DE60123238T2

DE60123238T2 - Zusammensetzungen zur behandlung von autoimmunkrankheiten

Info

Publication number: DE60123238T2
Application number: DE60123238T
Authority: DE
Inventors: Habib Columbia ZAGHOUANI
Original assignee: University of Tennessee Research Foundation
Current assignee: University of Tennessee Research Foundation
Priority date: 2000-06-05
Filing date: 2001-06-04
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2021-06-05
Also published as: CA2416656A1; AU2001265417A1; DE60123238D1; EP1292621B1; US20020038002A1; JP2004509978A; WO2002026833A1; EP1292621A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Zusammensetzungen für die wirksame endozytische Präsentation von immunsuppressiven Faktoren. Im Spezielleren betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die immunsuppressive Faktoren umfassen, die zur Behandlung verschiedener Störungen zweckdienlich sind, die Autoimmunstörungen umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind. In bevorzugten Ausführungsformen können die immunsuppressiven Faktoren T-Zellen-Rezeptorantagonisten oder -Agonisten sein. Andere Ausführungsformen der Erfindung sorgen für die Toleranzausbildung bei Neugeborenen oder Säuglingen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die ein an ein Antigen gebundenes aggregiertes Immunglobulin oder einen an ein Antigen gebundenen Teil davon umfasst, worin das Immunglobulin oder der Teil davon fähig ist, an den Zelloberflächen von Antigen-präsentierenden Zellen vorhandene Fc-Rezeptoren zu vernetzen. Ausführungsformen betreffen Verfahren der Erhöhung der Spiegel von IL-10 in einem Individuum, welches dieses benötigt. Weitere Ausführungsformen sind bei Verfahren der Stimulierung von peripherer Toleranz und/oder „Bystander"-Suppression in einem Individuum zweckdienlich, welches dies benötigt. Andere Ausführungsformen betreffen Zusammensetzungen zur Verminderung des IFNγ-Spiegels in einem Individuum, welches dies benötigt. In weiteren Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die die Präsentation eines Autoantigens durch Antigen-präsentierende Zellen erleichtern, denen costimulatorische Moleküle fehlen oder die ein vermindertes Ausmaß davon aufweisen.
Hintergrund der Erfindung
Vertebraten besitzen die Fähigkeit, eine Immunreaktion als Verteidigung gegen Pathogene aus der Umgebung sowie gegen abnormale Zellen, wie z.B. Tumorzellen, die sich intern entwickeln, aufzubauen. Die Immunreaktion ist das Resultat komplexer Wechselwirkungen zwischen einer Reihe von Zellen und Faktoren, umfasst jedoch im Allgemeinen zwei Hauptaspekte. Der eine ist eine Zellkomponente, bei der spezialisierte Zellen ein angreifendes Agens (das das Antigen trägt) direkt attackieren, während der andere eine humorale Komponente ist, bei der Antikörpermoleküle spezifisch an das Antigen binden und seine Eliminierung unterstützen. Indem sie zusammenarbeiten, sind die einzelnen Elemente recht wirksam bei der Begrenzung des anfänglichen Angriffs eindringender Pathogene und deren Eliminierung aus dem Wirt.
Die bei der Immunreaktion hauptbeteiligten Zellen sind Lymphozyten, die im Allgemeinen zwei Hauptklassen umfassen. Die erste davon, die als B-Zellen oder B-Lymphozyten bezeichnet werden, wird typischerweise im Knochenmark erzeugt und ist unter anderem für die Produktion und Sekretion von Antikörpern verantwortlich. B-Zellen-Antikörperprodukte neigen dazu, mit fremden Antigenen direkt zu reagieren und sie zu neutralisieren, oder aktivieren andere Komponenten des Immunsystems, die dann diese eliminieren. Insbesondere binden opsonierende Antikörper an extrazelluläre fremde Agenzien, wodurch sie der Phagozytose und anschließenden intrazellulären Abtötung zugänglich gemacht werden. Andererseits sind T-Zellen oder T-Lymphozyten, die sich im Allgemeinen im Thymus entwickeln oder dort reifen, für die Vermittlung der zellulären Immunreaktion verantwortlich. Diese Zellen erkennen vollständige Antigene nicht, sondern reagieren stattdessen auf kurze Peptidfragmente davon, die an spezialisierte Proteine gebunden sind, die an der Oberfläche einer Target-Zelle auftauchen. Im Spezielleren scheint es so zu sein, dass innerhalb einer Zelle produzierte Proteine oder Proteine, die von einer Zelle aus dem extrazellulären Milieu aufgenommen werden, durch normale metabolische Stoffwechselwege kontinuierlich abgebaut werden. Die resultierenden kurzen Fragmente assoziieren mit intrazellulären Haupthistokompatibilitätskomplex- (MHC-) Molekülen, und die MHC-Peptid-Komplexe werden an die Oberfläche der Zellen zur Erkennung durch T-Zellen transportiert. Folglich beobachtet das zelluläre Immunsystem laufend ein vollständiges Spektrum von Proteinen, die von den Zellen produziert oder aufgenommen werden, und ist bereit, jegliche Zellen, die fremdes Antigen oder Tumorantigene präsentieren, d.h. virusinfizierte Zellen oder Krebszellen, zu eliminieren.
Die allgemeine Struktur von Immunglobulin G (IgG), dem häufigsten der Säugetierantikörper, ist in 1 schematisch dargestellt. Wie illustriert ist IgG ein tetramerer Proteinkomplex, der zwei identische Schwer- (H-) Ketten und zwei identische Immunglobulin-Leicht- (-L-) Ketten umfasst. Diese Ketten sind durch Disulfidbrücken miteinander verbunden, um den Y-förmigen Antikörperkomplex auszubilden. In Lösung nimmt das Molekül jedoch eine eher globuläre Form ein und bindet leicht an die in biologischen Flüssigkeiten vorhandenen fremden Antigene.
Die Aminosäuresequenzanalyse von Immunglobulinen hat zur Definition spezifischer Regionen mit verschiedenen funktionellen Aktivitäten innerhalb der Ketten geführt. Jede Leichtkette und jede Schwerkette weist eine variable Region auf (V_L bzw. V_H), die sich innerhalb der ersten 110 aminoterminalen Reste befinden. Die dreidimensionale Paarung der V_L- und V_H-Regionen begründet den Antigenerkennungsabschnitt oder die „antigenkombinierende Stelle" („ACS") von Immunglobulinmolekülen. Wegen der tetrameren Natur von Immunglobulinen gibt es zwei identische antigenkombinierende Stellen pro Molekül. Die variablen Domänen dieser Ketten sind hinsichtlich Sequenz höchst heterogen und sorgen für die Diversität der antigenkombinierende Stellen, um für eine große Vielfalt an antigenen Strukturen höchst spezifisch zu sein. Die Heterogenität der variablen Domänen ist nicht gleichmäßig über die variablen Regionen verteilt, sondern ist in drei Segmenten lokalisiert, die komplementaritätsbestimmende Regionen („CDRs") genannt werden, die als CDR1, CDR2 und CDR3 bezeichnet werden. Für weitere Informationen bezüglich dieser Strukturen siehe Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4. Aufl., Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, CA (1987).
Jede der Schwerketten umfasst auch eine konstante Region, die einen bestimmten Isotyp definiert und das Immunglobulin einer der Immunglobulinklassen und -Unterklassen zuordnet. Die konstante Region enthält Einheiten, die Domänen genannt werden (d.h. C_H1, C_H2 usw.), die unter Antikörpern einer einzelnen Klasse nicht signifikant variieren. Die konstante Region nimmt nicht an der Antigenbindung teil, kann jedoch mit einer Anzahl biologischer Aktivitäten assoziiert sein, die als „Effektorfunktionen" bekannt sind, wie z.B. Bindung an Fc-Rezeptoren an Zelloberflächen Antigen-präsentierender Zellen (APCs) sowie Bindung an Komplementproteine. Antigen-präsentierende Zellen, wie z.B. dendritische Zellen und Makrophagen, sind neben anderen Eigenschaften durch die Gegenwart eines Fc-Rezeptors gekennzeichnet. Daher kann er, wenn ein Antikörper an ein Pathogen gebunden ist, über den Fc-Abschnitt an einen Phagozyten binden. Dies ermöglicht die Aufnahme und Zerstörung des Pathogens durch den Phagozyten, einen als Opsonisation bekannten Vorgang. Darüber hinaus können verschiedene pathogene Antigene, wie unten ausführlicher besprochen wird, durch die APC prozessiert und präsentiert werden, um eine Immunreaktion weiter zu stimulieren.
Im Gegensatz zu Schwerketten weisen die Leichtketten eine einzige konstante Domäne (C_L) auf. Eine Leichtkette paart sich mit einer Schwerkette über eine Disulfidbindung, die die schwere konstante Region C_H1 an C_L anbindet. Außerdem weisen die Schwerketten eine Gelenksregion auf, die die konstanten Regionen C_H1 und C_H2 vom Rest des Moleküls trennt. Es ist diese Gelenksregion, die hauptsächlich für die Flexibilität des Tetramers verantwortlich ist. Die beiden Schwerketten des Moleküls paaren sich miteinander über Disulfidbindungen an der Verbindungsstelle zwischen der Gelenksregion und C_H2.
Um ein derartig breites Repertoire bereitzustellen, haben sich Immunglobulingene so entwickelt, dass sie die Produktion einer enormen Anzahl verschiedener Immunglobulinproteine aus einer endlichen Anzahl von Genen ermöglichen (d.h. inhärenter Polymorphismus). Aufgrund des inhärenten Polymorphismus sind Säugetiere fähig, Antikörper gegen eine scheinbar unendliche Anzahl von Antigenen zu produzieren. Für einen Überblick über die Genetik und Proteinstruktur von Immunglobulinen siehe Lewin, Genes III, John Wiley and Sons, New York (1987); und Benjamini et al., Immunology, Alan R. Liss, Inc., New York (1988).
In den letzten Jahren sind Antikörper wegen ihrer Diversität und Spezifität äußerst wichtig für diagnostische und therapeutische Anwendungen geworden. Im steigenden Ausmaß sind molekularbiologische Techniken verwendet worden, um die Vielfalt und Verfügbarkeit von Antikörpern für wissenschaftliche Anwendungen zu erweitern.
Beispielsweise kann eine einzelne Antikörper produzierende B-Zelle durch Fusion mit einer Tumorzelle immortalisiert und vermehrt werden, um eine In-vitro-Quelle von Antikörpern einer einzigen Spezifität bereitzustellen, die als „monoklonale Antikörper" (mAb) bekannt sind. Eine derartige unsterbliche B-Zelllinie wird „Hybridom" genannt.
Bis vor kurzem sind in vitro kultivierte murine (Maus-) Hybridome die Quelle der meisten mAb gewesen. D.h. dass eine Maus typischerweise mit einem ausgewählten Antigen oder Immunogen injiziert wurde. Anschließend wurde das Tier getötet, und aus seiner Milz entfernte Zellen wurden mit unsterblichen Myelomzellen fusioniert. Obgleich sie ausgiebig bei diagnostischen Verfahren verwendet worden sind, haben sich murine mAb als nicht gut geeignet für therapeutische Anwendungen bei den meisten Säugetieren, einschließlich des Menschen, erwiesen. Teilweise liegt das an der Tatsache, dass murine Antikörper von anderen Säugetierspezies als fremd erkannt werden und eine Immunreaktion hervorrufen, die selbst Krankheit oder unerwünschte Nebenwirkungen verursachen kann.
Um zumindest einige dieser Probleme des Immunsystems zu überwinden, die durch fremde mAb und das Fehlen geeigneter menschlicher mAb erzeugt werden, ist Gentechnologie angewendet worden, um humanisierte chimäre Immunglobulinmoleküle zu konstruieren, die die antigenbindenden komplementaritätsbestimmenden Regionen der murinen Antikörper enthalten, bei denen sich jedoch der Rest des Moleküls aus menschlichen Antikörpersequenzen zusammensetzt, die nicht als fremd erkannt werden. Derartige Antikörper sind verwendet worden, um Tumoren zu behandeln, da die variable Region der Maus das Tumorantigen erkennt und der humanisierte Abschnitt des Moleküls fähig ist, eine Immunreaktion zu vermitteln, ohne vom Körper rasch eliminiert zu werden. Siehe beispielsweise Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986).
Andere Verwendungen derartiger Antikörper sind in der ebenfalls anhängigen US-Anmeldung Nr. 08/363.276 und PCT-Anmeldung Nr. WO 94/14847 ausgeführt. In diesen Fällen werden Epitope fremder Antigene, wie z.B. virale oder bakterielle Epitope, auf die hypervariable Region eines Immunglobulins gepfropft, um eine Reakti on auszulösen. Das heißt, dass die konstruierten Antikörper als Vakzine verwendet werden, um eine Immunreaktion hervorzurufen und ein Langzeit-Immungedächtnis zu verleihen, wodurch es dem Patienten ermöglicht wird, nachfolgende Infektionen abzuwenden.
Diese und herkömmlichere Vakzinen sind insofern wirksam, als dass sie beide Arme des Immunsystems stimulieren. Trotz der mit der humoralen Komponente der Immunreaktion verbundenen Schwierigkeiten wäre es an sich und aus sich selbst heraus nicht fähig, ein Tier vor den unzähligen pathogenen Angriffen zu schützen, denen es jeden Tag ausgesetzt ist. Stattdessen ist es einzig die Gegenwart einer höchst evolvierten zellulären Reaktion, die es höheren Organismen ermöglicht, zu überleben und sich zu vermehren.
Wie oben angedeutet, sind T-Lymphozyten oder T-Zellen, die aus Vorläufern im Knochenmark hervorgehen, zentrale Akteure bei der Immunreaktion gegen eindringende Viren und andere Mikroorganismen. Die Vorläuferstammzellen wandern zum Thymus, wo sie sich als so genannte Thymozyten spezialisieren. Insbesondere beginnen sie die Rezeptormoleküle zu präsentieren, die es reifen T-Zellen später ermöglichen, eine Infektion zu detektieren. Um förderlich zu sein, müssen T-Zellen fähig sein, sich über ihre Rezeptoren an mikrobielle Antigene (Proteinmarker, die die Gegenwart eines Eindringlings signalisieren) anzuheften. Gleichzeitig sollten sie auf vom Körper hergestellte Substanzen blind sein, da selbstreaktive T-Zellen normale Gewebe zerstören können. Typischerweise werden nur jene Thymozyten, die nützliche Rezeptoren herstellen, vollständig reifen und in die Blutbahn eintreten, um den Körper zu kontrollieren. Andere, die unwirksam wären oder das eigene Gewebe des Körpers angreifen würden, werden in gesunden Individuen durch Apoptose vor dem Verlassen des Thymus eliminiert.
Reife T-Zellen, die schließlich entweder als zytolytische T-Lymphozyten oder T-Helferzellen in den Kreislauf eintreten, verbleiben im Ruhestadium außer wenn sie Antigenen antreffen, die ihre Rezeptoren erkennen können. Nach dem Aufeinandertreffen mit spezifischen Antigenen, für die die Lymphozyten Affinität aufweisen, ver mehren sie sich und führen Effektorfunktionen aus, deren Resultat die Eliminierung fremder Antigene ist.
T-Zellen sind auf Basis der von ihnen durchgeführten Aufgaben in mehrere Unterpopulationen eingeteilt worden. Diese Unterpopulationen umfassen Helfer-T-Zellen (T_h), die zur Förderung oder Verstärkung von T- und B-Zellenreaktionen erforderlich sind; zytotoxische (oder zytolytische) T-Lymphozyten (CTL), die ihre Zielzellen durch Zelllyse direkt abtöten; und Suppressor-T-Zellen (T_S), die die Immunreaktion herabregulieren. In jedem Fall erkennen T-Zellen Antigene, jedoch nur, wenn sie an der Oberfläche einer Zelle durch einen spezialisierten Proteinkomplex präsentiert werden, der an der Oberfläche Antigen-präsentierender Zellen haftet. Im Spezielleren verwenden T-Zellen einen spezifischen Rezeptor, der als T-Zellen-Antigenrezeptor (TCR) bezeichnet wird, der ein Transmembranproteinkomplex ist, der zur Erkennung eines Antigens in Verbindung mit der Gruppe von Proteinen fähig ist, die zusammen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) genannt werden. Tausende identische TCRs werden an jeder Zelle exprimiert. Der TCR ist hinsichtlich Funktion sowie Struktur mit dem Oberflächenantikörper (nicht sekretiert) verwandt, den B-Zellen als ihre Antigenrezeptoren verwenden. Weiters exprimieren verschiedene Unterpopulationen von T-Zellen außerdem eine Vielzahl von Zelloberflächenproteinen, von denen manche „Markerproteine" genannt werden, da sie für bestimmte Unterpopulationen charakteristisch sind. Beispielsweise exprimieren die meisten T_h-Zellen das Zelloberflächen-CD4-Protein, wogegen die meisten CTL- und T_S-Zellen das Zelloberflächen-CD8-Protein exprimieren. Diese Oberflächenproteine sind bei der Initiation und Erhaltung von Immunreaktionen wichtig, die von der Erkennung von und Wechselwirkung zwischen bestimmten Proteinen oder Proteinkomplexen an der Oberfläche von APCs abhängen.
Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass der Haupthistokompatibilitätskomplex oder MHC tatsächlich eine Reihe von glykosylierten Proteinen umfasst, die unterschiedliche Quartärstrukturen umfassen. Im Allgemeinen sind die Strukturen von zweierlei Art: Klasse-I-MHC, der Peptide aus Proteinen präsentiert, die innerhalb von Zellen hergestellt werden (wie z.B. Proteine, die im Anschluss an Virusreplikation produziert werden), und Klasse-II-MHC, der im Allgemeinen Peptide aus Proteinen präsentiert, die von außen in die Zelle eingedrungen sind (lösliche Antigene, wie z.B. bakterielle Toxine). Die Erkennung verschiedener Antigene wird durch ererbten Polymorphismus sichergestellt, der fortlaufend einen diversen Pool von MHC-Molekülen bereitstellt, die zur Bindung an jegliche mikrobielle Peptide fähig sind, die auftreten könnten. Im Wesentlichen produzieren und exprimieren alle kernhaltigen Zellen Klasse-I-MHC, der natürlich auftretende Peptide, tumorassoziierte Peptide oder von einem viralen Eindringling produzierte Peptide aufweisen kann. Im Gegensatz dazu produzieren und exprimieren nur wenige spezialisierte Lymphoidzellen Klasse-II-MHC-Proteine, nämlich jene, die allgemein als Antigen-präsentierende Zellen bekannt sind. Unabhängig vom Zelltyp führen beide Klassen von MHC Peptide an die Zelloberfläche und präsentieren sie ruhenden T-Lymphozyten. Für gewöhnlich erkennen T_h-Zellen Klasse-II-MHC-Antigenkomplexe, während CTLs dazu neigen, Klasse-I-MHC-Antigenkomplexe zu erkennen.
Wenn eine ruhende T-Zelle, die einen geeigneten TCR trägt, auf die APC trifft, die das Peptid an ihrer Oberfläche trägt, bindet der TCR an den Peptid-MHC-Komplex. Im Spezielleren binden hunderte von TCRs an zahlreiche Peptid-MHC-Komplexe. Wenn ausreichend TCRs kontaktiert sind, aktiviert der kumulative Effekt die T-Zelle. Rezeptoren an T-Zellen, die für die spezifische Erkennung von und Reaktion auf den MHC-Antigenkomplex verantwortlich sind, sind aus einem Komplex aus mehreren integralen Plasmamembranproteinen zusammengesetzt. Wie beim vorher erörterten MHC-Komplex wird ein diverser Pool von TCRs durch inhärenten Polymorphismus sichergestellt, was zu somatischer Neuordnung führt. Es sollte betont werden, dass, obgleich der Pool von TCRs divers sein kann, jede einzelne T-Zelle nur einen einzigen spezifischen TCR exprimiert. Jedoch weist jede T-Zelle typischerweise tausende Kopien dieses Rezeptors, der für nur ein Peptid spezifisch ist, an der Oberfläche jeder Zelle auf. Außerdem sind mehrere andere Typen von membranassoziierten Proteinen an der T-Zellenbindung und -Aktivierung beteiligt.
Die Aktivierung der T-Zelle bedingt die Erzeugung einer Reihe von chemischen Signalen (in erster Linie Cytokinen), die in der direkten Aktivierung der Zelle oder Stimu lation anderer Zellen des Immunsystems zur Aktivität resultiert. Im Falle der Klasse-I-MHC-Antigenaktivierung proliferieren CTLs und zerstören infizierte Zellen, die dasselbe Antigen präsentieren. Das Abtöten einer infizierten Zelle entzieht einem Virus die Lebensgrundlage und macht ihn Antikörpern zugänglich, die ihn schließlich eliminieren. Im Gegensatz dazu zerstört die Aktivierung von T_h-Zellen durch Klasse-II-MHC-Antigenkomplexe nicht die Antigen-präsentierende Zelle (die Teil des Verteidigungssystem des Wirts ist), sondern stimuliert die T_h-Zelle, zu proliferieren und Signale zu erzeugen (wiederum in erster Linie Cytokine), die verschiedene Zellen beeinflussen. Unter anderen Konsequenzen führt die Signalisierung zur B-Zellaktivierung, Makrophagenaktivierung, CTL-Differenzierung und Entzündungsförderung. Diese gemeinschaftliche Reaktion ist relativ spezifisch und richtet sich gegen fremde Elemente, die das vom Klasse-II-MHC-System präsentierte Peptid tragen.
Wenn sie richtig funktioniert, ist die Immunreaktion überraschend wirksam bei der Eliminierung von mikroskopischen Pathogenen und, im geringeren Ausmaß, neoplastischen Zellen. Im Allgemeinen sind die komplizierten Mechanismen für die Selbsterkennung sehr effizient und ermöglichen, dass sich eine starke Reaktion ausschließlich gegen fremde Antigene richtet. Leider versagt das Immunsystem gelegentlich und richtet sich gegen die Zellen des Wirts und entfacht dadurch eine Autoimmunreaktion. Typischerweise tritt Autoimmunität auf, wenn die Antigenrezeptoren auf den Immunzellen spezifische Antigene an gesunden Zellen erkennen und das Absterben der Zellen verursachen, die diese speziellen Substanzen tragen. In vielen Fällen sind Autoimmunreaktionen insofern selbstlimitiert, als dass sie verschwinden, wenn die Antigene, die sie ausgelöst haben, beseitigt sind. Jedoch überleben in manchen Fällen die autoreaktiven Lymphozyten länger als sie sollten und induzieren weiterhin Apoptose oder eliminieren auf andere Weise normale Zellen. Manche Ergebnisse bei Tieren und Menschen weisen darauf hin, dass verlängerte Überlebenszeit autoreaktiver Zellen mit zumindest zwei chronischen Autoimmunstörungen, systemischem Lupus erythematodes und rheumatoider Arthritis, in Verbindung stehen.
Von anderen Wirkmechanismen wird ebenfalls angenommen, dass sie zur Entwicklung verschiedener Autoimmunstörungen beitragen. Beispielsweise ist es über die letzten Jahre hinweg klar geworden, dass die Avidität von T-Zellen-APC-Wechselwirkungen Lernen und Toleranz des Thymus gegen Selbstantigene bestimmt. Demgemäß führen Wechselwirkungen hoher Avidität zur Eliminierung der T-Zelle, wogegen Wechselwirkungen niedriger Avidität Reifung und Austreten aus dem Thymus ermöglichen. Obgleich dieser Mechanismus wirksam ist, um das Immunsystem von Autoreaktivität zu befreien, könnten mit Selbstreaktivität ausgestattete T-Zellen-Vorläufer nach wie vor erzeugt werden und zur Peripherie wandern, wenn das Autoantigen sequestriert wird und keine wirksamen Ausmaße der Thymuspräsentation erreicht, der Thymustarnung unterworfen ist oder schlecht präsentiert wird. Darüber hinaus könnten zur Reaktion mit bestimmten T-Zellen-Rezeptoren fähige Superantigene und Ereignisse, die Antigenmimikry, Epitopausbreitung oder periphere Lockerung der Peptidtarnung stimulieren, die Aktivierung dieser selbstreaktiven T-Zellen auslösen und Antigenexposition verursachen. Auf alle Fälle sind das anhaltende Angebot von Autoantigen und reichliche Erzeugung von T-Zellen-Rezeptorliganden (Peptid-MHC-Komplexen) wahrscheinliche Mechanismen der Aggressivität von T-Zellen. Beispiele eines derartigen spontanen Ausschaltens der Selbsttoleranz umfassen multiple Sklerose (MS), rheumatoide Arthritis (möglicherweise mehr als ein Mechanismus) und Diabetes vom Typ I, wobei von allen diesen angenommen wird, dass sie von T-Zellen vermittelte Autoimmunkrankheiten sind.
Unabhängig davon, welcher Mechanismus für den Verfall des Immunsystems verantwortlich ist, können die Ergebnisse für das Individuum verheerend sein. Beispielsweise ist multiple Sklerose eine chronische entzündliche Störung, die ungefähr 250.000 Individuen in den Vereinigten Staaten beeinträchtigt. Der entzündliche Prozess tritt in erster Linie innerhalb der weißen Substanz des Zentralnervensystems auf und wird von T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen vermittelt, die für die Demyelinisation der Axons verantwortlich sind. Obgleich der klinische Verlauf recht unterschiedlich sein kann, manifestiert sich die häufigste Form durch remittierende neurologische Defizite, einschließlich Paralyse, sensorische Defizite und Sehschwächen.
Wenn sich Immunzellen einmal auf die weiße Substanz des Zentralnervensystems ausgebreitet haben, richtet sich die Immunreaktion auf mehrere verschiedene Anti gene am Myelin. Beispielsweise gibt es eine entscheidende, gegen Myelin gerichtete Antikörperreaktion, die die Komplementkaskade aktiviert, wobei Membranangriffskomplexe in der Hirn-Rückenmarksflüssigkeit auftreten. Weiters zielen T-Zellen auf gewisse Schlüsselabschnitte verschiedener Myelinantigene ab, wie z.B. auf jene, die am basischen Myelinprotein (MBP) und Proteolipidprotein (PLP) präsentiert sind. Die T-Zellen produzieren wiederum Cytokine, die dann Makrophagen dazu bringen, das Myelin anzugreifen und große Stücke der Myelinscheide zu phagozytieren. Der gemeinschaftliche Angriff führt zu Bereichen der Demyelinisation, was die gesunde Leitung entlang des Axons beeinträchtigt und den pathophysiologischen Defekt hervorruft. Multiple Immunreaktionen gegen mehrere Komponenten einer supramolekularen Struktur, wie z.B. die Myelinscheide bei multipler Sklerose und der Pyruvatdehydrogenase-Komplex bei primärer biliärer Zirrhose, sind bei Individuen mit Autoimmunkrankheiten, die einzelne Organe umfassen, häufig.
Behandlungen für Autoimmunkrankheiten waren bisher in unterschiedlichem Ausmaß erfolgreich. Beispielsweise ist es häufig möglich, eine organspezifische Autoimmunkrankheit durch Stoffwechselregulation zu beheben. Wo die Funktion verloren gegangen ist und nicht wiederhergestellt werden kann, können mechanischer Ersatz oder Gewebetransplantate geeignet sein. Jedoch gibt es keine wirksamen Behandlungen für die meisten behindernden Störungen, einschließlich MS. Während eine Reihe von Verbindungen, einschließlich Kortikosteroide und modifiziertes Beta-Interferon, manche MS-Symptome vermindern können, weisen sie nachgewiesenermaßen schwere Nebenwirkungen auf oder erwiesen sich als alles andere als wünschenswert für Langzeitverwendung. Andere der Behandlungsmöglichkeiten waren viel versprechend, jedoch muss ihre Wirksamkeit erst nachgewiesen werden.
In dieser Hinsicht ist eine viel versprechende Behandlung für MS in WO 96/16086 beschrieben worden, die die Verwendung von Peptidanaloga des basischen Myelinproteins (MBP) offenbart. Diese Analoga umfassende Zusammensetzungen sind laut Berichten fähig, Symptome von MS ohne übermäßige Nebenwirkungen zu lindern. Darüber hinaus erwiesen sich Peptidanaloga für konstitutive Myelinproteine als ebenfalls wirksam bei der Behandlung der Symptome der experimentellen allergi schen Enzephalomyelitis (EAE), einer organspezifischen Immunstörung, die bei Mäusen als Modell für MS häufig verwendet wird. Im Speziellen wurde eine Umkehrung von EAE mit einem Peptidanalogon erzielt, das sich vom Proteolipid- (PLP-) Peptid herleitet (Kuchroo et al., J. Immunol. 153, 3326-3336 (1994)). Es wurde gezeigt, dass bei Mutation der hauptsächlichen TCR-kontaktierenden Reste im natürlich vorkommenden PLP-Peptid das resultierende Peptidanalogon wie das natürliche Peptid MHC band, PLP-spezifische T-Zellen jedoch nicht aktiviert. Stattdessen hemmt das PLP-Analogon die In-vitro-Aktivierung der T-Zellen.
Obgleich Peptidanaloga einen viel versprechenden Ansatz zur Modulation der Effektorfunktionen aggressiver T-Zellen darstellen und Autoimmunkrankheiten bessern, schränken mehrere Probleme ihre Wirksamkeit ein. Beispielsweise sind nur wenige MHC-Peptidkomplexe an der Oberfläche einer typischen APC vorhanden, was bedeutet, dass ein einzelner Komplex erforderlich sein könnte, um hintereinander ungefähr 200 TCRs zu veranlassen, die T-Zelle zu aktivieren. Wo das Autoantigen ständig für die normale Prozessierung und Präsentation durch das MHC-System verfügbar ist, scheint es so zu sein, dass normalerweise sehr wenige Oberflächen-MHC-Komplexe verfügbar sind, um das Peptidanalogon zu binden. Da außerdem freie Peptide typischerweise sehr kurze Halbwertszeiten aufweisen, werden sie nicht leicht vom MHC-Antigen-präsentierenden System inkorporiert und prozessiert, wenig wird von Natur aus auf den APC exprimiert. Aufgrund der ineffizienten Präsentation erfordert die direkte Tätigkeit der tausenden TCRs auf jeder T-Zelle wahrscheinlich untragbar hohe intrazelluläre Ausmaße an freiem Peptid. Der Umsatz von Zelloberflächen-MHC-Molekülen trägt außerdem zum kurzen Verbleib von am extrazellulären Milieu gebildeten Komplexen bei (d.h. dass MHC-Klasse-II-Moleküle sich für einige Zeit in der Zelloberfläche befunden haben, bevor sie das extrazelluläre Peptid binden), während im endozytischen Kompartiment gebildete Komplexe für einen normalen Zeitraum verbleiben werden, da sie gerade erst an die Oberfläche verlagert worden sind. Schließlich ist die Verabreichung derartiger synthetischer Epitope oder Analoga, wie vorhin angedeutet worden ist, in Anbetracht der kurzen Halbwertszeit von Peptiden im Säugetierkörper extrem problematisch. Zwischen den kurzen Halbwertszeiten der MHC-Komplexe und den verabreichten Peptiden ist die wirksame Exposition zu kurz, um die Induktion einer befriedigenden Immunreaktion zu ermöglichen, was weitere höhere Dosen notwendig macht.
Demgemäß ist es ein allgemeines Ziel der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen zur wirksamen Modifizierung des Immunsystems eines Vertebraten bereitzustellen, um eine Immunstörung zu behandeln.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zweckdienlich sein: (i) für die wirksame Präsentation von T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten oder -Agonisten, um die zelluläre Immunreaktion in einem Patienten zu modulieren, der dies benötigt; (ii) für die Behandlung und Besserung der verschiedenen Immunstörungen; (iii) für die Induktion von T-Zellen-Toleranz in Neugeborenen oder Säuglingen; oder (iv) für die Linderung der mit Autoimmunstörungen, wie z.B. multipler Sklerose, verbundenen Symptome.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem weit gefassten Aspekt stellt die Erfindung ein Fc-Rezeptor-vermitteltes, endozytisches Abgabesystem bereit. In ausgewählten Ausführungsformen sorgt die Erfindung für die wirksame Präsentation von immunsuppressiven Faktoren, die in bevorzugten Ausführungsformen Antagonisten oder Agonisten von T-Zellen-Rezeptoren umfassen können. Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen immunsuppressive Faktoren, die ein oder mehrere autoantigene Polypeptide oder Fragmente davon umfassen. Das heißt, dass die vorliegende Erfindung im Allgemeinen Zusamensetzungen bereitstellt, um immunsuppressive Faktoren für die selektive Modifikation einer Immunreaktion in einem Vertebraten zu präsentieren. In insbesondere bevorzugten Ausführungsformen sorgt die Erfindung für eine Fc-Rezeptor-vermittelte endozytische Präsentation von einem oder mehreren ausgewählten Antagonisten oder Agonisten des T-Zellen-Rezeptors, um eine gegen ein spezifisches Antigen aufgebaute Immunreaktion zu modulieren. Wie der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung anerkennen wird, können die offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden, um jegliche mit der Immunreaktion eines Ver tebraten in Beziehung stehende physiologische Störung zu behandeln. Beispielsweise kann diese Fähigkeit zur Suppression ausgewählter Komponenten des Immunsystems unter anderen Dingen die Behandlung von Autoimmunkrankheiten, Erleichterung von Gewebe- oder Organtransplantationen und die Milderung von durch Allergene hervorgerufenen Symptomen ermöglichen. Darüber hinaus sorgt die vorliegende Erfindung außerdem für die Induktion der Toleranz bei Neugeborenen und Säuglingen in Bezug auf Autoantigene.
Gemäß der Erfindung wird die endozytische Präsentation des ausgewählten immunsuppressiven Faktors durch die Verwendung eines Immunomodulators erleichtert, der zur Bindung an den Fc-Rezeptor (FcR) von Antigen-präsentierenden Zellen fähig ist. Typischerweise wird der Immunomodulator zumindest einen immunsuppressiven Faktor umfassen, der mit zumindest einem zur Bindung an einen Fc-Rezeptor fähigen Liganden assoziiert ist. Nach Bindung an die Antigen-präsentierende Zelle (APC) wird der Immunomodulator vom natürlichen endozytischen Stoffwechselweg der APC internalisiert und prozessiert. Vorzugsweise wird der internalisierte immunsuppressive Faktor, der Teil oder die Gesamtheit eines autoantigenen Polypeptids oder T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten oder -Agonisten sein kann, dann mit den neu synthetisierten endogenen MHC-Klasse-II-Strukturen assoziiert und an der Oberfläche der APC präsentiert sein. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass die immunsuppressiven Faktoren (insbesondere Antagonisten), obgleich sie bei Bindung an MHC-Klasse-II-Strukturen mit T-Zellen-Rezeptoren komplexieren, die Aktivierung der T-Zelle nicht fördern werden. Gleichermaßen ist anzuerkennen, dass die Präsentation von autoantigenen, Polypeptid-hergeleiteten oder direkt verabreichten TCR-Agonisten durch APCs in Abwesenheit von costimulierenden Molekülen zur Induktion von Toleranz führen wird. Demgemäß kann die effiziente FcR-vermittelte Präsentation von geeigneten TCR-Antagonisten oder -Agonisten (worin die Agonisten von autoantigenen Polypeptiden oder Fragmenten davon stammen können) eine vorher geprimte (d.h. gegen ein bestimmtes Autoantigen sensibilisierte) T-Zelle daran hindern, eine Immunreaktion trotz normaler Präsentation des natürlich vorkommenden Autoantigens zu aktivieren und auszulösen.
In einem umfassenden Sinne können die Immunomodulatoren der vorliegenden Erfindung jeglichen Liganden (FcR-Liganden) umfassen, der fähig ist, an den Fc-Rezeptor einer Antigen-präsentierenden Zelle zu binden und durch ihn internalisiert zu werden. Das heißt, dass der FcR-Ligand jegliches Protein, Proteinfragment, Peptid oder Molekül sein kann, das wirksam an einen Fc-Rezeptor an der Oberfläche jeglicher Antigen-präsentierenden Zelle bindet. Vorzugsweise wird der FcR-Ligand zumindest einen Abschnitt einer konstanten Region eines Immunglobulinmoleküls umfassen oder nachahmen und wird im Patienten keine antigene Reaktion hervorrufen. In ausgewählten Aspekten der Erfindung wird der FcR-Ligand einen Teil oder die gesamte Region aus einem IgG-Molekül umfassen. Insbesondere bevorzugte Ausführungsformen werden FcR-Liganden einsetzen, die die gesamte konstante Region eines gewählten Immunglobulinmoleküls aus der zu behandelnden Spezies umfassen. Selbstverständlich ist ebenfalls anzuerkennen, dass die Bindung an den Fc-Rezeptor auch durch Liganden bewirkt werden kann, die kleine Fragmente einer einzelnen Domäne einer konstanten Region oder Moleküleinheiten umfassen, die nicht auf Aminosäuren basieren. Auf jeden Fall kann der FcR-Ligand unter Anwendung moderner pharmazeutischer Techniken, wie z.B. gerichteter Evolution, kombinatorischer Chemie oder rationalem Wirkstoffdesign, hergeleitet werden.
