NO342384B1 - Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider - Google Patents

Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider Download PDF

Info

Publication number
NO342384B1
NO342384B1 NO20160483A NO20160483A NO342384B1 NO 342384 B1 NO342384 B1 NO 342384B1 NO 20160483 A NO20160483 A NO 20160483A NO 20160483 A NO20160483 A NO 20160483A NO 342384 B1 NO342384 B1 NO 342384B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
chimeric protein
factor
biologically active
active molecule
protein according
Prior art date
Application number
NO20160483A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20160483A1 (no
Inventor
Robert T Peters
Adam R Mezo
Daniel S Rivera
James M Stattel
Susan C Low
Alan J Bitonti
Original Assignee
Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33458764&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO342384(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Publication of NO20160483A1 publication Critical patent/NO20160483A1/no
Application filed by Bioverativ Therapeutics Inc filed Critical Bioverativ Therapeutics Inc
Publication of NO342384B1 publication Critical patent/NO342384B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

SAMMENDRAG Den foreliggende oppfinnelsen angår et kimært monomer-dimerhybridprotein hvor nevnte protein omfatter en første og en andre polypeptidkjede, og hvor nevnte første polypeptidkjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og et biologisk aktivt molekyl, og hvor nevnte andre polypeptidkjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten det biologisk aktive molekylet fra den første kjeden. Oppfinnelsen angår også fremgangsmåter for anvendelse samt fremgangsmåter for fremstilling av det kimære monomer-dimerhybridproteinet ifølge oppfinnelsen.

