JP6893554B2 - 免疫グロブリンａ腎症に罹患したヒト対象におけるタンパク尿を低減するための方法 - Google Patents

免疫グロブリンａ腎症に罹患したヒト対象におけるタンパク尿を低減するための方法 Download PDF

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Description

配列表に関する記載
本願に関連する配列表はハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み入れられる。配列表を含むテキストファイルの名前は、MP_1_0269_PCT_Sequence_Listing_20171013_ST25である。このテキストファイルは136 KBであり、2017年10月10日に作成され、本明細書の出願と共にEFS-Webを介して提出されている。
背景
補体系は、ヒトおよび他の脊椎動物において微生物感染症および他の急性侵襲に対する免疫応答を開始、増幅、および組織化するための初期作用機構を提供する(M.K. Liszewski and J. P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, W.E, Paul編, Raven Press, Ltd., New York（非特許文献1）)。補体活性化は潜在的な病原体に対する有益な第一線の防御を提供するが、防御免疫応答を促進する補体の活性は宿主にとって潜在的な脅威となることもある(K.R, Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994（非特許文献2）)。例えば、C3およびC5タンパク質分解産物は好中球を動員および活性化する。活性化好中球は宿主防御に不可欠であるが見境なく破壊酵素を放出し、臓器損傷を引き起こすことがある。さらに、補体活性化によって、近くの宿主細胞ならびに微生物標的の表面に溶解性補体成分が沈着し、その結果、宿主細胞が溶解する場合がある。
補体系はまた、心筋梗塞、脳卒中、ARDS、再灌流傷害、敗血症ショック、熱傷後の毛細血管漏出、心肺バイパス術後炎症、移植片拒絶、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、およびアルツハイマー病を含む、非常に多くの急性疾患状態および慢性疾患状態の発生に関係している。これらの状態のほぼ全てにおいて、補体は原因でないが、発生に関与するいくつかの因子の1つである。それにもかかわらず、補体活性化は主要な病理学的機構であると考えられ、これらの疾患状態の多くにおける臨床管理のための有効なポイントということになる。様々な疾患状態において補体媒介性組織損傷が重要であるという認識の高まりは、有効な補体阻害薬物の必要性を強調する。現在に至るまで、抗C5抗体であるエクリズマブ(Solaris(登録商標))がヒトでの使用に認可されている唯一の補体標的化薬物である。だが、C5は、補体系の「下流」に位置する、いくつかのエフェクター分子の1つであり、C5が遮断されても補体系活性化は阻害されない。従って、補体活性化の開始工程の阻害因子は「下流」補体阻害因子よりもかなり優位に立っていると考えられる。
現在、補体系は3つの異なる経路:古典経路、レクチン経路、および第二経路を介して活性化できることが広く認められている。古典経路は、通常、外来粒子(すなわち、抗原)に結合した宿主抗体からなる複合体によって誘発され、従って、特異的抗体反応を発生させるために抗原への前曝露を必要とする。古典経路の活性化は宿主による以前の獲得免疫応答に左右されるので、古典経路は後天免疫系の一部である。対照的に、レクチン経路および第二経路はいずれも獲得免疫とは無関係であり、自然免疫系の一部である。
補体系の活性化により、セリンプロテアーゼ酵素前駆体の連続して起こる活性化がもたらされる。古典経路活性化の第一段階は、特異的認識分子C1qと、抗原に結合したIgG分子およびIgM分子との結合である。C1qは、C1と呼ばれる複合体としてC1rおよびC1sセリンプロテアーゼプロ酵素と結合する。C1qと免疫複合体が結合すると、C1rのArg-Ile部位が自己タンパク分解によって切断された後に、C1rによって媒介されるC1sの切断および活性化が起こり、それによって、C4およびC2を切断する能力が獲得される。C4は、C4aおよびC4bと呼ばれる2つの断片に切断され、同様に、C2はC2aおよびC2bに切断される。C4b断片は、隣接するヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を結合し、活性化C2のC2a断片との非共有結合的相互作用を介してC3コンバターゼ(C4b2a)を生成することができる。C3コンバターゼ(C4b2a)は、C5コンバターゼ(C4b2a3b)の生成をもたらす、C3aおよびC3b小成分へのタンパク質切断によって、C3を活性化し、C5コンバターゼ(C4b2a3b)は、C5を切断することによって、細胞膜を破壊して細胞溶解をもたらすことができる膜侵襲複合体(C5bがC6、C7、C8、およびC9と組み合わされ、「MAC」とも呼ばれる)の形成をもたらす。C3およびC4の活性化型(C3bおよびC4b)は共有結合により外来標的表面に沈着し、複数の食細胞上にある補体受容体によって認識される。
独立して、レクチン経路を介した補体系活性化における第一段階も、特異的認識分子の結合と、それに続く、関連するセリンプロテアーゼプロ酵素の活性化である。しかしながら、C1qによる免疫複合体の結合ではなく、レクチン経路の認識分子は、総称してレクチンと呼ばれる炭水化物結合タンパク質(マンナン結合レクチン(MBL)、H-フィコリン、M-フィコリン、L-フィコリン、およびC型レクチンCL-11)の一群を含む。J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, (2002)（非特許文献3）; Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21:547-578(2003)（非特許文献4）; Teh et al., Immunology 101:225-232(2000)（非特許文献5）)を参照されたい。J. Lu et al., Biochim Biophys Acta 1572:387-400(2002)（非特許文献3）; Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21:547-578(2003)（非特許文献4）; Teh et al., Immunology 101:225-232(2000)（非特許文献5）; Hansen et al., J, Immunol 185(10):6096-6104(2010)（非特許文献6）も参照されたい。
Ikedaらは、C1qと同様にMBLが酵母マンナンでコーティングされた赤血球と結合すると、C4依存的に補体系を活性化できることを初めて証明した(Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, (1987)（非特許文献7）)。コレクチンタンパク質ファミリーのメンバーであるMBLは、3-ヒドロキシ基および4-ヒドロキシ基がピラノース環の赤道結合面に配向されている炭水化物と結合するカルシウム依存性レクチンである。従って、MBLの目立ったリガンドはD-マンノースおよびN-アセチル-D-グルコサミンであるのに対して、この立体的要件に合わない炭水化物はMBLに対して検出不可能な親和性を有する(Weis et al., Nature 360:127-134, (1992)（非特許文献8）)。MBLと一価糖との相互作用は極めて弱く、解離定数は典型的に1桁のミリモル範囲内である。MBLは、アビディティによって、すなわち、互いに近くに位置する複数の単糖残基と同時に相互作用することによってグリカンリガンドと緊密で特異的な結合を達成する(Lee et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992)（非特許文献9）)。MBLは、一般的に、微生物、例えば、細菌、酵母、寄生生物、およびある特定のウイルスを装飾する炭水化物パターンを認識する。対照的に、MBLは、通常、哺乳動物の血漿糖タンパク質上および細胞表面糖タンパク質上に存在する「成熟」複合糖質を装飾する最後から2番目の糖および最後の糖であるD-ガラクトースおよびシアル酸を認識しない。この結合特異性は、「外来」表面の認識を促進し、「自己活性化」からの保護を助けると考えられる。しかしながら、MBLは、哺乳動物細胞の小胞体中およびゴルジ中で隔離されたN結合糖タンパク質および糖脂質における高マンノース「前駆」グリカンのクラスターに高親和性で結合する(Maynard et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, (1982)（非特許文献10）)。従って、損傷細胞は、MBL結合を介したレクチン経路活性化の潜在的な標的である。
フィコリンは、フィブリノゲン様ドメインと呼ばれる、MBLとは異なるタイプのレクチンドメインを有する。フィコリンはCa++非依存的に糖残基に結合する。ヒトでは、3種類のフィコリン(L-フィコリン、M-フィコリン、およびH-フィコリン)が同定されている。2種類の血清フィコリンであるL-フィコリンおよびH-フィコリンは共通してN-アセチル-D-グルコサミンに対する特異性を有する。しかしながら、H-フィコリンはN-アセチル-D-ガラクトサミンにも結合する。L-フィコリン、H-フィコリン、CL-11、およびMBLの糖特異性が異なることは、異なるレクチンが補い合い、重複によって異なる複合糖質を標的とし得ることを意味する。この考えは、レクチン経路にある公知のレクチンのうちL-フィコリンだけが、全てのグラム陽性細菌に見られる細胞壁複合糖質であるリポテイコ酸に特異的に結合するという最近の報告によって裏付けられている(Lynch et al., J. Immunol. 172:1198-1202, (2004)（非特許文献11）)。コレクチン(すなわち、MBL)およびフィコリンはアミノ酸配列において有意な類似性を有さない。しかしながら、これらの2つのタンパク質グループは、類似したドメイン構成を有し、かつ、C1qと同様に集合して、多部位結合の可能性を最大にするオリゴマー構造を構築する。
MBLの血清中濃度は健常集団においてかなり変動し、これは、MBL遺伝子のプロモーター領域およびコード領域の両方にある多型/変異によって遺伝的に制御される。急性期タンパク質として、炎症中にMBL発現はさらに上方制御される。L-フィコリンは、MBLの濃度とほぼ同じ濃度で血清中に存在する。従って、レクチン経路のL-フィコリン分岐は強さが場合によってはMBL部門に匹敵する。MBLおよびフィコリンはオプソニンとしても機能することができる。このために、食細胞は、MBLによって装飾された表面およびフィコリンによって装飾された表面を標的とすることが可能になる(Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3):328-36(2004)（非特許文献12）, Matsushita and Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7(2002)（非特許文献13）, Aoyagi et al., J. Immunol, 174(1):418-25(2005)（非特許文献14）を参照されたい)。このオプソニン化は、これらのタンパク質と食細胞受容体との相互作用を必要とする(Kuhlman et al., J. Exp. Med. 169:1733, (1989)（非特許文献15）; Matsushita et al., J. Biol. Chem. 271:2448-54, (1996)（非特許文献16）)。食細胞受容体の正体は証明されていない。
ヒトMBLは、そのコラーゲン様ドメインを介して、MBL関連セリンプロテアーゼ(MASP)と呼ばれる独特のC1r/C1s様セリンプロテアーゼと特異的な、かつ高親和性の相互作用を生じさせる。現在に至るまで、3種類のMASPが述べられている。第1に、単一の酵素「MASP」が、補体カスケードの開始(すなわち、C2およびC4の切断)を担う酵素として特定および特徴決定された(Matsushita et al., J Exp Med 176(6):1497-1502(1992)（非特許文献17）:Ji et al., J. Immunol 150:571-578, (1993)（非特許文献18）)。その後に、MASP活性が実際には、2種類のプロテアーゼ:MASP-1およびMASP-2の混合であることが明らかにされた(Thiel et al., Nature 386:506-510, (1997)（非特許文献19）)。しかしながら、補体活性化にはMBL-MASP-2複合体だけでも十分であることが証明された(Vorup-Jensen et al., J. Immunol 165:2093-2100, (2000)（非特許文献20）)。さらに、MASP-2だけが高い割合でC2およびC4を切断した(Ambrus et al., J. Immunol, 170:1374-1382, (2003)（非特許文献21）)。従って、MASP-2は、C4およびC2を活性化してC3コンバターゼであるC4b2aを生成するのを担うプロテアーゼである。これは、2種類の特異的なセリンプロテアーゼ(C1rおよびC1s)の協調作用が補体系活性化につながる古典経路のC1複合体とは大きな違いである。さらに、第3の新規プロテアーゼであるMASP-3が単離されている(Dahl, M.R. et al., Immunity 15:127-35, 2001（非特許文献22）)。MASP-1およびMASP-3は同じ遺伝子のオルタナティブスプライシング産物である。
MASPは、C1複合体の酵素成分であるC1rおよびC1sのドメイン構成と同一のドメイン構成を有する(Sim et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, (2000)（非特許文献23）)。これらのドメインは、N末端C1r/C1s/ウニ(sea urchin)VEGF/骨形成タンパク質(CUB)ドメイン、上皮細胞成長因子様ドメイン、第2のCUBドメイン、補体制御タンパク質ドメインの縦列配列、およびセリンプロテアーゼドメインを含む。C1プロテアーゼと同様に、MASP-2の活性化は、セリンプロテアーゼドメインに隣接するArg-Ile結合の切断によって起こる。この切断によって、酵素はジスルフィド結合したA鎖およびB鎖に分けられる。後者はセリンプロテアーゼドメインからなる。
MBLはまた、MASP-2の触媒活性を欠く、19kDaのMBL関連タンパク質(MAp19)または低分子MBL関連タンパク質(sMAP)として公知のオルタナティブスプライシング型MASP-2と結合することもできる(Stover, J. Immunol. 162:3481-90, (1999)（非特許文献24）; Takahashi et al., Int. Immunol. 11:859-863, (1999)（非特許文献25）)。MAp19は、MASP-2の最初の2つのドメインに続いて、4個の独特のアミノ酸からなる余分な配列を含む。Map19の機能は不明である(Degn et al., J. Immunol. Methods. 2011（非特許文献26）)。MASP-1遺伝子およびMASP-2遺伝子は、それぞれ、ヒト第3染色体および第1染色体に位置する(Schwaeble et al., Immunobiology 205:455-466, (2002)（非特許文献27）)。
いくつかの証拠から、異なるMBL-MASP複合体があり、かつ血清中のMASPの大部分がMBLと複合体を形成しないことが示唆されている(Thiel. et al., J. Immunol. 165:878-887, (2000)（非特許文献28）)。H-フィコリンおよびL-フィコリンはいずれもMBLと同様に全てのMASPに結合し、レクチン補体経路を活性化する(Dahl et al., Immunity 15:127-35, (2001)（非特許文献22）; Matsushita et al., J. Immunol. 168:3502-3506, (2002)（非特許文献29）)。レクチン経路および古典経路はいずれも共通のC3コンバターゼ(C4b2a)を形成し、2つの経路はこの段階で1つになる。
レクチン経路は、ナイーブな宿主における感染症に対する宿主防御において主な役割を有すると広く考えられている。宿主防御においてMBLが関与する強力な証拠が、機能的MBLの血清中レベルが低い患者の分析から得られた(Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002)（非特許文献30）)。このような患者は反復性の細菌感染症および真菌感染症に対して感受性を示す。これらの症状は、通常、若年期に、母系由来抗体価が漸減する時であるが抗体反応の全レパートリーが発達する前の見かけの(apparent)脆弱期間に現れる。この症候群は、MBLコラーゲン部分におけるいくつかの部位での変異に起因する場合が多く、該変異はMBLオリゴマーの適切な形成を妨害する。しかしながら、MBLは補体に関係なくオプソニンとして機能することができるので、感染症に対する感受性の増大がどの程度まで補体活性化の障害によるものであるかは分かっていない。
3つ全ての経路(すなわち、古典経路、レクチン経路、および第二経路)は、複数の炎症誘発作用を有する産物を形成するために切断されるC5において1つになると考えられてきた。1つになった経路は終末補体経路と呼ばれてきた。C5aは、平滑筋緊張および血管緊張の変化ならびに血管透過性を誘導する最も強力なアナフィラトキシンである。それはまた好中球および単球の強力なケモタキシンおよび活性化因子である。C5aを介した細胞活性化は、サイトカイン、加水分解酵素、アラキドン酸代謝産物、および活性酸素種を含む複数種のさらなる炎症メディエーターの放出を誘導することによって、炎症反応を著しく増幅することができる。C5が切断されると、膜侵襲複合体(MAC)としても公知のC5b-9が形成される。現在、溶解を引き起こすのに十分でない(sublytic)MAC沈着が、溶解性ポア形成複合体としての役割に加えて炎症において重要な役割を果たし得るという強力な証拠がある。
補体系は、免疫防御における必須の役割に加えて、多くの臨床状態における組織損傷の一因となる。古典補体経路および第二補体経路の両方が非感染性ヒト疾患の発生に関係していることを示す幅広い証拠があるが、レクチン経路の役割は評価され始めたばかりである。最近の研究から、レクチン経路の活性化は虚血/再灌流傷害における補体活性化および関連炎症を担っている可能性があるという証拠が得られた。Collard et al.,(2000)は、酸化ストレスに供された培養内皮細胞はMBLに結合し、ヒト血清に曝露されるとC3沈着を示すと報告した(Collard et al., Am. J. Pathol 156:1549-1556,(2000)（非特許文献31）)。さらに、ヒト血清を遮断抗MBLモノクローナル抗体で処理すると、MBL結合および補体活性化が阻害された。これらの知見をラット心筋虚血-再灌流モデルに広げた。このモデルでは、ラットMBLに対する遮断抗体で処置されたラットは、冠状動脈閉塞時に対照抗体処置ラットよりも有意に少ない心筋損傷を示した(Jordan et al., Circulation, 104:1413-1418,(2001)（非特許文献32）)。酸化ストレス後の血管内皮とのMBL結合の分子機構は不明である。最近の研究から、酸化ストレス後のレクチン経路の活性化は血管内皮サイトケラチンとのMBL結合によって媒介されるが、複合糖質によって媒介されない可能性があることが示唆されている(Collard e al., Am. J. Pathol. 159:1045-1054,(2001))。他の研究は古典経路および第二経路が虚血/再灌流傷害の発生に関係していることを示しており、この疾患におけるレクチン経路の役割は議論の余地が残されている(Riedermann, N.C. et al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003（非特許文献33）)。
線維症は、一般的に損傷または傷害に応答した、臓器または組織における過剰な結合組織の形成である。線維症の顕著な特徴は、局所外傷後に、過剰な細胞外マトリックスが産生されることである。傷害に対する正常な生理学的応答は結合組織の沈着をもたらすが、この最初のうちは有益であった修復プロセスが持続し、病気を起こし、それにより組織の構造および機能が変化する場合がある。細胞レベルでは上皮細胞および線維芽細胞は増殖し、筋線維芽細胞に分化し、その結果としてマトリックスの収縮、硬直性の増加、微小血管の圧迫、および低酸素が起こる。マクロファージおよびリンパ球を含む炎症細胞が流入するとサイトカインが放出され、コラーゲン、フィブロネクチン、および他の線維症マーカーの沈着が増幅する。従来の治療アプローチは、主に、コルチコステロイドおよび免疫抑制薬物を用いて、線維症の炎症プロセスに向けられてきた。残念なことに、これらの抗炎症剤には臨床効果がほとんど無いか、全く無い。現在、線維症に有効な治療法または治療剤は無いが、動物試験およびヒトでの事例報告の両方から、線維性組織損傷は逆転する可能性があると示唆されている(Tampe and Zeisberg, Nat Rev Nephrol, Vol 10:226-237, 2014（非特許文献34）)。
腎臓には、傷害から回復する能力があまりない。様々な腎臓病態が、腎臓組織の瘢痕および線維症を引き起こす局所炎症の原因となる。炎症刺激の永続化は、慢性腎疾患における尿細管間質の炎症および線維症ならびに進行性の腎機能障害の原動力となる。末期腎不全まで進行すると、かなり大きな罹患率および死亡率と結び付けられる。尿細管間質性線維症は複数の腎臓病態の共通するエンドポイントであるので、腎不全の予防を目的とする療法の重要な標的である。原発性腎臓病とは独立した危険因子(例えば、タンパク尿)が局所炎症の原動力となることで腎臓線維症の発症と腎臓排泄機能の喪失の一因となり、その結果として疾患進行が速まる。
例えば、慢性腎疾患につながる尿細管間質性線維症などの多くの疾患および障害における線維症の役割を考慮すると、線維症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患および状態を治療するための、治療に有効な物質を開発する差し迫った必要性がある。さらに、腎臓病における線維促進性の炎症経路を標的とする新たな治療および既存の治療がほとんど無いことを考慮すると、腎臓線維症を治療し、阻害し、予防し、および/または逆転させ、それによって進行性の慢性腎疾患を予防するための、治療に有効な物質を開発する必要性がある。
M.K. Liszewski and J. P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, W.E, Paul編, Raven Press, Ltd., New York K.R, Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994 J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, (2002) Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21:547-578(2003) Teh et al., Immunology 101:225-232(2000) Hansen et al., J, Immunol 185(10):6096-6104(2010) Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, (1987) Weis et al., Nature 360:127-134, (1992) Lee et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992) Maynard et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, (1982) Lynch et al., J. Immunol. 172:1198-1202, (2004) Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3):328-36(2004) Matsushita and Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7(2002) Aoyagi et al., J. Immunol, 174(1):418-25(2005) Kuhlman et al., J. Exp. Med. 169:1733, (1989) Matsushita et al., J. Biol. Chem. 271:2448-54, (1996) Matsushita et al., J Exp Med 176(6):1497-1502(1992) Ji et al., J. Immunol 150:571-578, (1993) Thiel et al., Nature 386:506-510, (1997) Vorup-Jensen et al., J. Immunol 165:2093-2100, (2000) Ambrus et al., J. Immunol, 170:1374-1382, (2003) Dahl, M.R. et al., Immunity 15:127-35, (2001) Sim et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, (2000) Stover, J. Immunol. 162:3481-90, (1999) Takahashi et al., Int. Immunol. 11:859-863, (1999) Degn et al., J. Immunol. Methods. 2011 Schwaeble et al., Immunobiology 205:455-466, (2002) Thiel. et al., J. Immunol. 165:878-887, (2000) Matsushita et al., J. Immunol. 168:3502-3506, (2002) Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002) Collard et al., Am. J. Pathol 156:1549-1556,(2000) Jordan et al., Circulation, 104:1413-1418,(2001) Riedermann, N.C. et al., Am. J. Pathol. 162:363-367, (2003) Tampe and Zeisberg, Nat Rev Nephrol, Vol 10:226-237, (2014)
概要
本概要は、以下の詳細な説明においてさらに説明される幅広い概念を簡単な形で紹介するために提供される。本概要は、特許請求の範囲に記載された対象の重要な特徴を特定することを意図されていることも、また、特許請求の範囲に記載された対象の範囲の決定を助けるものとして用いられることを意図されていることもない。
一局面において、本発明は、線維症および/もしくは炎症によって引き起こされるかもしくは悪化する疾患もしくは障害に罹患しているか、またはこれを発症するリスクがある哺乳動物対象において、線維症を治療、阻害、軽減、または予防するための方法であって、線維症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害物質を該対象に投与する工程を含む、方法を提供する。一態様において、MASP-2阻害物質はMASP-2抗体またはその断片である。一態様において、MASP-2阻害物質は、SEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、MASP-2モノクローナル抗体またはその断片である。一態様において、MASP-2阻害物質は、C1q依存性補体活性化を実質的に阻害することなくレクチン経路補体活性化を選択的に阻害する。一態様において、対象は、(i)虚血再灌流傷害に関連する線維症および/もしくは炎症、(ii)腎臓線維症および/もしくは腎臓炎症(例えば、尿細管間質性線維症、慢性腎疾患、慢性腎不全、腎糸球体疾患(例えば、巣状分節性糸球体硬化症)、免疫複合体障害(例えば、IgA腎症、膜性腎症)、ループス腎炎、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、尿細管間質損傷、および糸球体腎炎(例えば、C3糸球体症)、(iii)肺の線維症および/もしくは肺の炎症(例えば、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、強皮症に関連する肺線維症、気管支拡張症、および肺高血圧症)、(iv)肝臓の線維症および/もしくは肝臓の炎症(例えば、硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患(脂肪性肝炎))、アルコール乱用に続発する肝線維症、急性肝炎または慢性肝炎に続発する肝線維症、胆管疾患、および中毒性肝傷害(例えば、アセトアミノフェンまたは他の薬物によって誘発される薬物性肝損傷による肝毒性)、(v)心臓の線維症および/もしくは心臓の炎症(例えば、心臓線維症、心筋梗塞、心臓弁線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症、不整脈原性右室心筋症(ARVC)、(vi)血管の線維症(例えば、血管疾患、アテローム動脈硬化性血管疾患、血管狭窄、再狭窄、脈管炎、静脈炎、深部静脈血栓、および腹部大動脈瘤)、(vii)皮膚の線維症(例えば、過剰な創傷治癒、強皮症、全身性硬化症、ケロイド、結合組織病、瘢痕、および肥厚性瘢痕)、(viii)関節の線維症(例えば、関節線維症)、(ix)中枢神経系の線維症(例えば、脳卒中、外傷性脳傷害、および脊髄傷害)、(x)消化器系の線維症(例えば、クローン病、膵臓線維症、および潰瘍性大腸炎)、(xi)眼線維症(例えば、前嚢下白内障、後嚢混濁、黄斑変性、ならびに網膜および硝子体の網膜症)、(xii)筋骨格軟部組織構造の線維症(例えば、癒着性関節包炎、デュプュイトラン拘縮、および骨髄線維症)、(xiii)生殖器の線維症(例えば、子宮内膜症およびペーロニー病)、(xiv)線維症および/もしくは炎症を引き起こす慢性感染症(例えば、アルファウイルス、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、結核、HIV、およびインフルエンザ)、(xv)線維症および/もしくは炎症を引き起こす自己免疫疾患(例えば、強皮症および全身性エリテマトーデス(SLE)、(xvi)外傷に関連する瘢痕(例えば、外傷に関連する瘢痕は、手術合併症(例えば、手術に起因する癒着。この場合、瘢痕組織が内蔵間で形成して拘縮、疼痛の原因となることがあり、不妊の原因となることがある)、化学療法薬誘発性線維症、放射線誘発性線維症、および火傷に関連する瘢痕からなる群より選択される)、または(xvii)臓器移植、乳房線維症、筋肉線維症、後腹膜線維症、甲状腺線維症、リンパ節線維症、膀胱線維症、および胸膜線維症の少なくとも1つによって引き起こされるかもしくは悪化する疾患もしくは障害に罹患している。
別の局面において、本発明は、腎臓の線維症および/もしくは腎臓の炎症によって引き起こされるかもしくは悪化する疾患もしくは障害に罹患しているか、またはこれを発症するリスクがある哺乳動物対象において、腎臓線維症を治療、阻害、軽減、または予防するための方法であって、腎臓線維症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害物質を該対象に投与する工程を含む、方法を提供する。一態様において、MASP-2阻害物質はMASP-2抗体またはその断片である。一態様において、MASP-2阻害物質は、SEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、MASP-2モノクローナル抗体またはその断片である。一態様において、MASP-2抗体またはその断片は、SEQ ID NO:6を含むポリペプチドに、補体系の別の抗原に結合するよりも少なくとも10倍高い親和性で特異的に結合する。一態様において、前記抗体またはその断片は、組換え抗体、低下したエフェクター機能を有する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される。一態様において、MASP-2阻害物質は、C1q依存性補体活性化を実質的に阻害することなくレクチン経路補体活性化を選択的に阻害する。一態様において、MASP-2阻害物質は皮下投与されるか、腹腔内投与されるか、筋肉内投与されるか、動脈内投与されるか、静脈内投与されるか、または吸入剤として投与される。一態様において、MASP-2阻害物質は尿細管間質性線維症を阻害するために有効な量で投与される。一態様において、MASP-2阻害物質は、対象における透析の必要性を低減するか、遅延させるか、または排除するために有効な量で投与される。一態様において、対象は、慢性腎疾患、慢性腎不全、腎糸球体疾患(例えば、巣状分節性糸球体硬化症)、免疫複合体障害(例えば、IgA腎症、膜性腎症)、ループス腎炎、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、尿細管間質損傷、および糸球体腎炎(例えば、C3糸球体症)からなる群より選択される腎臓の疾患または障害に罹患している。一態様において、対象はタンパク尿に罹患しており、MASP-2阻害物質は、対象におけるタンパク尿を低減するために有効な量で投与される。一態様において、MASP-2阻害物質は、処置前の対象におけるベースラインの24時間の尿タンパク質排泄と比較して24時間の尿タンパク質排泄の少なくとも20％低下(例えば、少なくとも30パーセント低下、または少なくとも40パーセント低下、または少なくとも50パーセント低下)を達成するために有効な量および時間で投与される。一態様において、対象は、ネフローゼ症候群、子癇前症、子癇、腎臓の毒性病変、アミロイドーシス、コラーゲン血管疾患(例えば、全身性エリテマトーデス)、脱水、腎糸球体疾患(例えば、膜性糸球体腎炎、巣状分節性糸球体腎炎、C3糸球体症、微小変化群、リポイドネフローゼ)、激しい運動、ストレス、良性直立位(benign orthostatis)(起立性)タンパク尿、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症(すなわち、ベルジェ病)、IgM腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎症、微小変化群、類肉腫症、アルポート症候群、糖尿病(糖尿病性腎症)、薬物誘発性毒性(例えば、NSAIDS、ニコチン、ペニシラミン、炭酸リチウム、金および他の重金属、ACE阻害因子、抗生物質(例えば、アドリアマイシン)またはオピエート(例えば、ヘロイン)または他のネフロトキシン);ファブリー病、感染症(例えば、HIV、梅毒、A型肝炎、B型肝炎、またはC型肝炎、連鎖球菌感染後感染症、尿路住血吸虫症);アミノ酸尿、ファンコニー症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、鎌状赤血球症、ヘモグロビン尿、多発性骨髄腫、ミオグロビン尿、臓器拒絶反応(例えば、腎移植拒絶反応)、エボラ出血熱、爪膝蓋骨症候群、家族性地中海熱、HELLP症候群、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症、関節リウマチ、1型糖原病、グッドパスチャー症候群、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、腎臓に広がった尿路感染症、シェーグレン症候群ならびに感染後糸球体腎炎(post-infections glomerulonepthritis)からなる群より選択される、タンパク尿に関連する腎臓の疾患または障害に罹患している。一態様において、対象はIgA腎症に罹患している。一態様において、対象は膜性腎症に罹患している。
別の局面において、本発明は、タンパク尿に関連する疾患または状態に罹患している対象において腎損傷を予防または低減する方法であって、対象におけるタンパク尿を低減または予防するために有効な量のMASP-2阻害物質を投与する工程を含む、方法を提供する。一態様において、MASP-2阻害物質はMASP-2抗体またはその断片である。一態様において、MASP-2阻害物質は、SEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、MASP-2モノクローナル抗体またはその断片である。一態様において、MASP-2阻害物質は、C1q依存性補体活性化を実質的に阻害することなくレクチン経路補体活性化を選択的に阻害する。一態様において、タンパク尿に関連する疾患または状態は、ネフローゼ症候群、子癇前症、子癇、腎臓の毒性病変、アミロイドーシス、コラーゲン血管疾患(例えば、全身性エリテマトーデス)、脱水、腎糸球体疾患(例えば、膜性糸球体腎炎、巣状分節性糸球体腎炎、C3糸球体症、微小変化群、リポイドネフローゼ)、激しい運動、ストレス、良性直立位(起立性)タンパク尿、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症(すなわち、ベルジェ病)、IgM腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎症、微小変化群、類肉腫症、アルポート症候群、糖尿病(糖尿病性腎症)、薬物誘発性毒性(例えば、NSAIDS、ニコチン、ペニシラミン、炭酸リチウム、金および他の重金属、ACE阻害因子、抗生物質(例えば、アドリアマイシン)またはオピエート(例えば、ヘロイン));ファブリー病、感染症(例えば、HIV、梅毒、A型肝炎、B型肝炎、またはC型肝炎、連鎖球菌感染後感染症、尿路住血吸虫症);アミノ酸尿、ファンコニー症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、鎌状赤血球症、ヘモグロビン尿、多発性骨髄腫、ミオグロビン尿、臓器拒絶反応(例えば、腎移植拒絶反応)、エボラ出血熱、爪膝蓋骨症候群、家族性地中海熱、HELLP症候群、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症、関節リウマチ、1型糖原病、グッドパスチャー症候群、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、腎臓に広がった尿路感染症、シェーグレン症候群、ならびに感染後糸球体腎炎からなる群より選択される。一態様において、MASP-2阻害物質は、処置前の対象におけるベースラインの24時間の尿タンパク質排泄と比較して24時間の尿タンパク質排泄の少なくとも20％低下(例えば、少なくとも30パーセント低下、または少なくとも40パーセント低下、または少なくとも50パーセント低下)を達成するために有効な量および時間で投与される。
別の局面において、本発明は、慢性腎疾患の進行を阻害する方法であって、慢性腎疾患の進行の阻害を必要とする対象において、腎臓線維症、例えば、尿細管間質性線維症を低減または予防するために有効な量のMASP-2阻害物質を投与する工程を含む、方法を提供する。一態様において、MASP-2阻害物質はMASP-2抗体またはその断片である。一態様において、MASP-2阻害物質は、SEQ ID NO:6の一部に特異的に結合するMASP-2モノクローナル抗体またはその断片である。一態様において、MASP-2阻害物質は、C1q依存性補体活性化を実質的に阻害することなくレクチン経路補体活性化を選択的に阻害する。一態様において、前記阻害を必要とする対象は、MASP-2阻害物質の投与前にタンパク尿を示し、MASP-2阻害物質の投与によって対象のタンパク尿が減少する。一態様において、MASP-2阻害物質は、処置前の対象におけるベースラインの24時間の尿タンパク質排泄と比較して24時間の尿タンパク質排泄の少なくとも20％低下(例えば、少なくとも30パーセント低下、または少なくとも40パーセント低下、または少なくとも50パーセント低下)を達成するために有効な量および時間で投与される。一態様において、MASP-2阻害物質は、対象における透析の必要性を低減するか、遅延させるか、または排除するために有効な量で投与される。
別の局面において、本発明は、1種もしくは複数種の腎毒性剤を用いた処置を受けたことがある対象、1種もしくは複数種の腎毒性剤を用いた処置を受けている対象、または1種もしくは複数種の腎毒性剤を用いた処置を受ける予定の対象において、腎損傷から腎臓を保護する方法であって、薬物誘発性腎症を予防するかまたは寛解させるために有効な量のMASP-2阻害物質を投与する工程を含む、方法を提供する。一態様において、MASP-2阻害物質はMASP-2抗体またはその断片である。一態様において、MASP-2阻害物質は、SEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、MASP-2モノクローナル抗体またはその断片である。一態様において、MASP-2阻害物質は、C1q依存性補体活性化を実質的に阻害することなくレクチン経路補体活性化を選択的に阻害する。
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンA腎症(IgAN)に罹患しているヒト対象を治療する方法であって、MASP-2依存性補体活性化を阻害するために有効な量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。一態様において、対象はステロイド依存性IgANに罹患している。一態様において、MASP-2阻害抗体は、ヒトMASP-2に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその断片である。一態様において、前記抗体またはその断片は、組換え抗体、低下したエフェクター機能を有する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される。一態様において、MASP-2阻害抗体は古典経路を実質的に阻害しない。一態様において、MASP-2阻害抗体は90％ヒト血清中でのC3b沈着をIC50 30nM以下で阻害する。一態様において、前記方法は、腎機能を改善するために有効な量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を対象に投与する工程の前に、ステロイド依存性IgANを有するヒト対象を同定する工程をさらに含む。一態様において、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片は、腎機能を改善するために有効な量で投与される。一態様において、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片は、処置前の対象におけるベースラインの24時間の尿タンパク質排泄と比較して24時間の尿タンパク質排泄の少なくとも20％低下を達成するために有効な量および十分な時間で投与される。一態様において、前記組成物は、前記対象における腎機能を改善しかつコルチコステロイド投与量を低減するために十分な量で投与される。一態様において、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む。
別の局面において、本発明は、膜性腎症(MN)に罹患しているヒト対象を治療する方法であって、MASP-2依存性補体活性化を阻害するために有効な量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。一態様において、対象はステロイド依存性MNに罹患している。一態様において、MASP-2阻害抗体は、ヒトMASP-2に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその断片である。一態様において、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片は、腎機能を改善するために有効な量で投与される。一態様において、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片は、処置前の対象におけるベースラインの24時間の尿タンパク質排泄と比較して24時間の尿タンパク質排泄の少なくとも20％低下を達成するために有効な量および十分な時間で投与される。一態様において、前記組成物は、前記対象における腎機能を改善しかつコルチコステロイド投与量を低減するために十分な量で投与される。一態様において、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む。
別の局面において、本発明は、ループス腎炎(LN)に罹患しているヒト対象を治療する方法であって、MASP-2依存性補体活性化を阻害するために有効な量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、対象に投与する工程を含む、方法を提供する。一態様において、前記対象はステロイド依存性LNに罹患している。一態様において、MASP-2阻害抗体は、ヒトMASP-2に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその断片である。一態様において、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片は、腎機能を改善するために有効な量で投与される。一態様において、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片は、処置前の対象におけるベースラインの24時間の尿タンパク質排泄と比較して24時間の尿タンパク質排泄の少なくとも20パーセント低下を達成するために有効な量および十分な時間で投与される。一態様において、前記組成物は、前記対象における腎機能を改善しかつコルチコステロイド投与量を低減するために十分な量で投与される。一態様において、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む。
別の局面において、本発明は、IgANに罹患しているヒト対象におけるタンパク尿を低減する方法であって、以下の投与計画:
(a) IgANに罹患している対象への、約4mg/kg(すなわち、3.6mg/kg〜4.4mg/kg)の抗体の少なくとも12週間の処置期間にわたる週1回の静脈内投与;または
(b) IgANに罹患している対象への、約180mg〜約725mg(すなわち、162mg〜797mg)の抗体の少なくとも12週間の処置期間にわたる週1回の静脈内投与
に従い、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、ならびにCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を、対象に投与する工程
を含み、前記ヒト対象におけるタンパク尿を低減する、方法を提供する。
[本発明1001]
IgANに罹患しているヒト対象におけるタンパク尿を低減する方法であって、以下の投与計画:
(a)IgANに罹患している対象への、約4mg/kg(すなわち、3.6mg/kg〜4.4mg/kg)の抗体の少なくとも12週間の処置期間にわたる週1回の静脈内投与;または
(b)IgANに罹患している対象への、約180mg〜約725mg(すなわち、162mg〜797mg)の抗体の少なくとも12週間の処置期間にわたる週1回の静脈内投与
に従い、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を、前記対象に投与する工程
を含み、前記ヒト対象におけるタンパク尿を低減する、前記方法。
[本発明1002]
前記処置期間が12週間である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記処置期間の後に、少なくとも2ヶ月の休止期間(すなわち、MASP-2阻害因子の投与なし)がある、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記処置期間の後に、少なくとも3ヶ月の休止期間(すなわち、MASP-2阻害因子の投与なし)がある、本発明1001または1002の方法。
[本発明1005]
前記処置期間の後に、少なくとも4ヶ月の休止期間(すなわち、MASP-2阻害因子の投与なし)がある、本発明1001または1002の方法。
[本発明1006]
前記処置期間の後に、少なくとも5ヶ月の休止期間(すなわち、MASP-2阻害因子の投与なし)がある、本発明1001または1002の方法。
[本発明1007]
前記処置期間の後に、少なくとも6ヶ月の休止期間(すなわち、MASP-2阻害因子の投与なし)がある、本発明1001または1002の方法。
[本発明1008]
前記処置期間の終了時および/または休止期間の終了時に、前記対象におけるタンパク尿がベースライン(処置前)から少なくとも20％低減している(すなわち、uACRの減少および/または24時間の尿タンパク質濃度の減少)、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記処置期間の終了時および/または休止期間の終了時に、前記対象におけるタンパク尿がベースライン(処置前)から少なくとも30％低減している(すなわち、uACRの減少および/または24時間の尿タンパク質濃度の減少)、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記処置期間の終了時および/または休止期間の終了時に、前記対象におけるタンパク尿がベースライン(処置前)から少なくとも40％低減している(すなわち、uACRの減少および/または24時間の尿タンパク質濃度の減少)、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記処置期間の終了時および/または休止期間の終了時に、前記対象におけるタンパク尿がベースライン(処置前)から少なくとも50％低減している(すなわち、uACRの減少および/または24時間の尿タンパク質濃度の減少)、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記処置期間の終了時および/または休止期間の終了時に、前記対象におけるタンパク尿がベースライン(処置前)から50％超低減している(すなわち、uACRの減少および/または24時間の尿タンパク質濃度の減少)、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記処置期間および/または休止期間の間に、前記対象における尿中タンパク質レベルを定期的にモニタリングする工程をさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記対象において推算糸球体濾過量(eGFR)が増加する、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記処置期間の終了時および/または休止期間の終了時に、前記対象がコルチコステロイド投与を中断しているか、またはMASP-2阻害抗体による処置開始の前に受容したコルチコステロイド投与量と比較してコルチコステロイド投与量を大幅に低減している、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記MASP-2阻害抗体またはその断片が、組換え抗体、低下したエフェクター機能を有する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記MASP-2阻害抗体またはその断片が、
(a)(i)SEQ ID NO:67の31〜35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H1;および(ii)SEQ ID NO:67の50〜65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H2;および(iii)SEQ ID NO:67の95〜107のアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H3を含む、重鎖可変領域、ならびに
(b)(i)SEQ ID NO:69の24〜34のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L1;および(ii)SEQ ID NO:69の50〜56のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L2;および(iii)SEQ ID NO:69の89〜97のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L3を含む、軽鎖可変領域
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記MASP-2阻害抗体またはその断片が、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記MASP-2阻害抗体またはその断片が、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、SEQ ID NO:69に示した軽鎖可変領域を含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
処置前に、前記IgANに罹患している対象が、24時間の尿タンパク質排泄あたりタンパク質1グラム超のタンパク尿を有しており、前記方法が、前記対象におけるタンパク尿を少なくとも30％低減するために有効である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
ループス腎炎(LN)に罹患しているヒト対象を治療する方法であって、MASP-2依存性補体活性化を阻害するために有効な量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、対象に投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1022]
前記対象がステロイド依存性LNに罹患している、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記MASP-2阻害抗体が、ヒトMASP-2に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその断片である、本発明1021または1022の方法。
[本発明1024]
前記抗体またはその断片が、組換え抗体、低下したエフェクター機能を有する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、本発明1021の方法。
[本発明1025]
前記MASP-2阻害抗体が古典経路を実質的に阻害しない、本発明1021の方法。
[本発明1026]
前記MASP-2阻害抗体が、90％ヒト血清中でのC3b沈着をIC50 30nM以下で阻害する、本発明1021の方法。
[本発明1027]
腎機能を改善するために有効な量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を前記対象に投与する工程の前に、ステロイド依存性LNを有するヒト対象を同定する工程をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1028]
前記MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、腎機能を改善するために有効な量で投与される、本発明1021の方法。
[本発明1029]
前記MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、処置前の前記対象におけるベースラインの24時間の尿タンパク質排泄と比較して24時間の尿タンパク質排泄の少なくとも20パーセント低下を達成するために有効な量および十分な時間で投与される、本発明1021の方法。
[本発明1030]
前記組成物が、前記対象における腎機能を改善しかつコルチコステロイド投与量を低減するために十分な量で投与される、本発明1021の方法。
[本発明1031]
前記MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む、本発明1021の方法。
本発明の前述の局面および付随する利点の多くは、添付の図面と共に用いられる際に以下の詳細な説明を参照することによってさらによく理解されるようになるので、さらに容易に認識されると考えられる。
ヒトMASP-2のゲノム構造を示す図である。 図2Aは、ヒトMASP-2タンパク質のドメイン構造を示す模式図である。図2Bは、ヒトMAp19タンパク質のドメイン構造を示す模式図である。 マウスMASP-2ノックアウト戦略を示した図である。 ヒトMASP-2ミニ遺伝子構築物を示した図である。 実施例2に記載のように、マンナン上へのC4b沈着の欠如によって測定された場合に、MASP-2欠損が、レクチン経路によって媒介されるC4活性化の消失につながることを証明した結果を示す。 実施例2に記載のように、ザイモサン上へのC4b沈着の欠如によって測定された場合に、MASP-2欠損が、レクチン経路によって媒介されるC4活性化の消失につながることを証明した結果を示す。 実施例2に記載のように、マンナン上およびザイモサン上へのC4b沈着によって測定された場合に、MASP-2+/-;MASP-2-/-および野生型系統から得られた血清試料の相対的C4活性化レベルを証明した結果を示す。 実施例2に記載のように、マンナン上へのC4b沈着によって測定された場合に、マウス組換えMASP-2をMASP-2-/-血清試料に添加することによって、レクチン経路によって媒介されるC4活性化がタンパク質濃度依存的に回復することを証明した結果を示す。 実施例8に記載のように、古典経路がMASP-2-/-系統において機能することを証明した結果を示す。 実施例10に記載のように、抗MASP-2 Fab2抗体番号11がC3コンバターゼ形成を阻害することを証明した結果を示す。 実施例10に記載のように、抗MASP-2 Fab2抗体番号11が天然のラットMASP-2に結合することを証明した結果を示す。 実施例10に記載のように、抗MASP-2 Fab2抗体番号41がC4切断を阻害することを証明した結果を示す。 実施例10に記載のように、C3コンバターゼ形成を阻害した、試験された抗MASP-2 Fab2抗体の全てがC4切断も阻害することが見出されたことを証明した結果を示す。 実施例11に記載のように、MASP-2遮断Fab2抗体のエピトープマッピングに用いられたラットMASP-2由来組換えポリペプチドを示した図である。 実施例11に記載のように、抗MASP-2 Fab2番号40および番号60とラットMASP-2ポリペプチドとの結合を証明した結果を示す。 実施例12に記載のように、レクチン経路特異的アッセイ条件下、ヒトMASP-2モノクローナル抗体(OMS646)の存在下または非存在下でのMAC沈着レベルを図示する。これから、OMS646は、IC50値 約1nMで、レクチンを介したMAC沈着を阻害することが証明される。 実施例12に記載のように、古典経路特異的アッセイ条件下、ヒトMASP-2モノクローナル抗体(OMS646)の存在下または非存在下でのMAC沈着レベルを図示する。これから、OMS646は、古典経路を介したMAC沈着を阻害しないことが証明される。 実施例12に記載のように、第二経路特異的アッセイ条件下、ヒトMASP-2モノクローナル抗体(OMS646)の存在下または非存在下でのMAC沈着レベルを図示する。これから、OMS646は、第二経路を介したMAC沈着を阻害しないことが証明される。 実施例12に記載のように、マウスにおけるヒトMASP-2モノクローナル抗体(OMS646)の薬物動態学的(PK)プロファイルを図示する。示された用量で投与した後の時間の関数としてのOMS646濃度(n=3動物/群の平均)を示した。 実施例12に記載のように、静脈内投与後のマウスにおける全身レクチン経路活性の低下として測定した、ヒトMASP-2モノクローナル抗体(OMS646)の薬力学的(PD)応答を図示する。 実施例12に記載のように、皮下投与後のマウスにおける全身レクチン経路活性の低下として測定した、ヒトMASP-2モノクローナル抗体(OMS646)の薬力学的(PD)応答を図示する。 シリウスレッドで染色された腎臓組織切片のコンピュータによる画像解析の結果を図示する。ここで、組織切片は、実施例14に記載のように、片側尿管結紮(unilateral ureteric obstruction)(UUO)を7日間行った後の野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスならびに偽手術した野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスから入手した。 F4/80マクロファージ特異的抗体で染色された腎臓組織切片のコンピュータによる画像解析の結果を図示する。ここで、組織切片は、実施例14に記載のように、片側尿管結紮(UUO)を7日間行った後の野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスならびに偽手術した野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスから入手した。 実施例14に記載のように、片側尿管結紮(UUO)を7日間行った後の野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスならびに偽手術した野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスから入手した腎臓組織切片において定量PCR(qPCR)によって測定した時のコラーゲン-4の相対mRNA発現レベルを図示する。 実施例14に記載のように、片側尿管結紮(UUO)を7日間行った後の野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスならびに偽手術した野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスから入手した腎臓組織切片においてqPCRによって測定した時のトランスフォーミング成長因子β-1(TGFβ-1)の相対mRNA発現レベルを図示する。 実施例14に記載のように、片側尿管結紮(UUO)を7日間行った後の野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスならびに偽手術した野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスから入手した腎臓組織切片においてqPCRによって測定した時のインターロイキン-6(IL-6)の相対mRNA発現レベルを図示する。 実施例14に記載のように、片側尿管結紮(UUO)を7日間行った後の野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスならびに偽手術した野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスから入手した腎臓組織切片においてqPCRによって測定した時のインターフェロン-γの相対mRNA発現レベルを図示する。 シリウスレッドで染色された腎臓組織切片のコンピュータによる画像解析の結果を図示する。ここで、組織切片は、実施例15に記載のように、MASP-2阻害抗体で処置した野生型マウスおよびアイソタイプ対照抗体で処置した野生型マウスから、片側尿管結紮(UUO)を7日間行った後に入手した。 実施例15に記載のように、IgG4アイソタイプ対照で処置した野生型マウスから入手した、結紮された腎臓に由来する組織におけるヒドロキシルプロリンレベルと比較した時の、MASP-2阻害抗体で処置した野生型マウスから入手した、片側尿管結紮(UUO)を7日間行った後に採取した腎臓からのヒドロキシルプロリン含有量を図示する。 実施例16に記載のように、食塩水だけ与えた野生型対照マウス(n=2)、BSAを与えた野生型マウス(n=6)、およびBSAを与えたMASP-2-/-マウス(n=6)における、タンパク質過負荷(protein overload)研究の15日目に測定した血清タンパク質の総量(mg/ml)を図示する。 実施例16に記載のように、食塩水だけ与えた野生型対照マウス(n=2)、BSAを与えた野生型(n=6)、およびBSAを与えたMASP-2-/-マウス(n=6)からの、タンパク質過負荷研究の15日目に24時間にわたって収集した尿中にある排泄タンパク質の総量(mg)を図示する。 実施例16に記載のように、以下の通りタンパク質過負荷研究の15日目に、以下のマウス群:(パネルA)野生型対照マウス;(パネルB)MASP-2-/-対照マウス、(パネルC)BSAで処置した野生型マウス;および(パネルD)ウシ血清アルブミン(BSA)で処置したMASP-2-/-マウスから得た代表的なヘマトキシリン・エオシン(H&E)染色腎臓組織切片を示す。 マクロファージ平均染色領域(％)を示す、マクロファージ特異的抗体F4/80で染色された腎臓組織切片のコンピュータによる画像解析の結果を図示する。ここで、組織切片は、実施例16に記載のように、タンパク質過負荷研究の15日目に、野生型対照マウス(n=2)、BSAで処置した野生型マウス(n=6)、およびBSAで処置したMASP-2-/-マウス(n=5)から入手した。 実施例16に記載のように、24時間の試料に由来する尿中で測定した総排泄タンパク質対マクロファージ浸潤(平均染色領域％)をプロットすることによって、BSAで処置した、それぞれの野生型マウス(n=6)にマクロファージ-タンパク尿の相関が存在するかどうかの分析を図示する。 実施例16に記載のように、24時間の試料の尿中にある総排泄タンパク質対マクロファージ浸潤(平均染色領域％)をプロットすることによって、BSAで処置した、それぞれのMASP-2-/-マウス(n=5)にマクロファージ-タンパク尿の相関が存在するかどうかの分析を図示する。 実施例16に記載のように、BSAで処置した野生型マウス(n=4)およびBSAで処置したMASP-2-/-マウス(n=5)における、抗TGFβ抗体で染色された組織切片のコンピュータによる画像解析の結果(TGFβ抗体染色領域％として測定した)を図示する。 実施例16に記載のように、BSAで処置した野生型マウス(n=4)およびBSAで処置したMASP-2-/-マウス(n=5)における、抗TNFα抗体で染色された組織切片のコンピュータによる画像解析の結果(TNFα抗体染色領域％として測定した)を図示する。 実施例16に記載のように、野生型対照マウス、MASP-2-/-対照マウス、BSAで処置した野生型マウス(n=7)、およびBSAで処置したMASP-2-/-マウス(n=7)における、抗IL-6抗体で染色された組織切片のコンピュータによる画像解析の結果(IL-6抗体染色領域％として測定した)を図示する。 実施例16に記載のように、野生型対照マウス(n=1)、MASP-2-/-対照マウス(n=1)、BSAで処置した野生型マウス(n=6)、およびBSAで処置したMASP-2-/-マウス(n=7)の腎皮質に由来する組織切片から得た連続して選択した20個の高倍率視野(HPF)において計数したTUNELアポトーシス細胞の頻度を図示する。 実施例17に記載のように、BSAで処置した後、15日目の以下のマウス群:(パネルA)食塩水で処置した野生型対照マウス、(パネルB)アイソタイプ抗体で処置した対照マウス、および(パネルC)MASP-2阻害抗体で処置した野生型マウスからの代表的なH&E染色組織切片を示す。 実施例17に記載のように、食塩水対照およびBSAで処置した野生型マウス(n=8)、アイソタイプ対照抗体およびBSAで処置した野生型マウス(n=8)、ならびにMASP-2阻害抗体およびBSAで処置した野生型マウス(n=7)の腎皮質に由来する組織切片から得た連続して選択した20個の高倍率視野(HPF)において計数したTUNELアポトーシス細胞の頻度を図示する。 実施例17に記載のように、BSAおよび食塩水で処置した野生型マウス(n=8)、BSAおよびアイソタイプ対照抗体で処置した野生型マウス(n=7)、ならびにBSAおよびMASP-2阻害抗体で処置した野生型マウス(n=8)における、抗TGFβ抗体で染色された組織切片のコンピュータによる画像解析の結果(TGFβ抗体染色領域％として測定した)を図示する。 実施例17に記載のように、BSAおよび食塩水で処置した野生型マウス(n=8)、BSAおよびアイソタイプ対照抗体で処置した野生型マウス(n=7)、ならびにBSAおよびMASP-2阻害抗体で処置した野生型マウス(n=8)における、抗TNFα抗体で染色された組織切片のコンピュータによる画像解析の結果(TNFα抗体染色領域％として測定した)を図示する。 実施例17に記載のように、BSAおよび食塩水で処置した野生型マウス(n=8)、BSAおよびアイソタイプ対照抗体で処置した野生型マウス(n=7)、ならびにBSAおよびMASP-2阻害抗体で処置した野生型マウス(n=8)における、抗IL-6抗体で染色された組織切片のコンピュータによる画像解析の結果(IL-6抗体染色領域％として測定した)を図示する。 実施例18に記載のように、アドリアマイシンまたは食塩水だけ(対照)で処置した後、14日目の以下のマウス群:(パネルA-1、A-2、A-3)食塩水だけで処置した野生型対照マウス;(パネルB-1、B-2、B-3)アドリアマイシンで処置した野生型マウス;および(パネルC-1、C-2、C-3)アドリアマイシンで処置したMASP-2-/-マウスからの代表的なH&E染色組織切片を示す。 実施例18に記載のように、アドリアマイシンまたは食塩水だけ(野生型対照)で処置した後、14日目の以下のマウス群:食塩水だけで処置した野生型対照マウス;アドリアマイシンで処置した野生型マウス;食塩水だけで処置したMASP-2-/-マウス、およびアドリアマイシンで処置したMASP-2-/-マウスからのマクロファージ平均染色領域(％)を示した、マクロファージ特異的抗体F4/80で染色された腎臓組織切片のコンピュータによる画像解析の結果を図示する。**p=0.007。 実施例18に記載のように、アドリアマイシンまたは食塩水だけ(野生型対照)で処置した後、14日目の以下のマウス群:食塩水だけで処置した野生型対照マウス;アドリアマイシンで処置した野生型マウス;食塩水だけで処置したMASP-2-/-マウス、およびアドリアマイシンで処置したMASP-2-/-マウスからのコラーゲン沈着染色領域(％)を示す、シリウスレッドで染色された腎臓組織切片のコンピュータによる画像解析の結果を図示する。**p=0.005。 実施例19に記載のように、12週間の試験中にMASP-2阻害抗体(OMS646)を用いて毎週処置した2人のIgA患者における尿アルブミン/クレアチニン比(uACR)を図示する。 実施例21に記載のように、OMS646で処置した4人のIgAN患者のuACR(mg/g)をベースラインから120日まで経時的に図示する。 実施例21に記載のように、OMS646で処置した4人のIgAN患者における、処置前の1日目のベースラインから処置後の24時間の尿タンパク質の変化を図示する。 実施例21に記載のように、OMS646で処置した4人のIgAN患者における、ベースラインから処置後の24時間の尿タンパク質の変化の平均を図示する。