Wie vorher angedeutet, umfassen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung außerdem einen mit dem FcR-Liganden assoziierten immunsuppressiven Faktor, um einen Immunomodulator bereitzustellen. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung kann der immunsuppressive Faktor jegliche Moleküleinheit sein, die in der Lage ist, von einer APC prozessiert und in Assoziation mit Klasse-II-MHC-Molekülen an der Zelloberfläche präsentiert zu werden. Wie oben erwähnt, umfassen ausgewählte Ausführungsformen der Erfindung das Assoziieren von zumindest einem T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten oder -Agonisten mit einem FcR-Liganden für die effiziente Präsentation über Fc-vermittelte Aufnahme. Bei insbesondere bevorzugten Ausführungsformen kann der immunsuppressive Faktor ein oder mehrere ausgewählte autoantigene Polypeptide oder Fragmente davon umfassen, die prozessiert (d.h. verdaut oder proteolysiert) werden können, um gewünschte TCR-Agonisten bereitzustellen. Vorzugsweise wird/werden das/die autoantigene(n) Polypeptid(e) oder Frag mente davon nach Proteolyse während der endozytischen Prozessierung mehr als einen Peptidagonisten (d.h. Peptide, die mehr als eine Aminosäuresequenz umfassen) bereitstellen. Die Präsentation der Antagonisten oder Agonisten durch APCs in Abwesenheit geeigneter costimulatorischer Moleküle wird dann in der Herabregulation der Immunreaktion gegen das maßgebliche Autoantigen resultieren.
In Bezug auf insbesondere bevorzugte Ausführungsformen setzt die vorliegende Erfindung immunsuppressive Faktoren ein, die die Gesamtheit oder einen Teil eines T-Zellen-Antagonisten umfassen. Zum Zwecke dieser Offenbarung umfasst der Ausdruck „Antagonist" gemäß seiner normalen Bedeutung jegliche Substanz, die die physiologische Wirkung einer anderen durch Kombinieren mit und Blockieren seinem/s Rezeptor(s) stört. Im Spezielleren sind TCR-Antagonisten Moleküleinheiten, die in Kombination mit Klasse-II-MHC-Molekülen fähig sind, nicht-reaktiv mit einem T-Zellen-Rezeptor zu assoziieren und eine negative Signalisierung über den T-Zellen-Rezeptor auszulösen. Vorzugsweise umfasst der TCR-Antagonist ein Peptid oder Proteinfragment, das ein Analogon des normalen aktivierenden Antigenagonisten ist. Bei insbesondere bevorzugten Ausführungsformen ist der TCR-Antagonist ein Analogon eines T-Zellen-Epitops.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen kann der immunosuppressive Faktor einen T-Zellen-Agonisten umfassen, der präsentiert wird, der jedoch geprimte TCRs bei Bindung nicht aktiviert. In Bezug auf diesen Aspekt der Erfindung ist überraschenderweise gefunden worden, dass bei effizienter Präsentation von Autoantigen-Agonisten unter Verwendung eines FcR-Liganden diese zur Induktion von Toleranz und nicht zur Stimulierung des Immunsystems führen können. Das heißt, dass angenommen wird, dass die effiziente FcR-Aufnahme autoantigener Agonisten zur Präsentation der Agonisten durch nicht-professionelle und/oder nicht-aktivierte professionelle APCs führt, denen im Allgemeinen costimulatorische Moleküle fehlen. Im Gegensatz zur Ansicht des Stands der Technik induziert dieser Typ von Präsentation letztendlich die Inaktivierung autoreaktiver T-Zellen, Herabregulation des Immunsystems und Besserung einer jeglichen assoziierten Autoimmunkrankheit. Um die Aktivierung von APCs oder die Produktion costimulatorischer Moleküle (d.h. B-7.1, B- 7.2, CD40 usw.) zu vermeiden, wird die Verabreichung von TCR-Agonistkonstrukten oder Agonisten, die autoantigene Polypeptidkonstrukte produzieren, vorzugsweise unter Verwendung eines Trägers stattfinden, denen ein Adjuvans (wie z.B. Salzlösung) fehlt.
Zum Zwecke der vorliegenden Offenbarung wird der Ausdruck „Agonist" gemäß seiner allgemein anerkannten biochemischen Bedeutung verwendet. Diesbezüglich ist anzuerkennen, dass, obgleich der T-Zellen-Agonist jegliches Molekül sein kann, das das gewünschte immunogene Resultat liefert, der gewählte Agonist vorzugsweise ein Peptid oder Proteinfragment umfassen wird. Darüber hinaus wird der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung anerkennen, dass Immunomodulatoren, die einen oder mehrere T-Zellen-Rezeptor-Agonisten umfassen, mit Immunomodulatoren kombiniert werden können, die einen oder mehrere T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten umfassen, um pharmazeutische Formulierungen bereitzustellen, die verwendet werden könnten, um die Immunreaktion eines Patienten selektiv abzuschwächen.
In Bezug auf diesen Aspekt der Erfindung können die letztendlich präsentierten TCR-Agonisten von einem immunsuppressiven Faktor stammen, der die Gesamtheit oder einen Teil von einem oder mehreren autoantigenen Polypeptiden umfasst. Das heißt, dass die Konstrukte der vorliegenden Erfindung vorzugsweise einen FcR-Liganden umfassen können, der mit einem oder mehreren autoantigenen Polypeptiden oder Fragmenten davon assoziiert ist. Typischerweise wird/werden das/die inkorporierte(n) autoantigene(n) Polypeptid(e) oder Fragmente die Aminosäuresequenz der Wildform umfassen und werden bei Prozessierung (d.h. Proteolyse) nach der FcR-vermittelten Aufnahme einen oder mehrere TCR-Agonisten zur Präsentation durch professionelle und nicht-professionelle APCs bereitstellen. Die Verabreichung derartiger Konstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung ist besonderes vorteilhaft, da sie verwendet werden kann, um Schwierigkeiten mit der Epitopausbreitung zu überwinden. Im Spezielleren wird, wenn die Autoimmunität mehrere Epitope an einem Autoantigen umfasst, die Präsentation von jedem der entsprechenden Agonisten (hergeleitet von einem immunsuppressiven Faktor, der das gesamte Autoantigen umfasst) zu Toleranz in Bezug auf alle Epitope von Interesse führen. Gleicher maßen wird sich die Präsentation mehrerer Agonisten wahrscheinlich als effizient erweisen, wenn sie an Populationen verabreicht werden, wo unterschiedliche Individuen eine Autoreaktivität gegen verschiedene Epitope eines bestimmten Autoantigens entwickeln.
Als Beispiel könnte ein Konstrukt der vorliegenden Erfindung die Form eines Fusions- oder chimären Proteins einnehmen, das die gesamte Fc-Region eines IgG-Moleküls, kovalent an natürliches basisches Myelinprotein (MBP) oder natürliches Proteolipidprotein (PLP) gebunden, umfasst. In anderen Ausführungsformen können mit der vorliegenden Erfindung vereinbare Fusionsproteine die Fc-Region von IgG umfassen, die kovalent an einen immunsuppressiven Faktor gebunden ist, der die kovalent angebundenen natürlichen Formen von PLP und MBP umfasst (d.h. IgGFc-MBP-PLP). Derartige Konstrukte werden über FcR internalisiert und endozytisch prozessiert (proteolysiert, wobei die resultierenden Agonistenfragmente mit den MHC-Komplexen assoziiert sind) und an der Oberfläche der APCs präsentiert. Es muss betont werden, dass aufgrund der relativ hohen Ausmaße an präsentierten Agonisten auf Basis der effizienten Aufnahme der Konstrukte und dem Fehlen costimulatorischer Moleküle die Verabreichung der FcR-Liganden/Autoantigen-Konstrukte Anergie induziert anstatt eine Immunreaktion zu stimulieren. Selbstverständlich könnten ausgewählte Fragmente oder Abschnitte der natürlich vorkommenden autoantigenen Polypeptide verwendet werden, um kompatible immunsuppressive Faktoren zu bilden. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass derartige Fusionsproteine oder chimäre Proteine unter Anwendung moderner molekularbiologischer Techniken leicht konstruiert werden können.
In den offenbarten Verbindungen und damit verbundenen Verfahren ist der FcR-Ligand mit dem immunsuppressiven Faktor assoziiert, um einen Immunomodulator auszubilden, so dass beide von den APC im Wesentlichen zur selben Zeit internalisiert werden. Wie oben angedeutet, kann diese Assoziation in Form von zwei oder mehreren Molekülen vorliegen, die wie bei einem Antikörper-Antigen-Komplex aneinander gebunden sind, oder kann bei bevorzugten Ausführungsformen die Bildung eines einzelnen Fusions- oder chimären Moleküls umfassen, in dem der immuno suppressive Faktor (d.h. ein oder mehrere autoantigene Polypeptide oder Fragmente davon oder ein TCR-Antagonist oder -Agonist) sowie ein FcR-Ligand enthalten sind. Beispielsweise könnte ein ausgewählter TCR-Antagonist chemisch an eine FcR-Ligandenregion gebunden sein, die durch proteolytische Techniken produziert wurde (d.h. ein Fc-Fragment). Andere Ausführungsformen können ein normales Immunglobulin umfassen, das einen sterisch an ein antagonistisches oder agonistisches Peptid gebundenen FcR-Liganden umfasst. Insbesondere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen chimäre Immunglobuline, die durch gentechnische Verfahren produziert werden. Bei diesen Verbindungen umfasst der FcR-Ligand (und üblicherweise der Hauptteil des Moleküls) eine oder mehrere konstante Immunglobulinregionen, während eine oder mehrere der variablen Regionen so konstruiert sind, dass sie einen oder mehrere gewünschte Peptid-TCR-Antagonisten oder TCR-Agonisten exprimieren. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass jegliche Kombination der oben genannten Immunomodulatoren zur Bildung von Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zusammengestellt werden kann, so wie es ähnliche Immunomodulatoren werden können, die unterschiedliche immunsuppressive Faktoren umfassen. Darüber hinaus sind, wie vorher erörtert, Gemische oder „Cocktails" verschiedener Immunomodulatoren ausdrücklich als im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegend vorgesehen.
In der vorliegenden Erfindung befindet sich der Immunomodulator in einer Form, die fähig ist, die an den Zelloberflächen von Antigen-präsentierenden Zellen vorhandenen Fc-Rezeptoren zu vernetzen. Beispielsweise kann der Immunomodulator in mehrwertiger Form vorliegen. Das oder die Immunomodulator(en) ist/sind aggregiert, um Konstrukte oder Strukturen bereitzustellen, die fähig sind, die an den Zelloberflächen von Antigen-präsentierenden Zellen vorhandenen Fc-Rezeptoren zu vernetzen.
Von der Vernetzung von FcγR an Makrophagen ist gezeigt worden, dass sie entzündungshemmende Aktivität aufweist (Berger et al., Eur. J. immunol. 26, 1297-1301 (1996); Berger et al., Eur. J. Immunol. 27, 2994-3000 (1997); Sutterwala et al., J. Exp. Med. 188, 217-222 (1998)). Gleichermaßen verleiht die Aggregation den Igs mit Fc assoziierte Funktionen, wie z.B. Vernetzung von FcRs und Komplementbindung (Christian, J. Immunol. 84, 112-121 (1960); Rosenqvist et al., Mol. Immunol. 24, 495-501 (1987)).
Von T-Zellen- oder Hybridomzelllinien, in denen IL-10 oder IL-4 aus Plasmid- oder Virusvektoren produziert werden, ist gezeigt worden, dass sie Genesung von der Krankheit induzieren, wenn sie in Tiere mit anhaltender EAE injiziert werden (Mathisen et al., J. Exp. Med. 186, 159-164 (1997); Shaw et al., J. Exp. Med. 185, 1711-1714 (1997); Ma et al., J. Immunol. 161, 1518-1524 (1998)).
Von IL-10, das von Makrophagen nach Exposition mit Antigen-Antikörper-Komplexen produziert wird, ist gezeigt worden, dass es antagonistische Wirkungen auf die IL-12-Produktion ausübt und die entzündungsfördernden Reaktionen umkehrt (Sutterwala et al., J. Exp. Med. 188, 217-222 (1998); Berger et al., Eur. J. Immunol. 27, 2994-3000 (1997)).
Außerdem kann IL-10 „Bystander"-Suppression bereitstellen, wodurch die sich gegen eine Vielzahl von für Autoimmunkrankheit verantwortlichen Antigenen richtende Aktivität von T-Zellen gehemmt wird (Falcone et al., J. Exp. Med. 185, 901-907 (1997); Stohlman et al., J. Immunol. 163, 6338-6344 (1999)). Es ist vorgeschlagen worden, dass die „Bystander"-Suppression aus dem Antagonismus pathogener T-Zellen durch IL-10 resultiert, das von APCs produziert wird, oder aus der Herabregulation durch regulatorische T-Zellen resultiert, die durch die Wirkung von IL-10 erzeugt werden (Groux et al., Nature (London) 389, 737-742 (1997)). Es ist vorgeschlagen worden, dass IL-10 naive T-Zellen befähigt, sich zu regulatorischen Zellen zu entwickeln, die IL-10, IL-5 oder TGFβ produzieren und die Funktion pathogener T-Zellen hemmen könnten, wodurch die Suppression aufrechterhalten wird (Groux et al., Nature (London) 389, 737-742 (1997); Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 388-391 (1996); Asseman et al., J. Exp. Med. 190, 995-1003 (1999); Groux et al., Immunol. Today 20, 442-445 (1999); Seddon et al., J. Exp. Med. 189, 877-881 (1999); Seddon et al., Immunol. Today 21, 95-99 (2000)).
Folglich kann der Immunomodulator bei manchen Ausführungsformen der Erfindung die Produktion von entzündungshemmenden Cytokinen, wie z.B. IL-10 und IL-6, induzieren und/oder den Spiegel von IFNγ in einem Individuum vermindern, wie unten ausführlicher beschrieben wird. Die Behandlung mit aggregierten Immunomodulatoren kann außerdem zur Hinaufregulation anderer Cytokine, wie z.B. IL-4, IL-9, IL-13, TGF-β, führen.
Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass die gewünschten aggregierten Immunomodulatoren unter Anwendung jeglicher einer Anzahl wohlbekannter Techniken angefertigt werden können. Beispielsweise können die Immunomodulatoren chemisch oder thermodynamisch gebunden oder verändert werden, um lösliche oder unlösliche Aggregate zu bilden. In weiteren Ausführungsformen können aggregierte Immunomodulatoren durch Präzipitation, wie z.B. Ammonsulfatpräzipitation, hergestellt werden. Diese Aggregate können dann mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger kombiniert und nach den Lehren hierin verabreicht werden.
Außerdem kann der Immunomodulator den Spiegel costimulierender Moleküle vermindern, die an den Zelloberflächen von Antigen-präsentierenden Zellen vorhanden sind, was zur peripheren Toleranz führt (Fowlkes et al., Curr. Opin. Immunol. 5, 873-879 (1993); Arnold et al., Immunol. Today 14, 12-14 (1993); Kosaka et al., J. Exp. Med. 177, 387-378 (1993); McCormack et al., J. Immunol. 150, 3785-3792 (1993); Rocha et al., Science (Washington, D.C.) 251, 1225-1228 (1991); Webb et al., Cell 63, 1249-1256 (1990); Jenkins et al., Curr. Opin. Immunol. 5, 361-367 (1993)). Periphere Toleranz resultiert aus der Verfügbarkeit eines an der Autoimmunkrankheit beteiligten Antigens in der Peripherie (d.h. außerhalb des Thymus, wo die anfängliche Selektion gegen auf Selbstantigen abzielende T-Zellen auftritt) und der Präsentation des Selbstantigens in der Peripherie durch nicht aktivierte Antigen-präsentierende Zellen, in denen costimulatorische Moleküle fehlen oder in vermindertem Ausmaß vorhanden sind.
Im Spezielleren können die offenbarten Zusammensetzungen unter Anwendung herkömmlicher pharmazeutischer Techniken und Träger formuliert werden und können über die üblichen Wege verabreicht werden. Insbesondere bevorzugte Ausführungsformen umfassen die Verwendung von Formulierungen oder Trägern, die keine Adjuvantien umfassen. Die Versorgung mit Antigen in Adjuvans-freier Form stimuliert möglicherweise nicht die Expression von costimulatorischen Molekülen an APCs, was in einer Antigenpräsentation resultiert, die für T-Zellen-Aktivierung ungeeignet ist (Fowlkes et al., Curr. Opin. Immunol. 5, 873-879 (1993); Jacobs et al., Immunology 82, 294-300 (1994); Mueller et al., Curr. Opin. Immunol. 7, 375-381 (1995)). Dieser Ansatz moduliert autoreaktive T-Zellen und fördert die Genesung von der Krankheit (Elliott et al., J. Clin. Invest. 98, 1602-1612 (1996); Gaur et al., Science (Washington, D.C.) 258, 1491-1494 (1992); Liblau et al., Immunol. Today 18, 599-604 (1997); Critchfield et al., Science (Washington, D.C.) 263, 1139-1143 (1994); Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 388-391 (1996); Devaux et al., J. Neuroimmunol. 75, 169-173 (1997); Leadbetter et al., J. Immunol. 161, 504-512 (1998); Staykova et al., Immunol. Cell Biol. 75, 54-64 (1997)). Folglich wird der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung anerkennen, dass derartige Präparate die Erzeugung costimulatorischer Moleküle verhindern oder minimieren können, die eine Immunreaktion hervorrufen könnten.
Jedenfalls vermeidet die Verwendung der FcR-vermittelten Aufnahme des Immunomodulators viele der mit Zusammensetzungen nach dem Stand der Wissenschaft verbundenen Probleme. Im Spezielleren überwinden die Verfahren der vorliegenden Erfindung viele der Einschränkungen, die mit der Verabreichung der nach dem Stand der Technik offenbarten freien Peptidantagonisten verbunden sind. Demgemäß kann die effiziente endozytische Präsentation eines immunsuppressiven Faktors, wie z.B. eines TCR-Antagonisten, signifikante Ausmaße an MHC-antagonistischen Liganden erzeugen, um natürlich vorkommende MHC-autoantigene Komplexe zu bekämpfen, die bei spontanen Immunstörungen erzeugt werden, die die andauernde Präsentation eines autoreaktiven Antigens umfassen. Gleichermaßen kann die effiziente Aufnahme von FcR-Ligand-Agonist- (oder autoantigenen Polypeptid-) Konstrukten und anschließende Präsentation des/der gewünschten Agonisten Anergie in autoreakti ven T-Zellen induzieren. An sich kann die Erfindung angewendet werden, um jegliche Immunstörung zu behandeln, die auf die Präsentation von immunsuppressiven Faktoren reagiert. Dies gilt insbesondere für T-Zellen-vermittelte Autoimmunstörungen, einschließlich beispielsweise multiple Sklerose, Lupus, rheumatoide Arthritis, Sklerodermia, Insulin-abhängigen Diabetes und Colitis ulcerosa. Auf eine ähnliche Weise kann die vorliegende Erfindung angewendet werden, um das Immunsystem in Bezug auf fortwährend präsentierte Agonisten, wie z.B. Allergene, selektiv herabzuregulieren. Weiters können die Verbindungen und damit in Zusammenhang stehenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um verschiedene Komponenten des Immunsystems selektiv zu unterdrücken, um die Wahrscheinlichkeit von Gewebe- oder Organabstoßung nach Transplantation zu vermindern.
Zusätzlich zu den oben genannten Vorteilen ist überraschenderweise gefunden worden, dass die Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um Toleranz gegen verschiedene Autoantigene in Neugeborenen und Säuglingen auszulösen. Im Spezielleren stellt die vorliegende Erfindung außerdem Zusammensetzungen und Verfahren bereit, um Neugeborenen oder Säuglingen von Säugetieren Resistenz gegen die Induktion einer Autoimmunkrankheit während des adulten Lebens zu verleihen. Gemäß den Lehren hierin ist diese Neugeborenentoleranz durch eine abweichende Reaktion in den sekundären lymphoiden Organen und ungewöhnliche Gamma-Interferon-vermittelte Milz-Anergie nach Exposition mit dem passenden Autoantigen gekennzeichnet. Wie oben erörtert, könnten bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung für die Induktion der gewünschten neonatalen Toleranz nach Verabreichung in einem nicht-reaktiven Träger (d.h. jenen ohne Adjuvans) sorgen.
Einige Aspekte der vorliegenden Erfindung sind unten zusammengefasst.
Eine der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, die ein aggregiertes Immunglobulin oder einen Abschnitt davon, das/der an ein Antigen gebunden ist, umfasst, worin das Immunglobulin oder der Abschnitt davon zur Vernetzung von Fc-Rezeptoren fähig ist, die an den Zelloberflächen von Antigenpräsentierenden Zellen vorhanden sind. Die Zusammensetzung kann außerdem einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung kein Adjuvans. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform liegt das Immunglobulin in mehrwertiger Form vor. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Immunglobulin in/an eine Matrix eingebettet oder absorbiert. In weiteren Aspekten dieser Ausführungsform ist das Immunglobulin ein IgG-Molekül. In anderen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst das Antigen ein mit einer Autoimmunkrankheit assoziiertes Antigen. Beispielsweise kann das Antigen mit einer Autoimmunkrankheit assoziiert sein, die aus der aus multipler Sklerose, Lupus, rheumatoider Arthritis, Skleroderma, insulinabhängigem Diabetes und Colitis ulcerosa bestehenden Gruppe ausgewählt ist. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen ein Antigen aus Proteolipidprotein. In anderen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen ein Antigen aus basischem Myelinprotein. In weiteren Aspekten dieser Ausführungsform umfasst das Immunglobulin oder der Abschnitt davon zumindest einen Teil einer Domäne einer konstanten Region eines Immunglobulinmoleküls. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst das Immunglobulin ein Fusionsprotein, bei dem das Antigen kovalent an das Immunglobulin oder den Abschnitt davon gebunden ist. Beispielsweise kann das Antigen innerhalb von zumindest einer komplementaritätsbestimmenden Region des Immunglobulins positioniert sein, um die komplementaritätsbestimmende Region teilweise oder vollständig zu ersetzen. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen innerhalb von CDR3 positioniert. In anderen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Immunglobulin ein menschliches IgG-Molekül. In anderen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Immunglobulin eine Chimäre.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in einem Verfahren der Linderung der mit einer Autoimmunkrankheit verbundenen Symptome umfasst eine Zusammensetzung, umfassend ein aggregiertes Immunglobulin oder einen Abschnitt davon, gebunden an ein an der Autoimmunkrankheit beteiligtes Antigen, worin das Immunglobulin oder der Abschnitt davon zur Vernetzung von Fc- Rezeptoren fähig ist, die an den Zelloberflächen Antigen-präsentierender Zellen vorhanden sind, sowie das Verabreichen der Zusammensetzung an ein Individuum, das an der Autoimmunkrankheit leidet. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung außerdem einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung kein Adjuvans. Das Antigen ist mit einer Autoimmunkrankheit assoziiert. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen mit einer aus der aus multipler Sklerose, Lupus, rheumatoider Arthritis, Skleroderma, insulinabhängigem Diabetes und Colitis ulcerosa bestehenden Gruppe ausgewählten Autoimmunkrankheit assoziiert. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen ein Antigen aus Proteolipidprotein. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen ein Antigen aus basischem Myelinprotein. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst das Immunglobulin oder ein Abschnitt davon zumindest einen Teil einer Domäne einer konstanten Region eines Immunglobulinmoleküls. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst das Immunglobulin ein Fusionsprotein, in dem das Antigen kovalent an das Immunglobulin oder den Abschnitt davon gebunden ist. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen innerhalb von zumindest einer komplementaritätsbestimmenden Region des Immunglobulins positioniert, um die komplementaritätsbestimmende Region teilweise oder vollständig zu ersetzen. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen innerhalb von CDR3 positioniert. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Immunglobulin ein menschliches IgG-Molekül. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Immunglobulin eine Chimäre.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung in einem Verfahren der Verminderung von Krankheitssymptomen in einem Individuum, umfassend das Identifizieren eines Individuums, das einen erhöhten Spiegel von IL-10 benötigt, und Erhöhen des Spiegels von IL-10 im Individuum durch Verabreichen einer Zusammensetzung der Erfindung. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform leidet das Individuum an einer Autoimmunkrankheit. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung weiters einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. In manchen Aspekten dieser Ausführungs form umfasst die Zusammensetzung kein Adjuvans. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen mit einer aus der aus multipler Sklerose, Lupus, rheumatoider Arthritis, Skleroderma, insulinabhängigem Diabetes und Colitis ulcerosa bestehenden Gruppe ausgewählten Autoimmunkrankheit assoziiert. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen ein Antigen aus Proteolipidprotein. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen ein Antigen aus basischem Myelinprotein. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst das Immunglobulin oder ein Abschnitt davon zumindest einen Teil einer Domäne einer konstanten Region eines Immunglobulinmoleküls. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst das Immunglobulin ein Fusionsprotein, in dem das Antigen kovalent an das Immunglobulin oder einen Abschnitt davon gebunden ist. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen innerhalb von zumindest einer komplementaritätsbestimmenden Region des Immunglobulins positioniert, um die komplementaritätsbestimmende Region teilweise oder vollständig zu ersetzen. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen innerhalb von CDR3 positioniert. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Immunglobulin ein menschliches IgG-Molekül. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Immunglobulin eine Chimäre.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung in einem Verfahren der Verminderung von Krankheitssymptomen in einem Individuum, umfassend das Identifizieren eines Individuums, das einen erhöhten Spiegel von IL-10 benötigt und die Stimulation peripherer Toleranz benötigt, und Erhöhen des Spiegels von IL-10 und Stimulieren der peripheren Toleranz des Individuums durch Verabreichen einer Zusammensetzung der Erfindung. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform leidet das Individuum an einer Autoimmunkrankheit. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung weiters einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung kein Adjuvans. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen mit einer aus der aus multipler Sklerose, Lupus, rheumatoider Arthritis, Skleroderma, insulinabhängigem Diabetes und Colitis ulcerosa bestehenden Gruppe ausgewählten Autoimmunkrankheit assoziiert. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen ein Antigen aus Proteolipidprotein. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen ein Antigen aus basischem Myelinprotein. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst das Immunglobulin oder ein Abschnitt davon zumindest einen Teil einer Domäne einer konstanten Region eines Immunglobulinmoleküls. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform umfasst das Immunglobulin ein Fusionsprotein, in dem das Antigen kovalent an das Immunglobulin oder einen Abschnitt davon gebunden ist. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen innerhalb von zumindest einer komplementaritätsbestimmenden Region des Immunglobulins positioniert, um die komplementaritätsbestimmende Region teilweise oder vollständig zu ersetzen. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Antigen innerhalb von CDR3 positioniert. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Immunglobulin ein menschliches IgG-Molekül. In manchen Aspekten dieser Ausführungsform ist das Immunglobulin eine Chimäre.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung in einem Verfahren der Verminderung von Krankheitssymptomen in einem Individuum, umfassend das Identifizieren eines Individuums, das einen verminderten Spiegel von IFNγ benötigt, und Vermindern des Spiegels von IFNγ im Individuum durch Verabreichen einer Zusammensetzung der Erfindung.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung in einem Verfahren der Verminderung von Symptomen einer Autoimmunkrankheit, die aus einer Immunreaktion auf mehrere Selbstantigene resultiert, umfassend das Verabreichen einer Zusammensetzung der Erfindung.
Andere Ziele, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung aus der Betrachtung der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten beispielhaften Ausführungsformen davon in Verbindung mit den Figuren offensichtlich, die zunächst kurz beschrieben werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1A und 1B sind schematische Darstellungen von chimären Immunglobulin-G-(IgG-) Molekülen, die deren allgemeine Eigenschaften illustrieren sowie den Einbau fremder Peptide innerhalb der CDR-3-Schleife der variablen Region der Schwerkette, worin 1A (Ig-PLP1) die Insertion eines natürlich vorkommenden, von Proteolipidprotein stammenden Peptids PLP1 (Agonist) zeigt, wogegen 1B (Ig-PLP-LR) einen Immunomodulator illustriert, umfassend den Einbau eines PLP-LR genannten Peptidanalogons (Antagonisten) gegen PLP1.
2A und 2B sind grafische Darstellungen, die den mittels Radioimmuntest (RIA) durchgeführten Einfang chimärer Antikörper Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR illustrieren, die den in 1A bzw. 1B gezeigten entsprechen, und zwar unter Verwendung von Antikörpern, die gegen die entsprechenden freien Peptide gerichtet sind, worin 2A die Einfangmengen durch gegen PLP1 gerichtete Antikörper zeigt und 2B die Einfangmengen durch gegen PLP-LR gerichtete Antikörper zeigt, wobei Ig-W, ein Antikörper der Wildform, als Negativkontrolle agierte.
3A und 3B sind Grafiken, die die Präsentation von Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR (sowie positive und negative Kontrollen) gegen PLP1-spezifische T-Zellen-Hybridome 4E3 (3A) und 5B6 (3B) illustrieren, um die relativen T-Zellen-Aktivierungspotentiale der durch IL-2-Produktion gemessenen chimären Immunglobuline zu ermitteln.
4 ist eine grafische Darstellung, die die relative Wirksamkeit der Präsentation von PLP1 unter Verwendung der chimären Antikörper der vorliegenden Erfindung (Ig-PLP1) gegenüber freiem Peptid PLP1 oder nativem Proteolipidprotein (PLP) illustriert, gemessen durch Spiegel der IL-2-Produktion nach Inkubation mit Milz-SJL-Antigen-präsentierenden Zellen und PLP1-spezifischen 4E3-T-Zellen-Hybridomen.
5A, 5B und 5C sind grafische Vergleiche, die den Ig-PLP-LR-Antagonismus von durch PLP1 (5A), Ig-PLP1 (5B) und PLP (5C) vermittelter T-Zellen-Aktivierung zeigt, gemessen durch IL-2-Produktion durch T-Zellen-Hybridom 4E3 in Gegenwart von SJL-Milz-APCs, die vorher mit dem entsprechenden Agonisten und verschiedenen Konzentrationen Ig-PLP-LR oder Kontrollen inkubiert wurden.
6 ist eine Grafik, die den relativen Antagonismus von Ig-PLP2, Ig-PLP-LR und Ig-W zeigt, gemessen durch die Produktion von IL-2 durch T-Zellen-Hybridom HT-2 in Gegenwart von SJL-Milz-APCs, die vorher mit nativem Proteolipidprotein in Kombination mit einem der oben erwähnten Immunglobuline inkubiert worden sind.
7A und 7B sind Grafiken, die die In-vivo-Präsentation von PLP1 nach Inkubation mit Ig-PLP1 nachweisen, gemessen durch ³H-Thymidin-Inkorporation durch Zellen aus dem Lymphknoten (7A) oder aus der Milz (7B), worin die illustrierten Werte die Fähigkeit von aus einzelnen Mäusen geernteten Zellen darstellen, eine mittels ³H-Thymidin-Inkorporation gemessene T-Zellen-Reaktion bei Exposition mit dem Agonisten PLP1 oder dem Kontrollpeptid PLP2 zu erzeugen.
8A und 8B sind grafische Darstellungen, die die Fähigkeit von Ig-PLP-LR zeigen, die Immunreaktion gegen PLP1-Peptid bei gemeinsamer Verabreichung mit Ig-PLP1 zu vermindern, gemessen in murinen Zellen aus dem Lymphknoten (8A) oder der Milz (8B), worin die illustrierten Werte die Fähigkeit von aus einzelnen Mäusen geernteten Zellen darstellen, eine mittels ³H-Thymidin-Inkorporation gemessene T-Zellen-Reaktion bei Exposition mit PLP1 zu erzeugen.
9A und 9B sind Grafiken, die nachweisen, dass mit einem Gemisch aus Ig-PLP-LR und Ig-PLP1 inokulierte Mäuse eine heftigere Immunreaktion gegen das Peptidanalogon PLP-LR als Peptid PLP1 entwickeln, gemessen in Zellen aus dem Lymphknoten (9A) oder der Milz (9B), worin die illustrierten Werte die Fähigkeit von aus einzelnen Individuen geernteten Zellen darstellen, eine T-Zellen-Reaktion bei Exposition mit PLP1-Peptid oder dem Peptidanalogon PLP-LR zu erzeugen, wie sie sich mittels ³H-Thymidin-Inkorporation widerspiegelt.
10A-10D sind grafische Darstellungen von proliferativen Reaktionen von Lymphknoten auf Immunisierung mit Ig-PLP-Chimären mit Mäusen, die einzeln in dreifacher Ausführung in Wells für jeden Stimulator getestet wurden und wo die angegebenen cpm-Werte den Mittelwert +/– SD nach Abzug der Hintergrund-cpm-Werte darstellen.
11 ist eine grafische Darstellung der proliferativen Reaktion von Lymphknoten-T-Zellen auf Coimmunisierung mit Ig-PLP1 und Ig-PLPLR mit Stimulatoren, die 5 μg/ml PPD; 15 μg/ml PLP 1, PLP-LR und PLP2 umfassen.
12 ist eine grafische Darstellung der proliferativen Reaktion von Milz-T-Zellen von Mäusen, die mit Ig-W, Ig-PLP1, IG-PLP-LR und Kombinationen davon immunisiert wurden, wenn sie mit PLP1 (volle Balken) und PLP-LR (schraffierte Balken) in Wells in dreifacher Ausführung stimuliert wurden.
13A-13C sind grafische Darstellungen der Produktion von IL-2 (13A), IFNγ (13B) und IL-4 (13C) durch Milzzellen von Mäusen, die mit Ig-W, Ig-PLP1, Ig-PLP-LR und Kombinationen davon immunisiert worden sind.
14A-14D illustrieren grafisch die Proliferation von Antigen-erfahrenen T-Zellen aus mit Ig-PLP1 (a und b) oder Ig-PLP-LR (c und d) in CFA immunisierten Mäusen nach In-vitro-Stimulation mit PLP1-Peptiden, PLP-LR-Peptiden und Gemischen davon.
15A und 15B sind grafische Darstellungen der Produktion von IL-2 durch mit Ig-PLP1 (15A) und Ig-PLP-LR (15B) immunisierte, Antigen-erfahrene T-Zellen nach In-vitro-Stimulation mit PLP1-Peptid, PLP-LR-Peptid oder Gemischen davon.
16A und 16B illustrieren grafisch, dass mit Ig-PLP1, nicht jedoch Ig-W injizierte neugeborene Mäuse der Induktion von EAE widerstehen, wobei klinisch abgeleitete Kurven für alle Mäuse (16A) und für überlebende Mäuse (16B) gezeigt sind.
17A und 17B zeigen grafisch die In-vivo-Präsentation von Ig-PLP1 durch neugeborene Antigen-präsentierende Thymus- (17A) und Milz- (17B) Zellen nach Injektion mit Ig-PLP1 oder Ig-W innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt.
18A und 18B illustrieren grafisch die proliferative Lymph- (18A) und Milz- (18B) T-Zellen-Reaktion in Mäusen, injiziert mit Ig-PLP1 oder Ig-W kurz nach der Geburt, nach Stimulation mit freiem PLP1, PLP2 oder einem negativen Kontrollpeptid, entsprechend der enzephalitisbewirkenden Sequenz 178-191 von PLP.
19A-19C stellen grafisch die Lymphknoten-T-Zellen-Abweichung dar, gemessen durch Produktion von IL-2 (19A), IL-4 (19B) und IFNγ (19C) in Mäusen, die kurz nach der Geburt mit Ig-PLP1 behandelt und mit freiem PLP1 und PLP2 stimuliert wurden.
20A-20C stellen grafisch die Milz-T-Zellen-Abweichung dar, gemessen durch Produktion von IL-2 (20A), IL-4 (20B) und IFNγ (20C) in Mäusen, die kurz nach der Geburt mit Ig-PLP1 behandelt und mit freiem PLP1 oder PLP2 stimuliert wurden.
21 illustriert grafisch die durch Cytokin vermittelte Wiederherstellung der Proliferation von Milz-T-Zellen in Mäusen, injiziert mit Ig-PLP1 kurz nach der Geburt, immunisiert mit freiem PLP1 nach sieben Wochen und stimuliert mit freiem PLP1, wobei die Zellen in Kontrollmedium (NIL), Medium mit IL-12 und Medium mit IFNγ gezüchtet wurden, wobei die angegebenen cpm-Werte für jede Maus den Mittelwert +/– SD von Wells in dreifacher Ausführung darstellen.
22 illustriert die Ergebnisse der Verabreichung von löslichem Ig-PLP1, löslichem Ig-W oder freiem PLP1-Peptid an Mäuse, die zur Entwicklung von EAE induziert wurden. Die Verabreichung von löslichem Ig-PLP1 verminderte den Schweregrad der Lähmung und unterdrückte Rückfälle bei Mäusen mit EAE.
23 illustriert die Ergebnisse der Verabreichung von löslichem Ig-PLP1, löslichem Ig-PLP-LR oder löslichem Ig-W an Mäuse, die zur Entwicklung von EAE induziert wurden. Mit Ig-PLP1 sowie Ig-PLP-LP behandelte Mäuse wiesen eine verminderten klinischen Schweregrad während des Anfangshöhepunkts der Krankheit auf. Während die Mäuse, denen Ig-W verabreicht wurde, durchgehend während der 120-tägigen Beobachtung Rückfälle zeigten, erholten sich die mit Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR behandelten von der Paralyse bis zum Tag 31 bzw. 38 und zeigten keine Rückfälle.
