TW201946929A - 表現因子ｖｉｉｉ之慢病毒載體之使用 - Google Patents

表現因子ｖｉｉｉ之慢病毒載體之使用 Download PDF

Info

Publication number
TW201946929A
TW201946929A TW108103837A TW108103837A TW201946929A TW 201946929 A TW201946929 A TW 201946929A TW 108103837 A TW108103837 A TW 108103837A TW 108103837 A TW108103837 A TW 108103837A TW 201946929 A TW201946929 A TW 201946929A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
less
nucleotides
nucleic acid
fviii
Prior art date
Application number
TW108103837A
Other languages
English (en)
Inventor
安德里 安諾尼
亞雷修 肯托雷
道格拉斯 德爾格
彤瑤 劉
米契拉 米拉尼
傑夫 墨菲特
路吉 納迪尼
蘇珊娜 帕塔羅懷
羅伯特 彼得斯
阿列克謝 塞雷琴
Original Assignee
美商生物化學醫療公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商生物化學醫療公司 filed Critical 美商生物化學醫療公司
Publication of TW201946929A publication Critical patent/TW201946929A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本發明提供包含密碼子優化之因子VIII序列的慢病毒載體及使用此類慢病毒載體之方法。本文揭示之靶向肝臟之慢病毒載體可用於基因療法，其中該慢病毒基因遞送能夠將轉殖基因表現卡匣穩定整合至兒科(例如新生)或成人個體之靶細胞(例如肝細胞)之基因組中，從而在低慢病毒載體劑量(例如5×1010或更低，諸如1.5×109或更低，或1×108TU/kg或更低)下實現FVIII表現之提高(例如提高100倍)。本發明亦提供治療諸如血友病(例如A型血友病)之出血病症之方法，其包括向有需要之個體投與低劑量(1×108TU/kg或更低至1.5×1010TU/kg)的包含密碼子優化之因子VIII核酸序列的靶向肝臟之慢病毒載體。

Description

表現因子ＶＩＩＩ之慢病毒載體之使用
相關申請案
本申請案主張於2018年2月1日申請之美國臨時專利申請案序列號62/625,145、2018年5月15日申請之美國臨時專利申請案序列號62/671,915及2019年1月16日申請之美國臨時專利申請案序列號62/793,158的優先權，該等臨時專利申請案之整個揭示內容在此以引用之方式併入本文中。

對電子提交之序列表的提及
以ASCII文本文件(名稱：609730_SA9-460-3_Sequence_Listing.txt；大小：204,086位元組；及創建日期：2019年1月16日)電子提交之序列表的內容以引用之方式整體併入本文中。
本發明係關於表現因子VIII之慢病毒載體之使用。
凝血路徑部分涉及因子VIIIa(FVIIIa)與因子IXa(FIXa)之酶促複合物(Xase複合物)在血小板表面上的形成。FIXa係在無輔因子FVIIIa下具有相對較弱之催化活性的絲胺酸蛋白酶。Xase複合物將因子X(FX)裂解成因子Xa(FXa)，因子Xa繼而與因子Va(FVa)相互作用，使凝血酶原裂解且產生凝血酶。A型血友病係一種由FVIII(FVIII)基因突變及/或缺失，導致FVIII活性缺乏所引起之出血病症(Peyvandi等人2006)。在一些情況下，由於存在FVIII抑制劑，諸如抗FVIII抗體，患者具有降低水準之FVIII。
該疾病可藉由目標為恢復FVIII活性以防自發出血之替補療法來治療。存在血漿衍生及重組FVIII產品，其可用於根據需要治療出血事件或藉由預防性治療來預防出血事件發生。基於此等產品之半衰期(10-12小時)(White G.C.等人,Thromb. Haemost. 77:660-7(1997)；Morfini, M.,Haemophilia 9 (增刊1):94-99;discussion 100(2003))，治療方案需要頻繁靜脈內投與，通常預防為每週二至三次，且按需治療為每日一至三次(Manco-Johnson, M.J.等人,N. Engl. J. Med. 357:535-544(2007))。此類頻繁投與不便且成本高。
向患者提供低成本重組FVIII蛋白之一個主要障礙係大規模生產之高成本。FVIII蛋白在異源表現系統中表現不佳，比類似尺寸之蛋白質低二至三個數量級。(Lynch等人,Hum. Gene. Ther. ; 4:259-72(1993)。對FVIII表現之生物學之瞭解的發展已引起更有效FVIII變異體之發展。舉例而言，生物化學研究顯示FVIII B-結構域並非FVIII輔因子活性所必需的。B-結構域之缺失使mRNA水準比全長野生型FVIII增加17倍且分泌蛋白質增加30%。(Toole等人,Proc Natl Acad Sci USA 83:5939-42(1986))。儘管如此，在本領域中仍然需要在異源系統中有效表現之FVIII序列。
本發明提供治療有需要之個體之出血病症的方法，該等方法包括向該個體投與至少一個劑量之5×1010 TU/kg轉導單位/公斤(TU/kg)或更少(例如5×109 或更少或者108 TU/kg或更少)之慢病毒載體，該慢病毒載體包含包括編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的經分離之核酸分子，其中該核苷酸序列具有(i)與SEQ ID NO: 1之核苷酸58-2277及2320-4374至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；(ii)與SEQ ID NO: 2之核苷酸58-2277及2320-4374至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；(iii)與SEQ ID NO: 70之核苷酸58-2277及2320-4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；(iv)與SEQ ID NO: 71之核苷酸58-2277及2320-4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；(v)與SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-4374至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；(vi)與SEQ ID NO: 4之核苷酸58-2277及2320-4374至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；(vii)與SEQ ID NO: 5之核苷酸58-2277及2320-4374至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；(viii)與SEQ ID NO: 6之核苷酸58-2277及2320-4374至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；或(ix)或(i)至(viii)之任何組合。
本發明亦提供治療有需要之個體之出血病症的方法，該等方法包括向該個體投與至少一個劑量之5×1010 TU/kg或更少(例如5×109 或更少或者108 TU/kg或更少)之慢病毒載體，該慢病毒載體包含包括如下核苷酸序列之經分離之核酸分子，該核苷酸序列包含編碼因子VIII(FVIII)多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；(a)其中該第一核酸序列具有：(i)與SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-1791至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；(ii)與SEQ ID NO: 4之核苷酸58-2277及2320-1791至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；(iii)與SEQ ID NO: 5之核苷酸58-1791至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；或(iv)與SEQ ID NO: 6之核苷酸58-1791至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；(b)其中該第二核酸序列具有：(i)與SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-2277及2320-4374至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；(ii)與SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-2277及2320-4374至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；(iii)與SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；或(iv)與SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；或(c)(a)與(b)之任何組合；且其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性。
在以上揭示之方法之一些實施例中，劑量為約9.5×108 TU/kg、約9×108 TU/kg、約8.5×108 TU/kg、約8×108 TU/kg、約7.5×108 TU/kg、約7×108 TU/kg、約6.5×108 TU/kg、約6×108 TU/kg、約5.5×108 TU/kg、約5×108 TU/kg、約4.5×108 TU/kg、約4×108 TU/kg、約3.5×108 TU/kg、約3×108 TU/kg、約2.5×108 TU/kg、約2×108 TU/kg、約1.5×108 TU/kg或約1×108 TU/kg、約5×1010 TU/kg、約4.5×1010 TU/kg、約4×1010 TU/kg、約3.5×1010 TU/kg、約3×1010 TU/kg、約2.5×1010 TU/kg、約2×1010 TU/kg、約1.5×1010 TU/kg、約1×1010 TU/kg、約9.5×109 TU/kg、約9×109 TU/kg、約8.5×109 TU/kg、約8×109 TU/kg、約7.5×109 TU/kg、約7×109 TU/kg、約6.5×109 TU/kg、約6×109 TU/kg、約5.5×109 TU/kg、約5×109 TU/kg、約4.5×109 TU/kg、約4×109 TU/kg、約3.5×109 TU/kg、約3×109 TU/kg、約2.5×109 TU/kg、約2×109 TU/kg、約1.5×109 TU/kg或約1×109 TU/kg。
在一些實施例中，劑量小於約9.5×108 TU/kg、小於約9×108 TU/kg、小於約8.5×108 TU/kg、小於約8×108 TU/kg、小於約7.5×108 TU/kg、小於約7×108 TU/kg、小於約6.5×108 TU/kg、小於約6×108 TU/kg、小於約5.5×108 TU/kg、小於約5×108 TU/kg、小於約4.5×108 TU/kg、小於約4×108 TU/kg、小於約3.5×108 TU/kg、小於約3×108 TU/kg、小於約2.5×108 TU/kg、小於約2×108 TU/kg、小於約1.5×108 TU/kg或小於約1×108 TU/kg、小於約5×1010 TU/kg、小於約4.5×1010 TU/kg、小於約4×1010 TU/kg、小於約3.5×1010 TU/kg、小於約3×1010 TU/kg、小於約2.5×1010 TU/kg、小於約2×1010 TU/kg、小於約1.5×1010 TU/kg、小於約1×1010 TU/kg、小於約9.5×109 TU/kg、小於約9×109 TU/kg、小於約8.5×109 TU/kg、小於約8×109 TU/kg、小於約7.5×109 TU/kg、小於約7×109 TU/kg、小於約6.5×109 TU/kg、小於約6×109 TU/kg、小於約5.5×109 TU/kg、小於約5×109 TU/kg、小於約4.5×109 TU/kg、小於約4×109 TU/kg、小於約3.5×109 TU/kg、小於約3×109 TU/kg、小於約2.5×109 TU/kg、小於約2×109 TU/kg、小於約1.5×109 TU/kg或小於約1×109 TU/kg。
在一些實施例中，劑量介於1×108 與5×1010 TU/kg之間、1×108 與5×109 TU/kg之間、1×108 與1×109 TU/kg之間、1×108 與1×1010 TU/kg之間、1×109 與5×1010 TU/kg之間、2×109 與5×1010 TU/kg之間、3×109 與5×1010 TU/kg之間、4×109 與5×1010 TU/kg之間、5×109 與5×1010 TU/kg之間、6×109 與5×1010 TU/kg之間、7×109 與5×1010 TU/kg之間、8×109 與5×1010 TU/kg之間、9×109 與5×1010 TU/kg之間、1010 與5×1010 TU/kg之間、1.5×1010 與5×1010 TU/kg之間、2×1010 與5×1010 TU/kg之間、2.5×1010 與5×1010 TU/kg之間、3×1010 與5×1010 TU/kg之間、3.5×1010 與5×1010 TU/kg之間、4×1010 與5×1010 TU/kg之間或4.5×1010 與5×1010 TU/kg之間。在一些實施例中，劑量介於1×109 與5×1010 TU/kg之間、1×109 與4.5×1010 TU/kg之間、1×109 與4×1010 TU/kg之間、1×109 與3.5×1010 TU/kg之間、1×109 與3×1010 TU/kg之間、1×109 與2.5×1010 TU/kg之間、1×109 與2×1010 TU/kg之間、1×109 與1.5×1010 TU/kg之間、1×109 與1010 TU/kg之間、1×109 與9×109 TU/kg之間、1×109 與8×109 TU/kg之間、1×109 與7×109 TU/kg之間、1×109 與6×109 TU/kg之間、1×109 與5×109 TU/kg之間、1×109 與4×109 TU/kg之間、1×109 與3×109 TU/kg之間及1×109 與2×109 之間。在一些實施例中，劑量介於1×1010 與2×1010 TU/kg之間、1.1×1010 與1.9×1010 TU/kg之間、1.2×1010 與1.8×1010 TU/kg之間、1.3×1010 與1.7×1010 TU/kg之間或1.4×1010 與1.6×1010 TU/kg之間。在一些實施例中，劑量為約1.5×1010 TU/kg。在一些實施例中，劑量為1.5×109 TU/kg。在一些實施例中，劑量介於2.5×109 TU/kg與3.5×109 TU/kg之間、2.6 ×109 TU/kg與3.4×109 TU/kg之間、2.7×109 TU/kg與3.3×109 TU/kg之間、2.8×109 TU/kg與3.2×109 TU/kg之間或2.9×109 TU/kg與3.1×109 TU/kg之間。在一些實施例中，劑量為約3.0×109 TU/kg。在一些實施例中，劑量介於5.5×109 TU/kg與6.5×109 TU/kg之間、5.6 ×109 TU/kg與6.4×109 TU/kg之間、5.7×109 TU/kg與6.3×109 TU/kg之間、5.8×109 TU/kg與6.2×109 TU/kg之間或5.9×109 TU/kg與6.1×109 TU/kg之間。在一些實施例中，劑量為約6.0×109 TU/kg。
