CN105188750A - 治疗和预防远端缺血-再灌注损伤 - Google Patents

治疗和预防远端缺血-再灌注损伤 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗和/或预防远端缺血-再灌注损伤(IRI)的接触活化系统抑制物、优选地C1INH，包括向个体施用接触活化系统抑制物。

Description

治疗和预防远端缺血-再灌注损伤
背景技术
建立无血液环境是重建手术和矫形手术中的前提，这常通过应用止血带实现。血液和氧丧失(称作局部缺血)导致受累组织的时间依赖性分子变化和结构变化。当血流量恢复时，则复杂炎症级联(如补体、凝血以及血浆激肽释放酶-激肽系统)激活，导致局部缺血/再灌注损伤(IRI)。止血带所致的IRI表现为水肿形成、肌肉活力丧失和凋亡，这显著影响手术介入结局。另外，已知IRI引起局部炎症反应以及全身性炎症反应，导致远端组织和器官损伤，一种在门诊熟知的现象。直至现在，不存在治疗IRI后局部炎症反应以及全身性炎症反应的门诊可用药物存在(1)。
已经显示天然补体抑制物C1酯酶抑制物(C1INH)抑制全部三条补体途径(经典途径、凝集素途径以及旁路途径)、凝血系统以及激肽释放酶-激肽系统(2-4)。血浆衍生的C1INH成功用于门诊中来治疗患有遗传性血管性水肿(HAE)的C1INH缺陷型患者(2)。几项动物研究已经展示血浆衍生的C1INH对局部IRI即实体器官移植、心肌梗死、卒中、肝和肠道IRI的治疗潜力(4)。两个不同研究展示了血浆衍生的C1INH对局部骨骼肌IRI的潜在治疗作用，这种作用归功于补体系统(5,6)。一项使用以“生理性超”高血浆水平过量表达人C1INH的转基因小鼠的研究显示在下躯干IRI模型中肺和骨骼肌内远端器官损伤减少(7)。但是，在这个模型中C1INH组成型表达，包括在胚胎发育期间，这可能导致生理学和病理生理反应性的改变。迄今，尚未展示血浆衍生的C1INH对IRI所致远端组织或器官损伤的影响。
令人惊讶地，使用应用止血带的后肢IRI的大鼠动物模型，发明人可以展示血浆衍生的C1INH对本地组织和器官损伤及对远端组织和器官损伤的治疗作用。例如，观察到肺水肿显著减少。C1INH在抑制接触活化系统中发挥主要作用，并且其对远端组织和器官损伤的作用显示该系统的这种组分对IRI期间观察到的本地组织和器官损伤及远端损伤的重大病理生理作用。结果表明，靶向接触活化系统的物质如C1INH、激肽释放酶抑制物或因子XII(FXII)抑制物，改善或甚至防止远端组织和器官损伤。
发明概述
本发明尤其涉及以下项[1]至[32]中定义的主体。
[1].一种选自C1酯酶抑制物(C1INH)、激肽释放酶抑制物和因子XII(FXII)抑制物的接触活化系统抑制物，用于治疗和/或预防远端缺血-再灌注损伤(IRI)，包括向个体施用所述接触活化系统抑制物。
[2]根据项[1]使用的接触活化系统抑制物，其中接触活化系统抑制物是C1INH、优选地人C1INH、更优选地人血浆衍生的C1INH或人重组C1INH。
[3]根据项[1]使用的接触活化系统抑制物，其中接触活化系统抑制物是FXII抑制物。
[4]根据前述项中任一项使用的接触活化系统抑制物，其中将接触活化系统抑制物以肠胃外方式向个体施用。
[5]根据前述项中任一项使用的接触活化系统抑制物，其中将接触活化系统抑制物以静脉内、动脉内或皮下方式向个体施用。
[6]根据前述项中任一项使用的接触活化系统抑制物，其中接触活化系统抑制物是C1INH并且其中向个体施用的C1INH的剂量是1至5000IU/kg体重、优选地1至1000IU/kg体重、更优选地10至500IU/kg体重。
[7]根据项[6]使用的接触活化系统抑制物，其中向个体施用的C1INH的剂量是10至250IU/kg体重、优选地20至100IU/kg体重。
[8]根据项[3]或[4]使用的接触活化系统抑制物，其中接触活化系统抑制物是FXII抑制物，并且其中向个体施用的FXII抑制物的剂量适于完全抑制FXIIa的酰胺分解活性。优选地，当FXII抑制物是抗体时，向个体施用的剂量是0.01至50mg/kg体重、优选地0.1至10mg/kg体重。
[9]根据前述项中任一项使用的接触活化系统抑制物，其中个体是将接受或已经接受手术介入的患者。
[10]根据项[9]使用的接触活化系统抑制物，其中将接触活化系统抑制物，优选地C1INH，在开始手术介入或开始再灌注之前7天内、优选地6天内、更优选地5天内、甚至更优选地4天内施用至患者。更优选地在开始手术介入或开始再灌注之前72小时内、优选地48小时内、更优选地24小时内、更优选地12小时内、甚至更优选地6小时内施用。
[11]根据项[9]或项[10]使用的接触活化系统抑制物，其中将接触活化系统抑制物、优选地C1INH在手术介入期间施用至患者。
[12]根据项[9]至[11]中任一项使用的接触活化系统抑制物，其中将接触活化系统抑制物、优选地C1INH在终止手术介入后或在开始再灌注后施用至患者。
[13]根据项[12]使用的接触活化系统抑制物，其中将接触活化系统抑制物、优选地C1INH在终止手术介入或开始再灌注后72小时内、优选地48小时内、更优选地24小时内、更优选地12小时内、甚至更优选地6小时内或最优选地直接施用至患者。
[14]根据项[9]至[13]中任一项使用的接触活化系统抑制物，其中手术介入是重建手术或创伤手术。
[15]根据项[9]至[13]中任一项使用的接触活化系统抑制物，其中手术介入是矫形手术。
[16]根据项[15]使用的接触活化系统抑制物，其中矫形手术选自膝部手术、肩部手术和手部手术。
[17]根据项[9]至[13]中任一项使用的接触活化系统抑制物，其中手术介入是移植。
[18]根据项[17]使用的接触活化系统抑制物，其中移植是器官移植、组织移植或细胞移植、优选地肾、肝、肺、肠、胰、心脏、肢端(例如手)、皮肤或胰岛细胞移植。
[19]根据项[9]至[13]中任一项使用的接触活化系统抑制物，其中手术介入是血管手术或治疗碰撞/挤压损伤的手术。
[20]根据项[9]至[13]中任一项使用的接触活化系统抑制物，其中手术介入是插入向个体递送药理活性物质(如溶栓物质或血管舒张药)或注射药理活性物质(如溶栓物质或血管舒张药)的装置、优选地导管，或插入用于机械消除血管完全或部分阻塞的装置。
[21]根据项[20]使用的接触活化系统抑制物，其中个体已经罹患心肌梗死、卒中、血栓形成、优选地深静脉血栓形成或在异物表面如支架处血栓形成事件、血栓栓塞、肺栓塞、因动脉粥样硬化所致慢性局部缺血、优选地因外周动脉粥样硬化所致慢性肢体局部缺血或其他的血管完全或部分阻塞。
[22]根据项[1]至[8]使用的接触活化系统抑制物，其中远端IRI归因于个体中自发或由手术介入之外的手段引起的受损血流量改善。
[23]根据项[22]使用的接触活化系统抑制物，其中在再灌注之前例如预防性施用或在再灌注发生后尽快施用。
[24]根据前述项中任一项使用的接触活化系统抑制物，其中接触活化系统抑制物是从人血浆分离的人C1INH。
[25]一种治疗和/或预防远端缺血-再灌注损伤(IRI)的方法，包括向个体施用有效剂量的接触活化系统抑制物。
[26]一种在将接受或已经接受手术介入的患者中预防缺血-再灌注损伤(IRI)的方法，包括在手术介入之前和/或其期间和/或之后或者在开始再灌注之前和/或之后，向所述患者施用有效剂量的接触活化系统抑制物，其中缺血-再灌注损伤(IRI)累及远离手术部位和/或初始局部缺血的器官、肢体或组织。
[27]项[25]或[26]的方法，其中接触活化系统抑制物选自C1INH、FXII抑制物和激肽释放酶抑制物。
[28]项[27]的方法，其中接触活化系统抑制物是C1INH、优选地人C1INH、更优选地血浆衍生的人C1INH。
[29]项[27]的方法，其中接触活化系统抑制物是FXII抑制物。
[30]根据项[25]至[29]中任一项的方法，其中远端缺血-再灌注损伤(IRI)累及肺、肾、脑、肝、心、肠、胰或其他器官和肢端。
