UA126908C2 - Спосіб зменшення протеїнурії у людини, що страждає від імуноглобулін a-нефропатії - Google Patents

Description

ЗАЯВА ВІДНОСНО СПИСКУ ПОСЛІДОВНОСТІ

Список послідовностей, пов'язаний з цією заявкою, представлений у текстовому форматі замість паперової копії і включений у дану заявку за допомогою посилання. Текстовий файл, що містить список послідовностей, названий МР 1 0269 РСТ Зедиепсе І ібзіпд 20171013 5725.

Текстовий файл має розмір 136 КБ; був створений 10 жовтня 2017 року і доступний через ЕЕ5- умер з моменту подачі опису.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

У людей і інших хребетних система комплементу забезпечує механізм ранньої дії по ініціації, ампліфікації і регуляції імунної відповіді на мікробну інфекцію і інші гострі інфекції (І іє27ем/5Кі

М.К. апа АїкКіпзоп У.Р., 1993, іп Еипдатепаї! Іттипо!оду, Тпіка Едйіоп, едітед ру МЕ. Раці, Намеп

Ргез55, Ца., Мем/ ХогКк). Хоча активація комплементу забезпечує важливу першу лінію захисту від потенційних патогенів, активність комплементу, яка стимулює формування захисної імунної відповіді, може також бути потенційною загрозою для хазяїна (Каїїйї К.М. еї аї., 5ргіпдег бЗетіп.

Іттипораїної. 15:41-431, 1994; Могдап В.Р., Ек. У). Сіїпіса! Іпмевзід. 24:219-228, 1994).

Наприклад, протеолітичні продукти СЗ ії С5 стимулюють рекрутування і активацію нейтрофілів.

Хоча нейтрофіли необхідні для захисту хазяїна, активовані нейтрофіли не виборні по вивільненню ними деструктивних ферментів і можуть викликати ушкодження органів. Крім того, активація комплементу може викликати відкладення літичних компонентів комплементу на сусідніх клітинах-хазяїнах, а також на мікробних мішенях, приводячи до лізису клітин-хазяїнів.

Система комплементу також бере участь у патогенезі численних гострих і хронічних захворювань, включаючи інфаркт міокарда, інсульт, РДСД, реперфузійне ушкодження, септичний шок, капілярний витік після термічних опіків, запалення після операції по кардіопульмонарному шунтуванню, відторгнення трансплантата, ревматоїдний артрит, множинний склероз, міастенію і хворобу Альцгеймера. Майже при всіх цих станах сам комплемент не викликає ці стани, але є одним з декількох факторів, що беруть участь у патогенезі. Проте, активація комплементу може бути основним патологічним механізмом і являє собою ефективну ланку для клінічного контролю при багатьох зазначених хворобливих станах.

Усе зростаюче визнання важливого значення в розумінні механізмів опосередкованого комплементом ураження тканин при різних хворобливих станах ще раз указує на необхідність у

Зо розробці ефективних лікарських речовин, інгібуючих комплемент. На сьогоднішній день

Екулізумаб (ЗоїагієФф (Соларіс)), тобто анти-С5 антитіло, є єдиним лікарським засобом, націленим на комплемент, схваленим для використання людиною. Проте, С5 є однією з декількох ефекторних молекул, що діють на "пізніх" етапах системи комплементу, і блокада С5 не приводить до пригнічення активації системи комплементу. Отже, інгібітор етапів ініціації активації комплементу мав би суттєву перевагу в порівнянні з інгібітором компонента комплементу, що діє на пізніх етапах.

На даний час загальновизнано, що система комплементу може бути активована трьома різними шляхами: класичним, лектиновим і альтернативним. Класичний шлях звичайно запускається комплексом, що складається з антитіл хазяїна, зв'язаних із чужорідною частинкою (тобто антигеном), і, отже, вимагає попереднього впливу антигену для генерації специфічної відповіді антитіла. Оскільки активація класичного шляху залежить від попередньої адаптивної імунної відповіді хазяїна, класичний шлях є частиною системи набутого імунітету. На противагу цьому, і лектиновий, і альтернативний шляхи не залежать від адаптивного імунітету і є частиною системи вродженого імунітету.

Активація системи комплементу приводить до послідовної активації зимогенів серинової протеази. Першим етапом активації класичного шляху є зв'язування молекули специфічного розпізнавання С1д 3 антигензв'язаними молекулами /дсС і ІМ. С14д асоційований з проферментами серинової протеази Сіг і С15 у вигляді комплексу, називаного С1. При зв'язуванні С1д з імунним комплексом аутопротеолітичне розщеплення Аго-Пе сайта Сг супроводжується опосередкованим Сіг розщепленням і активацією С15, таким чином забезпечуючи здатність розщеплювати С4 і С2. С4 розщеплюється на два фрагменти, позначені С4а і С4б, ї С2, аналогічно, розщеплюється на Сга і С2р6. Фрагменти С4Б6 можуть утворювати ковалентні зв'язки з сусідніми гідроксильними групами або аміногрупами і генерувати СЗ-конвертазу (С4рг2а) за допомогою нековалентної взаємодії з фрагментом С2а активованого С2. СЗ-конвертаза (С4р2а) активує ССЗ за допомогою протеолітичного розщеплення на субкомпоненти СЗа і СЗБ, приводячи до утворення С5-конвертази (С4ргазь), яка через розщеплення С5 приводить до утворення мембраноатакуючого комплексу (С5Б разом з Сб, С7, С8 і С9, також називаного МАС), який може руйнувати клітинні мембрани, приводячи до лізису клітин. Активовані форми СЗ і С4 (С3Бр ї С4б) у результаті ковалентного зв'язування бо осаджуються на поверхнях чужорідних мішеней, які розпізнаються рецепторами комплементу на багатьох фагоцитах.

Незалежно від цього, першим етапом активації системи комплементу по лектиновому шляху також є зв'язування молекул специфічного розпізнавання, після якого відбувається активація проферментів, асоційованих з сериновою протеазою. Однак, замість зв'язування імунних комплексів за допомогою С14, молекули розпізнавання в лектиновому шляху містять групу вуглеводзв'язувальних білків (мананзв'язувальний лектин (МВ), Н-фіколін, М-фіколін, І -фіколін і лектин С-типу СІ -11), відомих під загальною назвою лектини. Див. Ги .). еї аї., Віоспіт. Віорпуз.

Асіа, 1572:387-400, (2002); НоІт5Ком еї аї., Аппи. Нем. Іттипої. 21:547-578 (2003); Теп еї аї.,

Іттипоіоду, 101:225-232 (2000). Див. також І! цеї У. еї аї., Віоспіт. Віорпу5. Асіа, 1572:387-400 (2002); НоІт5Ком вї аїЇ, Аппи. Нехм. Іттипої. 21:547-578 (2003); Теп еї аї!., Іттипоіоду, 101:225- 232 (2000); Напзеп еї аї, 9. Іттипої. 185(10):6096-6104 (2010).

Ікеда еї амІ. уперше продемонстрували, що МВІ, подібно С1д, може активувати систему комплементу після зв'язування з еритроцитами, покритими дріжджовим мананом, по С4- залежному механізму (ІКеда еї аї., 9. ВіоІ. Спет. 2(52):7451-7454, (1987)). МВІ, член сімейства білків колектинів, являє собою кальційзалежний лектин, який зв'язується з вуглеводами по 3- |і 4-гідроксигрупах, орієнтованих у горизонтальній площині піранозного кільця. Таким чином, основними лігандами для МВІ є ЮО-маноза і М-ацетил-О-глюкозамін, а вуглеводи, що не задовольняють цю стеричну вимогу, мають невиявлювану спорідненість до МВ. (Умеїв5 еї аї.,

Маїшге, 360:127-134, (1992)). Взаємодія між МВІ і моновалентними цукрами є дуже слабкою з константами дисоціації, що звичайно знаходяться в однорозрядному мілімолярному діапазоні.

Сильне, специфічне зв'язування МВІ. з глікановими лігандами досягається за рахунок авідності, тобто взаємодії одночасно з множиною залишків моносахаридів, локалізованих у безпосередній близькості один від одного (ее еї аї., Агспім. Віоспет. Віорпуб5. 299:129-136, (1992)). МВІ розпізнає вуглеводні патерни, як правило, утворені мікроорганізмами, такими як бактерії, дріжджі, паразити і визначені віруси. На відміну від цього, МВІ не розпізнає О-галактозу і сіалову кислоту, передостанні і останні цукри, які, як правило, містяться в "зрілих" складних глікокон'югатах, присутніх на клітинній поверхні і у плазмі ссавців. Вважається, що ця специфічність зв'язування сприяє розпізнаванню "чужорідних" поверхонь і допомагає захищати від "аутоактивації". Однак МВІ не зв'язується з високою спорідненістю з кластерами "попередників" гліканів з високим вмістом манози на М-зв'язаних глікопротеїнах і гліколіпідах, секвестрованих в ендоплазматичній мережі і в апараті Гольджі клітин ссавців (Маупага еї аї.,».

ВіоІ. Снет. 257:3788-3794, (1982)). Таким чином, ушкоджені клітини є потенційними мішенями для активації лектинового шляху за допомогою зв'язування з МВІ..

Фіколіни містять лектиновий домен, що відрізняється від лектинового домену МВІ., який називають фібриногеноподібним доменом. Фіколіни зв'язуються з залишками цукрів Са-- незалежним способом. У людини були ідентифіковані фіколіни трьох видів (І -фіколін, М-фіколін і Н-фіколін). Два сироваткові фіколіни, І -фіколін ії Н-фіколін, мають загальну специфічність до М- ацетил-О-глюкозаміну, однак Н-фіколін також зв'язується і з М-ацетил-О-галактозаміном.

Різниця в специфічності до цукрів І -фіколіну, Н-фіколіну, СІ-11 ї МВІ. означає, що різні лектини можуть бути комплементарними і впливати на різні, нехай навіть такі, що перекриваються, глікокон'югати. Ця концепція підтверджується останніми повідомленнями в літературі про те, що з відомих лектинів у лектиновому шляху тільки І-фіколін специфічно зв'язується з ліпотейхоєвою кислотою, тобто глікокон'югатом клітинної стінки, що виявляється у всіх грампозитивних бактерій (Гупсп М.. еї аї., 9У. Іттипої. 172:1198-1202, 2004). Колектини (тобто

МВІ) ї фіколіни не мають значимої подібності по амінокислотних послідовностях. Однак ці дві групи білків мають однакову організацію доменів і, подібно С1д, збираються в олігомерні структури, що максимально збільшує можливість мультисайтового зв'язування.

Концентрації МВ у сироватці сильно варіюють у популяціях здорових індивідуумів і генетично контролюються поліморфізмами/мутаціями в промоторі і кодуючих областях гена

МВІ.. Експресія МВІ,, як білка гострої фази, додатково підсилюється при запаленні. І -фіколін присутній у сироватці в концентраціях, аналогічних МВІ.. Отже, І -фіколінова гілка лектинового шляху потенційно порівнянна по своїй силі з гілюою МВ. МВ. ї фіколіни також функціонують як опсоніни, які дозволяють фагоцитам впливати на МВІ- і фіколін-декоровані поверхні (див. Уаск еї аї., У. ГеиКос. Віої., 77(3):328-36 (2004), Маїви5па апа Еційа, Іттипобіоіоду, 205(4-5):490-7 (2002), Асуаді еї аї., У. Іттипої. 174(1):418-25(2005)). Така опсонізація вимагає взаємодії цих білків з рецепторами фагоцитів (КипІтап еї аї., У. Ехр. Мед. 169:1733, (1989); Маїзивзнйа еї аї., ».

ВіоІ. Спет. 277:2448-54, (1996)), ідентичність яких поки не встановлена.

Специфічна і високоафінна взаємодія людського МВІ з унікальними С1г/С15-подібними сериновими протеазами, називаними МВІ-асоційованими сериновими протеазами (МАЗР), бо здійснюється через його колагеноподібний домен. На цей момент описано три МА5БР. Спочатку був ідентифікований один фермент "МАБР", який був охарактеризований як фермент, відповідальний за ініціацію каскаду комплементу (тобто розщеплення С2 і С4) (Маїзив5нйа еї аї.,

У. Ехр. Мей. 176(6):1497-1502 (1992); Фі еї аї., У. Іттипої. 750:571-578, (1993)). Потім було визначено, що активність МАБР фактично представлена сумішшю двох протеаз: МА5РА-Ї і

МАБР-2 (Тієї єї аїЇ., Маїште, 556:506-510, (1997)). Однак було показано, що для активації комплементу достатньо одного комплексу МВІ-МАБР-2 (Могир-Уепвеп еї аї., 9. Іттипої. 165:2093-2100, (2000)). Крім того, тільки МАБР-2 розщеплював С2 і С4 з високою швидкістю (Атбргиб еї аї. У. Іттипої. 770:1374-1382, (2003)) Таким чином, МАБР-2 є протеазою, відповідальною за активацію С4 і Сб2 з утворенням СЗ-конвертази, С4р2а. Це є суттєвою відмінністю від комплексу С1 класичного шляху, де координована дія двох специфічних серинових протеаз (Сіг ії С15) приводить до активації системи комплементу. Крім того, була виділена третя нова протеаза, МАБР-З (Бані М.В. еї аї., Іттипйу, 15:127-35, 2001). МА5Р-1 і

МА5Р-3 є продуктами альтернативного сплайсингу одного і того ж гена.

Організація доменів МАБР ідентична такій в Стіг і С15, що є ферментативними компонентами комплексу Ст (Зіт еї аїЇ., Віоспет. ос. Тгап5. 28:545, (2000)). Ці домени включають М-кінцевий С1г/С15//ЕСЕ морського їжака/домен кісткового морфогенетичного білка (СОВ), домен, подібний епідермальному фактору росту, другий домен СИОВ, тандем доменів регуляторних білків комплементу і домен серинової протеази. Як і в протеазах С1, активація

МАБР-2 здійснюється через розщеплення Аго-ІПе-зв'язку, суміжного з доменом серинової протеази, приводячи до розділення ферменту на ланцюги А і В, з'єднані дисульфідним зв'язком, де останній складається з домену серинової протеази.

МВІ також може бути асоційований з альтернативно сплайсованою формою МАЗБР-2, відомою як МВІ -асоційований білок розміром 19 кДа (МАр19) або малий МВІ -асоційований білок (5МАР), у якого відсутня каталітична активність МАЗР-2 (5іомег, у). Іттипої. 162:3481-90 (1999); ТаКканавні еї аї., Ійї. Іттипої. 11:859-863, (1999)). МАр19 містить перші два домени

МАБР-2, за якими іде додаткова послідовність з чотирьох унікальних амінокислот. Функція

МАр19 залишається неясною (Оеодп еї аї.,». Іттипої. Меїоа5, 2011). Гени МА5БР-1 і МА5БР-2 локалізовані на хромосомах З і 1 людини, відповідно (З5спугаебіе еї аї., Іттипобіоіоду, 205:455- 466 (2002)).

Зо Існує ряд даних, які дозволяють припустити, що різні комплекси МВІ--МА5Р і велика фракція

МАБР у сироватці не утворюють комплекси з МВ. (ТпПіеї 5. еї аї., У. Іттипої. 165:878-887, 2000).

Як Н-, так ії І-фіколін зв'язуються з усіма МАР і, як і МВІ, активують лектиновий шлях комплементу (ШБай!і М.К. еї аї., Іттипйу, 15:127-35, 2001; Маїзивніа М. еї аї., 9. Іттипо). 165:3502-3506, 2002). Лектиновий і класичні шляхи утворюють загальну СЗ-конвертазу (С4рга), і на цьому етапі ці два шляхи сходяться.

Існує широко розповсюджена думка, що лектиновий шлях відіграє важливу роль у захисті неінфікованого хазяїна від інфекції. Переконливі докази участі МВІ у захисті хазяїна були одержані з аналізу пацієнтів зі зниженими рівнями функціонального МВІГ. у сироватці (Кіїраїгіск

О.б., Віосніт. Віорпуз. Асіа, 1572:401-413, 2002). У цих пацієнтів спостерігається сприйнятливість до рецидивуючих бактеріальних і грибкових інфекцій. Такі симптоми звичайно з'являються в ранньому віці у межах очевидного "вікна уразливості", коли відбувається зниження титрів материнських антитіл, доти, поки не сформується повний репертуар антитіл.

Цей синдром часто є результатом мутацій у декількох сайтах у колагеновій частині МВІ, які перешкоджають правильному утворенню олігомерів МВ. Однак, оскільки МВ може функціонувати як опсонін незалежно від комплементу, то невідомо, у якому ступені підвищення чутливості до інфекції обумовлене зниженням активації комплементу.

Вважається, що всі три шляхи (тобто класичний, лектиновий і альтернативний) сходяться в

С5, який розщеплюється з утворенням продуктів із численними прозапальними ефектами.

Шлях, у якому сходяться всі три шляхи, був визначений як термінальний шлях комплементу.

Сба являє собою найбільш сильний анафілотоксин, індукуючий зміну тонусу гладких м'язів і судин, а також проникності судин. Він також є потужним хемотаксином і активатором нейтрофілів і моноцитів. Сба-опосередкована активація клітин може значно підсилювати запальні відповіді шляхом індукування вивільнення множини додаткових медіаторів запалення, включаючи цитокіни, гідролітичні ферменти, метаболіти арахідонової кислоти і частинки активного кисню. Розщеплення С5 приводить до утворення С5р-9, також відомого як мембраноатакуючий комплекс (МАС). На даний час існують переконливі докази того, що сублітичне відкладення МАС, крім його ролі як літичного пороутворювального комплексу, може відігравати важливу роль у запальному процесі.

Додатково до своєї важливої ролі в імунному захисті система комплементу бере участь в бо ураженні тканин при багатьох клінічних станах. Незважаючи на наявність множини даних, що вказують на участь класичного і альтернативного шляхів комплементу в патогенезі неінфекційних захворювань у людини, роль лектинового шляху в такому патогенезі почали оцінювати тільки зараз. Нещодавні дослідження показали, що активація лектинового шляху може бути відповідальна за активацію комплементу і пов'язане з ним запалення при ішемічному/реперфузійному ушкодженні. СоПага еї а). (2000) показали, що культивовані ендотеліальні клітини, піддані окисному стресу, зв'язуються з МВІ. і демонструють відкладення

СЗ у відповідь на вплив людської сироватки (Соїага еї аї., Ат. 9. Раїйої. 156:1549-1556, (2000)).

Крім того, обробка людської сироватки блокувальними моноклональними анти-МВІ. антитілами пригнічувала зв'язування МВІ і активацію комплементу. Ці дані підтверджували на щурячій моделі ішемії/реперфузії міокарда, при якій у щурів, що одержали блокувальні антитіла до щурячого МВІ., спостерігалося значиме зниження ушкодження міокарда на фоні оклюзії коронарної артерії, у порівнянні з щурами, що одержували контрольне антитіло (Чогдап «У.Е. еї а!., Сігсшайоп, 104:1413-1418, 2001). Молекулярний механізм зв'язування МВІ із судинним ендотелієм після окисного стресу залишається поки неясним, однак останні дослідження дозволяють припустити, що активація лектинового шляху після окисного стресу може бути опосередкована зв'язуванням МВІ з судинними ендотеліальними цитокератинами, а не з глікокон'югатами (СоПага С.О. еї аі,, Ат. У. РаїйоїЇ. 159:1045-1054, 2001). Інші дослідження вказали на роль класичного і альтернативного шляхів у патогенезі ішемічного/реперфузійного ушкодження, а роль лектинового шляху в патогенезі такого захворювання поки залишається предметом дискусії (Ківдептапп М.С. еї аї!.,, Ат. у). Райпої. 162:363-367, 2003).

Фіброз являє собою утворення надлишкової кількості сполучної тканини в органі або тканині, що утворюється як правило у відповідь на ушкодження або ураження. Відмітною ознакою фіброзу є продукування надлишкового позаклітинного матриксу після локальної травми.

Нормальна фізіологічна відповідь на ураження приводить до утворення сполучної тканини, але цей початково цілющий процес відновлення може затягтися і стати патологічним, змінюючи архітектуру і функцію тканини. На клітинному рівні, епітеліальні клітини і фібробласти розмножуються і диференціюються в міофібробласти, приводячи до скорочення матриксу, збільшення ригідності, мікроваскулярної компресії і гіпоксії. Приплив запальних клітин, включаючи макрофаги і лімфоцити, приводить до вивільнення цитокінів і підсилює відкладення

Зо колагену, фібронектину і інших молекулярних маркерів фіброзу. Традиційні терапевтичні підходи в основному були спрямовані на запальний процес при фіброзі з використанням кортикостероїдів і імунодепресантів. На жаль, усі ці протизапальні агенти мають невеликий клінічний ефект. На даний час відсутнє ефективне лікування або терапія фіброзу, однак і звіти досліджень на тваринах, і епізодичні звіти про результати лікування людей говорять про те, що фіброзні ураження тканин можуть бути купірувані (Татре апа 7еїзрего, Маї. Кеу. Мерпгої!., Мої. 10:226-237, 2014).

Нирка має обмежену здатність до відновлення після травми. Різні патології нирок приводять до місцевого запалення, яке викликає рубцювання і фіброз нирок. Вплив запальних стимулів, що не припиняється, приводить до тубулоіїнтерстиціального запалення і фіброзу і прогресуючого функціонального порушення нирок при хронічному захворюванні нирок. Його прогресування до термінальної стадії ниркової недостатності пов'язане зі значним рівнем захворюваності і смертності Оскільки тубулоінтерстиціальний фіброз є загальною термінальною точкою багатьох ниркових патологій, він являє собою важливу мішень для лікування, спрямованого на запобігання нирковій недостатності. Фактори ризику (наприклад, протеїнурія), незалежні від первинного захворювання нирок, сприяють розвитку фіброзу нирок і втраті екскреторної функції нирок, стимулюючи розвиток місцевого запалення, що, у свою чергу, підсилює прогресування захворювання.

Враховуючи роль фіброзу в багатьох захворюваннях і розладах, таких як, наприклад, тубулоінтерстиціальний фіброз, що приводить до хронічного захворювання нирок, існує нагальна потреба в розробці терапевтично ефективних засобів для лікування захворювань і станів, викликаних або ускладнених фіброзом. Також, враховуючи нестачу у нових і існуючих методах лікування, що впливають на запальні профіброзні фактори при ниркових захворюваннях, необхідно розробити терапевтично ефективні засоби для лікування, пригнічення, профілактики і/або купірування фіброзу нирок, тим самим запобігання прогресуванню хронічного захворювання нирок.

СУТЬ ВИНАХОДУ

Цей розділ опису призначений для введення набору понять, представлених у спрощеному вигляді, які більш докладно описані нижче. Цей розділ опису не призначений для визначення ключових ознак заявленого об'єкта винаходу і не призначений для визначення обсягу 60 заявленого об'єкта винаходу.

В одному з аспектів винахід стосується способу лікування, пригнічення, полегшення або профілактики фіброзу у ссавця, що страждає або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту кількості інгібуючого МА5БР-2 агента, ефективної для пригнічення фіброзу. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент являє собою МАБР-2 антитіло або його фрагмент. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент являє собою моноклональне МА5ЗР-2 антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною

ЗЕО ІЮ МО:6. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент вибірково пригнічує активацію лектинового шляху комплементу без пригнічення по суті активації С1д-залежного комплементу. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим щонайменше одним з наступного: (ї) фіброзу і/або запалення, пов'язаного з ішемічним реперфузійним ушкодженням, (ії) фіброзу і/або запалення нирок (наприклад, тубулоінтерстиціального фіброзу, хронічного захворювання нирок, хронічної ниркової недостатності, гломерулярного захворювання (наприклад, фокального сегментарного гломерулосклерозу)), порушення імунного комплексу (наприклад, ІдА-нефропатії, мембранозної нефропатії), вовчакового нефриту, нефротичного синдрому, діабетичної нефропатії, тубулоінтерстиціального ураження і гломерулонефриту (наприклад, СЗ-гломерулопатії), (іїї) фіброзу і/або запалення легенів (наприклад, хронічної обструктивної хвороби легенів, кістозного фіброзу, фіброзу легенів, пов'язаного зі склеродермією, бронхоектазу і легеневої гіпертензії), (ім) фіброзу і/або запалення печінки (наприклад, цирозу, неалкогольної жирової хвороби печінки (стеатогепатиту)), фіброзу печінки, вторинного відносно зловживання алкоголем, фіброзу печінки, вторинного відносно гострого або хронічного гепатиту |(індукованої ліками гепатотоксичності, викликаної ацетамінофеном або іншим лікарським засобом), (м) фіброзу і/або запалення серця (наприклад, серцевого фіброзу, інфаркту міокарда, фіброзу клапана, фіброзу передсердя, фіброзу ендоміокарда, аритмічної кардіоміопатії правого шлуночка (АКПШ), (мі) судинного фіброзу (наприклад, судинного захворювання, атеросклеротичного судинного захворювання, стенозу судин, рестенозу, васкуліту, флебіту, тромбозу глибоких вен і аневризми черевної аорти), (мі) фіброзу шкіри (наприклад, надмірного загоєння ран, склеродермії, системного склерозу, келоїдів, захворювання сполучної тканини, рубцювання і гіпертрофічних

Зо рубців), (мії) фіброзу суглобів (наприклад, артрофіброзу), (їх) фіброзу центральної нервової системи (наприклад, інсульту, травматичного ушкодження головного мозку і травми спинного мозку), 09 фіброзу травної системи (наприклад, хвороби Крона, фіброзу підшлункової залози і виразкового коліту), (хі) очного фіброзу (наприклад, передньої субкапсулярної катаракти, помутніння задньої капсули, дегенерації жовтої плями і ретинальної і вітреальної ретинопатії), (хії) фіброзу структур м'яких тканин скелетно-м'язової системи (наприклад, клітинного капсуліту, контрактури Дюпюїтрена і мієлофіброзу), (хії) фіброзу репродуктивних органів (наприклад, ендометріозу і хвороби Пейроні), (хім) хронічного інфекційного захворювання, яке викликає фіброз і/або запалення (наприклад, альфа-вірусу, гепатиту А, гепатиту В, гепатиту С, туберкульозу, ВІЛ і грипу), (хм) аутоїмунного захворювання, яке викликає фіброз і/або запалення (наприклад, склеродермії і системного червоного вовчака (СЧВ), (хмї) рубцювання, пов'язаного із травмою (наприклад, де пов'язані з травмою рубці вибирають із групи, що складається з хірургічних ускладнень (наприклад, післяопераційних спайок, при яких може утворюватися рубцева тканина між внутрішніми органами, що викликає контрактуру, біль і може приводити до безплідності), індукованого хіміотерапевтичними засобами фіброзу, індукованого радіацією фіброзу і рубцювання, пов'язаного з опіками), або (хмії) трансплантації органів, фіброзу молочної залози, м'язового фіброзу, ретроперитонеального фіброзу, фіброзу щитовидної залози, фіброзу лімфатичних вузлів, фіброзу сечового міхура і плеврального фіброзу.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу лікування, пригнічення, полегшення або профілактики фіброзу нирок у ссавця, що страждає або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням нирок, який включає введення суб'єкту кількості інгібуючого МАБР-2 агента, ефективної для пригнічення фіброзу нирок. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент являє собою МА5Р-2 антитіло або його фрагмент. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент являє собою моноклональне МА5ЗР-2 антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною

ЗЕО ІЮ МО:6. В одному з варіантів здійснення МА5Р-2 антитіло або його фрагмент специфічно зв'язується з поліпептидом, що містить 5ЕО ІЮО МО:6, зі спорідненістю, яка щонайменше в 10 разів перевищує спорідненість зв'язування з іншим антигеном у системі комплементу. В одному з варіантів здійснення антитіло або його фрагмент вибирають із групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла зі зниженою ефекторною функцією, химерного антитіла, бо гуманізованого антитіла і людського антитіла. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р-

2 агент вибірково пригнічує активацію лектинового шляху комплементу без пригнічення по суті активації Сід-залежного комплементу. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5ЗР-2 агент вводять підшкірно, інтраперитонеально, внутрішньом'язово, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно або шляхом інгаляції. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент вводять у кількості, ефективній для пригнічення тубулоінтерстиціального фіброзу. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент вводять у кількості, ефективній для зменшення, затримання або усунення необхідності в діалізі у суб'єкта. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає захворюванням нирок або захворюванням, вибраним із групи, що складається з хронічного захворювання нирок, хронічної ниркової недостатності, гломерулярного захворювання (наприклад, фокального сегментарного гломерулосклерозу), вовчакового нефриту, нефротичного синдрому, діабетичної нефропатії, тубулоінтерстиціального ураження і гломерулонефриту (наприклад, СЗ-гломерулопатії). В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає протеїнурією, і інгібуючий МА5Р-2 агент вводять у кількості, ефективній для зменшення тяжкості протеїнурії у суб'єкта. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент вводять у кількості і протягом періоду часу, які є ефективними для досягнення щонайменше 20 95 зменшення (наприклад, щонайменше 30 95 зменшення або щонайменше 40 95 зменшення, або щонайменше 50 95 зменшення) 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає захворюванням або розладом нирок, асоційованим з протеїнурією, вибраною із групи, що складається з нефротичного синдрому, прееклампсії, еклампсії, токсичного ураження нирок, амілоїдозу, судинно- колагенозних захворювань (наприклад, системного червоного вовчака), зневоднювання, гломерулярних захворювань (наприклад, мембранозного гломерулонефриту, фокального сегментарного гломерулонефриту, СЗ3-гломерулопатії, хвороби мінімальних змін, ліпоїдного нефрозу), інтенсивного фізичного навантаження, стресу, доброякісної ортостатичної (постуральної) протеїнурії, фокального сегментарного гломерулосклерозу, ІдА-нефропатії (наприклад, хвороби Бергера), ІчЧМ-нефропатії, мембранопроліферативного гломерулонефриту, мембранозної нефропатії, хвороби мінімальних змін, саркоїдозу, синдрому Альпорта, цукрового діабету (діабетичної нефропатії), індукованої ліками токсичності (наприклад, індукованої НПЗП, нікотином, пеніциламіном, карбонатом літію, золотом і іншими важкими металами, інгібіторами

АПФ, антибіотиками (наприклад, адріаміцином) або опіатами (наприклад, героїном) або іншими нефротоксинами); хвороби Фабрі, інфекції (наприклад, ВІЛ, сифілісу, гепатиту А, В або С, постстрептококової інфекції, сечового шистосомозу); аміноацидурії, синдрому Фанконі, гіпертонічного нефросклерозу, інтерстиціального нефриту, серпоподібноклітинної хвороби, гемоглобінурії, множинної мієломи, міоглобінурії, відторгнення органів (наприклад, відторгнення трансплантата нирки), геморагічної пропасниці Ебола, синдрому нігтьової патели, сімейної пропасниці, синдрому НЕГІР, системного червоного вовчака, гранулематозу Вегенера, ревматоїдного артриту, хвороби накопичення глікогену типу 1 (хвороба Гірке), синдрому

Гудпасчера, пурпури Шенлейна-Геноха, інфекції сечових шляхів, що поширилася на нирки, синдрому Шегрена і постінфекційного гломерулонефриту. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає ІдА-нефропатією. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає мембранозною нефропатією.

В іншому аспекті даного винаходу надається спосіб профілактики або зменшення ураження нирок у суб'єкта, що страждає захворюванням або станом, асоційованим із протеїнурією, який включає введення кількості інгібуючого МАБР-2 агента, ефективної для зменшення або профілактики протеїнурії у суб'єкта. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАЗР-2 агент являє собою МА5Р-2 антитіло або його фрагмент. В одному з варіантів здійснення інгібуючий

МА5Р-2 агент являє собою моноклональне МАБ5бР-2 антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною 5ЕО ІЮО МО:6. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент вибірково пригнічує активацію лектинового шляху комплементу без пригнічення по суті активації

Стд-залежного комплементу. В одному з варіантів здійснення захворювання або стан, асоційований з протеїнурією, вибирають із групи, що складається з нефротичного синдрому, прееклампсії, еклампсії, токсичної ураження нирок, амілоїдозу, судинно-колагенозних захворювань (наприклад, системного червоного вовчака), зневоднювання, гломерулярних захворювань (наприклад, мембранозного гломерулонефриту, фокального сегментарного гломерулонефриту, СЗ-гломерулопатії, хвороби мінімальних змін, ліпоїдного нефрозу), інтенсивного фізичного навантаження, стресу, доброякісної ортостатичної (постуральної) протеїнурії, фокального сегментарного гломерулосклерозу, ІдА-нефропатії (наприклад, хвороби

Бергера), ІдМ-нефропатії, мембранопроліферативного гломерулонефриту, мембранозної бо нефропатії, хвороби мінімальних змін, саркоїдозу, синдрому Альпорта, цукрового діабету

(діабетичної нефропатії), індукованої ліками токсичності (наприклад, індукованої НПЗП, нікотином, пеніциламіном, карбонатом літію, золотом і іншими важкими металами, інгібіторами

АПФ, антибіотиками (наприклад, адріаміцином) або опіатами (наприклад, героїном)); хвороби

Фабрі, інфекції (наприклад, ВІЛ, сифілісу, гепатиту А, В або С, постстрептококової інфекції, сечового шистосомозу); аміноацидурії, синдрому Фанконі, гіпертонічного нефросклерозу, інтерстиціального нефриту, серпоподібноклітинної хвороби, гемоглобінурії, множинної мієломи, міоглобінурії, відторгнення органів (наприклад, відторгнення трансплантата нирки), геморагічної пропасниці Ебола, синдрому нігтьової патели, сімейної пропасниці, синдрому НЕЇ ІР, системного червоного вовчака, гранулематозу Вегенера, ревматоїдного артриту, хвороби накопичення глікогену типу 1, синдрому Гудпасчера, пурпури Шенлейна-Геноха, інфекції сечових шляхів, що поширилася на нирки, синдрому Шегрена і постінфекційного гломерулонефриту. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент вводять у кількості і протягом періоду часу, які є ефективними для досягнення щонайменше 20 95 зменшення (наприклад, щонайменше 30 95 зменшення або щонайменше 40 95 зменшення, або щонайменше 50 95 зменшення) 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24- годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування.

В іншому аспекті даного винаходу надається спосіб пригнічення прогресування хронічного захворювання нирок, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, кількості інгібуючого

МАБР-2 агента, ефективної для зменшення або профілактики фіброзу нирок, наприклад тубулоіїнтерстиціального фіброзу. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент являє собою МА5Р-2 антитіло або його фрагмент. В одному з варіантів здійснення інгібуючий

МА5Р-2 агент являє собою моноклональне МА5Р-2 антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною 5ЕО ІЮО МО:6. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАЗР-2 агент вибірково пригнічує активацію лектинового шляху комплементу без пригнічення по суті активації

Стда-залежного комплементу. В одному з варіантів здійснення суб'єкт, що цього потребує, страждав протеїнурією до введення інгібуючого МА5Р-2 агента, причому введення інгібуючого

МА5БР-2 агента зменшує протеїнурію у суб'єкта. В одному з варіантів здійснення інгібуючий

МА5Р-2 агент вводять у кількості і протягом періоду часу, які є ефективними для досягнення щонайменше 20 95 зменшення (наприклад, щонайменше 30 95 зменшення або щонайменше

Зо 40 95 зменшення, або щонайменше 50 95 зменшення) 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент вводять у кількості, ефективній для зменшення, затримання або усунення необхідності в діалізі у суб'єкта.

В іншому аспекті даного винаходу надається спосіб захисту нирок від ураження у суб'єкта, який одержував, одержує або буде одержувати лікування одним або більше нефротоксичними агентами, який включає введення кількості інгібуючого МАБР-2 агента, ефективної для профілактики або полегшення індукованої ліками нефропатії. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент являє собою МАБР-2 антитіло або його фрагмент. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент являє собою моноклональне МА5Р-2 антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною ЗЕО ІЮ МО:6. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент вибірково пригнічує активацію лектинового шляху комплементу без пригнічення по суті активації С1д-залежного комплементу.

В одному з аспектів винаходу надається спосіб лікування людини, що страждає імуноглобулін А-нефропатією (ДАМ), який включає введення суб'єкту композиції, що містить кількість інгібуючого МА5Р-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для пригнічення МАБР-2-залежної активації комплементу. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає стероїдзалежною ІДАМ. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5БР-2 антитіло являє собою моноклональне антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з людським МА5Р-2. В одному з варіантів здійснення антитіло або його фрагмент вибирають із групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла зі зниженою ефекторною функцією, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і людського антитіла. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5БР-2 антитіло по суті не пригнічує активацію класичного шляху. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5Р-2 антитіло пригнічує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці зі значенням ІСзо 30 нМ або менше. В одному з варіантів здійснення спосіб додатково включає ідентифікацію суб'єкта, що має стероїдзалежну (ДАМ, до етапу введення суб'єкту композиції, що містить кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для поліпшення функції нирок. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МАБР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості, ефективній для поліпшення функції нирок. В одному з варіантів здійснення бо інгібуюче МАБЗР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості і протягом періоду часу, які є ефективними для досягнення щонайменше 20 95 зменшення 24- годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування. В одному з варіантів здійснення композицію вводять у кількості, достатній для поліпшення функції нирок і зменшення дози кортикостероїдів у зазначеного суб'єкта. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МАБЗР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить СОК-НІ, СОВ-Н2 і СОК-НЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:67, варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить СОБ-І 1, СОВ-12 і СОК-ЇЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:70.

В іншому аспекті винаходу надається спосіб лікування людини, що страждає мембранозною нефропатією (МН), який включає введення суб'єкту композиції, що містить кількість інгібуючого

МА5Р-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для пригнічення МАР - 2-залежної активації комплементу. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає стероїдзалежною МН. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5Р-2 антитіло являє собою моноклональне антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з людським МА5БР-2. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МАБЗР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості, ефективній для поліпшення функції нирок. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5БР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості і протягом періоду часу, які є ефективними для досягнення щонайменше 20 95 зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування. В одному з варіантів здійснення композицію вводять у кількості, достатній для поліпшення функції нирок і зменшення дози кортикостероїдів у зазначеного суб'єкта. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5БР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить СОВБ-

НІ, СОВ-Н2 і СОВБ-НЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:67, варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить СОК-І1, СОВ-12 і СОК-ЇЗ амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЗЕО ІЮ МО:70.

В іншому аспекті винаходу надається спосіб лікування людини, що страждає вовчаковим нефритом (ВН), який включає введення суб'єкту композиції, що містить кількість інгібуючого

МА5Р-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для пригнічення МАР -

Зо 2-залежної активації комплементу. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає стероїдзалежним ВН. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5БР-2 антитіло являє собою моноклональне антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з людським МА5БР-2. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МАБР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості, ефективній для поліпшення функції нирок. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МАБР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості і протягом періоду часу, які є ефективними для досягнення щонайменше 20 95 зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування. В одному з варіантів здійснення композицію вводять у кількості, достатній для поліпшення функції нирок і зменшення дози кортикостероїдів у зазначеного суб'єкта. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МАЗР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить СОБ-

НІ, СОВ-Н2 їі СОК-НЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить СОК-І1, СОВ-12 і СОК-ЇЗ амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЗЕО ІЮ МО:70.

В іншому аспекті винаходу надається спосіб зменшення протеїнурії у людини, що страждає

ІЧАМ, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого МА5ЗР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить СОВ-НІ, СОВ-Н2 ї СОБ-НЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ХЕО

ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить СОК-І1, СОВ-1І2 ії СОК-І З

БО амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:70, згідно з наступними схемами дозування: а) введення приблизно 4 мг/кг (тобто від 3,6 до 4,4 мг/кг) зазначеного антитіла суб'єкту, що страждає ІДАМ, внутрішньовенно раз на тиждень протягом періоду лікування, що становить щонайменше 12 тижнів; р) введення від приблизно 180 мг до приблизно 725 мг (тобто від 162 до 797 мг) зазначеного антитіла суб'єкту, що страждає ІДАМ, внутрішньовенно раз на тиждень протягом періоду лікування, що становить щонайменше 12 тижнів, при цьому спосіб зменшує протеїнурію у зазначеного суб'єкта.

ОПИС КРЕСЛЕНЬ бо Вищевикладені аспекти і багато які із супутніх переваг цього винаходу стануть більш зрозумілими з посиланням на наведений нижче докладний опис з посиланням на прикладені креслення, на яких: фіг. 1 являє собою діаграму, що ілюструє геномну структуру людського МАБ5Р-2; фіг. 2А являє собою схематичну діаграму, що ілюструє структуру доменів людського білка

МА5Р-2; фіг. 28 являє собою схематичну діаграму, що ілюструє структуру доменів людського білка

МАр19; фіг. З являє собою діаграму, що ілюструє стратегію нокауту мишачого МА5Р-2; фіг. 4 являє собою діаграму, що ілюструє конструкцію міні-гена МА5Р-2; на фіг. БА представлені результати, які демонструють, що дефіцит МАБР-2 приводить до втрати С4-опосередкованої активації лектинового шляху, визначеної по відсутності відкладень

С46р на манані, як описано в прикладі 2; на фіг. 58 представлені результати, які демонструють, що дефіцит МАБР-2 приводить до втрати С4-опосередкованої активації лектинового шляху, визначеної по відсутності відкладень

С4р на зимозані, як описано в прикладі 2; на фіг. 5С представлені результати, які демонструють відносні рівні активації С4 у зразках сироватки, одержаних з МАБР-2-/-, МА5Р-2-/- ліній і лінії дикого типу, визначені по відкладенню

С46б на манані і на зимозані, як описано в прикладі 2; на фіг. б представлені результати, які демонструють, що додавання мишачого рекомбінантного МАБР-2 до зразків МАБР-2-/- сироватки відновлює С4-опосередковану активацію лектинового шляху, яка залежить від концентрації білка, визначену по відкладенню

С46р на манані, як описано в прикладі 2; на фіг. 7 представлені результати, які демонструють, що класичний шлях є функціональним у МА5Р-2-/- лінії, як описано в прикладі 8; на фіг. ВА представлені результати, які демонструють, що анти-МА5БР-2 антитіло Бар2 Мо 11 пригнічує утворення СЗ3-конвертази, як описано в прикладі 10; на фіг. 88 представлені результати, які демонструють, що анти-МА5Р-2 антитіло Раб2 Мо 11 зв'язується з нативним щурячим МА5Р-2, як описано в прикладі 10; на фіг. 8С представлені результати, які демонструють, що анти-МА5Р-2 антитіло Рар2 Мо 41

Зо пригнічує розщеплення С4, як описано в прикладі 10; на фіг. 9 представлені результати, які демонструють, що всі протестовані анти-МАБР-2 антитіла Рабр2, які пригнічували утворення СЗ-конвертази, також пригнічують розщеплення Са4, як описано в прикладі 10; фіг. 10 являє собою діаграму, що ілюструє рекомбінантні поліпептиди, одержані із щурячого

МАБ5Р-2, які були використані для картування епітопів блокуючих МАБР-2 антитіл Рар2, як описано в прикладі 11; на фіг. 11 представлені результати, що демонструють зв'язування анти-МАБР-2 Баб2 МоМо і 60 з щурячими поліпептидами МА5Р-2, як описано в прикладі 11; на фіг. 12А графічно показаний рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності 40 людського моноклонального анти-МАБР-2 антитіла (0ОМ5646) в умовах тестування, специфічних для лектинового шляху, що свідчить про те, що ОМ5646 пригнічує опосередковане лектином відкладення МАС з величиною ІСзо, що дорівнює приблизно 1 нМ, як описано в прикладі 12; на фіг. 128 графічно показаний рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності людського моноклонального анти-МАБР-2 антитіла (0ОМ5646) в умовах тестування, специфічних для класичного шляху, що свідчить про те, що ОМ5646 не пригнічує опосередковане класичним шляхом відкладення МАС, як описано в прикладі 12; на фіг. 12С графічно показаний рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності людського моноклонального анти-МАБР-2 антитіла (0ОМ5646) в умовах тестування, специфічних для альтернативного шляху, що свідчить про те, що ОМ5646 не пригнічує опосередковане альтернативним шляхом відкладення МАС, як описано в прикладі 12; на фіг. 13 графічно показаний фармакокінетичний (РК) профіль людського моноклонального анти-МАБ5Р-2 антитіла (0М5646) у мишей, що показує концентрацію ОМ5646 (середнє значення для п-З тварини/групу) залежно від часу після введення зазначеної дози, як описано в прикладі 12; на фіг. 14А графічно показана фармакодинамічна (РО) відповідь моноклонального анти-

МАБР-2 антитіла людини (0М5646), визначена по падінню активності лектинового шляху системи комплементу у мишей після внутрішньовенного введення, як описано в прикладі 12; на фіг. 148 графічно показана фармакодинамічна (РО) відповідь моноклонального МАБР-2 бо антитіла людини (0М5646), визначена по зниженню активності лектинового шляху системи комплементу у мишей після підшкірного введення, як описано в прикладі 12; на фіг. 15 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених сіріусом червоним; зрізи тканин одержували у мишей дикого типу і МАБР-2- /- мишей через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) і псевдооперованих мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей, як описано в прикладі 14; на фіг. 16 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених антитілами до маркера макрофагів Е4/80; зрізи тканин одержували у мишей дикого типу їі МА5БР-2-/- мишей через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШОС) і псевдооперованих мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей, як описано в прикладі 14; на фіг. 17 графічно показані відносні рівні експресії мРНК колагену-4, виміряні кількісною

ПЛР (кПЛР) у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу Її МАБР-2-/- мишей через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) і псевдооперованих мишей дикого типу і

МАБ5БР-2-/- мишей, як описано в прикладі 14; на фіг. 18 графічно показані відносні рівні експресії МРНК трансформуючого фактора росту бета-1 (ТаЕр-1), виміряні кПЛР у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МА5Р- 2-/- мишей через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) і псевдооперованих мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей, як описано в прикладі 14; на фіг. 19 графічно показані відносні рівні експресії мРНК інтерлейкіну-б (1І/-6), виміряні

КПЛР у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МАБР-2-/- мишей через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) і псевдооперованих мишей дикого типу і

МАБ5БР-2-/- мишей, як описано в прикладі 14; на фіг. 20 графічно показані відносні рівні експресії мРНК інтерферону-у, виміряні кПЛР, у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) і псевдооперованих мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей, як описано в прикладі 14; на фіг. 21 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених сіріусом червоним; зрізи тканин одержували через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШО) у мишей дикого типу, що одержували інгібуюче

МАБ5Р-2 антитіло і антитіло ізотипного контролю, як описано в прикладі 15;

Зо на фіг. 22 графічно показаний вміст гідроксипроліну в нирках, одержаних через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШО) у мишей дикого типу, що одержували інгібуюче

МАБР-2 антитіло, у порівнянні з рівнем гідроксипроліну в тканині оклюдованих нирок, одержаних від мишей дикого типу, що одержували ізотипний контроль, Ідс4, як описано в прикладі 15; на фіг. 23 графічно показана загальна кількість сироваткових білків (мг/мл), виміряна на 15-й день вивчення впливу передозування білка у контрольних мишей дикого типу (п-2), що одержували тільки фізіологічний розчин, мишей дикого типу, що одержували ВЗА (п-б), і МА5Р- 2-/- мишей, що одержували В5А (п:-6б), як описано в прикладі 16; на фіг. 24 графічно показана загальна кількість білка (мг), виділеного із сечею, зібраною протягом 24-х годин, на 15-й день вивчення впливу передозування білка у контрольних мишей дикого типу (п-2), що одержували тільки фізіологічний розчин, мишей дикого типу, що одержували ВЗА (п:-б), і МА5Р-2-/- мишей, що одержували ВЗА (п-б), як описано в прикладі 16; на фіг. 25 показані репрезентативні зрізи тканин нирок, забарвлені гематоксиліном і еозином (НЕ), на 15-й день вивчення рівня передозування білка у наступних груп мишей: (панель А) контрольні миші дикого типу; (панель В) МА5Р-2-/- контрольні миші, (панель С) миші дикого типу, що одержували ВЗА; і (панель Ю) МА5Р-2-/- миші, що одержували бичачий сироватковий альбумін (ВЗА), як описано в прикладі 16; на фіг. 26 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених антитілом до маркера макрофагів Е4/80, що показують середню забарвлену площу макрофагів (90), де зрізи тканин одержували на 15-й день вивчення впливу передозування білка у контрольних мишей дикого типу (п-2), мишей дикого типу, що одержували ВЗА (п-б), і мишей МА5Р-2-/-, що одержували ВЗА (п-5), як описано в прикладі 16; на фіг. 27А графічно показаний аналіз наявності кореляції між рівнем макрофагів і протеїнурією у кожної миші дикого типу (п-б), що одержувала ВЗА, у вигляді графіка залежності загальної кількості виділеного білка, виміряної в 24-годинному зразку сечі, від інфільтрації макрофагів (середня забарвлена площа, 95), як описано в прикладі 16; на фіг. 27В графічно показаний аналіз наявності кореляції між рівнем макрофагів і протеїнурією у кожної МА5Р-2-/- миші (п-5), що одержувала В5А, у вигляді графіка залежності загальної кількості виділеного білка, виміряної в 24-годинному зразку сечі, від інфільтрації бо макрофагів (середня забарвлена площа, 9б5), як описано в прикладі 16;

на фіг. 28 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТаєЕр антитілом (виміряно у вигляді площі забарвлених анти-ТОЕр антитіл, вираженої у відсотках), у мишей дикого типу, що одержували В5А (п-4), і МАБР-2-/- мишей, що одержували ВЗА (п:-5), як описано в прикладі 16; на фіг. 29 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТМЕо; антитілом (виміряно у вигляді площі забарвлених анти-ТМЕс; антитіл), у мишей дикого типу, що одержували В5А (п--4), і МА5Р-2-/- мишей, що одержували ВЗА (п:-5), як описано в прикладі 16; на фіг. 30 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень ділянок тканин, забарвлених анти-1ІЇ-6 антитілом (виміряно у вигляді площі забарвлених анти-1І-6 антитіл), у контрольних мишей дикого типу, контрольних МАБР-2-/- мишей, мишей дикого типу, що одержували ВЗА (п-7), і МАБР-2-/- мишей, що одержували ВЗА (п- 7), як описано в прикладі 16; на фіг. 31 графічно показана частота ТОМЕЇ -позитивних апоптотичних клітин, підрахована у послідовно вибраних 20 полях зору під великим збільшенням (НРЕ) у зрізах тканин ниркової кіркової речовини, одержаних від контрольних мишей дикого типу (п-1), контрольних МАР -2-/- мишей (п-1), мишей дикого типу, що одержували В5А (п-б), і МАЗР-2-/- мишей, що одержували

ВЗА (п-7), як описано в прикладі 16; на фіг. 32 показані репрезентативні зрізи тканин, забарвлені НЕ, одержані на 15-й день після лікування В5А наступних груп мишей: (панель А) контрольні миші дикого типу, миші, що одержували фізіологічний розчин; (панель В) миші, що одержували антитіло ізотипного контролю, і (панель С) миші дикого типу, що одержували інгібуюче МА5Р-2 антитіло, як описано в прикладі 17; на фіг. 33 графічно показана частота ТОМЕ! -позитивних апоптотичних клітин, підрахована в послідовно вибраних 20 полях зору під великим збільшенням (НРЕ) у зрізах тканин ниркової кіркової речовини, одержаних від контрольних мишей дикого типу, що одержували контрольний фізіологічний розчин і ВБА (п-8), мишей дикого типу, що одержували антитіло ізотипного контролю і ВБА (п-8), і мишей дикого типу, що одержували інгібуюче МА5БР-2 антитіло і ВБА (п-7), як описано в прикладі 17; на фіг. 34 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень ділянок тканин,

Зо забарвлених анти-ТИЕрР антитілом (виміряних у вигляді площі забарвлених анти-ТаєЕр антитіл, 90), у мишей дикого типу, що одержували В5А і фізіологічний розчин (п-8), мишей дикого типу, що одержували ВЗА і антитіло ізотипного контролю (п-7), і мишей дикого типу, що одержували ВЗА і інгібуюче МА5бР-2 антитіло (п-8), як описано в прикладі 17; на фіг. 35 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТМЕо антитілом (виміряних у вигляді площі забарвлених анти-ТМЕо антитіл, 90), у мишей дикого типу, що одержували В5А і фізіологічний розчин (п-8), мишей дикого типу, що одержували ВЗА і антитіло ізотипного контролю (п-7), і мишей дикого типу, що одержували ВЗА і інгібуюче МА5бР-2 антитіло (п-8), як описано у прикладі 17; на фіг. 36 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-1Ї -6 антитілом (виміряних у вигляді площі забарвлених анти-1Ї -6 антитіл, Уро), у мишей дикого типу, що одержували В5А і фізіологічний розчин (п-8), мишей, що одержували

В5А і антитіло ізотипного контролю (п-7), і мишей дикого типу, що одержували В5А і інгібуюче

МА5БР-2 антитіло (п-8), як описано в прикладі 17; на фіг. 37 показані репрезентативні зрізи тканин, забарвлені НЕ, одержані на 14-й день після лікування тільки адріаміцином або фізіологічним розчином (контрольні), для наступних груп мишей: (панелі А-1, А-2, А-3) контрольні миші дикого типу, що одержували тільки фізіологічний розчин; (панелі В-1, В-2, В-3) миші дикого типу, що одержували адріаміцин; і (панелі С-1, б-2, С-3) МА5Р-2-/- миші, що одержували адріаміцин, як описано в прикладі 18; на фіг. 38 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених антитілом до маркера макрофагів Е4/80, що показують середню забарвлену площу макрофагів (95) на 14-й день після лікування тільки адріаміцином або фізіологічним розчином (контрольні миші дикого типу), для наступних груп мишей: контрольні миші дикого типу, що одержували тільки фізіологічний розчин; миші дикого типу, що одержували адріаміцин;

МА5Р-2-/- миші, що одержували тільки фізіологічний розчин, і МАЗР-2-/- миші, що одержували адріаміцин, де ""р-0,007, як описано в прикладі 18; на фіг. 39 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених сіріусом червоним, що показують забарвлені області відкладення колагену (96) на 14-й день після лікування тільки адріаміцином або фізіологічним розчином (контрольні миші дикого типу), для наступних груп мишей: контрольні миші дикого типу, що одержували бо тільки фізіологічний розчин; миші дикого типу, що одержували адріаміцин; МА5Р -2-/- миші, що одержували тільки фізіологічний розчин, і МАБР-2-/- миші, що одержували адріаміцин, де «хр-0,005, як описано в прикладі 18; на фіг. 40 графічно показане співвідношення альбумін/креатинін в сечі (ЧАСЕ) у двох ІдА- пацієнтів протягом дванадцятитижневого дослідження з тижневим лікуванням інгібуючим МА5Р- 2 антитілом (0М5646), як описано в прикладі 19; на фіг. 41 показаний графік залежності величини ЧАСскК (мг/г) від часу для чотирьох ІДАМ- пацієнтів, що одержували ОМ5646, від початкового моменту до дня 120, як описано в прикладі 21; на фіг. 42 графічно показана зміна рівня білка в 24-годинному зборі сечі після лікування відносно вихідного рівня в день 1 до лікування для чотирьох пацієнтів з ІЗАМ, що одержували

ОМ5646, як описано в прикладі 21; і на фіг. 43 графічно показана середня зміна рівня білка в 24-годинному зборі сечі після лікування відносно вихідного рівня до лікування для чотирьох пацієнтів з ІЗАМ, що одержували

ОМ5646, як описано в прикладі 21.

ОПИС СПИСКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

ЗЕО ІО МО:1 - КДНК людського МАр19;

ЗЕО ІО МО:С2 - людський білок МАр119 (з лідерною послідовністю);

ЗЕО ІО МО:З - людський білок МАр!19 (зрілий);

ЗЕО ІЮ МО:4 - КДНК людського МА5Р-2;

ЗЕО ІО МО:5 - людський білок МА5БР-2 (з лідерною послідовністю);

ЗЕО І МО:6 - людський білок МА5Р-2 (зрілий);

ЗЕО ІО МО:7 - ГДНК людського МА5Р-2 (екзони 1-6).

АНТИГЕНИ (ВІДНОСНО ЗРІЛОГО БІЛКА МА5БР-2)

ЗЕО І МО:8 - послідовність СИОВІ (аа 1-121);

ЗЕО І МО:9 - послідовність СОВЕСЕ (аа 1-166);

ЗЕО ІЮ МО:10 - СОВЕСЕСИВІЇ (аа 1-293);

ЗЕО ІО МО:11 - ЕСЕ-ділянка (аа 122-166);

ЗЕО ІО МО:12 - домен серинової протеази (аа 429-671);

ЗЕО ІО МО:13 - неактивний домен серинової протеази (аа 610-625 із заміною Зегб18 на Аа);

ЗЕО ІЮ МО:14 - ТРІ ОРКМУРЕРМУЕСКІ (пептид СИОВІ);

ЗЕО ІЮ МО:15 - ТАРРОУРКІ КІ МЕТНЕОГГ ЕІ ЗНІ СЕМОЄРМКІ З5ОАКМІ АТІ СО (пептид СИОВІ);

ЗЕО ІЮ МО:16 - ТЕКЗОУЗМ (центральна частина зв'язувальної ділянки МВІ);

ЗЕО ІЮ МО:17 - ЕМ5І а55І ОІТЕАЗОУЗМЕКРЕТОЕ (зв'язувальна ділянка МВІ);

ЗЕО ІЮ МО:18 - ІПОЕСОМАРО (пептид ЕСРБЕ);

ЗЕО Ір МО: 19 - АММІ САС ЕЗОСКОЗСКОрЗОСАЇ М (центральна частина, що зв'язує серинову протеазу).

ДОКЛАДНИЙ ОПИС

ПЕПТИДНІ ІНГІБІТОРИ

ЗЕО ІЮ МО:20 - повнорозмірна кКДНК МВІ;

ЗЕО ІЮ МО:21 - повнорозмірний білок МВІ ;

ЗЕО ІЮ МО:22 - ОБК-Х-ОР (консенсус зв'язування);

ЗЕО Ір МО:23 - ОСКІ С;

ЗЕО Ір МО:24 - СІ В СО СРО СОКІ РО С;

ЗЕО Ір МО:25 - аРО СРО СГА СО СРО СКІ СРО СРО СРО;

ЗЕО Ір МО26 -- акранраткаЕКсСЕРИООСІ НА ОСРОСКІ аРОСЄ;

ЗЕО І МО:27 - вАНЛОВ5БОСЕКСАОБРОСРОСРОСКМОРКОЕОСБО (людський Н-фіколін);

ЗЕО Ір МО28 - асосвіГгосдовркаєЕдатчакваЕВНаРОСРОСКАСРОС РМаАОсСЕО (людський фіколін р35);

ЗЕО ІЮ МО:29 - ГОКАЇ ЕП/'РМЕМТІКАМЕРЕЇМРЇ (сайт розщеплення С4).

ІНГІБІТОРИ ЕКСПРЕСІЇ

ЗЕО ІЮ МО:З30 - КДНК домену СОВІ-ЕСЕЕ (нуклеотиди 22-680 в ЗЕО ІЮ МО 4);

ЗЕО ІЮ МО:31 - У-СсССсайСАСАССАТОАДСЬ СТО СТОАССоСтТОоСтТасяаас-з, 12-45 нуклеотиди в

ЗЕО ІЮ МО:4, що включає сайт початку ініціації трансляції МА5Р-2 (смислова);

ЗЕО Ір МО:32 - У-(44АСАТТАССТТ ССИаСТОСОаАСТОСААСОПСАСАдСИ-3", 361-396 нуклеотиди в

ЗЕО ІЮ МО:4, кодуючій ділянку, що містить МВІ--зв'язуючий сайт МА5Р-2 (смислова);

ЗЕО Ір МО:33 - У-АВСАдаСССТаААТАСССАСОвИССОСТАТОССАДА-З3", 610-642 нуклеотиди в

ЗЕО ІЮ МО:4, кодуючій ділянку, що містить домен СОВІЇ.

ПРАЙМЕРИ КОДУВАННЯ

ЗЕО Ір МО:34 - бсасасАТоСАТаАдаасСтТастаАСсстТо (5-ПЛР для СИВ); 60 ЗЕО ІЮ МО:35 - айААТТОСТАСаИстасАТА (3-ПЛР для СИВ);

ЗЕО ІЮ МО:36 - айААТТСОСТАСАСИаассаст (3-ПЛР для СОВІЕСБЕ);

ЗЕО І МО:37 - айААТТОСТАаТАСстТасАТ (3-ПЛР для СОВІЕСЕСОВІЇ);

ЗЕО ІЮ МО:38-47 - праймери клонування для гуманізованого антитіла;

ЗЕО ІЮ МО:48 - пептидний зв'язок з 9 амінокислот.

ВЕКТОР ЕКСПРЕСІЇ

ЗЕО ІЮ МО:49 являє собою вставку міні-гена МА5Р-2; 5ЕО ІЮ МО:50 являє собою кКДНК мишачого МА5Р-2;

ЗЕО ІЮ МО:51 являє собою мишачий білок МА5Р-2 (з лідерною послідовністю);

ЗЕО ІЮ МО:52 являє собою зрілий мишачий білок МА5Р-2;

ЗЕО ІЮ МО:53 являє собою КДНК щурячого МА5Р-2;

ЗЕО ІЮ МО:54 являє собою щурячий білок МА5Р-2 (з лідерною послідовністю);

ЗЕО ІЮ МО:55 являє собою зрілий щурячий білок МАБР-2;

ЗЕО 10 МО:56-59 являють собою олігонуклеотиди для сайт-спрямованого мутагенезу людського МА5Р-2, які використовуються для одержання людського МАБР-2А;

ЗЕО 10 МО:60-63 являють собою олігонуклеотиди для сайт-спрямованого мутагенезу мишачого МА5Р-2, які використовуються для одержання мишачого МАЗР-2А;

ЗЕО 10 МО:64-65 являють собою олігонуклеотиди для сайт-спрямованого мутагенезу щурячого МА5Р-2, які використовуються для одержання щурячого МАБР-2А;

ЗЕБЕО ІЮ МО:6б являє собою ДНК, кодуючу варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) 17020 асз5МНн2г1М11М. (ОМ5646) (без сигнального пептиду);

ЗЕБЕО ІЮ МО:67 являє собою поліпептид 17020 асз5МнН2г1М11МІ (0М5646) варіабельної ділянки важкого ланцюга (МН);

ЗЕО ІЮ МО:68 являє собою поліпептид 17М1бтс варіабельної ділянки важкого ланцюга (МН);

ЗЕО ІЮ МО:69 являє собою ДНК, кодуючу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ) 17020 асзБунгтмМ11МІ (ОМ5646);

ЗЕБЕО ІЮ МО:70 являє собою поліпептид 17020 асз5МнН2г1М11МІ (0М5646) варіабельної ділянки легкого ланцюга (Мі);

ЗЕО ІО МО:71 являє собою поліпептид 17М16 ас17М9 варіабельної ділянки легкого ланцюга (МУ);

ЗЕО ІЮ МО:72 являє собою ЗОМІ-2І. (повнорозмірний);

ЗЕО ІЮ МО:73 являє собою ЗОМІ-2М (укорочений варіант середньої довжини);

ЗЕО ІЮ МО:74 являє собою ЗОМІ-25 (укорочений варіант, короткий);

ЗЕО ІЮ МО:75 являє собою зрілий поліпептид, що містить МН-М2абб6-5ОаМІ-2-М і константну область людського ІдС4 з мутацією в шарнірній області;

ЗЕО ІЮ МО:76 являє собою зрілий поліпептид, що містить МН-М2абьб6-5ОаМІ-2-С і константну область людського Ідс4 з мутацією в шарнірній області;

ЗЕО ІЮО МО:77 являє собою зрілий поліпептид, що містить МІ -М2абБб-5СО2МІ-2-М і константну область ланцюга лямбда людського Ід;

ЗЕО ІЮО МО:78 являє собою зрілий поліпептид, що містить МІ -М2абБб6-5С2МІ-2-С і константну область ланцюга лямбда людського Ід;

ЗЕО ІЮ МО:79 являє собою пептидний лінкер (10 аа);

ЗЕО ІЮ МО:80 являє собою пептидний лінкер (6 аа);

ЗЕО ІЮ МО:81 являє собою пептидний лінкер (4 аа);

ЗЕО І МО:82 являє собою полінуклеотид, кодуючий поліпептид, що містить МН-Ма2арб-

ЗОМІ-2-М і константну область людського Ідс4 з мутацією в шарнірній області;

ЗЕО ІЮ МО:83 являє собою полінуклеотид, кодуючий поліпептид, що містить МН-Ма2арб-

ЗОаМІ-2-С і константну область людського Ідс4 з мутацією в шарнірній області;

ЗЕБЕО ІЮ МО:84 представляє полінуклеотид, кодуючий поліпептид, що містить МІ -Магарб-

БО ЗОМІ-2-М і константну область ланцюга лямбда людського Ід;

ЗЕБЕО ІЮ МО:85 представляє полінуклеотид, кодуючий поліпептид, що містить МІ -Магабрб-

ЗОаМІ-2-С і константну область ланцюга лямбда людського Ід.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Даний винахід оснований на несподіваному відкритті авторів даного винаходу, що інгібування мананзв'язувальної лектинасоційованої серинової протеази-2 (МАБР-2), ключового регулятора лектинового шляху системи комплементу, значною мірою зменшує запалення і фіброз у різних моделях тварин фіброзного захворювання, включаючи модель односторонньої обструкції сечоводу (ШОЮ), модель передозування білка і модель фіброзу нирок при індукованій адріаміцином нефропатії. Таким чином, автори винаходу продемонстрували, що пригнічення бо МА5Р-2-опосередкованої активації лектинового шляху забезпечує ефективний терапевтичний підхід для полегшення, лікування або профілактики фіброзу нирок, наприклад тубулоінтерстиціального запалення і фіброзу, незалежно від основної причини. У даному описі також показано, що застосування інгібуючого МАБ5Р-2 антитіла (0М5646) ефективно поліпшує функції нирок і зменшує необхідність в кортикостероїдах у людей, що страждають імуноглобулін

А-нефропатією (ІдАМ) і мембранозною нефропатією (МН).

Ї. ВИЗНАЧЕННЯ

Якщо спеціально не зазначене інше, то всі використовувані в даному описі терміни мають таке ж значення, яке є зрозумілим фахівцю в галузі, до якої належить даний винахід. Наведені нижче визначення призначені для прояснення термінів, які використовуються в описі і у формулі даного винаходу.

Використовуваний у даному описі термін "МАБР-2-залежна активація комплементу" стосується МА5БР-2-залежної активації лектинового шляху, яка відбувається у фізіологічних умовах (тобто в присутності Сам) і яка приводить до утворення С3-конвертази С4р2а лектинового шляху і накопичення продукту розщеплення С3, такого як СЗБр, а далі утворення

С5-конвертази С4Б2а(С3р)п, що, як було визначено, є основною причиною опсонізації.

Використовуваний у даному описі термін "альтернативний шлях" стосується активації комплементу, яка ініціюється, наприклад, зимозаном із клітинних стінок грибів і дріжджів, ліпополісахаридом (ЛПС) зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій і кролячими еритроцитами, а також множиною чистих полісахаридів, кролячих еритроцитів, вірусів, бактерій, пухлинних клітин тварин, паразитів і ушкоджених клітин, і яка, як прийнято вважати, виникає в результаті спонтанного протеолітичного розщеплення фактора комплементу СЗ з утворенням

СЗЗ.

Використовуваний у даному описі термін "лектиновий шлях" стосується активації комплементу, яка відбувається за допомогою специфічного зв'язування сироваткових і несироваткових карбогідратзв'язувальних білків, включаючи мананзв'язувальний лектин (МВ),

СІ -11 ї фіколіни (Н-фіколін, М-фіколін або І -фіколін).

Використовуваний у даному описі термін "класичний шлях" стосується активації комплементу, яка запускається антитілом, зв'язаним з чужорідною частинкою, і для здійснення якої необхідне зв'язування з молекулою розпізнавання С14.

Зо Використовуваний у даному описі термін "інгібуючий МАЗР-2 агент" означає будь-який агент, який зв'язується або безпосередньо взаємодіє з МА5БР-2 і ефективно пригнічує МАБР-2- залежну активацію комплементу, включаючи анти-МА5БР-2 антитіла і їх МАБ5БР-2-зв'язуючі фрагменти, натуральні і синтетичні пептиди, малі молекули, розчинні МАБР-2 рецептори, інгібітори експресії і виділені натуральні інгібітори; а також пептиди, які при активації лектинового шляху конкурують із МАБР-2 за зв'язування з іншими молекулами розпізнавання (наприклад, МВГІ, Н-фіколіном, М-фіколіном або І -фіколіном), при цьому цей термін не охоплює антитіла, які зв'язуються з іншими молекулами розпізнавання. Інгібуючі МА5БР-2 агенти, використовувані в даному винаході можуть знижувати рівень МАБР-2-опосередкованої активації комплементу більше ніж на 20 95, наприклад більше ніж на 50 95, наприклад більше ніж на 9095. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент знижує рівень МА5БР-2- опосередкованої активації комплементу більше ніж на 9095 (тобто рівень МАБР-2- опосередкованої активації комплементу буде в результаті становити тільки 10 95 або менше).

Використовуваний у даному описі термін "фіброз" означає утворення або присутність надлишкової сполучної тканини на органі або тканині. Фіброз може виникнути як реакція відповіді у вигляді відновлення або заміщення на стимул, такий як ушкодження тканини або запалення. Відмітною ознакою фіброзу є продукування надлишкового позаклітинного матриксу.

Нормальна фізіологічна відповідь на ушкодження приводить до утворення сполучної тканини, як складової процесу загоєння, але це утворення сполучної тканини може затягтися і стати патологічним, змінюючи архітектуру і функцію тканини. На клітинному рівні, епітеліальні клітини і фібробласти розмножуються і диференціюються в міофібробласти, приводячи до скорочення матриксу, збільшення ригідності, мікроваскулярної компресії і гіпоксії.

Використовуваний у даному описі термін "лікування фіброзу у ссавця, що страждає або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням" означає купірування, ослаблення, полегшення або пригнічення фіброзу у зазначеного ссавця.

Використовуваний у даному описі термін "протеїнурія" означає наявність білка в сечі людини в аномальній кількості, наприклад у кількості, що перевищує 0,3 г білка в сечі людини, зібраній за 24 години, або в концентрації, що перевищує 1 г/л. У деяких варіантах здійснення суб'єкт, що страждає протеїнурією, належить до суб'єкта, наприклад суб'єкта, що страждає 60 імуноглобулін А (ІдА) нефропатією, у якого кількість білка в сечі перевищує 1,0 г білка в 24-

годинному зборі сечі.

Використовуваний у даному описі термін "поліпшення при протеїнурії" або "зменшення протеїнурії" означає зменшення у суб'єкта, що страждає протеїнурією, 24-годинної екскреції білка з сечею щонайменше на 20 95, наприклад щонайменше на 30 95, наприклад щонайменше на 40 95, наприклад щонайменше на 50 95, або більше у порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до його лікування інгібуючим МА5Р-2 агентом. В одному з варіантів здійснення лікування інгібуючим МАБ5бР-2 агентом згідно зі способом за винаходом є ефективним відносно зменшення протеїнурії у людини настільки, що досягається більше ніж 2095 зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею або, наприклад, більше ніж 3095 зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею, або, наприклад, більше ніж 40 95 зменшення 24- годинної екскреції білка з сечею, або, наприклад, більше ніж 50 95 зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею.

Використовуваний у даному описі термін "антитіло" охоплює антитіла і їх фрагменти, одержані від будь-якого виробляючого антитіла ссавця (наприклад, миші, щура, кролика і примата, включаючи людину) або одержані за допомогою гібридоми, відбору фагів, рекомбінантної експресії або трансгенних тварин (або іншими способами одержання антитіл або фрагментів антитіл), де зазначені антитіла або їх фрагменти специфічно зв'язуються з цільовим поліпептидом, таким як, наприклад, МА5Р-2, його поліпептидами або ділянками. Це не означає, що термін "антитіло" обмежений зазначеними в даному описі джерелами походження антитіл або способами їх одержання (наприклад, за допомогою гібридоми, відбору фагів, рекомбінантної експресії, трансгенних тварин, синтезу пептидів і т. п.). Антитіла, що наводяться як приклад, включають поліклональні, моноклональні і рекомбінантні антитіла; мультивалентні, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла, триспецифічні антитіла); гуманізовані антитіла; мишачі антитіла; химерні антитіла; моноклональні антитіла "миша- людина", "миша-примат", "примат-людина"; і антиїідіотипічні антитіла, які можуть бути інтактними антитілами, або їх фрагменти. Використовуваний у даному описі термін "антитіло" охоплює не тільки інтактні поліклональні або моноклональні антитіла, але також їх фрагменти (такі як АБ, Раб, Рар', К(аб)»2, Ем), одноланцюжкові фрагменти (5СЕм), їх синтетичні варіанти, природні варіанти, гібридні білки, що включають частину антитіла разом з антигензв'язувальним

Зо фрагментом з потрібною специфічністю, гуманізовані антитіла, химерні антитіла і будь-які модифіковані конфігурації імуноглобулінових молекул, що містять антигензв'язувальну ділянку або фрагмент (ділянку, що розпізнає епітоп) з потрібною специфічністю. "Моноклональне антитіло" означає гомогенну популяцію антитіл, у якій моноклональне антитіло складається з амінокислот (що зустрічаються в природі і не зустрічаються в природі), які беруть участь у селективному зв'язуванні епітопа. Моноклональні антитіла є високоспецифічними відносно цільового антигену. Термін "моноклональне антитіло" охоплює не тільки інтактні моноклональні антитіла і повнорозмірні моноклональні антитіла, але також їх фрагменти (такі як Раб, Раб Е(ар)г, Ем), одноланцюжкові фрагменти (5сЕм), їх варіанти, рекомбінантні білки, що містять антигензв'язувальну частину, гуманізовані моноклональні антитіла, химерні моноклональні антитіла і будь-яку модифіковану конфігурацію імуноглобулінової молекули, що містить антигензв'язувальний фрагмент (ділянку, що розпізнає епітоп) з потрібною специфічністю і здатністю зв'язуватися з епітопом. Це не означає, що цей термін обмежений зазначеними в даному описі джерелами походження антитіл або способами їх одержання (наприклад, за допомогою гібридоми, відбору фагів, рекомбінантної експресії, трансгенних тварин і т. п.). Цей термін включає цілі імуноглобуліни, а також фрагменти і т. д., описані вище під визначенням "антитіло".

Використовуваний у даному описі термін "фрагмент антитіла" стосується частини, яка одержана або належить до повнорозмірного антитіла, такого як, наприклад, анти-МА5Р-2 антитіло, що звичайно включає антигензв'язувальну або варіабельну ділянку цього антитіла.

Репрезентативні приклади фрагментів антитіл включають Раб, Раб, Е(аб)», Кіа)» їі Емх- фрагменти, 5сЕм-фрагменти, діатіла, лінійні антитіла, молекули одноланцюжкових антитіл і мультиспецифічні антитіла, утворені із фрагментів антитіл.

Використовуваний у даному описі "одноланцюжковий Ем" або "5сЕм"-фрагмент антитіла містить МН- і Мі-домени антитіла, причому ці домени присутні в одному поліпептидному ланцюзі. Як правило, Ем-поліпептид додатково містить поліпептидний лінкер між МН- і МІ - доменами, який дозволяє 5сЕм формувати потрібну структуру для зв'язування антигену.

Використовуваний у даному описі термін "химерне антитіло" являє собою рекомбінантний білок, який містить варіабельні домени і області, що визначають комплементарність, одержані з нелюдського (наприклад, гризуна) антитіла, тоді як інша частина молекули антитіла одержана з 60 людського антитіла.

Використовуваний у даному описі термін "гуманізоване антитіло" являє собою химерне антитіло, що містить мінімальну послідовність, яка відповідає специфічним областям, що визначають комплементарність, одержаним з нелюдського імуноглобуліну, трансплантованого в каркас антитіла людини. Гуманізовані антитіла, як правило, являють собою рекомбінантні білки, у яких тільки області що визначають комплементарність, антитіла мають нелюдське походження.

Використовуваний у даному описі термін "мананзв'язувальний лектин" (МВ!) є еквівалентним мананзв'язувальному білку (МВР).

Використовуваний у даному описі термін "мембраноатакуючий комплекс" (МАС) означає комплекс із п'яти кінцевих компонентів комплементу (С5р, об'єднаний з Сб, С7, С8 і С9), який вбудовується в мембрани і руйнує їх (також називаний С56Б-9).

Використовуваний у даному описі термін "суб'єкт" включає всіх ссавців, включаючи, без обмеження, людей, приматів, що не належать до людини, собак, кішок, коней, овець, кіз, корів, кроликів, свиней і гризунів.

Використовувані в даному описі амінокислотні залишки мають нижченаведені скорочення: аланін (Аїа; А), аспарагін (Азп; М), аспарагінова кислота (Азр; 0), аргінін (Аго; К), цистеїн (Сув;

С), глутамінова кислота (Сім; Е), глутамін (Сп; С), гліцин (Су; с), гістидин (Нів; Н), ізолейцин (Пе; І), лейцин (Гени; І), лізин (Гуз; К), метіонін (Ме; М), фенілаланін (Ре; Е), пролін (Рго; Р), серин (5ег; 5), треонін (ТАг; Т), триптофан (Тгр; МУ), тирозин (ТуУг; У) і валін (маї; М).

У більш широкому розумінні, природні амінокислоти можуть бути розділені на групи, виходячи з хімічних властивостей бічних ланцюгів відповідних амінокислот. "Гідрофобними" амінокислотами є Пе, Гей, Меї, Ре, Тгр, Туг, Маї, Аа, Суб5 або Рго. "Гідрофільними" амінокислотами є су, Авп, Сп, Зег, ТПг, Ар, Сім, Гуз, Агуд або Ні. Ця група амінокислот може бути також розділена на підкласи. "Незарядженими гідрофільними" амінокислотами є зЗег, ТНг,

Ап або Сіп. "Кислотними" амінокислотами є Сім або Ар. "Основними" амінокислотами є Гуз,

Агуд або Нів.

Використовуваний у даному описі термін "консервативна амінокислотна заміна" представлений амінокислотними замінами усередині однієї з наступних груп: (1) гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин, (2) фенілаланін, тирозин і триптофан, (3) серин і треонін, (4) аспартат

Зо і глутамат, (5) глутамін і аспарагін, і (6) лізин, аргінін і гістидин.

Використовуваний у даному описі термін "олігонуклеотид" означає олігомер або полімер рибонуклеїнової кислоти (РНК) або дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) або їх міметики. Цей термін також охоплює такі олігонуклеобази, які складаються із природних нуклеотидів, цукрів і ковалентних міжнуклеозидних (остов) зв'язків, а також олігонуклеотидів, які мають модифікації, що не зустрічаються в природі.

Використовуваний у даному описі термін "епітоп" означає ділянку на білку (наприклад, білку

МА5Р-2), з якою зв'язується антитіло. "Епітопи, що перекриваються" включають щонайменше один (наприклад, два, три, чотири, п'ять або шість) загальний амінокислотний залишок (залишки), включаючи лінійні і нелінійні епітопи.

Використовувані в даному описі терміни "поліпептид", "пептид" і "білок" є взаємозамінними і означають будь-який зв'язаний з пептидом ланцюг амінокислот, незалежно від довжини або посттрансляційної модифікації. Білок МА5БР-2, розкритий у даному описі, може містити або являти собою білок дикого типу або може являти собою варіант, який має не більше 50 (наприклад, не більше 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 або 50) консервативних амінокислотних замін. Консервативні заміни звичайно включають заміни в межах однієї з наступних груп: гліцин їі аланін; валін, ізолейцин і лейцин; аспарагінова кислота і глутамінова кислота; аспарагін, глутамін, серин і треонін; лізин, гістидин і аргінін; і фенілаланін і тирозин.

У деяких варіантах здійснення людський білок МАБР-2 може мати амінокислотну послідовність, яка є ідентичною на 70 95 або більше (наприклад, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 95) людському білку МАБР-2, що має амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО:5.

У деяких варіантах здійснення пептидні фрагменти можуть мати в довжину щонайменше 6 (наприклад, щонайменше 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 400, 450, 500 або 600 або більше) амінокислотних залишків (наприклад, щонайменше 6 суміжних амінокислотних залишків з ЗЕО ІЮ МО:5). У деяких варіантах здійснення антигенний пептидний фрагмент білка

МАБ5Р-2 людини має в довжину менше 500 (наприклад, менше 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 60 48, 47, Аб, 45, 44, 43, 42, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,

20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 або 6) амінокислотних залишків (наприклад, менше 500 суміжних амінокислотних залишків у будь-якому місці послідовності ЗЕО ІЮ МО:5).

Відсоток (95) ідентичності амінокислотної послідовності визначається як відсотковий вміст амінокислот у послідовності-кандидаті, які ідентичні амінокислотам у контрольній послідовності після вирівнювання послідовностей і введення зазорів (гепів), при необхідності, для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей. Вирівнювання з метою визначення відсотка ідентичності послідовностей може бути досягнуте різними способами, які знаходяться у межах компетенції фахівця в даній галузі, наприклад за допомогою загальнодоступного програмного забезпечення, такого як ВІАБТ, ВІГАБТ-2, АСОМ, АГІСМ-2 або Медаїїдн (ОМАЗТАК). Відповідні параметри для вимірювання вирівнювання, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання опо всій довжині порівнюваних послідовностей, можуть бути визначені відомими методами.

Використовуваний у даній заявці термін "приблизно" перед числовим значенням указує на це значення плюс або мінус 10 95 від зазначеного значення.

І. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Як розкрито в даному описі, автори винаходу визначили центральну роль лектинового шляху в ініціації і прогресуванні захворювання тубулярної патології нирок, що має на увазі ключову роль активації лектинового шляху в патофізіології широкого спектра ниркових захворювань, включаючи ІдА-нефропатію, СЗ-гломерулопатію і інші гломерулонефрити. У даному описі також зазначено, що автори даного винаходу відкрили, що інгібування мананзв'язувальної лектинасоційованої серинової протеази-2 (МА5Р-2), ключового регулятора лектинового шляху системи комплементу, значно зменшує запалення і фіброз у різних моделях тварин фіброзного захворювання, включаючи модель односторонньої обструкції сечоводу (ОО), модель передозування білка і модель фіброзу нирок при індукованій адріаміцином нефропатії. Таким чином, автори винаходу показали, що пригнічення МА5Р -2-опосередкованої активації лектинового шляху забезпечує ефективний терапевтичний підхід для полегшення, лікування або профілактики фіброзу нирок, наприклад тубулоінтерстиціального фіброзу, незалежно від основної причини.

Лектини (МВ, М-фіколін, Н-фіколін, І-фіколін ії СІ-11) є специфічними молекулами

Зо розпізнавання, які запускають систему комплементу по механізму реалізації вродженого імунітету, і така система включає лектиновий шлях ініціації і зв'язану з ним петлю посилення термінального шляху, яка підсилює ініційовану лектином активацію термінальних ефекторних молекул комплементу. С1д являє собою специфічну молекулу розпізнавання, яка запускає систему комплементу по механізму реалізації набутого імунітету, і така система включає класичний шлях ініціації і асоційовану з ним петлю посилення термінального шляху, яка підсилює С1д-ініційовану активацію термінальних ефекторних молекул комплементу. Автори посилаються на ці дві основні системи активації комплементу, такі як лектинзалежна система комплементу і С1д-залежна система комплементу, відповідно.

Додатково до своєї важливої ролі в імунному захисті система комплементу додає внесок в ураження тканин при багатьох клінічних станах. Таким чином, існує дуже нагальна потреба в розробці терапевтично ефективних інгібіторів комплементу для попередження розвитку цих побічних ефектів. Установлення факту можливості пригнічення МАЗР-2-опосередковуваного лектиного шляху, при цьому не зачіпаючи класичний шлях, забезпечує можливість для дуже бажаного специфічного пригнічення активації тільки системи комплементу, що викликає конкретну патологію, не пригнічуючи повністю здатність комплементу до імунного захисту. Так, наприклад, при патологічних станах, при яких активація комплементу опосередковується переважно лектинзалежною системою комплементу, переважним є специфічне пригнічення тільки цієї системи. Для регуляції процесингу імунного комплексу і для забезпечення захисту хазяїна від інфекції, система С1ід-залежної активації комплементу повинна залишатися незмінною.

Переважним білюювим компонентом для мішені при розробці терапевтичних агентів для специфічного пригнічення лектинзалежної системи комплементу є МАБР-2. Із усіх відомих білкових компонентів лектинзалежної системи комплементу (МВІ, Н-фіколіну, М-фіколіну, І- фіколіну, МАЗР-2, Сб2-С9, фактора В, фактора О і пропердину), тільки МА5Р-2 є унікальним і необхідним для функціонування цієї лектинзалежної системи комплементу. Лектини (МВ, Н- фіколін, М-фіколін, І -фіколін і СІ-11) також є унікальними компонентами лектинзалежної системи комплементу. Однак втрата будь-якого одного із цих лектинових компонентів необов'язково буде пригнічувати активацію цієї системи, що обумовлено надлишковою кількістю лектину. Для гарантії пригнічення активації лектинзалежної системи комплементу необхідно бо інгібувати всі п'ять лектинів. Крім того, оскільки відомо, що МВ і фіколіни також мають опсонінову активність, що не залежить від комплементу, то пригнічення функції лектину буде приводити до втрати цього цінного механізму захисту хазяїна від інфекції. На противагу цьому, така опсонінова активність лектину, що не залежить від комплементу, залишиться незачепленою, якщо мішенню для інгібування є МАБР-2. Інша перевага МА5БР-2 як терапевтичної мішені для пригнічення активації лектинзалежної системи комплементу полягає в тому, що концентрація МАБР-2 у плазмі, у порівнянні з будь-якими іншими білками комплементу, є найбільш низькою (500 нг/мл), і тому для повного пригнічення будуть достатніми низькі концентрації високоафінних інгібіторів МАБР-2 (МоїІег-Кіівіепзеп М. еї аї.,..

Іттипої. Меїйпоав, 282:159-167, 2003).

Як розкрито в прикладі 14 даного опису, на тваринній моделі фіброзної хвороби нирок (одностороння обструкція сечоводу ШОО) було визначено, що захворювання нирок у мишей, позбавлених гена МАБР-2 (МАБР-2-/-), виявилося в значно меншому ступені в порівнянні з контрольними тваринами дикого типу, про що свідчили запальні клітинні інфільтрати (зниження на 75 95) і гістологічні маркери фіброзу, такі як відкладення колагену (зменшення на одну третину). У прикладі 15 додатково показано, що миші дикого типу, яким системно вводили моноклональне анти-МАБР-2 антитіло, що вибірково блокує лектиновий шлях, залишаючи незачепленим класичний шлях, були захищені від фіброзу нирок у порівнянні з мишами дикого типу, яким вводили антитіло ізотипного контролю. Ці результати свідчать про те, що лектиновий шлях є ключовим фактором, що викликає захворювання нирок, і ще раз демонструють, що блокуючий лектиновий шлях інгібітор МА5Р-2, такий як анти-МА5Р-2 антитіло, є ефективним як антифіброзний агент. У прикладі 16 на моделі передозування білка додатково показано, що у мишей дикого типу, які одержували бичачий сироватковий альбумін (В5А), розвилася протеїнурична нефропатія, тоді як у МАБР-2-/- мишей, що одержували таку ж дозу ВЗА, ушкодження нирок виявилося в меншому ступені. У прикладі 17 показано, що миші дикого типу, яким системно вводили моноклональне анти-МА5Р-2 антитіло, що вибірково блокує лектиновий шлях, залишаючи незачепленим класичний шлях, були захищені від ушкодження нирок у моделі передозування білка. У прикладі 18 показано, що у МАЗР-2-/- мишей спостерігалося запалення нирок і тубулоінтерстиціальне ушкодження в індукованій адріаміцином нефрологічній моделі фіброзу нирок у меншому ступені в порівнянні з мишами дикого типу. У прикладі 19 показано,

Зо що у фазі 2 відкритого клінічного дослідження ниркових захворювань, що проводиться на даний момент, пацієнти з ІдДА-нефропатією, яким вводили анти-МА5Р-2 антитіло, до кінця лікування мали клінічно значиме і статистично достовірне зменшення співвідношення альбумін/креатинін у сечі (ШАСК) протягом усього дослідження, а також зменшення рівня білка в сечі, що збирається протягом 24-годин, у порівнянні з вихідним рівнем. У прикладі 19 також показано, що в тому ж дослідженні фази 2 у пацієнтів з мембранозною нефропатією, яким вводили анти-

МАБ5БР-2 антитіло, також спостерігалося зниження ЧАС під час лікування. У прикладі 20 показано, що фазі 2 відкритого дослідження нирок, що проводиться на даний час, наприкінці лікування у 4 з 5 пацієнтів з вовчаковим нефритом (ВН), яких лікували анти-МА5Р-2 антитілом, спостерігали клінічно значиме зменшення рівня білка в 24-годинному зборі сечі відносно вихідного рівня.