在以上揭示之方法之一些實施例中，投與慢病毒載體後24小時至48小時的血漿FVIII活性相對於投與包含包括SEQ ID NO: 16之核酸分子之參考載體的個體增加。在一些實施例中，血漿FVIII活性增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍、至少約110倍、至少約120倍、至少約130倍、至少約140倍、至少約150倍、至少約160倍、至少約170倍、至少約180倍、至少約190倍或至少約200倍。
在以上揭示之方法之一些實施例中，慢病毒載體係呈單個劑量或多個劑量投與。在一些實施例中，慢病毒載體係經由靜脈內注射投與。在一些實施例中，個體係兒科個體。在一些實施例中，個體係成人個體。
在一些實施例中，慢病毒載體包含組織特異性啟動子。在一些實施例中，組織特異性啟動子選擇性地增強具有FVIII活性之多肽在標靶肝臟細胞中之表現。在一些實施例中，選擇性地增強具有FVIII活性之多肽在標靶肝臟細胞中之表現的組織特異性啟動子包含mTTR啟動子。在一些實施例中，標靶肝臟細胞為肝細胞。在一些實施例中，經分離之核酸分子穩定地整合至肝細胞之基因組中。在一些實施例中，出血病症為A型血友病。
在以上揭示之方法之一些實施例中，經分離之核酸分子包含LV-coFVIII-6(SEQ ID NO:71)。在一些實施例中，經分離之核酸分子包含LV-coFVIII-6-XTEN(SEQ ID NO:72)。
在一些實施例中，慢病毒載體之劑量一次投與或分成兩個亞劑量、三個亞劑量、四個亞劑量、五個亞劑量或六個亞劑量。在一些實施例中，慢病毒載體之劑量重複至少兩次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。在一些實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列進一步包含編碼信號肽之核酸序列，其中該編碼信號肽之核酸序列具有與以下各者至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸1至57；(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸1至57；(iii)SEQ ID NO: 3之核苷酸1至57；(iv)SEQ ID NO: 4之核苷酸1至57；(v)SEQ ID NO: 5之核苷酸1至57；(vi)SEQ ID NO: 6之核苷酸1至57；(vii)SEQ ID NO: 70之核苷酸1至57；(viii)SEQ ID NO: 71之核苷酸1至57；或(ix)SEQ ID NO: 68之核苷酸1至57。
在一些實施例中，核酸分子(或編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列)包含一或多種選自由以下組成之群的性質：(a)核酸分子或其一部分之人類密碼子適應指數相對於SEQ ID NO: 16增加；(b)核苷酸序列或其一部分之最佳密碼子之頻率相對於SEQ ID NO: 16增加；(c)核苷酸序列或其一部分含有比SEQ ID NO: 16中G/C核苷酸之百分比高的G/C核苷酸之百分比；(d)核苷酸序列或其一部分之相對同義密碼子使用度相對於SEQ ID NO: 16增加；(e)核苷酸序列或其一部分之有效密碼子數目相對於SEQ ID NO: 16減少；(f)核苷酸序列相對於SEQ ID NO: 16含有更少MARS/ARS序列(SEQ ID NO: 21及22)；(g)核苷酸序列相對於SEQ ID NO: 16含有更少去穩定元件(SEQ ID NO : 23及24)；及(h)其任何組合。
在一些實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列進一步包含編碼異源胺基酸序列(例如半衰期延長子)之異源核苷酸序列。在一些實施例中，異源胺基酸序列為免疫球蛋白恆定區或其一部分、XTEN、轉鐵蛋白、白蛋白或PAS序列。在一些實施例中，異源胺基酸序列連接於由核苷酸序列編碼之胺基酸序列之N端或C端或在選自表3之一或多個插入位點處插入由核苷酸序列編碼之胺基酸序列中的兩個胺基酸之間。在一些實施例中，FVIII多肽為全長FVIII或B結構域缺失之FVIII。
本發明描述使用編碼具有因子VIII(FVIII)活性之多肽的經密碼子優化之基因進行的靶向肝臟之慢病毒基因療法。參見例如國際公開案WO2017136358，其以引用之方式整體併入本文中。
因此，在一些態樣中，本發明係針對基因療法，其包括投與包含經密碼子優化之核酸分子的慢病毒載體，該等經密碼子優化之核酸分子包含編碼具有因子VIII活性之多肽的核酸序列。在特定態樣中，本發明係針對治療諸如血友病(例如A型血友病)之出血病症之方法，其包括向個體投與靶向肝臟(例如肝細胞)的包含經密碼子優化之因子VIII核酸序列之慢病毒載體。本發明經由基因療法途徑滿足本領域中之重要需求，該基因療法方法將包含經密碼子優化之因子VIII核酸序列的轉殖基因表現卡匣穩定整合至靶細胞之基因組中。
此系統顯示，當慢病毒載體以5×1010 轉導單位/kg(TU/kg)或更低，例如約1.5×1010 TU/kg或更少或約1.5×109 TU/kg或更少或約108 TU/kg或更少之至少一個劑量投與個體時因子VIII在靶細胞(例如肝細胞)中之長期表現增加。
在特定實施例中，本文揭示之慢病毒載體包含包括SEQ ID NO: 71(LV-coFVIII-6)、由其組成或基本上由其組成的經密碼子優化之核酸序列。
在一些其他特定實施例中，本文揭示之慢病毒載體包含包括SEQ ID NO: 72(LV-coFVIII-6-XTEN)、由其組成或基本上由其組成的經密碼子優化之核酸序列。
本文揭示之靶向肝臟之慢病毒載體能夠將包含經密碼子優化之編碼FVIII之核酸的轉殖基因表現卡匣穩定整合至兒科(例如新生)或成人個體之靶細胞(例如肝細胞)之基因組中，在低慢病毒載體劑量(例如5×1010 或更低，諸如109 TU/kg或更低，或108 TU/kg或更低)下實現FVIII表現之提高(例如提高100倍)。因為所揭示之慢病毒載體可在極低劑量(例如109 TU/kg或更低，或108 TU/kg或更低)下實現治療水準之循環FVIII，所以此等載體可顯著降低與慢病毒載體治療有關之潛在急性毒性。此外，慢病毒載體及尤其第三代載體之使用可引起個體基因組中可能終身整合。相對於其他基因遞送系統(例如AAV)，慢病毒載體之大容量(10 kb)允許轉殖基因中包括更多調控元件，例如控制FVIII轉殖基因在不同組織(例如肝細胞及肝內皮細胞)中之表現的啟動子。本文揭示之慢病毒載體可用於活體內、活體外或離體治療。
本發明之例示性構築體在附圖及序列表中予以說明。
為提供對說明書及申請專利範圍之清楚瞭解，下文提供以下定義。

I. 定義
應注意術語「一種(a/an)」實體係指一或多種該實體：舉例而言，「一種核苷酸序列」應理解為表示一或多種核苷酸序列。因而，術語「一種」、「一或多種」及「至少一種」在本文中可交換使用。
術語「約」在本文中用以意謂大約、大致、約略或大概。當術語「約」結合數值範圍使用時，其藉由將邊界延伸超過及低於所闡述之數值來修飾該範圍。一般而言，術語「約」在本文中用以修飾數值，超過及低於所述值達10%之變化，朝上或朝下(更高或更低)。
出於本發明之目的之術語「經分離」表示已自原始環境(其天然存在之環境)移出之生物材料(細胞、多肽、多核苷酸或其片段、變異體或衍生物)。舉例而言，以自然狀態存在於植物或動物中之多核苷酸未分離，然而，與其天然存在於之相鄰核酸分開的相同多核苷酸視為「經分離」。無需特定水準之純化。出於本發明之目的，重組產生之多肽及在宿主細胞中表現之蛋白質視為經分離，已藉由任何合適技術分開、分級分離或部分或實質上純化之天然或重組多肽亦視為經分離。
「核酸」、「核酸分子」、「寡核苷酸」及「多核苷酸」可互換使用且係指核糖核苷(腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷；「RNA分子」)或去氧核糖核苷(去氧腺嘌呤核苷、去氧鳥嘌呤核苷、去氧胸腺嘧啶核苷或去氧胞嘧啶核苷；「DNA分子」)之磷酸酯聚合物形式或其任何磷酸酯類似物，諸如硫代磷酸酯及硫酯，呈單鏈形式或雙鏈螺旋。雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA螺旋係可能的。術語核酸分子及尤其DNA或RNA分子僅僅係指分子之一級及二級結構，且不將其限於任何特定三級形式。因此，此術語包括尤其在線性或環狀DNA分子(例如限制片段)、質體、超捲曲DNA及染色體中發現之雙鏈DNA。在論述特定雙鏈DNA分子之結構時，本文中序列可根據僅僅假設序列沿著DNA之非轉錄鏈(亦即具有與mRNA同源之序列的鏈)呈5’至3’方向的正常約定來描述。「重組DNA分子」為經歷分子生物學操控之DNA分子。DNA包括(但不限於)cDNA、基因組DNA、質體DNA、合成DNA及半合成DNA。本發明之「核酸組合物」包含如本文所述之一或多種核酸。
如本文所用，「編碼區」或「編碼序列」為多核苷酸之一部分，其由可轉譯成胺基酸之密碼子組成。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)通常不轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區之一部分，然而，例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子及其類似物之任何側接序列並非編碼區之一部分。編碼區之邊界通常由編碼所產生之多肽之胺基端的5’端之起始密碼子及編碼所產生之多肽之羧基端的3’端之轉譯起始密碼子決定。本發明之兩個或更多個編碼區可存在於單個多核苷酸構築體中，例如存在於單個載體上，或存在於分開之多核苷酸構築體中，例如存在於分開(不同)之載體上。由此可見單個載體可含有僅僅單個編碼區，或包含兩個或更多個編碼區。
由哺乳動物細胞分泌之某些蛋白質與分泌信號肽有關，一旦生長中之蛋白質鏈開始跨過粗糙型內質網輸出，則分泌信號肽自成熟蛋白質裂解。本領域之一般技術人員清楚，信號肽一般與多肽之N端融合，且自完整或「全長」多肽裂解，產生多肽之分泌或「成熟」形式。在某些實施例中，天然信號肽或保留指導可操作地與其締合之多肽分泌之能力的該序列之功能衍生物。可替代地，可使用異源哺乳動物信號肽，例如人類組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶信號肽或其功能衍生物。
術語「下游」係指相對於參考核苷酸序列位於3’之核苷酸序列。在某些實施例中，下游核苷酸序列涉及在轉錄起始點後之序列。舉例而言，基因之轉譯起始密碼子位於轉錄開始位點之下游。
術語「上游」係指相對於參考核苷酸序列位於5’之核苷酸序列。在某些實施例中，上游核苷酸序列涉及位於編碼區或轉錄起始點之5’側的序列。舉例而言，大部分啟動子位於轉錄起始位點之上游。
如本文所用，術語「基因調控區」或「調控區」係指位於編碼區上游(5’非編碼序列)、內部或下游(3’非編碼序列)且影響相關編碼區之轉錄、RNA加工、穩定性或轉譯的核苷酸序列。調控區可包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結合位點及莖環結構。若編碼區意欲在真核細胞中表現，則聚腺苷酸化信號及轉錄終止序列將通常相對於編碼序列位於3’。
編碼例如多肽之基因產物的多核苷酸可包括啟動子及/或可操作地與一或多個編碼區締合之其他表現(例如轉錄或轉譯)控制元件。在可操作之締合中，例如多肽之基因產物的編碼區與一或多個調控區以將基因產物之表現置於調控區影響或控制下的方式締合。舉例而言，若對啟動子功能之誘導引起編碼由編碼區編碼之基因產物之mRNA的轉錄，且若啟動子與編碼區之間的連接性質不干擾啟動子指導基因產物表現之能力或干擾DNA模板轉錄之能力，則編碼區與啟動子「可操作地締合」。除啟動子之外，例如強化子、操縱子、阻遏子及轉錄終止信號之其他表現控制元件亦可操作地與編碼區締合以指導基因產物之表現。
「轉錄控制序列」係指提供編碼序列在宿主細胞中表現之DNA調控序列，諸如啟動子、強化子、終止子及其類似物。本領域之技術人員已知多種轉錄控制區域。此等包括不限於在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區，諸如但不限於來自巨細胞病毒(即刻早期啟動子，結合內含子-A)、猿猴病毒40(早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞氏肉瘤病毒)之啟動子及強化子區段。其他轉錄控制區域包括源自於脊椎動物基因之區域，諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-球蛋白以及能夠控制真核細胞中基因表現之其他序列。其他合適轉錄控制區包括組織特異性啟動子及強化子以及淋巴因子誘導型啟動子(例如干擾素或介白素誘導型啟動子)。
類似地，本領域之一般技術人員已知多種轉譯控制元件。此等包括但不限於核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子以及源自細小核糖核酸病毒之元件(尤其內部核糖體進入位點或IRES，亦稱CITE序列)。
如本文所用之術語「表現」係指多核苷酸產生例如RNA或多肽之基因產物的過程。其包括不限於多核苷酸轉錄成信使RNA(mRNA)、轉移RNA(tRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA)或任何其他RNA產物，以及mRNA轉譯成多肽。表現產生「基因產物」。如本文所用，基因產物可為核酸，例如由基因轉錄產生之信使RNA，或者為自轉錄物轉譯而來之多肽。本文所述之基因產物進一步包括具有例如聚腺苷酸化或剪接之轉錄後修飾之核酸，或具有例如甲基化、糖基化、添加脂質、與其他蛋白質子單元締合或蛋白水解裂解之轉譯後修飾之多肽。如本文所用之術語「產量」係指由基因表現產生之多肽之量。
「載體」係指用於選殖及/或轉移核酸至宿主細胞中之任何媒劑。載體可為複製子，另一核酸區段可附接至其，從而複製所附接之區段。「複製子」係指在活體內充當自主複製單元，亦即能夠在自己控制下複製的任何遺傳元件(例如質體、噬菌體、黏粒、染色體、病毒)。術語「載體」包括用於在活體外、離體或活體內將核酸引入至細胞中之病毒與非病毒媒劑。此項技術中已知且使用大量載體，例如質體、經修飾之真核病毒或經修飾之細菌病毒。可藉由將適當多核苷酸片段接合至具有互補黏性末端之所選載體來實現多核苷酸插入合適載體中。
載體可經工程改造以編碼用於選擇或鑑別併有載體之細胞的可選擇標記物或報導分子。可選擇標記物或報導分子之表現允許鑑別及/或選擇併有且表現載體上所含之其他編碼區的宿主細胞。本領域中已知及使用之可選擇標記物基因之實例包括：提供安比西林(ampicillin)、鏈黴素(streptomycin)、慶大黴素(gentamycin)、卡那黴素
(kanamycin)、潮黴素(hygromycin)、雙丙胺磷(bialaphos)除草劑、磺醯胺及其類似物之抗性的基因；及用作表型標記物之基因，亦即花青素調控基因、異戊基轉移酶基因及其類似基因。本領域中已知及使用之報導分子之實例包括：螢光素酶(Luc)、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡萄糖醛酸苷酶(Gus)及其類似物。可選擇標記物亦可視為報導分子。
