NO20210848A1 - Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider - Google Patents

Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider Download PDF

Info

Publication number
NO20210848A1
NO20210848A1 NO20210848A NO20210848A NO20210848A1 NO 20210848 A1 NO20210848 A1 NO 20210848A1 NO 20210848 A NO20210848 A NO 20210848A NO 20210848 A NO20210848 A NO 20210848A NO 20210848 A1 NO20210848 A1 NO 20210848A1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
chimeric protein
biologically active
fact
active molecule
protein according
Prior art date
Application number
NO20210848A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert T Peters
Adam R Mezo
Daniel S Rivera
James M Stattel
Susan C Low
Alan J Bitonti
Original Assignee
Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2004/014064 external-priority patent/WO2005001025A2/en
Publication of NO20210848A1 publication Critical patent/NO20210848A1/no
Application filed by Bioverativ Therapeutics Inc filed Critical Bioverativ Therapeutics Inc

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Den foreliggende søknaden har prioritet i forhold til US foreløpig søknad nr.
60/469,600 innsendt 6. mai 2003, US foreløpige søknad nr.60/487,964 innsendt 17. juli 2003 og US foreløpigs søknad nr. 60/539,207 innsendt 26. januar 2004, som alle i sin helhet inngår som referanser. Den US ikke foreløpige søknaden med tittelen "Fremgangsmåter for kjemisk syntese av immunoglobulin kimære proteiner", innlevert samtidig den 6. mai 2004, inngår som en referanse.
Oppfinnelsen angår generelt terapeutiske kimære proteiner som består av to polypeptidkjeder hvor den første kjeden omfatter et terapeutisk biologisk aktivt molekyl mens den andre kjeden ikke omfatter det terapeutiske biologisk aktive molekylet fra den første kjeden. Mer spesifikt angår oppfinnelsen kimære proteiner som består av to polypeptidkjeder og hvor begge kjedene består av minst en del av et immunoglobulinkonstant område, hvor den første kjeden er modifisert slik at den ytterligere omfatter et biologisk aktivt molekyl, mens den andre kjeden ikke er modifisert på denne måten. Oppfinnelsen angår således et kimært protein som er en monomer-dimerhybrid, det vil si et kimært protein med et dimert aspekt og et monomert aspekt, hvor det dimere aspektet skyldes at proteinet består av to polypeptidkjeder som hver består av en del av et immunoglobulinkonstant området og hvor det monomere aspektet kommer av at bare en av de to kjedene omfatter et terapeutisk biologisk aktivt molekyl. Figur 1 viser et eksempel på en monomerdimerhybrid hvor det biologisk aktive molekylet er erytropoietin (EPO) og delen av et immunoglobulinkonstant område et er IgG Fc-område.
Immunoglobuliner består av fire polypeptidkjeder, to tunge og to lette kjeder, som er assosiert eller bundet sammen ved hjelp av disulfidbindinger slik at det dannes tetramerer. Hver kjede består videre av et variabelt område og et konstant område. De variable områdene kontrollerer antigengjenkjennelse og binding, mens de konstante områdene, da spesielt de konstante områdene i de tunge kjedene, kontrollerer og styrer en rekke effektorfunksjoner så som komplementbinding og Fc-reseptorbinding (se for eksempel US patentene 6,086,875; 5,624,821;
5,116,964).
Det konstante området består videre av domener som er betegnet CH (konstant tunge) -domener (CH1, CH2, osv). Avhengig av isotypen (det vil si IgG, IgM, IgA, IgD og IgE) kan det konstante området omfatte eller bestå av tre eller fire CH-domener. Enkelte konstante områder i visse isotyper (for eksempel IgG) inneholder også et hengselområde Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.
Det foreligger flere beskrivelser på hvordan man skaper kimære proteiner som omfatter immunoglobulinkonstante områder forbundet til et protein av interesse eller et fragment av dette (se for eksempel US patentene 5,480,981 og 5,808,029; Gascoigne et al.1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2936; Capon et al. 1989, Nature 337: 525; Traunecker et al. 1989, Nature 339: 68; Zettmeissl et al.1990, DNA Cell Biol. USA 9: 347; Byrn et al.1990, Nature 344: 667; Watson et al. 1990, J. Cell. Biol. 110: 2221; Watson et al.1991, Nature 349: 164; Aruffo et al. 1990, Cell 61: 1303; Linsley et al. 1991, J. Exp. Med. 173: 721; Linsley et al. 1991, J. Exp. Med. 174: 561; Stamenkovic et al., 1991, Cell 66: 1133; Ashkenazi et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535; Lesslauer et al. 1991, Eur. J. Immunol. 27: 2883; Peppell et al.1991, J. Exp. Med. 174: 1483; Bennett et al. 1991, J. Biol.
Chem. 266: 23060; Kurschner et al. 1992, J. Biol. Chem. 267: 9354; Chalupny et al.
1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10360; Ridgway og Gorman, 1991, J. Cell. Biol. 115, Utdrag nr. 1448; Zheng et al. 1995, J. Immun. 154: 5590). Disse molekylene har vanligvis både den biologiske aktivitet som er assosiert med det forbundne molekylet av interesse, så vel som effektorfunksjonen, eller enkelte andre forønskede egenskaper som er assosiert med det immunoglobulinkonstante området (for eksempel biologisk stabilitet, cellulær sekresjon).
Fc-delen av et immunoglobulinkonstant område, avhengig av immunoglublinisotypen, kan inkludere CH2-, CH3- og CH4-domener så vel som hengselområdet. Kimære proteiner som inneholder en Fc-del av et immunoglobulin gir proteinet flere ønskelige egenskaper så som bedret stabilitet og forlenget serumhalvliv (Se Capon et al. 1989, Nature 337: 525) så vel som binding til Fcreseptorer så som den neonatale Fc-reseptoren (FcRn) (US patent nr. 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).
FcRn er aktiv i epitelvev hos voksne personer og uttrykkes i fordøyelsessystemets hulrom, luftveiene, nasale overflater, vaginale overflater, i kolon og på rektale overflater (US patent nr. 6,845,726). Kimære proteiner som omfatter FcRnbindende partnere (for eksempel IgG, Fc-fragmenter) kan effektivt bevege seg på tvers av epiteliske barrierer ved hjelp av FcRn, noe som tilveiebringer ikkeinvaderende måter for å systemisk administrere et forønsket terapeutisk molekyl. Videre blir kimære proteiner som omfatter en FcRn-bindende partner endocytosert av celler som uttrykker FcRn. Men i stedet for å bli merket for nedbrytning, blir disse kimære proteinene resirkulert i kroppen, noe som øker disse proteinenes in vivo halvliv.
Deler av de immunoglobulinkonstante områdene, for eksempel FcRnbindingspartnere, vil typisk assosiere seg via disulfidbindinger eller andre ikkespesifikke interaksjoner, med hverandre og danne dimerer eller multimerer av høyere orden. Den foreliggende oppfinnelsen er basert på den overraskende oppdagelsen at transcytose av kimære proteiner som omfatter FcRn-bindende partnere synes å være begrenset av molekylvekten på det kimære proteinet, idet proteiner med høyere molekylvekt har mindre effektiv transport.
Kimære proteiner som omfatter eller inneholder biologisk aktive molekyler, vil så snart de er administrert interagere eller virke sammen med et målmolekyl eller celle. Den foreliggende oppfinnelsen er videre delvis basert på den overraskende oppdagelsen at monomer-dimerhybrider med ett biologisk aktivt molekyl, men to deler av et immunoglobulinkonstant område, for eksempel to FcRn-bindende partnere, fungerer og kan transporteres mer effektivt enn homodimerer, også betegnet her ganske enkelt som "dimerer" eller multimerer av høyere orden med to eller flere kopier av det biologisk aktive molekylet. Dette skyldes delvis det faktum at kimære proteiner som omfatter to eller flere biologisk aktive molekyler som eksisterer som dimerer eller multimerer av høyere orden kan bli sterisk hindret fra å virke sammen med sitt målmolekyl eller celle, noe som skyldes nærværet av to eller flere biologisk aktive molekyler svært nær hverandre, og at det biologisk aktive molekylet kan ha høy affinitet for seg selv.
Ett aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer således kimære proteiner som omfatter et biologisk aktivt molekyl som transporteres på tvers av den epiteliske barrieren. Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer kimære proteiner som omfatter minst ett biologisk aktivt molekyl som er i stand til å virke sammen med sitt målmolekyl eller celle med liten eller ingen sterisk hindring eller selvaggregering.
De forskjellige aspektene av oppfinnelsen tilveiebringer kimære proteiner som omfatter en første og en andre polypeptidkjede, og hvor den første kjeden omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og hvor delen av det immunoglobulinkonstante området er blitt modifisert slik at det inkluderer et biologisk aktivt molekyl, mens den andre kjeden omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og hvor denne delen av det immunoglobulinkonstante området ikke er blitt modifisert til å inkludere det biologisk aktive molekylet i den første kjeden.
Den foreliggende oppfinnelsen angår et kimært protein som omfatter ett biologisk aktivt molekyl og to molekyler av minst en del av et immunoglobulinkonstant område. Det kimære proteinet er i stand til å virke sammen med et målmolekyl eller celle med mindre sterisk hindring sammenlignet med et kimært protein som omfatter minst to biologisk aktive molekyler og minst en del av to immunoglobulinkonstante områder. Oppfinnelsen angår også et kimært protein som omfatter minst ett biologisk aktivt molekyl og to molekyler av minst en del av et immunoglobulinkonstant område som transporteres på tvers av en epitelisk barriere mer effektivt enn den tilsvarende homodimeren, det vil si hvor begge kjeder er bundet til det samme biologisk aktive molekylet. Oppfinnelsen angår således et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede som er bundet sammen, og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, og hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område, men intet immunoglobulinvariabelt område og uten noe tilknyttet biologisk aktivt molekyl.
Oppfinnelsen angår et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede som er forbundet med hverandre og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, mens nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten et immunoglobulinvariabelt område eller et biologisk aktivt molekyl, og hvor nevnte andre kjede ikke er kovalent bundet til noe molekyl med en molekylvekt større enn 1 kD, 2 kD, 5 kD, 10 kD eller 20 kD. I en utførelse er den andre kjeden ikke kovalent bundet til noe molekyl med en molekylvekt som er større enn 0-2 kD. I en utførelse er den andre kjeden ikke kovalent bundet til noe molekyl med en molekylvekt som er større enn 5-10 kD. I en utførelse er den andre kjeden ikke kovalent bundet til noe molekyl med en molekylvekt som er større enn 15-20 kD.
Den foreliggende oppfinnelsen angår et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede som er forbundet med hverandre, og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, og hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og ikke kovalent forbundet med noe annet molekyl, bortsett fra delen av et immunoglobulin i nevnte første polypeptidkjede.
Den foreliggende oppfinnelsen angår et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede som er forbundet med hverandre og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, og hvor nevnte andre kjede består av minst en del av et immunoglobulinkonstant område og eventuelt en affinitetstag.
Oppfinnelsen angår et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede som er forbundet med hverandre og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, og hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten et immunoglobulinvariabelt område eller et biologisk aktivt molekyl, og eventuelt et molekyl med en molekylvekt på mindre enn 10 kD, 5 kD, 2 kD eller 1 kD. I en utførelse omfatter den andre kjeden et molekyl med en molekylvekt på mindre enn 15-20 kD. I en utførelse omfatter den andre kjeden et molekyl som har en molekylvekt på mindre enn 5-10 kD. I en utførelse omfatter den andre kjeden et molekyl med en molekylvekt på mindre enn 1-2 kD.
Oppfinnelsen angår et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og minst et første domene, og hvor nevnte første domene har minst en spesifikk bindingspartner og hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og minst et andre domene, hvor nevnte andre domene er en spesifikk bindingspartner for nevnte første domene uten noe immunoglobulinvariabelt område eller et biologisk aktivt molekyl.
Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede hvor den første polypeptidkjeden og den andre polypeptidkjeden er forskjellige og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å transfektere en celle med et første DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en første polypeptidkjede som omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og eventuelt en linker og et andre DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en andre polypeptidkjede som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten noe biologisk aktivt molekyl eller et immunoglobulinvariabelt område og eventuelt en linker, for deretter å dyrke cellen under betingelser slik at den polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet blir uttrykt og deretter isolere monomer-dimerhybrider som omfatter polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet og polypeptidkjeden som er kodet av det andre DNA-konstruktet.
Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor nevnte første polypeptidkjede og andre polypeptidkjede er forskjellige, og hvor nevnte første polypeptidkjede omfatter et biologisk aktivt molekyl, minst en del av et immunoglobulinkonstant område og minst et første domene, og hvor nevnte første domene har minst en spesifikk bindingspartner og hvor nevnte andre polypeptidkjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og et andre domene hvor nevnte andre domene er en spesifikk bindingspartner for nevnte første domene uten ethvert biologisk aktivt molekyl eller et immunoglobulinvariabelt område og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å transfektere en celle med et første DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder nevnte første polypeptidkjede og et andre DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder nevnte andre polypeptidkjede, deretter dyrke cellene under betingelser slik at polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet blir uttrykt, og polypeptidkjeden som er kodet av det andre DNA-konstruktet blir uttrykt og deretter isolere monomer-dimerhybrider som omfatter polypeptidkjeden som blir kodet av det første DNA-konstruktet og polypeptidkjeden som blir kodet av det andre DNA-konstruktet.
Oppfinnelsen omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein ifølge den foreliggende oppfinnelsen hvor fremgangsmåten omfater å transfektere en celle med et første DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en første polypeptidkjede som omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og eventuelt en linker, for deretter å dyrke cellene under betingelser slik at den polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet blir uttrykt for deretter å isolere polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet, og transfektere en celle med et andre DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en andre polypeptidkjede som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten ethvert biologisk aktivt molekyl eller immunoglobulinvariabelt område, dyrke cellene under slike betingelser at polypeptidkjeden som er kodet av det andre DNA-konstruktet blir uttrykt, isolere den polypeptidkjeden som er kodet av det andre DNA-konstruktet, kombinere polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet med polypeptidkjeden som er kodet av det andre DNA-konstruktet under slike betingelser at det dannes monomer-dimerhybrider som omfatter polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet og polypeptidkjeden som er kodet av det andre DNA-konstruktet, for deretter å isolere nevnte monomer-dimerhybrider.
Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor den første polypeptidkjeden og den andre polypeptidkjeden ikke er identiske, og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å transfektere en celle med et DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en polypeptidkjede som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område, dyrke cellene under slike betingelser at polypeptidkjeden som kodes av DNA-konstruktet blir uttrykt med et N-terminalt cystein slik at det dannes dimerer av polypeptidkjeden og så isolere dimerene som omfatter to kopier av den polypeptidkjeden som er kodet av DNA-konstruktet og så kjemisk reagere de isolerte dimerene med et biologisk aktivt molekyl hvor nevnte biologisk aktivt molekyl har en C-terminus tioester, under slike betingelser at det biologisk aktive molekylet i alt vesentlig reagerer bare med en polypeptidkjede i dimeren, hvorved det dannes en monomer-dimerhybrid.
Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor den første polypeptidkjeden og den andre polypeptidkjeden ikke er identiske, og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å transfektere en celle med et DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en polypeptidkjede som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område, dyrke cellene under slike betingelser at polypeptidkjeden som kodes av DNA-konstruktet blir uttrykt med et N-terminalt cystein slik at det dannes dimerer av polypeptidkjeden og så isolere dimerene som omfatter to kopier av den polypeptidkjeden som er kodet av DNA-konstruktet og så kjemisk reagere de isolerte dimerene med et biologisk aktivt molekyl hvor nevnte biologisk aktivt molekyl har en C-terminus tioester, slik at det biologisk aktive molekylet er forbundet med hver kjede i dimeren, denaturere dimeren som omfatter delen av immunoglobulinet som er forbundet med det biologisk aktive molekylet slik at det dannes monomere kjeder, kombinere de monomere kjedene med en polypeptidkjede som omfatter i det minste en del av et immunoglobulinkonstant område uten å være forbundet med et biologisk aktivt molekyl, slik at det dannes monomer-dimerhybrider, og så isolere disse.
Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor den første polypeptidkjeden og den andre polypeptidkjeden ikke er identiske, og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å transfektere en celle med et DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en polypeptidkjede som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område, dyrke cellene under slike betingelser at polypeptidkjeden som kodes av DNA-konstruktet blir uttrykt som en blanding av to polypeptidkjeder hvor blandingen omfatter et polypeptid med et N-terminalt cystein og et polypeptid med et cystein svært nær nevnte N-terminus, isolere dimerene som omfatter en blanding av polypeptidkjeder som er kodet av DNA-konstruktet og kjemisk reagere de isolerte dimerene med et biologisk aktivt molekyl hvor nevnte biologisk aktive molekyl har en aktiv tioester slik at det i det minste dannes noen monomer-dimerhybrider, og deretter isolere nevnte monomer-dimerhybrider fra nevnte blanding.
Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for å behandle en sykdom eller en tilstand som omfatter å administrere et kimært protein ifølge den foreliggende oppfinnelsen og derved behandle sykdommen eller tilstanden.
Ytterligere hensikter og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av den etterfølgende beskrivelsen og vil også delvis være innlysende fra beskrivelsen eller kan oppnås ved å praktisere oppfinnelsen. Hensiktene og fordelene ved oppfinnelsen vil kunne realiseres og oppnås ved hjelp av de elementer og kombinasjoner som spesielt er påpekt i de etterfølgende krav.
Det er underforstått at både den foregående generelle beskrivelsen og den etterfølgende detaljerte beskrivelsen bare er forklarende og ikke begrensende for oppfinnelsen slik dette fremgår av de etterfølgende kravene.
KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
Figur 1 er et skjematisk diagram som sammenligner strukturen for en EPO-Fchomodimer eller -dimer med strukturen for en Epo-FC-monomer-dimerhybrid.
Figur 2a er aminosyresekvensen for det kimære proteinet faktor VII-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som blir spaltet av cellen og propeptidet (fet skrift) som blir gjenkjent av den vitamin K-avhengige γ-karboksylasen som modifiserer faktor VII slik at denne får full aktivitet. Sekvensen blir deretter spaltet av PACE, noe som gir faktor VII-Fc.
Figur 2b er aminosyresekvensen for det kimære proteinet faktor IX-Fc, inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen og propeptidet (fet skrift) som blir gjenkjent av den vitamin K-avhengige γ-karboksylasen som modifiserer faktor IX slik at denne får full aktivitet. Sekvensen blir deretter spaltet av PACE, noe som gir faktor IX-Fc.
Figur 2c er aminosyresekvensen for det kimære proteinet IFN α-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne IFN α-Fc.
Figur 2d er aminosyresekvensen for det kimære proteinet IFN α-Fc Δ-linker.
Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i den modne IFN α-Fc Δ-linkeren.
Figur 2e er aminosyresekvensen for det kimære proteinet Flag-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne Flag-Fc.
Figur 2f er aminosyresekvensen for det kimære proteinet Epo-CCA-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne Epo-CCA-Fc. Også vist med fest skrift er det sure oppkveilede coildomenet.
Figur 2g er aminosyresekvensen for det kimære proteinet CCB-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne CCB-Fc. Også vist med fet skrift er det basiske oppkveilede coildomenet.
Figur 2h er aminosyresekvensen for det kimære proteinet Cys-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne Cys-Fc. Når denne sekvensen blir produsert i CHO-celler, så vil en viss prosent av molekylene bli galt spaltet av signalpeptidasen slik at to ekstra aminosyrer blir igjen på N-terminus, noe som hindrer bindingen av et biologisk aktivt molekyl med en C-terminal tioester (for eksempel via en nativ ligering). Når disse uriktig spaltede proteinene dimeriseres med riktig spaltet Cys-Fc og deretter reageres med biologisk aktive molekyler med C-terminale tioestere, vil det danne seg monomer-dimerhybrider.
Figur 2i er aminosyresekvensen for det kimære proteinet IFN α-GS15-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne IFN α-GS15-Fc.
Figur 2j er aminosyresekvensen for det kimære proteinet Epo-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne Epo-Fc. Også vist med fet skrift er 8 aminosyrelinkeren.
Figur 3a er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor VII-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) og propeptidet (fet skrift) som gjenkjennes av den vitamin K-avhengige γ-karboksylasen som modifiserer faktor VII slik at denne får full aktivitet. Den translaterte sekvensen blir deretter spaltet av PACE, noe som gir det modne faktor VII-Fc.
Figur 3b er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor IX-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) og propeptidet (fet skrift) som gjenkjennes av den vitamin K-avhengige γ-karboksylasen som modifiserer faktor IX slik at denne får full aktivitet. Den translaterte sekvensen blir deretter spaltet av PACE, noe som gir det modne faktor IX-Fc.
Figur 3c er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor IFN α-Fc.
Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne IFN α-Fc.
Figur 3d er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor IFN α-Fc Δ-linker. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne IFN α-Fc Δ-linker.
Figur 3e er aminosyresekvensen for det kimære proteinet faktor Flag-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne Flag-Fc.
Figur 3f er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor Epo-CCA-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne Epo-CCA-Fc. Også vist med fet skrift er det sure oppkveilede coildomenet.
Figur 3g er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor CCB-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne CCB-Fc. Også vist med fet skrift er det basiske oppkveilede coildomenet.
Figur 3h er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor Cys-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne Cys-Fc.
Figur 3i er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor IFN α-GS15-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne IFN α-GS15-Fc.
Figur 3j er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor Epo-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne Epo-Fc. Også vist med fet skrift er nukleinsyresekvensen som koder 8 aminosyrelinkeren.
Figur 4 viser forskjellige måter for å danne monomer-dimerhybrider ved hjelp av nativ ligering.
Figur 5a viser aminosyresekvensen for Fc MESNA (SEKV.ID. NR.4).
Figur 5b viser aminosyresekvensen for Fc MESNA (SEKV.ID. NR.5).
Figur 6 sammenligner den antivirale aktiviteten for IFN α homodimer (som omfatter 2 IFN α-molekyler) med en IFN α monomer-dimerhybrid (det vil si omfatter 1 IFN α-molekyl).
Figur 7 er en sammenligning mellom koaguleringsaktiviteten for en kimær monomer-dimerhybrid faktor VIIa-Fc (ett faktor VII-molekyl) og en kimær homodimer faktor VIIa-Fc (to faktor VII-molekyler).
Figur 8 sammenligner den orale doseringen i neonatale rotter av en kimær monomer-dimerhybrid faktor VIIa-Fc (ett faktor VII-molekyl) og en kimær homodimer faktor VIIa-Fc (to faktor VII-molekyler).
Figur 9 sammenligner den orale doseringen av neonatale rotter med en kimær monomer-dimerhybrid faktor IX-Fc (ett faktor IX-molekyl) med en kimær homodimer.
Figur 10 er en tidsstudie som sammenligner den kimære monomer-dimerhybriden faktor IX-Fc (ett faktor IX-molekyl) som blir administrert oralt til neonatale rotter med en oralt administrert kimær homodimer.
Figur 11 viser farmakokinetikken for en Epo-Fc-dimer sammenlignet med en Epo-Fc monomer-dimerhybrid i cynomolgusaper etter en enkelt lungedose.
Figur 12 sammenligner serumkonsentrasjonen i aper som er subkutant administrert en Epo-Fc monomer-dimerhybrid med subkutant administrert Aranesp <® >(darbepoetin alfa).
Figur 13 sammenligner serumkonsentrasjonen i aper som er intravenøst administrert en Epo-Fc monomer-dimerhybrid med intravenøst administrert Aranesp <® >(darbepoetin alfa) og Epogen <® >(epoetin alfa).
Figur 14 viser spor fra en Mimetic Red 2<TM>-kolonne (ProMetic LifeSciences, Inc., Wayne, NJ) og en SDS-PAGE av fraksjoner fra kolonnen som inneholdt en EpoFc monomer-dimerhybrid, EpoFc-dimer og Fc. EpoFc monomer-dimerhybriden blir funnet i fraksjonene 11, 12, 13 og 14. EpoFc blir funnet i fraksjon 18, mens Fc blir funnet i fraksjonene 1/2.
Figur 15 viser farmakokinetikkene for IFN βFc med en 8 aminosyrelinker i cynomolgusaper etter en enkelt lungedose.
Figur 16 viser neopterinstimulering som en respons på IFN β-Fc-homodimeren og IFN β-Fc N297A monomer-dimerhybriden i cynomolgusaper.
Figur 17a viser nukleotidsekvensen for interferon β-Fc; figur 17b viser aminosyresekvensen for interferon β-Fc.
Figur 18 viser aminosyresekvensen for T20(a); T21(b) og T1249(c).
BESKRIVELSE AV UTFØRELSENE
A. Definisjoner
Affinitetsmerke slik det brukes her, betyr et molekyl som er knyttet til et andre molekyl av interesse og som er i stand til å virke sammen med en spesifikk bindingspartner for det formål å isolere eller identifisere nevnte andre molekyl av interesse.
Analoger av kimære proteiner ifølge oppfinnelsen eller proteiner eller peptider som i alt vesentlig er identiske med de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen slik de brukes her, betyr at en relevant aminosyresekvens for et protein eller et peptid er minst 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% eller 100% identisk med en gitt sekvens. For eksempel kan slike sekvenser være varianter som er avledet fra forskjellige arter, eller de kan være avledet fra en gitt sekvens ved forkortelse, fjerning, aminosyresubstitusjon eller addering. Prosent identitet mellom to aminosyresekvenser bestemmes ved standard sammenstillingsalgoritmer så som for eksempel Basic Local Alignment Tool (BLAST) beskrevet i Altschul et al. 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410, algoritmen til Needleman et al. 1970, J. Mol. Biol., 48: 444-453; algoritmen til Meyers et al. 1988, Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17; eller Tatusova et al. 1999, FEMS Microbiol. Lett., 174: 247-250, osv. Slike algoritmer er inkorporert i BLASTN-, PLASTP- og "BLAST 2 Sequences"-programmene (se www.ncbi.nlm.nih-gov/BLAST). Når man bruker slike programmer kan man bruke standardparameterne. For nukleotidsekvenser kan for eksempel de følgende settinger brukes for "BLAST 2 Sequences": BLASTN-prgrammet, belønning for tilpasning 2, penalitet for mistilpasning -2, åpent gap og forlengelsesgappenaliteter 5 og 2 henholdsvis, gap x_dropoff 50, forventet 10, ordstørrelse 11 og filter PÅ. For aminosyresekvenser kan følgende settinger brukes for "BLAST 2 Sequences":
BLASTP-programmet, matrise BLOSUM62, åpent gap og forlengelsesgappenaliteter 11 og 1 henholdsvis, gap x_dropoff 50, forventet 10, ordstørrelse 3, filter PÅ.
Biotilgjengelighet slik det brukes her, betyr graden og hastigheten ved hvilken en forbindelse blir absorbert i et levende system eller blir gjort tilgjengelig på stedet for fysiologisk aktivitet.
Biologisk aktivt molekyl slik det brukes her, betyr et ikke-immunoglobulinmolekyl eller fragment av dette som er i stand til å behandle en sykdom eller tilstand eller lokalisere eller lede et molekyl til et sete for en sykdom eller tilstand i kroppen ved å gjennomføre en funksjon eller en virkning, eller ved å stimulere eller responderen på en funksjon, en virkning eller en reaksjon i en biologisk sammenheng (for eksempel i en organisme, en celle eller i en in vitro modell på disse). Biologisk aktive molekyler kan omfatte minst en av polypeptider, nukleinsyrer eller små molekyler, så som små organiske eller uorganiske molekyler.
Et kimært protein slik det brukes her, refererer seg til ethvert protein som omfatter en første aminosyresekvens avledet fra en første kilde som er bundet, enten kovalent eller ikke-kovalent, til en andre aminosyresekvens som er avledet fra en andre kilde, hvor nevnte første og andre kilder er forskjellige. En første og en andre kilde som er forskjellige kan inkludere to forskjellige biologiske enheter, eller to forskjellige proteiner fra den samme biologiske enheten, eller en biologisk enhet og en ikkebiologisk enhet. Et kimært protein kan for eksempel inkludere et protein som er avledet fra minst 2 forskjellige biologiske kilder. En biologisk kilde kan inkludere enhver ikke-syntetisk fremstilt nukleinsyre eller aminosyresekvens (for eksempel en genomisk eller cDNA-sekvens, et plasmid eller en viral vektor, et naturlig virion eller en mutant eller analog av dette, slik det ytterligere er beskrevet i det etterfølgende, av enhver av de ovennevnte). En syntetisk kilde kan inkludere et protein eller en nukleinsyresekvens som er fremstilt kjemisk og ikke av et biologisk system (for eksempel en fastfasesyntese av aminosyresekvenser). Et kimært protein kan også inkludere et protein som er avledet fra minst 2 forskjellige syntetiske kilder eller et protein avledet fra minst en biologisk kilde og minst en syntetisk kilde. Et kimært protein kan også omfatte en første aminosyresekvens avledet fra en første kilde som kovalent eller ikke-kovalent er forbundet med en nukleinsyre avledet fra enhver kilde, eller et lite organisk eller uorganisk molekyl avledet fra enhver kilde. Det kimære proteinet kan omfatte et linkermolekyl mellom den første og den andre aminosyresekvensen, eller mellom den første aminosyresekvensen og nukleinsyren, eller mellom den første aminosyresekvensen og det lille organiske eller uorganiske molekylet.