配列表の説明
SEQ ID NO:1 ヒトMAp19 cDNA
SEQ ID NO:2 ヒトMAp19タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:3 ヒトMAp19タンパク質(成熟)
SEQ ID NO:4 ヒトMASP-2 cDNA
SEQ ID NO:5 ヒトMASP-2タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:6 ヒトMASP-2タンパク質(成熟)
SEQ ID NO:7 ヒトMASP-2 gDNA(エキソン1-6)
抗原:(MASP-2成熟タンパク質を基準にした)
SEQ ID NO:8 CUBI配列(aa1〜121)
SEQ ID NO:9 CUBEGF配列(aa1〜166)
SEQ ID NO:10 CUBEGFCUBII(aa1〜293)
SEQ ID NO:11 EGF領域(aa122〜166)
SEQ ID NO:12 セリンプロテアーゼドメイン(aa429〜671)
SEQ ID NO:13 セリンプロテアーゼドメイン不活性(Ser618からAlaへの変異を有するaa610〜625)
SEQ ID NO:14
Figure 0006893554
(CUBIペプチド)
SEQ ID NO:15
Figure 0006893554
(CUBIペプチド)
SEQ ID NO:16 TFRSDYSN(MBL結合領域コア)
SEQ ID NO:17
Figure 0006893554
(MBL結合領域コア)
SEQ ID NO:18 IDECQVAPG(EGFペプチド)
SEQ ID NO:19
Figure 0006893554
(セリンプロテアーゼ結合コア)
詳細な説明
ペプチド阻害因子:
SEQ ID NO:20 MBL完全長cDNA
SEQ ID NO:21 MBL完全長タンパク質
SEQ ID NO:22 OGK-X-GP(コンセンサス結合)
Figure 0006893554
(ヒトh-フィコリン)
SEQ ID NO:28
Figure 0006893554
(ヒトフィコリンp35)
SEQ ID NO:29
Figure 0006893554
(C4切断部位)
発現阻害因子:
SEQ ID NO:30 CUBI-EGFドメインのcDNA(SEQ ID NO:4のヌクレオチド22〜680)
SEQ ID NO:31
Figure 0006893554
MASP-2翻訳開始部位を含むSEQ ID NO:4のヌクレオチド12〜45(センス)
SEQ ID NO:32
Figure 0006893554
MASP-2 MBL結合部位を含む領域をコードするSEQ ID NO:4のヌクレオチド361〜396(センス)
SEQ ID NO:33
Figure 0006893554
CUBIIドメインを含む領域をコードするSEQ ID NO:4のヌクレオチド610〜642
クローニングプライマー:
SEQ ID NO:34
Figure 0006893554
(CUB用の5'PCR)
SEQ ID NO:35
Figure 0006893554
(CUB用の3'PCR)
SEQ ID NO:36
Figure 0006893554
(CUBIEGF用の3'PCR)
SEQ ID NO:37
Figure 0006893554
(CUBIEGFCUBII用の3'PCR)
SEQ ID NO:38〜47は、ヒト化抗体用のクローニングプライマーである。
SEQ ID NO:48は、9aaペプチド結合である。
発現ベクター:
SEQ ID NO:49は、MASP-2ミニ遺伝子インサートである。
SEQ ID NO:50は、マウスMASP-2 cDNAである。
SEQ ID NO:51は、マウスMASP-2タンパク質(w/リーダー)である。
SEQ ID NO:52は、成熟マウスMASP-2タンパク質である。
SEQ ID NO:53は、ラットMASP-2 cDNAである。
SEQ ID NO:54は、ラットMASP-2タンパク質(w/リーダー)である。
SEQ ID NO:55は、成熟ラットMASP-2タンパク質である。
SEQ ID NO:56〜59は、ヒトMASP-2Aを生成するために用いられるヒトMASP-2の部位特異的変異誘発用オリゴヌクレオチドである。
SEQ ID NO:60〜63は、マウスMASP-2Aを生成するために用いられるマウスMASP-2の部位特異的変異誘発用オリゴヌクレオチドである。
SEQ ID NO:64〜65は、ラットMASP-2Aを生成するために用いられるラットMASP-2の部位特異的変異誘発用オリゴヌクレオチドである。
SEQ ID NO:66 17D20_dc35VH21N11VL(OMS646)重鎖可変領域(VH)(シグナルペプチドなし)をコードするDNA
SEQ ID NO:67 17D20_dc35VH21N11VL(OMS646)重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:68 17N16mc重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:70 17D20_dc35VH21N11VL(OMS646)軽鎖可変領域(VL)をコードするDNA
SEQ ID NO:69 17D20_dc35VH21N11VL(OMS646)軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:71 17N16_dc17N9軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:72:SGMI-2L(完全長)
SEQ ID NO:73:SGMI-2M(中型切断バージョン)
SEQ ID NO:74:SGMI-2S(短い切断バージョン)
SEQ ID NO:75:VH-M2ab6-SGMI-2-Nとヒンジ変異のあるヒトIgG4定常領域とを含む成熟ポリペプチド
SEQ ID NO:76:VH-M2ab6-SGMI-2-Cとヒンジ変異のあるヒトIgG4定常領域とを含む成熟ポリペプチド
SEQ ID NO:77:VL-M2ab6-SGMI-2-NとヒトIgλ定常領域とを含む成熟ポリペプチド
SEQ ID NO:78:VL-M2ab6-SGMI-2-CとヒトIgλ定常領域とを含む成熟ポリペプチド
SEQ ID NO:79:ペプチドリンカー(10aa)
SEQ ID NO:80:ペプチドリンカー(6aa)
SEQ ID NO:81:ペプチドリンカー(4aa)
SEQ ID NO:82:VH-M2ab6-SGMI-2-Nとヒンジ変異のあるヒトIgG4定常領域とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
SEQ ID NO:83:VH-M2ab 6-SGMI-2-Cとヒンジ変異のあるヒトIgG4定常領域とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
SEQ ID NO:84:VL-M2ab6-SGMI-2-NとヒトIgλ定常領域とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
SEQ ID NO:85:VL-M2ab6-SGMI-2-CとヒトIgλ定常領域とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
詳細な説明
本発明は、腎臓線維症の片側尿管結紮(unilateral ureteral obstruction)(UUO)モデル、タンパク質過負荷モデル、およびアドリアマイシン誘発性ネフロロジー(adriamycin-induced nephrology)モデルを含む線維性疾患の様々な動物モデルにおいて、補体系のレクチン経路の重要な制御因子であるマンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ-2(MASP-2)を阻害すると炎症および線維症が大幅に低減するという本発明者らによる驚くべき発見に基づいている。従って、本発明者らによって、根底にある原因に関係なく、MASP-2を介したレクチン経路活性化の阻害が、腎臓線維症、例えば、尿細管間質の炎症および線維症を寛解させるか、治療するか、または予防するための有効な治療アプローチとなることが証明された。さらに本明細書に記載のように、MASP-2阻害抗体(OMS646)の使用は、免疫グロブリンA腎症(IgAN)および膜性腎症(MN)に罹患しているヒト対象において腎機能を改善しかつコルチコステロイドの必要性を低減するために有効である。
I.定義
本明細書において特に定義がない限り、本明細書において用いられる全ての用語は、本発明の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本発明を説明するために明細書および特許請求の範囲において用いられる用語をわかりやすくするために、以下の定義が提供される。
本明細書で使用する「MASP-2依存性補体活性化」という用語は、レクチン経路C3コンバターゼC4b2aの形成とそれに続く、C3切断産物C3bの蓄積時のC5コンバターゼC4b2a(C3b)nの形成につながる、生理学的条件下(すなわち、Ca++の存在下)で起こるレクチン経路のMASP-2依存性活性化を含み、主に、オプソニン化を引き起こすことが判明されている。
本明細書で使用する「第二経路」という用語は、例えば、真菌細胞壁および酵母細胞壁に由来するザイモサン、グラム陰性細菌の外膜に由来するリポ多糖(LPS)、およびウサギ赤血球、ならびに多くの純粋な多糖、ウサギ赤血球、ウイルス、細菌、動物腫瘍細胞、寄生生物、および損傷細胞によって誘発され、従来、補体因子C3からC3bの自発的タンパク質分解生成から生じると考えられてきた補体活性化を指す。
本明細書で使用する「レクチン経路」という用語は、マンナン結合レクチン(MBL)、CL-11、およびフィコリン(H-フィコリン、M-フィコリン、またはL-フィコリン)を含む血清炭水化物結合タンパク質および非血清炭水化物結合タンパク質の特異的結合を介して起こる補体活性化を指す。
本明細書で使用する「古典経路」という用語は、外来粒子に結合している抗体によって誘発され、認識分子C1qの結合を必要とする補体活性化を指す。
本明細書で使用する「MASP-2阻害物質」という用語は、MASP-2に結合するかまたはMASP-2と直接相互作用して、MASP-2依存性補体活性化を効果的に阻害する任意の物質を指し、抗MASP-2抗体およびそのMASP-2結合断片、天然ペプチドおよび合成ペプチド、低分子、可溶性MASP-2受容体、発現阻害因子、ならびに単離された天然阻害因子を含み、レクチン経路において別の認識分子(例えば、MBL、H-フィコリン、M-フィコリン、またはL-フィコリン)との結合においてMASP-2と競合するペプチドも包含するが、このような他の認識分子に結合する抗体を包含しない。本発明の方法において有用なMASP-2阻害物質は、MASP-2依存性補体活性化を20％超、例えば、50％超、例えば、90％超低下させ得る。一態様において、MASP-2阻害物質は、MASP-2依存性補体活性化を90％超低下させる(すなわち、MASP-2補体活性化を10％またはそれ未満しかもたらさない)。
本明細書で使用する「線維症」という用語は、臓器または組織において過剰な結合組織が形成または存在することを指す。線維症は、組織損傷または炎症などの刺激に対する修復応答または交換応答として発生する場合がある。線維症の顕著な特徴は過剰な細胞外マトリックスが産生されることである。損傷に対する正常な生理学的応答は治癒プロセスの一環として結合組織の沈着をもたらすが、この結合組織沈着が持続し、病気を起こし、それにより組織の構造および機能が変化する場合がある。細胞レベルでは上皮細胞および線維芽細胞が増殖し、筋線維芽細胞に分化し、その結果、マトリックスの収縮、硬直性の増加、微小血管の圧迫、および低酸素が起こる。
本明細書で使用する「線維症および/もしくは炎症によって引き起こされるかもしくは悪化する疾患もしくは障害に罹患しているか、またはこれを発症するリスクがある哺乳動物対象において、線維症を治療する」という用語は、前記哺乳動物対象において、線維症を逆転させるか、軽減するか、寛解させるか、または阻害することを指す。
本明細書で使用する「タンパク尿」という用語は、尿中タンパク質が異常な量で存在すること、例えば、ヒト対象からの24時間の尿収集物中に0.3gタンパク質を超える量で存在すること、またはヒト対象において1リットルあたり1gを超える濃度で存在することを指す。いくつかの態様において、タンパク尿症に罹患している対象は、免疫グロブリンA(IgA)腎症に罹患している対象などのヒト対象からの24時間の尿収集物中に尿中タンパク質が1.0gタンパク質を超える量で存在することを指す。
本明細書で使用する「タンパク尿を改善する」または「タンパク尿を低減する」という用語は、タンパク尿に罹患している対象における24時間の尿タンパク質排泄を、MASP-2阻害物質を用いた処置の前の対象におけるベースラインの24時間の尿タンパク質排泄と比較して少なくとも20％、例えば、少なくとも30％、例えば、少なくとも40％、例えば、少なくとも50％、またはそれより多く低減することを指す。一態様において、本発明の方法に従うMASP-2阻害物質を用いた処置は、ヒト対象におけるタンパク尿を低減するために、例えば、24時間の尿タンパク質排泄の20パーセント超の低下、もしくは、例えば、24時間の尿タンパク質排泄の30パーセント超の低下、もしくは、例えば、24時間の尿タンパク質排泄の40パーセント超の低下、もしくは、例えば、24時間の尿タンパク質排泄の50パーセント超の低下を成し遂げるのに有効である。
本明細書で使用する「抗体」という用語は、標的ポリペプチド、例えば、MASP-2ポリペプチドまたはその一部に特異的に結合する、任意の抗体産生哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、およびヒトを含む霊長類)に由来するかあるいはハイブリドーマ、ファージセレクション、組換え発現、またはトランスジェニック動物(または抗体もしくは抗体断片を産生する他の方法)に由来する抗体およびその抗体断片を包含する。「抗体」という用語は、抗体源、または抗体が作製されるやり方の点で(例えば、ハイブリドーマ、ファージセレクション、組換え発現、トランスジェニック動物、ペプチド合成などによって)限定されることが意図されない。例示的な抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および組換え抗体;汎(pan)特異的、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体);ヒト化抗体:マウス抗体;キメラ、マウス-ヒト、マウス-霊長類、霊長類-ヒトモノクローナル抗体;および抗イディオタイプ抗体を含み、任意のインタクトな抗体またはその断片でもよい。本明細書で使用する「抗体」という用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、その断片(例えば、dAb、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv)、単鎖(ScFv)、その合成変種、天然変種、抗体部分と、必要とされる特異性の抗原結合断片を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要とされる特異性の抗原結合部位または断片(エピトープ認識部位)を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変された構成も包含する。
「モノクローナル抗体」は均質な抗体集団を指し、モノクローナル抗体は、エピトープの選択的結合に関与するアミノ酸(天然および非天然)からなる。モノクローナル抗体は標的抗原に対して高度に特異的である。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体および完全長モノクローナル抗体だけでなく、その断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv)、単鎖(ScFv)、その変種、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要とされる特異性およびエピトープに結合する能力の抗原結合断片(エピトープ認識部位)を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変された構成も包含する。この用語は、抗体源、または抗体が作製されるやり方の点で(例えば、ハイブリドーマ、ファージセレクション、組換え発現、トランスジェニック動物などによって)限定されることが意図されない。この用語は、「抗体」の定義で前述された免疫グロブリン全体および断片などを含む。
本明細書で使用する「抗体断片」という用語は、完全長抗体、例えば、抗MASP-2抗体に由来または関連する、一般的には、その抗原結合領域または可変領域を含む、部分を指す。抗体断片の例示的な例には、Fab、Fab'、F(ab) 2、F(ab') 2、およびFv断片、scFv断片、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
本明細書で使用する「単鎖Fv」または「scFv」抗体断片は、抗体のVHドメインまたはVLドメインを含み、これらのドメインは1本のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このためにscFvは抗原結合のために望ましい構造を形成することができる。
本明細書で使用する「キメラ抗体」は、非ヒト種(例えば、げっ歯類)抗体に由来する可変ドメインおよび相補性決定領域を含有するが、抗体分子の残りがヒト抗体に由来する、組換えタンパク質である。
本明細書で使用する「ヒト化抗体」は、ヒト抗体フレームワークに移植された、非ヒト免疫グロブリンに由来する特異的な相補性決定領域に一致する最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、典型的には、抗体相補性決定領域のみが非ヒトに由来する組換えタンパク質である。
本明細書で使用する「マンナン結合レクチン」(「MBL」)という用語は、マンナン結合タンパク質(「MBP」)と同意義である。
本明細書で使用する「膜侵襲複合体」(「MAC」)は、膜に入り込み、膜を破壊する、5種類の終末補体成分の複合体(C5bとC6、C7、C8、およびC9との組み合わせ)(C5b-9とも呼ばれる)を指す。
本明細書で使用する「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ブタ、およびげっ歯類を含むが、それに限定されるわけではない、全ての哺乳動物を含む。
本明細書で使用するアミノ酸残基の略語は以下の通りである:アラニン(Ala;A)、アスパラギン(Asn;N)、アスパラギン酸(Asp;D)、アルギニン(Arg;R)、システイン(Cys;C)、グルタミン酸(Glu;E)、グルタミン(Gln;Q)、グリシン(Gly;G)、ヒスチジン(His;H)、イソロイシン(Ile;I)、ロイシン(Leu;L)、リジン(Lys;K)、メチオニン(Met;M)、フェニルアラニン(Phe;F)、プロリン(Pro;P)、セリン(Ser;S)、スレオニン(Thr;T)、トリプトファン(Trp;W)、チロシン(Tyr;Y)、およびバリン(Val;V)。
最も広い意味では、天然アミノ酸は、それぞれのアミノ酸の側鎖の化学特性に基づいてグループに分けることができる。「疎水性」アミノ酸とは、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、CysまたはProを意味する。「親水性」アミノ酸とは、Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg、またはHisを意味する。このアミノ酸グループは、以下のように、さらにサブグループに分けることができる。「無電荷親水性」アミノ酸とは、Ser、Thr、Asn、またはGlnを意味する。「酸性」アミノ酸とはGluまたはAspを意味する。「塩基性」アミノ酸とはLys、Arg、またはHisを意味する。
本明細書で使用する「保存的アミノ酸置換」という用語は、以下のそれぞれのグループ内のアミノ酸間の置換によって例示される:(1)グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、(2)フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、(3)セリンおよびスレオニン、(4)アスパラギン酸およびグルタミン酸、(5)グルタミンおよびアスパラギン、ならびに(6)リジン、アルギニンおよびヒスチジン。
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸(RNA)もしくはデオキシリボ核酸(DNA)またはその模倣物のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、天然のヌクレオチド、糖、およびヌクレオシド間(バックボーン)共有結合からなるオリゴヌクレオ塩基(oligonucleobase)、ならびに非天然改変を有するオリゴヌクレオチドもカバーする。
本明細書で使用する「エピトープ」は、抗体が結合する、タンパク質(例えば、ヒトMASP-2タンパク質)上の部位を指す。「重複エピトープ」は、直鎖エピトープおよび非直鎖エピトープを含む、少なくとも1個(例えば、2個、3個、4個、5個、または6個)の共通アミノ酸残基を含む。
本明細書で使用する「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は同義に用いられ、長さにも翻訳後修飾に関係なく任意のペプチド結合アミノ酸鎖を意味する。本明細書に記載のMASP-2タンパク質は野生型タンパク質を含有してもよく、野生型タンパク質でもよく、50個以下(例えば、1個以下、2個以下、3個以下、4個以下、5個以下、6個以下、7個以下、8個以下、9個以下、10個以下、12個以下、15個以下、20個以下、25個以下、30個以下、35個以下、40個以下、または50個以下)の保存的アミノ酸置換を有する変種でもよい。保存的置換は、典型的には、以下のグループ内の置換を含む;グリシンおよびアラニン;バリン、イソロイシン、およびロイシン;アスパラギン酸およびグルタミン酸;アスパラギン、グルタミン、セリン、およびスレオニン;リジン、ヒスチジン、およびアルギニン;ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。
一部の態様において、ヒトMASP-2タンパク質は、SEQ ID NO:5に示されたアミノ酸配列を有するヒトMASP-2タンパク質と70(例えば、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100)％同一、または70(例えば、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100)％超同一のアミノ酸配列を有してもよい。
一部の態様において、ペプチド断片は、長さが少なくとも6個(例えば、少なくとも7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、もしくは600個、またはそれ以上の)アミノ酸残基(例えば、SEQ ID NO:5の少なくとも6個の連続したアミノ酸残基)でもよい。一部の態様において、ヒトMASP-2タンパク質の抗原性ペプチド断片は、長さが500個未満(例えば、450個未満、400個未満、350個未満、325個未満、300個未満、275個未満、250個未満、225個未満、200個未満、190個未満、180個未満、170個未満、160個未満、150個未満、140個未満、130個未満、120個未満、110個未満、100個未満、95個未満、90個未満、85個未満、80個未満、75個未満、70個未満、65個未満、60個未満、55個未満、50個未満、49個未満、48個未満、47個未満、46個未満、45個未満、44個未満、43個未満、42個未満、41個未満、40個未満、39個未満、38個未満、37個未満、36個未満、35個未満、34個未満、33個未満、32個未満、31個未満、30個未満、29個未満、28個未満、27個未満、26個未満、25個未満、24個未満、23個未満、22個未満、21個未満、20個未満、19個未満、18個未満、17個未満、16個未満、15個未満、14個未満、13個未満、12個未満、11個未満、10個未満、9個未満、8個未満、7個未満、または6個未満)のアミノ酸残基(例えば、SEQ ID NO:5のいずれか1つにある500個未満の連続したアミノ酸残基)である。
パーセント(％)アミノ酸配列同一性は、最大のパーセント配列同一性を達成するように配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸と同一の候補配列中のアミノ酸のパーセントと定義される。パーセント配列同一性を求める目的で、当技術分野における技術の範囲内の様々な手法で、例えば、公的利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアを用いて、アラインメントを行うことができる。比較されている配列の完全長にわたって最大アラインメントを行うために必要な、任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータは公知の方法によって決定することができる。
本明細書で使用する用語「約」または「おおよそ」は、数値の前にある場合、値のプラスまたはマイナス10%の範囲を示す。
II.本発明の概略
本明細書に記載のように、本発明者らは、尿細管腎臓病態の開始および疾患進行におけるレクチン経路の中心的な役割を突き止めた。このことは、IgA腎症、C3糸球体症、および他の糸球体腎炎を含む様々な腎臓病の病態生理におけるレクチン経路活性化の重要な役割を意味している。さらに本明細書に記載のように、本発明者らは、補体系のレクチン経路の重要な制御因子であるマンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ-2(MASP-2)を阻害することによって、腎臓線維症の片側尿管結紮(UUO)モデル、タンパク質過負荷モデル、およびアドリアマイシン誘発性ネフロロジーモデルを含む線維性疾患の様々な動物モデルにおいて炎症および線維症が大幅に低減することを発見した。従って、本発明者らは、根底にある原因に関係なく、MASP-2を介したレクチン経路活性化の阻害が、腎臓線維症、例えば、尿細管間質性線維症を寛解させるか、治療するか、または予防するための有効な治療アプローチとなることを証明した。
レクチン(MBL、M-フィコリン、H-フィコリン、L-フィコリン、およびCL-11)は先天的補体系を誘発する特異的認識分子であり、この系は、レクチン開始経路、およびレクチンによって開始される終末補体エフェクター分子活性化を増幅する関連する終末経路増幅ループを含む。C1qは後天的補体系を誘発する特異的認識分子であり、この系は、古典的開始経路、およびC1qによって開始される終末補体エフェクター分子活性化を増幅する関連する終末経路増幅ループを含む。本発明者らは、これらの2つの主要な補体活性化系を、それぞれ、レクチン依存性補体系およびC1q依存性補体系と呼ぶ。
補体系は、免疫防御における必須の役割に加えて、多くの臨床状態における組織損傷の一因となる。従って、これらの副作用を阻止するために治療上有効な補体阻害因子を開発する差し迫った必要性がある。古典経路を完全な状態のままにしておきながら、レクチン媒介MASP-2経路を阻害することが可能だという認識の下で、補体の免疫防御能力を完全に遮断することなく、ある特定の病態の原因となる補体活性化系のみを特異的に阻害することが極めて望ましいことに気がついた。例えば、補体活性化が主にレクチン依存性補体系によって媒介される疾患状態では、この系だけを特異的に阻害することが有利であると考えられる。このために、免疫複合体処理を取り扱い、かつ感染症に対する宿主防御を助けるためにC1q依存性補体活性化系は完全な状態のままになると考えられる。
レクチン依存性補体系を特異的に阻害する治療剤の開発において対象となる好ましいタンパク質成分はMASP-2である。レクチン依存性補体系の公知の全てのタンパク質成分(MBL、H-フィコリン、M-フィコリン、L-フィコリン、MASP-2、C2-C9、B因子、D因子、およびプロペルジン)のうち、レクチン依存性補体系に特有にあり、かつ系が機能するために必要とされるものはMASP-2しかない。レクチン(MBL、H-フィコリン、M-フィコリン、L-フィコリン、およびCL-11)もレクチン依存性補体系において特有の成分である。しかしながら、これらのレクチン成分のいずれか1つが消失しても、レクチン重複性のために系の活性化は必ずしも阻害されるとは限らないと考えられる。レクチン依存性補体活性化系の阻害を保証するためには5種類全てのレクチンを阻害することが必要であると考えられる。さらに、MBLおよびフィコリンは補体とは無関係にオプソニン活性も有することが公知であるので、レクチン機能を阻害すると、感染症に対する、この有益な宿主防御機構が失われてしまうと考えられる。対照的に、MASP-2が阻害標的である場合には、この補体非依存的レクチンオプソニン活性は完全な状態のままであると考えられる。レクチン依存性補体活性化系を阻害する治療標的としてのMASP-2の付加的な利益は、補体タンパク質の最も低い血漿中濃度の中にMASP-2血漿中濃度(約500ng/ml)があることである。従って、完全な阻害を得るためには、それに応じた低い濃度の高親和性MASP-2阻害因子で十分である可能性がある(Moller-Kristensen, M., et al., J. Immunol Methods 282:159-167, 2003)。
本明細書の実施例14に記載のように、線維性腎臓疾患の動物モデル(片側尿管結紮UUO)において、MASP-2遺伝子の無いマウス(MASP-2-/-)は、炎症細胞浸潤物(75％低下)および線維症の組織学的マーカー、例えば、コラーゲン沈着(1/3低下)によって示されるように野生型対照動物と比較して有意に少ない腎臓疾患を示すことが確かめられた。さらに実施例15に示したように、古典経路を完全な状態のままにしておきながらレクチン経路を選択的に遮断する抗MASP-2モノクローナル抗体で全身的に処置した野生型マウスは、アイソタイプ対照抗体で処置した野生型マウスと比較して腎臓線維症から保護された。これらの結果から、レクチン経路は腎臓疾患の重要な一因であることが証明され、さらに、レクチン経路を遮断するMASP-2阻害因子、例えば、MASP-2抗体は抗線維形成剤として有効であることが証明される。さらに実施例16に示したように、タンパク質過負荷モデルでは、ウシ血清アルブミン(BSA)で処置した野生型マウスはタンパク尿性腎症(proteinuric nephropathy)を発症したのに対して、同じレベルのBSAで処置したMASP-2-/-マウスは腎損傷が少なかった。実施例17に示したように、タンパク質過負荷モデルでは、古典経路を完全な状態のままにしておきながらレクチン経路を選択的に遮断する抗MASP-2モノクローナル抗体で全身的に処置した野生型マウスは腎損傷から保護された。実施例18に記載のように、腎臓線維症のアドリアマイシン誘発性ネフロロジーモデルでは、MASP-2-/-マウスは野生型マウスと比較して腎臓炎症および尿細管間質損傷が少なかった。実施例19に記載のように、継続中の第2相非盲検腎臓試験では、抗MASP-2抗体で処置したIgA腎症患者は、試験全体を通して、臨床上意味があり、かつ統計的に有意な尿アルブミン/クレアチニン比(uACR)の減少を示し、ベースラインから処置の終わりまで24時間の尿タンパク質レベルの低下を示した。さらに実施例19に記載のように、同じ第2相腎臓試験では、抗MASP-2抗体で処置した膜性腎症患者も処置の間にuACR低下を示した。実施例20に記載のように、継続中の第2相非盲検腎臓試験では、抗MASP-2抗体で処置した5人のループス腎炎（LN）患者うち4人が、ベースラインから処置の終わりまで24時間の尿タンパク質レベルの臨床上意味がある低下を示した。
前述に従って、本発明は、抗線維形成剤としてのMASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体の使用、線維性の状態を治療するための医薬を製造するためのMASP-2阻害物質の使用、および線維性の状態の予防、治療、軽減、または逆転を必要とするヒト対象において、線維性の状態を予防するか、治療するか、軽減するか、または逆転させる方法であって、十分な量のMASP-2阻害物質(例えば、抗MASP-2抗体)を前記患者に投与する工程を含む、方法に関する。
本発明の方法は、腎臓の疾患(例えば、慢性腎疾患、IgA腎症、C3糸球体症、および他の糸球体腎炎)、肺の疾患(例えば、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、気管支拡張症)、肝臓の疾患(例えば、硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患)、心臓の疾患(例えば、心筋梗塞、心房線維症、心臓弁線維症、心内膜心筋線維症)、脳の疾患(例えば、脳卒中)、皮膚の疾患(例えば、過剰な創傷治癒、強皮症、全身性硬化症、ケロイド)、脈管構造の疾患(例えば、アテローム動脈硬化性血管疾患)、腸の疾患(例えば、クローン病)、眼の疾患(例えば、前嚢下白内障、後嚢混濁)、筋骨格軟部組織構造の疾患(例えば、癒着性関節包炎、デュプュイトラン拘縮、骨髄線維症)、生殖器の疾患(例えば、子宮内膜症、ペーロニー病)、ならびにいくつかの感染症(例えば、アルファウイルス、C型肝炎、およびB型肝炎)を含む、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する任意の疾患または障害に罹患しているヒト対象において、線維性の状態を予防するか、治療するか、軽減するか、または逆転させるのに使用することができる。
III.線維症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患および状態におけるMASP-2の役割
線維症とは、一般的に損傷または傷害に応答して、臓器または組織において過剰な結合組織が形成または存在することである。線維症の顕著な特徴は、傷害後に過剰な細胞外マトリックスが産生されることである。腎臓では、線維症は腎臓実質上への進行性の有害な結合組織沈着として特徴付けられ、この結合組織沈着は、元々の腎傷害の原因となった原発性腎臓病とは独立して、不可避的に腎機能の低下をまねく。尿細管上皮細胞が間葉系線維芽細胞に変わる細胞特徴変化である、いわゆる、上皮間葉転換(EMT)が腎臓線維症の主な機構を構成する。線維症はほぼ全ての組織および臓器系に影響を及ぼし、組織傷害または炎症などの刺激に対する修復応答または交換応答として発生する場合がある。傷害に対する正常な生理学的応答は結合組織の沈着をもたらすが、このプロセスが病気を起こすものであれば、高度に分化した細胞が瘢痕結合組織に置き換えられると組織の構造および機能が変化する。細胞レベルでは上皮細胞および線維芽細胞が増殖し、筋線維芽細胞に分化し、その結果、マトリックスの収縮、硬直性の増加、微小血管の圧迫、および低酸素が起こる。現在、線維症に有効な治療法または治療剤は無いが、動物試験およびヒトでの事例報告の両方から、線維性組織損傷は逆転する可能性があると示唆されている(Tampe and Zeisberg, Nat Rev Nephrol, Vol 10:226-237, 2014)。
腎臓の疾患(例えば、慢性腎疾患、IgA腎症、C3糸球体症、および他の糸球体腎炎)、肺の疾患(例えば、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、気管支拡張症)、肝臓の疾患(例えば、硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患)、心臓の疾患(例えば、心筋梗塞、心房線維症、心臓弁線維症、心内膜心筋線維症)、脳の疾患(例えば、脳卒中)、皮膚の疾患(例えば、過剰な創傷治癒、強皮症、全身性硬化症、ケロイド)、脈管構造の疾患(例えば、アテローム動脈硬化性血管疾患)、腸の疾患(例えば、クローン病)、眼の疾患(例えば、前嚢下白内障、後嚢混濁)、筋骨格軟部組織構造の疾患(例えば、癒着性関節包炎、デュプュイトラン拘縮、骨髄線維症)、生殖器の疾患(例えば、子宮内膜症、ペーロニー病)、ならびにいくつかの感染症(例えば、アルファウイルス、C型肝炎、B型肝炎など)を含む、多くの疾患が、進行性の臓器不全を引き起こす線維症の原因となる。
線維症は多くの組織および疾患において起こるが、その病態には共通の分子機構および細胞機構がある。線維芽細胞による細胞外マトリックスの沈着には、免疫細胞浸潤物、主として単核細胞が伴う(本明細書に参照により組み入れられる、Wynn T., Nat Rev Immunol 4(8):583-594, 2004を参照されたい)。強い炎症応答によって、増殖因子(TGF-β、VEGF、肝細胞増殖因子、結合組織増殖因子)、サイトカインおよびホルモン(エンドセリン、IL-4、IL-6、IL-13、ケモカイン)、消化酵素(エラスターゼ、マトリックスメタロプロイナーゼ(matrix metaloproteinase)、カテプシン)、ならびに細胞外マトリックスタンパク質(コラーゲン、フィブロネクチン、インテグリン)が発現する。
さらに、非常に多くの線維性疾患では補体系が活性化される。非常に多くの線維性組織標本において、膜攻撃複合体(membrane attack complex)を含む補体成分が同定されている。例えば、腎臓疾患(Satomura et al., Nephron. 92(3):702-4 (2002); Sato et al., Lupus 20(13):1378-86 (2011); Liu et al., Clin Exp Immunol, 174(1):152-60 (2013));肝臓疾患(Rensen et al., Hepatology 50(6): 1809-17 (2009));および肺疾患(Olesen et al., Clin Immunol 121(3):324-31 (2006))の線維性病変部においてレクチン経路の成分が発見されている。
免疫複合体を介した、かつ抗体とは無関係の糸球体腎炎の重要な一因として補体活性化の行き過ぎが確認されている。しかしながら、インサイチューでの制御されていない補体活性化が非腎糸球体疾患におけるTI線維症の病態生理学的進行に本質的に関与することを証明する強力な証拠がある(Quigg R.J, J Immunol 171:3319-3324, 2003、Naik A. et al., Semin Nephrol 33:575-585, 2013、Mathern D.R. et al., Clin J Am Soc Nephrol 10:P1636-1650, 2015)。局所的補体活性化によって誘発される強力な炎症誘発性シグナルは、濾過によって近位尿細管に入り、その後に間質空間に進入した補体成分によって、または尿細管細胞もしくは他の常在細胞および浸潤細胞による補体成分の異常合成によって、または腎臓細胞上にある補体調節タンパク質の発現変化によって、または補体調節成分の機能変異の非存在もしくは喪失もしくは獲得によって引き起こされる可能性がある(Mathern D.R. et al., Clin J Am Soc Nephrol 10:P1636-1650, 2015, Sheerin N.S., et al., FASEB J 22: 1065-1072, 2008)。例えば、マウスでは、補体調節タンパク質であるCR1-related gene/protein y(Crry)が欠損すると、尿細管間質性(TI)補体活性化と、その結果として、ヒトTI疾患において見られる損傷の典型である炎症および線維症が起こる(Naik A. et al., Semin Nephrol 33:575-585, 2013, Bao L. et al., J Am Soc Nephrol 18:811-822, 2007)。尿細管上皮細胞がアナフィラトキシンC3aに暴露されると上皮間葉転換が起こる(Tsang Z. et al., J Am Soc Nephrol 20:593-603, 2009)。最近、C3a受容体のみでC3aシグナル伝達を遮断すると、タンパク尿動物および非タンパク尿動物の腎臓TI線維症が和らぐことが示されている(Tsang Z. et al., J Am Soc Nephrol 20:593-603, 2009、Bao L. et al., Kidney Int. 80: 524-534, 2011)。
本明細書に記載のように、本発明者らは、尿細管腎臓病態の開始および疾患進行におけるレクチン経路の中心的な役割を突き止めた。このことは、IgA腎症、C3糸球体症、および他の糸球体腎炎を含む様々な腎臓病(Endo M. et al., Nephrol Dialysis Transplant 13: 1984-1990, 1998; Hisano S. et al., Am J Kidney Dis 45:295-302, 2005; Roos A. et al., J Am Soc Nephrol 17: 1724-1734, 2006; Liu L.L. et al., Clin Exp. Immunol 174:152-160, 2013; Lhotta K. et al., Nephrol Dialysis Transplant 14:881-886, 1999; Pickering et al., Kidney International 84:1079-1089, 2013)、糖尿病性腎症(Hovind P. et al., Diabetes 54:1523-1527, 2005)、虚血性再灌流傷害(Asgari E. et al., FASEB J 28:3996-4003, 2014)、ならびに移植拒絶反応(Berger S.P. et al., Am J Transplant 5:1361-1366, 2005)の病態生理におけるレクチン経路活性化の重要な役割を意味している。
さらに本明細書に記載のように、本発明者らは、尿細管間質性疾患のマウスモデルにおいてMASP-2阻害は炎症および線維を低減することを証明した。従って、MASP-2阻害物質は、尿細管間質の炎症および線維症、タンパク尿、IgA腎症、C3糸球体症、ならびに他の糸球体腎炎および腎臓虚血再灌流傷害を含む腎臓線維症の治療において有用だと予想される。
腎臓の疾患および障害
National Kidney Foundationによれば2600万人の米国成人が慢性腎疾患(CKD)に罹患している。ほとんどの患者には、腎不全につながる進行性疾患があり、このため、生存するには、赤血球形成を刺激する薬物、透析、または腎移植を用いた処置が必要である。CKDの主な症状である高血圧を処置することができる薬物がいくつかあるが、現在、根本原因に対処する薬物は無い。
研究から、進行性腎損傷は、ネフロンとして知られる腎臓の基礎構造における毛細血管高血圧によって引き起こされることが分かっている(Whitworth J.A., Annals Acad of Med, vol 34(1):2005)。このプロセスにおいてネフロン(腎臓の濾過単位)が傷つけられるか、または破壊されるので、炎症および組織瘢痕が生じ、ネフロンは、機能しない瘢痕組織に取って代わられる。結果として、腎臓が血液を濾過する能力はだんだんと低下する。これは腎臓線維症と呼ばれ、進行性腎臓病の共通する経路である。最初の傷害がどういったものであるかということに関係なく、腎臓線維症は、腎臓疾患が末期腎不全に進行する共通する最終経路だと考えられている。腎臓線維症の寛解は、以下:間質体積、コラーゲンIV沈着、および/または結合組織成長mRNAレベルの評価の1つまたは複数によって確かめられる場合がある。本明細書に記載の化合物および方法は腎臓線維症の治療において有用である。
腎臓の線維症および炎症は、ほぼ全ての原因の後期腎臓疾患の目立った特徴である(Boor et al., Boor P. et al., J of Am Soc of Nephrology 18:1508-1515, 2007およびChevalier et al., Kidney International 75:1145-1152, 2009を参照されたい)。いろいろな障害によって腎不全が引き起こされる可能性がある。進行性の腎機能不全はタンパク尿および腎機能不全につながる。患者の健康が悪化するにつれて、単に、腎臓に対する損傷を未然に防ぎ、多系統不全を予防するために、透析が必要となる場合がある。時が経つにつれて、腎不全および腎機能不全は、完全またはほぼ完全な永続的な腎機能喪失である末期腎臓病(ESRD)に進行する可能性がある。腎臓疾患の種類に応じて、腎機能は、ほんの数日もしくは数週間かのことで失われる場合がある、または何十年かの間にゆっくりと、かつ徐々に悪化する場合がある。患者がESRDまで進行してしまったら、死亡を防ぐために透析(血液透析(hemidialysis)または腹膜透析)が必要とされる。患者は何らかの種類の透析レジメンを受け続けなければならいか、または腎移植を受けなければならない。
腎臓疾患の線維性病変部においてレクチン経路の成分が見出されている(Satomura et al., Nephron. 92(3):702-4 (2002); Sato et al., Lupus 20(13):1378-86 (2011); Liu et al., Clin Exp Immunol, 174(1):152-60 (2013))。IgA腎症では、腎糸球体MBL沈着がある患者は、MBL沈着が無い患者よりもタンパク尿が重篤であり、腎機能が低下し、血清アルブミンレベルが低く、組織構造がひどく、血圧が高かった(Liu et al., Clin Exp Immunol. 2013 Oct;174(1):152-60)。ループス腎炎患者(Sato et al., Lupus, 20(13):1378-86, 2011)および慢性腎不全患者(Satomura et al., Nephron 92(3):702-4, 2002)にも高レベルのMBLとレクチン経路活性がある。
原発性尿細管間質損傷の非タンパク尿モデル、すなわち片側尿管結紮(UUO)において、C5欠損は腎臓線維症の主な成分の有意な寛解につながったことも証明されている(Boor P. et al., J of Am Soc of Nephrology 18:1508-1515, 2007)。UUO後の野生型マウスではC3遺伝子発現が増加し、UUO後のC3-/-マウスでは野生型マウスと比較してコラーゲン沈着が有意に低下したことも報告されている。このことから、腎臓線維症における補体活性化の役割が示唆される(Fearn et al., Mol Immunol 48:1666-1733, 2011: Abstract)。しかしながら、本発明者らによる本明細書に記載の発見の前には、腎臓線維症に関与する補体成分は詳細に明らかにされていなかった。本明細書の実施例14〜17に記載のように、MASP-2欠損、または古典経路を完全な状態のままにしておきながらレクチン経路を選択的に遮断する阻害抗体を用いたMASP-2遮断があると、腎臓疾患の様々な動物モデルにおいてマウスが腎臓線維症からはっきりと保護されることを本発明者らは思いがけず突き止めた。
従って、ある特定の態様では、本開示は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する腎臓の疾患または障害に罹患している対象において、腎臓線維症を阻害する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、抗MASP-2抗体を、腎臓線維症の阻害を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する腎臓の疾患または障害に罹患している対象に、腎臓線維症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、外科手術または局所注射の間に組成物を局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、抗MASP-2抗体)は、基礎となる腎臓の疾患または状態に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、抗MASP-2抗体)は透析またはプラスマフェレーシスレジメンと組み合わせて投与される。ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、抗MASP-2抗体)は、透析またはプラスマフェレーシスが必要とされる頻度を減らすために用いられる。ある特定の他の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、抗MASP-2抗体)は腎臓移植と組み合わせて用いられる。ある特定の他の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、抗MASP-2抗体)は、腎臓移植を待っている患者において腎機能不全を管理し、さらなる腎機能低下を予防するために用いられる。
例として、ある特定の態様では、抗MASP-2抗体は腎臓線維症を阻害し、それによって、腎糸球体疾患、例えば、巣状分節性糸球体硬化症およびネフローゼ症候群を治療するか、または寛解させる(疾患の症状を治療するか、または寛解させることを含む)のに用いられる。治療することができる例示的な症状には、高血圧、タンパク尿、高脂血症、血尿、および高コレステロール血症が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、MASP-2阻害物質は尿細管間質性線維症を阻害する。ある特定の態様において、治療は、腎機能を改善する工程、タンパク尿を減らす工程、高血圧を改善する工程、および/または腎臓線維症を軽減する工程を含む。ある特定の態様において、治療は、(i)腎機能不全、腎不全、もしくはESRDまでの進行を遅延させるか、または予防する工程;(ii)透析の必要性を遅延させるか、低減するか、または予防する工程;または(iii)腎臓移植の必要性を遅延させるか、または予防する工程を含む。
線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する、ある特定の具体的な腎臓の疾患および障害を下記で説明する。
ある特定の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する腎臓疾患は、腎糸球体疾患、例えば、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)である。腎糸球体疾患は糸球体を傷つけ、それにより、タンパク質、時として赤血球が尿に漏出する。時として、腎糸球体疾患は腎臓による老廃物のクリアランスも妨害し、そのため、老廃物は血中に増加し始める。腎糸球体疾患の症状には、タンパク尿、血尿、糸球体濾過量の低下、低タンパク血症、および浮腫が含まれる。多くの異なる疾患が腎糸球体疾患の原因となる可能性がある。腎糸球体疾患は、感染症または腎臓への毒性がある薬物の直接的な結果でもよく、高血圧症、糖尿病、または狼瘡などの体全体に影響を及ぼす疾患に起因してもよい。FSGSは、ある特定の腎糸球体疾患であるが、腎臓にある瘢痕を特徴とする、この特定の状態でさえも非常に多くの原因がある場合がある。FSGS患者は典型的に5〜20年以内に末期腎臓病に進行するが、この疾患の侵襲型(aggressive form)にかかっている患者は2〜3年でESRDに進行する。
ある特定の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する腎臓疾患は、糖尿病性腎症(DN)である。糖尿病性腎症(DN)は、未だ対処されていないが、かなりの医学的必要性がある分野である。糖尿病性腎症は糖尿病の合併症として生じる腎臓の疾患または損傷である。この状態は高血圧、高血糖値、ならびに高いコレステロール値および脂質値によって悪化する。糖尿病性腎症の正確な原因は分かっていない。しかしながら、理論に拘束されるものではないが、高血糖の放置が組織の線維症および瘢痕などの腎臓損傷の発症につながると考えられている。ヒトでは、DNは、アルブミン尿、糸球体濾過量(GFR)の進行性の低下、および心血管疾患リスクの増加で構成される臨床症候群として現れる。糖尿病性アルブミン尿は、腎糸球体基底膜(GBM)の厚化(ticking)および糸球体間質の拡大を含む独特の組織病理学的特徴の発症と関連する。アルブミン尿が進行し、続いて腎機能不全が起こるにつれて、糸球体硬化症、細動脈ヒアリン症、および尿細管間質性線維症が発症する。
従って、一態様では、本開示は、糖尿病性腎症を治療するための方法であって、有効量のMASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)を、糖尿病性腎症の治療を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。ある特定の態様において、治療は、糖尿病性腎症の1つまたは複数の症状を低減する工程を含む。ある特定の態様において、治療は、透析の必要性を低減するか、遅延させるか、または排除する工程を含む。ある特定の態様において、治療は、腎臓移植の必要性を低減するか、遅延させるか、または排除する工程を含む。ある特定の態様において、治療は、糖尿病性腎症から腎不全または末期腎臓病までの進行を遅延させるか、予防するか、または逆転させる工程を含む。
ある特定の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する腎臓疾患は、ループス腎炎である。下記でさらに詳細に説明するように、ループス腎炎は全身性エリテマトーデス(SLE)の重篤な合併症であり、MASP-2阻害物質(例えば、抗MASP-2抗体)を用いて治療することができる腎臓線維症の別の例である。
従って、一態様では、本開示は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する腎臓の疾患または障害に罹患している対象において、腎臓線維症を阻害するための方法であって、有効量のMASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)を投与する工程を含む、方法を提供する。一部の態様において、線維症および/または炎症によって悪化する腎臓の疾患または障害は、慢性腎疾患、慢性腎不全、腎糸球体疾患(例えば、巣状分節性糸球体硬化症)、免疫複合体障害(例えば、IgA腎症、膜性腎症)、ループス腎炎、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、尿細管間質損傷およびC3糸球体症、または他のタイプの糸球体腎炎からなる群より選択される。
薬物誘発性毒性によって引き起こされる腎損傷を予防または治療する方法
腎損傷の別の原因には薬物誘発性毒性が含まれる。例えば、ネフロトキシンは尿細管上皮細胞に対して直接的な毒性を引き起こすことができる。本明細書に記載のように、本発明者らは、MASP-2欠損マウスがアドリアマイシン誘発性腎症から保護されることを証明した。
ネフロトキシンには、治療用薬物(例えば、シスプラチン、ゲンタマイシン、セファロリジン、シクロスポリン、アンホテリシン、アドリアマイシン)、放射性造影剤色素、殺虫剤(例えば、パラコート)、および環境汚染物質(例えば、トリクロリエチレン(trichloriethylene)およびジクロロアセチレン)が含まれるが、これに限定されない。他の例には、ピューロマイシンアミノヌクレオシド(PAN);アミノグリコシド、例えば、ゲンタマイシン;セファロスポリン、例えば、セファロリジン;カルシニューリン阻害因子、例えば、タクロリムスまたはシロリムスが含まれる。薬物誘発性腎毒性はまた、非ステロイド性抗炎症剤、抗レトロウイルス剤、抗サイトカイン剤、免疫抑制剤、腫瘍学的薬物、またはACE阻害因子によって引き起こされる場合がある。さらに、薬物誘発性腎毒性は、鎮痛薬乱用(nalgesic abuse)、シプロフロキサシン、クロピドグレル、コカイン、cox-2阻害因子、利尿薬、フォスカメット(foscamet)、金、イホスファミド、イムノグロビン(immunoglobin)、漢方薬、インターフェロン、リチウム、マンニトール、メサラミン、マイトマイシン、ニトロソ尿素、ペニシラミン、ペニシリン、ペンタミジン、キニーネ、リファンピン、ストレプトゾシン、スルホンアミド、チクロピジン、トリアムテレン、バルプロ酸、ドキソルビシン、グリセロール、シドホビル、トブラマイシン、硫酸ネオマイシン、コリスチメタート、バンコマイシン、アミカシン、セフォタキシム、シスプラチン、アシクロビル、リチウム、インターロイキン-2、シクロスポリン、またはインジナビルによって引き起こされる場合がある。
従って、一態様では、腎損傷を発症するリスクがあるか、またはこれに罹患している対象には、腎毒性作用のある1種類または複数種の治療用薬物が与えられていてもよい。これらの対象には、このような治療剤の前に、またはこのような治療剤と同時に本発明のMASP-2阻害因子が投与されてもよい。同様に、腎毒性を治療するか、または腎毒性を発症する可能性を小さくする治療剤の後にMASP-2阻害因子が投与されてもよい。
タンパク尿に関連する疾患および状態
タンパク質の腎糸球体濾過が損なわれるとタンパク尿が生じ、全ての慢性腎疾患において起こる進行性のネフロン消失が加速すると実証されている(Remuzzi and Bertani, New Eng. J Med vol 339 (20):1448-1456, 1998)。例えば、Eddy et al., Am J Pathol 135:719-33, 1989に記載の研究では、アルブミンの腎糸球体濾過の後には常に間質性病変および瘢痕の発生が起こる。さらに、Eddy et al., 1989に記載のように、近位尿細管の管腔表面に補体C3が沈着することが、タンパク質過負荷によって誘発された腎症をもつラットにおいて観察された。このことから、糸球体によって濾過された補体系成分が間質損傷の原因となり得ることが分かる。補体枯渇またはC6欠乏が、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、アドリアマイシン腎症、5/6腎切除、およびピューロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼなどのタンパク尿動物モデルにおける尿細管間質損傷を寛解させたことが証明されている(Boor et al., J of Am Soc of Nephrology: JASN 18:1508-1515, 2007)。ヒト研究から、タンパク尿は慢性腎疾患進行の独立した予測因子であり、タンパク尿の低下は腎臓保護性であることが分かっている(Ruggenenti P. et al., J Am Soc Nephrol 23:1917-1928、2012)。
