PT1625209E - Híbridos monômero-dímero quiméricos de imunoglobulina - Google Patents

Híbridos monômero-dímero quiméricos de imunoglobulina Download PDF

Info

Publication number
PT1625209E
PT1625209E PT47759469T PT04775946T PT1625209E PT 1625209 E PT1625209 E PT 1625209E PT 47759469 T PT47759469 T PT 47759469T PT 04775946 T PT04775946 T PT 04775946T PT 1625209 E PT1625209 E PT 1625209E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
factor
chimeric protein
constant region
sequence
monomer
Prior art date
Application number
PT47759469T
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel S Rivera
Robert T Peters
Alan J Bitonti
Adam R Mezo
James M Stattel
Susan C Low
Original Assignee
Biogen Idec Hemophilia Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33458764&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PT1625209(E) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Hemophilia Inc filed Critical Biogen Idec Hemophilia Inc
Publication of PT1625209E publication Critical patent/PT1625209E/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Description

DESCRIÇÃO
HÍBRIDOS MONÔMERO—DíMERO QUIMÉRICOS DE IMUNOGLOBULINA
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se geralmente a proteínas quiméricas terapêuticas, compreendidas por duas cadeias de polipeptídeo, onde a primeira cadeia é compreendida por uma molécula terapêutica biologicamente ativa e a segunda cadeia não é compreendida pela molécula terapêutica biologicamente ativa da primeira cadeia. Mais especificamente, a invenção refere-se a proteínas quiméricas, compreendidas por duas cadeias de polipeptídeos, onde ambas as cadeias são compreendidas por pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina onde a primeira cadeia é modificada para ainda compreender uma molécula biologicamente ativa, e a segunda cadeia não é assim modificada. A invenção, assim refere-se a uma proteína quimérica que é um híbrido monômero-dímero, isto é, uma proteína quimérica tendo um aspecto dimérico e um aspecto monomérico, onde o aspecto dimérico refere-se ao fato de que ela é compreendida por duas cadeias de polipeptídeos cada uma compreendida por uma porção de uma região constante de imunoglobulina, e onde o aspecto monomérico refere-se ao fato de que somente uma das duas cadeias é compreendida por uma molécula terapêutica biologicamente ativa. A Figura 1 ilustra um exemplo de um híbrido monômero-dímero onde a molécula biologicamente ativa é eritropoiet ina (EPO) e a porção de uma região constante de imunoglobulina é uma região Fc IgG.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1
Imunoglobulinas são compreendidas por quatro cadeias de polipeptideo, duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, que se associam através de ligações dissulfeto para formação de tetrâmeros. Cada cadeia é 5 ainda compreendida por uma região variável e uma região constante. As regiões variáveis mediam reconhecimento e ligação de antigeno, enquanto as regiões constantes, particularmente as regiões constantes de cadeia pesada, mediam uma variedade de funções efetoras, por exemplo, ligação de complemento e ligação de receptor de Fc (ver, por exemplo, patentes US N°s 6,086,875; 5,624,821; 5,116,964). A região constante é ainda compreendida por dominios representados dominios CH (pesado constante) (CHI, CH2, etc.). Dependendo do isotipo (isto é, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) a região constante pode ser compreendida por três ou quatro domínios CH. Algumas regiões constantes de isotipos (por exemplo, IgG) também contêm uma região gonzo (Janeway et al. 2001, Imunnobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y. A criação de proteínas quiméricas compreendidas por regiões constantes de imunoglobulina ligadas a uma proteína de interesse, ou seu fragmento, foi descrita (ver, por exemplo, patentes US N°s 5,480,981 e 5,808,029; Gascoigne et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:2936; Capon et ai. 1989, nature 337:525; Traunecker et al. 1989, Nature 339:68; Zettmeissl et al. 1990, ADN Cell. Biol. USA 9:347; Byrn et ai. 1990, Nature 344:667; Watson et al. 1990, J. Cell Biol. 110:2221; Watson et al. 1991, Nature 349:164; Aruffo et al. 1990, Cell 61:1303; Linsley et al. 1991, J. Exp. Med. 173:721; Linsley et al. 1991, J. Exp. Med. 174:561; Stamenkovic et al., 1991, Cell 66:1133; Ashkenazi et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10535; Lesslauer et al. 1991, Eur. J. Immunol. 27:2883; Peppel et al. 1991, 2 J. Exp. Med. 174:1483; Bennett et al. 1991, J. Biol. Chem. 266:23060; Kurschner et al. 1992, J. Biol. Chem. 267:9354; Chalupny et al. 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. 30 USA 89:10360; Ridgway and Gorman, 1991, J. Cell. Biol. 115, Abstract N° 1448: Zheng et al. 1995, J. Immun. 154:5590). Estas moléculas usualmente possuem a atividade biológica associada com a molécula de interesse ligada assim como a função efetora, ou alguma outra caracteristica associada à região constante de imunoglobulina (por exemplo, estabilidade biológica, secreção celular). A porção Fc de uma região constante de imunoglobulina, dependendo do isotipo de imunoglobulina pode incluir os domínios CH2, CH3 e CH4, assim como a região gonzo. Proteínas quiméricas compreendendo uma porção Fc de uma imunoglobulina outorgam várias propriedades desejáveis sobre uma proteína quimérica incluindo aumentada estabilidade, aumentada meia vida de soro (ver Capon et ai. 1989, Nature 337:525) assim como ligação a receptores de Fc como o receptor de Fc neonatal (FcRn) (patentes US N°s 6 086 875, 6 485 726, 6 030 613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).
FcRn é ativo em tecido epitelial adulto e expresso no lúmen dos intestinos, vias aéreas pulmonares, superfícies nasais, superfícies vaginais, superfícies de cólon e reto (patente US N° 6 485 726). Proteínas quiméricas compreendidas por parceiros de ligação de FcRn (por exemplo, IgG, fragmentos Fc) podem ser efetivamente lançadas através de barreiras epiteliais por FcRn, assim provendo um meio não-invasivo para administrar sistemicamente uma desejada molécula terapêutica. Adicionalmente, proteínas quiméricas compreendendo um parceiro de ligação de FcRn são endocitosadas por células expressando o FcRn. Mas ao invés 3 de serem marcadas para degradação, estas proteínas quiméricas são recicladas novamente em circulação, assim aumentando a meia-vida in vivo destas proteínas.
Porções de regiões constantes de imunoglobulina, por exemplo, parceiros de ligação de FcRn tipicamente associam-se, via ligações dissulfeto e outras interações não-específicas, uns com os outros para formação de dímeros e multímeros de ordem superior. A presente invenção é baseada em parte na surpreendente descoberta de que transcitose de proteínas quiméricas compreendidas por parceiros de ligação de FcRn parece ser limitada pelo peso molecular da proteína quimérica, com espécies de maior peso molecular sendo transportadas menos eficientemente.
Proteínas quiméricas compreendidas por moléculas biologicamente ativas, uma vez administradas, tipicamente interagirão com uma molécula ou célula alvo. A presente invenção é ainda baseada em parte na surpreendente descoberta de que híbridos monômero-dímero, com uma molécula biologicamente ativa, mas duas porções de uma região constante de imunoglobulina, por exemplo, dois parceiros de ligação de FcRn, funcionam e podem ser transportados mais efetivamente que homodímeros, também referidos aqui simplesmente como "dímeros" ou multímeros de ordem superior com duas ou mais cópias da molécula biologicamente ativa. Isto é devido em parte ao fato de que proteínas quiméricas, compreendidas por duas ou mais moléculas biologicamente ativas, que existem como dímeros e multímeros de ordem superior, podem ser estereamente impedidas de interagirem com sua molécula ou célula alvo, devido à presença das duas ou mais moléculas biologicamente ativas em grande proximidade uma da outra e que a molécula 4 biologicamente ativa pode ter uma alta afinidade por si mesma.
De acordo com um aspecto a presente invenção provê proteínas quiméricas compreendidas por uma molécula biologicamente ativa que é transportada através de barreira de epitélio. Um adicional aspecto da invenção provê proteínas quiméricas compreendidas por pelo menos uma molécula biologicamente ativa que é capaz de interagir com sua molécula ou célula alvo com pequeno ou nenhum impedimento estéreo ou auto-agregação.
Os aspectos da invenção provêm proteínas quiméricas compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos, a primeira cadeia compreendendo pelo menos uma porção de região constante de imunoglobulina, onde a porção de uma região constante de imunoglobulina foi modificada para incluir uma molécula biologicamente ativa e a segunda cadeia compreendendo pelo menos uma porção de região constante de imunoglobulina, onde a porção de uma região constante de imunoglobulina não foi modificada para incluir a molécula biologicamente ativa da primeira cadeia.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente descrição refere-se a uma proteína quimérica compreendendo uma molécula biologicamente ativa e duas moléculas de pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina. A proteína quimérica é capaz de interagir com uma molécula ou célula alvo com menos impedimento estéreo comparada a uma proteína quimérica compreendida por pelo menos duas moléculas biologicamente ativas e pelo menos uma porção de duas regiões constantes de imunoglobulina. A presente descrição também refere-se a 5 uma proteína quimérica compreendendo pelo menos uma molécula biologicamente ativa e duas moléculas de pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina que é transportada através de uma barreira de epitélio mais eficientemente que um correspondente homodímero, isto é, onde ambas cadeias estão ligadas à mesma molécula biologicamente ativa. A presente divulgação, assim refere-se a uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeo ligadas, onde a dita primeira cadeia compreende uma molécula biologicamente ativa e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, e a dita segunda cadeia compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, mas nenhuma região variável de imunoglobulina e sem qualquer molécula biologicamente ativa ligada. A presente divulgação refere-se a uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeo ligadas, onde a dita primeira cadeia compreende uma molécula biologicamente ativa e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, e a dita segunda cadeia compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina numa região variável de imunoglobulina ou qualquer molécula biologicamente ativa e onde a dita segunda cadeia não está ligada covalentemente a qualquer molécula tendo um peso molecular maior que 1 kD, 2 kD, 5 kD, 10 kD, ou 20 kD. Numa modalidade, a segunda cadeia não está covalentemente ligada a qualquer molécula tendo um peso molecular maior que 0-2 kD. Numa modalidade, a segunda cadeia não está covalentemente ligada a qualquer molécula tendo um peso molecular maior que 5-10 kD. Numa modalidade, a segunda cadeia não está covalentemente ligada a qualquer molécula tendo um peso molecular maior que 15-20 kD. 6 A presente divulgação refere-se a uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos ligada, onde a dita primeira cadeia compreende uma molécula biologicamente ativa e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, e a dita segunda cadeia compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina não ligada covalentemente a qualquer outra molécula exceto a porção de uma imunoglobulina da dita primeira cadeia de polipeptídeo. A presente divulgação refere-se a uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos ligada, onde a dita primeira cadeia compreende uma molécula biologicamente ativa e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, e a dita segunda cadeia consiste em pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e opcionalmente um marcador de afinidade. A presente divulgação refere-se a uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos ligada, onde a dita primeira cadeia compreende uma molécula biologicamente ativa e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, e a dita segunda cadeia consiste essencialmente em pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e opcionalmente um marcador de afinidade. A presente divulgação refere-se a uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos ligada, onde a dita primeira cadeia compreende uma molécula biologicamente ativa e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e a dita segunda cadeia compreende pelo menos uma porção de uma 7 região constante de imunoglobulina numa região variável de imunoglobulina ou qualquer molécula biologicamente ativa e opcionalmente uma molécula com um peso molecular de menos que 10 kD, 5 kD, 2 kD ou 1 kD. Numa modalidade, a segunda cadeia compreende uma molécula de menos que 15-20 kD. Numa modalidade, a segunda cadeia compreende uma molécula de menos que 5-10 kD. Numa modalidade, a segunda cadeia compreende uma molécula de menos que 1-2 kD. A presente divulgação refere-se a uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos, onde a dita primeira cadeia compreende uma molécula biologicamente ativa, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, e pelo menos um primeiro domínio, o dito primeiro domínio tendo pelo menos um parceiro de ligação específico, e onde a dita segunda cadeia compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, e pelo menos um segundo domínio, onde o dito segundo domínio é um parceiro de ligação específico do dito primeiro domínio, sem qualquer região variável de imunoglobulina ou uma molécula biologicamente ativa.
A presente divulgação refere-se a um processo de fabricação de uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos, onde a primeira cadeia de polipeptídeo e a segunda cadeia de polipeptídeo não são idênticas, o dito processo compreendendo transfecção de uma célula com um primeiro constructo de ADN compreendendo uma molécula de ADN codificando uma primeira cadeia de polipeptídeo compreendendo uma molécula biologicamente ativa e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e opcionalmente um ligante, e um segundo constructo de ADN compreendendo uma molécula de ADN codificando uma segunda cadeia de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina sem qualquer molécula biologicamente ativa ou uma região variável de imunoglobulina, e opcionalmente um ligante, cultura de células sob condições tais que a cadeia de polipeptídeo codificada pelo primeiro constructo de ADN seja expressa e a cadeia de polipeptídeo codificada pelo segundo constructo de ADN seja expressa e isolamento de híbridos monômero-dímero compreendidos pela cadeia de polipeptídeo codificada pelo primeiro constructo de ADN e a cadeia de polipeptídeo codificada pelo segundo constructo de ADN. A presente divulgação refere-se a um processo de fabricação de uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos, onde a primeira cadeia de polipeptídeo e a segunda cadeia de polipeptídeo não são idênticas, e onde a dita primeira cadeia de polipeptídeos compreende uma molécula biologicamente ativa, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, e pelo menos um primeiro domínio, o dito primeiro domínio, tendo pelo menos um parceiro de ligação específico, e onde a dita segunda cadeia de polipeptídeo compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e um segundo domínio, onde o dito segundo domínio, é um parceiro de ligação específico do dito primeiro domínio, sem qualquer molécula biologicamente ativa ou uma região variável de imunoglobulina, o dito processo compreendendo transfecção de uma célula com um primeiro constructo de ADN compreendendo uma molécula de ADN codificando a dita primeira cadeia de polipeptídeo e um segundo constructo de ADN compreendendo uma molécula de ADN codificando a dita segunda cadeia de polipeptídeo, cultura de células sob condições tais que a cadeia de polipeptídeo codificada pelo 9 primeiro constructo de ADN seja expressa e a cadeia de polipeptideo codificada pelo segundo constructo de ADN seja expressa e isolamento de híbridos monômero-dímero compreendidos pela cadeia de polipeptideo codificada pelo primeiro constructo de ADN e cadeia de polipeptideo codificada pelo segundo constructo de ADN. A presente divulgação refere-se a um processo de fabricação de uma proteína guimérica da invenção o dito processo compreendendo transfecção de uma célula com um primeiro constructo de ADN compreendendo uma molécula de ADN codificando uma primeira cadeia de polipeptideo compreendendo uma molécula biologicamente ativa e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e opcionalmente um ligante, cultura de célula sob condições tais que a cadeia de polipeptideo codificada pelo primeiro constructo de ADN seja expressa, isolamento de cadeia de polipeptideo codificada pelo primeiro constructo de ADN e transfecção de uma célula com um segundo constructo de ADN compreendendo uma molécula de ADN codificando uma segunda cadeia de polipeptideo compreendendo pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina sem qualquer molécula biologicamente ativa ou região variável de imunoglobulina, cultura de célula sob condições tais que a cadeia de polipeptideo codificada pelo segundo constructo de ADN seja expressa, isolamento de cadeia de polipeptideo codificada pelo segundo constructo de ADN, combinação de cadeia de polipeptideo codificada pelo primeiro constructo de ADN e a cadeia de polipeptideo codificada pelo segundo constructo de ADN sob condições tais que híbridos monômero-dímero compreendendo a cadeia de polipeptideo codificada pelo primeiro constructo de ADN e a cadeia de polipeptideo codificada pelo segundo constructo de ADN se formam, e isolamento dos ditos híbridos monômero-dímero. 10 A presente divulgação refere-se a um processo de fabricação de uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos, onde a primeira cadeia de polipeptídeo e a segunda cadeia de polipeptídeos não são idênticas, o dito processo compreendendo transfecção de uma célula com um constructo de ADN compreendendo uma moléculade ADN codificando uma cadeia de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, cultura de células sob condições tais que a cadeia de polipeptídeo codificada pelo constructo de ADN é expressa com uma cisteína terminal N de modo que dímeros da cadeia de polipeptídeo se formam e isolamento de dímeros compreendidos por duas cópias da cadeia de polipeptídeo codificada pelo constructo de ADN e reagindo quimicamente os dímeros isolados com uma molécula biologicamente ativa, onde a dita molécula biologicamente ativa tem um tioéster término C, sob condições tais que a molécula biologicamenteativa reage predominantemente com somente uma cadeia de polipeptídeo do dímero pelo que formando um híbrido monômero-dímero. A presente divulgação refere-se a um processo de fabricação de uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos, onde a primeira cadeia de polipeptídeo e a segunda cadeia de polipeptídeos não são idênticas, o dito processo compreendendo transfecção de uma célula com um constructo de ADN compreendendo uma molécula de ADN codificando uma cadeia de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, cultura de células sob condições tais que a cadeia de polipeptídeo codificada pelo constructo de ADN seja expressa com uma cisteína terminal N de modo que dímeros das cadeias de polipeptídeo se formam, e isolamento de dímeros compreendidos por duas cópias da cadeia de 11 polipeptídeo codificada pelo constructo de ADN, e reagindo quimicamente os dimeros isolados com uma molécula biologicamente ativa, onde a dita molécula biologicamente ativa tem um tioéster término C, de modo que a molécula biologicamente ativa está ligada a cada cadeia do dimero, desnaturação de dimero compreendido pela porção da imunoglobulina ligada à molécula biologicamente ativa de modo que cadeias monoméricas se formam, combinação de cadeias monoméricas com uma cadeia de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina numa molécula biologicamente ativa ligada à mesma, de modo que híbridos monômero-dímero se formam, e isolamento de híbridos monômero-dímero. A presente divulgação refere-se a um processo de fabricação de uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos, onde a primeira cadeia de polipeptídeo e a segunda cadeia de polipeptídeo não são idênticas, o dito processo compreendendo transfecção de uma célula com um constructo de ADN compreendendo uma molécula de ADN codificando uma cadeia de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, cultura de células sob condições tais que a cadeia de polipeptídeo codificada pelo constructo de ADN é expressa como uma mistura de duas cadeias de polipeptídeos,onde a mistura compreende um polipeptídeo com uma cisteína terminal N, e um polipeptídeo com uma cisteína em grande proximidade do término N, isolamento de dimeros compreendidos pela mistura de cadeias de polipeptídeos codificadas pelo constructo de ADN e reagindo quimicamente os dimeros isolados com uma molécula biologicamente ativa, onde a dita molécula biologicamente ativa tem um tioéster ativo, de modo que pelo menos algum híbrido monômero-dímero 12 se forma e isolamento de híbrido monômero-dímero a partir da dita mistura. A presente divulgação refere-se a um processo de tratamento de uma doença ou condição compreendendo administração de uma proteína quimérica da invenção pelo que tratando a doença ou condição.
Adicionais objetivos e vantagens da invenção serão mostrados em parte na descrição que se segue, e em parte serão óbvios a partir da descrição, ou podem ser aprendidos através de prática da invenção. Os objetivos e vantagens da invenção serão realizados e obtidos por meio dos elementos e combinações particularmente destacadas nas reivindicações anexas. É para ser entendido que ambas, a descrição geral anterior e a seguinte descrição detalhada são exemplares e explanatórias somente e não são restritivas da invenção, como reivindicada.
Assim, com base na divulgação aqui contida, a presente invenção providencia uma proteína quimérica compreendendo uma primeira cadeia de polipéptidos e uma segunda cadeia de polipéptidos, em que a dita primeira cadeia de polipéptidos compreende um factor de coagulação e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina que é um receptor Fc neonatal (FcRn) parceiro de ligação e em que a dita segunda cadeia de polipéptidos consiste numa região constante de imunoglobulina, ou uma porção dos mesmo, é um parceiro de ligação FcRn, para uso num método de tratamento. 13 A presente invenção compreende ainda uma composição farmacêutica compreendendo a dita proteína quimérica e um excipiente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção compreende ainda um primeiro polinucleotídeo que codifica a primeira cadeia polipéptica da dita proteína quimérica e um segundo polinucleotídeo de codificação da segunda cadeia polipeptídica da dita proteína quimérica.
Outros aspetos e formas de realização da presente invenção são indicados nas reivindicações anexas.
Deve ser compreendido que ambas as descrições, a anterior e a descrição em detalhe que se segue, são exemplares e explicativas e não são restritivas da invenção, como reivindicada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um diagrama esquemático comparando a estrutura de um homodímero EPO-Fc, ou dímero, e a estrutura de um híbrido monômero-dímero Epo-Fc. A Figura 2a é a sequência de aminoácidos do Fator VII-Fc de proteína quimérica. Incluído na sequência é o peptídeo sinal (sublinhado), que é clivado pela célula e o pró-peptídeo (negrito), que é reconhecido pela carboxilase e dependente de vitamina K que modifica o Fator VII para obter atividade total. A sequência é subsequentemente clivada por PACE para render Fator VII-Fc. A Figura 2b é a sequência de aminoácidos do Fator IX-Fc de proteína quimérica. Incluído na sequência está o peptídeo 14 sinal (sublinhado) que é clivado pela célula e o pró-peptideo (negrito) que é reconhecido pela carboxilase γ dependente de vitamina K que modifica o Fator IX para obter total atividade. A sequência é subsequentemente clivada por PACE para render Fator IX-Fc. A Figura 2c é a sequência de aminoácidos da proteína quimérica IFNa-Fc. Incluído na sequência é o peptídeo sinal (sublinhado), que é clivado pela célula resultando na IFNa-
Fc. A Figura 2d é a sequência de aminoácidos da proteína quimérica 30 IFNa-Fc Δ ligante. Incluído na sequência é o peptídeo sinal (sublinhado) que é clivado pela célula resultando na IFNa-Fc Δ ligante. A Figura 2e é a sequência de aminoácidos da proteína quimérica Flag-Fc. Incluído na sequência é o peptídeo sinal (sublinhado), que é activado pela célula resultando na Flag-Fc madura. A Figura 2f é a sequência de aminoácidos da proteína quimérica Epo-CCA-Fc. Incluída na sequência é o peptídeo sinal (sublinhado), que é clivado pela célula resultando em Epo-CCA-Fc madura. Também mostrado em negrito é o domínio da espira espiralada ácida. A Figura 2g é a sequência de aminoácidos da proteína quimérica CCS-Fc. Incluído na sequência é o peptídeo sinal (sublinhado), que é clivado pela célula resultando em CCS-fc madura. Também mostrado em negrito é o domínio espiral espiralado básico. 15 A Figura 2h é a sequência de aminoácidos da proteína quimérica Cys-Fc. Incluído na sequência está o peptídeo sinal (sublinhado), que é clivado pela célula resultando na Cys-fc madura. Quando esta sequência é produzida em células CHO uma percentagem das moléculas são incorretamente activadas pela peptidase sinal de modo que dois aminoácidos extras são deixados no término N, assim prevenindo a ligação de uma molécula biologicamente ativa com um tioéster terminal C (por exemplo, via ligação nativa). Quando estas espécies impropriamente clivadas dimerizam com a Cys-Fc clivada propriamente e são subsequentemente reagidas com moléculas biologicamente ativas com tioésteres terminais C, híbridos monômero-dímero se formam. A Figura 2i é a sequência de aminoácidos da proteína quimérica IFNa-GS15-Fc. Incluído na sequência está o peptídeo sinal (sublinhado) que é clivado pela célula resultando em IFNoí-GS15-Fc madura. A Figura 2j é a sequência de aminoácidos da proteína quimérica Epo-Fc. Incluído na sequência está o peptídeo sinal (sublinhado), que é clivado pela célula resultando na Epo-Fc madura. Também mostrado em negrito está o ligante de 8 aminoácidos. A Figura 3a é a sequência de ácidos nucleicos da proteína quimérica Fator VII-Fc. Incluído na sequência está o peptídeo sinal (sublinhado) e o pró-peptídeo (negrito) que é reconhecido pela carboxilase dependente de vitamina K que modifica o Fator VII para obter atividade total. A sequência traduzida é subsequentemente activada por PACE para render Fator VII-Fc maduro. 16 A Figura 3b é a sequência de ácidos nucleicos da proteína quimérica Fator IX-Fc. Incluído na sequência está o peptídeo sinal (sublinhado) e o pró-peptídeo (negrito) que é reconhecido pela carboxilase y dependente de vitamina K que modifica o Fator IX para obter atividade total. A sequência traduzida é subsequentemente clivada por PACE para render Fator IX-Fc maduro. A Figura 3c é a sequência de ácido nucleico da proteína quimérica IFNa-Fc. Incluído na sequência está o peptídeo sinal (sublinhado), que é activado pela célula após tradução resultando na IFNa-Fc madura. A Figura 3d é a sequência de ácidos nucleicos da proteína quimérica IFNa-Fc ligante. Incluído na sequência está o peptídeo sinal (sublinhado) que é activado pela célula após tradução resultando na IFNa-Fc Δ ligante madura. A Figura 3e é a sequência de aminoácidos da proteína quimérica Flag-Fc. Incluído na sequência está o peptídeo sinal (sublinhado), que é clivado pela célula após tradução resultando na Flag-Fc madura. A Figura 3f é a sequência de ácidos nucleicos da proteína quimérica Epo-CCA-Fc. Incluído na sequência está o peptídeo sinal (sublinhado), que é clivado pela célula após tradução resultando na Epo-CCA-Fc madura. É também mostrado em negrito o domínio espiral espiralado ácido. A Figura 3g é a sequência de ácidos nucleicos da proteína quimérica CCS-Fc. Incluído na sequência está o peptídeo sinal (sublinhado), que é clivado pela célula após tradução resultando na CCS-Fc madura. Também mostrado em negrito é o domínio espiral espirado básico. 17 A Figura 3h é a sequência de ácidos nucleicos da proteína quimérica Cys-Fc. Incluído na sequência está o peptídeo sinal (sublinhado), que é clivado pela célula após tradução resultando na Cys-Fc madura. A Figura 3i é a sequência de ácidos nucleicos da proteína quimérica IFNa-GS15-Fc. Incluído na sequência está o peptídeo sinal (sublinhado) que é clivado pela célula após tradução resultando na IFNoí-GS15-Fc madura. A Figura 3j é a sequência de ácidos nucleicos da proteína quimérica Epo-Fc. Incluído na sequência está o peptídeo sinal (sublinhado), que é clivado pela célula após tradução resultando na Epo-Fc madura. É também mostrado em negrito uma sequência de ácidos nucleicos codificando o ligante de 8 aminoácidos. A Figura 4 demonstra maneiras para formação de híbridos monômero-dímero através de ligação nativa. A Figura 5a mostra a sequência de aminoácidos de Fc MESNA (SEQ ID N°: 4). A Figura 5b mostra a sequência de ADN de Fc MESNA (SEQ ID N°: 5) . A Figura 6 compara atividade antiviral de IFNa homodímero (isto é, compreendido por 2 moléculas de IFNa) com um híbrido monômero-dímero IFNa (isto é, compreendido por uma molécula de IFNa). A Figura 7 é uma comparação de atividade coagulante de um Fator VIIa-Fc híbrido monômero-dímero quimérico (uma 18 molécula de Fator VII) e um Fator VIIa-Fc homodímero quimérico (duas moléculas, de Fator VII). A Figura 8 compara dosagem oral em ratos neonatais de um Fator VIIa-Fc híbrido monômero-dímero quimérico (uma molécula de Fator VII) e um Fator VIIa-Fc homodímero quimérico (duas moléculas de Fator VII). A Figura 9 compara dosagem oral em ratos neonatais de um Fator IX-Fc híbrido monômero-dímero quimérico (uma molécula de Fator IX) com um homodímero quimérico. A Figura 10 é um estudo de curso de tempo comparando um Fator IX-Fc híbrido monômero-dímero quimérico (uma molécula de Fator IX) administrado oralmente a ratos neonatais com um homodímero quimérico administrado oralmente. A Figura 11 demonstra fármaco - cinéticas de dímero Epo-Fc comparado a híbrido monômero-dímero Epo-Fc em macacos cynomolgus após uma dose pulmonar simples. A Figura 12 compara concentração em soro em macacos de híbrido monômero-dímero Epo-Fc administrado subcutaneamente com Aranesp™ (darbepoetina alfa) administrado subcutaneamente. A Figura 13 compara concentração em soro em macacos de híbrido monômero-dímero Epo-Fc administrado intravenosamente com Aranesp™ (darbepoetina alfa) e Epogen™ (epoetina alfa) administrados intravenosamente. A Figura 14 mostra um traço de uma coluna Mimetic Red 2™ (ProMetic Lifesciences, Inc., Wayne, NJ) e uma SDS-PAGE de frações a partir da coluna contendo híbrido monômero-dímero 19
EpoFc, dímero EpoFc, e Fc. Híbrido monômero-dímero EpoFc é encontrado em frações, 11, 12, 13, e 14. Dímero EpoFc é encontrado na fração 18. Fc é encontrado nas frações 1/2. A Figura 15 mostra as fármaco-cinéticas de IFNPFc com um ligante de 8 aminoácidos em macacos cynomolgus após uma dose pulmonar simples. A Figura 16 mostra estimulação de neopterina em resposta ao homodímero IFNp-Fc e o híbrido monômero-dímero ΙΡΝβ-Fc N297A em macacos cynomolgus. A Figura 17a mostra a sequência de nucleotídeos de interferon β-Fc; a Figura 17b mostra a sequência de aminoácidos de interferon β-Fc. A Figura 18 mostra a sequência de aminoácidos de T20(a); T21(b) e T1249(c). DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO A. Definições
Marcador de afinidade, como aqui usado, significa uma molécula ligada a uma segunda molécula de interesse, capaz de interagir com um específico parceiro de ligação para o propósito de isolamento ou identificação da dita segunda molécula de interesse.
Análogos de proteínas quiméricas da invenção, ou proteínas ou peptídeos substancialmente idênticos às proteínas quiméricas da invenção, como aqui usados, significam que uma sequência de aminoácidos relevante de uma proteína ou um peptídeo é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 20 98%, 99% ou 100% idêntica a uma dada sequência. A titulo de exemplo, tais sequências podem ser variantes derivadas de várias espécies, ou elas podem ser derivadas de uma dada sequência por truncação, supressão, substituição ou adição de aminoácido. A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada através de algoritmos de alinhamento padrões como, por exemplo, Basic Local Alignment Tool (BLAST) descrito em Altschul et al. 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410, o algoritmo de Needleman et ai. 1970, J. Mol. Biol., 48:444-453; o algoritmo de Meyers et ai. 1988, Computo Appl. Biosci., 4:11-17; ou Tatusova et al. 1999, FEMS Microbiol. Lett., 174:247-250, etc. Tais algoritmos são incorporados nos programas BLASTN, BLASTP e "BLAST 2 Sequences" (ver www.ncbLnlm.nih.gov/BLAST). Quando utilizando tais programas, os parâmetros default podem ser usados. Por exemplo, para sequências de nucleotideos as seguintes fixações podem ser usadas para "BLAST 2 Sequences": programa BLASTN, prémio para emparelhamento 2, penalidade para desemparelhamento -2, folga aberta e folga de extensão penalidades 5 e 2, respectivamente, folga x_ retirada 50, espera 10, tamanho de palavra 11, filtro ligado. Para sequências de aminoácidos as seguintes fixações podem ser usadas para "BLAST 2 Sequences": programa BLASTP, matriz BLOSUM62, penalidades de folga aberta e folga de extensão de 11 e 1, respectivamente, folga x_ retirada 50, espera 10, tamanho de palavra 3, filtro LIGADO.
Biodisponibilidade, como aqui usado, significa a extensão e taxa nas quais uma substância é absorvida em um sistema vivo ou é feita disponível no sítio de atividade fisiológica. 21
Molécula biologicamente ativa, como aqui usado, significa uma molécula de não-imunoglobulina ou seu fragmento, capaz de tratar uma doença ou condição no corpo realizando uma função ou uma ação, ou estimulando ou respondendo a uma função, uma ação, ou uma reação, num contexto biológico (por exemplo, em um organismo, uma célula, ou um seu modelo in vitro) . Moléculas biologicamente ativas podem compreender pelo menos um de polipeptideos, ácidos nucleicos, moléculas pequenas como moléculas pequenas orgânicas ou inorgânicas.
Uma proteína quimérica, como aqui usado, refere-se a qualquer proteína compreendida por uma primeira sequência de aminoácidos derivada de uma primeira fonte, ligada, covalentemente ou não-covalentemente, a uma segunda sequência de aminoácidos derivada de uma segunda fonte, onde a primeira e segunda fontes não são idênticas. Uma primeira fonte e uma segunda fonte que não são idênticas podem incluir duas diferentes entidades biológicas, ou duas diferentes proteínas a partir da mesma entidade biológica, ou uma entidade biológica e uma entidade não-biológica. Uma proteína quimérica pode incluir, por exemplo, uma proteína derivada de pelo menos 2 fontes biológicas diferentes. Uma fonte biológica pode incluir qualquer sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos produzida não sinteticamente (por exemplo, uma sequência de ADNc ou genómico, um vetor plasmídeo ou virai, um virion nativo ou um mutante ou análogo, como ainda descrito aqui, de qualquer um dos acima). Uma fonte sintética pode incluir uma sequência de proteína ou ácido nucleico produzida quimicamente e não através de um sistema biológico (por exemplo, síntese em fase sólida de sequências de aminoácidos). Uma proteína quimérica também pode incluir uma proteína derivada de pelo menos 2 fontes sintéticas 22 diferentes ou uma proteína derivada de pelo menos uma fonte biológica e pelo menos uma fonte sintética. Uma proteína quimérica também pode compreender uma primeira sequência de aminoácidos derivada de uma primeira fonte, ligada covalentemente ou não-covalentemente a um ácido nucleico, derivado de qualquer fonte ou uma molécula orgânica ou inorgânica pequena derivada de qualquer fonte. A proteína quimérica pode compreender uma molécula ligadora entre a primeira e segundas sequências de aminoácidos ou entre a primeira sequência de aminoácidos e o ácido nucleico, ou entre a primeira sequência de aminoácidos e a molécula pequena orgânica ou inorgânica.
Fator de coagulação, como aqui usado, significa qualquer molécula, ou seu análogo, ocorrendo naturalmente ou recombinantemente produzida que previne ou diminui a duração de um episódio de sangramento em um sujeito com uma desordem hemostática. Em outras palavras, significa qualquer molécula tendo atividade de coagulação.
Atividade de coagulação, como aqui usado, significa a habilidade de participar Numa cascata de reações bioquímicas que culmina na formação de um coágulo de fibrina e/ou reduz a seriedade, duração ou frequência de hemorragia ou episódio de sangramento.
Dimero como aqui usado refere-se a uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos, onde as primeiras e segundas cadeias compreendem uma molécula biologicamente ativa, e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina. Um homodímero refere-se a um dimero onde ambas moléculas biologicamente ativas são idênticas. 23 Híbrido monômero-dímero ligado dimericamente refere-se a uma proteína quimérica compreendida por pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, por exemplo, um fragmento Fc de uma imunoglobulina, uma molécula biologicamente ativa, e um ligante que liga dos dois juntos de modo que uma molécula biologicamente ativa está ligada a 2 cadeias de polipeptídeos, cada uma compreendendo uma porção de uma região constante de imunoglobulina. A Figura 4 mostra um exemplo de um híbrido monômero-dímero ligado dimericamente.
Constructo de ADN, como aqui usado, significa uma molécula de ADN, ou um clone de uma tal molécula, tanto de fita simples ou dupla que foi modificado através de intervenção humana para conter segmentos de ADN combinados Numa maneira que como um todo não pode de outro modo existir em natureza. Constructos de ADN contêm a informação necessária para direcionar a expressão de polipeptídeos de interesse. Constructos de ADN podem incluir promotores, aperfeiçoadores e terminadores de transcrição. Constructos de ADN contendo a informação necessária para direcionar a secreção de um polipeptídeo também conterão pelo menos uma sequência sinal secretora.
Domínio, como aqui usado; significa uma região de um polipeptídeo (incluindo proteínas como este termo é definido) tendo alguma característica física distinta ou papel incluindo por exemplo, uma estrutura dobrada independentemente composta de uma seção de uma cadeia de polipeptídeo. Um domínio pode conter a sequência da característica física distintiva do polipeptídeo ou pode conter um fragmento da característica física que retém suas características Ligantes (isto é, ele pode se ligar a um segundo domínio) . Um domínio pode estar associado com outro 24 domínio. Em outras palavras, um primeiro domínio pode se ligar naturalmente a um segundo domínio.
Um fragmento, como agui usado, refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 2 resíduos de aminoácidos contíguos, de pelo menos 5 resíduos de aminoácidos contíguos, de pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos, de pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, de pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, de pelo menos 25 resíduos de aminoácidos contíguos, de pelo menos 40 resíduos de aminoácidos contíguos, de pelo menos 50 resíduos de aminoácidos contíguos, de pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos, de pelo menos 200 resíduos de aminoácidos contíguos ou qualquer supressão ou truncação de uma proteína, peptídeo ou polipeptídeo. Hemóstase r como aqui usado, significa a parada de sangramento ou hemorragia; ou a paragem de fluxo de sangue através de um vaso sanguíneo ou parte de corpo.
Desordem hemostática, como aqui usado, significa uma condição adquirida ou herdada geneticamente caracterizada por uma tendência a hemorragia, tanto espontaneamente ou como um resultado de trauma, devido a uma habilidade prejudicada ou inabilidade para formar um coágulo de fibrina.
Ligada, como aqui usado, refere-se a uma primeira sequência de ácido nucleico ligada covalentemente a uma segunda sequência de ácido nucleico. A primeira sequência de ácido nucleico pode estar diretamente ligada ou justaposta à segunda sequência de ácidos nucleicos ou alternativamente uma sequência interveniente pode unir covalentemente a 25 primeira sequência à segunda sequência. Ligado como aqui usado também pode referir-se a uma primeira sequência de aminoácidos ligada covalentemente ou não-covalentemente a uma segunda sequência de aminoácidos. A primeira sequência de aminoácidos pode estar ligada diretamente ou justaposta à segunda sequência de aminoácidos ou alternativamente uma sequência interveniente pode ligar covalentemente a primeira sequência de aminoácidos à segunda sequência de aminoácidos.
Operativamente ligada, como aqui usado, significa uma primeira sequência de ácidos nucleicos ligada a uma segunda sequência de ácidos nucleicos de modo que ambas sequências sejam capazes de serem expressas como uma proteina ou peptideo biologicamente ativo.
Polipeptideo, como aqui usado, refere-se a um polímero de aminoácidos e não refere-se a um específico comprimento do produto; assim, peptídeos, oligopeptídeos, e proteínas estão incluídos na definição de polipeptídeos. Este termo não exclui modificações pós-expressão do polipeptideo, por exemplo, glicosilação, acetilação, fosforilação, pegilação, adição de uma metade lipídeo, ou a adição de qualquer molécula orgânica ou inorgânica. Incluídos na definição, estão por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais) e polipeptídeos com ligações substituídas, assim como outras modificações conhecidas na técnica, ocorrendo naturalmente e ocorrendo não naturalmente.
Alta rigorosidade, como aqui usado, inclui condições facilmente determinadas por aqueles versados na técnica baseado em, por exemplo, o comprimento do ADN. Geralmente, 26 tais condições são definidas em Sam-brook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, pp. 1.101104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), e inclui uso de uma solução de pré-lavagem para os filtros de nitrocelulose 5XSSC, SOS 0,5%, EOTA 1,0 mM (pH 8,0), condições de hibridização de formamida 50%, 6X SSC a 42°C (ou outra solução de hibridização similar, tal como solução de Stark, em formamida 50% a 42 °C, e com lavagem em aproximadamente 68°C, 0,2 x SSC, SDS 0,1%. Aqueles versados na técnica reconhecerão que a temperatura e concentração de sal de solução de lavagem podem ser ajustadas quando necessário de acordo com fatores, tais como o comprimento da sonda.
Rigorosidade moderada, como aqui usado, inclui condições que podem ser facilmente determinadas por aqueles versados na técnica baseado em, por exemplo, o comprimento do ADN. As condições básicas são mostradas por Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. Vol. 1, pp. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), e incluem o uso de uma solução de pré-lavagem para os filtros de nitrocelulose 5X SSC, 0,5% SDS, EOTA 1,0 mM (pH 8,0), condições de hibridização de formamida 50%, 6X SSC a 42°C (ou outra solução de hibridização similar, como solução de Stark, em formamida 50% a 42°C), e condições de lavagem de 6 0 °C, 0,5X SSC, SDS 0,1%.
Uma molécula inorgânica pequena, como aqui usado significa uma molécula não contendo átomos de carbono e não sendo maior que 50kD.
Uma molécula orgânica pequena, como aqui usado significa uma molécula contendo pelo menos um átomo de carbono e não sendo maior que 50 kD. 27
Tratar, tratamento, tratando, como aqui usados significam, qualquer um do seguinte: a redução em seriedade de uma doença ou condição; a redução na duração de um curso de doença; a melhora de um ou mais sintomas associados com uma doença ou condição; a provisão de efeitos benéficos para um sujeito com uma doença ou condição, sem necessariamente cura de doença ou condição, a profilaxia de um ou mais sintomas associados com uma doença ou condição. B. Aperfeiçoamentos Oferecidos Por Certas Formas de Realização da Invenção A presente divulgação provê proteínas quiméricas (híbridos monómero-dímero) compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos, onde a dita primeira cadeia compreende uma molécula biologicamente ativa e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, e a dita segunda cadeia compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina sem qualquer molécula biologicamente ativa ou região variável de uma imunoglobulina. A Figura 1 contrasta tradicionais dímeros de proteína de fusão com um exemplo do híbrido monômero-dímero da invenção. Neste exemplo, a molécula biologicamente ativa é EPO e a porção de uma imunoglobulina é região IgG Fc.
Como outras proteínas quiméricas compreendidas por pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, a presente divulgação provê proteínas quiméricas que proporcionam aperfeiçoada estabilidade e aumentada biodisponibilidade da proteína quimérica comparada à molécula biologicamente ativa sozinha. Adicionalmente, entretanto, porque somente uma das duas cadeias compreende a molécula biologicamente ativa, a proteína quimérica tem 28 um peso molecular menor que uma proteína quimérica onde todas as cadeias compreendem uma molécula biologicamente ativa e embora não desejando ser preso por qualquer teoria, isto pode resultar na proteína quimérica sendo mais facilmente transcitosada através de barreira de epitélio, por exemplo, através de ligação ao receptor de FcRn pelo que aumentando a meia-vida da proteína quimérica. Numa modalidade, a invenção assim provê um processo não-invasivo aperfeiçoado (por exemplo, via qualquer superfície de mucosa, tal como oralmente, bucalmente, sublingualmente, nasalmente, retalmente, vaginalmente, ou via pulmonar ou Via ocular) de administração de uma proteína quimérica terapêutica da invenção. A presente divulgação assim provê processos de obtenção de níveis terapêuticos das proteínas quiméricas da invenção usando doses menos frequentes e menores comparadas a proteínas quiméricas descritas anteriormente (por exemplo, proteínas quiméricas compreendidas por pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e uma molécula biologicamente ativa, onde todas as cadeias da proteína quimérica compreendem uma molécula biologicamente ativa).