術語「可選擇標記物」係指能夠基於標記物基因之作用進行選擇的鑑別因子、通常抗生素或化學抗性基因，亦即抗生素抗性、除草劑抗性、比色標記物、酶、螢光標記物及其類似物，其中該作用用於追蹤所關注核酸之遺傳及/或鑑別已遺傳所關注之核酸的細胞或生物體。本領域中已知及使用之可選擇標記物基因之實例包括：提供安比西林、鏈黴素、慶大黴素、卡那黴素、潮黴素、雙丙胺磷除草劑、磺醯胺及其類似物之抗性的基因；及用作表型標記物之基因，亦即花青素調控基因、異戊基轉移酶基因及其類似基因。
術語「報導基因」係指編碼能夠基於報導基因之作用鑑別之鑑別因子的核酸，其中該作用用於追蹤所關注核酸之遺傳，鑑別已遺傳所關注核酸之細胞或生物體，及/或量測基因表現誘導或轉錄。本領域中已知及使用之報導基因之實例包括：螢光素酶(Luc)、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡萄糖醛酸苷酶(Gus)及其類似物。可選擇標記物基因亦可視為報導基因。
「啟動子」及「啟動子序列」可互換使用且係指能夠控制編碼序列或功能RNA表現之DNA序列。一般而言，編碼序列相對於啟動子序列位於3’。啟動子可整體源自天然基因，或由源自於在自然界中發現之不同啟動子的不同元件構成，或甚至包含合成DNA區段。本領域之技術人員應瞭解不同啟動子可指導基因在不同組織或細胞類型中或在不同發育階段或回應於不同環境或生理條件之表現。引起基因大部分時間在大部分細胞類型中表現之啟動子通常稱為「組成型啟動子」。引起基因在特定細胞類型中表現之啟動子通常稱為「細胞特異性啟動子」或「組織特異性啟動子」。引起基因在特定發育或細胞分化階段表現之啟動子通常稱為「發育特異性啟動子」或「細胞分化特異性啟動子」。誘導及引起基因在用誘發啟動子之藥劑、生物分子、化學物質、配位體、光或其類似物暴露或處理之後表現的啟動子通常稱為「誘導型啟動子」或「可調控啟動子」。進一步認識到因為在大部分情況下調控序列之確切邊界尚未完全界定，所以不同長度之DNA片段可具有一致啟動子活性。
啟動子序列通常在其3’端由轉錄起始位點限制，且向上游延伸(5’方向)以包括在超過背景可偵測之水準下起始轉錄所需的最小數目之鹼基或元件。在啟動子序列內將發現轉錄起始位點(宜例如藉由用核酸酶S1定位來界定)以及負責RNA聚合酶結合之蛋白結合域(一致序列)。
術語「限制性核酸內切酶」及「限制酶」可互換使用且係指在雙鏈DNA內之特定核苷酸序列內結合且切割之酶。
術語「質體」係指經常運載並非細胞中心代謝一部分之基因的染色體外元件，且通常呈圓形雙鏈DNA分子形式。此類元件可為自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，係線性、圓形或超捲曲的，屬於單鏈或雙鏈DNA或RNA，源自任何來源，其中許多核苷酸序列已接合或重組成能夠將所選基因產物之啟動子片段及DNA序列以及適當3’未轉譯序列引入細胞中的獨特結構。
「選殖載體」係指作為連續複製且包含複製起點之核酸之單元長度的「複製子」，諸如質體、噬菌體或黏粒，另一核酸區段可附接至其，從而複製所附接之區段。某些選殖載體能夠在例如細菌之一種細胞類型中複製且在例如真核細胞之另一細胞類型中表現。選殖載體通常包含一或多個可用於選擇包含載體之細胞的序列及/或一或多個用於插入所關注之核酸序列的多選殖位點。
術語「表現載體」係指經設計以在插入宿主細胞後使所插入之核酸序列表現的媒劑。所插入之核酸序列與如上所述之調控區可操作地締合。
載體藉由本領域中熟知之方法，例如轉染、電穿孔、微量注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、脂質體轉染(溶酶體融合)、使用基因槍或DNA載體輸送來引入至宿主細胞中。
如本文所用，「培養(Culture、to culture及culturing)」意謂在允許細胞生長或分裂或維持細胞處於活的狀態下之活體外條件下培育細胞。如本文所用，「培養細胞」意謂在活體外繁殖之細胞。
如本文所用，術語「多肽」意欲涵蓋單數「多肽」以及複數「多肽」，且係指包含由醯胺鍵(亦稱肽鍵)線性連接之單體(胺基酸)構成的分子。術語「多肽」係指具有兩個或更多個胺基酸之任何鏈，且並非指產物之特定長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或任何其他用於指具有兩個或更多個胺基酸之鏈的術語包括在「多肽」之定義內，且術語「多肽」可代替或與此等術語中之任一術語互換使用。術語「多肽」亦欲指多肽之表現後修飾之產物，該等修飾包括不限於糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護基團/阻斷基團衍生化、蛋白水解裂解或藉由非天然存在之胺基酸修飾。多肽可源自於天然生物來源或藉由重組技術產生，但不一定自指定核酸序列轉譯。其可以任何方式，包括藉由化學合成來產生。
術語「胺基酸」包括丙胺酸(Ala或A)；精胺酸(Arg或R)；天冬醯胺酸(Asn或N)；天冬胺酸(Asp或D)；半胱胺酸(Cys或C)；麩醯胺酸(Gln或Q)；麩胺酸(Glu或E)；甘胺酸(Gly或G)；組胺酸(His或H)；異白胺酸(Ile或I)：白胺酸(Leu或L)；離胺酸(Lys或K)；甲硫胺酸(Met或M)；苯丙胺酸(Phe或F)；脯胺酸(Pro或P)；絲胺酸(Ser或S)；蘇胺酸(Thr或T)；色胺酸(Trp或W)；酪胺酸(Tyr或Y)；及纈胺酸(Val或V)。非傳統胺基酸亦在本發明之範圍內且包括正白胺酸、鳥胺酸、正纈胺酸、高絲胺酸及其他胺基酸殘基類似物，諸如Ellman等人 Meth. Enzym. 202:301-336(1991)中描述之彼等胺基酸殘基類似物。為產生此類非天然存在之胺基酸殘基，可使用Noren等人 Science 244:182(1989)及Ellman等人 , 上述之程序。簡言之，此等程序包括用非天然存在之胺基酸殘基化學上活化抑制tRNA，接著進行RNA之活體外轉錄及轉譯。非傳統胺基酸之引入亦可使用本領域中已知之肽化學實現。如本文所用，術語「極性胺基酸」包括具有零淨電荷，但在其側鏈之不同部分(例如M、F、W、S、Y、N、Q、C)中具有非零部分電荷的胺基酸。此等胺基酸可參與疏水性相互作用及靜電相互作用。如本文所用，術語「帶電胺基酸」包括可在其側鏈(例如R、K、H、E、D)上具有非零淨電荷之胺基酸。此等胺基酸可參與疏水性相互作用及靜電相互作用。
本發明中亦包括多肽之片段或變異體及其任何組合。當提及本發明之多肽結合域或結合分子時術語「片段」或「變異體」包括保留參考多肽之至少一些性質(例如對FcRn結合域或Fc變異體之FcRn結合親和力，或FVIII變異體之凝血活性或FVIII對VWF片段之結合活性)的任何多肽。除本文中其他地方論述之特定抗體片段之外，多肽之片段亦包括蛋白水解片段以及缺失片段，但不包括天然存在之全長多肽(或成熟多肽)。本發明之多肽結合域或結合分子之變異體包括如上所述之片段，以及胺基酸序列由於胺基酸取代、缺失或插入而改變的多肽。變異體可天然存在或非天然存在。非天然存在之變異體可使用本領域已知之誘變技術產生。變異多肽可包含保守或非保守之胺基酸取代、缺失或添加。
「保守之胺基酸取代」為其中胺基酸殘基經具有相似側鏈之胺基酸殘基替換的胺基酸取代。本領域中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電之極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸經來自相同側鏈家族之另一胺基酸替換，則取代視為保守的。在另一實施例中，一串胺基酸可經側鏈家族成員之次序及/或組成不同的一串結構上相似的胺基酸保守地替換。
如本領域中已知之術語「一致性百分比」係兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個多核苷酸序列之間如藉由比較該等序列所確定的關係。在本領域中，「一致性」亦意謂多肽或多核苷酸序列(視情況)之間如藉由此類序列串之間的匹配所確定的序列相關度。「一致性」容易藉由已知方法計算，該等方法包括但不限於以下中所述之方法：Computational Molecular Biology (Lesk, A. M.編輯)Oxford University Press, New York(1988)；Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W.編輯)Academic Press, New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編輯)Humana Press, New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G.編輯)Academic Press(1987)；及Sequence Analysis Primer (Gribskov, M.及Devereux, J.編輯)Stockton Press, New York(1991)。測定一致性之較佳方法經設計以使所測試之序列之間進行最佳匹配。測定一致性之方法編譯成公眾可獲得之電腦程式。序列比對及一致性百分比計算可使用如下序列分析軟體進行：LASERGENE生物信息學計算套件之Megalign程式(DNASTAR公司, Madison, WI)、GCG程式套件(Wisconsin Package 9.0版, Genetics Computer Group(GCG), Madison, WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403(1990))及DNASTAR(DNASTAR公司, 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA)。在本申請案之上下文內，應瞭解在序列分析軟體用於分析之情況下，除非另作說明，否則分析結果將基於所提及程式之「預設值」。如本文所用，「預設值」將意謂最初初始化時最初軟體負載之任何數值或參數集合。為測定本發明之優化BDD FVIII序列與參考序列之間的一致性百分比，僅僅參考序列中與本發明之優化BDD FVIII序列對應的核苷酸用於計算一致性百分比。舉例而言，當將含有B結構域之全長FVIII核苷酸序列與本發明之優化B結構域缺失(BDD)FVIII核苷酸序列比較時，包括A1、A2、A3、C1及C2結構域之比對部分將用於計算一致性百分比。全長FVIII序列之部分中編碼B結構域之核苷酸(在比對中將引起大「缺口」)不算作錯配。另外，在測定本發明之優化BDD FVIII序列或其指定部分(例如SEQ ID NO:3之核苷酸58-2277及2320-4374)與參考序列之間的一致性百分比時，藉由將匹配核苷酸之數目除以優化BDD-FVIII序列或其指定部分之完整序列中的核苷酸總數來計算一致性百分比，如本文中所敍述。
如本文所用，藉由比對本發明之優化BDD FVIII序列以最大化與參考FVIII序列之一致性來鑑別「與本發明之優化BDD FVIII序列中之核苷酸對應的核苷酸」。用於鑑別參考FVIII序列中之同等胺基酸之編號係基於用於鑑別本發明之優化BDD FVIII序列中之對應胺基酸的編號。
「融合」或「嵌合」蛋白包含連接於第二胺基酸序列之第一胺基酸序列，在自然界中第一胺基酸序列與第二胺基酸序列不天然連接。通常存在於分開蛋白質中之胺基酸序列可一起彙集在融合多肽中，或通常存在於相同蛋白質中之胺基酸序列可呈新的排列方式置於融合多肽中，例如本發明之因子VIII結構域與Ig Fc結構域之融合。融合蛋白例如藉由化學合成，或藉由產生及轉譯其中肽區域以所需關係進行編碼之多核苷酸來產生。嵌合蛋白可進一步包含藉由共價鍵、非肽鍵或非共價鍵與第一胺基酸序列締合之第二胺基酸序列。
如本文所用，術語「插入位點」係指FVIII多肽或其片段、變異體或衍生物中緊鄰異源部分可插入之位置上游的位置。「插入位點」表示為編號，該編號為成熟天然FVIII(SEQ ID NO: 15；圖11A)中插入位點所對應之胺基酸的編號，其緊鄰插入位置之N端。舉例而言，短語「a3在與SEQ ID NO: 15之胺基酸1656對應的插入位點處包含異源部分」指示異源部分位於與SEQ ID NO: 15之胺基酸1656及胺基酸1657對應之兩個胺基酸之間。
如本文所用，短語「緊鄰胺基酸之下游」係指緊靠胺基酸之末端羧基之位置。類似地，短語「緊鄰胺基酸之上游」係指緊靠胺基酸之末端胺基之位置。
如本文所用，術語「插入(inserted)」、「插入(is inserted)」、「插入……中(inserted into)」或語法相關術語係指相對於在天然成熟人類FVIII中之類似位置，異源部分在重組FVIII多肽中之位置。如本文所用，該等術語係指重組FVIII多肽相對於天然成熟人類FVIII之特徵，且並非指示、暗示或推斷製造重組FVIII多肽之任何方法或製程。
如本文所用，術語「半衰期」係指特定多肽在活體內之生物半衰期。半衰期可由向個體投與之一半量自循環中及/或動物中之其他組織清除所需的時間來表示。當既定多肽之清除曲線作為時間函數建構時，曲線通常為具有快速α-相及更長β-相的雙相。α相通常表示所投與之Fc多肽在血管內空間與血管外空間之間的平衡，且部分由多肽尺寸決定。β-相通常表示多肽在血管內空間中之分解代謝。在一些實施例中，FVIII及包含FVIII之嵌合蛋白為單相，且因此不具有α相，而僅僅具有單一β相。因此，在某些實施例中，如本文所用之術語半衰期係指多肽在β相中之半衰期。
如本文所用之術語「連接」係指第一胺基酸序列或核苷酸序列分別共價或非共價地與第二胺基酸序列或核苷酸序列接合。第一胺基酸或核苷酸序列可直接與第二胺基酸或核苷酸序列接合或並置，或可替代地，間插序列可共價接合第一序列與第二序列。術語「連接」不僅意謂第一胺基酸序列與第二胺基酸序列在C端或N端之融合，而且亦包括整個第一胺基酸序列(或第二胺基酸序列)插入第二胺基酸序列(或相對應地第一胺基酸序列)中之任兩個胺基酸中。在一個實施例中，第一胺基酸序列可藉由肽鍵或連接子連接於第二胺基酸序列。第一核苷酸序列可藉由磷酸二酯鍵或連接子連接於第二核苷酸序列。連接子可為肽或多肽(對於多肽鏈)或核苷酸或核苷酸鏈(對於核苷酸鏈)或任何化學部分(對於多肽鏈與多核苷酸鏈)。術語「連接」亦由連字符(-)指示。
如本文所用，術語「與……締合」係指在第一胺基酸鏈與第二胺基酸鏈之間形成的共價或非共價鍵。在一個實施例中，術語「與……締合」意謂共價、非肽鍵或非共價鍵。此締合可藉由冒號，亦即(:)指示。在另一實施例中，其意謂除肽鍵外之共價鍵。舉例而言，胺基酸半胱胺酸包含可與第二半胱胺酸殘基上之硫醇基形成二硫鍵或橋的硫醇基。在大部分天然存在之IgG分子中，CH1及CL區由二硫鍵締合，且兩個重鏈由處於與使用Kabat編號系統(位置226或229，EU編號系統)之239及242對應的位置處的兩個二硫鍵締合。共價鍵之實例包括(但不限於)肽鍵、二硫鍵、σ鍵、π鍵、δ鍵、糖苷鍵、不可知鍵、彎鍵、偶極鍵、π反向鍵、雙鍵、三鍵、四鍵、五鍵、六鍵、共軛、超共軛、芳香性、哈普托數(hapticity)或反鍵。非共價鍵之非限制性實例包括離子鍵(例如陽離子-π鍵或鹽鍵)、金屬鍵、氫鍵(例如二氫鍵、二氫複合物、低障壁氫鍵或對稱氫鍵)、凡得瓦爾力(van der Walls force)、倫敦色散力(London dispersion force)、機械鍵、鹵鍵、親金相互作用、插入、堆疊、熵力或化學極性。
本文中所用之「單體-二聚體混雜物」係指包含藉由二硫鍵彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈的嵌合蛋白，其中第一鏈包含例如因子VIII之凝血因子及第一Fc區，且第二鏈包含第二Fc區、基本上由其組成或由其組成，無凝血因子。因此單體-二聚體混雜構築體為包含僅僅具有凝血因子之單體態樣及具有兩個Fc區之二聚體態樣的混雜物。