Відповідно до вищесказаного, даний винахід стосується застосування інгібуючих МА5БР-2 агентів, таких як інгібуючі МА5БР-2 антитіла, як антифіброзних агентів, застосування інгібуючих

МА5Р-2 агентів для виготовлення лікарського засобу для лікування фіброзного стану і способів профілактики, лікування, полегшення або купірування фіброзного стану у людини, що цього потребує, де зазначений спосіб включає введення зазначеному пацієнту ефективної кількості інгібуючого МА5Р-2 агента (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла).

Способи за винаходом можуть бути використані для профілактики, лікування, полегшення або купірування фіброзного стану у людини, що страждає будь-яким захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, включаючи захворювання нирок (наприклад, хронічне захворювання нирок, ІдА-нефропатія, СЗ-гломерулопатія і інші гломерулонефрити), легенів (наприклад, ідіопатичний фіброз легенів, кістозний фіброз, бронхоектаз), печінки (наприклад, цироз, неалкогольна жирова хвороба печінки), серця (наприклад, інфаркт міокарда, фіброз передсердь, фіброз клапанів, фіброз ендоміокарда), мозку (наприклад, інсульт), шкіри (наприклад, надмірне загоєння ран, склеродермія, системний склероз, келоїди), судинної системи (наприклад, атеросклеротичне судинне захворювання), кишечнику (наприклад, хвороба Крона), очей (наприклад, передня субкапсулярна катаракта, помутніння задньої капсули), структур м'яких тканин скелетно-м'язової системи (наприклад, клітинний капсуліт, контрактура Дюпюїтрена, мієлофіброз), репродуктивних органів (наприклад, ендометріоз, хвороба Пейроні) і деяких інфекційних захворювань (наприклад, альфа-вірус, бо гепатит С і гепатит В).

І. РОЛЬ МАБ5БР-2 ПРИ ЗАХВОРЮВАННЯХ І СТАНАХ, ВИКЛИКАНИХ АБО УСКЛАДНЕНИХ

ФІБРОЗОМ

Фіброз являє собою утворення або наявність надлишкової кількості сполучної тканини в органі або тканині, що утворюється як правило у відповідь на ушкодження або ураження.

Відмітною ознакою фіброзу є продукування надлишкового позаклітинного матриксу після ураження. У нирках фіброз характеризується як прогресуюче згубне відкладення сполучної тканини на паренхімі нирки, що неминучо приводить до зниження функції нирок незалежно від первинного захворювання нирок, яке викликає їх початкове ушкодження. Так званий епітеліально-мезенхімний перехід (ЕМТ), зміна клітинних характеристик, при якій канальцеві епітеліальні клітини трансформуються в мезенхімальні фібробласти, є основним механізмом фіброзу нирок. Фіброз уражує майже всі тканини і системи органів і може виникати як реакція відповіді у вигляді відновлення або заміщення на стимул, такий як ушкодження тканини або запалення. Нормальна фізіологічна відповідь на ушкодження приводить до накопичення сполучної тканини, але, якщо цей процес стає патологічним, заміна високодиференційованих клітин шляхом рубцювання сполучної тканини змінює структуру і функцію тканини. На клітинному рівні, епітеліальні клітини і фібробласти розмножуються і диференціюються в міофібробласти, приводячи до скорочення матриксу, збільшення ригідності, мікроваскулярної компресії і гіпоксії. На даний час відсутнє ефективне лікування або терапія фіброзу, але і звіти досліджень на тваринах, і епізодичні звіти по лікуванню людей говорять про те, що фіброзні ураження тканин можуть бути купірувані (Татре апа 7еїзрегуд, Маї. Кему. Мерпгої., Мої. 10:226- 237, 2014).

Багато які захворювання є результатом фіброзу, який викликає прогресування органної недостатності, включаючи захворювання нирок (наприклад, хронічне захворювання нирок, ІдА- нефропатія, СЗ-гломерулопатія і інші гломерулонефрити), легенів (наприклад, ідіопатичний фіброз легенів, кістозний фіброз, бронхоектаз), печінки (наприклад, цироз, неалкогольна жирова хвороба печінки), серця (наприклад, інфаркт міокарда, фіброз передсердь, фіброз клапанів, фіброз ендоміокарда), мозку (наприклад, інсульт), шкіри (наприклад, надмірне загоєння ран, склеродермія, системний склероз, келоїди), судинної системи (наприклад, атеросклеротичне судинне захворювання), кишечнику (наприклад, хвороба Крона), очей (наприклад, передня

Зо субкапсулярна катаракта, помутніння задньої капсули), структур м'яких тканин скелетно- м'язової системи (наприклад, клітинний капсуліт, контрактура Дюпюїтрена, мієлофіброз), репродуктивних органів (наприклад, ендометріоз, хвороба Пейроні) і деяких інфекційних захворювань (наприклад, альфа-вірус, гепатит С і гепатит В і т. д.).

Хоча фіброз виникає в багатьох тканинах і при багатьох захворюваннях, у його патології існують загальні молекулярні і клітинні механізми. Відкладення позаклітинного матриксу фібробластами супроводжується інфільтратами імунних клітин, переважно мононуклеарних клітин (див. МУупп Т., Маї. Кеум. Іттипої. 4(8):583-594, 2004, включений у даний опис у вигляді посилання). Активна запальна відповідь приводить до експресії факторів росту (ТОЕДВ, МЕСБЕ, фактора росту гепатоцитів, фактора росту сполучної тканини), цитокінів і гормонів (ендотеліну,

І. -4, 1-6, 1-13, хемокінів), ферментів деструкції (еластази, матриксних металопротеїназ, катепсинів) і білків позаклітинного матриксу (колагенів, фібронектину, інтегринів).

Крім того, система комплементу стає активною при численних фіброзних захворюваннях.

Компоненти комплементу, включаючи мембраноатакуючий комплекс, були ідентифіковані в численних зразках фіброзної тканини. Наприклад, компоненти лектинового шляху були виявлені при фіброзних ураженнях нирок (Заотига еї а!., Мерпгоп., 92(3):702-4 (2002), Заю евї а!., І ирив, 29(13):1378-86 (2011), ім еї аї., Сіпй. Ехр. Іттипої., 174(1):152-60 (2013)); захворюваннях печінки (Кепзеп еї аї., Нерайюіоду, 50(6):1809-17 (2009)); і хворобі легенів (ОіІезеп еї аї., Сііп.

Іттипої. 121(3):324-31 (2006)).

Було встановлено, що надмірна активація системи комплементу є одним із ключових факторів розвитку опосередкованого імунним комплексом, а також антитілонезалежного, гломерулонефриту. Проте існують переконливі свідчення того, що неконтрольована активація комплементу /л7 5йи пов'язана з патофізіологічним прогресуванням ТІ фіброзу при негломерулярному захворюванні (Сцідд К.9., у. Іттипої. 171:3319-3324, 2003, МаїкК А. еї аї.,

Зетіп Мерпгої. 33:575-585, 2013, Маїйегтп О.Н. еї аї., Сіїп. У. Ат. ос. Мерйгої. 10:Р1636-1650, 2015). Сильні прозапальні сигнали, викликані локальною активацією комплементу, можуть бути ініційовані компонентами комплементу, що потрапляють шляхом фільтрації в проксимальні канальці і надалі в інтерстиціальний простір, або аномальним синтезом компонентів комплементу канальцевими або іншими резидентними і інфільтруючими клітинами, або зміненою експресією регуляторних білків комплементу в клітинах нирок, або відсутністю або бо втратою, або збільшенням функціональних мутацій у регуляторних компонентах комплементу

(Маїнет О.В. еї аї., Сіп. У. Ат. ос. Мернгої. 10:Р1636-1650, 2015, Зпеегіп М.5. єї а!., ЕАБЕВ .. 22:1065-1072, 2008). Наприклад, у мишей дефіцит регуляторного білка/гена (Сітгу), пов'язаного з регуляторним білком комплементу СК!, приводить до активації комплементу по типу тубулоінтерстиціального (ТІ) ушкодження з наступним запаленням і фіброзом, характерним для ушкодження, спостережуваного при ТІ захворюваннях людини (Маїк А. еї аї., Зетіп Мернпгої. 33:575-585, 2013, Вао І. єї аІ., 9). Ат. бос. МерпгоіЇ. 18:811-822, 2007). Вплив канальцевих епітеліальних клітин на анафілатоксин СЗа приводить до епітеліально-мезенхімного переходу (Твапа 7. єї а. У. Ат. бос. МерпгоїЇ. 20:593-603, 2009). Нещодавно було показано, що блокування передачі сигналу СЗа тільки через СЗа-рецептор зменшує ТІ фіброз нирок у тварин із протеїнуричними і непротеїнуричними захворюваннями (Тзапа 2. еї аї., 9. Ат. ос. Мернпгої. 20:593-603, 2009, Вао І. еї аї., Кідпеу Іпї. 80:524-534, 2011).

Як розкрито в даному описі, автори винаходу визначили центральну роль лектинового шляху в ініціації і прогресуванні тубулярної патології нирок, що має на увазі ключову роль активації лектинового шляху в патофізіології широкого спектра захворювань нирок, включаючи

ІДА-нефропатію, СЗ-гломерулопатію і інші гломерулонефрити (Епао М. еї аї!., Мерпгої. Оіаїувів

Тгапзріапі, 13:1984-1990, 1998; Нізапо 5. еї а!., Ат. У. Кідпеу Рів. 45:295-302, 2005; Вооз А. єї аІ., у. Ат. бос. Мернго!. 17:1724-1734, 2006; Пи | .Ї... еї аї., СіІіп. Ехр. Іттипої. 174:152-160, 2013;

Ї пона К. еї аї., Ткапзріапі Мернгої. Оівувів, 14:881-886, 1999; РісКетгіпод еї аї., Кідпеу Іпіегпайопаї, 84:1079-1089, 2013), діабетичну нефропатію (Номіпа Р. еї аї., Оіабесе5, 54:1523-1527, 2005), ішемічне реперфузійне ураження (Аздагі Е. еї аІ., РЕАБЕВ у. 28:3996-4003, 2014) і відторгнення трансплантата (Вегдег 5. Р. еї аї., Ат. 9. Тгапзріапі. 5:1361-1366, 2005).

Як додатково показано в даному описі, автори винаходу продемонстрували, що пригнічення

МАБР-2 зменшує запалення і фіброз у мишачих моделях тубулоінтерстиціального захворювання. Тому передбачається, що інгібуючі МА5Р-2 агенти будуть корисні при лікуванні фіброзу нирок, включаючи тубулоіїнтерстиціальне запалення і фіброз, протеїнурію, ІдА- нефропатію, СЗ-гломерулопатію і інші гломерулонефрити і ішемічні реперфузійні ураження нирок.

Ниркові захворювання і розлади

За даними Національного ниркового фонду 26 мільйонів дорослих американців страждають

Зо хронічним захворюванням нирок (ХЗН). Більшість пацієнтів мають прогресуюче захворювання, що приводить до ниркової недостатності, яка вимагає лікування препаратами, що стимулюють еритропоез, діалізу або трансплантації нирки для виживання. Існує декілька препаратів, які можуть лікувати основний симптом ХЗН, гіпертонію, але на даний час немає ліків, які усувають його першопричину.

Дослідження показали, що прогресуюче ушкодження нирок викликане капілярною гіпертензією в підструктурах нирки, відомих як нефрони (МУпімогій У.А., Аппаї!5. Асад. ої Меа., мої. 34(1):2005). Оскільки нефрони (фільтруючі одиниці нирок) ушкоджуються або руйнуються в цьому процесі, виникає запалення і відбувається рубцювання тканини, що приводить до заміни нефронів нефункціональною рубцевою тканиною. У результаті здатність нирки фільтрувати кров знижується з перебігом часу. Це називається фіброзом нирок, який є загальним процесом прогресуючого захворювання нирок. Незалежно від характеру початкового ураження, фіброз нирок вважається загальним кінцевим процесом, по якому захворювання нирок прогресує до термінальної стадії ниркової недостатності. Ослаблення фіброзу нирок можна визначити за одним або більше з наступних параметрів: оцінка інтерстиціального об'єму, відкладення колагену ІМ і/або рівні мРНК, що містить гени, які контролюють ріст сполучної тканини. Сполуки і способи, описані в даній заявці, корисні в лікуванні фіброзу нирок.

Фіброз і запалення нирок є характерними ознаками пізньої стадії захворювання нирок практично будь-якої етіології (див. Воог еї аї., Воог Р. еї аї., У. ої Ат. бос. Мерпгоіоду, 18:1508- 1515, 2007; ї Спемаїіег еї аї., Кідпеу Іпегаїйопаї, 75:1145-1152, 2009). Ниркова недостатність може бути викликана гетерогенною групою розладів. Прогресивна дисфункція нирок приводить до протеїнурії і ниркової недостатності. Оскільки стан здоров'я пацієнта погіршується, може знадобитися діаліз просто для запобігання ушкодженню нирок і попередження багатосистемної недостатності. З перебігом часу ураження нирок і ниркова недостатність можуть прогресувати до термінальної стадії ниркової недостатності (ТОНН), яка є повною або майже повною, безповоротною втратою функції нирок. Залежно від форми захворювання нирок функція нирок може бути втрачена протягом декількох днів або тижнів або може повільно і поступово погіршуватися протягом десятиліть. Після того, як захворювання пацієнта прогресувало до

ТСНН, для запобігання смерті пацієнта потрібен діаліз (гемодіаліз або перитонеальний діаліз).

Пацієнтів необхідно підтримувати в деякій формі діалізного режиму або надати нирковий бо трансплантат.

Компоненти лектинового шляху були виявлені при фіброзних ураженнях при ниркових захворюваннях (Заїотига еї аї., Мерпгоп., 92(3):702-4 (2002), Заю еї а!., Гирив, 20(13):1378-86 (2011), Ци еї аї., Сіп. Ехр. Іттипої., 174(1):152-60 (2013)). При ІдА-нефропатії у пацієнтів з гломерулярним відкладенням МВІі спостерігалася більш виражена протеїнурія, знижена функція нирок, більш низькі рівні сироваткового альбуміну, більш важка гістологія і підвищений артеріальний тиск у порівнянні з пацієнтами без відкладення МВІ. (І ім еї аї., Сііп Ехр Іттипої. (1):1152-60). У пацієнтів з вовчаковим нефритом (За еї аІ., Гири5, 20(13):1378-86, 2011) і хронічною нирковою недостатністю (Зайотига еї аїЇ., Мерпгоп 92(3):702-4, 2002) також спостерігали підвищені рівні МВІ. і активність лектинового шляху.

Було також продемонстровано, що дефіцит С5 приводить до значного ослаблення основних компонентів фіброзу нирок у непротеїнуричній моделі первинного тубулоінтерстиціального ураження, а саме односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) (Воог Р. еї аї., 9. ої Ат. Боб. ої

Мерпгоїоду, 18:1508-1515, 2007). Також є повідомлення про збільшену експресію гена С3 у мишей дикого типу після ШОО і значне зменшення відкладень колагену у С3-/- мишей після ШО у порівнянні з мишами дикого типу, що вказує на роль активації комплементу при фіброзі нирок (Геат еї аї., Мої. Іттипої. 48:1666-1733, 2011: Арзігас). Однак до описаного в даній заявці відкриття авторами даного винаходу, компоненти комплементу, що беруть участь у фіброзі нирок, не були чітко визначені. Як описано в прикладах 14-17 даної заявки, автори даного винаходу несподівано визначили, що дефіцит МАБР-2 або блокада інгібуючим МАБР-2 антитілом, яке вибірково блокує лектиновий шлях, не зачіпаючи класичний шлях, явно забезпечує захист мишей від фіброзу нирок на різних тваринних моделях захворювання нирок.

Відповідно, у деяких варіантах здійснення надається спосіб пригнічення фіброзу нирок у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом нирок, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як анти-

МА5БР-2 антитіло, суб'єкту, що потребує цього. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МАБР-2, ефективну для пригнічення фіброзу нирок у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом нирок, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад

Зо шляхом локального нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інгаляційно, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю над цим станом.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, придатними для першопричинного захворювання або стану нирок. У деяких варіантах здійснення інгібуючі

МА5Р-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла) вводять у комбінації з режимом діалізу або плазмаферезу. У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р- 2 антитіла) використовуються для зменшення частоти необхідного діалізу або плазмаферезу. У деяких інших варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла) використовуються в комбінації з трансплантацією нирки. У деяких інших варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла) використовуються для здійснення контролю над нирковою недостатністю і запобігання подальшому погіршенню функції нирок у пацієнтів, що очікують трансплантації нирок.

Як приклад, у деяких варіантах здійснення анти-МА5бР-2 антитіла використовуються для пригнічення фіброзу нирок і, таким чином, лікування або полегшення (включаючи лікування або полегшення симптомів захворювання) гломерулярних захворювань, таких як фокальний сегментарний гломерулосклероз і нефротичний синдром. Прикладами симптомів, які можна лікувати, є, крім іншого, гіпертензія, протеїнурія, гіперліпідемія, гематурія і гіперхолестеринемія.

У деяких варіантах здійснення інгібуючий МАБР-2 агент пригнічує тубулоінтерстиціальний фіброз. У деяких варіантах здійснення лікування включає поліпшення функції нирок, зменшення протеїнурії, поліпшення стану при гіпертонії і/або зменшення фіброзу нирок. У деяких варіантах здійснення лікування включає (ї) затримання або профілактику прогресування ниркової недостатності, згасання функції нирок або розвитку ТСНН; (ії) затримання, зменшення частоти або усунення необхідності в діалізі; або (ії) затримання або усунення необхідності в трансплантації нирок. бо Нижче описані деякі специфічні захворювання і розлади нирок, викликані або ускладнені фіброзом і/або запаленням.

У деяких варіантах здійснення захворювання нирок, викликане або ускладнене фіброзом і/або запаленням, являє собою гломерулярне захворювання, таке як фокальний сегментарний гломерулосклероз (Е5055). Гломерулярні захворювання уражують клубочки, дозволяючи білкам, а іноді і червоним кров'яним клітинам, проникати в сечу. Іноді гломерулярне захворювання також перешкоджає ниркам здійснювати очищення від продуктів життєдіяльності, тому вони починають накопичуватися в крові. Симптоми гломерулярного захворювання включають протеїнурію, гематурію, зниження швидкості клубочкової фільтрації, гіпопротеїнемію і набряки. Декілька різних захворювань можуть привести до розвитку гломерулярного захворювання. Це може бути прямим результатом інфекції або приймання ліків, токсичних для нирок, або результатом захворювання, яке уражує весь організм, такого як гіпертонія, діабет або вовчак. ТОНН є одним із гломерулярних захворювань, але навіть цей особливий стан, що характеризується рубцюванням у нирках, може мати множину причин. У пацієнтів з ТОНН, як правило, термінальна стадія ниркової недостатності досягається протягом 5-20 років, хоча пацієнти з агресивними формами захворювання досягають ТОНН через 2-3 роки.

У деяких варіантах здійснення захворювання нирок, викликане або ускладнене фіброзом і/або запаленням, являє собою діабетичну нефропатію (ДН), яка належить до сфери медицини, що вимагає негайних рішень. Діабетична нефропатія - це захворювання нирок або порушення функції нирок, яке ускладнене діабетом. Стан погіршується високим кров'яним тиском, високим рівнем цукру в крові і високим рівнем холестерину і ліпідів. Точна причина діабетичної нефропатії невідома. Однак, не обмежуючись конкретною теорією, передбачається, що неконтрольований високий рівень цукру в крові призводить до ураження нирок, такого як фіброз і рубцювання тканини. У людей ДН проявляється у вигляді клінічного синдрому, який складається з альбумінурії, поступово знижуваної швидкості клубочкової фільтрації (СЕК) і підвищеного ризику серцево-судинних захворювань. Діабетична альбумінурія пов'язана з розвитком характерних гістопатологічних ознак, включаючи стовщення клубочкової базальної мембрани (КБМ) і експансію мезангіального матриксу. У міру розвитку альбумінурії і ниркової недостатності розвиваються гломерулосклероз, артеріолярний гіаліноз і тубулоінтерстиціальний фіброз.

Відповідно, в одному з варіантів здійснення в даному розкритті надаються способи лікування діабетичної нефропатії, які включають введення ефективної кількості інгібуючого

МА5Р-2 агента (наприклад, інгібуючого МАЗР-2 антитіла) суб'єкту, що потребує цього. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення одного або більше симптомів діабетичної нефропатії. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення, уповільнення або усунення необхідності в діалізі. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення, уповільнення або усунення необхідності в трансплантації нирок. У деяких варіантах здійснення лікування включає затримання, профілактику або купірування прогресування діабетичної нефропатії до згасання функції нирок або термінальної стадії ниркової недостатності.

У деяких варіантах здійснення захворювання нирок, викликане або ускладнене фіброзом або запаленням, являє собою вовчаковий нефрит. Згідно з докладним описом, наведеним нижче, вовчаковий нефрит, який є серйозним ускладненням системного червоного вовчака (СЧВ), є ще одним прикладом фіброзу нирок, який можна лікувати інгібуючими МА5БР-2 агентами (наприклад, анти-МА5Р-2 антитілами).

Відповідно, в одному з варіантів здійснення дане розкриття включає способи пригнічення фіброзу нирок у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом нирок, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, які включають введення ефективної кількості інгібуючого МАБР-2 агента (наприклад, інгібуючого МАБР-2 антитіла). У деяких варіантах здійснення захворювання або розлад нирок, ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з хронічного захворювання нирок, хронічної ниркової недостатності, гломерулярного захворювання (наприклад, фокального сегментарного гломерулосклерозу), імунного комплексного розладу (наприклад, ІдА-нефропатії, мембранозної нефропатії), вовчакового нефриту, нефротичного синдрому, діабетичної нефропатії, тубулоінтерстиціального ураження і СЗ-гломерулопатії або інших типів гломерулонефриту.

Способи профілактики або лікування ушкодження нирок, викликаного індукованою ліками токсичністю

Інша причина ушкодження нирок включає індуковану ліками токсичність. Наприклад, нефротоксини можуть виявляти безпосередню токсичну дію на канальцеві епітеліальні клітини.

Як розкрито в даному описі, автори винаходу продемонстрували, що миші з дефіцитом МА5Р-2 захищені від індукованої адріаміцином нефропатії. бо Нефротоксини включають, без обмеження, терапевтичні лікарські речовини (наприклад,

цисплатин, гентаміцин, цефалоридин, циклоспорин, амфотерицин, адріаміцин), радіоконтрастний барвник, пестициди (наприклад, паракват) і речовини, що забруднюють навколишнє середовище (наприклад, трихлоретилен і дихлорацетилен). Інші приклади включають пуроміцин-амінонуклеозид (РАМ); аміноглікозиди, такі як гентаміцин; цефалоспорини, такі як цефалоридин; інгібітори кальциневрину, такі як такролімус або сиролімус. Індукована ліками нефротоксичність також може бути викликана нестероїдними протизапальними засобами, антиретровірусними препаратами, антицитокінами, імунодепресантами, онкологічними препаратами або інгібіторами АПФ. Крім того, індукована ліками нефротоксичність може бути викликана зловживанням нальгезином, ципрофлоксацином, клопідогрелем, кокаїном, інгібіторами сох-2, діуретиками, фоскаметом, золотом, іфосфамідом, імуноглобіном, китайськими травами, інтерфероном, літієм, манітолом, мезаламіном, мітоміцином, нітрозосечовиною, пеніциламіном, пеніциліном, пентамідином, хініном, рифампіном, стрептозоцином, сульфонамідами, тиклопідином, триамтереном, вальпроєвою кислотою, доксорубіцином, гліцерином, цидофовіром, тобраміцином, неоміцинсульфатом, колістиметатом, ванкоміцином, амікацином, цефотаксимом, цисплатином, ацикловіром, літієм, інтерлейкіном-2, циклоспорином або індинавіром.

Відповідно, в одному з варіантів здійснення суб'єкт, що має ризику розвитку або страждає ушкодженням нирок, може одержувати один або більше терапевтичних препаратів, які виявляють нефротоксичну дію. Цим суб'єктам можна вводити інгібітори МА5Р-2 за винаходом до або одночасно з такими терапевтичними агентами. Аналогічно, інгібітори МАБР-2 можна вводити після введення терапевтичного агента для лікування або зниження ймовірності розвитку нефротоксичності.

Захворювання і стани, асоційовані з протеїнурією

Установлено, що порушення клубочкової фільтрації білка приводить до протеїнурії і прискорює прогресуючу втрату нефронів, яка відбувається при всіх хронічних ниркових захворюваннях (Кетил7лі апа Вегпапі, Мем Епд. У. Мей., мої. 339(20):11448-1456, 1998).

Наприклад, у дослідженні, описаному Еаду еї аї., Ат. У). Раїйої. 135:719-33, 1989, гломерулярна фільтрація альбуміну незмінно супроводжувалася розвитком інтерстиціальних уражень і рубцюванням. Едау еї аїЇ., 1989, також відзначили, що відкладення комплементу СЗ3 на

Зо люмінальній поверхні проксимальних канальців спостерігалося у щурів з нефропатією, викликаною передозуванням білка, що вказує на те, що компоненти системи комплементу, фільтровані в гломерулах, можуть викликати інтерстиціальні ушкодження. Було продемонстровано, що виснаження комплементу або відсутність Сб полегшувало тубулоінтерстиціальне ушкодження в протеїнуричних моделях тварин, таких як мезангіопроліферативний гломерулонефрит, адріаміцинова нефропатія, 5/6 нефректомія і пуроміцин-амінонуклеозидний нефроз (Воог еї аї., Еї аї!., У. ої Ат. ос. ої Мерпгоїоду: У9АЗМ, 18:11508-1515, 2007). Дослідження на людях показали, що протеїнурія є незалежним прогностичним фактором прогресування хронічного захворювання нирок, і що зменшення протеїнурії є нирково-захисним (Киддепепії Р. єї а!., У. Ат. ос. Мернгої. 23:1917-1928, 2012).

Відповідно, в одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів профілактики або зменшення протеїнурії і/або профілактики або зменшення ураження нирок у суб'єкта, що страждає захворюванням або станом, асоційованим із протеїнурією, які включають введення кількості інгібуючого МА5Р-2 агента (наприклад, інгібуючого МА5Р-2 антитіла), ефективної для зменшення або профілактики протеїнурії у суб'єкта В одному з варіантів здійснення захворювання або стан, асоційований з протеїнурією, вибирають із групи, що складається з нефротичного синдрому, прееклампсії, еклампсії, токсичного ураження нирок, амілоїдозу, судинно-колагенозних захворювань (наприклад, системного червоного вовчака), зневоднювання, гломерулярних захворювань (наприклад, мембранозного гломерулонефриту, фокального сегментарного гломерулонефриту, СЗ3-гломерулопатії, хвороби мінімальних змін, ліпоїдного нефрозу), інтенсивного фізичного навантаження, стресу, доброякісної ортостатичної (постуральної) протеїнурії, фокального сегментарного гломерулосклерозу, ІдА-нефропатії (наприклад, хвороби Бергера), ІчМ-нефропатії, мембранопроліферативного гломерулонефриту, мембранозної нефропатії, хвороби мінімальних змін, саркоїдозу, синдрому Альпорта, цукрового діабету (діабетичної нефропатії), індукованої ліками токсичності (наприклад, індукованої НПЗП, нікотином, пеніциламіном, карбонатом літію, золотом і іншими важкими металами, інгібіторами

АПФ, антибіотиками (наприклад, адріаміцином) або опіатами (наприклад, героїном)); хвороби

Фабрі, інфекції (наприклад, ВІЛ, сифілісу, гепатиту А, В або С, постстрептококової інфекції, сечового шистосомозу); аміноацидурії, синдрому Фанконі, гіпертонічного нефросклерозу, інтерстиціального нефриту, серпоподібноклітинної хвороби, гемоглобінурії, множинної мієломи, бо міоглобінурії, відторгнення органів (наприклад, відторгнення трансплантата нирки), геморагічної пропасниці Ебола, синдрому нігтьової патели, сімейної пропасниці, синдрому НЕЇ Р, системного червоного вовчака, гранулематозу Вегенера, ревматоїдного артриту, хвороби накопичення глікогену типу 1, синдрому Гудпасчера, пурпури Шенлейна-Геноха, інфекції сечових шляхів, що поширилася на нирки, синдрому Шегрена і постінфекційного гломерулонефриту.

Захворювання печінки

Фіброз печінки, також називаний печінковим фіброзом, обумовлений накопиченням рубцевої тканини в печінці і є характерним для більшості видів захворювань печінки. Заміна здорової тканини печінки рубцевою тканиною знижує здатність печінки функціонувати належним чином.

Якщо стан, що викликає рубцювання, не лікується, фіброз печінки може прогресувати до цирозу печінки і повної печінкової недостатності, небезпечного для життя стану. Основними причинами фіброзу печінки є зловживання алкоголем, хронічна інфекція вірусу гепатиту С, неалкогольний стеатогепатит і гепатотоксичність (наприклад, індуковане ліками ушкодження печінки, викликане ацетамінофеном або іншим лікарським засобом).

Компоненти лектинового шляху були виявлені при фіброзних ураженнях печінки (Кепзеп еї а!., Нераїюіоду, 50(6):1809-17 (2009)). Наприклад, при неалкогольному стеатогепатиті (також відомому як жирове захворювання печінки) широко розповсюджена активація білків системи комплементу, і їх експресія пов'язана з тяжкістю захворювання (Кепзеп еї аї., Нераф!оду, 50(6):1809-17 (2009), причому, крім відкладень СЗ і СУ, було виявлене накопичення МВІ., що підтверджує активацію лектинового шляху.

Відповідно, у деяких варіантах здійснення надається спосіб пригнічення печінкового фіброзу у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом печінки, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого

МА5БР-2 агента, такого як інгібуюче МА5Р-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МА5БР-2, ефективну для пригнічення печінкового фіброзу у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом печінки, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або

Зо безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного захворювання або стану печінки.

У деяких варіантах здійснення захворювання або розлад печінки, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з: цирозу, неалкогольної жирової хвороби печінки (стеатогепатиту), фіброзу печінки, вторинного відносно зловживання алкоголем, фіброзу печінки, вторинного відносно гострого або хронічного гепатиту, біліарного захворювання і токсичного ураження печінки (наприклад, гепатотоксичності в результаті індукованого ліками ушкодження печінки, викликаного ацетамінофеном або іншим лікарським засобом).

Захворювання легенів

Легеневий фіброз - це утворення або розвиток надлишкової волокнистої сполучної тканини в легенях, при цьому нормальна легенева тканина замінюється фіброзною тканиною. Це рубцювання приводить до ригідності легенів і порушення структури і функції легенів.

Вважається, що у людей фіброз легенів є результатом багаторазового ушкодження тканини усередині крихітних повітряних мішечків (альвеол) у легенях і між ними. В експериментальних дослідженнях аспекти захворювання людини були відтворені на різних моделях тварин.

Наприклад, чужорідний агент, такий як блеоміцин, ізотіоціанат флуоресцеїну, оксид кремнію або азбест, може бути введений у трахею тварини (СПпагаєе-Кептапі єї аЇ., Апіта! Моадеї5 ої

Риїтопагу Рібгозі5. Меїподз Мої. Меа., 2005, 117:251-259).

Відповідно, у деяких варіантах здійснення надається спосіб пригнічення легеневого фіброзу у суб'єкта, що страждає легеневим захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого

МА5БР-2 агента, такого як інгібуюче МА5БР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, бо яка містить кількість інгібітору МАБР-2, ефективну для пригнічення легеневого фіброзу,

зменшення фіброзу в легенях і/або поліпшення функції легенів. Поліпшення симптомів функції легенів включає поліпшення функції і/або ємності легенів, зниження утоми і поліпшення насичення киснем.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується способу лікування, пригнічення, профілактики або полегшення легеневого фіброзу у суб'єкта, що страждає кістозним фіброзом, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МАБР-2 агента, такого як інгібуюче МАБ5БР-2 антитіло.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, придатними для першопричинного захворювання або стану легенів.

Нижче описані деякі специфічні легеневі захворювання і розлади, викликані або ускладнені фіброзом і/або запаленням.

У деяких варіантах здійснення захворювання легенів, викликане або ускладнене фіброзом або запаленням, являє собою хронічну обструктивну хворобу легенів (ХОХЛ). ХОХЛ - це захворювання, при якому стінки дихальних шляхів є фіброзними 3 накопиченням міофібробластів і колагену, і воно є основною причиною інвалідності і четвертою основною причиною смертності в Сполучених Штатах. При ХОХЛ блокується повітряний потік і ускладнюється дихання хворого. ХОХЛ викликається ушкодженням дихальних шляхів, яке в остаточному підсумку перешкоджає обміну кисню і вуглекислого газу в легенях. ХОХЛ включає хронічний обструктивний бронхіт і емфізему і часто і те, і інше. Пацієнти з ХОХЛ, легені яких вже ушкоджені, і функція легенів уже порушена, мають підвищений ризик ускладнень, пов'язаних з

Зо бактеріальними і вірусними інфекціями.

Відповідно, в одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів лікування хронічної обструктивної хвороби легенів (ХОХЛ), які включають введення суб'єкту, що цього потребує, кількості інгібуючого МАЗР-2 агента (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла), ефективної для пригнічення і/або зменшення фіброзу легені. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення одного або декількох симптомів ХОХЛ. Симптоми ХОХЛ і/або фіброзу легенів включають, без обмеження, кашель зі слизом, задишку (диспноє), яка може погіршуватися при помірній активності, утому, часті респіраторні інфекції, хрип, здавленість у грудях, нерегулярні серцеві скорочення (аритмію), потребу в дихальному апараті і кисневій терапії правосторонню серцеву недостатність або пульмонію (набряк серця і серцеву недостатність через хронічне захворювання легенів), пневмонію, пневмоторакс, серйозну втрату маси тіла і неналежне харчування. Симптоми також включають зниження функції легенів, згідно з оцінками, одержаними в результаті тестування з використанням одного або більше стандартних тестів функції легенів.

У деяких варіантах здійснення хвороба легенів, викликана або ускладнена фіброзом і/або запаленням, являє собою фіброз легенів, асоційований зі склеродермією. Як більш докладно описано нижче, легеневий фіброз, асоційований зі склеродермією, є ще одним прикладом фіброзу легенів, який можна лікувати інгібіторами МА5БР-2 (наприклад, інгібуючими МАБР-2 антитілами).

У деяких варіантах здійснення захворювання легенів або порушення функції легенів, викликане або ускладнене фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з хронічної обструктивної хвороби легенів, кістозного фіброзу, фіброзу легенів, асоційованого зі склеродермією, бронхоектазу і легеневої гіпертензії.

Серцево-судинні захворювання

Причиною ряду різних серцево-судинних патологій є загальний фіброзний процес. Надмірне відкладення фіброзної тканини в серці приводить до серцевої патології, при якій продукування білків позаклітинного матриксу змінює структуру, архітектуру, форму серця і впливає на його скорочувальну функцію (Кпап апа зперрага, Іттипоїіоду, 118:10-24, 2006).

Дослідження показують, що фіброз може значною мірою сприяти серцевій дисфункції при ішемічній, дилатаційній і гіпертрофічній кардіоміопатії. Наприклад, було показано, що у пацієнтів бо з хронічною фібриляцією передсердь були виявлені більш високі рівні інтерстиціального фіброзу міокарда в порівнянні з контролем (Кпап апа Зперрага, Іттипоїіоду, 118:10-24, 2006).

Як інший приклад було встановлено, що в більшості випадків аритмогенної кардіоміопатії правого шлуночка (АКПШ) у США спостерігається інфільтрація жиру і рубцювання (фіброжирова

АКПШ) (ВигКе еї аї., Сігсшіацоп, 97:1571-1580, 1998). У дослідженні, у якому вивчали гістопатологічні характеристики міокарда шлуночків у людей з АКПШ, було встановлено, що великий фіброз був присутній у зразках біопсії у пацієнтів дитячого віку з АКПШ (Міхпікама Т. еї а!І., Сагдіомазсшаг Раїпоіоду, мої. 8(4):185-189, 1999).

Відповідно, у деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає серцевим або судинним захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5БР-2 агента, такого як інгібуюче МА5БР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МАБР-2, ефективну для пригнічення серцевого і/або судинного фіброзу і/або поліпшення серцевої і/або судинної функції.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується способу лікування, пригнічення, профілактики або ослаблення фіброзу у суб'єкта, що страждає фіброзом клапана, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче МАБР-2 антитіло.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МА5БР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, придатними для першопричинного серцевого або судинного захворювання або стану.

Зо У деяких варіантах здійснення серцеве або судинне захворювання або розлад, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з: серцевого фіброзу, інфаркту міокарда, фіброзу передсердь, фіброзу ендоміокарда, аритмогенної кардіоміопатії правого шлуночка (АКПШ), судинного захворювання, атеросклеротичного судинного захворювання, судинного стенозу, рестенозу, васкуліту, флебіту, тромбозу глибоких вен і аневризми черевної аорти.

Хронічні інфекційні захворювання

Хронічні інфекційні захворювання, такі як гепатит С і гепатит В, викликають запалення тканин і фіброз, а висока активність лектинового шляху може бути шкідливою. При таких захворюваннях інгібітори МА5БР-2 можуть бути корисними. Наприклад, було виявлено, що рівні

МВІ. ї МА5Р-1 є важливими прогностичними параметрами тяжкості фіброзу печінки при інфекції вірусу гепатиту С (Вгом/п еї аї., Сііп. Ехр. Іттипої., 147(1):90-8, 2007, Заадапау еї аї., Агар. 3.

Савзігоепієгої. 12(2):68-73, 2011; Заеєай еї аї., Сіп. Ехр. Іттипої. 174(2):265-73, 2013). Раніше було показано, що МА5БР-1 є потужним активатором МА5Р-2 і лектинового шляху (Медуєгі еї аї.,

У. Віої. Спет., 29:288(13):8922-34, 2013). Альфавіруси, такі як вірус чикунгунья і вірус Росс-

Рівер, викликають сильну запальну відповідь у хазяїна, що приводить до артриту і міозиту, і ця патологія опосередковується МВІ. і активацією лектинового шляху (Сипп еї аї., Ріо5. Раїпод. 8(3):е1002586, 2012).

Відповідно, у деяких варіант здійснення розкриття надає спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає або раніше переніс хронічне інфекційне захворювання, яке викликає запалення і/або фіброз, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче

МА5Р-2 антитіло.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, 60 до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного хронічного інфекційного захворювання.

У деяких варіантах здійснення хронічне інфекційне захворювання, яке викликає запалення мМабо фіброз, вибирають з групи, що складається з: альфа-вірусу, гепатиту А, гепатиту В, гепатиту С, туберкульозу, ВІЛ і грипу.

Аутоїмунні захворювання

Склеродермія - хронічне аутоїмунне захворювання, що характеризується фіброзом, судинними змінами і аутоантитілами. Існують дві основні форми: обмежена системна склеродермія і дифузійна системна склеродермія. Шкірні симптоми обмеженої системної склеродермії уражують руки, плечі і обличчя. Пацієнти з цією формою склеродермії часто мають одне або декілька з наступних ускладнень: кальциноз, феномен Рейно, дисфункцію стравоходу, склеродактилія і телеангіектазії. Дифузійна системна склеродермія швидко прогресує і зачіпає велику область шкіри і один або більше внутрішніх органів, часто нирки, стравохід, серце і/або легені.

Склеродермія уражує невеликі кровоносні судини, відомі як артеріоли, у всіх органах.

Спочатку, ендотеліальні клітини артеріол гинуть у результаті апоптозу разом із гладком'язовими клітинами. Ці клітини заміняються колагеном і іншим волокнистим матеріалом. Запальні клітини, зокрема СОр4і-- хелперні Т-клітини, проникають в артеріолу і викликають подальше ушкодження.

Шкірні прояви склеродермії можуть бути болісними, приводити до уникнення використання ураженої ділянки (наприклад, рук, пальців рук, пальців ніг, ніг і т. д.-) і можуть приводити до спотворювання таких ділянок. На шкірі можуть з'явитися виразки, і такі виразки можуть бути схильні до інфікування або навіть гангрени. Укрита виразками шкіра може бути важковиліковною або повільно піддаватися лікуванню. Тяжкість при загоєнні виразок шкіри може бути особливо ускладнена у пацієнтів з порушенням кровообігу, наприклад з феноменом

Рейно. У деяких варіантах здійснення способи за даним винаходом використовуються для лікування склеродермії, наприклад шкірних симптомів склеродермії. У деяких варіантах здійснення лікування склеродермії включає лікування шкірних виразок, таких як дигітальні виразки. Введення інгібуючого МАБР-2 агента, такого як анти-МА5БР-2 антитіло, можна

Зо використовувати для зменшення фіброзних і/або запальних симптомів склеродермії в уражених тканинах і/або органах.

Крім шкірних симптомів/проявів, склеродермія може також впливати на серце, нирки, легені, суглоби і травний тракт. У деяких варіантах здійснення лікування склеродермії включає лікування симптомів захворювання в будь-якій одній або більше з цих тканин, наприклад шляхом зменшення фіброзних і/або запальних симптомів. Проблеми, пов'язані з легенями, є одними з найбільш серйозних ускладнень склеродермії і відповідальні за більшу частину смертельних кінців, пов'язаних із цим захворюванням. Двома переважними станами легенів, пов'язаними зі склеродермією, є фіброз легенів і легенева гіпертензія. Пацієнт з ураженими легенями може мати або один, або обидва ці стани. Фіброз легенів, асоційований зі склеродермією, є одним з прикладів легеневого фіброзу, який можна лікувати інгібіторами

МА5БР-2. Склеродермія, що зачепила легеню, викликає рубцювання (фіброз легенів). Такий легеневий фіброз зустрічається у приблизно 70 95 пацієнтів зі склеродермією, хоча його прогресування, як правило, є повільним, і симптоми сильно відрізняються у пацієнтів по ступеню тяжкості. У пацієнтів, які мають симптоми, асоційовані з легеневим фіброзом, такі симптоми включають сухий кашель, задишку і зниження здатності до фізичного навантаження.

У приблизно 16 95 пацієнтів з деяким рівнем фіброзу легенів розвивається важкий фіброз легенів. У пацієнтів з важким легеневим фіброзом спостерігається значне зниження функції легенів і альвеоліт.

У деяких варіантах здійснення способи за даним винаходом використовуються для лікування склеродермії, наприклад фіброзу легенів, асоційованого зі склеродермією. Введення інгібуючих МА5Р-2 агентів, таких як інгібуючі МА5Р-2 антитіла, можна використовувати для зменшення фіброзних симптомів склеродермії в легенях. Наприклад, ці способи можна використовувати для поліпшення функції легенів і/або зниження ризику смерті через склеродермію.

У пацієнтів зі склеродермією також часто можуть бути уражені нирки. Фіброз нирок, асоційований зі склеродермією, є прикладом фіброзу нирок, який можна лікувати шляхом введення інгібуючих МАБР-2 агентів, таких як анти-МА5БР-2 антитіла. У деяких варіантах здійснення способи за даним винаходом використовуються для лікування склеродермії, наприклад фіброзу нирок, асоційованого зі склеродермією. В одному з варіантів здійснення бо введення інгібуючих МАБЗР-2 антитіл можна використовувати для зменшення фіброзних симптомів склеродермії в нирках. Наприклад, ці способи можна використовувати для поліпшення функції нирок, зменшення білка в сечі, зменшення тяжкості артеріальної гіпертонії іабо зниження ризику розвитку ниркового кризу, який може привести до фатальної ниркової недостатності.

Системний червоний вовчак (СЧВ) є хронічним запальним аутоїмунним розладом, що характеризуються спонтанною аутореактивністю В- і Т-клітин і мультиорганним імунним ушкодженням і може впливати на шкіру, суглоби, нирки і інші органи. Майже у всіх людей з СЧВ є біль у суглобах і у більшості розвивається артрит. Часто ураженими суглобами є суглоби пальців, рук, зап'ястя і колін. Загальні симптоми СЧВ включають: артрит; утому; загальний дискомфорт, занепокоєння або погане самопочуття (нездужання); біль у суглобах і припухлість; біль у м'язах; нудоту і блювання; і шкірний висип. Крім того, симптоми також можуть включати: біль у животі; кров у сечі; зміну кольору пальців при здавлюванні або на холоді; оніміння і поколювання; і червоні плями на шкірі. У деяких пацієнтів з СЧВ є ураження легенів або нирок.

Не обмежуючись теорією, запалення і/або фіброз у легенях і нирках призводить до ураження цих органів і розвитку симптомів, асоційованих з ушкодженням легенів і/або нирок. У деяких випадках у пацієнтів з СЧВ розвивається певний стан нирок, називаний вовчаковим нефритом.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується способів лікування СЧВ, які включають введення ефективної кількості інгібуючого МАБЗР-2 агента, такого як анти-МА5Р-2 антитіло.

Введення інгібуючих МА5Р-2 антитіл можна використовувати для зменшення одного або більше симптомів СЧВ. У деяких варіантах здійснення введення анти-МА5бР-2 антитіл використовується для лікування СЧВ у пацієнта з вовчаковим нефритом. У таких випадках лікування СЧВ включає лікування вовчакового нефриту, наприклад шляхом зменшення симптомів вовчакового нефриту. У деяких варіантах здійснення лікування включає лікування шкірних симптомів СЧВ. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення одного або більше симптомів вовчакового нефриту. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення, уповільнення або усунення необхідності в діалізі. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення, уповільнення або усунення необхідності в трансплантації нирок. У деяких варіантах здійснення лікування включає затримання або запобігання прогресуванню вовчакового нефриту до ниркової недостатності або термінальної стадії ниркової недостатності.

Зо Вовчаковий нефрит є запаленням нирок і серйозним ускладненням системного червоного вовчака (СЧВ). Що стосується нирок, вовчаковий нефрит може привести до інвалідизуючої втрати їх функції. У пацієнтів з вовчаковим нефритом в остаточному підсумку може розвитися ниркова недостатність, і їм може знадобитися діаліз або трансплантація нирок. Пов'язані із цим ускладнення, які також можна лікувати способами за винаходом, включають інтерстиціальний нефрит і нефротичний синдром. Симптоми вовчакового нефриту включають: кров у сечі, пінистий вигляд сечі, високий кров'яний тиск, білок у сечі, затримання рідини і набряки. Інші симптоми включають ознаки і симптоми фіброзу нирок і/або ниркової недостатності. Якщо хворобу не лікувати, вовчаковий нефрит може привести до ниркової недостатності і навіть термінальної стадії ниркової недостатності.

Відповідно, у деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає аутоїмунним захворюванням, яке викликане або ускладнюється фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МАБЗР-2 агента, такого як інгібуюче МАБР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МА5Р-2, ефективну для пригнічення фіброзу.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МА5БР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного аутоїмунного захворювання.

У деяких варіантах здійснення аутоїмунне захворювання, яке викликане або ускладнюється фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається зі склеродермії і системного червоного вовчака (СЧВ). бо Захворювання і стани центральної нервової системи

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом центральної нервової системи, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як анти-МА5Р-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МАБР-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного захворювання або розладу центральної нервової системи.

У деяких варіантах здійснення захворювання або розлад центральної нервової системи, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з: інсульту, травматичного ушкодження головного мозку і ушкодження спинного мозку.

Шкірні захворювання або стани

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає хворобою або розладом шкіри, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МАЗР-2 агента, такого як інгібуюче МА5ЗР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МА5бР-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу композицію МАБР-2 можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції на шкіру або місцевого застосування під час операції

Зо або локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного шкірного захворювання або розладу.

У деяких варіантах здійснення шкірне захворювання або розлад, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з фіброзу шкіри, загоєння ран, склеродермії, системного склерозу, келоїдів, захворювань сполучної тканини, рубцювання і гіпертрофічних рубців.

Захворювання і стани кісток і м'яких тканин скелетно-м'язової системи

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом кісток або м'яких тканин, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче МА5БР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МА5Р-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції на структуру кістки або м'якої тканини або місцевого нанесення під час операції або локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера. Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які 60 придатні для першопричинного захворювання або розладу кісток або м'яких тканин.

У деяких варіантах здійснення захворювання або розлад кісток або м'яких тканин, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з остеопорозу і/або остеопенії, пов'язаної, наприклад, З кістозним фіброзом, мієлодиспластичними станами зі збільшенням кісткового фіброзу, адгезивного капсуліту, контрактури Дюпюїтрена і мієлофіброзу.

Суглобові захворювання або стани

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає суглобовим захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче

МАБР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору

МА5Р-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції на суглоб, або місцевого нанесення під час операції або локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного суглобового захворювання або розладу.

У деяких варіантах здійснення суглобове захворювання або розлад, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, являє собою артрофіброз.

Захворювання або стани травної системи

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом травної системи, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який

Зо включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче

МАБР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору

МА5Р-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом локальної ін'єкції або 35 напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера. Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення 40 стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного захворювання або розладу травної системи.

У деяких варіантах здійснення захворювання або розлад травної системи, викликаний або 45 ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з хвороби Крона, виразкового коліту і фіброзу підшлункової залози.

Очні захворювання або стани

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає очним 50 захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче

МАБР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору

МА5Р-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад 55 шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера. Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення в око (наприклад, очні краплі), або, у випадку 60 непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного очного захворювання або розладу.

У деяких варіантах здійснення очне захворювання або розлад, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з передньої субкапсулярної катаракти, помутніння задньої капсули, дегенерації жовтої плями і ретинальної і вітреальної ретинопатії.

Захворювання або стани репродуктивних органів

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом репродуктивних органів, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче МА5БР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МА5Р-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера. Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного захворювання або розладу репродуктивних органів.

У деяких варіантах здійснення захворювання або розлад репродуктивних органів, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з: ендометріозу і хвороби Пейроні.

Зо Рубцювання, пов'язане з травмою

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає захворюванням або станом, що є результатом рубцювання, пов'язаного з травмою, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5БР-2 агента, такого як інгібуюче МАБ5бР-2 антитіло.

Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МАБР-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера. Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного захворювання або розладу.

У деяких варіантах здійснення рубцювання, пов'язане з травмою, вибирають із групи, що складається з: хірургічних ускладнень (наприклад, хірургічних спайок, у яких рубцева тканина може утворюватися між внутрішніми органами, викликаючи контрактуру, біль, і може приводити до безплідності), хіміотерапевтичного індукованого ліками фіброзу, індукованого радіацією фіброзу і рубцювання, пов'язаного з опіками.

Додаткові захворювання і розлади, викликані або ускладнені фіброзом і/або запаленням

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом, викликаним і/або ускладненим фіброзом і/або запаленням, вибраним із групи, що складається з трансплантації органів, фіброзу молочної залози, м'язового фіброзу, ретроперитонеального фіброзу, фіброзу щитовидної залози, фіброзу лімфатичних вузлів, фіброзу сечового міхура і плеврального фіброзу, який включає введення суб'єкту, що цього 60 потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче МА5Р-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МАБР-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера. Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення в око (наприклад, очні краплі), або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МА5БР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного захворювання або розладу.

У деяких варіантах здійснення будь-якого з описаних у даній заявці різних способів і фармацевтичних композицій, інгібуюче МА5Р-2 антитіло вибірково пригнічує лектиновий шлях, не зачіпаючи при цьому класичний шлях.

У різних аспектах даний винахід стосується способів пригнічення несприятливих ефектів фіброзу і/або запалення, які включають введення інгібуючого МА5Р-2 агента суб'єкту, що цього потребує. Інгібуючі МА5Р-2 агенти вводять у кількості, ефективній для пригнічення МА5Р-2- залежної активації комплементу у живого суб'єкта. При практичному здійсненні цього аспекту винаходу типові інгібуючі МАБР-2 агенти включають: молекули, що пригнічують біологічну активність МАБР-2 (такі як низькомолекулярні інгібітори, анти-МА5БР-2 антитіла (наприклад, інгібуючі МА5Р-2 антитіла) або блокувальні пептиди, які взаємодіють з МАБ5Р-2 або порушують білок-білюову взаємодію) і молекули, які зменшують експресію МА5БР-2 (такі як молекули антисмислової нуклеїнової кислоти МАБР-2, МАБР-2-специфічні молекули РНКі і МА5БР-2 рибозими), тим самим не допускаючи МА5БР-2-активацію лектинового шляху комплементу.

Інгібуючі МАЗР-2 агенти можна використовувати окремо як первинну терапію або в комбінації з іншими терапевтичними засобами як ад'ювантну терапію для підвищення терапевтичного ефекту інших медичних препаратів.

Зо Пригнічення МАБР-2-залежної активації комплементу характеризується щонайменше однією з наступних змін у компоненті системи комплементу, які відбуваються в результаті введення інгібуючого МА5бР-2 агента згідно зі способами за винаходом: пригнічення генерації або продукування продуктів МА5Р-2-залежної активації комплементу С4Б, СЗа, Сба і/або С5Б5-9 (МАС) (виміряні, наприклад, як описано в прикладі 2), зменшення рівня розщеплення Са і відкладення С4р (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 2) або зменшення рівня розщеплення СЗЗ і відкладення СЗБ (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 2).

Відповідно до даного винаходу використовуються інгібуючі МА5Р-2 агенти, які ефективні в пригніченні фіброзу і/або запалення і проявляють виявлювану антифіброзну активність і/або індукують зменшення фіброзу. У контексті винаходу антифіброзна активність може включати щонайменше одне або більше з наступного: (1) зменшення запалення, наприклад, яке оцінюється по активації і рекрутуванню макрофагів і ендотеліальних клітин; рекрутування і активація лімфоцитів і/або еозинофілів шляхом секреції ряду цитокінів/хемокінів; вивільнення цитотоксичних медіаторів і фіброгенних цитокінів; (2) зниження проліферації клітин, синтез ВКМ (ЕСМ) або ангіогенез; і/або (3) зменшення рівня відкладення колагену в порівнянні з фіброзною активністю за відсутності інгібуючого МАЗР-2 агента.

Оцінка антифіброзного агента, такого як інгібуючий МА5бР-2 агент, може здійснюватися шляхом виявлення будь-яким відомим фахівцю в даній галузі методом. Наприклад, оцінка антифіброзного агента може здійснюватися за допомогою моделі ШО (як описано в даній заявці в прикладах 12 і 14). Якщо оцінювану антифіброзну активність і/або зменшення або зниження фіброзу оцінюють за допомогою інгібуючого МАЗР-2 агента, вважається, що інгібуючий МА5БР-2 агент використовується як лікарський засіб для профілактики, лікування, купірування і/або пригнічення фіброзу.

Оцінку фіброзу можна здійснювати періодично, наприклад щотижня або щомісяця. Таким чином, збільшення/зменшення фіброзу і/або наявність антифіброзної активності можна оцінювати періодично, наприклад щотижня або щомісяця. Ця оцінка переважно здійснюється в декількох часових точках для даного суб'єкта або в одній або більше часових точках для даного суб'єкта і здорового контролю. Оцінка може проводитися через регулярні інтервали часу, наприклад щотижня або щомісяця. Тому оцінку можна здійснювати регулярно, наприклад щотижня або щомісяця. Якщо в результаті оцінки виявлене зменшення фіброзу або наявність 60 антифіброзної активності, вважається, що інгібуючий МА5Р-2 агент, такий як інгібуюче МАЗР-2 антитіло, проявляє виявлювану антифіброзну активність і/або індукує зменшення або зниження фіброзу.

Інгібуючі МАБР-2 агенти, у випадку практичного застосування цього аспекту винаходу, включають, наприклад, МА5БР-2 антитіла і їх фрагменти, інгібуючі МАБР-2 пептиди, малі молекули, розчинні МАЗР-2 рецептори і інгібітори експресії. Інгібуючі МАБЗР-2 агенти можуть пригнічувати систему МА5бР-2-залежної активації комплементу, блокуючи біологічну функцію

МА5Р-2. Наприклад, інгібуючий агент може ефективно блокувати взаємодію білка МА5Р-2 з білком, перешкоджати димеризації або збиранню МА5БР-2, блокувати зв'язування з Са», інтерферувати з активною ділянкою серинової протеази МА5Р-2 або знижувати рівень експресії білка МА5Р-2.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти вибірково пригнічують МА5Р-2- залежну активацію комплементу, не зачіпаючи функціональну активність системи С1д-залежної активації комплементу.

В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент, використовуваний у способах за винаходом, являє собою специфічний інгібуючий МА5Р-2 агент, який специфічно зв'язується з поліпептидом, що містить ЗЕ ІЮ МО:6, зі спорідненістю зв'язування, що щонайменше в 10 разів перевищує спорідненість зв'язування з іншими антигенами в системі комплементу. В іншому варіанті здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент специфічно зв'язується з поліпептидом, що містить ЗЕ ІЮ МО:6, зі спорідненістю зв'язування, що щонайменше в 100 разів перевищує спорідненість зв'язування з іншими антигенами в системі комплементу. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент специфічно зв'язується щонайменше з одним з домену

ССРІ-ССР2 (аа 300-431 в ЗЕО ІЮ МО:6) або домену серинової протеази МА5Р-2 (аа 445-682 в

ЗБО ІЮ МО:6б) і пригнічує активацію МА5Р-2-залежного комплементу. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5ЗР-2 агент являє собою моноклональне антитіло МА5БР-2 або його фрагмент, що специфічно зв'язується з МА5Р-2. Спорідненість зв'язування інгібуючого МАЗР-2 агента може бути визначена за допомогою придатного аналізу зв'язування.

Поліпептид МА5Р-2 має молекулярну структуру, аналогічну структурі МАБР-1, МАБ5Р-3 і С1г і С15, протеаз системи комплементу С1. Молекула кКДНК, представлена в 5ЕО ІЮ МО:4, кодує типовий приклад МА5Р-2 (що складається з амінокислотної послідовності, представленої в зХЕО

ІО МО:5) і забезпечує людський поліпептид МА5Р-2 з лідерною послідовністю (аа 1-15), який розщеплюється після секреції, утворюючи зрілу форму людського МАБР-2 (5ЕО ІЮ МО:6). Як показано на фіг. 2, ген людського МА5Р-2 містить дванадцять екзонів. КДНК людського МА5Р-2 кодується екзонами В, С, О, ЕЕ, 0, Н, І, у, К ії М. У результаті альтернативного сплайсингу утворюється білок розміром 20 кДа, називаний МВІ -асоційованим білком 19 (МАр19, також називаний 5МАР) (ЗЕО ІЮ МО:2), кодований (5ЕО ІЮ МО), одержуваний з екзонів В, С, О і Е, як показано на фіг. 2. Молекула кКДНК, представлена в 5ЕО ІЮ МО:50, кодує мишачий МА5Р-2 (що складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮО МО:51) і забезпечує поліпептид мишачого МА5Р-2 з лідерною послідовністю, у результаті розщеплення якої після секреції утворюється зріла форма мишачого МАБР-2 (5ЕБЕО ІЮ МО:52). Молекула кДНК, представлена в 5ЕБЕО І МО:53, кодує щурячий МАБР-2 (що складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮ МО:54) і забезпечує поліпептид щурячого МАЗР-2 з лідерною послідовністю, у результаті розщеплення якої після секреції утворюється зріла форма щурячого МАЗР-2 (ЗЕО І МО:55).

Фахівці в даній галузі техніки зрозуміють, що послідовності, розкриті в ЗЕО ІЮ МО:4, 5ЗЕО ІЮ

МО:50 ії БЕО ІЮ МО:53, являють собою одиночні алелі людського, мишачого і щурячого МА5Р-2, відповідно, і що можливі алельні варіанти і альтернативний сплайсинг. Алельні варіанти нуклеотидних послідовностей, наведені в ЗЕО ІЮ МО:4, 5ЕБЕО ІЮ МО:50 і 5ЕБО ІО МО:53, включаючи ті, які містять сайленс-мутації, і ті, у яких мутації приводять до змін амінокислотної послідовності, знаходяться у межах даного винаходу. Алельні варіанти послідовності МАБР-2 можуть бути клоновані шляхом зондування кДНК або геномних бібліотек від різних індивідуумів згідно зі стандартними процедурами.

Домени людського білка МАБР-2 (ЗЕО ІЮ МО:6) показані на фіг. 1 і 2А і включають домени

М-кінцевий С1г/С15//ЕСЕ морського їжака/домен кісткового морфогенетичного білка (СВІ) (аа 1-121 в ЗЕО ІО МО:6), домен, подібний епідермальному фактору росту (аа 122-166), другий домен СИВІ (аа 167-293), а також тандем доменів регуляторних білків комплементу.

Альтернативний сплайсинг гена МА5БР-2 приводить до утворення МАр19, показаного на фіг. 1.

МАр19 являє собою неферментний білок, що містить М-термінальну СОВІ-ЕСЕ ділянку МАБР-2 з чотирма додатковими залишками (ЕОБІ), одержаними з екзона Е, показаного на фіг. 1.

Було показано, що деякі білки здатні зв'язуватися або взаємодіяти з МА5БР-2 за допомогою 60 білок-білкових взаємодій. Наприклад, відомо, що МА5БР-2 здатний зв'язуватися і формувати

Саг-залежні комплекси з лектиновими білками МВ, Н-фіколіном і І-фіколіном. Було показано, що кожний комплекс МАЗР-2/лектиновий білок здатний активувати комплемент за допомогою

МА5БР-2-залежного розщеплення білків С4 і С2 (ІКеда К. еї аї., 9. Віої. Спет. 262:7451-7454, 1987; Маїзивнйа М. еї а!., У. Ехр. Мед. 176:1497-2284, 2000; Маїзивпйа М. еї аї., 9. Іттипої. 168:3502-3506, 2002). Дослідження показали, що домени СОВІ-ЕСЕ МАБР-2 є важливими для зв'язування МАБР-2 з МВІ (Тпівїєп5 М.М. еї аї., У. Іттипої. 166:5068, 2001). Також було показано, що домени СОВІЕСЕСИВІ!Ї опосередковують димеризацію МАБР-2, необхідну для формування активного комплексу МВІ (УМаїїїв5 В. еї аї.,». Віої. Спет. 275:30962-30969, 2000).

Звідси випливає, що інгібуючі МАБР-2 агенти характеризуються своєю здатністю зв'язуватися або взаємодіяти з МА5Р-2 ділянками-мішенями, що відіграють важливу роль у процесі МАБР-2- залежної активації комплементу.

АНТИ-МАБ5БР-2 АНТИТІЛА

У деяких варіантах здійснення цього аспекту даного винаходу інгібуючий МА5Р-2 агент включає анти-МА5бР-2 антитіло, яке пригнічує систему МАЗР-2-залежної активації комплементу.

Анти-МА5БР-2 антитіла, придатні для здійснення цього аспекту даного винаходу, включають поліклональні, моноклональні або рекомбінантні антитіла, одержані від будь-якого продукуючого антитіла ссавця, і дані антитіла можуть бути мультиспецифічними, химерними, гуманізованими, антиідіотипічними антитілами і фрагментами антитіл. Фрагменти антитіл включають Раб, Рар', Е(абр)г, К(ар)», ГЕм-фрагменти, зсЕм-фрагменти і одноланцюжкові антитіла, описані нижче.

Анти-МАБР-2 антитіла можуть бути піддані скринінгу на здатність пригнічення системи

МАБР-2-залежної активації комплементу і на антифіброзну активність і/або пригнічення ниркового ураження, асоційованого з протеїнурією або індукованою адріаміцином нефропатією, за допомогою описаного в даній заявці аналізу. Деякі анти-МА5Р-2 антитіла були описані в науковій літературі, декілька з них перераховані в таблиці 1. Наприклад, як показано в даній заявці в прикладах 10 ії 11, було знайдено, що анти-МА5Р-2 антитіла Гар2 блокують МА5ЗР-2- залежну активацію комплементу. Як показано в прикладі 12 і описано в М/О 2012/151481, включеній в даний опис у вигляді посилання, було визначено, що повністю людські анти-МАБР- 2 антитіла 5сЕм (наприклад, ОМ5646) блокують МА5ЗР-2-залежну активацію комплементу. Як описано в прикладі 13, а також в М/О 024141442, включеній в даний опис у вигляді посилання, анти-МАБР-2 антитіла, що несуть пептид 5ОМІ-2, і їх фрагменти, що проявляють інгібуючу

МАБ5БР-2 активність, були одержані шляхом злиття з амінокислотною послідовністю пептиду

ЗОМІ-2 (ЗЕО ІО МО:72, 73 або 74) на аміно- або карбоксильному кінці важкого і/або легкого ланцюга людського анти-МА5Р-2 антитіла (наприклад, ОМ5646-512:3МІ-2).

Відповідно, в одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент для використання в способах за винаходом містить людське антитіло, таке як, наприклад, ОМ5646. Відповідно, в одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент для використання в композиціях і способах за заявленим винаходом містить людське антитіло, яке зв'язує поліпептид, що складається з людського МАЗР-2 (ЗЕО ІЮ МО:6), причому антитіло містить: (І) (а) варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить: ї) СОК-НІ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 31-35 в 5ЕБО ІЮ МО:67; і ії) СОК-Н2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 50-65 в 5ЕО ІЮ МО:67; і ії) СОК-НЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 95-107 в ЗЕО ІЮ МО:67; і (5) варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить: Її) СОК-Ї1 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 24-34 в 5ЕО ІО МО:70; і її) СОК-1 2 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 50-56 в 5БО ІЮ МО:70; і її) СОМК-ЇЗ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 89-97 в ЗЕО ІЮ МО:70; або (ІІ) його варіант, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга з щонайменше 9095 ідентичністю (наприклад, з щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 9565, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 9895, щонайменше 99 95 ідентичністю) з 5ЕО ІЮ МО:67; і варіабельну ділянку легкого ланцюга з щонайменше 90 95 ідентичністю (наприклад, з щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 93 965, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 965, щонайменше 98 96, щонайменше 99 95 ідентичністю) з БЗЕО ІЮ МО:70.

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка містить деяку кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: б7, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО:70. 60 У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка містить інгібуюче МА5Р-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людському МА5Р-2, розпізнаваному референсним антитілом

ОМ5646, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, як зазначено в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, як зазначено в 5ЕО ІЮ МО:70. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент, використовуваний у способах за винаходом, містить людське антитіло ОМ5646.

ТАБЛИЦЯ 1

НАВЕДЕНІ ЯК ПРИКЛАД МА5ЗР-2-СПЕЦИФІЧНІ АНТИТІЛА

Іттипої!. 37:803-811, 2000

Фрагмент рекомбінантного Мої Іег-Кгібіїепзеп М.., єї аї., 9. ої людського ССР1/2-5Р Щуряче МоАБ (підклас ІдС1) Іттипої. Меїйоав, 282:159-167,

МодЬ 885 2003

МАМ | Моїег-Ктісїепзеп М., еї аї., у. ої (перехресна реакція з Щуряче МоАБ (підклас ІдС1) піде Меїпод5, 282:159-167,

МАБР-2

Мишаче МоАБ (М-терм.) Іттипої!. 35:409, Арії! 1998

Щуряче МоАбБ: Мітоар101, клітинною лінією 03050904 (ЕСАСС)

Мишаче МоАбз:

МітоАБ104, продуковане гібридомною клітинною лінією

МОо545УМ035 (054М2)

МітоАБІт08, продуковане . - |гібридомною клітинною лінією пока (повнорозмірний, | //545УМО29 (О5М7) УО 2004/106384 ів-мічений) .

МітоОоАб109 продуковане гібридомною клітинною лінією

МмОо545УМ046 (05472)

МітоАбІ110 продуковане гібридомною клітинною лінією мМо545у5М048 (05М2 (повнорозмірний) ЕРарг

АНТИ-МАБР-2 АНТИТІЛА ЗІ ЗНИЖЕНОЮ ЕФЕКТОРНОЮ ФУНКЦІЄЮ

У деяких варіантах здійснення цього аспекту даного винаходу анти-МА5Р-2 антитіла мають знижену ефекторну функцію для зменшення запалення, яке може виникати при активації класичного шляху комплементу. Було виявлено, що здатність молекул до запускати класичний шлях активації комплементу пов'язана з Ес-ділянкою молекули (ЮОипсап А.К. еї аї., Майшге, 332:738-740 1988). Молекули Ідс, у яких Ес-ділянка була видалена за допомогою ферментного розщеплення, позбавлені даної ефекторної функції (див. Нагпом/, Апііродіев: А Іарогаюгу

Мапиаї!, Соїй Зргіпд Нагрог ІГарогаїогу, Мем; ЖМогК, 1988). Відповідно до цього, антитіла зі зниженою ефекторною функцією можуть бути одержані в результаті видалення Ес-ділянки молекули, що містить генно-інженерну Ес-послідовність, яка має мінімальну ефекторну функцію, ця молекула може належати як до людського ізотипу Ідс2, так і до ізотипу Ід.

Антитіла зі зниженою ефекторною функцією можуть бути одержані за допомогою стандартних молекулярних біологічних маніпуляцій з Ес-ділянкою важких ланцюгів Ідс, як описано в даній заявці і показано в УоїІйТе еї аї., пс! Кем. Іттипої. 10:241-250, 11993, і Коадгідце5 еї аї., У. Іттипої. 151:6954-6961, 1998. Антитіла зі зниженою ефекторною функцією також включають людські ізотипи Ідс2 і Ід4, які мають знижену здатність активувати комплемент ілабо вступати у взаємодію з Ес-рецепторами (Камеїсі УМ. еї аї., Аппи. Кем. Іттипої. 9:457-492, 1991; Ізсаасз У.О. єї аї., У. Іттипої. 148:3062-3071, 1992; мап де М/іпКкеї У.сх. еї аї., Іттипої. Тодау, 14:215-221, 1993). Гуманізовані або повноцінні людські антитіла, специфічні до людського

МАБР-2, що включають ізотипи ЇдД52 або Ід054, можуть бути одержані одним з декількох способів, відомих фахівцю в даній галузі техніко, як описано в Мацдпап Т.9. еї аї., Маїиге

Віоїєсппіса!, 16:535-539, 1998.

ОДЕРЖАННЯ АНТИ-МА5БР-2 АНТИТІЛ

Анти-МАБР-2 антитіла можуть бути одержані за допомогою поліпептидів МАБР-2 (наприклад, повнорозмірного МАБР-2) або антигенних пептидів, що несуть епітоп МА5ЗР-2 (наприклад, частина поліпептиду МАЗР-2). Імунногенні пептиди можуть складатися всього з п'яти амінокислотних залишків. Наприклад, поліпептид МА5Р-2, що містить повну амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:б, може бути використаний для індукції анти-МА5Р-2 антитіл, які можуть бути використані в способі за даним винаходом. Відомо, що конкретні домени МАБ5бР-2, залучені в білок-білкові взаємодії, такі як домени СИОВІ ії СОВІЄСЕ, а також область, що містить активну ділянку серинової протеази, можна експресувати у вигляді рекомбінантних поліпептидів, як описано в прикладі 3, і використовувати як антигени. Крім того, пептиди, які містять ділянку, що складається з щонайменше 6 амінокислот поліпептиду МАБР-2 (5ЕО І

МО:6), також можна використовувати для індукції МА5БР-2 антитіл. Додаткові приклади одержаних антигенів МА5Р-2, що мають здатність індукувати МА5Р-2 антитіла, наведені нижче в таблиці 2. Пептиди і поліпептиди МА5Р-2, використовувані для генерації антитіл, можуть бути виділені у вигляді природних поліпептидів або рекомбінантних або синтетичних пептидів і каталітично неактивних рекомбінантних поліпептидів, таких як МА5Р-2А, як описано далі в даній заявці. У деяких варіантах здійснення цього аспекту даного винаходу анти-МА5Р-2 антитіла одержані з використанням трансгенної лінії мишей, як описано нижче в даній заявці.

Антигени, здатні продукуватися анти-МА5Р-2 антитіла, також включають злиті поліпептиди, наприклад поліпептиди, одержані в результаті злиття МА5Р-2 або його частини з поліпептидом імуноглобуліну або білком, що зв'язує мальтозу. Поліпептидний імуноген може бути представлений повнорозмірною молекулою або її частиною. Якщо частина поліпептиду представлена гаптеном, така частина може бути переважно приєднана або зв'язана для імунізації з макромолекулярним носієм (таким як гемоціанін фісурели (КІН), бичачий сироватковий альбумін (В5А) або правцевий анатоксин).

ТАБЛИЦЯ 2

АНТИГЕНИ МА5БР-2 5ЕО І МО:

ЗЕО ІЮ МО:б6 Людський білок МА5Р-2

ЗЕО ІЮ МО:51 Мишачий білок МА5Р-2 , Домен СИиИВІ людського МАБР-2

ЗБОЮ МОВ аа 1-121 в БЕО ІЮ МО:6) , Домени СОВІЄСЕ людського МА5Р-2

ЗБОЮ МОЗ аа 1-166 в ЗЕО ІЮ МО:6) , Домени СОВІЕСЕСИВІЇ людського МАБР-2

ЗО Юр МОЛо аа 1-293 в БЕО ІЮ МО:6) , Домен ЕСЕ людського МАБР-2

ЗБОЮ МО аа 122-166 в 5ЕО ІЮ МО:6) , Домен серинової протеази людського МА5Р-2

ЗЕО о Мол аа 429-671 в 5БЕО ІЮ МО:6

ЕО ІЮ МОЗ протея форма з інактивованим доменом серинової косо вАУНІ. аа 610-625 в 5ЕО ІО МО:6 з мутантним Зег 618)

ЗЕО ІЮ МО:14 о

ТРІ СРКМ/РЕРМЕСВІ. Людський пептид СОВІ

ЗЕО ІЮ МО:15:

ТАРРОМНІ ВІ МЕТНЕОІ ЕЇ. Людський пептид СОВІ

ЗНІ СЕМОБГМКІ 55И(;1АКМІ АТІ ССО

ЗЕО ІО МО:16: ; . .

ТЕВЄПУЄМ МВІ -зв'язуюча ділянка в людському домені СОВІ

ТАБЛИЦЯ 2

АНТИГЕНИ МА5БР-2

ЗЕО І МО:18

АММІ САаГЕЗССКОЗСнОрзасаціАї мМ

ПОЛІКЛОНАЛЬНІ АНТИТІЛА

Поліклональні анти-МАБР-2 антитіла можуть бути одержані шляхом імунізації тварин поліпептидом МА5БР-2 або його імуногенною ділянкою способами, добре відомими фахівцю в даній галузі техніки. Див., наприклад, Сгееп еї аї., Ргодисіоп ої Роїусіопа! Апіїзега, в

Ітітипоспетіса! РгоїосоЇї5 (Мапзоп, еа.), стор. 105. Імуногенність поліпептиду МАБР-2 можна підвищити за допомогою ад'юванту, включаючи мінеральні гелі, такі як гідроксид алюмінію або ад'ювант Фрейнда (повний або неповний), поверхнево-активних речовин, таких як лізолецитин, високомолекулярних спиртів - плюроніків, поліаніонів, масляних емульсій, гемоціаніну фісурели і динітрофенолу. Для одержання поліклональних антитіл звичайно використовують тварин, таких як коні, корови, собаки, кури, щури, миші, кролики, морські свинки, кози або вівці. Як альтернатива, анти-МА5Р-2 антитіло, використовуване в даному винаході, може також бути одержане від людиноподібної мавпи. Загальний метод одержання діагностично і терапевтично корисних антитіл у бабуїнів можна знайти, наприклад, в СоїЇдепрегуд еї аї., публікація міжнародної заявки на патент УМО 91/11465, і в Го5тап М... еї аї., Іпї. У. Сапсег, 46:310, 1990.

Потім за допомогою стандартних загальновідомих процедур із крові таких імунізованих тварин одержують сироватку, що містить імунологічно активні антитіла.

МОНОКЛОНАЛЬНІ АНТИТІЛА

У деяких варіантах здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент являє собою моноклональне анти-

МАБР-2 антитіло. Моноклональні анти-МА5БР-2 антитіла є високоспецифічним епітопом, спрямованим проти одного епітопа МА5Р-2. Як використовується в даному описі, модифікатор "моноклональне" указує на характер антитіла, одержаного з по суті гомогенної популяції антитіл, і не має на увазі одержання антитіл яким-небудь конкретним способом. Моноклональні антитіла можуть бути одержані будь-яким методом, що передбачає одержання молекул антитіл у культурі стабільної клітинної лінії, таким як, наприклад, метод гібридом, описаний в Копіег 0. еї аїЇ,, Майшиге, 256:495, 1975, або вони можуть бути одержані методами рекомбінантних ДНК (див., наприклад, патент США Мо 4,816,567, Сарійу). Моноклональні антитіла можуть бути також виділені з фагової бібліотеки антитіл методами, описаними в Сіаскзоп Т. еї а!., Макиге, 352:624- 628, 1991, і Магкз 9.0. еї аї., У. Мої. Віої. 222:581-597, 1991. Подібні антитіла можуть належати до

Зо будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи Ідс, ІМ, ІДЕ, ІдА, до, ії будь-якого їх підкласу.

Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути одержані шляхом ін'єкцій придатному ссавцю (наприклад, миші лінії ВАЇ.В/с) композиції, яка містить поліпептид МАБЗР-2 або його частину. Після попередньо визначеного періоду часу, у миші виділяють спленоцити і ресуспендують їх у культуральному середовищі. Потім здійснюють злиття спленоцитів з імморталізованою клітинною лінією для утворення гібридоми. Утворені гібридоми вирощують у культурі клітин і піддають їх скринінгу на здатність до продукування моноклональних антитіл до

МАБР-2. Далі в даному описі наведені приклади одержання моноклональних анти-МА5Р-2 антитіл (див. також Сигтепі Ргоїосої5 іп Іттипоіоду, Мої. 1, дхопп Уміеу 5 5оп5, радез 2.5.1-2.6.7, 1991).

Людські моноклональні антитіла можуть бути одержані від трансгенних мишей, створених методами генної інженерії для продукування людських антитіл у відповідь на антигенний стимул. У цьому методі елементи локусу важких і легких ланцюгів людського імуноглобуліну вводять у лінії мишей, одержані із клітинних ліній ембріональних стовбурних клітин, які містять спрямовані руйнування локусів важких і легких ланцюгів ендогенного імуноглобуліну. Трансгенні миші можуть синтезувати людські антитіла, специфічні до людських антигенів, таких як антигени

МАБР-2, описані в даному винаході, і цих мишей можна використовувати для одержання гібридом, секретуючих антитіла до людського МА5Р-2, шляхом злиття В-клітин, одержаних від таких тварин, з придатними клітинними лініями мієломи звичайним методом Келера-

Мільштейна, як описано нижче в даній заявці. Трансгенні миші з геномом людського імуноглобуліну є комерційно доступними (наприклад, від Абдепіх, Іпс., Егетопі, СА, і Медагех,

Іпс., Аппапааїє, М.)У.). Способи одержання людських антитіл від трансгенної миші описані в науковій літературі, наприклад Стеєп 1 .Ї. єї аЇ., Майте Сепеї, 7:13, 1994; І опрегу М. еї аї.,

Майшге, 368:856, 1994; і Тауїог І.О. еї аї., Іпї. Іттип. 6:579, 1994.

Моноклональні антитіла можуть бути виділені і очищені від гібридомної культури різними добре відомих методами. Такі методи виділення включають афінну хроматографію на сефарозі з білком А, ексклюзійну хроматографію і іонообмінну хроматографію (див., наприклад, Соїїдап стор. 2.7.1-2.7.12 і стор. 2.9.1-2.9.3; Ваїпев5 еї аї., "Риніїїсайоп ої Іттиподіобиїйп С (ду, в

Меїпосд3з іп МоїІесшціаг Віоіоду, Те Нитапа Ргез5, Іпс., Мої. 10, стор. 79-104, 1992).

Після одержання поліклональні, моноклональні антитіла або антитіла, вироблені фагами, спочатку тестують на специфічне зв'язування з МАБР-2. Для визначення антитіл, що специфічно зв'язуються з МАБР-2, можна використовувати множину різних способів, відомих фахівцю в даній галузі техніки. Ілюстративні приклади аналізів, що проводяться стандартними способами, включають вестерн-блот або аналіз імунопреципітації (наприклад, як описано в

А!Їзире! еї аї), імуноелектрофорез, імуноферментний аналіз (ІФА), дот-блотинг, аналіз пригнічення або конкурентний аналіз (як описано в Нагіом/ і І апа, Апііїбодіеє: А І аброгафгу

Мапиа!ї, Соїй Зргіпд Нагрог Гарогаїогу Ргез55, 1988). Після визначення антитіл, здатних специфічно зв'язуватися з МАБР-2, анти-МАБР-2 антитіла тестують на можливість функціонувати як інгібуючий МАБР-2 агент одним з декількох методів оцінки, таким як, наприклад, аналіз лектин-специфічного розщеплення С4 (описаний у прикладі 2), аналіз відкладення СЗБ (описаний у прикладі 2) або аналіз відкладення С46Б (описаний у прикладі 2).

Спорідненість зв'язування анти-МА5Р-2 моноклональних антитіл може бути легко визначена фахівцем у даній галузі техніки (див., наприклад, 5саїспага А., МУ Асай. з5сі. 51:660-672, 1949).

В одному з варіантів здійснення моноклональні анти-МА5БР-2 антитіла, використовувані в способах за даним винаходом, зв'язуються з МА5Р-2 зі спорідненістю зв'язування «100 нмоль, переважно «10 нмоль і більш переважно «2 нмоль.

ХИМЕРНІ/ГУМАНІЗОВАНІ АНТИТІЛА

Моноклональні антитіла, використовувані в способі за даним винаходом, включають химерні антитіла, у яких частина важкого і/або легкого ланцюга є ідентичною або гомологічною відповідним послідовностям в антитілах, які одержані з конкретного виду або належать до конкретного класу або підкласу антитіл, у той час як інша частина ланцюга (ланцюгів) є ідентичною або гомологічною відповідним послідовностям антитіл, які виділені з іншого виду або належать до іншого класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл (патент

США Мо 4,816,567, Сарійу; і Моїтізоп 5.І... еї аї., Ргос. Маг! Асад. 5сі. ОБА, 81:6851-6855, 1984).

Одна з форм химерного антитіла, використовуваного в даному винаході, представлена гуманізованим моноклональним анти-МАБР-2 антитілом. Гуманізовані форми нелюдських (наприклад, мишачих) антитіл представлені химерними антитілами, які містять мінімальну послідовність, виділену з нелюдського імуноглобуліну. Гуманізовані моноклональні антитіла одержують шляхом перенесення нелюдських (наприклад, мишачих) областей, що визначають комплементарність (СОК), з варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів імуноглобуліну миші в людський варіабельний домен. Як правило, залишки людських антитіл потім заміщають у каркасних областях нелюдських прототипів. Більше того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які не виявляються в антитілах реципієнта або в антитілах донора. Дані модифікації проводяться з метою подальшого поліпшення ефективності антитіл. У загальному випадку, гуманізоване антитіло може містити по суті всі з щонайменше одного і, як правило, двох варіабельні доменів, у яких усі або по суті усі гіперваріабельні петлі відповідають петлям нелюдського імуноглобуліну і всі або по суті всі Ем-каркасні області є областями з послідовності людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло може також містити щонайменше частину константної області імуноглобуліну (Ес), як правило людського імуноглобуліну. Докладний опис можна знайти в ЧЩопез еї аї., Маїиге, 321:522-525, 1986; Неісптапп еї а!., Маїшиге, 332:323-329, 1988; Ргезіа, Ст. Ор. Бігисі. Віо!., 2:593-596, 1992.

Гуманізовані антитіла, використовувані в даному винаході включають людські моноклональні антитіла, що включають щонайменше МА5БР-2-зв'язуючу ділянку СОКНЗ. Крім того, Рс-ділянки можуть бути замінені таким чином, щоб продукувалися ІдА або ІдМ, а також людські дб антитіла. Таким чином, гуманізовані антитіла знайдуть, зокрема, клінічне застосування, оскільки вони будуть специфічно розпізнавати людський МА5Р-2, не викликаючи у людини імунної відповіді проти самого антитіла. Як наслідок, вони краще придатні для введення людині /л у//о, особливо, коли потрібне повторне або тривале введення.

Приклад одержання гуманізованого анти-МА5Р-2 антитіла з мишачого моноклонального 60 анти-МАБР-2 антитіла наведений в прикладі 6. Методи одержання гуманізованих моноклональних антитіл також описані, наприклад, в Щдопе5 Р.Т. еї аї., Маїиге, 321:522, 1986;

Сапег Р. еї аї!., Ргос. Маг. Асад. сі. ОБА, 89:4285, 1992; Запапи ..5., Стії. Веу. Віоїесн. 12:437, 1992; Біпдег І.І. еї аї., У. Іттип. 150:2844, 1993; Бицаніг (єд.), Апіїбоду Епдіпеегіпуд Ргоїосо!в,

Нитапа Ргезз, Іпс., 1995; КеїЇеу, "Епдіпеегіпд Тнегарешіс Апііродієв", іп Ргоїєїп Епдіпеегіпд:

Ргіпсірієх апа Ргасіїсе, Сівеіапа еї аї. (вдв.), дойп УМУПеу в 5Бопв, Іпс., радез5 399-434, 1996; і в патенті США Мо 5,693,762, Оцееп, 1997. Крім того, існують комерційні організації, які синтезують гуманізовані антитіла зі специфічних ділянок антитіла, наприклад Ргоїєїп Оезідп І арх (Мошипіаїп

Мієм, СА).

РЕКОМБІНАНТНІ АНТИТІЛА

Анти-МАБ5БР-2 антитіла також можуть бути одержані за допомогою рекомбінантних методів.

Наприклад, людські антитіла можуть бути одержані з використанням експресійної бібліотеки людського імуноглобуліну (доступні, наприклад, в бігаїадепе, Согр., І а доПа, СА) для одержання фрагментів людських антитіл (МН, Мі, Ем, Ба, Раб або Р(аб)2). Ці фрагмента потім використовуються для конструювання повноцінних людських антитіл методами, аналогічними методам, використовуваним для одержання химерних антитіл.

АНТИІДІОТИПІЧНІ АНТИТІЛА

Після визначення анти-МА5Р-2 антитіл з потрібною інгібуючою активністю, ці антитіла можна використовувати для одержання антиідіотипічних антитіл, які схожі з частиною МА5Р-2, методами, добре відомими в даній галузі. Див., наприклад, Сгеепзрап М.5. єї аї., ЕАБЕВ 9. 17:437, 1993. Наприклад, антитіла, які зв'язуються з МА5Р-2 і конкурентно пригнічують МА5Р-2- білкові взаємодії, необхідні для активації комплементу, можуть бути використані для одержання антиідіотипічних антитіл, які мають подібність з МВІ -зв'язуючою ділянкою білка МА5Р-2 і, отже, зв'язуються і нейтралізують зв'язування лігандів МА5Р-2, таких як, наприклад, МВІ..