Numa outra modalidade, a invenção provê um processo invasivo, por exemplo, subcutâneo, intravenoso, de administração de uma proteína quimérica terapêutica da invenção. Administração invasiva da proteína quimérica terapêutica da invenção provê uma aumentada meia-vida da proteína quimérica terapêutica o que resulta em uso de doses menos frequentes e menores comparado a proteínas quiméricas descritas anteriormente (por exemplo, proteínas quiméricas compreendidas por pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e uma molécula biologicamente ativa, onde todas as cadeias da proteína quimérica compreendem uma molécula biologicamente ativa). 29
Ainda uma outra vantagem de uma proteína quimérica onde somente uma das cadeias compreende uma molécula biologicamente ativa é a aperfeiçoada acessibilidade da molécula biologicamente ativa para sua célula ou molécula alvo resultante de diminuído impedimento estéreo, diminuídas interações hidrofóbicas, diminuídas interações iónicas, ou diminuído peso molecular comparado a uma proteína quimérica onde todas as cadeias são compreendidas por uma molécula biologicamente ativa. C. Proteínas Quiméricas A presente divulgação refere-se a proteínas quiméricas compreendendo uma molécula biologicamente ativa, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina , e opcionalmente pelo menos um ligante. A porção de uma imunoglobulina terá ambos, um término N ou amino, e um término C ou carbóxi. A proteína quimérica pode ter a molécula biologicamente ativa ligada ao término N da porção de uma imunoglobulina. Alternativamente, a molécula biologicamente ativa pode estar ligada ao término C da porção de uma imunoglobulina. Numa modalidade, a ligação é uma ligação covalente. Numa outra modalidade, a ligação é uma ligação não covalente. A proteína quimérica opcionalmente pode compreender pelo menos um ligante; assim, a molécula biologicamente ativa não tem de estar diretamente ligada à porção de uma região constante de imunoglobulina. 0 Ligante pode intervir entre a molécula biologicamente ativa e a porção de uma região constante de imunoglobulina. 0 ligante pode ser ligado ao término N da porção de uma região constante de imunoglobulina, ou o término C da porção de uma região constante de imunoglobulina. Se a molécula biologicamente 30 ativa é compreendida por pelo menos um aminoácido a molécula biologicamente ativa terá um término N e um término C e o Ligante pode ser ligado ao término N da molécula biologicamente ativa ou o término C da molécula biologicamente ativa. A presente divulgação refere-se a uma proteina quimérica da fórmula X-LaF:F ou F:F-La-X, onde X é uma molécula biologicamente ativa, L é um ligante opcional, F é pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e, a é qualquer inteiro ou zero. A invenção também se refere a uma proteina quimérica da fórmula Ta-X-La-F:F ou Ta-F:F-La-X, onde X é uma molécula biologicamente ativa, L é um ligante opcional, F é pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, a é qualquer inteiro ou zero, T é um segundo Ligante ou alternativamente um marcador que pode ser usado para facilitar purificação da proteina quimérica, por exemplo, um marcador FLAG, um marcador histidina, um marcador GST, um marcador de proteina de ligação maltose e (:) representa uma associação quimica, por exemplo, pelo menos uma ligação não-peptideo. Em certas modalidades, a associação química, isto é, (:) é uma ligação covalente. Em outras modalidades, a associação química, isto é, ( : ) é uma interação não-covalente, por exemplo, uma interação iónica, uma interação hidrofóbica, uma interação hidrofílica, uma interação de Van der Waals, uma ligação de hidrogénio. Será entendido pelo técnico versado que quando a é igual a zero X estará diretamente ligado a F. Assim, por exemplo, a pode ser 0, 1,2, 3, 4, 5, ou mais que 5.
Numa modalidade, a proteína quimérica da invenção compreende a sequência de aminoácidos de figura 2a (SEQ ID N°: 6). Numa modalidade, a proteína quimérica da invenção 31 compreende a sequência de N°: 8). Numa modalidade, compreende a sequência de N°:10). Numa modalidade, compreende a sequência de N°: 12). Numa modalidade, compreende a sequência de N°: 14). Numa modalidade, compreende a sequência de N°: 16). Numa modalidade, compreende a sequência de N°: 18). Numa modalidade, compreende a sequência de N°: 20). Numa modalidade, compreende a sequência de N°: 22). Numa modalidade, compreende a sequência de N°: 24). Numa modalidade, compreende a sequência de N° : 27) .
aminoácidos de figura 2b (SEQ ID a proteína quimérica da invenção aminoácidos de figura 2c (SEQ ID a proteína quimérica da invenção aminoácidos de figura 2d (SEQ ID a proteína quimérica da invenção aminoácidos de figura 2e (SEQ ID a proteína quimérica da invenção aminoácidos de figura 2f (SEQ ID a proteína quimérica da invenção aminoácidos de figura 2g (SEQ ID a proteína quimérica da invenção aminoácidos de figura 2h (SEQ ID a proteína quimérica da invenção aminoácidos de figura 2i (SEQ ID a proteína quimérica da invenção aminoácidos de figura 2j (SEQ ID a proteína quimérica da invenção aminoácidos de figura 17b (SEQ ID
Com base na descrição que é providenciada acima, e na descrição contida neste documento, a presente invenção providencia proteínas quiméricas no âmbito da reivindicação 1 anexa. 1. Variantes de Proteína Quimérica
Derivados das proteínas quiméricas da invenção, incluindo as proteínas quiméricas da presente invenção, anticorpos contra as proteínas quiméricas da invenção e anticorpos contra parceiros ligantes das proteínas quiméricas da invenção são todos contempladas, e podem ser fabricadas através de alteração de suas sequências de aminoácidos por 32 substituições, adições, e/ou supressões/truncações ou através de introdução de modificação química que resulte em moléculas funcionalmente equivalentes. Será entendido por aqueles versados na técnica que certos aminoácidos Numa sequência de qualquer proteína podem ser substituídos com outros aminoácidos sem afetar adversamente a atividade da proteína. Várias mudanças podem ser feitas nas sequências de aminoácidos das proteínas quiméricas da invenção ou sequências de ADN codificando as mesmas sem apreciável perda de sua atividade biológica, função ou utilidade. Derivados, análogos, ou mutantes resultantes de tais mudanças e o uso de tais derivados estão dentro do escopo da presente invenção. Numa modalidade específica, o derivado é funcionalmente ativo, isto é, capaz de exibir uma ou mais atividades associadas com as proteínas quiméricas da invenção, por exemplo, ligação de FcRn, inibição virai, hemóstase, produção de células vermelhas de sangue. Muitos ensaios capazes de testarem a atividade de uma proteína quimérica compreendendo uma molécula biologicamente ativa são conhecidos na técnica. Onde a molécula biologicamente ativa é um inibidor de VIH, atividade pode ser testada através de medição de atividade de transcriptase reversa usando processos conhecidos (ver, por exemplo, Barre-Sinoussi et al., 1983, Science 220:868; Gallo et al. 1984, Science 224:500). Alternativamente, atividade pode ser medida através de medição de atividade fusogénica (ver, por exemplo, Nussbaum et al. 1994, J. Virol. 68(9): 5411). Onde a atividade biológica é hemóstase, um ensaio StaClotFVlla- rTF pode ser realizado para avaliar atividade de derivados de Fator Vila (Johannessen et al. 2000, Blood Coagulation and Fibrinolysis 11 :S159). 33
Substitutos para um aminoácido dentro de sequência podem ser selecionados a partir de outros membros da classe à qual o aminoácido pertence (ver Tabela 1) . Além disso, vários aminoácidos são comummente substituídos com aminoácidos neutros, por exemplo, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, e metionina (ver, por exemplo, MacLennan et al. 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al. 1998, Adv. Biophys. 35:1-24).
Tabela 1
Resíduos Originais Substituições Exemplares Substituições Típicas Ala (A) Vai, Leu, lie Vai Arg (R) Lys, Gin, Asn Lys, Asn (N) Gin Gin Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser, Ala Ser Gin (Q) Asn Asn Gly (G) Pro, Ala Ala His (H) Asn, Gin, Lys, Arg Arg He (I) Leu, Vai, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu (L) Norleucina, lie, Vai, Met, Ala, lie Lys (K) Arg, Ácido 1,4-diamino-butírco, Gin, Asn Arg Met (M) Leu, Phe, lie Leu Phe (F) Leu, Vai, lie, Ala, Tyr Leu Pro (P) Ala Gly 34
Ser (S) Thr, Ala, Cys Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr, Phe Tyr Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe Vai (V) lie, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu 2. Moléculas Biologicamente Ativas
Nas formas de realização da presente invenção a molécula biologicamente ativa é um fator de coagulação. No entanto, a presente divulgação de modo mais geral contempla o uso de qualquer molécula biologicamente ativa tal como a molécula terapêutica da presente divulgação. A molécula biologicamente ativa pode ser um aminoácido simples. A molécula biologicamente ativa pode incluir um polipeptídeo modificado. A molécula biologicamente ativa pode incluir uma molécula de lipídeo (por exemplo, um esteroide ou colesterol, um ácido graxo, um triacilglicerol, glícero fosfolipídeo, ou esfingolipídeo). A molécula biologicamente ativa pode incluir uma molécula de açúcar (por exemplo, glicose, sucrose, manose) . A molécula biologicamente ativa pode incluir uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, ADN, ARN) . A molécula biologicamente ativa pode incluir uma molécula orgânica pequena ou uma molécula inorgânica pequena. a. Citocinas e Fatores de Crescimento
Numa modalidade, a molécula biologicamente ativa é um fator de crescimento, ou citocina ou seu análogo ou fragmento. A 35 molécula biologicamente ativa pode ser qualquer agente capaz de induzir crescimento e proliferação de célula. Numa modalidade específica, a molécula biologicamente ativa é qualquer agente que possa induzir proliferação de eritrócitos. Assim, um exemplo de uma molécula biologicamente ativa contemplado pela invenção é EPO. A molécula biologicamente ativa também pode incluir, mas não está limitado a, RANTES, ΜΙΡΙα, ΜΙΡΙβ, IL-2, IL-3, GM-CSF, hormónio de crescimento, fator de necrose de tumor (por exemplo, TNFa ou β). A molécula biologicamente ativa pode incluir interferon a, se produzido sinteticamente ou recombinantemente, incluindo mas não limitado a, qualquer um dos cerca de vinte e cinco subtipos estruturalmente relacionados, como, por exemplo, interferon-α 2a, agora comercialmente disponível para uso clínico (ROFERON™, Roche) e interferon-α 2b também aprovado para uso clínico (INTRON™, Schering) assim como versões geneticamente engenheiradas de vários subtipos, incluindo, mas não limitado a, interferon α consenso comercialmente disponível (INFERGEN™, Intermune, desenvolvido por Amgen) e interferon de leucócito humano consenso ver, por exemplo, patentes US N°s 4,695,623; 4,897,471, interferon a, fator de crescimento de epiderme, hormónio de liberação de gonadotropina (GnRH), leuprolide, hormónio de estimulação de folículo, progesterona, estrogênio, ou testosterona.
Uma lista de citocinas e fatores de crescimento que podem ser usados na proteína quimérica da invenção foi anteriormente descrita (ver, por exemplo, patentes US N°s 6 086 875, 6 485 726, 6 030 613; WO 03/077834; US2003-0235536A1). b. Agentes Antivirais 36
Numa modalidade, a molécula biologicamente ativa é um agente antiviral, incluindo seus fragmentos e análogos. Um agente antiviral pode incluir qualquer molécula que inibe ou previne replicação virai, ou inibe ou previne entrada virai Numa célula, ou inibe ou previne egresso virai a partir de uma célula. Numa modalidade, o agente antiviral é um inibidor de fusão. Numa modalidade, o agente antiviral é uma citocina que inibe replicação virai numa outra modalidade, o aqente antiviral é interferon a. 0 inibidor de fusão virai para uso na proteína quimérica pode ser qualquer molécula que diminua ou previna penetração virai de uma membrana celular de uma célula alvo. 0 inibidor de fusão virai pode ser qualquer molécula que diminua ou previna a formação de sincícios entre pelo menos duas células suscetíveis. 0 inibidor de fusão virai pode ser qualquer molécula que diminua ou previna a ligação de uma membrana bicamada de lipídeo de uma célula eucariótica e uma bicamada de lipídeo de um vírus envelopado. Exemplos de vírus envelopados incluem, mas não são limitados a VIH-1, VIH-2, SIV, influenza, parainfluenza, vírus de Epstein-Barr, CMV, herpes simplex 1, herpes simplex 2 e vírus sincício respiratório. 0 inibidor de fusão virai pode ser qualquer que diminua ou previna fusão virai incluindo, mas não limitado a, um polipeptídeo, uma molécula orgânica pequena, ou uma molécula inorgânica pequena. Numa modalidade, o inibidor de fusão é um polipeptídeo. Numa modalidade, o inibidor de fusão virai é um polipeptídeo de 3-36 aminoácidos. Numa modalidade, 10 o inibidor de fusão virai é um polipeptídeo de 3-50 aminoácidos, 10-65 aminoácidos, 10-75 aminoácidos. 37 0 polipeptídeo pode ser compreendido por uma sequência de aminoácidos ocorrendo naturalmente (por exemplo, um fragmento de gp41) incluindo seus análogos e mutantes ou o polipeptídeo pode ser compreendido por uma sequência de aminoácidos não encontrada na natureza, tanto quanto o polipeptídeo exiba atividade inibidora de fusão virai.
Numa modalidade, o inibidor de fusão virai é um polipeptídeo, identificado como sendo um inibidor de fusão virai usando pelo menos um algoritmo de computador, por exemplo, ALLM0TI5, 107x178x4 e PLZIP (ver, por exemplo, patentes US 6 013 263; 6 015 881; 6017 536; 6 020 459; 6 060 065; 6 068 973; 6 093 799; e 6 228 983).
Numa modalidade, o inibidor de fusão virai é um inibidor de fusão de VIH. Numa modalidade, VIH é VIH-1. Numa outra modalidade, VIH é VIH-2. Numa modalidade, o inibidor de fusão de VIH é um polipeptídeo compreendido por um fragmento da proteína envelope gp41 de VIH-1. 0 inibidor de fusão de VIH pode compreender, por exemplo, T20 (SEQ ID N°: 1) ou um seu análogo, T21 (SEQ ID N°: 2) ou um seu análogo, T1249 (SEQ ID N° : 3) ou um seu análogo, NccGgp41 (Louis et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: (31)29485 ou um seu análogo, ou 5 hélice (Root et al. 2001, Science 291 :884) ou um seu análogo.
Ensaios conhecidos na técnica podem ser usados para testar atividade de inibição de fusão virai de um polipeptídeo, uma molécula orgânica pequena, ou uma molécula inorgânica pequena. Estes ensaios incluem um ensaio de transcriptase reversa, um ensaio p24, ou ensaio de formação de sincício (ver, por exemplo, patente US 5 464 933). 38
Uma lista de agentes antivirais que podem ser usados na proteína quimérica da invenção foi anteriormente descrita (ver, por exemplo, patentes US N°s 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US20030235536A1). c. Agentes Hemostáticos
Numa modalidade, a molécula biologicamente ativa é um fator de coagulação ou outro agente que promove hemostase, incluindo seus fragmentos e análogos. O fator de coagulação pode incluir qualquer molécula que tenha atividade coagulante ou ative uma molécula com atividade coagulante. O fator de coagulação pode ser compreendido por um polipeptídeo. O fator de coagulação pode ser, como um exemplo, mas não limitado a Fator VIII, Fator IX, Fator XI, Fator XII, fibrinogénio, protrombina, Fator V, Fator VII, Fator X, Fator XIII ou fator de Willebrand. Numa modalidade, o fator de coagulação é Fator VII ou Fator Vila. 0 fator de coagulação pode ser um fator que participa no caminho extrínseco. 0 fator de crescimento pode ser um fator que participa no caminho intrínseco. Alternativamente, o fator de coagulação pode ser um fator que participa em ambos caminhos extrínseco e intrínseco. 0 fator de coagulação pode ser um fator de coagulação humano ou um fator de coagulação não-humano, por exemplo, derivado de um primata não-humano, um porco ou qualquer mamífero. O fator de coagulação pode ser fator de coagulação quimérico, por exemplo, o fator de coagulação pode compreender uma porção de um fator de coagulação humano e uma porção de um fator de coagulação suíno ou uma porção de um primeiro fator de coagulação não-humano e uma porção de um segundo fator de coagulação não-humano. 39 0 fator de coagulação pode ser um fator de coagulação ativado. Alternativamente, o fator de coagulação pode ser uma forma inativa de um fator de coagulação, por exemplo, um zimogénio. 0 fator de coagulação inativo pode sofrer ativação subsequente a ser ligado a pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina. 0 fator de coagulação inativo pode ser ativado subsequente a administração a um sujeito. Alternativamente, o fator de coagulação inativo pode ser ativado antes de administração.
Em certas modalidades uma endopeptidase, por exemplo, enzima clivando aminoácido básico emparelhado (PACE), ou qualquer membro de família PACE, tal como PCSK1-9, incluindo suas versões truncadas, ou seu equivalente levedura Kex2 de S. cerevisiae e versões truncadas de Kex2 (Kex2 1-675) (ver, por exemplo, patente US N°s 5 077 204; 5 162 220; 10 5 234 830; 5 885 821; 6 329 176) pode ser usada para clivar um pró-peptídeo para formar a proteína quimérica madura da invenção (por exemplo, fator VII, fator IX) . d. Outras Moléculas Proteináceas Biologicamente Ativas
Numa modalidade, a molécula biologicamente ativa é um receptor ou um seu fragmento ou análogo. O receptor pode ser expresso sobre uma superfície de célula, ou alternativamente o receptor pode ser expresso no interior da célula. O receptor pode ser um receptor virai, por exemplo, CD4, CCR5, CXCR4, CD21, CD46. A molécula biologicamente ativa pode ser um receptor bacterial. A molécula biologicamente ativa pode ser uma proteína matriz extra celular ou um seu fragmento ou análogo, importante em colonização e infecção bacterial (ver, por exemplo, patentes US N°s 5 648 240; 5 189 015; 5 175 096) ou uma 40 proteína de superfície bacterial importante em adesão e infecção (ver, por exemplo, patente US 5 648 240). A molécula biologicamente ativa pode ser um fator de crescimento, hormónio ou receptor de citocina, ou um seu fragmento ou análogo, por exemplo, receptor de TNFoí, o receptor de eritropoietina, CD25, CD122 ou CD132.
Uma lista de outras moléculas protéicas gue podem ser usadas na proteína quimérica da invenção foi previamente descrita (ver, por exemplo, patentes US N°s 6,086,875; 6,485,726; 6,030,613; WO 03/077834; 30 US2003-0235536A1). e. Ácidos Nucleicos
Numa modalidade, a molécula biologicamente ativa é um ácido nucleico, por exemplo, ADN, ARN. Numa modalidade específica, a molécula biologicamente ativa é um ácido nucleico que pode ser usado em interferência ARN (ARNi). A molécula de ácido nucleico pode ser como um exemplo, mas não como uma limitação, uma molécula anti-sentido ou uma ribozima ou um aptamero.
Moléculas de ADN e ARN anti-sentido atuam para diretamente bloquear a tradução de ARNm através de hibridização para ARNm alvejado e prevenção de tradução de proteína. Abordagens anti-sentido envolvem o desenho de oligonucleot ídeos que são complementares a um ARNm gene alvo. Os oligonucleotídeos anti-sentido ligarão aos transcritos de ARNm gene alvo complementares e prevenirão tradução. Complementaridade absoluta não é requerida.
Uma sequência "complementar" a uma porção de ARN, como aqui referida, significa uma sequência tendo suficiente complementaridade para ser capaz de hibridizar com o ARN, 41 formando um duplex estável; no caso de ácidos nucleicos anti-sentido de fita dupla, uma fita simples do ADN duplex pode assim ser testada, ou formação triplex pode ser ensaiada. A habilidade para hibridizar dependerá de ambos, o grau de complementaridade e o comprimento do ácido nucleico anti-sentido. Geralmente, quanto mais longo o ácido nucleico hibridizando, mais desemparelhamento de base com um ARRN ele pode conter e ainda formar um duplex estável (ou triplex, como pode ser ocaso). Aqueles versados na técnica podem determinar um grau tolerável de desemparelhamento através do uso de procedimentos padrões para determinar o ponto de fusão do complexo hibridizado. Ácidos nucleicos anti-sentido devem ser de pelo menos seis nucleotideos em comprimento, e são preferivelmente oligonucleotideos variando de 6 a cerca de 50 nucleotideos em comprimento. Em aspectos específicos, o oligonucleotídeo é pelo menos de 10 nucleotideos, pelo menos 17 nucleotideos, pelo menos 25 nucleotideos ou pelo menos 50 nucleotideos.
Os oligonucleot ideos podem ser ADN ou ARN ou misturas quiméricas ou suas versões derivadas ou modificadas, de fita simples ou fita dupla. O oligonucleotídeo pode ser modificado na metade base, metade açúcar, ou cadeia principal fosfato, para aperfeiçoar estabilidade da molécula, hibridização, etc. O oligonucleotídeo pode incluir outros grupos apostos, tais como polipeptideos (por exemplo, para alvejar receptores de célula hospedeira in vivo) , ou agentes facilitando transporte através de membrana de célula (ver, por exemplo, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6553; Lemaitre et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:648; WO 88/09810) ou a barreira de sangue - cérebro (ver, por exemplo, WO 42 89/10134), agentes de clivagem disparado - hibridização (ver, por exemplo, Krol et al. 1988, BioTechniques 6:958) ou agentes intercalantes (ver, por exemplo, Zon 1988, Pharm. Res. 5:539). Para este fim, o oligonucleotideo pode ser conjugado a uma outra molécula, por exemplo, um polipeptideo, agentes de reticulação disparado com hibridização, agente de transporte, ou agente de clivagem disparado por hibridização.
Moléculas ribozimas designadas para clivagem catalítica de transcritos de ARNm gene alvos também podem ser usadas para prevenirem tradução de ARNm gene alvo e, por isso, expressão de produto gene alvo. (Ver, por exemplo, WO 90/11364; Sarver et al. 1990, Science 247, 1222-1225).
Ribozimas são moléculas de ARN enzimáticas capazes de catalisarem a específica clivagem de ARN. (Ver Rossi 1994, Current Biology 4:469). O mecanismo de ação de ribozima envolve hibridização específica de sequência da molécula de ribozima para ARN alvo complementar, seguida por um evento de clivagem endonucleolítica. A composição de moléculas ribozima tem de incluir uma ou mais sequências complementares ao ARNm gene alvo, e tem de incluir a bem conhecida sequência catalítica responsável por clivagem de ARNm. Para esta sequência, ver, por exemplo, patente US 5 093 246.
Numa modalidade, ribozimas que clivam ARNm em sequências de reconhecimento específicas de sítio podem ser usadas para destruição de ARNm's gene alvo. Numa outra modalidade, o uso de ribozimas cabeça de martelo é contemplado. Ribozimas cabeça de martelo clivam ARNm's em localizações ditadas por regiões de flanco que formam pares de 34 bases complementares com o ARNm alvo. O único requisito é que o 43 ARNm alvo tenha a seguinte sequência de duas bases: 5'-UG-3'. O constructo e produção de ribozimas cabeça de martelo são bem conhecidos na técnica e são mais inteiramente descritas em Myers 1995, Molecular Biology and Bio-technology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York, e em Haseloff and Gerlach 1988, Nature, 334:585. f. Moléculas pequenas A presente divulgação também contempla o uso de qualquer molécula pequena terapêutica ou droga como a molécula biologicamente ativa na proteína quimérica da invenção. Uma lista de moléculas pequenas e drogas que podem ser usadas na proteína quimérica da invenção foi anteriormente descrita (ver, por exemplo, patentes US N°s 6 086 875; 6 485 726; 6 030 613; WO 03/077834; US2003-0235536A1). 2. Imunoglobulinas
As proteínas quiméricas da invenção compreendem pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina. Imunoglobulinas são compreendidas por quatro cadeias de proteínas que associam-se covalentemente duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cadeia é ainda compreendida por uma região variável e uma região constante. Dependendo do isótopo de imunoglobulina, a região constante de cadeia pesada é compreendida por 3 ou 4 domínios de região constante (por exemplo, CHI, CH2, CH3, CH4). Alguns isótopos ainda são compreendidos por uma região de gonzo. A porção de uma região constante de imunoglobulina pode ser obtida a partir de qualquer mamífero. A porção de uma região constante de imunoglobulina pode incluir uma porção 44 de uma região constante de imunoglobulina humana, uma região constante de imunoglobulina de primata não humano, uma região constante de imunoglobulina bovina, uma região constante de imunoglobulina suina, uma região constante de imunoglobulina murina, uma região constante de imunoglobulina ovina ou uma região constante de imunoglobulina de rato. A porção de uma região constante de imunoglobulina pode ser produzida de modo recombinante ou sinteticamente. A imunoglobulina pode ser isolada a partir de uma biblioteca de ADNc. A porção de uma região constante de imunoglobulina pode ser isolada a partir de uma biblioteca de fago (Ver, por exemplo, McCafferty et al., 1990, Nature 348:552, Kang et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:4363; EP 0 589 877 Bl). A porção de uma região constante de imunoglobulina pode ser obtida por lançamento de gene de sequências conhecidas (Mark et al. 1992, Bio/Technol. 10:779). A porção de uma região constante de imunoglobulina pode ser isolada através de recombinação in vivo (Waterhouse et al. 1993, Nucl. Acid Res. 21:2265). A imunoglobulina pode ser uma imunoglobulina humanizada (patente US N° 5 585089, Jones et al. 1986, Nature 332:323). A porção de uma região constante de imunoglobulina pode incluir uma porção de uma IgG, uma IgA, uma IgM, uma IgO, ou uma IgE. Numa modalidade, a imunoglobulina Numa IgG. Numa outra modalidade, a imunoglobulina é IgGl. Numa outra modalidade, a imunoglobulina é IgG2. A porção de uma região constante de imunoglobulina pode incluir a inteira região constante de cadeia pesada, ou um seu fragmento ou análogo. Numa modalidade, uma região constante de cadeia pesada pode compreender um domínio CHI, 45 um domínio CH2, um domínio CH3, e/ou uma região gonzo. Numa outra modalidade, uma região constante de cadeia pesada pode compreender um domínio CHI, um domínio CH2, um domínio CH3, e/ou um domínio CH4. A porção de uma região constante de imunoglobulina pode incluir um fragmento Fc. Um fragmento Fc pode ser compreendido pelos domínios CH2 e CH3 de uma imunoglobulina e a região gonzo da imunoglobulina. 0 fragmento Fc pode ser o fragmento Fc de uma IgGl, IgG2, uma IgG3 ou uma IgG4. Numa modalidade específica, a porção de uma região constante de imunoglobulina é um fragmento Fc de uma IgGl. Numa outra modalidade, a porção de uma região constante de imunoglobulina é um fragmento Fc de uma IgG2.
Com base na divulgação providenciada acima e na divulgação contida aqui, as proteínas quiméricas da presente invenção compreendem pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina. Contudo, é também uma exigência que estas proteínas quiméricas da presente invenção, a porção da região constante de imunoglobulina sejam um parceiro de ligação de receptor neonatal Fc (FcRn). Um parceiro de ligação de FcRn é qualquer molécula que pode ser especificamente ligada pelo receptor de FcRn com consequente transporte ativo pelo receptor de FcRn do parceiro de ligação de FcRn. Especificamente ligado refere-se a duas moléculas formando um complexo que é relativamente estável sob condições fisiológicas. Ligação específica é caracterizada por uma alta afinidade e uma capacidade baixa a moderada como distinguida de ligação não-específica que usualmente tNuma baixa afinidade com uma capacidade alta a moderada. Tipicamente, ligação é considerada específica quando a constante de afinidade KA é maior que 10 ΝΓ , ou mais preferivelmente maior que 10 M . 46
Se necessário, a ligação não-especifica pode ser reduzida sem afetar substancialmente ligação especifica através de variação de condições de ligação. As apropriadas condições de ligação como concentração das moléculas, resistência iónica da solução, temperatura, tempo permitido para ligação, concentração de um agente de bloqueio (por exemplo, albumina de soro, caseína de leite), etc., podem ser otimizadas por aqueles versados na técnica usando técnicas rotineiras. 0 receptor de FcRn foi isolado de várias espécies mamíferas incluindo humanos. As sequências de FcRn humano, FcRn de macaco, F-cRn de rato e FcRn de camundongo são conhecidas (Story et alo 1994, J. Exp. Med. 180:2377). O receptor de FcRn liga IgG (mas não outras classes de imunoglobulinas como IgA, IgM, IgD, e IgE) em pH relativamente baixo, transporta ativamente a IgG transcelularmente numa direção luminal para serosal, e então libera a IgG em pH relativamente maior encontrado nos fluidos intersticiais. Ele é expresso em tecido epitelial adulto (patentes US N°s 6 485 726, 6 030 613, 6 086 875;WO 03/077834; US2003-0235536A1) incluindo pulmão e epitélio intestinal (Israel et al. 1997, Immunology 92:69) epitélio tubular proximal renal (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358) assim como epitélio nasal, superfícies vaginais, e superfícies de árvore biliar.
Parceiros de ligação de FcRn da presente invenção encampam qualquer molécula que pode ser especificamente ligada pelo receptor FcRn, incluindo IgG integral, o fragmento Fc de IgG, e outros fragmentos que incluem a completa região ligante do receptor FcRn. A região da porção Fc de IgG que liga-se ao receptor FcRn foi descrita baseada em cristalografia de raios X (Burmeister et al. 1994, Nature 47 372:379). A principal área de contato do Fc com o FcRn está próxima da junção dos domínios CH2 e CH3. Contatos Fc-FcRn encontram-se todos dentro uma cadeia pesada Ig simples. Os parceiros de ligação de FcRn incluem IgG integral, o fragmento Fc de IgG, e outros fragmentos de IgG que incluem a completa região ligante de FcRn. Os principais sítios de contato incluem resíduos de aminoácidos 248,250-257,272, 285,288,290-291,308-311, e 314 do domínio CH2 e resíduos de aminoácidos 385-387, 428, e 433-436 do domínio CH3. Referências feitas a numeração de aminoácidos de imunoglobulinas ou fragmentos de imunoglobulinas, ou regiões, são todas baseadas em Kabat et al. 1991, sequences of Proteins of Immunological Interest, U.5. Department of Public Health, Bethesda, MD. A região Fc de IgG pode ser modificada de acordo com procedimentos bem reconhecidos como mutagénese direcionada sítio e semelhantes para render IgG modificada ou fragmentos Fc ou suas porções que serão ligados por FcRn. Tais modificações incluem modificações remotas a partir dos sítios de contato de FcRn assim como modificações dentro de sítios de contato que preservam ou mesmo aperfeiçoam ligação ao FcRn. Por exemplo, os seguintes resíduos de aminoácidos simples em IgGl Fc(Fcyl) podem ser substituídos sem significante perda de afinidade Ligante de Fc para FcRn:
: P238A ., 5239A , K246A, K248A, 0249A, M252A, T256A, E258A T260A, 25 D265A, 5267A , H268A, , E269A, D270A, E272A, L274A N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, 5298A Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, 5324A, K326A, A327Q P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, 5337A, K338A K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M3 5 8A 48 T359A, K360A, N361 A, Q362A, Y373A, 5375A, D376A , A378Q E380A, E382A, 53 83A, N384A, Q386A, E388A, N389A, , N390A Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, , R416A Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, , T437A Q438A, K439A, S440A, S444A, e K447A, onde por exemplo Ρ238Α representa prolina tipo selvagem substituída por alanina na posição número 238. Como um exemplo, uma modalidade específica, incorpora a mutação N297A, removendo um sítio de N-glicosilação altamente conservado. Em adição a alanina outros aminoácidos podem ser substitutos dos aminoácidos do tipo selvagem nas posições especificadas acima. Mutações podem ser introduzidas simplesmente em Fc dando origem a mais de cem parceiros de ligação de FcRn distintos a partir de Fc nativo. Adicionalmente, combinações de duas, três ou mais destas mutações individuais podem ser introduzidas juntas, originando mais centenas de parceiros de ligação de FcRn. Além disso, um dos parceiros de ligação de FcRn do híbrido monômero-dímero pode sofrer mutação e o outro parceiro de ligação de FcRn não sofrer mutação, ou ambos podem sofrer mutação mas com mutações diferentes. Qualquer uma das mutações aqui descritas, incluindo N297A, pode ser usada para modificar Fc, independente da molécula biologicamente ativa (por exemplo, EPO, IFN, Fator IX, T20).
Certas mutações acima podem conferir nova funcionalidade sobre o parceiro de ligação de FcRn. Por exemplo, uma modalidade incorpora N297A, removendo um sítio de N-glicosilação altamente conservado. 0 efeito desta mutação é reduzir imunogenicidade, pelo que aperfeiçoando meia vida circulante do parceiro de ligação de FcRn, e tornar o parceiro de ligação de FcRn incapaz de ligação a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, e FcyRIIIA, sem comprometer afinidade por FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend 49 et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591) . Ainda como um exemplo de nova funcionalidade surgindo de mutações descritas acima afinidade para FcRn pode ser aumentada além daquela de tipo selvagem em alguns exemplos. Esta afinidade aumentada pode refletir uma aumentada taxa "on", uma diminuída taxa "off" ou ambas, uma aumentada taxa "on" e uma diminuída taxa "off". Mutações acreditadas proporcionam uma afinidade aumentada para FcRn incluindo T256A, T307A, E380A, e N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
Adicionalmente, pelo menos três receptores gama Fc humanos parecem reconhecer um sítio de ligação sobre IgG dentro de região gonzo inferior, geralmente aminoácidos 234-237. Por isso, um outro exemplo de nova funcionalidade e potencial imunogenicidade diminuída pode surgir de mutações desta região, como por exemplo, através de substituição de aminoácidos 233-236 de IgGl humana "ELLG" para a correspondente sequência de IgG2 "PVA" (com uma supressão de aminoácido). Foi mostrado que FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, que mediam várias funções efetoras não se ligarão a IgGl quando tais mutações foram introduzidas. Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 e Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.
Numa modalidade, o parceiro de ligação de FcRn é um polipeptídeo incluindo a sequência PKNSSMISNTP (SEQ ID N° : 26) e ainda opcionalmente incluindo uma sequência selecionada de HQSLGTQ (SEQ ID N° : 27), HQNLSOGK (SEQ ID N°: 28), HQNISOGK (SEQ ID N°: 29), ou VISSHLGQ (SEQ ID N°: 30) (patente US N° 5,739,277).
Dois receptores FcRn podem ligar-se a uma simples molécula Fc. Dados cristalográficos sugerem que cada molécula FcRn 50 se liga a um simples peptídeo do homodimero Fc. Numa modalidade, ligação do parceiro de ligação FcRn, por exemplo, um fragmento Fc de uma IgG, a uma molécula biologicamente ativa provê um meio de liberação de molécula biologicamente ativa oralmente, bucalmente, sublingualmente, retalmente, vaginalmente, como um aerossol administrado nasalmente ou via uma Via pulmonar, ou via uma Via ocular. Numa outra modalidade, a proteína quimérica pode ser administrada invasivamente, por exemplo, subcutaneamente, intravenosamente. 0 técnico versado entenderá que porções de uma região constante de imunoglobulina para uso na proteína quimérica da invenção podem incluir mutantes ou seus análogos, ou podem incluir regiões constantes de imunoglobulina modificadas quimicamente (por exemplo, pegiladas), ou seus fragmentos (ver, por exemplo, Aslam and Dent 1998, Bioconjugation: Protein Coupling Techniques For the Biomedical Sciences Macmilan Reference, London). Em um exemplo, um mutante pode prover aperfeiçoada ligação de um parceiro de ligação de FcRn para o FcRn. Também contemplados para uso na proteína quimérica da invenção são miméticos de peptídeos de pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, por exemplo, um mimético peptídeo de um fragmento Fc ou um mimético peptídeo de um parceiro de ligação de FcRn. Numa modalidade, o mimético peptídeo é identificado usando mostrador fago ou via seleção de biblioteca química (ver, por exemplo, McCafferty et ai. 1990, Nature 348:552, Kang et ai. 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:4363; EP 0589 877 Bl). 3. Ligantes Opcionais 51 A proteína quimérica da invenção opcionalmente pode compreender pelo menos uma molécula ligadora. 0 Ligante pode ser compreendido por qualquer molécula orgânica. Numa modalidade, o Ligante é polietileno glicol (PEG). Numa outra modalidade, o Ligante é compreendido por aminoácidos. 0 Ligante pode compreender 1-5 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 10-50 aminoácidos, 50-100 aminoácidos, 100-200 aminoácidos. Numa modalidade, o Ligante é o ligante de oito aminoácidos EFA-GAAAV (SEQ ID N°: 31) . Qualquer um dos ligantes aqui descritos pode ser usado na proteína quimérica da invenção, por exemplo, um híbrido monômero-dímero, incluindo EFAGAAAV, independente da molécula biologicamente ativa (por exemplo, EPO, IFN, Fator IX). O Ligante pode compreender a sequência Gn. O Ligante pode compreender a sequência (GA)n (SEQ ID N°: 32). O Ligante pode compreender a sequência (GGS)n (SEQ ID N°: 33). O ligante pode compreender a sequência (GGS) n (GGGGS) n (SEQ ID N° : 34). Nestes exemplos, n pode ser um inteiro de 1-10, isto é, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Exemplos de ligantes incluem, mas não são limitados a, GGG (SEQ ID N°:35), SGGSGGS (SEQ ID N°: 36), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID N°:37), GGSGGSGGGGSG GGGS (SEQ ID N°: 38), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID N°: 39). O ligante não elimina ou diminui a atividade biológica da proteína quimérica. Opcionalmente, o Ligante aperfeiçoa a atividade biológica da proteína quimérica, por exemplo, através de ainda diminuição de efeitos de impedimento estéreo e tomando a molécula biologicamente ativa mais acessível para seu sítio de ligação alvo.
Numa modalidade específica, o ligante para interferon a é de 15-25 aminoácidos de comprimento. Numa outra modalidade específica, o ligante para interferon α é de 15-20 52 aminoácidos de comprimento. Numa outra modalidade especifica, o ligante para interferon α é de 10-25 aminoácidos de comprimento. Numa outra modalidade especifica, o ligante para interferon α é de 15 aminoácidos de comprimento. Numa modalidade, o Ligante para interferon α é (GGGGS)n(SEQ ID N° : 40) onde G representa glicina, S representa serina e n é um inteiro de 1-10. Numa modalidade especifica, n é 3. O ligante também pode incorporar uma metade capaz de ser activada tanto quimicamente (por exemplo, hidrólise de uma ligação éster), enzimaticamente (isto é, incorporação de uma sequência de clivagem protease) ou fotoliticamente (por exemplo, um cromóforo, tal como ácido 3-amino3-(2-nitrofenil) propiónico (ANP» de modo a liberar a molécula biologicamente ativa da proteína Fc. 4. Dimerização de Proteína Quimérica Usando Parceiros de Ligação Específicos
Numa modalidade, a proteína quimérica da invenção compreende uma primeira cadeia de polipeptídeo compreendendo pelo menos um primeiro domínio, do dito primeiro domínio tendo pelo menos um parceiro de ligação específico, e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreendendo pelo menos um segundo domínio, onde o dito segundo domínio, é um parceiro de ligação específico do dito primeiro domínio. A proteína quimérica assim compreende um polipeptídeo capaz de dimerizar com um outro polipeptídeo devido à interação do primeiro domínio e o segundo domínio. Processos de dimerização de anticorpos usando domínios heterólogos são conhecidos na técnica (ver patentes US N°s 5,807,706, e 5,910,573; Kostelny et al. 1992, J. Immunol. 148(5):1547). 53
Dimerização pode ocorrer através de formação de uma ligação covalente, ou alternativamente uma ligação não-covalente, por exemplo, interação hidrofóbica, forças de Van der Waal's, interdigitação de peptideos anfifilicos tais como, mas não limitado a, hélices a, interações carga - carga de aminoácidos transportando cargas opostas, tais como, mas não limitado a, lisina e ácido aspártico, arginina e ácido glutâmico. Numa modalidade, o dominio é um feixe de hélice compreendendo uma hélice, uma volta e uma outra hélice. Numa outra modalidade, o dominio é um ziper leucina compreendendo um peptideo tendo vários aminoácidos de repetição onde cada sétimo aminoácido é um resíduo leucina. Numa modalidade, os parceiros de ligação específicos são fos/jun. (ver Branden et al. 1991, Introduction To Protein Struture, Garland Publishing, New York).
Numa outra modalidade, ligação é mediada por uma ligação química (ver, por exemplo, Brennan et al. 1985, Science 229:81). Nesta modalidade, imunoglobulinas intactas, ou proteínas quiméricas compreendidas por pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina são clivadas para gerarem fragmentos de cadeia pesada. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante ditiolarsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e prevenir formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos gerados são então convertidos a derivados tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados TNB é então reconvertido ao fragmento de cadeia pesada tiol por redução com mercapto etilamina e é então misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado TNB para formar um dímero quimérico. D. Ácidos Nucleicos 54 A invenção refere-se a um primeiro constructo de ácido nucleico e um segundo constructo de ácido nucleico cada uma compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos uma porção da proteína quimérica da invenção. Numa modalidade, o primeiro constructo de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma porção de uma região constante de imunoglobulina ligada operativamente a uma segunda sequência de ADN codificando uma molécula biologicamente ativa, e o dito segundo constructo de ADN compreende uma sequência de ADN codificando uma região constante de imunoglobulina sem a segunda sequência de ADN codificando uma molécula biologicamente ativa. A molécula biologicamente ativa pode incluir, por exemplo, mas não como uma limitação, um inibidor de fusão virai, um fator de coagulação, um fator de crescimento ou hormónio, ou um receptor, ou análogo, ou fragmento de qualquer dos precedentes. As sequências de ácidos nucleicos também podem incluir adicionais sequências ou elementos conhecidos na técnica (por exemplo, promotores, aperfeiçoadores, sequências poli A, marcadores de afinidade). Numa modalidade, a sequência de ácidos nucleicos do segundo constructo opcionalmente pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos codificando um Ligante colocado entre a sequência de ácidos nucleicos codificando a molécula biologicamente ativa e a porção da região constante de imunoglobulina. A sequência de ácidos nucleicos do segundo constructo de ADN opcionalmente pode incluir uma sequência ligadora colocada antes ou após a sequência de ácidos nucleicos codificando a molécula biologicamente ativa e/ou a porção da região constante de imunoglobulina. 55
Numa modalidade, o constructo de ácido nucleico é compreendido por ADN. Numa outra modalidade, o constructo de ácido nucleico compreendido por ARN. 0 constructo de ácido nucleico pode ser um vetor, por exemplo, um vetor virai ou um plasmídeo. Exemplos de vetores virais incluem, mas não são limitados a, vetor adenovirus, um vetor virus associado adeno, ou um vetor virus de leucemia murino. Exemplos de plasmideos incluem, mas não são limitados a, pUC, pGEM e pGEX.
Numa modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de figura 3a (SEQ ID N°: 7). Numa modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de figura 3b (SEQ ID N° : 9) . Numa modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de figura 3c (SEQ ID N°: 11). Numa modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de figura 3d (SEQ ID N°: 13). Numa modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de figura 3e (SEQ ID N°: 15). Numa modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de figura 3f (SEQ ID N°: 17). Numa modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de figura 3g (SEQ ID N°: 19). Numa modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de figura 3h (SEQ ID N°: 21). Numa modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de figura 3i (SEQ ID N°: 23). Numa modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de figura 3j (SEQ ID N°: 25). Numa modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de figura 17a (SEQ ID N°: 27). 56
Devido à conhecida degenerescência do código genético, onde mais de um códon pode codificar o mesmo aminoácido, uma sequência de ADN pode variar daquela mostrada em SEQ ID N°s: 7,9,11,13,15,17,19, 21, 23, 25 ou 27 e ainda codificar um polipeptideo tendo a correspondente sequência de aminoácidos de SEQ ID N°s: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,20,22, 24 ou 26, respetivamente. Tais sequências de ADN variantes podem resultar de mutações silenciosas (por exemplo, ocorrendo durante amplificação peR), ou podem ser o produto de mutagénese deliberada de uma sequência nativa. A invenção assim provê sequências de ADN isoladas codificando polipeptídeos da invenção, escolhidos de: (a) ADN compreendendo a sequência de nucleotideos de SEQ ID N°s: 7, 9,11,13,15,17,19,21,23,25 ou 27; (b) ADN codificando os polipeptídeos de SEQ ID N°s: 6, 8, 10, 12, 25 14, 16, 18,20,22, 24 ou 26; (c) ADN capaz de hibridização a um ADN de (a) ou (b) sob condições de rigorosidade moderada e que codifica polipeptídeos da invenção; (d) ADN capaz de hibridização a um ADN de (a) ou (b) sob condições de alta rigorosidade e que codifica polipeptídeos da invenção, e (e) ADN que é degenerado como um resultado do código genético a um ADN definido em (a) , (b) , (c) , ou (d) e que codifica polipeptídeos da invenção. É claro, polipeptídeos codificados por tais sequências de ADN são abrangidos pela presente divulgação.