如本文所用之止血意謂出血或流血停止或減慢；或穿過血管或身體部分之血流停止或減慢。
如本文所用之止血病症意謂一種特徵為自發地或作為外傷之結果，由於形成血纖維蛋白凝塊之能力減弱或不能形成血纖維蛋白凝塊，而有流血傾向的遺傳性或獲得性病狀。此類病症之實例包括血友病。三種主要形式為A型血友病(因子VIII缺乏)、B型血友病(因子IX缺乏或「克里斯馬斯氏病(Christmas disease)」及C型血友病(因子XI缺乏、輕度出血傾向)。其他止血病症包括例如馮威里氏病、因子XI缺乏症(PTA缺乏症)、因子XII缺乏症、血纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII缺乏或結構異常、伯-蘇氏症候群(Bernard-Soulier syndrome)(其為GPIb缺陷或缺乏)。GPIb為vWF受體，可有缺陷且引起最初凝塊形成(最初止血)缺乏及出血趨向增加)，及格蘭茲曼與納爾格利血小板無力症(thrombasthenia of Glanzman and Naegeli)(格蘭茲曼血小板無力症(Glanzmann thrombasthenia))。在肝衰竭(急性及慢性形式)中，肝臟產生凝血因子不足；此可增加出血風險。
包含本發明之經分離之核酸分子的慢病毒載體可預防性使用。如本文所用，術語「預防性治療」係指在出血事件前投與分子。在一個實施例中，需要通用止血劑之個體進行或即將進行外科手術。舉例而言，本發明之慢病毒載體可在外科手術之前或之後作為預防藥投與。本發明之慢病毒載體可在外科手術期間或之後投與以控制急性出血事件。外科手術可包括(但不限於)肝移植、肝切除、牙科手術或幹細胞移植。
本發明之慢病毒載體亦用於按需治療。術語「按需治療」係指根據出血事件之症狀或在可引起出血之活動前投與本文揭示之慢病毒載體。在一個態樣中，可在開始出血時，諸如在損傷之後，或在預計出血時，諸如在外科手術之前，給與個體按需治療。在另一個態樣中，可在諸如碰撞性運動的增加出血風險之活動之前給與按需治療。
如本文所用，術語「急性出血」係指不管根本原因如何之出血事件。舉例而言，個體可患有外傷、尿毒症、遺傳性出血病症(例如因子VII缺乏症)、血小板病症或由針對凝血因子之抗體之發展引起的抗性。
如本文所用之治療(Treat、treatment、treating)係指例如疾病或病狀之嚴重程度降低；疾病過程之持續時間減少；一或多種與疾病或病狀相關之症狀得到改善；為患有疾病或病狀之個體提供有益作用，無需治癒疾病或病狀；或預防一或多種與疾病或病狀相關之症狀。在一個實施例中，術語「治療(treating或treatment)」意謂藉由投與本發明之慢病毒載體維持個體中FVIII穀水準為至少約1 IU/dL、2 IU/dL、3 IU/dL、4 IU/dL、5 IU/dL、6 IU/dL、7 IU/dL、8 IU/dL、9 IU/dL、10 IU/dL、11 IU/dL、12 IU/dL、13 IU/dL、14 IU/dL、15 IU/dL、16 IU/dL、17 IU/dL、18 IU/dL、19 IU/dL或20 IU/dL。在另一實施例中，治療意謂維持FVIII穀水準介於約1與約20 IU/dL、約2與約20 IU/dL、約3與約20 IU/dL、約4與約20 IU/dL、約5與約20 IU/dL、約6與約20 IU/dL、約7與約20 IU/dL、約8與約20 IU/dL、約9與約20 IU/dL或約10與約20 IU/dL之間。疾病或病狀之治療亦可包括維持個體中FVIII活性處於可與非血友病個體中FVIII活性之至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%相當的水準下。在一個實施例中，術語「治療」意謂藉由投與本發明之慢病毒載體維持個體中FVIII穀水準為至少約30 IU/dL、40 IU/dL、50 IU/dL、60 IU/dL、70 IU/dL、80 IU/dL、90 IU/dL、100 IU/dL、110 IU/dL、120 IU/dL、130 IU/dL、140 IU/dL或150 IU/dL。在另一實施例中，治療意謂維持FVIII穀水準介於約10與約20 IU/dL、約20與約23 IU/dL、約30與約40 IU/dL、約40與約50 IU/dL、約50與約60 IU/dL、約60與約70 IU/dL、約70與約80 IU/dL、約80與約90 IU/dL、約90與約100 IU/dL、約110與約120 IU/dL、約120與約130 IU/dL、約130與約140 IU/dL或約140與約150 IU/dL之間。疾病或病狀之治療亦可包括維持個體中FVIII活性處於可與非血友病個體中FVIII活性之至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%或150%相當的水準下。治療所需之最低谷水準可藉由一或多種已知方法量測且可針對每個人進行調整(增加或減少)。
如本文所用，「投與」意謂經由醫藥學上可接受之途徑給與個體醫藥學上可接受之編碼因子VIII之核酸分子、因子VIII多肽或包含本發明之編碼因子VIII之核酸分子的載體。投藥途徑可為靜脈內，例如靜脈內注射及靜脈內輸注。其他投藥途徑包括例如皮下、肌肉內、經口、經鼻及經肺投與。核酸分子、多肽及載體可作為包含至少一種賦形劑之醫藥組合物的一部分投與。
如本文所用，短語「有需要之個體」包括將得益於本發明之核酸分子、多肽或載體投與，例如改善止血之個體，諸如哺乳動物個體。在一個實施例中，個體包括(但不限於)患有血友病之個體。在另一實施例中，個體包括(但不限於)已發展FVIII抑制劑，因此需要繞過治療之個體。個體可為成年人或未成年人(例如小於12歲)。
如本文所用，術語「凝血因子」係指天然存在或重組產生之預防個體中出血事件或減少出血事件之持續時間的分子或其類似物。換言之，其意謂具有促凝血活性之分子，亦即引起血纖維蛋白原轉變成不溶性血纖維蛋白網，使血液凝結或凝固。「可活化凝血因子」為呈非活性形式(例如呈酶原形式)之能夠轉變成活性形式的凝血因子。
如本文所用之凝血活性意謂參與生物化學反應級聯之能力，其在血纖維蛋白凝塊形成時達到頂點及/或降低流血或出血事件之嚴重程度、持續時間或頻率。
如本文所用，術語「異源」或「外源」係指通常在給定背景下，例如在細胞或多肽中未發現之此類分子。舉例而言，外源或異源分子可例如藉由轉染或其他遺傳工程改造形式引入細胞中且僅在操控細胞之後存在，或異源胺基酸序列可存在於天然未發現其之蛋白質中。
如本文所用，術語「異源核苷酸序列」係指在既定多核苷酸序列下非天然存在之核苷酸序列。在一個實施例中，異源核苷酸序列編碼能夠延長FVIII半衰期之多肽。在另一實施例中，異源核苷酸序列編碼增加FVIII之流體動力學半徑之多肽。在其他實施例中，異源核苷酸序列編碼改善FVIII之一或多種藥物動力學性質而不顯著影響其生物活性或功能(例如其促凝血活性)的多肽。在一些實施例中，FVIII藉由連接子連接或連結於由異源核苷酸序列編碼之多肽。由異源核苷酸序列編碼之多肽部分的非限制性實例包括免疫球蛋白恆定區或其一部分、白蛋白或其片段、白蛋白結合部分、轉鐵蛋白、美國專利申請案第20100292130號之PAS多肽、HAP序列、轉鐵蛋白或其片段、人類絨毛膜促性腺激素之β子單元之C端肽(CTP)、白蛋白結合小分子、XTEN序列、FcRn結合部分(例如結合於FcRn之完整Fc區或其一部分)、單鏈Fc區(ScFc區，例如如US 2008/0260738、WO 2008/012543或WO 2008/1439545中所述)、聚甘胺酸連接子、聚絲胺酸連接子、選自甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)之兩種類型胺基酸之6-40個胺基酸的具有小於50%至超過50%之不同程度二級結構的肽及短多肽或其兩個或更多個組合。在一些實施例中，由異源核苷酸序列編碼之多肽連接於非多肽部分。非多肽部分之非限制性實例包括聚乙二醇(PEG)、白蛋白結合小分子、聚唾液酸、羥乙基澱粉(HES)、其衍生物或其任何組合。
如本文所用，術語「Fc區」定義為與天然Ig之Fc區對應，亦即如由兩個重鏈之相應Fc結構域之二聚締合所形成的多肽部分。天然Fc區與另一Fc區形成同源二聚體。相比之下，如本文所用之術語「基因融合之Fc區」或「單鏈Fc區」(scFc區)係指由基因連接在單一多肽鏈內(亦即在單一相鄰遺傳序列中編碼)之Fc結構域構成的合成二聚Fc區。
在一個實施例中，「Fc區」係指在鉸鏈區中緊鄰木瓜蛋白酶裂解位點(亦即IgG中之殘基216，取重鏈恆定區之第一殘基為114)上游開始且終止於抗體之C端的單一Ig重鏈部分。因此，完整Fc結構域包含至少一個鉸鏈結構域、CH2結構域及CH3結構域。
視Ig同型而定，Ig恆定區之Fc區可包括CH2、CH3及CH4結構域以及鉸鏈區。包含Ig之Fc區之嵌合蛋白給予嵌合蛋白若干合乎需要之性質，包括增加之穩定性、增加之血清半衰期(參見Capon等人, 1989,Nature 337:525)以及結合於Fc受體，諸如新生Fc受體(FcRn)(美國專利第6,086,875號、第6,485,726號、第6,030,613號；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，以引用之方式整體併入本文中。
「參考核苷酸序列」在本文中用於與本發明之核苷酸序列比較時，係除了與FVIII序列對應之部分未優化外，基本上與本發明之核苷酸序列一致的多核苷酸序列。舉例而言，由SEQ ID NO: 1之密碼子優化之BDD FVIII及在3’末端連接於SEQ ID NO: 1之編碼單鏈Fc區之異源核苷酸序列組成的核酸分子的參考核苷酸序列為由SEQ ID NO: 16之原始(或「親本」)BDD FVIII(圖1I)及在3’末端連接於SEQ ID NO: 16之編碼單鏈Fc區之一致異源核苷酸序列組成的核酸分子。
如本文所用之「密碼子適應指數」係指密碼子使用偏好之量度。密碼子適應指數(CAI)量測編碼既定蛋白質之基因序列相對於參考基因集合之偏差(Sharp PM及Li WH,Nucleic Acids Res . 15(3):1281-95(1987))。CAI藉由確定該基因序列長度上與各密碼子相關之權重的幾何平均數(以密碼子量測)來計算：
對於每個胺基酸，其每個密碼子之權重計算為觀察到之密碼子頻率(fi)與該胺基酸之同義密碼子之頻率(fj)之間的比率：
如本文所用，關於核苷酸序列之術語「優化」係指如下編碼多肽之多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列已突變以增強該多核苷酸序列之性質。在一些實施例中，進行優化以增加轉錄水準、增加轉譯水準、增加穩態mRNA水準、增加或減少諸如通用轉錄因子之調控蛋白之結合、增加或減少剪接或增加由多核苷酸序列產生之多肽的產率。多核苷酸序列為求優化而可進行之改變的實例包括密碼子優化、G/C含量優化、移除重複序列、移除富含AT之元件、移除隱藏剪接位點、移除抑制轉錄或轉譯之順式作用元件、添加或移除多聚-T或多聚-A序列、在轉錄起始位點添加增強轉錄之序列(諸如科紮克一致序列(Kozak consensus sequences))、移除可形成莖環結構之序列、移除去穩定序列及其兩個或更多個組合。

II. FVIII 慢病毒基因療法
已對體細胞基因療法作為出血病症及尤其A型血友病之可能治療進行探索。基因療法為一種尤其有吸引力之血友病治療，因為其能夠在單次投與編碼FVIII之載體之後經由連續內源性產生FVIII來治癒該疾病。A型血友病非常適合於基因替代方法，因為其臨床表現完全可歸因於在血漿中微量(200 ng/ml)循環之單一基因產物(FVIII)的缺乏。
慢病毒載體作為基因運載媒劑正引人注意，因為其容量大且具有經由整合維持轉殖基因表現之能力。已在許多離體細胞療法臨床方案中評估慢病毒載體，其具有有前景之功效及安全性概況。
藉由提供包含顯示在個體中表現增加且在用於基因療法方法中時可能產生更大治療功效的密碼子優化之FVIII序列的慢病毒載體，本發明滿足本領域中之重要需求。本發明之實施例係針對包含一或多種編碼本文所述之具有FVIII活性之多肽的密碼子優化之核酸分子的慢病毒載體、包含慢病毒載體之宿主細胞(例如肝細胞)及使用所揭示之慢病毒載體的方法(例如使用本文揭示之慢病毒載體治療出血病症)。
一般而言，本文揭示之治療方法包括投與包含包括至少一種密碼子優化之編碼FVIII凝血因子之核酸序列的核酸分子的慢病毒載體，其中該編碼FVIII凝血因子之核酸序列可操作地連接於合適表現控制序列，在一些實施例中，該等表現控制序列併入慢病毒載體(例如複製缺陷型慢病毒載體)中。
本發明提供治療有需要之個體之出血病症(例如A型血友病)的方法，該等方法包括向該個體投與至少一個劑量之5×1010 (TU/kg)或更少(或109 TU/kg或更少或者108 TU/kg或更少)之慢病毒載體，該慢病毒載體包含包括編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的經分離之核酸分子，其中該核苷酸序列具有：
(i) 與SEQ ID NO: 1之核苷酸58-2277及2320-4374至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；
(ii) 與SEQ ID NO: 2之核苷酸58-2277及2320-4374至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；
(iii) 與SEQ ID NO: 70之核苷酸58-2277及2320-4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；
(iv) 與SEQ ID NO: 71之核苷酸58-2277及2320-4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；
(v) 與SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-4374至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；
(vi) 與SEQ ID NO: 4之核苷酸58-2277及2320-4374至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；
(vii) 與SEQ ID NO: 5之核苷酸58-2277及2320-4374至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；
(viii) 與SEQ ID NO: 6之核苷酸58-2277及2320-4374至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；或
(ix) 或(i)至(viii)之任何組合。
本發明亦提供一種治療有需要之個體之出血病症(例如A型血友病)的方法，該等方法包括向該個體投與至少一個劑量之5×1010 或更少轉導單位/公斤(TU/kg)(或109 TU/kg或更少或者108 TU/kg或更少)之慢病毒載體，該慢病毒載體包含包括如下核苷酸序列之經分離之核酸分子，該核苷酸序列包含編碼因子VIII(FVIII)多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列；
(a) 其中該第一核酸序列具有：
(i) 與SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-1791至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；
(ii) 與SEQ ID NO: 4之核苷酸58-2277及2320-1791至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；