Koaguleringsfaktor slik det brukes her, betyr ethvert molekyl eller analog av dette, naturlig forekommende eller rekombinant fremstilt, som hindrer eller nedsetter varigheten av en blødning i en pasient med en hemostatisk lidelse. Med andre ord, det betyr ethvert molekyl som har en koaguleringsaktivitet.
Koaguleringsaktivitet slik det brukes her, betyr evnen til å delta i en kaskade av biokjemiske reaksjoner som kulminerer i dannelsen av en fibrinklump og/eller reduserer graden, varigheten eller frekvensen av en blødning.
Dimer slik det brukes her, refererer seg til et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede hvor den nevnte første og andre kjeden begge omfatter et biologisk aktivt molekyl og i det minste en del av et immunoglobulinkonstant område. En homodimer refererer seg til en dimer hvor begge de biologisk aktive molekylene er identiske.
Dimerisk forbundet monomer-dimerhybrid refererer seg til et kimært protein som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område, for eksempel et Fc-fragment av et immunoglobulin, et biologisk aktivt molekyl og en linker som binder de to sammen slik at ett biologisk aktivt molekyl er bundet til 2 polypeptidkjeder som hver omfatter en del av et immunoglobulinkonstant område. Figur 4 viser et eksempel på en dimerisk forbundet monomer-dimerhybrid.
DNA-konstrukt slik det brukes her, betyr et DNA-molekyl eller en klon av et slikt molekyl, enten enkelt- eller dobbelttrådet som er blitt modifisert ved et aktivt inngrep slik at det inneholder segmenter av DNA kombinert på en slik måte at det ellers ikke ville eksistere i naturen. DNA-konstrukter inneholder den informasjon som er nødvendig for å styre ekspresjonen av polypeptider av interesse. DNA-konstrukter kan inkludere promotere, forsterkere og transkripsjonsterminatorer. DNA-konstrukter som inneholder den informasjonen som er nødvendig for å styre sekresjonen av et polypeptid, vil også inneholde minst én sekretorisk signalsekvens.
Domene slik det brukes her, betyr et område av et polypeptid (inklusive proteiner slik dette begrepet er definert her) med distinkte fysiske egenskaper eller roller, og kan for eksempel inkludere en uavhengig foldet struktur sammensatt av en seksjon av en polypeptidkjede. Et domene kan inneholde sekvensen for en distinkt fysisk karakter for polypeptidet, eller kan inneholde et fragment av den nevnte fysiske karakter som har beholdt sine bindingsegenskaper (for eksempel at den kan binde seg til et andre domene). Et domene kan være assosiert med et annet domene. Med andre ord, et første domene kan naturlig binde seg til et andre domene.
Et fragment slik det brukes her, refererer seg til et peptid eller polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som har minst 2 sammenhengende aminosyrerester, minst 5 sammenhengende aminosyrerester, minst 10 sammenhengende aminosyrerester, minst 15 sammenhengende aminosyrerester, minst 20 sammenhengende aminosyrerester, minst 25 sammenhengende aminosyrerester, minst 40 sammenhengende aminosyrerester, minst 50 sammenhengende aminosyrerester, minst 100 sammenhengende aminosyrerester, minst 200 sammenhengende aminosyrerester eller enhver delesjon eller forkortelse av et protein, peptid eller polypeptid.
Hemostase slik det brukes her, betyr å stoppe en blødning eller stoppe blodstrømmen gjennom et blodkar eller en del av kroppen.
Hemostatisk lidelse slik det brukes her, betyr en genetisk arvet eller ervervet tilstand som er karakterisert ved en tendens til blødningen, enten spontant eller som et resultat av traume, noe som skyldes en svekket evne eller manglende evne til å danne en fibrinklump.
Forbundet slik det brukes her, refererer seg til en første nukleinsyresekvens som kovalent er forbundet med en andre nukleinsyresekvens. Den første nukleinsyresekvensen kan være direkte forbundet eller plassert inntil den andre nukleinsyresekvensen, eller alternativt en mellomliggende sekvens kan forbinde den første sekvensen til den andre sekvensen. Forbundet slik det brukes her, refererer seg også til en første aminosyresekvens som kovalent eller ikke-kovalent er forbundet med en andre aminosyresekvens. Den første aminosyresekvensen kan være direkte forbundet eller plassert inntil den andre aminosyresekvensen, eller alternativt en mellomliggende sekvens kan kovalent forbinde den første aminosyresekvensen til den andre aminosyresekvensen.
Operativt forbundet slik det brukes her, betyr at en første nukleinsyresekvens er forbundet med en andre nukleinsyresekvens slik at begge sekvensene er i stand til å bli uttrykt som et biologisk aktivt protein eller peptid.
Polypeptid slik det brukes her, refererer seg til en polymer av aminosyrer og refererer seg ikke til en spesifikk lengde på produktet; peptider, oligopeptider og proteiner inngår således i definisjonen av et polypeptid. Dette begrepet utelukker ikke postekspresjonsmodifikasjoner av polypeptidet, for eksempel glykosylering, acetylering, fosforylering, pegylering, addering av en lipidgruppe eller addering av ethvert organisk eller uorganisk molekyl. Definisjonen inkluderer for eksempel polypeptider som inneholder en eller flere analoger av en aminosyre (inklusive for eksempel unaturlige aminosyrer) og polypeptider med substituerte bindinger så vel som andre modifikasjoner av velkjent art, enten disse er naturlig forekommende eller ikke-naturlig forekommende.
Høy stringens slik det brukes her, inkluderer betingelser som lett kan bestemmes av en fagperson basert for eksempel på lengden av DNA-molekylet. Generelt er slike betingelser definert i Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, bind 1, sidene 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) og inkluderer bruken av en forvaskingsløsning for nitrocellulosefiltrene 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), hybridiseringsbetingelser med 50% formamid, 6X SSC ved 42 ºC (eller en annen lignende hybridiseringsløsning så som Starks løsning i 50% formamid ved 42 ºC og vasking ved omtrent 68 ºC, 0,2X SSC, 0,1% SCS). En fagperson vil lett forstå at temperatur og saltkonsentrasjonen i vaskeløsningen kan justeres etter behov avhengig av faktorer så som lengden på proben.
Moderat stringens slik det brukes her, inkluderer betingelser som lett kan bestemmes av fagpersoner og er basert for eksempel på lengden av DNA-molekylet. De generelle betingelsene er angitt i Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, bind 1, sidene 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) og inkluderer bruken av forvaskingsløsning for nitrocellulosefiltrene 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) og hybridiseringsbetingelser med 50% formamid, 6X SSC ved 42 ºC (eller andre lignende hybridiseringsløsninger så som Starks løsning i 50% formamid ved 42 ºC) og vaskebetingelser ved 60 ºC, 0,5X SSC, 0,1% SDS.
Et lite uorganisk molekyl slik det brukes her, betyr et molekyl uten karbonatomer og med en molekylvekt som er mindre enn 50 kD.
Et lite organisk molekyl slik det brukes her, betyr et molekyl som inneholder minst ett karbonatom og som har en molekylvekt som er mindre enn 50 kD.
Behandling og å behandle slik det brukes her, betyr enhver av de følgende:
Reduksjon av graden av en sykdom eller en tilstand; reduksjon med hensyn til varigheten av sykdomsforløpet; lindring av en eller flere symptomer som er assosiert med en sykdom eller tilstand; tilveiebringelse av fordelaktige effekter for en pasient som har en sykdom eller en tilstand uten at man derved helbreder sykdommen eller tilstanden, profylakse med hensyn til ett eller flere symptomer som er assosiert med en sykdom eller tilstand.
B. Forbedringer som er tilveiebrakt ved visse utførelser av oppfinnelsen
Oppfinnelsen tilveiebringer kimære proteiner (monomer-dimerhybrider) som omfatter en første og en andre polypeptidkjede hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, mens nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten noe biologisk aktivt molekyl eller variabelt område av et immunoglobulin. Figur 1 viser forskjellen mellom tradisjonelle fusjonsproteindimerer og et eksempel på monomer-dimerhybriden ifølge oppfinnelsen. I dette eksempelet er det biologisk aktive molekylet EPO og delen av et immunoglobulin er IgG Fc-området.
På samme måte som andre kimære proteiner som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område, så tilveiebringer oppfinnelsen kimære proteiner som har bedret stabilitet og forhøyet biotilgjengelighet for det kimære proteinet sammenlignet med det biologisk aktive molekylet alene. Dessuten, på grunn av at bare en av de to kjedene omfatter det biologisk aktive molekylet, så har imidlertid det kimære proteinet lavere molekylvekt enn et kimært protein hvor alle kjedene omfatter et biologisk aktivt molekyl, og uten at man ønsker å være bundet til en spesifikk teori, så kan dette gjøre at det kimære proteinet blir lettere transcytosert over den epiteliske barrieren, for eksempel ved binding til FcRn-reseptoren, noe som øker halvlivet til det kimære proteinet. I en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen således en bedret ikke-invaderende fremgangsmåte (for eksempel via enhver slimhinneoverflate så som oralt, bukalt, sublingualt, nasalt, rektalt, vaginalt eller via en pulmonær eller okulær rute) for å administrere et terapeutisk kimært protein ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen tilveiebringer således fremgangsmåter for å oppnå terapeutiske nivåer av de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen ved å bruke mindre frekvente og lavere doser enn sammenlignet med tidligere beskrevne kimære proteiner (det vil si kimære proteiner som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og et biologisk aktivt molekyl hvor alle kjedene i det kimære proteinet omfatter et biologisk aktivt molekyl).
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en invaderende fremgangsmåte, for eksempel subkutant eller intravenøst, for å administrere et terapeutisk kimært protein ifølge oppfinnelsen. Invaderende administrering av det terapeutisk kimære proteinet ifølge den foreliggende oppfinnelsen gir et forlenget halvliv for det terapeutiske kimære proteinet som resulterer i at man kan bruke mindre frekvente og lavere doser sammenlignet med tidligere beskrevne kimære proteiner (det vil si kimære proteiner som omfatter i det minste en del av et immunoglobulinkonstant område og et biologisk aktivt molekyl hvor alle kjedene i det kimære proteinet omfatter et biologisk aktivt molekyl).
En annen fordel ved et kimært protein hvor bare en av kjedene omfatter et biologisk aktivt molekyl, er at det biologisk aktive molekylet har bedret tilgjengelighet for sin målcelle eller molekyl, noe som er et resultat av nedsatt sterisk hindring, færre hydrofobe interaksjoner, færre ioniske interaksjoner eller nedsatt molekylvekt, sammenlignet med et kimært protein hvor alle kjedene omfatter et biologisk aktivt molekyl.
C. Kimære proteiner
Oppfinnelsen angår kimære proteiner som omfatter et biologisk aktiv molekyl, minst en del av et immunoglobulinkonstant område og eventuelt minst en linker. Delen av det immunoglobulin vil ha både en N- eller en aminoterminus og en C-eller karboksyterminus. Det kimære proteinet kan ha det biologisk aktive molekylet forbundet med N-terminus i delen av et immunoglobulin. Alternativt kan det biologisk aktive molekylet være forbundet med C-terminus i delen av et immunoglobulin. I en utførelse er forbindelsen en kovalent binding. I en annen utførelse er forbindelsen en ikke-kovalent binding.
Det kimære proteinet kan eventuelt omfatte minst en linker, således at det biologisk aktive molekylet ikke er direkte forbundet med delen av et immunoglobulinkonstant område. Linkeren kan ligge mellom det biologisk aktive molekylet og delen av et immunoglobulinkonstant område. Linkeren kan være forbundet med N-terminus i delen av et immunoglobulinkonstant område, eller C-terminus i delen av et immunoglobulinkonstant område. Hvis det biologisk aktive molekylet omfatter minst en aminosyre, så vil det biologisk aktive molekylet ha en N-terminus og en C-terminus og linkeren kan være forbundet med N-terminus i det biologisk aktive molekylet, eller C-terminus i det biologisk aktive molekylet.
Oppfinnelsen angår et kimært protein med formel X-La-F:F eller F:F-La-X, hvor X er et biologisk aktivt molekyl, L er en eventuell linker og F er minst en del av et immunoglobulinkonstant område og a er ethvert tall eller null. Oppfinnelsen angår også et kimært protein med formel Ta-X-La-F:F eller Ta-F:F-La-X, hvor X er et biologisk aktivt molekyl, L er en eventuell linker, F er minst en del av et immunoglobulinkonstant område og a er ethvert tall eller null. T er en andre linker eller alternativt et merke som kan brukes for å lette rensingen av det kimære proteinet, for eksempel et FLAG-merke, en histidinmerke, et GST-merke, et maltosebindende proteinmerke og (:) representerer en kjemisk assosiasjon, det vil si minst en ikke-peptidinbinding. I visse utførelser den kjemiske assosiasjonen, det vil si (:) en kovalent binding. I andre utførelser er den kjemiske assosiasjonen, det vil si (:) en ikke-kovalent interaksjon, for eksempel en ionisk interaksjon, en hydrofob interaksjon, en hydrofil interaksjon, en Van der Waals interaksjon eller en hydrogenbinding. Det er underforstått at når a er null så vil X være direkte forbundet med F. For eksempel kan a være 0, 1, 2, 3, 4, 5 eller mer.
I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2a (SEKV.ID. NR. 6). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2b (SEKV.ID. NR. 8). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2c (SEKV.ID. NR.
10). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2e (SEKV.ID. NR. 14). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2f (SEKV.ID. NR. 16). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2g (SEKV.ID. NR.
18). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2h (SEKV.ID. NR. 20). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2i (SEKV.ID. NR. 22). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2j (SEKV.ID. NR.
24). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 17b (SEKV.ID. NR. 27).
1. Kimære proteinvarianter
Oppfinnelsen angår også derivater av de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen, antistoffer mot de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen og antistoffer mot bindingspartnere for de kimære proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelsen, og disse kan fremstilles ved å endre deres aminosyresekvenser ved substitusjoner, adderinger og/eller delesjoner/forkortelser eller ved å innføre en kjemisk modifikasjon som resulterer i funksjonelt ekvivalente molekyler. Det vil være innlysende for fagpersoner at visse aminosyrer i en sekvens for ethvert protein kan substitueres med andre aminosyrer uten at man derved skadelig påvirker proteinets aktivitet.
Det kan utføres forskjellige forandringer i aminosyresekvensene for de kimære proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelsen eller de DNA-sekvenser som koder dem, uten at det derved oppstår et betydelig tap av deres biologiske aktivitet, funksjon eller anvendbarhet. Derivater, analoger eller mutanter som er et resultat av slike forandringer og anvendelse av slike derivater, ligger innenfor den foreliggende oppfinnelsen. I en spesifikk utførelse er derivatet funksjonelt aktivt, det vil si at det er i stand til å oppvise en eller flere av de aktiviteter som er assosiert med de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen, for eksempel FcRn-binding, viral hemming, hemostase og produksjon av røde blodceller. Det er kjent mange prøver som kan brukes for å teste aktiviteten for et kimært protein som omfatter et biologisk aktivt molekyl. Når det biologisk aktive molekylet er en HIV-hemmer, så kan aktiviteten testes ved å måle den reverse transkriptaseaktiviteten ved å bruke kjente fremgangsmåter (se for eksempel Barre-Sinoussi et al. 1983, Science 220: 868; Gallo et al.1984, Science 224: 500). Alternativt kan aktiviteten måles ved å måle den fusogene aktiviteten (se for eksempel Nussbaum et al. 1994, J. Virol.68(9): 5411). I de tilfeller at den biologiske aktiviteten er hemostase, så kan det gjennomføres en StaCLot FVIIa-rTF-prøve for å bedømme aktiviteten til faktor VIIa-derivater (Johannessen et al. 2000, Blood Coagulation and Fibrinolysis 11: S159).
Substitutter for en aminosyre i en sekvens kan velges blant andre aminosyrer i samme klasse som aminosyren tilhører (se tabell 1). Videre er forskjellige aminosyrer ofte substituert med nøytrale aminosyrer, for eksempel alanin, leukin, isoleukin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin (se for eksempel MacLennan et al.1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643: 55-67; Sasaki et al. 1998, Adv. Biophys. 35: 1-24).
TABELL 1
2. Biologisk aktive molekyler
Ifølge den foreliggende oppfinnelsen man anvende ethvert biologisk aktivt molekyl som det terapeutiske molekylet ifølge oppfinnelsen. Det biologisk aktive molekylet kan være et polypeptid. Det biologisk aktive molekylet kan være en enkelt aminosyre. Det biologisk aktive molekylet kan inkludere et modifisert polypeptid.
Det biologisk aktive molekylet kan inkludere et lipidmolekyl (for eksempel et steroid eller kolesterol, en fettsyre, en triacylglyserol, glyserofosfolipid eller sfingolipid). Det biologisk aktive molekylet kan inkludere et sukkermolekyl (for eksempel glukose, sukrose eller mannose). Det biologisk aktive molekylet kan inkludere et nukleinsyremolekyl (for eksempel DNA eller RNA). Det biologisk aktive molekylet kan inkludere et lite organisk molekyl eller et lite uorganisk molekyl.
a. Cytokiner og vekstfaktorer
I en utførelse er det biologisk aktive molekylet en vekstfaktor, et hormon eller cytokin eller en analog eller fragment av disse. Det biologisk aktive molekylet kan være ethvert middel som er i stand til å indusere cellevekst og proliferering. I en spesifikk utførelse er det biologisk aktive molekylet ethvert middel som kan indusere en proliferering av erytrocytter. Et eksempel på et biologisk aktivt molekyl som således inngår i oppfinnelsen, er EPO. Det biologisk aktive molekylet kan også inkludere, men er ikke begrenset til, RANTES, MIP1 α, MIP1 β, IL-2, IL-3, GM-CSF, veksthormon, tumornekrosefaktor (for eksempel TNF α eller - β).
Det biologisk aktive molekylet kan inkludere interferon α, enten dette er fremstilt syntetisk eller rekombinant og inkluderer, men er ikke begrenset til, enhver av omkring tjuefem strukturelt beslektede undertyper, for eksempel interferon- α2a, nå kommersielt tilgjengelige for klinisk bruk (ROFERON ®, Roche) og interferon- α2b, også godkjent for klinisk bruk (INTRON ®, Schering), så vel som genetisk endrede versjoner av forskjellige undertyper inklusive, men ikke begrenset til, kommersielt tilgjengelig konsensusinterferon α (INFERGEN ®, Intermune, utviklet av Amgen) og konsensus humant leukocyttinterferon, se for eksempel U.S. patent nr. 4,695,623 og 4,897,471, interferon β, epidermal vekstfaktor, gonadotropinfrigjørende hormon (GnRH), leuprolid, follikkelstimulerende hormon, progesteron, østrogen eller testosteron.
En liste over de cytokiner og vekstfaktorer som kan brukes i de kimære proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet tidligere (se for eksempel U.S. patentene nr. 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613, WO 03/077834, US2003-0235536A1).
b. Antivirale midler
I en utførelse er det biologisk aktive molekylet et antiviralt middel inklusive fragmenter og analoger av dette. Et antiviralt middel kan inkludere ethvert molekyl som hindrer eller hemmer den virale replikasjonen, hemmer eller hindrer den virale inntrengingen i en celle eller hemmer eller hindrer en viral utvandring fra en celle. I en utførelse er det antivirale middelet en fusjonshemmer. I en utførelse er det antivirale middelet et cytokin som hemmer viral replikasjon. I en annen utførelse er det antivirale middelet interferon α.
Den virale fusjonshemmeren som kan brukes i det kimære proteinet kan være ethvert molekyl som nedsetter eller hindrer viral inntrengning gjennom en cellulær membran hos en målcelle. Den virale fusjonshemmeren kan være ethvert molekyl som nedsetter eller hindrer dannelsen av syncytia mellom minst to utsatt celler. Den virale fusjonshemmeren kan være ethvert molekyl som nedsetter eller hindrer forbindelsen mellom en lipid tolags membran hos en eukaryot celle og et lipid med to lag hos et innesluttet virus. Eksempler på innesluttede virus inkluderer, men er ikke begrenset til, HIV-1, HIV-2, SIV, influensa, parainfluensa, Epstein-Barr-virus, CMV, herpes simplex 1, herpes simplex 2 og respiratorisk syncytiavirus.
Den virale fusjonshemmeren kan være ethvert molekyl som nedsetter eller hindrer den virale fusjonen og inkluderer, men er ikke begrenset til, et polypeptid, et lite organisk molekyl eller et lite uorganisk molekyl. I en utførelse er fusjonshemmeren et polypeptid. I en utførelse er den virale fusjonshemmeren et polypeptid med 3-36 aminosyrer. I en annen utførelse er den virale fusjonshemmeren et polypeptid med 3-50 aminosyrer, 10-65 aminosyrer eller 10-75 aminosyrer. Polypeptidet kan omfatte en naturlig forekommende aminosyresekvens (for eksempel et fragment av gp41) inklusive analoger og mutanter av denne, eller polypeptidet kan omfatte en aminosyresekvens som ikke forefinnes i naturen så lenge polypeptidet har en viral fusjonshemmende aktivitet.
I en utførelse er den virale fusjonshemmeren et polypeptid som er identifisert som en viral fusjonshemmer ved å bruke minst en dataalgoritme, for eksempel ALLMOTI5, 107x178x4 og PLZIP (se for eksempel U.S. patentene 6,013,263; 6,015,881; 6,017,536; 6,020,459; 6,060,065; 6,068,973; 6,093,799; og 6,228,983).
I en utførelse er den virale fusjonshemmeren en HIV-fusjonshemmer. I en utførelse er nevnte HIV HIV-1. I en annen utførelse er nevnte HIV HIV-2. I en utførelse er HIV-fusjonshemmeren et polypeptid som omfatter et fragment av det gp41-omsluttende proteinet for HIV-1. HIV-fusjonshemmeren kan for eksempel omfatte T20 (SEKV.ID. NR. 1) eller en analog av denne, T21 (SEKV.ID. NR. 2) eller en analog av denne, T1249 (SEKV.ID. NR. 3) eller en analog av denne, NCCGgp41 (Louis et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: (31)29485) eller en analog av denne, eller 5-heliks (Root et al. 2001, Science 291: 884) eller en analog av denne.
Det er kjent flere prøver som kan brukes for å teste den virale fusjonshemmende aktiviteten for et polypeptid, et lite organisk molekyl eller et lite uorganisk molekyl. Disse prøvene inkluderer en revers transkriptaseprøve, en p24-prøve eller en syncytiadannelsesprøve (se for eksempel U.S. patent nr.5,464,933).
En liste over antivirale midler som kan brukes i de kimære proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet tidligere (se for eksempel U.S. patent nr. 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).
c. Hemostatiske midler
I en utførelse er det biologisk aktive molekylet en koaguleringsfaktor eller et annet middel som fremmer hemostase, inklusive fragmenter og analoger av disse.
Koaguleringsfaktoren kan inkludere ethvert molekyl som har koaguleringsaktivitet eller aktiverer et molekyl med slik aktivitet. Koaguleringsfaktoren kan omfatte et polypeptid. Den kan for eksempel være, men er ikke begrenset til, faktor VIII, faktor IX, faktor XI, faktor XII, fibrinogen, protrombin, faktor V, faktor VII og faktor X, faktor XIII eller von Willebrandfaktor. I en utførelse er koaguleringsfaktoren faktor VII eller faktor VIIa. Koaguleringsfaktoren kan være en faktor som deltar i den ekstriniske reaksjonsveien. Koaguleringsfaktoren kan være en faktor som deltar i den intriniske reaksjonsveien. Alternativt kan koaguleringsfaktoren være en faktor som deltar både i den ekstriniske og intriniske reaksjonsveien.
Koaguleringsfaktoren kan være en human koaguleringsfaktor eller en ikke-human koaguleringsfaktor, for eksempel avledet fra en ikke-human primat, en gris eller ethvert pattedyr. Koaguleringsfaktoren kan være en kimær koaguleringsfaktor, for eksempel kan koaguleringsfaktoren omfatte en del av en human koaguleringsfaktor og en del av en svinekoaguleringsfaktor, eller en del av en første ikke-human koaguleringsfaktor og en del av en andre ikke-human koaguleringsfaktor.
Koaguleringsfaktoren kan være en aktivert koaguleringsfaktor. Alternativt kan koaguleringsfaktor være en inaktiv form av en koaguleringsfaktor, for eksempel et zymogen. Den inaktive koaguleringsfaktoren kan så bli aktivert etter å ha blitt forbundet til minst en del av et immunoglobulinkonstant område. Den inaktive koaguleringsfaktoren kan aktiveres etter administrering til en pasient. Alternativt kan den inaktive koaguleringsfaktor aktiveres før administrering.
I visse utførelser kan en endopeptidase, for eksempel et paret basisk aminosyrespaltende enzym (PACE) eller ethvert annet enzym i PACE-familien så som PCSK1-9, inklusive trunkerte versjoner av slike, eller dens gjærekvivalent Kex2 fra S. cerevisiae og trunkerte versjoner av Kex2 (Kex2 1-675) (se for eksempel U.S. patentene 5,077,204; 5,162,220; 5,234,830; 5,885,821; 6,239,176) brukes for å spalte et propeptid for derved å danne det modne kimære proteinet ifølge oppfinnelsen (for eksempel faktor VII eller faktor IX).
d. Andre proteinaktige biologisk aktive molekyler
I en utførelse er det biologisk aktive molekylet en reseptor eller et fragment eller analog av dette. Reseptoren kan uttrykkes på en celleoverflate eller alternativt kan den uttrykkes i det indre av en celle. Reseptoren kan være en viral reseptor, for eksempel CD4, CCR5, CXCR4, CD21 eller CD46. Det biologisk aktive molekylet kan være en bakteriell reseptor. Det biologisk aktive molekylet kan være et ekstracellulært matriseprotein eller fragment eller analog av dette, noe som er viktig ved bakteriekolonisering og infeksjon (se for eksempel U.S. patentene 5,648,240; 5,189,015; 5,175,096) eller et bakterielt overflateprotein som er viktig ved tilfesting og infeksjon (se for eksempel U.S. patent nr.5,648,240). Det biologisk aktive molekylet kan være en vekstfaktor, hormon eller cytokinreseptor eller et fragment eller analog av disse, for eksempel TNF α-reseptor, erytropoietinreseptoren, CD25, CD122 eller CD132.
Det er tidligere beskrevet en liste av andre proteinaktige molekyler som kan brukes i det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen (se for eksempel U.S. patentene 6,086,875; 6,485,726; 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).
e. Nukleinsyrer
I en utførelse er det biologisk aktive molekylet en nukleinsyre, for eksempel DNA eller RNA. I en spesifikk utførelse er det biologisk aktive molekylet en nukleinsyre som kan brukes ved RNA-interferens (RNAi). Nukleinsyremolekylet kan for eksempel være, men er ikke begrenset til, et antisensmolekyl eller et ribozym eller en aptamer.
Antisens RNA- og DNA-molekyler virker slik at de direkte blokkerer translateringen av mRNA ved å hybridisere seg til det målsøkte mRNA og derved hindre proteintranslatering. Antisensmetoder innbefatter blant annet å utforme oligonukleotider som er komplementære til et målgen mRNA.
Antisensoligonukleotidene vil binde seg til de komplementære målgen mRNA-transkriptene og hindre translatering. Det er ikke nødvendig med absolutt komplementaritet.
En sekvens som er "komplementær" til en del av et RNA slik dette er angitt her, betyr en sekvens som har tilstrekkelig komplementaritet til å være i stand til å hybridisere seg med RNA, danne en stabil dupleks og i forbindelse med dobbelttrådede antisensnuklinsyrer, kan således en enkelt tråd av dupleks DNA testes eller det kan undersøkes hvorvidt det har skjedd en tripleksdannelse. Evnen til å hybridisere vil være avhengig både av graden av komplementaritet og lengden på antisensnukleinsyren. Generelt er det slik at jo lenger hybridiseringsnukleinsyren er, jo flere basemistilpasninger med et RNA kan den inneholde og ikke desto mindre danne en stabil dupleks (eller tripleks hvis dette skulle være tilfellet). En fagperson vil lett kunne fastslå en toleransegrad med hensyn til mistilpasning ved å bruke standardprosedyrer for å bestemme smeltepunktet for det hybridiserte komplekset.
Antisensnukleinsyrene bør ha en lengde på minst seks nukleotider og fortrinnsvis bør oligonukleotidene ha en lengde på fra 6 til omtrent 50 nukleotider. I visse aspekter inneholder oligonukleotidet minst 10 nukleotider, minst 17 nukleotider, minst 25 nukleotider eller minst 50 nukleotider.
Oligonukleotidene kan være DNA eller RNA eller kimære blandinger eller derivater eller modifiserte versjoner av disse, enten de er enkelttrådede eller dobbelttrådede. Oligonukleotidet kan være modifisert ved hjelp av basegrupper, sukkergrupper eller fosfatkjeder, for derved for eksempel å bedre stabiliteten på molekylet, en hybridisering, osv. Oligonukleotidet kan inkludere andre tilfestede grupper så som polypeptider (for eksempel for å målsøke vertscellereseptorer in vivo) eller midler som letter transport på tvers av cellemembranen (se for eksempel Letsinger et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553; Lemaitre et al.1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648; WO 88/09810) eller blod-hjernebarrieren (se for eksempel WO 89/10134), hybridiseringsutløsende spaltingsmidler (se for eksempel Krol et al. 1988, BioTechniques 6: 958) eller interkalerende midler (se for eksempel Zon 1988, Pharm. Res. 5: 539). I så henseende kan oligonukleotidet være konjugert til et annet molekyl, for eksempel et polypeptid, et hybridiseringsutløst tverrbindingsmiddel, transportmiddel eller et hybridiseringsutløst spaltingsmiddel.
Ribozymmolekyler som er formet slik at de katalytisk spalter målgen mRNA-transkriptene kan også brukes for å hindre translatering av målgen mRNA, og derfor ekspresjon av målgenproduktet (se for eksempel WO 90/11364; Sarver et al. 1990, Science 247, 1222-1225).
Ribozymer er enzymatiske RNA-molekyler som er i stand til å katalysere den spesifikke spaltingen av RNA (se Rossi 1994, Current Biology 4: 469).
Mekanismen ved ribozymvirkning innbefatter en sekvensspesifikk hybridisering av ribozymmolekylet til det komplementære mål-RNA fulgt av en endonukleolytisk spaltingsreaksjon. Sammensetningen av ribozymmolekyler må inkludere en eller flere sekvenser som er komplementære til målgen mRNA og må inkludere velkjente katalytiske sekvenser som er ansvarlige for mRNA-spalting. For slike sekvenser, se for eksempel U.S. patent nr. 5,093,246.
I en utførelse kan man bruke ribozymer som spalter mRNA ved setespesifikk gjenkjennelsessekvenser for derved å ødelegge målgen mRNA-molekylene. I en annen utførelse er det mulig å bruke såkalte hammerhoderibozymer. Slike hammerhoderibozymer spalter mRNA-molekylene på steder som er diktert eller kontrollert av flankerende områder som danner komplementære basepar med målmRNA-molekylet. Det eneste kravet er at mål-mRNA-molekylet har den følgende sekvens av to baser: 5'-UG-3'. Konstruksjon og produksjon av hammerhoderibozymer er velkjente innenfor bioteknologien og er blant annet mer detaljert beskrevet i Myers 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York og i Haseloff og Gerlach 1988, Nature, 334: 585.