[31]根据项[25]至[30]中任一项的方法，其中缺血-再灌注损伤(IRI)包括多器官功能障碍综合征或全身性炎症反应综合征。
[32]根据项[2]使用的接触活化系统抑制物，其中接触活化系统抑制物是C1INH、优选地人C1INH，并且与合成性或天然糖胺聚糖例如肝素、N-乙酰肝素、硫酸类肝素、硫酸葡聚糖、硫酸皮肤素和硫酸软骨素组合和/或与其他物质如静脉内用免疫球蛋白、抗凝血酶III、α1抗胰蛋白酶或FXII抑制物组合以改善治疗效果。这些物质可以作为联合疗法或多药疗法施用。
附图简述
图1：C1INH显著地防止腓肠肌湿:干比评估的局部骨骼肌水肿。A：湿:干比分析。B：非C1INH治疗的肢体(左)和C1INH治疗的肢体(右)的代表性图每个点表示一只动物的值。水平标度显示不同动物的均数。显示均值±SD数据。使用GraphPadPrism5软件，通过单因素方差分析连同Dunnetts后检验(post-test)确定统计学显著性。样品之间的统计学显著性如下指示*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图2：C1INH显著防止远端肺水肿。每个点表示一只动物的值。水平标度显示不同动物的均数。显示均值±SD数据。使用GraphPadPrism5软件，通过单因素方差分析连同Dunnetts后检验确定统计学显著性。样品之间的统计学显著性如下指示*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图3：C1INH对通过IF所分析的肺中缓激肽受体B1R和B2R表达的影响。A：B1R表达。B：B2R表达。每个点表示一只动物的值。水平标度显示不同动物的均数。显示均值±SD数据。使用GraphPadPrism5软件，通过单因素方差分析连同Dunnetts后检验确定统计学显著性。样品之间的统计学显著性如下指示*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图4：C1INH防止纤维蛋白在肺中沉积。每个点表示一只动物的值。水平标度显示不同动物的均数。使用GraphPadPrism5软件，通过单因素方差分析连同Dunnetts后检验确定统计学显著性。显示均值±SD数据。样品之间的统计学显著性如下指示*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图5：C1INH减少对侧腿中的纤维蛋白沉积。每个点表示一只动物的值。水平标度显示不同动物的均数。显示均值±SD数据。使用GraphPadPrism5软件，通过单因素方差分析连同Dunnetts后检验确定统计学显著性。样品之间的统计学显著性如下指示*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图6：C1INH抑制对侧肢体中的C3b和因子B沉积。每个点表示一只动物的值。A：C3b沉积。B：因子B沉积。水平标度显示不同动物的均数。显示均值±SD数据。使用GraphPadPrism5软件，通过单因素方差分析连同Dunnetts后检验确定统计学显著性。样品之间的统计学显著性如下指示*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图7：通过C1INH减弱对侧肢体中的硫酸类肝素散播。每个点表示一只动物的值。水平标度显示不同动物的均数。显示均值±SD数据。使用GraphPadPrism5软件，通过单因素方差分析连同Dunnetts后检验确定统计学显著性。样品之间的统计学显著性如下指示*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
发明详述
在一个方面，本发明涉及一种用于治疗和/或预防远端缺血-再灌注损伤(IRI)的接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物，包括向个体施用接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物。
术语“治疗”应当理解为包括完全治愈病理状况以及改善或缓和所述状况。
术语“预防”应当理解成包括完全预防、预防病理状况、减少其严重程度，以及降低个体因所述状况而患病的风险。这个术语还应当理解成包括通过在非常早期(例如在手术介入之前，在全面诊断远端IRI之前)施用本文所述的接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物，将组织预条件化，从而防止组织遭受损伤。
术语“个体”指人类或动物受试者。
表述“有效量”意在包括本公开物质(agent)的任何量，所述量足以引起所需的治疗性或预防性结果，特别当施用至个体时。
远端或远侧IRI
如本文所用，术语“缺血-再灌注损伤”(IRI)指因恢复先前已经由于缺血事件出现血流量不足的组织或器官区域的血流量产生的损伤。
IRI可以例如由天然事件(例如，心肌梗死后血流量恢复)、创伤造成或由恢复已经遭遇血液供应削弱的组织或器官的血流量的一种或多种外科手术或其他治疗性干预造成。这类外科手术例如包括冠状动脉旁路移植手术，冠脉血管成形术、器官移植手术等。
缺血组织的再灌注导致局部和全身性或远端反应，所述反应转而可以导致广泛微血管功能障碍和组织屏障功能改变。炎症反应可以甚至导致全身性炎症反应综合征(重症炎性反应综合征)或多器官功能障碍综合征(MODS)。
如本文所用，本文中互换使用的短语“远端IRI”(“remoteIRI”)或“远侧IRI”(“distantIRI”)或“远端或远侧IRI”指累及与已经再灌注的局部缺血器官和组织不同的器官或组织的病理生理过程如血栓形成过程、血栓栓塞过程和/或炎症过程，包括细胞性损伤、补体激活和/或水肿形成。
在一个实施方案中，远端或远侧IRI累及肺。这个实施方案的远端或远侧IRI可以包括肺水肿、肺内血栓形成过程、肺栓塞和/或肺组织的炎症。
在另一个实施方案中，远端IRI累及肾。这个实施方案远端IRI可以包括肾衰竭、水肿形成、血栓形成、血栓栓塞和/或肾组织的炎症。
在另一个实施方案中，远端IRI累及心血管系统。这个实施方案远端IRI可以包括心肌顿抑(尽管不存在不可逆性损伤，再灌注后持续存在的心肌功能障碍)、血栓形成、再灌注心率失常和/或心肌组织的炎症/梗死。
在另一个实施方案中，远端IRI累及胃肠系统，优选地累及肠。这个实施方案远端IRI可以包括肠道屏障功能降低、消化道运动性和吸收受损，血栓形成、血栓栓塞和/或胃肠道组织的炎症。
在另一个实施方案中，远端IRI累及中枢神经系统。这个实施方案远端IRI可以包括血脑屏障破坏、沉默型脑缺血，卒中、脑水肿、颅内压升高，和/或神经元组织的炎症。
远端IRI可以以炎症例如全身性炎症为特征。炎症可以例如累及肺、胃肠系统、心血管系统、其他四肢和/或中枢神经系统。
远端IRI可以包括全身性炎症反应综合征(重症炎性反应综合征)和/或多器官功能障碍综合征(MODS)。
远端IRI之前的缺血事件可以归因于手术，或归因于非手术引起的血管阻塞。
手术介入
在一个实施方案中，远端IRI归因于手术介入后缺血组织和/或器官的再灌注。手术介入包括任何外科手术。
根据本发明的可能应用包括通过施用接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物，连同因动脉瘤疾病而外科修复胸主动脉或肾上主动脉或腹主动脉一起、还连同主器官移植(包括肝、肾、小肠、肢端和胰)期间和/或之后引起或需要内脏血液供应一过性闭塞或迂回的那些外科手术一起，预防远端IRI。还包括连同导致一过性减少或阻止血流量的外科手术一起预防远端IRI，所述外科手术包括肝和胆手术切除、全胰切除术及部分胰切除术、全胃切除术和部分胃切除术、食管切除术，结直肠手术、肠系膜血管疾病的血管手术或腹腔镜外科术期间腹部注气。额外应用包括导致内脏器官血流量中断的钝器伤或贯通伤，包括源自戳伤或源自继发于机动车意外的贯通伤或钝性腹部创伤的那些创伤。其他应用包括挤压损伤，例如在天灾后挤压损伤。额外的应用包括插入下述装置，所述装置用于递送药理活性物质如溶栓剂或血管舒张药和/或用于机械消除完全阻塞或部分阻塞的装置以及用于初始血栓形成病症或血栓栓塞病症或另一种引起缺血的病症(包括但不限于卒中、心肌梗死、深静脉血栓形成、动脉粥样硬化或异物表面处血栓事件)发作之后注射药理活性物质如溶栓剂或血管舒张药。