ФРАГМЕНТИ ІМУНОГЛОБУЛІНУ

Інгібуючі МАБР-2 агенти, використовувані в способі за винаходом, охоплюють не тільки інтактні молекули імуноглобулінів, але і добре відомі фрагменти, включаючи Раб, Раб", Е(аб)»,

Каб)» і Ем-фрагменти, зсЕм-фрагменти, димери, лінійні антитіла, одноланцюжкові молекули антитіл і мультиспецифічні антитіла, сформовані із фрагментів антитіл.

Добре відомо, що тільки невелика частина молекули антитіла, паратоп, бере участь у зв'язуванні антитіла з його епітопом (див., наприклад, Сіагк М/.К., Те Ехрегітепаї! Роипаайоп5 ої Модет Іттипоіоду, УМіеу 5 Боп5, Іпс., МУ, 1986). Ділянки рЕс і Ес антитіла є ефекторами класичного шляху активації комплементу, але не беруть участь у зв'язування антигенів.

Антитіло, від якого ферментативно відщеплена ділянка рЕс або яке було продуковане без ділянки рЕс, позначене Е(аб)г-фрагментом і містить обидві антигензв'язувальні ділянки інтактного антитіла. Виділений фрагмент Е(аб)» належить до бівалентного моноклонального фрагмента через наявність двох антигензв'язувальних ділянок. Аналогічно, антитіло, від якого ферментативно відщеплена ділянка Ес або яке було продуковане без ділянки Ес, позначене

Еаб-фрагментом і містить одну з антигензв'язувальних ділянок молекули інтактного антитіла.

Фрагменти антитіл можуть бути одержані шляхом протеолітичного гідролізу, такого як пепсиновий або папаїновий гідроліз цільних антитіл, стандартними способами. Наприклад, фрагменти антитіла можуть бути одержані ферментним розщепленням антитіл пепсином з одержанням фрагмента 55, позначеного К(аб)». Цей фрагмент може бути далі розщеплений за допомогою агента, що відновлює тіол, з одержанням 3,55 Рар' моновалентних фрагментів.

Необов'язково, реакцію розщеплення можна здійснювати з використанням групи, блокуючої сульфгідрильні групи, одержані в результаті розщеплення дисульфідних зв'язків. Як альтернатива, ферментне розщеплення за допомогою пепсину дає два моновалентних фрагменти Раб і фрагмент Ес. Ці способи описані, наприклад, у патенті США Мо 4,331,647,

Соідепрего; Мібзопоїйї А. єї аї., Агсп. Віоспет. Віорпуз. 89230, 1960; Ропег В.В., Віоспет. .. 73:119, 1959; Едеїтап еї аї!., в Меїйпод5 іп Еплутоїіоду 1:422, Асадетіс Ргез5, 1967; і в Соїїдап, стор. 2.8.1-2.8.10 і 2.10.-2.10.4.

У деяких варіантах здійснення використання фрагментів антитіл з відсутньою Ес-ділянкою є переважним, оскільки дозволяє уникнути активації класичного шляху комплементу, яка ініціюється шляхом зв'язування Ес з рецептором Есу. Існує декілька способів продукування

МоАр, яке не впливає на взаємодії рецептора Есу. Наприклад, Ес-ділянка моноклонального антитіла може бути видалена хімічним способом шляхом часткового розщеплення за участі протеолітичних ферментів (наприклад, розщеплення фіцином), з одержанням, наприклад, антигензв'язувальних фрагментів антитіл, таких як фрагменти Раб або К(аб)» (Маїапі М. еї аї.,

МОЇ. Іттипої. 28:69-71, 1991). Альтернативно, ізотип у4 людського ІДС, який не зв'язується з рецепторами Есу, може бути використаний для створення гуманізованого антитіла, як описано в 60 даній заявці. Антитіла, одноланцюжкові антитіла і антигензв'язувальні домени, у яких відсутній

Ес-домен, також можуть бути створені рекомбінантними методами, описаними в даній заявці.

ФРАГМЕНТИ ОДНОЛАНЦЮЖКОВИХ АНТИТІЛ

Альтернативно, можна створити МАБР-2-специфічні молекули, що зв'язують один поліпептидний ланцюг, у яких Ем-ділянки важкого і легкого ланцюгів зв'язані між собою. Ем- фрагменти можуть бути зв'язані за допомогою пептидного лінкера з утворенням одноланцюжкового антигензв'язувального білка (5СЕм). Такі одноланцюжкові антигензв'язувальні білки одержують шляхом створення структурного гена, що містить послідовності ДНК, кодуючі домени МН і Мі, зв'язані з олігонуклеотидом. Структурний ген вбудовують у вектор експресії, який потім вводять у клітину-хазяїна, таку як, БЕ. соїї.

Рекомбінантні клітини-хазяїни синтезують одиничний поліпептидний ланцюг з пептидним лінкером, що зв'язує два М-домени. Способи одержання 5сЕм описані, наприклад, в МУпйШому еї а!., "Мешод5: А Сотрапіоп їо Меїподвз іп Епгутоіоду", 2:97, 1991; Віга еї а!., 5сіепсе, 242:423, 1988; патент США Мо 4,946,7 78, І адпег; РаскК Р. еї а!ї., Віо/ТесппоїЇоду, 11:1271, 1993.

Як ілюстративний приклад, МАБЗР-2-специфічний 5сЕм можна одержувати, піддаючи лімфоцити впливу поліпептиду МА5Р-2 /п уйго і селекції бібліотек антитіл методом фагового дисплея у фагах або аналогічних векторах (наприклад, шляхом використання іммобілізованих або мічених білків або пептидів МАБР-2). Гени, кодуючі поліпептиди, що містять потенційні домени, які зв'язують поліпептиди МА5Р-2, можуть бути одержані шляхом скринінгу будь-яких пептидних бібліотек, відображених на фагу або бактеріях, таких як Е. соїї. Ці випадкові пептидні фагові бібліотеки можуть бути використані для скринінгу пептидів, які взаємодіють з МАЗР-2.

Методи створення і скринінгу таких випадкових пептидних дисплейних бібліотек добре відомі (див. патент США Мо 5,223,409, І агапег; патент США Мо 4,946,778, І аапег; патент США Мо 5,403,484, І агапег; патент США Мо 5,571,698, І агапег; і Кау еї аІ.,, Рпаде бізріау оїрерііде5 апа

Ргоївіп5 Асадетіс Ргев5, Іпс., 1996), а випадкові пептидні дисплейні бібліотеки і набори для скринінгу таких бібліотек є комерційно доступними, наприклад від СІ ОМТЕСН І абогаютгієв, Іпс. (Раїо АЮ, Саїї.), Іпийгодеп Іпс. (Зап Оієдо, Саїйї.), Мем/ Епдіапа Віоїарв, Іпс. (Ірем/ісп, Ма55.) і

Рпаптасіа І КВ Віотесппоіоду Іпс. (Різсаїамау, М.У.).

Іншою формою фрагмента анти-МАБР-2 антитіла, використовуваного в цьому аспекті даного винаходу, є пептид, кодуючий одну область, що визначає комплементарність (СОК), яка

Зо зв'язується з епітопом на антигені МА5Р-2 і пригнічує МАБР-2-залежну активацію комплементу.

СОК пептиди ("мінімальні одиниці розпізнавання") можуть бути одержані шляхом конструювання генів, кодуючих СОК антитіла, що представляє інтерес. Такі гени одержують, наприклад, методом полімеразної ланцюгової реакції для синтезу варіабельної ділянки із РНК клітини, продукуючої антитіла (див., наприклад, І аггіск еї аіІ., Меїподв5: А Сотрапіоп ою Меїносдз іп Епгутоіоду 2:106, 1991; Сошпепау-І исК, "Сепеїїс Мапіршіайоп ої Мопосіопа! Апііроадієв", в

Мопосіопаї! Апііродієв: Ргодисійп, Епаіпеегіпд апа Сіїпіса! Арріїсатіоп, Віцег єї аї. (єдв.), раде 166,

Сатрьгідде Опімегейу Ргевзв5, 1995; і УМага еї аї., "Сепеїїс Мапіршіанйоп апа Ехргевзвіоп ої

Апіїродієв", в Мопосіопаї! Апііродієв: Ргіпсіріє5 апа Арріїсайоп5, Вікси еї а!. (ед5.), раде 137, УМіІеу-

І ів5, Іпс., 1995).

Анти-МА5БР-2 антитіла, описані в даній заявці, вводять суб'єкту, що цього потребує, для пригнічення МА5Р-2-залежної активації комплементу. У деяких варіантах здійснення інгібуючий

МА5БР-2 агент являє собою людське або гуманізоване моноклональне анти-МАБ5Р-2 антитіло зі зниженою ефекторною функцією.

ПЕПТИДНІ ІНГІБІТОРИ

У деяких варіантах здійснення цього аспекту даного винаходу інгібуючий МАЗР-2 агент містить виділені пептидні інгібітори МА5Р-2, у тому числі виділені природні пептидні інгібітори і синтетичні пептидні інгібітори, які пригнічують систему МАЗР-2-залежної активації комплементу.

Як зазначено в даному описі, термін "виділені пептидні інгібітори МА5Р-2" стосується пептидів, які інгібують МАБР-2-залежну активацію комплементу шляхом зв'язування з МА5БР-2, конкуренції з МА5Р-2 за зв'язування з іншою молекулою розпізнавання (наприклад, МВІГ., Н- фіколіном, М-фіколіном або І-фіколіном) при активації лектинового шляху і/або шляхом прямої взаємодії з МА5БР-2, таким чином пригнічуючи МА5Р-2-залежну активацію комплементу, при цьому ці інгібітори є по суті чистими і практично не містять інші речовини, з якими вони можуть знаходитися в природних умовах, настільки, що є придатними для застосування за цільовим призначенням.

Пептидні інгібітори успішно використовуються /л умо з метою пригнічення білок-білкових взаємодій і каталітичної ділянки. Наприклад, пептидні інгібітори молекул адгезії, структурно споріднені ГЕА-1, нещодавно були схвалені для клінічного застосування при коагулопатії (Оптап Е.М. єї аІ., Єигорвап Неап -. 16:50-55, 1995). Було показано, що короткі лінійні пептиди бо («30 амінокислот) мають здатність попереджати або перешкоджати інтегринзалежній адгезії

(Мигауата 0. еї аї.,, 9. Віоспет. 120:445-51, 1996). Більш довгі пептиди, від 25 до 200 амінокислотних залишків, також успішно використовувалися для блокування інтегринзалежної адгезії (папа Г. еї аї., 9. Віої. Спет. 271(47):29953-57, 1996). Як правило, більш довгі пептидні інгібітори мають більш високу спорідненість і/або більш низькі швидкості дисоціації, ніж короткі пептиди, і, отже, можуть бути більш ефективними інгібіторами. Також було показано, що циклічні пептидні інгібітори є ефективними інгібіторами інтегринів /л у//о при лікуванні запальних захворювань людини (даскхоп О.У. еї аї., У. Мед. Спет. 40:3359-68, 1997). Один зі способів одержання циклічних пептидів включає синтез пептидів, у якому термінальні амінокислоти пептиду є цистеїнами, що дозволяє пептиду існувати в циклічній формі за рахунок утворення дисульфідних зв'язків між термінальними амінокислотами, що, як було показано, поліпшує спорідненість зв'язування і період напіввиведення /л у//о при лікуванні гемопоетичних неоплазій (наприклад, патент США Мо 6,649,592, І агвоп).

СИНТЕТИЧНІ ПЕПТИДНІ ІНГІБІТОРИ МА5Р-2

Пептиди, інгібуючі МАБР-2, використовувані в способах цього аспекту даного винаходу, являють собою амінокислотні послідовності, які імітують ділянки-мішені, важливі для функції

МА5БР-2. Розміри інгібуючих пептидів, використовуваних на практиці в способах за даним винаходом, знаходяться у межах від приблизно 5 амінокислот до приблизно 300 амінокислот. У таблиці З представлений список наведених як приклад інгібуючих пептидів, які можуть бути використані при практичному застосуванні цього аспекту даного винаходу. Інгібуючий МА5Р-2 пептид-кандидат може бути протестований на здатність функціонувати як інгібуючий МА5Р-2 агент в одному або більше аналізах, включаючи, наприклад, аналіз лектин-специфічного розщеплення С4 (описаний в прикладі 2) і аналіз відкладення СЗБ (описаний в прикладі 2).

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 пептиди одержують із поліпептидів МАЗР-2 і вибирають із повнорозмірного зрілого білюка МАБЗР-2 (ЗЕО ІЮ МО:6) або з конкретного домену білка МА5Р-2, такого як, наприклад, домен СИВІ (ЗЕО ІЮ МО:8), домен СОВІЄСЕ (ЗЕО ІЮ МО:9), домен ЕСЕ (5ЕО ІО МО:11) і домен серинової протеази (5ЕО ІО МО:12). Як описувалося раніше, було показано, що ділянки СОВЕСЕСИВІЇ необхідні для димеризації і зв'язування з МВІ. (Тпівїеп5 еї аї., зирга). Зокрема, у дослідженні з ідентифікації людини, що несе гомозиготну заміну Азр105 на СІу105, яка приводить до втрати МА5Р-2 з комплексу МВІ,, було показано, що

Зо пептидна послідовність ТРКЗОММ (5ЕО І МО:16) у домені СОВІ МАЗР-2 бере участь у зв'язуванні з МВІ. (Зіепдаага-Редегзеп К. єї аї., Мем Епдіапа У). Меа. 349:554-560, 2003).

У деяких варіантах здійснення пептиди, інгібуючі МАБР-2, одержували з лектинових пептидів, які зв'язуються з МА5Р-2 і беруть участь в активації лектинового шляху комплементу.

Були визначені декілька різних лектинів, які беруть участь у цьому шляху, включаючи мананзв'язувальний лектин (МВІ)), І -фіколін, М-фіколін і Н-фіколін (Ікеда К. еї аї.,». ВіоїЇ. Спет. 262:7451-7454, 1987; Маїзизніа М. еї а!., У. Ехр. Мед. 176:1497-2284, 2000; Маїзизніа М. еїаї.,».

Іттипої. 168:3502-3506, 2002). Ці лектини присутні в сироватці у вигляді олігомерів або гомотримерних субодиниць, кожна з яких має М-термінальні колагеноподібні волокна, з доменами упізнавання вуглеводнів. Було показано, що ці різні лектини зв'язуються з МА5Р-2, і комплекс лектин/МмМА5Р-2 активує комплемент через розщеплення білків С4 і С2. Н-фіколін має амінокислотну термінальну ділянку з 24 амінокислот, колагеноподібний домен з 11 повторами

Спіу-Хаа-Уаа, шийковий домен з 12 амінокислот і фібриногеноподібний домен зі 207 амінокислот (Маїзибпйа М. еї аї., У. Іттипої. 168:3502-3506, 2002). Н-фіколін зв'язується з СІСМАс і аглютинує людські еритроцити, покриті ЛПС, одержані з 5. урпітигпит, 5. тіппезоїа і Е. сої.

Було показано, що Н-фіколін зв'язується з МАБР-2 і МАр 19 і активує лектиновий шлях комплементу. /й. І -фіколін/Р35 також зв'язується з СІСМАс і, як було показано, утворює зв'язки з

МА5Р-2 і МАр19 у людській сироватці, і цей комплекс активує лектиновий шлях комплементу (Маїзихпйа М. еї аї., 9У. Іттипої. 164:2281, 2000). Відповідно, інгібуючі МАБР-2 пептиди, використовувані в даному винаході, можуть містити ділянку, що складається з щонайменше 5 амінокислот, вибраних з білка МВІ (5ЕО ІЮО МО:21), білка Н-фіколін (номер доступу в Сепрапк

ММ 173452), білка М-фіколін (номер доступу в Сепрапк 000602) і білка І-фіколін (номер доступу сепрапк ММ 015838).

Більш конкретно, учені ідентифікували зв'язуючу МА5Р-2 ділянку в МВІ, що складається з 12 триплетів Сіу-х-У "ЯКО по ТК СЕК ЕР ОСИ НИ ГО РОСІЇ КІС РОС МОСС РБа 5О0СА

РКа ока роа ке" (ЗЕО ІЮ МО:26), які розташовані між шарнірною і шийковою ділянками в С- термінальній частині колагеноподібного домену МВР (Умаїїїв МК. еї аї., У. ВіоЇ. Спет. 279:14065, 2004). Ця зв'язуюча МА5Р-2 ділянка є також дуже консервативною у людського Н-фіколіну і людського І -фіколіну. Описана консенсусна ділянка зв'язування, яка представлена у всіх трьох лектинових білках, що містить амінокислотну послідовність "ОСК-Х-СР" (ЗЕО І МО:22), де 60 буква "О" означає гідроксипролін, а буква "Х" являє собою гідрофобний залишок (Умаїїї5 еї аї.,

2004, в5ирга). Відповідно, у деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 пептиди, використовувані в цьому аспекті даного винаходу, мають у довжину щонайменше 6 амінокислот і містять ЗЕО ІЮ МО:22. Було показано, що пептиди, одержані з МВІ, які включають амінокислотну послідовність "БІ В ОО СРО СКІ СРО а" (5ЕО ІО МО:24), зв'язуються з МАЗР- 2 іп міо (УМаїйй5, еї аі,, 2004, 5ирга). Для посилення зв'язування з МАБР-2 можуть бути синтезовані пептиди, фланковані двома триплетами СРО на кожному кінці ("«ЯРО СРО СІ В

СО аРО КІ РО СОР ОСР 0", 5ЕО ІЮО МО:25) для підвищення ймовірності утворення потрійних спіралей, виявлених у нативного білка МВІ. (як описано в Умаїйй5 М. еї аї., У. Віої. Спет. 279:14065, 2004).

Інгібуючі МА5Р-2 пептиди також можуть бути одержані з людського Н-фіколіну, який включає послідовність "СЧАО 250 СЕК БАО СРО СРО СРО ЯКМ РК СБО 200" (ЗЕО ІЮ МО:27), з консенсусної МАБР-2-зв'язуючої ділянки в Н-фіколіні. Також включені пептиди, одержані з людського І-фіколіну, який включає послідовність "Я4СО СІ1О пАО ОК СЕА сТМ ОКА СЕН

СРО СРО КА ПРО РМ ПСАО СЕС" (ЗЕО ІЮ МО:28), з консенсусної МАЗР-2-зв'язуючої ділянки в І -фіколіні.

Інгібуючі МАБР-2 пептиди також можуть бути одержані із сайта розщеплення С4, такого як " ОВАГЕІП РМАМТІКАМАРЕЇ МЕ!" (ЗЕО ІЮ МО:29), який є сайтом розщеплення С4, зв'язаним з

С-термінальною частиною антитромбіну ПІ (Сіомег 6.1. єї аї., Мої. Іттипої. 251261 (1988)).

ТАБЛИЦЯ З

НАВЕДЕНІ ЯК ПРИКЛАД ІНГІБУЮЧІ МАЗР-2 ПЕПТИДИ

ЗЕО Ір МО:22 рак-х-аР, . . ,; пн . пкт Синтетичний пептид, консенсусна ділянка зв'язування з гідрофобним аміноксилотним залишком аів-са о-аРО-СКІ-аРО-а МАБР-2

СРОСРО утворення потрійних спіралей

ЗЕО Ір МО:26 екравраткаЕкКаЕРООСІ ВИ. .

ОСРОСКІСРОСМОСРУЗСЗОСРК | Лодські МВР триплети 1-17 сока,ароако5

Пр ожююевосноз люееенеюттяня садоаБОоаЕКаАОСРОаЧРОССРОС Людський Н-фіколін (Наїака) кМмаРКкаЕоаро

ЗЕО Ір МО:28

ЕВНаРОСРОСКАСРОСРМИадОСсСЕО

ТАБЛИЦЯ З

НАВЕДЕНІ ЯК ПРИКЛАД ІНГІБУЮЧІ МАЗР-2 ПЕПТИДИ

Бош 00

КЗ5АУМСТКІ МСМО

ЗЕО ІЮ МО:73

ТСЕРОТТЕКОКСМТонОСОаБООКЗА ЗОМІ-2М (укорочений варіант, середня довжина)

УСсТКкІмУСсМО

Пептиди, одержані з сайта розщеплення С4, а також інші пептиди, інгібуючі ділянку серинової протеази МА5Р-2, можуть бути хімічно модифіковані таким чином, щоб вони стали необоротно діючими інгібіторами протеази. Наприклад, придатні модифікації можуть включати, без обмеження, галогенметилкетони (Вг, СІ, І, Е) на С-термінальному кінці, А5р або Сім, або можуть бути приєднані до функціональних бічних ланцюгів; галогенацетилові (або інші а- галогенацетилові) групи на аміногрупах або інших функціональних бічних ланцюгах; епоксид- або імінвмісні групи на аміно- або карбокситермінальних кінцях або функціональних бічних ланцюгах; або складні ефіри, імідати на аміно- або карбокситермінальних кінцях або функціональних бічних ланцюгах. Такі модифікації можуть забезпечувати перевагу при необоротному пригніченні ферменту за рахунок ковалентного приєднання пептиду. Це може привести до зменшення ефективної дози і/або зниження частоти введення пептидного інгібітору.

Додатково до описаних вище інгібуючих пептидів, інгібуючі МАБР-2 пептиди, використовувані в способі за даним винаходом, включають пептиди, що містять МА5Р-2- зв'язуючу ділянку СОКЗ в анти-МА5Р-2 МоАБ, одержаному описаним у даній заявці способом.

Послідовність ділянок СОК для застосування в синтезі пептидів може бути визначена відомими в даній галузі способами. Варіабельна ділянка важкого ланцюга являє собою пептид, довжина якого звичайно знаходиться в межах від 100 до 150 амінокислот. Варіабельна ділянка легкого ланцюга являє собою пептид, довжина якого звичайно знаходиться в межах від 80 до 130 амінокислот. Послідовності СОК усередині варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів включають послідовності, що складаються тільки з приблизно 3-25 амінокислот, які можуть бути легко секвеновані фахівцем у даній галузі техніки.

Фахівцям у даній галузі техніки відомо, що по суті гомологічні варіанти описаних вище інгібуючих МА5Р-2 пептидів також будуть проявляти МА5Р-2-інгібуючу активність. Ілюстративні варіанти включають, без обмеження, пептиди, що містять вставки, делеції, заміни і/або додаткові амінокислоти на карбокситермінальних або амінотермінальних ділянках заявлених пептидів, і їх суміші. Відповідно, такі гомологічні пептиди, що мають МАБ5БР-2-інгібуючу активність, також передбачаються для використання в способах за даним винаходом. Описані

Зо пептиди також можуть включати повторювані мотиви і інші модифікації з консервативними замінами. Консервативні варіанти описані в даній заявці і включають заміну однієї амінокислоти іншою амінокислотою з аналогічним зарядом, аналогічного розміру, з аналогічною гідрофобністю і т. д.

Інгібуючі МАБР-2 пептиди можуть бути модифіковані для збільшення розчинності і/або одержання максимального позитивного або негативного заряду для посилення подібності з сегментом в інтактному білку. Похідне може мати або не мати точну первинну амінокислотну структуру пептиду, розкритого в даній заявці, за умови, що це похідне залишається функціонально активним відносно інгібування МАБР-2. Модифікації можуть включати заміну амінокислоти однією з добре відомих двадцяти амінокислот або будь-якою іншою амінокислотою, дериватизованою або заміщеною амінокислотою з додатковими необхідними характеристиками, такими як стійкість до ферментного розщеплення, або О-амінокислотою, або заміну іншою молекулою або сполукою, такою як вуглевод, що імітує природну конформацію і функцію амінокислоти, амінокислот або пептиду; делецію амінокислоти; вставку однієї із двадцяти добре відомих амінокислот або будь-якої іншої амінокислоти, дериватизованої або заміщеної амінокислоти з додатковими необхідними характеристиками, такими як стійкість до ферментного розщеплення, або Ю-амінокислоти, або заміну іншою молекулою або сполукою, такою як вуглевод, що імітує природну конформацію їі функцію амінокислоти, амінокислот або пептиду; або заміну іншою молекулою або сполукою, такою як вуглевод або мономер нуклеїнової кислоти, що імітує природну конформацію, розподіл зарядів і функцію батьківського пептиду. Пептиди також можуть бути модифіковані шляхом ацетилювання або амідування.

Синтез похідних інгібуючих пептидів може бути оснований на відомих методах біосинтезу пептидів, біосинтезу вуглеводів і т. п. Як відправну точку, фахівець може використовувати придатну комп'ютерну програму для визначення конформації пептиду, що представляє інтерес.

Після визначення конформації розкритого в даному описі пептиду, фахівець, використовуючи методи моделювання, може визначити тип замін, який необхідний на тій або іншій ділянці для одержання похідного, у якого збережена базова конформація і розподіл заряду, характерні для батьківського пептиду, але яке може мати характеристики, відсутні у батьківського пептиду або поліпшені в порівнянні з характеристиками батьківського пептиду. Після ідентифікації похідних молекул-кандидатів, ці похідні можуть бути протестовані за допомогою описаних у даному винаході аналізів для визначення їх здатності функціонувати як інгібуючі МА5Р-2 агенти.

СКРИНІНГ ІНГІБУЮЧИХ МА5БР-2 ПЕПТИДІВ

Для одержання і скринінгу пептидів, які імітують молекулярну структуру ключових ділянок зв'язування МАБР-2 і пригнічують МАБР-2-залежну активацію комплементу, можна використовувати методи молекулярного моделювання і раціонального молекулярного проектування. Молекулярні структури, використовувані для моделювання, включають ділянки

СОК анти-МА5Р-2 моноклональних антитіл, а також цільові області, відомі своєю важливістю для функціонування МА5Р-2, включаючи ділянку, необхідну для димеризації, ділянку, залучену у зв'язування МВ, і активну ділянку серинової протеази, як описано вище. Способи ідентифікації пептидів, які зв'язуються з конкретною мішенню, добре відомі в даній галузі.

Наприклад, для де помо конструювання макромолекулярних структур, таких як пептиди, що зв'язуються з конкретною молекулою, можна використовувати молекулярний імпринтинг. Див., наприклад, Зпеа К..)., "Моїесшіаг Ітрііпіїпуд ої Зупіпеїїс Меймогк Роїутетв: Те Ое Момо зупіпевів ої Масготоїіесціаг Віпаїпу апа Саїа|уїіс 5пев", ТАІР, 2:(5), 1994.

Як ілюстрація нижче наведений приклад одного зі способів одержання міметиків МА5Р-2- зв'язуючих пептидів. Функціональні мономери відомого МАБР-2-зв'язуючого пептиду або зв'язувальної ділянки анти-МА5Р-2 антитіла, які пригнічують активність МАЗР-2 (матриця)

Зо піддають полімеризації. Потім матрицю видаляють, після чого іде полімеризація другого класу мономерів у тому місці, звідки була видалена матриця, для створення нової молекули, що демонструє одну і більше необхідних властивостей, аналогічних властивостям матриці. Крім одержання пептидів, таким способом можуть бути одержані інші МАБР-2-зв'язуючі молекули, які є інгібуючими МАБР-2 агентами, такі як полісахариди, нуклеозиди, лікарські речовини, нуклеопротеїни, ліпопротеїни, вуглеводи, глікопротеїни, стероїди, ліпіди і інші біологічно активні речовини. Даний спосіб можна використовувати для створення великого різноманіття біологічних міметиків, які є більш стабільними, ніж їх природні прототипи, оскільки вони одержані методом вільнорадикальної полімеризації функціональних мономерів, утворюючи в результаті сполуку з каркасом, не схильним до біохімічного розкладання.

СИНТЕЗ ПЕПТИДІВ

Інгібуючі МА5БР-2 пептиди можуть бути одержані методами, добре відомими в даній галузі, такими як метод твердофазного синтезу, вперше описаний МеггіїйеІй, в У. Атег. Спет. Зоб. 85:2149-2154, 1963. За допомогою апарата 431А Рерійїде Зупіпезігег від Арріїєй Віозуєтет5 (Бобієг Сйпу, Саїй) можна виконувати автоматизований синтез відповідно до інструкцій виробника. Інші методи описані, наприклад, в Водап57Ку М. еї аї., Рерііїде Зупіпевзіб5, зесопа еайіоп, доп УМієу 5 Боп5, 1976, а також в інших роботах, відомих фахівцям у даній галузі техніки.

Пептиди також можуть бути одержані стандартними методами генної інженерії, відомими фахівцям у даній галузі техніки. Наприклад, пептид може бути одержаний у результаті ферментативного синтезу шляхом введення нуклеїнової кислоти, кодуючої пептид, у вектор експресії, що здійснює експресію ДНК і трансляцію цієї ДНК у пептид у присутності необхідних амінокислот. Потім пептид очищають за допомогою хроматографії або електрофорезу, або білка-носія, який може бути злитий, а надалі відщеплений від пептиду, шляхом вбудовування у вектор експресії послідовності нуклеїнової кислоти, кодуючої білок-носій, разом з кодуючою пептид послідовністю. Злитий білок-пептид може бути виділений за допомогою методів хроматографії, електрофорезу або імунологічних методів (наприклад, зв'язування білка-носія зі смолою за допомогою антитіла). Пептид може бути відщеплений хімічним методом або ферментативно, наприклад за допомогою гідролази.

Інгібуючі МА5БР-2 пептиди, використовувані в способі за винаходом, також можуть бути 60 одержані в рекомбінантних клітинах-хазяїнах за допомогою звичайних методів. Для експресії послідовності, кодуючої інгібуючі МАБР-2 пептиди, молекула нуклеїнової кислоти, кодуюча пептид, повинна бути функціонально зв'язана з регуляторними послідовностями, що контролюють транскрипційну експресію у векторі експресії, а потім впроваджена в клітину- хазяїна. Додатково до транскрипційних регулюючих послідовностей, таких як промотори і енхансери, вектори експресії можуть включати трансляційні регуляторні послідовності і маркерний ген, які є придатними для відбору клітин, що несуть вектор експресії.

Молекули нуклеїнових кислот, кодуючі інгібуючий МА5БР-2 пептид, можуть бути синтезовані за допомогою "генних машин" по протоколах, таких як фосфорамідний метод. Якщо для додатка, такого як синтез гена або фрагмент гена, необхідний хімічний синтез двониткової ДНК, то кожну комплементарну нитку синтезують окремо. Одержання коротких генів (від 60 до 80 пар основ) не викличе складностей і може бути виконане шляхом синтезування комплементарних ниток з наступним відпалом. Для одержання більш довгих генів синтетичні гени (двониткові) збирають у модульну форму з одноланцюжкових фрагментів довжиною від 20 до 100 нуклеотидів. Огляд синтезу полінуклеотидів можна знайти, наприклад, в сСіїсК апа Разхіегпак,

Моїесшіаг ВіоїесНпоіоду, Ргіпсірієз апа Арріїсайопв ої Весотбріпапі ОМА, АЗМ Ргезз, 1994; ПаКига

К. еї аІ., Аппи. Кем. Віоспет. 53:323, 1984; і Сійтіє 5. єї аїЇ., Ргос. Маг! Асай. сі. ОБА, 87:633, 1990.

НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНІ ІНГІБІТОРИ

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МА5Р-2 агенти являють собою низькомолекулярні інгібітори, включаючи природні і синтетичні речовини, що мають низьку молекулярну масу, такі як пептиди, пептидоміметики і непептидні інгібітори (включаючи олігонуклеотиди і органічні речовини). Низькомолекулярні інгібітори МАБР-2 можуть бути одержані на основі молекулярної структури варіабельних ділянок анти-МА5Р-2 антитіл.

Низькомолекулярні інгібітори також можуть бути сконструйовані і створені на основі кристалічної структури МАБР-2 за допомогою програм для комп'ютерного моделювання лікарських речовин (Кипія 1.0. еї аї., Зсіепсе, 257:1078, 1992). Описана кристалічна структура щурячого МА5Р-2 (Реїіпрегу Н. еї аІ., ЕМВО 4. 22:2348-2359, 2003). Використовуючи метод, описаний Кипі7 еї аЇ., координати кристалічної структури МАБР-2 вводять у комп'ютерну програму, таку як СОСК, яка на виході видає список низькомолекулярних структур, які, як

Зо передбачається, зв'язуються з МАЗР-2. Використання таких комп'ютерних програм добре відоме фахівцю в даній галузі техніки. Наприклад, кристалічна структура інгібітору протеази

НІМ-1 була використана для ідентифікації унікальних непептидних лігандів, які є інгібіторами протеази НІМ-1, шляхом оцінки сумісності речовин з бази даних Сатрбгідде СтгувзіаПодгарпіс зі зв'язувальним сайтом ферменту за допомогою програми СОСК (Кипіг 1.0. еї аї., у. Мої. Віої.

З5 0 М/:269-288, 1982; Оезіапаї» В.Г. єї аіІ., РМАБ, 87:6644-6648, 1990).

Список низькомолекулярних структур, ідентифікованих за допомогою комп'ютерних програм як потенційні інгібітори МА5Р-2, піддають скринінгу в аналізі зв'язування МА5Р-2, такому, як описано в прикладі 10. Ті малі молекули, які, як було визначено, зв'язуються з МА5Р-2, потім оцінюють у функціональному аналізі, такому, як описано в прикладі 2, для визначення їх здатності пригнічувати МА5Р-2-залежну активацію комплементу.

РОЗЧИННІ РЕЦЕПТОРИ МАЗБР-2

Вважається, що інші придатні інгібуючі МАБР-2 агенти включають розчинні рецептори

МАБ5Р-2, які можуть бути одержані методами, добре відомими фахівцю в даній галузі техніки.

ІНГІБІТОРИ ЕКСПРЕСІЇ МА5Р-2

В іншому варіанті здійснення цього аспекту винаходу, інгібуючий МА5Р-2 агент являє собою інгібітор експресії МА5Р-2, здатний пригнічувати МА5БР-2-залежну активацію комплементу. При практичному застосуванні цього аспекту здійснення даного аспекту винаходу характерні інгібітори експресії МА5БР-2 включають молекули антисмислової нуклеїнової кислоти МА5Р-2 (такі як антисмислова мРНК, антисмислова ДНК або антисмислові олігонуклеотиди), рибозими

МА5Р-2 і молекули РНКі МА5Р-2.

Антисмислові молекули РНК і ДНК прямо блокують трансляцію МРНК МА5БР-2 шляхом гібридизації з МРНК МАБ5Р-2, запобігаючи трансляції білела МАБР-2. Молекула антисмислової нуклеїнової кислоти може бути сконструйована різними способами, і вона здатна перешкоджати експресії МАБР-2. Наприклад, молекула антисмислової нуклеїнової кислоти може бути сконструйована шляхом інвертування кодуючої ділянки (або її частини) КДНК МА5БР-2 (ЗЕО ІЮ

МО:4) відносно її нормальної орієнтації при транскрипції, що забезпечує транскрипцію її комплементу.

Звичайно молекула антисмислової нуклеїнової кислоти є ідентичною щонайменше частині цільового гена або генів. Однак для пригнічення експресії цільового гена нуклеїнова кислота не 60 обов'язково повинна бути абсолютно ідентичною його нуклеотидній послідовності. Як правило,

чим коротше послідовність антисмислової нуклеїнової кислоти, тим більш високу гомологію вона повинна мати. Мінімальний відсоток ідентичності звичайно становить не менше приблизно 65 95, але більш високий відсоток дозволяє досягати більш ефективного пригнічення експресії ендогенної послідовності. Відсоток ідентичності, що суттєво перевищує приблизно 80 95, звичайно є переважним, хоча значення в інтервалі від приблизно 95 95 до повної ідентичності є найбільш переважними.

Молекула антисмислової нуклеїнової кислоти не обов'язково повинна мати інтрон або екзон такої ж структури, як у цільового гена; некодуючі сегменти цільового гена можуть бути так само ефективні в досягненні антисмислового пригнічення експресії цільового гена, як і кодуючі сегменти. Як молекула антисмислової нуклеїнової кислоти може бути використана послідовність ДНК з 8 або більше нуклеотидів, хоча переважною є більш довга послідовність. У даному винаході типовим прикладом інгібуючого МАБР-2 агента є молекула антисмислової нуклеїнової кислоти МА5Р-2, яка щонайменше на 90 95 ідентична комплементарній КДНК МА5Р- 2, що складається з послідовності нуклеїнової кислоти, представленої в 5ЕБЕО ІЮО МоО:4.

Послідовність нуклеїнової кислоти, представлена в 5ЕБО ІЮ МО:4, кодує білок МАБР-2, що складається з амінокислотної послідовності, представленої в зЕО ІЮ МОБ.

Націлювання антисмислових олігонуклеотидів на зв'язування з МРНК МА5БР-2 являє собою інший механізм, який може бути використаний для зниження рівня синтезу білка МА5Р-2.

Наприклад, синтез полігалактуронази і ацетилхолінового мускаринового рецептора типу 2 пригнічується антисмисловими олігонуклеотидами, спрямованими на відповідні послідовності

МРНК (патент США Мо 5,739,119, Спепо, і патент США Мо 5,759,829, ЗпемлтакКег). Крім того, приклад антисмислового пригнічення був продемонстрований для ядерного білка цикліну, гена множинної лікарської стійкості (МОС1), ІСАМ-1, Е-селектину, З5ТК-1, стріарного рецептора

ГАМК» і людського ЕСЕ (див., наприклад, патент США Мо 5,801,154, Вагасспіпі; патент США Мо 5,789,573, ВаКег; патент США Мо 5,718,709, Сопвідіпе; і патент США Мо 5,610,288, Кеибепвіевїп).

Була описана система, яка дозволяє фахівцю в даній галузі техніки визначати, які олігонуклеотиди можуть бути використані для цілей даного винаходу, яка включає зондування придатних сайтів у цільовій МРНК шляхом розщеплення РНКазою Н як індикатором доступності послідовностей у транскриптах. зспе!т М. еї а!., Мисієїс Асіаз Кез. 26:5079-5085, 1998; ПІсуа єї

Зо а!., Мисієїс Асідб5 Нев5. 29:3665-3673, 2001. Суміш антисмислових олігонуклеотидів, що є комплементарними відносно певних ділянок транскрипту МА5Р-2, додають у клітинні екстракти, експресуючі МАБ5Р-2, такі як гепатоцити, і здійснюють гібридизацію для створення сайтів, чутливих до дії РНКази Н. Цей спосіб може бути об'єднаний з вибором послідовностей за допомогою комп'ютерної програми, яка може передбачити вибір оптимальних послідовностей для антисмислових композицій на основі їх відносної здатності формувати димери, шпильки або інші вторинні структури, які могли б знизити або запобігти специфічному зв'язуванню з цільовою

МРНК у клітині-хазяїні. Аналіз цих вторинних структур і вибір цільових сайтів можуть бути виконані за допомогою комп'ютерної програми ФО ІСО для аналізу праймерів (КУсПІЇїК І., 1997) і комп'ютерної програми ВІГАБТМ 2.0.5 (Акб5спиці 5.Е. еї а!., Мисі. Асід5 Кев5. 25:3389-3402, 1997).

Антисмислові сполуки, спрямовані на цільову послідовність, переважно містять від приблизно 8 до приблизно 50 нуклеотидів. Антисмислові олігонуклеотиди, що містять від приблизно 9 до приблизно 35 нуклеотидів, є особливо переважними. Автори винаходу розглядають усі олігонуклеотидні композиції в межах від 9 до 35 нуклеотидів (тобто, що мають у довжину 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 або 35 нуклеотидів) як найбільш переважні для способів за винаходом, основаних на застосуванні антисмислових олігонуклеотидів. Найбільш переважними цільовими ділянками мРНК МА5Р-2 є ті, які розташовані в безпосередній близькості від кодону ініціації трансляції А!Їс, і послідовності, які по суті комплементарні 5'-ділянкам мРНК, наприклад між -10 ії 410 ділянками нуклеотидної послідовності гена МАЗР-2 (ЗЕО ІЮ МО:4). Приклади інгібіторів експресії МАБР-2 представлені в ТАБЛИЦІ 4.

ТАБЛИЦЯ 4

ПРИКЛАДИ ІНГІБІТОРІВ ЕКСПРЕСІЇ МАБР-2

МО:4 (ЗЕО ІЮ МО:4), кюдуюча СОВІЕСЕ

ЗЕО ІЮ МО:З1 Нуклеотиди 12-45 послідовності ЗЕО ІЮ МО:4, 5-СсапсаСАСАССАТОАСаСсТастад включаючи сайт ініціації трансляції МА5Р-2 состоСтасас-3' смисловий

ЗЕО ІЮ МО:32 Нуклеотиди 361-396 послідовності БЕО ІЮ МО:4, 5-ВАСАТТАССТТОСОСТОСОСАСТО кодуючої ділянку, що містить МВІ -зв'язуючий сайт

СААдСОаАсСАдс-3! МА5Р-2 (смисловий)

ЗЕО ІЮ МО:ЗЗ3 . . І в-АССАССССТОААТАСССАСОССС Пуклеотиди біси послідовності БЕОЦЮ МОМ,

СТАТСССААА-З ду ділянку, що містить домен

Як вказувалося вище, використовуваний у даному описі термін "олігонуклеотид" означає олігомер або полімер рибонуклеїнової кислоти (РНК) або дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) або їх міметики. Цей термін також охоплює такі олігонуклеобази, які складаються з природних нуклеотидів, цукрів і ковалентних міжнуклеозидних (остов) зв'язків, а також олігонуклеотидів, які мають модифікації, що не зустрічаються в природі. Такі модифікації дозволяють вводити певні потрібні властивості, яких не мають природні олігонуклеотиди, такі як зменшення токсичних властивостей, поліпшення стійкості до розщеплення нуклеазою і підвищення клітинного захоплення. В ілюстративних варіантах здійснення антисмислові сполуки за винаходом відрізняються від нативної ДНК модифікаціями фосфодіефірного остова, призначеними для продовження життєвого циклу антисмислового олігонуклеотиду, в якому фосфатні замісники замінені фосфоротіоатами. Подібним чином, один або обидва кінці олігонуклеотиду можуть бути заміщені одним або більше акридиновими похідними, які інтеркалюють між сусідніми парами нуклеотидів у ланцюзі нуклеїнової кислоти.

Іншою альтернативою використання антисмислових елементів є використання "РНК інтерференції" (РНКІ). Дволанцюжкові РНК (длРНК) можуть провокувати сайленсинг генів у ссавців /л м/о. Природна функція РНКІ їі косупресія, очевидно, є захистом геному від інвазії мобільних генетичних елементів, таких як ретротранспозони і віруси, продукуючі аберантні РНК або длРНК у клітині-хазяїні при їх активації (див., наприклад, Уепзеп .. еї аї., Маї. Ссепеї. 21:209- 12, 1999). Молекула дволанцюжкової РНК може бути одержана в процесі синтезу двох ланцюгів

РНК, здатних формувати молекули дволанцюжкової РНК, кожний з яких має довжину від приблизно 19 до 25 (наприклад, 19-23 нуклеотидів). Наприклад, молекула длРНК, використовувана в способах за винаходом, може містити РНК, відповідну послідовності і її комплементу, наведеним у таблиці 4. Переважно, щонайменше один ланцюг РНК має 3 "липкий" кінець із 1-5 нуклеотидів. Синтезовані ланцюги РНК комбінують в умовах, при яких утворюється дволанцюжкова молекула. Послідовність РНК може містити щонайменше частини з 8 нуклеотидів послідовності зЕО ІЮ МО:4 з загальною довжиною 25 нуклеотидів або менше.

Конструювання послідовностей міРНК для заданої мішені добре відоме фахівцю в даній галузі

Зо техніки. Існують комерційні організації, що займаються конструюванням послідовностей міРНК, які гарантують щонайменше 70 95 нокдаун експресії (Оіадеп, МаіІепсіа, Саїїю).

ДлЛРНК може бути введена у формі фармацевтичної композиції відомими способами, за допомогою яких нуклеїнову кислоту вводять у необхідну клітину-мішень. Загальновідомі способи перенесення генів включають фосфат-кальцієвий спосіб, ОЕАЕ-декстрановий спосіб, електропорацію, мікроін'єкцію і способи з використанням вірусів. Такі способи описані в А!йзиреї еї аі., Сцтепі Ргоїюсої5 іп Моїіесшіаг Віоіоду, допп УМіеу б Бопв, Іпс., 1993.

Для зменшення кількості і/або біологічної активності МА5Р-2 також можуть бути використані рибозими, такі як рибозими, націлені на мРНК МА5БР-2. Рибозими являють собою каталітичні молекули РНК, здатні розщеплювати молекули нуклеїнової кислоти з послідовністю, повністю або частково гомологічною послідовності рибозиму. Існує можливість конструювання рибозимних трансгенів, кодуючих рибозими РНК, які утворюють специфічні пари з цільовою РНК і розщеплюють фосфодіефірний остов у специфічній ділянці, внаслідок чого відбувається функціональна інактивація цільової РНК. При здійсненні такого розщеплення сам рибозим не міняється і, таким чином, здатний до рециклінгу і розщеплення інших молекул. Включення рибозимних послідовностей в антисмислові РНК обумовлює активність розщеплення РНК,

таким чином збільшуючи активність антисмислових конструкцій.

Рибозими, використовувані у винаході, звичайно містять ділянку, що гібридизується, із щонайменше дев'яти нуклеотидів, яка є комплементарною нуклеотидній послідовності щонайменше частини цільової МРНК МА5Р-2, і каталітичну область, яка здатна до розщеплення цільової МРНК (див. ЕРА Мо 0 321 201; УМО 88/04300; Назеїйонй .). еї аІ., Майшге, 334:585-591, 1988;

Еєедог М.У. еї аї!., Ргос. Май). Асад. осі. ОБА, 87:1668-1672, 1990; Сесі Т.В. єї аї., Апп. Веу.

Віоспет. 55:599-629, 1986).

Рибозими можуть або бути націлені безпосередньо на клітини у формі олігонуклеотидів

РНК, що включають рибозимні послідовності, або бути введені в клітину як вектор експресії, кодуючий необхідну рибозимну РНК. Рибозими можна використовувати і застосовувати практично так само, як описано для антисмислових полінуклеотидів.

Антисмислові РНК і ДНК, рибозими і молекули РНКІі, використовувані в способах за винаходом, можуть бути одержані будь-яким методом, відомим у даній галузі, для синтезу молекул ДНК і РНК. Вони включають методи хімічного синтезу олігодезоксирибонуклеотидів і олігорибонуклеотидів, широко відомі в галузі техніки, такі як твердофазний фосфорамідний хімічний синтез. Альтернативно, молекули РНК можуть бути одержані за допомогою /л Уйго і /п мімо транскрипції послідовностей ДНК, кодуючих молекулу антисмислової РНК. Такі послідовності ДНК можуть бути введені в широкий спектр векторів, які включають придатні промотори РНК полімерази, такі як промотори полімерази Т7 або 5Рб. Альтернативно, конструкції антисмислової кДНК, синтезуючі антисмислову РНК конститутивно або індуцибельно, залежно від використовуваного промотору, можуть стабільно вводитися в клітинні лінії.

Різні добре відомі модифікації молекул ДНК можуть бути введені для підвищення стабільності і періоду напіввиведення. Придатні модифікації включають, без обмеження, додавання фланкуючих послідовностей рибонуклеотидів або дезоксирибонуклеотидів до 5'- мМабо З3-кінців молекули або використання фосфоротіоату або 2-О-метилу замість фосфодіефірних зв'язків усередині олігодезоксирибонуклеотидного каркаса.

М. ФАРМАЦЕВТИЧНІ КОМПОЗИЦІЇ і СПОСОБИ ДОСТАВКИ

ДОЗУВАННЯ

Зо В іншому аспекті даного винаходу надаються композиції для пригнічення побічних ефектів

МА5Р-2-залежної активації комплементу у суб'єкта, що страждає захворюванням або станом, як розкрито в даному описі, які містять терапевтично ефективну кількість інгібуючого МАЗР-2 агента і фармацевтично прийнятний носій. Інгібуючі МАБР-2 агенти можуть вводитися суб'єкту, що цього потребує, в терапевтично ефективних дозах для лікування або поліпшення станів, асоційованих з МА5БР-2-залежною активацією комплементу. Під терапевтично ефективною дозою мається на увазі кількість інгібуючого МАБР-2 агента, достатня для полегшення симптомів, асоційованих із захворюванням або станом.

Токсичність і терапевтична ефективність інгібуючих МАБР-2 агентів може бути визначена стандартними фармацевтичними процедурами з використанням експериментальних тваринних моделей, таких як МАБР-2-/- мишача модель, експресуюча людський трансген МАЗБР-2, описаний у прикладі 1. Використовуючи такі тваринні моделі, значення МОАБЕЇ (рівень відсутності спостережуваних побічних ефектів) і МЕО (мінімальна ефективна доза) можуть бути визначені стандартними способами. Відношення дози між ефектами МОАБЇ і МЕО є терапевтичним відношенням, яке виражається як відношення МОАЕЇ/МЕО. Інгібуючі МАБР-2 агенти, що демонструють високі терапевтичні відношення або показники, є найбільш переважними. Дані, одержані в результаті вивчення клітинних культур і тварин, можуть бути використані для визначення діапазону доз для людини. Дози інгібуючого МА5БР-2 агента переважно знаходяться у діапазоні концентрацій, спостережуваних у кровотоку, які включають

МЕО з мінімальною токсичністю або без неї. Доза може варіювати усередині цього діапазону залежно від лікарської форми або використовуваного способу введення.

У деяких варіантах здійснення, терапевтична ефективність інгібуючих МА5Р-2 агентів для лікування, пригнічення, полегшення або профілактики фіброзу у ссавця, що страждає або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням, визначають за допомогою одного або більше із наступного: зменшення в нирковій тканині одного або більше маркерів запалення або рубцювання (наприклад, ТОЕДр-1, СТЕР, 1-6, апоптозу, фібронектину, ламініну, колагенів, ЕМТ, інфільтруючих макрофагів); зменшення рівня вивільнення в сечу або плазму розчинних маркерів запалення і фіброзного ниркового захворювання (наприклад шляхом вимірювання ниркової екскреторної функції).

Для складу будь-якої сполуки, терапевтично ефективну дозу можна оцінити за допомогою 60 тваринних моделей. Наприклад, доза може бути підібрана на тваринній моделі таким чином,

щоб досягався діапазон концентрацій, циркулюючих у плазмі, який включає МЕО. Кількісні рівні інгібуючого МА5БР-2 агента в плазмі також можуть бути виміряні, наприклад, за допомогою високоефективної рідинної хроматографії.

Крім вивчення токсичності, ефективну дозу також можна оцінити по кількості МА5Р-2 білка у живого суб'єкта і спорідненості зв'язування інгібуючого МАЗР-2 агента. Було показано, що рівні

МА5Р-2 у здорових людей у сироватці є низькими, у межах 500 нг/мл, при цьому рівні МАЗР-2 у конкретного суб'єкта можуть бути визначені методами кількісного аналізу МАБР-2, як описано в

Мої Іег-Кгібїепзеп М. еї аї., У. Іттипої. Меїйосв5, 282:159-167, 2003.

Звичайно, доза композицій, що вводяться, які містять інгібуючі МАЗР-2 агенти, варіює залежно від таких факторів як вік суб'єкта, його маса тіла, ріст, стать, загальний стан здоров'я і історія хвороби. Як ілюстрація, інгібуючі МА5Р-2 агенти, такі як анти-МА5Р-2 антитіла, можуть вводитися в межах дози від приблизно 0,010 до 10,0 мг/кг, переважно від 0,010 до 1,0 мг/кг, більш переважно від 0,010 до 0,1 мг/кг маси тіла суб'єкта. У деяких варіантах здійснення композиція містить комбінацію анти-МА5Р-2 антитіл і інгібуючих МАЗР-2 пептидів.

Терапевтична ефективність інгібуючих МАЗР-2 композицій і способів за винаходом для даного суб'єкта, а також придатні дози можуть бути визначені за допомогою аналізу реакцій комплементу, добре відомих фахівцю в даній галузі техніки. Комплемент генерує численні специфічні продукти. За останні десять років були розроблені точні і специфічні аналізи, які є комерційно доступними для більшості з таких продуктів активації, включаючи малі фрагменти активації СЗа, Сда і С5а і великі фрагменти активації іС3Зр, С4а, ВЬ і 5С56-9. У більшості цих аналізів використовуються моноклональні антитіла, які реагують на нові антигени (неоантигени), розташовані на цих фрагментах, але не на нативні білки, з яких вони утворилися, що робить ці аналізи досить доступними і специфічними. У більшості випадків використовують метод ІФА, хоча для СЗа і Сба дотепер усе ще іноді використовується радіоімунологічний аналіз. Останній аналіз використовується для вимірювання рівня як непроцесованих фрагментів, так і їх «езАго' фрагментів, які є основними формами, що виявляються в кров'яному руслі. Непроцесовані фрагменти і Сбадеєслю швидко виводяться через зв'язування з рецепторами клітинної поверхні і, отже, присутні в дуже низьких концентраціях, тоді як СЗадезлю не зв'язується з клітинами і накопичується в плазмі. Вимірювання СЗа є чутливим, незалежним індикатором активації

Зо комплементу. Альтернативний шлях активації комплементу може бути визначений шляхом вимірювання фрагмента Вр. Виявлення розчинних продуктів активації мембраноатакуючого шляху, 5С5Б-9, є свідченням того, що комплемент повністю активований. Оскільки обидва, лектиновий і класичний, шляхи активації генерують одні і ті ж продукти активації, С4а і С44, вимірювання цих двох фрагментів не дає ніякої інформації про те, який із цих двох шляхів активації комплементу згенерував продукти активації.

Пригнічення МАБР-2-залежної активації комплементу характеризується щонайменше однією з наступних змін у компоненті системи комплементу, які виникають у результаті введення інгібуючого МА5бР-2 агента згідно зі способами за винаходом: пригнічення генерації або продукування продуктів системи МА5Р-2-залежної активації комплементу: С4Б, СЗа, Сба або С56-9 (виміряні, наприклад, як описано в прикладі 2), зменшення рівня розщеплення Са і відкладення С4Бб (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 10) або зменшення рівня розщеплення СЗЗ і відкладення СЗБ (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 10).

ДОДАТКОВІ АГЕНТИ

У деяких варіантах здійснення способи профілактики, лікування, купірування і/або пригнічення фіброзу і або запалення включають введення пригнічуючого МА5БР-2 агента (наприклад, інгібуючого МА5Р-2 антитіла) у рамках терапевтичної схеми з однією або більше іншими лікарськими речовинами, біологічними речовинами або терапевтичними методами лікування, що придатні для пригнічення фіброзу і/або запалення. У деяких варіантах здійснення додаткові лікарська, біологічна речовина або терапевтичний метод лікування є придатними для конкретних симптомів, асоційованих з захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням. Як приклад, інгібуючі МА5Р-2 антитіла можна вводити як частину терапевтичної схеми разом з одним або більше імунодепресантами, такими як метотрексат, циклофосфамід, азатіоприн і мікофеноляту мофетил. Як інший приклад, інгібуючі

МА5Р-2 антитіла можна вводити як частину терапевтичної схеми разом з одним або більше агентами, призначеними для посилення кровотоку (наприклад, ніфедипін, амлодипін, дилтіазем, фелодипін або нікардипін). Як інший приклад, інгібуючі МА5БР-2 антитіла можна вводити як частину терапевтичної схеми разом з одним або більше агентами, призначеними для зменшення фіброзу, такими як а-пеніциламін, колхіцин, РОМА, релаксин, циклоспорин, ТОЕр- блокатори і/або р38 МАРК-блокатори. Як додатковий приклад, інгібуючі МА5Р-2 антитіла можна 60 вводити як частину терапевтичної схеми разом зі стероїдами або бронхорозширювачами.

Композиції і способи, що використовують інгібуючі МА5Р-2 агенти (наприклад, інгібуючі

МА5БР-2 антитіла), необов'язково можуть включати один або більше додаткових терапевтичних агентів, які здатні підсилювати активність інгібуючого МАБР-2 агента або які забезпечують споріднені терапевтичні функції, забезпечуючи додатковий або синергетичний ефект.

Наприклад, у контексті лікування суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, один або більше інгібуючих агентів

МАБР-2 можна вводити в комбінації (включаючи спільне введення) з одним або більше додатковими антифіброзними агентами і/або одним або більше протизапальними агентами і/або імунодепресантами.

Інгібуючі МА5Р-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАЗР-2 антитіла) можна застосовувати в комбінації з іншими терапевтичними агентами, такими як імунодепресанти загальної дії, такі як кортикостероїди, імунодепресанти або цитотоксичні агенти і/або антифіброзні агенти.

ФАРМАЦЕВТИЧНІ НОСІЇ ї ЗАСОБИ ДОСТАВКИ

Як правило, композиції інгібуючих МА5БР-2 агентів за даним винаходом, об'єднані з будь- яким іншим вибраним терапевтичним агентом, містяться в придатному фармацевтично прийнятному носії. Носій є нетоксичним, біосумісним і вибирається так, щоб можна було уникнути шкідливого впливу біологічної активності інгібуючого МА5БР-2 агента (і будь-якого іншого терапевтичного агента, включеного в комбінацію). Типові фармацевтично прийнятні носії для пептидів описані в патенті США Мо 5,211,657, Матада. Анти-МАБ5Р-2 антитіла і інгібуючі пептиди, використовувані в даному винаході, можуть бути складені у тверду, напівтверду, гелеподібну, рідку і газоподібну лікарську форму, таку як таблетки, капсули, порошки, гранули, мазі, розчини, супозиторії, інгаляції і ін'єкції для перорального, парентерального або хірургічного введення. Даний винахід також передбачає місцеве введення композицій шляхом нанесення покриття на медичні інструменти і т. п.

Придатними носіями для парентерального введення шляхом ін'єкції, інфузії або зрошення і місцевої доставки є дистильована вода, забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчин

Рінгера, нормальний або з лактатом, розчин ЮО-глюкози, розчин Хенка або пропандіол. Крім того, стерильні нелеткі масла можуть застосовуватися як розчинник або суспендуюче середовище.

Для цієї мети можна використовувати будь-яке біосумісне масло, включаючи синтетичні моно-

Зо або дигліцериди. Крім того, жирні кислоти, такі як олеїнова кислота, можуть застосовуватися для приготування придатних для ін'єкції препаратів. Носій і агент можуть бути змішані у вигляді рідких розчинів, суспензій, здатних або не здатних до полімеризації гелів, паст або бальзамів.

Носії також можуть містити засіб доставки для уповільнення (тобто пролонгування, затримання або контролю) доставки агента (агентів) або для посилення доставки, поглинання, стабілізації або фармакокінетичних параметрів терапевтичного агента (агентів). Такий засіб доставки може включати, без обмеження, мікрочастинки, мікросфери, наносфери або наночастинки, що складаються з білків, ліпосом, вуглеводів, синтетичних органічних речовин, неорганічних сполук, полімерних або співполімерних гідрогелів і полімерних міцел. Придатні системи доставки на основі гідрогелів і міцел включають співполімери РЕО:РНВ'РЕО і співполімерні/циклодекстринові комплекси, описані в УУО 2004/009664 А2, і РЕО і

РЕО/циклодекстринові комплекси, описані в публікації заявки на патент США Мо 2002/0019369

А1. Такі гідрогелі можуть бути введені шляхом місцевих ін'єкцій в область передбачуваного впливу або підшкірно, або внутрішньом'язово для забезпечення уповільненого вивільнення агента.

У випадку внутрішньосуглобової доставки інгібуючий МАЗР-2 агент може бути доставлений у вищеописаних призначених для ін'єкцій рідких або гелевих носіях, вищеописаних призначених для ін'єкцій засобах доставки, що забезпечують уповільнене вивільнення, або носіях на основі гіалуронової кислоти або її похідних.

У випадку перорального введення непептидергічних агентів інгібуючий МА5Р-2 агент може бути доставлений в інертних наповнювачах або розчинниках, таких як сахароза, кукурудзяний крохмаль або целюлоза.

У випадку місцевого введення інгібуючий МА5Р-2 агент може бути доставлений у складі мазі, лосьйону, крему, гелю, крапель, супозиторія, спрею, рідини або порошку, або в гелевих або мікрокапсульних системах доставки за допомогою трансдермального пластиру.

Різні назальні і легеневі системи доставки, включаючи аерозолі, дозуючі інгалятори, інгалятори сухого порошку і розпилювачі, знаходяться у стадії розробки і можуть відповідним чином бути адаптовані для доставки препарату за даним винаходом за допомогою аерозолю, інгалятора або засобу доставки у вигляді розпилювача, відповідно.

У випадку інтратекальної (ІТ) або інтрацеребровентрикулярної (ІСМ) доставки можуть бути 60 використані відповідні стерильні системи доставки (наприклад, рідини, гелі, суспензії і т. д.).

Композиції за даним винаходом також можуть включати біосумісні наповнювачі, такі як диспергуючі або зволожуючі агенти, суспендуючі агенти, розчинники, буфери, агенти, що підсилюють проникнення, емульгатори, зв'язуючі засоби, загусники, ароматизуючі речовини (для перорального введення).

ФАРМАЦЕВТИЧНІ НОСІЇ ДЛЯ АНТИТІЛ І ПЕПТИДІВ

Більш конкретно, відносно анти-МА5бР-2 антитіл і інгібуючих пептидів, наведені як приклад склади можуть вводитися парентерально у вигляді дозованих ін'єкцій розчину або суспензії сполуки у фізіологічно прийнятному розчиннику з фармацевтичним носієм, який може являти собою стерильну рідину, таку як вода, масло, фізіологічний розчин, гліцерин або етанол. У композиціях, що містять анти-МА5БР-2 антитіла і інгібуючі пептиди, додатково можуть бути присутні допоміжні речовини, такі як зволожуючі або емульгуючі агенти, поверхнево-активні речовини, регулюючі рН речовини і т. п. Додаткові компоненти фармацевтичних композицій включають вуглеводневу суміш (таку як тваринного, рослинного або синтетичного походження), наприклад соєву олію і мінеральне масло. Для розчинів, що вводяться шляхом ін'єкцій, переважними рідкими носіями, як правило, є гліколі, такі як пропіленгліколь і поліетиленгліколь.

Анти-МАБР-2 антитіла і інгібуючі пептиди також можуть вводитися у формі ін'єкцій речовин уповільненого всмоктування або імплантованого препарату, який може бути складений з можливістю уповільненого або пульсуючого вивільнення активних агентів.

ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЙНЯТНІ НОСІЇ ДЛЯ ІНГІБІТОРІВ ЕКСПРЕСІЇ

Що стосується інгібіторів експресії, використовуваних у способах за винаходом, надаються композиції, які містять інгібітор експресії, як описано вище, і фармацевтично прийнятний носій або розчинник. Композиції можуть додатково містити колоїдну дисперсійну систему.

Фармацевтичні композиції, які містять інгібітори експресії, можуть включати, без винятку, склади, що містять розчини, емульсії і ліпосоми. Такі композиції можуть бути одержані з різних компонентів, що включають, без обмеження, попередньо приготовлені рідини, самоемульговані тверді речовини і самоемульговані напівтверді речовини. Приготування таких композицій звичайно включає комбінування інгібітору експресії з одним або більше з наступного: буфери, антиоксиданти, низькомолекулярні поліпептиди, білки, амінокислоти, вуглеводи, включаючи глюкозу, сахарозу або декстрин, хелатуючі агенти, такі як ЕОТА, глютатіон і інші стабілізатори і

Зо наповнювачі. Нейтральні забуферені фізіологічні розчини або фізіологічні розчини, змішані з неспецифічним сироватковим альбуміном, є прикладами відповідних розчинників.

У деяких варіантах здійснення композиції можуть бути приготовлені і складені у вигляді емульсій, які звичайно є гетерогенними системами однієї рідкої речовини, диспергованої в іншій у вигляді мікрокрапель (див., Іїа5оп, в Рпаптасеціїса! бозаде ЕРогіт5, Мої. 1, Нієдег апа ВапкКег (єаз.), Магсек ЮОекКег, Іпс., М.МУ., 1988). Прикладами природних емульгуючих агентів, використовуваних для складів у вигляді емульсій, є гуміарабік, бджолиний віск, ланолін, лецитин і фосфатиди.

В одному з варіантів здійснення композиції, які містять нуклеїнові кислоти, можуть бути складені у вигляді мікроемульсій. Мікроемульсія, як зазначено в даному описі, являє собою систему з води, масла і амфіфільної речовини, яка являє собою єдиний оптично однорідний і термодинамічно стабільний рідкий склад (див. Мо5оїї, в Рпаппасешіса! бозаде ЕРогтв, МоЇ1.1).

Спосіб за винаходом також може включати використання ліпосом для перенесення і доставки антисмислових олігонуклеотидів у потрібну ділянку.

Фармацевтичні композиції і склади інгібіторів експресії для топічного нанесення можуть включати трансдермальні пластири, мазі, лосьйони, креми, гелі, краплі, супозиторії, спреї, рідини і порошки. Також можуть бути використані традиційні фармацевтичні носії, наприклад на основі води, порошків або масел, загусники і т. п.

СПОСОБИ ВВЕДЕННЯ

Фармацевтичні композиції, які містять інгібуючі МА5Р-2 агенти, можуть бути введені різними

БО способами, залежно від того, який зі способів введення, місцевий або системний, є більш придатним для захворювання, що підлягає лікуванню. Далі, композиції за даним винаходом можуть бути доставлені шляхом покривання або включення композицій у поверхню імплантованого медичного пристрою або в сам цей пристрій.

СИСТЕМНА ДОСТАВКА

Відповідно до даного опису, термін "системна доставка" або "системне введення" включає, без обмеження, пероральний і парентеральний способи введення, включаючи внутрішньом'язовий (ІМ), підшкірний, внутрішньовенний (ІМ), внутрішньоартеріальний, інгаляційний, під'язиковий, букальний, топічне нанесення, трансдермальний, назальний, ректальний, вагінальний і інші способи введення, які забезпечують ефективне диспергування 60 доставленого агента в одній або численних ділянках передбачуваного терапевтичного впливу.

Переважні способи системної доставки цих композицій включають внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, підшкірний і інгаляційний. Буде зрозуміло, що точний спосіб системного введення вибраних агентів, використовуваних у конкретних композиціях за даним винаходом, може бути визначений з урахуванням схильності цього агента до метаболічної трансформації способом, асоційованим з даним способом введення. Наприклад, найбільш придатним способом введення пептидергічних агентів є будь-який, крім перорального.

Антитіла і поліпептиди, інгібуючі МАБР-2, можуть бути доставлені суб'єкту, що цього потребує, будь-яким придатним способом. Способи доставки антитіл і поліпептидів МАБР-2 включають пероральне, пульмональне, парентеральне введення (наприклад, внутрішньом'язові, інтраперитонеальні, внутрішньовенні (ІМ) або підшкірні ін'єкції), інгаляцію (наприклад, тонкоподрібненого порошку), трансдермальне, назальне, вагінальне, ректальне або підшкірне введення, і можуть бути приготовлені в лікарських формах, придатних для кожного зі способів введення.

Як ілюстративний приклад, антитіла і пептиди, інгібуючі МАБР-2, можуть бути введені в живий організм шляхом нанесення на слизову оболонку, що має здатність абсорбувати поліпептиди, наприклад слизову носа, шлунково-кишкового тракту і прямої кишки. Поліпептиди звичайно наносять на абсорбуючу слизову оболонку в комбінації з агентом, що підсилює проникність (див., наприклад, І ее М.Н.Г.., Стії. Кем. Тег. Огид Саїтіег Зуб. 5:69, 1988; І ее М.Н.Г..,

У. СопігоПей Веївазе, 13:213, 1990; ее М.Н.Г., Ед., Рерііїде апа Ргоїєїп Огид ОеїЇїмегу, Магсеї

ОекКег, Мем мок (1991); Оероег А.О. еї аї., У. СопігоПей Кеїєазе, 13:241, 1990). Наприклад,

ЗТОНЕ являє собою синтетичне похідне фусидової кислоти, стероїдної поверхнево-активної речовини, яка по своїй структурі аналогічна солям жовчних кислот і яка використовується як агент, що підсилює проникність при назальній доставці (І еє М/.А., Віорпагт. 22, Мом./Оеєс. 1990).

Антитіла і поліпептиди, інгібуючі МАБР-2, можуть бути введені в комбінації з іншою молекулою, наприклад ліпідом, для захисту поліпептидів від ферментної деградації. Наприклад, ковалентне прикріплення полімерів, зокрема поліетиленгліколю (РЕС), використовували для захисту деяких білків від ферментного гідролізу в організмі і, таким чином, продовжували період їх напіввиведення (Епегіде5 Р. єї аї., У. СопігоПей Веїєазе, 11:139, 1990). Описані багато які полімерні системи для доставки білків (Ває У.Н. еї аї.,У9. СопігоїІей КеїІеазе, 9:271, 1989; Ногі Є.

Зо еї аі., Рнапт. Незв. 6:813, 1989; МатакКауча І. єї аї., У. Рнапт. сі. 79:505, 1990; Мознпініго І. еї аї., у.

Сопігоїїєд Веїєазе, 10:195, 1989; Азапо М. евї аї.,. СопігоїІєй Веїєазе, 9:111, 1989; Козепбіаїй 9. еї аї., у. СопігоїІєд Веїєазе, 9:195, 1989; Макіпо К., У. Сопігоей Неїєазе 12:235, 1990; ТаКаКита

У. еї а!., У. Рпагт. 5сі. 78:117, 1989; Такакига У. єї аї., 9. Рнатт. 5сі. 78:219, 1989).

Нещодавно були розроблені ліпосоми з підвищеною стабільністю в сироватці і збільшеним періодом напіввиведення (див., наприклад, патент США Мо 5,741,516, УМерб). Крім того, були розглянуті різні способи виробництва ліпосом і ліпосомоподібних препаратів як потенційних носіїв лікарських речовин (див., наприклад, патент США Мо 5,567,434, 520Ка; патент США Мо 5,552,157, Маді; патент США Мо 5,565,213, МаКатогі; патент США Мо 5,738,868, ЗПпіпКагепко; і патент США Мо 5,795,587, сао).

Для трансдермального нанесення антитіла і поліпептиди, інгібуючі МА5ЗР-2, можуть бути об'єднані з іншими придатними інгредієнтами, такими як носії і/або ад'юванти. Такі інгредієнти використовуються незалежно від їх природи, за винятком того, що вони повинні бути фармацевтично прийнятними для передбачуваного введення і не повинні зменшувати вплив активних інгредієнтів композиції. Приклади придатних основ включають креми, мазі, гелі або суспензії, що містять або не містять очищений колаген. Антитіла і поліпептиди, інгібуючі МА5Р- 2, також можуть бути імпрегновані в трансдермальні пластири, пов'язки і бандажі, переважно в рідкій або напіврідкій формі.

Композиції за даним винаходом можуть вводитися системно через визначені проміжки часу, необхідні для підтримання необхідного рівня терапевтичного ефекту. Наприклад, склади можуть вводитися шляхом підшкірних ін'єкцій кожні два-чотири тижні або через менш часті проміжки часу. Схема дозування визначається лікарем з урахуванням різних факторів, які можуть впливати на дію комбінації агентів. Ці фактори включають ступінь прогресування захворювання, що підлягає лікуванню, вік пацієнта, його стать і масу тіла і інші клінічні фактори.

Доза кожного окремого агента буде мінятися залежно від функції інгібуючого МА5Р-2 агента, включеного в композицію, а також від наявності і природи будь-якого засобу для доставки лікарської речовини (наприклад, засобу для доставки з уповільненим вивільненням). Крім того, дозування можна коректувати з урахуванням частоти введення і фармакокінетичної поведінки агента (агентів), що доставляється.

МІСЦЕВА ДОСТАВКА бо Використовуваний у даному описі термін "місцеве" охоплює нанесення препарату на або навколо області передбачуваного місцевого впливу і може включати, наприклад, топічну доставку на шкіру або іншу уражену тканину, офтальмологічну доставку, інтратекальне (ІТ), інтрацеребровентрикулярне (ІСМ), внутрішньосуглобове, внутрішньопорожнинне, внутрішньочерепне або внутрішньоміхурове введення, розміщення або зрошення. Місцеве введення може бути більш переважним з точки зору введення більш низьких доз, запобігання виникненню системних побічних ефектів і для більш точного контролю часу доставки і концентрації активних агентів у ділянці місцевої доставки. Місцеве введення передбачає відомі концентрації в цільовій області, незалежно від індивідуальних відмінностей між пацієнтами з точки зору метаболізму, кровообігу і т. д. Поліпшений контроль дозування також забезпечується прямою доставкою.

Місцева доставка інгібуючого МА5Р-2 агента може бути досягнута в контексті хірургічних методів лікування захворювань або розладів, викликаних або ускладнених фіброзом і/або запаленням, наприклад під час процедур, таких як операція.

СХЕМИ ЛІКУВАННЯ

У профілактичних цілях фармацевтичні композиції, які містять інгібуючий МА5БР-2 агент (наприклад, інгібуюче МАБР-2 антитіло), вводять суб'єкту, що схильний до або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням, у кількості, достатній для пригнічення фіброзу і/або запалення, таким чином усуваючи або зменшуючи ризик розвитку симптомів цього стану. У деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції вводять суб'єкту з підозрою на наявність захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням, або який вже страждає таким захворюванням або розладом, у терапевтично ефективній кількості, достатній для полегшення або щонайменше часткового зменшення симптоматики цього стану. Як у профілактичних, так і в терапевтичних цілях, композиції, які містять інгібуючий МАБР-2 агент, можуть вводитися декількома дозами до досягнення достатнього терапевтичного результату. Застосування інгібуючих МА5Р-2 композицій за даним винаходом може здійснюватися шляхом однократного введення композиції або обмеженої серії введень для лікування гострого стану, асоційованого з фіброзом і/або запаленням. Альтернативно, композиція може вводитися через визначені проміжки часу протягом тривалого часу для лікування хронічного стану, асоційованого з

Зо фіброзом і/або запаленням.

Як у профілактичних, так і в терапевтичних цілях, композиції, які містять інгібуючий МАЗР-2 агент, можуть вводитися декількома дозами до досягнення достатнього терапевтичного результату. В одному з варіантів здійснення, інгібуючий МА5Р-2 агент містить інгібуюче МАБР-2 антитіло, яке переважно може бути введене дорослому пацієнту (наприклад, дорослому пацієнту з середньою масою тіла 70 кг) у дозі в межах від 0,1 до 10000 мг, більш переважно від 1,0 до 5000 мг, більш переважно від 10,0 до 2000 мг, більш переважно від 10,0 до 1000 мг ії ще більш переважно від 50,0 до 500 мг. Для пацієнтів дитячого віку дозу можна коректувати пропорційно масі тіла пацієнта. Застосування інгібуючих МАБР-2 композицій за даним винаходом може здійснюватися шляхом однократного введення композиції або обмеженої серії введень для лікування суб'єкта що страждає або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням. Альтернативно, композицію можна вводити через визначені проміжки часу, наприклад щодня, два рази на тиждень, раз на тиждень, через тиждень, раз на місяць, два рази на місяць, протягом тривалого часу для лікування суб'єкта що страждає або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням.

Як у профілактичних, так і в терапевтичних цілях, композиції, які містять інгібуючий МА5Р-2 агент, можуть вводитися декількома дозами до досягнення достатнього терапевтичного результату.

У деяких варіантах здійснення суб'єкта ідентифікують як такого, що має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом або запаленням, шляхом визначення наявності у суб'єкта одного або більше симптомів порушення функції нирок, оцінених, наприклад, шляхом вимірювання рівня креатиніну в сироватці, швидкості виведення креатиніну з сироватки, рівня азоту в сечі, білка в сечі і/або шляхом вимірювання одного або більше біомаркерів, асоційованих з захворюванням або ураженням нирок.

Способи оцінки функції нирок добре відомі в даній галузі і включають, без обмеження, вимірювання системного кров'яного тиску і гломерулярного капілярного тиску, протеїнурії (наприклад, альбумінурії), мікроскопічної і макроскопічної гематурії, рівня креатиніну в сироватці (наприклад, відповідно одній з формул оцінки функції нирок у людей, рівень креатиніну, що дорівнює 2,0 мг/дл, відповідає 50 96 нормальній функції нирок, а 4,0 мг/дл - 25 95), зниження бо швидкості клубочкової фільтрації (наприклад, швидкості кліренсу креатиніну) і ступінь канальцевого ушкодження. Наприклад, оцінка функції нирок може включати оцінку щонайменше однієї функції нирок з використанням біологічних і/або фізіологічних параметрів, таких як рівень креатиніну в сироватці крові, швидкість кліренсу креатиніну, секреція білка за 24 години, швидкість клубочкової фільтрації, співвідношення креатиніну і альбуміну в сечі, швидкість виведення альбуміну (наприклад, визначення ступеня фіброзу нирок шляхом вимірювання відкладення колагену і/або фібронектину).

МІ. ПРИКЛАДИ

Наведені нижче приклади є тільки ілюстрацією найкращого способу практичної реалізації даного винаходу і не повинні розглядатися як обмежуючі даний винахід. Усі згадані в даній заявці літературні джерела включені в даний опис у вигляді посилання.

ПРИКЛАД 1

У цьому прикладі описане одержання мишачої лінії, дефіцитної по МАБР-2 (МА5Р-2-/-), але повноцінної по МАр19 (МАр19-/).

Матеріали і методи

Цільовий вектор рКОо-МТКкМУ-1901 створювали для руйнування трьох екзонів, кодуючих С- термінальний кінець мишачого МАБР-2, включаючи екзон, який кодує домен серинової протеази, як показано на фіг. 3. РКО-МТКМУ-1901 використовували для трансфекції мишачої Е5 клітинної лінії Е14.1а (5М129 Оїа;)». Відбирали клони, стійкі до неоміцину і чутливі до тимідинкінази. 600 Е5-клонів піддавали скринінгу, і з них за допомогою саузерн-блот-аналізу ідентифікували і верифікували чотири різні клони, що містять необхідні селективні цільові і рекомбінантні події, як показано на фіг. 3. Шляхом перенесення ембріона із цих чотирьох позитивних клонів одержували химери. Потім химери піддали зворотному схрещуванню з фоновим фенотипом С57/ВІб6 з одержанням трансгенних особин чоловічої статі. Потім трансгенних особин чоловічої статі схрещували з жіночими з одержанням НЕ1 з 50 95 потомства, що проявляє гетерозиготність по порушеному гену МА5БР-2. Гетерозиготних мишей схрещували між собою з одержанням гомозиготного потомства, дефіцитного по МА5БР-2, з одержаним співвідношенням між гетерозиготними мишами і мишами дикого типу 1:2:1, відповідно.

Результати і фенотип

Одержаних у результаті гомозиготних МАБР-2-/- дефіцитних мишей, які виявилися

Зо життєздатними і фертильними, перевіряли на дефіцит по МАБР-2 за допомогою саузерн-блот- аналізу для підтвердження коректної цільової події, за допомогою нозерн-блот-аналізу для підтвердження відсутності мРНК МАБР-2 і за допомогою вестерн-блот-аналізу для підтвердження відсутності білка МА5Р-2 (дані не показані). Наявність мРНК Март9 і відсутність

МРНК МА5БР-2 далі підтверджували методом ПЛР-РЧ з розрізненням за часом на пристрої

ПопСусіег. Як і очікувалося, у МАЗР-2-/- мишей тривала експресія мРНК і білків Мар19, МА5Р-1 і МАБ5БР-3 (дані не показані). МАБР-2-/- мишей аналізували на наявність і надмірну кількість

МРНК пропердину, фактора В, фактора 0, С4, С2 і СЗ за допомогою аналізу ГідпіСусіег, і було знайдено, що вони ідентичні рівням, наявним у контрольних одноприплідних тварин дикого типу (дані не показані). Плазма гомозиготних МА5ЗР-2-/- мишей була повністю дефіцитною відносно активації комплементу, опосередкованої лектиновим шляхом, як описано нижче в прикладі 2.

Генерація МА5Р-2-/- лінії на чистому фоновому генотипі С57ВІ 6

МА5Р-2-/- мишей піддавали зворотному схрещуванню з чистою лінією С57ВІ 6 протягом дев'яти генерацій до використання МА5Р-2-/- лінії як експериментальної тваринної моделі.

Трансгенну мишачу лінію, яка являє собою мишачу МАЗР-2-/-, МАр19-/- лінію і яка експресує людський МАБР-2 трансген (мишачий МА5БР-2 нокаут і людський МА5Р-2 нокін), одержували наступним чином.

Матеріали і методи

Створювали міні-ген, коюдуючий людський МА5Р-2, названий "міні-пМАБР-2" (5ЕО ІО МО:49), як показано на фіг. 4, який включає промоторну область гена людського МАБ5Р-2, включаючи три перші екзони (екзон 1 - екзон 3), за якою іде послідовність КДНК, яка є кодуючою послідовністю з 8 послідовно розташованих екзонів, забезпечуючи кодування повнорозмірного білка МА5Р-2, що запускається ендогенним промотором. Конструкцію міні-ЛМА5Р-2 вводили в запліднені яйця МАБР-2-/-. щоб замінити дефіцитний мишачий МАБР-2 ген трансгенно експресованим людським МА5Р-2.

ПРИКЛАД 2

У цьому прикладі показано, що МАБР-2 потрібний для активації комплементу через лектиновий шлях.

Матеріали і методи

Аналіз розщеплення С4, специфічного для лектинового шляху бо Аналіз розщеплення С4 описаний в Регїегзеп еї аї.,.. Іпттипої. Меїйпоаз, 257:107 (2001), у якому вимірювали активацію лектинового шляху, ініційовану ліпотейхоєвою кислотою (І ТА) від о. ашеив, яка зв'язується з І -фіколіном. Аналіз, описаний Реїегзеп еї аї. (2001), адаптували для вимірювання активації лектинового шляху за допомогою МВІ шляхом нанесення на планшет

ЛПС ї манану або зимозану перед додаванням сироватки, одержаної від МА5Р-2-/- мишей, як описано нижче. Аналіз також модифікували для виключення можливості розщеплення С4 по класичному шляху. Це досягалося шляхом використання буфера для розведення зразка, що містить ТМ Масі, який забезпечував високу спорідненість зв'язування компонентів упізнавання лектинового шляху зі своїми лігандами, але запобігав активації ендогенного С4, таким чином виключаючи участь класичного шляху в результаті дисоціації комплексу С1. Коротко, у модифікованому аналізі зразки сироватки (розведені буфером з високим вмістом солі (1М масі) додавали в планшети, покриті лігандом, з наступним додаванням постійної кількості очищеного СА у буфері з фізіологічною концентрацією солі. Зв'язані комплекси упізнавання, що містять МАБР-2, розщеплюють С4, приводячи до відкладення С4р.

Способи аналізу 1) Титраційні мікропланшети Мипс Махізого (МахібЗогоФ, Мипс, кат. Мо 442404, Різпег

Зсіепійіс) покривали 1 мкг/мл мананом (М7504 5бідта) або будь-яким іншим лігандом (таким, як перераховані нижче), розведеним у буфері для нанесення покриття (15 мМ МаСОз, 35 мМ

Ммансо», рН 9,6).

В аналізі використовували наступні реагенти: а) манан (1 мкг на ямку манану (М7504 Зідта) в 100 мкл буфера для нанесення покриття); р) зимозан (1 мкг на ямку зимозану (бідта) в 100 мкл буфера для нанесення покриття); с) Г ТА (1 мкг на ямку в 100 мкл буфера для нанесення покриття або 2 мкг на ямку в 20 мкл метанолу); а) 1 мкг Н-фіколін-специфічного Маб 4Н5 у буфері для нанесення покриття; е) РЗА від Аегососсиз мігідапз (2 мкг на ямку в 100 мкл буфера для нанесення покриття);

І) 100 мкл на ямку 5. ашеих О5ЗМ20233, фіксованого у формаліні (ОЮ55о-0,5), у буфері для нанесення покриття. 2) Планшет інкубували протягом ночі при 4 "С.

З) Після нічної інкубації ділянки зв'язування білка, що залишилися, насичували шляхом

Зо інкубації планшетів з 0,1 95 НБА-ТВ5 блокувальним буфером (0,1 95 (в/о) НЗА в 10 мМ Ттів-СІ, 140 мм Масі, 1,5 мМ Мам», рН 7,4) протягом 1-3 годин, і потім планшети промивали три рази сумішшю ТВ5/Твін/Саг: (ТВ5 з 0,05 95 Твін 20 і 5 мМ Сасі», 1 мМ Мас», рН 7,4). 4) Зразки сироватки, що підлягають тестуванню, розбавляли в МВІ -зв'язуючому буфері (1М масі), і розведені зразки додавали в планшети і інкубували протягом ночі при 4 "С. Ямки, у які додавали тільки буфер, використовували як негативний контроль. 5) Після нічної інкубації при 4 "С, планшети тричі промивали сумішшю ТВ5/Івін/Саг:. Потім у планшет додавали людський С4 (1 мкг/мл розведеного в ВВ5 (4 мМ барбіталу, 145 мМ Масі, 2

ММ Сасі», 1 мМ Масі», рН 7,4) по 100 мкл на ямку) і інкубували протягом 90 хвилин при 37 "С.

Потім планшети знову тричі промивали сумішшю ТВ5/Твін/Саг». 6) Відкладення С4р визначали за допомогою кон'югованого з лужною фосфатазою курячого антилюдського С4с (розведеного у співвідношенні 1:1000 в ТВ5/Івін/Са?), що додавали в планшети і інкубували протягом 90 хв. при кімнатній температурі. Потім планшети знову тричі промивали сумішшю ТВ5/Твін/Саг». 7) Лужну фосфатазу детектували шляхом додавання 100 мкл розчину п- нітрофенілфосфатного субстрату, інкубації при кімнатній температурі протягом 20 хвилин і зчитування оптичної густини ОО на пристрої зчитування титраційних мікропланшетів.

Результати

На фіг. 5БА-В показане відкладення С46 на манані (фіг. 5А) і зимозані (фіг. 58) у розведених сироватках, одержаних від МАБР-2-/- (хрести), МАБР-2-/- (замкнені кільця) і МАБР-2-/- (замкнені трикутники) мишей. На фіг. 5С показана відносна активність С4-конвертази на планшетах, покритих зимозаном (білі стовпці) або мананом (темні стовпці) для МАБР-2-/-- мишей (п-5) ії МАБР-2-/- мишей (п-4) відносно мишей дикого типу (п-5), виміряна по відкладенню С4Бб, нормалізованого відносно сироватки мишей дикого типу. Планки погрішностей представляють стандартне відхилення. Як показано на фіг. 5А-С, у покритих мананом і зимозаном планшетах плазма, одержана від МАБР-2-/- мишей, є повністю дефіцитною по активації комплементу, опосередкованій лектиновим шляхом. Ці результати з очевидністю демонструють, що МА5БР-2, а не МАБР-1 або МАБбР-3, є ефекторним компонентом лектинового шляху.

Рекомбінантний МАБР-2 відновлює активацію С4, опосередковану лектиновим шляхом, у 60 сироватці, одержаній від МА5Р-2-/- мишей

Для встановлення факту, що відсутність у МАБР-2-/- мишей МА5БР-2 є безпосередньою причиною втрати активації С4, залежної від лектинового шляху, за допомогою описаного вище аналізу розщеплення С4 оцінювали вплив додавання рекомбінантного білка МАБР-2 у зразки сироватки. Рекомбінантні білки, функціонально активний мишачий МАБР-2 і каталітично неактивний мишачий МА5Р-2А (у якому сериновий залишок в активній ділянці домену серинової протеази заміщений залишком аланіну), одержували і очищали, як описано нижче в прикладі 3.

Об'єднану сироватку, одержану від чотирьох МАБР-2-/- мишей, попередньо інкубували з підвищенням концентрації рекомбінантного мишачого МА5Р-2 або неактивного рекомбінантного мишачого МА5Р-2А, і активність С4-конвертази оцінювали, як описано вище.

Результати

Як показано на фіг. 6, додавання функціонально активного мишачого рекомбінантного білка

МАБР-2 (показаного білими трикутниками) у сироватку, одержану від МАБР-2-/- мишей, відновлювало активацію С4, залежну від лектинового шляху, залежно від концентрації білка, при цьому каталітично неактивний мишачий білок МАБР-2А (показаний зірочками) не відновлював активацію С4. Результати, показані на фіг. б, нормалізували відносно активації С4, спостережуваної в об'єднаній сироватці мишей дикого типу (позначено пунктирною лінією).