従って、一態様では、本開示は、タンパク尿に関連する疾患または状態に罹患している対象において、タンパク尿を予防もしくは低減する、および/または腎損傷を予防もしくは低減するための方法であって、対象におけるタンパク尿を低減または予防するために有効な量のMASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)を投与する工程を含む、方法を提供する。一部の態様において、タンパク尿に関連する疾患または状態は、ネフローゼ症候群、子癇前症、子癇、腎臓の毒性病変、アミロイドーシス、コラーゲン血管疾患(例えば、全身性エリテマトーデス)、脱水、腎糸球体疾患(例えば、膜性糸球体腎炎、巣状分節性糸球体腎炎、微小変化群、リポイドネフローゼ)、激しい運動、ストレス、良性直立位(起立性)タンパク尿、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症(すなわち、ベルジェ病)、IgM腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎症、微小変化群、類肉腫症、アルポート症候群、糖尿病(糖尿病性腎症)、薬物誘発性毒性(例えば、NSAIDS、ニコチン、ペニシラミン、炭酸リチウム、金および他の重金属、ACE阻害因子、抗生物質、またはオピエート(例えば、ヘロイン));ファブリー病、感染症(例えば、HIV、梅毒、A型肝炎、B型肝炎、またはC型肝炎、連鎖球菌感染後感染症、尿路住血吸虫症);アミノ酸尿、ファンコニー症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、鎌状赤血球症、ヘモグロビン尿、多発性骨髄腫、ミオグロビン尿、臓器拒絶反応(例えば、腎移植拒絶反応)、エボラ出血熱、爪膝蓋骨症候群、家族性地中海熱、HELLP症候群、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症、関節リウマチ、1型糖原病、グッドパスチャー症候群、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、腎臓に広がった尿路感染症、シェーグレン症候群、ならびに感染後糸球体腎炎からなる群より選択される。
肝臓疾患
肝線維症(liver fibrosis)は肝線維症(hepatic fibrosis)とも呼ばれ、肝臓に瘢痕組織が蓄積することによって引き起こされ、ほとんどのタイプの肝臓疾患の特徴である。健常な肝臓組織が瘢痕組織に取って代わられるので、肝臓が正しく機能する能力が損なわれる。瘢痕を引き起こす状態が治療されなければ、肝線維症は、肝硬変、および命にかかわる状態である完結した肝不全まで進行する場合がある。肝線維症の主な原因は、アルコール乱用、慢性C型肝炎ウイルス感染、非アルコール性脂肪性肝炎、および肝毒性傷害(例えば、アセトアミノフェンまたは他の薬物によって誘発される薬物性肝損傷)である。
肝臓疾患の線維性病変部においてレクチン経路の成分が見出されている(Rensen et al., Hepatology 50(6): 1809-17 (2009))。例えば、非アルコール性脂肪性肝炎(脂肪肝疾患とも知られる)では補体系タンパク質の広範な活性化があり、その発現は疾患重篤度に関連する(Rensen et al., Hepatology 50(6): 1809-17 (2009)。ここでは、C3およびC9の沈着に加えてMBL蓄積が見出され、レクチン経路の活性化が確かめられた。
従って、ある特定の態様では、本開示は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する肝臓の疾患または障害に罹患している対象において、肝線維症を阻害する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、肝線維症の阻害を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する肝臓の疾患または障害に罹患している対象に、肝線維症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、外科手術または局所注射の間に組成物を局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、基礎となる肝臓の疾患または状態に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
一部の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する肝臓の疾患または障害は、硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患(脂肪性肝炎)、アルコール乱用に続発する肝線維症、急性肝炎または慢性肝炎に続発する肝線維症、胆管疾患、および中毒性肝傷害(例えば、アセトアミノフェンまたは他の薬物によって誘発される薬物性肝損傷による肝毒性)からなる群より選択される。
肺疾患
肺線維症とは、肺において過剰な線維性結合組織が形成または発生することであり、この場合、正常な肺組織は線維性組織に取って代わられる。この瘢痕は、肺の硬直と肺構造および肺機能の障害につながる。ヒトでは、肺線維症は、肺の小さな気嚢(肺胞)の中にある組織、およびその間にある組織が繰り返し傷つけられることに起因すると考えられている。実験の場では、様々な動物モデルがヒト疾患の局面を再現してきた。例えば、ブレオマイシン、フルオレセインイソチオシアネート、シリカ、またはアスベストなどの外来因子が動物の気管に注入されることがある(Gharaee-Kermani et al., Animal Models of Pulmonary Fibrosis. Methods Mol. Med., 2005, 117:251-259)。
従って、ある特定の態様では、本開示は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する肺の疾患または障害に罹患している対象において、肺線維症を阻害する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、肺線維症の阻害を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、肺線維症を阻害するか、肺線維症を軽減するか、および/または肺機能を改善するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。肺機能の症状の改善には、肺機能および/または肺容量の改善、疲労の減少、ならびに酸素飽和度の改善が含まれる。
一部の態様において、本開示は、嚢胞性線維症に罹患している対象において、肺線維症を治療するか、阻害するか、予防するか、または寛解させる方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、肺線維症の治療、阻害、予防、または寛解を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、外科手術または局所注射の間に組成物を局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、基礎となる肺疾患または肺状態に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する、ある特定の具体的な肺疾患および肺障害を下記で説明する。
ある特定の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する肺疾患は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)である。COPDとは、筋線維芽細胞およびコラーゲンの蓄積により気道壁に線維がある疾患であり、身体障害の主な原因であり、米国において第4位の死因である。COPDは気流を遮断し、患者が呼吸するのをますます困難なものにしている。COPDは気道への損傷によって引き起こされ、気道への損傷は最終的には肺での酸素と二酸化炭素の交換を妨害する。COPDには慢性閉塞性気管支炎および気腫、多くの場合、その両方が含まれる。肺が既に傷ついており、肺機能が既に損なわれているCOPD患者は、細菌感染症およびウイルス感染症に関連する合併症のリスクが高い。
従って、一態様では、本開示は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)を治療するための方法であって、慢性閉塞性肺疾患(COPD)の治療を必要とする対象において、肺線維症を阻害および/または減少するために有効な量のMASP-2阻害物質(例えば、抗MASP-2抗体)を投与する工程を含む、方法を提供する。ある特定の態様において、治療は、COPDの1つまたは複数の症状を低減する工程を含む。COPDおよび/または肺線維症の症状には、粘液を伴う咳、軽度の活動で悪化し得る息切れ(呼吸困難)、疲労、頻繁な呼吸器感染症、喘鳴、胸部絞扼感、不規則な心拍(不整脈)、呼吸装置および酸素療法の必要性、右心不全または肺性心(慢性肺疾患による心臓肥大および心不全)、肺炎、気胸、重度の重量減少、ならびに栄養失調が含まれるが、これに限定されない。症状には、1つまたは複数の標準的な肺機能検査を用いて評価されるような肺機能の低下も含まれる。
ある特定の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する肺疾患は、強皮症に関連する肺線維症である。下記でさらに詳細に説明するように、強皮症に関連する肺線維症は、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)で治療することができる肺線維症の別の例である。
一部の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する肺の疾患または障害は、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、強皮症に関連する肺線維症、気管支拡張症、および肺高血圧症からなる群より選択される。
心臓および血管の疾患
多くの異なる心臓病態および血管病態が共通の線維プロセスによって引き起こされる。心臓に線維性組織が過剰に沈着すると心臓病態が起こる。この場合、細胞外マトリックスタンパク質が過剰に産生されるので、心臓の構造、構成、形状が変化し、心臓の収縮機能が影響を受ける(Khan and Sheppard, Immunology 118: 10-24, 2006)。
研究から、線維症は、虚血性心筋症、拡張型心筋症、および肥大性心筋症における心機能不全に大きく寄与する場合があることが分かっている。例えば、慢性心房細動患者には対照と比較して高度の心筋間質性線維症があると見出されたことが証明されている(Khan and Sheppard, Immunology 118: 10-24, 2006)。別の例として、USにおいて不整脈原性右室心筋症(ARVC)のほとんどの症例が脂肪浸潤と瘢痕を示すことが確かめられている(線維脂肪性ARVC)(Burke et al., Circulation 97:1571-1580, 1998)。ARVCにかかっているヒト対象における心室心筋の病理組織学的特徴を調べた研究では、ARVCにかかっている小児患者に由来する生検標本に広範な線維症が存在することが確かめられた(Nishikawa T. et al., Cardiovascular Pathology vol 8 (4):185-189, 1999)。
従って、ある特定の態様では、本開示は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する心臓または血管の疾患または障害に罹患している対象において、線維症および/または炎症を予防する、治療する、逆転させる、阻害する、および/または低減する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、線維症および/または炎症の予防、治療、逆転、阻害、および/または低減を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、心臓および/もしくは血管の線維症を阻害するために、ならびに/または心臓および/もしくは血管の機能を改善するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。
一部の態様において、本開示は、心臓弁線維症に罹患している対象において、線維症を治療するか、阻害するか、予防するか、または寛解させる方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、線維症の治療、阻害、予防、または寛解を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、外科手術または局所注射の間に組成物を局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、基礎となる心臓病または血管疾患もしくは血管状態に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
一部の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する心臓または血管の疾患または障害は、心臓線維症、心筋梗塞、心房線維症、心内膜心筋線維症、不整脈原性右室心筋症(ARVC)、血管疾患、アテローム動脈硬化性血管疾患、血管狭窄、再狭窄、脈管炎、静脈炎、深部静脈血栓、および腹部大動脈瘤からなる群より選択される。
慢性感染症
C型肝炎およびB型肝炎などの慢性感染症は組織炎症および線維症を引き起こし、高いレクチン経路活性が有害となる場合がある。このような疾患において、MASP-2阻害物質は有益な場合がある。例えば、MBLおよびMASP-1レベルは、C型肝炎ウイルス(HCV)感染における肝線維症重篤度の重要な予測因子になることが見出されている(Brown et al., Clin Exp Immunol. 147(1):90-8, 2007; Saadanay al., Arab J Gastroenterol. 12(2):68-73, 2011; Saeed et al., Clin Exp Immunol. 174(2):265-73, 2013)。MASP-1は、以前に、MASP-2およびレクチン経路の強力なアクチベーターであることが示されている(Megyeri et al., J Biol Chem. 29: 288(13):8922-34, 2013)。チクングニアウイルスおよびロスリバーウイルスなどのアルファウイルスは、関節炎および筋炎の原因となる強力な宿主炎症応答を誘発し、この病態はMBLおよびレクチン経路によって媒介される(Gunn et al., PLoS Pathog. 8(3):e1002586, 2012)。
従って、ある特定の態様では、本開示は、炎症および/もしくは線維症を引き起こす慢性感染症に罹患しているかまたは以前に罹患したことのある対象において、線維症および/または炎症を予防する、治療する、逆転させる、阻害する、および/または低減する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、線維症および/または炎症の予防、治療、逆転、阻害、および/または低減を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、外科手術または局所注射の間に組成物を局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、基礎となる慢性感染症に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
一部の態様において、炎症および/または線維症を引き起こす慢性感染症は、アルファウイルス、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、結核、HIV、およびインフルエンザからなる群より選択される。
自己免疫疾患:
強皮症は、線維症、血管変化、および自己抗体を特徴付とする慢性自己免疫疾患である。2つの主な種類:限局型全身性強皮症(limited systemic scleroderma)と、びまん性全身性強皮症(diffuse systemic scleroderma)がある。限局型全身性強皮症の皮膚症状は手、腕、および顔を冒す。この種類の強皮症にかかっている患者には、以下の合併症:石灰沈着、レイノー現象、食道機能不全、手指硬化(sclerodactyl)、および末梢血管拡張の1つまたは複数があることが多い。びまん性全身性強皮症は急速に進行し、皮膚の広い範囲と、1つまたは複数の内臓、しばしば、腎臓、食道、心臓、および/または肺を冒す。
強皮症は、全ての臓器において、小動脈として知られる小さな血管を冒す。まず最初に、小動脈の内皮細胞が平滑筋細胞と一緒にアポトーシスにより死に絶える。これらの細胞はコラーゲンおよび他の線維性材料に置き換えられる。炎症細胞、特に、CD4+ヘルパーT細胞が小動脈に浸潤し、さらなる損傷を引き起こす。
強皮症の皮膚徴候は痛みを伴うことがあり、患部の使用(例えば、手、指、足指、足などの使用)を損なうことがあり、外観を損なうことがある。皮膚の潰瘍化が起こる場合があり、このような潰瘍は感染を起こしやすく、または壊疽さえも起こしやすい場合がある。潰瘍化した皮膚は治るのが難しいか、または遅い場合がある。皮膚潰瘍化を治癒することの難しさは、循環障害のある患者、例えば、レイノー現象のある患者では特に悪化する場合がある。ある特定の態様において、本開示の方法は、強皮症、例えば、強皮症の皮膚症状を治療するために用いられる。ある特定の態様において、強皮症の治療は、皮膚潰瘍化、例えば、指潰瘍を治療することを含む。MASP-2阻害物質、例えば、抗MASP-2抗体の投与は、冒された組織および/または臓器における強皮症の線維症状および/または炎症症状を低減するために使用することができる。
強皮症は皮膚の症状/徴候に加えて、心臓、腎臓、肺、関節、および消化管にも影響を及ぼす場合がある。ある特定の態様において、強皮症の治療は、例えば、線維症状および/または炎症症状を低減することによって、これらの組織のいずれか1つまたは複数における疾患の症状を治療することを含む。強皮症の最も重篤な合併症の中に肺問題があり、この疾患に関連する死亡の多くの原因である。強皮症に関連する2つの主要な肺状態が肺線維症および肺高血圧症である。肺合併症にかかっている患者には、いずれかの状態または両方の状態がある場合がある。強皮症に関連する肺線維症は、MASP-2阻害物質で治療することができる肺線維症の一例である。肺が関与する強皮症は瘢痕(肺線維症)の原因となる。このような肺線維症は強皮症患者の約70％において起こるが、その進行は典型的にはゆっくりしており、患者間で症状は重篤度の点で大きく異なる。肺線維症に関連する症状が無い患者の場合、症状には、乾性咳、息切れ、および運動能力の低下が含まれる。何らかのレベルの肺線維症にかかっている患者の約16％が重篤な肺線維症を発症する。重篤な肺線維症にかかっている患者は大幅な肺機能低下と肺胞炎を経験する。
ある特定の態様において、本開示の方法は、強皮症、例えば、強皮症に関連する肺線維症を治療するために用いられる。MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体の投与は、肺における強皮症の線維性症状を低減するために使用することができる。例えば、前記方法は、肺機能を改善する、および/または強皮症による死亡リスクを下げるのに使用することができる。
強皮症患者では腎臓合併症も見られる。強皮症に関連する腎臓線維症は、MASP-2阻害物質、例えば、抗MASP-2抗体の投与によって治療することができる腎臓線維症の一例である。ある特定の態様において、本開示の方法は、強皮症、例えば、強皮症に関連する腎臓線維症を治療するために用いられる。一態様において、MASP-2阻害抗体の投与は、腎臓における強皮症の線維症状を低減するために使用することができる。例えば、前記方法は、腎機能を改善する、尿中タンパク質を低減する、高血圧を下げる、および/または致死的な腎不全につながり得る腎クリーゼ(renal crisis)リスクを下げるのに使用することができる。
全身性エリテマトーデス(SLE)は、B細胞およびT細胞の自発的な自己反応性ならびに多臓器免疫損傷を特徴とする慢性炎症性自己免疫性障害であり、皮膚、関節、腎臓、および他の臓器を冒すことがある。SLEにかかっている、ほぼ全ての人に関節痛があり、ほとんどの人が関節炎を発症する。よく冒される関節は、指、手、手首、および膝である。SLEの一般的な症状には、関節炎;疲労;全身違和感、不安、または悪感情(倦怠感);関節痛および関節腫脹;筋肉痛;悪心および嘔吐;ならびに皮膚発疹が含まれる。さらに、症状には、腹痛;血尿;圧力が加えられると、または寒さで色が変わる指;しびれ感および刺痛;ならびに皮膚にある赤色の斑点も含まれ得る。一部の患者では、SLEに肺合併症または腎臓合併症がある。理論に拘束されるものではないが、肺および腎臓における炎症および/または線維症は、これらの臓器を傷つけ、肺および/または腎臓の損傷に関連する症状につながる。場合によっては、SLE患者は、ループス腎炎と呼ばれる特定の腎臓状態を発症する。ある特定の態様において、本開示は、有効量のMASP-2阻害物質、例えば、抗MASP-2抗体を投与する工程を含む、SLEを治療する方法を提供する。MASP-2阻害抗体を投与する工程はSLEの1つまたは複数の症状を減少させるのに使用することができる。ある特定の態様において、抗MASP-2抗体を投与する工程はループス腎炎患者においてSLEを治療するために用いられる。このような場合、SLEの治療は、例えば、ループス腎炎の症状を低減することによって、ループス腎炎を治療する工程を含む。ある特定の態様において、治療は、SLEの皮膚症状を治療する工程を含む。ある特定の態様において、治療は、ループス腎炎の1つまたは複数の症状を治療する工程を含む。ある特定の態様において、治療は、透析の必要性を低減するか、遅延させるか、または排除する工程を含む。ある特定の態様において、治療は、腎臓移植の必要性を低減するか、遅延させるか、または排除する工程を含む。ある特定の態様において、治療は、ループス腎炎から腎不全または末期腎臓病への進行を遅延させるか、または予防する工程を含む。
ループス腎炎は腎臓の炎症であり、全身性エリテマトーデス(SLE)の重篤な合併症である。腎臓では、ループス腎炎は衰弱性の機能喪失につながる可能性がある。ループス腎炎患者は最終的には腎不全を発症し、透析または腎臓移植を必要とする場合がある。本開示の方法を用いて治療することができる関連する合併症には間質性腎炎およびネフローゼ症候群が含まれる。ループス腎炎の症状には、血尿、尿の泡状外観、高血圧、尿中タンパク質、体液貯留、および浮腫が含まれる。他の症状には、腎臓線維症および/または腎不全の徴候および症状が含まれる。ループス腎炎は治療しないままであれば腎不全につながり、末期腎臓病さえもつながる可能性がある。
従って、ある特定の態様では、本開示は、線維症および/または炎症を引き起こすかまたは悪化させる自己免疫疾患に罹患している対象において、線維症および/または炎症を予防する、治療する、逆転させる、阻害する、および/または低減する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、線維症および/または炎症の予防、治療、逆転、阻害、および/または低減を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、線維症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、外科手術または局所注射の間に組成物を局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、基礎となる自己免疫疾患に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
一部の態様において、線維症および/または炎症を引き起こすかまたは悪化させる自己免疫疾患は、強皮症および全身性エリテマトーデス(SLE)からなる群より選択される。
中枢神経系の疾患および状態:
ある特定の態様において、本開示は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する中枢神経系の疾患または障害に罹患している対象において、線維症および/または炎症を予防する、治療する、逆転させる、阻害する、および/または低減する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、抗MASP-2抗体を、線維症および/または炎症の予防、治療、逆転、阻害、および/または低減を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、線維症および/または炎症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、外科手術または局所注射の間に組成物を局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、中枢神経系の基礎となる疾患または障害に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
一部の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する中枢神経系の疾患または障害は、脳卒中、外傷性脳傷害、および脊髄傷害からなる群より選択される。
皮膚の疾患および状態
ある特定の態様において、本開示は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する皮膚の疾患および状態に罹患している対象において、線維症および/または炎症を予防する、治療する、逆転させる、阻害する、および/または低減する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、線維症および/または炎症の予防、治療、逆転、阻害、および/または低減を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、線維症および/または炎症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、組成物を皮膚に局所適用することによって、または外科手術もしくは局所注射の間に局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、局部投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、基礎となる皮膚の疾患および状態に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
一部の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する皮膚の疾患および状態は、皮膚線維症、創傷治癒、強皮症、全身性硬化症、ケロイド、結合組織病、瘢痕、および肥厚性瘢痕からなる群より選択される。
筋骨格の骨および軟部組織の障害および状態
ある特定の態様において、本開示は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する骨または軟部組織の疾患または障害に罹患している対象において、線維症および/または炎症を予防する、治療する、逆転させる、阻害する、および/または低減する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、線維症および/または炎症の予防、治療、逆転、阻害、および/または低減を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、線維症および/または炎症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、組成物を骨もしくは軟部組織構造に局所適用することによって、または外科手術もしくは局所注射の間に局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、局部投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、基礎となる骨または軟部組織の疾患または障害に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
一部の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する骨または軟部組織の疾患または障害は、骨粗鬆症および/または骨減少、例えば、嚢胞性線維症に関連する骨減少、骨線維症の増加を伴う骨髄異形成状態、癒着性関節包炎、デュプュイトラン拘縮、および骨髄線維症からなる群より選択される。
関節の疾患および状態
ある特定の態様において、本開示は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する関節の疾患または障害に罹患している対象において、線維症および/または炎症を予防する、治療する、逆転させる、阻害する、および/または低減する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、線維症および/または炎症の予防、治療、逆転、阻害、および/または低減を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、線維症および/または炎症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、組成物を関節に局所適用することによって、または外科手術もしくは局所注射の間に局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、局部投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、基礎となる関節の疾患または障害に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
一部の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する関節の疾患または障害は、関節線維症である。
消化器の疾患および状態
ある特定の態様において、本開示は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する消化器の疾患または障害に罹患している対象において、線維症および/または炎症を予防する、治療する、逆転させる、阻害する、および/または低減する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、線維症および/または炎症の予防、治療、逆転、阻害、および/または低減を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、線維症および/または炎症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、外科手術または局所注射の間に局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、局部投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、基礎となる消化器の疾患または障害に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
一部の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する消化器の疾患または障害は、クローン病、潰瘍性大腸炎、および膵臓線維症からなる群より選択される。
眼の疾患および状態
ある特定の態様において、本開示は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する眼の疾患または障害に罹患している対象において、線維症および/または炎症を予防する、治療する、逆転させる、阻害する、および/または低減する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、線維症および/または炎症の予防、治療、逆転、阻害、および/または低減を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、線維症および/または炎症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、外科手術または局所注射の間に局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、(例えば、点眼薬として)眼への局部投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、基礎となる眼の疾患または障害に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
一部の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する眼の疾患または障害は、前嚢下白内障、後嚢混濁、黄斑変性、ならびに網膜および硝子体の網膜症からなる群より選択される。
生殖器の疾患および状態
ある特定の態様において、本開示は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する生殖器の疾患または障害に罹患している対象において、線維症および/または炎症を予防する、治療する、逆転させる、阻害する、および/または低減する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、線維症および/または炎症の予防、治療、逆転、阻害、および/または低減を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、線維症および/または炎症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、外科手術または局所注射の間に局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、局部投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、基礎となる生殖器の疾患または障害に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
一部の態様において、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する生殖器の疾患または障害は、子宮内膜症およびペーロニー病からなる群より選択される。
外傷に関連する瘢痕
ある特定の態様において、本開示は、外傷に関連する瘢痕に起因する疾患または状態に罹患している対象において、線維症および/または炎症を予防する、治療する、逆転させる、阻害する、および/または低減する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、線維症および/または炎症の予防、治療、逆転、阻害、および/または低減を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、線維症および/または炎症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、外科手術または局所注射の間に局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、局部投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、基礎となる疾患または障害に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
一部の態様において、外傷に関連する瘢痕は、手術合併症(例えば、手術に起因する癒着。この場合、瘢痕組織が内蔵間で形成して拘縮、疼痛の原因となることがあり、不妊の原因となることがある)、化学療法薬誘発性線維症、放射線誘発性線維症、および火傷に関連する瘢痕からなる群より選択される。
線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する、さらなる疾患および障害
ある特定の態様において、本開示は、臓器移植、乳房線維症、筋肉線維症、後腹膜線維症、甲状腺線維症、リンパ節線維症、膀胱線維症、および胸膜線維症からなる群より選択される、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している対象において、線維症および/または炎症を予防する、治療する、逆転させる、阻害する、および/または低減する方法であって、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体を、線維症および/または炎症の予防、治療、逆転、阻害、および/または低減を必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。この方法は、線維症および/または炎症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害因子を含む組成物を投与する工程を含む。
MASP-2阻害性組成物は線維症の領域に局所投与されてもよく、例えば、直接、または離れて、例えば、カテーテルによって、外科手術または局所注射の間に局所適用することによって線維症の領域に局所投与されてもよい。または、MASP-2阻害物質は、例えば、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与、皮下投与、または他の非経口投与によって対象に全身投与されてもよく、(例えば、点眼薬として)眼への局部投与によって対象に全身投与されてもよく、潜在的には非ペプチド物質の場合には経口投与によって対象に全身投与されてもよい。投与は、前記状態が回復するまで、または管理されるまで医師によって決定されるように繰り返されてもよい。
ある特定の態様において、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、基礎となる疾患または障害に適した1種類または複数種の物質または治療モダリティーと組み合わせて投与される。
本明細書に記載の任意の様々な方法および薬学的組成物のある特定の態様において、MASP-2阻害抗体は古典経路を完全な状態のままにしておきながらレクチン経路を選択的に遮断する。
IV.MASP-2阻害物質
様々な局面において、本発明は、線維症および/または炎症の副作用を阻害する方法であって、線維症および/または炎症の副作用の阻害を必要とする対象にMASP-2阻害物質を投与する工程を含む、方法を提供する。MASP-2阻害物質は、生きている対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害するために有効な量で投与される。本発明のこの局面の実施において、代表的なMASP-2阻害物質には、MASP-2の生物学的活性を阻害する分子(例えば、低分子阻害因子、抗MASP-2抗体(例えば、MASP-2阻害抗体)、またはMASP-2と相互作用するか、もしくはタンパク質間相互作用を妨害する遮断ペプチド)、ならびにMASP-2発現を減らし、それによって、MASP-2がレクチン補体経路を活性化しないようにする分子(例えば、MASP-2アンチセンス核酸分子、MASP-2特異的RNAi分子、およびMASP-2リボザイム)が含まれる。MASP-2阻害物質は主な療法として単独で用いられてもよく、他の医学的処置の治療利益を強化するアジュバント療法として他の治療剤と組み合わせて用いられてもよい。
MASP-2依存性補体活性化の阻害は、本発明の方法に従うMASP-2阻害物質の投与の結果として生じる、以下の補体系成分の変化:MASP-2依存性補体活性化系産物C4b、C3a、C5a、および/もしくはC5b〜9(MAC)の生成もしくは産生の阻害(例えば、実施例2に記載のように測定した)、C4切断およびC4b沈着の低下(例えば、実施例2に記載のように測定した)、またはC3切断およびC3b沈着の低下(例えば、実施例2に記載のように測定した)の少なくとも1つによって特徴付けられる。
本発明によれば、線維症および/または炎症を阻害するために有効であり、かつ検出可能な抗線維形成活性を示しおよび/または線維症の減少を誘発するMASP-2阻害物質が利用される。本発明の文脈の中で、抗線維活性は、以下:(1)例えば、マクロファージおよび内皮細胞の活性化および動員によって評価されるような、炎症の低下;多くのサイトカイン/ケモカインの分泌を介するリンパ球および/もしくは好酸球の動員および活性化;細胞傷害性メディエーターおよび線維形成性サイトカインの放出;(2)細胞増殖、ECM合成、もしくは血管形成の低下、ならびに/または(3)MASP-2阻害物質の非存在下での線維形成活性と比較したコラーゲン沈着の低下の少なくとも1つまたは複数を含んでもよい。
抗線維形成剤、例えば、MASP-2阻害物質の評価は、当業者に公知の任意の技法を用いて検出することができる。例えば、抗線維形成剤の評価は(本明細書中の実施例12および実施例14に記載のように)UUOモデルにおいて評価される場合がある。MASP-2阻害物質を用いて、検出可能な抗線維形成活性および/または線維症の低下もしくは減少が評価されれば、このようなMASP-2阻害物質は、線維症を予防する、治療する、逆転させる、および/または阻害するための医薬として用いられるといわれる。
線維症の評価は、定期的に、例えば、毎週または毎月行われてもよい。従って、線維症の増加/減少および/または抗線維形成活性の存在は、定期的に、例えば、毎週または毎月行われてもよい。この評価は、好ましくは、ある特定の対象については、いくつかの時点で行われてもよく、ある特定の対象および健常対照については1つまたはいくつかの時点で行われてもよい。評価は、一定の時間間隔を開けて、例えば、毎週または毎月行われてもよい。従って、評価は、定期的に、例えば、毎週または毎月行われてもよい。ある評価が線維症の減少の発見または抗線維形成活性の存在につながった時に、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体は、検出可能な抗線維形成活性を示す、および/または線維症の低下もしくは減少を誘発するといわれる。
本発明のこの局面の実施において有用なMASP-2阻害物質には、例えば、MASP-2抗体およびその断片、MASP-2阻害ペプチド、低分子、MASP-2可溶性受容体、ならびに発現阻害因子が含まれる。MASP-2阻害物質は、MASP-2の生物学的機能を遮断することによってMASP-2依存性補体活性化系を阻害してもよい。例えば、阻害物質は、MASP-2タンパク質間相互作用を効果的に遮断してもよく、MASP-2二量体化または集合を妨害してもよく、Ca2+結合を遮断してもよく、MASP-2セリンプロテアーゼ活性部位を妨害してもよく、MASP-2タンパク質発現を減少させてもよい。
一部の態様において、MASP-2阻害物質は、C1q依存性補体活性化系の機能を損なわずにMASP-2補体活性化を選択的に阻害する。
一態様において、本発明の方法において有用なMASP-2阻害物質は、補体系の他の抗原よりも少なくとも10倍高い親和性で、SEQ ID NO:6を含むポリペプチドに特異的に結合する特異的MASP-2阻害物質である。別の態様において、MASP-2阻害物質は、補体系の他の抗原よりも少なくとも100倍高い結合親和性で、SEQ ID NO:6を含むポリペプチドに特異的に結合する。一態様において、MASP-2阻害物質は、MASP-2の(i)CCP1-CCP2ドメイン(SEQ ID NO:6のaa300〜431)またはセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:6のaa445〜682)の少なくとも1つに特異的に結合し、MASP-2依存性補体活性化を阻害する。一態様において、MASP-2阻害物質は、MASP-2に特異的に結合する、MASP-2モノクローナル抗体またはその断片である。MASP-2阻害物質の結合親和性は適切な結合アッセイ法を用いて確かめることができる。
MASP-2ポリペプチドは、C1補体系のプロテアーゼであるMASP-1、MASP-3、ならびにC1rおよびC1sに類似した分子構造を示す。SEQ ID NO:4に示されたcDNA分子は、MASP-2(SEQ ID NO:5に示されたアミノ酸配列からなる)の代表例をコードし、分泌後に切断されて成熟型ヒトMASP-2(SEQ ID NO:6)を生じる、リーダー配列(aa1〜15)を有するヒトMASP-2ポリペプチドを提供する。図2に示したように、ヒトMASP2遺伝子は12個のエキソンを含む。ヒトMASP-2 cDNAは、エキソンB、C、D、F、G、H、I、J、K、およびLによってコードされる。図2に示したように、オルタナティブスプライスから、エキソンB、C、D、およびEから生じる(SEQ ID NO:1)によってコードされるMBL関連タンパク質19(「MAp19」、「sMAP」とも呼ばれる)(SEQ ID NO:2)と呼ばれる20kDaタンパク質が生じる。SEQ ID NO:50に示されたcDNA分子はマウスMASP-2(SEQ ID NO:51に示されたアミノ酸配列からなる)をコードし、分泌後に切断されて成熟型マウスMASP-2(SEQ ID NO:52)を生じる、リーダー配列を有するマウスMASP-2ポリペプチドを提供する。SEQ ID NO:53に示されたcDNA分子はラットMASP-2(SEQ ID NO:54に示されたアミノ酸配列からなる)をコードし、分泌後に切断されて成熟型ラットMASP-2(SEQ ID NO:55)を生じる、リーダー配列を有するラットMASP-2ポリペプチドを提供する。
当業者であれば、SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:50、およびSEQ ID NO:53に開示される配列は、それぞれ、ヒトMASP-2、マウスMASP-2、およびラットMASP-2の単一の対立遺伝子であり、対立遺伝子変化およびオルタナティブスプライシングが生じると予想されることを認めると考えられる。サイレント変異を含有する対立遺伝子変種および変異によってアミノ酸配列が変化する対立遺伝子変種を含む、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:50、およびSEQ ID NO:53に示したヌクレオチド配列の対立遺伝子変種は本発明の範囲内である。MASP-2配列の対立遺伝子変種は、標準的な手順に従って、異なる個体に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをプローブすることによってクローニングすることができる。
ヒトMASP-2タンパク質(SEQ ID NO:6)のドメインが図1および図2Aに示され、N末端C1r/C1s/ウニVegf/骨形成タンパク質(CUBI)ドメイン(SEQ ID NO:6のaa1〜121)、上皮細胞成長因子様ドメイン(aa122〜166)、別のCUBIドメイン(aa167〜293)、ならびに補体対照タンパク質ドメインの縦列配列およびセリンプロテアーゼドメインを含む。MASP2遺伝子のオルタナティブスプライシングから図1に示したMAp19が得られる。MAp19は、図1に示したように、MASP-2のN末端CUBI-EGF領域とエキソンEに由来する4個のさらなる残基(EQSL)を含有する非酵素タンパク質である。
いくつかのタンパク質が、タンパク質間相互作用を介してMASP-2に結合するかまたはMASP-2と相互作用することが示されている。例えば、MASP-2は、レクチンタンパク質であるMBL、H-フィコリン、およびL-フィコリンに結合し、これらとCa2+依存性複合体を形成することが公知である。それぞれのMASP-2/レクチン複合体は、タンパク質C4およびC2のMASP-2依存性切断を介して補体を活性化することが示されている(Ikeda, K., et al., J. Biol Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med 176:197-2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol.168:3502-3506, 2002)。研究により、MASP-2のCUBI-EGFドメインはMASP-2とMBLとの結合に不可欠なことが示されている(Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068, 2001)。CUBIEGFCUBIIドメインは、活性MBL複合体の形成に必要なMASP-2二量体化を媒介することも示されている(Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000)。従って、MASP-2依存性補体活性化に重要なことが公知であるMASP-2標的領域に結合するMASP-2阻害物質、または該MASP-2標的領域を妨害するMASP-2阻害物質を同定することができる。
抗MASP-2抗体
本発明のこの局面の一部の態様において、MASP-2阻害物質は、MASP-2依存性補体活性化系を阻害する抗MASP-2抗体を含む。本発明のこの局面において有用な抗MASP-2抗体は、任意の抗体産生哺乳動物に由来するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換え抗体を含み、多重特異的、キメラ、ヒト化、抗イディオタイプ、および抗体断片でもよい。抗体断片には、本明細書においてさらに説明されるように、Fab、Fab'、F(ab) 2、F(ab') 2、Fv断片、scFv断片、および単鎖抗体が含まれる。
MASP-2抗体のMASP-2依存性補体活性化系を阻害する能力および抗線維形成活性ならびに/またはタンパク尿もしくはアドリアマイシン誘発性腎症に関連する腎損傷を阻害する能力を、本明細書に記載のアッセイ法を用いてスクリーニングすることができる。いくつかのMASP-2抗体が文献に記載されており、一部は新たに作製されており、このうちの一部は下記の表1に列挙される。例えば、本明細書中の実施例10および実施例11に記載のように、MASP-2依存性補体活性化を遮断する抗MASP-2 Fab2抗体が同定されている。実施例12に記載のように、また参照により本明細書に組み入れられるWO2012/151481にも記載のように、MASP-2依存性補体活性化を遮断する完全ヒトMASP-2 scFv抗体(例えば、OMS646)が同定されている。実施例13に記載のように、また参照により本明細書に組み入れられるWO2014/144542にも記載のように、SGMI-2ペプチドアミノ酸配列(SEQ ID NO:72、73、または74)を、ヒトMASP-2抗体(例えば、OMS646-SGMI-2)の重鎖および/または軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端と融合することによって、MASP-2阻害活性を有する、SGMI-2ペプチドを含むMASP-2抗体およびその断片を作製した。
従って、一態様では、本発明の方法において使用するためのMASP-2阻害物質は、例えば、OMS646などのヒト抗体を含む。従って、一態様では、本発明の組成物および方法において使用するためのMASP-2阻害物質は、ヒトMASP-2(SEQ ID NO:6)からなるポリペプチドに結合するヒト抗体を含む。前記抗体は、(I)(a)(i)SEQ ID NO:67の31〜35に由来するアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H1;および(ii)SEQ ID NO:67の50〜65に由来するアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H2;および(iii)SEQ ID NO:67の95〜107に由来するアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H3を含む、重鎖可変領域、ならびに(b)(i)SEQ ID NO:69の24〜34に由来するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L1;および(ii)SEQ ID NO:69の50〜56に由来するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L2;および(iii)SEQ ID NO:69の89〜97に由来するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L3を含む、軽鎖可変領域、あるいは(II)SEQ ID NO:67と少なくとも90％の同一性(例えば、SEQ ID NO:67と少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の同一性)を有する重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:69と少なくとも90％の同一性(例えば、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の同一性)を有する軽鎖可変領域を含む、その変種を含む。
一部の態様において、前記方法は、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ある量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を対象に投与する工程を含む。
一部の態様において、前記方法は、SEQ ID NO:67に示した重鎖可変領域およびSEQ ID NO:69に示した軽鎖可変領域を含む参照抗体OMS646が認識する、ヒトMASP-2上のエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を対象に投与する工程を含む。一態様において、本発明の方法において使用するためのMASP-2阻害物質はヒト抗体OMS646を含む。
(表１)例示的なMASP-2特異的抗体
Figure 0006893554
低下したエフェクター機能を有する抗MASP-2抗体
本発明のこの局面の一部の態様では、古典的補体経路の活性化から生じ得る炎症を緩和するために、抗MASP-2抗体は低下したエフェクター機能を有する。IgG分子が古典的補体経路を誘発する能力は、この分子のFc部分内にあることが示されている(Duncan, A.R.. et al., Nature 332:738-740 1988)。この分子のFc部分が酵素切断によって除去されているIgG分子には、このエフェクター機能がない(Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照されたい)。従って、エフェクター機能を最小化する遺伝子操作Fc配列を有することによって、またはヒトIgG2もしくはIgG4アイソタイプにすることによって、この分子のFc部分を欠いた結果としてエフェクター機能が低下した抗体を作製することができる。
低下したエフェクター機能を有する抗体は、本明細書に記載のように、ならびにJolliffe et al., Int'l Rev. Immunol. 10:241-250, 1993およびRodrigues et al., J. Immunol. 151:6954-6961, 1998にも記載のように、IgG重鎖のFc部分の標準的な分子生物学的操作によって作製することができる。低下したエフェクター機能を有する抗体はまた、補体を活性化しかつ/またはFc受容体と相互作用する能力が低下したヒトIgG2およびIgG4アイソタイプも含む(Ravetch, J. V., et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991 ; Isaacs, J.D., et al., J. Immunol. 148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., et al., Immunol Today 14:215-221, 1993)。IgG2またはIgG4アイソタイプからなる、ヒトMASP-2に特異的なヒト化抗体または完全ヒト抗体は、Vaughan, T.J., et al., Nature Biotechnical 16:535-539, 1998に記載のように当業者に公知のいくつかの方法の1つによって作製することができる。
抗MASP-2抗体の作製
抗MASP-2抗体は、MASP-2ポリペプチド(例えば、完全長MASP-2)または抗原性MASP-2エピトープ含有ペプチド(例えば、MASP-2ポリペプチドの一部)を用いて作製することができる。免疫原性ペプチドは5アミノ酸残基と小さくてもよい。例えば、本発明の方法において有用な抗MASP-2抗体を誘導するために、SEQ ID NO:6の全アミノ酸配列を含むMASP-2ポリペプチドが用いられてもよい。タンパク質間相互作用に関与することが公知である特定のMASP-2ドメイン、例えば、CUBIおよびCUBIEGFドメイン、ならびにセリン-プロテアーゼ活性部位を含む領域が、実施例3に記載のように組換えポリペプチドとして発現され、抗原として用いられてもよい。さらに、MASP-2ポリペプチド(SEQ ID NO:6)の少なくとも6アミノ酸の部分を含むペプチドもまた、MASP-2抗体を誘導するために有用である。MASP-2抗体を誘導するために有用なMASP-2由来抗原のさらなる例を以下の表2に示した。抗体を産生させるのに用いられるMASP-2ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書にさらに記載されるように、天然ポリペプチドまたは組換えペプチドもしくは合成ペプチドおよび触媒的に不活性な組換えポリペプチド、例えば、MASP-2Aとして単離されてもよい。本発明のこの局面の一部の態様において、抗MASP-2抗体は、本明細書に記載されるように、トランスジェニックマウス系統を用いて得られる。
抗MASP-2抗体の作製において有用な抗原はまた、融合ポリペプチド、例えば、MASP-2またはその一部と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質との融合も含む。ポリペプチド免疫原は完全長分子またはその一部でもよい。ポリペプチド部分がハプテン様である場合には、このような部分は、免疫のために、都合よく、巨大分子担体(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、または破傷風トキソイド)に接合または連結されてもよい。
（表２）MASP-2由来抗原
Figure 0006893554
ポリクローナル抗体
MASP-2に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて、動物をMASP-2ポリペプチドまたはその免疫原性部分で免疫することによって調製することができる。例えば、Green et al.,「Production of Polyclonal Antisera」, Immunochemical Protocols(Manson, ed.), 105頁を参照されたい。MASP-2ポリペプチドの免疫原性は、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウムまたはフロイントアジュバント(完全もしくは不完全)、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールを含むアジュバントを用いて高まることができる。ポリクローナル抗体は、典型的には、動物、例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、またはヒツジにおいて産生される。または、本発明において有用な抗MASP-2抗体はまた、ヒトに近い霊長類に由来してもよい。ヒヒにおいて診断および治療に有用な抗体を産生するための一般的な技法は、例えば、Goldenberg et al.,国際特許公報WO91/11465、およびLosman, M.J., et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990において見られ得る。次いで、免疫学的に活性な抗体を含有する血清が、当技術分野において周知の標準的な手順を用いて、このような免疫動物の血液から生成される。
モノクローナル抗体
一部の態様において、MASP-2阻害物質は抗MASP-2モノクローナル抗体である。抗MASP-2モノクローナル抗体は、単一のMASP-2エピトープに対して作製されているので高度に特異的である。本明細書で使用する「モノクローナル」という修飾語は、抗体が実質的に均一な抗体集団から得られているという特徴を示し、特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈してはならない。モノクローナル抗体は、連続培養細胞株による抗体分子の作製を提供する任意の技法、例えば、Kohler, G., et al., Nature 256:495, 1975に記載のハイブリドーマ法を用いて得ることができる。または、モノクローナル抗体は、組換えDNA法(例えば、Cabillyに対する米国特許第4,816,567号を参照されたい)によって作製されてもよい。モノクローナル抗体は、Clackson, T., et al., Nature 352:624-628, 1991、およびMarks, J.D., et al., J. Mol Biol. 222:581-597, 1991に記載の技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含む任意の免疫グロブリンクラスおよびその任意のサブクラスの抗体でよい。
例えば、モノクローナル抗体は、適切な哺乳動物(例えば、BALB/cマウス)に、MASP-2ポリペプチドまたはその一部を含む組成物を注射することによって得ることができる。予め決められた期間の後に、脾臓細胞をマウスから取り出し、細胞培地に懸濁する。次いで、脾臓細胞を不死細胞株と融合して、ハイブリドーマを形成する。形成されたハイブリドーマを細胞培養において増殖させ、MASP-2に対するモノクローナルを産生する能力についてスクリーニングする。抗MASP-2モノクローナル抗体の作製についてさらに述べている例が本願明細書に提供される(Current Protocols in Immunology, Vol.1., John Wiley & Sons, 2.5.1-2.6.7頁, 1991も参照されたい)。
抗原曝露に反応して特異的ヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスを用いて、ヒトモノクローナル抗体を得ることができる。この技法では、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の要素を、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含有する胚性幹細胞株に由来するマウスの系統に導入する。このトランスジェニックマウスは、ヒト抗原、例えば、本明細書に記載のMASP-2抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、本願明細書にさらに述べられるように従来のケーラー・ミルステイン技術を用いて、このような動物に由来するB細胞を適切なミエローマ細胞株と融合することによってヒトMASP-2抗体分泌ハイブリドーマを作製するために使用することができる。ヒト免疫グロブリンゲノムを有するトランスジェニックマウスは、(例えば、Abgenix, Inc., Fremont, CA.およびMedarex, Inc., Annandale, N.J.から)市販されている。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Green, L.L., et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N., et al., Nature 368:856, 1994;およびTaylor, L.D., et al., Int. Immun. 6:579, 3994によって述べられている。
モノクローナル抗体は、十分に確立した様々な技法によってハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。このような単離法には、プロテインA Sepharoseを用いたアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる(例えば、Coliganの2.7.1-2.7.12頁および2.9.1-2.9.3頁; Baines et al., 「Purification of Immunoglobulin G(IgG)」, Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol.10, 79-104頁, 1992を参照されたい)。
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはファージ由来抗体が作製されたら、最初に特異的MASP-2結合について試験される。MASP-2に特異的に結合する抗体を検出するために、当業者に公知の様々なアッセイ法を使用することができる。例示的なアッセイ法には、標準的な方法によるウエスタンブロットまたは免疫沈降分析(例えば、Ausubel et al.,に記載)、免疫電気泳動、酵素結合免疫吸着測定法、ドットブロット、阻害アッセイ法または競合アッセイ法、およびサンドイッチアッセイ法(Harlow and Land, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988に記載)が含まれる。MASP-2に特異的に結合する抗体が同定されたら、抗MASP-2抗体は、いくつかのアッセイ法の1つ、例えば、レクチン特異的C4切断アッセイ法(実施例2に記載)、C3b沈着アッセイ法(実施例2に記載)、またはC4b沈着アッセイ法(実施例2に記載)においてMASP-2阻害物質として機能する能力について試験される。