优选地，手术介入选自矫形手术、血管手术、心脏手术、导管引导的手术、癌症手术和创伤手术。矫形手术优先地选自膝部手术、手部手术、肩部手术、受创伤的长骨、髋关节置换和背部手术。
血管手术可以归因于修复和/或事故，例如主动脉瘤等。
在一个实施方案中，手术是创伤手术，例如归因于车辆事故、碰撞损伤和挤压损伤，总体包括严重创伤伴血容量过低。
在一个具体实施方案中，手术介入是移植，优选地是器官移植。
非手术所致的血管阻塞
其他优选的应用包括导致全身性低血压的疾病或手术，所述全身性低血压破坏或降低血液流向内脏器官，包括因失血所致的出血性休克、因心肌梗死或心力衰竭所致的心源性休克、神经源性休克、肾源性休克或过敏反应。
远端IRI可以归因于局部缺血后的血流量改善，所述局部缺血因导致外周局部缺血伴随或不伴随器官局部缺血的低灌注所致。
远端IRI也可以归因于原发性器官或组织内部初始血栓形成过程或血栓栓塞过程(例如卒中和心肌梗死)后的血流量改善。
在一个实施方案中，远端IRI归因于慢性局部缺血事件如因外周动脉粥样硬化所致慢性肢体局部缺血后的血流量改善。
接触活化系统抑制物
如本文所用，术语“接触活化系统抑制物”指能够抑制接触活化系统的任何化合物。接触活化系统抑制物选自C1酯酶抑制物(C1INH)、因子XII(FXII)抑制物和激肽释放酶抑制物。这些抑制物具有优点：它们在接触活化系统途径中早期发挥作用并在接触活化系统中的多个点处相互作用。相反，缓激肽抑制物，如缓激肽受体拮抗药，在该系统的远点处发挥作用并且主要干预点在水肿形成层面(参考Souza等人(10))。
C1酯酶抑制物
来自人血浆的C1酯酶抑制物(C1INH)是一种具有478个氨基酸残基的糖基化单链多肽。人C1INH的氨基酸序列在SEQIDNO:1显示。平均血浆浓度是约240μg/mL。C1INH的同义词是C1-酯酶抑制蛋白、α2-神经氨基糖蛋白、C1s-抑制蛋白和C1-失活蛋白.
一国际单元(IU)的C1INH通过与WHO国际标准血浆C1-抑制蛋白比较确定。当前首选国际标准是NIBSC代码08/262，这种制品的赋予效力是0.89IU/安瓿。
如本文所用，术语“C1INH”指这样的多肽，所述多肽包含与如SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的同一性程度指两个序列之间相同的氨基酸的百分数。使用程序“BLAST2SEQUENCES(blastp)”(Tatusova等人,(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174,247-250)连同以下参数：矩阵BLOSUM62；开放缺口：罚分11和延伸缺口：罚分1；缺口x_dropoff50；期望：10.0；字长3；过滤程序：无，通过比较所讨论的氨基酸序列和SEQIDNO1，确定氨基酸序列相对于SEQIDNO:1的同一性程度。根据本发明，该序列比较覆盖至少400个氨基酸、优选地至少425个氨基酸、更优选地至少450个氨基酸和最优选地至少475个氨基酸。
C1INH优选地具有可以如Drouet等人(1988,ClinChimActa.174:121-30)所述那样分析的C1-抑制活性。更优选地，C1INH是具有如SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的人C1INH(还参见UniProtP05155)。
在一个实施方案中，C1INH已经从人或动物血浆、优选地人血浆分离。根据这个实施方案，C1INH优选地如天然人C1INH那样糖基化。
在另一个实施方案中，人或动物C1INH从表达C1INH的转染宿主细胞获得。这种“重组产生的”C1INH可以通过任何合适的方法制备。它可以例如在已经用编码C1INH的DNA转染的重组宿主细胞或生物中制备。
适用于本发明中的C1INH可以从培养基获得并通过标准方法纯化，其中所述培养基由分泌该蛋白质的修饰细胞条件化。
可以使用编码C1INH多肽的分离的核酸，通过重组技术获得该蛋白质或多肽。一般分子生物学方法例如由Sambrook等人,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,N.Y.，第2版,1989，并由Ausubel等人,((编著)CurrentProtocolsinMolecularBiology,NewYork(1987)描述。适宜的序列可以使用标准技术从基因组或cDNA文库获得。可以使用聚合酶链反应(PCR)技术。参见，例如PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,1990,Innis等人,(编著),AcademicPress,NewYork,N.Y。文库由从适宜细胞提取的核酸构成。可用基因序列可以例如存在于各种序列数据库(例如，对于核酸，GenBank，并且对于蛋白质，Swiss-Prot)。
标准方法可以用来产生大量表达该多肽的转化原核细胞系、哺乳动物细胞系、酵母细胞系或昆虫细胞系。示例性哺乳动物细胞系包括COS-7细胞、小鼠L细胞和CHO细胞。参见Sambrook(1989)，上文和Ausubel等人,1987,上文。
多种表达载体可以用来表达编码C1INH的DNA。可以使用用于原核细胞或真核细胞中表达重组蛋白的常规载体。
C1INH可以是以可溶性形式产生，如转化的或转染的酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞的分泌型产物。该肽随后可以通过本领域已知的标准程序纯化。例如，纯化步骤可以包括硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤、电泳、亲和层析等。参见EnzymologyPurificationPrinciplesandPractices(Springer-Verlag,N.Y.,1982)。
可选地，C1INH可以是以不可溶形式产生，如聚集物或包含体。这种形式的C1INH由本领域已知的标准程序纯化。纯化步骤的例子包括通过离心从破碎的宿主细胞分离包含体，并且随后用离液剂和还原剂溶解包含体，从而肽采取生物活性构象。
可以使用标准技术修饰用来转染宿主细胞的核苷酸序列，以产生具有多种所需特性的C1INH或其片段。这类修饰的C1INH可以在一级结构水平例如因氨基酸插入、置换、缺失和融合而不同于天然存在的序列。这些修饰可以按多种组合使用以产生最终的修饰的蛋白质链。可以按构思的多种目标制备氨基酸序列变体，包括增加或减少血清半寿期、促进纯化或制备、改善治疗效力、和减轻治疗性使用期间副作用的严重程度或发生率。氨基酸序列变体通常是自然界中不存在的预定变体，虽然其他可以是翻译后变体。这类变体可以用于本发明中，只要它们保留C1INH的生物活性。本发明的C1INH包括WO2007/073186和US8,071,532B2中公开的C1INH分子。
在多种宿主细胞中的表达可以产生具有修饰的糖结构的C1INH(与血浆衍生的C1INH相比)。与血浆衍生的C1INH相比，可以在以下一个或多个方面修饰C1INH：移除糖部分(从天然存在的糖蛋白变体或重组表达的糖蛋白变体)、优选地从N联糖链移除唾液酸和/或半乳糖和/或移除导致甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡糖胺和/或岩藻糖残基暴露的糖链。另外，构思修饰C1INH以增加其血浆半寿期，例如与延长半寿期的部分如白蛋白、免疫球蛋白Fc区融合，或化学修饰如C1INH的PEG化或羟基化。