f. Små molekyler
Den foreliggende oppfinnelsen angår også bruken av ethvert terapeutisk lite molekyl eller medikament som det biologisk aktive molekylet i det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen. Det er tidligere beskrevet lister av små molekyler og medikamenter som kan brukes i det kimære proteinet ifølge den foreliggende oppfinnelsen (se for eksempel U.S. patentene 6,086,875; 6,485,726; 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).
2. Immunoglobuliner
De kimære proteinene ifølge oppfinnelsen omfatter i det minste en del av et immunoglobulinkonstant område. Immunoglobuliner består av fire proteinkjeder som er kovalent assosiert - to tunge kjeder og to lette kjeder. Hver kjede omfatter videre et variabelt område og et konstant område. Avhengig av immunoglobulinisotypen, så omfatter det tungkjedekonstante området 3 eller 4 konstante områdedomener (for eksempel CH1, CH2, CH3 eller CH4). Enkelte isotyper omfatter videre et hengselområde.
Delen av et immunoglobulinkonstant område kan oppnås fra ethvert pattedyr. Delen av et immunoglobulinkonstant område kan inkludere en del av et humant immunoglobulinkonstant område, et ikke-humant primat immunoglobulinkonstant område, et storfe immunoglobulinkonstant område, et svine immunoglobulinkonstant område, et muse immunoglobulinkonstant område, et saue immunoglobulinkonstant område eller et rotte immunoglobulinkonstant område.
Nevnte del av et immunoglobulinkonstant område kan fremstilles rekombinant eller syntetisk. Immunoglobulinet kan isoleres fra et cDNA-bibliotek. Delen av et immunoglobulinkonstant område kan isoleres fra et fagbibliotek (se for eksempel McCafferty et al. 1990, Nature 348: 552, Kang et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4353; EP 0589 877 B1). Delen av et immunoglobulinkonstant område kan oppnås ved såkalt genstokking av kjente sekvenser (Mark et al. 1992, Bio/Technol.
10: 779). Nevnte del av et immunoglobulinkonstant område kan isoleres ved in vivo rekombinasjon (Waterhouse et al. 1993, Nucl. Acid Res. 21: 2265).
Immunoglobulinet kan være et humanisert immunoglobulin (U.S. patent nr.
5,585,089, Jones et al., 1986, Nature 332: 323).
Delen av et immunoglobulinkonstant område kan inkludere en del av et IgG, et IgA, et IgM, et IgD eller et IgE. I en utførelse er immunoglobulinet en IgG. I en annen utførelse er immunoglobulinet IgG1. I en annen utførelse er immunoglobulinet IgG2.
Delen av et immunoglobulinkonstant område kan inkludere hele det tungkjedekonstante området eller et fragment eller analog av dette. I en utførelse kan et tungkjedekonstant område omfattet CH1-domene, et CH2-domene, et CH3-domene og/eller et hengselområde. I en annen utførelse kan et tungkjedekonstant område omfatte et CH1-domene, et CH2-domene, et CH3-domene og/eller et CH4-domene.
Delen av et immunoglobulinkonstant område kan inkludere et Fc-fragment. Et Fcfragment kan omfatte CH2- og CH3-domenene fra et immunoglobulin og immunoglobulinets hengselområde. Fc-fragmentet kan være Fc-fragmentet fra et IgG1, et IgG2, et IgG3 eller et IgG4. I en spesifikk utførelse er delen av et immunoglobulinkonstant område et Fc-fragment av et IgG1. I en annen utførelse er delen av et immunoglobulinkonstant område et Fc-fragment av et IgG2.
I en annen utførelse er delen av et immunoglobulinkonstant område en Fc-neonatal reseptor (FcRn) bindingspartner. En FcRn-bindingspartner er ethvert molekyl som spesifikt kan bindes av FcRn-reseptoren med etterfølgende aktiv transport ved hjelp av FcRn-reseptoren i nevnte FcRn-bindingspartner. Begrepet spesifikt bundet refererer seg til to molekyler som danner et kompleks som er relativt stabilt under de fysiologiske betingelsene. Spesifikk binding er karakterisert ved en høy affinitet og med en lav til moderat evne i motsetning til ikke-spesifikk binding som vanligvis har lav affinitet med moderat til høy kapasitet. Typisk vil man anse en binding å være spesifikk når affinintetskonstanten KA er høyere enn 10<6 >M<-1 >eller fortrinnsvis høyere enn 10<8 >M<-1>. Hvis det er nødvendig, kan ikke-spesifikk binding reduseres uten at man derved i vesentlig grad påvirker den spesifikke bindingen, noe som kan gjøres ved å variere bindingsbetingelsene. Passende bindingsbetingelser så som konsentrasjon av molekylene, løsningens ionestyrke, temperatur, reaksjonstid for binding, konsentrasjon av et blokkerende middel (for eksempel serum albumin, melkekasein), osv, kan optimaliseres av en person med faglig innsikt ved å bruke rutineteknikker.
FcRn-reseptoren er blitt isolert fra flere arter av pattedyr, inklusive mennesker. Sekvensene for det humane FcRn, ape FcRn, rotte FcRn og muse FcRn er kjente (Story et al. 1994, J. Exp. Med.180: 2377). FcRn-reseptoren binder IgG (men ingen andre immunoglobulinklasser så som IgA, IgM, IgD og IgE) ved relativt lav pH, transporterer så aktivt det nevnte IgG transcellulært i en luminal til serosal retning og frigjør deretter IgG ved den relativt høyere pH som forefinnes i de interstitiale væsker. Det blir uttrykt i voksent epitelisk vev (U.S. patentene 6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536A1) inklusive lunge- og tarmepitel (Israel et al. 1997, Immunology 92: 69), renalt proksimalt kanalepitel (Kobayashi et al.2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282: F358) så vel som i nasalt epitel, i vaginale overflater og i galltreoverflater.
FcRn-bindingspartnere ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatter ethvert molekyl som spesifikt kan bindes av FcRn-reseptoren inklusive hele IgG, Fcfragmentet av IgG og andre fragmenter som inkluderer det fullstendige bindingsområdet i FcRn-reseptoren. Området av Fc-delen av IgG som binder seg til FcRn-reseptoren er blitt beskrevet på basis av røntgenkrystallografi (Burmeister et al. 1994, Nature 372: 379). Hovedkontaktområdet for nevnte Fc med nevnte FcRn ligger nær kontaktpunktet for CH2- og CH3-domenene. Fc-FcRn-kontaktene ligger alle innenfor en enkelt Ig-tungkjede. FcRn-bindingspartnerne inkluderer hele IgG, Fc-fragmentet av IgG og andre fragmenter av IgG som inkluderer det fullstendige bindingsområdet for FcRn. De viktigste kontaktsetene inkluderer aminosyrerestene 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 og 314 av CH2-domenet og aminosyrerestene 385-387, 428 og 433-436 i CH3-domenet. Referansene til aminosyrenummereringen i immunoglobuliner eller immunoglobulinfragmenter eller -områder er alle basert på Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, MD.
Fc-området i IgG kan modifiseres ved hjelp av velkjente fremgangsmåter så som seterettet mutagenese og lignende for derved å gi modifiserte IgG- eller Fcfragmenter eller deler av disse, som vil bli bundet av FcRn. Slike modifikasjoner inkluderer modifikasjoner som ligger fjernt fra nevnte FcRn-kontaktseter så vel som modifikasjoner inne i kontaktsetene som vil bevare eller endog bedre bindingen til FcRn. For eksempel kan de følgende enkeltaminosyrerestene i det humane IgG1 Fc (Fc γ1) substitueres uten signifikant tap av Fc-bindingsaffinitet for FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, 1342A, R344A, E345A, 1347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A og K447A hvor for eksempel P238A representerer villtypeprolin som er substituert med alanin i stilling 238. Som et eksempel kan det nevnes at en spesifikk utførelse inkorporerer N297A-mutasjonen, noe som fjerner det sterkt konserverte N-glykosyleringssetet. I tillegg til alanin kan også andre aminosyrer erstatte de villtypeaminosyrer som er angitt i de ovenfor spesifiserte posisjonene. Mutasjoner kan være innført enkeltvis i Fc, noe som gir opphav til mer enn hundre FcRnbindingspartnere som er distinkte fra det native eller opprinnelige Fc. Videre kan kombinasjoner av to, tre eller flere av disse individuelle mutasjonene innføres sammen, noe som gir opphav til hundrevis av flere FcRn-bindingspartnere. Videre kan en av FcRn-bindingspartnerne i monomer-dimerhybriden muteres, mens den andre FcRn-bindingspartneren ikke er mutert i det hele tatt, eller de kan begge være mutert, men med forskjellige mutasjoner. Enhver av de mutasjoner som er beskrevet her, inklusive N297A, kan brukes for å modifisere Fc, uavhengig av det biologisk aktive molekylet (for eksempel EPO, IFN, faktor IX eller T20).
Enkelte av de ovennevnte mutasjonene kan gi FcRn-bindingspartneren ny funksjonalitet. En utførelse inkorporerer for eksempel N297A, noe som fjerner et sterkt konservert N-glykosyleringssete. Effekten av denne mutasjonen er å redusere immunogenisitet og derved bedre det sirkulerende halvlivet for FcRnbindingspartneren og gjøre FcRn-bindingspartneren ute av stand til å binde seg til Fc γRI, Fc γRIIA, Fc γRIIB og Fc γRIIIA, uten at dette svekker affiniteten for FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60: 847; Friend et al. 1999, Transplantation 68: 1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276: 6591). Som et ytterligere eksempel på en ny funksjonalitet som kan oppstå ved hjelp av mutasjoner slik disse er beskrevet ovenfor, er at affiniteten for FcRn kan øke utover det som i enkelte tilfeller er kjent i villtypen. Denne forsterkede affiniteten kan reflektere en forsterket "på"-hastighet, en nedsatt "av"-hastighet eller både en forhøyet "på"-hastighet og en nedsatt "av"-hastighet. Mutasjoner som er antatt å gi en bedret affinitet for FcRn inkluderer T256A, T307A, E380A og N434 A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591).
Minst tre humane Fc-gammareseptorer synes også å gjenkjenne et bindingssete på IgG i det lavere hengselområdet, generelt aminosyrene 234-237. Et annet eksempel på en ny funksjonalitet og en mulig nedsatt immunogenisitet vil derfor kunne oppstå ved mutasjoner i dette området, for eksempel ved å erstatte aminosyrene 233-236 i det humane IgG1 "ELLG" med den tilsvarende sekvensen fra IgG2 "PVA" (med fjerning av en aminosyre). Det er blitt vist at Fc γRI, Fc γRII og Fc γRIII som kontrollerer og styrer visse effektorfunksjoner, ikke vil binde seg til IgG1 når slike mutasjoner er blitt innført. Ward og Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2: 77 og Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29: 2613.
I en utførelse er nevnte FcRn-bindingspartner et polypeptid som inkluderer sekvensen PKNSSMISNTP (SEKV.ID. NR. 26) og eventuelt ytterligere inkluderer en sekvens valgt fra HQSLGTQ (SEKV.ID. NR. 27), HQNLSDGK (SEKV.ID. NR.
28), HQNISDGK (SEKV.ID. NR. 29) eller VISSHLGQ (SEKV.ID. NR.30) (U.S. patent nr. 5,739,277).
To FcRn-reseptorer kan binde et enkelt Fc-molekyl. Krystallografiske data antyder at hvert FcRn-molekyl binder seg til et enkelt polypeptid i Fc-homodimeren. I en utførelse vil en forbindelse mellom FcRn-bindingspartneren, for eksempel et Fcfragment av et IgG med et biologisk aktivt molekyl, gi en mulighet for å tilføre et biologisk aktivt molekyl oralt, bukalt, sublingualt, rektalt eller vaginalt som en aerosol som kan administreres nasalt eller via lungene, eller via en okulær vei. I en annen utførelse kan det kimære proteinet administreres invaderende, for eksempel subkutant eller intravenøst.
En person med faglig innsikt vil forstå at deler av et immunoglobulinkonstant område som skal brukes i det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan inkludere mutanter eller analoger av dette, eller kan inkludere kjemisk modifiserte immunoglobulinkonstante områder (for eksempel pegylert) eller fragmenter derav (se for eksempel Aslam og Dent 1998, Bioconjugation: Protein Coupling Techniques For the Biomedical Sciences Macmilan Reference, London). I ett tilfelle kan en mutant gi en bedret binding av FcRn-bindingspartneren til FcRn. I de kimære proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det også mulig å bruke peptidetterligninger for minst en del av et immunoglobulinkonstant område, for eksempel en peptidetterligning av et Fc-fragment eller en peptidetterligning av en FcRn-bindingspartner. I en utførelse blir peptidetterligningen identifisert via fagdisplay eller via kjemisk bibliotekscreening (se for eksempel McCafferty et al.
1990, Nature 348: 552, Kang et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363; EP 0 589 877 B1).
3. Eventuelle linkere
Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan eventuelt omfatte mints ett linkermolekyl. Linkeren kan bestå av ethvert organisk molekyl. I en utførelse er linkeren en polyetylenglykol (PEG). I en annen utførelse består linkeren av aminosyrer. Linkeren kan omfatte 1-5 aminosyrer, 1-10 aminosyrer, 1-20 aminosyrer, 10-50 aminosyrer, 50-100 aminosyrer eller 100-200 aminosyrer. I en utførelse består linkeren av åtte aminosyrer EFAGAAAV (SEKV.ID. NR. 31). Enhver av de linkere som er beskrevet her kan brukes i det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen, for eksempel en monomer-dimerhybrid inklusive EFAGAAAV, uten hensyn til det biologisk aktive molekylet (for eksempel EPO, IFN eller faktor IX).
Linkeren kan omfatte sekvensen Gn. Linkeren kan omfatte sekvensen (GA)n (SEKV.ID. NR. 32). Linkeren kan omfatte sekvensen (GGS)n (SEKV.ID. NR.33). Videre kan linkeren omfatte sekvensen (GGS)n(GGGGS)n (SEKV.ID. NR. 34). I disse tilfellene kan n være et helt tall fra 1-10, for eksempel 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10. Eksempler på linkere inkluderer, men er ikke begrenset til, GGG (SEKV.ID. NR. 35), SGGSGGS (SEKV.ID. NR. 36), GGSGGSGGSGGSGGG (SEKV.ID. NR.
37), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEKV.ID. NR. 38), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEKV.ID. NR. 39). Linkeren eliminerer eller svekker ikke den biologiske aktiviteten til det kimære proteinet. Eventuelt kan linkeren forsterke den biologiske aktiviteten til det kimære proteinet, for eksempel ved å svekke effektene av sterisk hindring og dessuten gjøre det biologisk aktive molekylet mer tilgjengelig for sitt målbindingssete.
I en spesifikk utførelse har linkeren for interferon α en lengde på 15-25 aminosyrer. I en annen spesifikk utførelse har linkeren for interferon α en lengde på 15-20 aminosyrer. I en annen spesifikk utførelse har linkeren for interferon α en lengde på 10-25 aminosyrer. I en annen spesifikk utførelse har linkeren for interferon α en lengde på 15 aminosyrer. I en utførelse er linkeren for interferon α (GGGGS)n (SEKV.ID. NR. 40) hvor G representerer glysin, S representerer serin og n er et helt tall fra 1 til 10. I en spesifikk utførelse n lik 3.
Linkeren kan også inkorporere en gruppe som er i stand til å bli spaltet, enten kjemisk (for eksempel hydrolyse av en esterbinding), enzymatisk (for eksempel ved å inkorporere en proteasespaltingssekvens) eller fotolytisk (for eksempel ved hjelp av en kromofor så som 3-amino-3-(2-nitrofenyl)propionsyre (ANP)) for å frigjøre det biologisk aktive molekylet fra Fc-proteinet.
4. Kimær proteindimerisering ved å bruke spesifikke bindingspartnere
I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen en første polypeptidkjede som omfatter minst ett første domene, og hvor nevnte første domene har minst én spesifikk bindingspartner og en andre polypeptidkjede som omfatter minst ett andre domene, hvor nevnte andre domene er en spesifikk bindingspartner for nevnte første domene. Det kimære proteinet omfatter således et polypeptid som er i stand til å dimerisere seg med et annet polypeptid på grunn av interaksjonen mellom nevnte første og nevnte andre domene. Fremgangsmåter for å dimerisere antistoffer ved å bruke heterologe domener er kjent (U.S. patentene n5.
5,807,706 og 5,910,573; Kostelny et al. 1992, J. Immunol. 148(5): 1547).
Dimeriseringen kan skje ved at det dannes en kovalent binding eller alternativt en ikke-kovalent binding, for eksempel en hydrofob interaksjon, ved hjelp av Van der Waalske krefter, interdigitering av amfifile peptider så som, men ikke begrenset til, alfahelikser, ladning-ladningsinteraksjoner mellom aminosyrer som har motsatte ladninger så som, men ikke begrenset til, lysin og aspartinsyre, arginin og glutaminsyre. I en utførelse er domenet en heliksbunt som består av en heliks, en vridning og en ny heliks. I en annen utførelse er domenet en såkalt leukinzipper som omfatter et peptid med flere repeterende aminosyrer hvor hver syvende aminosyre er en leukinrest. I en utførelse er de spesifikke bindingspartnerne fos/jun (se Branden et al. 1991, Introduction To Protein Structure, Garland Publishing, New York).
I en annen utførelse blir bindingen styrt ved hjelp av kjemisk binding (se for eksempel Brennan et al. 1985, Science 229: 81). I denne utførelsen omfatter intakte immunoglobuliner eller kimære proteiner minst en del av et immunoglobulinkonstant område som spaltes for å utvikle tungkjedefragmenter. Disse fragmentene kan redusere i nærværet av det ditiolkompleksdannende middelet natriumarsenitt for derved å stabilisere nærliggende ditioler og hindre intermolekylær disulfiddannelse. De dannede fragmentene kan så omdannes til tionitrobenzoat (TNB) -derivater. Ett av TNB-derivatene kan så omdannes tilbake til tungkjedefragmenttiolen ved reduksjon med merkaptoetylamin som så blandes med en ekvimolar mengde av det andre TNB-derivatet for å danne en kimær dimer.
D. Nukleinsyrer
Oppfinnelsen angår et første nukleinsyrekonstrukt og et andre nukleinsyrekonstrukt som hver omfatter en nukleinsyresekvens som koder minst en del av det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen. I en utførelse omfatter det første nukleinsyrekonstruktet en nukleinsyresekvens som koder en del av et immunoglobulinkonstant område som operativt er forbundet med en andre DNA-sekvens som koder et biologisk aktivt molekyl og hvor nevnte andre DNA-konstrukt omfatter en DNA-sekvens som koder et immunoglobulinkonstant område men ikke et biologisk aktivt molekyl.
Det biologisk aktive molekylet kan for eksempel inkludere, men ikke begrenset til, en viral fusjonshemmer, en koaguleringsfaktor, en vekstfaktor eller et hormon, eller en reseptor, eller analog eller fragment av enhver av de foregående.
Nukleinsyresekvensene kan også inkludere ytterligere sekvenser eller elementer av velkjent type (for eksempel promoterer, forsterkere, poly A-sekvenser eller affinitetstagger). I en utførelse kan nukleinsyresekvensen i det andre konstruktet eventuelt inkludere en nukleinsyresekvens som koder en linker plassert mellom nukleinsyresekvensen som koder det biologisk aktive molekylet og delen av det immunoglobulinkonstante området. Nukleinsyresekvensen i det andre DNA-konstruktet kan eventuelt inkludere en linkersekvens som er plassert før eller etter den nukleinsyresekvensen som koder det biologisk aktive molekylet og/eller delen av det immunoglobulinkonstante området.
I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet DNA. I en annen utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet RNA. Nukleinsyrekonstruktet kan være en vektor, for eksempel en viral vektor eller et plasmid. Eksempler på virale vektorer inkluderer, men er ikke begrenset til, adenovirusvektor, en adenoassosiert virusvektor eller en museleukemivirusvektor. Eksempler på plasmider inkluderer, men er ikke begrenset til, pUC, pGEM og pGEX.
I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3a (SEKV.ID. NR.7). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3b (SEKV.ID. NR.9). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3c (SEKV.ID. NR. 11). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3d (SEKV.ID. NR.13). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3e (SEKV.ID. NR. 15). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3f (SEKV.ID. NR. 17). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3g (SEKV.ID. NR. 19). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3h (SEKV.ID. NR. 21). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3i (SEKV.ID. NR. 23). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3j (SEKV.ID. NR. 25). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 17a (SEKV.ID. NR. 27).
På grunn av den kjente degenereringen av den genetiske koden hvor mer enn ett kodon kan kode den samme aminosyren, så kan en DNA-sekvens variere fra det som er vist i SEKV.ID. NR.7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 eller 27 og ikke desto mindre kode et polypeptid som har den tilsvarende aminosyresekvensen som vist med SEKV.ID. NR. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 eller 26 henholdsvis. Slike variante DNA-sekvenser kan være et resultat av tause mutasjoner (som for eksempel opptrer under PCR-amplifisering) eller kan være et produkt av en bevisst mutagenese i en naturlig sekvens. Oppfinnelsen tilveiebringer således isolerte DNA-sekvenser som koder polypeptidene ifølge oppfinnelsen valgt fra: (a) Et DNA som omfatter nukleotidsekvensen fra SEKV.ID. NR. 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 24, 25 eller 27; (b) DNA som koder polypeptidene med SEKV.ID. NR. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 eller 26; (c) DNA som er i stand til å hybridisere seg til et DNA fra (a) eller (b) under betingelser med moderat stringens og som koder polypeptidet ifølge oppfinnelsen; (d) DNA som er i stand til hybridisering til et DNA fra (a) eller (b) under betingelser med høy stringens og som koder polypeptider ifølge oppfinnelsen; og (e) DNA som er degenerert som et resultat av den genetiske koden til et DNA som definert i (a), (b), (c) eller (d) og som koder polypeptidene ifølge oppfinnelsen. Polypeptider som er kodet av slike DNA-sekvenser omfattes selvsagt av oppfinnelsen.
I en annen utførelse som omfatter nukleinsyremolekylene en sekvens som koder det kimære proteinet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, så kan de også omfatte nukleotidsekvenser som er minst 80% identiske med en naturlig sekvens.
Oppfinnelsen angår også utførelser hvor et nukleinsyremolekyl som omfatter en sekvens som koder det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen, og hvor dette inkluderer en sekvens som er minst 90% identisk, minst 95% identisk, minst 98% identisk, minst 99% identisk eller minst 99,9% identisk til en naturlig sekvens. En naturlig sekvens kan inkludere enhver DNA-sekvens som ikke kunstig er endret. Identitetsprosenten kan bestemmes ved visuell undersøkelse og ved hjelp av matematiske beregninger. Alternativt kan prosent identitet mellom to nukleinsyresekvenser bestemmes ved å sammenligne sekvensinformasjon ved å bruke GAP-dataprogrammet, versjon 6.0, beskrevet av Devereux et al.1984, Nucl. Acids Res. 12: 387 og som er tilgjengelig fra University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). De foretrukne standardparametrene for GAP-programmet inkluderer: (1) En unær sammenligningsmatrise (inneholder en verdi på 1 for identiteter og 0 for ikke identiteter) for nukleotider og den veiede sammenligninsmatrisen til Gribskov og Burgess 1986, Nucl. Acids Res. 14: 6745, slik den er beskrevet av Schwartz og Dayhoff, red. 1979, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, sidene 353-358; (2) en penalitet på 3,0 for hvert gap og ytterligere 0,10 penalitet for hvert symbol i hvert gap; og (3) ingen penalitet for sluttgap. Man kan også bruke andre programmer som er velkjente innenfor bioteknologien med hensyn til sammenligning av sekvenser.
E. Syntese av kimære proteiner
Kimære proteiner som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og et biologisk aktivt molekyl kan syntetiseres ved å bruke velkjente teknikker. For eksempel kan de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen syntetiseres rekombinant i celler (se for eksempel Sambrook et al.1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. og Ausubel et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates og Wiley Interscience, N.Y.). Alternativt kan de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen syntetiseres ved å bruke kjente syntesemetoder så som en fastfasesyntese.
Synteseteknikker er velkjente innenfor bioteknologien (se for eksempel Merrifield, 1973, Chemical Polypeptides, (Katsoyannis og Panayotis red.) sidene 335-61;
Merrifield 1963, J. Am. Chem. Soc.85: 2149; Davis et al.1985, Biochem. Intl. 10: 394; Finn et al. 1976, The Proteins (3. utgave) 2: 105; Erikson et al. 1976, The Proteins (3. utgave) 2: 257; U.S. patent nr. 3,941,763. Alternativt kan de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen syntetiseres ved å bruke en kombinasjon av rekombinante og vanlig kjente syntesemetoder. For visse anvendelser kan det være fordelaktig å bruke enten en rekombinant metode eller en kombinasjon av en rekombinant og vanlig syntesemetode.
Nukleinsyrer som koder et biologisk aktivt molekyl kan lett syntetiseres ved å bruke velkjent rekombinant teknikk. Alternativt kan peptidene som sådan syntetiseres kjemisk. Nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres ved hjelp av standardmetoder, for eksempel ved å bruke et automatisert DNA-synteseapparat (for eksempel av den typen som er kommersielt tilgjengelig fra Biosearch, Applied Biosystems, osv.). Fosfortioatoligonukleotider kan for eksempel syntetiseres ved fremgangsmåten til Stein et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209, metylfosfonatoligonukleotider kan fremstilles ved hjelp av kontrollerte poreglasspolymerunderlag slik det er beskrevet i Sarin et al.1988, Proc. Natl. Scad. Sci. USA 85: 7448. Ytterligere fremgangsmåter for nukleinsyresyntese er velkjente innenfor bioteknologien (se for eksempel U.S. patentene 6,015,881; 6,281,331; 6,469,136).
DNA-sekvenser som koder immunoglobulinkonstante områder eller fragmenter av disse kan klones fra en rekke kjente genomiske eller cDNA-biblioteker. Teknikker for å isolere slike DNA-sekvenser ved å bruke probebaserte fremgangsmåter er velkjent teknikk innenfor bioteknologien. Prober for å isolere slike DNA-sekvenser kan være basert på publiserte DNA-sekvenser (se for eksempel Hieter et al. 1980, Cell 22: 197-207). Man kan også bruke den polymerasekjedereaksjons (PCR) -metoden som er beskrevet av Mullis et al. (U.S. patent nr.4,683,195) og Mullis (U.S. patent nr. 4,683,202). Valget av bibliotek og valg av prober for isolering av slike DNA-sekvenser vil lett kunne bestemmes av en person med faglig innsikt. Alternativt kan DNA-sekvenser som koder immunoglobuliner eller fragmenter av disse oppnås fra velkjente vektorer som inneholder immunoglobuliner eller fragmenter av disse.
For rekombinant produksjon kan en første polynukleotidsekvens som koder en del av det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen (for eksempel en del av et immunoglobulinkonstant område) og en andre polynukleotidsekvens som koder en del av det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen (for eksempel en del av et immunoglobulinkonstant område og et biologisk aktivt molekyl), innsettes i passende ekspresjonsenheter, for eksempel vektorer som inneholder de nødvendige elementene for transkripsjon og translatering av den eller de innsatte kodende sekvensene, eller i forbindelse med en RNA-viral vektor, de nødvendige elementene for replikasjon og translatering. Nukleinsyrene som koder det kimære proteinet blir innsatt i vektoren i en riktig leseramme.
Ekspresjonsenhetene eller -elementene blir så transfektert eller samtransfektert inn i en egnet målcelle som så vil uttrykke polypeptidene. Transfeksjonsteknikker er velkjente innenfor bioteknologien og inkluderer, men er ikke begrenset til, kalsiumfosfatutfelling (Wigler et al.1978, Cell 14: 725) og elektroporering (Neumann et al.1982, EMBO, J. 1: 841) og liposombaserte reagenser. En rekke forskjellige vertsekspresjonsvektorsystemer kan brukes for å uttrykke de kimære proteinene som er beskrevet her, inklusive både prokaryote eller eukaryote celler. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, mikroorganismer så som bakterier (for eksempel E. coli) transformert med rekombinante bakteriofag DNA- eller plasmide DNA-ekspresjonsvektorer som inneholder en passende kodende sekvens; gjær eller trådformede sopp som er transformert med rekombinante gjær- eller soppekspresjonsvektorer som inneholder passende kodende sekvenser; insektcellesystemer som er infisert med rekombinante virusekspresjonsvektorer (for eksempel baculovirus) som inneholder en passende kodende sekvens; plantecellesystemer som er infisert med rekombinante virusekspresjonsvektorer (for eksempel blomkålmosaikkvirus eller tobakkmosaikkvirus) eller transformert med rekombinante plasmidekspresjonsvektorer (for eksempel Ti-plasmid) som inneholder en passende kodende sekvens; eller dyrecellesystemer inklusive pattedyrceller (for eksempel CHO-, Cos- eller HeLa-celler).
Når det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen blir rekombinant syntetisert i en prokaryot celle, kan det være ønskelig å refolde det kimære proteinet. Det kimære proteinet fremstilt ved denne fremgangsmåten kan refoldes til en biologisk aktiv konformasjon ved å bruke velkjente betingelser, for eksempel denaturering under reduserende betingelser og så dialyse langsomt over i PBS.
Avhengig av de ekspresjonssystemer som brukes, kan det uttrykte kimære proteinet deretter isoleres ved hjelp av velkjente fremgangsmåter (for eksempel affinitetskromatografi, størrelsesutelukkelseskromatografi og ioneutbyttingskromatografi).
Ekspresjonsvektorene kan kode for merker som muliggjør lett rensing av det rekombinant fremstilte kimære proteinet. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til, vektor pUR278 (Ruther et al. 1983, EMBO J. 2: 1791) hvor kodende sekvenser for det kimære proteinet som beskrevet her kan ligeres inn i vektoren i ramme med det lac z-kodende området slik at det fremstilles et hybridprotein; pGEX-vektorer kan brukes for å uttrykke de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen med en glutation S-transferase (GST) -tag. Disse proteinene er vanligvis løselige og kan lett renses fra celler ved absorpsjon på glutation-agaroseperler fulgt av en eluering i nærvær av fritt glutatinon. Vektorene inkluderer spaltingsseter (trombin eller faktor Xa-protease eller PreScission Protease<TM >(Pharmacia, Peapack, N.J.)) for lett fjerning av nevnte merke etter rensing.
For å øke produksjonseffektiviteten, kan polynukleotidene utformes slik at de koder multiple enheter av det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen skilt av enzymatiske spaltingsseter. Det resulterende polypeptidet kan så spaltes (for eksempel ved behandling med det passende enzymet) for å innvinne polypeptidenhetene. Dette kan øke utbyttet av polypeptider som drives av en enkelt promoter. Når denne brukes i passende virale ekspresjonssystemer, så vil translateringen av hvert enkelt polypeptid som kodes av mRNA styres internt i transkriptet, for eksempel ved hjelp av et internt ribosominntrengningssete, IRES. Det polycistroniske konstruktet styrer således transkriberingen av et enkelt stort polycistronisk mRNA som så igjen styrer translateringen av multiple individuelle polypeptider. Denne fremgangsmåten eliminerer produksjonen og den enzymatiske bearbeidingen av polyproteiner og kan i betydelig grad øke utbyttet av polypeptid som drives av en enkelt promoter.