(iii) 與SEQ ID NO: 5之核苷酸58-1791至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；或
(iv) 與SEQ ID NO: 6之核苷酸58-1791至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；
(b) 其中該第二核苷酸序列具有：
(i) 與SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-2277及2320-4374至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；
(ii) 與SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-2277及2320-4374至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；
(iii) 與SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；或
(iv) 與SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；或
(c) (a)與(b)之任何組合；及
其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性。
在一些實施例中，劑量為約5.0×1010 TU/kg、約4.9×1010 TU/kg、約4.8×1010 TU/kg、約4.7×1010 TU/kg、約4.6×1010 TU/kg、約4.5×1010 TU/kg、約4.4×1010 TU/kg、約4.3×1010 TU/kg、約4.2×1010 TU/kg、約4.1×1010 TU/kg、約4.0×1010 TU/kg、約3.9×1010 TU/kg、約3.8×1010 TU/kg、約3.7×1010 TU/kg、約3.6×1010 TU/kg、約3.5×1010 TU/kg、約3.4×1010 TU/kg、約3.3×1010 TU/kg、約3.2×1010 TU/kg、約3.1×1010 TU/kg、約3.0×1010 TU/kg、約2.9×1010 TU/kg、約2.8×1010 TU/kg、約2.7×1010 TU/kg、約2.6×1010 TU/kg、約2.5×1010 TU/kg、約2.4×1010 TU/kg、約2.3×1010 TU/kg、約2.2×1010 TU/kg、約2.1×1010 TU/kg、約2.0×1010 TU/kg、約1.9×1010 TU/kg、約1.8×1010 TU/kg、約1.7×1010 TU/kg、約1.6×1010 TU/kg、約1.5×1010 TU/kg、約1.4×1010 TU/kg、約1.3×1010 TU/kg、約1.2×1010 TU/kg、約1.1×1010 TU/kg或約1.0×1010 TU/kg。
在一些實施例中，劑量為約9.9×109 TU/kg、約9.8×109 TU/kg、約9.7×109 TU/kg、約9.6×109 TU/kg、約9.5×109 TU/kg、約9.4×109 TU/kg、約9.3×109 TU/kg、約9.2×109 TU/kg、約9.1×109 TU/kg、約9.0×109 TU/kg、約8.9×109 TU/kg、約8.8×109 TU/kg、約8.7×109 TU/kg、約8.6×109 TU/kg、約8.5×109 TU/kg、約8.4×109 TU/kg、約8.3×109 TU/kg、約8.2×109 TU/kg、約8.1×109 TU/kg、約8.0×109 TU/kg、約7.9×109 TU/kg、約7.8×109 TU/kg、約7.7×109 TU/kg、約7.6×109 TU/kg、約7.5×109 TU/kg、約7.4×109 TU/kg、約7.3×109 TU/kg、約7.2×109 TU/kg、約7.1×109 TU/kg、約7.0×109 TU/kg、約6.9×109 TU/kg、約6.8×109 TU/kg、約6.7×109 TU/kg、約6.6×109 TU/kg、約6.5×109 TU/kg、約6.4×109 TU/kg、約6.3×109 TU/kg、約6.2×109 TU/kg、約6.1×109 TU/kg、約6.0×109 TU/kg、約5.9×109 TU/kg、約5.8×109 TU/kg、約5.7×109 TU/kg、約5.6×109 TU/kg、約5.5×109 TU/kg、約5.4×109 TU/kg、約5.3×109 TU/kg、約5.2×109 TU/kg、約5.1×109 TU/kg、約5.0×109 TU/kg、約4.9×109 TU/kg、約4.8×109 TU/kg、約4.7×109 TU/kg、約4.6×109 TU/kg、約4.5×109 TU/kg、約4.4×109 TU/kg、約4.3×109 TU/kg、約4.2×109 TU/kg、約4.1×109 TU/kg、約4.0×109 TU/kg、約3.9×109 TU/kg、約3.8×109 TU/kg、約3.7×109 TU/kg、約3.6×109 TU/kg、約3.5×109 TU/kg、約3.4×109 TU/kg、約3.3×109 TU/kg、約3.2×109 TU/kg、約3.1×109 TU/kg、約3.0×109 TU/kg、約2.9×109 TU/kg、約2.8×109 TU/kg、約2.7×109 TU/kg、約2.6×109 TU/kg、約2.5×109 TU/kg、約2.4×109 TU/kg、約2.3×109 TU/kg、約2.2×109 TU/kg、約2.1×109 TU/kg、約2.0×109 TU/kg、約1.9×109 TU/kg、約1.8×109 TU/kg、約1.7×109 TU/kg、約1.6×109 TU/kg、約1.5×109 TU/kg、約1.4×109 TU/kg. 約1.3×109 TU/kg、約1.2×109 TU/kg、約1.1×109 TU/kg或約1.0×109 TU/kg。
在一些實施例中，劑量為約9.9×108 TU/kg、約9.8×108 TU/kg、約9.7×108 TU/kg、約9.6×108 TU/kg、約9.5×108 TU/kg、約9.4×108 TU/kg、約9.3×108 TU/kg、約9.2×108 TU/kg、約9.1×108 TU/kg、約9.0×108 TU/kg、約8.9×108 TU/kg、約8.8×108 TU/kg、約8.7×108 TU/kg、約8.6×108 TU/kg、約8.5×108 TU/kg、約8.4×108 TU/kg、約8.3×108 TU/kg、約8.2×108 TU/kg、約8.1×108 TU/kg、約8.0×108 TU/kg、約7.9×108 TU/kg、約7.8×108 TU/kg、約7.7×108 TU/kg、約7.6×108 TU/kg、約7.5×108 TU/kg、約7.4×108 TU/kg、約7.3×108 TU/kg、約7.2×108 TU/kg、約7.1×108 TU/kg、約7.0×108 TU/kg、約6.9×108 TU/kg、約6.8×108 TU/kg、約6.7×108 TU/kg、約6.6×108 TU/kg、約6.5×108 TU/kg、約6.4×108 TU/kg、約6.3×108 TU/kg、約6.2×108 TU/kg、約6.1×108 TU/kg、約6.0×108 TU/kg、約5.9×108 TU/kg、約5.8×108 TU/kg、約5.7×108 TU/kg、約5.6×108 TU/kg、約5.5×108 TU/kg、約5.4×108 TU/kg、約5.3×108 TU/kg、約5.2×108 TU/kg、約5.1×108 TU/kg、約5.0×108 TU/kg、約4.9×108 TU/kg、約4.8×108 TU/kg、約4.7×108 TU/kg、約4.6×108 TU/kg、約4.5×108 TU/kg、約4.4×108 TU/kg、約4.3×108 TU/kg、約4.2×108 TU/kg、約4.1×108 TU/kg、約4.0×108 TU/kg、約3.9×108 TU/kg、約3.8×108 TU/kg、約3.7×108 TU/kg、約3.6×108 TU/kg、約3.5×108 TU/kg、約3.4×108 TU/kg、約3.3×108 TU/kg、約3.2×108 TU/kg、約3.1×108 TU/kg、約3.0×108 TU/kg、約2.9×108 TU/kg、約2.8×108 TU/kg、約2.7×108 TU/kg、約2.6×108 TU/kg、約2.5×108 TU/kg、約2.4×108 TU/kg、約2.3×108 TU/kg、約2.2×108 TU/kg、約2.1×108 TU/kg、約2.0×108 TU/kg、約1.9×108 TU/kg、約1.8×108 TU/kg、約1.7×108 TU/kg、約1.6×108 TU/kg、約1.5×108 TU/kg、約1.4×108 TU/kg、約1.3×108 TU/kg、約1.2×108 TU/kg、約1.1×108 TU/kg或約1.0×108 TU/kg。
在一些實施例中，劑量少於5.0×1010 TU/kg、少於4.9×1010 TU/kg、少於4.8×1010 TU/kg、少於4.7×1010 TU/kg、少於4.6×1010 TU/kg、少於4.5×1010 TU/kg、少於4.4×1010 TU/kg、少於4.3×1010 TU/kg、少於4.2×1010 TU/kg、少於4.1×1010 TU/kg、少於4.0×1010 TU/kg、少於3.9×1010 TU/kg、少於3.8×1010 TU/kg、少於3.7×1010 TU/kg、少於3.6×1010 TU/kg、少於3.5×1010 TU/kg、少於3.4×1010 TU/kg、少於3.3×1010 TU/kg、少於3.2×1010 TU/kg、少於3.1×1010 TU/kg、少於3.0×1010 TU/kg、少於2.9×1010 TU/kg、少於2.8×1010 TU/kg、少於2.7×1010 TU/kg、少於2.6×1010 TU/kg、少於2.5×1010 TU/kg、少於2.4×1010 TU/kg、少於2.3×1010 TU/kg、少於2.2×1010 TU/kg、少於2.1×1010 TU/kg、少於2.0×1010 TU/kg、少於1.9×1010 TU/kg、少於1.8×1010 TU/kg、少於1.7×1010 TU/kg、少於1.6×1010 TU/kg、少於1.5×1010 TU/kg、少於1.4×1010 TU/kg、少於1.3×1010 TU/kg、少於1.2×1010 TU/kg、少於1.1×1010 TU/kg或少於1.0×1010 TU/kg。
在一些實施例中，劑量少於9.9×109 TU/kg、少於9.8×109 TU/kg、少於9.7×109 TU/kg、少於9.6×109 TU/kg、少於9.5×109 TU/kg、少於9.4×109 TU/kg、少於9.3×109 TU/kg、少於9.2×109 TU/kg、少於9.1×109 TU/kg、少於9.0×109 TU/kg、少於8.9×109 TU/kg、少於8.8×109 TU/kg、少於8.7×109 TU/kg、少於8.6×109 TU/kg、少於8.5×109 TU/kg、少於8.4×109 TU/kg、少於8.3×109 TU/kg、少於8.2×109 TU/kg、少於8.1×109 TU/kg、少於8.0×109 TU/kg、少於7.9×109 TU/kg、少於7.8×109 TU/kg、少於7.7×109 TU/kg、少於7.6×109 TU/kg、少於7.5×109 TU/kg、少於7.4×109 TU/kg、少於7.3×109 TU/kg、少於7.2×109 TU/kg、少於7.1×109 TU/kg、少於7.0×109 TU/kg、少於6.9×109 TU/kg、少於6.8×109 TU/kg、少於6.7×109 TU/kg、少於6.6×109 TU/kg、少於6.5×109 TU/kg、少於6.4×109 TU/kg、少於6.3×109 TU/kg、少於6.2×109 TU/kg、少於6.1×109 TU/kg、少於6.0×109 TU/kg、少於5.9×109 TU/kg、少於5.8×109 TU/kg、少於5.7×109 TU/kg、少於5.6×109 TU/kg、少於5.5×109 TU/kg、少於5.4×109 TU/kg、少於5.3×109 TU/kg、少於5.2×109 TU/kg、少於5.1×109 TU/kg、少於5.0×109 TU/kg、少於4.9×109 TU/kg、少於4.8×109 TU/kg、少於4.7×109 TU/kg、少於4.6×109 TU/kg、少於4.5×109 TU/kg、少於4.4×109 TU/kg、少於4.3×109 TU/kg、少於4.2×109 TU/kg、少於4.1×109 TU/kg、少於4.0×109 TU/kg、少於3.9×109 TU/kg、少於3.8×109 TU/kg、少於3.7×109 TU/kg、少於3.6×109 TU/kg、少於3.5×109 TU/kg、少於3.4×109 TU/kg、少於3.3×109 TU/kg、少於3.2×109 TU/kg、少於3.1×109 TU/kg、少於3.0×109 TU/kg、少於2.9×109 TU/kg、少於2.8×109 TU/kg、少於2.7×109 TU/kg、少於2.6×109 TU/kg、少於2.5×109 TU/kg、少於2.4×109 TU/kg、少於2.3×109 TU/kg、少於2.2×109 TU/kg、少於2.1×109 TU/kg、少於2.0×109 TU/kg、少於1.9×109 TU/kg、少於1.8×109 TU/kg、少於1.7×109 TU/kg、少於1.6×109 TU/kg、少於1.5×109 TU/kg、少於1.4×109 TU/kg、少於1.3×109 TU/kg、少於1.2×109 TU/kg、少於1.1×109 TU/kg或少於1.0×109 TU/kg。
在一些實施例中，劑量少於9.9×108 TU/kg、少於9.8×108 TU/kg、少於9.7×108 TU/kg、少於9.6×108 TU/kg、少於9.5×108 TU/kg、少於9.4×108 TU/kg、少於9.3×108 TU/kg、少於9.2×108 TU/kg、少於9.1×108 TU/kg、少於9.0×108 TU/kg、少於8.9×108 TU/kg、少於8.8×108 TU/kg、少於8.7×108 TU/kg、少於8.6×108 TU/kg、少於8.5×108 TU/kg、少於8.4×108 TU/kg、少於8.3×108 TU/kg、少於8.2×108 TU/kg、少於8.1×108 TU/kg、少於8.0×108 TU/kg、少於7.9×108 TU/kg、少於7.8×108 TU/kg、少於7.7×108 TU/kg、少於7.6×108 TU/kg、少於7.5×108 TU/kg、少於7.4×108 TU/kg、少於7.3×108 TU/kg、少於7.2×108 TU/kg、少於7.1×108 TU/kg、少於7.0×108 TU/kg、少於6.9×108 TU/kg、少於6.8×108 TU/kg、少於6.7×108 TU/kg、少於6.6×108 TU/kg、少於6.5×108 TU/kg、少於6.4×108 TU/kg、少於6.3×108 TU/kg、少於6.2×108 TU/kg、少於6.1×108 TU/kg、少於6.0×108 TU/kg、少於5.9×108 TU/kg、少於5.8×108 TU/kg、少於5.7×108 TU/kg、少於5.6×108 TU/kg、少於5.5×108 TU/kg、少於5.4×108 TU/kg、少於5.3×108 TU/kg、少於5.2×108 TU/kg、少於5.1×108 TU/kg、少於5.0×108 TU/kg、少於4.9×108 TU/kg、少於4.8×108 TU/kg、少於4.7×108 TU/kg、少於4.6×108 TU/kg、少於4.5×108 TU/kg、少於4.4×108 TU/kg、少於4.3×108 TU/kg、少於4.2×108 TU/kg、少於4.1×108 TU/kg、少於4.0×108 TU/kg、少於3.9×108 TU/kg、少於3.8×108 TU/kg、少於3.7×108 TU/kg、少於3.6×108 TU/kg、少於3.5×108 TU/kg、少於3.4×108 TU/kg、少於3.3×108 TU/kg、少於3.2×108 TU/kg、少於3.1×108 TU/kg、少於3.0×108 TU/kg、少於2.9×108 TU/kg、少於2.8×108 TU/kg、少於2.7×108 TU/kg、少於2.6×108 TU/kg、少於2.5×108 TU/kg、少於2.4×108 TU/kg、少於2.3×108 TU/kg、少於2.2×108 TU/kg、少於2.1×108 TU/kg、少於2.0×108 TU/kg、少於1.9×108 TU/kg、少於1.8×108 TU/kg、少於1.7×108 TU/kg、少於1.6×108 TU/kg、少於1.5×108 TU/kg、少於1.4×108 TU/kg、少於1.3×108 TU/kg、少於1.2×108 TU/kg、少於1.1×108 TU/kg或少於1.0×108 TU/kg。
在一些實施例中，劑量介於1×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、1.5×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、2×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、2.5×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、3×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、3.5×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、4×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、4.5×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、5×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、5.5×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、6×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、6.5×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、7×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、7.5×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、8×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、8.5×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、9×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、9.5×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、1×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、1.5×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、2×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、2.5×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、3×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、3.5×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、4×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、4.5×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、5×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、5.5×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、6×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、6.5×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、7×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、7.5×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、8×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、8.5×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、9×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、9.5×109 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、1010 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、1.5×1010 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、2×1010 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、2.5×1010 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、3×1010 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、3.5×1010 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、4×1010 TU/kg與5×1010 TU/kg之間或4.5×1010 TU/kg與5×1010 TU/kg之間。
在一些實施例中，劑量介於1×108 TU/kg與5×1010 TU/kg之間、1×108 TU/kg與4.5×1010 TU/kg之間、1×108 TU/kg與4×1010 TU/kg之間、1×108 TU/kg與3.5×1010 TU/kg之間、1×108 TU/kg與3×1010 TU/kg之間、1×108 TU/kg與2.5×1010 TU/kg之間、1×108 TU/kg與2×1010 TU/kg之間、1×108 TU/kg與1.5×1010 TU/kg之間、1×108 TU/kg與1010 TU/kg之間、1×108 TU/kg與9×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與8.5×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與8×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與7.5×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與7×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與6.5×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與6×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與5.5×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與5×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與4.5×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與4×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與3.5×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與3×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與2.5×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與2×109 之間、1×108 TU/kg與1.5×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與1×109 TU/kg之間、1×108 TU/kg與9.5×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與9×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與8.5×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與8×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與7.5×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與7×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與6.5×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與6×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與5.5×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與5×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與4.5×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與4×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與3.5×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與3×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與2.5×108 TU/kg之間、1×108 TU/kg與2×108 之間或1×108 TU/kg與1.5×108 TU/kg之間。
在一些實施例中，劑量介於1×1010 TU/kg與2×1010 TU/kg之間、1.1×1010 TU/kg與1.9×1010 TU/kg之間、1.2×1010 TU/kg與1.8×1010 TU/kg之間、1.3×1010 TU/kg與1.7×1010 TU/kg之間或1.4×1010 TU/kg與1.6×1010 TU/kg之間。在一些實施例中，劑量為約1.5×1010 TU/kg。在一些實施例中，劑量為1.5×1010 TU/kg。
在一些實施例中，劑量介於1×109 TU/kg與2×109 TU/kg之間、1.1×109 TU/kg與1.9×109 TU/kg之間、1.2×109 TU/kg與1.8×109 TU/kg之間、1.3×109 TU/kg與1.7×109 TU/kg之間或1.4×109 TU/kg與1.6×109 TU/kg之間。在一些實施例中，劑量為1.5×109 TU/kg。在某些實施例中，劑量為約3.0 × 109 TU/kg。
在一些實施例中，劑量介於2.5×109 TU/kg與3.5×109 TU/kg之間、2.6 ×109 TU/kg與3.4×109 TU/kg之間、2.7×109 TU/kg與3.3×109 TU/kg之間、2.8×109 TU/kg與3.2×109 TU/kg之間或2.9×109 TU/kg與3.1×109 TU/kg之間。在一些實施例中，劑量為約3.0×109 TU/kg。在一些實施例中，劑量為3.0×109 TU/kg。
在一些實施例中，劑量介於5.5×109 TU/kg與6.5×109 TU/kg之間、5.6 ×109 TU/kg與6.4×109 TU/kg之間、5.7×109 TU/kg與6.3×109 TU/kg之間、5.8×109 TU/kg與6.2×109 TU/kg之間或5.9×109 TU/kg與6.1×109 TU/kg之間。在一些實施例中，劑量為約6.0×109 TU/kg。在一些實施例中，劑量為6.0×109 TU/kg。
在一些實施例中，投與本發明之慢病毒載體後24小時、36小時或48小時的血漿FVIII活性相對於投與包含包括SEQ ID NO: 16之核酸分子之參考載體的個體的血漿FVIII活性增加。
在一些實施例中，投與慢病毒載體後48小時之後的血漿FVIII活性相對於投與包含包括SEQ ID NO: 16之核酸分子之參考載體的個體中的血漿FVIII活性增加。
在另一實施例中，投與慢病毒載體後約21天的血漿FVIII活性相對於投與包含SEQ ID NO: 16之參考核酸分子、包含參考核酸分子之參考病毒載體或由參考核酸分子編碼之多肽的個體增加。
在一些實施例中，投與慢病毒載體後約6小時、約12小時、約18小時、約24小時、約36小時、約48小時、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、約25天、約26天、約27天或約28天的血漿FVIII活性相對於投與包含SEQ ID NO: 16之參考核酸分子、包含參考核酸分子之參考病毒載體或由參考核酸分子編碼之多肽的個體增加。
在一些實施例中，相對於個體中之基礎水準，相對於投與包含SEQ ID NO: 16之參考核酸分子之個體中的水準、相對於投與包含參考核酸分子之參考病毒載體之個體中的水準或相對於在投與由參考核酸分子編碼之多肽之後個體中之水準，個體中之血漿FVIII活性增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍、至少約100倍、至少約110倍、至少約120倍、至少約130倍、至少約140倍、至少約150倍、至少約160倍、至少約170倍、至少約180倍、至少約190倍或至少約200倍。