Description

Den foreliggende søknaden har prioritet i forhold til US foreløpig søknad nr.
60/469,600 innsendt 6. mai 2003, US foreløpige søknad nr.60/487,964 innsendt 17. juli 2003 og US foreløpigs søknad nr. 60/539,207 innsendt 26. januar 2004, som alle i sin helhet inngår som referanser. Den US ikke foreløpige søknaden med tittelen "Fremgangsmåter for kjemisk syntese av immunoglobulin kimære proteiner", innlevert samtidig den 6. mai 2004, inngår som en referanse.
Beskrivelsen angår generelt terapeutiske kimære proteiner som består av to polypeptidkjeder hvor den første kjeden omfatter et terapeutisk biologisk aktivt molekyl mens den andre kjeden ikke omfatter det terapeutiske biologisk aktive molekylet fra den første kjeden. Mer spesifikt angår beskrivelsen kimære proteiner som består av to polypeptidkjeder og hvor begge kjedene består av minst en del av et immunoglobulinkonstant område, hvor den første kjeden er modifisert slik at den ytterligere omfatter et biologisk aktivt molekyl, mens den andre kjeden ikke er modifisert på denne måten. Beskrivelsen angår således et kimært protein som er en monomer-dimerhybrid, det vil si et kimært protein med et dimert aspekt og et monomert aspekt, hvor det dimere aspektet skyldes at proteinet består av to polypeptidkjeder som hver består av en del av et immunoglobulinkonstant området og hvor det monomere aspektet kommer av at bare en av de to kjedene omfatter et terapeutisk biologisk aktivt molekyl. Figur 1 viser et eksempel på en monomerdimerhybrid hvor det biologisk aktive molekylet er erytropoietin (EPO) og delen av et immunoglobulinkonstant område et er IgG Fc-område.
Immunoglobuliner består av fire polypeptidkjeder, to tunge og to lette kjeder, som er assosiert eller bundet sammen ved hjelp av disulfidbindinger slik at det dannes tetramerer. Hver kjede består videre av et variabelt område og et konstant område. De variable områdene kontrollerer antigengjenkjennelse og binding, mens de konstante områdene, da spesielt de konstante områdene i de tunge kjedene, kontrollerer og styrer en rekke effektorfunksjoner så som komplementbinding og Fc-reseptorbinding (se for eksempel US patentene 6,086,875; 5,624,821;
5,116,964).
Det konstante området består videre av domener som er betegnet CH (konstant tunge) -domener (CH1, CH2, osv). Avhengig av isotypen (det vil si IgG, IgM, IgA, IgD og IgE) kan det konstante området omfatte eller bestå av tre eller fire CH-domener. Enkelte konstante områder i visse isotyper (for eksempel IgG) inneholder også et hengselområde Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.
Det foreligger flere beskrivelser på hvordan man skaper kimære proteiner som omfatter immunoglobulinkonstante områder forbundet til et protein av interesse eller et fragment av dette (se for eksempel US patentene 5,480,981 og 5,808,029; Gascoigne et al.1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2936; Capon et al. 1989, Nature 337: 525; Traunecker et al. 1989, Nature 339: 68; Zettmeissl et al.1990, DNA Cell Biol. USA 9: 347; Byrn et al.1990, Nature 344: 667; Watson et al. 1990, J. Cell. Biol. 110: 2221; Watson et al.1991, Nature 349: 164; Aruffo et al. 1990, Cell 61: 1303; Linsley et al. 1991, J. Exp. Med. 173: 721; Linsley et al. 1991, J. Exp. Med. 174: 561; Stamenkovic et al., 1991, Cell 66: 1133; Ashkenazi et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535; Lesslauer et al. 1991, Eur. J. Immunol. 27: 2883; Peppell et al.1991, J. Exp. Med. 174: 1483; Bennett et al. 1991, J. Biol.
Chem. 266: 23060; Kurschner et al. 1992, J. Biol. Chem. 267: 9354; Chalupny et al.
1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10360; Ridgway og Gorman, 1991, J. Cell. Biol. 115, Utdrag nr. 1448; Zheng et al. 1995, J. Immun. 154: 5590). Disse molekylene har vanligvis både den biologiske aktivitet som er assosiert med det forbundne molekylet av interesse, så vel som effektorfunksjonen, eller enkelte andre forønskede egenskaper som er assosiert med det immunoglobulinkonstante området (for eksempel biologisk stabilitet, cellulær sekresjon).
Fc-delen av et immunoglobulinkonstant område, avhengig av immunoglublinisotypen, kan inkludere CH2-, CH3- og CH4-domener så vel som hengselområdet. Kimære proteiner som inneholder en Fc-del av et immunoglobulin gir proteinet flere ønskelige egenskaper så som bedret stabilitet og forlenget serumhalvliv (Se Capon et al. 1989, Nature 337: 525) så vel som binding til Fcreseptorer så som den neonatale Fc-reseptoren (FcRn) (US patent nr. 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).
FcRn er aktiv i epitelvev hos voksne personer og uttrykkes i fordøyelsessystemets hulrom, luftveiene, nasale overflater, vaginale overflater, i kolon og på rektale overflater (US patent nr. 6,845,726). Kimære proteiner som omfatter FcRnbindende partnere (for eksempel IgG, Fc-fragmenter) kan effektivt bevege seg på tvers av epiteliske barrierer ved hjelp av FcRn, noe som tilveiebringer ikkeinvaderende måter for å systemisk administrere et forønsket terapeutisk molekyl. Videre blir kimære proteiner som omfatter en FcRn-bindende partner endocytosert av celler som uttrykker FcRn. Men i stedet for å bli merket for nedbrytning, blir disse kimære proteinene resirkulert i kroppen, noe som øker disse proteinenes in vivo halvliv.
Deler av de immunoglobulinkonstante områdene, for eksempel FcRnbindingspartnere, vil typisk assosiere seg via disulfidbindinger eller andre ikkespesifikke interaksjoner, med hverandre og danne dimerer eller multimerer av høyere orden. Den foreliggende beskrivelsen, inkludert den umiddelbare oppfinnelsen er basert delvis på den overraskende oppdagelsen at transcytose av kimære proteiner som omfatter FcRn-bindende partnere synes å være begrenset av molekylvekten på det kimære proteinet, idet proteiner med høyere molekylvekt har mindre effektiv transport.
Kimære proteiner som omfatter eller inneholder biologisk aktive molekyler, vil så snart de er administrert interagere eller virke sammen med et målmolekyl eller celle. Den foreliggende beskrivelsen, inkludert den umiddelbare oppfinnelsen, er videre delvis basert på den overraskende oppdagelsen at monomer-dimerhybrider med ett biologisk aktivt molekyl, men to deler av et immunoglobulinkonstant område, for eksempel to FcRn-bindende partnere, fungerer og kan transporteres mer effektivt enn homodimerer, også betegnet her ganske enkelt som "dimerer" eller multimerer av høyere orden med to eller flere kopier av det biologisk aktive molekylet. Dette skyldes delvis det faktum at kimære proteiner som omfatter to eller flere biologisk aktive molekyler som eksisterer som dimerer eller multimerer av høyere orden kan bli sterisk hindret fra å virke sammen med sitt målmolekyl eller celle, noe som skyldes nærværet av to eller flere biologisk aktive molekyler svært nær hverandre, og at det biologisk aktive molekylet kan ha høy affinitet for seg selv.
Ett aspekt ved den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer således kimære proteiner som omfatter et biologisk aktivt molekyl som transporteres på tvers av den epiteliske barrieren. Et ytterligere aspekt av beskrivelsen tilveiebringer kimære proteiner som omfatter minst ett biologisk aktivt molekyl som er i stand til å virke sammen med sitt målmolekyl eller celle med liten eller ingen sterisk hindring eller selvaggregering.
De forskjellige aspektene av beskrivelsen tilveiebringer kimære proteiner som omfatter en første og en andre polypeptidkjede, og hvor den første kjeden omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og hvor delen av det immunoglobulinkonstante området er blitt modifisert slik at det inkluderer et biologisk aktivt molekyl, mens den andre kjeden omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og hvor denne delen av det immunoglobulinkonstante området ikke er blitt modifisert til å inkludere det biologisk aktive molekylet i den første kjeden.
Oppsummering av den foreliggende beskrivelsen
Den foreliggende beskrivelsen angår et kimært protein som omfatter ett biologisk aktivt molekyl og to molekyler av minst en del av et immunoglobulinkonstant område. Det kimære proteinet er i stand til å virke sammen med et målmolekyl eller celle med mindre sterisk hindring sammenlignet med et kimært protein som omfatter minst to biologisk aktive molekyler og minst en del av to immunoglobulinkonstante områder. Beskrivelsen angår også et kimært protein som omfatter minst ett biologisk aktivt molekyl og to molekyler av minst en del av et immunoglobulinkonstant område som transporteres på tvers av en epitelisk barriere mer effektivt enn den tilsvarende homodimeren, det vil si hvor begge kjeder er bundet til det samme biologisk aktive molekylet. Beskrivelsen angår således et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede som er bundet sammen, og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, og hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område, men intet immunoglobulinvariabelt område og uten noe tilknyttet biologisk aktivt molekyl.
Beskrivelsen angår et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede som er forbundet med hverandre og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, mens nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten et immunoglobulinvariabelt område eller et biologisk aktivt molekyl, og hvor nevnte andre kjede ikke er kovalent bundet til noe molekyl med en molekylvekt større enn 1 kD, 2 kD, 5 kD, 10 kD eller 20 kD. I en utførelse er den andre kjeden ikke kovalent bundet til noe molekyl med en molekylvekt som er større enn 0-2 kD. I en utførelse er den andre kjeden ikke kovalent bundet til noe molekyl med en molekylvekt som er større enn 5-10 kD. I en utførelse er den andre kjeden ikke kovalent bundet til noe molekyl med en molekylvekt som er større enn 15-20 kD.
Den foreliggende beskrivelsen angår et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede som er forbundet med hverandre, og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, og hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og ikke kovalent forbundet med noe annet molekyl, bortsett fra delen av et immunoglobulin i nevnte første polypeptidkjede.
Den foreliggende beskrivelsen angår et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede som er forbundet med hverandre og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, og hvor nevnte andre kjede består av minst en del av et immunoglobulinkonstant område og eventuelt en affinitetstag.
Beskrivelsen angår et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede som er forbundet med hverandre og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, og hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten et immunoglobulinvariabelt område eller et biologisk aktivt molekyl, og eventuelt et molekyl med en molekylvekt på mindre enn 10 kD, 5 kD, 2 kD eller 1 kD. I en utførelse omfatter den andre kjeden et molekyl med en molekylvekt på mindre enn 15-20 kD. I en utførelse omfatter den andre kjeden et molekyl som har en molekylvekt på mindre enn 5-10 kD. I en utførelse omfatter den andre kjeden et molekyl med en molekylvekt på mindre enn Beskrivelsen angår et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og minst et første domene, og hvor nevnte første domene har minst en spesifikk bindingspartner og hvor nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og minst et andre domene, hvor nevnte andre domene er en spesifikk bindingspartner for nevnte første domene uten noe immunoglobulinvariabelt område eller et biologisk aktivt molekyl.
Beskrivelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede hvor den første polypeptidkjeden og den andre polypeptidkjeden er forskjellige og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å transfektere en celle med et første DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en første polypeptidkjede som omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og eventuelt en linker og et andre DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en andre polypeptidkjede som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten noe biologisk aktivt molekyl eller et immunoglobulinvariabelt område og eventuelt en linker, for deretter å dyrke cellen under betingelser slik at den polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet blir uttrykt og deretter isolere monomer-dimerhybrider som omfatter polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet og polypeptidkjeden som er kodet av det andre DNA-konstruktet.
Det er beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor nevnte første polypeptidkjede og andre polypeptidkjede er forskjellige, og hvor nevnte første polypeptidkjede omfatter et biologisk aktivt molekyl, minst en del av et immunoglobulinkonstant område og minst et første domene, og hvor nevnte første domene har minst en spesifikk bindingspartner og hvor nevnte andre polypeptidkjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og et andre domene hvor nevnte andre domene er en spesifikk bindingspartner for nevnte første domene uten ethvert biologisk aktivt molekyl eller et immunoglobulinvariabelt område og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å transfektere en celle med et første DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder nevnte første polypeptidkjede og et andre DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder nevnte andre polypeptidkjede, deretter dyrke cellene under betingelser slik at polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet blir uttrykt, og polypeptidkjeden som er kodet av det andre DNA-konstruktet blir uttrykt og deretter isolere monomer-dimerhybrider som omfatter polypeptidkjeden som blir kodet av det første DNA-konstruktet og polypeptidkjeden som blir kodet av det andre DNA-konstruktet.
Det er beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein ifølge den foreliggende beskrivelsen hvor fremgangsmåten omfatter å transfektere en celle med et første DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en første polypeptidkjede som omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og eventuelt en linker, for deretter å dyrke cellene under betingelser slik at den polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet blir uttrykt for deretter å isolere polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet, og transfektere en celle med et andre DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en andre polypeptidkjede som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten ethvert biologisk aktivt molekyl eller immunoglobulinvariabelt område, dyrke cellene under slike betingelser at polypeptidkjeden som er kodet av det andre DNA-konstruktet blir uttrykt, isolere den polypeptidkjeden som er kodet av det andre DNA-konstruktet, kombinere polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet med polypeptidkjeden som er kodet av det andre DNA-konstruktet under slike betingelser at det dannes monomer-dimerhybrider som omfatter polypeptidkjeden som er kodet av det første DNA-konstruktet og polypeptidkjeden som er kodet av det andre DNA-konstruktet, for deretter å isolere nevnte monomer-dimerhybrider.
Beskrivelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor den første polypeptidkjeden og den andre polypeptidkjeden ikke er identiske, og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å transfektere en celle med et DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en polypeptidkjede som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område, dyrke cellene under slike betingelser at polypeptidkjeden som kodes av DNA-konstruktet blir uttrykt med et N-terminalt cystein slik at det dannes dimerer av polypeptidkjeden og så isolere dimerene som omfatter to kopier av den polypeptidkjeden som er kodet av DNA-konstruktet og så kjemisk reagere de isolerte dimerene med et biologisk aktivt molekyl hvor nevnte biologisk aktivt molekyl har en C-terminus tioester, under slike betingelser at det biologisk aktive molekylet i alt vesentlig reagerer bare med en polypeptidkjede i dimeren, hvorved det dannes en monomer-dimerhybrid.
Beskrivelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor den første polypeptidkjeden og den andre polypeptidkjeden ikke er identiske, og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å transfektere en celle med et DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en polypeptidkjede som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område, dyrke cellene under slike betingelser at polypeptidkjeden som kodes av DNA-konstruktet blir uttrykt med et N-terminalt cystein slik at det dannes dimerer av polypeptidkjeden og så isolere dimerene som omfatter to kopier av den polypeptidkjeden som er kodet av DNA-konstruktet og så kjemisk reagere de isolerte dimerene med et biologisk aktivt molekyl hvor nevnte biologisk aktivt molekyl har en C-terminus tioester, slik at det biologisk aktive molekylet er forbundet med hver kjede i dimeren, denaturere dimeren som omfatter delen av immunoglobulinet som er forbundet med det biologisk aktive molekylet slik at det dannes monomere kjeder, kombinere de monomere kjedene med en polypeptidkjede som omfatter i det minste en del av et immunoglobulinkonstant område uten å være forbundet med et biologisk aktivt molekyl, slik at det dannes monomer-dimerhybrider, og så isolere disse.
Beskrivelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor den første polypeptidkjeden og den andre polypeptidkjeden ikke er identiske, og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å transfektere en celle med et DNA-konstrukt som omfatter et DNA-molekyl som koder en polypeptidkjede som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område, dyrke cellene under slike betingelser at polypeptidkjeden som kodes av DNA-konstruktet blir uttrykt som en blanding av to polypeptidkjeder hvor blandingen omfatter et polypeptid med et N-terminalt cystein og et polypeptid med et cystein svært nær nevnte N-terminus, isolere dimerene som omfatter en blanding av polypeptidkjeder som er kodet av DNA-konstruktet og kjemisk reagere de isolerte dimerene med et biologisk aktivt molekyl hvor nevnte biologisk aktive molekyl har en aktiv tioester slik at det i det minste dannes noen monomer-dimerhybrider, og deretter isolere nevnte monomer-dimerhybrider fra nevnte blanding.
Beskrivelsen angår også en fremgangsmåte for å behandle en sykdom eller en tilstand som omfatter å administrere et kimært protein ifølge den foreliggende beskrivelsen og derved behandle sykdommen eller tilstanden.
Ytterligere hensikter og fordeler ved materialet vil fremgå av den etterfølgende beskrivelsen og vil også delvis være innlysende fra beskrivelsen eller kan oppnås ved å praktisere det beskrevne. Hensiktene og fordelene ved oppfinnelsen vil kunne realiseres og oppnås ved hjelp av de elementer og kombinasjoner som spesielt er påpekt i de etterfølgende krav.
OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN
Basert på innholdet som beskrevet heri tilveiebringer oppfinnelsen
Et kimært protein omfattende et biologisk aktivt molekyl og to immunoglobulinkonstant områder eller deler derav, som er en Fc neonatal reseptor (FcRn) bindingspartner, hvor det kimære proteinet omfatter en første polypeptidkjede og en andre polypeptidkjede,
hvor nevnte første kjede omfatter en immunoglobelin konstant region eller del derav som er en FcRn bindingspartner
og hvor nevnte andre kjede består av et immunoglobulinkonstant område eller en del derav som er en FcRn bindende partner og valgfritt et molekyl med en molekylærvekt ikke større enn 2 kD,
hvori det biologiske aktive molekylet er bundet av en linker til ethvert av nevnte første og nevnte andre kjede,
og hvori det biologisk aktive molekylet er et protein selektert fra gruppen bestående av et cytokin, et hormon og en koaguleringsfaktor.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer videre en farmasøytisk blanding omfattende nevnte kimære protein og farmasøytisk akseptable eksipienter.
Videre aspekter og utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelsen er som beskrevet i de etterfølgende kravene.
Det er underforstått at både den foregående generelle beskrivelsen og den etterfølgende detaljerte beskrivelsen bare er forklarende og ikke begrensende for oppfinnelsen slik dette fremgår av de etterfølgende kravene.
KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
Figur 1 er et skjematisk diagram som sammenligner strukturen for en EPO-Fchomodimer eller -dimer med strukturen for en Epo-FC-monomer-dimerhybrid.
Figur 2a er aminosyresekvensen for det kimære proteinet faktor VII-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som blir spaltet av cellen og propeptidet (fet skrift) som blir gjenkjent av den vitamin K-avhengige γ-karboksylasen som modifiserer faktor VII slik at denne får full aktivitet. Sekvensen blir deretter spaltet av PACE, noe som gir faktor VII-Fc.
Figur 2b er aminosyresekvensen for det kimære proteinet faktor IX-Fc, inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen og propeptidet (fet skrift) som blir gjenkjent av den vitamin K-avhengige γ-karboksylasen som modifiserer faktor IX slik at denne får full aktivitet. Sekvensen blir deretter spaltet av PACE, noe som gir faktor IX-Fc.
Figur 2c er aminosyresekvensen for det kimære proteinet IFN α-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne IFN α-Fc.
Figur 2d er aminosyresekvensen for det kimære proteinet IFN α-Fc Δ-linker.
Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i den modne IFN α-Fc Δ-linkeren.
Figur 2e er aminosyresekvensen for det kimære proteinet Flag-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne Flag-Fc.
Figur 2f er aminosyresekvensen for det kimære proteinet Epo-CCA-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne Epo-CCA-Fc. Også vist med fest skrift er det sure oppkveilede coildomenet.
Figur 2g er aminosyresekvensen for det kimære proteinet CCB-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne CCB-Fc. Også vist med fet skrift er det basiske oppkveilede coildomenet.
Figur 2h er aminosyresekvensen for det kimære proteinet Cys-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne Cys-Fc. Når denne sekvensen blir produsert i CHO-celler, så vil en viss prosent av molekylene bli galt spaltet av signalpeptidasen slik at to ekstra aminosyrer blir igjen på N-terminus, noe som hindrer bindingen av et biologisk aktivt molekyl med en C-terminal tioester (for eksempel via en nativ ligering). Når disse uriktig spaltede proteinene dimeriseres med riktig spaltet Cys-Fc og deretter reageres med biologisk aktive molekyler med C-terminale tioestere, vil det danne seg monomer-dimerhybrider.
Figur 2i er aminosyresekvensen for det kimære proteinet IFN α-GS15-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne IFN α-GS15-Fc.
Figur 2j er aminosyresekvensen for det kimære proteinet Epo-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen, noe som resulterer i det modne Epo-Fc. Også vist med fet skrift er 8 aminosyrelinkeren.
Figur 3a er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor VII-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) og propeptidet (fet skrift) som gjenkjennes av den vitamin K-avhengige γ-karboksylasen som modifiserer faktor VII slik at denne får full aktivitet. Den translaterte sekvensen blir deretter spaltet av PACE, noe som gir det modne faktor VII-Fc.
Figur 3b er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor IX-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) og propeptidet (fet skrift) som gjenkjennes av den vitamin K-avhengige γ-karboksylasen som modifiserer faktor IX slik at denne får full aktivitet. Den translaterte sekvensen blir deretter spaltet av PACE, noe som gir det modne faktor IX-Fc.
Figur 3c er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor IFN α-Fc.
Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne IFN α-Fc.
Figur 3d er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor IFN α-Fc Δ-linker. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne IFN α-Fc Δ-linker.
Figur 3e er aminosyresekvensen for det kimære proteinet faktor Flag-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne Flag-Fc.
Figur 3f er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor Epo-CCA-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne Epo-CCA-Fc. Også vist med fet skrift er det sure oppkveilede coildomenet.
Figur 3g er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor CCB-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne CCB-Fc. Også vist med fet skrift er det basiske oppkveilede coildomenet.
Figur 3h er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor Cys-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne Cys-Fc.
Figur 3i er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor IFN α-GS15-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne IFN α-GS15-Fc.
Figur 3j er nukleinsyresekvensen for det kimære proteinet faktor Epo-Fc. Inkludert i sekvensen er signalpeptidet (understreket) som spaltes av cellen etter translatering, noe som resulterer i det modne Epo-Fc. Også vist med fet skrift er nukleinsyresekvensen som koder 8 aminosyrelinkeren.
Figur 4 viser forskjellige måter for å danne monomer-dimerhybrider ved hjelp av nativ ligering.
Figur 5a viser aminosyresekvensen for Fc MESNA (SEKV.ID. NR.4).
Figur 5b viser aminosyresekvensen for Fc MESNA (SEKV.ID. NR.5).
Figur 6 sammenligner den antivirale aktiviteten for IFN α homodimer (som omfatter 2 IFN α-molekyler) med en IFN α monomer-dimerhybrid (det vil si omfatter 1 IFN α-molekyl).
Figur 7 er en sammenligning mellom koaguleringsaktiviteten for en kimær monomer-dimerhybrid faktor VIIa-Fc (ett faktor VII-molekyl) og en kimær homodimer faktor VIIa-Fc (to faktor VII-molekyler).
Figur 8 sammenligner den orale doseringen i neonatale rotter av en kimær monomer-dimerhybrid faktor VIIa-Fc (ett faktor VII-molekyl) og en kimær homodimer faktor VIIa-Fc (to faktor VII-molekyler).
Figur 9 sammenligner den orale doseringen av neonatale rotter med en kimær monomer-dimerhybrid faktor IX-Fc (ett faktor IX-molekyl) med en kimær homodimer.
Figur 10 er en tidsstudie som sammenligner den kimære monomer-dimerhybriden faktor IX-Fc (ett faktor IX-molekyl) som blir administrert oralt til neonatale rotter med en oralt administrert kimær homodimer.
Figur 11 viser farmakokinetikken for en Epo-Fc-dimer sammenlignet med en Epo-Fc monomer-dimerhybrid i cynomolgusaper etter en enkelt lungedose.
Figur 12 sammenligner serumkonsentrasjonen i aper som er subkutant administrert en Epo-Fc monomer-dimerhybrid med subkutant administrert Aranesp<®>(darbepoetin alfa).
Figur 13 sammenligner serumkonsentrasjonen i aper som er intravenøst administrert en Epo-Fc monomer-dimerhybrid med intravenøst administrert Aranesp<®>(darbepoetin alfa) og Epogen<®>(epoetin alfa).
Figur 14 viser spor fra en Mimetic Red 2<TM>-kolonne (ProMetic LifeSciences, Inc., Wayne, NJ) og en SDS-PAGE av fraksjoner fra kolonnen som inneholdt en EpoFc monomer-dimerhybrid, EpoFc-dimer og Fc. EpoFc monomer-dimerhybriden blir funnet i fraksjonene 11, 12, 13 og 14. EpoFc blir funnet i fraksjon 18, mens Fc blir funnet i fraksjonene 1/2.
Figur 15 viser farmakokinetikkene for IFN βFc med en 8 aminosyrelinker i cynomolgusaper etter en enkelt lungedose.
Figur 16 viser neopterinstimulering som en respons på IFN β-Fc-homodimeren og IFN β-Fc N297A monomer-dimerhybriden i cynomolgusaper.
Figur 17a viser nukleotidsekvensen for interferon β-Fc; figur 17b viser aminosyresekvensen for interferon β-Fc.
Figur 18 viser aminosyresekvensen for T20(a); T21(b) og T1249(c).
BESKRIVELSE AV UTFØRELSENE
A. Definisjoner
Affinitetsmerke slik det brukes her, betyr et molekyl som er knyttet til et andre molekyl av interesse og som er i stand til å virke sammen med en spesifikk bindingspartner for det formål å isolere eller identifisere nevnte andre molekyl av interesse.
Analoger av kimære proteiner ifølge beskrivelsen, for eksempel av kimære proteiner ifølge oppfinnelsen, eller proteiner eller peptider som i alt vesentlig er identiske med de kimære proteinene ifølge beskrivelsen, for eksempel av kimære proteiner ifølge oppfinnelsen slik de brukes her, betyr at en relevant aminosyresekvens for et protein eller et peptid er minst 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% eller 100% identisk med en gitt sekvens. For eksempel kan slike sekvenser være varianter som er avledet fra forskjellige arter, eller de kan være avledet fra en gitt sekvens ved forkortelse, fjerning, aminosyresubstitusjon eller addering. Prosent identitet mellom to aminosyresekvenser bestemmes ved standard sammenstillingsalgoritmer så som for eksempel Basic Local Alignment Tool (BLAST) beskrevet i Altschul et al.1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410, algoritmen til Needleman et al.1970, J. Mol. Biol., 48: 444-453; algoritmen til Meyers et al. 1988, Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17; eller Tatusova et al.1999, FEMS Microbiol. Lett., 174: 247-250, osv. Slike algoritmer er inkorporert i BLASTN-, PLASTP- og "BLAST 2 Sequences"-programmene (se www.ncbi.nlm.nih-gov/BLAST). Når man bruker slike programmer kan man bruke standardparameterne. For nukleotidsekvenser kan for eksempel de følgende settinger brukes for "BLAST 2 Sequences": BLASTN-prgrammet, belønning for tilpasning 2, penalitet for mistilpasning -2, åpent gap og forlengelsesgappenaliteter 5 og 2 henholdsvis, gap x_dropoff 50, forventet 10, ordstørrelse 11 og filter PÅ. For aminosyresekvenser kan følgende settinger brukes for "BLAST 2 Sequences":
BLASTP-programmet, matrise BLOSUM62, åpent gap og forlengelsesgappenaliteter 11 og 1 henholdsvis, gap x_dropoff 50, forventet 10, ordstørrelse 3, filter PÅ.
Biotilgjengelighet slik det brukes her, betyr graden og hastigheten ved hvilken en forbindelse blir absorbert i et levende system eller blir gjort tilgjengelig på stedet for fysiologisk aktivitet.
Biologisk aktivt molekyl slik det brukes her, betyr et ikke-immunoglobulinmolekyl eller fragment av dette som er i stand til å behandle en sykdom eller tilstand eller lokalisere eller lede et molekyl til et sete for en sykdom eller tilstand i kroppen ved å gjennomføre en funksjon eller en virkning, eller ved å stimulere eller responderen på en funksjon, en virkning eller en reaksjon i en biologisk sammenheng (for eksempel i en organisme, en celle eller i en in vitro modell på disse). Biologisk aktive molekyler kan omfatte minst en av polypeptider, nukleinsyrer eller små molekyler, så som små organiske eller uorganiske molekyler.
Et kimært protein slik det brukes her, refererer seg til ethvert protein som omfatter en første aminosyresekvens avledet fra en første kilde som er bundet, enten kovalent eller ikke-kovalent, til en andre aminosyresekvens som er avledet fra en andre kilde, hvor nevnte første og andre kilder er forskjellige. En første og en andre kilde som er forskjellige kan inkludere to forskjellige biologiske enheter, eller to forskjellige proteiner fra den samme biologiske enheten, eller en biologisk enhet og en ikkebiologisk enhet. Et kimært protein kan for eksempel inkludere et protein som er avledet fra minst 2 forskjellige biologiske kilder. En biologisk kilde kan inkludere enhver ikke-syntetisk fremstilt nukleinsyre eller aminosyresekvens (for eksempel en genomisk eller cDNA-sekvens, et plasmid eller en viral vektor, et naturlig virion eller en mutant eller analog av dette, slik det ytterligere er beskrevet i det etterfølgende, av enhver av de ovennevnte). En syntetisk kilde kan inkludere et protein eller en nukleinsyresekvens som er fremstilt kjemisk og ikke av et biologisk system (for eksempel en fastfasesyntese av aminosyresekvenser). Et kimært protein kan også inkludere et protein som er avledet fra minst 2 forskjellige syntetiske kilder eller et protein avledet fra minst en biologisk kilde og minst en syntetisk kilde. Et kimært protein kan også omfatte en første aminosyresekvens avledet fra en første kilde som kovalent eller ikke-kovalent er forbundet med en nukleinsyre avledet fra enhver kilde, eller et lite organisk eller uorganisk molekyl avledet fra enhver kilde. Det kimære proteinet kan omfatte et linkermolekyl mellom den første og den andre aminosyresekvensen, eller mellom den første aminosyresekvensen og nukleinsyren, eller mellom den første aminosyresekvensen og det lille organiske eller uorganiske molekylet.
Koaguleringsfaktor slik det brukes her, betyr ethvert molekyl eller analog av dette, naturlig forekommende eller rekombinant fremstilt, som hindrer eller nedsetter varigheten av en blødning i en pasient med en hemostatisk lidelse. Med andre ord, det betyr ethvert molekyl som har en koaguleringsaktivitet.
Koaguleringsaktivitet slik det brukes her, betyr evnen til å delta i en kaskade av biokjemiske reaksjoner som kulminerer i dannelsen av en fibrinklump og/eller reduserer graden, varigheten eller frekvensen av en blødning.
Dimer slik det brukes her, refererer seg til et kimært protein som omfatter en første og en andre polypeptidkjede hvor den nevnte første og andre kjeden begge omfatter et biologisk aktivt molekyl og i det minste en del av et immunoglobulinkonstant område. En homodimer refererer seg til en dimer hvor begge de biologisk aktive molekylene er identiske.
Dimerisk forbundet monomer-dimerhybrid refererer seg til et kimært protein som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område, for eksempel et Fc-fragment av et immunoglobulin, et biologisk aktivt molekyl og en linker som binder de to sammen slik at ett biologisk aktivt molekyl er bundet til 2 polypeptidkjeder som hver omfatter en del av et immunoglobulinkonstant område. Figur 4 viser et eksempel på en dimerisk forbundet monomer-dimerhybrid.
DNA-konstrukt slik det brukes her, betyr et DNA-molekyl eller en klon av et slikt molekyl, enten enkelt- eller dobbelttrådet som er blitt modifisert ved et aktivt inngrep slik at det inneholder segmenter av DNA kombinert på en slik måte at det ellers ikke ville eksistere i naturen. DNA-konstrukter inneholder den informasjon som er nødvendig for å styre ekspresjonen av polypeptider av interesse. DNA-konstrukter kan inkludere promotere, forsterkere og transkripsjonsterminatorer. DNA-konstrukter som inneholder den informasjonen som er nødvendig for å styre sekresjonen av et polypeptid, vil også inneholde minst én sekretorisk signalsekvens.
Domene slik det brukes her, betyr et område av et polypeptid (inklusive proteiner slik dette begrepet er definert her) med distinkte fysiske egenskaper eller roller, og kan for eksempel inkludere en uavhengig foldet struktur sammensatt av en seksjon av en polypeptidkjede. Et domene kan inneholde sekvensen for en distinkt fysisk karakter for polypeptidet, eller kan inneholde et fragment av den nevnte fysiske karakter som har beholdt sine bindingsegenskaper (for eksempel at den kan binde seg til et andre domene). Et domene kan være assosiert med et annet domene. Med andre ord, et første domene kan naturlig binde seg til et andre domene.
Et fragment slik det brukes her, refererer seg til et peptid eller polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som har minst 2 sammenhengende aminosyrerester, minst 5 sammenhengende aminosyrerester, minst 10 sammenhengende aminosyrerester, minst 15 sammenhengende aminosyrerester, minst 20 sammenhengende aminosyrerester, minst 25 sammenhengende aminosyrerester, minst 40 sammenhengende aminosyrerester, minst 50 sammenhengende aminosyrerester, minst 100 sammenhengende aminosyrerester, minst 200 sammenhengende aminosyrerester eller enhver delesjon eller forkortelse av et protein, peptid eller polypeptid.
Hemostase slik det brukes her, betyr å stoppe en blødning eller stoppe blodstrømmen gjennom et blodkar eller en del av kroppen.
Hemostatisk lidelse slik det brukes her, betyr en genetisk arvet eller ervervet tilstand som er karakterisert ved en tendens til blødningen, enten spontant eller som et resultat av traume, noe som skyldes en svekket evne eller manglende evne til å danne en fibrinklump.
Forbundet slik det brukes her, refererer seg til en første nukleinsyresekvens som kovalent er forbundet med en andre nukleinsyresekvens. Den første nukleinsyresekvensen kan være direkte forbundet eller plassert inntil den andre nukleinsyresekvensen, eller alternativt en mellomliggende sekvens kan forbinde den første sekvensen til den andre sekvensen. Forbundet slik det brukes her, refererer seg også til en første aminosyresekvens som kovalent eller ikke-kovalent er forbundet med en andre aminosyresekvens. Den første aminosyresekvensen kan være direkte forbundet eller plassert inntil den andre aminosyresekvensen, eller alternativt en mellomliggende sekvens kan kovalent forbinde den første aminosyresekvensen til den andre aminosyresekvensen.
Operativt forbundet slik det brukes her, betyr at en første nukleinsyresekvens er forbundet med en andre nukleinsyresekvens slik at begge sekvensene er i stand til å bli uttrykt som et biologisk aktivt protein eller peptid.
Polypeptid slik det brukes her, refererer seg til en polymer av aminosyrer og refererer seg ikke til en spesifikk lengde på produktet; peptider, oligopeptider og proteiner inngår således i definisjonen av et polypeptid. Dette begrepet utelukker ikke postekspresjonsmodifikasjoner av polypeptidet, for eksempel glykosylering, acetylering, fosforylering, pegylering, addering av en lipidgruppe eller addering av ethvert organisk eller uorganisk molekyl. Definisjonen inkluderer for eksempel polypeptider som inneholder en eller flere analoger av en aminosyre (inklusive for eksempel unaturlige aminosyrer) og polypeptider med substituerte bindinger så vel som andre modifikasjoner av velkjent art, enten disse er naturlig forekommende eller ikke-naturlig forekommende.
Høy stringens slik det brukes her, inkluderer betingelser som lett kan bestemmes av en fagperson basert for eksempel på lengden av DNA-molekylet. Generelt er slike betingelser definert i Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, bind 1, sidene 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) og inkluderer bruken av en forvaskingsløsning for nitrocellulosefiltrene 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), hybridiseringsbetingelser med 50% formamid, 6X SSC ved 42 ºC (eller en annen lignende hybridiseringsløsning så som Starks løsning i 50% formamid ved 42 ºC og vasking ved omtrent 68 ºC, 0,2X SSC, 0,1% SCS). En fagperson vil lett forstå at temperatur og saltkonsentrasjonen i vaskeløsningen kan justeres etter behov avhengig av faktorer så som lengden på proben.
Moderat stringens slik det brukes her, inkluderer betingelser som lett kan bestemmes av fagpersoner og er basert for eksempel på lengden av DNA-molekylet. De generelle betingelsene er angitt i Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, bind 1, sidene 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) og inkluderer bruken av forvaskingsløsning for nitrocellulosefiltrene 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) og hybridiseringsbetingelser med 50% formamid, 6X SSC ved 42 ºC (eller andre lignende hybridiseringsløsninger så som Starks løsning i 50% formamid ved 42 ºC) og vaskebetingelser ved 60 ºC, 0,5X SSC, 0,1% SDS.
Et lite uorganisk molekyl slik det brukes her, betyr et molekyl uten karbonatomer og med en molekylvekt som er mindre enn 50 kD.
Et lite organisk molekyl slik det brukes her, betyr et molekyl som inneholder minst ett karbonatom og som har en molekylvekt som er mindre enn 50 kD.
Behandling og å behandle slik det brukes her, betyr enhver av de følgende:
Reduksjon av graden av en sykdom eller en tilstand; reduksjon med hensyn til varigheten av sykdomsforløpet; lindring av en eller flere symptomer som er assosiert med en sykdom eller tilstand; tilveiebringelse av fordelaktige effekter for en pasient som har en sykdom eller en tilstand uten at man derved helbreder sykdommen eller tilstanden, profylakse med hensyn til ett eller flere symptomer som er assosiert med en sykdom eller tilstand.
B. Forbedringer som er tilveiebrakt ved visse utførelser av oppfinnelsen
Beskrivelsen tilveiebringer kimære proteiner (monomer-dimerhybrider) som omfatter en første og en andre polypeptidkjede hvor nevnte første kjede omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, mens nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten noe biologisk aktivt molekyl eller variabelt område av et immunoglobulin. Figur 1 viser forskjellen mellom tradisjonelle fusjonsproteindimerer og et eksempel på monomer-dimerhybriden ifølge beskrivelsen. I dette eksempelet er det biologisk aktive molekylet EPO og delen av et immunoglobulin er IgG Fc-området.
På samme måte som andre kimære proteiner som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område, så tilveiebringer beskrivelsen kimære proteiner som har bedret stabilitet og forhøyet biotilgjengelighet for det kimære proteinet sammenlignet med det biologisk aktive molekylet alene. Dessuten, på grunn av at bare en av de to kjedene omfatter det biologisk aktive molekylet, så har imidlertid det kimære proteinet lavere molekylvekt enn et kimært protein hvor alle kjedene omfatter et biologisk aktivt molekyl, og uten at man ønsker å være bundet til en spesifikk teori, så kan dette gjøre at det kimære proteinet blir lettere transcytosert over den epiteliske barrieren, for eksempel ved binding til FcRn-reseptoren, noe som øker halvlivet til det kimære proteinet. I en utførelse tilveiebringer beskrivelsen således en bedret ikke-invaderende fremgangsmåte (for eksempel via enhver slimhinneoverflate så som oralt, bukalt, sublingualt, nasalt, rektalt, vaginalt eller via en pulmonær eller okulær rute) for å administrere et terapeutisk kimært protein ifølge beskrivelsen. Beskrivelsen tilveiebringer således fremgangsmåter for å oppnå terapeutiske nivåer av de kimære proteinene ifølge beskrivelsen ved å bruke mindre frekvente og lavere doser enn sammenlignet med tidligere beskrevne kimære proteiner (det vil si kimære proteiner som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og et biologisk aktivt molekyl hvor alle kjedene i det kimære proteinet omfatter et biologisk aktivt molekyl).
I en annen utførelse tilveiebringer beskrivelsen en invaderende fremgangsmåte, for eksempel subkutant eller intravenøst, for å administrere et terapeutisk kimært protein ifølge beskrivelsen. Invaderende administrering av det terapeutisk kimære proteinet ifølge den foreliggende beskrivelsen gir et forlenget halvliv for det terapeutiske kimære proteinet som resulterer i at man kan bruke mindre frekvente og lavere doser sammenlignet med tidligere beskrevne kimære proteiner (det vil si kimære proteiner som omfatter i det minste en del av et immunoglobulinkonstant område og et biologisk aktivt molekyl hvor alle kjedene i det kimære proteinet omfatter et biologisk aktivt molekyl).
En annen fordel ved et kimært protein hvor bare en av kjedene omfatter et biologisk aktivt molekyl, er at det biologisk aktive molekylet har bedret tilgjengelighet for sin målcelle eller molekyl, noe som er et resultat av nedsatt sterisk hindring, færre hydrofobe interaksjoner, færre ioniske interaksjoner eller nedsatt molekylvekt, sammenlignet med et kimært protein hvor alle kjedene omfatter et biologisk aktivt molekyl.
C. Kimære proteiner
Beskrivelsen angår kimære proteiner som omfatter et biologisk aktiv molekyl, minst en del av et immunoglobulinkonstant område og eventuelt minst en linker. Delen av det immunoglobulin vil ha både en N- eller en aminoterminus og en C- eller karboksyterminus. Det kimære proteinet kan ha det biologisk aktive molekylet forbundet med N-terminus i delen av et immunoglobulin. Alternativt kan det biologisk aktive molekylet være forbundet med C-terminus i delen av et immunoglobulin. I en utførelse er forbindelsen en kovalent binding. I en annen utførelse er forbindelsen en ikke-kovalent binding.
Det kimære proteinet kan eventuelt omfatte minst en linker, således at det biologisk aktive molekylet ikke er direkte forbundet med delen av et immunoglobulinkonstant område. Linkeren kan ligge mellom det biologisk aktive molekylet og delen av et immunoglobulinkonstant område. Linkeren kan være forbundet med N-terminus i delen av et immunoglobulinkonstant område, eller C-terminus i delen av et immunoglobulinkonstant område. Hvis det biologisk aktive molekylet omfatter minst en aminosyre, så vil det biologisk aktive molekylet ha en N-terminus og en C-terminus og linkeren kan være forbundet med N-terminus i det biologisk aktive molekylet, eller C-terminus i det biologisk aktive molekylet.
Beskrivelsen angår et kimært protein med formel X-La-F:F eller F:F-La-X, hvor X er et biologisk aktivt molekyl, L er en eventuell linker og F er minst en del av et immunoglobulinkonstant område og a er ethvert tall eller null. Beskrivelsen angår også et kimært protein med formel Ta-X-La-F:F eller Ta-F:F-La-X, hvor X er et biologisk aktivt molekyl, L er en eventuell linker, F er minst en del av et immunoglobulinkonstant område og a er ethvert tall eller null. T er en andre linker eller alternativt et merke som kan brukes for å lette rensingen av det kimære proteinet, for eksempel et FLAG-merke, en histidinmerke, et GST-merke, et maltosebindende proteinmerke og (:) representerer en kjemisk assosiasjon, det vil si minst en ikke-peptidinbinding. I visse utførelser den kjemiske assosiasjonen, det vil si (:) en kovalent binding. I andre utførelser er den kjemiske assosiasjonen, det vil si (:) en ikke-kovalent interaksjon, for eksempel en ionisk interaksjon, en hydrofob interaksjon, en hydrofil interaksjon, en Van der Waals interaksjon eller en hydrogenbinding. Det er underforstått at når a er null så vil X være direkte forbundet med F. For eksempel kan a være 0, 1, 2, 3, 4, 5 eller mer.
I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge beskrivelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2a (SEKV.ID. NR. 6). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge beskrivelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2b (SEKV.ID. NR. 8). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge beskrivelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2c (SEKV.ID. NR.
10). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge beskrivelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2e (SEKV.ID. NR. 14). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge beskrivelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2f (SEKV.ID. NR. 16). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge beskrivelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2g (SEKV.ID. NR.
18). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge beskrivelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2h (SEKV.ID. NR. 20). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge beskrivelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2i (SEKV.ID. NR. 22). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge beskrivelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 2j (SEKV.ID. NR.
24). I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge beskrivelsen den aminosyresekvensen som er vist på figur 17b (SEKV.ID. NR. 27).
1. Kimære proteinvarianter
Beskrivelsen angår også derivater av de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen, antistoffer mot de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen og antistoffer mot bindingspartnere for de kimære proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelsen, og disse kan fremstilles ved å endre deres aminosyresekvenser ved substitusjoner, adderinger og/eller delesjoner/forkortelser eller ved å innføre en kjemisk modifikasjon som resulterer i funksjonelt ekvivalente molekyler. Det vil være innlysende for fagpersoner at visse aminosyrer i en sekvens for ethvert protein kan substitueres med andre aminosyrer uten at man derved skadelig påvirker proteinets aktivitet.
Det kan utføres forskjellige forandringer i aminosyresekvensene for de kimære proteinene ifølge den foreliggende beskrivelsen eller de DNA-sekvenser som koder dem, uten at det derved oppstår et betydelig tap av deres biologiske aktivitet, funksjon eller anvendbarhet. Derivater, analoger eller mutanter som er et resultat av slike forandringer og anvendelse av slike derivater, ligger innenfor den foreliggende beskrivelsen. I en spesifikk utførelse er derivatet funksjonelt aktivt, det vil si at det er i stand til å oppvise en eller flere av de aktiviteter som er assosiert med de kimære proteinene ifølge beskrivelsen, for eksempel FcRn-binding, viral hemming, hemostase og produksjon av røde blodceller. Det er kjent mange prøver som kan brukes for å teste aktiviteten for et kimært protein som omfatter et biologisk aktivt molekyl. Når det biologisk aktive molekylet er en HIV-hemmer, så kan aktiviteten testes ved å måle den reverse transkriptaseaktiviteten ved å bruke kjente fremgangsmåter (se for eksempel Barre-Sinoussi et al. 1983, Science 220: 868; Gallo et al.1984, Science 224: 500). Alternativt kan aktiviteten måles ved å måle den fusogene aktiviteten (se for eksempel Nussbaum et al. 1994, J. Virol.68(9): 5411). I de tilfeller at den biologiske aktiviteten er hemostase, så kan det gjennomføres en StaCLot FVIIa-rTF-prøve for å bedømme aktiviteten til faktor VIIa-derivater (Johannessen et al. 2000, Blood Coagulation and Fibrinolysis 11: S159).
Substitutter for en aminosyre i en sekvens kan velges blant andre aminosyrer i samme klasse som aminosyren tilhører (se tabell 1). Videre er forskjellige aminosyrer ofte substituert med nøytrale aminosyrer, for eksempel alanin, leukin, isoleukin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin (se for eksempel MacLennan et al.1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643: 55-67; Sasaki et al. 1998, Adv. Biophys. 35: 1-24).
TABELL 1
2. Biologisk aktive molekyler
Ifølge den foreliggende oppfinnelsen er det biologisk aktivt molekyl et protein selektert fra gruppen bestående av et cytokin, et hormon or en koaguleringsfaktor (som eksemplifisert i den etterfølgende beskrivelsen) Derimot inneholder den foreliggende beskrivelsen betraktninger av anvendelser av ethvert biologisk molekyl som det terapeutiske molekylet ifølge beskrivelsen. Det biologisk aktive molekylet kan være et polypeptid. Det biologisk aktive molekylet kan være en enkelt aminosyre. Det biologisk aktive molekylet kan inkludere et modifisert polypeptid.
Det biologisk aktive molekylet kan inkludere et lipidmolekyl (for eksempel et steroid eller kolesterol, en fettsyre, en triacylglyserol, glyserofosfolipid eller sfingolipid). Det biologisk aktive molekylet kan inkludere et sukkermolekyl (for eksempel glukose, sukrose eller mannose). Det biologisk aktive molekylet kan inkludere et nukleinsyremolekyl (for eksempel DNA eller RNA). Det biologisk aktive molekylet kan inkludere et lite organisk molekyl eller et lite uorganisk molekyl.
a. Cytokiner og vekstfaktorer
I en utførelse er det biologisk aktive molekylet en vekstfaktor, et hormon eller cytokin eller en analog eller fragment av disse. Det biologisk aktive molekylet kan være ethvert middel som er i stand til å indusere cellevekst og proliferering. I en spesifikk utførelse er det biologisk aktive molekylet ethvert middel som kan indusere en proliferering av erytrocytter. Et eksempel på et biologisk aktivt molekyl som således inngår i beskrivelsen, er EPO. Det biologisk aktive molekylet kan også inkludere, men er ikke begrenset til, RANTES, MIP1 α, MIP1 β, IL-2, IL-3, GM-CSF, veksthormon, tumornekrosefaktor (for eksempel TNF α eller - β).
Det biologisk aktive molekylet kan inkludere interferon α, enten dette er fremstilt syntetisk eller rekombinant og inkluderer, men er ikke begrenset til, enhver av omkring tjuefem strukturelt beslektede undertyper, for eksempel interferon- α2a, nå kommersielt tilgjengelige for klinisk bruk (ROFERON ®, Roche) og interferon- α2b, også godkjent for klinisk bruk (INTRON ®, Schering), så vel som genetisk endrede versjoner av forskjellige undertyper inklusive, men ikke begrenset til, kommersielt tilgjengelig konsensusinterferon α (INFERGEN ®, Intermune, utviklet av Amgen) og konsensus humant leukocyttinterferon, se for eksempel U.S. patent nr. 4,695,623 og 4,897,471, interferon β, epidermal vekstfaktor, gonadotropinfrigjørende hormon (GnRH), leuprolid, follikkelstimulerende hormon, progesteron, østrogen eller testosteron.
En liste over de cytokiner og vekstfaktorer som kan brukes i de kimære proteinene ifølge den foreliggende beskrivelsen er beskrevet tidligere (se for eksempel U.S.
patentene nr. 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613, WO 03/077834, US2003-0235536A1).
b. Antivirale midler
I en utførelse er det biologisk aktive molekylet et antiviralt middel inklusive fragmenter og analoger av dette. Et antiviralt middel kan inkludere ethvert molekyl som hindrer eller hemmer den virale replikasjonen, hemmer eller hindrer den virale inntrengingen i en celle eller hemmer eller hindrer en viral utvandring fra en celle. I en utførelse er det antivirale middelet en fusjonshemmer. I en utførelse er det antivirale middelet et cytokin som hemmer viral replikasjon. I en annen utførelse er det antivirale middelet interferon α.
Den virale fusjonshemmeren som kan brukes i det kimære proteinet kan være ethvert molekyl som nedsetter eller hindrer viral inntrengning gjennom en cellulær membran hos en målcelle. Den virale fusjonshemmeren kan være ethvert molekyl som nedsetter eller hindrer dannelsen av syncytia mellom minst to utsatt celler. Den virale fusjonshemmeren kan være ethvert molekyl som nedsetter eller hindrer forbindelsen mellom en lipid tolags membran hos en eukaryot celle og et lipid med to lag hos et innesluttet virus. Eksempler på innesluttede virus inkluderer, men er ikke begrenset til, HIV-1, HIV-2, SIV, influensa, parainfluensa, Epstein-Barr-virus, CMV, herpes simplex 1, herpes simplex 2 og respiratorisk syncytiavirus.
Den virale fusjonshemmeren kan være ethvert molekyl som nedsetter eller hindrer den virale fusjonen og inkluderer, men er ikke begrenset til, et polypeptid, et lite organisk molekyl eller et lite uorganisk molekyl. I en utførelse er fusjonshemmeren et polypeptid. I en utførelse er den virale fusjonshemmeren et polypeptid med 3-36 aminosyrer. I en annen utførelse er den virale fusjonshemmeren et polypeptid med 3-50 aminosyrer, 10-65 aminosyrer eller 10-75 aminosyrer. Polypeptidet kan omfatte en naturlig forekommende aminosyresekvens (for eksempel et fragment av gp41) inklusive analoger og mutanter av denne, eller polypeptidet kan omfatte en aminosyresekvens som ikke forefinnes i naturen så lenge polypeptidet har en viral fusjonshemmende aktivitet.
I en utførelse er den virale fusjonshemmeren et polypeptid som er identifisert som en viral fusjonshemmer ved å bruke minst en dataalgoritme, for eksempel ALLMOTI5, 107x178x4 og PLZIP (se for eksempel U.S. patentene 6,013,263; 6,015,881; 6,017,536; 6,020,459; 6,060,065; 6,068,973; 6,093,799; og 6,228,983).
I en utførelse er den virale fusjonshemmeren en HIV-fusjonshemmer. I en utførelse er nevnte HIV HIV-1. I en annen utførelse er nevnte HIV HIV-2. I en utførelse er HIV-fusjonshemmeren et polypeptid som omfatter et fragment av det gp41-omsluttende proteinet for HIV-1. HIV-fusjonshemmeren kan for eksempel omfatte T20 (SEKV.ID. NR. 1) eller en analog av denne, T21 (SEKV.ID. NR. 2) eller en analog av denne, T1249 (SEKV.ID. NR. 3) eller en analog av denne, NCCGgp41 (Louis et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: (31)29485) eller en analog av denne, eller 5-heliks (Root et al. 2001, Science 291: 884) eller en analog av denne.