抗MASP-2モノクローナル抗体の親和性は当業者によって容易に決定することができる(例えば、Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949を参照されたい)。一態様において、本発明の方法に有用な抗MASP-2モノクローナル抗体は、＜100nM、好ましくは、＜10nM、最も好ましくは＜2nMの結合親和性でMASP-2に結合する。
キメラ/ヒト化抗体
本発明の方法において有用なモノクローナル抗体には、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、キメラ抗体、ならびに、このような抗体の断片が含まれる(Cabillyに対する米国特許第4,816,567号;およびMorrison, S.L., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984)。
本発明において有用なキメラ抗体の一形態は、ヒト化モノクローナル抗MASP-2抗体である。非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの可変重鎖および可変軽鎖に由来する非ヒト(例えば、マウス)相補性決定領域(CDR)をヒト可変ドメインに導入することによって作製される。次いで、典型的に、非ヒト対応物のフレームワーク領域においてヒト抗体残基が代用される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能にさらに磨きをかけるためになされる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、および典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、Fvフレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のFvフレームワーク領域に対応する。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Jones, P.T, et al., Nature 321:522-525, 1986; Reichmann, L., et al., Nature 332:323-329, 1988;およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992を参照されたい。
本発明において有用なヒト化抗体には、少なくともMASP-2結合CDRH3領域を含むヒトモノクローナル抗体が含まれる。さらに、IgA抗体またはIgM抗体ならびにヒトIgG抗体を作製するためにFc部分が交換されてもよい。このようなヒト化抗体は、ヒトMASP-2を特異的に認識するが、ヒトにおいて抗体それ自体に対する免疫応答を引き起こさないので特に臨床において有用であると考えられる。その結果、このようなヒト化抗体は、ヒトでのインビボ投与に特に反復投与または長期投与が必要な場合にはより適している。
マウス抗MASP-2モノクローナル抗体からヒト化抗MASP-2抗体の作製の一例が本明細書の実施例6において示される。ヒト化モノクローナル抗体を作製する技法は、例えば、Jones, P.T, et al., Nature 321:522, 1986; Carter, P., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer, I.I., et al., J. Immun. 150:2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., 1995; Kelley, 「Engineering Therapeutic Antibodies」, Protein Engineering:Principles and Practice, Cleland et al.(eds.), John Wiley & Sons, Inc., 399-434頁, 1996;およびQueen, 1997に対する米国特許第5,693,762号にも記載されている。さらに、Protein Design Labs (Mountain View, CA)などの特定のマウス抗体領域からヒト化抗体を合成する商業的実体がある。
組換え抗体
抗MASP-2抗体は組換え法を用いて作製することもできる。例えば、ヒト抗体断片(VH、VL、Fv、Fd、Fab、またはF(ab') 2)を作製するようにヒト免疫グロブリン発現ライブラリー(例えば、Stratagene, Corp., La Jolla, CAから入手可能)を用いてヒト抗体を作製することができる。次いで、キメラ抗体の作製法に類似した技法を用いて、これらの断片を用いてヒト抗体全体を構築する。
抗イディオタイプ抗体
望ましい阻害活性を有する抗MASP-2抗体が同定されたら、これらの抗体を用いて、当技術分野において周知の技法を用いてMASP-2の一部に似ている抗イディオタイプ抗体を生成することができる。例えば、Greenspan, N.S., et al., FASEB J. 7:437, 1993を参照されたい。例えば、MASP-2に結合し、補体活性化に必要とされるMASP-2タンパク質相互作用を完全に阻害する抗体を用いて、MASP-2タンパク質上のMBL結合部位に似ている、従って、MASP-2の結合リガンド、例えば、MBLに結合し、これを中和する抗イディオタイプを生成することができる。
免疫グロブリン断片
本発明の方法において有用なMASP-2阻害物質は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、抗体断片から形成された、Fab、Fab'、F(ab) 2、F(ab') 2、およびFv断片、scFv断片、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ならびに多重特異性抗体を含む周知の断片も包含する。
抗体とそのエピトープの結合には抗体分子の小さな部分であるパラトープしか関与しないことは当技術分野において周知である(例えば、Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986を参照されたい)。抗体のpFc'およびFc領域は古典的補体経路のエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。pFc'領域が酵素切断されている抗体、またはpFc'領域なしで作製されている抗体はF(ab')2断片と呼ばれ、インタクトな抗体の抗原結合部位を両方とも保持する。単離されたF(ab') 2断片は、その2つの抗原結合部位のために二価モノクローナル断片と呼ばれる。同様に、Fc領域が酵素切断されている抗体、またはFc領域なしで作製されている抗体はFab断片と呼ばれ、インタクトな抗体分子の抗原結合部位のうちの1つを保持する。
抗体断片は、従来の方法による抗体全体のタンパク質加水分解、例えば、ペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、抗体をペプシンで酵素切断して、F(ab') 2と呼ばれる5S断片を得ることによって作製することができる。この断片は、3.5S Fab'一価断片を生じるチオール還元剤を用いてさらに切断することができる。任意で、ジスルフィド結合を切断する、スルフヒドリル基のブロック基を用いて、切断反応を行うことができる。代替として、ペプシンを用いた酵素切断によって、2つの一価Fab断片および1つのFc断片が直接、生成される。これらの方法は、例えば、Goldenbergに対する米国特許第4,331,647号; Nisonoff, A., et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, R.R., Biochem, J. 73:119, 1959; Edelman, et al., Methods in Enzymology 1:422, Academic Press, 1967;ならびにColiganの2.8.1〜2.8.10頁および2.10.〜2.10.4頁に記載されている。
一部の態様において、FcとFcγ受容体が結合すると開始する古典的補体経路の活性化を回避するためには、Fc領域の無い抗体断片を使用することが好ましい。Fcγ受容体相互作用を回避するMoAbを作製することができる、いくつかの方法がある。例えば、モノクローナル抗体のFc領域をタンパク質分解酵素による部分消化(例えば、フィシン消化)を用いて化学的に除去し、それによって、例えば、抗原結合抗体断片、例えば、Fab断片またはF(ab) 2断片を生成することができる(Mariani, M., et al., Mol. Immunol. 28:69-71, 1991)。または、Fcγ受容体に結合しないヒトγ4 IgGアイソタイプを、本明細書に記載のようにヒト化抗体の構築中に使用することができる。Fcドメインの無い抗体、単鎖抗体、および抗原結合ドメインはまた、本明細書に記載の組換え法を用いて操作することもできる。
単鎖抗体断片
代替的に、重鎖Fv領域および軽鎖Fv領域が接続されている、MASP-2に特異的なペプチド単鎖結合分子を作製することができる。Fv断片は、単鎖抗原結合タンパク質(scFv)を形成するようにペプチドリンカーで接続されてもよい。これらの単鎖抗原結合タンパク質は、オリゴヌクレオチドで接続されている、VHおよびVLドメインをコードするDNA配列を含む、構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、その後に、大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する1本のポリペプチド 鎖を合成する。scFvを作製するための方法は、例えば、Whitlow, et al.,「Methods:A Companion to Methods in Enzymology」2:97, 1991; Bird, et al., Science 242:423, 1988; Ladnerに対する米国特許第4,946,778号; Pack, P., et al., Bio/Technology 11:1271, 1993に記載されている。
例示的な例として、MASP-2特異的scFvは、インビトロでリンパ球をMASP-2ポリペプチドに曝露し、(例えば、固定化または標識されたMASP-2タンパク質またはペプチドを使用することによって)ファージベクター中または類似ベクター中の抗体ディスプレイライブラリーを選択することによって得ることができる。潜在的なMASP-2ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージまたは細菌、例えば、大腸菌にディスプレイされたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングによって得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを用いて、MASP-2と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングするための技法は当技術分野において周知である(Lardnerに対する米国特許第5,223,409号; Ladnerに対する米国特許第4,946,778号; Ladnerに対する米国特許第5,403,484号; Ladnerに対する米国特許第5,571,698号;およびKay et al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996)。このようなライブラリーをスクリーニングするためのランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびキットは、例えば、CLONTECH Laboratories, Inc.(Palo Alto, Calif.)、Invitrogen Inc.(San Diego, Calif.)、New England Biolabs, Inc.(Ipswich, Mass.)、およびPharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway, N.J.)から市販されている。
本発明のこの局面において有用な抗MASP-2抗体断片の別の形態は、MASP-2抗原上のエピトープに結合し、MASP-2依存性補体活性化を阻害する、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。CDRペプチド(「最小認識ユニット」)は、関心対象の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ鎖反応を用いて抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される(例えば、Larrick et al., Methods; A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, 「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」, Monoclonal Antibodies:Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al., (eds.), 166頁, Cambridge University Press, 1995;およびWard et al.,「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」, Monoclonal Antibodies:Principles and Applications, Birch et al., (eds,), 137頁, Wiley-Liss, Inc., 1995を参照されたい)。
MASP-2依存性補体活性化を阻害するために、本明細書に記載のMASP-2抗体は、それを必要とする対象に投与される。一部の態様において、MASP-2阻害物質は、エフェクター機能が低下した、高親和性ヒトまたはヒト化モノクローナル抗MASP-2抗体である。
ペプチド阻害因子
本発明のこの局面の一部の態様において、MASP-2阻害物質は、MASP-2依存性補体活性化系を阻害する、単離された天然ペプチド阻害因子および合成ペプチド阻害因子を含む単離されたMASP-2ペプチド阻害因子を含む。本明細書で使用する「単離されたMASP-2ペプチド阻害因子」という用語は、MASP-2に結合することによって、レクチン経路の別の認識分子(例えば、MBL、H-フィコリン、M-フィコリン、もしくはL-フィコリン)への結合についてMASP-2と競合することによって、および/またはMASP-2と直接相互作用してMASP-2依存性補体活性化を阻害することによって、MASP-2依存性補体活性化を阻害するペプチドを指し、該ペプチドは実質的に純粋であり、かつ天然で一緒に見出され得る他の物質を現実的でかつ目的の用途に適した程度まで本質的に含まない。
ペプチド阻害因子は、タンパク質間相互作用および触媒部位を妨害するためにインビボで首尾よく用いられてきた。例えば、最近、LFA-1と構造上関連する接着分子に対するペプチド阻害因子が凝固障害における臨床使用に認可された(Ohman, E.M., et al., European Heart J. 16:50-55, 1995)。インテグリン依存性接着を阻止または妨害する短い直鎖ペプチド(＜30アミノ酸)が述べられている(Murayama, O., et al., J. Biochem. 120:445-51, 1996)。インテグリン依存性接着を遮断するために、長さが25〜200アミノ酸残基に及ぶ長いペプチドも首尾よく用いられてきた(Zhang, L., et al., J. Biol. Chem. 271(47):29953-57, 1996)。一般的に、長いペプチド阻害因子は短いペプチドよりも高い親和性および/またはゆっくりとしたオフレート(off-rate)を有し、従って、強力な阻害因子になり得る。環式ペプチド阻害因子もまたヒト炎症疾患治療のためのインビボで有効なインテグリン阻害因子であると示されている(Jackson, D.Y., et al., J. Med. Chem. 40:3359-68, 1997)。環式ペプチドを作製する方法の1つは、ペプチドの末端アミノ酸がシステインであり、それによって、末端アミノ酸間のジスルフィド結合によってペプチドが環状形態で存在することが可能になるペプチド合成を伴う。この環状形態は、造血性新生物の治療のためにインビボでの親和性および半減期を改善することが示されている(例えば、Larsonに対する米国特許第6,649,592号)。
合成MASP-2ペプチド阻害因子
本発明のこの局面の方法において有用なMASP-2阻害ペプチドは、MASP-2機能に重要な標的領域を模倣するアミノ酸配列によって例示される。本発明の方法の実施において有用な阻害ペプチドはサイズが約5アミノ酸〜約300アミノ酸に及ぶ。表3は、本発明のこの局面の実施において有用であり得る例示的な阻害ペプチドのリストを提供する。例えば、レクチン特異的C4切断アッセイ法(実施例2に記載)およびC3b沈着アッセイ法(実施例2に記載)を含む、いくつかのアッセイ法の1つにおいて、候補MASP-2阻害ペプチドがMASP-2阻害物質として機能する能力を試験することができる。
一部の態様において、MASP-2阻害ペプチドはMASP-2ポリペプチドに由来し、完全長成熟MASP-2タンパク質(SEQ ID NO:6)、またはMASP-2タンパク質の特定のドメイン、例えば、CUBIドメイン(SEQ ID NO:8)、CUBIEGFドメイン(SEQ ID NO:9)、EGFドメイン(SEQ ID NO:11)、およびセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:12)より選択される。前記のように、CUBEGFCUBII領域は二量体化およびMBLとの結合に必要なことが示されている(Thielens et al., 前記)。特に、MASP-2のCUBIドメインにあるペプチド配列TFRSDYN(SEQ ID NO:16)は、Asp105からGly105へのホモ変異を有し、その結果、MBL複合体からMASP-2が失われるヒトを特定した研究においてMBLとの結合に関与することが示されている(Stengaard-Pedersen, K., et al., New England J. Med. 349:554-560, 2003)。
一部の態様において、MASP-2阻害ペプチドは、MASP-2に結合し、レクチン補体経路に関与するレクチンタンパク質に由来する。マンナン結合レクチン(MBL)、L-フィコリン、M-フィコリン、およびH-フィコリンを含む、この経路に関与する、いくつかの異なるレクチンが同定されている(Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002)。これらのレクチンは、それぞれが炭水化物認識ドメインを有するN末端コラーゲン様繊維を有するホモ三量体サブユニットのオリゴマーとして血清中に存在する。これらの異なるレクチンはMASP-2に結合することが示されており、レクチン/MASP-2複合体はタンパク質C4およびC2を切断することによって補体を活性化する。H-フィコリンは、24アミノ酸のアミノ末端領域、11個のGly-Xaa-Yaaリピートを有するコラーゲン様ドメイン、12アミノ酸のネック(neck)ドメイン、および207アミノ酸のフィブリノゲン様ドメインを有する(Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002)。H-フィコリンはGlcNAcに結合し、ネズミチフス菌(S.typhimurium)、S.ミネソタ(S.minnesota)、および大腸菌に由来するLPSでコーティングされたヒト赤血球を凝集させる。H-フィコリンはMASP-2およびMAp19に結合し、レクチン経路を活性化することが示されている。すなわち、L-フィコリン/P35もまたGlcNAcに結合し、ヒト血清中のMASP-2およびMAp19に結合することが示されている。この複合体はレクチン経路を活性化することが示されている(Matsushita, M., et al., J. Immunol. 164:2281, 2000)。従って、本発明において有用なMASP-2阻害ペプチドは、MBLタンパク質(SEQ ID NO:21)、H-フィコリンタンパク質(GenBankアクセッション番号NM_173452)、M-フィコリンタンパク質(GenBankアクセッション番号O00602)、およびL-フィコリンタンパク質(GenBankアクセッション番号NM_015838)より選択される少なくとも5個のアミノ酸の領域を含んでもよい。
より具体的には、科学者達は、MBL上のMASP-2結合部位が、MBPのコラーゲン様ドメインのC末端部分にあるヒンジとネックとの間にある12個のGly-X-Yトリプレット
Figure 0006893554
内にあることを同定した(Wallis, R. et al., J. Biol Chem. 279:14065, 2004)。このMASP-2結合部位領域はまたヒトH-フィコリンおよびヒトL-フィコリンにおいても高度に保存されている。アミノ酸配列「OGK-X-GP」(SEQ ID NO:22)を含む、3種類全てのレクチンタンパク質において存在し、文字「O」がヒドロキシプロリンを表しかつ文字「X」が疎水残基である、コンセンサス結合部位が記載されている(Wallis et al., 2004, 前記)。従って、一部の態様において、本発明のこの局面において有用なMASP-2阻害ペプチドは長さが少なくとも6個のアミノ酸であり、SEQ ID NO:22を含む。アミノ酸配列「GLR GLQ GPO GKL GPO G」(SEQ ID NO:24)を含む、MBLに由来するペプチドは、インビトロでMASP-2に結合することが示されている(Wallis, et al., 2004, 前記)。MASP-2との結合を増強するために、天然のMBLタンパク質において見られるような三重らせんの形成を増強する、各末端に2個のGPOトリプレットが隣接するペプチド
Figure 0006893554
を合成することができる(Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004においてさらに説明される)。
MASP-2阻害ペプチドはまた、H-フィコリンのコンセンサスMASP-2結合領域に由来する配列
Figure 0006893554
を含む、ヒトH-フィコリンに由来してもよい。L-フィコリンのコンセンサスMASP-2結合領域に由来する配列
Figure 0006893554
を含む、ヒトL-フィコリン由来ペプチドも含まれる。
MASP-2阻害ペプチドはまた、抗トロンビンIIIのC末端部分と連結したC4切断部位である
Figure 0006893554
などのC4切断部位に由来してもよい(Glover, G.I., et al., Mol. Immunol. 25:1261(1988))。
（表３）例示的なMASP-2阻害ペプチド
Figure 0006893554
Figure 0006893554
注:文字「O」はヒドロキシプロリンを表す。文字「X」は疎水残基である。
C4切断部位に由来するペプチドならびにMASP-2セリンプロテアーゼ部位を阻害する他のペプチドは、不可逆的プロテアーゼインヒビターになるように化学的に改変することができる。例えば、適切な改変は、C末端、Asp、もしくはGluにおける、または官能側鎖に付加されるハロメチルケトン(Br、Cl、I、F);アミノ基または他の官能側鎖にあるハロアセチル(または他のαハロアセチル)基;アミノ末端もしくはカルボキシ末端または官能側鎖にあるエポキシド含有基またはイミン含有基;あるいはアミノ末端もしくはカルボキシ末端または官能側鎖にあるイミデートエステルを含んでもよいが、必ずしもこれに限定されない。このような改変を行えば、ペプチドの共有結合によって酵素を永久に阻害するという利点が得られると考えられる。これによって有効量が少なくなる可能性があり、かつ/またはペプチド阻害因子の投与頻度の低下が必要になる可能性がある。
前記の阻害ペプチドに加えて、本発明の方法において有用なMASP-2阻害ペプチドには、本明細書に記載のように得られた抗MASP-2 MoAbのMASP-2結合CDRH3領域を含有するペプチドが含まれる。ペプチド合成において使用するためのCDR領域の配列は、当技術分野において公知の方法によって決定することができる。重鎖可変領域は、一般的に長さが100〜150アミノ酸のペプチドである。軽鎖可変領域は、一般的に長さが80〜130アミノ酸のペプチドである。重鎖可変領域内および軽鎖可変領域内のCDR配列には、当業者によって容易に配列決定され得る、たった約3〜25アミノ酸の配列が含まれる。
当業者であれば、MASP-2阻害ペプチドの実質的に相同なバリエーションもMASP-2阻害活性を示すことを認めると考えられる。例示的なバリエーションには、本ペプチドのカルボキシ末端部分またはアミノ末端部分に挿入、欠失、交換、および/またはさらなるアミノ酸を有するペプチド、ならびにその混合物が含まれるが、必ずしもこれに限定されない。従って、MASP-2阻害活性を有する相同なペプチドは本発明の方法において有用だとみなされる。記載のペプチドはまた、重複モチーフおよび保存的置換による他の改変も含んでよい。保存的変種は本明細書の他の場所において説明され、あるアミノ酸を、類似した電荷、サイズ、または疎水性などのアミノ酸と交換することを含む。
インタクトなタンパク質中のセグメントにさらによく似せるために、MASP-2阻害ペプチドは、溶解度を増加するように、および/または正電荷もしくは負電荷を最大にするように改変されてもよい。誘導体は、望ましいMASP-2阻害特性を機能的に保持する限り、本明細書において開示されたペプチドの正確な一次アミノ酸構造を有してもよく、有さなくてもよい。改変は、一般的に公知である20種類のアミノ酸の1つまたは別のアミノ酸を用いたアミノ酸置換、補助的な望ましい特徴、例えば、酵素分解に対する耐性を有する誘導体化アミノ酸もしくは置換アミノ酸またはDアミノ酸を用いたアミノ酸置換、あるいは天然コンフォメーションおよび1個のアミノ酸、複数のアミノ酸、またはペプチドの機能を模倣する別の分子もしくは化合物、例えば、炭水化物を用いた置換;アミノ酸欠失;一般的に公知である20種類のアミノ酸の1つまたは別のアミノ酸を用いたアミノ酸挿入、補助的な望ましい特徴、例えば、酵素分解に対する耐性を有する誘導体化アミノ酸もしくは置換アミノ酸またはDアミノ酸を用いたアミノ酸挿入、あるいは天然コンフォメーションおよび1個のアミノ酸、複数のアミノ酸、またはペプチドの機能を模倣する別の分子もしくは化合物、例えば、炭水化物を用いた置換;あるいは天然コンフォメーション、電荷分布、および親ペプチドの機能を模倣する別の分子または化合物、例えば、炭水化物または核酸モノマーを用いた置換を含んでもよい。ペプチドはまたアセチル化またはアミド化によって改変されてもよい。
誘導体阻害ペプチドの合成は、ペプチド生合成、炭水化物生合成などの公知の技法に頼ってもよい。出発点として、当業者は、関心対象のペプチドのコンフォメーションを決定するために適切なコンピュータプログラムに頼ることがある。本明細書において開示されたペプチドのコンフォメーションが分かったら、当業者は、親ペプチドの基本コンフォメーションおよび電荷分布を保持するが、親ペプチドに存在しない特徴または親ペプチドに見られる特徴以上に強化された特徴を有し得る誘導体を作製するために、合理的設計のやり方で、1つまたは複数の部位に、どんな種類の置換を加えることができるかを決定することができる。候補誘導体分子が同定されたら、MASP-2阻害物質として機能するかどうか判定するために、本明細書に記載のアッセイ法を用いて誘導体を試験することができる。
MASP-2阻害ペプチドのスクリーニング
MASP-2の重要な結合領域の分子構造を模倣し、MASP-2の補体活性を阻害するペプチドを生成およびスクリーニングするために、分子モデリングおよび合理的分子設計も使用することができる。以前に述べられたように、モデリングに用いられる分子構造には、抗MASP-2モノクローナル抗体のCDR領域、ならびに二量体化に必要な領域、MBLとの結合に関与する領域、およびセリンプロテアーゼ活性部位を含む、MASP-2機能に重要なことが公知の標的領域が含まれる。ある特定の標的に結合するペプチドを同定する方法は当技術分野において周知である。例えば、ある特定の分子に結合する巨大分子構造、例えば、ペプチドの新規構築のために分子インプリンティングを使用することができる。例えば、Shea, K.J.,「Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers:The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties」, TRIP 2(5) 1994を参照されたい。
例示的な例として、MASP-2結合ペプチドの模倣物を調製する方法の1つは以下の通りである。公知のMASP-2結合ペプチド、またはMASP-2阻害を示す抗MASP-2抗体の結合領域の機能的モノマー(鋳型)が重合される。次いで、鋳型は取り出され、その後に、鋳型によって残された空隙の中に別のクラスのモノマーが重合されて、鋳型に類似した、1つまたは複数の望ましい特性を示す新たな分子が得られる。このようにペプチドを調製することに加えて、MASP-2阻害物質である他のMASP-2結合分子、例えば、多糖、ヌクレオシド、薬物、核タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、糖タンパク質、ステロイド、脂質、および他の生物学的に活性な材料も調製することができる。この方法は、天然対応物よりも安定性が高い多種多様な生物学的模倣物の設計に有用である。なぜなら、これらの生物学的模倣物は、典型的に、機能的モノマーのフリーラジカル重合によって調製され、その結果、非生分解性バックボーンを有する化合物が得られるからである。
ペプチド合成
MASP-2阻害ペプチドは、当技術分野において周知の技法、例えば、J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963においてMerrifieldによって最初に述べられた固相合成技法を用いて調製することができる。自動合成は、例えば、Applied Biosystems 431 A Peptide Synthesizer(Foster City, Calif.)を用いて、製造業者により提供される説明書に従って行うことができる。他の技法は、例えば、Bodanszky, M., et al., Peptide Synthesis, 第二版, John Wiley & Sons, 1976ならびに当業者に公知の他の参照文献において見られ得る。
ペプチドはまた、当業者に公知の標準的な遺伝子工学的技法を用いて調製することもできる。例えば、ペプチドは、ペプチドをコードする核酸を発現ベクターに挿入し、DNAを発現させ、必要とされるアミノ酸の存在下でDNAをペプチドに翻訳することによって酵素的に作製することができる。次いで、ペプチドを、クロマトグラフィー法もしくは電気泳動法を用いて精製するか、またはペプチドをコードする配列を、担体タンパク質をコードする核酸配列とインフレーム(in phase)で発現ベクターに挿入することによって、ペプチドと融合し、後で切断することができる担体タンパク質によって精製する。融合タンパク質ペプチドは、クロマトグラフィー法、電気泳動法、または免疫学的技法(例えば、抗体を介した樹脂と担体タンパク質との結合)を用いて単離されてもよい。ペプチドは、化学的方法論を用いて、または酵素的に、例えば、加水分解酵素によって切断することができる。
本発明の方法において有用なMASP-2阻害ペプチドはまた、従来技法に従って組換え宿主細胞において産生することもできる。MASP-2阻害ペプチドをコードする配列を発現させるために、ペプチドをコードする核酸分子を、発現ベクター内で転写発現を制御する調節配列に機能的に連結し、次いで、宿主細胞に導入しなければならない。プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列に加えて、発現ベクターは、翻訳調節配列、および発現ベクターを有する細胞の選択に適したマーカー遺伝子を含んでもよい。
MASP-2阻害ペプチドをコードする核酸分子は、「遺伝子合成機(gene machine)」によりホスホルアミダイト法などのプロトコールを用いて合成することができる。遺伝子または遺伝子断片の合成などの適用に化学合成二本鎖DNAが必要である場合には、それぞれの相補鎖が別々に作製される。短い遺伝子(60〜80塩基対)の作製は技術的に簡単であり、相補鎖を合成し、次いで、これらをアニーリングすることによって達成することができる。さらに大きな遺伝子を作製するために、合成遺伝子(二本鎖)がモジュール形式で、長さが20〜100ヌクレオチドの一本鎖断片から組み立てられる。ポリヌクレオチド合成に関する総説については、例えば、Glick and Pasternak,「Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA」, ASM Press, 1994; Itakura, K., et al., Annu. Rev, Biochem. 53:323, 1984;およびClimie, S., et al., Proc. Nal'l Acad. Sci. USA 87:633, 1990を参照されたい。
低分子阻害因子
一部の態様において、MASP-2阻害物質は、低分子量を有する天然物質および合成物質を含む低分子阻害因子、例えば、ペプチド、ペプチドミメティック、および非ペプチド阻害因子(オリゴヌクレオチドおよび有機化合物を含む)である。MASP-2低分子阻害因子は、抗MASP-2抗体の可変領域の分子構造に基づいて作製することができる。
低分子阻害因子はまた、コンピュータ計算薬物設計(computational drug design)を用いて、MASP-2結晶構造に基づいて設計および生成されてもよい(Kuntz I.D., et al., Science 257:1078, 1992)。ラットMASP-2の結晶構造は説明されている(Feinberg, H., et al., EMBO J. 22:2348-2359, 2003)。Kuntzらに記載の方法を用いて、MASP-2に結合すると予想される低分子構造のリストを出力するコンピュータプログラム、例えば、DOCKの入力として、MASP-2結晶構造座標が用いられる。このようなコンピュータプログラムの使用は当業者に周知である。例えば、プログラムDOCKを用いて、CambridgeCrystallographicデータベースに見られる化合物と酵素結合部位とのフィット(fit)を評価することによってHIV-1プロテアーゼインヒビターである独特の非ペプチドリガンドを同定するために、HIV-1プロテアーゼインヒビターの結晶構造が用いられた(Kuntz, I.D., et al., J. Mol. Biol. 161:269-288, 1982; DesJarlais, R.L., et al., PNAS 87:6644-6648, 1990)。
コンピュータ計算方法によって潜在的なMASP-2阻害因子として同定された低分子構造のリストは、MASP-2結合アッセイ法、例えば、実施例10に記載のMASP-2結合アッセイ法を用いてスクリーニングされる。次いで、MASP-2に結合すると見出された低分子は、MASP-2依存性補体活性化を阻害するかどうか判定するために、機能アッセイ法、例えば、実施例2に記載の機能アッセイ法においてアッセイされる。
MASP-2可溶性受容体
他の適切なMASP-2阻害物質は、当業者に公知の技法を用いて作製することができるMASP-2可溶性受容体を含むと考えられる。
MASP-2の発現阻害因子
本発明のこの局面の別の態様において、MASP-2阻害物質は、MASP-2依存性補体活性化を阻害することができるMASP-2発現阻害因子である。本発明のこの局面の実施において、代表的なMASP-2発現阻害因子には、MASP-2アンチセンス核酸分子(例えば、アンチセンスmRNA、アンチセンスDNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド)、MASP-2リボザイム、およびMASP-2 RNAi分子が含まれる。
アンチセンスRNA分子およびDNA分子は、MASP-2 mRNAにハイブリダイズし、MASP-2タンパク質の翻訳を阻止することによってMASP-2 mRNAの翻訳を直接遮断するように働く。アンチセンス核酸分子はMASP-2の発現を妨害することができるという条件で、多数の異なるやり方で構築されてもよい。例えば、アンチセンス核酸分子は、MASP-2 cDNA(SEQ ID NO:4)のコード領域(またはその一部)の相補鎖を転写できるように、正常な転写方向に対して、MASP-2 cDNA(SEQ ID NO:4)のコード領域(またはその一部)を逆にすることによって構築することができる。
アンチセンス核酸分子は、通常、1つの標的遺伝子または複数の標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一である。しかしながら、発現を阻害するために核酸は完全に同一である必要はない。一般的に、高い相同性を用いて、短いアンチセンス核酸分子の使用を補うことができる。最小パーセント同一性は典型的には約65％超であるが、さらに高いパーセント同一性によって、内因性配列の発現がより効果的に抑制される場合がある。約80％超のかなり高いパーセント同一性が典型的に好ましいが、約95％〜完全同一性が典型的に最も好ましい。
アンチセンス核酸分子は、標的遺伝子と同じイントロンパターンまたはエキソンパターンを有する必要はない。標的遺伝子の非コードセグメントが、標的遺伝子発現のアンチセンス抑制を達成する点でコードセグメントと等しく有効な場合がある。少なくとも約8個かそれくらいのヌクレオチドのDNA配列がアンチセンス核酸分子として用いられ得るが、さらに長い配列が好ましい。本発明において、有用なMASP-2阻害物質の代表例は、SEQ ID NO:4に示された核酸配列からなるMASP-2 cDNAの相補鎖と少なくとも90パーセント同一のアンチセンスMASP-2核酸分子である。SEQ ID NO:4に示された核酸配列は、SEQ ID NO:5に示されたアミノ酸配列からなるMASP-2タンパク質をコードする。
MASP-2 mRNAに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的化は、MASP-2タンパク質合成のレベルを低下させるのに用いられ得る別の機構である。例えば、ポリガラクツロナーゼおよびムスカリン2型アセチルコリン受容体の合成は、それぞれのmRNA配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される(Chengに対する米国特許第5,739,119号、およびShewmakerに対する米国特許第5,759,829号)。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多罪耐性遺伝子(MDG1)、ICAM-1、E-セレクチン、STK-1、線条体GABAA受容体、およびヒトEGFを用いて証明されている(例えば、Baracchiniに対する米国特許第5,801,154号; Bakerに対する米国特許第5,789,573号; Considineに対する米国特許第5,718,709号;およびReubensteinに対する米国特許第5,610,288号を参照されたい)。
どのオリゴヌクレオチドが本発明において有用であるか当業者が判断することができるシステムが述べられている。このシステムは、転写物内の配列の到達性の指標としてRNAseH切断を用いて標的mRNA内の適切な部位をプローブすることを伴う。Scherr, M., et al., Nucleic Acids Res. 25:5079-5085, 1998; Lloyd, et al., Nucleic Acids Res. 29:3665-3673, 2001。RNAse Hに対して脆弱な部位を作製するために、MASP-2転写物のある特定の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物が、MASP-2を発現する細胞抽出物、例えば、肝細胞に添加され、ハイブリダイズされる。この方法は、宿主細胞内の標的mRNAとの特異的結合を減少させるかまたは防止する二量体、ヘアピン、または他の二次構造を形成する相対的な能力に基づいて、アンチセンス組成物の最適配列選択を予測することができるコンピュータ支援配列選択と組み合わせることができる。これらの二次構造分析および標的部位選択の検討は、OLIGOプライマー分析ソフトウェア(Rychlik, I., 1997)およびBLASTN 2.0.5アルゴリズムソフトウェア(Altschul, S.F., et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997)を用いて行うことができる。標的配列に対するアンチセンス化合物は好ましくは長さが約8〜約50のヌクレオチドを含む。約9〜約35などのヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に好ましい。本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに基づく本発明の方法の実施のために、9〜35ヌクレオチド(すなわち、長さが9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35塩基ほど)の範囲内の全てのオリゴヌクレオチド組成物が非常に好ましいことを意図する。MASP-2 mRNAの非常に好ましい標的領域は、AUG翻訳開始コドンにあるかまたはAUG翻訳開始コドンの近くにある標的領域、およびmRNAの5'領域に実質的に相補的なこれらの配列、例えば、MASP-2遺伝子ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:4)の-10〜+10領域である。例示的なMASP-2発現阻害因子を表4に示した。
（表４）MASP-2の例示的な発現阻害因子
Figure 0006893554
前述のように、本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸(RNA)もしくはデオキシリボ核酸(DNA)またはその模倣物のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語はまた、天然ヌクレオチド、糖、および共有結合のヌクレオシド間(バックボーン)結合からなるオリゴヌクレオ塩基、ならびに非天然の改変を有するオリゴヌクレオチドをカバーする。これらの改変があると、天然オリゴヌクレオチドでは提供されない、ある特定の望ましい特性、例えば、低い毒性、ヌクレアーゼ分解に対する高い安定性、および多量の細胞取り込みを導入することが可能になる。例示的な態様において、本発明のアンチセンス化合物は、リン酸置換基がホスホロチオエートによって置換されている、アンチセンスオリゴヌクレオチドの寿命を延ばすホスホジエステルバックボーン改変だけ天然DNAと異なる。同様に、オリゴヌクレオチドの一端または両端は、核酸鎖内の隣接する塩基対の間にインターカレートする1種類または複数種のアクリジン誘導体で置換されてもよい。
アンチセンスに代わる別のものは「RNA干渉」(RNAi)の使用である。二本鎖RNA(dsRNA)はインビボで哺乳動物において遺伝子サイレンシングを誘発することができる。RNAiおよびコサプレッションの天然機能は、レトロトランスポゾンなどの可動遺伝要素、および活性化した場合に宿主細胞内で異常なRNAまたはdsRNAを産生するウイルスによる侵入からのゲノムの保護であるように思われる(例えば、Jensen, J., et al., Nat. Genet. 27:209-12, 1999を参照されたい)。二本鎖RNA分子は、それぞれの長さが約19〜25(例えば、19〜23ヌクレオチド)である、二本鎖RNA分子を形成することができる2本のRNA鎖を合成することによって調製することができる。例えば、本発明の方法において有用なdsRNA分子は、表4に列挙された配列およびその相補鎖に対応するRNAを含んでもよい。好ましくは、少なくとも1本のRNA鎖は1〜5ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する。合成されたRNA鎖は、二本鎖分子を形成する条件下で組み合わされる。このRNA配列は、25ヌクレオチドまたはそれ未満の全長でSEQ ID NO:4の少なくとも8個のヌクレオチド部分を含んでもよい。ある特定の標的に対するsiRNA配列の設計は当技術分野における通常の技術の範囲内である。siRNA配列を設計し、少なくとも70％の発現ノックダウンを保証する商業サービスが利用可能である(Qiagen, Valencia, Calif)。
dsRNAは薬学的組成物として投与され、核酸が望ましい標的細胞に導入される公知の方法によって実施することができる。一般的に用いられる遺伝子導入法には、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびウイルス法が含まれる。このような方法は、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1993に開示される。
MASP-2の量および/または生物学的活性を減少させるために、リボザイム、例えば、MASP-2 mRNAを標的とするリボザイムも利用することができる。リボザイムは、リボザイム配列に完全または部分的に相同な配列を有する核酸分子を切断することができる触媒RNA分子である。標的RNAと特異的に対になり、特定の位置のホスホジエステルバックボーンを切断し、それによって、標的RNAを機能的に不活化するRNAリボザイムをコードするリボザイムトランスジーンを設計することができる。この切断を実施する際に、リボザイムそのものは変化せず、従って、再利用し、他の分子を切断することができる。アンチセンスRNAの中にリボザイム配列を含めると、RNA切断活性がアンチセンスRNAに付与され、それによって、アンチセンス構築物の活性が増大する。
本発明の実施において有用なリボザイムは、典型的には、標的MASP-2 mRNAの少なくとも一部とヌクレオチド配列において相補的な、少なくとも約9個のヌクレオチドのハイブリダイズ領域、および標的MASP-2 mRNAを切断するように適合された触媒領域を含む(一般的に、EPA No.0321201; WO88/04300; Haseloff, J., et al., Nature 534:585-591, 1988; Fedor, M.J., et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 87:1668-1672, 1990; Cech, T.R., et al., Ann. Rev, Biochem. 55:599-629, 1986を参照されたい)。
リボザイムは、リボザイム配列を組み込んだRNAオリゴヌクレオチドの形で細胞に直接、標的化されてもよく、望ましいリボザイムRNAをコードする発現ベクターとして細胞に導入されてもよい。リボザイムは、アンチセンスポリヌクレオチドについて述べられたやり方とほとんど同じやり方で使用および適用することができる。
本発明の方法において有用なアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイム、ならびにRNAi分子は、DNA分子およびRNA分子を合成するための当技術分野において公知の任意の方法によって調製することができる。これらには、当技術分野において周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学合成するための技法、例えば、固相ホスホルアミダイト化学合成が含まれる。または、RNA分子は、アンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロ転写およびインビボ転写によって作製されてもよい。このようなDNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多種多様なベクターに組み込まれてもよい。または、使用されるプロモーターに応じて構成的または誘導的にアンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築物を細胞株に安定して導入することができる。
安定性を増大させかつ半減期を延長する手段として、DNA分子の様々な周知の改変を導入することができる。有用な改変には、分子の5'末端および/もしくは3'末端へのリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドバックボーン内のホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートもしくは2'O-メチルの使用が含まれるが、これに限定されない。
V.薬学的組成物および送達方法
投薬
別の局面において、本発明は、治療的有効量のMASP-2阻害物質および薬学的に許容される担体を含む組成物を対象に投与することを含む、本明細書において開示された疾患または状態に罹患している対象におけるMASP-2依存性補体活性化の副作用を阻害するための組成物を提供する。MASP-2依存性補体活性化に関連した状態を治療または寛解させるために、MASP-2阻害物質を、治療上有効な用量で、それを必要とする対象に投与することができる。治療上有効な用量は、疾患または状態に関連した症状を寛解させるのに十分なMASP-2阻害物質の量を指す。
MASP-2阻害物質の毒性および治療有効性は、実験動物モデル、例えば、実施例1に記載のヒトMASP-2トランスジーンを発現するマウスMASP-2-/-マウスモデルを用いた標準的な薬学的手順によって求めることができる。このような動物モデルを用いて、NOAEL(無毒性量)およびMED(最小有効量)を標準的な方法を用いて求めることができる。NOAEL効果とMED効果との用量比が治癒比であり、比NOAEL/MEDとして表される。大きな治癒比または指数を示すMASP-2阻害物質が最も好ましい。細胞培養アッセイ法および動物研究から得られたデータを、ヒトでの使用のために、ある範囲の投与量の処方において使用することができる。MASP-2阻害物質の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどない、または毒性がない、MEDを含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。
一部の態様において、線維症および/もしくは炎症によって引き起こされるかもしくは悪化する疾患もしくは障害に罹患しているか、またはこれを発症するリスクがある哺乳動物対象において、線維症を治療、阻害、軽減、または予防するためのMASP-2阻害物質の治療効力は、以下:腎臓組織における炎症および瘢痕の1つまたは複数のマーカー(例えば、TGFβ-1、CTFF、IL-6、アポトーシス、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、EMT、浸潤性マクロファージ)の低下;尿および血漿への炎症可溶性マーカーおよび線維性腎臓病可溶性マーカーの放出の低下(例えば、腎臓排泄機能の測定による)の1つまたは複数によって確かめられる。
任意の化合物製剤について、動物モデルを用いて、治療上有効な用量を評価することができる。例えば、MEDを含む循環血漿中濃度範囲に達する用量を動物モデルにおいて処方することができる。血漿中のMASP-2阻害物質の定量レベルはまた、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
毒性研究に加えて、有効投与量はまた、生きている対象に存在するMASP-2タンパク質の量およびMASP-2阻害物質の結合親和性に基づいて評価されてもよい。正常ヒト対象におけるMASP-2レベルは500ng/mlの範囲内の低レベルで血清中に存在し、ある特定の対象におけるMASP-2レベルは、Moller-Kristensen M., et al., J. Immunol Methods 282:159-167, 2003に記載の定量MASP-2アッセイ法を用いて決定することができる。
一般的に、MASP-2阻害物質を含む、投与される組成物の投与量は、対象の年齢、体重、身長、性別、全身状態(general medical condition)、および既往歴などの要因に応じて変化する。例示として、抗MASP-2抗体などのMASP-2阻害物質は、約0.010〜10.0mg/kg対象体重、好ましくは0.010〜1.0mg/kg対象体重、より好ましくは0.010〜0.1mg/kg対象体重の投与量範囲内で投与することができる。一部の態様において、組成物は、抗MASP-2抗体およびMASP-2阻害ペプチドの組み合わせを含む。
ある特定の対象における本発明のMASP-2阻害組成物および方法の治療有効性、ならびに適切な投与量は、当業者に周知の補体アッセイ法に従って決定することができる。補体は非常に多くの特異的産物を生成する。過去十年間に、小さな活性化断片C3a、C4a、およびC5a、ならびに大きな活性化断片iC3b、C4d、Bb、およびsC5b-9を含む、これらの活性化産物の大部分について高感度かつ特異的なッセイが開発され、市販されている。これらのアッセイ法の大部分は、断片の上に露出しているが、新抗原(ネオ抗原)が形成される天然タンパク質の上には露出していない新抗原(ネオ抗原)と反応するモノクローナル抗体を利用する。このために、これらのアッセイ法は非常に簡単かつ特異的である。大部分はELISA技術に頼っているが、C3aおよびC5aの場合は、ラジオイムノアッセイ法が依然として用いられる場合もある。これらの後者のアッセイ法は、処理されていない断片、および循環中に見られる主な形態である、これらの「desArg」断片を両方とも測定する。処理されていない断片およびC5adesArgは細胞表面受容体と結合することによって迅速に切断され、従って、非常に低い濃度で存在する。これに対して、C3adesArgは細胞に結合せず、血漿中に蓄積する。C3a測定は、高感度の経路依存的な補体活性化指標を提供する。第二経路活性化はBb断片を測定することによって評価することができる。膜侵襲経路活性化の液相産物であるsC5b-9の検出は、補体が最後まで活性化されているという証拠を提供する。レクチン経路および古典経路はいずれも同じ活性化産物であるC4aおよびC4dを生成するので、これらの2つの断片を測定しても、これらの2つの経路のどちらが活性化産物を生成したかという情報は得られない。
MASP-2依存性補体活性化の阻害は、本発明の方法によるMASP-2阻害物質の投与の結果として生じる補体系成分の以下の変化のうちの少なくとも1つを特徴とする:MASP-2依存性補体活性化系の産物C4b、C3a、C5a、および/もしくはC5b-9(MAC)の生成または産生の阻害(例えば、実施例2に記載のように測定される)、C4切断およびC4b沈着の減少(例えば、実施例10に記載のように測定される)、またはC3切断およびC3b沈着の減少(例えば、実施例10に記載のように測定される)。
さらなる物質
ある特定の態様において、線維症および/もしくは炎症を予防する、治療する、逆転させる、ならびに/または阻害する方法は、線維症および/もしくは炎症を阻害するために適した1種もしくは複数種の他の薬物、生物製剤、または治療介入と一緒に治療レジメンの一部としてMASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)を投与する工程を含む。ある特定の態様において、さらなる薬物、生物製剤、または治療介入は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に関連する特定の症状に適している。例として、MASP-2阻害抗体は、1種類または複数種の免疫抑制剤、例えば、メトトレキセート、シクロホスファミド、アザチオプリン、およびミコフェノール酸モフェチルと一緒に治療レジメンの一部として投与されてもよい。さらなる例として、MASP-2阻害抗体は、血流を増やすように設計された1種類または複数種の物質(例えば、ニフェジピン、アムロジピン、ジルチアゼム、フェロジピン、またはニカルジピン)と一緒に治療レジメンの一部として投与されてもよい。さらなる例として、MASP-2阻害抗体は、線維症を減少させることが意図される1種類または複数種の物質、例えば、d-ペニシラミン、コルヒチン、PUVA、リラキシン、シクロスポリン、TGFβ遮断薬、および/またはp38 MAPK遮断薬と一緒に治療レジメンの一部として投与されてもよい。さらなる例として、MASP-2阻害抗体は、ステロイドまたは気管支拡張剤と一緒に治療レジメンの一部として投与されてもよい。
MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)を含む組成物および方法は、任意で、MASP-2阻害物質の活性を増強し得る、または関連する治療機能を相加的もしくは相乗的に提供し得る1種類または複数種のさらなる治療剤を含んでもよい。例えば、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している対象を治療する工程の状況において、1種類もしくは複数種のMASP-2阻害物質は、1種もしくは複数種のさらなる抗線維形成剤ならびに/または1種もしくは複数種の抗炎症剤および/もしくは免疫抑制剤と組み合わせて投与されてもよい(同時投与を含む)。
MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)は、他の治療剤、例えば、一般的な免疫抑制薬物、例えば、コルチコステロイド、免疫抑制剤もしくは細胞傷害剤、および/または抗線維形成剤と併用することができる。
薬学的担体および送達ビヒクル
一般的に、他の任意の選択された治療剤と組み合わされた本発明のMASP-2阻害物質組成物は、適宜、薬学的に許容される担体中に含まれる。担体は、無毒で、生体適合性があり、MASP-2阻害物質(およびそれと組み合わされた他の任意の治療剤)の生物学的活性に悪影響を及ぼさないように選択される。ペプチド用の例示的な薬学的に許容される担体は、Yamadaに対する米国特許第5,211,657号に記載されている。本発明において有用な抗MASP-2抗体および阻害ペプチドは、経口投与、非経口投与、または外科的投与を可能にする、固体、半固体、ゲル、液体、または気体の形をした調製物、例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、デポジトリ(depository)、吸入剤、および注射剤に処方されてもよい。本発明はまた、医療装置などをコーティングすることによる組成物の局所投与も意図する。
注射、注入、または灌注、および局部送達を介した非経口送達に適した担体には、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、通常のリンガー液もしくは乳酸加リンガー液、デキストロース液、ハンクス液、またはプロパンジオールが含まれる。さらに、溶媒または分散媒として滅菌不揮発性油が使用されることもある。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の生体適合性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が注射液の調製において有用である。担体および物質は、液体、懸濁液、重合可能もしくは重合不可能なゲル、ペースト、または軟膏として配合されてもよい。
担体はまた、物質の送達を持続(すなわち、延長、遅延、もしくは調節)するために、または治療剤の送達、取り込み、安定性、もしくは薬物動態を増強するために送達ビヒクルを含んでもよい。このような送達ビヒクルは、非限定的な例として、タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成有機化合物、無機化合物、ポリマーまたはコポリマーのヒドロゲル、およびポリマーミセルからなる、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、またはナノ粒子を含んでもよい。適切なヒドロゲルおよびミセル送達システムには、WO2004/009664A2に開示されるPEO:PHB:PEOコポリマーおよびコポリマー/シクロデキストリン複合体、ならびに米国特許出願公開第2002/0019369A1号に開示されるPEOおよびPEO/シクロデキストリン複合体が含まれる。このようなヒドロゲルは目的の作用部位に局所に注射されてもよく、持効性デポーを形成するように皮下または筋肉内に注射されてもよい。
関節内送達の場合、MASP-2阻害物質は、注射可能な前記の液体担体もしくはゲル担体、注射可能な前記の持効性送達ビヒクル、またはヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体の中に入れて運ばれてもよい。
非ペプチド物質の経口投与の場合、MASP-2阻害物質は、スクロース、コーンスターチ、またはセルロースなどの不活性な増量剤または希釈剤の中に入れて運ばれてもよい。
局部投与の場合、MASP-2阻害物質は、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、点眼薬、坐剤、スプレー、液体もしくは粉末の中に入れて運ばれてもよく、ゲルまたはマイクロカプセル送達システムの中に入れて経皮パッチを介して運ばれてもよい。
エアゾール剤、定量吸入器、ドライパウダー吸入器、およびネブライザーを含む様々な鼻送達システムおよび肺送達システムが開発中であり、それぞれ、エアゾール剤、吸入剤、または噴霧送達ビヒクルの中に入れて本発明の送達に適切に合わることができる。
くも膜下腔内(IT)送達または脳室内(ICV)送達の場合、適切に滅菌した送達システム(例えば、液体;ゲル、懸濁液など)を用いて、本発明の組成物を投与することができる。
本発明の組成物はまた、生体適合性の賦形剤、例えば、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、希釈剤、緩衝液、浸透促進剤、乳化剤、結合剤、増粘剤、調味料(経口投与の場合)を含んでもよい。
抗体およびペプチドのための薬学的担体
抗MASP-2抗体および阻害ペプチドに関してより具体的には、例示的な製剤を、水、油、食塩水、グリセロール、またはエタノールなどの滅菌液体でもよい薬学的担体と共に、生理学的に許容される希釈剤に溶解した化合物の注射投与量の溶液または懸濁液として非経口投与することができる。さらに、抗MASP-2抗体および阻害ペプチドを含む組成物中には、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、pH緩衝物質などが存在してもよい。薬学的組成物のさらなる成分には、石油(例えば、動物由来、野菜由来、または合成由来の石油)、例えば、ダイズ油および鉱油が含まれる。一般的に、グリコール、例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが注射液に好ましい液体担体である。
抗MASP-2抗体および阻害ペプチドはまた、活性物質を徐放または拍動放出(pulsatile release)するように処方することができるデポー注射剤または移植片調製物の形で投与することができる。
発現阻害因子のための薬学的に許容される担体
本発明の方法において有用な発現阻害因子に関してより具体的には、前記の発現阻害因子および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物が提供される。該組成物はコロイド分散系をさらに含んでもよい。
発現阻害因子を含む薬学的組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤が含まれ得るが、これに限定されない。これらの組成物は、前もって形成された液体、自己乳化固体、および自己乳化半固体を含むが、これに限定されない様々な成分から生成することができる。このような組成物の調製は、典型的には、発現阻害因子を、以下のうちの1つまたは複数と組み合わせることを含む:緩衝液、酸化防止剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロース、またはデキストリンを含む炭水化物、EDTAなどのキレート剤、グルタチオン、ならびに他の安定剤および賦形剤。適切な希釈剤の例は、中性緩衝食塩水または非特異的血清アルブミンと混合された食塩水である。
一部の態様において、前記組成物は、典型的には、ある液体を液滴の形で別の液体の中に分散させた不均一系であるエマルジョンとして調製および処方することができる(Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Vol.1, Rieger and Banker (eds.), Marcek Dekker, Inc., N.Y., 1988を参照されたい)。エマルジョン製剤において用いられる天然乳化剤の例には、アラビアゴム、蜜ろう、ラノリン、レシチン、およびホスファチドが含まれる。
