JP2004509978A - 免疫抑制因子のエンドサイトーシスによる提示のための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
少なくとも1つのFcレセプターリガンドと少なくとも1つの免疫抑制因子を含む免疫調節剤、及びその製造並びに使用方法を提供する。免疫調節剤は、ポリペプチドまたはキメラ抗体の形態であってもよく、T細胞レセプターアゴニストまたはアンタゴニストを含む免疫抑制因子を組み込んでいることが好ましい。本発明の化合物及び組成物は、アレルギー、移植組織拒絶反応、及び自己免疫性糖尿病、リウマチ様関節炎並びに多発性硬化症を含む自己免疫疾患のような免疫疾患に関連する症状を治療するために、選択的に免疫系を抑制するために使用することができる。
Description
【0001】
[発明の分野]
本発明は、概して、免疫抑制因子をエンドサイトーシスによって効果的に提示するための化合物、組成物及び方法に関する。さらに詳細には、本発明は、限定はされないが、自己免疫疾患を含む種々の疾患の治療に有用な免疫抑制因子を含む化合物、方法及び組成物に関する。好ましい実施態様では、前記免疫抑制因子はT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストであり得る。本発明の他の実施態様によって新生児または乳児における寛容の誘導がもたらされる。さらなる実施態様は、免疫グロブリンまたはその一部が抗原提示細胞の細胞表面に存在するFcレセプターと架橋することができる、抗原と結合する免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を提供する。他の実施態様は、IL−10レベルを、それを必要とする個体において増加する方法に関する。さらに他の実施態様は、末梢性寛容及び/またはバイスタンダーによる抑制を、それを必要とする個体において刺激する方法に関する。他の実施態様は、IFNγレベルを、それを必要とする個体において減少する方法に関する。さらなる実施態様において、本発明は、同時刺激性分子を欠如するか、あるいはそのレベルが低下している抗原提示細胞による自己抗原提示を促進する組成物を提供する。
【0002】
[発明の背景]
脊椎動物は、環境由来の病原体、及び、例えば内部的に発生する腫瘍細胞のような、異常細胞に対する防御として免疫応答を生じさせる能力を有している。免疫応答は多様な細胞と因子との間の複雑な相互作用の結果であるが、一般的には2つの主要な様相を含んでいる。1つは、細胞性成分であって、この場合には特別の細胞が(抗原を有する)有害作用物質を直接攻撃し、もう1つは体液性成分であって、この場合には抗体分子が抗原に特異的に結合してその排除を助長する。協同して働くと、それぞれの要素は侵入病原体の初期攻撃を制限して、それら病原体を宿主から排除するのに極めて有効である。
【0003】
免疫応答の提供に関与する主要な細胞はリンパ球であり、リンパ球は一般的に2つの主要なクラスを含む。B細胞またはBリンパ球と命名されるこれらクラスの第一のものは、典型的には骨髄で産生され、そして中でも、抗体の産生及び分泌に関与している。B細胞抗体産物は外来抗原と直接反応して、これらを中和するか、あるいは免疫系のその他の成分を活性化して、抗原を排除する傾向がある。特に、オプソニン化抗体は細胞外の外来因子と結合し、それによって食作用(ファゴサイトーシス)並びに後続する細胞内殺作用を受けやすくなる。他方、T細胞またはTリンパ球は、一般的には胸腺で発生あるいは成熟し、細胞性免疫応答の媒介に関与している。これらの細胞は抗原全体を認識するのではなく、その代わりに、標的細胞の表面に出現する特定のタンパク質に結合した抗原の短いペプチドフラグメントに応答する。さらに詳細には、細胞内で産生されるか、または細胞によって細胞外環境から取り込まれたタンパク質は正常な代謝経路によってペプチドまで連続的に分解されると思われる。その結果生じる短いフラグメントは細胞内の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子と会合して、このMHC−ペプチド複合体は細胞表面に輸送されてT細胞によって認識される。従って、細胞免疫系は細胞が産生または摂取した全てのタンパク質を常に監視しており、外来抗原または腫瘍抗原を提示している全ての細胞、即ちウイルス感染細胞またはガン細胞、を排除するために構えている。
【0004】
哺乳類抗体のうちで最も一般的な免疫グロブリンG(IgG)の一般的構造を図1に概略的に示す。図示されるように、IgGは2本の同一の重(H)鎖と2本の同一の免疫グロブリン軽(L)鎖を含む四量体タンパク質複合体である。これらの鎖はジスルフィド結合で結合されて、Y字状抗体複合体を形成する。しかしながら、溶液中ではこの分子はより球状の形態をとり、生体体液中に存在する外来抗原と容易に結合する。
【0005】
免疫グロブリンのアミノ酸配列分析によって、種々の機能活性を有する特異的な領域が鎖内に特定されている。各L鎖及び各H鎖は、最初の110個のアミノ末端残基内に特定された可変領域(それぞれ、VL及びVH)を有する。VL及びVH領域の三次元的対合は、免疫グロブリン分子の抗原認識部分あるいは「抗原結合部位」(「ACS」)を構成する。免疫グロブリンは四量体であるため、1分子当たり2個の同一の抗原結合部位が存在している。これらの鎖の可変ドメインは配列が高度に不均一であるので、極めて多様な抗原構造に対して高度に特異的な抗原結合部位の多様性が生じる。可変ドメインの不均一性は可変領域全体に均等に分布しているのではなくて、3つのセグメントに位置しており、相補性決定領域(「CDR」)と呼ばれ、CDR1、CDR2及びCDR3と命名されている。 これらの構造に関するさらなる情報については、Watsonら、Molecular Biology of the Gene(遺伝子の分子生物学)、第4版、Benjamin/Cummings Publishing Co.,Inc.、Menlo Park, CA、 1987 (本明細書に参照により編入されている)を参照のこと。
【0006】
各H鎖はまた、特別のイソタイプを特定する定常領域も含んでおり、これによって免疫グロブリンは免疫グロブリンクラス及びサブクラスの1つに割り当てられる。定常領域は、単一クラスの抗体間で顕著には変動しないドメインと呼ばれる単位(すなわち、CH1、CH2等)を含んでいる。定常領域は抗原結合に関与せず、例えば、抗原提示細胞(APC)の細胞表面のFcレセプターとの結合並びに補体タンパク質との結合のような「エフェクター機能」として公知のいくつかの生物学的活性に関連する可能性がある。樹状細胞及びマクロファージのような抗原提示細胞は、なかでも、Fcレセプターの存在という特徴によって一般に識別される。従って、抗体が病原体と結合する場合には、抗体は食細胞とFc部分を介して結合することができる。これは食細胞によって病原体が摂取および破壊されることを可能とし、このプロセスはオプソニン化として公知である。さらに、以下で詳細に考察するように、種々の病原性抗原はAPCによってプロセシング且つディスプレイされて免疫応答をさらに刺激すると思われる。
【0007】
H鎖とは異なり、L鎖は単一の定常ドメイン(CL)を有している。L鎖は、H定常領域CH1をCLに結合するジスルフィド結合によってH鎖と対合する。 さらに、H鎖は定常領域CH1及びCH2を分子の残り部分から分離するヒンジ領域を有している。四量体の可動性(フレキシビリティ)に大いに寄与しているのはこのヒンジ領域である。分子の2本のH鎖はヒンジ領域とCH2間の結合部でジスルフィド結合によって対合する。
【0008】
このような広範なレパートリーを提供するために、免疫グロブリン遺伝子は有限数の遺伝子から莫大な数の異なる免疫グロブリンタンパク質の産生が可能になるように(即ち遺伝的多型性)進化している。 遺伝的多型性の故に、哺乳動物は見たところは無限に多様な抗原に対して抗体を産生することができる。免疫グロブリン遺伝学及びタンパク質構造の総説については、Lewin、Genes III(遺伝子III)、John Wiley and Sons、New York、 1987、並びにBenjaminiら、Immunology(免疫学)、Alan R.Liss,Inc.、New York、 1988(これらは本明細書に参照により編入されている)を参照のこと。
【0009】
この2、3年の間に、その多様性及び特異性の故に、抗体は診断や治療の用途に極めて重要になってきている。科学的用途における抗体の多様性や利用可能性を発展させるために、分子生物学技術がますます使用されるようになっている。例えば、単一の抗体産生B細胞を腫瘍細胞との融合によって不死化させて、「モノクローナル抗体」(mAb)として公知の単一の特異性を有する抗体のインビトロの源を提供するように増殖することができる。このような不死化B細胞系は「ハイブリドーマ」と称されている。
【0010】
最近まで、ほとんどのmAbの源はインビトロで培養されたマウスハイブリドーマであった。すなわち、マウスは典型的には選択された抗原または免疫原の注射を受ける。その後、動物を屠殺し、その脾臓から取り出した細胞を不死化骨髄腫細胞と融合させた。これらは診断方法で広範に使用されているが、マウスmAbがヒトを含む大部分の哺乳動物での治療適用に好適であるとは証明されていない。これは、一部には、マウス抗体が他の哺乳類種によって外来性として認識され、そして疾病または望ましくない副作用を起因し得る免疫応答を誘発するという事実に拠る。
【0011】
外来性mAbによって生じる免疫応答並びに適切なヒトmAbが無いという問題のうちの少なくともいくつかを克服するために、遺伝子工学を使用して、マウス抗体の抗原結合相補性決定領域は含有しているが分子の残り部分は外来性と認識されないヒト抗体配列から成るヒト化キメラ免疫グロブリン分子が構築されてきた。そのような抗体は、マウス可変領域が腫瘍抗原を認識し、さらに分子のヒト化部分が、身体によって迅速に排除されることなく免疫応答を媒介することが可能であるために、腫瘍の治療に使用されている。例えば、Jonesら、Nature、321:522〜525、1986年を参照のこと(本明細書に参照により編入されている)。
【0012】
そのような抗体の他の用途は、同時係属中の米国特許出願第08/363,276号及びPCT公開第WO 94/14847号に詳記されている(これらもまた本明細書に参照により編入している)。これらの場合には、ウイルスまたは細菌エピトープのような外来抗原のエピトープが免疫グロブリンの超可変領域に移植されて応答を誘導する。すなわち、工学操作された抗体はワクチンとして使用されて免疫応答を誘発し、そして長期間の抗原性記憶を与え、それによって対象はその後の感染を退けることができる。
【0013】
これらのワクチン及びより伝統的なワクチンは、免疫系の両枝を刺激する点で効果的である。免疫応答の体液性成分に関連した複雑な作用にも係わらず、体液成分のみでは毎日曝されている無数の病原体攻撃から動物を効果的に保護することはできないであろう。むしろ、高等生物の生存及び増殖を可能にするのは高度に進化した細胞応答の存在のみである。
【0014】
前記に示したように、骨髄内の前駆体から生じるTリンパ球またはT細胞が、侵入ウイルス並びにその他の微生物に対する免疫応答における主役である。前駆幹細胞は胸腺に移動し、そこで、所謂胸腺細胞として特異化される。特に、これらは後に成熟T細胞による感染の検出を可能にするレセプター分子をディスプレイし始める。有益であるためには、T細胞はそのレセプターを介して微生物抗原(侵入物の存在をシグナル伝達するタンパク質マーカー)に付着可能でなければならない。同時に、自己反応性T細胞は正常組織を破壊する可能性があるので、それらは身体によって生成される物質に対して遮蔽されていなければならない。典型的には、有用なレセプターを作成する胸腺細胞のみが完全に成熟して血流に入って、身体をパトロールする。効果のない、あるいは身体自体の組織を攻撃するその他の細胞は、健常な個体では、胸腺を離れる前にアポトーシスによって排除される。
【0015】
細胞溶解性Tリンパ球またはTヘルパー細胞のどちらかとして最終的に循環に入る成熟T細胞は、そのレセプターが認識し得る抗原に遭遇しない限り、静止状態にある。前記リンパ球が親和性を有する特異的抗原に遭遇すると、リンパ球は増殖して、エフェクター機能を果たし、その結果外来抗原が排除される。
【0016】
T細胞は、これらが果たす異なるタスクに基づいていくつかの亜集団に分類されている。これらの亜集団には、T及びB細胞応答の促進または増強に必要なヘルパーT細胞(Th)、細胞溶解によって標的細胞を直接殺傷する細胞毒性(または細胞溶解性)Tリンパ球(CTL)、及び免疫応答をダウンレギュレートするサプレッサーT細胞(Ts)が含まれる。各々の場合に、T細胞は、抗原が抗原提示細胞表面に付着した特殊なタンパク質複合体によって細胞表面に提示されたときのみに、抗原を認識する。さらに詳細には、T細胞は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と集合的に称されるタンパク質群と会合した抗原を認識し得る膜貫通タンパク質複合体である、T細胞抗原レセプター(TCR)と称する特異的なレセプターを使用する。数千もの同一のTCRが各細胞に発現される。TCRは、機能と構造の両面について、B細胞が抗原レセプターとして使用する表面抗体(非分泌性)と関連する。さらに、T細胞の異なる亜集団もまた多様な細胞表面タンパク質を発現し、これらのうちのいくつかは特定の亜集団に特徴的であるため、「マーカータンパク質」と称される。例えば、ほとんどのTh細胞は細胞表面にCD4タンパク質を発現するが、ほとんどのCTL及びTs細胞は細胞表面にCD8タンパク質を発現する。これらの表面タンパク質は、APC表面にある特定のタンパク質またはタンパク質複合体の認識及びこれらタンパク質間の相互作用に依存する免疫応答の開始及び維持に重要である。
【0017】
かなり長い間、主要組織適合遺伝子複合体、すなわちMHCは実際に、明白な四次構造を含む一連のグリコシル化タンパク質を含むことが公知である。一般的には、この構造は以下の2つのタイプから成る:細胞内部で生成されるタンパク質由来のペプチド(ウイルス複製後に産生されるタンパク質等)をディスプレイしているクラスI MHC、及び一般的に外部から細胞に入ったタンパク質由来のペプチド(細菌トキシンのような可溶性抗原)をディスプレイしているクラスII MHC。種々の抗原の認識は、生じ得る微生物ペプチドのいずれをも結合することが可能な多様なMHC分子プールを連続的に生じる遺伝的多型性によって保証される。本質的に、全ての有核細胞は、天然ペプチド、腫瘍関連ペプチド、あるいはウイルス侵入物によって産生されたペプチドを呈示することができるクラスI MHCを産生且つ発現する。それとは逆に、一般的に抗原提示細胞として公知である、2、3の特定のリンパ系細胞のみが、クラスII MHCタンパク質を産生且つ発現する。細胞型に関わらず、MHCの両クラスはペプチドを細胞表面に運搬し、これらを静止Tリンパ球に提示する。通常、Th細胞はクラスII MHC−抗原複合体を認識し、一方CTLはクラスI MHC−抗原複合体を認識する傾向がある。
【0018】
適切なTCRを有する静止T細胞が、ペプチドをその表面にディスプレイしているAPCに遭遇すると、TCRはペプチド−MHC複合体と結合する。さらに詳細には、数百ものTCRが多数のペプチド−MHC複合体と結合する。十分なTCRが接触すると、累積効果がT細胞を活性化する。MHC−抗原複合体の特異的認識、及びこれに対する応答の原因となるT細胞上のレセプターは、いくつかの不可欠な血漿膜タンパク質の複合体で構成されている。先に考察したMHC複合体と同様に、多様なTCRプールは、体細胞の再配置を誘導する遺伝的多型性によって保証される。TCRのプールは多様であるが、それぞれ個々のT細胞は単一の特異的TCRのみを発現するということが強調されるべきである。しかしながら、各T細胞は典型的には、各細胞表面にある1個のペプチドにのみ特異的なこのレセプターのコピーを数千個も呈示する。その上に、他のいくつかのタイプの膜関連タンパク質がT細胞結合及び活性化に関与している。
【0019】
T細胞の活性化は一連の化学的シグナル(主として、サイトカイン)の産生を伴い、その結果細胞は直接作用するかまたは免疫系の他の細胞を刺激して作用させる。クラスI MHC−抗原活性化の場合には、CTLは増殖し、同一の抗原を提示している感染細胞を破壊するように作用する。感染細胞の殺傷はウイルスから生命維持を奪って抗体へのアクセスを可能として、最終的にウイルスを排除する。対照的に、クラスII MHC−抗原複合体によるTh細胞の活性化は、(宿主の防御系の一部である)抗原提示細胞を破壊するのではなくて、むしろTh細胞を刺激して増殖させ、そして種々の細胞に影響を与えるシグナル(再び主としてサイトカイン)を産生させる。特に、シグナル伝達は、B細胞の刺激、マクロファージの活性化、CTLの分化、並びに炎症の促進を誘導する。この協同した応答は比較的特異的であり、そしてクラスII MHC系によって提示されるペプチドを有する外来性エレメントに向けられる。
【0020】
正しく機能するとき、免疫応答は、微細病原体、そして程度はより低いが、新生細胞の排除に驚くほど有効である。一般的に、自己認識の複雑なメカニズムは極めて効率的であり、外来抗原に限ってのみ強い応答を起こすことが可能である。残念なことに、免疫系はしばしば機能不全を起こし、宿主の細胞に向かい、それによって自己免疫応答を誘発する。典型的には、自己免疫は、免疫細胞上の抗原レセプターが健常細胞上の特定の抗原を認識すると自己免疫が生じ、そのような特定の物質を有する細胞の死滅を起こすと考えられる。多くの場合に、自己免疫反応はこの反応を促す抗原がなくなると消失する点で、自己限定的である。しかしながら、ある場合は、自己反応性リンパ球は本来あるべき状態よりも長く生存して、アポトーシスを誘導するか、さもなければ正常細胞を排除し続ける。動物及びヒトにおいて、自己反応性細胞の生存の延長が少なくとも2つの慢性自己免疫疾患、即ち全身性エリテマトーデス及びリウマチ様関節炎、に関与していることを示すいくつかの証拠がある。
【0021】
他の作用メカニズムも種々の自己免疫疾患発症の原因であると考えられる。例えば、この数年間に、T細胞−APC相互作用のアビディティーが自己抗原に対する胸腺の学習と寛容を指令することが明らかになってきた。従って、アビディティー相互作用が高いとT細胞が排除されるが、アビディティー相互作用が低いと成熟及び胸腺からの退出が可能になる。このメカニズムは自己反応性の免疫系を除去するのに有効であるが、自己抗原が隔離されたり、有効レベルの胸腺提示値を達成しないか、胸腺の潜在性の影響を受けるか、または殆ど提示されない場合、自己反応性を有するT細胞前駆体は依然として産生されて末梢まで移動することができる。さらに、特定のT細胞レセプターと反応し得る超抗原、並びに抗原擬態、エピトープの拡散、またはペプチド潜在性よる末梢解放を刺激し得るイベントはそれらの自己反応性T細胞の活性化をトリガして、抗原暴露を起こす可能性がある。いずれの場合にも、自己抗原の連続的供給及びT細胞レセプターリガンド(ペプチド−MHC複合体)の豊富な産生がT細胞攻撃力のメカニズムであるらしい。自己寛容のこのような自然発生的崩壊の例には、多発性硬化症(MS)、リウマチ様関節炎(多分、複数のメカニズム)及びI型糖尿病が含まれ、その全てがT細胞介在性自己免疫疾患であると考えられている。
【0022】
いずれのメカニズムが免疫系の崩壊に寄与するかに関わりなく、その結果は個体にとって破滅的であり得る。例えば、多発性硬化症は米国において約250,000人に影響を与えている慢性の炎症性疾患である。この炎症プロセスは始めは中枢神経系の白質内で生じ、T細胞、B細胞及びマクロファージによって媒介され、軸索の脱髄の原因となる。臨床的な経過は正に多様であるが、最も一般的な形態は麻痺、感覚欠損及び視覚障害を含む神経欠損の再発によって示される。
【0023】
免疫細胞が中枢神経系の白質に拡散すると、免疫応答はミエリン上のいくつかの異なる抗原に対して標的化される。例えば、髄液中に出現する膜攻撃複合体によって補体カスケードを活性化するミエリンに向けられる重大な抗体応答が存在する。さらに、T細胞は、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)及びプロテオリピドタンパク質(PLP)上に提示されているような種々のミエリン抗原の一定の重要部分に対して標的化される。T細胞は次々にサイトカインを産生し、次にマクロファージが影響を受けてミエリンを攻撃し、ミエリン鞘の大きなチャンクを貧食する。協同的な攻撃によって脱髄部分が生じ、これによって軸索に沿った健全な伝達機能が障害されて、病態生理学的欠陥が生じる。多発性硬化症におけるミエリン鞘または原発性胆汁性肝硬変におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のような超分子構造のいくつかの成分に対する複数の免疫応答は、別々の臓器に関わる自己免疫疾患に罹患している個体に共通している。
【0024】
自己免疫疾患の治療法は種々のレベルで成功している。例えば、代謝制御によって臓器特異性自己免疫疾患を矯正することがしばしば可能である。機能を喪失して回復し得ない場合、機械的代用品または組織移植片が適当であることがある。しかしながら、MSを含むほとんどの不能障害のいくつかには有効な治療法がない。 コルチコステロイド及び修飾β−インターフェロンを含むいくつかの化合物は、MSの症状のあるものを軽減し得るが、重篤な副作用を有することが実証されているか、あるいは長期間の使用には望ましくないことが示されている。その他の治療法が有望であることが示されているが、有効性は未だ示されていない。
【0025】
この点に関して、MSの1つの有望な治療法はWO 96/16086(本明細書に参照により編入している)に記載されており、これはミエリン塩基性タンパク質(MBP)のペプチド類似体の使用について開示している。これらの類似体を含む組成物は、過度の副作用を有することなくMSの症状を改善できることが報告されている。さらに、ミエリン構築タンパク質のペプチド類似体の使用は、MSモデルとしてのマウスでしばしば使用される臓器特異性免疫疾患である、実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)の症状の治療に有効であることが示されている。 詳細には、プロテオリピド(PLP)ペプチド由来のペプチド類似体によって、EAEの回復が達成された(Kuchrooら、J.Immunol.153:3326〜3336、1994、本明細書に参照より編入している)。天然PLPペプチド内の主要TCR接触残基を変異させたとき、結果として生じるペプチド類似体は、天然ペプチドと同様に、MHCに結合するがPLP特異的T細胞を活性化しないことが示された。その代わり、PLP類似体はT細胞のインビトロ活性化を阻害する。
【0026】
ペプチド類似体は、攻撃的なT細胞のエフェクター機能を調節し、自己免疫疾患を改善する魅力的なアプローチを代表するが、いくつかの問題がこれらペプチド類似体の有効性を制限する。例えば、典型的なAPCの表面では数個のMHC−ペプチド複合体しか利用が可能ではなく、これはT細胞を活性化するために単一複合体が約200個のTCRを連続的にトリガしなければならないことを意味する。自己抗原がMHC系による正常なプロセシング及び提示用に連続的に利用できる場合、前記ペプチド類似体との結合には極めて少数の表面MHC複合体しか利用できないように思われる。さらに、遊離ペプチドは典型的に半減期が非常に短く、MHC−抗原提示系によって容易に取り込まれたりプロセシングされたりしないので、天然ではAPC上に殆ど発現されない。提示が非効率的であるため、各T細胞上にある数千ものTCRと直接に結合するためには、細胞内において法外に高レベルの遊離ペプチドを必要とすると思われる。細胞表面MHC分子の代謝も細胞外環境で形成された複合体の存在時間が短い一因である(すなわち、MHCクラスII分子は細胞外ペプチドと結合する前にかなりの期間細胞表面に存在している)が、エンドサイトーシス用コンパートメントで形成された複合体は細胞表面に位置を移されたばかりなので、通常の期間残留する。結局、先に言及したように、そのような合成エピトープまたは類似体の投与は哺乳類体内におけるペプチドの半減期が短いことからしても、非常に問題が多い。MHC複合体と投与されたペプチドの短い半減期の間では、十分な免疫応答の誘導を可能にするには有効な暴露が短すぎて、さらに高用量を必要とする。
【0027】
従って、本発明の一般的な目的は、免疫疾患を治療するために脊椎動物の免疫系を効果的に修飾するための方法と関連組成物を提供することである。
【0028】
本発明の他の目的は、細胞免疫応答の調節を必要としている対象の細胞免疫応答を調節するために、T細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストを効果的に提示するための方法と組成物を提供することである。
【0029】
本発明のさらなる目的は、種々の免疫疾患の治療及び改善のための方法と組成物を提供することである。
【0030】
本発明のさらに他の目的は、新生児または乳児におけるT細胞寛容の誘導のための方法及び組成物を提供することである。
【0031】
本発明のさらに他の目的は、多発性硬化症を含む自己免疫疾患に関連する病理学的症状の軽減を提供することである。
【0032】
[発明の概要]
これら及びその他の目的は、広範な見地からすれば、Fcレセプターが媒介する、エンドサイトーシス送達系を提供する本発明の方法並びに関連化合物及び組成物によって達成される。選択された実施態様では、本発明は免疫抑制因子の効果的な提示を提供し、好ましい実施態様では、前記因子はT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストを含み得る。その他の好ましい実施態様は、1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む免疫抑制因子を組み込んでいる。即ち、本発明は一般的に、脊椎動物において免疫応答を選択的に修飾するための免疫抑制因子を提示する方法、化合物及び組成物を提供する。特に好ましい実施態様では、本発明は、特定の抗原に対して生じる免疫応答を調節するために、1つまたはそれ以上の選択されたT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストのFcレセプター介在性のエンドサイトーシスによる提示を提供する。当業者によって認められるように、開示された方法及び組成物を使用して、脊椎動物の免疫応答に関連する任意の生理学的異常を治療することができる。例えば、免疫系の選択された成分を抑制するこの能力は、中でも、自己免疫疾患の治療、組織または臓器移植の容易化、並びにアレルゲンによって生じた症状の緩和を可能にすると思われる。また、本発明はさらに、新生児及び乳児において自己抗原に関する寛容の誘導を提供する。
【0033】
本発明の好ましい局面では、選択された免疫抑制因子のエンドサイトーシスによる提示は、抗原提示細胞のFcレセプター(FcR)と結合することのできる免疫調節剤の使用によって容易になる。典型的には、前記免疫調節剤はFcレセプターと結合し得る少なくとも1つのリガンドと会合した少なくとも1つの免疫抑制因子を含む。免疫調節剤は抗原提示細胞(APC)と結合すると、APCの天然エンドサイトーシス経路によって細胞内に取り込まれそしてプロセシングされる。好ましくは、自己抗原性ポリペプチドまたはT細胞レセプターアンタゴニスト又はアゴニストの一部またはそれ自体であり得る免疫抑制因子は細胞内に取り込まれた後、新たに合成された内因性MHCクラスII構造体と会合してAPC表面に提示される。当業者は、免疫抑制因子(特にアンタゴニスト)は、MHCクラスII構造体と結合したときT細胞レセプターと複合体を形成するが、T細胞の活性化は促進しないことを認めるであろう。同様に、同時刺激性分子が存在しない場合、自己抗原性ポリペプチドまたは直接投与されたTCRアゴニストのAPCによる提示が寛容の誘導を導くことが認められるであろう。従って、適切なTCRアンタゴニストまたはアゴニストがFcR介在によって効率良く提示されると(ここで、アゴニストは自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントに由来し得る)、既に感作されたT細胞(即ち、特定の自己抗原に感作された細胞)が活性化され、天然自己抗原が正常に提示されているにもかかわらず、免疫応答をトリガすることを防御できる。
【0034】
広義には、本発明の免疫調節剤は、抗原提示細胞のFcレセプターと結合して細胞内に取り込まれることができる任意のリガンド(FcRリガンド)を含み得る。即ち、FcRリガンドは、任意の抗原提示細胞の表面のFcレセプターと効果的に結合する任意のタンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチドまたは分子であり得る。FcRリガンドは、免疫グロブリン分子の定常領域の少なくともある部分を含むか、あるいは模擬しており、対象内で抗原応答を誘発しないことが好ましい。本発明の選択された局面では、FcRリガンドはIgG分子の定常領域の一部または全部を含んでいる。特に好ましい実施態様では、治療を受ける種に由来する選択された免疫グロブリン分子の全定常領域を含むFcRリガンドが使用される。勿論、Fcレセプターとの結合はまた、単一定常領域ドメインの小フラグメントまたは非アミノ酸分子を含むリガンドによって影響されることがあることも認められよう。いずれにしても、FcRリガンドは、定方向進化、組み合わせ化学、またはラショナルドラッグデザインのような近代的製薬技術を用いて得ることができる。
【0035】
先に言及したように、本発明の化合物は、免疫調節剤を供給するためにFcRリガンドと会合した免疫抑制因子をさらに含む。本発明の目的では、免疫抑制因子はAPCによってプロセシングされ、細胞表面のクラスII MHC分子と会合して提示され得る任意の分子であり得る。前述するように、本発明の選択された実施態様は、Fc介在性取り込みを介して効果的な提示を行うために、少なくとも1個のT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストをFcRリガンドと会合させること含む。特に好ましい実施態様では、免疫抑制因子は、所望するTCRアゴニストを供給するためにプロセシング(即ち、消化あるいはタンパク質分解)し得る、1つまたはそれ以上の選択された自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントを含む。好ましくは、自己抗原性ポリペプチド(複数でもよい)、またはそのフラグメントは、エンドサイトーシスによるプロセシング中のタンパク質分解から生じる、1つ以上のペプチドアゴニスト(即ち、1つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド)を供給する。適切な同時刺激性分子が存在しない場合にAPCによってアンタゴニストまたはアゴニストが提示されると、関連する自己抗原に対する免疫応答のダウンレギュレーションを起因する。
【0036】
特に好ましい実施態様では、本発明はT細胞アンタゴニストの全部または一部を含む免疫抑制因子を使用する。本開示の目的では、「アンタゴニスト」の用語は、その通常の意味に従って、別の物質のレセプターと結合し、これをブロックすることによって、その物質の生理学的作用を干渉する任意の物質を含む。さらに詳細には、TCRアンタゴニストは、クラスII MHC分子と共同して、T細胞レセプターと非反応的に会合して、さらにそのT細胞レセプターを介して負のシグナル伝達を誘導できる分子的実体である。好ましくは、TCRアンタゴニストは、正常な活性化抗原アゴニストの類似体であるペプチドまたはタンパク質フラグメントを含む。特に好ましい実施態様では、TCRアンタゴニストはT細胞エピトープの類似体である。
【0037】
他の好ましい実施態様では、免疫抑制因子は、提示されるが、結合に際して感作TCRを活性化しないT細胞アゴニストを含むことができる。本発明のこの局面に関して、驚くべきことには、FcRリガンドを用いて自己抗原アゴニストが効果的に提示されると、免疫系を刺激するよりはむしろ寛容誘導を導き得ることが発見されている。即ち、自己抗原性アゴニストの効率の良いFcR取り込みは、一般的に同時刺激性分子を欠如するノンプロフェッショナル及び/または非活性化プロフェッショナルAPCによるアゴニストの提示を導くと思われる。先行技術に基づく考えに反して、このタイプの提示は、最終的には自己反応性T細胞の不活性化、免疫系のダウンレギュレーション、及び任意の関連する自己免疫疾患の改善を誘導する。APCの活性化または同時刺激性分子(即ち、B−7.1、B−7.2、CD40等)の産生を回避するために、TCRアゴニスト構築物あるいは自己抗原性ポリペプチド構築物を産生するアゴニストの投与は、好ましくは(生理食塩水のような)アジュバントを欠如する担体を用いて行われる。
【0038】
本開示の目的では、「アゴニスト」の用語は通常容認される生化学的意味に従って使用される。この点に関して、T細胞アゴニストは所望の免疫原性結果を提供する任意の分子であり得るが、選択されるアゴニストは好ましくはペプチド又はタンパク質フラグメントを含むことが認められるであろう。さらに、当業者は、1つまたはそれ以上のT細胞レセプターアゴニストを含む免疫調節剤は、1つまたはそれ以上のT細胞レセプターアンタゴニストを含む免疫調節剤と組み合わせて、患者の免疫応答を選択的に軽減するために使用できる医薬製剤を提供することができることを認めるであろう。
【0039】
本発明のこの局面に関して、最終的に提示されたTCRアゴニストは1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドの全部または一部を含む免疫抑制因子に由来し得る。即ち、本発明の構築物は、1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントと会合するFcRリガンドを含むことが好ましい。典型的には、組み込まれた自己抗原性ポリペプチド(複数でもよい)またはフラグメントは、野生型アミノ酸配列を含み、FcR介在による取り込み後にプロセシング(即ちタンパク質分解)されたときに、プロフェッショナルまたはノンプロフェッショナルAPCによる提示に対する1つまたはそれ以上のTCRアゴニストを供給する。本発明に従うそのような構築物の投与は、エピトープの拡散を伴う障害を克服するために使用できるために特に好都合である。さらに詳細には、自己免疫が自己抗原上にある複数のエピトープに関連する場合、対応する(自己抗原全体を含む免疫抑制因子由来の)アゴニストのそれぞれの提示は、目的のエピトープ全てについて寛容を誘導する。同様にして、複数のアゴニストの提示は、別々の個体が特定の自己抗原の別々のエピトープに対して自己反応性を生じるような集団に投与される場合に有効であると証明されるであろう。
【0040】
例として、本発明の構築物は、天然ミエリン塩基性タンパク質(MBP)または天然プロテオリピドタンパク質(PLP)に共有結合するIgG分子の全Fc領域を含む融合またはキメラタンパク質の形状をとり得る。他の実施態様では、本発明と適合性のある融合タンパク質は、共有結合されたPLP及びMBPの天然型(即ち、IgGFc−MBP−PLP)を含む免疫抑制因子に共有結合するIgGのFc領域を含むことができる。そのような構築物は、FcRを介して細胞内に取り込まれ、エンドサイトーシスによるプロセシングを受け(タンパク質分解され、結果生じるアゴニストフラグメントがMHC複合体と会合する)、そしてAPCの表面上に提示される。構築物の効率の良い取り込みと同時刺激性分子の欠如に基づき、提示されるアゴニストレベルが比較的高い故に、FcRリガンド/自己抗原構築物の投与は、免疫応答を刺激するというよりはむしろアネルギー(抗原反応不顕性)を誘導する。勿論、天然自己抗原性ポリペプチドの選択されたフラグメントまたは部分を使って、適合性のある免疫抑制因子を作成することができる。当業者は、そのような融合またはキメラタンパク質は、近代の分子生物学技術を用いて容易に構築し得ることを認めるであろう。
【0041】
開示する化合物及び関連方法では、FcRリガンドは免疫抑制因子と会合して免疫調節剤を形成するため、実質的に同時に両方ともAPCによって細胞内に取り込まれる。先に言及したように、本会合は、抗体−抗原複合体のように互いに結合する2個またはそれ以上の分子の形状をとるか、または、好ましい実施態様では、免疫抑制因子(即ち、1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはTCRアンタゴニストまたはアゴニスト)及びFcRリガンドの両方を組み込む単一の融合またはキメラ分子の形成を含むことがある。例えば、選択されたTCRアンタゴニストは、タンパク質分解技術によって産生されたFcRリガンド領域(即ち、Fcフラグメント)に化学的に結合されてもよい。その他の実施態様は、アンタゴニストまたはアゴニストペプチドに立体的に結合されたFcRリガンドを含む正常免疫グロブリンを含み得る。本発明の特に好ましい実施態様は、遺伝子工学技術によって産生されたキメラ免疫グロブリンを含む。これらの化合物においては、FcRリガンド(そして通常は該分子の大部分)は1つまたはそれ以上の免疫グロブリン定常領域を含んでおり、一方1つまたはそれ以上の可変領域が工学操作されて、1つまたはそれ以上の所望のペプチドTCRアンタゴニストまたはTCRアゴニストを発現する。当業者は、前述の免疫調節剤の任意の組み合わせを会合させて本発明の組成物を形成できるように、別の免疫抑制因子を含む類似の免疫調節剤も同様に形成できることを認めるであろう。さらに、先に考察したように、種々の免疫調節剤の混合物または「カクテル」は、本発明の範囲内に含まれるように特に意図されている。
【0042】
本発明のある局面では、免疫調節剤は、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターを架橋することが可能な形状であり得る。例えば、免疫調節剤は多価型であり得る。ある実施態様では、免疫調節剤(複数でもよい)は固定化あるいは凝集されて、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターを架橋することが可能な構築物または構造体を提供することができる。
【0043】
マクロファージ上にあるFcγRの架橋が抗炎症活性を有することが示されている。(Berger ら、Eur. J. Immunol.、 26:1297〜1301、1996; Bergerら、Eur. J. Immunol.、 27:2994〜3000、 1997; Sutterwala ら、 J. Exp. Med.、188:217〜222、1998、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。同様に、凝集は、FcRの架橋及び補体結合のようなIg Fc関連機能を供与する(Christian, J. Immunol.、 84:112〜121、 1960; Rosenqvist ら、 Mol Immunol.、 24:495〜501、 1987、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。
【0044】
IL−10またはIL−4がプラズミドまたはウイルスベクターから産生されるT細胞またはハイブリドーマ細胞株を、進行性のEAEを罹患する動物に注射すると、疾患の回復を誘導することが示されている(Mathisen ら、 J. Exp. Med.、186:159〜164、1997; Shawら、J. Exp. Med.、185:1711〜1714、1997; Maら、J. Immunol. 161:1516〜1524、 1998、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。
【0045】
抗原−抗体複合体への暴露に際してマクロファージによって産生されるIL−10が、IL−12産生に対するアンタゴニスト効果を及ぼすこと、並びにプロ炎症応答を回復することが示されている(Sutterwalaら、J. Exp. Med.、188:217〜222、 1998; Bergerら、Eur. J. Immunol. 27:2994〜3000、 1997、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。
【0046】
その上、IL−10はバイスタンダー抑制を生じ、それによって自己免疫疾患の原因となる種々の抗原に向けられたT細胞の活性を阻害することができる(Falconeら、J. Exp. Med.、185:901〜907、 1997; Stohlmanら、J. Immunol.、163:6338〜6344、 1999、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。バイスタンダー抑制は、APCによって産生されたIL−10による病原性T細胞のアンタゴニズム(拮抗性)に起因するか、あるいはIL−10の作用によって生じた制御性T細胞によるダウンレギュレーションに起因すると提案されている(Grouxら、Nature (Lond.)、389:737〜742、1997、この開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。IL−10が、ナイーブT細胞をIL−10、IL−5、あるいはTGFβを産生できる調節細胞に発生分化させ、抑制を持続することにより病原性T細胞の機能を阻害することが示唆されている(Grouxら、Nature (Lond.)、389:737〜742、1997;Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 93:388〜391、1996; Assemanら、J. Exp. Med. 190:995〜1003、1999; Grouxら、Immunol. Today、20:442〜445、1999; Seddonら、J. Exp. Med.、189:877〜881、1999;Seddonら、Immunol. Today、 21:95〜99、2000、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。
【0047】
従って、本発明のある実施態様では、免疫調節剤は、IL−10及びIL−6のような抗炎症性サイトカインの産生を誘導且つ/または以下にさらに詳細に記述されるように個体においてIFNγのレベルを減少することができる。凝集免疫調節剤による治療はまた、IL−4、IL−9、IL−13、TGF−βのようなその他のサイトカインのアップレギュレーションを誘導し得る。
【0048】
当業者は、所望する凝集または固定化免疫調節剤は、いくつかの公知の技術の任意の一つを用いて製造し得ることを認めるであろう。例えば、本発明の免疫調節剤は、ミクロスフェアまたは微細粒子(例えば、ラテックス、脂質、アルブミン、PVP、あるいはメタクリル酸塩微細粒子)と化学的に会合するか、または投与し易いポリマー基質中に固定化することができる。他の実施態様では、免疫調節剤は、化学的または熱力学的に結合または修飾されて、可溶性あるいは不溶性凝集物を形成することができる。さらなる実施態様では、凝集免疫調節剤は、硫酸アンモニウム沈降法のような、沈降法によって調製することができる。これらの凝集物あるいは固定化構築物は次に、薬学的に許容可能な担体を組み合わせて、本明細書の教示に従って投与することができる。
【0049】
その上、免疫調節剤は、抗原提示細胞の細胞表面上に存在する同時刺激性分子のレベルを減少して、それによって末梢性寛容を誘導する(Fowlkesら、Curr. Opin. Immunol.、5:873〜879、 1993; Arnold ら、 Immunol. Today、14:12〜14、1993;Kosakaら、J. Exp. Med.、177:367〜378、1993;McCormackら、J. Immunol.、150:3785〜3792、1993;Rochaら、Science (Washington、 D.C.)、 251:1225〜1228、1991;Webbら、Cell.、63:1249〜1256、1990;Jenkinsら、Curr Opin Immunol.、5:361〜367、1993、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。末梢性寛容は、末梢(即ち、自己抗原を標的化するT細胞に対する初期選択が起こる胸腺の外部)における自己免疫疾患に関与する抗原の利用性、及び同時刺激性分子が存在しないか、あるいはそのレベルが低下している非活性化抗原提示細胞による末梢での自己抗原の提示に起因する。
【0050】
さらに詳細には、凝集、固定化または非凝集の可溶性形状のいずれであるにせよ、開示された組成物は、従来の製薬技術および担体を用いて製剤化することができ、通常のルートで投与することができる。特に好ましい実施態様は、アジュバントを含まない製剤または担体の使用を含む。アジュバントを含まない形状での抗原の供給は、APC上の同時刺激性分子の発現を刺激せず、これによってT細胞活性化に不適当である抗体提示を起因するらしい(Fowlkesら、Curr. Opin. Immunol.、 5:873〜879、 1993;Jacobsら、Immunology、82:294〜300、1994; Muellerら、Curr. Opin. Immunol.、7:375〜381、 1995、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。このアプローチは、自己反応性T細胞を調節し、さらに疾病の回復を促進する(Elliottら、J. Clin. Invest.、98:1602〜1612、1996; Gaurら、Science (Washington、 D.C.)、 258:1491〜1494、1992;Liblauら、Immunol. Today、 18:599〜604, 1997;Critchfieldら、Science (Washington、 D.C.)、263:1139〜1143、 1994;Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:388〜391、1996; Devauxら、J. Neuroimmunol.、 75:169〜173、1997; Leadbetterら、J. Immunol.、161:504〜512、1998;Staykovaら、Immunol Cell Biol.、75:54〜64、1997、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。従って、当業者は、そのような調剤は、免疫応答を惹起し得る同時刺激性分子の発生を回避するか、あるいは最小限にすることを認めるであろう。
【0051】
いずれにせよ、免疫調節剤のFcR介在性取り込みを使用することによって先行技術による組成物に関連した問題の多くが回避される。さらに詳細には、本発明の方法は、先行技術で開示されているような遊離ペプチドアンタゴニストの投与に関連した制限の多くを克服している。従って、TCRアンタゴニストのような免疫抑制因子のエンドサイトーシスによる効率の良い提示によって相当量のMHC−アンタゴニストリガンドが産生され、自己反応性抗原の連続的提示に係わる自然発生免疫疾患で産生される天然MHC−自己抗原複合体に対抗することができる。同様に、FcRリガンド−アゴニスト(または自己抗原性ポリペプチド)構築物の効果の良い取り込みと、これに後続する所望するアゴニスト(複数でもよい)の提示は、自己反応性T細胞にアネルギーを誘導することができる。このため、本発明を使用して免疫抑制因子の提示に応答する任意の免疫疾患を治療することができる。これは、例えば、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎を含むT細胞介在性自己免疫疾患に特に当てはまる。同様にして、本発明を使用してアレルゲンのような連続的に提示されるアゴニストに関して免疫系を選択的にダウンレギュレートすることができる。さらに、本発明の化合物や関連組成物を使用して免疫系の種々の成分を選択的に抑制して、移植後の組織または臓器の拒絶反応の可能性を低下させることができる。
【0052】
前述の利点の他に、驚くべきことには、本発明の化合物、組成物及び方法を使用して新生児及び乳児に種々の自己抗原に対する寛容を誘導できることが見い出された。さらに詳細には、本発明は、成体期における自己免疫疾患の誘導に対して新生児または乳児哺乳類に耐性を与える組成物や方法をさらに提供する。本明細書の教示によれば、この新生児寛容は、二次リンパ系器官における応答の逸脱及び適切な自己抗原のチャレンジに際しての異常なγインターフェロン介在性脾臓アネルギーを特徴としている。前記に考察するように、本発明の好ましい実施態様は、非反応性担体(すなわち、アジュバントを含まないもの)中での投与に際して、所望する新生児寛容の誘導を提供することができる。
【0053】
本発明のいくつかの局面を以下に要約する。
【0054】
本発明の一つの実施態様は、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物であり、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部は、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターと架橋することができる。組成物はさらに薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。本実施態様のある局面において、組成物はアジュバントを含まない。本発明のある局面では、免疫グロブリンは多価型である。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは基質中に包埋されているか、あるいは吸着されている。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは凝集している。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンはIgG分子である。本実施態様のその他の局面では、抗原は疾患に関連する抗原を含む。本実施態様のその他の局面では、抗原は自己免疫疾患に関連する抗原を含む。例えば、抗原は、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連し得る。本実施態様のある局面では、抗原はプロテオリピドタンパク質由来の抗原である。本実施態様のその他の局面では、抗原はミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である。本実施態様のさらなる局面では、免疫グロブリンまたはその一部は、免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む。例えば、抗原は、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換していることがある。本実施態様のある局面では、抗原はCDR3内に位置する。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはヒトIgG分子である。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはキメラである。
【0055】
本発明の他の実施態様は、自己免疫疾患に関連する症状を改善する方法であって、前記方法が、前記自己免疫疾患に係わる抗原と結合する免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を得ることを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部は抗原提示細胞の細胞表面に存在するFcレセプターを架橋することができ、さらに前記組成物を前記自己免疫疾患に罹患している個体に投与することを含む。本実施態様のある局面では、組成物はさらに製剤上に許容可能な担体を含む。本実施態様のある局面において、組成物はアジュバントを含まない。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは凝集している。本実施態様のある局面では、抗原は疾患と関連する。本実施態様のある局面では、抗原は自己免疫疾患と関連する。本実施態様のある局面では、抗原は、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する。本実施態様のある局面では、抗原はプロテオリピドタンパク質由来の抗原である。本実施態様のその他の局面では、抗原はミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンまたはその一部は、免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む。本実施態様のある局面では、抗原は、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換していることがある。本実施態様のある局面では、抗原はCDR3内に位置する。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンはヒトIgG分子である。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはキメラである。
【0056】
本発明の他の実施態様は、個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法が、IL−10レベルを増加する必要性のある個体を識別すること、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することにより前記個体のIL−10レベルを増加することを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部が、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターを架橋することができる。本実施態様のある局面では、個体は自己免疫疾患に罹患している。本実施態様のある局面では、組成物はさらに製剤上に許容可能な担体を含む。本実施態様のある局面において、組成物はアジュバントを含まない。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは凝集している。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは脂質またはポリマー基質上に固定化されている。本実施態様のある局面では、抗原は、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する。本実施態様のある局面では、抗原はプロテオリピドタンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、抗原はミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンまたはその一部は、免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む。本実施態様のある局面では、抗原は、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換する。本実施態様のある局面では、抗原はCDR3内に位置する。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンはヒトIgG分子である。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはキメラである。
【0057】
本発明の他の実施態様は、個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法がIL−10レベルを増加する必要性及び末梢性寛容を刺激する必要性のある個体を識別すること、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することにより該個体のIL−10レベルを増加並びに末梢性寛容を刺激することを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部が、抗原提示細胞の細胞表面に存在するFcレセプターを架橋することができる。本実施態様のある局面では、個体は自己免疫疾患に罹患している。本実施態様のある局面では、組成物はさらに製剤上に許容可能な担体を含む。本実施態様のある局面において、組成物はアジュバントを含まない。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは凝集している。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは脂質またはポリマー基質上に固定化されている。本実施態様のある局面では、抗原は、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する。本実施態様のある局面では、抗原はプロテオリピドタンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、抗原はミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンまたはその一部は、免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む。本実施態様のある局面では、抗原は、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換していることがある。本実施態様のある局面では、抗原はCDR3内に位置する。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンはヒトIgG分子である。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはキメラである。
【0058】
本発明の他の実施態様は、個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法が、IFNγレベルを低下させる必要性のある個体を識別すること、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することにより前記個体のIFNγレベルを低下させることを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部が、抗原提示細胞の細胞表面に存在するFcレセプターを架橋することができる。
【0059】
本発明の他の実施態様は、複数の自己抗原に対する免疫応答に起因する自己免疫疾患の症状を軽減する方法であって、前記方法が、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部が、抗原提示細胞の細胞表面に存在するFcレセプターを架橋することができ、さらに前記抗原が前記自己免疫疾患の原因となる抗原の一つである。
【0060】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、本発明の以下に詳記した好ましい実施態様の説明を、簡単に記載されている図面と共に考慮することによって、当業者には明白であろう。
【0061】
[好ましい実施態様の詳細な説明]
本発明は多数の異なる形態で実施することができるが、本明細書では本発明の原理を例示する具体的な実施例を開示する。本発明は例示した特定の実施態様に限定されないことを強調すべきである。
【0062】
先に言及したように、本発明はFcレセプター介在性エンドサイトーシス送達系を用いて脊椎動物の免疫応答を選択的に修飾する化合物、組成物及び方法を提供する。本質的に、免疫系をダウンレギュレートするためにこの細胞取り込み形態を利用できる免疫調節剤はいずれも本発明の一部を構成すると考えられる。中でも、本発明の免疫調節剤はキメラまたは融合ポリペプチド、抗原−抗体複合体、キメラ抗体または非ペプチド性免疫活性化合物を含むことができる。好ましい実施態様では、本明細書に開示した免疫調節化合物は少なくとも1つのFcRリガンドと、エンドサイトーシスによる提示に際して免疫応答をダウンレギュレートし得る少なくとも1つの免疫抑制因子を含む。本発明の特に好ましい実施態様は、免疫抑制因子が、エンドサイトーシスによるプロセシング及び提示後に、感作T細胞表面のレセプターとは結合し得るが免疫原性応答を生じさせることができない、1以上のT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストである免疫調節剤を含む。このような実施態様では、提示された免疫抑制因子は、関連する感作T細胞の活性化を防止して、生じる応答を低下させる。この免疫系の選択的抑制は、中でも、T細胞介在性自己免疫疾患を含む免疫疾患、アレルギー及び移植手術における組織拒絶反応に関連した症状を治療するために使用することができる。
【0063】
従って、一つの実施態様では、本発明は脊椎動物の抗原提示細胞の表面に免疫抑制因子をエンドサイトーシスによって提示するための免疫調節剤を含み、前記免疫調節剤は少なくとも1つのFcレセプターリガンドと少なくとも1つの免疫抑制因子とを含む。好ましい実施態様では、免疫グロブリン定常領域ドメインの少なくとも一部分に相当するFcレセプターリガンドが含まれており、一方免疫抑制因子は少なくとも1つのT細胞レセプターアンタゴニストに相当する。他の好ましい実施態様は、T細胞レセプターアゴニストを含む免疫抑制因子が組み入れられている。さらに、前記に詳細に考察したように、免疫抑制因子は1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントを含むことができ、従って、エンドサイトーシスによるプロセシング及び提示の際に1つまたはそれ以上のTCRアゴニストを生じる。特に好ましい実施態様では、免疫調節剤は組換えポリペプチドまたはキメラ抗体を含む。
【0064】
選択した免疫調節剤のFcR介在性取り込みを利用することによって、本発明は身体自体の代謝経路を非常に巧妙に利用して有害な免疫応答をダウンレギュレートする。さらに詳細には、本発明は、T細胞が他の細胞の表面に付着すると外来抗原を認識且つ応答するという事実を利用している。本明細書の教示に従って適当な免疫調節剤(複数でもよい)を選択すると、投与された化合物の効率的な取り込みが生じる。FcR介在性取り込み後に、抗原提示細胞の天然エンドサイトーシス経路によって、選択された免疫抑制因子はMHCクラスII分子と複合体を形成し効果的に提示される。
【0065】