ПРИКЛАД З

У цьому прикладі показана рекомбінантна експресія і продукування рекомбінантних повнорозмірних людських, щурячих і мишачих білків МА5Р-2, поліпептидів, похідних від МА5Р- 2, і каталітично неактивних мутантних форм МА5Р-2.

Експресія повнорозмірного людського, щурячого і мишачого МАБР-2

Повнорозмірну послідовність КДНК людського МАБР-2 (5ЕО ІЮ МО:4) також субклонували у вектор експресії рСІ-Мео ссавців (Рготеда), який керує еукаріотичною експресією під контролем

СММ енхансерної/промоторної області (описано в Кашїйтап К..). еї аї., Мисівїс Асід5 Кезеагсі, 19:4485-90, 1991; Кашїтап, Меїноад5 іп Епгутоіоду, 185:531-66 (1991)). Повнорозмірні мишачу

КДНК (ЗЕО ІЮ МО:50) і щурячу КДНК МАБР-2 (5ЕО ІЮ МО:53) субклонували у вектор експресії рЕО. Вектори експресії МА5БР-2 потім трансфікували в адгезивні лінії клітин яєчників китайського хом'ячка ОХВІ1 по стандартній процедурі трансфекції з використанням фосфату кальцію, що описана в Мапіаїй5 еї а!., 1989. Клітини, трансфіковані такими конструкціями, розвивалися дуже

Зо повільно, що можна пояснити цитотоксичністю кодованої протеази.

В іншому підході, конструкцію міні-гена (ЗЕО ІЮ МО:49), що містить людську КДНК МА5бР-2, керовану ендогенним промотором, піддавали тимчасовій трансфекції в клітинах яєчників китайського хом'ячка (СНО). Людський білок МАБР-2, секретований у культуральне середовище, виділяли за схемою, описаною нижче.

Експресія повнорозмірного каталітично неактивного МАБР-2

Обгрунтування

МАБР-2 активували шляхом аутокаталітичного розщеплення після зв'язування субкомпонентів розпізнавання МВІ. або фіколінів (або І-фіколіну, Н-фіколіну, або М-фіколіну) з відповідними їм вуглеводними молекулами. Аутокаталітичне розщеплення, що приводить до активації МА5Р-2, часто відбувається під час процедури виділення МА5Р-2 із сироватки або під час очищення після рекомбінантної експресії. Для одержання більш стабільного препарату білка для застосування як антигену каталітично неактивну форму МА5Р-2, позначену як МА5Р-2А, створювали шляхом заміщення залишку серину, який присутній у каталітичній тріаді домену протеази, залишком аланіну у щурів (5ЕО ІЮ МО:55 5егб617 на АїІаб17); у мишей (ЗЕО ІО МО:52 зЗегб617 на АІаб17) або у людини (ЗЕО ІЮ МО:6 Зегб18 на АїІаб18).

Для одержання каталітично неактивних людських і мишачих білків МА5Р-2А, здійснювали сайт-спрямований мутагенез, використовуючи олігонуклеотиди, представлені в таблиці 5.

Олігонуклеотиди, наведені в таблиці 5, створювали шляхом відпалу з ділянкою людської і мишачої кДНК, кодуючої ферментативно активний серин, а олігонуклеотид містив невідповідність для заміни кодону серину на кодон аланіну. Наприклад, ПЛР-олігонуклеотиди

ЗЕО ІЮ МО5:56-59 використовували в комбінації з лодською КДНК МАБР-2 (5ЕО ІЮО МО:4) для ампліфікації ділянки від старт-кодону до ферментативно активного серину і від серину до стоп- кодону для одержання повного відкритого зчитування з мутованого МАБР-2А, що містить мутацію Зегб18/АІаб18. Продукти ПЛР очищали після електрофорезу в агарозному гелі і одержання смуг, і одержували одиночні аденозинові перекриття, використовуючи стандартну процедуру нарощування. Потім МАБР-2А з доданим аденозином клонували у вектор РОЕМ-Т

Еазу і трансформували в Е. со).

Каталітично неактивний щурячий білок МАЗР-2А одержували, піддаючи 5ЕО ІЮ МО:64 і ЗЕО

ІО МО:65 дії кінази і відпалу шляхом об'єднання цих двох олігонуклеотидів у рівних молярних бо об'ємах, нагрівання при температурі 100 "С протягом 2 хвилин і повільного охолодження при кімнатній температурі. Одержаний у результаті відпалу фрагмент містив Р5И і Хбваї1 сумісні кінці і був вставлений замість фрагмента РеИ-Хра!1! КДНК щурячого МА5БР-2 дикого типу (ЗЕО ІЮ

МО:53) з одержанням щурячого МА5Р-2А. 5в-алдсстадСса,асАаа,асвсАа,аасаСАТТАСТаТттт-3 (5ЕО І МО:64);

Б-СТАБАААСАСТААТОССССТоСстТасСсаТтСАССТОСТасА-З (5ЕО ІЮ МО:65).

Потім кожний з людського, мишачого і щурячого МА5Р-2А субклонували у вектори експресії ссавців РЕО або рсіІ-Мео і трансфікували в лінії клітин ОХВІ1 яєчників китайського хом'ячка, як описано нижче.

В іншому підході каталітично неактивну форму МА5БР-2 одержували способом, описаним в

Спеп еї аї., У. Віої. Спет., 276(28); 25894-25902, 2001. Коротко, плазміду, що містить повнорозмірну КДНК людського МА5Р-2 (описано в ТПіеї еї а. Майшге, 386:506, 1997), розрізали рестриктазами Хпої і ЕсоК1, і кДНК МАБР-2 (наведену в даному описі в 5ЕО ІЮ МО:4) клонували по відповідних сайтах рестрикції в бакуловірусний вектор перенесення рЕабзіВавє (І іїте

Тесппоодіе5, МУ). Потім Зегб618 в активній ділянці серинової протеази МА5Р-2 заміняли АІаб18 шляхом заміщення двониткових олігонуклеотидів, кодуючих ділянку пептиду з 610 по 625 амінокислоту (ЗЕО ІЮО МО:13), природною ділянкою з 610 по 625 амінокислоту для одержання повнорозмірного поліпептиду МА5Р-2 з неактивним протеазним доменом.

Конструювання експресійних плазмід, що містять поліпептидні ділянки, одержані від людського МАБР-2

Для забезпечення секреції різних доменів МАЗР-2 одержували наступні конструкції з використанням сигнального пептиду МАБР-2 (залишки 1-15 в 5ЕБО ІЮ МО:5). Конструкцію, експресуючу домен СОВІ людського МАБР-2 (З5ЕБЕО ІО МО:8), одержували ПЛР-ампліфікацією ділянки, кодуючої залишки 1-121 МАБР-2 (ЗЕО ІЮ МО:6) (відповідає М-термінальному домену

СИВІ) Конструкцію, експресуючу домен СИВІЕЄСЕ людського МАБР-2 (5ЕБЕО ІЮ МО:9), одержували ПЛР-ампліфікацією ділянки, кодуючої залишки 1-166 МАБР-2 (5ЕО ІЮ МО:6) (відповідає М-термінальному домену СИВІЕСЕ). Конструкцію, експресуючу домен

СОВІЕСЕСИиВІЇ людського МАБР-2 (5ЕБЕО ІЮ МО:10), одержували ПЛР-ампліфікацією ділянки, кодуючої залишки 1-293 МАБР-2 (5ЕБЕО ІЮ МО:6) (відповідає М-термінальному домену

СОВІЕСЕСИВІІ)О. Вищевказані домени ампліфікували методом ПЛР, використовуючи Мепів

Зо полімеразу і рВ5-МАБР-2 як матрицю, відповідно до встановлених способів ПЛР. У послідовність 5'-праймера смислового праймера (5-СсССсСасСАТОСАТОАаСсОаСсТастаАСссСто-3'

ЗБО ІЮ МО:34) вводили сайт рестрикції Ватні (підкреслений) на 5'-кінці ПЛР-продукту.

Антисмислові праймери для кожного домену МА5Р-2, показані нижче в таблиці 5, одержували шляхом введення стоп-кодону (напівжирний шрифт), за яким додавали сайт Есокі (підкреслений) на кінці кожного ПЛР-продукту. Після ампліфікації фрагменти ДНК обробляли рестриктазами Ватні і ЕсокіІ і клонували у відповідні ділянки вектора рЕазіВас1. Одержані в результаті конструкції були охарактеризовані за допомогою рестрикційного картування і підтверджені секвенуванням длДНК.

ТАБЛИЦЯ 5

ПЛР-ПРАЙМЕРИ ДЛЯ МАБ5БР-2 5ЕО ІО МО:8 СТЕ АСОСТО У (вою | 5-СОААТТОСТАСОСТОСА

СИВІ (аа 1-121 в ЗЕО ІЮ МО:б) МО:з4 ТА (5ЕО І МО:З35)

ЗЕО І МО:9 5-бсс,пАТоСАТада '

МО:6 МО:34 І

ЗЕО І МО0 5-бсс,пАТоСАТада '

ІО МО:6б МО:34 І

ЕО ІЮ МОА 5-АТЯВОАСОЯОСТО,СТаА Б-ТТААААТСАСТААТТАТ

Людський МАЄР-? состостасасстто-5' (5ЕО | аТтотТоСалдто-з' (5ЕО І

ІО МО:56) ЛИМАБР-2 прямий МО:59) ЛИМАБР-2 зворотний

ЕО ІЮ МОА 5-бдадаатадСОасСА Б-атассостостасатсА «ДНК людського МАБР-? садо,аасйсСАС-З3 (5ЕО ІЮ СсСтеСта-3 (5ЕО ІО МО:57)

МО:58) ИМАБР-2 Аа прямий |ПМАБ5Р-2 Аа зворотний

ТАБЛИЦЯ 5

ПЛР-ПРАЙМЕРИ ДЛЯ МАБ5БР-2 тптМАБР-2 прямий МО:63) тпМАБ5бР-2 зворотний

ЕО ІЮ МО5О0 5Б-ссссоссста7асиато 5-стаСсАаадсатадСасАа

КДНК мишачого МА5Р-2 Аестотасда-35' (5ЕО І ссасциза-3' (5ЕО ІЮ МО:61)

МО:62) тМА5бР-2 Аа прямий |тМАБР-2 Аа зворотний

Еукаріотична експресія рекомбінантного МАБР-2 і одержання ферментативно неактивних мишачого, щурячого і людського білків МАЗР-2А

Вищеописані експресійні конструкції МАБР-2 і МАБР-2А трансфікували в ОХВ1-клітини за допомогою стандартної процедури кальцій-фосфатної трансфекції (Мапіаї5 еї а!., 1989). МА5Р- 2А одержували в безсироватковому живильному середовищі, щоб виключити контамінацію препаратів іншими сироватковими білками. Через день збирали конфлюентні клітини з живильних середовищ (у загальній складності процес проводили чотири рази). Середній рівень рекомбінантного МАБЗР-2А для кожного із трьох видів склав приблизно 1,5 мг/літр культурального середовища.

Очищення білка МА5Р-2А

МА5Р-2А (мутантну форму Зег-АІа, описану вище) очищали афінною хроматографією на колонках із МВР-А-агарозою. Ця стратегія дозволяє проводити швидке очищення без використання зовнішніх маркерів. МАБР-2А (100-200 мл живильного середовища, розведеного рівним об'ємом завантажувального буфера (50 мМ Ттгі5-СІ, рН 7,5, що містить 150 мМ Масі і 25

ММ Сасіг) завантажували в колонку з МВР-агарозою (4 мл) для афінної хроматографії, попередньо зрівноважену 10 мл завантажувального буфера. Після промивання додатковими 10 мл завантажувального буфера білок елюювали в 1 мл фракціях з 50 мМ Тті5-СІ, рН 7,5, що містить 1,25М Масі і 10 мМ ЕОТА. Фракції, що містять МА5Р-2А, ідентифікували за допомогою зО5-електрофорезу в поліакриламідному гелі. При необхідності, МАЗР-2А додатково очищали за допомогою іонообмінної хроматографії на колонці МопоО (МЕ. 5/5). Білок діалізували з 50 мМ

Тіів-СІ, рН 7,5, що містить 50 мМ Масі, і завантажували в колонку, зрівноважену тим же буфером. Після промивання зв'язаний МАБР-2А елюювали 10 мл 0,05-1М градієнтним розчином Масі.

Результати

Вихід білка МАБР-2А склав 0,25-0,5 мг на 200 мл середовища. Молекулярна маса, визначена методом МАГОІ-М5, склала 77,5 кДа, що перевищило розрахункову величину для немодифікованого поліпептиду (73,5 кДа) у зв'язку з глікозилуванням. Приєднання гліканів до кожного з сайтів М-глікозилування пояснює спостережувану масу. МАБР-2А мігрував у вигляді

Зо однієї смуги в 5ЗО5-поліакриламідних гелях, свідчачи про те, що в процесі біосинтезу він не піддався протеолітичному розкладанню. Середньозважена молекулярна маса, визначена шляхом рівноважного ультрацентрифугування, узгоджується з розрахунковою величиною для гомодимерів глікозилованого поліпептиду.

ОДЕРЖАННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ ПОЛІПЕПТИДІВ ЛЮДСЬКОГО МАЗБР-2

Інший спосіб одержання рекомбінантних похідних поліпептидів МА5Р-2 і МАБР-2А описаний в ТВієїепе М.М. еї аї., у. Іттипої. 166:5068-5077, 2001. Коротко, клітини комахи броаоріега тидірегда «клітини Кеаду-Ріадне 519, одержані від компанії Момадеп, Мадізоп, УМ) вирощують і підтримують у безсироватковому живильному середовищі 519001Ї (І іїте Тесппоіодіе5), що містить 50 Мо/мл пеніциліну і 50 мг/мл стрептоміцину (Се Тесппоіодіеє5). Клітини комахи Г/споріивіа пі (Нідп Ріме) (одержані від дайм/іда Спгоросгек, ІпзіШшшії де Віоіодіє БігисіигаІє, согепоріє, Егапсе), підтримують у середовищі ТС100 (І їе Тесппоіодієв5), що містить 10 925 ЕС5 (Ботіпідие ЮОшвсенег,

Вгитаїйй, Егапсе), доповненому 50 МО/мл пеніциліну і 50 мг/мл стрептоміцину. Рекомбінантні бакуловіруси одержують за допомогою системи Вас-0о-Вас (І їе Тесппоіодіе5). Бакмідну ДНК очищають за допомогою системи очищення Сіадеп тідіргер (Оіадеп) і використовують для трансфекції клітин комах 519, використовуючи селфектин у середовищі 51900 І ЕМ (іїе

Тесппоодіє5), згідно з протоколом виробника. Рекомбінантні вірусні частинки збирають через 4 дні, титрують методом вірусних бляшок і ампліфікують, як описано в Кіпд апа Роб5зеє, Те

Васшомігив Ехргезвіоп Зувзієт: А І арогаюгу Сшціде, Спартап апа Наї! Че., І опаоп, рр. 111-114, 1992.

Клітини Нідп іме (1,75х107 клітин/175-см" тканинної культури в колбі) інфікували рекомбінантними вірусами, що містять поліпептиди МА5Р-2, шляхом множинного інфікування, 2 рази, у середовищі 51900 І 5ЕМ при 28 С протягом 96 годин. Супернатанти збирали центрифугуванням і додавали дізопропілфосфорофлуоридат до одержання кінцевої концентрації 1 мМ.

Поліпептиди МАБР-2 секретувалися у клітинній культурі в живильне середовище.

Культуральні супернатанти піддавали діалізу проти 50 мМ Масі, 1 мМ Сасі», 50 мМ триетаноламіну гідрохлориду, рН 8,1, і завантажували зі швидкістю 1,5 мл/хв. у колонку О- зЗерпагозе Раві Ріом/ (Атег5Нат РНаптасіа Віоїесі) (2,8х12 см), зрівноважену тим же буфером.

Елюювання проводили, використовуючи 1,2 літра лінійного градієнта в 350 мМ Масі у цьому ж буфері. Фракції, що містять рекомбінантні поліпептиди МА5Р-2, ідентифікували вестерн-блот- аналізом, осаджували шляхом додавання (МН4)25О54 до 60 95 (по масі) і залишали на ніч при 4 7б. Осади ресуспендували в 145 мМ Масі, 1 мМ Сасі», 50 мМ триетаноламіну гідрохлориду, рН 7,4, і вносили в колонку Т5К 53000 БУМО (7,5х600 мм) (Тозопаа5, МопідотегуміПе, РА), зрівноважену тим же буфером. Потім очищені поліпептиди концентрували до 0,3 мг/мл методом ультрафільтрації в мікроконцентраторах Місгозер (порогове значення МУУ-10000) (Рійгоп,

Капвівіп, Септапу).

ПРИКЛАД 4

У цьому прикладі описане одержання поліклональних антитіл до МА5Р-2 поліпептидів.

Матеріали і методи

МА5Р-2 антигени

Поліклональну антисироватку проти людського МАБР-2 одержували імунізацією кроликів наступними виділеними поліпептидами МА5БР-2: людський МАБР-2 (ЗЕО ІО МО:6), виділений із сироватки; рекомбінантний людський МА5Р-2 (5ЕО ІЮО МО:б6), МА5Р-2А, що містить неактивний домен протеази (ЗЕО ІЮ МО:13), описаний у прикладі 3; і рекомбінантні СОВІ (ЗЕО ІЮ МО:8),

СОВЕСРІ (ЗЕО ІО МО:9) ії СОВЕСЕСОВІ! (ЗЕО І МО:10), експресовані, як описано в прикладі 3.

Поліклональні антитіла

Шеститижневих кроликів, примованих ВСО (вакциною проти бацили Кальметта-Герена), імунізували шляхом введення у вигляді ін'єкції 100 мкг поліпептиду МА5Р-2 у концентрації 100 мкг/мл у фізіологічному розчині. Ін'єкції здійснювали кожні 4 тижні титром антитіл, який

Зо відслідковували методом ІФА, як описано в прикладі 5. Культуральні супернатанти збирали для очищення антитіл за допомогою афінної хроматографії з білком А.

ПРИКЛАД 5

У цьому прикладі описаний спосіб одержання мишачих моноклональних антитіл проти щурячих або людських поліпептидів МАБР-2.

Матеріали і методи

Самцям мишей лінії А/У (Нагіап, Ноизіоп, Тех.) у віці 8-12 тижнів підшкірно вводили 100 мкг людських або щурячих поліпептидів ГМА5Р-2 або гМА5Р-2А (одержаних, як описано в прикладі 3) у повному ад'юванті Фрейнда (Оіїсо І арогайогіе5, ЮОеїгоїї, Місп.) в 200 мкл забуференого фосфатом фізіологічного розчину (РВ5), рН 7,4. Миші двічі одержували підшкірні ін'єкції 50 мкг людського або щурячого поліпептиду ГМА5Р-2 або гМАЗР-2А у неповному ад'юванті Фрейнда із двотижневими інтервалами. На четвертому тижні миші одержували ін'єкцію 50 мкг людського або щурячого поліпептиду ГІМА5Р-2 або гМА5Р-2А в РВЕ, і через 4 дні миші були використані для злиття.

Для кожного злиття приготовляли одноклітинні суспензії із селезінки імунізованої миші і використовували для злиття з 5рг/0 клітинами мієломи. Злиття 5х108 клітин 5р2/0 і 5х108 клітин селезінки здійснювали в середовищі, що містить 50 96 поліетиленгліколю (М.М/. 1450) (Кодак,

Воспезіег, М.М.) ії 5595 диметилсульфоксиду (бідта СПетіса! Со., 5. Гоці5, Мо.). Потім концентрацію клітин доводили до 1,5х10? клітин селезінки в 200 мкл суспензії в середовищі

Ібсоме ((сірсо, Сгапа Івзіапа, М.М.), доповненому 1095 фетальної сироватки, 100 Од/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину, 0,1 мМ гіпоксантину, 0,4 мкМ аміноптерину і 16 мкм тимідину. Двісті мікролітрів клітинної суспензії додавали в кожну ямку із приблизно двадцяти 96- ямкових мікропланшетів. Через десять днів методом ІФА виконували скринінг культуральних супернатантів на їх здатність вступати в реакцію з очищеним фактором МА5Р-2.

Аналіз ІФА

Ямки мікропланшетів ІпттипоїФф 2 (Оупаїесі І арогайгіе5, СпапіШу, Ма.) покривали шляхом додавання 50 мкл очищеного ПМАЗР-2 або щурячого гГМАБР-2 (або гМАБР-2А) з концентрацією 50 нг/мл протягом ночі при кімнатній температурі. Низька концентрація МА5БР-2 для покриття забезпечує можливість для відбору високоафінних антитіл. Після видалення розчину для покриття шляхом струшування планшета, у кожну ямку на одну годину для блокування бо неспецифічних сайтів додавали 200 мкл ВГ ОТТО (знежирене сухе молоко) в РВ5. Через годину ямки промивали буфером РВ5БТ (РВЗ з вмістом 0,0595 Твін 20). П'ятдесят мікролітрів культуральних супернатантів від кожного злиття збирали і змішували з 50 мкл ВІ ОТТО і потім додавали в окремі ямки мікропланшетів. Через годину інкубації ямки промивали РВ5Т. Потім зв'язані мишачі антитіла детектували за допомогою реакції з козячими антимишачими Іде (Ес- специфічними), кон'югованими з пероксидазою хрону (НКР) (даскбзоп ІттипоКезеагсп

І арогагогіех, МуУеб5і Сгоме, Ра.), і розбавляли у співвідношенні 1:2000 в ВІОТТО. Розчин субстрату пероксидази, що містить 0,1 95 3,3,5,5-тетраметилбензидину (Зідта, І оці5, Мо.) і 0,0003 95 перекису водню (зідта), додавали в ямки і залишали на 30 хвилин для проявлення забарвлення. Реакцію завершували додаванням у кожну ямку 50 мкл 2М Не25О»х. Оптичну густину реакційної суміші при 450 нм визначали за допомогою приладу ВіоТек ЕГІЗА Кеадег (ВіоТекф Іпвігитепів, УМіпоо5кі, МІ.).

Аналіз зв'язування МА5Р-2

Культуральні супернатанти, що дали позитивний результат в аналізі МА5Р-2 методом ІФА, як описано вище, можуть бути протестовані в аналізі зв'язування для визначення спорідненості зв'язування інгібуючих МА5ЗР-2 агентів з МАЗР-2. Аналогічний аналіз може бути використаний для визначення здатності інгібуючого агента зв'язуватися з іншими антигенами в системі комплементу.

Ямки полістирольного мікропланшета (96-ямкові планшети для зв'язування середовища,

Согпіпд Совіаг, Сатьгідде, МА) покривали МАБ5Р-2 (20 нг/100 мкл на ямку, Адмапсей Кезеагсп

Тесппоіоду, Зап Оіедо, СА) у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (РВ5), рН 7,4, протягом ночі при 4 "С. Після видалення розчину МА5Р-2 ямки блокували РВ5, що містить 1 95 бичачого сироваткового альбуміну (ВБА; бідта СПпетіса!), протягом 2 годин при кімнатній температурі. Ямки без покриття МАБР-2 використовували як контроль. У ямки додавали аліквоти гібридомних супернатантів або очищених анти-МА5БР-2 МоАБ зі змінною концентрацією в блокувальному розчині. Після двогодинної інкубації при кімнатній температурі ямки рясно промивали РВ5. МАБР-2-зв'язане анти-МА5БР-2 МоАБр детектували шляхом додавання кон'югованих з пероксидазою козячих антимишачих Ідс (Зідта СПпетісаї) у блокувальний розчин, який інкубували 1 годину при кімнатній температурі. Планшет знову обполіскували РВ5, після чого додавали 100 мкл субстрату 3,3,5,5'-тетраметилбензидину (ТМВ) (Кігкедаага апа

Зо Регту І арогайогіе5, сСайпегзригу, МО). Реакцію ТМВ зупиняли шляхом додавання 100 мкл 1М фосфорної кислоти, і планшет зчитували при 450 нм за допомогою пристрою зчитування мікропланшетів (ЗРЕСТКА МАХ 250, МоїІесшціаг Оемісе5, З,иппумаїє, СА).

Потім культуральні супернатанти з позитивних ямок тестували на здатність пригнічувати активацію комплементу у функціональному аналізі, такому як аналіз розщеплення С4, як описано в прикладі 2. Після цього, клітини з позитивних ямок клонували методом серійних розведень. МОоАБ знову тестували методом ІФА на їх здатність вступати в реакцію з АМА5Р-2, як описано вище. Відібрані гібридоми вирощували в обертових колбах, і виснажений культуральний супернатант збирали для очищення антитіл за допомогою афінною хроматографії з білком А.

ПРИКЛАД 6

У цьому прикладі описане одержання і продукування гуманізованих мишачих анти-МА5Р-2 антитіл і фрагментів антитіл.

Мишаче анти-МАБР-2 моноклональне антитіло одержували у самців мишей лінії А/), як описано в прикладі 5. Потім мишаче антитіло піддавали процесу гуманізації, як описано нижче, для зменшення його імуногенності шляхом заміни мишачих константних областей людськими аналогами з одержанням химерного Ідс і Еар-фрагмента антитіла, який може бути використаний для пригнічення побічних ефектів МА5Р-2-залежної активації комплементу у людей, відповідно до даного винаходу. 1. Клонування генів варіабельних ділянок анти-МА5Р-2 із клітин мишачої гібридоми

Загальну РНК виділяли із клітин гібридоми, секретуючих анти-МА5БР-2 МоАБ (одержаної, як описано в прикладі 7), використовуючи ЕМА?2ої, відповідно до протоколу виробника (Віоїесй,

Ноизіоп, Тех). Перший ланцюг кДНК синтезували на основі загальної РНК, використовуючи оліго-8Т як праймер. ПЛР виконували, використовуючи 3'-праймери, одержані з константної С- області імуноглобуліну, і набори вироджених праймерів, одержаних з лідерного пептиду або першої каркасної області генів мишачих МУн або Мк, як 5'-праймерів. Заякорену ПЛР виконували, як описано в Спеп і Ріаїзисаз5 (Спеп Р.Е, зсапа. у. Іттипої. 35:539-549, 1992). Для клонування гена Мк одержували дволанцюжкову кДНК за допомогою праймера Мой-МАКІ (5- тассасСсастатАдаатастатсттт-3 5ЕО ІО МО:38). Піддані відпалу адаптери АО1 (5- ваААТТСАСТСИаТТАТТСТОССОА-3 ЗЕО ІЮ МО:39) і АО2 (5-ТССОСАСААТААСО,адИатТа-3 ЗЕО І бо МО:40) лігували з обома 5'- і 3і"кінцями дволанцюжкової кКДНК. Адаптери на 3'-кінцях видаляли шляхом розщеплення Мой. Потім продукт розщеплення використовували як матрицю в ПЛР з олігонуклеотидом АЮ як 5'-праймером і МАК2 (5-САТТФАААаСТ т ТассаатАаААдаТтТа,атто-3

ЗБО ІЮО МО:41) як 3-праймером. Фрагменти ДНК довжиною приблизно 500 пара основ клонували у вектор риС19. Декілька клонів відбирали для аналізу послідовності для підтвердження того, що клонована послідовність охоплює необхідну константну область мишачого імуноглобуліну. Олігонуклеотиди МоОй-МАКІ ії МАК? одержували з області Мк і розташовували на ділянках 182 і 84 п.о., відповідно, нижче від першої пари основ гена С-Карра.

Відбирали клони, які містили повнорозмірний Ук і лідерний пептид.

Для клонування гена Мн одержували дволанцюжкову КкДНК за допомогою праймера Мой1- мдатї п-ссСсса,асСс,асбАастасТСсАпАататАСЦА-В ЗЕО ІЮО МО:42). Піддані відпалу адаптери

АБІ і АОБ2 лігували з обома 5- і 3'-кінцями дволанцюжкової кКДНК. Адаптери на 3'-кінцях видаляли шляхом розщеплення Мой. Потім продукт розщеплення використовували як матрицю в ПЛР з олігонуклеотидом АОІ і МАС2 (5-СССИСТААаСтТтСАСТас!сстоАсаасАААТА-З' 5ЕО Ір

МО:43) як праймерами. Фрагменти ДНК розміром від 500 до 600 п.о. клонували в рисС19.

Олігонуклеотиди Мой1-МАС1 і МАС2 одержували з мишачої області Су.7.1 і розташовували на ділянках 180 ї 93 п.о., відповідно, нижче від першої пари основ у гені мишачого Су.7.1.

Відбирали клони, які містили повнорозмірний Мн і лідерний пептид. 2. Конструювання векторів експресії для химерного МА5Р-2 Ід і Бар

Клоновані гени Мн і Мк, описані вище, використовували як матрицю в реакції ПЛР для додавання консенсусної послідовності Козака до 5'-кінця і донора сплайсингу до 3'-кінця нуклеотидної послідовності. Після аналізу послідовностей на відсутність ПЛР-помилок гени Мн і

Мк вбудовували в касети векторів експресії, що містять людський С.у! і С.Карра, відповідно, з одержанням ромМ2пеоуН-пиСу! і реМ2пеом-пиСу. Очищені в градієнті С5СІ плазмідні ДНК векторів важкого і легкого ланцюгів використовували для трансфекції клітин СО5 методом електропорації. Через 48 годин інкубації культуральний супернатант тестували методом ІФА для підтвердження наявності приблизно 200 нг/мл химерного до. Із зібраних клітин виділяли тотальну РНК. Перший ланцюг кКДНК синтезували на основі тотальної РНК, використовуючи оліго-ЧДТ як праймер. Цю кДНК використовували як матрицю в ПЛР для одержання ДНК- фрагментів для Ба і Карра. Для гена Ба виконували ПЛР, використовуючи 5'-

Зо ААпчААХасттасСасСАССАТОааАТТааСтТатасААСТ-3 (ЗЕО ІЮ МО:44) як 5-праймер і 3- праймер, виділений з СНІ (5-сСсацпАТССТСАААСТТТСОТТатоСАССТТОИ-3 5ЕО ІЮ МО:45).

Підтверджували, що послідовність ДНК містить повноцінний Мн і домен СНІ людського ІдДС1.

Після проведення розщеплення відповідними ферментами фрагменти ДНК для Ба вбудовували в сайти рестрикції Ніпа! ї Ватні у касеті вектора експресії ремг2антпт-тО5 для одержання роуУганптва. Плазміда ремМ2 є комерційно доступною і складається із сегментів ДНК, одержаних з різних джерел: ДНК рВвкзЗ22 (тонка лінія) містить сайт початку реплікації ДНК рвК322 (рВЕ огі) і ген стійкості лактамази до ампіциліну (Атр); ДНК 5М40, показана широкими штрихами і маркуванням, містить сайт початку реплікації ДНК 5М40 (5440 огі), ранній промотор (5' до генів апіїї ї пео) і сигнал поліаденілювання (3 до генів аПіїї і пео). Сигнал поліаденілювання, одержаний з 5М40 (рА), також поміщали на 3'-кінець гена Га.

Для гена Карра проводили ПЛР, використовуючи 5-

ААСАААДИаСсТТасСсасСАССАТаТтТСсТСАСТАССТОСТ-3 (5ЗБО ІЮ МО:46) як 5-праймер і 3- праймер, одержаний з Ск (5-СОСбСсССАТОСТСТОССТСТААСАСТСТ-3 БЕО 10 МО:47).

Підтверджували, що послідовність ДНК містить ділянки повнорозмірного Мк і людського Ск.

Після розщеплення відповідними ферментами рестрикції ДНК фрагменти для Карра вбудовували в сайти рестрикції Ніпапй і Ватні у касеті вектора експресії ремМ2пео-ТО5 з одержанням роМ2пеокК. Експресію обох генів Га і Карра ініціювали за допомогою енхансера і промотору, одержаних з НСМУ. Оскільки ген га не включає залишок цистеїнової амінокислоти, що бере участь в утворенні дисульфідного зв'язку між ланцюгами, цей рекомбінантний химерний Раб містить нековалентним чином зв'язані важкі і легкі ланцюги. Цей химерний Бар позначений як сЕаб.

Для одержання рекомбінантного Бар з дисульфідним зв'язком між важким і легким ланцюгами, вищевказаний ген БЯ може бути подовжений шляхом включення послідовності, кодуючої дев'ять додаткових амінокислот (ЕРК5СОКТН ЗЕО ІЮ МО:48) із шарнірної області людського ІДС1. Сегмент ДНК Ве(ЕІ-Ватні, кодуючий 30 амінокислот на 3'-кінці гена Ба, може бути заміщений сегментами ДНК, кодуючими подовжений Ба, що в результаті дає роУганптга/Здаа. 3. Експресія і очищення химерного анти-МА5Р-2 Ід

Для одержання клітинних ліній, секретуючих химерний анти-МАБР-2 ІдС, клітини МБО бо трансфікували очищеними ДНК-плазмідами реМм2пеоМН-писС 1 ї рем2пеом-пиС-Карра методом електропорації. Трансфіковані клітини відбирали в присутності 0,7 мг/мл (3418. Клітини вирощували в 250 мл обертовій колбі з середовищем, що містить сироватку.

Культуральний супернатант, одержаний після центрифугування 100 мл культури, завантажували в 10 мл колонку РКОЗБЕР-А (Віоргосеззіпо, Іпс., Ргіпсейоп, М.9У.). Колонку промивали 10 об'ємами шару РВ5. Зв'язане антитіло елюювали 50 мМ цитратним буфером, рн 3,0. Рівний об'єм 1М Неревз, рН 8,0, додавали до фракції, що містить очищене антитіло, для доведення рН до 7,0. Залишкові солі видаляли шляхом заміни буфера на РВ5 методом ультрафільтрації через мембрану Мійїроге (порогове значення ММУ: 3000). Концентрацію білка очищеного антитіла визначали методом ВСА (Ріегсе). 4. Експресія і очищення химерного анти-МА5Р-2 Раб

Для одержання клітинних ліній, секретуючих химерні анти-МА5БР-2 Раб, клітини СНО трансфікували очищеними ДНК-плазмідами ромганпнтва (або рамг2гаптва/аа) і рем2пеоКкарра методом електропорації. Трансфіковані клітини відбирали в присутності 5418 і метотрексату.

Відібрані клітинні лінії розмножували при підвищених концентраціях метотрексату. Клітини були представлені одиночними клітинами, субклонованими методом серійних розведень. Потім високопродуктивні клітинні лінії, одержані від субклонованих одиночних клітин, вирощували в 100 мл культури в безсироватковому середовищі при постійному перемішуванні.

Химерне анти-МА5БР-2 Раб очищали методом афінної хромотографії з використанням мишачого антиідіотипічного МОАБ до МАБР-2 МоАБ. Антиїдіотипічне МАБР-2 МоАБ може бути одержане шляхом імунізації мишей мишачим анти-МАБР-2 МоАБ, кон'югованим з гемоціаніном фісурели (КІН), а потім піддане скринінгу на специфічне зв'язування з МоАб, яке може конкурувати з людським МА5БР-2. Для очищення, 100 мл супернатанту з культури клітин СНО, продукуючих сЕаб або сЕар/9аа, завантажували в афінну колонку зі зв'язаним антиіїдіотипічним

МАБР-2 МоАр. Потім колонку ретельно промивали РВ5 до елюції зв'язаного Бар 50 мМ діетиламіном, рН 11,5. Залишкові солі видаляли шляхом заміни буфера, як описано вище.

Концентрацію білка очищеного Раб визначали методом ВСА (Ріегсе).

Здатність химерних МАЗР-2 ІдС, сРаб і сбар/даа пригнічувати МАБР-2-залежний шлях активації комплементу може бути визначена шляхом аналізу пригнічення, описаного в прикладі 2.

ПРИКЛАД 7

У цьому прикладі описаний аналіз розщеплення С4 /1 уйго, використовуваний як функціональний скринінг для ідентифікації інгібуючих МА5бР-2 агентів, здатних пригнічувати

МА5Р-2-залежну активацію, за допомогою І -фіколіну/Р35, Н-фіколіну, М-фіколіну або манану.

Аналіз розщеплення С4

Аналіз розщеплення С4 описаний в Реїегзеп, еї аї., 9. Іттипої. Меїйоаз5, 257:107 (2001), у якому вимірювали активацію лектинового шляху, ініційовану ліпотейхоєвою кислотою (І ТА) з 5. ашмгейив, яка зв'язується з І -фіколіном.

Реагенти

Фіксований у формаліні препарат 5. ашеоив (05М20233) приготовляли наступним чином: бактерії вирощували протягом ночі при 37 "С у середовищі на основі триптон-соєвого агару з додаванням крові, тричі промивали РВ5, потім фіксували протягом 1 години при кімнатній температурі в РВ5Б/О,5 96 формалін і тричі відмивали РВ5 перед ресуспендуванням у буфері для іммобілізації (15 мМ МагСОз, 35 мМ Мансо», рн 9,6).

Аналіз

Ямки мікропланшета Мипс Махізогр (Маїдепе Мипс Іпіегпайопаї, Коспевзієег, МУ) покривали 100 мкл препарату фіксованого у формаліні 5. ашеих Ю5М20233 (00550-0,5) у буфері для іммобілізації з 1 мкг І-фіколіну. Після інкубації протягом ночі ямки блокували 0,1 96 розчином сироваткового альбуміну людини (НА) в ТВ5 (10 мМ Тгтгі5-НСІ, 140 мм масі, рн 7,4), потім промивали ТВ5, що містить 0,05 95 Твін 20 і 5 мМ Сасі» (промивальний буфер). Зразки людської сироватки розчиняли в 20 мМ Ттгі5-НСІ, 1М Масі, 10 мм Сасі», 0,05 95 ТИйоп Х-100, 0,1 95 НЗА, рН 7,4, який попереджав активацію ендогенного С4 і приводив до дисоціації комплексу С1 (що складається з С1д, Стіг ії С15). Інгібуючі МАБР-2 агенти, включаючи анти-МА5бР-2 МоАБ і інгібуючі пептиди, додавали до зразків сироватки в різних концентраціях. Розведені зразки наносили на планшет і інкубували протягом ночі при 4 "С. Через 24 години планшети ретельно промивали промивальним буфером, потім у кожну ямку додавали 0,1 мкг очищеного людського

С4 (одержаного, як описано в Бодаз АМУ., МеШшоа5 Еплутої!. 223:46, 1993) в 100 мкл 4 мМ барбіталу, 145 мМ Масі, 2 мм Сасі», 1 мМ Мосі», рН 7,4. Через 1,5 години інкубації при 37 "С планшети знову промивали, і визначали відкладення С4р, використовуючи кон'югований з лужною фосфатазою курячий антилюдський С4с (Іттипзузіет, Оррзаїа, Зууедеп), і вимірювали бо колориметричним методом за допомогою субстрату п-нітрофенілфосфат.

Аналіз С4 на манані

Вищеописаний аналіз адаптували для вимірювання активації лектинового шляху за допомогою МВІ шляхом покривання планшета ЛПС і мананом перед додаванням сироватки, змішаної з різними інгібуючими МА5бР-2 агентами.

Аналіз С4 по Н-фіколіну (НакКаїа Ад)

Вищеописаний аналіз адаптували для вимірювання активації лектинового шляху за допомогою Н-фіколіну шляхом покривання планшета ЛПС і Н-фіколіном перед додаванням сироватки, змішаної з різними інгібуючими МА5Р-2 агентами.

ПРИКЛАД 8

Наступний аналіз демонструє наявність активації класичного шляху у мишей дикого типу і

МА5Р-2-/- мишей.

Методи

Імунні комплекси одержували /п 5Ли шляхом покривання мікропланшетів (Махізого, Мипс, кат. Мо 442404, Рієпег Зсієепійіс) 0,1 95 розчином людського сироваткового альбуміну в 10 мМ

Тгі5, 140 мМ Масі, рн 7,4, протягом 1 години при кімнатній температурі з наступною інкубацією протягом ночі при 4 "С з овечою антицільною антисироваткою (5сойцізп Апібоду Ргодисіоп Опії,

Сапике, ЗсоМПапа), розведеною у співвідношенні 1:1000 сумішшю ТВ5/Твін/Са?:. Зразки сироватки одержували від мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей і додавали в покриті планшети.

Приготовляли контрольні зразки, у яких С14 витягали зі зразків сироватки мишей дикого типу і

МА5Р-2-/- мишей. Мишачу сироватку, збіднену по С14, приготовляли за допомогою зв'язаних з білком А мікросфер ЮупареадбзФ (Оупа! Віоїесп, О5Іо, Могмау), покритих кролячими антилюдськими ІдсС Стід (Оако, Сіозігир, ЮОептагк), відповідно до інструкцій виробника.

Планшети інкубували протягом 90 хвилин при 37 "С. Зв'язаний СЗЬ детектували за допомогою поліклональних антилюдських СЗс антитіл (Шако А 062), розведених в ТВ5/Івін/Са-є у співвідношенні 1:1000. Вторинне антитіло являло собою козячі антикролячі Ідо.

Результати

На фіг. 9 показані відносні рівні відкладення СЗБ на покритих (до планшетах у сироватці дикого типу, сироватці МАБР-2-/-, збідненій по С1д сироватці дикого типу і збідненій по Ста сироватці МА5БР-2-/-. Ці результати свідчать про те, що у мишей лінії МАБР-2-/- класичний шлях

Зо залишається незачепленим.

ПРИКЛАД 9

Наступний аналіз використовували для перевірки здатності інгібуючого МА5БР-2 агента блокувати класичний шлях активації шляхом вивчення дії інгібуючого МА5Р-2 агента в умовах ініціації класичного шляху імунними комплексами.

Методи

Для оцінки дії інгібуючого МА5Р-2 агента в умовах активації комплементу, при яких ініціація класичного шляху здійснюється імунними комплексами, три зразки сироватки, по 50 мкл кожний, що містили 90 95 МН5, інкубували при 37 "С у присутності 10 мкг/мл імунного комплексу (ІС) або

РВ5, і паралельно інкубували ще три зразки (-/-ІС), що містять 200 нМ анти-пропердин моноклональних антитіл, при 37 "С. Після двогодинної інкубації при 37 "С в усі зразки додавали 13 мМ ЕДТО для зупинення подальшої активації комплементу, після чого всі зразки негайно охолоджували до 5 "С. Потім зразки зберігали при -70 "С до моменту їх використання в аналізі на продукти активації комплементу (СЗа і 5С25р0-9) за допомогою набору ІФА (Опцідеї, кат. МоМо

АО15 і АО09), відповідно до інструкцій виробника.

ПРИКЛАД 10

У цьому прикладі описана ідентифікація високоафінних фрагментів Бар2 анти-МА5Р-2 антитіл, блокуючих активність МА5Р-2.

Передумови і обгрунтування

МАБР-2 являє собою білковий комплекс з множиною окремих функціональних доменів, включаючи: ділянку (ділянки) зв'язування для МВІ. і фіколінів, каталітичну ділянку серинової протеази, ділянку зв'язування для протеолітичного субстрату С2, ділянку зв'язування для протеолітичного субстрату С4, ділянку розщеплення МА5Р-2 для самоактивації зимогену

МАБР-2 і дві Са--зв'язуючі ділянки. Ідентифіковані фрагменти Бар2 антитіл, які є високоафінними відносно МАБ5Р-2, і ці ідентифіковані Гар2-фрагменти були протестовані у функціональному аналізі для визначення їх здатності блокувати функціональну активність

МА5Р-2.

Для блокування функціональної активності МАБР-2 антитіло або Рар2-фрагмент антитіла має зв'язуватися або інтерферувати зі структурним епітопом на МА5Р-2, який необхідний для функціональної активності МАЗР-2. Отже, багато які або всі високоафінні зв'язуючі анти-МА5Р- бо 2 Бар2 не мають здатності пригнічувати функціональну активність МАБР-2, якщо вони не зв'язуються зі структурними епітопами на МАБР-2, які беруть безпосередню участь у функціональній активності МА5Р-2.

Функціональний аналіз по вимірюванню пригнічення утворення СЗ-конвертази лектинового шляху використовували для оцінки "блокувальної активності" анти-МА5БР-2 Рар2. Відомо, що первинна фізіологічна роль МА5Р-2 в активації комплементу по лектиновому шляху полягає в утворенні наступного функціонального компонента лектинзалежної активації комплементу, відомого як СЗ-конвертаза лектинового шляху. СЗ3-конвертаза лектинового шляху являє собою критичний ферментний комплекс (С4рсСга), який здійснює протеолітичне розщеплення СЗ на

СЗа і СЗ3Б. МА5БР-2 не є структурним компонентом СЗ-конвертази лектинового шляху (С4рсС2а); однак функціональна активність МАЗР-2 необхідна для утворення двох білкових компонентів (С4р, С2а), які містять СЗ-конвертазу лектинового шляху. Крім того, усі окремі види функціональної активності МА5Р-2, перераховані вище, є необхідними для утворення за участі

МА5БР-2 СЗ-конвертази лектинового шляху. Із цієї причини переважним способом аналізу для оцінки "блокувальної активності" анти-МА5Р-2 Рабр2 вважається функціональний аналіз, який дозволяє виконувати вимірювання пригнічення утворення СЗ-конвертази лектинового шляху.

Утворення високоафінних Бар2

Для створення високоафінних Бар2 до щурячого білка МАБЗР-2 (5ЕБЕО ІО МО:55) використовували бібліотеку фагового дисплея послідовностей легкого і важкого ланцюгів людського антитіла і автоматизовану технологію відбору антитіл для ідентифікації Рабр2г, які реагують з вибраними лігандами, що представляють інтерес. Відому кількість щурячого білка

МАБР-2 (-1 мг, »85 95 чистоти) використовували для скринінгу антитіл. Для відбору антитіл з найкращою спорідненістю використовували три цикли ампліфікації. Для скринінгу методом ІФА відбирали приблизно 250 різних варіантів, експресуючих фрагменти антитіл. Високоафінні варіанти надалі секвенували для визначення унікальності різних антитіл.

П'ятдесят унікальних анти-МА5Р-2 антитіл очищали, і 250 мкг кожного очищеного антитіла

Еар2 використовували для характеристики спорідненості зв'язування МА5Р-2 і функціонального тестування шляху комплементу, як описано більш докладно нижче.

Аналізи, використовувані для оцінки пригнічувальної (блокувальної) активності анти-МАБР-2

Еарг

Зо 1. Аналіз для вимірювання пригнічення утворення СЗ-конвертази лектинового шляху

Передумови

С3-конвертаза лектинового шляху являє собою ферментативний комплекс (С4рсС2а), який здійснює протеолітичне розщеплення ССЗ на два потенційні прозапальні фрагменти, анафілатоксин СЗа і опсонін СЗ3Б. Утворення СЗ-конвертази є ключовим етапом у лектиновому 35 шляху з точки зору опосередкування запалення. МАБР-2 не є структурним компонентом С3- конвертази (С4Б0БС2а) лектинового шляху, тому анти-МАБР-2 антитіла (або Бар2) не будуть прямо пригнічувати активність раніше існуючої СЗ-конвертази. Однак для одержання двох білкових компонентів (С4Б, С2а), які містять СЗ3-конвертазу лектинового шляху, потрібна активність серинової протеази МАБР-2. Отже, анти-МАБР-2 Рар2, які пригнічують 40 функціональну активність МА5Р-2 (тобто блокують анти-МА5Р-2 Рар2), будуть пригнічувати ае помо утворення СЗ-конвертази лектинового шляху. СЗ містить незвичайну і високореактивну тіоефірну групу у своїй структурі. При розщепленні ССЗ СЗ-конвертазою у цьому аналізі тіоефірна група на СЗ3р може утворювати ковалентний зв'язок з гідроксильними групами або аміногрупами на макромолекулах, іммобілізованих на дні пластикових ямок, за допомогою 45 складноефірних або амідних зв'язків, що полегшує виявлення СЗБЬ методом ІФА.

Дріжджовий манан відомий як активатор лектинового шляху. У наступному методі вимірювання утворення С3-конвертази пластикові ямки, покриті мананом, інкубували протягом хв. при 37 "С з розведеною щурячою сироваткою для активації лектинового шляху. Потім ямки промивали і аналізували на наявність СЗБ, іммобілізованого в ямках, стандартними методами ІФА. Кількість СЗЬ, утвореного в цьому аналізі, є прямим відображенням де ломо утворення СЗ-конвертази лектинового шляху. Анти-МА5Р-2 Рар2 в вибраних концентраціях тестували в цьому аналізі на їх здатність пригнічувати утворення СЗ-конвертази і наступного утворення СЗБ.

Методи 9б-ямкові планшети Совзіаг Меадішт Віпаїпуд інкубували протягом ночі при 5 "С з мананом, розведеним в 50 мМ карбонатному буфері (рН 9,5) у кількості 1,0 мкг/50 мкл/ямку. Після нічної інкубації кожну ямку тричі промивали 200 мкл РВ5. Потім ямки блокували 100 мкл/ямку 1 95-ним бичачим сироватковим альбуміном в РВ5 і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі при легкому помішуванні. Кожну ямку тричі промивали 200 мкл РВ5. Зразки анти- 60 МА5Р-2 Рар2 розбавляли до вибраних концентрацій буфером СМУВ, що містить Са і Мд"- (4,0

ММ барбіталу, 141 мМ Масі, 1,0 мМ Масі», 2,0 мМ Сасі», 0,1 95 желатин, рН 7,4), при 5 "С. У зазначені вище зразки додавали 0,5 95 щурячу сироватку при 5 "С, і по 100 мкл вносили в кожну ямку. Планшети закривали кришкою і інкубували протягом 30 хвилин на водяній бані при 37 "С для активації комплементу. Реакцію зупиняли шляхом перенесення планшетів з водяної бані з температурою 37 "С у контейнер, що містить суміш льоду і води. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5-Твін 20 (0,05 95 Твін 20 в РВ5), потім двічі промивали 200 мкл РВ5. Первинне антитіло (кроляче антилюдське СЗс, ВАКО А0йОб2) з розведенням 1:10000 у кількості 100 мкл/ямку додавали в РВ5, що містить 2,0 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну, і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі при слабкому перемішуванні. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5. Вторинне антитіло (кон'юговане з перксидазою козячого антикролячого дО, Атегісап Оцаіех АТ02РИ) з розведенням 1:10000 у кількості 100 мкл/ямку додавали в РВ5, що містить 2,0 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну, і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі на шейкері при слабкому перемішуванні. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5. Пероксидазний субстрат ТМВ (КігкКедаага 45 Реггту

І арогафогіе5) додавали в кількості 100 мкл/ямку і інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Пероксидазну реакцію зупиняли шляхом додавання 1,0М НзРОх у кількості 100 мкл/ямку і вимірювали ОЮг50. 2. Аналіз для вимірювання пригнічення МАР -2-залежного розщеплення С4

Передумови

Активність серинової протеази МАБР-2 має високу специфічність, і тільки два білкові субстрати ідентифіковані для МАБР-2, С2 і С4. При розщепленні С4 утворюються С4а і С4р.

Анти-МАБР-2 Бабр2 може зв'язуватися зі структурними епітопами на МАБР-2, які беруть безпосередню участь у розщеплення С4 (наприклад, МА5Р-2-зв'язуюча ділянка для С4; МА5Р- 2-каталітична ділянка серинової протеази) і таким чином пригнічують функціональну активність

МА5Р-2, що приводить до розщеплення С4.

Дріжджовий манан відомий як активатор лектинового шляху. В описаному нижче способі вимірювання активності МАБР-2 по розщепленню С4, пластикові ямки, покриті мананом, інкубували протягом 30 хвилин при 37 "С з розведеною щурячою сироваткою для активації лектинового шляху. Оскільки первинні антитіла, використані в цьому методі ІФА, розпізнають

Зо тільки С4, розведену щурячу сироватку також доповнювали людським С4 (1,0 мкг/мл). Потім ямки промивали і аналізували на наявність людського С4Б, іммобілізованого на ямках, стандартними способами ІФА. Кількість утвореного в цьому аналізі С4б5 є мірою МА5БР-2- залежної активності розщеплення С4. Анти-МА5Р-2 Рабр2 в вибраних концентраціях тестували в цьому аналізі на їх здатність пригнічувати розщеплення Са.

Методи 9б-ямкові планшети Совзіаг Меадішт Віпаїпуд інкубували протягом ночі при 5 "С з мананом, розведеним в 50 мМ карбонатному буфері (рн 9,5) у кількості 1,0 мкг/50 мкл/ямку. Кожну ямку промивали три рази 200 мкл РВ5. Потім ямки блокували 100 мкл/ямку 1 95-ним бичачим сироватковим альбуміном в РВ5 і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі при легкому помішуванні. Кожну ямку промивали три рази 200 мкл РВ5. Зразки анти-МА5Р-2

Еар2 розбавляли до вибраних концентрацій буфером СМВ, що містить Са і Мод (4,0 мМ барбіталу, 141 мМ масі, 1,0 мМ Маосі», 2,0 мМ Сасі», 0,1 95 желатин, рН 7,4), при 5 "С. У ці зразки також вводили 1,0 мкг/мл людського С4 (ОцідеІ!)М. У зазначені вище зразки додавали 0,5 96 щурячої сироватки при 5 "С, і по 100 мкл вносили в кожну ямку. Планшети закривали кришкою і інкубували протягом 30 хвилин на водяній бані при 37 "С для активації комплементу.

Реакцію зупиняли шляхом перенесення планшетів з водяної бані з температурою 37 "С у контейнер, що містить суміш льоду і води. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5-Твін 20 (0,05 95 Твін 20 в РВ5), потім кожну ямку двічі промивали 200 мкл РВ5. Кон'югований з біотином курячий антилюдський С4 (Іттипзувіет АВ, Оррзаїа, Змедеп) з розведенням 1:700 у кількості 100 мкл/ямку додавали в РВ5, що містить 2,0 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну (В5А), і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі при слабкому перемішуванні.

Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5. 0,1 мкг/мл кон'югованого з пероксидазою стрептавідину (Ріегсе Спетісаї! 221126) у кількості 100 мкл/ямку додавали в РВ5, що містить 2,0 мг/мл В5А, і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі на шейкері при слабкому перемішуванні. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5. Пероксидазний субстрат ТМВ (Кігкедаага 8. Регту І арогайюгіе5) додавали в кількості 100 мкл/ямку і інкубували при кімнатній температурі протягом 16 хвилин. Пероксидазну реакцію зупиняли шляхом додавання 1,0М

НзРоОх у кількості 100 мкл/ямку і вимірювали ОЮзво. 3. Аналіз зв'язування антищурячого МА5Р-2 Рабр2 з нативним щурячим МА5Р-2 60

Передумови

МАБР-2 звичайно присутній у плазмі у формі димерних комплексів МАБР-2, які також включають специфічні лектинові молекули (манозозв'язувальний білок (МВІ) і фіколіни). Як наслідок, при наявності інтересу до вивчення зв'язування анти-МА5Р-2 Раб2 з фізіологічно релевантною формою МАБР-2, важливо розробити аналіз зв'язування, у якому використовується взаємодія Рар2 не з очищеним рекомбінантним МА5Р-2, а з нативним МА5Р- 2 у плазмі. У такому аналізі зв'язування нативний комплекс МАБР-2-МВІГ з 10 9у5-ної щурячої сироватки спочатку іммобілізують у ямках, покритих мананом. Потім вивчають спорідненість зв'язування різних анти-МАБР-2 Раб2 відносно іммобілізованого нативного МАБР-2 стандартним методом ІФА.

Методи 9б-ямкові планшети Совіаг Нідп Віпаійпуд інкубували протягом ночі при 5 "С з мананом, розведеним в 50 мМ карбонатному буфері (рн 9,5) у кількості 1 мкг/50 мкл/ямку. Кожну ямку промивали три рази 200 мкл РВ5. Ямки блокували 0,5 965 знежиреним сухим молоком в РВЗТ (РВЗ з 0,05 95 Твін 20) у кількості 100 мкл/ямку і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі при легкому помішуванні. Кожну ямку промивали три рази 200 мкл промивального буфера ТВ5/Івін/Са"" (фізіологічний розчин, забуферений Тріс, 0,05 95 Твін 20, що містить 5,0

ММ Сасі», рН 7.4). На льоду приготовляли 10 95 щурячу сироватку в буфері іммобілізації з високим вмістом солі (20 мМ Тті5, 1,0М Масі, 10 мМ Сасіг, 0,05 965 Тийоп Х100, 0,1 95 (в/о) бичачий сироватковий альбумін, рН 7,4). 100 мкл/ямку додавали і інкубували протягом ночі при 5 "Сб. Ямки промивали три рази 200 мкл промивального буфера ТВ5/ТІвін/Са"". Потім ямки промивали два рази 200 мкл РВ5. 100 мкл/ямку вибраної концентрації анти-МАБР-2 Рарг, розведених у буфері СУВ, що містить Са»: і Мд"" (4,0 мМ барбітал, 141 мМ Масі, 1,0 мМ Мосі», 2,0 ММ Сасі», 0,195 желатин, рН 7,4), додавали і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі при слабкому перемішуванні. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл

РВ5. Кон'юговані з НЕР козячі анти-Рар2 (Віодепезіз кат. Мо 0500-0099), розведені у співвідношенні 1:5000 в 2,0 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну в РВ5, додавали в кількості 100 мкг/ямку і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі при слабкому перемішуванні. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5. Пероксидазний

Зо субстрат ТМВ (Кігкедаага 8. Реїту І арогайогіє5) додавали в кількості 100 мкл/ямку і інкубували при кімнатній температурі протягом 70 хвилин. Пероксидазну реакцію зупиняли шляхом додавання 1,0М НзРоОх у кількості 100 мкл/ямку і вимірювали ОЮг50.

Результати

Приблизно 250 різних Рабрг, які реагували з високою спорідненістю з щурячим білюом МА5БР- 2, відбирали для скринінгу методом ІФА. Ці високоафінні Рар2 секвенували для визначення унікальності різних антитіл, і 50 унікальних анти-МА5БР-2 антитіл очищали для подальшого аналізу. 200 мкг кожного очищеного антитіла Бар2 використовували для характеристики спорідненості зв'язування МАБР-2 і функціонального тестування шляху комплементу.

Результати цього аналізу представлені нижче в Таблиці 6.

ТАБЛИЦЯ 6

АНТИ-МАБР-2 ЕАВ2, БЛОКУЮЧІ АКТИВАЦІЮ КОМПЛЕМЕНТУ ПО ЛЕКТИНОВОМУ ШЛЯХУ . СЗ3-конвертаза Розщеплення С4 11112786. 055 | юю л147 11111 77111766 | .ЮюЮюрю092 |... 45 юЮщЩщ | м 22601716 11111181 1111111 мосСсС 11268 Ї11111117120 11117166 1111101 8811171 ЇГ11111118011171 11111125 11111111

ТАБЛИЦЯ 6

АНТИ-МАБР-2 ЕАВ2, БЛОКУЮЧІ АКТИВАЦІЮ КОМПЛЕМЕНТУ ПО ЛЕКТИНОВОМУ ШЛЯХУ . СЗ3-конвертаза Розщеплення С4 22871160 25 |... м с

Як показано вище в таблиці 6, з 50 протестованих анти-МА5Р-2 Рабр2 сімнадцять Рар2 були ідентифіковані як РГар2, блокуючі МА5Р-2, які потенційно можуть пригнічувати утворення С3- конвертази з ІСво, що дорівнює або менше 10 нмоль Рар2 (34 95-ний позитивний коефіцієнт успіху). Вісім із сімнадцяти ідентифікованих Бар2 мають значення ІСзо у субнаномолярній області. Крім цього, усі сімнадцять Рар2, що блокують МА5бР-2, показані в таблиці 6, по суті демонструють повне пригнічення утворення СЗ-конвертази в аналізі СЗ-конвертази лектинового шляху. На фіг. ВА графічно показані результати аналізу утворення СЗ-конвертази для антитіла

Бар2 Мо 11, яке є типовим представником протестованих антитіл Рар2, результати яких наведені в таблиці 6. Цей факт є важливим, оскільки він передбачає теоретичну можливість того, що "блокуюче" Рар2 може тільки частково пригнічувати функцію МА5Р-2, навіть коли кожна молекула МА5Р-2 зв'язується з Бар2г.

Хоча манан є відомим активатором лектинового шляху, існує теоретична можливість того, що наявність анти-мананових антитіл у щурячій сироватці також може активувати класичний шлях і генерувати СЗр за допомогою СЗ-конвертази класичного шляху. Однак кожне із сімнадцяти блокуючих анти-МА5Р-2 Рар2, перерахованих у цьому прикладі, потенційно може пригнічувати утворення СЗБ (295 95), таким чином демонструючи специфічність даного аналізу відносно СЗ-конвертази лектинового шляху.

Аналіз зв'язування також виконували для всіх сімнадцяти блокуючих Бар2 з метою підрахунку уявного Ка для кожного з них. Результати аналізу зв'язування анти-щурячих МАБР-2

Еар2 з нативними щурячими МА5Р-2 для шести блокуючих Рабр2 також представлені в таблиці 6. На фіг. 88 графічно показані результати аналізу зв'язування антитіла Бар2 Мо 11. Подібний аналіз зв'язування також виконували для інших ЕРаб2г, результати яких представлені в таблиці 6.

В основному, уявні Ка, одержані для зв'язування кожного із шести Бар2 з нативним МА5Р-2, повністю відповідають ІСво для Рар2 у функціональному аналізі СЗ-конвертази. Існують докази того, що МАБР-2 піддається конформаційним змінам з неактивної в активну форму при активації його протеазної активності (Реїіпрегод еї аІ., ЕМВО . 22:2348-59 (2003); Са! еї аї., 9. Віої.

Спет. 280:33435-44 (2005)). У нормальній щурячій плазмі, використовуваній в аналізі утворення

СЗ-конвертази, МАБР-2 присутній в основному в "неактивній" конформації зимогену. На

Зо противагу цьому, в аналізі зв'язування МА5БР-2 присутній у вигляді частини комплексу з МВІ, зв'язаного з іммобілізованим мананом; тому МАБР-2 скоріше представлений "активною" конформацією (Регїегзеп еї аї.,». Іттипої. Мейоз, 257:107-16, 2001). Отже, не слід очікувати чіткого зв'язку між ІСво і Ка для кожного із сімнадцяти блокуючих Рабв2, протестованих у цих двох функціональних аналізах, оскільки в кожному аналізі Бар2 буде зв'язуватися з різними конформаційними формами МАБР-2. Проте, за винятком Бар2 Мо 88, очевидно існує досить близька відповідність між ІСзо і уявним Ка для кожного з інших шістнадцяти Рабр2, протестованих у двох тестах (див. таблицю 6).

Деякі блокуючі Рар2 оцінювали на здатність пригнічувати МАЗР-2-залежне розщеплення С4.

На фіг. 8С графічно показані результати аналізу розщеплення С4, що демонструють пригнічення у випадку Бар2 Мо 41, з ІСво-0,81 нМ (див. таблицю 6). Як показано на фіг. 9, усі з протестованих Рар2 пригнічували розщеплення С4 зі значеннями ІСвхо, аналогічними тим, які були одержані в аналізі СЗ-конвертази (див. таблицю 6).

Хоча манан є відомим активатором лектинового шляху, існує теоретична можливість того, що наявність анти-мананових антитіл у щурячій сироватці також може активувати класичний шлях і, таким чином, генерувати С46 за допомогою розщеплення С4, опосередкованого С15.

Однак було ідентифіковано декілька анти-МА5Р-2 Раб2г, які ефективно пригнічували утворення

С4р (29595), тим самим демонструючи специфічність цього аналізу відносно МАБР-2- опосередкованого розщеплення С4. С4, подібно ССЗ, містить у своїй структурі незвичайну і високореактивну тіоефірну групу. У цьому аналізі при розщепленні С4 за участі МАБР-2 тіоефірна група на С45 може утворювати ковалентний зв'язок з гідроксильними групами або аміногрупами на макромолекулах, іммобілізованих на дні пластикових ямок, за допомогою складноефірних або амідних зв'язків, що полегшує виявлення С4Б методом ІФА.

Ці дослідження наочно демонструють створення високоафінних Бар2 для щурячого білка

МАБР-2, які функціонально блокують активність як С4-, так і СЗ-конвертази, тим самим попереджаючи активацію лектинового шляху.

ПРИКЛАД 11

У цьому прикладі описане картування епітопів декількох блокувальних антищурячих МА5Р-2 антитіл Рар2, одержаних описаним у прикладі 10 способом.

Методи

Як показано на фіг. 10, наступні білки, усі з М-термінальними бхНів-мітками, експресувалися у клітинах СНО за допомогою вектора рЕО4: щурячий МАБР-2А, повнорозмірний білок МАБР-2, інактивований шляхом заміни в активному центрі серину аланіном (5613А); щурячий МАБР-2К, повнорозмірний білок МА5Р-2, змінений для зменшення аутоактивації (8424К);

СОВІ-П, М-термінальний фрагмент щурячого МАБР-2, який містить тільки домени СИВІ,

ЕСЕЕ-подібний і СОВІЇ; і

СОВІ/ЕСЕЕ-подібний, М-термінальні фрагменти щурячого МАЗ5Р-2, які містять тільки домени

СИиВІ ї ЕСЕ-подібний.

Ці білки очищали з культуральних супернатантів нікель-афіною хроматографією, як було описано раніше (Спеп еї аї., 9. Віої. Спет. 276:25894-02 (2001)).

С-термінальний поліпептид (ССРІІ-5Р), що містить ССРІЇ і домен серинової протеази щурячого МА5Р-2, експресували в БЕ. сої/ у вигляді злитого з тіоредоксином білка за допомогою рТтхгиз (Іпмігодеп). Білок очищали від клітинних лізатів за допомогою афінної смоли Тпіобропа.

Злитий з тіоредоксином білок експресували в порожньому ртгіхРиз5 як негативний контроль.

Усі рекомбінантні білки піддавали діалізу в буфері ТВ, і їх концентрації визначили шляхом вимірювання ОО при 280 нм.

Дот-блот-аналіз

Серійне розведення п'яти рекомбінантних поліпептидів МА5Р-2, описаних вище і показаних на фіг. 10 (і поліпептид тіоредоксину як негативний контроль для поліпептиду ССРІІ-серинової

Зо протеази), наносили на нітроцелюлозну мембрану. Кількість білка, що наноситься, знаходилася в діапазоні від 100 нг до 6,4 пг, у п'ятикратних розведеннях. У наступних експериментах, кількість білка, що наноситься, знаходилася в діапазоні від 50 нг до 16 пг, також у п'ятикратних розведеннях. Мембрани блокували 595 знежиреним сухим молоком в ТВ5 (блокувальний буфер), потім інкубували з 1,0 мкг/мл анти-МА5БР-2 Рар2 у блокувальному буфері (що містить 5,0 ММ Са). Зв'язані Гар2 визначали, використовуючи НЕР-кон'юговане антилюдське ЕРар (АрО/Зегоїес; розведене в співвідношенні 1/10000) і набір для виявлення ЕСІ. (Атег5пат). Одну мембрану інкубували з поліклональним кролячим антилюдським МАБР-2 АБ (описаним в 5іомег еї аї., У. Іттипої. 163:6848-59 (1999)) як позитивним контролем. У цьому випадку, зв'язане АБ детектували за допомогою НКР-кон'югованого козячого антикролячого Іде (Бако; розведеного у співвідношенні 1/2000).

Аналіз зв'язування МА5Р-2

Планшети ІФА покривали рекомбінантним МАБР-2А або поліпептидом СОВІ-Й у карбонатному буфері (рн 9,0) у кількості 1,0 мкг на ямку протягом ночі при 4 "С. Ямки блокували 1 95 В5А в ТВ5, потім додавали серійні розведення анти-МА5бР-2 Рабр2 в ТВ5, що містить 5,0 мМ

Са. Планшети інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі. Після потрійного промивання ТВ5/Івін/Са, додавали НКР-кон'юговане антилюдське Бар (АБрОр/Зегоїес), розведене у співвідношенні 1/10000 в ТВ5/Саг:, і планшети знову інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі. Зв'язане антитіло детектували за допомогою набору ТМВ, субстрату пероксидази (Віогай).

Результати

Результати дот-блот-аналізу, що демонструють реакційну здатність БГар2 відносно різних поліпептидів МА5Р-2, представлені нижче в таблиці 7. Числові значення, наведені в таблиці 7, позначають кількість білка, що наноситься, необхідну для одержання сигналу з інтенсивністю приблизно 1/2 від максимального значення. Як можна бачити, позитивне контрольне АБ (сироватка поліклонального антилюдського МАБР-2, одержана від кроликів) розпізнавало всі поліпептиди (виключення становить тільки химерний білок тіоредоксину).

ТАБЛИЦЯ 7

РЕАКЦІЙНА ЗДАТНІСТЬ ВІДНОСНО РІЗНИХ РЕКОМБІНАНТНИХ ПОЛІПЕПТИДІВ

ЩУРЯЧОГО МА5БР-2 У ДОТ-БЛОТ-АНАЛІЗІ подібний 60 | о4н | ОбО4ні | мА | ма | мВ ЯЯОК 7.66 | о4н | мА | мА | 2бн | мВ ЯЖ 7.86 | об4н | мА | мА | Он | мА Я Же контроль

МА-немає реакції. Позитивне контрольне антитіло являє собою сироватку поліклонального антилюдського МА5Р-2, одержану від кроликів.

Усі Рар2 вступали в реакцію з МА5БР-2А, а також з МА5БР-2К (дані не показані). Більшість

Бар2 розпізнавали поліпептид ССРІІ-5Р, але не М-термінальні фрагменти. Виключення представляють Рабр2 Мо 60 і Бар2 Мо 57. Бар2 Мо 60 розпізнає МА5БР-2А і фрагмент СОВІ-ЇЇ, але не розпізнає СОВІ/ЛЕСЕ-подібний поліпептид або ССРІІ-5Р поліпептид, що передбачає його зв'язування з епітопом на СОВІЇ, або перекривання СИВІЇ! ії ЕСЕ-подібного домену. Бар2 Мо 57 розпізнає МА5Р-2А, при цьому не розпізнає жоден із протестованих фрагментів МА5Р-2, що вказує на те, що це антитіло БГар2 розпізнає епітоп на ССРІ. Бар2 Мо 40 і Мо 49 зв'язуються тільки з повним МА5Р-2А. В аналізі зв'язування ІФА, показаному на фіг. 11, Бар2 Мо 60 також зв'язувався з поліпептидом СИВІ-ІЇ, хоча із трохи більш низькою уявною спорідненістю.

Ці результати демонструють унікальну здатність Бар2 блокувати численні ділянки білка

МА5Р-2.

ПРИКЛАД 12

У цьому прикладі описана ідентифікація за допомогою фагового дисплея повністю людських 5сЕм-антитіл, які зв'язуються з МА5Р-2 і пригнічують опосередковувану лектином активацію комплементу, при цьому не зачіпаючи класичний (С1д-залежний) шлях компонента імунної системи.

Короткий огляд

Повністю людські, високоафінні антитіла МАБР-2 ідентифікували шляхом скринінгу бібліотеки фагового дисплея. Фрагменти варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів антитіл виділяли як у форматі 5сЕм, так і у форматі повнорозмірного Ід. Людські антитіла до

МАБР-2 є корисними для пригнічення клітинного ушкодження, асоційованого з опосередкованою лектином активацією шляху комплементу, при цьому не зачіпаючи класичний (Стд-залежний) шлях компонента імунної системи. У деяких варіантах здійснення представлені інгібуючі МАБР-2 антитіла мають наступні характеристики: (а) висока спорідненість до людського МАБР-2 (наприклад, Ко-10 нМ або менше) і (Б) пригнічують МАЗР-2-залежну

Зо активність комплементу в 90 95 людській сироватці з ІСво, що дорівнює 30 нМ або менше.

Методи

Експресія повнорозмірного каталітично неактивного МА5Р-2

Повнорозмірну послідовність КДНК людського МАБР-2 (ЗЕО ІЮ МО:4), кодуючу людський поліпептид МАЗР-2 з лідерною послідовністю (ЗЕО ІЮ МО:5), субклонували у вектор експресії рСІ-Мео ссавців (Рготеда), який запускає експресію у еукаріот під керуванням СММУ енхансерної/промоторної області (описано в Каййтап К.). еї аїЇ., Мисіеіс Асіає Кезеагсй,

19:4485-90, 1991; Каштап, Меїподз іп Епгутоїіоду, 185:531-66 (1991)).

Для одержання каталітично неактивного людського білка МА5БР-2А здійснювали сайт- спрямований мутагенез, як описано в 5 2007/0172483, включеному в даний опис у вигляді посилання. Продукти ПЛР очищали після електрофорезу в агарозному гелі і одержання смуг, і одержували одиночні аденозинові перекриття за допомогою стандартної процедури нарощування. Потім МАБР-2А з доданим аденозином клонували у вектор рОЕМ-Т Еаву і трансформували в БЕ. соїї. Людський МАЗР-2А додатково субклонували у вектор експресії ссавців РЕО або рсСІ-Мео.

Вищеописану експресійну конструкцію МАБР-2 і МАБР-2А трансфікували в клітини ОХВ1, використовуючи стандартну процедуру кальцій-фосфатної трансфекції (Мапіаїі5 еї аї., 1989).

МАБР-2А одержували в безсироватковому живильному середовищі, щоб виключити контамінацію препаратів іншими сироватковими білками. Через день збирали конфлюентні клітини з живильних середовищ (загалом процес проводили чотири рази). Середній рівень рекомбінантного МАБР-2А склав приблизно 1,5 мг/літр культурального середовища. МАБР-2А (мутантну форму 5ег-АЇІа, описану вище) очищали афінною хроматографією на колонках з МВР-

А-агарозою.

Метод ІФА для МА5БР-2А на клонах-кандидатах 5сСЕм, ідентифікованих шляхом пенінг/5сЕм- перетворення і скринінгу за допомогою фільтра

Бібліотеку фагового дисплея послідовностей варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів людського імуноглобуліну піддавали антигенному пенінгу з наступним автоматизованим скринінгом і відбором для виявлення високоафінних 5сЕм-антитіл до людського білка МА5БР-2. Виконували три цикли пенінгу 5сЕм-фагової бібліотеки відносно НІ5- мітки або міченого біотином МА5Р-2А. У третьому циклі пенінгу виконували елюцію спочатку з

МВІ, а потім з ТЕА (лужний). Для відстеження специфічного збагачення фагів, що демонструють фрагменти 5сЕм відносно цільового МАБР-2А, виконували ІФА для поліклональних фагів проти іммобілізованого МА5Р-2А. Гени 5сЕм із циклу З пенінгу клонували у вектор експресії РНОС і виконували скринінг через дрібний фільтр для пошуку конкретних клонів, націлених на МАБР-2А.

Бактеріальні колонії, що містять плазміди, кодуючі 5сЕм-фрагменти із циклу З пенінгу,

Зо збирали, поміщали на нітроцелюлозні мембрани і вирощували протягом ночі на неіндукуючому середовищі для одержання майстер-планшетів. Загалом було відібрано і проаналізовано 18000 колоній із циклу З пенінгу, половина в результаті конкурентної елюції і половина в результаті наступної елюції ТЕА. Пенінг бібліотеки фагмідних 5сЕм проти МАБЗР-2А з наступним 5сЕхм- перетворенням і скринінгом з використанням фільтра дав 137 позитивних клонів. 108/137 клонів виявилися позитивними в аналізі ІФА відносно зв'язування МА5Р-2 (дані не показані), з яких 45 клонів були додатково проаналізовані на здатність блокувати активність МАБР-2 у нормальній людській сироватці.

Аналіз для вимірювання пригнічення утворення СЗ-конвертази лектинового шляху

Функціональний аналіз по вимірюванню пригнічення утворення СЗ-конвертази лектинового шляху використовували для оцінки "блокувальної активності" зсЕм-клонів-кандидатів МА5Р-2.

Для одержання двох білкових компонентів (С4Б, Сга), які містять СЗ-конвертазу лектинового шляху, потрібна активність серинової протеази МАЗР-2. Отже, зсЕм МАБР-2, які пригнічують функціональну активність МА5Р-2 (тобто блокують зсЕм МАЗР-2), будуть пригнічувати де похо утворення СЗ-конвертази лектинового шляху. СЗ містить у своїй структурі незвичайну і високореактивну тіоефірну групу. При розщепленні СЗ3 СЗ-конвертазою у цьому аналізі тіоефірна група на СЗ3р може утворювати ковалентний зв'язок з гідроксильними групами або аміногрупами на макромолекулах, іммобілізованих на дні пластикових ямок, за допомогою складноефірних або амідних зв'язків, що полегшує виявлення СЗБЬ методом ІФА.

Дріжджовий манан відомий як активатор лектинового шляху. У наступному методі вимірювання утворення СЗ-конвертази пластикові ямки, покриті мананом, інкубували з розведеною людською сироваткою для активації лектинового шляху. Потім ямки промивали і аналізували на наявність СЗБ, іммобілізованого в ямках, стандартними методами ІФА. Кількість

СЗр, утвореного в цьому аналізі, є прямим відображенням йе ломо утворення СЗ-конвертази лектинового шляху. 5сЕм-клони МА5Р-2 в вибраних концентраціях тестували в цьому аналізі на здатність пригнічувати утворення СЗ-конвертази і наступного утворення СЗБ.

Методи 45 клонів-кандидатів, ідентифікованих, як описано вище, експресували, очищали і розбавляли до однієї і тієї ж маточної концентрації, яку знову розбавляли буфером СМВ, що містить Са і Мд"- (4,0 мМ барбіталу, 141 мМ Масі, 1,0 мМ Мосі», 2,0 мМ Сасі», 0,1 95 желатин, бо рН 7,4), для гарантії того, що всі клони мають однакову кількість буфера. 5сЕм-клони тестували в трьох повторах у концентрації 2 мкг/мл. Позитивним контролем служив ОМ5100 Рар2, який тестували при концентрації 0,4 мкг/мл. Утворення СЗс відслідковували в присутності і за відсутності клонів 5сЕм/Іда.

Манан розбавляли до концентрації 20 мкг/мл (1 мкг/ямку) в 50 мМ карбонатному буфері (15

ММ МагбОз-35 мМ МансСозая1,5 мМ Мам»), рН 9,5, і покривали ним планшети ІФА, залишаючи на ніч при 4 "С. Наступного дня покриті мананом планшети промивали З рази 200 мкл РВ5.

Потім у ямки додавали по 100 мкл 1 95 блокуючого Н5А розчину і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшети тричі промивали 200 мкл РВЗ5 і зберігали на льоду з 200 мкл РВ5З до додавання зразків.

Звичайну людську сироватку розбавляли до 0,5 95 концентрації в буфер СамосмвВ, і в цей буфер додавали 5сЕм-клони або позитивний контроль ОМ5100 Рар2 трьома повторами в концентраціях 0,01 мкг/мл, 1 мкг/мл (тільки контроль ОМ5100) ії 10 мкг/мл і попередньо інкубували протягом 45 хвилин на льоду перед додаванням у заблокований планшет ІФА.

Реакцію ініціювали інкубацією протягом однієї години при 37 С, яку зупиняли шляхом перенесення планшетів на льодяну баню. Відкладення СЗр детектували за допомогою кролячого антитіла до о-мишачого СЗс, після якого використовували НКР-кон'юговане козяче анти-о-кроляче антитіло. Негативним контролем служив буфер без антитіл (без антитіл-максимальний рівень відкладень СЗБ), а позитивним контролем служив буфер з ЕДТО (без відкладення СЗ3Б). Фон визначали, використовуючи той же аналіз, за винятком того, що ямки не містили манан. Фоновий сигнал відносно планшетів без манану віднімали із сигналів у мананвмісних ямках. Критерій порогового значення встановлювали рівним половині активності нерелевантного 5сЕм-клону (МАМ) і чистого буфера.

Результати

Грунтуючись на критерії порогового значення, загалом було виявлено 13 клонів, блокуючих активність МАЗР-2. Усі 13 клонів, що забезпечують »50 95 пригнічення шляху, відбирали і секвенували, одержавши 10 унікальних клонів. Було знайдено, що всі десять клонів мають легкий ланцюг одного і того ж підкласу, АЗ, але важкий ланцюг трьох різних підкласів: МН2, УНЗ і

МНВб. У функціональному аналізі у п'яти з десяти 5сЕу-клонів-кандидатів значення ІСзо у НМ були менше цільового критерію, 25 нМ, із застосуванням 0,5 95 людської сироватки.

Для виявлення антитіл з поліпшеною ефективністю, три материнські 5сЕм-клони, визначені, як описано вище, піддавали методу перетасування легкого ланцюга. Цей процес включав створення комбінаторної бібліотеки, що складається з Мн кожного материнського клону, спареного з бібліотекою нативних людських легких лямбда-ланцюгів (Мі), одержаних від шести здорових донорів. Потім цю бібліотеку піддавали скринінгу на виявлення 5сЕм-клонів з поліпшеною спорідненістю зв'язування і/або функціональністю.

ТАБЛИЦЯ 8

Порівняння функціональної ефективності по ІСво (НМ) основних дочірніх клонів і відповідних їм материнських клонів (усі у форматі 5сЕм) 1 95 людська сироватка, 90 95 людська 90 95 людська 5сСЕУ-клон аналіз СЗ сироватка, сироватка, (ІСво НМ) аналіз СЗ аналіз С4

ІСво НМ) ІСво НМ)

ЛЯМмІбтс777777771717171111111176811111171 11111111 ма | мсСщС

Нижче представлені послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга (МН) для материнських клонів і дочірніх клонів, показаних вище в таблиці 8.

СО (31-35 (НІ), 50-65 (Н2) і 95-107 (НЗ)) по Кабваї виділені напівжирним шрифтом; і СОК (26-32 (НІ), 52-56 (Н2) і 95-101 (НЗ)) по Споїйіа підкреслені.

Варіабельна ділянка важкого ланцюга (МН) 17020 35МН-21М11М (5ЕО ІО МО:67, кодованої

ЗЕО І МО:66)

ОМТІКЕБОаРМІ МКРТЕТІ ТІ ТСТУБав5І ЗНАКМОаУ5УМвОРРОКАЇ ЕМ .АНІЕЗ5ЗОЕКВУВТ5І.

КОАІГТІЗКОТЗКМОММІ ТМТММОРУЮОТАТУУСАВІВВОСІЮУМУСОСТІ УТУБ5, варіабельна ділянка важкого ланцюга (МН) 417М9 (ЗЕО ІВ МО:68)

ОМОГ ОО5аРИЇ МКРБОТІ 5І ТСАІЗИО5УЗЗТЗААМММІВОЗРОВИа ЕМ ОаВТУУВЗКУМУМОУ

АМ5УКЗАІТІМРОТЗКМОГБІ ОЇ М5МТРЕОТАМУУСАНОРЕСУРЕОМ/СОСТМУТУБЗ5.

Нижче представлені послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга (МІ) для материнських клонів і дочірніх клонів, показаних вище в таблиці 8.

СО (24-34 (І 1); 50-56 (І 2) і 89-97 (І 3)) по Кабваї виділені напівжирним шрифтом; і СОК (24- 34 (11); 50-56 (12) ї 89-97 (13)) СпоїШпіа підкреслені. Ці ділянки є однаковими, незалежно від системи нумерації, по Кабаї або Споїпіа.

Варіабельна ділянка легкого ланцюга (МІ) 17020т а3521М11 М5ЕО ІЮО МО:70, кодованої

ЗЕО ІЮ МО:69)

ОРМГТОРРБОІ БМБРООТАБІТОЗОЕКІ СОКУ АУМУООКРООБЗРМІ УММОВКОВРЗаИаРЕНЕ5СО

ЗМЗамтТАТІ ТІЗа ТГОАМОЕАВУМСОАМОЗЗТАМЕСССИТКІ ТМІ, варіабельна ділянка легкого ланцюга (МІ) 17М1бт а17М9 (ЗЕО ІВ МО:71)

ЗУЄЕПОРРОУЗМАРСОТАТІТСАаОМ СККАУНМУООАРИООАРМІ МІМООЗОВРЗа! РОВЕЗАБМ

ЗаМТАТІ ТІТАСЕАВРЕАОУМСОММОІАТОНУУРгИаСИткІ ТМ ААДОИЗЕОКІ ІЗЕ.

Анти-МАБР-2 антитіла ОМ5100 і Модр а3521М11М| (що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, представлену в 5ЕО ІЮО МО:70, також називані "ОМ5646" і "тАБб"), які обидва продемонстрували зв'язування людського МАБР-2 з високою спорідненістю і мають здатність блокувати функціональну активність комплементу, проаналізували відносно зв'язування епітопа за допомогою дот-блот-аналізу. Результати показують, що антитіла ОМ5646 і ОМ5100 є високоспецифічними відносно МА5Р-2 і не зв'язуються з МА5Р-1/3. Жодне антитіло, зв'язане з

МАр19 або фрагментами МА5БР-2, не містило домен ССРІ1І МАБР-2, що дозволило зробити висновок, що ділянки зв'язування включають ССРІ1.

Було визначено, що анти-МА5Р-2 антитіло ОМ5646 активно зв'язується з рекомбінантним

МА5Р-2 (Ка від 60 до 250 мкМ) з селективністю, що перевищує в 5000 разів таку для зв'язування

С15, С1г або МА5Р-1 (див. таблицю 9 нижче).

ТАБЛИЦЯ 9

Спорідненість зв'язування і специфічність взаємодії анти-МАБР-2 антитіла ОМ5646 з МА5Р-2, за результатами твердофазного ІФА "середнє значенняй50; п-12.

ОМ5646 специфічно блокує компоненти лектинзалежної активації

Методи

Зо Вплив ОМ5646 на відкладення мембраноатакуючого комплексу (МАС) проаналізували, використовуючи специфічні умови для лектинового шляху, класичного шляху і альтернативного шляху. Із цією метою використовували набір для скринінгу комплементу УМезіаб Сотр300 (Умезіаб, І ипа, зугедеп), відповідно до інструкцій виготовлювача.

Результати

На фіг. 12А графічно показаний рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності анти-МА5Р-2 антитіла (0М5646) у специфічних для лектинового шляху умовах. На фіг. 128 графічно показаний рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності анти-МА5Р-2 антитіла (0М5646) у специфічних для класичного шляху умовах. На фіг. 12С графічно показаний рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності анти-МА5Р-2 антитіла (ОМ5646) у специфічних для альтернативного шляху умовах.

Як показано на фіг. 12А, ОМ5646 блокує опосередковану лектином активацію відкладення

МАС зі значенням ІСвхо, що дорівнює приблизно 1 нМ. Однак ОМ5646 не впливав на відкладення

МАС, що відбувається в результаті активації, опосередкованої класичним шляхом (фіг. 128) або альтернативним шляхом (фіг. 1253).

Фармакокінетика і фармакодинаміка ОМ5646 після внутрішньовенного (ІМ) або підшкірного (52) введення мишам

Фармакокінетику (РК) і фармакодинаміку (РО) ОМ5646 оцінювали в 28-денному дослідженні

РК/РО у мишей при однократному введенні дози. У дослідженні тестували рівні доз 5 мг/кгі 15 мг/кг 0М5646, що вводяться підшкірно (5С), а також рівень дози 5 мг/кг ОМ5646, що вводиться внутрішньовенно (ІМ).

Що стосується РК-профілю ОМ5646, на фіг. 13 графічно показана концентрація ОМ5646 (середня кількість тварин п-З на групу) залежно від часу після введення ОМ5646 у зазначеній дозі. Як показано на фіг. 13, при 5 мг/кг 5С максимальна концентрація ОМ5646 у плазмі, що дорівнює 5-6 мкг/мл, була досягнута приблизно через 1-2 дні після дозування. Біодоступність

ОМ5646 при 5 мг/кг 5С становила приблизно 60 95. На фіг. 13 також показано, що при 15 мг/кг 5С максимальна концентрація в плазмі ОМ5646, що дорівнює 10-12 мкг/мл, була досягнута приблизно через 1-2 дні після дозування. У всіх групах ОМ5646 повільно виводився із системного кровотоку з кінцевим періодом напіврозпаду приблизно 8-10 днів. Профіль ОМ5646 виявився типовим для людських антитіл у мишей.