Numa outra modalidade, as moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando a proteína quimérica da invenção também podem compreender sequências de nucleotideos que são pelo menos 80% idênticas a uma sequência nativa. São também contempladas modalidades nas quais moléculas de ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando a proteína quimérica da invenção compreendem uma sequência que é pelo menos 90% idêntica, 57 pelo menos 95% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, ou pelo menos 99,9% idêntica a uma sequência nativa. Uma sequência nativa pode incluir qualquer sequência de ADN não alterada pela mão humana. A percentagem de identidade pode ser determinada através de inspeção visual e cálculo matemático. Alternativamente, a percentagem de identidade de duas sequências de ácidos nucleicos pode ser determinada através de comparação de informação de sequência usando o programa de computador GAP, versão 6.0 descrito por Devereux et al. 1984, Nucl. Acids Res. 12:387, e disponível da University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Os parâmetros default preferidos para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e O para não- identidades) para nucleotideos, e a matriz de comparação pesada de Gribskov and Burgess 1986, Nucl. Acids Res. 14:6745, como descrito por Schwartz and Dayhoff, eds. 1979, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358; (2) uma penalidade de 3,0 para cada folga e uma adicional penalidade de 0,10 para cada símbolo em cada folga; e (3) nenhuma penalidade para folgas de extremidade. Outros programas usados por aqueles versados na técnica de comparação de sequências também podem ser usados. Com base na divulgação acima, e na divulgação aqui contida, a presente invenção providencia primeiros e segundos polinucleotídeos como indicado nas reivindicações anexas. E. Síntese de Proteínas Quiméricas
Proteínas quiméricas compreendendo pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e uma molécula biologicamente ativa podem ser sintetizadas usando-se 58 técnicas bem conhecidas. Por exemplo, as proteínas quiméricas da invenção podem ser sintetizadas de modo recombinante em células (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular cloning A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, N.Y. e Ausubel et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).
Alternativamente, as proteínas quiméricas da invenção podem ser sintetizadas usando-se conhecidos processos sintéticos como síntese de fase sólida. Técnicas sintéticas são bem conhecidas (ver, por exemplo, Merrifield, 1973, Chemical Polypeptides (Katsoyannis and Panayotis eds.) pp. 335-61; Merrifield 1963, J. Am. Chem. Soe. 85:2149; Davis et al. 1985, Biochem. Intl. 10:394; Finn et al. 1976, The Proteins (3d ed.) 2:105; Erikson et al. 1976, The Proteins (3d ed.) 2:257; patente US N° 3 941 763. Alternativamente, as proteínas quiméricas da invenção podem ser sintetizadas usando uma combinação de processos recombinantes e sintéticos. Em certas aplicações, pode ser benéfico usar um processo recombinante ou uma combinação de processos recombinantes e sintéticos. Ácidos nucleicos codificando uma molécula biologicamente ativa podem ser facilmente sintetizados usando técnicas recombinantes bem conhecidas. Alternativamente, os próprios peptídeos podem ser quimicamente sintetizados. Ácidos nucleicos da invenção podem ser sintetizados através de processos padrões conhecidos na técnica, por exemplo, através de uso de um sintetizador de ADN automatizado (como disponível comercialmente de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como exemplos, oligonucleotídeos fosforotioatos podem ser sintetizados através do processo de Stein et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16:3209, oligonucleotídeos de fosfonato de metila podem 59 ser preparados através do uso de suportes de polímero de vidro de poro controlado como descrito em Sarin et al. 1988, proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:7448. Processos adicionais de síntese de ácidos nucleicos são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, patentes US N°s 6,015,881; 6,281,331; 6,469,136) .
Sequências de ADN codificando regiões constantes de imunoglobulina, ou seus fragmentos, podem ser clonadas de uma variedade de bibliotecas genómicas ou ADNc conhecidas na técnica. As técnicas para isolamento de tais sequências de ADN usando processos baseados em sonda são técnicas convencionais e são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Sondas para isolamento de tais sequências de ADN podem ser baseadas em sequências de ADN publicadas (ver, por exemplo, Hieter et al. 1980, Cell 22:197-207). O processo de reação de cadeia polimerase (PCR) mostrado por Mullis et al. (patente US N° 4 683 195) e Mullis (patente US N° 4 683 202) pode ser usado. A escolha de biblioteca e seleção de sondas para o isolamento de tais sequências de ADN está dentro do nível de conhecimento comum na técnica. Alternativamente, sequências de ADN codificando imunoglobulinas ou seus fragmentos podem ser obtidas a partir de vetores conhecidos na técnica conterem imunoglobulina ou seus fragmentos.
Para produção recombinante, uma primeira sequência de polinucleotídeo codificando uma porção da proteína quimérica da invenção (isto é, uma porção de uma região constante de imunoglobulina) e uma segunda sequência de polinucleotídeo codificando uma porção da proteína quimérica da invenção (por exemplo, uma porção de uma região constante de imunoglobulina e uma molécula biologicamente ativa) são inseridas em apropriados 60 isto é veículos de expressão, isto é, vetores que contêm os necessários elementos para a transcrição e tradução da sequência codificante inserida, ou no caso de um vetor virai ARN, os elementos necessários para replicação e tradução. Os ácidos nucleicos codificando a proteína quimérica são inseridos no vetor em próprio quadro de leitura.
Os veículos de expressão são então transfectados ou co-transfectados Numa apropriada célula alvo, que expressará os polipeptídeos. Técnicas de transfecção conhecidas incluem, mas não são limitadas a, precipitação com fosfato de cálcio (Wigler et al. 1978, Cell 14:725) e eletroporação (Neumann et al. 1982, EMBO, J. 1:841), e reagentes baseados em lipossoma. Uma variedade de sistemas de vetor de expressão - hospedeiro pode ser utilizada para expressar as proteínas quiméricas aqui descritas incluindo ambas células procarióticas ou eucarióticas. Estas incluem, mas não são limitadas a, microrganismos como bactérias (por exemplo, E. co") transformadas com vetores de expressão de ADN plasmídeo ou ADN de bacteriófago recombinante contendo uma apropriada sequência codificante; levedura ou fungos filamentosos transformados com vetores de expressão de fungos ou levedura recombinantes contendo uma apropriada sequência codificante; sistemas de células de insetos infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) contendo uma apropriada sequência codificante; sistemas de células de plantas infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus mosaico de couve-flor ou vírus mosaico de tabaco) ou transformadas com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo uma apropriada sequência codificante; ou sistemas de célula 61 animal, incluindo células de mamíferos (por exemplo, células CHO, Cos, HeLa).
Quando a proteína quimérica da invenção é recombinantemente sintetizada Numa célula procariótica pode ser desejável dobrar novamente a proteína quimérica. A proteína quimérica produzida através deste processo pode ser re-dobrada para uma conformação biologicamente ativa usando condições conhecidas na técnica, por exemplo, desnaturação sob condições redutoras e então lentamente dializada em PBS.
Dependendo do sistema de expressão usado, a proteína quimérica expressa é então isolada através de procedimentos bem estabelecidos na técnica (por exemplo, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca de iões).
Os vetores de expressão podem codificar marcadores que permitam fácil purificação da proteína quimérica produzida recombinantemente. Exemplos incluem, mas não são limitados a vetor pUR278 (Ruther et al. 1983, BEMO J. 2:1791) onde a proteína quimérica aqui descrita codificando sequências pode ser ligada no vetor em estrutura com a região codificante lac Z de modo que uma proteína híbrida é produzida; vetores pGEX podem ser usados para expressarem proteínas quiméricas da invenção com um marcador glutationa S-transferase (GST). Estas proteínas são usualmente solúveis e podem ser facilmente purificadas de células por adsorção a contas de glutationa - agarose seguido por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores incluem sítios de clivagem (trombina ou Fator Xa protéase ou PreScission Protease™ (Pharmacia, Peapack, N.J.)) para fácil remoção do marcador após purificação. 62
Para aumentar eficiência de produção, os polinucleotideos podem ser designados para codificação de múltiplas unidades da proteína quimérica da invenção separadas por sítios de clivagem enzimática. 0 resultante polipeptídeo pode ser clivado (por exemplo, através de tratamento com a enzima apropriada) de modo a recuperar as unidades de polipeptídeo. Isto pode aumentar o rendimento de polipeptídeos dirigido por um promotor simples. Quando usado em apropriados sistemas de expressão virai, a tradução de cada polipeptídeo codificado pelo ARNm é direcionada internamente no transcrito; por exemplo, através de um sítio de entrada de ribossoma interno, IRES. Assim, o constructo policistrônica direciona a transcrição de um ARNm policistrônico grande, simples que, por sua vez, direciona a tradução de polipeptídeos individuais, múltiplos. Esta abordagem elimina a produção e processamento enzimático de poliproteínas e pode aumentar significantemente rendimento de polipeptídeo dirigido por um simples promotor.
Vetores usados em transformação usualmente conterão um marcador selecionável usado para identificar transformantes. Em sistemas bacteriais, isto pode incluir um gene de resistência a antibióticos como ampicilina ou canamicina. Marcadores selecionáveis para uso em células cultivadas de mamíferos incluem genes que conferem resistência a drogas, como neomicina, higromicina e metotrexate. 0 marcador selecionável pode ser um marcador selecionável amplificável. Um marcador selecionável amplificável é o gene DHFR. Um outro marcador amplificável é o ADNc DHFR (Simonsen and Levinson 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:2495). Marcadores selecionáveis são revistos por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA) e a escolha de 63 marcadores selecionáveis está bem dentro do nível de conhecimento comum da técnica.
Marcadores selecionáveis podem ser introduzidos na célula num plasmídeo separado ao mesmo tempo como o gene de interesse, ou eles podem ser introduzidos sobre o mesmo plasmídeo. Se sobre o mesmo plasmídeo, o marcador selecionável e o gene de interesse podem estar sob o controlo de diferentes promotores ou o mesmo promotor, o último arranjo produzindo uma mensagem dicistrônica. Constructos deste tipo são conhecidos na técnica (por exemplo, patente US N° 4,713,339).
Os elementos de expressão dos sistemas de expressão variam em suas resistências e especificidades. Dependendo do sistema hospedeiro/vetor utilizado, qualquer um de um número de elementos de transcrição e tradução apropriados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, pode ser usado no vetor de expressão. Por exemplo, quando clonando em sistemas bacteriais, promotores induzíveis como pL de bacteriófago ê, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-Iac) e semelhantes podem ser usados; quando clonando em sistemas de células de insetos, promotores, tais como o pro-motor poliedron baculovírus podem ser usados; quando clonando em sistemas de célula de planta, promotores derivados do genoma de células de plantas (por exemplo, promotores de choque térmica; o promotor para a subunidade pequena de RUBISCO; o promotor para a proteína de ligação a/b de clorofila) ou de vírus de plantas (por exemplo, o promotor 35S ARN de CaMV; o promotor proteína de revestimento de TMV) pode ser usado; quando clonando em sistemas de células mamíferas, promotores derivados do genoma de células mamíferas (por exemplo, promotor metalotioneína) ou de vírus mamíferos (por exemplo, o promotor posterior de adenovírus); o promotor de 7,5 K de vírus vaccinia) pode ser usado; quando gerando linhas de células que contêm múltiplas cópias de produto de expressão, vetores baseados em SV40, BPV e EBV podem ser usados com um apropriado marcador selecionável.
Em casos onde vetores de expressão em plantas são usados, a expressão de sequências codificando formas lineares ou não-ciclizadas das proteínas quiméricas da invenção pode ser dirigida através de qualquer um de um número de promotores. Por exemplo, promotores virais, tais como os promotores 355 ARN e 19S ARN de CaMV (Brisson et al. 1984, nature 310:511-514), ou o promotor proteína de revestimento de TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6:307-311) pode ser usado; alternativamente, promotores de plantas como a subunidade pequena de RUBISCO (Coruzzi et al. 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al. 1984:, Science 224:838-843) ou promotores de choque térmico, por exemplo, soja hspl7.5-E ou hspl7.3-B (Gurley et al. 1986, Mal. Cell. Biol. 6:559-565) pode ser usado. Estes constructos podem ser introduzidos em células de plantas usando plasmídeos Ti, plasmídeos Ri, vetores de vírus de planta, transformação de ADN direta, micro-injeção, eletroporação, etc. Para revisões de tais técnicas ver, por exemplo, Weissbach & Weissbach 1988, Methods for Plant Molecular Biology, academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463; e Grierson & Corey 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9.
Em um sistema de expressão em inseto que pode ser usado para produção de proteínas quiméricas da invenção, vírus de polihidrose nuclear Autographa califomica (AcNPV) é usado como um vetor para expressar os genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. Uma 65 sequência codificante pode ser clonada em regiões não-essenciais (por exemplo, o gene poliedron) do vírus e colocado sob controlo de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor poliedron). Inserção bem-sucedida de uma sequência codificante resultará em inativação do gene poliedron e produção de vírus recombinante não-ocluído (isto é, vírus carecendo de revestimento protéico codificado pelo gene poliedron). Estes vírus recombinantes são então usados para infecção de células de Spodoptera frugiperda onde o gene inserido é expresso (ver, por exemplo, Smith et al. 1983, J. Virol. 46:584; patente US N° 4 215 051). Ainda exemplos deste sistema de expressão podem ser encontrados em Ausubel et al., eds. 1989, Current protocols in Molecular Biology, Vai. 2, Greene Publish. Assoe. & Wiley Interscience.
Um outro sistema que pode ser usado para expressar as proteínas quiméricas da invenção é o sistema de expressão de gene glutamina sintetase, também referido como o "sistema de expressão GS" (Lonza Biologics PLC, Berkshire UK) . Este sistema de expressão é descrito em detalhes na patente US N° 5 981 216.
Em células hospedeiras mamíferas, um número de sistemas de expressão baseados em vírus pode ser utilizado. Em casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, uma sequência codificante pode ser ligada a um complexo de controlo de transcrição/tradução adenovírus, por exemplo, o promotor late e sequência líder tripartite. Este gene quimérico então pode ser inserido no genoma de adenovírus através de recombinação in vitro ou in vivo. Inserção Numa região não-essencial do genoma virai (por exemplo, região EI ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar peptídeo em hospedeiros infectados 66 (ver, por exemplo, Logan & Shenk 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3655). Alternativamente, o promotor de 7,5 K vaccinia pode ser usado (ver, por exemplo, Mackett et al. 1982, proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:7415; Mackett et al. 1984, J. Virol. 49:857; Panicali et al. 1982, proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:4927).
Em casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, uma sequência codificante pode ser ligada a um complexo de controlo de transcrição/tradução adenovírus, por exemplo, o promotor late e sequência líder tripartite. Este gene quimérico então pode ser inserido no genoma de adenovírus através de recombinação in vitro ou in vivo. Inserção Numa região não-essencial do genoma virai (por exemplo, região E1 ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar peptídeo em hospedeiros infectados (ver, por exemplo, Logan & Shenk 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3655). Alternativamente, o promotor de 7,5 K vaccinia pode ser usado (ver, por exemplo, Mackett et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:7415; Mackett et al. 1984, J. Virol.
49:857; Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 : 4927) . Células hospedeiras contendo constructos de ADN da proteína quimérica são desenvolvidas em um meio de crescimento apropriado. Como aqui usado, o termo "meio de crescimento apropriado" significa um meio contendo nutrientes requeridos para o crescimento de células. Nutrientes requeridos para crescimento de células podem incluir uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogénio, aminoácidos essenciais, vitaminas, minerais e fatores de crescimento. Opcionalmente os meios podem conter soro de bezerro bovino ou soro fetal de bezerro. Numa modalidade, 67 os meios substancialmente não contêm IgG. 0 meio de crescimento geralmente selecionará para células contendo o constructo de ADN através de, por exemplo, seleção de droga ou deficiência em um nutriente essencial que é complementado pelo marcador selecionável sobre o constructo de ADN ou co-transfectado com o constructo de ADN. Células mamíferas cultivadas são geralmente desenvolvidas em meios livres de soro ou contendo soro comercialmente disponível (por exemplo, MEM, DMEM). Seleção de um meio apropriado para a particular linha de células usada está dentro do nível de conhecimento na técnica. A proteína quimérica produzida recombinantemente da invenção pode ser isolada dos meios de cultura. 0 meio de cultura a partir de células hospedeiras transformadas ou transfectadas apropriadamente crescidas é separado do material de célula, e a presença de proteínas quiméricas é demonstrada. Um processo de deteção de proteínas quiméricas, por exemplo, é através de ligação das proteínas quiméricas ou porções das proteínas quiméricas a um anticorpo específico reconhecendo a proteína quimérica da invenção. Um anticorpo proteína antiquimérica pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal elevado contra a proteína quimérica em questão. Por exemplo, a proteína quimérica contém pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina. Anticorpos reconhecendo a região constante de muitas imunoglobulinas são conhecidos na técnica e são comercialmente disponíveis. Um anticorpo pode ser usado para realizar ELISA ou western blot para detectar a presença da proteína quimérica da presente divulgação, por exemplo proteína quimérica da presente invenção. 68 A proteína quimérica da invenção pode ser sintetizada em um animal transgénico, tal como um roedor, vaca, porco, carneiro ou cabra. 0 termo "animais transgénicos" refere-se a animais não-humanos que incorporaram um gene estranho em seu genoma. Devido este gene estar presente em tecidos de linha germe, ele é passado de parente para a descendência. Genes exógenos são introduzidos em embriões celled-simples (Brinster et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:4438). Processos de produção de animais transgénicos são conhecidos na técnica, incluindo transgénicos que produzem moléculas de imunoglobulina (Wagner et al. 1981, Prc. Natl. Acad. Sei. USA 78:6376; McKnight et al. 1983, Cell 34:335; Brinster et al. 1983,
Nature 306:332; Ritchie et al.1984, Nature 312:517; Baldassarre et al. 2003, Theriogenology 59:831; Robl et al. 2003, Theriogenology 59:107; Malassagne et al. 2003, Xenotransplantation 10(3):267). A proteína quimérica da invenção também pode ser produzida através de uma combinação de química sintética e técnicas recombinantes.
Por exemplo, a porção de uma região constante de imunoglobulina pode ser expressa recombinantemente como descrito acima. A molécula biologicamente ativa, pode ser produzida usando técnicas de síntese química conhecidas (por exemplo, síntese de fase sólida). A porção de uma região constante de imunoglobulina pode ser ligada à molécula biologicamente ativa usando química de ligação apropriada e então combinada com uma porção de uma região constante de imunoglobulina que não foi ligada a uma molécula biologicamente ativa para formar a proteína quimérica da invenção. Numa modalidade, a porção de uma 69 região constante de imunoglobulina é um fragmento Fc. 0 fragmento Fc pode ser produzido recombinantemente para formar Cys-Fc e reagido com uma molécula biologicamente ativa expressando um tioéster para obter um híbrido monômero-dímero. Numa outra modalidade, um Fc-tioéster é obtido e reagido com uma molécula biologicamente ativa expressando uma cisteína em término N (Figura 4).
Numa modalidade, a porção de uma região constante de imunoglobulina ligada à molécula biologicamente ativa formará homodímeros. Os homodímeros podem ser interrompidos através de exposição de homodímeros a condições desnaturantes e redutoras (por exemplo, p-mercapto etanol e ureia 8M) e então subsequentemente combinados com uma porção de uma região constante de imunoglobulina não ligada a uma molécula biologicamente ativa para formar híbridos monômero-dímero. Os híbridos monômero-dímero são então renaturados e novamente dobrados através de diálise em PBS e isolados, por exemplo, por cromatografia de exclusão de tamanho ou afinidade.
Numa outra modalidade, a porção de uma região constante de imunoglobulina formará homodímeros antes de ser ligada a uma molécula biologicamente ativa. Nesta modalidade, condições de reação para ligação de molécula biologicamente ativa ao homodímero podem ser ajustadas de modo que ligação da molécula biologicamente ativa a somente uma cadeia do homodímero é favorecida (por exemplo, através de ajuste de equivalentes molares de cada reagente). A molécula biologicamente ativa pode ser quimicamente sintetizada com uma cisteína terminal N. A sequência codificando uma porção de uma região constante de 70 imunoglobulina pode ser subclonada em um vetor codificando inteina ligada a um domínio de ligação quitina (New England Biolabs, Beverly, MA). A inteina pode ser ligada ao término C da porção de uma região constante de imunoglobulina. Numa modalidade, a porção da imunoglobulina com a inteina ligada a seu término C pode ser expressa Numa célula procariótica. Numa outra modalidade, a porção da imunoglobulina com a inteina ligada a seu término C pode ser expressa numa célula eucariótica. A porção de região constante de imunoglobulina ligada a inteina pode ser reagida com MESNA. Numa modalidade, a porção de uma região constante de imunoglobulina ligada a inteina é ligada a uma coluna, por exemplo, uma coluna quitina e então eluída com MESNA. A molécula biologicamente ativa e porção de uma imunoglobulina podem ser reagidas juntas de modo a ocorrer rearranjo nucleofílico e a molécula biologicamente ativa seja covalentemente ligada à porção de uma imunoglobulina via uma ligação amida. (Dawsen et al. 2000, Annu. Rev. Biochem. 69:923). A proteína quimérica sintetizada desta maneira opcionalmente pode incluir um peptídeo ligante entre a porção de uma imunoglobulina e a molécula biologicamente ativa. 0 ligante pode ser, por exemplo, sintetizado sobre o término N da molécula biologicamente ativa. Ligantes podem incluir peptídeos e/ou moléculas orgânicas (por exemplo, polietileno glicol e/ou sequências de aminoácidos curtas). Esta síntese recombinante e química combinada permite a rápida seleção de moléculas biologicamente ativas e Ligantes para otimizar desejadas propriedades da proteína quimérica da invenção, por exemplo, inibição virai, hemóstase, produção de células vermelhas de sangue, meia-vida biológica, estabilidade, ligação a proteínas de soro ou alguma outra propriedade da proteína quimérica. O processo também permite a 71 incorporação de aminoácidos não-naturais na proteína quimérica da invenção que pode ser útil para otimização de uma desejada propriedade da proteína quimérica da invenção. Se desejado, a proteína quimérica produzida através deste processo pode ser novamente dobrada para uma conformação biologicamente ativa usando condições conhecidas na técnica, por exemplo, condições redutoras e então lentamente dialisada em PBS.
Alternativamente, a cisteína terminal-N pode estar sobre a porção de uma região constante de imunoglobulina, por exemplo, um fragmento Fc. Um fragmento Fc pode ser gerado com uma cisteína terminal-N tomando vantagem do fato de que um Fc nativo numa cisteína na posição 226 (ver Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, MD).
Para expor uma cisteína terminal, um fragmento Fc pode ser expresso recombinantemente. Numa modalidade, o fragmento Fc é expresso Numa célula procariótica, por exemplo, E. co/i. A sequência codificando a porção Fc começando com Cys 226 (numeração EU) pode ser colocada seguindo imediatamente uma sequência extremidade codificando um peptídeo sinal, por exemplo, OmpA, PhoA, STII. A célula procariótica pode sofrer choque osmótico para liberar o fragmento Fc recombinante. Numa outra modalidade, o fragmento Fc é produzido Numa célula eucariótica, por exemplo, uma célula CHO, uma célula BHK. A sequência codificando o fragmento de porção Fc pode ser colocada diretamente seguindo uma sequência codificando um peptídeo sinal, por exemplo, cadeia leve Igx de camundongo ou sequência sinal Kb classe I MHC, de modo que quando a proteína quimérica recombinante é sintetizada por uma célula eucariótica, a sequência sinal será activada, 72 deixando uma cisteína terminal N que então pode ser isolada e reagida quimicamente com uma molécula transportando um tioéster (por exemplo, um tioéster terminal C se a molécula é compreendida por aminoácidos). A cisteina terminal N sobre um fragmento Fc também pode ser gerada usando uma enzima que cliva seu substrato em seu término N, por exemplo, Fator Xa, enterocinase, e o produto isolado e reagido com uma molécula com um tioéster. 0 fragmento Fc expresso recombinantemente pode ser usado para fabricação de homodímeros ou híbridos monômero-dímero.
Numa modalidade específica, um fragmento Fc é expresso com o peptídeo sinal interferon-α adjacente à Cys na posição 226. Quando um constructo codificando este polipeptídeo é expressa em células CHO, as células CHO clivam o peptídeo sinal em duas posições distintas (em Cys 226 e em Vai dentro de peptídeo sinal 2 aminoácidos à montante na direção de término N) . Isto gera uma mistura de duas espécies de fragmentos Fc (uma com uma Vai terminal-N e uma com uma Cys terminal-N). Isto por sua vez resulta numa mistura de espécies diméricas (homodímeros com Vai terminal, homodímeros com Cys terminal e heterodímeros onde uma cadeia tem um terminal Cys e a outra cadeia tem um terminal Vai). Os fragmentos Fc podem ser reagidos com uma molécula biologicamente ativa tendo um tioéster terminal C e o resultante híbrido monômero-dímero pode ser isolado da mistura (por exemplo, por cromatografia de exclusão de tamanho. É contemplado quando outras sequências de peptídeo sinal são usadas para expressão de fragmentos Fc em células CHO uma mistura de espécies de 73 fragmentos Fc com pelo menos dois termini N diferentes será gerada.
Numa outra modalidade, uma Cys-Fc produzida recombinantemente pode formar um homodímero. 0 homodímero pode ser reagido com peptídeo que tem um ligante ramificado sobre o término C, onde o ligante ramificado tem dois tioésteres terminais C que podem ser reagidos com a Cys-Fc. Numa outra modalidade, a molécula biologicamente ativa tem um tioéster não-terminal simples que pode ser reagido com Cys-Fc. Alternativamente, o Ligante ramificado pode ter duas cisteínas terminais C que podem ser reagidas com um tioéster Fc. Numa outra modalidade, o ligante ramificado tem dois grupos funcionais que podem ser reagidos com o tioéester Fc, por exemplo, 2-mercapto amina. A molécula biologicamente ativa pode ser compreendida por aminoácidos. A molécula biologicamente ativa pode incluir uma molécula orgânica pequena ou uma molécula inorgânica pequena. F. Processos de Uso de Proteínas Quiméricas
As proteínas quiméricas da invenção têm muitos usos como será reconhecido por aqueles versados na técnica, incluindo, mas não limitado a processos de tratamento de um sujeito com uma doença ou condição. A doença ou condição pode incluir, mas não está limitada a, uma infecção virai, uma desordem hemostática, anemia, câncer, leucemia, uma condição inflamatória ou uma doença auto-imune (por exemplo, artrite, psoríase, lupus eritematoso, esclerose múltipla), ou uma infecção bacterial (ver, por exemplo, patentes US 6 086 875, 6 030 613, 6 485 726; WO 03/077834; US20030235536A1). 74 1. Processos de Tratamento de um Sujeito com uma Deficiência de Células Vermelhas de Sangue A invenção refere-se a um processo de tratamento de um sujeito tendo uma deficiência de células vermelhas de sangue, por exemplo, anemia, compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos uma proteína quimérica, onde a proteína quimérica compreende uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos, onde a primeira cadeia compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e pelo menos um agente capaz de induzir proliferação de células vermelhas de sangue, por exemplo, EPO, e a segunda cadeia de polipeptídeo compreende pelo menos uma porção de uma imunoglobulina sem o agente capaz de induzir proliferação de células vermelhas de sangue da primeira cadeia. 2. Processos de tratamento de um sujeito com uma infecção virai A invenção refere-se a um processo de tratamento de um sujeito tendo uma infecção virai ou exposto a um vírus compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos uma proteína quimérica, onde a proteína quimérica compreende uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos, onde a primeira cadeia compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e pelo menos um agente antiviral, por exemplo, um inibidor de fusão ou interferon a e a segunda cadeia de polipeptídeo compreende pelo menos uma porção de uma imunoglobulina sem o agente antiviral da primeira cadeia. Numa modalidade, o sujeito está infectado com um vírus que pode ser tratado com IFNa, por exemplo, 75 vírus de hepatite C. Numa modalidade, o sujeito está infectado com VIH, tal como VIH-1 ou VIH-2.
Numa modalidade, a proteína quimérica da invenção inibe replicação virai. Numa modalidade, a proteína quimérica da invenção previne ou inibe entrada virai em células alvos, pelo que interrompendo, prevenindo, ou limitando a disseminação de uma infecção virai em um sujeito e diminuindo a carqa virai em um sujeito infectado. Através de ligação de uma porção de uma imunoglobulina a um inibidor de fusão virai a invenção provê uma proteína quimérica com atividade inibidora de fusão virai com maior estabilidade e maior biodisponibilidade comparado a inibidores de fusão virai sozinhos, por exemplo, T20, T21, T1249. Assim, Numa modalidade, o inibidor de fusão virai diminui ou previne infecção de VIH sobre uma célula alvo, por exemplo, VIH-1. a. Condições que podem ser tratadas A proteína quimérica da invenção pode ser usada para inibir ou prevenir a infecção de uma célula alvo por um vírus de hepatite, por exemplo, vírus de hepatite C. A proteína quimérica pode compreender um agente antiviral que inibe replicação virai.
Numa modalidade, a proteína quimérica da invenção compreende um inibidor de fusão. A proteína quimérica da invenção pode ser usada para inibir ou prevenir a infecção de qualquer célula alvo por qualquer vírus (ver, por exemplo, patentes US N°s 6 086 875, 6 030 613, 6 485 726; WO 03/077834; US2003-0235536A1). Numa modalidade, o vírus é um vírus envelopado tal como, mas não limitado a, VIH, SIV, sarampo, influenza, vírus Epstein-Barr, vírus 76 sincício respiratório, ou vírus para influenza. Numa outra modalidade, o vírus é um vírus não-envelopado, tal como vírus rhino ou vírus de pólio. A proteína quimérica da invenção pode ser usada para tratar um sujeito já infectado com um vírus. 0 sujeito pode estar agudamente infectado com um vírus. Alternativamente, o sujeito pode estar cronicamente infectado com um vírus. A proteína quimérica da invenção também pode ser usada para tratar profilaticamente um sujeito em risco de contrair uma infecção virai, por exemplo, um sujeito conhecido ou acredita estar em contato próximo com um vírus ou sujeito acreditado estar infectado ou transportando um vírus. A proteína quimérica da invenção pode ser usada para tratar um sujeito que pode ter sido exposto a um vírus, mas que ainda não foi diagnosticado positivamente.
Numa modalidade, a invenção refere-se a um processo de tratamento de um sujeito infectado com HCV compreendendo administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma proteína quimérica, onde a proteína quimérica compreende um fragmento Fc de uma IgG Numa citocina, por exemplo, IFNa.
Numa modalidade, a invenção refere-se a um processo de tratamento de um sujeito infectado com VIH compreendendo administração para o sujeito de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma proteína quimérica onde a proteína quimérica compreende um fragmento Fc de uma IgG e o inibidor de fusão virai compreende T20. 3. Processos de Tratamento de um Sujeito Tendo uma Desordem Hemostática 77 A presente divulgação refere-se a um processo de tratamento de um sujeito tendo uma desordem hemostática compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos uma proteína quimérica, onde a proteína quimérica compreende uma primeira e uma segunda cadeia, onde a primeira cadeia compreende pelo menos um fator de coagulação e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, e a segunda cadeia compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina. A proteína quimérica da invenção trata ou previne uma desordem hemostática através de promoção de formação de um coágulo de fibrina. A proteína quimérica da invenção pode ativar qualquer membro de uma cascata de coagulação. 0 fator de coagulação pode ser um participante no caminho extrínseco, o caminho intrínseco, ou ambos. Numa modalidade, o fator de coagulação é Fator VII ou Fator Vila. Fator Vila pode ativar Fator X que interage com Fator Va para clivar, protrombina a trombina, que por sua vez cliva fibrinogénio em fibrina. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é Fator IX ou Fator IXa. Ainda Numa outra modalidade, o fator de coagulação é Fator VIII ou Fator Vllla. Ainda Numa outra modalidade, o fator de coagulação é Fator de von Willebrand, Fator XI, Fator XII, Fator V, Fator X ou Fator XIII. a. Condições que podem ser tratadas A proteína quimérica da invenção pode ser usada para tratar qualquer desordem hemostática. As desordens hemostáticas que podem ser tratadas através de administração da proteína quimérica da invenção incluem, mas não são limitadas a, hemofilia A, hemofilia S, doença 78 de von Willebrand deficiência de Fator XI (deficiência PTA), deficiência de Fator XII, assim como deficiências ou anormalidades estruturais em fibrinogénio, protrombina, Fator V, Fator VII, Fator X, ou Fator XIII.
Numa modalidade/forma de realização, a desordem hemostática é uma desordem herdada. Numa modalidade, o sujeito tem hemofilia A, e a proteína quimérica compreende Fator VIII ou Fator VlIIa. Numa outra modalidade, o sujeito tem hemofilia A e a proteína quimérica compreende Fator VII ou Fator Vila. Numa outra modalidade, o sujeito tem hemofilia S e a proteína quimérica compreende Fator IX ou Fator IXa. Numa outra modalidade, o sujeito tem hemofilia S e a proteína quimérica compreende Fator VII ou Fator Vila. Numa outra modalidade, o sujeito tem anticorpos inibidores para Fator VIII ou Fator Vllla e a proteína quimérica compreende Fator VII ou Fator Vila. Ainda Numa outra modalidade, o sujeito tem anticorpos inibidores contra Fator IX ou Fator IXa e a proteína quimérica compreende Fator VII ou Fator Vila. A proteína quimérica da invenção pode ser usada para tratar pro-filaticamente um sujeito com uma desordem hemostática. A proteína quimérica da invenção pode ser usada para tratar um episódio de sangramento agudo em um sujeito com uma desordem hemostática.
Numa modalidade, a desordem hemostática é o resultado de uma deficiência em um fator de coagulação, por exemplo, Fator IX, Fator VIII. Numa outra modalidade/forma de realização a desordem hemostática pode ser o resultado de um fator de coagulação defeituoso, por exemplo, Fator de von Willebrand. 79
Numa outra modalidade/forma de realização a desordem hemostática pode ser uma desordem adquirida. A desordem adquirida pode resultar de uma doença ou condição secundária subjacente. A condição não-relacionada pode ser, por exemplo, mas não como uma limitação, câncer, uma doença autoimune, ou gravidez. A desordem adquirida pode resultar de velhice ou de medicação para tratar uma desordem secundária subjacente (por exemplo, quimioterapia de cancro) . 4. Processos de tratamento de um sujeito em necessidade de um agente hemostático geral A invenção também se refere a processos de tratamento de um sujeito que não tem uma desordem hemostática ou uma doença ou condição secundária resultando em aquisição de uma desordem hemostática. A invenção assim refere-se a um processo de tratamento de um sujeito em necessidade de um agente hemostático genérico compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos uma proteína quimérica, onde a proteína quimérica compreende uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos onde a primeira cadeia de polipeptídeo compreende pelo menos uma porção de uma região constante de, imunoglobulina e pelo menos um fator de coagulação e a segunda cadeia compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina sem o fator de coagulação da primeira cadeia de polipeptídeo. a. Condições que podem ser tratadas
Numa modalidade, o sujeito em necessidade de um agente hemostático geral é sofrendo, ou está perto de sofrer, cirurgia. A proteína quimérica da invenção pode ser 80 administrada antes de ou após cirurgia como um profilático. A proteína quimérica da invenção pode ser administrada durante ou após cirurgia para controlar um episódio de sangramento agudo. A cirurgia pode incluir, mas não é limitada a, transplante de fígado, ressecção de fígado, ou transplante célula tronco. A proteína quimérica da invenção pode ser usada para tratar um sujeito tendo um episódio de sangramento agudo que não tem uma desordem hemostática. 0 episódio de sangramento agudo pode resultar de trauma severo, por exemplo, cirurgia, um acidente de automóvel, ferimento, laceração de disparo de arma, ou qualquer outro evento traumático resultando em sangramento descontrolado. 5. Modalidades de Tratamento A proteína quimérica da invenção pode ser administrada intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, ou via qualquer superfície de mucosa, por exemplo, oralmente, sublingualmente, bucalmente, nasalmente, retalmente, vaginalmente ou via pulmonar. A proteína quimérica pode ser implantada dentro ou ligada a um suporte sólido de biopolímero que permite a lenta liberação da proteína quimérica para o sítio desejado. A dose da proteína quimérica da invenção irá variar dependendo do sujeito e com a via particular de administração usada. Dosagens podem variar de 0,1 a 100 000 pg/kg de peso de corpo. Numa modalidade, o intervalo de dosagem é 0,1-1000 pg/kg. A proteína pode ser administrada continuamente ou em específicos intervalos de tempo. Ensaios in vitro podem ser empregues para determinar intervalos de dose ótima e/ou programas para 81 administração. Muitos ensaios in vitro que medem infectividade virai são conhecidos na técnica. Por exemplo, um ensaio de transcriptase reversa, ou um ensaio PCR ta ou ensaio de ADN ramificado pode ser usado para medir concentrações de VIH. Um ensaio StaClot pode ser usado para medir atividade de coagulação. Adicionalmente, doses efetivas podem ser extrapoladas de curvas de dose resposta obtidas de modelos animais. A invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor de fusão virai, pelo menos uma porção de uma imunoglobulina e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Exemplos de apropriados veículos farmacêuticos são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences por E.W. Martin. Exemplos de excipientes podem incluir amido, glicose, lactose, sucrose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, mono estearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol, e semelhantes. A composição também pode conter reagentes de tamponamento de pH, e agentes umectantes ou emulsificantes.
Para administração oral, a composição farmacêutica pode tomar a forma de comprimidos ou cápsulas preparadas por meios convencionais. A composição também pode ser preparada como um líquido, por exemplo, um xarope ou uma suspensão. 0 líquido pode incluir agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose, ou gorduras comestíveis hidrogenadas), agentes emulsificantes (lecitina ou acácia), veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoas, ésteres oleosos, álcool etílico, ou óleos vegetais fracionados), e conservantes (por exemplo, p-hidróxi benzoatos de metila ou propila ou 82 ácido sórbico). As preparações também podem incluir agentes aromatizantes, corantes e adoçantes. Alternativamente, a composição pode ser apresentada como um produto seco para constituição com água ou um outro veículo apropriado.
Para administração bucal e sublingual a composição pode tomar a forma de comprimidos, losangos ou filmes de rápida dissolução de acordo com protocolos convencionais.
Para administração através de inalação, os compostos para uso de acordo com a presente invenção são convenientemente liberados na forma de um spray aerossol de uma embalagem pressurizada ou nebulizador (por exemplo, em PBS), com um propelenete apropriado, por exemplo, dicloro diflúor metano, tricloro flúor metano, dicloro tetra flúor metano, dióxido de carbono ou outro gás apropriado. No caso de um aerossol pressurizado a dosagem unitária pode ser determinada através de provimento de uma válvula para liberação de uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para uso em um inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura pulverizada do composto e uma apropriada base pulverizada como lactose ou amido. A composição farmacêutica pode ser formulada para administração parenteral (isto é, intravenosa ou intramuscular) através de injeção de quantidade relativamente grande; Formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multidoses com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas, tais como suspensões, soluções, ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e conterem agentes de formulação como agentes de 83 suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar em forma pulverizada para constituição com um veiculo apropriado, por exemplo, água livre de pirogênio. A composição farmacêutica também pode ser formulada para administração retal como um supositório ou enema de retenção, por exemplo, contendo convencionais bases de supositório como manteiga de cacau ou outros glicerideos. 6. Terapia de Combinação A proteína guimérica da invenção pode ser usada para tratar um sujeito com uma doença ou condição em combinação com pelo menos um outro agente conhecido para tratar a dita doença ou condição.
Numa modalidade, a invenção refere-se a um processo de tratamento de um sujeito infectado com VIH compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia, onde a primeira cadeia compreende um inibidor de fusão de VIH e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e uma segunda cadeia compreende pelo menos uma porção de uma imunoglobulina sem um inibidor de fusão de VIH da primeira cadeia, em combinação com pelo menos um outro agente anti-VIH. 0 dito outro agente anti-VIH pode ser qualquer terapêutico que tenha demonstrado atividade anti-VIH. 0 dito outro agente anti-VIH pode incluir, por exemplo, mas não como limitação, um inibidor de protease (por exemplo, Amprenavir™, Crixivan™, Ritonivir™) , um análogo de nucleosídeo transcriptase reversa (por exemplo, AZT, 001, 04T, 3TC, Ziagen™), um inibidor de transcriptase reversa 84 análogo não-nucleosideo (por exemplo, Sustiva™), um outro inibidor de fusão de VIH, um anticorpo neutralizante específico para VIH, um anticorpo específico para C04, uma imitação C04, por exemplo, proteína de fusão C04-lgG2 (pedido de patente US 09/912 824) ou um anticorpo específico para CCR5, ou CXCR4 ou um parceiro de ligação específico de CCR5, ou CXCR4.
Numa outra modalidade, a invenção refere-se a um processo de tratamento de um sujeito com um distúrbio hemostático compreendendo administração de quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos uma proteína quimérica compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia, onde a primeira cadeia compreende pelo menos um fator de coagulação e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, e a segunda cadeia compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina sem o fator de coagulação da primeira cadeia, em combinação com pelo menos um outro fator de coagulação ou agente que promove hemostase. O dito outro fator de coagulação ou agente que promove hemostase pode ser qualquer terapêutico com demonstrada atividade de coagulação. Como um exemplo, mas não como limitação, o fator de coagulação ou agente hemostático pode incluir Fator V, Fator VII, Fator VIII, Fator IX, Fator X, Fator XI, Fator XII, Fator XIII, protrombina, ou fibrinogénio ou formas ativadas de qualquer um dos anteriores. O fator de coagulação de agente hemostático também pode incluir drogas antifibrinolíticas, por exemplo, ácido épsilon amino capróico, ácido tranexâmico. 7. Processos de Inibição de Fusão Virai com uma Célula Alvo 85 A invenção também refere-se a um processo in vitro de inibição de fusão de VIH com uma célula mamífera compreendendo combinação de célula mamífera com pelo menos uma proteína quimérica, onde a proteína quimérica compreende uma primeira e uma segunda cadeia, onde a primeira cadeia compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e um inibidor de VIH e a segunda cadeia compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina sem o inibidor de VIH da primeira cadeia. A célula mamífera pode incluir qualquer célula ou linha de célula suscetível a infecção por VIH incluindo, mas não limitado a, células CD4+ T humanas primárias ou macrófagos, células MOLT-4, células CEM, células AA5, ou células HeLa que expressam CD4 sobre superfície de célula. 6. Processos de Isolamento de Proteínas Quiméricas