Vektorer som brukes i transformeringen vil vanligvis inneholde en selekterbar markør som kan brukes for å identifisere transformantene. I bakteriesystemer kan denne markøren inkludere et antibiotikaresistensgen så som ampicillin eller kanamycin. Egnede markører som kan brukes i dyrkede pattedyrceller inkluderer gener som gir resistens for medikamenter så som neomycin, hygromycin og metotreksat. Den selekterbare markøren kan være en amplifiserbar selekterbar markør. En slik amplifiserbar selekterbar markør er DHFR-genet. Andre amplifiserbare markører er DHFR cDNA (Simonsen og Levinson 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495). En oversikt over selekterbare markører er gitt av Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA) og valget av selekterbare markører kan lett gjøres av bioteknologisk kompetente personer.
Selekterbare markører kan innføres i cellen på et separat plasmid på samme tid som genet av interesse, eller de kan innføres på det samme plasmidet. Hvis dette skjer på det samme plasmidet, kan den selekterbare markøren og genet av interesse være under kontroll av forskjellige promoterer eller den samme promoteren, og det sistnevnte arrangementet gir et dicistronisk budskap. Konstrukter av denne type er velkjente (for eksempel U.S. patent nr. 4,713,339).
Ekspresjonselementene i ekspresjonssystemene varierer med hensyn til styrke og spesifisitet. Avhengig av de verts/vektorsystemet som brukes, kan man bruke enhver av en rekke forskjellige egnede transkripsjons- og translateringselementer, inklusive konstitutive og induserbare promoterer i ekspresjonsvektoren. Når man for eksempel utfører en kloning i bakteriesystemer, så kan man bruke induserbare promoterer så som pL i bakteriofag �, plac, ptrp og ptac (ptrp-lac-hybridpromoter) og lignende; mens man når kloningen utføres i insektceller kan bruke promoterer så som baculovirus polyhedronpromoteren; og ved kloning i plantecellesystemer så kan man bruke promoterer avledet fra genomet i planteceller (for eksempel varmesjokkpromoteren; promoteren for den lille underenheten av RUBISCO; promoteren fra det klorofyll a/b-bindende proteinet) eller fra plantevirus (for eksempel 35S RNA-promoteren fra CaMV; kappeproteinpromoteren av TMV); og ved kloning i pattedyrcellesystemer kan man brukes promoterer avledet fra genomet i pattedyrceller (for eksempel metallotioneinpromoteren) eller fra pattedyrvirus (for eksempel adenovirus sen promoter; vacciniavirus 7,5 K-promoteren); og når man utvikler cellelinjer som inneholder multiple kopier av ekspresjonsproduktet, så kan man bruke SV40-, BPV- og EBV-baserte vektorer med en passende selekterbar markør.
I de tilfeller hvor det brukes planteekspresjonsvektorer, så kan ekspresjonen av sekvenser som koder lineære eller ikke sykliserte former av det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen, drives av enhver av en rekke forskjellige promoterer. For eksempel kan man bruke virale promoterer så som 35S RNA- og 19S RNA-promoterne fra CaMV (Brisson et al. 1984, Nature 310: 511-514) eller kappeproteinpromoteren fra TMV (Takamatsu et al. 1987, EMBO J.6: 307-311); eller alternativt kan man bruke plantepromoterer så som den lille underenheten av RUBISCO (Coruzzi et al. 1984, EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie et al.1984, Science 224: 838-843) eller varmesjokkpromoterer, for eksempel soyabønne hsp17.5-E eller hsp17.3-B (Gurley et al. 1986, Mol. Cell. Biol.6: 559-565). Disse konstruktene kan innføres i planteceller ved å bruke Ti-plasmider, Ri-plasmider, plantevirusvektorer, direkte DNA-transformering, mikroinjeksjon, elektroporering, osv. For en oversikt over slike teknikker, se for eksempel Weissbach & Weissbach 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, del VIII, sidene 421-463; og Grierson & Corey 1988, Plant Molecular Biology, 2. utgave, Blackie, London, kapitlene 7-9.
I et insektekspresjonssystem som kan brukes for å fremstille de kimære proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelsen, så kan Autographa californica kjernepolyhidrosisvirus (AcNPV) brukes som en vektor for å uttrykke de fremmede genene. Dette viruset gror i Spodoptera frugiperda-celler. En kodende sekvens kan klones inn i ikke-essensielle områder (for eksempel polyhedrongenet) i nevnte virus og plasseres under kontroll av en AcNPV-promoter (for eksempel polyhedronpromoteren). En heldig innsetting av den kodende sekvensen vil resultere i en inaktivering av polyhedrongenet og produksjon av ikke-okludert rekombinant virus (det vil si virus som mangler den proteinaktige kappen som kodes av polyhedrongenet). Disse rekombinant virusene kan så brukes for å infisere Spodoptera frugiperda-celler hvor det innsatte genet så blir uttrykt (se for eksempel Smith et al. 1983, J. Virol.46: 584; U.S. patent nr. 4,215,051). Ytterligere eksempler på dette ekspresjonssystemet er gitt i Ausubel et al., red. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, bind 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.
Et annet system som kan brukes for å uttrykke de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen er glutaminsyntetase genekspresjonssystemet, også betegnet som "GS-ekspresjonssystemet" (Lonza Biologics PLC, Berkshire UK). Dette ekspresjonssystemet er detaljert beskrevet i U.S. patent nr. 5,981,216.
I pattedyrvertsceller kan man bruke en rekke forskjellige virusbaserte ekspresjonssystemer. I de tilfeller hvor det brukes et adenovirus som en ekspresjonsvektor, så kan en kodende sekvens ligeres til et adenovirus transkripsjons/translateringskontrollkompleks, for eksempel den sene promoteren og tripartittledersekvensen. Dette kimære genet kan så innsettes i adenovirusgenomet ved en in vitro eller in vivo rekombinasjon. Innsetting i et ikke-essensielt område av det virale genomet (for eksempel område E1 eller E3) vil resultere i et rekombinant virus som er levedyktig og i stand til å uttrykke peptidet i infiserte verter (se for eksempel Logan & Shenk 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655). Alternativt kan man bruke vaccinia 7,5 K-promoteren (se for eksempel Mackett et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415; Mackett et al. 1984, J. Virol. 49: 857; Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927).
I de tilfeller hvor det brukes et adenovirus som en ekspresjonsvektor, så kan en kodende sekvens ligeres til et adenovirus transkripsjons/translateringskontrollkompleks, for eksempel den sene promoteren og tripartittledersekvensen. Dette kimære genet kan så innsettes i adenovirusgenomet ved en in vitro eller in vivo rekombinasjon. Innsetting i et ikke-essensielt område av det virale genomet (for eksempel område E1 eller E3) vil resultere i et rekombinant virus som er levedyktig og i stand til å uttrykke peptidet i infiserte verter (se for eksempel Logan & Shenk 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655). Alternativt kan man bruke vaccinia 7,5 K-promoteren (se for eksempel Mackett et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415; Mackett et al. 1984, J. Virol. 49: 857; Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927).
Vertsceller som inneholder DNA-konstrukter av det kimære proteinet dyrkes i et passende vekstmedium. Begrepet "passende vekstmedium" slik det brukes her, betyr et medium som inneholder næringsstoffer som er nødvendige for vekst av cellene. Næringsstoffer som er nødvendige for cellevekst kan inkludere en karbonkilde, en nitrogenkilde, essensielle aminosyrer, vitaminer, mineraler og vekstfaktorer.
Eventuelt kan nevnte media inneholde storfekalveserum eller fosterkalveserum. I en utførelse inneholder nevnte media i alt vesentlig intet IgG. Vekstmediet vil generelt velges ut spesifikt for celler som inneholder DNA-konstruktet, for eksempel ved valg av medikament eller mangel på et vesentlig næringsstoff som så kan komplementeres eller suppleres av den selekterbare markøren på DNA-konstruktet eller som er samtransfektert med DNA-konstruktet. Pattedyrceller blir generelt dyrket i kommersielt tilgjengelige serumholdige eller serumfrie media (for eksempel MEM eller DMEM). Valg av et medium som er passende for den spesielle cellelinjen som brukes, vil lett kunne utføres av en molekylærbiologisk fagkompetent person.
Det rekombinant fremstilte kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan isoleres fra dyrkningsmediet. Dyrkningsmediet for passende dyrkede transformerte eller transfekterte vertsceller kan skilles fra cellematerialet og nærværet av de kimære proteinene kan så påvises. En fremgangsmåte for å påvise de kimære proteinene er for eksempel ved at disse enten helt eller delvis bindes til et spesifikt antistoff som gjenkjenner det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen. Et antikimært proteinantistoff kan være et monoklonalt eller polyklonalt antistoff som er utviklet mot det angjeldende kimære proteinet. For eksempel vil det kimære proteinet inneholde minst en del av et immunoglobulinkonstant område. Det er kjent mange antistoffer som gjenkjenner det konstante området i mange forskjelliger immunoglobuliner, og disse er kommersielt tilgjengelige. Man kan bruke et antistoff for å gjennomføre en ELISA eller et western blot for å påvise nærværet av de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen.
Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres i et transgent dyr så som en gnager, ku, gris, sau eller geit. Begrepet "transgene dyr" refererer seg til ikkehumane dyr hvor det i deres genom er inkorporert et fremmed gen. Fordi dette genet er tilstede i kimlinjevev, så vil det overføres fra foreldrene til avkommet. Eksogene gener blir innført i enkeltcelleembryoer (Brinster et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438). Fremgangsmåter for å fremstille transgene dyr er velkjente, inklusive transgene dyr som produserer immunoglobulinmolekyler (Wagner et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight et al.1983, Cell 34: 335; Brinster et al. 1983, Nature 306: 332; Ritchie et al.1984, Nature 312: 517;
Baldassarre et al.2003, Theriogenology 59: 831; Robl et al.2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne et al.2003, Xenotransplantation 10(3): 267).
Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles ved en kombinasjon av syntesekjemi og rekombinante teknikker. For eksempel kan en del av et immunoglobulinkonstant område uttrykkes rekombinant slik det er beskrevet ovenfor. Det biologisk aktive molekylet kan så fremstilles ved hjelp av kjent kjemisk synteseteknikk (for eksempel fastfasesyntese).
Delen av et immunoglobulinkonstant område kan ligeres til det biologisk aktive molekylet ved å bruke passende ligeringsteknikk og så kombineres med en del av et immunoglobulinkonstant område som ikke er blitt ligert til et biologisk aktivt molekyl for derved å danne det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen. I en utførelse er delen av et immunoglobulinkonstant området et Fc-fragment. Fc-fragmentet kan rekombinant fremstilles slik at det dannes Cys-Fc og reageres med et biologisk aktivt molekyl som uttrykker en tioester for derved å få fremstilt en monomerdimerhybrid. I en annen utførelse fremstilles en Fc-tioester som deretter reageres med et biologisk aktivt molekyl som uttrykker et N-terminuscystein (figur 4).
I en utførelse vil den delen av et immunoglobulinkonstant område som ligeres til det biologisk aktive molekylet danne homodimerer. Homodimerene kan kuttes eller brytes ved at de eksponeres overfor denaturerende og reduserende betingelser (for eksempel beta-merkaptoetanol og 8 M urea) og deretter kombineres med en del av et immunoglobulinkonstant område som ikke er forbundet med biologisk aktivt molekyl, slik at det dannes monomer-dimerhybrider. Disse kan så renatureres og foldes på nytt ved dialyse over i PBS og deretter isoleres, for eksempel ved størrelsesutelukkelses- eller affinitetskromatografi.
I en annen utførelse kan delen av et immunoglobulinkonstant område danne homodimerer før det forbindes til et biologisk aktivt molekyl. I denne utførelsen kan reaksjonsbetingelsene for å forbinde det biologisk aktive molekylet med homodimeren justeres slik at man begunstiger at bindingen av det biologisk aktive molekylet bare skjer til én kjede i homodimeren (for eksempel ved å justere de molare ekvivalentene for hver enkelt reaktant).
Det biologisk aktive molekylet kan kjemisk syntetiseres med et N-terminalt cystein. Sekvensen som koder en del av et immunoglobulinkonstant område kan subklones over i en vektor som koder intein forbundet med et kitinbindende domene (New England Biolabs, Beverly, MA). Inteinet kan forbindes med C-terminus i delen av et immunoglobulinkonstant område. I en utførelse blir delen av immunoglobulinet med inteinet forbundet med sin C-terminus, uttrykt i en prokaryot celle. I en annen utførelse blir delen av immunoglobulinet med inteinet forbundet med sin C-terminus, uttrykkes i en eukaryot celle. Den delen av et immunoglobulinkonstant område som er forbundet med intein kan reageres med MESNA. I en utførelse blir delen av et immunoglobulinkonstant område som er forbundet med intein, bundet til en kolonne, for eksempel en kitinkolonne og deretter eluert med MESNA. Det biologisk aktive molekylet og delen av et immunoglobulin kan reageres slik at det skjer en nukleofil omleiring, hvor det biologisk aktive molekylet blir kovalent forbundet med delen av et immunoglobulin via en amidbinding (Dawsen et al. 2000, Annu. Rev. Biochem. 69: 923). Det kimære proteinet syntetisert på denne måten kan eventuelt inkludere et linkerpeptid mellom delen av et immunoglobulin og det biologisk aktive molekylet. Linkeren kan for eksempel være syntetisert på N-terminus i det biologisk aktive molekylet. Anvendbare linkere kan inkludere peptider og/eller organiske molekyler (for eksempel polyetylenglykol og/eller korte aminosyresekvenser). Denne kombinerte rekombinerende og kjemiske syntesen gjør det mulig med en rask screening av biologisk aktive molekyler linkere for derved å optimalisere de forønskede egenskaper ved det kimære proteinet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, for eksempel viral hemming, hemostase, produksjon av røde blodceller, biologisk halvliv, stabilitet, binding til serumproteiner eller andre egenskaper som forefinnes i det kimære proteinet. Fremgangsmåten muliggjør også en inkorporering av ikke-naturlige aminosyrer i det kimære proteinet ifølge den foreliggende oppfinnelsen og som kan brukes for å optimalisere en forønsket egenskap i proteinet. Hvis det er ønskelig, kan det kimære proteinet fremstilt ved denne fremgangsmåten refoldes til en biologisk aktiv konformasjon ved å bruke velkjente betingelser, for eksempel reduserende betingelser og så en langsom dialyse over i PBS.
Alternativt kan det N-terminale cysteinet være plassert på delen av et immunoglobulinkonstant område, for eksempel et Fc-fragment. Det kan utvikles et Fc-fragment med et N-terminalt cystein ved å ta hensyn til det faktum at et naturlig Fc har et cystein i posisjon 226 (se Kabat et al.1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, MD).
For å eksponere et terminalt cystein, kan et Fc-fragment bli uttrykt rekombinant. I en utførelse blir Fc-fragmentet uttrykt i en prokaryot celle, for eksempel E. coli.
Den sekvensen som koder Fc-delen som begynner med Cys 226 (EU-nummerering) kan plasseres umiddelbart etter en sekvens som koder et signalpeptid, for eksempel OmpA, PhoA, STII. Den prokaryote cellen kan så osmotisk sjokkbehandles slik at den frigjør det rekombinante Fc-fragmentet. I en annen utførelse kan Fc-fragmentet fremstilles i en eukaryot celle, for eksempel en CHO-celle eller en BHK-celle. Den sekvensen som koder Fc-delfragmentet kan plasseres direkte etter en sekvens som koder et signalpeptid, for eksempel en muse Ig κ-lettkjede eller MHC klasse I Kbsignalsekvens, slik at når det rekombinante kimære proteinet syntetiseres av en eukaryot celle, så vil signalsekvensen bli spaltet og etterlate et N-terminalt cystein som kan isoleres og kjemisk reageres med et molekyl med en tioester (for eksempel en C-terminal tioester hvis molekylet omfattes av aminosyrer).
Det N-terminale cysteinet på et Fc-fragment kan også utvikles ved å bruke et enzym som spalter dets substrat ved dets N-terminus, for eksempel faktor X<a>, enterokinase og produktet kan isoleres og reageres med et molekyl med en tioester.
Det rekombinant uttrykte Fc-fragmentet kan brukes for å fremstille homodimerer eller monomer-dimerhybrider.
I en spesifikk utførelse blir et Fc-fragment uttrykt med et humant α-interferon signalpeptid inntil Cys-resten i posisjon 226. Når et konstrukt som koder dette polypeptidet blir uttrykt i CHO-celler, så vil sistnevnte celler spalte signalpeptidet i to distinkte posisjoner (ved Cys 226 og ved Val inne i signalpeptidet 2 aminosyrer oppstrøms fra N-terminusretningen). Dette gir en blanding av to typer av Fcfragmenter (ett med et N-terminalt Val og ett med et N-terminalt Cys). Dette resulterer så igjen i en blanding av forskjellige dimerer (homodimerer med terminal Val, homodimerer med terminal Cys og heterodimerer hvor en kjede har en terminal Cys mens den andre har en terminal Val). Fc-fragmentene kan reageres med et biologisk aktivt molekyl som har en C-terminal tioester og den resulterende monomer-dimerhybriden kan isoleres fra blandingen (for eksempel ved størrelsesutelukkelseskromatografi). Det er antatt at når andre signalpeptidsekvenser brukes for ekspresjon av Fc-fragmenter i CHO-celler, så vil det kunne utvikles en blanding av forskjellige Fc-fragmenter med minst to forskjellige N-termini.
I en annen utførelse kan et rekombinant fremstilt Cys-Fc danne en homodimer. Homodimeren kan reageres med et peptid som har en grenet linker på C-terminus og hvor den grenede linkeren har to C-terminale tioestere som kan reageres med Cys-Fc. I en annen utførelse har det biologisk aktive molekylet en enkel ikke-terminal tioester som kan reageres med Cys-Fc. Alternativt kan den grenede linkeren ha to C-terminale cysteiner som kan reageres med en Fc-tioester. I en annen utførelse har den grenede linkeren to funksjonelle grupper som kan reageres med Fc-tioesteren, for eksempel 2-merkaptoamin. Det biologisk aktive molekylet kan omfatte aminosyrer. Det biologisk aktive molekylet kan også inkludere et lite organisk molekyl eller et lite uorganisk molekyl.
F. Fremgangsmåter for anvendelse av kimære proteiner
De kimære proteinene ifølge oppfinnelsen har mange anvendelsesområder, noe som tør være innlysende for en person med faglig innsikt i bioteknologi inklusive, men ikke begrenset til, fremgangsmåter for å behandle en pasient som har en sykdom eller tilstand. Sykdommen eller tilstanden kan inkludere, men er ikke begrenset til, en virusinfeksjon, en hemostatisk lidelse, anemi, kreft, leukemi, en inflammatorisk tilstand eller en autoimmun sykdom (for eksempel artritt, psoriasis, lupus erytematose eller multippel sklerose) eller en bakterieinfeksjon (se for eksempel U.S. patentene 6,086,875, 6,030,613, 6,485,726; WO 03/077834; UW2003-0235536A1).
1. Fremgangsmåter for å behandle en pasient med en rød blodcellesvikt
Den foreliggende oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for å behandle en pasient som har svikt med hensyn til røde blodceller som for eksempel anemi, som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av minst ett kimært protein hvor dette omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor nevnte første kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og minst ett middel som er i stand til å indusere proliferering av røde blodceller, for eksempel EPO, og hvor den nevnte andre polypeptidkjeden omfatter minst en del av et immunoglobulin uten det middelet som er i stand til å indusere den røde blodcelleprolifereringen og som var tilstede på den første kjeden.
2. Fremgangsmåter for å behandle en pasient med en virusinfeksjon
Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for å behandle en pasient med en virusinfeksjon eller som er eksponert for virus, som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av minst ett kimært protein hvor dette omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor den første kjeden omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og minst ett antiviralt middel, for eksempel en fusjonshemmer eller interferon α, mens den andre polypeptidkjeden omfatter minst en del av et immunoglobulin uten det antivirale middelet fra den første kjeden. I en utførelse er pasienten infisert med et virus som kan behandles med IFN α, for eksempel hepatitt C-virus. I en utførelse er pasienten infisert med HIV så som HIV-1 eller HIV-2.
I en utførelse så hemmer det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen viral replikasjon. I en utførelse så hindrer eller hemmer det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen en viral inntrengning i målceller, hvorved man stopper, hindrer eller begrenser spredningen av en virusinfeksjon i en pasient og senker virusbyrden i en infisert pasient. Ved å forbinde en del av et immunoglobulin med en viral fusjonshemmer, vil oppfinnelsen kunne tilveiebringe et kimært protein med en viral fusjonshemmende aktivitet med større stabilitet og bedre biotilgjengelighet enn ved å anvende den virale fusjonshemmeren alene, for eksempel T20, T21 eller T1249. I en utførelse vil således den virale fusjonshemmeren svekke eller hindre en HIV-infeksjon i en målcelle, for eksempel HIV-1.
a. Tilstander som kan behandles
Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan brukes for å hemme eller hindre infeksjon i en målcelle av hepatittvirus, for eksempel hepatittvirus C. Det kimære proteinet kan omfatte et antiviralt middel som hemmer viral replikasjon.
I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen en fusjonshemmer. Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan brukes for å hemme eller hindre infeksjon i enhver målcelle ved enhver type virus (se for eksempel U.S. patentene 6,086,875, 6,030,613, 6,485,726; WO 03/077834; US2003-0235536A1). I en utførelse er nevnte virus et kappebelagt virus så som, men ikke begrenset til, HIV, SIV, meslinger, influensa, Epstein-Barrvirus, respiratorisk syncytiavirus eller parainfluensavirus. I en annen utførelse er nevnte virus et ikke-kappevirus så som rhinovirus eller poliovirus.
Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan brukes for å behandle en pasient som allerede er infisert med et virus. Pasienten kan være akutt infisert med et virus, eller alternativt kan pasienten være kronisk infisert med et virus. Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan også brukes profylaktisk for å behandle en pasient som har en risiko for å få en virusinfeksjon, for eksempel en pasient som er kjent for eller antatt å være i nær kontakt med et virus eller en pasient som man antar er infisert eller bærer et virus. Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan brukes for å behandle en pasient som kan være eksponert overfor et virus men som hittil ikke er blitt positivt diagnostisert.
I en utførelse angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å behandle en pasient som er infisert med HCV som omfatter å administrere pasienten en terapeutisk effektiv mengde av et kimært protein hvor det kimære proteinet omfatter et Fc-fragment av et IgG og et cytokin, for eksempel IFN α.
I en utførelse angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å behandle en pasient som er infisert med HIV og som omfatter å administrere pasienten en terapeutisk effektiv mengde av et kimært protein hvor dette omfatter et Fc-fragment av et IgG og den virale fusjonshemmeren som omfatter T20.
3. Fremgangsmåter for å behandle en pasient med en hemostatisk lidelse
Den foreliggende oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for å behandle en pasient med en hemostatisk lidelse som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av minst ett kimært protein hvor dette omfatter en første og en andre kjede og hvor nevnte første kjede omfatter minst én koaguleringsfaktor minst en del av et immunoglobulinkonstant område, mens nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område.
Det kimære proteinet ifølge den foreliggende oppfinnelsen behandler eller hemmer en hemostatisk lidelse ved å fremme dannelsen av en fibrinklump. Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan aktivere enhver forbindelse eller polypeptid som deltar i en koaguleringskaskade. Koaguleringsfaktoren kan delta i en ekstrinisk reaksjonsvei, intrinisk reaksjonsvei eller begge. I en utførelse er koaguleringsfaktoren faktor VII eller faktor VIIa. Faktor VIIa kan aktivere faktor X som virker sammen med faktor Va for å spalte protrombin til trombin som så igjen spalter fibrinogen til fibrin. I en annen utførelse er koaguleringsfaktoren faktor IX eller faktor IXa. I en ytterligere utførelse er koaguleringsfaktoren faktor VIII eller faktor VIIIa. I enda en ytterligere utførelse er koaguleringsfaktoren von Willebrandfaktor, faktor XI, faktor XII, faktor V, faktor X eller faktor XIII.
a. Tilstander som kan behandles
Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan brukes for å behandle enhver hemostatisk lidelse. De hemostatiske lidelser som kan behandles ved å administrere det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, hemofili A, hemofili B, von Willebrands sykdom, faktor XI-svikt (PTA-svikt), faktor XII-svikt så vel som forskjellige andre typer svikt og strukturelle abnormaliteter med hensyn til fibrinogen, protrombin, faktor V, faktor VII, faktor X eller faktor XIII.
I en utførelse er den hemostatiske lidelsen en arvet lidelse. I en utførelse har pasienten hemofili A og det kimære proteinet omfatter faktor VIII eller faktor VIIIa. I en annen utførelse har pasienten hemofili A og det kimære proteinet omfatter faktor VII eller faktor VIIa. I en annen utførelse har pasienten hemofili B og det kimære proteinet omfatter faktor IX eller faktor IXa. I en annen utførelse har pasienten hemofili B mens det kimære proteinet omfatter faktor VII eller faktor VIIa. I en annen utførelse har pasienten hemmende antistoffer til faktor VIII, faktor VIIIa og det kimære proteinet omfatter faktor VII eller faktor VIIa. I en ytterligere utførelse har pasienten hemmende antistoffer mot faktor IX eller faktor IXa og det kimære proteinet omfatter faktor VII og faktor VIIa.
Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan brukes profylaktisk for å behandle en pasient med en hemostatisk lidelse. Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan brukes for å behandle akutte blødningsepisoder i en pasient med en hemostatisk lidelse.
I en utførelse er den hemostatiske lidelsen et resultat av en svikt i en koagulasjonsfaktor, for eksempel faktor IX eller faktor VIII. I en annen utførelse er den hemostatiske lidelsen et resultat av en defekt koaguleringsfaktor, for eksempel von Willebrands faktor.
I en annen utførelse kan den hemostatiske lidelsen være en ervervet lidelse. Den ervervede lidelsen kan være et resultat av en underliggende sekundær sykdom eller tilstand. Den urelaterte tilstanden kan for eksempel være, men er ikke begrenset til, kreft, en autoimmun sykdom eller svangerskap. Den ervervede lidelsen kan være et resultat av alder eller fra medisinsk behandling som er brukt for å behandle en underliggende sekundær lidelse (for eksempel kreftkjemoterapi).
4. Fremgangsmåter for å behandle en pasient som har behov for et generelt hemostatisk middel
Oppfinnelsen angår også fremgangsmåter for å behandle en pasient som ikke har en hemostatisk lidelse eller en sekundær sykdom eller tilstand som resulterer at pasienten får en hemostatisk lidelse. Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte for å behandle en pasient som har behov for et generelt hemostatisk middel og som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av minst ett kimært protein hvor dette omfatter en første og en andre polypeptidkjede, og hvor nevnte første polypeptidkjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og minst én koaguleringsfaktor, mens nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten koagulasjonsfaktoren fra den første polypeptidkjeden.
a. Tilstander som kan behandles
I en utførelse er den pasienten som har behov for et generelt hemostatisk middel under kirurgisk behandling eller skal behandles kirurgisk. Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan administreres før eller etter det kirurgiske inngrepet som et profylaktikum. Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan administreres under eller etter et kirurgisk inngrep for å kontrollere en akutt blødningsepisode. Det kirurgiske inngrepet kan inkludere, men er ikke begrenset til, levertransplantering, leverreseksjon eller stamcelletransplantering.
Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan brukes for å behandle en pasient med en akutt blødning og som ikke har en hemostatisk lidelse. Den akutte blødningen kan være et resultat av et alvorlig traume, for eksempel kirurgisk inngrep, en bilulykke, et sår, et skuddsår eller enhver annen traumatisk begivenhet som resulterer i ukontrollert blødning.
5. Behandlingsmodaliteter
Det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan administreres intravenøst, subkutant, intramuskulært eller via enhver slimhinneoverflate, for eksempel oralt, sublingualt, bukalt, sublingualt, nasalt, rektalt, vaginalt eller via lungene. Det kimære proteinet kan implanteres inne i eller forbundet med et fast underlag av en biopolymer som muliggjør langsom frigjøring av det kimære proteinet på et forønsket sted.
Dosen av det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen vil variere avhengig av pasienten og den spesielle administrasjonsvei som brukes. Dosene kan variere fra 0,1 til 100000 μg/kg kroppsvekt. I en utførelse er doseringsområdet fra 0,1 til 1000 μg/kg. Proteinet kan administreres kontinuerlig eller på spesifiserte tidspunkter. In vitro prøver kan brukes for å bestemme de optimale doseområdene og/eller administreringsregimene. Det er kjent mange in vitro prøver for å måle viral ineffektivitet. For eksempel kan en revers transkriptaseprøve eller en rt-PCR-prøve eller såkalt grenet DNA-prøve brukes for å måle HIV-konsentrasjoner. En StaClotprøve kan brukes for å måle koaguleringsaktiviteten. Videre kan effektive doser ekstrapoleres fra doseresponskurver som er oppnådd via dyremodeller.
Oppfinnelsen angår også en farmasøytisk sammensetning som omfatter en viral fusjonshemmer med minst en del av et immunoglobulin og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel. Eksempler på egnede farmasøytiske bærere er beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences av E.W. Martin.
Eksempler på fortynningsmidler er stivelse, glukose, laktose, sukrose, gelatin, malt, ris, mel, kalk, silikagel, natriumstearat, glyserolmonostearat, talkum, natriumklorid, tørket skummet melk, glyserol, propylenglykol, vann, etanol og lignende.
Sammensetningen kan også inneholde pH-bufferreagenser og fukte- og emulgeringsmidler.
For oral administrering kan den farmasøytiske sammensetningen være i form av tabletter eller kapsler fremstilt å vanlig kjent måte. Sammensetningen kan også fremstilles som en væske, for eksempel som en sirup eller en suspensjon. Væsken kan inkludere suspenderingsmidler (for eksempel sorbitolsirup, cellulosederivater eller hydrogenerte spiselige fett), emulgeringsmidler (lecitin eller akasie), ikkevandige væsker (for eksempel mandelolje, oljeaktige estere, etylalkohol eller fraksjonerte vegetabilske oljer) og konserveringsmidler (for eksempel metyl- eller propyl-p-hydroksybenzoater eller sorbinsyre). Preparatene kan også inneholde smaksstoffer, fargestoffer og søtningsmidler. Alternativt kan sammensetningen være opparbeidet som et tørt produkt som så kan konstitueres med vann eller en annen egnet væske.