РО-активність ОМ5646 графічно показана на фіг. 14А і 14В. На фіг. 14А ї 14В показана відповідь РО (зниження системної активності лектинового шляху) для кожної миші в групах, що одержали 5 мг/кг ІМ (фіг. 14А) ї 5 мг/кг 5С (фіг. 148). Пунктирна лінія вказує вихідний рівень в аналізі (максимальне пригнічення, інтактна мишача сироватка, ін'єктована /л мто з надлишком

ОМ5646 перед аналізом). Як показано на фіг. 14А, після ІМ введення 5 мг/кг ОМ5646 активність лектинового шляху системи комплементу відразу знизилася майже до невиявлюваних рівнів, а відновлення активності лектинового шляху протягом 28-денного періоду спостереження було помірним. Як показано на фіг. 1488, у мишей, що одержали дозу 5 мг/кг 0М5646 5С, спостерігалося залежне від часу пригнічення активності лектинового шляху. Активність лектинового шляху знижувалася до майже невиявлюваних рівнів протягом 24 годин після введення лікарської речовини і залишалася на низькому рівні протягом щонайменше 7 днів.

Активність лектинового шляху поступово збільшувалася з перебігом часу, але не верталася до рівнів, спостережуваних до введення дози, протягом 28-денного періоду спостереження.

Профіль активності лектинового шляху залежно від часу, спостережуваний після введення 15 мг/кг 5С, був аналогічним профілю для дози 5 мг/кг 5С (дані не показані), що вказує на насичення кінцевої точки РО. Дані також указують на те, що дози 5 мг/кг ОМ5646, що вводяться раз на тиждень або ІМ, або 5С, є достатніми для досягнення безперервного пригнічення

Зо активності лектинового шляху системи комплементу у мишей.

ПРИКЛАД 13

У цьому прикладі описане одержання рекомбінантних антитіл, які інгібують МА5Р-2, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга і/або легкого ланцюга, яка містить одну або більше СОК, які специфічно зв'язуються з МАБР-2, і щонайменше одну ядерну пептидну послідовність ЗОМІ (також називаних анти-МА5бР-2 антитіло, що несе ЗОМІ-пептид, або його антигензв'язувальний фрагмент).

Передумови/обгрунтування

Створення специфічних інгібіторів МА5Р-2, називаних 5ОМІ-2, описане в Неда еї аї., 9. Віоі!.

Спет. 287:20290 (2012); і Неда єї аІ., РМА5, 109:10498 (2012), які включені у даний опис у вигляді посилання. 5ОМІ-2 являє собою пептид з 36 амінокислот, який був вибраний з фагової бібліотеки варіантів інгібітору 2 протеази бсРівіосегса дгедапа, у якому шість із восьми положень зв'язуючої протеазу петлі були повністю рандомізовані. Наступна еволюція /л Уго давала в результаті моноспецифічні інгібітори з однорозрядними значеннями Кі у нМ діапазоні (Неа єї аї., 9. ВіоіІ., Спет., 287:20290, 2012). Структурні дослідження показали, що оптимізована зв'язуюча протеазу петля утворює первинну ділянку зв'язування, яка визначає специфічність двох інгібіторів. Амінокислотні послідовності подовжених вторинних і внутрішніх зв'язувальних ділянок є загальними для обох інгібіторів і додають внесок у ділянку контакту (Не)а еї аї., 2012.

У. Вісі. Спет., 287:20290). Механічно ЗОМІ-2 блокує активацію лектинового шляху комплементу, не впливаючи на класичний шлях (Неда єї аї., 2012. Ргос. Май. Асайд. 5сі. 109:10498).

Амінокислотні послідовності інгібіторів зОМІ-2 наведені нижче:

ЗОМІ-2І,, повнорозмірний:

ГЕМТСЕРОТТЕКОКСМТСсАСаБООаКЗАМСТКІ МУСМО (5ЕО ІЮ МО:72),

ЗОМІ-2ГІ,, середньої довжини:

ТСЕРОТТЕКОКСМТсАСаБОракЗАМСТКІ МСМО (ЗЕО І МО:73),

ЗОМІ-2І,, короткий: тонСавзраквзАМСТКІМСМО (5ЕО ІО МО:74).

Як описано в цьому прикладі, а також в УМО 2014/144542, анти-МАБ5Р-2 антитіла, що несуть пептид ЗОМІ-2, і їх фрагменти одержували шляхом злиття з амінокислотною послідовністю пептиду ЗОМІ-2 (ЗЕО ІО МО:72, 73 або 74) на аміно- або карбоксильному кінці важкого і/або 60 легкого ланцюга людського анти-МА5Р-2 антитіла. Анти-МА5БР-2 антитіла, що несуть пептид

ЗОМІ-2, і їх фрагменти мають підвищену інгібуючу активність у порівнянні з анти-МАБР-2 антитілом з оголеним остовом, яке не містить пептидну послідовність 5ОМІ-2, згідно з результатами аналізу відкладення СЗ3Б або С4Бб з використанням людської сироватки, як описано в УМО 2014/144542, а також мають підвищену інгібуючу активність у порівнянні з анти-

МА5БР-2 антитілом з оголеним остовом, виміряну в мишачій моделі /л м/імо. Способи одержання анти-МА5БР-2 антитіла, що несе пептид 5ОМІ-2, описані нижче.

Методи

Одержували експресійні конструкції для кодування чотирьох ілюстративних анти-МА5Р-2 антитіл, що несуть пептид 5ЗОМІ-2, де пептид ЗОМІ-2 був злитий або з М-, або з С-кінцем важкого або легкого ланцюга репрезентативного інгібуючого МАБР-2 антитіла ОМ5646 (як описано в прикладі 12).

ТАБЛИЦЯ 10

ЗЛИТТЯ МА5БР-2 АНТИТІЛО/ЗОМІ-2 нІі-м2 болемдероомемє | 70017101 н-ема-5емМмі2-м 0 | вамі2 | - | - | - 1 75570 н-ма-5амі2с | 7 - | 5аМмі2 | /- | - | 76570 -ма-заміаМ ЇЇ 7777-1717 - | в5Бамі2 | - | 67-77 п-ма-земіаС ЇЇ 7777-7177 - 171 - | Бема | 67-78

Позначення в таблиці 10: "Н-М":амінокінець важкого ланцюга; "Н-С"-карбоксильний кінець важкого ланцюга; "| -М"-амінокінець легкого ланцюга; "| -бС"«карбоксильний кінець легкого ланцюга; "М2г"хостов МАБР-2 ар (0М5646).

Для М-кінцевих злиттів, показаних у таблиці 10, додавали пептидний лінкер (оТобоообОо55 5ЕО ІЮ МО:79) між пептидом 5ОМІ-2 і варіабельною ділянкою.

Для С-кінцевих злиттів, показаних у таблиці 10, додавали пептидний лінкер (ГААСО5О' ЗЕО

ІО МО:80) між константною областю і пептидом 5СОЕМІ-2, а другий пептид "З5ОА"' (ЗЕО ІЮ МО:81) додавали на С-кінці злитого поліпептиду для захисту С-кінцевих пептидів 5ОМІ-2 від деградації.

Амінокислотні послідовності наведені нижче для наступних репрезентативних злиттів МА5Р - 2 антитіло/ФЗОМІ-2:

Н-М2арб-5ОМІ-2-М (ЗЕО ІО МО:75, кодована 5ЕО ІО МО:82):

ГЕМТСЕРСОТТЕКОКСМТСАСОаЗОаКкКБЗАУСТК УСМОСТИСОсСоСОвООМТІ КЕЗОРМІ МКРТЕТ

ЕтстотУзаєві знакмаувзУвоРРОКАЇ ЕМ АНІЕЄЗ5ЗОЕКОЗМУВТ5І КОЗА ТІЗКОТЗКМОММІ ТМ

ММОРМОТАТУУСАВІВННССІСВУМУСОСТІ МТГУ55АЗТКаРОЗМЕРІ АРСЗАЗТЗЕЗТААГ СС МКОМЕР

ЕРМТУБМ/МЗСИАЇ ТЗаМНТЕРАМІ О55О11 У5І 55 УРЗБІІ ТКУ СММОНКРУОЬМТКУМОКАМЕЗК

УИаРРСОРРОРАРЕРІ СаРБЗМУЕГЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУМОУЗОБЕОРЕМОЄМИУ ММрОаМЕМНМА

КТКРАЕЕОЕЄМЗТУВУМУМІ ТМ НОВУ МЕ КЕУКСКУЗМКаї РЗБІЕКТІЗКАКИООРАВЕРОММУТІ РРБ

ОБЕМТКМОМ5І ТС УКЕЕМРЗОІАМЕМ ЕЗМООРЕММУКТТРРМІ ЮОБОраЗЕРІ ЗА ТМОКЗАМОвС

МУМЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКОІ 51 5І СК 491 аа білок, аа 1-36-5025МІ-2 (підкреслено), аа 37-46-лінкер (виділено курсивом); аа 47- 164-варіабельна ділянка важкого ланцюга МАБР-2 аб Мо 6 (підкреслено); аа 165-491-Ідс4 константна ділянка з мутацією в шарнірній областіЇ.

Н-М2арб-5ОМІ-2-С (ЗЕО ІО МО:76, кодована 5ЕО ІО МО:83):

ОМТКЕБЗОаРМІ МКРТЕТ ТТСТУЗаИаЕ5І БДаЕКМОаму5УВОРРОКАСЕУМ АНІЕЗЗОЕКОЗУВТОІ.

КЗАСТІЗКОТ5КМОММІ ТМТММОРУЮВТАТУУСАВІВ НОСІ СОСТІ УТУ55АЗТКОаРОЗМУЕРІ АРС

ЗАЗТЗЕЗТААЇ аСІ УКОМЕРЕРУТУБУУМЗСИАЇ ТЗаУНТЕРАМІ О55О0І 51 55 ГУРЗБУИТКТМТ

СМУОНКРУЬМТКУОКАМЕЗКУСРРОРРОРАРЕРІ ОРБЗМУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗВАВТРЕМТСУУМОМБОЕ

ОРЕМОЕЄМУМУрамМЕМНМАКТКРАЕЄОЕМЗТУВУММІ ТМ НОБУУЛІ МСКЕУКОСКУЗМКИаї РЗОЕКТІ

ЗКАКИОРВЕРОМУТІ РРЗОЄЕМТКМОМУБІ ТС УКИЕМРЗОІАМЕЖМ ЕЗМСООРЕММУКТТРРМІ О502

ЗЕ МЗА ТМОКЗАУМОБ,ММЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКОБІ 5І БІ АКААССОСІ ЕМТСЕРСТТЕКОКС мМмтовса,авзраквАУСтТкІУСМОсьсА 491 аа білок, аа 1-118-варіабельна ділянка важкого ланцюга МА5БР-2 аб Мо 6 (підкреслено);

аа 119-445-|3654 константна ділянка з мутацією в шарнірній області; аа 446-451-перший лінкер (виділено курсивом); аа 452-487-5(02МІ-2; аа 488-491-другий лінкер (виділено курсивом).

Г-М2арбв-5СаМІ-2-М (5ЕО ІО МО:77, кодована ЗЕО ІЮ МО:84):

ГЕМІСЕРСОТТРКОКСОМТс!СсаОСКБЗАМСТКІ МСМОСТЕИСОСОООБОРМІ ТОРРБІ 5М5РОЮТ

АБІТОВИЕК арКУАУММООКРЕОБРМІ УМУОСКОВРЗСІРЕНЕЗОЗМЗСИМТАТІ ТІБСТОАМОЕА

ВУМСОАМроЗГТАМгасаТтк ТМ аОРКААРЗМТІ ЕРРЗЗЕБЕЇ ОАМКАТІ МСГ ІБОЕМРОАМТМАМКА

Р5ЗРУКАСМЕТТТРОКОЗММКМУААБЗУЗМІ ЗІ ТРЕОМУКЗНАЗУЗСОМТНЕВЗТУЕКТУМАРТЕСЗ (258 аа білок, аа 1-36-5025МІ-2 (підкреслено); аа 37-46-лінкер (виділено курсивом); аа 47- 152-варіабельна ділянка легкого ланцюга МАБР-2 ар Мо 6 (підкреслено); аа 153- 258-константна ділянка людського Ід лямбда).

Г-М2арб-5ИаМІ-2-С (5ЕО ІО МО:78, кодована ЗЕО ІЮ МО:85):

ОРМІТОРРБОІ БМ5РООТАБІТОЗСЕКГ СОКМАМУУООКРИОБРМІ УМУОВСКОВАРЗИаІРЕВЕЗСО

ЗМЗамМТАТІ ТІЗС ТОАМОЕАВУМСОАМ О551ТАМгСаИИТткеТМ СОРКААРБЗМТІ ЕРРЗБЗЕБЇ ОАМКА

ТМСПІЗОЕУРЕІАМТМАМКАОЗЗРУКАСМЕТТТРУКОЗММКУААБЗОЗМУІ ЗІ ТРЕОСМУКЗНАЗУЗСОМТН

ЕВЗТУЕКТМАРТЕСЗААССЬСІ ЕМТІСЕРСОТТЕКОКСМТ СнНССОСЗВИакКЗАУСТК УСМОСеСА (258 аа білок, аа 1-106-варіабельна ділянка легкого ланцюга МАБР-2 ар Мо 6 (підкреслено); аа 107-212-константна ділянка людського Ід лямбда; аа 213-21в8-перший лінкер; аа 219- 254-5(2МІ-2; аа 255-258-другий лінкері.

Функціональний аналіз

Чотири конструкції анти-МА5Р-2-502МІ-2 злитого антитіла транзієнтно експресували в клітинах Ехрі293Е (Іпмігодеп), очищали за допомогою афінної хроматографії з білком А і тестували в 10 95 нормальній людській сироватці для пригнічення відкладення СЗБ в аналізі з мікросферами, покритими мананом, як описано нижче.

Тестування МАЗР-2-5ОМІ-2 злиттів в аналізі відкладення СЗБЬ з використанням мікросфер, покритих мананом

МА5БР-2-5ОЕМІ-2 злиті антитіла оцінювали на здатність пригнічувати лектиновий шлях в аналізі відкладення СЗБбБ на покритих мананом мікросферах. Цей аналіз, який дозволяє визначити ступінь активності методом проточної цитометрії, має більш високе розрізнення, ніж аналіз УмезіарфФ. Аналіз лектинового шляху з використанням мікросфер виконували наступним

Зо чином: манан адсорбували на полістирольних мікросферах діаметром 7 мкМ (Вапо5

І арогафогіе5, Різпегв5, ІМ, ОА) протягом ночі при 4 "С у карбонатно-бікарбонатному буфері (рн 9,6). Мікросфери промивали РВ5 і піддавали впливу 1095 людської сироватки або 10 95 сироватку попередньо інкубували з антитілами або інгібіторами. Суміш сироватка-мікросфери інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години при перемішуванні. Після інкубації в сироватці мікросфери промивали, і відкладення СЗ3Об на мікросферах вимірювали шляхом виявлення за допомогою анти-СЗс поліклонального кролячого антитіла (Юако Могпйп Атегіса,

Сагріпіеєгіа, СА, ЮОБА) і РЕ-Суб-кон'югованого козячого анти-кролячого вторинного антитіла (Зошегп Віоїесі, Віппіпдпат, АГ, О5А). Після процедури забарвлення мікросфери аналізували за допомогою проточного цитометра Расзсаїїриг. Мікросфери аналізували у вигляді однорідної популяції, використовуючи пряме і бічне розсіювання, і відкладення СЗЬ проявлялося у вигляді

ЕІ З-позитивних частинок (РІ -3 або "РІ -3-канал" указують на третій або червоний канал на цитометрі). Середню геометричну інтенсивність флуоресценції (МЕЇ) для популяції для кожного експериментального стану виводили на графіку залежності від концентрації антитіло/інгібітор для оцінки пригнічення лектинового шляху.

Значення ІСво розраховували за допомогою програмного забезпечення СгарпРай РКІЗМ.

Зокрема, значення ІСво одержували шляхом застосування нелінійної (чотирипараметричної), зі змінюваним кутом нахилу підгонки кривих залежності Ід (антитіло) від середньої інтенсивності флуоресценції, одержаних у результаті цитометричного аналізу.

Результати показані в таблиці 11.

ТАБЛИЦЯ 11

Відкладення СЗБ (аналіз з використанням покритих мананом мікросфер) в 10 95 людській сироватці

Результати

Контрольне анти-МАБР-2 антитіло з "голим" остовом, що не містить ЗОМІ (тАр Мо 6), виявилося інгібуючим у цьому аналізі з величиною ІС5хо»3,63 НМ, що узгоджується з результатами інгібування, спостережуваними в прикладі 12. Примітно те, що, як показано в таблиці 11, усі злиття 5ОМІ-2-МА5БР-2 антитіло, які були протестовані, поліпшували ефективність антитіла МАБР-2-остов у цьому аналізі, що вказує на те, що підвищена валентність також може бути корисною при пригніченні відкладення С3р.

Тестування злиттів МАБР-2-5024МІ-2 в аналізі з покритими мананом мікросферами для вивчення відкладення С46 з 10 95 людською сироваткою

Аналіз відкладення С4б проводили з використанням 10 95 людської сироватки, у тих же умовах аналізу, які описані вище для аналізу відкладення СЗБ0, з наступними модифікаціями.

Аналіз для виявлення СА і аналіз проточної цитометрії проводили шляхом забарвлення реакції відкладення анти-С45б мишачим о моноклональним антитілом (1:500, ОпцідеІ))Й ї шляхом забарвлення вторинним козячим антимишачим Е(ар')г2, кон'югованим з РЕ-Су5 (1200, бошпет

Віоїесі)), перед аналізом проточної цитометрії.

Результати

Обидва злиття 50ОМ5-2-несуче анти-МАБР-2-М-термінальне антитіло (Н-М2-5СаМІ-2-М:

ІСво-0,34 НМ, І-М2-5ОМІ-2-М: ІСто-0,41 нМ) мали підвищену ефективність у порівнянні з антитілом анти-МА5Р-2-остов (НІ-М2: ІСво-0,78 НМ).

Аналогічним чином, злиття одиночне 5ОМ-2-несуче С-термінальне анти-ММ5-2-антитіло (Н-

М2-5ОМІ-2-С: ІСво-0,45 нМ ї Г-М2-52МІ-2О: ІСво-0,47 НМ) мали підвищену активність у порівнянні з антитілом анти-МА5Р-2-остов (НІ -М2: ІСво-1,2 нМ).

Тестування злиттів МА5БР-2-52МІ-2 в аналізі відкладення СЗБ з покритими мананом мікросферами з 10 956 мишачою сироваткою

Аналіз відкладення СЗБ з покритими мананом мікросферами здійснювали, як описано вище, з 1095 мишачою сироваткою. Аналогічно результатам, спостережуваним у випадку використання людської сироватки, було встановлено, що в мишачій сироватці злиття ЗОМІ-2-

Зо несучі анти-МАБР-2 мають підвищену ефективність у порівнянні з антитілом анти-МАБР-2- остов.

Короткий огляд результатів. Результати в цьому прикладі демонструють, що всі злиття

ЗОаМІ-2-МАБР-2 антитіло, які були протестовані, поліпшували ефективність антитіла анти-

МА5Р-2-остов.

ПРИКЛАД 14

У цьому прикладі представлені результати, одержані з використанням моделі фіброзу нирок на фоні односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) у МАЗР-2-/- дефіцитних і МАЗР-2-/-- достатніх мишей для оцінки ролі лектинового шляху при фіброзі нирок.

Передумови/обгрунтування

Фіброз нирок і запалення є характерними ознаками пізньої стадії захворювання нирок.

Тубулоінтерстиціальний фіброз нирок являє собою прогресуючий процес, що включає стійке ушкодження клітин, аберантне загоєння, активацію резидентних і інфільтруючих клітин нирок, вивільнення цитокінів, запалення і фенотипічну активацію клітин нирок для продукування позаклітинного матриксу. Тубулоінтерстиціальний (ТІ) фіброз нирок є загальною термінальною точкою множинних патологій нирок і являє собою ключову ціль для потенційних методів лікування, спрямованих на запобігання прогресуючому функціональному порушенню нирок при хронічному захворюванні нирок (ХЗН). Ниркова ТІ недостатність тісно пов'язана зі зниженням функції нирок при гломерулярних захворюваннях (Кізаоп К.А. еї аї., І апсеї. 1:363-366, 1968;

ЗесНаїписк І.І. еї аі., Нит. Раїйпої. 1:631-640, 1970; Маїй К.А., Ат. У. Кіа. Оів. 20:1-17, 1992) і характерна для ХЗН, при якому відбувається накопичення міофібробластів, а потенційний простір між канальцями і перитубулярними капілярами забивається матриксом, що складається з колагенів і інших протеогліканів. Питання походження ТІ міофібробластів залишається досить суперечливим, але фіброзу звичайно передує запалення, яке спочатку характеризується Ті- накопиченням Т-лімфоцитів, а потім макрофагів (Гі У. еї аІ., Маї. Кем. Мерпгої. 7:684-696, 2011;

БинйівЇіа 9У.5., у. Сііп. Іпмеві. 124:2299-2306, 2014).

Модель ОО гризунів генерує прогресуючий фіброз нирок, відмітну ознаку прогресуючого захворювання нирок практично будь-якої етіології (Спемаїіег еї аї., Кідпеу Іпіегпайопаї, 75:1145- 1152, 2009). Є повідомлення про збільшену експресію гена СЗ у мишей дикого типу після ОО і значне зменшення відкладень колагену у С3-/- нокаутних мишей після ОО у порівнянні з мишами дикого типу, що вказує на роль активації комплементу при фіброзі нирок (Реат еї аї.,

МОЇ. Іттипої. 48:1666-1733, 2011). Є також повідомлення, що дефіцит С5 приводив до значного ослаблення основних компонентів фіброзу нирок у моделі тубулоінтерстиціального ураження (Воог Р. еї аї., У. ої Ат. бос. ої Мерпгоіоду, 18:1508-1515, 2007). Однак до описаного в даній заявці дослідження, виконаного авторами винаходу, конкретні компоненти комплементу, що беруть участь у фіброзі нирок, не були чітко визначені. Таким чином, було проведене наступне дослідження для оцінки МА5Р-2 (-/-) і МАБР-2 (1/к) мишей у моделі односторонньої обструкції сечоводу (ШОО).

Методи

Одержували МА5Р-2-/- мишу, як описано в прикладі 1, і піддавали зворотному схрещуванню протягом 10 поколінь з С57ВІ /ю. Мишей дикого типу (М/Т) С57ВІ/6 і гомозиготних МА5Р-2- дефіцитних (МАБР-2-/-) мишей на фоні С57ВІ /6 тримали в стандартизованих умовах із циклом день/ніч - 12/12, при цьому мишей годували стандартними харчовими гранулами, вода і їжа були у вільному доступі. Десятитижневих мишей, по б на групу, анестезували 2,595 ізофлураном в 1,5 л/хв. кисню. Праві сечоводи у двох групах десятитижневих самців мишей

С56/ВІ 6, дикого типу і МА5Р-2-/- лігували хірургічним шляхом. Праву нирку оголювали через бічний розріз довжиною 1 см. Правий сечовід повністю блокували у двох точках, використовуючи поліглактинову нитку 6/0). Анестезію здійснювали бупренорфіном інтраопераційно кожні 12 годин до 5 доз залежно від ступеня болю. Місцеву анестезію

Зо бупівакаїном проводили один раз під час операції.

Мишей умертвляли через 7 днів після операції, а тканини нирок збирали, фіксували і заливали в парафінові блоки. Кров збирали у мишей шляхом серцевої пункції під анестезією, і після нефректомії мишей знекровлювали. Кров залишали на льоду для коагуляції на 2 години, і сироватку відокремлювали центрифугуванням і зберігали в замороженому вигляді у вигляді 35 аліквот при -80 20.

Імуногістохімія тканини нирок

Для вимірювання ступеня фіброзу в нирках по відкладенню колагену 5-мікронні парафінові зрізи нирок забарвлювали пікросіріусом червоним, колаген-специфічні плями, як описано в

Мупінакег Р. еї а!., Вазіс Вез. Сагаїйо!. 89:397-410, 1994. Коротко, зрізи нирок депарафінували, 40 регідратували і колаген забарвлювали протягом 1 години водним розчином червоного пікросіріусу (0,5 г сіріусу червоного, Зідта, Юогзеї ОК) в 500 мл насиченого водного розчину пікринової кислоти. Слайди двічі промивали підкисленою водою (0,5 95 льодяна оцтова кислота в дистильованій воді) протягом 5 хвилин кожного разу, потім зневоднювали і приготовляли препарат для дослідження. 45 Для вимірювання ступеня запалення, про що свідчить інфільтрація макрофагів, зрізи нирок забарвлювали специфічним до макрофагів антитілом Е4/80 наступним чином. Фіксовані у формаліні, залиті парафіном 5-мікронні зрізи нирок депарафінізували і регідратували.

Демаскування антигену проводили в цитратному буфері при 95 "С протягом 20 хвилин з наступним блокуванням ендогенної активності пероксидази шляхом інкубації в З 95 НгО» 50 протягом 10 хвилин. Зрізи тканин інкубували в блокувальному буфері (10 95 інактивована теплом нормальна козяча сироватка з 1 95 бичачим сироватковим альбуміном у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (РВ5)) протягом 1 години при кімнатній температурі з наступним блокуванням авідином/біотином. Зрізи тканини промивали РВ5 після кожної стадії по три рази протягом 5 хвилин. Первинне антитіло до макрофага Е4/80 (Запіа Стги7, Раїіав, ТХ, 55 ОБА), розведене 1:100 у блокувальному буфері, наносили протягом 1 години. Потім біотинільоване козяче антищуряче вторинне антитіло, розведене 1:200, наносили протягом 30 хвилин з наступним нанесенням кон'югованого з пероксидази хрону (НКР) ферменту протягом хвилин. Колір забарвлення проявлявся під впливом субстрату діамінобензидину (АВ) (уУесіог І арх, Регегрогоцдп ШК) протягом 10 хвилин, і слайди промивали у воді, зневоднювали і 60 приготовляли для дослідження без контрастного забарвлення для спрощення комп'ютерного аналізу.

Аналіз зображень

Відсоток забарвлення кортикального шару нирок визначали, як описано в Ригпе55 Р.М. еї аї.,

У. Сііп. Раїнпої. 50:118-122, 1997. Коротко, 24-бітові кольорові зображення брали з послідовних полів, що не перекриваються, ниркової кіркової речовини безпосередньо під нирковою капсулою навколо всієї периферії зрізу нирки. Після кожного захоплення зображення використовували

МІН-зображення для витягання з нього червоного каналу у вигляді 8-бітового монохромного зображення. Нерівномірність фонового освітлення віднімали, використовуючи попередньо записане зображення освітленого поля мікроскопа без розміщеного на ньому зрізу. Для зображення задавали фіксований поріг для визначення області зображення, відповідної позитивному забарвленню. Потім обчислювали відсоток чорних пікселів, і після того, як усі зображення навколо нирки були виміряні таким чином, реєстрували середній відсоток, що забезпечує значення, відповідне відсотку забарвленої області в зрізі нирки.

Аналіз експресії генів

Експресію декількох генів, що мають відношення до запалення нирок і фіброзу в нирках миші, вимірювали кількісною ПЛР (кКПЛР) наступним чином. Загальну РНК виділяли з ниркової кіркової речовини за допомогою Ттгі2о!їФф (ТептоРіб5пег Зсіепійіс, РаїбІеу, ШОК), згідно з інструкціями виробника. Екстраговану РНК обробляли за допомогою набору Тигро без ДНК (Тпептогізпег 5сієепіййс) для усунення забруднення ДНК, а потім синтезували першу нитку КДНК за допомогою АММ-системи зворотної транскрипції (Рготеда, Маадізоп, УМ, О5А). Цілісність

КДНК підтверджували однією реакцією кПЛР за допомогою набору ТадМап САРОН Авззау (Арріїей Віозузієт5, Раїзієу ОК) з наступною реакцією кПЛР з використанням 96б-ямкових планшетів Сибіот Тадмап Агтау (Іе Тесппоіодіє5, Раїзієу, ОК).

У цьому аналізі вивчали дванадцять генів:

Колаген типу ІМ альфа-1 (соі4о--1; ІД аналізу: МіпО1210125 т/);

Трансформуючий фактор росту бета-1 (ТаЕрД-1; ІД аналізу: МтО1178820 т/!);

Кадгерин-1 (Сан-1; ІД аналізу: Мт0О1247357 т/!);

Фібронектин 1 (Еп1; ІД аналізу: МтО1256744 ті);

Інтерлейкін-6 (ІІ -6; ІД аналізу Мт00446191 т/);

Зо Інтерлейкін-10 (1-10; ІД аналізу МтО0439614 т/);

Інтерлейкін-12а (ІІ -12а; ІД аналізу МтоО0434165 пт);

Віментин (Міт; ІД аналізу МтО1333430 т);

Актинін альфа-1 (Асіп-1; ІД аналізу МтОо1304398 1);

Фактор некрозу пухлини ос; (ТМЕс, ІД аналізу Мт0О0443260 91);

Компонент комплементу З (С3; ІД аналізу МтО0437838 т/!);

Інтерферон-гамма (Нп-у; ІД аналізу МтО1168134).

Використовували наступні конститутивні контрольні гени:

Гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (САРОН, ІД аналізу Мітп99999915 91);

Глюкуронідази бета (Си5р; ІД аналізу МітО0446953 тт!);

Еукаріотичної 185 рРНК (185; ІД аналізу Н»599999901 51);

Гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази (НРЕТ; ІД аналізу МіпО0446968 1). 20 мкл реакційних агентів ампліфікували, використовуючи суміш ТадМап Раві Опімегзаї

Мазхіег Міх (Арріїей Віозувзіетв5), протягом 40 циклів. Дані ампліфікації ПЛР у реальному часі аналізували з використанням програмного забезпечення Арріїед Віозувієт5 7000 505 м1.4.

Результати

Після односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) в оклюдованих нирках спостерігається приплив запальних клітин, зокрема макрофагів, з наступним швидким розвитком фіброзу, про що свідчить накопичення колагену поряд з дилатацією трубочок і стоншенням проксимального трубчастого епітелію (див. Спемаїйег Е.І... еї аї., Кіапеу Іпї. 75:1145-1152, 2009).

На фіг. 15 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених сіріусом червоним, де ділянки тканини одержували від мишей дикого типу і

МАБР-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу (ШОО) і від псевдооперованих контрольних мишей. Як показано на фіг. 15, ділянки нирок мишей дикого типу через 7 днів після обструкції сечоводу показали значно більшу кількість відкладень колагену в порівнянні з МА5 Р- 2-/- мишами (значення р-0,0096). Середні значеннястандартна помилка середнього для ШОО- оперованих мишей у групах дикого типу і МА5Р-2 -/- становили 24,79-1,908 (п-б) і 16,58-41,3 (п-б), відповідно. Як додатково показано на фіг. 15, зрізи тканини від псевдооперованих контрольних мишей дикого типу і псевдооперованих контрольних МА5Р-2 -/- мишей показали дуже низькі рівні забарвлення колагену, як і очікувалося. бо На фіг. 16 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених антитілами, специфічними до маркера макрофагів Е4/80, де зрізи тканин одержували від мишей дикого типу і МАЗР-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу або від псевдооперованих контрольних мишей. Як показано на фіг. 16, у порівнянні з мишами дикого типу, тканини, одержані з ШОО-нирок МАБР-2-/- мишей, показали значно меншу інфільтрацію макрофагів через 7 днів після обструкції сечоводу (95 площі макрофагів, забарвленої в М/Т: 2,23--0,4, проти МАБР-2-/-: 0,53--0,06, р-0,0035). Як додатково показано на фіг. 16, зрізи тканин від псевдооперованих мишей дикого типу і псевдооперованих МА5Р-2-/- мишей не показали виявлюваного забарвлення макрофагів.

Аналіз експресії множини різних генів, пов'язаних з запаленням нирок і фіброзом, здійснювали на зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МАБР-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу і від псевдооперованих мишей дикого типу і МАЗР-2-/- мишей.

Дані, показані на фіг. 17-20, являють собою Годо відносної кількості в зразку псевдооперованих мишей дикого типу, а планки являють собою стандартну помилку середнього. Що стосується результатів аналізу експресії генів, пов'язаних з фіброзом, на фіг. 17 графічно показані відносні рівні експресії МРНК колагену ІМ типу альфа-1 (колаген-4), виміряні методом кПЛР у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МАБР-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу і від псевдооперованих контрольних мишей. На фіг. 18 графічно показані відносні рівні експресії МРНК трансформуючого фактора росту бета-1ї (ТОаЕр-1), виміряні КПЛР, у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МАБР-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу і від псевдооперованих контрольних мишей. Як показано на фіг. 17 і 18, оклюдовані нирки мишей дикого типу показали значимо збільшену експресію пов'язаних з фіброзом генів колагену типу ІМ (фіг. 17) ї ТОЕр-1 (фіг. 18) у порівнянні з псевдооперованими нирками у мишей дикого типу, що свідчить про те, що ці пов'язані з фіброзом гени були індуковані після ШОО- ушкодження у мишей дикого типу, як і очікувалося. Навпаки, як додатково показано на фіг. 17 і 18, оклюдовані нирки МАБР-2-/- мишей, підданих ШОО-ушкодженню, продемонстрували значиме зниження експресії колагену типу ІМ (фіг. 17, р-0,0388) і значиме зниження експресії такегр-1 (фіг. 18, р-0,0174) у порівнянні з мишами дикого типу, пдданими ШОО-ушкодженню.

Що стосується результатів аналізу експресії генів, пов'язаних із запаленням, то на фіг. 19 графічно показані відносні рівні експресії мРНК інтерлейкіну-б (1-6), виміряні КПЛР у зрізах

Зо тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МАБР-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу і від псевдооперованих контрольних мишей. На фіг. 20 графічно показані відносні рівні експресії МРНК інтерферону-у, виміряні КПЛР, у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МАЗР-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу і від псевдооперованих контрольних мишей. Як показано на фіг. 19 ї 20, оклюдовані нирки у мишей дикого типу продемонстрували значимо підвищену експресію пов'язаних із запаленням генів інтерлейкіну-б (фіг. 19) і інтерферону-у (фіг. 20) у порівнянні з псевдооперованими нирками мишей дикого типу, що свідчить про те, що ці пов'язані із запаленням гени індукуються після ШОО-ушкодження у мишей дикого типу. Навпаки, як додатково показано на фіг. 19 і 20, оклюдовані нирки МА5Р -2-/- мишей, підданих ШОО-ураженню, продемонстрували значиме зниження експресії інтерлейкіну-б (фіг. 19, р-0,0109) і інтерферону-у (фіг. 20, р-0,0182) у порівнянні з мишами дикого типу, підданими ШОО-ураженню.

Слід зазначити, що експресія генів Міт, Асіп-1, ТМЕсо, СЗ і 11-10 значно підсилюється в ШОО- нирках, одержаних як від мишей дикого типу, так і МА5Р-2-/- мишей, без суттєвої різниці в рівнях експресії цих конкретних генів між мишами дикого типу і МАБР-2-/- мишами (дані не показані). Рівні експресії генів Сап-1 ії 1/-12а не змінилися в оклюдованих нирках тварин у жодній з груп (дані не показані).

Обговорення

Визнано, що ОШО-модель у гризунів викликає раннє, активне і глибоке ушкодження в оклюдованій нирці зі зменшеним нирковим кровотоком, інтерстиціальним запаленням і швидким фіброзом протягом одного-двох тижнів після обструкції і широко використовується для розуміння загальних механізмів і медіаторів запалення і фіброзу в нирках (див., наприклад,

Спемаїег В.Г, Кідпеу Іпї. 75:1145-1152, 2009; Мапа Н. еї аї., Огид Оібвсом. Тодау ів. Модеів, 7:13- 19, 2010).

Результати, описані в цьому прикладі, демонструють значиме зниження відкладення колагену і рівня інфільтрації макрофагів в ШОШО-оперованих нирках у МАБР-2 (-/-) мишей у порівнянні з контрольними (1/5) мишами дикого типу. Несподівані результати, що свідчать про значиме скорочення ушкодження нирок як на гістологічному рівні, так і на рівні експресії генів у

МА5Р-2-/- тварин, показують, що лектиновий шлях активації комплементу впливає на розвиток запалення і фіброз в оклюдованій нирці. Не обмежуючись конкретною теорією, вважається, що бо лектиновий шлях впливає на патофізіологію фіброзного захворювання шляхом запуску і підтримання прозапальних стимулів, які закріплюють порочне коло, у якому ушкодження клітин викликає запалення, що, у свою чергу, викликає подальше ураження клітин, рубцювання і втрату тканини. Виходячи із цих результатів, очікується, що пригнічення або блокада МАБР-2 інгібітором буде мати профілактичний і/або терапевтичний ефект, що проявляється в пригніченні або профілактиці фіброзу нирок, а також у пригніченні або профілактиці фіброзу взагалі (тобто незалежно від тканини або органа).

ПРИКЛАД 15

У цьому прикладі описаний аналіз ефективності моноклонального інгібуючого антитіла

МА5Р-2 у моделі односторонньої обструкції сечоводу (ШОЮ), мишачій моделі фіброзу нирок.

Передумови/обгрунтування

Полегшення тубулоінтерстиціального фіброзу, загальної кінцевої точки багатьох ниркових патологій, являє собою важливу мішень для методів лікування, спрямованих на профілактику прогресування ниркових захворювань. Враховуючи нестачу нових і існуючих методів лікування, спрямованих на запальні профіброзні шляхи при захворюванні нирок, існує гостра потреба в розробці нових методів лікування. Багато які пацієнти з протеїнуричним захворюванням нирок мають тубулоінтерстиціальне запалення і прогресуючий фіброз, які тісно пов'язані зі зниженням функції нирок. Протеїнурія сама по собі викликає тубулоінтерстиціальне запалення і приводить до розвитку протеїнуричної нефропатії (Вгип5Кії! М.у. еї аіІ., У. Ат. ос. МерпгоїЇ. 15:504-505, 2004). Незалежно від первинної хвороби нирок тубулоінтерстиціальне запалення і фіброз незмінно спостерігаються у пацієнтів з прогресуючою нирковою недостатністю і тісно корелюють зі зниженням екскреторної функції (Кізаоп Е.А. еї аї., І апсеї. 1:363-366, 1968; ЗсНнаіпискК І.І. єї аІ., Нит. Раїйої. 1:631-640, 1970). Методи терапії, здатні перервати загальні ключові клітинні шляхи, що ведуть до фіброзу, знайдуть широке застосування при ниркових розладах.

Як описано в прикладі 14, в ШШО-моделі непротеїнуричного фіброзу нирок було встановлено, що у МАЗР-2-/- мишей спостерігається значно більш низький ступінь фіброзу і запалення нирок у порівнянні з контрольними тваринами дикого типу, про що свідчать запальні клітинні інфільтрати (75 9б) і гістологічні маркери фіброзу, такі як колаген (зменшення на одну третину), тим самим доводячи ключову роль лектинового шляху при фіброзі нирок.

Як описано в прикладі 13, також було показано, що синтезоване моноклональне анти-МАБР-

Зо 2 антитіло (0ОМ5646-502МІ-2 злитий білок, що містить пептид ЗОМІ-2, злитий з С-кінцем важкого ланцюга ОМ5646), яке специфічно блокує функцію лектинового шляху у людини, блокує лектиновий шлях у мишей. У цьому прикладі ОМ5646-524МІ-2 аналізували в мишачій ШШО- моделі фіброзу нирок у мишей дикого типу для визначення здатності специфічного інгібітору

МА5Р-2 пригнічувати фіброз нирок.

Методи

У цьому дослідженні оцінювали вплив інгібуючого МА5Р-2 антитіла (10 мг/кг ОМ5646-502МІ- 2) у порівнянні з контрольним антитілом до людського ізотипу Ід(4 (10 мг/кг ЕТ904) і контролем у вигляді середовища доставки у самців М/Ї мишей С57ВІ /6. Антитіла (10 мг/кг) вводили групам з 9 мишей шляхом внутрішньоочеревинної (і.р.) ін'єкції на 7-й день, 4-й день і 1-й день до операції ОО і потім на 2-й день після операції. Зразки крові брали перед введенням антитіл, і наприкінці експерименту оцінювали функціональну активність лектинового шляху.

Операцію ОО, збирання тканин і забарвлення сірі усом червоним і специфічним до макрофагів антитілом Е4/80 проводили способами, описаними в прикладі 14.

Вміст гідроксипроліну в нирках мишей вимірювали за допомогою специфічного тестового набору для колориметричного аналізу (Зідта), відповідно до інструкцій виробника.

Для оцінки фармакодинамічного ефекту інгібуючого тАр-МАБР-2 у мишей оцінювали активність лектинового шляху системи комплементу шляхом кількісного визначення індукованої лектином активації СЗ у мінімально розведених зразках сироватки, зібраних у зазначений час після ір. введення мишам тА МАБР-2 або контрольного тАр. Коротко, полістирольні мікросфери діаметром 7 мкМ (Вапоз Гарогайогіє5, Різпег ІМ, ОБА) покривали мананом шляхом інкубації протягом ночі з 30 мкг/мл манану (Зідта) у натрій-бікарбонатному буфері (рН 9,6), потім промивали, блокували 1 95 фетальної бичачої сироватки в РВ5З і ресуспендували в РВ5 до кінцевої концентрації 1їх108 міросфер/мл. Реакції відкладення комплементу ініціювали додаванням 2,5 мкл мікросфер, покритих мананом (7250000 мікросфер), в 50 мкл мінімально розведених зразків мишачої сироватки (кінцева концентрація сироватки 90 95) з наступною інкубацією протягом 40 хвилин при 4 С. Після припинення реакції відкладення шляхом додавання 250 мкл льодяного буфера для проточної цитометрії (ЕВ:РВ5, що містить 0,1 95 фетальної бичачої сироватки), мікросфери збирали центрифугуванням і промивали ще два рази 300 мкл льодяного ЕВ. бо Для кількісної оцінки індукованої лектином активації СЗ мікросфери інкубували протягом 1 години при 4 2С з 50 мкл кролячого анти-людського СЗс антитіла (ОСако, Сагрепієгіа, СА, ОБА), розведеного в ЕВ. Після двох промивань ЕВ для видалення незв'язаного матеріалу мікросфери інкубували протягом 30 хвилин при 4 С з 50 мкл козячого антикролячого антитіла, кон'югованого з РЕ-Су5 (ЗошПпегп Віоїесі, Вігптіпопат, АГ, ОА), розведеного в ЕВ. Після двох промивань ЕВ для видалення незв'язаного матеріалу мікросфери ресуспендували в ЕВ і аналізували за допомогою цитометра БАС Саїїриг Мікросфери аналізували у вигляді однорідної популяції, використовуючи пряме і бічне розсіювання, і виконували кількісне визначення відкладення СЗБр у кожному зразку у вигляді середньої інтенсивності флуоресценції.

Результати

Оцінка відкладення колагену

На фіг. 21 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених сіріусом червоним, де зрізи тканин були одержані через 7 днів після обструкції сечоводу у мишей дикого типу, що одержували або інгібуюче МА5Р-2 антитіло, або антитіло ізотипного контролю. Як показано на фіг. 21, зрізи тканини із нирок, зібраних через 7 днів після обструкції (ШООС), одержані від мишей дикого типу, що одержували інгібуюче МАЗР-2 антитіло, показали значиме зниження (р-0,0477) відкладення колагену в порівнянні з кількістю відкладень колагену в зрізах тканин з оклюдованих нирок, одержаних від мишей дикого типу, що одержували Ідся4 ізотипний контроль.

Оцінка вмісту гідроксипроліну

Гідроксипролін вимірювали в тканинах нирок як індикатор вмісту колагену. Гідроксипролін є параметром, який є дуже показовим індикатором патофізіологічного прогресування захворювання, індукованого в цій моделі.

На фіг. 22 графічно показаний вміст гідроксипроліну в нирках, зібраних через 7 днів після обструкції (ШОО), одержаних від мишей дикого типу, що одержували або інгібуюче МА5БР-2 антитіло, або антитіло ізотипного контролю. Як показано на фіг. 22, тканини оклюдованих нирок мишей, що одержували інгібуюче МАБР-2 антитіло, показали значиме зменшення гідроксипроліну, індикатору вмісту колагену, у порівнянні з нирками мишей, що одержували тАр ізотипного контролю, Ідс4 (р-0,0439).

Оцінка запалення

Зо В оклюдованих нирках від тварин дикого типу, що одержували антитіло ізотипного контролю, і тварин дикого типу, що одержували інгібуюче МА5Р-2 антитіло, спостерігали рясний інфільтрат макрофагів. Ретельна кількісна оцінка не виявила суттєвої різниці в відсотковому вмісті забарвлених макрофагів між цими двома групами (дані не показані). Однак, незважаючи на еквівалентну кількість інфільтруючих макрофагів, в оклюдованих нирках від тварин, ін'єктованих інгібуючими МАБР-2 антитілами, фіброз розвився в значно меншому ступені, судячи з забарвлення сіріусом червоним, у порівнянні з оклюдованими нирками від тварин, яким вводили ізотипний контроль, цей результат узгоджується з результатами, згідно з якими тканини оклюдованих нирок від мишей, що одержували інгібуюче МАБбР-2 антитіло, мали значимо меншу кількість гідроксипроліну, ніж в нирках мишей, що одержували тАб ізотипного контролю, Ідсо4.

Обговорення

Результати, описані в цьому прикладі, показали, що використання інгібуючого МА5БР-2 антитіла забезпечує захист від фіброзу нирок в ШОО-моделі, що узгоджується з результатами, описаними в прикладі 14, які демонструють, що фіброз і запалення нирок у МАЗР-2-/- миші в

ОШОО-моделі виявилися значимо меншого ступеня в порівнянні з мишами дикого типу.

Результати в цьому прикладі демонструють зменшений фіброз у мишей, що одержували інгібуюче МА5Р-2 антитіло. Виявлення того, що фіброз в ШОО-нирках зменшується у тварин зі зменшенням або блокадою МА5Р-2-залежної активності лектинового шляху, є дуже значимим новим відкриттям. У сукупності результати, представлені в прикладі 14 і в цьому прикладі, демонструють сприятливий ефект інгібування МА5ЗР-2 на тубулоінтерстиціальне запалення нирок, ушкодження канальцевих клітин, вивільнення профіброзних цитокінів і рубцювання.

Зменшення фіброзу нирок залишається ключовою ціллю лікування нирок. ШОО-модель є моделлю важкого стану з прискореним фіброзом нирок, і втручання, яке зменшує фіброз у цій моделі, наприклад використання інгібуючих МАБ5бР-2 антитіл, імовірно, буде використовуватися для пригнічення або запобігання фіброзу нирок. Результати ШОО-моделі, імовірно, також можна віднести до захворювань нирок, що характеризуються гломерулярним і/або протеїнуричним ушкодженням канальців.

ПРИКЛАД 16

У цьому прикладі представлені результати, які були одержані з використанням моделі бо фіброзу, запалення і тубулоіїнтерстиціального ушкодження нирок на фоні викликаної передозуванням білка протеїнурії у МА5ЗР-2-/- мишей і мишей дикого типу для оцінки ролі лектинового шляху при протеїнуричній нефропатії.

Передумови/обгрунтування

Протеїнурія є фактором ризику розвитку фіброзу нирок і втрати екскреторної функції незалежно від первинної хвороби нирок (Тгуддмазоп К. еї аї.,.). Іпїегп. Мей. 254:216-224, 2003,

Матв М., Ат. У). Мернгої. 25:77-94, 2005). Поняття протеїнуричної нефропатії описує токсичні ефекти надлишкового білка, що надходить у проксимальні канальці в результаті порушення гломерулярної вибірної селективності (Вгип5КіїЇ М.9., у. Ат. бос. Мерпгої. 15:504-505, 2004,

Ваіїпез ВА.9У., Маїште Веху. МерНгоїЇ. 7:177-180, 2011). Це явище, звичайне для багатьох захворювань клубочків, приводить до прозапального середовища рубцювання в нирках і характеризується змінами в проксимальному рості канальцевих клітин, апоптозом, транскрипцією генів і продукуванням запальних цитокінів як наслідок сигнальних шляхів з порушеною регуляцією, стимульованих протеїнуричною канальцевою рідиною. Протеїнурична нефропатія звичайно визнається ключовим фактором, що сприяє прогресуючому ураженню нирок, характерному для різних первинних патологій нирок.

Хронічна хвороба нирок уражує більше 15 95 дорослого населення в Сполучених Штатах і щорічно є причиною приблизно 750 000 смертей в усьому світі (І о7апо К. еї аї., І апсеї. мої. 380,

І65йце 9859:2095-2128, 2012). Протеїнурія є показником хронічного захворювання нирок, а також фактором, що сприяє прогресуванню захворювання. Багато пацієнтів із протеїнуричним захворюванням нирок мають тубулоінтерстиціальне запалення і прогресуючий фіброз, які тісно пов'язані зі зниженням функції нирок. Протеїнурія сама по собі викликає тубулоінтерстиціальне запалення і приводить до розвитку протеїнуричної нефропатії (Вгип5кКіїЇ М... еї аї., У. Ат. Боб.

Мерпгої. 15:504-505, 2004). При протеїнуричних захворюваннях нирок надмірна кількість альбуміну і інших макромолекул фільтрується через клубочки і повторно поглинається проксимальними трубчастими епітеліальними клітинами. Це викликає порочне запальне коло, опосередковане активацією комплементу, що приводить до інфільтратів цитокінів і лейкоцитів, які викликають інтерстиціальне ушкодження канальців і фіброз, тим самим збільшуючи протеїнурію і приводячи до втрати функції нирок і, в остаточному підсумку, до прогресування аж до термінальної стадії ниркової недостатності (див., наприклад, Сіагк єї аїЇ., Сападіап Меаіса!

Зо Авзосіайоп дошцгтпаї, 178:173-175, 2008). Очікується, що методи лікування, які модулюють цей шкідливий цикл запалення і протеїнурії, поліпшать результат при хронічному захворюванні нирок.

Враховуючи позитивний ефект інгібування МАБР-2 в ШОО-моделі тубулоінтерстиціального ушкодження, був виконаний наступний експеримент для визначення, чи може інгібування

МАБР-2 зменшити ушкодження нирок у моделі передозування білка. У цьому дослідженні використовували передозування білка для індукування протеїнуричного захворювання нирок, як описано в Ізпоїа еї аІ., Еигореап Кепаї Авзосіайоп, 21:591-597, 2006.

Методи

Одержували МА5Р-2-/- мишу, як описано в прикладі 1, і піддавали зворотному схрещуванню протягом 10 поколінь з ВАЇ В/с. У даному дослідженні порівнювали результати, одержані для мишей дикого типу і МАБР-2-/- ВАЇВ/с мишей у моделі індукованої передозуванням білка протеїнурії.

За тиждень до початку експерименту мишам видаляли одну нирку перед передозуванням білка для одержання оптимальної відповіді. Індукуючий протеїнурію агент являв собою бичачий сироватковий альбумін з низьким рівнем ендотоксину (ВЗА, Зідта), який вводили в нормальному фізіологічному розчині УМТ (п-:7) і МАБР-2-/- мишам (п--7) у наступних дозах: одну дозу по 2 мг ВБА/г, 4 мг В5А/г, 6 мг В5А/г, 8 мг ВЗА/г, 10 мг В5А/г і 12 мг В5А/г маси тіла і 9 доз по 15 мг В5А/г маси тіла, загалом протягом 15 днів було введено і.р. 15 доз. Контрольні миші

ММТ (п-:4) ії МАБР-2-/- (п-4) миші одержували фізіологічний розчин, що вводиться тільки внутрішньоочеревинно. Після введення останньої дози тварин розміщали по одній в метаболічні клітки на 24 години для збирання сечі. Кров збирали за допомогою серцевої пункції під наркозом, кров залишали для коагуляції на льоду на 2 години, і сироватку відокремлювали центрифугуванням. Зразки сироватки і сечі збирали наприкінці експерименту на 15-й день, зберігали і заморожували для аналізу.

Мишей умертвляли через 24 години після останнього введення ВЗА на 15-й день, і для аналізу збирали різні тканини. Нирки збирали і обробляли для забарвлення НЕ і імунозабарвлення. Імуногістохімічне забарвлення проводили наступним чином. Фіксовані у формаліні, залиті парафіном 5-мікронні зрізи тканин нирок від кожної миші депарафінізували і регідратували. Демаскування антигену проводили в цитратному буфері при 95 "С протягом 20 бо хвилин з наступною інкубацією тканин в З 95 Н2Ог протягом 10 хвилин. Потім тканини інкубували в блокувальному буфері (10 95 сироватки з виду, у якому було вирощене вторинне антитіло, і 195 В5А в РВ5) з 10 95 розчином авідину протягом 1 години при кімнатній температурі. Зрізи тканин промивали РВБ5 після кожної стадії по три рази протягом 5 хвилин. Потім використовували первинне антитіло в блокувальному буфері з 10 95 розчином біотину протягом 1 години при концентрації 1:100 для антитіл Е4/80 (Запіа Сги7, кат. Мо 56-25830), ТаЕр (Запіа

Сги, кат. Мо 5с-7892), 1-6 (Запіа Сги7, кат. Мо 50-1265) і концентрації 1:50 для антитіла ТМЕо; (Запіа Стги7, кат. Мо 50с-1348). Потім застосовували біотинільоване вторинне антитіло протягом 30 хвилин при концентрації 1:200 для зрізів з Е4/80, ТОЕр і 11 -6 ї 1:100 для зрізів з ТМЕо з наступним застосуванням кон'югата ферменту НЕР протягом ще 30 хвилин. Забарвлення проводили за допомогою набору із субстратом діамінобензидину (САВ) (Месіог І абз) протягом 10 хвилин, і слайди промивали у воді, зневоднювали і приготовляли для дослідження без контрастного забарвлення для спрощення комп'ютерного аналізу. Забарвлені зрізи тканин з ниркової кіркової речовини аналізували за допомогою захоплення цифрового зображення з наступною кількісною оцінкою з використанням програмного забезпечення для автоматичного аналізу зображень.

Апоптоз оцінювали в зрізах тканин шляхом забарвлення кінцевої мітки ЯОТР. з використанням термінальної дезоксинуклеотидилтрансферази (ТОМЕЇ) наступним чином.

Апоптотичні клітини в зрізах нирок забарвлювали, використовуючи набір з пероксидазою

АрортТадФ Регохідазе (МіПроге) наступним чином. Залиті парафіном, фіксовані формаліном зрізи нирок від кожної миші депарафінізували, регідратували, а потім білок пермеабілізували за допомогою протеїнази К (20 мкг/мл), яку наносили на кожний зразок протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Між стадіями зразки промивали РВ5. Активність ендогенної пероксидази гасили шляхом інкубації тканин в З 95 Н2гО» протягом 10 хвилин. Потім тканини інкубували в зрівноважувальному буфері з наступною інкубацією з ферментом Тат протягом 1 години при 37 аб. Після промивання в зупинному/промивальному буфері протягом 10 хвилин кон'югат анти- дигоксигеніну наносили на 30 хвилин при кімнатній температурі з наступним промиванням.

Забарвлення здійснювали за допомогою набору з ЮАВ-субстратом протягом 4 хвилин з наступним промиванням у воді. Тканини піддавали контрастному забарвленню в гематоксиліні і установлювали в ОВХ. Частоту ТОМЕЇ -забарвлених (коричневого кольору) апоптотичних клітин

Зо підраховували вручну в послідовно вибраних 20 полях зору кіркової речовини під великим збільшенням за допомогою світлового мікроскопа І еіса ОВХМ.

Результати

Оцінка протеїнурії

Для підтвердження наявності протеїнурії у мишей загальний білок у сироватці аналізували на 15-й день, а загальну кількість виділеного білка вимірювали в зразках сечі, зібраних протягом 24 годин на 15-й день дослідження.

На фіг. 23 графічно показана загальна кількість сироваткових білків (мг/мл), виміряна на 15- й день у контрольних мишей дикого типу (п-2), що одержували тільки фізіологічний розчин, мишей дикого типу, що одержували В5А (п-б), і МАБР-2-/- мишей, що одержували ВЗА (п-б).

Як показано на фіг. 23, введення ВЗА збільшувало загальний рівень білка в сироватці як у групах дикого типу, так і в МАБР-2-/- групі більше ніж у два рази в порівнянні з концентрацією в контрольній групі, що одержувала тільки фізіологічний розчин, при цьому між групами, що одержали лікування, суттєвої різниці не спостерігалося.

На фіг. 24 графічно показана загальна кількість білка (мг), виділеного із сечею, зібраною протягом 24 годин на 15-й день вивчення у контрольних мишей дикого типу (п-2), що одержували тільки фізіологічний розчин, мишей дикого типу, що одержували ВЗА (п-б), і МА5Р- 2-/- мишей, що одержували В5А (п-6). Як показано на фіг. 24, на 15-й день цього дослідження спостерігали приблизно шестикратне збільшення загальної кількості виділеного з сечею білка в групах, що одержували ВЗА, у порівнянні з контрольною групою з імітованим лікуванням, яка одержувала тільки фізіологічний розчин. Результати, наведені на фіг. 23 і 24, свідчать про те, що модель протеїнурії працює, як очікувалося.

Оцінка гістологічних змін у нирках

На фіг. 25 показані репрезентативні забарвлені НУЕ зрізи тканин нирок, які збирали на 15-й день дослідження передозування білка від мишей наступних груп: (панель А) контрольні миші дикого типу; (панель В) МАБР-2-/- контрольні миші; (панель С) миші дикого типу, що одержували В5А; і (панель Ю) МАБР-2-/- миші, що одержували ВЗА. Як показано на фіг. 25, у групі МАБР-2-/- передозування (панель 0) спостерігали значно більш високий ступінь збереження тканини в порівнянні з групою передозування дикого типу (панель С) при однаковому рівні провокації передозуванням білка. Наприклад, капсули Боумена у мишей бо дикого типу, що одержували ВЗА (передозування) (панель С), були значимо розширені в порівнянні з капсулами Боумена в контрольній групі дикого типу (панель А). Навпаки, у капсул

Боумена мишей МА5Р-2-/- (передозування), що одержували таку ж кількість В5А (панель 0), зберігалася морфологія, аналогічна тій, яка спостерігалася у контрольних МАЗР-2-/- мишей (панель В) і контрольних мишей дикого типу (панель А). Як додатково показано на фіг. 25, великі литі структури білків накопичуються в проксимальних і дистальних канальцях ниркових ділянок у дикого типу (панель С), які є більш крупними і більш численними в порівнянні з такими у МА5Р-2-/- мишей (панель 0).

Слід також зазначити, що аналіз зрізів нирок у цьому дослідженні за допомогою просвічувального електронного мікроскопа показав, що миші, які одержували ВЗА, мали загальне ураження на циліарних краях у дистальних і проксимальних клітинах ниркового канальця з вмістом клітин і ядрами, що впровадилися в просвіт канальця. Навпаки, тканина у

МА5Р-2-/- мишей, що одержували ВЗА, зберігалася.

Оцінка інфільтрації макрофагів у нирках

Щоб виміряти ступінь запалення, про що свідчить інфільтрація макрофагів, зрізи тканин зібраних нирок забарвлювали також антитілом до маркера макрофагів Е4/80 способами, описаними в Воог еї аї., У. ої Ат. ос. МерпгоЇоду, 18:1508-1515, 2007.

На фіг. 26 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених антитілом до маркера макрофагів Е4/80, що показують середню забарвлену площу макрофагів (95), де зрізи тканин одержували на 15-й день вивчення передозування білка у контрольних мишей дикого типу (п-:-2), мишей дикого типу, що одержували В5А (п-б), і МА5Р- 2-/- мишей, що одержували ВЗА (п-5). Як показано на фіг. 26, зрізи тканин нирок, забарвлені антитілом до маркерів макрофагів Р4/80, свідчать про те, що, хоча обидві групи, що одержували

ВЗА, показали значиме збільшення інфільтрації макрофагів у нирках (виміряне у вигляді 95 області забарвлених Е4/80 антитіл) у порівнянні з контрольними мишами дикого типу з імітованим лікуванням, значиме зниження інфільтрації макрофагів спостерігали в зрізах тканин у МАБР-2-/- мишей, що одержували В5А, у порівнянні з інфільтрацією макрофагів у зрізах тканин у мишей дикого типу, що одержували ВЗА (значення р-0,0345).

На фіг. 27А графічно показаний аналіз наявності кореляції між рівнем макрофагів і протеїнурією у кожної миші дикого типу (п-6), що одержувала ВЗА, у вигляді графіка залежності загальної кількості виділеного білка, виміряної в сечі з 24-годинного зразка, від ступеня інфільтрації макрофагів (95 середньої забарвленої площі). Як показано на фіг. 27А, більшість зразків із нирок дикого типу дали позитивну кореляцію між рівнем протеїнурії і ступенем інфільтрації макрофагів.

На фіг. 27В графічно показаний аналіз наявності кореляції між рівнем макрофагів і протеїнурією у кожної МА5Р-2-/- миші (п-5), що одержувала В5А, у вигляді графіка залежності загальної кількості виділеного білка, виміряної в сечі з 24-годинного зразка, від ступеня інфільтрації макрофагів (95 середньої забарвленої площі). Як показано на фіг. 27В, позитивна кореляція, спостережувана у мишей дикого типу, між рівнем протеїнурії і ступенем інфільтрації макрофагів (показана на фіг. 27А) не спостерігалася у МА5ЗР-2-/- мишей. Не обмежуючись конкретною теорією, ці результати можуть указувати на наявність механізму очищення від запалення при високих рівнях протеїнурії у МАБР-2-/- мишей.

Оцінка інфільтрації цитокінів

Інтерлейкін-б (1-6), трансформуючий фактор росту бета (ТОЕрД) і фактор некрозу пухлини альфа (ТМЕо) є прозапальними цитокінами, які, як відомо, активуються в проксимальних канальцях мишей дикого типу в моделі протеїнурії (Арраїе М. еї аї., УЧоигпа! ої те Атегісап зЗосієїу ої Мерпгоіїоду: ЗАМ, 17:2974-2984, 2006; ЮОамій 5. єї аї.,, Мерпгоіоду, ОБідаїувів,

Тгаперіапіайоп, ОНісіа! Рибіїсайоп ої Ше Еигореап Оіаїузізапа Тгапзріапі Авззосіайоп - Еигореап

Вепа! Аззосіайоп, 12:51-56, 1997). Зрізи тканин нирок забарвлювали цитокін-специфічними антитілами, як описано вище.

На фіг. 28 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТИЕВ антитілом (виміряно у вигляді 95 площі забарвлених анти-ТаєЕр антитіл), у мишей дикого типу, що одержували В5А (п-4), і МА5Р-2-/- мишей, що одержували

ВЗА (п-5). Як показано на фіг. 28, значиме збільшення забарвлення ТОЕрД спостерігалося в групі мишей дикого типу, що одержувала ВЗА (передозування), у порівнянні з групою, МАБР-2-/- мишей, що одержувала В5А (передозування) (р-:0,026).

На фіг. 29 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТМЕо антитілом (виміряно у вигляді95 площі забарвлених анти-ТМЕо, антитіл), у мишей дикого типу, що одержували В5А, і МАБР-2-/- мишей, що одержували ВБА (п-5). Як показано на фіг. 29, значиме збільшення забарвлення ТМЕо; спостерігалося в групі бо дикого типу, що одержувала В5А (передозування), у порівнянні з МА5БР-2-/- групою, що одержувала ВЗА (передозування) (р-0,0303).

На фіг. 30 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-1І -6 антитілом (виміряно у вигляді 95 площі забарвлених анти-1ЇІ -6 антитіл), у контрольних мишей дикого типу, контрольних МАБР-2-/- мишей, мишей дикого типу, що одержували В5А (п-7), і МА5БР-2-/- мишей, що одержували В5А (п-:7). Як показано на фіг. 30, у групі дикого типу, що одержувала В5А, спостерігалося дуже значне збільшення забарвлення ЇЇ - 6 у порівнянні з МА5Р-2-/- групою, що одержувала ВЗА (р-0,0016).

Оцінка апоптозу

Апоптоз оцінювали в тканинних зрізах шляхом забарвлення кінцевої мітки ЯОТР. з використанням термінальної дезоксинуклеотидилтрансферази (ТОМЕЇ), а частоту забарвлених

ТОМЕЇ -апоптотичних клітин підраховували в послідовно вибраних 20 полях зору кіркової речовини під великим збільшенням (НРЕ).

На фіг. 31 графічно показана частота ТОМЕЇ -позитивних апоптотичних клітин, підрахована у послідовно вибраних 20 полях зору під великим збільшенням (НРРЕ), у зрізах тканин ниркової кіркової речовини у контрольних мишей дикого типу (п-1), контрольних МА5Р-2-/- мишей (п-1), мишей дикого типу, що одержували В5А (п-б), і МАБР-2-/- мишей, що одержували ВЗА (п-7).

Як показано на фіг. 31, значно більш високий рівень апоптозу в кірковій речовині спостерігався в нирках, одержаних від мишей дикого типу, що одержували ВЗА, у порівнянні з нирками, одержаними від МА5Р-2-/- мишей, що одержували ВЗА (р-0,0001).

Загальний огляд результатів і висновки

Результати цього прикладу свідчать про те, що у МАБР-2-/- миші зменшене ушкодження нирок у моделі передозування білка. Отже, інгібуючі МА5Р-2 агенти, такі як інгібуючі МАБР-2 антитіла, як очікувалося, пригнічують або запобігають шкідливому циклу запалення і протеїнурії і поліпшують результати при хронічному захворюванні нирок.

ПРИКЛАД 17

У цьому прикладі описаний аналіз моноклонального інгібуючого антитіла МАБР-2 на ефективність у зниженні і/або запобіганні запаленню нирок і тубулоінтерстиціальному ушкодженню в моделі викликаної передозуванням білка протеїнурії у мишей дикого типу.

Передумови/обгрунтування

Зо Як описано в прикладі 16, у моделі викликаної передозуванням білка протеїнурії було встановлено, що МА5Р-2-/- миші демонструють значно кращі результати (наприклад, менший ступінь тубулоїнтерстиціального ушкодження і менший ступінь запалення нирок), ніж миші дикого типу, що має на увазі патогенну роль лектинового шляху в протеїнуричному захворюванні нирок.

Як описано в прикладі 13, було створено моноклональне інгібуюче МАЗБР-2 антитіло (О0М5646-5(22МІ-2), яке специфічно блокує функцію лектинового шляху у людини, а також було показано, що воно блокує лектиновий шлях у мишей. У цьому прикладі оцінювали ефективність інгібуючого МАБР-2 антитіла ОМ5646-5(22МІ-2 у мишачій моделі викликаної передозуванням білка протеїнурії відносно зменшення і/або профілактики запалення нирок «і тубулоінтерстиціального ушкодження у мишей дикого типу.

Методи

У цьому дослідженні оцінювали вплив інгібуючого МА5Р-2 антитіла (10 мг/кг ОМ5646-502МІ- 2) у порівнянні з антитілом до людського Ідс4 ізотипного контролю (10 мг/кг ЕТ904) і контролем з фізіологічним розчином.

Подібно дослідженню, описаному в прикладі 16, у цьому дослідженні використовували передозування білка для індукування протеїнуричного захворювання нирок (Із5поїа еї аї.,

Ешгореап Вепаї Аззосіаїйоп, 21:591-597, 2006). Протеїнурію індукували у Ваїр/с мишей з однією видаленою ниркою щоденною і.р. ін'єкцією ескалаційних доз (від 2 до 15 г/кг) бичачого сироваткового альбуміну з низьким вмістом ендотоксину (В5А) протягом 15 днів, як описано в прикладі 16.

Лікування антитілами здійснювали шляхом і.р. ін'єкції два рази на тиждень, починаючи за 7 днів до індукції протеїнурії протягом усього дослідження. Ця схема дозування була вибрана на основі попередніх досліджень РК/РО і фармакологічних досліджень, що демонструють стійке пригнічення лектинового шляху (дані не показані). Мишей умертвляли на 15-й день, і нирки збирали і обробляли для забарвлення НУЕ і імунозабарвлення. Забарвлені зрізи тканин з ниркової кіркової речовини аналізували за допомогою захоплення цифрового зображення з наступною кількісною оцінкою з використанням програмного забезпечення для автоматичного аналізу зображень.

Оцінку імуногістохімічного забарвлення і апоптозу проводили, як описано в прикладі 16. бо Результати

Оцінка протеїнурії

Для підтвердження наявності протеїнурії у мишей загальну кількість виділеного з сечею білка аналізували в зразках сечі, зібраних протягом 24-х годин, на 15-й день (кінець експерименту). Було встановлено, що в зразках сечі загальний рівень білка в середньому був збільшений майже в шість разів у групах, що одержували В5А, у порівнянні з контрольними групами, що не одержували В5А (дані не показані), що підтверджує наявність протеїнурії у мишей, які одержували ВЗА. У рівнях білка між групами, що одержували В5А, ніяких суттєвих відмінностей не спостерігалося.

Оцінка гістологічних змін

На фіг. 32 показані типові зрізи забарвлених НУЕ тканин для наступних груп мишей на 15-й день після лікування ВЗА: (панель А) контрольні миші дикого типу, що одержували фізіологічний розчин; (панель В) контрольні миші, що одержували ізотип антитіла; і (панель С) миші дикого типу, що одержували інгібуюче МА5Р-2 антитіло.

Як показано на фіг. 32, у групі, що одержувала інгібуюче МА5бР-2 антитіло (панель С), спостерігався значно більш високий ступінь збереження тканини в порівнянні з групою дикого типу, що одержувала фізіологічний розчин (панель А) або ізотипний контроль (панель В), при тому ж рівні провокації передозуванням білка.

Оцінка апоптозу

Апоптоз оцінювали в тканинних зрізах шляхом забарвлення кінцевої мітки ЯОТР з використанням термінальної дезоксинуклеотидилтрансферази (ТОМЕЇ), а частоту забарвлених

ТОМЕЇ -апоптотичних клітин підраховували в послідовно вибраних 20 полях зору кіркової речовини під великим збільшенням (НРЕ). На фіг. 33 графічно показана частота ТОМЕЇ - позитивних апоптотичних клітин, підрахована в послідовно вибраних 20 полях зору під великим збільшенням (НРЕ) у зрізах тканин ниркової кіркової речовини у контрольних мишей дикого типу, що одержували фізіологічний розчин і ВЗА (п-8), мишей дикого типу, що одержували антитіло ізотипного контролю і В5А (п-8), і мишей дикого типу, що одержували інгібуюче МА5Р- 2 антитіло і ВБ5А (п-7). Як показано на фіг. 33, дуже значне зниження рівня апоптозу в кірковій речовині спостерігалося в нирках, одержаних з групи, що одержувала інгібуюче МА5БР-2 антитіло, у порівнянні з групою, що одержувала фізіологічний розчин і ізотипний контроль

Зо (р-0,0002 для контролю з фізіологічним розчином проти інгібуючого МА5Р-2 антитіла; р-0,0052 для ізотипного контролю проти інгібуючого МА5Р-2 антитіла).

Оцінка інфільтрації цитокінів

У зрізах тканин нирок, одержаних у цьому дослідженні, оцінювали інтерлейкін-б (ІІ -6), трансформуючий фактор росту бета (ТОЕр) і фактор некрозу пухлини альфа (ТМЕо), які є прозапальними цитокінами і, як відомо, активуються в проксимальних канальцях у мишей дикого типу в моделі протеїнурії.

На фіг. 34 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТИЕВ антитілом (виміряно у вигляді 95 площі забарвлених анти-ТаєЕр антитіл), у мишей дикого типу, що одержували ВЗА і фізіологічний розчин (п-8), мишей дикого типу, що одержували В5ЗА і антитіло ізотипного контролю (п-:7), і мишей дикого типу, що одержували ВЗА і інгібуюче МА5Р-2 антитіло (п--8). Як показано на фіг. 34, кількісне визначення забарвлених ТОЕр областей показало значиме зниження рівнів Тр у мишей, що одержували інгіібуюче МА5БР-2 антитіло, у порівнянні із групами, що одержували фізіологічний розчин і антитіла ізотипного контролю (значення р-0,0324 і 0,0349, відповідно).

На фіг. 35 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТМЕо антитілом (виміряно у вигляді95 площі забарвлених анти-ТМЕо, антитіл), у мишей дикого типу, що одержували ВЗА і фізіологічний розчин (п-8), мишей дикого типу, що одержували ВЗА і антитіло ізотипного контролю (п-7), і мишей дикого типу, що одержували В5А і інгібуюче МА5Р-2 антитіло (п-8). Як показано на фіг. 35, аналіз забарвлених зрізів показав значиме зниження рівня ТМЕс; у групі, що одержувала інгібуюче МАЗР-2 антитіло, у порівнянні з контрольною групою, що одержувала фізіологічний розчин (р-0,011), а також групою, що одержувала ізотипний контроль (р-:0,0285).

На фіг. 36 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-1І -6 антитілом (виміряно у вигляді 95 площі забарвлених анти-1ЇІ -6 антитіл), у мишей дикого типу, що одержували В5А і фізіологічний розчин (п-8), мишей, що одержували

В5А і антитіло ізотипного контролю (п-7), і мишей дикого типу, що одержували ВЗА і інгібуюче

МА5Р-2 антитіло (п-8). Як показано на фіг. 36, аналіз забарвлених ділянок показав значиме зниження рівня ІЇ/-б у групі, що одержувала інгібуюче МАБР-2 антитіло, у порівнянні з контрольною групою, що одержувала фізіологічний розчин (р-0,0269), а також групою, що бо одержувала ізотипний контроль (р-:0,0455).

Загальний огляд результатів і висновки

Результати в цьому прикладі демонструють, що використання інгібуючого МА5Р-2 антитіла забезпечує захист від ниркового ушкодження в моделі передозування білка, що узгоджується з результатами, описаними в прикладі 16, який демонструє, що у МАБР-2-/- мишей зменшене ушкодження нирок у моделі протеїнурії.

ПРИКЛАД 18

У цьому прикладі представлені результати, які були одержані з використанням моделі фіброзу нирок, запалення і тубулоіїнтерстиціального ушкодження на фоні індукованої адріаміцином нефрології у МА5Р-2-/- мишей і мишей дикого типу для оцінки ролі лектинового шляху при протеїнуричній нефропатії.

Передумови/обгрунтування

Адріаміцин є антацикліновим протипухлинним антибіотиком, використовуваним для лікування широкого спектра онкологічних захворювань, включаючи гематологічні злоякісні пухлини, саркоми м'яких тканин і багато які види карцином. Індукована адріаміцином нефропатія - добре відома модель хронічної хвороби нирок у гризунів, яка дозволила краще зрозуміти прогресування хронічної протеїнурії (І ее апа Наїтіх5, Мерпгоїоду, 16:30-38, 2011). Тип структурного і функціонального ушкодження при індукованій адріаміцином нефропатії дуже схожий на тип хронічного протеїнуричного захворювання нирок у людей (Рірріп еї аї., Атегісап

Уоитаї! ої Репаї Рпузіоіоду, 296:6213-29, 2009).

Індукована адріаміцином нефропатія характеризується ушкодженням подоцитів з наступним гломерулосклерозом, тубулоіїнтерстиціальним запаленням і фіброзом. У багатьох дослідженнях показано, що індукована адріаміцином нефропатія модулюється як імунними, так і неїімунними механізмами (І ее апа Нагтіз, Мерпгоїоду, 16:30-38, 2011). Індукована адріаміцином нефропатія має декілька переваг як модель захворювання нирок. По-перше, це дуже добре відтворена і передбачувана модель ушкодження нирок, оскільки вона характеризується індукцією ушкодження нирок протягом декількох днів після введення лікарського засобу, що дозволяє полегшити розробку експерименту, оскільки ушкодження розвивається послідовно з перебігом часу. Це також модель, у якій ступінь ушкодження тканини є серйозним, незважаючи на прийнятний рівень смертності («5 905) і захворюваності (втрата маси тіла). Тому через тяжкість і

Зо розвиток з перебігом часу ушкодження нирок при індукованій адріаміцином нефропатії ця модель є придатною для тестування терапевтичних методів, що захищають від ушкодження нирок.

Як описано в прикладах 16 і 17, у моделі індукованої передозуванням білка протеїнурії було встановлено, що МА5Р-2-/- миші і миші, що одержували інгібуюче МАЗР-2 антитіло, показали значно поліпшені результати (наприклад, менший ступінь тубулоіїнтерстиціального ушкодження і менший ступінь запалення нирок), у порівнянні з мишами дикого типу, що свідчить про патогенну роль лектинового шляху при протеїнуричній хворобі нирок.

У цьому прикладі МА5БР-2-/- мишей аналізували в порівнянні з мишами дикого типу в індукованій адріаміцином (АМ) нефрологічній моделі для визначення того, чи може дефіцит

МАБР-2 зменшити і/або запобігти розвитку запалення нирок і тубулоінтерстиціального ушкодження, викликаного адріаміцином.

Методи 1. Оптимізація дози і часової точки

Спочатку проводили експеримент для визначення дози адріаміцину і часової точки, при якій у мишей ВАЇВ/с розвивається рівень запалення нирок, придатний для тестування терапевтичного втручання.

Трьом групам мишей ВАГ В/с дикого типу (п-8) вводили ІМ одну дозу адріаміцину (10,5 мг/кг).

Мишей умертвляли в трьох точках: через один тиждень, два тижні і чотири тижні після введення адріаміцину. Контрольним мишам вводили тільки фізіологічний розчин.

Результати

У всіх мишей у трьох групах спостерігали ознаки гломерулосклерозу і протеїнурії, обумовлені забарвленням НЯЕ, з поступовим збільшенням ступеня запалення тканин, як виміряно по ступеню інфільтрації макрофагів у нирках (дані не показані). Ступінь ушкодження тканини був помірним в однотижневій групі, помірним у двотижневій групі і важким в чотиритижневій групі (дані не показані) Для частини дослідження, що залишилася, була вибрана двотижнева точка. 2. Аналіз індукованої адріаміцином нефропатії у мишей дикого типу і МАЗР-2-/- мишей

Щоб з'ясувати роль лектинового шляху комплементу в індукованій адріаміцином нефропатії, групу МА5Р-2-/- (ВАЇ В/с) мишей порівнювали з мишами дикого типу (ВАЇ В/с) при однаковій дозі бо адріаміцину. МА5Р-2-/- мишей схрещували з ВАГ В/с мишами протягом 10 поколінь.

Мишам дикого типу (п-8) і МАБР-2-/- мишам (п-8) вводили ІМ адріаміцин (10,5 мг/кг) і трьом мишам кожної лінії вводили тільки фізіологічний розчин як контроль. Усіх мишей умертвляли через два тижні після лікування, і тканини збирали. Ступінь гістопатологічного ушкодження оцінювали шляхом забарвлення НаЕ.

Результати

На фіг. 37 показані типові зрізи забарвлених НУЕ тканин для наступних груп мишей на 14-й день після лікування тільки адріаміцином або фізіологічним розчином (контроль): (панелі А-1, А- 2, А-3) контрольні миші дикого типу, що одержували тільки фізіологічний розчин; (панелі В-1, В- 2, В-3) миші дикого типу, що одержували адріаміцин; і (панелі С-1, 0-2, С-3) МАБР-2-/- миші, що одержували адріаміцин. Кожна фотографія (наприклад, панель А-1, А-2, А-3) являє собою окрему мишу.

Як показано на фіг. 37, в МАБР-2-/- групі, що одержувала адріаміцин, спостерігається набагато більш високий ступінь збереження тканини в порівнянні з групою дикого типу, що одержувала таку ж дозу адріаміцину.

На фіг. 38 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених антитілом до маркера макрофагів Е4/80, що показують середню забарвлену площу макрофагів (95) для наступних груп мишей на 14 день після лікування тільки адріаміцином або фізіологічним розчином (контроль дикого типу): контрольні миші дикого типу, що одержували тільки фізіологічний розчин; миші дикого типу, що одержували адріаміцин;

МА5Р-2-/- миші, що одержували тільки фізіологічний розчин, і МА5Р-2-/- миші, що одержували адріаміцин. Як показано на фіг. 38, у МАБР-2-/- мишей, що одержували адріаміцин, ступінь інфільтрації макрофагів знижений ("р-0,007) у порівнянні з мишами дикого типу, що одержували адріаміцин.

На фіг. 39 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених сіріуусом червоним, що показують область забарвленого відкладення колагену (95) для наступних груп мишей на 14 день після лікування тільки адріаміцином або фізіологічним розчином (контроль дикого типу): контрольні миші дикого типу, що одержували тільки фізіологічний розчин; миші дикого типу, що одержували адріаміцин; МА5Р -2-/- миші, що одержували тільки фізіологічний розчин, ії МАБР-2-/- миші, що одержували адріаміцин. Як

Зо показано на фіг. 39, у МАБР-2-/- мишей, що одержували адріаміцин, ступінь відкладення колагену знижений (""р-0,005) у порівнянні з мишами дикого типу, що одержували адріаміцин.

Результати і висновки

Полегшення ниркового тубулоіїнтерстиціального запалення є ключовою ціллю лікування захворювань нирок. Представлені в даному описі результати показують, що лектиновий шлях активації комплементу додає суттєвий внесок у розвиток ниркового тубулоінтерстиціального запалення. Як додатково показано в даному описі, інгібуючий МА5Р-2 агент, такий як інгібуюче

МАБР-2 антитіло, може бути використаний як новий терапевтичний підхід для лікування протеїнуричної нефропатії, індукованої адріаміцином нефропатії і для зменшення ниркового тубулоінтерстиціального запалення.

ПРИКЛАД 19

У цьому прикладі описані початкові результати поточного клінічного випробування фази 2 для оцінки безпеки і клінічної ефективності повністю людського моноклонального інгібуючого

МАБР-2 антитіла у дорослих зі стероїдзалежною імуноглобулін-А нефропатією (ДАМ) Її у дорослих зі стероїдзалежною мембранозною нефропатією (МН).

Передумови

Хронічні захворювання нирок уражують більше 20 мільйонів людей у Сполучених Штатах (Огаму? Р. єї аї., Апп. Іпієт. Меа. 162(11), ІТС1-16, 2015). Гломерулонефропатії (СМ), включаючи

ІЗАМ і МН, є захворюваннями нирок, при яких ушкоджені клубочки і які часто приводять до термінальної стадії ниркової недостатності і діалізу. Існує декілька типів первинних ОМ, найпоширенішою з яких є ІДАМ. У багатьох із цих пацієнтів спостерігається персистуюче запалення нирок і прогресуюче погіршення стану. Часто ці пацієнти лікуються кортикостероїдами або імунодепресантами, для яких характерні численні серйозні віддалені несприятливі наслідки. У багатьох пацієнтів стан продовжує погіршуватися навіть при цих методах лікування. Спосіб лікування ІДАМ або МН відсутній.

ІДА-нефропатія

Імуноглобулін А-нефропатія (ДАМ) - це аутоїмунне захворювання нирок, яке приводить до внутрішнього запалення нирок і їх ушкодження. ІДАМ є найпоширенішим з первинних гломерулонефритів в усьому світі (Мадівігопі еї аї., Кідпеу Іпі. 88(5):974-89, 2015). Судячи з оцінок, при щорічному рівні захворюваності приблизно 2,5 на 100000 людей у 1 з 1400 людей у бо США розвивається ІДАМ. У 40 95 пацієнтів з ІДАМ хвороба буде прогресувати до термінальної стадії ниркової недостатності (ТОНН) у межах 20 років після встановлення діагнозу (Сорро К., р'Атісо а., У. Мерптгої. 18(5):503-12, 2005; Хіє еї а!., Ріо5 Опе, 7(6):е38904 (2012)). У пацієнтів, як правило, спостерігається мікроскопічна гематурія з легкою і помірною протеїнурією і різними рівнями ниркової недостатності (Мууай кК.)). еї а!., М. Епоаї. У. Меа. 368(25):2402-14, 2013). Клінічні маркери, такі як порушення функції нирок, тривала гіпертензія і важка протеїнурія (більше 1 г на день), пов'язані з поганим прогнозом (соїо М. еї аї., Тгапзріапі. Мерпгої. Оіаї. 24(10):3068-74, 2009; Вепоих БЕ. вї а!., У. Ат. бос. Мернго!. 22(4):752-61, 2011). Протеїнурія є найбільш сильним прогностичним фактором, що не залежить від інших факторів ризику за результатами декількох великих неекспериментальних і проспективних досліджень (Сорро К. еї а1., У. Мерпгої. 18(5):503- 12, 2005; ВАвісн Н.М. єї аї., 9). Ат. бос. Мернпгої. 18(12):3177-83, 2007). По оцінках, 15-20 95 пацієнтів досягають ТОНН протягом 10 років після початку захворювання, якщо вони не одержують лікування (С'Атісо 0., Ат. у. Кідпеу бів. 36(2):227-37, 2000).

Діагностичною ознакою ІДАМ є переважання відкладення або тільки ІдА, або в комбінації з

ІДС, ІМ або обох у гломерулярному мезангіумі. При ІДАМ біопсія нирок виявляє гломерулярне відкладення мананзв'язувального лектину (МВІ), ключової молекули розпізнавання для активації МАБР-2, ефекторного ферменту лектинового шляху системи комплементу.

Гломерулярні відкладення МВІ, які звичайно локалізовані спільно з ІдА і указують на активацію комплементу, і високий рівень МВІ. у сечі пов'язані з несприятливим прогнозом при ІДАМ, при цьому у цих пацієнтів проявляються більш серйозні гістологічні зміни і мезангіальна проліферація, ніж у пацієнтів без відкладення МВІ. або з високими рівнями МВІ. у сечі (Маїзида

М. єї аї., Мерпгоп, 80(4):408-13, 1998; (іш І. єї аї., СіІїп. Ехр. Іттипої. 169(2):148-155, 2012;

Воо5 А. еї аї., у). Ат. ос. Мерпгої. 17(6):1724-34, 2006; Пи Г.С. еї аї., Сіїп. Ехр. Іттипої. 174(1):152-60, 2013). Частота ремісії також значно нижче у пацієнтів з відкладенням МВІ. (Гі

Г.М. еїа)., Сііп. Ехр. Іттипої. 174(1):152-60, 2013).

Сучасні підходи до лікування ІДАМ основані на спробах уповільнити, зупинити або відстрочити погіршення функції нирок. У посібнику по клінічній практиці при гломерулонефриті "Хвороба нирок: поліпшення загальних результатів" (Те Кідпеу Оівеазе: Ітргоміпуд СпПобаї

Ошісотез (КОІСО)) рекомендована схема лікування ІДАМ, згідно з якою першочергову увагу слід приділяти контролю артеріального тиску шляхом блокади ренін-ангіотензинової системи

Зо (КАБ) ЇКОІСО Умогк Сгоир, 2012). Для пацієнтів з постійною добовою протеїнурією 1 г або більше, незважаючи на максимально переносимі дози антигіпертензивних засобів і добре контрольований артеріальний тиск, рекомендоване лікування включає кортикостероїди і/або інші імунодепресанти, такі як циклофосфамід, азатіоприн або мікофеноляту мофетил. Згідно з керівництвом по клінічній практиці при гломерулонефриті "Хвороба нирок: поліпшення загальних результатів" (КОІСО) (Іпї Бос. ої МерпгоїЇ. 2(2):1139-274, 2012) рекомендується вводити кортикостероїди пацієнтам з протеїнурією дозою, яка вище або дорівнює 1 г/день, зі звичайною тривалістю лікування 6 місяців. Для пацієнтів з серпоподібною ІДАМ (визначуваною як наявність серпоподібних клітин в 25095 клубочків) і швидким погіршенням функції ниркового кліренсу до кортикостероїдів може бути доданий інший імунодепресант (наприклад, циклофосфамід). Однак навіть при агресивному імуносупресивному лікуванні, яке пов'язане з серйозними віддаленими наслідками, у деяких пацієнтів спостерігається прогресуюче погіршення функції нирок. На сьогоднішній день відсутнє схвалене ЕОА лікування ІДАМ, навіть у випадку застосування інгібіторів ангіотензинперетворювального ферменту (АСЕ) або блокаторів рецепторів ангіотензину (АКВ) для контролю артеріального тиску у деяких пацієнтів зберігається підвищена протеїнурія. Було показано, що жоден із цих методів не зупиняє або навіть не уповільнює прогресування ІДАМ у пацієнтів з ризиком швидкого прогресування захворювання. Альтернативні методи лікування, які могли б зменшити або усунути необхідність у тривалій кортикостероїдній і/або імуносупресивній терапії, однозначно вирішили б незадоволені медичні потреби.