一態様において、核酸を含む組成物をマイクロエマルジョンとして処方することができる。本明細書で使用するマイクロエマルジョンは、単一の、光学的に等方な、かつ熱力学的に安定した液体溶液である、水、油、および両親媒性物質の系を指す(Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Vol.1を参照されたい)。本発明の方法はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドを望ましい部位に導入および送達するためにリポソームを使用することがある。
局部投与用の発現阻害因子の薬学的組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、点眼薬、坐剤、スプレー、液体、および粉末を含んでもよい。従来の薬学的担体、ならびに水性、粉末、または油性の主剤および増粘剤などが用いられてもよい。
投与の方法
MASP-2阻害物質を含む薬学的組成物は、局所投与方法または全身投与方法が、治療されている状態に最も適しているかどうかに応じて多くのやり方で投与することができる。さらに、本発明の組成物を移植可能な医療装置の表面に、または移植可能な医療装置にコーティングするかまたは組み込むことによって、本発明の組成物を送達することができる。
全身送達
本明細書で使用する「全身送達」および「全身投与」という用語は、筋肉内(IM)投与経路、皮下投与経路、静脈内(IV)投与経路、動脈内投与経路、吸入投与経路、舌下投与経路、頬投与経路、局部投与経路、経皮投与経路、鼻投与経路、直腸投与経路、腟投与経路、および送達物質を1つまたは複数の目的の治療作用部位に効果的に分散させる他の投与経路を含む、経口経路および非経口経路を含むが、これに限定されないことが意図される。本組成物の好ましい全身送達経路には、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、および吸入経路が含まれる。本発明の特定の組成物において用いられる選択された物質の正確な全身投与経路は、部分的には、ある特定の投与経路に関連した代謝変換経路に対する物質感受性を説明するように決定されることが理解されると考えられる。例えば、ペプチド物質は、最も適切には、経口以外の経路によって投与することができる。
MASP-2阻害抗体およびポリペプチドを、それを必要とする対象に任意の適切な手段によって送達することができる。MASP-2抗体およびポリペプチドの送達方法は、経口投与経路、肺投与経路、非経口投与経路(例えば、筋肉内投与経路、腹腔内投与経路、静脈内(IV)投与経路、もしくは皮下注射投与経路)、吸入投与経路(例えば、細粉製剤を介した吸入投与経路)、経皮投与経路、鼻投与経路、腟投与経路、直腸投与経路、または舌下投与経路を含み、それぞれの投与経路に適した剤形で処方することができる。
代表的な例として、ポリペプチドを吸収することができる身体の膜、例えば、鼻、胃腸、および直腸の膜に適用することによって、MASP-2阻害抗体およびペプチドを生体内に導入することができる。ポリペプチドは典型的には浸透促進剤と共に吸収性の膜に適用される(例えば、Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5:69, 1988; Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13:213, 1990; Lee, V.H.L,, Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York(1991); DeBoer, A.G., et al., J. Controlled Release 13:241, 1990を参照されたい)。例えば、STDHFは、胆汁塩と構造が類似し、鼻送達用の浸透促進剤として用いられてきたステロイド性界面活性剤であるフシジン酸合成誘導体である(Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dec. 1990)。
酵素分解からポリペプチドを保護するために、MASP-2阻害抗体およびポリペプチドを脂質などの別の分子と結合させて導入することができる。例えば、ある特定のタンパク質を体内の酵素加水分解から保護し、従って、半減期を延長するために、ポリマー、特にポリエチレングリコール(PEG)の共有結合が用いられてきた(Fuertges, P., et al., J. Controlled Release 11:139, 1990)。タンパク質送達のための多くのポリマー系が報告されている(Bae, Y.H., et al., J. Controlled Release 9:271, 1989; Hori, R., et al., Pharm. Res. 6:813, 1989:Yamakawa, L, et al., J. Pharm. Sci. 79:505, 1990; Yoshihiro, I., et al., Controlled Release 10:195, 1989; Asano, M., et al., J. Controlled Release 9:111, 1989; Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9:195, 1989; Makino, K., J. Controlled Release 12:235, 1990; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:117, 1989; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:219, 1989)。
最近、血清安定性および循環半減期が改善したリポソームが開発された(例えば、Webbに対する米国特許第5,741,516号を参照されたい)。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製の様々な方法が詳しく調べられている(例えば、Szokaに対する米国特許第5,567,434号;Yagiに対する米国特許第5,552,157号;Nakamoriに対する米国特許第5,565,213号;Shinkarenkoに対する米国特許第5,738,868号;およびGaoに対する米国特許第5,795,587号を参照されたい)。
経皮適用の場合、MASP-2阻害抗体およびポリペプチドは担体および/またはアジュバントなどの他の適切な成分と組み合わされてもよい。このような他の成分が、目的の投与のために薬学的に許容される必要があり、かつ組成物の活性成分の活性を分解することができないことを除けば、該成分がどういったものかには制限はない。適切なビヒクルの例には、精製コラーゲンを含む、または含まない、軟膏、クリーム、ゲル、または懸濁液が含まれる。MASP-2阻害抗体およびポリペプチドはまた、好ましくは、液体または半液体の形で、経皮パッチ、硬膏、および包帯に含浸されてもよい。
本発明の組成物は、望ましいレベルの治療効果を維持するよう決定された間隔で定期的に全身投与されてもよい。例えば、組成物は、例えば、皮下注射によって2〜4週間ごとにまたはそれより少ない頻度で投与されてもよい。投与計画は、物質の組み合わせの作用に影響を及ぼし得る様々な要因を考慮して医師によって決定されると考えられる。これらの要因は、治療されている状態の進行の程度、患者の年齢、性別、および体重、ならびに他の臨床要因を含むと考えられる。それぞれの個々の物質の投与量は、組成物に含まれるMASP-2阻害物質、ならびに任意の薬物送達ビヒクル(例えば、持効性送達ビヒクル)の存在および内容の関数として変化すると考えられる。さらに、送達物質の投与頻度および薬物動態学的挙動の変動の原因となるように投与量を調節することができる。
局所送達
本明細書で使用する「局所」という用語は、目的の限局作用の部位の中に、または目的の限局作用の部位の周囲に薬物を適用することを包含し、例えば、皮膚または他の患部組織への局部送達、眼送達、くも膜下腔内(IT)、脳室内(ICV)、関節内、洞内、頭蓋内、もしくは小胞内の投与、留置、または灌注を含んでもよい。局所投与は、低用量の投与が全身副作用を回避するために、ならびに局所送達部位に活性物質を送達および濃縮するタイミングをより正確に制御するために好ましい場合がある。局所投与は、代謝、血流などの患者間のばらつきに関係なく標的部位において既知濃度を供給する。改善された投与量制御は直接的な送達方法によっても提供される。
MASP-2阻害物質の局所送達は、線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害を治療するための外科的方法の状況において、例えば、外科手術などの処置中に行うことができる。
治療レジメン
予防用途では、MASP-2阻害物質(例えば、MASP-2阻害抗体)を含む薬学的組成物は、線維症および/もしくは炎症によって引き起こされるかもしくは悪化する疾患もしくは障害にかかりやすい対象、またはそうでなければ、これを発症するリスクがある対象に、線維症および/または炎症を阻害し、それによって、状態の症状を発症するリスクを排除または低減するために十分な量で投与される。一部の態様において、薬学的組成物は、線維症および/もしくは炎症によって引き起こされるかもしくは悪化する疾患もしくは障害に罹患していると疑われる対象、またはこれに既に罹患している対象に、状態の症状を軽減する、または少なくとも部分的に低減するために十分な治療的有効量で投与される。予防レジメンおよび治療レジメンの両方において、MASP-2阻害物質を含む組成物は、対象において十分な治療アウトカムが得られるまで、いくつかの投与量に分けて投与されてもよい。本発明のMASP-2阻害性組成物の適用は、線維症および/もしくは炎症に関連する急性状態の処置の場合は組成物の単回投与によって、または限定された一連の投与によって行われてもよい。または、組成物は、線維症および/または炎症に関連する慢性状態の処置の場合は長期間にわたって定期的な間隔で投与されてもよい。
予防レジメンおよび治療レジメンの両方において、MASP-2阻害物質を含む組成物は、対象において十分な治療アウトカムが得られるまで、いくつかの投与量に分けて投与されてもよい。本発明の一態様において、MASP-2阻害物質はMASP-2抗体を含み、MASP-2抗体は、適切には、0.1mg〜10,000mg、より適切には1.0mg〜5,000mg、より適切には10.0mg〜2,000mg、より適切には10.0mg〜1,000mg、さらにより適切には50.0mg〜500mgの投与量で成人患者(例えば、70kgの平均成人体重)に投与されてもよい。小児患者の場合、投与量は患者の体重に比例して調整することができる。本発明のMASP-2阻害性組成物の適用は、線維症および/もしくは炎症によって引き起こされるかもしくは悪化する疾患もしくは障害に罹患しているか、またはこれを発症するリスクがある対象の処置の場合は、組成物の単回投与によって、または限定された一連の投与によって行われてもよい。または、組成物は、線維症および/もしくは炎症によって引き起こされるかもしくは悪化する疾患もしくは障害に罹患しているか、またはこれを発症するリスクがある対象の処置の場合は、長期間にわたって、定期的な間隔で、例えば、毎日、週2回、毎週、隔週、毎月、または隔月、投与されてもよい。
予防レジメンおよび治療レジメンの両方において、MASP-2阻害物質を含む組成物は、対象において十分な治療アウトカムが得られるまで、いくつかの投与量に分けて投与されてもよい。
一部の態様では、例えば、血清クレアチニンレベル、血清クレアチニンクリアランス、血中尿素窒素レベル、尿中タンパク質を測定することによって、および/または腎臓の疾患もしくは損傷に関連する1種もしくは複数種のバイオマーカーを測定することによって評価された時に、対象に腎機能障害の1つまたは複数の症状があることを確かめることによって、対象には、線維症または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害を発症するリスクがあると同定される。
腎機能を評価するための方法は当技術分野において周知であり、全身血圧および腎糸球体毛細血管圧、タンパク尿(例えば、アルブミン尿)、顕微鏡的血尿および肉眼的血尿、血清クレアチニンレベル(例えば、ヒトにおいて腎機能を評価する式の1つは、正常腎機能の50パーセントまでは2.0mg/dl、25パーセントまでは4.0mg/dlのクレアチニンレベルに等しい)、糸球体濾過量(例えば、クレアチニンクリアランス速度)の低下、ならびに尿細管損傷の程度の測定を含むが、これに限定されない。例えば、腎機能の評価には、生物学的パラメータおよび/または生理学的パラメータ、例えば、血清クレアチニンレベル、クレアチニンクリアランス速度、24時間の尿中タンパク質分泌、糸球体濾過量、尿中アルブミンクレアチニン比、アルブミン排泄速度、ならびに腎臓生検(例えば、コラーゲンおよび/またはフィブロネクチンの沈着を測定することによって腎臓線維症の程度を確かめる)を用いて少なくとも1つの腎機能を評価することが含まれてもよい。
VI.実施例
以下の実施例は、本発明の実施について意図された最良の形態の単なる例示であり、本発明を限定すると解釈してはならない。本明細書中の全ての文献引用が明確に参照により組み入れられる。
実施例1
本実施例は、MASP-2が欠損しているが(MASP-2-/-)MAp19は十分な(MAp19+/+)マウス系統の生成について述べる。
材料および方法:図3に示したように、セリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを含む、マウスMASP-2のC末端をコードする3つのエキソンを破壊するために、ターゲティングベクターpKO-NTKV1901を設計した。pKO-NTKV1901を用いて、マウスES細胞株E14.1a(SV129Ola)をトランスフェクトした。ネオマイシン耐性およびチミジンキナーゼ感受性のクローンを選択した。600個のESクローンをスクリーニングした。このうち4個の異なるクローンが同定され、図3に示したように、サザンブロットによって、予想された選択的標的化および組換え事象を含むことが立証された。胚移植によって、これら4個の陽性クローンからキメラを生成した。次いで、キメラを遺伝的バックグラウンドC57/BL6において戻し交配して、トランスジェニック雄を作製した。トランスジェニック雄を雌と交配させてF1を得た。子孫の50％は、破壊されたMASP-2遺伝子についてヘテロ接合性を示した。ヘテロマウスを交雑させて、ホモMASP-2欠損子孫、ヘテロマウス、および野生型マウスをそれぞれ1:2:1の比で得た。
結果および表現型:結果として生じたホモMASP-2-/-欠損マウスは生存可能であり、生殖能力があることが見出され、正しい標的化事象を確認するためにサザンブロットによって、MASP-2 mRNAの非存在を確認するためにノザンロットによって、MASP-2タンパク質の非存在を確認するためにウエスタンブロットによって、MASP-2欠損であることが立証された(データ示さず)。LightCycler装置による時間分解型RT-PCRを用いて、MAp19 mRNAの存在およびMASP-2 mRNAの非存在がさらに確認された。MASP-2-/-マウスは、予想通り、MAp19、MASP-1、およびMASP-3のmRNAおよびタンパク質を発現し続ける(データ示さず)。MASP-2-/-マウスにおけるプロペルジン、B因子、D因子、C4、C2、およびC3のmRNAの存在および量をLightCycler分析によって評価し、野生型同腹仔対照のものと同一であることが見出された(データ示さず)。ホモMASP-2-/-マウスに由来する血漿は、実施例2にさらに記載のように、レクチン経路を介した補体活性化が完全に欠損している。
純粋なC57BL6バックグラウンドのMASP-2-/-系統の生成:MASP-2-/-マウスをC57BL6純系と9世代にわたって戻し交配した後に、MASP-2-/-系統を実験動物モデルとして使用した。
マウスMASP-2-/-, MAp19+/+であり、ヒトMASP-2トランスジーン(マウスMASP-2ノックアウトおよびヒトMASP-2ノックイン)を発現するトランスジェニックマウス系統も以下のように生成した。
材料および方法:図4に示したように、最初の3つのエキソン(エキソン1〜エキソン3)を含むヒトMASP2遺伝子のプロモーター領域の後に、次の8つのエキソンからなるコード配列に相当するcDNA配列を含み、それによって、その内因性プロモーターによって駆動される完全長MASP-2タンパク質をコードする「ミニhMASP-2」と呼ばれるヒトMASP-2をコードするミニ遺伝子(SEQ ID NO:49)を構築した。欠損マウスMASP2遺伝子を、遺伝子導入により発現されるヒトMASP-2で置換するために、ミニhMASP-2構築物をMASP-2-/-受精卵に注入した。
実施例2
本実施例はレクチン経路を介した補体活性化にはMASP-2が必要であることを証明する。
方法および材料:
レクチン経路特異的C4切断アッセイ法:C4切断アッセイ法は、Petersen, S.V., et al., J. Immunol Methods 257:107(2001)によって述べられており、L-フィコリンに結合する黄色ブドウ球菌由来リポテイコ酸(LTA)に起因するレクチン経路活性化を測定する。下記のようにプレートをLPSおよびマンナンまたはザイモサンでコーティングした後に、MASP-2-/-マウスに由来する血清を添加することによって、Petersen et al., (2001)に記載のアッセイ法がMBLを介したレクチン経路活性化を測定するように適合化された。このアッセイ法を、古典経路によるC4切断の可能性を取り除くようにも変更した。これは、レクチン経路認識成分とそのリガンドとの高親和性結合を可能にするが、内因性C4の活性化を阻止し、それによって、C1複合体を解離することによって古典経路の関与を排除する、1M NaClを含有する試料希釈緩衝液を使用することによって達成された。簡単に述べると、変更されたアッセイ法では、血清試料(高塩(1M NaCl)緩衝液で希釈した)をリガンドコーティングプレートに添加した後に、生理学的濃度の塩を含む緩衝液に溶解した一定量の精製C4を添加した。MASP-2を含有する結合した認識複合体はC4を切断し、その結果、C4bが沈着する。
アッセイ方法;
(1)Nunc Maxisorbマイクロタイタープレート(Maxisorb(登録商標), Nunc, カタログ番号442404, Fisher Scientific)を、コーティング緩衝液(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH9.6)で希釈した1μg/mlマンナン(M7504 Sigma)または他の任意のリガンド(例えば、以下の列挙したリガンド)でコーティングした。
以下の試薬をアッセイ法において使用した:
a.マンナン(100μlコーティング緩衝液中に1μg/ウェルのマンナン(M7504 Sigma));
b.ザイモサン(100μlコーティング緩衝液中に1μg/ウェルのザイモサン(Sigma));
c.LTA(100μlコーティング緩衝液中に1μg/ウェルまたは20μlメタノール中に2μg/ウェル);
d.コーティング緩衝液中に1μgのH-フィコリン特異的Mab 4H5;
e.エロコッカス・ビリダンス(Aerococcus viridans)に由来するPSA(100μlコーティング緩衝液中に2μg/ウェル);
f.コーティング緩衝液中に100μl/ウェルのホルマリン固定黄色ブドウ球菌DSM20233(OD550=0.5)。
(2)プレートを4℃で一晩インキュベートした。
(3)一晩のインキュベーション後、プレートを0.1％HSA-TBSブロッキング緩衝液(0.1％(w/v)HSAを含む10mM Tris-CL、140mM NaCl、1.5mM NaN3、pH7.4)とともに1〜3時間インキュベートし、次いで、プレートをTBS/tween/Ca2+(0.05％Tween20および5mM CaCl2、1mM MgCl2、pH7.4を含むTBS)で3回洗浄することによって、残存するタンパク質結合部位を飽和させた。
(4)試験しようとする血清試料をMBL結合緩衝液(1M NaCl)で希釈し、希釈試料をプレートに添加し、4℃で一晩インキュベートした。緩衝液だけが入っているウェルを陰性対照として使用した。
(5)4℃で一晩のインキュベーション後、プレートをTBS/tween/Ca2+で3回洗浄した。次いで、ヒトC4(100μl/ウェル。1μg/ml。BBS(4mMバルビタール、145mM NaCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、pH7.4)で希釈した)をプレートに添加し、37℃で90分間インキュベートした。プレートをTBS/tween/Ca2+で3回、再洗浄した。
(6)C4b沈着を、アルカリホスファターゼ結合ニワトリ抗ヒトC4c(TBS/tween/Ca2+で1:1000に希釈した)で検出し、アルカリホスファターゼ結合ニワトリ抗ヒトC4cをプレートに添加し、室温で90分間インキュベートした。次いで、プレートをTBS/tween/Ca2+で3回、再洗浄した。
(7)100μlのp-ニトロフェニルリン酸基質溶液を添加し、室温で20分間インキュベートし、マイクロタイタープレートリーダーにおいてOD405を読み取ることによって、アルカリホスファターゼを検出した。
結果:図5AおよびBは、MASP-2+/+(十字)、MASP-2+/-(黒丸)、およびMASP-2-/-(黒三角)の血清希釈液中のマンナン(図5A)およびザイモサン(図5B)におけるC4b沈着の量を示す。図5Cは、野生型血清に対して正規化されたC4b沈着量の測定に基づく、野生型マウス(n=5)と比較した、MASP-2-/+マウス(n=5)およびMASP-2-/-マウス(n=4)の、ザイモサン(白色の棒)またはマンナン(影付きの棒)でコーティングされたプレート上での相対的C4コンバターゼ活性を示す。エラーバーは標準偏差を示す。図5A〜Cに示したように、MASP-2-/-マウスに由来する血漿は、マンナンコーティングプレート上およびザイモサンコーティングプレート上でのレクチン経路を介した補体活性化が完全に欠損している。これらの結果から、MASP-2はレクチン経路のエフェクター成分であることがはっきりと証明される。
組換えMASP-2はMASP-2-/-マウスに由来する血清中でレクチン経路依存性C4活性化を再構成する
MASP-2の非存在がMASP-2-/-マウスにおけるレクチン経路依存性C4活性化消失の直接の原因であることを証明するために、血清試料への組換えMASP-2タンパク質の添加の効果を前記のC4切断アッセイ法において調べた。機能的に活性なマウスMASP-2組換えタンパク質および触媒不活性マウスMASP-2A(セリンプロテアーゼドメイン中の活性部位セリン残基がアラニン残基で置換された)組換えタンパク質を以下の実施例3に記載のように産生および精製した。4匹のMASP-2-/-マウスからプールされた血清を、漸増タンパク質濃度の組換えマウスMASP-2または不活性組換えマウスMASP-2Aとプレインキュベートし、C4コンバターゼ活性を前記のようにアッセイした。
結果:図6に示したように、機能的に活性なマウス組換えMASP-2タンパク質(白三角として示した)をMASP-2-/-マウスから得られた血清に添加すると、レクチン経路依存性C4活性化がタンパク質濃度依存的に回復したのに対して、触媒不活性マウスMASP-2Aタンパク質(星として示した)はC4活性化を回復しなかった。図6に示した結果は、プールされた野生型マウス血清を用いて観察されたC4活性化(点線として示した)に対して正規化されている。
実施例3
本実施例は、組換え完全長ヒトMASP-2、ラットおよびマウスのMASP-2、MASP-2に由来するポリペプチド、ならびに触媒不活化変異型MASP-2の組換え発現およびタンパク質産生について述べる。
完全長ヒトMASP-2、マウスMASP-2、およびラットMASP-2の発現:
ヒトMASP-2の完全長cDNA配列(SEQ ID NO:4)を、CMVエンハンサー/プロモーター領域の制御下で真核生物発現を駆動する哺乳動物発現ベクターpCI-Neo(Promega)にもサブクローニングした(Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Emymology, 185:537-66(1991)に記載)。完全長マウスcDNA(SEQ ID NO:50)およびラットMASP-2 cDNA(SEQ ID NO:53)をそれぞれpED発現ベクターにサブクローニングした。次いで、Maniatis et al., 1989に記載の標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション手順を用いて、MASP-2発現ベクターを、付着性のチャイニーズハムスター卵巣細胞株DXB1にトランスフェクトした。これらの構築物でトランスフェクトされた細胞は非常にゆっくりと増殖した。このことは、コードされたプロテアーゼが細胞傷害性であることを意味する。
別のアプローチでは、MASP-2の内因性プロモーターによって駆動されるヒトMASP-2 cDNAを含有するミニ遺伝子構築物(SEQ ID NO:49)をチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)に一過的にトランスフェクトした。ヒトMASP-2タンパク質を培養培地に分泌させ、下記のように単離した。
完全長触媒不活性MASP-2の発現:
原理:認識小成分MBLまたはフィコリン(L-フィコリン、H-フィコリン、もしくはM-フィコリンのいずれか)がそれぞれの炭水化物パターンに結合した後に、MASP-2は自己触媒切断によって活性化される。血清からのMASP-2の単離手順中に、または組換え発現後の精製中に、MASP-2を活性化する自己触媒切断が起こることが多い。抗原として使用するための、より安定したタンパク質調製物を得るために、ラットではプロテアーゼドメインの触媒三残基(catalytic triad)に存在するセリン残基をアラニン残基で(SEQ ID NO:55 Ser617からAla617)、またはマウスでは(SEQ ID NO:52 Ser617からAla617)で;ヒトでは(SEQ ID NO:6 Ser618からAla618)で置換することによって、MASP-2Aと呼ばれる触媒不活性型MASP-2を作製した。
触媒不活性なヒトMASP-2Aタンパク質およびマウスMASP-2Aタンパク質を生成するために、表5に示したオリゴヌクレオチドを用いて部位特異的変異誘発を行った。酵素的に活性なセリンをコードするヒトcDNAおよびマウスcDNAの領域にアニーリングするように表5のオリゴヌクレオチドを設計した。セリンコドンをアラニンコドンに変えるためにオリゴヌクレオチドはミスマッチを含有する。例えば、開始コドンから酵素的に活性なセリンまで、このセリンから停止コドンまでの領域を増幅して、Ser618からAla618への変異を含有する変異MASP-2Aからの完全オープンリーディングフレームを生成するために、PCRオリゴヌクレオチドSEQ ID NO:56〜59をヒトMASP-2 cDNA(SEQ ID NO:4)と組み合わせて使用した。アガロースゲル電気泳動およびバンド調製の後にPCR産物を精製し、標準的なテーリング手順を用いて単一アデノシン重複を作製した。次いで、アデノシン尾部のあるMASP-2AをpGEM-T easyベクターにクローニングし、形質転換によって大腸菌に導入した。
SEQ ID NO:64およびSEQ ID NO:65をキナーゼ処理し、これらの2つのオリゴヌクレオチドを等モル量で組み合わせ、100℃で2分間、加熱し、室温までゆっくりと冷却することによってアニーリングすることによって、触媒不活性ラットMASP-2Aタンパク質を生成した。結果として生じたアニーリング断片はPst1およびXba1適合末端を有し、野生型ラットMASP-2 cDNA(SEQ ID NO:53)のPst1-Xba1断片の代わりに挿入して、ラットMASP-2Aを生成した。
Figure 0006893554
下記のように、ヒトMASP-2A、マウスMASP-2A、およびラットMASP-2Aをそれぞれ哺乳動物発現ベクターpEDまたはpCI-Neoにさらにサブクローニングし、チャイニーズハムスター卵巣細胞株DXB1にトランスフェクトした。
別のアプローチでは、Chen et al., J. Biol. Chem., 276(28):25894-25902, 2001に記載の方法を用いて触媒不活性型MASP-2を構築する。簡単に述べると、完全長ヒトMASP-2 cDNAを含有するプラスミド(Thiel et al., Nature 386:506, 1997に記載)をXho1およびEcoR1で消化し、MASP-2 cDNA(SEQ ID NO:4として本明細書に記載)をpFastBac1バキュロウイルストランスファーベクター(Life Technologies, NY)の対応する制限部位にクローニングする。次いで、ペプチド領域アミノ酸610〜625をコードする二本鎖オリゴヌクレオチド(SEQ ID NO:13)を天然領域アミノ酸610〜625で置換して、不活性プロテアーゼドメインを有するMASP-2完全長ポリペプチドを作製することによって、Ser618にあるMASP-2セリンプロテアーゼ活性部位をAla618に変える。
ヒトMasp-2に由来するポリペプチド領域を含有する発現プラスミドの構築
MASP-2の様々なドメインを分泌させるために、MASP-2シグナルペプチド(SEQ ID NO:5の残基1-15)を用いて以下の構築物を作製する。MASP-2(SEQ ID NO:6)の残基1〜121をコードする領域(N末端CUBIドメインに対応する)を増幅するPCRによって、ヒトMASP-2 CUBIドメイン(SEQ ID NO:8)を発現する構築物を作製する。MASP-2(SEQ ID NO:6)の残基1〜166をコードする領域(N末端CUBIEGFドメインに対応する)を増幅するPCRによって、ヒトMASP-2 CUBIEGFドメイン(SEQ ID NO:9)を発現する構築物を作製する。MASP-2(SEQ ID NO:6)の残基1〜293をコードする領域(N末端CUBIEGFCUBIIドメインに対応する)を増幅するPCRによって、ヒトMASP-2 CUBIEGFCUBIIドメイン(SEQ ID NO:10)を発現する構築物を作製する。確立されたPCR法に従って、VentRポリメラーゼおよび鋳型としてpBS-MASP-2を用いたPCRによって前述のドメインを増幅する。センスプライマーの5'プライマー配列
Figure 0006893554
は、PCR産物の5'末端にBamHI制限部位(下線)を導入する。以下の表5に示した、それぞれのMASP-2ドメインのアンチセンスプライマーは、それぞれのPCR産物の末端に停止コドン(太字体)の後にEcoRI部位(下線)を導入するように設計されている。DNA断片を増幅したら、BamHIおよびEcoRIで消化し、pFastBac1ベクターの対応する部位にクローニングする。結果として生じた構築物を制限酵素マッピングによって特徴決定し、dsDNA配列決定によって確認する。
（表５）MASP-2 PCRプライマー
Figure 0006893554
MASP-2の組換え真核生物発現、ならびに酵素的に不活性なマウスMASP-2A、ラットMASP-2A、およびヒトMASP-2Aのタンパク質産生
標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション手順(Maniatis et al., 1989)を用いて、前記のMASP-2発現構築物およびMASP-2A発現構築物をDXB1細胞にトランスフェクトした。調製物が他の血清タンパク質で確実に汚染されないようにするために、MASP-2Aを無血清培地中で産生させた。1日おきに(計4回)、培地をコンフルエント細胞から回収した。組換えMASP-2Aレベルの平均は、3種類の種それぞれについて培地1リットルにつき約1.5mgであった。
MASP-2Aタンパク質の精製:MASP-2A(前記のSer-Ala変異体)を、MBP-A-アガロースカラムでのアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。この戦略によって、外部タグを使用することなく迅速な精製が可能になった。MASP-2A(等量のローディングバッファー(150mM NaClおよび25mM CaCl2を含有する50mM Tris-Cl, pH7.5で希釈した培地100〜200ml)を、10mlのローディングバッファーで予め平衡状態にしたMBP-アガロースアフィニティカラム(4ml)にロードした。さらに10mlのローディングバッファーで洗浄した後に、1.25M NaClおよび10mM EDTAを含有する50mM Tris-Cl, pH7.5を用いて、タンパク質を1ml画分中に溶出させた。MASP-2Aを含有する画分をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって同定した。必要に応じて、MASP-2Aを、MonoQカラム(HR5/5)でのイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。タンパク質を、50mM NaClを含有する50mM Tris-Cl pH7.5を用いて透析し、同じ緩衝液で平衡状態にしたカラムにロードした。洗浄後、結合しているMASP-2Aを、10mlにわたって0.05〜1MのNaCl勾配で溶出させた。
結果:収量0.25〜0.5mgのMASP-2Aタンパク質を培地200mlから得た。MALDI-MSによって求められた分子量77.5kDaは、グリコシル化のために非修飾ポリペプチドの算出値(73.5kDa)よりも大きい。それぞれのN-グリコシル化部位におけるグリカンの付着が、観察された質量の原因となっている。MASP-2AはSDS-ポリアクリルアミドゲル上でシングルバンドとして移動し、このことから、MASP-2Aは生合成中にタンパク質分解処理されないことが証明される。平衡超遠心分離によって求められた重量平均分子量はグリコシル化ポリペプチドのホモ二量体の算出値と一致する。
組換えヒトMASP-2ポリペプチドの産生
組換えMASP-2およびMASP2A由来ポリペプチドを産生するための別の方法は、Thielens, N.M., et al., J. Immunol 166:5068-5077, 2001に記載されている。簡単に述べると、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)昆虫細胞(Novagen, Madison, WIから得たReady-Plaque Sf9細胞)を、50IU/mlペニシリンおよび50mg/mlストレプトマイシン(Life Technologies)を添加したSf900II無血清培地(Life Technologies)中で増殖および維持する。イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)(High Five)昆虫細胞(Jadwiga Chroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, Franceにより提供された)を、50 IU/mlペニシリンおよび50mg/mlストレプトマイシンで添加した、10％FCS(Dominique Dutscher, Brumath, France)を含有するTC100培地(Life Technologies)中で維持する。組換えバキュロウイルスを、Bac-to-Bacシステム(登録商標)(Life Technologies)を用いて生成する。バクミドDNAを、Qiagen midiprep精製システム(Qiagen)を用いて精製し、製造業者のプロトコールに記載のようにSf900 II SFM培地(Life Technologies)に溶解したセルフェクション(cellfectin)を用いてSf9昆虫細胞をトランスフェクトするために使用する。組換えウイルス粒子を4日後に収集し、ウイルスプラークアッセイ法によって滴定し、King and Possee, The Baculovirus Expression System:A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., London, pp.111-114, 1992に記載のように増幅する。
High Five細胞(1.75×107細胞/175cm2組織培養フラスコ)に、Sf900 II SFM培地中、感染効率2で、MASP-2ポリペプチドを含有する組換えウイルスを28℃で96時間、感染させる。上清を遠心分離によって収集し、ジイソプロピルホスホロフルオリデートを1mMの最終濃度まで添加する。
MASP-2ポリペプチドを培地中に分泌させる。培養上清を、50mM NaCl、1mM CaCl2、50mM塩酸トリエタノールアミン, pH8.1に対して透析し、同じ緩衝液で平衡状態にしたQ-Sepharose Fast Flowカラム(Amersham Pharmacia Biotech)(2.8×12cm)に1.5ml/分でロードする。溶出は、同じ緩衝液に溶解した350mM NaClまでの1.2リットル直線勾配を適用することによって行う。組換えMASP-2ポリペプチドを含有する画分をウエスタンブロット分析によって同定し、60％(w/v)まで(NH4) 2SO4を添加することによって沈降させ、4℃で一晩静置する。ペレットを、145mM NaCl、1mM CaCl2、50mM塩酸トリエタノールアミン, pH7.4に再懸濁し、同じ緩衝液で平衡状態にしたTSK G3000 SWGカラム(7.5×600mm)(Tosohaas, Montgomeryville, PA)に適用する。次いで、精製されたポリペプチドを、Microsepマイクロコンセントレーター(microconcentrator)(m.w.カットオフ=10,000)(Filtron, Karlstein, Germany)での限外濾過によって0.3mg/mlまで濃縮する。
実施例4
本実施例はMASP-2ポリペプチドに対するポリクローナル抗体を作製する方法について述べる。
材料および方法;
MASP-2抗原:以下の単離されたMASP-2ポリペプチドを用いてウサギを免疫することによって、ポリクローナル抗ヒトMASP-2抗血清を作製する:血清から単離されたヒトMASP-2(SEQ ID NO:6);実施例3に記載の組換えヒトMASP-2(SEQ ID NO:6)、不活性プロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:13)を含有するMASP-2A;ならびに前記の実施例3に記載のように発現された、組換えCUBI(SEQ ID NO:8)、CUBEGFI(SEQ ID NO:9)、およびCUBEGFCUBII(SEQ ID NO:10)。
ポリクローナル抗体: BCG(カルメット・ゲラン杆菌ワクチン)で初回刺激を受けた6週齢ウサギを、滅菌食塩水に溶解した100μgのMASP-2ポリペプチド100μg/mlの注射によって免疫する。注射を4週間ごとに行い、実施例5に記載のようにELISAアッセイ法によって抗体価をモニタリングする。プロテインAアフィニティクロマトグラフィーによる抗体精製のために、培養上清を収集する。
実施例5
本実施例は、ラットMASP-2ポリペプチドまたはヒトMASP-2ポリペプチドに対するマウスモノクローナル抗体を作製するための方法について述べる。
材料および方法:
雄A/Jマウス(Harlan, Houston, Tex.)、8〜12週齢に、完全フロイントアジュバント(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)を含む200μlのリン酸緩衝食塩水(PBS)pH7.4に溶解したヒトまたはラットのrMASP-2またはrMASP-2Aポリペプチド(実施例3に記載のように作った)100μgを皮下注射する。2週間の間隔で2回、マウスに、不完全フロイントアジュバントに溶解したヒトまたはラットのrMASP-2またはrMASP-2Aポリペプチド50μgを皮下注射する。4週目に、マウスに、PBSに溶解したヒトまたはラットのrMASP-2またはrMASP-2Aポリペプチド50μgを注射し、4日後に融合する。
それぞれの融合について、免疫したマウスの脾臓からシングルセル懸濁液を調製し、Sp2/0ミエローマ細胞との融合に使用する。50％ポリエチレングリコール(M.W.1450)(Kodak, Rochester, N.Y.)および5％ジメチルスルホキシド(Sigma Chemical Co., St. Louis. Mo.)を含有する培地中で、5×108個のSp2/0および5×108個の脾臓細胞を融合する。次いで、10％胎仔ウシ血清、100単位/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、0.1mMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、および16μMチミジンを添加したIscove培地(Gibco, Grand Island, N.Y.)に溶解して、細胞を1.5×105個の脾臓細胞/懸濁液200μlの濃度まで調節する。200マイクロリットルの細胞懸濁液を、約20個の96ウェルマイクロカルチャープレートの各ウェルに添加する。約10日後に、ELISAアッセイ法における精製因子MASP-2との反応性についてスクリーニングするために培養上清を取り出す。
ELISAアッセイ法: 50ng/mlの精製hMASP-2 50μlまたはラットrMASP-2(もしくはrMASP-2A)を室温で一晩、添加することによって、Immulon(登録商標) 2(Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.)マイクロテストプレートのウェルをコーティングする。コーティング用のMASP-2濃度が低いので、高親和性抗体の選択が可能である。プレートをパチンとはじくことによって、コーティング溶液を除去した後に、非特異的部位をブロックするために、PBSに溶解した200μlのBLOTTO(無脂肪ドライミルク)を各ウェルに1時間、添加する。次いで、1時間後、ウェルを緩衝液PBST(0.05％Tween20を含有するPBS)で洗浄する。それぞれの融合ウェルから50マイクロリットルの培養上清を収集し、50μlのBLOTTOと混合し、次いで、マイクロテストプレートの個々のウェルに添加する。1時間のインキュベーション後に、ウェルをPBSTで洗浄する。次いで、結合したマウス抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗マウスIgG(Fc特異的)(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.)との反応によって検出し、BLOTTOで1:2,000に希釈する。発色させるために、0.1％3,3,5,5テトラメチルベンジジン(Sigma, St. Louis, Mo.)および0.0003％過酸化水素(Sigma)を含有するペルオキシダーゼ基質溶液をウェルに30分間、添加する。反応を50μlの2M H2SO4/ウェルを添加することによって止める。反応混合物の450nmでの光学密度をBioTek(登録商標) ELISA Reader(BioTek(登録商標) Instruments, Winooski, Vt.)で読み取る。
MASP-2結合アッセイ法:
前記のMASP-2 ELISAアッセイ法の試験において陽性と判定された培養上清を、MASP-2に対するMASP-2阻害物質の結合親和性を決定するために結合アッセイ法において試験することができる。阻害物質が補体系の他の抗原に結合するかどうか判定するために類似アッセイ法も使用することができる。
ポリスチレンマイクロタイタープレートウェル(96ウェル培地結合プレート, Corning Costar, Cambridge, MA)を、リン酸緩衝食塩水(PBS)pH7.4に溶解したMASP-2(20ng/100μl/ウェル, Advanced Research Technology, San Diego, CA)で4℃において一晩コーティングする。MASP-2溶液を吸引した後に、ウェルを、1％ウシ血清アルブミン(BSA; Sigma Chemical)を含有するPBSで室温において2時間ブロックする。MASP-2コーティングのないウェルはバックグラウンド対照として役立つ。ブロッキング溶液に溶解した様々な濃度のハイブリドーマ上清または精製抗MASP-2 MoAbのアリコートをウェルに添加する。室温で2時間のインキュベーション後に、ウェルをPBSで大規模にリンスする。ブロッキング溶液に溶解したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG(Sigma Chemical)を添加し、室温で1時間インキュベートすることによって、MASP-2に結合した抗MASP-2 MoAbを検出する。プレートをPBSで徹底的に再度リンスし、100μlの3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(TMB)基質(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を添加する。TMBの反応を、100μlの1Mリン酸を添加することによってクエンチし、プレートをマイクロプレートリーダー(SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)において450nmで読み取る。
次いで、陽性ウェル由来の培養上清を、機能アッセイ法、例えば、実施例2に記載のC4切断アッセイ法において補体活性化を阻害する能力について試験する。次いで、陽性ウェル中の細胞を限界希釈によってクローニングする。MoAbを、前記のようにELISAアッセイ法においてhMASP-2との反応性について再試験する。選択されたハイブリドーマをスピナーフラスコの中で増殖させ、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーによる抗体精製のために、使用済みの培養上清を収集する。
実施例6
本実施例は、ヒト化マウス抗MASP-2抗体および抗体断片の生成および作製について述べる。
実施例5に記載のように、雄A/Jマウスにおいてマウス抗MASP-2モノクローナル抗体を生成する。次いで、マウス抗体は、マウス抗体の免疫原性を弱めるために、マウス定常領域をそのヒト対応物で置換して抗体のキメラIgGおよびFab断片を生成することによって、下記のようにヒト化され、これは、本発明によるヒト対象におけるMASP-2依存性補体活性化の副作用を阻害するために有用である。
1.マウスハイブリドーマ細胞に由来する抗MASP-2可変領域遺伝子のクローニング
RNAzolを用いて製造業者のプロトコール(Biotech, Houston, Tex.)に従って、総RNAを、抗MASP-2 MoAbを分泌するハイブリドーマ細胞(実施例7に記載のように得た)から単離する。プライマーとしてオリゴdTを用いて第一鎖cDNAを総RNAから合成する。免疫グロブリン定常C領域に由来する3'プライマー、および5'プライマーとしてリーダーペプチドまたはマウスVH遺伝子もしくはVK遺伝子の最初のフレームワーク領域に由来する縮重プライマーセットを用いてPCRを行う。アンカーPCRは、Chen and Platsucas(Chen, P.F., Scand. J. Immunol. 35:539-549, 1992)に記載のように行う。VK遺伝子をクローニングするために、Not1-MAK1プライマー
Figure 0006893554
を用いて二本鎖cDNAを調製する。アニーリングされたアダプター
Figure 0006893554
を二本鎖cDNAの5'末端および3'末端の両方に連結する。3'末端にあるアダプターをNot1消化によって除去する。次いで、消化産物を、5'プライマーとしてAD1オリゴヌクレオチドおよび3'プライマーとしてMAK2
Figure 0006893554
を使用するPCRにおける鋳型として使用する。約500bpのDNA断片をpUC19にクローニングする。クローニングされた配列が、予想されたマウス免疫グロブリン定常領域を含むことを確認するために、配列分析用に、いくつかのクローンを選択する。Not1-MAK1およびMAK2オリゴヌクレオチドはVK領域に由来し、それぞれ、Cκ遺伝子の最初の塩基対から182bpおよび84bp下流にある。完全なVKおよびリーダーペプチドを含むクローンを選択する。
VH遺伝子をクローニングするために、Not1 MAG1プライマー
Figure 0006893554
を用いて二本鎖cDNAを調製する。アニーリングされたアダプターAD1およびAD2を、二本鎖cDNAの5'末端および3'末端の両方に連結する。3'末端にあるアダプターをNot1消化によって除去する。消化産物を、プライマーとしてAD1オリゴヌクレオチドおよびMAG2
Figure 0006893554
を使用するPCRにおける鋳型として使用する。長さが500〜600bpのDNA断片をpUC19にクローニングする。Notl-MAG1およびMAG2オリゴヌクレオチドはマウスCγ.7.1領域に由来し、それぞれ、マウスCγ.7.1遺伝子の最初の塩基対から180bp下流および93bp下流にある。完全なVHおよびリーダーペプチドを含むクローンを選択する。
2.キメラMASP-2 IgGおよびFab用の発現ベクターの構築
Kozakコンセンサス配列をヌクレオチド配列の5'末端に付加し、スプライスドナーを3'末端に添加するためのPCR反応の鋳型として、前記のクローニングされたVH遺伝子およびVK遺伝子を使用する。PCRエラーが存在しないことを確認するために配列を分析した後に、VH遺伝子およびVK遺伝子を、それぞれ、ヒトC.γ1を含有する発現ベクターカセットおよびヒトC.κを含有する発現ベクターカセットに挿入して、pSV2neoVH-huCγ1およびpSV2neoV-huCγを得る。重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターのCsCl勾配精製プラスミドDNAを用いて、エレクトロポレーションによってCOS細胞をトランスフェクトする。48時間後に、約200ng/mlのキメラIgGの存在を確認するために、培養上清をELISAによって試験する。細胞を回収し、総RNAを調製する。プライマーとしてオリゴdTを用いて、総RNAから第一鎖cDNAを合成する。Fd DNA断片およびκDNA断片を生成するために、このcDNAをPCRにおける鋳型として使用する。Fd遺伝子の場合、5'プライマーとして
Figure 0006893554
およびCH1由来3'プライマー
Figure 0006893554
を用いてPCRを行う。DNA配列は、ヒトIgG1の完全なVHドメインおよびヒトCH1ドメインを含有することが確認される。適切な酵素で消化した後に、Fd DNA断片を、発現ベクターカセットpSV2dhfr-TUSのHindIII制限部位およびBamHI制限部位に挿入して、pSV2dhfrFdを得る。pSV2プラスミドは市販されており、様々な供給源に由来するDNAセグメントからなる。pBR322DNA(薄い線)は、pBR322のDNA複製起点(pBRori)およびラクタマーゼアンピシリン耐性遺伝子(Amp)を含有する。幅広のハッチングによって表され、印が付けられているSV40 DNAは、SV40 DNA複製起点(SV40ori)、初期プロモーター(dhfr遺伝子およびneo遺伝子の5'側)、ならびにポリアデニル化シグナル(dhfr遺伝子およびneo遺伝子の3'側)を含有する。SV40由来ポリアデニル化シグナル(pA)もFd遺伝子の3'末端に配置される。
κ遺伝子の場合、5'プライマーとして
Figure 0006893554
およびCK由来3'プライマー
Figure 0006893554
を用いてPCRを行う。DNA配列は、完全なVK領域およびヒトCK領域を含有することが確認される。適切な制限酵素を用いた消化後に、κDNA断片を発現ベクターカセットpSV2neo-TUSのHindIII制限部位およびBamHI制限部位に挿入して、pSV2neoKを得る。Fd遺伝子およびκ遺伝子の発現は、HCMV由来エンハンサーおよびプロモーターエレメントによって駆動される。Fd遺伝子は、鎖間ジスルフィド結合に関与するシステインアミノ酸残基を含まないので、この組換えキメラFabは、非共有結合により連結された重鎖および軽鎖を含有する。このキメラFabはcFabと呼ばれる。
重鎖と軽鎖の間のジスルフィド結合を有する組換えFabを得るために、ヒトIgG1のヒンジ領域に由来する9個のさらなるアミノ酸(EPKSCDKTH SEQ ID NO:48)のコード配列を含むように、前記のFd遺伝子を延長することができる。Fd遺伝子の3'末端にある30アミノ酸をコードするBstEII-BamHI DNAセグメントを、延長したFdをコードするDNAセグメントと取り替えて、pSV2dhfrFd/9aaを得ることができる。
3.キメラ抗MASP-2 IgGの発現および精製
キメラ抗MASP-2 IgGを分泌する細胞株を生成するために、NSO細胞を、エレクトロポレーションによってpSV2neoVH-huC.γ1およびpSV2neoV-huCκの精製プラスミドDNAでトランスフェクトする。トランスフェクト細胞を、0.7mg/ml G418の存在下で選択する。細胞を、血清含有培地を用いて250mlスピナーフラスコ中で増殖させる。
100mlスピナー培養物の培養上清を、10ml PROSEP-Aカラム(Bioprocessing, Inc., Princeton, NJ.)にロードする。カラムを10ベッド体積のPBSで洗浄する。結合している抗体を50mMクエン酸緩衝液, pH3.0で溶出させる。pHを7.0に調節するために、等量の1M Hepes, pH8.0を、精製抗体を含有する画分に添加する。残留塩を、Millipore膜限外濾過(M.W.カットオフ:3,000)によるPBSを用いた緩衝液交換によって除去する。精製抗体のタンパク質濃度をBCA法(Pierce)によって求める。
4.キメラ抗MASP-2 Fabの発現および精製
キメラ抗MASP-2 Fabを分泌する細胞株を生成するために、CHO細胞を、エレクトロポレーションによってpSV2dhfrFd(またはpSV2dhfrFd/9aa)およびpSV2neoκの精製プラスミドDNAでトランスフェクトする。トランスフェクト細胞をG418およびメトトレキセートの存在下で選択する。選択された細胞株を漸増濃度のメトトレキセートの中で増幅する。細胞を限界希釈によってシングルセルサブクローニングする。次いで、高産生シングルセルサブクローニング細胞株を、無血清培地を用いて100mlスピナーフラスコ中で増殖させる。
キメラ抗MASP-2 Fabを、MASP-2 MoAbに対するマウス抗イディオタイプMoAbを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製する。抗イディオタイプMASP-2 MoAbは、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)と結合したマウス抗MASP-2 MoAbでマウスを免疫し、ヒトMASP-2と競合することができる特異的MoAb結合をスクリーニングすることによって作製することができる。精製のために、cFabまたはcFab/9aaを産生するCHO細胞のスピナー培養物由来の上清100mlを、抗イディオタイプMASP-2 MoAbと結合したアフィニティカラムにロードする。次いで、カラムをPBSで徹底的に洗浄した後に、結合しているFabを50mMジエチルアミン、pH11.5で溶出させる。残留塩を前記のように緩衝液交換によって除去する。精製Fabのタンパク質濃度をBCA法(Pierce)によって求める。
キメラMASP-2 IgG、cFab、およびcFAb/9aaがMASP-2依存性補体経路を阻害する能力は実施例2または実施例7に記載の阻害アッセイ法を用いることによって求めることができる。
実施例7
本実施例は、L-フィコリン/P35、H-フィコリン、M-フィコリン、またはマンナンを介したMASP-2依存性補体活性化を遮断することができるMASP-2阻害物質を同定するための機能スクリーニングとして用いられるインビトロC4切断アッセイ法について述べる。
C4切断アッセイ法: C4切断アッセイ法は、Petersen, S.V., et al., J. Immunol. Methods 257:107, 2001によって述べられており、L-フィコリンに結合する黄色ブドウ球菌由来リポテイコ酸(LTA)に起因するレクチン経路活性化を測定する。
試薬:ホルマリン固定黄色ブドウ球菌(DSM20233)を以下のように調製する。細菌をトリプティックソイ血液培地中で37℃において一晩増殖させ、PBSで3回洗浄し、次いで、PBS/0.5％ホルマリン中で室温において1時間固定し、PBSでさらに3回洗浄した後に、コーティング緩衝液(15mM Na2Co3、35mM NaHCO3、pH9.6)に再懸濁する。
アッセイ法:Nunc MaxiSorb(登録商標)マイクロタイタープレート(Nalgene Nunc International, Rochester, NY)のウェルを、コーティング緩衝液に溶解した1μgのL-フィコリンと共に、コーティング緩衝液に溶解した100μlのホルマリン固定黄色ブドウ球菌DSM20233(OD550=0.5)でコーティングする。一晩のインキュベーション後、ウェルを、TBS(10mM Tris-HCl、140mM NaCl pH7.4)に溶解した0.1％ヒト血清アルブミン(HSA)でブロックし、次いで、0.05％Tween20および5mM CaCl2を含有するTBS(洗浄液緩衝液)で洗浄する。ヒト血清試料を、内因性C4の活性化を阻止し、C1複合体(C1q、C1r、およびC1sからなる)を解離する、20mM Tris-HCl、1M NaCl、10mM CaCl2、0.05％Triton X-100、0.1％HSA、pH7.4で希釈する。抗MASP-2 MoAbおよび阻害ペプチドを含むMASP-2阻害物質を様々な濃度で血清試料に添加する。希釈試料をプレートに添加し、4℃で一晩インキュベートする。24時間後、プレートを洗浄緩衝液で徹底的に洗浄する。次いで、100μlの4mMバルビタール、145mM NaCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、pH7.4に溶解した、0.1μgの精製ヒトC4(Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993に記載のように得た)を各ウェルに添加する。37℃で1.5時間後に、プレートを再洗浄し、C4b沈着をアルカリホスファターゼ結合ニワトリ抗ヒトC4c(Immunsystem, Uppsala, Swedenから得た)を用いて検出し、比色分析基質ρ-ニトロフェニルリン酸を用いて測定する。
マンナン上でのC4アッセイ法:MBLを介したレクチン経路活性化を測定するために、プレートをLSPおよびマンナンでコーティングした後に、様々なMASP-2阻害物質と混合した血清を添加することによって、前記のアッセイ法を適合化させる。
H-フィコリン(Hakata Ag)上でのC4アッセイ法:H-フィコリンを介したレクチン経路活性化を測定するために、プレートをLPSおよびH-フィコリンでコーティングした後に、様々なMASP-2阻害物質と混合した血清を添加することによって、前記のアッセイ法を適合化させる。
実施例8
以下のアッセイ法は、野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスにおける古典経路活性化の存在を証明する。
方法:マイクロタイタープレート(Maxisorb(登録商標), Nunc, カタログ番号442404, Fisher Scientific)を、10mM Tris、140mM NaCl、pH7.4に溶解した0.1％ヒト血清アルブミンで室温において1時間コーティングした後に、TBS/tween/Ca2+で1:1000に希釈したヒツジ抗全血清(whole serum)抗血清(Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Scotland)と4℃で一晩インキュベートすることによって、免疫複合体をインサイチューで生成した。血清試料を野生型およびMASP-2-/-マウスから得て、コーティングされたプレートに添加した。野生型血清試料およびMASP-2-/-血清試料からC1qを枯渇させた対照試料を調製した。C1q枯渇マウス血清は、ウサギ抗ヒトC1q IgG(Dako, Glostrup, Denmark)でコーティングされたプロテインA結合Dynabeads(登録商標)(Dynal Biotech, Oslo, Norway)を用いて供給業者の説明書に従って調製した。プレートを37℃で90分間インキュベートした。結合しているC3bを、TBS/tw/Ca++で1:1000に希釈したポリクローナル抗ヒトC3c抗体(DakoA062)を用いて検出した。二次抗体はヤギ抗ウサギIgGである。
結果:図7は、野生型血清、MASP-2-/-血清、C1q枯渇野生型血清、およびC1q枯渇MASP-2-/-血清中のIgGでコーティングされたプレート上の相対的C3b沈着レベルを示す。これらの結果からMASP-2-/-マウス系統において古典経路は損なわれていないことが証明される。
実施例9
以下のアッセイ法を用いて、免疫複合体によって古典経路が開始する条件下でMASP-2阻害物質の効果を分析することによって、MASP-2阻害物質が古典経路を遮断するかどうか試験する。
方法:免疫複合体によって古典経路が開始する補体活性化の状態に対するMASP-2阻害物質の効果を試験するために、90％NHSを含有する3つ組の試料50μlを、10μg/ml免疫複合体(IC)またはPBSの存在下で37℃においてインキュベートする。37℃でのインキュベーション中に、200nM抗プロペルジンモノクローナル抗体を含有する3つ組の対応する試料(+/-IC)も含める。37℃で2時間のインキュベーション後に、さらなる補体活性化を止めるために、13mM EDTAを全ての試料に添加し、すぐに、試料を5℃まで冷却する。次いで、試料を-70℃で保管した後に、ELISAキット(Quidelカタログ番号A015およびA009)を用いて製造業者の説明書に従って補体活性化産物(C3aおよびsC5b-9)をアッセイする。
実施例10
本実施例はMASP-2活性を遮断する高親和性抗MASP-2 Fab2抗体断片の特定について述べる。
背景および原理:MASP-2は、MBLおよびフィコリンの結合部位、セリンプロテアーゼ触媒部位、タンパク質分解基質C2の結合部位、タンパク質分解基質C4の結合部位、MASP-2酵素前駆体自己活性化のためのMASP-2切断部位、ならびに2つのCa++結合部位を含む、多くの別個の機能ドメインを有する複合タンパク質である。高親和性でMASP-2に結合するFab2抗体断片を同定し、同定されたFab2断片がMASP-2機能活性を遮断できるかどうか判定するために機能アッセイ法において試験した。
MASP-2機能活性を遮断するためには、抗体またはFab2抗体断片は、MASP-2機能活性に必要とされるMASP-2上の構造エピトープに結合し、これを妨害しなければならない。従って、高親和性結合抗MASP-2 Fab2の多くまたは全ては、それらが、MASP-2機能活性に直接関与するMASP-2上の構造エピトープに結合する場合を除いて、MASP-2機能活性を阻害しないことがある。
レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定する機能アッセイ法を用いて、抗MASP-2 Fab2の「遮断活性」を評価した。レクチン経路におけるMASP-2の最も重要な生理学的役割は、レクチン媒介補体経路の次の機能成分、すなわち、レクチン経路C3コンバターゼを生成することであることが公知である。レクチン経路C3コンバターゼは、C3をC3aおよびC3bにタンパク分解によって切断する重要な酵素複合体(C4bC2a)である。MASP-2はレクチン経路C3コンバターゼ(C4bC2a)の構造成分ではない。しかしながら、レクチン経路C3コンバターゼを構成する2つのタンパク質成分(C4b、C2a)を生成するために、MASP-2の機能活性が必要とされる。さらに、MASP-2がレクチン経路C3コンバターゼを生成するためには、前記で列挙されたMASP-2の別個の機能活性の全てが必要であるように見える。これらの理由で、抗MASP-2 Fab2の「遮断活性」の評価において使用するための好ましいアッセイ法は、レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定する機能アッセイ法だと考えられる。
高親和性Fab2の生成:ヒト軽鎖抗体可変配列および重鎖抗体可変配列のファージディスプレイライブラリー、ならびに関心対象の選択されたリガンドと反応するFab2を同定するための自動抗体選択技術を用いて、ラットMASP-2タンパク質(SEQ ID NO:55)に対する高親和性Fab2を作製した。抗体スクリーニングのために、既知量のラットMASP-2(約1mg、＞85％純粋)タンパク質を利用した。親和性が最も高い抗体を選択するために3回の増幅を利用した。ELISAスクリーニングのために、抗体断片を発現する約250個の異なるヒットを選んだ。この後に、異なる抗体のユニークさ(uniqueness)を決定するために高親和性ヒットを配列決定した。
50個のユニークな抗MASP-2抗体を精製し、以下でさらに詳述するように、それぞれの精製Fab2抗体250μgをMASP-2結合親和性の特徴決定および補体経路の機能試験に使用した。
抗MASP-2 Fab2の阻害(遮断)活性の評価に用いられるアッセイ法