因子XII抑制物
如本申请中所用，缩写“FXII”指因子XII(FXII)和活化型因子XII(FXIIa)之一或二者。因此，术语“FXII抑制物”包括FXII和FXIIa之一或二者的抑制物。另外，抗FXII抗体包含结合于并抑制FXII和FXIIa之一或二者的抗体。术语“FXII抑制物”还意在包含与延长半寿期的多肽连接的FXII的抑制物。FXII抑制物可以直接与延长半寿期的多肽连接，或可以经接头、优选地可切割接头连接。
在一些实施方案中，FXII抑制物是FXII的直接抑制物。术语“直接”抑制物意指通过与FXII(或FXIIa)接触(例如，结合)而发挥作用的抑制物。相反，间接抑制物可以在不接触FXII(或FXIIa)蛋白的情况下发挥作用；例如，反义RNA可以用来减少FXII基因表达或某种分子可以通过与直接下游FXIIa反应配偶体如因子XI的直接相互作用抑制FXIIa的作用，但是它不与FXII蛋白直接相互作用。因此与直接抑制物相反，间接抑制物从FXII蛋白上游或下游发挥作用。下文提出直接抑制物的一些例子。FXII抑制物通常是非内源抑制物；即，它们不是人体或动物体内天然存在的抑制物。
A.Infestin-4
在一个实施方案中，本申请提供包含Infestin结构域4(Infestin-4)的FXII抑制物。在一个实施方案中，FXII抑制物包含Infestin-4的变体。在另一个实施方案中，FXII抑制物包含Infestin结构域4并任选地包含Infestin结构域1、2和/或3；已知这些蛋白质是FXII的强力抑制物(参见WO2008/098720；还参见FEBSLett.512-516,2004)。提供Infestin-4的野生型多肽序列(SEQIDNO:2)。如本文所用，术语“变体”指带有氨基酸突变的多肽，其中“突变是定义为对野生型Infestin-4序列置换、缺失或添加，其中这类变化不改变该多肽抑制FXII的功能性能力。术语“变体”包括野生型或突变Infestin-4序列的片段。下文提供这类变体的其他例子。
在一个实施方案中，Infestin-4变体包含野生型Infestin-4序列的N端氨基酸2-13和N端氨基酸外部的至少一个及至多五个氨基酸突变，所述氨基酸突变产生与野生型Infestin-4序列的差异，或包含六个保守半胱氨酸残基和与野生型Infestin-4序列的至少70％同源性。基于分析与凝血酶结合的长红锥蝽(Rhodniusprolixus)相关抑制物(PDB:1TSO)的结构性数据和分析与胰凝乳蛋白酶结合的SPINK-1(二者共有接触位点在N端区域堆积的共同特征)，Infestin-4序列的N端氨基酸2-13可能对结合于FXII重要。因此在一个实施方案中，Infestin-4的变体包含野生型Infestin-4序列的氨基酸2-13的保守N端区域和这些保守N端氨基酸外部的至少一个及至多五个氨基酸突变，所述氨基酸突变产生与野生型Infestin-4序列的差异。突变可以是置换、缺失或添加。如本文所用，术语“所述N端氨基酸外部”指沿变体的多肽链，除包含序列VRNPCACFRNYV即来自野生型Infestin-4序列的氨基酸2-13的连续氨基酸片段之外的任何氨基酸。在另一个实施方案中，Infestin-4变体包含六个保守半胱氨酸残基并与野生型Infestin-4序列具有至少70％同源性。在一个实施方案中，六个保守半胱氨酸残基是在野生型Infestin-4序列的位置6、8、16、27、31和48处的氨基酸。在一个实施方案中，该变体包含最后的保守半胱氨酸。在其他实施方案中，半胱氨酸残基的确切位置和彼此相对位置可以因Infestin-4变体中的插入或缺失而不同于野生型Infestin-4序列的位置6、8、16、27、31和48。然而，在这些实施方案中，Infestin-4变体包含全部六个半胱氨酸并且可以与野生型Infestin-4序列享有70％、75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性。
在实施方案中，Infestin-4变体特征在于它抑制FXII。可以例如通过体外和/或体内表征，包括检验FXII酶活性抑制作用、凝血时间延长(即活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT))的直接分析法或评价凝血的体内方法，评估抑制FXII的功能活性，。Infestin-4变体的其他例子是下文描述的SPINK-1突变体。
B.SPINK-1突变体
一个实施方案涉及人类中治疗性使用的FXII抑制物。可以使用与Infestin-4具有高度相似性的人蛋白。例如，与Infestin-4具有最高相似性的人蛋白质是SPINK-1，一种在胰中表达的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制物(也称作胰分泌性胰蛋白酶抑制物，PSTI)。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制物家族是众多丝氨酸蛋白酶抑制物家族之一。已经描述了来自不同物种的许多蛋白质(LaskowskiM和KatoI,49Ann.Rev.Biochem.593-626,1980)。基于野生型SPINK-1序列，可以生成不同变体以增加SPINK-1序列与Infestin-4的同源性。短语“增加与Infestin-4的同源性”指借以对SPINK-1进行氨基酸突变以使得SPINK-1序列更接近于Infestin-4序列的过程。
在一个实施方案中，将SPINK-1突变以包含野生型Infestin-4序列的N端氨基酸2-13；将多肽序列给出并称作K1。如上文所述，认为Infestin-4序列的N末端部分对FXII抑制性功能重要。
因此，在一个实施方案中，突变的SPINK-1的变体还包含野生型Infestin-4序列的N端氨基酸2-13和所述N端氨基酸外部的至少一个及至多五个氨基酸突变，所述氨基酸突变产生与野生型Infestin-4序列的差异并增加变体与野生型Infestin-4序列的同源性。在另一个实施方案中，突变的SPINK-1的变体包含六个保守半胱氨酸残基并与野生型SPINK-1序列具有至少70％同源性。突变可以是置换、缺失或添加。如上文定义，术语“所述N端氨基酸外部”指沿变体的多肽链，除了由序列VRNPCACFRNYV即来自野生型Infestin-4序列的氨基酸2-13组成的连续氨基酸片段之外的任何氨基酸。术语“变体”包括所述突变的SPINK-1序列的片段。在一个实施方案中，六个保守半胱氨酸残基可以是在野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56处的氨基酸。在一个实施方案中，该变体包含最后的保守半胱氨酸。在另一个实施方案中，半胱氨酸的确切位置和彼此相对位置可以因SPINK-1变体中的插入或缺失而不同于野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56。然而，在这些实施方案中，SPINK-1变体包含全部六个半胱氨酸。在实施方案中，SPINK-1变体还特征在于它抑制FXII。EP2497489A1中公开了其他SPINK变体，所述专利的公开内容完整并入本文。
C.其他FXII抑制物
在一个实施方案中，将其他FXII抑制物施用至接受医学手术的患者。如上文讨论，术语FXII抑制物包括FXII和FXIIa的抑制物。在W02006/066878中，提出了针对FXII的抗体的用途或FXII的抑制物的用途。具体而言，FXII的抑制物包括抗凝血酶III(ATIII)、血管紧张素转化酶抑制物、抑蛋白酶肽、α-1蛋白酶抑制物、抗痛素([(S)-1-羧基-2-苯乙基]-氨甲酰基-L-Arg-L-Val-精氨醛)、Z-Pro-脯氨醛-二甲基乙酸酯、DX88(DyaxInc.,300TechnologySquare,Cambridge,MA02139，美国；引用自：WilliamsA和BairdLG,29TransfusApheresisSci.255-258,2003)、亮肽素、脯氨酰寡肽酶的抑制物如Fmoc-Ala-Pyr-CN、com-胰蛋白酶抑制物、牛胰腺胰蛋白酶抑制物的突变体、ecotin、刺黄盖蝶抗凝血蛋白、笋瓜(Cucurbitamaxima)胰蛋白酶抑制物-V，包括笋瓜同效抑制物和Hamadarin(如IsawaH等人,277J.Biol.Chem.27651-27658,2002公开)。