Det er kjent flere prøver som kan brukes for å teste den virale fusjonshemmende aktiviteten for et polypeptid, et lite organisk molekyl eller et lite uorganisk molekyl. Disse prøvene inkluderer en revers transkriptaseprøve, en p24-prøve eller en syncytiadannelsesprøve (se for eksempel U.S. patent nr.5,464,933).
En liste over antivirale midler som kan brukes i de kimære proteinene ifølge den foreliggende beskrivelsen er beskrevet tidligere (se for eksempel U.S. patent nr. 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).
c. Hemostatiske midler
I en utførelse er det biologisk aktive molekylet en koaguleringsfaktor eller et annet middel som fremmer hemostase, inklusive fragmenter og analoger av disse.
Koaguleringsfaktoren kan inkludere ethvert molekyl som har koaguleringsaktivitet eller aktiverer et molekyl med slik aktivitet. Koaguleringsfaktoren kan omfatte et polypeptid. Den kan for eksempel være, men er ikke begrenset til, faktor VIII, faktor IX, faktor XI, faktor XII, fibrinogen, protrombin, faktor V, faktor VII og faktor X, faktor XIII eller von Willebrandfaktor. I en utførelse er koaguleringsfaktoren faktor VII eller faktor VIIa. Koaguleringsfaktoren kan være en faktor som deltar i den ekstriniske reaksjonsveien. Koaguleringsfaktoren kan være en faktor som deltar i den intriniske reaksjonsveien. Alternativt kan koaguleringsfaktoren være en faktor som deltar både i den ekstriniske og intriniske reaksjonsveien.
Koaguleringsfaktoren kan være en human koaguleringsfaktor eller en ikke-human koaguleringsfaktor, for eksempel avledet fra en ikke-human primat, en gris eller ethvert pattedyr. Koaguleringsfaktoren kan være en kimær koaguleringsfaktor, for eksempel kan koaguleringsfaktoren omfatte en del av en human koaguleringsfaktor og en del av en svinekoaguleringsfaktor, eller en del av en første ikke-human koaguleringsfaktor og en del av en andre ikke-human koaguleringsfaktor.
Koaguleringsfaktoren kan være en aktivert koaguleringsfaktor. Alternativt kan koaguleringsfaktor være en inaktiv form av en koaguleringsfaktor, for eksempel et zymogen. Den inaktive koaguleringsfaktoren kan så bli aktivert etter å ha blitt forbundet til minst en del av et immunoglobulinkonstant område. Den inaktive koaguleringsfaktoren kan aktiveres etter administrering til en pasient. Alternativt kan den inaktive koaguleringsfaktor aktiveres før administrering.
I visse utførelser kan en endopeptidase, for eksempel et paret basisk aminosyrespaltende enzym (PACE) eller ethvert annet enzym i PACE-familien så som PCSK1-9, inklusive trunkerte versjoner av slike, eller dens gjærekvivalent Kex2 fra S. cerevisiae og trunkerte versjoner av Kex2 (Kex2 1-675) (se for eksempel U.S. patentene 5,077,204; 5,162,220; 5,234,830; 5,885,821; 6,239,176) brukes for å spalte et propeptid for derved å danne det modne kimære proteinet ifølge beskrivelsen (for eksempel faktor VII eller faktor IX).
d. Andre proteinaktige biologisk aktive molekyler
I en utførelse ifølge denne beskrivelsen er det biologisk aktive molekylet en reseptor eller et fragment eller analog av dette. Reseptoren kan uttrykkes på en celleoverflate eller alternativt kan den uttrykkes i det indre av en celle. Reseptoren kan være en viral reseptor, for eksempel CD4, CCR5, CXCR4, CD21 eller CD46. Det biologisk aktive molekylet kan være en bakteriell reseptor. Det biologisk aktive molekylet kan være et ekstracellulært matriseprotein eller fragment eller analog av dette, noe som er viktig ved bakteriekolonisering og infeksjon (se for eksempel U.S. patentene 5,648,240; 5,189,015; 5,175,096) eller et bakterielt overflateprotein som er viktig ved tilfesting og infeksjon (se for eksempel U.S. patent nr. 5,648,240). Det biologisk aktive molekylet kan være en vekstfaktor, hormon eller cytokinreseptor eller et fragment eller analog av disse, for eksempel TNF α-reseptor, erytropoietinreseptoren, CD25, CD122 eller CD132.
Det er tidligere beskrevet en liste av andre proteinaktige molekyler som kan brukes i det kimære proteinet ifølge beskrivelsen (se for eksempel U.S. patentene 6,086,875; 6,485,726; 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).
e. Nukleinsyrer
I en utførelse er det biologisk aktive molekylet en nukleinsyre, for eksempel DNA eller RNA. I en spesifikk utførelse er det biologisk aktive molekylet en nukleinsyre som kan brukes ved RNA-interferens (RNAi). Nukleinsyremolekylet kan for eksempel være, men er ikke begrenset til, et antisensmolekyl eller et ribozym eller en aptamer.
Antisens RNA- og DNA-molekyler virker slik at de direkte blokkerer translateringen av mRNA ved å hybridisere seg til det målsøkte mRNA og derved hindre proteintranslatering. Antisensmetoder innbefatter blant annet å utforme oligonukleotider som er komplementære til et målgen mRNA.
Antisensoligonukleotidene vil binde seg til de komplementære målgen mRNA-transkriptene og hindre translatering. Det er ikke nødvendig med absolutt komplementaritet.
En sekvens som er "komplementær" til en del av et RNA slik dette er angitt her, betyr en sekvens som har tilstrekkelig komplementaritet til å være i stand til å hybridisere seg med RNA, danne en stabil dupleks og i forbindelse med dobbelttrådede antisensnuklinsyrer, kan således en enkelt tråd av dupleks DNA testes eller det kan undersøkes hvorvidt det har skjedd en tripleksdannelse. Evnen til å hybridisere vil være avhengig både av graden av komplementaritet og lengden på antisensnukleinsyren. Generelt er det slik at jo lenger hybridiseringsnukleinsyren er, jo flere basemistilpasninger med et RNA kan den inneholde og ikke desto mindre danne en stabil dupleks (eller tripleks hvis dette skulle være tilfellet). En fagperson vil lett kunne fastslå en toleransegrad med hensyn til mistilpasning ved å bruke standardprosedyrer for å bestemme smeltepunktet for det hybridiserte komplekset.
Antisensnukleinsyrene bør ha en lengde på minst seks nukleotider og fortrinnsvis bør oligonukleotidene ha en lengde på fra 6 til omtrent 50 nukleotider. I visse aspekter inneholder oligonukleotidet minst 10 nukleotider, minst 17 nukleotider, minst 25 nukleotider eller minst 50 nukleotider.
Oligonukleotidene kan være DNA eller RNA eller kimære blandinger eller derivater eller modifiserte versjoner av disse, enten de er enkelttrådede eller dobbelttrådede. Oligonukleotidet kan være modifisert ved hjelp av basegrupper, sukkergrupper eller fosfatkjeder, for derved for eksempel å bedre stabiliteten på molekylet, en hybridisering, osv. Oligonukleotidet kan inkludere andre tilfestede grupper så som polypeptider (for eksempel for å målsøke vertscellereseptorer in vivo) eller midler som letter transport på tvers av cellemembranen (se for eksempel Letsinger et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553; Lemaitre et al.1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648; WO 88/09810) eller blod-hjernebarrieren (se for eksempel WO 89/10134), hybridiseringsutløsende spaltingsmidler (se for eksempel Krol et al. 1988, BioTechniques 6: 958) eller interkalerende midler (se for eksempel Zon 1988, Pharm. Res. 5: 539). I så henseende kan oligonukleotidet være konjugert til et annet molekyl, for eksempel et polypeptid, et hybridiseringsutløst tverrbindingsmiddel, transportmiddel eller et hybridiseringsutløst spaltingsmiddel.
Ribozymmolekyler som er formet slik at de katalytisk spalter målgen mRNA-transkriptene kan også brukes for å hindre translatering av målgen mRNA, og derfor ekspresjon av målgenproduktet (se for eksempel WO 90/11364; Sarver et al. 1990, Science 247, 1222-1225).
Ribozymer er enzymatiske RNA-molekyler som er i stand til å katalysere den spesifikke spaltingen av RNA (se Rossi 1994, Current Biology 4: 469).
Mekanismen ved ribozymvirkning innbefatter en sekvensspesifikk hybridisering av ribozymmolekylet til det komplementære mål-RNA fulgt av en endonukleolytisk spaltingsreaksjon. Sammensetningen av ribozymmolekyler må inkludere en eller flere sekvenser som er komplementære til målgen mRNA og må inkludere velkjente katalytiske sekvenser som er ansvarlige for mRNA-spalting. For slike sekvenser, se for eksempel U.S. patent nr. 5,093,246.
I en utførelse kan man bruke ribozymer som spalter mRNA ved setespesifikk gjenkjennelsessekvenser for derved å ødelegge målgen mRNA-molekylene. I en annen utførelse er det mulig å bruke såkalte hammerhoderibozymer. Slike hammerhoderibozymer spalter mRNA-molekylene på steder som er diktert eller kontrollert av flankerende områder som danner komplementære basepar med målmRNA-molekylet. Det eneste kravet er at mål-mRNA-molekylet har den følgende sekvens av to baser: 5'-UG-3'. Konstruksjon og produksjon av hammerhoderibozymer er velkjente innenfor bioteknologien og er blant annet mer detaljert beskrevet i Myers 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York og i Haseloff og Gerlach 1988, Nature, 334: 585.
f. Små molekyler
Den foreliggende beskrivelsen angår også bruken av ethvert terapeutisk lite molekyl eller medikament som det biologisk aktive molekylet i det kimære proteinet ifølge beskrivelsen. Det er tidligere beskrevet lister av små molekyler og medikamenter som kan brukes i det kimære proteinet ifølge den foreliggende beskrivelsen (se for eksempel U.S. patentene 6,086,875; 6,485,726; 6,030,613; WO 03/077834;
US2003-0235536A1).
2. Immunoglobuliner
De kimære proteinene ifølge denne beskrivelsen omfatter i det minste en del av et immunoglobulinkonstant område. Immunoglobuliner består av fire proteinkjeder som er kovalent assosiert - to tunge kjeder og to lette kjeder. Hver kjede omfatter videre et variabelt område og et konstant område. Avhengig av immunoglobulinisotypen, så omfatter det tungkjedekonstante området 3 eller 4 konstante områdedomener (for eksempel CH1, CH2, CH3 eller CH4). Enkelte isotyper omfatter videre et hengselområde.
Delen av et immunoglobulinkonstant område kan oppnås fra ethvert pattedyr. Delen av et immunoglobulinkonstant område kan inkludere en del av et humant immunoglobulinkonstant område, et ikke-humant primat immunoglobulinkonstant område, et storfe immunoglobulinkonstant område, et svine immunoglobulinkonstant område, et muse immunoglobulinkonstant område, et saue immunoglobulinkonstant område eller et rotte immunoglobulinkonstant område.
Nevnte del av et immunoglobulinkonstant område kan fremstilles rekombinant eller syntetisk. Immunoglobulinet kan isoleres fra et cDNA-bibliotek. Delen av et immunoglobulinkonstant område kan isoleres fra et fagbibliotek (se for eksempel McCafferty et al. 1990, Nature 348: 552, Kang et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4353; EP 0589 877 B1). Delen av et immunoglobulinkonstant område kan oppnås ved såkalt genstokking av kjente sekvenser (Mark et al. 1992, Bio/Technol.
10: 779). Nevnte del av et immunoglobulinkonstant område kan isoleres ved in vivo rekombinasjon (Waterhouse et al. 1993, Nucl. Acid Res. 21: 2265).
Immunoglobulinet kan være et humanisert immunoglobulin (U.S. patent nr.
5,585,089, Jones et al., 1986, Nature 332: 323).
Delen av et immunoglobulinkonstant område kan inkludere en del av et IgG, et IgA, et IgM, et IgD eller et IgE. I en utførelse er immunoglobulinet en IgG. I en annen utførelse er immunoglobulinet IgG1. I en annen utførelse er immunoglobulinet IgG2.
Delen av et immunoglobulinkonstant område kan inkludere hele det tungkjedekonstante området eller et fragment eller analog av dette. I en utførelse kan et tungkjedekonstant område omfattet CH1-domene, et CH2-domene, et CH3-domene og/eller et hengselområde. I en annen utførelse kan et tungkjedekonstant område omfatte et CH1-domene, et CH2-domene, et CH3-domene og/eller et CH4-domene.
Delen av et immunoglobulinkonstant område kan inkludere et Fc-fragment. Et Fcfragment kan omfatte CH2- og CH3-domenene fra et immunoglobulin og immunoglobulinets hengselområde. Fc-fragmentet kan være Fc-fragmentet fra et IgG1, et IgG2, et IgG3 eller et IgG4. I en spesifikk utførelse er delen av et immunoglobulinkonstant område et Fc-fragment av et IgG1. I en annen utførelse er delen av et immunoglobulinkonstant område et Fc-fragment av et IgG2.
Som beskrevet annetsteds inneholder de kimære proteiner ifølge oppfinnelsen minst en del av et immunoglobulinkonstant område som er en Fc-neonatal reseptor (FcRn) bindingspartner. Dette reflekterer et annet eksempel på at delen av det immunoglobulinkonstante området er en FcRn bindingspartner. En FcRnbindingspartner er ethvert molekyl som spesifikt kan bindes av FcRn-reseptoren med etterfølgende aktiv transport ved hjelp av FcRn-reseptoren i nevnte FcRnbindingspartner. Begrepet spesifikt bundet refererer seg til to molekyler som danner et kompleks som er relativt stabilt under de fysiologiske betingelsene. Spesifikk binding er karakterisert ved en høy affinitet og med en lav til moderat evne i motsetning til ikke-spesifikk binding som vanligvis har lav affinitet med moderat til høy kapasitet. Typisk vil man anse en binding å være spesifikk når affinintetskonstanten KAer høyere enn 10<6>M<-1>eller fortrinnsvis høyere enn 10<8>M<-1>. Hvis det er nødvendig, kan ikke-spesifikk binding reduseres uten at man derved i vesentlig grad påvirker den spesifikke bindingen, noe som kan gjøres ved å variere bindingsbetingelsene. Passende bindingsbetingelser så som konsentrasjon av molekylene, løsningens ionestyrke, temperatur, reaksjonstid for binding, konsentrasjon av et blokkerende middel (for eksempel serum albumin, melkekasein), osv, kan optimaliseres av en person med faglig innsikt ved å bruke rutineteknikker.
FcRn-reseptoren er blitt isolert fra flere arter av pattedyr, inklusive mennesker. Sekvensene for det humane FcRn, ape FcRn, rotte FcRn og muse FcRn er kjente (Story et al. 1994, J. Exp. Med.180: 2377). FcRn-reseptoren binder IgG (men ingen andre immunoglobulinklasser så som IgA, IgM, IgD og IgE) ved relativt lav pH, transporterer så aktivt det nevnte IgG transcellulært i en luminal til serosal retning og frigjør deretter IgG ved den relativt høyere pH som forefinnes i de interstitiale væsker. Det blir uttrykt i voksent epitelisk vev (U.S. patentene 6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536A1) inklusive lunge- og tarmepitel (Israel et al. 1997, Immunology 92: 69), renalt proksimalt kanalepitel (Kobayashi et al.2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282: F358) så vel som i nasalt epitel, i vaginale overflater og i galltreoverflater.
FcRn-bindingspartnere til bruk ifølge den foreliggende beskrivelsen, inkludert den foreliggende oppfinnelsen, omfatter ethvert molekyl som spesifikt kan bindes av FcRn-reseptoren inklusive hele IgG, Fc-fragmentet av IgG og andre fragmenter som inkluderer det fullstendige bindingsområdet i FcRn-reseptoren. Området av Fcdelen av IgG som binder seg til FcRn-reseptoren er blitt beskrevet på basis av røntgenkrystallografi (Burmeister et al.1994, Nature 372: 379).
Hovedkontaktområdet for nevnte Fc med nevnte FcRn ligger nær kontaktpunktet for CH2- og CH3-domenene. Fc-FcRn-kontaktene ligger alle innenfor en enkelt Igtungkjede. FcRn-bindingspartnerne inkluderer hele IgG, Fc-fragmentet av IgG og andre fragmenter av IgG som inkluderer det fullstendige bindingsområdet for FcRn. De viktigste kontaktsetene inkluderer aminosyrerestene 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 og 314 av CH2-domenet og aminosyrerestene 385-387, 428 og 433-436 i CH3-domenet. Referansene til aminosyrenummereringen i immunoglobuliner eller immunoglobulinfragmenter eller -områder er alle basert på Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S.
Department of Public Health, Bethesda, MD.
Fc-området i IgG kan modifiseres ved hjelp av velkjente fremgangsmåter så som seterettet mutagenese og lignende for derved å gi modifiserte IgG- eller Fcfragmenter eller deler av disse, som vil bli bundet av FcRn. Slike modifikasjoner inkluderer modifikasjoner som ligger fjernt fra nevnte FcRn-kontaktseter så vel som modifikasjoner inne i kontaktsetene som vil bevare eller endog bedre bindingen til FcRn. For eksempel kan de følgende enkeltaminosyrerestene i det humane IgG1 Fc (Fc γ1) substitueres uten signifikant tap av Fc-bindingsaffinitet for FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, 1342A, R344A, E345A, 1347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A og K447A hvor for eksempel P238A representerer villtypeprolin som er substituert med alanin i stilling 238. Som et eksempel, en spesifikk utførelse av det heri beskrevne, for eksempel en spesifikk utførelse av oppfinnelsen, kan inkorporerer N297A-mutasjonen, noe som fjerner det sterkt konserverte N-glykosyleringssetet. I tillegg til alanin kan også andre aminosyrer erstatte de villtypeaminosyrer som er angitt i de ovenfor spesifiserte posisjonene. Mutasjoner kan være innført enkeltvis i Fc, noe som gir opphav til mer enn hundre FcRn-bindingspartnere som er distinkte fra det native eller opprinnelige Fc. Videre kan kombinasjoner av to, tre eller flere av disse individuelle mutasjonene innføres sammen, noe som gir opphav til hundrevis av flere FcRn-bindingspartnere. Videre kan en av FcRnbindingspartnerne i monomer-dimerhybriden muteres, mens den andre FcRnbindingspartneren ikke er mutert i det hele tatt, eller de kan begge være mutert, men med forskjellige mutasjoner. Enhver av de mutasjoner som er beskrevet her, inklusive N297A, kan brukes for å modifisere Fc, uavhengig av det biologisk aktive molekylet (for eksempel EPO, IFN, faktor IX eller T20).
Enkelte av de ovennevnte mutasjonene kan gi FcRn-bindingspartneren ny funksjonalitet. En utførelse inkorporerer for eksempel N297A, noe som fjerner et sterkt konservert N-glykosyleringssete. Effekten av denne mutasjonen er å redusere immunogenisitet og derved bedre det sirkulerende halvlivet for FcRnbindingspartneren og gjøre FcRn-bindingspartneren ute av stand til å binde seg til Fc γRI, Fc γRIIA, Fc γRIIB og Fc γRIIIA, uten at dette svekker affiniteten for FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60: 847; Friend et al. 1999, Transplantation 68: 1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276: 6591). Som et ytterligere eksempel på en ny funksjonalitet som kan oppstå ved hjelp av mutasjoner slik disse er beskrevet ovenfor, er at affiniteten for FcRn kan øke utover det som i enkelte tilfeller er kjent i villtypen. Denne forsterkede affiniteten kan reflektere en forsterket "på"-hastighet, en nedsatt "av"-hastighet eller både en forhøyet "på"-hastighet og en nedsatt "av"-hastighet. Mutasjoner som er antatt å gi en bedret affinitet for FcRn inkluderer T256A, T307A, E380A og N434 A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591).
Minst tre humane Fc-gammareseptorer synes også å gjenkjenne et bindingssete på IgG i det lavere hengselområdet, generelt aminosyrene 234-237. Et annet eksempel på en ny funksjonalitet og en mulig nedsatt immunogenisitet vil derfor kunne oppstå ved mutasjoner i dette området, for eksempel ved å erstatte aminosyrene 233-236 i det humane IgG1 "ELLG" med den tilsvarende sekvensen fra IgG2 "PVA" (med fjerning av en aminosyre). Det er blitt vist at Fc γRI, Fc γRII og Fc γRIII som kontrollerer og styrer visse effektorfunksjoner, ikke vil binde seg til IgG1 når slike mutasjoner er blitt innført. Ward og Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2: 77 og Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29: 2613.
I en utførelse er nevnte FcRn-bindingspartner et polypeptid som inkluderer sekvensen PKNSSMISNTP (SEKV.ID. NR. 26) og eventuelt ytterligere inkluderer en sekvens valgt fra HQSLGTQ (SEKV.ID. NR. 27), HQNLSDGK (SEKV.ID. NR.
28), HQNISDGK (SEKV.ID. NR. 29) eller VISSHLGQ (SEKV.ID. NR.30) (U.S. patent nr. 5,739,277).
To FcRn-reseptorer kan binde et enkelt Fc-molekyl. Krystallografiske data antyder at hvert FcRn-molekyl binder seg til et enkelt polypeptid i Fc-homodimeren. I en utførelse beskrevet heri, for eksempel i en utførelse av oppfinnelsen, vil en forbindelse mellom FcRn-bindingspartneren, for eksempel et Fc-fragment av et IgG med et biologisk aktivt molekyl (som i oppfinnelsen er en cytokin, et hormon eller en koaguleringsfaktor), gi en mulighet for å tilføre et biologisk aktivt molekyl oralt, bukalt, sublingualt, rektalt eller vaginalt som en aerosol som kan administreres nasalt eller via lungene, eller via en okulær vei. I en annen utførelse, for eksempel i en annen utførelse av oppfinnelsen, kan det kimære proteinet administreres invaderende, for eksempel subkutant eller intravenøst.
En person med faglig innsikt vil forstå at deler av et immunoglobulinkonstant område som skal brukes i det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen kan inkludere mutanter eller analoger av dette, eller kan inkludere kjemisk modifiserte immunoglobulinkonstante områder (for eksempel pegylert) eller fragmenter derav (se for eksempel Aslam og Dent 1998, Bioconjugation: Protein Coupling Techniques For the Biomedical Sciences Macmilan Reference, London). I ett tilfelle kan en mutant gi en bedret binding av FcRn-bindingspartneren til FcRn. I de kimære proteinene ifølge den foreliggende beskrivelsen er det også mulig å bruke peptidetterligninger for minst en del av et immunoglobulinkonstant område, for eksempel en peptidetterligning av et Fc-fragment eller en peptidetterligning av en FcRn-bindingspartner. I en utførelse blir peptidetterligningen identifisert via fagdisplay eller via kjemisk bibliotekscreening (se for eksempel McCafferty et al.
1990, Nature 348: 552, Kang et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363; EP 0 589 877 B1).
3. Eventuelle linkere
Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan eventuelt omfatte minst ett linkermolekyl. Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen vil alltid omfatte minst ett linkermolekyl. Linkeren kan bestå av ethvert organisk molekyl. I en utførelse ifølge beskrivelsen, for eksempel i en utførelse ifølge oppfinnelsen, er linkeren en polyetylenglykol (PEG). I en annen utførelse består linkeren av aminosyrer.
Linkeren kan omfatte 1-5 aminosyrer, 1-10 aminosyrer, 1-20 aminosyrer, 10-50 aminosyrer, 50-100 aminosyrer eller 100-200 aminosyrer. I en utførelse består linkeren av åtte aminosyrer EFAGAAAV (SEKV.ID. NR. 31). Enhver av de linkere som er beskrevet her kan brukes i det kimære proteinet ifølge beskrivelsen, for eksempel i det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen, for eksempel en monomerdimerhybrid inklusive EFAGAAAV, uten hensyn til det biologisk aktive molekylet (for eksempel EPO, IFN eller faktor IX).
Linkeren kan omfatte sekvensen Gn. Linkeren kan omfatte sekvensen (GA)n(SEKV.ID. NR. 32). Linkeren kan omfatte sekvensen (GGS)n(SEKV.ID. NR.33). Videre kan linkeren omfatte sekvensen (GGS)n(GGGGS)n(SEKV.ID. NR. 34). I disse tilfellene kan n være et helt tall fra 1-10, for eksempel 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10. Eksempler på linkere inkluderer, men er ikke begrenset til, GGG (SEKV.ID. NR. 35), SGGSGGS (SEKV.ID. NR. 36), GGSGGSGGSGGSGGG (SEKV.ID. NR.
37), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEKV.ID. NR. 38), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEKV.ID. NR. 39). Linkeren eliminerer eller svekker ikke den biologiske aktiviteten til det kimære proteinet. Eventuelt kan linkeren forsterke den biologiske aktiviteten til det kimære proteinet, for eksempel ved å svekke effektene av sterisk hindring og dessuten gjøre det biologisk aktive molekylet mer tilgjengelig for sitt målbindingssete.
I en spesifikk utførelse ifølge beskrivelsen, for eksempel i en utførelse ifølge oppfinnelsen, har linkeren for interferon α en lengde på 15-25 aminosyrer. I en annen spesifikk utførelse ifølge beskrivelsen/oppfinnelsen har linkeren for interferon α en lengde på 15-20 aminosyrer. I en annen spesifikk utførelse ifølge beskrivelsen/oppfinnelsen har linkeren for interferon α en lengde på 10-25 aminosyrer. I en annen spesifikk utførelse ifølge beskrivelsen/oppfinnelsen har linkeren for interferon α en lengde på 15 aminosyrer. I en utførelse ifølge beskrivelsen/oppfinnelsen er linkeren for interferon α (GGGGS)n(SEKV.ID. NR.
40) hvor G representerer glysin, S representerer serin og n er et helt tall fra 1 til 10. I en spesifikk utførelse ifølge beskrivelsen/oppfinnelsen, n lik 3.
Linkeren kan også inkorporere en gruppe som er i stand til å bli spaltet, enten kjemisk (for eksempel hydrolyse av en esterbinding), enzymatisk (for eksempel ved å inkorporere en proteasespaltingssekvens) eller fotolytisk (for eksempel ved hjelp av en kromofor så som 3-amino-3-(2-nitrofenyl)propionsyre (ANP)) for å frigjøre det biologisk aktive molekylet fra Fc-proteinet.
4. Kimær proteindimerisering ved å bruke spesifikke bindingspartnere
I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge beskrivelsen en første polypeptidkjede som omfatter minst ett første domene, og hvor nevnte første domene har minst én spesifikk bindingspartner og en andre polypeptidkjede som omfatter minst ett andre domene, hvor nevnte andre domene er en spesifikk bindingspartner for nevnte første domene. Det kimære proteinet omfatter således et polypeptid som er i stand til å dimerisere seg med et annet polypeptid på grunn av interaksjonen mellom nevnte første og nevnte andre domene. Fremgangsmåter for å dimerisere antistoffer ved å bruke heterologe domener er kjent (U.S. patentene n5.
5,807,706 og 5,910,573; Kostelny et al. 1992, J. Immunol. 148(5): 1547).
Dimeriseringen kan skje ved at det dannes en kovalent binding eller alternativt en ikke-kovalent binding, for eksempel en hydrofob interaksjon, ved hjelp av Van der Waalske krefter, interdigitering av amfifile peptider så som, men ikke begrenset til, alfahelikser, ladning-ladningsinteraksjoner mellom aminosyrer som har motsatte ladninger så som, men ikke begrenset til, lysin og aspartinsyre, arginin og glutaminsyre. I en utførelse er domenet en heliksbunt som består av en heliks, en vridning og en ny heliks. I en annen utførelse er domenet en såkalt leukinzipper som omfatter et peptid med flere repeterende aminosyrer hvor hver syvende aminosyre er en leukinrest. I en utførelse er de spesifikke bindingspartnerne fos/jun (se Branden et al. 1991, Introduction To Protein Structure, Garland Publishing, New York).
I en annen utførelse blir bindingen styrt ved hjelp av kjemisk binding (se for eksempel Brennan et al. 1985, Science 229: 81). I denne utførelsen omfatter intakte immunoglobuliner eller kimære proteiner minst en del av et immunoglobulinkonstant område som spaltes for å utvikle tungkjedefragmenter. Disse fragmentene kan redusere i nærværet av det ditiolkompleksdannende middelet natriumarsenitt for derved å stabilisere nærliggende ditioler og hindre intermolekylær disulfiddannelse. De dannede fragmentene kan så omdannes til tionitrobenzoat (TNB) -derivater. Ett av TNB-derivatene kan så omdannes tilbake til tungkjedefragmenttiolen ved reduksjon med merkaptoetylamin som så blandes med en ekvimolar mengde av det andre TNB-derivatet for å danne en kimær dimer.
D. Nukleinsyrer
Beskrivelsen angår et første nukleinsyrekonstrukt og et andre nukleinsyrekonstrukt som hver omfatter en nukleinsyresekvens som koder minst en del av det kimære proteinet ifølge beskrivelsen. I en utførelse omfatter det første nukleinsyrekonstruktet en nukleinsyresekvens som koder en del av et immunoglobulinkonstant område som operativt er forbundet med en andre DNA-sekvens som koder et biologisk aktivt molekyl og hvor nevnte andre DNA-konstrukt omfatter en DNA-sekvens som koder et immunoglobulinkonstant område men ikke et biologisk aktivt molekyl.
Det biologisk aktive molekylet kan for eksempel inkludere, men ikke begrenset til, en viral fusjonshemmer, en koaguleringsfaktor, en vekstfaktor eller et hormon, eller en reseptor, eller analog eller fragment av enhver av de foregående.
Nukleinsyresekvensene kan også inkludere ytterligere sekvenser eller elementer av velkjent type (for eksempel promoterer, forsterkere, poly A-sekvenser eller affinitetstagger). I en utførelse kan nukleinsyresekvensen i det andre konstruktet eventuelt inkludere en nukleinsyresekvens som koder en linker plassert mellom nukleinsyresekvensen som koder det biologisk aktive molekylet og delen av det immunoglobulinkonstante området. Nukleinsyresekvensen i det andre DNA-konstruktet kan eventuelt inkludere en linkersekvens som er plassert før eller etter den nukleinsyresekvensen som koder det biologisk aktive molekylet og/eller delen av det immunoglobulinkonstante området.
I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet DNA. I en annen utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet RNA. Nukleinsyrekonstruktet kan være en vektor, for eksempel en viral vektor eller et plasmid. Eksempler på virale vektorer inkluderer, men er ikke begrenset til, adenovirusvektor, en adenoassosiert virusvektor eller en museleukemivirusvektor. Eksempler på plasmider inkluderer, men er ikke begrenset til, pUC, pGEM og pGEX.
I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3a (SEKV.ID. NR.7). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3b (SEKV.ID. NR.9). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3c (SEKV.ID. NR. 11). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3d (SEKV.ID. NR.13). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3e (SEKV.ID. NR. 15). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3f (SEKV.ID. NR. 17). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3g (SEKV.ID. NR. 19). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3h (SEKV.ID. NR. 21). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3i (SEKV.ID. NR. 23). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 3j (SEKV.ID. NR. 25). I en utførelse omfatter nukleinsyrekonstruktet den nukleinsyresekvensen som er vist på figur 17a (SEKV.ID. NR. 27).
På grunn av den kjente degenereringen av den genetiske koden hvor mer enn ett kodon kan kode den samme aminosyren, så kan en DNA-sekvens variere fra det som er vist i SEKV.ID. NR.7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 eller 27 og ikke desto mindre kode et polypeptid som har den tilsvarende aminosyresekvensen som vist med SEKV.ID. NR. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 eller 26 henholdsvis. Slike variante DNA-sekvenser kan være et resultat av tause mutasjoner (som for eksempel opptrer under PCR-amplifisering) eller kan være et produkt av en bevisst mutagenese i en naturlig sekvens. Beskrivelsen tilveiebringer således isolerte DNA-sekvenser som koder polypeptidene ifølge beskrivelsen valgt fra: (a) Et DNA som omfatter nukleotidsekvensen fra SEKV.ID. NR. 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 24, 25 eller 27; (b) DNA som koder polypeptidene med SEKV.ID. NR. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 eller 26; (c) DNA som er i stand til å hybridisere seg til et DNA fra (a) eller (b) under betingelser med moderat stringens og som koder polypeptidet ifølge beskrivelsen; (d) DNA som er i stand til hybridisering til et DNA fra (a) eller (b) under betingelser med høy stringens og som koder polypeptider ifølge beskrivelsen; og (e) DNA som er degenerert som et resultat av den genetiske koden til et DNA som definert i (a), (b), (c) eller (d) og som koder polypeptidene ifølge beskrivelsen. Polypeptider som er kodet av slike DNA-sekvenser omfattes selvsagt av beskrivelsen.
I en annen utførelse som omfatter nukleinsyremolekylene en sekvens som koder det kimære proteinet ifølge den foreliggende beskrivelsen, så kan de også omfatte nukleotidsekvenser som er minst 80% identiske med en naturlig sekvens.
Beskrivelsen angår også utførelser hvor et nukleinsyremolekyl som omfatter en sekvens som koder det kimære proteinet ifølge beskrivelsen, og hvor dette inkluderer en sekvens som er minst 90% identisk, minst 95% identisk, minst 98% identisk, minst 99% identisk eller minst 99,9% identisk til en naturlig sekvens. En naturlig sekvens kan inkludere enhver DNA-sekvens som ikke kunstig er endret. Identitetsprosenten kan bestemmes ved visuell undersøkelse og ved hjelp av matematiske beregninger. Alternativt kan prosent identitet mellom to nukleinsyresekvenser bestemmes ved å sammenligne sekvensinformasjon ved å bruke GAP-dataprogrammet, versjon 6.0, beskrevet av Devereux et al.1984, Nucl. Acids Res. 12: 387 og som er tilgjengelig fra University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). De foretrukne standardparametrene for GAP-programmet inkluderer: (1) En unær sammenligningsmatrise (inneholder en verdi på 1 for identiteter og 0 for ikke identiteter) for nukleotider og den veiede sammenligninsmatrisen til Gribskov og Burgess 1986, Nucl. Acids Res. 14: 6745, slik den er beskrevet av Schwartz og Dayhoff, red. 1979, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, sidene 353-358; (2) en penalitet på 3,0 for hvert gap og ytterligere 0,10 penalitet for hvert symbol i hvert gap; og (3) ingen penalitet for sluttgap. Man kan også bruke andre programmer som er velkjente innenfor bioteknologien med hensyn til sammenligning av sekvenser.
E. Syntese av kimære proteiner
Kimære proteiner som omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og et biologisk aktivt molekyl kan syntetiseres ved å bruke velkjente teknikker. For eksempel kan de kimære proteinene ifølge beskrivelsen syntetiseres rekombinant i celler (se for eksempel Sambrook et al.1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. og Ausubel et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates og Wiley Interscience, N.Y.). Alternativt kan de kimære proteinene ifølge beskrivelsen, inkludert de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen, syntetiseres ved å bruke kjente syntesemetoder så som en fastfasesyntese. Synteseteknikker er velkjente innenfor bioteknologien (se for eksempel Merrifield, 1973, Chemical Polypeptides, (Katsoyannis og Panayotis red.) sidene 335-61; Merrifield 1963, J. Am. Chem. Soc.
85: 2149; Davis et al. 1985, Biochem. Intl. 10: 394; Finn et al.1976, The Proteins (3. utgave) 2: 105; Erikson et al.1976, The Proteins (3. utgave) 2: 257; U.S. patent nr. 3,941,763. Alternativt kan de kimære proteinene ifølge beskrivelsen inkludert de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen syntetiseres ved å bruke en kombinasjon av rekombinante og vanlig kjente syntesemetoder. For visse anvendelser kan det være fordelaktig å bruke enten en rekombinant metode eller en kombinasjon av en rekombinant og vanlig syntesemetode.
Nukleinsyrer som koder et biologisk aktivt molekyl kan lett syntetiseres ved å bruke velkjent rekombinant teknikk. Alternativt kan peptidene som sådan syntetiseres kjemisk. Nukleinsyrene ifølge beskrivelsen kan syntetiseres ved hjelp av standardmetoder, for eksempel ved å bruke et automatisert DNA-synteseapparat (for eksempel av den typen som er kommersielt tilgjengelig fra Biosearch, Applied Biosystems, osv.). Fosfortioatoligonukleotider kan for eksempel syntetiseres ved fremgangsmåten til Stein et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209, metylfosfonatoligonukleotider kan fremstilles ved hjelp av kontrollerte poreglasspolymerunderlag slik det er beskrevet i Sarin et al.1988, Proc. Natl. Scad. Sci. USA 85: 7448. Ytterligere fremgangsmåter for nukleinsyresyntese er velkjente innenfor bioteknologien (se for eksempel U.S. patentene 6,015,881; 6,281,331; 6,469,136).
DNA-sekvenser som koder immunoglobulinkonstante områder eller fragmenter av disse kan klones fra en rekke kjente genomiske eller cDNA-biblioteker. Teknikker for å isolere slike DNA-sekvenser ved å bruke probebaserte fremgangsmåter er velkjent teknikk innenfor bioteknologien. Prober for å isolere slike DNA-sekvenser kan være basert på publiserte DNA-sekvenser (se for eksempel Hieter et al. 1980, Cell 22: 197-207). Man kan også bruke den polymerasekjedereaksjons (PCR) -metoden som er beskrevet av Mullis et al. (U.S. patent nr.4,683,195) og Mullis (U.S. patent nr. 4,683,202). Valget av bibliotek og valg av prober for isolering av slike DNA-sekvenser vil lett kunne bestemmes av en person med faglig innsikt. Alternativt kan DNA-sekvenser som koder immunoglobuliner eller fragmenter av disse oppnås fra velkjente vektorer som inneholder immunoglobuliner eller fragmenter av disse.
For rekombinant produksjon kan en første polynukleotidsekvens som koder en del av det kimære proteinet ifølge beskrivelsen (for eksempel en del av et immunoglobulinkonstant område) og en andre polynukleotidsekvens som koder en del av det kimære proteinet ifølge beskrivelsen (for eksempel en del av et immunoglobulinkonstant område og et biologisk aktivt molekyl), innsettes i passende ekspresjonsenheter, for eksempel vektorer som inneholder de nødvendige elementene for transkripsjon og translatering av den eller de innsatte kodende sekvensene, eller i forbindelse med en RNA-viral vektor, de nødvendige elementene for replikasjon og translatering. Nukleinsyrene som koder det kimære proteinet blir innsatt i vektoren i en riktig leseramme.
Ekspresjonsenhetene eller -elementene blir så transfektert eller samtransfektert inn i en egnet målcelle som så vil uttrykke polypeptidene. Transfeksjonsteknikker er velkjente innenfor bioteknologien og inkluderer, men er ikke begrenset til, kalsiumfosfatutfelling (Wigler et al.1978, Cell 14: 725) og elektroporering (Neumann et al.1982, EMBO, J. 1: 841) og liposombaserte reagenser. En rekke forskjellige vertsekspresjonsvektorsystemer kan brukes for å uttrykke de kimære proteinene som er beskrevet her, inklusive både prokaryote eller eukaryote celler. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, mikroorganismer så som bakterier (for eksempel E. coli) transformert med rekombinante bakteriofag DNA- eller plasmide DNA-ekspresjonsvektorer som inneholder en passende kodende sekvens; gjær eller trådformede sopp som er transformert med rekombinante gjær- eller soppekspresjonsvektorer som inneholder passende kodende sekvenser; insektcellesystemer som er infisert med rekombinante virusekspresjonsvektorer (for eksempel baculovirus) som inneholder en passende kodende sekvens; plantecellesystemer som er infisert med rekombinante virusekspresjonsvektorer (for eksempel blomkålmosaikkvirus eller tobakkmosaikkvirus) eller transformert med rekombinante plasmidekspresjonsvektorer (for eksempel Ti-plasmid) som inneholder en passende kodende sekvens; eller dyrecellesystemer inklusive pattedyrceller (for eksempel CHO-, Cos- eller HeLa-celler).
Når det kimære proteinet ifølge beskrivelsen blir rekombinant syntetisert i en prokaryot celle, kan det være ønskelig å refolde det kimære proteinet. Det kimære proteinet fremstilt ved denne fremgangsmåten kan refoldes til en biologisk aktiv konformasjon ved å bruke velkjente betingelser, for eksempel denaturering under reduserende betingelser og så dialyse langsomt over i PBS.
Avhengig av de ekspresjonssystemer som brukes, kan det uttrykte kimære proteinet deretter isoleres ved hjelp av velkjente fremgangsmåter (for eksempel affinitetskromatografi, størrelsesutelukkelseskromatografi og ioneutbyttingskromatografi).
Ekspresjonsvektorene kan kode for merker som muliggjør lett rensing av det rekombinant fremstilte kimære proteinet. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til, vektor pUR278 (Ruther et al. 1983, EMBO J. 2: 1791) hvor kodende sekvenser for det kimære proteinet som beskrevet her kan ligeres inn i vektoren i ramme med det lac z-kodende området slik at det fremstilles et hybridprotein; pGEX-vektorer kan brukes for å uttrykke de kimære proteinene ifølge beskrivelsen med en glutation S-transferase (GST) -tag. Disse proteinene er vanligvis løselige og kan lett renses fra celler ved absorpsjon på glutation-agaroseperler fulgt av en eluering i nærvær av fritt glutatinon. Vektorene inkluderer spaltingsseter (trombin eller faktor Xa-protease eller PreScission Protease<TM>(Pharmacia, Peapack, N.J.)) for lett fjerning av nevnte merke etter rensing.
For å øke produksjonseffektiviteten, kan polynukleotidene utformes slik at de koder multiple enheter av det kimære proteinet ifølge beskrivelsen skilt av enzymatiske spaltingsseter. Det resulterende polypeptidet kan så spaltes (for eksempel ved behandling med det passende enzymet) for å innvinne polypeptidenhetene. Dette kan øke utbyttet av polypeptider som drives av en enkelt promoter. Når denne brukes i passende virale ekspresjonssystemer, så vil translateringen av hvert enkelt polypeptid som kodes av mRNA styres internt i transkriptet, for eksempel ved hjelp av et internt ribosominntrengningssete, IRES. Det polycistroniske konstruktet styrer således transkriberingen av et enkelt stort polycistronisk mRNA som så igjen styrer translateringen av multiple individuelle polypeptider. Denne fremgangsmåten eliminerer produksjonen og den enzymatiske bearbeidingen av polyproteiner og kan i betydelig grad øke utbyttet av polypeptid som drives av en enkelt promoter.
Vektorer som brukes i transformeringen vil vanligvis inneholde en selekterbar markør som kan brukes for å identifisere transformantene. I bakteriesystemer kan denne markøren inkludere et antibiotikaresistensgen så som ampicillin eller kanamycin. Egnede markører som kan brukes i dyrkede pattedyrceller inkluderer gener som gir resistens for medikamenter så som neomycin, hygromycin og metotreksat. Den selekterbare markøren kan være en amplifiserbar selekterbar markør. En slik amplifiserbar selekterbar markør er DHFR-genet. Andre amplifiserbare markører er DHFR cDNA (Simonsen og Levinson 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495). En oversikt over selekterbare markører er gitt av Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA) og valget av selekterbare markører kan lett gjøres av bioteknologisk kompetente personer.
Selekterbare markører kan innføres i cellen på et separat plasmid på samme tid som genet av interesse, eller de kan innføres på det samme plasmidet. Hvis dette skjer på det samme plasmidet, kan den selekterbare markøren og genet av interesse være under kontroll av forskjellige promoterer eller den samme promoteren, og det sistnevnte arrangementet gir et dicistronisk budskap. Konstrukter av denne type er velkjente (for eksempel U.S. patent nr. 4,713,339).
Ekspresjonselementene i ekspresjonssystemene varierer med hensyn til styrke og spesifisitet. Avhengig av de verts/vektorsystemet som brukes, kan man bruke enhver av en rekke forskjellige egnede transkripsjons- og translateringselementer, inklusive konstitutive og induserbare promoterer i ekspresjonsvektoren. Når man for eksempel utfører en kloning i bakteriesystemer, så kan man bruke induserbare promoterer så som pL i bakteriofag �, plac, ptrp og ptac (ptrp-lac-hybridpromoter) og lignende; mens man når kloningen utføres i insektceller kan bruke promoterer så som baculovirus polyhedronpromoteren; og ved kloning i plantecellesystemer så kan man bruke promoterer avledet fra genomet i planteceller (for eksempel varmesjokkpromoteren; promoteren for den lille underenheten av RUBISCO; promoteren fra det klorofyll a/b-bindende proteinet) eller fra plantevirus (for eksempel 35S RNA-promoteren fra CaMV; kappeproteinpromoteren av TMV); og ved kloning i pattedyrcellesystemer kan man brukes promoterer avledet fra genomet i pattedyrceller (for eksempel metallotioneinpromoteren) eller fra pattedyrvirus (for eksempel adenovirus sen promoter; vacciniavirus 7,5 K-promoteren); og når man utvikler cellelinjer som inneholder multiple kopier av ekspresjonsproduktet, så kan man bruke SV40-, BPV- og EBV-baserte vektorer med en passende selekterbar markør.
I de tilfeller hvor det brukes planteekspresjonsvektorer, så kan ekspresjonen av sekvenser som koder lineære eller ikke sykliserte former av det kimære proteinet ifølge beskrivelsen, drives av enhver av en rekke forskjellige promoterer. For eksempel kan man bruke virale promoterer så som 35S RNA- og 19S RNA-promoterne fra CaMV (Brisson et al. 1984, Nature 310: 511-514) eller kappeproteinpromoteren fra TMV (Takamatsu et al. 1987, EMBO J.6: 307-311); eller alternativt kan man bruke plantepromoterer så som den lille underenheten av RUBISCO (Coruzzi et al. 1984, EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie et al.1984, Science 224: 838-843) eller varmesjokkpromoterer, for eksempel soyabønne hsp17.5-E eller hsp17.3-B (Gurley et al. 1986, Mol. Cell. Biol.6: 559-565). Disse konstruktene kan innføres i planteceller ved å bruke Ti-plasmider, Ri-plasmider, plantevirusvektorer, direkte DNA-transformering, mikroinjeksjon, elektroporering, osv. For en oversikt over slike teknikker, se for eksempel Weissbach & Weissbach 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, del VIII, sidene 421-463; og Grierson & Corey 1988, Plant Molecular Biology, 2. utgave, Blackie, London, kapitlene 7-9.
I et insektekspresjonssystem som kan brukes for å fremstille de kimære proteinene ifølge den foreliggende beskrivelsen, så kan Autographa californica kjernepolyhidrosisvirus (AcNPV) brukes som en vektor for å uttrykke de fremmede genene. Dette viruset gror i Spodoptera frugiperda-celler. En kodende sekvens kan klones inn i ikke-essensielle områder (for eksempel polyhedrongenet) i nevnte virus og plasseres under kontroll av en AcNPV-promoter (for eksempel polyhedronpromoteren). En heldig innsetting av den kodende sekvensen vil resultere i en inaktivering av polyhedrongenet og produksjon av ikke-okludert rekombinant virus (det vil si virus som mangler den proteinaktige kappen som kodes av polyhedrongenet). Disse rekombinant virusene kan så brukes for å infisere Spodoptera frugiperda-celler hvor det innsatte genet så blir uttrykt (se for eksempel Smith et al. 1983, J. Virol.46: 584; U.S. patent nr. 4,215,051). Ytterligere eksempler på dette ekspresjonssystemet er gitt i Ausubel et al., red. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, bind 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.
Et annet system som kan brukes for å uttrykke de kimære proteinene ifølge beskrivelsen er glutaminsyntetase genekspresjonssystemet, også betegnet som "GS-ekspresjonssystemet" (Lonza Biologics PLC, Berkshire UK). Dette ekspresjonssystemet er detaljert beskrevet i U.S. patent nr. 5,981,216.
I pattedyrvertsceller kan man bruke en rekke forskjellige virusbaserte ekspresjonssystemer. I de tilfeller hvor det brukes et adenovirus som en ekspresjonsvektor, så kan en kodende sekvens ligeres til et adenovirus transkripsjons/translateringskontrollkompleks, for eksempel den sene promoteren og tripartittledersekvensen. Dette kimære genet kan så innsettes i adenovirusgenomet ved en in vitro eller in vivo rekombinasjon. Innsetting i et ikke-essensielt område av det virale genomet (for eksempel område E1 eller E3) vil resultere i et rekombinant virus som er levedyktig og i stand til å uttrykke peptidet i infiserte verter (se for eksempel Logan & Shenk 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655). Alternativt kan man bruke vaccinia 7,5 K-promoteren (se for eksempel Mackett et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415; Mackett et al. 1984, J. Virol. 49: 857; Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927).
I de tilfeller hvor det brukes et adenovirus som en ekspresjonsvektor, så kan en kodende sekvens ligeres til et adenovirus transkripsjons/translateringskontrollkompleks, for eksempel den sene promoteren og tripartittledersekvensen. Dette kimære genet kan så innsettes i adenovirusgenomet ved en in vitro eller in vivo rekombinasjon. Innsetting i et ikke-essensielt område av det virale genomet (for eksempel område E1 eller E3) vil resultere i et rekombinant virus som er levedyktig og i stand til å uttrykke peptidet i infiserte verter (se for eksempel Logan & Shenk 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655). Alternativt kan man bruke vaccinia 7,5 K-promoteren (se for eksempel Mackett et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415; Mackett et al. 1984, J. Virol. 49: 857; Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927).
Vertsceller som inneholder DNA-konstrukter av det kimære proteinet dyrkes i et passende vekstmedium. Begrepet "passende vekstmedium" slik det brukes her, betyr et medium som inneholder næringsstoffer som er nødvendige for vekst av cellene. Næringsstoffer som er nødvendige for cellevekst kan inkludere en karbonkilde, en nitrogenkilde, essensielle aminosyrer, vitaminer, mineraler og vekstfaktorer.
Eventuelt kan nevnte media inneholde storfekalveserum eller fosterkalveserum. I en utførelse inneholder nevnte media i alt vesentlig intet IgG. Vekstmediet vil generelt velges ut spesifikt for celler som inneholder DNA-konstruktet, for eksempel ved valg av medikament eller mangel på et vesentlig næringsstoff som så kan komplementeres eller suppleres av den selekterbare markøren på DNA-konstruktet eller som er samtransfektert med DNA-konstruktet. Pattedyrceller blir generelt dyrket i kommersielt tilgjengelige serumholdige eller serumfrie media (for eksempel MEM eller DMEM). Valg av et medium som er passende for den spesielle cellelinjen som brukes, vil lett kunne utføres av en molekylærbiologisk fagkompetent person.
Det rekombinant fremstilte kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan isoleres fra dyrkningsmediet. Dyrkningsmediet for passende dyrkede transformerte eller transfekterte vertsceller kan skilles fra cellematerialet og nærværet av de kimære proteinene kan så påvises. En fremgangsmåte for å påvise de kimære proteinene er for eksempel ved at disse enten helt eller delvis bindes til et spesifikt antistoff som gjenkjenner det kimære proteinet ifølge beskrivelsen. Et antikimært proteinantistoff kan være et monoklonalt eller polyklonalt antistoff som er utviklet mot det angjeldende kimære proteinet. For eksempel vil det kimære proteinet inneholde minst en del av et immunoglobulinkonstant område. Det er kjent mange antistoffer som gjenkjenner det konstante området i mange forskjelliger immunoglobuliner, og disse er kommersielt tilgjengelige. Man kan bruke et antistoff for å gjennomføre en ELISA eller et western blot for å påvise nærværet av de kimære proteinene ifølge beskrivelsen.
Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan syntetiseres i et transgent dyr så som en gnager, ku, gris, sau eller geit. Begrepet "transgene dyr" refererer seg til ikkehumane dyr hvor det i deres genom er inkorporert et fremmed gen. Fordi dette genet er tilstede i kimlinjevev, så vil det overføres fra foreldrene til avkommet. Eksogene gener blir innført i enkeltcelleembryoer (Brinster et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438). Fremgangsmåter for å fremstille transgene dyr er velkjente, inklusive transgene dyr som produserer immunoglobulinmolekyler (Wagner et al.
1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight et al.1983, Cell 34: 335; Brinster et al. 1983, Nature 306: 332; Ritchie et al.1984, Nature 312: 517;
Baldassarre et al.2003, Theriogenology 59: 831; Robl et al.2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne et al.2003, Xenotransplantation 10(3): 267).
Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan også fremstilles ved en kombinasjon av syntesekjemi og rekombinante teknikker. For eksempel kan en del av et immunoglobulinkonstant område uttrykkes rekombinant slik det er beskrevet ovenfor. Det biologisk aktive molekylet kan så fremstilles ved hjelp av kjent kjemisk synteseteknikk (for eksempel fastfasesyntese).
Delen av et immunoglobulinkonstant område kan ligeres til det biologisk aktive molekylet ved å bruke passende ligeringsteknikk og så kombineres med en del av et immunoglobulinkonstant område som ikke er blitt ligert til et biologisk aktivt molekyl for derved å danne det kimære proteinet ifølge beskrivelsen. I en utførelse er delen av et immunoglobulinkonstant området et Fc-fragment. Fc-fragmentet kan rekombinant fremstilles slik at det dannes Cys-Fc og reageres med et biologisk aktivt molekyl som uttrykker en tioester for derved å få fremstilt en monomerdimerhybrid. I en annen utførelse fremstilles en Fc-tioester som deretter reageres med et biologisk aktivt molekyl som uttrykker et N-terminuscystein (figur 4).
I en utførelse vil den delen av et immunoglobulinkonstant område som ligeres til det biologisk aktive molekylet danne homodimerer. Homodimerene kan kuttes eller brytes ved at de eksponeres overfor denaturerende og reduserende betingelser (for eksempel beta-merkaptoetanol og 8 M urea) og deretter kombineres med en del av et immunoglobulinkonstant område som ikke er forbundet med biologisk aktivt molekyl, slik at det dannes monomer-dimerhybrider. Disse kan så renatureres og foldes på nytt ved dialyse over i PBS og deretter isoleres, for eksempel ved størrelsesutelukkelses- eller affinitetskromatografi.
I en annen utførelse kan delen av et immunoglobulinkonstant område danne homodimerer før det forbindes til et biologisk aktivt molekyl. I denne utførelsen kan reaksjonsbetingelsene for å forbinde det biologisk aktive molekylet med homodimeren justeres slik at man begunstiger at bindingen av det biologisk aktive molekylet bare skjer til én kjede i homodimeren (for eksempel ved å justere de molare ekvivalentene for hver enkelt reaktant).
Det biologisk aktive molekylet kan kjemisk syntetiseres med et N-terminalt cystein. Sekvensen som koder en del av et immunoglobulinkonstant område kan subklones over i en vektor som koder intein forbundet med et kitinbindende domene (New England Biolabs, Beverly, MA). Inteinet kan forbindes med C-terminus i delen av et immunoglobulinkonstant område. I en utførelse blir delen av immunoglobulinet med inteinet forbundet med sin C-terminus, uttrykt i en prokaryot celle. I en annen utførelse blir delen av immunoglobulinet med inteinet forbundet med sin C-terminus, uttrykkes i en eukaryot celle. Den delen av et immunoglobulinkonstant område som er forbundet med intein kan reageres med MESNA. I en utførelse blir delen av et immunoglobulinkonstant område som er forbundet med intein, bundet til en kolonne, for eksempel en kitinkolonne og deretter eluert med MESNA. Det biologisk aktive molekylet og delen av et immunoglobulin kan reageres slik at det skjer en nukleofil omleiring, hvor det biologisk aktive molekylet blir kovalent forbundet med delen av et immunoglobulin via en amidbinding (Dawsen et al. 2000, Annu. Rev. Biochem. 69: 923). Det kimære proteinet syntetisert på denne måten kan eventuelt inkludere et linkerpeptid mellom delen av et immunoglobulin og det biologisk aktive molekylet. Linkeren kan for eksempel være syntetisert på N-terminus i det biologisk aktive molekylet. Anvendbare linkere kan inkludere peptider og/eller organiske molekyler (for eksempel polyetylenglykol og/eller korte aminosyresekvenser). Denne kombinerte rekombinerende og kjemiske syntesen gjør det mulig med en rask screening av biologisk aktive molekyler linkere for derved å optimalisere de forønskede egenskaper ved det kimære proteinet ifølge den foreliggende beskrivelsen, for eksempel viral hemming, hemostase, produksjon av røde blodceller, biologisk halvliv, stabilitet, binding til serumproteiner eller andre egenskaper som forefinnes i det kimære proteinet. Fremgangsmåten muliggjør også en inkorporering av ikke-naturlige aminosyrer i det kimære proteinet ifølge den foreliggende beskrivelsen, for eksempel i det kimære proteinet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, og som kan brukes for å optimalisere en forønsket egenskap i proteinet ifølge beskrivelsen, for eksempel i det kimære proteinet ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Hvis det er ønskelig, kan det kimære proteinet fremstilt ved denne fremgangsmåten refoldes til en biologisk aktiv konformasjon ved å bruke velkjente betingelser, for eksempel reduserende betingelser og så en langsom dialyse over i PBS.