Мембранозна нефропатія

Щорічний рівень захворюваності мембранозною нефропатією (МН) становить приблизно 10- 12 на 1000000 людей. Пацієнти з МН можуть мати змінний перебіг захворювання, але приблизно у 25 95 буде розвиватися термінальна стадія ниркової недостатності.

Мембранозна нефропатія - це імуномодульоване клубочкове захворювання і одна з найпоширеніших причин нефротичного синдрому у дорослих. Хвороба характеризується утворенням імунних відкладень, у першу чергу Ідс54, на зовнішньому шарі гломерулярної базальної мембрани, які містять антигени подоцитів і антитіла, специфічні до цих антигенів, що приводить до активації комплементу. Початкові прояви МЕН пов'язані з нефротичним синдромом: протеїнурією, гіпоальбумінемією, гіперліпідемією і набряком. бо Хоча МН може слабшати спонтанно, без лікування, у однієї третини пацієнтів спостерігається прогресуюча втрата функції нирок і прогресування захворювання до ТОНН у середньому через 5 років після встановлення діагнозу. Часто для лікування МН застосовуються кортикостероїди, і існує необхідність у розробці альтернативних методів лікування. Крім того, пацієнти, які, як вважається, мають помірний ризик прогресування, залежно від тяжкості протеїнурії одержують преднізон у комбінації з циклофосфамідом або інгібітором кальциневрину, і ці два методи лікування, застосовувані спільно, часто пов'язані з серйозними системними побічними ефектами.

Методи

Два клінічні дослідження фази 1, проведені на здорових добровольцях, продемонстрували, що як внутрішньовенне, так і підшкірне введення інгібуючого МАБР-2 антитіла, ОМ5646, приводило до стійкого пригнічення лектинового шляху.

У цьому прикладі описані проміжні результати фази 2, що проводиться на даний час, неконтрольованого, багатоцентрового дослідження інгібуючого МАБР-2 антитіла, ОМ5646, у суб'єктів з ІЗАМ і МН. Згідно з критеріями включення необхідно, щоб стан усіх пацієнтів у цьому дослідженні, незалежно від підтипу захворювання нирок, підтримувався прийманням стабільної дози кортикостероїдів протягом щонайменше 12 тижнів до їх включення в дослідження (тобто пацієнти були залежними від стероїдів). Дослідження являє собою непорівняльне пілотне дослідження з 12-тижневим лікуванням і б-тижневим періодом спостереження.

Згідно з планом дослідження, необхідно набрати приблизно по чотири пацієнти на одне захворювання. Дослідження призначене для оцінки можливості ОМ5646 поліпшувати функцію нирок (наприклад, зменшувати тяжкість протеїнурії) і знижувати потреби в кортикостероїдах у пацієнтів з (ДАМ ії МН. На сьогоднішній день 2 пацієнти з ІдА-нефропатією і 2 пацієнти з мембранозною нефропатією завершили лікування в цьому дослідженні.

Для входження в дослідження кожний суб'єкт повинен мати високий рівень білка в сечі, незважаючи на постійне лікування стабільною дозою кортикостероїдів. Ці критерії вибрані для пацієнтів, у яких навряд чи відбудеться спонтанне поліпшення під час дослідження.

Вік суб'єктів під час відбору становив 218, і суб'єктів включали в дослідження тільки в тому випадку, якщо у них діагностували одне з наступного: ІДАМ при біопсії нирок або первинну МН при біопсії нирок. Зараховані пацієнти також повинні були відповідати всім наведеним нижче

Зо критеріям включення: (1) середнє співвідношення альбумін/креатинін у сечі »0,6 у трьох зразках, що збираються послідовно і щодня перед кожним з двох відвідувань у період відбору; (2) приймання преднізону дозою 210 мг або еквівалентною дозою протягом щонайменше 12 тижнів до відвідування 1 у період відбору; (3) при фоновому імуносупресивному лікуванні (наприклад, циклофосфамідом, мікофеноляту мофетилом) прийом стабільної дози протягом як мінімум 2 місяців до візиту 1 у період відбору без очікуваної зміни дози під час дослідження; (4) розрахункова швидкість клубочкової фільтрації (есЕкК) 230 мл/хв./1,73 ме, обчислена по рівнянню МОКО"; (5) проходження призначеної лікарем стабільної, оптимізованої терапії інгібіторами ангіотензинперетворювального ферменту (АСЕЇ) і/або блокаторами рецепторів ангіотензину (АКВ), систолічний артеріальний тиск «150 мм рт. ст. і діастолічний артеріальний тиск «90 мм рт. ст. у розслабленому стані; (б) невикористання белімумабу, ецулізумабу або ритуксимабу протягом б місяців до відвідування 1 у період відбору; а також (7) відсутність трансплантації нирки. "Рівняння МОКО: ес (мл/хв./1,73 м2е)-175 х (5Обг)1и154 х (Вік) 203 х (0,742 для жінок) х (1,122 для афроамериканців). Примітка: 5Сг-рівень креатиніну в сироватці крові повинен бути виражений в мг/дл.

Моноклональне антитіло, використовуване в цьому дослідженні, ОМ5646, являє собою повністю людське ІдД54 моноклональне антитіло, яке зв'язує і інгібує людський МАБР-2. МАБР-2 є ефекторним ферментом лектинового шляху. Як показано в прикладі 12, ОМ5646 ефективно зв'язується з рекомбінантним МА5Р-2 (уявна рівноважна константа дисоціації в діапазоні 100

ПМ) і проявляє більше ніж 5000-кратну селективність до гомологічних білків С15, С1іг і МАБР-1. У функціональних аналізах ОМ5646 пригнічує активність лектинового шляху людини з ефективністю в межах наномолів (концентрація, що забезпечує 50 95 інгібування (ІСво), становить приблизно З нМ), але не виявляє суттєвого впливу на класичний шлях. ОМ5646, що вводиться або внутрішньовенною (ІМ), або підшкірною (5С) ін'єкцією мишам, приматам, що не належать до людини, і людям, приводив до високих концентрацій у плазмі, які були пов'язані з бо пригніченням активації лектинового шляху в аналізі ех м/о.

У цьому дослідженні лікарська речовина ОМ5646 надавалася в концентрації 100 мг/мл, яку додатково розбавляли для ІМ введення. Відповідний розрахований об'єм 100 мг/мл розчину

ОМ5646 для ін'єкцій витягали з флакона за допомогою шприца для приготування дози. Мішок для інфузії вводили протягом чотирьох годин після приготування.

Дослідження включало періоди скринінгу (28 днів), лікування (12 тижнів) і наступного спостереження (6 тижнів), як показано на схемі дослідження, наведеній нижче.

Схема дослідження її вана : : вгода : лікування плпостереження не ! сину - унннннннну : : і пе КІ еБЕеЖНІ лек 5 | девунення, / ТЕБЕ по птЕІ

ОЗ ов періюді 00 тлюющь КА ОУН 100000 підеюо 0000100БЖеЕ 000000: першюдо 00 межею

Пкдень СЯ пеюча вова: за ОТ І Ї сен день Х3 І ін ія : : пстеройлав ої МЕМ і ! пень 15: іижужне АВ

Під час відбору до введення першої дози ОМ5646 пацієнти, що пройшли відбір, надавали по три зразки сечі (які збирали раз на добу) у кожному із двох триденних періодів для встановлення вихідних значень відношення альбуміну до креатиніну в сечі. Після закінчення періоду відбору відібраним суб'єктам вводили ІМ ОМ5646 по 4 мг/кг один раз на тиждень протягом 12 тижнів (період лікування). Після останньої дози ОМ5646 йшов б-тижневий період спостереження.

Протягом перших 4 тижнів лікування за допомогою ОМ5646 випробувані продовжували приймати стабільну дозу кортикостероїдів, яку приймали до початку лікування. Наприкінці перших 4 тижнів 12-тижневого періоду приймання суб'єктами кортикостероїду поступово скорочували (тобто дозу кортикостероїдів зменшували), якщо це було можливо, протягом 4 тижнів, а потім йшли 4 тижні, протягом яких продовжувалося приймання одержаної в результаті зменшеної дози кортикостероїдів. Метою було зниження дози преднізону до «б мг (або еквівалентної дози) щодня. У цей період поступове зниження дози припиняли у пацієнтів, у яких спостерігалося погіршення функції нирок, по оцінці дослідника. Суб'єктів лікували ОМ5646 на фоні поступового зниження дози кортикостероїду і протягом повних 12 тижнів. Потім пацієнтів спостерігали протягом додаткових б тижнів після останнього приймання ОМ5646. Поступове зниження дози кортикостероїдів і лікування ОМ5646 дозволили оцінити, чи дозволяє приймання

ОМ5646 знижувати дози кортикостероїдів, необхідних для підтримання стабільної функції нирок.

Ключовими заходами ефективності в цьому дослідженні є зміна відношення альбумін/креатинін у сечі (АСК) і 24-годинний рівень білка відносно вихідного рівня, одержаного до початку 12 тижнів. Вимірювання білка або альбуміну в сечі звичайно використовується для оцінки ураження нирок, а стійкі високі рівні білка в сечі корелюють з прогресуванням захворювання нирок. шАСК використовується в клінічних дослідженнях для оцінки протеїнурії.

Оцінка ефективності

Аналізоване значення цЦАСК визначають як середнє від усіх значень, одержаних у деякій часовій точці. Планована кількість ЧАСК дорівнює трьом для кожного запланованого моменту часу. Вихідне значення пАСК визначали як середнє значення аналізованих значень при двох відвідуваннях.

Результати

На фіг. 40 графічно показані шАСК для двох пацієнтів з (ДАМ протягом 12-тижневого дослідження із щотижневим лікуванням інгібуючим МАБР-2 антитілом (0М5646) у кількості 4 мг/кг. Як показано на фіг. 40, зміна від вихідного рівня статистично значима в часовій точці "а" (р-0,003); часовій точці "р" (р-0,007) і часовій точці "с" (р-0,033), згідно з нетрансформованим аналізом. У таблиці 12 представлені дані для білка в 24-годинному зборі сечі пацієнтів з ІДАМ, що одержували ОМ5646.

ТАБЛИЦЯ 12

Білок в 24-годинному зборі сечі (мг/добу) у ІДАМ-пацієнтів, що одержували ОМ5646 (мг/24 години) (мг/24 години)

Як показано на фіг. 40 і в таблиці 12, у ході дослідження у пацієнтів з (ДАМ спостерігали клінічно і статистично значиме поліпшення функції нирок. Статистично значиме зниження як величини ЧАСЕ (див. фіг. 40), так і концентрації білка в 24-годинному зборі сечі (див. таблицю 12). Як показують дані шАСК на фіг. 40, середній вихідний рівень шАСК становив 1264 мг/г і наприкінці лікування досяг 525 мг/г (р-0,011), знизившись до 128 мг/г наприкінці періоду спостереження. На фіг. 40 додатково показано, що лікувальний ефект підтримувався протягом усього періоду спостереження. Вимірювання 24-годинної екскреції білка з сечею відслідковували по ЧАСК, з середнім зниженням від 3156 мг/24 години до 1119 мг/24 години (р-0,017). Ефекти лікування у двох пацієнтів були у високому ступені узгодженими. У обох пацієнтів спостерігалося зниження приблизно на 2000 мг/добу, і обидва пацієнти досягали часткової ремісії (визначеної як більше 50 95 зниження екскреції білка в 24-годинному зборі сечі і/або кінцевої екскреції білка менше 1000 мг/добу; повну ремісію визначали як екскрецію білка менше 300 мг/добу). Величина 24-годинного зменшення протеїнурії у обох пацієнтів з ІдА- нефропатією пов'язана зі значним поліпшенням виживаності нирок. Обидва пацієнти з ІдА- нефропатією також виявилися толерантними до суттєвого зменшення прийнятих ними доз стероїдів, зі зниженням добової дози до «5 мг (від 60 до 0 мг, від ЗО до 5 мг).

У двох пацієнтів з МН також спостерігали зниження ЧчАСК під час лікування ОМ5646. У одного пацієнта з МН рівень чАСЕ знизився з 1003 до 69 мг/г, і цей низький рівень зберігався протягом періоду спостереження. У іншого пацієнта з МН спостерігалося зниження ЧАсСк з 1323 до 673 мг/г зі змінним курсом після лікування. У першого пацієнта з МН спостерігали виражене зниження рівня білка в 24-годинному зборі сечі (10771 мг/24 години на початку лікування до 325 мг/24 години на день 85), що забезпечувало часткову і майже повну ремісію, тоді як у іншого він залишався практично незмінним (4272 мг/24 години на початку лікування до 4502 мг/24 на день 85). Рівні стероїдів у двох пацієнтів з МН поступово знижувалися від 30 до 15 мг від 10 до 5 мг.

Таким чином, узгоджені поліпшення функції нирок спостерігали у пацієнтів з ІЗАМ і МН, що одержували лікування інгібуючим МА5БР-2 антитілом, ОМ5646. Ефекти лікування ОМ5646 у пацієнтів з ІДАМ є надійними і узгодженими, що свідчить про сильний сигнал ефективності. Ці

Зо ефекти підтверджені результатами у пацієнтів з МН. Часовий профіль і величина змін ПАсСкК під час лікування були узгодженими у всіх чотирьох пацієнтів з ІДАМ і МН. Ніяких суттєвих проблем з безпекою не спостерігалося. Пацієнти в цьому дослідженні належали до групи, важкодоступної для лікування, і терапевтичний ефект у цих пацієнтів свідчить про ефективність інгібуючого МА5Р-2 антитіла, такого як ОМ5646, у пацієнтів з ІДАМ і МН, таких як пацієнти, що страждають стероїдзалежними ІДАМ і МН (тобто пацієнтів, що одержували лікування стабільною дозою кортикостероїдів до лікування інгібуючим МА5Р-2 антитілом), у тому числі пацієнтів з підвищеним ризиком швидкого прогресування до термінальної стадії ниркової недостатності.

Відповідно до вищевикладеного, в одному з варіантів здійснення винаходу надається спосіб лікування людини, що страждає ДАМ або МН, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла, ефективну для пригнічення МАЗР-2-залежної активації комплементу. В одному з варіантів здійснення спосіб включає введення людині, що страждає ІЩАМ або МН, кількості інгібуючого МАБР-2 антитіла, достатньої для поліпшення функції нирок (наприклад, зменшення протеїнурії). В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає стероїдзалежною ДАМ. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає стероїдзалежною МН. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5БР-2 антитіло вводиться суб'єкту, що страждає стероїдзалежною ІДАМ або стероїдзалежною МН, у кількості, достатній для поліпшення функції нирок і/або зниження дози кортикостероїдів у зазначеного суб'єкта.

В одному з варіантів здійснення спосіб додатково включає ідентифікацію суб'єкта, що страждає стероїдзалежною ІДАМ, до етапу введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгіібуючого МАБР-2 антитіла, ефективну для пригнічення МАБР-2-залежної активації комплементу.

В одному з варіантів здійснення спосіб додатково включає ідентифікацію суб'єкта, що має стероїдзалежну МН, до етапу введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого

МА5Р-2 антитіла, ефективну для пригнічення МА5Р-2-залежної активації комплементу.

Відповідно до будь-якого з розкритих тут варіантів здійснення інгібуюче МАЗР-2 антитіло проявляє щонайменше одну або декілька з наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує людський МАБбР-2 з Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп у домені ССРІ1

МАБ5БР-2, зазначене антитіло пригнічує відкладення СЗБ в аналізі /л м/о в 1 95 людській сироватці з ІСво 10 нМ або менше, зазначене антитіло пригнічує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці з ІС5о 30 нМ або менше, де антитіло являє собою фрагмент антитіла, вибраний із групи, що складається з Ем, Бар, Раб", Е(ар)» і Е(ар)г2, де антитіло являє собою одноланцюжкову молекулу, де зазначене антитіло являє собою молекулу Ідс2, де зазначене антитіло являє собою молекулу ІдДО1, де зазначене антитіло являє собою молекулу Ідс4ї, де молекула Ідс4 містить мутацію 5228Р. В одному з варіантів здійснення антитіло зв'язується з

МА5Р-2 і вибірково пригнічує лектиновий шлях без пригнічення по суті класичного шляху (тобто пригнічує лектиновий шлях, залишаючи неушкодженим класичний шлях комплементу).

В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5Р-2 антитіло вводять у кількості, ефективній для поліпшення щонайменше одного або більше клінічних параметрів, пов'язаних з функцією нирок, таких як зменшення протеїнурії (наприклад, зменшення шАСЕ і/або зменшення концентрації білка в 24-годинному зборі сечі, таке як більше ніж 20 95 зменшення екскреції білка в 24-годинному зборі сечі або таке як більше ніж 30 95 зменшення екскреції білка в 24- годинному зборі сечі, або таке як більше ніж 40 95 зменшення екскреції білка в 24-годинному зборі сечі, або таке як більше 50 95 зменшення екскреції білка в 24-годинному зборі сечі).

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення інгібуючого МА5Р-2 антитіла суб'єкту, що страждає ІДАМ (такою як стероїдзалежна ІдАМ), через катетер (наприклад, внутрішньовенно) протягом першого періоду часу (наприклад, щонайменше від одного дня до тижня або двох тижнів, або трьох тижнів, або чотирьох тижнів або більше) з наступним введенням інгібуючого МАБР-2 антитіла суб'єкту підшкірно протягом другого періоду часу (наприклад, хронічної фази протягом щонайменше двох тижнів або більше).

Зо У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення інгібуючого МА5Р-2 агента суб'єкту, що страждає МН (такою як стероїдзалежна МН), через катетер (наприклад, внутрішньовенно) протягом першого періоду часу (наприклад, щонайменше від одного дня до тижня або двох тижнів, або трьох тижнів, або чотирьох тижнів, або більше) з наступним введенням інгібуючого

МА5Р-2 антитіла суб'єкту підшкірно протягом другого періоду часу (наприклад, хронічної фази протягом щонайменше двох тижнів або більше).

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення інгібуючого МА5Р-2 антитіла суб'єкту, що страждає ІДАМ (такою як стероїдзалежна ДАМ) або МН (такою як стероїдзалежна

МН) внутрішньовенно, внутрішньом'язово або підшкірно. Лікування може бути хронічним і вводитися щодня щомісяця, але переважно щонайменше кожні два тижні або щонайменше раз на тиждень, наприклад два рази на тиждень або три рази на тиждень.

В одному з варіантів здійснення спосіб включає лікування суб'єкта, що страждає ІДАМ (такою як стероїдзалежна ІДАМ) або МН (такою як стероїдзалежна МН), яке включає введення суб'єкту композиції, що містить кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла або антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить СОБ-НІ, СОВ-Н2 і

СОВ-НЗ амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить СОК-І1, СОВ-12 і СОК-І3 амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮ МО:70. У деяких варіантах здійснення композиція містить інгібуюче

МА5Р-2 антитіло, що містить (І) (а) варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить: ї) СОК-НІ1 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 31-35 в 5ЕО ІЮ МО:67; і ії) СОК-

Н2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 50-65 в 5ЕО ІЮО МО:67; і їїї)

СОВ-НЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 95-107 в 5ЕО ІЮ МО:67; і (Б) варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить: ї) СОК-Ї1 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 24-34 в 5ЕО ІЮ МО:70; і і) СОК-12 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 50-56 в 5ЕБО ІЮО МО:70; і ії) СОК-І З легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 89-97 в 5ЕБЕО ІЮ МО:70; або (ІІ) його варіант, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга з щонайменше 90 95 ідентичністю (наприклад, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 9565, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 9895, щонайменше 99 95 ідентичністю) з ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга з ідентичністю бо щонайменше 9095 (наприклад, щонайменше 91 956, щонайменше 92 956, щонайменше 93 95,

щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 965, щонайменше 98 96, щонайменше 99 95 ідентичністю) з БЗЕО ІЮ МО:70.

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого МА5БР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в

ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО:70.

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка містить інгібуюче МА5Р-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людському МА5Р-2, розпізнаваному референсним антитілом

ОМ5646, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, як зазначено в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, як зазначено в ЗЕО ІЮ МО:70.

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення суб'єкту, що страждає або має ризик розвитку ІЇДАМ (такої як стероїдзалежна ДАМ) або МН (такої як стероїдзалежна МН), композиції, яка містить інгібуюче МАЗР-2 антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: б7, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО:70, у дозі від 1 до 10 мг/кг (тобто 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9 або 10 мг/кг) не рідше одного разу на тиждень (наприклад, щонайменше два рази на тиждень або щонайменше три рази на тиждень) протягом щонайменше З тижнів або протягом щонайменше 4 тижнів, або протягом щонайменше 5 тижнів, або протягом щонайменше б тижнів, або протягом щонайменше 7 тижнів, або протягом щонайменше 8 тижнів, або протягом щонайменше 9 тижнів, або протягом щонайменше 10 тижнів, або протягом щонайменше 11 тижнів, або протягом щонайменше 12 тижнів.

ПРИКЛАД 20

У цьому прикладі описані попередні результати фази 2 клінічного дослідження, що продовжується на даний час, з оцінки безпеки і клінічної ефективності повністю людського моноклонального інгібуючого МАБР-2 антитіла у дорослих зі стероїдзалежним вовчаковим нефритом (ВН).

Зо Передумови

Хронічними захворюваннями нирок страждають більше 20 мільйонів людей у Сполучених

Штатах (Огам/? Р. еї аї., Апп. Іпїегп. Мей. 162(11); ІТС1-16, 2015). Гломерулонефропатії (М), включаючи ІдАМ, МН і ВН, є захворюваннями нирок, при яких ушкоджуються клубочки, що часто приводить до термінальної стадії ниркової недостатності і діалізу. У багатьох з цих пацієнтів є персистуюче запалення нирок і прогресуюче погіршення. Часто таких пацієнтів лікують кортикостероїдами або імунодепресантами, для яких характерні численні тривалі серйозні несприятливі наслідки. Навіть при цих методах лікування у багатьох пацієнтів продовжується погіршення.

Вовчаковий нефрит

Основним ускладненням при системному червоному вовчаку (СЧВ) є нефрит, також відомий як вовчаковий нефрит, який класифікується як вторинна форма гломерулонефриту. Пізніше в ході захворювання майже у 60 95 дорослих з СЧВ розвивається та або інша форма ураження нирок (Кода-Кітрбіє еї а!., Кода-Кітріє апа Моипд'5 Арріїєй Тнегарешісв: Те сіїпіса! иве ої агдв, 10 Ей, Пірріпсой УМіате 8 УМіКіпе: радев 792-9, 2012) з частотою 20-70 на 100000 чоловік у

США. Вовчаковий нефрит часто супроводжується у пацієнтів іншими симптомами активного

СЧВ, включаючи утому, пропасницю, висип, артрит, серозит або захворювання центральної нервової системи (Різеї5Ку 0.5. еї аїЇ.,, Мей. Сіїп. Могій. Ат. 81(1):113-28, 1997). У деяких пацієнтів спостерігається безсимптомний вовчаковий нефрит; однак, згідно з результатами регулярного моніторингу, лабораторні відхилення, такі як підвищений рівень креатиніну в сироватці, низький рівень альбуміну або білок або осад у сечі, свідчать про активний вовчаковий нефрит. Аутоімунітет відіграє важливу роль у патогенезі вовчакового нефриту. Ці аутоантитіла утворюють внутрішньосудинні патогенні імунні комплекси, які відкладаються в клубочках. Аутоантитіла можуть також зв'язуватися з антигенами, вже розташованими в базальній мембрані клубочків, утворюючи імунні комплекси /л 5. Імунні комплекси сприяють запальній відповіді, активуючи комплемент і залучаючи запальні клітини (О'Адаїї М.О. еї аї.,

Гирив пернгйв: раїйпоіоду апа раїподепевів: УМаїїасе 0.3. Нанпп, Юиброїв' І прив Егуїпетаїо5ив, 77

ЕЯ РПїйадеІрпа: Іірріпсой МУйШіатве й УМіКІїпе: рр. 1094-111, 2007). Таким чином, активація комплементу, опосередкована імунним комплексом, відіграє ключову роль у патогенезі вовчакового нефриту. Відкладення С44 присутні в нирковій тканині і звичайно пов'язані з 60 відкладеннями імунного комплексу, С1д і СЗ, ініціюючи класичний шлях. У деяких випадках відкладення С4а присутні без С1д, що вказує на можливе залучення лектинового шляху (Кіт

М.К. еї аї., Іпі. У. Сііп. Ехр. Раїної. 6(10):2157-67, 2013).

Додатковим підтвердженням важливої ролі лектинового шляху є той факт, що відкладення

МВІ. відбуваються в осередках ураження шкіри пацієнтів з СЧВ (Умаїййт Г.М. еї аІ., Нит. Іттипої. 75(7):629-32, 2014). Крім того, у більшості біопсій нирок у пацієнтів з вовчаковим нефритом спостерігалося стійке відкладення МВІ і фіколінів (Мізіпага К.М. еї аї., Нит. Іттипої. 74(8):907- 10, 2013). Відкладення МВІ. у нирках найбільш явним було у пацієнтів з високою протеїнурією.

Крім того, рівні МВІ. у плазмі були значно вище у пацієнтів з СЧВ, ніж у здорових контролів, а рівні МВІ. корелювали з активністю захворювання, що дозволяє припустити, що рівні МВІ. можуть являти собою біомаркер активності захворювання СЧВ (Рапаа А.К. еї аї., Агійпгйі5 Кезв.

Тег. 14(5):К218, 2012). Кортикостероїди є основним традиційним варіантом лікування пацієнтів з вовчаковим нефритом легкого ступеня. У більш важких випадках у клінічній практиці використовували високі дози преднізону, метилпреднізолону, мікофеноляту мофетилу, циклофосфаміду, азатіоприну і циклоспорину. Варіанти лікування СЧВ і вовчакового нефриту пов'язані з високою частотою ускладнень і смертністю. Побічні ефекти, особливо при тривалому застосуванні кортикостероїдів, обмежують додержання пацієнтом схеми лікування з наступним впливом на його ефективність. Існує необхідність у розробці схем лікування, які легше переносяться пацієнтами.

Методи

Як описано вище в прикладі 19, два клінічні дослідження фази 1, проведені на здорових добровольцях, продемонстрували, що як внутрішньовенне, так і підшкірне введення інгібуючого

МА5БР-2 антитіла, ОМ5646, приводило до стійкого пригнічення лектинового шляху.

У цьому прикладі описані проміжні результати, одержані на фазі 2 неконтрольованого багатоцентрового дослідження, що триває на даний час, інгібуючого МА5БР-2 антитіла, ОМ5646, у пацієнтів з вовчаковим нефритом (ВН). Відповідно до критеріїв включення в дослідження всі пацієнти в цьому дослідженні, незалежно від підтипу захворювання нирок, повинні одержувати стабільну дозу кортикостероїдів протягом щонайменше 12 тижнів до їх включення в дослідження (тобто пацієнти є стероїдзалежними). Дослідження являє собою просте (без порівняння) пілотне дослідження з 12-тижневим курсом лікування і б-тижневим періодом

Зо спостереження.

Дослідження призначене для оцінки здатності ОМ5646 поліпшувати функцію нирок (наприклад, ослабити протеїнурію) і знижувати потребу в кортикостероїдах у пацієнтів з ВН. На сьогоднішній день 5 пацієнтів з вовчаковим нефритом (ВН) завершили лікування в дослідженні.

На початку дослідження кожний суб'єкт повинен мати високий рівень білка в сечі, незважаючи на продовжуване лікування стабільною дозою кортикостероїдів. Ці критерії дозволяють вибрати пацієнтів, у яких навряд чи буде спостерігатися спонтанне поліпшення протягом періоду дослідження.

Під час скринінгу вік пацієнтів був 218 років, і в дослідження були включені тільки ті пацієнти, у яких при біопсії нирок був діагностований вовчаковий нефрит. Включені в дослідження пацієнти також повинні були відповідати всім наступним критеріям включення: (1) середнє відношення альбумін/креатинін у сечі 20,6 у трьох зразках, що здаються послідовно і щодня перед кожним з 2 відвідувань протягом періоду скринінгу; (2) приймання 210 мг преднізону або еквівалентної дози протягом не менше 12 тижнів до скринінгу 1; (3) у випадку імуносупресивної терапії (наприклад, циклофосфамідом, мікофеноляту мофетилом), прийом стабільної дози протягом не менше 2 місяців до скринінгового візиту 1 без очікуваного зміни дози протягом дослідження; (4) розрахункова швидкість клубочкової фільтрації (есЕР) х»30 мл/хв./1,73 ме, обчислена по рівнянню МОКО"; (5) одержання під керівництвом лікаря стабільного оптимізованого лікування інгібіторами ангіотензинперетворювального ферменту (АСЕЇ) і/або блокаторами рецепторів ангіотензину (АКВ), і систолічний артеріальний тиск «150 мм рт. ст. і діастолічний артеріальний тиск «90 мм рт. ст. у стані спокою; (6) невикористання белімумабу, екулізумабу або ритуксимабу протягом 6 місяців після скринінгового відвідування 1; а також (7) відсутність в анамнезі трансплантації нирки. "Рівняння МОКО: ес (мл/хв./1,73м2)-175 х (5017157 х (Вік) 203 х (0,742 (для жінок)) х (1,212 (для афроамериканців)). Примітка: ЗСт-рівень креатиніну в сироватці крові повинен бути виражений у мг/дл. 60 Моноклональне антитіло, використовуване в цьому дослідженні, ОМ5646, є повністю людським моноклональним антитілом Ідеї, яке зв'язується і інгібує МАБР-2 людини. МА5Р-2 є ефекторним ферментом лектинового шляху. Як показано в прикладі 12, ОМ5646 активно зв'язується з рекомбінантним МАБ5бР-2 (уявна константа дисоціації рівноваги становить 100 пМ) і проявляє більше ніж 5000-кратну селективність відносно гомологічних білків С15, С1г і МА5Р-1.

У функціональних аналізах ОМ5646 пригнічує лектиновий шлях людини з наномолярною активністю (концентрація, що приводить до 50 95 інгібування (ІСво|, становить приблизно З нМ), але не виявляє суттєвого впливу на класичний шлях. В ех у/мо аналізі високі концентрації

ОМ5646 у плазмі, що вводиться внутрішньовенною (ІМ) або підшкірною (5С) ін'єкцією мишам, приматам, відмінним від людини, і людям, приводили до пригнічення активації лектинового шляху.

У цьому дослідженні лікарську речовину ОМ5646 надавали в концентрації 100 мг/мл, яку потім розбавляли для внутрішньовенного введення. Відповідний розрахований об'єм ін'єкційного розчину ОМ5646 100 мг/мл витягали з флакона шприцом для приготування дози.

Інфузійний пакет вводили протягом чотирьох годин після приготування.

Дослідження складається з періодів скринінгу (28 днів), лікування (12 тижнів) і наступного спостереження (6 тижнів), як показано нижче на схемі дослідження. : хяифорани" ! : ках . Піжуєввинх Опостережемих гра "ера Догувкня, | твори ЕЕ ема

ОВО Я пам ї-4 ЛВАЕ КЕ ЕВВВга ума то псля (| І ЗКХДМВКИЖХУС ок ово повішни Кі оон ПОБУ нні ОБЕЗА НЖАУН М ооефо менвея реф ЛіКУВаМНЯ оф СПОСТЕЮВЮ сохне ЗА З : ІНК 3; ОплеюскиВ яко екеівах ! до і ї і : Пувкуах ЗЕ Керн» в

Уююєєюююєтююєєюююєюю Манна СЕКТ і сикюют ді і Косетеєтттттттттюєи уєеєєтююєєюююєююююююй нний

Під час періоду скринінгу і перед введенням першої дози ОМ5646 випробувані, що відповідають критеріям включення в дослідження, здавали по три зразки сечі (які збираються раз на добу) три дні поспіль у кожний з двох періодів здачі сечі протягом трьох послідовних днів для визначення вихідного рівня білка в 24-годинному зборі сечі і відношення альбумін-креатинін у сечі. Після періоду скринінгу суб'єкти, що відповідають критеріям включення, одержували

ОМ5646 у дозі 4 мг/кг внутрішньовенно один раз на тиждень протягом 12 тижнів (період лікування). Після останньої дози ОМ5646 йшов б-тижневий період спостереження.

Протягом перших 4 тижнів лікування ОМ5646 суб'єкти одержували стабільну дозу кортикостероїдів, одержувану до дослідження. Наприкінці перших 4 тижнів 12-тижневого періоду лікування суб'єкти одержували поступово зменшувану дозу кортикостероїдів (тобто дозу кортикостероїдів зменшували), по можливості, протягом 4 тижнів, за якими ішли 4 тижні, протягом яких суб'єкти продовжували одержувати фінальну дозу кортикостероїдів. Метою було зниження добової дози преднізону до 6 мг (або еквівалентної дози). Протягом цього періоду зниження дози припиняли для тих суб'єктів, у яких, по оцінках дослідника, спостерігалося погіршення ниркової функції. Суб'єкти одержували лікування ОМ5646 під час зменшення дози кортикостероїдів і протягом усіх 12 тижнів періоду лікування. Потім пацієнтів спостерігали протягом додаткових 6 тижнів після приймання останньої дози. Зниження дози кортикостероїдів і лікування ОМ5646 дозволили оцінити здатність ОМ5646 знижувати дозу кортикостероїдів, необхідну для підтримання стабільної функції нирок.

Аналіз ефективності

Ключовим показником ефективності в цьому дослідженні є зміна 24-годинного рівня білка від вихідного рівня протягом 12 тижнів. Вимірювання білка або альбуміну в сечі звичайно використовується для оцінки ураження нирок, а постійний високий рівень білка в сечі корелює з прогресуванням захворювання нирок. Часткова ремісія визначається як більше ніж 50 95 зниження 24-годинної екскреції білка з сечею.

Результати

У таблиці 13 представлений рівень білка в 24-годинному зборі сечі (мг/добу) для п'яти пацієнтів з ВН, що одержували ОМ5646.

ТАБЛИЦЯ 13

Рівень білка в 24-годинному зборі сечі (мг/добу) у пацієнтів з ВН, що одержували ОМ5646

Середнє

Час узяття | Пацієнт Мо 1 |Пацієнт Мо 2| Пацієнт Мо З | Пацієнт Мо 4 | Пацієнт Мо 5 значення зразка (мг/24 год.) | (мг/24 год.) | (мг/24 год.) | (мг/24 год.) | (мг/24 год.) | (пацієнти Мо 2-

Примітка: у пацієнта Мо 1 під час лікування виникло несподіване загострення системного захворювання. 5 Як показано в таблиці 13, у пацієнтів з ВН спостерігалося клінічно і статистично значиме поліпшення функції нирок протягом усього дослідження. Як показано в таблиці 13, у чотирьох з п'яти пацієнтів 3 ВН під час лікування спостерігали значиме (у середньому 69 відсотків) зниження 24-годинної екскреції білка з сечею. У п'ятого пацієнта (пацієнта Мо 1) відбулося раптове загострення системного захворювання з помітним збільшенням. Для більшості респондентів з вовчаком дози стероїдів, що ними приймалися, були знижені.

Таким чином, значне поліпшення функції нирок спостерігали у чотирьох з п'яти пацієнтів з

ВН, що одержували інгібуюче МА5БР-2 антитіло, ОМ5646. Результати лікування ОМ5646 у пацієнтів з ВН були стійкими і достовірними, що свідчить про сильний сигнал ефективності.

Ніяких суттєвих проблем, пов'язаних з безпекою, не спостерігалося. У цьому дослідженні пацієнти представляють складну для лікування групу, і передбачається, що терапевтичний ефект, спостережуваний у цих пацієнтів, є прогностичним фактором ефективності інгібуючого

МАБ5БР-2 антитіла, такого як ОМ5646, у пацієнтів з ВН, таких як пацієнти, що страждають стероїдзалежним ВН (тобто пацієнти, що одержували курс лікування стабільною дозою кортикостероїдів до початку лікування інгібуючим МА5Р-2 антитілом), включаючи пацієнтів з ризиком швидкого прогресування захворювання нирок до термінальної стадії.

Відповідно до вищевикладеного, в одному з варіантів здійснення винаходу пропонується спосіб лікування суб'єкта-людини, що страждає ВН, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого МА5Р-2 антитіла, ефективну для пригнічення МАЗР-2-залежної активації комплементу. В одному з варіантів здійснення спосіб включає введення суб'єкту- людині, що страждає ВН, кількості інгібуючого МА5Р-2 антитіла, достатньої для поліпшення функції нирок (наприклад, для ослаблення протеїнурії). В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає стероїдзалежним ВН. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5Р-2 антитіло вводять суб'єкту, що страждає стероїдзалежним ВН, у кількості, достатній для поліпшення функції нирок у зазначеного суб'єкта і/або зменшення дози кортикостероїдів.

В одному з варіантів здійснення спосіб додатково включає ідентифікацію суб'єкта-людини, що страждає стероїдзалежним ВН, до етапу введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгіібуючого МАБР-2 антитіла, ефективну для пригнічення МАБР-2-залежної активації комплементу.

Відповідно до будь-якого з розкритих у даній заявці варіантів здійснення, інгібуюче МАБР-2 антитіло проявляє щонайменше одну або більше з наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує МАБР-2 людини з Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп у домені ССР1 МАБ5Р-2, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в /л мітго аналізі 1 95 людської сироватки при ІСвоо 10 нМ або менше, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці при ІСво 30 нМ або менше, причому антитіло являє собою фрагмент антитіла, вибраний з групи, що складається з Ем, Бар, Раб", Е(аб)» і Е(аб)», причому антитіло являє собою одноланцюжкову молекулу, причому зазначене антитіло являє собою молекулу

Ід9052, причому зазначене антитіло являє собою молекулу ІДС1, причому зазначене антитіло являє собою молекулу Ідс4, де молекула Ідс4 містить мутацію 5228Р. В одному з варіантів здійснення антитіло зв'язується з МА5Р-2 і селективно пригнічує лектиновий шлях і по суті не пригнічує класичний шлях (тобто пригнічує лектиновий шлях, залишаючи при цьому класичний шлях комплементу без змін).

В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5БР-2 антитіло вводять суб'єкту, що страждає

ВН, у кількості, ефективній для поліпшення щонайменше одного або більше клінічних параметрів, пов'язаних з функцією нирок, таких як ослаблення протеїнурії (наприклад,

зменшення ЧАС і/або зниження концентрації білка в 24-годинному зборі сечі, наприклад зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею більше ніж на 20 95 або зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею більше ніж на 30 95, або зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею більше ніж на 40 95, або, наприклад, зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею більше ніж на 5095). У деяких варіантах здійснення інгібуюче МАБР-2 антитіло вводять суб'єкту, що страждає ВН, у кількості, ефективній для одержання щонайменше часткової ремісії протеїнурії (тобто більше ніж 50 95 зниження 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідним рівнем).

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення інгібуючого МАЗР-2антитіла суб'єкту, що страждає ВН (таким як стероїдзалежний ВН), через катетер (наприклад, внутрішньовенно) протягом першого періоду часу (наприклад, щонайменше одного дня на тиждень, два тижні, три тижні або чотири тижні або більше) з наступним введенням суб'єкту інгібуючого МА5БР-2 антитіла підшкірно протягом другого періоду часу (наприклад, хронічної фази тривалістю щонайменше два тижні або більше).

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення інгібуючого МАБбР-2 антитіла суб'єкту, що страждає ВН (таким як стероїдзалежний ВН), внутрішньовенно, внутрішньом'язово або підшкірно. Лікування може бути тривалим і проводитися щодня або щомісяця, але переважно щонайменше кожні два тижні або щонайменше один раз на тиждень, наприклад два рази на тиждень або три рази на тиждень.

В одному з варіантів здійснення спосіб включає лікування суб'єкта, що страждає ВН (таким як стероїдзалежний ВН), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгіібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить СОК-НІ, СОВ-Н2 ії СОБ-НЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить

СОВв-11, СОВ-І2 і СОВ-ІЇЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:70. У деяких варіантах здійснення композиція містить інгібуюче МАБР-2 антитіло, що містить (І) (а) варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить: ) СОК-НІ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з 31-35 послідовності зБЕО ІЮ МО:67; і і) СОК-Н2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з 50-65 послідовності ЗЕО ІЮ МО:67; і ії) СОК-НЗ

Зо важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з 95-107 5ЕО ІЮ МО:67, ії Б) варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить: Ї) СОК-Ї1 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з 24-34 5ЕО ІЮ МО:70; і ії) СОК-12 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з 50-56 5ЕО ІЮО МО:70; і її) СОК-І З легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з 89-97 ЗЕО ІО МО:70, або (І) його варіант, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга з щонайменше 9095 ідентичністю (наприклад, з щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 9565, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 9895, щонайменше 99 95 ідентичністю) з 5ЕО ІЮ МО:67; і варіабельну ділянку легкого ланцюга з щонайменше 90 95 ідентичністю (наприклад, з щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 93 965, щонайменше 94 96, щонайменше 95 956, щонайменше 96 956, щонайменше 97 906, щонайменше 98 956, щонайменше 99 95 ідентичністю) з БЗЕО ІЮ МО:70.

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення суб'єкту, що страждає ВН (таким як стероїдзалежний ВН), композиції, яка містить кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО:70.

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення суб'єкту, що страждає ВН (таким як стероїдзалежний ВН), композиції, яка містить інгібуюче МАБР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людському МАЗ5Р-2, розпізнаваному референсним антитілом ОМ5646, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, як зазначено в ЗЕО ІЮО МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, як зазначено в 5ЕО ІЮ МО:70.

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення суб'єкту, що страждає або має ризику розвитку ВН (такого як стероїдзалежний ВН), композиції, яка містить інгібуюче МАБР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:70, у дозі від 1 до 10 мг/кг (тобто 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 мг/кг) щонайменше один раз на тиждень (наприклад, щонайменше два рази на тиждень або щонайменше три рази на тиждень) протягом 60 періоду щонайменше 3 тижні або щонайменше 4 тижні, або щонайменше 5 тижнів, або щонайменше 6 тижнів, або щонайменше 7 тижнів, або щонайменше 8 тижнів, або щонайменше 9 тижнів, або щонайменше 10 тижнів, або щонайменше 11 тижнів, або щонайменше 12 тижнів.

ПРИКЛАД 21

У цьому прикладі описані додаткові результати, одержані в ході фази 2, що триває на даний час, клінічних досліджень по оцінці безпеки і клінічної ефективності повністю людського моноклонального інгібуючого МАБР-2 антитіла, ОМ5646, відносно зменшення протеїнурії у дорослих пацієнтів з г ломерулопатіями, включаючи ІдАМ, як описано в прикладі 19.

Методи

Як описано в прикладі 19, у фазі 2 брали участь пацієнти з ДАМ, що одержували кортикостероїди під час їх запису для участі в дослідженні; усі пацієнти одержували ОМ5646 відкритим способом, і у двох пацієнтів з ІЧАМ були одержані позитивні результати. На даний час ще два пацієнти з ІДАМ завершили етап введення доз методами, описаними в прикладі 19, і загалом вже чотири пацієнти з ІДАМ завершили дослідження.

Для включення в це дослідження пацієнти з ІДАМ повинні були мати (1) діагностовану при біопсії ІЗАМ, (2) шАСЕ »0,6 г/г, (3) есЕК 530 мл/хв./1,73 м, (4) контрольований артеріальний тиск під час лікування стабільною дозою АСЕЇ/АКВ, і (5) приймання стабільної дози стероїду преднізону 210 мг протягом не менше 12 тижнів.

Усі чотири дорослі пацієнти з ІДАМ, яких у цьому дослідженні лікували ОМ5646, мали раніше діагностовану ниркову недостатність з розрахунковою швидкістю клубочкової фільтрації (есЕмк) від 30 до 46 мл/мг/1,73 м: і 24-годинним рівнем білка від 2,44 до 4,87 г/24 години. До початку дослідження всі пацієнти одержували стабільну блокаду ренін-ангіотензинової системи (РАС) і щонайменше 3-місячне лікування кортикостероїдами.

Усі пацієнти одержували ОМ5646 ІМ один раз на тиждень протягом 12 тижнів. Пацієнти проходили чотиритижневий вступний період, після чого проводилося лікування ОМ5646, яке включало чотири тижні приймання стабільної дози стероїдів, чотири тижні зменшення дози стероїдів, що приймаються, по можливості, і чотири тижні приймання зменшеної дози стероїдів.

Після лікування ОМ5646 пацієнтів спостерігали протягом ще б тижнів, що входять у дослідження. Після завершення дослідження, дослідник продовжував спостереження пацієнтів.

Для оцінки ефективності в дослідженні вимірювали наступні параметри: (1) співвідношення

Зо альбумін/креатинін у сечі (ЧАСЕК), вимірюване 6 разів до лікування (вихідний рівень) і З рази при кожній оцінці ефективності під час лікування і спостереження; і (2) рівень білка в 24-годинному зборі сечі, вимірюваний один раз до лікування ОМ5646 і один раз через 2-4 тижні після завершення лікування ОМ5646. Згідно з протоколом, дозу кортикостероїдів зменшували між 4 і 8 тижнями, якщо це було клінічно доцільно.

Результати

Чотири пацієнти з (ДАМ пройшли б-тижневий період спостереження після лікування. У таблиці 14 представлені демографічні і вихідні характеристики цих пацієнтів.

ТАБЛИЦЯ 14

Демографія і вихідні характеристики 11111111 | Пацієнт! | Пацієнт2 | Пацієнтт3 | Пацієнт4 поси зони | ще | вище | гою . 8 років 5 місяців 5 місяців 2 роки діагнозу есЕВ мм рт. ст. есЕВ - розрахункова швидкість клубочкової фільтрації; З5А - стандартна площа поверхні (1,73 ме); ШАСВ - відношення альбумін/креатинін у сечі.

У всіх пацієнтів спостерігали помітне зменшення протеїнурії під час лікування ОМ5646.

Статистично і клінічно значимі поліпшення проявлялися як у величині ЧАСск, так і в 24-годинних рівнях білка, як показано на фіг. 41 і 42.

На фіг. 41 показаний графік залежності величини ЧАСскК (мг/г) від часу для чотирьох ІДАМ- пацієнтів, що одержували ОМ5646, від початкового моменту до дня 120. Як показано на фіг. 41, від початкового моменту до кінця дослідження середнє значення цАСК зменшилося на 1,13 г/гл-0,27 (зниження на 77 95, р-0,026). Як додатково показано на фіг. 41, на момент останнього відвідування в період спостереження після лікування ОМ5646 величина ПАСК у кожного пацієнта знизилася на 94, 86, 47 і 89 95 (пацієнти 1-4, відповідно) відносно вихідного рівня.

На фіг. 42 графічно показана зміна рівня білка в 24-годинному зборі сечі після лікування відносно вихідного рівня на день 1 до лікування у чотирьох пацієнтів з ІДАМ, що одержували

ОМ5646. Як показано на фіг. 42, рівень білка в 24-годинному зборі сечі зменшився на 54, 81, 63 і 95 95 (пацієнти 1-4, відповідно) відносно вихідного рівня.

На фіг. 43 графічно показана середня зміна рівня білка в 24-годинному зборі сечі після лікування відносно вихідного рівня до лікування для чотирьох пацієнтів з ІЗАМ, що одержували

ОМ5646. Як показано на фіг. 43, середній рівень білка в 24-годинному зборі сечі зменшився на 2,87--1,08 г/добу (зниження на 73 95; р-0,013).

Усі пацієнти могли припинити приймання кортикостероїдів під час або незабаром після дослідження, що є свідченням того, що вплив ОМ5646 на протеїнурію навряд чи пов'язаний з кортикостероїдами. Розрахункові швидкості клубочкової фільтрації (ес) (розраховані за формулою модифікації дієти при захворюваннях нирок) були стабільними протягом усього періоду лікування і наступного періоду спостереження.

ОМ5646 добре переносився всіма пацієнтами.

Таким чином, у фазі 2 цього відкритого клінічного дослідження значне і стійке зниження

АСК спостерігалося у всіх пацієнтів з ІЯАМ, що одержували ОМ5646 протягом 12 тижнів. 24- годинна протеїнурія була значно зменшена у всіх пацієнтів. Спостережуваний ступінь зменшення протеїнурії був пов'язаний з суттєвими поліпшеннями прогнозів захворювання нирок і клінічних результатів (ІпКег Г.А. еї аї., Ат. 9. Кідпеу Оів. 68(3):392-401 (2016)). Результати, що демонструють сильне зменшення протеїнурії, які дозволяють відмовитися від стероїдів після лікування ОМ5646, моноклональним анти-МА5Р-2 антитілом, яке пригнічує дію лектинового шляху комплементу, підтверджують можливість використання ОМ5646 як терапевтичного

Зо засобу для поліпшення результатів лікування ІдА-гломерулопатії. Ефекти ОМ5646 у пацієнтів з

ІДАМ є стійкими і достовірними, свідчачи про його ефективність у цій популяції.

ПРИКЛАД 22

Збереження ремісії після завершення лікування ОМ5646 у пацієнтів з ІдА-нефропатією (ЧАМ)

Передумови

Згідно з прикладами 19 і 21, у фазі 2 досліджень пацієнтів з ІДАМ чотирьох пацієнтів з ІЧАМ лікували ОМ5646, повністю людським моноклональним антитілом, яке інгібує активність МАБР- 2. Як описано в прикладах 19 і 21, усі пацієнти одержували ОМ5646 ІМ один раз на тиждень протягом 12 тижнів. Згідно з прикладом 21, після лікування ОМ5646 досліджувані пацієнти знаходилися під спостереженням ще 6 тижнів, і у всіх пацієнтів з ІЯАМ, що приймали ОМ5646, спостерігалася часткова ремісія (визначувана як зниження більше ніж на 50 95 в 24-годинній екскреції білка з сечею і/або фінальна екскреція білка менше 1000 мг/добу). Як описано в цьому прикладі, після завершення дослідження ці чотири пацієнти знаходилися під спостереженням для оцінки тривалості ремісії після лікування ОМ5646.

Методи

Після завершення фази 2 клінічних досліджень, описаних у прикладі 21, дослідник спостерігав стан 4 пацієнтів з ІДАМ, що одержували ОМ5646. Кінцевими точками в дослідженні були чАСЕ і 24-годинна протеїнурія. Як описано в прикладі 21, наприкінці дослідження у всіх чотирьох пацієнтів з ДАМ спостерігали часткову ремісію. При наступному спостереженні вимірювали відношення білка до креатиніну в сечі (иРСК). Кожне значення иРСЕ було перетворене в ЧАСК (відношення альбумін/креатинін у сечі) шляхом множення на 0,64 (див. пао еї аї., Сііп. )У. Ат. ос. Мерпгої. 11:947-55, 2016).

Результати

У всіх пацієнтів спостерігали часткову ремісію після лікування ОМ5646. Середній вік трьох жінок і одного чоловіка становив 42 роки; троє з них були європейцями, а один - азіатом.

Середнє значення есЕР склало 41 мл/хв./1,73 м7, а середня доза стероїдів, що вводиться, становила 55 мг. Період спостереження після введення останньої дози ОМ5646 становив від 2 до 10 місяців. Як описано в прикладі 21, під час дослідження середнє значення чЧАсСК зменшилося на 77 95 (р-0,026). Під час спостереження у трьох пацієнтів зберігалася часткова 60 ремісія (зниження ЧАСК на 54, 93 і 78 95 через 12, 12 і 5 місяців, відповідно). У одного пацієнта значення ЧАСК склало 88 95 від вихідного рівня через 7 місяців. Під час спостереження у трьох пацієнтів також спостерігалося поліпшення есЕК на 7, 13 і 7 мл/хв./1,73 ме. есмК у четвертого пацієнта була стабільною. Усі пацієнти припинили приймання стероїдів. ОМ5646 добре переносився.

Таким чином, як описано в прикладі 21, протеїнурія значно зменшилася у пацієнтів з ІЗАМ протягом 12-тижневого лікування ОМ5646 і б-тижневого періоду спостереження після лікування, що входив у дослідження. Це зменшення протеїнурії зберігалося до 10 місяців після завершення лікування. Ці дані підтверджують застосування ОМ5646 як терапевтичного засобу для поліпшення результатів ІдЧА-гломерулопатії.

В оновленій інформації, одержаній від дослідника про стан чотирьох описаних у цьому прикладі пацієнтів через приблизно один рік спостереження після одного 12-тижневого курсу лікування ОМ5646, повідомлялося про те, що у трьох з чотирьох пацієнтів зберігалося зменшення протеїнурії. У цих трьох пацієнтів ЦАСК залишалися зниженими на 14, 23 і 24 95 відносно вихідних значень, які були у пацієнтів до лікування ОМ5646. Крім того, поліпшення в розрахунковій швидкості клубочкової фільтрації (ес), яка є мірою функції нирок, після дослідження спостерігалося у 3 з 4 пацієнтів. У пацієнта з найбільш вираженим зниженням функції нирок спостерігали поліпшення ес з 30 мл/хв.11,73 м? до 47 мл/хв./1,73 м", тобто поліпшення склало 57 95.

Таким чином, стійке зменшення протеїнурії після завершення одного курсу лікування

ОМ5646 залишалося вражаючим протягом одного року спостереження. Поліпшення, спостережуване в значенні есЕК, виявилося несподіваним, особливо через рік спостереження, оскільки передбачалося, що для цього буде потрібний більш тривалий період часу. Як описано вище, у двох з чотирьох пацієнтів спостерігали незначне підвищення есЕК, а відповідь у одного з пацієнтів була вражаючою - поліпшення на 5095. Поліпшення, спостережувані в есгк, указують на те, що додатковий сприятливий вплив, здійснюваний ОМ5646 на пацієнтів, полягає в потенційному виключенні або суттєвому відстроченні необхідності діалізу, а також у зниженні ризику ускладнень, пов'язаних з прогресуванням хронічного захворювання нирок.

Відповідно до вищевикладеного, в одному з варіантів здійснення винахід стосується способу зменшення протеїнурії у суб'єкта-людини, що страждає ІДАМ, який включає введення суб'єкту

Зо інгібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить СОК-НІ, СОВ-Н2 ії СОБ-НЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить

СОВв-11, СОВ-І2 і СОВ-І З амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:70, згідно з наступними схемами дозування: с) введення приблизно 4 мг/кг (тобто від 3,6 до 4,4 мг/кг) зазначеного антитіла суб'єкту, що страждає ІДАМ, внутрішньовенно раз на тиждень протягом періоду лікування, що становить щонайменше 12 тижнів; або а) введення від приблизно 180 мг до приблизно 725 мг (тобто від 162 до 797 мг) зазначеного антитіла суб'єкту, що страждає ІДАМ, внутрішньовенно раз на тиждень протягом періоду лікування, що становить щонайменше 12 тижнів, при цьому спосіб зменшує протеїнурію у зазначеного суб'єкта-людини.

В одному з варіантів здійснення доза інгібуючого МАБР-2 антитіла становить приблизно 4 мг/кг (тобто від 3,6 до 4,4 мг/кг), наприклад приблизно 3,6 мг/кг, приблизно 3,7 мг/кг, приблизно 3,8 мг/кг, приблизно 3,9 мг/кг, приблизно 4,0 мг/кг, приблизно 4,1 мг/кг, приблизно 4,2 мг/кг, приблизно 4,3 мг/кг або приблизно 4,4 мг/кг.

В одному з варіантів здійснення доза інгібуючого МА5Р-2 антитіла являє собою фіксовану дозу від приблизно 180 мг до приблизно 725 мг (тобто від 160 до 800 мг або від приблизно 300 до 500 мг, наприклад від приблизно 300 мг до приблизно 400 мг), наприклад приблизно 160 мг, приблизно 165 мг, приблизно 170 мг, приблизно 175 мг, приблизно 180 мг, приблизно 185 мг,

БО приблизно 190 мг, приблизно 195 мг, приблизно 200 мг, приблизно 205 мг, приблизно 210 мг, приблизно 215 мг, приблизно 220 мг, приблизно 225 мг, приблизно 230 мг, приблизно 240 мг, приблизно 245 мг, приблизно 250 мг, приблизно 255 мг, приблизно 260 мг, приблизно 265 мг, приблизно 270 мг, приблизно 275 мг, приблизно 280 мг, приблизно 285 мг, приблизно 290 мг, приблизно 295 мг, приблизно 300 мг, приблизно 305 мг, приблизно 310 мг, приблизно 315 мг, приблизно 320 мг, приблизно 325 мг, приблизно 330 мг, приблизно 335 мг, приблизно 340 мг, приблизно 345 мг, приблизно 350 мг, приблизно 355 мг, приблизно 360 мг, приблизно 365 мг, приблизно 370 мг, приблизно 375 мг, приблизно 380 мг, приблизно 385 мг, приблизно 390 мг, приблизно 395 мг, приблизно 400 мг, приблизно 405 мг, приблизно 410 мг, приблизно 415 мг, приблизно 420 мг, приблизно 425 мг, приблизно 430 мг, приблизно 435 мг, приблизно 440 мг, 60 приблизно 445 мг, приблизно 450 мг, приблизно 455 мг, приблизно 460 мг, приблизно 465 мг,

приблизно 470 мг, приблизно 475 мг, приблизно 480 мг, приблизно 485 мг, приблизно 490 мг, приблизно 495 мг, приблизно 500 мг, приблизно 505 мг, приблизно 510 мг, приблизно 515 мг, приблизно 520 мг, приблизно 525 мг, приблизно 530 мг, приблизно 535 мг, приблизно 540 мг, приблизно 545 мг, приблизно 550 мг, приблизно 555 мг, приблизно 560 мг, приблизно 565 мг, приблизно 570 мг, приблизно 575 мг, приблизно 580 мг, приблизно 585 мг, приблизно 590 мг, приблизно 595 мг, приблизно 600 мг, приблизно 605 мг, приблизно 610 мг, приблизно 615 мг, приблизно 620 мг, приблизно 625 мг, приблизно 630 мг, приблизно 635 мг, приблизно 640 мг, приблизно 645 мг, приблизно 650 мг, приблизно 655 мг, приблизно 660 мг, приблизно 665 мг, приблизно 670 мг, приблизно 675 мг, приблизно 680 мг, приблизно 685 мг, приблизно 690 мг, приблизно 695 мг, приблизно 700 мг, приблизно 705 мг, приблизно 710 мг, приблизно 715 мг, приблизно 720 мг, приблизно 725 мг, приблизно 730 мг, приблизно 735 мг, приблизно 740 мг, приблизно 745 мг, приблизно 750 мг, приблизно 755 мг, приблизно 760 мг, приблизно 765 мг, приблизно 770 мг, приблизно 775 мг, приблизно 780 мг, приблизно 785 мг, приблизно 790 мг, приблизно 795 мг або приблизно 800 мг.

В одному з варіантів здійснення період лікування становить 12 тижнів.

В одному з варіантів здійснення за періодом лікування іде перерва (тобто період без введення інгібітору МА5Р-2), що становить щонайменше 2 місяці, або перерва, що становить щонайменше З місяці, або перерва, що становить щонайменше 4 місяці, або перерва, що становить щонайменше 5 місяців, або перерва, що становить щонайменше б місяців або довше, така як перерва, що становить щонайменше 7 місяців, або перерва, що становить щонайменше 8 місяців, або перерва, що становить щонайменше 9 місяців, або перерва, що становить щонайменше 10 місяців, або перерва, що становить щонайменше 11 місяців, або перерва, що становить щонайменше 12 місяців або довше.

У деяких варіантах здійснення спосіб додатково включає періодичний моніторинг рівнів білка в сечі у суб'єкта під час періоду лікування і/або перерви і, необов'язково, поновлення лікування інгібуючим МА5бР-2 антитілом після виявлення рецидиву протеїнурії.

У деяких варіантах здійснення спосіб ефективний для зменшення протеїнурії у суб'єкта, що страждає (ДАМ, щонайменше на 30 95, наприклад щонайменше на 40 956 або щонайменше на 5095 або більше ніж на 5095, від вихідного рівня (до лікування), згідно з результатами

Зо наприкінці періоду лікування і/або наприкінці перерви.

У деяких варіантах здійснення спосіб ефективний для збільшення розрахункової швидкості клубочкової фільтрації (ес) у суб'єкта, що страждає ІДАМ.

У деяких варіантах здійснення у суб'єкта, що страждає ІДАМ, протеїнурія становить більше 1 г білка/24-годинна екскреція білка з сечею до лікування, і спосіб ефективний для зменшення протеїнурії у суб'єкта щонайменше на 30 95, наприклад щонайменше на 40 95 або щонайменше на 50 95, або більше ніж на 50 95, від вихідного рівня (до лікування), згідно з результатами наприкінці періоду лікування і/або наприкінці перерви, і/або для зменшення протеїнурії до рівня менше 1 г білка/24-годинна екскреція білка з сечею, згідно з результатами наприкінці періоду лікування і/або наприкінці перерви.

У деяких варіантах здійснення суб'єкт, що страждає ІДАМ, має протеїнурію, що перевищує 1 г білка/24-годинна екскреція білка з сечею, незважаючи на максимальні переносимі дози антигіпертензивних засобів і добре контрольований артеріальний тиск до лікування, і спосіб ефективний для зменшення протеїнурії у суб'єкта щонайменше на 3095, наприклад щонайменше на 40 95 або щонайменше на 50 95, або більше ніж на 50 95, від вихідного рівня (до лікування), визначеного наприкінці періоду лікування і/або наприкінці перерви, і/або для зменшення протеїнурії до менше ніж 1 г білка/24-годинна екскреція білка з сечею, визначеного наприкінці періоду лікування і/або наприкінці перерви.

У деяких варіантах суб'єкт, що страждає ІДдАМ, не лікувався стероїдами протягом щонайменше одного року. У деяких варіантах здійснення суб'єкт, що страждає ІДАМ, одержує лікування стероїдами протягом щонайменше частини 12-тижневого періоду лікування ОМ5646.

У деяких варіантах суб'єк, що страждає ІДАМ, одержує лікування стероїдами протягом щонайменше частини 12-тижневого періоду лікування ОМ5646, і спосіб ефективний для зменшення протеїнурії і зменшення або усунення необхідності лікування стероїдами до кінця періоду лікування і/або до кінця перерви.

Інші варіанти здійснення

Усі публікації, патентні заявки і патенти, згадані в цьому описі, включені в даний опис у вигляді посилання.

Різні модифікації і варіанти описаних способів і композицій за винаходом будуть очевидні фахівцям у даній галузі техніки без відхилення від обсягу і суті винаходу. Хоча винахід описаний 60 відносно конкретних переважних варіантів здійснення, слід розуміти, що заявлений винахід жодним чином не повинен бути обмежений такими конкретними варіантами здійснення.

Відповідно до вищевикладеного винахід пропонує наступні варіанти здійснення. 1А. Спосіб лікування, пригнічення, полегшення або профілактики фіброзу у ссавця, що страждає або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту кількості інгібуючого МАЗР-2 агента, ефективної для пригнічення фіброзу. 2А. Спосіб згідно з параграфом ТА, де інгібуючий МАБР-2 агент являє собою МА5БР-2 антитіло або його фрагмент.

ЗА. Спосіб згідно з параграфом 2А, де інгібуючий МА5Р-2 агент являє собою моноклональне

МА5БР-2 антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною ЗЕО ІЮ МО:6. 4А. Спосіб згідно з параграфом 2А, де МАБР-2 антитіло або його фрагмент специфічно зв'язується з поліпептидом, що містить 5ЕО ІЮ МО:6, зі спорідненістю, що в 10 разів перевищує спорідненість зв'язування з іншим антигеном у системі комплементу.

БА. Спосіб згідно з параграфом 2А, де антитіло або його фрагмент вибирають з групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла зі зниженою ефекторною функцією, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і людського антитіла. бА. Спосіб згідно з параграфом ТА, де інгібуючий МА5БР-2 агент селективно пригнічує активацію лектинового шляху комплементу без суттєвого пригнічення С1д-залежної активації комплементу.

ТА. Спосіб згідно з параграфом ТА, де інгібуючий МАБР-2 агент вводять підшкірно, інтраперитонеально, внутрішньом'язово, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно або шляхом інгаляції. 8А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1А-7А, де захворювання або розлад, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, асоційований з ішемічним реперфузійним ушкодженням. 9А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1А-7А, де захворювання або розлад, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, не є асоційованим з ішемічним реперфузійним ушкодженням. 10А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1А-7А, де до введення інгібуючого МА5Р-2

Зо агента суб'єкт страждав протеїнурією, і введення інгібуючого МАБР-2 агента зменшує протеїнурію у суб'єкта. 11А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів ТА-7А, де суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням нирок. 12А. Спосіб згідно з параграфом 11А, де інгібуючий МА5БР-2 агент вводять у кількості, ефективній для пригнічення тубулоінтерстиціального фіброзу. 13А. Спосіб згідно з параграфом 11А, де інгібуючий МА5Р-2 агент вводять у кількості, ефективній для зменшення, затримання або усунення необхідності в діалізі у суб'єкта. 14А. Спосіб згідно з параграфом 114А, де захворювання або розлад вибирають з групи, що складається з хронічного захворювання нирок, хронічної ниркової недостатності, гломерулярного захворювання (наприклад, фокального сегментарного гломерулосклерозу), імунного комплексного розладу (наприклад, ІдА-нефарпатії, мембранозної нефропатії), вовчакового нефриту, нефротичного синдрому, діабетичної нефропатії, тубулоінтерстиціального ураження і гломерулонефриту (наприклад, СЗ-гломерулопатії). 15А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів ТА-7А, де суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням легенів. 16А. Спосіб згідно з параграфом 15А, де захворювання або розлад вибирають з групи, що складається з хронічної обструктивної хвороби легенів, кістозного фіброзу, фіброзу легенів, асоційованого зі склеродермією, бронхоектазу і легеневої гіпертензії. 17А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів ТА-7А, де суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням печінки. 18А. Спосіб згідно з параграфом 17А, де захворювання або розлад вибирають з групи, що складається з: цирозу, неалкогольної жирової хвороби печінки (стеатогепатиту), фіброзу печінки, вторинного відносно зловживання алкоголем, фіброзу печінки, вторинного відносно гострого або хронічного гепатиту, біліарного захворювання і токсичного ураження печінки (наприклад, індукованої ліками гепатотоксичності, викликаної ацетамінофеном або іншим лікарським засобом, таким як нефротоксин). 19А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів ТА-7А, де суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням серця. 20А. Спосіб згідно з параграфом 19А, де захворювання або розлад вибирають з групи, що 60 складається з серцевого фіброзу, інфаркту міокарда, фіброзу клапана, фіброзу передсердя,

фіброзу ендоміокарда, аритмічної кардіоміопатії правого шлуночка (АКІПШ). 21А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів ТА-7А, де суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим судинним фіброзом. 22А. Спосіб згідно з параграфом 21А, де захворювання або розлад вибирають з групи, що складається з судинного захворювання, атеросклеротичного судинного захворювання, стенозу судин, рестенозу, васкуліту, флебіту, тромбозу глибоких вен і аневризми черевної аорти. 23А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів ТА-7А, де суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом шкіри. 24А. Спосіб згідно з параграфом 23А, де захворювання або розлад вибирають з групи, що складається з надмірного загоєння ран, склеродермії, системного склерозу, келоїдів, захворювань сполучної тканини, рубцювання і гіпертрофічних рубців. 25А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів ТА-7А, де суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом суглобів. 26А. Спосіб згідно з параграфом 25А, де захворювання або розлад являє собою артрофіброз. 27А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів ТА-7А, де суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом центральної нервової системи. 28. Спосіб згідно з параграфом 27А, де захворювання або розлад вибирають з групи, що складається з інсульту, травматичного ушкодження головного мозку і ушкодження спинного мозку. 29А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів ТА-7А, де суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом травної системи.

ЗОА. Спосіб згідно з параграфом 29А, де захворювання або розлад вибирають з групи, що складається з хвороби Крона, фіброзу підшлункової залози і виразкового коліту.

З1А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1А-7А, де суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим очним фіброзом.

З32А. Спосіб згідно з параграфом З1А, де захворювання або розлад вибирають з групи, що складається з передньої субкапсулярної катаракти, помутніння задньої капсули, дегенерації жовтої плями і ретинальної і вітреальної ретинопатії.

Зо ЗЗА. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1А-7А, де суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом кістки або структури м'яких тканин кістково- м'язової системи. 34А. Спосіб згідно з параграфом ЗЗА, де захворювання або розлад вибирають з групи, що складається з остеопорозу і/або остеопенії, пов'язаної з кістозним фіброзом, мієлодиспластичних станів зі збільшенням кісткового фіброзу, клітинного капсуліту, контрактури

Дюпюїтрена і мієлофіброзу.

З5А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1А-7А, де суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом репродуктивних органів.

ЗбА. Спосіб згідно з параграфом З35А, де захворювання або розлад вибирають з групи, що складається з ендометріозу і хвороби Пейроні.

З7А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів ТА-7А, де суб'єкт страждає хронічним інфекційним захворюванням, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням.

З8А. Спосіб згідно з параграфом 37А, де інфекційне захворювання вибирають з групи, що складається з альфа-вірусу, гепатиту А, гепатиту В, гепатиту С, туберкульозу, ВІЛ і грипу.

З9А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів ТА-7А, де суб'єкт страждає аутоїмунним захворюванням, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням. 40А. Спосіб згідно з параграфом З9А, де аутоїмунне захворювання вибирають з групи, що складається зі склеродермії і системного червоного вовчака (СЧВ).

А1А. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1А-7А, де суб'єкт страждає рубцюванням, пов'язаним з травмою. 42А. Спосіб згідно з параграфом 41А, де рубцювання, пов'язане з травмою, вибирають з групи, що складається з: хірургічних ускладнень (наприклад, хірургічних спайок, у яких рубцева тканина може утворюватися між внутрішніми органами, викликаючи контрактуру, біль, і може приводити до безплідності), індукованого хіміотерапевтичними засобами фіброзу, індукованого радіацією фіброзу і рубцювання, пов'язаного з опіками. 4ЗА. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1А-7А, у якому захворювання або розлад, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають з групи, що складається з трансплантації органів, фіброзу молочної залози, м'язового фіброзу, ретроперитонеального фіброзу, фіброзу щитовидної залози, фіброзу лімфатичних вузлів, фіброзу сечового міхура і 60 плеврального фіброзу.

18. Спосіб профілактики або зменшення ураження нирок у суб'єкта, що страждає захворюванням або станом, асоційованим з протеїнурією, який включає введення кількості інгібуючого МА5Р-2 агента, ефективної для зменшення або профілактики протеїнурії у суб'єкта. 28. Спосіб згідно з параграфом 1В, де інгібуючий МАБЗР-2 агент являє собою інгібуюче

МА5Р-2 антитіло або його фрагмент.

ЗВ. Спосіб згідно з параграфом 18 або 28, де інгібуючий МА5Р-2 агент вводять у кількості і протягом періоду часу, які є ефективними для досягнення щонайменше 20 95 зменшення 24- годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта перед лікуванням. 4В. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 18-3В, де захворювання або стан, асоційований з протеїнурією, вибирають з групи, що складається з нефротичного синдрому, прееклампФсії, екслампсії, токсичного ураження нирок, амілоїдозу, судинно-колагенозних захворювань (наприклад, системного червоного вовчака), вовчакового нефриту, зневоднювання, гломерулярних захворювань (наприклад, мембранозного гломерулонефриту, фокального сегментарного гломерулонефриту, СЗ-гломерулопатії, хвороби мінімальних змін, ліпоїдного нефрозу), інтенсивного фізичного навантаження, стресу, доброякісної ортостатичної (постуральної) протеїнурії, фокального сегментарного гломерулосклерозу, ІдА-нефропатії (наприклад, хвороби Бергера), ІчЧМ-нефропатії, мембранопроліферативного гломерулонефриту, мембранозної нефропатії, хвороби мінімальних змін, саркоїдозу, синдрому Альпорта, цукрового діабету (діабетичної нефропатії), індукованої ліками токсичності (наприклад, індукованої НПЗП, нікотином, пеніциламіном, карбонатом літію, золотом і іншими важкими металами, інгібіторами

АПФ, антибіотиками (наприклад, адріаміцином) або опіатами (наприклад, героїном) або іншими нефротоксинами); хвороби Фабрі, інфекцій (наприклад, ВІЛ, сифілісу, гепатиту А, В або С, постстрептококової інфекції, сечового шистосомозу); аміноацидурії, синдрому Фанконі, гіпертонічного нефросклерозу, інтерстиціального нефриту, серпоподібноклітинної хвороби, гемоглобінурії, множинної мієломи, міоглобінурії, відторгнення органів (наприклад, відторгнення трансплантата нирки), геморагічної пропасниці Ебола, синдрому нігтьової патели, сімейної пропасниці, синдрому НЕГІГР, системного червоного вовчака, гранулематозу Вегенера, ревматоїдного артриту, хвороби накопичення глікогену типу 1, синдрому Гудпасчера, пурпури

Зо Шенлейна-Геноха, інфекції сечових шляхів, що поширилася на нирки, синдрому Шегрена і постінфекційного гломерулонефриту. 5В. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 18-3В, де захворювання або стан, асоційований з протеїнурією, являє собою ІдА-нефропатію (тобто хворобу Бергера). 68. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 18-3В, де захворювання або стан, асоційований з протеїнурією, являє собою мембранозну нефропатію. 7В. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 18-3В, де захворювання або стан, асоційований з протеїнурією, являє собою вовчаковий нефрит. 10. Спосіб пригнічення прогресування хронічного захворювання нирок, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, кількості інгібуючого МАБР-2 агента, ефективної для зменшення або профілактики тубулоінтерстиціального фіброзу нирок. 26. Спосіб згідно з параграфом 1С, де інгібуючий МА5БР-2 агент являє собою інгібуюче

МА5Р-2 антитіло або його фрагмент.

ЗС. Спосіб згідно з параграфом 1С, де суб'єкт, що цього потребує, має протеїнурію до введення інгібуючого МАБР-2 агента, і введення інгібуючого МАБР-2 агента зменшує протеїнурію у суб'єкта так, що у суб'єкта є щонайменше 20 95 зниження 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у зазначеного суб'єкта до початку лікування. 4С. Спосіб згідно з параграфом 1С, де інгібуючий МАБР-2 агент вводять у кількості, ефективній для зменшення, затримання або усунення необхідності в діалізі у суб'єкта. 10. Спосіб захисту нирок від ураження нирок у суб'єкта, що одержував, одержує або буде одержувати лікування одним або більше нефротоксичними агентами, який включає введення кількості інгібуючого МА5Р-2 агента, ефективної для профілактики або полегшення індукованої ліками нефропатії. 20. Спосіб згідно з параграфом 10, де інгібуючий МА5БР-2 агент являє собою інгібуюче

МА5Р-2 антитіло або його фрагмент. 30. Спосіб згідно з параграфом 1сС, де інгібуючий МА5Р-2 агент вводять перед введенням зазначеного нефротоксичного агента. 40. Спосіб згідно з параграфом 1С, у якому інгібуючий МА5Р-2 агент вводять разом з зазначеним нефротоксичним агентом. 60 50. Спосіб згідно з параграфом 1сС, де інгібуючий МАБ5бР-2 агент вводять після зазначеного нефротоксичного агента для лікування нефротоксичності. 1Е. Спосіб лікування людини, що страждає імуноглобін А-нефропатією (ІДАМ), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для пригнічення МАБР-2-залежної активації комплементу. 2ЕБ. Спосіб згідно з параграфом 1Е, де суб'єкт страждає стероїдзалежною ІдАМ.

ЗЕ. Спосіб згідно з параграфом 1Е або 2Е, де інгібуюче МА5бР-2 антитіло являє собою моноклональне антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з людським МА5Р-2. 4Е. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1Е-ЗЕ, де антитіло або його фрагмент вибирають з групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла зі зниженою ефекторною функцією, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і антитіла людини.

БЕ. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1Е-4Е, де інгібуюче МА5Р-2 антитіло по суті не пригнічує класичний шлях. 6Е. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1Е-5Е, де інгібуюче МАБ5Р-2 антитіло пригнічує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці з ІСво 30 нМ або менше.

ТЕ. Спосіб згідно з параграфом 2Е, який додатково включає ідентифікацію людини, що має стероїдзалежну (ДАМ, до етапу введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого

МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для поліпшення функції нирок. 8Е. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1Е-7Е, де інгібуюче МА5Р-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості, ефективній для поліпшення функції нирок.

ОЕ. Спосіб згідно з параграфом 8Е, де інгібуюче МАБР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості і протягом періоду часу, які є ефективними для досягнення щонайменше 20 95 зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування. 10. Спосіб згідно з параграфом ТЕ, де композицію вводять у кількості, достатній для поліпшення функції нирок і зменшення дози кортикостероїдів у зазначеного суб'єкта. 11Є. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1Е-10Е, де інгібуюче МА5БР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить СОВБ-

Зо НІ, СОВ-Н2 їі СОК-НЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить СОК-І1, СОВ-І2 ії СОВ-ІЇ З амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:70. 1Р. Спосіб лікування людини, що страждає мембранозною нефропатією (МН), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для пригнічення МАБР-2-залежної активації комплементу. 2. Спосіб згідно з параграфом 1, де суб'єкт страждає стероїдзалежною МН.

ЗЕ. Спосіб згідно з параграфом 1Е або 2РЕ, де інгібуюче МА5БР-2 антитіло являє собою моноклональне антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з МАБР-2 людини. 4Р. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1Е-ЗЕ, де антитіло або його фрагмент вибирають з групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла зі зниженою ефекторною функцією, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і антитіла людини.

БЕ. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1Р-4Е, де інгібуюче МА5Р-2 антитіло по суті не пригнічує класичний шлях. 6Р. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1БЕ-5Е, де інгібуюче МА5Р-2 антитіло пригнічує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці з ІСво 30 нМ або менше.

ТЕ. Спосіб згідно з параграфом МР, де спосіб додатково включає ідентифікацію суб'єкта- людини, що має стероїдзалежну МН, до етапу введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для поліпшення функції нирок. 8. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1Е-7Е, де інгібуюче МА5Р-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості, ефективній для поліпшення функції нирок.

ОР. Спосіб згідно з параграфом 8Е, де інгібуюче МАБР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості і протягом періоду часу, які є ефективними для досягнення щонайменше 20 95 зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування.

ТОР. Спосіб згідно з параграфом 1Е або 2Е, де композицію вводять у кількості, достатній для поліпшення функції нирок і зменшення дози кортикостероїдів у зазначеного суб'єкта. 117. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 1Е-10Е, де інгібуюче МА5Р-2 антитіло або його бо антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить СОК-

НІ, СОВ-Н2 їі СОК-НЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить СОК-І1, СОВ-І2 ії СОВ-ІЇ З амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:70. 16. Спосіб лікування суб'єкта-людини, що страждає вовчаковим нефритом (ВН), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого МА5Р-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для пригнічення МА5Р-2-залежної активації комплементу. 26. Спосіб згідно з параграфом 1с, де суб'єкт страждає стероїдзалежним ВН.

Зб. Спосіб згідно з параграфом 10 або 20, де інгібуюче МА5Р-2 антитіло являє собою моноклональне антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з МАБР-2 людини. 406. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 105-305, де антитіло або його фрагмент вибирають з групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла зі зниженою ефекторною функцією, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і антитіла людини. 50. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 105-405, де інгібуюче МА5Р-2антитіло по суті не пригнічує класичний шлях. 66. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 10-56, де інгібуюче МАБ5бР-2 антитіло пригнічує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці з ІСво 30 нМ або менше. 76. Спосіб згідно з параграфом 10, де спосіб додатково включає ідентифікацію суб'єкта- людини, що має стероїдзалежний ВН, до етапу введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для поліпшення функції нирок. 80. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 10-70, де інгібуюче МА5Р-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості, ефективній для поліпшення функції нирок. 90. Спосіб згідно з параграфом 8Сб, де інгібуюче МАБР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості і протягом періоду часу, які є ефективними для досягнення щонайменше 20 95 зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування. 1020. Спосіб згідно з параграфом 10 або 20, де композицію вводять у кількості, достатній для поліпшення функції нирок і зменшення дози кортикостероїдів у зазначеного суб'єкта.

Зо 116. Спосіб згідно з будь-яким з параграфів 105-100, де інгібуюче МА5Р-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить СОК-

НІ, СОВ-Н2 ї СОК-НЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить СОК-І1, СОВ-І2 ії СОВ-ІЇ З амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:70.

Хоча продемонстровані і описані ілюстративні варіанти здійснення, буде зрозуміло, що можуть бути внесені різні зміни без відхилення від суті і обсягу винаходу.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 Отего5 Согрогаєкіоп

Опімегзіїу ої Геісе5тег

ВгопоКі11, Міреї!