在另外的实施方案中，FXII抑制物是H-D-Pro-Phe-Arg-氯甲基酮(PCK)。(Tans等人,Eur.J.Biochem.1987；164:637-42；Kleinschnitz等人,JExpMed.2006；203:513-8)。
FXII抑制物可以例如是淀粉样前体蛋白的Kunitz蛋白酶抑制物结构域的类似物，如美国专利号6,613,890第4栏至第8栏中公开。
在另一个实施方案中，FXII抑制物可以是与FXII结合并抑制FXII激活和/或活性的抗FXII抗体。这种抗体已经例如在WO2006/066878和在Ravon等人,1Blood4134-43,1995中描述。
针对人FXII的其他单克隆抗体(mAb)包括Pixley等人(JBiolChem1987；262,10140-45)描述的B7C9mAb、Small等人(Blood1985；65:202-10)描述的mAb；Nuijens等人(J.Biol.Chem.1989；264:12941-49)描述的mAbF1和F3；在WO89/11865中描述针对FXII的轻链的B6F5、C6B7和D2E10mAb；WO90/08835中描述的相对于FXII选择性结合FXIIa-β的mAb；和WO91/17258中描述抗FXII抗体OT-2。
额外的优选的抗FXII/FXIIa单克隆抗体及其抗原结合片段在WO2013/014092中描述，所述专利通过引用方式并入本文。这些抗体对人FXIIa-β的结合亲和力较之针对人FXII的结合亲和力高2倍以上并且能够抑制人FXIIa的酰胺分解活性。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段具有以下一个或多个特征：(a)结合鼠FXII/FXIIa；(b)包含与SEQIDNO:7的序列超过85％相同的重链可变(VH)区；(c)包含与SEQIDNO:8的序列超过85％相同的轻链可变(vL)区；(d)包含与SEQIDNO:9的序列至少80％相同的重链CDR1，和/或与SEQIDNO:10至少60％相同的重链CDR2，和/或与SEQIDNO:12的序列至少80％相同的重链CDR3；(e)包含与SEQIDNO:14至少50％相同的轻链CDR1，和/或SEQIDNO:15的轻链CDR2，和/或具有序列A-X1-W-X2-X3-X4-X5-R-X6-X7的轻链CDR3，其中X1可以是A或S，X5可以是L或V，其他Xns可以是任何氨基酸(SEQIDNO:17)；(f)以大于10-8M的KD结合人FXIIa-β；(g)与Infestin-4竞争结合人FXIIa-β；或(h)是人IgG或其变体，优选地人IgG4或其变体。
在其他实施方案中，抗FXII抗体是一种IgG抗体，所述IgG抗体结合人FXII并且包含了(a)包含如SEQIDNO:9中所述的重链CDR1、如SEQIDNO:11中所述的重链CDR2和如SEQIDNO:13中所述的重链CDR3的VH区；和/或(b)包含如SEQIDNO:14中所述的轻链CDR1、如SEQIDNO:15中所述的轻链CDR2和如SEQIDNO:17中所述的轻链CDR3的VL区。包含SEQIDNO:11的重链CDR2包含序列GIX1X2X3X4X5X6TVYADSVKG，其中X1是R、N或D，X2是P、V、I,或M；X3是S、P或A；X4是G、L、V或T；X5可以是任何氨基酸，优选地X5是G、Y、Q、K、R、N或M；并且X6是T、G或S。包含SEQIDNO:13的重链CDR3包含序列ALPRSGYLX1X2X3X4YYYYALDV，其中X1是I、M或V；X2是S或K；X3是P、K、T或H；并且X4是H、N、G或Q。包含SEQIDNO:17的轻链CDR3包含序列AX1WX2X3X4X5RX6X7，其中X1是A或S；X2是D、Y、E、T、W、E或S；X3是A、N、I、L、V、P、Q或E；X4是S、D、P、E、Q或R；X5是L或V；X6是G、L或K；并且X7是V、A、D、T、M或G。
在其他实施方案中，抗FXII抗体抗原结合片段是IgG抗体的片段，其中所述IgG抗体结合人FXII并且包含了(a)包含如SEQIDNO:9中所述的重链CDR1、如SEQIDNO:10中所述的重链CDR2和如SEQIDNO:12中所述的重链CDR3的VH区；和/或(b)包含如SEQIDNO:14中所述的轻链CDR1、如SEQIDNO:15中所述的轻链CDR2和如SEQIDNO:16中所述的轻链CDR3的VL区。
在一个实施方案中，抗FXII抗体或其抗原结合片段是实施例3中所用的抗体“3F7”。表1中呈现3F7的可变区和CDR的序列。
表1
在另外的实施方案中，抗FXII抗体或抗原结合片段选自亲和力成熟(matured)(相对于3F7)的抗体VR115、VR112、VR24、VR110、VR119。
表2
mAb HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
3F7 9 10 12 14 15 16
VR119 9 11 12 14 15 16
VR112 9 11 12 14 15 16
VR115 9 11 12 14 15 16
VR24 9 10 12 18 15 16
VR110 9 11 12 14 15 16
如上文所示，SEQIDNO:11是简并序列。VR119包含SEQIDNO:11，其中X1是N，X2是V，X3是P；X4是L，X5是Y并且X6是G。VR112包含SEQIDNO:11，其中X1是N，X2是V，X3是P，X4是V，X5是Q并且X6是G。VR115包含SEQIDNO:11，其中X1是D，X2是I，X3是P，X4是T，X5是K并且X6是G。VR110包含SEQIDNO:11，其中X1是D，X2是M，X3是P，X4是T，X5是K并且X6是G。VR24包含独特LCDR1：SGSSEMTVHHYVY(SEQIDNO:18)。
在涉及抗体CDR的实施方案中，CDR根据KABAT编号体系确定。(KabatEA,WuTT,PerryHM,GottesmanKS,FoellerC(1991)Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,美国卫生和公众服务部,NIH,Bethesda,MD)。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是以FXIIa-α对抗体的摩尔比1:0.2使用时抑制FXIIa-α超过40％、超过50％或超过60％的抗FXII/FXIIa单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，在FXIIa-α对抗体的摩尔比1:0.5时，抗体或其抗原结合片段抑制FXIIa-α超过80％、超过85％或超过90％。在一个实施方案中，抗体在摩尔比1:0.5时实现彻底抑制FXIIa-α。在一个实施方案中，FXIIa-α是人FXIIa-α。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段对人FXIIa具有至少可比较于抗体3F7的亲和力。
如上文讨论，“抗FXII抗体”包括结合于并抑制FXII和FXIIa之一或二者的抗体。在一个实施方案中，抗体可以处于全长Ig、Fab、F(ab)2、Fv、scFv或其他形式或其变体形式。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以特征在于同种型是IgM、IgD、IgA、IgG或IgE或者其任何亚类如IgG1，或者其变体。抗体可以来自哺乳动物物种，所述哺乳动物物种包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、山羊、仓鼠或猴。抗体可以人源化或移植有CDR。抗体可以经突变或修饰以改变免疫原性、半寿期或以赋予与治疗性抗体相关的其他有利特性。在一个实施方案中，抗体是与FXII(其中“FXII”包括FXII和FXIIa)的重链或轻链上的表位(如中和性表位)结合的抗FXII抗体。抗体可以具有结合FXII的高亲和性和/或高亲和力。抗体可以缀合于多肽、核酸或小分子。
D.与延长半寿期的部分连接的FXII抑制物
多肽
本申请的另一个方面提供与增强半寿期的多肽(HLEP)连接的FXII抑制物。例如，在一个实施方案中，FXII抑制物与延长半寿期的蛋白质连接。“增强半寿期的多肽”增加FXII抑制物在患者中或在动物中的体内半寿期。例如，已经将白蛋白和免疫球蛋白及其片段或衍生物描述为增强半寿期的多肽(HLEP)。Ballance等人(WO2001/79271)描述多种不同治疗性多肽的融合多肽，其中预测所述治疗性多肽与人血清白蛋白融合时具有增加的体内功能半寿期和延长的货架期。EP2497489A1中公开的涉及与增强半寿期的多肽连接的FXII抑制物的实施方案可以根据本发明使用并且通过引用方式并入本文。
E.接头
在一个实施方案中，可以在治疗性多肽和HLEP之间引入间插性肽接头。在一个实施方案中，引入可切割接头，尤其如果HLEP例如因空间位阻作用干扰治疗性多肽的特异活性。在某些实施方案中，接头由酶如(内在、外在或共同凝血途径的凝血蛋白酶)切割。内在途径凝血蛋白酶是接触活化途径中的蛋白酶，例如包括FXlla、FXla或FIXa。在一个实施方案中，接头由FXlla切割。外在途径蛋白酶包括组织因子途径中的蛋白酶，例如FVIIa。共同途径蛋白酶包括参与纤维蛋白原转化成纤维蛋白的蛋白酶，例如FXa、FIIa和FXIIIa。
组合/试剂盒
本发明的另一个方面是C1INH与药物的组合。优选地，C1INH可以与已知激动C1INH活性的合成性或天然糖胺聚糖例如肝素、N-乙酰肝素、硫酸类肝素、硫酸葡聚糖、硫酸皮肤素和硫酸软骨素组合施用。此外，C1INH可以与其他物质组合，包括但不限于静脉内用免疫球蛋白、抗凝血酶III、α1抗胰蛋白酶或FXII抑制物，以改善治疗效果。这些物质可以作为联合疗法或多药疗法施用。因此，本发明的方面还是包含施用说明的用于预防和/或治疗远端IRI的包含C1INH和一种或多种上述物质的试剂盒。本发明的一个实施方案因此是用于预防和/或治疗远端IRI时同时、独立或依次使用的包含C1INH和如上文所列的至少一种其他物质的组分试剂盒。
施用
本文所述的接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物，优选地作为药物组合物的部分施用，所述药物组合物包含接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物，和可药用赋形剂。药物组合物可以按肠胃外方式容易地施用，例如，通过静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、鞘内、鼻内、肺内，皮肤或皮下施加。肠胃外施用可以通过将本发明的组合物掺入溶液剂、乳剂或混悬剂中完成。
优选地，将包含接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物的组合物通过单次或多次快速浓注和/或通过连续输注或在某个时间段内输注以静脉内、动脉内或皮下方式施用。
可选地，药物组合物可以肠内施用，例如，通过口服施加或直肠应施加。
待施用至个体的C1INH的剂量范围从1至5000IU/kg体重。优选地，该剂量在1至2500IU/kg、更优选地1至500IU/kg、甚至更优选地10至500IU/kg体重的范围内。最优选地，该剂量范围从10IU/kg至250IU/kg体重，或甚至从20IU/kg至100IU/kg体重。技术人员将知道需要根据多种因素如施用途径调整该剂量。
根据所用抑制物的类型、施用途径和技术人员将非常清楚的其他因素调整FXII抑制物的剂量范围。优选地选择剂量和给药间隔时间，从而将FXIIa的酰胺分解活性完全抑制持续所需的治疗时间。例如，将FXII抑制性抗体按范围从0.01至50mg/kg体重、从约0.01至30mg/kg、从约0.1至30mg/kg、从约0.1至10mg/kg、从约0.1至5mg/kg、从约1至5mg/kg、从约0.1至2mg/kg或从约0.1至1mg/kg的剂量施用。治疗可以包括给予单个剂量或多个剂量。如果需要多个剂量，可以将它们每日、每隔1日、每周、每两周、每月或每两月或按要求施用。也可以使用缓慢及连续释放抗体或其抗原结合片段的储库剂。治疗有效剂量可以是抑制受试者中FXIIa至少50％、优选地至少60％、70％、80％、90％、更优选地至少95％、99％或甚至100％的剂量。
在基于Infestin的FXII抑制物(例如融合白蛋白的Infestin-4)的情况下，剂量可以在0.1和1000mg/kg体重之间，优选地在1和1000mg/kg之间，更优选地在1和500mg/kg之间，甚至更优选地在50和500mg/kg之间。
对于这些抑制物和其他FXII抑制物，技术人员将能够按治疗需要调整剂量，并且将知晓所需剂量的因素，如施用途径、抑制物的半寿期、抑制物的抑制活性、抑制物对FXIIa的亲和力等。
为了治疗治疗性干预如外科手术引起的远端或远侧IRI，优选在手术介入(例如肢体手术、心脏手术、器官移植等)之前，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物施用至接受治疗的个体。在一个方面，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物因此在开始手术介入之前施用至个体。
可以将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在开始手术介入之前1周、6天、5天、4天或72小时内、优选地48小时内、更优选地24小时内、甚至更优选地在开始手术介入之前12小时内、最优选地6小时内施用至患者。
例如，可以将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在手术介入之前例如约1小时，约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时或约72小时施用至接受治疗的个体。也可以将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在治疗性干预之前例如，约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟或约45分钟施用至接受治疗的个体。
备选地或额外地，可以将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在手术介入时或其期间施用至接受治疗的个体。在另一个实施方案中，因而将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在手术介入期间施用至患者。例如，可以将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在手术介入过程期间以多种间隔时间(例如，15分钟间隔时间)施用一次或多次。备选地，可以将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在治疗性干预的持续时间自始至终连续施用。
另外，可以将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物施用至手术介入后接受治疗的个体。在又一个实施方案中，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在终止手术介入后、优选地终止手术介入后72小时时间内施用至患者。例如，可以将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在手术介入后例如约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约12小时、约24小时或约48小时施用至接受治疗的受试者。也可以将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在手术介入后，例如，约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟或约45分钟施用至接受治疗的受试者。优选地，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在手术介入后尽快施用并且将治疗在手术介入后维持至少24小时、优选地至少48小时、更优选地至少72小时或更长时间，如果需要的话。
在又一个实施方案中，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在手术介入期间和在终止手术介入后施用至患者。
在又一个实施方案中，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在开始手术介入之前、在手术介入期间和在终止手术介入后施用至患者。
在又一个实施方案中，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在开始手术介入之前和在终止手术介入后施用至患者，但在手术介入期间不施用。
在又一个实施方案中，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在开始手术介入之前和在手术介入期间施用至患者，但是在终止手术介入后不施用。
在又一个实施方案中，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在开始再灌注之前施用。优选地，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在再灌注之前至多1周、至多6天、5天、4天、优选地至多72小时、更优选地直至48小时、甚至更优选地至多24小时、至多12小时施用，最优选地在再灌注之前至多6小时施用。
在又一个实施方案中，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在开始再灌注之后施用。优选地，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在开始再灌注后至多72小时、更优选地至多48小时、至多12小时、甚至更优选地至多6小时施用，最优选地在开始再灌注后立即施用。
在一个优选实施方案中，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在开始再灌注之前和在开始再灌注后施用。优选地，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物在再灌注之前至多1周、至多6天、5天、4天、优选地至多72小时、更优选地直至48小时、甚至更优选地至多24小时、至多12小时施用，最优选地在再灌注之前至多6小时施用，并将治疗随后在开始再灌注后维持一段时间，优选地至少72小时、更优选地至少4天、甚至更优选地至少1周，最优选地2周或更长时间，如果需要的话。
在一个具体实施方案中，将接触活化系统抑制物、优选地C1INH或FXII抑制物向患者施用少于1个月、优选地少于14天、更优选地少于7天、最优选地少于48小时。
实施例
材料和方法
动物和饲养
全部实验均按照瑞士动物保护法的条款实施并且由州兽医部门动物伦理委员会(伯尔尼州，瑞士)批准。雄性Wistar大鼠(野生型，内部动物设施，伯尔尼大学)按每笼三只在标准饲养(housing)条件下饲养，自由摄取食物和水。动物饲养于20±2℃热中性环境和室内湿度45％–65％受控的房间内，在所述房间中维持昼夜节律12/12小时(基于冬季时间)。在光照周期期间，动物暴露于200lux强度的光。
试剂
C1INH和溶媒(10mg/mL甘氨酸、2.9mg/mL柠檬酸钠和8.5mg/mL氯化钠)由CSLBehringAG(伯尔尼，瑞士)提供。诱导局部缺血之前5分钟，通过使用静脉内套管(BDVasculonPlus)，将C1INH作为推注剂(bolus)经尾静脉施用。
诱导局部缺血之前5分钟，将FXIIa抑制物rHA-Infestin-4(Hagedorn等人,2010,Circulation121:1510-1517)作为推注剂经尾静脉以100mg/kg剂量施用。
外科手术
将重量在250g和350g之间的雄性Wistar大鼠用于以下实验。在麻醉药箱中用氧中的2.5％异氟烷进行麻醉的诱导并随后通过经鼻罩吸入1.5％异氟烷维持。为了评定肢体灌流，用电动剃刀从双后肢完全移除被毛。将大鼠保持在加热垫以维持体温在37℃。麻醉诱导后大约30分钟，诱导单侧后肢局部缺血3小时。通过夹紧股动脉诱导局部缺血。因此，在腹股沟区域内产生一个切口，小心摘出脂肪组织并暴露股血管。接下来，将股动脉与静脉分离。
在夹紧动脉之前，将止血带(标准化重量450g)如前文所述置于股血管下方(8)。将股动脉临时用两只微血管钳(B1-V，S&T瑞士)封闭。立即地，张紧止血带以阻断微血管血流量。在整个手术期间监测血液动力学(Mouseoxplus,Starlifesciences)。在3小时局部缺血后，使各肢体分别再灌注24小时。在24小时再灌注期间，大鼠苏醒并用镇痛药(丁丙诺啡，0.05mg/kg，TemgesicReckittBenckiser(SwitzerlandAG))处理。在实验结束时，取得肺以及双侧缺血性腓肠肌和对侧腓肠肌用于分析。
水肿形成的评定
为了评定水肿形成，从两条腿取得两份腓肠肌样品并立即称重以获得湿重。将肌肉样品或肺在80℃干燥24小时直至可以实现恒定重量。在第二称量步骤中，获得干重。随后，计算湿重对干重比并与对侧对照肌肉的湿重对干重比比较。
肌肉和肺组织中沉积的补体组分和其他蛋白质的测定
将免疫荧光法(IF)用来对补体系统的各种组分以及纤维蛋白/纤维蛋白原、硫酸类肝素、缓激肽受体B1和缓激肽受体B2的沉积定量。取得来自两条腿的腓肠肌和肺的组织样品，在PBS中洗涤，蘸干并在干冰上包埋于基质中(OCT,Tissuetek)。立即将样品贮存在-20℃直至切制冰冻切片(Cryostat,LeicaCM3050S)。切片用丙酮固定并在TBS中再水化。将第一抗体在4℃温育过夜并接着将第二抗体在室温温育1小时。随后，将盖玻片封装并覆盖。用荧光显微镜(Leica)拍照并通过使用ImageJ软件分析。
使用多重阵列测量细胞因子/趋化因子
一种由缀合靶蛋白特异性捕获抗体的磁珠组成的多重免疫测定法用来检测一系列细胞因子和趋化因子(BioplexProTM大鼠细胞因子组I集合，BioRad，Hercules，美国)。该测定法根据制造商的说明书进行。
简而言之，将血浆1:3稀释并且与抗体偶联的磁珠温育。洗涤步骤后与生物素酰化的检测抗体温育。在链霉亲和素-藻红蛋白温育后，测量细胞因子/趋化因子浓度。重组细胞因子/趋化因子用来建立标准曲线。使用Bio-PlexManager4.0软件(Bio-Rad,Hercules,美国)计算分析物浓度。
通过TUNEL测定法评估凋亡
通过使用TdT介导的dUTP切刻末端标记(TUNEL)测定法(原位细胞死亡检测试剂盒，TMR红，Roche，曼海姆，德国)，评估凋亡。简言之，将组织样品的冰冻切片在室温在丙酮中固定5分钟，洗涤并用0.1％Triton-X-100在冰上透化。将切片在37℃在暗处与TUNEL反应混合物温育1小时并用DAPI复染。在洗涤步骤后，将切片封装、加盖玻片并用荧光显微镜分析。免疫荧光法图像用图像J(国家健康研究所，Bethesda，MD，美国)分析。相对于DAPI染色的全部胞核覆盖的面积，分析并计算由TUNEL阳性胞核覆盖的面积％。
统计分析
数据表述为均值±SD。使用GraphPadPrism5软件，通过单因素方差分析连同Dunnetts后检验确定统计学显著性。P值<0.05认为是统计学显著。
结果
i)C1INH对局部IRI组织损伤的作用
C1INH防止局部IRI所致的骨骼肌水肿
作为第一步骤，通过防止后肢中的局部水肿形成来评估C1INH(50IU/kg)的治疗作用。对动物用人血浆衍生的C1INH全身性预加载高度显著地防止骨骼肌水肿形成(参见图1A和图1B)。使用FXII抑制物例如单克隆抗FXII抗体或rHA-Infestin-4，预期有类似的结果，即肌肉水肿形成减少
ii)C1INH对IRI所致远端组织和器官损伤的影响
C1INH通过减弱肺水肿抑制远端器官损伤
分析了C1INH对远端组织和器官损伤的影响。C1INH因与FXIIa和激肽释放酶相互作用是非常有力的血浆激肽释放酶-激肽系统抑制物。如图2中所示，C1INH显著防止水肿形成，如通过湿:干比所分析，和因此保护肺中的内皮细胞完整性。
C1INH对肺和心脏中缓激肽受体表达的影响
血浆激肽释放酶-激肽系统的激活导致缓激肽产生。这种分子是非常有力的血管活性肽，诱导血管舒张和水肿。已经显示激肽释放酶-激肽系统在IRI发挥关键作用。缓激肽2受体(B2R)的拮抗剂已经成功在门诊中用于治疗HAE患者(9)。通过IF分析C1INH对B1R和B2R表达的影响。令人惊讶地，C1INH显著抑制肺组织中IRI所致的B1R上调(参见图3A)，而不能观察到对B2R表达的抑制作用(参见图3B)。在心脏组织中观察到相同的影响(数据未显示)。
C1INH抑制肺中纤维蛋白沉积
除了补体抑制作用，C1INH还通过与FXII和FXI相互作用而作用于凝血系统。凝血系统的激活导致产生将纤维蛋白原切割成纤维蛋白的凝血酶。用C1INH处理显著抑制肺组织中的纤维蛋白沉积(参见图4)。
C1INH通过阻止纤维蛋白沉积防止对侧肢体中的远端组织损伤
如上文所述，我们不能在不缺血的对侧肢体中检测到水肿形成。令人惊讶地，我们可以观察到对侧腿中的纤维蛋白沉积(参见图5)。如肺中所观察(参见图4A)，我们观察到C1INH显著抑制不缺血的对侧肢体中的纤维蛋白沉积(参见图5)。
对侧肢体、肾和肝中补体沉积被C1INH抑制
对缺血的腿和对侧不缺血的腿分析作为补体激活标志物的补体片段的沉积。如图6A和6B中所示，C1INH显著减少再灌注的腿中及对侧腿中C3b(经典途径和凝血素途径)以及因子B(旁路途径补体激活)的沉积。此外，用C1INH处理导致肾中的C3b沉积显著减少和肝中的因子B沉积显著减少。
用C1INH处理保护对侧肢体中的内皮糖被膜
健康的EC被一层糖胺聚糖如硫酸类肝素(HS)覆盖，这对内皮的抗凝和抗炎性特性至关重要。HS在炎症和组织损伤条件下快速释放(11-14)。令人惊讶地，C1INH防止HS在对侧肢体中散播(参见图7)。
C1INH对炎性细胞因子和趋化因子网络的抑制性影响
使用xMAP技术在基线即在诱导局部缺血之前并在24小时再灌注后终点取得的EDTA-血浆中测量细胞因子、生长因子以及趋化因子。分析揭示出C1INH处理显著降低IL-1α、IL-4、IL-7、IL-17A和IL-18以及IFN-γ、MIP-1α、MIP-3α和TNF-α的水平(参见表3)。
表3
不能检出以下细胞因子：IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12p70、IL-13、G-CSF和GM-CSF。数据表述为均值±SD。使用GraphPadPrism5软件，通过Studentt-检验确定统计学显著性。P值<0.05认为是统计学显著。
C1INH治疗对肺和肾皮层中凋亡的影响
使用TUNEL测定法评估凋亡。在溶媒处理的动物的肺组织中，细胞显示高程度的凋亡(76±21％)。还在溶媒处理的动物中肾皮层的近端肾小管上皮细胞内观察到凋亡(43±25％)。相比之下，C1INH处理的动物显示凋亡细胞显著减少(肺中10±12％)(P<0.0001)和在肾皮层中7±8％)。
iii)FXII抑制物rHA-Infestin-4对IRI所致远端组织和器官损伤的影响
用如上文所述的rHA-Infestin-4处理还导致肺水肿显著减少并且可能还减少其他组织中的水肿形成。
此外，在肺中(并且可能还在其他组织中)观察到纤维蛋白沉积显著减少。
用rHA-Infestin-4处理后，观察到肺和其他组织中凋亡显著减少。rHA-Infestin-4处理后还导致IgM和补体组分的沉积减少，并且可能还显示对炎性细胞因子和趋化因子网络的影响。
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Claims (15)

1.一种选自C1酯酶抑制物(C1INH)、激肽释放酶抑制物和FXII抑制物的接触活化系统抑制物，用于治疗和/或预防远端缺血-再灌注损伤(IRI)，包括向个体施用所述接触活化系统抑制物。
2.根据权利要求1所述用途的接触活化系统抑制物，其中接触活化系统抑制物是C1INH。
3.根据权利要求1或权利要求2所述用途的接触活化系统抑制物，其中将接触活化系统抑制物以肠胃外方式向个体施用。
4.根据权利要求3所述用途的接触活化系统抑制物，其中将接触活化系统抑制物以静脉内、动脉内或皮下方式向个体施用。
5.根据权利要求2所述用途的接触活化系统抑制物，其中向个体施用的C1INH的剂量是1至1000IU/kg体重。
6.根据前述权利要求中任一项所述用途的接触活化系统抑制物，其中个体是将接受或已经接受手术介入的患者。
7.根据权利要求6所述用途的接触活化系统抑制物，其中将接触活化系统抑制物在开始手术介入或开始再灌注之前6小时内施用至患者。
8.根据权利要求6或权利要求7所述用途的接触活化系统抑制物，其中将接触活化系统抑制物在手术介入之前和/或其期间和/或之后或在开始再灌注之前和/或之后施用至患者。
9.根据权利要求8所述用途的接触活化系统抑制物，其中将接触活化系统抑制物在终止手术介入或开始再灌注后72小时内施用至患者。
10.根据权利要求6至9中任一项所述用途的接触活化系统抑制物，其中手术介入选自(a)择期手术、重建手术、血管手术、心脏手术、创伤手术、碰撞伤或挤压伤手术、癌症手术、矫形手术、移植，最小侵入性手术，或(b)在初始血栓形成病症或血栓栓塞病症或另一种引起缺血的病症发作之后，插入用于递送药理活性物质如溶栓剂或血管舒张药和/或用于机械消除完全阻塞或部分阻塞并注射药物活性物质如溶栓剂或血管舒张药的装置。
11.根据权利要求1至5中任一项所述用途的接触活化系统抑制物，其中再灌注自发地发生或受损的血流量因除手术介入之外的干预改善。
12.一种治疗和/或预防远端缺血-再灌注损伤(IRI)的方法，包括向个体施用有效剂量的接触活化系统抑制物，其中接触活化系统抑制物选自C1INH、激肽释放酶抑制物和FXII抑制物。
13.一种在将要接受手术介入的患者中预防缺血-再灌注损伤(IRI)的方法，包括在手术介入之前和/或其期间和/或之后或者在开始再灌注之前和/或之后，向所述患者施用有效剂量的接触活化系统抑制物，其中缺血-再灌注损伤(IRI)累及远离手术部位的器官或组织。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中远端缺血-再灌注损伤(IRI)累及多个器官如肺、心、脑、肾、肠、胰、肝或肢端/四肢。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中远端缺血-再灌注损伤(IRI)将在不治疗的情况下导致多器官功能障碍综合征或全身性炎症反应综合征。
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