Alternativt kan det N-terminale cysteinet være plassert på delen av et immunoglobulinkonstant område, for eksempel et Fc-fragment. Det kan utvikles et Fc-fragment med et N-terminalt cystein ved å ta hensyn til det faktum at et naturlig Fc har et cystein i posisjon 226 (se Kabat et al.1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, MD).
For å eksponere et terminalt cystein, kan et Fc-fragment bli uttrykt rekombinant. I en utførelse blir Fc-fragmentet uttrykt i en prokaryot celle, for eksempel E. coli. Den sekvensen som koder Fc-delen som begynner med Cys 226 (EU-nummerering) kan plasseres umiddelbart etter en sekvens som koder et signalpeptid, for eksempel OmpA, PhoA, STII. Den prokaryote cellen kan så osmotisk sjokkbehandles slik at den frigjør det rekombinante Fc-fragmentet. I en annen utførelse kan Fc-fragmentet fremstilles i en eukaryot celle, for eksempel en CHO-celle eller en BHK-celle. Den sekvensen som koder Fc-delfragmentet kan plasseres direkte etter en sekvens som koder et signalpeptid, for eksempel en muse Ig к-lettkjede eller MHC klasse I Kbsignalsekvens, slik at når det rekombinante kimære proteinet syntetiseres av en eukaryot celle, så vil signalsekvensen bli spaltet og etterlate et N-terminalt cystein som kan isoleres og kjemisk reageres med et molekyl med en tioester (for eksempel en C-terminal tioester hvis molekylet omfattes av aminosyrer).
Det N-terminale cysteinet på et Fc-fragment kan også utvikles ved å bruke et enzym som spalter dets substrat ved dets N-terminus, for eksempel faktor X<a>, enterokinase og produktet kan isoleres og reageres med et molekyl med en tioester.
Det rekombinant uttrykte Fc-fragmentet kan brukes for å fremstille homodimerer eller monomer-dimerhybrider.
I en spesifikk utførelse blir et Fc-fragment uttrykt med et humant α-interferon signalpeptid inntil Cys-resten i posisjon 226. Når et konstrukt som koder dette polypeptidet blir uttrykt i CHO-celler, så vil sistnevnte celler spalte signalpeptidet i to distinkte posisjoner (ved Cys 226 og ved Val inne i signalpeptidet 2 aminosyrer oppstrøms fra N-terminusretningen). Dette gir en blanding av to typer av Fcfragmenter (ett med et N-terminalt Val og ett med et N-terminalt Cys). Dette resulterer så igjen i en blanding av forskjellige dimerer (homodimerer med terminal Val, homodimerer med terminal Cys og heterodimerer hvor en kjede har en terminal Cys mens den andre har en terminal Val). Fc-fragmentene kan reageres med et biologisk aktivt molekyl som har en C-terminal tioester og den resulterende monomer-dimerhybriden kan isoleres fra blandingen (for eksempel ved størrelsesutelukkelseskromatografi). Det er antatt at når andre signalpeptidsekvenser brukes for ekspresjon av Fc-fragmenter i CHO-celler, så vil det kunne utvikles en blanding av forskjellige Fc-fragmenter med minst to forskjellige N-termini.
I en annen utførelse, for eksempel i en utførelse ifølge oppfinnelsen, kan et rekombinant fremstilt Cys-Fc danne en homodimer. Homodimeren kan reageres med et peptid som har en grenet linker på C-terminus og hvor den grenede linkeren har to C-terminale tioestere som kan reageres med Cys-Fc. I en annen utførelse har det biologisk aktive molekylet en enkel ikke-terminal tioester som kan reageres med Cys-Fc. Alternativt kan den grenede linkeren ha to C-terminale cysteiner som kan reageres med en Fc-tioester. I en annen utførelse, for eksempel i en utførelse ifølge oppfinnelsen, har den grenede linkeren to funksjonelle grupper som kan reageres med Fc-tioesteren, for eksempel 2-merkaptoamin. Det biologisk aktive molekylet kan omfatte aminosyrer. Det biologisk aktive molekylet kan også inkludere et lite organisk molekyl eller et lite uorganisk molekyl. I en utførelse ifølge oppfinnelsen, er det biologisk aktive molekylet et protein selektert fra gruppen bestående av et cytokin, et hormon og en koaguleringsfaktor.
F. Fremgangsmåter for anvendelse av kimære proteiner
De kimære proteinene ifølge beskrivelsen har mange anvendelsesområder, noe som tør være innlysende for en person med faglig innsikt i bioteknologi inklusive, men ikke begrenset til, fremgangsmåter for å behandle en pasient som har en sykdom eller tilstand. Sykdommen eller tilstanden kan inkludere, men er ikke begrenset til, en virusinfeksjon, en hemostatisk lidelse, anemi, kreft, leukemi, en inflammatorisk tilstand eller en autoimmun sykdom (for eksempel artritt, psoriasis, lupus erytematose eller multippel sklerose) eller en bakterieinfeksjon (se for eksempel U.S. patentene 6,086,875, 6,030,613, 6,485,726; WO 03/077834; UW2003-0235536A1).
1. Fremgangsmåter for å behandle en pasient med en rød blodcellesvikt
Den foreliggende beskrivelsen angår en fremgangsmåte for å behandle en pasient som har svikt med hensyn til røde blodceller som for eksempel anemi, som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av minst ett kimært protein hvor dette omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor nevnte første kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og minst ett middel som er i stand til å indusere proliferering av røde blodceller, for eksempel EPO, og hvor den nevnte andre polypeptidkjeden omfatter minst en del av et immunoglobulin uten det middelet som er i stand til å indusere den røde blodcelleprolifereringen og som var tilstede på den første kjeden.
2. Fremgangsmåter for å behandle en pasient med en virusinfeksjon
Beskrivelsen angår en fremgangsmåte for å behandle en pasient med en virusinfeksjon eller som er eksponert for virus, som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av minst ett kimært protein hvor dette omfatter en første og en andre polypeptidkjede og hvor den første kjeden omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og minst ett antiviralt middel, for eksempel en fusjonshemmer eller interferon α, mens den andre polypeptidkjeden omfatter minst en del av et immunoglobulin uten det antivirale middelet fra den første kjeden. I en utførelse er pasienten infisert med et virus som kan behandles med IFN α, for eksempel hepatitt C-virus. I en utførelse er pasienten infisert med HIV så som HIV-1 eller HIV-2.
I en utførelse så hemmer det kimære proteinet ifølge beskrivelsen viral replikasjon. I en utførelse så hindrer eller hemmer det kimære proteinet ifølge beskrivelsen en viral inntrengning i målceller, hvorved man stopper, hindrer eller begrenser spredningen av en virusinfeksjon i en pasient og senker virusbyrden i en infisert pasient. Ved å forbinde en del av et immunoglobulin med en viral fusjonshemmer, vil beskrivelsen kunne tilveiebringe et kimært protein med en viral fusjonshemmende aktivitet med større stabilitet og bedre biotilgjengelighet enn ved å anvende den virale fusjonshemmeren alene, for eksempel T20, T21 eller T1249. I en utførelse vil således den virale fusjonshemmeren svekke eller hindre en HIV-infeksjon i en målcelle, for eksempel HIV-1.
a. Tilstander som kan behandles
Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan brukes for å hemme eller hindre infeksjon i en målcelle av hepatittvirus, for eksempel hepatittvirus C. Det kimære proteinet kan omfatte et antiviralt middel som hemmer viral replikasjon.
I en utførelse omfatter det kimære proteinet ifølge beskrivelsen en fusjonshemmer. Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan brukes for å hemme eller hindre infeksjon i enhver målcelle ved enhver type virus (se for eksempel U.S. patentene 6,086,875, 6,030,613, 6,485,726; WO 03/077834; US2003-0235536A1). I en utførelse er nevnte virus et kappebelagt virus så som, men ikke begrenset til, HIV, SIV, meslinger, influensa, Epstein-Barrvirus, respiratorisk syncytiavirus eller parainfluensavirus. I en annen utførelse er nevnte virus et ikke-kappevirus så som rhinovirus eller poliovirus.
Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan brukes for å behandle en pasient som allerede er infisert med et virus. Pasienten kan være akutt infisert med et virus, eller alternativt kan pasienten være kronisk infisert med et virus. Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan også brukes profylaktisk for å behandle en pasient som har en risiko for å få en virusinfeksjon, for eksempel en pasient som er kjent for eller antatt å være i nær kontakt med et virus eller en pasient som man antar er infisert eller bærer et virus. Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan brukes for å behandle en pasient som kan være eksponert overfor et virus men som hittil ikke er blitt positivt diagnostisert.
I en utførelse angår beskrivelsen en fremgangsmåte for å behandle en pasient som er infisert med HCV som omfatter å administrere pasienten en terapeutisk effektiv mengde av et kimært protein hvor det kimære proteinet omfatter et Fc-fragment av et IgG og et cytokin, for eksempel IFN α.
I en utførelse angår beskrivelsen en fremgangsmåte for å behandle en pasient som er infisert med HIV og som omfatter å administrere pasienten en terapeutisk effektiv mengde av et kimært protein hvor dette omfatter et Fc-fragment av et IgG og den virale fusjonshemmeren som omfatter T20.
3. Fremgangsmåter for å behandle en pasient med en hemostatisk lidelse
Den foreliggende beskrivelsen angår en fremgangsmåte for å behandle en pasient med en hemostatisk lidelse som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av minst ett kimært protein hvor dette omfatter en første og en andre kjede og hvor nevnte første kjede omfatter minst én koaguleringsfaktor minst en del av et immunoglobulinkonstant område, mens nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område.
Det kimære proteinet ifølge den foreliggende beskrivelsen behandler eller hemmer en hemostatisk lidelse ved å fremme dannelsen av en fibrinklump. Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan aktivere enhver forbindelse eller polypeptid som deltar i en koaguleringskaskade. Koaguleringsfaktoren kan delta i en ekstrinisk reaksjonsvei, intrinisk reaksjonsvei eller begge. I en utførelse er koaguleringsfaktoren faktor VII eller faktor VIIa. Faktor VIIa kan aktivere faktor X som virker sammen med faktor Va for å spalte protrombin til trombin som så igjen spalter fibrinogen til fibrin. I en annen utførelse er koaguleringsfaktoren faktor IX eller faktor IXa. I en ytterligere utførelse er koaguleringsfaktoren faktor VIII eller faktor VIIIa. I enda en ytterligere utførelse er koaguleringsfaktoren von Willebrandfaktor, faktor XI, faktor XII, faktor V, faktor X eller faktor XIII.
a. Tilstander som kan behandles
Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan brukes for å behandle enhver hemostatisk lidelse. De hemostatiske lidelser som kan behandles ved å administrere det kimære proteinet ifølge beskrivelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, hemofili A, hemofili B, von Willebrands sykdom, faktor XI-svikt (PTA-svikt), faktor XII-svikt så vel som forskjellige andre typer svikt og strukturelle abnormaliteter med hensyn til fibrinogen, protrombin, faktor V, faktor VII, faktor X eller faktor XIII.
I en utførelse er den hemostatiske lidelsen en arvet lidelse. I en utførelse har pasienten hemofili A og det kimære proteinet omfatter faktor VIII eller faktor VIIIa. I en annen utførelse har pasienten hemofili A og det kimære proteinet omfatter faktor VII eller faktor VIIa. I en annen utførelse har pasienten hemofili B og det kimære proteinet omfatter faktor IX eller faktor IXa. I en annen utførelse har pasienten hemofili B mens det kimære proteinet omfatter faktor VII eller faktor VIIa. I en annen utførelse har pasienten hemmende antistoffer til faktor VIII, faktor VIIIa og det kimære proteinet omfatter faktor VII eller faktor VIIa. I en ytterligere utførelse har pasienten hemmende antistoffer mot faktor IX eller faktor IXa og det kimære proteinet omfatter faktor VII og faktor VIIa.
Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan brukes profylaktisk for å behandle en pasient med en hemostatisk lidelse. Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan brukes for å behandle akutte blødningsepisoder i en pasient med en hemostatisk lidelse.
I en utførelse er den hemostatiske lidelsen et resultat av en svikt i en koagulasjonsfaktor, for eksempel faktor IX eller faktor VIII. I en annen utførelse er den hemostatiske lidelsen et resultat av en defekt koaguleringsfaktor, for eksempel von Willebrands faktor.
I en annen utførelse kan den hemostatiske lidelsen være en ervervet lidelse. Den ervervede lidelsen kan være et resultat av en underliggende sekundær sykdom eller tilstand. Den urelaterte tilstanden kan for eksempel være, men er ikke begrenset til, kreft, en autoimmun sykdom eller svangerskap. Den ervervede lidelsen kan være et resultat av alder eller fra medisinsk behandling som er brukt for å behandle en underliggende sekundær lidelse (for eksempel kreftkjemoterapi).
4. Fremgangsmåter for å behandle en pasient som har behov for et generelt hemostatisk middel
Beskrivelsen angår også fremgangsmåter for å behandle en pasient som ikke har en hemostatisk lidelse eller en sekundær sykdom eller tilstand som resulterer at pasienten får en hemostatisk lidelse. Beskrivelsen angår således en fremgangsmåte for å behandle en pasient som har behov for et generelt hemostatisk middel og som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av minst ett kimært protein hvor dette omfatter en første og en andre polypeptidkjede, og hvor nevnte første polypeptidkjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og minst én koaguleringsfaktor, mens nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten koagulasjonsfaktoren fra den første polypeptidkjeden.
a. Tilstander som kan behandles
I en utførelse er den pasienten som har behov for et generelt hemostatisk middel under kirurgisk behandling eller skal behandles kirurgisk. Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan administreres før eller etter det kirurgiske inngrepet som et profylaktikum. Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan administreres under eller etter et kirurgisk inngrep for å kontrollere en akutt blødningsepisode. Det kirurgiske inngrepet kan inkludere, men er ikke begrenset til, levertransplantering, leverreseksjon eller stamcelletransplantering.
Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen kan brukes for å behandle en pasient med en akutt blødning og som ikke har en hemostatisk lidelse. Den akutte blødningen kan være et resultat av et alvorlig traume, for eksempel kirurgisk inngrep, en bilulykke, et sår, et skuddsår eller enhver annen traumatisk begivenhet som resulterer i ukontrollert blødning.
5. Behandlingsmodaliteter
Det kimære proteinet ifølge beskrivelsen, for eksempel det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen, kan administreres intravenøst, subkutant, intramuskulært eller via enhver slimhinneoverflate, for eksempel oralt, sublingualt, bukalt, sublingualt, nasalt, rektalt, vaginalt eller via lungene. Det kimære proteinet kan implanteres inne i eller forbundet med et fast underlag av en biopolymer som muliggjør langsom frigjøring av det kimære proteinet på et forønsket sted.
Dosen av det kimære proteinet ifølge beskrivelsen, for eksempel av det kimære proteinet ifølge oppfinnelsen, vil variere avhengig av pasienten og den spesielle administrasjonsvei som brukes. Dosene kan variere fra 0,1 til 100000 μg/kg kroppsvekt. I en utførelse er doseringsområdet fra 0,1 til 1000 μg/kg. Proteinet kan administreres kontinuerlig eller på spesifiserte tidspunkter. In vitro prøver kan brukes for å bestemme de optimale doseområdene og/eller administreringsregimene. Det er kjent mange in vitro prøver for å måle viral ineffektivitet. For eksempel kan en revers transkriptaseprøve eller en rt-PCR-prøve eller såkalt grenet DNA-prøve brukes for å måle HIV-konsentrasjoner. En StaClot-prøve kan brukes for å måle koaguleringsaktiviteten. Videre kan effektive doser ekstrapoleres fra doseresponskurver som er oppnådd via dyremodeller.
Beskrivelsen angår også en farmasøytisk sammensetning som omfatter en viral fusjonshemmer med minst en del av et immunoglobulin og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel. Eksempler på egnede farmasøytiske bærere er beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences av E.W. Martin.
Eksempler på fortynningsmidler er stivelse, glukose, laktose, sukrose, gelatin, malt, ris, mel, kalk, silikagel, natriumstearat, glyserolmonostearat, talkum, natriumklorid, tørket skummet melk, glyserol, propylenglykol, vann, etanol og lignende.
Sammensetningen kan også inneholde pH-bufferreagenser og fukte- og emulgeringsmidler.
For oral administrering kan den farmasøytiske sammensetningen være i form av tabletter eller kapsler fremstilt å vanlig kjent måte. Sammensetningen kan også fremstilles som en væske, for eksempel som en sirup eller en suspensjon. Væsken kan inkludere suspenderingsmidler (for eksempel sorbitolsirup, cellulosederivater eller hydrogenerte spiselige fett), emulgeringsmidler (lecitin eller akasie), ikkevandige væsker (for eksempel mandelolje, oljeaktige estere, etylalkohol eller fraksjonerte vegetabilske oljer) og konserveringsmidler (for eksempel metyl- eller propyl-p-hydroksybenzoater eller sorbinsyre). Preparatene kan også inneholde smaksstoffer, fargestoffer og søtningsmidler. Alternativt kan sammensetningen være opparbeidet som et tørt produkt som så kan konstitueres med vann eller en annen egnet væske.
For bukal eller sublingual administrering kan sammensetningen være i form av tabletter, drops eller raskt oppløselige filmer fremstilt på vanlig kjent måte.
For administrering ved inhalering kan forbindelsene som skal brukes ifølge den foreliggende beskrivelsen hensiktsmessig tilføres i form av en aerosolspray fra en beholder under trykk eller en forstøvningsanordning (for eksempel i PBS) med et egnet drivmiddel, for eksempel diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluormetan, karbondioksid eller enhver annen egnet gass. I forbindelse med en aerosol under trykk, kan doseringsenheten bestemmes ved at det er tilveiebrakt en ventil som leverer en oppmålt mengde. Kapsler eller patroner, for eksempel av gelatin som skal brukes i et inhaleringsapparat eller i en insufflator kan opparbeides slik at det inneholder en pulverblanding av forbindelsen og en egnet pulverbase, for eksempel laktose eller stivelse.
Den farmasøytiske sammensetningen kan også opparbeides for parenteral administrering (for eksempel intravenøst eller intramuskulært) ved en bolusinjeksjon. Preparater for injeksjon kan være opparbeidet i enhetsdoseform, for eksempel i ampuller eller i multidosebeholdere med tilsatt konserveringsmiddel. Sammensetningene kan være i form av suspensjoner, løsninger eller emulsjoner i oljeholdige eller vandige væsker, og kan inneholde hjelpestoffer så som suspenderingsmidler, stabilisatorer og/eller dispergeringsmidler. Alternativt kan den aktive bestanddelen være i pulverform for konstituering med en egnet væske, for eksempel pyrogenfritt vann.
Den farmasøytiske sammensetningen kan også formuleres for rektal administrering som en stikkpille eller retensjonsenema og kan for eksempel inneholde vanlige stikkpillebaser så som kakaosmør eller andre glyserider.
6. Kombinasjonsterapi
Det kimære proteinet ifølge den foreliggende beskrivelsen, for eksempel ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan brukes for å behandle en pasient med en sykdom eller tilstand i kombinasjon med minst ett annet kjent middel for å behandle nevnte sykdom eller tilstand.
I en utførelse angår beskrivelsen en fremgangsmåte for å behandle en pasient som er infisert med HIV og som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av minst ett kimært protein som omfatter en første og en andre kjede, hvor første kjede omfatter en HIV-fusjonshemmer og minst en del av et immunoglobulinkonstant område og den andre kjeden omfatter minst en del av et immunoglobulin uten en HIV-fusjonshemmer som i den første kjeden, i kombinasjon med minst ett annet anti-HIV-middel. Nevnte andre anti-HIV-middel kan være ethvert terapeutisk middel som har vist anti-HIV-aktivitet. Nevnte andre anti-HIV-middel kan for eksempel inkludere som et eksempel, men ikke begrenset til, en proteasehemmer (for eksempel Amprenavir<®>, Crixivan<®>, Rotonivir<®>), en revers transkriptase nukleosidanalog (for eksempel AZT, DDI, D4T, 3TC og Ziagen<®>), en ikkenukleosidanalog revers transkriptasehemmer (for eksempel Sustiva<®>), en annen HIV-fusjonshemmer, et nøytraliserende antistoff som er spesifikt til HIV, et antistoff som er spesifikt til CD4, en CD4-etterligning, for eksempel et CD4-IgG2-fusjonsprotein (U.S. patentsøknad 09/912,824) eller et antistoff som er spesifikt til CCR5 eller CXCR4 eller en spesifikk bindende partner for CCR5 eller CXCR4.
En annen utførelse ifølge den foreliggende beskrivelsen angår en fremgangsmåte for å behandle en pasient med en hemostatisk lidelse som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av minst ett kimært protein som omfatter en første og en andre kjede og hvor nevnte første kjede omfatter minst én koaguleringsfaktor og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, mens nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten koaguleringsfaktoren fra nevnte første kjede, i kombinasjon med minst én annen koaguleringsfaktor eller middel som fremmer hemostase. Nevnte andre koaguleringsfaktor eller middel som fremmer hemostase kan være ethvert terapeutikum som har vist koaguleringsaktivitet. Som et eksempel, men ikke som en begrensning, kan koaguleringsfaktoren eller det hemostatiske middelet inkludere faktor V, faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor X, faktor XI, faktor XII, faktor XIII, protrombin eller fibrinogen eller aktiverte former av enhver av de foregående. Koaguleringsfaktoren eller det hemostatiske middelet kan også inkludere antifibrinolytiske medikamenter, for eksempel epsilon-aminokaproinsyre eller tranexaminsyre.
7. Fremgangsmåter for å hemme viral fusjon inne i en målcelle
Den foreliggende beskrivelsen angår også en in vitro metode for å hemme HIV-fusjon med en pattedyrcelle som omfatter å kombinere pattedyrcellen med minst ett kimært protein, hvor det kimære proteinet omfatter en første og en andre kjede, og hvor nevnte første kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område og en HIV-hemmer, mens nevnte andre kjede omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten HIV-hemmeren fra den første kjeden.
Pattedyrcellen kan være enhver celle eller cellelinje som er følsom for infeksjon av HIV inklusive, men ikke begrenset til, primære humane CD4<+>T-celler eller makrofager, MOLT-4-celler, CEM-celler, AA5-celler eller HeLa-celler som uttrykker CD4 på celleoverflaten-
G. Fremgangsmåter for å isolere kimære proteiner
Når de kimære proteinene ifølge beskrivelsen, inkludert de kimære proteinene ifølge oppfinnelsen blir fremstilt, vil de typisk forefinnes i en blanding av andre molekyler så som andre proteiner eller proteinfragmenter. Beskrivelsen tilveiebringer således fremgangsmåter for å isolere ethvert av de kimære proteinene som er beskrevet tidligere fra en blanding som inneholder de kimære proteinene. Man har funnet at de kimære proteinene ifølge beskrivelsen, for eksempel proteinene ifølge oppfinnelsen, binder seg til fargestoffligander under egnede betingelser og at ved å endre disse betingelsene etter binding, kan bryte bindingen mellom fargestoffliganden og det kimære proteinet, og derved tilveiebringe en fremgangsmåte for å isolere det kimære proteinet. I visse utførelser kan blandingen omfatte en monomer-dimerhybrid, en dimer og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, for eksempel en Fc. I en utførelse tilveiebringer således beskrivelsen en fremgangsmåte for å isolere en monomer-dimerhybrid. I en annen utførelse tilveiebringer beskrivelsen en fremgangsmåte for å isolere en dimer.
I en utførelse tilveiebringer følgelig beskrivelsenn en fremgangsmåte for å isolere en monomer-dimerhybrid fra en blanding, hvor blandingen omfatter
a) monomer-dimerhybriden som omfatter en første og en andre polypeptidkjede, hvor den første kjeden omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område, og hvor den andre kjeden omfatter minst en del av et immunoglobulinkonstant område uten et biologisk aktivt molekyl eller et immunoglobulinvariabelt område;
b) en dimer som omfatter en første og en andre polypeptidkjede hvor både den første og den andre kjeden omfatter et biologisk aktivt molekyl og minst en del av et immunoglobulinkonstant område; og
c) en del av et immunoglobulinkonstant område; og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter
1) å kontakte blandingen med en fargestoffligand som er forbundet med et fast underlag under slike betingelser slik at både monomer-dimerhybriden og dimeren binder seg til fargestoffliganden;
2) fjerne den ubundne delen av et immunoglobulinkonstant område;
3) endre de egnede betingelsene fra avsnitt 1) slik at bindingen mellom monomerdimerhybriden og fargestoffliganden som er forbundet med det faste underlaget brytes;
4) isolere monomer-dimerhybriden.
Før man kontakter blandingen med en fargestoffligand, så kan blandingen i visse utførelser først kontaktes et kromatografisk stoff så som protein A-sefarose eller lignende. Blandingen blir eluert fra det kromatografiske stoffet ved å bruke en passende elueringsbuffer (for eksempel en buffer med lav pH), hvoretter eluatet som inneholder blandingen kontaktes fargeliganden.
Egnede betingelser for å kontakte blandingen med fargestoffliganden kan inkludere en buffer som holder blandingen på en passende pH-verdi. En passende pH-verdi kan inkludere en pH fra 3-10, 4-9 eller 5-8. I en utførelse er den passende pH-verdien 8,0. Man kan anvende enhver kjent buffer så lenge denne opprettholder pH-verdien i det passende området, for eksempel tris, HEPES, PIPES eller MOPS. Egnede betingelser kan også inkludere en vaskebuffer for å eluere ubundne proteiner fra fargestoffliganden. Vaskebufferen kan være enhver buffer som ikke bryter bindingen av et bundet polypeptid. For eksempel kan vaskebufferen være den samme bufferen som brukes i kontakttrinnet.
Så snart det kimære proteinet er bundet til fargestoffliganden, kan det kimære proteinet isoleres ved å endre de egnede betingelsene. En endring av betingelsen kan inkludere at det tilsettes et salt til bufferen. I så henseende kan man bruke ethvert salt, for eksempel natriumklorid eller kaliumklorid. Saltet bør tilsettes ved så høy konsentrasjon at man bryter bindingen mellom fargestoffliganden og det forønskede proteinet, for eksempel en monomer-dimerhybrid.
I enkelte utførelser hvor blandingen omfatter en Fc, en monomer-dimerhybrid ng en dimer, har man funnet at ndvnte Fc ikke binder seg til fargestoffliganden og vil således bli eluert med den gjennomgående strømmen. Dimeren binder seg kraftigere til fargestoffliganden enn monomer-dimerhybriden. Det kreves således en høyere saltkonsentrasjon for å bryte bindingen mellom dimeren og fargestoffliganden sammenlignet med den saltkonsentrasjonen som er nødvendig for å bryte bindingen mellom fargestoffliganden og monomer-dimerhybriden.
I visse utførelser kan natriumklorid brukes for å isolere monomer-dimerhybriden fra blandingen. I enkelte utførelser vil den passende saltkonsentrasjonen som bryter bindingen mellom fargestoffliganden og monomer-dimerhybriden variere fra 200 til 700 mM, 300-600 mM eller 400-500 mM. I en utførelse vil konsentrasjonen av NaCl som er nødvendig for å bryte bindingen mellom fargestoffliganden og monomer-dimerhybriden være 400 mM.
NaCl kan også brukes for å isolere dimeren fra blandingen. Typisk vil monomerdimerhybriden bli isolert fra blandingen før dimeren. Dimeren isoleres ved å tilsette en passende saltkonsentrasjon til bufferen, noe som bryter bindingen mellom fargestoffliganden og dimeren. I enkelte utførelser vil en passende saltkonsentrasjon som bryter bindingen mellom fargestoffliganden og dimeren være fra 800 mM til 2 M, fra 900 mM til 1,5 M eller fra 950 mM til 1,2 M. I en spesifikk utførelse brukes det 1 M NaCl for å bryte bindingen mellom fargestoffliganden og dimeren.
Fargestoffliganden kan være et biomimetikum. Et biomimetikum er et menneskelig fremstilt stoff, anordning eller system som etterligner naturen. I enkelte utførelser vil således fargest/ffliganden etterligne eller imitere et molekyls naturlig forekommende ligand. Fargestoffliganden kan velges fra Mimetic Red 1<TM>, Mimetic Red 2<TM>, Mimetic Orange 1<TM>, Mimetic Orange 2<TM>, Mimetic Orange 3<TM>, Mimetic Yellow 1<TM>, Mimetic Yellow 2<TM>, Mimetic Green 1<TM>, Mimetic Blue 1<TM>og Mimetic Blue 2<TM>(Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). I en spesifikk utførelse er fargestoffliganden Mimetic Red 2<TM>(Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). I visse utførelser er fargestoffliganden forbundet med et fast underlag, for eksempel fra Mimetic Red 1A6XL<TM>, Mimetic Red 2 A6XL<TM>, Mimetic Orange 1 A6XL<TM>, Mimetic Orange 2 A6XL<TM>, Mimetic Orange 3 A6XL<TM>, Mimetic Yellow 1 A6XL<TM>, Mimetic Yellow 2 A6XL<TM>, Mimetic Green 1 A6XL<TM>, Mimetic Blue 1 A6XL<TM>og Mimetic Blue 2 A6XL<TM>(Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ).
Fargestoffliganden kan være bundet til et fast underlag. Det faste underlaget kan være ethvert fast underlag av velkjent type innenfor bioteknologien (se for eksempel www.seperationsNOW.com). Eksempler på faste underlag kan inkludere en perle, en gel, en membran, en nanopartikkel eller en mikrokule. Det faste underlaget kan bestå av ethvert materiale som kan forbindes med en fargestoffligand (for eksempel agarose, polystyren, sefarose eller sefadex). De faste underlagene kan omfatte enhver syntetisk kjent organisk polymer så som polyakrylsyre, vinylpolymerer, akrylat, polymetakrylat og polyakrylamid. De faste underlagene kan også omfatte en karbohydratpolymer, for eksempel agarose, cellulose eller dekstran. De faste underlagene kan også omfatte uorganiske oksider så som silika, zirkonium, titan, ceria, alumina, magnesia (det vil si magnesiumoksid) eller kalsiumoksid. De faste underlagene kan også omfatte kombinasjoner av enkelte av de ovennevnte faste underlagene som inkluderer, men som ikke er begrenset til, dekstranakrylamid.
Eksempler
Eksempel 1: Molekylvekten påvirker FcRn-kontrollert transcytose
Kimære proteiner som omfatter forskjellige proteiner av interesse og IgG Fc ble fremstilt rekombinant (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), eller når det gjelder kontaktin-Fc, MAB- β-gal (et kompleks av et monoklonalt antistoff bundet til β-gal) (Biodesign International, Saco, ME) og MAB-GH (et kompleks av monoklonalt antistoff og veksthormon) (Research Diagnostics, Inc. Flanders, NJ), så ble disse kjøpt kommersielt. Kort fortalt så ble de genene som kodet proteinet av interesse klonet ved hjelp av PCR og så subklonet inn i et Fc-fusjonsekspresjonsplasmid. Plasmidene ble så transfektert inn i DG44 CHO-celler og stabile transfektanter ble valgt ut og amplifisert med metotreksat. De kimære proteinhomodimerene ble renset ved hjelp av en protein A-kolonne. De proteiner som ble undersøkt inkluderte interferon α, veksthormon, erytropoietin, follikkelstimulerende hormon, faktor IX, beta-galaktosidase, kontaktin og faktor VIII. Ved å forbinde proteinene til immunoglobulindeler, inklusive den FcRn-reseptorbindende partneren, eller bruke kommersielt tilgjengelig helt antistoff (inklusive det FcRn-bindende området) -antigenkomplekser, gjorde det mulig å undersøke transcytose som en funksjon av molekylvekten (se U.S. patent nr. 6,030,613). De kimære proteinene ble administrert rotter oralt og serumnivåene ble målt 2-4 timer etter administrering ved å bruke en ELISA for de rekombinant fremstilte kimære proteinene, og både et western blot og ELISA for de antistoffkomplekser og kimære proteiner som var kjøpt kommersielt. Ytterligere ble alle de kommersielt oppnådde proteiner eller komplekser så vel som faktor VIII-Fc, faktor IX-Fc og Epo-Fc-kontroller behandlet med jod ved å bruke IODO-perler (Pierce, Pittsburg, PA). Resultatene indikerer at serumnivåene av Fc og de monoklonale antistoffkimære proteinene som ble oralt administrert til rotter er direkte relatert til størrelsen på proteinet. Det tilsynelatende avslutningspunktet for oralt administrert Fc-kimære proteiner er mellom 200 og 285 kD (tabell 2).
TABELL 2
Eksempel 2: Kloning av pcDNA 3.1-Flag-Fc
Sekvensen for FLAG-peptidet (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), en vanlig kjent affinitetstag som brukes for å identifisere eller rense proteiner, ble klonet inn i pcDNA 3.1-Fc-plasmidet som inneholder muse Ig к-signalsekvensen fulgt av Fcfragmentet fra humant IgG1 (aminosyrene 221-447, EU-nummerering). Konstruktet ble fremstilt ved hjelp av overlappende PCR og ved å bruke de følgende primere:
FlagFc-F1: 5'-GCTGGCTAGCCACCATGGC-3' (SEKV.ID. NR. 41)
FlagFc-R1: 5'-CTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTCACCAGTGGAACCTGG AAC-3' (SEKV.ID. NR. 42)
FlagFc-F2: 5'-GACTACAAGG ACGACGATGA CAAGGACAAA ACTCACACAT GCCCACCGTG CCCAGCTCCG GAACTCC-3' (SEKV.ID. NR. 43)
FlagFc-R2: 5'-TAGTGGATCCTCATTTACCCG-3' (SEKV.ID. NR. 44).
pcDNA 3.1-Fc-templaten ble så tilsatt to separate PCR-reaksjoner som hver inneholdt 50 pmol av primerparene FlagFc-F1/R1 eller FlagFc-F2/R2 i et 50 μl reaksjonsvolum ved å bruke Pfu Ultra DNA-polymerase (Stratagene, CA) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke de følgende sykluser: 95 ºC 2 minutter; 30 sykluser med (95 ºC 30 sekunder, 52 ºC 30 skunder, 72 ºC 45 sekunder) fulgt av 72 ºC i 10 minutter. Produktene fra disse to reaksjonene ble så blandet i en annen PCR-reaksjon (2 μl hver) med 50 pmol av FlagFc-F1- og FlagFc-R2-primere i et reaksjonsvolum på 50 μl ved å bruke Pfu Ultra DNA-polymerase (Stratagene, CA) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke følgende sykluser: 95 ºC 2 minutter; 30 sykluser med (95 ºC 30 sekunder, 52 ºC 30 skunder, 72 ºC 45 sekunder) fulgt av 72 ºC i 10 minutter. Det resulterende fragmentet ble gelrenset, kuttet og innsatt i pcDNA 3.1-Fc-plasmidet NheI-BamHI. Det resulterende plasmidet inneholder muse Ig к-signalsekvensen som produserer FlagFc-proteinet.
Eksempel 3: Kloning av faktor VII-Fc-konstrukt
Den kodende sekvensen for faktor VII ble oppnådd ved hjelp av RT-PCR fra human fosterlever RNA (Clontech, Palo Alto, CA). Det klonede området omfattet cDNA-sekvensen fra bp 36 til bp 1430 som er avsluttet like før stoppkodonet. Et SbfI-sete ble innført i N-terminus, mens et BspEI-sete ble innført i C-terminus. Konstruktet ble klonet ved hjelp av PCR og ved hjelp av følgende primere:
Nedstrøms: 5' GCTACCTGCAGGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGG 3' (SEKV.ID. NR. 45)
Oppstrøms: 5' CAGTTCCGGAGCTGGGCACGGCGGGCACGTGTGAGTTT TGTCGGGAAAT GG 3' (SEKV.ID. NR. 46)
og de følgende betingelser: 95 ºC i 5 minutter fulgt av 30 sykluser på 95 ºC i 30 sekunder, 55 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 1 minutt og 45 sekunder og til slutt en avsluttende forlengelsessyklus på 72 ºC i 10 minutter.
Fragmentet ble kuttet med SbfI-BspEI og innsatt i pED.dC-Fc, et plasmid som koder Fc-fragmentet fra et IgG1.
Eksempel 4: Kloning av faktor IX-Fc-konstruktet
Den humane faktor IX-kodende sekvensen inklusive prepropeptidsekvensen, ble fremstilt ved hjelp av RT-PCR-amplifisering fra voksen humant lever RNA ved å bruke de følgende primerne:
natFIX-F: 5'-TTACTGCAGAAGGTTATGCAGCGCGTGAACATG-3' (SEKV.ID. NR. 47)
F9-R: 5'-TTTTTCGAATTCAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATCC-3' (SEKV.ID. NR. 48)
20 ng av voksen humant lever RNA (Clontech, Palo Alto, CA) og 25 pmol av hver primer ble tilsatt en RT-PCR-reaksjon ved å bruke SuperScript<TM>ettrinns RP-PCR med PLATINUM ® Taq-systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved å følge fabrikantens protokoll. Reaksjonen ble utført i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke de følgende sykluser: 50 ºC i 30 minutter; 94 ºC i 2 minutter; 35 sykluser på (94 ºC i 30 sekunder, 58 ºC i 30 sekunder og 72 ºC i 1 minutt) og til slutt 72 ºC i 10 minutter. Fragmentet ble gelrenset ved å bruke et Qiagen gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og kuttet med PstI-EcoRI, gelrenset og klonet inn i den tilsvarende utkuttede delen av pED.dC.XFc-plasmidet.
Eksempel 5: Kloning av PACE-konstrukt
Den kodende sekvensen for human PACE (parret basisk aminosyrespaltende enzym), en endoprotease, ble fremstilt ved hjelp av RT-PCR. De følgende primere ble brukt:
PACE-F1: 5'-GGTAAGCTTGCCATGGAGCTGAGGCCCTGGTTGC-3' (SEKV.ID. NR. 49)
PACE-R1: 5'-GTTTTCAATCTCTAGGACCCACTCGCC-3' (SEKV.ID. NR. 50)
PACE-F2: 5'-GCCAGGCCACATGACTACTCCGC-3' (SEKV.ID- NR. 51)
PACE-R2: 5'-GGTGAATTCTCACTCAGGCAGGTGTGAGGGCAGC-3' (SEKV.ID. NR. 52)
PACE-F1-primeren adderer et HindIII-sete til 5'-enden av PACE-sekvensen som begynner med 3 nukleotider før startkodonet, mens PACE-¤2-primeren adderer et stoppkodon etter aminosyre 715 som er plassert ved enden av det ekstracellulære domenet i PACE så vel som en addering av et EcoRI-sete til 3'-enden av stoppkodonet. PACE-R1- og -F2-primerne binder seg på henholdsvis 3'- og 5'-sidene av et internt BamHI-sete. Det ble så utført to RT-PCR-reaksjoner ved å bruke 25 pmol av hver av primerparene PACE-F1/R1 eller PACE-F2/R2 med 20 ng av voksen humant lever RNA (Clontech; Palo Alto, CA) i en 50 μl RT-PCR-reaksjonsblanding ved å bruke SuperScript<TM>One-Step RT-PCR med PLATINUM ® Taq-systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved å følge fabrikantens protokoll. Reaksjonene ble utført i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke følgende sykluser: 50 ºC i 30 minutter; 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 58 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 2 minutter) fulgt av 72 ºC i 10 minutter. Disse fragmentene ble begge ligert inn i vektoren pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) og sekvensert. F2-R2-fragmentet ble så subklonet inn i pcDNA6 V5/His (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved å bruke BamHI/EcoRI-setene og deretter ble F1-R1-fragmentet klonet inn i konstruktet ved å bruke HindIII/BamHI-setene. Det endelige plasmidet, pcDNA6-PACE, produserer en løselig form av PACE (aminosyrene 1-715) ettersom transmembranområdet er blitt fjernet. Sekvensen for PACE i pcDNA6-PACE er i alt vesentlig som beskrevet av Harrison et al.1998, Seminars in Hematology 35: 4.
Eksempel 6: Kloning av IFN α-Fc åtte aminosyrelinkerkonstrukt
Den humane interferon α 2b (hIFN α) -kodende sekvensen inklusive signalsekvensen, ble fremstilt ved hjelp av PCR fra humant genomisk DNA ved å bruke følgende primere:
INFa-Sig-F: 5'-GCTACTGCAGCCACCATGGCCTTGACCTTTGCTTTAC-3' (SEKV.ID. NR. 53)
IFNa-EcoR-R: 5'-CGTTGAATTCTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC-3' (SEKV.ID. NR. 54)
Genomisk DNA ble fremstilt fra en 373 MG human astrocytomcellelinje ved hjelp av standardmetoder (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Kort beskrevet ble omtrent 2 x 10<5>celler pelletert ved hjelp av sentrifugering, på nytt suspendert i 100 μl fosfatbufret saltløsning pH 7,4 og så blandet med et tilsvarende volum av en oppløsningsbuffer (100 mM Tris pH 8,0/200 mM NaCl/2% SDS/5 mM EDTA). Proteinase K ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 100 μg/ml og prøven ble kuttet ved 37 ºC i 4 timer ved forsiktig blanding fra tid til annen. Prøven ble så ekstrahert to ganger med fenol:kloroform og DNA ble utfelt ved å tilsette natriumacetat ved pH 7,0 til en konsentrasjon på 100 mM og et tilsvarende volum isopropanol, hvoretter blandingen ble sentrifugert i 10 minutter ved romtemperatur.
Supernatanten ble fjernet og pelleten ble vasket en gang med kald 70% etanol og så lufttørket før den på nytt ble suspendert i TE (10 mM Tris pH 8,0/1 mM EDTA).
100 ng av dette genomiske DNA ble så brukt i en 25 μl PCR-reaksjonsblanding med 25 pmol av hver av primerne ved å bruke Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å bruke fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser på (94 ºC i 30 sekunder, 50 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 45 sekunder) og til slutt 72 ºC i 10 minutter. Båndet med den forventede størrelsen (�550 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA), kuttet med PstI/EcoRI, på nytt gelrenset og klonet inn i PstI/EcoRI-setet i pED.dC.XFc som inneholder en 8 aminosyrer lang linker (EFAGAAAV), fulgt av Fc-området fra humant IgG1.
Eksempel 7: Kloning av IFN αFc Δ-linkerkonstrukt
1 μg renset pED.dC.naturlig humant IFN αFc DNA fra eksempel 6 ble så brukt som en templat i en 25 μl PCR-reaksjonsblanding med 25 pmol av både primeren IFNa-Sig-F og den følgende primeren:
hIFNaNoLinkFc-R: 5'CAGTTCCGGAGCTGGGCACGGCGGG CACGTGTGAGTTTTGTCTTCCTTACTTCTTAAACTTTTTGCAAGTTTG-3' (SEKV.ID. NR. 55)
PCR-reaksjonen ble utført ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et RapidCycler termosykliseringsapparat (Idaho Technology, Salt Lake City, UT), denaturering ved 94 ºC i 2 minutter fulgt av 18 sykluser på 95 ºC i 15 sekunder, 55 ºC i 0 sekunder og 72 ºC i 1 minutt med en helning på 6, fulgt av en 72 ºC forlengelse i 10 minutter. Et PCR-produkt med den riktige størrelsen (�525 bp) ble gelrenset ved å bruke et gelekstraksjonssett (Qiagen; Valencia, CA), kuttet med PstI- og BspEI-restriksjonsenzymer, gelrenset og subklonet inn i de tilsvarende setene i et modifisert pED.dC.XFc hvor aminosyrene 231-233 i Fc-området var endret ved å bruke degenereringen av den genetiske koden for å inkorporere et BspEI-sete samtidig som man beholdt villtypeaminosyresekvensen.
Eksempel 8: Kloning av IFN αFc GS15-linkerkonstrukt
Det ble fremstilt en ny kjedevektor ved å bruke det Fc som ble funnet i Δ-linkerkonstruktet (som inneholder BspEI og RsrII-seter i 5'-enden ved å bruke degenereringen av den genetiske koden for å opprettholde aminosyresekvensen) og deretter bruke dette DNA som en templat for en PCR-reaksjon med de følgende primere:
5' B2xGGGGS: 5'gtcaggatccggcggtggagggagcgacaaaactcacacgtgccc 3' (SEKV.ID. NR. 56)
3' GGGGS: 5' tgacgcggccgctcatttacccggagacaggg 3' (SEKV.ID. NR.57)
En PCR-reaksjon ble utført med 25 pmol av hver av primerne ved å bruke Pfu Turbo-enzym (Stratagene, La Jolla, CA) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke den følgende fremgangsmåten: 95 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (95 ºC i 30 skunder, 54 ºC i 30 sekunder og 72 ºC i 2 minutter) og til slutt 72 ºC i 10 minutter. Et bånd med den forventede størrelsen (�730 bp) ble gelrenset med gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA), kuttet med BamHI/NotI; på nytt gelrenset og klonet inn i den BamHI/NotI-kuttede vektoren av pcDNA6 ID, en versjon av pcDNA6 med IRES-sekvensen og dhfr-gen innsatt i et NotI/XbaI-sete.
500 ng av renset pED.dC.nativt humant IFN αFc DNA ble så brukt som en templat i en 25 μl PCR-reaksjonsblanding med de følgende primere:
5' IFNa for GGGGS: 5' ccgctagcctgcaggccaccatggccttgacc 3' (SEKV.ID. NR. 58)
3' IFNa for GGGGS: 5' ccggatccgccgccaccttccttactacgtaaac 3' (SEKV.ID. NR. 59)
En PCR-reaksjon ble utført med 25 pmol av hver av primerne ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat ved de følgende sykluser: 95 ºC i 2 minutter; 14 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 48 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 1 minutt) og til slutt 72 ºC i 10 minutter. Et bånd med den forventede størrelsen (�600 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA), kuttet med NheI/BamHI, igjen gelrenset og så klonet inn i NheI/BamHI-setet i pcDNA6 ID/Fc-vektoren ovenfor for derved å frembringe en IFN α Fc-fusjon med en 10 aminosyrer Gly/Ser-linker (2 x GGGGS), pcDNA6 ID/IFN α-GS10-Fc.
Det ble så utført en PCR-reaksjon ved å bruke 500 ng av dette pcDNA6 ID/IFN α-GS10-Fc med de følgende primere:
5' B3XGGGGS: 5' (SEKV.ID. NR. 60)
gtcaggatccggtggaggcgggtccggcggtggagggagcgacaaaactcacacgtgccc 3' (SEKV.ID. NR. 61)
fcclv-R: 5' atagaagcctttgaccaggc 3' (SEKV.ID. NR.62)
Det ble så utført en PCR-reaksjon med 25 pmol av hver av primerne ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke de følgende sykluser: 95 ºC i 2 minutter; 14 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 48 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 1 minutt) og til slutt 72 ºC i 10 minutter. Et bånd med den forventede størrelsen (504 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA), kuttet med BamHI/BspEI, det 68 bp båndet ble gelrenset og klonet inn i BamHI/BspEI-setet for pcDNA6 ID/IFN α-GS10-Fc-vektoren for å frembringe en IFN α Fc-fusjon med en 15 aminosyrer Gly/Ser-linker (3 x GGGGS), pcDNA6 ID/IFN α-GS15-Fc.
Eksempel 9: Kloning av et basisk peptidkonstrukt
Hengselområdet i det humane IgG1 Fc-fragmentet fra aminosyre 221-229 (EU-nummerering) ble erstattet med et basisk peptid (CCB). Det ble brukt fire overlappende oligonukleotider (IDT, Coralville, IA):
1. CCB-Fc-sens 1:
5' GCC GGC GAA TTC GGT GGT GAG TAC CAG GCC CTG AAG AAG AAG GTG GCC CAG CTG AAG GCC AAG AAC CAG GCC CTG AAG AAG AAG 3' (SEKV.ID. NR. 63)
2. CCB-Fc-sens 2:
5'GTG GCC CAG CTG AAG CAC AAG GGC GGC GGC CCC GCC CCA GAG CTC CTG GGC GGA CCG A 3' (SEKV.ID. NR. 64)
3. CCB-Fc-antisens 1:
5' CGG TCC GCC CAG GAG CTC TGG GGC GGG GCC GCC GCC CTT GTG CTT CAG CTG GGC CAC CTT CTT CTT CAG GGC CTG GTT CTT G 3' (SEKV.ID. NR. 65)
4. CCB-Fc-antisens 2:
5' GCC TTC AGC TGG GCC ACC TTC TTC TTC AGG GCC TGG TAC TCA CCA CCG AAT TCG CCG GCA 3' (SEKV.ID. NR. 66)
Oligonukleotidene ble rekonstituert til en konsentrasjon på 50 μM med dH2O. 5 μl av hvert oligonukleotid ble festet til hverandre ved at de ble blandet i et tynnvegget PCR-rør med 2,2 μl av en restriksjonsbuffer nr. 2 (det vil si en sluttkonsentrasjon på 10 mM Tris HCl pH 7,9, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 1 mM ditiotreitol) (New England Biolabs, Beverly, MA) og oppvarmet til 95 ºC i 30 skunder og så hensatt for hybridisering med langsom avkjøling i 2 timer til 25 ºC.5 pmol av de nå hybridiserte oligonukleotidene ble ligert inn i en pGEM T-Easy-vektor som angitt i settmanualen (Promega, Madison, WI). Ligeringsblandingen ble tilsatt 50 μl DH5 αkompetente E. coli-celler (Invitrogen, Carlsbad, CA) på is i 2 minutter, innkubert ved 37 ºC i 5 minutter, innkubert på is i 2 minutter og så utplatet på LB 100 μg/l ampicillin agarplater og plassert i et kammer ved 37 ºC i 14 timer. Individuelle bakteriekolonier ble tatt ut og plassert i 5 ml av LB 100 μg/l ampicillin og hensatt for vekt i 14 timer. Rørene ble spunnet ned ved 2000xg, 4 ºC i 15 minutter, hvoretter vektor-DNA ble isolert ved å bruke Qiagen miniprepsettet (Qiagen, Valencia, CA) slik det er angitt i settmanualen. 2 μg av DNA ble kuttet med NgoM IV-Rsr-II. Fragmentet ble gelrenset ved hjelp av Qiaquick-metoden som angitt i settmanualen (Qiagen, Valencia, CA) og ligert til pED.dcEpoFc med NgoM IV/Rsr II. Ligeringen ble transformert over i DH5 α-kompetente E. coli-celler og DNA ble så fremstilt som beskrevet for pGEM T-Easy-vektoren.
Eksempel 10: Kloning av det erytropoietinsyre peptid Fc-konstruktet
Hengselområdet av det humane IgG1 Fc-fragmentet i EPO-Fc fra aminosyre 221-229 (EU-nummerering) ble erstattet med et surt peptid (CCA). De følgende fire overlappende oligonukleotidene ble brukt (IDT, Coralville, IA):
1. Epo-CCA-Fc-sens 1:
5' CCG GTG ACA GGG AAT TCG GTG GTG AGT ACC AGG CCC TGG AGA AGG AGG TGG CCC AGC TGG AG 3' (SEKV.ID. NR 67)
2. Epo-CCA-Fc-sens 2:
5' GCC GAG AAC CAG GCC CTG GAG AAG GAG GTG GCC CAG CTG GAG CAC GAG GGT GGT GGT CCC GCT CCA GAG CTG CTG GGC GGA CA 3' (SEKV.ID. NR. 68)
3. Epo-CCA-Fc-antisens 1:
5' GTC CGC CCA GCA GCT CTG GAG CGG GAC CAC CAC CCT CGT GCT CCA GCT GGG CCA C 3' (SEKV.ID. NR. 69)
4. Epo-CCA-Fc-antisens 2:
5' CTC CTT CTC CAG GGC CTG GTT CTC GGC CTC CAG CTG GGC CAC CTC CTT CTC CAG GGC CTG GTA CTC ACC ACC GAA TTC CCT GTC ACC GGA 3' (SEKV.ID. NR. 70)
Oligonukleotidene ble rekonstituert til en konsentrasjon på 50 μM med dH2O.5 μl av hvert oligonukleotid ble festet til hverandre ved at de ble blandet i et tynnvegget PCR-rør med 2,2 μl restriksjonsbuffer nr. 2 (New England Biolabs, Beverly, MA) og oppvarmet til 95 ºC i 30 sekunder og så hensatt for langsom avkjøling i løpet av 2 timer til 25 ºC. 5 pmol av de nå hybridiserte oligonukleotidene ble ligert inn i en pGEM T-Easy-vektor som angitt i settmanualen (Promega, Madison, WI).
Ligeringsblandingen ble tilsatt 50 μl av DH5 α-kompetente E. coli-celler (Invitrogen, Carlsbad, CA) på is i 2 minutter, innkubert ved 37 ºC i 5 minutter, innkubert på is i 2 minutter og så utplatet på LB 100 μg/l ampicillin agarplater og plassert i et kammer ved 37 ºC i 14 timer. Individuelle bakteriekolonier ble tatt ut og plassert i 5 ml LB 100 μg/l ampicillin og hensatt for dyrking i 14 timer. Rørene ble spunnet ned ved 2000xg, 4 ºC i 5 minutter og vektor-DNA ble fremstilt ved å bruke et Qiagen miniprepsett (Qiagen, Valencia, CA) ved å følge settmanualen. 2 μg av DNA ble kuttet med Age I-Rsr-II. Fragmentet ble gelrenset ved hjelp av Qiaquickmetoden som angitt i settmanualen (Qiagen, Valencia, CA) og ligert inn i pED.Epo Fc.1 Age I-Rsr II. Ligeringen ble så transformert inn i DH5 α-kompetente E. coli-celler og DNA fremstilt som beskrevet ovenfor.
Eksempel 11: Kloning av Cys-Fc-konstrukt
Ved å bruke PCR og standard molekylærbiologisk teknikk (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press), ble det utviklet et pattedyrekspresjonskonstrukt slik at den kodende sekvensen for det humane IFN α-signalpeptidet var plassert direkte inn mot den kodende sekvensen av Fc som begynner ved den første cysteinresten (Cys 226, EU-nummerering). Ved signalpeptidasespalting og utskillelse fra pattedyrceller, ble det således utviklet et Fc-protein med en N-terminal cysteinrest. Kort beskrevet ble følgende primere brukt:
IFNa-Sig-F (IFNa-Sif-F: 5' GCTACTGCAGCCACCATGGCCTTGACCTT TGCTTTAC-3') (SEKV.ID. NR. 71) og Cys-Fc-R (5'-CAGTTCCGGAGCTGGGCACGGCGGA GAGCCCACAGAGCAGCTTG-3') (SEKV.ID. NR. 72) i en PCR-reaksjon for å skape et fragment som forbinder IFN α signalsekvensen med N-terminus i Fc som begynner med Cys 226. 500 ng av pED.dC.nativ hIFN α Δ-linker ble tilsatt 25 pmol av hver primer i en PCR-reaksjon med et Expand High Fidelity-system (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll. Reaksjonen ble utført i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 50 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 45 sekunder) og til slutt 72 ºC i 10 minutter. Båndet med den forventede størrelsen (�112 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA), kuttet med PstI- og BspEI-restriksjonsenzymer, gelrenset og deretter subklonet inn i de tilsvarende setene av pED.dC.nativ hIFN α Δ-linker for å utviklet pED.dC.Cys-Fc (figur 5).
Eksempel 12: Proteinekspresjon og fremstilling av Fc-MESNA
Den kodende sekvensen for Fc (det konstante området i humant IgG1) ble fremstilt ved hjelp av PCR-amplifisering fra et Fc-holdig plasmid ved å bruke standardbetingelser og reagenser og ved å følge fabrikantens anbefalte fremgangsmåte for å subklone den Fc-kodende sekvensen NdeI/SapI. Kort beskrevet ble primerne 5'-GTGGTCATATGGGCATTGAAGGCAGAGGCGCCGCTGCGGT CG-3' (SEKV.ID. NR. 73) og 5'-GGTGGTTGCTCTTCCGCAAAAACCCGGAGAC AGG GAGAGACTCTTCTGCG-3' (SEKV.ID. NR. 74) brukt for amplifisere Fcsekvensen fra 500 ng av plasmidet pED.dC.Epo-Fc ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Basel, Sveits) i et RapidCycler termosykliseringsapparat (Idaho Technology Salt Lake City, Utah) ved å anvende en denaturering ved 95 ºC i 2 minutter fulgt av 18 sykluser ved 95 ºC i 0 sekunder, 55 ºC i 0 sekunder og 72 ºC i 1 minutt med en nedtrapping på 4, fulgt av en forlengelse ved 72 ºC i 10 minutter. PCR-produktet ble subklonet i en intermediær kloningsvektor og sekvensert og deretter subklonet ved å bruke NdeI- og SapI-setene i pTWIN1-vektoren ved å følge standardmetoder. Sambrook, J., Fritsch, E.F. og Maniatis, T. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave; Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Dette plasmidet ble så transformert inn i BL21(DE3) pLysS-celler ved å bruke standard teknikker. En 1 liter kultur av celler ble dyrket til en absorpsjon på 0,8 AU ved 37 ºC, indusert med 1 mM isopropyl beta-D-1-tiogalaktopyranosid og dyrket over natten ved 25 ºC. Cellene ble nedsentrifugert, oppløst i 20 mM Tris 8,8/1% NP40/=,1 mM fenylmetansulfonylfluorid/1 μg/ml abenzonase (Novagen Madison, WI) og bundet til kitinperler (New England Biolabs; Beverly, MA) over natten ved 4 ºC. Perlene ble så vasket med flere kolonnevolumer av 20 mM Tris 8,5/500 mM NaCl/1 mM EDTA, og så lagret ved -80 ºC. Renset Fc-MESNA ble utviklet ved å proteinet ble eluert fra perlene i 20 mM Tris 8,5/500 mM NaCl/1 mM EDTA/500 mM 2-merkaptoetansulfonsyre (MESNA) og eluatet ble brukt direkte i det etterfølgende koblingsreaksjonen.
Eksempel 13: Faktor VII-Fc monomer-dimerhybridekspresjon og rensing
Det ble etablert CHO DG-44-celler som uttrykker faktor VII-Fc. CHO DG-44-cellene ble dyrket ved 37 ºC, 5% CO2i MEM alfa pluss nukleosid og ribonukleosider og supplert med 5% varmeinaktivert storfefosterserum inntil transfeksjon.
DG44-celler ble utplatet i 100 mm vevsdyrkningspetriskåler og dyrket til en sammenflytning på 50%-60%. Totalt 10 μg av DNA ble brukt for å transfektere en 100 mm skål: 7,5 μg pED.dC.FVII-Fc 1,5 ºg pcDNA3/Flag-Fc 1 μg pcDNA6-PACE. Cellene ble transfektert som beskrevet i Superfect transfeksjonsreagensmanualen (Qiagen, Valencia, CA). Media ble fjernet fra transfeksjonen etter 48 timer og erstattet med MEM alfa uten nukleosider pluss 5% dialysert storfefosterserum og 10 μg/ml blasticidin (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 0,2 mg/ml geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter 10 dager ble cellene fjernet fra platen med 0,25% trypsin og overført til T25 vevsdyrkningskolber og seleksjonen ble fortsatt i 10-14 dager inntil cellene vokste så bra at det var etablert stabile cellelinjer. Proteinekspresjonen ble deretter amplifisert ved å tilsette 25 nM metotreksat.
Omtrent 2 x 10<7>celler ble brukt for å inokulere 300 ml vekstmedium i en 1700 cm<2>rullekolbe (Corning, Corning, NY) supplert med 5 μg/ml av vitamin K3(menadionnatriumbisulfitt) (Sigma, St. Louis, MO). Rullekolbene ble innkubert i 5% CO2ved 37 ºC i 72 timer. Vekstmediet ble så byttet ut med 300 ml serumfritt produksjonsmedium (DMEM/F12 med 5 μg/ml storfeinsulin og 10 μg/ml gentamicin) supplert med 5 μg/l av vitamin K3. Produksjonsmediet (kondisjonert medium) ble oppsamlet hver 10. dag og lagret ved 4 ºC. Friskt produksjonsmedium ble tilsatt rullekolbene etter hver oppsamling og kolbene ble så igjen plassert i inkubatoren. De samlede media ble først renset ved å bruke et Sartoclean glassfiberfilter (3,0 μm 0,2 μm) (Sartorius Corp., Gottingen, Tyskland) fulgt av et Acropack 500-filter (0,8 μm 0,2 μm) (Pall Corp., East Hills, NY). Det klare og rensede mediet ble så konsentrert omtrent 20 ganger ved å bruke Pellicon Biomax tagentiale strømfiltreringskasetter (10 kDa MWCO) (Millipore Corp., Billerica, MA).