24 illustriert die Ausmaße an costimulatorischen Molekülen nach Verabreichung von löslichem Ig-PLP1 ohne Adjuvans an Mäuse mit EAE. Mäuse, die Ig-PLP1 erhielten, zeigten niedrigere Ausmaße an B7.1 und CD40 als Kontrollmäuse, die Medium alleine erhielten.
25 illustriert, dass die Verabreichung von aggregiertem Ig-PLP1 EAE in Mäusen effizient bessert, wie mittels klinischer Einstufung des Leidens über einen breiten Zeitraum gezeigt ist.
26A und 26B zeigen, dass die Inkubation von aggregiertem Ig-PLP1 mit gereinigten APCs die Produktion von entzündungshemmenden Cytokinen IL-6 (26A) und IL-10 (26B) vorteilhaft induziert.
27a vergleicht die Fähigkeiten von aggregiertem Ig-PLP1 und aggregiertem Ig-W, EAE zu lindern. Aggregiertes Ig-PLP1 erhaltende Mäuse zeigten einen verminderten Schweregrad der Krankheit und wurden niemals rückfällig, während mit aggregiertem Ig-W (agg-Ig-W) behandelte Mäuse sich nie erholten und Rückfälle während des gesamten Zeitraums der klinischen Bewertung zeigten.
27b ist ein direkter Vergleich des Krankheitsverlaufs von durch PLP1-Peptid induzierter EAE, gefolgt von Behandlung mit löslichem Ig-PLP1 (sol-Ig-PLP1) gegenüber agg-Ig-PLP1. Die mittlere maximale klinische Bewertung von Mäusen, die agg-Ig-PLP1 erhielten, war wesentlich niedriger und die Genesungszeit war kürzer als bei Mäusen, die sol-Ig-PLP1 erhielten.
28a ist ein Vergleich der Fähigkeiten von agg-Ig-PLP1, sol-Ig-PLP1, agg-Ig-W, agg-Ig-PLP2 und sol-Ig-PLP2 zur Induktion von IL-10-Produktion durch Milzzellen. Agg-Ig-PLP1-, Ig-PLP2- und Ig-W-Chimären stimulierten die Produktion von IL-10 durch Milzzellen auf dosisabhängige Weise, während die löslichen Formen der Chimären keine nachweisbaren Mengen an IL-10 induzierten.
28b illustriert die Wirkungen von agg-Ig-PLP1 und IgM auf die IL-10-Produktion durch B-Zellen, dendritische Zellen und Makrophagen. Makrophagen und dendritische Zellen, nicht jedoch B-Zellen produzieren IL-10 nach Inkubation mit agg-Ig-PLP1. Maus-IgM war unfähig, IL-10-Produktion durch irgendeine der getesteten APCs zu stimulieren.
29 illustriert die IL-10-Produktion nach Kontaktieren von Splenozyten mit 0,1 M sol-Ig-PLP1, 0,1 M agg-Ig-PLP1, 0,1 M agg-Ig-PLP1 + 50 g/ml 2.4G2, oder 0,1 M agg-Ig-PLP1 + 100 g/ml Maus-Ig. Agg-Ig-PLP1 induziert IL-10 durch Vernetzung der FcγR1-Rezeptoren.
30a illustriert die proliferative Reaktion von TCC-PLP1-1B10 auf PLP1, PLP2, agg-Ig-PLP1 und agg-Ig-PLP2. TCC-PLP1-1B10 proliferiert nach Inkubation mit Paraformaldehyd-fixierten Milz-APCs, die vorher mit freiem PLP1-Peptid oder agg-Ig-PLP1 gepulst worden waren, zeigte jedoch keine signifikante Proliferation, wenn die APCs mit der Negativkontrolle PLP2 oder agg-Ig-PLP2 gepulst wurden.
30b ist eine Messung der IL-2-Produktion durch TCC-PLP1-1B10 nach Inkubation mit nicht-fixierten Milz-APCs und freiem PLP1-Peptid oder agg-Ig-PLP1. TCC-PLP1-1B10 produzierte signifikante Mengen von IL-2 bei Inkubation mit freiem PLP1-Peptid sowie agg-Ig-PLP1.
30c ist eine Messung der IFNγ-Produktion durch TCC-PLP1-1B10 nach Inkubation mit nicht-fixierten Milz-APCs und freiem PLP1-Peptid oder agg-Ig-PLP1. TCC- PLP1-1B10 produzierte signifikante Mengen an IFNγ bei Inkubation mit freiem PLP1-Peptid sowie agg-Ig-PLP1.
30d ist eine Messung der IL-4-Produktion durch TCC-PLP1-1B10 nach Inkubation mit nicht-fixierten Milz-APCs und freiem PLP1-Peptid oder agg-Ig-PLP1. TCC-PLP1-1B10 produzierte signifikante Mengen an IL-4 bei Inkubation mit freiem PLP1-Peptid sowie agg-Ig-PLP1.
30e ist eine Messung der IL-10-Produktion durch TCC-PLP1-1B10 nach Inkubation mit nicht-fixierten Milz-APCs und freiem PLP1-Peptid oder agg-Ig-PLP1. IL-10 war in signifikanten Ausmaßen nachweisbar, wenn der Stimulator agg-Ig-PLP1 war, nicht jedoch freies PLP1.
31 ist eine Messung der IL-10-Produktion nach Inkubation fixierter oder lebender APCs mit agg-Ig-PLP1 und anschließender Inkubation mit TCC-PLP1-1B10. IL-10 war mit fixierten APCs nicht nachweisbar, wurde jedoch von lebenden APCs produziert.
32a misst die Fähigkeit von durch Splenozyten produziertem IL-10 zur Antagonisierung der Produktion von IFNγ durch T-Zellen. Durch Splenozyten produziertes IL-10 ist fähig, die Produktion von IFNγ durch die T-Zellen zu antagonisieren.
32b misst die Fähigkeit von durch dendritische Zellen produziertem IL-10 zur Antagonisierung der Produktion von IFNγ durch T-Zellen. Durch dendritische Zellen produziertes IL-10 ist fähig, die Produktion von IFNγ durch die T-Zellen zu antagonisieren.
32c misst die Fähigkeit von durch Makrophagen produziertem IL-10 zur Antagonisierung der Produktion von IFNγ durch T-Zellen. Durch Makrophagen produziertes IL-10 ist fähig, die Produktion von IFNγ durch die T-Zellen zu antagonisieren.
32d zeigt Ausmaße von IL-10 und IFNγ, wenn B-Zellen mit agg-Ig-PLP1 und TCC-PLP1-1B10 inkubiert werden. B-Zellen produzieren kein IL-10 nach Inkubation mit agg-Ig-PLP1 und hemmen nicht die Sekretion von IFNγ durch T-Zellen.
33a zeigt Ausmaße von produziertem IFNγ und IL-10, wenn TCC-PLP1-1B10 mit peritonealen Makrophagen und agg-Ig-PLP1 inkubiert wurde. Die IFNγ-Produktion verminderte sich proportional zum Ausmaß des durch die präsentierenden Makrophagen sekretierten IL-10.
33b zeigt Ausmaße von produziertem IFNγ und IL-10, wenn TCC-PLP1-1B10 mit peritonealen Makrophagen, agg-Ig-PLP1 und Anti-IL-10-mAb 2A5 inkubiert wurde. Die Hemmung der IFNγ-Produktion durch die T-Zellen stand in direkter Beziehung zu APC-abstammendem IL-10, da die Neutralisierung von derartigem IL-10 durch Anti-IL-10-mAb 2A5 die IFN-Produktion wiederherstellte.
33c zeigt Ausmaße von produziertem IFNγ und IL-10, wenn TCC-PLP1-1B10 mit peritonealen Makrophagen, agg-Ig-PLP1 und Ratten-IgG inkubiert wurde. Die Inkubation mit der Isotyp-Kontrolle Ratten-Ig anstelle von Anti-IL-10 hatte keine Wirkung auf die Fähigkeit von IL-10, die IFN-Produktion durch TCC-PLP1-1B10 zu hemmen.
34a zeigt die Wirkungen der Behandlung mit agg-Ig-PLP1, agg-Ig-PLP1 und Anti-IL-10, agg-Ig-PLP1 und Ratten-IgG, agg-Ig-W oder agg-Ig-W und Anti-IL-10 auf Mäuse mit EAE. Antikörper gegen IL-10 hinderte agg-Ig-PLP1 daran, Krankheitssymptome zu lindern.
34b zeigt die Wirkungen der Behandlung mit sol-Ig-PLP1, agg-Ig-PLP1, sol-Ig-PLP1 und IL-10, oder agg-Ig-W auf Mäuse mit EAE. Lösliches Ig-PLP1, das keine nachweisbaren Ausmaße an IL-10 induziert, bessert die Krankheit etwas, während sol-Ig-PL1 zusammen mit exogenem IL-10 die Krankheit auf ein Ausmaß weiter vermindert, das mit dem bei mit agg-Ig-PLP1 behandelten Mäusen beobachteten Ausmaß vergleichbar ist.
35 zeigt die Wirkungen der Behandlung mit agg-Ig-W, agg-Ig-PLP1 oder agg-Ig-W und PLP1 auf Mäuse mit EAE. Nur die Behandlung mit agg-Ig-PLP1 verminderte Krankheitssymptome, was beweist, dass zur Modulation der Krankheit durch endogenes IL-10 ein physikalische Brücke von den APCs zu den T-Zellen notwendig ist.
36 zeigt die Wirkungen der Verabreichung von agg-Ig-PLP-LR oder agg-Ig-PLP1 an Mäuse, die an EAE leiden. Obgleich Mäuse, die einen dieser beiden Immunomodulatoren erhielten, sich von der Krankheit erholten, erfolgt die Genesung mit agg-Ig-PLP1 schneller.
37 ist eine histophatologische Analyse von Mäusen, die wie in 36 behandelt wurden. Mit agg-Ig-PLP1 behandelte Mäuse hatten eine signifikant verminderte Anzahl von Entzündungsherden in Cerebrum sowie Lendenrückenmark.
38 zeigt die Wirkungen von agg-Ig-PLP1 auf die Ausmaße costimulatorischer Moleküle auf peritoneale Makrophagen. Agg-Ig-PLP1 bewirkt die Herabregulation der Expression von B7.1, B7.2 oder CD40.
39a zeigt die Wirkungen der Behandlung mit agg-Ig-PLP1 auf Mäuse, bei denen EAE durch PLP1 sowie PLP2 induziert wurde. Die Behandlung mit agg-Ig-PLP1 verminderte den Krankheitsschweregrad.
39b zeigt die Wirkungen der Behandlung mit agg-Ig-PLP1 auf Mäuse, bei denen EAE durch PLP2 induziert wurde. Die Behandlung mit agg-Ig-PLP1 verminderte den Krankheitsschweregrad.
40a zeigt den Test der T-Zellen-Proliferation als Reaktion auf PLP1, PLP2, MBP3 oder HA in mit agg-Ig-PLP1 oder Ig-W behandelten Mäusen nach Induktion von EAE mit ZNS-Homogenat.
40b zeigt IL-2-Ausmaße in den Mäusen aus 40a.
40c zeigt IFNγ-Ausmaße in den Mäusen aus 40a.
40d zeigt IL-4-Ausmaße in den Mäusen aus 40a.
40e zeigt IL-10-Ausmaße in den Mäusen aus 40a.
40f zeigt IL-5-Ausmaße in den Mäusen aus 40a.
40g zeigt TGF-β-Ausmaße in den Mäusen aus 40a.
41 zeigt die Wirkungen der Behandlung mit agg-Ig-PLP1 auf Mäuse, bei denen EAE mit ZNS-Homogenat induziert wurde. Die Behandlung mit agg-Ig-PLP1 verminderte den Krankheitsschweregrad.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Obgleich die vorliegende Erfindung in zahlreichen verschiedenen Formen ausgeführt werden kann, werden hierin spezielle illustrative Ausführungsformen davon offenbart, die die Prinzipien der Erfindung beispielhaft darstellen. Es sollte betont werden, dass die vorliegende Erfindung von den speziellen illustrierten Ausführungsformen nicht eingeschränkt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die hierin offenbarten Immunomodulationsverbindungen zumindest einen FcR-Liganden und zumindest einen immunsuppressiven Faktor umfassen, der zur Herabregulation einer Immunreaktion nach endozytischer Präsentation fähig ist. Insbesondere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen einen Immunomodulator, worin der immunsuppressive Faktor ein oder mehrere T-Zellen-Rezeptor-Agonisten oder -Antagonisten ist, der nach endozytischer Prozessierung und Präsentation fähig ist, an einen Rezeptor an der Oberfläche einer geprimten T-Zelle zu binden, jedoch nicht fähig ist, eine immunogene Reaktion zu erzeugen. In derartigen Ausführungsformen wird der präsentierte immunsuppressive Faktor die Aktivierung der maßgeblichen geprimten T-Zellen verhindern und die hervorgerufene Reaktion vermindern. Diese selektive Suppression des Immunsystems kann unter anderen Indikationen verwendet werden, um mit Immunkrankheiten in Verbindung stehende Symptome, einschließlich durch T-Zellen vermittelte Autoimmunstörungen, Allergien und Gewebeabstoßung bei Transplantationsoperationen, zu behandeln.
Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung in einer ihrer Ausführungsformen einen Immunomodulator für die endozytische Präsentation eines immunsuppressiven Faktors an der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle eines Vertebraten, der zumindest einen Fc-Rezeptor-Liganden und zumindest einen immunsuppressiven Faktor umfasst. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen einen Fc-Rezeptor-Liganden, der zumindest einem Teil einer konstanten Immunglobulindomänenregion entspricht, während der immunsuppressive Faktor zumindest einem T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten entspricht. Andere bevorzugte Ausführungsformen enthalten einen immunsuppressiven Faktor, der einen T-Zellen-Rezeptor-Agonisten umfasst. Außerdem kann der immunsuppressive Faktor, wie oben ausführlich erörtert, ein oder mehrere autoantigene Polypeptide oder Fragmente davon umfassen, die nach endozytischer Prozessierung und Präsentation einen oder mehrere TCR-Agonisten bereitstellen. In insbesondere bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Immunomodulator ein rekombinantes Polypeptid oder einen chimären Antikörper.
Durch Ausnützen der FcR-vermittelten Aufnahme des gewählten Immunomodulators verwendet die vorliegende Erfindung auf sehr intelligente Weise die dem Köper eigenen Stoffwechselwege, um die schädlichen Immunreaktionen herabzuregulieren. Im Spezielleren nützt die vorliegende Erfindung die Tatsache, dass T-Zellen fremde Antigene erkennen und darauf reagieren, wenn sie an der Oberfläche anderer Zellen anhaften. Die Auswahl des/der geeigneten Immunomodulators/en gemäß den Lehren hierin sorgt für die effiziente Aufnahme der verabreichten Verbindung. Nach der FcR-vermittelten Aufnahme sorgt der natürliche endozytische Stoffwechselweg für die wirksame Präsentation des gewählten, mit den MHC-Klasse-II-Molekülen komplexierten immunsuppressiven Faktors.
Wie oben beschrieben, sind die beiden erforderlichen Eigenschaften, die es einer Zelle ermöglichen, als Antigen-präsentierende Zelle für Klasse-II-MHC-eingeschränkte Helfer-T-Zellen-Lymphozyten zu fungieren, die Fähigkeit zur Prozessierung von endozytisch aufgenommenen Antigenen und die Expression von Klasse-II-MHC-Genprodukten. Die meisten Zellen, einschließlich professionelle und nicht-professionelle APCs, scheinen zur Endozytose und Prozessierung von Proteinantigenen fähig zu sein. Demgemäß scheint in Hinblick auf professionelle APCs die Expression der Klasse-II-MHC-Moleküle der entscheidende Faktor zu sein. In diesem Zusammenhang umfassen die am besten definierten Antigen-präsentierenden Zellen für Helfer-T-Lymphozyten einkernige Phagozyten, B-Lymphozyten, dendritische Zellen, Langerhans-Zellen der Haut und, in manchen Säugetieren, Endothelzellen. Selbstverständlich ist anzuerkennen, dass verschiedene Zellen in verschiedenen Bereichen konzentriert sein können und an verschiedenen Stadien der T-Zellen-vermittelten Immunreaktion beteiligt sein können.
Auf jeden Fall wird unter dem Ausdruck „professionelle Antigen-präsentierende Zelle" oder „professionelle APC" bei Verwendung hierin jegliche Zelle verstanden, die zur Induktion einer durch T-Zellen vermittelten Immunreaktion und Expression hoher Konzentrationen an costimulatorischen Molekülen fähig ist. Im Gegensatz dazu exprimieren nicht-professionelle APCs typischerweise keine hohe Konzentration an costimulatorischen Molekülen. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung ist anzuerkennen, dass beide Zelltypen verwendet werden können, um die gewählten immunsuppressiven Faktoren zu präsentieren und das Immunsystem herunterzuregulieren. In diesem Zusammenhang kann der gewählte FcR-Ligand mit einer Anzahl von verschiedenen Fc-Rezeptoren wechselwirken, die sich auf einer Vielzahl an Zelltypen finden, um die Endozytose des Immunomodulators zu fördern. Nur als Beispiel können ausgewählte menschliche Fc-Rezeptoren, die eingesetzt werden können, die FcγRI-, FcγRIIA-, FcγRIIB-, FcγRIIIA-, oder FcγRIIIB-Unterfamilien umfassen.
Die FcR-Liganden der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise zumindest einen Teil einer Domäne einer konstanten Region eines Immunglobulins umfassen. In insbesondere bevorzugten Ausführungsformen wird der FcR-Ligand eine oder mehrere von einer konstanten Region eines Immunglobulins stammende Domänen umfassen. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass verschiedene Immunglobulin-Isotypen und -Allotypen nach Wunsch eingesetzt werden können. Beispielsweise können kompatible FcR-Liganden aus Aminosäuresequenzen ausgewählt werden, die jenen entsprechen, die sich in den konstanten Regionen von IgG, IgE, IgA oder IgM finden. Unter anderen Faktoren kann die Auswahl eines bestimmten Isotyps zur Verwendung als FcR-Ligand auf biochemischen Eigenschaften basieren, wie z.B. auf Bindungskoeffizienten oder niedriger Immunreaktivität in der zu behandelnden Spezies. Gleichermaßen kann die Auswahl einer einzelnen Domäne, eines Fragments davon oder mehrerer Domänen auf Basis biochemischer Faktoren oder letztendlich der Präsentationseffizienz ermittelt werden.
Wie vorher erörtert wurde, umfassen die Immunomodulatoren der vorliegenden Erfindung außerdem einen immunsuppressiven Faktor. Gemäß dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung kann der immunsuppressive Faktor jegliche Verbindung sein, die bei endozytischer Prozessierung und Präsentation an der Oberfläche einer APC das Immunsystem herunterreguliert. An sich können immunsuppressive Faktoren kleine Moleküle, Peptide, Proteinfragmente, Proteinderivate, Polypeptide oder Kombinationen davon umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen agiert der immunsuppressive Faktor, wenn er an der Oberfläche der APV präsentiert wird, insofern als Antagonist, als dass er die Bindung eines ähnlich präsentierten Agonisten an einen ausgewählten Rezeptor stört. In insbesondere bevorzugten Ausführungsformen umfasst der immunsuppressive Faktor einen T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten, der mit einem T-Zellen-Rezeptor ohne Aktivierung einer Immunreaktion assoziieren wird. Es ist anzuerkennen, dass andere Ausführungsformen der Erfindung Immunomodulatoren umfassen, die T-Zellen-Rezeptor-Agonisten enthalten, die die Immunreaktion auf das gegenständliche Autoantigen herabsetzen. In Bezug auf diese Ausführungsformen ist anzuerkennen, dass die Fc-vermittelte Präsentation natürlich vorkommender autoantigener Polypeptide verwendet werden kann, um die gewünschten T-Zellen-Rezeptor-Agonisten über endozytische Prozessierung bereitzustellen. Das heißt, dass die Verabreichung von natürlich vorkommenden autoantigenen Polypeptiden oder Fragmenten davon in Verbindung mit einem FcR-Liganden in der effizienten Präsentation von einem oder mehreren T-Zellen-Rezeptor-Agonisten gemäß der Lehren hierin resultiert.
Obgleich jegliches funktionell kompatible Molekül als immunsuppressiver Faktor gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, werden Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung anerkennen, dass Proteine (Polypeptide), Proteinfragmente oder Peptide zur Verwendung bei den offenbarten Verbindungen und Verfahren besonders zweckdienlich sind. Derartige Moleküle werden von den normalen endozytischen Stoffwechselwegen leicht prozessiert und werden leicht präsentiert, beispielsweise in Übereinstimmung mit den MHC-Klasse-II-Molekülen an der Oberfläche der Antigen-präsentierenden Zelle. Darüber hinaus sind T-Zellen-Rezeptoren, da der Großteil der eine unerwünschte Immunreaktion hervorrufenden Verbindungen typischerweise Proteinfragmente sind, üblicherweise auf ähnliche Fragmente, ob sie nun Agonisten oder Antagonisten sind, höchst reaktiv. In insbesondere bevorzugten Ausführungsformen werden antagonistische immunsuppressive Faktoren Analoga eines gewählten Peptids oder Proteinfragments sein, das mit einem gewählten T-Zellen-Rezeptor immunreaktiv ist.
„Peptidanaloga" oder „Analoga" enthalten bei Verwendung hierin zumindest eine andere Aminosäure in den jeweiligen entsprechenden Sequenzen zwischen dem Analogon und dem nativen Proteinfragment oder Peptid. Wenn nicht anders angegeben, bezieht sich eine benannte Aminosäure auf die L-Form. Eine L-Aminosäure aus dem nativen Peptid kann in jede andere der 20 üblicherweise in Proteinen vorkommenden L-Aminosäuren, in jede der entsprechenden D-Aminosäuren, seltene Aminosäure, wie z.B. 4-Hydroxyprolin und Hydroxylysin, oder in eine Nicht-Protein-Aminosäure, wie z.B. B-Alanin und Homoserin, geändert werden. Ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung enthalten sind Aminosäuren, die durch chemische Mittel, wie z.B. Methylierung (z.B. a-Methylamin), Amidierung der C-terminalen Aminosäure durch Alkylamin, wie z.B. Ethylamin, Ethanolamin und Ethylendiamin, und Acetylierung oder Methylierung einer Aminosäurekettenseitenfunktion (z.B. Acetylierung der Epsilon-Aminogruppe von Lysin) geändert worden sind.
Verfahren zur Auswahl effizienter Peptidantagonisten zur Behandlung multipler Sklerose (MS) werden in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 96/16086 bereitgestellt. Die offenbarten Verfahren können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um wirksame immunsuppressive Faktoren zur Inkorporation in die offenbarten Immunomodulatoren bereitzustellen. Beispielsweise können unter Anwendung von unten ausführlich beschriebenen Tests Kandidat-Peptidanaloga auf ihre Eignung zur Behandlung von MS gescreent werden, indem ein Test, der die kompetitive Bindung an MHC misst, T-Zellen-Proliferationstests oder ein Test durchgeführt wird, der die Induktion von experimenteller Enzephalomyelitis (EAE) feststellt. Jene Analoga, die die Bindung der nativen autoreaktiven Peptide hemmen, die Proliferation von mit dem nativen Peptid reaktiven Zelllinien nicht stimulieren und die Entwicklung von EAE (einem experimentellen Modell für MS) durch bekannte Autoantigene hemmen, sind für Therapeutika zweckdienlich. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass ähnliche Testtypen verwendet werden können, um immunsuppressive Faktoren für andere native Peptide (d.h. fortwährend präsentierte Autoantigene) oder andere Immunstörungen zu screenen. In insbesondere bevorzugten Ausführungsformen umfassen die ausgewählten immunsuppressiven Faktoren Analoga von T-Zellen-Epitopen.
Allgemeiner gesprochen können immunsuppressive Faktoren (ob Agonisten oder Antagonisten) für eine Anzahl von Krankheiten, die eine Vielzahl von immunreaktiven Mitteln aufweisen, ohne übermäßiges Experimentieren hergeleitet werden. Zum Beispiel können Peptidanaloga-Antagonisten oder -Agonisten für T-Zellen-Epitope an Proteolipidprotein sowie basischem Myelinprotein erzeugt werden, um multiple Sklerose zu behandeln. Alternativ dazu können natürlich vorkommende Polypeptide (d.h. MBP oder PLP) oder Kombinationen davon mit einem FcR-Liganden assoziiert und verabreicht werden, um die gewünschte immunsuppressive Wirkung bereitzustellen. Gleichermaßen können natürlich vorkommende Polypeptide oder Fragmente davon, die dem Pyruvatdehydrogenasekomplex oder T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten oder -Agonisten entsprechen, die von T-Zellen-Epitopen derselben Proteine stammen, zur Behandlung primärer biliärer Zirrhose verwendet werden. In beiden Fällen werden die natürlich vorkommenden oder abgeleiteten immunsuppressiven Faktoren wie hierin beschrieben in einen Immunomodulator eingebaut und einem Patienten verabreicht, der diese benötigt. Die wirksame Präsentation des immunsuppressiven Faktors (einschließlich Agonisten, die aus der Verabreichung von natürlich vorkommenden Autoantigenen resultieren) wird die Stimulation der autoreaktiven T-Zellen durch natives Peptid selektiv vermindern, wodurch die Symptome der gegenständlichen Immunstörung gelindert werden.
Der ausgewählte immunsuppressive Faktor und FcR-Ligand, zusammen mit einem Immunomodulator, kann auf jede einer Reihe von Weisen wirksam verabreicht werden. Im Spezielleren können die Immunomodulatoren der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben jegliche Form der jeweiligen Elemente kombinieren, die bei der selektiven Suppression der Immunreaktion funktionell wirksam sind. Beispielsweise kann der Immunomodulator ein rekombinantes (oder Fusions-) Polypeptid oder Protein umfassen, das unter Anwendung molekularbiologischer Techniken hergestellt wird, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. In derartigen Fällen kann der FcR-Ligand ein Fragment einer einzelnen konstanten Region einer Immunglobulindomäne oder vorzugsweise die gesamte konstante Region umfassen. In anderen Ausführungsformen kann der Immunomodulator einen sterisch gebundenen Antikörper-Antigen-Komplex umfassen, worin das Antigen einen T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten oder -Agonisten oder ein natürlich vorkommendes Autoantigen umfasst. Andere bevorzugte Ausführungsformen bieten einen Immunomodulator, der einen chimären Antikörper umfasst, worin ein immunsuppressiver Faktor auf dem Fab-Fragment exprimiert wird. Bei noch weiteren Ausführungsformen kann der Immunomodulator zwei kovalent gebundene Moleküle umfassen, die einen wirksamen FcR-Liganden bzw. immunsuppressiven Faktor umfassen.
Insbesondere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden rekombinante Nucleotidkonstrukte einsetzen, die für Immunomodulatoren kodieren, die ein einzelnes Fusionspolypeptid umfassen. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass standardmäßige Gentechnologie Fusionsproteine oder Chimären bereitstellen kann, die zumindest einen FcR-Liganden und zumindest einen immunsuppressiven Faktor umfassen. Die Ausdrücke „Chimäre" oder „chimär" werden bei Verwendung hierin im weitesten Sinne verwendet, um jegliches Polynucleotid oder Polypeptid zu umfassen, das Sequenzfragmente aus mehr als einer Quelle umfasst. Beispielsweise könnte ein gentechnisch hergestelltes Polypeptid, das einen Peptid-TCR-Antagonisten und eine einzelne Fc-Domäne aus einem IgG-Molekül enthält, richtigerweise ein chimäres Protein oder Fusionsprotein genannt werden. Gleichermaßen kann ein chimärer Antikörper eine rekombinante Schwerkette umfassen, die so konstruiert ist, dass sie ein als immunsuppressiver Faktor wirkendes heterologes Peptid und eine Leichtkette der Wildform enthält. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung ist es nicht notwendig, dass die ungleichen Regionen aus unterschiedlichen Spezies stammen. Das heißt, dass ein chimärer Antikörper menschliche Leicht- und Schwerketten und einen konstruierten menschlichen TCR-Antagonisten, exprimiert in einer CDR, umfassen kann. Im Gegensatz dazu können chimäre Immunomodulatoren FcR-Liganden und immunsuppressive Faktoren umfassen, die aus anderen Spezies, wie z.B. Mensch oder Maus, stammen.
An sich umfasst einer der Aspekte der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes Polynucleotidmolekül, das für ein Polypeptid kodiert, worin das Polynucleotidmolekül zumindest eine einem Fc-Rezeptor-Liganden entsprechende Nucleotidsequenz und zumindest eine einem immunsuppressiven Faktor entsprechende Nucleotidsequenz umfasst. Vorzugsweise entspricht der immunsuppressive Faktor einem oder mehreren natürlich vorkommenden autoantigenen Polypeptiden oder Fragmenten davon oder einem T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten oder -Agonisten, und der Fc-Rezeptor-Ligand entspricht zumindest einer der konstanten Regionen einer Immunglobulindomäne. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform kodiert das Polynucleotidmolekül für eine Nucleotidsequenz, die einer Immunglobulin-Schwerkette entspricht, worin eine komplementaritätsbestimmende Region zumindest teilweise deletiert und durch eine Nucleotidsequenz ersetzt worden ist, die einem T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten oder -Agonisten entspricht. Zusammensetzungen, die Gemische aus immunsuppressiven Faktoren umfassen, können ebenfalls gemäß den Lehren hierin wirksam verwendet werden.
Jedenfalls können DNA-Konstrukte, die die gewünschten Immunomodulatoren umfassen, entweder in prokaryotischen oder in eukaryotischen Zellen unter Anwendung von Techniken exprimiert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Siehe beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982). In bevorzugten Ausführungsformen wird das konstruierte Plasmid in immortalisierte Zelllinien transformiert werden, die das gewünschte Produkt sekretieren. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, können derartige konstruierte Organismen modifiziert werden, um relativ hohe Mengen des gewählten Immunomodulators zu produzieren. Alternativ dazu können die konstruierten Moleküle in prokaryotischen Zellen, wie z.B. E. coli, exprimiert werden. Welche Produktionsquelle auch immer eingesetzt wird, es können Produkte unter Anwendung herkömmlicher biochemischer Verfahren, wie z.B. Fraktionierung, Chromatographie oder anderer Reinigungsverfahren und herkömmlicher Formulierungstechniken, aufgetrennt und anschließend in zur Abgabe geeignete Zusammensetzungen formuliert werden.
Der immunsuppressive Faktor entspricht vorzugsweise einem oder mehreren natürlich vorkommenden autoantigenen Polypeptiden oder Fragmenten davon oder einem T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten oder -Agonisten, und der Fc-Rezeptorligand umfasst vorzugsweise zumindest einen Teil einer konstanten Region einer Immunglobulindomäne. Bevorzugter umfasst der Immunomodulator ein Polypeptid oder einen chimären Antikörper, worin zumindest eine komplementaritätsbestimmende Region (CDR) durch einen T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten oder -Agonisten ersetzt worden ist.
Es ist außerdem anzuerkennen, dass die chimären Antikörper, Polypeptide und anderen Konstrukte der vorliegenden Erfindung entweder alleine oder als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden können. Zusammenfassend können pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere der hierin beschriebenen Immunomodulatoren in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Verdünnern oder Exzipienten umfassen. Eine derartige Zusammensetzung kann Puffer, wie z.B. neutral gepufferte Salzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung und dergleichen, Kohlenhydrate, wie z.B. Glucose, Mannose, Saccharose oder Dextrane, Mannit, Proteine, Polypeptide oder Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Antioxidantien, Komplexierungsmittel, wie z.B. EDTA oder Glutathion, Adjuvantien (z.B. Aluminiumhydroxid) und Konservierungsmittel umfassen. Trotzdem umfassen bevorzugte Ausführungsformen, wie oben dargelegt, pharmazeutisch annehmbare Träger, die keine Adjuvantien enthalten, die zur Induktion costimulatorischer Moleküle fähig sind. Jedoch können pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere zusätzliche aktive Bestandteile, wie z.B. Cytokine wie B-Interferon, enthalten.
In dieser Beziehung umfasst die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt pharmazeutische Zusammensetzungen für die endozytische Präsentation eines immunsuppressiven Faktors an der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle eines Vertebraten, die zumindest einen Immunomodulator und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen, wobei der zumindest eine Immunomodulator zumindest einen Fc-Rezeptor-Liganden und zumindest einen immunsuppressiven Faktor umfasst. Gleichermaßen umfasst die Erfindung Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Immunstörung, das das Kombinieren von zumindest einem Immunomodulator mit einem physiologisch annehmbaren Träger oder Verdünner umfasst, worin der Immunomodulator zumindest einen Fc-Rezeptor-Liganden und zumindest einen immunsuppressiven Faktor umfasst. Bei beiden dieser Aspekte kann der immunsuppressive Faktor ein oder mehrere natürlich vorkommende autoantigene Polypeptide oder Fragmente davon oder einen T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten oder -Agonisten umfassen, und der Fc-Rezeptor-Ligand kann zumindest einen Teil einer konstanten Region einer Immunglobulindomäne umfassen. Vorzugsweise wird der Immunomodulator in Form eines rekombinanten Polypeptids oder eines chimären Antikörpers vorliegen.
Wie oben erwähnt, sind Immunomodulatoren, die chimäre Antikörper umfassen, ein insbesondere bevorzugter Aspekt der Erfindung. Derartige Antikörper können durch Substituieren von zumindest einem Abschnitt von einer oder mehreren komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR) durch einen immunsuppressiven Faktor, typi scherweise einen Peptid-TCR-Antagonisten oder -Agonisten, gebildet werden. Wie in den unten stehenden Beispielen ausführlicher beschrieben wird, kann die für die Schwerkette kodierende Nucleotidsequenz so konstruiert werden, dass sie einen Abschnitt oder die gesamte von zumindest einer CDR durch ein Peptid oder Peptidanalogon eines vollständigen oder eines Abschnitts eines Autoantigens ersetzt. Nach Expression durch die geeignete Zelllinie können die rekombinanten Schwerketten mit Leichtketten der Wildform komplexieren, um ein immunreaktives Tetramer zu bilden, das zwei immunsuppressive Faktoren zeigt. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass die Immungobulinmoleküle aus der zu behandelnden Spezies gewählt werden, um die Hervorrufung einer schädlichen Immunreaktion (d.h. einer Human-Anti-Maus-Reaktion) zu minimieren. Da die konstante Region des gewählten Immunglobulins im Wesentlichen unmodifiziert ist, wird diese Form von Immunomodulator leicht durch Endozytose prozessiert, was eine wirksame Präsentation des assoziierten immunsuppressiven Faktors ermöglicht.
Bei anderen Formen können die Immunomodulatoren der vorliegenden Erfindung einen Antigen-Antikörper-Komplex umfassen, worin das Antigen ein immunsuppressiver Faktor ist. Es ist anzuerkennen, dass moderne immunologische Verfahren verwendet werden können, um die gewünschten Antikörper zu erzeugen und zu reinigen, die vorzugsweise monoklonal sind. Nur als Beispiel kann ein gewählter Peptidantagonist (d.h. ein Analogon eines Peptidautoantigens) oder Agonist in eine Maus injiziert werden, um immunreaktive Zellen bereitzustellen, die dann geerntet und unter Anwendung von Standardverfahren immortalisiert werden können. Falls erwünscht, kann der murine monoklonale Antikörper unter Anwendung herkömmlicher Rekombinationsverfahren „humanisiert" werden, um eine kleine murine variable Region zu hinterlassen, die auf einem ansonsten menschlichen Immunglobulin exprimiert wird, das keine schädliche Immunreaktion in einem Patienten hervorrufen wird. Auf alle Fälle wird der monoklonale Antikörper mit dem immunsuppressiven Faktor komplexiert, um den gewünschten Immunomodulator zu bilden, der dann wie oben beschrieben formuliert und verabreicht werden kann. Mit der den Fc-Liganden bildenden konstanten Region sollte die Phagozytose relativ rasch und die Präsentation des angebundenen immunsuppressiven Faktors effizient sein.
Obgleich Ausführungsformen die Fc-Rezeptorliganden umfassen können, die der gesamten konstanten Region entsprechen, muss betont werden, dass die vorliegende Erfindung nicht erfordert, dass der verabreichte Immunomodulator eine intakte konstante Immunglobulinregion umfasst. Stattdessen kann jeglicher FcR-Ligand, der an FcR binden und Endozytose erfahren kann, in Verbindung mit dem gewählten immunsuppressiven Faktor verwendet werden. Im Speziellen können einzelne Domänen konstanter Regionen oder Fragmente davon mit Peptidantagonisten kombiniert werden, um monomere Polypeptide zu bilden (die eine einzige Aminosäurekette aufweisen), die das Immunsystem gemäß der Lehren hierin supprimieren können. Es können derartige Fusionsproteine konstruiert werden die, den minimalen wirksamen FcR-Liganden und/oder immunsuppressiven Faktor aufweisend, viel stabiler sein könnten, wodurch die Abgabe erleichtert und möglicherweise die Bioverfügbarkeit erhöht wird. Darüber hinaus könnte es möglich sein, diese konstruierten Polypeptide oder Proteine über einen Zeitraum zu verabreichen, ohne eine Immunreaktion hervorzurufen, wie sie bei Verabreichung vollständiger Antikörper heterologer Spezies zu beobachten ist. An sich könnten sich relativ kleine chimäre Polypeptide als wirksame Immunomodulatoren erweisen.