前記のように、ある細胞をクラスII MHC制限ヘルパーT細胞リンパ球用の抗原提示細胞として機能させることができる2つの必須の特性は、エンドサイトーシスを受けた抗原をプロセシングできること及びクラスII MHC遺伝子産物の発現である。プロフェッショナル及びノンプロフェッショナルAPCを含むほとんどの細胞は、タンパク質抗原をエンドサイトーシスし、且つプロセシングできると思われる。従って、プロフェッショナルAPCに関しては、決定因子はクラスII MHC分子の発現であると考えられる。この点に関して、ヘルパーTリンパ球について最も的確に特定された抗原提示細胞には、単核食細胞、Bリンパ球、樹状細胞、皮膚のランゲルハンス細胞が含まれ、そしていくつかの哺乳動物においては、内皮細胞が含まれる。勿論、別々の細胞が別々の領域で集中し、T細胞介在性免疫応答の異なる段階に関与し得ることが認められよう。
【0066】
いずれにしても、本明細書で使用する際は、「プロフェッショナル抗原提示細胞」または「プロフェッショナルAPC」とは、T細胞介在性免疫応答を誘導し、高レベルの同時刺激性分子を発現し得る任意の細胞を意味すると考えるべきである。反対に、ノンプロフェッショナルAPCは典型的には高レベルの同時刺激性分子を発現しない。本発明の目的には、両型の細胞が、選択された免疫抑制因子を提示し、そして免疫系をダウンレギュレートするために利用できることが認識されよう。これについては、選択されたFcRリガンドは、多様な細胞型に見られるいくつかの異なるFcレセプターのいずれかと相互作用して、免疫調節剤のエンドサイトーシスを促進し得る。単なる例として、利用可能である選択されたヒトFcレセプターにはFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIAまたはFcγRIIIBサブファミリーが含まれる。
【0067】
さらに一般的には、本発明に従って、当業者は、FcR複合体と結合してエンドサイトーシスを開始し得るリガンドはいずれも本発明に適合し、さらに開示された免疫調節剤に組み入れることができることが認められよう。従って、FcRリガンドは、限定はしないが、ペプチド、タンパク質、タンパク質誘導体、またはアミノ酸を組み込むかあるいは組み込まない小分子的実体を含むことができる。例えば、リコンビナントケミストリーまたはラショナルドラッグデザインのような近代生化学技術を用いて誘導される小分子は、必須のAPC取り込みを提供する限りにおいて使用することができる。
【0068】
適合性のある分子はいずれのタイプでも使用できることを強調しなけれはならないが、本発明のFcRリガンドは1つまたはそれ以上のペプチドを含んでいることが好ましい。さらに好ましくは、FcRリガンドは免疫グロブリンの定常領域のドメインの少なくとも一部分を含んでいる。特に好ましい実施態様では、FcRリガンドは、免疫グロブリン分子の定常領域由来のドメインを1つまたはそれ以上含んでいる。当業者は、必要に応じて、種々の免疫グロブリンのイソタイプ及びアロタイプを使用できることを認めるであろう。例えば、適合性のあるFcRリガンドはIgG、IgE、IgAまたはIgMの定常領域に見られるアミノ酸配列に相当するものから選択することができる。中でも、FcRリガンドとして使用される特定のイソタイプの選択は、結合係数のような生化学的特性または治療対象となる種において免疫反応性が低いことに基づいて属性を断定できる。同様に、単一ドメイン、そのフラグメント、または複数ドメインの選択は生化学的因子、あるいは最終的には、提示効率に基づいて決定することができる。
【0069】
前記のように、本発明の免疫調節剤はさらに免疫抑制因子を含む。本発明の範囲によれば、免疫抑制因子は、エンドサイトーシスによってプロセシングされてAPC表面に提示されるとき、免疫系をダウンレギュレートする任意の化合物であり得る。このため、免疫抑制因子は小分子、ペプチド、タンパク質フラグメント、タンパク質誘導体、ポリペプチドまたはそれらの組み合わせを含み得る。好ましい実施態様では、免疫抑制因子は、APC表面に提示されるとき、同様に提示されたアゴニストと選択されたレセプターとの結合に干渉するという点で、アンタゴニストとして作用する。特に好ましい実施態様では、免疫抑制因子は、免疫応答を活性化しないでT細胞レセプターと会合するT細胞レセプターアンタゴニストを含む。本発明のその他の実施態様が、対象の自己抗原に対する免疫応答を低下させるT細胞レセプターアゴニストを組み入れている免疫調節剤を含むことが認められるであろう。これらの実施態様に関しては、天然自己抗原性ポリペプチドのFc介在性提示を使って、エンドサイトーシスによる提示を介して所望するT細胞レセプターアゴニストを提供できることが認められよう。即ち、FcRリガンドと会合する天然自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントの投与は、本明細書の教示に従って1つまたはそれ以上のT細胞レセプターアゴニストの効率の良い提示を起因する。
【0070】
本発明による免疫抑制因子として任意の機能的に適合性のある分子を使用できるが、当業者は、開示された化合物及び方法における用途にはタンパク質(ポリペプチド)、タンパク質フラグメントまたはペプチドが特に適していることを認めるであろう。そのような分子は正常なエンドサイトーシス経路で容易にプロセシングされて、例えば、MHCクラスII分子と協同して容易に抗原提示細胞表面に提示される。さらに、望ましくない免疫応答を誘発する化合物の大部分は典型的にはタンパク質フラグメントであるために、T細胞レセプターは通常、これらがアゴニストでもまたはアンタゴニストであっても、類似するフラグメントに対して最も応答性がある。特に好ましい実施態様では、アンタゴニスト性の免疫抑制因子は、選定されたT細胞レセプターと免疫反応性のある選択されたペプチドまたはタンパク質フラグメントの類似体である。
【0071】
本明細書で使用される、「ペプチド類似体」または「類似体」は、類似体と天然タンパク質フラグメントまたはペプチドとの間のそれぞれの対応する配列に少なくとも1つの異なるアミノ酸を含む。他に示さない限り、指定したアミノ酸はL型を言う。天然ペプチド由来のL−アミノ酸はタンパク質中に通常見られる20種のLアミノ酸のうちの任意の他のもの、対応するD−アミノ酸のうちの任意のもの、希少アミノ酸、例えば4−ヒドロキシプロフィン及びヒドロキシリジン、または非タンパク質アミノ酸、例えばβ−アラニン及びホモセリン、に改変することができる。メチル化(例えば、a−メチルバリン)、エチルアミン、エタノールアミン及びエチレンジアミンのようなアルキルアミンによるC末端アミノ酸のアミド化、並びにアミノ酸側鎖官能基のアシル化またはメチル化(例えば、リジンのイプシロンアミノ基のアシル化)のような化学的手段で改変されたアミノ酸も本発明の範囲内に含まれる。
【0072】
多発性硬化症(MS)の治療に効率の良いペプチドアンタゴニストを選択する方法は、本出願で先に参照したPCT公開第WO 96/16086号に開示されている。開示された方法を本発明と一緒に使用して、開示された免疫調節剤に組み入れる有効な免疫抑制因子を提供することができる。例えば、以下で詳記するアッセイを使用し、MHCとの競合的結合を測定するアッセイ、T細胞増殖アッセイまたは実験的脳脊髄炎(EAE)の誘導を評価するアッセイによって、候補ペプチド類似体のMS治療能力をスクリーニングすることができる。天然自己反応性ペプチドの結合を阻害し、天然ペプチド反応性細胞系の増殖を刺激せず、そして公知の自己抗原によるEAE(MSの実験的モデル)の発生を阻害する類似体は治療法に有用である。当業者は、類似するタイプのアッセイを使用して、他の天然ペプチド(即ち、連続的に提示される自己抗原)及び他の免疫疾患用の免疫抑制因子をスクリーニングできることを認めるであろう。特に好ましい実施態様では、選択された免疫抑制因子はT細胞エピトープの類似体を含む。
【0073】
さらに一般的には、多様な免疫反応性の作因を有する多数の疾病について、不必要に過度の実験を行うことなく免疫抑制因子(アゴニストまたはアンタゴニスト)を得ることができる。例えば、多発性硬化症を治療するために、ペプチド類似体アンタゴニストまたはアゴニストをプロテオリピドタンパタ質またはミエリン塩基性タンパク質上のT細胞エピトープについて産生させることができる。他方、天然ポリペプチド(即ち、MBPまたはPLP)またはその組み合わせをFcRリガンドと会合させて投与することにより、所望する免疫抑制効果を供与することができる。同様に、原発性胆汁性肝硬変を治療するために、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、あるいは同一タンパク質のT細胞エピトープから誘導されたT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストに相当する天然ポリペプチドまたはそのフラグメントを使用することができる。どちらの例も、天然または誘導免疫抑制因子は本明細書に記載したように免疫調節剤に組み込まれて、これを必要とする患者に投与される。(天然自己抗原の投与に起因するアゴニストを含む)免疫抑制因子が効果的に提示されると、天然ペプチドによる自己反応性T細胞の刺激が選択的に減少され、それによって対象の免疫疾患の症状が緩和される。
【0074】
共に免疫調節剤を構成している選択された免疫抑制因子とFcRリガンドは、多数の形態のうちの任意の1つで効果的に投与することができる。さらに詳細には、前記のように、本発明の免疫調節剤は、免疫応答を選択的抑制することにおいて機能的に有効である任意の形態のそれぞれの要素を組み合わせることができる。例えば、免疫調節剤は、当業者に公知である分子生物学を用いて産生された組換え(または融合)ポリペプチドまたはタンパク質を含むことができる。そのような場合には、FcRリガンドは単一の免疫グロブリン定常領域ドメインの1つのフラグメントまたは、好ましくは、定常領域全体を含み得る。他の実施態様では、免疫調節剤は、抗原がT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストあるいは天然自己抗原を含んでいる、立体的に結合した抗体−抗原複合体を含むことかできる。他の好ましい実施態様は、免疫抑制因子がFabフラグメント上に発現されているキメラ抗体を含む免疫調節剤を特徴としている。さらに他の実施態様では、免疫調節剤は、有効なFcRリガンドと免疫抑制因子をそれぞれ含む2個の共有結合された分子を含むことができる。
【0075】
本発明の特に好ましい実施態様では、単一の融合ポリペプチドを含む免疫調節剤をコードする組換えヌクレオチド構築物が使用される。当業者は、標準的な遺伝子工学技術によって少なくとも1つのFcRリガンドと少なくとも1つの免疫抑制因子を含む融合タンパタ質またはキメラが提供され得ることを認めるであろう。本明細書で使用するとき、「キメラ」または「キメラの」の用語は、1つ以上の源からの配列フラグメントを含む任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包含するように最も広範な意味で使用される。例えば、ペプチドTCRアンタゴニストとIgG分子からの単一のFcドメインを組み入れている遺伝子工学操作によるポリペプチドは、正確にはキメラまたは融合タンパク質と称される。同様に、キメラ抗体は、異種ペプチド免疫抑制因子を組み入れるように工学操作された組換えH鎖及び野生型L鎖を含むことができる。本発明の目的では、前記の本質的に相違する領域は異なる種に由来する必要はない。即ち、キメラ抗体はヒトL及びH鎖並びにCDRで発現されている工学操作されたヒトTCRアンタゴニストを含むことができる。逆に、キメラ免疫調節剤はヒトとマウスのような異なる種に由来するFcRリガンドと免疫抑制因子を含むことができる。
【0076】
このため、本発明の1つの局面は、Fcレセプターリガンドに相当する少なくとも1つのヌクレオチド配列及び免疫抑制因子に相当する少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド分子を含む。好ましくは、免疫抑制因子は、1つまたはそれ以上の天然自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストに相当し、Fcレセプターリガンドは免疫グロブリンの定常領域ドメインの少なくとも一つに相当する。特に好ましい実施態様では、ポリヌクレオチド分子は、相補性決定領域が少なくとも一部欠失しておりT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストに相当するヌクレオチド配列で置換されている、免疫グロブリンH鎖に相当するヌクレオチド配列をコードしている。免疫抑制因子の混合物を含む組成物もまた本明細書の教示に従って効果的に使用することができる。
【0077】
いずれにしても、当該分野で公知の技術を使用して、所望の免疫調節剤を含むDNA構築物を原核または真核細胞内で発現させることができる。例えば、Maniatisら、Molecular Cloning(分子クローニング):A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York、1982(本明細書に参照により編入)参照のこと。好ましい実施態様では、工学操作されたプラスミドは不死化細胞系内にトランスフェクトされて、前記細胞が所望の産物を分泌する。当該分野で公知であるように、そのように工学操作された生物は選択された免疫調節剤を比較的高いレベルで産生するように修飾することができる。他方、工学操作された分子は大腸菌のような原核細胞内で発現させることができる。いずれの産生源を使用しようと、分画、クロマトグラフィーまたはその他の精製方法のような通常の生化学方法と従来の製剤化技術を用いて、産物を分離し次いで送達可能な組成物に製剤化することができる。
【0078】
従って、本発明のもう1つの局面は、脊椎動物の抗原提示細胞の表面に免疫抑制因子をエンドサイトーシスによって提示するための免疫調節剤を製造する方法を含み、この方法は、
a.適切な宿主細胞を、少なくとも1つのFcレセプターリガンド及び少なくとも1つの免疫抑制因子を含むホリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチド分子で形質転換またはトランスフェクトすること、
b.形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、前記細胞が組換えポリヌクレオチド分子を発現して、免疫調節剤の少なくとも一部分を含む前記ポリペプチドを産生させる条件下で培養すること、 並びに
c.前記免疫調節剤を回収すること、から成る工程を含む。
【0079】
同様に、本発明のもう1つの局面は、ポリペプチドであって、少なくとも1つのFcレセプターリガンドと少なくとも1つの免疫抑制因子を含むポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド分子を含むトランスフェクトまたは形質転換された細胞を含む。
【0080】
前記の局面のどちらにおいても、好ましくは、免疫抑制因子は、1つまたはそれ以上の天然自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストに相当し、Fcレセプターリガンドは好ましくは免疫グロブリンの定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。さらに好ましくは、免疫調節剤は、少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)がT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストで置換されている、ポリペプチドまたはキメラ抗体を含む。
【0081】
本発明のキメラ抗体、ポリペプチド及びその他の構築物は単独でまたは医薬組成物として投与できることがさらに認められよう。端的には、本発明の医薬組成物は、本明細書で記載した1つまたはそれ以上の免疫調節剤を1つまたはそれ以上の医薬的にまたは生理学的に許容性のある担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含むことができる。そのような組成物は、中性の緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等のような緩衝液、グルコース、マンノース、ショ糖またはデキストランのような炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸、抗酸化剤、EDTAのようなキレート剤又はグルタチオン、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)及び保存剤を含むことができる。その上、前述のように、好ましい実施態様は、同時刺激性分子を誘導可能なアジュバントを含まない医薬的に許容性のある担体を含む。しかし、本発明の医薬組成物は、例えばサイトカイン様B−インターフェロンのような1つまたはそれ以上の追加活性成分を含有することもできる。
【0082】
この点に関して、本発明のさらなる局面は、脊椎動物の抗原提示細胞の表面に免疫抑制因子をエンドサイトーシスによって提示するための医薬組成物を含み、前記組成物は少なくとも1つの免疫調節剤と医薬的に許容性のある担体とを含んでおり、前記の少なくとも1つの免疫調節剤は少なくとも1つのFcレセプターリガンドと少なくとも1つの免疫抑制因子とを含む。同様に、本発明は免疫疾患を治療する医薬組成物の製造方法を含み、前記方法は少なくとも1つのFcレセプターリガンドと少なくとも1つの免疫抑制因子とを含む少なくとも1つの免疫調節剤を生理学的に許容性のある担体または希釈剤と組み合わせることを含む。これらの局面のどちらにおいても、免疫抑制因子は、1つまたはそれ以上の天然自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストを含み、且つ前記Fcレセプターリガンドは免疫グロブリンの定常領域ドメインの少なくとも一部を含むことができる。好ましくは、前記免疫調節剤は組換えポリペプチドまたはキメラ抗体の形態である。
【0083】
前述するように、キメラ抗体を含む免疫調節剤は本発明の特に好ましい局面である。そのような抗体は、典型的にはペプチドTCRアンタゴニストまたはアゴニストである免疫抑制因子を、1つまたはそれ以上の相補性決定領域(CDR)の少なくとも一部分と置換することによって形成することができる。以下の実施例でさらに詳細に記載されるように、H鎖をコードするヌクレオチド配列を工学操作して少なくとも1つのCDRの全部または一部を自己抗原の全部または一部であるペプチドまたはペプチド類似体で置換することができる。適当な細胞系で発現されると、組換えH鎖は野生型L鎖と複合体を形成して、2つの免疫抑制因子をディスプレイする免疫反応性四量体を形成することができる。当業者は、有害な免疫応答(即ち、ヒトの抗マウス応答)の発生を最小限にするために、免疫グロブリン分子は治療を受ける種から選択できることを認めるであろう。選択した免疫グロブリンの定常領域は本質的に修飾されていないため、この形態の免疫調節剤は容易にエンドサイトーシスを受けて、関連免疫抑制因子の効果的な提示を可能にする。
【0084】
他の形態では、本発明の免疫調節剤は、抗原が免疫抑制因子である抗原−抗体複合体を含むことができる。近代免疫学的技術を使用して、好ましくはモノクローナル抗体である所望の抗体を産生且つ精製できることが認められよう。単なる例として、選択されたペプチドアンタゴニスト(即ち、ペプチド自己抗原の類似体)またはアゴニストをマウスに注射して免疫反応性細胞を生じることができ、前記細胞はその後標準的な方法を用いて収集且つ不死化することができる。所望するならば、マウスモノクローナルは従来の組換え方法を使用して「ヒト化」して、患者に有害な免疫応答を誘発しないヒト免疫グロブリン上に小さなマウス可変領域を発現させることができる。いずれにしても、モノクローナル抗体は免疫抑制因子と複合体を形成して所望の免疫調節剤を形成し、その後、前述のように製剤化且つ投与することができる。FcRリガンドを形成する無傷の定常領域を用いると、ファゴサイトーシスの生起は比較的急速であり、さらに結合した免疫抑制因子の提示の効率が良いはずである。
【0085】
実施態様は定常領域全体に相当するFcレセプターリガンドを含むことができるが、本発明は、投与された免疫調節剤が無傷の免疫グロブリン定常領域を含むことを必要としないことを強調しなければならない。むしろ、FcRと結合してエンドサイトーシスを受けることができる任意のFcRリガンドを、選択した免疫抑制因子と組み合わせて使用することができる。詳細には、定常領域の単一ドメインまたはそれらのフラグメントをペプチドアンタゴニストと組み合わせて、本明細書の教示に従って免疫系を抑制し得る単量体ポリペプチド(単一アミノ酸鎖を有する)を形成することができる。最小量の有効なFcRリガンド及び/または免疫抑制因子を有し、はるかに安定であるために送達を促進させ、おそらく生物利用効率を高めることができるような融合タンパク質を構築することができる。さらに、これらの工学操作したポリペプチドまたはタンパク質は、異種の全抗体を投与するときに見られるような免疫応答を誘発することなく、長期間投与することができると思われる。このため、比較的小さなキメラポリペプチドが有効な免疫調節剤であることが証明されるであろう。
【0086】
同様に、非ペプチド分子実体は、効率の良いFcRリガンド、免疫抑制因子、または組み合わせることにより免疫調節剤であることが証明されるであろう。当業者は、選択された役割(即ち、FcRリガンド)で有効に機能する分子実体(ペプチド性または非ペプチド性)が、リコンビナントケミストリー、定方向進化、ラショナルドラッグデザインのような現行の方法を用いて提供できることを認めるであろう。例えば、ラショナルドラッグデザインを使用して、既に解明されているFcレセプターと有効に結合する非ペプチド小分子実体を作ることが可能であり得る。次いで、誘導されたFcRリガンドをペプチドアンタゴニストのような免疫抑制因子と共有結合させ(またはそうでない場合、可逆的に会合させ)て、特別な安定性または他の望ましい形質を示す免疫調節剤を提供することができる。
【0087】
既述のように、本発明の免疫調節剤または融合タンパク質は固定化あるいは凝集されて、Fcレセプターの架橋に便利な構築物または構造体を生じたり、及び/またはIL−10及びIL−6のような抗炎症性サイトカインの産生を誘導することができる。凝集または固定化構築物が完全形態であることは重要ではなく、本発明との関連においては開示された免疫調節剤の任意の形態も包含される。この点に関しては、凝集または固定化構築物は可溶性または不溶性であり、さらに専ら薬剤から構成され、あるいは薬剤と会合する担体、基質、構造体または微粒子を含むことができる。例えば、開示された薬剤は、任意の生物学的適合性のある物質を含む微細粒子担体と会合または複合体形成するか、あるいは比較的持続性の長い脂質またはポリマー基質中に包埋または吸着することができる。当業者には、多数の商業的に利用可能な構造体及び生物学的構築物を会合する関連方法があることが認められるであろう。そのため、代表的な微細粒子担体は、タンパク質、多糖類、脂質、または合成及び天然ポリマーを含むことができる。
【0088】
特に好ましい実施態様では、複合体化された薬剤は、当該分野に公知の技術を用いて凝集される。その他の方法では、凝集物は、熱、化学的架橋または、硫酸アンモニウム沈降法のような沈降を用いて形成することができる。生成される凝集物は、可溶性、不溶性、あるいはその混合物であり得る。そのβプリーツシート構造のために、免疫グロブリンの変性は、分子内というよりはむしろ分子間相互作用に有利な疎水基を露出することはさらに認められるであろう。これらの分子間相互作用が凝集を促進する。例えば、免疫グロブリン(即ち、免疫調節剤)を63℃で15分加熱すると、免疫複合体に類似する多数の生物学的特性を有する可溶性凝集物の形成を導出する。そのような凝集物または構築物は、所望する免疫応答をそれを必要とする患者において提供するために特に有効である。
【0089】
特定の理論によって制限されることは望まないが、凝集または固定化することによって免疫調節剤はオプソニン化抗原を模擬することができると思われる。典型的には、標的細胞は、オプソニン化粒子を効率良く消化して、生物学的応答修飾因子を分泌して、適切に炎症応答を増強あるいはダウンレギュレートする。凝集または固定化薬剤の場合、構築物は、初期感染に対する炎症応答が鎮静される免疫応答後期を模擬するように作用すると思われる。即ち、凝集または固定化免疫調節剤は、免疫活性細胞を「ごまかして」、感染因子が排除され、従って保護的免疫応答がもはや必要ではないと考えさせる。さらに詳細には、活性化されたAPCは、活性T細胞をダウンレギュレートするIL−10及びIL−6のような生物学的応答修飾因子を分泌する。本明細書に説明するように、IL−10産生は、自己免疫疾患に関連する複数のT細胞特異的エピトープの活性を阻害し(即ち、IL−10はバイスタンダー抑制を供与する)、さらに自己免疫疾患の症状を改善する。その上、免疫調節剤は、投与される対象においてIFNγレベルを低下させることができる。本発明と関連する場合、そのような生物学的応答修飾因子の分泌は、対象の自己免疫疾患の原因である自己反応性T細胞をダウンレギュレートするために作用する。
【0090】
前記のように、本発明の組成物は、Th1/Th2発生経路に関与するサイトカインを含む生物学的応答修飾因子の誘導を提供し、さらにAPCとして機能できる細胞によって産生されることが公知である。この点では、Th1/Th2発生に関与すると思われるサイトカインは、IL−4、IL−12、及びIL−10を含む。単球によって産生され、IL−4合成を誘導すると思われるIL−6は、Th2 T細胞の発生に関与する。IL−10は単球によって産生され、MHCクラスII発現を明らかにダウンレギュレートし、且つ同時刺激性分子のアップレギュレーションを阻害することによって、APC依存性T細胞活性化を阻害する機能を有する。同時刺激性分子がそのレベルが低下しているか、あるいは存在しないAPCによる抗原の提示は末梢性寛容を刺激する。便利なことには、本発明は、これら及びその他の有利な生物学的応答修飾因子の選択的な刺激を可能にする。
【0091】
さらに詳細には、以下の実施例XXVII及びXXVIIIに説明するように、凝集性免疫調節剤は、EAEマウスにおいて症状を改善するために使用することができ(実施例XXVII)、さらに活性化細胞において選択された生物学的応答修飾因子の産生を誘導できる(実施例XXVIII)。これに関しては、図25が、凝集性構築物の投与によってEAEマウスにおける疾患の臨床的徴候が劇的に減少することを示す。後の実施例では、マクロファージ、樹状細胞及びB細胞を精製し、凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートして、IL−6及びIL―10の産生について試験した。図26A及び26Bに示す結果は、マクロファージはIL−6及びIL−10のどちらも産生するが、樹状細胞はIL−10のみを産生することを示す。凝集性免疫調節剤で刺激される場合、B細胞はどちらのサイトカインも産生しないと思われる。
【0092】
当業者は、IL−10が抗増殖性サイトカインであり、その他のサイトカインの産生を阻害することが公知であることを認めるであろう。Ig−PLP1(特に凝集性Ig−PLP1)を結合し、次いでIL−10を産生するAPCは、少なくとも2つの方法でT細胞−APC相互作用を影響できる。第一に、IL−10はクラスII分子の発現及び同時刺激性分子のアップレギュレーションを阻害することはどちらも公知である(Steinbrinkら、J. Immunol.、 159:4772〜4780、1997; Dingら、J. Immunol.、 151:1224〜1234、1993;Willemsら、Eur. J. Immunol.、24:1007〜1009、1994;Mooreら、Annu. Rev. Immunol.、 19:683〜765、 2001;Peguet−Navarroら、J. Immunol.、 24:884〜891、1994、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。その上、IL−10は、T細胞活性化に必要なサイトカインの合成を阻害することができる。前記例はさらに、処理されたAPCがTh2型細胞の発生を有利にすることが公知のサイトカインであるIL−6を産生できることを示す。免疫調節剤の結合時にAPCによって産生されたIL−6は、T細胞−APC相互作用を有利に影響して、T細胞の調節を誘導することができることが認められるに違いない。さらに、TGFβがAPCによって産生されると、これはまたT細胞に対して調節効果を及ぼすことができる。これに関して、凝集性または固定化免疫調節剤は、抗炎症性サイトカイン産生の誘導に特に有効であり得る。
【0093】
事実、実施例XXIX及びXXXIVに示すように、凝集性免疫調節剤はEAEの治療に特に有効である。実施例XXX及びXXXIに示すように、凝集性免疫調節剤はFcγR1レセプターを架橋することによってIL−10産生を誘導する。凝集性免疫調節剤はまた、IFNγレベルを低下させる(実施例XXXII)。さらに、IL−10は、末梢性寛容と相乗して、自己免疫反応に関与するT細胞の活性を低下させる(実施例XXXIII)。実施例XXXVに実証されるように、凝集性免疫調節剤への応答において産生されるIL−10は、マクロファージ上の同時刺激性分子をダウンレギュレートする。凝集免疫グロブリンはまた、バイスタンダー抑制を介して、自己免疫疾患に関与する複数の抗原に特異的なT細胞の活性を抑制することができる。(実施例XXXVI及びXXXVII)。
【0094】
特定の理論によって制限されることは望まないが、固定化または凝集性免疫調節剤はFcγレセプターを架橋し、さらにIL−10の産生を誘導する。IL−10はIFNγ産生の低下を誘導する。さらに、IL−10はAPCの表面上の同時刺激性分子をダウンレギュレートして、それによって末梢性寛容を誘導する。IL−10はまたバイスタンダー抑制を生じ、それによって自己免疫疾患に関与する複数の抗原に対するT細胞の活性を低下させる。このことは、IL−10のインビボ中和によって保護効果が取り消されることを実証する実施例XXXIIIにおいて直接支持される。
【0095】
要約すると、固定化または凝集性免疫調節剤による処置は、病原性T細胞活性を直接的あるいは間接的にダウンレギュレートできるIL―10を含む可溶性媒介物質のAPCによる産生を誘導し、MHCクラスII分子及び同時刺激性分子の発現をダウンレギュレートするか、あるいはIFNγレベルを低下させることによりAPCの機能を抑制でき、同時刺激性分子が存在しないか、あるいはそのレベルが低下しているノンプロフェッショナルAPCによる治療用エピトープの提示を誘導でき、抗原活性化細胞死またはアネルギーを誘導する。さらに、固定化または凝集性免疫調節剤は、末梢性寛容及び/またはバイスタンダー抑制を刺激することができる。総じて、これらの効果は、病原性T細胞の発生の予防、T細胞機能を病原性から非病原性状態に転換する、疾患を抑制するT細胞の産生、及び病原性T細胞の排除として説明できる。これは、本明細書の教示に従って、自己免疫疾患の予防、安定化、または寛解を導くことができる。
【0096】
いずれの形態の免疫調節剤を選択するにしても、本発明の組成物は所望する安定性を提供し、且つ選択する投与形態を容易にするために製剤化することができる。例えば、組成物は、経口、経膣、経耳、経鼻、経肺、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋肉内投与を含むがこれらに限定されない従来の全ての経路を使用して投与することができる。本発明の他の実施態様の範囲内で、本明細書に記載した組成物は徐放性インプラントの一部として投与することができる。さらに他の実施態様の範囲内で、本発明の組成物は、安定性が強化する適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物または噴霧乾燥製剤として製剤化することができる。これらの好ましい製剤は、次に乾燥粉末吸入器を用いて、担体または噴霧剤と組み合わせる場合は、計量式吸入器、ネブライザー、アトマイザー、噴霧瓶またはドロッパーから投与できる。
【0097】
本発明は、ダウンレギュレーションを受ける免疫系を含む任意の脊椎動物の治療に有用である。本発明は、細胞免疫応答を有する哺乳動物のような脊椎動物において特に有用である。好ましい実施態様では、治療対象となる脊椎動物は新生児または乳児の状態である。
【0098】
この点に関して、本発明のさらなる局面では、免疫調節剤を生理学的に許容性のある担体または希釈剤と組み合わせて含む治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む免疫疾患の治療方法が含まれ、ここで前記免疫調節剤は少なくとも1つのFcレセプターリガンド及び少なくとも一つの免疫抑制因子を含む。この局面では、免疫抑制因子はT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストを含み、Fcレセプターリガンドは免疫グロブリン定常領域ドメインの少なくとも一部を含むことができる。先に言及したように、免疫調節剤は、好ましくは組換えポリペプチドまたはキメラ抗体の形態である。前記方法は、自己免疫疾患、アレルギー応答及び移植片拒絶反応を含む免疫疾患を治療するために使用することができ、そして多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される自己免疫疾患の治療に特に有用である。
【0099】
前述のように、本発明の組成物、化合物及び方法は、新生児または乳児哺乳動物において寛容を誘導し、それによって将来の自己免疫を予防するかまたは低下させるのに特に有用である。「乳児」の用語は、本明細書で使用する際は、免疫系が末だ十分には成熟していない誕生後の生活期間中のヒトまたは非ヒト哺乳動物を言及する。ヒトでは、この期間は誕生から約9カ月齢までであり、一方マウスでは、この期間は誕生から約4週齢までである。「新生」及び「新生児」の用語は、本質的に正に生まれたばかりの乳児哺乳動物のサブセットを意味する。本発明による「乳児」に関連した他の特徴には、(i)高ゾーン寛容になりやすい(T細胞前駆体の欠失/アネルギー、アポトーシス傾向の増大)、(ii)Th2バイアスヘルパー応答(新生児T細胞の表現型特徴、新生児T細胞でのCD40L発現の低下)、(iii)細胞性応答の低下(機能性T細胞数の減少、抗原提示細胞機能の低下)、及び(iv)体液応答の低下及び型の限定(IgMhIgh、IgDlow、B細胞の優勢、ThとB細胞間の協力の低下)を有する免疫応答が含まれる。本発明の具体的な非限定的実施態様では、開示された免疫調節剤は、母親の抗体が検出可能な量で未だ存在している乳児哺乳動物に投与することができる。関連実施態様では、所望のT細胞寛容を胎児に生じさせるように、開示された組成物を妊娠母親に接種することができる。いずれにしても、誘導されたT細胞寛容は、投与された免疫調節剤に関連する自己免疫疾患の後の発症に抵抗性を付与することができる。
【0100】
対象が乳児であるかそれとも成体であるかに関係なく、本発明の医薬組成物を、治療(または予防)する疾病に適する方法で投与することができる。投与量及び回数は、患者の状態並びに患者の疾病の型及び重篤度のような要素によって決定される。本発明の特に好ましい実施態様の範囲内で、本明細書に記載した医薬組成物は、適当な投与量を臨床試験で決定することができるが、1mg〜50mg/kgまでの範囲の用量で投与してもよい。当業者は、MRIまたは臨床悪化の徴候によって治療有効性について患者をモニターできることを認めるであろう。
【0101】
投与後に、免疫調節剤は少なくとも1つの型の抗原提示細胞表面に存在する1つまたはそれ以上のFcレセプターと結合すると考えられる。当業者は、FcRリガンドの選択が、免疫調節剤を細胞内に取り込むためにどのクラスのFcレセプターを使用するのかを、少なくともある程度まで、決定することを認めるであろう。即ち、IgG定常領域に相当するFcRリガンドはIgE定常領域に相当するFcRリガンドとは異なるクラスのFcレセプターによって結合される。さらに、異なるクラスのFcレセプターが異なる型の抗原提示細胞上に発現されるので、選択されたAPC上に免疫抑制因子を提示することが可能である。例えば、IgG定常領域に相当するFcRリガンドは、マクロファージまたは好中球によってエンドサイトーシスを受け、それに応じて提示されると思われる。これは、ある種のAPCは種々のタイプの抗原を提示するのに一層効果的であり、その抗原が次にどのT細胞を活性化するのかに影響を与え得るという点で興味深い。
【0102】
いずれにしても、免疫調節剤全体がAPCによるレセプター介在性エンドサイトーシスを受け、そして通常はクラスリン被覆小胞内に局在化する。細胞内取り込み後、免疫調節剤は最終的にAPC表面に提示されるようにプロセシングされる。プロセシングは一般的に、酸性pHと、プロテアーゼを含む選択された酵素を含む細胞小器官であるリソソームへの、免疫調節剤の小胞輸送を伴う。ここで免疫調節剤は消化されて、本発明の目的ではタンパク質、ポリペプチド、あるいはペプチドの形態であり得る遊離免疫抑制因子を生じる。放出された免疫抑制因子が自己抗原性ポリペプチドまたはタンパク質、あるいはそのフラグメントを含む場合、前記因子はさらに消化されて、1またはそれ以上のT細胞レセプターアゴニストを生じると考えられる。ペプチドがアンタゴニストまたはアゴニスト(免疫調節剤の一部として直接投与されるか、あるいは投与された自己抗原性ポリペプチドに由来する)のいずれであっても、提示されたペプチドの平均長は、例えば、5〜30アミノ酸程度である。消化後、免疫抑制因子フラグメントを含む免疫調節剤フラグメントのうち少なくとも一部はエキソサイトーシス用小胞内でMHC分子と会合する。MHC−免疫抑制因子複合体は、次にAPC表面まで輸送され、ヘルパーT細胞に提示される。
【0103】
前記に指摘のように、本発明の好ましい実施態様では、クラスII MHC分子と協同して提示される免疫抑制因子としてTCRアンタゴニストを使用する。従って、以下の考察の目的では、(ペプチド類似体であり得る)そのようなアンタゴニストが使用される。しかしながら、本発明は、免疫応答をダウンレギュレートする任意の免疫抑制因子をレセプター介在性エンドサイトーシスで提示するために使用できることを強調しなければならない。このため、所望する免疫原性応答の低下を提供するT細胞レセプターアゴニストを免疫抑制因子として使用することができ、そしてこのようなアゴニストは本発明の範囲内である。さらに、既に示したように、提示されたアゴニスト(または複数可)は、免疫抑制因子として直接的に投与されるか、または1またはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む免疫抑制因子から得てもよい。
【0104】
即ち、選択された実施態様では、投与される免疫抑制因子は、FcRリガンドからのエンドサイトーシスによる分離後に実質的にプロセシングされずに、MHC複合体と協同して提示されるアゴニストペプチドであり得る。その他の実施態様では、免疫抑制因子は好ましくは少なくとも1つの自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。そのような場合、免疫抑制因子は、典型的にはFcRリガンドから切断された後、プロセシング(消化)を受け、1またはそれ以上のペプチドアゴニストを生じ、それが次に本明細書の教示に従って、MHCクラスII分子と協同して提示される。他の場合は、T細胞レセプターに対する適切なアゴニストの効率の良い提示を利用して免疫応答をダウンレギュレートすることができる。
【0105】
従って、単なる例として、T細胞をミエリン塩基性タンパク質のフラグメントに相当するペプチドアゴニストに予め感作させることができる。多発性硬化症では、この自己アゴニストが連続的に提示され、それによってミエリン鞘の構成成分に向けた免疫応答が活性化される。さらに詳細には、感作された個々のT細胞は、提示された自己アゴニストと選択的に結合して細胞にシグナル伝達する数千ものレセプターを発現する。十分なレセプターが結合されると、感作T細胞は応答を生じさせるように働き、即ち、インターロイキンを分泌する。TCRアンタゴニストがMHCクラスII分子と協同して提示される場合、T細胞は提示された複合体を認識するが活性化はされない。
【0106】
従って、本発明によれば、免疫抑制因子(即ち、アンタゴニスト)をエンドサイトーシスによって効率良く提示すると、レセプターに対する競合によってアゴニスト−TCR結合が阻害される。即ち、提示されたTCRアンタゴニストは感作T細胞のTCRと効果的に結合し、それによって提示された自己抗原またはそのフラグメントの結合を妨げる。しかし、免疫抑制因子−TCR複合体は、自己抗原−TCR複合体とは異なって、応答を生じさせるようにはT細胞にシグナル伝達を行わない。従って、免疫抑制因子(非反応性アゴニストまたはアンタゴニスト)の結合は、T細胞が十分な自己抗原と結合して、細胞が作用するように誘導する活性化レベルのしきい値に達するのを妨げることができる。それ故、天然のアゴニストを含む、連続提示されている自己抗原に対する有害な免疫応答は回避される。
【0107】
他方、FcR介在によるアゴニストの効率の良い提示は、本明細書の教示に従って哺乳動物の免疫応答をダウンレギュレートするために使用できる。これに関しては、最終的に提示されるアゴニスト(複数でもよい)は、免疫抑制因子として直接的に投与されるか、またはエンドサイトーシスによってタンパク質分解される自己抗原性ポリペプチド免疫抑制因子から得てもよい。特定の理論によって制限されることは望まないが、自己抗原性アゴニストは、同時刺激性分子を欠如する、あるいは低レベルの同時刺激性分子を有するノンプロフェッショナル及び/または非活性化APCによって提示され得ると考えられる。前述のように、このタイプの提示が最終的にT細胞の不活性化を誘導することが驚くべきことにも見出された。特に、以下に説明するように、本発明の免疫調節剤は、IL−10の産生を誘導し、IFNγレベルを低下させ、さらに末梢性寛容及び/またはバイスタンダー抑制を刺激する。そのような実施態様では、免疫調節剤構築物は、同時刺激性分子の活性化及び/産生を最小限に抑えるか、あるいは排除するためにアジュバントを含まない小胞中に投与されることが好ましい。本発明のこの局面に関する特に好ましい実施態様は、1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む免疫抑制因子を包含することができる。例えば、本実施態様による構築物は、少なくとも1つのCDR領域が少なくとも部分的にPLPからのペプチドアゴニストで置換されている融合またはキメラIgGを含み得る。そのような構築物は、アジュバントを含まない医薬的に有効な担体中で治療有効量を投与されると、多発性硬化症に関連する少なくともいくつかの症状を改善することができるはずである。多発性硬化症治療用のその他の有効な構築物は、自己抗原性タンパク質MBP及びPLPを含む免疫抑制因子に共有結合されているIgGのFc領域を含む融合ポリペプチドを含んでいることがある。これらの構築物はさらにアジュバントを含まない担体中で投与されてもよい。
【0108】
1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントの投与は典型的に、APCの表面における1つ以上のペプチドアゴニストのエンドサイトーシスによる効果的な提示を起こすことであろうことが認められよう。即ち、投与された自己抗原性ポリペプチド(複数でもよい)は、エンドサイトーシスによりタンパク質分解されて、いくつかの異なるペプチドアゴニストを生じ、これらが同時に提示されると思われる。複数アゴニストのそのような提示は、エピトープの拡散と集団の多様性に関連する困難についての解決を提供する。この点に関しては、自己免疫疾患は1つまたはそれ以上のポリペプチド上にある1つ以上の自己抗原性エピトープに起因するであろうことが認められるべきである。同様に、対象集団内の別々の個体が1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド上の別々のエピトープに対する自己免疫を発生することがあり得る。しかし、前述のように、本発明は、1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントを投与することにより、正常エンドサイトーシスによるプロセシング後に、APC表面上に複数のアゴニストペプチドの提示を起こすことによって、極めて巧妙にそのような困難を回避することができる。即ち、全てのペプチドアゴニストを、本明細書に開示される組成物と技術を使用して、効率的に提示することができる。そのようなアゴニストの提示は、本発明が提供するようなFcR介在による効率的な取り込みなしには達成できないと思われることを強調するべきである。さらに詳細には、天然自己抗原性ポリペプチド(即ち、FcRリガンドを含まない)または遊離アゴニストペプチドのカクテルの単純な投与によっては治療有効レベルのアゴニストの提示を達成できるとは思われない。そのような組成物が効率良く細胞内に取り込まれて、投与されたアゴニストの提示が治療有効量になることは疑わしい。逆に、本発明は比較的低用量で所望するアゴニストの有効な提示を提供する。
【0109】
さらに、以下に説明するように、本発明の免疫調節剤は、バイスタンダー抑制を刺激する。特定の理論によって制限されることは望まないが、本発明の免疫調節剤を取り込んだAPCによって分泌されるIL−10は、免疫調節剤に含まれる抗原以外の抗原に対する特異性を有する近隣T細胞による免疫応答を低下させることができると思われる。
【0110】
以下の非限定例の呈示は、本発明の原理をさらに説明するのに役立つであろう。この点に関して、以下の考察及び実施例を通して使用する略号と対応する定義の一覧を示す。
MBP:ミエリン塩基性タンパク質、多発性硬化症の病因に関係している。
PLP:プロテオリピドタンパク質、多発性硬化症の病因に関係している。
PLP1:アミノ酸残基139〜151を含むPLPのペプチドフラグメント。
PLP−LR:PLP1のペプチド類似体、PLP1パルス細胞を活性化しない。
PLP2:アミノ酸残基178〜151を含むPLPのペプチドフラグメント。
Ig−W:Balb/cg2b定常領域と結合した抗アルソン酸塩(anti−arsonate)抗体91A3のH鎖可変領域及び親の91A3κL鎖を含むIg構築物(本明細書ではコントロールとして使用されている)。
Ig−PLP1:H鎖CDR3がPLPのアミノ酸残基139〜151で置換されたことを除いてIg−Wと同一の構築物。
Ig−PLP−LR:H鎖CDR3がPLPのアミノ酸残基139〜151のペプチド類似体で置換されたことを除いてIg−Wと同一の構築物。
Ig−HA:(本明細書ではコントロールとして使用されている)H鎖CDR3がインフルエンザウイルスHAのアミノ酸残基110〜120で置換されたことを除いてIg−Wと同一の構築物。
PPD:精製タンパク質誘導体、コントロールアクチベーターとして使用される全結核菌(Mycobacterium tubercuolosis)抽出物。
【0111】
明白な実施上及び道徳上の理由により、多数の疾病に関する実験的組成物または方法の有効性を決定するヒトでの初期研究は実行できない。それ故、医薬品の初期開発中には、安全性及び費用の理由により適当な動物モデルを使用することが標準的な方法である。実験動物モデルの実行で成功するという根拠は、主要抗原決定基が異なる宿主種でしばしば活性であるという理解に基づいている。従って、1つの種、例えば、齧歯類またはブタにおいて有効な自己免疫の治療法は、ヒトのような異なる種においても有効である。適当な動物モデルが十分に開発された後でのみ、ヒトにおけるワクチンの安全性及び有効性をさらに証明するヒトでの臨床試験が実施される。従って、限定の目的ではなく説明の目的として、本発明は主として、哺乳類宿主としてのマウスに関する例で証明される。当業者は、本発明をヒト及び家畜動物を含む他の哺乳類宿主で実施できることを認めるであろう。
【0112】
この点に関して、MSの動物モデルとして使用される実験的脳脊髄炎(EAE)は、PLP及びミエリン塩基性タンパク質(MBP)のようなミエリン自己抗原を用いてマウスの感受性系で誘導することができる。これらタンパク質の脳炎誘発活性は、インビボでクラスII制限脳炎誘発性T細胞を誘導し、そして結果としてEAEを誘導するペプチドの存在と相関している。PLPのアミノ酸残基139〜151に相当するペプチド(PLP1)はH−2s SJLマウスにおいて脳炎誘発性であり、PLP1に特異的なT細胞系はEAEをナイーブ動物に伝達する。ヒトMSでの標的抗原(複数でもよい)は未だ議論の余地があるが、ミエリンタンパク質に特異的なT細胞の頻度は正常な対象よりMS患者の方が多い。それらのミエリン反応性T細胞のサイレンシングは、MSを回復するための論理的な方法であると思われる。このため、このモデルを使用して本発明の利点を証明する。
【0113】
実施例 I
ペプチドの調製
本出願においては、アミノ酸は標準的な3文字または1文字コードで呼称される。他に特定しない限り、アミノ酸はL型が意図されている。1文字コードを使用するとき、大文字はL型を示し、そして小文字はD型を示す。1文字コードは次の通りである。A、アラニン;C、システイン;D、アスパラギン酸;E、グルタミン酸;F、フェニルアラニン;G、グリシン;H、ヒスチジン;I、イソロイシン;K、リジン;L、ロイシン;M、メチオニン;N、アスパラギン;P、プロリン;Q、グルタミン;R、アルギニン;S、セリン;T、スレオニン;V、バリン;W、トリプトファン;及びY、チロシン。
【0114】
以下の実施例で使用するペプチドは全て、Research Genetic,Inc.(Huntsville、 Alabama)で固相法を使用して製造され、そして従来の方法を使用してHPLCカラムで90%以上の純度まで精製された。PLP1ペプチド(HSLGKWLGHPNKF:配列番号1)は、天然プロテオリピドタンパク質のアミノ酸残基139〜151に相当する脳炎誘発配列を包含している。PLP−LR(HSLGKLLGRPNKF:配列番号2)はPLP1の類似体であり、Trp 144とHis 147がそれぞれLeuとArg(下線表示)で置換されていた。PLP1とPLP−LRはI−ASクラスII分子(即ち、マウスの特定の系で産生されるMHCクラスII構造)と良く結合する。PLP2ペプチド(NTWTTCQSIAFPSK:配列番号3)はPLPのアミノ酸残基178〜191に相当する脳炎誘発配列を包含している。このペプチドもI−ASクラスII分子と結合してSJLマウスでEAEを誘導する。HAペプチド(配列表示なし)はインフルエンザウイルスのヘマグルチニンのアミノ酸残基110〜120に相当する。HAはI−EDクラスII分子と結合してここではコントロールペプチドとして使用される。
【0115】
実施例 II
外因性ペプチドを含むマウスキメラ免疫グロブリンの産生
Ig−PLP1及びIg−PLP−LRと命名され、図1に概略的に示す2つの免疫グロブリン−ペプチドキメラを実施例 Iに説明するように構築して、ペプチドPLP1及びPLP−LRを発現させた。どちらも、H鎖CDR3ループを欠失し、選択したペプチドをコードするヌクレオチド配列で置換された。従来のDNA配列決定分析法によって、ペプチドヌクレオチド配列が正しい読み枠に挿入されていることが示された。
【0116】
これらのキメラを構築するために使用した遺伝子には、Gillianら、Cell.33:717、1983、によって記載されたBALBK IgG2b定常領域をコードする遺伝子、Ruthbanら、J.Mol.Bio.、202:383〜398、1988、によって記載された91A3H鎖可変領域をコードする遺伝子、及びGaryら、Proc.Natl.Acad.Sci.、84:1085〜1089、1987、によって記載された全91A3κL鎖をコードする遺伝子が含まれる(これら文献は全て本明細書に参照により編入する)。H鎖CDR3領域を欠失させそしてPLP1及びPLP−LRをコードするヌクレオチド配列で置換する方法は、PR8インフルエンザAウイルスの核タンパク質のアミノ酸残基147〜161に相当するCTLエピトープを有するキメラであるIg−NPの産生についてZaghouaniら、J.Immunol.148:3604〜3609、1992、(本明細書に参照により編入されている)によって記載された方法と同様である。同一の参照文献が、91A3 IgGのCDR3がペプチド発現に適合しており、また天然セグメントの代わりにグラフトされたときに、クラスI及びクラスII制限エピトープがどちらも効率良くプロセシングされてT細胞に提示されたことを報告している。
【0117】
端的には、91A3VH遺伝子をpUC19プラスミドのEcoRI部位にサブクローン化して、PCR変異誘発反応で鋳型DNAとして使用して、CDR3の代わりにPLP1(91A3VH−PLP1)及びPLP−LR(91A3VH−PLP−LR)配列を有する91A3VHフラグメントを生成した。ヌクレオチド配列決定分析によって、PLP1及びPLP−LRの全配列が正しい読み枠に挿入されていることが示された(表示なし)。91A3VH−PLP1及び91A3VH−PLP−LRフラグメントを次に、それぞれpSv2−gpt−91A3VH−PLP1−Cg2b及びpSv2−gpt−91A3VH−PLP1−LR−Cg2bプラスミドを発生させる、Balb/cg2bの定常領域をコードするエキソンの前にあるpSv2−gpt−Cg2bのEcoRI部位にサブクローンした。これらのプラズミドを次に別々に非Ig産生SP2/0B骨髄腫細胞中に親の91A3L鎖である、pSV2−neo−91A3Lを有する発現ベクターと共にコトランスフェクト(同時形質移入)した。Igキメラを産生するトランスフェクタントはゲネチシン及びミコフェノール酸の存在下で選択した。トランスフェクタントを限界希釈法によりクローン化して、最終クローンは1〜4μg/mLのIg−PLP1またはIg−PLP−LR(まとめてIg−PLPキメラと称する)を分泌した。選択した細胞系はIg−PLP1−9B11及びIg−PLP−LR−21A10と命名され、本発明者の実験室で継代培養して永久保存している。
【0118】
キメラ及び野生型抗体もコントロールとして使用した。例えば、Ig−HAは、Dセグメントの代わりに、CDR3内部に挿入されたペプチドだけがIg−PLP1及びIg−PLP−LRと異なっている、インフルエンザウイルスHAから得られたHA110−120Tヘルパーエピトープを有しているIgG分子である。Ig−Wは、修飾されていない(野生型)91A3VH遺伝子産物、即ち、Balb/cg2b定常領域及び91A3κL鎖である。それ故、これは、親のDセグメントを含むCDR3領域がIg−PLP1及びIg−PLP−LRと異なっている。つまり、Ig−PLP2は、H鎖CDR3ループ内にPLPのアミノ酸残基178〜191を有するキメラ抗体である。従来のクローン化、配列決定、及び精製方法を使用して適当な細胞系を作成した。これらの方法はZaghouaniら(前記引用)によって記載された方法及びIg−HAを産生させるために先に使用した方法(Zaghouaniら、Science.259:224〜227、1993(本明細書に参照によりまた編入されている)と同様である。
【0119】
トランスフェクタントの大規模培養は10%の鉄濃縮子牛血清(Intergen、New York)を含有するDMEM培地中で実施した。Ig−PLPキメラは、ラット抗マウス κ鎖mAbをCNBr活性化セファロース4B(Pharmacia)に結合させたカラムの培養上清から精製した。ラット抗マウス κ鎖mAb(RAM187.1またはATCC番号、HB−58)及びマウス抗ラット κL鎖mAb(MAR18.5またはATCC番号、TIB 216)はATCCから調達した。これらのハイブリドーマは大規模にまで増殖させ、そして互いに培養上清から精製した。ラット抗マウスκmAbを使用してカラムを調製し、そしてこのカラムでIg−PLPキメラを培養上清から精製した。交差汚染を避けるために、別々のカラムを使用して個々のキメラを精製した。
【0120】
実施例 III
プロテオリピドタンパク質の精製
天然プロテオリピドタンパク質またはPLPは、Leesら、Preparation of Proteolipids、Research Methods in Neurochemistry(神経化学研究方法−プロテオリピドの調製方法)、N.Marks及びR.Rodnight編、Plunemum Press、New York、 1978 (本明細書に参照により編入している)によって先に記載された方法に従ってラット脳から精製した。
【0121】
端的には、脳組織は2/1(v/v)のクロロホルム/メタノール中でホモジナイズし、さらに焼結ガラス漏斗でろ過して可溶性の粗脂質抽出物を分離した。PLPを次にアセトンで沈殿させ、ペレットをクロロホルム/メタノール/酢酸の混合物中に再溶解し、さらにLH−20−100セファデックスカラム(Sigma)を通過させて残留脂質を除去した。溶出物からのクロロホルムの除去とPLPからアポタンパク質体への転換は、穏やかな窒素流下で水を徐々に添加して同時に実施した。その後、水に対する十分な透析を実施して、残留酢酸及びメタノールを除去した。
【0122】
実施例 IV
ウサギ抗ペプチド抗体の産生
実施例Iで調製したPLP1及びPLP−LRペプチドを、Zaghouaniら、Proc.Natl.Acad.Sci USA. 88:5645〜5649、1991(本明細書に参照により編入している)に記載されるようにKLH及びBSAと結合させた。ニュージーランドシロウサギはMyrtle’s Rabbitry(Thompson Station、 TN)から購入した。これらのウサギは、1mgのペプチド−KLH複合体を含有する完全フロイントアジュバント(CFA)で免疫し、そして1mgの複合体を含有する不完全フロイントアジュバント(IFA)で、高い抗体力価に達するまで毎月チャレンジ(攻撃誘発)した。ペプチド−BSA複合体はセファロースと結合させ、ウサギ抗血清から抗ペプチド抗体を精製するために使用した。
【0123】
実施例 V
ウサギ抗ペプチド抗体の特徴づけ
捕獲ラジオイムノアッセイ(RIA)を使用し、実施例IIに説明するように製造したIg−PLP1及びIg−PLP−LRを用いて、IgG分子上のPLP1及びPLP−LRペプチドの発現を評価した。
【0124】
マイクロタイター96ウエルプレートは、実施例IVで製造したウサギ抗ペプチド抗体(5μg/mL)を用いて4℃で一晩コートし、さらに2%のBSA含有PBSを用いて室温で1時間ブロックした。これらのプレートを次にPBSで3回洗浄し、そして段階的に変化する量のIg−PLP1及びIg−PLP−LRを添加し、そして室温で2時間インキュベートした。PBSで3回洗浄後、捕獲されたIg−PLP1及びIg−PLP−LRは、プレートに100×103cpmの125I標識ラット抗マウス κmAbを加えて37℃で2時間インキュベートして検出した。プレートを次にPBSで5回洗浄してから、LKBガンマカウンターでカウントした。27mg/mLのキメラで得られた三重測定の平均値±SDが示される。
【0125】
図2に示すように、合成PLP1及びPLP−LRペプチドに対するウサギ抗体は、実施例IIで製造されたキメラ抗体Ig−PLP1及びIg−PLP−LRを認識した。さらに詳細には、Ig−PLP1及びIg−PLP−LRは、ウサギ抗PLP1でコートしたプレート上でインキュベートしたとき、有意量で捕獲され、また標識ラット抗マウスκ鎖mAbと結合した(図2A)。同様に、Ig−PLP1及びIg−PLP−LRはどちらもウサギ抗PLP−LRによって捕獲された(図2B)。逆に、Ig−W、即ち、外因性ペプチドを有していない野生型91A3マウス抗体及びIgMコントロール抗体(表示なし)、はウサギ抗体との有意な結合を示さなかった。Ig−PLP1は、Ig−PLP−LRよりも抗PLP1及び抗PLP−LRの両方と良く結合し、構造の違いがウサギ抗体に対するペプチドのアクセス可能性に影響を与えることを示した。さらに、図2に示された結果は、キメラでペプチドが発現しても、ウサギ抗体はH鎖上のPLPペプチドと結合し、標識ラット抗マウスκはL鎖に結合するために、H鎖とL鎖の対合を改変しなかったことを示している。
【0126】
実施例 VI
抗原特異的T細胞系増殖アッセイ
PLP1特異的T細胞ハイブリドーマ5B6及び4E3並びにIL−2依存性HT−2 Tヘルパー細胞は、Eunice Kennedy Shriver Center、Waltham、 MAから得た。5B6及び4E3 T細胞は、Kuchrooら、J.Immunol.153:3326〜3336、1994(本明細書に参照により編入している)によって報告されているように、I−ASクラスII MHCと会合したペプチドPLP1を認識し、これと共にインキュベートしたとき、IL−2を産生する。逆に、Kuchrooらは、PLP1で刺激して、さらにその後PLP−LRで刺激したとき、5B6及び4E3細胞は最早どちらもIL−2を産生しないことを報告している。同様に、PLP−LRの存在下でT細胞ハイブリドーマをPLP1で刺激すると明らかにIL−2産生を阻害する。
【0127】
Kuchrooらと実質的に同一の技術を使用して、種々のアゴニストに対するT細胞ハイブリドーマの活性化を次のようにして実施した。SJLマウス由来の照射(3,000ラド)脾細胞をこの実施例用の抗原提示細胞(APC)として使用した。照射脾細胞は、96ウェルの丸底プレート(5×105細胞/ウェル/50mL)中で、段階的に変化する濃度の抗原(100mL/ウェル)を加えてインキュベートした。1時間後、T細胞ハイブリドーマ、即ち、5B6または4E3(5×104細胞/ウェル/50 mL)を添加して培養を一晩継続した。T細胞の活性化(即ち増殖)は培養上清中におけるIL−2の産生を測定することにより評価した。これはIL−2依存性HT−2細胞を用いる3H−チミジン取り込みによって実施された。即ち、IL−2が存在する(即ち、活性化したT細胞によって分泌される)と、HT−2細胞は増殖し、周囲培地から標識チミジンを取り込む。
【0128】
これらのアッセイを実施するために用いた培養用培地は10%FBS、0.05mM 2−メルカプトエタノール、2mMグルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム及び50mg/mL硫酸ゲンタマイシンを補充したDMEMであった。端的には、培養上清(100 mL/ウェル)は96ウェルの平底プレート中で、HT−2細胞(1×104細胞/ウェル/100 mL)を加えて24時間インキュベートした。その後1ウェル当たり1mCiの3H−チミジンを添加し、さらに12〜14時間培養を続けた。細胞を次にガラスファイバーフィルター上に収集して、取り込まれなかった3H−チミジンを洗い流した。次に、トレース96プログラム及びInotech bカウンターを使用して取り込まれたチミジンをカウントした。IL−2(活性化T細胞ハイブリドーマ細胞株によって分泌された)レベルがより高いウェルはより高レベルのHT−2細胞増殖を誘導し、3H−チミジン取り込み値の増加を記録することが認められよう。
【0129】