Fc-kimærene ble så tatt ut fra det konsentrerte mediet ved en passasje over en protein A sefarose 4 Fast Flow-kolonne (AP Biotech, Piscataway, NJ). En 5 x 5 cm (100 ml) kolonne ble påsatt med �5 mg Fc-protein pr ml kolonnevolum med en lineær strømhastighet på 100 cm/time, noe som ga en oppholdstid på ≥3 minutter. Kolonnen ble så vasket med >5 kolonnevolumer av 1X DPBS for å fjerne ikkespesifikt bundne proteiner. De bundne proteinene ble så eluert med 100 mM glysin pH 3,0. Elueringsfraksjoner som inneholdt proteintoppen ble nøytralisert ved å tilsette 1 del 1 M Tris-HCl, pH 8 til 10 eluerte fraksjoner.
For å fjerne FLAG-Fc-homodimerer (det vil si kimære Fc-dimerer med FLAG-peptid uttrykt som fusjoner med begge Fc-molekylene) fra preparatet, ble det samlede media fra protein A sefarose 4 Fast Flow-kolonnen ført gjennom en Unosphere S kationutbyttingskolonne (BioRad Corp., Richmond, CA). Under kolonnens driftsbetingelser vil FLAG-Fc monomer-dimerhybriden forbli uladet (FLAG-Fc teoretisk pl = 6,19) og strømme gjennom kolonnen mens hFVII-Fckonstruktene er positivt ladde og vil således binde seg til kolonnen og kan elueres ved høyere ionestyrke. Det samlede medium fra protein A sefarose 4 Fast Flowkolonnen ble først dialysert over i 20 mM MES, 20 mM NaCl, pH 6,1. Det dialyserte materialet ble så påsatt en 1,1 x 11 cm (9,9 ml) kolonne ved en strømhastighet på 150 cm/time. Under vasking og eluering ble strømhastigheten økt til 500 cm/time. Kolonnen ble vasket først med 8 kolonnevolumer av 20 mM MES, 20 mM NaCl, pH 6,1 og 8 kolonnevolumer av 20 mM MES, 40 mM NaCl, pH 6,1. Det absorberte proteinet ble eluert med 20 mM MES, 750 mM NaCl, pH 6,1. De eluerte fraksjoner som inneholdt proteintoppen ble slått sammen og sterilfiltrert gjennom en 0,2 μm filterskive før lagring ved -80 ºC.
En anti-FLAG MAB-affinitetskolonne ble brukt for å separere de kimære Fcdimerene hvor hFVII var fusjonert med begge Fc-molekylene, fra de med ett FLAG-peptid og en hFVII-fusjon. Eluatet fra Unosphere S-kolonnen ble fortynnet 1:1 med 20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 8 og påsatt en 1,6 x 5 cm M2 anti-FLAG-sefarosekolonnen (Sigma Corp., St. Louis, MO) med en lineær strømhastighet på 60 cm/time. Tilsetning til kolonnen var tilpasset til <2,5 mg monomer-dimerhybrid pr/ml kolonnevolum. Etter at kolonnen var lastet ble den vasket med 5 kolonnevolumer 20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 8,0 og monomer-dimerhybriden ble så eluert med 100 mM glysin pH 3,0. De eluerte fraksjonene som inneholdt proteintoppen ble så nøytralisert ved å tilsette 1 del 1 M Tris-HCl, pH 8 til 10 eluerte fraksjoner. Det samlede produktet ble lagret ved -80 ºC.
Eksempel 14: Faktor IX-Fc-homodimer og monomer-dimerhybridekspresjon og rensing
CHO DG-44-celler som uttrykte faktor IX-Fc ble etablert. DG44-celler ble utplatet i 100 mm vevsdyrkningspetriskåler og dyrket til en sammenflytning på 50%-60%. Totalt 10 μg DNA ble brukt for å transfektere en 100 mm skål; og for homodimertransfeksjon ble det brukt 8 μg pED.dC.faktor IX-Fc 2 μg pcDNA6-PACE; og for monomer-dimerhybridtransfeksjon ble det brukt 8 μg pED.dC.faktor IX-Fc 1 μg pcDNA3-FlagFc 1 μg pcDNA6-PACE. Cellene ble transfektert som beskrevet i Superfect transfeksjonsreagensmanualen (Qiagen, Valencia, CA).
Mediet ble fjernet fra transfeksjonsskålene etter 48 timer og erstattet MEM alfa uten nukleosider pluss 5% dialysert storfefosterserum og 10 μg/ml blasticidin (Invitrogen, Carlsbad, CA) for begge transfeksjonene, mens monomerdimerhybridtransfeksjonen ble supplert med 0,2 mg/ml geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter 3 dager ble cellene fjernet fra platen med 0,25% trypsin og overført til T25 vevsdyrkningskolber og seleksjonen ble fortsatt i 10-14 dager inntil cellene begynte å vokse så godt at det var etablert stabile cellelinjer.
Proteinekspresjonen ble deretter amplifisert ved å tilsette 10 nM eller 100 nM metotreksat for homodimeren eller monomer-dimerhybriden henholdsvis.
For begge cellelinjene ble omtrent 2 x 10<7>celler brukt for å inokulere 300 ml vekstmedium i en 1700 cm<2>rullekolbe (Corning, Corning, NY) supplert med 5 μg/ml av vitamin K3(menadionnatriumbisulfitt) (Sigma, St. Louis, MO).
Rullekolbene ble innkubert i en 5% CO2-atmosfære ved 37 ºC i omtrent 72 timer. Vekstmediet ble byttet ut med 300 ml serumfritt produksjonsmedium (DMEM/F12 med 5 μg/ml storfeinsulin og 10 μg/ml gentamycin) supplert med 5 μg/l av vitamin K3. Produksjonsmediet (kondisjonert medium) ble oppsamlet hver dag i 10 dager og lagret ved 4 ºC. Friskt produksjonsmedium ble tilsatt rullekolbene etter hver oppsamling og kolbene ble så igjen plassert i inkubatoren. Før kromatografi ble mediet renset ved å bruke et SuporCap-100 (0,8/0,2 μm) filter (Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). Alle de følgende trinnene ble utført ved 4 ºC. Det rensede mediet ble tilsatt en protein A sefarosekolonne, vasket med 5 kolonnevolumer av 1X PBS (10 mM fosfat, pH 7,2, 2,7 mM KCl og 137 mM NaCl), eluert med 0,1 M glysin, pH 2,7 og så nøytralisert med 1/10 volumer av 1 M Tris-HCl, pH 9,0.
Proteinet ble så dialysert over i PBS.
Monomer-dimerhybridtransfeksjonsproteinprøven ble underkastet ytterligere rensing ettersom den inneholdt en blanding av FIX-Fc:FIX-Fc-homodimer, FIX-Fc:Flag-Fc monomer-dimerhybrid og Flag-Fc:Flag-Fc-homodimer. Materialet ble konsentrert og påsatt en 2,6 cm x 60 cm (318 ml) Superdex 200 preparativ analysekolonne med en strømhastighet på 4 ml/minutt (36 cm/time) og så eluert med 3 kolonnevolumer av 1X PBS. Fraksjoner som tilsvarte to topper på UV-detektoren ble oppsamlet og analysert ved SDS-PAGE. Fraksjoner fra den første toppen inneholdt enten FIX-Fc:FIC-Fc-homodimer eller FIX-Fc:FlagFc monomerdimerhybrid, mens den andre toppen inneholdt FlagFc:FlagFc-homodimer. Alle de fraksjoner som inneholdt monomer-dimerhybriden men ingen FlagFc:FlacFchomodimer ble slått sammen og direkte påsatt en 1,6 x 5 cm M2 anti-FLAG sefarosekolonne (Sigma Corp., St. Louis, MO) med en lineær strømhastighet på 60 cm/time. Etter påsetting ble kolonnen vasket med 5 kolonnevolumer PBS.
Monomer-dimerhybriden ble så eluert med 100 mM glysin, pH 3,0. De eluerte fraksjonene som inneholdt proteintoppen ble så nøytralisert ved å tilsette et 1/10 volum av 1 M Tris-HCl og analysert ved reduserende og ikke-reduserende SDSPAGE. Fraksjonene ble dialysert over i PBS, konsentrert til 1-5 mg/ml og så lagret ved -80 ºC.
Eksempel 15: IFN α homodimer og monomer-dimerhybridekspresjon og rensing
CHO DG-44-celler som uttrykker hIFN α ble etablert. DG44-celler ble utplatet på 100 mm vevsdyrkningspetriskåler og dyrket til en sammenflytning på 50%-60%. Totalt ble 10 μg DNA brukt for å transfektere en 100 mm skål: For homodimertransfeksjon 10 μg av hIFN αFc-konstruktene; for monomerdimerhybridtransfeksjon 8 μg av hIFN αFc-konstrukter 2 μg pcDNA3-FlagFc. Cellene ble transfektert som beskrevet i Superfect transfeksjonsreagensmanualen (Qiagen, Valencia, CA). Media ble fjernet fra transfeksjonen etter 48 timer og erstattet med MEM alfa uten nukleosider pluss 5% dialysert storfefosterserum, mens monomer-dimerhybridtransfeksjonen ble også supplert med 0,2 mg/ml geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter 3 dager ble cellene fjernet fra platene med 0,25% trypsin og overført til T25 vevsdyrkningskolber og seleksjonen ble fortsatt i 10-14 dager inntil cellene vokste så godt at det var etablert stabile cellelinjer.
Proteinekspresjonen ble deretter amplifisert ved å tilsette metotreksat fra 10 til 50 nM.
For alle cellelinjer ble omtrent 2 x 10<7>celler brukt for å inokulere 300 ml vekstmedium i en 1700 cm<2>rulleflaske (Corning, Corning, NY). Rulleflaskene ble innkubert i en 5% CO2-atmosfære ved 37 ºC i omtrent 72 timer. Vekstmediet ble så byttet ut med 300 ml serumfritt produksjonsmedium (DMEM/D12 med 5 μg/ml storfeinsulin og 10 μg/ml gentamicin). Produksjonsmediet (kondisjonert medium) ble oppsamlet hver 10. dag og lagret ved 4 ºC. Friskt produksjonsmedium ble tilsatt rulleflaskene etter hver oppsamling og de ble så igjen plassert i inkubatoren. Før kromatografi ble mediet renset ved å bruke et SuporCap-100 (0,8/0,2 μm) filter fra Pall Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). Alle de følgende trinnene ble utført ved 4 ºC. Det rensede mediet ble tilsatt en protein A sefarosekolonne, vasket med 5 kolonnevolumer 1X PBS (10 mM fosfat, pH 7,4, 2,7 mM KCl og 137 mM NaCl), eluert med 0,1 M glysin, pH 2,7 og så nøytralisert med 1/10 volum av 1 M Tris-HCl, pH 9,0. Proteinet ble så dialysert over i PBS.
Monomer-dimerhybridtransfeksjonsproteinprøvene ble så underkastet ytterligere rensting ettersom de inneholder en blanding av IFN αFc:IFN αFc-homodimer, IFN αFc:FlagFc monomer-dimerhybrid og FlagFc:FlacFc-homodimer (eller Δ-linker eller GS15-linker). Materialet ble konsentrert og påsatt en 2,6 x 60 cm (318 ml) Superdex 200 Prep-kolonne med en strømhastighet på 4 ml/min (36 cm/time) og så eluert med 3 kolonnevolumer 1X PBS. De fraksjonene som tilsvarte de to toppene på UV-detektoren ble oppsamlet og analysert ved SDS-PAGE. Fraksjoner fra den første toppen inneholdt enten IFN αFc:IFN αFc-homodimer eller IFN αFc:FlagFc monomer-dimerhybrid, mens den andre toppen inneholdt FlagFc:FlacFchomodimer. Alle de fraksjoner som inneholdt monomer-dimerhybriden men ingen FlagFc-homodimer, ble slått sammen og direkte påsatt en 1,6 x 5 cm M2 anti-FLAG sefarosekolonne (Sigma Corp., St. Louis, MO) med en lineær strømhastighet på 60 cm/time. Etter påsettingen ble kolonnen vasket med 5 kolonnevolumer PBS og monomer-dimerhybridene ble så eluert med 100 mM glysin, pH 3,0. De eluerte fraksjoner som inneholdt proteintoppen ble så nøytralisert ved å tilsettes 1/10 volum av 1 M Tris-HCl og analysert ved hjelp av reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE. Fraksjonene ble dialysert over i PBS, konsentrert til 1-5 mg/ml og så lagret ved -80 ºC.
Eksempel 16: Viklet coilproteinekspresjon og rensing
Plasmidene pED.dC Epo-CCA-Fc og pED.dC CCB-Fc vil bli transfektert enten alene eller sammen i et 1:1 forhold i CHO DG44-celler. Cellene vil så bli transfektert som beskrevet i Superfect transfeksjonsreagensmanualen (Qiagen, Valencia, CA). Media vil bli fjernet etter 48 timer og erstattet med MEM alfa med eller uten nukleosider pluss 5% dialysert storfefosterserum. Rensing vil bli gjort ved affinitetskromatografi i en protein A-kolonne ved hjelp av de fremgangsmåter som er velkjente. Alternativt kan rensingen utføres ved størrelsesutelukkelseskromatografi.
Eksempel 17: Cys-Fc-ekspresjon og rensing
CHO DG-44-celler som uttrykker Cys-Fc ble etablert. pED.dC.Cys-Fcekspresjonsplasmidet som inneholder muse dihydrofolatreduktase (dhfr) -genet ble transfektert inn i CHO DG44 (med dhfr-svikt) -celler ved å bruke Superfect-reagens (Qiagen; Valencia, CA) ifølge fabrikantens protokoll, fulgt av en seleksjon for stabile transfektanter i αMEM (uten nukleosider) vevsdyrkningsmedium supplert med 5% dialysert FBS og penicillin/streptomycinantibiotika (Invitrogen; Carlsbad, CA) i 10 dager. Den resulterende samlingen av stabilt transfekterte celler ble så amplifisert med 50 nM metotreksat for å forsterke ekspresjonen. Omtrent 2 x 10<7>celler ble brukt for å inokulere 300 ml vekstmedium i en 1700 cm<2>valsekolbe (Corning, Corning, NY). Valsekolbene ble innkubert i en 5% CO2-atmosfære ved 37 ºC i omtrent 72 timer. Vekstmediet ble byttet ut med 300 ml serumfritt produksjonsmedium (DMEM/F12 med 5 μg/ml storfeinsulin og 10 μg/ml gentamicin). Produksjonsmediet (kondisjonert medium) ble oppsamlet hver 10. dag og lagret ved 4 ºC. Friskt produksjonsmedium ble tilsatt flaskene etter hver oppsamling og disse ble så satt tilbake i inkubatoren. Før kromatografi ble mediet renset ved å bruke et SuporCap-100 (0,8/0,2 μm) filter fra Pall Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). Alle de følgende trinnene ble utført ved 4 ºC. Det rensede mediet ble påsatt en protein A sefarosekolonne, vasket med 5 kolonnevolumer av 1X PBS (10 mM fosfat, pH 7,4, 2,7 mM KCl og 137 mM NaCl), eluert med 0,1 M glysin, pH 2,7, og så nøytralisert med 1/10 volum av 1 M Tris-HCl, pH 9,0. Proteinet ble dialysert over i PBS og brukt direkte i konjugeringsreaksjoner.
Eksempel 18: Kobling av T20-tioestere til Cys-Fc
Cys-Fc (4 mg, 3,2 mg/ml sluttkonsentrasjon) og enten T20-tioester eller T20-PEG-tioester (2 mg, omtrent 5 molare ekvivalenter) ble innkubert i 16 timer ved romtemperatur i 0,1 M Tris 8/10 mM MESNA. Analyse ved SDS-PAGE (Tris-Glygel) ved å bruke reduserende prøvebuffer indikerte nærværet av et nytt bånd som var omtrent 5 kDa større enn Fc-kontrollen (>40-50% omdannelse til konjugatet). Tidligere N-terminal sekvensering av Cys-Fc og uomsatt Cys-Fc indikerte at signalpeptidet ikke var riktig bearbeidet i en viss fraksjon av molekylene, noe som ga en blanding av (Cys)-Fc som vil reagere gjennom nativ ligering med peptidtioestere, mens dette ikke vil være tilfellet med (Val)-(Gly)-(Cys)-Fc. Ettersom reaksjonsbetingelsene er utilstrekkelige til å bryte dimeriseringen av Cys-Fcmolekylene, så utviklet denne reaksjonen en blanding av T20-Cys-Fc:T20-Cys-Fchomodimerer, T20-Cys-Fc:Fc monomer-dimerhybrider og Cys-Fc:Cys-Fc Fcdimerer. Proteinet ble renset ved å bruke størrelsesutelukkelseskromatografi som angitt ovenfor for å skille de tre typene av molekylet. Resultatene ble bekreftet ved en SDS-PAGE-analyse under ikke-reduserende betingelser.
Eksempel 19: Antiviral prøve for IFN α-aktivitet
Antiviral aktivitet (IU/ml) for IFN α-fusjonsproteiner ble bestemt ved å bruke en CPE (cytopatisk effekt) -prøve. A549-celler ble utplatet i en 96 brønners vevsdyrkningsplate i vekstmedium (RPMI 1640 supplert med 10% storfefosterserum (FBS) og 2 mM L-glutamin) i 2 timer ved 37 ºC, 5% CO2. IFN αstandarder og IFN α-fusjonsproteiner ble fortynnet i vekstmedium og tilsatt cellene i tre paralleller i 20 timer ved 37 ºC, 5% CO2. Etter innkubering ble alt media fjernet fra brønnene, encefalomyocardittvirus (EMC) ble fortynnet i vekstmedium og tilsatt (3000 pfu/brønn) til hver brønn med unntak av kontrollbrønnene. Platene ble så innkubert ved 37 ºC, 5% CO2i 28 timer. Levende celler ble fiksert med 10% kald trifluoreddiksyre (TCA) og så farget med sulforodamin B (SRB) ifølge publiserte protokoller (Rubinstein et al. 1990, J. Natl. Cancer. Inst. 82, 1113). SRB-fargestoffet ble gjort løselig med 10 mM Tris pH 10,5 og resultatet ble avlest på et spektrofotometer ved 490 nm. Prøvene ble analysert ved å sammenligne aktivitetene i forhold til en kjent standardkurve som er publisert av World Health Organization IFN α 2b internasjonal standard, varierer fra 5 til 0,011 IU/ml. Resultatene er gitt nedenfor i tabell 3 og figur 6 og viser forsterket antiviral aktivitet for monomerdimerhybrider.
TABELL 3: INTERFERON ANTIVIRAL PRØVE HOMODIMER VERSUS
MONOMER-DIMERHYBRID
Eksempel 20: FVIIa koaguleringsaktivitetsanalyse
StaClot FVIIa-rTF-prøvesettet ble kjøpt fra Diagnostica Stago (Parsippany, NJ) og modifisert som beskrevet i Johannessen et al. 2000, Blood Coagulation and Fibrinolysis 11: S159. Det ble utviklet en standardkurve med FVIIa World Health Organization standard 89/688. Prøven ble brukt for å sammenligne koagulasjonsaktiviteten for monomer-dimerhybrider sammenlignet med homodimerer. Resultatene viste at monomer-dimerhybriden hadde fire ganger sterkere koagulasjonsaktivitet enn homodimeren (figur 7).
Eksempel 21: FVIIa-Fc oral dosering i dag 10-rotter
25 grams dag 9 nyfødte Sprague Dawley-rotter ble kjøpt fra Charles River (Wilmington, MA) som fikk lov til å akklimatisere seg i 24 timer. Rottene ble dosert oralt med FVIIaFc-homodimer, monomer-dimerhybrid eller en 50:50 blanding av de to. Det ble administrert et volum på 200 μl av en FVIIaFc-løsning for en dose på 1 mg/kg kroppsvekt. Løsningen var sammensatt av en Tris-HClbuffer pH 7,4 med 5 mg/ml soyabønnetrypsinhemmer. Rottene ble avlivet med CO2på flere tidspunkter og det ble så tatt ut en blodprøve på 200 μl ved hjelp av hjertepunktering. Plasma ble fremstilt ved å tilsette en 3,8% natriumcitratløsning og prøven ble så sentrifugert ved romtemperatur ved en hastighet på 1268xg.
Plasmaprøvene ble enten analysert friske eller frosne ved -20 ºC. Den oralt doserte monomer-dimerhybriden resulterte i signifikant høyere maksimale (Cmax) serumkonsentrasjoner sammenlignet med den homodimere faktor VII (figur 8).
Eksempel 22: Faktor IX-Fc oral dosering av neonatale rotter
Ti dager gamle neonatale Sprague-Dawley-rotter ble dosert p.o. med 200 μl FIX-Fchomodimer eller FIX-Fc:FlagFc monomer-dimerhybrid i omtrentlig ekvimolare doser på 10 nmol/kg kroppsvekt i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 6,5 som inneholdt 5 mg/ml soyabønnetrypsinhemmer og 0,9% NaCl. 1, 2, 4, 8, 24, 48 eller 72 timer etter injeksjonen ble dyrene avlivet med CO2og det ble tatt ut en blodprøve ved hjertepunktering og plasma ble fremstilt ved å tilsette en 3,8% natriumcitratløsning hvoretter prøvene ble sentrifugert ved romtemperatur ved en hastighet på 1268xg. Prøvene ble så sedimentert ved sentrifugering, serum ble oppsamlet og frosset ved -20 ºC inntil fusjonsproteinene ble analysert ved hjelp av ELISA.
Eksempel 23: Faktor IX-Fc ELISA
En 96 brønners Immulon 4HBX ELISA-plate (Thermo LabSystems, Vantaa, Finland) ble belagt med 100 μl/brønn av geite anti-faktor IX IgG (Affinity Biologicals, Ancaster, Canada) fortynnet 1:100 i 50 mM karbonatbuffer, pH 9,6. Platene ble innkubert ved omgivelsestemperatur i 2 timer eller over natten ved 4 ºC lukket med en plastfilm. Brønnene ble vasket 4 ganger med PBST, 300 μl/brønn ved å bruke TECAN-platevaskeren. Brønnene ble så blokkert med PBST 6% BSA, 200 μl/brønn, hvoretter platene ble innkubert i 90 minutter ved omgivelsestemperatur. Brønnene ble vasket 4 ganger med PBST, 300 μl/brønn ved å bruke TECAN-platevaskeren. Standarder og blodprøver fra rotter som beskrevet i eksempel 18 ble tilsatt brønnene (100 μl/brønn), hvoretter platene ble innkubert i 90 minutter ved omgivelsestemperatur. Prøvene og standarder ble fortynnet i HBET-buffer (HBET: 5,95 g HEPES, 1,46 g NaCl, 0,93 g Na2EDTA, 2,5 g storfe serumalbumin, 0,25 ml Tween-20, fortynnet til 250 ml med dH2O og pH justert til 7,2). Standardkurvevariasjonen var fra 200 ng/ml til 0,78 ng/ml med 2 ganger fortynninger i mellom. Brønnene ble vasket 4 ganger med PBST, 300 μl/brønn ved å bruke TECAN-platevaskeren. 100 μl/brønn av konjugert geit antihumant IgG-Fc-HARP-antistoff (Pierce, Rockford, IL) fortynnet i HBET 1:25000 ble tilsatt hver brønn. Platene ble så innkubert i 90 minutter ved omgivelsestemperatur. Brønnene ble vasket 4 ganger med PBST, 300 μl/brønn ved å bruke TECAN-platevaskeren. Platene ble så fremkalt med 100 μl/brønn av tetrametylbenzidinperoksidasesubstrat (TMB) (Pierce, Rockford, IL) tilsatt som angitt i fabrikantens instruksjoner. Platene ble innkubert i 5 minutter ved omgivelsestemperatur i mørke eller inntil det ble fremkalt en farge. Reaksjonen ble stoppet med 100 μl/brønn av 2 M svovelsyre. Absorpsjonen ble avlest ved 450 nm i en SpectraMax plussplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Analyser av blod tatt ut etter 4 timer indikerte mer enn en 10 gangers forskjell med hensyn til serumkonsentrasjon mellom faktor IX-Fc monomer-dimerhybrider sammenlignet med faktor IX Fc-homodimerer (figur 9). Resultatene indikerer at faktor IX-Fc monomer-dimerhybridnivåene var vedvarende høyere enn for faktor IX-Fc-homodimerer (figur 10).
Eksempel 24: Kloning av Epo-Fc
Det modne Epo-kodende området ble oppnådd ved hjelp av PCR-amplifisering fra et plasmid som koder den modne erytropoietinkodende sekvensen, opprinnelig oppnådd ved hjelp av RT-PCR fra Hep G2 mRNA og primere hepoxba-F og hepoeco-R slik det er angitt i det etterfølgende. Primer hepoxba-F inneholder et XbaI-sete, mens primeren hepoeco-R inneholder et EcoRI-sete. PCR ble utført i et Idaho Technology Rapid sykliseringsapparat ved å bruke Vent-polymerase, denaturering ved 95 ºC i 15 sekunder fulgt av 28 sykluser med en helning på 6,0 ved 95 ºC i 0 sekunder, 55 ºC i 0 sekunder og 72 ºC i 1 minutt og 20 sekunder fulgt av 3 minutters forlengelse ved 72 ºC. Et omtrentlig 514 bp produkt ble gelrenset, kuttet med XbaI og EcoRI, gelrenset på nytt og direkte subklonet inn i en XbaI/EcoRI-kuttet, gelrenset pED.dC.XFc-vektor som nevnte ovenfor. Dette konstruktet ble betegnet pED.dC.EpoFc.
Epo-sekvensen som inneholder både det endogene signalpeptidet og den modne sekvensen ble fremstilt ved PCR-amplifisering ved å bruke et voksent nyre QUICK-klon cDNA-preparat som templat og primerne Epo+Pep-Sbf-F og Epo+Pep-Sbf-R som beskrevet i det etterfølgende. Primeren Epo+Pep-Sbf-F inneholder et SbfI-sete oppstrøms for startkodonet, mens primeren Epo+Pep-Sbf-R fester seg nedstrøms til det endogene SbfI-setet i Epo-sekvensen. PCR-reaksjonen ble utført i PTC-200 MJ termosykliseringsapparatet ved å bruke Expand-polymerase, denaturering ved 94 ºC i 2 minutter fulgt av 32 sykluser ved 94 ºC i 30 sekunder, 57 ºC i 30 sekunder og 72 ºC i 45 sekunder, fulgt av en 10 minutters forlengelse ved 72 ºC. Et omtrentlig 603 bp produkt ble gelisolert og subklonet inn i pGEM-T Easy-vektoren. Den riktige kodende sekvensen ble tatt ut ved SbfI-kutting, gelrenset og klonet inn i det PstI-kuttede, rekealkalisk fosfatase (SAP) -behandlede og gelrensede pED.dC.EpoFc-plasmidet. Plasmidet med innsettingen i den riktige orienteringen ble først bestemt ved KpnI-kutting. En XmnI- og PvuII-kutting av dette konstruktet ble sammenlignet med pED.dC.EpoFc og bekreftet til å være i den riktige orienteringen. Sekvensen ble bestemt og konstruktet ble betegnet pED.dC.natEpoFc.
PCR-primere:
hepoxba-F (EPO-F): 5'-AATCTAGAGCCCCACCACGCCTCATCTGTGAC-3' (SEKV.ID. NR. 75)
hepoeco-R (EPO-R): 5'-TTGAATTCTCTGTCCCCTGTCCTGCAGGCC-3' (SEKV.ID. NR. 76)
Epo+Pep-Sbf-F: 5'-GTACCTGCAGGCGGAGATGGGGGTGCA-3' (SEKV.ID. NR.
77)
Epo+Pep-Sbf-R: 5'-CCTGGTCATCTGTCCCCTGTCC-3' (SEKV.ID. NR. 78)
Eksempel 25: Kloning av Epo-Fc
Det er i det etterfølgende beskrevet en alternativ fremgangsmåte for kloning av EPO-Fc. Det ble først utformet primere for å amplifisere den fullengde Epokodende sekvensen inklusive den native signalsekvensen som følger:
Epo-F: 5'-GTCCAACCTG CAGGAAGCTTG CCGCCACCAT GGGAGTGCAC GAATGTCCTG CCTGG-3' (SEKV.ID. NR. 79)
Epo-R: 5'-GCCGAATTCA GTTTTGTCGA CCGCAGCGG CGCCGGCGAA CTCTCTGTCC CCTGTTCTGC AGGCCTCC-3' (SEKV.ID. NR. 80)
Foroverprimeren inkorporerer et SbfI- og HindIII-sete oppstrøms for en Kozaksekvens mens den reverse primeren fjerner det indre SbfI-setet og adderer en 8 aminosyrer linker til 3'-enden av den kodende sekvensen (EFAGAAAV) (SEKV.ID. NR. 81) så vel som SalI- og EcoRI-restriksjonsseter. Den Epo-kodende sekvensen blir så amplifisert fra et nyre cDNA-bibliotek (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) ved å bruke 25 pmol av disse primerne i en 25 μl PCR-reaksjon ved å bruke det Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat og ved å bruke de følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 58 ºC i 30 sekunder og 72 ºC i 45 sekunder) fulgt av 72 ºC i 10 minutter. Båndet med den forventede størrelsen (641 bp) ble renset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og ligert inn i den intermediære kloningsvektoren pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI). DNA ble transformert inn i DH5 α-celler (Invitrogen, Carlsbad, CA) og miniprepkulturer ble dyrket og renset med et Plasmid miniprepsett (Qiagen, Valencia, CA) ved å følge fabrikantens standardprotokoller. Så snart sekvensen var bekreftet, ble denne innsettingen kuttet ut med SbfI/EcoRI-restriksjonsenzymer, gelrenset og klonet inn i PstI/EcoRI-setene i pattedyrekspresjonsvektoren pED.dC på en lignende måte.
Det ble utformet primere for å amplifisere den kodende sekvensen for det konstante området i det humane IgG1 (Fc-området, EU-nummerering 221-447) som følger:
Fc-F: 5'-GCTGCGGTCG ACAAAACTCA CACATGCCCA CCGTGCCCAG CTCCGGAACT CCTGGGCGGA CCGTCAGTC-3' (SEKV.ID. NR. 82)
FC-R: 5'-ATTGGAATTC TCATTTACCC GGAGACAGGG AGAGGC-3' (SEKV.ID. NR. 83)
Foroverprimeren inkorporerer et SalI-sete ved linker-Fc-sammenbindingen, så vel som at det innføres BspEI- og RsrII-seter i Fc-området uten at dette påvirker den kodende sekvensen, mens den reverse primeren adderer et EcoRI-sete etter stoppkodonet. Den Fc-kodende sekvensen ble så amplifisert fra et leukocytt cDNA-bibliotek (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) ved å bruke 25 pmol av disse primerne i en 25 μl PCR-reaksjon og ved å bruke det Expand High Fidelitysystemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll, i et MJ termosykliseringsapparat ved å bruke de følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 58 ºC i 30 sekunder og 72 ºC i 45 sekunder) fulgt av 72 ºC i 10 minutter. Båndet med den forventede størrelsen (696 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og ligert inn i den intermediære kloningsvektoren pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI). DNA ble så transformert inn i DH5 α-celler (Invitrogen, Carlsbad, CA) og miniprepkulturer ble dyrket og renset med et Plasmid miniprepsett (Qiagen, Valencia, CA), begge ifølge fabrikantens standardprotokoller. Så snart sekvensen var bekreftet ble denne innsettingen kuttet ut med SaI/EcoRI-restriksjonsenzymer, gelrenset og klonet inn i SalI/EcoRI-setene i plasmid pED.dC.Epo (se ovenfor) på lignende måte, noe som gir pattedyrekspresjonsplasmidet pED.dC.EpoFc. I et annet eksperiment ble dette plasmidet også kuttet med RsrII/XmaI, og det tilsvarende fragmentet fra pSYN-Fc-002 som inneholder Asn 297 Ala-mutasjonen (EU-nummerering) ble klonet inn, noe som ga pED.dC.EPO-Fc N297A (pSYN-EPO-004). Ekspresjon i pattedyrceller var som beskrevet i eksempel 26. Aminosyresekvensen for EpoFc med en åtte aminosyrelinker er gitt på figur 2j. Under denne alternative kloningsmetoden, skjønt den nøyaktige EpoFc-aminosyresekvensen ble bevart (figur 2J), så ble det utført en rekke ikke-kodende forandringer på nukleotidnivået (figur 3J). Disse er G6A (G ved nukleotid 6 ble forandret til A) (eliminerer en mulig sekundær struktur i primeren), G567A (fjerner det endogene SbfI-setet fra Epo), A582G (fjerner EcoRI-setet fra linkeren), A636T og T639G (adderer et unikt BspEI-sete til Fc) og G651C (adderer et unikt RsrII-sete til Fc). Nukleotidsekvensen på figur 3J er fra konstruktet fremstilt i eksempel 25 som inkorporerer disse forskjellene fra sekvensen for konstruktet fra eksempel 24.
Eksempel 26: EPO-Fc homodimer og monomer-dimerhybridekspresjon og rensing
DG44-celler ble utplatet i 100 mm vevsdyrkningspetriskåler og dyrket til en sammenflytning på 50%-60%. Totalt 10 μg DNA ble brukt for å transfektere en 100 mm skål; for homodimertransfeksjonen 10 μg av pED.dC.EPO-Fc; for homomerdimerhybridtransfeksjon 8 μg av pED.dC.EPO-Fc 2 μg av pcDNA3-FlagFc. De brukte konstruktene ble klonet som beskrevet i eksempel 24. Kloningsmetoden som er beskrevet i eksempel 25 kan også brukes for å fremstille konstrukter som kan brukes i dette eksempelet. Cellene ble transfektert som beskrevet i Superfect transfeksjonsreagensmanualen (Qiagen, Valencia, CA). Alternativt kan pED.dC.EPO-Fc samtransfekteres med pSYN-Fc-016 for å få fremstilt en utagget monomer. Media ble fjernet fra transfeksjonen etter 48 timer og erstattet med MEM alfa uten nukleosider pluss 5% dialysert storfefosterserum for begge transfeksjonene, mens monomer-dimerhybridtransfeksjonen også ble supplert med 0,2 mg/ml geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter 3 dager ble cellene frigjort fra platen med 0,25% trypsin og overført til T25 vevskulturkolber og seleksjon ble fortsatt i 10-14 dager inntil cellene begynte å vokse så godt at det var etablert stabile cellelinjer. Proteinekspresjon ble deretter amplifisert ved å tilsette metotreksat.
For begge cellelinjene ble tilnærmingsvis 2 x 10<7>celler brukt for å inokulere 300 ml vekstmedium i en 1700 cm<2>rulleflaske (Corning, Corning, NY). Flaskene ble innkubert i en 5% CO2-atmosfære ved 37 ºC i tilnærmet 72 timer. Vekstmediet ble erstattet med 300 ml serumfritt produksjonsmedium (DMEM/F12 med 5 μg/ml av storfeinsulin og 10 μg/ml gentamicin). Produksjonsmediet (kondisjonert medium) ble oppsamlet hver dag i 10 dager og lagret ved 4 ºC. Friskt produksjonsmedium ble tilsatt rulleflaskene etter hver oppsamling, hvoretter flaskene igjen ble plassert i inkubatoren. Før kromatografi ble mediet renset ved å bruke et SuporCap-100 (0,8/0,2 μm) filter fra Pall Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). Alle de følgende trinnene ble utført ved 4 ºC. Det rensede mediet ble påsatt en protein A sefarosekolonne, vasket med 5 kolonnevolumer av 1X PBS (10 mM fosfat, pH 7,4, 2,7 mM KCl og 137 mM NaCl) og eluert med 0,1 M glysin, pH 2,7 og så nøytralisert med 1/10 volum av 1 M Tris-HCl, pH 9,0. Proteinet ble så dialysert over i PBS.
Monomer-dimerhybridtransfeksjonsproteinprøven ble underkastet ytterligere rensing ettersom den inneholdt en blanding av EPO-Fc:EPO-Fc-homodimer, EPO-Fc:Flag-Fc monomer-dimerhybrid og Flag-Fc:Flag-Fc-homodimer. Prøven ble konsentrert og påsatt en 2,6 cm x 60 cm (318 ml) Superdex 200 Prep kvalitetskolonne med en strømhastighet på 4 ml/min (36 cm/time) og så eluert med 3 kolonnevolumer av 1X PBS. De fraksjonene som tilsvarte to topper på UV-detektoren ble oppsamlet og analysert ved SDS-PAGE. Fraksjonene fra den første toppen inneholdt enten EPO-Fc:EPO-Fc-homodimer eller EPO-Fc:FlagFc monomer-dimerhybrid, mens den andre toppen inneholdt FlagFc:FlacFchomodimer. Alle de fraksjoner som inneholdt monomer-dimerhybriden men ingen FlagFc-homodimer ble slått sammen og direkte påsatt en 1,6 x 5 cm M2 anti-FLAG sefarosekolonne (Sigma Corp.) med en lineær strømhastighet på 60 cm/time. Etter påsettingen ble kolonnen vasket med 5 kolonnevolumer PBS. Monomerdimerhybridene ble så eluert med 100 mM glysin, pH 3,0. De elueringsfraksjoner som inneholdt proteintoppen ble så nøytralisert ved å tilsette 1/10 volum av 1 M Tris-HCl og analysert ved reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE.
Fraksjonene ble dialysert over i PBS, konsentrert til 1-5 mg/ml og lagret ved -80 ºC.
Alternativt kan fraksjoner fra den første toppen av Superdex 200-kolonnen analyseres ved SDS-PAGE og bare fraksjoner som inneholdt mesteparten av EpoFc monomer-dimerhybriden og noe EpoFc-homodimer ble slått sammen. Dette sammenslåtte produktet som var anriket på monomer-dimerhybriden ble så igjen påsatt en Superdex 200-kolonne og de fraksjoner som bare inneholdt EpoFc monomer-dimerhybriden ble så slått sammen, dialysert og lagret som renset protein. Det skal bemerkes at denne alternative rensemetoden også kan brukes for å rense ikke-taggede monomer-dimerhybrider.
Eksempel 27: Administrering av EpoFc-dimer og monomer-dimerhybrid med en åtte aminosyrer linker til cynomolgusaper
For lungeadministrering ble det fremstilt aerosoler av enten EpoFc-dimer eller EpoFc monomer-dimerhybridproteiner (begge med 8 aminosyrer linkeren) i PBS, pH 7,4, med Aeroneb Pro<TM>(AeroGen, Mountain View, CA) nebulisator, in-line med en Bird Mark 7A-respirator og administrert bedøvde naturlige cynomolgusaper ved endotrakeale rør (omtrent normal tidal pusting). Begge proteinene ble også administrert naturlige cynomolgusaper ved intravenøs injeksjon. Det ble tatt prøver på forskjellige tidspunkter og mengden av Epo-holdig protein i det resulterende plasma ble kvantifisert ved å bruke den Qantikine IVD humane Epo-immunoprøven (R&D Systems, Minneapolis, MN). Farmakokinetiske parametere ble beregnet ved å bruke dataprogrammet WinNonLin. Tabell 4 angir biotilgjengelighetsresultatene for cynomolgusaper behandlet med EpoFc monomer-dimerhybrid eller EpoFc-dimer.
TABELL 4: ADMINISTRERING AV EPOFC MONOMER-DIMERHYBRID
OG EPOFC-DIMER TIL APER
<1>Basert p en 15% avsetningsfraksjon av forstøvet dose slik dette ble bestemt ved gammascintigrafi
Prosent biotilgjengelighet (F) ble beregnet for lungedosene ved hjelp av følgende likning:
F = (AUC lunge / dose lunge) / (AUC IV / dose IV) * 100
TABELL 5: BEREGNING AV PROSENT BIOTILGJENGELIGHET FOR EPOFC MONOMER-DIMERHYBRID VERSUS DIMER ETTER LUNGEADMINISTRERING TIL NATURLIGE CYNOMOLGUSAPER
<1>Basert p 15% avsetningsfraksjon av forstøvet dose slik dette ble bestemt ved gammascintigrafi<2>Midlere AUC for IV EpoFc monomer-dimerhybrid = 18,913 ng .time/ml (n=3 aper) dosert med 25 μg/kg. Midlere AUC for IC EpoFc-dimer = 70,967 ng .time/ml (n=6 aper) dosert med 150 μg/kg.
Farmakokinetikken for EpoFc med en 8 aminosyrelinker som ble administrert cynomolgusapene er angitt på figur 11. Figuren sammenlignet EpoFc-dimeren med EpoFc monomer-dimerhybriden i aper etter administrering av en enkel lungedose. Basert på en molar sammenligning, ble det oppnådd signifikant høyere serumnivåer i apene som var behandlet med monomer-dimerhybriden sammenlignet med dimeren.
Eksempel 28: Subkutan administrering av EPOFc monomer-dimerhybrid
For å sammenligne serumkonsentrasjonene av kjente erytropoietinmidler med EPOFc monomer-dimerhybrider, ble både EPOFc monomer-dimerhybriden og Aranesp<®>(darbepoetin alfa) som ikke er et kimært fusjonsprotein administrert subkutant til forskjellige aper, hvoretter serumkonsentrasjonen av begge de angitte midlene ble målt over tid.
Cynomolgusaper (n = 3 pr gruppe) ble injisert subkutant med 0,025 mg/kg EpoFc monomer-dimerhybrid. Blodprøver ble oppsamlet predose og på tidspunkter opptil 144 timer postdose. Serum ble fremstilt fra blodet og lagret frosset inntil det ble analysert ved hjelp av ELISA (human Epo Quantikine immunoprøve) (R & D Systems, Minneapolis, MN). De farmakokinetiske parameterne ble bestemt ved å bruke dataprogrammet WinNonLinâ<®>(Pharsight, Mountainview, CA).
Resultatene indikerer at serumkonsentrasjonene av både EPOFc monomerdimerhybrid og Aranesp<®>(darbepoetin alfa) var lik over tid, selv om den administrerte molare dosen av Aranesp<®>(darbepoetin alfa) var noe større (tabell 6) (figur 12).
TABELL 6
Eksempel 29: Intravenøs administrering av EPOFc monomer-dimerhybrid
For å sammenligne serumkonsentrasjonene av kjente erytropoietinmidler med EPOFc monomer-dimerhybrider, ble EPOFc monomer-dimerhybrid, Aranesp<®>(darbepoetin alfa) og Epogen<®>(epoetin alfa), hvorav de to siste ikke er et kimært fusjonsprotein, administrert intravenøst til forskjellige aper, og serumkonsentrasjonen for alle de nevnte midler ble målt over tid.
Cynomolgusaper (n = 3 pr gruppe) ble injisert subkutant med 0,025 mg/kg EpoFc monomer-dimerhybrid. Blodprøver ble oppsamlet predose og på tidspunkter opptil 144 timer postdose. Serum ble fremstilt fra blodet og lagret frosset inntil det ble analysert ved hjelp av ELISA (human Epo Quantikine immunoprøve) (R & D Systems, Minneapolis, MN). De farmakokinetiske parameterne ble bestemt ved å bruke dataprogrammet WinNonLinâ<®>(Pharsight, Mountainview, CA).
Resultatene indikerer at serumkonsentrasjon versus tid (AUC) for EPOFc monomerdimerhybriden var større enn konsentrasjonen for både Epogen<®>(epoetin alfa) eller Aranesp<®>(darbepoetin alfa), selv om apene fikk større molare doser av både Epogen<®>(epoetin alfa) og Aranesp<®>(darbepoetin alfa) (tabell 7) (figur 13).
TABELL 7
Eksempel 30: Alternativ rensing av EpoFc monomer-dimerhybrid
Dette eksempelet beskriver enda et ytterligere alternativ for rensing av EPO-Fc. En blanding som inneholdt Fc, EpoFc monomer-dimerhybrid og EpoFc-dimer ble påsatt en protein A sefarosekolonne (Amersham, Uppsala, Sverige). Blandingen ble så eluert ved å følge fabrikantens instruksjoner. Protein A sefaroseeluatet som inneholdt blandingen ble bufferutbyttet over i 50 mM Tris-Cl (pH 8,0).
Proteinblandingen ble så påsatt en 8 ml Mimetic Red 2 XL-kolonne (ProMetic Life Sciences, Inc., Wayne, NJ) som var blitt ekvilibrert i 50 mM Tris-Cl (pH 8,0).
Kolonnen ble så vasket med 50 mM Tris-Cl (pH 8,0) og 50 mM NaCl. Dette trinnet fjernet mesteparten av nevnte Fc. EpoFc monomer-dimerhybriden ble spesifikt eluert fra kolonnen med 50 mM Tris-Cl (pH 8,0) og 400 mM NaCl. EpoFc-dimeren kan elueres og kolonnen regenereres med 5 kolonnevolumer av 1 M NaOH. De eluerte fraksjonene fra kolonnen ble analysert ved SDS-PAGE (figur 14).
Eksempel 31: Kloning av Ig к-signalsekvens - Fc-konstrukt for fremstilling av umerket Fc alene
Den kodende sekvensen for det konstante området i IgG1 (EU nr. 221-447; Fcområdet) ble oppnådd ved PCR-amplifisering fra et leukocytt cDNA-bibliotek (Clontech, CA) ved å bruke de følgende primere:
rcFc-F 5'-GCTGCGGTCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCC GGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTC-3' (SEKV.ID. NR. 84)
rcFc-R 5'-ATTGGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC-3' (SEKV.ID. NR. 85)
Foroverprimeren adderer tre aminosyrer (AAV) og et SalI-kloningssete før begynnelsen av Fc-området og inkorporerer også et BspEI-restriksjonssete ved aminosyrene 231-233 og et RsrII-restriksjonssete ved aminosyrene 236-238 ved å bruke degenereringen av den genetiske koden for å bevare den riktige aminosyresekvensen (EU-nummerering). Den reverse primeren adderer et EcoRI-kloningssete etter stoppkodonet for Fc. Det ble utført en 25 μl PCR-reaksjon med 25 pmol av hver av primerne ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikanten standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat og ved å bruke de følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 58 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 45 sekunder) og 72 ºC i 10 minutter. Et bånd med den forventede størrelsen (�696 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og klonet inn i pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI), noe som ga et intermediært plasmid pSYN-Fc-001 (pGEM T-Easy/Fc).
Muse Ig к-signalsekvensen ble tilføyd Fc CDS ved å bruke følgende primere: rc-Ig к sig seq-F: 5'-TTTAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCC TGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACAAAACT CACACATGCCCACCG-3' (SEKV.ID. NR. 86)
Fc-noXma-GS-R: 5'-GGTCAGCTCATCGCGGGATGGG-3' (SEKV.ID. NR. 87)
Fc-noXma-GS-F: 5'-CCCATCCCGCGATGAGCTGACC-3' (SEKV.ID. NR. 88)
rc-Ig к-signalsekvens-F-primeren adderer et HindIII-restriksjonssete til 5'-enden av molekylet fulgt av en Kozaksekvens (GCCGCCACC) (SEKV.ID. NR. 89) fulgt av signalsekvensen fra muse Ig к-lettkjeden, direkte satt inntil begynnelsen av Fcsekvensen (EU nr. 221). Fc-noXma-GS-F- og -R-primerne fjerner det indre XmaI-setet fra den Fc-kodende sekvensen ved å bruke degenereringen av den genetiske koden for å bevare den riktige aminosyresekvensen. Det ble utført to 25 μl PCR-reaksjoner med 25 pmol av enten rc-Ig к-signalsekvensen-F og Fc-noXma-GS-R eller Fc-noXma-GS-F og rcFc-R ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat. Den første reaksjonen ble utført med 500 ng leukocytt cDNA-bibliotek (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) som en templat og ved å bruke følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 30 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 55 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 45 sekunder) og 72 ºC i 10 minutter. Den andre reaksjonen ble utført med 500 ng pSYN-Fc-001 som templat (se ovenfor) ved å bruke følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 16 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 58 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 45 sekunder) og 72 ºC i 10 minutter. Båndet med de forventede størrelsene ( �495 og 299 bp henholdsvis) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og så kombinert i en PCR-reaksjon med 25 pmol av rc-Ig к-signalsekvens-F og rcFc-R-primere og kjørt som tidligere, med hybridisering ved 58 ºC og fortsettelse i 16 sykluser. Et bånd med den forventede størrelsen (�772 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og klonet inn i pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI), noe som ga et intermediært plasmid pSYN-Fc-007 (pGEM T-Easy/Ig к sig seq-Fc). Hele Ig к-signalsekvens-Fc-kasetten ble så subklonet ved å bruke HindIII- og EcoRI-setene enten inn i pEE6.4 (Lonza, Slough, UK) eller pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) pattedyrekspresjonsvektor, avhengig av hvilket system som skal brukes, for å utvikle pSYN-Fc-009 (pEE6.4/Ig к sig seq-Fc) og pSYN-Fc-015 (pcDNA3/Ig к sig seq-Fc).
Eksempel 32: Kloning av Ig к-signalsekvens - Fc N297A-konstrukt for fremstilling av umerket Fc N297A alene
For å mutere Asn 297 (EU-nummerering) i nevnte Fc til en Ala-rest, ble følgende primere brukt:
N297A-F 5'-GAGCAGTACGCTAGCACGTACCG-3' (SEKV.ID. NR. 90)
N297A-4 5'-GGTACGTGCTAGCGTACTGCTCC-3' (SEKV.ID. NR. 91)
Det ble utført to PCR-reaksjoner med 25 pmol av enten rc-Ig к-signalsekvens-F og N297A-R eller N297A-F og rcFc-R ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat. Begge reaksjoner ble utført ved å bruke 500 ng av pSYN-Fc-007 som en templat og følgende sykluser: 94 ºC i 2 minutter; 16 sykluser med (94 ºC i 30 sekunder, 48 ºC i 30 sekunder, 72 ºC i 45 sekunder) og 72 ºC i 10 minutter. Båndet med de forventede størrelsene (�319 og 475 bp henholdsvis) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og så blandet i en PCR-reaksjon med 25 pmol av rc-Ig к-signalsekvens-F og rcFc-R-primere og kjørt som tidligere, med hybridisering ved 58 ºC og fortsettelse i 16 sykluser. Et bånd med den forventede størrelsen (�772 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og klonet inn i pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI), noe som ga et intermediært plasmid pSYN-Fc-008 (pGEM T-Easy/Ig к sig seq-Fc N297A). Hele Ig к-signalsekvens-Fc alene-kassetten ble så subklonet ved å bruke HindIII- og EcoRI-setene enten i pEE6.4 (Lonza, Slough, UK) eller pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) pattedyrekspresjonsvektorer, avhengig av det systemet som skal brukes, for å utvikle pSYN-Fc-010 (pEE6.4/Ig к sig seq-Fc N297A) og pSYN-Fc-016 (pGEM T Easy/Fc N297A).
De samme N297A-primerne ble også brukt med rcFc-F- og rcFc-R-primerne og pSYN-Fc-001 som templat i en PCR-reaksjon fulgt av subkloning som angitt ovenfor for å utvikle pSYN-Fc-002 (pGEM T Easy/Fc N297A).
Eksempel 33: Kloning av EpoFc og Fc inn i et enkelt plasmid for dobbeltgenvektorer for fremstilling av EpoFc villtype eller N297A monomerdimerhybrid, og ekspresjon.
Et alternativ til å transfektere EpoFc og Fc-konstruktene på separate plasmider er å klone de begge inn i et enkelt plasmid, også kalt en dobbeltgenvektor, slik det for eksempel brukes i Lonza Biologics (Slough, UK) -systemet. RsrII/EcoRI-fragmentet fra pSYN-Fc-002 ble subklonet inn i de tilsvarende setene i pEE12.4 (Lonza Biologics, Slough, UK) ved hjelp av standardmetoder for å utviklet pSYN-Fc-006 (pEE12.4/Fc N297A-fragment). pSYN-EPO-004-plasmidet ble brukt som en templat for en PCR-reaksjon som bruker Epo-F-primeren fra eksempel 25 og den følgende primeren:
EpoRsr-R: 5'-CTGACGGTCCGCCCAGGAGTTCCG GAGCTGGGCACGGTGGGCATG TGTGAGTTTTGTCGACCGCAGCGG-3' (SEKV.ID. NR. 91).
Det ble utført en PCR-reaksjon ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat som beskrevet tidligere med 16 sykluser og en hybridiseringstemperatur på 55 ºC. Et bånd med den forventede størrelsen (�689 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og klonet inn i pSYN-Fc-006 ved å bruke HindIII/RsrII-restriksjonssetene for å utvikle pSYN-EPO-005 (pEE12.4/EpoFc N297A). Dobbeltgenvektoren for EpoFc N297A monomer-dimerhybriden ble så konstruert ved å klone NotI/BamHI-fragmentet fra pSYN-Fc-010 inn i de tilsvarende setene i pSYN-EPO-005 for å utvikle pSYN-EPO-008 (pEE12.4-6.4/EpoFc N297A/Fc N297A).
Villtypekonstruktet ble også fremstilt ved å subklone villtype Fc-sekvensen fra pSYN-Fc-001 inn i pSYN-EPO-005 ved å bruke RsrII- og EcoRI-setene for å utvikle pSYN-EPO-006 (pEE12.4/EpoFc). Dobbeltgenvektoren for EpoFc monomer-dimerhybriden ble å konstruert ved å klone NotI/BamHI-fragmentet fra pSYN-Fc-009 inn i de tilsvarende setene i pSYN-EPO-006 for å utvikle pSYN-EPO-007 (pEE12.4-6.4/EpoFc/Fc).
Hvert plasmid ble transfektert inni CHOK1SV-celler og positive kloner ble identifisert og tilpasset en serumfri suspensjon slik det er angitt i Lonza Biologics Manual for standard operasjonsprosedyrer (Lonza Biologics, Slough, UK) og renset som angitt for de andre monomer-dimerkonstruktene.
Eksempel 34: Kloning av humane IFN βFc, IFN β-Fc N297A med åtte aminosyrelinkere og Ig к-Fc-6His-konstrukter
10 ng av et humant genomisk DNA-bibliotek fra Clontech (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) ble brukt som en templat for å isolere humant IFN β med sin naturlige signalsekvens ved å bruke de følgende primere:
IFN β-F H3/SbfI:
5'-CTAGCCTGCAGGAAGCTTGCCGCCACCATGACCA ACAAGTGTCTCCTC-3' (SEKV.ID. NR. 92)
IFN β-R (EFAG)Sal:
5'TTTGTCGACCGCAGCGGCGCCGGCGAACTCGTTTCGG AGGTAACCTGTAAG-3' (SEKV.ID. NR. 93)
Den reverse primeren ble også brukt for å skape en åtte aminosyrelinkersekvens (EFAGAAAV) (SEKV.ID. NR. 94) på 3'-enden av den humane IFN β-sekvensen. PCR-reaksjonen ble utført ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et Rapid Cycler termosykliseringsapparat (Idaho Technology, Salt Lake City, UT). Et PCR-produkt med den riktige størrelsen (�607 bp) ble gelrenset ved å bruke et gelekstraksjonssett (Qiagen; Valencia, CA), klonet inn i TA-kloningsvektoren (Promega, Madison, WI) og så sekvensert. Dette konstruktet ble betegnet pSYN-IFN β-002. pSYN-IFN β-002 ble kuttet med SbfI og SalI og klonet inn i pSP72 (Promega) og PstI- og SalI-setene, noe som ga pSYN-IFN β-005.
Renset pSYN-Fc-001 (0,6 μg) ble kuttet med SalI og EcoRI og klonet inn i de tilsvarende setene i pSYN-IFN β-005 for å skape plasmidet pSYN-IFN β-006 som inneholder humant IFN β forbundet med humant Fc gjennom en åtte aminosyrelinkersekvens. pSYN-IFN β-006 ble så kuttet med SbfI og EcoRI og fullengde IFN β-Fc-sekvensen ble så klonet inn i PstI- og EcoRI-setene i pEDdc.sig for å skape plasmidet pSYN-IFN β-008.
pSYN-Fc-002 som inneholder det humane Fc DNA med en enkelt aminosyreforandring fra asparagin til alanin i posisjon 297 (N297A: EU-nummerering) ble kuttet med BspEI og XmaI for å isolere et DNA-fragment på �365 bp som inneholder N297A-mutasjonen. Dette DNA-fragmentet ble klonet inn i de tilsvarende setene i pSYN-IFN β-008 for å skape plasmidet pSYN-IFN β-009 som inneholder IFN β-Fc-sekvensen med en åtte aminosyrelinker og en N297A-mutasjon i Fc i ekspresjonsvektoren pED.dC.
Kloning av Ig к-signalsekvens-Fc N297A-6His. De følgende primere ble brukt for å addere en 6xHis-tag til C-terminus i den Fc N297A-kodende sekvensen:
Fc GS-F: 5'-GGCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCC-3' (SEKV.ID. NR. 95)
Fc.6His-R: 5'-TCAGTGGTGATGGTGATGATGTTTACCCGGAGACAGGGAG-3' (SEKV.ID. NR. 96)
Fc.6His-F: 5'-GGTAAACATCATCACCATCACCACTGAGAATTCC AATATCACTAGTGAATTCG-3' (SEKV.ID. NR. 97)
Sp6+T-R: 5'-GCTATTTAGGTGACACTATAGAATACTCAAGC-3' (SEKV.ID. NR. 98)
Det ble utført to PCR-reaksjoner med 50 pmol av enten Fc GS-F og Fc.6His-R eller Fc.6His-F og Sp6+T-R ved å bruke Expand High Fidelity-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å følge fabrikantens standardprotokoll i et MJ termosykliseringsapparat. Begge reaksjonene ble utført ved å bruke 500 ng pSYN-Fc-008 som en templat i en 50 μl reaksjonsblanding ved å bruke de standardbetingelser som er beskrevet tidligere med hensyn til sykluser og temperaturer. Bånd med de forventede størrelser (�780 og 138 bp henholdsvis) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og så blandet i en 50 μl PCR-reaksjonsblanding med 50 pmol av Fc GS-F og Sp6+T-R-primere og kjørt som tidligere ved å bruke standardbetingelser som beskrevet tidligere. Båndet med den forventede størrelsen (�891 bp) ble gelrenset med et gelekstraksjonssett (Qiagen, Valencia, CA) og klonet inn i pcDNA6 V5-His B ved å bruke HindIII- og EcoRI-setene for å utviklet pSYN-Fc-014 (pcDNA6/Ig к sig seq-Fc N297A-6 His).
Eksempel 35: Ekspresjon og rensing av IFN βFc, IFN β-Fc N297A-homodimer og IFN β-Fc N297 A monomer-dimerhybrid
CHO DG44-celler ble utplatet i 100 mm vevskulturskåler og dyrket til en sammenflytning på 50%-60%. Totalt 10 μg DNA ble brukt for å transfektere en enkelt 100 mm skål. For homodimertransfeksjonen ble det brukt 10 μg av pSYN-FN β-008- eller pSYN-IFN β-009-konstruktet; for monomerdimerhybridtransfeksjonen 8 μg av pSYN-IFN β-009 2 μg av pSYN-Fc-014-konstruktet. Cellene ble transfektert ved å bruke Superfect transfeksjonsreagenser (Qiagen, Valencia, CA) ved å følge fabrikantens instruksjoner. 48 til 72 timer etter transfeksjon ble vekstmediet fjernet og cellene ble frigjort fra platene med 0,25% trypsin og overført til T72 vevskulturkolber i seleksjonsmedium (MEM alfa uten nukleosider pluss 5% dialysert storfefosterserum). Seleksjonsmediet for monomerdimerhybridtransfeksjonen ble supplert med 5 μg/ml blasticidin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Seleksjonen ble fortsatt i 10-14 dager inntil cellene begynte å vokse så godt at det var etablert stabile cellelinjer. Proteinekspresjonen ble deretter amplifisert ved å tilsette metotreksat i en mengde som varierte fra 10 til 50 nM.
For alle cellelinjene ble omtrent 2 x 10<7>celler brukt for å inokulere 300 ml vekstmedium i en 1700 cm<2>valseflaske (Corning, Corning, NY). Flaskene ble innkubert i en 5% CO2-atmosfære ved 37 ºC i omtrent 72 timer. Vekstmediet ble så byttet ut med 300 ml serumfritt produksjonsmedium (DMEM/F12 med 5 μg/ml av humant insulin). Produksjonsmediet (kondisjonert medium) ble oppsamlet hver dag i 10 dager og lagret ved 4 ºC. Friskt produksjonsmedium ble tilsatt rulleflaskene etter hver oppsamling og flaskene ble så igjen plassert i inkubatoren. Før kromatografi ble mediet renset ved å bruke en SuporCap-100 (0,8/0,2 μm) filter fra Pall Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). Alle de følgende trinnene ble utført ved 4 ºC. Det rensede mediet ble påsatt en protein A sefarosekolonne, vasket med 5 kolonnevolumer av 1X PBS (10 mM fosfat, pH 7,4, 2,7 mM KCl og 137 mM NaCl) eluert med 0,1 M glysin, pH 2,7 og så nøytralisert med et 1/10 volum av 1 M Tris-HCl pH 8,5 og 5 M NaCl. Homodimerproteinene ble ytterligere renset på en Superdex 200 Prep Grade-kolonne som ble kjørt og eluert med 50 mM natriumfosfat pH 7,5, 500 mM NaCl og 10% glyserol.
Monomer-dimerhybridproteinet ble underkastet ytterligere rensing ettersom det inneholdt en blanding av IFN βFc N297A:IFN βFc N297A-homodimer, IFN βFc N297A:Fc N297A His monomer-dimerhybrid og Fc N297A His: Fc N297A Hishomodimer. Blandingen ble påsatt en nikkelgelaterende kolonne i 50 mM natriumfosfat pH 7,5, 500 mM NaCl. Etter påsetting ble kolonnen vasket med 50 mM imidazol i 50 mM natriumfosfat pH 7,5, 500 mM NaCl og proteinet ble eluert med en gradient fra 50 til 500 mM imidazol i 50 mM natriumfosfat pH 7,5, 500 mM NaCl. Fraksjoner som tilsvarte elueringstoppene på en UV-detektor ble oppsamlet og analysert ved SDS-PAGE. Fraksjonene fra den første toppen inneholdt IFN βFc N297A:Fc N297A His monomer-dimerhybrid, mens den andre toppen inneholdt Fc N297A His:Fc N297A His homodimer. Alle de fraksjoner som inneholdt monomerdimerhybriden men ingen Fc-homodimer, ble slått sammen og direkte påsatt en Superdex 200 Prep Grade-kolonne som så ble kjørt og eluert med 50 mM natriumfosfat pH 7,5, 500 mM NaCl, 10% glyserol. De fraksjoner som inneholdt IFN β-Fc N297A:Fc N297A His monomer-dimerhybridene ble slått sammen og lagret ved -80 ºC.
Eksempel 36: Antiviral prøve for IFN β-aktivitet
Antiviral aktivitet (IU/ml) for IFN β-fusjonsproteiner ble bestemt ved å bruke en CPE (cytopatisk effektiv) prøve. A549-celler ble utplatet i en 96 brønners vevskulturplate i vekstmedium (RPMI 1640 supplert med 10% storfefosterserum (FBS) og 2 mM L-glutamin) i 2 timer ved 37 ºC, 5% CO2. IFN β-standarder og IFN β-fusjonsproteiner ble fortynnet i vekstmedium og tilsatt cellene i tre paralleller i 20 timer ved 37 ºC, 5% CO2. Etter innkubering ble alt medium fjernet fra brønnene, encefalomyokardittvirus (EMCV) fortynnet i vekstmedium ble tilsatt (3000 pfu/brønn) til hver brønn med unntak av kontrollbrønnene. Platene ble så innkubert ved 37 ºC, 5% CO2i 28 timer. Levende celler ble fiksert med 10% kald trikloreddiksyre (TCA) og deretter farget med sulforodamin B (SRB) ifølge publiserte protokoller (Rubinstein et al. 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82, 1113). SRB-fargestoffet ble gjort løselig med 10 mM Tris pH 10,5 og resultatet ble avlest på et spektrofotometer ved 490 nm. Prøvene ble analysert ved å sammenligne aktivitetene med en kjent standardkurve som varierte fra 10 til 0,199 IU/ml. Resultatene er angitt i den etterfølgende tabell 8 og viser økt antiviral aktivitet for monomerdimerhybrider.
TABELL 8: INTERFERON BETA ANTIVIRAL PRØVE HOMODIMER
VERSUS MONOMER-DIMERHYBRID
Eksempel 37: Administrering av IFN βFc-homodimer og monomer-dimerhybrid med en åtte aminosyrelinker til cynomolgusaper
For lungeadministrering ble det fremstilt aerosoler av enten IFN βFc-homodimer eller IFN βFc N297A monomer-dimerhybridproteiner (begge med 8 aminosyrelinkeren) i PBS, pH 7,4, 0,25% HSA, med Aeroneb Pro<TM>(AeroGen, Mountain View, CA) nebulisator, in-line med en Bird Mark 7A-respirator, og administrert bedøvde naturlige cynomolgusaper gjennom endotrakeale rør (omtrentlig normal åndedrettspust). Det ble tatt blodprøver på forskjellige tidspunkter og mengden av IFN β-holdig protein i det resulterende serumet ble kvantifisert ved å bruke en human IFN β-immunoprøve (Biosource International, Camarillo, CA). De farmakokinetiske parameterne ble beregnet ved å bruke dataprogrammet WinNonLin. Tabell 9 viser resultatene for cynomolgusaper behandlet med IFN βFc N297A monomer-dimerhybrid eller IFN βFc-homodimer.
TABELL 9: ADMINISTRERING AV IFN βFC N297A MONOMER-DIMERHYBRID OG IFN βFC-HOMODIMER TIL APER
<1>Basert p 15% avsetningsfraksjon av forstøvet dose slik dette var bestemt ved gammascintigrafi
Farmakokinetiske data for IFN βFc med en 8 aminosyrelinker administrert til cynomolgusaper er vist på figur 15. Figuren sammenligner IFN βFc-homodimeren med IFN βFc N298A monomer-dimerhybriden i aper etter administrering av en enkel lungedose. Det ble oppnådd signifikant høyere serumnivåer i aper behandlet med monomer-dimerhybriden sammenlignet med homodimeren.
Serumprøver ble også analysert for neopterinnivåer (en biomarkør for IFN βaktivitet) ved å bruke neopterin immunoprøve (MP Biomedicals, Orangeburg, NY). Resultatene for denne analysen er vist på figur 16. Figuren sammenligner neopterinstimulering som en respons på IFN β-Fc-homodimeren og IFN β-Fc N297A monomer-dimerhybriden. Det fremgår at signifikant høyere neopterinnivåer ble påvist i aper behandlet med IFN β-Fc N297A monomer-dimerhybriden sammenlignet med IFN β-Fc-homodimeren.
Alle tall som angir kvantiteter med hensyn til ingredienser, reaksjonsbetingelser og så videre i den foreliggende beskrivelsen og de etterfølgende kravene er å forstå slik at de i alle tilfeller er modifisert med begrepet "omkring". Hvis det ikke spesifikt er angitt å være et unntak, så er følgelig de numeriske parameterne som er angitt i beskrivelsen og de etterfølgende kravene tilnærminger som kan variere avhengig av de forønskede egenskaper man ønsker å oppnå ved hjelp av den foreliggende oppfinnelsen. Og helt til slutt og ikke som et forsøk på å begrense anvendelsen av den doktrine med hensyn til ekvivalenter som er brukt i de etterfølgende kravene, så må hver numeriske parameter ses på bakgrunn av antallet signifikante tall og ordinære avrundingsmetoder.
Det er underforstått at beskrivelsen og eksemplene utelukkende må anses som eksempler, slik at oppfinnelsens virkelige omfang og intensjon fremgår av de etterfølgende krav.