Gleichermaßen könnten sich auf Nicht-Peptid basierende Moleküleinheiten als wirksame immunsuppressive Faktoren oder, in Kombination, Immunomodulatoren erweisen. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass Moleküleinheiten (auf Peptid oder Nicht-Peptid basierend), die in einer ausgewählten Rolle (z.B. als FcR-Ligand) effektiv funktionieren, unter Anwendung gegenwärtiger Verfahren, wie z.B. kombinatorischer Chemie, gerichteter Evolution oder rationalem Wirkstoffdesign, bereitgestellt werden können. Beispielsweise kann es möglich sein, rationales Wirkstoffdesign anzuwenden, um eine kleine Nicht-Peptid-Moleküleinheit zu modellieren, die wirksam an einen vorher entdeckten Fc-Rezeptor bindet. Der hergeleitete FcR-Ligand kann kovalent an einen immunsuppressiven Faktor, wie z.B. einen Peptidantagonisten, gebunden (oder ansonsten reversibel assoziiert) werden, um einen Immunomodulator bereitzustellen, der eine besondere Stabilität oder andere wünschenswerte Eigenschaften zeigt.
Wie vorher erwähnt, sind die Immunomodulatoren oder Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung aggregiert, um Konstrukte oder Strukturen bereitzustellen, die vorteilhaft Fc-Rezeptoren vernetzen und/oder die Produktion entzündungshemmender Cytokine, wie z.B. IL-10 und IL-6, induzieren. Die absolute Form der aggregierten Konstrukte ist nicht entscheidend und umfasst im Kontext mit der vorliegenden Erfindung jegliche Konfiguration der offenbarten Immunomodulatoren. In dieser Hinsicht können die aggregierten Konstrukte löslich oder unlöslich sein und können ausschließlich aus dem Agens bestehen oder können einen Träger, eine Matrix, Struktur oder ein mit dem Agens assoziiertes Teilchen umfassen. Beispielsweise können die offenbarten Agenzien mit Mikroteilchenträgern assoziiert oder komplexiert sein, die ein beliebiges biologisch kompatibles Material umfassen, oder können in eine relativ lange beständige Lipid- oder Polymermatrix eingebettet oder daran absorbiert sein. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass es zahlreiche im Handel erhältliche Strukturen und diesbezügliche Verfahren zur Assoziation biologischer Strukturen gibt. An sich ist anzuerkennen, dass beispielhafte Mikroteilchenträger Proteine, Saccharide, Lipide oder synthetische und natürliche Polymere umfassen können.
In insbesondere bevorzugten Ausführungsformen wird das komplexierte Agens unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannten Techniken aggregiert. Unter anderen Verfahren können die Aggregate unter Anwendung von Hitze, chemischer Vernetzung oder Präzipitation, wie z.B. Ammonuimsulfatpräzipitation, gebildet werden. Die resultierenden Aggregate können lösliche, unlösliche oder ein Gemisch davon sein. Es ist außerdem anzuerkennen, dass die Denaturierung von Immunglobulinen wegen ihrer β-Faltblatt-Hüllstruktur hydrophobe Gruppen exponiert, die eher intermolekulare als intramolekulare Wechselwirkungen begünstigen. Diese intermolekularen Wechselwirkungen fördern die Aggregation. Beispielsweise führt das Erhitzen von Immunglobulinen (d.h. Immunomodulatoren) für 15 Minuten auf 63°C zur Bildung löslicher Aggregate, die viele biologische Eigenschaften besitzen, die Immunkomplexen ähnlich sind. Derartige Aggregate oder Konstrukte sind besonders wirksam zur Bereitstellung der gewünschten Immunreaktion in einem Patienten, der dies benötigt.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen wird angenommen, dass die Aggregation der Immunomodulatoren es ihnen ermöglicht, opsonierte Antigene zu imitieren. Typischerweise verdauen Zielzellen effizient opsonierte Teilchen und sekretieren biologische Reaktionsmodifikatoren, um die Entzündungsreaktion entsprechend zu verstärken oder herabzuregulieren. Im Falle aggregierter oder immobilisierter Agenzien wird angenommen, dass die Konstrukte so agieren, dass sie eine Immunreaktion im Spätstadium nachahmen, wo die Entzündungsreaktion zur anfänglichen Infektion unterdrückt ist. Das heißt, dass die aggregierten oder immobilisierten Agenzien die immunreaktiven Zellen „täuschen", zu glauben, dass das infektiöse Agens eliminiert worden ist und dass die schützende Immunreaktion nicht länger notwendig ist. Im Spezielleren sekretieren die aktivierten APCs biologische Reaktionsmodifikatoren, wie z.B. IL-10 und IL-6, die aktive T-Zellen herunterregulieren. Wie hierin beschrieben wird, hemmt die IL-10-Produktion die Aktivität von T-Zellen, die für mehrere Epitope spezifisch und an der Autoimmunkrankheit beteiligt sind (d.h. IL-10 sorgt für „Bystander"-Suppression), was die Symptome der Autoimmunkrankheit weiter bessert. Außerdem können die Immunomodulatoren den IFNγ-Spiegel im Patienten vermindern, an den sie verabreicht werden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird die Sekretion derartiger biologischer Reaktionsmodifikatoren so wirken, dass sie autoreaktive T-Zellen herabreguliert, die für die Autoimmunstörung des Patienten verantwortlich sind.
Wie angedeutet wurde, sorgen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung für die Induktion von biologischen Reaktionsmodifikatoren, einschließlich Cytokinen, die an den Stoffwechselwegen der Th₁/Th₂-Entwicklung beteiligt sind und bekanntermaßen von Zellen produziert werden, die dazu fähig sind, als APCs zu fungieren. In dieser Hinsicht umfassen Cytokine, die an der Entwicklung von Th₁/Th₂ beteiligt zu sein scheinen, IL-4, IL-12 und IL-10. IL-6, das von Monozyten produziert wird und die IL-4-Synthese zu induzieren scheint, ist an der Entwicklung von Th₂-T-Zellen betei ligt. IL-10 kann von Monozyten produziert werden und kann die APC-abhängige T-Zellen-Aktivierung hemmen, indem scheinbar die MHC-Klasse-II-Expression herabreguliert und die Hinaufregulation costimulierender Moleküle gehemmt wird. Die Präsentation von Antigen durch APCs, auf denen costimulatorische Moleküle in vermindertem Ausmaß vorhanden sind oder fehlen, stimuliert die periphere Toleranz. Vorteilhafterweise ermöglicht die vorliegende Erfindung die selektive Stimulation dieser und anderer vorteilhafter biologischer Reaktionsmodifikatoren.
Im Spezielleren können, wie in den unten stehenden Beispielen XXVII und XXVIII beschrieben, aggregierte Immunomodulatoren verwendet werden, um Symptome bei EAE in Mäusen zu bessern (Beispiel XXVII) und die Produktion ausgewählter biologischer Reaktionsmodifikatoren in aktivierten Zellen zu induzieren (Beispiel XXVIII). In diesem Zusammenhang zeigt 25, dass die Verabreichung von aggregierten Konstrukten die klinischen Krankheitsanzeichen in Mäusen mit EAE drastisch vermindert. Für das letztere Beispiel wurden Makrophagen, dendritische Zellen und B-Zellen gereinigt, mit aggregiertem Ig-PLP1 inkubiert und auf Produktion von IL-6 und IL-10 getestet. Die in 26A und 26B gezeigten Ergebnisse zeigen an, dass Makrophagen IL-6 sowie IL-10 produzieren, während dendritische Zellen nur IL-10 produzieren. Es scheint, dass B-Zellen keines der Cytokine produzieren, wenn sie mit aggregierten Immunomodulatoren stimuliert werden.
Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass IL-10 ein antiproliferatives Cytokin ist und bekanntermaßen die Produktion anderer Cytokine hemmt. APCs, die Ig-PLP1 (insbesondere aggregiertes Ig-PLP1) binden und anschließend IL-10 produzieren, könnten die T-Zellen-APC-Wechselwirkungen auf zumindest zwei Weisen beeinflussen. Erstens hemmt IL-10 bekannterweise sowohl die Expression von Klasse-II-Molekülen als auch die Hinaufregulation costimulierender Moleküle (Steinbrink et al., J. Immunol. 159, 4772-4780 (1997); Ding et al., J. Immunol. 151, 1224-1234 (1993); Willems et al., Eur. J. Immunol. 24, 1007-1009 (1994); Moore et al., Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001); Peguet-Navarro et al., J. Immunol. 24, 884-891 (1994)). Außerdem kann IL-10 die Synthese von Cytokinen hemmen, die für die Aktivierung von T-Zellen erforderlich sind. Das Beispiel zeigt außerdem, dass behandelte APCs IL-6 produzieren konnten, ein Cytokin, das bekanntermaßen die Entwicklung von Zellen des Th₂-Typs begünstigt. Es ist anzuerkennen, dass von den APCs nach Bindung der Immunomodulatoren produziertes IL-6 die T-Zellen-APC-Wechselwirkungen vorteilhaft beeinflussen und die Modulation der T-Zellen induzieren könnte. Falls weiters TGFβ von den APCs produziert wird, könnte dies ebenfalls eine Modulationswirkung auf T-Zellen haben. In diesem Zusammenhang könnten aggregierte oder immobilisierte Immunomodulatoren für die Induktion entzündungshemmender Cytokin-Produktion besonders wirksam sein.
In der Tat sind aggregierte Immunomodulatoren, wie in den Beispielen XXIX und XXXIV gezeigt ist, bei der Behandlung von EAE höchst wirksam. Wie in den Beispielen XXX und XXXI gezeigt ist, induzieren aggregierte Immunomodulatoren die Produktion von IL-10 durch Vernetzen von FcγR1-Rezeptoren. Aggregierte Immunomodulatoren vermindern außerdem den Spiegel von IFNγ (Beispiel XXXII). Außerdem wirkt IL-10 synergistisch mit peripherer Toleranz, um die Aktivität von an der Autoimmunreaktion beteiligten T-Zellen zu vermindern (Beispiel XXXIII). Wie in Beispiel XXXV bewiesen wird, werden costimulatorische Moleküle auf Makrophagen durch in Reaktion auf aggregierte Immunomodulatoren produziertes IL-10 herabreguliert. Aggregierte Immunglobuline sind außerdem fähig, die Aktivität von T-Zellen, die für mehrere an der Autoimmunkrankheit beteiligte Antigene spezifisch sind, durch „Bystander"-Suppression zu unterdrücken (Beispiele XXXVI und XXXVII).
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen, vernetzen immobilisierte oder aggregierte Immunomodulatoren Fcγ-Rezeptoren und induzieren die Produktion von IL-10. IL-10 führt zur Verminderung der IFNγ-Produktion. Außerdem werden costimulatorische Moleküle an der Oberfläche der APCs durch IL-10 herabreguliert, was zu peripherer Toleranz führt. IL-10 sorgt außerdem für „Bystander"-Suppression, wodurch die Aktivität von T-Zellen, die sich gegen mehrere an der Autoimmunkrankheit beteiligte Antigene richten, herabgesetzt wird. Dies wird vom Beispiel XXXIII direkt bestätigt, was die Aufhebung schützender Wirkungen durch In-vivo-Neutralisation von IL-10 beweist.
Zusammenfassend kann die Behandlung mit immobilisierten oder aggregierten Immunomodulatoren Folgendes induzieren: Produktion von löslichen Vermittlern durch APCs, einschließlich IL-10, die direkt oder indirekt die Aktivität von pathogenen T-Zellen herabregulieren können; die Funktion von APCs durch Herabregulation der Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen und costimulatorischen Molekülen oder durch Vermindern des IFNγ-Spiegels unterdrücken kann; zur Präsentation von therapeutischen Epitopen durch nicht-professionelle APCs führen kann, in denen costimulatorische Moleküle fehlen oder in einem verminderten Ausmaß vorhanden sind, was zu Antigen-aktiviertem Zelltod oder zu Anergie führen kann. Außerdem können immobilisierte oder aggregierte Immunomodulatoren die periphere Toleranz und/oder „Bystander"-Suppression stimulieren. Zusammen können diese Wirkungen zu Folgendem umgesetzt werden: Verhinderung der Erzeugung pathogener T-Zellen; funktioneller Umschaltung von T-Zellen vom pathogenen zum nicht-pathogenen Zustand; Erzeugung von die Krankheit unterdrückenden T-Zellen; und Eliminierung pathogener T-Zellen. Dies kann die Prävention, Stabilisierung oder Remission von Autoimmunstörungen gemäß den Lehren hierin bewirken.
Welche Form von Immunomodulator auch immer gewählt wird, die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können so formuliert werden, dass die gewünschte Stabilität bereitgestellt und die gewählte Form der Verabreichung erleichtert wird. Beispielweise können die Zusammensetzungen unter Anwendung aller herkömmlichen Wege verabreicht werden, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, orale, vaginale, aurale, nasale, pulmonale, intravenöse, intrakraniale, intraperitoneale, subkutane oder intramuskuläre Verabreichung. Im Rahmen anderer Ausführungsformen der Erfindung können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen als Teil eines Implantats mit nachhaltiger Freisetzung verabreicht werden. Im Rahmen weiterer anderer Ausführungsformen können Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als Lyophilisat oder sprühgetrocknete Formulierung formuliert werden, wobei geeignete Exzipienten eingesetzt werden, die für eine erhöhte Stabilität sorgen. Diese bevorzugten Formulierungen können dann unter Verwendung von Trockenpulver-Inhalatoren oder, bei Kombination mit einem Träger oder Treibmittel, aus einem Dosieraerosol, Vernebler, Zerstäuber, Sprayflasche oder Tropfflasche verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung ist für die Behandlung eines beliebigen Vertebraten zweckdienlich, der ein Immunsystem umfasst, das der Herabregulation unterworfen ist. Die Erfindung ist insbesondere bei jenen Vertebraten, wie z.B. Säugetieren, zweckdienlich, die zelluläre Immunreaktionen besitzen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der zu behandelnde Vertebrat sich im Neugeborenen- oder Säuglingszustand befinden.
In diesem Zusammenhang umfasst ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Immunstörung, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten, umfassend einen Immunomodulator in Kombination mit einem physiologisch annehmbaren Träger oder Verdünner, worin der Immunomodulator zumindest einen Fc-Rezeptorliganden und zumindest einen immunsuppressiven Faktor umfasst. Für diesen Aspekt kann der immunsuppressive Faktor einen T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten oder -Agonisten umfassen, und der Fc-Rezeptorligand kann zumindest einen Teil einer konstanten Region einer Immunglobulindomäne umfassen. Wie vorher angedeutet, wird der Immunomodulator vorzugsweise in Form eines rekombinanten Polypeptids oder chimären Antikörpers vorliegen. Die Verfahren können verwendet werden, um Immunstörungen zu behandeln, die Autoimmunstörungen, allergische Reaktionen und Transplantatabstoßung umfassen, und sind insbesondere zweckdienlich bei der Behandlung von Autoimmunstörungen, die aus der aus multipler Sklerose, Lupus, rheumatoider Arthritis, Skleroderma, insulinabhängigem Diabetes und Colitis ulcerosa bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Wie oben erörtert wurde, sind die Zusammensetzungen, Verbindungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung insbesondere zur Induktion von Toleranz in Säugetier-Neugeborenen oder Säuglingen zweckdienlich, wodurch eine zukünftige Autoimmunität verhindert oder vermindert wird. Der Ausdruck „Säugling" bezieht sich bei Verwendung hierin auf ein menschliches oder nicht-menschliches Säugetier während des Lebenszeitraums nach der Geburt, in dem das Immunsystem noch nicht vollständig gereift ist. Beim Menschen erstreckt sich dieser Zeitraum von der Geburt bis zu einem Alter von etwa neun Monaten, während sich dieser Zeitraum bei Mäusen von der Geburt bis zu einem Alter von etwa vier Wochen erstreckt. Die Ausdrücke „neugeboren" oder „neonatal" beziehen sich auf eine Untergruppe von Säugetier-Säuglingen, die im Wesentlichen gerade geboren worden sind. Andere mit „Säuglingen" in Verbindung stehende Eigenschaften gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen eine Immunreaktion, die (i) Empfänglichkeit für Zonen hoher Toleranz (Deletion/Anergie von T-Zellen-Vorläufern, erhöhte Neigung zur Apoptose); (ii) eine Th₂-beeinflusste Helfer-Reaktion (phänotypische Besonderheiten neonataler T-Zellen; verminderte CD40L-Expression auf neonatalen T-Zellen); (iii) ein vermindertes Ausmaß an zellulärer Reaktion (verminderte Anzahl an funktionstüchtigen T-Zellen; verminderte Funktion Antigen-präsentierender Zellen); und (iv) ein vermindertes Ausmaß und eingeschränkten Typ von humoraler Reaktion (Vorherrschen von IgM^high, IgD^low, B-Zellen, vermindertes Zusammenspiel von Th- und B-Zellen) aufweisen. In speziellen, nicht einschränkenden Ausführungsformen der Erfindung können die offenbarten Immunomodulatoren an einen Säugetier-Säugling verabreicht werden, worin maternale Antikörper in nachweisbaren Mengen vorhanden bleiben. In einer ähnlichen Ausführungsform kann die trächtige/schwangere Mutter mit den offenbarten Zusammensetzungen inokuliert werden, so dass die gewünschte T-Zellen-Toleranz im Fötus hervorgerufen wird. Auf jeden Fall kann die ausgelöste T-Zellen-Toleranz Resistenz gegen die spätere Entwicklung einer mit dem verabreichten Immunomodulator verbundenen Autoimmunkrankheit verleihen.
Unabhängig davon, ob der Patient ein Säugling oder Erwachsener ist, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auf eine Weise verabreicht werden, die für die zu behandelnde (oder zu verhindernde) Krankheit geeignet ist. Die Menge und Häufigkeit der Verabreichung sind von solchen Faktoren wie dem Zustand des Patienten und der Art und Schwere der Krankheit des Patienten bestimmt. Im Rahmen von insbesondere bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung können die hierin beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen in einer Dosierung im Bereich von 1 mg bis 50 mg/kg verabreicht werden, obgleich geeignete Dosierungen durch klinische Tests bestimmt werden können. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass Patienten auf therapeutische Wirksamkeit mittels MRI oder Anzeichen klinischer Verschlimmerung überwacht werden können.
Es wird angenommen, dass der Immunomodulator nach Verabreichung an einen oder mehrere auf der Oberfläche von zumindest einem Typ von Antigen-präsentierender Zelle vorhandenen Fc-Rezeptoren bindet. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass die Auswahl des FcR-Liganden zumindest teilweise bestimmen wird, welche Klasse von Fc-Rezeptor verwendet wird, um den Immunomodulator zu internalisieren. Das heißt, dass ein einer konstanten IgG-Region entsprechender FcR-Ligand von einer anderen Klasse von Fc-Rezeptor gebunden wird als ein einer konstanten IgE-Region entsprechender FcR-Ligand. Da unterschiedliche Klassen von Fc-Rezeptoren auf unterschiedlichen Typen von Antigenpräsentierenden Zellen exprimiert werden, ist es darüber hinaus möglich, den immunsuppressiven Faktor auf ausgewählten APCs zu präsentieren. Beispielsweise ist es wahrscheinlich, dass ein einer konstanten IgG-Region entsprechender FcR-Ligand von einem Makrophagen oder einem Neutrophilen endozytiert und dementsprechend präsentiert wird. Dies ist insofern von Interesse, als dass gewisse APCs hinsichtlich Präsentation verschiedener Typen von Antigenen effizienter sind, die wiederum beeinflussen können, welche T-Zellen aktiviert werden.
Jedenfalls wird der gesamte Immunomodulator der rezeptorvermittelten Endozytose durch die APC unterzogen und wird üblicherweise in Clathrin-beschichtete Vesikel befördert. Nach Internalisierung wird der Immunomodulator für die letztendliche Präsentation an der Oberfläche der APC prozessiert. Prozessierung bedingt im Allgemeinen den Vesikeltransport des Immunomodulators zum Lysosom, einer Organelle, die einen sauren pH aufweist und ausgewählte Enzyme, einschließlich Proteasen, umfasst. Hier wird der Immunomodulator verdaut, um einen freien immunsuppressiven Faktor bereitzustellen, der zum Zwecke der vorliegenden Erfindung in Form eines Proteins, Polypeptids oder Peptids vorliegen kann. Wenn der freigesetzte im munsuppressive Faktor ein autoantigenes Polypeptid oder Protein oder Fragment davon umfasst, versteht es sich, dass der Faktor weiter verdaut wird, um einen oder mehrere T-Zellen-Rezeptor-Agonisten bereitzustellen. Ob das Peptid nun ein Antagonist oder Agonist ist (entweder direkt als Teil des Immunomodulators verabreicht oder von einem verabreichten autoantigenen Polypeptid stammend), mittlere präsentierte Peptidlängen können beispielsweise im Bereich von 5 bis 30 Aminosäuren liegen. Nach dem Verdau sind zumindest einige der Fragmente des Immunomodulators, einschließlich Fragmente des immunsuppressiven Faktors, mit MHC-Molekülen in exozytischen Vesikeln assoziiert. Der Komplex aus immunsuppressiven Faktor und MHC wird dann an die Oberfläche der APC transportiert und den Helfer-T-Zellen präsentiert.
Wie oben aufgezeigt, verwenden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung einen TCR-Antagonisten als immunsuppressiven Faktor, der zusammen mit den Klasse-II-MHC-Molekülen präsentiert wird. Demgemäß werden derartige Antagonisten (die Peptidanaloga sein können) zum Zwecke der folgenden Diskussion verwendet. Jedoch muss betont werden, dass die vorliegende Erfindung für die rezeptorvermittelte endozytische Präsentation eines beliebigen immunsuppressiven Faktors angewendet werden kann, der eine Immunreaktion herunterreguliert. An sich können T-Zellen-Rezeptor-Agonisten, die die gewünschte Verminderung der immunogenen Reaktion bereitstellen, als immunsuppressive Faktoren verwendet werden und liegen im Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung. Darüber hinaus kann/können der/die präsentierte(n) Agonist oder Agonisten direkt als immunsuppressiver Faktor verabreicht werden oder können von einem immunsuppressiven Mittel stammen, das ein oder mehrere autoantigene Polypeptide oder Fragmente davon umfasst.
Das heißt, dass in ausgewählten Ausführungsformen der verabreichte immunsuppressive Faktor ein Agonistenpeptid sein kann, das zusammen mit MHC-Komplexen ohne wesentliche Prozessierung nach endozytischer Trennung vom FcR-Liganden präsentiert wird. Für andere Ausführungsformen wird der immunsuppressive Faktor vorzugsweise zumindest ein autoantigenes Polypeptid oder Fragmente davon umfassen. In derartigen Fällen wird der immunsuppressive Faktor typischer weise nach Spaltung vom FcR-Liganden prozessiert (verdaut), um einen oder mehrere Peptidagonisten bereitzustellen, die dann zusammen mit den MHC-Klasse-II-Molekülen gemäß den Lehren hierin präsentiert werden. In jedem Fall kann die effiziente Präsentation des geeigneten Agonisten gegenüber dem T-Zellen-Rezeptor verwendet werden, um die Immunreaktion herabzuregulieren.
Ausschließlich als Beispiel kann demgemäß eine T-Zelle vorher gegen einen Peptidagonisten, der einem Fragment des basischen Myelinproteins entspricht, sensibilisiert worden sein. Bei multipler Sklerose wird dieser Autoagonist fortwährend präsentiert, wodurch eine gegen Bestandteile der Myelinscheide gerichtete Immunreaktion aktiviert wird. Im Spezielleren exprimieren die sensibilisierten individuellen T-Zellen tausende Rezeptoren, die selektiv an den präsentierten Autoagonisten binden und der Zelle signalisieren. Wenn ausreichend Rezeptoren gebunden sind, baut die sensibilisierte T-Zelle eine Reaktion auf, d.h. sie sekretiert Interleukin. In Fällen, wo ein TCR-Antagonist zusammen mit MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert wird, wird die T-Zelle den präsentierten Komplex erkennen, wird jedoch nicht aktiviert.
Daher hemmt die effiziente endozytische Präsentation eines immunsuppressiven Faktors (d.h. eines Antagonisten) gemäß der vorliegenden Erfindung die Agonist-TCR-Bindung durch Konkurrenz um die Rezeptoren. Das heißt, dass der präsentierte TCR-Antagonist effektiv an den TCR einer sensibilisierten T-Zelle bindet, wodurch die Bindung eines präsentierten Autoantigens oder Fragments davon ausgeschlossen wird. Dennoch gibt der Komplex aus immunsuppressivem Faktor und TCR im Gegensatz zu einem Autoantigen-TCR-Komplex der T-Zelle kein Signal, um eine Reaktion aufzubauen. Folglich kann die Bindung des immunsuppressiven Faktors (nicht-reaktiven Agonisten oder Antagonisten) eine T-Zelle daran hindern, ausreichend Autoantigen zu binden, um einen Schwellenwert der Aktivierung zu erreichen, der die Zelle veranlasst, sich zu betätigen. Daher wird eine schädliche Immunreaktion auf das fortwährend präsentierte, einen natürlichen Agonisten umfassende Autoantigen abgewendet.
Alternativ dazu kann eine effiziente FcR-vermittelte Präsentation von Agonisten verwendet werden, um die Immunreaktion eines Säugetiers gemäß den Lehren hierin herunterzuregulieren. In dieser Hinsicht kann/können der/die letztendlich präsentierte(n) Agonist(en) direkt als immunsuppressiver Faktor verabreicht werden oder kann/können von autoantigenen immunsuppressiven Polypeptidfaktoren hergeleitet werden, die endozytisch proteolysiert werden. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen wird angenommen, dass die autoantigenen Agonisten durch nicht-professionelle und/oder nicht-aktivierte APCs präsentiert werden können, denen costimulatorische Moleküle fehlen oder die costimulatorische Moleküle in verringerten Ausmaßen aufweisen. Wie oben erörtert, wurde überraschenderweise gefunden, dass dieser Präsentationstyp letztendlich die Inaktivierung von T-Zellen induziert. Insbesondere induzieren die Immunomodulatoren der vorliegenden Erfindung, wie unten beschrieben wird, die Produktion von IL-10, vermindern IFNγ-Spiegel und stimulieren die periphere Toleranz und/oder „Bystander"-Suppression. Bei derartigen Ausführungsformen ist zu bevorzugen, dass die Immunomodulatorkonstrukte in Vehikeln verabreicht werden, die kein Adjuvans enthalten, so dass die Aktivierung und/oder Produktion costimulatorischer Moleküle minimiert oder eliminiert wird. Insbesondere bevorzugte Ausführungsformen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung können immunsuppressive Faktoren umfassen, die ein oder mehrere autoantigene Polypeptide oder Fragmente davon umfassen. Beispielsweise können Konstrukte gemäß dieser Ausführungsform ein Fusions- oder chimäres IgG umfassen, worin zumindest eine der CDR-Regionen zumindest teilweise durch einen aus PLP stammenden Peptidagonisten ersetzt worden ist. Derartige Konstrukte sollten, wenn sie in therapeutisch wirksamen Mengen in einem Adjuvans-freien, pharmazeutisch wirksamen Träger verabreicht werden, fähig sein, zumindest einige der mit multipler Sklerose verbundenen Symptome zu lindern. Andere wirksame Konstrukte für die Behandlung multipler Sklerose können Fusionspolypeptide umfassen, die die Fc-Region eines IgG umfassen, das kovalent an einen immunsuppressiven Faktor gebunden ist, der die autoantigenen Proteine MBP und PLP umfasst. Diese Konstrukte würde man wiederum in Adjuvans-freien Trägern verabreichen.
Es ist anzuerkennen, dass die Verabreichung von einem oder mehreren autoantigenen Polypeptiden oder Fragmenten davon typischerweise in der effizienten endozytischen Präsentation von mehr als einem Peptidagonisten an der Oberfläche der APCs resultiert. Das heißt, dass das/die verabreichte(n) Polypeptid(e) wahrscheinlich endozytisch proteolysiert wird/werden, um mehrere verschiedene Peptidagonisten bereitzustellen, die dann gleichzeitig präsentiert werden. Eine derartige Präsentation mehrerer Agonisten stellt eine Lösung für jegliche Schwierigkeiten bereit, die mit Epitop-Ausbreitung und Populationsdiversität assoziiert sind. In dieser Hinsicht sollte anerkannt werden, dass Autoimmunstörungen das Resultat von mehr als einem autoantigenen Epitop an einem oder mehreren Polypeptiden sein können. Gleichermaßen können verschiedene Individuen in einer Population von Patienten Autoimmunität gegen verschiedene Epitope auf einem oder mehreren autoantigenen Polypeptiden entwickeln. Dennoch kann die vorliegende Erfindung, wie oben dargelegt ist, auf sehr intelligente Weise derartige Schwierigkeiten umgehen, indem ein oder mehrere autoantigene Polypeptide oder Fragmente davon verabreicht werden, die nach normaler endozytischer Prozessierung in der Präsentation von mehr als einem Agonistenpeptid an der Oberfläche der APCs resultieren werden. Das heißt, dass ein vollständiges Spektrum von Peptidagonisten unter Verwendung der hierin offenbarten Zusammensetzungen und Techniken effizient präsentiert werden kann. Es sollte betont werden, dass es unwahrscheinlich ist, dass die Präsentation derartiger Agonisten ohne die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellte effiziente, FcR-vermittelte Aufnahme erzielt werden kann. Im Spezielleren ist es unwahrscheinlich, dass man therapeutisch wirksame Ausmaße an Agonistenpräsentation einfach durch die Verabreichung natürlich vorkommender autoantigener Polypeptide (d.h. ohne den FcR-Liganden) oder Cocktails freier Agonistenpeptide erzielen könnte. Es ist zweifelhaft, dass derartige Zusammensetzungen ausreichend effizient internalisiert werden würden, um in einer therapeutisch wirksamen Präsentation verabreichter Agonisten zu resultieren. Im Gegensatz dazu sorgt die vorliegende Erfindung für eine wirksame Präsentation der gewünschten Agonisten bei relativ niedriger Dosierung.
Außerdem stimulieren die Immunomodulatoren der vorliegenden Erfindung, wie unten beschrieben wird, die „Bystander"-Suppression. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen wird angenommen, dass IL-10, das von APCs sekretiert wurde, die die Immunomodulatoren der vorliegenden Erfindung internalisiert haben, die Immunreaktion durch benachbarte T-Zellen vermindern kann, die Spezifität für Antigene aufweisen, die nicht jene sind, die in den Immunomodulatoren enthalten sind.
Die Präsentation der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele dient der Illustration der Prinzipien der vorliegenden Erfindung. Diesbezüglich wird eine Liste von Abkürzungen mit entsprechender Definition bereitgestellt, die in der gesamten folgenden Diskussion und in den Beispielen verwendet wird.

MBP:: basisches Myelinprotein, ist mit der Ätiologie von multipler Sklerose in Verbindung gebracht worden;
PLP:: Proteolipidprotein, ist mit der Ätiologie von multipler Sklerose in Verbindung gebracht worden;
PLP1:: ein Peptidfragment von PLP, das die Aminosäurereste 139-151 umfasst;
PLP-LR:: ein Peptidanalogon von PLP1, das gepulste PLP1-Zellen nicht aktiviert:
PLP2:: ein Peptidfragment von PLP, das die Aminosäurereste 178-191 umfasst;
Ig-W:: ein Ig-Konstrukt (hierin als Kontrolle verwendet), umfassend die variable Region der Schwerkette des Anti-Arsonat-Antikörpers 91A3, gebunden an eine konstante Balb/cg2b-Region, und die elterliche 91A3-Kappa-Leichtkette;
Ig-PLP1:: dasselbe Konstrukt wie Ig-W mit der Ausnahme, dass die Schwerketten-CDR3 durch die Aminosäurereste 139-151 von PLP ersetzt wurde;
Ig-PLP-LR:: dasselbe Konstrukt wie Ig-W mit der Ausnahme, dass die Schwerketten-CDR3 durch ein Peptidanalogon der Aminosäurereste 139-151 von PLP ersetzt wurde;
Ig-HA:: (hierin als Kontrolle verwendet) dasselbe Konstrukt wie Ig-W mit der Ausnahme, dass die Schwerketten-CDR3 durch die Aminosäuren 110-120 des Influenzavirus HA ersetzt wurde;
PPD:: gereinigtes Proteinderivat, Gesamtextrakt aus Mycobacterium tuberculosis, der als Kontrollaktivator verwendet wurde.

Aus offensichtlichen praktischen und moralischen Gründen ist eine anfängliche Arbeit beim Menschen zur Ermittlung der Wirksamkeit experimenteller Zusammensetzungen oder Verfahren im Hinblick auf viele Krankheiten undurchführbar. Daher ist während der frühen Entwicklung jeglichen Medikaments der Einsatz geeigneter Tiermodelle aus Gründen der Sicherheit und Kosten das standardmäßige Verfahren. Der Erfolg der Implementierung von Versuchstiermodellen basiert auf dem Verständnis, dass immundominante Epitope häufig in unterschiedlichen Wirtsspezies aktiv sind. Daher sind bei einer Spezies, wie z.B. Nagern oder Schweinen, wirksame Verfahren der Behandlung von Autoimmunität in anderen Spezies, wie z.B. dem Menschen, wirksam. Erst nachdem die geeigneten Tiermodelle ausreichend entwickelt sind, werden klinische Versuche beim Menschen durchgeführt, um überdies die Sicherheit und Wirksamkeit einer Vakzine im Menschen nachzuweisen. Demgemäß wird die vorliegende Erfindung ausschließlich zum Zwecke der Erläuterung und nicht zum Zwecke der Einschränkung in erster Linie im beispielhaften Kontext von Mäusen als Säugetierwirt demonstriert. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass die vorliegende Erfindung mit anderen Säugetierwirten, einschließlich dem Menschen und domestizierten Tieren, praktisch durchgeführt werden kann.
In diesem Zusammenhang kann experimentelle Enzephalomyelitis (EAE), die als Tiermodell für MS verwendet wird, in empfänglichen Stämmen von Mäusen mit Myelin-Autoantigenen, wie z.B. PLP und basischem Myelinprotein (MBP), induziert werden. Die Enzephalitis bewirkende Aktivität dieser Proteine korreliert mit der Gegenwart von Peptiden, die in vivo Klasse-II-beschränkte Enzephalitis bewirkende T-Zellen und folglich EAE induzieren. Das den Aminosäureresten 139-151 von PLP (PLP1) entsprechende Peptid bewirkt Enzephalitis in H-2s-SJL-Mäusen, und für PLP1 spezifische T-Zelllinien transferieren EAE in naive Tiere. Obgleich das/die Zielantigen(e) bei menschlicher MS nach wie vor umstritten sind, ist die Häufigkeit von T-Zellen, die für Myelinproteine spezifisch sind, bei MS-Patienten höher als bei normalen Patienten. Das „Silencing" dieser Myelin-reaktiven T-Zellen kann ein logischer Ansatz zur Umkehrung von MS sein. Als solches wird dieses Modell verwendet, um die Vorteile der vorliegenden Erfindung zu beweisen.
Beispiel I
Herstellung von Peptiden
Zum Zwecke dieser Anmeldung werden die Aminosäuren durch ihren standardmäßigen Dreibuchstaben- oder Einbuchstabencode bezeichnet. Wenn nicht anders angegeben, ist die L-Form der Aminosäure gemeint. Wenn der Einbuchstabecode verwendet wird, kennzeichnet ein Großbuchstabe die L-Form und ein Kleinbuchstabe die D-Form. Der Einbuchstabencode ist der folgende: A, Alanin; C, Cystein; D, Asparaginsäure; E, Glutaminsäure; F, Phenylalanin; G, Glycin; H, Histidin; I, Isoleucin; K, Lysin; L, Leucin; M, Methionin; N, Asparagin; P, Prolin; Q, Glutamin; R, Arginin; S, Serin; T, Threonin; V, Valin; W, Tryptophan; und Y, Tyrosin.
Alle in den folgenden Beispielen verwendeten Peptide wurden von Research Genetic, Inc. (Huntsville, Alabama) unter Anwendung von Festphasenverfahren hergestellt und an HPLC-Säulen auf > 90% Reinheit unter Anwendung herkömmlicher Verfahren gereinigt. PLP1-Peptid (HSLGKWLGHPNKF: Seq.-ID Nr. 1) umfasst eine Enzephalitis bewirkende Sequenz, die den Aminosäuren 139-151 des natürlich vorkommenden Proteolipidproteins entspricht. PLP-LR (HSLGKLLGRPNKF: Seq.-ID Nr. 2) ist ein Analogon von PLP1, bei dem Trp144 und His147 durch Leu bzw. Arg (unterstrichen) ersetzt wurden. PLP1 und PLP-LR binden gut an I-A^S-Klasse-II-Moleküle (d.h. an eine MHC-Klasse-II-Struktur, die von einem speziellen Mausstamm produziert wird). PLP2-Peptid (NTWTTCQSIAFPSK: Seq.-ID Nr. 3) umfasst eine Enzephalitis bewirkende Sequenz, die den Aminosäureresten 178-191 von PLP entspricht. Dieses Peptid bindet auch an I-A^S-Klasse-II-Moleküle und induziert EAE in SJL-Mäusen. HA-Peptid (Sequenz nicht dargestellt) entspricht den Aminosäureresten 110-120 des Hämagglutinins des Influenzavirus. HA bindet an I-E^D-Klasse-II-Moleküle und wird hier als Kontrollpeptid verwendet.