Tipicamente, quando proteinas quiméricas da invenção são produzidas elas são contidas Numa mistura de outras moléculas, tais como outras proteinas ou fragmentos de proteínas. A invenção assim provê processos de isolamento de qualquer uma das proteínas quiméricas descritas acima a partir de uma mistura contendo as proteínas quiméricas. Foi determinado que as proteínas quiméricas da invenção se ligam a ligantes corantes sob condições apropriadas e que alteração daquelas condições subsequente a ligação pode interromper a ligação entre o ligante corante e a proteína quimérica, pelo que provendo um processo de isolamento de proteína quimérica. Em algumas modalidades a mistura pode compreender um híbrido monômero-dímero, um dímero e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, por exemplo, uma Fc. Assim, Numa modalidade, a invenção provê um processo de isolamento de 86 um híbrido monômero-dímero. Numa outra modalidade, a invenção provê um processo de isolamento de um dímero.
Da mesma maneira, Numa modalidade, a invenção provê um processo de isolamento de um híbrido monômero-dímero a partir de uma mistura, onde a mistura compreende a) um híbrido monômero-dímero compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos, onde a primeira cadeia compreende uma molécula biologicamente ativa, e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina e onde a segunda cadeia compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina numa molécula biologicamente ativa ou região variável de imunoglobulina; b) um dímero compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de polipeptídeos, onde as primeira e segunda cadeias ambas compreendem uma molécula biologicamente ativa, e pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina; e c) uma porção de uma região constante de imunoglobulina; o dito processo compreendendo 1) contato de mistura com um ligante corante ligado a um suporte sólido sob condições apropriadas de modo que ambos, o híbrido monômero-dímero e o dímero ligam-se ao Ligante corante; 2) remoção de porção não-ligada de uma região constante de imunoglobulina; 3) alteração de condições apropriadas de 1) de modo que a ligação entre o híbrido monômero-dímero e o ligante corante ligado ao suporte sólido seja interrompida; 4) isolamento de híbrido monômero-dímero. 87
Nalgumas modalidades, antes de contato de mistura com um ligante corante, a mistura pode ser contactada com uma substância cromatográfica tal como proteína A sefarose ou semelhente. A mistura é eluída da substância cromatográfica usando um tampão de eluição apropriado (por exemplo, um tampão de baixo pH) e o eluato contendo a mistura é então contatado com o ligante corante.
Condições apropriadas para contato de mistura com o Ligante corante podem incluir um tampão para manter a mistura em um pH apropriado. Um pH apropriado pode incluir um pH de 3-10,4-9,5-8. Numa modalidade, o pH apropriado é 8,0. Qualquer agente tamponante conhecido na técnica pode ser usado tanto quanto mantenha o pH na apropriada faixa, por exemplo, tris, HEPES, PIPES, MOPS. Condições apropriadas também incluem um tampão de lavagem para eluir espécies não-ligadas do Ligante corante. O tampão de lavagem pode ser qualquer tampão que não interrompa ligação de uma espécie ligada. Por exemplo, o tampão de lavagem pode ser o mesmo tampão usado na etapa de contato.
Uma vez a proteína quimérica esteja ligada ao ligante corante, a proteína quimérica é isolada através de alteração de condições apropriadas. Alteração de condições apropriadas pode incluir a adição de um sal ao tampão. Qualquer sal pode ser usado, por exemplo, NaCl, KC1. O sal deve ser adicionado Numa concentração que é alta o suficiente para interromper a ligação entre o Ligante corante e as espécies desejadas, por exemplo, um híbrido monômero-dímero.
Em algumas modalidades onde a mistura é compreendida por uma Fc, um híbrido monômero-dímero, e um dímero, foi verificado que a Fc não se liga ao Ligante corante e assim elui com o fluxo. 0 dímero se liga mais hermeticamente ao ligante corante que o hibrido monômero-dimero. Assim, uma maior concentração de sal é requerida para interromper a ligação (por exemplo, eluir) entre o dimero e o ligante corante em comparação à concentração de sal requerida para interromper a ligação entre o ligante corante e o hibrido monômero-dimero.
Em algumas modalidades NaCl pode ser usado para isolar o hibrido monômero-dimero da mistura. Em algumas modalidades, a apropriada concentração de sal que interrompe a ligação entre o ligante corante e o hibrido monômero-dimero é de 200-700 mM, 300-600 mM, 400-500 mM. Numa modalidade, a concentração de NaCl requerida para interromper a ligação entre o ligante corante e hibrido monômero-dimero é 400 mM.
NaCl também pode ser usado para isolar o dimero da mistura. Tipicamente, o hibrido monômero-dimero é isolado da mistura antes de dimero. O dimero é isolado por adição de uma apropriada concentração de sal ao tampão, pelo que interrompendo a ligação entre o ligante corante e o dimero. Em algumas modalidades a apropriada concentração de sal que interrompe a ligação entre o Ligante corante e o dimero é de 800 mM a 2 M, 900 mM a 1,5 M, 950 mM a 1,2 M. Numa modalidade especifica, NaCl 1M é usado para interromper a ligação entre o Ligante corante e o dimero. O ligante corante pode ser um bio-mimético. Um bio-mimético é uma substância feita pelo homem, dispositivo, ou sistema que imita natureza. Assim, em algumas modalidades o Ligante corante imita um ligante ocorrendo naturalmente da molécula. O ligante corante pode ser escolhido de Mimetic Redl™, Mimetic Red2™, Mimetic Orange 89 1™, Mimetic Orange 2™, Mimetic Orange 3™, Mimetic Yellow 1™Λ Mimetic Yellow 2™, Mimetic Green 1™Λ Mimetic Blue 1™, e Mimetic Blue 2™ (Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ) . Numa modalidade especifica, o ligante corante é Mimetic Red 2™ (Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). Em certas modalidades o ligante corante está ligado a um suporte sólido, por exemplo, de Mimetioc Orange 2 A6XL™, Mimetic Orange 3 A6XL™, Mimetic Yellow 1 A6XL™, Mimetic Yellow 2 A6XL™, Mimetic Green 1 A6XL™, Mimetic Blue 1 A6XL™, e Mimetic Blue 2 A6XL™(Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). 0 ligante corante pode estar ligado a um suporte sólido. 0 suporte sólido pode ser qualquer suporte sólido conhecido na técnica (ver, por exemplo, www.seperationsNOW.com). Exemplos de suportes sólidos podem incluir uma conta, um gel, uma membrana, uma nanopartícula, ou uma microesfera. 0 suporte sólido pode compreender qualquer material que possa ser ligado a um ligante corante (por exemplo, agarose, poliestireno, sefarose, sephadex). Suportes sólidos podem compreender qualquer polímero orgânico sintético tal como poliacrílico, polímeros vinila, acrilato, polimetacrilato, e poliacrilamida. Suportes sólidos também podem compreender um polímero carboidrato, por exemplo, agarose, celulose ou dextrano. Suportes sólidos podem compreender óxidos inorgânicos, como sílica, zirconia, titânia, céria, alumina, magnésia (isto é, óxido de magnésio), ou óxido de cálcio. Suportes sólidos também podem compreender combinações de alguns dos suportes mencionados acima incluindo, mas não limitado a, dextrano-acrilamida.
Exemplos 90
Exemplo 1: Peso molecular afeta transcitose mediada por
FcRn
Proteínas quiméricas compreendidas por varias proteínas de interesse e IgG Fc foram recombinantemente produzidas (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed;. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) ou no caso de contactina-Fc, ΜΑΒ-β-gal (um complexo de um anticorpo monoclonal ligado a β-gal) (Biodesign International, Saco, ME) e MAB-GH (um complexo de anticorpo monoclonal e hormónio de crescimento) (Research Diagnostics, Inc. Flanders, NJ) foram adquiridos comercialmente. Resumidamente, os genes codificando a proteína de interesse foram clonados por peR, e então subclonados em um plasmídeo de expressão de fusão Fc. Os plasmídeos foram transfectados em células DG44 CHO e transfectantes estáveis foram selecionados e amplificados com metotrexato. Os homodímeros de proteína quimérica foram purificados sobre uma coluna de proteína A. As proteínas testadas incluíram interferon a, hormónio de crescimento, eritropoietina, hormónio de estimulação de folículo, Fator IX, β galactosidase, contactina, e Fator VIII. Ligação de proteínas a porções de imunoglobulina, incluindo o parceiro de ligação de receptor de FcRn, ou usando complexos comercialmente disponíveis de anticorpo inteiro (incluindo a região de ligação de FcRn) - antígeno permitiu a investigação de transcitose como uma função de peso molecular (ver patente US 6,030,613). As proteínas quiméricas foram administradas a ratos oralmente e níveis em soro foram medidos 2-4 horas após administração usando um ELISA para proteínas quiméricas produzidas recombinantemente e ambos, um western blot e ELISA para complexos anticorpos obtidos comercialmente e proteínas quiméricas. Adicionalmente, todos as proteínas ou 91 complexos obtidos comercialmente assim como controlos Fator VIII-Fc, Fator IX-Fc e Epo-Fc foram iodados usando contas 1000 (Pierce, Pittsburgh, PA). Os resultados indicaram que niveis em soro de Fc e proteínas quiméricas de anticorpo monoclonal administrados oralmente a ratos são diretamente relacionados ao tamanho da proteína. O ponto de corte aparente para proteínas quiméricas Fc administradas oralmente está entre 200-285 kO (Tabela 2).
Tabela 2
Proteína Tamanho (kD) Transcitose IFNOC-Fc 92 ++++ GH-Fc 96 +++ Epo-Fc 120 +++ FSH-Fc 170 +++ MAB:GH 172-194 +++ FIX-Fc 200 + MAB:PGal 285-420 - Contactina-Fc 300 - FVIIIA-Fc 380 -
Exemplo 2: Clonagem de pcADN 3.1-Flag-Fc A sequência para o peptídeo FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-AspAsp-Lys), um marcador de afinidade comum usado para identificar ou purificar proteínas, foi cionado no plasmídeo pcADN 3.1-Fc, que contém a sequência sinallgk de camundongo seguida pelo fragmento Fc de IgGl humana (aminoácidos 221-447, numeração EU) . 0 constructo foi criado por peR sobreposição usando os seguintes iniciadores:
FlagFc-Fl: 5'- GCTGGCTAGCCACCATGGA -3' (SEQ ID N°: 41) FlagFc-Rl: 5'- CTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTCACCAGTGG AACCTGGAAC -3' (SEQ ID N°: 42)
FlagFc-F2: 5'- GACTACAAGG ACGACGATGA CAAGGACAAAACTC ACACAT GCCCACCGTG CCCAGCTCCG GAACTCC -3' (SEQ ID N°: 43) 92
FlagFc-R2: 5'- TAGTGGATCCTCATTIACCCG -3' (SEQ ID N°: 44) 0 molde pcADN 3.1-Fc foi então adicionado a duas reações PCR separadas contendo 50 pmol de cada um dos pares de iniciadores FlagFc-Fl/Rl ou FlagFc-F2/R2 Numa reação de 50 pL usando Pfu Ultra ADN polimerase (Stratagene, CA) de acordo com protocolo padrão de fabricante em um MJ Thermocycler usando os seguintes ciclos: 95°C 2 minutos; ciclos de (95°C 30 segundos, 52°C 30 segundos, 72°C 45 segundos), seguido por 72°C por 10 minutos. Os produtos destas duas reações foram então misturados Numa outra reação PCR (2 pL cada) com 50 pmoles de iniciadores FlagFc-F1 e FlagFc-R2 Numa reação de 50 pL usando Pfu Ultra ADN polimerase (Stratagene, CA) de acordo com protocolo padrão do fabricante em um MJ Thermocycler usando os seguintes ciclos: 95°C 2 minutos; ciclos de (95°C 30 segundos, 52°C 30 segundos, 72°C 45 segundos), seguido por 72°C por 10 minutos. O resultante fragmento foi purificado com gel, digerido e inserido no plasmídeo pcADN 3.1-Fc Nhel-Bam Hl. O plasmideo resultante contém a sequência sinal IgK de camundongo produzindo a proteína FlagFc.
Exemplo 3: Clonagem de constructo Fator VII-Fc A sequência codificante para Fator VII, foi obtida por RT-PCR a partir de ARN de fígado fetal humano (Clontech, Paio Alto, CA) . A região clonada é compreendida pela sequência de ADNc a partir de bp 36 para bp 1430 terminando justo antes de códon de interrupção. Um sítio Sbfl foi introduzido no término-N. Um sítio BspEI foi introduzido sobre o término-C. O constructo foi clonado por PCR usando os iniciadores: 93
Jusante: 5' GCTACCTGCAGGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGG 3' (SEQ ID N°: 45)
Montante: 5' CAGTICCGGAGCTGGGCACGGCGGGCACGTGTGAGTTTIGTCGGG AAAT GG 3' (SEQ ID N°: 46) e as seguintes condições: 95°C por 5 minutos seguido por 30 ciclos de 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto e 45 segundos, e um ciclo de extensão final de 72°C por 10 minutos. O fragmento foi digerido Sbfl-BspE I e inserido em pED.dC-Fc um plasmídeo codificando o fragmento Fc de IgGl.
Exemplo 4: Clonaqem de constructo Fator IX-Fc A sequência codificando Fator IX humano, incluindo a sequência de pré-peptídeo, foi obtida por amplificação de RT-PCR a partir de ARN de fígado humano adulto usando os seguintes iniciadores:
natFIX-F: 5'-TTACTGCAGAAGGTTATGCAGCGCGTGAACATG- 3' (SEQ ID N° : 47)
F9-R: 5' -1 TTTTCGAATTCAGTGAGCTTTGTTTTTICCTTAATCC- 3' (SEQ ID N°: 48) 20 ng de ARN de fígado humano adulto (Clontech, Paio Alto, CA) e 25 pmoles de cada iniciador foram adicionados a uma reação de RT-PCR usando o sistema SuperScript™. RT-PCR de uma etapa com sistema PLATINUM™ Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com protocolo de fabricantes. Reação foi realizada em um MJ Thermocycler usando os seguintes ciclos: 50°C 30 minutos; 94°C 2 minutos; 35 ciclos de (94°C 30 segundos, 58°C 30 segundos, 72°C 1 minuto), e um final de 72°C 10 minutos. O fragmento foi purificado em gel usando Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Valência, CA) , e 94 digerido com Pstl-EcoRI, purificado em gel, e clonado na correspondente digestão do plasmídeo pED.dC.xFc.
Exemplo 5: Clonagem de constructo PACE A sequência codificando PACE humana (enzima clivando aminoácido básico emparelhado), uma endoprotease, foi obtida por RT-PCR. Os seguintes iniciadores foram usados: PACE-F1 N° : 49) PACE-R1 50) PACE-F2 PACE-R2 N°: 52)
5'- GGTAAGCTIGCCATGGAGCTGAGGCCCTGGTIGC -3' (SEQ ID 5'- GTITICAATCTCTAGGACCCACTCGCC -3' (SEQ ID N°: 5'- GCCAGGCCACATGACTACTCCGC -3' (SEQ ID N°: 51)
5'- GGTGAATTCTCACTCAGGCAGGTGTGAGGGCAGC -3' (SEQ ID
O iniciador PACE-F1 adiciona um sitio Hindlll à extremidade 5' da sequência PACE começando com 3 nucleotídeos antes de códon de partida, enquanto o iniciador PACE-R2 adiciona um códon de parada após aminoácido 715, que ocorre na extremidade de domínio extracelular de PACE, assim como adicionando um sítio EcoRI à extremidade 3' do códon de parada. Os iniciadores PACE-R1 e -F2 anelam sobre os lados 3' e 5' de um sítio BamHI interno, respectivamente. Duas reações RT-PCR foram então estabelecidas usando 25 pmoles de cada um dos pares de iniciadores de PACEF1/R1 ou PACE-F2/R2 com 20 ng de ARN de fígado humano adulto (Clonte-ch; Paio Alto, CA) Numa reação RT-PCR de 50 JJL usando o SuperScript™. RT-PCR de uma etapa com sistema PLATINUM Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com protocolo do fabricante. A reação foi realizada em um MJ Thermocycler usando os seguintes ciclos: 50°C 30 minutos; 94°C 2 minutos;ciclos de (94°C 30 segundos, 58°C 30 segundos, 72°C 95 2 minutos), seguido por 72°C 10 minutos. Estes fragmentos foram ligados no vetor pGEM TEasy (Promega, Madison, WI) e inteiramente seguenciados. O fragmento F2-R2 foi então subclonado em pcADNô V5/His (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando os sítios BamHI/EcoRl, e então o fragmento Fl-Rl foi cionado neste constructo usando os sítios Hindlll/BamHI. O plasmídeo final, pcADN6-PACE, produz uma forma solúvel de PACE (aminoácidosl-715) , na medida em que a região de transmembrana foi suprimida. A sequência de PACE em pcADNô-PACE é essencialmente como descrito em Harrison et al. 1998, Seminars in Hematology 35:4.
Exemplo 6: Clonagem de constructo de ligante de oito aminoácidos IFNa-Fc A sequência codificando interferon α 2b humano (hlFNa), incluindo a sequência sinal, foi obtida por PCR a partir de ADN genómico humano usando os seguintes iniciadores: IFNa-Sig-F: 5'-GCTACTGCAGCCACCATGGCCTTGACCTTTGCTTTAC-3' (SEQ ID N°: 53)
IFNa-EcoR-R: 5'-CGTTGAATTCTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC-3' (SEQ ID N°: 54) ADN genómico foi preparado de linha de células astrocitoma humana 373MG, de acordo com processos padrões (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press). Resumidamente, aproximadamente 2xl05 células foram peletizadas por centrifugação, re-suspensas em 100 pL de solução salina tamponada com fosfato pH 7,4, então misturadas com igual volume de tampão de lise (Tris 100 mM pH 8,0/NaCl Mm 200 / 2% SDS/ 5Mm eDTA) . Proteinase K foi adicionada a uma concentração final de 100 μ/mL, e a amostra foi digerida a 96 37°C por 4 horas com ocasional mistura suave. A amostra foi então extraida duas vezes com fenol: clorofórmio, o ADN precipitado através de adição de acetato de sódio pH 7,0 para 100 mM e um igual volume de isopropanol, e peletizado por centrifugação por 10 minutos em temperatura ambiente. 0 sobrenadante foi removido e o pélete foi lavado uma vez com etanol 70% frio e deixado secar ao ar antes de re-suspensão em TE (Tris 10 mM pH 8,0/EDTA 1 mM). 100 ng deste ADN genómico foram então usados numa reação PCR de 25 pL com 25 pmoles de cada iniciador usando Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) de acordo com protoloco padrão de fabricante num MJ Thermocycler usando os seguintes ciclos: 94°C 2 minutos; 30 ciclos de (94°C 30 segundos, 50°C 30 segundos, 72°C 25 45 segundos), e finalmente 72°C 10 minutos. A banda de tamanho esperado (-550 bp) foi purificada com gel com um kit Gel Extraction (Qiagen, Valência, CA), digerida com Pstl/EcoRl, novamente purificada com gel, e clonada no sitio Pstl/EcoRI de pED.dC.XFc, que contém um Ligante de 8 aminoácidos (EFAGAAAV) seguido pela região Fc de IgGl humana.
Exemplo 7: Clonagem de constructo IFNaFc Aligante 1 μΐ de pED.dC.nativo humano IFNaFc ADN, do Exemplo 6, foi então usado como um molde Numa reação PCR de 25 μΐ com 25 pmoles de cada iniciador IFNa-Sig-F e o seguinte iniciador: hlFNaNoLinkFc-R: 5'CAGTTCCGGAGCTGGGCACGGCGGGCACGTGTGAG TTTTGTCTTCCTTACTTCTTAAAC I I I I IGCAAGTTIG- 3' (SEQ ID N°: 55) 97 A reação PCR foi realizada usando Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) de acordo com o protocolo padrão do fabricante em um RapidCycler thermocycler (Idaho Technology, Salt Lake City, UT), desnaturando a 94°C por 2 minutos seguido por 18 ciclos de 95°C por 15 segundos, 55°C por segundo, e 72°C por 1 minuto com uma inclinação de 6, seguido por extensão em 72°C por 10 minutos. Um produto PCR do tamanho correto (-525 bp) foi purificado com gel usando um kit Gel Extraction (Qiagen; valência, CA), digerido com as enzimas de restrição Pstl e BspEI, purificado com gel, e subclonado nos correspondentes sítios de um pED.dC.XFc modificado, onde os aminoácidos 231-233 da região Fc foram alterados usando a degenerescência do código genético para incorporar um sítio BspEI enquanto mantendo a sequência de aminoácidos de tipo selvagem.
Exemplo 8: Clonagem de constructo IFNocFc Ligante GS15
Um vetor cadeia principal novo foi criado usando a Fc encontrada em constructo Aligante (contendo sítios BspEI e Rsrll na extremidade 5' usando a degenerescência do código genético para manter a sequência de aminoácidos), usando este ADN como um molde para uma reação PCR com os seguintes iniciadores: 5' B2xGGGGS: 5' gtcaggatccggcggtggagggagcgacaaaac tcacacgtgccc 3' (SEQ ID N°: 56) 3' GGGGS: 5' tgacgcggccgctcatttacccggagacaggg 3'(SEQ ID N°: 57)
Uma reação PCR foi realizada com 25 pmoles de cada iniciador usando enzima Pfu Turbo (Stratagene, La Jolla, CA) de acordo com protocolo padrão de fabricante em um MJ Thermocycler usando o seguinte processo: 95°C 2 minutos; 30 98 ciclos de (95°C 30 segundos, 54°C 30 segundos, 72°C 2 minutos), 72°C 10 minutos. A banda de tamanho esperado (-730 bp) foi purificada com gel com um kit Gel Extraction (Qiagen, Valência, CA), digerida com BamHIINotl; novamente purificada com gel, e clonada no vetor digerido BamHI/Notl de pcADN6 10, uma versão de pcADN6 com a sequência IRES e gene dhfr inseridos no sitio Notl/Xbal. 500 ng de pED.dc.ADN IFNOCFc humano nativo foram então usados como um molde Numa reação PCR de 25 μΐ com os seguintes iniciadores: 5' IFNCC for GGGGS: 5' ccgctagcctgcaggccaccatggccttgacc 3' (SEQ ID N°: 58) 3' IFNCC for GGGGS: 5'ccggatccgccgccaccttccttactacgtaaac 3' (SEQ ID N°: 59)
Uma reação PCR foi realizada com 25 pmoles de cada iniciador usando Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) de acordo com o protocolo padrão do fabricante em um MJ Thermocycler 15 usando os seguintes ciclos: 95°C 2 minutos; 14 ciclos de (94°C 30 segundos, 48°C 30 segundos, 72°C 1 minuto), 72°C 10 minutos. A banda de tamanho esperado (-600 bp) foi purificada em gel com um kit Gel Extraction (Qiagen, Valência, CA) , digerida com Nhel/BamHl, novamente purificada com gel, e clonada no sítio Nhel/BamHI do vetor pcADN6 10/Fc, acima, para criar uma fusão IFNa Fc com um ligante Gly/Ser de aminoácidos (2xGGGGS) , pcADN610HFNOC-GSlO-Fc.
Uma reação PCR foi então realizada usando 500 ng deste pcADN6 ID(IFNa-GSlO-Fc com os seguintes iniciadores: 5' B3XGGGGS: 5'(SEQ ID N°: 60) 99 gtcaggatccggtggaggcgggtccggcggtggagggagcgacaaaactcacacgtgcc c 3' (SEQ ID N°: 61) fcclv-R: 5' atagaagcctttgaccaggc 3' (SEQ ID N°: 62)
Uma reação PCR foi realizada com 25 pmoles de cada iniciador usando Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) de acordo com protocolo padrão de fabricante em um MJ Thermocycler usando os seguintes ciclos: 95°C 2 minutos; 14 ciclos de (94°C 30 segundos, 48°C 30 segundos, 72°C 1 minuto), 72°C 10 minutos. A banda de tamanho esperado (504 bp) foi purificada em gel com um kit Gel Extraction (Qiagen, Valência, CA) , digerida com BamHI/BspEI, a banda de 68 bp foi purificada com gel, e clonada no sitio BamHI/BspEI do vetor pcADN6 ID/IFNaGSlO-Fc, acima, para criar uma fusão IFNa Fc com um Ligante Gly/Ser de aminoácidos (3xGGGGS), pcADN6 IDIIFNcx-GS15-Fc.
Exemplo 9: Clonagem de um constructo de peptídeo básico A região gonzo do fragmento Fc de IgGl humana de aminoácidos 221-229 (numeração EU) foi substituída com um peptídeo básico (CCB).
Quatro oligos de sobreposição foram usados (IDT, Coralville, IA): 1. CCB-Fc Sentido 1: 5' GCC GGC GAA TTC GGT GGT GAG TAC CAG GCC CTG AAG AAG AAG GTG GCC CAG CTG AAG GCC AAG AAC CAG GCC CTG AAG AAG AAG 3' (SEQ ID N°: 63) 2. CCB-Fc Sentido 2: 5' GTG GCC CAG CTG AAG CAC AAG GGC GGC GGC CCC GCC CCA GAG CTC CTG GGC GGA CCG A 3' (SEQ ID N°: 64) 100 3. CCB-Fc Anti-Sentido 1: 5' CGG TCC GCC CAG GAG CTC TGG GGC GGG GCC GCC GCC CTT GTG CTT CAG CTG GGC CAC CTT CTT CTT CAG GGC CTG GTT CTT G 3 ' (SEQ ID N°: 65) 4. CCB-Fc Anti-Sentido 2: 5' GCC TTC AGC TGG GCC ACC TTC TTC nc AGG GCC TGG TAC TCA CCA CCG AAT TCG CCG GCA 3' (SEQ ID N°: 66)
Os oligos foram reconstituídos para uma concentração de 50 μΜ com dH20. 5 μΐ de cada oligo foram anelados uns aos outros através de combinação com um tubo de PCR de parede fina com 2,2 μΐ de tampão de restrição n° 2 (isto é, concentração final de 10 mM Tris HCI pH 7,9, 10 mM MgCl2, 50 mM Na Cl, 1M ditiotreitol)(New England Biolabs, Beverly, MA) e aquecidos a 95°C por 30 segundos e então deixados anelarem através de lento arrefecimento por 2 horas para 25°C. 5 pmoles dos oligos agora anelados foram ligados em um vetor pGEM T-Easy como direcionado no manual do kit (Promega, Madison, WI). A mistura de ligação foi adicionada a 50 μΐ de células de E. coli competentes DH5a (Invitrogen, Carlsbad, CA) sobre gelo por 2 minutos, incubada a 37°C por 5 minutos, incubada sobre gelo por 2 minutos, e então revestida sobre placas de ágar ampicilina 100 μΙ/L LB+ e colocadas a 37°C por 14 horas. Colónias bacteriais individuais foram tomadas e colocadas em 5 mL de LB+ 100 μΙ/L ampicilina e deixadas crescerem por 14 horas. Os tubos foram girados em 2000xg, 4°C por 15 minutos e o ADN vetor
foi isolado usando kit Qiagen miniprep (Qiagen, Valência, CA) como indicado no manual do kit. 2 pg de ADN foram digeridos com NgoM IVRsr-II. O fragmento foi purificado em gel com o processo Qiaquick como instruído no manual do kit (Qiagen, Valência, CA) e ligado a pEO.dcEpoFc com NgoM 101 IV/Rsr 11. A ligação foi transformada em células E. coli competentes 0H5a e o ADN preparado como descrito para o vetor pGEM T-Easy.
Exemplo 10: Clonaqem do constructo eritropoietina - Fc peptídeo ácido A região gonzo do fragmento Fc de IgGl humana em EPO-Fc de aminoácido 221-229 (numeração EU) foi substituída com um peptídeo ácido (CCA). Quatro oligos de sobreposição foram usados (IDT, Coralville, IA): 1. Epo-CCA-Fc Sentido 1: 5 ' CCG GTG ACA GGG AAT TCG GTG GTG AGT ACC AGG CCC TGG AGA AGG AGG TGG CCC AGC TGG AG 3' (SEQ ID N°: 67) 2. Epo-CCA-Fc Sentido 2: 5' GCC GAG AAC CAG GCC CTG GAG AAG GAG GTG GCC CAG CTG GAG CAC GAG GGT GGT GGT CCC GCT CCA GAG CTG CTG GGC GGA CA 3 ' (SEQ ID N°: 68) 3. Epo-CCA-Fc Anti-Sentido 1: 5 ' GTC CGC CCA GCA GCT CTG GAG CGG GAC CAC CAC CCTCGT GCT CCA GCT GGG CCA C 3' (SEQ ID N°: 69) 4. Epo-CCA-Fc Anti-Sentido 2: 5' CTC cn CTC CAG GGC CTG Gn CTC GGC CTC CAG CTG GGC CAC CTC cn CTC CAG GGC CTG GTA CTC ACC ACC GAA TTC CCT GTC ACC GGA 3' (SEQ ID N° : 70) 102
Os oligos foram reconstituídos para uma concentração de 50 μΜ com dH20. 5 μΐ de cada oligo foram anelados uns aos outros em um tubo de PCR de parede fina com 2,2 IJL de tampão de restrição N° 2 (New England Biolabs, Beverly, MA) e aquecidos a 95°C por 30 segundos e então deixados arrefecerem lentamente por 2 horas para 25°C. 5 pmoles dos oligos agora anelados foram ligados em um vetor pGEM T-Easy como direcionado no manual do kit (Promega, Madison, WI). A mistura de ligação foi adicionada a 50 μΐ de células de E.coli competentes DH5a (Invitrogen, Carlsbad, CA) sobre gelo por 2 minutos, incubadas a 37°C 5 minutos, incubadas sobre gelo por 2 minutos, e então revestidas sobre placas de LB+ 100 pg/L ampicilina ágar e colocadas a 37°C por 14 horas. Colónias bacteriais individuais foram tomadas e colocadas em 5 mL de LB+ 100 μΙ/L ampicilina e deixadas crescerem por 14 horas. Os tubos foram girados em 2000xg, 4°C por 15 minutos e o ADN vetor foi preparado usando kit Qiagen miniprep (Qiagen, Valência, CA) como indicado no manual do kit. 2 pg de ADN foram digeridos com Age I-Rsr-II. O fragmento foi purificado através do processo Qiaquick como instruído no manual do kit (Qiagen, Valência, CA) e ligado em pED.Epo Fc.l Age I-Rsr 11. A ligação foi transformada em células E. coli competentes OH5a e ADN preparado como descrito acima.
Exemplo 11: Clonagem de constructo Cys-Fc
Usando PCR e técnicas padrões de biologia molecular (Sambrook et ai. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold spring Hlaboratory Press), um constructo de expressão de mamífero foi gerado de modo que a sequência codificando o peptídeo sinal IFNa humano foi diretamente limitada contra a sequência codificando Fc iniciando no primeiro resíduo cisteína (Cys 226, numeração 103
EU). Com clivagem de peptidase sinal e secreção a partir de células mamíferas, uma proteína Fc com um resíduo cisteína terminal-N foi assim gerada. Resumidamente, os iniciadores IFNaSig-F (IFNa-Sig-F: 5'-GCTACTGCAGCCACCATGGCCTTGACC TITGCTIT AC-3 ' ) (SEQ ID N° : 71) e Cys-Fc-R (5'- CAGTTCCGGAGCTGGGCACGGCGGAGAGCCCACAGAGCAGCTTG-3') (SEQ ID N°: 72) foram usados Numa reação de PCR para criação de um fragmento ligando a sequência sinal IFNa com o término N de Fc, iniciando com Cys 226. 500 ng de pED.dc. hlFNa Aligante nativo foram adicionados a 25 pmoles de cada iniciador Numa reação PCR com Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) de acordo com protocolo padrão de fabricante. A reação foi realizada em um MJ Thermocycler usando os seguintes ciclos: 94°C 2 minutos; 30 ciclos de (94°C 30 segundos, 50°C 30 segundos, 72°C 45 segundos), e finalmente 72°C 10 minutos. A banda de tamanho esperado (-112 bp) foi purificada em gel com um kit Gel Extraction (Qiagen, Valência, CA) , digerida com as enzimas de restrição Pstl e BspEI, purificada com gel, e subclonada nos correspondentes sítios pED.dc.hlFNa Aligante nativo para geração de pED.dc.Cys-Fc (Figura 5).
Exemplo 12: Expressão de proteína e preparação de Fc-MESNA
A sequência codificando Fc (a região constante de IgGl humana) foi obtida por amplificação PCR a partir de um plasmídeo contendo Fc usando condições e reagentes padrões, seguindo o procedimento recomendado pelo fabricante para subclonar a sequência codificando Fc Ndel/Sapl. Resumidamente, os iniciadores 5'-GTGGTCATA TGGGCATTGAAGGCA-GAGGCGCCGCTGCGGTCG-3' (SEQ ID N° : 73) e 5'-GGTGGTTGC TCTTCCGCAAAAACCCGGAGACAGGGAGAGACTCTTCTGCG-3'(SEQ ID N°: 74) foram usados para amplificar a sequência Fc a partir de 500 ng do plasmídeo pED.dC.Epo-Fc usando Expand High Fidelity 104
System (Boehringer Mannheim, Basel, Switzerland) em um termociclador RapidCylcler (Idaho Technology, sal Lake City, Utah), desnaturando a 95°C por 2 minutos seguido por 18 ciclos de 95°C por 0 segundo. 55°C por 0 segundo, e 72°C por 1 minuto com uma inclinação de 4, seguido por extensão em 72°C por 10 minutos. O produto de PCR foi subclonado em um vetor de clonagem intermediário e inteiramente sequenciado, e então subclonado usando os sitios Ndel e Sapl no vetor pTWINl seguindo procedimentos padrão. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.; Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Este plasmideo foi então transformado em células BL21 (OE3) pLysS usando processos padrões. Id. Uma cultura de 1 litro de células foi desenvolvida para uma leitura de absorbância de 0,8 AU a 37°C, induzida com isopropil beta-D-l-tiogalacto piranosídeo 1 mM, e crescida por toda a noite a 25°C. Células foram peletizadas por centrifugação, Iisadas em Tris 8.8 20 mM/NP40 l%lfIuoreto de fenil metano sulfonila 0,1 mM/Benzonase 1 pg/mL (Novagen, Madison, WI), e ligadas a contas de quitina (New England Biolabs; Beverly, MA) por toda noite a 4°C. Contas foram então lavadas com vários volumes de coluna de Tris 8.5 20 mM/NaCl 500 mM/EDTA 1 mM, e então armazenadas a -80°C. Fc-MESNA purificada foi gerado por eluição de proteína a partir das contas em Tris 8.5 20 mM/NaCl 500 mM/EDTA 1 mM/ácido 2-mercapto etano sulfônico 500 mM (MESNA), e o eluato foi usado diretamente na reação de acoplamento, abaixo.
Exemplo 13: Expressão e purificação de híbrido monômero-dímero Fator VII-Fc Células CHO DG-44 expressando Fator VII-Fc foram estabelecidas. Células CHO DG-44 foram desenvolvidas a 105 37°C, 5% C02, ribonucleosídeos inativado 5% até em MEM Alpha plus nucleosídeo e e suplementado com soro bovino fetal termo transfecção. Células DG44 foram revestidas em placas de Petri de cultura de tecido de 100 mm e crescidas para uma confluência de 50%-60%. Um total de 10 pg de ADN foi usado para transfectar uma placa de 100 mm: 7,5 pg de pED.dC.FVII-Fc + 1,5 pg pcADN3/Flag-Fc + 1 pg de pcADN6-Pace. As células foram transfectadas como descrito no manual de reagente de transfecção Superfect (Qiagen, Valência, CA). Os meios foram removidos da transfecção após 48 horas e substituídos com MEM Alpha sem nucleosídeos plus soro bovino fetal dializado 5% e 10 pg/mL de Blasticidin (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 0,2 mg/mL de geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Após 10 dias, as células foram libertadas da placa com tripsina 0,25% e transferidas em frascos de cultura de tecido T25, e a seleção foi continuada por 10-14 dias até as células começarem a crescer bem quando linhas estáveis de células foram estabelecidas. Expressão de proteína foi subsequentemente amplificada pela adição de metotrexato 25 nM.
Aproximadamente 2 x 107 células foram usadas para inocular 300 mL de meio de crescimento Numa garrafa de rolo de 1700 cm2 (Corning, Corning, NY) suplementado com 5 ~g/mL de vitamina K3 (bissulfito de sódio menadiona) (Sigma, St. Louis, MO) . As garrafas de rolar foram incubadas em 5% de CO2 a 37°C por 72 horas. Então o meio de crescimento foi trocado com 300 mL de meio de produção livre de soro (DMEM/F12 com 5 pg/mL de insulina bovina e 10 pg/ml de Gentamicina) suplementado com 5 pg/L de vitamina K3. O meio de produção (meio condicionado) foi coletado todo dia por 10 dias e armazenado a 4°C. Meio de produção novo foi 106 adicionado às garrafas de rolo após cada coleta e as garrafas foram retomadas para a incubadora. Meios reunidos foram primeiro clarificados usando um filtro de fibra de vidro Sartoclean (3,0 pm + 0,2 pm) (Sartorius Corp. Gottingen, Germany) seguido por um filtro Acropack 500 (0,8 pm + 0,2 pm)(Pall Corp., East Hills, NY). Os meios clarificados foram então concentrados aproximadamente 20 vezes usando cassetes de filtração de fluxo tangencial Pellicon Biomax (10 kDa MWCO) (Millipore Corp., Billerica, MA) .
Quimeras Fc foram então capturadas a partir dos meios concentrados através de passagem sobre uma coluna de fluxo rápido de Protein A Sefarose 4 (AP Biotech, Piscataway, NJ) . Uma coluna 5x5 em (100 ml) foi carregada com >5 mg proteína Fc por mL de volume de coluna Numa taxa de fluxo linear de 100 em/hora para obter um tempo de residência de >3 minutos. A coluna foi então lavada com >5 volumes de coluna de 1XDPBS para remover proteínas ligadas não-especificamente. As proteínas ligadas foram eluídas com glicina 100 mM pH 3,0. Frações de eluição contendo o pico de proteína foram então neutralizadas pela adição de 1 parte de TrisHCI 1 M, pH 8 a 10 partes de fração eluída.
Para remoção de homodímeros FLAG-Fc (ou seja, dímeros Fc quiméricos com peptídeo FLAG expresso como fusões com ambas moléculas Fc) a partir de preparação, a reunião de Protein A Sefarose 4 Fast Flow foi passada sobre uma coluna de troca de cátions Unosphere S (BioRad Corp., Richmond, CA). Sob as condições de operação para a coluna, o híbrido monômero-dímero FLAG-Fc é não-carregado (FLAG-Fc teórico pl = 6,19) e flui através da coluna enquanto os constructos hFVII-Fc são carregados positivamente, e assim se ligam à coluna e eluem em maior resistência iônica. A reunião de 107
Protein A Sefarose 4 Fast Flow foi primeiro dializada em MES 20 mM, NaCl 20 mM, ρΗ 6Λ1. O material dializado foi então carregado numa coluna de 1,1 x 11 em (9,9 mL) em 150 em/hora. Durante a lavagem e eluição, a taxa de fluxo foi aumentada para 500 em/hora. A coluna foi lavada sequencialmente com 8 volumes de coluna de MÊS 20 mM, NaCl 20 mM, pH 6,1 e 8 volumes de coluna de MES, NaCl 40 mM, pH 6,1. A proteina ligada foi eluida com MES 20 mM, NaCl 750 mM, pH 6,1. Frações de eluição contendo o pico de proteina foram reunidas e filtradas estéreis através de um disco de filtro de 0,2 pm antes de estocagem a -80°C.
Uma coluna de afinidade MAB anti-FLAG foi usada para separar dimeros Fc quiméricos com hFVII fundido a ambas moléculas Fc a partir daquelas com um peptídeo FLAG e uma fusão hFVII. A reunião Unosphere S Eluate foi diluída 1:1 com Tris 20 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 8 e carregada sobre uma coluna M2 anti-FLAG sefarose de 1,6x5 em (Sigma Corp., St. Louis, MO) Numa taxa de fluxo linear de 60 em/hora. Carga foi alvejada para <2,5 mg de híbrido monômero-dímero/mL de volume de coluna. Após carga a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de Tris 20 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 8,0, híbridos monômero-dímero foram então eluídos com glicina 100 mM, pH 3,0. Frações de luição contendo o pico de proteína foram então neutralizadas pela adição de 1 parte de Tris-HCI 1 M, .pH 8 a 10 partes de fração de eluato. Reuniões foram armazenadas a -80°C.
Exemplo 14: Expressão e purificação de híbrido monômero-dímero e homodímero Fator IX-Fc Células CHO DG-44 expressando Fator IX-Fc foram estabelecidas. Células DG44 foram revestidas em placas de petri de cultura de tecido de 100 mm e crescidas para uma 108 confluência de 50%-60%. Um total de 10 pg de ADN foi usado para transfectar uma placa de 100' mm: para a transfecção de homodímero, 8 pg de pED.dC. Fator IX-Fc + 2 pg de pcADNôPACE foram usados; para a transfecção de híbrido monômero-dímero, 8 pg de pED.dC. Fator IX-Fc + 1 pg de pcADN3-FlagFc + 1 pg de pcADN6-PACE foram usados. As células foram transfectadas como descrito no manual de reagente de transfecção Superfect (Qiagen, Valência, CA) . Os meios foram removidos de transfecção após 48 horas e substituídos com MEM Alpha sem nucleosídeos plus soro bovino fetal dializado 5% e 10 pg/mL de Blasticidin (Invitrogen, Carlsbad, CA) para ambas transfecções, enquanto a transfecção de híbrido monômero-dímero também foi suplementada com 0,2 mg/mL de geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Após 3 dias, as células foram libertadas da placa com tripsina 0,25% e transferidas em frascos de cultura de tecido T25, e a seleção foi continuada por 10-14 dias até as células começarem a crescer bem quando linhas estáveis de células foram estabelecidas. Expressão de proteína foi subsequentemente amplificada pela adição de metotrexato 10 nM ou 100 nM para o homodímero ou híbrido monômero-dímero, respectivamente.
Para ambas linhas de células, aproximadamente 2xl07 células foram usadas para inocular 300 mL de meio de crescimento Numa garrafa de rolo de 1700 cm2 (Corning, Corning, NY) , suplementado com 5 pg/L de vitamina K3 (bissulfito de sódio menadiona) (Sigma, St. Louis, MO). As garrafas de rolo foram incubadas em 5% de CO2 a 37°C por aproximadamente 72 horas. O meio de crescimento foi trocado com 300 mL de meio de produção livre de soro (DMEM/F12 com 5 pg/mL de insulina bovina e 10 pg/mL gentamicina) , suplementado com 5 pg/L de vitamina K3. O meio de produção (meio condicionado) foi coletado todo dia por 10 dias e armazenado a 4°C. Meio de 109 produção novo foi adicionado às garrafas de rolo após cada coleta e as garrafas foram retornadas para a incubadora. Antes de cromatografia, o meio foi clarificado usando um filtro SuporCap-100 (0,8/0,2 pm) (Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). Todas as etapas que se seguem foram realizadas a 4°C. O meio clarificado foi aplicado a Proteína A Sefarose, lavado com 5 volumes de coluna de 1XPBS (fosfato 10 mM, pH 7,4, KCI 2,7 mM, e NaCl 137 mM) , eluído com glicina 0,1 M, pH 2,7, e então neutralizado com 1/10 de volume de Tris-HCI 1 M, pH 9,0. A proteína foi então dializada em PBS. A amostra de proteína de transfecção híbrido monômero-dímero foi ainda submetida a purificação, na medida em que ela continha uma mistura de homodímero FIX-Fc:FIX-Fc, híbrido monômero-dímero FIX-Fc:Flag-Fc, e homodímero Flag-Fc: Flag-Fc. Material foi concentrado e aplicado a uma coluna Superdex 200 Prep Grade de 2,6 cm x 6 0 cm (318 mL) numa taxa de fluxo de 4 ml/minuto (36 cm/hora) e então eluída com 3 volumes de coluna de 1XPBS. Frações correspondendo a dois picos sobre o detetor UV foram coletadas e analisadas por SOS-PAGE. Frações do primeiro pico contiveram homodímero FIX-Fc:FIX-Fc ou híbrido monômero-dímero FIXFc: FlagFc, enquanto o segundo pico conteve homodímero FlagFc:FlagFc. Todas as frações contendo
0 híbrido monômero-dímero mas não homodímero FlagFc foram reunidas e aplicadas diretamente a uma coluna de M2 antiFLAG sefarose de 1,6x5 cm (Sigma Corp., St. Louis, MO) Numa taxa de fluxo linear de 60 cm/hora. Após carga, a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de PBS. Híbridos monômero-dímero foram então eluídos com glicina 100 mM, pH 3,0. Frações de eluição contendo o pico de proteína foram então neutralizadas pela adição de 1/10 volume de Tris-HCI 1 M, e analisadas por SOS-PAGE redutora e não-redutora. 110
Frações foram dializadas em PBS, concentradas para 1-5 mg/mL, e armazenadas a -80°C.
Exemplo 15: Expressão e purificação de híbrido monômero-dímero e homodímero IFNa Células CHO DG-44 expressando hlFNa foram estabelecidas. Células OG44 foram revestidas em placas de Petri de cultura de tecido e crescidas para confluência de 50%-60%. Um total de 10 pg de ADN foi usado para transfectar uma placa de 100 mm: para a transfecção de homodímero, 10 pg dos constructos hlFNOCFc; para a transfecção de híbrido monômero-dímero, 8 pg dos constructos hlFNOCFc + 2 pg de pcADN3-FlagF c. As células foram transfectadas como descrito no manual de reagente de transfecção Superfect (Qiagen, Valência, CA) . Os meios foram removidos de transfecção após 48 horas e substituídos com MEM Alpha sem nucleosídeos plus soro bovino fetal dializado 5%, enquanto a transfecção de híbrido monômero-dímero também foi suplementada com geneticina 0,2 mg/mL (Invitrogen, Carlsbad, CA). Após 3 dias, as células foram libertadas da placa com tripsina 0,25% e transferidas em frascos de cultura de tecido T25, e a seleção foi continuada por 10-14 dias até as células começarem a crescer bem e linhas de células estáveis serem estabelecidas. Expressão de proteína foi subsequentemente amplificada pela adição de metotrexato: variando de 10 a 50nM.
Para todas as linhas de células, aproximadamente 2xl07 células foram usadas para inocular 300 mL de meio de crescimento Numa garrafa de rolo de 1700 cm2 (Corning, Corning, NY) . As garrafas de rolo foram incubadas Numa atmosfera de CO2 5% a 3 7°C por aproximadamente 72 horas o Então o meio de crescimento foi trocado com 300 mL de meio 111 de produção livre de soro (0MEM/F12 com 5 pg/mL de insulina bovina e 10 pg/mL Gentamicina) . O meio de produção (meio condicionado) foi coletado todo dia por 10 dias e armazenado a 4°C. Meio de produção novo foi adicionado às garrafas de rolo após cada coleta e as garrafas foram retomadas à incubadora. Antes de cromatografia, o meio foi clarificado usando um filtro SuporCap-100 (0,8/0,2 pm) de PaU Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). Todas as etapas que se seguem foram realizadas a 4°C. O meio clarificado foi a Protein A Sefarose, lavado 5 volumes de coluna de 1XPBS (fosfato 10 mM, pH 7,4, KCI2,7 mM, e NaC1137 mM) , eluido com glicina 0,1 M, pH 2,7, e então neutralizado com 1/10 volume de Tris-HCI 1 M, pH 9,0. A proteína foi então dializada em PBS.
As amostras de proteína de transfecção híbrido monômero-dímero foram então submetidas a ainda purificação, na medida em que contiveram uma mistura de homodímero IFNaFc:IFNa, híbrido monômero-dímero IFNaFc: FlagFc, e homodímero FalgFc: FlagFc (ou Aligante ou GS15 ligante). Material foi concentrado e aplicado a uma coluna de Superdex200 Prep Grade 2,6 cm x 60 cm (318 mL) Numa taxa de fluxo de 4 ml minuto (36 cm/h) e então eluída com 3 volumes de coluna de 1XPBS. Frações correspondendo a dois picos sobre o detetor UV foram coletadas e analisadas por SOS-PAGE. Frações do primeiro pico contiveram homodímero IFN IFNaFc Fc: IFNaFc ou híbrido monômero-dímero IFN IFNaFc Fc: FlagFc, enquando o segundo pico conteve homodímero FlagFc: FlagFc. Toda as frações contendo o híbrido
monômero-dímero, mas nenhuma homodímero FlagFc, foram reunidas e diretamente aplicadas a uma coluna 1,6x5 cm M2 anti-FLAG sefarose (Sigma Corp., St. Louis, MO) Numa taxa de fluxo linear de 60 cm/hora. Após carga a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna híbridos monômero-dímero PBS 112 foram então eluídos com glicina 100 mM, pH 3,0. Frações de eluição contendo o pico de proteína foram então neutralizadas pela adição de 1/10 volume de Tris-HCI 1 M, e analisadas por SDS-PAGE redutora e não-redutora. Frações foram dializadas em PBS, concnetradas para 1-5 mg/mL, e armazenadas a -80°C.
Exemplo 16: Expressão e purificação de proteína espiral espiralada
Os plasmídeos pED.dC Epo-CCA-Fc e pED.dC CCS-Fc serão transfectados sozinhos ou juntos Numa razão 1:1 em células CHO DG44. As células serão transfectadas como descrito no manual de reagente de transfecção Superfect (Qiagen, Valência, CA) . Os meios serão removidos após 48 horas e substituídos com MEM Alpha w/o nucleosídeos plus 5% soro bovino fetal dialisado. Purificação será feita por cromatografia de afinidade sobre uma coluna de proteína A de acordo com processos conhecidos na técnica.
Alternativamente, purificação pode ser obtida usando-se cromatografia de exclusão de tamanho.
Exemplo 17: Expressão e purificação de Cys-Fc Células CHO DG-44 expressando Cys-Fc foram estabelecidas. O plasmídeo de expressão pED.dC.Cys-Fc, que contém o gene diidrofolato redutase de camundongo (dhfr), foi transfectado em células CHO DG44 (deficiente dhfr) usando reagente Superfect (Qiagen; Valência, CA) de acordo com o protocolo do fabricante, seguido por seleção para transfectantes estáveis em meio de cultura de tecido aMEM (sem nucleosídeos) suplementado com FBS dializado 5% e antibióticos penicilina/streptomicina (Invitrogen;
Carlsbad, CA) por 10 dias. A resultante reunião de células 113 estavelmente transfectadas foi então amplificada com metotrexato 50 nM para aumentar expressão. Aproximadamente 2x107 células foram usadas para inoculação de 300 mL de meio de cultura Numa garrafa de rolo de 1700cm2 (Corning, Corning, NY). As garrafas de rolo foram incubadas em CO2 5% a 37°C por aproximadamente 72 horas. O meio de crescimento foi trocado com 300 mL de meio de produção livre de soro (DMEM/F12 com 5 pg/mL de insulina bovina e 10 pg/mL de Gentamicina). O meio de produção (meio condicionado) foi coletado todo dia por 10 dias e armazenado a 4°C. Meio de produção novo foi adicionado às garrafas de rolo após cada coleta e as garrafas foram retomadas para a incubadora. Antes de cromatografia, o meio foi clarificado usando um filtro SuporCap-100 (0,8/0,2 pm) de Pai! Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). Todas as etapas seguintes foram realizadas a 4°C. O meio clarificado foi aplicado a Protein A Sefarose, lavado com 5 volumes de coluna de 1XPBS (fosfato 10 mM, pH 7,4, KCI 2,7 mM, e NaCl 137 mM) , eluido com glicina 0,1 M, pH 2,7, e então neutralizado com 1110 volume de Tris-HCIl M, pH 9,0. Proteína foi dializada em PBS e usada diretamente em reações de conjugação.
Exemplo 18: Acoplamento de T20-tioésteres a Cys-Fc
Cys-Fc (4 mg, 3,2 mg/mL concentração final) e T20-tioéster ou T20-PEG-tioéster (2 mg, aproximadamente 5 equivalentes molares) foram incubados por 16 horas em temperatura ambiente em Tris 0,1 8/10 mM/MESNA. Análises por SOS-PAGE (gel Tris-Gly) usando tampão de amostra redutora indicaram a presença de uma nova banda aproximadamente 5 kDa maior que o controlo Fc (>40-50% de conversão ao conjugado). Prévio sequenciamento terminal-N de Cys-Fc e Cys-Fc não reagido indicou que o peptídeo sinal é incorretamente processado Numa fração das moléculas, deixando uma mistura 114 de (Cys)-Fc, que reagirá através de ligação nativa com peptideo - tioésteres, e (Vai)-(Gly)-(Cys)-Fc, não reagirá. Na medida em que as condições de reação são insuficientes para interrupção de dimerização das moléculas de Cys-Fc, esta reação gerou uma mistura de homodímeros T20-Cys-Fc:T2Ο-Cys-Fc, híbridos monômero-dímero T2Ο-Cys-Fc:Fc, e dímeros Cys-Fc:Cys-FcFc. Esta proteína foi purificada usando cromatografia de exclusão de tamanho como indicado acima para separação de três espécies. 0 resultado foi confirmado por análise SOS-PAGE sob condições não redutoras .