Claims (19)

PATENTKRAV
1. Kimært protein omfattende et biologisk aktivt molekyl og to immunoglobulinkonstant områder eller deler derav, som er en Fc neonatal reseptor (FcRn) bindingspartner, hvor det kimære proteinet omfatter en første polypeptidkjede og en andre polypeptidkjede,
hvor nevnte første kjede omfatter en immunoglobelin konstant region eller del derav som er en FcRn bindingspartner
og hvor nevnte andre kjede består av et immunoglobulinkonstant område eller en del derav som er en FcRn bindende partner og valgfritt et molekyl med en molekylærvekt ikke større enn 2 kD,
hvori det biologiske aktive molekylet er bundet av en linker til ethvert av nevnte første og nevnte andre kjede,
og hvori det biologisk aktive molekylet er et protein selektert fra gruppen bestående av et cytokin, et hormon og en koaguleringsfaktor.
2. Kimært protein ifølge krav 1, hvori det immunoglobulinkonstant områder eller deler derav, er et Fc fragment.
3. Kimært protein ifølge krav 1 eller krav 2, hvor det immunoglobulinkonstante området er IgG1 eller IgG2 konstante områder.
4. Kimært protein ifølge et hvert av kravene 1 til 3, hvor det biologisk aktive molekylet er en koaguleringsfaktor.
5. Kimært protein ifølge krav 4, hvor koaguleringsfaktoren er valgt fra gruppen bestående av faktor VII, faktor Vlla, faktor VIII, faktor V, faktor IX, faktor X, faktor XI, faktor XII, faktor XIII, fibrinogen, protrombin, og von Willebrand faktor.
6. Kimært protein ifølge krav 5, hvor koaguleringsfaktoren er faktor IX.
7. Kimært protein ifølge krav 5, hvor koaguleringsfaktoren er faktor VIII.
8. Kimært protein ifølge krav 5, hvor koaguleringsfaktoren er faktor VI1 eller VI1a.
9. Kimært protein ifølge ethvert av kravene 1 til 3, hvor det biologisk aktive molekylet er et hormon.
10. Kimært protein ifølge krav 9, hvor hormonet er erytropoietin (EPO).
11. Kimært protein ifølge et hvert av kravene 1 til 3, hvor det biologisk aktive molekylet er et cytokin.
12. Kimært protein ifølge krav 11, hvor cytokinet er interferon� α eller interferon β.
13. Kimært protein ifølge ethvert av kravene 1 til 3, hvor linkeren er polyetylene glykol (PEG).
14. Kimært protein ifølge ethvert av kravene 1 til 3, hvor linkeren omfatter aminosyrer.
15. En farmasøytisk omfattende det kimære proteinet ifølge ethvert av kravene 1-14 og en farmasøytisk akseptabel eksipient.
16. Kimært protein ifølge ethvert av kravene 1 til 14 for anvendelse i behandling eller forebygging av en sykdom eller tilstand.
17. Kimært protein ifølge ethvert av kravene 4 til 8 for anvendelse i behandling av et subjekt som har en hemostatisk forstyrrelse.
18. Kimært protein ifølge kravene 11 eller 12 for anvendelse i behandling av en viral infeksjon.
19. Kimært protein for anvendelse ifølge ethvert av kravene 16-18, hvori det kimære proteinet blir administrert intravenøst, intramuskulært, subkutant, oralt, bukalt, sublikalt, nasalt, parenteralt, rektalt, vaginalt, via en mukosal overflate, via en aerosol, eller via en pulmonær rute.
NO20160483A 2003-05-06 2016-03-22 Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider NO342384B1 (no)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46960003P 2003-05-06 2003-05-06
US48796403P 2003-07-17 2003-07-17
US53920704P 2004-01-26 2004-01-26
PCT/US2004/014064 WO2005001025A2 (en) 2003-05-06 2004-05-06 Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20160483A1 NO20160483A1 (no) 2006-01-04
NO342384B1 true NO342384B1 (no) 2018-05-14