For bukal eller sublingual administrering kan sammensetningen være i form av tabletter, drops eller raskt oppløselige filmer fremstilt på vanlig kjent måte.
For administrering ved inhalering kan forbindelsene som skal brukes ifølge den foreliggende oppfinnelsen hensiktsmessig tilføres i form av en aerosolspray fra en beholder under trykk eller en forstøvningsanordning (for eksempel i PBS) med et egnet drivmiddel, for eksempel diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluormetan, karbondioksid eller enhver annen egnet gass. I forbindelse med en aerosol under trykk, kan doseringsenheten bestemmes ved at det er tilveiebrakt en ventil som leverer en oppmålt mengde. Kapsler eller patroner, for eksempel av gelatin som skal brukes i et inhaleringsapparat eller i en insufflator kan opparbeides slik at det inneholder en pulverblanding av forbindelsen og en egnet pulverbase, for eksempel laktose eller stivelse.
Den farmasøytiske sammensetningen kan også opparbeides for parenteral administrering (for eksempel intravenøst eller intramuskulært) ved en bolusinjeksjon. Preparater for injeksjon kan være opparbeidet i enhetsdoseform, for eksempel i ampuller eller i multidosebeholdere med tilsatt konserveringsmiddel. Sammensetningene kan være i form av suspensjoner, løsninger eller emulsjoner i oljeholdige eller vandige væsker, og kan inneholde hjelpestoffer så som suspenderingsmidler, stabilisatorer og/eller dispergeringsmidler. Alternativt kan den aktive bestanddelen være i pulverform for konstituering med en egnet væske, for eksempel pyrogenfritt vann.
Den farmasøytiske sammensetningen kan også formuleres for rektal administrering som en stikkpille eller retensjonsenema og kan for eksempel inneholde vanlige stikkpillebaser så som kakaosmør eller andre glyserider.
6. Kombinasjonsterapi
Det kimære proteinet ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan brukes for å behandle en pasient med en sykdom eller tilstand i kombinasjon med minst ett annet kjent middel for å behandle nevnte sykdom eller tilstand.
I en utførelse angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å behandle en pasient som er infisert med HIV og som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av minst ett kimært protein som omfatter en første og en andre kjede, hvor første kjede omfatter en HIV-fusjonshemmer og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og den andre kjeden omfatter minst en del av et immunoglobulin uten en HIV-fusjonshemmer som i den første kjeden, i kombinasjon med minst ett annet anti-HIV-middel. Nevnte andre anti-HIV-middel kan være ethvert terapeutisk middel som har vist anti-HIV-aktivitet. Nevnte andre anti-HIV-middel kan for eksempel inkludere som et eksempel, men ikke begrenset til, en proteasehemmer (for eksempel Amprenavir <®>, Crixivan <®>, Rotonivir <®>), en revers transkriptase nukleosidanalog (for eksempel AZT, DDI, D4T, 3TC og Ziagen <®>), en ikke-nukleosidanalog revers transkriptasehemmer (for eksempel Sustiva <®>), en annen HIV-fusjonshemmer, et nøytraliserende antistoff som er spesifikt til HIV, et antistoff som er spesifikt til CD4, en CD4-etterligning, for eksempel et CD4-IgG2-fusjonsprotein (U.S. patentsøknad 09/912,824) eller et antistoff som er spesifikt til CCR5 eller CXCR4 eller en spesifikk bindende partner for CCR5 eller CXCR4.
En annen utførelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for å behandle en pasient med en hemostatisk lidelse som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av minst ett kimært protein som omfatter en første og en andre kjede og hvor nevnte første kjede omfatter minst én koaguleringsfaktor og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, mens nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten koaguleringsfaktoren fra nevnte første kjede, i kombinasjon med minst én annen koaguleringsfaktor eller middel som fremmer hemostase. Nevnte andre koaguleringsfaktor eller middel som fremmer hemostase kan være ethvert terapeutikum som har vist koaguleringsaktivitet. Som et eksempel, men ikke som en begrensning, kan koaguleringsfaktoren eller det hemostatiske middelet inkludere faktor V, faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor X, faktor XI, faktor XII, faktor XIII, protrombin eller fibrinogen eller aktiverte former av enhver av de foregående. Koaguleringsfaktoren eller det hemostatiske middelet kan også inkludere antifibrinolytiske medikamenter, for eksempel epsilon-aminokaproinsyre eller tranexaminsyre.
7. Fremgangsmåter for å hemme viral fusjon inne i en målcelle
Den foreliggende oppfinnelsen angår også en in vitro metode for å hemme HIV-fusjon med en pattedyrcelle som omfatter å kombinere pattedyrcellen med minst ett kimært protein, hvor det kimære proteinet omfatter en første og en andre kjede, og hvor nevnte første kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og en HIV-hemmer, mens nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten HIV-hemmeren fra den første kjeden.
Pattedyrcellen kan være enhver celle eller cellelinje som er følsom for infeksjon av HIV inklusive, men ikke begrenset til, primære humane CD4<+ >T-celler eller makrofager, MOLT-4-celler, CEM-celler, AA5-celler eller HeLa-celler som uttrykker CD4 på celleoverflaten-
G. Fremgangsmåter for å isolere kimære proteiner
Når de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen blir fremstilt, vil de typisk forefinnes i en blanding av andre molekyler så som andre proteiner eller proteinfragmenter. Oppfinnelsen tilveiebringer således fremgangsmåter for å isolere ethvert av de kimære proteinene som er beskrevet tidligere fra en blanding som inneholder de kimære proteinene. Man har funnet at de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen binder seg til fargestoffligander under egnede betingelser og at ved å endre disse betingelsene etter binding, kan bryte bindingen mellom fargestoffliganden og det kimære proteinet, og derved tilveiebringe en fremgangsmåte for å isolere det kimære proteinet. I visse utførelser kan blandingen omfatte en monomerdimerhybrid, en dimer og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, for eksempel en Fc. I en utførelse tilveiebringer således oppfinnelsen en fremgangsmåte for å isolere en monomer-dimerhybrid. I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å isolere en dimer.
I en utførelse tilveiebringer følgelig oppfinnelsen en fremgangsmåte for å isolere en monomer-dimerhybrid fra en blanding, hvor blandingen omfatter
a) monomer-dimerhybriden som omfatter en første og en andre polypeptidkjede, hvor den første kjeden omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, og hvor den andre kjeden omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten et biologisk aktivt molekyl eller et immunoglobulinvariabelt område;
b) en dimer som omfatter en første og en andre polypeptidkjede hvor både den første og den andre kjeden omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område; og
c) en del av et immunoglobulinkonstant område; og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter
1) å kontakte blandingen med en fargestoffligand som er forbundet med et fast underlag under slike betingelser slik at både monomer-dimerhybriden og dimeren binder seg til fargestoffliganden;
2) fjerne den ubundne delen av et immunoglobulinkonstant område;
3) endre de egnede betingelsene fra avsnitt 1) slik at bindingen mellom monomerdimerhybriden og fargestoffliganden som er forbundet med det faste underlaget brytes;
4) isolere monomer-dimerhybriden.
Før man kontakter blandingen med en fargestoffligand, så kan blandingen i visse utførelser først kontaktes et kromatografisk stoff så som protein A-sefarose eller lignende. Blandingen blir eluert fra det kromatografiske stoffet ved å bruke en passende elueringsbuffer (for eksempel en buffer med lav pH), hvoretter eluatet som inneholder blandingen kontaktes fargeliganden.
Egnede betingelser for å kontakte blandingen med fargestoffliganden kan inkludere en buffer som holder blandingen på en passende pH-verdi. En passende pH-verdi kan inkludere en pH fra 3-10, 4-9 eller 5-8. I en utførelse er den passende pH-verdien 8,0. Man kan anvende enhver kjent buffer så lenge denne opprettholder pHverdien i det passende området, for eksempel tris, HEPES, PIPES eller MOPS. Egnede betingelser kan også inkludere en vaskebuffer for å eluere ubundne proteiner fra fargestoffliganden. Vaskebufferen kan være enhver buffer som ikke bryter bindingen av et bundet polypeptid. For eksempel kan vaskebufferen være den samme bufferen som brukes i kontakttrinnet.
Så snart det kimære proteinet er bundet til fargestoffliganden, kan det kimære proteinet isoleres ved å endre de egnede betingelsene. En endring av betingelsen kan inkludere at det tilsettes et salt til bufferen. I så henseende kan man bruke ethvert salt, for eksempel natriumklorid eller kaliumklorid. Saltet bør tilsettes ved så høy konsentrasjon at man bryter bindingen mellom fargestoffliganden og det forønskede proteinet, for eksempel en monomer-dimerhybrid.
I enkelte utførelser hvor blandingen omfatter en Fc, en monomer-dimerhybrid ng en dimer, har man funnet at ndvnte Fc ikke binder seg til fargestoffliganden og vil således bli eluert med den gjennomgående strømmen. Dimeren binder seg kraftigere til fargestoffliganden enn monomer-dimerhybriden. Det kreves således en høyere saltkonsentrasjon for å bryte bindingen mellom dimeren og fargestoffliganden sammenlignet med den saltkonsentrasjonen som er nødvendig for å bryte bindingen mellom fargestoffliganden og monomer-dimerhybriden.
I visse utførelser kan natriumklorid brukes for å isolere monomer-dimerhybriden fra blandingen. I enkelte utførelser vil den passende saltkonsentrasjonen som bryter bindingen mellom fargestoffliganden og monomer-dimerhybriden variere fra 200 til 700 mM, 300-600 mM eller 400-500 mM. I en utførelse vil konsentrasjonen av NaCl som er nødvendig for å bryte bindingen mellom fargestoffliganden og monomer-dimerhybriden være 400 mM.
NaCl kan også brukes for å isolere dimeren fra blandingen. Typisk vil monomerdimerhybriden bli isolert fra blandingen før dimeren. Dimeren isoleres ved å tilsette en passende saltkonsentrasjon til bufferen, noe som bryter bindingen mellom fargestoffliganden og dimeren. I enkelte utførelser vil en passende saltkonsentrasjon som bryter bindingen mellom fargestoffliganden og dimeren være fra 800 mM til 2 M, fra 900 mM til 1,5 M eller fra 950 mM til 1,2 M. I en spesifikk utførelse brukes det 1 M NaCl for å bryte bindingen mellom fargestoffliganden og dimeren.
Fargestoffliganden kan være et biomimetikum. Et biomimetikum er et menneskelig fremstilt stoff, anordning eller system som etterligner naturen. I enkelte utførelser vil således fargest/ffliganden etterligne eller imitere et molekyls naturlig forekommende ligand. Fargestoffliganden kan velges fra Mimetic Red 1<TM>, Mimetic Red 2<TM>, Mimetic Orange 1<TM>, Mimetic Orange 2<TM>, Mimetic Orange 3<TM>, Mimetic Yellow 1<TM>, Mimetic Yellow 2<TM>, Mimetic Green 1<TM>, Mimetic Blue 1<TM >og Mimetic Blue 2<TM >(Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). I en spesifikk utførelse er fargestoffliganden Mimetic Red 2<TM >(Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). I visse utførelser er fargestoffliganden forbundet med et fast underlag, for eksempel fra Mimetic Red 1A6XL<TM>, Mimetic Red 2 A6XL<TM>, Mimetic Orange 1 A6XL<TM>, Mimetic Orange 2 A6XL<TM>, Mimetic Orange 3 A6XL<TM>, Mimetic Yellow 1 A6XL<TM>, Mimetic Yellow 2 A6XL<TM>, Mimetic Green 1 A6XL<TM>, Mimetic Blue 1 A6XL<TM >og Mimetic Blue 2 A6XL<TM >(Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ).
Fargestoffliganden kan være bundet til et fast underlag. Det faste underlaget kan være ethvert fast underlag av velkjent type innenfor bioteknologien (se for eksempel www.seperationsNOW.com). Eksempler på faste underlag kan inkludere en perle, en gel, en membran, en nanopartikkel eller en mikrokule. Det faste underlaget kan bestå av ethvert materiale som kan forbindes med en fargestoffligand (for eksempel agarose, polystyren, sefarose eller sefadex). De faste underlagene kan omfatte enhver syntetisk kjent organisk polymer så som polyakrylsyre, vinylpolymerer, akrylat, polymetakrylat og polyakrylamid. De faste underlagene kan også omfatte en karbohydratpolymer, for eksempel agarose, cellulose eller dekstran. De faste underlagene kan også omfatte uorganiske oksider så som silika, zirkonium, titan, ceria, alumina, magnesia (det vil si magnesiumoksid) eller kalsiumoksid. De faste underlagene kan også omfatte kombinasjoner av enkelte av de ovennevnte faste underlagene som inkluderer, men som ikke er begrenset til, dekstranakrylamid.
Eksempler
Eksempel 1: Molekylvekten påvirker FcRn-kontrollert transcytose
Kimære proteiner som omfatter forskjellige proteiner av interesse og IgG Fc ble fremstilt rekombinant (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), eller når det gjelder kontaktin-Fc, MAB- β-gal (et kompleks av et monoklonalt antistoff bundet til β-gal) (Biodesign International, Saco, ME) og MAB-GH (et kompleks av monoklonalt antistoff og veksthormon) (Research Diagnostics, Inc. Flanders, NJ), så ble disse kjøpt kommersielt. Kort fortalt så ble de genene som kodet proteinet av interesse klonet ved hjelp av PCR og så subklonet inn i et Fc-fusjonsekspresjonsplasmid. Plasmidene ble så transfektert inn i DG44 CHO-celler og stabile transfektanter ble valgt ut og amplifisert med metotreksat. De kimære proteinhomodimerene ble renset ved hjelp av en protein A-kolonne. De proteiner som ble undersøkt inkluderte interferon α, veksthormon, erytropoietin, follikkelstimulerende hormon, faktor IX, beta-galaktosidase, kontaktin og faktor VIII. Ved å forbinde proteinene til immunoglobulindeler, inklusive den FcRn-reseptorbindende partneren, eller bruke kommersielt tilgjengelig helt antistoff (inklusive det FcRn-bindende området) -antigenkomplekser, gjorde det mulig å undersøke transcytose som en funksjon av molekylvekten (se U.S. patent nr. 6,030,613). De kimære proteinene ble administrert rotter oralt og serumnivåene ble målt 2-4 timer etter administrering ved å bruke en ELISA for de rekombinant fremstilte kimære proteinene, og både et western blot og ELISA for de antistoffkomplekser og kimære proteiner som var kjøpt kommersielt. Ytterligere ble alle de kommersielt oppnådde proteiner eller komplekser så vel som faktor VIII-Fc, faktor IX-Fc og Epo-Fc-kontroller behandlet med jod ved å bruke IODO-perler (Pierce, Pittsburg, PA). Resultatene indikerer at serumnivåene av Fc og de monoklonale antistoffkimære proteinene som ble oralt administrert til rotter er direkte relatert til størrelsen på proteinet. Det tilsynelatende avslutningspunktet for oralt administrert Fc-kimære proteiner er mellom 200 og 285 kD (tabell 2).
TABELL 2
Eksempel 2: Kloning av pcDNA 3.1-Flag-Fc
Sekvensen for FLAG-peptidet (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), en vanlig kjent affinitetstag som brukes for å identifisere eller rense proteiner, ble klonet inn i pcDNA 3.1-Fc-plasmidet som inneholder muse Ig κ-signalsekvensen fulgt av Fcfragmentet fra humant IgG1 (aminosyrene 221-447, EU-nummerering). Konstruktet ble fremstilt ved hjelp av overlappende PCR og ved å bruke de følgende primere:
FlagFc-F1: 5'-GCTGGCTAGCCACCATGGC-3' (SEKV.ID. NR. 41)
FlagFc-R1: 5'-CTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTCACCAGTGGAACCTGG AAC-3' (SEKV.ID. NR. 42)
FlagFc-F2: 5'-GACTACAAGG ACGACGATGA CAAGGACAAA ACTCACACAT GCCCACCGTG CCCAGCTCCG GAACTCC-3' (SEKV.ID. NR. 43)
FlagFc-R2: 5'-TAGTGGATCCTCATTTACCCG-3' (SEKV.ID. NR. 44).
pcDNA 3.1-Fc-templaten ble så tilsatt to separate PCR-reaksjoner som hver inneholdt 50 pmol av primerparene FlagFc-F1/R1 eller FlagFc-F2/R2 i et 50 μl reaksjonsvolum ved å bruke Pfu Ultra DNA-polymerase (Stratagene, CA) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke de følgende sykluser: 95 ºC 2 minutter; 30 sykluser med (95 ºC 30 sekunder, 52 ºC 30 skunder, 72 ºC 45 sekunder) fulgt av 72 ºC i 10 minutter. Produktene fra disse to reaksjonene ble så blandet i en annen PCR-reaksjon (2 μl hver) med 50 pmol av FlagFc-F1- og FlagFc-R2-primere i et reaksjonsvolum på 50 μl ved å bruke Pfu Ultra DNA-polymerase (Stratagene, CA) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke følgende sykluser: 95 ºC 2 minutter; 30 sykluser med (95 ºC 30 sekunder, 52 ºC 30 skunder, 72 ºC 45 sekunder) fulgt av 72 ºC i 10 minutter. Det resulterende fragmentet ble gelrenset, kuttet og innsatt i pcDNA 3.1-Fc-plasmidet NheI-BamHI. Det resulterende plasmidet inneholder muse Ig κ-signalsekvensen som produserer FlagFc-proteinet.
Eksempel 3: Kloning av faktor VII-Fc-konstrukt
Den kodende sekvensen for faktor VII ble oppnådd ved hjelp av RT-PCR fra human fosterlever RNA (Clontech, Palo Alto, CA). Det klonede området omfattet cDNA-sekvensen fra bp 36 til bp 1430 som er avsluttet like før stoppkodonet. Et SbfI-sete ble innført i N-terminus, mens et BspEI-sete ble innført i C-terminus. Konstruktet ble klonet ved hjelp av PCR og ved hjelp av følgende primere:
Nedstrøms: 5' GCTACCTGCAGGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGG 3' (SEKV.ID. NR. 45)
Oppstrøms: 5' CAGTTCCGGAGCTGGGCACGGCGGGCACGTGTGAGTTT TGTCGGGAAAT GG 3' (SEKV.ID. NR. 46)
og de følgende betingelser: 95 ºC i 5 minutter fulgt av 30 sykluser på 95 ºC i 30 sekunder, 55 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 1 minutt og 45 sekunder og til slutt en avsluttende forlengelsessyklus på 72 ºC i 10 minutter.
Fragmentet ble kuttet med SbfI-BspEI og innsatt i pED.dC-Fc, et plasmid som koder Fc-fragmentet fra et IgG1.
Eksempel 4: Kloning av faktor IX-Fc-konstruktet
Den humane faktor IX-kodende sekvensen inklusive prepropeptidsekvensen, ble fremstilt ved hjelp av RT-PCR-amplifisering fra voksen humant lever RNA ved å bruke de følgende primerne:
natFIX-F: 5'-TTACTGCAGAAGGTTATGCAGCGCGTGAACATG-3' (SEKV.ID. NR. 47)
F9-R: 5'-TTTTTCGAATTCAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATCC-3' (SEKV.ID. NR. 48)
20 ng av voksen humant lever RNA (Clontech, Palo Alto, CA) og 25 pmol av hver primer ble tilsatt en RT-PCR-reaksjon ved å bruke SuperScript<TM >ettrinns RP-PCR med PLATINUM ® Taq-systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved å følge fabrikantens protokoll. Reaksjonen ble utført i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke de følgende sykluser: 50 ºC i 30 minutter; 94 ºC i 2 minutter; 35 sykluser på (94 ºC i 30 sekunder, 58 ºC i 30 sekunder og 72 ºC i 1 minutt) og til slutt 72 ºC i 10 minutter. Fragmentet ble gelrenset ved å bruke et Qiagen gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og kuttet med PstI-EcoRI, gelrenset og klonet inn i den tilsvarende utkuttede delen av pED.dC.XFc-plasmidet.
Eksempel 5: Kloning av PACE-konstrukt
Den kodende sekvensen for human PACE (parret basisk aminosyrespaltende enzym), en endoprotease, ble fremstilt ved hjelp av RT-PCR. De følgende primere ble brukt:
PACE-F1: 5'-GGTAAGCTTGCCATGGAGCTGAGGCCCTGGTTGC-3' (SEKV.ID. NR. 49)
PACE-R1: 5'-GTTTTCAATCTCTAGGACCCACTCGCC-3' (SEKV.ID. NR. 50)
PACE-F2: 5'-GCCAGGCCACATGACTACTCCGC-3' (SEKV.ID- NR. 51)
PACE-R2: 5'-GGTGAATTCTCACTCAGGCAGGTGTGAGGGCAGC-3' (SEKV.ID. NR. 52)
PACE-F1-primeren adderer et HindIII-sete til 5'-enden av PACE-sekvensen som begynner med 3 nukleotider før startkodonet, mens PACE-¤2-primeren adderer et stoppkodon etter aminosyre 715 som er plassert ved enden av det ekstracellulære domenet i PACE så vel som en addering av et EcoRI-sete til 3'-enden av stoppkodonet. PACE-R1- og -F2-primerne binder seg på henholdsvis 3'- og 5'-sidene av et internt BamHI-sete. Det ble så utført to RT-PCR-reaksjoner ved å bruke 25 pmol av hver av primerparene PACE-F1/R1 eller PACE-F2/R2 med 20 ng av voksen humant lever RNA (Clontech; Palo Alto, CA) i en 50 μl RT-PCRreaksjonsblanding ved å bruke SuperScript<TM >One-Step RT-PCR med PLATINUM ® Taq-systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved å følge fabrikantens protokoll. Reaksjonene ble utført i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke følgende sykluser: 50 ºC i 30 minutter; 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 58 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 2 minutter) fulgt av 72 ºC i 10 minutter. Disse fragmentene ble begge ligert inn i vektoren pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) og sekvensert. F2-R2-fragmentet ble så subklonet inn i pcDNA6 V5/His (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved å bruke BamHI/EcoRI-setene og deretter ble F1-R1-fragmentet klonet inn i konstruktet ved å bruke HindIII/BamHI-setene. Det endelige plasmidet, pcDNA6-PACE, produserer en løselig form av PACE (aminosyrene 1-715) ettersom transmembranområdet er blitt fjernet. Sekvensen for PACE i pcDNA6-PACE er i alt vesentlig som beskrevet av Harrison et al.1998, Seminars in Hematology 35: 4.
Eksempel 6: Kloning av IFN α-Fc åtte aminosyrelinkerkonstrukt
Den humane interferon α 2b (hIFN α) -kodende sekvensen inklusive signalsekvensen, ble fremstilt ved hjelp av PCR fra humant genomisk DNA ved å bruke følgende primere:
INFa-Sig-F: 5'-GCTACTGCAGCCACCATGGCCTTGACCTTTGCTTTAC-3' (SEKV.ID. NR. 53)
IFNa-EcoR-R: 5'-CGTTGAATTCTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC-3' (SEKV.ID. NR. 54)
Genomisk DNA ble fremstilt fra en 373 MG human astrocytomcellelinje ved hjelp av standardmetoder (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Kort beskrevet ble omtrent 2 x 10<5 >celler pelletert ved hjelp av sentrifugering, på nytt suspendert i 100 μl fosfatbufret saltløsning pH 7,4 og så blandet med et tilsvarende volum av en oppløsningsbuffer (100 mM Tris pH 8,0/200 mM NaCl/2% SDS/5 mM EDTA). Proteinase K ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 100 μg/ml og prøven ble kuttet ved 37 ºC i 4 timer ved forsiktig blanding fra tid til annen. Prøven ble så ekstrahert to ganger med fenol:kloroform og DNA ble utfelt ved å tilsette natriumacetat ved pH 7,0 til en konsentrasjon på 100 mM og et tilsvarende volum isopropanol, hvoretter blandingen ble sentrifugert i 10 minutter ved romtemperatur.
Supernatanten ble fjernet og pelleten ble vasket en gang med kald 70% etanol og så lufttørket før den på nytt ble suspendert i TE (10 mM Tris pH 8,0/1 mM EDTA).
100 ng av dette genomiske DNA ble så brukt i en 25 μl PCR-reaksjonsblanding med 25 pmol av hver av primerne ved å bruke Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å bruke fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser på (94 ºC i 30 sekunder, 50 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 45 sekunder) og til slutt 72 ºC i 10 minutter. Båndet med den forventede størrelsen ( ~550 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA), kuttet med PstI/EcoRI, på nytt gelrenset og klonet inn i PstI/EcoRI-setet i pED.dC.XFc som inneholder en 8 aminosyrer lang linker (EFAGAAAV), fulgt av Fc-området fra humant IgG1.
Eksempel 7: Kloning av IFN αFc Δ-linkerkonstrukt
1 μg renset pED.dC.naturlig humant IFN αFc DNA fra eksempel 6 ble så brukt som en templat i en 25 μl PCR-reaksjonsblanding med 25 pmol av både primeren IFNa-Sig-F og den følgende primeren:
hIFNaNoLinkFc-R: 5'CAGTTCCGGAGCTGGGCACGGCGGG CACGTGTGAGTTTTGTCTTCCTTACTTCTTAAACTTTTTGCAAGTTTG-3' (SEKV.ID. NR. 55)
PCR-reaksjonen ble utført ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et RapidCycler termosykliseringsapparat (Idaho Technology, Salt Lake City, UT), denaturering ved 94 ºC i 2 minutter fulgt av 18 sykluser på 95 ºC i 15 sekunder, 55 ºC i 0 sekunder og 72 ºC i 1 minutt med en helning på 6, fulgt av en 72 ºC forlengelse i 10 minutter. Et PCR-produkt med den riktige størrelsen ( ~525 bp) ble gelrenset ved å bruke et gelekstraksjonssett (Qiagen; Valencia, CA), kuttet med PstI- og BspEI-restriksjonsenzymer, gelrenset og subklonet inn i de tilsvarende setene i et modifisert pED.dC.XFc hvor aminosyrene 231-233 i Fc-området var endret ved å bruke degenereringen av den genetiske koden for å inkorporere et BspEI-sete samtidig som man beholdt villtypeaminosyresekvensen.
Eksempel 8: Kloning av IFN αFc GS15-linkerkonstrukt
Det ble fremstilt en ny kjedevektor ved å bruke det Fc som ble funnet i Δ-linkerkonstruktet (som inneholder BspEI og RsrII-seter i 5'-enden ved å bruke degenereringen av den genetiske koden for å opprettholde aminosyresekvensen) og deretter bruke dette DNA som en templat for en PCR-reaksjon med de følgende primere:
5' B2xGGGGS: 5'gtcaggatccggcggtggagggagcgacaaaactcacacgtgccc 3' (SEKV.ID. NR. 56)
3' GGGGS: 5' tgacgcggccgctcatttacccggagacaggg 3' (SEKV.ID. NR.57)
En PCR-reaksjon ble utført med 25 pmol av hver av primerne ved å bruke Pfu Turbo-enzym (Stratagene, La Jolla, CA) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke den følgende fremgangsmåten: 95 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (95 ºC i 30 skunder, 54 ºC i 30 sekunder og 72 ºC i 2 minutter) og til slutt 72 ºC i 10 minutter. Et bånd med den forventede størrelsen ( ~730 bp) ble gelrenset med gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA), kuttet med BamHI/NotI; på nytt gelrenset og klonet inn i den BamHI/NotI-kuttede vektoren av pcDNA6 ID, en versjon av pcDNA6 med IRES-sekvensen og dhfr-gen innsatt i et NotI/XbaI-sete.
500 ng av renset pED.dC.nativt humant IFN αFc DNA ble så brukt som en templat i en 25 μl PCR-reaksjonsblanding med de følgende primere:
5' IFNa for GGGGS: 5' ccgctagcctgcaggccaccatggccttgacc 3' (SEKV.ID. NR. 58)
3' IFNa for GGGGS: 5' ccggatccgccgccaccttccttactacgtaaac 3' (SEKV.ID. NR. 59)
En PCR-reaksjon ble utført med 25 pmol av hver av primerne ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat ved de følgende sykluser: 95 ºC i 2 minutter; 14 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 48 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 1 minutt) og til slutt 72 ºC i 10 minutter. Et bånd med den forventede størrelsen ( ~600 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA), kuttet med NheI/BamHI, igjen gelrenset og så klonet inn i NheI/BamHI-setet i pcDNA6 ID/Fc-vektoren ovenfor for derved å frembringe en IFN α Fc-fusjon med en 10 aminosyrer Gly/Ser-linker (2 x GGGGS), pcDNA6 ID/IFN α-GS10-Fc.
Det ble så utført en PCR-reaksjon ved å bruke 500 ng av dette pcDNA6 ID/IFN α-GS10-Fc med de følgende primere:
5' B3XGGGGS: 5' (SEKV.ID. NR. 60)
gtcaggatccggtggaggcgggtccggcggtggagggagcgacaaaactcacacgtgccc 3' (SEKV.ID. NR. 61)
fcclv-R: 5' atagaagcctttgaccaggc 3' (SEKV.ID. NR.62)
Det ble så utført en PCR-reaksjon med 25 pmol av hver av primerne ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke de følgende sykluser: 95 ºC i 2 minutter; 14 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 48 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 1 minutt) og til slutt 72 ºC i 10 minutter. Et bånd med den forventede størrelsen (504 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA), kuttet med BamHI/BspEI, det 68 bp båndet ble gelrenset og klonet inn i BamHI/BspEI-setet for pcDNA6 ID/IFN α-GS10-Fc-vektoren for å frembringe en IFN α Fc-fusjon med en 15 aminosyrer Gly/Ser-linker (3 x GGGGS), pcDNA6 ID/IFN α-GS15-Fc.
Eksempel 9: Kloning av et basisk peptidkonstrukt
Hengselområdet i det humane IgG1 Fc-fragmentet fra aminosyre 221-229 (EU-nummerering) ble erstattet med et basisk peptid (CCB). Det ble brukt fire overlappende oligonukleotider (IDT, Coralville, IA):
1. CCB-Fc-sens 1:
5' GCC GGC GAA TTC GGT GGT GAG TAC CAG GCC CTG AAG AAG AAG GTG GCC CAG CTG AAG GCC AAG AAC CAG GCC CTG AAG AAG AAG 3' (SEKV.ID. NR. 63)
2. CCB-Fc-sens 2:
5'GTG GCC CAG CTG AAG CAC AAG GGC GGC GGC CCC GCC CCA GAG CTC CTG GGC GGA CCG A 3' (SEKV.ID. NR. 64)
3. CCB-Fc-antisens 1:
5' CGG TCC GCC CAG GAG CTC TGG GGC GGG GCC GCC GCC CTT GTG CTT CAG CTG GGC CAC CTT CTT CTT CAG GGC CTG GTT CTT G 3' (SEKV.ID. NR. 65)
4. CCB-Fc-antisens 2:
5' GCC TTC AGC TGG GCC ACC TTC TTC TTC AGG GCC TGG TAC TCA CCA CCG AAT TCG CCG GCA 3' (SEKV.ID. NR. 66)
Oligonukleotidene ble rekonstituert til en konsentrasjon på 50 μM med dH2O. 5 μl av hvert oligonukleotid ble festet til hverandre ved at de ble blandet i et tynnvegget PCR-rør med 2,2 μl av en restriksjonsbuffer nr. 2 (det vil si en sluttkonsentrasjon på 10 mM Tris HCl pH 7,9, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 1 mM ditiotreitol) (New England Biolabs, Beverly, MA) og oppvarmet til 95 ºC i 30 skunder og så hensatt for hybridisering med langsom avkjøling i 2 timer til 25 ºC.5 pmol av de nå hybridiserte oligonukleotidene ble ligert inn i en pGEM T-Easy-vektor som angitt i settmanualen (Promega, Madison, WI). Ligeringsblandingen ble tilsatt 50 μl DH5 αkompetente E. coli-celler (Invitrogen, Carlsbad, CA) på is i 2 minutter, innkubert ved 37 ºC i 5 minutter, innkubert på is i 2 minutter og så utplatet på LB 100 μg/l ampicillin agarplater og plassert i et kammer ved 37 ºC i 14 timer. Individuelle bakteriekolonier ble tatt ut og plassert i 5 ml av LB 100 μg/l ampicillin og hensatt for vekt i 14 timer. Rørene ble spunnet ned ved 2000xg, 4 ºC i 15 minutter, hvoretter vektor-DNA ble isolert ved å bruke Qiagen miniprepsettet (Qiagen, Valencia, CA) slik det er angitt i settmanualen. 2 μg av DNA ble kuttet med NgoM IV-Rsr-II. Fragmentet ble gelrenset ved hjelp av Qiaquick-metoden som angitt i settmanualen (Qiagen, Valencia, CA) og ligert til pED.dcEpoFc med NgoM IV/Rsr II. Ligeringen ble transformert over i DH5 α-kompetente E. coli-celler og DNA ble så fremstilt som beskrevet for pGEM T-Easy-vektoren.
Eksempel 10: Kloning av det erytropoietinsyre peptid Fc-konstruktet
Hengselområdet av det humane IgG1 Fc-fragmentet i EPO-Fc fra aminosyre 221-229 (EU-nummerering) ble erstattet med et surt peptid (CCA). De følgende fire overlappende oligonukleotidene ble brukt (IDT, Coralville, IA):
1. Epo-CCA-Fc-sens 1:
5' CCG GTG ACA GGG AAT TCG GTG GTG AGT ACC AGG CCC TGG AGA AGG AGG TGG CCC AGC TGG AG 3' (SEKV.ID. NR 67)
2. Epo-CCA-Fc-sens 2:
5' GCC GAG AAC CAG GCC CTG GAG AAG GAG GTG GCC CAG CTG GAG CAC GAG GGT GGT GGT CCC GCT CCA GAG CTG CTG GGC GGA CA 3' (SEKV.ID. NR. 68)
3. Epo-CCA-Fc-antisens 1:
5' GTC CGC CCA GCA GCT CTG GAG CGG GAC CAC CAC CCT CGT GCT CCA GCT GGG CCA C 3' (SEKV.ID. NR. 69)
4. Epo-CCA-Fc-antisens 2:
5' CTC CTT CTC CAG GGC CTG GTT CTC GGC CTC CAG CTG GGC CAC CTC CTT CTC CAG GGC CTG GTA CTC ACC ACC GAA TTC CCT GTC ACC GGA 3' (SEKV.ID. NR. 70)
Oligonukleotidene ble rekonstituert til en konsentrasjon på 50 μM med dH2O.5 μl av hvert oligonukleotid ble festet til hverandre ved at de ble blandet i et tynnvegget PCR-rør med 2,2 μl restriksjonsbuffer nr. 2 (New England Biolabs, Beverly, MA) og oppvarmet til 95 ºC i 30 sekunder og så hensatt for langsom avkjøling i løpet av 2 timer til 25 ºC. 5 pmol av de nå hybridiserte oligonukleotidene ble ligert inn i en pGEM T-Easy-vektor som angitt i settmanualen (Promega, Madison, WI).