Exemplo 19: Ensaio antiviral para atividade de IFNa
Atividade antiviral (IU/mL) de proteínas de fusão IFNa foi determinada usando um ensaio CPE (efetio citopático). Células A549 foram revestidas Numa placa de cultura de tecido de 96 cavidades em meios de crescimento (RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal 10% (FBS) e L-glutamina 2 mM) por 2 horas a 37°C, CO2 5%. Padrões IFNa e proteínas 90 de fusão IFNa foram diluídas em meios de crescimento e adicionados a células em triplicata por20 horas a 37°C, 5% CO2. Seguindo incubação, todos os meios foram removidos de cavidades, vírus de encéfalo miocardite (EMC) foi diluído em meios de crescimento e adicionados (3000 pfu/cavidade) a cada cavidade com a exceção de cavidades controlos. Placas foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 28 horas. Células vivas foram fixadas com ácido tricloro acético frio 10% (TCA) e então manchadas com Sulforhodamine B (SRB) de acordo com protocolos publicados (Rubinstein et al. 1990, J. Natl. Câncer Inst. 82, 1113). O corante SRB foi solubilizado com Tria 10 mM pH 10,5 e lido sobre um espectrofotômetro em 490 nm. Amostras foram analisadas através de comparação de atividades de uma curva padrão 115 conhecida de World Helath Organization IFNa 2b
International Standard variando de 5 a 0,011 IU/mL. Os resultados são apresentados abaixo na Tabela 3 e Figura 6 e demonstram aumentada atividade antiviral de híbridos monômero-dímero.
Tabela 3: Ensaio antiviral de intereferon homodímero v. híbrido monômero-dímero
Proteína Atividade antiviral (IU/nmol) Desvio Padrão Homodímero IFNa Iigante de 8aa 0,45xl05 0,29xl05 IFNaFc Iigante de 8aa: híbrido monômero-dímero FlagFc 4,5xl05 1,2xl05 Homodímero IFNaFc Aligante 0,22xl05 0,0 7x105 Híbrido monômero-dímero IFNaFc Ãdelta Iigante: FlagFc 2,4x105 0,0005xl05 Homodímero IFNaFc GS15 Iigante 2,3x105 1,OxlO5 Híbrido monômero-dímero IFNaFc GS 15 Iigante 5,3x105 0,15xl05
Exemplo 20: Análises de Atividade de Coagulação de FVlla 0 kit de ensaio StaClot FVlla-rTF foi adquirido de Diagnostica Stago (Parsipany, NJ) e modificado como 116 descrito em Johannessen et al. 2000, Blood Coagulation and Fibrinolysis 11:S159. Uma curva padrão foi pré-formada com o FVlla World Health Organization Standard 89/688. O ensaio foi usado para comparar atividade de coagulação de híbridos monômero-dímero comparados a homodímeros. Os resultados mostraram que o híbrido monômero-dímero teve quatro vezes a atividade de coagulação comparado ao homodímero (Figura 7).
Exemplo 21: Dosagem oral de FVIIa-Fc em ratos 10 dias
Ratos Sprague Dawley recém nascidos de 9 dias de 25 gramas foram adquiridos de Charles River (Wilmington, MA) e deixados em aclimatação por 24 horas. Os ratos foram dosados oralmente com homodímero 10 FVllaFc, híbrido monômero-dímero ou uma mistura 50:50 dos dois. Um volume de 200 μΐ de uma solução de FVllaFc para uma dose de 1 mg/kg foi administrado. A solução foi composta por um tampão Tris-HCI pH 7,4 com 5 mg/mL de inibidor tripsina de soja. Os ratos sofreram eutanásia com CO2 em vários pontos de tempo, e 200 μΐ de sangue foram retirados através de perfuração cardíaca. Plasma foi obtido através da adição de solução 3,8% de citrato de sódio e centrifugação em temperatura ambiente Numa velocidade de 1268xg. As amostras de plasma foram ensaiadas frescas ou congeladas a 20°C. Híbrido monômero-dímero dosado oralmente resultou em concentrações em soro máximas (Cmax) signif icantemente maiores comparadas a Fator VII homodimérico (Figura 8).
Exemplo 22: Dosagem oral de Fator IX-Fc de ratos neonatais
Ratos Sprague-Dawley neonatais foram dosados p.o. com 200 μΐ de homodímero FIX-Fc ou híbrido monômero-dímero FIX-Fc:FlagFc em doses aproximadamente equimolares de 10 nmoles/kg em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 6,5 contendo 117 5 mg/mL de inibidor tripsina de soja e NaCl 0,9%. Em 1, 2, 4, 8, 24, 48, e 72 horas após injeção, animais sofreram eutanásia com CO2, sangue foi retirado via perfuração cardíaca e plasma foi obtido através da adição de uma solução 3,8% de citrato de sódio e centrifugação em temperatura ambiente Numa velocidade de 1268xg. Amostras foram então sedimentadas por centrifugação, soro coletado e congelado a 20° C até análise das proteínas de fusão por ELISA.
Exemplo 23: ELISA de Fator IX-Fc
Uma placa de ELISA Immulon 4HBX de 96 cavidades (Thermo LabSystems, Vantaa, Finland) foi revestida com 100 μΐ/ cavidade de IgG Anti-Fator IX de cabra (Affinity Biologicals, Ancaster, Canadá) diluída 1:100 em tampão carbonato 50 mM, pH 9,6. As placas foram incubadas em temperatura ambiente por 2 horas ou por toda noite a 4°C seladas com filme plástico. As cavidades foram lavadas 4 vezes com PBST, 30Ομΐ/cavidade usando o lavador de placas TECAN. As cavidades foram bloqueadas com PBST + 6% BSA, 200 μΐ/cavidade, e incubadas 90 minutos em temperatura ambiente. As cavidades foram lavadas 4 vezes com PBST, 300 μΐ/cavidade usando o lavador de placas TECAN. Padrões e amostras de sangue de ratos descritas no Exemplo 18 foram adicionados às cavidades (100 μΐ/cavidade), e incubadas por 90 minutos em temperatura ambiente. Amostras e padrões foram diluídos em tampão HBET (HBET: 5,95 9 HEPES, 1,46 9 NaCl, 0,93 9 Na2EDTA, 2,5 9 albumina de soro bovino, 0,25 mL Tween-20, levando para 250 mL com dH20, ajustar pH para 7,2) . Faixa de curva padrão foi de 200 ng/mL a 0,78 ng/mL com diluições de 2 vezes entre. Cavidades foram lavadas 4 vezes com PBST, 300 μΐ/cavidade usando o lavador de placa TECAN. 100 μΐ/cavidade de anticorpo IgG-Fc-HARP anti-humano 118 cabra conjugado (Pierce, Rockford, IL) diluídos em HBET 1:25000 foi adicionado a cada cavidade. As placas foram incubadas 90 minutos em temperatura ambiente. As cavidades foram lavadas 4 vezes com PBST, 300 μΐ/cavidade usando o lavador de placas TECAN. As placas foram desenvolvidas com 100 μΐ/cavidade de substrato tetra metil benzidina peroxidase (TMB)(Pierce, Rockford, IL) adicionados de acordo com as instruções de fabricante. As placas foram incubadas 5 minutos em temperatura ambiente no escuro ou até desenvolvimento de cor. A reação foi interrompida com 100 μΐ/cavidade de 2 M de ácido sulfúrico. Absorvência foi lida em 450 nm em um leitor SpectraMax plusplate (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . Análises de sangue retirado em 4 horas indicaram uma diferença de mais de 10 vezes em concentração em soro entre híbridos monômero-dímero Fator IX-Fc comparados a homodímeros Fator IX Fc (Figura 9) . Os resultados indicaram que níveis de híbrido monômero-dímero Fator IX-Fc foram consistentemente maiores que homodímeros Fator IX-Fc (Figura 10).
Exemplo 24: Clonagem de Epo-Fc A região codificando Epo madura foi obtida por amplificação PCR a partir de um plasmídeo codificando a sequência codificando eritropoietina madura, originalmente obtida por RT-PCR a partir de ARNm Hep G2 e iniciadores hepoxba-F e hepoeco-R, indicados abaixo. Iniciador hepoxba-F contém um sítio Xbal, enquanto iniciador hepoeco-R contém um sítio EcoRI. PCR foi realizada no Idaho Technology RapidCycler usando Vent polimerase, desnaturando a 95°C por 15 segundos, seguido por 28 ciclos com uma inclinação de 6,0 de 95°C por Osegundo, 55°C por Osegundo, e 72°C por 1 minuto e 20 segundos, seguido por 3 minutos de extensão a 72 °C. Um produto de aproximadamente 514 bp foi purificado 119 com gel, digerido com Xbal e EcoRI, novamente purificado com gel e subclonado direcionalmente em um vetor pED.dC.xFc purificado com gel, digerido em Xbal/EcoRI, mencionado acima. Este constructo foi chamado pED.dC.EpoFc. A sequência Epo, contendo ambos, o peptídeo sinal endógeno e a sequência madura, foi obtida por amplificação PCR usando uma preparação de ADNc QUICK-clone de rim adulto como o molde e iniciadores Epo+Pep-Sbf-F e Epo+Pep-Sbf-R, descritos abaixo. 0 iniciador Epo+Pep-SbfF contém um sítio Sbfl a montante do códon de partida, enquanto o iniciador Epo + Pep-Sbf-R anela à jusante do sítio Sbfl endógeno na sequência Epo. A reação PCR foi realizada no PTC-200 MJ Thermocycler usando Expand polimerase, desnaturando a 94°C por 2 minutos, seguido por 32 ciclos de 94°C por 30 segundos, 57°C por 30 segundos, e 72°C por 45 segundos, seguido por uma extensão de 10 minutos a 72°C. Um produto de aproximadamente 603 bp foi isolado com gel e subclonado no vetor pGEM-T Easy. A correta sequência codificando foi excisada através de digestão Sbfl, purificada com gel, e clonada no plasmídeo pED.dC.EpoFc purificado com gel, tratado com fosfatase alcalina de camarão (SAP), digerido com Pstl. O plasmídeo com a inserção na correta orientação foi inicialmente determinado através de digestão com Kpnl. Uma digestão Xmnl e Pvull deste constructo foram comparadas com pED.dc.EpoFc e confirmada estar na orientação correta. A sequência foi determinada e a constructo foi nomeado pED.dc.natEpoFc.
Iniciadores PCR: hepoxba-F (EPO-F): 5'-MTCTAGAGCCCCACCACGCCTCATCTGTGAC-3' (SEQ ID N°: 75) 120 hepoeco-R (EPO-R) 5'-TTGMTTCTCTGTCCCCTGTCCTGCAGGCC-3' (SEQ ID N° : 76)
Epo+Pep-Sbf-F: 5'-GTACCTGCAGGCGGAGATGGGGGTGCA3' (SEQ ID N°: 77) Epo+Pep-Sbf-R: 5'-CCTGGTCATCTGTCCCCTGTCC-3' (SEQ ID N°: 78)
Exemplo 25: Clonagem de Epo-Fc
Um processo alternativo de clonagem de Epo-Fc é aqui descrito.
Iniciadores foram primeiro designados para amplificação de inteiro comprimenta de sequência codificando Epo, incluindo a sequência sinal nativa, como se segue:
Epo-F: 5'-GTCCMCCTG CAGGMGCTTG CCGCCACCAT GGGAGTGCAC GMTGTCCTG CCTGG - 3' (SEQ ID N°: 79)
Epo-R: 5'-GCCGMTTCA GTTTTGTCGA CCGCAGCGG CGCCGGCGM CTCTCTGTCC CCTGTTCTGC AGGCCTCC - 3' (SEQ ID N°: 80) O iniciador dianteiro incorpora um sitio Sbfl e Hindlll à montante de uma sequência Kozak, enquanto o iniciador reverso remove o sítio Sbfl interno, e adiciona um ligante de 8 aminoácidos à extremidade 3' da sequência codificante (EFAGAAAV) (SEQ ID N°: 81) assim Como sítios de restrição
Sall e EcoRI. A sequência codificando Epo foi então amplificada a partir de uma biblioteca de ONAc de rim (BO Biosciences Clontech, Pala Alto, CA) usando 25 pmoles destes iniciadores Numa reação PCR de 25 μΐ usando Expand High Fideliry System (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) de acordo com protocolo padrão de fabricante em um MJ Thermocycler usando os seguinte ciclos: 94°C 2 minutos; 30 ciclos de (94°C 30 segundos, 58°C 30 segundos, 72°C 45 segundos), seguido por 72°C por 10 minutos. A banda com 121 tamanho esperada (641 bp) foi purificada com gel com um Gel Extraction kit (Qiagen, Valência, CA) e ligada com o vetor de clonagem intermediário pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) . ADN foi transformado em células 0H5a (Invitrogen, Carlsbad, CA) e culturas miniprep crescidas e purificadas com um Plasmid Miniprep Kit (Qiagen, Valência, CA) ambos de acordo com protocolos padrões de fabricantes. Uma vez a sequência tenha sido confirmada, esta inserção foi digerida com enzimas de restrição Sbfi/EcoRI, purificada com gel, e clonada nos sítios Pstl/EcoRI do vetor de expressão mamífero pEO.dC Numa maneira similar.
Iniciadores foram designados para amplificação de sequência codificante para a região constante de IgGl humana (a região Fc, numeração EU 221-447) como se segue:
Fc-F: 5'-GCTGCGGTCG ACAAAACTCA CACATGCCCA CCGTGCCCAG
CTCCGGAACT CCTGGGCGGA CCGTCAGTC- 3' (SEQ ID N°: 82) Fc-R 5'-ATTGGAATTC TCATTTACCC GGAGACAGGG AGAGGC-3' (SEQ ID N° : 83) 0 iniciador dianteiro incorpora um sítio Sall na junção Ligante-Fc, assim como introduzindo sítios BspEI e Rsrll na região Fc sem afetar a sequência codificante, enquanto o iniciador reverso adiciona um sítio EcoRI após o códon de interrupção. A sequência codificando Fcfoi então amplificada a partir de uma biblioteca de ONAc de leucócito (BO Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) usando 25 pmoles destes iniciadores Numa reação de PCR de 25 IJL usando Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim,
Indianápolis, IN) de acordo com protocolo padrão de fabricante em um MJ Thermocycler usando os seguintes ciclos: 94°C 2 minutos; 30 ciclos de (94°e 30 segundos, 122 58°e 30 segundos, 72°C 45 segundos), seguido por 72°C por 10 minutos. A banda de tamanho esperado (696 bp) foi purificada com gel com um kit Gel Extraction (Qiagen, Valência, CA) e ligada no vetor de clonagem intermediário pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI). ADN foi transformado em células OH5a (Invitrogen, Carlsbad, CA) e culturas miniprep crescidas e purificadas com um Plasmid Miniprep Kit (Qiagemn, Valência, CA), de acordo com protocolos do fabricante. Uma vez a sequência tenha sido confirmada, esta inserção foi digerida com enzimas de restrição SallEcoRl, purificada com gel, e clonada nos sítios SalllEcoRI do plásmídeo pED.dC.Epo (acima) Numa maneira similar, para gerar o plásmídeo de expressão mamífero pED.dC.EpoFc. Em um outro experimento este plásmídeo também foi digerido com RsrlIIXmal, e o correspondente fragmento de pSYN-Fc-002, que contém a mutação Asn 297 Ala (numeração EU) foi clonado para criar pED.dC.EPO-Fc N297A (pSYN-EPO-004). Expressão em células mamíferas foi como descrito no Exemplo 26. A sequência de aminoácidos de EpoFc com um Ligante de oito aminoácidos é provida na figura 2j. Durante o processo deste método de clonagem alternativo, embora a exata sequência de aminoácidos EpoFc tenha sido preservada (figura 2J) , um número de alterações não-codificantes foi feito ao nível de nucleotídeo (figura 3J). Estes são G6A (G em nucleotídeo 6 trocado para A)(elimina possível estrutura secundária em iniciador), G567A (remove sítio Sbfl endógeno de Epo), A582G (remove sítio EcoRI de Ligante), A636T e T639G (adicionam único sítio BspEI a Fc) , e G651 C (adiciona único sítio Rsrll a Fc) . A sequência de nucleotídeos na figura 3J é do constructo feita no Exemplo 25, que incorpora estas diferenças a partir da sequência do constructo do Exemplo 24. 123
Exemplo 26: Expressão e purificação de híbrido monômero-dimero e homodímero EPO-Fc Células DG44 foram revestidas em placas de Petri de cultura de tecido de 100 mm e crescidas para uma confluência de 50%-60%. Um total de 10 pg de ADN foi usado para transfectar uma placa de 100 mm: para a transfecção de homodimero, 10 pg de pED.dC.EPO-Fc; para a transfecção de híbrido monômero-dímero, 8 pg de pED. dC. EPO-Fc + 2 pg de pcADN3-FlagFc. Os constructos usados foram clonados como descrito no Exemplo 24. O processo de clonagem descrito no Exemplo 25 também pode ser usado para obtenção de constructos para uso neste exemplo. As células foram transfectadas como descrito no manual de reação de transfecção Superfect (Qiagen, Valência, CA) . Alternativamente, PED.dC.EPO-Fc foi cotransfectado com pSYN-Fc-016 para fabricar um monômero não-marcado. Os meios foram removidos de transfecção após 48 horas e substituídos com MEM Alpha sem nucleosídeos plus soro bovino fetal dialisado para ambas transfecções, enquanto a transfecção de híbrido monômero-dímero também foi suplementada com 0,2 mg/mL de geneticina (Invitrogen, Carlsbad. CA) . Após 3 dias, as células foram libertadas da placa com tripsina 0,25% e transferidas em frascos de cultura de tecido T25, e a seleção foi continuada por 10-14 dias até as células começarem a crescer bem quando linhas de células estáveis foram estabelecidas. Expressão de proteína foi subsequentemente amplificada pela adição de metotrexato.
Para ambas linhas de células, aproximadamente 2xl07 células foram usadas para inocular 300 mL de meio de crescimento Numa garrafa de rolo de 1700 cm2 (Corning, Corning, NY). As garrafas de rolo foram incubadas em C02 5% a 37°C por aproximadamente 72 horas. O meio de crescimento foi trocado 124 com 300 mL de meio de produção livre de soro (DMEM/F12 com 5 pg/ml de insulina bovina e 10 pg/ml Gentamicina). O meio de produção (meio condicionado) foi coletado todo dia por 10 dias e armazenado a 4°C. Meio de produção novo foi adicionado às garrafas de rolo após cada coleta e as garrafas foram retornadas para a incubadora. Antes de cromatografia, o meio foi clarificado usando um filtro SuporCap-100 (0,8/0,2 pm) de Pall Gelman Sciences (Ann Arbor, MI) . Todas as etapas seguintes foram realizadas a 4°C. O meio clarificado foi aplicado a Protein A Sefarose, lavado com 5 volumes de coluna de IX PBS (fosfato 10 mM, pH 7,4, KC12,7 mM, e NaCl 137 mM), eluido com glicina 0,1 M, pH 2,7, e então neutralizado com 1/10 volume de Tris-HCI 1 M, pH 9,0. Proteína foi então dialisada em PBS. A amostra de proteína de transfecção híbrido monômero-dímero foi submetida ainda a purificação, na medida em que ela conteve uma mistura de homodimero EPO-Fc:EPO-Fc, híbrido monômero-dimero EPO-Fc:Flag-Fc, e homodimero Flag-Fc:Flag-Fc. Material foi concentrado e aplicado a uma coluna Superdex 200 Prep Grade de 2,6 cm x 60 cm (318 mL) Numa taxa de fluxo de 4 mLlminuto (36 cm/hora) e então eluída com 3 volumes de coluna de IX PBS. Frações correspondendo a dois picos sobre o detetor de UV foram coletadas e analisadas por SOS-PAGE. Frações do primeiro pico contiveram tanto homodimero EPO-Fc:EPO-Fc como híbrido monômero-dimero EPO-FC:FlagFc, enquanto o segundo pico conteve homodimero FlagFc:FlagFc. Todas as frações contendo o híbrido monômero-dimero mas não homodimero FalgFc foram reunidas e diretamente aplicadas a uma coluna M2 anti-FLAG sefarose de 1,6 x 5 em (Sigma Corp.) Numa taxa de fluxo linear de 60 em/hora. Após carga a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de PBS. Híbridos monômero-dimero foram então eluídos com glicina 100 mM, pH 3,0. Frações de 125 eluição contendo o pico de proteína foram então neutralizadas pela adição de 1/10 de volume de TrisHCI 1M, e analisadas por SOS-PAGE redutora e não-redutora. Frações foram dialisadas em PBS, concentradas para 1-5 mg/mL, e armazenadas em -80°C.
Alternativamente, frações do primeiro pico da Superdex 200 foram analisadas por SOS-PAGE, e somente frações contendo uma maioria de híbrido monômero-dímero EpoFc, com uma minoria de homodímero EpoFc, foram reunidas. Esta reunião, enriquecida em híbrido monômero-dímero, foi então reaplicada a uma coluna Superdex 200, e frações contendo somente híbrido monômero-dímero EpoFc foram então reunidas, dialisadas e armazenadas como proteína purificada. Notar que este processo de purificação alternativo também pode ser usado para purificar híbridos monômero-dímero não-marcadors.
Exemplo 27: Administração de híbrido monômero-dímero e dímero EpoFc com um Ligante de oito aminoácidos a macacos Cynomolgus
Para administração pulmonar, aerossóis de proteínas dímero EpoFc ou híbrido monômero-dímero EpoFc (ambas com o Ligante de 8 aminoácidos) em PBS, pH 7,4 foram criadas com o nebulizador Aeroneb Pro™ (AeroGen, Mountain View, CA) , em linha com um respirador Bird Mark 7A, e administrados a macacos cynomolgus simples anestesiado através de tubos endotraqueais (aproximando respiração tidal normal). Ambas proteínas também foram administradas a macacos cynomolgus simples através de injeção intravenosa. Amostras foram tomadas em vários pontos de tempo, e a quantidade de proteína contendo-Epo no resultante plasma foi determinada usando o Quantikine IVO Human Epo Immunoassay (R & O 126
Systems, Minneapolis, MN). Parâmetros fármaco-cinéticos foram calculados usando o software WinNonLin. A Tabela 4 apresenta os resultados de biodisponibilidade de macacos cynomolgus tratados com híbrido monômero-dímero EpoFc ou dímero EpoFc.
TABELA 4: ADMINISTRAÇÃO DE HÍBRIDO MONÔMERO-DÍMERO EPOFC E
DÍMERO EPOFC A MACACOS
Proteína Macaco # Via Dose1 Depositada Aproximada (pg/kg) Cmax (ng/ml) Cmax (fmol/ml) 11 /2 (h) 11/2 avg (h) Híbrido monômero- dímero EpoFc C06181 pulm 20 72,3 1014 23,6 25, 2 C06214 pulm 20 50,1 703 23,5 C07300 pulm 20 120 1684 36,2 C07332 pulm 20 100 1403 17, 5 C07285 IV 25 749 10508 21,3 22,6 C07288 IV 25 566 7941 23 CO 73 43 IV 25 551 1014 23,5 Dímero EpoFc 00026 pulm 15 10, 7 120 11,5 22,1 00062 pulm 15 21,8 244 27,3 00046 pulm 15 6,4 72 21,8 00015 pulm 15 12,8 143 20,9 00038 pulm 35 27 302 29 F4921 IV 150 3701 41454 15, 1 14,6 96Z002 IV 150 3680 41219 15,3 1261CQ IV 150 2726 30533 23,6 127- 107 IV 150 4230 47379 15, 0 118-22 IV 150 4500 50403 8, 7 126-60 IV 150 3531 39550 9,8 1 Baseado em fração de deposição de 15% de dose nebulizada como determinado por cintigrafia gama. 127 A percentagem de biodisponibilidade (F) foi calculada para as doses pulmonares usando a seguinte equação: F =(AUC pulmonar/dose pulmonar)/(AUC IV/Dose IV)*100
TABELA 5: CÁLCULO DE PERCENTAGEM DE BIODISPONIBILIDADE PARA HÍBRIDO MONÔMERO—DíMERO EPOFC V. DíMERO APÓS ADMINISTRAÇÃO PULMONAR A MACACOS CYNOMOLGUS SIMPLES
Proteína Macaco # Dose Aproximada (depositada) AUC ngeh/mL Biodispo nibilidade 2 (F) Biodispo nibilidade Média Híbrido monômero- dímero EpoFc C06181 20 pg/kg 3810 25, 2% 34,9% C06214 20 pg/kg 3072 20,3% C07300 20 pg/kg 9525 63, 0% C07332 20 pg/kg 4708 31, 1% 00026 15 pg/kg 361 5,1% 00062 15 pg/kg 1392 19, 6% Dímero 00046 15 pg/kg 267 3,8% EpoFc 00015 15 pg/kg 647 9,1% 10,0% 00038 35 pg/kg 2062 12, 4% 1 baseado em fração de deposição de 15% de dose nebulizada como determinado por cintigrafia gama. 2 média AUC para híbrido monômero-dímero IV EpoFc = 18.913 ng.h/mL (n=3 macacos), dosado em 25 pg/kg. Média AUC para dímero IV EpoFc = 70,967 ng.h/mL (n=6 macacos), dosado em 150 pg/kg.
As fármaco-cinéticas de EpoFc com um ligante de 8 aminoácido administrado a macacos cynomolgus são apresentadas na figura 11. A figura compara o dímero EpoFc com o híbrido monômero-dímero EpoFc em macacos após administração de uma dose pulmonar simples. Baseado Numa 128 comparação molar níveis em soro significativamente maiores foram obtidos em macacos tratados como híbrido monômero-dímero comparado ao dímero.
Exemplo 28: Administração subcutânea de híbrido monômero-dímero EPOFc
Para comparar concentrações em soro de conhecidos agentes eritropoietina com híbridos monômero-dímero EPOFc, ambos híbrido monômero-dímero EPOFc e Aranesp™ (darbepoetin alfa,), que não é uma proteína de fusão quimérica, foram administrados subcutaneamente a diferentes macacos e a concentração em soro de ambos foi medida com o tempo.
Macacos cynomolgus (n=3 por grupo) foram injetados subcutaneamente com 0,025 mg/kg de híbrido monômero-dímero EpoFc. Amostras de sangue foram coletadas pré-dose e em momentos até 144 horas após dose. Soro foi preparado a partir de sangue e armazenado congelado até análises por ELISA (Human Epo Quantikine Immunoassay)(R & D Systems, Minneapolis, MN) . Parâmetros fármaco-cinéticos foram determinados usando software WinNonLina (Pharsight, Mountainview, CA).
Os resultados indicaram que as concentrações de soro de ambos, híbrido monômero-dímero EPOFc e Aranesp (darbepoetin a) foram equivalentes com o tempo, embora a dose molar administrada de Aranesp (darbepoetin a) tenha sido levemente maior (Tabela 6) (figura 12). TABELA 6
Via Dose Dose c ^max AUC Tl/2 o o (pg/k (nmol/ (ng/m (ng·hr· (h) Biodispo g) kg) L) rnL-1) ni- 129 bilidade (F) Híbrido monômer o- dímero EpoFc Subc utân ea 25 0,3 133±3 4 10,745± 3, 144 2 6 ± 5 57±1 7 Aranesp TM Subc utân ea 20 0,54 83±11 5390 ± 747 22± 2 53±8
Exemplo 29: Administração intravenosa de híbrido monômero-dírnero EPOFc
Para comparar concentrações em soro de conhecidos agentes eritropoietina com híbridos monômero-dímero EPOFc, híbrido monômero-dímero EPOFc, Aranesp™ (dabepoetin alfa), e Epogen™ (epoetin alfa,), nenhum dos quais é uma proteína de fusão quimérica, foram administrados intravenosamente a diferentes macacos e a concentração em soro de ambos foi medida com o tempo.
Macacos cynomolgus (n=3 por grupo) foram injetados intravenosamente com 0,025 mg/kg de híbrido monômero-dímero EpoFc. Amostras de sangue foram coletadas pré-dose e em tempos de até 144 horas após dose. Soro foi preparado a partir de sangue e armazenado congelado até análise por ELISA (Human Epo Quantikine Immunoassay) (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Parâmetros fármaco - cinéticos foram determinados usando software WinNonLina (Pharsight, Mountainview, CA).
Os resultados indicaram que a concentração em soro versus tempo (AUC) de híbrido monômero-dímero EPOFc foi maior que 130 a) ou tenham (epoetin 13) . as concentrações de Epogen (epoetin (darbepoetin alfaj, embora os macacos maiores doses molares de ambos Epogen Aranesp (darbepoetil a)(Tabela 7)(Figura
Aranesp recebido alfa) e 131 TABELA 7
Via Dose (pg/kg) Dose (nmol/kg) Cmax (ng/mL) AUC (ng-hr-mL“ 1) Tl/2 (h) Híbrido Monômero- dímero EpoFc Intravenosa 25 O co 6221110 18,9131 3, 022 23 + 1 Aranesp™ Intravenosa 20 0,54 52118 10,219+ 298 20 + 1 Epogen Intravenosa 20 0,66 514+172 3936+636 6,3+0,6
Exemplo 30: Purificação alternativa de híbrido monômero-dímero EpoFc
Ainda uma outra alternativa para purificação de EPO-Fc é aqui descrita. Uma mistura contendo Fc, híbrido monômero-dímero e dímero EpoFc foi aplicada a uma coluna de Proteína A Sefarose (Amersham, Uppsala, Sweden). A mistura foi eluída de acordo com as instruções do fabricante. 0 eluato de Proteína A Sefarose, contendo a mistura foi trocada com tampão em Tris-CI 50 mM (pH 8,0). A mistura de proteínas foi carregada sobre uma coluna Mimetic Red 2 XL de 8mL (ProMetic Life Sciences, Inc., Wayne, NJ) que foi equilibrada cem Tris-CI 50 mM (pH 8,0). A coluna foi então lavada com Tris-CI 50 mM (pH 8,0); NaCl 50 mM. Esta etapa removeu maior parte de Fc. Híbrido monômero-dímero EpoFc foi especificamente eluído da coluna com Tris-CI 50 mM (pH 8,0); NaCl 400 mM. Dímeros EpoFc pode ser eluído e a coluna regenerada com 5 volumes de coluna de NaOH 1 M. Frações eluídas da coluna foram analisadas por SOS-PAGE (Figura 14) . 132
Exemplo 31: Clonagem de constructo Fc - sequência sinal Igx para fabrico de FC não-marcada sozinha A sequência codificando a região constante de IgGl (EU# 221-447; a região Fc) foi obtida por amplificação PCR a partir de uma biblioteca de ONAc de leucócito (Clontech, CA) usando os seguintes iniciadores: rcFc-F 5'- GCTGCGGTCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCC GGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTC -3' (SEQ ID N°: 84) rcFc-R 5'- ATTGGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC -3' (SEQ ID N°: 85) 0 iniciador para frente adiciona três aminoácidos (AAV) e um sitio de clonagem Sall antes de inicio da região Fc, e também incorpora um sitio de restrição BspEI em aminoácidos 231-233 e um sitio de restrição Rsrll em aminoácidos 236-238 usando a degenerescência do código genético para preservar a correta sequência de aminoácidos (numeração EU) . 0 iniciador reverso adiciona um sítio de clonagem
EcoRI após o códon de interrupção da Fc. Uma reação PCR de 25 μΐ foi realizada com 25 pmoles de cada iniciador usando Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim,
Indianápolis, IN) de acordo com protocolo padrão de fabricante em um MJ Thermocycler usando os seguintes ciclos: 94°C 2 minutos; 30 ciclos de (94°C 30 segundos, 58°C 30 segundos, 72°C 45 segundos), 72°C 10 minutos. A banda de tamanho esperado (-696 bp) foi purificada com gel com um kit de Extração de Gel (Qiagen, Valência, CA) , e clonada em pGEM T-Easy (Pro-mega, Madison, WI) para produzir um plasmídeo intermediário pSYN-Fc-001 (pGEM T-Easy/Fc). A sequência sinal Igx de camundongo foi adicionada à Fc CDS usando os seguintes iniciadores: 133
rc-lgK sig seq-F: 5'-TTTAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAG ACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACAAAACT CACACATGCCCACCG -3' (SEQ ID N°: 86) F c-noXma-GS-R: 5'- GGTCAGCTCATCGCGGGATGGG -3' (SEQ ID N°: 87)
Fc-noXma-GS-F: 5'- CCCATCCCGCGATGAGCTGACC -3' (SEQ ID N°: 88) O iniciador F-sequência sinal rc-lgK adiciona um sítio de restrição Hindlll à extremidade 5' da molécula, seguida por uma sequência Kozak (GCCGCCACC)(SEQ ID N°: 89) seguida pela sequência sinal da cadeia leve Igx de camundongo, diretamente limitada ao início da sequência Fc (EU# 221). Os iniciadores Fc-noXma-GS-F e -R removem o sítio Xmal interno da sequência codificando Fc, usando a degenerescência do código genético para preservar a correta sequência de aminoácidos. Duas reações PCR de 25μ1 foram realizadas com 25 pmoles de F-sequência sinal rc-lgK e FcnoXma-GS-R ou Fc-noXma-GS-F e rcFc-R usando Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) de acordo com o protocolo padrão do fabricante em um MJ Thermocycler. A primeira reação foi realizada com 500 ng de biblioteca de ONAc de leucócito (BO Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) como um molde usando os seguintes ciclos: 94°C 2 minutos; ciclos de (94°C 30 segundos, 55°C 30 segundos, 72°C 45 segundos), 72°C 10 minutos. A segunda reação foi realizada com 500 ng de pSYN-FcOOl como um molde (acima) usando os seguintes ciclos: 94°C 2 minutos; 16 ciclos de (94°C 30 segundos, 58°C 30 segundos, 72°C 45 segundos), 72°C 10 minutos. As bandas de tamanho esperado (-495 e 299 bp, respectivamente) foram purificadas com gel com um kit GelExtraction (Qiagen, Valência, CA) , então combinadas Numa reação PCR com 25 pmoles de iniciadores F-sequência sinalrc-Igx e rcFc-R e corridas como antes, 134 anelando a 58°C e continuando por 16 ciclos. A banda de tamanho esperado (-772 bp) foi purificada com gel em um kit Gel Extraction (Qiagen, Valência, CA) e clonada em pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) para produzir um plasmideo intermediário pSYN-Fc-007 (pGEM T-Easy/Igx sig seq-Fc). 0 cassete Fc sequência sinal Igx inteiro foi então subclonado usando os sítios Hindlll e EcoRI no vetor de expressão em mamífero pEE6.4 (Lonza, Slough, UK) ou pcADN3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), dependendo do sitema a ser usado, para gerar pSYN-Fc-009 (pEE6.4/lgK sig seq-Fc) e pSYN-Fc-015 (pcADN 3/lgx sig seq-Fc).
Exemplo 32: Clonagem de constructo sequência sinal Igx - Fc N297A para fabricação de Fc N297A não-marcada sozinha
De modo a realizar mutação de Asn 297 (numeração EU) de Fc para um resíduo Ala, os seguintes iniciadores foram usados: N297A-F 5'- GAGCAGTACGCTAGCACGTACCG -3' (SEQ ID N°: 90) N297A-R 5'- GGTACGTGCTAGCGTACTGCTCC -3' (SEQ ID N°: 91)
Duas reações PCR foram realizadas com 25 pmoles de sequência sinal rc-Igx -Fe N297A-R ou N297A-F e rcFc-R usando Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) de acordo com o protocolo padrão de fabricante em um MJ Thermocycler. Ambas reações foram realizadas usando 500 ng de pSYN-Fc-007 como um molde usando os seguintes ciclos: 94°C 2 minutos; 16 ciclos de (94°C 30 segundos, 48°C 30 segundos, 72°C 45 segundos), 72°C 10 minutos. As bandas de tamanho esperado (-319 e 475 bp, respetivamente) foram purificadas com gel com um kit
Gel Extraction (Qiagen, Valência, CA) , então combinadas Numa reação PCR com 25 pmoles de iniciadores sequência sinal rc-Igx -Fe rcFc-R e corridas como antes, anelando a 135 58°C e continuando por 16 ciclos. A banda de tamanho esperado (-772 bp) foi purificada com gel com um kit Gel Extraction (Qiagen, Valência, CA) e clonada em pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) para produzir um plasmideo intermediário pSYN-Fc-008 (pGEM T-Easy/lgx sig seq-Fc N297A). Toda a cassete sozinha de sequência sinal lgx - Fc foi então subclonada usando os sítios Hindlll e EcoRI no vetor de expressão mamífero pEE6.4' (Lonza, Slough, UK) ou pcADN3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), dependendo do sistema a ser usado, para gerar pSYN-Fc-016 (pEE6.4/lgic sig seq-Fc N297A) e pSYN-Fc-016 (pcADN3/lgK sig seq-Fc N297A).
Estes mesmos iniciadores N297A também foram usados com iniciadores rcFc-F e rcFc-R e pSYN-Fc-001 como um molde Numa reação PCR seguida por subclonagem como indicado acima para gerar pSYN-Fcl07 002 (pGEM T-Easy/Fc N297A).
Exemplo 33: Clonagem de EpoFc e Fc em plasmideo simples para vetores de gene duplo para fabricação de EpoFc tipo selvagem ou híbridos monômero-dímero N297A e expressão.
Uma alternativa para transfecção de constructos EpoFc e Fc sobre plasmídeos separados é clonar as mesmas num plasmideo simples, também chamado um vetor de gene duplo, tal como usado no sistema Lonza Biologics (Slough, UK). O fragmento Rsrll/EcoRI de pSYN-Fc-002 foi subclonado nos correspondentes sítios em pEE12.4 (Lonza Biologics, Slough,UK) de acordo com procedimentos padrões para gerar pSYN-Fc-006 (fragmento pEE12.4/Fc N297A). O plasmideo pSYN-EPO-004 foi usado como um molde para reação PCR usando iniciador Epo-F de Exemplo 25 e o seguinte iniciador:
EpoRsr-R: 5'- CTGACGGTCCGCCCAGGAGTTCCGGAGCTGG GCACGGTGGGCATG TGTGAGTTTTGTCGACCGCAGCGG -3' (SEO ID N°: 91) 136
Uma reação PCR foi realizada usando Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) de acordo com protocolo padrão de fabricante em um MJ Thermocycler como indicado acima, por 16 ciclos com 55°C de temperatura de anelamento. A banda de tamanho esperado (-689 bp) foi purificada com gel com um kit Gel Extraction (Oiagen, Valência, CA) e clonada em pSYN-EPO-005 (pEE12.4/EpoFc N297A).0 vetor gene duplo para o híbrido monômero-dímero EpoFc N297A foi então construído através de clonagem de fragmento Notl/BamHI de pSYN-Fc-010 nos correspondentes sítios em pSYN-Fc-006 usando os sítios de restrição Hindlll/Rsrll, pSYN-EPO-005 para gerar pSYN-EPO-008 (pEE12.4-6.4/EpoFc N297A1FC N297A). 0 constructo tipo selvagem também foi fabricado por subclonagem de sequência Fc tipo selvagem de pSYN-Fc-001 em pSYN-EPO-005 usando os sítios Rsrll e EcoRI, para gerar pSYN-EPO-006 (pEE12.4/EpoFc). 0 vetor gene duplo para o híbrido monômero-dímero EpoFc foi então construído através de clonagem de fragmento Notl/BamHI a partir de pSYN-Fc-009 nos m correspondentes sítios em pSYN-EPO-006 para gerar pSYN-EPO-O0 7 (pEE12.4-6.4/EpoFc/Fc) .
Cada plasmídeo foi transfectado em células CH0K1 SV e clones positivos identificados e adaptados para suspensão livre de soro, como indicado em Lonza Biologics Manual for Standard Operating procedures (Lonza Biologics, Slough, UK), e purificado como indicado para outros constructos de monômero-dímero.
Exemplo 34: Clonagem de IFN3Fc humana. IFN3~Fc N297A com liqantes de oito aminoácidos e constructos lqK-Fc-6His 137 10 ng de uma biblioteca de ADN genómico humano de Clontech (BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) foram usados como um molde para isolar ΙΕΝβ humano com sua sequência sinal nativa usando os seguintes iniciadores: IFNpp-F H3/Sbf1: 5'-CTAGCCTGCAGGAAGCTTGCCGCCACCATGACCA ACAAGTGTCTCCTC -3' (SEQ ID N°: 92) ΙΕΝβ-R (EFAG) Sal: 5'- TTTGTCGACCGCAGCGGCGCCGGCG AACTCGTTTCGGAGGTAACCTGTAAG -3' (SEQ ID N°: 93) O iniciador reverso também foi usado para criar uma sequência ligadora de oito aminoácidos (EFAGAAAV)(SEQ ID N°: 94) sobre a extremidade 3' da sequência ΙΕΝβ humana. A reação PCR foi realizada usando Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) de acordo com protocolo padrão de fabricante em um Rapid Cycler Thermocycler (Idaho Technology, Salt Lake City, UT) . Um produto de PCR do tamanho correto (-607 bp) foi purificado com gel usando um kit Gel Extraction (Qiagen, Valência, CA) , clonado em um vetor de clonagem TA (Promega, Madison, WI) e sequenciado. Este constructo foi nomeado pSYN-ΙΕΝβ-002 . ρ3ΥΝ-ΙΕΝβ-002 foi digerida com Sbfl e Sall e clonada em pSP72 (Promega) em sítios Pstl e Sall para render pSYN-ΙΕΝβ-005. pSYN-Fc-001 purificada (0,6 pg) foi digerida com Sall e EcoRI e clonada nos correspondentes sítios de ρ3ΥΝ-ΙΕΝβ-005 para criar o plasmídeo pSYN-ΙΕΝβ-ΟΟδ que contém ΙΕΝβ humano ligado a Fc humana através de uma sequência ligadora de oito aminoácidos. PSYN-ΙΕΝβ-ΟΟβ foi então digerida com Sbfl e EcoRI e a sequência ΙΕΝβ-Fc de inteiro comprimento 138 cionada nos sítios Pstl e EcoRI de pEDdC.sig para criar plasmídeo pSYNIFNp-008. pSYN-Fc-002 contendo Fc ADN humano com uma alteração de aminoácido simples de asparagina para alanina na posição 297 (N297A; numeração EU) foi digerido com BspEI e Xmal para isolar um fragmento de ADN de -365 bp contendo a mutação N297A. Este fragmento de ADN foi clonado nos correspondentes sítios em pSYN-ΙΕΝβ-Ο08 para criar plasmídeo pSYN-IF^-009 que contém a sequência ΙΕΝβ-Fc com um ligante de oito aminoácidos e uma mutação N297A em Fc no vetor de expressão, pED.dC.
Clonagem de sequência sinal Igx - Fc N297A-6HÍS. Os seguintes iniciadores foram usados para adicionar um marcador 6xHis ao término C da sequência codificando Fc N297A:
Fc GS-F: 5'- GGCAAGCTIGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCC -3' (SEO ID N°: 95) FC.6HÍS-R: 5'- TCAGTGGTGATGGTGATGATGTTIACCCGGAGACAGGGAG -3' (SEO ID N°: 96)
Fc.6His-F: 5'- GGT AAACAT CAT CACCAT CAC CAC T GAGAAT T CCAA TATCACTAGTGAATICG -3' (SEO ID N°: 97)
Sp6+T-R: 5'- GCTATTIAGGTGACACTATAGAATACTCAAGC -3' (SEO ID N°: 98)
Duas reações PCR foram realizadas com 50 pmoles de Fc GS-F e Fc.6His-R ou Fc.6His-F e Sp6+T-R usando o Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) de acordo com protocolo padrão de fabricante em um MJ 139
Thermocycler. Ambas reações foram realizadas usando 500 ng de pSYN-Fc-008 como um molde Numa reação de 50 μΐ, usando condições de ciclização padrões. As bandas de tamanho esperado (-780 e 138 bp, respectivamente) foram purificadas com gel com um kit Gel Extraction (Oiagen, Valência, CA), então combinadas Numa reação PCR de 50 μΐ com 50 pmoles de iniciadores Fc GS-F e Sp6+T-R e corridas como antes, usando condições de ciclização padrões. A banda de tamanho esperado (-891 bp) foi purificada com gel com um kit Gel Extraction (Qiagen, Valência, CA) e clonado em pCADN6 V5-His B usando os sítios Hindlll e EcoRI para gerar pSYN-Fc-014 (pcADNô/lgx sig seq-Fc N297A-6HÍS) .
Exemplo 35: Expressão e purificação de IFNPFc. homodímero IFN3~Fc N297A e híbrido monômero-dímero IFNP-Fc N297A Células CHO DG44 foram revestidas em placas de cultura de tecido de 100 mm e crescidas para uma confluência de 50%-60%. Um total de 10 μΐ de ADN foi usado para transfectar uma simples placa de 100 mm. Para a transfecção de homodímero, 10 μΐ do constructo pSYN-FNp-008 ou pSYN-IF^-009 foram usados; para a transfecção de híbrido monômero-dímero, 8 μΐ do constructo pSYN-IFNp-009 + 2 μΐ de pSYN-Fc-014 foram usados. As células foram transfectadas usando reagentes de transfecção Superfect (Qiagen, Valência, CA) de acordo com instruções do fabricante 48 a 72 horas após transfecção, meio de crescimento foi removido e as células foram libertadas das placas com tripsina 0,25% e transferidas para frascos de cultura de tecido T75 em meio de seleção MEM Alpha sem nucleosídeos plus soro bovino fetal dializado 5%) . O meio de seleção para a transfecção de híbrido monômero-dímero foi suplementado com 5 μΙ/mL de Blasticidin (Invitrogen, Carlsbad,CA). Seleção foi continuada por 10-14 dias até as células começarem a 140 crescer bem e linhas de células estáveis foram estabelecidas. Expressão de proteína foi subsequentemente amplificada pela adição de metotrexato: variando de 10 a 50 nM.
Para todas as linhas de células, aproximadamente 2xl07 células foram usadas para inocular 300 mL de meio de crescimento Numa garrafa de rolo de 1700 cm2 (Corning, Corning, NY) . As garrafas de rolo foram incubadas Numa incubadora de CO2 5% a 37°C por aproximadamente 72 horas. O meio de crescimento foi então trocado com 300 mL de meio de produção livre de soro (DMEM/F12 com 5 μΙ/mL de insulina humana). O meio de produção (meio condicionado) foi coletado cada dia por 10 dias e armazenado a 4°C. Meio de produção novo foi adicionado às garrafas de rolo após cada coleta e as garrafas foram retornadas para a incubadora. Antes de cromatografia, o meio foi clarificado usando um filtro SuporCap-100 (0,8/0,2 pm) de Pall Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). Todas as etapas seguintes foram realizadas a 4°C. O meio clarificado foi aplicado a Proteína A Sefarose, lavado com 5 volumes de coluna de IX PBS (fosfato 10 mM, pH 7.4, KC1 2,7 mM e NaCl 137 mM) , eluído com glicina 0,1 M, pH 2,7, e então neutralizado com 1/10 volume de Tris-HCI 1 M pH 8,0, NaCl 5 M. As proteínas homodímero foram ainda purificadas sobre uma coluna Superdex 200 Prep Grade sizing corridas e eluídas em fosfato de sódio 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol 10%. A proteína híbrido monômero-dímero foi submetida a ainda purificação uma vez que ela conteve uma mistura de homodímero IFNfiFc N297A:IFNPFc N297A, híbrido monômero-dímero IFNPFc N297A:Fc N297A His, e homodímero Fc N297A His:Fc N297A His. Material foi aplicado a uma coluna quelante de níquel em fosfato de sódio 50 mM pH 7,5, NaCl 141 500 mM. Após carga, a coluna foi lavada com imidazol 50 mM em fosfato de sódio 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM e proteína foi eluída com um gradiente de imidazol 50-500 mM em fosfato de sódio 50- mM pH 7,5, NaCl 500 mM. Frações correspondendo a picos de eluição sobre um detector UV foram coletadas e analisadas por SOS-PAGE. Frações do primeiro pico contiveram híbrido monômero-dímero IF^Fc N297A:Fc N297A His, enquanto o segundo pico conteve homodimero Fc N297A His:FC N297A His. Todas as frações contendo o híbrido monômero-dímero, mas nenhum homodimero Fc, foram reunidas e aplicadas diretamente a uma coluna Superdex 200 Prep Grade sizing, corridas e eluídas em fosfato de sódio 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol 10%. Frações contendo híbridos monômero-dímero ΙΕΝβ-Fc N297A:Fc N297A His foram reunidas e armazenadas em -80°C.
Exemplo 36: Ensaio antiviral para atividade IFNP
Atividade antiviral (IU/mL) de proteínas de fusão IFN|3 foi determinada usando um ensaio CPE (efeito citopático). Células A549 foram revestidas Numa placa de cultura de tecido de 96 cavidades em meios de crescimento (RPMI suplementado com soro bovino fetal 10% (FBS) e L-30 glutamina 2 mM) por 2 horas a 37°C, CO2 5%. Padrões IFNB e proteínas de fusão IFNP foram diluídos em meios de crescimento e adicionados a células em triplicata por 20 horas a 37°C, CO2 5%. Seguindo incubação, todos os meios foram removidos de cavidades, vírus de encéfalomiocardite (EMCV) foi diluído em meios de crescimento e adicionados (3000 pfu/cavidade) a cada cavidade com a exceção de cavidades controlos. Placas foram incubadas a 37°C, C02 5% por 28 horas. Células vivas foram fixadas com ácido tricloro acético (TCA) frio 10% e então manchadas com sulfo rodamina B (SRB) de acordo com protocolos publicados 142 (Rubinstein et al. 1990, J. Natl. Câncer Inst. 82, 1113) . O corante SRB foi solubilizado com Tris 10 mM pH 10,5 e lido sobre um espectrofotômetro em 490 nm. Amostras foram analisadas através de comparação de atividades a uma curva padrão conhecida variando de 10 a 0,199 IU/mL. Os resultados são apresentados abaixo na Tabela 8 e demonstram aumentada atividade antiviral de híbridos monômero-dímero.
TABELA 8: ENSAIO ANTIVIRAL INTERFERON B HOMODÍMERO V. HÍBRIDO MONÔMERO-DÍMERO
Protéina Atividade antiviral (IU/nmol) Desvio padrão Homodímero IF^-Fc ligante 8aa 4,5xl05 0,72xl05 Homodímero IF^Fc N297A ligante de 8aa 3,21xl05 0,48xl05 Híbrido monômero-dímero IFNPFc N297A ligante de 8aa: Fe His 12,2xl05 2xl05
Exemplo 37: Administração de homodímero IFNflFc e híbrido monômero-dímero com um Ligante de oito aminoácidos a macacos cynomolcrus
Para administração pulmonar, aerossóis de proteínas homodímero IF^Fc ou híbrido monômero-dímero IFNPFc N297A (ambas com o Ligante de 8 aminoácidos) em PBS, pH 7,4, HSA 0,25% foram criados com o nebulizador Aeroneb Pro™ (AeroGen, Mountain View, CA) , em linha com um respirador Bird Mark 7A, e administradas a macacos cynomolgus anestesiados através de tubos endotraqueais (aproximando respiração tidal normal). Amostras de sangue foram tomadas 143 em vários pontos de tempo, e a quantidade de proteína contendo IFNB no resultante soro foi determinada usando um ensaio imuno de IFNB humano (Biosource International, Camarillo, CA) . Parâmetros fármaco-cinéticos foram calculados usando o software WinNonUn. A Tabela 9 apresenta os resultados de macacos cynomolgus tratados com híbrido monômero-dímero IFNPFc N297A ou homodímero IF^Fc.
TABELA 9: ADMINISTRAÇÃO DE HÍBRIDO MONÔMERO—DíMERO IFNBFC N297A E 5 HOMODÍMERO IFNBFC A MACACOS
Proteína Macaco # Via Dose 1 Depositada Aproximada (pg/kg) Cmax (nglml) AUC (h*ng/ml) 11 /2 (hr) 11/2 avg (h) Híbrido C07308 pulm 20 23,3 987, 9 27,6 Monómero- CO 7336 pulm 20 22,4 970,6 25, 6 dímero ifnPfc N297A C07312 pulm 20 21,2 1002,7 28,0 27, 1 Homodímero C07326 pulm 20 2,6 94,6 11, 1 11,4 ifnPfc C07338 pulm 20 5, 0 150,6 11, 7
Baseado em fração de deposição de 15% de dose nebulizada como determinado por cintigrafia gama.
As fármaco-cinéticas de ΙΓΝβΗο com um ligante de 8 aminoácidos administrada a macacos cynomolgus são apresentadas na figura 15. A figura compara o homodímero IF^Fc com o híbrido monômero-dímero ΙΗΝβΓο N297A em macacos após administração de uma dose pulmonar simples. Níveis em soro significantemente maiores foram obtidos em macacos tratados com o híbrido monômero-dímero compara ao homodímero. 144
Amostras de soro também foram analisadas para níveis de neopterina (um biomarcador de atividade de IFNB) usando um ensaio imuno neopterina (MP Biomedicals, Orangeburg, NY) . Os resultados para estas análises são mostrados na figura 16. A figura compara estimulação de neopterina em resposta ao homodímero ΙΕΝβ-Fc e o híbrido monômero-dímero IFNp-Fc N297A. Pode ser visto que níveis de neopterina significantemente maiores foram detectados em macacos tratados com híbrido monômero-dímero IFNp-Fc N297A comparado ao homodímero IFNp-Fc.
Todos os números expressando quantidades de ingredientes, condições de reação, e assim por diante usados no relatório descritivo e reivindicações são para serem entendidos como sendo modificados em todos os exemplos pelo termo "cerca". Da mesma maneira, a menos que indicado ao contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e reivindicações apostas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas buscadas serem obtidas pela presente invenção. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar o pedido de patente da doutrina de equivalentes para o âmbito das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser construído na luz do número de dígitos significantes e abordagens de arredondamento comuns.
As formas de realização específicas aqui descritas são providenciadas a título de exemplo e não se destinam a ser limitativas de modo algum
Lisboa, 17 de Outubro de 2013 145