2種の異なるT細胞系を使用した前述のアッセイの結果を図3に示す。詳細には、T細胞ハイブリドーマ4E3(図3A)及び5B6(図3B)はIg−PLP1、PLP1及び天然PLPを加えて予めインキュベートしたAPCによって刺激した後、IL−2をかなりの量産生した。ネガティブコントロールであるIg−W、Ig−HA及びPLP2ペプチドはT細胞によるIL−2の産生を誘導しなかった。同様に、Ig−PLP−LR及びPLP−LRペプチドはどちらも5B6及び4E3を刺激せず、有意量のIL−2を産生しなかった。PLP−LRペプチドはIL−2産生を刺激するというよりはむしろ無効にすることが知られているので、前記した最後の結果は予期されないことでない。抗原濃度はIg−PLP1、Ig−PLP−LR、Ig−HA及びIg−Wについては0.1mM、PLP1及びPLP2ペプチドについては1mM、そしてPLPについては1.7mMであった。各値は三重複ウエルの平均値±SDを表す。
【0130】
これらの結果は、Ig−PLP1が活性化を伝導する様式でT細胞ハイブリドーマに提示されたことを示している。立体障害は抗体全体がMHC構造及びTCRに同時・直接的に結合することを妨げるように思われる。T細胞は可溶性タンパク質とは反応しないので、PLP1ペプチドはエンドサイトーシスによるプロセシングによってIgから遊離され、さらにMHCクラスII I−AS分子と結合したと思われる。従って、PLP1ペプチドの隣接領域はIg−PLP1のエンドサイトーシスによるプロセシング、またはPLP1ペプチドとMHCクラスII構造との結合に干渉しないと思われる。
【0131】
実施例 VII
PLP1ペプチドのIg−PLP1を介するT細胞への提示
自然発生免疫疾患においては、自己抗原の暴露及び連続的なエンドサイトーシスによる提示によってかなりのレベルのMHC−自己抗原複合体が生じると思われる。現在、多数の免疫疾患にはこの連続的な提示を再現する有効なインビトロモデルが存在せず、有効な治療法の開発に重大な障害となっている。比較的効率の悪い細胞内取り込みメカニズムまたは先に考察した遊離ペプチドに関する限界のため、所望の刺激を供与するためには比較的高レベルの天然抗原が必要である。従って、本発明の1つの局面は、アゴニストリガンドをエンドサイトーシスによって連続的に提示するインビトロモデルを提供することである。
【0132】
さらに詳細には、本発明は、
a)Fcレセプターを発現する複数の抗原提示細胞を含む培地を用意し、そして
b)前記培地を、免疫調節剤組成物であって少なくとも1つのFcレセプターリガンド及び少なくとも1つの免疫抑制因子を有している免疫調節剤並びに適合性のある担体を含む組成物と組み合わせる、
工程を含む、T細胞アンタゴニストをインビトロエンドサイトーシスによって効果的に提示する方法を提供する。
【0133】
好ましくは、免疫抑制因子は少なくとも1つのT細胞レセプターアンタゴニストであり、そしてFcレセプターリガンドは免疫グロブリン定常領域ドメインの少なくとも一部分である。さらに、本発明の好ましい局面では、免疫調節剤は組換えポリペプチドまたはキメラ抗体を含む。
【0134】
この点に関して、Ig−PLP1(または任意の免疫グロブリン会合アゴニスト)は、免疫系を研究するためのインビトロ系を提供するために、エンドサイトーシス経路で効率的に機能し、さらに高レベルのアゴニストリガンドを生じさせ得るペプチド送達系を確立する目的で使用することができる。特に、開示した系は、自己抗原のインビボ提示と同様の状況における拮抗作用を研究するために使用することができる。
【0135】
抗原の連続的なエンドサイトーシスによる提示を模擬するために免疫グロブリン会合アゴニストが使用できることを証明するために、T細胞活性化アッセイを遊離PLP1ペプチド、天然PLP及びIg−PLP1を使用して実施した。これらのアッセイの結果を図4に示す。
【0136】
詳細には、異なる濃度の3つの抗原(即ち、アゴニスト)に照射SJL/J脾細胞を加えてインキュベートし、その後4E3 T細胞ハイブリドーマと会合させた。IL−2産生は、実施例VIに説明したように、IL−2依存性HT−2細胞を用いて3H−チミジン取り込みによって測定した。各点は三重測定の平均値を表す。標準偏差は平均値の10%を超えなかった。
【0137】
図4は、最大活性値は3種のアゴニスト間で様々であったが、T細胞を刺激するのに必要な値は遊離PLP1または天然PLPのいずれよりもIg−PLP1の方がはるかに低かったことを示している。即ち、細胞系を刺激するには、天然PLPまたは遊離ペプチドのどちらよりもIg−PLP1の方が実質的に少量を要した(1/100程度)。詳細には、最大値の半分まで刺激するためには、Ig−PLP1(0.005 mM)はPLP(0.5 mM)またはPLP1ペプチド(0.6 mM)と比べて少量を必要とするのみであった。これらの結果は、PLP1 T細胞エプトープが天然PLPまたは合成PLP1ペプチドよりも、Ig−PLP1によってより良く提示されることを示している。IL−2産生のプラトーは、T細胞アクチベーターが遊離PLP1合成ペプチドであるときの方がより高かったが、これはインビボで長期間にわたって得ることは困難と思われるような実質的により高値のアゴニストを必要とする。
【0138】
いかなる方法によっても本発明を限定するものではないが、ペプチド送達におけるIg−PLP1の効力はFcR介在性細胞内取り込み及び新たに合成されたMHC分子へのアクセス性に関係していると思われる。さらに詳細には、天然PLPはむしろ効果的ではない単純な流体相ピノサイトーシスによる細胞内取り込みを行い、一方遊離PLP1ペプチドは細胞表面の空MHCクラスII分子と単純に結合するだけであるように思われる。これらの形態による自己抗原の無効な提示は図4で明らかに示されており、これはMHCクラスII分子と組み合わせてPLP1ペプチドを提示するには、Ig−PLP1の方が遊離ペプチドまたは天然タンパク質よりも効率が良いことを明白に示している。
【0139】
実施例 VIII
インビトロにおけるT細胞活性化の阻害
Ig−PLP1−LRによるPLP1、PLP及びIg−PLP1 T細胞活性化の拮抗作用をプレパルス増殖アッセイを使用して検出した。
【0140】
照射(3,000ラド)SJL脾細胞(APCとして使用)は、選択したアゴニスト(1mM PLP1ペプチド、0.05 mM Ig−PLP1または7 mM PLP)及び種々の濃度のアンタゴニスト(100 mL/ウェル)を加えて96ウェルの丸底プレート(5×105細胞/ウェル/50 mL)中で1時間インキュベートした。次に、4E3T細胞ハイブリドーマ(5×104細胞/ウェル/50 mL)を添加し、そして培養を一晩継続した。HT−2細胞を用いて実施例VIと同様に測定した上清中のIL−2産生をT細胞活性化の尺度として使用した。このアッセイの結果を図5に示す。
【0141】
さらに詳細には、図5A、5B及び5Cはそれぞれ、遊離PLP1ペプチド(5A)、Ig−PLP1キメラ免疫グロブリン(5B)及び天然PLP(5C)の拮抗作用を示す。アンタゴニストはIg−PLP−LR(□)及びPLP−LR(○)であり、コントロールはIg−W(◇)及びPLP2(△)であった。
【0142】
アゴニストを加えるがアンタゴニストを使用しないでAPCをインキュベートしたときに得られたcpm値をコントロールチミジン取り込みとして使用した。この値はIg−PLP1では7,503±1,302、PLP1ペプチドでは31,089±3,860、そしてPLPでは8,268±915であった。APCをアゴニストもアンタゴニストも加えずにインキュベートしたときに得られたcpm値はバックグランド(BG)として使用した。この値はIg−PLP1では1,560±323、PLP1ペプチドでは2,574±290、そしてPLPでは2,127±177であった。コントロールに対するチミジン取り込みパーセントは次のようにして計算した。[(試験アンタゴニストの存在下で得られたcpm)−(BG)]/[(cpmコントロールチミジン取り込み値)−(BG)]。各点は三重測定の平均値を表す。
【0143】
前記で考察したように、Ig−PLP1キメラのMHCクラスII分子へのペプチド負荷能力は、抗原の連続的な供給によってしばしばT細胞を攻撃的にトリガできる自己ペプチドを豊富に産生させるインビボ自己免疫環境に似ていると思われる。図5A(PLP1アゴニスト)は、T細胞にPLP1及びIg−PLP−LRの両方が存在する状態でAPCを加えてインキュベートしたとき、Ig−PLP−LR濃度が上昇するに従いIL−2産生がかなり減少したことを示している。PLP1ペプチドによるT細胞活性化中に合成PLP−LRペプチドを使用したとき、IL−2産生の減少が同様に明白であった。逆に、コントロールIg−W免疫グロブリン及びPLP2ペプチドでは拮抗作用効果は観察されなかった。IL−2産生の最大値の50%阻害(コントロールに対して60%のチミジン取り込み)には、PLP−LRペプチドでは9mMであるのに対してIg−PLP−LRでは0.4mMしか必要でなく、Ig−PLP−LRがはるかに効率の良い提示及びT細胞拮抗作用を示す。
【0144】
T細胞拮抗作用においてキメラ免疫グロブリンが遊離ペプチドよりも効率が良いというさらなる証拠は図5B及び5Cに示されている。詳細には、図5Bは、Ig−PLP−LRはIg−PLP1によって介在されるT細胞活性化を阻害したが、遊離PLP−LRは、ネガティブコントロールPLP2ペプチドと同様に、有意な拮抗作用を全く示さなかったことを示している。意義深いことに、図5Bはまた、Ig−W、即ち外因性ペプチドを有していない野生型91A3免疫グロブリン、がIg−PLP介在性T細胞活性化で部分的な阻害活性を呈することも示している。これは、Ig−PLP1とIg−Wがどちらも同一のIgG2定常領域を共有しているため、APC上でのFcR結合に対する競合の結果であると考えられる。IL−2産生の50%阻害の最大値は、Ig−PLP1によるT細胞の活性化がIg−Wの存在下で行われたときに見られた。従って、Ig−WはFcR結合及び細胞内取り込みについてIg−PLP1と競合し、それによってT細胞の活性化を低下させると思われる。即ち、Ig−Wの濃度が土昇するに従い、FcRと結合してAPCによって細胞内に取り込まれるIg−PLP1は少なくなり、その結果、提示及びこれに対応するIL−2産生が減少することになる。応答におけるこのIg−W介在性の減少は拮抗効果の結果ではなくて、むしろ単にFcR結合に対する競合の結果であることに注目することが重要である。即ち、提示されたIg−WエピトープはPLP1に対するTCRアンタゴニストではなく、PLP1特異的TCRとは相互作用しない。
【0145】
図5Bとは対照的に、図5CはIg−WではなくてIg−PLP−LRが天然PLPによるT細胞の活性化を有意に低下させることを示している。Ig−Wは天然PLPと異なる様式で細胞内に取り込まれるらしく(Fcレセプターに対して、単純な流体相ピノサイトーシス)、取り込み及びプロセシングについて直接的な競合は全くないので阻害もないはずである。
【0146】
便宜上の目的で、図5に示した結果をすぐ下の表1にまとめる。APCをIg−PLP−LRの存在下でPLP1ペプチドを加えてインキュベートしたとき、PLP1特異的T細胞ハイブリドーマは活性化されなかった(図5a)。さらに、天然PLP及びIg−PLP1によるT細胞の活性化を種々の濃度のIg−PLP−LRの存在下で実施したとき、IL−2産生(即ち、T細胞活性化)はIg−PLP−LRの増加につれて減少した。しかしなから、遊離PLP−LRペプチドは、天然PLPまたはIg−PLP1によって介在されるT細胞活性化を阻害できなかった。これらの2つの系列の証拠によって、T細胞のIg−PLP−LR介在性不活性化の主要なメカニズムは、細胞表面上でのMHCクラスII分子の直接的な遮断というよりはむしろエンドサイトーシスによる提示とTCR拮抗作用であることが示唆される。
【0147】
以下の表で、プラスの記号はIL−2産生の阻害し、従って拮抗作用があることを示し、マイナスの記号はIL−2産生を殆どまたは全く阻害せず、従って拮抗作用が殆どまたは全くないことを示す。
【0148】
【表1】
【0149】
前述の実施例の結果は、ペプチドアンタゴニストのFcR介在性取り込み及びそれに続くプロセシングが抗原提示細胞による効率的な提示と矛盾しないことを示している。これは、遊離ペプチド類似体が送達されると、MHCまたはTCR結合部位についての直接的な競合によって効率的な拮抗作用が提供されると考えられた先行技術からは全く予期されていなかったことである。
【0150】
実施例 IX
Ig−PLP−LRによる拮抗作用のメカニズムの特徴づけ
実施例VIIIで実施したアッセイと同様のアッセイを用いて、Fcレセプターとの直接的な結合についての競合は、それ自体、Ig−PLP−LR介在性拮抗作用のメカニズムではないであろうことが証明された。
【0151】
SJL脾臓APCを、2mMのIg−PLP2、Ig−PLP−LRまたはIg−Wの存在下で天然PLP(6.8mM)を加えてインキュベートし、そして前記実施例のようにHT−2細胞を用いて3H−チミジン取り込みによってIL−2産生をアッセイした。Ig−PLP2は実施例Iに詳記した配列を用いて実施例IIのように調製した。コントロールに対するチミジン取り込み%は実施例VIIIと同様に計算した。アッセイの結果を図6に示す。図6の各欄は三重測定の平均値±SDを表す。
【0152】
図5Bに示した結果と同様に、本実施例はMHCクラスII構造上での効率の良い提示及び有効なペプチド類似体の両方によって最も顕著な結果がもたらされるという見解を支持している。即ち、例えIg−PLP2キメラ抗体が取り込まれてプロセシングされたとしても、これが天然PLPアゴニストの類似体ではないため、I−ASによるPLP2ペプチドの効率的な提示はT細胞の活性化を妨げない。従って、抗原提示細胞上におけるMHCクラスII分子との単純な競合結合では所望の拮抗作用を生じさせないと思われる。
【0153】
実施例 X
PLP1に対するT細胞応答のインビボ誘導
この実施例によって、本発明のキメラ抗体は、インビトロでのT細胞応答を生じさせる(実施例VII)ことに加えて、インビボで細胞応答を生じさせるために使用できることが証明された。詳細には、次の実施例はIg−PLP1によるPLP1特異的T細胞のインビボ感作を実証する。
【0154】
6〜8週齢のSJLマウス(H−2S)をHarlan Sprague Dawley(Frederick、 MD)から購入し、実験期間は動物施設で飼育した。
【0155】
マウスは、1:1(v/v)のPBS/CFA混合物200mL中で乳化した50mgのIg−PLP1を使用して足蹠並びに肢基部及び尾に皮下免疫した。10日後、頸部脱臼によってマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節(腋窩、鼠蹊部、膝窩及び仙骨)を切除し、単一細胞懸濁液を調製し、T細胞応答を分析した。図7に示した結果は、4×105リンパ節細胞/ウェル(7A)及び10×105脾細胞/ウェル(7B)で得られたものである。アクチベーター PLP1及びPLP2は15mg/mLで使用し、そしてPPDは5mg/mLで使用した。
【0156】
先の実施例と同様に、T細胞活性化は3H−チミジン取り込みを含む増殖アッセイを使用してモニタした。ここでは、リンパ節及び脾細胞は、それぞれ4及び10×105個の細胞/100mL/ウェルで、96ウェル丸底プレート内において、単一の選択したアクチベーター100mLを加えてに3日間インキュベートした。その後1ウェル当たり1mCiの3H−チミジンを添加し、さらに12〜14時間培養を続けた。細胞を次にグラスファイバーフィルター上に収集して、取り込まれた3H−チミジンはトレース96プログラム及びInotechβカウンターを使用してカウントした。刺激剤を有していないコントロール培地を各マウスについて含み、バックグランドとして使用した。
【0157】
図7に示した各値は実施例VIIIに説明するように計算され、アクチベーターを含まない培地で得られたバックグランドcpmを差し引いた後の三重測定の平均値±SDを表す。マウス当たり150mgのIg−PLPでマウスを免疫したときに、同様の結果が得られた(表示なし)。
【0158】
図7A及び7Bは、Ig−PLP1を足蹠並びに肢基部及び尾に皮下注射したとき、PLP1ペプチドに対する強く特異的なT細胞応答が誘導されたことを明らかに示している。反応の強さに関しては個々のマウス間で幾らか変動があったが、各マウスのリンパ節及び脾細胞はPLP1ペプチドによるチャレンジの際に顕著な応答を生じた。興味深いことに、全身性抗原を主としてろ過しそして応答する臓器である脾臓において顕著なPLP1特異的応答が検出されている。これらの結果を説明するために提案できる1つの可能性は、Ig−PLP1は半減期が長いために、循環してリンパ及び血液循環の両方に到達して、その結果全身及びリンパの両部位で提示される可能性があったことである。これは自己免疫疾患の治療法を実施する際に非常に有益な可能性がある。マウスのなかには、細胞をPLP2ペプチドによってインビトロ刺激すると増殖を示すものがあることも興味深かった。おそらく、このペプチドがI−AS様PLP1によって提示されるという事実によって、親和性の低い細胞が結合して応答を生じさせることが可能である。いずれにしても、その結果は、Ig−PLP1が効率良くペプチドをT細胞にインビトロ提示することを示す前記実施例によって示された結果と一致していた。
【0159】
実施例 XI
PLP1に対するT細胞応答のインビボ阻害
先の実施例に見られるように、Ig−PLP1はインビボでT細胞を感作することができ、アゴニストPLP1ペプチドに暴露されたとき強力な免疫応答を生じる。本実施例では、ペプチドアンタゴニストをキメラ抗体免疫調節剤の形態で投与するとアゴニストリガンドのエンドサイトーシスによる提示によって生じる免疫応答を実質的に低下できることが証明される。具体的には、この実施例はIg−PLP−LRをIg−PLP1と同時投与することによってPLP1ペプチドに対する免疫応答が顕著に減少することを証明する。
【0160】
マウスは、50mgのIg−PLP1と150mgのIg−PLP−LR、または50mgのIg−PLP1と150mgのIg−Wのいずれかの混合物で同時免疫した。特に、3つの群(4マウス/群)の個々のマウスに、50mgのIg−PLP1と150mgのIg−PLP−LRの混合物、50mgのIg−PLP1と150mgのIg−Wの混合物、あるいはIg−PLP1と100mg のPLP−LRペプチドの混合物のうちの1つを含有する200mLの混合物(PBS/CFA、1:1 v/v)を用いて実施例 Xと同様に皮下注射した。脾臓及びリンパ節T細胞応答は、実施例 Xに記載したプロトコルを用いて免疫後10日目に分析した。リンパ節細胞は4×105細胞/ウェルで、脾細胞は10×105細胞/ウェルでアッセイした。アゴニストリガンドは15mg/mLのPLP1であった。それぞれ図8A及び8Bに示され以下の表2に要約されたリンパ節及び脾細胞に関する結果は、アゴニストを含有しない培地で得られたバックグランドcpmを差し引いた後の三重測定の平均値±SDを表す。
【0161】
図8A及び8Bは、Ig−PLP1が効率的に提示され、強いインビボT細胞応答を誘導した(実施例X)が、マウスに投与した混合物中にIg−PLP−LRを含むことによってそのような応答に拮抗作用することが可能であったことを示す。実際、マウスにIg−PLP1とIg−PLP−LRを同時投与したとき、それに引き続いて生じる遊離PLP1ペプチドに対する免疫応答は図8A及び8Bの右半分に示したように顕著に減少した。Ig−PLP1と野生型抗体であるIg−Wとの同時投与がT細胞応答を有意に低下させなかったので、脾臓及びリンパ節の両組織のPLP1応答の低さはPLP−LR拮抗作用の結果であったと思われる。これらの結果は、細胞応答低下の原因は、Ig−PLP−LRのFcR結合とエンドサイトーシスによるプロセシングを介するPLP−LRの効率的なインビボ提示であることを強く示している。
【0162】
さらに、すぐ下の表2に示されるように、遊離PLP−LRペプチドとIg−PLP1を同時投与したとき、PLP1応答が減少した徴候はなかった。この表に示した数値はPPD特異的増殖に対するPLP1特異的増殖のパーセント値を表しており、以下ようにして得られた。(PLP1刺激で得られた三重測定の平均値(cpm)−三重測定BGの平均値(cpm))/(PPDで得られた三重測定の平均値(cpm)−三重測定BGの平均値(cpm))×100。
【0163】
【表2】
【0164】
前記の結果は明らかに、遊離アンタゴニストペプチド、またはアンタゴニストペプチドを欠損するコントロールIg−Wとの同時投与は、発生する免疫応答を殆ど影響しないことを示している。遊離PLP−LRペプチドによる拮抗作用効果の欠如は、マウスは遊離ペプチド形態のPLP−LRをIg−PLP−LR形態のものより約34倍多く投与された(150,000Dの分子量に基づくと、マウスに投与された150μgのIg−PLP−LRは2nMのPLP−LRペプチドを含有する1nMのIgに相当し、一方100μgの遊離PLP−LRペプチドは、分子量が1,468ダルトンであるので、68nMのペプチドに相当する)ので、注射ペプチドの正味量がより少ないためではなかった。Ig−PLP1 T細胞刺激に拮抗するIg−PLP−LRの潜在能力と合わせても、PLP−LRペプチドがIg−PLP1介在性T細胞活性化を阻害しなかったことは、Ig−PLP−LR介在性インビボ拮抗作用が提示の効率の良さに関連しているであろうという考えを支持している。
【0165】
実施例 XII
エンドサイトーシスによって提示されたアンタゴニストに対するT細胞応答の誘導
先の実施例は、アゴニストリガンドを含むキメラ抗体の投与がインビボで免疫細胞を感作できることを示している。アンタゴニストを含むキメラ抗体の投与が、その後のアゴニストリガンドによるチャレンジに対する応答を低下させ得ることもまた示された。この実施例では、アンタゴニストの効率的な提示は免疫細胞をインビボで感作し、そしてアゴニストペプチドに対するT細胞の反応に影響を与え得る強い応答を生じさせ得ることを証明する。具体的には、Ig−PLP1とIg−PLP−LRを同時に注射したマウスは、PLP−LRに対して比較的高い増殖応答を発生するが、PLP1ペプチドに対しては実際には全く応答を生じない。
【0166】
リンパ節及び脾細胞は、Ig−PLP1とIg−PLP−LRとの同時投与後に実施例Xに先述した方法と同様にして得た。個々のマウスの増殖応答も、15μg/mLの遊離PLP1ペプチドまたはPLP−LRペプチドのどちらかによるインビトロ刺激後に先の実施例に前述した方法を用いて測定した。リンパ節及び脾臓細胞を用いたアッセイの結果をそれぞれ図9A及び9Bに示す。
【0167】
図9から理解されるように、脾臓とリンパ節は共にアンタゴニストPLP−LRに対して応答を生じたが、PLPアゴニストPLP1には応答を生じなかった。Ig−PLP−LRをIg−PLP1と同時投与したとき、Ig−PLP−LRがPLP−LR特異的T細胞を誘導したことを理解すると、これらのPLP−LR特異的T細胞はPLP1特異的T細胞をダウンレギュレートすると推測することができる。逆に、遊離PLP−LRペプチドをIg−PLP1と共に投与したとき、PLP−LR特異的応答の誘導が生じた(表示なし)が、PLP1に対する増殖応答の明白な減少はなかった。従って、本実施例に記載したデータは、アンタゴニストを含むキメラ抗体の使用が、遊離ペプチドアンタゴニストよりも、抗原アゴニストに対する免疫応答を調節するのにははるかに有効であることを証明している。
【0168】
さらに詳細には、先述の実施例から、APC表面でTCRがPLP−LR−I−AS複合体(即ち、MHC−PLP−LR複合体)に結合すると、T細胞を刺激するというよりはむしろこれらに拮抗作用するように思われる。従って、エンドサイトーシス液胞内でのIg−PLP−LRの効率的な提示によって有意なレベルのPLP−LR−AS複合体(アンタゴニスト複合体)が確実に産生されるため、Ig−PLP−LRによる拮抗作用が生じると思われる。細胞表面にある複合体の量はAPCに提供されるIg−PLP−LRの量に比例する。PLP1刺激をIg−PLP−LRの存在下で実施すると、PLP−LR−I−ASとPLP1−I−ASの両方とも所定APCの表面に提示され、そこでIg−PLP−LR濃度が上昇するとPLP−LR−I−AS複合体数がさらに増加する。T細胞が活性化されるためには約3500個のTCRが結合されなければならず、そしてMHCクラスII−ペプチド複合体のうちの所定の複合体が約200個のTCRを連続的に結合することが認められよう。このため、PLP−LR−I−AS複合体によるTCRの結合がアゴニストPLP1−I−ASによる結合に優先するときに、T細胞が拮抗作用されると思われる。総じて、Ig−PLP−LRによってPLP−LRが効率的に負荷されるため、T細胞拮抗作用はPLP−LR−I−AS複合体によるTCRのより頻繁な連続的なトリガによって達成される。即ち、Ig−PLP−LRの効率的な取り込み及びプロセシングは単に、余りにも多くの表面MHC複合体がPLP−LRアンタゴニストを提示するので、PLP1アゴニストリガンドを提示する残りの表面複合体がT細胞を活性化するためのTCR数を結合できないことを意味している。それ故、アンタゴニストが、MHCクラスII−アゴニスト複合体の活性化濃度がAPCに到達しないことが確実な速度で提示されない限り、T細胞は活性化されない。
【0169】
実施例 XIII
Ig−PLPキメラによる免疫に対するリンパ節増殖応答
増殖応答は、個々のIg−PLPキメラまたはIg−PLP1とIg−PLP−LRから成る種々の混合物で免疫したマウスで測定した。マウスに単独で投与したIg−PLP−LRがT細胞を誘導したことが観察され、そしてこれらのT細胞は、Ig−PLP1によって誘導されたT細胞と同様に、PLP1及びPLP−LRペプチドの両方と交差反応した。しかしながら、驚いたことに、応答の交差反応性にも拘わらず、キメラを共に投与したとき、これらは互いに用量依存性拮抗作用を呈示し、その結果両T細胞応答のダウンレギュレーションを起因した。つまり、IG−PLP1またはIG−PLP−LRのどちらかによって誘導された抗原特異的T細胞は、これら細胞をPLP1及びPLP−LRの両方で同時にインビトロ刺激したとき、ペプチド混合物によるダウンレギュレーションに抵抗を示し、有意に増殖した。これらの所見は、アゴニストとアンタゴニストのペプチドのどちらも互いに逆反応を及ぼし、逆平行拮抗作用及びナイーブT細胞のレベルでTCRトリガにストリンジェントな制御があることを示している。
【0170】
前述のように材料を取得してマウスを免疫した。増殖応答は前記実施例VIに先述したようにチミジン取り込みによって測定した。リンパ節及び脾細胞は、Ig−PLP1とIg−PLP−LRの同時投与後に実施例Xに先述した方法と同方法で得た。マウスには、50μgのIg−PLP1(10A)、50μgのIg−PLP−LR(10B)、100μgのPLP1(10C)または100μgのPLP−LR(10D)を含有するCFAを注射して、10日後に、リンパ節細胞を指定の遊離ペプチドでインビトロ刺激した。刺激剤PLP1、PLP−LR及びPLP2は15μg/mLの特定された最適濃度で使用した。
【0171】
図10A〜10Dに示したデータは、PLP1ペプチドと同様に、Ig−PLP1がPLP1ペプチドに対する特異的T細胞応答を誘導することを示した。同様に、PLP−LRペプチドと同様に、Ig−PLP−LRはPLP−LRペプチドに対する特異的T細胞応答を誘導した。Igキメラまたは遊離ペプチドのどちらも、I−ASクラスII分子によって提示されるペプチドであるネガティブコントロールPLP2と有意に反応するT細胞を誘導しなかった。しかしながら、驚いたことに、Ig−PLP1によって誘導される応答はPLP−LRペプチドと交差反応し、一方Ig−PLP−LRによって誘導される応答はPLP1と交差反応した。遊離PLP1または遊離PLP−LRで誘導される応答は交差反応性ではなかった。
【0172】
実施例 XIV
Ig−PLP1とIg−PLP−LRによる同時免疫に対する リンパ節T細胞増殖応答 マウスに指定したキメラを注射して、10日後にリンパ節細胞を遊離ペプチドでインビトロ刺激し、先に詳記した[3H]チミジン取り込みによって増殖アッセイを行った。結果を図11に示す。
【0173】
Igキメラ表示の前の数字はマウス当たりの注射量(μg)を示す。刺激剤は5μg/mLのPPD、15μg/mLのPLP1、PLP−LR及びPLP2であった。刺激剤を加えないでインキュベートした細胞をバックグランド(BG)として使用した。マウスは個別に試験し、そして各刺激剤について三重複ウェルをアッセイした。結果を標準化して個々に固有の変動性を排除するために、本発明者は結果を以下のように算定した相対的増殖として表した:(試験ペプチドの平均値(cpm)−BGの平均値(cpm))/(PPDの平均値(cpm)−BGの平均値(cpm))。表示の相対的増殖は個別に試験した5匹のマウスの平均値±SDを表す。異なるマウス群についてPPD刺激で得られた平均値(cpm)±SDを以下に示す:50μg Ig−PLP1:16,413±1330;50μg Ig−PLP−LR:11,224±3481;50μg Ig−W:11,513±1,572;50μg Ig−PLP1+50μg Ig−PLP−LR:16,817±2,869;50μg Ig−PLP1+150μg Ig−PLP−LR:16,156±2006;50μg Ig−PLP1+150μg Ig−W:11,699±1,142;50μg Ig−PLP−LR+150μg Ig−W:13,435±1,650;50μg Ig−PLP1+50μg Ig−PLP2:10,056±1,407;及び50μg Ig−PLP−LR+50μg Ig−PLP2:10,877±563。斜め格子付き棒及び平行斜線付き棒はそれぞれPLP1及びPLP−LRに対する増殖を示す。PLP2ペプチドに対する増殖は、Ig−PLP2を免疫混合物中に使用した場合を除いてはバックグランドレベルであった。
【0174】
図11に見られるように、Ig−PLP1で免疫したマウス群由来のリンパ節T細胞はPLP1及びPLP−LRに対して同等に良く増殖したが、Ig−Wコントロールは殆ど反応を起こさなかった。驚いたことに、PLP−LR応答はバックグランドレベルであった。従って、Igキメラに対する応答はPLP1及びPLP−LRペプチド間に交差反応性を共有しているが、この混合物は追加応答ではなくてダウンレギュレーションを起こした。事実、これらのデータはIg−PLP1(アゴニスト)とIg−PLP−LR(アンタゴニスト)間に逆平行ダウンレギュレーションがあることを示唆している。50μgの Ig−PLP1と150μgの Ig−PLP−LRの混合物を注射したマウスがPLP1には応答せず、PLP−LRに対してはIg−PLP1のみを注射したマウスで観察された値にまで減少した応答を生じたため、このダウンレギュレーションは用量依存性であると思われた。
【0175】
IG−PLP1とIg−PLP−LR間で観察された逆方向のダウンレギュレーションに対する1つの可能な説明は、クローンの増殖には同種ペプチドによる最適な連続トリガが必要である(即ち、増殖するためには単一のナイーブT細胞上のレセプターの全てまたは大部分が1つの型のペプチドを利用しなければならない)ということである。Ig−PLP1とIg−PLP−LRの混合物に関わる免疫中に生じる可能性がある、TCR接触残基に僅かな差異を有するペプチドでナイーブT細胞を同時刺激すると、T細胞の増殖及びインビトロ増殖を生じさせない。
【0176】
実施例 XV
Ig−PLP1及びIg−PLP−LRで同時免疫したマウスの脾臓増殖T細胞応答
図12に示したように、実施例XIVに記載したマウス由来の脾細胞を、三重複ウェルでPLP1(斜め格子付き棒)及びPLP−LR(平行斜線付き棒)で刺激して、前記のように増殖を測定した。結果は、PPD刺激による脾細胞の増殖が最小であったため、リンパ節T細胞で得られたPPDのcpmを使用して前記のように標準化した。表示した相対的増殖は個別に試験した5匹のマウスの平均値±SDを表す。
【0177】
これらのマウス由来の脾臓T細胞はPLP−LR刺激に応答しなかった。しかしながら、別の群のマウスをIg−PLP−LRで免疫したとき、リンパ節と脾細胞はどちらもPLP1及びPLP−LRペプチドに対して増殖した。脾臓では、増殖応答はリンパ節よりもはるかに低かったが、追加応答は未だ観察されなかった。むしろ、Ig−PLP1とIg−PLP−LR間に逆方向のダウンレギュレーション効果が観察された。Ig−WにIg−PLP1またはIg−PLP−LRのいずれかを加える同時注射はどちらの応答にも影響を与えなかったが、Ig−PLP2とIg−PLP1の同時注射はIg−PLP1で誘導されたT細胞のなかでPLP−LRに対する反応性を増加させた。
【0178】
実施例 XVI
Ig−PLP1及びIg−PLP−LRで同時免疫したマウスの脾細胞によるIL−2産生
Ig−PLP1とIg−PLP−LR間の逆方向のダウンレギュレーションをさらに研究するために、脾臓抗原誘導性サイトカイン応答を、単一のIg−キメラまたは両方のIg−キメラのいずれかで免疫した動物で測定した。図13に示されるように、実施例XIVで説明したマウス由来の脾臓細胞(1×106細胞/ウェル)をPLP1(斜め格子付き棒)及びPLP−LR(平行斜線付き棒)で24時間刺激した。IL−1(13A)、IFNγ(13B)及びIL−4(13C)の産生は以下のように測定した。
【0179】
細胞は、96ウェルの丸底プレートの10×105細胞/100μL/ウェルで100μLの刺激剤を使用して先述のように、24時間インキュベートした。サイトカイン産生は、100μLの培養上清を使用してPharmingenの指示に従ってELISA法で測定した。捕獲抗体はラット抗マウスIL−2、JES6−1A12;ラット抗マウスIL−4、11B11;ラット抗マウスIFNγ、R4−6A2;及びラット抗マウスIL−10、JES5−2A5であった。ビオチン化抗サイトカイン抗体はラット抗マウスIL−2、JES6−5H4;ラット抗マウスIL−4、BVD6−24G2;ラット抗マウスIFNγ、XMG12;及びラット抗マウスIL−10、JES5−16E3であった。OD405は、SOH MAX PROバージョン1.2.0.ソフトウエアを使用してSpec 340カウンター(Molecular Devices)で測定した。標準曲線を作成するために、段階的に変化する量の組換えマウスIL−2、IL−4、IFNγ及びIL−10を全ての実験に含めた。培養上清中のサイトカイン濃度は標準曲線の直線部分から外挿して算定した。刺激剤を加えないでインキュベートした細胞をバックグランド(BG)として使用した。各マウスは各刺激剤について三重複ウエルで個別に試験し、表示値(cpm)はBG値(cpm)を差し引いた後の平均値±SDを表す。IL−10の産生も測定したが、結果はバックグランドレベルであった(表示なし)。
【0180】
PLP1ペプチドによるインビトロ刺激に際して、Ig−PLP1で免疫したマウス由来のT細胞はIL−2、IFNγ及び少量のIL−4を産生した。しかしながら、同一細胞をPLP−LRで刺激すると最小量のIL−2が産生されたが、IFNγまたはIL−4は検出されなかった。Ig−PLP−LRで免疫したマウス由来の脾細胞は、PLP1ペプチドによる刺激によってIL−2を産生したが、IFNγまたはIL−4は全く産生しなかった。さらに、PLP−LRペプチド刺激では最小限のIL−2応答しか生じなかった。等量のIg−PLP1及びIg−PLP−LRで免疫したマウスでは、いずれのペプチドによる刺激の際も、サイトカイン産生は最小限またはバックグランドレベルにまで減少した。Ig−Wとキメラのいずれかによる同時免疫はサイトカイン産生パターンに対して測定可能な効果を及ぼさなかった。動物にIg−PLP−LR:Ig−PLP1=3:1の比率になるようにキメラを投与したとき、脾臓増殖応答及びIL−2産生はバックグランドレベルであったが、PLP−LRペプチドによる刺激の際に有意量のIL−4及びIFNγが産生されたことが明らかであった。従って、過剰Ig−PLP−LRは、PLP−LRが優先する混合によるTCRトリガを導き、サイトカインを産生できる細胞を誘導するが増殖応答は示さない。これらのデータは、Ig−PLP1とIg−PLP−LRは互いに逆の反応を及ぼし合い、両T細胞応答のダウンレギュレーションをもたらすことを示した。
【0181】
実施例 XVII
PLP1とPLP−LRペプチド混合物によるインビトロ刺激時の抗原暴露T細胞の増殖
Ig−PLP1とIg−PLP−LRが、抗原に暴露された交差反応性T細胞レベルで互いに逆の反応を呈することができるか否かを研究するために、マウスをIg−PLP1またはIg−PLP−LR単独で免疫し、そして遊離PLP1とPLP−LRペプチドから成る種々の混合物によるインビトロ刺激時の増殖性T細胞応答を評価した。
【0182】
さらに詳細には、マウス(4匹/群)は、50μgのIg−PLP1(14Aと14B)または50μgのIg−PLP−LR(14Cと14D)を含有するCFAで免疫し、10日後にリンパ節(14Aと14C)及び脾臓(14Bと14D)の細胞を指定のペプチドで刺激して、前記のように[3H]チミジン取り込みについてアッセイした。ペプチド標示の前の数字は、インビトロ刺激に使用した量μg/mLを示す。特異的増殖は、試験サンプルから得た値(cpm)からBG(刺激剤なしで細胞をインキュベートして得た)の平均値(cpm)を差し引いて評価した。表示値(cpm)は個別に試験した4匹のマウスの平均値±SDを表す。NDは測定しなかったことを示す。
【0183】
図14A〜14Dに見られるように、Ig−PLP1またはIg−PLP−LRで免疫したマウス由来のリンパ節と脾の細胞はどちらも、単一のペプチドによる刺激に対してと同様に、PLP1とPLP−LRの混合物に対して同等に増殖した。前記混合物に対する増殖応答は、殆どの場合、単一ペプチドの刺激に対する応答よりもさらに高かった。
【0184】
実施例 XVIII
PLP1 / PLP−LRペプチド混合物による インビトロ刺激時の抗原暴露T細胞によるIL−2産生
Ig−PLP1とIg−PLP−LRが、抗原に暴露された交差反応性T細胞レベルで互いに逆の反応を呈することができるか否かを研究するために、マウスをIg−PLP1またはIg−PLP−LR単独で免疫し、そして遊離PLP1とPLP−LRペプチドから成る種々の混合物によるインビトロ刺激時のサイトカイン応答を評価した。結果を図15Aと15Bに示す。
【0185】
Ig−PLP1(15A)及びIg−PLP−LR(15B)で免疫したマウス由来の脾細胞を指定するペプチドで刺激し、そして実施例XVIのようにELISA法によってIL−2産生について試験した。これらの実験で使用した脾臓細胞は実施例XVIIに記載のマウス由来であった。ペプチドの名称の前の数字は刺激に使用した量μg/mLを表す。表示のμg/mLのIL−2値は個別に試験した4匹のマウスの平均値d:SDを表す。
【0186】
実施例XVIIで示したように、IL−2産生はPLP1とPLP−LRから成る種々の混合物による脾細胞の刺激時には減少しなかった。反対に、ペプチド混合物による刺激の殆どの場合、IL−2産生は単一ペプチドによる刺激よりも多かった。これらの所見は、アゴニストとアンタゴニストのペプチドのどちらも互いに逆の反応を及ぼし、そして逆平行拮抗作用及びナイーブT細胞のレベルでTCRトリガにストリンジェントな制御があることを示している。
【0187】
成体の免疫応答を減弱するために、T細胞レセプターアンタゴニスト及びアゴニストを含む免疫調節剤を使用することに加えて、以下の実施例で証明されるように、好都合にも同一組成物が新生児及び乳児で寛容を誘導するために使用できる。
【0188】
実施例 XIX
出生時にIg−PLP1の注射を受けたSJL/Jマウスは成体期でのEAEの誘導に抵抗性を有する
本発明の組成物を新生児または乳児に接種することの利点を証明するために、本明細書に説明するように新生児マウスに免疫調節剤を投与し、そして自己免疫誘導剤に暴露した。
【0189】
さらに詳細には、新生児マウス(10マウス/群)に、誕生後24時間以内に100μgのアフィニティクロマトグラフィー精製Ig−PLP1またはIg−Wを注射して、7週齢時に遊離PLP1ペプチドでEAEを誘導した。臨床徴候についてマウスを以下のように毎日スコアした。0、臨床徴候なし;1、尾部緊張の喪失;2、後肢弱化;3、後肢麻痺;4、前肢麻痺;及び5、瀕死または死亡。パネルAは全マウスの臨床スコア平均値を示し、パネルBは生存動物についてのみスコア平均値を示す。EAEは足跡並びに肢及び尾基部に、100μgの遊離PLP1ペプチド及び200μgの結核菌(M.tubeeculosis)H37Raを含有する200μLのIFA/PBS(1v/1v)溶液を皮下注射することによって誘導した。6時間後、5×109個の不活性化百日咳菌(B.pertussis)を静脈内投与した。48時間後、さらに5×109個の不活性化百日咳菌をマウスに投与した。
【0190】
図16A及び16Bに見られるように、出生時にIg−PLP1含有生理食塩水を投与された成体マウスは遊離PLP1ペプチドによるEAE誘導に抵抗性を有した。実際、それらのマウスにおいては、PLPペプチドを有さない親の野生型IgであるIg−Wを投与された動物よりも臨床スコアがはるかに低かった。その上、Ig−Wを投与されたマウスとは反対に、Ig−PLP1を注射されたマウスは再発を示さなかった(図16B)。
【0191】
実施例 XX
新生児胸腺及び脾臓抗原提示細胞による Ig−PLP1のインビボ提示
実施例 XIXで観察された臨床結果を確認するために、サイトカイン応答を新生児マウスで測定した。得られたデータを図17示す。
【0192】
詳細には、新生児(5マウス/群)に、誕生後24時間以内に100μgのIg−PLP1またはIg−Wを注射した。2日後マウスを屠殺し、プールした胸腺(17A)及び脾臓(17B)の細胞を照射し、前述のようにPLP1特異的T細胞ハイブリドーマ4E3の刺激用APCとして使用した。T細胞活性化の尺度として使用した上清中のIL−2産生は、IL−2依存性HT−2細胞系を使用して、Kuchrooら、J.Immunol.153:3326、1994、に説明されるように測定した(本明細書に参照により編入している)。表示の値(cpm)は三重測定の平均値±SDを表す。
【0193】
投与されたIg−PLP1は新生児APCによって効率的に提示された。Ig−PLP1を投与された新生児由来の胸腺(17A)及び脾臓(17B)のAPCはどちらも、外因性抗原を追加しなくてもPLP1ペプチドに特異的なT細胞ハイブリドーマを活性化した。Ig−Wを投与された新生児由来のAPCはT細胞ハイブリドーマを活性化できなかった。
【0194】
実施例 XXI
出生時に Ig−PLP1 を投与されたマウスにおける脾臓増殖T細胞応答の低下
先の2つの実施例で観察された結果をさらに確認するために、増殖応答を出生時に免疫調節剤を接種されたマウスで測定した。結果を図18Aと18Bに示す。
【0195】
新生児には、100μgのIg−PLP1またはIg−W含有生理食塩水を誕生後24時間以内に腹腔内(i.p.)に注射した。マウスが7週齢に達したとき、足跡並びに肢及び尾基部の皮下(s.c.)に100μgの遊離PLP1ペプチドを含有する200μLのCFA/PBS(1容量/1容量)で免疫した。10日後マウスを屠殺し、(18A)リンパ節(0.4×106細胞/ウェル)及び(18B)脾臓(1×106細胞/ウェル)の細胞を、PLPの脳炎誘発配列178〜191(13)に相当するネガティブコントロールペプチドである、15μg/mLの遊離PLP1またはPLP2で4日間インビトロ刺激した。1μCi/ウェルの[3H]チミジンを、刺激の最後の14.5時間中に添加し、増殖はInotechγカウンター及びトレース96 Inotechプログラムを使用して測定した。表示の値(cpm)は個別に試験したマウスの三重複試験平均値±SDを表す。Ig−PLP1及びIg−Wを投与された全てのマウスのリンパ節増殖応答の平均値(cpm)±SDはそれぞれ、34,812±7,508及び37,026±10,133であった。脾臓増殖応答平均値はIg−PLP1投与群で3,300±3,400であり、Ig−W投与群では14,892±4,769であった。
【0196】
出生日にIg−PLP1を投与されたマウスは、Ig−Wを注射されたマウスと同様に、これらマウスを遊離PLP1ペプチド(18A)を含有するCFAで免疫したとき、PLP1に対して等価の成体リンパ節T細胞増殖応答を生じた。しかしながら、脾臓増殖応答はIg−PLP1を投与されたマウス(18B)において顕著に減少し、従って寛容の誘導を示した。どの群のマウスも、PLP1と同様に、I−ASクラスII分子によって提示されるネガティブコントロールペプチドであるPLP2に対して有意な増殖応答を示さなかった。
【0197】
実施例 XXII
出生時にIg−PLP1で処理したマウスにおけるリンパ節T細胞逸脱
乳児または新生児における寛容の誘導をさらに証明するために、出生時に免疫調節剤を接種したマウスでサイトカイン応答を測定した。結果を図19A〜19Cに示す。
【0198】
特に、実施例XXIに記載したマウス由来のリンパ節細胞(4×105細胞/ウェル)を、遊離PLP1またはPLP2(15μg/mL)を用いてインビトロで24時間刺激し、そしてIL−2(19A)、IL−4(19B)及びIFNγ(19C)の産生を、Pharmingenの抗サイトカイン抗体対を用いて実施例XVIに説明するようにELISPOTで測定した。表示の値(スポット形成単位)は個別に試験した8匹のマウスの平均値±SDを表す。
【0199】
これらの結果は、サイトカイン産生パターンが新生児マウスの接種によって影響されたことを示す。出生時にIg−Wを投与されたマウス由来のリンパ節細胞は、PLP1刺激すると、IL−2を産生したがIFNγまたはIL−4は産生しなかった。対照的に、Ig−PLP1を投与されたマウス由来の細胞は逸脱し、そして代わりにIL−4を産生した。PLP2ペプチドで刺激してもサイトカイン産生は観察されなかった。
【0200】
実施例 XXIII
出生日にIg−PLP1の注射を受けたマウス由来の脾臓T細胞によるIFNγ産生の低下
実施例XXIIで得られた結果を確認するために、同一マウス由来の脾細胞をサイトカイン応答についてアッセイした。結果を図20Aと20Bに示す。
【0201】
さらに詳細には、前記マウス由来の脾細胞(1×106細胞/ウェル)を、遊離PLP1またはPLP2(15μg/mL)を用いてインビトロで24時間刺激し、上清中のIL−2(20A)、IL−4(20B)及びIFNγ(20C)の産生を、Pharmingen製の抗サイトカイン抗体対を製造者の指示に従って用いてELISA法で測定した(実施例XVI)。表示のサイトカイン量は個々に試験した8匹のマウスの平均値±SDを表す。
【0202】
脾臓では、Ig−Wを接種したマウス由来細胞はIL−2及びIFNγを産生した。逆に、Ig−PLP1の注射を受けたマウス由来の細胞はIL−2を産生したが検出可能なレベルのIFNγは産生しなかった。ネガティブコントロールであるPLP2ペプチドはサイトカイン産生を誘導しなかった。
【0203】
実施例 XXIV
出生時にIg−PLP1の注射を受けたマウスにおける脾臓T細胞増殖のサイトカイン介在性回復
増殖応答が回復可能であることを証明するために、接種された新生児マウス由来の細胞を外因性IFNγに暴露した。結果を図21に示す。
【0204】
特に、出生時に100μgのIg−PLP1を腹腔内注射された新生児群は、実施例XXIのように100μgのPLP1ペプチドを含有するCFAで免疫して、遊離PLP1ペプチド(15μg/mL)による脾細胞(1×106細胞/ウェル)のインビトロ刺激を、100単位のIFNγまたはIL−12を含むことを以外は、実施例XXIに記載したように実施した。各マウスについての表示値(cpm)は三重複ウエルの平均値±SDを表す。
【0205】
驚いたことには、出生時にIg−PLP1を投与されたマウス由来の脾細胞に外因性IFNγを添加すると増殖応答を回復した。IFNγの誘導物質(14)であるIL−12も脾臓細胞増殖応答を回復した。
【0206】
総じて、出生時にIg−PLP1の注射を受けたマウスはリンパ節T細胞逸脱及び異常なIFNγ介在性脾臓アネルギーを発生した。興味深いことに、遊離PLP1ペプチドを用いてこれらのマウスにEAEを誘導したとき、マウスは軽度の単相性疾病を発症したが、再発はなかった。Igは長い半減期を有しているため、Igに基づく免疫調節剤は長期間にわたって存続すると思われ、その結果、従来の抗原を有する不完全フロイントアジュバントを用いた通常の新生児寛容化方法で生じるものと同様な免疫抑制因子の連続的且つ緩慢な放出が生じる可能性がある。従って、Igで送達すると新生児寛容の誘導においてアジュバントの使用が回避できると思われる。さらに、FcRを介する免疫抑制因子の細胞内取り込みとそれに続くエンドサイトーシス経路におけるプロセシングによって、新たに合成されたMHCクラスII分子にアクセスが可能となり、有意量のMHC−免疫抑制因子複合体が産生される。これらの好ましいパラメーター(即ち、FcR介在性APC活性化、緩慢なペプチド放出及び効率の良いペプチド提示)はリンパ節逸脱及び脾臓アネルギーの誘導に寄与すると思われる。本開示による組成物の成体への投与と同様に、アジュバントを使用しない寛容化方法を使用して自己反応性T細胞を沈静化し、自己免疫を予防することができる。
【0207】
実施例 XXV
可溶性Ig−PLP1はEAE罹患マウスにおいて麻痺の重症度を低下させ、さらに臨床的再発を抑制する
遊離PLP1ペプチドでSJL/JマウスにEAEを誘導し、疾患の臨床的徴候が明白になったとき、動物に可溶性Ig−PLP1(可溶性Ig−PLP1)を含有する生理食塩水の注射を3回、4日間隔で行い、疾患重症度の低下について評価した。コントロールマウスには、PLP1ペプチドを含まない親Igである、可溶性Ig−W(可溶性Ig−W)を投与した。6〜8週齢のSJL/Jマウス群に100μgのPLP1ペプチドを用いてEAEを誘導し、次に疾患誘導後9日目、13日目、及び17日目に、500μgの可溶性Ig−PLP1、500μgの可溶性Ig−W、または100μgの遊離PLP1ペプチドを含有するPBSの腹腔内投与を行った。Ig−PLP1の分子量(150kD)及び遊離PLP1の分子量(1.5kD)に基づき、3回の注射中に投与された300μgの遊離PLP1は、約 200nMのPLP1ペプチドに相当し、1500μgの可溶性Ig−PLP1は約 20nMのPLP1ペプチドを包含する。従って、遊離PLP1を処理に使用する場合、マウスは可溶性Ig−PLP1による処理よりも 約10倍多いペプチドを投与された。
【0208】
結果は図22に示す。各点は8匹のマウスの臨床スコア平均値を表す。図22に示す結果は、2つの個別の実験を表示する。
【0209】
図22に示すように、可溶性Ig−Wで処理されたマウスは、麻痺の初期重症フェーズでは最大スコア平均値が3.7 ( 0.5 であり、120日間の試験期間を通して再発を呈した。しかしながら、可溶性Ig−PLP1処理を受けたマウスは、疾患の初期フェーズにおいて麻痺重症度が軽減され、最大スコア平均値が2.5 ( 0.3 (p< 0.005) を示し、42日目までには完全に回復した。遊離PLP1ペプチドの10倍過剰で処理されたマウスは、疾患の初期フェーズで麻痺重症度を若干軽減したが(最大臨床スコア平均値:3.0 ( 0.2)、全く回復することはなく、さらに120日間の全観察期間を通じて再発を起こした(図22)。
【0210】
図22に示すように、罹患マウスへのアジュバントを含まないIg−PLP1キメラの注射はPLP1特異的病原性T細胞を調節して、EAEを改善するために(図22)、Igによるペプチド送達の効力は、同時刺激性分子その発現レベルが最小限であるか、あるいは発現していない末梢APCにまで拡大すると思われる。この結論は、遊離ペプチド形態にある200nMのPLP1では疾患重症度を僅か軽減するのみで、動物が回復しないが、可溶性Ig−PLP1形態にある20nMのペプチドは、疾患初期フェーズの重症度を低下させ、さらにほとんどの動物が42日までに完全に回復したという所見によって支持される(図22)。
【0211】
実施例 XXVI
アゴニストまたはアンタゴニストを含むがアジュバントを含まない可溶性免疫グロブリンの投与は、疾患重症度を低下させ、さらに同時刺激がなくてもペプチ ド提示を生じる
PLP1ペプチドでSJLマウス群にEAEを誘導し、疾患が臨床的に明らかになったとき、動物に可溶性Ig−PLP1または可溶性Ig−PLP−LRを含有する生理食塩水の注射を3回、4日間隔で行って、疾患重症度の低下について評価した。コントロール目的で、ミエリンペプチドを含まない親のIgであるIg−Wを投与されたマウス群を含んだ。
【0212】
SJL/Jマウスの群に、100μgのPLP1ペプチドを含有する200μgの結核菌(Mycobacterium tuberculosis) H37Raを含むPBS/IFA(v/v)の皮下注射によってEAEを誘導した。注射の6時間及び48時間後に、5×109 百日咳菌(Bordetella pertussis)を静脈内投与して、麻痺の徴候について以下のように毎日マウスをスコア付けした:0、臨床徴候なし;1、尾部緊張の喪失;2、後肢弱化;3、後肢麻痺;4、前肢麻痺;及び5、瀕死または死亡。疾患誘導後9日目、13日目、及び17日目に、マウスに500μg 可溶性Ig−PLP1、Ig−PLP−LR、またはIg−Wを含有する500μlPBSを腹腔内投与した。
【0213】
図23に示す結果は、Ig−PLP1及びIg−PLP−LR処理マウスはどちらも疾患の初期ピーク中に臨床的重症度を軽減し、最大スコア平均値は、Ig−W処理マウスの3.7 ( 0.5からIg−PLP−LR及びIg−PLP1処理マウスではそれぞれ 2.9 ( 0.2及び2.4 ( 0.3 までの降下を呈した(表3)。興味深いことには、Ig−W投与マウスは観察した全120日を通して再発を示したが、Ig−PLP1及びIg−PLP−LR処理マウスはそれぞれ31日及び38日までに麻痺を回復し、再発を示さなかった。10倍過剰の遊離PLP1またはPLP−LRペプチドで処理されたマウスは、臨床的重症度をほとんど軽減せず、120日の観察期間を通じて再発を続けた(データ表示なし)。
【0214】
【表3】
【0215】
Ig−キメラはアジュバントなしでマウスに投与されたため、末梢APC上の同時刺激性分子のアップレギュレーションが生じることはなく、同時刺激性分子を欠如するか、あるいはそのレベルが低下されている細胞によるペプチド提示を誘導して、それによって自己反応性T細胞の寛容を導く可能性はない。
【0216】
この点を研究するために、APC表面上の主要な同時刺激性分子の発現を、可溶性Igキメラを加えてインキュベーションすることによって評価した。マクロファージは2mLのチオグリコレートブロスの注射を行った5日後に、腹膜腔を8mLのHBSS 4μM EDTAで洗浄することによってマウスの腹膜細胞から収集した。マクロファージ(1.0 x 106 細胞/mL)は次に0.3μM 可溶性Ig−PLPキメラ(黒線)または培地のみ(NIL、灰色)を加えてインキュベートした。24時間後、細胞を収集して抗−F4/80(HB−198、ATCC)、及び抗B7.1(1G10;CRL−2223,ATCC)、抗−B7.2(2D10;CRL−2226、ATCC)、あるいは抗CD40で染色した。柱状図表は、F4/80+ゲート細胞を示し、B7.1、B7.2、あるいはCD40の強度を示す。
【0217】
図24に示す結果は、可溶性Ig−キメラの存在下で24時間培養された腹膜マクロファージは、Ig−キメラを含まない状態で培養されたマクロファージと同レベルのB7.2を有することを示す。しかしながら、B7.1及びCD40発現は、可溶性Ig−キメラを含まない培地中で培養された細胞に観察される発現の基礎レベルと比べて低下されている。従って、アゴニストまたはアンタゴニストを含む可溶性免疫グロブリンによる処理は、同時刺激なしにペプチド提示を生ぜしめ、それによって天然末梢性寛容を刺激して自己反応性T細胞を調節する。
【0218】
実施例 XXVII
凝集性Ig−PLP1によるEAEの改善
本発明の組成物及び方法に関する臨床的利点をさらに記述するために、EAEマウスに凝集性Ig−PLP1を接種した。結果を図25に示す。
【0219】
EAEは、10匹のマウスから成る群において、前述のように100μgの遊離PLP1ペプチドで誘導した。溶解可能な凝集性Ig−PLP1はIg−PLP1溶液を63℃で15分加熱し、次に遠心分離してから生成された調製物を濾過して、本プロセス中に形成された不溶性凝集物を取り除くことによって調製された。可溶化凝集物の濃度を次に標準的な生化学技術を用いて定量した。
【0220】
疾患誘導後10日目にEAEの臨床的徴候が生じたとき、マウスに300μgの加熱凝集性Ig−PLP1を含む生理食塩溶液を注射した。2回目及び3回目の300μgの凝集性Ig−PLP1の注射を14日目と17日目に行った。凝集性Ig−W及び可溶性(非凝集性)Ig−PLP1を用いるコントロール処理を平行して行った。臨床状態の類別を実施例XIXに記載するように行った。図25では、凝集性Ig−PLP1処理マウスを●によって表し、一方コントロールは○(可溶性Ig−PLP1)及び△(凝集性Ig−W)で表す。
【0221】
この結果は明らかに、開示の免疫調節剤の凝集性配合物は免疫疾患に関連する症状を効果的に軽減するために使用できることを示す。
【0222】
実施例 XXVIII
凝集性Ig−PLP1を精製APCと共にインキュベートするとIL−6及びIL−10産生を誘導する
本発明による組成物が好都合にも抗炎症性サイトカインを誘導することを実証するために、抗原提示細胞を凝集性Ig−PLP1に暴露した。結果を図26Aと26Bに示す。
【0223】
3つの細胞型を、凝集性Igペプチド構築物を加えてインキュベートする際のサイトカイン産生について試験した。これらはB細胞、マクロファージ/単球、及び樹状細胞を含む。マクロファージを得るためには、SJL/J成体マウスにチオグリコレートを注射して、注射5日後に、氷冷ショ糖(0.34M)で十分に洗浄することによって腹膜細胞から収集し、プラスチック製の培養フラスコに4時間粘着させた。非粘着細胞は勢いよくピペット操作して除去した。さらに一晩培養した後、粘着細胞を細胞スクレーパーによって回収した。樹状細胞は脾臓から精製し、標準的な生化学技術を用いて濃縮した。B細胞はラット抗κmAbによるパニングによって脾臓から精製した。静止B細胞の濃縮には、マクロファージ、樹状細胞、及び大型(活性化)B細胞をセファデックスG10カラムを使って除去した。次に、抗Thy1.2抗体及び補体処理によって溶出細胞からTリンパ球を取り除いた。90%以上にまで濃縮された調製物のみが凝集性構築物によって刺激されることを確実にするために、次にFACS分析を実施する。
【0224】
濃縮マクロファージは、Pharmingen(San Diego、CA)製の抗サイトカイン抗体を用いてELISA法によってIL−6及びIL−10の産生について試験した。マクロファージは100×103細胞/ウェル、そしてB細胞及び樹状細胞は50×103細胞/ウェルを使用した。細胞(三重複ウェル)に段階的に変化する量の凝集性Ig−PLP1またはマウス骨髄腫IgMを加えて24時間インキュベートして、その上清をサイトカイン産生測定に使用した。上清中のサイトカイン量は、サイトカインの既知量によって作成された標準曲線上に外挿することによって算定した。
【0225】
図26A及び26Bは、凝集性Ig−PLP1の投与がIL−6及びIL−10のような抗炎症性サイトカインの産生を増強することを示す。さらに詳細には、図26Aは、凝集性構築物への暴露がマクロファージにおいて比較的高レベルのIL−6を誘導し(□)、他方図26Bは同一構築物がマクロファージ(□)及び樹状細胞(△)においてIL−10産生を増強することを示す。そのようなサイトカインの産生は、Th2型細胞の発生を促すが、MHCクラスII分子の発現及び同時刺激性分子のアップレギュレーションを阻害できることが認められるであろう。
【0226】
実施例 XXIX
活動性EAEの転帰において凝集性Ig−PLP1は可溶性Ig−PLP1よりもより高い有効性を呈する
可溶性免疫調節剤は自己免疫疾患の症状を改善し、本発明の範囲に含まれるが、標的細胞上のFcレセプターを架橋することができ、さらに自己免疫疾患を改善する免疫調節剤の能力について以下のように研究した。
【0227】
FcRを架橋し、さらにIL−10産生を誘導し、それによって可溶性Ig−PLP1よりも自己免疫疾患をさらに大きく改善する、凝集性Ig−PLP1の能力はを以下のように研究した。Ig−W、Ig−PLP1、及びIg−PLP2トランスフェクタントの大規模培養を10% serum supreme(BioWhittaker、 Walkersville、 MD)を含むDMEMで行い、交差汚染を避けるために別のラット抗マウスκ鎖セファロースカラム上で精製した。次に、Ig−キメラをPBSに対して透析して、コロジオン膜(Schleicher & Schuall、 Keene、NH)で濃縮した。キメラは説明したように50%飽和(NH4)2SO4 による沈降によって凝集された(Chase ら、 Chemical Analyses、 Methods in Immunology and Immnochemistry、 Williams ら、編集 Academic Press、 New York、 2:249〜341、 1968、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。端的には、可溶性Ig−キメラ調製物に同量の濾過済み100%飽和(NH4)2SO4 を加えた。この混合物を20分ごとに緩やかな撹拌を加えながら24℃で1時間インキュベートした。次に試料を10,000rpmで沈降して、ペレットを1mg/mLとなるようにPBSに再懸濁した。10%アクリルアミドゲル上の電気泳動は、可溶性Ig−キメラがゲル中に入り、約160kDに移動することを示した。しかしながら、凝集性Ig−キメラはゲルには入らなかった。2μgに等価の凝集性Ig−キメラをアプライし、さらに本テクノロジーの感度が0.1μgであることが知られているため、発明者らは少なくとも95%の凝集性Ig−キメラ調製物が凝集形態であると結論した。
【0228】
マウス(8匹/群)の群に100μgのPLP1でEAEを誘導して、次に疾患誘導後9日目、13日目、及び17日目に、300μgの凝集性Ig−PLP1またはIg−Wを含有するPBSで処理を行った。結果を図27Aと27Bに示す。
【0229】
図27aに見られるように、麻痺性疾患重症度の初期フェーズは、最大スコア平均値が凝集性Ig−W処理動物の3.3 ( 0.3 から凝集性Ig−PLP1を投与されたマウスの1.1 ( 0.5 (p<0.001) にまで減少した。その上、動物は処理完了の9日以内に完全に回復し、全120日の観察期間を通じて全く再発しなかったが、一方凝集性Ig−W処理マウスは決して回復することがなく、臨床評価の全期間を通じて再発を示した。
【0230】