Ligeringsblandingen ble tilsatt 50 μl av DH5 α-kompetente E. coli-celler (Invitrogen, Carlsbad, CA) på is i 2 minutter, innkubert ved 37 ºC i 5 minutter, innkubert på is i 2 minutter og så utplatet på LB 100 μg/l ampicillin agarplater og plassert i et kammer ved 37 ºC i 14 timer. Individuelle bakteriekolonier ble tatt ut og plassert i 5 ml LB 100 μg/l ampicillin og hensatt for dyrking i 14 timer. Rørene ble spunnet ned ved 2000xg, 4 ºC i 5 minutter og vektor-DNA ble fremstilt ved å bruke et Qiagen miniprepsett (Qiagen, Valencia, CA) ved å følge settmanualen. 2 μg av DNA ble kuttet med Age I-Rsr-II. Fragmentet ble gelrenset ved hjelp av Qiaquickmetoden som angitt i settmanualen (Qiagen, Valencia, CA) og ligert inn i pED.Epo Fc.1 Age I-Rsr II. Ligeringen ble så transformert inn i DH5 α-kompetente E. coli-celler og DNA fremstilt som beskrevet ovenfor.
Eksempel 11: Kloning av Cys-Fc-konstrukt
Ved å bruke PCR og standard molekylærbiologisk teknikk (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press), ble det utviklet et pattedyrekspresjonskonstrukt slik at den kodende sekvensen for det humane IFN α-signalpeptidet var plassert direkte inn mot den kodende sekvensen av Fc som begynner ved den første cysteinresten (Cys 226, EU-nummerering). Ved signalpeptidasespalting og utskillelse fra pattedyrceller, ble det således utviklet et Fc-protein med en N-terminal cysteinrest. Kort beskrevet ble følgende primere brukt:
IFNa-Sig-F (IFNa-Sif-F: 5' GCTACTGCAGCCACCATGGCCTTGACCTT TGCTTTAC-3') (SEKV.ID. NR. 71) og Cys-Fc-R (5'-CAGTTCCGGAGCTGGGCACGGCGGA GAGCCCACAGAGCAGCTTG-3') (SEKV.ID. NR. 72) i en PCR-reaksjon for å skape et fragment som forbinder IFN αsignalsekvensen med N-terminus i Fc som begynner med Cys 226. 500 ng av pED.dC.nativ hIFN α Δ-linker ble tilsatt 25 pmol av hver primer i en PCR-reaksjon med et Expand High Fidelity-system (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll. Reaksjonen ble utført i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 50 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 45 sekunder) og til slutt 72 ºC i 10 minutter. Båndet med den forventede størrelsen ( ~112 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA), kuttet med PstI- og BspEI-restriksjonsenzymer, gelrenset og deretter subklonet inn i de tilsvarende setene av pED.dC.nativ hIFN α Δ-linker for å utviklet pED.dC.Cys-Fc (figur 5).
Eksempel 12: Proteinekspresjon og fremstilling av Fc-MESNA
Den kodende sekvensen for Fc (det konstante området i humant IgG1) ble fremstilt ved hjelp av PCR-amplifisering fra et Fc-holdig plasmid ved å bruke standardbetingelser og reagenser og ved å følge fabrikantens anbefalte fremgangsmåte for å subklone den Fc-kodende sekvensen NdeI/SapI. Kort beskrevet ble primerne 5'-GTGGTCATATGGGCATTGAAGGCAGAGGCGCCGCTGCGGT CG-3' (SEKV.ID. NR. 73) og 5'-GGTGGTTGCTCTTCCGCAAAAACCCGGAGAC AGG GAGAGACTCTTCTGCG-3' (SEKV.ID. NR. 74) brukt for amplifisere Fcsekvensen fra 500 ng av plasmidet pED.dC.Epo-Fc ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Basel, Sveits) i et RapidCycler termosykliseringsapparat (Idaho Technology Salt Lake City, Utah) ved å anvende en denaturering ved 95 ºC i 2 minutter fulgt av 18 sykluser ved 95 ºC i 0 sekunder, 55 ºC i 0 sekunder og 72 ºC i 1 minutt med en nedtrapping på 4, fulgt av en forlengelse ved 72 ºC i 10 minutter. PCR-produktet ble subklonet i en intermediær kloningsvektor og sekvensert og deretter subklonet ved å bruke NdeI- og SapI-setene i pTWIN1-vektoren ved å følge standardmetoder. Sambrook, J., Fritsch, E.F. og Maniatis, T. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave; Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Dette plasmidet ble så transformert inn i BL21(DE3) pLysS-celler ved å bruke standard teknikker. En 1 liter kultur av celler ble dyrket til en absorpsjon på 0,8 AU ved 37 ºC, indusert med 1 mM isopropyl beta-D-1-tiogalaktopyranosid og dyrket over natten ved 25 ºC. Cellene ble nedsentrifugert, oppløst i 20 mM Tris 8,8/1% NP40/=,1 mM fenylmetansulfonylfluorid/1 μg/ml abenzonase (Novagen Madison, WI) og bundet til kitinperler (New England Biolabs; Beverly, MA) over natten ved 4 ºC. Perlene ble så vasket med flere kolonnevolumer av 20 mM Tris 8,5/500 mM NaCl/1 mM EDTA, og så lagret ved -80 ºC. Renset Fc-MESNA ble utviklet ved å proteinet ble eluert fra perlene i 20 mM Tris 8,5/500 mM NaCl/1 mM EDTA/500 mM 2-merkaptoetansulfonsyre (MESNA) og eluatet ble brukt direkte i det etterfølgende koblingsreaksjonen.
Eksempel 13: Faktor VII-Fc monomer-dimerhybridekspresjon og rensing
Det ble etablert CHO DG-44-celler som uttrykker faktor VII-Fc. CHO DG-44-cellene ble dyrket ved 37 ºC, 5% CO2 i MEM alfa pluss nukleosid og ribonukleosider og supplert med 5% varmeinaktivert storfefosterserum inntil transfeksjon.
DG44-celler ble utplatet i 100 mm vevsdyrkningspetriskåler og dyrket til en sammenflytning på 50%-60%. Totalt 10 μg av DNA ble brukt for å transfektere en 100 mm skål: 7,5 μg pED.dC.FVII-Fc 1,5 ºg pcDNA3/Flag-Fc 1 μg pcDNA6-PACE. Cellene ble transfektert som beskrevet i Superfect transfeksjonsreagensmanualen (Qiagen, Valencia, CA). Media ble fjernet fra transfeksjonen etter 48 timer og erstattet med MEM alfa uten nukleosider pluss 5% dialysert storfefosterserum og 10 μg/ml blasticidin (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 0,2 mg/ml geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter 10 dager ble cellene fjernet fra platen med 0,25% trypsin og overført til T25 vevsdyrkningskolber og seleksjonen ble fortsatt i 10-14 dager inntil cellene vokste så bra at det var etablert stabile cellelinjer. Proteinekspresjonen ble deretter amplifisert ved å tilsette 25 nM metotreksat.
Omtrent 2 x 10<7 >celler ble brukt for å inokulere 300 ml vekstmedium i en 1700 cm<2 >rullekolbe (Corning, Corning, NY) supplert med 5 μg/ml av vitamin K3 (menadionnatriumbisulfitt) (Sigma, St. Louis, MO). Rullekolbene ble innkubert i 5% CO2 ved 37 ºC i 72 timer. Vekstmediet ble så byttet ut med 300 ml serumfritt produksjonsmedium (DMEM/F12 med 5 μg/ml storfeinsulin og 10 μg/ml gentamicin) supplert med 5 μg/l av vitamin K3. Produksjonsmediet (kondisjonert medium) ble oppsamlet hver 10. dag og lagret ved 4 ºC. Friskt produksjonsmedium ble tilsatt rullekolbene etter hver oppsamling og kolbene ble så igjen plassert i inkubatoren. De samlede media ble først renset ved å bruke et Sartoclean glassfiberfilter (3,0 μm 0,2 μm) (Sartorius Corp., Gottingen, Tyskland) fulgt av et Acropack 500-filter (0,8 μm 0,2 μm) (Pall Corp., East Hills, NY). Det klare og rensede mediet ble så konsentrert omtrent 20 ganger ved å bruke Pellicon Biomax tagentiale strømfiltreringskasetter (10 kDa MWCO) (Millipore Corp., Billerica, MA).
Fc-kimærene ble så tatt ut fra det konsentrerte mediet ved en passasje over en protein A sefarose 4 Fast Flow-kolonne (AP Biotech, Piscataway, NJ). En 5 x 5 cm (100 ml) kolonne ble påsatt med ≤5 mg Fc-protein pr ml kolonnevolum med en lineær strømhastighet på 100 cm/time, noe som ga en oppholdstid på ≥3 minutter. Kolonnen ble så vasket med >5 kolonnevolumer av 1X DPBS for å fjerne ikkespesifikt bundne proteiner. De bundne proteinene ble så eluert med 100 mM glysin pH 3,0. Elueringsfraksjoner som inneholdt proteintoppen ble nøytralisert ved å tilsette 1 del 1 M Tris-HCl, pH 8 til 10 eluerte fraksjoner.
For å fjerne FLAG-Fc-homodimerer (det vil si kimære Fc-dimerer med FLAG-peptid uttrykt som fusjoner med begge Fc-molekylene) fra preparatet, ble det samlede media fra protein A sefarose 4 Fast Flow-kolonnen ført gjennom en Unosphere S kationutbyttingskolonne (BioRad Corp., Richmond, CA). Under kolonnens driftsbetingelser vil FLAG-Fc monomer-dimerhybriden forbli uladet (FLAG-Fc teoretisk pl = 6,19) og strømme gjennom kolonnen mens hFVII-Fckonstruktene er positivt ladde og vil således binde seg til kolonnen og kan elueres ved høyere ionestyrke. Det samlede medium fra protein A sefarose 4 Fast Flowkolonnen ble først dialysert over i 20 mM MES, 20 mM NaCl, pH 6,1. Det dialyserte materialet ble så påsatt en 1,1 x 11 cm (9,9 ml) kolonne ved en strømhastighet på 150 cm/time. Under vasking og eluering ble strømhastigheten økt til 500 cm/time. Kolonnen ble vasket først med 8 kolonnevolumer av 20 mM MES, 20 mM NaCl, pH 6,1 og 8 kolonnevolumer av 20 mM MES, 40 mM NaCl, pH 6,1. Det absorberte proteinet ble eluert med 20 mM MES, 750 mM NaCl, pH 6,1. De eluerte fraksjoner som inneholdt proteintoppen ble slått sammen og sterilfiltrert gjennom en 0,2 μm filterskive før lagring ved -80 ºC.
En anti-FLAG MAB-affinitetskolonne ble brukt for å separere de kimære Fcdimerene hvor hFVII var fusjonert med begge Fc-molekylene, fra de med ett FLAG-peptid og en hFVII-fusjon. Eluatet fra Unosphere S-kolonnen ble fortynnet 1:1 med 20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 8 og påsatt en 1,6 x 5 cm M2 anti-FLAG-sefarosekolonnen (Sigma Corp., St. Louis, MO) med en lineær strømhastighet på 60 cm/time. Tilsetning til kolonnen var tilpasset til <2,5 mg monomer-dimerhybrid pr/ml kolonnevolum. Etter at kolonnen var lastet ble den vasket med 5 kolonnevolumer 20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 8,0 og monomer-dimerhybriden ble så eluert med 100 mM glysin pH 3,0. De eluerte fraksjonene som inneholdt proteintoppen ble så nøytralisert ved å tilsette 1 del 1 M Tris-HCl, pH 8 til 10 eluerte fraksjoner. Det samlede produktet ble lagret ved -80 ºC.
Eksempel 14: Faktor IX-Fc-homodimer og monomer-dimerhybridekspresjon og rensing
CHO DG-44-celler som uttrykte faktor IX-Fc ble etablert. DG44-celler ble utplatet i 100 mm vevsdyrkningspetriskåler og dyrket til en sammenflytning på 50%-60%. Totalt 10 μg DNA ble brukt for å transfektere en 100 mm skål; og for homodimertransfeksjon ble det brukt 8 μg pED.dC.faktor IX-Fc 2 μg pcDNA6-PACE; og for monomer-dimerhybridtransfeksjon ble det brukt 8 μg pED.dC.faktor IX-Fc 1 μg pcDNA3-FlagFc 1 μg pcDNA6-PACE. Cellene ble transfektert som beskrevet i Superfect transfeksjonsreagensmanualen (Qiagen, Valencia, CA).
Mediet ble fjernet fra transfeksjonsskålene etter 48 timer og erstattet MEM alfa uten nukleosider pluss 5% dialysert storfefosterserum og 10 μg/ml blasticidin (Invitrogen, Carlsbad, CA) for begge transfeksjonene, mens monomerdimerhybridtransfeksjonen ble supplert med 0,2 mg/ml geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter 3 dager ble cellene fjernet fra platen med 0,25% trypsin og overført til T25 vevsdyrkningskolber og seleksjonen ble fortsatt i 10-14 dager inntil cellene begynte å vokse så godt at det var etablert stabile cellelinjer.
Proteinekspresjonen ble deretter amplifisert ved å tilsette 10 nM eller 100 nM metotreksat for homodimeren eller monomer-dimerhybriden henholdsvis.
For begge cellelinjene ble omtrent 2 x 10<7 >celler brukt for å inokulere 300 ml vekstmedium i en 1700 cm<2 >rullekolbe (Corning, Corning, NY) supplert med 5 μg/ml av vitamin K3 (menadionnatriumbisulfitt) (Sigma, St. Louis, MO).
Rullekolbene ble innkubert i en 5% CO2-atmosfære ved 37 ºC i omtrent 72 timer. Vekstmediet ble byttet ut med 300 ml serumfritt produksjonsmedium (DMEM/F12 med 5 μg/ml storfeinsulin og 10 μg/ml gentamycin) supplert med 5 μg/l av vitamin K3. Produksjonsmediet (kondisjonert medium) ble oppsamlet hver dag i 10 dager og lagret ved 4 ºC. Friskt produksjonsmedium ble tilsatt rullekolbene etter hver oppsamling og kolbene ble så igjen plassert i inkubatoren. Før kromatografi ble mediet renset ved å bruke et SuporCap-100 (0,8/0,2 μm) filter (Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). Alle de følgende trinnene ble utført ved 4 ºC. Det rensede mediet ble tilsatt en protein A sefarosekolonne, vasket med 5 kolonnevolumer av 1X PBS (10 mM fosfat, pH 7,2, 2,7 mM KCl og 137 mM NaCl), eluert med 0,1 M glysin, pH 2,7 og så nøytralisert med 1/10 volumer av 1 M Tris-HCl, pH 9,0.
Proteinet ble så dialysert over i PBS.
Monomer-dimerhybridtransfeksjonsproteinprøven ble underkastet ytterligere rensing ettersom den inneholdt en blanding av FIX-Fc:FIX-Fc-homodimer, FIX-Fc:Flag-Fc monomer-dimerhybrid og Flag-Fc:Flag-Fc-homodimer. Materialet ble konsentrert og påsatt en 2,6 cm x 60 cm (318 ml) Superdex 200 preparativ analysekolonne med en strømhastighet på 4 ml/minutt (36 cm/time) og så eluert med 3 kolonnevolumer av 1X PBS. Fraksjoner som tilsvarte to topper på UV-detektoren ble oppsamlet og analysert ved SDS-PAGE. Fraksjoner fra den første toppen inneholdt enten FIX-Fc:FIC-Fc-homodimer eller FIX-Fc:FlagFc monomerdimerhybrid, mens den andre toppen inneholdt FlagFc:FlagFc-homodimer. Alle de fraksjoner som inneholdt monomer-dimerhybriden men ingen FlagFc:FlacFchomodimer ble slått sammen og direkte påsatt en 1,6 x 5 cm M2 anti-FLAG sefarosekolonne (Sigma Corp., St. Louis, MO) med en lineær strømhastighet på 60 cm/time. Etter påsetting ble kolonnen vasket med 5 kolonnevolumer PBS.
Monomer-dimerhybriden ble så eluert med 100 mM glysin, pH 3,0. De eluerte fraksjonene som inneholdt proteintoppen ble så nøytralisert ved å tilsette et 1/10 volum av 1 M Tris-HCl og analysert ved reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE. Fraksjonene ble dialysert over i PBS, konsentrert til 1-5 mg/ml og så lagret ved -80 ºC.
Eksempel 15: IFN α homodimer og monomer-dimerhybridekspresjon og rensing
CHO DG-44-celler som uttrykker hIFN α ble etablert. DG44-celler ble utplatet på 100 mm vevsdyrkningspetriskåler og dyrket til en sammenflytning på 50%-60%. Totalt ble 10 μg DNA brukt for å transfektere en 100 mm skål: For homodimertransfeksjon 10 μg av hIFN αFc-konstruktene; for monomerdimerhybridtransfeksjon 8 μg av hIFN αFc-konstrukter 2 μg pcDNA3-FlagFc. Cellene ble transfektert som beskrevet i Superfect transfeksjonsreagensmanualen (Qiagen, Valencia, CA). Media ble fjernet fra transfeksjonen etter 48 timer og erstattet med MEM alfa uten nukleosider pluss 5% dialysert storfefosterserum, mens monomer-dimerhybridtransfeksjonen ble også supplert med 0,2 mg/ml geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter 3 dager ble cellene fjernet fra platene med 0,25% trypsin og overført til T25 vevsdyrkningskolber og seleksjonen ble fortsatt i 10-14 dager inntil cellene vokste så godt at det var etablert stabile cellelinjer.
Proteinekspresjonen ble deretter amplifisert ved å tilsette metotreksat fra 10 til 50 nM.
For alle cellelinjer ble omtrent 2 x 10<7 >celler brukt for å inokulere 300 ml vekstmedium i en 1700 cm<2 >rulleflaske (Corning, Corning, NY). Rulleflaskene ble innkubert i en 5% CO2-atmosfære ved 37 ºC i omtrent 72 timer. Vekstmediet ble så byttet ut med 300 ml serumfritt produksjonsmedium (DMEM/D12 med 5 μg/ml storfeinsulin og 10 μg/ml gentamicin). Produksjonsmediet (kondisjonert medium) ble oppsamlet hver 10. dag og lagret ved 4 ºC. Friskt produksjonsmedium ble tilsatt rulleflaskene etter hver oppsamling og de ble så igjen plassert i inkubatoren. Før kromatografi ble mediet renset ved å bruke et SuporCap-100 (0,8/0,2 μm) filter fra Pall Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). Alle de følgende trinnene ble utført ved 4 ºC. Det rensede mediet ble tilsatt en protein A sefarosekolonne, vasket med 5 kolonnevolumer 1X PBS (10 mM fosfat, pH 7,4, 2,7 mM KCl og 137 mM NaCl), eluert med 0,1 M glysin, pH 2,7 og så nøytralisert med 1/10 volum av 1 M Tris-HCl, pH 9,0. Proteinet ble så dialysert over i PBS.
Monomer-dimerhybridtransfeksjonsproteinprøvene ble så underkastet ytterligere rensting ettersom de inneholder en blanding av IFN αFc:IFN αFc-homodimer, IFN αFc:FlagFc monomer-dimerhybrid og FlagFc:FlacFc-homodimer (eller Δ-linker eller GS15-linker). Materialet ble konsentrert og påsatt en 2,6 x 60 cm (318 ml) Superdex 200 Prep-kolonne med en strømhastighet på 4 ml/min (36 cm/time) og så eluert med 3 kolonnevolumer 1X PBS. De fraksjonene som tilsvarte de to toppene på UV-detektoren ble oppsamlet og analysert ved SDS-PAGE. Fraksjoner fra den første toppen inneholdt enten IFN αFc:IFN αFc-homodimer eller IFN αFc:FlagFc monomer-dimerhybrid, mens den andre toppen inneholdt FlagFc:FlacFchomodimer. Alle de fraksjoner som inneholdt monomer-dimerhybriden men ingen FlagFc-homodimer, ble slått sammen og direkte påsatt en 1,6 x 5 cm M2 anti-FLAG sefarosekolonne (Sigma Corp., St. Louis, MO) med en lineær strømhastighet på 60 cm/time. Etter påsettingen ble kolonnen vasket med 5 kolonnevolumer PBS og monomer-dimerhybridene ble så eluert med 100 mM glysin, pH 3,0. De eluerte fraksjoner som inneholdt proteintoppen ble så nøytralisert ved å tilsettes 1/10 volum av 1 M Tris-HCl og analysert ved hjelp av reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE. Fraksjonene ble dialysert over i PBS, konsentrert til 1-5 mg/ml og så lagret ved -80 ºC.
Eksempel 16: Viklet coilproteinekspresjon og rensing
Plasmidene pED.dC Epo-CCA-Fc og pED.dC CCB-Fc vil bli transfektert enten alene eller sammen i et 1:1 forhold i CHO DG44-celler. Cellene vil så bli transfektert som beskrevet i Superfect transfeksjonsreagensmanualen (Qiagen, Valencia, CA). Media vil bli fjernet etter 48 timer og erstattet med MEM alfa med eller uten nukleosider pluss 5% dialysert storfefosterserum. Rensing vil bli gjort ved affinitetskromatografi i en protein A-kolonne ved hjelp av de fremgangsmåter som er velkjente. Alternativt kan rensingen utføres ved størrelsesutelukkelseskromatografi.
Eksempel 17: Cys-Fc-ekspresjon og rensing
CHO DG-44-celler som uttrykker Cys-Fc ble etablert. pED.dC.Cys-Fcekspresjonsplasmidet som inneholder muse dihydrofolatreduktase (dhfr) -genet ble transfektert inn i CHO DG44 (med dhfr-svikt) -celler ved å bruke Superfect-reagens (Qiagen; Valencia, CA) ifølge fabrikantens protokoll, fulgt av en seleksjon for stabile transfektanter i αMEM (uten nukleosider) vevsdyrkningsmedium supplert med 5% dialysert FBS og penicillin/streptomycinantibiotika (Invitrogen; Carlsbad, CA) i 10 dager. Den resulterende samlingen av stabilt transfekterte celler ble så amplifisert med 50 nM metotreksat for å forsterke ekspresjonen. Omtrent 2 x 10<7 >celler ble brukt for å inokulere 300 ml vekstmedium i en 1700 cm<2 >valsekolbe (Corning, Corning, NY). Valsekolbene ble innkubert i en 5% CO2-atmosfære ved 37 ºC i omtrent 72 timer. Vekstmediet ble byttet ut med 300 ml serumfritt produksjonsmedium (DMEM/F12 med 5 μg/ml storfeinsulin og 10 μg/ml gentamicin). Produksjonsmediet (kondisjonert medium) ble oppsamlet hver 10. dag og lagret ved 4 ºC. Friskt produksjonsmedium ble tilsatt flaskene etter hver oppsamling og disse ble så satt tilbake i inkubatoren. Før kromatografi ble mediet renset ved å bruke et SuporCap-100 (0,8/0,2 μm) filter fra Pall Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). Alle de følgende trinnene ble utført ved 4 ºC. Det rensede mediet ble påsatt en protein A sefarosekolonne, vasket med 5 kolonnevolumer av 1X PBS (10 mM fosfat, pH 7,4, 2,7 mM KCl og 137 mM NaCl), eluert med 0,1 M glysin, pH 2,7, og så nøytralisert med 1/10 volum av 1 M Tris-HCl, pH 9,0. Proteinet ble dialysert over i PBS og brukt direkte i konjugeringsreaksjoner.
Eksempel 18: Kobling av T20-tioestere til Cys-Fc
Cys-Fc (4 mg, 3,2 mg/ml sluttkonsentrasjon) og enten T20-tioester eller T20-PEG-tioester (2 mg, omtrent 5 molare ekvivalenter) ble innkubert i 16 timer ved romtemperatur i 0,1 M Tris 8/10 mM MESNA. Analyse ved SDS-PAGE (Tris-Glygel) ved å bruke reduserende prøvebuffer indikerte nærværet av et nytt bånd som var omtrent 5 kDa større enn Fc-kontrollen (>40-50% omdannelse til konjugatet). Tidligere N-terminal sekvensering av Cys-Fc og uomsatt Cys-Fc indikerte at signalpeptidet ikke var riktig bearbeidet i en viss fraksjon av molekylene, noe som ga en blanding av (Cys)-Fc som vil reagere gjennom nativ ligering med peptidtioestere, mens dette ikke vil være tilfellet med (Val)-(Gly)-(Cys)-Fc. Ettersom reaksjonsbetingelsene er utilstrekkelige til å bryte dimeriseringen av Cys-Fcmolekylene, så utviklet denne reaksjonen en blanding av T20-Cys-Fc:T20-Cys-Fchomodimerer, T20-Cys-Fc:Fc monomer-dimerhybrider og Cys-Fc:Cys-Fc Fcdimerer. Proteinet ble renset ved å bruke størrelsesutelukkelseskromatografi som angitt ovenfor for å skille de tre typene av molekylet. Resultatene ble bekreftet ved en SDS-PAGE-analyse under ikke-reduserende betingelser.
Eksempel 19: Antiviral prøve for IFN α-aktivitet
Antiviral aktivitet (IU/ml) for IFN α-fusjonsproteiner ble bestemt ved å bruke en CPE (cytopatisk effekt) -prøve. A549-celler ble utplatet i en 96 brønners vevsdyrkningsplate i vekstmedium (RPMI 1640 supplert med 10% storfefosterserum (FBS) og 2 mM L-glutamin) i 2 timer ved 37 ºC, 5% CO2. IFN αstandarder og IFN α-fusjonsproteiner ble fortynnet i vekstmedium og tilsatt cellene i tre paralleller i 20 timer ved 37 ºC, 5% CO2. Etter innkubering ble alt media fjernet fra brønnene, encefalomyocardittvirus (EMC) ble fortynnet i vekstmedium og tilsatt (3000 pfu/brønn) til hver brønn med unntak av kontrollbrønnene. Platene ble så innkubert ved 37 ºC, 5% CO2 i 28 timer. Levende celler ble fiksert med 10% kald trifluoreddiksyre (TCA) og så farget med sulforodamin B (SRB) ifølge publiserte protokoller (Rubinstein et al. 1990, J. Natl. Cancer. Inst. 82, 1113). SRB-fargestoffet ble gjort løselig med 10 mM Tris pH 10,5 og resultatet ble avlest på et spektrofotometer ved 490 nm. Prøvene ble analysert ved å sammenligne aktivitetene i forhold til en kjent standardkurve som er publisert av World Health Organization IFN α 2b internasjonal standard, varierer fra 5 til 0,011 IU/ml. Resultatene er gitt nedenfor i tabell 3 og figur 6 og viser forsterket antiviral aktivitet for monomerdimerhybrider.
TABELL 3: INTERFERON ANTIVIRAL PRØVE HOMODIMER VERSUS
MONOMER-DIMERHYBRID
Eksempel 20: FVIIa koaguleringsaktivitetsanalyse
StaClot FVIIa-rTF-prøvesettet ble kjøpt fra Diagnostica Stago (Parsippany, NJ) og modifisert som beskrevet i Johannessen et al. 2000, Blood Coagulation and Fibrinolysis 11: S159. Det ble utviklet en standardkurve med FVIIa World Health Organization standard 89/688. Prøven ble brukt for å sammenligne koagulasjonsaktiviteten for monomer-dimerhybrider sammenlignet med homodimerer. Resultatene viste at monomer-dimerhybriden hadde fire ganger sterkere koagulasjonsaktivitet enn homodimeren (figur 7).
Eksempel 21: FVIIa-Fc oral dosering i dag 10-rotter
25 grams dag 9 nyfødte Sprague Dawley-rotter ble kjøpt fra Charles River (Wilmington, MA) som fikk lov til å akklimatisere seg i 24 timer. Rottene ble dosert oralt med FVIIaFc-homodimer, monomer-dimerhybrid eller en 50:50 blanding av de to. Det ble administrert et volum på 200 μl av en FVIIaFc-løsning for en dose på 1 mg/kg kroppsvekt. Løsningen var sammensatt av en Tris-HClbuffer pH 7,4 med 5 mg/ml soyabønnetrypsinhemmer. Rottene ble avlivet med CO2 på flere tidspunkter og det ble så tatt ut en blodprøve på 200 μl ved hjelp av hjertepunktering. Plasma ble fremstilt ved å tilsette en 3,8% natriumcitratløsning og prøven ble så sentrifugert ved romtemperatur ved en hastighet på 1268xg.
Plasmaprøvene ble enten analysert friske eller frosne ved -20 ºC. Den oralt doserte monomer-dimerhybriden resulterte i signifikant høyere maksimale (Cmax) serumkonsentrasjoner sammenlignet med den homodimere faktor VII (figur 8).
Eksempel 22: Faktor IX-Fc oral dosering av neonatale rotter
Ti dager gamle neonatale Sprague-Dawley-rotter ble dosert p.o. med 200 μl FIX-Fchomodimer eller FIX-Fc:FlagFc monomer-dimerhybrid i omtrentlig ekvimolare doser på 10 nmol/kg kroppsvekt i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 6,5 som inneholdt 5 mg/ml soyabønnetrypsinhemmer og 0,9% NaCl. 1, 2, 4, 8, 24, 48 eller 72 timer etter injeksjonen ble dyrene avlivet med CO2 og det ble tatt ut en blodprøve ved hjertepunktering og plasma ble fremstilt ved å tilsette en 3,8% natriumcitratløsning hvoretter prøvene ble sentrifugert ved romtemperatur ved en hastighet på 1268xg. Prøvene ble så sedimentert ved sentrifugering, serum ble oppsamlet og frosset ved -20 ºC inntil fusjonsproteinene ble analysert ved hjelp av ELISA.
Eksempel 23: Faktor IX-Fc ELISA
En 96 brønners Immulon 4HBX ELISA-plate (Thermo LabSystems, Vantaa, Finland) ble belagt med 100 μl/brønn av geite anti-faktor IX IgG (Affinity Biologicals, Ancaster, Canada) fortynnet 1:100 i 50 mM karbonatbuffer, pH 9,6.
Platene ble innkubert ved omgivelsestemperatur i 2 timer eller over natten ved 4 ºC lukket med en plastfilm. Brønnene ble vasket 4 ganger med PBST, 300 μl/brønn ved å bruke TECAN-platevaskeren. Brønnene ble så blokkert med PBST 6% BSA, 200 μl/brønn, hvoretter platene ble innkubert i 90 minutter ved omgivelsestemperatur. Brønnene ble vasket 4 ganger med PBST, 300 μl/brønn ved å bruke TECAN-platevaskeren. Standarder og blodprøver fra rotter som beskrevet i eksempel 18 ble tilsatt brønnene (100 μl/brønn), hvoretter platene ble innkubert i 90 minutter ved omgivelsestemperatur. Prøvene og standarder ble fortynnet i HBET-buffer (HBET: 5,95 g HEPES, 1,46 g NaCl, 0,93 g Na2EDTA, 2,5 g storfe serumalbumin, 0,25 ml Tween-20, fortynnet til 250 ml med dH2O og pH justert til 7,2). Standardkurvevariasjonen var fra 200 ng/ml til 0,78 ng/ml med 2 ganger fortynninger i mellom. Brønnene ble vasket 4 ganger med PBST, 300 μl/brønn ved å bruke TECAN-platevaskeren. 100 μl/brønn av konjugert geit antihumant IgG-Fc-HARP-antistoff (Pierce, Rockford, IL) fortynnet i HBET 1:25000 ble tilsatt hver brønn. Platene ble så innkubert i 90 minutter ved omgivelsestemperatur. Brønnene ble vasket 4 ganger med PBST, 300 μl/brønn ved å bruke TECAN-platevaskeren. Platene ble så fremkalt med 100 μl/brønn av tetrametylbenzidinperoksidasesubstrat (TMB) (Pierce, Rockford, IL) tilsatt som angitt i fabrikantens instruksjoner. Platene ble innkubert i 5 minutter ved omgivelsestemperatur i mørke eller inntil det ble fremkalt en farge. Reaksjonen ble stoppet med 100 μl/brønn av 2 M svovelsyre. Absorpsjonen ble avlest ved 450 nm i en SpectraMax plussplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Analyser av blod tatt ut etter 4 timer indikerte mer enn en 10 gangers forskjell med hensyn til serumkonsentrasjon mellom faktor IX-Fc monomer-dimerhybrider sammenlignet med faktor IX Fc-homodimerer (figur 9). Resultatene indikerer at faktor IX-Fc monomer-dimerhybridnivåene var vedvarende høyere enn for faktor IX-Fc-homodimerer (figur 10).
Eksempel 24: Kloning av Epo-Fc
Det modne Epo-kodende området ble oppnådd ved hjelp av PCR-amplifisering fra et plasmid som koder den modne erytropoietinkodende sekvensen, opprinnelig oppnådd ved hjelp av RT-PCR fra Hep G2 mRNA og primere hepoxba-F og hepoeco-R slik det er angitt i det etterfølgende. Primer hepoxba-F inneholder et XbaI-sete, mens primeren hepoeco-R inneholder et EcoRI-sete. PCR ble utført i et Idaho Technology Rapid sykliseringsapparat ved å bruke Vent-polymerase, denaturering ved 95 ºC i 15 sekunder fulgt av 28 sykluser med en helning på 6,0 ved 95 ºC i 0 sekunder, 55 ºC i 0 sekunder og 72 ºC i 1 minutt og 20 sekunder fulgt av 3 minutters forlengelse ved 72 ºC. Et omtrentlig 514 bp produkt ble gelrenset, kuttet med XbaI og EcoRI, gelrenset på nytt og direkte subklonet inn i en XbaI/EcoRI-kuttet, gelrenset pED.dC.XFc-vektor som nevnte ovenfor. Dette konstruktet ble betegnet pED.dC.EpoFc.
Epo-sekvensen som inneholder både det endogene signalpeptidet og den modne sekvensen ble fremstilt ved PCR-amplifisering ved å bruke et voksent nyre QUICK-klon cDNA-preparat som templat og primerne Epo+Pep-Sbf-F og Epo+Pep-Sbf-R som beskrevet i det etterfølgende. Primeren Epo+Pep-Sbf-F inneholder et SbfI-sete oppstrøms for startkodonet, mens primeren Epo+Pep-Sbf-R fester seg nedstrøms til det endogene SbfI-setet i Epo-sekvensen. PCR-reaksjonen ble utført i PTC-200 MJ termosykliseringsapparatet ved å bruke Expand-polymerase, denaturering ved 94 ºC i 2 minutter fulgt av 32 sykluser ved 94 ºC i 30 sekunder, 57 ºC i 30 sekunder og 72 ºC i 45 sekunder, fulgt av en 10 minutters forlengelse ved 72 ºC. Et omtrentlig 603 bp produkt ble gelisolert og subklonet inn i pGEM-T Easy-vektoren. Den riktige kodende sekvensen ble tatt ut ved SbfI-kutting, gelrenset og klonet inn i det PstI-kuttede, rekealkalisk fosfatase (SAP) -behandlede og gelrensede pED.dC.EpoFc-plasmidet. Plasmidet med innsettingen i den riktige orienteringen ble først bestemt ved KpnI-kutting. En XmnI- og PvuII-kutting av dette konstruktet ble sammenlignet med pED.dC.EpoFc og bekreftet til å være i den riktige orienteringen. Sekvensen ble bestemt og konstruktet ble betegnet pED.dC.natEpoFc.
PCR-primere:
hepoxba-F (EPO-F): 5'-AATCTAGAGCCCCACCACGCCTCATCTGTGAC-3' (SEKV.ID. NR. 75)
hepoeco-R (EPO-R): 5'-TTGAATTCTCTGTCCCCTGTCCTGCAGGCC-3' (SEKV.ID. NR. 76)
Epo+Pep-Sbf-F: 5'-GTACCTGCAGGCGGAGATGGGGGTGCA-3' (SEKV.ID. NR.
77)
Epo+Pep-Sbf-R: 5'-CCTGGTCATCTGTCCCCTGTCC-3' (SEKV.ID. NR. 78)
Eksempel 25: Kloning av Epo-Fc
Det er i det etterfølgende beskrevet en alternativ fremgangsmåte for kloning av EPO-Fc. Det ble først utformet primere for å amplifisere den fullengde Epokodende sekvensen inklusive den native signalsekvensen som følger:
Epo-F: 5'-GTCCAACCTG CAGGAAGCTTG CCGCCACCAT GGGAGTGCAC GAATGTCCTG CCTGG-3' (SEKV.ID. NR. 79)
Epo-R: 5'-GCCGAATTCA GTTTTGTCGA CCGCAGCGG CGCCGGCGAA CTCTCTGTCC CCTGTTCTGC AGGCCTCC-3' (SEKV.ID. NR. 80)
Foroverprimeren inkorporerer et SbfI- og HindIII-sete oppstrøms for en Kozaksekvens mens den reverse primeren fjerner det indre SbfI-setet og adderer en 8 aminosyrer linker til 3'-enden av den kodende sekvensen (EFAGAAAV) (SEKV.ID.
NR. 81) så vel som SalI- og EcoRI-restriksjonsseter. Den Epo-kodende sekvensen blir så amplifisert fra et nyre cDNA-bibliotek (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) ved å bruke 25 pmol av disse primerne i en 25 μl PCR-reaksjon ved å bruke det Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat og ved å bruke de følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 58 ºC i 30 sekunder og 72 ºC i 45 sekunder) fulgt av 72 ºC i 10 minutter. Båndet med den forventede størrelsen (641 bp) ble renset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og ligert inn i den intermediære kloningsvektoren pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI). DNA ble transformert inn i DH5 α-celler (Invitrogen, Carlsbad, CA) og miniprepkulturer ble dyrket og renset med et Plasmid miniprepsett (Qiagen, Valencia, CA) ved å følge fabrikantens standardprotokoller. Så snart sekvensen var bekreftet, ble denne innsettingen kuttet ut med SbfI/EcoRI-restriksjonsenzymer, gelrenset og klonet inn i PstI/EcoRI-setene i pattedyrekspresjonsvektoren pED.dC på en lignende måte.
Det ble utformet primere for å amplifisere den kodende sekvensen for det konstante området i det humane IgG1 (Fc-området, EU-nummerering 221-447) som følger:
Fc-F: 5'-GCTGCGGTCG ACAAAACTCA CACATGCCCA CCGTGCCCAG CTCCGGAACT CCTGGGCGGA CCGTCAGTC-3' (SEKV.ID. NR. 82)
FC-R: 5'-ATTGGAATTC TCATTTACCC GGAGACAGGG AGAGGC-3' (SEKV.ID. NR. 83)
Foroverprimeren inkorporerer et SalI-sete ved linker-Fc-sammenbindingen, så vel som at det innføres BspEI- og RsrII-seter i Fc-området uten at dette påvirker den kodende sekvensen, mens den reverse primeren adderer et EcoRI-sete etter stoppkodonet. Den Fc-kodende sekvensen ble så amplifisert fra et leukocytt cDNA-bibliotek (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) ved å bruke 25 pmol av disse primerne i en 25 μl PCR-reaksjon og ved å bruke det Expand High Fidelitysystemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll, i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke de følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 58 ºC i 30 sekunder og 72 ºC i 45 sekunder) fulgt av 72 ºC i 10 minutter. Båndet med den forventede størrelsen (696 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og ligert inn i den intermediære kloningsvektoren pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI). DNA ble så transformert inn i DH5 α-celler (Invitrogen, Carlsbad, CA) og miniprepkulturer ble dyrket og renset med et Plasmid miniprepsett (Qiagen, Valencia, CA), begge ifølge fabrikantens standardprotokoller. Så snart sekvensen var bekreftet ble denne innsettingen kuttet ut med SaI/EcoRI-restriksjonsenzymer, gelrenset og klonet inn i SalI/EcoRI-setene i plasmid pED.dC.Epo (se ovenfor) på lignende måte, noe som gir
pattedyrekspresjonsplasmidet pED.dC.EpoFc. I et annet eksperiment ble dette plasmidet også kuttet med RsrII/XmaI, og det tilsvarende fragmentet fra pSYN-Fc-002 som inneholder Asn 297 Ala-mutasjonen (EU-nummerering) ble klonet inn, noe som ga pED.dC.EPO-Fc N297A (pSYN-EPO-004). Ekspresjon i pattedyrceller var som beskrevet i eksempel 26. Aminosyresekvensen for EpoFc med en åtte aminosyrelinker er gitt på figur 2j. Under denne alternative kloningsmetoden, skjønt den nøyaktige EpoFc-aminosyresekvensen ble bevart (figur 2J), så ble det utført en rekke ikke-kodende forandringer på nukleotidnivået (figur 3J). Disse er G6A (G ved nukleotid 6 ble forandret til A) (eliminerer en mulig sekundær struktur i primeren), G567A (fjerner det endogene SbfI-setet fra Epo), A582G (fjerner EcoRI-setet fra linkeren), A636T og T639G (adderer et unikt BspEI-sete til Fc) og G651C (adderer et unikt RsrII-sete til Fc). Nukleotidsekvensen på figur 3J er fra konstruktet fremstilt i eksempel 25 som inkorporerer disse forskjellene fra sekvensen for konstruktet fra eksempel 24.
Eksempel 26: EPO-Fc homodimer og monomer-dimerhybridekspresjon og rensing
DG44-celler ble utplatet i 100 mm vevsdyrkningspetriskåler og dyrket til en sammenflytning på 50%-60%. Totalt 10 μg DNA ble brukt for å transfektere en 100 mm skål; for homodimertransfeksjonen 10 μg av pED.dC.EPO-Fc; for homomerdimerhybridtransfeksjon 8 μg av pED.dC.EPO-Fc 2 μg av pcDNA3-FlagFc. De brukte konstruktene ble klonet som beskrevet i eksempel 24. Kloningsmetoden som er beskrevet i eksempel 25 kan også brukes for å fremstille konstrukter som kan brukes i dette eksempelet. Cellene ble transfektert som beskrevet i Superfect transfeksjonsreagensmanualen (Qiagen, Valencia, CA). Alternativt kan pED.dC.EPO-Fc samtransfekteres med pSYN-Fc-016 for å få fremstilt en utagget monomer. Media ble fjernet fra transfeksjonen etter 48 timer og erstattet med MEM alfa uten nukleosider pluss 5% dialysert storfefosterserum for begge transfeksjonene, mens monomer-dimerhybridtransfeksjonen også ble supplert med 0,2 mg/ml geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter 3 dager ble cellene frigjort fra platen med 0,25% trypsin og overført til T25 vevskulturkolber og seleksjon ble fortsatt i 10-14 dager inntil cellene begynte å vokse så godt at det var etablert stabile cellelinjer. Proteinekspresjon ble deretter amplifisert ved å tilsette metotreksat.
For begge cellelinjene ble tilnærmingsvis 2 x 10<7 >celler brukt for å inokulere 300 ml vekstmedium i en 1700 cm<2 >rulleflaske (Corning, Corning, NY). Flaskene ble innkubert i en 5% CO2-atmosfære ved 37 ºC i tilnærmet 72 timer. Vekstmediet ble erstattet med 300 ml serumfritt produksjonsmedium (DMEM/F12 med 5 μg/ml av storfeinsulin og 10 μg/ml gentamicin). Produksjonsmediet (kondisjonert medium) ble oppsamlet hver dag i 10 dager og lagret ved 4 ºC. Friskt produksjonsmedium ble tilsatt rulleflaskene etter hver oppsamling, hvoretter flaskene igjen ble plassert i inkubatoren. Før kromatografi ble mediet renset ved å bruke et SuporCap-100 (0,8/0,2 μm) filter fra Pall Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). Alle de følgende trinnene ble utført ved 4 ºC. Det rensede mediet ble påsatt en protein A sefarosekolonne, vasket med 5 kolonnevolumer av 1X PBS (10 mM fosfat, pH 7,4, 2,7 mM KCl og 137 mM NaCl) og eluert med 0,1 M glysin, pH 2,7 og så nøytralisert med 1/10 volum av 1 M Tris-HCl, pH 9,0. Proteinet ble så dialysert over i PBS.
Monomer-dimerhybridtransfeksjonsproteinprøven ble underkastet ytterligere rensing ettersom den inneholdt en blanding av EPO-Fc:EPO-Fc-homodimer, EPO-Fc:Flag-Fc monomer-dimerhybrid og Flag-Fc:Flag-Fc-homodimer. Prøven ble konsentrert og påsatt en 2,6 cm x 60 cm (318 ml) Superdex 200 Prep kvalitetskolonne med en strømhastighet på 4 ml/min (36 cm/time) og så eluert med 3 kolonnevolumer av 1X PBS. De fraksjonene som tilsvarte to topper på UV-detektoren ble oppsamlet og analysert ved SDS-PAGE. Fraksjonene fra den første toppen inneholdt enten EPO-Fc:EPO-Fc-homodimer eller EPO-Fc:FlagFc monomer-dimerhybrid, mens den andre toppen inneholdt FlagFc:FlacFchomodimer. Alle de fraksjoner som inneholdt monomer-dimerhybriden men ingen FlagFc-homodimer ble slått sammen og direkte påsatt en 1,6 x 5 cm M2 anti-FLAG sefarosekolonne (Sigma Corp.) med en lineær strømhastighet på 60 cm/time. Etter påsettingen ble kolonnen vasket med 5 kolonnevolumer PBS. Monomerdimerhybridene ble så eluert med 100 mM glysin, pH 3,0. De elueringsfraksjoner som inneholdt proteintoppen ble så nøytralisert ved å tilsette 1/10 volum av 1 M Tris-HCl og analysert ved reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE.
Fraksjonene ble dialysert over i PBS, konsentrert til 1-5 mg/ml og lagret ved -80 ºC.
Alternativt kan fraksjoner fra den første toppen av Superdex 200-kolonnen analyseres ved SDS-PAGE og bare fraksjoner som inneholdt mesteparten av EpoFc monomer-dimerhybriden og noe EpoFc-homodimer ble slått sammen. Dette sammenslåtte produktet som var anriket på monomer-dimerhybriden ble så igjen påsatt en Superdex 200-kolonne og de fraksjoner som bare inneholdt EpoFc monomer-dimerhybriden ble så slått sammen, dialysert og lagret som renset protein. Det skal bemerkes at denne alternative rensemetoden også kan brukes for å rense ikke-taggede monomer-dimerhybrider.
Eksempel 27: Administrering av EpoFc-dimer og monomer-dimerhybrid med en åtte aminosyrer linker til cynomolgusaper
For lungeadministrering ble det fremstilt aerosoler av enten EpoFc-dimer eller EpoFc monomer-dimerhybridproteiner (begge med 8 aminosyrer linkeren) i PBS, pH 7,4, med Aeroneb Pro<TM >(AeroGen, Mountain View, CA) nebulisator, in-line med en Bird Mark 7A-respirator og administrert bedøvde naturlige cynomolgusaper ved endotrakeale rør (omtrent normal tidal pusting). Begge proteinene ble også administrert naturlige cynomolgusaper ved intravenøs injeksjon. Det ble tatt prøver på forskjellige tidspunkter og mengden av Epo-holdig protein i det resulterende plasma ble kvantifisert ved å bruke den Qantikine IVD humane Epo-immunoprøven (R&D Systems, Minneapolis, MN). Farmakokinetiske parametere ble beregnet ved å bruke dataprogrammet WinNonLin. Tabell 4 angir biotilgjengelighetsresultatene for cynomolgusaper behandlet med EpoFc monomer-dimerhybrid eller EpoFc-dimer.
TABELL 4: ADMINISTRERING AV EPOFC MONOMER-DIMERHYBRID
OG EPOFC-DIMER TIL APER
<1>Basert p en 15% avsetningsfraksjon av forstøvet dose slik dette ble bestemt ved gammascintigrafi
Prosent biotilgjengelighet (F) ble beregnet for lungedosene ved hjelp av følgende likning:
F = (AUC lunge / dose lunge) / (AUC IV / dose IV) * 100
TABELL 5: BEREGNING AV PROSENT BIOTILGJENGELIGHET FOR EPOFC MONOMER-DIMERHYBRID VERSUS DIMER ETTER LUNGEADMINISTRERING TIL NATURLIGE CYNOMOLGUSAPER
<1>Basert p 15% avsetningsfraksjon av forstøvet dose slik dette ble bestemt ved gammascintigrafi <2>Midlere AUC for IV EpoFc monomer-dimerhybrid = 18,913 ng ·time/ml (n=3 aper) dosert med 25 μg/kg. Midlere AUC for IC EpoFc-dimer = 70,967 ng ·time/ml (n=6 aper) dosert med 150 μg/kg.
Farmakokinetikken for EpoFc med en 8 aminosyrelinker som ble administrert cynomolgusapene er angitt på figur 11. Figuren sammenlignet EpoFc-dimeren med EpoFc monomer-dimerhybriden i aper etter administrering av en enkel lungedose. Basert på en molar sammenligning, ble det oppnådd signifikant høyere serumnivåer i apene som var behandlet med monomer-dimerhybriden sammenlignet med dimeren.
Eksempel 28: Subkutan administrering av EPOFc monomer-dimerhybrid
For å sammenligne serumkonsentrasjonene av kjente erytropoietinmidler med EPOFc monomer-dimerhybrider, ble både EPOFc monomer-dimerhybriden og Aranesp <® >(darbepoetin alfa) som ikke er et kimært fusjonsprotein administrert subkutant til forskjellige aper, hvoretter serumkonsentrasjonen av begge de angitte midlene ble målt over tid.
Cynomolgusaper (n = 3 pr gruppe) ble injisert subkutant med 0,025 mg/kg EpoFc monomer-dimerhybrid. Blodprøver ble oppsamlet predose og på tidspunkter opptil 144 timer postdose. Serum ble fremstilt fra blodet og lagret frosset inntil det ble analysert ved hjelp av ELISA (human Epo Quantikine immunoprøve) (R & D Systems, Minneapolis, MN). De farmakokinetiske parameterne ble bestemt ved å bruke dataprogrammet WinNonLinâ <® >(Pharsight, Mountainview, CA).
Resultatene indikerer at serumkonsentrasjonene av både EPOFc monomerdimerhybrid og Aranesp <® >(darbepoetin alfa) var lik over tid, selv om den administrerte molare dosen av Aranesp <® >(darbepoetin alfa) var noe større (tabell 6) (figur 12).
TABELL 6
Eksempel 29: Intravenøs administrering av EPOFc monomer-dimerhybrid
For å sammenligne serumkonsentrasjonene av kjente erytropoietinmidler med EPOFc monomer-dimerhybrider, ble EPOFc monomer-dimerhybrid, Aranesp <® >(darbepoetin alfa) og Epogen <® >(epoetin alfa), hvorav de to siste ikke er et kimært fusjonsprotein, administrert intravenøst til forskjellige aper, og serumkonsentrasjonen for alle de nevnte midler ble målt over tid.
Cynomolgusaper (n = 3 pr gruppe) ble injisert subkutant med 0,025 mg/kg EpoFc monomer-dimerhybrid. Blodprøver ble oppsamlet predose og på tidspunkter opptil 144 timer postdose. Serum ble fremstilt fra blodet og lagret frosset inntil det ble analysert ved hjelp av ELISA (human Epo Quantikine immunoprøve) (R & D Systems, Minneapolis, MN). De farmakokinetiske parameterne ble bestemt ved å bruke dataprogrammet WinNonLinâ <® >(Pharsight, Mountainview, CA).
Resultatene indikerer at serumkonsentrasjon versus tid (AUC) for EPOFc monomerdimerhybriden var større enn konsentrasjonen for både Epogen <® >(epoetin alfa) eller Aranesp <® >(darbepoetin alfa), selv om apene fikk større molare doser av både Epogen <® >(epoetin alfa) og Aranesp <® >(darbepoetin alfa) (tabell 7) (figur 13).
TABELL 7
Eksempel 30: Alternativ rensing av EpoFc monomer-dimerhybrid
Dette eksempelet beskriver enda et ytterligere alternativ for rensing av EPO-Fc. En blanding som inneholdt Fc, EpoFc monomer-dimerhybrid og EpoFc-dimer ble påsatt en protein A sefarosekolonne (Amersham, Uppsala, Sverige). Blandingen ble så eluert ved å følge fabrikantens instruksjoner. Protein A sefaroseeluatet som inneholdt blandingen ble bufferutbyttet over i 50 mM Tris-Cl (pH 8,0).
Proteinblandingen ble så påsatt en 8 ml Mimetic Red 2 XL-kolonne (ProMetic Life Sciences, Inc., Wayne, NJ) som var blitt ekvilibrert i 50 mM Tris-Cl (pH 8,0).
Kolonnen ble så vasket med 50 mM Tris-Cl (pH 8,0) og 50 mM NaCl. Dette trinnet fjernet mesteparten av nevnte Fc. EpoFc monomer-dimerhybriden ble spesifikt eluert fra kolonnen med 50 mM Tris-Cl (pH 8,0) og 400 mM NaCl. EpoFc-dimeren kan elueres og kolonnen regenereres med 5 kolonnevolumer av 1 M NaOH. De eluerte fraksjonene fra kolonnen ble analysert ved SDS-PAGE (figur 14).
Eksempel 31: Kloning av Ig κ-signalsekvens - Fc-konstrukt for fremstilling av umerket Fc alene
Den kodende sekvensen for det konstante området i IgG1 (EU nr. 221-447; Fcområdet) ble oppnådd ved PCR-amplifisering fra et leukocytt cDNA-bibliotek (Clontech, CA) ved å bruke de følgende primere:
rcFc-F 5'-GCTGCGGTCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCC GGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTC-3' (SEKV.ID. NR. 84)
rcFc-R 5'-ATTGGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC-3' (SEKV.ID. NR. 85)
Foroverprimeren adderer tre aminosyrer (AAV) og et SalI-kloningssete før begynnelsen av Fc-området og inkorporerer også et BspEI-restriksjonssete ved aminosyrene 231-233 og et RsrII-restriksjonssete ved aminosyrene 236-238 ved å bruke degenereringen av den genetiske koden for å bevare den riktige aminosyresekvensen (EU-nummerering). Den reverse primeren adderer et EcoRI-kloningssete etter stoppkodonet for Fc. Det ble utført en 25 μl PCR-reaksjon med 25 pmol av hver av primerne ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikanten standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat og ved å bruke de følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 58 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 45 sekunder) og 72 ºC i 10 minutter. Et bånd med den forventede størrelsen ( ~696 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og klonet inn i pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI), noe som ga et intermediært plasmid pSYN-Fc-001 (pGEM T-Easy/Fc).
Muse Ig κ-signalsekvensen ble tilføyd Fc CDS ved å bruke følgende primere:
rc-Ig κ sig seq-F: 5'-TTTAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCC TGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACAAAACT CACACATGCCCACCG-3' (SEKV.ID. NR. 86)
Fc-noXma-GS-R: 5'-GGTCAGCTCATCGCGGGATGGG-3' (SEKV.ID. NR. 87)
Fc-noXma-GS-F: 5'-CCCATCCCGCGATGAGCTGACC-3' (SEKV.ID. NR. 88)
rc-Ig κ-signalsekvens-F-primeren adderer et HindIII-restriksjonssete til 5'-enden av molekylet fulgt av en Kozaksekvens (GCCGCCACC) (SEKV.ID. NR. 89) fulgt av signalsekvensen fra muse Ig κ-lettkjeden, direkte satt inntil begynnelsen av Fcsekvensen (EU nr. 221). Fc-noXma-GS-F- og -R-primerne fjerner det indre XmaI-setet fra den Fc-kodende sekvensen ved å bruke degenereringen av den genetiske koden for å bevare den riktige aminosyresekvensen. Det ble utført to 25 μl PCR-reaksjoner med 25 pmol av enten rc-Ig κ-signalsekvensen-F og Fc-noXma-GS-R eller Fc-noXma-GS-F og rcFc-R ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat. Den første reaksjonen ble utført med 500 ng leukocytt cDNA-bibliotek (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) som en templat og ved å bruke følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 55 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 45 sekunder) og 72 ºC i 10 minutter. Den andre reaksjonen ble utført med 500 ng pSYN-Fc-001 som templat (se ovenfor) ved å bruke følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 16 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 58 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 45 sekunder) og 72 ºC i 10 minutter. Båndet med de forventede størrelsene ( ~495 og 299 bp henholdsvis) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og så kombinert i en PCR-reaksjon med 25 pmol av rc-Ig κ-signalsekvens-F og rcFc-R-primere og kjørt som tidligere, med hybridisering ved 58 ºC og fortsettelse i 16 sykluser. Et bånd med den forventede størrelsen ( ~772 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og klonet inn i pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI), noe som ga et intermediært plasmid pSYN-Fc-007 (pGEM T-Easy/Ig κ sig seq-Fc). Hele Ig κ-signalsekvens-Fc-kasetten ble så subklonet ved å bruke HindIII- og EcoRI-setene enten inn i pEE6.4 (Lonza, Slough, UK) eller pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) pattedyrekspresjonsvektor, avhengig av hvilket system som skal brukes, for å utvikle pSYN-Fc-009 (pEE6.4/Ig κ sig seq-Fc) og pSYN-Fc-015 (pcDNA3/Ig κ sig seq-Fc).
Eksempel 32: Kloning av Ig κ-signalsekvens - Fc N297A-konstrukt for fremstilling av umerket Fc N297A alene
For å mutere Asn 297 (EU-nummerering) i nevnte Fc til en Ala-rest, ble følgende primere brukt:
N297A-F 5'-GAGCAGTACGCTAGCACGTACCG-3' (SEKV.ID. NR. 90)
N297A-4 5'-GGTACGTGCTAGCGTACTGCTCC-3' (SEKV.ID. NR. 91)
Det ble utført to PCR-reaksjoner med 25 pmol av enten rc-Ig κ-signalsekvens-F og N297A-R eller N297A-F og rcFc-R ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat. Begge reaksjoner ble utført ved å bruke 500 ng av pSYN-Fc-007 som en templat og følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 16 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 48 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 45 sekunder) og 72 ºC i 10 minutter. Båndet med de forventede størrelsene ( ~319 og 475 bp henholdsvis) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og så blandet i en PCR-reaksjon med 25 pmol av rc-Ig κ-signalsekvens-F og rcFc-R-primere og kjørt som tidligere, med hybridisering ved 58 ºC og fortsettelse i 16 sykluser. Et bånd med den forventede størrelsen ( ~772 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og klonet inn i pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI), noe som ga et intermediært plasmid pSYN-Fc-008 (pGEM T-Easy/Ig κ sig seq-Fc N297A). Hele Ig κ-signalsekvens-Fc alene-kassetten ble så subklonet ved å bruke HindIII- og EcoRI-setene enten i pEE6.4 (Lonza, Slough, UK) eller pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) pattedyrekspresjonsvektorer, avhengig av det systemet som skal brukes, for å utvikle pSYN-Fc-010 (pEE6.4/Ig κ sig seq-Fc N297A) og pSYN-Fc-016 (pGEM T Easy/Fc N297A).
De samme N297A-primerne ble også brukt med rcFc-F- og rcFc-R-primerne og pSYN-Fc-001 som templat i en PCR-reaksjon fulgt av subkloning som angitt ovenfor for å utvikle pSYN-Fc-002 (pGEM T Easy/Fc N297A).
Eksempel 33: Kloning av EpoFc og Fc inn i et enkelt plasmid for dobbeltgenvektorer for fremstilling av EpoFc villtype eller N297A monomerdimerhybrid, og ekspresjon.
Et alternativ til å transfektere EpoFc og Fc-konstruktene på separate plasmider er å klone de begge inn i et enkelt plasmid, også kalt en dobbeltgenvektor, slik det for eksempel brukes i Lonza Biologics (Slough, UK) -systemet. RsrII/EcoRI-fragmentet fra pSYN-Fc-002 ble subklonet inn i de tilsvarende setene i pEE12.4 (Lonza Biologics, Slough, UK) ved hjelp av standardmetoder for å utviklet pSYN-Fc-006 (pEE12.4/Fc N297A-fragment). pSYN-EPO-004-plasmidet ble brukt som en templat for en PCR-reaksjon som bruker Epo-F-primeren fra eksempel 25 og den følgende primeren:
EpoRsr-R: 5'-CTGACGGTCCGCCCAGGAGTTCCG GAGCTGGGCACGGTGGGCATG TGTGAGTTTTGTCGACCGCAGCGG-3' (SEKV.ID. NR. 91).
Det ble utført en PCR-reaksjon ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat som beskrevet tidligere med 16 sykluser og en hybridiseringstemperatur på 55 ºC. Et bånd med den forventede størrelsen ( ~689 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og klonet inn i pSYN-Fc-006 ved å bruke HindIII/RsrII-restriksjonssetene for å utvikle pSYN-EPO-005 (pEE12.4/EpoFc N297A). Dobbeltgenvektoren for EpoFc N297A monomer-dimerhybriden ble så konstruert ved å klone NotI/BamHI-fragmentet fra pSYN-Fc-010 inn i de tilsvarende setene i pSYN-EPO-005 for å utvikle pSYN-EPO-008 (pEE12.4-6.4/EpoFc N297A/Fc N297A).
Villtypekonstruktet ble også fremstilt ved å subklone villtype Fc-sekvensen fra pSYN-Fc-001 inn i pSYN-EPO-005 ved å bruke RsrII- og EcoRI-setene for å utvikle pSYN-EPO-006 (pEE12.4/EpoFc). Dobbeltgenvektoren for EpoFc monomer-dimerhybriden ble å konstruert ved å klone NotI/BamHI-fragmentet fra pSYN-Fc-009 inn i de tilsvarende setene i pSYN-EPO-006 for å utvikle pSYN-EPO-007 (pEE12.4-6.4/EpoFc/Fc).
Hvert plasmid ble transfektert inni CHOK1SV-celler og positive kloner ble identifisert og tilpasset en serumfri suspensjon slik det er angitt i Lonza Biologics Manual for standard operasjonsprosedyrer (Lonza Biologics, Slough, UK) og renset som angitt for de andre monomer-dimerkonstruktene.
Eksempel 34: Kloning av humane IFN βFc, IFN β-Fc N297A med åtte aminosyrelinkere og Ig κ-Fc-6His-konstrukter
10 ng av et humant genomisk DNA-bibliotek fra Clontech (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) ble brukt som en templat for å isolere humant IFN β med sin naturlige signalsekvens ved å bruke de følgende primere:
IFN β-F H3/SbfI:
5'-CTAGCCTGCAGGAAGCTTGCCGCCACCATGACCA ACAAGTGTCTCCTC-3' (SEKV.ID. NR. 92)
IFN β-R (EFAG)Sal:
5'TTTGTCGACCGCAGCGGCGCCGGCGAACTCGTTTCGG AGGTAACCTGTAAG-3' (SEKV.ID. NR. 93)
Den reverse primeren ble også brukt for å skape en åtte aminosyrelinkersekvens (EFAGAAAV) (SEKV.ID. NR. 94) på 3'-enden av den humane IFN β-sekvensen. PCR-reaksjonen ble utført ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et Rapid Cycler termosykliseringsapparat (Idaho Technology, Salt Lake City, UT). Et PCR-produkt med den riktige størrelsen ( ~607 bp) ble gelrenset ved å bruke et gelekstraksjonssett (Qiagen; Valencia, CA), klonet inn i TA-kloningsvektoren (Promega, Madison, WI) og så sekvensert. Dette konstruktet ble betegnet pSYN-IFN β-002. pSYN-IFN β-002 ble kuttet med SbfI og SalI og klonet inn i pSP72 (Promega) og PstI- og SalI-setene, noe som ga pSYN-IFN β-005.
Renset pSYN-Fc-001 (0,6 μg) ble kuttet med SalI og EcoRI og klonet inn i de tilsvarende setene i pSYN-IFN β-005 for å skape plasmidet pSYN-IFN β-006 som inneholder humant IFN β forbundet med humant Fc gjennom en åtte aminosyrelinkersekvens. pSYN-IFN β-006 ble så kuttet med SbfI og EcoRI og fullengde IFN β-Fc-sekvensen ble så klonet inn i PstI- og EcoRI-setene i pEDdc.sig for å skape plasmidet pSYN-IFN β-008.
pSYN-Fc-002 som inneholder det humane Fc DNA med en enkelt aminosyreforandring fra asparagin til alanin i posisjon 297 (N297A: EU-nummerering) ble kuttet med BspEI og XmaI for å isolere et DNA-fragment på ~365 bp som inneholder N297A-mutasjonen. Dette DNA-fragmentet ble klonet inn i de tilsvarende setene i pSYN-IFN β-008 for å skape plasmidet pSYN-IFN β-009 som inneholder IFN β-Fc-sekvensen med en åtte aminosyrelinker og en N297A-mutasjon i Fc i ekspresjonsvektoren pED.dC.
Kloning av Ig κ-signalsekvens-Fc N297A-6His. De følgende primere ble brukt for å addere en 6xHis-tag til C-terminus i den Fc N297A-kodende sekvensen:
Fc GS-F: 5'-GGCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCC-3' (SEKV.ID. NR. 95)
Fc.6His-R: 5'-TCAGTGGTGATGGTGATGATGTTTACCCGGAGACAGGGAG-3' (SEKV.ID. NR. 96)
Fc.6His-F: 5'-GGTAAACATCATCACCATCACCACTGAGAATTCC AATATCACTAGTGAATTCG-3' (SEKV.ID. NR. 97)
Sp6+T-R: 5'-GCTATTTAGGTGACACTATAGAATACTCAAGC-3' (SEKV.ID. NR. 98)
Det ble utført to PCR-reaksjoner med 50 pmol av enten Fc GS-F og Fc.6His-R eller Fc.6His-F og Sp6+T-R ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat. Begge reaksjonene ble utført ved å bruke 500 ng pSYN-Fc-008 som en templat i en 50 μl reaksjonsblanding ved å bruke de standardbetingelser som er beskrevet tidligere med hensyn til sykluser og temperaturer. Bånd med de forventede størrelser ( ~780 og 138 bp henholdsvis) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og så blandet i en 50 μl PCR-reaksjonsblanding med 50 pmol av Fc GS-F og Sp6+T-R-primere og kjørt som tidligere ved å bruke standardbetingelser som beskrevet tidligere. Båndet med den forventede størrelsen ( ~891 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og klonet inn i pcDNA6 V5-His B ved å bruke HindIII- og EcoRI-setene for å utviklet pSYN-Fc-014 (pcDNA6/Ig κ sig seq-Fc N297A-6 His).
Eksempel 35: Ekspresjon og rensing av IFN βFc, IFN β-Fc N297A-homodimer og IFN β-Fc N297 A monomer-dimerhybrid
CHO DG44-celler ble utplatet i 100 mm vevskulturskåler og dyrket til en sammenflytning på 50%-60%. Totalt 10 μg DNA ble brukt for å transfektere en enkelt 100 mm skål. For homodimertransfeksjonen ble det brukt 10 μg av pSYN-FN β-008- eller pSYN-IFN β-009-konstruktet; for monomer
dimerhybridtransfeksjonen 8 μg av pSYN-IFN β-009 2 μg av pSYN-Fc-014-konstruktet. Cellene ble transfektert ved å bruke Superfect transfeksjonsreagenser (Qiagen, Valencia, CA) ved å følge fabrikantens instruksjoner. 48 til 72 timer etter transfeksjon ble vekstmediet fjernet og cellene ble frigjort fra platene med 0,25% trypsin og overført til T72 vevskulturkolber i seleksjonsmedium (MEM alfa uten nukleosider pluss 5% dialysert storfefosterserum). Seleksjonsmediet for monomerdimerhybridtransfeksjonen ble supplert med 5 μg/ml blasticidin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Seleksjonen ble fortsatt i 10-14 dager inntil cellene begynte å vokse så godt at det var etablert stabile cellelinjer. Proteinekspresjonen ble deretter amplifisert ved å tilsette metotreksat i en mengde som varierte fra 10 til 50 nM.
For alle cellelinjene ble omtrent 2 x 10<7 >celler brukt for å inokulere 300 ml vekstmedium i en 1700 cm<2 >valseflaske (Corning, Corning, NY). Flaskene ble innkubert i en 5% CO2-atmosfære ved 37 ºC i omtrent 72 timer. Vekstmediet ble så byttet ut med 300 ml serumfritt produksjonsmedium (DMEM/F12 med 5 μg/ml av humant insulin). Produksjonsmediet (kondisjonert medium) ble oppsamlet hver dag i 10 dager og lagret ved 4 ºC. Friskt produksjonsmedium ble tilsatt rulleflaskene etter hver oppsamling og flaskene ble så igjen plassert i inkubatoren. Før kromatografi ble mediet renset ved å bruke en SuporCap-100 (0,8/0,2 μm) filter fra Pall Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). Alle de følgende trinnene ble utført ved 4 ºC. Det rensede mediet ble påsatt en protein A sefarosekolonne, vasket med 5 kolonnevolumer av 1X PBS (10 mM fosfat, pH 7,4, 2,7 mM KCl og 137 mM NaCl) eluert med 0,1 M glysin, pH 2,7 og så nøytralisert med et 1/10 volum av 1 M Tris-HCl pH 8,5 og 5 M NaCl. Homodimerproteinene ble ytterligere renset på en Superdex 200 Prep Grade-kolonne som ble kjørt og eluert med 50 mM natriumfosfat pH 7,5, 500 mM NaCl og 10% glyserol.
Monomer-dimerhybridproteinet ble underkastet ytterligere rensing ettersom det inneholdt en blanding av IFN βFc N297A:IFN βFc N297A-homodimer, IFN βFc N297A:Fc N297A His monomer-dimerhybrid og Fc N297A His: Fc N297A Hishomodimer. Blandingen ble påsatt en nikkelgelaterende kolonne i 50 mM natriumfosfat pH 7,5, 500 mM NaCl. Etter påsetting ble kolonnen vasket med 50 mM imidazol i 50 mM natriumfosfat pH 7,5, 500 mM NaCl og proteinet ble eluert med en gradient fra 50 til 500 mM imidazol i 50 mM natriumfosfat pH 7,5, 500 mM NaCl. Fraksjoner som tilsvarte elueringstoppene på en UV-detektor ble oppsamlet og analysert ved SDS-PAGE. Fraksjonene fra den første toppen inneholdt IFN βFc N297A:Fc N297A His monomer-dimerhybrid, mens den andre toppen inneholdt Fc N297A His:Fc N297A His homodimer. Alle de fraksjoner som inneholdt monomerdimerhybriden men ingen Fc-homodimer, ble slått sammen og direkte påsatt en Superdex 200 Prep Grade-kolonne som så ble kjørt og eluert med 50 mM natriumfosfat pH 7,5, 500 mM NaCl, 10% glyserol. De fraksjoner som inneholdt IFN β-Fc N297A:Fc N297A His monomer-dimerhybridene ble slått sammen og lagret ved -80 ºC.
Eksempel 36: Antiviral prøve for IFN β-aktivitet
Antiviral aktivitet (IU/ml) for IFN β-fusjonsproteiner ble bestemt ved å bruke en CPE (cytopatisk effektiv) prøve. A549-celler ble utplatet i en 96 brønners vevskulturplate i vekstmedium (RPMI 1640 supplert med 10% storfefosterserum (FBS) og 2 mM L-glutamin) i 2 timer ved 37 ºC, 5% CO2. IFN β-standarder og IFN β-fusjonsproteiner ble fortynnet i vekstmedium og tilsatt cellene i tre paralleller i 20 timer ved 37 ºC, 5% CO2. Etter innkubering ble alt medium fjernet fra brønnene, encefalomyokardittvirus (EMCV) fortynnet i vekstmedium ble tilsatt (3000 pfu/brønn) til hver brønn med unntak av kontrollbrønnene. Platene ble så innkubert ved 37 ºC, 5% CO2 i 28 timer. Levende celler ble fiksert med 10% kald trikloreddiksyre (TCA) og deretter farget med sulforodamin B (SRB) ifølge publiserte protokoller (Rubinstein et al. 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82, 1113). SRB-fargestoffet ble gjort løselig med 10 mM Tris pH 10,5 og resultatet ble avlest på et spektrofotometer ved 490 nm. Prøvene ble analysert ved å sammenligne aktivitetene med en kjent standardkurve som varierte fra 10 til 0,199 IU/ml. Resultatene er angitt i den etterfølgende tabell 8 og viser økt antiviral aktivitet for monomerdimerhybrider.
TABELL 8: INTERFERON BETA ANTIVIRAL PRØVE HOMODIMER
VERSUS MONOMER-DIMERHYBRID
Eksempel 37: Administrering av IFN βFc-homodimer og monomer-dimerhybrid med en åtte aminosyrelinker til cynomolgusaper
For lungeadministrering ble det fremstilt aerosoler av enten IFN βFc-homodimer eller IFN βFc N297A monomer-dimerhybridproteiner (begge med 8 aminosyrelinkeren) i PBS, pH 7,4, 0,25% HSA, med Aeroneb Pro<TM >(AeroGen, Mountain View, CA) nebulisator, in-line med en Bird Mark 7A-respirator, og administrert bedøvde naturlige cynomolgusaper gjennom endotrakeale rør (omtrentlig normal åndedrettspust). Det ble tatt blodprøver på forskjellige tidspunkter og mengden av IFN β-holdig protein i det resulterende serumet ble kvantifisert ved å bruke en human IFN β-immunoprøve (Biosource International, Camarillo, CA). De farmakokinetiske parameterne ble beregnet ved å bruke dataprogrammet WinNonLin. Tabell 9 viser resultatene for cynomolgusaper behandlet med IFN βFc N297A monomer-dimerhybrid eller IFN βFc-homodimer.
TABELL 9: ADMINISTRERING AV IFN βFC N297A MONOMER-DIMERHYBRID OG IFN βFC-HOMODIMER TIL APER
<1>Basert p 15% avsetningsfraksjon av forstøvet dose slik dette var bestemt ved gammascintigrafi
Farmakokinetiske data for IFN βFc med en 8 aminosyrelinker administrert til cynomolgusaper er vist på figur 15. Figuren sammenligner IFN βFc-homodimeren med IFN βFc N298A monomer-dimerhybriden i aper etter administrering av en enkel lungedose. Det ble oppnådd signifikant høyere serumnivåer i aper behandlet med monomer-dimerhybriden sammenlignet med homodimeren.
Serumprøver ble også analysert for neopterinnivåer (en biomarkør for IFN βaktivitet) ved å bruke neopterin immunoprøve (MP Biomedicals, Orangeburg, NY). Resultatene for denne analysen er vist på figur 16. Figuren sammenligner neopterinstimulering som en respons på IFN β-Fc-homodimeren og IFN β-Fc N297A monomer-dimerhybriden. Det fremgår at signifikant høyere neopterinnivåer ble påvist i aper behandlet med IFN β-Fc N297A monomer-dimerhybriden sammenlignet med IFN β-Fc-homodimeren.
Alle tall som angir kvantiteter med hensyn til ingredienser, reaksjonsbetingelser og så videre i den foreliggende beskrivelsen og de etterfølgende kravene er å forstå slik at de i alle tilfeller er modifisert med begrepet "omkring". Hvis det ikke spesifikt er angitt å være et unntak, så er følgelig de numeriske parameterne som er angitt i beskrivelsen og de etterfølgende kravene tilnærminger som kan variere avhengig av de forønskede egenskaper man ønsker å oppnå ved hjelp av den foreliggende oppfinnelsen. Og helt til slutt og ikke som et forsøk på å begrense anvendelsen av den doktrine med hensyn til ekvivalenter som er brukt i de etterfølgende kravene, så må hver numeriske parameter ses på bakgrunn av antallet signifikante tall og ordinære avrundingsmetoder.
Alle de her siterte referanser inngår i sin helhet og for alle formål til samme grad som hvis hver individuelle publikasjon eller patent eller patentsøknad var spesifikt og individuelt indikert til å være inkorporert som en referanse i sin helhet for alle formål. I den grad at publikasjoner eller patenter eller patentsøknader som er inkorporert som en referanse står i motsetning til den beskrivelse som er gitt her, så er det beskrivelsen som gjelder og/eller tar presedens over ethvert slikt motstridende materiale.
Det kan utføres mange modifikasjoner og variasjoner av denne oppfinnelsen uten at man derved forlater dens omfang og intensjon, noe som vil være innlysende for personer innen fagfeltet. De spesifikke utførelser som er beskrevet her er utelukkende gitt som et eksempel og er ikke på noen måte ment å være begrensende. Det er underforstått at beskrivelsen og eksemplene utelukkende må anses som eksempler, slik at oppfinnelsens virkelige omfang og intensjon fremgår av de etterfølgende krav.

Claims (194)

PATENTKRAV
1. Kimært protein,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en første og en andre polypeptidkjede hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og
hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten et biologisk aktivt molekyl eller immunoglobulinvariabelt område.
2. Kimært protein ifølge krav 1,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte andre kjede ytterligere omfatter et affinitetsmerke.
3. Kimært protein ifølge krav 2,
k a r a k t e r i s e r t v e d at affinitetsmerket er et FLAG-merke.
4. Kimært protein ifølge krav 1,
k a r a k t e r i s e r t v e d at delen av et immunoglobulin er et Fc-fragment.
5. Kimært protein ifølge krav 4,
k a r a k t e r i s e r t v e d at delen av et immunoglobulin er en FcRnbindingspartner.
6. Kimært protein ifølge krav 5,
k a r a k t e r i s e r t v e d at FcRn-bindingspartneren er en peptidetterligning av et Fc-fragment av et immunoglobulin.
7. Kimært protein ifølge krav 1 eller 5,
k a r a k t e r i s e r t v e d at immunoglobulinet er IgG.
8. Kimært protein ifølge krav 1 eller 5,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er et polypeptid.
9. Kimært protein ifølge krav 7,
k a r a k t e r i s e r t v e d at IgG er et IgG1 eller et IgG2.
10. Kimært protein ifølge krav 1 eller 5,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er en viral fusjonshemmer.
11. Kimært protein ifølge krav 10,
k a r a k t e r i s e r t v e d at den virale fusjonshemmeren er en HIV-fusjonshemmer.
12. Kimært protein ifølge krav 11,
k a r a k t e r i s e r t v e d at HIV-fusjonshemmeren er T20 (SEKV.ID. NR. 1), T21 (SEKV.ID. NR. 2) eller T1249 (SEKV.ID. NR. 3).
13. Kimært protein ifølge krav 1 eller 5,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er en koaguleringsfaktor.
14. Kimært protein ifølge krav 13,
k a r a k t e r i s e r t v e d at koaguleringsfaktoren er faktor VII eller VIIa.
15. Kimært protein ifølge krav 13,
k a r a k t e r i s e r t v e d at koaguleringsfaktoren er faktor IX.
16. Kimært protein ifølge krav 1 eller 5,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er et lite molekyl.
17. Kimært protein ifølge krav 16,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er leuprolid.
18. Kimært protein ifølge krav 1 eller 5,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon.
19. Kimært protein ifølge krav 18,
k a r a k t e r i s e r t v e d at interferonet er interferon α og har en linker med en lengde på 15-25 aminosyrer.
20. Kimært protein ifølge krav 19,
k a r a k t e r i s e r t v e d at interferon α har en linker på 15-20 aminosyrer.
21. Kimært protein ifølge krav 1 eller 5,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er en nukleinsyre.
22. Kimært protein ifølge krav 21,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nukleinsyren er DNA eller RNA.
23. Kimært protein ifølge krav 21,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nukleinsyren er et antisensmolekyl.
24. Kimært protein ifølge krav 21,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nukleinsyren er et ribozym.
25. Kimært protein ifølge krav 1 eller 5,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er en vekstfaktor.
26. Kimært protein ifølge krav 25,
k a r a k t e r i s e r t v e d at vekstfaktoren er erytropoietin.
27. Kimært protein ifølge krav 16,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det lille molekylet er en VLA4-antagonist.
28. Kimært protein,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en første og en andre polypeptidkjede hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, og
hvor nevnte andre kjede består av minst en del av et immunoglobulinkonstant område og eventuelt et affinitetsmerke.
29. Kimært protein ifølge krav 28,
k a r a k t e r i s e r t v e d at affinitetsmerket er et FLAG-merke.
30. Kimært protein ifølge krav 21,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en første og en andre polypeptidkjede hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, og
hvor nevnte andre kjede består i alt vesentlig av minst en del av et immunoglobulinkonstant område og eventuelt et affinitetsmerke.
31. Kimært protein ifølge krav 30,
k a r a k t e r i s e r t v e d at affinitetstaggen er et FLAG-merke.
32. Kimært protein,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en første og en andre polypeptidkjede
a) hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og et første domene som har minst én spesifikk bindingspartner; og
b) hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulin uten et biologisk aktivt molekyl eller immunoglobulinvariabelt område og ytterligere omfatter et andre domene og hvor nevnte andre domene er en spesifikk bindingspartner for nevnte første domene.
33. Kimært protein ifølge krav 32,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte andre kjede ytterligere omfatter et affinitetsmerke.
34. Kimært protein ifølge krav 33,
k a r a k t e r i s e r t v e d at affinitetsmerket er et FLAG-merke.
35. Kimært protein ifølge krav 32,
k a r a k t e r i s e r t v e d at delen av et immunoglobulin er et Fc-fragment.
36. Kimært protein ifølge krav 32 eller 35,
k a r a k t e r i s e r t v e d at immunoglobulinet er IgG.
37. Kimært protein ifølge krav 35,
k a r a k t e r i s e r t v e d at delen av et immunoglobulin er en FcRnbindingspartner.
38. Kimært protein ifølge krav 37,
k a r a k t e r i s e r t v e d at FcRn-bindingspartneren er en peptidetterligning av et Fc-fragment av et immunoglobulin.
39. Kimært protein ifølge krav 32 eller 37,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det første domenet er ikke-kovalent bundet til det andre domenet.
40. Kimært protein ifølge krav 32 eller 37,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det første domenet er halvparten en leukinzipperkveilet coil og det andre domenet er den komplementære bindingspartneren til nevnte leukinzipperkveilede coil.
41. Kimært protein ifølge krav 32 eller 37,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er et peptid.
42. Kimært protein ifølge krav 32 eller 37,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon.
43. Kimært protein ifølge krav 42,
k a r a k t e r i s e r t v e d at interferonet er interferon α og har en linker på 15-25 aminosyrer.
44. Kimært protein ifølge krav 43,
k a r a k t e r i s e r t v e d at interferon α har en linker på 15-20 aminosyrer.
45. Kimært protein ifølge krav 41,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er leuprolid.
46. Kimært protein ifølge krav 32 eller 37,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er en viral fusjonshemmer.
47. Kimært protein ifølge krav 46,
k a r a k t e r i s e r t v e d at den virale fusjonshemmeren er en HIV-fusjonshemmer.
48. Kimært protein ifølge krav 47,
k a r a k t e r i s e r t v e d at HIV-fusjonshemmeren er T20 (SEKV.ID. NR. 1) eller T21 (SEKV.ID. NR. 2) eller T1249 (SEKV.ID. NR. 3).
49. Kimært protein ifølge krav 32 eller 37,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er en koaguleringsfaktor.
50. Kimært protein ifølge krav 49,
k a r a k t e r i s e r t v e d at koaguleringsfaktoren er faktor VII eller faktor VIIa.
51. Kimært protein ifølge krav 49,
k a r a k t e r i s e r t v e d at koaguleringsfaktoren er faktor IX.
52. Kimært protein ifølge krav 32 eller 37,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er et lite molekyl.
53. Kimært protein ifølge krav 52,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det lille molekylet er en VLA4-antagonist.
54. Kimært protein ifølge krav 32 eller 37,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet omfatter en nukleinsyre.
55. Kimært protein ifølge krav 54,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nukleinsyren er DNA eller RNA.
56. Kimært protein ifølge krav 54,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nukleinsyren er en antisensnukleinsyre.
57. Kimært protein ifølge krav 54,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nukleinsyren er et ribozym.
58. Kimært protein ifølge krav 32 eller 37,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er en vekstfaktor eller et hormon.
59. Kimært protein ifølge krav 58,
k a r a k t e r i s e r t v e d at vekstfaktoren er erytropoietin.
60. Farmasøytisk sammensetning,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte det kimære proteinet ifølge krav 1, 5, 32 eller 37 og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel.
61. Kimært protein,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en første og en andre polypeptidkjede
a) hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og et første domene med minst én spesifikk bindingspartner; og
b) hvor nevnte andre kjede består av minst en del av et immunoglobulin og et andre domene, og hvor nevnte andre domene er en spesifikk bindingspartner til det første domenet, og eventuelt et affinitetsmerke.
62. Kimært protein ifølge krav 61,
k a r a k t e r i s e r t v e d at affinitetstaggen er et FLAG-merke.
63. Kimært protein,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en første og en andre polypeptidkjede
a) hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl, minst en del av et immunoglobulinkonstant område og et første domene minst én spesifikk bindingspartner; og
b) hvor nevnte andre kjede i alt vesentlig består av minst en del av et immunoglobulin og et andre domene, og hvor nevnte andre domene er en spesifikk bindingspartner for nevnte første domene og eventuelt et affinitetsmerke.
64. Kimært protein ifølge krav 63,
k a r a k t e r i s e r t v e d at affinitetsmerket er et FLAG-merke.
65. Fremgangsmåte for fremstilling av et biologisk aktivt kimært protein, k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte:
a) å transfektere en første celle med et første DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder et polypeptid som omfatter et biologisk aktivt molekyl som operativt er forbundet med et andre DNA-molekyl som koder minst en del av et immunoglobulinkonstant område;
b) å transfektere en andre celle med et andre DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder et polypeptid som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten et biologisk aktivt molekyl eller et variabelt område av et immunoglobulin;
c) å dyrke cellen fra a) og b) under slike betingelser at polypeptidet som er kodet av nevnte første DNA-konstrukt og nevnte andre DNA-konstrukt blir uttrykt; og
d) å isolere dimerene fra a) og b) fra nevnte transfekterte celle.
66. Fremgangsmåte ifølge krav 65,
k a r a k t e r i s e r t v e d at delen av et immunoglobulinkonstant område er en FcRn-bindingspartner.
67. Fremgangsmåte ifølge krav 65 eller 66,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er et polypeptid.
68. Fremgangsmåte ifølge krav 65 eller 66,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon.
69. Fremgangsmåte ifølge krav 68,
k a r a k t e r i s e r t v e d at interferonet er interferon α og har en linker på 15-25 aminosyrer.
70. Fremgangsmåte ifølge krav 69,
k a r a k t e r i s e r t v e d at interferon α har en linker på 15-20 aminosyrer.
71. Fremgangsmåte ifølge krav 65 eller 66,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er et peptid.
72. Fremgangsmåte ifølge krav 65 eller 66,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er en viral fusjonshemmer.
73. Fremgangsmåte ifølge krav 72,
k a r a k t e r i s e r t v e d at den virale fusjonshemmeren er en HIV-viral fusjonshemmer.
74. Fremgangsmåte ifølge krav 73,
k a r a k t e r i s e r t v e d at den HIV-virale fusjonshemmeren er T20 (SEKV.ID. NR. 1), T21 (SEKV.ID. NR. 2) eller T1249 (SEKV.ID. NR. 3).
75. Fremgangsmåte ifølge krav 65 eller 66,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet omfatter en koaguleringsfaktor.
76. Fremgangsmåte ifølge krav 75,
k a r a k t e r i s e r t v e d at koaguleringsfaktoren er faktor VII eller faktor VIIa.
77. Fremgangsmåte ifølge krav 75,
k a r a k t e r i s e r t v e d at koaguleringsfaktoren er faktor IX.
78. Fremgangsmåte ifølge krav 65 eller 66,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er et lite molekyl.
79. Fremgangsmåte ifølge krav 65 eller 66,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet omfatter en nukleinsyre.
80. Fremgangsmåte ifølge krav 79,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nukleinsyren er DNA eller RNA.
81. Fremgangsmåte ifølge krav 79,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nukleinsyren er et antisensmolekyl.
82. Fremgangsmåte ifølge krav 79,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nukleinsyren er et ribozym.
83. Fremgangsmåte ifølge krav 65 eller 66,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet omfatter en vekstfaktor eller et hormon.
84. Fremgangsmåte ifølge krav 83,
k a r a k t e r i s e r t v e d at vekstfaktoren er erytropoietin.
85. Fremgangsmåte ifølge krav 65 eller 66,
k a r a k t e r i s e r t v e d at dimerene isoleres ved kromatografi.
86. Fremgangsmåte ifølge krav 65 eller 66,
k a r a k t e r i s e r t v e d at cellen er en eukaryot celle.
87. Fremgangsmåte ifølge krav 86,
k a r a k t e r i s e r t v e d at den eukaryote cellen er en CHO-celle.
88. Fremgangsmåte ifølge krav 65 eller 66,
k a r a k t e r i s e r t v e d at cellen er en prokaryot celle.
89. Fremgangsmåte ifølge krav 88,
k a r a k t e r i s e r t v e d at den prokaryote cellen er E. coli.
90. Fremgangsmåte for å behandle en pasient med en sykdom eller tilstand, k a r a k t e r i s e r t v e d å administrere pasienten et kimært protein slik at nevnte sykdom eller tilstand blir behandlet, og hvor nevnte kimære protein omfatter en første og en andre polypeptidkjede,
a) nevnte første kjede omfatter en FcRn-bindingspartner og et biologisk aktivt molekyl, og
b) nevnte andre kjede omfatter en FcRn-bindingspartner uten et biologisk aktivt molekyl eller et variabelt område av et immunoglobulin.
91. Fremgangsmåte ifølge krav 90,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte kimære protein administreres intravenøst, subkutant, oralt, bukalt, sublingualt, nasalt, parenteral, rektalt, vaginalt eller via lungene.
92. Fremgangsmåte ifølge krav 90,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte sykdom eller tilstand er en virusinfeksjon.
93. Fremgangsmåte ifølge krav 90,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon.
94. Fremgangsmåte ifølge krav 93,
k a r a k t e r i s e r t v e d at interferonet er interferon α og har en linker på 15-25 aminosyrer.
95. Fremgangsmåte ifølge krav 94,
k a r a k t e r i s e r t v e d at interferon α har en linker på 15-20 aminosyrer.
96. Fremgangsmåte ifølge krav 90,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte sykdom eller tilstand er HIV.
97. Fremgangsmåte ifølge krav 90,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte biologisk aktive molekyl er en virusfusjonshemmer.
98. Fremgangsmåte ifølge krav 97,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte virusfusjonshemmer er T20, T21 eller T1249.
99. Fremgangsmåte ifølge krav 90,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte sykdom eller tilstand er en hemostatisk lidelse.
100. Fremgangsmåte ifølge krav 90,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte sykdom eller tilstand er hemofilia A.
101. Fremgangsmåte ifølge krav 90,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte sykdom eller tilstand er hemofilia B.
102. Fremgangsmåte ifølge krav 90,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte biologisk aktive molekyl er faktor VII eller faktor VIIa.
103. Fremgangsmåte ifølge krav 90,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte biologisk aktive molekyl er faktor IX.
104. Fremgangsmåte ifølge krav 90,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte sykdom eller tilstand er anemi.
105. Fremgangsmåte ifølge krav 90,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte biologisk aktive molekyl er erytropoietin.
106. Kimært protein,
k a r a k t e r i s e r t v e d formelen
X-La-F:F eller F:F-La-X
hvor X er et biologisk aktivt molekyl, L er en linker, F er minst en del av et immunoglobulinkonstant område og a er ethvert helt tall eller null.
107. Kimært protein ifølge krav 106,
k a r a k t e r i s e r t v e d at F er en FcRn-bindingspartner.
108. Kimært protein ifølge krav 106,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte FcRn er en peptidetterligning av et Fcfragment av et immunoglobulin.
109. Kimært protein ifølge krav 106 eller 107,
k a r a k t e r i s e r t v e d at hver F er kjemisk assosiert med den andre F.
110. Kimært protein ifølge krav 109,
k a r a k t e r i s e r t v e d at den kjemiske assosiasjonen er en ikke-kovalent interaksjon.
111. Kimært protein ifølge krav 109,
k a r a k t e r i s e r t v e d at den kjemiske bindingen er en kovalent binding.
112. Kimært protein ifølge krav 109,
k a r a k t e r i s e r t v e d at den kjemiske bindingen er en disulfidbinding.
113. Kimært protein ifølge krav 106 eller 107,
k a r a k t e r i s e r t v e d at F er forbundet med F ved en binding som ikke er en disulfidbinding.
114. Kimært protein ifølge krav 106,
k a r a k t e r i s e r t v e d at F er et IgG immunoglobulinkonstant område.
115. Kimært protein ifølge krav 106,
k a r a k t e r i s e r t v e d at F er et IgG1.
116. Kimært protein ifølge krav 106,
k a r a k t e r i s e r t v e d at F er et Fc-fragment.
117. Kimært protein ifølge krav 106,
k a r a k t e r i s e r t v e d at X er et polypeptid.
118. Kimært protein ifølge krav 106,
k a r a k t e r i s e r t v e d at X er leuprolin.
119. Kimært protein ifølge krav 106,
k a r a k t e r i s e r t v e d at X er et lite molekyl.
120. Kimært protein ifølge krav 119,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det lille molekylet er en VLA4-antagonist.
121. Kimært protein ifølge krav 106,
k a r a k t e r i s e r t v e d at X er en virusfusjonshemmer.
122. Kimært protein ifølge krav 121,
k a r a k t e r i s e r t v e d at virusfusjonshemmeren er en HIV-fusjonshemmer.
123. Kimært protein ifølge krav 122,
k a r a k t e r i s e r t v e d at HIV-fusjonshemmeren er T20 (SEKV.ID. NR. 1) eller T21 (SEKV.ID. NR. 2) eller T1249 (SEKV.ID. NR. 3).
124. Kimært protein ifølge krav 106 eller 107,
k a r a k t e r i s e r t v e d at X er en koaguleringsfaktor.
125. Kimært protein ifølge krav 124,
k a r a k t e r i s e r t v e d at koaguleringsfaktoren er faktor VII eller VIIa.
126. Kimært protein ifølge krav 124,
k a r a k t e r i s e r t v e d at koaguleringsfaktoren er faktor IX.
127. Kimært protein ifølge krav 106 eller 107,
k a r a k t e r i s e r t v e d at X er en nukleinsyre.
128. Kimært protein ifølge krav 127,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nukleinsyren er et DNA- eller RNA-molekyl.
129. Kimært protein ifølge krav 106 eller 107,
k a r a k t e r i s e r t v e d at X er en vekstfaktor.
130. Kimært protein ifølge krav 129,
k a r a k t e r i s e r t v e d at vekstfaktoren er erytropoietin.
131. Fremgangsmåte for å behandle en sykdom eller en tilstand i en pasient, k a r a k t e r i s e r t v e d å administrere det kimære proteinet ifølge krav 1, 5, 32, 37, 106 eller 107 til nevnte pasient.
132. Fremgangsmåte ifølge krav 131,
k a r a k t e r i s e r t v e d at sykdommen eller tilstanden er en virusinfeksjon.
133. Fremgangsmåte ifølge krav 131,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon.
134. Fremgangsmåte ifølge krav 133,
k a r a k t e r i s e r t v e d at interferonet er interferon α og har en linker på 15-25 aminosyrer.
135. Fremgangsmåte ifølge krav 134,
k a r a k t e r i s e r t v e d at interferon α har en linker på 15-20 aminosyrer.
136. Fremgangsmåte ifølge krav 132,
k a r a k t e r i s e r t v e d at virusinfeksjonen er HIV.
137. Fremgangsmåte ifølge krav 131,
k a r a k t e r i s e r t v e d at sykdommen eller tilstanden er en bløderlidelse.
138. Fremgangsmåte ifølge krav 137,
k a r a k t e r i s e r t v e d at bløderlidelsen er hemofilia A.
139. Fremgangsmåte ifølge krav 137,
k a r a k t e r i s e r t v e d at bløderlidelsen er hemofilia B.
140. Fremgangsmåte ifølge krav 131,
k a r a k t e r i s e r t v e d at sykdommen eller tilstanden er anemi.
141. Fremgangsmåte ifølge krav 131,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det kimære proteinet administreres intravenøst, intramuskulært, subkutant, oralt, bukalt, sublingualt, nasalt, rektalt, vaginalt, via en aerosol eller via lungene.
142. Fremgangsmåte ifølge krav 141,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det kimære proteinet administreres via lungene.
143. Fremgangsmåte ifølge krav 141,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det kimære proteinet administreres oralt.
144. Fremgangsmåte ifølge krav 131,
k a r a k t e r i s e r t v e d at immunoglobulinet er IgG.
145. Fremgangsmåte ifølge krav 131,
k a r a k t e r i s e r t v e d at delen av et immunoglobulin er et Fc-fragment.
146. Kimært protein,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en første og en andre polypeptidkjede som er forbundet med hverandre, og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten det biologisk aktive molekylet fra nevnte første kjede og hvor nevnte andre kjede ikke er kovalent bundet til noe molekyl med en molekylvekt som er større enn 2 kD.
147. Kimært protein ifølge krav 146,
k a r a k t e r i s e r t v e d at delen av et immunoglobulinkonstant område er en FcRn-bindingspartner.
148. Kimært protein,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en første og en andre polypeptidkjede som er forbundet med hverandre, og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område som ikke kovalent forbundet med noe annet molekyl, bortsett fra delen av et immunoglobulin i nevnte første polypeptidkjede.
149. Kimært protein ifølge krav 148,
k a r a k t e r i s e r t v e d at delen av et immunoglobulinkonstant område er en FcRn-bindingspartner.
150. Kimært protein,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en første og en andre polypeptidkjede som er forbundet med hverandre, og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og hvor nevnte andre kjede består av minst en del av et immunoglobulinkonstant område.
151. Kimært protein ifølge krav 150,
k a r a k t e r i s e r t v e d at delen av et immunoglobulinkonstant område er en FcRn-bindingspartner.
152. Kimært protein,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en første og en andre polypeptidkjede som er forbundet med hverandre, og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten det biologisk aktive molekylet fra den første kjeden, og et molekyl som kovalent er tilknyttet og som har en molekylvekt på mindre enn 2 kD.
153. Kimært protein ifølge krav 152,
k a r a k t e r i s e r t v e d at delen av et immunoglobulinkonstant område er en FcRn-bindingspartner.
154. Fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein som omfatter et Fcfragment av et immunoglobulin forbundet med et biologisk aktivt molekyl, k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte
a) å transfektere en celle med et DNA-konstrukt som omfatter en DNA-sekvens som koder et Fc-fragment av et immunoglobulin og en andre DNA-sekvens som koder intein;
b) å dyrke nevnte celle under slike betingelser at Fc-fragmentet og intein blir uttrykt;
c) å isolere nevnte Fc-fragment og intein fra nevnte celle;
d) kjemisk å syntetisere et biologisk aktivt molekyl med en N-terminal Cys;
e) å reagere det isolerte intein Fc fra c) med MESNA for å utviklet en C-terminal tioester;
f) å reagere det biologisk aktive molekylet fra d) med nevnte Fc fra e) for derved å få fremstilt et kimært protein som omfatter et Fc forbundet med et biologisk aktivt molekyl.
155. Fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein som omfatter et Fcfragment av et immunglobulin forbundet med et biologisk aktivt molekyl, k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte
a) å transfektere en celle med et DNA-konstrukt som omfatter en DNA-sekvens som koder et Fc-fragment av et immunoglobulin og en andre DNA-sekvens som koder et signalpeptid hvor nevnte signalpeptid er nærliggende til et Fc-fragment cystein;
b) å dyrke nevnte celle under slike betingelser at Fc-fragmentet og signalpeptidet blir uttrykt og Fc-fragmentet blir utskilt fra cellen uten signalpeptidet og med et N-terminalt cystein;
c) å isolere dimerene av nevnte Fc-fragment med et N-terminalt cystein fra nevnte celle;
d) kjemisk å syntetisere et biologisk aktivt molekyl med en tioester;
e) å reagere det biologisk aktive molekylet fra d) med nevnte Fc fra c) under slike betingelser at det biologisk aktive molekylet kan forbinde seg til en kjede i dimeren fra c) for derved å få fremstilt et kimært protein som omfatter et Fc forbundet med et biologisk aktivt molekyl.
156. Fremgangsmåte ifølge krav 155,
k a r a k t e r i s e r t v e d at tioesteren er en C-terminal tioester.
157. Fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein som omfatter et Fcfragment av et immunoglobulin forbundet med et biologisk aktivt molekyl, k a r a k t e r i s e r t v e d å
a) å transfektere en celle med et DNA-konstrukt som omfatter en DNA-sekvens som koder et Fc-fragment av et immunoglobulin og en andre DNA-sekvens som koder et signalpeptid hvor nevnte signalpeptid er nærliggende til et Fc-fragment cystein;
b) å dyrke nevnte celle under slike betingelser at Fc-fragmentet og signalpeptidet blir uttrykt forbundet med hverandre og at nevnte signalpeptid blir avspaltet fra Fcfragmentet av cellen i en posisjon som er nærliggende til cysteinet eller en andre posisjon nærliggende til et valin;
c) å isolere dimerene av nevnte Fc-fragmenter med to N-terminale cysteiner eller to N-terminale valiner eller et N-terminalt cystein og et N-terminalt valin fra nevnte celle;
d) kjemisk å syntetisere et biologisk aktivt molekyl med en tioester;
e) å reagere det biologisk aktive molekylet fra d) med dimerene fra c) for derved å få fremstilt et kimært protein som omfatter en første kjede som omfatter et Fc forbundet med et biologisk aktivt molekyl og en andre kjede som omfatter et Fc ikke forbundet med noe biologisk aktivt molekyl eller et variabelt område av et immunoglobulin.
158. Fremgangsmåte ifølge krav 157,
k a r a k t e r i s e r t v e d at tioesteren er en C-terminal tioester.
159. Kimært protein ifølge krav 20,
k a r a k t e r i s e r t v e d at linkeren er (GGGS)3.
160. Fremgangsmåte for å isolere en monomer-dimerhybrid fra en blanding, hvor blandingen omfatter
a) monomer-dimerhybriden som omfatter en første og en andre polypeptidkjede hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunglobulinkonstant område, og hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten et biologisk aktivt molekyl eller immunoglobulinvariabelt område;
b) en dimer som omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor begge kjedene omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område;
c) en del av et immunoglobulinkonstant område;
k a r a k t e r i s e r t v e d å
1) kontakte blandingen med en fargestoffligand bundet til et fast underlag under egnede betingelser slik at både monomer-dimerhybriden og dimeren binder seg til fargestoffliganden;
2) fjerne den ubundne delen av et immunoglobulinkonstant område;
3) endre de egnede betingelsene fra 1) slik at bindingen mellom monomerdimerhybriden og fargestoffliganden som er forbundet med det faste underlaget blir brutt;
4) isolere monomer-dimerhybriden.
161. Fremgangsmåte ifølge krav 160,
k a r a k t e r i s e r t v e d at delen av et immunoglobulin er et Fc-fragment.
162. Fremgangsmåte ifølge krav 160,
k a r a k t e r i s e r t v e d at fargestoffliganden er et biomimetikummolekyl.
163. Fremgangsmåte ifølge krav 160,
k a r a k t e r i s e r t v e d at fargestoffliganden velges fra Mimetic Red 1<TM>, Mimetic Red 2<TM>, Mimetic Orange 1<TM>, Mimetic Orange 2<TM>, Mimetic Orange 3<TM>, Mimetic Yellow 1<TM>, Mimetic Yellow 2<TM>, Mimetic Green 1<TM>, Mimetic Blue 1<TM >og Mimetic Blue 2<TM>.
164. Fremgangsmåte ifølge krav 160,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det kimære proteinet omfatter Epo.
165. Fremgangsmåte ifølge krav 163 eller 164,
k a r a k t e r i s e r t v e d at fargestoffliganden er Mimetic Red 2<TM>.
166. Fremgangsmåte ifølge krav 160,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det kimære proteinet omfatter faktor VII eller VIIa.
167. Fremgangsmåte ifølge krav 160,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det kimære proteinet omfatter faktor IX.
168. Fremgangsmåte ifølge krav 160,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det kimære proteinet omfatter interferon.
169. Fremgangsmåte ifølge krav 160,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det kimære proteinet omfatter en HIV-fusjonshemmer.
170. Fremgangsmåte ifølge krav 163 eller 167,
k a r a k t e r i s e r t v e d at fargestoffliganden er Mimetic Green 1<TM>.
171. Fremgangsmåte ifølge krav 160,
k a r a k t e r i s e r t v e d at de egnede betingelsene omfatter en buffer med en pH i området fra 4 til 9 inklusive.
172. Fremgangsmåte ifølge krav 171,
k a r a k t e r i s e r t v e d at endring av de egnede betingelsene omfatter å tilsette minst ett salt til bufferen i en konsentrasjon som er tilstrekkelig til å bryte bindingen mellom monomer-dimerhybriden og fargestoffliganden for derved å isolere monomer-dimerhybriden.
173. Fremgangsmåte ifølge krav 172,
k a r a k t e r i s e r t v e d at minst ett salt er NaCl.
174. Fremgangsmåte ifølge krav 171,
k a r a k t e r i s e r t v e d at bufferen har en pH på 8.
175. Fremgangsmåte ifølge krav 174,
k a r a k t e r i s e r t v e d at saltkonsentrasjonen er 400 mM og det kimære proteinet omfatter Epo.
176. Fremgangsmåte ifølge krav 172,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det ytterligere tilsettes en høyere saltkonsentrasjon sammenlignet med den saltkonsentrasjonen som bryter bindingen mellom monomerdimerhybriden og fargestoffliganden slik at den høyere saltkonsentrasjonen bryter bindingen mellom dimeren og fargestoffliganden for derved å isolere dimeren.
177. Kimært protein ifølge krav 18,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon α.
178. Kimært protein ifølge krav 18,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon β.
179. Kimært protein ifølge krav 42,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon α.
180. Kimært protein ifølge krav 42,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon β.
181. Kimært protein ifølge krav 68,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon α.
182. Kimært protein ifølge krav 68,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon β.
183. Kimært protein ifølge krav 93,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon α.
184. Kimært protein ifølge krav 93,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon β.
185. Kimært protein ifølge krav 133,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon α.
186. Kimært protein ifølge krav 133,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon β.
187. Kimært protein ifølge krav 168,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon α.
188. Kimært protein ifølge krav 168,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det biologisk aktive molekylet er interferon β.
189. Kimært protein,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en første og en andre polypeptidkjede hvor nevnte første kjede omfatter EPO, en åtte aminosyrelinker med aminosyresekvensen EFAGAAAV og et Fc-fragment av et immunoglobulinkonstant område som omfatter en mutasjon av asparagin til alanin i posisjon 297; og
hvor nevnte andre kjede omfatter et Fc-fragment av et immunoglobulinkonstant område som omfatter en mutasjon av asparagin til alanin i posisjon 297.
190. Kimært protein ifølge krav 189,
k a r a k t e r i s e r t v e d ytterligere å omfatte et affinitetsmerke.
191. Kimært protein,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en første og en andre polypeptidkjede hvor nevnte første kjede omfatter IFN β, en åtte aminosyrelinker med aminosyresekvensen EFAGAAAV og et Fc-fragment av et immunoglobulinkonstant område som omfatter en mutasjon av asparagin til alanin i posisjon 297; og
hvor nevnte andre kjede omfatter et Fc-fragment av et immunoglobulinkonstant område som omfatter en mutasjon av asparagin til alanin i posisjon 297.
192. Kimært protein ifølge krav 191,
k a r a k t e r i s e r t v e d ytterligere å omfatte et affinitetsmerke.
193. Kimært protein,
k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en første og andre polypeptidkjede hvor nevnte første kjede omfatter faktor IX, en åtte aminosyrelinker med aminosyresekvensen EFAGAAAV og et Fc-fragment av et immunglobulinkonstant område som omfatter en mutasjon av asparagin til alanin i posisjon 297; og hvor nevnte andre kjede omfatter et Fc-fragment av et immunoglobulinkonstant område som omfatter en mutasjon av asparagin til alanin i posisjon 297.
194. Kimært protein ifølge krav 193,
k a r a k t e r i s e r t v e d ytterligere å omfatte et affinitetsmerke.
NO20210848A 2003-05-06 2021-06-30 Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider NO20210848A1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46960003P 2003-05-06 2003-05-06
US48796403P 2003-07-17 2003-07-17
PCT/US2004/014064 WO2005001025A2 (en) 2003-05-06 2004-05-06 Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NO20210848A1 true NO20210848A1 (no) 2006-01-04

Family

ID=67137102

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20180506A NO345794B1 (no) 2003-05-06 2018-04-13 Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider
NO20210848A NO20210848A1 (no) 2003-05-06 2021-06-30 Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20180506A NO345794B1 (no) 2003-05-06 2018-04-13 Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider

Country Status (1)

Country Link
NO (2) NO345794B1 (no)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2641468A1 (fr) * 1989-01-11 1990-07-13 Merieux Inst Anticorps chimeriques anti-recepteur de l'interleukine-2 humaine, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant

Also Published As

Publication number Publication date
NO20180506A1 (no) 2006-01-04
NO345794B1 (no) 2021-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11168125B2 (en) Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7348004B2 (en) Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
NO20210848A1 (no) Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider
AU2012200470B2 (en) Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids
AU2016244273A1 (en) Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids
AU2013245463A1 (en) Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids

Legal Events

Date Code Title Description
FC2A Withdrawal, rejection or dismissal of laid open patent application