1.レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定するためのアッセイ法:
背景:レクチン経路C3コンバターゼは、C3を2つの強力な炎症誘発断片であるアナフィラトキシンC3aおよびオプソニンC3bにタンパク分解によって切断する酵素複合体(C4bC2a)である。C3コンバターゼの形成は、炎症を媒介する点でレクチン経路の重要な段階であるように思われる。MASP-2はレクチン経路C3コンバターゼ(C4bC2a)の構造成分ではない。従って、抗MASP-2抗体(またはFab2)は、既にあるC3コンバターゼの活性を直接阻害しない。しかしながら、レクチン経路C3コンバターゼを構成する2つのタンパク質成分(C4b、C2a)を生成するために、MASP-2セリンプロテアーゼ活性が必要とされる。従って、MASP-2機能活性を阻害する抗MASP-2 Fab2(すなわち、遮断抗MASP-2 Fab2)はレクチン経路C3コンバターゼの新規形成を阻害する。C3は、その構造の一部として、珍しく、かつ高反応性のチオエステル基を含有する。このアッセイ法ではC3がC3コンバターゼによって切断されると、C3b上のチオエステル基は、エステル結合またはアミド結合を介してプラスチックウェルの底に固定化された巨大分子上のヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を形成することができ、従って、ELISAアッセイ法におけるC3bの検出が容易になる。
酵母マンナンはレクチン経路の公知の活性化因子である。C3コンバターゼ形成を測定する以下の方法では、マンナンでコーティングされたプラスチックウェルを希釈ラット血清と37℃で30分間インキュベートして、レクチン経路を活性化した。次いで、ウェルを洗浄し、標準的なELISA法を用いて、ウェル上に固定化されたC3bについてアッセイした。このアッセイ法において生成されたC3bの量は、レクチン経路C3コンバターゼの新規形成を直接反映するものである。このアッセイ法では、選択された濃度の抗MASP-2 Fab2がC3コンバターゼ形成を阻害し、その結果として起きるC3b生成を阻害する能力を試験した。
方法:
96ウェルCostar Medium Bindingプレートを、1μg/50μl/ウェルで、50mM炭酸緩衝液、pH9.5で希釈したマンナンと5℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、200μl PBSで各ウェルを3回洗浄した。次いで、ウェルを、PBSに溶解した100μl/ウェルの1％ウシ血清アルブミンでブロックし、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、各ウェルを200μlのPBSで3回洗浄した。抗MASP-2 Fab2試料を、5Cで、Ca++およびMg++を含有するGVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1％ゼラチン、pH7.4)で選択された濃度まで希釈した。0.5％ラット血清を5℃で前記の試料に添加し、100μlを各ウェルに移した。プレートに蓋をし、補体活性化を可能にするために37C水浴中で30分間インキュベートした。37℃水浴から、氷と水の混合物を含む容器にプレートを移すことによって、反応を止めた。各ウェルを、PBS-Tween20(0.05％Tween20を含むPBS)で200μlで5回洗浄し、次いで、200μlのPBSで2回洗浄した。2.0mg/mlウシ血清アルブミンを含有するPBSに溶解した100μl/ウェルの一次抗体(ウサギ抗ヒトC3c、DAKO A0062)1:10,000希釈液を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを5×200μlのPBSで洗浄した。2.0mg/mlウシ血清アルブミンを含有するPBSに溶解した、100μl/ウェルの二次抗体(ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG, American Qualex A102PU)1:10,000希釈液を添加し、シェーカーに載せて穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルをPBSで200μlで5回洗浄した。100μl/ウェルのペルオキシダーゼ基質TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加し、室温で10分間インキュベートした。100μl/ウェルの1.0M H3PO4を添加することによってペルオキシダーゼ反応を止め、OD450を測定した。
2.MASP-2依存性C4切断の阻害を測定するためのアッセイ法:
背景:MASP-2のセリンプロテアーゼ活性は高度に特異的であり、MASP-2のタンパク質基質はC2およびC4の2種類しか同定されていない。C4の切断によってC4aおよびC4bが生成される。抗MASP-2 Fab2は、C4切断に直接関与するMASP-2上の構造エピトープ(例えば、C4のMASP-2結合部位;MASP-2セリンプロテアーゼ触媒部位)に結合し、それによって、MASP-2のC4切断機能活性を阻害する可能性がある。
酵母マンナンはレクチン経路の公知の活性化因子である。MASP-2のC4切断活性を測定する以下の方法では、マンナンでコーティングされたプラスチックウェルを希釈ラット血清と37℃で30分間インキュベートして、レクチン経路を活性化した。このELISA法において用いられる一次抗体はヒトC4しか認識しないので、希釈ラット血清にヒトC4(1.0μg/ml)も添加した。次いで、ウェルを洗浄し、標準的なELISA方法を用いて、ウェルに固定化されたヒトC4bについてアッセイした。このアッセイ法において生成されたC4bの量はMASP-2依存性C4切断活性の尺度である。このアッセイ法では、選択された濃度の抗MASP-2 Fab2がC4切断を阻害する能力を試験した。
方法:96ウェルCostar Medium Bindingプレートを、1.0μg/50μl/ウェルで、50mM炭酸緩衝液、pH9.5で希釈したマンナンと5℃で一晩インキュベートした。200μl PBSで各ウェルを3回洗浄した。次いで、ウェルを、PBSに溶解した100μl/ウェルの1％ウシ血清アルブミンでブロックし、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200μlのPBSで3回洗浄した。抗MASP-2 Fab2試料を、5℃で、Ca++およびMg++を含有するGVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1％ゼラチン、pH7.4)で選択された濃度まで希釈した。これらの試料に1.0μg/ml/ヒトC4(Quidel)も含めた。前記の試料に0.5％ラット血清を5℃で添加し、100μlを各ウェルに移した。プレートに蓋をし、補体を活性化するために37℃水浴中で30分間インキュベートした。37℃水浴から、氷と水の混合物を含む容器にプレートを移すことによって、反応を止めた。各ウェルを、PBS-Tween20(0.05％Tween20を含むPBS)で200μlで5回洗浄した。次いで、各ウェルを200μlのPBSで2回洗浄した。2.0mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBSに溶解した、100μl/ウェルのビオチン結合ニワトリ抗ヒトC4c(Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)1:700希釈液を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200μlのPBSで5回洗浄した。2.0mg/ml BSAを含有するPBSに溶解した、100μl/ウェルの0.1μg/mlのペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(Pierce Chemical#21126)を添加し、シェーカーに載せて穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200μlのPBSで5回洗浄した。100μl/ウェルのペルオキシダーゼ基質TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加し、室温で16分間インキュベートした。100μl/ウェルの1.0M H3PO4を添加することによってペルオキシダーゼ反応を止め、OD450を測定した。
3.抗ラットMASP-2 Fab2と「天然」ラットMASP-2との結合アッセイ法
背景:MASP-2は、通常、特異的レクチン分子(マンノース結合タンパク質(MBL)およびフィコリン)も含むMASP-2二量体複合体として血漿中に存在する。従って、抗MASP-2 Fab2と生理学的に関連する形態のMASP-2との結合の研究に興味があるのであれば、精製組換えMASP-2ではなく、Fab2と血漿中の「天然」MASP-2との相互作用が用いられる結合アッセイ法を開発することが重要である。この結合アッセイ法では、最初に、10％ラット血清に由来する「天然」MASP-2-MBL複合体をマンナンコーティングウェルに固定化した。次いで、標準的なELISA法を用いて、固定化「天然」MASP-2に対する様々な抗MASP-2 Fab2の結合親和性を研究した。
方法:96ウェルCostar High Bindingプレートを、1μg/50μl/ウェルで、50mM炭酸緩衝液、pH9.5で希釈したマンナンと5℃で一晩インキュベートした。200μlのPBSで各ウェルを3回洗浄した。ウェルを100μl/ウェルの、PBST(0.05％Tween20を含むPBS)に溶解した0.5％無脂肪ドライミルクでブロックし、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200μlのTBS/Tween/Ca++洗浄緩衝液(5.0mM CaCl2を含有するTris緩衝食塩水、0.05％Tween20、pH7.4)で3回洗浄した。High Salt Binding Buffer(20mM Tris、1.0M NaCl、10mM CaCl2、0.05％Triton-X100、0.1％(w/v)ウシ血清アルブミン、pH7.4)に溶解した10％ラット血清を氷上で調製した。100μl/ウェルを添加し、5℃で一晩インキュベートした。ウェルを200μlのTBS/Tween/Ca++洗浄緩衝液で3回洗浄した。次いで、ウェルを200μlのPBSで2回洗浄した。Ca++およびMg++を含有するGVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1％ゼラチン、pH7.4)で希釈した100μl/ウェルの選択された濃度の抗MASP-2 Fab2を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200μlのPBSで5回洗浄した。2.0mg/mlウシ血清アルブミンを含むPBSで1:5000に希釈した100μl/ウェルのHRP結合ヤギ抗Fab2(Biogenesisカタログ番号0500-0099)を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200μlのPBSで5回洗浄した。100μl/ウェルのペルオキシダーゼ基質TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加し、室温で70分間インキュベートした。100μl/ウェルの1.0M H3PO4を添加することによってペルオキシダーゼ反応を止め、OD450を測定した。
結果:
ELISAスクリーニングのために、高親和性でラットMASP-2タンパク質と反応した約250個の異なるFab2を選んだ。異なる抗体のユニークさを決定するために、これらの高親和性Fab2を配列決定した。さらなる分析のために、50個のユニークな抗MASP-2抗体を精製した。それぞれの精製Fab2抗体250μgを、MASP-2結合親和性の特徴決定および補体経路の機能試験に使用した。この分析の結果を以下の表6に示した。
（表６）レクチン経路補体活性化を遮断する抗MASP-2 FAB2
Figure 0006893554
表6に示したように、試験した50個の抗MASP-2 Fab2のうち17個のFab2が、10nM Fab2に等しい、または10nM Fab2未満のIC50でC3コンバターゼ形成を強力に阻害するMASP-2遮断Fab2であると同定された(34％の陽性ヒット率)。17個のFab2のうち8個のIC50はnM以下の範囲である。さらに、表6に示したMASP-2遮断Fab2のうち17個全てが、レクチン経路C3コンバターゼアッセイ法においてC3コンバターゼ形成の本質的に完全な阻害を示した。図8Aは、試験された他のFab2抗体を代表するFab2抗体番号11についてのC3コンバターゼ形成アッセイ法の結果を図示する。この結果を表6に示した。それぞれのMASP-2分子がFab2に結合している場合でも、「遮断」Fab2がMASP-2機能をほんのわずかにしか阻害しない場合があるのは理論上可能なので、これは重要な考慮事項である。
マンナンはレクチン経路の公知の活性化因子であるが、ラット血清中に抗マンナン抗体が存在することでも古典経路が活性化し、古典経路C3コンバターゼを介してC3bが生成され得ることも理論上可能である。しかしながら、本実施例において列挙された17個の遮断抗MASP-2 Fab2はそれぞれC3b生成を強力に阻害する(＞95％)。従って、このことから、レクチン経路C3コンバターゼに対する、このアッセイ法の特異性が証明される。
それぞれの遮断Fab2の見かけのKdを算出するために、17個全ての遮断Fab2を用いて結合アッセイ法も行った。遮断Fab2のうちの6個についての、天然ラットMASP-2に対する抗ラットMASP-2 Fab2の結合アッセイ法の結果も表6に示した。図8Bは、Fab2抗体番号11を用いた結合アッセイ法の結果を図示する。他のFab2についても同様の結合アッセイ法を行った。この結果を表6に示した。一般的に、6個のFab2のそれぞれと「天然」MASP-2の結合について得られた見かけのKdは、C3コンバターゼ機能アッセイ法におけるFab2のIC50と妥当によく一致する。MASP-2はそのプロテアーゼ活性が活性化されると「不活性」型から「活性」型へとコンフォメーション変化を受けるという証拠がある(Feinberg et al., EMBO J 22:2348-59(2003); Gal et al., J. Biol.Chem. 250:33435-44(2005))。C3コンバターゼ形成アッセイ法において用いられる正常ラット血漿中には、MASP-2は主に「不活性な」酵素前駆体コンフォメーションの状態で存在する。対照的に、結合アッセイ法では、MASP-2は、固定化マンナンと結合したMBLとの複合体の一部として存在する。従って、MASP-2は「活性」コンフォメーション状態にあると考えられる(Petersen et al., J. Immunol Methods 257:107-16, 2001)。その結果、これらの2つの機能アッセイ法において試験された17個の遮断Fab2のそれぞれについてIC50とKdの間に厳密な対応関係が予想されるとは限らないと考えられる。なぜなら、それぞれのアッセイ法において、Fab2は異なるコンフォメーション型のMASP-2を結合するからである。にもかかわらず、Fab2番号88を除いて、2つのアッセイ法において試験された他の16個のFab2のそれぞれについてIC50と見かけのKdの間に妥当に密接な対応関係があるように思われる(表6を参照されたい)。
MASP-2によって媒介されるC4切断の阻害について遮断Fab2のいくつかを評価した。図8Cは、Fab2番号41による阻害、IC50=0.81nMを示すC4切断アッセイ法の結果を図示する(表6を参照されたい)。図9に示したように、試験されたFab2の全てが、C3コンバターゼアッセイ法において得られたIC50とほぼ同じIC50でC4切断を阻害することが見出された(表6を参照されたい)。
マンナンはレクチン経路の公知の活性化因子であるが、ラット血清中に抗マンナン抗体が存在することでも古典経路が活性化し、それによって、C1sを介したC4切断によってC4bが生成され得ることも理論上可能である。しかしながら、C4b生成を強力に阻害する(＞95％)、いくつかの抗MASP-2 Fab2が同定されている。従って、このことから、MASP-2によって媒介されるC4切断に対する、このアッセイ法の特異性が証明される。C4はC3と同様に、その構造の一部として、珍しく、かつ高反応性のチオエステル基を含有する。このアッセイ法においてC4がMASP-2によって切断されると、C4b上のチオエステル基は、エステル結合またはアミド結合を介してプラスチックウェルの底に固定化された巨大分子上のヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を形成することができ、従って、ELISA法におけるC4bの検出が容易になる。
これらの結果から、C4およびC3コンバターゼ活性を両方とも機能的に遮断する、ラットMASP-2タンパク質に対する高親和性Fab2が作製され、それによって、レクチン経路活性化が阻止されることがはっきりと証明される。
実施例11
本実施例は、実施例10に記載のように生成された遮断抗ラットMASP-2 Fab2抗体のいくつかのエピトープマッピングについて述べる。
方法:
図10に示したように、全てN末端6×Hisタグを有する以下のタンパク質を、pED4ベクターを用いてCHO細胞において発現させた:
ラットMASP-2A、活性中心にあるセリンをアラニンに変えることによって不活性化された完全長MASP-2タンパク質(S613A);
ラットMASP-2K、自己活性化を低下させるように変えられた完全長MASP-2タンパク質(R424K);
CUBI-II、CUBIドメイン、EGF様ドメイン、およびCUBIIドメインしか含まないラットMASP-2 N末端断片;ならびに
CUBI/EGF様、CUBIドメインおよびEGF様ドメインしか含まないラットMASP-2 N末端断片。
以前に述べられたように(Chen et al., J. Biol. Chem. 276:25894-02(2001))、これらのタンパク質をニッケル-アフィニティクロマトグラフィーによって培養上清から精製した。
ラットMASP-2のCCPIIおよびセリンプロテアーゼドメインを含有するC末端ポリペプチド(CCPII-SP)を、pTrxFus(Invitrogen)を用いてチオレドキシン融合タンパク質として大腸菌において発現させた。タンパク質を、Thiobondアフィニティ樹脂を用いて細胞溶解産物から精製した。チオレドキシン融合パートナーを陰性対照として空のpTrxFusから発現させた。
全ての組換えタンパク質をTBS緩衝液で透析し、280nmのODを測定することによって濃度を求めた。
ドットブロット分析:
前述したおよび図10に示した5個の組換えMASP-2ポリペプチドの段階希釈液(ならびにCCPII-セリンプロテアーゼポリペプチドの陰性対照としてチオレドキシンポリペプチド)をニトロセルロース膜上にスポットした。スポットされたタンパク質の量は5倍段階で100ng〜6.4pgであった。後の実験において、スポットされたタンパク質の量は、再度、5倍段階で50ng〜16pgであった。膜を、TBS(ブロッキング緩衝液)に溶解した5％スキムミルク粉末でブロックし、次いで、ブロッキング緩衝液(5.0mM Ca2+を含有する)に溶解した1.0μg/mlの抗MASP-2 Fab2とインキュベートした。結合しているFab2を、HRP結合抗ヒトFab(AbD/Serotec;1/10,000に希釈した)およびECL検出キット(Amersham)を用いて検出した。1枚の膜を、陽性対照としてポリクローナルウサギ抗ヒトMASP-2 Ab(Stover et al., J Immunol 163:6848-59(1999)に記載)とインキュベートした。この場合、結合しているAbを、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG(Dako; 1/2,000に希釈した)を用いて検出した。
MASP-2結合アッセイ法
ELISAプレートを、炭酸緩衝液(pH9.0)に溶解した1.0μg/ウェルの組換えMASP-2AまたはCUBI-IIポリペプチドで4℃において一晩コーティングした。ウェルを、TBSに溶解した1％BSAでブロックし、次いで、5.0mM Ca2+を含有するTBSに溶解した抗MASP-2 Fab2の段階希釈液を添加した。プレートをRTで1時間インキュベートした。TBS/tween/Ca2+で3回洗浄した後、TBS/Ca2+で1/10,000に希釈したHRP結合抗ヒトFab(AbD/Serotec)を添加し、プレートをRTでさらに1時間インキュベートした。結合している抗体を、TMBペルオキシダーゼ基質キット(Biorad)を用いて検出した。
結果:
Fab2と様々なMASP-2ポリペプチドとの反応性を証明したドットブロット分析の結果を以下の表7に示した。表7に示した数値は、ほぼ最大半量のシグナル強度を得るのに必要とされる、スポットされたタンパク質の量を示す。示したように、(チオレドキシン融合パートナー単独を除く)全てのポリペプチドが、陽性対照Ab(ポリクローナル抗ヒトMASP-2血清、ウサギにおいて産生された)によって認識された。
（表７）ドットブロットにおける様々な組換えラットMASP-2ポリペプチドとの反応性
Figure 0006893554
NR=反応なし。陽性対照抗体は、ウサギにおいて産生されたポリクローナル抗ヒトMASP-2血清である。
全てのFab2がMASP-2AならびにMASP-2Kと反応した(データ示さず)。Fab2の大半はCCPII-SPポリペプチドを認識したが、N末端断片を認識しなかった。2つの例外はFab2番号60およびFab2番号57である。Fab2番号60はMASP-2AおよびCUBI-II断片を認識するが、CUBI/EGF様ポリペプチドもCCPII-SPポリペプチドも認識しない。このことから、Fab2番号60は、CUBII中のエピトープまたはCUBIIとEGF様ドメインにまたがるエピトープに結合することが示唆される。Fab2番号57は、MASP-2Aを認識するが、試験されたいかなるMASP-2断片も認識することはなく、このFab2がCCP1中のエピトープを認識することを示す。Fab2番号40および番号49は完全なMASP-2Aにしか結合しなかった。図11に示したELISA結合アッセイ法において、Fab2番号60は、わずかに低い見かけの親和性ではあるがCUBI-IIポリペプチドにも結合した。
これらの知見から、MASP-2タンパク質の複数の領域に対するユニークな遮断Fab2が同定されたことが証明される。
実施例12
本実施例は、免疫系の古典的(C1q依存的)経路成分を完全な状態のままにしておきながら、MASP-2に結合し、かつレクチンを介した補体活性化を阻害する完全ヒトscFv抗体をファージディスプレイを用いて同定することについて述べる。
概略:
ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって完全ヒト高親和性MASP-2抗体を同定した。抗体の可変軽鎖断片および可変重鎖断片をscFv形式および完全長IgG形式で単離した。ヒトMASP-2抗体は、免疫系の古典的(C1q依存的)経路成分を完全な状態のままにしておきながら、レクチン経路を介した補体経路活性化に関連する細胞損傷を阻害するために有用である。一部の態様において、このMASP-2阻害抗体は、以下の特徴を有する:(a)ヒトMASP-2に対する親和性が高い(例えば、KD 10nM以下)、および(b)IC50 30nM以下で90％ヒト血清中でMASP-2依存性補体活性を阻害すること。
方法:
完全長触媒不活性MASP-2の発現:
ヒトMASP-2ポリペプチドをコードするヒトMASP-2完全長cDNA配列(SEQ ID NO:4)とリーダー配列(SEQ ID NO:5)を哺乳動物発現ベクターpCI-Neo(Promega)にサブクローニングした。哺乳動物発現ベクターpCI-Neo(Promega)は、CMVエンハンサー/プロモーター領域の制御下で真核生物において発現を駆動する(Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)に記載)。
触媒不活性ヒトMASP-2Aタンパク質を作製するために、本明細書に参照により組み入れられるUS2007/0172483に記載のように部位特異的変異誘発を行った。アガロースゲル電気泳動後にPCR産物を精製し、バンド調製物および1アデノシンオーバーラップを標準的なテーリング法を用いて作製した。次いで、アデノシンテールMASP-2AをpGEM-T easyベクターにクローニングし、形質転換によって大腸菌(E.coli)に導入した。ヒトMASP-2Aを哺乳動物発現ベクターpEDまたはpCI-Neoのいずれかにさらにサブクローニングした。
標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法(Maniatis et al.,1989)を用いて、前記のMASP-2A発現構築物をDXB1細胞に導入した。確実に調製物が他の血清タンパク質で汚染されないように、MASP-2Aを無血清培地中で産生させた。培地をコンフルエント細胞から一日おきに収集した(合計4回)。組換えMASP-2Aレベルの平均は培養培地1リットルあたり約1.5mgであった。MBP-A-アガロースカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーによってMASP-2A(前記のSer-Ala変異体)を精製した。
パニング/scFv変換およびフィルタースクリーニングによって同定したScFv候補クローンに対するMASP-2A ELISA
ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列のファージディスプレイライブラリーを抗原パニングに供し、その後に、ヒトMASP-2タンパク質に対する高親和性scFv抗体を同定するために自動抗体スクリーニングおよび選択を行った。HIS-タグ化MASP-2Aまたはビオチン-タグ化MASP-2Aに対するscFvファージライブラリーパニングを3回行った。3回目のパニングを最初にMBLで溶出させ、次いでTEA(アルカリ性)で溶出させた。標的MASP-2Aに対するscFv断片を示すファージの特異的濃縮をモニタリングするために、固定化MASP-2Aに対するポリクローナルファージELISAを行った。3回目のパニングからのscFv遺伝子をpHOG発現ベクターにクローニングし、MASP-2Aに対する特異的クローンを探すためにスモールスケールフィルタースクリーニングに供した。
3回目のパニングからのscFv断片をコードするプラスミドを含有する細菌コロニーをつつき、ニトロセルロース膜上で格子状にし(grid)、非誘導培地上で一晩増殖させてマスタープレートを作製した。3回目のパニングから合計18,000個のコロニーをつつき、分析した。半分は競合的溶出由来であり、半分は、その後のTEA溶出由来であった。MASP-2Aに対するscFvファージミドライブラリーのパニングとそれに続くscFv変換およびフィルタースクリーニングによって137個の陽性クローンが得られた。137個のうち108個のクローンが、MASP-2結合についてのELISAアッセイ法において陽性であった(データは示さず)。このうち45個のクローンを、正常ヒト血清中でMASP-2活性を妨げる能力についてさらに分析した。
レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定するためのアッセイ法
レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定する機能アッセイ法を用いて、MASP-2 scFv候補クローンの「ブロッキング活性」を評価した。レクチン経路C3コンバターゼを構成する2つのタンパク質成分(C4b、C2a)を生成するためにはMASP-2セリンプロテアーゼ活性が必要とされる。従って、MASP-2機能活性を阻害するMASP-2 scFv(すなわち、ブロッキングMASP-2 scFv)はレクチン経路C3コンバターゼの新規形成を阻害する。C3は、その構造の一部として珍しい高反応性のチオエステル基を含有する。このアッセイ法においてC3コンバターゼによりC3が切断されると、C3b上にあるチオエステル基は、エステル結合またはアミド結合を介して、プラスチックウェルの底に固定化された高分子上にあるヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を形成することができ、従って、ELISAアッセイ法におけるC3b検出が容易になる。
酵母マンナンは公知のレクチン経路アクチベーターである。C3コンバターゼの形成を測定する以下の方法では、マンナンでコーティングしたプラスチックウェルを希釈ヒト血清とインキュベートして、レクチン経路を活性化した。次いで、ウェルを洗浄し、標準的なELISA法を用いてウェル上に固定化したC3bについてアッセイした。このアッセイ法において生成したC3bの量は、レクチン経路C3コンバターゼの新規形成を直接反映したものである。このアッセイ法では、選択された濃度のMASP-2 scFvクローンが、C3コンバターゼ形成およびその結果として起きるC3b生成を阻害する能力を試験した。
方法:
前記のように同定した45個の候補クローンを発現させ、精製し、同じストック濃度まで希釈し、確実に全クローンに等量の緩衝液があるように、Ca++およびMg++を含有するGVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1％ゼラチン、pH7.4)で再希釈した。scFvクローンをそれぞれ、2μg/mLの濃度で3つ組で試験した。陽性対照はOMS100 Fab2であり、0.4μg/mLで試験した。scFv/IgGクローンの存在下および非存在下でC3c形成をモニタリングした。
マンナンを、50mM炭酸緩衝液(15mM Na2CO3+35mM NaHCO3+1.5mM NaN3)、pH9.5で20μg/mL(1μg/ウェル)の濃度まで希釈し、ELISAプレートに4℃で一晩コーティングした。翌日、マンナンコーティングプレートをPBS 200μlで3回洗浄した。次いで、1％HSAブロッキング溶液100μlをウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートはPBS 200μlで3回洗浄され、かつ、試料の添加までPBS 200μlを加えて氷上で保管された。
正常ヒト血清をCaMgGVB緩衝液で0.5％まで希釈し、この緩衝液に、scFvクローンまたはOMS100 Fab2陽性対照を0.01μg/mL;1μg/mL(OMS100対照のみ)および10μg/mLにおいて3つ組で添加し、氷上で45分間プレインキュベートした後に、ブロックされたELISAプレートに添加した。37℃で1時間インキュベートすることによって反応を開始した。プレートを氷浴に移すことによって反応を止めた。ウサギα-マウスC3c抗体の後にヤギα-ウサギHRPを用いてC3b沈着が検出された。陰性対照は、抗体を含まない緩衝液(抗体なし=最大C3b沈着)であった。陽性対照は、EDTAを含む緩衝液(C3b沈着なし)であった。バックグラウンドは、ウェルがマンナンを含まないこと以外は同じアッセイ法を行うことによって決定された。マンナンを含有するウェルのシグナルから、マンナンを含まないプレートに対するバックグラウンドシグナルを差し引いた。カットオフ基準は、関連のないscFvクローン(VZV)および緩衝液のみの活性の半分に設定した。
結果:
カットオフ基準に基づいて、合計13個のクローンがMASP-2活性を妨げることが見出された。＞50％の経路抑制を生じた13個全てのクローンを選択および配列決定して、10個のユニークなクローンを得た。10個全てのクローンが同じ軽鎖サブクラス、λ3を有することが見出されたが、3つの異なる重鎖サブクラス:VH2、VH3、およびVH6を有することが見出された。機能アッセイ法において、10個の候補scFvクローンから5個が、0.5％ヒト血清を用いて、25nM目標基準よりも少ないIC50nM値を示した。
有効性が向上した抗体を同定するために、前記のように同定した3個の母scFvクローンを軽鎖シャッフリングに供した。このプロセスには、6人の健常ドナーに由来するナイーブヒトλ軽鎖(VL)ライブラリーと対になった、母クローンそれぞれのVHからなるコンビナトリアルライブラリーの作製を伴った。次いで、結合親和性および/または機能が改善されたscFvクローンがあるかどうか、このライブラリーをスクリーニングした。
（表８）主要な娘クローンおよびそれらのそれぞれの母クローン(全てscFv形式)のIC50 (nM)で表した機能的有効性の比較
Figure 0006893554
上記の表8に示した母クローンおよび娘クローンの重鎖可変領域(VH)配列を以下に示した。
Kabat CDR(31-35(H1)、50-65(H2)、および95-107(H3))を太字で示した。Chothia CDR(26-32(H1)、52-56(H2)、および95-101(H3))に下線を引いた。
17D20_35VH-21N11VL重鎖可変領域(VH)(SEQ ID NO:66によってコードされる、SEQ ID NO:67)
Figure 0006893554
d17N9重鎖可変領域(VH)(SEQ ID NO:68)
Figure 0006893554
上記の表8に示した母クローンおよび娘クローンの軽鎖可変領域(VL)配列を以下に示した。
Kabat CDR(24〜34(L1);50〜56(L2);および89〜97(L3)を太字で示した。Chothia CDR(24〜34(L1);50〜56(L2);および89〜97(L3)に下線を引いた。KabatシステムでナンバリングしてもChothiaシステムでナンバリングしても、これらの領域は同一である。
17D20m_d3521N11軽鎖可変領域(VL)(SEQ ID NO:70によってコードされる、SEQ ID NO:69)
Figure 0006893554
17N16m_d17N9軽鎖可変領域(VL)(SEQ ID NO:71)
Figure 0006893554
MASP-2抗体であるOMS100およびMoAb_d3521N11VL(SEQ ID NO:67に示した重鎖可変領域とSEQ ID NO:69に示した軽鎖可変領域を含む。「OMS646」および「mAb6」とも呼ぶ)はいずれも高い親和性でヒトMASP-2に結合し、機能的補体活性を妨げる能力を有することが証明されており、これらをドットブロット分析によってエピトープ結合について分析した。これらの結果により、OMS646抗体およびOMS100抗体はMASP-2に対して高度に特異的であり、MASP-1/3に結合しないことが示される。どちらの抗体も、MAp19にも、MASP-2のCCP1ドメインを含有しないMASP-2断片にも結合しなかった。このことから結合部位はCCP1を含むと結論付けられた。
MASP-2抗体OMS646は、C1s、C1r、またはMASP-1と比較して5000倍超の選択性で組換えMASP-2に強く結合することが決定された(Kd60〜250pM)(以下の表9を参照されたい)。
（表９）固相ELISA試験によって評価した場合のOMS646 MASP-2抗体-MASP-2相互作用の親和性および特異性
Figure 0006893554
＊平均±SD; n=12。
OMS646はレクチン依存的な終末補体成分活性化を特異的に遮断する
方法:
膜侵襲複合体(MAC)沈着に及ぼすOMS646の影響を、レクチン経路、古典経路、および第二経路の経路特異的条件を用いて分析した。この目的のために、Wieslab Comp300補体スクリーニングキット(Wieslab, Lund, Sweden)を製造業者の説明書に従って使用した。
結果:
図12Aは、レクチン経路特異的アッセイ条件下、抗MASP-2抗体(OMS646)の存在下または非存在下でのMAC沈着レベルを図示する。図12Bは、古典経路特異的アッセイ条件下、抗MASP-2抗体(OMS646)の存在下または非存在下でのMAC沈着レベルを図示する。図12Cは、第二経路特異的アッセイ条件下、抗MASP-2抗体(OMS646)の存在下または非存在下でのMAC沈着レベルを図示する。
図12Aに示したように、OMS646は、レクチン経路を介したMAC沈着活性化をIC50値 約1nMで遮断する。しかしながら、OMS646は、古典経路を介した活性化から生じたMAC沈着(図12B)にも第二経路を介した活性化から生じたMAC沈着(図12C)にも影響を及ぼさなかった。
マウスに静脈内(IV)投与または皮下(SC)投与した後のOMS646の薬物動態学および薬物動力学
マウスにおける28日間の単回投与PK/PD試験においてOMS646の薬物動態学(PK)および薬物動力学(PD)を評価した。この試験では、5mg/kgおよび15mg/kgの用量レベルの皮下(SC)投与OMS646ならびに5mg/kgの用量レベルの静脈内(IV)投与OMS646を試験した。
OMS646のPKプロファイルに関して、図13は、示された用量のOMS646を投与した後の時間の関数としてのOMS646濃度(n=3動物/群の平均)を図示する。図13に示したように、5mg/kg SCのOMS646は、投与してから約1〜2日後に5〜6μg/mLの最大血漿中濃度に達した。5mg/kg SCのOMS646のバイオアベイラビリティは約60％であった。図13にさらに示したように、15mg/kg SCのOMS646は、投与してから約1〜2日後に10〜12μg/mLの最大血漿中濃度に達した。全群について、OMS646は体循環からゆっくりと除去され、終末相半減期(terminal half-life)は約8〜10日であった。OMS646のプロファイルはマウスにおけるヒト抗体に典型的である。
OMS646のPD活性を図14Aおよび図14Bに図示した。図14Aおよび14Bは、5mg/kg IV(図14A)群および5mg/kg SC(図14B)群における、それぞれのマウスのPD応答(全身レクチン経路活性の低下)を示す。破線はアッセイ法のベースラインを示す(最大阻害;アッセイ前に、インビトロで過剰なOMS646が添加されたナイーブマウス血清)。図14Aに示したように、5mg/kgのOMS646をIV投与した後に全身レクチン経路活性はすぐに、ほぼ検出不可能なレベルまで低下した。レクチン経路活性は28日間の観察期間にわたってわずかな回復しか示さなかった。図14Bに示したように、5mg/kgのOMS646 SCが投与されたマウスでは、時間依存的なレクチン経路活性阻害が観察された。薬物を投与してから24時間以内にレクチン経路活性はほぼ検出不可能なレベルまで低下し、少なくとも7日間、低いレベルのままであった。レクチン経路活性は時間と共に徐々に増加したが、28日間の観察期間内に投与前のレベルに戻らなかった。15mg/kg SCを投与した後に観察されたレクチン経路活性対時間プロファイルは5mg/kg SC用量とほぼ同じであった(データは示さず)。これはPDエンドポイントの飽和を示している。さらに、データから、IVまたはSCのいずれかで投与された5mg/kgのOMS646の毎週用量が、マウスにおける全身レクチン経路活性の連続的な抑制を達成するのに十分であることが示された。
実施例13
本実施例は、MASP-2に特異的に結合する1つまたは複数のCDRを含む重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域と、少なくとも1つのSGMIコアペプチド配列を含む、MASP-2を阻害する組換え抗体(SGMIペプチド含有MASP-2抗体またはその抗原結合断片とも呼ばれる)の作製について説明する。
背景/基本原理:
SGMI-2と呼ばれるMASP-2特異的阻害因子の作製は、Heja et al., J Biol Chem 287:20290 (2012)およびHeja et al., PNAS 109:10498 (2012)に記載されている。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。SGMI-2は、プロテアーゼ結合ループの8つの位置のうち6つが完全にランダム化されたサバクトビバッタ(Schistocerca gregaria)プロテアーゼインヒビター2変種のファージライブラリーから選択された36アミノ酸ペプチドである。それに続くインビトロ進化によって、KI値が一桁のnMである単一特異的阻害因子が得られた(Heja et al., J. Biol. Chem. 287:20290, 2012)。構造研究から、最適化されたプロテアーゼ結合ループは、2つの阻害因子の特異性を規定する一次結合部位を形成することが明らかになった。拡大された二次結合領域および内部結合領域のアミノ酸配列は2つの阻害因子に共通して見られ、接触境界面に寄与する(Heja et al., 2012. J. Biol. Chem. 287:20290)。機構的に、SGMI-2は古典経路に影響を及ぼすことなく補体活性化のレクチン経路を遮断する(Heja et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109:10498)。
SGMI-2阻害因子のアミノ酸配列を以下に示した。
Figure 0006893554
本実施例に記載のように、またWO2014/144542に記載のように、SGMI-2ペプチドアミノ酸配列(例えば、SEQ ID NO:72、73、または74)をヒトMASP-2抗体の重鎖および/または軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端と融合することによって、SGMI-2ペプチド含有MASP-2抗体およびその断片を作製した。SGMI-2ペプチド含有MASP-2抗体および断片には、WO2014/144542に記載のようにヒト血清を用いるC3bまたはC4b沈着アッセイ法で測定した時に、SGMI-2ペプチド配列を含有しない裸のMASP-2スキャフォールド抗体と比較して強い阻害活性があり、マウスモデルにおいてインビボで測定した時にも裸のMASP-2スキャフォールド抗体と比較して強い阻害活性がある。SGMI-2ペプチド含有MASP-2抗体を作製する方法を以下で説明する。
方法:
4種類の例示的なSGMI-2ペプチド含有MASP-2抗体をコードするように発現構築物を作製した。ここでは、SGMI-2ペプチドを、代表的なMASP-2阻害抗体OMS646の重鎖または軽鎖のN末端またはC末端と融合した(実施例12に記載のように作製した)。
(表１０)MASP-2抗体/SGMI-2融合
Figure 0006893554
表10の略語:
「H-N」=重鎖のアミノ末端
「H-C」=重鎖のカルボキシル末端
「L-N」=軽鎖のアミノ末端
「L-C」=軽鎖のカルボキシル末端
「M2」=MASP-2 abスキャフォールド(代表的なOMS646)
表10に示したN末端融合については、ペプチドリンカー(「GTGGGSGSSS」SEQ ID NO:79)をSGMI-2ペプチドと可変領域との間に加えた。
表10に示したC末端融合については、ペプチドリンカー(「AAGGSG」SEQ ID NO: 80)を定常領域とSGMI-2ペプチドとの間に加え、C末端のSGMI-2ペプチドを分解から守るために第2のペプチド「GSGA」(SEQ ID NO: 81)を融合ポリペプチドのC末端に加えた。
以下の代表的なMASP-2抗体/SGMI-2融合のアミノ酸配列を下記に示した。
H-M2ab6-SGMI-2-N(SEQ ID NO:75。SEQ ID NO:82によってコードされる):
Figure 0006893554
[491aaタンパク質、aa1〜36=SGMI-2(下線)、aa37〜46=リンカー(イタリック体);aa47〜164=MASP-2 ab番号6の重鎖可変領域(下線);aa165〜491=ヒンジ変異のあるIgG4定常領域]
H-M2ab6-SGMI-2-C(SEQ ID NO:76。SEQ ID NO:83によってコードされる):
Figure 0006893554
[491aaタンパク質、aa1〜118=MASP-2 ab番号6の重鎖可変領域(下線);aa119〜445=ヒンジ変異のあるIgG4定常領域;aa446〜451=1番目のリンカー(イタリック体);aa452〜487=SGMI-2;aa488〜491=2番目のリンカー(イタリック体)]
L-M2ab6-SGMI-2-N(SEQ ID NO:77。SEQ ID NO:84によってコードされる):
Figure 0006893554
[258aaタンパク質、aa1〜36=SGMI-2(下線);aa37〜46=リンカー(イタリック体);aa47〜152=MASP-2 ab番号6の軽鎖可変領域(下線);aa153〜258=ヒトIgλ定常領域]
L-M2ab6-SGMI-2-C(SEQ ID NO:78。SEQ ID NO:85によってコードされる):
Figure 0006893554
[258aaタンパク質、aa1〜106=MASP-2 ab番号6の軽鎖可変領域(下線);aa107〜212=ヒトIgλ定常領域;aa213〜218=1番目のリンカー;aa219〜254=SGMI-2;aa255〜258=2番目のリンカー]
機能アッセイ法:
4種類のMASP-2-SGMI-2融合抗体構築物をExpi293F細胞(Invitrogen)において一過的に発現させ、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、下記で説明するように、C3b沈着を阻害するかどうかマンナンコーティングビーズアッセイ法において10％正常ヒト血清中で試験した。
C3b沈着があるかどうかMASP-2-SGMI-2融合をマンナンコーティングビーズアッセイ法において試験する
MASP-2-SGMI-2融合抗体がレクチン経路を阻害するかどうか、マンナンコーティングビーズ上でのC3b沈着アッセイ法において評価した。このアッセイ法は、フローサイトメトリーによって活性の程度を求め、Wieslab(登録商標)アッセイ法よりも高い分解能を提供する。レクチン経路ビーズアッセイ法を以下の通りに行った。マンナンを炭酸塩-重炭酸緩衝液(pH9.6)中で7μM直径のポリスチレンビーズ(Bangs Laboratories; Fishers, IN, USA)に4℃で一晩吸着させた。ビーズをPBSで洗浄し、10％ヒト血清、または抗体もしくは阻害因子とプレインキュベートした10％血清に曝露した。血清-ビーズ混合物を攪拌しながら室温で1時間インキュベートした。血清インキュベーション後に、ビーズを洗浄し、抗C3cウサギポリクローナル抗体(Dako North America; Carpinteria, CA, USA)およびPE-Cy5結合ヤギ抗ウサギ二次抗体(Southern Biotech; Birmingham, AL, USA)を用いた検出によってビーズ上でのC3b沈着を測定した。染色手順後に、FACSCaliburフローサイトメーターを用いてビーズを分析した。前方散乱光および側方散乱光を用いてビーズを均一な集団としてゲーティングした。C3b沈着はFL3陽性粒子として明らかであった(FL-3または「FL-3チャンネル」はサイトメーターにある3番目のチャンネルまたは赤色チャンネルを示す)。レクチン経路阻害を評価するために、各実験条件について集団の幾何平均蛍光強度(MFI)を抗体/阻害因子濃度に対してプロットした。
IC50値を、GraphPad PRISMソフトウェアを用いて計算した。具体的には、可変勾配(4パラメータ)非線形フィットを、サイトメトリーアッセイ法から得たlog(抗体)対平均蛍光強度曲線に適用することによってIC50値を得た。
結果を表11に示した。
(表１１)10％ヒト血清中でのC3b沈着(マンナンコーティングビーズアッセイ法)
Figure 0006893554
結果:
対照である、SGMIを含有しない「裸の」MASP-2スキャフォールド抗体(mAb番号6)は、このアッセイ法では阻害性であり、IC50値は≧3.63nMであった。これは、実施例12において観察された阻害結果と合致する。注目すべきことに、表11に示したように、試験したSGMI-2-MASP-2抗体融合は全て、このアッセイ法ではMASP-2スキャフォールド抗体の効力を改善した。このことから、結合価の増加もC3b沈着阻害に有益であり得ることが示唆される。
10％ヒト血清を用いたC4b沈着アッセイ法のためにマンナンコーティングビーズアッセイ法においてMASP-2-SGMI-2融合を試験する
10％ヒト血清と、C3b沈着アッセイ法について前述したものと同じアッセイ条件を使用し、以下の変更を加えてC4b沈着アッセイ法を行った。C4b検出およびフローサイトメトリー分析は、沈着反応を抗C4bマウスモノクローナル抗体(1:500, Quidel)で染色し、PE Cy5結合二次ヤギ抗マウスF(ab’)2(1:200, Southern Biotech)で染色した後に、フローサイトメトリーで分析することによって行った。
結果:
SGMI-2を有するMASP-2-N末端抗体融合(H-M2-SGMI-2-N:IC50=0.34nM)、L-M2-SGMI-2-N:IC50=0.41nM))は両方ともMASP-2スキャフォールド抗体(HL-M2:IC50=0.78nM)と比較して効力が高かった。
同様に、1つのSGMI-2を有するC末端MASP-2抗体融合(H-M2-SGMI-2-C:IC50=0.45nMおよびL-M2-SGMI-2C:IC50=0.47nM)は両方とも、MASP-2スキャフォールド抗体(HL-M2:IC50=1.2nM)と比較して効力が高かった。
10％マウス血清を用いてC3bが沈着するかどうかマンナンコーティングビーズアッセイ法においてMASP-2-SGMI-2融合を試験する
C3bが沈着するかどうか、10％マウス血清を用いてマンナンコーティングビーズアッセイ法を前記のように行った。ヒト血清において観察された結果と同様に、マウス血清中で、SGMI-2を有するMASP-2融合はMASP-2スキャフォールド抗体と比較して効力が高いことが確かめられた。
結果の概要:
本実施例の結果から、試験したSGMI-2-MASP-2抗体融合は全てMASP-2スキャフォールド抗体の効力を改善したことが証明される。
実施例14
本実施例は、腎臓線維症におけるレクチン経路の役割を評価するために、MASP-2-/-欠損マウスおよびMASP-2+/+十分マウスにおける腎臓線維症の片側尿管結紮(UUO)モデルを用いて得られた結果を示す。
背景/基本原理:
腎臓の線維症および炎症は後期腎臓疾患の顕著な特徴である。腎臓尿細管間質性線維症は、持続的な細胞損傷、異常な治癒、常在性腎臓細胞および浸潤腎臓細胞の活性化、サイトカイン放出、炎症、ならびに細胞外マトリックスを産生する腎臓細胞の表現型活性化を伴う進行性のプロセスである。腎臓尿細管間質性(TI)線維症は複数の腎臓病態の共通エンドポイントであり、慢性腎疾患(CKD)における進行性の腎機能障害を予防することを目的とする、可能性のある療法の重要な標的である。腎臓TI損傷は腎糸球体疾患における腎機能低下と密接な関係があり(Risdon R.A. et al., Lancet 1: 363-366, 1968; Schainuck L.I. et al, Hum Pathol 1: 631-640, 1970; Nath K.A., Am J Kid Dis 20:1-17, 1992)、CKDを特徴とする。この場合、筋線維芽細胞が蓄積し、尿細管と、管周囲の毛細血管との間にある潜在的な空間は、コラーゲンと他のプロテオグリカンで構成されるマトリックスによって占有されるようになる。TI筋線維芽細胞の起源は激しい議論の余地が残されているが、一般的に、線維症の前には、最初のうちはTリンパ球のTI蓄積を特徴とし、次いで後になってマクロファージのTI蓄積を特徴とする炎症が生じる(Liu Y. et al., Nat Rev Nephrol 7:684-696, 2011; Duffield J.S., J Clin Invest 124:2299-2306, 2014)。
UUOのげっ歯類モデルは、ほぼ全ての原因の進行性腎臓病の顕著な特徴である進行性腎臓線維症を生じる(Chevalier et al., Kidney International 75:1145-1152, 2009)。UUO後の野生型マウスではC3遺伝子発現が増加し、UUO後のC3-/-ノックアウトマウスでは野生型マウスと比較してコラーゲン沈着が有意に低下したと報告されている。このことから、腎臓線維症における補体活性化の役割が示唆される(Fearn et al., Mol Immunol 48:1666-1733, 2011)。C5欠損が尿細管間質損傷モデルにおける腎臓線維症の主な成分の有意な寛解につながったことも報告されている(Boor P. et al., J of Am Soc of Nephrology: 18:1508-1515, 2007)。しかしながら、本発明者らが行った本明細書に記載の研究の前には、腎臓線維症に関与する特定の補体成分は詳細に明らかにされていなかった。従って、片側尿管結紮(UUO)モデルにおいてMASP-2(-/-)雄マウスおよびMASP-2(+/+)雄マウスを評価するために以下の研究を行った。
方法:
実施例1に記載のようにMASP-2-/-マウスを作製し、C57BL/6と10世代にわたって戻し交配した。雄の野生型(WT)C57BL/6マウス、およびC57BL/6背景のホモ接合性MASP-2欠損(MASP-2-/-)マウスを12/12昼夜サイクルの標準化された条件下で飼育し、標準的なフードペレットを与え、食物および水を自由にとれるようにした。1群につき6匹の10週齢マウスに、1.5L/分 酸素で、2.5％イソフルランで麻酔をかけた。10週齢の雄C56/BL6マウスの2つの野生型群およびMASP-2-/-群の右尿管を外科手術により結紮した。1cm側腹部切開により右腎臓を露出させた。6/0ポリグラクチン縫合糸を用いて右尿管を2箇所で完全に結紮した。手術前後に、疼痛スコアリングに応じて12時間ごとに5回までブプレノルフィン無痛法を行った。外科手術中に局所ブピバカイン麻酔薬を1回与えた。
外科手術の7日後にマウスを屠殺し、腎臓組織を収集し、固定し、パラフィンブロックに包埋した。麻酔下で心臓穿刺によってマウスから血液を収集し、腎摘出後にマウスを放血によって間引いた。血液を氷上で2時間凝固させ、血清を遠心分離によって分離し、アリコートとして-80℃で凍結した。
腎臓組織の免疫組織化学
コラーゲン沈着によって示されるような腎臓線維症の程度を測定するために、Whittaker P. et al., Basic Res Cardiol 89:397-410, 1994に記載のように、5ミクロンのパラフィン包埋腎臓切片を、コラーゲン特異的染料であるピクロシリウスレッドで染色した。簡単に述べると、腎臓切片を脱パラフィンし、再水和し、ピクリン酸の飽和水溶液500mLに溶解したピクロシリウスレッド水溶液(0.5 gmシリウスレッド, Sigma, Dorset UK)で1時間、コラーゲン染色した。スライドを酸性化水(蒸留水に溶解した0.5％氷酢酸)で2回、それぞれ5分間洗浄し、次いで、脱水およびマウントした。
マクロファージ浸潤によって示されるような炎症の程度を測定するために、腎臓切片を以下の通りにマクロファージ特異的抗体F4/80で染色した。ホルマリン固定し、パラフィン包埋した5ミクロン腎臓切片を脱パラフィンおよび再水和した。抗原賦活化をクエン酸緩衝液中で95℃で20分間行い、その後に、3％H2O2中で10分間インキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼ活性を止めた。組織切片を、ブロッキング緩衝液(10％熱失活正常ヤギ血清と1％ウシ血清アルブミンを溶解したリン酸緩衝食塩水(PBS))の中で室温で1時間インキュベートし、その後に、アビジン/ビオチンブロッキングを行った。各工程の後に、組織切片をPBSで3回、5分間にわたって洗浄した。ブロッキング緩衝液で1:100に希釈したF4/80マクロファージ一次抗体(Santa Cruz, Dallas, TX, USA)を1時間適用した。次いで、1:200に希釈したビオチン化ヤギ抗ラット二次抗体を30分間適用し、その後に、ウマラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合酵素を30分適用した。ジアミノベンジジン(DAB)基質(Vector Labs, Peterborough UK)を用いて染料の色を10分間発色させ、スライドを水で洗浄し、脱水し、コンピュータによる分析を容易にするために対比染色することなくマウントした。
画像解析
腎皮質染色のパーセントを、Furness P. N. et al., J Clin Pathol 50:118-122, 1997に記載のように確かめた。簡単に述べると、24ビットカラー画像を、腎臓切片の周辺部全体を取り囲んでいる腎被膜の真下にある腎皮質の重複しない連続視野から取り込んだ。画像を取り込むごとに、NIH Imageを用いて8ビットモノクロ画像として赤色チャンネルを抽出した。切片が所定の位置に置かれていない、光を当てた顕微鏡視野の予め記録した画像を用いて、背景照明のばらつきを取り去った。染色陽性に対応する画像の領域を同定するために、画像を、ある決まった閾値にかけた。次いで、黒い画素のパーセントを計算した。このように、腎臓の周囲にある画像を全て測定した後に平均パーセントを記録して、腎臓切片にある染色領域のパーセントに対応する値を得た。
遺伝子発現分析
マウス腎臓における腎臓炎症および線維症に関連する、いくつかの遺伝子の発現を以下の通りに定量PCT(qPCR)によって測定した。トリゾル(登録商標)(ThermoFisher Scientific, Paisley、UK)を使用し、製造業者の説明書に従って、全RNAを腎皮質から単離した。DNA汚染を無くすために、Turbo DNA-free kit(ThermoFisher Scientific)を用いて、抽出したRNAを処理し、次いで、AMV Reverse Transcription System(Promega, Madison, WI, USA)を用いて第1鎖cDNAを合成した。TaqMan GAPDH Assay(Applied Biosystems, Paisley UK)を用いた1回のqPCR反応と、それに続くCustom TaqMan Array 96-well Plates(Life Technologies, Paisley, UK)を用いたqPCR反応によってcDNA完全性を確認した。
本分析では12の遺伝子を研究した:
コラーゲンIV型α1(col4α1; Assay ID: Mm01210125_m1)
トランスフォーミング成長因子β-1(TGFβ-1; Assay ID: Mm01178820_m1);
カドヘリン1(Cdh1; Assay ID: Mm01247357_m1);
フィブロネクチン1(Fn1; Assay ID:Mm01256744_m1);
インターロイキン6(IL6; Assay ID Mm00446191_m1);
インターロイキン10(IL10; Assay ID Mm00439614_m1);
インターロイキン12a(IL12a; Assay ID Mm00434165_m1);
ビメンチン(Vim; Assay ID Mm01333430_m1);
アクチニンα1(Actn1; Assay ID Mm01304398_m1);
腫瘍壊死因子-α(TNF-α; Assay ID Mm00443260_g1)
補体成分3(C3; Assay ID Mm00437838_m1);
インターフェロンγ(Ifn-γ; Assay ID Mm01168134)
以下のハウスキーピング対照遺伝子を使用した:
グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH; Assay ID Mm99999915_g1);
グルクロニダーゼβ(Gusβ; Assay ID Mm00446953_m1);
真核生物18S rRNA(18S; Assay ID Hs99999901_s1);
ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT; Assay ID Mm00446968_m1)
20μLの反応物を、TaqMan Fast Universal Master Mix(Applied Biosystems)を用いて40サイクルにわたって増幅した。リアルタイムPCR増幅データを、Applied Biosystems 7000 SDS v1.4ソフトウェアを用いて分析した。
結果:
片側尿管結紮(UUO)後に、結紮された腎臓には炎症細胞、特にマクロファージが流入し、その後にすぐさま、尿細管が膨張し、近位尿細管上皮が薄くなることと並行してコラーゲンが蓄積することにより証明されるように線維症が発症した(Chevalier R. L. et al., Kidney Int 75:1145-1152, 2009を参照されたい)。
図15は、シリウスレッドで染色された腎臓組織切片のコンピュータによる画像解析の結果を図示する。ここで、組織切片は、尿管結紮(UUO)を7日間行った後の野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスまたは偽手術した対照マウスから入手した。図15に示したように、尿管結紮を7日間行った後の野生型マウスの腎臓切片はMASP-2-/-マウスと比較して有意に多いコラーゲン沈着を示した(p値=0.0096)。野生型群のUUO手術マウスの平均値±平均の標準誤差は24.79±1.908(n=6)であり、MASP-2-/-群のUUO手術マウスの平均値±平均の標準誤差は16.58±1.3(n=6)であった。さらに図15に示したように、偽手術した対照野生型マウスおよび偽手術した対照MASP-2-/-マウスからの組織切片は、予想した通り、非常に低いレベルのコラーゲン染色を示した。
図16は、F4/80マクロファージ特異的抗体で染色された腎臓組織切片のコンピュータによる画像解析の結果を図示する。ここで、組織切片は、尿管結紮を7日間行った後の野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスまたは偽手術した対照マウスから入手した。図16に示したように、野生型マウスと比較して、MASP-2-/-マウスに由来するUUO腎臓から入手した組織は、尿管結紮を7日間行った後に、有意に少ないマクロファージ浸潤を示した(WTにおいて染色されたマクロファージ領域％:2.23±0.4対MASP-2-/-において染色されたマクロファージ領域％:0.53±0.06、p=0.0035)。さらに図16に示したように、偽手術した野生型マウスおよび偽手術したMASP-2-/-マウスに由来する組織切片は、検出可能なマクロファージ染色を示さなかった。
尿管結紮を7日間行った後の野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスならびに偽手術した野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスから入手した腎臓組織切片において、腎臓の炎症および線維症と結び付けられた様々な遺伝子の遺伝子発現分析を行った。図17〜図20に示したデータは、偽手術した野生型試料に対する相対的定量化のLog10であり、バーは平均の標準誤差を表す。線維症関連遺伝子の遺伝子発現分析の結果について、図17は、尿管結紮を7日間行った後の野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスならびに偽手術した対照マウスから入手した腎臓組織切片においてqPCRによって測定した時のコラーゲンIV型α1(コラーゲン-4)の相対mRNA発現レベルを図示する。図18は、尿管結紮を7日間行った後の野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスならびに偽手術した対照マウスから入手した腎臓組織切片においてqPCRによって測定した時のトランスフォーミング成長因子β-1(TGFβ-1)の相対mRNA発現レベルを図示する。図17および図18に示したように、野生型マウスに由来する、結紮された腎臓は、野生型マウスの偽手術した腎臓と比較して線維症関連遺伝子コラーゲンIV型(図17)およびTGFβ-1(図18)の有意な発現増加を示した。このことから、これらの線維症関連遺伝子は、予想した通り野生型マウスではUUO損傷後に誘発されることが証明される。対照的に、さらに図17および図18に示したように、UUO損傷に供されたMASP-2-/-に由来する、結紮された腎臓は、UUO損傷に供された野生型マウスと比較して、コラーゲンIV型の有意な発現低下(図17、p=0.0388)およびTGFβ-1の有意な発現低下(図18、p=0.0174)を示した。
炎症関連遺伝子の遺伝子発現分析の結果について、図19は、尿管結紮を7日間行った後の野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスならびに偽手術した対照マウスから入手した腎臓組織切片においてqPCRによって測定した時のインターロイキン-6(IL-6)の相対mRNA発現レベルを図示する。図20は、尿管結紮を7日間行った後の野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスならびに偽手術した対照マウスから入手した腎臓組織切片においてqPCRによって測定した時のインターフェロン-γの相対mRNA発現レベルを図示する。図19および図20に示したように、野生型マウスに由来する、結紮された腎臓は、野生型マウスにおける偽手術した腎臓と比較して炎症関連遺伝子インターロイキン-6(図19)およびインターフェロン-γ(図20)の有意な発現増加を示した。このことから、これらの炎症関連遺伝子は、野生型マウスではUUO損傷後に誘発されることが証明される。対照的に、さらに図19および図20に示したように、UUO損傷に供されたMASP-2-/-に由来する、結紮された腎臓は、UUO損傷に供された野生型マウスと比較してインターロイキン-6の有意な発現低下(図19、p=0.0109)およびインターフェロン-γの有意な発現低下(図20、p=0.0182)を示した。