Claims (17)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína quimérica compreendendo uma primeira cadeia polipeptídica e uma segunda cadeia polipeptídica, em que a referida primeira cadeia de polipeptídeos compreende um factor de coagulação e, pelo menos, uma porção de uma região constante de imunoglobulina, que é um parceiro de ligação de receptor neonatal (FcRn), e em que a referida segunda cadeia polipeptíca consiste numa região constante de imunoglobulina, ou uma sua porção, que é um parceiro de ligação FcRn, para utilização num método de tratamento.
  2. 2. A proteína quimérica da reivindicação 1, para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que as ditas porções de uma região constante de imunoglobulina são um fragmento Fc.
  3. 3. A proteína quimérica da reivindicação 1 ou reivindicação 2, para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a região constante de imunoglobulina é uma região constante de IgGl ou IgG2.
  4. 4. A proteína quimérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, para o uso de acordo com a reivindicação 1, em que o factor de coagulação é seleccionado a partir do grupo consistindo de Factor VII, Factor Vila, Factor VIII, o Factor VlIIa, Factor V, Factor IX, Factor IXa, Factor X, Factor XI, factor XII, factor XIII, fibrinogénio, protrombina, e Factor de von Willebrand. 1 para a o factor
  5. 5. A proteína quimérica da reivindicação 4, utilização de acordo com a reivindicação 1, em que de coagulação é o Factor IX ou o Factor IXa.
  6. 6. A proteína quimérica da reivindicação 4, para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o factor de coagulação é o Factor VIII ou Factor VlIIa.
  7. 7. A proteína quimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira cadeia polipeptídica compreende ainda um ligante entre o factor de coagulação e a porção da região constante de uma imunoglobulina.
  8. 8. A proteína quimérica da reivindicação 7, para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o ligante compreende 1-20 aminoácidos.
  9. 9. Uma composição farmacêutica compreendendo a proteína quimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
  10. 10. A proteína quimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, para utilização no tratamento de uma desordem hemostática.
  11. 11. A proteína quimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, para utilização no tratamento de hemofilia A.
  12. 12. A proteína quimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, para utilização no tratamento de hemofilia B. 2
  13. 13. A proteína quimérica de acordo com a reivindicação 1, para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína quimérica é administrada por via intravenosa, subcutânea, oral, bucal, sublinqual, nasal, parentérica, rectal, vaqinal, ou através de uma via pulmonar.
  14. 14. A proteína quimérica de acordo com a reivindicação 1, para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína quimérica é ser administrada por via intravenosa.
  15. 15. A proteína quimérica de acordo com a reivindicação 1, para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína quimérica é para ser administrada por via subcutânea.
  16. 16. Um primeiro polinucleótido que codifica a primeira cadeia de polipeptídeos da proteína quimérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, e um segundo polinucleótido que codifica a segunda cadeia de polipéptido da referida proteína quimérica.
  17. 17. Os primeiro e segundo polinucleótidos de acordo com a reivindicação 16, em que cada um dos referidos polinucleótidos está presente numa vector de expressão. Lisbos, 17 de Outubro de 2013 3
PT47759469T 2003-05-06 2004-05-06 Híbridos monômero-dímero quiméricos de imunoglobulina PT1625209E (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46960003P 2003-05-06 2003-05-06
US48796403P 2003-07-17 2003-07-17
US53920704P 2004-01-26 2004-01-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1625209E true PT1625209E (pt) 2013-10-24