Beispiel II
Herstellung von murinen chimären Immunglobulinen, die exogene Peptide umfassen
Zwei Immunglobulin-Peptid-Chimären, die als Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR bezeichnet werden und schematisch in 1 gezeigt sind, wurden konstruiert, um die Peptide PLP1 und PLP-LR wie in Beispiel 1 beschrieben zu exprimieren. In beiden Fällen wurde die Schwerketten-CDR-3-Schleife deletiert und durch für das gewählte Peptid kodierende Nucleotidsequenzen ersetzt. Die herkömmliche DNA-Sequenzierungsanalyse zeigte die Insertion von Peptidnucleotidsequenzen im korrekten Leseraster an.
Die zur Konstruktion dieser Chimären verwendeten Gene umfassen das für die konstante BALBK-IgG₂b-Region kodierende Gen, wie beschrieben von Gillian et al., Cell 33, 717 (1983), das für die variable Schwerkettenregion von 91A3 kodierende Gen, wie beschrieben von Ruthban et al., J. Mol. Bio. 202, 383-398 (1988), und das für die gesamte 91A3-Kappa-Leichtkette kodierende Gen, wie beschrieben von Gary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1085-1089 (1987). Die Verfahren zur Deletion der Schwerketten-CDR3-Region und Ersatz durch Nucleotidsequenzen, die für PLP1 und PLP-LR kodieren, sind ähnlich denen, die von Zaghouani et al., J. Immunol. 148, 3604-3609 (1992), zur Erzeugung von Ig-NP beschrieben werden, einer Chimäre, die ein CTL-Epitop trägt, das den Aminosäureresten X47-161 des Nucleoproteins von PR8-Influenza-A-Virus entspricht. Dieselbe Literaturstelle berichtet, dass die CDR3 von 91A3-IgG für Peptidexpression kompatibel ist und dass Klasse-I- sowie Klasse-II-beschränkte Epitope effizient prozessiert und T-Zellen präsentiert worden sind, wenn sie anstelle des natürlich vorkommenden Segments aufgepfropft worden sind.
Zusammenfassend wurde das 91A3V_H-Gen in die EcoRI-Stelle von Plasmid pUC19 subkloniert und als Templat-DNA in PCR-Mutagenesereaktionen verwendet, um 91A3V_H-Fragmente zu erzeugen, die PLP1- (91A3V_H-PLP1) und PLP-LR- (91A3V_H- PLP-LR) Sequenzen anstelle von CDR3 tragen. Die Nucleotidsequenzierungsanalyse zeigte an, dass vollständige PLP1- und PLP-LR-Sequenzen ins korrekte Leseraster insertiert wurden (nicht gezeigt). Die 91A3V_H-PLP1- und 91A3V_H-PLP-LR-Fragmente wurden dann in die EcoRI-Stelle von pSV2-gpt-Cg2b vor den für die konstante Region eines Balb/cg2b kodierenden Exons subkloniert, was die Plasmide pSV2-gpt-91A3V_H-PLP1-Cg2b bzw. pSV2-gpt-91A3V_H-PLP1-LR-Cg2b erzeugte. Diese Plasmide wurden dann gesondert in Nicht-Ig-produzierende SP2/0-B-Myelomzellen mit einem Expressionsvektor cotransfiziert, der die elterliche 91A3-Leichtkette pSV2-neo-91A3L trägt. Ig-Cimären produzierende Transfektanten wurden in Gegenwart von Geneticin und Mycophenolsäure selektiert. Transfektanten wurden durch Grenzverdünnung kloniert, und endgültige Klone sekretierten 1 bis 4 mg/ml Ig-PLP1 oder Ig-PLP-LR (zusammen Ig-PLP-Chimären genannt). Die selektierten Zelllinien, die als Ig-PLP1-9B11 und Ig-PLP-LR-21A10 bezeichnet werden, werden in Dauerlagerung im Labor des Erfinders gehalten.
Chimäre Antikörper und Antikörper der Wildform wurden auch als Kontrollen verwendet. Beispielsweise Ig-HA, einem IgG-Molekül, das anstelle des D-Segments das T-Helfer-Epitop HA110-120 aus dem HA des Influenzavirus trägt, das sich von Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR nur durch das in CDR3 insertierte Peptid unterscheidet. Ig-W ist das Produkt von unmodifiziertem (Wildform-) 91A3V_H-Gen, Balb/cg2b-Konstantregion und 91A3-Kappa-Leichtkette. Daher unterscheidet es sich von Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR in der CDR3-Region, die das elterliche D-Segment umfasst. Schließlich ist Ig-PLP2 ein chimärer Antikörper, der innerhalb der Schwerketten-CDR3-Schleife die Aminosäurereste 178-191 von PLP trägt. Herkömmliche Klonierungs-, Sequenzierungs- und Reinigungsverfahren wurden verwendet, um die geeigneten Zelllinien zu erzeugen, und sind ähnlich denen, die von Zaghouani et al. (vorher zitiert) beschrieben werden, und jenen, die vorher zur Erzeugung von Ig-HA verwendet wurden, Zaghouani et al., Science 259, 224-227 (1993).
Kultivierungen von Transfektanten im Großmaßstab wurden in 10% eisenangereichertes Kälberserum (Intergen, New York) enthaltendem DMEM-Medium durchgeführt. Ig-PLP-Chimären wurden aus Kulturüberständen an Säulen gereinigt, herge stellt aus Ratten-Anti-Maus-Kappaketten-mAb, und an CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) gekoppelt. Ratten-Anti-Maus-Kappaketten-mAb (RAM 187.1 oder ATCC-Bezeichnung HB-58) und Maus-Anti-Ratten-Kappaleichtketten-mAb (MAR 18.5 oder ATCC-Bezeichnung TIB 216) wurden von ATCC erhalten. Diese Hybridome wurden auf einen großen Maßstab gezüchtet und aus Kulturüberständen aufeinander gereinigt. Der Ratten-Anti-Maus-Kappa-mAb wurde verwendet, um die Säulen herzustellen, an denen die Ig-PLP-Chimären aus Kulturüberstand gereinigt wurden. Um eine gegenseitige Verunreinigung zu vermeiden, wurden gesonderte Säulen verwendet, um die einzelnen Chimären zu reinigen.
Beispiel III
Reinigung von Proteolipidprotein
Natives Proteolipidprotein oder PLP wurde aus Rattenhirn gemäß dem früher beschriebenen Verfahren von Lees et al., in: Preparation of Proteolipids, Research Methods in Neurochemistry, N. Marks und R. Rodnicht (Hrsg.), Plunemum Press, New York (1978), gereinigt.
Zusammenfassend wurde Hirngewebe in Chloroform/Methanol 2/1 (Vol./Vol.) homogenisiert und der lösliche Rohlipidextrakt mittels Filtration durch einen gesinterten Glastrichter getrennt. PLP wurde dann mit Aceton präzipitiert, und das Pellet wurde in einem Gemisch aus Chloroform/Methanol/Essigsäure aufgelöst und durch eine Säule aus LH-20-100-Sephadex (Sigma) geschickt, um restliche Lipide zu entfernen. Die Entfernung von Chloroform aus den Eluaten und die Umsetzung von PLP in seine Apoprotein-Form wurden simultan durch schrittweise Zugabe von Wasser unter einem leichten Stickstoffstrom durchgeführt. Anschließend wurde eine intensive Dialyse gegen Wasser durchgeführt, um restliche Essigsäure und Methanol zu entfernen.
Beispiel IV
Herstellung von Kaninchen-Anti-Peptid-Antikörpern
In Beispiel 1 hergestellte PLP1- und PLP-LR-Peptide wurden an KLH und BSA gekoppelt, wie in Zaghouani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5645-5649 (1991), beschrieben wird und hierin durch Verweis aufgenommen ist. New-Zealand-White-Kaninchen wurden von „Myrtle's Rabbitry" (Thompson Station, TN) bezogen. Die Kaninchen wurden mit 1 mg Peptid-KLH-Konjugaten in komplettem Freundschen Adjuvans (CFA) immunisiert und monatlich mit 1 mg Adjuvans in inkomplettem Freundschem (IFA) exponiert, bis ein hoher Antikörpertiter erreicht war. Die Peptid-BSA-Konjugate wurden an Sepharose gekoppelt und verwendet, um Anti-Peptid-Antikörper aus dem Kaninchen-Antiserum zu reinigen.
Beispiel V
Charakterisierung von Kaninchen-Anti-Peptid-Antikörpern
Einfang-Radioimmuntests (RIA) wurden verwendet, um die Expression von PLP1- und PLP-LR-Peptiden an einem IgG-Molekül unter Verwendung von wie im Beispiel II beschrieben hergestelltem Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR festzustellen.
96-Well-Mikrotiterplatten wurden mit den in Beispiel IV hergestellten Kaninchen-Anti-Peptid-Antikörpern (5 mg/ml) über Nacht bei 4°C beschichtet und mit 2% BSA in PBS 1 Stunde lang bei Raumtemperatur geblockt. Die Platten wurden dann 3-mal mit PBS gewaschen, und es wurden abgestufte Mengen Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR zugegeben und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3 Waschungen mit PBS wurden eingefangenes Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR durch 2-stündiges Inkubieren der Platten mit mit 100 × 10³ cpm ¹²⁵I markiertem Ratten-Anti-Maus-Kappa-mAb bei 37°C detektiert. Die Platten wurden dann 5-mal mit PBS gewaschen und unter Verwendung eines LKB-Gammazählers gezählt. Gezeigt sind die Mittelwerte +/– SD von Dreifachbestimmungen, die mit 27 mg/ml der Chimären erlangt wurden.
Wie in 2 gezeigt ist, erkannten die gegen synthetische PLP1- und PLP-LR-Peptide gerichteten Kaninchenantikörper die in Beispiel II hergestellten chimären Antikörper Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR. Im Spezielleren wurden Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR, wenn sie an mit Kaninchen-Anti-PLP1 beschichteten Platten inkubiert wurden, in signifikanter Menge eingefangen und banden markierten Ratten-Anti-Maus-Kappakette-mAb (2A). Gleichermaßen wurden sowohl Ig-PLP1 als auch Ig-PLP-LR durch Kaninchen-Anti-PLP-LR eingefangen (2B). Im Gegensatz dazu zeigten Ig-W, der murine Wildform-91A3-Antikörper ohne exogenes Peptid und ein IgM-Kontrollantikörper (nicht gezeigt) keine signifikante Bindung an Kaninchen-Antikörper. Ig-PLP1 banden an Anti-PLP1 sowie Anti-PLP-LR besser als Ig-PLP-LR, was darauf hinweist, dass strukturelle Unterschiede die Zugänglichkeit der Peptide zu den Kaninchenantikörpern beeinflussten. Weiters weisen die in 2 gezeigten Ergebnisse darauf hin, dass die Peptidexpression an den Chimären die Schwer- und Leichtkettenpaarung nicht verändert, da die Kaninchenantikörper an das PLP-Peptid an der Schwerkette und der markierte Ratten-Anti-Maus-Kappa an die Leichtkette binden.
Beispiel VI
Antigenspezifische T-Zelllinien-Proliferationstests
PLP1-spezifische T-Zellen-Hybridome 5B6 und 4E3 und die IL-2-abhängigen HT-2-T-Helferzellen wurden vom The Eunice Kennedy Shriver Center, Waltham, MA, erhalten. Die 5B6- und 4E3-T-Zellen erkennen das Peptid PLP1 in Assoziation mit I-A^S-Klasse-II-MHC und produzieren IL-2, wenn sie damit inkubiert werden, wie beschrieben von Kuchroo et al., J. Immunol. 153, 3326-3336 (1994), hierin durch Verweis aufgenommen. Im Gegensatz dazu berichten Kuchroo et al., dass bei Stimulation mit PLP1 und anschließend mit PLP-LR sowohl 5B6-Zellen als auch 4E3-Zellen kein IL-2 mehr produzieren. Gleichermaßen hemmt die Stimulation von T-Zellen-Hybridomen mit PLP1 in Gegenwart von PLP-LR scheinbar die Produktion von IL-2.
Unter Anwendung einer Technik, die im Wesentlichen dieselbe wie die von Kuchroo et al. ist, wurde die Aktivierung der T-Zellen-Hybridome für verschiedene Agonisten wie folgt durchgeführt. Bestrahlte (3.000 Rad) Splenozyten aus SJL-Mäusen wurden als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) in diesem Beispiel verwendet. Die bestrahlten Splenozyten wurden in 96-Well-Platten mit rundem Boden (5 × 10⁵ Zellen/Well/50 ml) mit abgestuften Konzentrationen von Antigenen (100 ml/Well) inkubiert. Nach einer Stunde wurden T-Zellen-Hybridome, d.h. 5B6 oder 4E3 (5 × 10⁴ Zellen/Well/50 ml), zugegeben und die Kultivierung über Nacht fortgesetzt. Die Aktivierung (oder Proliferation) der T-Zellen wurde durch Messen der Produktion von IL-2 im Kulturüberstand festgestellt. Dies wurde mittels ³H-Thymidin-Inkorporation unter Verwendung der IL-2-abhängigen HT-2-Zellen durchgeführt. Das heißt, dass die HT-2-Zellen proliferieren, wenn IL-2 vorhanden ist (d.h. von aktivierten T-Zellen sekretiert wird), wobei markiertes Thymidin aus dem umgebenden Medium inkorporiert wird.
Das zur Durchführung dieser Tests verwendete Kulturmedium war DMEM, das mit 10% FBS, 0,05 mM 2-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 50 mg/ml Gentamycinsulfat ergänzt war. Zusammenfassend wurden Kulturüberstände (100 ml/Well) mit HT-2-Zellen (1 × 10⁴ Zellen/Well/100 ml) in 96-Well-Platten mit flachem Boden 24 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurde der Kultur 1 mCi ³H-Thymidin pro Well zugegeben und die Kultivierung für weitere 12-14 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden dann auf Glasfaserfiltern geerntet und das nicht inkorporierte ³H-Thymidin ausgewaschen. Inkorporiertes Thymidin wurde dann unter Verwendung des „Trace-96"-Programms und eines Inotech-b-Counters gezählt. Es ist anzuerkennen, dass jene Wells, die höhere Konzentrationen an (von den aktivierten T-Zellen-Hybridomlinien sekretiertem) IL-2 enthalten, höhere Ausmaße an HT-2-Zellproliferation induzieren und höhere Ausmaße an ³H-Thymidin-Inkorporation zeigen werden.
Die Ergebnisse des oben genannten Tests unter Verwendung von zwei verschiedenen T-Zelllinien sind in 3 gezeigt. Im Speziellen produzierten die T-Zellen-Hybridome 4E3 (3A) und 5B6 (3B) substantielle Mengen an IL-2 nach Stimulation durch APCs, die vorher mit Ig-PLP1, PLP1 und nativem PLP inkubiert worden waren. Die Negativkontrollen Ig-W, Ig-HA und PLP2-Peptid induzierten nicht die Produktion von IL-2 durch die T-Zellen. Gleichermaßen wurden 5B6 und 4E3 durch Ig-PLP-LR- sowie PLP-LR-Peptide nicht stimuliert, signifikante Ausmaße an IL-2 zu produzieren. Diese letzteren Ergebnisse sind nicht unerwartet, da das PLP-LP-Peptid bekanntermaßen die IL-2-Produktion eher aufhebt als stimuliert. Die Konzentration an Antigen war 0,1 mM für Ig-PLP1, Ig-PLP-LR, Ig-HA und Ig-W; 1 mM für PLP1- und PLP2-Peptide; und 1,7 mM für PLP. Jeder Wert stellt den Mittelwert +/– SD von dreifach ausgeführten Wells dar.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass Ig-PLP1 den T-Zellen-Hybridomen in einer Weise präsentiert wurde, die der Aktivierung förderlich war. Sterische Hinderung scheint das gleichzeitige direkte Binden des ganzen Antikörpers an die MHC-Struktur und TCR auszuschließen. Da T-Zellen an löslichen Proteinen nicht reagieren werden, scheint es so zu sein, dass PLP1-Peptid vom Ig durch endozytische Prozessierung freigesetzt wurde und MHC-Klasse-II-I-A^S-Moleküle band. Demgemäß scheinen die das PLP1-Peptid flankierenden Regionen die endozytische Prozessierung von Ig-PLP1 oder die Bindung des PLP1-Peptids an die MHC-Klasse-II-Struktur nicht zu stören.
Beispiel VII
Präsentation von PLP1-Peptid an T-Zellen über Ig-PLP1
Bei spontanen Immunstörungen kann die Exposition und kontinuierliche endozytische Präsentation eines Autoantigens signifikante Spiegel von MHC-Autoantigenkomplexen erzeugen. Gegenwärtig fehlt für viele Immunkrankheiten ein einsatzfähiges In-vitro-Modell für die Replikation dieser kontinuierlichen Präsentation, was ein ernsthaftes Hindernis für die Entwicklung wirksamer Behandlungen darstellt. Aufgrund der relativ ineffizienten Internalisierungsmechanismen oder der vorher erörterten Einschränkungen in Bezug auf freie Peptide sind relativ hohe Spiegel an natürlichen Antigenen erforderlich, um die gewünschte Stimulation bereitzustellen. Demgemäß ist einer der Aspekte der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines In-vitro-Modells für die kontinuierliche endozytische Präsentation von Agonistenliganden.
In Spezielleren stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für die wirksame endozytische In-vitro-Präsentation eines T-Zellen-Antagonisten bereit, die die folgenden Schritte umfassen:

a. Bereitstellen eines Mediums, das mehrere Antigen-präsentierende Zeilen umfasst, die Fc-Rezeptoren exprimieren; und
b. Kombinieren des Mediums mit einer einen Immunomodulator umfassenden Zusammensetzung, worin die Zusammensetzung einen Immunomodulator, der zumindest einen Fc-Rezeptorliganden und zumindest einen immunsuppressiven Faktor aufweist, sowie einen kompatiblen Träger umfasst.

Vorzugsweise wird der immunsuppressive Faktor zumindest ein T-Zellen-Rezeptor-Antagonist sein, und der Fc-Rezeptorligand wird zumindest ein Teil einer konstanten Region einer Immunglobulindomäne sein. Weiters wird der Immunomoduiator in bevorzugten Aspekten der Erfindung ein rekombinantes Polypeptid oder einen chimären Antikörper umfassen.
In dieser Hinsicht kann Ig-PLP1 (oder jeglicher Immunglobulin-assoziierte Agonist) zum Zwecke der Etablierung eines Peptidabgabesystems verwendet werden, das über den endozytischen Stoffwechselweg effizient funktionieren und hohe Spiegel an Agonistenliganden erzeugen könnte, so dass es ein In-vitro-System bereitstellt, um das Immunsystem zu untersuchen. Insbesondere kann das offenbarte System ver wendet werden, um Antagonismus in Situationen zu untersuchen, die ähnlich der In-vivo-Präsentation von Autoantigenen sind.
Um nachzuweisen, dass mit Immunglobulin assoziierte Agonisten verwendet werden können, um die kontinuierliche endozytische Präsentation von Antigenen nachzuahmen, wurden T-Zellen-Aktivierungstests mit freiem PLP1-Peptid, nativem PLP und Ig-PLP1 durchgeführt. Die Ergebnisse der Tests sind in 4 gezeigt.
Im Speziellen wurden verschiedene Konzentrationen der drei Antigene (d.h. Agonisten) mit bestrahlten SJL/J-Splenozyten inkubiert, die anschließend mit 4E3-T-Zellen-Hybridomen assoziiert wurden. IL-2-Produktion wurde mittels ³H-Thymidin-Inkorporation unter Verwendung der IL-2-abhängigen HT-2-Zellen wie in Beispiel VI beschrieben gemessen. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von Dreifachbestimmungen dar. Die Standardabweichung überschritt nicht 10% des Mittelwerts.
4 zeigt, dass die zur Stimulation der T-Zellen erforderlichen Spiegel, obgleich die maximalen Aktivierungsspiegel unter den drei unterschiedlichen Agonisten variierten, für Ig-PLP1 viel niedriger waren als für entweder freies PLP1 oder PLP. Das heißt, dass vom Ig-PLP1 wesentlich weniger benötigt wurde, um die Zelllinie zu stimulieren, als vom nativen PLP oder freien Peptid (in der Größenordnung von 1/100). Im Speziellen erforderte die Stimulation auf das halbmaximale Ausmaß weniger Ig-PLP1 (0,005 mM) als PLP (0,5 mM) oder PLP1-Peptid (0,6 mM). Diese Ergebnisse zeigen an, dass das PLP1-T-Zellen-Epitop durch Ig-PLP1 besser präsentiert wird als durch natives PLP oder durch synthetisches PLP1-Peptid. Obgleich das Plateau der IL-2-Produktion höher war, wenn der T-Zellen-Aktivator freies synthetisches PLP1-Peptid ist, erfordert es wesentlich höhere Agonistenspiegel, die in vivo über einen längeren Zeitraum schwer zu erlangen sein werden.
Ohne die Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken scheint es so zu sein, dass die Wirksamkeit von Ig-PLP1 bei der Peptidabgabe mit der FcR-vermittelten Internalisierung und dem Zugang zu neu synthetisierten MHC-Molekülen in Verbindung steht. Im Spezielleren scheint natives PLP durch einfache Flüssigphasen-Pinozytose eher ineffizient zu internalisieren, während freies PLP-1-Peptid einfach an leere MHC-Klasse-II-Moleküle an der Zelloberfläche zu binden scheint. Die ineffektive Präsentation dieser Formen von Autoantigen wird durch 4 eindeutig illustriert, die unzweifelhaft zeigt, dass Ig-PLP1 hinsichtlich Präsentation von PLP1-Peptid in Kombination mit MHC-Klasse-II-Molekülen effizienter als entweder freies Peptid oder natives Protein ist.
Beispiel VIII
Hemmung von T-Zellen-Aktivierung in vitro
Antagonismus von PLP1-, PLP- und Ig-PLP1-T-Zellen-Aktivierung durch Ig-PLP-LR wurde unter Verwendung eines vorgepulsten Proliferationstests nachgewiesen.
Bestrahlte (3.000 Rad) SJL-Splenozyten (als APCs verwendet) wurden in 96-Well-Platten mit rundem Boden (5 × 10⁵ Zellen/Well/50 ml) mit dem gewählten Agonisten (1 mM PLP1-Peptid, 0,05 mM Ig-PLP1 oder 7 mM PLP) und verschiedenen Konzentrationen von Antagonist (100 ml/Well) 1 Stunde lang inkubiert. Anschließend wurden 4E3-T-Zellen-Hybridome (5 × 10⁴ Zellen/Well/50 ml) zugegeben und die Kultivierung über Nacht fortgesetzt. IL-2-Produktion im Überstand, wie in Beispiel VI unter Verwendung von HT-2-Zellen bestimmt, wurde als Maß für die T-Zellen-Aktivierung verwendet. Die Ergebnisse dieses Tests sind in 5 gezeigt.
Im Spezielleren zeigen 5A, 5B und 5C den Antagonismus von freiem PLP1-Peptid (5A), chimärem Immunglobulin Ig-PLP1 (5B) bzw. nativem PLP (5C). Die Antagonisten waren Ig-PLP-LR (Quadrate) und PLP-LR (Kreise) mit Kontrollen von Ig-W (Rauten) und PLP2 (Dreiecke).
Bei Inkubation der APCs mit dem Agonisten, jedoch ohne Antagonist erhaltene cpm-Werte wurden als Kontroll-Thymidin-Inkorporation verwendet. Dieser Wert betrug 7.503 +/– 1.302 für Ig-PLP1; 31.089 +/– 3.860 für PLP1-Peptid; und 8.268 +/– 915 für PLP. Der cpm-Wert, der bei Inkubation der APCs ohne Agonist oder Antagonist erlangt wurde, wurde als Hintergrund (BG) verwendet. Dieser Wert betrug 1.560 +/– 323 für Ig-PLP1; 2.574 +/– 290 für PLP1-Peptid; und 2.127 +/– 177 für PLP. Die prozentuelle Kontroll-Thymidin-Inkorporation wurde wie folgt berechnet: [(in Gegenwart von Testantagonist erlangte cpm) – (BG)]/[(cpm-Wert der Kontroll-Thymidin-Inkorporation) – (BG)]. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von Dreifachbestimmungen dar.
Wie vorhin erörtert wurde, könnte die Potenz von Ig-PLP1-Chimären bei der Peptidbeladung auf MHC-Klasse-II-Moleküle den Verhältnissen der In-vivo-Autoimmunität ähneln, wo eine anhaltende Versorgung mit Antigen häufig eine reichliche Erzeugung von Selbst-Peptiden ermöglicht, was die T-Zellen aggressiv triggern kann. 5A (PLP1-Agonist) zeigt, dass mit Erhöhung der Konzentration von Ig-PLP-LR eine wesentliche Verminderung der II-2-Produktion auftrat, wenn T-Zellen mit APCs in Gegenwart von PLP1 sowie Ig-PLP-LR inkubiert wurden. Eine ähnliche Abnahme der IL-2-Produktion war offensichtlich, wenn das synthetische PLP-LR-Peptid während der T-Zellen-Aktivierung mit PLP1-Peptid verwendet wurde. Im Gegensatz dazu wurden antagonistische Wirkungen mit dem Kontroll-Ig-W-Immunglobulin und dem PLP2-Peptid nicht beobachtet. Die Hemmung der IL-2-Produktion auf die Hälfte des Maximalausmaßes (60% Kontroll-Thymidin-Inkorporation) erforderte nur 0,4 mM Ig-PLP-LR gegenüber 9 mM PLP-LR-Peptid, was auf eine effizientere Präsentation von und T-Zellen-Antagonismus durch Ig-PLP-LR hinweist.
Weitere Belege dafür, dass das chimäre Immunglobulin effizienter als das freie Peptid beim T-Zellen-Antagonismus ist, sind in 5B und 5C gezeigt. Im Speziellen zeigt 5B, dass Ig-PLP-LR die durch Ig-PLP1 vermittelte T-Zellen-Aktivierung hemmte, während freies PLP-LR wie das PLP2-Peptid als Negativkontrolle keinen signifikanten Antagonismus zeigte. Bezeichnenderweise zeigt 5B außerdem, dass Ig-W, das 91A3-Immunglobulin der Wildform, ohne jegliches exogene Peptid eine partiell hemmende Aktivität bei der Ig-PLP1-vermittelten T-Zellen-Aktivierung zeigt. Es wird angenommen, dass dies das Resultat der Konkurrenz um Bindung an FcR an den APCs sein könnte, da Ig-PLP1 und Ig-W identische konstante IgG2b-Regionen aufweisen. Ein Maximum von 50% Hemmung der IL-2-Produktion wurde beobachtet, wenn die Aktivierung von T-Zellen durch Ig-PLP1 in Gegenwart von Ig-W durchgeführt wurde. Folglich würde Ig-W mit Ig-PLP1 um FcR-Bindung und Internalisierung konkurrieren und dadurch die Aktivierung von T-Zellen vermindern. Das heißt, dass mit der Erhöhung der Konzentration von Ig-W weniger Ig-PLP1 an FcR binden und durch die APCs internalisiert wird, was in einer verminderten Präsentation und entsprechenden IL-2-Produktion resultiert. Es ist wichtig anzumerken, dass diese durch Ig-W vermittelte Herabsetzung der Reaktion nicht das Resultat antagonistischer Effekte ist, sondern einfach ein Resultat der Konkurrenz um FcR-Bindung. Das heißt, dass die präsentierten Ig-W-Epitope nicht TCR-Antagonisten für PLP1 sind und nicht mit den für PLP1 spezifischen TCRs wechselwirken.
Im Gegensatz zu 5B zeigt 5C, dass Ig-PLP-LR, nicht jedoch Ig-W die Aktivierung von T-Zellen durch natives PLP signifikant vermindert. Da es wahrscheinlich ist, dass Ig-W auf eine andere Weise als natives PLP internalisiert wird (Fc-Rezeptor gegenüber einfacher Flüssigphasen-Pinozytose), sollte es keinerlei direkte Konkurrenz für die Aufnahme und Prozessierung und daher keine Hemmung geben.
Der Einfachheit halber sind die in 5 gezeigten Resultate in der unten stehenden Tabelle 1 zusammengefasst. Wenn APCs mit PLP1-Peptid in Gegenwart von Ig-PLP-LR inkubiert wurden, gab es keine Aktivierung der PLP1-spezifischen T-Zellen-Hybridome (5a). Darüber hinaus nahm die IL-2-Produktion (d.h. T-Zellen-Aktivierung) mit Erhöhung von Ig-PLP-LR ab, wenn die Aktivierung von T-Zellen durch natives PLP und Ig-PLP1 in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Ig-PLP-LR durchgeführt wurde. Jedoch war freies PLP-LR-Peptid nicht fähig, die durch natives PLP oder Ig-PLP1 vermittelte Aktivierung von T-Zellen zu hemmen. Diese beiden Beweisführungen weisen darauf hin, dass der Hauptmechanismus für die durch Ig-PLP-LR vermittelte Inaktivierung von T-Zellen wahrscheinlich endozytische Präsentation und TCR-Antagonismus ist und nicht die direkte Blockade von MHC-Klasse-II-Molekülen auf der Zelloberfläche.
In der unten stehenden Tabelle bezeichnet ein Pluszeichen Hemmung von IL-2-Produktion und daher Antagonismus, während ein Minuszeichen wenig oder keine Hemmung von IL-2-Produktion und daher wenig oder keinen Antagonismus bezeichnet. Tabelle 1. Ig-PLP-LR- und PLP-LR-vermittelter T-Zellen-Antagonismus.
Die Ergebnisse des vorangehenden Beispiels zeigen an, dass die durch FcR vermittelte Aufnahme und anschließende Prozessierung eines Peptidantagonisten mit der effizienten Präsentation durch die Antigen-präsentierende Zellen kompatibel ist. Dies ist in Anbetracht des Stands der Wissenschaft äußerst unerwartet, der annimmt, dass die Abgabe von freien Peptidanaloga für einen effizienten Antagonismus durch direkte Konkurrenz um MHC- oder TCR-Bindungsstellen sorgt.
Beispiel IX
Charakterisierung des Mechanismus für den Antagonismus durch Ig-PLP-LR
Unter Anwendung eines Tests, der dem in Beispiel VIII ähnlich ist, wurde nachgewiesen, dass die Konkurrenz um direkte Bindung an den Fc-Rezeptor an sich und selbst kein wahrscheinlicher Mechanismus für den durch Ig-PLP-LR vermittelten Antagonismus ist.
SJL-Milz-APCs wurden mit nativem PLP (6,8 mM) in Gegenwart von 2 mM Ig-PLP2, Ig-PLP-LR oder Ig-W inkubiert und auf IL-2-Produktion durch ³H-Thymidin- Inkorporation unter Verwendung von HT-2-Zellen wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben getestet. Ig-PLP2 wurde wie in Beispiel II unter Verwendung der in Beispiel I ausführlich beschriebenen Sequenz hergestellt. Die prozentuelle Kontroll-Thymidin-Inkorporation wurde wie in Beispiel VIII berechnet. Ergebnisse des Tests sind in 6 gezeigt, worin jede Spalte den Mittelwert +/– SD von Dreifachbestimmungen darstellt.
Wie bei den in 5B gezeigten Ergebnissen unterstützt das vorliegende Beispiel die Auffassung, dass beides, die effiziente Präsentation an der MHC-Klasse-II-Struktur sowie ein wirksames Peptidanalogon, die signifikantesten Ergebnisse liefert. Das heißt, dass trotz Aufnahme und Prozessierung des chimären Ig-PLP2-Antikörpers die effiziente Präsentation des PLP2-Peptids durch I-A^S die Aktivierung der T-Zellen nicht ausschließt, da es kein Analogon des nativen PLP-Agonisten ist. Demgemäß ist es unwahrscheinlich, dass eine einfache Konkurrenzbindung an MHC-Klasse-II-Moleküle auf den Antigen-präsentierenden Zellen den gewünschten Antagonismus hervorruft.
Beispiel X
In-vivo-Induktion einer T-Zellen-Reaktion gegen PLP1
Durch dieses Beispiel ist bewiesen worden, dass zusätzlich zur Erzeugung einer T-Zellen-Reaktion in vitro (Beispiel VII) die chimären Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten, um eine zelluläre Reaktion in vivo zu erzeugen. Im Speziellen beweist das folgende Beispiel das In-vivo-Priming von PLP1-spezifischen T-Zellen durch Ig-PLP1.
Sechs bis acht Wochen alte SJL-Mäuse (H-2^S) wurden von Harlan Sprague Dawley (Frederick, MD) erworben und in einer Tierhaltungsanlage für die Dauer der Experimente gehalten.
Die Mäuse wurden subkutan in die Fußballen und an der Basis von Gliedmaßen und Schwanz immunisiert, und zwar mit 50 mg Ig-PLP1, das in 200. ml eines 1:1-Gemischs (Vol./Vol.) von PBS/CFA emulgiert war. Zehn Tage später wurden die Mäuse durch Halswirbeldislokation getötet, die Milzen und Lymphknoten (axillär, inguinal, popliteal und sakral) entfernt, Einzelzellsuspensionen hergestellt und die T-Zellen-Reaktionen gemessen. Die in 7 gezeigten Ergebnisse sind jene, die mit 4 × 10⁵ Lymphknotenzellen/Well (7A) und 10 × 10⁵ Milzzellen/Well (7B) erhalten wurden. Die Aktivatoren PLP1 und PLP2 wurden mit 15 mg/ml verwendet, und PPD wurde mit 5 mg/ml verwendet.
Wie bei den vorhergehenden Beispielen wurde die Aktivierung von T-Zellen unter Anwendung eines Proliferationstests festgestellt, der ³H-Thymidin-Inkorporation umfasst. Hier wurden Lymphknoten- und Milzzellen drei Tage lang in 96-Well-Platten mit rundem Boden gemeinsam mit 100 ml eines einzelnen ausgewählten Aktivators mit 4 bzw. 10 × 10⁵ Zellen/100 ml/Well inkubiert. Anschließend wurde 1 mCi ³H-Thymidin pro Well zugegeben und die Kultivierung für weitere 12-24 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden dann auf Glasfaserfiltern geerntet, und inkorporiertes ³H-Thymidin wurde unter Verwendung des „Trace-96"-Programms an einem Inotech-b-Counter gezählt. Ein Kontrollmedium ohne Stimulator war für jede Maus inbegriffen und als wurde als Hintergrund verwendet.
Jeder in 7 gezeigte Wert wurde wie in Beispiel VIII beschrieben berechnet und stellt den Mittelwert +/– SD von Dreifachbestimmungen nach Abzug von Hintergrundcpm-Werten dar, die ohne Aktivator in Medium erhalten wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn Mäuse mit 150 mg Ig-PLP pro Maus immunisiert wurden (nicht gezeigt).
7A und 7B zeigen eindeutig, dass bei subkutaner Injektion von Ig-PLP1 in die Fußballen und an der Basis von Gliedmaßen und Schwanz eine starke spezifische T-Zellen-Reaktion auf das PLP1-Peptid ausgelöst wurde. Obgleich eine gewisse Variation hinsichtlich der Stärke der Reaktion unter einzelnen Mäusen bestand, produzierten die Lymphknoten- und Milzzellen jeder Maus eine signifikante Reaktion nach Exposition mit dem PLP1-Peptid. Interessanterweise gibt es eine signifikante PLP1-spezifische Reaktion, die in der Milz nachgewiesen wurde, einem Organ, das hauptsächlich systemische Antigene filtriert und darauf reagiert. Eine der Möglichkeiten, die eingebracht werden kann, um diese Ergebnisse zu erklären, ist, dass Ig-PLP1 aufgrund seiner langen Halbwertszeit fähig war, zu zirkulieren und den Lymph- und Blutkreislauf zu erreichen und folglich an systemischen sowie lymphatischen Stellen präsentiert wurde. Dies ist für die Implementierung therapeutischer Regime für Autoimmunstörungen möglicherweise sehr vorteilhaft. Es war außerdem interessant, dass manche Mäuse Proliferation zeigen, wenn die Zellen mit PLP2-Peptid in vitro stimuliert werden. Die Tatsache, dass dieses Peptid durch I-A^S wie PLP1 präsentiert wird, ermöglicht es vielleicht Zellen, mit niedriger Affinität zu binden und eine Reaktion zu erzeugen. Jedenfalls stehen die Ergebnisse im Einklang mit jenen, die durch die früheren Beispiele bereitgestellt werden, wo gezeigt worden ist, dass Ig-PLP1 darin effizient war, das Peptid den T-Zellen in vitro zu präsentieren.
Beispiel XI
In-vivo-Hemmung einer T-Zellen-Reaktion auf PLP1
Wie im vorhergehenden Beispiel zu sehen war, ist Ig-PLP1 fähig, T-Zellen in vivo zu primen, und erzeugt bei Exposition mit dem Agonistenpeptid PLP1 eine potente Immunreaktion. Dieses Beispiel beweist, dass die Verabreichung eines Peptidantagonisten in Form eines chimären Antikörper-Immunomodulators die durch die endozytische Präsentation eines Agonistenliganden erzeugte Immunreaktion wesentlich vermindert. Im Speziellen beweist dieses Beispiel, dass die gemeinsame Verabreichung von Ig-PLP-LR mit Ig-PLP1 die Immunreaktion auf PLP1-Peptid signifikant vermindert.
Mäuse wurden mit Gemischen von entweder 50 mg Ig-PLP1 und 150 mg Ig-PLP-LR oder 50 mg Ig-PLP1 kombiniert mit 150 mg Ig-W coimmunisiert. Insbesondere wurden einzelne Mäuse aus drei Gruppen (4 Mäuse pro Gruppe) subkutan wie in Bei spiel X mit 200 ml Gemisch (PBS/CFA, 1:1 Vol./Vol.) injiziert, das eines der folgenden Gemische enthielt: 50 mg Ig-PLP1 und 150 mg Ig-PLP-LR; 50 mg Ig-PLP1 und 150 mg Ig-W; oder Ig-PLP1 und 100 mg PLP-LR-Peptid. Milz- und Lymphknoten-T-Zellen-Reaktionen wurden am Tag 10 nach der Immunisierung unter Anwendung des in Beispiel X dargelegten Protokolls analysiert. Die Lymphknotenzellen wurden mit 4 × 10⁵ Zellen/Well getestet und die Milzzellen bei 10 × 10⁵ Zellen/Well. Der Agonistenligand war PLP1 mit 15 mg/ml. Ergebnisse für die Lymphknoten- und Milzzellen, gezeigt in 8A bzw. 8B und zusammengefasst in unten stehender Tabelle 2, stellen den Mittelwert +/– SD aus Dreifachbestimmungen nach Abzug der ohne Agonist im Medium erhaltenen Hintergrund-cpm-Werte dar.
8A und 8B zeigen, dass es, obgleich Ig-PLP1 effizient präsentiert wurde und eine starke In-vivo-T-Zellen-Reaktion induzierte (Beispiel X), möglich war, eine derartige Reaktion durch Aufnehmen von Ig-PLP-LR in das an Mäuse verabreichte Gemisch zu antagonisieren. In der Tat war bei gemeinsamer Verabreichung von Ig-PLP1 mit Ig-PLP-LR an Mäuse die anschließende Immunreaktion auf freies PLP1-Peptid deutlich vermindert, wie in der rechten Hälfte der 8A und 8B gezeigt ist. Es scheint so zu sein, dass die niedrige PLP1-Reaktion für das Milz- sowie Lymphknotengewebe ein Resultat des PLP-LR-Antagonismus war, da die gemeinsame Verabreichung mit Ig-PLP1 des Antikörpers der Wildform, Ig-W, die T-Zellen-Reaktion nicht signifikant vermindert. Diese Ergebnisse sind ein starker Hinweis darauf, dass es die effiziente In-vivo-Präsentation von PLP-LR über die FcR-Bindung und endozytische Prozessierung von Ig-PLP-LR ist, die für die verminderte zelluläre Reaktion verantwortlich ist.
Wie in der unten stehenden Tabelle 2 zu erkennen ist, gab es darüber hinaus keine Anzeichen einer Verminderung der PLP1-Reaktion, wenn freies PLP-LR-Peptid zusammen mit Ig-PLP1 verabreicht wurde. Die in der Tabelle bereitgestellten Zahlen stellen die Prozentwerte von PLP1-spezifischer Proliferation relativ zur PPD-spezifischen Proliferation bereit und wurden wie folgt hergeleitet: (mittlere cpm-Werte aus Dreifachbestimmungen, die mit PLP1-Stimulation erlangt wurden – mittlere cpm- Werte Dreifachbestimmungen BG)/(mittlere cpm-Werte aus Dreifachbestimmungen, die mit PPD erlangt wurden – mittlere cpm-Werte Dreifachbestimmungen BG) × 100. Tabelle 2. Ig-PLP-LR, nicht jedoch freies PLP-LR-Peptid, vermittelt T-Zellen-Antagonismus in vitro.
Die obigen Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die gemeinsame Verabreichung des freien Antagonistenpeptids oder der Kontrolle Ig-W, dem ein Antagonistenpeptid fehlt, kaum eine Wirkung auf die erzeugte Immunreaktion aufweist. Das Fehlen von Antagonistenwirkung durch freies PLP-IR-Peptid war nicht auf eine niedrigere Nettomenge des injizierten Peptids zurückzuführen, da den Mäusen ungefähr um das 34fache mehr PLP-LR in der freien Peptidform als in der Ig-PLPLR-Form verabreicht wurde (auf Basis eines Molekulargewichts von 150.000 D entsprechen die 150 μg des den Mäusen verabreichten Ig-PLP-LR 1 nmol Ig, das 2 nmol PLP-LR-Peptid enthält, während die 100 μg freies PLP-LR-Peptid mit einem Molekulargewicht von 1.468 Dalton 68 nmol Peptid entsprechen). Die Unfähigkeit des PLP-LR-Peptids, die durch Ig-PLP1 vermittelte T-Zellen-Aktivierung zu hemmen, zusammen mit der Leistungsfähigkeit von Ig-PLP-LR, die T-Zellen-Stimulation durch Ig-PLP1 zu antagonisieren, unterstützt die Annahme, dass der durch Ig-PLP-LR vermittelte In-vivo-Antagonismus wahrscheinlich mit effizienter Präsentation in Beziehung steht.
Beispiel XII
Induktion einer T-Zellen-Reaktion auf einen endozytisch präsentierten Antagonisten
Vorhergehende Beispiele haben gezeigt, dass die Verabreichung von chimären Antikörpern, die einen Agonistenliganden umfassen, Immunzellen in vivo primen können. Es ist außerdem gezeigt worden, dass die Verabreichung eines chimären Antikörpers, der einen Antagonisten umfasst, eine anschließende Reaktion auf Exposition durch einen Agonistenliganden vermindern kann. Dieses Beispiel beweist, dass die effiziente Präsentation eines Antagonisten Immunzellen in vivo primen und eine starke Reaktion aufbauen kann, die die Reaktion der T-Zellen auf ein Agonistenpeptid bewirken könnte. Im Speziellen entwickeln Mäuse, denen Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR gemeinsam verabreicht wurde, eine relativ hohe proliferative Reaktion auf PLP-LR und praktisch keine Reaktion auf PLP1-Peptid.
Lymphknoten- und Milzzellen wurden in derselben Weise wie in Beispiel X dargelegt nach gemeinsamer Verabreichung von Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR erlangt. Proliferative Reaktionen in einzelnen Mäusen wurden ebenfalls unter Anwendung der im vorhergehenden Beispiel dargelegten Verfahren nach In-vitro-Stimulation mit entweder freiem PLP1-Peptid oder PLP-LR-Peptid bei 15 μg/ml gemessen. Die Ergebnisse der Tests unter Verwendung von Lymphknoten- und Milzzellen sind in 9A bzw. 9B ausführlich dargestellt.
Wie aus 9 ersichtlich ist, entwickelten Milz sowie Lymphknoten Reaktionen auf den Antagonisten PLP-LR, nicht jedoch auf den PLP-Agonisten PLP1. Im Wissen, dass Ig-PLP-LR PLP-LR-spezifische T-Zellen induzierte, wenn es zusammen mit Ig-PLP1 verabreicht wurde, kann gemutmaßt werden, dass diese PLP-LR-spezifischen T-Zellen PLP1-spezifische T-Zellen herabregulieren. Obgleich eine Induktion von PLP-LR-spezifischer Reaktion auftrat, wenn freies PLP-LR-Peptid mit Ig-PLP1 verabreicht wurde (nicht gezeigt), trat keine offensichtliche Verminderung der proliferativen Reaktion auf PLP1 auf. Demgemäß beweist der im vorliegenden Beispiel dargelegte Datensatz, dass die Verwendung von chimären Antikörpern, die einen Antagonisten umfassen, zur Modulation der Immunreaktion auf einen Antigenagonisten viel wirksamer sind als der freie Peptidantagonist.
Im Spezielleren scheint es in Anbetracht der vorangehenden Beispiele so zu sein, dass die TCR-Beteiligung an PLP-LR-I-A^S-Komplexen (d.h. MHC-PLP-LR-Komplexen) auf der Oberfläche von APCs T-Zellen eher antagonisiert als stimuliert. Demgemäß könnte Antagonismus durch Ig-PLPLR auftreten, weil die effiziente Präsentation von Ig-PLP-LR in endozytischen Vakuolen gewährleistet, dass signifikante Ausmaße an PLP-LR-I-A^S-Komplexen (Antagonistenkomplexen) erzeugt werden. Die Menge an Komplexen auf der Zelloberfläche ist proportional der Menge des den APCs angebotenen Ig-PLP-LR. Wenn PLP1-Stimulation in Gegenwart von Ig-PLP-LR durchgeführt wird, sind PLP-LR-I-A^S und PLP1-I-A^S auf der Oberfläche einer gegebenen APC vorhanden, wobei eine Erhöhung der Konzentration von Ig-PLP-LR zu einer höheren Anzahl an PLP-LR-I-A^S-Komplexen führt. Es ist anzuerkennen, dass ungefähr 3.500 TCR betätigt werden müssen, um eine T-Zelle zu aktivieren, und dass ein vorhandener Komplex von MHC-Klasse-II-Peptidkomplex hintereinander ungefähr 200 TCRs betätigt. An sich scheint es so zu sein, dass eine T-Zelle antagonisiert wird, wenn die TCR-Betätigung mit PLP-LR-I-A^S-Komplexen die Betätigung mit dem Agonisten PLP1-I-A^S aufhebt. Insgesamt wird T-Zellen-Antagonismus wegen der effizienten Beladung von PLP-LR durch Ig-PLP-LR durch eine höhere Häufigkeit des fortlaufenden Triggerns von TCR durch PLP-LR-I-A^S-Komplexe erzielt. Das heißt, dass die effiziente Aufnahme und Prozessierung von Ig-PLP-LR einfach bedeutet, dass zu viele der Oberflächen-MHC-Komplexe den PLP-LR-Antagonisten präsentieren, um es den verbleibenden, den PLP1-Agonistenliganden präsentierenden Oberflächenkomplexen zu ermöglichen, die Anzahl der TCRs zur Aktivierung der T-Zellen zu betätigen. Daher werden die T-Zellen nicht aktiviert, solange der Antagonist in einer Rate präsentiert wird, die gewährleistet, dass die Aktivierungskonzentration von MHC-Klasse-II-Agonistenkomplexen auf der APC nicht erreicht wird.
Beispiel XIII
Proliferative Reaktionen von Lymphknoten auf Immunisierung mit Ig-PLP-Chimären
Proliferative Reaktionen wurden in mit einzelnen Ig-PLP-Chimären oder variierenden Gemischen von Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR immunisierten Mäusen gemessen. Es wurde beobachtet, dass die alleinige Verabreichung von Ig-PLP-LR an Mäuse T-Zellen induzierte, die wie jene durch Ig-PLP1 induzierten mit PLP1- sowie PLP-LR-Peptiden kreuzreagierten. Überraschenderweise zeigten die Chimären jedoch trotz der Kreuzreaktivität der Reaktionen bei gemeinsamer Verabreichung einen dosisabhängigen Antagonismus zueinander, die in der Herabregulation beider T-Zellen-Reaktionen resultierte. Schließlich waren antigenspezifische T-Zellen, die entweder durch Ig-PLP-1 oder IG-PLP-LR induziert wurden, unempfänglich für Herabregulation durch Peptidgemische und proliferierten signifikant, wenn sie gleichzeitig mit PLP1 und PLP-LR in vitro stimuliert wurden. Diese Befunde zeigen an, dass Agonisten- sowie Antagonistenpeptide ungünstige Reaktionen aufeinander ausüben, und offenbaren einen antiparallelen Antagonismus und eine stringente Kontrolle der TCR-Triggerung auf dem Niveau naiver T-Zellen.
Beschaffung von Materialien und Immunisierung von Mäusen erfolgten wie oben beschrieben. Proliferative Reaktionen wurden durch Thymidin-Inkorporation wie im obigen Beispiel VI dargelegt gemessen. Lymphknoten- und Milzzellen wurden in derselben Weise wie im Beispiel X dargelegt nach gemeinsamer Verabreichung von Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR erlangt. Mäuse wurden mit 50 μg Ig-PLP1 (10A), 50 μg Ig-PLP-LR (10B), 100 μg PLP1 (10C) oder 100 μg PLP-LR (10D) in CFA injiziert, und 10 Tage später wurden die Lymphknotenzellen in vitro mit den angegebenen freien Pepiden stimuliert. Die Stimulatoren PLP1, PLP-LR und PLP2 wurden bei der definierten optimalen Konzentration von 15 μg/ml verwendet.
Die in 10A-10D illustrierten Daten zeigen an, dass Ig-PLP1 wie PLP1-Peptid eine spezifische T-Zellen-Reaktion auf PLP1-Peptid induzierte. Gleichermaßen indu zierte Ig-PLP-LR wie PLP-LR-Peptid eine spezifische T-Zellen-Reaktion auf PLP-LR-Peptid. Weder die Ig-Chimären noch die freien Peptide induzierten T-Zellen, die signifikant mit der Negativkontrolle PLP2 reagierten, einem Peptid, das auch durch I-A^S-Klasse-II-Moleküle präsentiert wird. Überraschenderweise kreuzreagierte die durch Ig-PLP1 induzierte Reaktion mit PLP-LR-Peptid, während die durch Ig-PLP-LR induzierte Reaktion mit PLP1 kreuzreagierte. Die mit freiem PLP1 oder freiem PLP-LR induzierten Reaktionen waren nicht kreuzreaktiv.
Beispiel XIV
Proliferative Reaktion von Lymghknoten-T-Zellen auf Coimmunisierung mit Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR
Mäuse wurden mit den angegebenen Chimären immunisiert, und 10 Tage später wurden die Lymphknoten in vitro mit freien Peptiden stimuliert und auf Proliferation mittels [³H]-Thymidin-Inkorporation wie oben beschrieben getestet. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt.
Die Zahl, die der Ig-Chimären-Bezeichnung vorangeht, bezeichnet die pro Maus injizierte Menge in μg. Die Stimulatoren waren PPD, 5 μg/ml; PLP 1, PLP-LR und PLP2 mit 15 μg/ml. Ohne Stimulatoren inkubierte Zellen wurden als Hintergrund (BG) verwendet. Die Mäuse wurden einzeln getestet, und es wurden Wells in dreifacher Ausführung für jeden Stimulator getestet. Um die Ergebnisse zu standardisieren und die innewohnende individuelle Variabilität zu eliminieren, drückten die Erfinder die Ergebnisse als relative Proliferation aus, die wie folgt abgeschätzt wurde: (Mittlerer cpm-Wert des Testpeptids – mittlerer cpm-Wert BG)/(mittlerer cpm-Wert PPD – mittlerer cpm-Wert BG). Die angegebene relative Proliferation stellt der Mittelwert +/– SD von 5 einzeln getesteten Mäusen dar. Die mittleren cpm-Werte +/– SD, die mit PPD-Stimulation für die verschiedenen Gruppen von Mäusen erlangt wurden, waren die folgenden: 50 μg Ig-PLP1: 16.413 +/– 1.330; 50 μg Ig-PLP-LR: 11.224 +/– 3.481; 50 μg Ig-W: 11.513 +/– 1.572; 50 μg Ig-PLP1 + 50 μg Ig-PLP-LR: 16.817 +/– 2.869; 50 μg Ig-PLP1 + 150 μg Ig-PLP-LR: 16.156 +/– 2.006; 50 μg Ig-PLP1 + 150 μg Ig-W: 11.699 +/– 1.142; 50 μg Ig-PLP-LR + 150 μg Ig-W: 13.435 +/– 1.650; 50 μg Ig-PLP1 + 50 μg Ig-PLP2: 10.056 +/– 1.407; und 50 μg Ig-PLP-LR + 50 μg Ig-PLP2: 10.877 +/– 563. Volle und schraffierte Balken bezeichnen Proliferation auf PLP1 bzw. PLP-LR. Die Proliferation auf PLP2-Peptid entsprach Hintergrundausmaßen, außer wo Ig-PLP2 im Immunisierungsgemisch verwendet wurde.
Wie in 11 zu erkennen ist, proliferierten Lymphknoten-T-Zellen aus einer Gruppe von Mäusen, die mit Ig-PLP1 immunisiert wurden, gleich gut auf PLP1 und auf PLP-LR, wogegen Ig-W-Kontrolle kaum eine Reaktion bewirkte. Überraschenderweise befand sich die PLP-LR-Reaktion auf dem Niveau des Hintergrunds. Demgemäß bewirkte das Gemisch eine Herabregulation und keine additiven Reaktionen, obgleich die Reaktionen auf die Ig-Chimären Kreuzreaktivität zwischen PLP1- und PLP-LR-Peptiden aufweisen. In der Tat legen die Daten eine antiparallele Herabregulation zwischen Ig-PLP1 (Agonist) und Ig-PLP-LR (Antagonist) nahe. Diese Herabregulation schien dosisabhängig zu sein, da Mäuse, die mit einem Gemisch aus 50 μg Ig-PLP1 und 150 μg Ig-PLP-LR injiziert wurden, keine Reaktion auf PLP1 zeigten und Reaktionen gegen PLP-LR aufbauten, die auf Ausmaße vermindert war, die bei mit Ig-PLP1 alleine injizierten Mäusen beobachtet wurde.
Eine der möglichen Erklärungen für die beobachtete entgegengesetzte Herabregulation zwischen IG-PLP1 und Ig-PLP-LR ist, dass klonale Expansion ein optimales fortlaufendes Triggern mit einem homogenen Peptid erfordert (d.h. dass alle oder die meisten Rezeptoren auf einer einzelnen naiven T-Zelle einen Typ von Protein betätigen müssen, um zu expandieren). Die simultane Stimulation naiver T-Zellen mit Peptiden, die geringfügige Unterschiede an den TCR-Kontaktresten umfassen, die während der Gemische aus Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR umfassenden Immunisierungen auftreten kann, bewirkt keine T-Zellen-Expansion und In-vitro-Proliferation.
Beispiel XV
Proliferative Milz-T-Zellen-Reaktionen von Mäusen, die mit Ig-PLP1 und IG-PLP-LR co-immunisiert wurden
Wie in 12 gezeigt ist, wurden Milzellen aus den in Beispiel XIV beschriebenen Mäusen mit PLP1 (volle Balken) und PLP-LR (schraffierte Balken) in Wells in dreifacher Ausführung stimuliert, und die Proliferation wurde wie oben gemessen. Die Ergebnisse wurden wie oben unter Verwendung der mit Lymphknoten-T-Zellen erlangten PPD-cpm standardisiert, da die Proliferation von Milzzellen nach Stimulation mit PPD minimal war. Die angegebene relative Proliferation stellt den Mittelwert +/– SD von 5 einzeln getesteten Mäusen dar.
Milz-T-Zellen aus diesen Mäusen reagierten nicht auf PLP-LR-Stimulation. Wenn jedoch eine zusätzliche Gruppe von Mäusen mit Ig-PLP-LR immunisiert wurde, proliferierten Lymphknoten- und Milzzellen auf PLP1 sowie auf PLP-LR-Peptid. In der Milz wurden additive Reaktionen nach wie vor nicht beobachtet, obgleich die proliferativen Reaktionen viel niedriger als in den Lymphknoten waren. Stattdessen wurde eine gegensätzliche herabregulierende Wirkung zwischen Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR beobachtet. Obgleich die Co-Injektion von Ig-W mit entweder Ig-PLP1 oder Ig-PLP-LR keine der Reaktionen beeinflusste, erhöhte die Coinjektion von Ig-PLP2 mit Ig-PLP1 die Reaktivität auf PLP-LR unter den durch Ig-PLP1 induzierten Zellen.
Beispiel XVI
IL-2-Produktion durch Milzzellen von mit Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR coimmunisierten Mäusen
Um die gegensätzliche Herabregulation zwischen Ig-PLP-1 und Ig-PLP-LR weiter zu untersuchen, wurden Milzantigen-induzierte Cytokin-Reaktionen in Tieren gemessen, die entweder mit einer einzelnen oder mit beiden Ig-Chimären immunisiert waren.
Wie in 13 gezeigt ist, wurden Milzzellen (1 × 10⁶ pro Well) aus den in Beispiel XIV beschriebenen Mäusen mit PLP1 (volle Balken) und PLP-LR (schraffierte Balken) 24 Stunden lang stimuliert. Die Produktion von IL-2 (13A), IFNγ (13B) und IL-4 (13C) wurde wie unten dargelegt gemessen.
Zellen wurden in 96-Well-Platten mit rundem Boden mit 10 × 10⁵ Zellen/100 μl/Well mit 100 μl Stimulator wie oben 24 Stunden lang inkubiert. Cytokin-Produktion wurde mittels ELISA nach den Anweisungen von Pharmingen unter Verwendung von 100 μl Kulturüberstand gemessen. Einfang-Antikörper waren Ratten-Anti-Maus-IL-2, JES6-IAI2; Ratten-Anti-Maus-IL-4, 11 B11; Ratten-Anti-Maus-IFNγ, R4-6A2; und Ratten-Anti-Maus-IL10, JES5-2A5. Biotinylierte Anti-Cytokin-Antikörper waren Ratten-Anti-Maus-IL-2, JES6-5H4; Ratten-Anti-Maus-IL-4, BVD6-24G2; Ratten-Anti-Maus-IFNγ, XMG 12; und Ratten-Anti-Maus-IL-10, JES5-16E3. Die OD405 wurde an einem Spec-340-Zählgerät (Molecular Devices) unter Verwendung der Software SOH MAX PRO, Version 1.2.0, gemessen. Abgestufte Mengen von rekombinantem IL-2, IL-4, IFNγ und IL-10 aus der Maus waren in allen Experimenten mit inbegriffen, um Standardkurven zu erstellen. Die Konzentration von Cytokinen in Kulturüberständen wurde durch Extrapolation aus dem linearen Abschnitt der Standardkurve abgeschätzt. Ohne Stimulator inkubierte Zellen wurden als Hintergrund (BG) verwendet. Jede Maus wurde einzeln in Wells in dreifacher Ausführung für jeden Stimulator getestet, und die angegebenen cpm-Werte stellen den Mittelwert +/– SD nach Abzug der BG-cpm dar. Produktion von IL-10 wurde ebenfalls gemessen, jedoch lagen die Resultate auf Hintergrundniveau (nicht gezeigt).
Nach In-vitro-Stimulation mit PLP1-Peptid produzierten T-Zellen aus Ig-PLP1-immunisierten Mäusen IL-2, IFNγ und kleine Mengen IL-4. Jedoch lieferte die Stimulation derselben Zellen mit PLP-LR minimales IL-2 und nicht nachweisbares IFNγ oder IL-4. Milzzellen aus Ig-PLP-LR-immunisierten Mäusen erzeugten IL-2, nicht jedoch IFNγ oder IL-4 nach Stimulation mit PLP1-Peptid. Darüber hinaus produzierte die PLP-LR-Stimulation eine nur minimale IL-2-Reaktion. In Mäusen, die mit gleichen Mengen Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR immunisiert worden waren, war die gesamte Cyto kin-Produktion nach Stimulation mit irgendeinem der Peptide auf minimale oder Hintergrundausmaße herabgesetzt. Die Coimmunisierung von Ig-W mit irgendeiner der Chimären hatte keine messbare Wirkung auf das Cytokin-Produktionsmuster. Wenn den Tieren ein 3:1-Verhältnis von Ig-PLP-LR:Ig-PLP1 verabreicht wurde, waren signifikante Mengen an IL-4 und IFNγ nach Stimulation mit PLP-LR-Peptid offenkundig, obwohl die proliferativen Milz-Reaktionen und IL-2-Produktion auf Hintergrundniveau lagen. Folglich könnten der Überschuss von Ig-PLP-LR zu einem gemischten, jedoch PLP-LR-dominanten TCR-Triggering führen, das Zellen induziert, die zur Produktion von Cytokin fähig sind, die jedoch keine proliferative Reaktion zeigen. Diese Daten weisen darauf hin, dass Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR ungünstige Reaktionen aufeinander ausübten, was zur Herabregulation beider T-Zellen-Reaktionen führt.
Beispiel XVII
Proliferation von Antigen-erfahrenen T-Zellen nach In-vitro-Stimulation mit Gemischen aus PLP1- und PLP-LR-Peptiden
Um zu untersuchen, ob Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR ungünstige Reaktionen aufeinander auf der Ebene Antigen-erfahrener, kreuzreaktiver T-Zellen zeigen könnten, wurden Mäuse mit Ig-PLP1 oder Ig-PLP-LR alleine immunisiert und auf proliferative T-Zellen-Reaktionen nach In-vitro-Stimulation mit variierenden Gemischen aus freien PLP1- und PLP-LR-Peptiden bewertet.
Im Spezielleren wurden Mäuse (4 pro Gruppe) mit 50 μg Ig-PLP1 (14A und 14B) oder 50 μg Ig-PLP-LR (14C und 14D) in CFA immunisiert, und 10 Tage später wurden die Lymphknoten- (14A und 14C) und Milz- (14B und 14D) Zellen mit den angegebenen Peptiden stimuliert und auf [³H]Thymidin-Inkorporation wie oben getestet. Die der Peptidbezeichnung vorangehende Zahl bezeichnet die zur In-vitro-Stimulation verwendete Menge in μg/ml. Die spezifische Proliferation wurde durch Abziehen des mittleren BG-cpm-Werts (erhalten durch Inkubieren von Zellen ohne Stimulator) vom cpm-Wert der Testprobe erhalten. Die angegebenen cpm-Werte stellen den Mittelwert +/– SD von 4 einzeln getesteten Mäusen dar. ND, nicht ermittelt.
Wie in 14A-14D zu sehen ist, proliferierten Lymphknoten- sowie Milzzellen aus mit Ig-PLP1 oder Ig-PLP-LR immunisierten Mäusen gleich gut auf Stimulation mit einem einzelnen Peptid wie auf ein Gemisch von PLP1 und PLP-LR. Die proliferative Reaktion auf das Gemisch war in den meisten Fällen sogar höher als die Reaktion auf Stimulation mit einem einzelnen Peptid.
Beispiel XVIII
IL-2-Produktion durch Antigen-erfahrene T-Zellen nach In-vitro-Stimulation mit PLP1/PLP-LR-Peptidgemischen
Um zu untersuchen, ob Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR ungünstige Reaktionen aufeinander auf der Ebene Antigen-erfahrener, kreuzreaktiver T-Zellen zeigen könnten, wurden Mäuse mit Ig-PLP1 oder Ig-PLP-LR alleine immunisiert und auf Cytokin-Reaktionen nach In-vitro-Stimulation mit variierenden Gemischen aus freien PLP1- und PLP-LR-Peptiden bewertet. Die Ergebnisse sind in 15A und 15B gezeigt.
Milzzellen aus mit Ig-PLP1 (15A) und Ig-PLP-LR (15B) immunisierten Mäusen wurden mit den angegebenen Peptiden stimuliert und auf IL-2-Produktion mittels ELISA wie in Beispiel XVI getestet. Die in diesen Experimenten verwendeten Milzzellen waren aus den in Beispiel XVII beschriebenen Mäusen. Die dem Namen des Peptids vorangehende Zahl stellt die zur Stimulation verwendete Menge in μg/ml dar. Die angegebenen μg/ml-IL-2-Werte stellen den Mittelwert +/– SD von 4 einzeln getesteten Mäusen dar.
Wie Beispiel XVII anzeigte, war die Produktion von IL-2 nach Stimulation von Milzzellen mit variierenden Gemischen aus PLP1 und PLP-LR nicht vermindert. Im Gegenteil war in den meisten Fällen der Stimulation mit Peptidgemisch die IL-2-Produktion höher als bei Stimulation mit einem einzigen Peptid. Wiederum weisen diese Befunde darauf hin, dass Agonisten- sowie Antagonistenpeptide ungünstige Reaktionen aufeinander ausüben, und offenbaren einen antiparallelen Antagonismus und eine stringente Kontrolle der TCR-Triggerung auf dem Niveau naiver T-Zellen.
Zusätzlich zur Verwendung von Immunomodulatoren, die T-Zellen-Rezeptor-Antagonisten und -Agonisten für die Abschwächung adulter Immunreaktionen umfassen, könnten dieselben Zusammensetzungen vorteilhaft zur Induktion von Toleranz in Neugeborenen und Säuglingen verwendet werden, wie in den folgenden Beispielen bewiesen wird.
Beispiel XIX
SJL/J-Mäuse, denen bei der Geburt Ig-PLP1 injiziert wurde, widerstehen der Induktion von EAE während des adulten Lebens
Um die Vorteile der Inokulation von Neugeborenen oder Säuglingen mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nachzuweisen, wurden neugeborenen Mäusen die hierin beschriebenen Immunomodulatoren verabreicht, worauf sie Mitteln zur Induktion eines Autoimmunleidens ausgesetzt wurden.
Im Spezielleren wurden neugeborenen Mäusen (10 Mäuse pro Gruppe) 100 μl affinitätschromatographisch gereinigtes Ig-PLP1 oder Ig-W innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt injiziert, und sie wurden im Alter von 7 Wochen mit freiem PLP1-Peptid auf EAE induziert. Die Mäuse wurden täglich auf klinische Anzeichen wir folgt bewertet: 0, keine klinischen Anzeichen; 1, Verlust des Schwanztonus; 2, Hinterextremitätenschwäche; 3, Hinterextremitätenparalyse; 4, Vorderextremitätenparalyse; 5, sterbend oder Tod. Tafel A zeigt die mittlere klinische Bewertung aller Mäuse, und Tafel B zeigt nur die mittlere Bewertung der überlebenden Tiere. EAE wurde durch subkutane Injektion in die Fußballen und an der Basis von Extremitäten und Schwanz mit 200 μl einer IFA/PBS- (1 Vol./1 Vol.) Lösung induziert, die 100 μg frei es PLP1-Peptid und 200 μg M. tuberculosis H37Ra enthielt. Sechs Stunden später wurden 5 × 10⁹ inaktivierter B. pertussis intravenös verabreicht. Nach 48 Stunden wurde den Mäusen weitere 5 × 10⁹ inaktivierter B. pertussis verabreicht.
Wie aus 16A und 16B ersichtlich ist, widerstanden Mäuse, die Ig-PLP1 in Salzlösung bei der Geburt erhielten, der Induktion von EAE durch freies PLP1-Peptid. In der Tat waren die klinischen Bewertungen bei diesen Mäusen viel weniger schwerwiegend als bei Tieren, die Ig-W, das elterliche Ig der Wildform ohne jegliches PLP-Peptid, erhielten. Außerdem zeigten Mäuse, denen Ig-PLP1 injiziert wurde, im Gegensatz zu jenen Mäusen, die Ig-W erhielten, keine Rückfälle (16B).
Beispiel XX
In-vivo-Präsentation von Ig-PLP1 durch neonatale Antigen-präsentierende Thymus- und Milzzellen
Um die in Beispiel XIX beobachteten klinischen Ergebnisse zu bestätigen, wurden Cytokin-Reaktionen in neugeborenen Mäusen gemessen. Die erhaltenen Daten sind in 17 gezeigt.
Im Speziellen wurden neugeborenen Mäusen (5 Mäuse pro Gruppe) 100 μg Ig-PLP1 oder Ig-W innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt injiziert. Zwei Tage später wurde die Mäuse getötet, und gepoolte Thymus- (17A) und Milz- (17B) Zellen wurden bestrahlt und als APCs für die Stimulation des PLP1-spezifischen T-Zellen-Hybridoms 4E3 wie oben beschrieben verwendet. Die Produktion von IL-2 im Überstand, die als Maß der T-Zellen-Aktivierung verwendet wurde, wurde unter Verwendung der IL-2-abhängigen HT-2-Zelllinie wie von Kuchroo et al., J. Immunol. 153, 3326 (1994), beschrieben ermittelt. Die angegebenen cpm-Werte stellen den Mittelwert +/– SD von Dreifachbestimmungen dar.
Das verabreichte Ig-PLP1 wurde von neonatalen APCs wirksam präsentiert. Sowohl Thymus- (17A) als auch Milz- (17B) APCs aus neonatalen Empfängern von IG-PLP1 aktivierten ein für PLP1-Peptid spezifisches T-Zellen-Hybridom ohne Zusatz von exogenem Antigen. APCs aus neonatalen Empfängern von Ig-W waren nicht in der Lage, T-Zellen-Hybridome zu aktivieren.
Beispiel XXI
Verminderte proliferative Milz-T-Zellen-Reaktion in Mäusen, die bei der Geburt Ig-PLP1 erhielten
Um die in den vorhergehenden beiden Beispielen beobachteten Resultate weiter zu bestätigen, wurden proliferative Reaktionen in bei der Geburt mit einem Immunomodulator inokulierten Mäusen gemessen. Die Ergebnisse sind in 18A und 18B gezeigt.
Neugeborenen wurden intraperitoneal (i.p.) innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt 100 μg Ig-PLP1 oder Ig-W in Salzlösung injiziert. Nachdem die Mäuse ein Alter von 7 Wochen erreicht hatten, wurden sie mit 100 μg freiem PLP1-Peptid in 200 μl CFA/PBS (1 Vol./1 Vol.) s.c. in die Fußballen und an der Basis von Extremitäten und Schwanz immunisiert. Zehn Tage später wurden die Mäuse getötet, und (18A) die Lymphknoten- (0,4 × 10⁶ Zellen/Well) und (18B) die Milz- (1 × 10⁶ Zellen/Well) Zellen wurden in vitro stimuliert, und zwar für vier Tage mit 15 μg/ml freiem PLP1 oder PLP2, einem Negativkontrollpeptid, das der Enzephalitis bewirkenden Sequenz 178-191 von PLP (13) entspricht. Ein μCi/Well [³H]Thymidin wurde während der letzten 14,5 Stunden der Stimulation zugegeben, und die Proliferation wurde unter Verwendung eines Inotech-γ-Zählers und des „Trace-96"-Inotech-Programms gemessen. Die angegebenen cpm-Werte stellen den Mittelwert +/– SD von Wells in dreifacher Ausführung für einzeln getestete Mäuse dar. Die mittleren cpm-Werte +/– SD der proliferativen Lymphknotenreaktion aller Mäuse, die Ig-PLP1 und Ig-W erhielten, betrug 34.812 +/– 7.508 bzw. 37.026 +/– 10.133. Die mittlere proliferative Milzreaktion betrug 3.300 +/– 3.400 für die Gruppe, die Ig-PLP1 erhielt, und 14.892 +/– 4.769 für die Gruppe, die Ig-W erhielt.
Mäuse, die Ig-PLP1 am Tag der Geburt erhielten, entwickelten wie jene, denen Ig-W injiziert wurde, gleichwertige proliferative Reaktionen adulter Lymphknoten-T-Zellen auf PLP1, wenn sie mit freiem PLP1-Peptid in CFA immunisiert wurden (18A). Jedoch war die proliferative Milzreaktion bei Mäusen deutlich vermindert, die Ig-PLP1 erhielten (18B), was auf die Induktion von Toleranz hinweist. Keine der Gruppen von Mäusen zeigte eine signifikante proliferative Reaktion auf PLP2, einem Negativkontrollpeptid, das von I-A^S-Klasse-II-Molekülen wie PLP1 präsentiert wird.
Beispiel XXII
Lymphknoten-T-Zellen-Abweichung in Mäusen, die bei der Geburt mit Ig-PLP1 behandelt wurden
Um die Induktion von Toleranz in Säuglingen und Neugeborenen weiter zu beweisen, wurden Cytokin-Reaktionen in bei der Geburt mit einem Immunomodulator inokulierten Mäusen gemessen. Die Ergebnisse sind in 19A-19C gezeigt.
Im Speziellen wurden Lymphknotenzellen (4 × 10⁵ Zellen/Well) aus in Beispiel XXI beschriebenen Mäusen in vitro mit freiem PLP1 oder PLP2 (15 μg/ml) 24 Stunden lang stimuliert, und die Produktion von IL-2 (19A), IL-4 (19B) und IFNγ (19C) wurde mittels ELISPOT wie in Beispiel XVI beschrieben unter Verwendung von Anti-Cytokin-Antikörper-Paaren von Pharmingen gemessen. Die angegebenen Werte (Spot-bildenden Einheiten) stellen den Mittelwert +/– SD von 8 einzeln getesteten Mäusen dar.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Cytokin-Produktionsmuster von der Inokulation der neugeborenen Mäuse beeinflusst wurden. Lymphknotenzellen aus Mäusen, die bei der Geburt Ig-W erhielten, produzierten nach Stimulation mit PLP1 IL-2, nicht jedoch IFNγ oder IL-4. Zellen aus Mäusen, die Ig-PLP1 erhielten, wichen im Gegensatz dazu ab und produzierten stattdessen IL-4. Keine Cytokin-Produktion wurde nach Stimulation mit PLP2-Peptid beobachtet.
Beispiel XXIII
Verminderte IFNγ-Produktion durch Milz-T-Zellen aus Mäusen, denen am Tag der Geburt Ig-PLP1 injiziert wurde
Um die in Beispiel XXII erhaltenden Ergebnisse zu bestätigen, wurden Milzzellen aus denselben Mäusen auf Cytokin-Reaktionen getestet. Die Ergebnisse sind in 20A und 20B gezeigt.
Im Spezielleren wurden Milzzellen (1 × 10⁶ Zellen/Well) aus den Mäusen in vitro mit freiem PLP1 oder PLP2 (15 μg/ml) 24 Stunden lang stimuliert, und die Produktion von IL-2 (20A), IL-4 (20B) und IFNμ (20C) im Überstand wurde mittels ELISA unter Verwendung von Paaren von Anti-Cytokin-Antikörpern von Pharmingen gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen (Beispiel XVI). Die angegebenen Cytokin-Mengen Stellen den Mittelwert +/– SD von 8 einzeln getesteten Mäusen dar.
In der Milz, obgleich Zellen aus mit Ig-W inokulierten Mäusen IL-2 und IFNγ produzierten. Im Gegensatz dazu produzierten Zellen aus Mäusen, denen Ig-PLP1 injiziert wurde, IL-2, produzierten jedoch keine nachweisbaren Mengen an IFNγ. Die Negativkontrolle PLP2-Peptid induzierte keine Cytokin-Produktion.
Beispiel XXIV
Cytokin-vermittelte Wiederherstellung von Milz-T-Zellen-Proliferation in Mäusen, denen bei der Geburt Ig-PLP1 injiziert wurde
Um zu beweisen, dass proliferative Reaktionen wiederhergestellt werden können, wurden Zellen aus inokulierten neugeborenen Mäusen exogenem IFNγ ausgesetzt. Die Ergebnisse sind in 21 gezeigt.
Im Speziellen wurde eine i.p. mit 100 μg Ig-PLP1 injizierte Gruppe von Neugeborenen mit 100 μg PLP1-Peptid in CFA wie in Beispiel XXI immunisiert, und die In-vitro-Stimulation von Milzzellen (1 × 10⁶ Zellen/Well) mit freiem PLP1-Peptid (15 μg/ml) wurde wie in Beispiel XXI beschrieben durchgeführt, jedoch in Gegenwart von 100 Units IFNγ oder IL-12. Die angegebenen cpm-Werte für jede Maus stellen den Mittelwert +/– SD von dreifach ausgeführten Wells dar.
Überraschenderweise stellte die Zugabe von endogenem IFNγ zu Milzzellen aus Mäusen, die zum Zeitpunkt der Geburt Ig-PLP1 erhielten, die proliferative Reaktion wieder her. IL-12, ein Induktor von IFNγ (14) stellte die proliferative Milzreaktion ebenfalls wieder her.
Alles in allem entwickeln Mäuse, denen bei der Geburt Ig-PLP1 injiziert wird, eine Lymphknoten-T-Zellen-Abweichung und eine ungewöhnliche IFNγ-vermittelte Milzanergie. Interessanterweise entwickelten diese Mäuse, wenn sie mit freiem PLP1-Peptid für EAE induziert wurden, eine leichte monophasische Krankheit ohne Rückfälle. Da Igs lange Halbwertszeiten aufweisen, kann ein auf Ig basierender Immunomodulator einen längeren Zeitraum überstehen, was in einer anhaltenden und langsamen Freisetzung des immunsuppressiven Faktors resultiert, wie sie bei den üblichen neonatalen Toleranzausbildungsverfahren unter Verwendung von inkomplettem Freundschen Adjuvans mit einem herkömmlichen Antigen auftreten kann. Folglich könnte die Abgabe von Igs einem ermöglichen, die Verwendung von Adjuvans zur Induktion neonataler Toleranz zu umgehen. Weiters gewährleistet die Internalisierung eines immunsuppressiven Faktors über FcR und die anschließende Prozessierung im endozytischen Stoffwechselweg den Zugang zu neu synthetisierten MHC-Klasse-II-Molekülen, was signifikante Mengen an Komplexen aus MHC und immunsuppressivem Faktor erzeugt. Diese vorteilhaften Parameter (d.h. FcR-vermittelte Aktivierung von APCs, langsame Peptidfreisetzung und effiziente Peptidpräsentation) könnten zur Induktion von Lymphknotenabweichung und Milzanergie beitragen. Wie bei der Verabreichung der offenbarten Zusammensetzungen an Erwachsene könnte die Adjuvans-freie Toleranzausbildungsstrategie angewendet werden, um „Silencing" autoreaktiver T-Zellen zu bewirken und Autoimmunität zu verhindern.
Beispiel XXV
Lösliches Ig-PLP1 vermindert den Paralyseschweregrad und unterdrückt klinische Rückfälle in Mäusen mit bestehender EAE
SJL/J-Mäuse wurden mit freiem PLP1-Peptid für EAE induziert, und wenn die klinischen Krankheitsanzeichen offensichtlich waren, wurden den Tieren 3 Injektionen von löslichem Ig-PLP1 (sol-Ig-PLP1) in Salzlösung in 4-tägigen Intervallen verabreicht und die Tiere auf Verminderung des Schweregrads der Krankheit beurteilt. Kontrollmäusen wurde lösliches Ig-W (sol-Ig-W), das elterliche Ig ohne jegliches PLP1-Peptid, verabreicht. Gruppen von 6-8 Wochen alten SJL/J-Mäusen wurden mit 100 μg PLP1-Peptid für EAE induziert und dann i.p. mit 500 μg sol-Ig-PLP1, 500 μg sol-Ig-W oder 100 μg freiem PLP1-Peptid in PBS an den Tagen 9, 13 und 17 nach Krankheitsinduktion behandelt. Auf Basis eines Molekulargewichts von 150 kD für Ig-PLP1 und 1,5 kD für freies PLP1 entsprechen die 300 μg des während der drei Injektionen verabreichten freien PLP1 200 nmol PLP1-Peptid, und die 1.500 μg sol-Ig-PLP1 umfassen ~20 nmol PLP1-Peptid. Daher wurde den Mäusen bei Verwendung von freiem PLP1 für die Behandlung ~10-mal mehr Peptid verabreicht als für die Behandlung mit sol-Ig-PLP1.
Die Ergebnisse sind in 22 illustriert. Jeder Punkt stellt die mittlere klinische Bewertung von 8 Mäusen dar. Die in 22 dargestellten Ergebnisse repräsentieren 2 unabhängige Experimente.
Wie in 22 gezeigt ist, hatten mit sol-Ig-W behandelte Mäuse eine anfängliche schwere Paralysephase mit mittlerer maximaler Bewertung von 3,7 +/– 0,5 und zeigten Rückfälle während des gesamten 120-tägigen Untersuchungszeitraums. Die mit sol-Ig-PLP1 behandelten Mäuse jedoch wiesen einen verminderten Schweregrad der Paralyse in der anfänglichen Krankheitsphase mit einer mittleren maximalen Bewertung von 2,5 +/– 0,3 (p < 0,005) auf und gesundeten vollständig bis zum Tag 42. Mit einem 10fachen Überschuss von freiem PLP1-Peptid behandelte Mäuse wiesen eine leichte Verminderung des Schweregrads der Paralyse in der Anfangsphase der Krankheit auf (mittlere maximale klinische Bewertung 3,0 +/– 0,2), gesundeten jedoch nie und erlitten Rückfälle über den gesamten 120-tägigen Beobachtungszeitraum (22)
Wie in 22 illustriert ist, scheint sich die Wirksamkeit der Peptidabgabe durch Ig auf periphere APC zu erstrecken, die fast keine oder keine costimulatorischen Moleküle exprimieren, da die Injektion der Ig-PLP1-Chimäre ohne Adjuvans in erkrankte Mäuse PLP1-spezifische pathogene T-Zellen moduliert und EAE bessert (22). Diese Schlussfolgerung wird durch den Befund unterstützt, dass 200 nmol PLP1 in Form des freien Peptids die Schwere der Krankheit nur leicht verminderte und die Tiere niemals gesundeten, jedoch 20 nmol Peptid in Form von sol-Ig-PLP1 die Schwere der Anfangsphase der Krankheit verminderte und die meisten der Tiere bis zum Tag 42 völlig gesundeten (22).
Beispiel XXVI
Verabreichung von löslichen Immunglobulinen die Agonisten und Antagonisten ohne Adiuvans umfassen vermindert den Krankheitsschweregrad und sorgt für Peptidpräsentation ohne Costimulation
Gruppen von SJL-Mäusen wurden mit PLP1-Peptid für EAE induziert, und wenn die Krankheit klinisch offensichtlich war, wurden den Tieren 3 Injektionen von löslichem Ig-PLP1 oder löslichem Ig-PLP-LR in Salzlösung in 4-tägigen Intervallen verabreicht und die Tiere auf Verminderung des Krankheitsschweregrads beurteilt. Zu Kontrollzwecken war bei einer Gruppe von Mäusen, denen Ig-W verabreicht wurde, das elterliche Ig, das keinerlei Myelinpeptid enthält, mit enthalten.
Gruppen von SJL/J-Mäusen wurden durch subkutane Injektion von 100 g PLP1-Peptid in PBS/IFA (Vol./Vol.), das 200 g Mycobacterium tuberculosis H37Ra enthielt, für EAE induziert. Sechs und 48 Stunden nach Injektion wurden 5 × 10⁹ Bordetella pertussis intravenös verabreicht und die Mäuse täglich auf Anzeichen von Paralyse wie folgt bewertet: 0, keine klinischen Anzeichen; 1, Verlust von Schwanztonus; 2, Hinterextremitätenschwäche; 3, Hinterextremitätenparalyse; 4, Vorderextremitätenparalyse; und 5, sterbend oder Tod. An den Tagen 9, 13 und 17 nach der Krankheitsinduktion wurden die Mäuse intraperitoneal mit 500 g sol-Ig-PLP1, Ig-PLP-LR oder Ig-W in 500 l PBS behandelt.
Die in 23 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass sowohl mit Ig-PLP1 als auch mit Ig-PLP-LR behandelte Mäuse einen verminderten klinischen Schweregrad während des anfänglichen Krankheitsmaximums aufwiesen und einen Abfall der mittleren maximalen Bewertung von 3,7 +/– 0,5 für Ig-W-behandelte Mäuse auf 2,9 +/– 0,2 bzw. 2,4 +/– 0,3 für Ig-PLP-LR- bzw. Ig-PLP1-behandelte Mäuse zeigten (Tabelle 3). Interessanterweise erholten sich mit Ig-PLP1 und Ig-PLP-LR behandelte Mäuse von der Paralyse bis zum Tag 31 bzw. 38 und zeigten keine Rückfälle, während jene, denen Ig-W verabreicht wurde, Rückfälle über den gesamten 120-tägigen Beobachtungs zeitraum zeigten. Mäuse, die mit einem 10fachen Überschuss an freien PLP1- oder PLP-LR-Peptiden behandelt wurden, zeigten eine geringe Verminderung des klinischen Schweregrads und wurden während des gesamten 120-tägigen Beobachtungszeitraums fortlaufend rückfällig (Daten nicht gezeigt). Tabelle 3. Merkmale klinisch-manifester Krankheit nach Behandlung mit löslichen Ig-Chimären

*Mittelwert +/– SD des Tages des Krankheitsausbruchs
**Mittelwert +/– SD der maximalen klinischen Bewertungen
***Mäuse wurden als gesundet betrachtet, wenn ihre klinische Bewertung für die letzten 5 Tage < 0,5 war

Da die Ig-Cimären den Mäusen ohne Adjuvans verabreicht wurden, ist die Hinaufregulation von costimulatorischen Molekülen auf den peripheren APCs möglicherweise nicht aufgetreten, was zur Peptidpräsentation durch Zellen führt, denen costimulatorische Moleküle fehlen oder die ein vermindertes Ausmaß davon aufweisen, was die Toleranzausbildung der autoreaktiven T-Zellen bewirkt.
Um diese Frage zu untersuchen, wurde die Expression von costimulatorischen Schlüsselmolekülen an der Oberfläche von APCs nach Inkubation mit löslichen Ig-Chimären beurteilt. Makrophagen wurden aus Peritonealzellen von Mäusen fünf Tage nach Injektion mit 2 ml Thioglykolat-Bouillon durch Waschen der Peritonealhöhle mit 8 ml HBSS 40 M EDTA geerntet. Makrophagen (1,0 × 10⁶ Zellen/ml) wurden anschließend mit 0,3
löslicher Ig-PLP-Chimäre (schwarze Linie) oder Medium allei ne (NIL, grau) inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen geerntet und mit Anti-F4/80 (HB-198, ATCC) und entweder Anti-B7.1 (1G10; CRL-2223, ATCC), Anti-B7.2 (2D10; CRL-2226, ATCC) oder Anti-CD40 gefärbt. Histogramme stellen F4/80⁺-kontrollierte Zellen dar und zeigen die Intensität von entweder B7.1, B7.2 oder CD40.
Die in 24 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass peritoneale Makrophagen, die in Gegenwart von löslichen Ig-Chimären 24 Stunden lang kultiviert wurden, ähnliche Ausmaße an B7.2 wie jene aufwiesen, die ohne Ig-Chimären kultiviert wurden. Jedoch waren B7.1- und CD40-Expression im Vergleich zum Basisexpressionsausmaß vermindert, das mit Zellen beobachtet wurde, die in Medium ohne sol-Ig-Chimären gezüchtet wurden. Folglich treibt die Behandlung mit löslichen Immunglobulinen, die Agonisten oder Antagonisten enthalten, die Peptidpräsentation ohne Costimulation an, wodurch die natürliche periphere Toleranz zur Modulation autoreaktiver T-Zellen simuliert wird.
Beispiel XXVII
Besserung von EAE durch aggregiertes Ig-PLP1
Um die mit den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verbundenen klinischen Vorteile ausführlicher darzustellen, wurden EAE-Mäuse mit aggregiertem Ig-PLP1 inokuliert. Die Ergebnisse sind in 25 gezeigt.
EAE wurde in einer Gruppe von 10 Mäusen mit 100 μg freiem PLP1-Peptid wie oben beschrieben induziert. Lösliches aggregiertes Ig-PLP1 wurde durch 15-minütiges Erhitzen einer Lösung von Ig-PLP1 auf 63°C und anschließendes Zentrifugieren und Filtrieren des resultierenden Präparats, um jegliche unlöslichen Aggregate zu entfernen, die sich während des Vorgangs gebildet haben, hergestellt Die Konzentration von solubilisierten Aggregaten wurde dann unter Anwendung standardmäßiger biochemischer Techniken quantifiziert.
Wenn die klinischen Anzeichen von EAE sich am Tag 10 nach der Induktion der Krankheit zu entwickeln begannen, wurde den Mäusen eine Salzlösung injiziert, die 300 μg des hitzeaggregierten Ig-PLP1 enthielt. Eine zweite und dritte Injektion von 300 μg von aggregiertem Ig-PLP1 wurde am Tag 14 bzw. 17 verabreicht. Kontrollbehandlungen unter Verwendung von aggregiertem Ig-W und löslichem (nicht aggregiertem) Ig-PLP1 wurden parallel durchgeführt. Die Einstufung des klinischen Zustands wurde wie in Beispiel XIX beschrieben durchgeführt. In 25 sind die mit aggregiertem Ig-PLP1 behandelten Mäuse durch dunkle Kreise dargestellt, während die Kontrollen durch helle Kreise (lösliches Ig-PLP1) und Dreiecke (aggregiertes Ig-W) dargestellt sind.
Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass aggregierte Anordnungen der offenbarten Immunomodulatoren verwendet werden können, um die mit Immunstörungen verbundenen Symptome wirksam zu vermindern.
Beispiel XXVIII
Inkubation von aggregiertem Ig-PLP1 mit gereinigten APCs induziert die Produktion von IL-6 und IL-10
Um nachzuweisen, dass die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft entzündungshemmende Cytokine induzieren, wurden Antigen-präsentierende Zellen aggregiertem Ig-PLP1 ausgesetzt. Die Ergebnisse sind in 26A und 26B gezeigt.
Drei Typen von Zellen wurden auf Produktion von Cytokinen nach Inkubation mit aggregierten Konstrukten getestet. Diese umfassen B-Zellen, Makrophagen/Monozyten und dendritische Zellen. Um Makrophagen zu erlangen, wurde adulten SJL/J-Mäusen Thioglykolat injiziert, und am Tag 5 nach der Injektion wurden die Zellen aus der Peritonealhöhle durch ausgiebiges Waschen mit eiskalter Saccharose (0,34 M) geerntet und an Kunststoffkulturflaschen 4 Stunden lang anhaften gelassen. Nicht- anhaftende Zellen wurden durch kräftiges Pipettieren entfernt. Nach einer zusätzlichen Kultivierung über Nacht wurden anhaftende Zellen mit einem Zellschaber gesammelt. Dendritische Zellen wurden aus der Milz gereinigt und unter Anwendung standardmäßiger biochemischer Techniken angereichert. B-Zellen wurden aus der Milz durch Panning mit einem monoklonalen Ratten-Anti-Kappa-Antikörper gereinigt. Zur Anreicherung von ruhenden B-Zellen wurden Makrophagen, dendritischen Zellen und große (aktivierte) B-Zellen unter Verwendung einer Sephadex-G10-Säule entfernt. Anschließend wurden die eluierten Zellen durch Behandlung mit einem Anti-Thy-1.2-Antikörper und Komplement an T-Lymphozyten verarmt. Eine FACS-Analyse wird dann durchgeführt, um zu gewährleisten, dass nur Präparate mit den aggregierten Konstrukten stimuliert werden, die zu 90% oder darüber angereichert sind.
Die angereicherten Makrophagen wurden auf Produktion von IL-6 und IL-10 mittels ELISA unter Verwendung von Anti-Cytokin-Antikörperpaaren von Pharmingen (San Diego, CA) getestet. Die Makrophagen wurden bei 100 × 10³ Zellen/Well verwendet und die B-Zellen und dendritischen Zellen bei 50 × 10³ Zellen/Well. Die Zellen (Wells in dreifacher Ausführung) wurden mit abgestuften Mengen von aggregiertem Ig-PLP1 oder einem Maus-Myelom-IgM 24 Stunden lang inkubiert und zur Messung der Cytokin-Produktion verwendet. Die Menge an Cytokin im Überstand wurde durch Extrapolation an einer mit bekannten Mengen an Cytokin erstellten Standardkurve abgeschätzt.
26A und 26B zeigen, dass die Verabreichung von aggregiertem Ig-PLP1 die Produktion von entzündungshemmenden Cytokinen, wie z.B. IL-6 und IL-10, verstärkt. Im Spezielleren zeigt 26A, dass die Exposition mit aggregierten Konstrukten relativ hohe Ausmaße an IL-6 in Makrophagen induziert (Quadrate), während 26B zeigt, dass dieselben Konstrukte die Produktion von IL-10 in Makrophagen (Quadrate) und dendritischen Zellen (Dreiecke) verstärken. Es ist anzuerkennen, dass die Produktion derartiger Cytokine die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen und die Hinaufregulation von costimulatorischen Molekülen hemmen kann, während die Entwicklung von Zellen vom Th₂-Typ begünstigt wird.
Beispiel XXIX
Aggregiertes Ig-PLP1 zeigt höhere Wirksamkeit als lösliches Ig-PLP1 bei der Umkehrung von aktiver EAE
Obgleich lösliche Immunomodulatoren fähig sind, die Symptome einer Autoimmunkrankheit zu lindern, und im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen, wurde die Fähigkeit von Immunomodulatoren, die zur Vernetzung von Fc-Rezeptoren auf Target-Zellen zur weiteren Besserung einer Immunkrankheit in der Lage sind, wie folgt untersucht.
Die Fähigkeit von aggregiertem Ig-PLP1, FcRs zu vernetzen und IL-10-Produktion zu induzieren und dadurch eine stärkere Linderung der Autoimmunkrankheit als lösliches Ig-PLP1 bereitzustellen, wurde wie folgt untersucht. Kultivierungen von Ig-W-, Ig-PLP1- und Ig-PLP2-Transfektanten im größeren Maßstab wurden in 10% Serum Supreme (BioWhittaker, Walkersville, MD) enthaltendem DMEM durchgeführt und an getrennten Ratten-Anti-Maus-κ-Kette-Sepharosesäulen gereinigt, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Anschließend wurden die Ig-Chimären gegen PBS dialysiert und auf Collodiummembranen (Schleicher und Schuall, Keene, NH) konzentriert. Die Chimären wurden durch Präzipitation mit zu 50% gesättigtem (NH₄)₂SO₄ wie beschrieben aggregiert (Chase et al., Chemical Analyses, in: Methods in Immunology and Immunochemistry, Williams et al. (Hrsg.), Academic Press, New York, 2, 249-341 (1968)). Zusammenfassend wurde filtriertes, zu 100% gesättigtes (NH₄)₂SO₄ bei gleichem Volumen dem sol-Ig-Chimären-Präparat zugegeben. Das Gemisch wurde bei 24°C 1 Stunde lang unter vorsichtigem Rühren alle 20 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Proben bei 10.000 U/min zentrifugiert und das Pellet mit 1 mg/ml in PBS resuspendiert. Die Elektrophorese an einem 10%igen Acrylamidgel zeigte an, dass die sol-Ig-Chimären in das Gel eindrangen und bei etwa 160 kD wanderten. Jedoch drang die agg-Ig-Chimäre nicht in das Gel ein. Im Wissen, dass die Erfinder eine 2 g entsprechende Menge agg-Ig-Chimäre aufgetragen haben und dass die Empfindlichkeit der Technologie 0,1 g beträgt, zogen die Erfinder den Schluss, dass zumindest 95% des agg-Ig-Chimäre-Präparats sich in Aggregatform befinden.
Gruppen von Mäusen (8 pro Gruppe) wurden mit 100 μg PLP1 für EAE induziert und dann mit 300 μg agg-Ig-PLP1 oder agg-Ig-W in PBS an den Tagen 9, 13 und 17 nach Induktion der Krankheit behandelt. Die Ergebnisse sind in 27a und 27b gezeigt.
Wie in 27a zu erkennen ist, wurde die Anfangsphase des paralytischen Krankheitsschweregrads von einer mittleren maximalen Bewertung von 3,3 +/– 0,3 bei agg-Ig-W-behandelten Tieren auf 1,1 +/– 0,5 (p < 0,001) bei den agg-Ig-PLP1-behandelten Mäusen vermindert. Außerdem erholten sich die Tiere innerhalb von 9 Tagen nach Beendigung der Behandlung vollständig und erlitten niemals Rückfälle während des 120-tägigen Beobachtungszeitraums, während mit agg-Ig-W behandelte Mäuse sich nie erholten und Rückfälle über den gesamten Zeitraum der klinischen Bewertung zeigten.
27b ist ein direkter Vergleich des Krankheitsverlaufs von durch PLP1-Peptid induzierter EAE nach Behandlung mit sol-Ig-PLP1 (aus 22) gegenüber agg-Ig-PLP1 (aus 27a). Jeder Punkt stellt die mittlere klinische Bewertung von 8 Mäusen dar. Diese Ergebnisse stellen 3 unabhängige Experimente dar. Wie in 27b illustriert ist, war die Modulation der Krankheit durch aggregiertes Ig-PLP1 viel wirksamer, obgleich die 900 μg des den Mäusen verabreichten agg-Ig-PLP1 ~12 nmol PLP1 enthalten und ~17-mal weniger ist als die als freies PLP1 verabreichten 200 nmol. Die Wirksamkeit von agg-Ig-PLP1 wird auch offensichtlich, wenn die klinischen Paralyseanzeichen von agg-PLP1-behandelten Tieren mit jenen von Tieren verglichen wurden, denen sol-Ig-PLP1 injiziert wurde (p < 0,001) (27b). In der Tat war die mittlere klinische Bewertung viel niedriger und die Genesung schneller.
Eine histologische Untersuchung von mit agg-Ig-PLP1 oder agg-Ig-W behandelten Mäusen wurde ebenfalls durchgeführt. Mit agg-Ig-PLP1 oder agg-Ig-W behandelte Mäuse wurden am Höhepunkt der Anfangsphase der Krankheit (Tag 28 nach Induk tion der Krankheit) getötet und Gehirn und Rückenmark entfernt, mit Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Serienquerschnitte (6 μm) von Cerebellum, Cerebrum und Lendenrückenmark wurden angefertigt und mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) gefärbt. Perivaskuläre Cluster, die zumindest 20 einkernige Zellen enthielten, wurden als Entzündungsherde gewertet.
Die histologische Untersuchung des Cerebellums am Höhepunkt der Krankheit zeigte eine niedrigere Anzahl von Herden und eine verminderte Anzahl von infiltrierenden einkernigen Zellen pro Herd in den mit agg-Ig-PLP1 behandelten Mäusen gegenüber jenen an, denen agg-Ig-W verabreicht wurde (nicht gezeigt). Darüber hinaus trat eine zwei- bis dreifache Verminderung der Anzahl von Herden in agg-Ig-PLP1-behandelten Mäusen gegenüber Mäusen auf, die agg-Ig-W erhielten (Tabelle 4), wenn histologische Serienquerschnitte aus Hirn sowie Rückenmark präpariert und die mittleren Herde pro Querschnitt abgeschätzt wurden. Darüber hinaus wiesen die Herde in mit agg-Ig-PLP1 behandelten Mäusen weniger infiltrierende einkernige Zellen als jene von agg-Ig-W-behandelten Mäusen auf (agg-Ig-W: 73 +/– 39, agg-Ig-PLP1: 32 +/– 14, p < 0,005). Tabelle 4. Behandlung mit agg-Ig-PLP1 beseitigt klinische und histologische EAE
6-8 Wochen alte Mäuse wurden mit PLP1 für EAE induziert und dann anschließend mit 300 μg agg-Ig-PLP1 oder agg-Ig-W an den Tagen 9, 13 und 17 nach Induktion der Krankheit behandelt und täglich auf klinisch-manifeste Krankheit bewertet. Der mittlere maximale Schweregrad wurde durch Mitteln der von jeder Maus innerhalb einer Gruppe erlangten maximalen klinischen Bewertung bestimmt. Um die histologische Krankheit zu bestimmen, wurden Gehirn und Rückenmark aus den Mäusen am Tag 28 nach Induktion der Krankheit (Höhepunkt der Krankheit) entfernt, in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, und es wurden Serienquerschnitte mit 6 μm angefertigt und dann mit Hämotoxylin-Eosin (H&E) gefärbt. Ein Entzündungsherd entspricht einem Minimum von 20 einkernigen Zellen/perivaskulärem Cluster.
Beispiel XXX
Aggregiertes Ig-PLP1 induziert die Produktion von IL-10 durch APCs
Um den Mechanismus darzustellen, der der wirksamen Modulation von EAE durch agg-Ig-PLP1 zugrunde liegt, wurde die Fähigkeit von agg-Ig-PLP1 untersucht, die Produktion von IL-10 durch APCs zu stimulieren, sowie die Fähigkeit von IL-10, T-Zellen zu hemmen, die an der Erkennung des durch IL-10 produzierende APCs präsentierten PLP1-Peptids beteiligt sind. Zu diesem Zweck wurden naive Splenozyten mit sol- oder agg-Ig-Chimären inkubiert und die Überstände zum Nachweis von IL-10 verwendet.
Bestrahlte (3.000 Rad) SJL/J-Splenozyten (5 × 10⁵ Zellen/Well) wurden mit abgestuften Mengen sol-Ig-PLP1, agg-Ig-PLP1, agg-Ig-W, sol-Ig-PLP2 oder agg-Ig-PLP2 24 Stunden lang inkubiert, und die Überstände wurden verwendet, um die Produktion von IL-10 mittels ELISA wie folgt zu quantifizieren.
ELISA wurde nach dem Standardprotokoll von PharMingen durchgeführt, Der Einfang-Antikörper war Ratten-Anti-Maus-IL-10, und der biotinylierte Anti-Cytokin-Antikörper war Ratten-Anti-Maus-IL-10. Gebundener Ligand wurde unter Verwendung des TMB-Mikrowell-Peroxidasesubstratsystems festgestellt (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaitherburg, MA). Die Testergebnisse wurden an einem SpectraMAX-340-Counter abgelesen. Abgestufte Mengen von rekombinantem Maus-IL-10 waren in allen Experimenten zur Erstellung von Standardkurven mit inbegriffen. Die Cyto kin-Konzentration in Kulturüberständen wurde durch Extrapolation aus dem linearen Teil der Standardkurve abgeschätzt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von Wells in dreifacher Ausführung dar, und die Daten steilen 4 unabhängige Experimente dar.
Wie in 28a angegeben, stimulierten agg-Ig-PLP1-, Ig-PLP2- und Ig-W-Chimären die Produktion von IL-10 durch Milzzellen auf dosisabhängige Weise. Die löslichen Formen der Chimären induzierten keine nachweisbaren Ausmaße an IL-10.
Um zu untersuchen, ob Zellen, die bekanntermaßen als professionelle APCs fungieren, zur Produktion von IL-10 nach Inkubation mit agg-Ig-Chimären fähig sind, wurden die folgenden Experimente durchgeführt. Mit Thioglykolat induzierte peritoneale Makrophagen und Milz-B- und dendritische Zellen wurden isoliert und auf IL-10-Produktion nach Inkubation mit agg-Ig-PLP1 wie folgt getestet.
Makrophagen wurden aus den Peritonealzellen von Mäusen erlangt, denen wie früher beschrieben Thioglykolat-Bouillon injiziert wurde (Doyle et al., Murine macrophages: Isolation, cultivation, and characterization, in: Weirs Handbook of Experimental Immunology, Herzenberg et al. (Hrsg.), Blackwell Science, Cambridge, MA, 154.1-154.8 (1996)). Zusammenfassend wurden 2 ml Thioglykolat-Bouillon i.p injiziert, und nach 5 Tagen wurden die Makrophagen durch Waschen der Peritonealhöhle mit 8 ml HBSS 4 μM EDTA entfernt. Die Reinheit der Makrophagen betrug ≥ 93%, wie mittels FACS^®-Analyse unter Verwendung von Antikörpern gegen den F4/80-Marker ermittelt wurde.
Dendritische Zellen wurden aus SJL/J-Milz gemäß dem Standardverfahren Collagenase/differenzielle Anhaftung gereinigt (Romani et al., Dendritic cells, in: Weirs Handbook of Experimental Immunology, Herzenberg et al. (Hrsg.), Blackwell Science, Cambridge, MA, 156.1-156.14 (1996)). Die Zellreinheit betrug ≥ 94%, wie mittels FACS^®-Analyse unter Verwendung von Antikörpern gegen den 33D1-Marker ermittelt wurde.
SJL/J-Splenozyten wurden an mit Ratten-Anti-Maus-κ (1 mg/ml) beschichteten Platten 15 Minuten lang bei 25°C dem Panning unterzogen. Nicht-anhaftende Zellen wurden mit PBS ausgewaschen. B-Zellen wurden dann von der Platte durch Inkubation mit Lidocain-HCl (0,8 mg/ml) gefolgt von kräftigem Pipettieren abgelöst. Die Zellreinheit betrug ≥ 90%, wie mittels FACS^®-Analyse für Expression des B220-Markers ermittelt wurde.
Bestrahlte (3.000 Rad) B-Zellen (2 × 10⁵ Zellen/Well), Makrophagen (0,2 × 10⁵ Zellen/Well) und dendritische Zellen (0,2 × 10⁵ Zellen/Well) wurden mit abgestuften Mengen agg-Ig-PLP1 (offene Symbole) oder Maus-IgM (geschlossene Symbole) für 24 Stunden inkubiert, und der Zellkulturüberstand wurde verwendet, um die Produktion von IL-10 zu messen. Jeder Punkt stellt den Mittelwert aus dreifach ausgeführten Wells dar. Diese Daten stellen 4 unabhängige Experimente dar.
28b zeigt, dass Makrophagen und dendritische Zellen, nicht jedoch B-Zellen nach Inkubation mit agg-Ig-PLP1 IL-10 produzieren. Maus-IgM war unfähig, die Produktion von IL-10 durch irgendwelche der getesteten APCs zu stimulieren. Diese Ergebnisse zeigen an, dass agg-Ig-PLP1 FcγR vernetzt und die Produktion von IL-10 durch APCs induziert. Darüber hinaus hemmte die Vorinkubation von APCs mit löslichem Maus-IgG die durch agg-Ig-PLP1 induzierte Produktion von IL-10 (Daten nicht gezeigt).
Diese Ergebnisse zeigen an, dass das von den APCs produzierte IL-10 auf die Vernetzung von FcγR und nicht auf die Verunreinigung mit Endotoxin zurückzuführen war.
Beispiel XXXI
Agqregiertes Ig-PLP1 induziert IL-10 durch Vernetzung von FcγR1-Rezeptoren
Die Fähigkeit von agg-Ig-PLP1, Fc-Rezeptoren zu vernetzen, wurde wie folgt untersucht. Ig-PLP1 wurde unter Verwendung von Ammoniumsulfat aggregiert und auf Induktion von IL-10 getestet. SJL/J-Splenozyten (0,5 × 10⁶ Zellen/Well) wurden mit 0,1 M sol-Ig-PLP1, 0,1 M agg-Ig-PLP1, 0,1 M agg-Ig-PLP1 + 50 mg/ml 2.4G2 oder 0,1 M agg-Ig-PLP1 + 100 g/ml Maus-Ig inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen pelletiert, und 100 ml Kulturüberstand wurden verwendet, um die Produktion von IL-10 mittels ELISA gemäß dem Standardprotokoll von PharMingen festzustellen.
Wie in 29 zu sehen ist, führte die Inkubation von Splenozyten mit agg-Ig-Chimären, nicht jedoch mit sol-Ig-Chimären zur Induktion von IL-10 durch die APCs. IL-10-Produktion schien FcR1-abhängig zu sein, da die Blockade von Fc-R2 und Fc-R3 mit 2.4G2-mAb die Produktion von IL-10 nicht hemmte, während die Blockade aller drei Fc-Rs durch Inkubation mit Maus-Ig das durch die agg-Ig-Chimäre induzierte IL-10 sehr wohl signifikant verminderte. Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass die Aggregation der Ig-Chimären bewirkte, dass die APCs IL-10 auf eine von Fc-R1 abhängige Weise produzierten.
Beispiel XXXII
Agqregiertes Ig-PLP1 bewirkt die Herabregulation der Sekretion von IFNγ durch spezifische T-Zellen in vitro
Um die Wirkung zu untersuchen, die von APC stammendes IL-10 auf T-Zellen haben könnte, die sich spezifisch mit den APCs über Antigen-Präsentation betätigen, wurde ein PLP1-spezifischer Th0-Klon verwendet, der fähig ist, nach Peptidstimulation Cytokine vom Typ I sowie Typ II zu produzieren. Dieser als TCC-PLP1-1B10 bezeichnete Klon wurde wie folgt hergestellt.
Adulte SJL-Mäuse wurden subkutan mit 100 μg PLP1-Peptid in CFA immunisiert, und 10 Tage später wurden die ableitenden Lymphknoten entfernt und die Zellen (5 × 10⁶ Zellen/Well) mit PLP1 (15 μg/ml) stimuliert. Nach 5 Tagen wurden die Blasten an einem Histopaque-Gradienten (Sigma, St. Louis, MO) getrennt und dann wieder mit Peptid und frisch bestrahlten (3.000 Rad) syngenetischen APCs stimuliert. Zehn Tage später wurden die Zellen gewaschen, in 10% T-Stim (Collaborative Research, Boston, MA) enthaltendem Medium resuspendiert und 7 Tage lang ruhen gelassen. Nach drei Zyklen von Stimulation/Ruhe wurden die Zellen durch Grenzverdünnung (1 Zelle/3 Wells) kloniert, und positive Klone wurden einem zweiten Umlauf von Grenzverdünnungsklonierung unterzogen. Anschließend wurde einer der Klone, TCC-PLP1-1B10, wie folgt weiter charakterisiert.
Die proliferative Reaktion von TCC-PLP1-1B10 auf PLP1, PLP2, agg-Ig-PLP1 und agg-Ig-PLP2 wurde wie folgt untersucht. SJL/-Splenozyten (10 × 10⁵ Zellen/Well/100 μl) wurden mit abgestuften Mengen von Antigen auf 96-Well-Platten mit rundem Boden 4 Stunden lang gepulst, pelletiert, mit 1% Paraformaldehyd 15 Minuten lang fixiert, gewaschen und auf eine frische 96-Well-Platte übertragen. TCC-PLP1-1B10-Zellen (0,5 × 10⁵ Zellen/Well/100 μl) wurden dann zugegeben und 3 Tage lang inkubiert. Anschließend wurde 1 μCi [³H]Thymidin pro Well zugegeben und die Inkubation weitere 14,5 Stunden lang fortgesetzt. Die Zellen wurden dann auf Glasfasertiltern geerntet und inkorporiertes [³H]Thymidin unter Verwendung eines Inotech-β-Counters (Wohlen, Schweiz) gezählt. Die Ergebnisse sind in 30a gezeigt.
Wie in 30a illustriert ist, proliferiert TCC-PLP1-1B10 nach Inkubation mit Paraformaldehyd-fixierten Milz-APCs, die vorher mit freiem PLP1-Peptid oder agg-Ig-PLP1 gepulst worden waren. TCC-PLP1-1B10 zeigte keine signifikante Proliferation, wenn die APCs mit der Negativkontrolle PLP2 oder agg-Ig-PLP2 gepulst wurden.
Die von TCC-PLP1-1B10 nach Stimulation mit freiem PLP1 oder agg-Ig-PLP1 produzierten Cytokine wurden wie folgt untersucht. Bestrahlte (3.000 Rad) SJL/J- Splenozyten (5 × 10⁵ Zellen/Well) wurden mit abgestuften Mengen an PLP1-Peptid (geschlossene Kreise) oder agg-Ig-PLP1 (offene Kreise) 1 Stunde lang inkubiert, worauf TCC-PLP1-1B10-Zellen (0,5 × 10⁵ Zellen/Well) zugegeben und die Inkubation für weitere 24 Stunden fortgesetzt wurde. Die Cytokin-Produktion wurde mittels ELISA aus 100 μl Kulturüberstand wie folgt gemessen. Jeder Punkt stellt den Mittelwert aus dreifach ausgeführten Wells dar. ELISA wurde nach dem Standardprotokoll von PharMingen durchgeführt. Die Einfang-Antikörper waren Ratten-Anti-Maus-IL-2, JES6-1A12; Ratten-Anti-Maus-IL-4, 11B11; Ratten-Anti-Maus-IFNγ, R4-6A2; Ratten-Anti-Maus-IL-10, JES5-2A5; und Ratten-Anti-Maus-IL-5, TRFK5. Die biotinylierten Anti-Cytokin-Antikörper waren Ratten-Anti-Maus-IL-2, JES6-5H4; Ratten-Anti-Maus-IL-4, BVD6-24G2; Ratten-Anti-Maus-IFNγ, XMG1.2; Ratten-Anti-Maus-IL-10, JES5-16E3; und Ratten-Anti-Maus-IL-5, TRFK4. ELISA für die Detektion von aktivem TGF wurde unter Verwendung des menschlichen TGF-DuoSet-Sets (Genzyme, Cambridge, MA) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Gebundener Ligand wurde unter Verwendung des TMB-Mikrowell-Peroxidasesubstratsystems (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaitherburg, MA) festgestellt. Die Tests wurden an einem SpectraMAX-340-Counter abgelesen. Abgestufte Mengen an rekombinantem IL-10, IL-4, IFNγ, IL-10, IL-5 und TGF aus der Maus waren in allen Experimenten zur Erstellung von Standardkurven mit inbegriffen. Die Cytokin-Konzentration in Kulturüberständen wurde durch Extrapolation aus dem linearen Abschnitt der Standardkurve abgeschätzt.
Wenn es auf Cytokin-Produktion nach Inkubation mit unfixierten Milz-APCs und freiem PLP1-Peptid getestet wurde, produzierte TCC-PLP1-1B10 signifikante Mengen an IL-2, IL-4 und IFNγ (30b, 30c und 30d). Alle drei Cytokine wurden auch nachgewiesen, wenn agg-Ig-PLP1 zur Stimulation verwendet wurde (30b, 30c und 30d). Jedoch war IL-10 in signifikanten Ausmaßen nachweisbar, wenn der Stimulator agg-PLP1, nicht jedoch freies PLP1 war (30e).
Da agg-Ig-PLP1 die Produktion von IL-10 durch Makrophagen und dendritische Zellen induziert, ist es wahrscheinlich, dass das beim T-Zellen-Cytokin-Bewertungstest beobachtete IL-10 das Produkt von Milz-APCs und nicht von TCC-PLP1-1B10 war. Um dies zu bestätigen, wurden die folgenden Experimente durchgeführt. Fixierte und lebende APCs wurden verwendet, um die Quellen von IL-10 bei T-Zellen-Aktivierung durch agg-Ig-PLP1 zu identifizieren. Im Test mit fixierten APCs wurden SJL/J-Splenozyten (10 × 10⁵ Zellen/Well) mit abgestuften Mengen agg-Ig-PLP1 4 Stunden lang gepulst, ausgiebig gewaschen und mit Paraformaldehyd fixiert. Beim Test mit lebenden APCs wurden bestrahlte (3.000 Rad) SJL/J-Splenozyten (5 × 10⁵ Zellen/Well) mit abgestuften Mengen agg-Ig-PLP1 vermischt und 1 Stunde lang inkubiert. Anschließend wurden TCC-PLP1-1B10-Zellen (0,5 × 10⁵ Zellen/Well) beiden Tests zugegeben und die Inkubation für weitere 24 Stunden fortgesetzt. IL-10-Produktion wurde mittels ELISA aus 100 μl Kulturüberstand gemessen. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von Wells in dreifacher Ausführung dar.
Die Ergebnisse sind in 31 gezeigt. Wie in 31 illustriert ist, war IL-10 nicht nachweisbar, wenn mit agg-Ig-PLP1 gepulste APCs vor Inkubation mit TCC-PLP1-1B10 gewaschen und mit Paraformaldehyd fixiert wurden, was beweist, dass Milz-APCs und nicht TCC-PLP1-1B10 die Quellen von IL-10 waren.
Die andere auffällige Beobachtung aus dem T-Zellen-Cytokin-Bewertungstest war, dass die Produktion von IFNγ abzunehmen schien, wenn die IL-10-Produktion durch APCs anstieg (30c und 30e). Um die Frage weiter zu untersuchen, wurde ein erweiterter Bereich von Ig-PLP1-Konzentrationen zur Stimulation von rohen und gereinigten APCs verwendet, und IL-10- und IFNγ-Produktion wurden gleichzeitig aus demselben Gewebe wie folgt festgestellt.
Bestrahlte (3.000 Rad) SJL/J-Splenozyten (5 × 10⁵ Zellen/Well), dendritische Zellen (0,2 × 10⁵ Zellen/Well), Makrophagen (0,2 × 10⁵ Zellen/Well) oder B-Zellen (2 × 10⁵ Zellen/Well) wurden mit abgestuften Mengen an agg-Ig-PLP1 inkubiert, und nach 1 Stunde wurden TCC-PLP1-1B10-Zellen (0,5 × 10⁵ Zellen/Well) zugegeben, und die Inkubation wurde für weitere 24 Stunden fortgesetzt. Die Produktion von IFNγ und IL-10 im selben Kultivierungs-Well wurde mittels ELISA gemessen. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von dreifach ausgeführten Wells dar. Die Ergebnisse sind in 32 gezeigt.
Wie in 32 illustriert ist, antagonisiert das von den APCs sekretierte IL-10 die Produktion von IFNγ durch die T-Zellen. In der Tat war es so, dass bei Durchführung des Stimulationstests unter Verwendung von Splenozyten, gereinigten DCs oder angereicherten peritonealen Makrophagen als APCs (alle davon produzieren IL-10 nach Inkubation mit agg-Ig-PLP1, 28) die Produktion von IFNγ durch T-Zellen mit dem Anstieg der Produktion von IL-10 durch APCs sich drastisch verminderte oder nicht mehr nachweisbar war (32a, 32b und 32c). Wenn jedoch B-Zellen als APCs verwendet wurden, die nach Inkubation mit agg-Ig-PLP1 kein IL-10 produzieren (28b), blieb die Sekretion von IFNγ durch T-Zellen unbeeinflusst (32d). Insgesamt weisen die Ergebnisse darauf hin, dass agg-Ig-PLP1 die Produktion von IL-10 durch die präsentierenden APCs (dendritische Zellen und Makrophagen) triggert und dass derartiges IL-10 die Produktion von IFNγ durch die T-Zellen antagonisiert.
Um weiter zu bestätigen, dass die IL-10-Produktion die Produktion von IFNγ durch T-Zellen antagonisiert, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Bestrahlte (3.000 Rad) peritoneale SJL/J-Makrophagen (0,2 × 10⁵ Zellen/Well) (gereinigt wie oben beschrieben) wurden mit abgestuften Mengen an agg-Ig-PLP1 eine Stunde lang inkubiert, und dann wurde TCC-PLP1-1B10 (0,5 × 10⁵ Zellen/Well) zugegeben und die Inkubation für weitere 24 Stunden fortgesetzt. Die Produktion von IFN und IL-10 im selben Well wurde aus 100 l eines Kulturüberstands wie oben beschrieben festgestellt. Außerdem waren Anti-IL-10-mAb 2A5 oder Ratten-IgG in manchen Kulturen enthalten, um ihre Wirkungen auf die IFNγ-Produktion zu ermitteln.
Die Ergebnisse sind in 33 gezeigt. Wenn TCC-PLP1-1B10 mit peritonealen Makrophagen und agg-Ig-PLP1 inkubiert wurde, erfolgte eine Abnahme der IFNγ-Produktion proportional zum Ausmaß des von den präsentierenden Makrophagen sekretierten IL-10 (33a). Darüber hinaus stand die Hemmung der IFNγ-Produk tion durch die T-Zellen in direktem Zusammenhang mit dem von den APCs stammenden IL-10, da die Neutralisation von derartigem IL-10 durch Anti-IL-10-mAb 2A5 die IFN-Produktion wiederherstellte (33b). Die Inkubation mit der Isotyp-Kontrolle Ratten-IgG anstelle von Anti-IL-10 hatte keine Wirkung auf die Fähigkeit von IL-10, die IFN-Produktion durch TCC-PLP1-1B10 zu hemmen (33c).
Beispiel XXXIII
Synergie zwischen endogenem IL-10 und peripherer Toleranz für die In-vivo-Modulation aggressiver T-Zellen
An Tiere verabreichtes systemisches Antigen ohne Adjuvans treibt üblicherweise die Toleranz an, die über Antigenpräsentation durch periphere APCs wirkt, die minimale oder keine costimulatorischen Moleküle exprimieren. Die Inkubation von gereinigten Makrophagen oder dendritischen Zellen mit sol- oder agg-Ig-PLP1, was eine effiziente Aufladung von Peptid auf MHC-Klasse-II-Molekülen ermöglicht, führt zu keiner Hinaufregulation von B7-1, B7-2 oder CD40 (Daten nicht gezeigt). Da agg-Ig-PLP1 die Produktion von IL-10 durch APCs bewirkt (28), ist es darüber hinaus wahrscheinlich, dass IL-10 die Hinaufregulation costimulatorischer Moleküle auf APCs hemmt.
Da von IL-10 gezeigt worden ist, dass es Th1-Cytokine antagonisiert (Fiorentino et al., J. Immunol. 146, 3444-51 (1991)) und möglicherweise Entzündungsfunktionen stört, wurde die Wirksamkeit von agg-Ig-PLP1 bei der T-Zellen-Modulation und Krankheitsumkehrung über inadäquate Peptidpräsentation durch minimale costimulatorische Moleküle exprimierende APCs und die Hemmfunktion von durch derartige APCs produziertem IL-10 wie folgt untersucht.
Mäuse wurden mit PLP1-Peptid für EAE induziert, und wenn Anzeichen von Paralyse offensichtlich wurden, erhielten die Mäuse agg-Ig-PLP1 zusammen mit Anti-IL-10-Antikörper und wurden auf Verminderung des Krankheitsschweregrads wie folgt be wertet. SJL/J-Mäuse (8 pro Gruppe) wurden mit 100 μg PLP1 für EAE induziert und erhielten an den Tagen 9, 13 und 17 i.p. in PBS 300 μg agg-Ig-PLP1 (agg-Ig-PLP1); 300 μg agg-Ig-PLP1 + 500 μg Ratten-Anti-Maus-IL-10-Antikörper 2A5 (agg-Ig-PLP1 + Anti-IL-10); 300 μg agg-Ig-PLP1 + 500 μg Ratten-IgG (agg-Ig-PLP1 + Ratten-IgG); 300 μg agg-Ig-W (agg-Ig-W); oder 300 g agg-Ig-W + 500 g Ratten-Anti-Maus-IL-10-Antikörper 2A5 (agg-Ig-W + Anti-IL-10). Alle Injektionen wurden i.p in PBS durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 34a gezeigt.
Wie in 34a gezeigt ist, wurde der Schweregrad der Paralyse wiederhergestellt, wenn IL-10 in vivo durch den Anti-IL-10-Antikörper neutralisiert wurde. In der Tat hatten mit agg-Ig-PLP1 alleine behandelte Mäuse eine mittlere maximale klinische Bewertung von 1,1 +/– 0,5, während die mit agg-Ig-PLP1 und Anti-IL-10-Antikörper injizierten Mäuse eine Bewertung von 3,0 +/– 0,3 aufwiesen, die mit der Bewertung von 3,3 +/– 0,3 (p < 0,23) vergleichbar ist, die bei mit agg-Ig-W behandelten Mäusen beobachtet wurde. Darüber hinaus war bei Kontrollmäusen, denen agg-Ig-PLP1 zusammen mit Ratten-IgG anstelle von Anti-IL-10-Antikörper verabreicht wurde, keine Wiederherstellung des Krankheitsschweregrads festzustellen, und sie wiesen eine mittlere maximale Bewertung von 1,6 +/– 0,2 auf. Durch Injektion von Anti-IL-10-Antikörper zusammen mit agg-Ig-W wurde der Krankheitsschweregrad weder vermindert noch verschlimmert. Diese Ergebnisse beweisen, dass durch agg-Ig-PLP1 induziertes IL-10 eine signifikante Rolle bei der Steuerung des Krankheitsschweregrads spielt und dass für das Auftreten der Wirkungen von IL-10 eine spezifische Wechselwirkung zwischen APCs und den Ziel-T-Zellen erforderlich ist.
Ein weiterer Hinweis, der diesen Mechanismus unterstützt, ergibt sich aus der Tatsache, dass die Behandlung mit sol-Ig-PLP1 plus exogenem IL-10 den Schweregrad der Paralyse im selben Ausmaß vermindert wie agg-Ig-PLP1. Gruppen von Mäusen (8 pro Gruppe) wurden mit 100 μg PLP1 für EAE induziert und erhielten an den Tagen 9, 13 und 17 i.p. in PBS 300 μg sol-Ig-PLP1 (sol-Ig-PLP1); 300 μg agg-Ig-PLP1 (agg-Ig-PLP1); 300 μg sol-Ig-PLP1 + 400 U rIL-10 (sol-Ig-PLP1 + IL-10); oder 300 μg agg-Ig-W (agg-Ig-W). Wie in 34b gezeigt ist, bessert lösliches Ig-PLP1, das keine nachweisbaren Ausmaße IL-10 induziert, die Krankheit etwas mit einer mittleren maximalen Bewertung von 2,5 +/– 0,3, während sol-Ig-PLP1 zusammen mit exogenem IL-10 die Krankheit auf eine mittlere klinische Bewertung von 1,1 +/– 0,3 weiter vermindert, was mit der Bewertung von 1,1 +/– 0,5 vergleichbar ist, die bei mit agg-Ig-PLP1 behandelten Mäusen erlangt wurde.
Damit endogenes IL-10 die Krankheit modulieren kann, scheint eine physikalische Brückenbildung der APCs zu den T-Zellen erforderlich zu sein. Um diesen Mechanismus zu bestätigen, wurden die folgenden Experimente durchgeführt. Gruppen von Mäusen (8 pro Gruppe) wurden mit 100 μg PLP1 für EAE induziert und dann mit 300 μg agg-Ig-PLP1 (agg-Ig-PLP1), 300 μg agg-Ig-W (agg-Ig-W) oder 300 μg agg-Ig-W + 100 μg PLP1 (agg-Ig-W + PLP1) in PBS an den Tagen 9, 13 und 17 nach Induktion der Krankheit behandelt. Die Ergebnisse sind in 35 gezeigt.
Wie in 35 gezeigt ist, fand der Ausbruch der Krankheit bei diesen experimentellen Gruppen am Tag 7 statt. Die Behandlung der erkrankten Mäuse mit einem Gemisch aus agg-Ig-W und freiem PLP1-Peptid anstelle von agg-Ig-PLP1 verminderte nicht den Schweregrad der Krankheit. Insgesamt erfordert eine wirksame T-Zellen-Herabregulation die physikalische Wechselwirkung zwischen IL-10 produzierenden APCs und der pathogenen Ziel-T-Zelle. Die wahrscheinliche Erklärung für dieses Erfordernis ist, dass sich IL-10 als ein parakrines Cytokin in unmittelbarer Nachbarschaft zu T-Zellen befinden muss, um einen Antagonismus zu erzielen.
Beispiel XXXIV
Agg-Ig-PLP1 sorgt für die rasche Besserung von Autoimmunkrankheiten
Obgleich sowohl agg-Ig-PLP-LR als auch agg-Ig-PLP1 die Symptome der Autoimmunkrankheit bessern, sorgt agg-Ig-PLP1 für eine raschere Linderung. Gruppen von SJL-Mäusen wurden mit PLP1-Peptid für die Krankheit induziert und i.p. mit 300 μg agg-Ig-PLP1, agg-Ig-PLP-LR oder agg-Ig-W in 300 μl PBS an den Tagen 9, 13 und 17 behandelt. Die Ergebnisse sind in 36 und Tabelle 5 gezeigt.
Wie in 36 und Tabelle 5 zu sehen ist, verminderte die Behandlung mit agg-Ig-PLP1 drastisch den Schweregrad der Krankheit. Obgleich agg-Ig-PLP-LR- sowie agg-Ig-PLP1-Behandlung in der Genesung von EAE resultierten, gesundeten Mäuse, die agg-Ig-PLP1 erhielten, rascher als Mäuse, die agg-Ig-PLP-LR erhielten. Der Mittelwert der maximalen klinischen Bewertung wurde von 3,3 +/– 0,3 für die mit agg-Ig-W behandelte Gruppe auf 1,1 +/– 0,5 bei der agg-Ig-PLP1-Gruppe vermindert (siehe Tabelle 5). Darüber hinaus erfolgte die vollständige Genesung nach Behandlung mit agg-Ig-PLP1 schneller (Tag 24,4 +/– 2,2), und Rückfälle traten während des 120-tägigen Zeitraums der klinischen Bewertung nicht auf.
Es ist bemerkenswert, dass agg-Ig-PLP1 bei der Krankheitsmodulation wirksamer ist als sol-Ig-PLP1. Während agg-Ig-PLP1 die maximale klinische Bewertung auf 1,1 +/– 0,5 verminderte, verminderte die lösliche Form von Ig-PLP1 den Schweregrad der Paralyse nur auf 2,4 +/– 0,3 (vergleiche Tabelle 3 und Tabelle 5). Zusätzlich erfolgte die Genesung viel schneller für die mit agg-Ig-PLP1 behandelte Gruppe als für Mäuse, denen sol-Ig-PLP1 verabreicht wurde (siehe Tabelle 3 und Tabelle 5). Tabelle 5. Merkmale klinisch-manifester Krankheit nach Behandlung mit agg-Ig-Chimären

Histopathologische Analysen wurden ebenfalls durchgeführt. Gruppen von für EAE induzierten und mit agg-Ig-Chimären wie in 36 behandelten Mäusen wurden am Tag 28 nach der Induktion der Krankheit getötet. Gehirn und Rückenmark wurden entfernt, in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. 60 μm dicke Serienquerschnitte aus Cerebrum und Lendenrückenmark wurden angefertigt und mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) gefärbt. Perivaskuläre Cluster, die zumindest 20 einkernige Zellen enthielten, wurden als Entzündungsherd gezählt.
Die Ergebnisse sind in 37 gezeigt. Wie in 37 gezeigt ist, wiesen mit agg-Ig-PLP1 behandelte Mäuse eine signifikant verminderte Anzahl an Entzündungsherden in Cerebrum sowie im Lendenrückenmark auf.
Es ist bemerkenswert, dass die Wirksamkeit von agg-Ig-PLP1 bei der Besserung von EAE bei einer viel niedrigeren Dosis (300 μg/Injektion) als mit löslichem Ig-PLP1 auftritt, das mit 500 vg pro Injektion verabreicht wurde. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die In-vivo-Produktion von IL-10 nach Behandlung mit der aggregierten, nicht jedoch löslichen Form von Ig-PLP1 zurückzuführen.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen, könnten die folgenden Mechanismen die mit agg-Ig-PLP1 im Vergleich zu agg-PLP1-LR erlangten schnelleren Ergebnisse erklären. Da PLP-LR ein T-Zellen-Antagonistenpeptid ist, das durch Veränderung von PLP1 erzeugt wurde, könnte erwartet werden, dass die Affinität der Wechselwirkung zwischen T-Zellen, die dieses veränderte Peptid präsentieren, und APCs niedriger ist als die Affinität zwischen T-Zellen, die unverändertes PLP1 präsentieren, und APCs. Als Resultat dieser niedrigeren Affinität würden T-Zellen nicht mit APCs wechselwirken, die PLP-LR präsentieren, solange sie mit APCs wechselwirken, die PLP1 präsentieren, wodurch ihre Zeitdauer der Exposition mit durch aggregierte Immunglobuline induziertem IL-10 vermindert wird.
Alternativ dazu könnten die mit agg-Ig-PLP1 erlangten schnelleren Ergebnisse eine Folge der Diversität des autoreaktiven Repertoires von T-Zellen sein. Wenn die Häufigkeit der mit PLP1 reaktiven T-Zellen höher ist als die Häufigkeit der mit PLP-LR reaktiven T-Zellen, könnte eine differenzielle Modulation der Krankheit durch die beiden Chimären auftreten, die zum beobachteten Muster passt. In diesem Fall würden die löslichen Chimären in Abwesenheit von IL-10 eine gemeinsame Population von T-Zellen beeinflussen, jedoch würden die aggregierten Formen Ig-PLP1 bevorzugen, da hochaffine T-Zellen einer wirksamen IL-10-Exposition ausgesetzt wären.
Beispiel XXXV
In Reaktion auf agg-Ig-PLP1 produziertes IL-10 bewirkt die Herabregulation von costimulatorischen Molekülen
Von IL-10 ist berichtet worden, dass es die Expression costimulatorischer Moleküle auf APCs herabreguliert. Um zu ermitteln, ob in Reaktion auf agg-Ig-PLP1 produziertes IL-10 costimulatorische Moleküle auf APCs herabreguliert, wurde das folgende Experiment durchgeführt.
Peritoneale Makrophagen wurden mit agg-Ig-PLP-Chimären 24 Stunden lang inkubiert und dann auf Zelloberflächenexpression costimulatorischer Moleküle beurteilt. Makrophagen wurden aus Peritonealzellen von Mäusen gewonnen, denen Thioglykolat-Bouillon wie oben beschrieben injiziert worden ist. Gereinigte Makrophagen (1,0 × 10⁸ Zellen/ml) wurden anschließend mit 0,3 μM agg-Ig-PLP-Chimäre (schwarze Linie) oder Medium alleine (NIL, grau) inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen geerntet und mit Anti-F4/80 und entweder Anti-B7.1, Anti-B7.2 oder Anti-CD40 gefärbt. Histogramme stellen F480⁺-kontrollierte Zellen dar und zeigen die Intensität von entweder B7.1, B7.2 oder CD40.
Die Ergebnisse sind in 38 gezeigt. Wie in 38 gezeigt ist, bestand keine Hinaufregulation der Expression von B7.1, B7.2 oder CD40. Es bestand im Gegenteil eine signifikante Herabregulation dieser Moleküle relativ zum in Kulturen in Abwesenheit von agg-Ig-PLP-Chimären beobachteten Basisniveau. Daher bewirkt in Re aktion auf agg-Ig-PLP1 produziertes IL-10 die Herabregulation costimulatorischer Moleküle.
Beispiel XXXVI
Behandlung mit aggregiertem Ig-PLP1 vermindert den klinischen Schweregrad aktiver durch mehrere Epitope induzierter EAE
IL-10, dass durch APCs als Resultat von agg-Ig-PLP1-vermittelter FcR-Vernetzung produziert wird, könnte spezifische T-Zellen antagonisieren, die mit den PLP1-MHC-Liganden auf den APCs verbunden sind, sowie benachbarte T-Zellen mit verschiedenartiger Spezifität. Dieses als „Bystander"-Suppression bekannte Phänomen hat sich im Milieu von IL-4 und IL-10 als wirksam erwiesen.
Um zu ermitteln, ob „Bystander"-Suppression aus IL-10 resultiert, das in Reaktion auf aggregierte Immunglobuline produziert wird, die ein an Autoimmunkrankheiten beteiligtes Antigen umfassen, wurde EAE mit einem Gemisch aus Epitopen induziert und die Fähigkeit von agg-Ig-PLP1 gemessen, damit nicht in Beziehung stehende autoreaktive T-Zellen zu modulieren und die Krankheit zu bessern. Gruppen von SJL/J-Mäusen (8 pro Gruppe) wurden mit einem Gemisch von 100 μg PLP1 und 100 μg PLP2 für EAE induziert und an den Tagen 9, 13 und 17 mit 300 μg agg-Ig-PLP1 oder agg-Ig-W pro Injektion behandelt. Alle Behandlungen erfolgten i.p. in PBS. Der Ausbruch der Krankheit erfolgte bei diesen experimentellen Gruppen am Tag 7. Jeder Punkt stellt die mittlere klinische Bewertung von 8 Mäusen dar.
Die Ergebnisse sind in 39a gezeigt. Wie in 39a gezeigt ist, manifestierten Mäuse mit bestehender, durch ein Gemisch von PLP1- und PLP2-Peptiden induzierter EAE einen verminderten Paralyseschweregrad und gesundeten vollständig bis zum Tag 33 nach der Induktion der Krankheit nach Behandlung mit agg-Ig-PLP1, während mit agg-Ig-W behandelte Tiere eine schwere Paralyse aufwiesen und sich von der Krankheit während des 50-tägigen Zeitraums der klinischen Bewertung nicht erholten. Daher scheint endogenes IL-10 die Wirkungen auf PLP2-spzifische T-Zellen herabreguliert zu haben.
Krankheitsinduktion mit PLP2-Peptid sollte Gesamt-PLP exponieren und die Ausbreitung und Aktivierung von PLP1-spezifischen T-Zellen antreiben (McRae et al., J. Exp. Med. 182, 75-85 (1998); Tuohy et al., Immunol. Rev. 164, 93-100 (1998)). In diesem Fall sollte die Injektion von agg-Ig-PLP1 eine Brücke von IL-10 produzierenden APCs zu PLP1-spezifischen T-Zellen ausbilden und die „Bystander"-Suppression dieser Zellen sowie benachbarter PLP2-spezifischer T-Zellen fördern. Um zu ermitteln, ob die Verabreichung von agg-Ig-PLP1 an Mäuse, bei denen EAE mit PLP2 induziert wurde, für die „Bystander"-Suppression von PLP2-spezifischen T-Zellen sorgt, wurde das folgende Experiment durchgeführt.
Mäuse wurden mit PLP2-Peptid für EAE induziert und bei offensichtlichen Anzeichen von Paralyse mit agg-Ig-PLP1 wie folgt behandelt. Gruppen von SJL/J-Mäusen (8 pro Gruppe) wurden mit 100 μg PLP2 für EAE induziert und an den Tagen 9, 13 und 17 i.p. mit 300 μg agg-Ig-PLP1 pro Injektion behandelt. Eine Gruppe unbehandelter Mäuse (NIL) wurde zu Vergleichszwecken mit aufgenommen. Die Ergebnisse sind in 39b gezeigt.
Wie in 39b gezeigt ist, gesundeten die Tiere rasch bis zum Tag 26 und wurden im Gegensatz zu unbehandelten Mäusen für den verbleibenden Zeitraum der klinischen Bewertung nicht rückfällig, obwohl die Anfangsphase der Paralyse bei mit agg-Ig-PLP1 behandelten Mäusen nur wenig milder als bei unbehandelte Mäusen war. Diese Ergebnisse unterstützen die „Bystander"-Suppression und beweisen, dass die Epitop-Verbreitung eine Gelegenheit bietet, eine Krankheit in späteren Stadien der Paralyse zu modulieren.
Um die Fähigkeit von agg-Ig-PLP1 weiter zu erforschen, um die „Bystander"-Suppression von T-Zellen bereitzustellen, die für Antigene spezifisch sind, die nicht PLP1 sind, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Es wurde die Fähigkeit von agg-Ig-PLP1 zur Modulation der Krankheit gemessen, die mit ZNS-Homogenisat in duzierte wurde, das eine vollständige Palette von Myelin-Autoantigenen umfasst. ZNS-Homogenisat wurde wie folgt hergestellt. Fünfzig gefrorene ungestrippte Rattengehirne (Pelfreez Biologicals, Rodgers, AK) wurden in PBS unter Verwendung eines Waring-Mixers homogenisiert und mit PBS auf 300 mg/ml eingestellt. ZNS-Homogenisat wurde bei –20°C gelagert. Gruppen von SJL/J-Mäusen (9 pro Gruppe) wurden mit 6 mg ZNS-Homogenisat für EAE induziert und an den Tagen 9, 13 und 17 i.p. mit 300 μg agg-Ig-PLP1 oder agg-Ig-W pro Injektion behandelt. Eine Gruppe unbehandelter Mäuse (NIL) wurde zu Vergleichszwecken mit aufgenommen. Die Ergebnisse sind in 35 gezeigt.
Wie in 35 gezeigt ist, wiesen Mäuse, denen agg-Ig-PLP1 injiziert wurde, leichte Anzeichen von Paralyse in der Anfangsphase der Paralyse auf und gesundeten völlig bis zum Tag 24 nach Induktion der Krankheit ohne jegliche Rückfälle für den 60-tägigen Zeitraum der klinischen Bewertung. Mit agg-Ig-W anstelle von agg-Ig-PLP1 behandelte Kontrollmäuse wiesen ein Krankheitsmuster auf, das dem unbehandelter Mäuse ähnlich war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die herabregulierende Funktion von agg-Ig-PLP1 sich auf intra- sowie intermolekulare Epitope erstreckt und diverse T-Zellen-Spezifitäten supprimiert.
Beispiel XXXVII
Agg-Ig-PLP1 sorgt für Bystander"-Suppression durch Induzieren von APCs zur Produktion von IL-10
Exposition mit IL-10 scheint ein wahrscheinlicher Mechanismus zu sein, der der Herabregulation und Suppression von pathogenen Myelin-spezifischen T-Zellen zugrunde liegt. Die Quelle von IL-10 sind APCs, wie in 28 und 34 gezeigt ist, wie z.B. dendritische Zellen und Makrophagen. Jedoch warf die erweiterte Wirksamkeit und die Dauerhaftigkeit der T-Zellen-Modulation in dieser Situation die Frage auf, ob die „Bystander"-Suppression auf den Antagonismus der pathogenen T-Zellen durch IL-10 aus APCs oder auf die Herabregulation durch regulatorische T-Zellen zurückzuführen war, die unter der Wirkung von derartigem IL-10 erzeugt worden sind.
Um zu ermitteln, ob agg-Ig-PLP1 über eine Suppression der T-Zellen-Proliferation oder durch regulatorische T-Zellen agiert, wurden die folgenden Experimente durchgeführt. Lymphknoten-T-Zellen aus Mäusen, die sich von ZNS-induzierter Paralyse nach der Behandlung mit agg-Ig-PLP1 erholten, wurden mit Antigen stimuliert und auf Proliferation und Produktion von Cytokinen (Marker regulatorischer T-Zellen) getestet. Mäuse (6 pro Gruppe) wurden mit ZNS-Homogenisat für EAE induziert und dann mit agg-Ig-W (schraffierte Balken) oder agg-Ig-PLP1 (volle Balken) an den Tagen 9, 13 und 17 wie oben beschrieben behandelt. Zwei Tage nach Beendigung der Behandlungsregime wurden die Lymphknoten (axillär, lateral axillär und popliteal) geerntet und die Zellen (4 × 10⁵ Zellen/100 μl/Well) mit 100 μl/Well Antigen (PLP1, PLP2, MBP3 oder HA (Kontrolle)) stimuliert. Zellproliferation wurde drei Tage später unter Anwendung des [³H]Thymidin-Inkorporationstests festgestellt (40a). Zusätzlich wurden Cytokin-Reaktionen nach 24 Stunden Inkubation mit Antigen mittels ELISPOT unter Verwendung von 5 × 10⁵ Zellen pro Well analysiert (40b-g). ELISPOT-Tests wurden verwendet, um die durch Lymphknoten-T-Zellen nach Stimulation mit Antigen produzierten Cytokine wie in Min et al., J. Exp. Med. 188, 2007-2017 (1998), beschrieben zu messen. Zusammenfassend wurden Lymphknotenzellen (5 × 10⁵ Zellen/100 μl/Well) und das Antigen (100 μl/well) in mit Einfang-Antikörper beschichteten HA-Multiscreen-Platten (Millipore, Bedford, MA) 24 Stunden lang inkubiert. Gebundene Cytokine wurden mit Peroxidase und Anti-Cytokin-Antikörpern sichtbar gemacht. Die verwendeten Anti-Cytokin-Antikörper-Paare waren jene, die für die ELISA-Technik beschrieben wurden. Spots wurden unter einem Präpariermikroskop gezählt.
Die Antigene wurden bei den definierten optimalen Konzentrationen von 15 μg/ml für PLP1, PLP2 und HA und 30 μg/ml für MBP3 verwendet. Kontroll-Wells von Medium ohne Zusatz von Antigen waren mit enthalten und wurden als Hintergrund verwendet. Jeder Balken stellt den Mittelwert +/– Standardabweichung von 6 einzeln getesteten Mäusen dar. Die in 41 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass 2 Tage nach der letzten Injektion von agg-Ig-Chimären die Proliferation auf Myelin-Peptide bei den mit Kontroll-Ig-W behandelten Mäusen signifikant war, jedoch auf Hintergrundniveau für jene lag, die agg-Ig-PLP1 erhielten. Gleichermaßen wiesen Mäuse, die mit agg-Ig-PLP1 behandelt wurden, weder Th1- noch Th2-Typ-Cytokine auf und produzierten kein IL-10, IL-5 oder TGFβ, während jene, denen agg-Ig-W injiziert wurde, signifikante Mengen an IL-2 und IFNγ aufwiesen. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Mäuse am Tag 9 nach Beendigung der Behandlungsregime getestet wurden (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus zeigten Milz-T-Zellen und aus dem Peritoneum gewonnene Zellen ein ähnliches Reaktionsmuster (Daten nicht gezeigt). Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass die typischen proliferativen Reaktionen und Cytokinreaktionen als Markenzeichen regulatorischer T-Zellen in dieser speziellen Situation von systemischer Behandlung aktiver Autoimmunität nicht nachweisbar sind. Folglich ist die aus der Verabreichung von agg-Ig-PLP1 resultierende „Bystander"-Suppression auf Antagonismus der pathogenen T-Zellen durch von APCs produziertes IL-10 zurückzuführen.
Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird außerdem anerkennen, dass die vorliegende Erfindung in anderen speziellen Formen ausgeführt werden kann, ohne von deren beabsichtigten oder zentralen Merkmalen abzuweichen. Da die vorangehende Beschreibung der vorliegenden Erfindung lediglich beispielhafte Ausführungsformen davon offenbart, versteht es sich, dass andere Varianten als im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegend vorgesehen sind. Demgemäß ist die vorliegende Erfindung nicht auf die jeweiligen Ausführungsformen beschränkt, die hierin ausführlich beschrieben worden sind. Stattdessen sollte auf die beiliegenden Ansprüche als anzeigend für den Schutzumfang und Inhalt der Erfindung Bezug genommen werden.

Claims

Zusammensetzung, umfassend ein aggregiertes Immunglobulin oder einen Teil davon, gebunden an ein Antigen, das mit einer Autoimmunkrankheit assoziiert ist, worin das Immunglobulin oder der Teil davon in der Lage ist, Fc-Rezeptoren, die an den Zelloberflächen von Antigen-präsentierenden Zellen vorhanden sind, zu vernetzen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, weiters umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin die Zusammensetzung kein Adjuvans umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Immunglobulin in einer mehrwertigen Form vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Immunglobulin in eine Matrix eingebettet oder von ihr absorbiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Immunglobulin ein IgG-Molekül ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Antigen mit einer Autoimmunkrankheit, ausgewählt aus der aus multipler Sklerose, Lupus, rheumatoider Arthritis, Sclerodermia, Insulin-abhängigem Diabetes und Colitis ulcerosa bestehenden Gruppe, assoziiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Antigen ein Antigen aus Proteolipidprotein ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Antigen ein Antigen aus basischem Myelinprotein ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Immunglobulin oder der Teil davon zumindest einen Teil einer Domäne einer konstanten Region eines Immunglobulinmoleküls umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend ein Fusionsprotein, in dem das Antigen kovalent an das Immunglobulin oder den Teil davon gebunden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin das Antigen innerhalb von zumindest einer komplementaritätsbestimmenden Region des Immunglobulins angeordnet ist, um die komplementaritätsbestimmende Region teilweise oder vollständig zu ersetzen.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin das Antigen innerhalb von CDR3 angeordnet ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Immunglobulin ein menschliches IgG-Molekül ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Immunglobulin chimär ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung zu gesteigerter IL-10-Produktion durch Antigen-präsentierende Zellen führt und dadurch eine "Bystander"-Suppression von autoreaktiven T-Zellen bereitstellt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung zu gesteigerter IL-10-Produktion durch Antigen-präsentierende Zellen führt und dadurch die Produktion von IFNγ durch T-Zellen antagonisiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung die Eigenschaft aufweist, durch Zellen, die Fc-Rezeptoren tragen, Endocytose zu erfahren und durch die Antigen-präsentierenden Zellen verarbeitet zu werden, um so das Antigen in Assoziation mit endogenen MHC-Klasse-II-Molekülen zu präsentieren, wodurch die Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen in vivo unterbunden wird.