Vim、Actn-1、TNFα、C3、およびIL-10の遺伝子発現は全て、野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスから入手したUUO腎臓において有意にアップレギュレートされることが見出され、これらの特定の遺伝子の発現レベルには野生型マウスとMASP-2-/-マウスとの間で有意差が無かったことに注目する(データ示さず)。Cdh-1およびIL-12aの遺伝子発現レベルは、どの群の動物に由来する、結紮された腎臓でも変化しなかった(データ示さず)。
考察:
げっ歯類におけるUUOモデルは、結紮後、1〜2週間以内に、結紮された腎臓において、腎臓血流の低下、間質炎症、および急速な線維症を伴う早期の、活発な、かつ重度の損傷を誘発すると認識され、腎臓における炎症および線維症の共通の機構およびメディエーターを理解するために広範に用いられてきた(例えば、Chevalier R.L., Kidney Int 75:1145-1152, 2009; Yang H. et al., Drug Discov Today Dis Models 7:13-19, 2010を参照されたい)。
本実施例に記載の結果から、野生型(+/+)対照マウスと比べてMASP-2(-/-)マウスにおけるUUO手術した腎臓ではコラーゲン沈着およびマクロファージ浸潤が有意に低下することが証明される。MASP-2-/-動物では組織学的発現レベルおよび遺伝子発現レベル両方で腎損傷の有意な低下が示されたという予想外の結果から、結紮された腎臓における炎症および線維症の発症には補体活性化のレクチン経路が大いに寄与することが証明される。特定の理論に拘束されるものではないが、レクチン経路は、細胞損傷が炎症の原動力となり、炎症の結果として、さらなる細胞損傷、瘢痕、および組織喪失が起こる悪循環を永続させる炎症促進刺激を誘発および維持することで線維性疾患の病態生理に決定的に寄与すると考えられている。これらの結果を考えると、阻害因子を用いたMASP-2の阻害または遮断には、腎臓線維症の阻害または予防において予防効果および/または治療効果があり、それに加えて、線維症全般を(すなわち、組織または臓器とは無関係に)阻害または予防するための予防効果および/または治療効果があると予想される。
実施例15
本実施例は、腎臓線維症のマウスモデルである片側尿管結紮(UUO)モデルにおける効力についてのモノクローナルMASP-2阻害抗体の分析について説明する。
背景/基本原理:
複数の腎臓病態の共通エンドポイントである腎臓尿細管間質性線維症の寛解は、進行性腎臓病を予防することを目的とする治療方針の重要な目標である。腎臓病における炎症性線維促進経路を標的とする新たな治療および既存の治療がほとんど無いことを考慮すると、新たな療法を開発する差し迫った必要性がある。多くのタンパク尿性腎臓病患者が、尿細管間質性炎症と、腎機能の低下と密接に対応する進行性線維症を示す。タンパク尿そのものが、尿細管間質性炎症と、タンパク尿性腎症の発症を誘発する(Brunskill N.J. et al., J Am Soc Nephrol 15:504-505, 2004)。原発性腎臓病に関係なく、尿細管間質の炎症および線維症は進行性の腎機能低下がある患者において必ず認められ、排泄機能の低下と密接な相関関係がある(Risdon R.A. et al., Lancet 1:363-366, 1968; Schainuck L.I., et al., Hum Pathol 1: 631-640, 1970)。線維症につながる重要な共通する細胞経路を妨げる可能性のある療法には、腎臓障害において広い適用可能性があると期待される。
実施例14に記載のように、非タンパク尿性腎臓線維症のUUOモデルでは、MASP-2-/-マウスは、炎症細胞浸潤物(75％低下)および線維症の組織学的マーカー、例えば、コラーゲン(1/3低下)によって示されるように野生型対照動物と比較して有意に少ない腎臓の線維症および炎症を示すことが確かめられ、それによって、腎臓線維症におけるレクチン経路の重要な役割が実証された。
実施例13に記載のように、ヒトレクチン経路の機能を特異的に遮断する、モノクローナルMASP-2抗体(SGMI-2ペプチドがOMS646の重鎖のC末端と融合しているOMS646-SGMI-2融合)を作製した。これはマウスでもレクチン経路を遮断することが示されている。本実施例では、特異的なMASP-2阻害因子が腎臓線維症を阻害できるかどうか確かめるために、OMS646-SGMI-2を野生型マウスにおける腎臓線維症のUUOマウスモデルにおいて分析した。
方法:
本試験では、雄WT C57BL/6マウスにおけるMASP-2阻害抗体(10mg/kg OMS646-SGMI-2)の効果をヒトIgG4アイソタイプ対照抗体(10mg/kg ET904)およびビヒクル対照と比較して評価した。UUO外科手術の7日前、4日前、および1日前に、そして再度、外科手術の2日後に抗体(10mg/kg)を9匹のマウスの群に腹腔内(ip)注射によって投与した。レクチン経路の機能活性を評価するために、抗体投与前と、実験が終わった時に血液試料を採取した。
実施例14に記載の方法を用いて、UUO外科手術、組織収集、ならびにシリウスレッドおよびマクロファージ特異的抗体F4/80を用いた染色を行った。
特定の比色アッセイ試験キット(Sigma)を使用し、製造業者の説明書に従って、マウス腎臓のヒドロキシプロリン含有量を測定した。
マウスにおけるMASP-2阻害性mAbの薬力学的作用を評価するために、MASP-2 mAbまたは対照mAbをマウスに腹腔内投与した後、示された時間に収集した最小限に希釈した血清試料の中でレクチン誘発性C3活性化を定量することによって、全身レクチン経路活性を評価した。簡単に述べると、重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)に溶解した30μg/mLマンナン(Sigma)と一晩インキュベートすることによって、7μM直径ポリスチレンマイクロスフェア(Bangs Laboratories, Fisher IN, USA)をマンナンでコーティングし、次いで、洗浄し、PBSに溶解した1％胎仔ウシ血清でブロックし、1x108ビーズ/mLの最終濃度でPBSに再懸濁した。2.5μLのマンナンコーティングビーズ(約250,000個のビーズ)を50μLの最小限に希釈したマウス血清試料(90％最終血清濃度)に添加し、その後に、4℃で40分間インキュベートすることによって補体沈着反応を開始した。250μLの氷冷フローサイトメトリー緩衝液(FB: 0.1％胎仔ウシ血清を含有するPBS)を添加することによって沈着反応を終わらせた後に、ビーズを遠心分離によって収集し、300μLの氷冷FBを用いて、もう2回洗浄した。
レクチン誘発性C3活性化を定量するために、ビーズを、FBで希釈したウサギ抗ヒトC3c抗体(Dako, Carpenteria, CA, USA)50μLと4℃で1時間インキュベートした。結合しなかった材料を除去するためにFBで2回洗浄した後に、ビーズを、FBで希釈したPE-Cy5結合ヤギ抗ウサギ抗体(Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)50μLと4℃で30分間インキュベートした。結合しなかった材料を除去するためにFBで2回洗浄した後に、ビーズをFBに再懸濁し、FACS Caliburサイトメーターによって分析した。前方散乱光および側方散乱光を用いてビーズを均一な集団としてゲーティングし、各試料におけるC3b沈着を平均蛍光強度(MFI)として定量した。
結果:
コラーゲン沈着の評価:
図21は、シリウスレッドで染色された腎臓組織切片のコンピュータによる画像解析の結果を図示する。ここで、組織切片は、MASP-2阻害抗体で処置した野生型マウスおよびアイソタイプ対照抗体で処置した野生型マウスから、尿管結紮を7日間行った後に入手した。図21に示したように、MASP-2阻害抗体で処置した野生型マウスから入手した、結紮(UUO)して7日後に採取した腎臓からの組織切片は、IgG4アイソタイプ対照で処置した野生型マウスから入手した結紮された腎臓からの組織切片におけるコラーゲン沈着量と比較してコラーゲン沈着の有意な低下を示した(p=0.0477)。
ヒドロキシプロリン含有量の評価:
コラーゲン含有量の指標として腎臓組織においてヒドロキシプロリンを測定した。ヒドロキシプロリンは、このモデルにおいて誘発される疾患の病態生理学的進行を高度に示すパラメータである。
図22は、MASP-2阻害抗体またはアイソタイプ対照抗体で処置した野生型マウスから入手した、結紮(UUO)して7日後に採取した腎臓からのヒドロキシルプロリン含有量を図示する。図22に示したように、MASP-2阻害抗体で処置したマウスに由来する、結紮された腎臓組織は、IgG4アイソタイプ対照mAbで処置したマウスに由来する腎臓よりも有意に少ない、コラーゲン含有量の指標であるヒドロキシルプロリンを示した(p=0.0439)。
炎症の評価:
アイソタイプ対照抗体で処置した野生型動物およびMASP-2阻害抗体で処置した野生型動物からの結紮された腎臓は活発なマクロファージ浸潤物を示した。注意深く定量しても、これらの2つの群間でマクロファージ染色領域のパーセントには有意差が無いことが明らかになった(データ示さず)。しかしながら、同じ数の浸潤マクロファージがあったのにもかかわらず、MASP-2阻害抗体を注射した動物に由来する、結紮された腎臓は、シリウスレッド染色によって判断されるように、アイソタイプ対照を注射した動物に由来する、結紮された腎臓と比較して有意に少ない線維症を示した。この結果は、MASP-2阻害抗体で処置したマウスに由来する、結紮された腎臓組織のヒドロキシルプロリンが、IgG4アイソタイプ対照mAbで処置した腎臓よりも有意に少なかったという結果と合致する。
考察
本実施例に記載の結果から、MASP-2阻害抗体を使用すると、UUOモデルにおいて腎臓線維症からの保護が得られることが証明される。これは、MASP-2-/-マウスは野生型マウスと比較してUUOモデルの腎臓の線維症および炎症が有意に少ないことを証明した実施例14に記載の結果と合致する。本実施例の結果から、MASP-2阻害抗体で処置したマウスでは線維症が低減したことが分かる。MASP-2依存性レクチン経路活性が低下したか、または遮断された動物ではUUO腎臓の線維症が低減したという発見は極めて重要な新規の発見である。まとめると、実施例14および本実施例に示した結果から、腎臓尿細管間質性炎症、尿細管細胞損傷、線維形成促進性サイトカイン放出、および瘢痕に対するMASP-2阻害の有益な効果が証明される。腎臓線維症の緩和は依然として腎臓治療の重要な目標である。UUOモデルは進行性腎臓線維症の重大なモデルであり、MASP-2阻害抗体を使用するなど、このモデルにおいて線維症を低減する介入は、腎臓線維症を阻害または予防するために用いられる可能性が高い。UUOモデルからの結果は、腎糸球体損傷および/またはタンパク尿性尿細管損傷を特徴とする腎臓病に移すことができる可能性が高い。
実施例16
本実施例は、タンパク尿性腎症におけるレクチン経路の役割を評価するために、MASP-2-/-マウスおよび野生型マウスにおいて、腎臓線維症、炎症、および尿細管間質損傷のタンパク質過負荷タンパク尿モデルを用いて得られた結果を示す。
背景/基本原理:
タンパク尿は、原発性腎臓病に関係なく、腎臓線維症の発症と腎臓排泄性機能の喪失の危険因子である(Tryggvason K. et al., J Intern Med 254:216-224, 2003、Williams M., Am J. Nephrol 25:77-94, 2005)。タンパク尿性腎症という考えは、腎糸球体パームセレクティビティ(permselectivity)が損なわれた結果として生じる、近位尿細管に入る過剰なタンパク質の毒性作用を表している(Brunskill N.J., J Am Soc Nephrol 15:504-505, 2004、Baines R.J., Nature Rev Nephrol 7:177-180, 2011)。この現象は多くの腎糸球体疾患に共通して見られ、腎臓において炎症促進性の瘢痕環境をもたらし、タンパク尿性の尿細管液体によって刺激されたシグナル伝達経路調節不全の結果として、近位尿細管細胞の増殖、アポトーシス、遺伝子転写、および炎症性サイトカイン産生が変化することを特徴とする。タンパク尿性腎症は、多種多様な原発性腎臓病態に共通する進行性腎損傷の重要な一因だと一般に認められている。
慢性腎疾患は米国では成人集団の15％超に罹患し、世界中で毎年、約750,000件の死亡の原因となる(Lozano R. et al., Lancet vol 380, Issue 9859:2095-2128, 2012)。タンパク尿は慢性腎疾患の指標であり、疾患進行を促進する因子でもある。多くのタンパク尿性腎臓病患者が、尿細管間質性炎症と、腎機能の低下と密接に対応する進行性線維症を示す。タンパク尿そのものが尿細管間質性炎症と、タンパク尿性腎症の発症を誘発する(Brunskill N.J. et al., J Am Soc Nephrol 15:504-505, 2004)。タンパク尿性腎臓疾患では、過剰量のアルブミンと他の高分子が糸球体で濾過され、近位尿細管上皮細胞によって再吸収される。これは、サイトカインおよび白血球の浸潤につながる補体活性化によって媒介される炎症性の悪循環を引き起こす。この悪循環は尿細管間質の損傷および線維症の原因となり、それによってタンパク尿が悪化し、腎機能が失われ、最終的には末期腎不全への進行が起こる(例えば、Clark et al., Canadian Medical Association Journal 178:173-175, 2008を参照されたい)。この有害な炎症およびタンパク尿の循環を調整する療法が、慢性腎疾患におけるアウトカムを改善すると予想される。
尿細管間質性損傷のUUOモデルにおけるMASP-2阻害の有益な効果を考慮して、MASP-2阻害がタンパク質過負荷モデルにおいて腎損傷を低減するかどうか確かめるために以下の実験を行った。本研究では、タンパク尿性腎臓疾患を誘発するためにIshola et al., European Renal Association 21:591-597, 2006に記載のようにタンパク質過負荷を用いた。
方法:
実施例1に記載のようにMASP-2-/-マウスを作製し、BALB/cと10世代にわたって戻し交配した。本研究では、以下の通りにタンパク質過負荷タンパク尿モデルにおける野生型マウスおよびMASP-2-/-BALB/cマウスの結果を比較した。
最適な応答を見るために、実験の1週間前にマウスに片側腎摘出を行った後に、タンパク質過負荷曝露を行った。使用したタンパク尿誘発剤は、以下の用量で:15日間にわたって合計15回腹腔内投与するために、2mg BSA/gm、4mg BSA/gm、6mg BSA/gm、8mg BSA/gm、10mg BSA/gm、および12mg BSA/gm体重をそれぞれ1回投薬し、15mg BSA/gm体重を9回投薬して、生理食塩水に溶解してWT(n=7)およびMASP-2-/-マウス(n=7)に腹腔内投与する低エンドトキシンウシ血清アルブミン(BSA,Sigma)であった。対照のWT(n=4)マウスおよびMASP-2-/-(n=4)マウスには食塩水だけ腹腔内投与した。最後に投薬した後に、尿を収集するために、動物を代謝ケージ(metabolic cage)に別々に24時間入れた。麻酔下での心臓穿刺によって血液を収集し、血液を氷上で2時間凝固させ、血清を遠心分離によって分離した。15日目に実験が終わった時に血清試料および尿試料を収集し、分析のために保管および凍結した。
15日目にBSAを最後に投与して24時間後にマウスを屠殺し、分析のために様々な組織を収集した。腎臓を採取し、H&Eおよび免疫染色のために処理した。免疫組織化学染色を以下の通りに行った。各マウスに由来する、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した5ミクロン腎臓組織切片を脱パラフィンし、再水和した。抗原賦活化をクエン酸緩衝液中で95℃で20分間行い、その後に、組織を3％H2O2中で10分間インキュベートした。次いで、組織を、10％アビジン溶液を含むブロッキング緩衝液(二次抗体を作製した種に由来する10％血清と、1％BSAを含むPBS)の中で室温で1時間インキュベートした。各工程の後に切片をPBSで3回、それぞれ5分間洗浄した。次いで、一次抗体を、抗体F4/80(Santa Cruzカタログ番号sc-25830)、TGFβ(Santa Cruzカタログ番号sc-7892)、IL-6(Santa Cruzカタログ番号sc-1265)については1:100の濃度で、TNFα抗体(Santa Cruzカタログ番号sc-1348)については1:50で、10％ビオチン溶液を含むブロッキング緩衝液に溶解して1時間適用した。次いで、ビオチン化二次抗体を、F4/80切片、TGFβ切片、およびIL-6切片については1:200の濃度で、TNFα切片については1:100の濃度で30分間適用し、その後にHRP結合酵素をもう30分間適用した。ジアミノベンジジン(DAB)基質キット(Vector labs)を用いて10分間、発色を行い、スライドを水で洗浄し、脱水し、コンピュータによる画像解析を容易にするために対比染色することなくマウントした。デジタル画像を取り込み、その後に自動画像解析ソフトウェアを用いて定量することによって、染色された腎皮質組織切片を解析した。
以下の通りにデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼdUTPニック末端標識(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)(TUNEL)を用いた染色によって組織切片におけるアポトーシスを評価した。腎臓切片の中にあるアポトーシス細胞を以下の通りにApopTag(登録商標)Peroxidase kit(Millipore)を用いて染色した。各マウスに由来する、パラフィン包埋し、ホルマリンで固定した腎臓切片を脱パラフィンし、再水和し、次いで、プロテイナーゼK(20μg/mL)を用いてタンパク質透過処理した。プロテイナーゼK(20μg/mL)は、室温で15分間、各標本に適用した。工程間に標本をPBSで洗浄した。組織を3％H2O2中で10分間インキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼ活性を止めた。次いで、組織を平衡化緩衝液中でインキュベートし、その後に、TdT酵素と37℃で1時間インキュベートした。停止/洗浄緩衝液で10分間洗浄した後に、抗ジゴキシゲニン(digoxignenin)結合体を室温で30分間適用した後に、洗浄を行った。DAB基質キットで4分間、発色を行った後に、水で洗浄を行った。組織をヘマトキシリンで対比染色し、DBXにマウントした。皮質から連続して選択した20個の高倍率視野において、TUNELで染色された(茶色の)アポトーシス細胞の頻度をLeica DBXM光学顕微鏡を用いて手作業で数えた。
結果:
タンパク尿の評価
マウスにタンパク尿が存在することを確かめるために、血清中にある総タンパク質を15日目に分析し、尿中にある総排泄タンパク質を、研究の15日目に24時間にわたって収集した尿試料中で測定した。
図23は、食塩水だけ与えた野生型対照マウス(n=2)、BSAを与えた野生型マウス(n=6)、およびBSAを与えたMASP-2-/-マウス(n=6)において15日目に測定した血清タンパク質の総量(mg/ml)を図示する。図23に示したように、BSAを投与すると、野生型群およびMASP-2-/-群の両方で血清総タンパク質レベルが、食塩水しか与えなかった対照群の濃度の2倍超まで増加した。処置群間で有意差は無かった。
図24は、食塩水だけ与えた野生型対照マウス(n=2)、BSAを与えた野生型マウス(n=6)、およびBSAを与えたMASP-2-/-マウス(n=6)からの、研究の15日目に24時間にわたって収集した尿中にある排泄タンパク質の総量(mg)を図示する。図24に示したように、本研究の15日目に、食塩水だけを与えた偽処置対照群と比較して、BSA処置群では尿中にある総排泄タンパク質が約6倍増加した。図23および図24に示した結果から、タンパク尿モデルが予想通り機能したことが証明される。
腎臓における組織学的変化の評価
図25は、タンパク質過負荷研究の15日目に、以下のマウス群:(パネルA)野生型対照マウス;(パネルB)MASP-2-/-対照マウス;(パネルC)BSAで処置した野生型マウス;および(パネルD)BSAで処置したMASP-2-/-マウスから採集した代表的なH&E染色腎臓組織切片を示す。図25に示したように、同じタンパク質過負荷曝露レベルでは、MASP-2-/-過負荷群(パネルD)の組織保存の程度は野生型過負荷群(パネルC)と比較してかなり大きい。例えば、野生型対照群にあるボーマン嚢(パネルA)と比較して、BSAで処置した野生型マウス(過負荷)にあるボーマン嚢(パネルC)は大きく拡大していることが観察された。対照的に、同じレベルのBSAで処置したMASP-2-/-マウス(過負荷)にあるボーマン嚢(パネルD)は、MASP-2-/-対照マウス(パネルB)および野生型対照マウス(パネルA)と同様の形態を保持した。さらに図25に示したように、大きなタンパク質鋳造構造(cast structure)が野生型腎臓切片の近位尿細管および遠位尿細管に蓄積した(パネルC)。これは、MASP-2-/-マウス(パネルD)と比較して大きく、豊富にある。
透過型電子顕微鏡による本研究からの腎臓切片の解析から、BSAで処置したマウスには、全体的に、遠位尿細管細胞および近位尿細管細胞の繊毛縁(ciliary border)に対する損傷があり、細胞内容物および核が飛び出て尿細管管腔の中にあることにも注目する。対照的に、BSAで処置したMASP-2-/-マウスでは組織は保存されていた。
腎臓におけるマクロファージ浸潤の評価
マクロファージ浸潤によって示されるような炎症の程度を測定するために、採取した腎臓の組織切片を、Boor et al., J of Am Soc of Nephrology 18:1508-1515, 2007に記載の方法を用いてマクロファージ特異的抗体F4/80でも染色した。
図26は、マクロファージ平均染色領域(％)を示す、マクロファージ特異的抗体F4/80で染色された腎臓組織切片のコンピュータによる画像解析の結果を図示する。ここで、組織切片は、タンパク質過負荷研究の15日目に、野生型対照マウス(n=2)、BSAで処置した野生型マウス(n=6)、およびBSAで処置したMASP-2-/-マウス(n=5)から入手した。図26に示したように、F4/80抗マクロファージ抗体で染色された腎臓組織切片から、野生型偽対照と比較してBSAで処置した群は両方とも腎臓マクロファージ浸潤(F4/80抗体染色領域％として測定した)の有意な増加を示したが、BSAで処置した野生型マウスに由来する組織切片のマクロファージ浸潤と比較して、BSAで処置したMASP-2-/-マウスに由来する組織切片ではマクロファージ浸潤の有意な低下が観察されたことが分かった(p値=0.0345)。
図27Aは、24時間の試料に由来する尿中で測定した総排泄タンパク質対マクロファージ浸潤(平均染色領域％)をプロットすることによって、BSAで処置した、それぞれの野生型マウス(n=6)においてマクロファージ-タンパク尿の相関が存在するかどうかの分析を図示する。図27Aに示したように、野生型腎臓からの試料のほとんどが、存在するタンパク尿のレベルと、マクロファージ浸潤の程度との間で正の相関関係を示した。
図27Bは、24時間の試料の尿中にある総排泄タンパク質対マクロファージ浸潤(平均染色領域％)をプロットすることによって、BSAで処置した、それぞれのMASP-2-/-マウス(n=5)においてマクロファージ-タンパク尿の相関が存在するかどうかの分析を図示する。図27Bに示したように、野生型マウスにおいてタンパク尿レベルとマクロファージ浸潤の程度との間で観察された正の相関関係(図27Aに示した)がMASP-2-/-マウスでは観察されなかった。特定の理論に拘束されるものではないが、これらの結果は、MASP-2-/-マウスには、高レベルのタンパク尿での炎症クリアランス機構が存在することを示しているのかもしれない。
サイトカイン浸潤の評価
インターロイキン6(IL-6)、トランスフォーミング成長因子β(TGFβ)、および腫瘍壊死因子α(TNFα)はタンパク尿モデルでは野生型マウスの近位尿細管においてアップレギュレートされることが知られている炎症促進性サイトカインである(Abbate M. et al., Journal of the American Society of Nephrology: JASN, 17: 2974-2984, 2006; David S. et al., Nephrology, Didalysis, Transplantation, Official Publication of the European Dialysis and Transplant Association- European Renal Association 12: 51-56, 1997)。腎臓組織切片を前記のようにサイトカイン特異的抗体で染色した。
図28は、BSAで処置した野生型マウス(n=4)およびBSAで処置したMASP-2-/-マウス(n=5)における、抗TGFβ抗体で染色された組織切片のコンピュータによる画像解析の結果(TGFβ抗体染色領域％として測定した)を図示する。図28に示したように、MASP-2-/-BSA処置(過負荷)群と比較して、野生型BSA処置(過負荷)群ではTGFβ染色の有意な増加が観察された(p=0.026)。
図29は、BSAで処置した野生型マウス(n=4)およびBSAで処置したMASP-2-/-マウス(n=5)における、抗TNFα抗体で染色された組織切片のコンピュータによる画像解析の結果(TNFα抗体染色領域％として測定した)を図示する。図29に示したように、MASP-2-/-BSA処置(過負荷)群と比較して、野生型BSA処置(過負荷)群ではTNFα染色の有意な増加が観察された(p=0.0303)。
図30は、野生型対照マウス、MASP-2-/-対照マウス、BSAで処置した野生型マウス(n=7)、およびBSAで処置したMASP-2-/-マウス(n=7)における、抗IL-6抗体で染色された組織切片のコンピュータによる画像解析の結果(IL-6抗体染色領域％として測定した)を図示する。図30に示したように、MASP-2-/-BSA処置群と比較して野生型BSA処置群においてIL-6染色の極めて有意な増加が観察された(p=0.0016)。
アポトーシスの評価
アポトーシスをデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼdUTPニック末端標識(TUNEL)を用いた染色によって組織切片において評価し、TUNEL染色アポトーシス細胞の頻度を、皮質から連続して選択した20個の高倍率視野(HPF)において計数した。
図31は、野生型対照マウス(n=1)、MASP-2-/-対照マウス(n=1)、BSAで処置した野生型マウス(n=6)、およびBSAで処置したMASP-2-/-マウス(n=7)の腎皮質に由来する組織切片から連続して選択した20個の高倍率視野(HPF)において計数したTUNELアポトーシス細胞の頻度を図示する。図31に示したように、BSAで処置した野生型マウスから入手した腎臓では、BSAで処置したMASP-2-/-マウスから入手した腎臓と比較して皮質において有意に速いアポトーシス速度が観察された(p=0.0001)。
結果の全体の概要および結論:
本実施例の結果から、タンパク質過負荷モデルにおいてMASP-2-/-マウスは腎損傷が少ないことが証明される。従って、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体は、有害な炎症およびタンパク尿の循環を阻害または予防し、慢性腎疾患におけるアウトカムを改善すると予想されるだろう。
実施例17
本実施例は、マウスタンパク質過負荷タンパク尿モデルでの野生型マウスにおける腎臓炎症および尿細管間質損傷の低減および/または予防において効力があるかどうかについてのモノクローナルMASP-2阻害抗体の分析について説明する。
背景/基本原理:
実施例16に記載のように、タンパク質過負荷タンパク尿モデルにおいてMASP-2-/-マウスは野生型マウスよりも有意に良いアウトカム(例えば、尿細管間質損傷が少なく、腎臓炎症が少ない)を示すことが確かめられた。このことは、タンパク尿性腎臓疾患においてレクチン経路には病気を起こす役割があることを意味している。
実施例13に記載のように、ヒトレクチン経路の機能を特異的に遮断し、マウスでもレクチン経路を遮断することが示されているモノクローナルMASP-2阻害抗体(OMS646-SGMI-2)を作製した。本実施例では、野生型マウスにおいて腎臓炎症および尿細管間質損傷を低減および/または予防する効力があるかどうか、MASP-2阻害抗体OMS646-SGMI-2をマウスタンパク質過負荷タンパク尿モデルにおいて分析した。
方法:
本研究では、MASP-2阻害抗体(10mg/kg OMS646-SGMI-2)の効果をヒトIgG4アイソタイプ対照抗体であるET904(10mg/kg)および食塩水対照と比較して評価した。
実施例16に記載の研究と同様に、本研究では、タンパク尿性腎臓疾患を誘発するためにタンパク質過負荷を使用した(Ishola et al., European Renal Association 21:591-597, 2006)。実施例16に記載のように漸増用量(2g/kg〜15g/kg)の低エンドトキシンウシ血清アルブミン(BSA)を合計15日にわたって毎日、腹腔内注射することによって、片側腎摘出したBalb/cマウスにおいてタンパク尿を誘発した。
抗体処置を、タンパク尿誘発の7日前から始めて隔週で腹腔内注射することによって投与し、本研究全体を通して続けた。この投薬計画は、持続的なレクチン経路抑制を証明した以前のPK/PD研究および薬理学研究に基づいて選択された(データ示さず)。マウスを15日目に屠殺し、腎臓を採取し、H&Eおよび免疫染色のために処理した。デジタル画像を取り込み、その後に自動画像解析ソフトウェアを用いて定量することによって、染色された腎皮質組織切片を解析した。
免疫組織化学染色およびアポトーシス評価を実施例16に記載のように行った。
結果:
タンパク尿の評価
マウスにおけるタンパク尿の存在を確かめるために、尿中にある総排泄タンパク質を、15日目(実験の終わり)に24時間にわたって収集した尿試料中で測定した。BSAで処置した群では尿試料中の総タンパク質レベルは、BSAで処置していない対照群と比較して平均してほぼ6倍増加することが確かめられた(データ示さず)。このことから、BSAで処置したマウスにはタンパク尿が存在することが確かめられた。BSA処置群間のタンパク質レベルに有意差は観察されなかった。
組織学的変化の評価
図32は、以下のBSAで処置した後、15日目のマウス群:(パネルA)食塩水で処置した野生型対照マウス、(パネルB)アイソタイプ抗体で処置した対照マウス、および(パネルC)MASP-2阻害抗体で処置した野生型マウスからの代表的なH&E染色組織切片を示す。
図32に示したように、同じタンパク質過負荷曝露レベルでは、MASP-2阻害抗体処置群(パネルC)の組織保存の程度は、食塩水で処置した野生型群(パネルA)またはアイソタイプ対照で処置した野生型群(パネルB)と比較してかなり大きい。
アポトーシスの評価
アポトーシスをデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼdUTPニック末端標識(TUNEL)を用いた染色によって組織切片において評価し、TUNEL染色アポトーシス細胞の頻度を、皮質から連続して選択した20個の高倍率視野(HPF)において計数した。図33は、食塩水対照およびBSAで処置した野生型マウス(n=8)、アイソタイプ対照抗体およびBSAで処置した野生型マウス(n=8)、ならびにMASP-2阻害抗体およびBSAで処置した野生型マウス(n=7)の腎皮質に由来する組織切片から連続して選択した20個の高倍率視野(HPF)において計数したTUNELアポトーシス細胞の頻度を図示する。図33に示したように、食塩水およびアイソタイプ対照で処置した群と比較して、MASP-2阻害抗体処置群から入手した腎臓では、皮質におけるアポトーシス速度の非常に有意な減少が観察された(食塩水対照対MASP-2阻害抗体についてはp=0.0002;アイソタイプ対照対MASP-2阻害抗体についてはp=0.0052)。
サイトカイン浸潤の評価
タンパク尿モデルでは野生型マウスの近位尿細管においてアップレギュレートされることが知られている炎症促進性サイトカインであるインターロイキン6(IL-6)、トランスフォーミング成長因子β(TGFβ)、および腫瘍壊死因子α(TNFα)を、本試験において入手した腎臓組織切片において評価した。
図34は、BSAおよび食塩水で処置した野生型マウス(n=8)、BSAおよびアイソタイプ対照抗体で処置した野生型マウス(n=7)、ならびにBSAおよびMASP-2阻害抗体で処置した野生型マウス(n=8)における、抗TGFβ抗体で染色された組織切片のコンピュータによる画像解析の結果(TGFβ抗体染色領域％として測定した)を図示する。図34に示したように、TGFβ染色領域の定量から、MASP-2阻害抗体で処置したマウスではTGFβレベルが、食塩水で処置した対照群およびアイソタイプ対照抗体で処置した対照群(それぞれ、p値=0.0324およびp値=0.0349)と比較して有意に低下したことが分かった。
図35は、BSAおよび食塩水で処置した野生型マウス(n=8)、BSAおよびアイソタイプ対照抗体で処置した野生型マウス(n=7)、ならびにBSAおよびMASP-2阻害抗体で処置した野生型マウス(n=8)における、抗TNFα抗体で染色された組織切片のコンピュータによる画像解析の結果(TNFα抗体染色領域％として測定した)を図示する。図35に示したように、染色された切片の解析から、MASP-2阻害抗体処置群ではTNFαレベルが食塩水対照群(p=0.011)ならびにアイソタイプ対照群(p=0.0285)と比較して有意に低下したことが分かった。
図36は、BSAおよび食塩水で処置した野生型マウス(n=8)、BSAおよびアイソタイプ対照抗体で処置した野生型マウス(n=7)、ならびにBSAおよびMASP-2阻害抗体で処置した野生型マウス(n=8)における、抗IL-6抗体で染色された組織切片のコンピュータによる画像解析の結果(IL-6抗体染色領域％として測定した)を図示する。図36に示したように、染色された切片の解析から、MASP-2阻害抗体処置群ではIL-6レベルが食塩水対照群(p=0.0269)ならびにアイソタイプ対照群(p=0.0445)と比較して有意に低下したことが分かった。
結果の全体の概要および結論:
本実施例の結果から、MASP-2阻害抗体を使用すると、タンパク質過負荷モデルにおいて腎損傷からの保護が得られることが証明される。これは、タンパク尿モデルにおいてMASP-2-/-マウスの腎損傷が少ないことを証明した実施例16に記載の結果と合致する。
実施例18
本実施例は、アドリアマイシン誘発性腎症におけるレクチン経路の役割を評価するために、MASP-2-/-マウスおよび野生型マウスにおける腎臓線維症、炎症、および尿細管間質損傷のアドリアマイシン誘発性ネフロロジーモデルを用いて得られた結果を示す。
背景/基本原理:
アドリアマイシンは、血液悪性腫瘍、軟部組織肉腫、および多くのタイプの癌腫を含む広範囲の癌の処置において用いられるアントラサイクリン抗腫瘍性抗生物質である。アドリアマイシン誘発性腎症は、慢性タンパク尿の進行をより深く理解することを可能にしてきた、慢性腎疾患の十分に確立したげっ歯類モデルである(Lee and Harris, Nephrology, 16:30-38, 2011)。アドリアマイシン誘発性腎症における構造的損傷および機能的損傷のタイプは、ヒトにおける慢性タンパク尿性腎臓病のものとよく似ている(Pippin et al., American Journal of Renal Physiology 296:F213-29, 2009)。
アドリアマイシン誘発性腎症は、糸球体上皮細胞への損傷と、それに続く糸球体硬化症、尿細管間質の炎症および線維症を特徴とする。アドリアマイシン誘発性腎症は、免疫に由来する機構と、免疫に由来しない機構の両方によって調整されることが多くの研究において示されている(Lee and Harris, Nephrology, 16:30-38, 2011)。アドリアマイシン誘発性腎症には、腎臓疾患モデルとして、いくつかの強みがある。第1に、アドリアマイシン誘発性腎症は高度に再現性があり、かつ断定しうる(predicable)腎損傷モデルである。これは、このモデルが薬物投与の数日以内に腎損傷が誘導されることを特徴とし、このため、損傷のタイミングが変わらないので実験デザインを簡単にすることができるからである。アドリアマイシン誘発性腎症はまた、許容可能な死亡率(＜5％)と、罹患率(重量減少)に関連すると同時に、組織損傷の程度が重度になるモデルでもある。従って、アドリアマイシン誘発性腎症における腎損傷の重篤度とタイミングという理由から、これは、腎損傷から保護する介入を試験するために適したモデルである。
実施例16および17に記載のように、タンパク尿のタンパク質過負荷モデルでは、MASP-2-/-マウスと、MASP-2阻害抗体で処置したマウスは野生型マウスよりも有意に良好なアウトカムを示した(例えば、尿細管間質損傷が少なく、腎臓炎症が少ない)ことが確かめられた。このことは、タンパク尿性腎臓疾患においてレクチン経路には病気を起こす役割があることを意味している。
本実施例では、MASP-2欠損が、アドリアマイシンによって誘発される腎臓炎症および尿細管間質損傷を低減および/または予防するかどうか確かめるために、アドリアマイシン誘発性ネフロロジーモデル(AN)においてMASP-2-/-マウスを野生型マウスと比較して分析した。
方法:
1.投与量および時点の最適化
治療介入を試験するために適したレベルの腎臓炎症をBALB/cマウスが発症するアドリアマイシンの用量と時点を決定するために、初回実験を行った。
3つの野生型BALB/cマウス群(n=8)に単一用量の静脈内投与アドリアマイシン(10.5mg/kg)を注射した。3つの時点:アドリアマイシン投与の1週間後、2週間後、および4週間後にマウスを間引いた。対照マウスには食塩水だけを注射した。
結果:
3つの群にいるマウスは全てH&E染色によって確かめられた時には糸球体硬化症およびタンパク尿の徴候を示し、腎臓におけるマクロファージ浸潤によって測定された時には組織炎症の程度は徐々に増加した(データ示さず)。組織損傷の程度は1週間群では軽度であり、2週間群では中程度であり、4週間群では重度であった(データ示さず)。本研究の残りについては2週間の時点を選択した。
2.野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスにおけるアドリアマイシン誘発性ネフロロジーの分析
アドリアマイシン誘発性ネフロロジーにおける補体のレクチン経路の役割を解明するために、同じ用量のアドリアマイシンでMASP-2-/-マウス(BALB/c)群を野生型マウス(BALB/c)と比較した。MASP-2-/-マウスをBALB/cマウスと10世代にわたって戻し交配した。
野生型(n=8)およびMASP-2-/-(n=8)にアドリアマイシン(10.5mg/kg)を静脈内注射し、各系統の3匹のマウスには対照として食塩水だけ与えた。処置して2週間後に全てのマウスを間引き、組織を収集した。組織病理学的(histopatholigical)損傷の程度をH&E染色によって評価した。
結果:
図37は、以下のアドリアマイシンまたは食塩水だけ(対照)で処置した後、14日目のマウス群:(パネルA-1、A-2、A-3)食塩水だけで処置した野生型対照マウス;(パネルB-1、B-2、B-3)アドリアマイシンで処置した野生型マウス;および(パネルC-1、C-2、C-3)アドリアマイシンで処置したMASP-2-/-マウスからの代表的なH&E染色組織切片を示す。それぞれの写真は(例えば、パネルA-1、A-2、A-3)は異なるマウスを表している。
図37に示したように、アドリアマイシンで処置したMASP-2-/-群の組織保存の程度は同じ用量のアドリアマイシンで処置した野生型群と比較してかなり大きい。
図38は、以下のアドリアマイシンまたは食塩水だけ(野生型対照)で処置した後、14日目のマウス群:食塩水だけで処置した野生型対照マウス;アドリアマイシンで処置した野生型マウス;食塩水だけで処置したMASP-2-/-マウス、およびアドリアマイシンで処置したMASP-2-/-マウスからのマクロファージ平均染色領域(％)を示した、マクロファージ特異的抗体F4/80で染色された腎臓組織切片のコンピュータによる画像解析の結果を図示する。図38に示したように、アドリアマイシンで処置したMASP-2-/-マウスは、アドリアマイシンで処置した野生型マウスと比較してマクロファージ浸潤が少ない(**p=0.007)。
図39は、以下のアドリアマイシンまたは食塩水だけ(野生型対照)で処置した後、14日目のマウス群:食塩水だけで処置した野生型対照マウス;アドリアマイシンで処置した野生型マウス;食塩水だけで処置したMASP-2-/-マウス、およびアドリアマイシンで処置したMASP-2-/-マウスからの、コラーゲン沈着染色領域(％)を示す、シリウスレッドで染色された腎臓組織切片のコンピュータによる画像解析の結果を図示する。図39に示したように、アドリアマイシンで処置したMASP-2-/-マウスは、アドリアマイシンで処置した野生型マウスと比較してコラーゲン沈着が少ない(**p=0.005)。
全体の概要および結論:
腎臓尿細管間質性炎症の寛解は腎臓疾患処置の重要な目標である。本明細書において示した結果から、腎臓尿細管間質性炎症の発症には補体活性化のレクチン経路が大いに寄与することが分かる。本明細書においてさらに証明されるように、MASP-2阻害物質、例えば、MASP-2阻害抗体は、タンパク尿性腎症、アドリアマイシン腎症の処置および腎臓尿細管間質性炎症の寛解における新規の治療アプローチとして用いられる可能性がある。
実施例19
本実施例は、ステロイド依存性免疫グロブリンA腎症(IgAN)にかかっている成人およびステロイド依存性膜性腎症(MN)にかかっている成人における完全ヒトモノクローナルMASP-2阻害抗体の安全性および臨床的有効性を評価するための、継続中の第2相臨床試験の初期結果について説明する。
背景:
米国では2000万超の人が慢性腎疾患に罹患している(Drawz P. et al., Ann Intern Med 162(11); ITC1-16, 2015)。IgANおよびMNを含む糸球体腎症(GN)は、糸球体が損なわれ、しばしば末期腎臓病および透析につながる腎臓疾患である。いくつかのタイプの原発性GNが存在し、最もよく見られるものがIgANである。これらの患者の多くには、持続的な腎臓炎症および進行性の悪化がある。多くの場合、これらの患者は、多くの重篤な長期有害事象を有するコルチコステロイドまたは免疫抑制剤で治療される。これらの治療を受けていても多くの患者は悪化し続ける。IgANまたはMNの治療のために承認されている治療法は無い。
IgA腎症
免疫グロブリンA腎症(IgAN)は、腎臓内炎症および腎臓傷害をもたらす自己免疫性腎臓疾患である。IgANは、原発性腎糸球体腎炎の世界的に最もよく見られる形態である(Magistroni et al., Kidney Int. 88(5):974-89, 2015)。年間発生率は100,000人あたり約2.5人であり、米国では1400人に1人がIgANを発症すると見積もられている。診断後20年以内に、IgAN患者のうち40％もの患者が末期腎臓病(ESRD)を発症する(Coppo R., D’Amico G., J Nephrol 18(5):503-12, 2005; Xie et al., PLoS One, 7(6):e38904 (2012))。患者は、典型的には、軽度から中程度のタンパク尿を伴う顕微鏡的血尿と、様々なレベルの腎機能不全を呈する(Wyatt R.J. et al., N Engl J Med 368(25):2402-14, 2013)。腎機能障害、持続的な高血圧、および重いタンパク尿(1日に1g以上)などの臨床マーカーが予後不良と関連する(Goto M et al., Nephrol Dial Transplant 24(10):3068-74, 2009; Berthoux F. et al., J Am Soc Nephrol 22(4):752-61, 2011)。複数の大規模な観察研究および前向き試験では、タンパク尿は他の危険因子とは独立した最も強力な予後因子である(Coppo R. et al., J Nephrol 18(5):503-12, 2005; Reich H. N., et al., J Am Soc Nephrol 18(12):3177-83, 2007)。治療しないままであれば疾患が発症して10年以内に患者のうち15〜20％がESRDに達すると見積もられている(D’Amico G., Am J Kidney Dis 36(2):227-37, 2000)。
IgANの診断上の顕著な特徴は、腎糸球体メサンギウムにIgA沈着が単独で、IgG、IgM、またはその両方と一緒に圧倒的な数で存在することである。IgANでは、補体系のレクチン経路のエフェクター酵素であるMASP-2が活性化するための重要な認識分子であるマンナン結合レクチン(MBL)が腎糸球体に沈着することが腎臓生検から明らかになっている。腎糸球体へのMBL沈着は、通常、IgAと共存しており、かつ補体活性化と、高レベルの尿中MBLを示すものであり、IgANにおいて予後が悪いことと関連付けられている。これらの患者は、MBL沈着も高レベルの尿中MBLも無い患者よりも重篤な組織学的変化および糸球体間質増殖を示す(Matsuda M. et al., Nephron 80(4):408-13, 1998; Liu LL et al., Clin Exp Immunol 169(2):148-155, 2012; Roos A. et al., J Am Soc Nephrol 17(6):1724-34, 2006; Liu LL et al., Clin Exp Immunol 174(1):152-60, 2013)。MBL 沈着のある患者については、寛解 ラットもかなり低い(Liu LL et al., Clin Exp Immunol 174(1):152-60, 2013)。
IgANを処置をする現行のアプローチは全て、腎機能の悪化を遅くするか、止めるか、または遅延させることを試みている。Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) clinical practice guidelines for glomerulonephritisは、レニン-アンジオテンシン系(RAS)遮断による血圧調節を第一にウェイトを置いたIgAN治療計画を推奨している[KDIGO Work Group 2012]。最大耐量の血圧降下薬と良好に調節された血圧にもかかわらず1g以上のタンパク尿が毎日、持続的にある患者の場合、推奨される処置にはコルチコステロイドおよび/または他の免疫抑制剤、例えば、シクロホスファミド、アザチオプリン、またはミコフェノール酸モフェチルが含まれる。Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) Guidelines for Glomerulonephritis(Int. Soc of Nephrol 2(2):139-274, 2012)では、1g/日以上のタンパク尿患者にはコルチコステロイドを6ヶ月の通常治療期間で投与すべきであると推奨している。半月体形成性IgAN(crescentic IgAN))(糸球体の>50％に半月体(cresent)があると定義される)にかかっており、腎臓クリアランス機能が急速に悪化している患者の場合、別の免疫抑制剤(例えば、シクロホスファミド)がコルチコステロイドに加えられる場合がある。しかしながら、重大な長期後遺症と関連する積極的な免疫抑制処置を用いても、一部の患者には進行性の腎機能悪化がある。FDAに承認されたIgAN処置法は無く、血圧調節のためにアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害因子またはアンジオテンシン受容体遮断薬(ARB)を用いても、一部の患者ではタンパク尿の増加が持続する。これらの処置はどれも、この疾患が急速に進行するリスクがある患者ではIgANを止めることが示されておらず、IgANの進行を遅らせることさえ示されていない。慢性コルチコステロイドおよび/または免疫抑制療法の必要性を低減するか、または排除することができる代替処置法は、未だ対処されていない医学的必要性に間違いなく応えるだろう。
膜性腎症
膜性腎症(MN)の年間発生率は1,000,000人あたり約10〜12人である。MN患者には、一定しない臨床経過が起こる可能性があるが、約25％は末期腎臓病を発症する。
膜性腎症は、免疫を介した腎糸球体疾患であり、成人におけるネフローゼ症候群の最もよく見られる原因の1つである。この疾患は、腎糸球体基底膜の外側の側面に、糸球体上皮細胞抗原およびこの抗原に特異的な抗体を含有する免疫沈着物、主としてIgG4が形成し、その結果、補体が活性化されることを特徴とする。MNの初期徴候は、ネフローゼ症候群:タンパク尿、低アルブミン血症、高脂血症、および浮腫と関連する。
MNは治療なしで自然治癒する場合があるが、1/3もの患者が進行性の腎機能喪失を示し、診断後、5年の中央値でESRDに進行する。多くの場合、MNを治療するためにコルチコステロイドが用いられ、代替療法を開発する必要性がある。さらに、タンパク尿の重篤度に基づいて中程度の進行リスクがあると確かめられた患者は、シクロホスファミドまたはカルシニューリン阻害因子と一緒にプレドニゾンで処置され、これらの2種類の処置は共に重篤な全身副作用と関連することが多い。
方法:
健常人において行った2つの第1相臨床試験から、MASP-2阻害抗体、OMS646を静脈内投薬および皮下投薬すると持続的なレクチン経路阻害が起こることが証明されている。
本実施例は、IgANおよびMNにかかっている対象におけるMASP-2阻害抗体、OMS646の継続中の第2相無対照多施設試験からの中間結果について説明する。組み入れ規準は、腎臓病サブタイプに関係なく、本試験の患者全員が、試験登録前に少なくとも12週間にわたって安定用量のコルチコステロイドで維持されていたこと(すなわち、患者がステロイド依存性であること)を必要とする。本試験は、12週間の処置期間と、6週間の経過観察期間のある単一群パイロット試験である。
1つの疾患につき約4人の対象が登録する計画を立てる。本試験は、IgANおよびMNにかかっている対象においてOMS646が腎機能を改善し(例えば、タンパク尿を改善し)、コルチコステロイドの必要性を低減する可能性があるかどうか評価するようにデザインされた。現在までに、本試験において2人のIgA腎症患者および2人の膜性腎症患者が処置を完了している。
治験登録時には、安定コルチコステロイド用量を用いた処置が継続しているのにもかかわらず、各対象の尿中タンパク質値は高くなければならない。これらの判断基準によって、試験期間中に自然に改善する可能性が低い患者が選択される。
対象はスクリーニング時に18歳以上であり、以下:腎臓生検時に診断されるIgANまたは腎臓生検時に診断される原発性MNのうちの1つが診断された場合にのみ本試験に組み入れられた。登録した患者は、以下の組み入れ規準も全て満たさなければならなかった。
(1)スクリーニング期間中、2回の各来診の前に、連続して、かつ毎日収集した3つの試料からの平均尿アルブミン/クレアチニン比が＞0.6である;
(2)スクリーニング来診1の前に少なくとも12週間にわたって≧10mgのプレドニゾンまたは同等の用量が与えられていた;
(3)免疫抑制処置(例えば、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル)が与えられていたら、スクリーニング来診1の前に少なくとも2ヶ月にわたって安定用量が与えられており、試験期間にわたって用量の予想された変化は無い;
(4)MDRD式1によって計算される推算糸球体濾過量(eGFR)が≧30mL/分/1.73m2である;
(5)アンジオテンシン変換酵素阻害因子(ACEI)および/またはアンジオテンシン受容体遮断薬(ARB)を用いた、医師によって指導され、安定し、最適化された処置を受けており、安静時に収縮期血圧＜150mmHg、拡張期血圧＜90mmHgであること;
(6)スクリーニング来診1の6ヶ月以内にベリムマブ、エクリズマブ、またはリツジマブ(rituzimab)が用いられたことがないこと;
(7)腎臓移植の病歴がない。
1MDRD式:eGFR(mL/分/1.73m2)=175x(SCr) -1.154x(年齢) -0.203x(女性の場合、0.742)x(アフリカ系アメリカ人の場合、1.212)。注:SCr=血清クレアチニン測定値はmg/dLでなければならない。
本試験で使用したモノクローナル抗体であるOMS646は、ヒトMASP-2に結合し、これを阻害する完全ヒトIgG4モノクローナル抗体である。MASP-2はレクチン経路のエフェクター酵素である。実施例12において証明されたように、OMS646は組換えMASP-2に強く結合し(見かけの平衡解離定数は100pMの範囲である)、相同タンパク質C1s、C1r、およびMASP-1を上回る5,000倍超の選択性を示す。機能アッセイ法ではOMS646はナノモル効力でヒトレクチン経路を阻害するが(50％阻害する濃度[IC50]は約3nMである)、古典経路には有意な影響を及ぼさない。マウス、非ヒト霊長類、およびヒトへの静脈内(IV)注射または皮下(SC)注射によって投与したOMS646は、エクスビボアッセイ法でのレクチン経路活性化の抑制に関連する高い血漿中濃度をもたらした。
本試験では、OMS646原薬は100mg/mLの濃度で供給され、これをIV投与用にさらに希釈した。用量調製のために、OMS646 100 mg/mL注射溶液の計算された適切量を、注射器を用いてバイアルから引き抜いた。調製して4時間以内に注入バックを投与した。
本研究は、以下の試験デザインの概略図に示したように、スクリーニング(28日間)、処置(12週間)、および経過観察(6週間)の期間からなる。
試験デザインの概略図
Figure 0006893554
尿アルブミン/クレアチニン比のベースライン値を確立するために、スクリーニング期間内および1回目のOMS646投薬の前に、同意が得られた対象から、3日間連続した2つの期間のそれぞれにおいて3つの尿試料を得た(1日1回、収集した)。スクリーニング期間後に、資格がある対象に、OMS646 4 mg/kg IVを12週間(処置期間)にわたって週1回与えた。OMS646を最後に投与した後に6週間の経過観察期間があった。
OMS646を用いた最初の4週間の処置の間に、安定した試験前用量のコルチコステロイドを与えて対象を維持した。12週間の処置期間のうち最初の4週間が終わったら、忍容性が認められる場合は4週間にわたって、対象のコルチコステロイドを漸減させ(すなわち、コルチコステロイド用量を低減し)、その後に4週間にわたって、結果として生じたコルチコステロイド用量を維持した。この目標は、1日に≦6mgのプレドニゾン(または同等の用量)まで漸減させることであった。この期間の間に、試験責任者によって決定されるように、腎機能が悪化した対象では漸減を中断した。コルチコステロイド漸減を通じて、および全12週間の処置を通じて対象をOMS646で処置した。次いで、最後に処置した後、さらに6週間にわたって患者を追跡した。コルチコステロイド漸減とOMS646処置によって、安定した腎機能を維持するために必要なコルチコステロイド用量をOMS646は減らすかどうか評価することが可能になった。
本試験における重要な効力尺度は、ベースラインから12週間までの尿アルブミン/クレアチニン比(uACR)と24時間のタンパク質レベルの変化である。尿中タンパク質またはアルブミンの測定は腎臓合併症を評価するために日常的に用いられ、持続的な高レベルの尿中タンパク質は腎臓病の進行と相関関係にある。uACRはタンパク尿を評価するために臨床で用いられる。
効力分析
uACRの分析値は、ある時点で得られた全ての値の平均と定義された。計画されたuACR値は、予定された各時点では3である。ベースラインuACR値は、2回のスクリーニング来診時の分析値の平均と定義された。
結果:
図40は、12週間の試験中に、4mg/kg MASP-2阻害抗体(OMS646)を用いて毎週処置した2人のIgAN患者におけるuACRを図示する。図40に示したように、ベースラインからの変化は、未変換分析によって時点「a」(p=0.003)、時点「b」(p=0.007)、および時点「c」(p=0.033)では統計的に有意である。表12は、OMS646で処置した2人のIgAN患者の24時間の尿タンパク質データを示す。
（表１２）OMS646で処置したIgAN患者における24時間の尿タンパク質(mg/日)
Figure 0006893554
図40および表12に示したように、IgAN患者は試験中に臨床的かつ統計的に有意な腎機能改善を示した。uACR(図40を参照されたい)と24時間の尿タンパク質濃度(表12を参照されたい)は両方とも統計的に有意に減少した。図40のuACRデータに示したように、平均ベースラインuACRは1264mg/gであり、処置終了時には525mg/gに達し(p=0.011)、経過観察期間の終了時には128mg/gまで減少した。さらに図40に示したように、処置効果は経過観察全体を通して維持された。24時間の尿タンパク質排泄の測定はuACRを追従し、平均して3156mg/24時間から1119mg/24時間に低下した(p=0.017)。2人の患者間で処置効果はかなり一致していた。両患者とも約2000mg/日の低下を経験し、部分寛解(24時間の尿タンパク質排泄が50パーセント超低下する、および/またはその結果としてタンパク質排泄が1000mg/日未満になると定義される);完全寛解(タンパク質排泄が300mg/日未満だと定義される)に達した。両IgA腎症患者における24時間のタンパク尿低下の大きさは腎臓生存の有意な改善と関連する。両IgA腎症患者ともステロイドを大幅に漸減することもでき、それぞれが、一日量を≦5mgまで(60mgから0mgまで;30mgから5mgまで)低減することができた。
2人のMN患者も、OMS646を用いた処置の間にuACRの低下を示した。一方のMN患者はuACRが1003mg/gから69mg/gまで減少し、経過観察期間全体を通して、この低いレベルを維持した。他方のMN患者は、処置後、一定しない経過を伴って、uACRが1323mg/gから673mg/gまで減少した。第1のMN患者は24時間の尿タンパク質レベルが著しく低下し(ベースラインでは10,771mg/24時間から、85日目には325mg/24時間)、部分寛解およびほぼ完全な寛解に達した。これに対して、他方の患者は本質的に変化しないままであった(ベースラインでは4272mg/24時間から、85日目には4502mg/24)。2人のMN患者では、ステロイドが30mgから15mgまでと、10mgから5mgまで漸減した。
要約すると、MASP-2阻害抗体OMS646で処置したIgAN対象およびMN対象では、首尾一貫した腎機能改善が観察された。IgAN患者におけるOMS646処置の効果は強く、かつ首尾一貫しており、このことから、強力な効力シグナルが示唆される。これらの効果はMN患者での結果によって裏付けられる。4人全員のIgAN患者およびMN患者の間で、処置中の時間経過およびuACR変化の大きさは首尾一貫していた。有意な安全問題は観察されなかった。本試験の患者は、処置するのが難しい群であり、これらの患者での治療効果は、IgAN患者およびMN患者、例えば、末期腎臓病に急速に進行するリスクのある患者を含む、ステロイド依存性のIgANおよびMNに罹患している患者(すなわち、MASP-2阻害抗体を用いた処置の前に、安定したコルチコステロイド用量を用いた処置を受けている患者)における、OMS646などのMASP-2阻害抗体を用いた効力を予測するものだと考えられる。
前述に従って、一態様では、本発明は、IgANまたはMNに罹患しているヒト対象を治療する方法であって、MASP-2依存性補体活性化を阻害するために有効な量のMASP-2阻害抗体を含む組成物を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。一態様において、前記方法は、腎機能を改善する(例えば、タンパク尿を改善する)のに十分な量のMASP-2阻害抗体を、IgANまたはMNに罹患しているヒト対象に投与する工程を含む。一態様において、対象はステロイド依存性IgANに罹患している。一態様において、対象はステロイド依存性MNに罹患している。一態様において、MASP-2阻害抗体は、ステロイド依存性IgANまたはステロイド依存性MNに罹患している対象において腎機能を改善する、および/またはコルチコステロイド投与量を減らすのに十分な量で前記対象に投与される。
一態様において、前記方法は、MASP-2依存性補体活性化を阻害するために有効な量のMASP-2阻害抗体を含む組成物を対象に投与する工程の前に、ステロイド依存性IgANに罹患しているヒト対象を同定する工程をさらに含む。
一態様において、前記方法は、MASP-2依存性補体活性化を阻害するために有効な量のMASP-2阻害抗体を含む組成物を対象に投与する工程の前に、ステロイド依存性MNに罹患しているヒト対象を同定する工程をさらに含む。
本明細書中の開示されたどの態様でも、MASP-2阻害抗体は、以下の特徴:前記抗体はKD 10nM以下でヒトMASP-2に結合する、前記抗体はMASP-2のCCP1ドメイン内にあるエピトープに結合する、前記抗体はインビトロアッセイ法において1％ヒト血清中でのC3b沈着をIC50 10nM以下で阻害する、前記抗体は90％ヒト血清中でのC3b沈着をIC50 30nM以下で阻害する、前記抗体は、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、およびF(ab')2からなる群より選択される抗体断片である、前記抗体は単鎖分子である、前記抗体はIgG2分子である、前記抗体はIgG1分子である、前記抗体はIgG4分子である、IgG4分子はS228P変異を含む、の少なくとも1つまたは複数を示す。一態様において、前記抗体はMASP-2に結合し、レクチン経路を選択的に阻害し、古典経路を実質的に阻害しない(すなわち、古典的補体経路を完全な状態のままにしておきながらレクチン経路を阻害する)。
一態様において、MASP-2阻害抗体は、腎機能に関連する少なくとも1つまたは複数の臨床パラメータ、例えば、タンパク尿の改善(例えば、uACRの減少、および/または24時間の尿タンパク質濃度の減少、例えば、20パーセント超の24時間の尿タンパク質排泄の低下、もしくは、例えば、30パーセント超の24時間の尿タンパク質排泄の低下、もしくは、例えば、40パーセント超の24時間の尿タンパク質排泄の低下、もしくは、例えば、50パーセント超の24時間の尿タンパク質排泄の低下)を改善するために有効な量で投与される。
一部の態様において、前記方法は、第1の期間(例えば、少なくとも1日〜1週間もしくは2週間もしくは3週間もしくは4週間またはそれより長く)にわたってカテーテルを介して(例えば、静脈内に)、IgAN(例えば、ステロイド依存性IgAN)に罹患している対象にMASP-2阻害抗体を投与する工程を含み、その後に、第2の期間(例えば、少なくとも2週間またはそれより長い慢性期)にわたって対象にMASP-2阻害抗体を皮下投与する工程を含む。
一部の態様において、前記方法は、第1の期間(例えば、少なくとも1日〜1週間もしくは2週間もしくは3週間もしくは4週間またはそれより長く)にわたってカテーテルを介して(例えば、静脈内に)、MN(例えば、ステロイド依存性MN)に罹患している対象にMASP-2阻害物質を投与する工程を含み、その後に、第2の期間(例えば、少なくとも2週間またはそれより長い慢性期)にわたって対象にMASP-2阻害抗体を皮下投与する工程を含む。
一部の態様において、前記方法は、MASP-2阻害抗体を、IgAN(例えば、ステロイド依存性IgAN)またはMN(例えば、ステロイド依存性MN)に罹患している対象に静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与する工程を含む。処置は長期にわたってもよく、毎日〜毎月投与されてもよいが、好ましくは、少なくとも2週間ごとに、または少なくとも週1回、例えば、週2回もしくは週3回投与される。