Family

ID=33458764

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT101828903T PT2361932T (pt) 2003-05-06 2004-05-06 Híbridos monômero-dímero quiméricos de imunoglobulina
PT101829026T PT2357196T (pt) 2003-05-06 2004-05-06 Híbridos monômero-dímero quiméricos de imunoglobulina
PT47759469T PT1625209E (pt) 2003-05-06 2004-05-06 Híbridos monômero-dímero quiméricos de imunoglobulina

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT101828903T PT2361932T (pt) 2003-05-06 2004-05-06 Híbridos monômero-dímero quiméricos de imunoglobulina
PT101829026T PT2357196T (pt) 2003-05-06 2004-05-06 Híbridos monômero-dímero quiméricos de imunoglobulina

Country Status (28)

Country Link
US (13) US7404956B2 (pt)
EP (7) EP3978508A1 (pt)
JP (6) JP5091480B2 (pt)
CN (3) CN102234334B (pt)
AT (1) ATE446307T1 (pt)
AU (1) AU2004252422B2 (pt)
BE (1) BE2016C015I2 (pt)
BR (2) BR122019011535B1 (pt)
CA (1) CA2522590C (pt)
CY (4) CY1114639T1 (pt)
DE (1) DE602004023724D1 (pt)
DK (4) DK2174946T3 (pt)
EA (1) EA012566B1 (pt)
ES (3) ES2431116T3 (pt)
FR (1) FR16C0011I2 (pt)
HK (2) HK1161604A1 (pt)
HU (4) HUE031663T2 (pt)
IL (2) IL171779A (pt)
LT (2) LTC1625209I2 (pt)
LU (1) LU92991I2 (pt)
NL (1) NL300799I2 (pt)
NO (5) NO339539B1 (pt)
PL (3) PL2357196T3 (pt)
PT (3) PT2361932T (pt)
SI (4) SI1625209T1 (pt)
TW (1) TWI353991B (pt)
UA (1) UA95436C2 (pt)
WO (2) WO2004101739A2 (pt)

Families Citing this family (382)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5992710A (ja) * 1982-11-16 1984-05-29 関西電力株式会社 直接水冷線路の立坑部の布設方法
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8093357B2 (en) 2002-03-01 2012-01-10 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES2558102T3 (es) * 2003-05-06 2016-02-02 Biogen Hemophilia Inc. Proteínas quiméricas del factor de coagulación para el tratamiento de un trastorno hemostático
CA2522690A1 (en) * 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US8007805B2 (en) 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
US7736653B2 (en) 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin Fc region as a carrier
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US20150010550A1 (en) 2004-07-15 2015-01-08 Xencor, Inc. OPTIMIZED Fc VARIANTS
US20080176790A1 (en) 2004-10-29 2008-07-24 Defrees Shawn Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf)
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
CA2587617C (en) 2004-11-12 2011-02-01 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
MX2007008229A (es) 2005-01-10 2007-09-11 Neose Technologies Inc Factor estimulador de colonias de granulocitos glicopegilado.
US9187546B2 (en) 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US7833979B2 (en) * 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
JP2008545409A (ja) * 2005-05-26 2008-12-18 シェーリング コーポレイション インターフェロン−ＩｇＧ融合体
JP5335422B2 (ja) 2005-06-17 2013-11-06 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
RS57549B1 (sr) 2005-08-26 2018-10-31 Ares Trading Sa Proces za pripremu glikoziliranog interferona beta
DK1931709T3 (en) 2005-10-03 2017-03-13 Xencor Inc FC VARIETIES WITH OPTIMIZED FC RECEPTOR BINDING PROPERTIES
EP1951757B1 (en) 2005-10-06 2014-05-14 Xencor, Inc. Optimized anti-cd30 antibodies
US8153598B2 (en) * 2005-10-19 2012-04-10 Intrexon Corporation PKD ligands and polynucleotides encoding PKD ligands
JP5368798B2 (ja) * 2005-10-31 2013-12-18 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 癌を診断し処置するための組成物および方法
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
CA2625978A1 (en) 2005-12-09 2007-06-14 Ares Trading S.A. Method for purifying fsh or a fsh mutant
US7625564B2 (en) * 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
TW200745163A (en) * 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
EP2650305B1 (en) 2006-03-24 2024-05-08 Bioverativ Therapeutics Inc. PC5 as a factor IX propeptide processing enzyme
DE602007007923D1 (de) * 2006-04-11 2010-09-02 Csl Behring Gmbh Verfahren zur erhöhung der in-vivo-gewinnung therapeutischer polypeptide
RU2008145084A (ru) 2006-05-24 2010-06-27 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг (Ch) Аналоги фактора ix, имеющие пролонгированное время полужизни in vivo
ES2889920T3 (es) * 2006-06-14 2022-01-14 Csl Behring Gmbh Proteínas de fusión escindibles proteolíticamente con alta actividad específica molar
EP1867660A1 (en) * 2006-06-14 2007-12-19 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
AU2013202566C1 (en) * 2006-06-14 2018-07-12 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
US20100021379A1 (en) * 2006-06-29 2010-01-28 The Regents Of The University Of California Chemical Antibodies for Immunotherapy and Imaging
EP2049144B8 (en) 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
GB0614780D0 (en) * 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
US8524867B2 (en) 2006-08-14 2013-09-03 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target CD19
KR101105610B1 (ko) * 2006-08-17 2012-01-18 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｃｃｒ５ 에 대한 항체 및 항푸소제닉 펩타이드의 컨쥬게이트
TW200817438A (en) 2006-08-17 2008-04-16 Hoffmann La Roche A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide
WO2008051326A2 (en) * 2006-08-21 2008-05-02 President And Fellows Of Harvard College Identification of contactins and l1- cams as ligands for the amyloid precursor protein
CN101541825B (zh) * 2006-08-28 2013-08-14 阿雷斯贸易股份有限公司 Fc融合蛋白的纯化方法
PL2061803T5 (pl) * 2006-08-28 2023-03-27 Ares Trading S.A. Proces oczyszczania białek zawierających fc
CA2660795C (en) 2006-09-18 2014-11-18 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target hm1.24
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
US7820623B2 (en) * 2006-10-25 2010-10-26 Amgen Inc. Conjugated toxin peptide therapeutic agents
KR20090105913A (ko) * 2006-11-02 2009-10-07 다니엘 제이 카폰 이동 부분을 갖는 하이브리드 면역글로불린
EP3231440A1 (en) 2006-12-22 2017-10-18 CSL Behring GmbH Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
WO2008098720A1 (en) 2007-02-12 2008-08-21 Csl Behring Gmbh Therapeutic application of kazal-type serine protease inhibitors
JP2010523582A (ja) 2007-04-03 2010-07-15 バイオジェネリクス アクチェンゲゼルシャフト グリコｐｅｇ化ｇ−ｃｓｆを用いた治療方法
JP5591691B2 (ja) * 2007-05-22 2014-09-17 アムジエン・インコーポレーテツド 生物活性を有する融合タンパク質を作製するための組成物及び方法
MX2009013259A (es) 2007-06-12 2010-01-25 Novo Nordisk As Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos.
CL2008002092A1 (es) * 2007-07-20 2009-05-29 Hoffmann La Roche Conjugado que contiene dos o mas peptidos antifusogenicos y un anticuerpo anti-cd-4; metodo de produccion; composicion farmaceutica que lo comprende; polipeptidos antifusogenicos y uso del conjugado para tratar infecciones viricas.
TWI554520B (zh) * 2007-07-20 2016-10-21 諾華健控股公司 在活體中具有延長之半生期以及提高之紅血球生成活性的重組人類紅血球生成素（ｅｐｏ）-ｆｃ融合蛋白
CA2720628A1 (en) 2007-07-26 2009-01-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region
AU2008284047A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
CA2701032C (en) 2007-09-27 2021-01-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP2205258B1 (en) * 2007-09-28 2017-05-24 Janssen Biotech, Inc. Methods and structural conformations of antibody preparations with increased resistance to proteases
WO2009053368A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Single ifn-beta fused to a mutated igg fc fragment
CA2701221A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying an fc-containing protein
JP2011500756A (ja) * 2007-10-22 2011-01-06 メルク セローノ ソシエテ アノニム Ｆｃ融合タンパク質を精製する方法
CA2702289A1 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds exhibiting glucagon antagonist and glp-1 agonist activity
EP2219602A1 (en) 2007-11-15 2010-08-25 Amgen, Inc Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
EP2235059B1 (en) 2007-12-26 2015-02-18 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
KR101749310B1 (ko) * 2008-01-24 2017-06-21 에스퍼란스 파마슈티컬스, 인코포레이티드 용해 도메인 융합 구성물 및 이를 제조하고 사용하는 방법
ES2500066T3 (es) 2008-01-25 2014-09-30 Amgen, Inc Anticuerpos frente a ferroportina y métodos de uso
CN103497247A (zh) 2008-02-27 2014-01-08 诺沃—诺迪斯克有限公司 缀合的因子viii分子
WO2009139822A1 (en) 2008-05-01 2009-11-19 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
CN103641907A (zh) 2008-06-17 2014-03-19 印第安纳大学研究及科技有限公司 胰高血糖素/glp-1受体共激动剂
JP5753779B2 (ja) 2008-06-17 2015-07-22 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 生理学的ｐＨの緩衝液中で向上した溶解性及び安定性を示すグルカゴン類縁体
EP2300035B1 (en) 2008-06-17 2015-08-12 Indiana University Research and Technology Corporation Gip-based mixed agonists for treatment of metabolic disorders and obesity
EP2291523B1 (en) 2008-06-24 2014-12-17 CSL Behring GmbH Factor viii, von willebrand factor or complexes thereof with prolonged in vivo half-life
WO2010014909A1 (en) * 2008-08-01 2010-02-04 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
US8551789B2 (en) 2010-04-01 2013-10-08 OncoMed Pharmaceuticals Frizzled-binding agents and their use in screening for WNT inhibitors
CA2738485A1 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Frizzled-binding agents and uses thereof
EP2365979A2 (en) * 2008-10-22 2011-09-21 Biogen Idec MA Inc. Recombinant fcrn and variants thereof for purification of fc-containing fusion proteins
AU2009313902B9 (en) 2008-11-13 2014-03-27 The General Hospital Corporation Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of BMP-6
JP5730211B2 (ja) 2008-11-20 2015-06-03 バイオジェン アイデック エムエー インコーポレイティドＢｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ． ウイルスのアルギニン不活化
CA2744558A1 (en) 2008-12-19 2010-07-15 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
WO2010111414A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 Bayer Healthcare Llc Factor viii variants and methods of use
WO2010111617A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Van Andel Research Institute Parathyroid hormone peptides and parathyroid hormone-related protein peptides and methods of use
KR101431318B1 (ko) 2009-04-02 2014-08-20 로슈 글리카트 아게 전장 항체 및 단일쇄 ｆａｂ 단편을 포함하는 다중특이성 항체
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
CA2759333A1 (en) * 2009-04-22 2010-10-28 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
PE20120914A1 (es) 2009-06-16 2012-08-22 Univ Indiana Res & Tech Corp Compuestos glucagon activo de receptor de gip
AU2010290131C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Amunix Operating Inc. Coagulation factor VII compositions and methods of making and using same
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
SG10201408401RA (en) 2009-09-16 2015-01-29 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
CA2778105C (en) 2009-10-23 2019-04-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
CN102648212B (zh) 2009-11-13 2014-12-03 基立福疗法公司 包含冯维勒布兰德因子(vWF)的制剂及其相关制备方法、试剂盒和用途
CA2782424C (en) 2009-12-06 2021-07-27 Biogen Idec Hemophilia Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
WO2011075393A2 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
MX2012008603A (es) 2010-01-27 2013-01-25 Univ Indiana Res & Tech Corp Conjugados de antagonista de glucagon-agonista de gip y composiciones para el tratamiento de desordenes metabolicos y obesidad.
DK2547359T3 (en) 2010-03-15 2016-06-06 The Board Of Trustees Of The Univ Of Illionis Inhibitors of beta integrin G-protein alpha subunit-BINDING INTERACTIONS
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
EP2371857A1 (en) 2010-04-01 2011-10-05 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for treating interstitial lung disease
BR112012028704A2 (pt) 2010-05-13 2019-09-24 Univ Indiana Res & Tech Corp composto de glugagon da superfamília de peptídeos exibindo atividade do receptor com hormônio nuclear, pró fármaco, dímero ou multímero, composição farmacêutica que o compreendem e método de administração do mesmo.
EA024052B1 (ru) 2010-06-07 2016-08-31 Эмджен Инк. Устройство для доставки лекарственного средства
CA2802485C (en) 2010-06-16 2019-09-17 Indiana University Research And Technology Corporation Single chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor
KR20130102470A (ko) 2010-06-24 2013-09-17 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 아미드계 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드 프로드러그
CA2803164C (en) 2010-06-24 2018-08-21 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
PT2591006T (pt) * 2010-07-09 2019-07-29 Bioverativ Therapeutics Inc Moléculas de cadeia simples processáveis e polipéptidos preparados utilizando as mesmas
CN103140237A (zh) 2010-07-09 2013-06-05 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 因子ix多肽及其使用方法
EP3508573A1 (en) 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
JP5758004B2 (ja) 2010-08-24 2015-08-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ジスルフィドによって安定化されたＦｖ断片を含む二重特異性抗体
DE19177059T1 (de) 2010-10-01 2021-10-07 Modernatx, Inc. N1-methyl-pseudouracile enthältendes ribonucleinsäuren sowie ihre verwendungen
US9029502B2 (en) 2010-12-20 2015-05-12 The Regents Of The University Of Michigan Inhibitors of the epidermal growth factor receptor-heat shock protein 90 binding interaction
MX2013006304A (es) 2010-12-22 2013-07-02 Univ Indiana Res & Tech Corp Analogos de glucagon que exhiben actividad del receptor gip.
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
WO2012097333A2 (en) 2011-01-14 2012-07-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged immunoglobulin polypeptides and method of use thereof
DK2673294T3 (en) * 2011-02-10 2016-05-30 Roche Glycart Ag MUTANT INTERLEUKIN-2 POLYPEPTIDES
RU2013141078A (ru) 2011-02-28 2015-04-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Одновалентные антигенсвязывающие белки
CN103502271B (zh) 2011-02-28 2016-10-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗原结合蛋白
CA2829037C (en) 2011-03-09 2022-05-17 Csl Behring Gmbh Factor xii inhibitors for the administration with medical procedures comprising contact with artificial surfaces
EP2497489A1 (en) 2011-03-09 2012-09-12 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for the treatment of silent brain ischemia and ischemia of other organs
WO2012135805A2 (en) 2011-03-31 2012-10-04 modeRNA Therapeutics Delivery and formulation of engineered nucleic acids
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
PT2699293T (pt) 2011-04-20 2019-05-21 Amgen Inc Aparelho de autoinjeção
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
RU2600067C2 (ru) 2011-05-06 2016-10-20 Дзе Гавермент Оф Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари Оф Дзе Депармент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Рекомбинантный иммунотоксин, нацеленный на мезотелин
PT2717898T (pt) 2011-06-10 2019-05-20 Bioverativ Therapeutics Inc Compostos pró-coagulantes e processos para a sua utilização
US9156902B2 (en) 2011-06-22 2015-10-13 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
PT3513804T (pt) 2011-07-08 2022-06-02 Bioverativ Therapeutics Inc Polipéptidos fator viii híbridos e quiméricos, e métodos de utilização dos mesmos
EP2734552A1 (en) 2011-07-22 2014-05-28 CSL Behring GmbH Inhibitory anti -factor xii/xiia monoclonal antibodies and their uses
EA028914B1 (ru) * 2011-07-25 2018-01-31 Байоджен Хемофилия Инк. Исследования для мониторинга нарушений свертываемости крови
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
LT3682905T (lt) 2011-10-03 2022-02-25 Modernatx, Inc. Modifikuoti nukleozidai, nukleotidai ir nukleorūgštys bei jų naudojimas
AR088267A1 (es) 2011-10-06 2014-05-21 Hanmi Science Co Ltd Derivados, de los factores de coagulacion sanguinea vii y viia, conjugados y complejos que comprenden a los mismos y sus usos
EA030868B1 (ru) 2011-10-14 2018-10-31 Эмджен Инк. Инжектор и способ его сборки
WO2013065343A1 (ja) * 2011-10-31 2013-05-10 株式会社 島津製作所 非ペプチドヒンジ部含有フレキシブル抗体様分子
KR20140097151A (ko) 2011-11-17 2014-08-06 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 글루코코르티코이드 수용체 활성을 나타내는 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드
PL2791160T3 (pl) 2011-12-16 2022-06-20 Modernatx, Inc. Kompozycje zmodyfikowanego mrna
US9573987B2 (en) 2011-12-20 2017-02-21 Indiana University Research And Technology Corporation CTP-based insulin analogs for treatment of diabetes
BR112014017165B1 (pt) 2012-01-12 2023-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica compreendendo uma proteína de fator viii, composição farmacêutica, e seus usos
CN108465106B (zh) 2012-01-12 2022-05-27 普吉特海湾血液中心 降低经受因子viii疗法的个体中针对因子viii的免疫原性的方法
EP2623110A1 (en) 2012-01-31 2013-08-07 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for the treatment of neurological inflammatory disorders
EP2812357B1 (en) 2012-02-10 2020-11-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Single-chain antibodies and other heteromultimers
ES2771208T3 (es) 2012-02-15 2020-07-06 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
EP2814502B1 (en) 2012-02-15 2017-09-13 CSL Behring GmbH Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity
DK2822577T3 (en) 2012-02-15 2019-04-01 Bioverativ Therapeutics Inc RECOMBINANT FACTOR VIII PROTEINS
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
DE18200782T1 (de) 2012-04-02 2021-10-21 Modernatx, Inc. Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
WO2013166297A2 (en) * 2012-05-03 2013-11-07 Medimmune, Llc Method for analyzing sample components
EP3693000B1 (en) 2012-06-08 2022-03-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Procoagulant compounds
US10202595B2 (en) 2012-06-08 2019-02-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
MX356000B (es) 2012-06-21 2018-05-08 Hoffmann La Roche Analogos de glucagon que exhiben actividad del receptor gip.
CA2877358A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting gip receptor activity
CN104582736A (zh) 2012-06-21 2015-04-29 印第安纳大学研究及科技有限公司 Fc效应子功能改变的肠降血糖素受体配体多肽Fc区融合多肽和缀合物
MX354862B (es) 2012-06-27 2018-03-23 Hoffmann La Roche Método para la producción de entidades dirigidas altamente selectivas hechas a la medida y biespecíficas que contienen dos entidades de unión diferentes.
CA2871882A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
US10023628B2 (en) 2012-07-06 2018-07-17 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor VIII polypeptides and uses thereof
CN104661674A (zh) 2012-07-11 2015-05-27 阿穆尼克斯运营公司 具有xten和血管性血友病因子蛋白的因子viii复合物、及其用途
EP2872170A4 (en) * 2012-07-13 2016-06-22 Zymeworks Inc BISPECIFIC ASYMMETRIC HETÉRODIMÈRES COMPRISING ANTI-CD3 RECOMBINANT PRODUCTS
WO2014018777A2 (en) 2012-07-25 2014-01-30 Biogen Idec Ma Inc. Blood factor monitoring assay and uses thereof
SG11201408536WA (en) 2012-08-02 2015-01-29 Hoffmann La Roche METHOD FOR PRODUCING SOLUBLE FcR AS Fc-FUSION WITH INERT IMMUNOGLOBULIN Fc-REGION AND USES THEREOF
EP3542861A1 (en) 2012-09-25 2019-09-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fix polypeptides
US10391152B2 (en) 2012-10-18 2019-08-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
EP2911691B1 (en) 2012-10-23 2018-10-10 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using wnt pathway-binding agents
EP3446700A1 (en) 2012-10-30 2019-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fviii polypeptide
JP2015535464A (ja) 2012-11-21 2015-12-14 アムジエン・インコーポレーテツド 薬剤送達装置
RS63237B1 (sr) 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx Inc Terminalno modifikovana rnk
US10717965B2 (en) 2013-01-10 2020-07-21 Gloriana Therapeutics, Inc. Mammalian cell culture-produced neublastin antibodies
CN105073195A (zh) 2013-02-04 2015-11-18 昂科梅德制药有限公司 使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法及对该治疗的监测
DK2956477T4 (da) 2013-02-15 2024-04-15 Bioverativ Therapeutics Inc Optimeret faktor viii-gen
CN105188750A (zh) 2013-03-08 2015-12-23 德国杰特贝林生物制品有限公司 治疗和预防远端缺血-再灌注损伤
WO2014139994A1 (en) 2013-03-11 2014-09-18 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormone compounds
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
JP6768501B2 (ja) 2013-03-15 2020-10-14 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入機、および自動注入機システム
BR112015022042B1 (pt) 2013-03-15 2023-01-10 Amgen Inc Injetor para injetar um produto terapêutico
ES2973257T3 (es) 2013-03-15 2024-06-19 Amgen Inc Casete de fármaco, autoinyector y sistema de autoinyector
EP4039281A1 (en) * 2013-03-15 2022-08-10 Biomolecular Holdings LLC Hybrid immunoglobulin containing non-peptidyl linkage
RS60003B1 (sr) 2013-03-15 2020-04-30 Bioverativ Therapeutics Inc Formulacije polipeptida faktora viii
TWI745671B (zh) 2013-03-15 2021-11-11 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｉｘ多肽調配物
ES2695166T3 (es) 2013-03-15 2019-01-02 Intrinsic Lifesciences Llc Anticuerpos antihepcidina y usos de los mismos
SG11201507878SA (en) 2013-03-22 2015-10-29 Amgen Inc Injector and method of assembly
DK2796145T3 (da) 2013-04-22 2018-01-29 Csl Ltd Et kovalent kompleks af von Willebrand-faktor og faktor VIII linket af en disulfidbro
KR20160026905A (ko) 2013-06-28 2016-03-09 체에스엘 베링 게엠베하 인자 ｘｉｉ 억제제 및 ｃ1-억제제를 이용한 병용 치료요법
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
EP3043813B1 (en) 2013-08-08 2021-01-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Purification of chimeric fviii molecules
WO2015023891A2 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
CN103599527A (zh) * 2013-08-16 2014-02-26 安源生物科技(上海)有限公司 包含改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白的药物组合物
CN103397009B (zh) * 2013-08-16 2015-06-03 安源生物科技(上海)有限公司 改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白及其制备方法与用途
US9388430B2 (en) * 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US10611794B2 (en) 2013-09-25 2020-04-07 Bioverativ Therapeutics Inc. On-column viral inactivation methods
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EA201690675A1 (ru) 2013-10-03 2016-08-31 Модерна Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды, кодирующие рецептор липопротеинов низкой плотности
JP6422956B2 (ja) 2013-10-11 2018-11-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性ドメイン交換共通可変軽鎖抗体
ES2744837T3 (es) 2013-10-24 2020-02-26 Amgen Inc Inyector y procedimiento de ensamblaje
JP7051293B2 (ja) 2013-10-24 2022-04-11 アムジエン・インコーポレーテツド 温度感知制御を伴う薬剤送達システム
US10584147B2 (en) 2013-11-08 2020-03-10 Biovertiv Therapeutics Inc. Procoagulant fusion compound
PL3068797T3 (pl) 2013-11-11 2020-06-29 Wake Forest University Health Sciences Konstrukty wielowalentnego celowania w nowotwory
US10947319B2 (en) 2013-11-27 2021-03-16 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting HER2
WO2015085276A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Biogen Idec Ma Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
EP3083933A1 (en) 2013-12-20 2016-10-26 Biogen MA Inc. Use of perfusion seed cultures to improve biopharmaceutical fed-batch production capacity and product quality
CN106029087A (zh) 2013-12-20 2016-10-12 印第安纳大学研究及科技有限公司 脂质化肠降血糖素受体配体人免疫球蛋白fc区融合多肽
DK3091997T5 (da) 2014-01-10 2024-10-14 Bioverativ Therapeutics Inc Kimære faktor viii-proteiner og anvendelser deraf
KR102382402B1 (ko) 2014-02-04 2022-04-01 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온 교환 크로마토그래피의 용도
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
PT3116486T (pt) * 2014-03-14 2020-03-12 Biomolecular Holdings Llc Imunoglobulina híbrida que contém uma ligação não peptídica
WO2015148444A1 (en) * 2014-03-24 2015-10-01 Biogen Ma Inc. Lyophilized factor ix formulations
SI3129406T1 (sl) * 2014-04-11 2019-04-30 Medimmune, Llc Konjugirane spojine, ki vsebujejo cisteinsko konstruirana protitelesa
BR112016025852B1 (pt) 2014-05-07 2022-11-01 Amgen Inc Dispositivo de injeção para aplicação de fármaco
KR102416904B1 (ko) 2014-06-03 2022-07-04 암겐 인코포레이티드 약물 전달 디바이스에 의해 수집된 데이터를 원격으로 프로세싱하기 위한 시스템들 및 방법들
WO2015193457A1 (en) 2014-06-18 2015-12-23 Csl Behring Gmbh Therapy using a factor xii inhibitor in a neurotraumatic disorder
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
DK3164150T3 (da) 2014-07-02 2021-02-08 CSL Behring Lengnau AG Modificeret von willebrand-faktor
AU2015321462B2 (en) 2014-09-22 2020-04-30 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
KR20170062490A (ko) 2014-09-26 2017-06-07 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 안정화된 아드레노메둘린 유도체 및 그의 용도
WO2016061220A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
CA2964317C (en) 2014-10-14 2021-10-05 Halozyme, Inc. Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
ES2739289T3 (es) * 2014-11-27 2020-01-30 Novo Nordisk As Derivados de GLP-1 y sus usos
CN107001482B (zh) 2014-12-03 2021-06-15 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3250609A4 (en) 2015-01-26 2018-07-11 The University of Chicago Il13ra alpha 2 binding agents and use thereof in cancer treatment
US20180170992A1 (en) 2015-01-26 2018-06-21 The University Of Chicago CAR T CELLS RECOGNIZING CANCER-SPECIFIC IL 13Ra2
SG10201907215QA (en) 2015-02-05 2019-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibodies Comprising An Ion Concentration Dependent Antigen-Binding Domain, Fc Region Variants, Il-8-Binding Antibodies, And Uses Therof
CA3069716C (en) 2015-02-17 2021-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
EP3274457A4 (en) 2015-03-26 2018-08-08 Acceleron Pharma Inc. Follistatin-related fusion proteins and uses thereof
DK3298036T3 (da) 2015-05-22 2022-06-07 CSL Behring Lengnau AG Fremgangsmåder til forberedelse af modificeret von Willebrand faktor
CA2986626A1 (en) 2015-05-22 2016-12-01 Csl Behring Recombinant Facility Ag Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
EP3303380B1 (en) 2015-06-02 2020-01-15 Novo Nordisk A/S Insulins with polar recombinant extensions
WO2017024060A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Biogen Ma Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
CR20180217A (es) 2015-09-18 2018-05-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos
MA43348A (fr) 2015-10-01 2018-08-08 Novo Nordisk As Conjugués de protéines
WO2017070167A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for modified factor ix fusion proteins
WO2017100501A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
CN105384828B (zh) * 2015-12-18 2019-06-21 中国科学技术大学 长效干扰素-α及其改造方法
EP3184149A1 (en) 2015-12-23 2017-06-28 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Soluble glycoprotein v for treating thrombotic diseases
RU2647769C2 (ru) * 2015-12-30 2018-03-19 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Химерный улучшенный рекомбинантный фактор VIII
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
RU2018128582A (ru) 2016-01-07 2020-02-11 Цсл Беринг Ленгнау Аг Мутированный укороченный фактор фон виллебранда
AU2017205776B2 (en) 2016-01-07 2020-09-10 CSL Behring Lengnau AG Mutated von Willebrand factor
SG10201912405TA (en) 2016-01-11 2020-02-27 Inhibrx Inc Multivalent and multispecific 41bb-binding fusion proteins
US11753461B2 (en) 2016-02-01 2023-09-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor VIII genes
CN106397599B (zh) 2016-02-23 2020-08-07 上海交通大学 二价双特异性抗体杂交蛋白的表达和制备方法
CN106397598B (zh) * 2016-02-23 2020-07-14 上海交通大学 多价多特异性抗体及免疫杂合蛋白的表达和制备方法
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
AU2017247004B2 (en) 2016-04-06 2022-07-07 Csl Limited Method of treating atherosclerosis
US20190153119A1 (en) * 2016-04-14 2019-05-23 Iconic Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating disorders associated with neovascularization
AU2017257504A1 (en) 2016-04-26 2018-10-25 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017191817A1 (ja) 2016-05-02 2017-11-09 味の素株式会社 アジド基含有Ｆｃタンパク質
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
AU2017268198C1 (en) 2016-05-16 2020-11-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited Anti-Factor IX Padua antibodies
EP3465124A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
US11285266B2 (en) 2016-07-01 2022-03-29 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3519431A1 (en) 2016-09-28 2019-08-07 Cohbar Inc. Therapeutic mots-c related peptides
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
US11249082B2 (en) 2016-10-29 2022-02-15 University Of Miami Zika virus assay systems
EP3538133B1 (en) 2016-11-11 2021-02-17 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
CA3043397A1 (en) 2016-11-11 2018-05-17 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for extravascular administration in the treatment or prophylaxis of a blood coagulation disorder
JP2019536794A (ja) 2016-12-02 2019-12-19 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 凝固因子に対する免疫寛容を誘導する方法
EP3548066A1 (en) 2016-12-02 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilic arthropathy using chimeric clotting factors
MX2019008432A (es) 2017-01-17 2019-11-18 Amgen Inc Dispositivos de inyeccion y metodos relacionados de uso y ensamblaje.
EP3573641A4 (en) * 2017-01-25 2020-11-11 Iconic Therapeutics, Inc. TREATMENT METHODS FOR DISORDERS ASSOCIATED WITH ANGIOGENESIS AND NEOVASCULARIZATION
CA3051481A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Phospholipid ether (ple) car t cell tumor targeting (ctct) agents
AU2018221351B2 (en) 2017-02-17 2023-02-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
US11752258B2 (en) 2017-02-17 2023-09-12 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
US11117930B2 (en) 2017-02-23 2021-09-14 Adrx, Inc. Peptide inhibitors of transcription factor aggregation
CN110582288B (zh) 2017-02-28 2024-09-20 恩多塞特公司 用于car t细胞疗法的组合物和方法
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
US11571511B2 (en) 2017-03-07 2023-02-07 Amgen Inc. Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device
AU2018230486B2 (en) 2017-03-09 2023-05-11 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
US11872194B2 (en) 2017-03-14 2024-01-16 Ohio State Innovation Foundation Methods and compositions related to a tissue factor-targeting IGG3 immunoconjugates
CN110446499A (zh) 2017-03-20 2019-11-12 豪夫迈·罗氏有限公司 一种体外糖基工程化红细胞生成刺激蛋白的方法
HUE063805T2 (hu) 2017-03-28 2024-01-28 Amgen Inc Dugattyúrúd és fecskendõ összeállító rendszer és eljárás
WO2018185131A2 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Novo Nordisk A/S Oligomer extended insulin-fc conjugates
KR20190141686A (ko) * 2017-04-21 2019-12-24 제넨테크, 인크. 질환 치료를 위한 klk5 길항제의 용도
EP3621649A2 (en) * 2017-05-10 2020-03-18 Albajuna Therapeutics, S.L. Fc-fusion protein derivatives with high dual hiv antiviral and immunomodulatory activity
US20230137562A1 (en) 2017-06-07 2023-05-04 Adrx, Inc. Tau aggregation inhibitors
JP7200134B2 (ja) 2017-06-08 2023-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド トルク駆動式薬物送達デバイス
EP3634539A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
PL3641800T3 (pl) 2017-06-22 2024-03-18 CSL Behring Lengnau AG Modulacja immunogenności fviii przez skrócony vwf
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
JP7475860B2 (ja) 2017-06-23 2024-04-30 アムジエン・インコーポレーテツド スイッチアセンブリにより起動されるキャップを含む電子薬物送達デバイス
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
EP3655063A1 (en) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
BR112020002394A2 (pt) 2017-08-09 2020-07-28 Bioverativ Therapeutics Inc. moléculas de ácidos nucleicos e usos das mesmas
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
AU2018318319A1 (en) 2017-08-18 2020-02-20 Adrx, Inc. Tau aggregation peptide inhibitors
MA49897A (fr) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc Injecteur sur-corps avec patch adhésif stérile
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
CN111132711B (zh) 2017-10-06 2022-07-01 安进公司 带有联锁组件的药物递送装置及相关组装方法
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
WO2019090079A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
CA3079197A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CN111225696B (zh) 2017-11-10 2023-07-18 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
AU2018368338B2 (en) 2017-11-16 2024-07-25 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
IL273638B2 (en) 2017-11-16 2024-10-01 Amgen Inc Door lock mechanism for drug delivery device
JP7002927B2 (ja) 2017-11-22 2022-01-20 本田技研工業株式会社 駆動軸配置構造
WO2019144095A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Methods of use for car t cells
TW201946929A (zh) 2018-02-01 2019-12-16 美商生物化學醫療公司 表現因子ｖｉｉｉ之慢病毒載體之使用
US20200040103A1 (en) 2018-03-14 2020-02-06 Genentech, Inc. Anti-klk5 antibodies and methods of use
MX2020009975A (es) 2018-03-28 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso.
CU24554B1 (es) 2018-05-07 2021-11-04 Ct Inmunologia Molecular Proteínas de fusión compuestas por una muteína de interleucina 2 e interferón tipo 1
NZ769677A (en) 2018-05-18 2024-07-05 Bioverativ Therapeutics Inc Methods of treating hemophilia a
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
US11830582B2 (en) 2018-06-14 2023-11-28 University Of Miami Methods of designing novel antibody mimetics for use in detecting antigens and as therapeutic agents
CN112601517A (zh) 2018-07-03 2021-04-02 百时美施贵宝公司 Fgf-21配制品
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
WO2020033863A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
EP3856283A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
WO2020072577A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
TWI824026B (zh) 2018-10-05 2023-12-01 美商安進公司 具有劑量指示器之藥物遞送裝置
CN109439679A (zh) * 2018-10-09 2019-03-08 上海市儿童医院 一种高活性重组人凝血因子ix融合蛋白及其制备方法
KR20210076935A (ko) 2018-10-15 2021-06-24 암젠 인크 댐핑 메커니즘을 갖는 약물 전달 장치
SG11202101824VA (en) 2018-10-15 2021-03-30 Amgen Inc Platform assembly process for drug delivery device
WO2020086408A1 (en) 2018-10-26 2020-04-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A high-yield perfusion-based transient gene expression bioprocess
CA3113076A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
WO2020091956A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
CN113518784A (zh) 2019-01-28 2021-10-19 科巴公司 治疗性肽
KR20210141608A (ko) 2019-03-19 2021-11-23 체에스엘 베링 렝나우 아게 치료요법에서 인자 ix 변이체 및 이의 용도
CA3136720A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 Codiak Biosciences, Inc. Compositions of exosomes and aav
WO2020219482A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
US20220211808A1 (en) 2019-05-17 2022-07-07 Universitaet Zuerich Haptoglobin for use in treating an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke
EP3986918A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 Bayer Aktiengesellschaft Adrenomedullin-analogues for long-term stabilization and their use
AU2020300820A1 (en) 2019-07-04 2022-03-03 CSL Behring Lengnau AG A truncated von willebrand factor (vWF) for increasing the in vitro stability of coagulation factor VIII
EP4017560A2 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Amgen, Inc Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
TW202126284A (zh) 2019-09-30 2021-07-16 美商百歐維拉提夫治療公司 慢病毒載體配製物
WO2021094344A1 (en) 2019-11-11 2021-05-20 CSL Behring Lengnau AG Polypeptides for inducing tolerance to factor viii
EP4058465A1 (en) 2019-11-14 2022-09-21 Cohbar Inc. Cxcr4 antagonist peptides
JP2023510115A (ja) 2019-12-20 2023-03-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規ｉｌ２アゴニストおよびそれらの使用方法
AU2020411480B2 (en) 2019-12-23 2023-12-21 Denali Therapeutics Inc. Progranulin variants
KR20220139915A (ko) 2020-02-06 2022-10-17 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Il-10 및 그의 용도
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
EP4247416A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 CSL Behring GmbH Method for treating antibody-mediated rejection
EP4284407A1 (en) 2021-02-01 2023-12-06 CSL Behring AG Method of treating or preventing an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke
KR20240005075A (ko) 2021-05-07 2024-01-11 체에스엘 베링 아게 재조합 합토글로빈 (hp) 베타 쇄를 생산하기 위한 발현 시스템
MX2023013640A (es) 2021-05-21 2023-11-30 Amgen Inc Metodo de optimizacion de una receta de llenado para un contenedor de medicamento.
CN118451096A (zh) 2021-10-20 2024-08-06 辛德凯因股份有限公司 异二聚体fc细胞因子及其用途
TW202423475A (zh) 2022-09-02 2024-06-16 瑞士商Ｃｓｌ貝林股份有限公司 用於治療或預防過度勃起反應或勃起功能障礙之血紅素結合蛋白
WO2024094457A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing glycoprotein compositions
CN118496347B (zh) * 2024-05-30 2024-10-25 北京航空航天大学杭州创新研究院 一种用于抗体寡核苷酸偶联的方法