図27bは、可溶性Ig−PLP1(図22)に対する凝集Ig−PLP1(図27a)による処理後のPLP1ペプチド誘発性EAEの疾患経過の直接比較である。各点は8匹のマウスの臨床スコア平均値を示す。これらの結果は、3つの個別実験を表す。図27bに示すように、マウスに投与された900μgの凝集性Ig−PLP1は約12nMのPLP1を含み、遊離PLP1として投与された200nMよりも約17倍低いにも係わらず、凝集性Ig−PLP1による疾患の調節はずっと効果的であった。凝集性Ig−PLP1の有効性は、凝集性Ig−PLP1処理動物の臨床的徴候を可溶性Ig−PLP1を注射した動物のそれと比較したときにもまた明白である(p<0.001)(図27b)。実際に、最大臨床スコア平均値はかなり低くまた回復はより早かった。
【0231】
凝集性Ig−PLP1または凝集性Ig−Wで処理したマウスの組織学的検査をまた実施した。凝集性Ig−PLP1または凝集性Ig−Wで処理したマウスを、疾患の初期フェーズピーク時(疾患誘導後28日目)に屠殺して、脳及び脊髄を切除して、ホルマリンで固定してからパラフィンに包埋した。小脳、大脳、及び腰髄からの連続横断切片(6μm)を作成して、ヘマトキシリン−エオシン(H&E)染色を行った。少なくとも20個の単核細胞を含む血管周囲クラスタを炎症病巣としてカウントした。
【0232】
疾患ピーク時の小脳の病理組織検査は、所定の凝集性Ig−Wを投与されたマウスに対して凝集性Ig−PLP1処理マウスにおいては病巣数が少なく、病巣当たりの浸潤性単核細胞数が減少していることを示した(データ示さず)。さらに、連続的病理組織の横断切片を脳及び脊髄から作成して、横断切片当たりの平均病巣数を算定したとき、凝集性Ig−Wを投与されたマウスに対して凝集性Ig−PLP1処理マウスにおいて病巣数は2〜3倍減少していた(表4)。さらに、IgーPLP1処理マウスにおける病巣では、凝集性Ig−W処理マウスよりも浸潤性単核細胞数が少なかった(凝集性Ig−W:73 (39、凝集性Ig−PLP1:32 ( 14, p<0.005)。
【0233】
【表4】
【0234】
6〜8週齢マウスにPLP1でEAEを誘導して、次に引き続いて疾患誘導後9日目、13日目、及び17日目に300μgの凝集性Ig−PLP1または凝集性Ig−Wで処理して、臨床的疾患について毎日スコア付けした。最大重症度平均値は、群内の各マウスから得られた臨床スコア最大値を平均することによって決定した。病理学的疾患を決定するためには、疾患誘導後28日目(疾患ピーク時)にマウスから脳と脊髄を切除して、ホルマリン固定、パラフィン包埋して、6μmに横断切片してから、ヘマトキシリン−エオシン(H&E)染色を行った。炎症病巣は、最低でも20個の単核細胞/血管周囲クラスタを示す。
【0235】
実施例 XXX
凝集性IG−PLP1はAPCによるIL−10産生を誘導する
凝集性Ig−PLP1による効果的なEAEの調節の基礎となるメカニズムを描写するために、APCによるIL−10産生を刺激するための凝集性Ig−PLP1の能力及びIL−10産生APCによって提示されるPLP1ペプチドの識別に係わるT細胞を阻害するためのIL−10の能力を研究した。このため、ナイーブ脾細胞に可溶性または凝集性Igキメラを加えてインキュベートして、次にその上清をIL−10検出に使用した。
【0236】
照射(3000ラド)SJL/J脾細胞(5 x 105細胞/ウェル)に段階的に変化する量の可溶性Ig−PLP1、凝集性可溶性Ig−PLP1、凝集性Ig−W、可溶性Ig−PLP2、または凝集性Ig−PLP2を加えて24時間インキュベートして、その上清を使って以下のようにELISA法によりIL−10産生を定量した。
【0237】
ELISA法はPharMingenの標準プロトコルに従って実施した。捕獲抗体はラット抗マウスIL−10であり、ビオチン化抗サイトカイン抗体はラット抗マウスIL−10であった。結合リガンドはTMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム(Kirkegaard & Perry Laboratories、 Gaitherburg、MA)を用いて解明した。アッセイはSpectraMAX 340カウンターで読み取った。段階的に変化する量の組換えマウスIL−10を標準曲線を作成するための全ての実験に含んだ。培養上清中のサイトカイン濃度は標準曲線の直線部分から外挿して算定した。各点は三重複ウェルの平均値を示し、このデータは4回の個別実験を表す。
【0238】
図28aに示すように、凝集性Ig−PLP1、Ig−PLP2、及びIg−Wキメラは、用量依存性で脾臓細胞によるIL−10の産生を刺激した。キメラの可溶性形態は検出可能レベルのIL−10を誘導しなかった。
【0239】
プロフェッショナルAPCとして機能することが公知の細胞が、凝集性Igキメラと共にインキュベートする際にIL−10を産生できるか否かを研究するために、以下の実験を行った。チオグリコレート誘導腹膜マクロファージ及び脾性B細胞及び樹状細胞を単離して、以下のように凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートする際のIL−10産生について試験した。
【0240】
マクロファージは前述のようにチオグリコレートブロスを注射したマウスの腹膜細胞から得た(Doyleら、Murine macrophages Isolation, cultivation, and characterization, Weirs Handbook of Experimental Immunology、Herzenbergら編集、Blackwell Science, Cambridge, MA, 154.1〜154.8, 1996、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。端的には、チオグリコレートブロス 2mLを腹腔内注射して、その5日後に腹膜腔を8mLのHBSS 4μM EDTAで洗浄することによってマクロファージをマウスの腹膜細胞から収集した。マクロファージの純度はF4/80マーカーに対する抗体を用いてFACS(登録商標)分析によって測定された時に93%以上であった。
【0241】
樹状細胞は、標準コラゲナーゼ/分別粘着法に従ってSJL/J脾臓から精製された(Romaniら、Dendritic cells Weirs Handbook of Experimental Immunology、Herzenbergら、Blackwell Science、 Cambridge、 MA, 156.1〜156.14、 1996、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。細胞の純度は33D1マーカーに対する抗体を用いてFACS(登録商標)分析によって測定された時に94%以上であった。
【0242】
SJL/J脾細胞は、ラット抗マウスκ(1mg/mL)でコートしたプレート上、25℃で15分パニングされた。非粘着細胞はPBSで洗い流した。B細胞は次にリドカインHCl(0.8mg/mL)を加えてインキュベートした後で勢いよくピペット操作することによってプレートから剥離させた。細胞純度はB220マーカーの発現についてのFACS(登録商標)分析によって測定された時に90%以上であった。
【0243】
照射(3000ラド)B細胞(2x105細胞/ウェル)、マクロファージ(0.2x 105細胞/ウェル)及び樹状細胞(0.2x 105細胞/ウェル)に段階的に変化する量の凝集性Ig−PLP1(中白シンボル)またはマウスIgM(中塗りシンボル)を加えて24時間インキュベートして、細胞培養上清を使ってIL−10産生を測定した。各点は三重測定の平均値を表す。これらの結果は、4つの個別実験を表す。
【0244】
図28bはB細胞ではなく、マクロファージ及び樹状細胞は、凝集Ig−PLP1を加えてインキュベートするとIL−10を産生することを示す。マウスIgMは、試験されたいずれのAPCによってもIL−10産生を刺激できなかった。これらの結果は、凝集性Ig−PLP1がFcγRを架橋して、APCによるIL−10の産生を誘導することを示す。さらに、APCに可溶性マウスIgGを加えてプレインキュベートすると、凝集性Ig−PLP1−誘導によるIL−10産生を阻害した(データ表示なし)。
【0245】
これらの結果は、APCによって産生されたIL−10は、エンドトキシンによる汚染というよりはむしろFCγRの架橋に起因したことを示す。
【0246】
実施例 XXXI
凝集性Ig−PLP1は、FcγR1レセプターを架橋することによってIL―10を誘導する。
Fcレセプターを架橋する凝集性Ig−PLP1の能力を以下のようにして研究した。Ig−PLP1は硫酸アンモニウムを用いて凝集させ、IL−10の誘導について試験した。SJL/J脾細胞(0.5 x 106 細胞/ウェル)に0.1μM 可溶性Ig−PLP1、0.1μM 凝集性Ig−PLP1、0.1μM 凝集性Ig−PLP1+50μg/mL 2.4G2、または0.1μM 凝集性Ig−PLP1+100μg/mL マウスIgを加えてインキュベートした。24時間後、細胞をペレット化して、100mLの培養上清を使って、PharMingenの標準プロトコルに従ってELISA法によってIL−10産生を評価した。
【0247】
図29に見られるように、可溶性Ig−キメラではなく、凝集性Ig−キメラを加えて脾細胞をインキュベートすると、APCによるIL−10の誘導を導出した。2.4G2 mAbによるFcR2及びFcR3の遮断はIL−10産生を阻害しなかったが、マウスIgGを加えてインキュベートすることによる全3種のFcR遮断は凝集性Ig−キメラ誘導性IL−10を有意に低下させたため、IL−10産生はFcR1依存性であると思われる。総じて、これらの結果は、Ig−キメラの凝集はAPCを誘導してFcR1依存性でIL−10を産生することを示した。
【0248】
実施例 XXXII
凝集性IG−PLP1は特異的T細胞によるインビトロIFNγ分泌をダウンレギュレートする
抗原提示によってAPCと特異的に係わるT細胞に及ぼすAPC誘導性IL−10の影響を研究するため、ペプチド刺激に際してタイプI及びタイプIIサイトカインの両方を産生できるPLP1特異的Th0クローンを使用した。TCC−PLP1−1B10と命名されたこのクローンは以下のように調製された。
【0249】
成体SJLマウスを100μgのPLP1ペプチドを含有するCFAで皮下免疫して、10日後に流入領域リンパ節を切除して、その細胞(5 x 106 細胞/ml)をPLP1(15μg/mL)で刺激した。5日後に、芽球をHistopaque勾配(Sigma、 St. Louis、 MO)で単離して、次にペプチド及び新鮮な照射(3000ラド)シンジェニック(同質遺伝子的)APCで刺激した。10日後、細胞を洗浄して、10%T−Stim(Collaborative Research、 Boston、 MA)を含む培地に再懸濁して、7日間静止させた。刺激/静止を3サイクル繰り返した後、細胞を限界希釈(1細胞/3ウェル)によってクローン化して、ポジティブな細胞には限界希釈クローニングの第二ラウンドを行った。その後、TCC−PLP1−1B10と命名された一つのクローンを以下のようにさらに特徴づけした。
【0250】
PLP1、PLP2、凝集Ig−PLP1及び凝集Ig−PLP2に対するTCC−PLP1−1B10の増殖応答を以下のように試験した。SJL/J脾細胞(10 x 105細胞/ウェル/100μL)を丸底96ウェルプレートで段階的に変化する量の抗原で4時間パルスして、ペレット化し、1%のパラホルムアルデヒドで15分固定し、洗浄してから新しい96ウェルプレートに移した。TCC−PLP1−1B10細胞(0.5x 105細胞/ウェル/100μL)を次に添加して3日間インキュベートした。その後1ウェル当たり1μCiの[3H]−チミジンを添加し、さらに14.5時間インキュベートを継続した。細胞を次にガラスファイバーフィルター上に収集して、取り込まれた[3H]チミジンをInotechβカウンター(Wohlen、 Switzerland)を用いてカウントした。結果を図30aに示す。
【0251】
図30aに示すように、TCC−PLP1−1B10は、遊離PLP1ペプチドまたは凝集性Ig−PLP1で予めパルスした、パラホルムアルデヒドで固定した脾臓APCを加えてインキュベートすると増殖する。TCC−PLP1−1B10は、APCをネガティブコントロールであるPLP2または凝集性Ig−PLP2でパルスした場合は有意な増殖を示さなかった。
【0252】
遊離PLP1または凝集性Ig−PLP1による刺激に際してTCC−PLP1−1B10によって産生されるサイトカインを以下のように研究した。照射(3000ラド)SJL/J脾細胞(5 x 105細胞/ウェル)に段階的に変化する量のPLP1ペプチド(中塗り丸)または、凝集性Ig−PLP1(中白丸)を加えて1時間インキュベートし、その後TCC−PLP1−1B10細胞(0.5x 105細胞/ウェル)を加えてさらに24時間インキュベートを続けた。サイトカイン産生は100μLの培養上清から以下のようにしてELSA法によって測定した。各点は三重測定ウエルの平均値を表す。ELISA法はPharMingenの標準プロトコルに従って実施した。捕獲抗体は、ラッ抗マウストIL−2、JES6−1A12;ラット抗マウスIL−4、11B11;ラット抗マウスIFNγ、R4−6A2;ラット抗マウスIL−10、JES5−2A5;及びラット抗マウスIL−5、TRFK5であった。ビオチン化抗サイトカイン抗体は、ラット抗マウスIL−2、JES6−5H4;ラット抗マウスIL−4、BVD6−24G2;ラット抗マウスIFNγ、XMG1.2;ラット抗マウスIL−10、JES5−16E3;及びラット抗マウスIL−5、TRFK4であった。活性TGFβ検出のためのELISA法は、ヒトTGFβ1DuoSet kit (Genzyme、 Cambridge、 MA) を製造元の指示に従って用いて実施した。結合リガンドは、TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム(Kirkegaard & Perry Laboratories、 Gaitherburg、MA)を用いて解明した。アッセイはSpectraMAX 340カウンターで読み取った。標準曲線を作成するために、段階的に変化する量の組換えマウスIL−2、IL−4、IFNγ、IL−10、IL−5、及びTGFβを全ての実験に含めた。培養上清中のサイトカイン濃度は標準曲線の直線部分から外挿して算定した。
【0253】
非固定脾臓APC及び遊離PLP1ペプチドを加えてインキュベートした際のサイトカイン産生を試験したとき、TCC−PLP1−1B10は有意量のIL−2、IL−4、及びIFNγを産生した(図30b、30c、及び30d)3種のサイトカイン全てがまた、凝集性Ig−PLP1を刺激に使用したときにも検出された(図30b、30c、及び30d)。しかしながら、IL−10は、刺激剤が遊離PLP1ではなく凝集性Ig−PLP1のときに有意なレベルで検出可能であった(図30e)。
【0254】
凝集性Ig−PLP1はマクロファージ及び樹状細胞によるIL−10産生を誘導するため、T細胞サイトカイン評価アッセイに見られるIL−10はTCC−PLP1−1B10というよりはむしろ脾臓APCの産物であったと思われる。これを確認するために、以下の実験を行った。凝集性Ig−PLP1によるT細胞活性化におけるIL−10源を識別するために、固定及び生APCを使用した。固定APCアッセイでは、SJL/J脾細胞(10 x 105細胞/ウェル)を段階的に変化する量の凝集生Ig−PLP1で4時間パルスして、十分に洗浄してから、パラホルムアルデヒドで固定した。生APCアッセイでは、照射(3000ラド)SJL/J脾細胞(5 x 105細胞/ウェル)に段階的に変化する量の凝集性Ig−PLP1を混合して、1時間インキュベートした。その後TCC−PLP1−1B10細胞(0.5x 105細胞/ウェル)を両アッセイに加えてさらに24時間インキュベートを継続した。IL−10産生は100μLの培養上清からELSA法によって測定した。各点は三重測定ウエルの平均値を表す。
【0255】
結果を図31に示す。図31に示すように、凝集性Ig−PLP1でパルスされたAPCを洗浄して、TCC−PLP1−1B10を加えてインキュベートする前にパラホルムアルデヒドで固定したときは、IL−10は検出不能であり、これはTCC−PLP1−1B10というよりはむしろ脾臓APCがIL−10源であったことを実証した。
【0256】
T細胞サイトカイン評価アッセイからのその他の驚くべき観察は、APCによるIL−10産生が増加するとIFNγ産生が減少するらしいことであった(図30c及び30e)。この問題をさらに研究するために、さらに広範囲のIg−PLP1濃度をバルク及び精製APCの刺激に使用し、さらにIL−10及びIFNγ産生を以下のように同一組織培養ウェルから同時に評価した。
【0257】
照射(3000ラド)SJL/J脾細胞(5 x 105細胞/ウェル)、樹状細胞(0.2x 105細胞/ウェル)、マクロファージ(0.2x 105細胞/ウェル)、またはB細胞(2x 105細胞/ウェル)に段階的に変化する量の凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートし、1時間後にTCC−PLP1−1B10細胞(0.5x 105細胞/ウェル)を加えて、さらに24時間インキュベートを継続した。同一培養ウェルでのIFNγ及びIL―10産生をELISA法によって測定した。各点は三重測定ウエルの平均値を表す。結果を図32に示す。
【0258】
図32に示すように、APCによって分泌されるIL−10は、T細胞によるIFNγの産生に拮抗作用する。事実、脾細胞、精製DC、または濃縮腹膜マクロファージ(その全てが凝集性Ig−PLP1と共にインキュベートする際にIL−10を産生する。図28)をAPCとして用いて刺激アッセイを行うと、T細胞によるIFNγ産生は劇的に減少し、APCによるIL−10産生が増加すると検出不能になった(図32a、32b、及び32c)。しかしながら、凝集性Ig−PLP1と共にインキュベートされるときにIL−10を産生しないB細胞がAPCとして使用される場合(図28b)、T細胞によるIFNγ分泌は影響を受けなかった(図32d)。総じて、これらの結果は、凝集性Ig−PLP1が提示APC(樹状細胞及びマクロファージ)によるIL−10産生をトリガし、またそのようなIL−10がT細胞によるIFNγの産生に拮抗作用することを示す。
【0259】
さらにIL−10産生がT細胞によるIFNγの産生を拮抗作用することを確認するために、以下の実験を行った。照射(3000ラド)SJL/J腹膜マクロファージ(0.2 x 105細胞/ウェル)(前述のように精製した)に段階的に変化する量の凝集性Ig−PLP1を加えて1時間インキュベートし、次にTCC−PLP1−1B10細胞(0.5x 105細胞/ウェル)を加えてさらに24時間インキュベートを継続した。同一培養ウェルでのIFNγ及びIL―10産生を前記のように100μLの培養上清から評価した。その上、IFNγ産生に対する効果を測定するために、抗IL−10mAb 2A5またはラットIgGをいくつかの培養中に含んだ。
【0260】
その結果を図33に示す。TCC−PLP1−1B10に腹膜マクロファージ及び凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートすると、提示マクロファージによって分泌されるIL−10レベルと比例してIFNγ産生が減少する(図33a)。さらに、T細胞によるIFNγ産生の阻害は、抗IL−10 mAbである2A5によるそのようなIL−10の中和がIFNγ産生を回復するため、APC誘導性IL−10に直接的に関連する(図33b)。抗IL−10の代わりにイソタイプコントロールであるラットIgGを加えてインキュベートしても、TCC−PLP1−1B10によるIFNγ産生を阻害するIL−10の能力に効果はなかった。
【0261】
実施例 XXXIII
攻撃性T細胞のインビボ調節に対する内因性IL−10と末梢性寛容間の相乗作用
アジュバントなしで動物に投与された全身性抗原は、同時刺激性分子を発現していないか、あるいはその発現レベルが最小限である末梢APCによる抗原提示によって操作される寛容を生ぜしめる。精製マクロファージまたは樹状細胞に、MHCクラスII分子へのペプチドの効率的な負荷を可能にする可溶性または凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートすると、B7−1、B7−2、またはCD40のアップレギュレーションを誘導しない(データ表示なし)。さらに、凝集性Ig−PLP1はAPCによるIL−10の産生を起因するため(図28)、IL−10はAPC上にある同時刺激性分子のアップレギュレーションを阻害すると思われる。
【0262】
IL−10はTh1サイトカインを拮抗作用すること(Fiorentinoら、J. Immunol.、 146:3444〜51、1991、その開示はその全文を参照により本明細書に編入している)並びにおそらく炎症機能を妨害するであろうことが示されているため、T細胞調節における凝集性Ig−PLP1の有効性及び同時刺激性分子の発現レベルが最小限であるAPCによる不適切なペプチド提示を介する疾患の転帰、及びそのようなAPCによって産生されるIL−10の阻害機能を以下のように研究した。
【0263】
PLP1ペプチドを用いてマウスにEAEを誘導し、麻痺の徴候が明白になったとき、マウスに凝集性Ig−PLP1を抗IL−10抗体と共に投与して、以下のように疾患重症度の軽減について評価した。100μgのPLP1でSJL/Jマウス(8匹/群)にEAEを誘導し、9日目、13日目、及び17日目に300μg 凝集性Ig−PLP1(凝集性Ig−PLP1);300μg 凝集性Ig−PLP1+500μg ラット抗マウスIL−10抗体である2A5(凝集性Ig−PLP1+抗IL−10);300μg 凝集性Ig−PLP1+500μg ラットIgG(凝集性Ig−PLP1+ラットIgG);300μg 凝集性Ig−W(凝集性Ig−W);あるいは300μg 凝集性Ig−W+500μg ラット抗マウスIL−10抗体である2A5(凝集性Ig−W+抗IL−10)を含有するPBSを腹腔内投与した。全ての注射は腹腔内にPBSで行った。結果を図34aに示す。
【0264】
図34aに示すように、麻痺の重症度は、インビボIL−10が抗IL−10抗体によって中和されたときに回復した。事実、凝集性Ig−PLP1のみで処理したマウスは、最大臨床スコア平均値が1.1±0.5であったが、凝集性Ig−PLP1と抗IL−10抗体の両方の注射を受けたマウスは3.3±0.3のスコアを示し、これは凝集性Ig−W処理を受けたマウスに観察された3.3±0.3(p>0.23)と同等である。さらに、抗IL−10抗体の代わりにラットIgGを凝集性Ig−PLP1と共に投与されたコントロールマウスは、疾患重症度を回復せず、最大スコア平均値は1.6±0.2であった。抗IL−10抗体を凝集性Ig−Wと共に注射しても疾患重症度を軽減したり、悪化させることはなかった。これらの結果は、凝集性Ig−PLP1誘導性IL−10は、疾患重症度の制御において重要な役割を果たしており、IL−10の効果が生じるためにはAPCと標的T細胞間の特異的相互作用が必要であることを実証する。
【0265】
さらにこのメカニズムは、可溶性Ig−PLP1+外因性IL−10による処理が凝集性Ig−PLP1と同程度まで麻痺の重症度を軽減する事実に拠って支持される。100μgのPLP1でマウス群(8匹/群)にEAEを誘導し、9日目、13日目、及び17日目に300μg 可溶性Ig−PLP1(可溶性Ig−PLP1);300μg 凝集性Ig−PLP1(凝集性Ig−PLP1);300μg 可溶性Ig−PLP1+400U rIL10(可溶性Ig−PLP1+IL−10);または300μg Ig−W(凝集性Ig−W)を含有するPBSを投与した。図34bに示すように、検出可能レベルのIL−10を誘導しない可溶性Ig−PLP1は、疾患を僅かに改善し、最大スコア平均値が2.5±0.3であり、一方外因性IL−10と併用された可溶性Ig−PLP1は、疾患を最大臨床スコア平均値が1.1±0.3まで軽減し、これは凝集性Ig−PLP1処理されたマウスから得られたスコア1.1 ( 0.5 と同等である。
【0266】
内因性IL−10が疾患を調節するためには、APCをT細胞と物理的に架橋することが必要であると思われる。このメカニズムを確認するために、以下の実験を行った。100μgのPLP1でマウス群(8匹/群)にEAEを誘導し、次に疾患誘導後9日目、13日目、及び17日目に、300μg 凝集性Ig−PLP1(凝集性Ig−PLP1)、300μg 凝集性Ig−W(凝集性Ig−W)、または300μg 凝集性Ig−W+100μg PLP1(凝集性Ig−W+PLP1)を含有するPBSで処理した。結果を図35に示す。
【0267】
図35に示すように、疾患の発症はこれらの実験群では7日目であった。疾患マウスを、凝集性Ig−PLP1の代わりに凝集性Ig−Wと遊離PLP1ペプチドの混合物で処理すると、疾患重症度は軽減されなかった。総じて、有効なT細胞ダウンレギュレーションは、IL−10産生APCと標的病原性T細胞間の物理的相互作用を必要とする。この必要条件についての可能な説明は、パラ分泌サイトカインとしてのIL−10が拮抗作用を達成するためには、T細胞の近接に存在する必要があることである。
【0268】
実施例 XXXIV
凝集性IG−PLP1は、自己免疫疾患の迅速な改善を提供する
凝集性Ig−PLP−LR及び凝集性Ig−PLP1のどちらも自己免疫疾患の症状を改善するが、より迅速な軽減は凝集性Ig−PLP1によってもたらされる。SJLマウス群にPLP1ペプチドで疾患を誘導し、9日目、13日目、及び17日目に、300μg 凝集性Ig−PLP1、凝集性Ig−PLP−LR、または凝集性Ig−Wを含有する300μL PBSを用いて腹腔内処理した。結果は図36及び表5に示す。
【0269】
図36及び表5に見られるように、凝集性Ig−PLP1は疾患重症度を劇的に軽減した。凝集性Ig−PLP−LR及び凝集性Ig−PLP1処理のどちらもEAEの回復を起因するが、凝集性Ig−PLP1を投与されたマウスは、凝集性Ig−PLP−LR及を投与されたマウスよりもより迅速に回復した。最大臨床スコア平均値は、凝集性Ig−W処理群の3.3 ( 0.3 から、凝集性Ig−PLP1群では1.1( 0.5 に減少した(表5を参照)。さらに、凝集性Ig−PLP1による処理後の疾患の完全回復は迅速であり(24.4( 2.2日目)、120日の臨床評価期間中に再発は生じなかった。
【0270】
凝集性Ig−PLP1が可溶性Ig−PLP1よりも疾患調節においてより有効であることは特記に値する。凝集性Ig−PLP1は最大臨床スコアを1.1( 0.5まで減少するが、Ig−PLP1の可溶性形態は麻痺の重症度を2.4 ( 0.3 にまで低減するのみである(表3と表5を比較すること)。その上、回復は可溶性Ig−PLP1を投与されたマウスよりも凝集性Ig−PLP1処理された群の方がはるかに速かった(表3及び表5を参照)。
【0271】
【表5】
【0272】
組織病理学的分析をまた実施した。図36のようにEAEを誘導して凝集性Ig−キメラ処理されたマウス群を、疾患誘導後28日目に屠殺して、脳及び脊髄を取り出して、ホルマリンで固定してからパラフィンに包埋した。大脳及び腰髄からの連続横断切片(6μm)を作成して、ヘマトキシリン−エオシン(H&E)染色を行った。少なくとも20個の単核細胞を含む血管周囲クラスタを炎症病巣としてカウントした。
【0273】
結果を図37に示す。図37に示すように、凝集性Ig−PLP1処理マウスは、大脳及び腰脊髄のどちらにおいても炎症病巣数を有意に減少した。
【0274】
凝集性Ig−PLP1のEAE改善効力は、500μg/注射の量で投与された可溶性Ig−PLP1よりもはるかに低用量(300μg/注射)で生じた。これはおそらく、Ig−PLP1の可溶性形態ではなく凝集性形態による処理に際するIL−10のインビボ産生に起因すると思われる。
【0275】
特定の理論によって制限されることは望まないが、以下のメカニズムによって凝集性Ig−PLP−LRと比べて凝集性Ig−PLP1によって迅速な結果が得られることを説明できると思われる。PLP−LRはPLPを修飾することによって作成されるT細胞アンタゴニストペプチドであるため、この修飾ペプチドを提示するT細胞とAPC間の相互作用の親和性は、非修飾PLP1を提示するT細胞とAPC間の親和性よりも低いことが予測される。この低い親和性の結果として、T細胞はPLP1を提示するAPCと相互作用する限りは、PLP−LRを提示するAPCと相互作用せず、従って凝集免疫グロブリンによって誘導されるIL−10への暴露期間が減少する。
【0276】
他方、凝集性Ig−PLP1によって得られる迅速な結果は、自己反応性T細胞レパートリーの多様性の結果である。PLP1反応性であるT細胞の頻度がPLP−LR反応性であるT細胞の頻度よりも大きい場合、この二つのキメラによる疾患調節の示差は観察されたパターンに適合する。この場合、IL−10が存在しないと可溶性キメラはT細胞の通常集団を影響するが、高親和性T細胞が有効なIL−10暴露を受けるために、凝集性形態はIg−PLP1に有利に働く。
【0277】
実施例 XXXV
凝集性Ig−PLP1への応答で産生されたIL−10は同時刺激性分子をダウンレギュレートする
IL−10はAPC上の同時刺激性分子の発現をダウンレギュレートすることが報告されている。凝集性Ig−PLP1への応答で産生されたIL−10がAPC上の同時刺激性分子をダウンレギュレートするか否かを測定するために、以下の実験を行った。
【0278】
腹膜マクロファージに凝集性Ig−PLPキメラを加えて24時間インキュベートして、次に同時刺激性分子の細胞表面発現を評価した。マクロファージは、前述のようにチオグリコレートブロスを注射したマウスの腹膜細胞から収集した。精製マクロファージ(1.0 x 106 細胞/mL)は次に0.3μM 凝集性Ig−PLPキメラ(黒線)または培地のみ(NIL、灰色)を加えてインキュベートした。24時間後、細胞を収集して、抗−F4/80、及び抗B7.1、抗−B7.2、あるいは抗CD40で染色を行った。柱状図表は、F480+ゲート細胞を示し、B7.1、B7.2、あるいはCD40の強度を示す。
【0279】
結果を図38に示す。図38に示すように、B7.1、B7.2、あるいはCD40発現のアップレギュレーションはなかった。反対に、凝集性Ig−PLPキメラを含まない培養で観察される基礎レベルと比べてこれらの分子の有意なダウンレギュレーションがあった。従って、凝集性Ig−PLP1への応答で産生されるIL−10は、同時刺激性分子をダウンレギュレートする。
【0280】
実施例 XXXVI
凝集性Ig−PLP1処理は、複数エピトープによって誘導された活動性EAEの臨床重症度を低下させる。
凝集性Ig−PLP1介在によるFcR架橋の結果としてのAPCによるIL−10産生は、APC上のPLP1−MHCリガンドに係わる特異的T細胞、並びに無関係の特異性を有する隣接T細胞を拮抗作用することができる。バイスタンダー抑制として公知であるこの低下は、IL−4及びIL−10設定に有効であることが証明されている。
【0281】
バイスタンダー抑制が、自己免疫疾患に関与する抗原を含む凝集免疫グロブリンへの応答で産生されたIL―10に起因するか否かを測定するために、エピトープの混合物でEAEを誘導して、非関連自己反応性T細胞を調節し且つ疾患を改善する凝集性I−PLP1の能力を測定した。100μgのPLP1及び100μgのPLP2から成る混合物でSJL/Jマウス群(8匹/群)にEAEを誘導し、9日目、13日目、及び17日目に、300μg/注射量の凝集性Ig−PLP1または凝集性Ig−Wで処理した。全ての処理は腹腔内PBSであった。疾患の発症は、これらの実験群では7日目であった。各点は8匹のマウスの臨床スコア平均値を示す。
【0282】
結果を図39aに示す。図39aに示すように、PLP1とPLP2ペプチド混合物によって誘導された進行性のEAEを罹患するマウスは、麻痺の重症度の低下を示し、さらに凝集性Ig−PLP1処理後、疾患誘導後33日目に完全に回復したが、一方凝集性Ig−W処理動物は重度の麻痺を有し、50日の臨床評価期間中に疾患を回復しなかった。従って、内因性IL−10は、PLP2特異的T細胞へのダウンレギュレート効果を有すると思われる。
【0283】
PLP2ペプチドによる疾患の誘導は、全PLPを暴露して、PLP1特異的T細胞の拡散と活性化を生ぜしめるにちがいない(McRaeら、J. Exp. Med.、 182:75〜85、1998;Tuohy ら、 Immunol. Rev.、 164:93〜100、 1998、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。この場合、凝集性Ig−PLP1の注射は、IL−10産生APCをPLP1特異的T細胞に架橋して、これらの細胞並びに隣接PLP2特異性T細胞のバイスタンダー抑制を促進するにちがいない。PLP2によってEAEが誘導されているマウスへの凝集性Ig−PLP1の投与がPLP2特異的T細胞のバイスタンダー抑制を生じるか否かを測定するために、以下の実験を行った。
【0284】
PLP2ペプチドでマウスにEAEを誘導して、麻痺徴候が明らかになったとき、以下のように凝集性Ig−PLP1で処理した。100μgのPLP2でSJL/Jマウス群(8匹/群)にEAEを誘導し、9日目、13日目、及び17日目に、300μg/注射量の凝集性Ig−PLP1で腹腔内処理した。未処理マウス(NIL)群を、比較目的で含んだ。結果を図39bに示す。
【0285】
図39bに示すように、凝集性Ig−PLP1処理マウスにおける麻痺の初期フェーズは未処理マウスに比べて僅かに軽いのみであるが、動物は26日目までに迅速に回復して、未処理マウスとは異なり、残りの臨床評価期間のあいだに再発は見られなかった。これらの結果はバイスタンダー抑制を支持し、さらにエピトープの拡散が麻痺の後期に疾患を調節する機会を提供することを実証する。
【0286】
PLP1以外の抗原に特異的なT細胞のバイスタンダー抑制を生じる凝集性Ig−PLP1の能力をさらに探求するために、以下の実験を行った。ミエリン自己抗原の全域を組み込むCNSホモジネートによって誘導された疾患を調節するための凝集性Ig−PLP1の能力を測定した。CNSホモジネートは以下のように調製した。50個の冷凍した圧搾していないラット脳(Pelfreez Biologicals、 Rodgers、 AK)をWaringブレンダーを用いてPBS中でホモジネートして、PBSで300mg/mLに調整した。CNSホモジネートは−20℃で保存した。6mgのCNSホモジネートでSJL/Jマウス群(9匹/群)にEAEを誘導し、9日目、13日目、及び17日目に、300μg/注射量の凝集性Ig−PLP1または凝集性Ig−Wで腹腔内処理した。未処理マウス(NIL)群を、比較目的で含んだ。結果を図35に示す。
【0287】
図35に示すように、凝集性Ig−PLP1の注射を受けたマウスは、麻痺の初期フェーズにおいて麻痺の軽い徴候を有したが、疾患誘導後24日目までに完全に回復し、60日の臨床評価期間に再発はなかった。凝集性Ig−PLP1の代わりに凝集性Ig−W処理されたコントロールマウスは、未処理動物と同様な疾患パターンを有した。これらの結果は、凝集性Ig−PLP1のダウンレギュレーション機能は、分子内及び分子間エピトープのどちらにも拡大して、多様なT細胞特異性を抑制することを示す。
【0288】
実施例 XXXVII
凝集性Ig−PLP1は、APCによるIL−10産生を誘導することにより、バイスタンダー抑制を生じる
IL−10への暴露は、病原性ミエリン特異的T細胞のダウンレギュレーション及び抑制の基礎をなすメカニズムであると思われる。図28及び34に実証されたように、IL−10の源は、樹状細胞及びマクロファージのようなAPCである。しかしながら、この設定におけるT細胞調節の広範な有効性及び持久性は、このバイスタンダー抑制がAPCのIL−10による病原性T細胞の拮抗作用に起因するのか、あるいはそのようなIL−10の効果の下で発生した制御性T細胞によるダウンレギュレーションであるのかの疑問を提起した。
【0289】
凝集性Ig−PLP1がT細胞増殖の抑制を介するのか、あるいは制御性T細胞によって作用するのかを決定するために、以下の実験を行った。凝集性Ig−PLP1による処理を受けたCNS誘導性麻痺から回復するマウス由来リンパ節T細胞を抗原刺激して、増殖及びサイトカイン(制御性T細胞マーカー)の産生について試験した。マウス(6匹/群)にCNSホモジネートでEAEを誘導し、次に前記のように9日目、13日目、及び17日目に凝集性Ig−W(斜め格子付き棒)または凝集性Ig−PLP1(空白棒)で処理した。処理療法完了の2日後、リンパ節(腋窩、側腋窩、及び膝窩)を収集して、細胞(4×105細胞/100 μL/ウェル)を100 μL/ウェルの抗原(PLP1、PLP2、MBP3、またはHA(コントロール))で刺激した。細胞増殖を3日後に[3H]チミジン取り込みアッセイを用いて評価した(図40a)。その上、サイトカイン応答を、抗原を加えてインキュベートした24時間後に5 x 105 細胞/ウェルを用いてELISPOTによって分析した(図40b〜g)。ELISPOTアッセイは、Minら、J. Exp. Med.、188:2007〜2017、1998(その開示はその全文を参照により本明細書に編入している)に記載されるように抗原刺激の際にリンパ節T細胞によって産生されるサイトカインを測定することを用いた。端的には、リンパ節細胞(5 x 105細胞/100μL/ウェル)及び抗原(100μL/ウェル)を、捕獲抗体でコートされたHAマルチスクリーンプレート(Millipore、Bedford、 MA)中で24時間インキュベートした。結合サイトカインはペルオキシダーゼ及び抗サイトカイン抗体で解明された。使用した抗サイトカイン抗体対は、ELISA法に説明される抗体対であった。スポットは解剖顕微鏡下でカウントした。
【0290】
抗原は特定された最適濃度(PLP1、PLP2、及びHAは15μg/mL、並びにMBP3は30μg/mL)で使用した。抗原を添加しない培地のコントロールウェルを含み、バックグラウンドとして使用した。グラフの各棒は6匹の個別に試験されたマウスについての平均値±標準偏差を表す。図41に示す結果は、凝集性Ig−キメラの最終注射2日後、ミエリンペプチドの増殖は、コントロールIg−W処理されたマウスで有意であったが、凝集性Ig−PLP1を投与されたマウスではバックグラウンドレベルであったことを示す。同様に、凝集性Ig−Wの注射を受けたマウスは有意量のIL−2及びIFNγを有したが、凝集性Ig−PLP1処理マウスは、Th1及びTh2タイプサイトカインのどちらも有せず、さらにIL−10、IL−5、またはTGFβのいずれも産生しなかった。この処理療法完了後9日目にマウスを試験したときにも、同様な結果が得られた(データ表示なし)。さらに、脾臓T細胞及び腹膜から収集した細胞は、同様なパターンの応答を示した(データ表示なし)。総じて、これらの結果は、制御性T細胞の典型的な増殖性及びサイトカイン応答トレードマークは、活動性自己免疫の全身治療のこの特定の設定では検出不能であることを示唆する。従って、凝集性Ig−PLP1の投与に起因するバイスタンダー抑制はAPCによって産生されるIL−10による病原性T細胞の拮抗作用に起因した。
【0291】
当業者はさらに、本発明が、本発明の精神または主要な特質から逸脱することなく他の特定の形態で実施可能であることを認めるであろう。前述する本発明についての説明は本発明の例示的な実施態様を開示したに過ぎないという点で、他の変形が本発明の範囲内であることが意図されていると理解すべきである。従って、本発明は、本明細書に詳細に記載されている具体的な実施態様に限定されることはない。むしろ、本発明の範囲及び内容を示すものとしては付記する請求の範囲を参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1A及び1Bは、一般的な特徴及びH鎖可変領域のCDR3ループ内における外来ペプチドの封入体を示すキメラ免疫グロブリンG(IgG)分子の概略図であり、ここで図1A(Ig−PLP1)はプロテオリピドタンパク質由来の天然ペプチドPLP1(アゴニスト)の挿入を示し、一方図1B(Ig−PLPーLR)はPLPーLRと称するPLP1のペプチド類似体(アンタゴニスト)の封入体を含む免疫調節剤を示している。
【図2】
図2及び2Bは、対応する遊離ペプチドに対する抗体を使用して、それぞれ図1A及び1Bに示すキメラ抗体Ig−PLP1及びIg−PLP―LRのラジオイムノアッセイ(RIA)による捕獲を示すグラフであり、ここで、図2AはPLP1に対する抗体による捕獲レベルを示し、そして図2BはPLP−LRに対する抗体による捕獲レベルを示し、Ig−Wはネガティブコントロールとしての野生型抗体である。
【図3】
図3A及び3Bは、IL−2産生で測定される、キメラ免疫グロブリンの相対的なT細胞活性化能力を決定するために、PLP1特異的T細胞ハイブリドーマ4E3(図3A)及び5B6(図3B)に対するIg−PLP1及びIg−PLP−LR(並びにポジディブ及びネガティブコントロール)の提示を示すグラフである。
【図4】
図4は、脾臓SJL抗原提示細胞をPLP1特異的4E3T細胞ハイブリドーマと共にインキュベートした後にIL−2産生レベルで測定される、本発明のキメラ抗体(Ig−PLP1)に対する遊離ペプチドPLP1または未変性プロテオリピドタンパク質(PLP)の相対的なPLP1提示有効性を示すグラフである。
【図5】
図5A、5B及び5Cは、それぞれのアゴニスト及び種々のレベルのIg−PLP−LRまたはコントロールと共に予めインキュベートしたSJL脾臓APCの存在下、T細胞ハイブリドーマ4E3によるIL−2産生によって測定された、PLP1(5A)、Ig−PLP1(5B)及びPLP(5C)介在性T細胞活性化のIg−PLP1−LRアンタゴニズムを示す比較グラフである。
【図6】
図6は、前述の免疫グロブリンのうちの1つを天然プロテオリピドタンパク質とを組み合わせて予めインキュベートしたSJL脾臓APCの存在下で、T細胞ハイブリドーマHT−2によるIL−2の産生によって測定される、Ig−PLP2、Ig−PLP−LR及びIg−Wの相対的拮抗作用を示すグラフである。
【図7】
図7A及び7Bは、リンパ節(7A)または脾臓(7B)由来の細胞による3H−チミジン取り込みによって測定される、Ig−PLP1接種後のPLP1のインビボ提示を示すグラフであり、ここで示された値は、アゴニストPLP1またはコントロールペプチドPLP2に暴露したとき3H−チミジン取り込みによって測定される、個々のマウスから収集された細胞がT細胞応答を生じる能力を表している。
【図8】
図8A及び8Bは、Ig−PLP−LRをIg−PLP1と同時投与したとき、リンパ節(8A)または脾臓(8B)由来のマウス細胞で測定される、PLP1ペプチドに対する免疫応答を低下させるIg−PLP−LRの能力を示すグラフであり、ここで示された値はPLP1に暴露したとき3H−チミジン取り込みによって測定される、個々のマウスから収集された細胞がT細胞応答を生じる能力を表している。
【図9】
図9A及び9Bは、Ig−PLP−LRとIg−PLP1の混合物を接種されたマウスが、リンパ節(9A)または脾臓(9B)由来の細胞で測定すると、ペプチドPLP1に対してよりペプチド類似体PLP−LRに対して一層激しい免疫応答を発現することを示すグラフであり、ここで示された値は、PLP1ペプチドまたはペプチド類似体PLP−LRに暴露したとき3H−チミジン取り込みに反映される、個々の対象から収集された細胞がT細胞応答を生じる能力を表している。
【図10】
図10A〜10Dは、Ig−PLPキメラによる免疫化に対するリンパ節増殖応答を示すグラフであり、マウスは各刺激剤について三重複ウエルで個別に試験されて、ここで表示のcpmはバックグランドcpmを差し引いた後の平均値±SDを表す。
【図11】
図11は、Ig−PLP1とIg−PLP−LRによる同時免疫に対するリンパ節T細胞増殖応答のグラフであり、刺激剤はPPDを5μg/mL、PLP1、PLP−LR及びPLP2を15μg/mL含む。
【図12】
図12は、三重複ウエルでPLP1(斜め格子付き棒)及びPLP−LR(平行斜線付き棒)で刺激したとき、Ig−W、Ig−PLP1、Ig−PLP−LR及びこれらの組合せで免疫したマウスの脾臓増殖T細胞応答のグラフである。
【図13】
図13A〜13Cは、Ig−W、Ig−PLP1、Ig−PLP−LR及びこれらの組合せで免疫したマウスの脾臓細胞によるIL−2(13A)、INFγ(13B)及びIL−4(13C)の産生を示すグラフである。
【図14】
図14A〜14Dは、PLP1ペプチド、PLP−LRペプチド及びこれらの混合物によるインビトロ刺激に際して、Ig−PLP1(a及びb)またはIg−PLP−LR(c及びd)含有CFAで免疫したマウスからの、抗原暴露T細胞の増殖をグラフで示している。
【図15】
図15A及び15Bは、PLP1ペプチド、PLP−LRペプチド及びこれらの混合物によるインビトロ刺激に際して、Ig−PLP1(15A)及びIg−PLP−LR(15B)で免疫した抗原暴露T細胞によるIL−2産生を示すグラフである。
【図16】
図16A及び16Bは、Ig−WではなくIg−PLP1を注射した新生児マウスがEAEの誘導に抵抗することをグラフで示しており、臨床的に得られた曲線が全マウス(16A)と生存マウス(16B)について示されている。
【図17】
図17A及び17Bは、誕生後24時間以内にIg−PLP1またはIg−Wを注射した後の新生児の胸腺(17A)及び脾臓(17B)の抗原提示細胞によるIg−PLP1のインビボ提示をグラフで示している。
【図18】
図18A及び18Bは、誕生後すぐにIg−PLP1またはIg−Wを注射したマウスにおける、遊離PLP1、PLP2またはPLPの脳炎誘発配列178〜191に相当するネガティブコントロールペプチドによる刺激時の、リンパ節(18A)及び脾臓(18B)の増殖T細胞応答をグラフで示している。
【図19】
図19A〜19Cは、誕生後すぐにIg−PLP1で処理し、さらに遊離PLP1またはPLP2で刺激したマウスにおけるIL−2(19A)、IL−4(19B)及びIFNγ(19C)の産生によって測定される、リンパ節T細胞逸脱をグラフで表している。
【図20】
図20A〜20Cは、誕生後すぐにIg−PLP1で処理し、さらに遊離PLP1またはPLP2で刺激したマウスにおけるIL−2(20A)、IL−4(20B)及びIFNγ(20C)の産生によって測定される、脾臓T細胞逸脱をグラフで表している。
【図21】図21は、誕生後すぐにIg−PLP1を注射し、7週目に遊離PLP1で免疫し、さらに遊離PLP1で刺激したマウスにおける脾臓T細胞増殖のサイトカイン介在性回復をグラフで示しており、細胞はコントロール培地(NIL)、IL−12を有する培地及びINFγを有する培地中で増殖させ、各マウスについて示したcpmは三重複ウエルの平均値±SDを表している。
【図22】
図22は、EAEの発生分化を誘導したマウスに対する可溶性Ig−PLP1、可溶性Ig−W、あるいは遊離PLP1ペプチド投与の結果を示す。可溶性Ig−PLP1の投与は、EAEを罹患するマウスにおいて麻痺の重症度を低下させ、再発を抑制した。
【図23】
図23は、EAEの発生分化を誘導したマウスに対する可溶性Ig−PLP1、可溶性ig−PLP−LR、あるいは可溶性Ig−W投与の結果を示す。Ig−PLP1及びIg−PLP−LR処理マウスはどちらも、疾患の初期ピーク中において臨床的重症度を軽減した。Ig−W投与マウスは観察した全120日を通して再発を示したが、Ig−PLP1及びIg−PLP−LR処理マウスはそれぞれ31日及び38日までに麻痺を回復し、再発を示さなかった。
【図24】
図24は、EAE罹患マウスにアジュバンドを含まない可溶性Ig−PLP1を投与した後における同時刺激性分子レベルを示す。Ig−PLP1を投与されたマウスは、培地のみを投与されたコントロールマウスよりも低いB7.1及びCD40レベルを呈示した。
【図25】
図25は、凝集性Ig−PLP1の投与が、長期間にわたる状態の臨床段階付けによって示されるように、マウスにおいて効果的にEAEを改善することを示す。
【図26】
図26A及び26Bは、凝集性Ig−PLP1に精製APCを加えてインキュベートすると、好都合にも抗炎症性サイトカインIL−6(26A)及びIL−10(26B)の産生を誘導することを示す。
【図27】
図27aは、凝集性Ig−PLP1及び凝集性Ig−WがEAEを改善する能力を比較する。凝集性Ig−PLP1を投与されたマウスは疾患重症度の低下を呈したが、一方凝集性Ig−W処理マウスは決して回復せず、臨床評価の全期間を通じて再発を示した。
図27bは、可溶性Ig−PLP1と凝集性Ig−PLP1による処理後のPLP1ペプチド誘発性EAEの疾患経過の直接比較である。凝集Ig−PLP1を投与されたマウスの最大臨床スコア平均値ははるかに低く、また回復時間は可溶性Ig−PLP1を投与されたマウスよりも迅速であった。
【図28】
図28aは、脾臓細胞によるIL−10産生を誘導するための、凝集性Ig−PLP1、可溶性Ig−PLP1、凝集性Ig−W、凝集性Ig−PLP2及び可溶性Ig−PLP2の能力の比較である。凝集性Ig−PLP1、Ig−PLP2、及びIg−Wキメラは、脾臓細胞によるIL−10の産生を用量依存性で刺激するが、一方キメラの可溶型は検知可能レベルのIL−10を誘導しなかった。
図28bは、B細胞、樹状細胞、及びマクロファージによるIL−10産生に対する凝集性Ig−PLP1及びIgMの効果を示す。B細胞ではなく、マクロファージ及び樹状細胞は、凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートするとIL−10を産生する。マウスIgMは、試験されたいずれのAPCによってもIL−10産生を刺激できなかった。
【図29】
図29は、脾細胞を0.1μM 可溶性Ig−PLP1、0.1μM 凝集性Ig−PLP1、0.1μM 凝集性Ig−PLP1+50μg/mL 2.4G2、または0.1μM 凝集Ig−PLP1+100μg/mL マウスIgと接触後のIL−10産生を示す。凝集性Ig−PLP1は、FcγR1レセプターを架橋することによってIL−10を誘導する。
【図30】
図30aは、PLP1、PLP2、凝集性Ig−PLP1及び凝集性Ig−PLP2に対するTCC−PLP1−1B10の増殖応答を示す。TCC−PLP1−1B10は、遊離PLP1ペプチドまたは凝集Ig−PLP1で予めパルスしたパラホルムアルデヒド固定脾臓APCを加えてインキュベートすると増殖するが、APCをネガティブコントロールであるPLP2または凝集性Ig−PLP2でパルスした場合には有意な増殖を示さない。
図30bは、TCC−PLP1−1B10に非固定脾臓APC及び遊離PLP1ペプチドまたは凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートした時のIL−2産生の測定結果である。TCC−PLP1−1B10は、遊離PLP1ペプチド及び凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートすると大量のIL−2を産生した。
図30cは、TCC−PLP1−1B10に非固定脾臓APC及び遊離PLP1ペプチドまたは凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートした時のIFNγ産生の測定である。TCC−PLP1−1B10は、遊離PLP1ペプチド及び凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートすると大量のIFNγを産生した。
図30dは、TCC−PLP1−1B10に非固定脾臓APC及び遊離PLP1ペプチドまたは凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートした時のIL−4産生の測定である。TCC−PLP1−1B10は、遊離PLP1ペプチド及び凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートすると大量のIL−4を産生した。
図30eは、TCC−PLP1−1B10に非固定脾臓APC及び遊離PLP1ペプチドまたは凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートした時のIL−10産生の測定である。IL−10は、刺激剤が遊離PLP1ではなく凝集性Ig−PLP1のときに有意なレベルで検出可能であった。
【図31】
図31は、固定または生APCに凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートして、それに引き続いてTCC−PLP1−1B10を加えてインキュベートした後のIL−10産生の測定である。Il−10は、固定APCでは検出不能であったが、生APCはこれを産生した。
【図32】
図32aは、T細胞によるIFNγの産生に拮抗するために脾細胞によって産生されるIL−10の能力を測定する。脾細胞によって産生されるIL−10は、T細胞によるIFNγの産生に拮抗作用することができる。
図32bは、T細胞によるIFNγの産生に拮抗作用するための樹状細胞によって産生されるIL−10の能力を測定する。樹状細胞によって産生されるIL−10は、T細胞によるIFNγの産生に拮抗作用することができる。
図32cは、T細胞によるIFNγの産生に拮抗作用するためにマクロファージによって産生されるIL−10の能力を測定する。マクロファージによって産生されるIL−10は、T細胞によるIFNγの産生に拮抗作用することができる。
図32dは、B細胞に凝集Ig−PLP1及びTCC−PLP1−1B10を加えてインキュベートしたときのIL−10及びIFN−γレベルを示す。B細胞は凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートしたときにはIL−10を産生せず、またT細胞によるIFNγの分泌を阻害しない。
【図33】
図33aは、TCC−PLP1−1B10に腹膜マクロファージ及び凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートしたときに産生されるIFNγ及びIL−10レベルを示す。IFNγ産生は、提示マクロファージによって分泌されるIL−10レベルに比例して減少した。
図33bは、TCC−PLP1−1B10に腹膜マクロファージ、凝集性Ig−PLP1、及び抗IL−10mAbである2A5を加えてインキュベートしたときに産生されるIFNγ及びIL−10レベルを示す。T細胞によるIFNγ産生の阻害は、抗IL−10 mAbである2A5によるそのようなIL−10の中和がIFNγ産生を回復するため、APC誘導性IL−10に直接関連する。
図33cは、TCC−PLP1−1B10に腹膜マクロファージ、凝集性Ig−PLP1、及びラットIgGを加えてインキュベートしたときに産生されるIFNγ及びIL−10レベルを示す。抗IL−10の代わりにイソタイプコントロールであるラットIgGを加えてインキュベートしても、TCC−PLP1−1B10によるIFNγ産生を阻害するIL−10の能力に効果はなかった。
【図34】
図34aは、EAE罹患マウスにおける凝集性Ig−PLP1、凝集性Ig−PLP1+抗IL−10、凝集性Ig−PLP1+ラットIgG、凝集性Ig−W、または凝集性Ig−W+抗IL−10による処理効果を示す。IL−10に対する抗体は、凝集性Ig−PLP1による疾患症状の改善を阻止した。
図34bは、EAE罹患マウスに対する可溶性Ig−PLP1、凝集性Ig−PLP1、可溶性Ig−PLP1+IL−10、あるいは凝集性Ig−Wによる処理効果を示す。可溶性Ig−PLP1は、検出可能なレベルのIL―10を誘導せず、疾患を僅かに改善するが、一方可溶性Ig−PLP1に外因性IL−10を加えると、凝集性Ig−PLP1処理マウスに観察されるレベルと同等なレベルまでさらに疾患を軽減する。
【図35】
図35は、EAE罹患マウスに対する凝集性Ig−W、凝集性Ig−PLP1、または凝集性Ig−W+PLP1による処理効果を示す。凝集性Ig−PLP1による処理のみが疾患症状を軽減し、これは内因性IL−10が疾患を調節するためには、APCがT細胞に物理的に架橋する必要があることを実証した。
【図36】
図36は、EAE罹患マウスに対する凝集性Ig−PLP−LRまたは凝集性Ig−PLP1投与効果を示す。これらの免疫調節剤のいずれかを投与されたマウスは疾患を回復するが、凝集性Ig−PLP1を用いると回復がさらに迅速である。
【図37】
図37は、図36と同様に処理されたマウスの組織病理学的分析である。凝集性Ig−PLP1処理マウスは、大脳及び腰脊髄のどちらにおいても炎症病巣数が有意に減少した。
【図38】
図38は、腹膜マクロファージ上の同時刺激性分子レベルに対する凝集性Ig−PLP1の効果を示す。凝集性Ig−PLP1はB7.1、B7.2、またはCD40発現をダウンレギュレートする。
【図39】
図39aは、PLP1及びPLP2の両方によってEAEが誘導されたマウスに対する凝集性Ig−PLP1処理効果を示す。凝集性Ig−PLP1処理は疾患重症度を軽減した。
図39bは、PLP2によってEAEが誘導されたマウスに対する凝集性Ig−PLP1処理効果を示す。凝集性Ig−PLP1処理は疾患重症度を軽減した。
【図40】
図40aは、CNSホモジネートでEAEを誘導後に凝集性Ig−PLP1またはIg−Wで処理されたマウスの、PLP1、PLP2、MBP3、またはHAへの応答におけるT細胞増殖アッセイを示す。
図40bは、図40aのマウスのIL−2レベルを示す。
図40cは、図40aのマウスのIFNγレベルを示す。
図40dは、図40aのマウスのIL−4レベルを示す。
図40eは、図40aのマウスのIL−10レベルを示す。
図40fは、図40aのマウスのIL−5レベルを示す。
図40gは、図40aのマウスのTGFβレベルを示す。
【図41】
図41は、CNSホモジネートによってEAEが誘導されたマウスに対する凝集性Ig−PLP1処理効果を示す。凝集性IgPLP1処理は疾患重症度を軽減した。
[発明の分野]
本発明は、概して、免疫抑制因子をエンドサイトーシスによって効果的に提示するための化合物、組成物及び方法に関する。さらに詳細には、本発明は、限定はされないが、自己免疫疾患を含む種々の疾患の治療に有用な免疫抑制因子を含む化合物、方法及び組成物に関する。好ましい実施態様では、前記免疫抑制因子はT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストであり得る。本発明の他の実施態様によって新生児または乳児における寛容の誘導がもたらされる。さらなる実施態様は、免疫グロブリンまたはその一部が抗原提示細胞の細胞表面に存在するFcレセプターと架橋することができる、抗原と結合する免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を提供する。他の実施態様は、IL−10レベルを、それを必要とする個体において増加する方法に関する。さらに他の実施態様は、末梢性寛容及び/またはバイスタンダーによる抑制を、それを必要とする個体において刺激する方法に関する。他の実施態様は、IFNγレベルを、それを必要とする個体において減少する方法に関する。さらなる実施態様において、本発明は、同時刺激性分子を欠如するか、あるいはそのレベルが低下している抗原提示細胞による自己抗原提示を促進する組成物を提供する。
【0002】
[発明の背景]
脊椎動物は、環境由来の病原体、及び、例えば内部的に発生する腫瘍細胞のような、異常細胞に対する防御として免疫応答を生じさせる能力を有している。免疫応答は多様な細胞と因子との間の複雑な相互作用の結果であるが、一般的には2つの主要な様相を含んでいる。1つは、細胞性成分であって、この場合には特別の細胞が(抗原を有する)有害作用物質を直接攻撃し、もう1つは体液性成分であって、この場合には抗体分子が抗原に特異的に結合してその排除を助長する。協同して働くと、それぞれの要素は侵入病原体の初期攻撃を制限して、それら病原体を宿主から排除するのに極めて有効である。
【0003】
免疫応答の提供に関与する主要な細胞はリンパ球であり、リンパ球は一般的に2つの主要なクラスを含む。B細胞またはBリンパ球と命名されるこれらクラスの第一のものは、典型的には骨髄で産生され、そして中でも、抗体の産生及び分泌に関与している。B細胞抗体産物は外来抗原と直接反応して、これらを中和するか、あるいは免疫系のその他の成分を活性化して、抗原を排除する傾向がある。特に、オプソニン化抗体は細胞外の外来因子と結合し、それによって食作用(ファゴサイトーシス)並びに後続する細胞内殺作用を受けやすくなる。他方、T細胞またはTリンパ球は、一般的には胸腺で発生あるいは成熟し、細胞性免疫応答の媒介に関与している。これらの細胞は抗原全体を認識するのではなく、その代わりに、標的細胞の表面に出現する特定のタンパク質に結合した抗原の短いペプチドフラグメントに応答する。さらに詳細には、細胞内で産生されるか、または細胞によって細胞外環境から取り込まれたタンパク質は正常な代謝経路によってペプチドまで連続的に分解されると思われる。その結果生じる短いフラグメントは細胞内の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子と会合して、このMHC−ペプチド複合体は細胞表面に輸送されてT細胞によって認識される。従って、細胞免疫系は細胞が産生または摂取した全てのタンパク質を常に監視しており、外来抗原または腫瘍抗原を提示している全ての細胞、即ちウイルス感染細胞またはガン細胞、を排除するために構えている。
【0004】
哺乳類抗体のうちで最も一般的な免疫グロブリンG(IgG)の一般的構造を図1に概略的に示す。図示されるように、IgGは2本の同一の重(H)鎖と2本の同一の免疫グロブリン軽(L)鎖を含む四量体タンパク質複合体である。これらの鎖はジスルフィド結合で結合されて、Y字状抗体複合体を形成する。しかしながら、溶液中ではこの分子はより球状の形態をとり、生体体液中に存在する外来抗原と容易に結合する。
【0005】
免疫グロブリンのアミノ酸配列分析によって、種々の機能活性を有する特異的な領域が鎖内に特定されている。各L鎖及び各H鎖は、最初の110個のアミノ末端残基内に特定された可変領域(それぞれ、VL及びVH)を有する。VL及びVH領域の三次元的対合は、免疫グロブリン分子の抗原認識部分あるいは「抗原結合部位」(「ACS」)を構成する。免疫グロブリンは四量体であるため、1分子当たり2個の同一の抗原結合部位が存在している。これらの鎖の可変ドメインは配列が高度に不均一であるので、極めて多様な抗原構造に対して高度に特異的な抗原結合部位の多様性が生じる。可変ドメインの不均一性は可変領域全体に均等に分布しているのではなくて、3つのセグメントに位置しており、相補性決定領域(「CDR」)と呼ばれ、CDR1、CDR2及びCDR3と命名されている。 これらの構造に関するさらなる情報については、Watsonら、Molecular Biology of the Gene(遺伝子の分子生物学)、第4版、Benjamin/Cummings Publishing Co.,Inc.、Menlo Park, CA、 1987 (本明細書に参照により編入されている)を参照のこと。
【0006】
各H鎖はまた、特別のイソタイプを特定する定常領域も含んでおり、これによって免疫グロブリンは免疫グロブリンクラス及びサブクラスの1つに割り当てられる。定常領域は、単一クラスの抗体間で顕著には変動しないドメインと呼ばれる単位(すなわち、CH1、CH2等)を含んでいる。定常領域は抗原結合に関与せず、例えば、抗原提示細胞(APC)の細胞表面のFcレセプターとの結合並びに補体タンパク質との結合のような「エフェクター機能」として公知のいくつかの生物学的活性に関連する可能性がある。樹状細胞及びマクロファージのような抗原提示細胞は、なかでも、Fcレセプターの存在という特徴によって一般に識別される。従って、抗体が病原体と結合する場合には、抗体は食細胞とFc部分を介して結合することができる。これは食細胞によって病原体が摂取および破壊されることを可能とし、このプロセスはオプソニン化として公知である。さらに、以下で詳細に考察するように、種々の病原性抗原はAPCによってプロセシング且つディスプレイされて免疫応答をさらに刺激すると思われる。
【0007】
H鎖とは異なり、L鎖は単一の定常ドメイン(CL)を有している。L鎖は、H定常領域CH1をCLに結合するジスルフィド結合によってH鎖と対合する。 さらに、H鎖は定常領域CH1及びCH2を分子の残り部分から分離するヒンジ領域を有している。四量体の可動性(フレキシビリティ)に大いに寄与しているのはこのヒンジ領域である。分子の2本のH鎖はヒンジ領域とCH2間の結合部でジスルフィド結合によって対合する。
【0008】
このような広範なレパートリーを提供するために、免疫グロブリン遺伝子は有限数の遺伝子から莫大な数の異なる免疫グロブリンタンパク質の産生が可能になるように(即ち遺伝的多型性)進化している。 遺伝的多型性の故に、哺乳動物は見たところは無限に多様な抗原に対して抗体を産生することができる。免疫グロブリン遺伝学及びタンパク質構造の総説については、Lewin、Genes III(遺伝子III)、John Wiley and Sons、New York、 1987、並びにBenjaminiら、Immunology(免疫学)、Alan R.Liss,Inc.、New York、 1988(これらは本明細書に参照により編入されている)を参照のこと。
【0009】
この2、3年の間に、その多様性及び特異性の故に、抗体は診断や治療の用途に極めて重要になってきている。科学的用途における抗体の多様性や利用可能性を発展させるために、分子生物学技術がますます使用されるようになっている。例えば、単一の抗体産生B細胞を腫瘍細胞との融合によって不死化させて、「モノクローナル抗体」(mAb)として公知の単一の特異性を有する抗体のインビトロの源を提供するように増殖することができる。このような不死化B細胞系は「ハイブリドーマ」と称されている。
【0010】
最近まで、ほとんどのmAbの源はインビトロで培養されたマウスハイブリドーマであった。すなわち、マウスは典型的には選択された抗原または免疫原の注射を受ける。その後、動物を屠殺し、その脾臓から取り出した細胞を不死化骨髄腫細胞と融合させた。これらは診断方法で広範に使用されているが、マウスmAbがヒトを含む大部分の哺乳動物での治療適用に好適であるとは証明されていない。これは、一部には、マウス抗体が他の哺乳類種によって外来性として認識され、そして疾病または望ましくない副作用を起因し得る免疫応答を誘発するという事実に拠る。
【0011】
外来性mAbによって生じる免疫応答並びに適切なヒトmAbが無いという問題のうちの少なくともいくつかを克服するために、遺伝子工学を使用して、マウス抗体の抗原結合相補性決定領域は含有しているが分子の残り部分は外来性と認識されないヒト抗体配列から成るヒト化キメラ免疫グロブリン分子が構築されてきた。そのような抗体は、マウス可変領域が腫瘍抗原を認識し、さらに分子のヒト化部分が、身体によって迅速に排除されることなく免疫応答を媒介することが可能であるために、腫瘍の治療に使用されている。例えば、Jonesら、Nature、321:522〜525、1986年を参照のこと(本明細書に参照により編入されている)。
【0012】
そのような抗体の他の用途は、同時係属中の米国特許出願第08/363,276号及びPCT公開第WO 94/14847号に詳記されている(これらもまた本明細書に参照により編入している)。これらの場合には、ウイルスまたは細菌エピトープのような外来抗原のエピトープが免疫グロブリンの超可変領域に移植されて応答を誘導する。すなわち、工学操作された抗体はワクチンとして使用されて免疫応答を誘発し、そして長期間の抗原性記憶を与え、それによって対象はその後の感染を退けることができる。
【0013】
これらのワクチン及びより伝統的なワクチンは、免疫系の両枝を刺激する点で効果的である。免疫応答の体液性成分に関連した複雑な作用にも係わらず、体液成分のみでは毎日曝されている無数の病原体攻撃から動物を効果的に保護することはできないであろう。むしろ、高等生物の生存及び増殖を可能にするのは高度に進化した細胞応答の存在のみである。
【0014】
前記に示したように、骨髄内の前駆体から生じるTリンパ球またはT細胞が、侵入ウイルス並びにその他の微生物に対する免疫応答における主役である。前駆幹細胞は胸腺に移動し、そこで、所謂胸腺細胞として特異化される。特に、これらは後に成熟T細胞による感染の検出を可能にするレセプター分子をディスプレイし始める。有益であるためには、T細胞はそのレセプターを介して微生物抗原(侵入物の存在をシグナル伝達するタンパク質マーカー)に付着可能でなければならない。同時に、自己反応性T細胞は正常組織を破壊する可能性があるので、それらは身体によって生成される物質に対して遮蔽されていなければならない。典型的には、有用なレセプターを作成する胸腺細胞のみが完全に成熟して血流に入って、身体をパトロールする。効果のない、あるいは身体自体の組織を攻撃するその他の細胞は、健常な個体では、胸腺を離れる前にアポトーシスによって排除される。
【0015】
細胞溶解性Tリンパ球またはTヘルパー細胞のどちらかとして最終的に循環に入る成熟T細胞は、そのレセプターが認識し得る抗原に遭遇しない限り、静止状態にある。前記リンパ球が親和性を有する特異的抗原に遭遇すると、リンパ球は増殖して、エフェクター機能を果たし、その結果外来抗原が排除される。
【0016】
T細胞は、これらが果たす異なるタスクに基づいていくつかの亜集団に分類されている。これらの亜集団には、T及びB細胞応答の促進または増強に必要なヘルパーT細胞(Th)、細胞溶解によって標的細胞を直接殺傷する細胞毒性(または細胞溶解性)Tリンパ球(CTL)、及び免疫応答をダウンレギュレートするサプレッサーT細胞(Ts)が含まれる。各々の場合に、T細胞は、抗原が抗原提示細胞表面に付着した特殊なタンパク質複合体によって細胞表面に提示されたときのみに、抗原を認識する。さらに詳細には、T細胞は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と集合的に称されるタンパク質群と会合した抗原を認識し得る膜貫通タンパク質複合体である、T細胞抗原レセプター(TCR)と称する特異的なレセプターを使用する。数千もの同一のTCRが各細胞に発現される。TCRは、機能と構造の両面について、B細胞が抗原レセプターとして使用する表面抗体(非分泌性)と関連する。さらに、T細胞の異なる亜集団もまた多様な細胞表面タンパク質を発現し、これらのうちのいくつかは特定の亜集団に特徴的であるため、「マーカータンパク質」と称される。例えば、ほとんどのTh細胞は細胞表面にCD4タンパク質を発現するが、ほとんどのCTL及びTs細胞は細胞表面にCD8タンパク質を発現する。これらの表面タンパク質は、APC表面にある特定のタンパク質またはタンパク質複合体の認識及びこれらタンパク質間の相互作用に依存する免疫応答の開始及び維持に重要である。
【0017】
かなり長い間、主要組織適合遺伝子複合体、すなわちMHCは実際に、明白な四次構造を含む一連のグリコシル化タンパク質を含むことが公知である。一般的には、この構造は以下の2つのタイプから成る:細胞内部で生成されるタンパク質由来のペプチド(ウイルス複製後に産生されるタンパク質等)をディスプレイしているクラスI MHC、及び一般的に外部から細胞に入ったタンパク質由来のペプチド(細菌トキシンのような可溶性抗原)をディスプレイしているクラスII MHC。種々の抗原の認識は、生じ得る微生物ペプチドのいずれをも結合することが可能な多様なMHC分子プールを連続的に生じる遺伝的多型性によって保証される。本質的に、全ての有核細胞は、天然ペプチド、腫瘍関連ペプチド、あるいはウイルス侵入物によって産生されたペプチドを呈示することができるクラスI MHCを産生且つ発現する。それとは逆に、一般的に抗原提示細胞として公知である、2、3の特定のリンパ系細胞のみが、クラスII MHCタンパク質を産生且つ発現する。細胞型に関わらず、MHCの両クラスはペプチドを細胞表面に運搬し、これらを静止Tリンパ球に提示する。通常、Th細胞はクラスII MHC−抗原複合体を認識し、一方CTLはクラスI MHC−抗原複合体を認識する傾向がある。
【0018】
適切なTCRを有する静止T細胞が、ペプチドをその表面にディスプレイしているAPCに遭遇すると、TCRはペプチド−MHC複合体と結合する。さらに詳細には、数百ものTCRが多数のペプチド−MHC複合体と結合する。十分なTCRが接触すると、累積効果がT細胞を活性化する。MHC−抗原複合体の特異的認識、及びこれに対する応答の原因となるT細胞上のレセプターは、いくつかの不可欠な血漿膜タンパク質の複合体で構成されている。先に考察したMHC複合体と同様に、多様なTCRプールは、体細胞の再配置を誘導する遺伝的多型性によって保証される。TCRのプールは多様であるが、それぞれ個々のT細胞は単一の特異的TCRのみを発現するということが強調されるべきである。しかしながら、各T細胞は典型的には、各細胞表面にある1個のペプチドにのみ特異的なこのレセプターのコピーを数千個も呈示する。その上に、他のいくつかのタイプの膜関連タンパク質がT細胞結合及び活性化に関与している。
【0019】
T細胞の活性化は一連の化学的シグナル(主として、サイトカイン)の産生を伴い、その結果細胞は直接作用するかまたは免疫系の他の細胞を刺激して作用させる。クラスI MHC−抗原活性化の場合には、CTLは増殖し、同一の抗原を提示している感染細胞を破壊するように作用する。感染細胞の殺傷はウイルスから生命維持を奪って抗体へのアクセスを可能として、最終的にウイルスを排除する。対照的に、クラスII MHC−抗原複合体によるTh細胞の活性化は、(宿主の防御系の一部である)抗原提示細胞を破壊するのではなくて、むしろTh細胞を刺激して増殖させ、そして種々の細胞に影響を与えるシグナル(再び主としてサイトカイン)を産生させる。特に、シグナル伝達は、B細胞の刺激、マクロファージの活性化、CTLの分化、並びに炎症の促進を誘導する。この協同した応答は比較的特異的であり、そしてクラスII MHC系によって提示されるペプチドを有する外来性エレメントに向けられる。
【0020】
正しく機能するとき、免疫応答は、微細病原体、そして程度はより低いが、新生細胞の排除に驚くほど有効である。一般的に、自己認識の複雑なメカニズムは極めて効率的であり、外来抗原に限ってのみ強い応答を起こすことが可能である。残念なことに、免疫系はしばしば機能不全を起こし、宿主の細胞に向かい、それによって自己免疫応答を誘発する。典型的には、自己免疫は、免疫細胞上の抗原レセプターが健常細胞上の特定の抗原を認識すると自己免疫が生じ、そのような特定の物質を有する細胞の死滅を起こすと考えられる。多くの場合に、自己免疫反応はこの反応を促す抗原がなくなると消失する点で、自己限定的である。しかしながら、ある場合は、自己反応性リンパ球は本来あるべき状態よりも長く生存して、アポトーシスを誘導するか、さもなければ正常細胞を排除し続ける。動物及びヒトにおいて、自己反応性細胞の生存の延長が少なくとも2つの慢性自己免疫疾患、即ち全身性エリテマトーデス及びリウマチ様関節炎、に関与していることを示すいくつかの証拠がある。
【0021】
他の作用メカニズムも種々の自己免疫疾患発症の原因であると考えられる。例えば、この数年間に、T細胞−APC相互作用のアビディティーが自己抗原に対する胸腺の学習と寛容を指令することが明らかになってきた。従って、アビディティー相互作用が高いとT細胞が排除されるが、アビディティー相互作用が低いと成熟及び胸腺からの退出が可能になる。このメカニズムは自己反応性の免疫系を除去するのに有効であるが、自己抗原が隔離されたり、有効レベルの胸腺提示値を達成しないか、胸腺の潜在性の影響を受けるか、または殆ど提示されない場合、自己反応性を有するT細胞前駆体は依然として産生されて末梢まで移動することができる。さらに、特定のT細胞レセプターと反応し得る超抗原、並びに抗原擬態、エピトープの拡散、またはペプチド潜在性よる末梢解放を刺激し得るイベントはそれらの自己反応性T細胞の活性化をトリガして、抗原暴露を起こす可能性がある。いずれの場合にも、自己抗原の連続的供給及びT細胞レセプターリガンド(ペプチド−MHC複合体)の豊富な産生がT細胞攻撃力のメカニズムであるらしい。自己寛容のこのような自然発生的崩壊の例には、多発性硬化症(MS)、リウマチ様関節炎(多分、複数のメカニズム)及びI型糖尿病が含まれ、その全てがT細胞介在性自己免疫疾患であると考えられている。
【0022】
いずれのメカニズムが免疫系の崩壊に寄与するかに関わりなく、その結果は個体にとって破滅的であり得る。例えば、多発性硬化症は米国において約250,000人に影響を与えている慢性の炎症性疾患である。この炎症プロセスは始めは中枢神経系の白質内で生じ、T細胞、B細胞及びマクロファージによって媒介され、軸索の脱髄の原因となる。臨床的な経過は正に多様であるが、最も一般的な形態は麻痺、感覚欠損及び視覚障害を含む神経欠損の再発によって示される。
【0023】
免疫細胞が中枢神経系の白質に拡散すると、免疫応答はミエリン上のいくつかの異なる抗原に対して標的化される。例えば、髄液中に出現する膜攻撃複合体によって補体カスケードを活性化するミエリンに向けられる重大な抗体応答が存在する。さらに、T細胞は、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)及びプロテオリピドタンパク質(PLP)上に提示されているような種々のミエリン抗原の一定の重要部分に対して標的化される。T細胞は次々にサイトカインを産生し、次にマクロファージが影響を受けてミエリンを攻撃し、ミエリン鞘の大きなチャンクを貧食する。協同的な攻撃によって脱髄部分が生じ、これによって軸索に沿った健全な伝達機能が障害されて、病態生理学的欠陥が生じる。多発性硬化症におけるミエリン鞘または原発性胆汁性肝硬変におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のような超分子構造のいくつかの成分に対する複数の免疫応答は、別々の臓器に関わる自己免疫疾患に罹患している個体に共通している。
【0024】
自己免疫疾患の治療法は種々のレベルで成功している。例えば、代謝制御によって臓器特異性自己免疫疾患を矯正することがしばしば可能である。機能を喪失して回復し得ない場合、機械的代用品または組織移植片が適当であることがある。しかしながら、MSを含むほとんどの不能障害のいくつかには有効な治療法がない。 コルチコステロイド及び修飾β−インターフェロンを含むいくつかの化合物は、MSの症状のあるものを軽減し得るが、重篤な副作用を有することが実証されているか、あるいは長期間の使用には望ましくないことが示されている。その他の治療法が有望であることが示されているが、有効性は未だ示されていない。
【0025】
この点に関して、MSの1つの有望な治療法はWO 96/16086(本明細書に参照により編入している)に記載されており、これはミエリン塩基性タンパク質(MBP)のペプチド類似体の使用について開示している。これらの類似体を含む組成物は、過度の副作用を有することなくMSの症状を改善できることが報告されている。さらに、ミエリン構築タンパク質のペプチド類似体の使用は、MSモデルとしてのマウスでしばしば使用される臓器特異性免疫疾患である、実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)の症状の治療に有効であることが示されている。 詳細には、プロテオリピド(PLP)ペプチド由来のペプチド類似体によって、EAEの回復が達成された(Kuchrooら、J.Immunol.153:3326〜3336、1994、本明細書に参照より編入している)。天然PLPペプチド内の主要TCR接触残基を変異させたとき、結果として生じるペプチド類似体は、天然ペプチドと同様に、MHCに結合するがPLP特異的T細胞を活性化しないことが示された。その代わり、PLP類似体はT細胞のインビトロ活性化を阻害する。
【0026】
ペプチド類似体は、攻撃的なT細胞のエフェクター機能を調節し、自己免疫疾患を改善する魅力的なアプローチを代表するが、いくつかの問題がこれらペプチド類似体の有効性を制限する。例えば、典型的なAPCの表面では数個のMHC−ペプチド複合体しか利用が可能ではなく、これはT細胞を活性化するために単一複合体が約200個のTCRを連続的にトリガしなければならないことを意味する。自己抗原がMHC系による正常なプロセシング及び提示用に連続的に利用できる場合、前記ペプチド類似体との結合には極めて少数の表面MHC複合体しか利用できないように思われる。さらに、遊離ペプチドは典型的に半減期が非常に短く、MHC−抗原提示系によって容易に取り込まれたりプロセシングされたりしないので、天然ではAPC上に殆ど発現されない。提示が非効率的であるため、各T細胞上にある数千ものTCRと直接に結合するためには、細胞内において法外に高レベルの遊離ペプチドを必要とすると思われる。細胞表面MHC分子の代謝も細胞外環境で形成された複合体の存在時間が短い一因である(すなわち、MHCクラスII分子は細胞外ペプチドと結合する前にかなりの期間細胞表面に存在している)が、エンドサイトーシス用コンパートメントで形成された複合体は細胞表面に位置を移されたばかりなので、通常の期間残留する。結局、先に言及したように、そのような合成エピトープまたは類似体の投与は哺乳類体内におけるペプチドの半減期が短いことからしても、非常に問題が多い。MHC複合体と投与されたペプチドの短い半減期の間では、十分な免疫応答の誘導を可能にするには有効な暴露が短すぎて、さらに高用量を必要とする。
【0027】
従って、本発明の一般的な目的は、免疫疾患を治療するために脊椎動物の免疫系を効果的に修飾するための方法と関連組成物を提供することである。
【0028】
本発明の他の目的は、細胞免疫応答の調節を必要としている対象の細胞免疫応答を調節するために、T細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストを効果的に提示するための方法と組成物を提供することである。
【0029】
本発明のさらなる目的は、種々の免疫疾患の治療及び改善のための方法と組成物を提供することである。
【0030】
本発明のさらに他の目的は、新生児または乳児におけるT細胞寛容の誘導のための方法及び組成物を提供することである。
【0031】
本発明のさらに他の目的は、多発性硬化症を含む自己免疫疾患に関連する病理学的症状の軽減を提供することである。
【0032】
[発明の概要]
これら及びその他の目的は、広範な見地からすれば、Fcレセプターが媒介する、エンドサイトーシス送達系を提供する本発明の方法並びに関連化合物及び組成物によって達成される。選択された実施態様では、本発明は免疫抑制因子の効果的な提示を提供し、好ましい実施態様では、前記因子はT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストを含み得る。その他の好ましい実施態様は、1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む免疫抑制因子を組み込んでいる。即ち、本発明は一般的に、脊椎動物において免疫応答を選択的に修飾するための免疫抑制因子を提示する方法、化合物及び組成物を提供する。特に好ましい実施態様では、本発明は、特定の抗原に対して生じる免疫応答を調節するために、1つまたはそれ以上の選択されたT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストのFcレセプター介在性のエンドサイトーシスによる提示を提供する。当業者によって認められるように、開示された方法及び組成物を使用して、脊椎動物の免疫応答に関連する任意の生理学的異常を治療することができる。例えば、免疫系の選択された成分を抑制するこの能力は、中でも、自己免疫疾患の治療、組織または臓器移植の容易化、並びにアレルゲンによって生じた症状の緩和を可能にすると思われる。また、本発明はさらに、新生児及び乳児において自己抗原に関する寛容の誘導を提供する。
【0033】
本発明の好ましい局面では、選択された免疫抑制因子のエンドサイトーシスによる提示は、抗原提示細胞のFcレセプター(FcR)と結合することのできる免疫調節剤の使用によって容易になる。典型的には、前記免疫調節剤はFcレセプターと結合し得る少なくとも1つのリガンドと会合した少なくとも1つの免疫抑制因子を含む。免疫調節剤は抗原提示細胞(APC)と結合すると、APCの天然エンドサイトーシス経路によって細胞内に取り込まれそしてプロセシングされる。好ましくは、自己抗原性ポリペプチドまたはT細胞レセプターアンタゴニスト又はアゴニストの一部またはそれ自体であり得る免疫抑制因子は細胞内に取り込まれた後、新たに合成された内因性MHCクラスII構造体と会合してAPC表面に提示される。当業者は、免疫抑制因子(特にアンタゴニスト)は、MHCクラスII構造体と結合したときT細胞レセプターと複合体を形成するが、T細胞の活性化は促進しないことを認めるであろう。同様に、同時刺激性分子が存在しない場合、自己抗原性ポリペプチドまたは直接投与されたTCRアゴニストのAPCによる提示が寛容の誘導を導くことが認められるであろう。従って、適切なTCRアンタゴニストまたはアゴニストがFcR介在によって効率良く提示されると(ここで、アゴニストは自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントに由来し得る)、既に感作されたT細胞(即ち、特定の自己抗原に感作された細胞)が活性化され、天然自己抗原が正常に提示されているにもかかわらず、免疫応答をトリガすることを防御できる。
【0034】
広義には、本発明の免疫調節剤は、抗原提示細胞のFcレセプターと結合して細胞内に取り込まれることができる任意のリガンド(FcRリガンド)を含み得る。即ち、FcRリガンドは、任意の抗原提示細胞の表面のFcレセプターと効果的に結合する任意のタンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチドまたは分子であり得る。FcRリガンドは、免疫グロブリン分子の定常領域の少なくともある部分を含むか、あるいは模擬しており、対象内で抗原応答を誘発しないことが好ましい。本発明の選択された局面では、FcRリガンドはIgG分子の定常領域の一部または全部を含んでいる。特に好ましい実施態様では、治療を受ける種に由来する選択された免疫グロブリン分子の全定常領域を含むFcRリガンドが使用される。勿論、Fcレセプターとの結合はまた、単一定常領域ドメインの小フラグメントまたは非アミノ酸分子を含むリガンドによって影響されることがあることも認められよう。いずれにしても、FcRリガンドは、定方向進化、組み合わせ化学、またはラショナルドラッグデザインのような近代的製薬技術を用いて得ることができる。
【0035】
先に言及したように、本発明の化合物は、免疫調節剤を供給するためにFcRリガンドと会合した免疫抑制因子をさらに含む。本発明の目的では、免疫抑制因子はAPCによってプロセシングされ、細胞表面のクラスII MHC分子と会合して提示され得る任意の分子であり得る。前述するように、本発明の選択された実施態様は、Fc介在性取り込みを介して効果的な提示を行うために、少なくとも1個のT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストをFcRリガンドと会合させること含む。特に好ましい実施態様では、免疫抑制因子は、所望するTCRアゴニストを供給するためにプロセシング(即ち、消化あるいはタンパク質分解)し得る、1つまたはそれ以上の選択された自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントを含む。好ましくは、自己抗原性ポリペプチド(複数でもよい)、またはそのフラグメントは、エンドサイトーシスによるプロセシング中のタンパク質分解から生じる、1つ以上のペプチドアゴニスト(即ち、1つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド)を供給する。適切な同時刺激性分子が存在しない場合にAPCによってアンタゴニストまたはアゴニストが提示されると、関連する自己抗原に対する免疫応答のダウンレギュレーションを起因する。
【0036】
特に好ましい実施態様では、本発明はT細胞アンタゴニストの全部または一部を含む免疫抑制因子を使用する。本開示の目的では、「アンタゴニスト」の用語は、その通常の意味に従って、別の物質のレセプターと結合し、これをブロックすることによって、その物質の生理学的作用を干渉する任意の物質を含む。さらに詳細には、TCRアンタゴニストは、クラスII MHC分子と共同して、T細胞レセプターと非反応的に会合して、さらにそのT細胞レセプターを介して負のシグナル伝達を誘導できる分子的実体である。好ましくは、TCRアンタゴニストは、正常な活性化抗原アゴニストの類似体であるペプチドまたはタンパク質フラグメントを含む。特に好ましい実施態様では、TCRアンタゴニストはT細胞エピトープの類似体である。
【0037】
他の好ましい実施態様では、免疫抑制因子は、提示されるが、結合に際して感作TCRを活性化しないT細胞アゴニストを含むことができる。本発明のこの局面に関して、驚くべきことには、FcRリガンドを用いて自己抗原アゴニストが効果的に提示されると、免疫系を刺激するよりはむしろ寛容誘導を導き得ることが発見されている。即ち、自己抗原性アゴニストの効率の良いFcR取り込みは、一般的に同時刺激性分子を欠如するノンプロフェッショナル及び/または非活性化プロフェッショナルAPCによるアゴニストの提示を導くと思われる。先行技術に基づく考えに反して、このタイプの提示は、最終的には自己反応性T細胞の不活性化、免疫系のダウンレギュレーション、及び任意の関連する自己免疫疾患の改善を誘導する。APCの活性化または同時刺激性分子(即ち、B−7.1、B−7.2、CD40等)の産生を回避するために、TCRアゴニスト構築物あるいは自己抗原性ポリペプチド構築物を産生するアゴニストの投与は、好ましくは(生理食塩水のような)アジュバントを欠如する担体を用いて行われる。
【0038】
本開示の目的では、「アゴニスト」の用語は通常容認される生化学的意味に従って使用される。この点に関して、T細胞アゴニストは所望の免疫原性結果を提供する任意の分子であり得るが、選択されるアゴニストは好ましくはペプチド又はタンパク質フラグメントを含むことが認められるであろう。さらに、当業者は、1つまたはそれ以上のT細胞レセプターアゴニストを含む免疫調節剤は、1つまたはそれ以上のT細胞レセプターアンタゴニストを含む免疫調節剤と組み合わせて、患者の免疫応答を選択的に軽減するために使用できる医薬製剤を提供することができることを認めるであろう。
【0039】
本発明のこの局面に関して、最終的に提示されたTCRアゴニストは1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドの全部または一部を含む免疫抑制因子に由来し得る。即ち、本発明の構築物は、1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントと会合するFcRリガンドを含むことが好ましい。典型的には、組み込まれた自己抗原性ポリペプチド(複数でもよい)またはフラグメントは、野生型アミノ酸配列を含み、FcR介在による取り込み後にプロセシング(即ちタンパク質分解)されたときに、プロフェッショナルまたはノンプロフェッショナルAPCによる提示に対する1つまたはそれ以上のTCRアゴニストを供給する。本発明に従うそのような構築物の投与は、エピトープの拡散を伴う障害を克服するために使用できるために特に好都合である。さらに詳細には、自己免疫が自己抗原上にある複数のエピトープに関連する場合、対応する(自己抗原全体を含む免疫抑制因子由来の)アゴニストのそれぞれの提示は、目的のエピトープ全てについて寛容を誘導する。同様にして、複数のアゴニストの提示は、別々の個体が特定の自己抗原の別々のエピトープに対して自己反応性を生じるような集団に投与される場合に有効であると証明されるであろう。
【0040】
例として、本発明の構築物は、天然ミエリン塩基性タンパク質(MBP)または天然プロテオリピドタンパク質(PLP)に共有結合するIgG分子の全Fc領域を含む融合またはキメラタンパク質の形状をとり得る。他の実施態様では、本発明と適合性のある融合タンパク質は、共有結合されたPLP及びMBPの天然型(即ち、IgGFc−MBP−PLP)を含む免疫抑制因子に共有結合するIgGのFc領域を含むことができる。そのような構築物は、FcRを介して細胞内に取り込まれ、エンドサイトーシスによるプロセシングを受け(タンパク質分解され、結果生じるアゴニストフラグメントがMHC複合体と会合する)、そしてAPCの表面上に提示される。構築物の効率の良い取り込みと同時刺激性分子の欠如に基づき、提示されるアゴニストレベルが比較的高い故に、FcRリガンド/自己抗原構築物の投与は、免疫応答を刺激するというよりはむしろアネルギー(抗原反応不顕性)を誘導する。勿論、天然自己抗原性ポリペプチドの選択されたフラグメントまたは部分を使って、適合性のある免疫抑制因子を作成することができる。当業者は、そのような融合またはキメラタンパク質は、近代の分子生物学技術を用いて容易に構築し得ることを認めるであろう。
【0041】
開示する化合物及び関連方法では、FcRリガンドは免疫抑制因子と会合して免疫調節剤を形成するため、実質的に同時に両方ともAPCによって細胞内に取り込まれる。先に言及したように、本会合は、抗体−抗原複合体のように互いに結合する2個またはそれ以上の分子の形状をとるか、または、好ましい実施態様では、免疫抑制因子(即ち、1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはTCRアンタゴニストまたはアゴニスト)及びFcRリガンドの両方を組み込む単一の融合またはキメラ分子の形成を含むことがある。例えば、選択されたTCRアンタゴニストは、タンパク質分解技術によって産生されたFcRリガンド領域(即ち、Fcフラグメント)に化学的に結合されてもよい。その他の実施態様は、アンタゴニストまたはアゴニストペプチドに立体的に結合されたFcRリガンドを含む正常免疫グロブリンを含み得る。本発明の特に好ましい実施態様は、遺伝子工学技術によって産生されたキメラ免疫グロブリンを含む。これらの化合物においては、FcRリガンド(そして通常は該分子の大部分)は1つまたはそれ以上の免疫グロブリン定常領域を含んでおり、一方1つまたはそれ以上の可変領域が工学操作されて、1つまたはそれ以上の所望のペプチドTCRアンタゴニストまたはTCRアゴニストを発現する。当業者は、前述の免疫調節剤の任意の組み合わせを会合させて本発明の組成物を形成できるように、別の免疫抑制因子を含む類似の免疫調節剤も同様に形成できることを認めるであろう。さらに、先に考察したように、種々の免疫調節剤の混合物または「カクテル」は、本発明の範囲内に含まれるように特に意図されている。
【0042】
本発明のある局面では、免疫調節剤は、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターを架橋することが可能な形状であり得る。例えば、免疫調節剤は多価型であり得る。ある実施態様では、免疫調節剤(複数でもよい)は固定化あるいは凝集されて、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターを架橋することが可能な構築物または構造体を提供することができる。
【0043】
マクロファージ上にあるFcγRの架橋が抗炎症活性を有することが示されている。(Berger ら、Eur. J. Immunol.、 26:1297〜1301、1996; Bergerら、Eur. J. Immunol.、 27:2994〜3000、 1997; Sutterwala ら、 J. Exp. Med.、188:217〜222、1998、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。同様に、凝集は、FcRの架橋及び補体結合のようなIg Fc関連機能を供与する(Christian, J. Immunol.、 84:112〜121、 1960; Rosenqvist ら、 Mol Immunol.、 24:495〜501、 1987、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。
【0044】
IL−10またはIL−4がプラズミドまたはウイルスベクターから産生されるT細胞またはハイブリドーマ細胞株を、進行性のEAEを罹患する動物に注射すると、疾患の回復を誘導することが示されている(Mathisen ら、 J. Exp. Med.、186:159〜164、1997; Shawら、J. Exp. Med.、185:1711〜1714、1997; Maら、J. Immunol. 161:1516〜1524、 1998、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。
【0045】
抗原−抗体複合体への暴露に際してマクロファージによって産生されるIL−10が、IL−12産生に対するアンタゴニスト効果を及ぼすこと、並びにプロ炎症応答を回復することが示されている(Sutterwalaら、J. Exp. Med.、188:217〜222、 1998; Bergerら、Eur. J. Immunol. 27:2994〜3000、 1997、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。
【0046】
その上、IL−10はバイスタンダー抑制を生じ、それによって自己免疫疾患の原因となる種々の抗原に向けられたT細胞の活性を阻害することができる(Falconeら、J. Exp. Med.、185:901〜907、 1997; Stohlmanら、J. Immunol.、163:6338〜6344、 1999、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。バイスタンダー抑制は、APCによって産生されたIL−10による病原性T細胞のアンタゴニズム(拮抗性)に起因するか、あるいはIL−10の作用によって生じた制御性T細胞によるダウンレギュレーションに起因すると提案されている(Grouxら、Nature (Lond.)、389:737〜742、1997、この開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。IL−10が、ナイーブT細胞をIL−10、IL−5、あるいはTGFβを産生できる調節細胞に発生分化させ、抑制を持続することにより病原性T細胞の機能を阻害することが示唆されている(Grouxら、Nature (Lond.)、389:737〜742、1997;Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 93:388〜391、1996; Assemanら、J. Exp. Med. 190:995〜1003、1999; Grouxら、Immunol. Today、20:442〜445、1999; Seddonら、J. Exp. Med.、189:877〜881、1999;Seddonら、Immunol. Today、 21:95〜99、2000、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。
【0047】
従って、本発明のある実施態様では、免疫調節剤は、IL−10及びIL−6のような抗炎症性サイトカインの産生を誘導且つ/または以下にさらに詳細に記述されるように個体においてIFNγのレベルを減少することができる。凝集免疫調節剤による治療はまた、IL−4、IL−9、IL−13、TGF−βのようなその他のサイトカインのアップレギュレーションを誘導し得る。
【0048】
当業者は、所望する凝集または固定化免疫調節剤は、いくつかの公知の技術の任意の一つを用いて製造し得ることを認めるであろう。例えば、本発明の免疫調節剤は、ミクロスフェアまたは微細粒子(例えば、ラテックス、脂質、アルブミン、PVP、あるいはメタクリル酸塩微細粒子)と化学的に会合するか、または投与し易いポリマー基質中に固定化することができる。他の実施態様では、免疫調節剤は、化学的または熱力学的に結合または修飾されて、可溶性あるいは不溶性凝集物を形成することができる。さらなる実施態様では、凝集免疫調節剤は、硫酸アンモニウム沈降法のような、沈降法によって調製することができる。これらの凝集物あるいは固定化構築物は次に、薬学的に許容可能な担体を組み合わせて、本明細書の教示に従って投与することができる。
【0049】
その上、免疫調節剤は、抗原提示細胞の細胞表面上に存在する同時刺激性分子のレベルを減少して、それによって末梢性寛容を誘導する(Fowlkesら、Curr. Opin. Immunol.、5:873〜879、 1993; Arnold ら、 Immunol. Today、14:12〜14、1993;Kosakaら、J. Exp. Med.、177:367〜378、1993;McCormackら、J. Immunol.、150:3785〜3792、1993;Rochaら、Science (Washington、 D.C.)、 251:1225〜1228、1991;Webbら、Cell.、63:1249〜1256、1990;Jenkinsら、Curr Opin Immunol.、5:361〜367、1993、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。末梢性寛容は、末梢(即ち、自己抗原を標的化するT細胞に対する初期選択が起こる胸腺の外部)における自己免疫疾患に関与する抗原の利用性、及び同時刺激性分子が存在しないか、あるいはそのレベルが低下している非活性化抗原提示細胞による末梢での自己抗原の提示に起因する。
【0050】
さらに詳細には、凝集、固定化または非凝集の可溶性形状のいずれであるにせよ、開示された組成物は、従来の製薬技術および担体を用いて製剤化することができ、通常のルートで投与することができる。特に好ましい実施態様は、アジュバントを含まない製剤または担体の使用を含む。アジュバントを含まない形状での抗原の供給は、APC上の同時刺激性分子の発現を刺激せず、これによってT細胞活性化に不適当である抗体提示を起因するらしい(Fowlkesら、Curr. Opin. Immunol.、 5:873〜879、 1993;Jacobsら、Immunology、82:294〜300、1994; Muellerら、Curr. Opin. Immunol.、7:375〜381、 1995、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。このアプローチは、自己反応性T細胞を調節し、さらに疾病の回復を促進する(Elliottら、J. Clin. Invest.、98:1602〜1612、1996; Gaurら、Science (Washington、 D.C.)、 258:1491〜1494、1992;Liblauら、Immunol. Today、 18:599〜604, 1997;Critchfieldら、Science (Washington、 D.C.)、263:1139〜1143、 1994;Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:388〜391、1996; Devauxら、J. Neuroimmunol.、 75:169〜173、1997; Leadbetterら、J. Immunol.、161:504〜512、1998;Staykovaら、Immunol Cell Biol.、75:54〜64、1997、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。従って、当業者は、そのような調剤は、免疫応答を惹起し得る同時刺激性分子の発生を回避するか、あるいは最小限にすることを認めるであろう。
【0051】
いずれにせよ、免疫調節剤のFcR介在性取り込みを使用することによって先行技術による組成物に関連した問題の多くが回避される。さらに詳細には、本発明の方法は、先行技術で開示されているような遊離ペプチドアンタゴニストの投与に関連した制限の多くを克服している。従って、TCRアンタゴニストのような免疫抑制因子のエンドサイトーシスによる効率の良い提示によって相当量のMHC−アンタゴニストリガンドが産生され、自己反応性抗原の連続的提示に係わる自然発生免疫疾患で産生される天然MHC−自己抗原複合体に対抗することができる。同様に、FcRリガンド−アゴニスト(または自己抗原性ポリペプチド)構築物の効果の良い取り込みと、これに後続する所望するアゴニスト(複数でもよい)の提示は、自己反応性T細胞にアネルギーを誘導することができる。このため、本発明を使用して免疫抑制因子の提示に応答する任意の免疫疾患を治療することができる。これは、例えば、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎を含むT細胞介在性自己免疫疾患に特に当てはまる。同様にして、本発明を使用してアレルゲンのような連続的に提示されるアゴニストに関して免疫系を選択的にダウンレギュレートすることができる。さらに、本発明の化合物や関連組成物を使用して免疫系の種々の成分を選択的に抑制して、移植後の組織または臓器の拒絶反応の可能性を低下させることができる。
【0052】
前述の利点の他に、驚くべきことには、本発明の化合物、組成物及び方法を使用して新生児及び乳児に種々の自己抗原に対する寛容を誘導できることが見い出された。さらに詳細には、本発明は、成体期における自己免疫疾患の誘導に対して新生児または乳児哺乳類に耐性を与える組成物や方法をさらに提供する。本明細書の教示によれば、この新生児寛容は、二次リンパ系器官における応答の逸脱及び適切な自己抗原のチャレンジに際しての異常なγインターフェロン介在性脾臓アネルギーを特徴としている。前記に考察するように、本発明の好ましい実施態様は、非反応性担体(すなわち、アジュバントを含まないもの)中での投与に際して、所望する新生児寛容の誘導を提供することができる。
【0053】
本発明のいくつかの局面を以下に要約する。
【0054】
本発明の一つの実施態様は、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物であり、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部は、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターと架橋することができる。組成物はさらに薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。本実施態様のある局面において、組成物はアジュバントを含まない。本発明のある局面では、免疫グロブリンは多価型である。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは基質中に包埋されているか、あるいは吸着されている。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは凝集している。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンはIgG分子である。本実施態様のその他の局面では、抗原は疾患に関連する抗原を含む。本実施態様のその他の局面では、抗原は自己免疫疾患に関連する抗原を含む。例えば、抗原は、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連し得る。本実施態様のある局面では、抗原はプロテオリピドタンパク質由来の抗原である。本実施態様のその他の局面では、抗原はミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である。本実施態様のさらなる局面では、免疫グロブリンまたはその一部は、免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む。例えば、抗原は、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換していることがある。本実施態様のある局面では、抗原はCDR3内に位置する。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはヒトIgG分子である。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはキメラである。
【0055】
本発明の他の実施態様は、自己免疫疾患に関連する症状を改善する方法であって、前記方法が、前記自己免疫疾患に係わる抗原と結合する免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を得ることを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部は抗原提示細胞の細胞表面に存在するFcレセプターを架橋することができ、さらに前記組成物を前記自己免疫疾患に罹患している個体に投与することを含む。本実施態様のある局面では、組成物はさらに製剤上に許容可能な担体を含む。本実施態様のある局面において、組成物はアジュバントを含まない。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは凝集している。本実施態様のある局面では、抗原は疾患と関連する。本実施態様のある局面では、抗原は自己免疫疾患と関連する。本実施態様のある局面では、抗原は、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する。本実施態様のある局面では、抗原はプロテオリピドタンパク質由来の抗原である。本実施態様のその他の局面では、抗原はミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンまたはその一部は、免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む。本実施態様のある局面では、抗原は、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換していることがある。本実施態様のある局面では、抗原はCDR3内に位置する。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンはヒトIgG分子である。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはキメラである。
【0056】
本発明の他の実施態様は、個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法が、IL−10レベルを増加する必要性のある個体を識別すること、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することにより前記個体のIL−10レベルを増加することを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部が、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターを架橋することができる。本実施態様のある局面では、個体は自己免疫疾患に罹患している。本実施態様のある局面では、組成物はさらに製剤上に許容可能な担体を含む。本実施態様のある局面において、組成物はアジュバントを含まない。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは凝集している。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは脂質またはポリマー基質上に固定化されている。本実施態様のある局面では、抗原は、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する。本実施態様のある局面では、抗原はプロテオリピドタンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、抗原はミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンまたはその一部は、免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む。本実施態様のある局面では、抗原は、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換する。本実施態様のある局面では、抗原はCDR3内に位置する。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンはヒトIgG分子である。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはキメラである。
【0057】
本発明の他の実施態様は、個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法がIL−10レベルを増加する必要性及び末梢性寛容を刺激する必要性のある個体を識別すること、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することにより該個体のIL−10レベルを増加並びに末梢性寛容を刺激することを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部が、抗原提示細胞の細胞表面に存在するFcレセプターを架橋することができる。本実施態様のある局面では、個体は自己免疫疾患に罹患している。本実施態様のある局面では、組成物はさらに製剤上に許容可能な担体を含む。本実施態様のある局面において、組成物はアジュバントを含まない。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは凝集している。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは脂質またはポリマー基質上に固定化されている。本実施態様のある局面では、抗原は、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する。本実施態様のある局面では、抗原はプロテオリピドタンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、抗原はミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンまたはその一部は、免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む。本実施態様のある局面では、抗原は、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換していることがある。本実施態様のある局面では、抗原はCDR3内に位置する。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンはヒトIgG分子である。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはキメラである。
【0058】
本発明の他の実施態様は、個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法が、IFNγレベルを低下させる必要性のある個体を識別すること、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することにより前記個体のIFNγレベルを低下させることを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部が、抗原提示細胞の細胞表面に存在するFcレセプターを架橋することができる。
【0059】
本発明の他の実施態様は、複数の自己抗原に対する免疫応答に起因する自己免疫疾患の症状を軽減する方法であって、前記方法が、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部が、抗原提示細胞の細胞表面に存在するFcレセプターを架橋することができ、さらに前記抗原が前記自己免疫疾患の原因となる抗原の一つである。
【0060】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、本発明の以下に詳記した好ましい実施態様の説明を、簡単に記載されている図面と共に考慮することによって、当業者には明白であろう。
【0061】
[好ましい実施態様の詳細な説明]
本発明は多数の異なる形態で実施することができるが、本明細書では本発明の原理を例示する具体的な実施例を開示する。本発明は例示した特定の実施態様に限定されないことを強調すべきである。
【0062】
先に言及したように、本発明はFcレセプター介在性エンドサイトーシス送達系を用いて脊椎動物の免疫応答を選択的に修飾する化合物、組成物及び方法を提供する。本質的に、免疫系をダウンレギュレートするためにこの細胞取り込み形態を利用できる免疫調節剤はいずれも本発明の一部を構成すると考えられる。中でも、本発明の免疫調節剤はキメラまたは融合ポリペプチド、抗原−抗体複合体、キメラ抗体または非ペプチド性免疫活性化合物を含むことができる。好ましい実施態様では、本明細書に開示した免疫調節化合物は少なくとも1つのFcRリガンドと、エンドサイトーシスによる提示に際して免疫応答をダウンレギュレートし得る少なくとも1つの免疫抑制因子を含む。本発明の特に好ましい実施態様は、免疫抑制因子が、エンドサイトーシスによるプロセシング及び提示後に、感作T細胞表面のレセプターとは結合し得るが免疫原性応答を生じさせることができない、1以上のT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストである免疫調節剤を含む。このような実施態様では、提示された免疫抑制因子は、関連する感作T細胞の活性化を防止して、生じる応答を低下させる。この免疫系の選択的抑制は、中でも、T細胞介在性自己免疫疾患を含む免疫疾患、アレルギー及び移植手術における組織拒絶反応に関連した症状を治療するために使用することができる。
【0063】
従って、一つの実施態様では、本発明は脊椎動物の抗原提示細胞の表面に免疫抑制因子をエンドサイトーシスによって提示するための免疫調節剤を含み、前記免疫調節剤は少なくとも1つのFcレセプターリガンドと少なくとも1つの免疫抑制因子とを含む。好ましい実施態様では、免疫グロブリン定常領域ドメインの少なくとも一部分に相当するFcレセプターリガンドが含まれており、一方免疫抑制因子は少なくとも1つのT細胞レセプターアンタゴニストに相当する。他の好ましい実施態様は、T細胞レセプターアゴニストを含む免疫抑制因子が組み入れられている。さらに、前記に詳細に考察したように、免疫抑制因子は1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントを含むことができ、従って、エンドサイトーシスによるプロセシング及び提示の際に1つまたはそれ以上のTCRアゴニストを生じる。特に好ましい実施態様では、免疫調節剤は組換えポリペプチドまたはキメラ抗体を含む。
【0064】
選択した免疫調節剤のFcR介在性取り込みを利用することによって、本発明は身体自体の代謝経路を非常に巧妙に利用して有害な免疫応答をダウンレギュレートする。さらに詳細には、本発明は、T細胞が他の細胞の表面に付着すると外来抗原を認識且つ応答するという事実を利用している。本明細書の教示に従って適当な免疫調節剤(複数でもよい)を選択すると、投与された化合物の効率的な取り込みが生じる。FcR介在性取り込み後に、抗原提示細胞の天然エンドサイトーシス経路によって、選択された免疫抑制因子はMHCクラスII分子と複合体を形成し効果的に提示される。
【0065】
前記のように、ある細胞をクラスII MHC制限ヘルパーT細胞リンパ球用の抗原提示細胞として機能させることができる2つの必須の特性は、エンドサイトーシスを受けた抗原をプロセシングできること及びクラスII MHC遺伝子産物の発現である。プロフェッショナル及びノンプロフェッショナルAPCを含むほとんどの細胞は、タンパク質抗原をエンドサイトーシスし、且つプロセシングできると思われる。従って、プロフェッショナルAPCに関しては、決定因子はクラスII MHC分子の発現であると考えられる。この点に関して、ヘルパーTリンパ球について最も的確に特定された抗原提示細胞には、単核食細胞、Bリンパ球、樹状細胞、皮膚のランゲルハンス細胞が含まれ、そしていくつかの哺乳動物においては、内皮細胞が含まれる。勿論、別々の細胞が別々の領域で集中し、T細胞介在性免疫応答の異なる段階に関与し得ることが認められよう。
【0066】
いずれにしても、本明細書で使用する際は、「プロフェッショナル抗原提示細胞」または「プロフェッショナルAPC」とは、T細胞介在性免疫応答を誘導し、高レベルの同時刺激性分子を発現し得る任意の細胞を意味すると考えるべきである。反対に、ノンプロフェッショナルAPCは典型的には高レベルの同時刺激性分子を発現しない。本発明の目的には、両型の細胞が、選択された免疫抑制因子を提示し、そして免疫系をダウンレギュレートするために利用できることが認識されよう。これについては、選択されたFcRリガンドは、多様な細胞型に見られるいくつかの異なるFcレセプターのいずれかと相互作用して、免疫調節剤のエンドサイトーシスを促進し得る。単なる例として、利用可能である選択されたヒトFcレセプターにはFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIAまたはFcγRIIIBサブファミリーが含まれる。
【0067】
さらに一般的には、本発明に従って、当業者は、FcR複合体と結合してエンドサイトーシスを開始し得るリガンドはいずれも本発明に適合し、さらに開示された免疫調節剤に組み入れることができることが認められよう。従って、FcRリガンドは、限定はしないが、ペプチド、タンパク質、タンパク質誘導体、またはアミノ酸を組み込むかあるいは組み込まない小分子的実体を含むことができる。例えば、リコンビナントケミストリーまたはラショナルドラッグデザインのような近代生化学技術を用いて誘導される小分子は、必須のAPC取り込みを提供する限りにおいて使用することができる。
【0068】
適合性のある分子はいずれのタイプでも使用できることを強調しなけれはならないが、本発明のFcRリガンドは1つまたはそれ以上のペプチドを含んでいることが好ましい。さらに好ましくは、FcRリガンドは免疫グロブリンの定常領域のドメインの少なくとも一部分を含んでいる。特に好ましい実施態様では、FcRリガンドは、免疫グロブリン分子の定常領域由来のドメインを1つまたはそれ以上含んでいる。当業者は、必要に応じて、種々の免疫グロブリンのイソタイプ及びアロタイプを使用できることを認めるであろう。例えば、適合性のあるFcRリガンドはIgG、IgE、IgAまたはIgMの定常領域に見られるアミノ酸配列に相当するものから選択することができる。中でも、FcRリガンドとして使用される特定のイソタイプの選択は、結合係数のような生化学的特性または治療対象となる種において免疫反応性が低いことに基づいて属性を断定できる。同様に、単一ドメイン、そのフラグメント、または複数ドメインの選択は生化学的因子、あるいは最終的には、提示効率に基づいて決定することができる。
【0069】
前記のように、本発明の免疫調節剤はさらに免疫抑制因子を含む。本発明の範囲によれば、免疫抑制因子は、エンドサイトーシスによってプロセシングされてAPC表面に提示されるとき、免疫系をダウンレギュレートする任意の化合物であり得る。このため、免疫抑制因子は小分子、ペプチド、タンパク質フラグメント、タンパク質誘導体、ポリペプチドまたはそれらの組み合わせを含み得る。好ましい実施態様では、免疫抑制因子は、APC表面に提示されるとき、同様に提示されたアゴニストと選択されたレセプターとの結合に干渉するという点で、アンタゴニストとして作用する。特に好ましい実施態様では、免疫抑制因子は、免疫応答を活性化しないでT細胞レセプターと会合するT細胞レセプターアンタゴニストを含む。本発明のその他の実施態様が、対象の自己抗原に対する免疫応答を低下させるT細胞レセプターアゴニストを組み入れている免疫調節剤を含むことが認められるであろう。これらの実施態様に関しては、天然自己抗原性ポリペプチドのFc介在性提示を使って、エンドサイトーシスによる提示を介して所望するT細胞レセプターアゴニストを提供できることが認められよう。即ち、FcRリガンドと会合する天然自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントの投与は、本明細書の教示に従って1つまたはそれ以上のT細胞レセプターアゴニストの効率の良い提示を起因する。
【0070】
本発明による免疫抑制因子として任意の機能的に適合性のある分子を使用できるが、当業者は、開示された化合物及び方法における用途にはタンパク質(ポリペプチド)、タンパク質フラグメントまたはペプチドが特に適していることを認めるであろう。そのような分子は正常なエンドサイトーシス経路で容易にプロセシングされて、例えば、MHCクラスII分子と協同して容易に抗原提示細胞表面に提示される。さらに、望ましくない免疫応答を誘発する化合物の大部分は典型的にはタンパク質フラグメントであるために、T細胞レセプターは通常、これらがアゴニストでもまたはアンタゴニストであっても、類似するフラグメントに対して最も応答性がある。特に好ましい実施態様では、アンタゴニスト性の免疫抑制因子は、選定されたT細胞レセプターと免疫反応性のある選択されたペプチドまたはタンパク質フラグメントの類似体である。
【0071】
本明細書で使用される、「ペプチド類似体」または「類似体」は、類似体と天然タンパク質フラグメントまたはペプチドとの間のそれぞれの対応する配列に少なくとも1つの異なるアミノ酸を含む。他に示さない限り、指定したアミノ酸はL型を言う。天然ペプチド由来のL−アミノ酸はタンパク質中に通常見られる20種のLアミノ酸のうちの任意の他のもの、対応するD−アミノ酸のうちの任意のもの、希少アミノ酸、例えば4−ヒドロキシプロフィン及びヒドロキシリジン、または非タンパク質アミノ酸、例えばβ−アラニン及びホモセリン、に改変することができる。メチル化(例えば、a−メチルバリン)、エチルアミン、エタノールアミン及びエチレンジアミンのようなアルキルアミンによるC末端アミノ酸のアミド化、並びにアミノ酸側鎖官能基のアシル化またはメチル化(例えば、リジンのイプシロンアミノ基のアシル化)のような化学的手段で改変されたアミノ酸も本発明の範囲内に含まれる。
【0072】
多発性硬化症(MS)の治療に効率の良いペプチドアンタゴニストを選択する方法は、本出願で先に参照したPCT公開第WO 96/16086号に開示されている。開示された方法を本発明と一緒に使用して、開示された免疫調節剤に組み入れる有効な免疫抑制因子を提供することができる。例えば、以下で詳記するアッセイを使用し、MHCとの競合的結合を測定するアッセイ、T細胞増殖アッセイまたは実験的脳脊髄炎(EAE)の誘導を評価するアッセイによって、候補ペプチド類似体のMS治療能力をスクリーニングすることができる。天然自己反応性ペプチドの結合を阻害し、天然ペプチド反応性細胞系の増殖を刺激せず、そして公知の自己抗原によるEAE(MSの実験的モデル)の発生を阻害する類似体は治療法に有用である。当業者は、類似するタイプのアッセイを使用して、他の天然ペプチド(即ち、連続的に提示される自己抗原)及び他の免疫疾患用の免疫抑制因子をスクリーニングできることを認めるであろう。特に好ましい実施態様では、選択された免疫抑制因子はT細胞エピトープの類似体を含む。
【0073】
さらに一般的には、多様な免疫反応性の作因を有する多数の疾病について、不必要に過度の実験を行うことなく免疫抑制因子(アゴニストまたはアンタゴニスト)を得ることができる。例えば、多発性硬化症を治療するために、ペプチド類似体アンタゴニストまたはアゴニストをプロテオリピドタンパタ質またはミエリン塩基性タンパク質上のT細胞エピトープについて産生させることができる。他方、天然ポリペプチド(即ち、MBPまたはPLP)またはその組み合わせをFcRリガンドと会合させて投与することにより、所望する免疫抑制効果を供与することができる。同様に、原発性胆汁性肝硬変を治療するために、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、あるいは同一タンパク質のT細胞エピトープから誘導されたT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストに相当する天然ポリペプチドまたはそのフラグメントを使用することができる。どちらの例も、天然または誘導免疫抑制因子は本明細書に記載したように免疫調節剤に組み込まれて、これを必要とする患者に投与される。(天然自己抗原の投与に起因するアゴニストを含む)免疫抑制因子が効果的に提示されると、天然ペプチドによる自己反応性T細胞の刺激が選択的に減少され、それによって対象の免疫疾患の症状が緩和される。
【0074】
共に免疫調節剤を構成している選択された免疫抑制因子とFcRリガンドは、多数の形態のうちの任意の1つで効果的に投与することができる。さらに詳細には、前記のように、本発明の免疫調節剤は、免疫応答を選択的抑制することにおいて機能的に有効である任意の形態のそれぞれの要素を組み合わせることができる。例えば、免疫調節剤は、当業者に公知である分子生物学を用いて産生された組換え(または融合)ポリペプチドまたはタンパク質を含むことができる。そのような場合には、FcRリガンドは単一の免疫グロブリン定常領域ドメインの1つのフラグメントまたは、好ましくは、定常領域全体を含み得る。他の実施態様では、免疫調節剤は、抗原がT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストあるいは天然自己抗原を含んでいる、立体的に結合した抗体−抗原複合体を含むことかできる。他の好ましい実施態様は、免疫抑制因子がFabフラグメント上に発現されているキメラ抗体を含む免疫調節剤を特徴としている。さらに他の実施態様では、免疫調節剤は、有効なFcRリガンドと免疫抑制因子をそれぞれ含む2個の共有結合された分子を含むことができる。
【0075】
本発明の特に好ましい実施態様では、単一の融合ポリペプチドを含む免疫調節剤をコードする組換えヌクレオチド構築物が使用される。当業者は、標準的な遺伝子工学技術によって少なくとも1つのFcRリガンドと少なくとも1つの免疫抑制因子を含む融合タンパタ質またはキメラが提供され得ることを認めるであろう。本明細書で使用するとき、「キメラ」または「キメラの」の用語は、1つ以上の源からの配列フラグメントを含む任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包含するように最も広範な意味で使用される。例えば、ペプチドTCRアンタゴニストとIgG分子からの単一のFcドメインを組み入れている遺伝子工学操作によるポリペプチドは、正確にはキメラまたは融合タンパク質と称される。同様に、キメラ抗体は、異種ペプチド免疫抑制因子を組み入れるように工学操作された組換えH鎖及び野生型L鎖を含むことができる。本発明の目的では、前記の本質的に相違する領域は異なる種に由来する必要はない。即ち、キメラ抗体はヒトL及びH鎖並びにCDRで発現されている工学操作されたヒトTCRアンタゴニストを含むことができる。逆に、キメラ免疫調節剤はヒトとマウスのような異なる種に由来するFcRリガンドと免疫抑制因子を含むことができる。
【0076】
このため、本発明の1つの局面は、Fcレセプターリガンドに相当する少なくとも1つのヌクレオチド配列及び免疫抑制因子に相当する少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド分子を含む。好ましくは、免疫抑制因子は、1つまたはそれ以上の天然自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストに相当し、Fcレセプターリガンドは免疫グロブリンの定常領域ドメインの少なくとも一つに相当する。特に好ましい実施態様では、ポリヌクレオチド分子は、相補性決定領域が少なくとも一部欠失しておりT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストに相当するヌクレオチド配列で置換されている、免疫グロブリンH鎖に相当するヌクレオチド配列をコードしている。免疫抑制因子の混合物を含む組成物もまた本明細書の教示に従って効果的に使用することができる。
【0077】
いずれにしても、当該分野で公知の技術を使用して、所望の免疫調節剤を含むDNA構築物を原核または真核細胞内で発現させることができる。例えば、Maniatisら、Molecular Cloning(分子クローニング):A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York、1982(本明細書に参照により編入)参照のこと。好ましい実施態様では、工学操作されたプラスミドは不死化細胞系内にトランスフェクトされて、前記細胞が所望の産物を分泌する。当該分野で公知であるように、そのように工学操作された生物は選択された免疫調節剤を比較的高いレベルで産生するように修飾することができる。他方、工学操作された分子は大腸菌のような原核細胞内で発現させることができる。いずれの産生源を使用しようと、分画、クロマトグラフィーまたはその他の精製方法のような通常の生化学方法と従来の製剤化技術を用いて、産物を分離し次いで送達可能な組成物に製剤化することができる。
【0078】
従って、本発明のもう1つの局面は、脊椎動物の抗原提示細胞の表面に免疫抑制因子をエンドサイトーシスによって提示するための免疫調節剤を製造する方法を含み、この方法は、
a.適切な宿主細胞を、少なくとも1つのFcレセプターリガンド及び少なくとも1つの免疫抑制因子を含むホリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチド分子で形質転換またはトランスフェクトすること、
b.形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、前記細胞が組換えポリヌクレオチド分子を発現して、免疫調節剤の少なくとも一部分を含む前記ポリペプチドを産生させる条件下で培養すること、 並びに
c.前記免疫調節剤を回収すること、から成る工程を含む。
【0079】
同様に、本発明のもう1つの局面は、ポリペプチドであって、少なくとも1つのFcレセプターリガンドと少なくとも1つの免疫抑制因子を含むポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド分子を含むトランスフェクトまたは形質転換された細胞を含む。
【0080】
前記の局面のどちらにおいても、好ましくは、免疫抑制因子は、1つまたはそれ以上の天然自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストに相当し、Fcレセプターリガンドは好ましくは免疫グロブリンの定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。さらに好ましくは、免疫調節剤は、少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)がT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストで置換されている、ポリペプチドまたはキメラ抗体を含む。
【0081】
本発明のキメラ抗体、ポリペプチド及びその他の構築物は単独でまたは医薬組成物として投与できることがさらに認められよう。端的には、本発明の医薬組成物は、本明細書で記載した1つまたはそれ以上の免疫調節剤を1つまたはそれ以上の医薬的にまたは生理学的に許容性のある担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含むことができる。そのような組成物は、中性の緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等のような緩衝液、グルコース、マンノース、ショ糖またはデキストランのような炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸、抗酸化剤、EDTAのようなキレート剤又はグルタチオン、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)及び保存剤を含むことができる。その上、前述のように、好ましい実施態様は、同時刺激性分子を誘導可能なアジュバントを含まない医薬的に許容性のある担体を含む。しかし、本発明の医薬組成物は、例えばサイトカイン様B−インターフェロンのような1つまたはそれ以上の追加活性成分を含有することもできる。
【0082】
この点に関して、本発明のさらなる局面は、脊椎動物の抗原提示細胞の表面に免疫抑制因子をエンドサイトーシスによって提示するための医薬組成物を含み、前記組成物は少なくとも1つの免疫調節剤と医薬的に許容性のある担体とを含んでおり、前記の少なくとも1つの免疫調節剤は少なくとも1つのFcレセプターリガンドと少なくとも1つの免疫抑制因子とを含む。同様に、本発明は免疫疾患を治療する医薬組成物の製造方法を含み、前記方法は少なくとも1つのFcレセプターリガンドと少なくとも1つの免疫抑制因子とを含む少なくとも1つの免疫調節剤を生理学的に許容性のある担体または希釈剤と組み合わせることを含む。これらの局面のどちらにおいても、免疫抑制因子は、1つまたはそれ以上の天然自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストを含み、且つ前記Fcレセプターリガンドは免疫グロブリンの定常領域ドメインの少なくとも一部を含むことができる。好ましくは、前記免疫調節剤は組換えポリペプチドまたはキメラ抗体の形態である。
【0083】
前述するように、キメラ抗体を含む免疫調節剤は本発明の特に好ましい局面である。そのような抗体は、典型的にはペプチドTCRアンタゴニストまたはアゴニストである免疫抑制因子を、1つまたはそれ以上の相補性決定領域(CDR)の少なくとも一部分と置換することによって形成することができる。以下の実施例でさらに詳細に記載されるように、H鎖をコードするヌクレオチド配列を工学操作して少なくとも1つのCDRの全部または一部を自己抗原の全部または一部であるペプチドまたはペプチド類似体で置換することができる。適当な細胞系で発現されると、組換えH鎖は野生型L鎖と複合体を形成して、2つの免疫抑制因子をディスプレイする免疫反応性四量体を形成することができる。当業者は、有害な免疫応答(即ち、ヒトの抗マウス応答)の発生を最小限にするために、免疫グロブリン分子は治療を受ける種から選択できることを認めるであろう。選択した免疫グロブリンの定常領域は本質的に修飾されていないため、この形態の免疫調節剤は容易にエンドサイトーシスを受けて、関連免疫抑制因子の効果的な提示を可能にする。
【0084】
他の形態では、本発明の免疫調節剤は、抗原が免疫抑制因子である抗原−抗体複合体を含むことができる。近代免疫学的技術を使用して、好ましくはモノクローナル抗体である所望の抗体を産生且つ精製できることが認められよう。単なる例として、選択されたペプチドアンタゴニスト(即ち、ペプチド自己抗原の類似体)またはアゴニストをマウスに注射して免疫反応性細胞を生じることができ、前記細胞はその後標準的な方法を用いて収集且つ不死化することができる。所望するならば、マウスモノクローナルは従来の組換え方法を使用して「ヒト化」して、患者に有害な免疫応答を誘発しないヒト免疫グロブリン上に小さなマウス可変領域を発現させることができる。いずれにしても、モノクローナル抗体は免疫抑制因子と複合体を形成して所望の免疫調節剤を形成し、その後、前述のように製剤化且つ投与することができる。FcRリガンドを形成する無傷の定常領域を用いると、ファゴサイトーシスの生起は比較的急速であり、さらに結合した免疫抑制因子の提示の効率が良いはずである。
【0085】
実施態様は定常領域全体に相当するFcレセプターリガンドを含むことができるが、本発明は、投与された免疫調節剤が無傷の免疫グロブリン定常領域を含むことを必要としないことを強調しなければならない。むしろ、FcRと結合してエンドサイトーシスを受けることができる任意のFcRリガンドを、選択した免疫抑制因子と組み合わせて使用することができる。詳細には、定常領域の単一ドメインまたはそれらのフラグメントをペプチドアンタゴニストと組み合わせて、本明細書の教示に従って免疫系を抑制し得る単量体ポリペプチド(単一アミノ酸鎖を有する)を形成することができる。最小量の有効なFcRリガンド及び/または免疫抑制因子を有し、はるかに安定であるために送達を促進させ、おそらく生物利用効率を高めることができるような融合タンパク質を構築することができる。さらに、これらの工学操作したポリペプチドまたはタンパク質は、異種の全抗体を投与するときに見られるような免疫応答を誘発することなく、長期間投与することができると思われる。このため、比較的小さなキメラポリペプチドが有効な免疫調節剤であることが証明されるであろう。
【0086】
同様に、非ペプチド分子実体は、効率の良いFcRリガンド、免疫抑制因子、または組み合わせることにより免疫調節剤であることが証明されるであろう。当業者は、選択された役割(即ち、FcRリガンド)で有効に機能する分子実体(ペプチド性または非ペプチド性)が、リコンビナントケミストリー、定方向進化、ラショナルドラッグデザインのような現行の方法を用いて提供できることを認めるであろう。例えば、ラショナルドラッグデザインを使用して、既に解明されているFcレセプターと有効に結合する非ペプチド小分子実体を作ることが可能であり得る。次いで、誘導されたFcRリガンドをペプチドアンタゴニストのような免疫抑制因子と共有結合させ(またはそうでない場合、可逆的に会合させ)て、特別な安定性または他の望ましい形質を示す免疫調節剤を提供することができる。
【0087】
既述のように、本発明の免疫調節剤または融合タンパク質は固定化あるいは凝集されて、Fcレセプターの架橋に便利な構築物または構造体を生じたり、及び/またはIL−10及びIL−6のような抗炎症性サイトカインの産生を誘導することができる。凝集または固定化構築物が完全形態であることは重要ではなく、本発明との関連においては開示された免疫調節剤の任意の形態も包含される。この点に関しては、凝集または固定化構築物は可溶性または不溶性であり、さらに専ら薬剤から構成され、あるいは薬剤と会合する担体、基質、構造体または微粒子を含むことができる。例えば、開示された薬剤は、任意の生物学的適合性のある物質を含む微細粒子担体と会合または複合体形成するか、あるいは比較的持続性の長い脂質またはポリマー基質中に包埋または吸着することができる。当業者には、多数の商業的に利用可能な構造体及び生物学的構築物を会合する関連方法があることが認められるであろう。そのため、代表的な微細粒子担体は、タンパク質、多糖類、脂質、または合成及び天然ポリマーを含むことができる。
【0088】
特に好ましい実施態様では、複合体化された薬剤は、当該分野に公知の技術を用いて凝集される。その他の方法では、凝集物は、熱、化学的架橋または、硫酸アンモニウム沈降法のような沈降を用いて形成することができる。生成される凝集物は、可溶性、不溶性、あるいはその混合物であり得る。そのβプリーツシート構造のために、免疫グロブリンの変性は、分子内というよりはむしろ分子間相互作用に有利な疎水基を露出することはさらに認められるであろう。これらの分子間相互作用が凝集を促進する。例えば、免疫グロブリン(即ち、免疫調節剤)を63℃で15分加熱すると、免疫複合体に類似する多数の生物学的特性を有する可溶性凝集物の形成を導出する。そのような凝集物または構築物は、所望する免疫応答をそれを必要とする患者において提供するために特に有効である。
【0089】
特定の理論によって制限されることは望まないが、凝集または固定化することによって免疫調節剤はオプソニン化抗原を模擬することができると思われる。典型的には、標的細胞は、オプソニン化粒子を効率良く消化して、生物学的応答修飾因子を分泌して、適切に炎症応答を増強あるいはダウンレギュレートする。凝集または固定化薬剤の場合、構築物は、初期感染に対する炎症応答が鎮静される免疫応答後期を模擬するように作用すると思われる。即ち、凝集または固定化免疫調節剤は、免疫活性細胞を「ごまかして」、感染因子が排除され、従って保護的免疫応答がもはや必要ではないと考えさせる。さらに詳細には、活性化されたAPCは、活性T細胞をダウンレギュレートするIL−10及びIL−6のような生物学的応答修飾因子を分泌する。本明細書に説明するように、IL−10産生は、自己免疫疾患に関連する複数のT細胞特異的エピトープの活性を阻害し(即ち、IL−10はバイスタンダー抑制を供与する)、さらに自己免疫疾患の症状を改善する。その上、免疫調節剤は、投与される対象においてIFNγレベルを低下させることができる。本発明と関連する場合、そのような生物学的応答修飾因子の分泌は、対象の自己免疫疾患の原因である自己反応性T細胞をダウンレギュレートするために作用する。
【0090】
前記のように、本発明の組成物は、Th1/Th2発生経路に関与するサイトカインを含む生物学的応答修飾因子の誘導を提供し、さらにAPCとして機能できる細胞によって産生されることが公知である。この点では、Th1/Th2発生に関与すると思われるサイトカインは、IL−4、IL−12、及びIL−10を含む。単球によって産生され、IL−4合成を誘導すると思われるIL−6は、Th2 T細胞の発生に関与する。IL−10は単球によって産生され、MHCクラスII発現を明らかにダウンレギュレートし、且つ同時刺激性分子のアップレギュレーションを阻害することによって、APC依存性T細胞活性化を阻害する機能を有する。同時刺激性分子がそのレベルが低下しているか、あるいは存在しないAPCによる抗原の提示は末梢性寛容を刺激する。便利なことには、本発明は、これら及びその他の有利な生物学的応答修飾因子の選択的な刺激を可能にする。
【0091】
さらに詳細には、以下の実施例XXVII及びXXVIIIに説明するように、凝集性免疫調節剤は、EAEマウスにおいて症状を改善するために使用することができ(実施例XXVII)、さらに活性化細胞において選択された生物学的応答修飾因子の産生を誘導できる(実施例XXVIII)。これに関しては、図25が、凝集性構築物の投与によってEAEマウスにおける疾患の臨床的徴候が劇的に減少することを示す。後の実施例では、マクロファージ、樹状細胞及びB細胞を精製し、凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートして、IL−6及びIL―10の産生について試験した。図26A及び26Bに示す結果は、マクロファージはIL−6及びIL−10のどちらも産生するが、樹状細胞はIL−10のみを産生することを示す。凝集性免疫調節剤で刺激される場合、B細胞はどちらのサイトカインも産生しないと思われる。
【0092】
当業者は、IL−10が抗増殖性サイトカインであり、その他のサイトカインの産生を阻害することが公知であることを認めるであろう。Ig−PLP1(特に凝集性Ig−PLP1)を結合し、次いでIL−10を産生するAPCは、少なくとも2つの方法でT細胞−APC相互作用を影響できる。第一に、IL−10はクラスII分子の発現及び同時刺激性分子のアップレギュレーションを阻害することはどちらも公知である(Steinbrinkら、J. Immunol.、 159:4772〜4780、1997; Dingら、J. Immunol.、 151:1224〜1234、1993;Willemsら、Eur. J. Immunol.、24:1007〜1009、1994;Mooreら、Annu. Rev. Immunol.、 19:683〜765、 2001;Peguet−Navarroら、J. Immunol.、 24:884〜891、1994、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。その上、IL−10は、T細胞活性化に必要なサイトカインの合成を阻害することができる。前記例はさらに、処理されたAPCがTh2型細胞の発生を有利にすることが公知のサイトカインであるIL−6を産生できることを示す。免疫調節剤の結合時にAPCによって産生されたIL−6は、T細胞−APC相互作用を有利に影響して、T細胞の調節を誘導することができることが認められるに違いない。さらに、TGFβがAPCによって産生されると、これはまたT細胞に対して調節効果を及ぼすことができる。これに関して、凝集性または固定化免疫調節剤は、抗炎症性サイトカイン産生の誘導に特に有効であり得る。
【0093】
事実、実施例XXIX及びXXXIVに示すように、凝集性免疫調節剤はEAEの治療に特に有効である。実施例XXX及びXXXIに示すように、凝集性免疫調節剤はFcγR1レセプターを架橋することによってIL−10産生を誘導する。凝集性免疫調節剤はまた、IFNγレベルを低下させる(実施例XXXII)。さらに、IL−10は、末梢性寛容と相乗して、自己免疫反応に関与するT細胞の活性を低下させる(実施例XXXIII)。実施例XXXVに実証されるように、凝集性免疫調節剤への応答において産生されるIL−10は、マクロファージ上の同時刺激性分子をダウンレギュレートする。凝集免疫グロブリンはまた、バイスタンダー抑制を介して、自己免疫疾患に関与する複数の抗原に特異的なT細胞の活性を抑制することができる。(実施例XXXVI及びXXXVII)。
【0094】
特定の理論によって制限されることは望まないが、固定化または凝集性免疫調節剤はFcγレセプターを架橋し、さらにIL−10の産生を誘導する。IL−10はIFNγ産生の低下を誘導する。さらに、IL−10はAPCの表面上の同時刺激性分子をダウンレギュレートして、それによって末梢性寛容を誘導する。IL−10はまたバイスタンダー抑制を生じ、それによって自己免疫疾患に関与する複数の抗原に対するT細胞の活性を低下させる。このことは、IL−10のインビボ中和によって保護効果が取り消されることを実証する実施例XXXIIIにおいて直接支持される。
【0095】
要約すると、固定化または凝集性免疫調節剤による処置は、病原性T細胞活性を直接的あるいは間接的にダウンレギュレートできるIL―10を含む可溶性媒介物質のAPCによる産生を誘導し、MHCクラスII分子及び同時刺激性分子の発現をダウンレギュレートするか、あるいはIFNγレベルを低下させることによりAPCの機能を抑制でき、同時刺激性分子が存在しないか、あるいはそのレベルが低下しているノンプロフェッショナルAPCによる治療用エピトープの提示を誘導でき、抗原活性化細胞死またはアネルギーを誘導する。さらに、固定化または凝集性免疫調節剤は、末梢性寛容及び/またはバイスタンダー抑制を刺激することができる。総じて、これらの効果は、病原性T細胞の発生の予防、T細胞機能を病原性から非病原性状態に転換する、疾患を抑制するT細胞の産生、及び病原性T細胞の排除として説明できる。これは、本明細書の教示に従って、自己免疫疾患の予防、安定化、または寛解を導くことができる。
【0096】
いずれの形態の免疫調節剤を選択するにしても、本発明の組成物は所望する安定性を提供し、且つ選択する投与形態を容易にするために製剤化することができる。例えば、組成物は、経口、経膣、経耳、経鼻、経肺、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋肉内投与を含むがこれらに限定されない従来の全ての経路を使用して投与することができる。本発明の他の実施態様の範囲内で、本明細書に記載した組成物は徐放性インプラントの一部として投与することができる。さらに他の実施態様の範囲内で、本発明の組成物は、安定性が強化する適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物または噴霧乾燥製剤として製剤化することができる。これらの好ましい製剤は、次に乾燥粉末吸入器を用いて、担体または噴霧剤と組み合わせる場合は、計量式吸入器、ネブライザー、アトマイザー、噴霧瓶またはドロッパーから投与できる。
【0097】
本発明は、ダウンレギュレーションを受ける免疫系を含む任意の脊椎動物の治療に有用である。本発明は、細胞免疫応答を有する哺乳動物のような脊椎動物において特に有用である。好ましい実施態様では、治療対象となる脊椎動物は新生児または乳児の状態である。
【0098】
この点に関して、本発明のさらなる局面では、免疫調節剤を生理学的に許容性のある担体または希釈剤と組み合わせて含む治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む免疫疾患の治療方法が含まれ、ここで前記免疫調節剤は少なくとも1つのFcレセプターリガンド及び少なくとも一つの免疫抑制因子を含む。この局面では、免疫抑制因子はT細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストを含み、Fcレセプターリガンドは免疫グロブリン定常領域ドメインの少なくとも一部を含むことができる。先に言及したように、免疫調節剤は、好ましくは組換えポリペプチドまたはキメラ抗体の形態である。前記方法は、自己免疫疾患、アレルギー応答及び移植片拒絶反応を含む免疫疾患を治療するために使用することができ、そして多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される自己免疫疾患の治療に特に有用である。
【0099】
前述のように、本発明の組成物、化合物及び方法は、新生児または乳児哺乳動物において寛容を誘導し、それによって将来の自己免疫を予防するかまたは低下させるのに特に有用である。「乳児」の用語は、本明細書で使用する際は、免疫系が末だ十分には成熟していない誕生後の生活期間中のヒトまたは非ヒト哺乳動物を言及する。ヒトでは、この期間は誕生から約9カ月齢までであり、一方マウスでは、この期間は誕生から約4週齢までである。「新生」及び「新生児」の用語は、本質的に正に生まれたばかりの乳児哺乳動物のサブセットを意味する。本発明による「乳児」に関連した他の特徴には、(i)高ゾーン寛容になりやすい(T細胞前駆体の欠失/アネルギー、アポトーシス傾向の増大)、(ii)Th2バイアスヘルパー応答(新生児T細胞の表現型特徴、新生児T細胞でのCD40L発現の低下)、(iii)細胞性応答の低下(機能性T細胞数の減少、抗原提示細胞機能の低下)、及び(iv)体液応答の低下及び型の限定(IgMhIgh、IgDlow、B細胞の優勢、ThとB細胞間の協力の低下)を有する免疫応答が含まれる。本発明の具体的な非限定的実施態様では、開示された免疫調節剤は、母親の抗体が検出可能な量で未だ存在している乳児哺乳動物に投与することができる。関連実施態様では、所望のT細胞寛容を胎児に生じさせるように、開示された組成物を妊娠母親に接種することができる。いずれにしても、誘導されたT細胞寛容は、投与された免疫調節剤に関連する自己免疫疾患の後の発症に抵抗性を付与することができる。
【0100】
対象が乳児であるかそれとも成体であるかに関係なく、本発明の医薬組成物を、治療(または予防)する疾病に適する方法で投与することができる。投与量及び回数は、患者の状態並びに患者の疾病の型及び重篤度のような要素によって決定される。本発明の特に好ましい実施態様の範囲内で、本明細書に記載した医薬組成物は、適当な投与量を臨床試験で決定することができるが、1mg〜50mg/kgまでの範囲の用量で投与してもよい。当業者は、MRIまたは臨床悪化の徴候によって治療有効性について患者をモニターできることを認めるであろう。
【0101】
投与後に、免疫調節剤は少なくとも1つの型の抗原提示細胞表面に存在する1つまたはそれ以上のFcレセプターと結合すると考えられる。当業者は、FcRリガンドの選択が、免疫調節剤を細胞内に取り込むためにどのクラスのFcレセプターを使用するのかを、少なくともある程度まで、決定することを認めるであろう。即ち、IgG定常領域に相当するFcRリガンドはIgE定常領域に相当するFcRリガンドとは異なるクラスのFcレセプターによって結合される。さらに、異なるクラスのFcレセプターが異なる型の抗原提示細胞上に発現されるので、選択されたAPC上に免疫抑制因子を提示することが可能である。例えば、IgG定常領域に相当するFcRリガンドは、マクロファージまたは好中球によってエンドサイトーシスを受け、それに応じて提示されると思われる。これは、ある種のAPCは種々のタイプの抗原を提示するのに一層効果的であり、その抗原が次にどのT細胞を活性化するのかに影響を与え得るという点で興味深い。
【0102】
いずれにしても、免疫調節剤全体がAPCによるレセプター介在性エンドサイトーシスを受け、そして通常はクラスリン被覆小胞内に局在化する。細胞内取り込み後、免疫調節剤は最終的にAPC表面に提示されるようにプロセシングされる。プロセシングは一般的に、酸性pHと、プロテアーゼを含む選択された酵素を含む細胞小器官であるリソソームへの、免疫調節剤の小胞輸送を伴う。ここで免疫調節剤は消化されて、本発明の目的ではタンパク質、ポリペプチド、あるいはペプチドの形態であり得る遊離免疫抑制因子を生じる。放出された免疫抑制因子が自己抗原性ポリペプチドまたはタンパク質、あるいはそのフラグメントを含む場合、前記因子はさらに消化されて、1またはそれ以上のT細胞レセプターアゴニストを生じると考えられる。ペプチドがアンタゴニストまたはアゴニスト(免疫調節剤の一部として直接投与されるか、あるいは投与された自己抗原性ポリペプチドに由来する)のいずれであっても、提示されたペプチドの平均長は、例えば、5〜30アミノ酸程度である。消化後、免疫抑制因子フラグメントを含む免疫調節剤フラグメントのうち少なくとも一部はエキソサイトーシス用小胞内でMHC分子と会合する。MHC−免疫抑制因子複合体は、次にAPC表面まで輸送され、ヘルパーT細胞に提示される。
【0103】
前記に指摘のように、本発明の好ましい実施態様では、クラスII MHC分子と協同して提示される免疫抑制因子としてTCRアンタゴニストを使用する。従って、以下の考察の目的では、(ペプチド類似体であり得る)そのようなアンタゴニストが使用される。しかしながら、本発明は、免疫応答をダウンレギュレートする任意の免疫抑制因子をレセプター介在性エンドサイトーシスで提示するために使用できることを強調しなければならない。このため、所望する免疫原性応答の低下を提供するT細胞レセプターアゴニストを免疫抑制因子として使用することができ、そしてこのようなアゴニストは本発明の範囲内である。さらに、既に示したように、提示されたアゴニスト(または複数可)は、免疫抑制因子として直接的に投与されるか、または1またはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む免疫抑制因子から得てもよい。
【0104】
即ち、選択された実施態様では、投与される免疫抑制因子は、FcRリガンドからのエンドサイトーシスによる分離後に実質的にプロセシングされずに、MHC複合体と協同して提示されるアゴニストペプチドであり得る。その他の実施態様では、免疫抑制因子は好ましくは少なくとも1つの自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。そのような場合、免疫抑制因子は、典型的にはFcRリガンドから切断された後、プロセシング(消化)を受け、1またはそれ以上のペプチドアゴニストを生じ、それが次に本明細書の教示に従って、MHCクラスII分子と協同して提示される。他の場合は、T細胞レセプターに対する適切なアゴニストの効率の良い提示を利用して免疫応答をダウンレギュレートすることができる。
【0105】
従って、単なる例として、T細胞をミエリン塩基性タンパク質のフラグメントに相当するペプチドアゴニストに予め感作させることができる。多発性硬化症では、この自己アゴニストが連続的に提示され、それによってミエリン鞘の構成成分に向けた免疫応答が活性化される。さらに詳細には、感作された個々のT細胞は、提示された自己アゴニストと選択的に結合して細胞にシグナル伝達する数千ものレセプターを発現する。十分なレセプターが結合されると、感作T細胞は応答を生じさせるように働き、即ち、インターロイキンを分泌する。TCRアンタゴニストがMHCクラスII分子と協同して提示される場合、T細胞は提示された複合体を認識するが活性化はされない。
【0106】
従って、本発明によれば、免疫抑制因子(即ち、アンタゴニスト)をエンドサイトーシスによって効率良く提示すると、レセプターに対する競合によってアゴニスト−TCR結合が阻害される。即ち、提示されたTCRアンタゴニストは感作T細胞のTCRと効果的に結合し、それによって提示された自己抗原またはそのフラグメントの結合を妨げる。しかし、免疫抑制因子−TCR複合体は、自己抗原−TCR複合体とは異なって、応答を生じさせるようにはT細胞にシグナル伝達を行わない。従って、免疫抑制因子(非反応性アゴニストまたはアンタゴニスト)の結合は、T細胞が十分な自己抗原と結合して、細胞が作用するように誘導する活性化レベルのしきい値に達するのを妨げることができる。それ故、天然のアゴニストを含む、連続提示されている自己抗原に対する有害な免疫応答は回避される。
【0107】
他方、FcR介在によるアゴニストの効率の良い提示は、本明細書の教示に従って哺乳動物の免疫応答をダウンレギュレートするために使用できる。これに関しては、最終的に提示されるアゴニスト(複数でもよい)は、免疫抑制因子として直接的に投与されるか、またはエンドサイトーシスによってタンパク質分解される自己抗原性ポリペプチド免疫抑制因子から得てもよい。特定の理論によって制限されることは望まないが、自己抗原性アゴニストは、同時刺激性分子を欠如する、あるいは低レベルの同時刺激性分子を有するノンプロフェッショナル及び/または非活性化APCによって提示され得ると考えられる。前述のように、このタイプの提示が最終的にT細胞の不活性化を誘導することが驚くべきことにも見出された。特に、以下に説明するように、本発明の免疫調節剤は、IL−10の産生を誘導し、IFNγレベルを低下させ、さらに末梢性寛容及び/またはバイスタンダー抑制を刺激する。そのような実施態様では、免疫調節剤構築物は、同時刺激性分子の活性化及び/産生を最小限に抑えるか、あるいは排除するためにアジュバントを含まない小胞中に投与されることが好ましい。本発明のこの局面に関する特に好ましい実施態様は、1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む免疫抑制因子を包含することができる。例えば、本実施態様による構築物は、少なくとも1つのCDR領域が少なくとも部分的にPLPからのペプチドアゴニストで置換されている融合またはキメラIgGを含み得る。そのような構築物は、アジュバントを含まない医薬的に有効な担体中で治療有効量を投与されると、多発性硬化症に関連する少なくともいくつかの症状を改善することができるはずである。多発性硬化症治療用のその他の有効な構築物は、自己抗原性タンパク質MBP及びPLPを含む免疫抑制因子に共有結合されているIgGのFc領域を含む融合ポリペプチドを含んでいることがある。これらの構築物はさらにアジュバントを含まない担体中で投与されてもよい。
【0108】
1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントの投与は典型的に、APCの表面における1つ以上のペプチドアゴニストのエンドサイトーシスによる効果的な提示を起こすことであろうことが認められよう。即ち、投与された自己抗原性ポリペプチド(複数でもよい)は、エンドサイトーシスによりタンパク質分解されて、いくつかの異なるペプチドアゴニストを生じ、これらが同時に提示されると思われる。複数アゴニストのそのような提示は、エピトープの拡散と集団の多様性に関連する困難についての解決を提供する。この点に関しては、自己免疫疾患は1つまたはそれ以上のポリペプチド上にある1つ以上の自己抗原性エピトープに起因するであろうことが認められるべきである。同様に、対象集団内の別々の個体が1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド上の別々のエピトープに対する自己免疫を発生することがあり得る。しかし、前述のように、本発明は、1つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントを投与することにより、正常エンドサイトーシスによるプロセシング後に、APC表面上に複数のアゴニストペプチドの提示を起こすことによって、極めて巧妙にそのような困難を回避することができる。即ち、全てのペプチドアゴニストを、本明細書に開示される組成物と技術を使用して、効率的に提示することができる。そのようなアゴニストの提示は、本発明が提供するようなFcR介在による効率的な取り込みなしには達成できないと思われることを強調するべきである。さらに詳細には、天然自己抗原性ポリペプチド(即ち、FcRリガンドを含まない)または遊離アゴニストペプチドのカクテルの単純な投与によっては治療有効レベルのアゴニストの提示を達成できるとは思われない。そのような組成物が効率良く細胞内に取り込まれて、投与されたアゴニストの提示が治療有効量になることは疑わしい。逆に、本発明は比較的低用量で所望するアゴニストの有効な提示を提供する。
【0109】
さらに、以下に説明するように、本発明の免疫調節剤は、バイスタンダー抑制を刺激する。特定の理論によって制限されることは望まないが、本発明の免疫調節剤を取り込んだAPCによって分泌されるIL−10は、免疫調節剤に含まれる抗原以外の抗原に対する特異性を有する近隣T細胞による免疫応答を低下させることができると思われる。
【0110】
以下の非限定例の呈示は、本発明の原理をさらに説明するのに役立つであろう。この点に関して、以下の考察及び実施例を通して使用する略号と対応する定義の一覧を示す。
MBP:ミエリン塩基性タンパク質、多発性硬化症の病因に関係している。
PLP:プロテオリピドタンパク質、多発性硬化症の病因に関係している。
PLP1:アミノ酸残基139〜151を含むPLPのペプチドフラグメント。
PLP−LR:PLP1のペプチド類似体、PLP1パルス細胞を活性化しない。
PLP2:アミノ酸残基178〜151を含むPLPのペプチドフラグメント。
Ig−W:Balb/cg2b定常領域と結合した抗アルソン酸塩(anti−arsonate)抗体91A3のH鎖可変領域及び親の91A3κL鎖を含むIg構築物(本明細書ではコントロールとして使用されている)。
Ig−PLP1:H鎖CDR3がPLPのアミノ酸残基139〜151で置換されたことを除いてIg−Wと同一の構築物。
Ig−PLP−LR:H鎖CDR3がPLPのアミノ酸残基139〜151のペプチド類似体で置換されたことを除いてIg−Wと同一の構築物。
Ig−HA:(本明細書ではコントロールとして使用されている)H鎖CDR3がインフルエンザウイルスHAのアミノ酸残基110〜120で置換されたことを除いてIg−Wと同一の構築物。
PPD:精製タンパク質誘導体、コントロールアクチベーターとして使用される全結核菌(Mycobacterium tubercuolosis)抽出物。
【0111】
明白な実施上及び道徳上の理由により、多数の疾病に関する実験的組成物または方法の有効性を決定するヒトでの初期研究は実行できない。それ故、医薬品の初期開発中には、安全性及び費用の理由により適当な動物モデルを使用することが標準的な方法である。実験動物モデルの実行で成功するという根拠は、主要抗原決定基が異なる宿主種でしばしば活性であるという理解に基づいている。従って、1つの種、例えば、齧歯類またはブタにおいて有効な自己免疫の治療法は、ヒトのような異なる種においても有効である。適当な動物モデルが十分に開発された後でのみ、ヒトにおけるワクチンの安全性及び有効性をさらに証明するヒトでの臨床試験が実施される。従って、限定の目的ではなく説明の目的として、本発明は主として、哺乳類宿主としてのマウスに関する例で証明される。当業者は、本発明をヒト及び家畜動物を含む他の哺乳類宿主で実施できることを認めるであろう。
【0112】
この点に関して、MSの動物モデルとして使用される実験的脳脊髄炎(EAE)は、PLP及びミエリン塩基性タンパク質(MBP)のようなミエリン自己抗原を用いてマウスの感受性系で誘導することができる。これらタンパク質の脳炎誘発活性は、インビボでクラスII制限脳炎誘発性T細胞を誘導し、そして結果としてEAEを誘導するペプチドの存在と相関している。PLPのアミノ酸残基139〜151に相当するペプチド(PLP1)はH−2s SJLマウスにおいて脳炎誘発性であり、PLP1に特異的なT細胞系はEAEをナイーブ動物に伝達する。ヒトMSでの標的抗原(複数でもよい)は未だ議論の余地があるが、ミエリンタンパク質に特異的なT細胞の頻度は正常な対象よりMS患者の方が多い。それらのミエリン反応性T細胞のサイレンシングは、MSを回復するための論理的な方法であると思われる。このため、このモデルを使用して本発明の利点を証明する。
【0113】
実施例 I
ペプチドの調製
本出願においては、アミノ酸は標準的な3文字または1文字コードで呼称される。他に特定しない限り、アミノ酸はL型が意図されている。1文字コードを使用するとき、大文字はL型を示し、そして小文字はD型を示す。1文字コードは次の通りである。A、アラニン;C、システイン;D、アスパラギン酸;E、グルタミン酸;F、フェニルアラニン;G、グリシン;H、ヒスチジン;I、イソロイシン;K、リジン;L、ロイシン;M、メチオニン;N、アスパラギン;P、プロリン;Q、グルタミン;R、アルギニン;S、セリン;T、スレオニン;V、バリン;W、トリプトファン;及びY、チロシン。
【0114】
以下の実施例で使用するペプチドは全て、Research Genetic,Inc.(Huntsville、 Alabama)で固相法を使用して製造され、そして従来の方法を使用してHPLCカラムで90%以上の純度まで精製された。PLP1ペプチド(HSLGKWLGHPNKF:配列番号1)は、天然プロテオリピドタンパク質のアミノ酸残基139〜151に相当する脳炎誘発配列を包含している。PLP−LR(HSLGKLLGRPNKF:配列番号2)はPLP1の類似体であり、Trp 144とHis 147がそれぞれLeuとArg(下線表示)で置換されていた。PLP1とPLP−LRはI−ASクラスII分子(即ち、マウスの特定の系で産生されるMHCクラスII構造)と良く結合する。PLP2ペプチド(NTWTTCQSIAFPSK:配列番号3)はPLPのアミノ酸残基178〜191に相当する脳炎誘発配列を包含している。このペプチドもI−ASクラスII分子と結合してSJLマウスでEAEを誘導する。HAペプチド(配列表示なし)はインフルエンザウイルスのヘマグルチニンのアミノ酸残基110〜120に相当する。HAはI−EDクラスII分子と結合してここではコントロールペプチドとして使用される。
【0115】
実施例 II
外因性ペプチドを含むマウスキメラ免疫グロブリンの産生
Ig−PLP1及びIg−PLP−LRと命名され、図1に概略的に示す2つの免疫グロブリン−ペプチドキメラを実施例 Iに説明するように構築して、ペプチドPLP1及びPLP−LRを発現させた。どちらも、H鎖CDR3ループを欠失し、選択したペプチドをコードするヌクレオチド配列で置換された。従来のDNA配列決定分析法によって、ペプチドヌクレオチド配列が正しい読み枠に挿入されていることが示された。
【0116】
これらのキメラを構築するために使用した遺伝子には、Gillianら、Cell.33:717、1983、によって記載されたBALBK IgG2b定常領域をコードする遺伝子、Ruthbanら、J.Mol.Bio.、202:383〜398、1988、によって記載された91A3H鎖可変領域をコードする遺伝子、及びGaryら、Proc.Natl.Acad.Sci.、84:1085〜1089、1987、によって記載された全91A3κL鎖をコードする遺伝子が含まれる(これら文献は全て本明細書に参照により編入する)。H鎖CDR3領域を欠失させそしてPLP1及びPLP−LRをコードするヌクレオチド配列で置換する方法は、PR8インフルエンザAウイルスの核タンパク質のアミノ酸残基147〜161に相当するCTLエピトープを有するキメラであるIg−NPの産生についてZaghouaniら、J.Immunol.148:3604〜3609、1992、(本明細書に参照により編入されている)によって記載された方法と同様である。同一の参照文献が、91A3 IgGのCDR3がペプチド発現に適合しており、また天然セグメントの代わりにグラフトされたときに、クラスI及びクラスII制限エピトープがどちらも効率良くプロセシングされてT細胞に提示されたことを報告している。
【0117】
端的には、91A3VH遺伝子をpUC19プラスミドのEcoRI部位にサブクローン化して、PCR変異誘発反応で鋳型DNAとして使用して、CDR3の代わりにPLP1(91A3VH−PLP1)及びPLP−LR(91A3VH−PLP−LR)配列を有する91A3VHフラグメントを生成した。ヌクレオチド配列決定分析によって、PLP1及びPLP−LRの全配列が正しい読み枠に挿入されていることが示された(表示なし)。91A3VH−PLP1及び91A3VH−PLP−LRフラグメントを次に、それぞれpSv2−gpt−91A3VH−PLP1−Cg2b及びpSv2−gpt−91A3VH−PLP1−LR−Cg2bプラスミドを発生させる、Balb/cg2bの定常領域をコードするエキソンの前にあるpSv2−gpt−Cg2bのEcoRI部位にサブクローンした。これらのプラズミドを次に別々に非Ig産生SP2/0B骨髄腫細胞中に親の91A3L鎖である、pSV2−neo−91A3Lを有する発現ベクターと共にコトランスフェクト(同時形質移入)した。Igキメラを産生するトランスフェクタントはゲネチシン及びミコフェノール酸の存在下で選択した。トランスフェクタントを限界希釈法によりクローン化して、最終クローンは1〜4μg/mLのIg−PLP1またはIg−PLP−LR(まとめてIg−PLPキメラと称する)を分泌した。選択した細胞系はIg−PLP1−9B11及びIg−PLP−LR−21A10と命名され、本発明者の実験室で継代培養して永久保存している。
【0118】
キメラ及び野生型抗体もコントロールとして使用した。例えば、Ig−HAは、Dセグメントの代わりに、CDR3内部に挿入されたペプチドだけがIg−PLP1及びIg−PLP−LRと異なっている、インフルエンザウイルスHAから得られたHA110−120Tヘルパーエピトープを有しているIgG分子である。Ig−Wは、修飾されていない(野生型)91A3VH遺伝子産物、即ち、Balb/cg2b定常領域及び91A3κL鎖である。それ故、これは、親のDセグメントを含むCDR3領域がIg−PLP1及びIg−PLP−LRと異なっている。つまり、Ig−PLP2は、H鎖CDR3ループ内にPLPのアミノ酸残基178〜191を有するキメラ抗体である。従来のクローン化、配列決定、及び精製方法を使用して適当な細胞系を作成した。これらの方法はZaghouaniら(前記引用)によって記載された方法及びIg−HAを産生させるために先に使用した方法(Zaghouaniら、Science.259:224〜227、1993(本明細書に参照によりまた編入されている)と同様である。
【0119】
トランスフェクタントの大規模培養は10%の鉄濃縮子牛血清(Intergen、New York)を含有するDMEM培地中で実施した。Ig−PLPキメラは、ラット抗マウス κ鎖mAbをCNBr活性化セファロース4B(Pharmacia)に結合させたカラムの培養上清から精製した。ラット抗マウス κ鎖mAb(RAM187.1またはATCC番号、HB−58)及びマウス抗ラット κL鎖mAb(MAR18.5またはATCC番号、TIB 216)はATCCから調達した。これらのハイブリドーマは大規模にまで増殖させ、そして互いに培養上清から精製した。ラット抗マウスκmAbを使用してカラムを調製し、そしてこのカラムでIg−PLPキメラを培養上清から精製した。交差汚染を避けるために、別々のカラムを使用して個々のキメラを精製した。
【0120】
実施例 III
プロテオリピドタンパク質の精製
天然プロテオリピドタンパク質またはPLPは、Leesら、Preparation of Proteolipids、Research Methods in Neurochemistry(神経化学研究方法−プロテオリピドの調製方法)、N.Marks及びR.Rodnight編、Plunemum Press、New York、 1978 (本明細書に参照により編入している)によって先に記載された方法に従ってラット脳から精製した。
【0121】
端的には、脳組織は2/1(v/v)のクロロホルム/メタノール中でホモジナイズし、さらに焼結ガラス漏斗でろ過して可溶性の粗脂質抽出物を分離した。PLPを次にアセトンで沈殿させ、ペレットをクロロホルム/メタノール/酢酸の混合物中に再溶解し、さらにLH−20−100セファデックスカラム(Sigma)を通過させて残留脂質を除去した。溶出物からのクロロホルムの除去とPLPからアポタンパク質体への転換は、穏やかな窒素流下で水を徐々に添加して同時に実施した。その後、水に対する十分な透析を実施して、残留酢酸及びメタノールを除去した。
【0122】
実施例 IV
ウサギ抗ペプチド抗体の産生
実施例Iで調製したPLP1及びPLP−LRペプチドを、Zaghouaniら、Proc.Natl.Acad.Sci USA. 88:5645〜5649、1991(本明細書に参照により編入している)に記載されるようにKLH及びBSAと結合させた。ニュージーランドシロウサギはMyrtle’s Rabbitry(Thompson Station、 TN)から購入した。これらのウサギは、1mgのペプチド−KLH複合体を含有する完全フロイントアジュバント(CFA)で免疫し、そして1mgの複合体を含有する不完全フロイントアジュバント(IFA)で、高い抗体力価に達するまで毎月チャレンジ(攻撃誘発)した。ペプチド−BSA複合体はセファロースと結合させ、ウサギ抗血清から抗ペプチド抗体を精製するために使用した。
【0123】
実施例 V
ウサギ抗ペプチド抗体の特徴づけ
捕獲ラジオイムノアッセイ(RIA)を使用し、実施例IIに説明するように製造したIg−PLP1及びIg−PLP−LRを用いて、IgG分子上のPLP1及びPLP−LRペプチドの発現を評価した。
【0124】
マイクロタイター96ウエルプレートは、実施例IVで製造したウサギ抗ペプチド抗体(5μg/mL)を用いて4℃で一晩コートし、さらに2%のBSA含有PBSを用いて室温で1時間ブロックした。これらのプレートを次にPBSで3回洗浄し、そして段階的に変化する量のIg−PLP1及びIg−PLP−LRを添加し、そして室温で2時間インキュベートした。PBSで3回洗浄後、捕獲されたIg−PLP1及びIg−PLP−LRは、プレートに100×103cpmの125I標識ラット抗マウス κmAbを加えて37℃で2時間インキュベートして検出した。プレートを次にPBSで5回洗浄してから、LKBガンマカウンターでカウントした。27mg/mLのキメラで得られた三重測定の平均値±SDが示される。
【0125】
図2に示すように、合成PLP1及びPLP−LRペプチドに対するウサギ抗体は、実施例IIで製造されたキメラ抗体Ig−PLP1及びIg−PLP−LRを認識した。さらに詳細には、Ig−PLP1及びIg−PLP−LRは、ウサギ抗PLP1でコートしたプレート上でインキュベートしたとき、有意量で捕獲され、また標識ラット抗マウスκ鎖mAbと結合した(図2A)。同様に、Ig−PLP1及びIg−PLP−LRはどちらもウサギ抗PLP−LRによって捕獲された(図2B)。逆に、Ig−W、即ち、外因性ペプチドを有していない野生型91A3マウス抗体及びIgMコントロール抗体(表示なし)、はウサギ抗体との有意な結合を示さなかった。Ig−PLP1は、Ig−PLP−LRよりも抗PLP1及び抗PLP−LRの両方と良く結合し、構造の違いがウサギ抗体に対するペプチドのアクセス可能性に影響を与えることを示した。さらに、図2に示された結果は、キメラでペプチドが発現しても、ウサギ抗体はH鎖上のPLPペプチドと結合し、標識ラット抗マウスκはL鎖に結合するために、H鎖とL鎖の対合を改変しなかったことを示している。
【0126】
実施例 VI
抗原特異的T細胞系増殖アッセイ
PLP1特異的T細胞ハイブリドーマ5B6及び4E3並びにIL−2依存性HT−2 Tヘルパー細胞は、Eunice Kennedy Shriver Center、Waltham、 MAから得た。5B6及び4E3 T細胞は、Kuchrooら、J.Immunol.153:3326〜3336、1994(本明細書に参照により編入している)によって報告されているように、I−ASクラスII MHCと会合したペプチドPLP1を認識し、これと共にインキュベートしたとき、IL−2を産生する。逆に、Kuchrooらは、PLP1で刺激して、さらにその後PLP−LRで刺激したとき、5B6及び4E3細胞は最早どちらもIL−2を産生しないことを報告している。同様に、PLP−LRの存在下でT細胞ハイブリドーマをPLP1で刺激すると明らかにIL−2産生を阻害する。
【0127】
Kuchrooらと実質的に同一の技術を使用して、種々のアゴニストに対するT細胞ハイブリドーマの活性化を次のようにして実施した。SJLマウス由来の照射(3,000ラド)脾細胞をこの実施例用の抗原提示細胞(APC)として使用した。照射脾細胞は、96ウェルの丸底プレート(5×105細胞/ウェル/50mL)中で、段階的に変化する濃度の抗原(100mL/ウェル)を加えてインキュベートした。1時間後、T細胞ハイブリドーマ、即ち、5B6または4E3(5×104細胞/ウェル/50 mL)を添加して培養を一晩継続した。T細胞の活性化(即ち増殖)は培養上清中におけるIL−2の産生を測定することにより評価した。これはIL−2依存性HT−2細胞を用いる3H−チミジン取り込みによって実施された。即ち、IL−2が存在する(即ち、活性化したT細胞によって分泌される)と、HT−2細胞は増殖し、周囲培地から標識チミジンを取り込む。
【0128】
これらのアッセイを実施するために用いた培養用培地は10%FBS、0.05mM 2−メルカプトエタノール、2mMグルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム及び50mg/mL硫酸ゲンタマイシンを補充したDMEMであった。端的には、培養上清(100 mL/ウェル)は96ウェルの平底プレート中で、HT−2細胞(1×104細胞/ウェル/100 mL)を加えて24時間インキュベートした。その後1ウェル当たり1mCiの3H−チミジンを添加し、さらに12〜14時間培養を続けた。細胞を次にガラスファイバーフィルター上に収集して、取り込まれなかった3H−チミジンを洗い流した。次に、トレース96プログラム及びInotech bカウンターを使用して取り込まれたチミジンをカウントした。IL−2(活性化T細胞ハイブリドーマ細胞株によって分泌された)レベルがより高いウェルはより高レベルのHT−2細胞増殖を誘導し、3H−チミジン取り込み値の増加を記録することが認められよう。
【0129】
2種の異なるT細胞系を使用した前述のアッセイの結果を図3に示す。詳細には、T細胞ハイブリドーマ4E3(図3A)及び5B6(図3B)はIg−PLP1、PLP1及び天然PLPを加えて予めインキュベートしたAPCによって刺激した後、IL−2をかなりの量産生した。ネガティブコントロールであるIg−W、Ig−HA及びPLP2ペプチドはT細胞によるIL−2の産生を誘導しなかった。同様に、Ig−PLP−LR及びPLP−LRペプチドはどちらも5B6及び4E3を刺激せず、有意量のIL−2を産生しなかった。PLP−LRペプチドはIL−2産生を刺激するというよりはむしろ無効にすることが知られているので、前記した最後の結果は予期されないことでない。抗原濃度はIg−PLP1、Ig−PLP−LR、Ig−HA及びIg−Wについては0.1mM、PLP1及びPLP2ペプチドについては1mM、そしてPLPについては1.7mMであった。各値は三重複ウエルの平均値±SDを表す。
【0130】
これらの結果は、Ig−PLP1が活性化を伝導する様式でT細胞ハイブリドーマに提示されたことを示している。立体障害は抗体全体がMHC構造及びTCRに同時・直接的に結合することを妨げるように思われる。T細胞は可溶性タンパク質とは反応しないので、PLP1ペプチドはエンドサイトーシスによるプロセシングによってIgから遊離され、さらにMHCクラスII I−AS分子と結合したと思われる。従って、PLP1ペプチドの隣接領域はIg−PLP1のエンドサイトーシスによるプロセシング、またはPLP1ペプチドとMHCクラスII構造との結合に干渉しないと思われる。
【0131】
実施例 VII
PLP1ペプチドのIg−PLP1を介するT細胞への提示
自然発生免疫疾患においては、自己抗原の暴露及び連続的なエンドサイトーシスによる提示によってかなりのレベルのMHC−自己抗原複合体が生じると思われる。現在、多数の免疫疾患にはこの連続的な提示を再現する有効なインビトロモデルが存在せず、有効な治療法の開発に重大な障害となっている。比較的効率の悪い細胞内取り込みメカニズムまたは先に考察した遊離ペプチドに関する限界のため、所望の刺激を供与するためには比較的高レベルの天然抗原が必要である。従って、本発明の1つの局面は、アゴニストリガンドをエンドサイトーシスによって連続的に提示するインビトロモデルを提供することである。
【0132】
さらに詳細には、本発明は、
a)Fcレセプターを発現する複数の抗原提示細胞を含む培地を用意し、そして
b)前記培地を、免疫調節剤組成物であって少なくとも1つのFcレセプターリガンド及び少なくとも1つの免疫抑制因子を有している免疫調節剤並びに適合性のある担体を含む組成物と組み合わせる、
工程を含む、T細胞アンタゴニストをインビトロエンドサイトーシスによって効果的に提示する方法を提供する。
【0133】
好ましくは、免疫抑制因子は少なくとも1つのT細胞レセプターアンタゴニストであり、そしてFcレセプターリガンドは免疫グロブリン定常領域ドメインの少なくとも一部分である。さらに、本発明の好ましい局面では、免疫調節剤は組換えポリペプチドまたはキメラ抗体を含む。
【0134】
この点に関して、Ig−PLP1(または任意の免疫グロブリン会合アゴニスト)は、免疫系を研究するためのインビトロ系を提供するために、エンドサイトーシス経路で効率的に機能し、さらに高レベルのアゴニストリガンドを生じさせ得るペプチド送達系を確立する目的で使用することができる。特に、開示した系は、自己抗原のインビボ提示と同様の状況における拮抗作用を研究するために使用することができる。
【0135】
抗原の連続的なエンドサイトーシスによる提示を模擬するために免疫グロブリン会合アゴニストが使用できることを証明するために、T細胞活性化アッセイを遊離PLP1ペプチド、天然PLP及びIg−PLP1を使用して実施した。これらのアッセイの結果を図4に示す。
【0136】
詳細には、異なる濃度の3つの抗原(即ち、アゴニスト)に照射SJL/J脾細胞を加えてインキュベートし、その後4E3 T細胞ハイブリドーマと会合させた。IL−2産生は、実施例VIに説明したように、IL−2依存性HT−2細胞を用いて3H−チミジン取り込みによって測定した。各点は三重測定の平均値を表す。標準偏差は平均値の10%を超えなかった。
【0137】
図4は、最大活性値は3種のアゴニスト間で様々であったが、T細胞を刺激するのに必要な値は遊離PLP1または天然PLPのいずれよりもIg−PLP1の方がはるかに低かったことを示している。即ち、細胞系を刺激するには、天然PLPまたは遊離ペプチドのどちらよりもIg−PLP1の方が実質的に少量を要した(1/100程度)。詳細には、最大値の半分まで刺激するためには、Ig−PLP1(0.005 mM)はPLP(0.5 mM)またはPLP1ペプチド(0.6 mM)と比べて少量を必要とするのみであった。これらの結果は、PLP1 T細胞エプトープが天然PLPまたは合成PLP1ペプチドよりも、Ig−PLP1によってより良く提示されることを示している。IL−2産生のプラトーは、T細胞アクチベーターが遊離PLP1合成ペプチドであるときの方がより高かったが、これはインビボで長期間にわたって得ることは困難と思われるような実質的により高値のアゴニストを必要とする。
【0138】
いかなる方法によっても本発明を限定するものではないが、ペプチド送達におけるIg−PLP1の効力はFcR介在性細胞内取り込み及び新たに合成されたMHC分子へのアクセス性に関係していると思われる。さらに詳細には、天然PLPはむしろ効果的ではない単純な流体相ピノサイトーシスによる細胞内取り込みを行い、一方遊離PLP1ペプチドは細胞表面の空MHCクラスII分子と単純に結合するだけであるように思われる。これらの形態による自己抗原の無効な提示は図4で明らかに示されており、これはMHCクラスII分子と組み合わせてPLP1ペプチドを提示するには、Ig−PLP1の方が遊離ペプチドまたは天然タンパク質よりも効率が良いことを明白に示している。
【0139】
実施例 VIII
インビトロにおけるT細胞活性化の阻害
Ig−PLP1−LRによるPLP1、PLP及びIg−PLP1 T細胞活性化の拮抗作用をプレパルス増殖アッセイを使用して検出した。
【0140】
照射(3,000ラド)SJL脾細胞(APCとして使用)は、選択したアゴニスト(1mM PLP1ペプチド、0.05 mM Ig−PLP1または7 mM PLP)及び種々の濃度のアンタゴニスト(100 mL/ウェル)を加えて96ウェルの丸底プレート(5×105細胞/ウェル/50 mL)中で1時間インキュベートした。次に、4E3T細胞ハイブリドーマ(5×104細胞/ウェル/50 mL)を添加し、そして培養を一晩継続した。HT−2細胞を用いて実施例VIと同様に測定した上清中のIL−2産生をT細胞活性化の尺度として使用した。このアッセイの結果を図5に示す。
【0141】
さらに詳細には、図5A、5B及び5Cはそれぞれ、遊離PLP1ペプチド(5A)、Ig−PLP1キメラ免疫グロブリン(5B)及び天然PLP(5C)の拮抗作用を示す。アンタゴニストはIg−PLP−LR(□)及びPLP−LR(○)であり、コントロールはIg−W(◇)及びPLP2(△)であった。
【0142】
アゴニストを加えるがアンタゴニストを使用しないでAPCをインキュベートしたときに得られたcpm値をコントロールチミジン取り込みとして使用した。この値はIg−PLP1では7,503±1,302、PLP1ペプチドでは31,089±3,860、そしてPLPでは8,268±915であった。APCをアゴニストもアンタゴニストも加えずにインキュベートしたときに得られたcpm値はバックグランド(BG)として使用した。この値はIg−PLP1では1,560±323、PLP1ペプチドでは2,574±290、そしてPLPでは2,127±177であった。コントロールに対するチミジン取り込みパーセントは次のようにして計算した。[(試験アンタゴニストの存在下で得られたcpm)−(BG)]/[(cpmコントロールチミジン取り込み値)−(BG)]。各点は三重測定の平均値を表す。
【0143】
前記で考察したように、Ig−PLP1キメラのMHCクラスII分子へのペプチド負荷能力は、抗原の連続的な供給によってしばしばT細胞を攻撃的にトリガできる自己ペプチドを豊富に産生させるインビボ自己免疫環境に似ていると思われる。図5A(PLP1アゴニスト)は、T細胞にPLP1及びIg−PLP−LRの両方が存在する状態でAPCを加えてインキュベートしたとき、Ig−PLP−LR濃度が上昇するに従いIL−2産生がかなり減少したことを示している。PLP1ペプチドによるT細胞活性化中に合成PLP−LRペプチドを使用したとき、IL−2産生の減少が同様に明白であった。逆に、コントロールIg−W免疫グロブリン及びPLP2ペプチドでは拮抗作用効果は観察されなかった。IL−2産生の最大値の50%阻害(コントロールに対して60%のチミジン取り込み)には、PLP−LRペプチドでは9mMであるのに対してIg−PLP−LRでは0.4mMしか必要でなく、Ig−PLP−LRがはるかに効率の良い提示及びT細胞拮抗作用を示す。
【0144】
T細胞拮抗作用においてキメラ免疫グロブリンが遊離ペプチドよりも効率が良いというさらなる証拠は図5B及び5Cに示されている。詳細には、図5Bは、Ig−PLP−LRはIg−PLP1によって介在されるT細胞活性化を阻害したが、遊離PLP−LRは、ネガティブコントロールPLP2ペプチドと同様に、有意な拮抗作用を全く示さなかったことを示している。意義深いことに、図5Bはまた、Ig−W、即ち外因性ペプチドを有していない野生型91A3免疫グロブリン、がIg−PLP介在性T細胞活性化で部分的な阻害活性を呈することも示している。これは、Ig−PLP1とIg−Wがどちらも同一のIgG2定常領域を共有しているため、APC上でのFcR結合に対する競合の結果であると考えられる。IL−2産生の50%阻害の最大値は、Ig−PLP1によるT細胞の活性化がIg−Wの存在下で行われたときに見られた。従って、Ig−WはFcR結合及び細胞内取り込みについてIg−PLP1と競合し、それによってT細胞の活性化を低下させると思われる。即ち、Ig−Wの濃度が土昇するに従い、FcRと結合してAPCによって細胞内に取り込まれるIg−PLP1は少なくなり、その結果、提示及びこれに対応するIL−2産生が減少することになる。応答におけるこのIg−W介在性の減少は拮抗効果の結果ではなくて、むしろ単にFcR結合に対する競合の結果であることに注目することが重要である。即ち、提示されたIg−WエピトープはPLP1に対するTCRアンタゴニストではなく、PLP1特異的TCRとは相互作用しない。
【0145】
図5Bとは対照的に、図5CはIg−WではなくてIg−PLP−LRが天然PLPによるT細胞の活性化を有意に低下させることを示している。Ig−Wは天然PLPと異なる様式で細胞内に取り込まれるらしく(Fcレセプターに対して、単純な流体相ピノサイトーシス)、取り込み及びプロセシングについて直接的な競合は全くないので阻害もないはずである。
【0146】
便宜上の目的で、図5に示した結果をすぐ下の表1にまとめる。APCをIg−PLP−LRの存在下でPLP1ペプチドを加えてインキュベートしたとき、PLP1特異的T細胞ハイブリドーマは活性化されなかった(図5a)。さらに、天然PLP及びIg−PLP1によるT細胞の活性化を種々の濃度のIg−PLP−LRの存在下で実施したとき、IL−2産生(即ち、T細胞活性化)はIg−PLP−LRの増加につれて減少した。しかしなから、遊離PLP−LRペプチドは、天然PLPまたはIg−PLP1によって介在されるT細胞活性化を阻害できなかった。これらの2つの系列の証拠によって、T細胞のIg−PLP−LR介在性不活性化の主要なメカニズムは、細胞表面上でのMHCクラスII分子の直接的な遮断というよりはむしろエンドサイトーシスによる提示とTCR拮抗作用であることが示唆される。
【0147】
以下の表で、プラスの記号はIL−2産生の阻害し、従って拮抗作用があることを示し、マイナスの記号はIL−2産生を殆どまたは全く阻害せず、従って拮抗作用が殆どまたは全くないことを示す。
【0148】
【表1】
【0149】
前述の実施例の結果は、ペプチドアンタゴニストのFcR介在性取り込み及びそれに続くプロセシングが抗原提示細胞による効率的な提示と矛盾しないことを示している。これは、遊離ペプチド類似体が送達されると、MHCまたはTCR結合部位についての直接的な競合によって効率的な拮抗作用が提供されると考えられた先行技術からは全く予期されていなかったことである。
【0150】
実施例 IX
Ig−PLP−LRによる拮抗作用のメカニズムの特徴づけ
実施例VIIIで実施したアッセイと同様のアッセイを用いて、Fcレセプターとの直接的な結合についての競合は、それ自体、Ig−PLP−LR介在性拮抗作用のメカニズムではないであろうことが証明された。
【0151】
SJL脾臓APCを、2mMのIg−PLP2、Ig−PLP−LRまたはIg−Wの存在下で天然PLP(6.8mM)を加えてインキュベートし、そして前記実施例のようにHT−2細胞を用いて3H−チミジン取り込みによってIL−2産生をアッセイした。Ig−PLP2は実施例Iに詳記した配列を用いて実施例IIのように調製した。コントロールに対するチミジン取り込み%は実施例VIIIと同様に計算した。アッセイの結果を図6に示す。図6の各欄は三重測定の平均値±SDを表す。
【0152】
図5Bに示した結果と同様に、本実施例はMHCクラスII構造上での効率の良い提示及び有効なペプチド類似体の両方によって最も顕著な結果がもたらされるという見解を支持している。即ち、例えIg−PLP2キメラ抗体が取り込まれてプロセシングされたとしても、これが天然PLPアゴニストの類似体ではないため、I−ASによるPLP2ペプチドの効率的な提示はT細胞の活性化を妨げない。従って、抗原提示細胞上におけるMHCクラスII分子との単純な競合結合では所望の拮抗作用を生じさせないと思われる。
【0153】
実施例 X
PLP1に対するT細胞応答のインビボ誘導
この実施例によって、本発明のキメラ抗体は、インビトロでのT細胞応答を生じさせる(実施例VII)ことに加えて、インビボで細胞応答を生じさせるために使用できることが証明された。詳細には、次の実施例はIg−PLP1によるPLP1特異的T細胞のインビボ感作を実証する。
【0154】
6〜8週齢のSJLマウス(H−2S)をHarlan Sprague Dawley(Frederick、 MD)から購入し、実験期間は動物施設で飼育した。
【0155】
マウスは、1:1(v/v)のPBS/CFA混合物200mL中で乳化した50mgのIg−PLP1を使用して足蹠並びに肢基部及び尾に皮下免疫した。10日後、頸部脱臼によってマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節(腋窩、鼠蹊部、膝窩及び仙骨)を切除し、単一細胞懸濁液を調製し、T細胞応答を分析した。図7に示した結果は、4×105リンパ節細胞/ウェル(7A)及び10×105脾細胞/ウェル(7B)で得られたものである。アクチベーター PLP1及びPLP2は15mg/mLで使用し、そしてPPDは5mg/mLで使用した。
【0156】
先の実施例と同様に、T細胞活性化は3H−チミジン取り込みを含む増殖アッセイを使用してモニタした。ここでは、リンパ節及び脾細胞は、それぞれ4及び10×105個の細胞/100mL/ウェルで、96ウェル丸底プレート内において、単一の選択したアクチベーター100mLを加えてに3日間インキュベートした。その後1ウェル当たり1mCiの3H−チミジンを添加し、さらに12〜14時間培養を続けた。細胞を次にグラスファイバーフィルター上に収集して、取り込まれた3H−チミジンはトレース96プログラム及びInotechβカウンターを使用してカウントした。刺激剤を有していないコントロール培地を各マウスについて含み、バックグランドとして使用した。
【0157】
図7に示した各値は実施例VIIIに説明するように計算され、アクチベーターを含まない培地で得られたバックグランドcpmを差し引いた後の三重測定の平均値±SDを表す。マウス当たり150mgのIg−PLPでマウスを免疫したときに、同様の結果が得られた(表示なし)。
【0158】
図7A及び7Bは、Ig−PLP1を足蹠並びに肢基部及び尾に皮下注射したとき、PLP1ペプチドに対する強く特異的なT細胞応答が誘導されたことを明らかに示している。反応の強さに関しては個々のマウス間で幾らか変動があったが、各マウスのリンパ節及び脾細胞はPLP1ペプチドによるチャレンジの際に顕著な応答を生じた。興味深いことに、全身性抗原を主としてろ過しそして応答する臓器である脾臓において顕著なPLP1特異的応答が検出されている。これらの結果を説明するために提案できる1つの可能性は、Ig−PLP1は半減期が長いために、循環してリンパ及び血液循環の両方に到達して、その結果全身及びリンパの両部位で提示される可能性があったことである。これは自己免疫疾患の治療法を実施する際に非常に有益な可能性がある。マウスのなかには、細胞をPLP2ペプチドによってインビトロ刺激すると増殖を示すものがあることも興味深かった。おそらく、このペプチドがI−AS様PLP1によって提示されるという事実によって、親和性の低い細胞が結合して応答を生じさせることが可能である。いずれにしても、その結果は、Ig−PLP1が効率良くペプチドをT細胞にインビトロ提示することを示す前記実施例によって示された結果と一致していた。
【0159】
実施例 XI
PLP1に対するT細胞応答のインビボ阻害
先の実施例に見られるように、Ig−PLP1はインビボでT細胞を感作することができ、アゴニストPLP1ペプチドに暴露されたとき強力な免疫応答を生じる。本実施例では、ペプチドアンタゴニストをキメラ抗体免疫調節剤の形態で投与するとアゴニストリガンドのエンドサイトーシスによる提示によって生じる免疫応答を実質的に低下できることが証明される。具体的には、この実施例はIg−PLP−LRをIg−PLP1と同時投与することによってPLP1ペプチドに対する免疫応答が顕著に減少することを証明する。
【0160】
マウスは、50mgのIg−PLP1と150mgのIg−PLP−LR、または50mgのIg−PLP1と150mgのIg−Wのいずれかの混合物で同時免疫した。特に、3つの群(4マウス/群)の個々のマウスに、50mgのIg−PLP1と150mgのIg−PLP−LRの混合物、50mgのIg−PLP1と150mgのIg−Wの混合物、あるいはIg−PLP1と100mg のPLP−LRペプチドの混合物のうちの1つを含有する200mLの混合物(PBS/CFA、1:1 v/v)を用いて実施例 Xと同様に皮下注射した。脾臓及びリンパ節T細胞応答は、実施例 Xに記載したプロトコルを用いて免疫後10日目に分析した。リンパ節細胞は4×105細胞/ウェルで、脾細胞は10×105細胞/ウェルでアッセイした。アゴニストリガンドは15mg/mLのPLP1であった。それぞれ図8A及び8Bに示され以下の表2に要約されたリンパ節及び脾細胞に関する結果は、アゴニストを含有しない培地で得られたバックグランドcpmを差し引いた後の三重測定の平均値±SDを表す。
【0161】
図8A及び8Bは、Ig−PLP1が効率的に提示され、強いインビボT細胞応答を誘導した(実施例X)が、マウスに投与した混合物中にIg−PLP−LRを含むことによってそのような応答に拮抗作用することが可能であったことを示す。実際、マウスにIg−PLP1とIg−PLP−LRを同時投与したとき、それに引き続いて生じる遊離PLP1ペプチドに対する免疫応答は図8A及び8Bの右半分に示したように顕著に減少した。Ig−PLP1と野生型抗体であるIg−Wとの同時投与がT細胞応答を有意に低下させなかったので、脾臓及びリンパ節の両組織のPLP1応答の低さはPLP−LR拮抗作用の結果であったと思われる。これらの結果は、細胞応答低下の原因は、Ig−PLP−LRのFcR結合とエンドサイトーシスによるプロセシングを介するPLP−LRの効率的なインビボ提示であることを強く示している。
【0162】
さらに、すぐ下の表2に示されるように、遊離PLP−LRペプチドとIg−PLP1を同時投与したとき、PLP1応答が減少した徴候はなかった。この表に示した数値はPPD特異的増殖に対するPLP1特異的増殖のパーセント値を表しており、以下ようにして得られた。(PLP1刺激で得られた三重測定の平均値(cpm)−三重測定BGの平均値(cpm))/(PPDで得られた三重測定の平均値(cpm)−三重測定BGの平均値(cpm))×100。
【0163】
【表2】
【0164】
前記の結果は明らかに、遊離アンタゴニストペプチド、またはアンタゴニストペプチドを欠損するコントロールIg−Wとの同時投与は、発生する免疫応答を殆ど影響しないことを示している。遊離PLP−LRペプチドによる拮抗作用効果の欠如は、マウスは遊離ペプチド形態のPLP−LRをIg−PLP−LR形態のものより約34倍多く投与された(150,000Dの分子量に基づくと、マウスに投与された150μgのIg−PLP−LRは2nMのPLP−LRペプチドを含有する1nMのIgに相当し、一方100μgの遊離PLP−LRペプチドは、分子量が1,468ダルトンであるので、68nMのペプチドに相当する)ので、注射ペプチドの正味量がより少ないためではなかった。Ig−PLP1 T細胞刺激に拮抗するIg−PLP−LRの潜在能力と合わせても、PLP−LRペプチドがIg−PLP1介在性T細胞活性化を阻害しなかったことは、Ig−PLP−LR介在性インビボ拮抗作用が提示の効率の良さに関連しているであろうという考えを支持している。
【0165】
実施例 XII
エンドサイトーシスによって提示されたアンタゴニストに対するT細胞応答の誘導
先の実施例は、アゴニストリガンドを含むキメラ抗体の投与がインビボで免疫細胞を感作できることを示している。アンタゴニストを含むキメラ抗体の投与が、その後のアゴニストリガンドによるチャレンジに対する応答を低下させ得ることもまた示された。この実施例では、アンタゴニストの効率的な提示は免疫細胞をインビボで感作し、そしてアゴニストペプチドに対するT細胞の反応に影響を与え得る強い応答を生じさせ得ることを証明する。具体的には、Ig−PLP1とIg−PLP−LRを同時に注射したマウスは、PLP−LRに対して比較的高い増殖応答を発生するが、PLP1ペプチドに対しては実際には全く応答を生じない。
【0166】
リンパ節及び脾細胞は、Ig−PLP1とIg−PLP−LRとの同時投与後に実施例Xに先述した方法と同様にして得た。個々のマウスの増殖応答も、15μg/mLの遊離PLP1ペプチドまたはPLP−LRペプチドのどちらかによるインビトロ刺激後に先の実施例に前述した方法を用いて測定した。リンパ節及び脾臓細胞を用いたアッセイの結果をそれぞれ図9A及び9Bに示す。
【0167】
図9から理解されるように、脾臓とリンパ節は共にアンタゴニストPLP−LRに対して応答を生じたが、PLPアゴニストPLP1には応答を生じなかった。Ig−PLP−LRをIg−PLP1と同時投与したとき、Ig−PLP−LRがPLP−LR特異的T細胞を誘導したことを理解すると、これらのPLP−LR特異的T細胞はPLP1特異的T細胞をダウンレギュレートすると推測することができる。逆に、遊離PLP−LRペプチドをIg−PLP1と共に投与したとき、PLP−LR特異的応答の誘導が生じた(表示なし)が、PLP1に対する増殖応答の明白な減少はなかった。従って、本実施例に記載したデータは、アンタゴニストを含むキメラ抗体の使用が、遊離ペプチドアンタゴニストよりも、抗原アゴニストに対する免疫応答を調節するのにははるかに有効であることを証明している。
【0168】
さらに詳細には、先述の実施例から、APC表面でTCRがPLP−LR−I−AS複合体(即ち、MHC−PLP−LR複合体)に結合すると、T細胞を刺激するというよりはむしろこれらに拮抗作用するように思われる。従って、エンドサイトーシス液胞内でのIg−PLP−LRの効率的な提示によって有意なレベルのPLP−LR−AS複合体(アンタゴニスト複合体)が確実に産生されるため、Ig−PLP−LRによる拮抗作用が生じると思われる。細胞表面にある複合体の量はAPCに提供されるIg−PLP−LRの量に比例する。PLP1刺激をIg−PLP−LRの存在下で実施すると、PLP−LR−I−ASとPLP1−I−ASの両方とも所定APCの表面に提示され、そこでIg−PLP−LR濃度が上昇するとPLP−LR−I−AS複合体数がさらに増加する。T細胞が活性化されるためには約3500個のTCRが結合されなければならず、そしてMHCクラスII−ペプチド複合体のうちの所定の複合体が約200個のTCRを連続的に結合することが認められよう。このため、PLP−LR−I−AS複合体によるTCRの結合がアゴニストPLP1−I−ASによる結合に優先するときに、T細胞が拮抗作用されると思われる。総じて、Ig−PLP−LRによってPLP−LRが効率的に負荷されるため、T細胞拮抗作用はPLP−LR−I−AS複合体によるTCRのより頻繁な連続的なトリガによって達成される。即ち、Ig−PLP−LRの効率的な取り込み及びプロセシングは単に、余りにも多くの表面MHC複合体がPLP−LRアンタゴニストを提示するので、PLP1アゴニストリガンドを提示する残りの表面複合体がT細胞を活性化するためのTCR数を結合できないことを意味している。それ故、アンタゴニストが、MHCクラスII−アゴニスト複合体の活性化濃度がAPCに到達しないことが確実な速度で提示されない限り、T細胞は活性化されない。
【0169】
実施例 XIII
Ig−PLPキメラによる免疫に対するリンパ節増殖応答
増殖応答は、個々のIg−PLPキメラまたはIg−PLP1とIg−PLP−LRから成る種々の混合物で免疫したマウスで測定した。マウスに単独で投与したIg−PLP−LRがT細胞を誘導したことが観察され、そしてこれらのT細胞は、Ig−PLP1によって誘導されたT細胞と同様に、PLP1及びPLP−LRペプチドの両方と交差反応した。しかしながら、驚いたことに、応答の交差反応性にも拘わらず、キメラを共に投与したとき、これらは互いに用量依存性拮抗作用を呈示し、その結果両T細胞応答のダウンレギュレーションを起因した。つまり、IG−PLP1またはIG−PLP−LRのどちらかによって誘導された抗原特異的T細胞は、これら細胞をPLP1及びPLP−LRの両方で同時にインビトロ刺激したとき、ペプチド混合物によるダウンレギュレーションに抵抗を示し、有意に増殖した。これらの所見は、アゴニストとアンタゴニストのペプチドのどちらも互いに逆反応を及ぼし、逆平行拮抗作用及びナイーブT細胞のレベルでTCRトリガにストリンジェントな制御があることを示している。
【0170】
前述のように材料を取得してマウスを免疫した。増殖応答は前記実施例VIに先述したようにチミジン取り込みによって測定した。リンパ節及び脾細胞は、Ig−PLP1とIg−PLP−LRの同時投与後に実施例Xに先述した方法と同方法で得た。マウスには、50μgのIg−PLP1(10A)、50μgのIg−PLP−LR(10B)、100μgのPLP1(10C)または100μgのPLP−LR(10D)を含有するCFAを注射して、10日後に、リンパ節細胞を指定の遊離ペプチドでインビトロ刺激した。刺激剤PLP1、PLP−LR及びPLP2は15μg/mLの特定された最適濃度で使用した。
【0171】
図10A〜10Dに示したデータは、PLP1ペプチドと同様に、Ig−PLP1がPLP1ペプチドに対する特異的T細胞応答を誘導することを示した。同様に、PLP−LRペプチドと同様に、Ig−PLP−LRはPLP−LRペプチドに対する特異的T細胞応答を誘導した。Igキメラまたは遊離ペプチドのどちらも、I−ASクラスII分子によって提示されるペプチドであるネガティブコントロールPLP2と有意に反応するT細胞を誘導しなかった。しかしながら、驚いたことに、Ig−PLP1によって誘導される応答はPLP−LRペプチドと交差反応し、一方Ig−PLP−LRによって誘導される応答はPLP1と交差反応した。遊離PLP1または遊離PLP−LRで誘導される応答は交差反応性ではなかった。
【0172】
実施例 XIV
Ig−PLP1とIg−PLP−LRによる同時免疫に対する リンパ節T細胞増殖応答 マウスに指定したキメラを注射して、10日後にリンパ節細胞を遊離ペプチドでインビトロ刺激し、先に詳記した[3H]チミジン取り込みによって増殖アッセイを行った。結果を図11に示す。
【0173】
Igキメラ表示の前の数字はマウス当たりの注射量(μg)を示す。刺激剤は5μg/mLのPPD、15μg/mLのPLP1、PLP−LR及びPLP2であった。刺激剤を加えないでインキュベートした細胞をバックグランド(BG)として使用した。マウスは個別に試験し、そして各刺激剤について三重複ウェルをアッセイした。結果を標準化して個々に固有の変動性を排除するために、本発明者は結果を以下のように算定した相対的増殖として表した:(試験ペプチドの平均値(cpm)−BGの平均値(cpm))/(PPDの平均値(cpm)−BGの平均値(cpm))。表示の相対的増殖は個別に試験した5匹のマウスの平均値±SDを表す。異なるマウス群についてPPD刺激で得られた平均値(cpm)±SDを以下に示す:50μg Ig−PLP1:16,413±1330;50μg Ig−PLP−LR:11,224±3481;50μg Ig−W:11,513±1,572;50μg Ig−PLP1+50μg Ig−PLP−LR:16,817±2,869;50μg Ig−PLP1+150μg Ig−PLP−LR:16,156±2006;50μg Ig−PLP1+150μg Ig−W:11,699±1,142;50μg Ig−PLP−LR+150μg Ig−W:13,435±1,650;50μg Ig−PLP1+50μg Ig−PLP2:10,056±1,407;及び50μg Ig−PLP−LR+50μg Ig−PLP2:10,877±563。斜め格子付き棒及び平行斜線付き棒はそれぞれPLP1及びPLP−LRに対する増殖を示す。PLP2ペプチドに対する増殖は、Ig−PLP2を免疫混合物中に使用した場合を除いてはバックグランドレベルであった。
【0174】
図11に見られるように、Ig−PLP1で免疫したマウス群由来のリンパ節T細胞はPLP1及びPLP−LRに対して同等に良く増殖したが、Ig−Wコントロールは殆ど反応を起こさなかった。驚いたことに、PLP−LR応答はバックグランドレベルであった。従って、Igキメラに対する応答はPLP1及びPLP−LRペプチド間に交差反応性を共有しているが、この混合物は追加応答ではなくてダウンレギュレーションを起こした。事実、これらのデータはIg−PLP1(アゴニスト)とIg−PLP−LR(アンタゴニスト)間に逆平行ダウンレギュレーションがあることを示唆している。50μgの Ig−PLP1と150μgの Ig−PLP−LRの混合物を注射したマウスがPLP1には応答せず、PLP−LRに対してはIg−PLP1のみを注射したマウスで観察された値にまで減少した応答を生じたため、このダウンレギュレーションは用量依存性であると思われた。
【0175】
IG−PLP1とIg−PLP−LR間で観察された逆方向のダウンレギュレーションに対する1つの可能な説明は、クローンの増殖には同種ペプチドによる最適な連続トリガが必要である(即ち、増殖するためには単一のナイーブT細胞上のレセプターの全てまたは大部分が1つの型のペプチドを利用しなければならない)ということである。Ig−PLP1とIg−PLP−LRの混合物に関わる免疫中に生じる可能性がある、TCR接触残基に僅かな差異を有するペプチドでナイーブT細胞を同時刺激すると、T細胞の増殖及びインビトロ増殖を生じさせない。
【0176】
実施例 XV
Ig−PLP1及びIg−PLP−LRで同時免疫したマウスの脾臓増殖T細胞応答
図12に示したように、実施例XIVに記載したマウス由来の脾細胞を、三重複ウェルでPLP1(斜め格子付き棒)及びPLP−LR(平行斜線付き棒)で刺激して、前記のように増殖を測定した。結果は、PPD刺激による脾細胞の増殖が最小であったため、リンパ節T細胞で得られたPPDのcpmを使用して前記のように標準化した。表示した相対的増殖は個別に試験した5匹のマウスの平均値±SDを表す。
【0177】
これらのマウス由来の脾臓T細胞はPLP−LR刺激に応答しなかった。しかしながら、別の群のマウスをIg−PLP−LRで免疫したとき、リンパ節と脾細胞はどちらもPLP1及びPLP−LRペプチドに対して増殖した。脾臓では、増殖応答はリンパ節よりもはるかに低かったが、追加応答は未だ観察されなかった。むしろ、Ig−PLP1とIg−PLP−LR間に逆方向のダウンレギュレーション効果が観察された。Ig−WにIg−PLP1またはIg−PLP−LRのいずれかを加える同時注射はどちらの応答にも影響を与えなかったが、Ig−PLP2とIg−PLP1の同時注射はIg−PLP1で誘導されたT細胞のなかでPLP−LRに対する反応性を増加させた。
【0178】
実施例 XVI
Ig−PLP1及びIg−PLP−LRで同時免疫したマウスの脾細胞によるIL−2産生
Ig−PLP1とIg−PLP−LR間の逆方向のダウンレギュレーションをさらに研究するために、脾臓抗原誘導性サイトカイン応答を、単一のIg−キメラまたは両方のIg−キメラのいずれかで免疫した動物で測定した。図13に示されるように、実施例XIVで説明したマウス由来の脾臓細胞(1×106細胞/ウェル)をPLP1(斜め格子付き棒)及びPLP−LR(平行斜線付き棒)で24時間刺激した。IL−1(13A)、IFNγ(13B)及びIL−4(13C)の産生は以下のように測定した。
【0179】
細胞は、96ウェルの丸底プレートの10×105細胞/100μL/ウェルで100μLの刺激剤を使用して先述のように、24時間インキュベートした。サイトカイン産生は、100μLの培養上清を使用してPharmingenの指示に従ってELISA法で測定した。捕獲抗体はラット抗マウスIL−2、JES6−1A12;ラット抗マウスIL−4、11B11;ラット抗マウスIFNγ、R4−6A2;及びラット抗マウスIL−10、JES5−2A5であった。ビオチン化抗サイトカイン抗体はラット抗マウスIL−2、JES6−5H4;ラット抗マウスIL−4、BVD6−24G2;ラット抗マウスIFNγ、XMG12;及びラット抗マウスIL−10、JES5−16E3であった。OD405は、SOH MAX PROバージョン1.2.0.ソフトウエアを使用してSpec 340カウンター(Molecular Devices)で測定した。標準曲線を作成するために、段階的に変化する量の組換えマウスIL−2、IL−4、IFNγ及びIL−10を全ての実験に含めた。培養上清中のサイトカイン濃度は標準曲線の直線部分から外挿して算定した。刺激剤を加えないでインキュベートした細胞をバックグランド(BG)として使用した。各マウスは各刺激剤について三重複ウエルで個別に試験し、表示値(cpm)はBG値(cpm)を差し引いた後の平均値±SDを表す。IL−10の産生も測定したが、結果はバックグランドレベルであった(表示なし)。
【0180】
PLP1ペプチドによるインビトロ刺激に際して、Ig−PLP1で免疫したマウス由来のT細胞はIL−2、IFNγ及び少量のIL−4を産生した。しかしながら、同一細胞をPLP−LRで刺激すると最小量のIL−2が産生されたが、IFNγまたはIL−4は検出されなかった。Ig−PLP−LRで免疫したマウス由来の脾細胞は、PLP1ペプチドによる刺激によってIL−2を産生したが、IFNγまたはIL−4は全く産生しなかった。さらに、PLP−LRペプチド刺激では最小限のIL−2応答しか生じなかった。等量のIg−PLP1及びIg−PLP−LRで免疫したマウスでは、いずれのペプチドによる刺激の際も、サイトカイン産生は最小限またはバックグランドレベルにまで減少した。Ig−Wとキメラのいずれかによる同時免疫はサイトカイン産生パターンに対して測定可能な効果を及ぼさなかった。動物にIg−PLP−LR:Ig−PLP1=3:1の比率になるようにキメラを投与したとき、脾臓増殖応答及びIL−2産生はバックグランドレベルであったが、PLP−LRペプチドによる刺激の際に有意量のIL−4及びIFNγが産生されたことが明らかであった。従って、過剰Ig−PLP−LRは、PLP−LRが優先する混合によるTCRトリガを導き、サイトカインを産生できる細胞を誘導するが増殖応答は示さない。これらのデータは、Ig−PLP1とIg−PLP−LRは互いに逆の反応を及ぼし合い、両T細胞応答のダウンレギュレーションをもたらすことを示した。
【0181】
実施例 XVII
PLP1とPLP−LRペプチド混合物によるインビトロ刺激時の抗原暴露T細胞の増殖
Ig−PLP1とIg−PLP−LRが、抗原に暴露された交差反応性T細胞レベルで互いに逆の反応を呈することができるか否かを研究するために、マウスをIg−PLP1またはIg−PLP−LR単独で免疫し、そして遊離PLP1とPLP−LRペプチドから成る種々の混合物によるインビトロ刺激時の増殖性T細胞応答を評価した。
【0182】
さらに詳細には、マウス(4匹/群)は、50μgのIg−PLP1(14Aと14B)または50μgのIg−PLP−LR(14Cと14D)を含有するCFAで免疫し、10日後にリンパ節(14Aと14C)及び脾臓(14Bと14D)の細胞を指定のペプチドで刺激して、前記のように[3H]チミジン取り込みについてアッセイした。ペプチド標示の前の数字は、インビトロ刺激に使用した量μg/mLを示す。特異的増殖は、試験サンプルから得た値(cpm)からBG(刺激剤なしで細胞をインキュベートして得た)の平均値(cpm)を差し引いて評価した。表示値(cpm)は個別に試験した4匹のマウスの平均値±SDを表す。NDは測定しなかったことを示す。
【0183】
図14A〜14Dに見られるように、Ig−PLP1またはIg−PLP−LRで免疫したマウス由来のリンパ節と脾の細胞はどちらも、単一のペプチドによる刺激に対してと同様に、PLP1とPLP−LRの混合物に対して同等に増殖した。前記混合物に対する増殖応答は、殆どの場合、単一ペプチドの刺激に対する応答よりもさらに高かった。
【0184】
実施例 XVIII
PLP1 / PLP−LRペプチド混合物による インビトロ刺激時の抗原暴露T細胞によるIL−2産生
Ig−PLP1とIg−PLP−LRが、抗原に暴露された交差反応性T細胞レベルで互いに逆の反応を呈することができるか否かを研究するために、マウスをIg−PLP1またはIg−PLP−LR単独で免疫し、そして遊離PLP1とPLP−LRペプチドから成る種々の混合物によるインビトロ刺激時のサイトカイン応答を評価した。結果を図15Aと15Bに示す。
【0185】
Ig−PLP1(15A)及びIg−PLP−LR(15B)で免疫したマウス由来の脾細胞を指定するペプチドで刺激し、そして実施例XVIのようにELISA法によってIL−2産生について試験した。これらの実験で使用した脾臓細胞は実施例XVIIに記載のマウス由来であった。ペプチドの名称の前の数字は刺激に使用した量μg/mLを表す。表示のμg/mLのIL−2値は個別に試験した4匹のマウスの平均値d:SDを表す。
【0186】
実施例XVIIで示したように、IL−2産生はPLP1とPLP−LRから成る種々の混合物による脾細胞の刺激時には減少しなかった。反対に、ペプチド混合物による刺激の殆どの場合、IL−2産生は単一ペプチドによる刺激よりも多かった。これらの所見は、アゴニストとアンタゴニストのペプチドのどちらも互いに逆の反応を及ぼし、そして逆平行拮抗作用及びナイーブT細胞のレベルでTCRトリガにストリンジェントな制御があることを示している。
【0187】
成体の免疫応答を減弱するために、T細胞レセプターアンタゴニスト及びアゴニストを含む免疫調節剤を使用することに加えて、以下の実施例で証明されるように、好都合にも同一組成物が新生児及び乳児で寛容を誘導するために使用できる。
【0188】
実施例 XIX
出生時にIg−PLP1の注射を受けたSJL/Jマウスは成体期でのEAEの誘導に抵抗性を有する
本発明の組成物を新生児または乳児に接種することの利点を証明するために、本明細書に説明するように新生児マウスに免疫調節剤を投与し、そして自己免疫誘導剤に暴露した。
【0189】
さらに詳細には、新生児マウス(10マウス/群)に、誕生後24時間以内に100μgのアフィニティクロマトグラフィー精製Ig−PLP1またはIg−Wを注射して、7週齢時に遊離PLP1ペプチドでEAEを誘導した。臨床徴候についてマウスを以下のように毎日スコアした。0、臨床徴候なし;1、尾部緊張の喪失;2、後肢弱化;3、後肢麻痺;4、前肢麻痺;及び5、瀕死または死亡。パネルAは全マウスの臨床スコア平均値を示し、パネルBは生存動物についてのみスコア平均値を示す。EAEは足跡並びに肢及び尾基部に、100μgの遊離PLP1ペプチド及び200μgの結核菌(M.tubeeculosis)H37Raを含有する200μLのIFA/PBS(1v/1v)溶液を皮下注射することによって誘導した。6時間後、5×109個の不活性化百日咳菌(B.pertussis)を静脈内投与した。48時間後、さらに5×109個の不活性化百日咳菌をマウスに投与した。
【0190】
図16A及び16Bに見られるように、出生時にIg−PLP1含有生理食塩水を投与された成体マウスは遊離PLP1ペプチドによるEAE誘導に抵抗性を有した。実際、それらのマウスにおいては、PLPペプチドを有さない親の野生型IgであるIg−Wを投与された動物よりも臨床スコアがはるかに低かった。その上、Ig−Wを投与されたマウスとは反対に、Ig−PLP1を注射されたマウスは再発を示さなかった(図16B)。
【0191】
実施例 XX
新生児胸腺及び脾臓抗原提示細胞による Ig−PLP1のインビボ提示
実施例 XIXで観察された臨床結果を確認するために、サイトカイン応答を新生児マウスで測定した。得られたデータを図17示す。
【0192】
詳細には、新生児(5マウス/群)に、誕生後24時間以内に100μgのIg−PLP1またはIg−Wを注射した。2日後マウスを屠殺し、プールした胸腺(17A)及び脾臓(17B)の細胞を照射し、前述のようにPLP1特異的T細胞ハイブリドーマ4E3の刺激用APCとして使用した。T細胞活性化の尺度として使用した上清中のIL−2産生は、IL−2依存性HT−2細胞系を使用して、Kuchrooら、J.Immunol.153:3326、1994、に説明されるように測定した(本明細書に参照により編入している)。表示の値(cpm)は三重測定の平均値±SDを表す。
【0193】
投与されたIg−PLP1は新生児APCによって効率的に提示された。Ig−PLP1を投与された新生児由来の胸腺(17A)及び脾臓(17B)のAPCはどちらも、外因性抗原を追加しなくてもPLP1ペプチドに特異的なT細胞ハイブリドーマを活性化した。Ig−Wを投与された新生児由来のAPCはT細胞ハイブリドーマを活性化できなかった。
【0194】
実施例 XXI
出生時に Ig−PLP1 を投与されたマウスにおける脾臓増殖T細胞応答の低下
先の2つの実施例で観察された結果をさらに確認するために、増殖応答を出生時に免疫調節剤を接種されたマウスで測定した。結果を図18Aと18Bに示す。
【0195】
新生児には、100μgのIg−PLP1またはIg−W含有生理食塩水を誕生後24時間以内に腹腔内(i.p.)に注射した。マウスが7週齢に達したとき、足跡並びに肢及び尾基部の皮下(s.c.)に100μgの遊離PLP1ペプチドを含有する200μLのCFA/PBS(1容量/1容量)で免疫した。10日後マウスを屠殺し、(18A)リンパ節(0.4×106細胞/ウェル)及び(18B)脾臓(1×106細胞/ウェル)の細胞を、PLPの脳炎誘発配列178〜191(13)に相当するネガティブコントロールペプチドである、15μg/mLの遊離PLP1またはPLP2で4日間インビトロ刺激した。1μCi/ウェルの[3H]チミジンを、刺激の最後の14.5時間中に添加し、増殖はInotechγカウンター及びトレース96 Inotechプログラムを使用して測定した。表示の値(cpm)は個別に試験したマウスの三重複試験平均値±SDを表す。Ig−PLP1及びIg−Wを投与された全てのマウスのリンパ節増殖応答の平均値(cpm)±SDはそれぞれ、34,812±7,508及び37,026±10,133であった。脾臓増殖応答平均値はIg−PLP1投与群で3,300±3,400であり、Ig−W投与群では14,892±4,769であった。
【0196】
出生日にIg−PLP1を投与されたマウスは、Ig−Wを注射されたマウスと同様に、これらマウスを遊離PLP1ペプチド(18A)を含有するCFAで免疫したとき、PLP1に対して等価の成体リンパ節T細胞増殖応答を生じた。しかしながら、脾臓増殖応答はIg−PLP1を投与されたマウス(18B)において顕著に減少し、従って寛容の誘導を示した。どの群のマウスも、PLP1と同様に、I−ASクラスII分子によって提示されるネガティブコントロールペプチドであるPLP2に対して有意な増殖応答を示さなかった。
【0197】
実施例 XXII
出生時にIg−PLP1で処理したマウスにおけるリンパ節T細胞逸脱
乳児または新生児における寛容の誘導をさらに証明するために、出生時に免疫調節剤を接種したマウスでサイトカイン応答を測定した。結果を図19A〜19Cに示す。
【0198】
特に、実施例XXIに記載したマウス由来のリンパ節細胞(4×105細胞/ウェル)を、遊離PLP1またはPLP2(15μg/mL)を用いてインビトロで24時間刺激し、そしてIL−2(19A)、IL−4(19B)及びIFNγ(19C)の産生を、Pharmingenの抗サイトカイン抗体対を用いて実施例XVIに説明するようにELISPOTで測定した。表示の値(スポット形成単位)は個別に試験した8匹のマウスの平均値±SDを表す。
【0199】
これらの結果は、サイトカイン産生パターンが新生児マウスの接種によって影響されたことを示す。出生時にIg−Wを投与されたマウス由来のリンパ節細胞は、PLP1刺激すると、IL−2を産生したがIFNγまたはIL−4は産生しなかった。対照的に、Ig−PLP1を投与されたマウス由来の細胞は逸脱し、そして代わりにIL−4を産生した。PLP2ペプチドで刺激してもサイトカイン産生は観察されなかった。
【0200】
実施例 XXIII
出生日にIg−PLP1の注射を受けたマウス由来の脾臓T細胞によるIFNγ産生の低下
実施例XXIIで得られた結果を確認するために、同一マウス由来の脾細胞をサイトカイン応答についてアッセイした。結果を図20Aと20Bに示す。
【0201】
さらに詳細には、前記マウス由来の脾細胞(1×106細胞/ウェル)を、遊離PLP1またはPLP2(15μg/mL)を用いてインビトロで24時間刺激し、上清中のIL−2(20A)、IL−4(20B)及びIFNγ(20C)の産生を、Pharmingen製の抗サイトカイン抗体対を製造者の指示に従って用いてELISA法で測定した(実施例XVI)。表示のサイトカイン量は個々に試験した8匹のマウスの平均値±SDを表す。
【0202】
脾臓では、Ig−Wを接種したマウス由来細胞はIL−2及びIFNγを産生した。逆に、Ig−PLP1の注射を受けたマウス由来の細胞はIL−2を産生したが検出可能なレベルのIFNγは産生しなかった。ネガティブコントロールであるPLP2ペプチドはサイトカイン産生を誘導しなかった。
【0203】
実施例 XXIV
出生時にIg−PLP1の注射を受けたマウスにおける脾臓T細胞増殖のサイトカイン介在性回復
増殖応答が回復可能であることを証明するために、接種された新生児マウス由来の細胞を外因性IFNγに暴露した。結果を図21に示す。
【0204】
特に、出生時に100μgのIg−PLP1を腹腔内注射された新生児群は、実施例XXIのように100μgのPLP1ペプチドを含有するCFAで免疫して、遊離PLP1ペプチド(15μg/mL)による脾細胞(1×106細胞/ウェル)のインビトロ刺激を、100単位のIFNγまたはIL−12を含むことを以外は、実施例XXIに記載したように実施した。各マウスについての表示値(cpm)は三重複ウエルの平均値±SDを表す。
【0205】
驚いたことには、出生時にIg−PLP1を投与されたマウス由来の脾細胞に外因性IFNγを添加すると増殖応答を回復した。IFNγの誘導物質(14)であるIL−12も脾臓細胞増殖応答を回復した。
【0206】
総じて、出生時にIg−PLP1の注射を受けたマウスはリンパ節T細胞逸脱及び異常なIFNγ介在性脾臓アネルギーを発生した。興味深いことに、遊離PLP1ペプチドを用いてこれらのマウスにEAEを誘導したとき、マウスは軽度の単相性疾病を発症したが、再発はなかった。Igは長い半減期を有しているため、Igに基づく免疫調節剤は長期間にわたって存続すると思われ、その結果、従来の抗原を有する不完全フロイントアジュバントを用いた通常の新生児寛容化方法で生じるものと同様な免疫抑制因子の連続的且つ緩慢な放出が生じる可能性がある。従って、Igで送達すると新生児寛容の誘導においてアジュバントの使用が回避できると思われる。さらに、FcRを介する免疫抑制因子の細胞内取り込みとそれに続くエンドサイトーシス経路におけるプロセシングによって、新たに合成されたMHCクラスII分子にアクセスが可能となり、有意量のMHC−免疫抑制因子複合体が産生される。これらの好ましいパラメーター(即ち、FcR介在性APC活性化、緩慢なペプチド放出及び効率の良いペプチド提示)はリンパ節逸脱及び脾臓アネルギーの誘導に寄与すると思われる。本開示による組成物の成体への投与と同様に、アジュバントを使用しない寛容化方法を使用して自己反応性T細胞を沈静化し、自己免疫を予防することができる。
【0207】
実施例 XXV
可溶性Ig−PLP1はEAE罹患マウスにおいて麻痺の重症度を低下させ、さらに臨床的再発を抑制する
遊離PLP1ペプチドでSJL/JマウスにEAEを誘導し、疾患の臨床的徴候が明白になったとき、動物に可溶性Ig−PLP1(可溶性Ig−PLP1)を含有する生理食塩水の注射を3回、4日間隔で行い、疾患重症度の低下について評価した。コントロールマウスには、PLP1ペプチドを含まない親Igである、可溶性Ig−W(可溶性Ig−W)を投与した。6〜8週齢のSJL/Jマウス群に100μgのPLP1ペプチドを用いてEAEを誘導し、次に疾患誘導後9日目、13日目、及び17日目に、500μgの可溶性Ig−PLP1、500μgの可溶性Ig−W、または100μgの遊離PLP1ペプチドを含有するPBSの腹腔内投与を行った。Ig−PLP1の分子量(150kD)及び遊離PLP1の分子量(1.5kD)に基づき、3回の注射中に投与された300μgの遊離PLP1は、約 200nMのPLP1ペプチドに相当し、1500μgの可溶性Ig−PLP1は約 20nMのPLP1ペプチドを包含する。従って、遊離PLP1を処理に使用する場合、マウスは可溶性Ig−PLP1による処理よりも 約10倍多いペプチドを投与された。
【0208】
結果は図22に示す。各点は8匹のマウスの臨床スコア平均値を表す。図22に示す結果は、2つの個別の実験を表示する。
【0209】
図22に示すように、可溶性Ig−Wで処理されたマウスは、麻痺の初期重症フェーズでは最大スコア平均値が3.7 ( 0.5 であり、120日間の試験期間を通して再発を呈した。しかしながら、可溶性Ig−PLP1処理を受けたマウスは、疾患の初期フェーズにおいて麻痺重症度が軽減され、最大スコア平均値が2.5 ( 0.3 (p< 0.005) を示し、42日目までには完全に回復した。遊離PLP1ペプチドの10倍過剰で処理されたマウスは、疾患の初期フェーズで麻痺重症度を若干軽減したが(最大臨床スコア平均値:3.0 ( 0.2)、全く回復することはなく、さらに120日間の全観察期間を通じて再発を起こした(図22)。
【0210】
図22に示すように、罹患マウスへのアジュバントを含まないIg−PLP1キメラの注射はPLP1特異的病原性T細胞を調節して、EAEを改善するために(図22)、Igによるペプチド送達の効力は、同時刺激性分子その発現レベルが最小限であるか、あるいは発現していない末梢APCにまで拡大すると思われる。この結論は、遊離ペプチド形態にある200nMのPLP1では疾患重症度を僅か軽減するのみで、動物が回復しないが、可溶性Ig−PLP1形態にある20nMのペプチドは、疾患初期フェーズの重症度を低下させ、さらにほとんどの動物が42日までに完全に回復したという所見によって支持される(図22)。
【0211】
実施例 XXVI
アゴニストまたはアンタゴニストを含むがアジュバントを含まない可溶性免疫グロブリンの投与は、疾患重症度を低下させ、さらに同時刺激がなくてもペプチ ド提示を生じる
PLP1ペプチドでSJLマウス群にEAEを誘導し、疾患が臨床的に明らかになったとき、動物に可溶性Ig−PLP1または可溶性Ig−PLP−LRを含有する生理食塩水の注射を3回、4日間隔で行って、疾患重症度の低下について評価した。コントロール目的で、ミエリンペプチドを含まない親のIgであるIg−Wを投与されたマウス群を含んだ。
【0212】
SJL/Jマウスの群に、100μgのPLP1ペプチドを含有する200μgの結核菌(Mycobacterium tuberculosis) H37Raを含むPBS/IFA(v/v)の皮下注射によってEAEを誘導した。注射の6時間及び48時間後に、5×109 百日咳菌(Bordetella pertussis)を静脈内投与して、麻痺の徴候について以下のように毎日マウスをスコア付けした:0、臨床徴候なし;1、尾部緊張の喪失;2、後肢弱化;3、後肢麻痺;4、前肢麻痺;及び5、瀕死または死亡。疾患誘導後9日目、13日目、及び17日目に、マウスに500μg 可溶性Ig−PLP1、Ig−PLP−LR、またはIg−Wを含有する500μlPBSを腹腔内投与した。
【0213】
図23に示す結果は、Ig−PLP1及びIg−PLP−LR処理マウスはどちらも疾患の初期ピーク中に臨床的重症度を軽減し、最大スコア平均値は、Ig−W処理マウスの3.7 ( 0.5からIg−PLP−LR及びIg−PLP1処理マウスではそれぞれ 2.9 ( 0.2及び2.4 ( 0.3 までの降下を呈した(表3)。興味深いことには、Ig−W投与マウスは観察した全120日を通して再発を示したが、Ig−PLP1及びIg−PLP−LR処理マウスはそれぞれ31日及び38日までに麻痺を回復し、再発を示さなかった。10倍過剰の遊離PLP1またはPLP−LRペプチドで処理されたマウスは、臨床的重症度をほとんど軽減せず、120日の観察期間を通じて再発を続けた(データ表示なし)。
【0214】
【表3】
【0215】
Ig−キメラはアジュバントなしでマウスに投与されたため、末梢APC上の同時刺激性分子のアップレギュレーションが生じることはなく、同時刺激性分子を欠如するか、あるいはそのレベルが低下されている細胞によるペプチド提示を誘導して、それによって自己反応性T細胞の寛容を導く可能性はない。
【0216】
この点を研究するために、APC表面上の主要な同時刺激性分子の発現を、可溶性Igキメラを加えてインキュベーションすることによって評価した。マクロファージは2mLのチオグリコレートブロスの注射を行った5日後に、腹膜腔を8mLのHBSS 4μM EDTAで洗浄することによってマウスの腹膜細胞から収集した。マクロファージ(1.0 x 106 細胞/mL)は次に0.3μM 可溶性Ig−PLPキメラ(黒線)または培地のみ(NIL、灰色)を加えてインキュベートした。24時間後、細胞を収集して抗−F4/80(HB−198、ATCC)、及び抗B7.1(1G10;CRL−2223,ATCC)、抗−B7.2(2D10;CRL−2226、ATCC)、あるいは抗CD40で染色した。柱状図表は、F4/80+ゲート細胞を示し、B7.1、B7.2、あるいはCD40の強度を示す。
【0217】
図24に示す結果は、可溶性Ig−キメラの存在下で24時間培養された腹膜マクロファージは、Ig−キメラを含まない状態で培養されたマクロファージと同レベルのB7.2を有することを示す。しかしながら、B7.1及びCD40発現は、可溶性Ig−キメラを含まない培地中で培養された細胞に観察される発現の基礎レベルと比べて低下されている。従って、アゴニストまたはアンタゴニストを含む可溶性免疫グロブリンによる処理は、同時刺激なしにペプチド提示を生ぜしめ、それによって天然末梢性寛容を刺激して自己反応性T細胞を調節する。
【0218】
実施例 XXVII
凝集性Ig−PLP1によるEAEの改善
本発明の組成物及び方法に関する臨床的利点をさらに記述するために、EAEマウスに凝集性Ig−PLP1を接種した。結果を図25に示す。
【0219】
EAEは、10匹のマウスから成る群において、前述のように100μgの遊離PLP1ペプチドで誘導した。溶解可能な凝集性Ig−PLP1はIg−PLP1溶液を63℃で15分加熱し、次に遠心分離してから生成された調製物を濾過して、本プロセス中に形成された不溶性凝集物を取り除くことによって調製された。可溶化凝集物の濃度を次に標準的な生化学技術を用いて定量した。
【0220】
疾患誘導後10日目にEAEの臨床的徴候が生じたとき、マウスに300μgの加熱凝集性Ig−PLP1を含む生理食塩溶液を注射した。2回目及び3回目の300μgの凝集性Ig−PLP1の注射を14日目と17日目に行った。凝集性Ig−W及び可溶性(非凝集性)Ig−PLP1を用いるコントロール処理を平行して行った。臨床状態の類別を実施例XIXに記載するように行った。図25では、凝集性Ig−PLP1処理マウスを●によって表し、一方コントロールは○(可溶性Ig−PLP1)及び△(凝集性Ig−W)で表す。
【0221】
この結果は明らかに、開示の免疫調節剤の凝集性配合物は免疫疾患に関連する症状を効果的に軽減するために使用できることを示す。
【0222】
実施例 XXVIII
凝集性Ig−PLP1を精製APCと共にインキュベートするとIL−6及びIL−10産生を誘導する
本発明による組成物が好都合にも抗炎症性サイトカインを誘導することを実証するために、抗原提示細胞を凝集性Ig−PLP1に暴露した。結果を図26Aと26Bに示す。
【0223】
3つの細胞型を、凝集性Igペプチド構築物を加えてインキュベートする際のサイトカイン産生について試験した。これらはB細胞、マクロファージ/単球、及び樹状細胞を含む。マクロファージを得るためには、SJL/J成体マウスにチオグリコレートを注射して、注射5日後に、氷冷ショ糖(0.34M)で十分に洗浄することによって腹膜細胞から収集し、プラスチック製の培養フラスコに4時間粘着させた。非粘着細胞は勢いよくピペット操作して除去した。さらに一晩培養した後、粘着細胞を細胞スクレーパーによって回収した。樹状細胞は脾臓から精製し、標準的な生化学技術を用いて濃縮した。B細胞はラット抗κmAbによるパニングによって脾臓から精製した。静止B細胞の濃縮には、マクロファージ、樹状細胞、及び大型(活性化)B細胞をセファデックスG10カラムを使って除去した。次に、抗Thy1.2抗体及び補体処理によって溶出細胞からTリンパ球を取り除いた。90%以上にまで濃縮された調製物のみが凝集性構築物によって刺激されることを確実にするために、次にFACS分析を実施する。
【0224】
濃縮マクロファージは、Pharmingen(San Diego、CA)製の抗サイトカイン抗体を用いてELISA法によってIL−6及びIL−10の産生について試験した。マクロファージは100×103細胞/ウェル、そしてB細胞及び樹状細胞は50×103細胞/ウェルを使用した。細胞(三重複ウェル)に段階的に変化する量の凝集性Ig−PLP1またはマウス骨髄腫IgMを加えて24時間インキュベートして、その上清をサイトカイン産生測定に使用した。上清中のサイトカイン量は、サイトカインの既知量によって作成された標準曲線上に外挿することによって算定した。
【0225】
図26A及び26Bは、凝集性Ig−PLP1の投与がIL−6及びIL−10のような抗炎症性サイトカインの産生を増強することを示す。さらに詳細には、図26Aは、凝集性構築物への暴露がマクロファージにおいて比較的高レベルのIL−6を誘導し(□)、他方図26Bは同一構築物がマクロファージ(□)及び樹状細胞(△)においてIL−10産生を増強することを示す。そのようなサイトカインの産生は、Th2型細胞の発生を促すが、MHCクラスII分子の発現及び同時刺激性分子のアップレギュレーションを阻害できることが認められるであろう。
【0226】
実施例 XXIX
活動性EAEの転帰において凝集性Ig−PLP1は可溶性Ig−PLP1よりもより高い有効性を呈する
可溶性免疫調節剤は自己免疫疾患の症状を改善し、本発明の範囲に含まれるが、標的細胞上のFcレセプターを架橋することができ、さらに自己免疫疾患を改善する免疫調節剤の能力について以下のように研究した。
【0227】
FcRを架橋し、さらにIL−10産生を誘導し、それによって可溶性Ig−PLP1よりも自己免疫疾患をさらに大きく改善する、凝集性Ig−PLP1の能力はを以下のように研究した。Ig−W、Ig−PLP1、及びIg−PLP2トランスフェクタントの大規模培養を10% serum supreme(BioWhittaker、 Walkersville、 MD)を含むDMEMで行い、交差汚染を避けるために別のラット抗マウスκ鎖セファロースカラム上で精製した。次に、Ig−キメラをPBSに対して透析して、コロジオン膜(Schleicher & Schuall、 Keene、NH)で濃縮した。キメラは説明したように50%飽和(NH4)2SO4 による沈降によって凝集された(Chase ら、 Chemical Analyses、 Methods in Immunology and Immnochemistry、 Williams ら、編集 Academic Press、 New York、 2:249〜341、 1968、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。端的には、可溶性Ig−キメラ調製物に同量の濾過済み100%飽和(NH4)2SO4 を加えた。この混合物を20分ごとに緩やかな撹拌を加えながら24℃で1時間インキュベートした。次に試料を10,000rpmで沈降して、ペレットを1mg/mLとなるようにPBSに再懸濁した。10%アクリルアミドゲル上の電気泳動は、可溶性Ig−キメラがゲル中に入り、約160kDに移動することを示した。しかしながら、凝集性Ig−キメラはゲルには入らなかった。2μgに等価の凝集性Ig−キメラをアプライし、さらに本テクノロジーの感度が0.1μgであることが知られているため、発明者らは少なくとも95%の凝集性Ig−キメラ調製物が凝集形態であると結論した。
【0228】
マウス(8匹/群)の群に100μgのPLP1でEAEを誘導して、次に疾患誘導後9日目、13日目、及び17日目に、300μgの凝集性Ig−PLP1またはIg−Wを含有するPBSで処理を行った。結果を図27Aと27Bに示す。
【0229】
図27aに見られるように、麻痺性疾患重症度の初期フェーズは、最大スコア平均値が凝集性Ig−W処理動物の3.3 ( 0.3 から凝集性Ig−PLP1を投与されたマウスの1.1 ( 0.5 (p<0.001) にまで減少した。その上、動物は処理完了の9日以内に完全に回復し、全120日の観察期間を通じて全く再発しなかったが、一方凝集性Ig−W処理マウスは決して回復することがなく、臨床評価の全期間を通じて再発を示した。
【0230】
図27bは、可溶性Ig−PLP1(図22)に対する凝集Ig−PLP1(図27a)による処理後のPLP1ペプチド誘発性EAEの疾患経過の直接比較である。各点は8匹のマウスの臨床スコア平均値を示す。これらの結果は、3つの個別実験を表す。図27bに示すように、マウスに投与された900μgの凝集性Ig−PLP1は約12nMのPLP1を含み、遊離PLP1として投与された200nMよりも約17倍低いにも係わらず、凝集性Ig−PLP1による疾患の調節はずっと効果的であった。凝集性Ig−PLP1の有効性は、凝集性Ig−PLP1処理動物の臨床的徴候を可溶性Ig−PLP1を注射した動物のそれと比較したときにもまた明白である(p<0.001)(図27b)。実際に、最大臨床スコア平均値はかなり低くまた回復はより早かった。
【0231】
凝集性Ig−PLP1または凝集性Ig−Wで処理したマウスの組織学的検査をまた実施した。凝集性Ig−PLP1または凝集性Ig−Wで処理したマウスを、疾患の初期フェーズピーク時(疾患誘導後28日目)に屠殺して、脳及び脊髄を切除して、ホルマリンで固定してからパラフィンに包埋した。小脳、大脳、及び腰髄からの連続横断切片(6μm)を作成して、ヘマトキシリン−エオシン(H&E)染色を行った。少なくとも20個の単核細胞を含む血管周囲クラスタを炎症病巣としてカウントした。
【0232】
疾患ピーク時の小脳の病理組織検査は、所定の凝集性Ig−Wを投与されたマウスに対して凝集性Ig−PLP1処理マウスにおいては病巣数が少なく、病巣当たりの浸潤性単核細胞数が減少していることを示した(データ示さず)。さらに、連続的病理組織の横断切片を脳及び脊髄から作成して、横断切片当たりの平均病巣数を算定したとき、凝集性Ig−Wを投与されたマウスに対して凝集性Ig−PLP1処理マウスにおいて病巣数は2〜3倍減少していた(表4)。さらに、IgーPLP1処理マウスにおける病巣では、凝集性Ig−W処理マウスよりも浸潤性単核細胞数が少なかった(凝集性Ig−W:73 (39、凝集性Ig−PLP1:32 ( 14, p<0.005)。
【0233】
【表4】
【0234】
6〜8週齢マウスにPLP1でEAEを誘導して、次に引き続いて疾患誘導後9日目、13日目、及び17日目に300μgの凝集性Ig−PLP1または凝集性Ig−Wで処理して、臨床的疾患について毎日スコア付けした。最大重症度平均値は、群内の各マウスから得られた臨床スコア最大値を平均することによって決定した。病理学的疾患を決定するためには、疾患誘導後28日目(疾患ピーク時)にマウスから脳と脊髄を切除して、ホルマリン固定、パラフィン包埋して、6μmに横断切片してから、ヘマトキシリン−エオシン(H&E)染色を行った。炎症病巣は、最低でも20個の単核細胞/血管周囲クラスタを示す。
【0235】
実施例 XXX
凝集性IG−PLP1はAPCによるIL−10産生を誘導する
凝集性Ig−PLP1による効果的なEAEの調節の基礎となるメカニズムを描写するために、APCによるIL−10産生を刺激するための凝集性Ig−PLP1の能力及びIL−10産生APCによって提示されるPLP1ペプチドの識別に係わるT細胞を阻害するためのIL−10の能力を研究した。このため、ナイーブ脾細胞に可溶性または凝集性Igキメラを加えてインキュベートして、次にその上清をIL−10検出に使用した。
【0236】
照射(3000ラド)SJL/J脾細胞(5 x 105細胞/ウェル)に段階的に変化する量の可溶性Ig−PLP1、凝集性可溶性Ig−PLP1、凝集性Ig−W、可溶性Ig−PLP2、または凝集性Ig−PLP2を加えて24時間インキュベートして、その上清を使って以下のようにELISA法によりIL−10産生を定量した。
【0237】
ELISA法はPharMingenの標準プロトコルに従って実施した。捕獲抗体はラット抗マウスIL−10であり、ビオチン化抗サイトカイン抗体はラット抗マウスIL−10であった。結合リガンドはTMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム(Kirkegaard & Perry Laboratories、 Gaitherburg、MA)を用いて解明した。アッセイはSpectraMAX 340カウンターで読み取った。段階的に変化する量の組換えマウスIL−10を標準曲線を作成するための全ての実験に含んだ。培養上清中のサイトカイン濃度は標準曲線の直線部分から外挿して算定した。各点は三重複ウェルの平均値を示し、このデータは4回の個別実験を表す。
【0238】
図28aに示すように、凝集性Ig−PLP1、Ig−PLP2、及びIg−Wキメラは、用量依存性で脾臓細胞によるIL−10の産生を刺激した。キメラの可溶性形態は検出可能レベルのIL−10を誘導しなかった。
【0239】
プロフェッショナルAPCとして機能することが公知の細胞が、凝集性Igキメラと共にインキュベートする際にIL−10を産生できるか否かを研究するために、以下の実験を行った。チオグリコレート誘導腹膜マクロファージ及び脾性B細胞及び樹状細胞を単離して、以下のように凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートする際のIL−10産生について試験した。
【0240】
マクロファージは前述のようにチオグリコレートブロスを注射したマウスの腹膜細胞から得た(Doyleら、Murine macrophages Isolation, cultivation, and characterization, Weirs Handbook of Experimental Immunology、Herzenbergら編集、Blackwell Science, Cambridge, MA, 154.1〜154.8, 1996、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。端的には、チオグリコレートブロス 2mLを腹腔内注射して、その5日後に腹膜腔を8mLのHBSS 4μM EDTAで洗浄することによってマクロファージをマウスの腹膜細胞から収集した。マクロファージの純度はF4/80マーカーに対する抗体を用いてFACS(登録商標)分析によって測定された時に93%以上であった。
【0241】
樹状細胞は、標準コラゲナーゼ/分別粘着法に従ってSJL/J脾臓から精製された(Romaniら、Dendritic cells Weirs Handbook of Experimental Immunology、Herzenbergら、Blackwell Science、 Cambridge、 MA, 156.1〜156.14、 1996、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。細胞の純度は33D1マーカーに対する抗体を用いてFACS(登録商標)分析によって測定された時に94%以上であった。
【0242】
SJL/J脾細胞は、ラット抗マウスκ(1mg/mL)でコートしたプレート上、25℃で15分パニングされた。非粘着細胞はPBSで洗い流した。B細胞は次にリドカインHCl(0.8mg/mL)を加えてインキュベートした後で勢いよくピペット操作することによってプレートから剥離させた。細胞純度はB220マーカーの発現についてのFACS(登録商標)分析によって測定された時に90%以上であった。
【0243】
照射(3000ラド)B細胞(2x105細胞/ウェル)、マクロファージ(0.2x 105細胞/ウェル)及び樹状細胞(0.2x 105細胞/ウェル)に段階的に変化する量の凝集性Ig−PLP1(中白シンボル)またはマウスIgM(中塗りシンボル)を加えて24時間インキュベートして、細胞培養上清を使ってIL−10産生を測定した。各点は三重測定の平均値を表す。これらの結果は、4つの個別実験を表す。
【0244】
図28bはB細胞ではなく、マクロファージ及び樹状細胞は、凝集Ig−PLP1を加えてインキュベートするとIL−10を産生することを示す。マウスIgMは、試験されたいずれのAPCによってもIL−10産生を刺激できなかった。これらの結果は、凝集性Ig−PLP1がFcγRを架橋して、APCによるIL−10の産生を誘導することを示す。さらに、APCに可溶性マウスIgGを加えてプレインキュベートすると、凝集性Ig−PLP1−誘導によるIL−10産生を阻害した(データ表示なし)。
【0245】
これらの結果は、APCによって産生されたIL−10は、エンドトキシンによる汚染というよりはむしろFCγRの架橋に起因したことを示す。
【0246】
実施例 XXXI
凝集性Ig−PLP1は、FcγR1レセプターを架橋することによってIL―10を誘導する。
Fcレセプターを架橋する凝集性Ig−PLP1の能力を以下のようにして研究した。Ig−PLP1は硫酸アンモニウムを用いて凝集させ、IL−10の誘導について試験した。SJL/J脾細胞(0.5 x 106 細胞/ウェル)に0.1μM 可溶性Ig−PLP1、0.1μM 凝集性Ig−PLP1、0.1μM 凝集性Ig−PLP1+50μg/mL 2.4G2、または0.1μM 凝集性Ig−PLP1+100μg/mL マウスIgを加えてインキュベートした。24時間後、細胞をペレット化して、100mLの培養上清を使って、PharMingenの標準プロトコルに従ってELISA法によってIL−10産生を評価した。
【0247】
図29に見られるように、可溶性Ig−キメラではなく、凝集性Ig−キメラを加えて脾細胞をインキュベートすると、APCによるIL−10の誘導を導出した。2.4G2 mAbによるFcR2及びFcR3の遮断はIL−10産生を阻害しなかったが、マウスIgGを加えてインキュベートすることによる全3種のFcR遮断は凝集性Ig−キメラ誘導性IL−10を有意に低下させたため、IL−10産生はFcR1依存性であると思われる。総じて、これらの結果は、Ig−キメラの凝集はAPCを誘導してFcR1依存性でIL−10を産生することを示した。
【0248】
実施例 XXXII
凝集性IG−PLP1は特異的T細胞によるインビトロIFNγ分泌をダウンレギュレートする
抗原提示によってAPCと特異的に係わるT細胞に及ぼすAPC誘導性IL−10の影響を研究するため、ペプチド刺激に際してタイプI及びタイプIIサイトカインの両方を産生できるPLP1特異的Th0クローンを使用した。TCC−PLP1−1B10と命名されたこのクローンは以下のように調製された。
【0249】
成体SJLマウスを100μgのPLP1ペプチドを含有するCFAで皮下免疫して、10日後に流入領域リンパ節を切除して、その細胞(5 x 106 細胞/ml)をPLP1(15μg/mL)で刺激した。5日後に、芽球をHistopaque勾配(Sigma、 St. Louis、 MO)で単離して、次にペプチド及び新鮮な照射(3000ラド)シンジェニック(同質遺伝子的)APCで刺激した。10日後、細胞を洗浄して、10%T−Stim(Collaborative Research、 Boston、 MA)を含む培地に再懸濁して、7日間静止させた。刺激/静止を3サイクル繰り返した後、細胞を限界希釈(1細胞/3ウェル)によってクローン化して、ポジティブな細胞には限界希釈クローニングの第二ラウンドを行った。その後、TCC−PLP1−1B10と命名された一つのクローンを以下のようにさらに特徴づけした。
【0250】
PLP1、PLP2、凝集Ig−PLP1及び凝集Ig−PLP2に対するTCC−PLP1−1B10の増殖応答を以下のように試験した。SJL/J脾細胞(10 x 105細胞/ウェル/100μL)を丸底96ウェルプレートで段階的に変化する量の抗原で4時間パルスして、ペレット化し、1%のパラホルムアルデヒドで15分固定し、洗浄してから新しい96ウェルプレートに移した。TCC−PLP1−1B10細胞(0.5x 105細胞/ウェル/100μL)を次に添加して3日間インキュベートした。その後1ウェル当たり1μCiの[3H]−チミジンを添加し、さらに14.5時間インキュベートを継続した。細胞を次にガラスファイバーフィルター上に収集して、取り込まれた[3H]チミジンをInotechβカウンター(Wohlen、 Switzerland)を用いてカウントした。結果を図30aに示す。
【0251】
図30aに示すように、TCC−PLP1−1B10は、遊離PLP1ペプチドまたは凝集性Ig−PLP1で予めパルスした、パラホルムアルデヒドで固定した脾臓APCを加えてインキュベートすると増殖する。TCC−PLP1−1B10は、APCをネガティブコントロールであるPLP2または凝集性Ig−PLP2でパルスした場合は有意な増殖を示さなかった。
【0252】
遊離PLP1または凝集性Ig−PLP1による刺激に際してTCC−PLP1−1B10によって産生されるサイトカインを以下のように研究した。照射(3000ラド)SJL/J脾細胞(5 x 105細胞/ウェル)に段階的に変化する量のPLP1ペプチド(中塗り丸)または、凝集性Ig−PLP1(中白丸)を加えて1時間インキュベートし、その後TCC−PLP1−1B10細胞(0.5x 105細胞/ウェル)を加えてさらに24時間インキュベートを続けた。サイトカイン産生は100μLの培養上清から以下のようにしてELSA法によって測定した。各点は三重測定ウエルの平均値を表す。ELISA法はPharMingenの標準プロトコルに従って実施した。捕獲抗体は、ラッ抗マウストIL−2、JES6−1A12;ラット抗マウスIL−4、11B11;ラット抗マウスIFNγ、R4−6A2;ラット抗マウスIL−10、JES5−2A5;及びラット抗マウスIL−5、TRFK5であった。ビオチン化抗サイトカイン抗体は、ラット抗マウスIL−2、JES6−5H4;ラット抗マウスIL−4、BVD6−24G2;ラット抗マウスIFNγ、XMG1.2;ラット抗マウスIL−10、JES5−16E3;及びラット抗マウスIL−5、TRFK4であった。活性TGFβ検出のためのELISA法は、ヒトTGFβ1DuoSet kit (Genzyme、 Cambridge、 MA) を製造元の指示に従って用いて実施した。結合リガンドは、TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム(Kirkegaard & Perry Laboratories、 Gaitherburg、MA)を用いて解明した。アッセイはSpectraMAX 340カウンターで読み取った。標準曲線を作成するために、段階的に変化する量の組換えマウスIL−2、IL−4、IFNγ、IL−10、IL−5、及びTGFβを全ての実験に含めた。培養上清中のサイトカイン濃度は標準曲線の直線部分から外挿して算定した。
【0253】
非固定脾臓APC及び遊離PLP1ペプチドを加えてインキュベートした際のサイトカイン産生を試験したとき、TCC−PLP1−1B10は有意量のIL−2、IL−4、及びIFNγを産生した(図30b、30c、及び30d)3種のサイトカイン全てがまた、凝集性Ig−PLP1を刺激に使用したときにも検出された(図30b、30c、及び30d)。しかしながら、IL−10は、刺激剤が遊離PLP1ではなく凝集性Ig−PLP1のときに有意なレベルで検出可能であった(図30e)。
【0254】
凝集性Ig−PLP1はマクロファージ及び樹状細胞によるIL−10産生を誘導するため、T細胞サイトカイン評価アッセイに見られるIL−10はTCC−PLP1−1B10というよりはむしろ脾臓APCの産物であったと思われる。これを確認するために、以下の実験を行った。凝集性Ig−PLP1によるT細胞活性化におけるIL−10源を識別するために、固定及び生APCを使用した。固定APCアッセイでは、SJL/J脾細胞(10 x 105細胞/ウェル)を段階的に変化する量の凝集生Ig−PLP1で4時間パルスして、十分に洗浄してから、パラホルムアルデヒドで固定した。生APCアッセイでは、照射(3000ラド)SJL/J脾細胞(5 x 105細胞/ウェル)に段階的に変化する量の凝集性Ig−PLP1を混合して、1時間インキュベートした。その後TCC−PLP1−1B10細胞(0.5x 105細胞/ウェル)を両アッセイに加えてさらに24時間インキュベートを継続した。IL−10産生は100μLの培養上清からELSA法によって測定した。各点は三重測定ウエルの平均値を表す。
【0255】
結果を図31に示す。図31に示すように、凝集性Ig−PLP1でパルスされたAPCを洗浄して、TCC−PLP1−1B10を加えてインキュベートする前にパラホルムアルデヒドで固定したときは、IL−10は検出不能であり、これはTCC−PLP1−1B10というよりはむしろ脾臓APCがIL−10源であったことを実証した。
【0256】
T細胞サイトカイン評価アッセイからのその他の驚くべき観察は、APCによるIL−10産生が増加するとIFNγ産生が減少するらしいことであった(図30c及び30e)。この問題をさらに研究するために、さらに広範囲のIg−PLP1濃度をバルク及び精製APCの刺激に使用し、さらにIL−10及びIFNγ産生を以下のように同一組織培養ウェルから同時に評価した。
【0257】
照射(3000ラド)SJL/J脾細胞(5 x 105細胞/ウェル)、樹状細胞(0.2x 105細胞/ウェル)、マクロファージ(0.2x 105細胞/ウェル)、またはB細胞(2x 105細胞/ウェル)に段階的に変化する量の凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートし、1時間後にTCC−PLP1−1B10細胞(0.5x 105細胞/ウェル)を加えて、さらに24時間インキュベートを継続した。同一培養ウェルでのIFNγ及びIL―10産生をELISA法によって測定した。各点は三重測定ウエルの平均値を表す。結果を図32に示す。
【0258】
図32に示すように、APCによって分泌されるIL−10は、T細胞によるIFNγの産生に拮抗作用する。事実、脾細胞、精製DC、または濃縮腹膜マクロファージ(その全てが凝集性Ig−PLP1と共にインキュベートする際にIL−10を産生する。図28)をAPCとして用いて刺激アッセイを行うと、T細胞によるIFNγ産生は劇的に減少し、APCによるIL−10産生が増加すると検出不能になった(図32a、32b、及び32c)。しかしながら、凝集性Ig−PLP1と共にインキュベートされるときにIL−10を産生しないB細胞がAPCとして使用される場合(図28b)、T細胞によるIFNγ分泌は影響を受けなかった(図32d)。総じて、これらの結果は、凝集性Ig−PLP1が提示APC(樹状細胞及びマクロファージ)によるIL−10産生をトリガし、またそのようなIL−10がT細胞によるIFNγの産生に拮抗作用することを示す。
【0259】
さらにIL−10産生がT細胞によるIFNγの産生を拮抗作用することを確認するために、以下の実験を行った。照射(3000ラド)SJL/J腹膜マクロファージ(0.2 x 105細胞/ウェル)(前述のように精製した)に段階的に変化する量の凝集性Ig−PLP1を加えて1時間インキュベートし、次にTCC−PLP1−1B10細胞(0.5x 105細胞/ウェル)を加えてさらに24時間インキュベートを継続した。同一培養ウェルでのIFNγ及びIL―10産生を前記のように100μLの培養上清から評価した。その上、IFNγ産生に対する効果を測定するために、抗IL−10mAb 2A5またはラットIgGをいくつかの培養中に含んだ。
【0260】
その結果を図33に示す。TCC−PLP1−1B10に腹膜マクロファージ及び凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートすると、提示マクロファージによって分泌されるIL−10レベルと比例してIFNγ産生が減少する(図33a)。さらに、T細胞によるIFNγ産生の阻害は、抗IL−10 mAbである2A5によるそのようなIL−10の中和がIFNγ産生を回復するため、APC誘導性IL−10に直接的に関連する(図33b)。抗IL−10の代わりにイソタイプコントロールであるラットIgGを加えてインキュベートしても、TCC−PLP1−1B10によるIFNγ産生を阻害するIL−10の能力に効果はなかった。
【0261】
実施例 XXXIII
攻撃性T細胞のインビボ調節に対する内因性IL−10と末梢性寛容間の相乗作用
アジュバントなしで動物に投与された全身性抗原は、同時刺激性分子を発現していないか、あるいはその発現レベルが最小限である末梢APCによる抗原提示によって操作される寛容を生ぜしめる。精製マクロファージまたは樹状細胞に、MHCクラスII分子へのペプチドの効率的な負荷を可能にする可溶性または凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートすると、B7−1、B7−2、またはCD40のアップレギュレーションを誘導しない(データ表示なし)。さらに、凝集性Ig−PLP1はAPCによるIL−10の産生を起因するため(図28)、IL−10はAPC上にある同時刺激性分子のアップレギュレーションを阻害すると思われる。
【0262】
IL−10はTh1サイトカインを拮抗作用すること(Fiorentinoら、J. Immunol.、 146:3444〜51、1991、その開示はその全文を参照により本明細書に編入している)並びにおそらく炎症機能を妨害するであろうことが示されているため、T細胞調節における凝集性Ig−PLP1の有効性及び同時刺激性分子の発現レベルが最小限であるAPCによる不適切なペプチド提示を介する疾患の転帰、及びそのようなAPCによって産生されるIL−10の阻害機能を以下のように研究した。
【0263】
PLP1ペプチドを用いてマウスにEAEを誘導し、麻痺の徴候が明白になったとき、マウスに凝集性Ig−PLP1を抗IL−10抗体と共に投与して、以下のように疾患重症度の軽減について評価した。100μgのPLP1でSJL/Jマウス(8匹/群)にEAEを誘導し、9日目、13日目、及び17日目に300μg 凝集性Ig−PLP1(凝集性Ig−PLP1);300μg 凝集性Ig−PLP1+500μg ラット抗マウスIL−10抗体である2A5(凝集性Ig−PLP1+抗IL−10);300μg 凝集性Ig−PLP1+500μg ラットIgG(凝集性Ig−PLP1+ラットIgG);300μg 凝集性Ig−W(凝集性Ig−W);あるいは300μg 凝集性Ig−W+500μg ラット抗マウスIL−10抗体である2A5(凝集性Ig−W+抗IL−10)を含有するPBSを腹腔内投与した。全ての注射は腹腔内にPBSで行った。結果を図34aに示す。
【0264】
図34aに示すように、麻痺の重症度は、インビボIL−10が抗IL−10抗体によって中和されたときに回復した。事実、凝集性Ig−PLP1のみで処理したマウスは、最大臨床スコア平均値が1.1±0.5であったが、凝集性Ig−PLP1と抗IL−10抗体の両方の注射を受けたマウスは3.3±0.3のスコアを示し、これは凝集性Ig−W処理を受けたマウスに観察された3.3±0.3(p>0.23)と同等である。さらに、抗IL−10抗体の代わりにラットIgGを凝集性Ig−PLP1と共に投与されたコントロールマウスは、疾患重症度を回復せず、最大スコア平均値は1.6±0.2であった。抗IL−10抗体を凝集性Ig−Wと共に注射しても疾患重症度を軽減したり、悪化させることはなかった。これらの結果は、凝集性Ig−PLP1誘導性IL−10は、疾患重症度の制御において重要な役割を果たしており、IL−10の効果が生じるためにはAPCと標的T細胞間の特異的相互作用が必要であることを実証する。
【0265】
さらにこのメカニズムは、可溶性Ig−PLP1+外因性IL−10による処理が凝集性Ig−PLP1と同程度まで麻痺の重症度を軽減する事実に拠って支持される。100μgのPLP1でマウス群(8匹/群)にEAEを誘導し、9日目、13日目、及び17日目に300μg 可溶性Ig−PLP1(可溶性Ig−PLP1);300μg 凝集性Ig−PLP1(凝集性Ig−PLP1);300μg 可溶性Ig−PLP1+400U rIL10(可溶性Ig−PLP1+IL−10);または300μg Ig−W(凝集性Ig−W)を含有するPBSを投与した。図34bに示すように、検出可能レベルのIL−10を誘導しない可溶性Ig−PLP1は、疾患を僅かに改善し、最大スコア平均値が2.5±0.3であり、一方外因性IL−10と併用された可溶性Ig−PLP1は、疾患を最大臨床スコア平均値が1.1±0.3まで軽減し、これは凝集性Ig−PLP1処理されたマウスから得られたスコア1.1 ( 0.5 と同等である。
【0266】
内因性IL−10が疾患を調節するためには、APCをT細胞と物理的に架橋することが必要であると思われる。このメカニズムを確認するために、以下の実験を行った。100μgのPLP1でマウス群(8匹/群)にEAEを誘導し、次に疾患誘導後9日目、13日目、及び17日目に、300μg 凝集性Ig−PLP1(凝集性Ig−PLP1)、300μg 凝集性Ig−W(凝集性Ig−W)、または300μg 凝集性Ig−W+100μg PLP1(凝集性Ig−W+PLP1)を含有するPBSで処理した。結果を図35に示す。
【0267】
図35に示すように、疾患の発症はこれらの実験群では7日目であった。疾患マウスを、凝集性Ig−PLP1の代わりに凝集性Ig−Wと遊離PLP1ペプチドの混合物で処理すると、疾患重症度は軽減されなかった。総じて、有効なT細胞ダウンレギュレーションは、IL−10産生APCと標的病原性T細胞間の物理的相互作用を必要とする。この必要条件についての可能な説明は、パラ分泌サイトカインとしてのIL−10が拮抗作用を達成するためには、T細胞の近接に存在する必要があることである。
【0268】
実施例 XXXIV
凝集性IG−PLP1は、自己免疫疾患の迅速な改善を提供する
凝集性Ig−PLP−LR及び凝集性Ig−PLP1のどちらも自己免疫疾患の症状を改善するが、より迅速な軽減は凝集性Ig−PLP1によってもたらされる。SJLマウス群にPLP1ペプチドで疾患を誘導し、9日目、13日目、及び17日目に、300μg 凝集性Ig−PLP1、凝集性Ig−PLP−LR、または凝集性Ig−Wを含有する300μL PBSを用いて腹腔内処理した。結果は図36及び表5に示す。
【0269】
図36及び表5に見られるように、凝集性Ig−PLP1は疾患重症度を劇的に軽減した。凝集性Ig−PLP−LR及び凝集性Ig−PLP1処理のどちらもEAEの回復を起因するが、凝集性Ig−PLP1を投与されたマウスは、凝集性Ig−PLP−LR及を投与されたマウスよりもより迅速に回復した。最大臨床スコア平均値は、凝集性Ig−W処理群の3.3 ( 0.3 から、凝集性Ig−PLP1群では1.1( 0.5 に減少した(表5を参照)。さらに、凝集性Ig−PLP1による処理後の疾患の完全回復は迅速であり(24.4( 2.2日目)、120日の臨床評価期間中に再発は生じなかった。
【0270】
凝集性Ig−PLP1が可溶性Ig−PLP1よりも疾患調節においてより有効であることは特記に値する。凝集性Ig−PLP1は最大臨床スコアを1.1( 0.5まで減少するが、Ig−PLP1の可溶性形態は麻痺の重症度を2.4 ( 0.3 にまで低減するのみである(表3と表5を比較すること)。その上、回復は可溶性Ig−PLP1を投与されたマウスよりも凝集性Ig−PLP1処理された群の方がはるかに速かった(表3及び表5を参照)。
【0271】
【表5】
【0272】
組織病理学的分析をまた実施した。図36のようにEAEを誘導して凝集性Ig−キメラ処理されたマウス群を、疾患誘導後28日目に屠殺して、脳及び脊髄を取り出して、ホルマリンで固定してからパラフィンに包埋した。大脳及び腰髄からの連続横断切片(6μm)を作成して、ヘマトキシリン−エオシン(H&E)染色を行った。少なくとも20個の単核細胞を含む血管周囲クラスタを炎症病巣としてカウントした。
【0273】
結果を図37に示す。図37に示すように、凝集性Ig−PLP1処理マウスは、大脳及び腰脊髄のどちらにおいても炎症病巣数を有意に減少した。
【0274】
凝集性Ig−PLP1のEAE改善効力は、500μg/注射の量で投与された可溶性Ig−PLP1よりもはるかに低用量(300μg/注射)で生じた。これはおそらく、Ig−PLP1の可溶性形態ではなく凝集性形態による処理に際するIL−10のインビボ産生に起因すると思われる。
【0275】
特定の理論によって制限されることは望まないが、以下のメカニズムによって凝集性Ig−PLP−LRと比べて凝集性Ig−PLP1によって迅速な結果が得られることを説明できると思われる。PLP−LRはPLPを修飾することによって作成されるT細胞アンタゴニストペプチドであるため、この修飾ペプチドを提示するT細胞とAPC間の相互作用の親和性は、非修飾PLP1を提示するT細胞とAPC間の親和性よりも低いことが予測される。この低い親和性の結果として、T細胞はPLP1を提示するAPCと相互作用する限りは、PLP−LRを提示するAPCと相互作用せず、従って凝集免疫グロブリンによって誘導されるIL−10への暴露期間が減少する。
【0276】
他方、凝集性Ig−PLP1によって得られる迅速な結果は、自己反応性T細胞レパートリーの多様性の結果である。PLP1反応性であるT細胞の頻度がPLP−LR反応性であるT細胞の頻度よりも大きい場合、この二つのキメラによる疾患調節の示差は観察されたパターンに適合する。この場合、IL−10が存在しないと可溶性キメラはT細胞の通常集団を影響するが、高親和性T細胞が有効なIL−10暴露を受けるために、凝集性形態はIg−PLP1に有利に働く。
【0277】
実施例 XXXV
凝集性Ig−PLP1への応答で産生されたIL−10は同時刺激性分子をダウンレギュレートする
IL−10はAPC上の同時刺激性分子の発現をダウンレギュレートすることが報告されている。凝集性Ig−PLP1への応答で産生されたIL−10がAPC上の同時刺激性分子をダウンレギュレートするか否かを測定するために、以下の実験を行った。
【0278】
腹膜マクロファージに凝集性Ig−PLPキメラを加えて24時間インキュベートして、次に同時刺激性分子の細胞表面発現を評価した。マクロファージは、前述のようにチオグリコレートブロスを注射したマウスの腹膜細胞から収集した。精製マクロファージ(1.0 x 106 細胞/mL)は次に0.3μM 凝集性Ig−PLPキメラ(黒線)または培地のみ(NIL、灰色)を加えてインキュベートした。24時間後、細胞を収集して、抗−F4/80、及び抗B7.1、抗−B7.2、あるいは抗CD40で染色を行った。柱状図表は、F480+ゲート細胞を示し、B7.1、B7.2、あるいはCD40の強度を示す。
【0279】
結果を図38に示す。図38に示すように、B7.1、B7.2、あるいはCD40発現のアップレギュレーションはなかった。反対に、凝集性Ig−PLPキメラを含まない培養で観察される基礎レベルと比べてこれらの分子の有意なダウンレギュレーションがあった。従って、凝集性Ig−PLP1への応答で産生されるIL−10は、同時刺激性分子をダウンレギュレートする。
【0280】
実施例 XXXVI
凝集性Ig−PLP1処理は、複数エピトープによって誘導された活動性EAEの臨床重症度を低下させる。
凝集性Ig−PLP1介在によるFcR架橋の結果としてのAPCによるIL−10産生は、APC上のPLP1−MHCリガンドに係わる特異的T細胞、並びに無関係の特異性を有する隣接T細胞を拮抗作用することができる。バイスタンダー抑制として公知であるこの低下は、IL−4及びIL−10設定に有効であることが証明されている。
【0281】
バイスタンダー抑制が、自己免疫疾患に関与する抗原を含む凝集免疫グロブリンへの応答で産生されたIL―10に起因するか否かを測定するために、エピトープの混合物でEAEを誘導して、非関連自己反応性T細胞を調節し且つ疾患を改善する凝集性I−PLP1の能力を測定した。100μgのPLP1及び100μgのPLP2から成る混合物でSJL/Jマウス群(8匹/群)にEAEを誘導し、9日目、13日目、及び17日目に、300μg/注射量の凝集性Ig−PLP1または凝集性Ig−Wで処理した。全ての処理は腹腔内PBSであった。疾患の発症は、これらの実験群では7日目であった。各点は8匹のマウスの臨床スコア平均値を示す。
【0282】
結果を図39aに示す。図39aに示すように、PLP1とPLP2ペプチド混合物によって誘導された進行性のEAEを罹患するマウスは、麻痺の重症度の低下を示し、さらに凝集性Ig−PLP1処理後、疾患誘導後33日目に完全に回復したが、一方凝集性Ig−W処理動物は重度の麻痺を有し、50日の臨床評価期間中に疾患を回復しなかった。従って、内因性IL−10は、PLP2特異的T細胞へのダウンレギュレート効果を有すると思われる。
【0283】
PLP2ペプチドによる疾患の誘導は、全PLPを暴露して、PLP1特異的T細胞の拡散と活性化を生ぜしめるにちがいない(McRaeら、J. Exp. Med.、 182:75〜85、1998;Tuohy ら、 Immunol. Rev.、 164:93〜100、 1998、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している)。この場合、凝集性Ig−PLP1の注射は、IL−10産生APCをPLP1特異的T細胞に架橋して、これらの細胞並びに隣接PLP2特異性T細胞のバイスタンダー抑制を促進するにちがいない。PLP2によってEAEが誘導されているマウスへの凝集性Ig−PLP1の投与がPLP2特異的T細胞のバイスタンダー抑制を生じるか否かを測定するために、以下の実験を行った。
【0284】
PLP2ペプチドでマウスにEAEを誘導して、麻痺徴候が明らかになったとき、以下のように凝集性Ig−PLP1で処理した。100μgのPLP2でSJL/Jマウス群(8匹/群)にEAEを誘導し、9日目、13日目、及び17日目に、300μg/注射量の凝集性Ig−PLP1で腹腔内処理した。未処理マウス(NIL)群を、比較目的で含んだ。結果を図39bに示す。
【0285】
図39bに示すように、凝集性Ig−PLP1処理マウスにおける麻痺の初期フェーズは未処理マウスに比べて僅かに軽いのみであるが、動物は26日目までに迅速に回復して、未処理マウスとは異なり、残りの臨床評価期間のあいだに再発は見られなかった。これらの結果はバイスタンダー抑制を支持し、さらにエピトープの拡散が麻痺の後期に疾患を調節する機会を提供することを実証する。
【0286】
PLP1以外の抗原に特異的なT細胞のバイスタンダー抑制を生じる凝集性Ig−PLP1の能力をさらに探求するために、以下の実験を行った。ミエリン自己抗原の全域を組み込むCNSホモジネートによって誘導された疾患を調節するための凝集性Ig−PLP1の能力を測定した。CNSホモジネートは以下のように調製した。50個の冷凍した圧搾していないラット脳(Pelfreez Biologicals、 Rodgers、 AK)をWaringブレンダーを用いてPBS中でホモジネートして、PBSで300mg/mLに調整した。CNSホモジネートは−20℃で保存した。6mgのCNSホモジネートでSJL/Jマウス群(9匹/群)にEAEを誘導し、9日目、13日目、及び17日目に、300μg/注射量の凝集性Ig−PLP1または凝集性Ig−Wで腹腔内処理した。未処理マウス(NIL)群を、比較目的で含んだ。結果を図35に示す。
【0287】
図35に示すように、凝集性Ig−PLP1の注射を受けたマウスは、麻痺の初期フェーズにおいて麻痺の軽い徴候を有したが、疾患誘導後24日目までに完全に回復し、60日の臨床評価期間に再発はなかった。凝集性Ig−PLP1の代わりに凝集性Ig−W処理されたコントロールマウスは、未処理動物と同様な疾患パターンを有した。これらの結果は、凝集性Ig−PLP1のダウンレギュレーション機能は、分子内及び分子間エピトープのどちらにも拡大して、多様なT細胞特異性を抑制することを示す。
【0288】
実施例 XXXVII
凝集性Ig−PLP1は、APCによるIL−10産生を誘導することにより、バイスタンダー抑制を生じる
IL−10への暴露は、病原性ミエリン特異的T細胞のダウンレギュレーション及び抑制の基礎をなすメカニズムであると思われる。図28及び34に実証されたように、IL−10の源は、樹状細胞及びマクロファージのようなAPCである。しかしながら、この設定におけるT細胞調節の広範な有効性及び持久性は、このバイスタンダー抑制がAPCのIL−10による病原性T細胞の拮抗作用に起因するのか、あるいはそのようなIL−10の効果の下で発生した制御性T細胞によるダウンレギュレーションであるのかの疑問を提起した。
【0289】
凝集性Ig−PLP1がT細胞増殖の抑制を介するのか、あるいは制御性T細胞によって作用するのかを決定するために、以下の実験を行った。凝集性Ig−PLP1による処理を受けたCNS誘導性麻痺から回復するマウス由来リンパ節T細胞を抗原刺激して、増殖及びサイトカイン(制御性T細胞マーカー)の産生について試験した。マウス(6匹/群)にCNSホモジネートでEAEを誘導し、次に前記のように9日目、13日目、及び17日目に凝集性Ig−W(斜め格子付き棒)または凝集性Ig−PLP1(空白棒)で処理した。処理療法完了の2日後、リンパ節(腋窩、側腋窩、及び膝窩)を収集して、細胞(4×105細胞/100 μL/ウェル)を100 μL/ウェルの抗原(PLP1、PLP2、MBP3、またはHA(コントロール))で刺激した。細胞増殖を3日後に[3H]チミジン取り込みアッセイを用いて評価した(図40a)。その上、サイトカイン応答を、抗原を加えてインキュベートした24時間後に5 x 105 細胞/ウェルを用いてELISPOTによって分析した(図40b〜g)。ELISPOTアッセイは、Minら、J. Exp. Med.、188:2007〜2017、1998(その開示はその全文を参照により本明細書に編入している)に記載されるように抗原刺激の際にリンパ節T細胞によって産生されるサイトカインを測定することを用いた。端的には、リンパ節細胞(5 x 105細胞/100μL/ウェル)及び抗原(100μL/ウェル)を、捕獲抗体でコートされたHAマルチスクリーンプレート(Millipore、Bedford、 MA)中で24時間インキュベートした。結合サイトカインはペルオキシダーゼ及び抗サイトカイン抗体で解明された。使用した抗サイトカイン抗体対は、ELISA法に説明される抗体対であった。スポットは解剖顕微鏡下でカウントした。
【0290】
抗原は特定された最適濃度(PLP1、PLP2、及びHAは15μg/mL、並びにMBP3は30μg/mL)で使用した。抗原を添加しない培地のコントロールウェルを含み、バックグラウンドとして使用した。グラフの各棒は6匹の個別に試験されたマウスについての平均値±標準偏差を表す。図41に示す結果は、凝集性Ig−キメラの最終注射2日後、ミエリンペプチドの増殖は、コントロールIg−W処理されたマウスで有意であったが、凝集性Ig−PLP1を投与されたマウスではバックグラウンドレベルであったことを示す。同様に、凝集性Ig−Wの注射を受けたマウスは有意量のIL−2及びIFNγを有したが、凝集性Ig−PLP1処理マウスは、Th1及びTh2タイプサイトカインのどちらも有せず、さらにIL−10、IL−5、またはTGFβのいずれも産生しなかった。この処理療法完了後9日目にマウスを試験したときにも、同様な結果が得られた(データ表示なし)。さらに、脾臓T細胞及び腹膜から収集した細胞は、同様なパターンの応答を示した(データ表示なし)。総じて、これらの結果は、制御性T細胞の典型的な増殖性及びサイトカイン応答トレードマークは、活動性自己免疫の全身治療のこの特定の設定では検出不能であることを示唆する。従って、凝集性Ig−PLP1の投与に起因するバイスタンダー抑制はAPCによって産生されるIL−10による病原性T細胞の拮抗作用に起因した。
【0291】
当業者はさらに、本発明が、本発明の精神または主要な特質から逸脱することなく他の特定の形態で実施可能であることを認めるであろう。前述する本発明についての説明は本発明の例示的な実施態様を開示したに過ぎないという点で、他の変形が本発明の範囲内であることが意図されていると理解すべきである。従って、本発明は、本明細書に詳細に記載されている具体的な実施態様に限定されることはない。むしろ、本発明の範囲及び内容を示すものとしては付記する請求の範囲を参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1A及び1Bは、一般的な特徴及びH鎖可変領域のCDR3ループ内における外来ペプチドの封入体を示すキメラ免疫グロブリンG(IgG)分子の概略図であり、ここで図1A(Ig−PLP1)はプロテオリピドタンパク質由来の天然ペプチドPLP1(アゴニスト)の挿入を示し、一方図1B(Ig−PLPーLR)はPLPーLRと称するPLP1のペプチド類似体(アンタゴニスト)の封入体を含む免疫調節剤を示している。
【図2】
図2及び2Bは、対応する遊離ペプチドに対する抗体を使用して、それぞれ図1A及び1Bに示すキメラ抗体Ig−PLP1及びIg−PLP―LRのラジオイムノアッセイ(RIA)による捕獲を示すグラフであり、ここで、図2AはPLP1に対する抗体による捕獲レベルを示し、そして図2BはPLP−LRに対する抗体による捕獲レベルを示し、Ig−Wはネガティブコントロールとしての野生型抗体である。
【図3】
図3A及び3Bは、IL−2産生で測定される、キメラ免疫グロブリンの相対的なT細胞活性化能力を決定するために、PLP1特異的T細胞ハイブリドーマ4E3(図3A)及び5B6(図3B)に対するIg−PLP1及びIg−PLP−LR(並びにポジディブ及びネガティブコントロール)の提示を示すグラフである。
【図4】
図4は、脾臓SJL抗原提示細胞をPLP1特異的4E3T細胞ハイブリドーマと共にインキュベートした後にIL−2産生レベルで測定される、本発明のキメラ抗体(Ig−PLP1)に対する遊離ペプチドPLP1または未変性プロテオリピドタンパク質(PLP)の相対的なPLP1提示有効性を示すグラフである。
【図5】
図5A、5B及び5Cは、それぞれのアゴニスト及び種々のレベルのIg−PLP−LRまたはコントロールと共に予めインキュベートしたSJL脾臓APCの存在下、T細胞ハイブリドーマ4E3によるIL−2産生によって測定された、PLP1(5A)、Ig−PLP1(5B)及びPLP(5C)介在性T細胞活性化のIg−PLP1−LRアンタゴニズムを示す比較グラフである。
【図6】
図6は、前述の免疫グロブリンのうちの1つを天然プロテオリピドタンパク質とを組み合わせて予めインキュベートしたSJL脾臓APCの存在下で、T細胞ハイブリドーマHT−2によるIL−2の産生によって測定される、Ig−PLP2、Ig−PLP−LR及びIg−Wの相対的拮抗作用を示すグラフである。
【図7】
図7A及び7Bは、リンパ節(7A)または脾臓(7B)由来の細胞による3H−チミジン取り込みによって測定される、Ig−PLP1接種後のPLP1のインビボ提示を示すグラフであり、ここで示された値は、アゴニストPLP1またはコントロールペプチドPLP2に暴露したとき3H−チミジン取り込みによって測定される、個々のマウスから収集された細胞がT細胞応答を生じる能力を表している。
【図8】
図8A及び8Bは、Ig−PLP−LRをIg−PLP1と同時投与したとき、リンパ節(8A)または脾臓(8B)由来のマウス細胞で測定される、PLP1ペプチドに対する免疫応答を低下させるIg−PLP−LRの能力を示すグラフであり、ここで示された値はPLP1に暴露したとき3H−チミジン取り込みによって測定される、個々のマウスから収集された細胞がT細胞応答を生じる能力を表している。
【図9】
図9A及び9Bは、Ig−PLP−LRとIg−PLP1の混合物を接種されたマウスが、リンパ節(9A)または脾臓(9B)由来の細胞で測定すると、ペプチドPLP1に対してよりペプチド類似体PLP−LRに対して一層激しい免疫応答を発現することを示すグラフであり、ここで示された値は、PLP1ペプチドまたはペプチド類似体PLP−LRに暴露したとき3H−チミジン取り込みに反映される、個々の対象から収集された細胞がT細胞応答を生じる能力を表している。
【図10】
図10A〜10Dは、Ig−PLPキメラによる免疫化に対するリンパ節増殖応答を示すグラフであり、マウスは各刺激剤について三重複ウエルで個別に試験されて、ここで表示のcpmはバックグランドcpmを差し引いた後の平均値±SDを表す。
【図11】
図11は、Ig−PLP1とIg−PLP−LRによる同時免疫に対するリンパ節T細胞増殖応答のグラフであり、刺激剤はPPDを5μg/mL、PLP1、PLP−LR及びPLP2を15μg/mL含む。
【図12】
図12は、三重複ウエルでPLP1(斜め格子付き棒)及びPLP−LR(平行斜線付き棒)で刺激したとき、Ig−W、Ig−PLP1、Ig−PLP−LR及びこれらの組合せで免疫したマウスの脾臓増殖T細胞応答のグラフである。
【図13】
図13A〜13Cは、Ig−W、Ig−PLP1、Ig−PLP−LR及びこれらの組合せで免疫したマウスの脾臓細胞によるIL−2(13A)、INFγ(13B)及びIL−4(13C)の産生を示すグラフである。
【図14】
図14A〜14Dは、PLP1ペプチド、PLP−LRペプチド及びこれらの混合物によるインビトロ刺激に際して、Ig−PLP1(a及びb)またはIg−PLP−LR(c及びd)含有CFAで免疫したマウスからの、抗原暴露T細胞の増殖をグラフで示している。
【図15】
図15A及び15Bは、PLP1ペプチド、PLP−LRペプチド及びこれらの混合物によるインビトロ刺激に際して、Ig−PLP1(15A)及びIg−PLP−LR(15B)で免疫した抗原暴露T細胞によるIL−2産生を示すグラフである。
【図16】
図16A及び16Bは、Ig−WではなくIg−PLP1を注射した新生児マウスがEAEの誘導に抵抗することをグラフで示しており、臨床的に得られた曲線が全マウス(16A)と生存マウス(16B)について示されている。
【図17】
図17A及び17Bは、誕生後24時間以内にIg−PLP1またはIg−Wを注射した後の新生児の胸腺(17A)及び脾臓(17B)の抗原提示細胞によるIg−PLP1のインビボ提示をグラフで示している。
【図18】
図18A及び18Bは、誕生後すぐにIg−PLP1またはIg−Wを注射したマウスにおける、遊離PLP1、PLP2またはPLPの脳炎誘発配列178〜191に相当するネガティブコントロールペプチドによる刺激時の、リンパ節(18A)及び脾臓(18B)の増殖T細胞応答をグラフで示している。
【図19】
図19A〜19Cは、誕生後すぐにIg−PLP1で処理し、さらに遊離PLP1またはPLP2で刺激したマウスにおけるIL−2(19A)、IL−4(19B)及びIFNγ(19C)の産生によって測定される、リンパ節T細胞逸脱をグラフで表している。
【図20】
図20A〜20Cは、誕生後すぐにIg−PLP1で処理し、さらに遊離PLP1またはPLP2で刺激したマウスにおけるIL−2(20A)、IL−4(20B)及びIFNγ(20C)の産生によって測定される、脾臓T細胞逸脱をグラフで表している。
【図21】図21は、誕生後すぐにIg−PLP1を注射し、7週目に遊離PLP1で免疫し、さらに遊離PLP1で刺激したマウスにおける脾臓T細胞増殖のサイトカイン介在性回復をグラフで示しており、細胞はコントロール培地(NIL)、IL−12を有する培地及びINFγを有する培地中で増殖させ、各マウスについて示したcpmは三重複ウエルの平均値±SDを表している。
【図22】
図22は、EAEの発生分化を誘導したマウスに対する可溶性Ig−PLP1、可溶性Ig−W、あるいは遊離PLP1ペプチド投与の結果を示す。可溶性Ig−PLP1の投与は、EAEを罹患するマウスにおいて麻痺の重症度を低下させ、再発を抑制した。
【図23】
図23は、EAEの発生分化を誘導したマウスに対する可溶性Ig−PLP1、可溶性ig−PLP−LR、あるいは可溶性Ig−W投与の結果を示す。Ig−PLP1及びIg−PLP−LR処理マウスはどちらも、疾患の初期ピーク中において臨床的重症度を軽減した。Ig−W投与マウスは観察した全120日を通して再発を示したが、Ig−PLP1及びIg−PLP−LR処理マウスはそれぞれ31日及び38日までに麻痺を回復し、再発を示さなかった。
【図24】
図24は、EAE罹患マウスにアジュバンドを含まない可溶性Ig−PLP1を投与した後における同時刺激性分子レベルを示す。Ig−PLP1を投与されたマウスは、培地のみを投与されたコントロールマウスよりも低いB7.1及びCD40レベルを呈示した。
【図25】
図25は、凝集性Ig−PLP1の投与が、長期間にわたる状態の臨床段階付けによって示されるように、マウスにおいて効果的にEAEを改善することを示す。
【図26】
図26A及び26Bは、凝集性Ig−PLP1に精製APCを加えてインキュベートすると、好都合にも抗炎症性サイトカインIL−6(26A)及びIL−10(26B)の産生を誘導することを示す。
【図27】
図27aは、凝集性Ig−PLP1及び凝集性Ig−WがEAEを改善する能力を比較する。凝集性Ig−PLP1を投与されたマウスは疾患重症度の低下を呈したが、一方凝集性Ig−W処理マウスは決して回復せず、臨床評価の全期間を通じて再発を示した。
図27bは、可溶性Ig−PLP1と凝集性Ig−PLP1による処理後のPLP1ペプチド誘発性EAEの疾患経過の直接比較である。凝集Ig−PLP1を投与されたマウスの最大臨床スコア平均値ははるかに低く、また回復時間は可溶性Ig−PLP1を投与されたマウスよりも迅速であった。
【図28】
図28aは、脾臓細胞によるIL−10産生を誘導するための、凝集性Ig−PLP1、可溶性Ig−PLP1、凝集性Ig−W、凝集性Ig−PLP2及び可溶性Ig−PLP2の能力の比較である。凝集性Ig−PLP1、Ig−PLP2、及びIg−Wキメラは、脾臓細胞によるIL−10の産生を用量依存性で刺激するが、一方キメラの可溶型は検知可能レベルのIL−10を誘導しなかった。
図28bは、B細胞、樹状細胞、及びマクロファージによるIL−10産生に対する凝集性Ig−PLP1及びIgMの効果を示す。B細胞ではなく、マクロファージ及び樹状細胞は、凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートするとIL−10を産生する。マウスIgMは、試験されたいずれのAPCによってもIL−10産生を刺激できなかった。
【図29】
図29は、脾細胞を0.1μM 可溶性Ig−PLP1、0.1μM 凝集性Ig−PLP1、0.1μM 凝集性Ig−PLP1+50μg/mL 2.4G2、または0.1μM 凝集Ig−PLP1+100μg/mL マウスIgと接触後のIL−10産生を示す。凝集性Ig−PLP1は、FcγR1レセプターを架橋することによってIL−10を誘導する。
【図30】
図30aは、PLP1、PLP2、凝集性Ig−PLP1及び凝集性Ig−PLP2に対するTCC−PLP1−1B10の増殖応答を示す。TCC−PLP1−1B10は、遊離PLP1ペプチドまたは凝集Ig−PLP1で予めパルスしたパラホルムアルデヒド固定脾臓APCを加えてインキュベートすると増殖するが、APCをネガティブコントロールであるPLP2または凝集性Ig−PLP2でパルスした場合には有意な増殖を示さない。
図30bは、TCC−PLP1−1B10に非固定脾臓APC及び遊離PLP1ペプチドまたは凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートした時のIL−2産生の測定結果である。TCC−PLP1−1B10は、遊離PLP1ペプチド及び凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートすると大量のIL−2を産生した。
図30cは、TCC−PLP1−1B10に非固定脾臓APC及び遊離PLP1ペプチドまたは凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートした時のIFNγ産生の測定である。TCC−PLP1−1B10は、遊離PLP1ペプチド及び凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートすると大量のIFNγを産生した。
図30dは、TCC−PLP1−1B10に非固定脾臓APC及び遊離PLP1ペプチドまたは凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートした時のIL−4産生の測定である。TCC−PLP1−1B10は、遊離PLP1ペプチド及び凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートすると大量のIL−4を産生した。
図30eは、TCC−PLP1−1B10に非固定脾臓APC及び遊離PLP1ペプチドまたは凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートした時のIL−10産生の測定である。IL−10は、刺激剤が遊離PLP1ではなく凝集性Ig−PLP1のときに有意なレベルで検出可能であった。
【図31】
図31は、固定または生APCに凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートして、それに引き続いてTCC−PLP1−1B10を加えてインキュベートした後のIL−10産生の測定である。Il−10は、固定APCでは検出不能であったが、生APCはこれを産生した。
【図32】
図32aは、T細胞によるIFNγの産生に拮抗するために脾細胞によって産生されるIL−10の能力を測定する。脾細胞によって産生されるIL−10は、T細胞によるIFNγの産生に拮抗作用することができる。
図32bは、T細胞によるIFNγの産生に拮抗作用するための樹状細胞によって産生されるIL−10の能力を測定する。樹状細胞によって産生されるIL−10は、T細胞によるIFNγの産生に拮抗作用することができる。
図32cは、T細胞によるIFNγの産生に拮抗作用するためにマクロファージによって産生されるIL−10の能力を測定する。マクロファージによって産生されるIL−10は、T細胞によるIFNγの産生に拮抗作用することができる。
図32dは、B細胞に凝集Ig−PLP1及びTCC−PLP1−1B10を加えてインキュベートしたときのIL−10及びIFN−γレベルを示す。B細胞は凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートしたときにはIL−10を産生せず、またT細胞によるIFNγの分泌を阻害しない。
【図33】
図33aは、TCC−PLP1−1B10に腹膜マクロファージ及び凝集性Ig−PLP1を加えてインキュベートしたときに産生されるIFNγ及びIL−10レベルを示す。IFNγ産生は、提示マクロファージによって分泌されるIL−10レベルに比例して減少した。
図33bは、TCC−PLP1−1B10に腹膜マクロファージ、凝集性Ig−PLP1、及び抗IL−10mAbである2A5を加えてインキュベートしたときに産生されるIFNγ及びIL−10レベルを示す。T細胞によるIFNγ産生の阻害は、抗IL−10 mAbである2A5によるそのようなIL−10の中和がIFNγ産生を回復するため、APC誘導性IL−10に直接関連する。
図33cは、TCC−PLP1−1B10に腹膜マクロファージ、凝集性Ig−PLP1、及びラットIgGを加えてインキュベートしたときに産生されるIFNγ及びIL−10レベルを示す。抗IL−10の代わりにイソタイプコントロールであるラットIgGを加えてインキュベートしても、TCC−PLP1−1B10によるIFNγ産生を阻害するIL−10の能力に効果はなかった。
【図34】
図34aは、EAE罹患マウスにおける凝集性Ig−PLP1、凝集性Ig−PLP1+抗IL−10、凝集性Ig−PLP1+ラットIgG、凝集性Ig−W、または凝集性Ig−W+抗IL−10による処理効果を示す。IL−10に対する抗体は、凝集性Ig−PLP1による疾患症状の改善を阻止した。
図34bは、EAE罹患マウスに対する可溶性Ig−PLP1、凝集性Ig−PLP1、可溶性Ig−PLP1+IL−10、あるいは凝集性Ig−Wによる処理効果を示す。可溶性Ig−PLP1は、検出可能なレベルのIL―10を誘導せず、疾患を僅かに改善するが、一方可溶性Ig−PLP1に外因性IL−10を加えると、凝集性Ig−PLP1処理マウスに観察されるレベルと同等なレベルまでさらに疾患を軽減する。
【図35】
図35は、EAE罹患マウスに対する凝集性Ig−W、凝集性Ig−PLP1、または凝集性Ig−W+PLP1による処理効果を示す。凝集性Ig−PLP1による処理のみが疾患症状を軽減し、これは内因性IL−10が疾患を調節するためには、APCがT細胞に物理的に架橋する必要があることを実証した。
【図36】
図36は、EAE罹患マウスに対する凝集性Ig−PLP−LRまたは凝集性Ig−PLP1投与効果を示す。これらの免疫調節剤のいずれかを投与されたマウスは疾患を回復するが、凝集性Ig−PLP1を用いると回復がさらに迅速である。
【図37】
図37は、図36と同様に処理されたマウスの組織病理学的分析である。凝集性Ig−PLP1処理マウスは、大脳及び腰脊髄のどちらにおいても炎症病巣数が有意に減少した。
【図38】
図38は、腹膜マクロファージ上の同時刺激性分子レベルに対する凝集性Ig−PLP1の効果を示す。凝集性Ig−PLP1はB7.1、B7.2、またはCD40発現をダウンレギュレートする。
【図39】
図39aは、PLP1及びPLP2の両方によってEAEが誘導されたマウスに対する凝集性Ig−PLP1処理効果を示す。凝集性Ig−PLP1処理は疾患重症度を軽減した。
図39bは、PLP2によってEAEが誘導されたマウスに対する凝集性Ig−PLP1処理効果を示す。凝集性Ig−PLP1処理は疾患重症度を軽減した。
【図40】
図40aは、CNSホモジネートでEAEを誘導後に凝集性Ig−PLP1またはIg−Wで処理されたマウスの、PLP1、PLP2、MBP3、またはHAへの応答におけるT細胞増殖アッセイを示す。
図40bは、図40aのマウスのIL−2レベルを示す。
図40cは、図40aのマウスのIFNγレベルを示す。
図40dは、図40aのマウスのIL−4レベルを示す。
図40eは、図40aのマウスのIL−10レベルを示す。
図40fは、図40aのマウスのIL−5レベルを示す。
図40gは、図40aのマウスのTGFβレベルを示す。
【図41】
図41は、CNSホモジネートによってEAEが誘導されたマウスに対する凝集性Ig−PLP1処理効果を示す。凝集性IgPLP1処理は疾患重症度を軽減した。
Claims (67)
- 自己免疫疾患に関連する抗原に結合する免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物であって、前記組成物が抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターを架橋することができる組成物。
- 前記組成物がさらに薬学的に許容可能な担体を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物がアジュバントを含まない、請求項2に記載の組成物。
- 前記免疫グロブリンが多価型である、請求項1に記載の組成物。
- 前記免疫グロブリンが基質中に包埋または吸着されている、請求項1に記載の組成物。
- 前記免疫グロブリンが凝集している、請求項1に記載の組成物。
- 前記免疫グロブリンがIgG分子である、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗原が疾患に関連する抗原を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗原が、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗原がプロテオリピドタンパク質由来の抗原である、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗原がミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である、請求項1に記載の組成物。
- 前記免疫グロブリンまたはその一部が免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記免疫グロブリンが、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗原が、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換する、請求項13に記載の組成物。
- 前記抗原がCDR3内に位置している、請求項14に記載の組成物。
- 前記免疫グロブリンがヒトIgG分子である、請求項1に記載の組成物。
- 前記免疫グロブリンがキメラである、請求項1に記載の組成物。
- 自己免疫疾患に関連する症状を改善する方法であって、前記方法が、前記自己免疫疾患に係わる抗原と結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を得ることを含み、前記組成物が抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターを架橋することができ、並びに前記組成物を前記自己免疫疾患に罹患している個体に投与することを含む方法。
- 前記組成物がさらに薬学的に許容可能な担体を含む、請求項18に記載の組成物。
- 前記組成物がアジュバントを含まない、請求項19に記載の組成物。
- 前記免疫グロブリンが凝集している、請求項18に記載の組成物。
- 前記抗原が疾患に関連する、請求項18に記載の方法。
- 前記抗原が自己免疫疾患に関連する、請求項18に記載の方法。
- 前記抗原が、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する、請求項18に記載の方法。
- 前記抗原がプロテオリピドタンパク質由来の抗原である、請求項18に記載の方法。
- 前記抗原がミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である、請求項18に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンまたはその一部が免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンが、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記抗原が、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの範囲内に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換する、請求項18に記載の方法。
- 前記抗原がCDR3内に位置している、請求項29に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンがヒトIgG分子である、請求項18に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンがキメラである、請求項18に記載の方法。
- 個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法が、IL−10レベルを増加する必要性のある個体を識別すること、並びに抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することによって前記個体のIL−10レベルを増加することを含み、前記組成物が抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターを架橋することができる方法。
- 前記個体が自己免疫疾患に罹患している、請求項33に記載の方法。
- 前記組成物がさらに薬学的に許容可能な担体を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記組成物がアジュバントを含まない、請求項33に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンが凝集している、請求項33に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンが脂質またはポリマー基質上に固定化されている、請求項33に記載の方法。
- 前記抗原が自己免疫疾患に関連する、請求項33に記載の方法。
- 前記抗原が、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する、請求項34に記載の方法。
- 前記抗原がプロテオリピドタンパク質由来の抗原である、請求項33に記載の方法。
- 前記抗原がミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である、請求項33に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンまたはその一部が免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンが、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記抗原が、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換する、請求項33に記載の方法。
- 前記抗原がCDR3内に位置している、請求項45に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンがヒトIgG分子である、請求項33に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンがキメラである、請求項33に記載の方法。
- 個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法が、IL−10レベルを増加する必要性及び末梢性寛容を刺激する必要性のある個体を識別すること、並びに抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することによって前記個体のIL−10レベルを増加し且つ末梢性寛容を刺激することを含み、前記組成物が抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターを架橋することができる方法。
- 前記抗原が自己免疫疾患に関連する、請求項49に記載の方法。
- 前記個体が自己免疫疾患に罹患している、請求項49に記載の方法。
- 前記組成物がさらに薬学的に許容可能な担体を含む、請求項51に記載の方法。
- 前記組成物がアジュバントを含まない、請求項52に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンが凝集している、請求項49に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンが脂質またはポリマー基質上に固定化されている、請求項49に記載の方法。
- 前記抗原が、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する、請求項50に記載の方法。
- 前記抗原がプロテオリピドタンパク質由来の抗原である、請求項49に記載の方法。
- 前記抗原がミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である、請求項49に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンまたはその一部が免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む、請求項49に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンが、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む、請求項49に記載の方法。
- 前記抗原が、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換する、請求項49に記載の方法。
- 前記抗原がCDR3内に位置している、請求項61に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンがヒトIgG分子である、請求項49に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンがキメラである、請求項49に記載の方法。
- 個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法が、IFNγレベルを低下させる必要性のある個体を識別し、並びに抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することによって前記個体のIFNγレベルを低下させることを含み、前記組成物が抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターを架橋することができる方法。
- 前記抗原が自己免疫疾患に関連する、請求項65に記載の方法。
- 複数の自己抗原に対する免疫応答に起因する自己免疫疾患の症状を軽減する方法であって、前記方法が、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することを含み、前記組成物が、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターを架橋することができ、並びに前記抗原が前記自己免疫疾患の原因となる抗原の一つである方法。
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