Family

ID=33458764

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20055773A NO339539B1 (no) 2003-05-06 2005-12-06 Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider for anvendelse i en metode for terapi, samt polynukleotid, og fremgangsmåter for fremstillelse
NO20160483A NO342384B1 (no) 2003-05-06 2016-03-22 Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider
NO2017027C NO2017027I2 (no) 2003-05-06 2017-06-23 efmoroctocog alfa eller et biotilsvarende legemiddel ihht Artikkel 10(4) av Directive 2001/83/EC, som beskyttet av basispatentet.
NO2017028C NO2017028I2 (no) 2003-05-06 2017-06-23 eftrenonacog alfa eller et biotilsvarende legemiddel ihht Artikkel 10(4) av Directive 2001/83/EC, som beskyttet av basispatentet.
NO2020016C NO2020016I1 (no) 2003-05-06 2020-06-12 efmoroktokog alfa - forlenget SPC

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20055773A NO339539B1 (no) 2003-05-06 2005-12-06 Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider for anvendelse i en metode for terapi, samt polynukleotid, og fremgangsmåter for fremstillelse

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO2017027C NO2017027I2 (no) 2003-05-06 2017-06-23 efmoroctocog alfa eller et biotilsvarende legemiddel ihht Artikkel 10(4) av Directive 2001/83/EC, som beskyttet av basispatentet.
NO2017028C NO2017028I2 (no) 2003-05-06 2017-06-23 eftrenonacog alfa eller et biotilsvarende legemiddel ihht Artikkel 10(4) av Directive 2001/83/EC, som beskyttet av basispatentet.
NO2020016C NO2020016I1 (no) 2003-05-06 2020-06-12 efmoroktokog alfa - forlenget SPC

Country Status (28)

Country Link
US (13) US7404956B2 (no)
EP (7) EP3978508A1 (no)
JP (6) JP5091480B2 (no)
CN (3) CN102234334B (no)
AT (1) ATE446307T1 (no)
AU (1) AU2004252422B2 (no)
BE (1) BE2016C015I2 (no)
BR (2) BR122019011535B1 (no)
CA (1) CA2522590C (no)
CY (4) CY1114639T1 (no)
DE (1) DE602004023724D1 (no)
DK (4) DK2174946T3 (no)
EA (1) EA012566B1 (no)
ES (3) ES2431116T3 (no)
FR (1) FR16C0011I2 (no)
HK (2) HK1161604A1 (no)
HU (4) HUE031663T2 (no)
IL (2) IL171779A (no)
LT (2) LTC1625209I2 (no)
LU (1) LU92991I2 (no)
NL (1) NL300799I2 (no)
NO (5) NO339539B1 (no)
PL (3) PL2357196T3 (no)
PT (3) PT2361932T (no)
SI (4) SI1625209T1 (no)
TW (1) TWI353991B (no)
UA (1) UA95436C2 (no)
WO (2) WO2004101739A2 (no)

Families Citing this family (382)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5992710A (ja) * 1982-11-16 1984-05-29 関西電力株式会社 直接水冷線路の立坑部の布設方法
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8093357B2 (en) 2002-03-01 2012-01-10 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES2558102T3 (es) * 2003-05-06 2016-02-02 Biogen Hemophilia Inc. Proteínas quiméricas del factor de coagulación para el tratamiento de un trastorno hemostático
CA2522690A1 (en) * 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US8007805B2 (en) 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
US7736653B2 (en) 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin Fc region as a carrier
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US20150010550A1 (en) 2004-07-15 2015-01-08 Xencor, Inc. OPTIMIZED Fc VARIANTS
US20080176790A1 (en) 2004-10-29 2008-07-24 Defrees Shawn Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf)
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
CA2587617C (en) 2004-11-12 2011-02-01 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
MX2007008229A (es) 2005-01-10 2007-09-11 Neose Technologies Inc Factor estimulador de colonias de granulocitos glicopegilado.
US9187546B2 (en) 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US7833979B2 (en) * 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
JP2008545409A (ja) * 2005-05-26 2008-12-18 シェーリング コーポレイション インターフェロン−ＩｇＧ融合体
JP5335422B2 (ja) 2005-06-17 2013-11-06 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
RS57549B1 (sr) 2005-08-26 2018-10-31 Ares Trading Sa Proces za pripremu glikoziliranog interferona beta
DK1931709T3 (en) 2005-10-03 2017-03-13 Xencor Inc FC VARIETIES WITH OPTIMIZED FC RECEPTOR BINDING PROPERTIES
EP1951757B1 (en) 2005-10-06 2014-05-14 Xencor, Inc. Optimized anti-cd30 antibodies
US8153598B2 (en) * 2005-10-19 2012-04-10 Intrexon Corporation PKD ligands and polynucleotides encoding PKD ligands
JP5368798B2 (ja) * 2005-10-31 2013-12-18 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 癌を診断し処置するための組成物および方法
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
CA2625978A1 (en) 2005-12-09 2007-06-14 Ares Trading S.A. Method for purifying fsh or a fsh mutant
US7625564B2 (en) * 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
TW200745163A (en) * 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
EP2650305B1 (en) 2006-03-24 2024-05-08 Bioverativ Therapeutics Inc. PC5 as a factor IX propeptide processing enzyme
DE602007007923D1 (de) * 2006-04-11 2010-09-02 Csl Behring Gmbh Verfahren zur erhöhung der in-vivo-gewinnung therapeutischer polypeptide
RU2008145084A (ru) 2006-05-24 2010-06-27 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг (Ch) Аналоги фактора ix, имеющие пролонгированное время полужизни in vivo
ES2889920T3 (es) * 2006-06-14 2022-01-14 Csl Behring Gmbh Proteínas de fusión escindibles proteolíticamente con alta actividad específica molar
EP1867660A1 (en) * 2006-06-14 2007-12-19 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
AU2013202566C1 (en) * 2006-06-14 2018-07-12 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
US20100021379A1 (en) * 2006-06-29 2010-01-28 The Regents Of The University Of California Chemical Antibodies for Immunotherapy and Imaging
EP2049144B8 (en) 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
GB0614780D0 (en) * 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
US8524867B2 (en) 2006-08-14 2013-09-03 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target CD19
KR101105610B1 (ko) * 2006-08-17 2012-01-18 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｃｃｒ５ 에 대한 항체 및 항푸소제닉 펩타이드의 컨쥬게이트
TW200817438A (en) 2006-08-17 2008-04-16 Hoffmann La Roche A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide
WO2008051326A2 (en) * 2006-08-21 2008-05-02 President And Fellows Of Harvard College Identification of contactins and l1- cams as ligands for the amyloid precursor protein
CN101541825B (zh) * 2006-08-28 2013-08-14 阿雷斯贸易股份有限公司 Fc融合蛋白的纯化方法
PL2061803T5 (pl) * 2006-08-28 2023-03-27 Ares Trading S.A. Proces oczyszczania białek zawierających fc
CA2660795C (en) 2006-09-18 2014-11-18 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target hm1.24
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
US7820623B2 (en) * 2006-10-25 2010-10-26 Amgen Inc. Conjugated toxin peptide therapeutic agents
KR20090105913A (ko) * 2006-11-02 2009-10-07 다니엘 제이 카폰 이동 부분을 갖는 하이브리드 면역글로불린
EP3231440A1 (en) 2006-12-22 2017-10-18 CSL Behring GmbH Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
WO2008098720A1 (en) 2007-02-12 2008-08-21 Csl Behring Gmbh Therapeutic application of kazal-type serine protease inhibitors
JP2010523582A (ja) 2007-04-03 2010-07-15 バイオジェネリクス アクチェンゲゼルシャフト グリコｐｅｇ化ｇ−ｃｓｆを用いた治療方法
JP5591691B2 (ja) * 2007-05-22 2014-09-17 アムジエン・インコーポレーテツド 生物活性を有する融合タンパク質を作製するための組成物及び方法
MX2009013259A (es) 2007-06-12 2010-01-25 Novo Nordisk As Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos.
CL2008002092A1 (es) * 2007-07-20 2009-05-29 Hoffmann La Roche Conjugado que contiene dos o mas peptidos antifusogenicos y un anticuerpo anti-cd-4; metodo de produccion; composicion farmaceutica que lo comprende; polipeptidos antifusogenicos y uso del conjugado para tratar infecciones viricas.
TWI554520B (zh) * 2007-07-20 2016-10-21 諾華健控股公司 在活體中具有延長之半生期以及提高之紅血球生成活性的重組人類紅血球生成素（ｅｐｏ）-ｆｃ融合蛋白
CA2720628A1 (en) 2007-07-26 2009-01-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region
AU2008284047A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
CA2701032C (en) 2007-09-27 2021-01-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP2205258B1 (en) * 2007-09-28 2017-05-24 Janssen Biotech, Inc. Methods and structural conformations of antibody preparations with increased resistance to proteases
WO2009053368A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Single ifn-beta fused to a mutated igg fc fragment
CA2701221A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying an fc-containing protein
JP2011500756A (ja) * 2007-10-22 2011-01-06 メルク セローノ ソシエテ アノニム Ｆｃ融合タンパク質を精製する方法
CA2702289A1 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds exhibiting glucagon antagonist and glp-1 agonist activity
EP2219602A1 (en) 2007-11-15 2010-08-25 Amgen, Inc Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
EP2235059B1 (en) 2007-12-26 2015-02-18 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
KR101749310B1 (ko) * 2008-01-24 2017-06-21 에스퍼란스 파마슈티컬스, 인코포레이티드 용해 도메인 융합 구성물 및 이를 제조하고 사용하는 방법
ES2500066T3 (es) 2008-01-25 2014-09-30 Amgen, Inc Anticuerpos frente a ferroportina y métodos de uso
CN103497247A (zh) 2008-02-27 2014-01-08 诺沃—诺迪斯克有限公司 缀合的因子viii分子
WO2009139822A1 (en) 2008-05-01 2009-11-19 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
CN103641907A (zh) 2008-06-17 2014-03-19 印第安纳大学研究及科技有限公司 胰高血糖素/glp-1受体共激动剂
JP5753779B2 (ja) 2008-06-17 2015-07-22 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 生理学的ｐＨの緩衝液中で向上した溶解性及び安定性を示すグルカゴン類縁体
EP2300035B1 (en) 2008-06-17 2015-08-12 Indiana University Research and Technology Corporation Gip-based mixed agonists for treatment of metabolic disorders and obesity
EP2291523B1 (en) 2008-06-24 2014-12-17 CSL Behring GmbH Factor viii, von willebrand factor or complexes thereof with prolonged in vivo half-life
WO2010014909A1 (en) * 2008-08-01 2010-02-04 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
US8551789B2 (en) 2010-04-01 2013-10-08 OncoMed Pharmaceuticals Frizzled-binding agents and their use in screening for WNT inhibitors
CA2738485A1 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Frizzled-binding agents and uses thereof
EP2365979A2 (en) * 2008-10-22 2011-09-21 Biogen Idec MA Inc. Recombinant fcrn and variants thereof for purification of fc-containing fusion proteins
AU2009313902B9 (en) 2008-11-13 2014-03-27 The General Hospital Corporation Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of BMP-6
JP5730211B2 (ja) 2008-11-20 2015-06-03 バイオジェン アイデック エムエー インコーポレイティドＢｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ． ウイルスのアルギニン不活化
CA2744558A1 (en) 2008-12-19 2010-07-15 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
WO2010111414A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 Bayer Healthcare Llc Factor viii variants and methods of use
WO2010111617A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Van Andel Research Institute Parathyroid hormone peptides and parathyroid hormone-related protein peptides and methods of use
KR101431318B1 (ko) 2009-04-02 2014-08-20 로슈 글리카트 아게 전장 항체 및 단일쇄 ｆａｂ 단편을 포함하는 다중특이성 항체
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
CA2759333A1 (en) * 2009-04-22 2010-10-28 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
PE20120914A1 (es) 2009-06-16 2012-08-22 Univ Indiana Res & Tech Corp Compuestos glucagon activo de receptor de gip
AU2010290131C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Amunix Operating Inc. Coagulation factor VII compositions and methods of making and using same
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
SG10201408401RA (en) 2009-09-16 2015-01-29 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
CA2778105C (en) 2009-10-23 2019-04-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
CN102648212B (zh) 2009-11-13 2014-12-03 基立福疗法公司 包含冯维勒布兰德因子(vWF)的制剂及其相关制备方法、试剂盒和用途
CA2782424C (en) 2009-12-06 2021-07-27 Biogen Idec Hemophilia Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
WO2011075393A2 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
MX2012008603A (es) 2010-01-27 2013-01-25 Univ Indiana Res & Tech Corp Conjugados de antagonista de glucagon-agonista de gip y composiciones para el tratamiento de desordenes metabolicos y obesidad.
DK2547359T3 (en) 2010-03-15 2016-06-06 The Board Of Trustees Of The Univ Of Illionis Inhibitors of beta integrin G-protein alpha subunit-BINDING INTERACTIONS
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
EP2371857A1 (en) 2010-04-01 2011-10-05 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for treating interstitial lung disease
BR112012028704A2 (pt) 2010-05-13 2019-09-24 Univ Indiana Res & Tech Corp composto de glugagon da superfamília de peptídeos exibindo atividade do receptor com hormônio nuclear, pró fármaco, dímero ou multímero, composição farmacêutica que o compreendem e método de administração do mesmo.
EA024052B1 (ru) 2010-06-07 2016-08-31 Эмджен Инк. Устройство для доставки лекарственного средства
CA2802485C (en) 2010-06-16 2019-09-17 Indiana University Research And Technology Corporation Single chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor
KR20130102470A (ko) 2010-06-24 2013-09-17 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 아미드계 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드 프로드러그
CA2803164C (en) 2010-06-24 2018-08-21 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
PT2591006T (pt) * 2010-07-09 2019-07-29 Bioverativ Therapeutics Inc Moléculas de cadeia simples processáveis e polipéptidos preparados utilizando as mesmas
CN103140237A (zh) 2010-07-09 2013-06-05 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 因子ix多肽及其使用方法
EP3508573A1 (en) 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
JP5758004B2 (ja) 2010-08-24 2015-08-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ジスルフィドによって安定化されたＦｖ断片を含む二重特異性抗体
DE19177059T1 (de) 2010-10-01 2021-10-07 Modernatx, Inc. N1-methyl-pseudouracile enthältendes ribonucleinsäuren sowie ihre verwendungen
US9029502B2 (en) 2010-12-20 2015-05-12 The Regents Of The University Of Michigan Inhibitors of the epidermal growth factor receptor-heat shock protein 90 binding interaction
MX2013006304A (es) 2010-12-22 2013-07-02 Univ Indiana Res & Tech Corp Analogos de glucagon que exhiben actividad del receptor gip.
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
WO2012097333A2 (en) 2011-01-14 2012-07-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged immunoglobulin polypeptides and method of use thereof
DK2673294T3 (en) * 2011-02-10 2016-05-30 Roche Glycart Ag MUTANT INTERLEUKIN-2 POLYPEPTIDES
RU2013141078A (ru) 2011-02-28 2015-04-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Одновалентные антигенсвязывающие белки
CN103502271B (zh) 2011-02-28 2016-10-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗原结合蛋白
CA2829037C (en) 2011-03-09 2022-05-17 Csl Behring Gmbh Factor xii inhibitors for the administration with medical procedures comprising contact with artificial surfaces
EP2497489A1 (en) 2011-03-09 2012-09-12 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for the treatment of silent brain ischemia and ischemia of other organs
WO2012135805A2 (en) 2011-03-31 2012-10-04 modeRNA Therapeutics Delivery and formulation of engineered nucleic acids
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
PT2699293T (pt) 2011-04-20 2019-05-21 Amgen Inc Aparelho de autoinjeção
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
RU2600067C2 (ru) 2011-05-06 2016-10-20 Дзе Гавермент Оф Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари Оф Дзе Депармент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Рекомбинантный иммунотоксин, нацеленный на мезотелин
PT2717898T (pt) 2011-06-10 2019-05-20 Bioverativ Therapeutics Inc Compostos pró-coagulantes e processos para a sua utilização
US9156902B2 (en) 2011-06-22 2015-10-13 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
PT3513804T (pt) 2011-07-08 2022-06-02 Bioverativ Therapeutics Inc Polipéptidos fator viii híbridos e quiméricos, e métodos de utilização dos mesmos
EP2734552A1 (en) 2011-07-22 2014-05-28 CSL Behring GmbH Inhibitory anti -factor xii/xiia monoclonal antibodies and their uses
EA028914B1 (ru) * 2011-07-25 2018-01-31 Байоджен Хемофилия Инк. Исследования для мониторинга нарушений свертываемости крови
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
LT3682905T (lt) 2011-10-03 2022-02-25 Modernatx, Inc. Modifikuoti nukleozidai, nukleotidai ir nukleorūgštys bei jų naudojimas
AR088267A1 (es) 2011-10-06 2014-05-21 Hanmi Science Co Ltd Derivados, de los factores de coagulacion sanguinea vii y viia, conjugados y complejos que comprenden a los mismos y sus usos
EA030868B1 (ru) 2011-10-14 2018-10-31 Эмджен Инк. Инжектор и способ его сборки
WO2013065343A1 (ja) * 2011-10-31 2013-05-10 株式会社 島津製作所 非ペプチドヒンジ部含有フレキシブル抗体様分子
KR20140097151A (ko) 2011-11-17 2014-08-06 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 글루코코르티코이드 수용체 활성을 나타내는 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드
PL2791160T3 (pl) 2011-12-16 2022-06-20 Modernatx, Inc. Kompozycje zmodyfikowanego mrna
US9573987B2 (en) 2011-12-20 2017-02-21 Indiana University Research And Technology Corporation CTP-based insulin analogs for treatment of diabetes
BR112014017165B1 (pt) 2012-01-12 2023-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica compreendendo uma proteína de fator viii, composição farmacêutica, e seus usos
CN108465106B (zh) 2012-01-12 2022-05-27 普吉特海湾血液中心 降低经受因子viii疗法的个体中针对因子viii的免疫原性的方法
EP2623110A1 (en) 2012-01-31 2013-08-07 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for the treatment of neurological inflammatory disorders
EP2812357B1 (en) 2012-02-10 2020-11-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Single-chain antibodies and other heteromultimers
ES2771208T3 (es) 2012-02-15 2020-07-06 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
EP2814502B1 (en) 2012-02-15 2017-09-13 CSL Behring GmbH Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity
DK2822577T3 (en) 2012-02-15 2019-04-01 Bioverativ Therapeutics Inc RECOMBINANT FACTOR VIII PROTEINS
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
DE18200782T1 (de) 2012-04-02 2021-10-21 Modernatx, Inc. Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
WO2013166297A2 (en) * 2012-05-03 2013-11-07 Medimmune, Llc Method for analyzing sample components
EP3693000B1 (en) 2012-06-08 2022-03-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Procoagulant compounds
US10202595B2 (en) 2012-06-08 2019-02-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
MX356000B (es) 2012-06-21 2018-05-08 Hoffmann La Roche Analogos de glucagon que exhiben actividad del receptor gip.
CA2877358A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting gip receptor activity
CN104582736A (zh) 2012-06-21 2015-04-29 印第安纳大学研究及科技有限公司 Fc效应子功能改变的肠降血糖素受体配体多肽Fc区融合多肽和缀合物
MX354862B (es) 2012-06-27 2018-03-23 Hoffmann La Roche Método para la producción de entidades dirigidas altamente selectivas hechas a la medida y biespecíficas que contienen dos entidades de unión diferentes.
CA2871882A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
US10023628B2 (en) 2012-07-06 2018-07-17 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor VIII polypeptides and uses thereof
CN104661674A (zh) 2012-07-11 2015-05-27 阿穆尼克斯运营公司 具有xten和血管性血友病因子蛋白的因子viii复合物、及其用途
EP2872170A4 (en) * 2012-07-13 2016-06-22 Zymeworks Inc BISPECIFIC ASYMMETRIC HETÉRODIMÈRES COMPRISING ANTI-CD3 RECOMBINANT PRODUCTS
WO2014018777A2 (en) 2012-07-25 2014-01-30 Biogen Idec Ma Inc. Blood factor monitoring assay and uses thereof
SG11201408536WA (en) 2012-08-02 2015-01-29 Hoffmann La Roche METHOD FOR PRODUCING SOLUBLE FcR AS Fc-FUSION WITH INERT IMMUNOGLOBULIN Fc-REGION AND USES THEREOF
EP3542861A1 (en) 2012-09-25 2019-09-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fix polypeptides
US10391152B2 (en) 2012-10-18 2019-08-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
EP2911691B1 (en) 2012-10-23 2018-10-10 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using wnt pathway-binding agents
EP3446700A1 (en) 2012-10-30 2019-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fviii polypeptide
JP2015535464A (ja) 2012-11-21 2015-12-14 アムジエン・インコーポレーテツド 薬剤送達装置
RS63237B1 (sr) 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx Inc Terminalno modifikovana rnk
US10717965B2 (en) 2013-01-10 2020-07-21 Gloriana Therapeutics, Inc. Mammalian cell culture-produced neublastin antibodies
CN105073195A (zh) 2013-02-04 2015-11-18 昂科梅德制药有限公司 使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法及对该治疗的监测
DK2956477T4 (da) 2013-02-15 2024-04-15 Bioverativ Therapeutics Inc Optimeret faktor viii-gen
CN105188750A (zh) 2013-03-08 2015-12-23 德国杰特贝林生物制品有限公司 治疗和预防远端缺血-再灌注损伤
WO2014139994A1 (en) 2013-03-11 2014-09-18 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormone compounds
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
JP6768501B2 (ja) 2013-03-15 2020-10-14 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入機、および自動注入機システム
BR112015022042B1 (pt) 2013-03-15 2023-01-10 Amgen Inc Injetor para injetar um produto terapêutico
ES2973257T3 (es) 2013-03-15 2024-06-19 Amgen Inc Casete de fármaco, autoinyector y sistema de autoinyector
EP4039281A1 (en) * 2013-03-15 2022-08-10 Biomolecular Holdings LLC Hybrid immunoglobulin containing non-peptidyl linkage
RS60003B1 (sr) 2013-03-15 2020-04-30 Bioverativ Therapeutics Inc Formulacije polipeptida faktora viii
TWI745671B (zh) 2013-03-15 2021-11-11 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｉｘ多肽調配物
ES2695166T3 (es) 2013-03-15 2019-01-02 Intrinsic Lifesciences Llc Anticuerpos antihepcidina y usos de los mismos
SG11201507878SA (en) 2013-03-22 2015-10-29 Amgen Inc Injector and method of assembly
DK2796145T3 (da) 2013-04-22 2018-01-29 Csl Ltd Et kovalent kompleks af von Willebrand-faktor og faktor VIII linket af en disulfidbro
KR20160026905A (ko) 2013-06-28 2016-03-09 체에스엘 베링 게엠베하 인자 ｘｉｉ 억제제 및 ｃ1-억제제를 이용한 병용 치료요법
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
EP3043813B1 (en) 2013-08-08 2021-01-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Purification of chimeric fviii molecules
WO2015023891A2 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
CN103599527A (zh) * 2013-08-16 2014-02-26 安源生物科技(上海)有限公司 包含改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白的药物组合物
CN103397009B (zh) * 2013-08-16 2015-06-03 安源生物科技(上海)有限公司 改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白及其制备方法与用途
US9388430B2 (en) * 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US10611794B2 (en) 2013-09-25 2020-04-07 Bioverativ Therapeutics Inc. On-column viral inactivation methods
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EA201690675A1 (ru) 2013-10-03 2016-08-31 Модерна Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды, кодирующие рецептор липопротеинов низкой плотности
JP6422956B2 (ja) 2013-10-11 2018-11-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性ドメイン交換共通可変軽鎖抗体
ES2744837T3 (es) 2013-10-24 2020-02-26 Amgen Inc Inyector y procedimiento de ensamblaje
JP7051293B2 (ja) 2013-10-24 2022-04-11 アムジエン・インコーポレーテツド 温度感知制御を伴う薬剤送達システム
US10584147B2 (en) 2013-11-08 2020-03-10 Biovertiv Therapeutics Inc. Procoagulant fusion compound
PL3068797T3 (pl) 2013-11-11 2020-06-29 Wake Forest University Health Sciences Konstrukty wielowalentnego celowania w nowotwory
US10947319B2 (en) 2013-11-27 2021-03-16 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting HER2
WO2015085276A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Biogen Idec Ma Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
EP3083933A1 (en) 2013-12-20 2016-10-26 Biogen MA Inc. Use of perfusion seed cultures to improve biopharmaceutical fed-batch production capacity and product quality
CN106029087A (zh) 2013-12-20 2016-10-12 印第安纳大学研究及科技有限公司 脂质化肠降血糖素受体配体人免疫球蛋白fc区融合多肽
DK3091997T5 (da) 2014-01-10 2024-10-14 Bioverativ Therapeutics Inc Kimære faktor viii-proteiner og anvendelser deraf
KR102382402B1 (ko) 2014-02-04 2022-04-01 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온 교환 크로마토그래피의 용도
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
PT3116486T (pt) * 2014-03-14 2020-03-12 Biomolecular Holdings Llc Imunoglobulina híbrida que contém uma ligação não peptídica
WO2015148444A1 (en) * 2014-03-24 2015-10-01 Biogen Ma Inc. Lyophilized factor ix formulations
SI3129406T1 (sl) * 2014-04-11 2019-04-30 Medimmune, Llc Konjugirane spojine, ki vsebujejo cisteinsko konstruirana protitelesa
BR112016025852B1 (pt) 2014-05-07 2022-11-01 Amgen Inc Dispositivo de injeção para aplicação de fármaco
KR102416904B1 (ko) 2014-06-03 2022-07-04 암겐 인코포레이티드 약물 전달 디바이스에 의해 수집된 데이터를 원격으로 프로세싱하기 위한 시스템들 및 방법들
WO2015193457A1 (en) 2014-06-18 2015-12-23 Csl Behring Gmbh Therapy using a factor xii inhibitor in a neurotraumatic disorder
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
DK3164150T3 (da) 2014-07-02 2021-02-08 CSL Behring Lengnau AG Modificeret von willebrand-faktor
AU2015321462B2 (en) 2014-09-22 2020-04-30 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
KR20170062490A (ko) 2014-09-26 2017-06-07 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 안정화된 아드레노메둘린 유도체 및 그의 용도
WO2016061220A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
CA2964317C (en) 2014-10-14 2021-10-05 Halozyme, Inc. Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
ES2739289T3 (es) * 2014-11-27 2020-01-30 Novo Nordisk As Derivados de GLP-1 y sus usos
CN107001482B (zh) 2014-12-03 2021-06-15 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3250609A4 (en) 2015-01-26 2018-07-11 The University of Chicago Il13ra alpha 2 binding agents and use thereof in cancer treatment
US20180170992A1 (en) 2015-01-26 2018-06-21 The University Of Chicago CAR T CELLS RECOGNIZING CANCER-SPECIFIC IL 13Ra2
SG10201907215QA (en) 2015-02-05 2019-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibodies Comprising An Ion Concentration Dependent Antigen-Binding Domain, Fc Region Variants, Il-8-Binding Antibodies, And Uses Therof
CA3069716C (en) 2015-02-17 2021-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
EP3274457A4 (en) 2015-03-26 2018-08-08 Acceleron Pharma Inc. Follistatin-related fusion proteins and uses thereof
DK3298036T3 (da) 2015-05-22 2022-06-07 CSL Behring Lengnau AG Fremgangsmåder til forberedelse af modificeret von Willebrand faktor
CA2986626A1 (en) 2015-05-22 2016-12-01 Csl Behring Recombinant Facility Ag Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
EP3303380B1 (en) 2015-06-02 2020-01-15 Novo Nordisk A/S Insulins with polar recombinant extensions
WO2017024060A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Biogen Ma Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
CR20180217A (es) 2015-09-18 2018-05-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos
MA43348A (fr) 2015-10-01 2018-08-08 Novo Nordisk As Conjugués de protéines
WO2017070167A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for modified factor ix fusion proteins
WO2017100501A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
CN105384828B (zh) * 2015-12-18 2019-06-21 中国科学技术大学 长效干扰素-α及其改造方法
EP3184149A1 (en) 2015-12-23 2017-06-28 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Soluble glycoprotein v for treating thrombotic diseases
RU2647769C2 (ru) * 2015-12-30 2018-03-19 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Химерный улучшенный рекомбинантный фактор VIII
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
RU2018128582A (ru) 2016-01-07 2020-02-11 Цсл Беринг Ленгнау Аг Мутированный укороченный фактор фон виллебранда
AU2017205776B2 (en) 2016-01-07 2020-09-10 CSL Behring Lengnau AG Mutated von Willebrand factor
SG10201912405TA (en) 2016-01-11 2020-02-27 Inhibrx Inc Multivalent and multispecific 41bb-binding fusion proteins
US11753461B2 (en) 2016-02-01 2023-09-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor VIII genes
CN106397599B (zh) 2016-02-23 2020-08-07 上海交通大学 二价双特异性抗体杂交蛋白的表达和制备方法
CN106397598B (zh) * 2016-02-23 2020-07-14 上海交通大学 多价多特异性抗体及免疫杂合蛋白的表达和制备方法
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
AU2017247004B2 (en) 2016-04-06 2022-07-07 Csl Limited Method of treating atherosclerosis
US20190153119A1 (en) * 2016-04-14 2019-05-23 Iconic Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating disorders associated with neovascularization
AU2017257504A1 (en) 2016-04-26 2018-10-25 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017191817A1 (ja) 2016-05-02 2017-11-09 味の素株式会社 アジド基含有Ｆｃタンパク質
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
AU2017268198C1 (en) 2016-05-16 2020-11-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited Anti-Factor IX Padua antibodies
EP3465124A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
US11285266B2 (en) 2016-07-01 2022-03-29 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3519431A1 (en) 2016-09-28 2019-08-07 Cohbar Inc. Therapeutic mots-c related peptides
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
US11249082B2 (en) 2016-10-29 2022-02-15 University Of Miami Zika virus assay systems
EP3538133B1 (en) 2016-11-11 2021-02-17 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
CA3043397A1 (en) 2016-11-11 2018-05-17 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for extravascular administration in the treatment or prophylaxis of a blood coagulation disorder
JP2019536794A (ja) 2016-12-02 2019-12-19 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 凝固因子に対する免疫寛容を誘導する方法
EP3548066A1 (en) 2016-12-02 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilic arthropathy using chimeric clotting factors
MX2019008432A (es) 2017-01-17 2019-11-18 Amgen Inc Dispositivos de inyeccion y metodos relacionados de uso y ensamblaje.
EP3573641A4 (en) * 2017-01-25 2020-11-11 Iconic Therapeutics, Inc. TREATMENT METHODS FOR DISORDERS ASSOCIATED WITH ANGIOGENESIS AND NEOVASCULARIZATION
CA3051481A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Phospholipid ether (ple) car t cell tumor targeting (ctct) agents
AU2018221351B2 (en) 2017-02-17 2023-02-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
US11752258B2 (en) 2017-02-17 2023-09-12 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
US11117930B2 (en) 2017-02-23 2021-09-14 Adrx, Inc. Peptide inhibitors of transcription factor aggregation
CN110582288B (zh) 2017-02-28 2024-09-20 恩多塞特公司 用于car t细胞疗法的组合物和方法
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
US11571511B2 (en) 2017-03-07 2023-02-07 Amgen Inc. Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device
AU2018230486B2 (en) 2017-03-09 2023-05-11 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
US11872194B2 (en) 2017-03-14 2024-01-16 Ohio State Innovation Foundation Methods and compositions related to a tissue factor-targeting IGG3 immunoconjugates
CN110446499A (zh) 2017-03-20 2019-11-12 豪夫迈·罗氏有限公司 一种体外糖基工程化红细胞生成刺激蛋白的方法
HUE063805T2 (hu) 2017-03-28 2024-01-28 Amgen Inc Dugattyúrúd és fecskendõ összeállító rendszer és eljárás
WO2018185131A2 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Novo Nordisk A/S Oligomer extended insulin-fc conjugates
KR20190141686A (ko) * 2017-04-21 2019-12-24 제넨테크, 인크. 질환 치료를 위한 klk5 길항제의 용도
EP3621649A2 (en) * 2017-05-10 2020-03-18 Albajuna Therapeutics, S.L. Fc-fusion protein derivatives with high dual hiv antiviral and immunomodulatory activity
US20230137562A1 (en) 2017-06-07 2023-05-04 Adrx, Inc. Tau aggregation inhibitors
JP7200134B2 (ja) 2017-06-08 2023-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド トルク駆動式薬物送達デバイス
EP3634539A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
PL3641800T3 (pl) 2017-06-22 2024-03-18 CSL Behring Lengnau AG Modulacja immunogenności fviii przez skrócony vwf
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
JP7475860B2 (ja) 2017-06-23 2024-04-30 アムジエン・インコーポレーテツド スイッチアセンブリにより起動されるキャップを含む電子薬物送達デバイス
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
EP3655063A1 (en) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
BR112020002394A2 (pt) 2017-08-09 2020-07-28 Bioverativ Therapeutics Inc. moléculas de ácidos nucleicos e usos das mesmas
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
AU2018318319A1 (en) 2017-08-18 2020-02-20 Adrx, Inc. Tau aggregation peptide inhibitors
MA49897A (fr) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc Injecteur sur-corps avec patch adhésif stérile
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
CN111132711B (zh) 2017-10-06 2022-07-01 安进公司 带有联锁组件的药物递送装置及相关组装方法
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
WO2019090079A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
CA3079197A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CN111225696B (zh) 2017-11-10 2023-07-18 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
AU2018368338B2 (en) 2017-11-16 2024-07-25 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
IL273638B2 (en) 2017-11-16 2024-10-01 Amgen Inc Door lock mechanism for drug delivery device
JP7002927B2 (ja) 2017-11-22 2022-01-20 本田技研工業株式会社 駆動軸配置構造
WO2019144095A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Methods of use for car t cells
TW201946929A (zh) 2018-02-01 2019-12-16 美商生物化學醫療公司 表現因子ｖｉｉｉ之慢病毒載體之使用
US20200040103A1 (en) 2018-03-14 2020-02-06 Genentech, Inc. Anti-klk5 antibodies and methods of use
MX2020009975A (es) 2018-03-28 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso.
CU24554B1 (es) 2018-05-07 2021-11-04 Ct Inmunologia Molecular Proteínas de fusión compuestas por una muteína de interleucina 2 e interferón tipo 1
NZ769677A (en) 2018-05-18 2024-07-05 Bioverativ Therapeutics Inc Methods of treating hemophilia a
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
US11830582B2 (en) 2018-06-14 2023-11-28 University Of Miami Methods of designing novel antibody mimetics for use in detecting antigens and as therapeutic agents
CN112601517A (zh) 2018-07-03 2021-04-02 百时美施贵宝公司 Fgf-21配制品
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
WO2020033863A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
EP3856283A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
WO2020072577A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
TWI824026B (zh) 2018-10-05 2023-12-01 美商安進公司 具有劑量指示器之藥物遞送裝置
CN109439679A (zh) * 2018-10-09 2019-03-08 上海市儿童医院 一种高活性重组人凝血因子ix融合蛋白及其制备方法
KR20210076935A (ko) 2018-10-15 2021-06-24 암젠 인크 댐핑 메커니즘을 갖는 약물 전달 장치
SG11202101824VA (en) 2018-10-15 2021-03-30 Amgen Inc Platform assembly process for drug delivery device
WO2020086408A1 (en) 2018-10-26 2020-04-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A high-yield perfusion-based transient gene expression bioprocess
CA3113076A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
WO2020091956A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
CN113518784A (zh) 2019-01-28 2021-10-19 科巴公司 治疗性肽
KR20210141608A (ko) 2019-03-19 2021-11-23 체에스엘 베링 렝나우 아게 치료요법에서 인자 ix 변이체 및 이의 용도
CA3136720A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 Codiak Biosciences, Inc. Compositions of exosomes and aav
WO2020219482A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
US20220211808A1 (en) 2019-05-17 2022-07-07 Universitaet Zuerich Haptoglobin for use in treating an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke
EP3986918A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 Bayer Aktiengesellschaft Adrenomedullin-analogues for long-term stabilization and their use
AU2020300820A1 (en) 2019-07-04 2022-03-03 CSL Behring Lengnau AG A truncated von willebrand factor (vWF) for increasing the in vitro stability of coagulation factor VIII
EP4017560A2 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Amgen, Inc Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
TW202126284A (zh) 2019-09-30 2021-07-16 美商百歐維拉提夫治療公司 慢病毒載體配製物
WO2021094344A1 (en) 2019-11-11 2021-05-20 CSL Behring Lengnau AG Polypeptides for inducing tolerance to factor viii
EP4058465A1 (en) 2019-11-14 2022-09-21 Cohbar Inc. Cxcr4 antagonist peptides
JP2023510115A (ja) 2019-12-20 2023-03-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規ｉｌ２アゴニストおよびそれらの使用方法
AU2020411480B2 (en) 2019-12-23 2023-12-21 Denali Therapeutics Inc. Progranulin variants
KR20220139915A (ko) 2020-02-06 2022-10-17 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Il-10 및 그의 용도
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
EP4247416A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 CSL Behring GmbH Method for treating antibody-mediated rejection
EP4284407A1 (en) 2021-02-01 2023-12-06 CSL Behring AG Method of treating or preventing an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke
KR20240005075A (ko) 2021-05-07 2024-01-11 체에스엘 베링 아게 재조합 합토글로빈 (hp) 베타 쇄를 생산하기 위한 발현 시스템
MX2023013640A (es) 2021-05-21 2023-11-30 Amgen Inc Metodo de optimizacion de una receta de llenado para un contenedor de medicamento.
CN118451096A (zh) 2021-10-20 2024-08-06 辛德凯因股份有限公司 异二聚体fc细胞因子及其用途
TW202423475A (zh) 2022-09-02 2024-06-16 瑞士商Ｃｓｌ貝林股份有限公司 用於治療或預防過度勃起反應或勃起功能障礙之血紅素結合蛋白
WO2024094457A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing glycoprotein compositions
CN118496347B (zh) * 2024-05-30 2024-10-25 北京航空航天大学杭州创新研究院 一种用于抗体寡核苷酸偶联的方法

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0325262A2 (en) * 1988-01-22 1989-07-26 The General Hospital Corporation Cloned genes encoding IG-CD4 fusion proteins and the use thereof
FR2641468A1 (fr) * 1989-01-11 1990-07-13 Merieux Inst Anticorps chimeriques anti-recepteur de l'interleukine-2 humaine, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant
WO1992010209A1 (en) * 1990-12-04 1992-06-25 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
WO1993011162A1 (en) * 1991-11-29 1993-06-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody heterodimers
WO1996010582A1 (en) * 1994-10-03 1996-04-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Crosslinking processes/agents for zein
WO1996022024A1 (en) * 1995-01-17 1996-07-25 Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
WO1999059643A2 (en) * 1998-05-20 1999-11-25 Sdg, Inc. Liposomal delivery complex
US6030613A (en) * 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
WO2000066173A2 (en) * 1999-05-03 2000-11-09 Infectio Recherche Inc. Targeting of infectious agents bearing host cell proteins
WO2001002439A1 (en) * 1999-07-01 2001-01-11 Yale University Neovascular-targeted immunoconjugates
WO2001036637A1 (en) * 1999-11-17 2001-05-25 Immunex Corporation Receptor activator of nf-kappa b
US6310180B1 (en) * 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
WO2001083526A2 (en) * 2000-05-03 2001-11-08 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
WO2002046208A2 (en) * 2000-11-01 2002-06-13 Elusys Therapeutics, Inc. Method of producing biospecific molecules by protein trans-splicing
EP2077121A1 (en) * 2003-05-06 2009-07-08 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Clotting factor VII-Fc chimeric proteins for treatment of a hemostatic disorder

Family Cites Families (297)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US660843A (en) * 1900-05-16 1900-10-30 Rebecca Coyle Nursing-gown.
US786376A (en) 1902-05-15 1905-04-04 Fischer Motor Vehicle Company Electrogasolene-vehicle.
US3941763A (en) * 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
US4456591A (en) 1981-06-25 1984-06-26 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Therapeutic method for activating factor VII
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
AU561343B2 (en) 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US4444878A (en) 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5189015A (en) 1984-05-30 1993-02-23 Alfa-Laval Agri International Ab Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability
US5077204A (en) 1984-06-21 1991-12-31 Chiron Corporation Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use
US4849407A (en) 1986-08-13 1989-07-18 Zymogenetics, Inc. Biologically active mosaic proteins
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
DK525384D0 (da) * 1984-11-05 1984-11-05 Nordisk Insulinlab Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat
US5157021A (en) 1985-03-15 1992-10-20 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
EP0218712B1 (en) 1985-04-12 1992-02-26 Genetics Institute, Inc. Novel procoagulant proteins
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4745055A (en) 1985-05-07 1988-05-17 California Biotechnology Inc. Fused protein for enzyme immunoassay system
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
US5180583A (en) 1985-11-26 1993-01-19 Hedner Ulla K E Method for the treatment of bleeding disorders
ATE87663T1 (de) 1986-01-03 1993-04-15 Genetics Inst Verfahren zur herstellung von faktor-viii:c-typ- proteinen.
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
IL78444A (en) 1986-04-08 1992-05-25 Yeda Res & Dev Human gamma interferon-specific receptor protein,antibody against said protein,and compositions containing said protein and antibody
US5543502A (en) 1986-06-24 1996-08-06 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
CA1340456C (en) 1986-07-07 1999-03-23 Hubert J.P. Schoemaker Chimeric rodent/human immunoglobulins specific for tumor-associated antigens
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
NO873164L (no) 1986-07-30 1988-02-01 Teijin Ltd Muse-humane kimaere antistoffer.
IL84285A (en) 1986-10-27 1993-03-15 Int Genetic Engineering Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen
GB8626412D0 (en) 1986-11-05 1986-12-03 Clark M R Antibodies
CA1339445C (en) 1986-11-12 1997-09-09 The General Hospital Corporation Recombinant hybrid immunoglobulin molecules and method of use
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5258498A (en) * 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
IE69026B1 (en) 1987-06-12 1996-08-07 Immuno Ag Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US6018026A (en) * 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
JP2643968B2 (ja) 1988-02-03 1997-08-25 サントリー株式会社 Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼ及びその製造方法
US5234830A (en) 1988-02-03 1993-08-10 Suntory Limited DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
AU643427B2 (en) 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
SE8901687D0 (sv) 1989-05-11 1989-05-11 Alfa Laval Agri Int Fibronectin binding protein as well as its preparation
ES2057571T3 (es) 1989-05-22 1994-10-16 Zymogenetics Inc Receptor de pdgf-alfa.
US5061786A (en) 1989-05-25 1991-10-29 Genentech, Inc. Biologically active polypeptides based on transforming growth factor-β
US5194596A (en) 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
DE69005740T2 (de) 1989-08-21 1994-06-01 Ngk Insulators Ltd Aufzeichnungskopf, bestehend aus einem eine Elektrode tragenden Substrat mit einem dünnwandigen Kontaktendteil, und Schicht zur Verstärkung des Substrats.
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
JPH0396383A (ja) 1989-09-08 1991-04-22 Riso Kagaku Corp 画像形成装置
EP0417563B1 (de) 1989-09-12 2000-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US5935815A (en) 1989-10-25 1999-08-10 Katholieke Universiteit Leuven Process for micro biological production of proteins
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
US5648273A (en) 1989-12-27 1997-07-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Hepatic growth factor receptor is the MET proto-oncogene
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9009106D0 (en) 1990-04-23 1990-06-20 3I Res Expl Ltd Processes and intermediates for synthetic antibody derivatives
CA2040099A1 (en) 1990-05-01 1991-11-02 Mariano Barbacid Tyrosine kinase negative trkb
US20030064480A1 (en) 1990-06-28 2003-04-03 Leander Lauffer Fusion proteins with immunoglobulin portions, the preparation and use thereof
DK0464533T3 (da) 1990-06-28 1999-04-26 Gen Hospital Corp Fusionsproteiner med immunglobulindele, deres fremstilling og anvendelse
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5453491A (en) 1990-09-11 1995-09-26 Kiyoshi Takatsu Murine interleukin-5 receptor
JP4236698B2 (ja) 1990-11-26 2009-03-11 ジェネティックス インスティチュート，リミテッド ライアビリティ カンパニー 宿主細胞でのｐａｃｅの発現およびその使用法
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5374617A (en) 1992-05-13 1994-12-20 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of bleeding with modified tissue factor in combination with FVIIa
US5541063A (en) 1991-04-19 1996-07-30 Schering Corporation Human interleukin-3 receptor α subunit
ATE170559T1 (de) * 1991-05-31 1998-09-15 Genentech Inc Behandlung der hiv-assoziierten immun- thrombopenie purpura
US5227158A (en) 1991-06-10 1993-07-13 Genentech, Inc. Method of stimulating hepatocyte proliferation by administration of hepatocyte growth factor and gamma-interferon
US5346991A (en) 1991-06-13 1994-09-13 Genentech, Inc. Tissue factor mutants useful for the treatment of myocardial infarction and coagulopathic disorders
US5348856A (en) 1991-07-08 1994-09-20 E. R. Squibb & Sons, Inc. DNA encoding TRKC protein
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5116753A (en) * 1991-07-30 1992-05-26 The Salk Institute For Biological Studies Maintenance of pancreatic islets
US5454933A (en) * 1991-12-16 1995-10-03 Exxon Research And Engineering Company Deep desulfurization of distillate fuels
DK0654085T3 (da) * 1992-01-23 1997-09-22 Merck Patent Gmbh Monomere og dimere antistof-fragment-fusionsproteiner
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1993016177A1 (en) 1992-02-11 1993-08-19 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
ES2252732T3 (es) 1992-05-26 2006-05-16 Immunex Corporation Nueva citoquina que une cd30.
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
WO1994005328A1 (en) 1992-08-28 1994-03-17 The Scripps Research Institute Inhibition of tumor metastasis via neutralization of tissue factor function
GB2270845B (en) 1992-09-24 1996-07-10 Smiths Ind Med Syst Inc Suction catheter assemblies
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
DE69332859T2 (de) 1992-11-13 2003-12-18 Idec Pharmaceuticals Corp., San Diego Konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier-exprimierung
US5648446A (en) * 1993-02-24 1997-07-15 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Diguanamines and preparation process, derivatives and use thereof
WO1994028017A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 The Scripps Research Institute Human mutant tissue factor compositions useful as tissue factor antagonists
US6518013B1 (en) 1993-06-07 2003-02-11 Trimeris, Inc. Methods for the inhibition of epstein-barr virus transmission employing anti-viral peptides capable of abrogating viral fusion and transmission
US5464933A (en) 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6017536A (en) 1993-06-07 2000-01-25 Trimeris, Inc. Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
KR950003279A (ko) 1993-07-29 1995-02-16 고사이 아끼오 플루오로알칸 카르복사미드 유도체의 제조방법
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6740734B1 (en) 1994-01-14 2004-05-25 Biovitrum Ab Bacterial receptor structures
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5648240A (en) * 1994-05-24 1997-07-15 Texas A&M University MHC II analog from Staphylococcus aureus
HU220347B (hu) 1994-07-11 2001-12-28 Board Of Regents The University Of Texas System Készítmény az érrendszer specifikus koagulálásához
AU3559695A (en) * 1994-09-30 1996-04-26 Inex Pharmaceuticals Corp. Glycosylated protein-liposome conjugates and methods for their preparation
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5591573A (en) 1995-04-10 1997-01-07 Alpha Therapeutic Corporation Method and system for testing blood samples
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) * 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5579277A (en) * 1995-05-01 1996-11-26 Apple Computer, Inc. System and method for interleaving memory banks
US6184344B1 (en) * 1995-05-04 2001-02-06 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
JPH11507632A (ja) 1995-06-07 1999-07-06 トリメリス，インコーポレーテッド 併用療法を用いたｈｉｖおよび他のウイルス感染の治療
US5840529A (en) 1995-08-02 1998-11-24 Clinical Research Institute Of Montreal Mammalian pro-hormone convertase
DK0848755T4 (da) 1995-09-08 2011-05-23 Genentech Inc VEGF relateret protein
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US20030026779A1 (en) 1999-10-15 2003-02-06 Liming Yu Treatment of tumors and viral infections with a hybrid conjugate of interferon and an immunoglobulin Fc
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
CA2198968C (en) * 1996-03-04 2010-02-09 Toyofumi Masuda Process for production of secretory kex2 derivatives
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
WO1998000543A1 (en) 1996-07-03 1998-01-08 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor agonists and uses thereof
CA2203745A1 (en) 1996-07-26 1998-01-26 Robert Day Pro-protein converting enzyme
CA2262405A1 (en) 1996-08-02 1998-02-12 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
US6159462A (en) 1996-08-16 2000-12-12 Genentech, Inc. Uses of Wnt polypeptides
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
EP2371962A3 (en) 1996-12-23 2011-12-21 Immunex Corporation Receptor activator of NF-KAPPA B, receptor is member of TNF receptor superfamily
US6271349B1 (en) 1996-12-23 2001-08-07 Immunex Corporation Receptor activator of NF-κB
BR9806793A (pt) 1997-01-22 2000-05-16 Univ Texas Processos e composições de fator tissular para coagulação e tratamento de tumores.
TW502011B (en) * 1997-02-05 2002-09-11 Ajinomoto Kk Process for producing n-long-chain acyl acidic amino acids or salts thereof
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
JP4128227B2 (ja) 1997-03-14 2008-07-30 バイオジェン・アイデック・インコーポレイテッド 哺乳類細胞内の特定部位に相同組換えによって遺伝子を組み込む方法とそれを実施するためのベクター
DK0985039T3 (da) 1997-06-12 2008-06-09 Novartis Int Pharm Ltd Kunstige antistof-polypeptider
WO1998056807A1 (en) * 1997-06-13 1998-12-17 Gryphon Sciences Solid phase native chemical ligation of unprotected or n-terminal cysteine protected peptides in aqueous solution
EP0885571B1 (de) * 1997-06-21 2003-08-27 Tesa AG Klebfolienstreifen-Verbund und seine Verwendung
US6310183B1 (en) * 1997-09-10 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Coagulation factor VIIa composition
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
CA2318482C (en) 1998-01-23 2010-04-13 Immunex Corporation Il-18 receptors
HUP0100813A3 (en) 1998-02-25 2003-08-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
US6008321A (en) 1998-03-16 1999-12-28 Pharmacopeia, Inc. Universal linker for combinatorial synthesis
US6281331B1 (en) 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP1082137A4 (en) 1998-05-06 2004-05-19 Univ Temple REVERSE OF PERCENTAL RESPONSE BY INTERRUPTING THE MACROPHAGE RECEPTOR FcSg (g) RI
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6355782B1 (en) 1998-07-09 2002-03-12 Baylor College Of Medicine Hypohidrotic ectodermal dyplasia genes and proteins
US6596847B2 (en) 1998-07-15 2003-07-22 Genentech, Inc. Tissue factor protein variants
DK1100830T3 (da) * 1998-07-28 2004-01-19 Micromet Ag Heterominiantistoffer
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6927044B2 (en) 1998-09-25 2005-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-1 receptor based cytokine traps
EP1117693B1 (en) * 1998-09-30 2006-05-17 New England Biolabs, Inc. Intein mediated peptide ligation
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
AU773891C (en) 1998-10-23 2005-02-17 Kirin-Amgen Inc. Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to MP1 receptor and having thrombopoietic activity
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
JP4463988B2 (ja) 1998-11-06 2010-05-19 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト Ｖｉｉ因子の生産方法
US6280994B1 (en) 1998-11-25 2001-08-28 Zymogenetics, Inc. Zace 1: a human metalloenzyme
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
AU762047B2 (en) 1999-01-06 2003-06-19 Genentech Inc. Insulin-like growth factor (IGF) I mutant variants
JP3971108B2 (ja) 1999-01-06 2007-09-05 ジェネンテック・インコーポレーテッド インシュリン様成長因子（ｉｇｆ）ｉ突然変異体
EP1141024B1 (en) * 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
SE9901379D0 (sv) 1999-04-19 1999-04-19 Pharmacia & Upjohn Ab Receptor structures
US6602977B1 (en) 1999-04-19 2003-08-05 Biovitrum Ab Receptor structures
WO2000069913A1 (en) * 1999-05-19 2000-11-23 Lexigen Pharmaceuticals Corp. EXPRESSION AND EXPORT OF INTERFERON-ALPHA PROTEINS AS Fc FUSION PROTEINS
AU781618C (en) 1999-07-02 2006-03-16 Genentech Inc. FVIIa antagonists
IL147270A0 (en) 1999-07-02 2002-08-14 Genentech Inc Fusion peptides comprising a peptide ligand domain and a multimerization domain
US6469136B1 (en) 1999-07-07 2002-10-22 Trimeris, Inc. Methods and composition for peptide synthesis
ATE407697T1 (de) 1999-07-13 2008-09-15 Bolder Biotechnology Inc Erythropoietin immunglobulin fusionsproteine
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
CN1235911C (zh) * 1999-08-09 2006-01-11 利思进药品公司 多细胞因子－抗体复合物
CA2387545A1 (en) * 1999-10-14 2001-04-19 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating or preventing cell, tissue, and organ damage using human myeloid progenitor inhibitory factor-1 (mpif-1)
AU780693B2 (en) 1999-11-05 2005-04-14 Curis, Inc. Hedgehog fusion proteins and uses
WO2001036489A2 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gmbh Erythropoietin forms with improved properties
US6808902B1 (en) * 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
DE19963859A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
ATE428445T1 (de) 2000-02-11 2009-05-15 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
AU4314801A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Lexigen Pharm Corp Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
AU2001249389A1 (en) 2000-03-22 2001-10-03 The Children's Hospital Of Philadelphia Modified blood clotting factors and methods of use
ES2260219T3 (es) * 2000-04-21 2006-11-01 Amgen Inc. Derivados de peptidos apo-ai/aii.
DE10020332A1 (de) 2000-04-26 2001-11-15 Henkel Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel
US6756480B2 (en) 2000-04-27 2004-06-29 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
JP2003533187A (ja) 2000-05-03 2003-11-11 アムジエン・インコーポレーテツド 治療薬としてのＦｃドメインを含む修飾ペプチド
AU2001274904B2 (en) 2000-05-26 2006-08-31 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neuroprotective peptides
AU2001270609A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
WO2002018417A1 (en) 2000-09-01 2002-03-07 Gryphon Therapeutics, Inc. Nucleophile-stable thioester generating compounds, methods of production and use
DK1332209T3 (da) 2000-09-08 2010-03-29 Univ Zuerich Samlinger af repeatproteiner indeholdende repeatmoduler
US7208151B2 (en) 2001-09-12 2007-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Tweak receptor agonists as anti-angiogenic agents
US7138119B2 (en) * 2000-09-15 2006-11-21 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of HIV-1 infection
US7615537B2 (en) 2000-10-25 2009-11-10 Genzyme Corporation Methods for treating blood coagulation disorders
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
DE60143544D1 (de) 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
IL157142A0 (en) 2001-01-29 2004-02-08 Idec Pharma Corp Modified antibodies and methods of use
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
US20040132971A1 (en) * 2001-02-09 2004-07-08 Haaning Jesper Mortensen Rank ligand-binding polypeptides
HUP0303171A2 (hu) * 2001-02-19 2003-12-29 Merck Patent Gmbh Csökkentett immunogenitású mesterséges fehérjék
US7235638B2 (en) 2001-03-22 2007-06-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Coagulation factor VII derivatives
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
WO2002088171A2 (en) 2001-04-26 2002-11-07 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
WO2002089828A2 (en) 2001-05-04 2002-11-14 Institute Of Molecular And Cell Biology Interferons in the treatment of ischemia
US7419949B2 (en) 2001-07-16 2008-09-02 Novo Noridsk Healthcare A/G Single-dose administration of factor VIIa
US7144380B2 (en) * 2001-07-23 2006-12-05 Gilliam Larry A Traction method and device
DE60116091T2 (de) 2001-08-31 2006-08-31 Zeger De Lille Bohrvorrichtung
ATE364632T1 (de) 2001-10-05 2007-07-15 Affimed Therapeutics Ag Antikörper menschlichen ursprungs zur hemmung der thrombozytenaggregation
FR2831170B1 (fr) 2001-10-19 2004-03-19 Inst Nat Sante Rech Med Proteines c modifiees activables directement par la thrombine
US20030078180A1 (en) 2001-10-24 2003-04-24 Benchmark Research & Technology, Inc. Contaminant-tolerant foaming additive
ES2545090T3 (es) 2001-12-21 2015-09-08 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de albúmina y GCSF
US20040102440A1 (en) 2002-07-01 2004-05-27 Wong Erik Ho Fong Method of promoting smoking cessation
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
WO2003072060A2 (en) * 2002-02-27 2003-09-04 Immunex Corporation Polypeptide formulation
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
JP2006502091A (ja) 2002-03-01 2006-01-19 イミューノメディクス、インコーポレイテッド クリアランス速度を高めるための二重特異性抗体点変異
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
JP2005526769A (ja) 2002-03-15 2005-09-08 ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド 治療剤を全身搬送するための中央気道投与
MXPA05000063A (es) 2002-07-01 2005-04-08 Kenneth S Warren Inst Inc Citocinas recombinantes protectoras de tejido y acidos nucleicos que las codifican para la proteccion, restauracion y mejora de celulas, tejidos y organos respondedores.
WO2004004798A2 (en) 2002-07-03 2004-01-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
EP1523504A2 (en) 2002-07-12 2005-04-20 Novo Nordisk A/S A tissue factor binding immunoconjugate comprising factor viia
US20040110929A1 (en) 2002-07-12 2004-06-10 Bjorn Soren E. TF binding compound
JP4459810B2 (ja) 2002-08-14 2010-04-28 マクロジェニクス，インコーポレーテッド ＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体とその利用法
EP3502133A1 (en) 2002-09-27 2019-06-26 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
AU2003286467B2 (en) 2002-10-15 2009-10-01 Abbvie Biotherapeutics Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1587540B1 (en) 2003-01-09 2021-09-15 MacroGenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050281829A1 (en) 2003-05-06 2005-12-22 Hehir Cristina A T Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs
CA2522690A1 (en) 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ATE385806T1 (de) 2003-06-12 2008-03-15 Lilly Co Eli Fusionsproteine
AU2003264100A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
SG10202008722QA (en) 2003-11-05 2020-10-29 Roche Glycart Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
US7736653B2 (en) 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin Fc region as a carrier
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
US8263084B2 (en) 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
CA2546580A1 (en) 2003-11-18 2005-06-09 Iconic Therapeutics, Inc. Homogeneous preparations of chimeric proteins
US20050249723A1 (en) 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
UA86605C2 (ru) 2004-01-12 2009-05-12 Аплайд Молекьюлер Иволюшн, Инк. Антитело, которое содержит вариант исходного человеческого fс-участка
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2006083275A2 (en) 2004-05-21 2006-08-10 The Uab Research Foundation Variable lymphocyte receptors, related polypeptides and nucleic acids, and uses thereof
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
BRPI0510674A (pt) 2004-07-15 2007-12-26 Xencor Inc variantes fc otimizadas
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
WO2006055689A2 (en) 2004-11-16 2006-05-26 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
EP1868650B1 (en) 2005-04-15 2018-10-03 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US7427787B2 (en) 2005-07-08 2008-09-23 Texas Instruments Incorporated Guardringed SCR ESD protection
US7666622B2 (en) 2005-10-19 2010-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Monomeric self-associating fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
EP1820508A1 (en) 2006-02-21 2007-08-22 CSL Behring GmbH Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties
WO2007109254A2 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
EP2650305B1 (en) * 2006-03-24 2024-05-08 Bioverativ Therapeutics Inc. PC5 as a factor IX propeptide processing enzyme
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
ES2889920T3 (es) 2006-06-14 2022-01-14 Csl Behring Gmbh Proteínas de fusión escindibles proteolíticamente con alta actividad específica molar
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
EP1952822A1 (en) 2007-01-26 2008-08-06 Novo Nordisk A/S Factor VII polypeptides with increased affinity to platelets
CA2682605A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
EP2158318A2 (en) 2007-05-14 2010-03-03 Biogen Idec MA, Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
WO2009053368A1 (en) 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Single ifn-beta fused to a mutated igg fc fragment
TWI538916B (zh) 2008-04-11 2016-06-21 介控生化科技公司 經修飾的因子vii多肽和其用途
US20110077202A1 (en) 2008-05-16 2011-03-31 Bayer Healthcare Llc Targeted Coagulation Factors and Method of Using the Same
US20120093840A1 (en) 2009-04-06 2012-04-19 Novo Nordisk A/S Targeted delivery of factor viii proteins to platelets
JP5909180B2 (ja) 2009-06-25 2016-04-26 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル キメラ第ｖｉｉ因子分子
JP2013503140A (ja) 2009-08-27 2013-01-31 ノヴォ ノルディスク アー／エス 活性化血小板に対する組織因子の標的化
CA2782424C (en) 2009-12-06 2021-07-27 Biogen Idec Hemophilia Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
PT2591006T (pt) 2010-07-09 2019-07-29 Bioverativ Therapeutics Inc Moléculas de cadeia simples processáveis e polipéptidos preparados utilizando as mesmas
EP3508573A1 (en) * 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
CN103140237A (zh) * 2010-07-09 2013-06-05 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 因子ix多肽及其使用方法
JP6309273B2 (ja) 2011-03-02 2018-04-11 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 活性化血小板上のｔｌｔ−１に対する凝固因子の標的化

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0325262A2 (en) * 1988-01-22 1989-07-26 The General Hospital Corporation Cloned genes encoding IG-CD4 fusion proteins and the use thereof
FR2641468A1 (fr) * 1989-01-11 1990-07-13 Merieux Inst Anticorps chimeriques anti-recepteur de l'interleukine-2 humaine, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant
WO1992010209A1 (en) * 1990-12-04 1992-06-25 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
WO1993011162A1 (en) * 1991-11-29 1993-06-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody heterodimers
US6310180B1 (en) * 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
WO1996010582A1 (en) * 1994-10-03 1996-04-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Crosslinking processes/agents for zein
WO1996022024A1 (en) * 1995-01-17 1996-07-25 Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6030613A (en) * 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
WO1999059643A2 (en) * 1998-05-20 1999-11-25 Sdg, Inc. Liposomal delivery complex
WO2000066173A2 (en) * 1999-05-03 2000-11-09 Infectio Recherche Inc. Targeting of infectious agents bearing host cell proteins
WO2001002439A1 (en) * 1999-07-01 2001-01-11 Yale University Neovascular-targeted immunoconjugates
WO2001036637A1 (en) * 1999-11-17 2001-05-25 Immunex Corporation Receptor activator of nf-kappa b
WO2001083526A2 (en) * 2000-05-03 2001-11-08 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
WO2002046208A2 (en) * 2000-11-01 2002-06-13 Elusys Therapeutics, Inc. Method of producing biospecific molecules by protein trans-splicing
EP2077121A1 (en) * 2003-05-06 2009-07-08 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Clotting factor VII-Fc chimeric proteins for treatment of a hemostatic disorder

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GLENNIE MJ. and STEVENSON GT. Univalent antibodies kill tumour cells in vitro and in vivo. Nature. 1982, vol. 295, no. 5851, side 712-714. , Dated: 01.01.0001 *
KETAS TJ. ET AL. Human immunodeficiency virus type 1 attachment, coreceptor, and fusion inhibitors are active against both direct and trans infection of primary cells. J Virol. 2003, vol. 77, no. 4, side 2762-2767 , Dated: 01.01.0001 *
STEVENSON GT. ET AL. Chimeric univalent antibodies for treating lymphoid malignancies. Med Oncol Tumor Pharmacother. 1984, vol. 1, no. 4, side 275-278. , Dated: 01.01.0001 *
XU D. ET AL. Mimetic ligand-based affinity purification of immune complexes and immunoconjugates.J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 1998, vol. 706, no. 2, side 217-229. , Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2522590C (en) 2016-08-09
HK1161604A1 (zh) 2012-07-27
PL1625209T3 (pl) 2013-12-31
NO2017027I1 (no) 2017-06-23
AU2004252422B2 (en) 2011-10-27
US8932830B2 (en) 2015-01-13
SI1625209T1 (sl) 2013-12-31
NO20055773D0 (no) 2005-12-06
EP1625209A2 (en) 2006-02-15
WO2004101739A2 (en) 2004-11-25
LTPA2016007I1 (lt) 2021-07-12
US20200071385A1 (en) 2020-03-05
JP2018002737A (ja) 2018-01-11
BR122019011535B1 (pt) 2021-08-31
PT2361932T (pt) 2016-08-02
CY2016007I1 (el) 2016-08-31
EP2361932A1 (en) 2011-08-31
JP2012067142A (ja) 2012-04-05
HUE030065T2 (en) 2017-04-28
EP1654378A2 (en) 2006-05-10
ES2579938T3 (es) 2016-08-17
BRPI0410345A8 (pt) 2017-10-10
NO20160483A1 (no) 2006-01-04
EP2174946B1 (en) 2016-07-06
UA95436C2 (uk) 2011-08-10
EA012566B1 (ru) 2009-10-30
JP5091480B2 (ja) 2012-12-05
US20110159540A1 (en) 2011-06-30
EP2357196B1 (en) 2016-05-04
NO339539B1 (no) 2016-12-27
CA2522590A1 (en) 2005-01-06
TWI353991B (en) 2011-12-11
US7404956B2 (en) 2008-07-29
NO2020016I1 (no) 2020-06-12
US20080249288A1 (en) 2008-10-09
US20230023927A1 (en) 2023-01-26
NO2017027I2 (no) 2017-06-23
US9725496B1 (en) 2017-08-08
WO2004101739A3 (en) 2005-04-14
US11168125B2 (en) 2021-11-09
HK1159649A1 (zh) 2012-08-03
CN1852736B (zh) 2011-06-08
US20110182919A1 (en) 2011-07-28
EP2361932B1 (en) 2016-05-04
JP2014139244A (ja) 2014-07-31
CN104448003B (zh) 2019-03-26
US7862820B2 (en) 2011-01-04
PL2361932T3 (pl) 2016-11-30
EP1654378A4 (en) 2006-09-13
TW200510457A (en) 2005-03-16
EP3103809B1 (en) 2021-08-18
NL300799I2 (no) 2016-09-01
CY1117756T1 (el) 2017-05-17
CY2016007I2 (el) 2016-08-31
JP2016034977A (ja) 2016-03-17
PT2357196T (pt) 2016-07-15
US20170226189A1 (en) 2017-08-10
EP2361932B2 (en) 2022-06-22
CN102234334A (zh) 2011-11-09
ES2582947T3 (es) 2016-09-16
NO2017028I1 (no) 2017-06-23
CN1852736A (zh) 2006-10-25
CN104448003A (zh) 2015-03-25
US11401322B2 (en) 2022-08-02
JP2018126153A (ja) 2018-08-16
ATE446307T1 (de) 2009-11-15
US20070172928A1 (en) 2007-07-26
LU92991I2 (fr) 2016-05-09
EP3103809A1 (en) 2016-12-14
US9636416B2 (en) 2017-05-02
NO2017028I2 (no) 2017-06-23
EP1625209B1 (en) 2013-07-17
SI2357196T1 (sl) 2016-08-31
HUE031663T2 (en) 2017-07-28
BE2016C015I2 (no) 2023-08-09
US20220010000A1 (en) 2022-01-13
WO2005001025A3 (en) 2006-06-01
US20130171138A1 (en) 2013-07-04
JP6441432B2 (ja) 2018-12-19
SI2361932T1 (sl) 2016-08-31
BRPI0410345A (pt) 2006-05-30
IL171779A (en) 2010-11-30
NO20055773L (no) 2006-01-04
EP2357196A2 (en) 2011-08-17
EA200501756A1 (ru) 2006-08-25
ES2431116T3 (es) 2013-11-25
SI2174946T1 (sl) 2017-01-31
HUS1600011I1 (hu) 2016-04-28
CY1117764T1 (el) 2017-05-17
DK1625209T3 (da) 2013-10-28
FR16C0011I1 (no) 2016-04-22
HUE030293T2 (en) 2017-04-28
US7381408B2 (en) 2008-06-03
IL205802A (en) 2013-12-31
EP1625209A4 (en) 2007-01-03
EP2174946A1 (en) 2010-04-14
DE602004023724D1 (de) 2009-12-03
PT1625209E (pt) 2013-10-24
WO2005001025A2 (en) 2005-01-06
US20150139947A1 (en) 2015-05-21
LTC1625209I2 (lt) 2021-07-26
LTPA2016028I1 (lt) 2016-11-10
EP2357196B9 (en) 2016-10-05
JP2007500744A (ja) 2007-01-18
EP1654378B1 (en) 2009-10-21
US20170266309A1 (en) 2017-09-21
EP2357196A3 (en) 2011-11-30
CN102234334B (zh) 2014-10-29
DK2361932T3 (en) 2016-08-15
US8329182B2 (en) 2012-12-11
PL2357196T3 (pl) 2016-11-30
DK2357196T3 (en) 2016-08-15
AU2004252422A1 (en) 2005-01-06
US7820162B2 (en) 2010-10-26
FR16C0011I2 (fr) 2017-04-14
DK2174946T3 (en) 2016-10-24
JP6526281B2 (ja) 2019-06-05
CY1114639T1 (el) 2016-08-31
US20050032174A1 (en) 2005-02-10
EP3978508A1 (en) 2022-04-06
US20050027109A1 (en) 2005-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11168125B2 (en) Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7348004B2 (en) Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
NO20210848A1 (no) Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider
AU2012200470B2 (en) Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids
AU2016244273A1 (en) Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids
AU2013245463A1 (en) Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: BIOVERATIV THERAPEUTICS INC., US