Family Cites Families (312)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US660843A (en) * 1900-05-16 1900-10-30 Rebecca Coyle Nursing-gown.
US786376A (en) 1902-05-15 1905-04-04 Fischer Motor Vehicle Company Electrogasolene-vehicle.
US3941763A (en) * 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
US4456591A (en) 1981-06-25 1984-06-26 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Therapeutic method for activating factor VII
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
AU561343B2 (en) 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US4444878A (en) 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5189015A (en) 1984-05-30 1993-02-23 Alfa-Laval Agri International Ab Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability
US5077204A (en) 1984-06-21 1991-12-31 Chiron Corporation Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use
US4849407A (en) 1986-08-13 1989-07-18 Zymogenetics, Inc. Biologically active mosaic proteins
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
DK525384D0 (da) * 1984-11-05 1984-11-05 Nordisk Insulinlab Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat
US5157021A (en) 1985-03-15 1992-10-20 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
EP0218712B1 (en) 1985-04-12 1992-02-26 Genetics Institute, Inc. Novel procoagulant proteins
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4745055A (en) 1985-05-07 1988-05-17 California Biotechnology Inc. Fused protein for enzyme immunoassay system
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
US5180583A (en) 1985-11-26 1993-01-19 Hedner Ulla K E Method for the treatment of bleeding disorders
ATE87663T1 (de) 1986-01-03 1993-04-15 Genetics Inst Verfahren zur herstellung von faktor-viii:c-typ- proteinen.
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
IL78444A (en) 1986-04-08 1992-05-25 Yeda Res & Dev Human gamma interferon-specific receptor protein,antibody against said protein,and compositions containing said protein and antibody
US5543502A (en) 1986-06-24 1996-08-06 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
CA1340456C (en) 1986-07-07 1999-03-23 Hubert J.P. Schoemaker Chimeric rodent/human immunoglobulins specific for tumor-associated antigens
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
NO873164L (no) 1986-07-30 1988-02-01 Teijin Ltd Muse-humane kimaere antistoffer.
IL84285A (en) 1986-10-27 1993-03-15 Int Genetic Engineering Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen
GB8626412D0 (en) 1986-11-05 1986-12-03 Clark M R Antibodies
CA1339445C (en) 1986-11-12 1997-09-09 The General Hospital Corporation Recombinant hybrid immunoglobulin molecules and method of use
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5258498A (en) * 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
IE69026B1 (en) 1987-06-12 1996-08-07 Immuno Ag Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US6018026A (en) * 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
ZA89430B (en) * 1988-01-22 1989-10-25 Gen Hospital Corp Cloned genes encoding ig-cd4 fusion proteins and the use thereof
JP2643968B2 (ja) 1988-02-03 1997-08-25 サントリー株式会社 Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼ及びその製造方法
US5234830A (en) 1988-02-03 1993-08-10 Suntory Limited DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
AU643427B2 (en) 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FR2641468A1 (fr) * 1989-01-11 1990-07-13 Merieux Inst Anticorps chimeriques anti-recepteur de l'interleukine-2 humaine, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
SE8901687D0 (sv) 1989-05-11 1989-05-11 Alfa Laval Agri Int Fibronectin binding protein as well as its preparation
ES2057571T3 (es) 1989-05-22 1994-10-16 Zymogenetics Inc Receptor de pdgf-alfa.
US5061786A (en) 1989-05-25 1991-10-29 Genentech, Inc. Biologically active polypeptides based on transforming growth factor-β
US5194596A (en) 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
DE69005740T2 (de) 1989-08-21 1994-06-01 Ngk Insulators Ltd Aufzeichnungskopf, bestehend aus einem eine Elektrode tragenden Substrat mit einem dünnwandigen Kontaktendteil, und Schicht zur Verstärkung des Substrats.
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
JPH0396383A (ja) 1989-09-08 1991-04-22 Riso Kagaku Corp 画像形成装置
EP0417563B1 (de) 1989-09-12 2000-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US5935815A (en) 1989-10-25 1999-08-10 Katholieke Universiteit Leuven Process for micro biological production of proteins
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
US5648273A (en) 1989-12-27 1997-07-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Hepatic growth factor receptor is the MET proto-oncogene
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9009106D0 (en) 1990-04-23 1990-06-20 3I Res Expl Ltd Processes and intermediates for synthetic antibody derivatives
CA2040099A1 (en) 1990-05-01 1991-11-02 Mariano Barbacid Tyrosine kinase negative trkb
US20030064480A1 (en) 1990-06-28 2003-04-03 Leander Lauffer Fusion proteins with immunoglobulin portions, the preparation and use thereof
DK0464533T3 (da) 1990-06-28 1999-04-26 Gen Hospital Corp Fusionsproteiner med immunglobulindele, deres fremstilling og anvendelse
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5453491A (en) 1990-09-11 1995-09-26 Kiyoshi Takatsu Murine interleukin-5 receptor
JP4236698B2 (ja) 1990-11-26 2009-03-11 ジェネティックス インスティチュート，リミテッド ライアビリティ カンパニー 宿主細胞でのｐａｃｅの発現およびその使用法
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
EP0563214A4 (en) * 1990-12-04 1994-08-17 Wistar Inst Bifunctional antibodies and method of preparing same
US5374617A (en) 1992-05-13 1994-12-20 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of bleeding with modified tissue factor in combination with FVIIa
US5541063A (en) 1991-04-19 1996-07-30 Schering Corporation Human interleukin-3 receptor α subunit
ATE170559T1 (de) * 1991-05-31 1998-09-15 Genentech Inc Behandlung der hiv-assoziierten immun- thrombopenie purpura
US5227158A (en) 1991-06-10 1993-07-13 Genentech, Inc. Method of stimulating hepatocyte proliferation by administration of hepatocyte growth factor and gamma-interferon
US5346991A (en) 1991-06-13 1994-09-13 Genentech, Inc. Tissue factor mutants useful for the treatment of myocardial infarction and coagulopathic disorders
US5348856A (en) 1991-07-08 1994-09-20 E. R. Squibb & Sons, Inc. DNA encoding TRKC protein
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5116753A (en) * 1991-07-30 1992-05-26 The Salk Institute For Biological Studies Maintenance of pancreatic islets
US5932448A (en) * 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
US5454933A (en) * 1991-12-16 1995-10-03 Exxon Research And Engineering Company Deep desulfurization of distillate fuels
DK0654085T3 (da) * 1992-01-23 1997-09-22 Merck Patent Gmbh Monomere og dimere antistof-fragment-fusionsproteiner
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1993016177A1 (en) 1992-02-11 1993-08-19 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
ES2252732T3 (es) 1992-05-26 2006-05-16 Immunex Corporation Nueva citoquina que une cd30.
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
WO1994005328A1 (en) 1992-08-28 1994-03-17 The Scripps Research Institute Inhibition of tumor metastasis via neutralization of tissue factor function
GB2270845B (en) 1992-09-24 1996-07-10 Smiths Ind Med Syst Inc Suction catheter assemblies
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
DE69332859T2 (de) 1992-11-13 2003-12-18 Idec Pharmaceuticals Corp., San Diego Konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier-exprimierung
US5648446A (en) * 1993-02-24 1997-07-15 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Diguanamines and preparation process, derivatives and use thereof
WO1994028017A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 The Scripps Research Institute Human mutant tissue factor compositions useful as tissue factor antagonists
US6518013B1 (en) 1993-06-07 2003-02-11 Trimeris, Inc. Methods for the inhibition of epstein-barr virus transmission employing anti-viral peptides capable of abrogating viral fusion and transmission
US5464933A (en) 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6017536A (en) 1993-06-07 2000-01-25 Trimeris, Inc. Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
US6310180B1 (en) * 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
KR950003279A (ko) 1993-07-29 1995-02-16 고사이 아끼오 플루오로알칸 카르복사미드 유도체의 제조방법
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6740734B1 (en) 1994-01-14 2004-05-25 Biovitrum Ab Bacterial receptor structures
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5648240A (en) * 1994-05-24 1997-07-15 Texas A&M University MHC II analog from Staphylococcus aureus
HU220347B (hu) 1994-07-11 2001-12-28 Board Of Regents The University Of Texas System Készítmény az érrendszer specifikus koagulálásához
AU3559695A (en) * 1994-09-30 1996-04-26 Inex Pharmaceuticals Corp. Glycosylated protein-liposome conjugates and methods for their preparation
US5596080A (en) * 1994-10-03 1997-01-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Crosslinking processes/agents for zein
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
JP4026848B2 (ja) * 1995-01-17 2007-12-26 ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド 免疫原の受容体特異的経上皮輸送
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5591573A (en) 1995-04-10 1997-01-07 Alpha Therapeutic Corporation Method and system for testing blood samples
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) * 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5579277A (en) * 1995-05-01 1996-11-26 Apple Computer, Inc. System and method for interleaving memory banks
US6184344B1 (en) * 1995-05-04 2001-02-06 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
JPH11507632A (ja) 1995-06-07 1999-07-06 トリメリス，インコーポレーテッド 併用療法を用いたｈｉｖおよび他のウイルス感染の治療
US5840529A (en) 1995-08-02 1998-11-24 Clinical Research Institute Of Montreal Mammalian pro-hormone convertase
DK0848755T4 (da) 1995-09-08 2011-05-23 Genentech Inc VEGF relateret protein
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US20030026779A1 (en) 1999-10-15 2003-02-06 Liming Yu Treatment of tumors and viral infections with a hybrid conjugate of interferon and an immunoglobulin Fc
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
CA2198968C (en) * 1996-03-04 2010-02-09 Toyofumi Masuda Process for production of secretory kex2 derivatives
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
WO1998000543A1 (en) 1996-07-03 1998-01-08 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor agonists and uses thereof
CA2203745A1 (en) 1996-07-26 1998-01-26 Robert Day Pro-protein converting enzyme
CA2262405A1 (en) 1996-08-02 1998-02-12 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
US6159462A (en) 1996-08-16 2000-12-12 Genentech, Inc. Uses of Wnt polypeptides
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
EP2371962A3 (en) 1996-12-23 2011-12-21 Immunex Corporation Receptor activator of NF-KAPPA B, receptor is member of TNF receptor superfamily
US6271349B1 (en) 1996-12-23 2001-08-07 Immunex Corporation Receptor activator of NF-κB
BR9806793A (pt) 1997-01-22 2000-05-16 Univ Texas Processos e composições de fator tissular para coagulação e tratamento de tumores.
TW502011B (en) * 1997-02-05 2002-09-11 Ajinomoto Kk Process for producing n-long-chain acyl acidic amino acids or salts thereof
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
JP4128227B2 (ja) 1997-03-14 2008-07-30 バイオジェン・アイデック・インコーポレイテッド 哺乳類細胞内の特定部位に相同組換えによって遺伝子を組み込む方法とそれを実施するためのベクター
DK0985039T3 (da) 1997-06-12 2008-06-09 Novartis Int Pharm Ltd Kunstige antistof-polypeptider
WO1998056807A1 (en) * 1997-06-13 1998-12-17 Gryphon Sciences Solid phase native chemical ligation of unprotected or n-terminal cysteine protected peptides in aqueous solution
EP0885571B1 (de) * 1997-06-21 2003-08-27 Tesa AG Klebfolienstreifen-Verbund und seine Verwendung
US6310183B1 (en) * 1997-09-10 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Coagulation factor VIIa composition
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
CA2318482C (en) 1998-01-23 2010-04-13 Immunex Corporation Il-18 receptors
HUP0100813A3 (en) 1998-02-25 2003-08-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
US6008321A (en) 1998-03-16 1999-12-28 Pharmacopeia, Inc. Universal linker for combinatorial synthesis
US6281331B1 (en) 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP1082137A4 (en) 1998-05-06 2004-05-19 Univ Temple REVERSE OF PERCENTAL RESPONSE BY INTERRUPTING THE MACROPHAGE RECEPTOR FcSg (g) RI
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
AU4090299A (en) * 1998-05-20 1999-12-06 Sdg, Inc. Liposomal delivery complex
US6355782B1 (en) 1998-07-09 2002-03-12 Baylor College Of Medicine Hypohidrotic ectodermal dyplasia genes and proteins
US6596847B2 (en) 1998-07-15 2003-07-22 Genentech, Inc. Tissue factor protein variants
DK1100830T3 (da) * 1998-07-28 2004-01-19 Micromet Ag Heterominiantistoffer
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6927044B2 (en) 1998-09-25 2005-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-1 receptor based cytokine traps
EP1117693B1 (en) * 1998-09-30 2006-05-17 New England Biolabs, Inc. Intein mediated peptide ligation
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
AU773891C (en) 1998-10-23 2005-02-17 Kirin-Amgen Inc. Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to MP1 receptor and having thrombopoietic activity
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
JP4463988B2 (ja) 1998-11-06 2010-05-19 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト Ｖｉｉ因子の生産方法
US6280994B1 (en) 1998-11-25 2001-08-28 Zymogenetics, Inc. Zace 1: a human metalloenzyme
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
AU762047B2 (en) 1999-01-06 2003-06-19 Genentech Inc. Insulin-like growth factor (IGF) I mutant variants
JP3971108B2 (ja) 1999-01-06 2007-09-05 ジェネンテック・インコーポレーテッド インシュリン様成長因子（ｉｇｆ）ｉ突然変異体
EP1141024B1 (en) * 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
SE9901379D0 (sv) 1999-04-19 1999-04-19 Pharmacia & Upjohn Ab Receptor structures
US6602977B1 (en) 1999-04-19 2003-08-05 Biovitrum Ab Receptor structures
CA2270600A1 (en) * 1999-05-03 2000-11-03 Infectio Recherche Inc. Method and formulations for the treatment of diseases, particularly those caused by human immunodeficiency virus and leishmania
WO2000069913A1 (en) * 1999-05-19 2000-11-23 Lexigen Pharmaceuticals Corp. EXPRESSION AND EXPORT OF INTERFERON-ALPHA PROTEINS AS Fc FUSION PROTEINS
JP2003504315A (ja) 1999-07-01 2003-02-04 エール ユニバーシティ 血管新生標的免疫複合体
AU781618C (en) 1999-07-02 2006-03-16 Genentech Inc. FVIIa antagonists
IL147270A0 (en) 1999-07-02 2002-08-14 Genentech Inc Fusion peptides comprising a peptide ligand domain and a multimerization domain
US6469136B1 (en) 1999-07-07 2002-10-22 Trimeris, Inc. Methods and composition for peptide synthesis
ATE407697T1 (de) 1999-07-13 2008-09-15 Bolder Biotechnology Inc Erythropoietin immunglobulin fusionsproteine
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
CN1235911C (zh) * 1999-08-09 2006-01-11 利思进药品公司 多细胞因子－抗体复合物
CA2387545A1 (en) * 1999-10-14 2001-04-19 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating or preventing cell, tissue, and organ damage using human myeloid progenitor inhibitory factor-1 (mpif-1)
AU780693B2 (en) 1999-11-05 2005-04-14 Curis, Inc. Hedgehog fusion proteins and uses
WO2001036489A2 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gmbh Erythropoietin forms with improved properties
US6808902B1 (en) * 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
WO2001036637A1 (en) * 1999-11-17 2001-05-25 Immunex Corporation Receptor activator of nf-kappa b
DE19963859A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
ATE428445T1 (de) 2000-02-11 2009-05-15 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
AU4314801A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Lexigen Pharm Corp Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
AU2001249389A1 (en) 2000-03-22 2001-10-03 The Children's Hospital Of Philadelphia Modified blood clotting factors and methods of use
ES2260219T3 (es) * 2000-04-21 2006-11-01 Amgen Inc. Derivados de peptidos apo-ai/aii.
DE10020332A1 (de) 2000-04-26 2001-11-15 Henkel Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel
US6756480B2 (en) 2000-04-27 2004-06-29 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
US20020090646A1 (en) * 2000-05-03 2002-07-11 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
JP2003533187A (ja) 2000-05-03 2003-11-11 アムジエン・インコーポレーテツド 治療薬としてのＦｃドメインを含む修飾ペプチド
AU2001274904B2 (en) 2000-05-26 2006-08-31 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neuroprotective peptides
AU2001270609A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
WO2002018417A1 (en) 2000-09-01 2002-03-07 Gryphon Therapeutics, Inc. Nucleophile-stable thioester generating compounds, methods of production and use
DK1332209T3 (da) 2000-09-08 2010-03-29 Univ Zuerich Samlinger af repeatproteiner indeholdende repeatmoduler
US7208151B2 (en) 2001-09-12 2007-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Tweak receptor agonists as anti-angiogenic agents
US7138119B2 (en) * 2000-09-15 2006-11-21 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of HIV-1 infection
US7615537B2 (en) 2000-10-25 2009-11-10 Genzyme Corporation Methods for treating blood coagulation disorders
EP1339427A4 (en) 2000-11-01 2004-09-15 Elusys Therapeutics Inc PROCESS FOR PRODUCING BISPECIFIC MOLECULES BY TRANSEPISSANCE OF PROTEINS
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
DE60143544D1 (de) 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
IL157142A0 (en) 2001-01-29 2004-02-08 Idec Pharma Corp Modified antibodies and methods of use
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
US20040132971A1 (en) * 2001-02-09 2004-07-08 Haaning Jesper Mortensen Rank ligand-binding polypeptides
HUP0303171A2 (hu) * 2001-02-19 2003-12-29 Merck Patent Gmbh Csökkentett immunogenitású mesterséges fehérjék
US7235638B2 (en) 2001-03-22 2007-06-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Coagulation factor VII derivatives
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
WO2002088171A2 (en) 2001-04-26 2002-11-07 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
WO2002089828A2 (en) 2001-05-04 2002-11-14 Institute Of Molecular And Cell Biology Interferons in the treatment of ischemia
US7419949B2 (en) 2001-07-16 2008-09-02 Novo Noridsk Healthcare A/G Single-dose administration of factor VIIa
US7144380B2 (en) * 2001-07-23 2006-12-05 Gilliam Larry A Traction method and device
DE60116091T2 (de) 2001-08-31 2006-08-31 Zeger De Lille Bohrvorrichtung
ATE364632T1 (de) 2001-10-05 2007-07-15 Affimed Therapeutics Ag Antikörper menschlichen ursprungs zur hemmung der thrombozytenaggregation
FR2831170B1 (fr) 2001-10-19 2004-03-19 Inst Nat Sante Rech Med Proteines c modifiees activables directement par la thrombine
US20030078180A1 (en) 2001-10-24 2003-04-24 Benchmark Research & Technology, Inc. Contaminant-tolerant foaming additive
ES2545090T3 (es) 2001-12-21 2015-09-08 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de albúmina y GCSF
US20040102440A1 (en) 2002-07-01 2004-05-27 Wong Erik Ho Fong Method of promoting smoking cessation
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
WO2003072060A2 (en) * 2002-02-27 2003-09-04 Immunex Corporation Polypeptide formulation
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
JP2006502091A (ja) 2002-03-01 2006-01-19 イミューノメディクス、インコーポレイテッド クリアランス速度を高めるための二重特異性抗体点変異
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
JP2005526769A (ja) 2002-03-15 2005-09-08 ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド 治療剤を全身搬送するための中央気道投与
MXPA05000063A (es) 2002-07-01 2005-04-08 Kenneth S Warren Inst Inc Citocinas recombinantes protectoras de tejido y acidos nucleicos que las codifican para la proteccion, restauracion y mejora de celulas, tejidos y organos respondedores.
WO2004004798A2 (en) 2002-07-03 2004-01-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
EP1523504A2 (en) 2002-07-12 2005-04-20 Novo Nordisk A/S A tissue factor binding immunoconjugate comprising factor viia
US20040110929A1 (en) 2002-07-12 2004-06-10 Bjorn Soren E. TF binding compound
JP4459810B2 (ja) 2002-08-14 2010-04-28 マクロジェニクス，インコーポレーテッド ＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体とその利用法
EP3502133A1 (en) 2002-09-27 2019-06-26 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
AU2003286467B2 (en) 2002-10-15 2009-10-01 Abbvie Biotherapeutics Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1587540B1 (en) 2003-01-09 2021-09-15 MacroGenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050281829A1 (en) 2003-05-06 2005-12-22 Hehir Cristina A T Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs
CA2522690A1 (en) 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
ES2558102T3 (es) 2003-05-06 2016-02-02 Biogen Hemophilia Inc. Proteínas quiméricas del factor de coagulación para el tratamiento de un trastorno hemostático
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ATE385806T1 (de) 2003-06-12 2008-03-15 Lilly Co Eli Fusionsproteine
AU2003264100A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
SG10202008722QA (en) 2003-11-05 2020-10-29 Roche Glycart Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
US7736653B2 (en) 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin Fc region as a carrier
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
US8263084B2 (en) 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
CA2546580A1 (en) 2003-11-18 2005-06-09 Iconic Therapeutics, Inc. Homogeneous preparations of chimeric proteins
US20050249723A1 (en) 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
UA86605C2 (ru) 2004-01-12 2009-05-12 Аплайд Молекьюлер Иволюшн, Инк. Антитело, которое содержит вариант исходного человеческого fс-участка
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2006083275A2 (en) 2004-05-21 2006-08-10 The Uab Research Foundation Variable lymphocyte receptors, related polypeptides and nucleic acids, and uses thereof
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
BRPI0510674A (pt) 2004-07-15 2007-12-26 Xencor Inc variantes fc otimizadas
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
WO2006055689A2 (en) 2004-11-16 2006-05-26 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
EP1868650B1 (en) 2005-04-15 2018-10-03 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US7427787B2 (en) 2005-07-08 2008-09-23 Texas Instruments Incorporated Guardringed SCR ESD protection
US7666622B2 (en) 2005-10-19 2010-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Monomeric self-associating fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
EP1820508A1 (en) 2006-02-21 2007-08-22 CSL Behring GmbH Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties
WO2007109254A2 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
EP2650305B1 (en) * 2006-03-24 2024-05-08 Bioverativ Therapeutics Inc. PC5 as a factor IX propeptide processing enzyme
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
ES2889920T3 (es) 2006-06-14 2022-01-14 Csl Behring Gmbh Proteínas de fusión escindibles proteolíticamente con alta actividad específica molar
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
EP1952822A1 (en) 2007-01-26 2008-08-06 Novo Nordisk A/S Factor VII polypeptides with increased affinity to platelets
CA2682605A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
EP2158318A2 (en) 2007-05-14 2010-03-03 Biogen Idec MA, Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
WO2009053368A1 (en) 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Single ifn-beta fused to a mutated igg fc fragment
TWI538916B (zh) 2008-04-11 2016-06-21 介控生化科技公司 經修飾的因子vii多肽和其用途
US20110077202A1 (en) 2008-05-16 2011-03-31 Bayer Healthcare Llc Targeted Coagulation Factors and Method of Using the Same
US20120093840A1 (en) 2009-04-06 2012-04-19 Novo Nordisk A/S Targeted delivery of factor viii proteins to platelets
JP5909180B2 (ja) 2009-06-25 2016-04-26 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル キメラ第ｖｉｉ因子分子
JP2013503140A (ja) 2009-08-27 2013-01-31 ノヴォ ノルディスク アー／エス 活性化血小板に対する組織因子の標的化
CA2782424C (en) 2009-12-06 2021-07-27 Biogen Idec Hemophilia Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
PT2591006T (pt) 2010-07-09 2019-07-29 Bioverativ Therapeutics Inc Moléculas de cadeia simples processáveis e polipéptidos preparados utilizando as mesmas
EP3508573A1 (en) * 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
CN103140237A (zh) * 2010-07-09 2013-06-05 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 因子ix多肽及其使用方法
JP6309273B2 (ja) 2011-03-02 2018-04-11 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 活性化血小板上のｔｌｔ−１に対する凝固因子の標的化

Also Published As

Publication number Publication date
CA2522590C (en) 2016-08-09
HK1161604A1 (zh) 2012-07-27
PL1625209T3 (pl) 2013-12-31
NO2017027I1 (no) 2017-06-23
AU2004252422B2 (en) 2011-10-27
US8932830B2 (en) 2015-01-13
SI1625209T1 (sl) 2013-12-31
NO20055773D0 (no) 2005-12-06
EP1625209A2 (en) 2006-02-15
WO2004101739A2 (en) 2004-11-25
LTPA2016007I1 (lt) 2021-07-12
US20200071385A1 (en) 2020-03-05
JP2018002737A (ja) 2018-01-11
BR122019011535B1 (pt) 2021-08-31
PT2361932T (pt) 2016-08-02
CY2016007I1 (el) 2016-08-31
EP2361932A1 (en) 2011-08-31
JP2012067142A (ja) 2012-04-05
HUE030065T2 (en) 2017-04-28
EP1654378A2 (en) 2006-05-10
ES2579938T3 (es) 2016-08-17
BRPI0410345A8 (pt) 2017-10-10
NO20160483A1 (no) 2006-01-04
EP2174946B1 (en) 2016-07-06
UA95436C2 (uk) 2011-08-10
EA012566B1 (ru) 2009-10-30
JP5091480B2 (ja) 2012-12-05
US20110159540A1 (en) 2011-06-30
EP2357196B1 (en) 2016-05-04
NO339539B1 (no) 2016-12-27
CA2522590A1 (en) 2005-01-06
TWI353991B (en) 2011-12-11
US7404956B2 (en) 2008-07-29
NO2020016I1 (no) 2020-06-12
US20080249288A1 (en) 2008-10-09
US20230023927A1 (en) 2023-01-26
NO2017027I2 (no) 2017-06-23
US9725496B1 (en) 2017-08-08
WO2004101739A3 (en) 2005-04-14
US11168125B2 (en) 2021-11-09
HK1159649A1 (zh) 2012-08-03
CN1852736B (zh) 2011-06-08
US20110182919A1 (en) 2011-07-28
EP2361932B1 (en) 2016-05-04
JP2014139244A (ja) 2014-07-31
CN104448003B (zh) 2019-03-26
US7862820B2 (en) 2011-01-04
PL2361932T3 (pl) 2016-11-30
EP1654378A4 (en) 2006-09-13
TW200510457A (en) 2005-03-16
EP3103809B1 (en) 2021-08-18
NL300799I2 (pt) 2016-09-01
CY1117756T1 (el) 2017-05-17
CY2016007I2 (el) 2016-08-31
JP2016034977A (ja) 2016-03-17
PT2357196T (pt) 2016-07-15
US20170226189A1 (en) 2017-08-10
EP2361932B2 (en) 2022-06-22
CN102234334A (zh) 2011-11-09
ES2582947T3 (es) 2016-09-16
NO2017028I1 (no) 2017-06-23
CN1852736A (zh) 2006-10-25
CN104448003A (zh) 2015-03-25
US11401322B2 (en) 2022-08-02
JP2018126153A (ja) 2018-08-16
ATE446307T1 (de) 2009-11-15
US20070172928A1 (en) 2007-07-26
LU92991I2 (fr) 2016-05-09
EP3103809A1 (en) 2016-12-14
US9636416B2 (en) 2017-05-02
NO2017028I2 (no) 2017-06-23
EP1625209B1 (en) 2013-07-17
SI2357196T1 (sl) 2016-08-31
HUE031663T2 (en) 2017-07-28
BE2016C015I2 (pt) 2023-08-09
US20220010000A1 (en) 2022-01-13
WO2005001025A3 (en) 2006-06-01
US20130171138A1 (en) 2013-07-04
JP6441432B2 (ja) 2018-12-19
SI2361932T1 (sl) 2016-08-31
BRPI0410345A (pt) 2006-05-30
IL171779A (en) 2010-11-30
NO20055773L (no) 2006-01-04
EP2357196A2 (en) 2011-08-17
EA200501756A1 (ru) 2006-08-25
ES2431116T3 (es) 2013-11-25
SI2174946T1 (sl) 2017-01-31
HUS1600011I1 (hu) 2016-04-28
CY1117764T1 (el) 2017-05-17
DK1625209T3 (da) 2013-10-28
FR16C0011I1 (pt) 2016-04-22
HUE030293T2 (en) 2017-04-28
US7381408B2 (en) 2008-06-03
IL205802A (en) 2013-12-31
EP1625209A4 (en) 2007-01-03
EP2174946A1 (en) 2010-04-14
DE602004023724D1 (de) 2009-12-03
WO2005001025A2 (en) 2005-01-06
US20150139947A1 (en) 2015-05-21
LTC1625209I2 (lt) 2021-07-26
LTPA2016028I1 (lt) 2016-11-10
EP2357196B9 (en) 2016-10-05
JP2007500744A (ja) 2007-01-18
EP1654378B1 (en) 2009-10-21
US20170266309A1 (en) 2017-09-21
EP2357196A3 (en) 2011-11-30
CN102234334B (zh) 2014-10-29
NO342384B1 (no) 2018-05-14
DK2361932T3 (en) 2016-08-15
US8329182B2 (en) 2012-12-11
PL2357196T3 (pl) 2016-11-30
DK2357196T3 (en) 2016-08-15
AU2004252422A1 (en) 2005-01-06
US7820162B2 (en) 2010-10-26
FR16C0011I2 (fr) 2017-04-14
DK2174946T3 (en) 2016-10-24
JP6526281B2 (ja) 2019-06-05
CY1114639T1 (el) 2016-08-31
US20050032174A1 (en) 2005-02-10
EP3978508A1 (en) 2022-04-06
US20050027109A1 (en) 2005-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11168125B2 (en) Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7348004B2 (en) Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
AU2012200470B2 (en) Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids
NO20210848A1 (no) Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider
AU2016244273A1 (en) Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids
AU2013245463A1 (en) Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids