水に３０分間採取した。失血を重量測定法で定量した。
予防効果を、ＨｅｍＡマウスが外側尾静脈の切断の２４時間または４８時間前に１２ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））、またはビヒクルの単回静脈内投与を受けている以外は以前に報告された通りに（Pan,J. and Kim, J.Y., Blood. 114(13):2802-2811 (2009)）、尾静脈切断（ＴＶＴ）出血モデルで研究した。１２ＩＵ／ｋｇの用量は、１２ＩＵ／ｋｇが投与の２４時間後に受けるＴＶＴ傷害からのＨｅｍＡマウスの５０％保護を達成した（データ未記載）、ｒＦＶＩＩＩを用いた先の用量反応実験から特定した。
血友病Ａイヌ研究
ｒＦＶＩＩＩＦｃの単回投与ＰＫ／ＰＤ研究では、２匹の未処理血友病Ａイヌ（Ｍ１０およびＭ１１）に、１２５ＩＵ／ｋｇの静脈内投与を与えた。全血凝固時間（ＷＢＣＴ）のために、血液試料を、投与前および投与後に５分および３０分、並びに１、２、４、８、２４、３２、４８、７２、９６、１４４、および１６８時間の時点で採血した。ＦＶＩＩＩ活性（ａＰＴＴアッセイおよび発色アッセイ）、ｒＦＶＩＩＩＦｃ抗原（ＥＬＩＳＡ）、血液学、および血液化学用の血液採取には、ＷＢＣＴのための上記の時点、並びに投与の１５分後並びに３、６、および１２時間後が含まれた。
以下の逐次デザイン研究において、ｒＦＶＩＩＩ（ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標））を、イヌＭ１２においては１１４ＩＵ／ｋｇで、イヌＭ３８においては１２０ＩＵ／ｋｇで、静脈内投与した。凝固時間が２０分以上（ＦＶＩＩＩ：Ｃ≦１％と一致する時間）になるまでＷＢＣＴを測定し、試料も、ＦＶＩＩＩ活性（ａＰＴＴアッセイおよび発色アッセイ）、抗原（ＥＬＩＳＡ）および血液学検査のために特定の時点で採取した。次に、１２５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを同一のイヌに静脈内投与し、血液試料をＷＢＣＴ、ａＰＴＴ、ＥＬＩＳＡ、血液学検査、および血液生化学検査のために採取した。ＷＢＣＴのための時点には、投与前、並びにｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩＦｃの投与の５分および３０分後、並びに１、２、４、８、２４、３２、４８、および７２時間後が含まれた。血液はＦＶＩＩＩＦｃ投与の９６、１２０、１４４、および１６８時間後にも採取した。ＦＶＩＩＩ活性および抗原のための血液採取には、ＷＢＣＴのための上記の時点、並びに投与の１５分後および３、６、１２時間後が含まれた。ＷＢＣＴおよびａＰＴＴは、以前に報告された通りに（Herzog,et al., Nat Med. 5(1):56-63 (1999)）、行った。
ＦＶＩＩＩ発色アッセイ
血友病Ａイヌ血漿中のＦＶＩＩＩ活性を、シーメンスヘルスケア・ダイアグノスティクス社（SiemensHealthcare Diagnostics）（テキサス州ダラス）から入手した試薬を用い
て、Ｓｙｓｍｅｘ ＣＡ１５００装置（Ｓｙｓｍｅｘシスメックス社）上で、自動発色アッセイによって試験した。７ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＦＶＩＩＩ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（ＮＩＢＳＣコード９９／６７８）を、１．５〜０．０１６ＩＵ／ｍＬの範囲の濃度でヒトＦＶＩＩＩ枯渇血漿（スタゴ（Stago）、米国）中
にスパイクして、検量線を作成した。
ＨｅｍＡマウス血漿中のＦＶＩＩＩ活性を、製造業者の取扱説明書に従って、クロモジェニックス社（Chromogenix）（ディアファーマ社、マサチューセッツ州レキシントン）
から入手したＣｏａｔｅｓｔ ＳＰ ＦＶＩＩＩアッセイを用いて測定した。検量線を、未処理ＨｅｍＡマウス血漿を含有する緩衝液中で１００ｍＵ／ｍＬから０．７８ｍＵ／ｍＬまで連続希釈したｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩを用いて作成した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス血漿、ＦｃＲｎ ＫＯマウス血漿、およびＴｇ３２Ｂマウス血漿中のヒトＦＶＩＩＩ活性を測定するため、マウス血漿中の注入したｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩを、最初にヒトＦＶＩＩＩ特異的ｍＡｂのＧＭＡ８０１６（グリーン・マウンテン・アンチボディズ社（GreenMountain Antibodies）、バーモント州）で捕捉して、次に標準
的なＣｏａｔｅｓｔアッセイを行った。
ｒＦＶＩＩＩ特異的ＥＬＩＳＡおよびｒＦＶＩＩＩＦｃ特異的ＥＬＩＳＡ
血友病Ａイヌ血漿中のｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩＦｃ抗原レベルを、標準的なプロトコールに従ってＥＬＩＳＡで測定した。ＦＶＩＩＩ Ａ１ドメイン特異的ｍＡｂであるＧＭＡ−８００２（グリーン・マウンテン・アンチボディズ社、バーモント州バーリントン）を捕捉抗体として使用した。ＨＲＰ結合型抗ＦＶＩＩＩポリクローナルＡｂであるＦ８Ｃ−ＥＩＡ−Ｄ（アフィニティ・バイオロジカルズ社（AffinityBiologicals））を用いてｒＦＶＩＩＩを検出した。ＨＲＰ結合型ロバ抗ヒト（Ｆ（ａｂ）’２）７０９−０３６−０９８（ジャクソン・イムノロジカルズ社（JacksonImmunologicals））を用いてｒＦＶＩＩＩＦｃを検出した。
ｒＦＶＩＩＩＦｃ−ＦｃＲｎ相互作用のＳＰＲ解析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置を用いて行った。研究用グレードのＣＭ５センサーチップ、緩衝液、および固定化試薬は、ビアコア社（ＧＥヘルスケア社（GEHeathcare）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）から購入した。単鎖ヒト、イヌ、およびマウスＦｃＲｎ調製物を、標準的なアミン結合を用いて、シングルチップの隣接フローセル（adjacentflow cell）上に、およそ３７０共鳴単位（ＲＵ）の密度で固定化し、続いてエタノールアミンでのブロッキングを行った。異なる種の固定化ＦｃＲｎとのＦｃ含有分析物（ＦＶＩＩＩＦｃおよびＩｇＧ）の定常状態結合を、ｐＨ６．０泳動緩衝液（５０ｍＭ ＭＥＳ［４−モルホリンエタンスルホン酸］、２５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２ｍＭ 塩化カルシウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０［ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート］）中、１６の濃度（０．０６２５〜２０００ｎＭ）での、分析物の連続注入によって評価した。各サイクルは、２連で行われ、共に５μＬ／分の流速の４５分間の結合フェーズおよび１５分間の解離フェーズを含み、次に２５μＬ／分での１Ｍトリス塩酸の２回の６０秒注入による再生が行われた。二重参照減算（doublereference-subtraction）（ブランクフローセルおよび泳動緩衝液のみ）の後、結合フェーズの終わり間際に記録された結合反応を分析物濃度のの関数としてプロットし、ＥＣ５０値（Ｒｍａｘの５０％）を非線形回帰解析から得た。
統計解析
対応のないｔ検定、一元配置ＡＮＯＶＡ、マン・ホイットニー検定、Ｄｕｎｎ事後テストを伴うクラスカル・ワリス検定、生存曲線、および関連ログランク検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（グラフパッドソフトウェア社（Graph-PadSoftware Inc.）、
カリフォルニア州ラ・ホーヤ）で行った。０．０５未満の両側Ｐ値は統計的に有意と見なした。
結果
組換えＦＶＩＩＩＦｃ融合タンパク質（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）
ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ヒトＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩの、ヒトＩｇＧ１由来のＦｃとの、介在リンカー配列を持たない組換え融合物であり（図１４）、これは特徴がはっきりしたＨＥＫ２９３Ｈ細胞において産生された。ｒＦＶＩＩＩＦｃはタンパク質分解により細胞内で切断されて、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインおよびＡ３ドメインによって仲介される金属結合相互作用を介して非共有結合的に結合している約９０ｋＤａの重鎖および約１３０ｋＤａの軽鎖−Ｆｃを生じる。
１４の個別のバッチからのｒＦＶＩＩＩＦｃの平均比活性は、一段階凝固（ａＰＴＴ）アッセイでは８４６０±６９９ＩＵ／ｍｇ、および発色アッセイでは９３４８±１３５３ＩＵ／ｍｇであり、それぞれ１８６１±１５４ＩＵ／ｎｍｏｌおよび２０５７±２９８ＩＵ／ｎｍｏｌに相当する。ｒＦＶＩＩＩＦｃの比活性は、血漿中の野生型ヒトＦＶＩＩＩの比活性（１４２９ＩＵ／ｎｍｏｌ）と等程度である（Butenas,S. and Mann, K.G., Biochemistry (Mosc). 67(1):3-12 (2002)）。従って、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＦＶＩＩＩ活性は、ヒトＦＶＩＩＩのＣ末端のヒトＦｃのＮ末端への融合によって影響を受けず、ａＰＴＴアッセイおよび発色アッセイを用いて得られた結果は互いのおよそ１０％以内である。
ＦｃＲｎに対するｒＦＶＩＩＩＦｃの結合
単鎖マウス、イヌ、およびヒトＦｃＲｎに対するｒＦＶＩＩＩＦｃの親和性を、表面プラズモン共鳴を用いて評価した。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびマウスＦｃＲｎ間の複合体の結合速度および解離速度は、イヌおよびヒトのＦｃＲｎの結合速度および解離速度よりもかなり遅かった。ヒトＦｃＲｎに対するｒＦＶＩＩＩＦｃの最大半量結合（ＥＣ５０）は、イヌＦｃＲｎに対するそれよりおよそ４倍弱く、さらには、マウスＦｃＲｎに対するそれより２０倍弱かった（表１１）。同様に、ヒトＩｇＧ１はマウスＦｃＲｎに対して最も高い親和性も示し、一方、イヌＦｃＲｎに対する結合親和性はマウスＦｃＲｎと比較して小さかったが、ヒトＦｃＲｎと比較して大きかった（表１１）。
マウス内のｒＦＶＩＩＩＦｃの薬物動態におけるＦｃＲｎ依存的な向上
ＦｃのＦｃＲｎとの相互作用は、ＩｇＧおよびＦｃ−融合タンパク質の半減期を延長するための基礎をなす機構とみなされている。この作用機序がｒＦＶＩＩＩＦｃの半減期の延長にも関与していることを確認するために、１２５ＩＵ／ｋｇの単回静脈内投与の後、ｒＦＶＩＩＩＦｃの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを、ＦＶＩＩＩ欠損（ＨｅｍＡ）マウス（図１５Ａ）、正常（Ｃ５７ＢＬ／６）マウス（図１５Ｂ）、ＦｃＲｎ欠損（ＦｃＲｎ
ＫＯ）マウス（図１５Ｃ）、およびヒトＦｃＲｎ遺伝子導入（Ｔｇ３２Ｂ）マウス（図１５Ｄ）におけるｒＦＶＩＩＩと比較した。
ＰＫパラメーター（表１２）は、マウス血漿中のヒトＦＶＩＩＩ活性の発色測定によって決定した。ｒＦＶＩＩＩＦｃのｔ１／２は、ＨｅｍＡマウス（１３．７対７．６時間）および正常マウス（９．６対４．３時間）におけるｒＦＶＩＩＩよりも、１．８〜２．２倍長かった。ｒＦＶＩＩＩと比較したｒＦＶＩＩＩＦｃのｔ１／２延長は、ＦｃＲｎ ＫＯマウス（６．４対６．９時間）においては消失しており、ヒトＦｃＲｎ遺伝子導入Ｔｇ３２Ｂマウス（９．６対４．１時間）においては回復された。従って、これらの結果は、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＦｃＲｎ受容体との相互作用がその延長されたｔ１／２に関与することを確かにするものである。さらに、向上したｔ１／２と一致して、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＦｃＲｎ発現（ＨｅｍＡ、Ｃ５７Ｂｌ／６およびＴｇ３２Ｂ）マウスにおけるｒＦＶＩＩＩと比較して、１．６〜２．４倍より長いＭＲＴおよび１．２〜１．８倍に増加した全身暴露（ＡＵＣ）も示したが、ＦｃＲｎ ＫＯマウスでは示されなかった。
ｒＦＶＩＩＩＦｃはＨｅｍＡマウスにおける急性出血の治療に充分に活性がある。
ｒＦＶＩＩＩとの比較でｒＦＶＩＩＩＦｃの急性の効能を評価するために、ＨｅｍＡマウス（１６〜２０匹のマウス／群）を段階的に増加させる用量（２４、７２、および２１６ＩＵ／ｋｇ）のｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩで処置し、投与から５分後の尾切断によって傷を与えた。１ｍＬの失血中央値を有したビヒクル処置マウス（ｎ＝１８）と比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置およびｒＦＶＩＩＩ処置は共に、有意に向上した保護（Ｐ＜０．０５、Ｄｕｎｎ事後テストを伴うクラスカル・ワリス検定）をもたらした（図１６）。失血中央値は用量が増加するにつれて次第に減少していき、７２ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃにおいて０．２３ｍＬまで、および２１６ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩにおいて０．２０ｍＬまでの最大減少に達した。全体的に見て、失血は同じ投与量のｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩで処置された動物において同程度であったが、このことは、両治療薬が急性動脈出血の回復に同程度に活性があることを示している。
ＨｅｍＡマウスにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃの延長された予防効果
長期ＰＫが損傷からの長期的保護をもたらすかどうかを決定するために、ＨｅｍＡマウスにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩの予防効果を比較した。１２ＩＵ／ｋｇの静脈内投与の２４時間後、ＨｅｍＡマウスの１本の外側尾静脈を切断した。傷害後、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置マウスの１００％生存（ｎ＝１９）と比較して、４９％のｒＦＶＩＩＩ処置マウス（ｎ＝３９）が生存した（Ｐ＜０．００１、ログランク検定）（図１７Ａ）。ｒＦＶＩＩＩＦｃがより長い効力期間を維持することをさらに示すために、ＨｅｍＡマウスを、１２ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを投与した４８時間後に傷を与えた。やはり、５８％のｒＦＶＩＩＩＦｃ処置マウス（ｎ＝４０）が生存し、これは、投与の２４時間後に傷害されたｒＦＶＩＩＩ処置マウスにおいて達成された生存率（４９％）と同様である（図１７Ａ）。ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置およびｒＦＶＩＩＩ処置は共に、３％のマウスしか傷害から生存しなかった（Ｐ＜０．０００１）ＨｅｍＡビヒクル対照群（ｎ＝３０）よりも、有意に良好である（図１７Ａ）。ｒＦＶＩＩＩＦｃの予防効果の向上および延長は、傷害後再出血の測定によっても明らかである（図１７Ｂ）。１００％のビヒクル処置ＨｅｍＡマウスが尾静脈切断後１０時間以内に再出血した一方で、８７％のｒＦＶＩＩＩ処置マウスおよび４７％のｒＦＶＩＩＩＦｃ処置マウスが、それぞれ、投与の２４時間後に与えられた傷害の後に、再出血した（Ｐ＝０．００２、ｒＦＶＩＩＩＦｃ対ｒＦＶＩＩＩ）（図１７Ｂ）。４８時間において傷害されたｒＦＶＩＩＩＦｃ処置マウスの再出血プロファイルは、投与の２４時間後に傷害されたｒＦＶＩＩＩ処置マウスのそれと概ね同程度である。対照的に、４８時間において傷害されたｒＦＶＩＩＩ処置マウスの生存および再出血プロファイルの両方は、ビヒクル対照群のプロファイルと酷似している（データ未記載）。従って、これらの結果は、ｒＦＶＩＩＩＦｃがＨｅｍＡマウスを尾静脈傷害から、同用量のｒＦＶＩＩＩによって達成されるものよりも２倍長く保護することを示している。
血友病ＡイヌにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃの改善されたＰＫ／ＰＤ
ｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫおよび薬力学（ＰＤ）についても、血友病Ａイヌにおいて試験を行った。１２５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃの静脈内投与の後、ＷＢＣＴが正常なイヌにおいて８〜１２分の範囲にある標準へと直ちに補正された（図１８ＡおよびＢ）。ＷＢＣＴは、４匹中３匹のｒＦＶＩＩＩＦｃ処置イヌにおいておよそ４日間、および残りのイヌにおいて３日間を通して、１％超のＦＶＩＩＩ活性を示す、２０分未満のままであった（図１８Ａ）。１１４ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩで処置されたイヌＭ１２および１２０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩで処置されたイヌＭ３８においても、投与後にＷＢＣＴが標準へと直ちに補正された。しかし、ＷＢＣＴは、Ｍ１２においては２日間、Ｍ３８においては３日間２０分未満のままであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃによって達成されるものよりもおよそ１．５〜２倍短かった（図１８Ｂ）。さらに、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置およびｒＦＶＩＩＩ処置は共に、投与後５分の時点でａＰＴＴ凝固時間も同様に向上させた。
ｒＦＶＩＩＩＦｃ抗原のＰＫ（図１９Ａ）を、ＦＶＩＩＩおよび該分子のＦｃ部分の両方を検出するｒＦＶＩＩＩＦｃ特異的ＥＬＩＳＡを用いて、血漿中のｒＦＶＩＩＩＦｃの濃度を測定することにより決定した。ｒＦＶＩＩＩＦｃ抗原のｔ１／２は１５．７±１．７時間（図１９Ａ）であり、発色アッセイによって測定された（１５．４±０．３時間）、ｒＦＶＩＩＩＦｃ活性のｔ１／２（図１９Ｂ）と同様である（表１３）。ＦＶＩＩＩ活性およびｒＦＶＩＩＩＦｃ抗原のデータの間には良好な相関関係があり、これにより、ｒＦＶＩＩＩＦｃタンパク質がインビボにおいて充分に活性であったことが示される。
ｒＦＶＩＩＩＦｃ投与の７２時間前にｒＦＶＩＩＩの単回投与も受けた２匹のイヌ（Ｍ１２およびＭ３８）において、ｒＦＶＩＩＩ抗原のｔ１／２は６．９時間と決定され、ｒＦＶＩＩＩ活性は７．４時間と決定された。従って、ｒＦＶＩＩＩＦｃの血漿内半減期は、抗原および活性測定の両方によるｒＦＶＩＩＩのそれと比較して、およそ２倍長かった。
さらに、血小板数およびフィブリノーゲンを評価して、血栓形成性の予備試験とした。ｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩを投与した後、血小板数および血漿フィブリノーゲン濃度は投与前の値から変化しなかった（データ未記載）。
考察
これらの試験により、ｒＦＶＩＩＩＦｃが、正常な比活性を保持するのに加えて、ＨｅｍＡマウスにおける急性出血の治療において充分に活性があることが示された。本明細書に記載されていない他の試験によって、ｒＦＶＩＩＩＦｃが、テナーゼ複合体を形成する際のＦＩＸａ、ＦＸ、およびリン脂質との相互作用においても充分に機能的であることが示されている（Peterset al., J. Thromb Haemost. DOI: 10.1111/jth.12076 (2012)）
。さらに、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）に対する結合親和性は、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩの間で同等であり、ＫｄはｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩそれぞれついておよそ１．４ｎＭおよび０．８ｎＭであった（Peterset al., J. Thromb Haemost. DOI: 10.1111/jth.12076 (2012)）。
ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインンおよびＣ２ドメインは活性化した血小板表面上でのプロトロンビナーゼ複合体の形成に必須であるリン脂質結合に関与しなかったため、ｒＦＶＩＩＩＦｃの活性はＦＶＩＩＩのＣ末端の、ＦｃのＮ末端との融合によって影響を受けなかった（Foster, P.A., et al., Blood. 75(10):1999-2004 (1990)）。しかし、この発見は、リン脂質と結合すると考えられている残基（例えば、Ｃ１内のＫ２０９２／Ｆ２０９３、Ｃ２内のＭ２１９９／Ｆ２２００およびＬ２２５１／Ｌ２２５２）が全て、ＦＶＩＩＩのＣ末端残基の遠位にある表面を形成しているように見えるという知見と矛盾しない（Shen,B.W., et al., Blood. (2007); Ngo, J.C., et al., Structure.16(4):597-606 (2008)）。
ｒＦＶＩＩＩＦｃの半減期は、内因性マウスＦｃＲｎまたは遺伝子導入ヒトＦｃＲｎを発現しているマウスでのみ２倍になり、ＦｃＲｎ ＫＯマウスではそうならなかったが（図１５および表１２参照）、このことは、ｒＦＶＩＩＩＦｃの半減期延長の機構がＦｃＲｎによって媒介されることを示している。内皮細胞および造血細胞の両方が、ＩｇＧの寿命延長および分解からの保護を促進するために、内部移行したＩｇＧを細胞表面に再循環させることにおいて、等しく貢献していることが知られているが（Borvak,J., et al., Int Immunol. 10(9):1289-1298 (1998)）、（Akilesh, S., et al., JImmunol. 179(7):4580-4588 (2007)）、具体的に、どのＦｃＲｎ発現細胞型がｒＦＶＩＩＩＦｃの取り込みおよび再循環に関与しているかは知られていない。ＦｃＲｎは、血管内皮、腎臓上皮、肝臓上皮、脾臓上皮、およびマクロファージを含む骨髄由来ＡＰＣにおいて広く発現される（Borvak,J., et al., Int Immunol. 10(9):1289-1298 (1998)）、（Akilesh, S., et al., JImmunol. 179(7):4580-4588 (2007)）、（Yoshida, M., et al., Immunity. 20(6):769-783(2004)）。ＦＶＩＩＩは大部分は（約９８％）ＶＷＦとの複合体の状態で循環
しており（Lenting, P.J., et al., J Thromb Haemost. 5(7):1353-1360 (2007)）、組換えＦＶＩＩＩおよびＶＷＦがＶＷＦ欠損マウスに同時注射された場合、両タンパク質は肝臓および脾臓内のマクロファージに共局在するため（vanSchooten, C.J., et al., Blood. 112(5):1704-1712 (2008)）、マクロファージはｒＦＶＩＩＩＦｃの分解からのレスキューおよび半減期の延長に関与している可能性がある。しかし、これらの結果は、ＦＶＩＩＩ異化反応のための未だ認識されていない経路、およびＦｃ融合物によって可能となるタンパク質の救済を示すものでもあり得る。
凝固因子の半減期を延長するための開発中の手法としては、ペグ化（Rostin, J., etal., Bioconjug Chem.11(3):387-396 (2000)）、（Mei, B., etal., Blood. 116(2):270-279 (2010)）、糖ペグ化（glycopegylation)(Moss,J.,et al., J Thromb Haemost. 9(7):1368-1374 (2011)）、（Negrier,C., et al., Blood.(2011)）、およびアルブミンとの
結合（Metzner, H.J.,et al., Thromb Haemost. 102(4):634-644 (2009)）、（Weimer,T., etal., Thromb Haemost. 99(4):659-667 (2008)）が挙げられる。利用されるタンパク質操作にかかわらず、修飾されたｒＦＶＩＩＩ変異体の半減期は、種々の前臨床動物モデルにおける野生型ＦＶＩＩＩの最大で２倍になるようである（Liu,T., et al., Blood. 112:511 (2008)）、（Karpf,D.M., et al., 16(Suppl. S4):40 (2010)）。一貫した結果
がヒトにおいて示され、例えば、ｒＦＶＩＩＩＦｃが、血友病Ａ患者において、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、半減期をおよそ１．７倍に向上させることが報告された（Powell,J.S., et al., Blood. (2012) prepublishedonline.DOI:10.1182/blood-2011-09-382846）。このＦＶＩＩＩ半減期延長の制限は、ＶＷＦに関連していると思われる。ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦノックアウトマウスにおいて、予備実験によって、ｒＦＶＩＩＩＦｃの半減期においてｒＦＶＩＩＩと比較して５倍の増加が観察された（Liu,T et al.、
未公開の結果）。同様の発見がペグ化ＦＶＩＩＩを利用しているＶＷＦノックアウトマウスにおいて以前に報告された（Mei, B., et al., Blood.116(2):270-279 (2010)）。ま
とめると、これらの結果は、ＶＷＦがＦＶＩＩＩ半減期のさらなる延長に対する制限因子となり得ることを示している。
半減期延長の他に、ｒＦＶＩＩＩＦｃはさらなる恩恵を与える。ＦＶＩＩＩ補充療法を用いたある大きな課題は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体（阻害物質）の発生である。これは、前処置の無い患者の１５〜３０％において発生する。ｒＦＶＩＩＩＦｃは免疫寛容を誘導する可能性を有しているため、中和抗体の発生を妨げる。ＦＶＩＩＩドメインをＩｇ融合タンパク質として提示するレトロウイルスベクター形質導入Ｂ細胞が、ＨｅｍＡマウスにおける既存のＦＶＩＩＩ抗体を特異的に阻止または減少させることが報告されている（Lei,
T.C. and Scott, D.W., Blood. 105(12):4865-4870 (2005)）。Ｆｃが、インビトロにおけるＴｒｅｇ増殖および抗原特異的免疫応答の抑制を誘導することができる調節性Ｔ細胞エピトープを含有することも判っている（DeGroot, et al., Blood. 112(8):3303-3311 (2008)）。さらに、母系ＩｇＧおよびＦｃ融合タンパク質の胎児循環への胎盤を横切るＦｃＲｎを介した移動（Simister,N.E., Vaccine. 21(24):3365-3369 (2003)), Grubb, J.H., etal., Proc Natl Acad SciU.S.A. 105(24):8375-8380 (2008)）は、ｒＦＶＩＩＩ
Ｆｃに対する新生児免疫寛容を誘導し得るが、同時に、新生児に必要な、出産中の出血からの保護も与える。
結論として、ｒＦＶＩＩＩＦｃが、ＨｅｍＡマウスの尾静脈切断損傷からの保護およびＨｅｍＡイヌにおけるＷＢＣＴの向上において、ｒＦＶＩＩＩと比較しておよそ２倍長い効力期間を与えることを示した。効力の延長は、特定且つ確立した細胞内経路を介した、Ｆｃ融合タンパク質の再循環の結果である、ｒＦＶＩＩＩＦｃのｔ１／２の２倍の延長と深く関連している。
［実施例１１］
マウスにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃの免疫原性
試験開始時に７〜９週齢であった１３０匹の雄血友病Ａマウスを、年齢および体重に基づいて、１３の処置群に無作為に割り当てた（ｎ＝１０／群）。マウスを、５０、１００および２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｒＦＶＩＩＩ−ｍＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）またはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の反復的な静脈内投与で処置し、ＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）用の３つの製剤緩衝液の混合物を、ビヒクル対照群に用いた。ＩＶ投与時間は最初のＩＶ注射後の０日目、７日目、１４日目、２１日目、３５日目であり、血液試料は、最初の処置後の（−１）日目、１４日目、２１日目、２８日目および４２日目に、眼窩後血（Retro-orbitalblood）採取
によって採取した（図２０）。
血液採取の直後、血漿試料を遠心分離で単離し、５６℃、３０分間の加熱処理によって非働化して、抗ＦＶＩＩＩ抗体の正確な測定を確実にした。総抗ＦＶＩＩＩ抗体（図２１Ａ、２１Ｂおよび２１Ｃ）、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体（図２３）および総抗Ｆｃ抗体（図２４）の発生を、血漿試料を用いて調べた。
ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）処置マウスおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）処置マウスにおいて１０匹中５匹のマウスおよび１０匹中７匹のマウスであったのに対して、５０ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩＩで処置された場合、最初の注射の２８日後、１０匹中１匹のみのｒＦＶＩＩＩＦｃ処置群内マウス、１０匹中２匹のｒＦＶＩＩＩ−ｍＦｃ処置群内マウスが検出可能な抗ＦＶＩＩＩ抗体を発生させた（図２２Ｃ）。１００ＩＵ／ｋｇでは、２８日目に検出可能な抗ＦＶＩＩＩ抗体を有したマウスの数は、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置群、ｒＦＶＩＩＩ−ｍＦｃ処置群、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）処置群およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）処置群それぞれにおいて２、５、８および９匹であった（図２２Ｃ）。超生理学的用量である２５０ＩＵ／ｋｇでは、２８日目に検出可能な抗ＦＶＩＩＩ抗体を有したマウスの数は、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置群、ｒＦＶＩＩＩ−ｍＦｃ処置群、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）処置群およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）処置群それぞれにおいて１０、１０、７および７匹であった（図２２Ｃ）。１４日目、２１日目、および４２日目に対応するデータは、図２２Ａ、２２Ｂ、および２２Ｄにそれぞれ示される。
概して、抗体全体および抗ＦＶＩＩＩ中和抗体の間に良好な相関関係が観察され（Ｒ２＝０．７４５２）、両方の力価は時間とともに増加した（図２３）。治療的用量範囲（５０および１００ＩＵ／ｋｇ）内で、ＦＶＩＩＩ特異的抗体を発生させたマウスの数およびｒＦＶＩＩＩＦｃ処置群における抗体価は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して有意に低く（ｐ＜０．０５）、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）に対してはわずかに低かった（ｐ＝０．０５）。これらの結果は、ｒＦＶＩＩＩＦｃの免疫原性が低い可能性を示している。
［実施例１２］
市販のｒＦＶＩＩＩと比較した、ｒＦＶＩＩＩＦｃに対する脾臓リンパ細胞応答
ヒトＦｃ（ｈＦｃ、ＩｇＧ１）またはマウスＦｃ（ｍＦｃ、ＩｇＧ２ａ）と連結された場合の組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）に対する脾臓リンパ細胞応答を決定し、市販のｒＦＶＩＩＩ［完全長ＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））およびＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）／ＲＥＦＡＣＴＯ ＡＦ（登録商標））］に対する脾臓リンパ細胞応答と比較した。
ＨｅｍＡマウスに、週１回、６週間、５０ＩＵ／ｋｇまたは２５０ＩＵ／ｋｇの試験分子を注射した。５６日目に、各群からの４匹のマウスを安楽死させ、脾細胞を単離した（図２５）。半分の脾細胞を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用い、細胞内サイトカイン、調節性Ｔ細胞のマーカー、および樹状細胞の染色によって脾臓免疫原性プロファイルを決定するために使用した（図２６）。細胞のもう半分は、ＲＮＡを単離し、リアルタイムＰＣＲに基づくアレイを用いる経路プロファイリングを実行するために使用した。図２７Ａは、アイソタイプ対照のＦＡＣＳドットプロットプロファイルを示している。図２７Ｂは、ＣＤ４およびＴＮＦ−αの両方について陽性である脾細胞を含有する試料のＦＡＣＳドットプロットプロファイルを示している。二重陽性細胞の割合（％）を、全ての処置およびビヒクルから得られたドットプロットから決定した。ＦＶＩＩＩ処置マウスにおける二重陽性細胞の割合（％）を、ビヒクル処置群と比較することにより求めた。
細胞内サイトカイン染色を、Ｔ−ヘルパー細胞マーカーのＣＤ４、並びにＩＬ−２（図２８）、ＩＬ−４（図３０）、およびＴＮＦ−α（図２９）等のサイトカインに対する共染色によって行った。ＩＬ−２は、ｈｅｍＡマウスにおいてＦＶＩＩＩに応答して活性化Ｔ細胞によって分泌される、Ｔ細胞増殖に関与するＴ細胞マイトジェンである。ＩＬ−４は、ｈｅｍＡマウスにおいてＦＶＩＩＩに応答して活性化Ｔ細胞によって分泌されるサイトカインとして同定されている。ＴＮＦ−αは、血友病患者におけるより高い抗体産生に関与する炎症誘発性サイトカインである。各染色の蛍光強度を、フローサイトメトリーを用いて測定した。
同様に、免疫寛容誘発性樹状細胞および免疫原性樹状細胞の比率を、ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４）（図３２）およびＣＤ８０（図３３）等のマーカーの表面染色およびフローサイトメトリー解析によって決定した。ＰＤ−Ｌ１は、活性化Ｔ細胞上のＰＤ−１受容体と結合することにより、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在するＩＬ−２産生および増殖を遮断する抑制性リガンドである。ＰＤ−Ｌ１のより高いＤＣ発現は、免疫原性を阻害し寛容を促進し得る重要な要素である。ＣＤ８０は、抗原をＴ細胞に提示するための、抗原の貪食時および成熟中に樹状細胞上に通常見られる表面マーカーである。ＣＤ８０は、増殖のためにＴ細胞を活性化させる際の補助受容体の一団に属する。ＣＤ８０の表面染色が多いほど、樹状細胞によるより良好な成熟および抗原提示を間接的に示す。
さらに、脾臓中の調節細胞（Ｔｒｅｇ）の割合（％）を、これらの細胞のマーカーであるＣＤ４およびｆｏｘｐ３の共染色によって評価した（図３４）。Ｆｏｘｐ３は調節性Ｔ細胞の細胞内マーカーである。Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞媒介性末梢性寛容の確立、維持、および養子移入に関与する。
ＣＤ４マーカーおよびＴｉｍ３（図３５）マーカーまたはＣＤ２７９（ＰＤ−１）（図３６）マーカーの両方を発現する細胞の存在についても評価した。Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞応答の負の制御因子としてのＴｉｍ３（Ｔ細胞免疫グロブリン領域およびムチンドメイン３（T-cellimmunoglobulin domain and mucin domain 3））。Ｔｉｍ３は自然免
疫細胞によっても発現され、炎症誘発反応を促進し得る。Ｔｉｍ３はＴｈ１媒介性の自己免疫反応および同種免疫反応を阻害し、そのリガンドであるガレクチン−９を介して作用することでＴｈ１において細胞死を誘導するが、Ｔｈ２細胞においては誘導しない。ＣＤ２７９（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞制御因子である広範囲にわたるＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのメンバーである。ＰＤ−１は活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージの表面上に発現されるが、このことは、ＣＴＬＡ−４と比較して、ＰＤ−１はより広範に、免疫応答を負に調節することを示している。
免疫原性および阻害物質形成に関与する試験されたサイトカインの中で、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩ−ｈＦｃまたはｒＦＶＩＩＩ−ｍＦｃを注射されたマウスにおいて、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのレベルの著しい阻害があり、ＩＬ−２のレベルはビヒクル注射群と比較して変化しなかった。逆に、これらのサイトカインのレベルは、２５０ＩＵ／ｋｇのこれらの分子を与えられた群においてより高かった。５０ＩＵ／ｋｇのＸＹＮＴＨＡ（登録商標）またはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）を注射されたマウスはいかなる阻害も示さなかったが、２５０ＩＵ／ｋｇ群はＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＴＮＦ−αの細胞内含有量において増加を示した。さらに、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩ−ｍＦｃを注射されたマウスにおいて、他の処置と比較してより高い割合のｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞が存在した。５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩ−ｈＦｃおよびｒＦＶＩＩＩ−ｍＦｃを与えられているマウスは、Ｔ細胞活性化および増殖の抑制シグナルであるＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４）について陽性の、より高い割合の脾臓樹状細胞を有した。これらの群は、ＣＤ８０染色における減少によって示される、より高い割合（％）の未成熟樹状細胞も有した。
これらの結果は、ｈｅｍＡマウスにおける５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃが、市販のｒＦＶＩＩＩ［完全長ＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））およびＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）／ＲＥＦＡＣＴＯ ＡＦ（登録商標））］よりも低い免疫原性を示したことを示している。従って、ｒＦＶＩＩＩＦｃはより少ない抗体産生を促進し、免疫寛容を誘導し得る。
［実施例１３］
マウスにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃの体内分布およびクリアランス
ＩｇＧ１ Ｆｃ（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）の定常領域への単一ＦＶＩＩＩ分子の組換え融合は、ｒＦＶＩＩＩと比較して、抗体を血流中に再循環させる天然経路を用いるＦｃＲｎ依存的な様式で、クリアランスを減少させることが示されている（Powellet al., 2012 Blood）。さらに、上で開示されるように、血友病Ａ対象における第１／２ａ総臨床試験に
よって、ｒＦＶＩＩＩＦｃが組換え完全長ＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））よりも１．５〜１．７倍より長い半減期を有することが示された。従って、（ｉ）ｒＦＶＩＩＩＦｃの保護に寄与する細胞型および器官を特定するため、並びに（ｉｉ）マウスにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃの体内分布およびクリアランスに対するＦＶＩＩＩおよびＦｃドメインの相対的寄与を評価するために、試験を行った。
ｒＦＶＩＩＩＦｃのクリアランスを、ＦＶＩＩＩ（ＨｅｍＡ）またはフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を欠失している遺伝子修飾ＫＯマウスモデルにおいて、ｒＦＶＩＩＩに対して比較した。静脈内投与されるクロドロネート含有脂質小胞を、これらのマウスモデルにおけるクッパー細胞および単球／マクロファージを枯渇させるために用いた。枯渇の有効性を免疫組織化学およびＦＡＣＳ解析によって定量した。薬物動態解析を、ｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩの静脈内注射の後のＦＶＩＩＩ特異的Ｃｏａｔｅｓｔアッセイによって行った。
ＨｅｍＡマウスにおけるクッパー細胞枯渇はｒＦＶＩＩＩＦｃクリアランスを増加させた。さらに、ＶＷＦ非存在下（ＨｅｍＡ／ＶＷＦダブルノックアウトマウス）では、クッパー細胞およびマクロファージの枯渇は、ｒＦＶＩＩＩＦｃのクリアランスをｒＦＶＩＩＩのクリアランスと同様のレベルにまで増加させたが、このことは、これらの細胞が、このモデルにおいてのｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩＦｃ間のクリアランス差異の大部分に関与していることを示している。
これらの試験は、クッパー細胞がＦｃＲｎに仲介されるｒＦＶＩＩＩＦｃの再循環に寄与している可能性があることを示している。骨髄移植を用いたＦｃＲｎ ＫＯマウスでの試験が、この機構を検証するために進行中である。インビトロ細胞取り込み実験と組み合わされたこれらの試験は、クッパー細胞の寄与を、内皮細胞を含む他のＦｃＲｎ発現細胞型から区別する試みである。
［実施例１４］
血友病Ａマウスにおける、ｒＦＶＩＩＩＦｃに対する細胞媒介性の免疫応答
本試験の目的は、より良好な血友病Ａの治療管理を設計する上で重要な、組換えＦＶＩＩＩに対する細胞媒介性の免疫応答を確認することであった。従って、ヒトＦｃに連結している場合の組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）（ｒＦＶＩＩＩＦｃ；ＩｇＧ１）に対する脾臓リンパ細胞応答を、市販の完全長ｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））およびＢドメイン欠失ｒＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）／ＲＥＦＡＣＴＯ ＡＦ（登録商標））と比較して調べた。ＨｅｍＡマウスに、５０、１００または２５０ＩＵ／ｋｇの用量を、週１回を４回、続いて２週に１回を２回注射した。８週目の終わりに、各群からのマウスを安楽死させ、フローサイトメトリーおよびＲＮＡプロファイリングを用いて調節性Ｔ細胞および樹状細胞のマーカーである細胞内サイトカインについて検査することにより、それらの脾臓白血球免疫原性プロファイルを決定した。５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを注射したマウスにおて、ＩＬ−２、ＩＬ−４およいｂＴＮＦ−α（免疫原性を促進するサイトカイン）のレベルにおいて著しい阻害があった。これらのサイトカインのレベルは、２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ分子を与えられているマウスにおいてより高かった。５０ＩＵ／ｋｇのＸＹＮＴＨＡ（登録商標）またはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）を注射されたマウスはいかなる阻害も示さず、一方、２５０ＩＵ／ｋｇ群はＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＴＮＦ−αの細胞内含有量において増加を示した。さらに、５０および１００ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを注射されたマウスにおいて、他の処置と比較してより高い割合のｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞が存在した。５０および１００ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩを与えられているマウスは、Ｔ細胞活性化および増殖の抑制シグナルであるＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７９）について陽性の、より高い割合の脾臓樹状細胞を有した。これらの群は、ＣＤ８０染色における減少によって示される、より高い割合の未成熟樹状細胞も有した。従って、ｒＦＶＩＩＩＦｃの５０および１００ＩＵ／ｋｇ用量の両方が、このモデルにおいてより低い免疫原性および抗体産生を示した。
序論
ＦＶＩＩＩに対する阻害物質の発生は、血友病Ａの管理において重篤な合併症として認識されている。阻害物質形成の発生率は、全血友病Ａにおける２０％〜３０％から、重症における３０〜４０％までにわたると推定されている。（Green,Haemophilia 17:831-838 (2011); Eckhardt et al. J. Thromb.Haemost. 9:1948-58(2011)）。阻害物質陽性疾患は、現在は、ＦＶＩＩＩの頻回高用量投与を含む免疫寛容誘導によって管理される。患者における阻害物質形成の機構はほとんど知られておらず、複数の危険因子並びに免疫系の細胞および分子に依存している。
血友病における阻害物質発生には、免疫系の複数の細胞型、表面分子および分泌タンパク質、例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、抗原提示細胞（ＡＰＣ；樹状細胞およびマクロファージ）、サイトカイン、およびこれらの細胞型の調節性成分の複雑な相互作用が関与している。Ｂ細胞による抗体産生は、ＡＰＣからの抗原提示によって活性化されるＴ細胞からの最適な支援に依存している。
注射された治療用のペプチドおよびタンパク質（例えば、組換えＦＶＩＩＩ）への寛容は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と称されるＴ細胞の一種により仲介される（Caoet al., J. Thromb. Haemost. 7(S1):88-91 (2009)）。血友病患者における阻害物質形成と関連があるいくつかの重要な分子が特定されている。これらには、２〜３例を挙げると、炎症誘発性サイトカインＴＮＦ-α、抗炎症サイトカインインターロイキン（ＩＬ）−１０、お
よびＴｒｅｇマーカーＣＴＬＡ４が含まれる（Astermark et al., J. Thromb. Haemost. 5:263-5 (2007);Pavlova et al.J. Thromb. Haemost. 7:2006-15 (2009)）。
この試験において、組換え第ＶＩＩＩ因子Ｆｃ融合タンパク質（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）に対する脾臓リンパ細胞応答を、市販の完全長ｒＦＶＩＩＩ（ｆｌ−ｒＦＶＩＩＩ；ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））およびＢドメイン欠失ｒＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ；ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）／ＲＥＦＡＣＴＯ ＡＦ（登録商標））と比較して調べた。
材料および方法
材料
第ＶＩＩＩ因子欠損マウス（Bi et al. Nat Genet. 10:119-21(1995)）は、Ｋａｚａｚｉａｎ博士（ペンシルバニア大学、ペンシルバニア州フィラデルフィア）から最初に入手し、バイオジェン・アイデック・ヘモフィリアまたはチャールスリバー研究所で繁殖コロニーとして維持した。
染色およびＦＡＣＳ解析に用いた抗体は、ＢＤバイオサイエンス社（米国、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）またはイーバイオサイエンス社（eBioscience）（米
国カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。使用した抗体は、マウスＣＤ４（Ｔ−ヘルパー細胞）、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ８０（樹状細胞）、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２５（Ｔｒｅｇ細胞）等の表面マーカー、細胞内サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α）、並びに転写因子（Ｆｏｘｐ３）に対するものである。
免疫原性試験デザイン
３つの処置群に、５０、１００、または２５０ＩＵ／ｋｇの静脈内投与を与え、それらは、幾日かに投与された（図３７）。それぞれの処置および服用レベルを１０匹のマウスに投与した。動物を５６日目にＣＯ２吸入により安楽死させ、脾臓を無菌ＰＢＳ中に切除した。
脾細胞をマウス脾臓分離キットおよびｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ分離器（ミルテニーバイオテク社、ドイツ、コローニュ）を用いて分離した。脾細胞の単一細胞懸濁液を、ＦＡＣＳ染色用に３％ホルマリン中で固定するか、またはＲＮＡ単離用の解離緩衝液（ロシュ社）中に保存した。
評価
抗ＦＶＩＩＩ抗体を、社内で開発したＥＬＩＳＡを用いて決定した。簡潔に述べると、ＦＶＩＩＩを９６ウェルプレート上にコートし、それを用いて特定の時点に採取されたマウス血漿からの抗体を補足した。ＦＶＩＩＩ特異的抗体を、抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いて検出した。単離したマウス脾細胞に対してＴ細胞応答プロファイリングを行った（図３８）。脾臓内のリンパ球および樹状細胞を、表面標的および細胞内標的に対して染色した。
表面染色のためにｎ、１×１０６個の全脾細胞を、適切な濃度の抗体と一緒にインキュベートした。細胞内染色のために、細胞をＢＤ Ｆｉｘ−Ｐｅｒｍ溶液（ＢＤバイオサイエンス社）で透過処理し、次に、同一緩衝液中のサイトカインに対する抗体と一緒にインキュベートした。Ｆｏｘｐ３染色は、Ｆｏｘｐ３染色緩衝液（ＢＤバイオサイエンス社）中の抗体を用いて行った。ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを用いて蛍光強度を記録し、ＦＬＯＷＪＯ（登録商標）ソフトウェアを用いて解析を行った。
リンパ球を、ＣＤ４および細胞内マーカーのＩＬ−２、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−４で、共染色した。Ｔｒｅｇ細胞を表面マーカーのＣＤ４およびＣＤ２５に対して染色し、次に細胞内Ｆｏｘｐ３に対して染色した。脾細胞をＣＤ１１ｃおよびＰＤ−Ｌ１（樹状細胞）またはＣＤ４およびＰＤ−１（ＣＤ４＋Ｔ細胞）に対して染色して、ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１経路に関与する細胞を特定した。全ＲＮＡを単離し（ロシュ社）、ｃＤＮＡ（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）に逆転写した。ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ａ、およびＥＢＩ−３に対するプライマーを、ＩＤＴテクノロジーズ社（IDTtechnologies）から購入した。ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎに基づくリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、ＡＢＩ ７９００ Ｆａｓｔ ＢｌｏｃｋリアルタイムＰＣＲ装置を用い、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ系（キアゲン社）を用いて行った。７５００ソフトウェア（バージョン２．０．５）を用いてデータを解析した。
結果
４２日目の全抗ＦＶＩＩＩ抗体レベル
４２日目の全抗ＦＶＩＩＩ ＩｇＧレベルを、５０、１００または２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））または完全長ＦＶＩＩＩ（ｆｌ−ｒＦＶＩＩＩ）（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））を注射された血友病Ａマウスの血漿から、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。５０および１００ＩＵ／ｋｇの両方において、ｒＦＶＩＩＩＦｃ群は、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩおよび完全長ｆｌ−ＦＶＩＩＩと比較して有意により低い抗体レベルを有し、これは、ｒＦＶＩＩＩＦｃ注射によって付与されるＦＶＩＩＩに対するより低い抗原性を示すものであった。２５０ＩＵ／ｋｇにおいては、これらの群には互いに有意な差はなく、高い抗体レベルを有した（図３９）。
ＣＤ４＋細胞における細胞内サイトカイン（ＩＬ−２およびＴＮＦ−α）
各処置群において５０ＩＵ／ｋｇを与えられたマウスは、ＦＶＩＩＩに対する抗体レベルに基づいて非応答性であったが、一方、各処置群において２５０ＩＵ／ｋｇを与えられたマウスは、最も高い抗体レベルを有して応答性であった（データ未記載）。５０および１００ＩＵ／ｋｇ用量でのｒＦＶＩＩＩＦｃ（図４０Ａおよび図４０Ｂ）は、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α陽性ＣＤ４＋細胞の割合を減少させ、これによりより低い免疫原性が示されたが、一方、ＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩおよび完全長ｒＦＶＩＩＩはより高いサイトカイン陽性細胞を示した。２５０ＩＵ／ｋｇ用量での３種全ての処置（図４０Ｃ）が、サイトカイン陽性細胞の割合を高め、これは、この用量でのより高い免疫原性を示すものであった。同様の結果がＩＬ−４についても得られた。
ＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３三重陽性細胞（Ｔｒｅｇ細胞のマーカー）
１００ＩＵ／ｋｇ用量において、ビヒクルを超える、Ｔｒｅｇ細胞の割合増加は、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ群およびｆｌ−ｒＦＶＩＩＩ群と比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃ群において有意により高かった（Ｐ＜０．０５）（図４１）。５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃにおいても同様の結果が得られ、このことは、５０および１００ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ処置の両方が、Ｔｒｅｇ細胞の優勢を促進し、ＦＶＩＩＩに対する免疫応答を抑制し得ることを示している。
寛容関連性サイトカインに対するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
免疫寛容関連性のサイトカイン、すなわちＴＧＦ-β（図４２Ａ）、ＩＬ−１０（図４
２Ｂ）およびＩＬ−３５（ＩＬ−１２ａおよびＥＢＩ−３サブユニット、図４２Ｃおよび４２Ｄにそれぞれ示される）に対するリアルタイムＰＣＲ分析を、１００ＩＵ／ｋｇ処置群に属するマウスから単離したＲＮＡを用いて行った。ｍＲＮＡレベルは、１００ＩＵ／ｋｇにおいて、ｒＦＶＩＩＩＦｃ群（Ｐ＜０．０５）の試験サイトカインにおいて、その他の処置と比較して上方制御され、これにより、免疫寛容誘発性サイトカインを活発に発現することで免疫抑制性微小環境を促す脾細胞の存在が示された。免疫寛容マーカーのＦｏｘｐ３（図４２Ｅ）、ＣＤ２５（図４２Ｆ）、ＣＴＬＡ−４（図４２Ｇ）、およびインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ−１）（図４２Ｈ）のｍＲＮＡ発現は、１００ＩＵ／ｋｇ群からの全脾細胞においてより高かった。
ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１経路のＦＡＣＳ解析
樹状細胞上のＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４）はＴ細胞上のＰＤ−１（ＣＤ２７９）と結合して、Ｔ細胞の活性化および増殖を抑制し、それによって免疫応答の抑制をもたらす阻害経路を促進する。１００ＩＵ／ｋｇ群から得た脾細胞を、表面ＣＤ１１ｃおよびＰＤ−Ｌ１（図４３Ａ）、またはＣＤ４およびＰＤ−１（図４３Ｂ）に対して染色した。１００ＩＵ／ｋｇ用量において、ＰＤ−Ｌ１陽性の樹状細胞の割合（％）およびＰＤ−１陽性のＴ細胞の割合（％）は、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩおよびｆｌ−ｒＦＶＩＩＩを与えられている動物と比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃを与えられている動物においてより高かった（Ｐ＜−．０５）。これにより、ｒＦＶＩＩＩＦｃによる、樹状細胞およびＴ細胞の両方における免疫抑制経路の正の調節が示された。
考察
上記の実験結果により、５０および１００ＩＵ／ｋｇの用量のｒＦＶＩＩＩＦｃが、以下によって示されるように、低い免疫原性を有し、ＦＶＩＩＩに対する寛容を促進したことが示された：
（ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞における、他のＦＶＩＩＩ分子と比較してより低レベルの免疫原性促進性（pro-immunogenic）サイトカイン（ＩＬ−２およびＴＮＦ−α）；
（ｂ）ｒＦＶＩＩＩＦｃ注射マウスにおける免疫寛容に関与する調節性Ｔ細胞およびマーカー（Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２５、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４）の上方調節。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの重要性および血友病におけるＦＶＩＩＩに対する寛容促進でのＣＴＬＡ４の役割が、以前に報告されている（Caoet al., J. Thromb. Haemost. 7(S1):88-91 (2009); Astermark et al.J. Thromb.Haemost. 5:263-5 (2007)）。
（ｃ）ｒＦＶＩＩＩを注射されたマウスの脾細胞における、より高レベルの免疫寛容誘発性サイトカイン（Ｉｌ−１０、ＴＧＦ−β、ＩＬ−３５）。これらのマーカーは、いくつかの研究において、重要な免疫調節性サイトカインであり、免疫寛容の主要な決定因子であることが示されている（Biet al., Nat. Genet. 10:119-21 (1995)）。
（ｄ）ｒＦＶＩＩＩＦｃ注射後のマウスにおける、免疫寛容誘発性樹状細胞集団（ＰＤ−Ｌ１、ＩＤＯ−１、および減少したＣＤ８０）の増加。同時に、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置マウスは、５０および１００ＩＵ／ｋｇの用量においてＦＶＩＩＩに対する抗体がより少ない、または存在しないこと（Liuet al., WFH Abstract #FB-WE-04.2-5 (2012)）、並び
に５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃで寛容化された後に２５０ＩＵ／ｋｇの暴露に耐えたことも示された。
結論
ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置マウスは、伝統的なＦＶＩＩＩ治療と比較して、５０および１００ＩＵ／ｋｇの用量において、ＦＶＩＩＩに対する抗体がより少ないか、またはそれが存在しなかった。マウスにおけるＴ細胞および樹状細胞の試験に基づき、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、伝統的なＦＶＩＩＩ治療よりも低い免疫原性であることが判明し、免疫寛容誘発性経路を促進した。ｒＦＶＩＩＩＦｃは、免疫寛容を示すものである、血友病Ａマウスの脾細胞における重要な免疫調節性サイトカインを上方制御した。まとめると、これらの発見は、低用量（５０および１００ＩＵ／ｋｇ）のｒＦＶＩＩＩＦｃを注射されたマウスの脾臓における免疫寛容誘発性の微小環境の存在を示している。
これらの試験により、ｒＦＶＩＩＩＦｃが樹状細胞シグナル伝達を活性化し、これが免疫寛容の重要な決定因子であることが初めて示された。これらの発見は、血友病ＡマウスにおいてｒＦＶＩＩＩＦｃによって付与される、ＦＶＩＩＩに対する機能的免疫寛容の存在を示している。
［実施例１５］
血友病Ａマウスにおける、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較した、ｒＦＶＩＩＩＦｃに対する抗体応答の評価
補充ＦＶＩＩＩに対する抑制抗体の発生は前処置の無い患者の２０〜３０％で生じ、血友病治療の最も重篤な合併症である。ＦＶＩＩＩの頻回投与を必要とする免疫寛容誘導（ＩＴＩ）が、阻害物質を発生させる患者を治療するために現在用いられている。しかし、これらの患者の一部はＩＴＩに応答しない。例えば、Green,Haemophilia 17:831-838 (2011); Eckhardt et al. J. Thromb.Haemost. 9:1948-58(2011); Cao et al., J. Thromb. Haemost. 7(S1):88-91 (2009)を参照されたい。組換えＦＶＩＩＩＦｃは、ｒＦＶＩＩ
Ｉの半減期よりおよそ１．６倍長い半減期を有し、現在、第２／３相の臨床開発中である。本明細書で開示される実験により、ｒＦＶＩＩＩＦｃの免疫原性および免疫寛容特性が、血友病Ａ（ＨｅｍＡ）マウスにおいて、他のｒＦＶＩＩＩ補充タンパク質と比較して評価される。
（ａ）ＨｅｍＡマウスにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の免疫原性比較
抗体応答
１群あたり９〜１２匹のＨｅｍＡマウスを有するＨｅｍＡマウスの４つの群を、５０ＩＵ／ｋｇ、１００ＩＵ／ｋｇおよび２５０ＩＵ／ｋｇ用量のｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、およびビヒクル対照で処置した。０日目、７日目、１４日目、２１日目、および３５日目に各用量を投与した。０日目、１４日目、２１日目、２８日目および４２日目に血液を採取した（図４４）。
ｒＦＶＩＩＩＦｃは、５０ＩＵ／ｋｇ（図４５）および１００ＩＵ／ｋｇ（図４６）において、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して有意により低い抗体応答を誘導した。しかし、全てのＦＶＩＩＩタンパク質が、２５０ＩＵ／ｋｇにおいて同様の抗体応答を示した（図４７）。中和抗体の力価は総結合抗体レベルと相関した（図４８）。
（ｂ）ＨｅｍＡマウスにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の免疫原性比較
Ｔ細胞応答プロファイリング
脾細胞におけるＴ細胞応答プロファイリングにおいて、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、およびビヒクル対照の追加用量を５３日目に投与した。脾臓を５６日目に採取した（図４９）。ｒＦＶＩＩＩＦｃがＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３陽性Ｔｒｅｇ細胞の優勢を促進することが、結果により示された（図５０、右パネル）。
概要
ｒＦＶＩＩＩＦｃの投与により、５０および１００ＩＵ／ｋｇの用量において、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して有意により低度な抗体応答がもたらされた。５０および１００ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ投与後の免疫寛容誘発プロファイルにより、ｒＦＶＩＩＩＦｃがＴｒｅｇ細胞の優勢を促進し、ＦＶＩＩＩに対する免疫応答を抑制し得ることが示された。
（ｃ）ｒＦＶＩＩＩ免疫寛容化試験
ｒＦＶＩＩＩＦｃの反復投与がインビボにおいて機能的寛容を誘導し得るかどうかを調べるために、以下の投与計画を採用した。ＨｅｍＡマウス（８〜１０週齢）に、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃまたはビヒクルを、毎週、４週間（０、７、１４、２１日目）注射し、その後３５日目に１回注射した。４９日目を起点として、これらのマウスに週１回の２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを暴露して、これらの動物が高用量のｒＦＶＩＩＩＦｃに耐え得るかどうかを決定した。暴露用量は、試験の４９日目を起点として０、７、１４、および２１日目に投与した（図５１参照）。血液試料を特定の時点で採取して、ＥＬＩＳＡを用いて抗ＦＶＩＩＩ抗体の有無を確認した。図５２に示されるように、ｒＦＶＩＩＩＦｃの反復投与によって、２５０ＩＵ／ｋｇの高用量で暴露されたときに、ｒＦＶＩＩＩＦｃに対する抗体において統計的に有意な減少がもたらされたが、一方、ビヒクルを与えられた動物は暴露時により高いレベルの抗体を有した。これは、従った投与計画に基づく５０ＩＵ／ｋｇでのｒＦＶＩＩＩＦｃの反復投与が、より高用量のｒＦＶＩＩＩＦｃ（２５０ＩＵ／ｋｇ）に対する寛容を誘導し得ることを明らかに示している。
結論
治療量において、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、（１）ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較してより低い免疫原性であり、（２）ＨｅｍＡマウスにおいてＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘導することが可能であることが判った。
現在、低用量のｒＦＶＩＩＩＦｃでも、より高用量のｒＦＶＩＩＩＦｃに対する免疫寛容化をもたらすことができるかどうかが決定されている。本試験では、より低用量のｒＦＶＩＩＩＦｃ（すなわち２５ＩＵ／ｋｇおよび１０ＩＵ／ｋｇ）が寛容誘導フェーズ中に用いられている。この後に、以前の研究で行われたような、２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃでの暴露、およびＦＶＩＩＩに対する抗体の測定が行われる。
［実施例１６］
血友病ＡマウスにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃのクリアランス経路
持続性組換え凝固ＦＶＩＩＩＦｃ融合タンパク質（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）は、現在、血友病Ａを有する個体の発症時治療および予防的処置の第３相臨床試験にある。組換え完全長ＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、バクスター・ヘルスケア・コーポレーション社（BaxterHealthcare Corporation））と比較した場合、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、血友病Ａ
を有する患者において、１．７倍に延長された半減期および有意に減少されたクリアランスを有する。Powell et al., Blood 119:3031−7(2012)を参照されたい。この向上した薬物動態（ＰＫ）プロファイルは、Ｆｃと新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用によって媒介される。Dumontet al., Blood 119:3024−30 (2012)を参照されたい。ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃドメインに直接結合した単一Ｂドメイン欠失ヒト凝固ＦＶＩＩＩから成り、ＦｃＲｎとの相互作用を介して細胞取り込み（エンドサイトーシスまたはピノサイトーシス）後に自然に再循環される（図５３）。肝臓常在性マクロファージ（クッパー細胞）を含む単球細胞（マクロファージおよび樹状細胞）は、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）およびＦＶＩＩＩのクリアランスと関連付けられている（図５４）。vanSchooten et al., Blood 112(5):1704−12(2008)を参照されたい。
ｒＦＶＩＩＩＦｃの取り込み、クリアランス、およびＦｃＲｎ仲介性の再循環に関与する細胞型を明らかにするために、遺伝子修飾マウスモデルにおいて、ｒＦＶＩＩＩＦｃのクリアランスに対するマクロファージおよびクッパー細胞の枯渇の影響を試験した。
材料および方法
ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）のクリアランスを３種のノックアウト（ＫＯ）マウスモデルにおいて比較した：（１）血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ ＫＯ）、ＦＶＩＩＩ欠損；（２）ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの二重ＫＯ（ＤＫＯ）、ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの両方の発現欠如；並びに（３）ＦｃＲｎ−ＫＯ、ＦｃＲｎの発現欠如。３種のモデル全てにおいて、マクロファージおよびクッパー細胞を、ＣＬＯＤＲＯＳＯＭＥ（登録商標）（エンキャプスラ・ナノサイエンス社（EncapsulaNanoSciences, Inc））を用いて枯
渇させ、このＣＬＯＤＲＯＳＯＭＥ（登録商標）は、マクロファージにより特異的に貪食されるリポソームの膜に包まれた毒性ＡＴＰ類似体（クロドロネート）であり、アポトーシスを誘起させる。vanRooijen & Hendrikx, Methods Mol. Biol. 605:189−203 (2010)を参照。
各群の対照マウスをＥＮＣＡＰＯＳＯＭＥ（登録商標）非毒性リポソームで処置した（図５５）。ＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩＦｃの単回静脈内用量（１２５または２５０ＩＵ／ｋｇ）を、リポソームでの処置の２４時間後に注射した。血液試料を、眼窩後または大静脈血液採取によって特定の時点で採取した（時点あたり４サンプル）。
次に、血漿試料中のヒトＦＶＩＩＩ活性をＦＶＩＩＩ発色アッセイで測定し、ＰＫパラメーターはノンコンパートメント解析モデルを用いてＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）ソフトウェア（ファーサイト社（PharsightCorp.））で推定した。
クッパー細胞およびマクロファージの枯渇を免疫組織化学染色で評価し、Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍソフトウェア（デンマーク、ヒョースホルム）を用いて、または逆転写（reversetranscrition）ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、定量した。
結果
（ａ）マクロファージおよびクッパー細胞の枯渇
図５６は、血友病Ａマウスの対照ＥＮＣＡＰＳＯＭＥ（登録商標）（Ａ、Ａ’）処置またはＣＬＯＤＲＯＳＯＭＥ（登録商標）（Ｂ、Ｂ’）処置の２４時間後の、特異的なマクロファージマーカーであるＩｂａ−１に対する抗体による代表的な肝臓切片の染色を示している。Ａ’およびＢ’は、染色されたクッパー細胞（空色）、全組織領域（濃紺色）、および空領域（灰色）を強調している定量マスクを示している。同様の枯渇プロファイルが他のマウス系統で得られた。陽染領域の定量分析により、９０％超の肝臓クッパー細胞が枯渇され、ＣＬＯＤＲＯＳＯＭＥ（登録商標）処置後に３日間よりも長く（ｎ＝４）、対照ＥＮＣＡＰＳＯＭＥ（登録商標）処置動物と比較して、低く維持されたことが示された（図５７）。循環単球細胞もＣＬＯＤＲＯＳＯＭＥ（登録商標）処置の２４時間以内に５０％超減少し、これはＦ４／８０＋に対する標識抗体で染色された血液細胞のフローサイトメトリー分析によって評価された（ｎ＝４）。４８時間以内に、枯渇した血液細胞は回復した（図５７）。観察された肝臓内マクロファージの枯渇と一致して、マクロファージマーカーである上皮増殖因子モジュール含有ムチン様受容体１（epidermalgrowth factor module-containing mucin-like receptor 1：Ｅｍｒ１）（Ｆ４／８０）の発現のＲ
Ｔ−ＰＣＲ分析により、ＣＬＯＤＲＯＳＯＭＥ（登録商標）処置が、血友病Ａマウスの肝臓および肺においてＥｍｒ１のｍＲＮＡ発現を９５％超減少させたことが示された（図５８）。Ｅｍｒ１はヒトタンパク質に使用される名称である。マウス相同体はＦ４／８０として知られている。Ｅｍｒ１は成熟マクロファージの細胞表面上に存在する膜貫通型タンパク質である。
（ｂ）マウスモデルにおけるＦＶＩＩＩのクリアランス
クッパー細胞がＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの両方のクリアランスに関与することを示唆する既に報告された結果（van Schooten CJ, et al.Blood. 112(5):1704−12(2008)）とは対照的に、クッパー細胞の枯渇は、血友病ＡマウスにおけるＦＶＩＩＩクリアランスの予想された減少を引き起こさなかった（図５９）。その逆に、血友病Ａマウスにおけるクッパー細胞の枯渇によって、ｒＦＶＩＩＩＦｃのクリアランスが有意に増加された（図５９）。同様に、ＤＫＯマウスでは、クッパー細胞の枯渇はＦＶＩＩＩクリアランスを引き起こさず、ｒＦＶＩＩＩＦｃのクリアランスを有意に増加させた（図６０）。ＦｃＲｎ−ＫＯマウスでは、クッパー細胞の枯渇はＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩＦｃのクリアランスに影響を与えなかった（図６１）。
結論
血友病ＡマウスおよびＤＫＯマウス（ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦ欠失）におけるマクロファージおよびクッパー細胞の枯渇はｒＦＶＩＩＩＦｃクリアランスを増加させたが、ＦＶＩＩＩクリアランスは減少させず、このことは、マクロファージおよびクッパー細胞が、これらのマウスにおけるＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩＦｃの間のクリアランスの差の大半の原因となっている可能性があることをを示している。ＶＷＦおよびＦＶＩＩＩ両方の非存在下では（ＤＫＯマウス）、マクロファージおよびクッパー細胞の枯渇は、ｒＦＶＩＩＩＦｃのクリアランスを、ＦＶＩＩＩのクリアランスに近づくレベルにまで増加させる。
血友病ＡマウスまたはＤＫＯマウスにおけるＦＶＩＩＩクリアランスに対するクッパー細胞枯渇の影響の欠如は、以前の公表された研究と対照をなしている。vanRooijen & Hendrikx, Methods Mol. Biol. 605:189−203 (2010)を参照されたい。ＦｃＲｎ−ＫＯマウスにおけるマクロファージおよびクッパー細胞の枯渇は、ＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩＦｃの間の有意なクリアランスの差異をもたらさなかったが、このことは、マクロファージが媒介するｒＦＶＩＩＩＦｃ再循環におけるＦｃＲｎの潜在的役割を示している。
まとめると、これらの研究により、ｒＦＶＩＩＩＦｃがマクロファージ依存的および／またはクッパー細胞依存的に保護されること、並びにこれらの細胞における天然経路がＦｃＲｎにより媒介されるｒＦＶＩＩＩＦｃの再循環に寄与している可能性があることが示された。
［実施例１７］
既存の抗第ＶＩＩＩ因子抗体に対する免疫寛容化
ｒＦＶＩＩＩＦｃを与えられる患者が、異なるｒＦＶＩＩＩ治療を以前に受けていたことは大いにあり得る。約３０％の血友病Ａ患者はＦＶＩＩＩに対する抗体を発生させ、これは現在のＦＶＩＩＩ補充療法においては重大な問題である。現在、ＦＶＩＩＩ阻害物質を有する患者を寛容化するための唯一の承認された手法は、高用量のＦＶＩＩＩを、不定の期間、すなわち患者が寛容化されるまで、患者らに投与することである。従って、低用量ｒＦＶＩＩＩＦｃが、Ｔ細胞およびＢ細胞のシグナル経路を阻害し寛容へと傾斜させることによって、ＦＶＩＩＩの免疫原性を逆転させることができるかどうかを決定することは重要である。
本試験において、ｈｅｍＡマウス（８〜１０週齢）が、５０ＩＵ／ｋｇのＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））またはｆｌ−ＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標））を、週１回、５週間注射される。スキームに示される特定の日にこれらの動物から採取した血液試料中の抗ＦＶＩＩＩ抗体のレベルが決定される。抑制抗体の誘導の後、動物は、週１回、５週間の５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃの注射に切り替えられる。これが寛容化段階となる。抗ＦＶＩＩＩ抗体のレベルが、表示の通りに採取された血液試料から再度決定される。寛容化段階の後、動物は、５０ＩＵ／ｋｇのＸＹＮＴＨＡ（登録商標）またはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）を、別の４回の注射のために、再度注射され、採取された血液試料は抗ＦＶＩＩＩ抗体の有無について検査される。寛容化が成功した場合、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）またはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）での二次暴露は、いかなる抗ＦＶＩＩＩ抗体も生じさせないはずであり、これは、ＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘導するｒＦＶＩＩＩＦｃの能力を示すものであり得る。
［実施例１８］
Ｔ細胞養子免疫療法および免疫寛容の導入
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）は、ＦＶＩＩＩおよび他のペプチド治療薬に対する末梢性寛容の誘導および維持における主要因子である。機能的免疫寛容の有無を決定する際に用いられる重要な試験の１つは、寛容化動物から単離したＴｒｅｇ細胞をレシピエントに移植し、その後より高用量のＦＶＩＩＩに暴露することによるものである。機能的な寛容移植の有無は、暴露されたレシピエントマウスにおける抗体産生の欠如または減少によって証明される。
本試験では、ｈｅｍＡマウス（８〜１０週齢）に、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃまたはビヒクルを毎週、４週間（０、７、１４、２１日目）注射し、その後３５日目および５３日目に２回の注射を行うことにより、寛容化される。血漿試料が、ＥＬＩＳＡを用いた抗ＦＶＩＩＩ抗体レベルの決定のために採取される。５６日目に、抗体を有さないマウスが安楽死させられ、それらの脾臓が単離される。これらのマウスから脾細胞が採取され、脾細胞単離キット（ミルテニーバイオテク社）を用いて単一細胞懸濁液にされる。Ｔｒｅｇｓが、ＣＤ４ ＣＤ２５マウスＴｒｅｇ磁気ビーズ系単離キット（ミルテニーバイオテク社）を用いて、全脾細胞から単離される。単離されたＴｒｅｇｓが細胞カウンターを用いて計数される。細胞懸濁液の一定分量が、単離物の純度を決定するためのＦＡＣＳによる表現型分析用に、３％ホルマリンを用いて固定される。次に、Ｔｒｅｇｓはレシピエントマウスに、２００μＬの食塩水中１×１０６細胞／マウスで、０日目にＩＶ注射される。
１日目に開始して、動物は２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃに暴露され、８、１５、２２、および２９日目に週１回の頻回注射を受ける。血液試料が、ＥＬＩＳＡを用いる血漿中抗ＦＶＩＩＩ抗体解析用に、１５、２２、２９および３６日目に採取される。寛容の導入が成功した場合、ｒＦＶＩＩＩＦｃ寛容化動物由来のＴｒｅｇを与えられたマウスはＦＶＩＩＩに対する抗体を発生させないが、ビヒクル注射されたドナーマウスから単離されたＴｒｅｇを注射されたマウスは抗ＦＶＩＩＩ抗体の存在を示す。
［実施例１９］
ｒＦＶＩＩＩＦｃによる免疫寛容誘導の機構の特定：樹状細胞およびマクロファージを用いた試験
ｒＦＶＩＩＩＦｃを他のＦＶＩＩＩ製剤から区別する重要な特徴の１つは、自然発生的な成分であるＦｃ部分の存在である。これは、免疫応答を抑制し免疫寛容応答を駆動する１つの原因因子となり得る。ＩｇＧおよびｒＦＶＩＩＩＦｃ内に存在するＦｃ分子は、古典的なＩｇＧ Ｆｃ受容体およびＦｃＲｎと相互作用することができる。Ｆｃ受容体の中で、サブタイプのＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲ２ｂ）は抑制性受容体であり、その受容体を有する細胞型の活性化を抑える抑制シグナルを送達する。ＦｃＲｎを含むＦｃ受容体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ−樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞）に主に局在化するが、Ｔ細胞には局在化しない。従って、ｒＦＶＩＩＩＦｃがこれらの細胞内のＦｃＲ２ｂおよび／またはＦｃＲｎと結合して、免疫寛容誘発性表現型へと傾斜させ得る可能性がある。
ｒＦＶＩＩＩＦｃが樹状細胞およびマクロファージ内のＦｃＲ２ｂおよび／またはＦｃＲｎと結合して免疫寛容誘発性表現型を発生させるかどうかを確かめるために、以下の実験を行う：
１． Ｆｃ受容体と相互作用しないＦＶＩＩＩ単独またはＦＶＩＩＩＦｃ変異体（Ｎ２９７Ａ）との比較における、ｒＦＶＩＩＩＦｃによって制御される、マウスマクロファージ細胞株、脾臓マクロファージおよび脾臓樹状細胞内のｍＲＮＡレベルおよび細胞表面レベルにおける、マーカー（タンパク質）の特定。
２． ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞株におけるＦｃｇＲ２ｂまたはＦｃＲｎの過剰発現およびノックダウン、並びに下流標的を試験することによる、これらの受容体に対するｒＦＶＩＩＩＦｃの影響の調査。
３． ｒＦＶＩＩＩＦｃに対するＡＰＣ応答における、ＴＬＲ仲介性シグナル伝達等の重要な他の経路の関与の可能性の確認。
［実施例２０］
寛容誘導のための代替経路
ｒＦＶＩＩＩＦｃに対する免疫寛容は粘膜経路を介して達成され得る。寛容誘導が可能な２つの部位は胃腸粘膜および呼吸粘膜である。ｒＦＶＩＩＩＦｃに対する経口免疫寛容は、動物に餌として与えてまたは強制経口投与を用いて、該分子を腸管粘膜に送達することにより、誘導することができる。腸粘膜は、調節性免疫応答において重要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する特殊な二次リンパ器官、すなわちパイエル板を有する。これらのＡＰＣは、抗原を処理し、身体の他の部位に移動して抗原（この場合は外から供給されたＦＶＩＩＩ）存在下での免疫応答を抑制するように他の免疫系細胞をプログラムすることができる特殊な樹状細胞サブセットおよびＴｒｅｇサブセットを活性化することができる。この現象は、腸粘膜免疫系のＡＰＣ上に存在するＦｃＲｎおよび／またはＦｃｇＲ２ｂとのＦｃの相互作用によって仲介され得る。呼吸粘膜は、腸に対してと同じ機構に基づいて作動し得る、ｒＦＶＩＩＩＦｃのエアロゾルの吸入によって寛容化することができる。
免疫寛容が粘膜経路を介して達成できるかどうかを確かめるため、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）またはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）が経口的に、またはエアロゾルを介してｈｅｍＡマウスに投与される。抑制抗体の誘導後、動物はｒＦＶＩＩＩＦｃに切り替えられる。これが寛容化段階となる。抗ＦＶＩＩＩ抗体のレベルは表示の通りに採取された血液試料から決定される。寛容化段階の後、動物はＸＹＮＴＨＡ（登録商標）またはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）を再度注射され、採取された血液試料が抗ＦＶＩＩＩ抗体の有無について検査される。寛容化が成功した場合、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）またはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）での二次暴露は、いかなる抗ＦＶＩＩＩ抗体も生じさせないはずであり、これは、粘膜投与後にＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘導するｒＦＶＩＩＩＦｃの能力を示すものであり得る。
［実施例２１］
他の凝固因子に対する免疫寛容
ＦＶＩＩＩ以外の凝固因子ペイロード（payload）に対するＦｃによって免疫寛容が与
えられるかどうかを確かめるために、Ｆｃに融合したＦＶＩＩａ凝固因子（ｒＦＶＩＩａＦｃ）、またはＦｃに融合したＦＩＸ凝固因子（ｒＦＩＸＦｃ）を含むキメラポリペプチドが作製される。ｒＦＶＩＩａＦｃおよびｒＦＩＸＦｃの凝固、発現、および精製は、当該技術分野において公知の方法に従って行われる。ｒＦＶＩＩａＦｃおよびｒＦＩＸＦｃの生化学的、生物物理学的および薬物動態学的な特徴付けが、上記実施例に開示された通りに、および／または、当該技術分野において公知の方法を用いて行われる。市販の凝固因子と比較したｒＦＶＩＩａＦｃおよびｒＦＩＸＦｃに対する抗体応答の評価、並びに免疫寛容研究が、上記の実施例に開示された通りに行われる。凝固因子ペイロード（payload）およびｒＦＩＸＦｃまたはＦＶＩＩａＦｃ等のＦｃ部分を含むキメラポリペプチドは
、未修飾凝固因子（すなわち、Ｆｃ部分を有さないＦＩＸまたはＦＶＩＩ）に対する免疫寛容を効率的に誘導することができる
［実施例２２］
ｒＦＶＩＩＩＦｃを用いる、ＦＶＩＩＩに対する免疫寛容の経胎盤移行
本研究の目的は、妊娠中マウスへのｒＦＶＩＩＩＦｃの投与が、胎盤を介して（Ｆｃ部分の、胎盤細胞上のＦｃＲｎ受容体との相互作用により）胎児に該分子を移行させることができるかどうか、並びに、初期段階でのｒＦＶＩＩＩＦｃへの胎児免疫系の暴露が寛容をもたらすかどうかを、ＦＶＩＩＩを自己抗原として認識させてそれに対する免疫反応を発生させないように胸腺をプログラムすることによって、決定することであった。
妊娠中マウスに、ｒＦＶＩＩＩＦｃもしくはＸＹＮＴＨＡ（登録商標）の１回用量（６Ｕ）を妊娠の１６日目に眼窩後注射により静脈内に、または２回用量（それぞれ６Ｕ）を妊娠の１５日目および１７日目に尾静脈注射により、注入した。ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）の免疫原性を、免疫化した母親から生まれた子において、子が成熟（６〜９週齢）に達した後に、評価した。自己反応性Ｔ細胞を胸腺から除去する際に重要な役割を担う自己免疫調節分子のＡＩＲＥの発生と一致していたため、妊娠１６日目を選択した。結果は、妊娠１６日目におけるｒＦＶＩＩＩＦｃまたはＸＹＮＴＨＡ（登録商標）の単回注入による妊娠中マウスの投与を試験した第一の実験において、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置妊娠中マウスから生まれた子は、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）処置妊娠中マウスから生まれた子と比較して、統計的に有意により低い、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）に対するベテスダ力価を有した（図６２）ことを示た。妊娠１５日目および１７日目に妊娠中マウスの投与を試験した第二の実験において、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置妊娠中マウスから生まれた子は、対照母親から生まれた子と比較して統計的に有意により低い、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）に対するベテスダ力価、並びにＸＹＮＴＨＡ（登録商標）で処置された母親から生まれた子と比較してより低い力価の傾向を有した（図６３）。
母体循環から胎児循環へのタンパク質（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）の経胎盤移行は、免疫化マウスから生まれた子におけるＦＶＩＩＩ活性を検出することにより評価される。Ｔ細胞レベルでの作用は、Ｔ細胞プロファイリングおよびｒＦＶＩＩＩＦｃ寛容化された子からのＴｒｅｇ移植試験によって評価される。
［実施例２３］
ｒＦＶＩＩＩＦｃは抗原提示細胞において免疫寛容誘発性マーカーを調節する
材料および方法
マウス：１２９×Ｂ６バックグラウンド上にＦＶＩＩＩエクソン１６ノックアウトを有する血友病Ａ（ＨｅｍＡ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）（Bi, L.,Lawler, A.M., Antonarakis, S.E., High, K.A., Gearhart, J.D.,and Kazazian, H.H.,Jr. 1995. Targeted disruption of the mouse factor VIII geneproduces a model ofhaemophilia A. Nat Genet 10:119-121）を、Ｈ． Ｋａｚａｚｉａｎ（ペンシルバニア大学、米国ペンシルバニア州フィラデルフィア）から入手して、バイオジェン・アイデック・ヘモフィリアまたはチャールスリバー研究所またはジャクソン研究所で繁殖コロニーとして維持した。使用された全ての動物手順は施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認され、実験動物の飼育および使用の指針（Guideto the Care and Use of Laboratory Animals）から
のガイドラインに基づいて行われた。
抗体および試薬
染色およびフローサイトメトリーに用いられた抗体は、ＢＤバイオサイエンス社（米国ニュージャージー州フランクリン・レイクス）またはイーバイオサイエンス社（eBioscience）（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。使用した抗体は、ＣＤ４お
よびＰＤ−１（Ｔ−ヘルパー細胞）、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、およびＰＤ−Ｌ１（樹状細胞）、並びにＣＤ２５（Ｔｒｅｇ細胞）等のマウス表面マーカー、細胞内サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α）、並びに転写因子（Ｆｏｘｐ３）に対するものである。サイトカインおよび転写因子に対する細胞内染色用試薬は、ＢＤバイオサイエンス社から購入した。組換えＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩＦｃ（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）および組換えＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）は、Peterset al. (Peters, R.T., Toby, G.,
Lu, Q., Liu, T., Kulman,J.D., Low, S.C., Bitonti, A.J., and Pierce, G.F. 2012.Biochemical andfunctional characterization of a recombinant monomeric FactorVIII-Fc fusionprotein. J. Thromb Haemost. DOI: 10.1111/jth.12076）にある通りに合成
した。
他の第ＶＩＩＩ因子医薬原体、すなわちｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（ワイス・ファーマシューティカルズ社、米国ペンシルバニア州フィラデルフィア）、および完全長ＦＶＩＩＩ ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（バクスター・ヘルスケア・コーポレーション社（BaxterHealthcare Corporation）、米国カリフォルニア州ウェストレ
イクビレッジ）は購入し、製造業者のガイドラインに従って再構成した。
マウスにおける免疫／寛容誘導
８〜１０週齢雄ＨｅｍＡマウスから成る３つの処置群に、５０、１００、または２５０ＩＵ／ｋｇの静脈内投与を与え、投与は０、７、１４、２１、３５、および５３日目に行われた。それぞれの処置および服用レベルを１０匹のマウスに投与した。血液試料を０日目（出血前）、１４、２１、２８、および４２日目に眼窩後出血によって採取し、血漿を分離し、ＥＬＩＳＡを用いて抗ＦＶＩＩＩ抗体レベルを決定するために用いた。動物に５３日目にもう一度注射し、５６日目にＣＯ２吸入により安楽死させ、脾臓を無菌ＰＢＳ中に切除した。脾細胞をマウス脾臓分離キットおよびｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ分離器（ミルテニーバイオテク社、ドイツ、コローニュ）を用いて分離した。脾細胞の単一細胞懸濁液を、ＦＡＣＳ染色用に３％ホルマリン（ボストン・バイオプロダクツ社（BostonBioProducts））中で固定するか、またはＲＮＡ単離用の解離緩衝液（ロシュ・アプライド・サイエンス社、インディアナ州インディアナポリス）中に保存した。免疫寛容を調べる研究のために、マウスに０、７、１４、２１、および３５日目に５０ＩＵ／ｋｇを最初に注射した。４２日目にＦＶＩＩＩに対する抗体が存在しないことを確認した後、これらのマウスに、２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを週１回；すなわち、４９、５６、６３、および７０日目（再暴露の０、７、１４、および２１日目）に投与した。再暴露した動物を、１４、２１、および２８日目に採取された出血時の抗ＦＶＩＩＩ抗体レベルについて試験した。
抗ＦＶＩＩＩ抗体のＥＬＩＳＡ
従ったプロトコールはバイオジェン・アイデック・ヘモフィリアで社内設計された。アッセイの前に、全ての血漿試料を水浴中で５６℃に温めて、処置により導入された残存凝固因子およびプレート上にコートされた標準物質を分解し得る抗凝固酵素を不活化した。１日目に、９６ウェル、高結合能マイクロタイタープレート（ThermoImmulon 2HB）を、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の１μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル）のＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩでコートし、４℃で一晩（１２〜１８時間）インキュベートした。次の日、上清を除去し、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝食塩水）で４回洗浄した。次にプレートを、２００μｌ／ウェルの１０％熱不活化ウマ血清含有ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）で、室温で６０分間ブロッキングした。マウスＩｇＧに用いられる標準物質は、等量のＧＭＡ８００２（Ａ１）、ＧＭＡ８００８（Ｃ２）、ＧＭＡ８０１１（Ｃ１）、ＧＭＡ８０１５（Ａ２）、ＧＭＡ８０１６（Ａ２）、ＧＭＡ８００５（Ａ１／Ａ３）を混合することにより調製された抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体のポリクローナルプールであった。モノクローナル抗体は全て、グリーン・マウンテン・アンチボディズ社（バーモント州バーリントン）製であり、括弧内に示されるＦＶＩＩＩドメインエピトープを有した。マウス血漿試験試料をブロッキング緩衝液中で希釈し、同濃度の加熱血漿を標準物質として含有した。次に、ブロッキング緩衝液を除去し、希釈した標準物質および試料を１００μｌ／ウェル、２連で加えた。プレートを、オービタルシェーカー上で振盪させながら、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１００μｌ／ウェルの、ブロッキング緩衝液中で１：２００００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを加え、オービタルシェーカー上で振盪させながら３７℃で６０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで再度４回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを加え、室温で５〜１０分間インキュベートした。結果はプレートリーダーを用いてＯＤ６５０で読み出した。
中和抗体の力価を決定するためのベテスダアッセイ
このアッセイにより、所与の血漿試料中の抗ＦＶＩＩＩ中和抗体の力価が決定された。簡潔に述べると、前記アッセイは、血漿試料を既知濃度の組換えＦＶＩＩＩと混合し、３７℃で２時間インキュベートすることにより行われた。次に、混合物中の残存ＦＶＩＩＩ活性を、第ＩＸａ因子、第Ｘ因子、リン脂質およびＣａＣｌ２の存在下、Ｃｏａｔｅｓｔ
ＦＶＩＩＩ ＳＰキットを用いて検査した。ＦＶＩＩＩの活性を、あらゆる阻害物質の非存在下でｒＦＶＩＩＩを用いてプロットされたＦＶＩＩＩ活性の検量線を使用して、算出した。
ＦＡＣＳ染色
Ｔ細胞および樹状細胞の応答プロファイリングを、単離マウス脾細胞に対して行った。脾臓リンパ細胞および樹状細胞を表面標的および細胞内標的に対して染色した。表面染色において、１×１０６の全脾細胞を適切な濃度の抗体と一緒にインキュベートした。細胞内染色のために、細胞をＢＤ Ｆｉｘ−Ｐｅｒｍ溶液（ＢＤバイオサイエンス社）で透過処理した後、同一緩衝液中のサイトカインに対する抗体と一緒にインキュベートした。Ｆｏｘｐ３染色を、Ｆｏｘｐ３染色緩衝液（ＢＤバイオサイエンス社）中の抗体を用いて行った。ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを用いて蛍光強度を記録し、ＦＬＯＷＪＯソフトウェアを用いて解析した。リンパ球を、ＣＤ４および細胞内マーカーのＩＬ−２、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−４で共染色した。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、表面マーカーのＣＤ４およびＣＤ２５に対して染色した後、細胞内Ｆｏｘｐ３に対して染色した。脾細胞をＣＤ１１ｃおよびＰＤ−Ｌ１（樹状細胞）またはＣＤ４およびＰＤ−１（ＣＤ４＋Ｔ細胞）に対して染色して、ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１経路に関与する細胞を特定した。
リアルタイムＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲに基づくアレイ解析
全ＲＮＡを、ＲＮＡ単離キット（ロシュ・アプライド・サイエンンス社、インディアナ州インディアナポリス）を用いて単離し、ｃＤＮＡに逆転写した（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）。試験遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲプライマーを、インテグレーティッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ社（IDTtechnologies）のウェブサイト（www.idtdna.com）上で利用可能なオンラインアルゴリズムを用いて設計し、インテグレーティッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ社（アイオワ州コーラルビル）から購入した。ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎに基づくリアルタイムＰＣＲを、ＡＢＩ ７９００ Ｆａｓｔ ＢｌｏｃｋリアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオシステムズ社、 フォスターシティ、カリフォルニア州）においてＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ系（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲに基づくアレイについて、５００ｎｇの全ｃＤＮＡをＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎに基づくｑＰＣＲマスターミックスと混合し、９６ウェルプレートアレイ上に分注した（ＰＡＭＭ０４７Ｚ、Ｔ細胞アネルギーおよび免疫寛容ＰＣＲアレイ（T-cellAnergy and Immune Tolerance PCR Array）；ＳＡバイオサイエンス社（SA Biosciences）、米国メリーランド州フレデリック）。ＡＢＩ ７９００ Ｆａｓｔ ＢｌｏｃｋリアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて反応を実行した。７５００ソフトウェア（バージョン２．０．５）を用いて結果を解析し、遺伝子転写物の相対レベルを、内在性ハウスキーピング遺伝子を対照として用い、２−ΔＣｔ相対定量法（2−ΔCtrelative quantification method）（Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. 2001.Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR andthe 2(-Delta Delta C(T))Method. Methods 25:402-408）を用いて測定した。正規化に使用したハウスキーピング遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ、Ｈｓｐ９０ａｂ、β−アクチン、およびＧｕｓＢであった。各試料において、ハウスキーピング遺伝子の平均Ｃｔ値をまとめて、ΔＣｔの算出に使用した。３５を超える閾値までのサイクル数（thresholdcycle：Ｃｔ）を示したｍＲＮＡは解析から除外した。
Ｔ細胞増殖およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）レベルの決定
ＨｅｍＡマウス（８〜１０週齢）にＦＶＩＩＩ医薬原体を週１回、２週間注射した。２回目の注射の７２時間後、マウスを安楽死させ、無菌ＰＢＳを用いる洗浄により腹腔マクロファージを採取した。脾臓Ｔ細胞を、磁気ビーズに基づくマウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニーバイオテク社、ドイツ）を用いて単離した。Ｔ細胞を、１０μＭ ＣＦＳＥ（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて１５分間、温めたＰＢＳ中で標識し、９６ウェル超低接着プレート（コーニング社）に、１ウェルあたり１×１０６細胞／ｍｌの密度の腹腔マクロファージと一緒に播種した。次に、細胞を、共起刺激抗体、すなわち抗ＣＤ２８および抗ＣＤ４９ｄ（ＢＤバイオサイエンス社）を含有するＸ−ＶＩＶＯ １５培地（ロンザ社）中０．１、１および１０ｎＭのｒＦＶＩＩＩまたはビヒクルまたはＣＤ３／ＣＤ２８ミクロビーズ（ポジティブコントロール；ミルテニーバイオテク社）と一緒に、３７℃で９６時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、培養上清中のＩＦＮγレベルを、メソスケールデバイス社（MesoScale Devices：ＭＳＤ）製ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。Ｔ細胞増殖を、ＦＡＣＳ（ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ ＩＩ）を用いて、前方散乱光および側方散乱光に基づいてゲーティングしたＴ細胞におけるＣＦＳＥ蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することにより、決定した。
統計解析
結果の統計解析を、独立スチューデントｔ検定またはマンホイットニーのＴ検定を用いて行った。０．０５未満のＰ値を有意と見なした。
結果
樹状細胞はプロフェッショナル抗原提示細胞であり、免疫応答を寛容に傾斜させる際に中枢となる重要な分子および酵素を有する。ＦＶＩＩＩ医薬原体またはビヒクルを注射されたｈｅｍＡマウスから得られた脾細胞を、ＣＤ１１ｃおよびＭＨＣクラスＩＩ分子に対して染色して、樹状細胞をゲーティングした。より多くの抗原提示を示す成熟樹状細胞において上方制御されている表面マーカーであるＣＤ８０、およびＰＤ−１受容体に対するリガンドであるＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）等のマーカーを発現している樹状細胞の脾臓成分を、これらの分子に対する特異的抗体を用いて共染色することにより、特定した。図６３Ａに示す通り、１００ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃまたはＢＤＤ−ＦＶＩＩＩを注射されたＨｅｍＡマウス由来の脾細胞は、ＣＤ８０を発現している樹状細胞の割合（％）において有意な減少を示し、このことは、未成熟樹状細胞が大量に存在することを示唆している。
ｆｌ−ＦＶＩＩＩを与えられたマウスはビヒクルと比較してＣＤ８０＋樹状細胞の割合における減少を示したが、統計的有意性は達成されなかった（図６４Ａ）。５０ＩＵ／ｋｇ用量のｒＦＶＩＩＩＦｃを与えられているマウスについても同様の傾向であった。２５０ＩＵ／ｋｇでは、３種の処置のいずれも、脾細胞中のＣＤ８０＋樹状細胞の割合における変化を示さなかった。
ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）を発現している脾臓樹状細胞のＦＡＣＳ解析からの結果により、１００ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃが、ビヒクル処置および他のＦＶＩＩＩ処置と比較してこれらの細胞の割合を増強させたことが明らかにされた（図６４Ｂ）。この分子は、リアルタイムＰＣＲ分析によって示された通り、ｒＦＶＩＩＩＦｃによってｍＲＮＡレベルでの制御も受けた（図６４Ｃ）。このことは、ｒＦＶＩＩＩＦｃが重要な免疫抑制経路の１つであるＰＤ−Ｌ１：ＰＤ−１経路を調節することによって、ＦＶＩＩＩの免疫原性を低減させることを示している。ＣＤ２７４に加えて、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、トリプトファン代謝に影響を与えることによりＴ細胞の増殖および活性化を制御する重要な酵素であるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）のｍＲＮＡレベルも上方制御した（図６４Ｄ）。
［実施例２４］
低用量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、脾細胞における免疫寛容およびアネルギーのマーカーの発現を増強する
実験手順を実施例２３に記載の材料および方法に従って実行した。
ｒＦＶＩＩＩＦｃによって誘導される免疫寛容のマーカーを特定するために、免疫寛容およびアネルギーに特異的な遺伝子に焦点を当てたリアルタイムＰＣＲに基づくアレイ（ＳＡバイオサイエンス社）を使用した。５０および２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃおよびビヒクルを注射されたマウスから得られた脾細胞から単離されたｍＲＮＡを用いて、この医薬原体により活性化される新規の応答エレメントを特定した。
候補物質を、それらの発現レベル（ビヒクルよりも２倍高いまたは低い）、およびスチューデントｔ検定に基づくｐ値（＜０．０５）に基づいて特定した。各遺伝子の相対発現を、一連の５つのハウスキーピング遺伝子の平均Ｃｔ値に対して正規化した後、２−ΔＣｔ法（Livak,K.J., and Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of relative geneexpression data usingreal-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method. Methods25:402-408）を用いて決定した（実施例２３、材料および方法を参照）。
これらの基準に基づき、実行されたアレイ解析によって、ビヒクルおよび２５０ＩＵ／ｋｇを注射されたマウスとの比較において、脾細胞レベルで５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃによって優先的に制御された候補物質が明らかにされた（図６５および図６６）。これらには、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２５等の寛容特異的遺伝子；Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、およびＣＢＬ−Ｂ等のアネルギー関連遺伝子；腫瘍壊死因子スーパーファミリー（TumorNecrosis Factor Superfamily：ＴＮＦＲＳＦ）に属する遺伝子；プロス
タグランジンシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）およびプロスタグランジンＥ２受容体（ＰＴＧＥＲ２）の統計的に有意な発現上昇が含まれる（図６６参照）。逆に、このアレイを用いて特定された下方制御されたいくつかの遺伝子は、ＣＣＬ３およびＳＴＡＴ３等の公知の炎症誘発性分子である（図６６）。
これらの結果により、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを与えられている動物の脾細胞内に、免疫寛容誘発性経路および免疫寛容誘発性微小環境の存在が示された。前記アレイを用いて決定された遺伝子発現プロファイルは、特定された候補物質に対する個々のプライマー対を使用するリアルタイムＰＣＲを用いて妥当性を検査される。
［実施例２５］
２５０ＩＵ／ｋｇ群のマウスから得られたＣＤ４＋脾細胞は増殖し、高レベルのＩＦＮ−γを産生する。
実験手順は実施例２３に記載の材料および方法に従って実行した。
Ｔ細胞増殖試験を行って、第ＶＩＩＩ因子特異的なＴ細胞応答をエキソビボで調べた。５０または２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃの週１回の注射を２回与えられたマウスマウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＦＳＥで標識し、腹腔マクロファージ（抗原提示細胞；ＡＰＣ）で再構成し、３つの濃度（０．１、１、および１０ｎＭ）のＢドメイン欠失ｒＦＶＩＩＩの存在下でインキュベートした。
ＣＦＳＥ希釈シグナルに基づく増殖に関するＦＡＣＳ解析によって、２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃで処置された群から得られたＴ細胞が、増殖において用量依存的な増加を示し、これが、１０ｎＭにおいて統計的に有意であったことが明らかにされた（図６７）。並行して、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃで処置されたマウスから得られたＴ細胞は、漸増濃度のｒＦＶＩＩＩによる、ビヒクルと比較した、増殖における有意な増加をエキソビボで示さなかった（図６７）。
これらのインキュベーションの培養上清から測定されたＩＦＮレベルは、Ｔ細胞増殖パターン、すなわち、２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃで処置されたマウス由来のＴ細胞からの分泌における用量依存的な増加（図６８Ａ）、それに対する、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃで処置されたマウス由来のＴ細胞から得られるレベルの無変化と一致する、同様のプロファイルを明らかにした（図６８Ｂ）。
ＦＶＩＩＩに対する免疫応答の抑制におけるｒＦＶＩＩＩＦｃの作用機序を分析するために、２種類の変異構築物（一方はＦｃγ受容体に結合せず（ｒＦＶＩＩＩＦｃ−Ｎ２９７Ａと称する）、もう一方はＦｃＲｎ受容体への結合が欠如している（ｒＦＶＩＩＩＦｃ−ＩＨＨと称する））を使用した。これらの構築物を用いて、免疫抑制作用を引き起こす際のこれらの受容体の１つとのｒＦＶＩＩＩＦｃの相互作用を特定した。この目的を達成するために、２５０ＩＵ／ｋｇ用量（図６８Ｃ）および５０ＩＵ／ｋｇ用量（図６８Ｄ）のｒＦＶＩＩＩＦｃ−Ｎ２９７Ａの週１回注射を２回受けたマウスに由来するＴ細胞のＩＦＮγ分泌プロファイルを試験した。
２５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩＦｃ−Ｎ２９７Ａから得られたＴ細胞からのＩＦＮγ分泌の対照比較によって、サイトカインのレベルは、ビヒクルと比較して有意により高いレベルであるが、変異型を与えられている動物由来のＴ細胞において高度に低減されたことが明らかにされた。しかし、５０ＩＵ／ｋｇ群の変異型タンパク質からのＩＦＮγのレベルは、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃのそれとの有意差を示さなかった。これにより、より高い用量のｒＦＶＩＩＩＦｃで観察されたより高度な抗体産生およびＴ細胞増殖は、Ｆｃγ非結合変異体によって無効にされるＦｃγ受容体とのＦｃの相互作用の結果であり得ることが示唆される。
上記の特定の実施形態は本発明の一般的性質を充分に明らかにしているため、他の者は、必要以上の実験なしに、本発明の一般概念から逸脱することなく、当業者の技能の範囲内の知識を適用することによって、容易に改変することが可能であり、および／または特定の実施形態等の種々の応用に適合させることができる。従って、そのような適合および改変は、開示の実施形態の等価物の意味および範囲に含まれており、本明細書に示される教示および模範に基づくことが意図される。本明細書における語法または用語は説明を目的としたものであり、限定を目的をしたものではなく、本明細書の専門用語または語法は、教示および模範に照らし合わせて当業者によって解釈されるものであることを理解されたい。

表１：ポリヌクレオチド配列
Ａ． Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩＦｃ
（ｉ）Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩＦｃ鎖のＤＮＡ配列（下線はＦＶＩＩＩシグナルペプチド、太字はＦｃ領域）（配列番号２をコードする配列番号１）

（ｉｉ）Ｆｃ ＤＮＡ配列（下線はマウスＩｇκシグナルペプチド）（配列番号４をコードする配列番号３）

Ｂ． 完全長ＦＶＩＩＩＦｃ
（ｉ）完全長ＦＶＩＩＩＦｃのＤＮＡ配列（下線はＦＶＩＩＩシグナルペプチド、太字はＦｃ領域）（配列番号６をコードする配列番号５）

（ｉｉ）Ｆｃ（Ａ（ｉｉ）（配列番号３）と同一配列）］
表２：ポリペプチド配列
Ａ． Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ単量体ハイブリッド（ＢＤＤ ＦＶＩＩＩＦｃ単量体二量体）：ＢＤＤ ＦＶＩＩＩＦｃおよびＦｃ鎖を共発現することにより生成。
コンストラクト＝ＨＣ−ＬＣ−Ｆｃ融合物。
Ｆｃ発現カセットをＢＤＤＦＶＩＩＩ−Ｆｃと一緒に同時導入して、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩＦｃ単量体−を生成させる。
ＢＤＤ ＦＶＩＩＩＦｃ鎖において、Ｆｃ配列は太字で示され；ＨＣ配列は二重下線で示され；残りのＢドメイン配列はイタリックで示される。
シグナルペプチドには下線が引かれている。
ｉ） Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ鎖（下線は１９アミノ酸シグナル配列）（配列番号２）

ｉｉ）Ｆｃ鎖（下線はマウスＩｇκ鎖由来の２０アミノ酸の異種シグナルペプチド）（配列番号４）

Ｂ． 完全長ＦＶＩＩＩＦｃ単量体ハイブリッド（完全長ＦＶＩＩＩＦｃ単量体二量体）：ＦＶＩＩＩＦｃおよびＦｃ鎖の共発現によって生成。
コンストラクト＝ＨＣ−Ｂ−ＬＣ−Ｆｃ融合物。Ｆｃ発現カセットを完全長ＦＶＩＩＩ−Ｆｃと一緒に同時導入して、完全長ＦＶＩＩＩＦｃ単量体を生成する。ＦＶＩＩＩＦｃ鎖において、Ｆｃ配列は太字で示され；ＨＣ配列は二重下線で示され；Ｂドメイン配列はイタリックで示される。シグナルペプチドには下線が引かれる。
ｉ） 完全長ＦＶＩＩＩＦｃ鎖（下線はＦＶＩＩＩシグナルペプチド（配列番号６）

ｉｉ） Ｆｃ鎖（下線はマウスＩｇκ鎖由来の２０アミノ酸の異種シグナルペプチド）（配列番号４）

Claims (1)

  1. 本願明細書に記載の発明。
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