Ретори1о5, бгерогу А. ридІес, Тот 5спмаебТІе, Нап5-МіТпе1т «120» Способи зменшення протеїнурії у людини, що страдає від імуноглобулін А-нефропатії «1305 МР.1.0269. РОСТ «1505 62/527,926 «1515 2017-86-30 «1505 15/470,647 «1515 2017-03-27 «1505 15/399,524 «1515 2017-01-85 бо

«15905 62/407,979 «1515 2016-18-13 «1605 85 «170» РасепсІп мегзіоп 3.5 «2105 1 «2115 725 «2125 ДНК «2135 Ното зарієп5 «220» «221» Кодуюча послідовність «222» (27)..(584) «4005 1 вБессаввсса встврРасере сасасс асв аврв ств ств асс стс ств ввс ст 53

Ме Аг» Гей Ге Тиг Ге Ге о1у Геи 1 5

СТВ ТТ вес св вв всс асс о ссс тв ввсС ссв аав ївБ ССТ ваа сс 1801

Ге Суз с1у 5ег Маї А1їа Тиг Рго Гец (Ту Рго Гуз Тер Рго со1и Рго 189 15 20 25

ВЕБ ЕКС ВБР сСвсС ств вса сс ссс вБС ТТ сса веб вав тає всс ааєй 149

Мма1! Рпе 01у Аг» Ге А1ї1а 5ег Рго б1у Ріпе Рго с1у б1и Туг АТа Ап 3а 35 40

Зо вас сав вав се свС ївР асс ств астї вса ссс о ссс вес тТас свс сів 197

Азр біп бІ1ш Агсв Агсе Тер Тс Гей Тс АТа Рго Рго с1у Туг Аг» Гец 45 58 55

З5 свс о стсС жас тс асс сас Ес вас ств вав сс сс сас сс вс вав 245

Аге Гей Туг Рпе Тиг Ні Рпе Азр Гей бі Ге б5ег Ні Гей Су5 бІц ва 65 78

Жтас вас Ес вс аав ств авс се БР вБСсс аавр вів ств всс асв сів 293

Туг Азр Рпе Маї Гух5х Ге бег бег б1у Аїа Гух5 Маї Ге АТа Тиг Ге 75 80 85

ТС Бе сав вав авс аса вас асв вав свв всс сс вес аав вас аст 341

Суз с1у біп бій бег Тийг Ар Тйг бІи Агсе АТа Рго о1у Гуз Азр ТАг 90 95 189 195

Кс отас тсв ств вес Тсс оавс ств вас аєссасс тс свс сс вас тас 389

Рпе Туг бег Ге 01у 5ег 5ег Гец Азр І1е Тиг Рпе Аге 5ег Ар Туг 116 115 1209 їсс аас вав аав ссв ТЕС асв вве ТЕС вав всс тс тТас вса всс вав 437 б5ег Азп бІ1и Гуз Рго Рпе Тиг с1у Ре бі Аїа Рпе Туг Аї1а А1а о1и 125 130 135

Бас акс вас вав вс сав вів всс сс вва вав все ссс асс твс вас 485

Азр ІТ1е Азр бІ1и Су5 бІп Маї Аїа Рго с1у б1и АТа Рго Тиг Су Ар 140 145 1509 сас сас ївс сас аас сас ств вс о ввІ Тс Тас вс сс вс свс вса 533

Ні Ні Суб Ні Ап Ніб5х Ге б1у б1у Рпе Туг Су5 бег Су5 Аге А1Та 155 160 165 вес тас вїс ств сас свБЇ аас аав свс асс Твс са вав сав авс сіїс 581 с1у Туг Маї Ге Ні5 Аг» Ап Гу5 Аге Тг Суб бег бі біп 5ег Ге 178 175 188 185 тав сстсссствв австссввсс Твсссавсав віїсаваавсс авравссавсс 634

ТЕстввсстсС австссеевІ ТевеСсСІрРара Тест вТвсс ссаастссса ТЕсасссасс 694 асевасссаа Таасааасстї ввссссассс с 725 «2105 2 «2115 185 «212» Протеїн «2135 Ното зарієп5 «4005 2

Мет Аге Гей Ге ТПг Гей Ге с1у Ге Гей Сух с1у бег Маї Аїа Тиг 1 5 18 15

Рго Гец о1у Рго Гу5 Тер Рго бій Рго Ма! Ріпе с1у Аге Гей Аа 5ег 20 25 30

Зо Рго б1у Рпе Рго о1у бій Туг АТа Ап Азр біп б1и Аге Аге Тер Тс 4 45

Ге Тйг АТа Рго Рго б1у Туг Аге Гей Аг Гей Туг Ре ТПг Ні Ре 35 50 55 ва

Азр Гей 01 Гец бег Ні Гей Суз бІ1и Туг Азр Ріпе Ма! Гуз Геи бег 65 78 75 ва б5ег б1у АТїа Гуз Маї Ге Аїа Типг Ге Сух с1у б1п 01 5ег Тиг Ар 85 90 95

Те бій Ас АТа Рго б1у Гу5 Азр ТПг Рпе Туг бег Ге о1у б5ег 5ег 188 185 118

Гей Азр І1е Тиг Ріпе Аг 5ег Азр Туг бег Азп бІи Гуз Рго Ре Тиг 115 129 125 со1у Ре 01 АТа Рпе Туг Аїа Аїа б1и Азр І1е Азр 01и Су б1п Маї1 130 135 140

А1а Рго с1у оТ1и АТа Рго Тийг Суб Азр Ні Ні Суб Ні Авзп Ні Ге 145 1509 155 160 с1у о01у Рпе Туг Су бег Суб Аге Аїа сб1у Туг Маї Гец Ні Аге Азп 165 176 175

Гуз Аге Тйг Су5 бег бі б1іп бег Ге 188 185 «2105 З «2115 1706 «212» Протеїн «2135 Ното зарієп5 «4005 З

Те Рго Гей с1у Рго Гу Тер Рго бІ1и Рго Ма! Рпе о1у Аге Гей А1Та 1 5 16 15 б5ег Рго б1у Рпе Рго б01у б1и Туг А1Та Ап А5зр біп 01 Аге Аге Тгр 29 25 36

Те Се Те АТа Рго Рго б1у Туг Аг Гей Аг Ге Туг Ре Тиг Ні

Зо Рпе Азр Ге бі Ге бег Ні Ге Су5х бі Туг Азр РПпе Маї Гу Гец 60 б5ег 5ег 01у Аїа Гуз Маї Ге Аїа ТПг Ге Суз с1у бІп б01и бег Тиг 35 65 78 75 80

Азр Тс бі Асв АТа Рго с1у Губ5 Ар Тийг Ре Туг 5ег Гей о1у 5ег 85 90 95 40 б5ег Гей Азр І1е Тпг Ре Аге бег Азр Туг бег Азп бі Гу5 Рго Ре 166 185 116 45

Тиг б1у Ре сб1и ДАІіа Рпе Туг Аїа Аіа сб1и Азр Іе Ар оЇи Су бІп 115 1208 125 50 Мма1! А1ї1а Рго о01у бІ1ш А1їа Рго Тпг Суб Ар Ні Ні Суб Ні Азп Ні 1308 135 140 еи сб1у с1у Рпе Туг Су5 бег Су5з Аге Аї1а с1у Туг Маї Гец Ні Аге 55 145 1509 155 160

Азп Гуз Аге ТВйг Суб 5ег бІи б1п 5ег Ге 165 176

«21905 4 «211» 2466 «2125 ДНК «2135 Ното зарієп5 «220» «221» Кодуюча послідовність «222» (22)..(2082) «4005 4 вессавствв асеввсасас с аєв авв ств ств асс стс ств вес ст сів 51

Меє Аг Геи Ге Тиг Геци Ге о1у Геим Гец 1 5 189

ТІ ЕС ТсСв вїв вБСС асс ссс тв вес ссваав ївв сс ваа ссТ вів 99

Суз с1у бег Ма! Аї1а Тйг Рго Ге с1у Рго Гуз Тер Рго си Рго Маї 15 20 25

ТС о БеБ свС ств вСа сс ссс вес ТТ сса ввБ вав тає всс аат вас 147

Рпе б01у Аге Ге АТа б5ег Рго с1у Рпе Рго о1у бІіи Туг А1Та Азп дор 3а 35 40 сав вав свв свС ТвРБ асс ств астї вса ссс о ссс вес Тас свс ств свс 195 біп бі Агсв Аге Тер Тс Гей Тйг АТа Рго Рго о1у Туг Аге Геи Аге 45 58 55

Зо СЕС тас с оасс сас Ес вас ств вав стїс сс сас сс Твс вав тас 243

Ге Туг Ріпе Тийг Ні Рпе Ар Ге би Ге бег Ні Ге Су о1Їи Туг ва 65 78 вас їїсс вІс аав ств авс се врРе вСсс аавр вв сів всс асв сів ївс 291

Азр Рпе Маї Гух5 Ге бег б5ег с1у Аїа Гу5 Маї Ге А1а Тиг Геи Су 75 80 85 90

Бе сав вав авс аса вас асв вав свв всс сстЇ вес аав вас ас тс 339 с1у б1п 610 бег Тс Азр Тс бі Асе АТїа Рго с1у Гуз А5зр Тиг Ре 95 189 195

ЖТас св ств вес сс авс ств вас ас асс сс свсС Тсс вас ас їсс 387

Туг бег Гец 01у бег 5ег Ге Азр ІТ1е Тиг Рпе Аге 5ег Ар Туг 5ег 119 115 1209 аас вав аав ссв Тс ас вве Тс вав всс сс тає вса всс вав вас 435

А5зп бій Гуз Рго Рпе Тпг с1у Рпе бій А1їа Рпе Туг Аї1а АІїа с1и Ар 125 138 135 ак вас вав ївс сав вів всс сс вра вав все ссс асс твс вас сас 483

Іе Азр бІи Су5х б01п Маї А1їа Рго с1у об0Т1и АТа Рго Тиг Су Ар Ні 1406 145 1509 сас вс сас аас сас ств вс вв Тс Тас вс сс ївСс свС вса ввс 531

Ні Суб Ніб5 Ап Ніх Ге б1у б1у Рпе Туг Су5 бег Су5 Аге А1Іа с1у 155 169 165 179

Жтас вес ств сас сеї аас аав свс асс твс Тїса всс ств вс сс вес 579

Туг Маї Гей Ніб5 Аг» Ап Гу Аге Тйг Суб5 бег АТа Гец Суб б5ег б1у

175 1809 185 сав вїс їїс асс сав ав СТ вве вав стїс авс авс сс ваа тТас сса 627 біп Маї Рпе Тпг б1п Аг» бег б1у 01 Гей 5ег бег Рго бІи Туг Рго 196 195 299 свв ссв Таїт ссс оааа сс сс авт вс аст ас авс ас авс ств вав 675

Агв Рго Туг Рго Гу Ге 5ег бег Суб5 Тиг Туг 5ег І1е 5ег Гец би 295 216 215 вав вве ї2Жїс авт вїс ас ств вас ЇЇ їв вав сс Тїс ват вїв вав 723 бІіи о1у Рпе бег Ма! І1е Ге Азр Ріпе Маї бі бег Ріе Азр Маї си 229 225 230 аса сас сстЇ ваа асс ств ТвЇ ссс тТас вас ТЕС сс аар асї саа аса 771

Тиг Ні Рго 01 Тйг Ге Су Рго Туг Азр Рпе Ге уз І1е бІп Тиг 235 240 245 2509 вас ава ваа ваа саї ввБсС сса СС Т5БїЇ вве аав аса Св ссс сас ав 819

Азр Аге бі бі Ні б1у Рго Рпе Сух о1у Гуз Тиг Гец Рго Ні Аге 255 260 265 ассє ваа аса ааа авс аас асве вв асс ас асс ЇЇ вс аса ває ваа 867

Те бІи ТийгоГуз 5ег Азп Тйг Ма! Тис ІІе Тиг Рпе Маї Тиг Ар с1и 279 275 280 їса бра вас сас аса вес ТївбР аавр ас сас тас асв авс аса все сав 915 б5ег б1у Азр Ніх Тиг с1у Тер Гуз І1е Ні5 Туг Тиг 5ег Тиг А1а сп 285 298 295

Зо сССЕ Твс сст тає ссв аєсв все сса сст ааїтї ввсС сас вт їса сст вів 963

Рго Су Рго Туг Рго МеєЄ АТа Рго Рго Азп оТу Ні Маї 5ег Рго Маї1 399 395 319

З5 саа всс ааа тас ас ств ааа вас авс с Тсс аєс ТК тес вав ас 1811 б1іп АТа Гуз Туг І1е Гей Гуз Азр бег Рпе бег І1е Рпе Су5 си Тиг 315 320 325 330 вес тат вав СЕС ств саа вв сас се ссс ств ааа сс те ас вса 19859 с1у Туг 610 Ге Ге біп с1у Ні Гец Рго Гей ух бег Рпе Тиг А1Та 335 340 345

БЕС ТвБІ сар ааа вас вва СТ ре вас свв сса аїсв ссс все вс авс 1187

Ммаї! Су5х біп Гуз Ар б1у 5ег Тер А5зр Аге Рго Меє Рго А1Іа Су 5ег 359 355 360 ассє вс вас твЕ ввсС ссТ сстТ ває ват ста ссс авт вес сва вів вав 1155

І1е Маї Азр Суб сб1у Рго Рго Ар Ар Гей Рго 5ег о1у Аге Маї б1и 365 379 375

Жтас ас аса вевБЇ сстЇ вра вїв асс асс тас ааа всїЇ вБЕв ак сав тас 1283

Туг ІІе Тиг с1у Рго с1у Маї Тис Тпйг Туг Гуз Аїа Маї Іе сбІп Туг 389 385 399 авс її ваа вав асс їїс Тас аса аєв ааа їв ааї ває вії ааа тає 1251 б5ег Суз бІ1и 01 Тйг Рпе Туг Тийг Меє Гуз Маї Азп Азр о1у Гуз Туг 395 489 4985 416

БЕ ЇЇ вав вс ваї вва ТЕС ре ас авс сс ааа вва ваа ааа са 1299

Ммаї Суз 010 А1а Азр б1у Ре Тер Тийг 5ег бег Гуз Оо1у оЇи Гуз 5ег 415 4209 425 сс сса вїс БЕ вав сс ВІЇ ЇЇ вва ста їса вБсс свс аса аса вва 1347

Гей Рго Маї Суб5 бій Рго Маї Су5х сб1у Гей 5ег Аїа Аге Тиг Тиг с1у 430 435 440

Бе СБІЕ ата тає вва вве саа аав вса ааа сстТ ввІ ває КС сст їв 1395 с1у Аг» І1е Туг с1у о01у біп Гу5 АТа Гу5 Рго с01у Ар Рпе Рго Тгр 445 450 455 саа вїс ств ата са єї вва асс аса вса вса бБвБї вса стж їїТа тає 1443 б1п Маї Гей Іе Ге о01у с1у Тиг Тиг Аї1а АТа со1у Аа Геци Геи Туг 460 465 479 вас аас ве вс ста аса БСЕ вс саї всс вс Тас вав саа ааа са 1491

Азр Азп Тер Маї Гей Тпг АТа Аї1а Ніх АІа Маї Туг оси сп Гу Ні 475 486 485 498 ває вса сс всс ств вас ас сва аєв вес асс ств ааа ава ста са 1539

Азр Аї1а бег АТа Ге Азр І1е Аг» Меї о1у Тиг Гей Гуз Аге Гецй 5ег 495 589 585 сс сає таб аса саа всс Тев ЇСТ ваа встТ БІТ ЇЇ аса сає вгаа вв 1587

Рго Ні5 Туг Тийг біп А1їа Тер б5ег бій Аїа Маї Рпе І1е Ніх сіи о1у 518 515 528 тат аст сає вас вБст вес ЇЇ вас аає вас ата вса ств ас ааа ї-її6 1635

Туг ТАйе Ні Азр АТїа с1у Ре Азр Ап Азр ІІе АІа Гей І1Іе Гуз Геи

Зо 525 530 535 аає аас ааа 5Ї-Ї ва ас аає авс аас ас асв сст ак кв ств сса 1683

А5зп Абп Гуз Ма! Маї І11е Ап бег Азп І1е Тиг Рго І1е Су Гец Рго 540 545 558 ава ааа ваа СЕ ваа сс ЇЇ асе авб аса ває вас асс вва аст вса 1731

Аге Гуз бі АТа бі бег Рпе Меї Аг» Тиг Ар Азр І1е с1у Тиг АТа 555 569 565 578

ТС вва їв вва їтТа асс саа ав вві ЕС СТЄ вс авра ааї ста аїб 1779 б5ег б1у Тер 01у Гей Тийг біп Аге с1у Рпе Гец АТа Аге Ап Гей Меє 575 589 585 тас Ес вас аса ссв ас вс вас сає саа ааа єв5Е ас вс вса тах 1827

Туг Маї Азр І1е Рго І1е Маї Ар Ні5 біп Гух5 Сух Тиг АТа А1а Туг 598 595 6аа

Баа аав сса ссс таї сса ар вва аві вта асї вс аас аєв стЄ Тв 1875 бі Суб Рго Рго Туг Рго Аг» б1у бег Ма! Тпг Аїа Ап Мей Геи Су 605 619 615

БСЕ вБС їТа ваа авт 255 вБС аавр вас авс ївс ава ввї вас авс вва 1923

А1ї1а с1у Ге бі бег б1у с1у Гу5 А5зр бег Су5 Аге б1у Азр 5ег О1Уу 629 625 630

Бе вса ств ЕВ ЇЇ ста ває авї ваа аса вав аве їв ЇЇ вів вва 1971 с1у АТа Гей Ма! Рпе Гей Ар 5ег бі Тйг бій Аг» Тер Рпе Маї о1у 635 640 645 659 вва аса все сс ТвР вБІ сс аєв ааї Ї5їЇ веб ваа вса вві сав тай 2019 со1у ІІе Маї бег Тгр о01у б5ег Меї Азп Су5х о1у 01 АТа с1у сІп Туг 655 66а 665 вва віс тас аса ааа БІ асксаас тає ас ссс твер асс вав аас ата 2067 со1у Маї Туг Тиг Гуз Маї І1е А5п Туг ІШІе Рго Тер Пе б1и Азхп Пе 679 675 680 ас авї ває т таа сЕсесвЕвІсС свсавісаав ваєссттсає єессавгааат 2122

І1е бег Азр Ре 685 вБсстІвїваав асстсввсав свасвіввсї сраваавсає Есаєсаєсас все расатев 2182 всавтєвіїв стіссасссаа ааааасавас їссаввївав вствствІса тест ссаст 2242 твссавтсста аєсссавсст тасссаєсва сЕсааврврва сасааассас вававсваса 2302 вЕсаєстєсв сссасссавї вбааєвісас тестсаааєс асаєсєссаєе ассттааааа 2362 вссавтстст сЕсасаств вествЕївРвса Есе сааа севсствЕсс аєвсЕстетв 2422 ие стаааст тест таєс рааааааааа аааааааа 2460 «2195 5 «211» 686 «212» Протеїн «2135 Ното зарієп5

Зо «4005 5

Мет Аге Гей Ге ТПг Гей Ге с1у Ге Гей Сух с1у бег Маї Аїа Тиг 1 5 189 15

Рго Гец о1у Рго Гу5 Тер Рго бій Рго Маї! Рпе с1у Аг» Гей АІа 5ег 20 25 3а

Рго б1у Рпе Рго о1у бій Туг АТа Ап Азр біп б1и Аге Аге Тер Тс 35 40 45

Гей Тйг АТа Рго Рго об1у Туг Аг» Гей Аге Ге Туг Рпе Тиг Ні Ре 58 55 ва

Азр Гей 01 Гец бег Ні Гей Суз бІ1и Туг Азр Ріпе Ма! Гуз Геи бег 65 78 75 80 б5ег б1у АТа Гуз Маї Гей АТа Тпг Гей Суз с1у бІп б1и 5ег Тиг А5р 85 90 95

Те бій Ас АТа Рго б1у Гу5 Азр ТПг Рпе Туг бег Ге о1у б5ег 5ег 189 195 119

Гей Азр ІІе Тиг Ре Аге бег Азр Туг бег Азп бі Гу5 Рго Ре Тпг 115 1208 125 со1у Ре 01 АТа Рпе Туг Аїа Аїа б1и Азр І1е Азр 01и Су б1п Маї1 1308 135 140

А1а Рго о01у бІ1ш АТа Рго Тйг Суб Ар Ні Ні Суб5 Ні Азп Ні Гец 145 158 155 160 с1у о01у Рпе Туг Су бег Суб Аге Аїа сб1у Туг Маї Гец Ні Аге Азп 165 178 175

Гуз Аге Тс о Су5 бег АТа Ге Су5х 5ег б1у біп Ма! Рпе Тиг бІп Аге 188 185 199 б5ег б1у бій Гей б5ег бег Рго біи Туг Рго Аге Рго Туг Рго Гуз Ге 195 290 295 б5ег 5ег Су5 Тиг Туг 5ег І1е бег Ге 01 бІ1и с1у Рпе бег Ма! Пе 2168 215 229

Зо Гей Азр Рпе Ма! бій бег Ре Азр Ма! біи Тиг Ні Рго бі Тиг Ге 225 230 235 240

Суб Рго Туг Азр Рпе Ге Гуз І1е б1п Тиг Ар Аге б1и 01и Ніх с1у 245 2509 255

Рго Рпе Сух 01у Гу5 Тйг Гей Рго Ніб5 Аге І1е б1и ТПг Гу б5ег Авп 260 265 279

Тиг о Маї Тиг І1е Тиг Рпе Маї Тис Азр б1и бег с01у Азр Ніх Тиг о1Уу 275 2808 285

Тер Гуз Ше Ні Туг Тийг бег Тиг АТїа б1п Рго Су Рго Туг Рго Меє 2908 295 309

А1Та Рго Рго Ахп б1у Ні5 Ма! бег Рго Ма! біп А1а Гу5х Туг Пе Гец 395 316 315 329

Гуз Азр бег Рпе бег І1е Рпе Сух б1и Тиг с1у Туг ом Гей Геи бІп 325 330 335

Оо1у Ні Гей Рго Ге Гуз б5ег Рпе Тиг АІїа Маї Су5 бІп Гуз Азр о01у 340 345 359 б5ег Тер Ар Аг Рго Меї Рго Аїа Су бег І1е Маї Азр Су5 Оо1у Рго 355 зва 365

Рго Азр Ар Гец Рго 5ег б1у Аг» Ма! б1и Туг І1е Тпг с1у Рго о1у 3708 375 389

Ммаї Тис Тис Туг Гуз Аїа Маї ІІе біп Туг бег Су5х 01 обТи Тиг Ре 385 399 395 4ев

Туг Те Меє Гу Маї Ахп Азр б1у Гу Туг Маї Су5 01 АТа Азр с1у 405 416 415

Рпе Тер Тйг бег бег Гуз о1у си Гух5 бег Гей Рго Маї Су си Рго 420 425 430

Ммаї! Сух о01у Ге бег А1а Аге Тпг Тпг об1у о1у Аге І1е Туг с1у О1Уу 435 44о 445 б1іп Гуз Аїа Гуз Рго с0І1у Азр Рпе Рго Тгр б1п Ма! Гей Пе Гей о01у 4506 455 460

Зо о1у Тиг Тпг АТа АТа о1у АТа Гей Геи Туг Азр Азп Тгр Маї Гей Тиг 465 470 475 480

А1а А1ї1а Ні5 АТїа Маї Туг бій б1п Гу5 Ні5 Ар А1а 5ег АІа Гецй Азр 485 490 495

І1е Агв Меє с1у ТПг Гей Гуз Аге Гец 5ег Рго Ні5 Туг Тиг б1п АТа 589 595 518

Тер 5ег бІи А1їа Ма! Рпе І1е Ні5 бі с1у Туг Тиг Ні Азр Аїа о01у 515 529 525

Рпе Азр Азп Азр І1е ДАіа Гей І1е Гу5 Ге Азп Азп Гуз Ма! Ма1! Пе 539 535 540

Абзп бег Азп І1е Тиг Рго І1е Су Гец Рго Аге Гу5 бій АІїа о1и 5ег 545 550 555 560

Рпе Меї Аге Тиг Ар Азр І1е с1у Тпг АТа бег с1у Тер с1у Гей Тиг 565 5708 575 бІіп Аге б1у Рпе Гей Аїа Аге Аб5п Гей Меї Туг Маї Ар І1е Рго Пе

5808 585 599

Ммаї Азр Ніх б1п Гух Суз Тиг Аї1а Аїа Туг си Гуз Рго Рго Туг Рго 595 6о0 605

Аге б1у бег Ма! Тиг АТа Ап Меї Гей Су5х Аїа с1у Гей бІи 5ег О1у 618 615 620 о1у Гуз Азр 5ег Су Аг» б1у Ар бег б1у сб1у АІа Гец Маї Ре Ге 625 630 635 640

Азр бег бі Тийг бі Аге Тер Рпе Ма! с1у о1у І1е Ма! 5ег Тер 01у 645 659 655 бег Меє Азп Сух б1у бі АТїа б1у б1п Туг с1у Маї Туг Тиг Гуз Маї! 66О 665 670

Іе Азп Туг ІІе Рго Тер І1е 010 Азп ІІе І1е бег Азр РІПе 675 680 685 «2105 6 «2115 671

Зо «2125 Протеїн «2135 Ното зарієп5 «4005 6

Те Рго Гей с1у Рго Гу Тер Рго бІи Рго Ма! Ріе о1у Аге Геци А1Та 1 5 16 15 б5ег Рго б1у Рпе Рго б01у б1и Туг А1Та Ап А5зр біп 01 Аге Аге Тгр 20 25 36

Те Се Те АТа Рго Рго б1у Туг Аг Гей Аг» Ге Туг Ре Тиг Ні 35 40 45

Рпе Азр Ге бІи Ге бег Ніх еп Су5 01 Туг Азр Рпе Маї Гуз Геци 60 50 б5ег 5ег 01у Аїа Гуз Маї Ге Аїа ТПг Ге Суз о1у бІп о1и бег Тиг 65 70 75 80 55 Азр Тс бі Асв АТа Рго с1у Губ5 Ар Тийг Ре Туг 5ег Гей о1у 5ег 85 90 95 б5ег Гей Азр І1е Тпг Ре Аге бег Азр Туг бег Ап бі Гуз Рго Ріпе

166 185 116

Тиг б1у Ре сб1и ДАІіа Рпе Туг Аїа Аіа сб1и Азр Іе Ар оЇи Су бІп 115 129 125

Ммаї Аїа Рго сб1у об0Т1и А1а Рго Тиг Суб Азр Ні Ні Су5 Ні Ап Ні 1308 135 140 еи сб1у с1у Рпе Туг Су5 бег Су5з Аге Аї1а с1у Туг Маї Гец Ні Аге 145 158 155 160

Азп Гуз Аге Тйг Суб 5ег АТїа Гей Су5х бег б1у біп Ма! Рпе Тиг б1п 165 176 175

Аге бег б1у бі Ге бег 5ег Рго бІи Туг Рго Аге Рго Туг Рго Гу 188 185 199

Ге бег бег Су5з Тиг Туг бег І1е бег Ге бІ1и бІи о1у Рпе бег Маї1 195 290 295

ІІе Ге Азр Ріпе Ма! обТи 5ег Ріпе Азр Ма! сб1и Тиг Ні Рго о1и ТАг 2168 215 229

Зо

Ге Суб Рго Туг Азр Рпе Гей Гу5 І1е біп Тйг Азр Аг» би би Ні 225 230 235 240 с1у Рго Рпе Сузх с1у Гу5 Тийг Гец Рго Ні5 Аге І1е бІи Тиг Гу 5ег 245 258 255

Азп Те о Маї Тис І1е Тс Рпе Ма! Тиг Ар бі 5ег б1у Ар Ні Тиг 260 265 279 о1у Тер Гуз Ше Ні Туг Тиг б5ег Тиг Аїа бІп Рго Суб Рго Туг Рго 275 2808 285

Меє АТа Рго Рго Ап сІ1у Ні5 Маї бег Рго Ма! б1п Аїа Гуз Туг Пе 2908 295 309

Ге Гуз Азр б5ег Рпе 5ег І1е Рпе Сух б1и Тпг с1у Туг оЇи Геи Ге 395 316 315 329 б1іп о1у Ні5 Гей Рго Гей Гуз бег Ріпе Тпг АТа Маї Сух5 бІ1п Гуз Ар 325 339 335 с1у бег Тер Азр Аге Рго Меї Рго Аїа Сух 5ег І1е Маї Азр Сух о1у 340 345 359

Рго Рго Ар Ар Ге Рго 5ег с1у Аг» Ма! бі Туг І1е Тпг с1у Рго 355 зва 365 со1у Маї Тийг Тиг о Туг Гуз АТїа Ма! ІІе біп Туг бег Су5 о01и си Тиг 379 375 389

Рпе Туг Тйг Меж Гуз Маї Азп Азр о1у Гуз Туг Ма! Су5 о1и Аа Ар 385 399 395 4ев

Оо1у Ре Тер ТиИг 5ег бег Гуз оО1у бТ1и Гуз 5ег Гей Рго Маї Су с1и 405 416 415

Рго Ма! Сух о1у Ге б5ег А1ї1а Аг» Тиг Тиг о1у сб1у Аге І1е Туг О1у 420 425 430 с1у б1п Гуз АТа Гуз Рго б1у Ар Ріе Рго Тгр біп Ма! Гей Пе Гец 435 44о 445 со1у о1у Тийг Тиг АТа АТїа с1у АІа Ге Гей Туг Азр Азп Тгр Маї Геи

Зо 450 455 460

Тиг АТ1а АТа Ніх5 ДАІіа Маї Туг оЇїи бІп Гу5 Ні Азр АІа бег А1а Ге 465 470 475 480

Азр І1е Аге Меї о1у ТПг Гей Гуз Аг» Ге бег Рго Ні Туг Тиг бІп 485 490 495

А1а Тер 5ег 010 АТїа Ма! Рпе І1е Ні5 01 с01у Туг Тпг Ні Азр А1Іа 580 505 518 с1у Рпе Азр Азп Азр І1е Аї1а Ге ІТе Гу5 Гей Абзп Азп Гу Маї Маї 515 529 525

І1е Азп б5ег Азп І1е Тйг Рго І1е Су5 Гей Рго Аг» Гу5 б1и Аа б1и 5308 535 540 б5ег Рпе Меї Аг» Тпг Ар Азр І1е сб1у Тпг А1а бег о1у Тер О1у Ге 545 550 555 560

Те б1п Асе б1у Рпе Ге АТа Аге Азп Гей Меї Туг Маї Ар І1е Рго 565 5708 575

Іе Маї Азр Ніх сб1п Гуз Сух Тиг АТа АТа Туг оси Гу Рго Рго Туг 589 585 598

Рго Аге 01у бег Ма! Тпг АТа Ахп Меї Геи Су5 А1а с1у Гец би 5ег 595 600 605 с1у о01у Гуз Ар бег Суб Аг» б1у Ар 5ег б1у о01у АІїа Гец Маї Рпе 619 615 6209

Гей Азр бег біи Тйг бі Аге Тер Рпе Ма! с1у с1у Іе Ма! 5ег Тер 625 630 635 640 о1у бег Меж Азп Сух с1у сб1и Аїа с1у бІ1п Туг о1у Маї Туг Тиг Гуз 645 659 655

Ммаї ІІе Азп Туг ІІе Рго Тер І1е 01 Азп І1е І1е бег А5зр Ре 66а 665 679 «21905 7 «211» 4986 «2125 ДНК «2135 Ното зарієп5

Зо «4005 7 ссЕВТсствсС ствсстІвРваа СсІстТРавсав встївРвавіса ЄРвавтсват сссавраатс 6о ссававісав вгєварвстіввР ввСсавеввса ввіїсасірва сааасаваєс аааресвава 120 ссавсвтаврв аствсавасс аврвссаврвсс австввасвв всасассаєв арвтагрвіев 188 всвссасавс стссствСсав еєвІРїРееВБІ веРрРавсасав всствевсст сассвссссі 2408 вссствссса тавествств ассстсстве вССТТСТРІВ ТРЕСТСеРІв вссассссст 300

Таввсссваа вЕввсстваа ССЕВБІРТССВ РеСвсстІввБС ассссссввс тТтссареве 360 автаєсвссаа ївассаврвав севсесІвва ссстваствс ассссссвевс тассвсствс 420 всстстастї сасссастєс васстввавс тсЕсссасст севсвавтас вастєесвіса 480 аввївссвіс авасевваве вствРевСЕЄ сісаввРісв вРевРІсСссс ааргавтавс 540 савевіїсав врасасстве вавсаввевс саврестївес савваревав ассаввсстів 600 вВЕсСЕСвссТ састссств ївасасства ссссасавстї вавстсевее вссааврвтвс 66а

Тевссасвсї вївсевесав вававсасав асасевався вєвсссствес ааргасастт 728

Тстастсвсї вевстссавс ствРвасаєта ссЕсссвстІс свастастсс аасваваавс 780 свЕСсасвевв вЕЇсваввсс тЇстаєвсав ссваввврїва вссаававрвв вІсствсаас 840 ассесавтсї всвсавстве СсЕВБІРВРевІ аасЕствсстї тТаввссавес авссствсст 980 тЕсавееєссс сассестссс авревсавввв ававвсстсї ввсствасає сасссасаає 960

Бсааавасса ааасавссвї васстссаєє сасаївеевстї вавївссаас стРавссав 1920 ввасствавв асавсаєсвс стсаавртвас всавеваств вєссеввсесе всавстсасв 1986 ссЕвтаастс савсастєсєв вваввссвав всївестївРа бааєстваве вЕсаввавт 11406 "7 сааввссавс савревсааса севсвааастї стаєстссас таааастаса ааааставст 120806

БЕВСВїевів вІвсвсассї рвааєссссав стаставева вєвстіваввса гєвагааєттвс 1260

Тсваасствс ваврвїввавв сівсавріраа сававаєсьс ассастасас тссасствве 1320 свасаваста вастіссвіїсї саааааасаа аааасааааа ссасвсарев ссвавевссс 1380 асстсасааврс Евасааавсе ввссствсса всвеевавсевс тесавваєвї тЕрРасєтєсса 1440 7 ваєсссавіс сствсавава ссааствєвї васстстввс аавтввстса ассстствс 1586 тсстставаав сЕвствСсаав ввЕссавсевс Євтавссссв ссссствевї Тваєсваст 1560 ссссІсаєса вєстеввІрас сісевссеЕва састрааасї сссаствевІї Єаасававвї 1620 ваєвЕствса сЕСЕстссс авсестівств вравстісвса всвассстав всствтаавв 1680 тваєсевссс весассавіс ссвсассста васаввассяї аввсстсстс ЄРаввіссас 17406 7 Тстваввіса Теваєстсст веваввавіс саввствваї сссвсстстТ тссстсства 1880 сввссСТвсСсТ ввссстІвссї стсссссава сасєвасвав ївссаввївв ссссвеЕвава 1860

З5 БЕсвсссасс твЕсвассасс аствссасаа ссасстввес ввЕЕСстТастї встсствссе 1920 свсаввстас вісствсасс втаасаавсв сасствстса вРївавввав всівсствев 1980 ссссаасвса ссстЕстсств вратасссвв ввстсстсав вессаєсевст всЕСтТвссса 29040 7 бЕБРТвсСвва вевссівРеС стІРвасаств ввївстсстТа вевссствств сстссавстс 2186 сссттстсав ссствстТсс сстстсавса вссаввсіса їсавтвссас сствссстав 2160 саствавасї аастстааса єсссаствєв тТасстввієс сасстревсї стрРеЕваассс 2220 сІсаєсєвтавс сасевравав СсевРевтаєс тассстсвіЄ сстСеРВаств веЕССсСТвІТ 2280 ссствсСастів гєвеврРасевес савртвстств вєвеСсеїРевС авссссассс ТвЇРесвсів 2340 7 ассствстсс сссвастсвв ЄЕССТЕССТСЕ сеВРЕТСТСЕ ссЕСвсСсСТсСТ стваєстстс 24080 тсссававса вавсстстав сстсссствв австссввсї всссавсаве їсавраавсса 2460

Бавссавесії вствевСсстСса всЕсСсСеРВІЇ ввеЕСсСтТРаваї всівТвсссс аастсссаєтт 2520 сасссассає вєвасссааста абааасствв ссссасссса сствствссв свРівІсІств 2580

БЕБІвБРавв вІСЕРварес еВІРЕРЕСсВС вСЕССТСТСТ всстассстс сесасавсст 2640 саєваасссс аввЕствтвР вавсстсстс сасеввесса сасевісстї ввссісассс 2790 сСЕВЕСстївРа аваєввеевса стЕварвссвв аваргеввтаа ввсстсвсІс вавтссавв 2760 ? ссссававрвс ївавсссава втааєстєва ассассссса сЕсаревіЕсії ввсстввавв 2820 авсстІвассс асавраврвава сассстїввва вгатстаєссасї варвввтаає стеріссссс 2880 всаааєссав вєввІваєссс саствсссса таврвсасавс сасеївваав ааресавеса 2940 асвЕсввевс тсстСсастєс стававевссї сасаастєсаа аєвсссссса ствсавствв з60о

БЕБІВБРвІв вІввТасввв асевврасса авсст(їсстї раарвасавра всссавссса зе6о 7 асассссвсс ссвЕввсавс авсаєсасвї віїссаврсва враарвавав сассавастс 3120 авеЕсаєваєс астевесвссї СрРаасеїсса аваасавссс саввесааве вБісаааасав 3180

БеЕвРааавввв віваївавав аєсстЕстЕс севаїєвЕєсс тссавваасс аревевсіве 3240

СТІВВЕСТТРв СТРевІїсСвеР вБтТаврвавасс сасваєсваає ааастісєвева аїсастеввев 3300

Тест таав ввгааєссавв вєвавстіссва ареввссстї аввсісваве аваєвстсст 3360 7 сс ссс вааєтсссав врасссавва вавтівтссстї ЄСЕСССТСЕЄ ССТРЕвТвІсС 3420 саєссасссс свссссссвсС сствесСавав ствбРІвРаас савтвстст авсссстасс 3480

Зо СТВЕЕВЕСесС вастствесї саврврасасса ссасесіссс ТевРеРІвІв арївавввсс 3540

ТвЕвсвстсс аєсссвавтв ствссТвЇїї савстааавс сІсаааврсаа вагааасссс 3600 сІсСеЕсСтаавс ввсссстсав ссассеввів ввїсвССсве ТЕСсСтвРеРТа весстсарев 3660 7 вБстввссасс твсаврввссс авсссаассс ареваєвсав аєвісссавс сасаїєссств 3720 тсссавнсс сЕвстсссса авесаєссас сствствЕТР вІвсвавевс твРагсавраввв 3780 сасвссаавії састсссств ссстЄссстс стгссавссс ЯвТвсСтссвв ссаввістс 3840 асссававрвї ствеРеЕвавсії савсавсссї ваастасссас ввссвтаїсс сааастстсс 3900 авЕсвсастї асавсаєссав сствваввав вевІЕїсавтв їсаєссствва сЕСтесвРгав 3960 7 ТсстЕтсвасв сРвавасаса ссствааасс ствсвїсссТ асвасесєтст саарвсствв 4020 сСТсствввСС сстсаєстєв тсссаваєсс тссссстсса всссавствс ассссстаст 4де8а

Тсствсавса Тввсссссас сасвієЄсссв їсассстсвев Твассссасс Есттсарве 4140 сІсСтаєввав вїсаарвств вевсЕСсвРав тасаарївїв вбрРавресавав СРРеЕевавевв 4200 сассссааєс сасвевсствв вЕСевссіса ТеестІвїсс стЕвааасесї варварів 4260 7 вЕсбасттссс тссвсссавв ссавасссав всавствстс сссавстєтс аєвавстєст 4320 гЕстсаваєї сааасавраса вагаавааса Єввсссаєсс вер ваава сасєвсссса 4380 савваєсваа асааааавса асасевівас сассассеїї вЕсасаваєе ааєсаврвава дадда ссасасаврвс Твваавраєсс астасасвав сасавсвавс аавсеввстс авраєссттвв 4580

Теваавсевса вавствсстс ЄстстРвавії всааврвавстї вбававтвта вевстстс 4560 вБевСсаввасї аврваавввас ассаввтєта вїевїестіва вєвІствРавес авсавстєст 4620 аагввваавс асссвівссс тсстІсавсав сасссавсає стЄсассастї саєсстссаа 4680 ссасссаєсс асссаєсастї саєстсєттас ссасссассс Есвссастс аєсстеств 4740 ссстсаєсст тссаассаєї саєсааєсас ссасссаєсс аєссЕссевсс асасаассат 4800 ссасссаєсс тЕСтасстас ссаєсстаєс саєссаєсся єстаєсавса Єсстсстасс 4860 асссаєсстє свІЕсввІса тссаєсаєса єссаєссатс 4980 «21905 8 «2115 136 «212» Протеїн «2135 Ното зарієп5 «4005 8

Мет Аге Гей Ге ТПг Гей Ге с1у Ге Гей Сух с1у бег Маї Аїа Тиг 1 5 189 15

Зо

Рго Гец о1у Рго Гу5 Тер Рго бій Рго Ма! Ріпе с1у Аге Гей Аа 5ег 20 25 3а

Рго б1у Рпе Рго о1у бій Туг АТа Ап Азр біп б1и Аге Аге Тер Тс 35 40 45

Ге Тйг АТа Рго Рго б1у Туг Аг Гей Аг Гей Туг Ріпе Тиг Ні Ре 50 55 ва

Азр Гей 01 Гец бег Ні Гей Суз бІ1и Туг Азр Ріпе Ма! Гуз Геи бег 65 78 75 80 б5ег б1у АТа ух Маї Ге Аїа Тиг Ге Сузх с1у бІ1п о01и бег Тиг Ар 85 90 95

Те бій Ас АТа Рго б1у Гу5 Азр ТПг Рпе Туг бег Ге о1у б5ег 5ег 189 195 119

Гей Азр ІІе Тиг Ре Аге бег Азр Туг 5ег Азп бі Гу5 Рго Рпе Тпг 115 128 125 о1у Ре бІи АТа Ріе Туг А1а Аа

1308 135 «2105 9 «2115 181 «212» Протеїн «2135 Ното зарієп5 «4005 9

Мет Аге Гей Ге ТПг Гей Ге с01у Ге Гей Сух о01у бег Маї А1а Тиг 1 5 16 15

Рго Гец о1у Рго Гу5 Тер Рго бій Рго Ма! Ріпе с1у Аге Геи Аа 5ег 29 25 36

Рго б1у Рпе Рго о1у бІи Туг Аїа Азп Азр б1п б1и Аг» Аге Тер Твг 35 40 45

Ге Тйг АТа Рго Рго б1у Туг Аг Гей Аг Гей Туг Ре Тиг Ні Ре 50 55 60

Азр Гей 01 Ге 5ег Ні5 Ге Сух бТ1и Туг Азр Рпе Маї Гуз Геци 5бег 65 70 75 80

Зо б5ег б1у АТїа Гуз Маї Ге А1їа Типг Ге Суз б1у б1п 01 бег Тпг Аз5р 85 90 95

Те бій Ас АТа Рго сб1у Гуз Азр Тйг Ре Туг 5ег Ге о1у 5ег 5ег 166 185 116

Гей Азр ІІе Тиг Ре Аге бег Азр Туг бег Азп бі Гу5 Рго Ре Тпг 115 129 125 со1у Ре 01 АТа Рпе Туг Аїа Аїа б1и Азр І1е Азр 01и Су б1п Маї1 1308 135 140

А1а Рго с1у бІ1и АТа Рго Тийг Су Ар Ні Ні Су5 Ні Автп Ні Ге 145 158 155 160 с1у о01у Рпе Туг Су бег Суб Аге Аїа сб1у Туг Маї Гец Ні Аге Азп 165 176 175

Гуз Аге Тиг Су 5ег 188 «2105 16

«2115 293 «212» Протеїн «2135 Ното зарієп5 «4005 186

Мет Аге Гей Ге ТПг Гей Ге с1у Ге Гей Сух с1у бег Маї Аїа Тиг 1 5 16 15

Рго Гец о1у Рго Гу5 Тер Рго бій Рго Ма! Ріпе с1у Аге Геи Аа 5ег 29 25 36

Рго б1у Рпе Рго о1у бій Туг АТа Ап Азр біп б1и Аге Аге Тер Тс 35 40 45

Ге Тйг АТа Рго Рго б1у Туг Аг Гей Аг Гей Туг Ре Тиг Ні Ре 58 55 60

Азр Гей 01 Гец бег Ні Гей Суз бІ1и Туг Азр Ріпе Ма! Гуз Геи бег 65 70 75 80 б5ег б1у АТїа Гуз Маї Ге А1їа Типг Ге Суз б1у б1п 01 бег Тпг Аз5р 85 90 95

Зо

Те бій Ас АТа Рго б1у Гу5 Азр ТПг Рпе Туг бег Ге о1у б5ег 5ег 166 185 116

Гей Азр ІІе Тиг Ре Аге бег Азр Туг бег Азп бі Гу5 Рго Ре Тпг 115 1208 125 со1у Ре 01 АТа Рпе Туг Аїа Аїа б1и Азр І1е Азр 01и Су б1п Маї1 138 135 140

А1а Рго с1у бІ1и АТа Рго Тийг Су Ар Ні Ні Су5 Ні Автп Ні Ге 145 158 155 160 с1у о01у Рпе Туг Су бег Суб Аге Аїа сб1у Туг Маї Гец Ні Аге Азп 165 176 175

Гуз Аге Тс о Су5 бег АТа Ге Су5х 5ег б1у біп Ма! Рпе Тиг бІп Аге 188 185 199 б5ег б1у бій Гей б5ег бег Рго біи Туг Рго Аге Рго Туг Рго Гуз Ге 195 290 295 б5ег 5ег Су5 Тиг Туг 5ег І1е бег Ге 01 бІ1и с1у Рпе бег Ма! Пе

2168 215 229

ІГец Азр Рпе Маї бій б5ег Рпе Азр Ма! сб1и Тпг Ні Рго би Тпг Ге 225 230 235 240

Суб Рго Туг Азр Рпе Ге Гуз І1е б1п Тиг Ар Аге б1и 01и Ніх с1у 245 258 255

Рго Рпе Сух 01у Гу5 Тйг Гей Рго Ніб5 Аге І1е б1и ТПг Гу б5ег Авп 260 265 279

Тиг о Маї ТиИг І1е Тис Рпе Маї Тиг Азр оТи 5ег су Азр Ніх5 Тиг о1у 275 2808 285

Тер Гуз Пе Ні Туг 2908 «2105 11 «2115 41 «212» Протеїн «2135 Ното зарієп5 «4005 11

Зо бІ1и Ар ІТ1е Азр сб1и Сух5 сб01п Маї АТїа Рго с1у об01и АТа Рго Тиг Су 1 5 16 15

Ар Ні Ні Суб Ні Азп Ніх Гец б1у б01у Ре Туг Су5 5ег Су5 Аг 29 25 36

А1ї1а о1у Туг Маї Гец Ні Аге Ап Гу 35 40 «2105 12 «2115 242 «2125 Протеїн «2135 Ното зарієп5 «4005 12

І1е Туг с1у с1у б1п Гу5 АІТа Гу5 Рго сб1у Азр Рпе Рго Тер біп Маї 1 5 16 15

Їец І1е Ге с1у о1у Тпг Тпг А1а АІіа с1у АІа Гей Геци Туг Автр Азп 20 25 36

Тер Маї Геи Тиг Аї1а А1а Ні5 Аїа Ма! Туг 01 б1п Гуз Ні Ар АІа 35 40 45 б5ег А1ї1а Гей Азр І1е Аге Меї б1у ТПг Гей Гу5 Аге Гец б5ег Рго Ні 50 55 60

Туг Тйг бІп Аїа Тер 5ег 010 Аїа Ма! Рпе І1е Ні5 бІи о1у Туг Тиг 65 70 75 80

Ні Азр АТїа с1у Рпе Азр Ап Азр І1Іе Аїа Ге Пе їу5 Геци Авзп Авп 85 90 95

Гуз Ма! Ма! ІТІе Абп бег Ап І1е Тйг Рго ІІе Су Гец Рго Аге Гуз 166 185 116 бі АТа бій бег Рпе Меї Аге Тиг Ар Азр Іе о1у Тиг АТа 5ег с1у 115 129 125

Тер б1у Ге Тс біп Ас б1у Ре Гей Аїа Аг» Ап Ге Меї Туг Маї 1308 135 140

Азр ІТ1е Рго І1е Маї А5р Ні5 бІп Гуз Сух5 Тиг Аїа АТа Туг оси Гуз 145 158 155 160

Зо

Рго Рго Туг Рго Аге б1у 5ег Ма! Тпйг АТа Ап Меє Гей Су5х Аїа Оо1Уу 165 176 175 ей 61 бег с1у о1у Гуз Азр бег Суб Агев б1у Азр 5ег о1у о1у А1Та 188 185 199 еи Ма! Рпе Гей Ар бег бі Тйг бІи Аг» Тер Рпе Маї о1у о1у І1е 195 290 295

Ммаї бег Тер с1у бег Меє Азп Суз б1у б01и Аіа с1у бІп Туг с1у Маї 2168 215 229

Туг Тйг Гуз Ма! ІІ1е Азп Туг І1е Рго Тгр І1е бі Азп І1е І1е 5ег 225 230 235 240

Азр Рпе «2105 13 «2115 16 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність

«223» Синтетична «4005 13 о1у Гуз Азр 5ег Су Аг» б1у Азр АТїа с1у с1у АІа Гец Маї Ре Ге 1 5 18 15 «2105 14 «2115 15 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 14

Те Рго Гец с1у Рго Гу Тер Рго бІ1и Рго Ма! Ріе о1у Аге Геи 1 5 18 15 «2105 15 «2115» 43 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220»

Зо «223» Синтетична «4005 15

Те АТа Рго Рго бІ1у Туг Агв Гей Аге Гей Туг Ре Тиг Ні Ре Ар 1 5 18 15

Їеч бІи Ге 5ег Ні Ге Суз б1и Туг Азр Рпе Маї Гуз Гей б5ег бег 20 25 30 о1у АТа Гу Маї Ге АТа Тиг Гей Су о1у б1п 35 4 «2105 16 «2115 8 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 16

Те Рпе Аг» б5ег Ар Туг бег Азп 1 5

«2105 17 «2115 25 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 17

Рпе Туг бег Ге 01у 5ег 5ег Гец Азр І1е Тиг Рпе Аге 5ег Ар Туг 1 5 18 15 б5ег Азп бій Гу5 Рго Рпе Тиг о1у РПе «2105 18 20 «2115 9 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» 25 «223» Синтетична «4005 18

Іе Азр бІ1и Су5 сІ1п Маї АІа Рго с1у

Зо 1 5 «2105 19 «2115 25 «2125 Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 19

А1а Ахп Меї Гей Су5 Аі1а о1у Ге б0І1и бег оІу с1у Гуз Ар 5ег Су 1 5 18 15

Аге б1у Азр бег оО1у с1у А1а Геци Маї 20 25 «2105 29 «2115» 9606 «2125 ДНК «2135 Ното зарієп5 «220» «221» Кодуюча послідовність «222» (51)..(797)

«4005 29 ассаасєвав аєсаасстєс сствавсї стІсасассаа ввїваввасс атв сс 56

Мет 5ег 1 ств ЕС сса са стс сст стс стК сс ств авт ась вївб вса все с 194

Ге Рпе Рго 5ег Гец Рго Гей Гей Ге Ге 5ег Меї Ма! Аїа Аа 5ег 5 189 15

Жтас са ваа астї їв асс ївБїЇ вар ває всс саа аав асс вс сст вса 152

Туг 5ег бІи Тийг Маї Тиг Су5 обТ1и Азр АТа біп Гуз Тиг Су Рго А1а 20 25 3а

Ів асст всс твІ авс їстІ сса ввс ас аас вес Тс сса вес ааа ває 290

Ммаї ІІе А1а Су5х бег бег Рго б1у І1е Азп с01у Рпе Рго Оу Гуз Аз5р 35 40 45 58

Б СБІ ваї вес асс аар бра ваа аар вве ваа сса вс саа вв стс 248 со1у Аге Азр сб1у Тпг Гу5 о1у б1и Гу5 с1у б1и Рго о1у біп о1у Ге 55 ва 65 ава вес їЇта сав вес ссс ссТ вва аав ТС вве ссТ сса вва аає сса 296

Аге б1у Ге біп о01у Рго Рго сІ1у Гух5 Ге Оо1у Рго Рго с1у Ап Рго 76 75 80

БВБ ССТ СТ вве їса сса бра сса аар вБсС саа ааа вва вас сс вва 344 о1у Рго бег о1у 5ег Рго с1у Рго Гуз о1у бІ1п Гуз оТу Ар Рго о01у 85 90 95

Зо ааа авт ссе ваї вві ват авт авс ств всІ всс їса раа ава ааа вс 392

Гуз 5ег Рго Азр бІ1у Ар бег б5ег Гей АІїа АІ1а 5ег 01и Аге Гуз А1Та 196 195 119

З5 ств саа аса раа асе вса свБІ асс ааа аав свв сс асс ЄС Тс ств до

Гей б1п Тис біи Меє АТа Аге І1е Гуз Гу5 Тер Ге Тиг Ре 5ег Геи 115 1209 125 130 вес ааа саа ЇЇ БР аас аав СС с ств асс аас 55Бї раа аса аїб 488 с1у Гу5х б1п Ма! с1у Азп ух Ре Рпе Гей ТПг Азп б1у бІіи Іе Мет 135 140 145 асс т ваа ааа їв аав всс Тв Тв вїсС аав СС сав всс тс вів 536

Тиг Рпе обІТи Гуз Маї Гуз АТїа Ге Сузх Ма! Гуз Ріе б1п АІїа б5ег Маї 1509 155 169 всс асс ссс авв ааї всїЇ Бвбса вав ааї вва всс ас сав аає сс атс 584

А1а Тис Рго Аге Ахп А1ї1а А1ї1а бій Ахп б01у Аїа І1е б1п Ахп Ге Пе 165 178 175 аав вав ваа всс ТЕС ств вБС асс астї раї вар аав аса ваа вве сав 632

Гуз бІи б1и А1їа Рпе Геи сб1у І1е Тпг Азр би ух Тпг оїи о1у с1п 186 185 199

ТЕ БІБ ває ств аса вва ааї ара ств асс тас аса аас ев аас вав 680

Рпе Маї Ар Ге Тиг б1у Ап Аг» Гей Тийг Туг Тс Азп Тер Ап би 195 299 295 219

БВї ваа ссс аас аатї встї вв СІ ває ваа ває ЇЇ вста 6 ста сів 728 о1у обТи Рго Азп Азп АТїа с1у бег Азр бТи Ар Су Маї Геи Геци Ге 215 220 225 ааа аає вес сав веб ааї вас вс ссс о твсС сс асс тсс сає ств всс 776

Гуз Азп б1у біп Тер Азп Ар Маї Рго Суб5 5ег Тиг бег Ні Геци А1Та 230 235 240 вБЕС Тв вав Ес сст асс ва авввїсатає састсаввсс стССЕТвЕс 827

Ммаї Суз с1и Рпе Рго І1е 245 -есстаствса асссасаввс ссасавтаєв стЕсСваааава бЄааастаєає сааєтстсстс 887 асаєссавта Св ЕссстЇ ТетвРееСсааєї састааааає ваєсастаас аврсассааса 947 аавсааєаає авт 960 «2105 21 «2115 248 «212» Протеїн «2135 Ното зарієп5 «4005 21

Мет бег Гей Рпе Рго бег Гей Рго Ге Гей Гей Гей бег Ме Маї А1Та 1 5 18 15

Зо А1а б5ег Туг бег бі Тйг Маї Тис Су5 бІ Ар АТї1а б1п Гу Тис Су 20 25 30

Рго Аїа Ма! Іїе Аїа Су5 бег бег Рго б1у ІІе Азп о01у Ріе Рго о01у 35 40 45

Гуз Азр б1у Аг» Азр о1у Тиг Гуз б1у бІи Гу5х о1у 01 Рго о1у сп 58 55 ва со1у Ге Аге с1у Ге біп с1у Рго Рго с1у Гуз Гец о1у Рго Рго о1у 65 78 75 ва

Азп Рго с1у Рго бег б1у бег Рго о1у Рго Гуз с1у бІп Гуз о1у А5р 85 90 95

Рго б1у Гу бег Рго Азр б1у Азр 5ег бег Геу А1а А1а 5ег сІи Аге5 188 185 118

Гуз АТїа Ге біп Тйг бі Мет А1ї1а Аге ІТе Гу5 Гу5 Тер Ге Тиг Ре 115 129 125 б5ег Ге оІ1у Гуз бІ1п Ма! с01у Азп Гуз Ре Рпе Ге Тпг Азп о1у оси 138 135 140

Іе Меє Тиг Ре си Гуз Маї Гуз АТа Гей Сух Маї Гуз Рпе б1п А1а 145 1509 155 160 б5ег Ма! Аїа Тпйг Рго Аг» Ахп Аї1а А1ї1а біи Ахп б01у Аїа Іе б1п Азп 165 178 175

Їец І1е Гуз 01 01 А1їа Рпе Геи б1у І1е Тпг Азр бІи Гуз Тиг си 1809 185 199 с1у б1іп Рпе Маї Азр Гей Тпг о1у Ап Аг Гей Тйг о Тус Тс Азп Тер 195 290 295

Ап бій с01у бТ1и Рго Ап Азп Аїа б1у 5ег Ар с01и Азр Су Маї Геи 216 215 229

Ге Ге Гуз Азп б1у б01п Тер Азп Ар Маї Рго Су5 5ег Тиг 5ег Нів 225 230 235 240

Ге Аї1а Маї Су бІ1и Рпе Рго І1е 245

Зо «2105 22 «2115 6 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «220» «221» МІ5С ЕЕАТИВЕ «222» (1)..(1) «223» в якій Х в положенні 1 являє собою гідроксипролін «220» «221» МІ5С ЕЕАТИВЕ «222» (4)..(4) «223» в якій Х в положенні 4 являє собою гідрофобний залишок «4005 22

Хаа о1у Гуз Хаа с1у Рго 1 5 «2105 23 «2115 5 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність

«223» Синтетична «220» «221» МІ5С ЕЕАТИВЕ «222» (1)..(1) «223» в якій Х являє собою гідроксипролін «4005 23

Хаа о1у Гуз Геци а1у 1 5 «2105 24 «2115 16 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «220» «221» МІ5С ЕЕАТИВЕ «222» (9)..(15) «223» в якій Х в положенні 9 являє собою гідроксипролін

Зо «4005 24 со1у Ге Аге с1у Ге біп с01у Рго Хаа с1у Гух5 Гец о1у Рго Хаа о1у 1 5 18 15 «2105 Й -725 «2115 27 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «220» «221» МІ5С ЕЕАТИВЕ «2225 (3)..(27) «223» в'якій Х в положеннях 3, 6, 15, 21, 24, 27 являє собою гідроксипролін «4005 КЖ225

О1у Рго Хаа с1у Рго Хаа с1у Ге Аге с1у Гей біп о1у Рго Хаа о1у 1 5 18 15

Гуз Ге о1у Рго Хаа с1у Рго Хаа с1у Рго Хаа 20 25

«2105 26 «2115 53 «2125 Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «220» «221» ті5с Беаєиге «222» (26)..(26) «223» Хаа може бути будь-якою амінокислотою, що зустрічається в природі «220» «221» ті5с Беаєиге «2225» (32)..(32) «223» Хаа може бути будь-якою амінокислотою, що зустрічається в природі «220» «221» ті5с Беаєиге «222» (35)..(35) «223» Хаа може бути будь-якою амінокислотою, що зустрічається в природі «220» «221» ті5с Беаєиге «222» (41)..(41)

Зо «223» Хаа може бути будь-якою амінокислотою, що зустрічається в природі «220» «221» ті5с Беаєиге «222» (50)..(58) «223» Хаа може бути будь-якою амінокислотою, що зустрічається в природі «4005 726 с1у Гуз Азр сб1у Аге Азр б1у Тиг Гу сб1у бІ1и Гух о1у си Рго о1у 1 5 18 15 біп о01у Гей Аге с1у Гей біп с01у Рго Хаа с1у Гу5 Гец о1у Рго Хаа 20 25 30 о1у Азп Хаа о1у Рго бег с1у 5ег Хаа о1у Рго Гуз Оу бІ1п Гуз о1у 35 4 45

Азр Хаа с1у Гу 5ег 58 «2105 27 «2115 33 «212» Протеїн «213» Штучна послідовність

«223» Синтетична «220» «221» МІ5С ЕЕАТИВЕ «2225» (3)..(33) «223» в'якій Х в положеннях 3, 6, 12, 18, 21, 30, 33 являє собою гідроксипролін «4005 27 со1у АТїа Хаа о1у 5ег Хаа с1у с1и Гуз о1у АТїа Хаа о1у Рго сбІп о1у 1 5 18 15

Рго Хаа с1у Рго Хаа с1у Гух Меє о1у Рго ух с01у о1и Хаа с1у Ар 20

Хаа 25 «2105 28 «2115» 45 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність

Зо «220» «223» Синтетична «220» «221» МІ5С ЕЕАТИВЕ «2225 (3)..(45) «223» в'якій Х в положеннях 3, 6, 9, 27, 30, 36, 42, 45 являє собою гідроксипролін «4005 28 о1у Су5з Хаа о1у Ге Хаа с1у АІїа Хаа о1у Азр Гуз о1у оси Аїа о1Уу 1 5 18 15

Те Азп б1у Гуз Аг» б1у бі Аге б1у Рго Хаа о1у Рго Хаа Оо1у Гуз 20 25 30

А1їа с1у Рго Хаа о1у Рго Азхп с1у Аїа Хаа о1у с1и Хаа 35 4 45 «2105 29 «2115 24 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220»

«223» Синтетична «4005 29

Ге біп Аге АТа Ге бі І1е Гей Рго Азп Аг» Ма! Тпг Пе Гуз АТа 1 5 189 15

Азп Аг Рго Рпе Ге Ма! Рпе Пе 20 «2195 36 «2115 559 «2125 ДНК «2135 Ното зарієп5 «4005» 36 асваввствс Евассстссії вевсстТсТв ТРТРеСТСсвРе ТРЕССасссс СЕСеРеСССВ 6о аавєвевсств аасствсвсї сеРвСсвсстІв всаїсссссв всттЇссаве вгавтатвсс 120 ааєвассавве авсевсвств вассствасї всассссссв встассвсст всвсстстас 188 тТЕсасссаст свасствва встстсссас сІстесваві асвасттсвї саавствавс 2408

ТсевеБевСсса аввсівстіввс сасествївс РевСсаврава всасавасас ввгавсевврсс 300 сстввсааврве асасесєста стсвствввс тссавсстве асаєтасстє ссвстссвас 360

Зо тастссаасв аваавссвії сасееевіїс ваввсстїсї асесавссва вргасатсвас 420 вавівссавв їеєвссссРеРеЕ ававвсвссс асствсвасс ассаствсса саассасств 480

З5 БЕСЕВЕТТСТ аствстсств ссесвсаввс тасвісствс ассетаасаа всвсасствс 540

Есавссствї встссевсс 559 «2195 31 «211» 34 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 31 свевСасасс аєварвствс твассстсстї вес 34 «2195 32 «2115» 33 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична

«4005 32 васаєсасст єссвсЕссва стссаасвав аав 33 «2195 33 «2115» 33 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 33 авсавссств аастасссасв вссвтатссс ааа 33 «210» 34 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 34 свеваєссає вавествств ассстіс 26 «21905 35

Зо «2115 19 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220»

З5 «223» Синтетична «4005 35 ввааєссста ввствсата 19 «2195 36 «2115 19 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 36 ввааєсссста савевсвс 19 «2195 37 «2115 19 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична

«4005» 37 ввааєссста втавтевай 19 «2105» 38 «2115» 25 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 38

ТесСЕВССЕСЕ вІарвівств СТ 25 «2105 39 «2115» 23 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 39 ввааєссаст свЕТаєсстс вва 23 «210» 40 «2115 17 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 40 тссваваата асвавтв 17 «210» 41 «2115» 29 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 41 саєсвааавс Есе еРетав аавттвс 29 «2105» 42 «2115» 27 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220»

«223» Синтетична «4005 42 свсввссвса всІвсісава вЕвтава 27 «219» 43 «2115 28 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 43 сввтаавстє састввсіса вевааата 28 «2105 44 «2115 37 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 44 аавгаавстєв ссвссассаєї вргастївевств Єввааст 37

Зо «21905 45 «2115 31 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 45 свевассстс ааастєтстє вІссассттв в 31 «21905 46 «2115» 36 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 46 аавгааавстєЄ вссвссасса ЄвЕСстсасе австст 36 «21905 47 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність

«223» Синтетична «4005 47 свеваєсстє сЕссстІстаа састсе 26 «2195 48 «2115 9 «2125 Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 48 б1и Рго Гуз бег Су Ар Гуз Тиг Ні 1 5 «2195 49 «211» 4966 «2125 ДНК «2135 Ното 5аріепо «4005 49 ссввасвівв їввЕсесаєвс ствтааєссс австастсвв ваврвсіваве сарвагааєтт 6о

Зо вБсСІсваассс севавресава ввїЕїїеРІвеЕ сІсасасств Тааєсссавс асттєесвав 120 вБствавесав вІвсаєсвсї ЕсЄвеесісаве авїїсаарас савсствввс аасасарева 188 васссссаєс їстасааааа асааааасаа абасааареве ргасааааааа ааааааавас 2408 аавгасаєраа їссаєвавва сававсеїев ааравраавс авсавсстса аавтсствва 300 авствваара асавасааас аврвсесвааа баасєвсств вааавсаастї СЕС 360

ЕСЕ ТТ варте авістсастс ТРІСсвІссавр встврРавтвс авсевівсва 420 тстІсвватса сЕвсаассяс свсстсссав всісааврсаа ЄССЕсСсСтвсс тсавсстссс 480 вавтавствв ваєсаєсаавї еєсвсествсс асасствває васессвта ЕС тавтав 540 аваєвеваєєї їсассаєвсї ввїсаввств вістсааасї сссаасстсв Євгаєссассс 600 ассЕсввсстЇ сссааавтвс ївеРваїсаса вєестасааврсс ассвавссса вссаааався 66а астЕсстаавс стівЕсаарева ассерваасї ввів ЕсСасса ввісстЕСстТв асавввієта 720 аваааєставс савсстваве стввесасвв їввБсСІсасас стЕвсааєсссс авсастстевв 780 ваввестаавв саввівваїєс асстваврввс арвгавіссаа вассавсств ассаасаєев 840 авааасссса ссстассаа ааасаааааа ставрссавевї вів ївРївсС тсевсствтаа 980 тсссавстас тЕвеРваврвсії ваврвівввав вассестєЄва асасаврваав тававвствс 960 авєЕвавстає вассївсавса стЕвсастваа вссеввРесаа савраасаава тссааааааа 1920 авевавгвввї вравреввсава вссаввасєє всЕссаввс євЕсвЕТтасс таввіссвас 1986

Тсстввстсс сававсавссо ЄВТСсСсТЕвСсСсТЇ всствваасії стравсаввс ЄеРрРавісате 11406 вавісваєсіс ссаваасссс ававісаввв арестівврев савреввсаврв Їсаствраса 120806 аасаваєсаа аввївавасс авсвтавввс ївсавассав вссаврвссав ствеврасеввс 1260 "7 асассаєвав втаврвівввс всссасавсс тссствсарв БІВІРеРеІР вРавсасавв 1320 сСТввЕвсссТ сассвссссї вссствссса таврествсів ассстісстве всстТстРІв 1380

ТВЕЕСТСеЕВЕв вссассссст ЄеввСсСссваа БІВвСссСтваа ССТВТВЕТСВ РеЕСЕССТВВС 1440 ассссссввс ТЕтссаврввв автаєвссаа Євассарвав севесвствва ссстваствс 1586 ассссссввс тТассвсствс всстстастї сасссасеєс васстввавс тстЕсссасст 1560 7 стІвсвавтас вастЕєсвІса аввсессвіс аввасервав ввстяевввЕТ їСстСсаревіс 1620

БеввевевІссс саарвавтав ссавевіїса вввасасств вравсавевев ссаввстївв 1680 ссавваввва вгаєсавевссї вєввістсвсс тЕсастссстї вЕвасасств ассссасавс 17406

Твавсісвве вессааврвсв сІвевСссасвс ЇвївесеРесСа врававсаса васасевавс 1880

БевсСсссТвБ сааввасасе сстастсвс ТеввСстссав сстевасаєії асстстссвст 1860 7 ссвастастіс саасваваав ссвІїсасев вєвїїсваввс стЕСстаєсвса вссваревів 1920 авссааваре вєвІїсстІвсаа саєстсавтс Євсвсавств вствіввеев таастствіс 1980

З5 Тсгаввессаве савссствсс тЕтсавсєсс ссассттссс саврввсарвв вгававвссіс 29040

Тевсстваса їсасссасаа Євсаааврасс аааасавссвя Євасстссат сасатсеввс 2186

Тївавсвссаа сЕствавсса веваїсствав васавсаєсв сстсаавіва свсавеваст 2160 7 БВССвБеСсвС авсавстсас всствтаасї ссавсастєї вРєеваввссва вєвстевства 2220 тЕсаєстваве Ісаврвавтсс ааревссавсс ареввсаасас вєвсвааастс таєстссаст 2280 аааастасаа аааєсавсів вєвсеїевівв ТесеЕсасств вгааєсссавс таставввав 2340 вБствавесав вавааєсестї Єваасствсв арвївваввс ївсавсваас ававаєтеса 24080 ссастасасї ссавсствве срасававсї авастссвІс Ісааааааса ааааасаааа 2460 7 асвасвсаврв вєвссвавввс сссаєстаса встрРасааав Сееввссств ссавсеввав 2520 свствссавв аєвЕствасї ссаваєссса вІссствсав авассааств ТвРЕвасстст 2580 веЕсаавсввс їсааєеєстс ТестссттТав ваавстівств сааревіїса всествтавс 2640

СССВСССССТ вевЕСтвасії вастсссстс асставствве СрРасстсвве ссевасасів 2790 ааастсссас ТвевБЕссТааса ваввЕваєсвх Есвсассеє стсссавсвс ЄвствРгавс 2760 тсСвсавсвас сставвсств тааввїватї вєвсссввсас савтїсссвса ссставрасав 2820 васваввсстї ссЕстваввї ссастіствав вісаєсвеваєс ссствРевавв авсссаввсі 2880 ? вваєссссвссо ЖСЕСТСССТС ствасевссії всстввссстІ вссЕсСтсссс савасаєтсва 2940 свавтівссав вївевссссвР вававвсвсс сасствсвас сассаствсс асаассасст з60о

ББВСЕВТЕсС таствстсстї вссевсвсаве стасвісств сассвтїааса авсесассів зе6о стІсавссств ЄвсЕсСсввСС аввісттїсас ссавраввссї вєеРевавсіса всавссства 3120 асасссасвв ссвтасссса аастстссав свсастсас авсаєсавсс ТРрРаврваввв 3180 7 вЕссавтвіс асєстввасї Есе ЕврРавіс стЕСсвасвсв равасасасс серааассст 3240 вЕВЕссстас васттсстса аваєссааас аврасавараа ргаасаєввсс саєссстввв 3300

Баавасаєсь ссссасарвра Тїрааасааа аарсаасасв вІвгассаєса ссеттвЕсас 3360 аваєвааєса рєвавассаса саввстврраа васссастас асвавсасав сесасестїв 3420 сссттаєссв аєввсвссас стааєввсса свт Есассї всесаавсса аасасатсстя 3480 7 Бааавасавс сстссаєся ссесвавас СеРестаєвав сЕсствсаав вісасттвсс 3540 ссЕвааайсс ЕЕтаствсав св Есаваа аваєвеваєсї ЄвРевассеввс саасєвсссвс 3600

Зо БІвсавсастї вЕсваствів вссстсства їваєстассс авіввссвав ТевРавтасат 3660 сасаввїссї ввавсвасса сстасааавс всвРаєсссав тасавствсв ааравгасстт 3720 стасасааєве ааавсвааєе аєввсаааса есеїв ївав встваєвваї стр васвав 3780 7 сІссааарра раааааєсас сссавсств Євавсствсї ЄвРЕврРастає савсссвсас 3840 аасаврвареве свтасасасєе вгаревсаааа вєесаааасстї вєвсваєтс стсввсаавт 3900 сстІвасаєса вєвРїеваасса савсавсаве Твесастттїса тасвасаастї вєвевісстаас 3960 авсевстсає вссвістасв аврсаааваса Єваєвсаєсс вссстврРаса тЕсваасввв 4020 сассстївааа авастаєсас стЕсаєсасас асаавсствв стваавств ЕСЕ сатаса 4де8а 7 тваавветає астсаєваєв сІевстссврРа саасвасата всастваєса аастваасаа 4140 сааавтїсєвта аєсаасавса асассасвсс тастсєвїств ссаараааав аавстваатс 4200 сЕ-таєвавв асаваєваса Єсерааствс асстеваїтее ввастаассс ааагввв 4260 ств сСтава ааєстааєвс асессвасає ассвассєвсї вассаєсааа аасетаствс 4320

Твсасаєваа аавссассстї асссаавеее аавсесаастї встаасаєвс СТРЕС ве 4380 7 стІгаваааврї Реве вСсааве асавствсав аввївасавс вравеввсас ТевївЕСТс дадда аваєсавсваа асавравраввї вєБЕССеївеве авваатавте ЕсствРевІї ссасвааєтв 4580

ТеРеБаавса ввїсавтаєв вавістасас аааавстаєї аастасаєєс сствРваєсва 4560

Бваасаєааєс авєвассє аасесєесвсв сстЕвсавіса авваєссттс асесараа 4620 аєвсствсва авасстїевс авсвасвівв сісраваавс астсаєсаєсї асевтврваса 4680

Тевсавтсвї Тестссассс аааававаасав асессаввсв аввствствї саєстєстсса 4740 стЕвссавтє тааєсєссавс сЕсасссаєсї вастісааврее васаєбааасс асвравгавітва 4800 савісаєстє Євсссассса вЕвтааєвсс астестсааа тасаєсттса стассесааа 4860 аавссавтст сеЕСЕссатас тевствІтвв састєєствта аастесствЕ ссаєвстст 4920

Тв Тааа сттвЕїсІТта їсрааааааа аааааааааа 4960 «2195 56 «2115» 2898 «2125 ДНК «213» мишача «220» «221» Кодуюча послідовність «222» (33)..(2099) «4005 56

БесвсТввас ївсававста ЄвевРївеРсаса сс асв авв ста сс ас с сів 53

Зо Меє Аг Гей Ге І1е Рпе Геи 1 5

ВЕ ств ств ве авт Її БІР вБсс аса ст ств вв їса аав вв сс 1801

Оо1у Геи Ге Тер 5ег їеи Маї Аїа Тиг Гей Гей о1у бег Гуз Тер Рго 10 15 20

Бваа сст вТа с вве СБС СТВ вв СС ССТ вес їїсС сса вав аав тат 149 бі Рго Ма! Рпе с1у Аг» Гей Маї бег Рго б1у Ре Рго би Гу Туг 25 3а 35

БСЇ вас саї саа ваї сва сс треб аса ств асї вса ссс о сст вес тас 197

А1а Азр Ні5х біп Ар Аге 5ег Тер Тс о Ге Тиг АТа Рго Рго су Туг 40 45 58 55 свс ств свсС сс Тас Ес асс сас ТЕС рас ств ваа сс ТсТ Тас свс 245

Аге Гей Агв Ге Туг Ре Тпг Ніб5 Рпе Ар Ге бІ1и Гей б5ег Туг Аге ва 65 78

Тс вав тає вас ЇЇ БІС аав Се авс їса вве асс аав вв ств всс 293

Суз бІи Туг Азр Рпе Маї Гу Гей 5ег бег б1у Тиг Гуз Маї Геи А1Та 75 80 85 аса сб ЇЇ Бе сав вав авї аса вас асї вав сав вса сс вес аає 341

Тиг Ге Суз с1у бІіп б01и бег Тиг Азр Тиг бІи б1іп Аїа Рго о1у Ап 96 95 189 вас асс жїс тас са ств вБвї ссс авс ста аав вїс асс тс сас їсс 389

Азр Тйг Рпе Туг бег Ге б1у Рго бег Ге Гуз Ма! Тиг Рпе Ні 5ег 195 119 115 вас тас сс аає вав аав ссв СС аса вве ТС вав всс тс тає вса 437

Азр Туг б5ег Азп бІи Гуз Рго Рпе Тпг с1у Рпе бі АІ1а Рпе Туг Аа 1209 125 130 135 все вав ваї вів ваї ваа вс ава все СТ ств вва вас са вїс сс 485

А1ї1а бій Ар Маї Ар б1и Суб Аг» Ма! бег Гец б1у Азр 5ег Маї Рго 1406 145 1509

ТВ вас сає тає вс сас аас ас Те вес вес Тас тат ївс Тсс вс 533

Суз Азр Ні Туг Суз Ніз Азп Туг Ге с1у с1у Туг Туг Су 5ег Сузв 155 169 165 ава вс вс тас ас сс сас сав аас аав сас асв ївс са всс ст 581

Аге А1ї1а с01у Туг І1е Ге Ні5 б1іп Азп Гу5 Ні Тг Су 5ег Аа Гец 179 175 1809

ТвІ їса вес сав вв їїсС аса вва ава СТ вве тає сс авт авс сс 629

Суз 5ег б1у біп Ма! Ріпе Тпг с1у Аг» бег О01у Туг Гей 5ег 5ег Рго 185 199 195 вав тас ссв сав сса ас ссс о аав сс сс авс вс асс тас авс атс 677 бІ1и Туг Рго бІп Рго Туг Рго Гуз Ге бег бег Суз Тиг Туг бег Пе 299 295 219 215 свс ств вав вас вес тс авт вс асс ств вас сс вв вав сс Тс 725

Аге Гей бі Азр б1у Рпе б5ег Ма! І1е Ге Ар Рпе Ма! б1и 5ег Рпе 229 225 230

Зо ває вії вав асв сас сстІ раа всс о сав вс ссс таї вас сс сс аав 773

Азр Маї си Тиг Ні Рго обоТи Аїа бІп Су Рго Туг Азр 5ег Гецй Гу 235 240 245 ас саа аса вас аав веб ваа сас вс сса ТТ 5 рРеБбБ аав асев сів 821

І1е б1п Тег Ар Гуз о01у бій Ніб5 01у Рго Рпе Суб5 о1у Гу Тиг Ге 2509 255 260 ссСТЇ ссс авбв асї ваа асї вас авс сас аав вв асс ас асс 1 всс 869

Рго Рго Аге І1е бі Тйг Ар бег Нібх Гуз Ма! Тйг І1е Тпг Рпе АТа 265 279 275 астї вас вав їсе БР аас сас аса вес їв аар аса сас тас аса авс 917

Тиг Азр бІи 5ег б1у Ап Ні Тпг б1у Тер Гуз Іе Ні Туг Тиг 5ег 280 285 298 295 аса вса сеБ ссс ТвсС ссТ ває сса асб все сса сс ааїєї ввс авс ат 965

Те АтТа Аг» Рго Суб Рго Ар Рго Тпг АТа Рго Рго Азхп о01у бег І1е 399 395 319 їса сст вїв саа всс асе таї вїс ств аав вас авв ЕЕ СТ віс С 1813 б5ег Рго Ма! біп Аїа Тйг Туг Маї Гей Гуз А5зр Аге Ре бег Ма1 РПе 315 320 325

Тс аав аса вес Тс вав стї ств саа вв СТ вс ссс ств ааа їса 1861

Суз Гуз Тпг б1у Рпе бІ1и Ге Гей б1п с1у 5ег Маї Рго Геци Гу 5ег 330 335 340 тс оаст СЕ вїс ївїЇ сав ааа ват вва СТ ївбрР вас свв ссв атв сса 1189

Рпе Тпг АТа Маї Суб5х б1п Гуз Азр о1у бег Тгр Азр Аге Рго Меє Рго

345 359 355 вав ївс авс а акт ватє св вес сстТ ссс ває вас ста ссс аає вс 1157 бі Сузх бег ІТІе ІІе Ар Су с1у Рго Рго Азр А5р Геий Рго Азп о01у 360 365 379 375 сає вв вас тає ас аса вБС ссТ саа вїб астї асс тас ааа вс вів 1285

Ні Маї Азр Туг ІІїе Тпг с1у Рго б1п Ма! Тег Тиг Туг Гуз А1а Маї 389 385 399 ас сав тас авс ТїеїЇ враа вав астї (с тТас аса асе авс авс аає вв 1253

Те бІ1п Туг бег Суз бІ1и 01 Тиг Рпе Туг Тиг Меї 5ег 5ег Азп с1у 395 489 4985 ааа тає вв ЕВ вав всі ває вва ТС ївеБ асе авс їсс ааа вра ваа 1301

Гуз Туг Маї Суз бІ1и А1їа Ар с1у Рпе Тгр ТПг 5ег 5ег Гуз о1у си 416 415 4209 ааа стс ссс о ссв ВЕС ЇЇ вав сстї ВЕ Ї8БЇ вРБ ств їсс аса сас ас 1349

Гуз Гей Рго Рго Маї Су5х бі Рго Ма! Сух о1у Ге бег Тиг Ні ТАг 425 430 435 аса вва вва свс аса її вва вве сав сст вса аав сс БЕ вас 1397

І1е о01у с1у Аге5 І1е Ма! с1у о1у б1п Рго А1їа Гу5 Рго о01у Азр Ріе 440 445 456 455

СсСЕ ТвБ саа БІС ТТБ Сб СТР вв саа астї аса бса вса вса вв вса 1445

Рго Тер бІп Маї Ге Гей Ге сб1у б1п Тиг Тиг Аїа АТ1а Аїа о1у АІа 460 465 479

Зо

СТЕ аса саєс вас аає се вБІс ста аса всс всЕ сає вс вта тає вав 1493

Їеч ІІе Ні5 Ар Ап Тгр МаїЇ Ге Тпг Аїа Аїа Ніх5 А1а Ма! Туг си 475 486 485

З5 ааа ава аєв вса все сс Тсс ств аас ас сва аєв вес атс сс ааа 1541

Гуз Аге Меї Аїа А1а бег бег Гей Азп І1е Аг» Меї о1у Пе Геи Гуз 498 495 589 авв сЕс їса сстЕ сає тас астї саа всс ївеБ ссс вав раа асс її ата 1589

Аге Гей бег Рго Ніх Туг Тпг б1іп Аїа Тер Рго бі б1и І1е Рпе Пе 585 519 515 сає ваа вес тас аст сас БЕ СТ ввЇ ЇЇ вас аає вас ата вса її6 1637

Ні5 бІи о1у Туг Тйг Ніх б1у Аїа с1у Ріпе Ар Азп Азр ІІе А1а Ге 528 525 539 535 ассєааа сс аавр аас ааа вс аса асс аас вва авс аєс асв сст ві 1685

Те Гуз Гей Гуз Азп Гуз Ма! Тийг І1е Азп с1у бег І1е Меї Рго Маї1 540 545 558

Твбс ста сс сва ааа ваа вс вса їсс їтТа аєб ава аса вас с аст 1733

Суб Ге Рго Аг» Гу5 бі Аїа А1ї1а 5ег Ге Ме Аге Тиг Ар Ре Тпг 555 569 565

Ба аст БІВ ВСІ ЕС ТБ РЕБ їТа асс сав аав вве СЕТ СТ вс ава 1781 с1у Тиг Маї А1а сі1у Тер о1у Ге Тиг б1п Гу5х о1у Гей Гей Аа Аге 578 575 589 аас ста аєв ЇЇ веб рас ата сса ас вс вас сас саа ааа Т8ї асс 1829

А5зп о Гец Мет Рпе Маї Азр ІІе Рго І1е А1а А5р Ні5 бІп Гуз Суз Тиг 585 599 595 асс вїв Таї ваа аав сс тат сса вва вта ава вста авс всї аас ат 1877

Тис Маї Туг бІи Гу5 Ге Туг Рго сб1у Ма! Аге Маї бег А1а Азп Мей вав 605 619 615

СТС ТТ вСТ вБС ЇїТа вав асї в5Бї вес аав вас авс ївсС ава вв вас 1925

Гей Суз Аїа с01у Ге б1и Тийг б1у с1у Гу5 Ар бег Суб Аге О1у Азр 620 625 630 авї вг85 РеБ вСса та вв ЇЇ ста вас ааї вав аса сав сва Твв її 1973 б5ег б1у б1у Аїа Гей Маї Ре Гей Ар Азп біи Тийг біп Аге Тер РПе 635 640 645

БЕ вБа вва аса ЕТ сс ТР ввІ їсс ас аасє сь вве все вса вс 29021 маї с1у с1у І1е Маї б5ег Тер ос1у бег І1е Азп Сух с01у Аїа Аї1а о1у 6509 655 6в6О сав тає вв вїс Тас аса ааа вїс ас аас тає ас ссс тв аає вав 2069 б1іп Туг с01у Маї Туг Тиг Гуз Ма! Іе Азп Туг ІІе Рго Тер Азп с01и 665 679 675 аас аба аба авї аає с таа 2899

Азп І1е І1е бег Азп РПе 680 685 «2105 51

Зо «2115» 685 «212» Протеїн «2135 мишачий «4005 51

Мет Аг» Гей Ге І1е Рпе Гей с1у Ге Гей Тер бег Гец Маї Аїа Тиг 1 5 18 15

Гей Гей о01у бег Гу5 Тер Рго бій Рго Ма! Рпе о1у Аге Ге Маї 5ег 20 25 30

Рго б1у Ре Рго бі Гу Туг АТа Ар Ні5 біп Азр Аге 5ег Тер Тиг 35 4 45

Ге Тйг АТа Рго Рго б1у Туг Аг Гей Аг Гей Туг Ре Тиг Ні Ре 58 55 ва

Азр Гей бі Ге бег Туг Аге Су5 біи Туг Азр Рпе Маї Гу Гецй 5ег 65 78 75 ва б5ег б01у ТиИг Гуз Маї Ге А1їа Тиг Ге Суз б1у б1п 01 бег Тпг А5р 85 90 95

Тиг бІ бІ1п АТа Рго с1у Ап Азр Тс Ре Туг 5ег Ге о1у Рго 5бег 166 185 116

Гей Гуз Ма! Тис Рпе Ні бег Азр Туг бег Азп бі Гу5 Рго Ре ТЕиг 115 1208 125 с1у Рпе бі А1ї1а Рпе Туг Аї1а Аїа бІи Азр Ма! Азр бІи Су5 Аге Маї 138 135 140 б5ег Ге оІ1у Азр бег Ма! Рго Су Ар Ні Туг Су5 Ні Азп Туг Ге 145 158 155 160 с1у о1у Туг Туг Суз б5ег Суб Аге Аїа с1у Туг І1е Гец Ні бІп Ап 165 176 175

Гуз Ні Тис Суб бег АТа Ге Су5х 5ег б1у біп Ма! Рпе Тиг о1у Аге 188 185 199 б5ег б1у Туг Гей 5ег бег Рго біи Туг Рго біп Рго Туг Рго Гуз Ге 195 290 295 б5ег б5ег Су5 ТИг о Туг бег І1е Аге Гей бій Азр б1у Ре 5ег Ма! І1е

Зо 216 215 229

ІГец Азр Рпе Маї бій б5ег Рпе Азр Маї сб1и Тпг Ні Рго би А1а сп 225 230 235 240

Суз Рго Туг Азр бег Ге Гуз Іе бІп Тиг Азр Гуз с1у оЇи Ні о1у 245 258 255

Рго Рпе Сух 01у Гу Тйг Гей Рго Рго Аге І1е б1и ТПг Ар 5ег Ні 260 265 279

Гуз Ма! Тис ІІе Тис Рпе А1їа ТПг Ар біи б5ег 01у Азп Ніх Тиг о1у 275 2808 285

Тер Гуз І1е Ні5 Туг Тийг бег Тг АТа Аг» Рго Су Рго Азр Рго ТЕпг 298 295 309

А1а Рго Рго Азп с1у бег І1е бег Рго Ма! б1іп Аїа Тиг Туг Маї Ге 395 316 315 329

Гуз Азр Аге Ре бег Маї Ре Су5 Гух Тпг о1у Ре о1и Гец Гей сп 325 339 335 о1у бег Маї Рго Гей Гуз бег Рпе Тпг АТа Маї Су5 бІп Гуз Ар о01у 340 345 359 б5ег Тер Ар Ага Рго Меї Рго бій Су5х бег І1е І1е Ар Су5 Оо1у Рго 355 зва 365

Рго Азр Ар Гец Рго Ап б1у Ні5 Ма! Азр Туг І1е Тпг с1у Рго б1п 3708 375 389

Ммаї Тис Тис Туг Гуз Аїа Маї ІІе біп Туг бег Су5х 01 бІ1и Тпг Рпе 385 390 395 4ев

Туг Тс Ме 5ег бег Азп б1у Гуз Туг Ма! Суз б1и А1а Азр с1у Рпе 405 416 415

Тер Тс бег о б5ег Гуз с1у бТи Гуз Ге Рго Рго Маї Суз си Рго Маї 420 425 430

Суз с1у Гец бег Тпг Ніх Тиг І1е с1у с1у Аг» І1е Маї о1у о1у сІп 435 44о 445

Зо Рго Аїа Гу Рго б1у Азр Рпе Рго Тер біп Маї Гей Гей Гей с1у б1п 4506 455 460

Тиг Тс АТа А1а ДІіа с1у ДІа Ге І1е Ні5 А5р Азхп Тгр Маї Геи Тиг 465 470 475 480

А1а А1ї1а Ніб5 Аїа Маї Туг бій Губ5 Аг» Меї Аїа А1а 5ег 5ег Гецй Авп 485 490 495

І1е Аг Меє с1у І1е Гей Гу5 Агв Гец 5ег Рго Ні5 Туг Тиг б1іп АТа 580 505 518

Тер Рго бТїи 010 І1е Рпе І1е Ні5 бі с01у Туг Тиг Ні5 о1у А1а о1у 515 529 525

Рпе Азр Ахп Ар І1е Аїа Гей Іе Гух5 Ге Гу5 Азп Гуз Ма! Тис Пе 539 535 540

Азп б1у б5ег ІТ1е Меї Рго Ма! Су5 Гец Рго Аге Гуз б1и А1а Аа 5ег 545 559 555 560

Ге Меє Аг» Тиг Азр Рпе Тиг б1у Тпйг Маї Аїа о1у Тер о01у Геци Тпг 565 5708 575 біп Гу5х с1у Ге Ге А1їа Аг» Азп Ге Меє Рпе Ма! Азр І1е Рго Пе 589 585 599

А1а Азр Ніх б1п Гуз Суз Тийг Тйгс Маї Туг оТи Гуз Ге Туг Рго а1у 595 6о0 605

Мма1 Аг» Маї бег АТа Азп Меє Гей Су5х Аїа о01у Гей б1и Тпг с1у с1у 618 615 6206

Гуз Азр бег Суб Аг» б1у Ар бег б1у с01у Аїа Ге Маї Ре Геци Ар 625 630 635 640

Азп бій Тс біп Асе Тер Рпе Ма! с1у о01у І1е Ма! 5ег Тер с1у 5ег 645 6509 655

Іе Азп Су5х с1у А1а АТїа с1у б1п Туг о01у Маї Туг Тиг Гуз Маї І1е 6в6О 665 679

А5зп Туг І1е Рго Тер Азп бІ1и Азп ІІе І1е бег Ап РПе 675 680 685

Зо «2105 52 «2115 676 «212» Протеїн «213» мишачий «4005 52

Те Ге Гец с01у бег Гу5 Тер Рго бІ1и Рго Ма! Рпе о1у Аге Гей Маї! 1 5 18 15 б5ег Рго б1у Рпе Рго бі Гу Туг АТа Ар Ні біп Ар Аге 5ег Тгр 20 25 30

Те Се Те АТа Рго Рго б1у Туг Аг Гей Аг Ге Туг Ре Тиг Ні 35 4 45

Рпе Азр Ге бі Ге бег Туг Аг» Су5 бі Туг Азр РПпе Маї Гу Гец 58 55 ва б5ег 5ег б1у Тйг Гуз Ма! Ге Аїа ТПг Ге Суз с1у бІп б01и бег Тиг 65 78 75 80

Азр Тйг б1и б1п АТа Рго б1у Азп Ар Тйг Рпе Туг бег Гей со1у Рго 85 90 95 б5ег Ге Гуз Ма! Тийг Рпе Ні бег Ар Туг бег Азп бІи Гуз Рго Ре 166 185 116

Те б1у Рпе бій Аїа Рпе Туг Аї1а А1а б1іи Ар Маї Азтр о1Їи Су Аге 115 1208 125

Ммаї бег Ге б1у Азр бег Маї Рго Су Азр Ні Туг Су Ні Азп Туг 1308 135 140

Гени с1у с1у Туг Туг Су5 бег Су5 Аге АІїа с1у Туг Те Гец Ні сІп 145 158 155 160

А5зп Гуз Ні Тпг Суб бег Аїа Ге Су5з 5ег б1у б1п Ма! Ре Тиг о1у 165 178 175

Аге бег 01у Туг Ге 5ег 5ег Рго бІи Туг Рго бІп Рго Туг Рго Гу 188 185 199

Гей б5ег бег Су5 Тиг о Туг бег І1е Аге Гей бій Азр о1у Ріе 5ег Маї! 195 290 295

Зо

ІІе Ге Азр Рпе Маї обТи 5ег Ріпе Азр Ма! сб1и Тиг Ні Рго си А1а 2168 215 229 бІіп Су5 Рго Туг Азр бег Гей ух Іе б1п Тпг Азр Гух5 о1у си Ні 225 230 235 240 с1у Рго Рпе Сузх сб1у Гу5 Тпг Гец Рго Рго Аге І1е біи Тиг Ар 5ег 245 2509 255

Ніб5 Гуз Ма! Тйг ІТе Тпг Рпе Аїа Тпг Азр бІи бег б1у Ап Ні Тиг 260 265 279 с1у Тер Гуз І1е Ні Туг Тйг б5ег Тиг А1Та Аге Рго Суб Рго Ар Рго 275 2808 285

Тиг АТа Рго Рго Азп с1у бег І1е бег Рго Ма! б1іп А1їа Тиг Туг Маї1 2908 295 309

Гей Гуз Азр Аг» Рпе бег Маї Ре Су Гух Тиг о1у Ре о1и Геи Геи 395 316 315 329 б1іп о1у бег Маї Рго Гей Гуз бег Ріпе Тпг АТа Маї Су5 бІп Гуз Ар

325 339 335 с1у бег Тер Азр Аге Рго Меї Рго бі Сух 5ег І1е І1е А5зр Сух Оо1у 340 345 359

Рго Рго Азр Ар Ге Рго Азп с1у Ніх5 Ма! Азр Туг І1е Тиг с1у Рго 355 зва 365 б1іп Маї Тийг Тис о Туг Гуз АТїа Ма! Те б1іп Туг бег Су5 о01и си Тиг 3708 375 389