一態様において、前記方法は、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む、ある量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、IgAN(例えば、ステロイド依存性IgAN)またはMN(例えば、ステロイド依存性MN)に罹患している対象に投与する工程を含む、IgAN(例えば、ステロイド依存性IgAN)またはMN(例えば、ステロイド依存性MN)に罹患している対象を治療する工程を含む。一部の態様において、前記組成物は、(a)(i)SEQ ID NO:67の31〜35に由来するアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H1;および(ii)SEQ ID NO:67の50〜65に由来するアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H2;および(iii)SEQ ID NO:67の95〜107に由来するアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H3を含む、重鎖可変領域、ならびに(b)(i)SEQ ID NO:69の24〜34に由来するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L1;および(ii)SEQ ID NO:69の50〜56に由来するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L2;および(iii)SEQ ID NO:69の89〜97に由来するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L3を含む、軽鎖可変領域、あるいは(II)SEQ ID NO:67と少なくとも90％の同一性(例えば、SEQ ID NO:67と少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の同一性)を有する重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:69と少なくとも90％の同一性(例えば、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の同一性)を有する軽鎖可変領域を含む、その変種を含む、MASP-2阻害抗体を含む。
一部の態様において、前記方法は、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ある量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を対象に投与する工程を含む。
一部の態様において、前記方法は、SEQ ID NO:67に示した重鎖可変領域およびSEQ ID NO:69に示した軽鎖可変領域を含む参照抗体OMS646が認識する、ヒトMASP-2上のエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を対象に投与する工程を含む。
一部の態様において、前記方法は、IgAN(例えば、ステロイド依存性IgAN)もしくはMN(例えば、ステロイド依存性MN)に罹患しているか、またはこれを発症するリスクがある対象に、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、1mg/kg〜10mg/kg(すなわち、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、または10mg/kg)の投与量で、少なくとも週1回(例えば、少なくとも週2回または少なくとも週3回)、少なくとも3週間、または少なくとも4週間、または少なくとも5週間、または少なくとも6週間、または少なくとも7週間、または少なくとも8週間の期間、または少なくとも9週間、または少なくとも10週間、または少なくとも11週間、または少なくとも12週間にわたって投与する工程を含む。
実施例20
本実施例は、ステロイド依存性ループス腎炎(LN)に罹患している成人における完全ヒトモノクローナルMASP-2阻害抗体の安全性および臨床的有効性を評価するための、継続中の第2相臨床試験の初期結果について説明する。
背景:
米国では2000万超の人が慢性腎疾患に罹患している(Drawz P. et al., Ann Intern Med 162(11); ITC1-16, 2015)。IgAN、MN、およびLNを含む糸球体腎症(GN)は、糸球体が損なわれ、しばしば末期腎臓病および透析につながる腎臓疾患である。これらの患者の多くには持続的な腎臓炎症と進行性の悪化がある。多くの場合、これらの患者は、多くの重篤な長期有害事象を有するコルチコステロイドまたは免疫抑制剤で処置される。これらの処置を受けていても多くの患者は悪化し続ける。
ループス腎炎
全身性エリテマトーデス(SLE)の主な合併症はループス腎炎とも知られる腎炎である。ループス腎炎は続発型の腎炎として分類される。SLEの後期になると、この疾患に罹患している成人の60％までが何らかの形の腎臓合併症を有し(Koda-Kimble et al., Koda-Kimble and Young’s Applied Therapeutics: the clinical use of drugs, 10th Ed, Lippincott Williams & Wilkins: 792-9頁, 2012)、米国での有病率は100,000人に20〜70人である。ループス腎炎は、疲労、発熱、発疹、関節炎、漿膜炎、または中枢神経系疾患を含む、活動性SLEの他の症状を有する患者において現れることが多い(Pisetsky D.S. et al., Med Clin North Am 81(1):113-28,1997)。患者の中には無症候性ループス腎炎があるものもいるが、定期的な経過観察中に、高い血清クレアチニンレベル、低いアルブミンレベル、または尿中タンパク質もしくは堆積物などの臨床検査値異常によって活動性ループス腎炎が示唆される。自己免疫がループス腎炎の発病において主要な役割を果たしている。これらの自己抗体は病原性の免疫複合体を血管内に形成し、この免疫複合体は糸球体内に蓄積する。自己抗体はまた、糸球体基底膜に既にある抗原に結合して、その部位で免疫複合体を形成することもある。免疫複合体は補体を活性化し、炎症細胞を引きつけることによって炎症応答を促進する(D’Agati V.D. et al., Lupus nephritis: pathology and pathogenesis: Wallace D.J. Hahn, Dubois’ Lupus Erythematosus, 7th Ed Philadelpha: Lippincott Williams & Wiklins: p1094-111, 2007)。従って、免疫複合体を介した補体活性化はループス腎炎の発病において重要な役割を果たしている。C4d沈着物が腎臓組織に存在し、通常、免疫複合体沈着物、C1q、およびC3と結合して古典経路を引き起こす。場合によっては、C4d沈着物はC1q無しで存在し、このことは、可能性のあるレクチン経路の関与を示している(Kim M.K., et al. Int J Clin Exp Pathol 6(10):2157-67、2013)。
レクチン経路の重要な寄与のさらなる裏付けとして、SLE患者の皮膚病変部にMBL沈着物が生じる(Wallim L. R. et al., Hum Immunol 75(7):629-32, 2014)。さらに、ループス腎炎患者に由来する腎臓生検材料の大半においてMBLとフィコリンの活発な沈着が観察されている(Nisihara R. M. et al., Hum Immunol 74(8):907-10, 2013)。腎臓MBL沈着は高タンパク尿患者で最もよく分かった。さらに、SLE患者の血漿MBLレベルは健常対照よりもかなり高く、MBLレベルは疾患活動と相関関係にあった。このことから、MBLレベルはSLE患者活動のバイオマーカーになり得ることが示唆される(Panda A.K. et al., Arthritis Res Ther 14(5):R218, 2012)。コルチコステロイドは、軽度のループス腎炎に罹患している患者に対する主な従来の処置選択肢である。さらに重度の症例については、臨床業務では高用量のレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル、シクロホスファミド、アザチオプリン、およびシクロスポリンが使用されている。SLEおよびループス腎炎に対する処置選択肢は高い罹患率と死亡率が付随する。副作用、特に、長期コルチコステロイド使用に起因する副作用があるために患者のアドヒアランスが制限され、それに続く処置効力への影響がある。さらに優れた、忍容性が認められる処置レジメンを開発することが必要である。
方法:
実施例19において前述したように、健常人において行った2つの第1相臨床試験から、MASP-2阻害抗体であるOMS646を静脈内投薬および皮下投薬すると持続的なレクチン経路阻害が起こることが証明されている。
本実施例は、ループス腎炎(LN)に罹患している対象におけるMASP-2阻害抗体、OMS646の継続中の第2相無対照多施設試験からの中間結果について説明する。組み入れ規準は、腎臓病サブタイプに関係なく、本試験の患者全員が、試験登録前に少なくとも12週間にわたって安定用量のコルチコステロイドで維持されていたこと(すなわち、患者がステロイド依存性であること)を必要とする。本試験は、12週間の処置期間と6週間の経過観察期間のある単一群パイロット試験である。
本試験は、LNに罹患している対象におけるOMS646が腎機能を改善し(例えば、タンパク尿を改善し)かつコルチコステロイドの必要性を低減する可能性があるかどうか評価するようにデザインされた。現在までに、本試験において5人のループス腎炎(LN)患者が処置を完了している。
治験登録時には、安定コルチコステロイド用量を用いた処置が継続しているのにもかかわらず、各対象の尿中タンパク質値は高くなければならない。これらの判断基準によって、試験期間中に自然に改善する可能性が低い患者が選択される。
対象はスクリーニング時に18歳以上であり、腎臓生検時に診断されるループス腎炎が診断された場合にのみ本試験に組み入れられた。登録した患者は、以下の組み入れ規準も全て満たさなければならなかった。
(1)スクリーニング期間中、2回の各来診の前に、連続して、かつ毎日収集した3つの試料からの平均尿アルブミン/クレアチニン比が>0.6であること;
(2)スクリーニング来診1の前に少なくとも12週間にわたって≧10mgのプレドニゾンまたは同等量が与えられていたこと;
(3)免疫抑制処置(例えば、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル)が与えられていたら、スクリーニング来診1の前に少なくとも2ヶ月にわたって安定用量が与えられており、試験期間中に予想される用量の変化は無いこと;
(4)MDRD式1によって計算される推算糸球体濾過量(eGFR)が≧30mL/分/1.73m2であること;
(5)アンジオテンシン変換酵素阻害因子(ACEI)および/またはアンジオテンシン受容体遮断薬(ARB)を用いた、医師によって指導され、安定し、最適化された処置を受けており、安静時に収縮期血圧<150mmHg、拡張期血圧<90mmHgであること;
(6)スクリーニング来診1の6ヶ月以内にベリムマブ、エクリズマブ、またはリツジマブ(rituzimab)が用いられたことがないこと;
(7)腎臓移植の病歴がないこと。
1MDRD式:eGFR(mL/分/1.73m2)=175x(SCr)-1.154x(年齢)-0.203x(女性の場合、0.742)x(アフリカ系アメリカ人の場合、1.212)。注:SCr=血清クレアチニン測定値はmg/dLでなければならない。
本試験で使用したモノクローナル抗体であるOMS646は、ヒトMASP-2に結合し、これを阻害する完全ヒトIgG4モノクローナル抗体である。MASP-2はレクチン経路のエフェクター酵素である。実施例12において証明されたように、OMS646は組換えMASP-2に強く結合し(見かけの平衡解離定数は100pMの範囲である)、相同タンパク質C1s、C1r、およびMASP-1を上回る5,000倍超の選択性を示す。機能アッセイではOMS646はナノモル効力でヒトレクチン経路を阻害するが(50％阻害する濃度[IC50]は約3nMである)、古典経路には有意な影響を及ぼさない。マウス、非ヒト霊長類、およびヒトへの静脈内(IV)注射または皮下(SC)注射によって投与したOMS646は、エクスビボアッセイでのレクチン経路活性化の抑制に関連する高い血漿中濃度をもたらした。
本試験では、OMS646原薬は100mg/mLの濃度で供給され、これをIV投与用にさらに希釈した。用量調製のために、OMS646 100mg/mL注射溶液の計算された適切量を、注射器を用いてバイアルから引き抜いた。調製して4時間以内に注入バックを投与した。
本研究は、以下の試験デザインの概略図に示したように、スクリーニング(28日間)、処置(12週間)、および経過観察(6週間)の期間からなる。
試験デザインの概略図
Figure 0006893554
24時間の尿タンパク質および尿アルブミン/クレアチニン比のベースライン値を確立するために、スクリーニング期間内と1回目のOMS646投薬の前に、同意が得られた対象から、3日間連続した2つの期間のそれぞれにおいて3つの尿試料を得た(1日1回、収集した)。スクリーニング期間後に、資格がある対象に、OMS646 4mg/kg IVを12週間(処置期間)にわたって週1回与えた。OMS646を最後に投与した後に6週間の経過観察期間があった。
OMS646を用いた最初の4週間の処置の間に、安定した試験前用量のコルチコステロイドを与えて対象を維持した。12週間の処置期間のうち最初の4週間が終わったら、忍容性が認められた場合は4週間にわたって対象のコルチコステロイドを漸減させ(すなわち、コルチコステロイド用量を低減し)、その後に4週間にわたって、結果として生じたコルチコステロイド用量を維持した。この目標は、1日に≦6mgのプレドニゾン(または同等量)まで漸減させることであった。この期間の間に、試験責任者によって決定されるように腎機能が悪化した対象では漸減を中断した。コルチコステロイド漸減を通じて、および全12週間の処置を通じて対象をOMS646で処置した。次いで、最後に処置した後、さらに6週間にわたって患者を経過観察した。コルチコステロイド漸減とOMS646処置によって、安定した腎機能を維持するために必要なコルチコステロイド用量をOMS646は減らすかどうか評価することが可能になった。
効力分析
本試験における重要な効力尺度は、ベースラインから12週間までの24時間タンパク質レベルの変化である。尿中タンパク質またはアルブミンの測定は腎臓合併症を評価するために日常的に用いられ、持続的な高レベルの尿中タンパク質は腎臓病の進行と相関関係にある。部分寛解は、50パーセントより大きな24時間の尿タンパク質排泄の低下と定義される。
結果:
表13は、OMS646で処置した5人のLN患者の24時間の尿タンパク質(mg/day)を示す。
(表１３)OMS646で処置したLN患者における24時間の尿タンパク質(mg/day)
Figure 0006893554
注:患者#1は試験中に全身疾患フレア(flare)を経験した。
表13に示したように、LN患者は、試験中に臨床的かつ統計的に有意な腎機能改善を示した。表13に示したように、5人のLN患者のうち4人が処置期間にわたって大幅な(平均69パーセント)24時間の尿タンパク質排泄の低下を示した。5人目の患者(患者#1)は全身疾患フレアを経験し、大幅な増加を示した。ループス反応者の大半はステロイド用量を漸減することができた。
要約すると、MASP-2阻害抗体OMS646で処置した5人のLN患者のうち4人において有意な腎機能改善が観察された。LN患者におけるOMS646処置の効果は底堅く、かつ首尾一貫していた。このことから強力な効力シグナルが示唆される。有意な安全問題は観察されなかった。本試験の患者は、処置するのが難しい群であり、これらの患者での治療効果は、末期腎臓病に急速に進行するリスクのある患者を含む、LN患者、例えば、ステロイド依存性LNに罹患している患者(すなわち、MASP-2阻害抗体を用いた処置の前に、安定したコルチコステロイド用量を用いた処置を受けている患者)におけるOMS646などのMASP-2阻害抗体を用いた効力を予測するものだと考えられる。
前述に従って、一態様では、本発明は、LNに罹患しているヒト対象を治療する方法であって、MASP-2依存性補体活性化を阻害するために有効な量のMASP-2阻害抗体を含む組成物を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。一態様において、前記方法は、腎機能を改善する(例えば、タンパク尿を改善する)ために十分な量のMASP-2阻害抗体を、LNに罹患しているヒト対象に投与する工程を含む。一態様において、対象はステロイド依存性LNに罹患している。一態様において、MASP-2阻害抗体は、ステロイド依存性LNに罹患している対象における腎機能を改善する、および/またはコルチコステロイド投与量を低減するために十分な量で前記対象に投与される。
一態様において、前記方法は、MASP-2依存性補体活性化を阻害するために有効な量のMASP-2阻害抗体を含む組成物を対象に投与する工程の前に、ステロイド依存性LNに罹患しているヒト対象を同定する工程をさらに含む。
本明細書中の開示されたどの態様でも、MASP-2阻害抗体は、以下の特徴:前記抗体は10nM以下のKDでヒトMASP-2に結合する、前記抗体はMASP-2のCCP1ドメイン内にあるエピトープに結合する、前記抗体はインビトロアッセイにおいて1％ヒト血清中でのC3b沈着をIC50 10nM以下で阻害する、前記抗体は90％ヒト血清中でのC3b沈着をIC50 30nM以下で阻害する、前記抗体は、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、およびF(ab')2からなる群より選択される抗体断片である、前記抗体は単鎖分子である、前記抗体はIgG2分子である、前記抗体はIgG1分子である、前記抗体はIgG4分子である、IgG4分子はS228P変異を含む、の少なくとも1つまたは複数を示す。一態様において、前記抗体はMASP-2に結合し、レクチン経路を選択的に阻害し、古典経路を実質的に阻害しない(すなわち、古典的補体経路を完全な状態のままにしておきながらレクチン経路を阻害する)。
一態様において、MASP-2阻害抗体は、腎機能に関連する少なくとも1つまたは複数の臨床パラメータを改善するために有効な量で、例えば、タンパク尿の改善(例えば、uACRの減少、および/または24時間の尿タンパク質濃度の減少、例えば、20パーセント超の24時間の尿タンパク質排泄の低下、もしくは、例えば、30パーセント超の24時間の尿タンパク質排泄の低下、もしくは、例えば、40パーセント超の24時間の尿タンパク質排泄の低下、もしくは、例えば、50パーセント超の24時間の尿タンパク質排泄の低下)に有効な量で、LNに罹患している対象に投与される。一部の態様において、MASP-2阻害抗体は、少なくともタンパク尿の部分寛解(すなわち、ベースラインと比較して24時間の尿タンパク質排泄の50パーセント超の低下)をもたらすために有効な量で、LNに罹患している対象に投与される。
一部の態様において、前記方法は、第1の期間(例えば、少なくとも1日〜1週間もしくは2週間もしくは3週間もしくは4週間またはそれより長く)にわたってカテーテルを介して(例えば、静脈内に)、LN(例えば、ステロイド依存性LN)に罹患している対象にMASP-2阻害抗体を投与する工程を含み、その後に、第2の期間(例えば、少なくとも2週間またはそれより長い慢性期)にわたって対象にMASP-2阻害抗体を皮下投与する工程を含む。
一部の態様において、前記方法は、MASP-2阻害抗体を、LN(例えば、ステロイド依存性LN)に罹患している対象に静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与する工程を含む。処置は長期にわたってもよく、毎日〜毎月投与されてもよいが、好ましくは、少なくとも2週間ごとに、または少なくとも週1回、例えば、週2回もしくは週3回投与される。
一態様において、前記方法は、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む、ある量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を対象に投与する工程を含む、LN(例えば、ステロイド依存性LN)に罹患している対象を治療する工程を含む。一部の態様において、前記組成物は、(a)(i)SEQ ID NO:67の31〜35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H1;および(ii)SEQ ID NO:67の50〜65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H2;および(iii)SEQ ID NO:67の95〜107のアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H3を含む、重鎖可変領域、ならびに(b)(i)SEQ ID NO:69の24〜34のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L1;および(ii)SEQ ID NO:69の50〜56のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L2;および(iii)SEQ ID NO:69の89〜97のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L3を含む、軽鎖可変領域を含む、MASP-2阻害抗体、あるいは(II)SEQ ID NO:67と少なくとも90％の同一性(例えば、SEQ ID NO:67と少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の同一性)を有する重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:69と少なくとも90％の同一性(例えば、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の同一性)を有する軽鎖可変領域を含む、その変種を含む。
一部の態様において、前記方法は、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ある量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、LN(例えば、ステロイド依存性LN)に罹患している対象に投与する工程を含む。
一部の態様において、前記方法は、SEQ ID NO:67に示した重鎖可変領域およびSEQ ID NO:69に示した軽鎖可変領域を含む参照抗体OMS646が認識する、ヒトMASP-2上のエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、LN(例えば、ステロイド依存性LN)に罹患している対象に投与する工程を含む。
一部の態様において、前記方法は、LN(例えば、ステロイド依存性LN)に罹患しているか、またはこれを発症するリスクがある対象に、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、1mg/kg〜10mg/kg(すなわち、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、または10mg/kg)の投与量で、少なくとも週1回(例えば、少なくとも週2回または少なくとも週3回)、少なくとも3週間、または少なくとも4週間、または少なくとも5週間、または少なくとも6週間、または少なくとも7週間、または少なくとも8週間、または少なくとも9週間、または少なくとも10週間、または少なくとも11週間、または少なくとも12週間の期間で投与する工程を含む。
実施例21
本実施例は、実施例19に記載のように、IgANを含む糸球体症に罹患している成人患者における、タンパク尿の低減に関する完全ヒトモノクローナルMASP-2阻害抗体、OMS646の安全性および臨床的有効性を評価するための、継続中の第2相臨床試験で得られた追加の結果について説明する。
方法:
実施例19に記載のように、第2相試験は治験登録時にコルチコステロイドを服用していたIgAN患者を含む。患者全員が非盲検様式でOMS646を服用し、2人のIgAN患者から肯定的な結果が得られた。今では、実施例19に記載の方法を用いて、もう2人のIgAN患者への投薬が完了しており、合計4人のIgAN患者が本試験を完了している。
本試験に組み入れるために、IgAN患者は、(1)生検によってIgANと診断されており、(2)uACR>0.6g/gであり、(3)eGFR≧30mL/分/1.73m2であり、(4)安定ACEI/ARB処置を受けて血圧が調節されており、(5)少なくとも12週間にわたって安定ステロイド用量≧10mgのプレドニゾンを服用していなければならない。
本試験においてOMS646で処置した4人の成人IgAN患者全員には、すでに罹患している腎機能低下があり、登録時の推算糸球体濾過量(eGFR)は30〜46mL/mg/1.73m2であり、24時間タンパク質の測定値は2.44〜4.87g/24時間であった。治験登録時に患者全員が安定したレニン-アンジオテンシン系(RAS)遮断と少なくとも3ヶ月のコルチコステロイド処置を受けていた。
患者全員にOMS646を12週間にわたって週1回、IVで与えた。患者は、4週間の導入期間(run-in period)と、それに続く、安定ステロイド用量を服用する4週間と、忍容性が認められた場合はステロイドを漸減する4週間と、漸減したステロイド用量を服用する4週間を含むOMS646処置を受けた。OMS646処置後、本試験では、さらにもう6週間にわたって患者を経過観察した。試験完了後に試験責任者が患者を経過観察した。
本試験における効力尺度は、処置前(ベースライン)に6回測定し、処置中および経過観察中に、それぞれの効力評価時に3回測定した(1)尿アルブミン/クレアチニン比(uACR)と、(2)OMS646処置前に1回測定し、OMS646処置完了の2〜4週間後に1回測定した24時間の尿タンパク質であった。プロトコールによって、臨床上適切であれば4週目と8週目の間にコルチコステロイドを漸減した。
結果:
4人のIgAN患者は処置後6週間の経過観察期間を完了した。表14は、これらの患者の人口統計学およびベースライン特徴を示す。
(表１４)人口統計学およびベースライン特徴
Figure 0006893554
eGFR-推算糸球体濾過量;SSA-標準的な表面積(1.73m2);uACR-尿アルブミン/クレアチニン比
OMS646処置中に患者全員がタンパク尿の著しい低減を示した。図41および42に示したように、uACRと24時間タンパク質測定の両方で統計的かつ臨床的に有意な改善が観察された。
図41は、OMS646で処置した4人のIgAN患者のuACR(mg/g)をベースラインから120日まで経時的に図示する。図41に示したように、ベースラインから試験終了までuACRの平均は1.13g/g±0.27減少した(77％の低減、p=0.026)。図41にさらに示したように、OMS646処置後、最後の経過観察来診時に各患者のuACRはベースラインと比べて94％、86％、47％、および89％(それぞれ、患者1〜4)少なかった。
図42は、OMS646で処置した4人のIgAN患者における、処置前の1日目のベースラインから処置後の24時間の尿タンパク質の変化を図示する。図42に示したように、24時間の尿タンパク質はベースラインから54％、81％、63％、および95％(それぞれ、患者1〜4)減少した。
図43は、OMS646で処置した4人のIgAN患者における、ベースラインから処置後の24時間の尿タンパク質の変化の平均を図示する。図43に示したように、24時間の尿タンパク質の平均は2.87±1.08g/24時間減少した(73％の低減;p=0.013)。
患者全員が試験期間中または試験期間後すぐにコルチコステロイドを中断することができた。このことから、タンパク尿に対するOMS646の効果はコルチコステロイドに関連する可能性が低いと証明された。推算糸球体濾過量(eGFR)(Modification of Diet in Renal Disease Formulaによって計算した)は処置期間および経過観察期間全体を通して安定していた。患者全員においてOMS646の忍容性は良好であった。
要約すると、この非盲検第2相臨床研究において、OMS646で12週間処置したIgAN患者全員においてuACRの有意かつ持続的な減少が観察された。患者全員において24時間タンパク尿は有意に低減した。観察されたタンパク尿低減の程度は腎臓予後と臨床アウトカムの大幅な改善と関係づけられている(Inker L. A. et al., Am J Kidney Dis 68(3):392-401 (2016))。レクチン補体経路の効果を取り消す、MASP-2に対するモノクローナル抗体であるOMS646を用いた処置後にステロイド中止を可能にする非常に大きなタンパク尿低減が発見されたことから、IgA糸球体症におけるアウトカムを改善するための治療剤としてのOMS646の使用が裏付けられた。IgAN患者におけるOMS646の効果は底堅く、かつ首尾一貫している。このことから、この集団おいて効力があることが証明された。
実施例22
IgA腎症(IgAN)患者におけるOMS646処置完了後の寛解の維持
背景/基本原理:
実施例19および21に記載のように、IgAN患者における第2相試験において、4人のIgAN患者を、MASP-2活性を阻害する完全ヒトモノクローナル抗体であるOMS646で処置した。実施例19および21に記載のように、患者全員にOMS646を12週間にわたって週1回、IVで与えた。実施例21に記載のように、OMS646処置後、本試験において、さらにもう6週間にわたって患者を経過観察した。OMS646で処置したIgAN患者全員が部分寛解(24時間の尿タンパク質排泄の低下が50パーセント超である、および/または結果として生じるタンパク質排泄が1000mg/day未満であると定義される)を示した。本実施例に記載のように、試験後に、これら4人の患者を追跡し、OMS646処置後の寛解期間を評価した。
方法:
実施例21に記載の第2相臨床試験が完了した後に、試験責任者は、OMS646で処置した4人のIgAN患者を経過観察した。この試験においてエンドポイントはuACRと24時間タンパク尿であった。実施例21に記載のように、試験終了時に4人のIgAN患者全員が部分寛解した。試験後の経過観察において尿中タンパク質対クレアチニン比(uPCR)を測定した。それぞれのuPCR値に0.64を掛けることでuACR(尿アルブミン/クレアチニン比)に変換した(Zhao et al., Clin J Am Soc Nephrol 11:947-55, 2016を参照されたい)。
結果:
OMS646処置後に患者全員が部分寛解した。3人の女性および1人の男性の平均年齢は42才であった。3人が白人、1人がアジア人である。平均eGFRは41mL/分/1.73m2であり、登録時ステロイド用量の平均は55mgであった。経過観察は、最後のOMS646投薬の後、2〜10ヶ月に及んだ。実施例21に記載のように、平均uACRは試験中に77％(p=0.026)減少した。3人の患者は利用可能な経過観察中に部分寛解を維持した(それぞれ、12ヶ月で54％のuACR減少、12ヶ月で93％のuACR減少、および5ヶ月で78％のuACR減少)。1人の患者は7ヶ月でベースラインuACRの88％であった。3人の患者はまた、経過観察中に7ml/分/1.73m2、13ml/分/1.73m2、および7ml/分/1.73m2だけ改善したeGFRも示した。4人目の患者のeGFRは安定していた。患者全員がステロイドを中断した。OMS646の忍容性は良好であった。
要約すると、実施例21に記載のように、本試験に含まれるOMS646を用いた12週間の処置と処置後の6週間の期間中にIgAN患者のタンパク尿は有意に減少した。このタンパク尿の低減は処置完了後10ヶ月まで維持された。これらのデータは、IgA糸球体症におけるアウトカムを改善するための治療剤としてのOMS646の使用を裏付けるものである。
OMS646を用いた1回12週間の処置経過後、約1年の経過観察時での本実施例に記載した4人の患者の状態に関する試験責任者からの最新情報の中で、4人の患者のうち3人がタンパク尿低減を維持したと報告された。これら3人の患者のuACRは、OMS646処置前の患者ベースライン値の14パーセント、23パーセント、および24パーセントで少ないままであった。さらに、本試験後、4人の患者のうち3人において、腎機能の尺度である推算糸球体濾過量(eGFR)の改善が観察された。腎機能が最もひどく低下していた患者のeGFRは30mL/分/1.73m2から47mL/分/1.73m2に改善し、これは57パーセントの改善であった。
要約すると、1回のOMS646処置経過が完了した後、1年経過観察時に持続的なタンパク尿低減は強い印象を与え続けた。eGFRにおいて観察された改善は、特に1年の経過観察時では予想外のことである。なぜなら、このことは、明らかになるのに、もっとかなりの時間がかかると予想されたからである。前記のように4人の患者のうち2人がeGFRのわずかな増加を示し、これらの患者のうち1人が、人を興奮させる50パーセント改善の応答を示した。eGFRにおいて観察された改善から、OMS646は、潜在的に透析を防ぐことで、または透析が必要になるまでの時間を大幅に延ばし、慢性腎疾患の進行に関連する合併症のリスクを小さくすることで患者にさらなる利益を提供できることが分かる。
前述に従って、一態様では、本発明は、IgANに罹患しているヒト対象におけるタンパク尿を低減する方法であって、以下の投与計画:
(c) IgANに罹患している対象に約4mg/kg(すなわち、3.6mg/kg〜4.4mg/kg)の抗体を少なくとも12週間の処置期間にわたって週1回、静脈内投与する工程;または
(d) IgANに罹患している対象に約180mg〜約725mg(すなわち、162mg〜797mg)の抗体を少なくとも12週間の処置期間にわたって週1回、静脈内投与する工程
に従い、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を、対象に投与する工程
を含み、前記ヒト対象におけるタンパク尿を低減する、方法を提供する。
一態様において、MASP-2阻害抗体の投与量は、約4mg/kg(すなわち、3.6mg/kg〜4.4mg/kg)、例えば、約3.6mg/kg、約3.7mg/kg、約3.8mg/kg、約3.9m/kg、約4.0mg/kg、約4.1mg/kg、約4.2mg/kg、約4.3mg/kg、または約4.4mg/kgである。
一態様において、MASP-2阻害抗体の投与量は、約180mg〜約725mg(すなわち、160mg〜800mg、または約300mg〜500mg、例えば、約300mg〜約400mg)の、ある決まった用量、例えば、約160mg、約165mg、約170mg、約175mg、約180mg、約185mg、約190mg、約195mg、約200mg、約205mg、約210mg、約215mg、約220mg、約225mg、約230mg、約240mg、約245mg、約250mg、約255mg、約260mg、約265mg、約270mg、約275mg、約280mg、約285mg、約290mg、約295mg、約300mg、約305mg、約310mg、約315mg、約320mg、約325mg、約330mg、約335mg、約340mg、約345mg、約350mg、約355mg、約360mg、約365mg、約370mg、約375mg、約380mg、約385mg、約390mg、約395mg、約400mg、約405mg、約410mg、約415mg、約420mg、約425mg、約430mg、約435mg、約440mg、約445mg、約450mg、約455mg、約460mg、約465mg、約470mg、約475mg、約480mg、約485mg、約490mg、約495mg、約500mg、約505mg、約510mg、約515mg、約520mg、約525mg、約530mg、約535mg、約540mg、約545mg、約550mg、約555mg、約560mg、約565mg、約570mg、約575mg、約580mg、約585mg、約590mg、約595mg、約600mg、約605mg、約610mg、約615mg、約620mg、約625mg、約630mg、約635mg、約640mg、約645mg、約650mg、約655mg、約660mg、約665mg、約670mg、約675mg、約680mg、約685mg、約690mg、約695mg、約700mg、約705mg、約710mg、約715mg、約720mg、約725mg、約730mg、約735mg、約740mg、約745mg、約750mg、約755mg、約760mg、約765mg、約770mg、約775mg、約780mg、約785mg、約790mg、約795mg、または約800mgである。
一態様において、処置期間は12週間である。
一態様において、処置期間の後に、少なくとも2ヶ月の休止期間(すなわち、MASP-2阻害因子の投与なし)、または少なくとも3ヶ月の休止期間、または少なくとも4ヶ月の休止期間、または少なくとも5ヶ月の休止期間、または少なくとも6ヶ月の休止期間、またはそれより長い休止期間、例えば、少なくとも7ヶ月の休止期間、または少なくとも8ヶ月の休止期間、または少なくとも9ヶ月の休止期間、または少なくとも10ヶ月の休止期間、または少なくとも11ヶ月の休止期間、または少なくとも12ヶ月の休止期間、またはそれより長い休止期間がある。
一部の態様において、前記方法は、処置期間および/または休止期間の間に、対象における尿中タンパク質レベルを定期的にモニタリングする工程、および任意で、タンパク尿の再発が発見されたらMASP-2阻害抗体による処置を再開する工程をさらに含む。
一部の態様において、前記方法は、IgANに罹患している対象においてタンパク尿を処置期間の終了時および/または休止期間の終了時に確かめた時に、ベースライン(処置前)から少なくとも30％低減するか、例えば、少なくとも40％低減するか、または少なくとも50％低減するか、または50％超低減するために有効である。
一部の態様において、前記方法は、IgANに罹患している対象において推算糸球体濾過量(eGFR)を増やすために有効である。
一部の態様において、IgANに罹患している対象は、処置前に、24時間の尿タンパク質排泄あたりタンパク質1グラム超のタンパク尿を有しており、前記方法は、前記対象におけるタンパク尿を処置期間の終了時および/もしくは休止期間の終了時に確かめた時にベースライン(処置前)から少なくとも30％低減するか、例えば、少なくとも40％低減するか、もしくは少なくとも50％低減するか、もしくは50％超低減するために有効である、ならびに/またはタンパク尿を処置期間の終了時および/もしくは休止期間の終了時に確かめた時に、24時間の尿タンパク質排泄あたり1グラムのタンパク質より少ない量まで低減するために有効である。
一部の態様において、最大耐量の血圧降下薬と良好に調節された血圧にもかかわらず、IgANに罹患している対象は、処置前に、24時間の尿タンパク質排泄あたりタンパク質1グラム超のタンパク質尿を有しており、前記方法は、前記対象におけるタンパク尿を処置期間の終了時および/もしくは休止期間の終了時に確かめた時に、ベースライン(処置前)から少なくとも30％低減するか、例えば、少なくとも40％低減するか、もしくは少なくとも50％低減するか、もしくは50％超低減するために有効である、ならびに/またはタンパク尿を処置期間の終了時および/もしくは休止期間の終了時に確かめた時に、24時間の尿タンパク質排泄あたり1グラム未満のタンパク質まで低減するために有効である。
一部の態様において、IgANに罹患している対象は、少なくとも1年間、ステロイドで処置されていない。一部の態様において、IgANに罹患している対象は、OMS646を用いた12週間の処置の少なくとも一部分の間にステロイド処置を受けている。一部の態様において、IgANに罹患している対象は、OMS646を用いた12週間の処置の少なくとも一部分の間にステロイド処置を受けており、前記方法は、処置期間の終了までに、および/または休止期間の終了時にタンパク尿を低減し、ステロイド処置の必要性を低減するか、または排除するために有効である。
他の態様
本明細書において言及される刊行物、特許出願、および特許は全て参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明の説明された方法および組成物の様々な修正および変更が当業者に明らかである。本発明は、特定の望ましい態様に関連して説明されたが、請求された本発明は、このような特定の態様に過度に限定されてはならないことが理解されるはずである。
上記にしたがって、本発明は、以下の態様を特徴とする。
1A. 線維症および/もしくは炎症によって引き起こされるかもしくは悪化する疾患もしくは障害に罹患しているか、またはこれを発症するリスクがある哺乳動物対象において、線維症を治療、阻害、軽減、または予防するための方法であって、線維症を阻害するために有効な量のMASP-2阻害物質を該対象に投与する工程を含む、方法。
2A. MASP-2阻害物質がMASP-2抗体またはその断片である、パラグラフ1A記載の方法。
3A. MASP-2阻害物質が、SEQ ID NO:6の一部に特異的に結合するMASP-2モノクローナル抗体またはその断片である、パラグラフ2A記載の方法。
4A. MASP-2抗体またはその断片が、SEQ ID NO:6を含むポリペプチドに、補体系の別の抗原に結合するよりも少なくとも10倍高い親和性で特異的に結合する、パラグラフ2A記載の方法。
5A. 抗体またはその断片が、組換え抗体、低下したエフェクター機能を有する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、パラグラフ2A記載の方法。
6A. MASP-2阻害物質が、C1q依存性補体活性化を実質的に阻害することなくレクチン経路補体活性化を選択的に阻害する、パラグラフ1A記載の方法。
7A. MASP-2阻害物質が、皮下投与されるか、腹腔内投与されるか、筋肉内投与されるか、動脈内投与されるか、静脈内投与されるか、または吸入剤として投与される、パラグラフ1A記載の方法。
8A. 線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害が、虚血再灌流傷害に関連する、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
9A. 線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害が、虚血再灌流傷害に関連しない、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
10A. 対象が、MASP-2阻害物質の投与前にタンパク尿を示し、MASP-2阻害物質の投与によって該対象のタンパク尿が減少する、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
11A. 対象が、腎臓の線維症および/または腎臓の炎症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
12A. MASP-2阻害物質が、尿細管間質性線維症を阻害するために有効な量で投与される、パラグラフ11A記載の方法。
13A. MASP-2阻害物質が、対象における透析の必要性を低減するか、遅延させるか、または排除するために有効な量で投与される、パラグラフ11A記載の方法。
14A. 疾患または障害が、慢性腎疾患、慢性腎不全、腎糸球体疾患(例えば、巣状分節性糸球体硬化症)、免疫複合体障害(例えば、IgA腎症、膜性腎症)、ループス腎炎、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、尿細管間質損傷、および糸球体腎炎(例えば、C3糸球体症)からなる群より選択される、パラグラフ11A記載の方法。
15A. 対象が、肺の線維症および/または肺の炎症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
16A. 疾患または障害が、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、強皮症に関連する肺線維症、気管支拡張症、および肺高血圧症からなる群より選択される、パラグラフ15A記載の方法。
17A. 対象が、肝臓の線維症および/または肝臓の炎症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
18A. 疾患または障害が、硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患(脂肪性肝炎)、アルコール乱用に続発する肝線維症、急性肝炎または慢性肝炎に続発する肝線維症、胆管疾患、および中毒性肝傷害(例えば、アセトアミノフェンまたは他の薬物、例えば、ネフロトキシンによって誘発される薬物性肝損傷による肝毒性)からなる群より選択される、パラグラフ17A記載の方法。
19A. 対象が、心臓の線維症および/または心臓の炎症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
20A. 疾患または状態が、心臓線維症、心筋梗塞、心臓弁線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症、不整脈原性右室心筋症(ARVC)からなる群より選択される、パラグラフ19A記載の方法。
21A. 対象が、血管の線維症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
22A. 疾患または障害が、血管疾患、アテローム動脈硬化性血管疾患、血管狭窄、再狭窄、脈管炎、静脈炎、深部静脈血栓、および腹部大動脈瘤からなる群より選択される、パラグラフ21A記載の方法。
23A. 対象が、皮膚の線維症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
24A. 疾患または障害が、過剰な創傷治癒、強皮症、全身性硬化症、ケロイド、結合組織病、瘢痕、および肥厚性瘢痕からなる群より選択される、パラグラフ23A記載の方法。
25A. 対象が、関節の線維症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
26A. 疾患または障害が関節線維症である、パラグラフ2A5記載の方法。
27A. 対象が、中枢神経系の線維症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
28A. 疾患または障害が、脳卒中、外傷性脳傷害、および脊髄傷害からなる群より選択される、パラグラフ27A記載の方法。
29A. 対象が、消化器系の線維症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
30A. 疾患または障害が、クローン病、膵臓線維症、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される、パラグラフ29A記載の方法。
31A. 対象が、眼の線維症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
32A. 疾患または障害が、前嚢下白内障、後嚢混濁、黄斑変性、ならびに網膜および硝子体の網膜症からなる群より選択される、パラグラフ31A記載の方法。
33A. 対象が、筋骨格の骨または軟部組織構造の線維症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
34A. 疾患または障害が、骨粗鬆症および/または嚢胞性線維症に関連する骨減少、骨線維症の増加を伴う骨髄異形成状態、癒着性関節包炎、デュプュイトラン拘縮、ならびに骨髄線維症からなる群より選択される、パラグラフ33A記載の方法。
35A. 対象が、生殖器の線維症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
36A. 疾患または障害が、子宮内膜症およびペーロニー病からなる群より選択される、パラグラフ35A記載の方法。
37A. 対象が、線維症および/または炎症を引き起こす慢性感染症に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
38A. 感染症が、アルファウイルス、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、結核、HIV、およびインフルエンザからなる群より選択される、パラグラフ37A記載の方法。
39A. 対象が、線維症および/または炎症を引き起こす自己免疫疾患に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
40A. 自己免疫疾患が、強皮症および全身性エリテマトーデス(SLE)からなる群より選択される、パラグラフ39A記載の方法。
41A. 対象が、外傷に関連する瘢痕に罹患している、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
42A. 外傷に関連する瘢痕が、手術合併症(例えば、瘢痕組織が内蔵間で形成して拘縮、疼痛の原因となることがあり、不妊の原因となることがある、手術に起因する癒着)、化学療法薬誘発性線維症、放射線誘発性線維症、および火傷に関連する瘢痕からなる群より選択される、パラグラフ41A記載の方法。
43A. 線維症および/または炎症によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または障害が、臓器移植、乳房線維症、筋肉線維症、後腹膜線維症、甲状腺線維症、リンパ節線維症、膀胱線維症、および胸膜線維症からなる群より選択される、パラグラフ1A〜7Aのいずれか一つに記載の方法。
1B. タンパク尿に関連する疾患または状態に罹患している対象において腎損傷を予防または低減する方法であって、該対象においてタンパク尿を低減または予防するために有効な量のMASP-2阻害物質を投与する工程を含む、方法。
2B. MASP-2阻害物質がMASP-2阻害抗体またはその断片である、パラグラフ1B記載の方法。
3B. MASP-2阻害物質が、処置前のベースラインの24時間の尿タンパク質排泄と比較して24時間の尿タンパク質排泄の少なくとも20％低下を達成するために有効な量および時間で投与される、パラグラフ1Bまたは2B記載の方法。
4B. タンパク尿に関連する疾患または状態が、ネフローゼ症候群、子癇前症、子癇、腎臓の毒性病変、アミロイドーシス、コラーゲン血管疾患(例えば、全身性エリテマトーデス)、ループス腎炎、脱水、腎糸球体疾患(例えば、膜性糸球体腎炎、巣状分節性糸球体腎炎、C3糸球体症、微小変化群、リポイドネフローゼ)、激しい運動、ストレス、良性直立位(起立性)タンパク尿、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症(すなわち、ベルジェ病)、IgM腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎症、微小変化群、類肉腫症、アルポート症候群、糖尿病(糖尿病性腎症)、薬物誘発性毒性(例えば、NSAIDS、ニコチン、ペニシラミン、炭酸リチウム、金および他の重金属、ACE阻害因子、抗生物質(例えば、アドリアマイシン)またはオピエート(例えば、ヘロイン)または他のネフロトキシン);ファブリー病、感染症(例えば、HIV、梅毒、A型肝炎、B型肝炎、またはC型肝炎、連鎖球菌感染後感染症、尿路住血吸虫症);アミノ酸尿、ファンコニー症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、鎌状赤血球症、ヘモグロビン尿、多発性骨髄腫、ミオグロビン尿、臓器拒絶反応(例えば、腎移植拒絶反応)、エボラ出血熱、爪膝蓋骨症候群、家族性地中海熱、HELLP症候群、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症、関節リウマチ、1型糖原病、グッドパスチャー症候群、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、腎臓に広がった尿路感染症、シェーグレン症候群、ならびに感染後糸球体腎炎からなる群より選択される、パラグラフ1B〜3Bのいずれか一つに記載の方法。
5B. タンパク尿に関連する疾患または状態がIgA腎症(すなわち、ベルジェ病)である、パラグラフ1B〜3Bのいずれか一つに記載の方法。
6B. タンパク尿に関連する疾患または状態が膜性腎症である、パラグラフ1B〜3Bのいずれか一つに記載の方法。
7B. タンパク尿に関連する疾患または状態がループス腎炎である、パラグラフ1B〜3Bのいずれか一つに記載の方法。
1C. 慢性腎疾患の進行を阻害する方法であって、慢性腎疾患の進行の阻害を必要とする対象において尿細管間質性線維症を低減または予防するために有効な量のMASP-2阻害物質を投与する工程を含む、方法。
2C. MASP-2阻害物質がMASP-2阻害抗体またはその断片である、パラグラフ1C記載の方法。
3C. 前記阻害を必要とする対象が、MASP-2阻害物質の投与前にタンパク尿を示し、該対象が、処置前の対象におけるベースラインの24時間の尿タンパク質排泄と比較して24時間の尿タンパク質排泄の少なくとも20％低下を有するように、MASP-2阻害物質の投与によって該対象のタンパク尿が減少する、パラグラフ1C記載の方法。
4C. MASP-2阻害物質が、対象における透析の必要性を低減するか、遅延させるか、または排除するために有効な量で投与される、パラグラフ1C記載の方法。
1D. 1種もしくは複数種の腎毒性剤を用いた処置を受けたことがある対象、1種もしくは複数種の腎毒性剤を用いた処置を受けている対象、または1種もしくは複数種の腎毒性剤を用いた処置を受ける予定の対象において、腎傷害から腎臓を保護する方法であって、薬物誘発性腎症の発症を予防するかまたは寛解させるために有効な量のMASP-2阻害物質を投与する工程を含む、方法。
2D. MASP-2阻害物質がMASP-2阻害抗体またはその断片である、パラグラフ1D記載の方法。
3D. 腎毒性剤の前にMASP-2阻害物質が投与される、パラグラフ1D記載の方法。
4D. MASP-2阻害物質が腎毒性剤と同時に同時投与される、パラグラフ1D記載の方法。
5D. 腎毒性を治療するための腎毒性剤の後にMASP-2阻害物質が投与される、パラグラフ1D記載の方法。
1E. 免疫グロブリンA腎症(IgAN)に罹患しているヒト対象を治療する方法であって、MASP-2依存性補体活性化を阻害するために有効な量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
2E. 対象がステロイド依存性IgANに罹患している、パラグラフ1E記載の方法。
3E. MASP-2阻害抗体が、ヒトMASP-2に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその断片である、パラグラフ1Eまたは2E記載の方法。
4E. 抗体またはその断片が、組換え抗体、低下したエフェクター機能を有する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、パラグラフ1E〜3Eのいずれか一つに記載の方法。
5E. MASP-2阻害抗体が古典経路を実質的に阻害しない、パラグラフ1E〜4Eのいずれか一つに記載の方法。
6E. MASP-2阻害抗体が、90％ヒト血清中でのC3b沈着をIC50 30nM以下で阻害する、パラグラフ1E〜5Eのいずれか一つに記載の方法。
7E. 腎機能を改善するために有効な量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を対象に投与する工程の前に、ステロイド依存性IgANを有するヒト対象を同定する工程をさらに含む、パラグラフ2E記載の方法。
8E. MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、腎機能を改善するために有効な量で投与される、パラグラフ1E〜7Eのいずれか一つに記載の方法。
9E. MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、処置前の対象におけるベースラインの24時間の尿タンパク質排泄と比較して24時間の尿タンパク質排泄の少なくとも20％低下を達成するために有効な量および十分な時間で投与される、パラグラフ8E記載の方法。
10E. 組成物が、対象における腎機能を改善しかつコルチコステロイド投与量を低減するために十分な量で投与される、パラグラフ1E記載の方法。
11E. MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む、パラグラフ1E〜10Eのいずれか一つに記載の方法。
1F. 膜性腎症(MN)に罹患しているヒト対象を治療する方法であって、MASP-2依存性補体活性化を阻害するために有効な量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
2F. 対象がステロイド依存性MNに罹患している、パラグラフ1F記載の方法。
3F. MASP-2阻害抗体が、ヒトMASP-2に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその断片である、パラグラフ1Fまたは2F記載の方法。
4F. 抗体またはその断片が、組換え抗体、低下したエフェクター機能を有する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、パラグラフ1F〜3Fのいずれか一つに記載の方法。
5F. MASP-2阻害抗体が古典経路を実質的に阻害しない、パラグラフ1F〜4Fのいずれか一つに記載の方法。
6F. MASP-2阻害抗体が、90％ヒト血清中でのC3b沈着をIC50 30nM以下で阻害する、パラグラフ1F〜5Fのいずれか一つに記載の方法。
7F. 腎機能を改善するために有効な量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を対象に投与する工程の前に、ステロイド依存性MNを有するヒト対象を同定する工程をさらに含む、パラグラフ1F記載の方法。
8F. MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、腎機能を改善するために有効な量で投与される、パラグラフ1F〜7Fのいずれか一つに記載の方法。
9F. MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、処置前の対象におけるベースラインの24時間の尿タンパク質排泄と比較して24時間の尿タンパク質排泄の少なくとも20％低下を達成するために有効な量および十分な時間で投与される、パラグラフ8F記載の方法。
10F. 組成物が、対象における腎機能を改善しかつコルチコステロイド投与量を低減するために十分な量で投与される、パラグラフ1Fまたは2F記載の方法。
11F. MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む、パラグラフ1F〜10Fのいずれか一つに記載の方法。
1G. ループス腎炎(LN)に罹患しているヒト対象を治療する方法であって、MASP-2依存性補体活性化を阻害するために有効な量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、対象に投与する工程を含む、方法。
2G. 対象がステロイド依存性LNに罹患している、パラグラフ1G記載の方法。
3G. MASP-2阻害抗体が、ヒトMASP-2に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその断片である、パラグラフ1Gまたは2G記載の方法。
4G. 抗体またはその断片が、組換え抗体、低下したエフェクター機能を有する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、パラグラフ1G〜3Gのいずれか一つに記載の方法。
5G. MASP-2阻害抗体が古典経路を実質的に阻害しない、パラグラフ1G〜4Gのいずれか一つに記載の方法。
6G. MASP-2阻害抗体が、90％ヒト血清中でのC3b沈着をIC50 30nM以下で阻害する、パラグラフ1G〜5Gのいずれか一つに記載の方法。
7G. 腎機能を改善するために有効な量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を前記対象に投与する工程の前に、ステロイド依存性LNを有するヒト対象を同定する工程をさらに含む、パラグラフ1G記載の方法。
8G. MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、腎機能を改善するために有効な量で投与される、パラグラフ1G〜7gのいずれか一つに記載の方法。
9G. MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、処置前の対象におけるベースラインの24時間の尿タンパク質排泄と比較して24時間の尿タンパク質排泄の少なくとも20パーセント低下を達成するために有効な量および十分な時間で投与される、パラグラフ8G記載の方法。
10G. 組成物が、前記対象における腎機能を改善しかつコルチコステロイド投与量を低減するために十分な量で投与される、パラグラフ1Gまたは2G記載の方法。
11G. MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む、パラグラフ1G〜10Gのいずれか一つに記載の方法。
例示的な態様が例示および説明されたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を加えることができると理解される。

Claims (12)

  1. ステロイド依存性ループス腎炎(LN)に罹患しているヒト対象を治療するための、マンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ-2（MASP-2）阻害モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的組成物であって、前記抗体またはその断片が、ヒトMASP-2に特異的に結合し、かつ前記対象における腎機能を改善するために有効な量でMASP-2依存性補体活性化を阻害する、前記薬学的組成物。
  2. 前記抗体またはその断片が、組換え抗体、低下したエフェクター機能を有する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
  3. 前記MASP-2阻害抗体が古典経路を実質的に阻害しない、請求項1記載の薬学的組成物。
  4. 前記MASP-2阻害抗体が、90％ヒト血清中でのC3b沈着をIC50 30nM以下で阻害する、請求項1記載の薬学的組成物。
  5. 前記対象が、腎機能を改善するために有効な量のMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片を含む前記薬学的組成物の投与前に、ステロイド依存性LNを有するヒト対象として同定されている、請求項1記載の薬学的組成物。
  6. 前記対象における腎機能を改善しかつコルチコステロイド投与量を低減するために十分な量で投与される、請求項1記載の薬学的組成物。
  7. 前記MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
  8. 免疫グロブリンA腎症（IgAN）に罹患しているヒト対象におけるタンパク尿を低減するための薬学的組成物であって、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:69に示したアミノ酸配列のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む、マンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ-2（MASP-2）阻害モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含み、以下の投与計画:
    (a)IgANに罹患している対象への、約4mg/kg(すなわち、3.6mg/kg〜4.4mg/kg)の抗体の少なくとも12週間の処置期間にわたる週1回の静脈内投与;または
    (b)IgANに罹患している対象への、約180mg〜約725mg(すなわち、162mg〜797mg)の抗体の少なくとも12週間の処置期間にわたる週1回の静脈内投与
    に従って投与される、前記薬学的組成物。
  9. 前記処置期間の後に、少なくとも2ヶ月〜少なくとも6ヶ月の休止期間(すなわち、MASP-2阻害因子の投与なし)がある、請求項8記載の薬学的組成物。
  10. 前記処置期間および/または休止期間の間に、前記対象における尿中タンパク質レベルが定期的にモニタリングされる、請求項8記載の薬学的組成物。
  11. 前記処置期間の終了時および/または休止期間の終了時に、前記対象がコルチコステロイド投与を中断しているか、またはMASP-2阻害抗体による処置開始の前に受容したコルチコステロイド投与量と比較してコルチコステロイド投与量を大幅に低減している、請求項8記載の薬学的組成物。
  12. 前記MASP-2阻害抗体またはその断片が、SEQ ID NO:67に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつSEQ ID NO:69に示した軽鎖可変領域を含む、請求項8記載の薬学的組成物。
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