Рпе Туг Тйг Меж бег бег Азп с1у Гух Туг Маї Сух о1и Аї1а Азр о01у 385 399 395 4ев

Рпе Тер Тиг бег бег Гуз б1у бІи Гу Ге Рго Рго Ма! Су сІи Рго 405 416 415

Ммаї! Сух о1у Ге бег Тпг Ні Тпг І1е о01у о1у Аге І1е Ма! с1у о1у 420 425 430 б1іп Рго Аіїа Гух5 Рго о0Т1у Азр Ре Рго Тгр бІп Ма! Гей Геи Гей о1у 435 44о 445

Зо б1іп Тис Тпг АТа Аїа АТїа с1у АТа Ге ІІе Ні Азр Азп Тер Маї Ге 4506 455 460

Типе АтТа Аї1а Ні5 Аїа Маї Туг бій Гуз Аг» Меї АТа А1а 5ег 5ег Геи 465 470 475 480

Азп І1е Аг» Меї сб1у І1е Гей Гу5 Агв Гей 5ег Рго Ні Туг Тиг бІп 485 490 495

А1а Тер Рго 010 б01и І1е Рпе І1е Ні5 01 с1у Туг Тиг Ні о1у Аа 589 595 518

Оо1у Ре Ар Азп Ар І1е ДІа Ге ІТІе Гуз Гей Гуз Азп Гуз Ма! Тиг 515 529 525

І1е Ахп б1у 5ег І1е Ме Рго Маї Су5 Гей Рго Аг» Гу5 б1и АІа А1Та 539 535 540 б5ег Ге Меє Аг» Тпг Ар Ре Тпг с1у Тиг Маї Аїа о1у Тер о1у Ге 545 550 555 560

Те б1іп ух о1у Ге Ге АТа Аге Ап Ге Ме Ре Маї Ар І1е Рго 565 579 575

І1е АТа Ар Ні5 б1п Гу5 Суб Тиг Тиг Маї Туг би Гу Гец Туг Рго 589 585 599 с1у Маї Аг Ма! 5ег А1а Ахп Меї Ге Су5х А1ї1а о1у Ге бІи Тиг о1у 595 6о0 605 о1у Гуз Азр 5ег Су Аг» б1у Ар бег б1у сб1у АІа Гец Маї Ре Ге 618 615 6206

Азр Азп бі Тс біп Аве Тер Рпе Ма! с1у о1у І1е Ма! 5ег Тер 01у 625 630 635 640 б5ег І1е Азп Сух б1у А1ї1а ДАіа с1у б1п Туг с1у Маї Туг Тиг Гуз Маї 645 6509 655

І1е Ахп Туг І1е Рго Тер Азп бі Азхп І1е І1е 5ег А5зп РПпе 6в6О 665 679 «2105 53

Зо «2115 2891 «2125 ДНК «2135 щура «220» «221» Кодуюча послідовність «222» (18)..(2067) «4005 53

ТвЕсСасаса асв авв ста ств асс вс сів БІ ств СІЇ ївеБ авт в Рів 51

Мет Аг Гей Гей І1е Маї Ге с1у Гей Ге Тер 5ег Гецй Маї! 1 5 18 вБсс аса ст ТТБ вБС сс аав їв ССТ вав сст ва с РеБ СсвС сів 99

А1а Тпг Ге Ге о1у 5ег Гуз Тер Рго бі Рго Ма! Рпе с1у Аг» Гец 15 20 25 30

ВЕБ їсСсС ств вБсСс Тс сса вав аав таї вєБвБс аас сасї сав ває сва їсс 147

Ма! 5ег Ге АТа Рпе Рго бій Гух Туг 01у Ап Ні5 б1п Ар Аге 5ег 35 4 45

ТБ асв ств астї вса ссс о сстТ вес ТС свс ств свС сс Тас ї-с асс 195

Тер Тс Ге Те АТа Рго Рго б1у Рпе Аг» Гей Аге Ге Туг Ре ТАг 58 55 ва сас тс аас ств ваа сс СТ Тас сес ївсС вав тає вас Є вс аав 243

Ні Рпе Ахп Гей біи Ге бег Туг Аге Су5 біи Туг Ар Ріе Ма! Гуз 65 78 75

ТЇїв5 асс са вєвБ асс аав вв ста всс асв ств ЇЇ вве сав вав авт 291

Їец Тйг бег б1у Тийг Гуз Маї Ге А1а Тиг Ге Су5 с01у біп о1їи 5бег 80 85 90 аса ває астї вав свв вса сстЇ вес аає вас асс тс тас їса ств вві 339

Те Азр Тс бій Ас АТа Рго б1у Азп Азр Тпг Рпе Туг 5ег Геци с1у 95 189 195 119 ссс авс ста аав вїс асс тс сас сс вас ас сс ааї вав аав сса 387

Рго бег Ге Гуз Ма! Тис Рпе Ні бег Азр Туг бег Абзп 01и Гу Рго 115 1209 125 їс оаса вва СТ вав всс тс таї вса все вав ваї вв вас ваа вс 435

Рпе Тиг б1у Рпе обоІ1и Аіа Рпе Туг Аїа Аї1а си Азр Маї Ар си Су 130 135 140 ава аса їсс ств вва вас са вс сс БІ вас сає тає вс сас аас 483

Аге Тс обег Ге б1у Азр 5ег Ма! Рго Суб Ар Ні Туг Су Ні Ап 145 158 155

Тас ств вес вес тас тас вс сс ївсС сва їв вес тас ак ств сас 531

Туг Геи с1у с1у Туг Туг Су5 бег Суз Аг» Ма! о1у Туг Пе Геци Ні 166 165 179 сав аас аав сає асс вс са всс СЕС ТвїЇ їса вес сав вів -4їс ас 579 б1п Азп Гуз Ні Тиг Суб б5ег Аїа Геи Суз бег б1у бІп Маї Ре Тиг 175 1809 185 199

Бе авв сії вес ТТ стс авт авс ссїЇ вав тТас сса сав сса тас ссс 627

Зо О1у Аге бег б1у Рпе Гей бег б5ег Рго бій Туг Рго біп Рго Туг Рго 195 299 295 ааа сс тсс авс вс вБсс Тас аас ас свс ств вав ваа вес тс авт 675

Гуз Гей бег бег Су5х АТа Туг Азп І1е Аг» Ге бі бі о1у Ре 5ег

З5 216 215 229 ассоасс ств вас Ес вв вав сс т ваї їв вав ав сас сст ваа 723

Те Тиг Гей Азр Рпе Маї б1и бег Рпе Азр Маї оТи Меї Ні Рго с1и 225 238 235 всс сав вс ссс тас вас сс сс аав ассї саа аса вас аав аве ваа 771

А1а б1іп Суб Рго Туг Азр 5ег Гей Гу5 Іе біп ТПйг Ар Гуз Аге бІи 248 245 2509

Тас вс ссе ТЕ БІ врРрР аав ас ств ссс ссс арв ас! ваа ас вас 819

Туг б1у Рго Рпе Су5 о1у Гу5 Тг Гец Рго Рго Аге І1е бі Тиг А5р 255 260 265 279 авс аас аав вв асс аєсс асс її асс асс вас вав їса вве аас сас 867 б5ег Азп Гу5 Ма! Тпг І1е Тиг Рпе Тийг Тпг Ар бій б5ег о01у Ап Ні 275 280 285 аса вес їЇеБ5 аав аса сас тас аса авс аса вса сав ссс вс ссТ ват 915

Тиг о1у Тер Гуз ІТ1е Ні5х Туг Типг бег Тиг АТа бІіп Рго Су Рго Аз5р 298 295 389 сса асб все сса сст ааї вБЕ сас ас са сстЇ їв саа всс асв тах 963

Рго Тйг АТїа Рго Рго Ап б01у Ні5 І1е бег Рго Ма! біп Аїа Тиг Туг 395 316 315

БЕсС ств аавр вас авс ЕСЕ СТ ВЕС Тс вс аав астї вес Тс вав ст 1811

Ммаї Гей Гуз Азр бег Рпе бег Ма! Рпе Су Гуз Тиг с01у Ре о Ге 329 325 330 ств саа вт СТЕ вс ссс ств аав їса єс астї СТ вїс твБЇ сав ааа 19859

Їец бІп с1у 5ег Маї Рго Гец Гуз бег Рпе Тпг АТа Маї Су бІп Гуз 335 340 345 359 ває вва СТ ве вас свв ссв ата сса вав ївс авс ак ак вас ві 1187

Азр б1у бег Тгр Ар Аге Рго І1е Рго бі Сух5 5ег І1е І1е А5р Су 355 360 365 вс о сССТ ссс оває вас ста ссс аає вес сас вБївБ вас тає ас аса вс 1155

О1у Рго Рго Азр Азр Гей Рго Азп б1у Ні5 Ма! Азр Туг І1е Тиг о1у 379 375 зва

СсСТЇ ваа вїб асс асс тас ааа вБСсТЇ вв ас сав ас авс Її ваа вав 1283

Рго бІ1и Маї Тийг Тиг о Туг Гуз АТїа Маї І1е бІп Туг бег Су5 си о1и 385 399 395 асїЕ сс тас аса аєсбв авс авс аає вєвї ааа тає все її вав вст ват 1251

Тис Ре Туг Тийг Меж 5ег бег Азп б1у Гуз Туг Маї Су5з о1и А1Іа Ар 460 4985 416 вва їїс тер асбв авс їсс ааа вва ваа ааа їсс сс ссв в вс аав 1299

Оо1у Ре Тер ТиИг 5ег бег Гуз оО1у бТ1и Гуз 5ег Гей Рго Маї Су Гуз 415 4209 425 430

Зо ССТ ВЕС ТБІ вва ств їсСс аса сас астї їса вра вс сеї ата ас вва 1347

Рго Ма! Субх о1у Ге 5ег ТПг Ні5 Тиг о бег о01у б1у Аг5 І1е Пе О1Уу 435 440 445 вва сав сстї вса аавр сстї ввї вас СЕ сст ївБ саа БІС Тв їїа сів 1395 с1у б1п Рго А1ї1а Гух5 Рго б1у Ар Ріпе Рго Тгр біп Маї Гецй Геци Ге 456 455 4606

БВЇ ваа асї аса вса вса вв вс сІїЇ ата сає вас вас те вїс ста 1443 о1у оТи Тйг Тис АТа АТа с1у АІа Ге ІІе Ні Ар Азр Тгр Маї Геи 465 470 475 аса все вст саїє вс ва таї вер ааа аса вав все асв сс їсс ств 1491

Тиг АТ1а АТїа Ні5 Діа Ма! Туг о1у Гуз Тиг бІ Аїа Меї бег 5ег Ге 480 485 498 вас асс свс аєв вес асс стс ааа аве сс Тсс стс ас ас аст саа 1539

Азр І1е Аге Меї о1у І1е Гей Гу5 Аг» Ге бег Гей І1е Туг Тиг бІп 495 589 585 518

БСС ТвБ сса вав вс вІС ЇЇ аїс саїє ваа вес тас аст сас вва вс 1587

А1а Тер Рго 610 Аїа Ма! Рпе І1е Ні5 01 с1у Туг Тиг Ні о1у Аа 515 528 525

БВ ЕСЇ вас аає вас аста вса ств асї ааа сс аабв аас ааа вс аса 1635 с1у Рпе Азр Азп Азр І1е Аїа Гей І1е Гуз Гей Гу5 Азп Гуз Ма! Тиг 539 535 548 асс аас ава аас ас асв ссв асє св ста сса авра ааа ваа вБсТ вса 1683

І1е Азп Аге Азп І1е Ме Рго І1е Су Гей Рго Аге Гу б1и Аа А1Та

545 550 555 сс їїта аєбв ааа аса вас сс вБІїЇ вра асї Її СТ тес їБР ввв їїТа 1731 б5ег Ге Меє Гуз Тпг Азр Рпе Ма! с1у Тиг Маї Аїа су Тер о1у Ге 560 565 578 асс сав аав вве ТЕТ СТ вБСТЇ ава аас ста асв ЇЇ вї6 вас ата сса 1779

Те б1іп ух б1у Рпе Ге АТа Аге Азп Ге Ме Ре Маї Ар І1е Рго 575 589 585 598 ас в вас сас саа ааа БЕ БвБст астї все тає аса аав сав ссс тас 1827

Іе Маї Азр Ніх сб1п Гуз Сузх АІїа Тиг АТа Туг Тиг Гуз бІп Рго Туг 595 6аа 605 сса вва вса ааа вів асї вБїї аас аєв стс ТР ВСІ вес ста вас свс 1875

Рго б1у АТїа Гух Маї! Тйг Маї Ахп Меї Ге Суб А1а с1у Гей А5р Аге 619 615 6209

БВЇ вес аар вас авс їв6с ава веї вас авс вра вве вса а їв ТС 1923 с1у о01у Гуз Ар бег Суб Аг» б1у Ар 5ег б1у о01у АІїа Гец Маї Рпе 625 639 635 ста вас ааї ваа аса сав ава їевБ ЇЇ ве вра вва аїа ВЕС сс їв 1971

Гей Азр Ап біи Тйг о біп Асе Тер Рпе Ма! с1у о01у І1е Маї 5ег Тер 640 645 659

БЕ ст ас аас БІ ве БРЕ їсСа ваа сав тає веб вс тас асе ааа 2019 о1у бег І1е Азп Сух с01у с1у бег 01 бІіп Туг о1у Маї Туг Тиг Гуз 655 66а 665 679

Зо

БЕсС асв аас тає ас ссс твБе ас вав аас аба аба ааї аає с таа 2067

Ммаї Тпг Азп Туг ІШе Рго Тер І1е бТи Азп ІІе І1е А5п Азп Ріе 675 680 685

З5 тТЕтвсааааа аааааааааа аааа 2091 «2105 54 «211» 685 40 «2125 Протеїн «213» щура «4005 54 45 Мет Аг» Гей Ге І1е Ма! Ге о1у Ге Гей Тер бег Гец Маї Аїа Тиг 1 5 189 15

Гей Гей о01у бег Гу5 Тер Рго бій Рго Ма! Рпе о1у Аге Ге Маї 5ег 50 20 25 3а

Гей АТїа Рпе Рго біи Гу Туг б1у Ап Ніб5 біп Азр Аге бег Тгр ТАпг

Ге Тйг АТа Рго Рго б1у Ре Аг Гей Аг Гей Туг Ре Тиг Ні Ре 58 55 ва

Абп Ге бі Ге бег Туг Аге Су5 біи Туг Азр Рпе Маї Гуз Гец Тиг 65 70 75 80 б5ег б01у ТиИг Гуз Маї Ге А1їа Тиг Ге Суз б1у б1п 01 бег Тпг А5р 85 90 95

Те бій Ас АТа Рго б1у Ап Азр Тйг Рпе Туг бег Гец О1у Рго 5ег 166 185 116

Ге Гуз Ма! Тийг Ре Ні бег Азр Туг 5ег Ап бі Гуз Рго Ріпе Тиг 115 129 125 с1у Рпе 610 А1ї1а Рпе Туг Аї1а Аїа б1и Азр Маї Азр бІи Су5 Аге Тиг 1308 135 140 б5ег Ге оІ1у Азр бег Ма! Рго Су Ар Ні Туг Су5 Ні Азп Туг Ге 145 158 155 160 с1у о1у Туг Туг Суз бег Суб Аге Ма! с1у Туг І1е Гец Ні бІп Ап 165 176 175

Зо Гуз Ні Тис Суб бег АТа Ге Су5х 5ег б1у біп Ма! Рпе Тиг о1у Аге 188 185 199 б5ег б1у Ре Ге бег 5ег Рго бТи Туг Рго бІп Рго Туг Рго Гуз Ге 195 290 295 б5ег б5ег Су5х АІїа Туг Ахп І1е Аге Гей біи бій б01у Ре бег І1е Тпг 216 215 229

ІГец Азр Рпе Маї бій б5ег Рпе Азр Ма! с1и Меє Ні5 Рго би А1а сп 225 230 235 240

Суз Рго Туг Азр бег Ге Гуз І1е б1п Тпг Ар Гуз Аге б1и Туг сб1у 245 258 255

Рго Рпе Сух 01у Гу5 Тйг Гей Рго Рго Аге І1е бій ТПг Ар 5ег Авп 260 265 279

Гуз Ма! Тиг І1е Тийг Рпе Тиг Тийг Азр 01 бег с01у Азп Ніх Тиг с1у 275 2808 285

Тер Гуз Ше Ні Туг Тийг бег Тиг АТїа б1п Рго Су Рго Ар Рго Тпг 2908 295 309

А1а Рго Рго Азп б01у Ні5 ІІе бег Рго Ма! б1п Аїа Тиг Туг Маї Ге 395 316 315 329

Гуз Азр бег Рпе бег Ма! Рпе Су Гуз Тиг с01у Ре си Гей Геи бІп 325 339 335 о1у бег Маї Рго Ге Гуз б5ег Рпе Тиг Аїа Маї Су5 бІп Гуз Азр о01у 340 345 359 б5ег Тер Азр Аг Рго І1е Рго бій Су5х бег І1е І1е Ар Су5 Оо1у Рго 355 зва 365

Рго Азр Азр Гей Рго Азп б1у Ні5 Ма! Азр Туг І1е Тиг с1у Рго с1и 379 375 389

Ммаї Тис Тис Туг Гуз Аїа Маї ІІе біп Туг бег Су5х 01 бІ1и Тпг Рпе 385 399 395 4ев

Туг Тс Ме 5ег бег Азп б1у Гуз Туг Ма! Су5 бІ1и А1а Азр с1у Ре 405 416 415

Зо

Тер Тс бег б5ег Гуз с1у би Гуз бег Гец Рго Маї Суз Гуз Рго Маї 420 425 430

Суз с1у Гец б5ег Типг Ні Тийг б5ег б1у о1у Аг І1е І1е с1у о1у бІп 435 44о 445

Рго Аїа Гуз Рго о1у Азр Ріпе Рго Тгр бІп МаїЇ Геи ей Ге с1у о1и 450 455 460

Тиг Тс АТа Аїа о1у А1їа Гей І1е Ні Ар Азр Тгр МаїЇ Геи Тиг А1а 465 470 475 480

А1а Ні5 А1а Маї Туг с1у Гуз Тйг бій А1їа Меє 5ег бег Гей Азр Пе 485 490 495

Аге Меє о1у ІІе Гец Гуз Аг Гей бег Ге І1е Туг Тг сп Аа Тер 580 505 518

Рго бій Аїа Ма! Рпе І1е Ні5х сій с1у Туг Тиг Ні5 сб1у А1а с1у Рпе 515 529 525

Азр Азп Азр І1е АТїа їеи ІІе Гуз Гей Гуз Азп Гуз Ма! Тиг І1е Ап

539 535 540

Аге Азп ІТ1е Меї Рго І1е Сух5 Гей Рго Аге Гу5 б1и А1а А1а 5ег Гец 545 559 555 560

Межє Гуз Тпйг Азр Рпе Маї с1у Тиг Маї Аїа с1у Тер о1у Геи Тиг с1Іп 565 5708 575

Гуз б1у Ре Гец АТїа Аге Ап Гей Меє Рпе Маї Азр І1е Рго І1е Маї! 5808 585 599

Азр Ні5 б1п Гуз Суб АІ1а Тиг Аїа Туг Тис Гуз б1п Рго Туг Рго о1у 595 ве 605

А1їа Гуз Маї Тиг Маї Азп Меє Гей Су5 Аїа о1у Гей Азр Аге с1у О1Уу 618 615 620

Гуз Азр бег Суб Аг» б1у Ар бег б1у с01у Аїа Ге Маї Ре Геци Ар 625 630 635 640

Азп бій Тс біп Асе Тер Рпе Ма! с1у с01у І1е Ма! 5ег Тер о1у 5ег 645 659 655

Зо

Іе Азп Су5х ос1у с1у бег 01 б1п Туг о01у Маї Туг Тиг Гуз Маї ТАпг 66О 665 670

А5зп Туг І1е Рго Тер І1е бТ1и Азп І1е І1е А5п Ап Рпе 675 680 685 «2105 555 «2115 670 «212» Протеїн «2135 щура «4005 -ч55

Те Ге Гец с01у бег Гу5 Тер Рго бІ1и Рго Ма! Рпе о1у Аге Гей Маї! 1 5 16 15 б5ег Ге Аїа Рпе Рго бі Гу Туг б1у Азп Ніб5 біп Ар Аге 5ег Тгр 29 25 36

Тис Сей Тапг АТа Рго Рго біу Рпе Аге Ге Аг» Ге Туг Рпе Тиг Ні 35 40 45

Рпе Азп Ге бі Ге бег Туг Аг» Суб бі Туг Азр РПпе Маї Гу Ге

50 55 60

Тиг о5ег о1у Тийг Гуз Маї Ге Аїа Тпг Ге Суз с1у бІп б01и бег Тиг 65 78 75 80

Азр Тс бі Асв АТа Рго б1у Азп Ар Тийг Ре Туг 5ег Ге Оо1у Рго 85 90 95 б5ег Ге Гуз Ма! Тийг Рпе Ні бег Ар Туг бег Азп бІи Гуз Рго Ре 166 185 116

Те б1у Рпе бій Аїа Ріпе Туг А1ї1а А1їа б1іи Ар Маї! Ар си Су Аге 115 1208 125

Те 5ег Ге б1у Ар бег Маї Рго Су5 Ар Ні Туг Суб Ні Азп Туг 1308 135 140 еи сб1у с1у Туг Туг Су5 5ег Суб Аг» Маї о1у Туг І1е Гецй Ні б1Іп 145 1509 155 160

А5зп Гуз Ні Тпг Суб бег Аїа Ге Су5з 5ег б1у б1п Ма! Ре Тиг о1у 165 176 175

Зо

Аге бег б1у Ре Гец 5ег 5ег Рго біи Туг Рго бІп Рго Туг Рго Гу 188 185 199

Гей 5ег бег Суб Аїа Туг Азхп І1е Аге Гей біи бі о1у Ріпе б5ег І1е 195 290 295

Те Ге Азр Рпе Маї бі бег Рпе Азр Ма! біи Меї Ні5 Рго б1и А1Та 2168 215 229 бІіп Су5 Рго Туг Азр бег Ге Гух Іе б1п Тйг Ар Гуз Аге о1и Туг 225 230 235 240 с1у Рго Рпе Сузх сб1у Гу5 Тпг Гец Рго Рго Аге І1е біи Тиг Ар 5ег 245 258 255

А5зп Гуз Ма! Тпг Іе Тег Ре Тпг Тийг Азр 01 б5ег б1у Азп Ні Тпг 260 265 279 о1у Тер Гуз Ше Ні Туг Тиг б5ег Тиг Аїа бІп Рго Суб Рго Ар Рго 275 2808 285

Тиг АТа Рго Рго Азп с1у Ні5 І1е бег Рго Ма! б1п А1а Тиг Туг Маї 2908 295 309

Гей Гуз Азр бег Рпе бег Маї Ре Су5 Гух Тиг о1у Ре о1и Геи Геи 395 316 315 329 б1іп о1у бег Маї Рго Гей Гуз бег Ріпе Тпг АТа Маї Сух5 бІ1п Гуз Ар 325 330 335 с1у бег Тер Азр Аге Рго І1е Рго бі Сух5х 5ег І1е І1е А5зр Сух Оо1у 340 345 359

Рго Рго Азр Ар Ге Рго Азп с1у Ніх5 Ма! Азр Туг ІІе Тиг о1у Рго 355 зва 365 бІіи Маї Тийг Тис о Туг Гуз АТїа Ма! Те б1іп Туг бег Су5 о01и си Тиг 3708 375 389

Рпе Туг Тиг Мет бег б5ег Азп сІ1у Гу5 Туг Маї Су5 бІи А1а Азр о1у 385 399 395 4ев

Рпе Тер Тйг бег бег Гуз о1у си Губ5 бег Гей Рго Маї Су Гу Рго

Зо 485 416 415

Ммаї! Сух о1у Ге бег Тпг Ні Тпг бег б1у о1у Аге І1е І1е с1у О1Уу 420 425 430 б1іп Рго Аіїа Гух5 Рго о0Т1у Азр Ре Рго Тгр бІп Ма! Гей Геи Гей о1у 435 44о 445 бІ1и Тис Тс АТа АТа о1у Аїа Гей І1е Ні Ар Ар Тер Маї Гей Тиг 4506 455 460

А1ї1а Аї1а Ніб5 Аїа Маї Туг с1у Гу5 Тпйг бі Аїа Меє 5ег 5ег Гец А5р 465 470 475 480

І1е Аг Меє с1у І1е Гей Гу5 Аге Ге б5ег Гей І1е Туг Тиг б1іп А1Та 485 499 495

Тер Рго бТ1и А1їа Маї Рпе І1е Ні5 бі с01у Туг Тиг Ні5 о1у А1а о1у 580 505 518

Рпе Азр Азп Азр І1е Аіа Гей І1е Гу5 еп Гуз Азп Гуз Ма! Тйг Пе 515 529 525

Абзп Аге Абп ІТ1е Меї Рго І1е Су5 Гец Рго Аге Гуз б1и А1а Аа 5ег 5308 535 5409

Ге Меє Гуз Тийг Азр Рпе Маї с1у Тиг Маї Аїа с1у Тер (1у Геи Тиг 545 559 555 569 біп Гу5 б1у Рпе Ге А1їа Аг» Азп Ге Меє Рпе Ма! Азр І1е Рго Пе 565 579 575

Ммаї Азр Ніх б1п Гуз Суз Аїа Тиг Аїа Туг Тпг Гуз бІп Рго Туг Рго 589 585 599 с1у АТа Гуз Ма! Тпг Маї Ахп Меї Ге Су А1а о1у Гей Азр Аге О1у 595 6о0 605 о1у Гуз Азр 5ег Су Аг» б1у Ар бег б1у с1у Аїа Ге Маї Рпе Ге 618 615 6206

Азр Азп бі Тс біп Аве Тер Рпе Ма! с1у о1у І1е Ма! 5ег Тер 01у 625 630 635 640

Зо б5ег І1е Ахзп Су5 бІ1у б01у 5ег бі біп Туг б1у Ма! Туг Тиг Гу Маї 645 6509 655

Тис о Азп Туг І1е Рго Тер І1е 010 А5п І1е ІТ1е Ап Ап Рпе 6в6О 665 670 «2105 56 «2115 28 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Ното б5арієп5 «4005 56 асваввствс Евассстсстї ввевссТТс 28 «2105 57 «2115 23 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Ното б5арієп5 «4005 57 вЕВСсСссСТсСс ТвСсвЕсСасст сів 23

«2105 58 «2115 23 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Ното б5арієп5 «4005 58 сававрвївас всаврвавввве сас 23 «2105 59 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Ното б5арієп5 «4005 59

ЕсСааааєсас тааєсаєвс стсватс 27 «2105 60 «2115 22 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» мишача «4005» 60 асваввстас Есассессся во 22 «2105 61 «2115 23 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» мишача «4005 61 ствсававвї васвсавевв в88 23 «2105 62 «2115» 23 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» мишача «4005 62 ссссссствсС вісасстств сав 23 «2195 63 «2115 29 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» мишача «4005» 63

ЕсСавгаааєса сеЕсаєсаєвс єстсааєсс 29 «210» 64 «2115 29 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» щура «400» 64

Бвагвївасвс аввагвввса ЕСавтв 29 «2195 65 «2115 37

Зо «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» щура «4005 65 ставааасас тааєвсссст сствсвІсас стствса 37 «2195 66 «2115» 354 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 66 саввІсассї Твааввавсс їввїсствІв стврРІвааас ссасававас сстсасвсів 6о асствсассв ЕСТІСТРеВБІЇ стЕсастсавс авреевтаааа ее їЕвїІвав стеватсссв 120 савсссссав вєвааввсссї вравтїввстї всасасаєсї сссравіва срааааатсс 188

Тасаввасає сестрааврав саввстсасс аєстссаавре асасстссаа ааассарете 2408 вЕссттасаа Євассаасає гєвассствїв васасавсса свтаєсаств Евсасерата 300 свасвїврав вгааєсвасста ствевевссав вваассствв їсаствсстс стса 354

«2105 67 «2115 118 «2125 Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 67 б1іп Маї Тйг Гей Гуз б1и б5ег 01у Рго Маї Ге Маї Гу5 Рго Тиг си 1 5 18 15

Те Се Тс Ге Те Субх Тс о Маї 5ег б1у Рпе б5ег Гец 5ег Аге б1у 20

Гуз Меє с1у Ма! 5ег Тер Те Аге сп Рго Рго о1у Гуз АТа Гей си 4 45 25 Тер Ге Аїа Ні5 І1е Рпе бег бег Азр біи Гу5 бег Туг Аге Тг 5ег 58 55 ва

Гей Гуз бег Аг Гей Тиг І1е бег Гуз Азр Тиг бег Гу5 Азп б1іп Маї

Зо 65 78 75 80

Ммаї Ге Типг Меє ТиИг о Азп Меї Азр Рго Маї Азр Тиг А1а Тиг Туг Туг 85 90 95 35

Суз А1а Аг» І1е Аг» Аге б1у б1у І1е Азр Туг Тер о1у бІп о1у Тиг 188 185 118 еи Ма! Тиг Маї 5ег 5ег 115 «2105 68 «2115 121 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 68 біп Маї б1п Ге б1п б1п бег с01у Рго с1у Гей Маї Гу5 Рго 5ег біп 1 5 18 15

Тиг Ге бег Ге Тиг Суз А1іа І1е бег с1у Азр бег Ма! бег 5ег Тиг

20 25 30 б5ег А1ї1а Аїа Тер Азп Тер І1е Аге б1п 5ег Рго бег Аге О1у Гей би 35 40 45

Тер Ге с01у Аг Тийг о Тугс Туг Агсв б5ег Гуз Тер Туг Азп Азр Туг Аа 58 55 ва

Уаї! 5ег Маї Гу5 бег Аге І1е Тпйг ІТе Ап Рго Азр ТПг 5ег Гу Авп 65 78 75 ва б1іп Ре бег Гей б1п Гей Ап бег Ма! Тийг Рго бІи Азр Тиг А1а Маї 85 90 95

Туг Туг Суб Аїа Аг» Ар Рго Рпе б1у Ма! Рго Ріе Азр Те Тер с1у 188 185 118 б1іп о1у Тпйг Ме Маї ТиИг Маї бег 5ег 115 1208 «2105 69 «2115 186

Зо «2125 Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 69 б1іп Рго Маї Гей Тпг бІ1п Рго Рго б5ег ей б5ег Ма! бег Рго (у сп 1 5 18 15

Тиг АТ1а бег І1е Тпг Сузх бег о1у би Гуз Ге о1у Азр Гуз Туг АІа 20 25 30

Туг Тер Туг б1п бІіп Гуз Рго с1у б1п 5ег Рго Ма! Ге Маї Меє Туг 35 4 45 бІіп Ар Гуз б1п Аге Рго бег б1у І1е Рго бій Аг» Рпе 5ег Оо1у 5ег 58 55 ва

А5п бег с01у А5зп Тийг АТїа Тийг о Ге Тйг І1е бег с01у Тпг біп А1а Меє 65 78 75 80

Азр бій АТа Ар Тугс Тугс Суб б1п Аіа Тер Азр 5ег б5ег Тиг А1Іа Маї 85 90 95

Рпе с01у с1у о1у Тиг Гуз Гей Тпг Маї Ге 189 195 «2195 76 «2115 324 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 70 тсстаєвавс Свастасавсс ассстсввїв їсавїввссс сарвасавас ввссассате 6о асствївсвРе равасаассї СРевБаарааа свсвївсасї вертассавса ваврвссаввс 1206 саввсссств ЇвЇТввІсає стаїраєвраї авсвассввс сстІсареваї ссстрассва 188

ЕСЕ сСтвсСсСТ ссаастствв ваасасввсс ассствасса єсаставевв сваавссеве 2408 ваєваввссв астаєсаєсье єсаврвївсве васаєсевста стваєсаєвє вєвістСсевс 300 вБвавевасса австсассвї сста 324 «21905 71

Зо «2115 126 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220»

З5 «223» Синтетична «4005 71 б5ег Туг бІи Ге ІІе б1п Рго Рго бег Маї 5ег Маї А1а Рго о1у бІп 40 1 5 16 15

Те АТа Тс І1е Тиг Сух АТа 01у Ар Ахп Гей о1у Гуз Гуз Аге Маї 20 25 3а 45

Ні Тер Туг біп б1іп Аг» Рго б1у б1п Аї1а Рго Маї Ге Маї І1е Туг 4а 45

Ар Азр бег Ар Аге Рго 5ег с1у І1е Рго Ар Аге Рпе 5ег АТа 5ег 58 55 ва

Абзп бег б1у Ахп Тийг АТа Тйг Гей Тс І1е Тиг Аге с1у сб1и Аїа Оо1Уу 65 78 75 80

Азр бій АТа Ар Тусб Тугс Суз б1п Маї Тер Азр І1е АІа Тиг Аор Ні

85 90 95

Ммаї Ма! Рпе с1у оІ1у с1у Тиг Гуз Гей Тийг Маї Ге А1а Аїа Аї1а о01у 188 185 116 б5ег 01 бІ1п ух Ге Іе 5ег Оо1и 115 129 «2105 72 «2115 36 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 72

Їеч бІи Маї Тийг Суз 01 Рго с1у Тийг Тис Рпе Гуз Ар Гуз Су Авп 1 5 18 15

Те Суз Ага Суб б1у бег Азр б1у Гуз бег Аїа Маї Суб Тиг Гуз Ге 20 25 30

Зо Тер Су Ап б1п «2105 73 35 «2115 33 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 73

Те Суз бій Рго б1у Тийг Тис Ре Гуз Азр Гуз Суб Азп Тиг Су Аге 1 5 18 15

Суз с1у бег Азр о1у Гуз бег АТа Маї Су5 Тиг Гуз Гей Тер Су Азп 20 25 30 б1п «2105 74 «2115» 29 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність

«223» Синтетична «4005 74

Те Суз Ага Суб б1у бег Азр б1у Гуз бег Аїа Маї Су Тпг Гу Гец 1 5 18 15

Тер Суз Азп б1Іп 20 «2105 75 «2115» 491 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 75

Гей бІи Ма! Те Сухз б1и Рго сб1у Тйг Тис Ре Гуз Ар Гуз Су Азп 1 5 18 15

Те Суз Ага Суб б1у бег Азр б1у Гуз бег Аїа Маї Суб Тиг Гуз Ге

Зо 20 25 36

Тер Суз Азп б1п с1у Тпг с1у с1у о1у бег о1у 5ег бег 5ег б1п Маї1 4 45 35

Тиг Ге Гуз 01 бег с1у Рго Ма! Ге Маї Гуз Рго Тйг си Тпг Ге 58 55 ва

Те Се Те Сух Тс Маї бег б1у Рпе 5ег Ге бег Аге Оо1у Гуз Меє 65 78 75 ва с1у Маї 5ег Тер І1е Аг» біп Рго Рго с1у Гу Аа Гей си Тер Ге 85 90 95

А1а Ні5 І1е Рпе бег 5ег Азр бій Гуз бег Туг Аге ТПг 5ег Гецй Гу 188 185 116 б5ег Агв Гей Тпг о І1е бег Гу5 Азр Тг о бег Гуз Азп біп Маї Маї Ге 115 129 125

Тиг Мет ТиИг о Азп Меж Азр Рго Ма! Азр Тиг Аї1а Тиг Туг Туг Суз Аа 138 135 140

Аге І1е Аг Аг б1у б1у І1е Азр Туг Тер о01у б1п с1у Тиг Геци Маї 145 158 155 160

Тиг Маї бег 5ег АІа 5ег Тпг Гуз б1у Рго бег Маї Рпе Рго Геи Аа 165 176 175

Рго Суб бег Аге бег Тг 5ег бій бег Тиг АТа А1а Гей с1у Су Гец 188 185 199

Ммаї Гуз Азр Туг Ре Рго бій Рго Маї Тийг Маї 5ег Тер Азп 5ег О1у 195 290 295

А1а Гей Тпг бег о0І1у Ма! Ні5 Типг Рпе Рго ДАІіа Маї Ге біп 5ег 5ег 2168 215 229

О1у Геи Туг бег Ге бег 5ег Ма! Маї Тиг Маї Рго 5ег 5ег 5ег Ге 225 230 235 240 о1у Тиг Гуз Тис о Туг Тис Су Азп Маї Азр Ні Гуз Рго 5ег Азп Тиг 245 258 255

Зо Гуз Маї Азр Гуз Аг» Маї 01 бег Гуз Туг О1у Рго Рго Су Рго Рго 260 265 279

Суз Рго Аїа Рго бій Рпе Ге с01у б1у Рго бег Маї Рпе Гей Рпе Рго 275 2808 285

Рго Гуз Рго Гуз Азр Тйг Гей Меє ІТ1е бег Аге Тйг Рго бІи Маї Тиг 2908 295 309

Суз Маї Маї Маї Азр Маї бег бІ1п 01 Азр Рго бі Маї б1іп Ре Ап 395 316 315 329

Тер Туг Маї Азр с1у Маї б1и Маї Ні5 Ахп Аїа Гу5 Тиг Гу Рго Аге 325 339 335 бій 010 б1п Рпе Ап 5ег Типг Туг Аг» Ма! Маї 5ег Маї Гец Тиг Маї 340 345 359

Ге Ні біп Азр Тер Ге Азп о1у Гуз 01 Туг Гуз Суз Гуз Маї бег 355 зво 365

А5зп Гуз с1у Гей Рго бег бег І1е оТи Гуз Тиг І1е бег Гуз Аа Гу 3708 375 389 с1у б1п Рго Аге бій Рго біп Ма! Туг Тйг Гей Рго Рго 5ег біп б1и 385 390 395 4ев бІи Меє Тийг о Гуз Азп біп Маї бег Ге Тйг Сух Ге Маї Гуз с1у Ре 485 416 415

Туг Рго бег Азр ІІе А1ї1а Маї о0їи Тер сб1и бег Азп б1у біп Рго си 420 425 430

Абзп Азп о Туг Гуз Тс Те Рго Рго Маї Ге Ар 5ег Азр о1у 5ег Ріе 435 дда 445

Рпе Гей Туг бег Аге Гей ТПг Маї Азр Гуз 5ег Аге Тгр б1п сІи о1у 450 455 460

А5п Ма! Рпе бег Суб бег Ма! Мет Ні5 01 ДАІа Ге Ні Ап Ні Туг 465 470 475 4808

Тиг бІ1п Гуз 5ег Ге 5ег Ге бег Ге о1у Гуз 485 499

Зо «2105 76 «2115» 491 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 76 б1іп Маї Тйг Гей Гуз б1и б5ег 01у Рго Маї Ге Маї Гу5 Рго Тиг си 1 5 18 15

Те Се Тс Ге Те Субх Тс о Маї 5ег б1у Рпе б5ег Гец 5ег Аге б1у 20 25 30

Гуз Меє с1у Ма! 5ег Тер Те Аге сп Рго Рго о1у Гуз АТа Гей си 35 40 45

Тер Ге Аїа Ні5 І1е Рпе бег бег Азр біи Гу5 бег Туг Аге Тг 5ег 58 55 ва

Гей Гуз бег Аг Гей Тиг І1е бег Гуз Азр Тиг бег Гу5 Азп б1іп Маї 65 78 75 ва

Ммаї Ге Типг Меє ТиИг о Азп Меї Азр Рго Маї Азр Тиг А1а Тиг Туг Туг 85 90 95

Суз А1а Аг» І1е Аг» Аге б1у б1у І1е Азр Туг Тер о1у бІп о1у Тиг 166 185 116 еи Ма! Тис Маї бег бег АТа бег Тйг Гуз о1у Рго бег Ма! Рпе Рго 115 1208 125

Гей А1Та Рго Суб бег Аге бег Тг 5ег бій 5ег Тиг АТа АТа Геци с1у 138 135 140

Суз Ге Маї Гуз Азр Туг Рпе Рго 01 Рго Ма! Тиг Маї бег Тер Азп 145 158 155 160 б5ег б01у АТа Ге Тийг б5ег б1у Ма! Ні5 Тиг Рпе Рго А1Іа Маї Геи сп 165 176 175 б5ег 5ег о01у Ге Туг 5ег еп бег бег Ма! Ма! Тиг Маї Рго 5ег 5ег 188 185 199

Зо б5ег Ге б1у Тс о Гу5 Тийг о Туг Тс Су5 Азп Маї Ар Ні Гу Рго 5ег 195 290 295

Азп Те Гуз Маї Ар Гуз Аге Ма! бІи б5ег Гу5 Туг с1у Рго Рго Су 216 215 229

Рго Рго Суз Рго Аїа Рго б1и Рпе Гей б1у о1у Рго бег Ма! Рпе Геи 225 230 235 240

Рпе Рго Рго Гу Рго Гуз Азр ТИг Ге Меї І1е 5ег Аге Тиг Рго б1и 245 258 255

Ммаї Тиг Суз Маї Маї Маї Азр Маї бег б1п би Азр Рго би Маї сп 260 265 279

Рпе Азп Тер Туг Маї Азр сІ1у Маї б1и Маї Ні5 Ахзп АІа Гу5 Тиг Гу 275 2808 285

Рго Аг» бі бі біп Рпе Азп бег Тйг о Туг Аге Маї Ма! 5ег Маї Гец 298 295 309

Тиг Маї Геци Ні бІп Азр Тер Ге Азп с1у Гуз си Туг Гуз Су Туз 395 316 315 329

Маї бег Азп Гуз о1у Ге Рго бег бег І1е бІ1и їу5 Тиг Пе 5ег Гу 325 330 335

А1ї1а Гуз о1у біп Рго Аге бі Рго біп Ма! Туг Тйг Гей Рго Рго 5ег 340 345 3509 б1іп бТїи б1и Ме Типг Гуз Азп біп Маї бег Геи Тиг Су Геи Маї Гуз 355 зво 365 с1у Рпе Туг Рго 5ег Азр І1е Аїа Маї сб1и Тер біи 5ег Азп о1у бІп 379 375 380

Рго бІТи Азп Азп Тубсб Гуз Тс Те Ргсо Рго Маї Ге Азр 5ег А5р о1у 385 390 395 4ев б5ег Рпе Рпе Гей Туг бег Аге Гей Тг Маї Ар Гуз 5ег Аге Тер бІп 485 416 415 бІ1и о1у Ап Ма! Рпе бег Сух бег Маї Меї Ні5 о1и Аа Геи Ні Ап 420 425 430

Зо

Ні5 Туг Тиг б1І1п Гуз 5ег Ге бег Ге 5ег Ге о1у Гуз Аїа А1а о1у 435 дда 445 с1у бег б1у Ге бі Ма! Те Сух бІ1и Рго б1у Тис Тис Рпе Гу Азр 450 455 460

Гуз Суз Азп Тйг о Суб5 Аге Суб5 б1у бег Азр б1у Гу5 бег АТа Маї Су 465 470 475 480

Тиг Гуз Ге Тер Суз Азп бІп о1у 5ег о1у А1а 485 490 «2105 77 «2115 258 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 77

Їеч бІи Маї Тийг Суз 01 Рго с01у Тйг Тис Рпе Гуз Азр Гуз Су Азп 1 5 18 15

Те Суз Ага Суб б1у бег Азр б1у Гуз бег Аїа Маї Су Тпг Гу Гец 29 25 36

Тер Суз Азп б01п сб1у Тпйг сб1у с1у с1у 5ег б1у 5ег 5ег бег бІп Рго 35 40 45

Уаї Гей Тиг біп Рго Рго бег Ге бег Маї бег Рго б1у біп Тиг А1Та 50 55 60 б5ег І1е Тиг Сузх бег с1у би Гуз Ге с1у Ар Гуз Туг АІа Туг Тер 65 78 75 80

Туг бІ1п бІ1п Гуз Рго с1у б1п б5ег Рго Ма! Гей Маї Меє Туг б1п Ар 85 90 95

Гуз б1п Аг Рго бег б01у І1е Рго бій Аг» Рпе бег о1у бег Ап 5ег 166 185 116 о1у Азп Тйг АТа Тйг Гей Тйг Іе б5ег с01у Тиг бІп Аїа Мет А5р с1и 115 1208 125

Зо А1Та Азр Туг Туг Су5 б1п А1ї1а Тер Азр бег бег Тг А1а Маї! Ре о1у 1308 135 140 со1у о1у Тйг Гуз Ге Тиг Маї Гей о1у б1п Рго Гуз АТа АІа Рго 5ег 145 1509 155 160

Маї Тиг Ге Рпе Рго Рго бег бег б1и 01 Ге б1п АІа Ап Гуз АІа 165 176 175

Тиг Ге Маї Суз Ге І1е бег Азр Рпе Туг Рго с1у А1їа Ма! Тиг Маї 188 185 199

А1а Тер Гуз Аїа Азр бег бег Рго Маї Гуз Аіа с1у Ма! о01и Тег Тиг 195 290 295

Те Рго бег Гуз біп бег Абп Азп Гуз Туг Аї1а Аїа бег бег Туг Ге 2168 215 229 б5ег Ге Тйг Рго біи біп Тер Гу5 5ег Ніб5 Аг» бег Туг бег Су бІп 225 230 235 240

Ммаї Тиг Ніх 01 о1у бег Тийг Маї би Гуз Тиг Маї А1а Рго Тиг си 245 258 255

Суб 5ег «2105 78 «2115 258 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 78 б1іп Рго Маї Гей Тпг бІ1п Рго Рго б5ег ей б5ег Ма! бег Рго (у сп 1 5 18 15

Тиг АТ1а бег І1е Тпг Сузх бег о1у би Гуз Ге о1у Азр Гуз Туг АІа 20 25 30

Туг Тер Туг біп б1іп Гу Рго б1у б1п бег Рго Ма! Ге Маї Меє Туг 4 45 бІіп Ар Гуз б1п Аге Рго бег б1у І1е Рго бій Аг» Рпе 5ег Оо1у 5ег

Зо 58 55 60

А5п бег с01у А5зп Тийг АТїа Тийг о Ге Тйг І1е бег с01у Тпг біп А1а Меє 65 78 75 ва 35

Азр бій АТа Ар Тугс Тугс Суб б1п Аіа Тер Азр 5ег б5ег Тиг А1Іа Маї 85 90 95

Рпе с01у сб1у о1у Тиг Гуз Ге Тиг Маї Ге о1у бІп Рго Гуз Аа А1Та 188 185 118

Рго бег Маї Тийг Гец Рпе Рго Рго б5ег бег бі б1и Гей б1п Аа Ап 115 129 125

Гуз Аїа ТиИг Ге Маї Сузх Ге І1е бег Азр Рпе Туг Рго о1у А1а Маї 138 135 140

Тиг Маї АТїа Тер Гуз А1ї1а Ар бег бег Рго Ма! Гуз Аїа о1у Маї си 145 1509 155 160

Тис Те Тс Рго бег Гуз б1п бег Ап Азп Гуз Туг АІї1а АІа 5ег 5ег 165 178 175

Туг Ге 5ег Ге Тпг Рго бі б1іп Тер Гу5 бег Ніб5 Аге бег Туг 5ег 1809 185 199

Суз б1п Ма! Тпг Ні5 01 с01у бег Тпг Маї бІи ух Тйг Маї А1а Рго 195 290 295

Те бі Сух 5ег Аїа Аїа с1у б1у 5ег с01у Гей б1и Ма! Тиг Су5 си 216 215 220

Рго б1у Тийг Тийг Ре Гуз Азр Гуз Суб Азп Тиг Су Аге Су о1у 5ег 225 230 235 240

Азр с01у Гуз бег АТа Маї Сух Тпг Гуз Геци Тер Суз Азп біп с1у бег 245 2509 255

Оо1у А1Та «2105 79 «2115 16 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність

Зо «220» «223» Синтетична «4005 79 со1у Тиг о1у о1у с1у бег о1у 5ег 5ег бег 1 5 18 «2105 88 «2115 6 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 88

А1а Аїа о1у о1у бег с1у 1 5 «2105 81 «2115 4 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220»

«223» Синтетична «400» 81 о1у бег с1у А1а 1 «2105 82 «211» 1533 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 82 асваєвесст ЕСВЕСТЕСТСЕ вСЕССТвВІЇ ввсаєсстає сссаєвссас ссаввсстїв 6о

Баавївасві вївавсссев аасвасаєсєс ааарасаавї всаатастєе сеї есев 120 тсаваєвевва аассевсевІ ствсасааав стстевБІвта ассавревсас севБЕвравве 188

ТсвеБваєсса встсасаввї сасстєЄваав вавсстввіс стРТвсТвРвІ вааасссаса 2408 7 вавассстса свствасств сассвістсї вевЕсстсас їсавсаввее таааасевв 300 вЕвавсівва їссвІсавсс сссавеваав вссстввБавї вєвсЕсвсаса саєсстеєтсь 360

Зо авівасвааа аассстасавє васаєсвств ааравсавес їсассаєстс саарвасасс 420 тссааааасс аввсевіссІ Тасааєвасс аасаєввасс ствївРвасас авссасвтає 480 таствївсас ввастасвасв вРваврвааєї вастаствве вссавреваас сстевЕсаст 540 7 вЕСтТсСстсав сстссассаа вєввсссаєсс вЕсСтТсСсссс Тввсвссств стссавравс 600 асстссвавра всасавссвс сстевевстІвсС сІврРІсаарве астасесссс сраассевів 66а асевівісСвї враастсаврв свссстрасс аврсевсвівс асассттссс ввствІсста 720 савтїсстсав васестастс сстсавсавс вїввРївассвя вссстссав савсттеввс 780 асваавассї асасствсаа сетаваїсас аавсссавса асассааввї врасаавава 840 7 вЕсвавісса аасаєввісс сссаєвссса ссаєвсссав сасствавтє сстеререва 980 ссаєсавтіст тссЕвЕСссс сссаааассс ааврвасастс тсаєсваєстс ссевасссст 960

Баввісасві есвІРРіввї вРрРасвівравс саввааврасс ссваввісса віссааствв 1920 тасвсввасв всвІввБаввї всасаасевсс ааврасааавс сесевРварва всавсссаас 1986 авсасвтасс вївїввїсав свісстсасс вІісствсасс аврвастввсії ваасеесаав 11406 7 вавтасаавї всааввтстіс саасаааввс стсссвісст ссаєсваваа аассаєстсс 120806 ааавссааав вєвсавссссв ававссасав вІвтасассс всссссаєс ссавваввав 1260 асвассаавра ассаввїсав сствасствс стврІїсааав всЕсстассс савсвасатс 1320 вБссвТвРаві верРавравсаа Тер есавссв вараасаасї асаавассас всстсссвів 1380 стввастссв асевстсстЄ стсстсСтас авсаввстаа ссвІРрасаа гавсаввіев 1440 савваввврва аєвЕстєстс аєвстссвтв асвсаєсвавв сЕстТесасаа ссастасаса 1586 саваававсс ЕстссствссС тстсеРЕРааа ва 1533 «2105 83 «211» 1533 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 83 асваєвесст ЕСВЕСТЕСТСЕ вСЕССТввІТ ввсаєсстає ссаєвссас ссаввсссав 6о вЕсасстЕєЄва аввавсствв їсствІЇвсТвР вірРааассса сававассстї сасвствасс 120

ТвсассвЕстї стІРЕВТЇсІсС астсавсаврв вєрРіаааастев вївївавств ваєссвісав 188 сссссавррва аввссствва вівевБСЕЇвса сасаєстєс-ї свавівасва ааааєсстас 2408 аввасаєсвс Їваавравсавє встсассаєс тссааврваса сстІссааааа ссарвтввіс 300 7 стІсбасааєва ссаасаєвва ссстІеСрРрас асавссасвї аєсаствсвс асеватасва 360 свЕввРавраа свастаств вевссаврвва ассстввіса ствїстсстс авсстссасс 420

З5 аавввсссає ссвісттссс сстІРЕСсвссс Твстссаврва всасстссва ргавсасавсс 480

СССР всІ всстввІсаа вгвастастсс сссваассвв Евасевївіс вРіврРаастса 540 бвсвссства ссавсевсвї всасассттс ссевствісс тасавсісстс аввасестас 600 7 тссстсавса всвївевЕвас свЕвссстІсс авсавстієввР всасваарас стасасствс 66а аасвтаваєс асаавсссав саасассаав вІевРасаавра вавсєвавіс сааатаєев 720 сссссаєвсс сассаєвссс авсасствав ЕСССТвеРеЕ вгассаєсавтї сеєсствЕСс 780 сссссаааас ссаарвасас тстсаєваєс тсссввассс стваввісас віесвівРів 840 вБЕввРасвїва вссаврваавра ссссваввіс савстєсаастї ввтТасесввра ТевсвІввав 980 7 вБЕвсастааєея ссаарасааа єссесеевавр вавсавстса асавсасвта ссвсеїевІс 960 авсвісстіса ссвісствса ссавваствв стваасевса арвавртасаа вІвсааввтс 1920

Тссаасааав всстсссвіс стссаїсврав аааассаєстї ссааарссаа аревсавссс 1986 свававссас аввївстасас сствссссса їсссавраве авраєсрассаа ваассаввіс 11406 авсствассї всстввїсаа аввстЕєстас сссавсваса їсессвїрРва вІРевававс 120806 ааєввевесавс севаваасаа стасаавасс асвсстсссв ЄвстРвастс свасевстсс 1260

ГЕСТЕсСсСТсСТ асавсавевсї аассеївврас ааравсаврвї весавваврвв вааєвістс 1320 тЕсаєвстссв Тваєсвсаєва ввстствсас аассастаса сасавааврав сстстсссів 1380

ТсСІсСтсввва аавссевствв вРеТавтввї їЇсїврРааврїва свївСвавсс сераасваса 1440

ТЕсааавраса авівсаастас сеї сееТвесС вРІїсаваєе врааассевс ввіІстесаса 1586 аавстстввї втаассавее тавтевівсї тва 1533 «210» 84 «211» 834 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 84 асваєвесст ЕСВЕСТЕСТСЕ вСЕССТРвІЇ ввсаєссстає тссаєвссас ссаввссіїв 6о ваавївасвї вІвгавсссвв аасвасаєсс ааавасаавї всаастастте серії всев 120 тсаваєвевва аассевсевІ ствсасааав стстевБІвта ассавревсас севБЕвравве 188

Зо ТсЕвваєсса встісасавсс автвствасі савсссссстї саствіссвІ віссссаврва 2408 савасавсса всаєсасств сЕстеваврав аааєсевевве абааасаєвс ттастевтат 300 савсаваавс саввссавтс ссстІвївїЇїв вІсаєвтаєс аавраєбаааса всевссстса 360 веваєссств авсваєсстс тввстссаас ствер вРааса савссастсї врассаєсавс 420 вБевасссавв стасєвваєва вествастаєї таствїсарв сеївеевасав савсаствсе 480 вІіаксссевсе вгавевассаа всЕвассвіс ставессавс стаарвсевс всссісевіс 540 ассствЕЕсс свссстсстсС траврвавстє саавссааса аврвссасастї есеїв стс 600 асаавтївасї Естасссввр авссвїваса вїевссівва аврвсавастав савссссвіс 66а аагвсеврав ївевавассас сасассстсс ааасаааврса асаасааврта сесевссавс 720 австаєства вссЕвасвсс рРавсаврстев аавісссаса ваавстасав ствссаввіс 780 асвсаєваав гравсассвї вєвараавраса вїевсссста савааєветс атав 834 «2195 85 «211» 834 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична

«4005» 85 асваєвесст ЕСВЕСТЕСТСЕ вСЕССТввІТ ввсаєсстає ссаєвссас ссаввсссав 6о ссавівства сЕсавссссс стсаствісс вівіссссавр ргасаврасавс савсатсасс 120

ТвеСсЕсСтвРвав авааассеве вєвасааасає всЕсастввї ассавсаваа вссаввссав 188

ТссссТВІвЕ ТевІсаєвста їсаарасааа савсевсссї саврвваєссс ЄвРавсваттс 2408

ТстввсСтсса асістврваа сасавссасї ствассаєса всеврвассса ввстатеват 300 ваввствастї астаствіса гєвсеївееРвас авсавсаств севтТастісвв серавввасс 360 аавстірассв їсставвсса всстааресе всессстсвЕ їсассствії сссвссстсс 420

ТстІваврвавс тЕсаавссаа сааввессаса ствевЕвївІс їсасаавтва стстасссв 480 ввавссвїва савсевссів рааврвсаваї авсавссссв Есаавресввре автіевавасс 540 ассасасссї ссааасааарє саасаасаав Тасесввсса всавстаєсії вавсствасв 600 ссЕвавсавї вєваавсссса саваавстас авствссаве їсасвсаїєїва аррегавсасс 66а

БІгваваава савтівевсссс тТасавааєвї їсавссеств вівРвТавтвев ТЕЇсеРРаавів 720 асвївївавс ссвваасвас астсааавас аавтівсааста сесеїєсевІв севІЕсават 780 вБевааайсев севіствсас ааавстстве ТРїаассаве втавїввівс їтав 834

Зо

Claims (7)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб лікування суб'єкта-людини, що страждає стероїдзалежним вовчаковим нефритом (ВН), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить інгібуюче МАБР-2 моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно зв'язується з МАЗР-2 людини і пригнічує МА5БР-2-залежну активацію комплементу, в кількості, ефективній для поліпшення функції нирок, при цьому інгібуюче МА5БР-2 антитіло або його антигезв'язувальний фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить СОБК-НІ, СОВ-Н2 ії СОБ-НЗ амінокислотної послідовності, наведеної у вигляді зХЕО ІЮО МО: 67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить СОК-І1, СОВ-12 ії СОК-ЇЗ3 амінокислотної послідовності, наведеної у вигляді 5ЕО ІЮ МО: 69.

2. Спосіб за п. 1, у якому антитіло або його фрагмент вибирають із групи, яка складається з рекомбінантного антитіла, антитіла зі зниженою ефекторною функцією, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і антитіла людини.

3. Спосіб за п. 1, у якому інгібуюче МА5Р-2 антитіло по суті не пригнічує класичний шлях.

4. Спосіб за п. 1, у якому інгібуюче МАБ5бР-2 антитіло пригнічує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці з ІСво 30 НМ або менше.

5. Спосіб за п. 1, який додатково включає ідентифікацію суб'єкта-людини, що має стероїдзалежний ВН, до етапу отримання суб'єктом лікарського засобу, який містить кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективного для поліпшення функції нирок.

6. Спосіб за п. 1, у якому лікарський засіб, який містить інгібуюче МА5Р-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, потрібно вводити у кількості і протягом періоду часу, які є ефективними для досягнення щонайменше 20 95 зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею порівняно з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування.

7. Спосіб за п. 1, у якому лікарський засіб потрібно вводити у кількості, достатній для поліпшення функції нирок і зменшення дози кортикостероїдів у зазначеного суб'єкта.

ках Я сус, хиїї СВ ер -подюний т їх ї БЕЖ уся ВІВ ві ; З щ- СКК нн ан Мк ШЕ о ї Я ВЕР ий МЕ ноз Я Март УТ АЯдОомО І жи КК ї їй. ух гі ТУ Е ЯН де Кая и РІО ІЛ МАВ шт й кл и пе о я пет ху ся в се дона ВІ БЖ Б с ОВК КО Ж ний ко МУ о» ВММЯ 55 БИК МОЯ ск ПИ а 1 М же о Ах я «Ки и КК Б ин - ОК мо фе ЕЕШІННИЕ сд 1 шу ВОХШИЯ ММ БЩШЯ ОС фі БО ВОШЄиия МКК нн Шан й В лен не ши 00 Мк ОБКОМУ АК, ч і. х Є У є ран роди ит пт дик ет ох з Х х 2 ТА Є 7 жит ен кт че ОХ х ї Ж й й и ей в т ОХ те х х ї КІ Й А и си що т кв й Ше ЕМ ет еВ я Я У Кей ї и дк шт МУ ХЕ ВЕ В пух е в Пе ПО ПЕКИ заз п ше ВКА В ро ОМВО ОК КВ В В В дужнююютнчююкн ОБ пон ее в ї і і : ? су кан ї і ее 3 ї Ебе-овібний ї ЕВ обезмишова пен - мив сееват кине »еринова притевза СЕК Пе ши і .

Фіг.1 ТС МАКАР. УМХ. Ер Тваівяао ЗВ і З Св ї. КУ Ка Х і; АР «КЕ м мет сг ЕС ПП отв тт ть Де ВПО КЕ ВЕ КК ВК В т еВ МИШІ МК ЕК МО о се МК КЕН НІХ ту ТИМИ пу ДОННИХ ТОК ня МОМ Кк А Ки ЕН Я МИЛА пре Кн В КИ КИМ Дод ШИ няння ОКХ ші АН Кмин їх ї Й і і ї ї Ма У ев, Ж Я зр ох яд з, Субадомен Еббдомен Субаомен о Сора Її

М.Х ВЕ мови Али СИ а М в еВ і З Я Ме мен СВ аоМен СОР домен Домен серинової протеази . Фіг2А Е Ї; М чі, Ай УМО ок ке ; ОО ПО В КК О порою В я чі с г, одн СИВ домен ЕЕ Йоман Фіг2в

МС же Же . ве Стпруканов БОЖЕ ЕЛЬ я тт Ген ни ока ЯМ КІ ШІ Я 1-5 . ик їн «ВИК зеЕНЕ или ВчаМИ : уза жее, зхух сою рум Уже КК о я "м м й ТЕ іа А се БА Ж яВНАК жОВК здерк ї Мі ІК з, Ух. ик хх : я Не зії Нв МАБРХ і гот ЯНВ. МОДен г г 5 АК пав К сії ЩЕ ДОЗА преп смивої і її Я, й КЕ ЖОМ де же ЯЕя ек : в жк Він Дике птиця ї ї І ї ї ; : ї , Ум : ка З Я мі і З Сх іще ай мі, я їв жхяВЕ ре я тх ; ПАС ген нею - т ГУ їх дае МАЛОЮ іл» г ді у дов фо звис: НН ех. ж ; ТЕО: вно резистанеиоюті НЯМ БОМ ВН дня ей ; як Зв конепузкція, з ї і кА і ї ї килшев: до несвіуичу ВО, ЗБ ення клововннау Марков незатишно каоение й моркейо Ж касета В іна вирівнювання) ДАСТЕ ЛЕ ші Ра Му Ух ск в жк : х МІВ ІК; видану ШИНКИ 00 познашаново Й : ВЕМОру Й і ШЕ ; АВ і с урж пк ЯНВ з Кві ОБВЕ ї уві ВАМ ох сан Ва коор о їі МЕ щої Кай ам Я Я ! пе дьшя НОЖІ ВВЕ фей? ОВ ВОК ВО шу і рої і і Ї 3 її щВ НЕД : їі її ОНИ: і ее бони нетто ВВ об онов нн вон вемолевічної ! і (і и ї - мим дено ї резунитать свутевнокяст ЗВИК рано ачвліу для КБ-кпвців Не б ть. ММ. ВН пику "и пакту оо оо осо и ОО у зкео жк о є : и лій х Ж, ПИ зно касети й довккинн Зоно і Кай Золя дме нцйу СН Ї кА Р ла нн А А нн кнннннн і ЖК Зубноміаюень й ї їжу Мід. сруаїх Я, Це Гоевег рестрикції, Яекіі ТО дк. нень Мой Ілик ни вич ку ши ро в УЗИВЕНЦІМНІ ВАНМІК СМ О, де є сх. Ко, я а тори. йнкнео ие Бані ПІЦ прккнуєються тн ВК КИ !

Фіг.З Екзони є з г т ча Б сСубсломен о боб ожнес сов гр ЄСВ домен серичово претпевян с У . ЖД БОМ УМ Ми ЖОпо пнинУноВ НОЯ ши й І Ед Дт ЛВ М В КО ОВ УЖ КК и уже КОНИКИ КВТ АН М Ки ВОКІЖКОТИВ ОКШИ я КИЕВ, лен ІІІ ИдЕ ДИКивеЕ ИМИї І О КЕНЕ КВТ Ти і 2 дк ІВ. ЗИ ецидчка іУКУІЗИТИ З їх зії х ЧІМИТАЛІ ІНишюЮНУ ОБО НЕ і Кт ян МАЕ

Фіг.А їв КУ т тент Ї і І і ї і У и нн НО нн НН НН В В МО МО В ОВО 7 УМ ля я В МНН : яко ск і ; Мох і х х і ш ї х у за ЩА ще і "і вах я х ї я ї, г. Е ій ї х х ї со ї 1 ка ї Ух х Бей В її с- -ї . м Я джено, : і х х Кох ї х х і

5 . ХМ і ї х Ж і ї х ! і к х і і х ї зх м о і! ї дя. кою р нн . ' «1 хх «й пухом ДДТ : ЩЕ рент оф нях «фею тт феєю фест рек ЗК птн Е 1 Е і . і -8 Ї, анесенноооооотоооовоовотосгоовоннтоооовоовопотевовводовюгооовооооооосстооорегео КТК Ттт тво ово ТТН ооо совентккнни хх й я й - їх Х ж Я 5 Я па в - ДЕ Юд сержіних розевОень Фіг ЗА і тю йо і х х і і е х ' : і У М ння нннкнннятчннняня 1 во і у у ша ще у х ! ї х х : ! х х ї і х У і вх ї А я Ї ' гу ж пт . З 8 нин пн нн нн п ОО а 7 2 4 гу ї 5 7 У о серійних розведень

Фіг.5в ! і се вах п щі і і ! і Зимоза і Т і де й і ЗНА Ся і : не з Ж не ши т і Манан са і ї БЕН і дк і ПО і ярих а : ПЕ ЩІ ї5 07Я ПОЛ ї і Е ЩЕ ШЕ пе х Р Мои ї ПТС їх рі ЗИ ї ПИСК Я ж і КЕ й ш Б - о с | ДЕК ки с ЩЕ хи мя и : ех «5 с оон і нн ща й дня ! и пе ФО - ПОКИ ї ЕЕ і нн тик І ММ, 1 ки ит КК ї о : ЕЕ Кя р - пе седу В лий Я ЕМ. ге жан » х ТІ Мо. М2/- Фіг ас

Ї Її : ї х : Е ї

: х. сх Як Я ЩЕ но й ча. я ких й х ее Бе х и і х зе з ЯКЕ дк в а Ф : пев жук ах КС З а - ге мех и Еш : я Е -е хо їх ко х КЗ в рожа : ко шо ня КК . ПИ ен , . | ; ох х б хе В фрооіюкцро ооо р о юр іі ор кюро юсююю коо ; ! ї і Ба Ві і то пунк вки не діям : ТІРекомбінанттеий Щрокі мкалої -

Фіг.6 ин на а а а З б і В ! «о в й В 8 пн а а попееооо фе ЖК ета ТК КАК КК ення нт чн ї ж рт Я контронь Е ї сх їх І Й фони Верн нем ВЕ КИЙ контроль доня щи ; - ; і х ЗД Кі те - і Ж х інве М аббнені по СТ і му : ї пиуокті и ст ж ве фони днини Кн піп ї- «фен ОО ПІДНОС осені СА | м хх МАКУХА НАВААНА КАНАДА АНАААТА КАХ КЗ : меч й ї й х й ШЕ ч с Кк х Х Фо ся ж сх Шрот кн; о я МК зх щ чо спіши то КУМ УТ Ко пуд одн нютдялчяюнкттт нн МЕ Б Її ж З Я Ж я Ж Я 3. юд розведень сироватки

Фіг.7 що ї т. ЕОМ ж я в Не чи їх аа Мет, Пригнічення утворення

Ж . я 5 Соконвертахи Ж ! Б Ж З че іх і х зв о град в 4 к ЕН г ! З Повне пригнічення ми ї юВиС ПОИЙТиРшЯнЯ ШОВ МУ ВО х па і Же 5 7 і Ж й» : Б Дт рт ру рт рт рок р р у рн кур ке фреон унрдерде т рр» каре КИ НМ

Фіг.вА ва, Зв'язування Бара Ме з нативним МАЗА-2 о і сш 4 дн

0.30 й К 4 ож 4 ів с Ве як ВОМ Ко еОВЕНМ ї / Он є . 60024 6 8 2 34 8 8 о гарем ЯМ

Фіг.8в ів Е іо а і ; вла» аа Мої, Пригнічення позу 41, Пригнічення позщеплання СЯ т ч й шк І я ї щодо : ДОН ї 4 щен, ї ї кашеня ж ««аї як З 7 ЕД : - - Х І пак КО У їх ; даті що ВЛ х о ї х у уУх ехо -«

о. Іс5О ОВ нм й: фа шо її ПД т Те М о я о шуй 7 ; м ТК ТД «у ЕЕ ттодктете ек кре ік : пекуче рр ркфккевссеичкі свое рекіресвфну ща ве ! тити юр 1 ЗО - ри В ЕВ ЕВ 4 Ед Ме НМ - : ПИЕНЕ дос Р ; яоть Пригнічення позщенпленн СА : ПЕ 3 і ьКукя. ння я З ВИКО тк й ; і і ї З стгНАї сх с х ! і використанням є М гаво «а і З - : «а 1 і -- су Ї ГК я Ж і ж 4 ї кі ОО в. 4 т ї денну од рота - я ЕЗеї Н : і - і ро ! - : ще Х г шт ї і ! ї : : дощ р. НЕ т і Ух ї зу. 1 к ї ї Сх» ка і і Хр ї скждднкну ТЯ З ОБО Ж 4 рон пн В, Рі й ї ОБОЇ и ни оч, з вик ї ті КЕ: ; ї НК. ; ОО НЕ ! ОО БОБ. БО ши ши ше Ге ! БО ЕН ОО дек Я і їі 33 ї Її ті : ! В НЕ : хе і ОБ ОО: БО. що рН ши ши ш г Е БОБ. БО і ше Х 1 ї хі 1 ї КІ і Н : х ї ре і ї 1: 1 ї ї ті : і : І ;

Е . ши ши шшн ш Фо м нен ши НО аж ОН і дао р: І БОЇ - З З Рі 1 БОР Кі ! і ЕЕ ї і я З Н Рі 3: рі ЯН Ї і ІЗ і і КУ і і її 1 ПН: КІ : і 1 і: і 5-5 ї І: і: ня її і і їі НЕ ; це БО НТ НО і Ї БО БНО НО 4 З ЗІ 3: Рі НЕ її ! ГО З Ії! її ї і І 13 КІ : Ії і ті Н НЕ : в нинішні І ши ше Доменне ун рнтрін ун БНО ШЕ - ї передсерді снрчи в унисссХ Ії ЕН Ії ІН ; х 7 : 7 фот тютту шик зн гегукеиве х Її а 472 «5 85 що Торба еррвнерейтн х х гу ; І с; 5 2 її що ка да цу п ЗЕ ОБО Вт х . й МАМО Ко АНТАМАБРЯ ЕВНО

Фіг.8 іди Ебб-подійний сива сот СОВИ беринова притеаза мининн-- | | і і нка МННННН ! ; Е і ш о МАще. а Монте ееухт ен уюєю Ах ех нжуютчнч нки кни єтєтєиє тн кичиює де кнчтеєяяяиннни 00 Дани єю З ЗНА попелу понос о песосе чно пре локоньньтостс, подана учадннкнначнннн по Її і ї 3 ї ШЕ В ких ААЦАА АЛАНА мкА Маки АКУЛА АСУ М ЧАЙНА АКА ючи плчхахат А АХАМАААААЕА Ач т ж канала сус ЯНННННе ! - СОВЕ. В З дгиллччюча чаю люттю НнНННН- і Енн СИВУЕСЕ- подібний

ЩІ. 7 СВ Ве

Фіг.10 у ех еку генні г КІ, ї КК чек За -ї. слу . За язування АБО АБ МО та Мобо з попшентидами шурячеаго МАВРО х ДУ у У УК У УК КУ КК УК У У КТ У У УК У УТ Ку ук чук ук : ї 1 : до ; 1 чик Я ї дж : че па - ше У Лоуднинни щКх- ЕТ м т -- ! джен КЕДИ Геном - ЩОМАШВОА чу 5 - др Є пе дет і! опа я дян реження. ВО МАВРОА ї ою 5 вл се ; взято яна ЩО СуВІ Са і хх ї я «її по з фак ЯВИ СуВІЯ Копчена тт рН Кт п т Ще п и я нн а ни п и нн нн и і і п м а а В р а ! і і В зд ттто ко сттечн о сос ендо ствоссх тусрнсткнттст ето нс ротеттсетевстснкчнчннну з 20 40 во во здо ТАщі Ібн

Фіг.11

Лектиновий шлях

ЗЕ. че - у Ь х ! їх ! Ш- «к «12 «І «В В -й «Т із 646 пАВ, М! Фіг12А Кивсичний шлях о, :

хх .

ОО. я 8-2 і о «ій «А і «В «В «В -ї іо БЯб па, М!

Фіг.128

Апетернативний шлях що х ха - З

3 о. 9 нк :

ж. З З Ж :

ва . «ТЕ « «о В "В -Ї іосз 6546 тА, МІ

Фіг.12С 100000 косвиосп : ен 5 МІЖ : -ае 5 МКУ , я 15 МІЖ 5О т 100003 Лю де за нн Пеня - 0005 но б 200 405 БОЮ оо часі Фіг13 у мкЗ Х - / кавою ВІЇ А а. 8 «о 5 МКГ М М ОБІВІ Е : ан Інтактні Е ї «в» інтактні 4 (ОМ5846) Ф в 10 є о и - шк. в ш Я п . 1 ще шин я В як ско - ЩЕ - ей ще кое же В Де жеожк жк ом лк яко ЖК дю зве зх А А ХО ХМ ККОЖКОКЮ лк лк р о ване нн 2 5 па 00 що що 0 час Фіг/лЛ4д

Я.

щу . я ! К ле ГПК ДЯЄ вові чаю 5 МЕЖ М ТОМІВ) о ; тав |нтактні щ І ше Зізтезитні я АСВ д -В- інтактні « (0М5846) 2 1069 в ї Ше. ру і ах - ; де Е й «о хо жк хе в. зако нена ува х 7 ід Ж й і Б | ш ск і ща

0.04 фееееетенюетеесоеонх сосен сосоесесососефосе сего сего сесесефрес вот с со сегоососссеню их «83 БО щю час їі Фіг148в шо ск «ЦО оперовані х 403 як «Поевдооперовані са ! рун нн текти кекехух кто, х З Фе - с Ех Що с у сек хх З кВ хжунню во. . з 05 «г? х Но» о З сере ща ї ща. ща у зе. ЕАз ; хо т | -Ш- зво, ЗВ з | ' же є Дикий тип МАО Ффіг.15 я у «к і З вин т ци й оп врова н як з . в Псевдооперовані Во я - ж мя у 5» г воно Фо ее г Дикий тип МАЩЕЕ я» я же 035 Фіг 16

Колаген М/ типу в ! фронт е МТ, поевдооперцвані ха . се . Ов 5 я МАБРАЯ, псевдосперовані -Е | кое т а НОЮ Фо 15 шо ще ж МАО КСОМЮ о | ж во зон ЕЕ х У ж ен Я сееенфестня сх с Ї «Я що оо : КУ ще Ка Ко Гея її сь 58 У Кози Б Ф я Же ІК 5 «У ях ЩЕ Група мишей прац

Фіг.17 ТОБ дет! Са дня 5.5. франнкнклкй какинкіни за - х5 ? й -е МТ, повадобперовані -- «зб. т ; уз :ї вв зае ш МАВР-?, псевдослеповані о -ВЕ- й а ВТЩЮ Ж х « мМавво ко шо с ев с Я а у «а З а «ФВ нннтруеннюттнннртктсенсюнортсттотоопеюноєрнповнсоннкх . У ЗХ са я я я с «БУ 3 їь що КУ Я в я «Е Ф -? Я с, й Ко я й Група мишей тре свя Фіг18

Інтерлейкн о шику Кк Не З з фукннчнжнкжкланнукнкй тки 2 кН хг е М. псевдоюперовані Бо ще з ж МАВР-В, поевдосперовані

Ж. т МАЕ КОЦІЮ в. НВ ї ; Фо - «З Доктрину нкне рин норок зняянй Я г їх Сай до Є з «о К Бу Я зх «о Ж Кз «В СЯ С а щей що со Я Я -- - дА ке « и у ще ; . та во Група мищей зр«ОДі0В

Фіг.19 інтерферон гама - нтерферон гам фе ща ркчкнннноня «М, повадооперован: Ж зв за ж МАБР-Є, псевдооперовані ке от в В ІШО шок че - » ЧЕ ЖЖ во Як: «в внут инннннсннрюннннннорннннх . 2 ча З оо Я а с а зай т є ' «ї я а Я а я як тях ; з іх сх і вупа мишей АХ г, зе 0185

Фіг.20

Забарелення сном червоним нипок, знбювних через 7 дивюля МОЮ п х «Ж ву функ орендне Ей Х 7 х ;

БЕ. я ве ШЕ й бе ЦЕХ і АКА кох за ех лляні КО сл ко В м ор «я ме я й - а У заепоєту

Фіг.21 Вміст пдрокнпроліну в нирках, зібраних через 7 днів після ЦО няні. т 135 во що і Б во в з ще . -Е ї пюре в гак 3 ооо їх. е Же спря - і «вв ж шко б ше ЗЕ жу хи 5 ха є я сш з «Е К- де сей М КУ зона ео3 о

Фіг.22

Загальна клькість протетнази в сироватці зФ в ЕЕ в- Ж ше МТ контроль 0-х . - шо ВО - во АТ КУ сту ме МЕДИК в ж ве ее Е ш в ж «в. с-, Мт з ж Ба ! У п ; оеососососо осо рого кекс ссокососок ех осо роюсосососососне КМ ех » ах як а м Групи

Фіг.23 Загальна кількість біпків, виведених із сечею 125 години! же 5 5 т ВО : : й й з 2004 » я М 5 Шо з МАВР я. 0 За Же Я ва х 7 5 100 ші З ї ! й ТМ «в Ж з до ск к ще ж пе « - в у У з Гожпя

Фіг.24

Дикмй тив ВАДА ія КО ОХ вно дк КК - . ск д ОО ще МО ООН в МОВ КК КО ОС А М КІ ХМ УКХ У М ще а ОО МК о Ох с у . СС о. ОО В ОО я МОСК 0 хе х А ОО М КБ З З ХУ КО ОО В ОК хе - СУХО ОО хх ОО ОО ВЕ ОК Ох ОМ КО п В В ВО г що фа ОХ о році ЗОЗ ОО ЕК 5 В В БО а, ОО 3 ЩО ЗО ЕВ З сс г УК по ОО ОХ КОКО ПО їх АК КК З ж МК ХМК МК МОХ ОО ОХ КК СХ ОВ ЗА КК щ ВО ОО КО о о ну т ВО о М В ОО ВК в о - с с КВ ее ОКО ВК ОК ОК о ОКО ОК КОВКА ОК КК В ВХ З с с жи шен не 0 Б . ї ТОМ ЖК ЗО ОВК ОККО ОХ ММК одв тиимн КО о пен М ВО оо кока с Б БВ с. в В ОХ АК у ОБУ ЗКУ ОО ОВ ОКХ ОМ м ЗХ хх ОК М ЗО ї ОК ОК ХМ ОК В Я до ОО М ОО а В В БУ о УК УА ОО ОК г ОКО Он -Х З ОО о ОО У КЕ ОН М СО ОХ Ох у и М ме ОО с. М ВОК ОО я у що КО В ОК о с МО а КБ ее МО В ОККО М КК

СС. Хе Ж БО Ее ОК ОК ПАМ ОО ВВ З ХОМ ОО. ОК КК Х

Фіг.25 інекльтваніи ман вагів, Б міді Коль ваців макрефагів, РУВО антитіла, шк МИ рхерчу Фу І Фк УТ проти МАВР-ДУ»

о. цйх В р « о ; ях Ж п : панни 4 но фуееву Я ве о ж МИ КНИШЛЬ зи хни Уч во ви ший М а МАРИЯ ше сеекиефмтнтня ї е Я п Ж т ду же а в-о м п . ШО па і її о У й я і БеЯ е зу к о; а Я Групи З

Фіг.26 інфільтрація макрофагів, кореляція є з протеїнурією (дикий тип) р Ф ря е ' док Я 5 Шк що г ОТ Ж ух дх де а КУ сх В во інфільтрація макрафагів ІСередній 25 забаовленої площі)

Фіг.27А р інфільтрація макрофага, кореляція з протеїнурією ї (МАБР-Й

5 о. Я ОБ | ж БОБ в в що ї г шо ва за е а 2 а ке З 5 оо М сла інфільтрація макрофагів (Свредній 5 забарвленої плащі)

Фіг.27 В

Трансформуючий фактор росту де За 7Х жк оон я - МАБР М . 7 що х ов їн З З В : ооо шк й ж 5 кох лі о 154 т р 3 ща ;

Во. ке Ж що «в «г Групи хрей. 026

Фіг.28 Фактор некрозу пухляни аль --- я я - фононттоттююттюотюнетеснююетннй а А Не « в о МАБР о я. є --- х Е а Б КУ зененокне : че х К у ка жре0. 0303

Фіг.29 інтерлейкін 6 й фен .е МИ контроль ВоЯо а МАБР-ОУ Контроль є ь « че ік ж т МАВ. і «ка є х с ко Ж зо » чо НК) БОООВА онюнтуютттння приток чі Ко а В КУ сег Кк «8 же -х я щих Мар Я Групи КН

Фіг. 30 АпоптоЗ З - З ВО ках ще ж рання а. М контроль к кв я МАР контроль ГУ І. ще Є Ж а Мп Ж ! жк до - -- т МАР 2. я: дк зані 5 пани БоОВО- к т «ДЕ х х м зо їх де ж" їх 2 «я ж че щк ч в да Групи кжвжний ОЇ

Фіг.31

Патопопені зміни, забарвлення НеЕ А В С с о с с г ПЕК о. о /і с СО с В УК В ЗХ М ПМК ОПП я КУ ШИХ хх що ХХ с МКК о с с с КО В ОО М В КК М В З ВХ В пи и ЕЕ о о . Ох с с с. о о о. ОО с с що с о о с 0. 0. с о с пон Контрольна група, що Група, що атоимувала Група, що отримувала отримувала фізюлогічний розчин іїзотипний контроль МАЗР-Е ТА фіг.32 що Апоптаз ре Б дк не НО . - - руно тонноеоноонюннони е Контрольна, фізопогічний розчин ве фреону шо ІЗзотИипний контроль в ПИ що їж ках ша я її в хх мій У ке Групи «з деОюЮУ жи 5

Фіг.33

ТОВ СЕ ше В фонетичне е Контрольна, фізюлогчний розчин с з рост сно ж іЗотилний контроль Ж З 7 СУК зи фо а з « а МАБР-Я МА В | в к А ми З Я ї ! у що хо к я КЗ с жо» її їхх с о ою - ше 7 8 З Ту сх о з -кх КО ше о ОК «У мя « " її З - ке чо - Групи тр: 0.5324 перева

Фіг.34 ТКА ми ик о ТМА яльса Шолщ, х що я як а фронтон - / Кантольна, фФізюпогчний розчин Ж Е- : дннннюннннн В нннннннн шо іотийнЯх комтюль 5 ах ; НН Б ву а « МАЕР-о ТА Кеш 3 - осн - с Ж р з Ж й «де ЖК і в ж : во ! ках Б я ще айв і. : : ші З сх М що с ща ЩО т а ; е ї Аш У бу я У Я к ще її д зи М Я а КУ А Ех че соодя Групи мишей жу ТІ хз ОІВ

Фіг.35 хі інтерлейкін б жд я не ака ітд кі ще Вк з -ь а 0 воантрольне, диаалеапчниМ розчин тп у нн ї ск Є Я І, ч п нІї к х . що ж шо мотипний контроль їх | ЗАМ ди г їй і а МА ша мо ож ; ф 5 ЯМ ех ж во СОКУ з я я Ех ; З ІЗ ж ї С є ї Фо Ж В дюннястнттетюсткевотертютттсювсстстетевсттозоєнттснся -Ех ки З ак Я «о с гуре МОЯ «Ех щу ЖЖ «У се сх Ця ке ще МУ щу хх ще чо са 5 чу З ех шо Не чо Не о УК з З МЕНЕ М Групи мишей жо гу ребдеео «ер«едлМАВ

Фіг.36 план ям ую с - се ії КОВІ й Адвріаміцин-індукована нефропатія (забаралення НЯЄ) ОВТ ювьна птУва, ща стркмувана о кеді дич і за уж х. що зіюпогчний розчи БО МАУ - ВОМС КО ВВ з 5 КОВО ВК ока -л ВЕК поковок ш 0000000 щ 00000 ща ОО ОМ ОМ Б ох о ВО в ОКХ о ХХ п. Ох С о ОХ КВ о ОККО КК МО В КОХ ОК В : ОО У о. ККУ ОО МО МЕ с шщ-- 0 с І М МЕМ У 0. З ОО ОКО ОО КК г В а ПО у ОО ВХ як ОККО ВХ ОКОМ ЗОМ ж Х КК ММ ОХ КК о п 5, ПОВ В о не я п ї ОККО КК ХХ Кх У МК МКМ дз КО ХК В За сов ТО зх хх ох влУв х са осо ПК - тю ДОБКООХ : ХК я - с с с МО В о Є КО о о В В Є КН ОА о В ОО зх ОХ ОК В о ОО В ККЗ о п Ох о ОВО ОХ о я ОО В с с с ОКО о ОВ Ме А ОК ЖК ММ М КМУ КК СХ пе о КВ ОК КК Ко КАК КК ОВ с ОО КО по Хе ЕК п. : ОВ КК: А ЗО ОВ ОЕОЕ ОО

! . с с с. З ХХ ЗО ОМ ОМ щ-з ВОВК ВО З ЖК 5.5 ВОК КК о; ОК Ве Аз сг я сг я ог КК МОХ КК ОК с х ОО 5 М ОКХ ХУ хх КОВО ОКХ У вах ОКХ МО МОБ СХ ОО М КК ОО ОО ОО МОМ ОМ ОО ОК ОО іх хх ОО ХК ООН їх КМ ОО М Я ОО ОА У ОК ЗУ ще ЗО СО МОХ З КОХ М СК ОО МОМ ОМВО ; ОХ У ОККО ЗО щ оо ОК ще ОО М МО 5 КО НК ОО и п Б 000 щш,. 0000

Фіг.37 інфільтрація макрофана Ж ж ок х й ! фреколкюк ук юю мтс й ш в о . ЩО з щщ З о / й ЩІ с в їх і і 8. хх ж м секкюКу де ї сх сх р се й «ке С Ж дао о В іх ще ще й ще че

Фіг.38 с Відкладення колагену ще У -к ву . : ї Дону єму ма муку кк

Се . - - ї 5 С жк ї во - Ж : з.

ї . й . очно Ж «и - 1 ее мен Х Зв совсвовве, : щї ї «и. еВ ха х й сх З в в. і ; о - з ча г даю че ще че оо а ЖЕ У ще с : щу чо в

Фіг.39

Альбумінкреатини відношення (АСК У ДАМ пацієнтів, що отримували (ОМОбЯЄІ г воо дл ст та-тижновеє пікудання е5во в ; ; Мен, роко Пацієнт ж око Пацієнт? я АХ Ж : 7 М х : ее У-н-н "В : Меси, : еВ а за й че за НЕ Зміна від вихідного рівня Под трансформований: а: веб: реВ ОВ; с рев Зміна від вихідного рівня: я: ре од в: вео ов сечо

Фіг.40 ма регу ше пененеврння бан 00 ОоБимиМмимМийМ,. : У У х. : хо У х ее ГацЕНКТ КЕ | же ше У х Же пам 2 щ І Дух мкмечкктт я Б сх же -- щ й : х М х К- за» ДПашент З Ж Коко ї пи . А . пен пн пи о ИН пінні ПУТ Гівцівнт 4 ' х іч У Ж пен нн кдд Ж пн фінан : Те Пд - Ша : п я оевудттн, : Хжну вас с ау коні : Ах Учюмл я тех Уха Позатювий омент Дениой 00 Деней? 00 Деньйб 00 День й 00 Дені чу

Фіг.41