在一些實施例中，慢病毒載體係呈單個劑量或多個劑量投與。在一些實施例中，慢病毒載體之劑量一次投與或分成多個亞劑量，例如兩個亞劑量、三個亞劑量、四個亞劑量、五個亞劑量、六個亞劑量或超過六個亞劑量。在一些實施例中，投與超過一種慢病毒載體。
在一些實施例中，慢病毒載體之劑量重複至少兩次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次時間或至少十次投與。在一些實施例中，慢病毒載體係經由靜脈內注射投與。
在一些實施例中，個體為兒科個體，而在其他態樣中，個體為成年個體。
在一些實施例中，慢病毒載體包含至少一種組織特異性啟動子，亦即將調控具有FVIII活性之多肽在特定組織或細胞類型中之表現的啟動子。在一些實施例中，慢病毒載體中組織特異性啟動子選擇性地增強具有FVIII活性之多肽在標靶肝臟細胞中之表現。在一些實施例中，選擇性地增強具有FVIII活性之多肽在標靶肝臟細胞中之表現的組織特異性啟動子包含mTTR啟動子。在一些實施例中，標靶肝臟細胞為肝細胞。
因為慢病毒載體可轉導所有肝臟細胞類型，所以轉殖基因(例如FVIII)在不同細胞類型中之表現可藉由在慢病毒載體中使用不同啟動子來控制。因此，慢病毒載體可包含將控制FVIII轉殖基因在不同組織或細胞類型，諸如不同肝組織或細胞類型中之表現的特異性啟動子。因此，在一些實施例中，慢病毒載體可包含將控制FVIII轉殖基因在肝臟內皮組織中之表現的內皮特異性啟動子，或將控制FVIII轉殖基因在肝細胞中之表現的肝細胞特異性啟動子或兩者。
在一些實施例中，慢病毒載體包含控制FVIII轉殖基因在除肝臟以外之組織中之表現的組織特異性啟動子。在一些實施例中，經分離之核酸分子穩定地整合至標靶細胞或標靶組織之基因組中，例如肝細胞之基因組中或肝臟內皮細胞之基因組中。
在一些實施例中，本發明之慢病毒載體中的編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列包含LV-coFVIII-6(SEQ ID NO:71)、由其組成或基本上由其組成。
在其他實施例中，本發明之慢病毒載體中的編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列包含LV-coFVIII-6-XTEN(SEQ ID NO:72)、由其組成或基本上由其組成。
在一些實施例中，本發明之慢病毒載體中的編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列進一步包含編碼信號肽之核酸序列，其中該編碼信號肽之核酸序列具有相對於以下各者至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸1至57；(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸1至57；(iii)SEQ ID NO: 3之核苷酸1至57；(iv)SEQ ID NO: 4之核苷酸1至57；(v)SEQ ID NO: 5之核苷酸1至57；(vi)SEQ ID NO: 6之核苷酸1至57；(vii)SEQ ID NO: 70之核苷酸1至57；(viii)SEQ ID NO: 71之核苷酸1至57；或(ix)SEQ ID NO: 68之核苷酸1至57。
在一些實施例中，本發明之慢病毒載體中的經分離之核酸分子包含一或或多種選自由以下組成之群的性質：(a)核酸分子或其一部分之人類密碼子適應指數相對於SEQ ID NO: 16增加；(b)核苷酸序列或其一部分之最佳密碼子之頻率相對於SEQ ID NO: 16增加；(c)核苷酸序列或其一部分含有比SEQ ID NO: 16中G/C核苷酸之百分比高的G/C核苷酸之百分比；(d)核苷酸序列或其一部分之相對同義密碼子使用度相對於SEQ ID NO: 16增加；(e)核苷酸序列或其一部分之有效密碼子數目相對於SEQ ID NO: 16減少；(f)核苷酸序列相對於SEQ ID NO: 16含有更少MARS/ARS序列(SEQ ID NO: 21及22)；(g)核苷酸序列相對於SEQ ID NO: 16含有更少去穩定元件(SEQ ID NO : 23及24)；及(h)其任何組合。
在一些實施例中，本發明之慢病毒載體中的經分離之核酸分子進一步包含編碼異源胺基酸序列(例如半衰期延長子)之異源核苷酸序列。在一些實施例中，異源胺基酸序列為免疫球蛋白恆定區或其一部分、XTEN、轉鐵蛋白、白蛋白或PAS序列。在一些實施例中，異源胺基酸序列連接於由核苷酸序列編碼之胺基酸序列之N端或C端，或在選自表3之一或多個插入位點處插入由核苷酸序列編碼之胺基酸序列中的兩個胺基酸之間。
在一些實施例中，FVIII多肽為全長FVIII或B結構域缺失之FVIII。
本文揭示之慢病毒載體可以低劑量(例如1010 TU/kg或更低、109 TU/kg或更低或108 TU/kg或更低)用於活體內哺乳動物、例如人類患者中，使用基因療法治療選自由以下組成之群的出血疾病或病症將為治療有益的：出血性凝血障礙、關節積血、肌肉出血、口腔出血、大出血、大出血至肌肉、口腔大出血、外傷、頭部外傷、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸廓內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後隙出血及髂腰肌鞘出血。在一個實施例中，出血疾病或病症為血友病。在另一實施例中，出血疾病或病症為A型血友病。
在一些實施例中，在向患者投與前標靶細胞(例如肝細胞)在活體外用低劑量(例如1010 TU/kg或更低、109 TU/kg或更低或108 TU/kg或更低)本文揭示之慢病毒載體治療。在某些實施例中，在向患者投與前標靶細胞(例如肝細胞)在活體外用約3.0×109 TU/kg本文揭示之慢病毒載體治療。在又一實施例中，在向患者投與前來自患者之細胞(例如肝細胞)離體用低劑量(例如1010 TU/kg或更低、109 TU/kg或更低或108 TU/kg或更低)本文揭示之慢病毒載體治療。
在一些實施例中，投與本文揭示之慢病毒載體(投與例如1010 TU/kg或更低、109 TU/kg或更低或108 TU/kg或更低)後的血漿FVIII活性相對於生理上正常循環之FVIII水準增加至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約200%、至少約210%、至少約220%、至少約230%、至少約240%、至少約250%、至少約260%、至少約270%、至少約280%、至少約290%或至少約300%。
在一個實施例中，投與本發明之慢病毒載體後的血漿FVIII活性相對於生理上正常循環之FVIII水準增加至少約3,000%至約5,000%。在一些實施例中，在投與本文所述之包含編碼具有因子VIII(FVIII)活性之多肽的密碼子優化之基因的慢病毒載體後21天，血漿FVIII活性相對於投與包含包括SEQ ID NO: 16之參考核酸分子之對應慢病毒載體的個體增加至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍、至少約110倍、至少約120倍、至少約130倍、至少約140倍、至少約150倍、至少約160倍、至少約170倍、至少約180倍、至少約190倍或至少約200倍。
本發明亦提供治療、預防或改善有需要之個體之止血病症(例如出血病症，諸如A型血友病)的方法，該等方法包括向該個體投與治療有效量的包含經分離之核酸分子的慢病毒載體，該經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該慢病毒載體以至少一個劑量之5×1010 TU/kg或更少、109 TU/kg或更少或108 TU/kg或更少投與。
本發明之慢病毒載體的治療、改善及預防可為繞過療法。接受繞過療法之個體可能已發展針對凝血因子，例如FVIII之抑制劑，或正在發展凝血因子抑制劑。
本發明之慢病毒載體藉由促進血纖維蛋白凝塊形成來治療或預防止血病症。由本發明之核酸分子編碼的具有FVIII活性之多肽可活化凝血級聯之成員。凝血因子可參與外部路徑、內部路徑或兩者。
本發明之慢病毒載體可用於治療已知可用FVIII治療之止血病症。可使用本發明之方法治療之止血病症包括(但不限於)A型血友病、血友病B、馮威里氏病、因子XI缺乏症(PTA缺乏症)、因子XII缺乏症以及血纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII缺乏或結構異常、關節積血、肌肉出血、口腔出血、大出血、大出血至肌肉、口腔大出血、外傷、頭部外傷、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸廓內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後隙出血及髂腰肌鞘出血。
投與個體之組合物包括包含核酸分子之慢病毒載體，該等核酸分子包含編碼FVIII凝血因子(基因療法應用)以及FVIII多肽分子之本發明之優化核苷酸序列。在一些實施例中，用於投與之組合物為在活體內、活體外或離體與本發明之慢病毒載體接觸的細胞。
在一些實施例中，止血病症為遺傳性病症。在一個實施例中，個體患有A型血友病。在其他實施例中，止血病症為FVIII缺乏之結果。在其他實施例中，止血病症可為缺陷FVIII因子之結果。
在另一實施例中，止血病症為獲得性病症。獲得性病症可由潛在繼發性疾病或病狀產生。不相關病狀可為例如(但不限制)癌症、自體免疫性疾病或懷孕。獲得性病症可由年老或治療潛在繼發性病症之藥物治療(例如癌症化學療法)引起。
本發明亦關於治療未患止血病症或引起患上止血病症之繼發性疾病或病狀之個體的方法。因此本發明係關於一種治療需要通用止血劑之個體的方法，其包括投與治療有效量之本發明之慢病毒載體。舉例而言，在一個實施例中，需要通用止血劑之個體進行或即將進行外科手術。本發明之慢病毒載體可在外科手術之前或之後作為預防藥投與。
本發明之慢病毒載體可在外科手術期間或之後投與以控制急性出血事件。外科手術可包括(但不限於)肝移植、肝切除或幹細胞移植。
在另一實施例中，本發明之慢病毒載體可用於治療未患止血病症之發生急性出血事件之個體。急性出血事件可由嚴重外傷，例如外科手術、車禍、創傷、槍彈傷口或引起不受控制之出血的任何其他外傷事件引起。
慢病毒載體可用於預防性治療患有止血病症之個體。慢病毒載體亦可用於治療患有止血病症之個體中之急性出血事件。
在另一實施例中，本文揭示之慢病毒載體之投與及/或隨後FVIII蛋白質轉殖基因之表現未在個體中誘發免疫反應。在一些實施例中，免疫反應包含發展針對FVIII之抗體。在一些實施例中，免疫反應包含分泌細胞介素。在一些實施例中，免疫反應包含B細胞、T細胞或B細胞與T細胞之活化。在一些實施例中，免疫反應為抑制性免疫反應，其中相對於未發生免疫反應之個體中之FVIII活性，個體中之免疫反應降低FVIII蛋白質之活性。在某些實施例中，藉由投與本發明之慢病毒載體表現FVIII蛋白質可預防針對FVIII蛋白質之抑制性免疫反應或FVIII蛋白質自經分離之核酸分子或慢病毒載體表現。
在一些實施例中，本發明之慢病毒載體與至少一種促進止血之其他藥劑組合投與。該促進止血之其他藥劑係在顯示凝血活性之治療劑中。舉例而言(但不限制)，止血劑可包括因子V、因子VII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原或血纖維蛋白原或前述任一者之活化形式。凝血因子或止血劑亦可包括抗血纖維蛋白溶解藥物，例如ε-胺基-己酸、凝血酸。
在本發明之一個實施例中，組合物(例如慢病毒載體)為當投與個體時FVIII呈可活化形式存在之組合物。此類可活化分子可在投與個體之後在活體內在凝血部位活化。
本發明之慢病毒載體可經靜脈內、皮下、肌肉內或經由任何黏膜表面，例如經口、舌下、經頰、舌下、經鼻、經直腸、經陰道或經由肺途徑投與。慢病毒載體可植入允許載體緩慢釋放至所需部位之生物聚合物固體支撐物內或連接於生物聚合物固體支撐物。
在一個實施例中，慢病毒載體之投與途徑係非經腸。如本文所用之術語非經腸包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、直腸或陰道投與。非經腸投與之靜脈內形式為較佳。雖然所有此等投與形式清楚地涵蓋於本發明之範疇內，但一種投與形式將為用於注射、尤其用於靜脈內或動脈內注射或滴注之溶液。通常，適用於注射之醫藥組合物可包含緩衝劑(例如乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑)、界面活性劑(例如聚山梨酸酯)、視情況穩定劑(例如人類白蛋白)等。然而，在與本文中之教示相容的其他方法中，慢病毒載體可直接遞送至有害細胞群體部位，從而增加患病組織對治療劑之暴露。
用於非經腸投與之製劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。在本發明中，醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)0.01-0.1M且較佳0.05M磷酸鹽緩衝液或0.8%鹽水。其他常見非經腸媒劑包括磷酸鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer’s dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發性油。靜脈內媒劑包括液體及營養素補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖之電解質補充劑)及其類似物。亦可存在防腐劑及其他添加劑，諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體及其類似物。
更具體而言，適合於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(水溶性情況下)或分散液及臨用方製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。在此類情況下，組合物必須無菌且應為流體，達至容易注射之程度。其在製造及儲存條件下將為穩定的，且較佳將防止諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其合適混合物之溶劑或分散介質。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。
可藉由多種抗細菌及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物來預防微生物之作用。多數情況下，組合物中較佳包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可藉由在組合物中包括例如單硬脂酸鋁及明膠之延遲吸收劑，延長可注射組合物之吸收。
在任何情況下，無菌可注射溶液可藉由將需要量之活性化合物(例如單獨或與其他活性劑組合之多肽)併入根據需要具有一種本文中列舉之成分或組合之合適當溶劑中，接著過濾滅菌來製備。一般地，分散液藉由將活性化合物併入含有基礎分散介質及來自以上列舉之成分的所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及凍乾，此自先前無菌過濾之溶液產生活性成分加上任何額外所需成分的粉末。對用於注射之製劑進行加工，填充至諸如安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶之容器中，且根據本領域中已知之方法密封在無菌條件下。此外，製劑可進行包裝且呈套組形式出售。此類製品較佳將具有標籤或包裝說明書，其指示相關組合物可用於治療罹患或易患凝血病症之個體。
醫藥組合物亦可調配成栓劑或保留灌腸，例如含有習知栓劑基質，諸如可可脂或其他甘油酯，用於直腸投與。
本發明組合物治療病狀之有效劑量視許多不同因素而變化，該等因素包括投與方式、目標部位、患者生理狀態、患者為人類還是動物、其他投與之藥物治療及治療為預防性還是治療性。通常，患者為人類，但亦可治療非人類哺乳動物，包括轉殖基因哺乳動物。治療劑量可使用本領域之技術人員已知之常規方法來滴定以使安全性及功效最佳。
慢病毒載體可呈單個劑量或多個劑量投與，其中多個劑量可連續或以特定時間間隔投與。活體外分析可用以確定投與之最佳劑量範圍及/或時程。本領域中已知量測凝血因子活性之活體外分析。另外，可自獲自動物模型，例如患血友病犬之劑量反應曲線推斷有效劑量(Mount等人 2002, Blood 99(8): 2670)。
在上述範圍中間的劑量亦欲在本發明之範疇內。個體可每日、交替日、每週或根據由經驗分析確定之任何其他時程投與此類劑量。例示性治療需要在持續時期，例如至少六個月內投與多個劑量。
本發明之慢病毒載體可多個時刻投與。單個劑量之間的時間間隔可為每日、每週、每月或每年。時間間隔亦可為不規則的，如藉由量測患者中經修飾之多肽或抗原之血液水準所指示。本發明之慢病毒載體之劑量及頻率視由轉殖基因編碼之FVIII多肽在患者中之半衰期而變化。
本發明之慢病毒載體之投與劑量及頻率可視治療為預防性還是治療性而變化。在預防性應用中，含有本發明之慢病毒載體之組合物投與已不處於疾病病況中之患者以增強患者對疾病之抵抗力或將疾病影響減至最少。此類量定義為「預防有效劑量」。在長時間內以相對不頻繁之時間間隔投與相對較低之劑量。一些患者在其餘生中繼續接受治療。
本發明之慢病毒載體可視情況與有效治療需要治療(例如預防性或治療性)之病症或病狀的其他藥劑組合投與。
如本文所用，本發明之慢病毒載體與輔助療法聯合或組合投與意謂療法與所揭示多肽相繼、同時、同延、併發、相伴或同時期投與或施加。本領域之技術人員將瞭解組合治療方案之多種組分的投與或施加可選擇適宜時間以增強治療之總效果。熟練技術人員(例如醫師)不進行過度實驗，基於所選輔助療法及本說明書之教示容易辨別有效組合治療方案。
進一步瞭解本發明之慢病毒載體可與藥劑聯合或組合使用(例如提供組合治療方案)。本發明之慢病毒載體可組合之例示性藥劑包括代表針對所治療之特定病症的現行標準護理的藥劑。此類藥劑之性質可為化學或生物的。術語「生物」或「生物劑」係指由活生物體及/或其產物製成之意欲用作治療劑的任何醫藥活性劑。
與本發明之慢病毒載體組合使用的藥劑之量可依個體而變化或可根據本領域中已知來投與。參見例如Bruce A Chabner等人,Antineoplastic Agents, Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287((Joel G. Hardman等人編輯, 第9版 1996)。在另一實施例中，投與符合標準護理之量的此類藥劑。
在某些實施例中，本發明之慢病毒載體結合免疫抑制劑、抗過敏劑或消炎劑投與。此等藥劑一般係指用於抑制或遮蔽本文中所治療個體之免疫系統的物質。此等藥劑包括抑制細胞介素產生、下調或抑制自體抗原表現或遮蔽MHC抗原之物質。此類藥劑之實例包括2-胺基-6-芳基-5-取代之嘧啶；咪唑硫嘌呤(azathioprine)；環磷醯胺(cyclophosphamide)；溴隱亭(bromocryptine)；達那唑(danazol)；達普松(dapsone)；戊二醛；針對MHC抗原及MHC片段之抗獨特型抗體；環孢菌素A(cyclosporin A)；類固醇，諸如糖皮質類固醇(glucocorticosteroid)，例如潑尼松(prednisone)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)及地塞米松(dexamethasone)；細胞介素或細胞介素受體拮抗體，包括抗干擾素-γ、干擾素-β或干擾素-α抗體、抗腫瘤壞死因子-α抗體、抗腫瘤壞死因子-β抗體、抗介白素-2抗體及抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CD11a及抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；全-T抗體；含有LFA-3結合域之可溶性肽；鏈激酶；TGF-β；鏈道酶；FK506；RS-61443；去氧精胍菌素；及雷帕黴素(rapamycin)。在某些實施例中，藥劑為抗組胺劑。如本文所用之「抗組胺劑」為對抗組胺之生理作用的藥劑。抗組胺劑之實例為氯芬胺(chlorpheniramine)、苯海拉明(diphenhydramine)、異丙嗪(promethazine)、色甘酸鈉(cromolyn sodium)、阿司咪唑(astemizole)、馬來酸阿紮他定(azatadine maleate)、馬來酸非尼拉敏(bropheniramine maleate)、馬來酸氯苯吡醇胺(carbinoxamine maleate)、鹽酸西替利嗪(cetirizine hydrochloride)、富馬酸氯馬斯丁(clemastine fumarate)、鹽酸二苯環庚啶(cyproheptadine hydrochloride)、馬來酸右溴苯那敏(dexbrompheniramine maleate)、馬來酸右氯苯那敏(dexchlorpheniramine maleate)、茶苯海明(dimenhydrinate)、鹽酸苯海拉明(diphenhydramine hydrochloride)、琥珀酸多西拉敏(doxylamine succinate)、鹽酸非芬達定(fexofendadine hydrochloride)、鹽酸特非那定(terphenadine hydrochloride)、鹽酸羥嗪(hydroxyzine hydrochloride)、氯雷他定(loratidine)、鹽酸美克洛嗪(meclizine hydrochloride)、檸檬酸吡苄明(tripelannamine citrate)、鹽酸吡苄明(tripelennamine hydrochloride)及鹽酸丙吡咯啶(triprolidine hydrochloride)。
免疫抑制劑、抗過敏劑或消炎劑可併入慢病毒載體投與方案中。舉例而言，免疫抑制劑或消炎劑之投與可在投與所揭示之慢病毒載體之前開始，且此後可繼續一或多劑。在某些實施例中，免疫抑制劑或消炎劑作為慢病毒載體之術前用藥投與。
如先前所論述，本發明之慢病毒載體可以活體內治療凝血病症之醫藥學上有效量投與。關於此，應瞭解本發明之慢病毒載體可經調配以有助於投與且促進活性劑之穩定性。較佳地，根據本發明之醫藥組合物包含醫藥學上可接受之無毒無菌載劑，諸如生理鹽水、無毒緩衝劑、防腐劑及其類似物。當然，本發明之醫藥組合物可以單個或多個劑量投與以提供多肽之醫藥學上有效量。
許多測試可用於評定凝血系統之功能：活化部分凝血活酶時間(aPTT)測試、顯色分析、ROTEM® 分析、凝血酶原時間(PT)測試(亦用於測定INR)、血纖維蛋白原測試(常藉由克勞斯法(Clauss method))、血小板計數、血小板功能測試(常藉由PFA-100)、TCT、出血時間、混合測試(若患者血漿與正常血漿混合，則校正異常)、凝血因子、抗磷脂抗體、D-二聚體、遺傳測試(例如因子V Leiden、凝血酶原突變G20210A)、稀釋魯塞爾蝰蛇毒時間(dilute Russell’s viper venom time，dRVVT)、混雜血小板功能測試、凝血彈性描記法(TEG或Sonoclot)、旋轉式血栓彈性測定法(TEM® ，例如ROTEM® )或優球蛋白溶解時間(ELT)。
aPTT測試為量測「內部」(亦稱為接觸活化路徑)與常見凝血路徑之功效的效能指示物。此測試通常用於量測市售重組凝血因子，例如FVIII或FIX之凝血活性。其與量測外部路徑之凝血酶原時間(PT)聯合使用。
ROTEM® 分析提供有關整個止血動力學之資訊：凝血時間、凝塊形成、凝塊穩定性及溶解。旋轉式血栓彈性測定法中之不同參數視胞質凝血系統之活性、血小板功能、血纖維蛋白溶解或影響此等相互作用之許多因素而定。此分析可提供第二期止血之完整觀察。

III. 慢病毒載體
慢病毒包括牛類慢病毒組、馬類慢病毒組、貓科慢病毒組、綿羊山羊慢病毒組及靈長類動物慢病毒組之成員。用於基因療法之慢病毒載體之發展已於Klimatcheva等人(1999)Frontiers in Bioscience 4:481-496中評述。適合於基因療法之慢病毒載體之設計及使用例如描述於美國專利第6,207,455號及第6,615,782號中。慢病毒之實例包括(但不限於)HIV-1、HIV-2、HIV-1/HIV-2假型、HIV-1/SIV、FIV、山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒及牛免疫缺陷病毒。
本發明之慢病毒載體之示意圖呈現於圖19中。在一些實施例中，本發明之慢病毒載體為「第三代」慢病毒載體。如本文所用，術語「第三代」慢病毒載體係指具有第二代載體系統之特性，且進一步缺乏功能tat基因，諸如tat基因已缺失或失活的慢病毒包裝系統。通常，編碼rev之基因提供在分開的表現構築體上。參見例如Dull等人(1998)J. Virol. 72: 8463-8471。如本文所用，術語「第二代」慢病毒載體係指缺乏功能輔助基因，諸如輔助基因vif、vpr、vpu及nef已缺失或失活的慢病毒包裝系統。參見例如Zufferey等人(1997)Nat. Biotechnol. 15:871-875。如本文所用，「包裝系統」係指包含編碼參與包裝重組病毒之病毒蛋白質之基因的一組病毒構築體。通常，包裝系統之構築體最終將併入包裝細胞中。
在一些實施例中，本發明之第三代慢病毒載體為自我失活慢病毒載體。在一些實施例中，慢病毒載體為VSV.G假型慢病毒載體。在一些實施例中，慢病毒載體包含用於表現轉殖基因之肝細胞特異性啟動子。在一些實施例中，肝細胞特異性啟動子為增強之轉甲狀腺素蛋白啟動子。在一些實施例中，慢病毒載體包含miR-142之一或多種標靶序列以減少對轉殖基因產物之免疫反應。在一些實施例中，miR-142之一或多種標靶序列併入本發明之慢病毒載體中允許所需轉殖基因表現概況。舉例而言，miR-142之一或多種標靶序列的併入可抑制血管內及血管外造血譜系中轉殖基因表現，而非造血細胞中維持轉殖基因表現。在用本發明之慢病毒載體系統處理的易長腫瘤之小鼠中未偵測到腫瘤發生。參見Brown等人(2007)Blood 110:4144-52；Brown等人(2006)Nat. Ned. 12:585-91及Cantore等人(2015)Sci. Transl. Med. 7(277):277ra28。
本發明之慢病毒載體包括編碼本文所述之BDD FVIII蛋白質的密碼子優化之多核苷酸。在一個實施例中，針對BDD FVIII蛋白質之優化編碼序列可操作地連接於表現控制序列。如本文所用，當兩個核酸序列以允許各組分核酸序列保留其功能性之方式共價連接時可操作地連接。編碼序列及基因表現控制序列在以將編碼序列之表現或轉錄及/或轉譯置於基因表現控制序列之影響或控制下的方式共價連接時稱為可操作地連接。若5’基因表現序列中啟動子之誘導引起編碼序列之轉錄且若兩個DNA序列之間的連接性質不(1)引入移碼突變，(2)干涉啟動子區域指導編碼序列轉錄之能力或(3)干擾對應RNA轉錄物轉譯成蛋白質之能力，則該兩個DNA序列稱為可操作地連接。因此，若基因表現序列能夠實現編碼核酸序列之轉錄，使得所得到之轉錄物轉譯成所需蛋白質或多肽，則該基因表現序列可操作地連接於該編碼核酸序列。
在某些實施例中，慢病毒載體為能夠感染非分裂細胞之重組慢病毒之載體。在某些實施例中，慢病毒載體為能夠感染肝細胞(例如肝細胞)之重組慢病毒之載體。慢病毒基因組及前病毒DNA通常具有在反轉錄病毒中發現之三個基因：gag、pol及env，該等基因側接兩個長末端重複(LTR)序列。gag基因編碼內部結構(基質、衣殼及核衣殼)蛋白質；pol基因編碼RNA指導之DNA聚合酶(反轉錄酶)、蛋白酶及整合酶；且env基因編碼病毒包膜糖蛋白。5’及3’ LTR用於促進病毒體RNA之轉錄及聚腺苷酸化。LTR含有病毒複製所必需之所有其他順式作用序列。慢病毒具有額外基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef及vpx(HIV-l、HIV-2及/或SIV中)。
與5’ LTR鄰接的係基因組反轉錄(tRNA引子結合位點)及病毒RNA有效包殼至粒子(Psi位點)所必需之序列。若病毒基因組中缺乏包殼(或反轉錄病毒RNA包裝至感染病毒體)所必需之序列，則順式缺陷阻止基因組RNA之包殼。
然而，所得突變體保持能夠指導所有病毒體蛋白質之合成。本發明提供一種產生能夠感染非分裂細胞之重組慢病毒的方法，其包括用兩種或更多種具有包裝功能，亦即gag、pol及env以及rev及tat之載體轉染合適宿主細胞。如下文中所揭示，缺乏功能tat基因之載體合乎某些應用需要。因此，舉例而言，第一載體可提供編碼病毒gag及病毒pol之核酸，且另一載體可提供編碼病毒env之核酸，以產生包裝細胞。提供異源基因之載體(本文中確定為轉移載體)引入該包裝細胞中產生生產細胞，生產細胞釋放運載所關注外源基因之感染病毒粒子。
根據載體及外源基因之以上指示之構型，第二載體可提供編碼病毒包膜(env)基因之核酸。env基因可源自於幾乎任何合適病毒，包括反轉錄病毒。在一些實施例中，env蛋白質為允許人類及其他物種之細胞轉導的雙嗜性包膜蛋白。
反轉錄病毒源性env基因之實例包括(但不限於)：莫洛尼鼠科白血病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMuLV或MMLV)、哈維鼠科肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus，HaMuSV或HSV)、鼠類乳腺腫瘤病毒(MuMTV或MMTV)、長臂猿白血病毒(GaLV或GALV)、人類免疫缺陷性病毒(HIV)及勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)。亦可使用其他env基因，諸如水皰性口腔炎病毒(VSV)蛋白G(VSV G)、肝炎病毒及流感。在一些實施例中，病毒env核酸序列與本文中其他地方所述之調控序列可操作地締合。
在某些實施例中，慢病毒載體缺失HIV致病性基因env、vif、vpr、vpu及nef，無損載體轉導非分裂細胞之能力。在一些實施例中，慢病毒載體包含3’ LTR之U3區域之缺失。U3區域之缺失可為完整缺失或部分缺失。
在一些實施例中，包含本文所述之FVIII核苷酸序列的本發明之慢病毒載體可在細胞中用(a)包含gag、pol或gag及pol基因之第一核苷酸序列及(b)包含異源env基因之第二核苷酸序列轉染；其中該慢病毒載體缺乏功能tat基因。在其他實施例中，細胞進一步用包含rev基因之第四核苷酸序列轉染。在某些實施例中，慢病毒載體缺乏選自vif、vpr、vpu、vpx及nef或其組合之功能基因。
在某些實施例中，本發明之慢病毒載體包含編碼gag蛋白、Rev反應元件、中央多嘌呤段(cPPT)或其任何組合之一或多種核苷酸序列。
在一些實施例中，慢病毒載體在其表面上表現改善慢病毒載體或所編碼之FVIII多肽之靶向及/或活性的一或多種多肽。一或多種多肽可藉由慢病毒載體編碼，或可在慢病毒載體自宿主細胞出芽期間併入。在慢病毒產生期間，病毒粒子自生產宿主細胞出芽。在出芽過程期間，病毒粒子具有脂質包衣，其源自於宿主細胞之類脂膜。因此，病毒粒子之脂質包衣可包括先前存在於宿主細胞表面上之膜結合之多肽。
在一些實施例中，慢病毒載體在其表面上表現一或多種抑制在投與人類個體後對慢病毒載體之免疫反應的多肽。在一些實施例中，慢病毒載體之表面包含一或多個CD47分子。CD47係在人類細胞上普遍表現之「自我標記」蛋白質。CD47之表面表現經由CD47與巨噬細胞表現之SIRPα的相互作用抑制巨噬細胞誘發之內源細胞吞噬。表現高水準CD47之細胞不太可能由人類巨噬細胞在活體內靶向及破壞。
在一些實施例中，慢病毒載體在其表面上包含高濃度之CD47多肽分子。在一些實施例中，慢病毒載體在具有高表現水準之CD47的細胞株中產生。在某些實施例中，慢病毒載體在CD47高 細胞中產生，其中該細胞在細胞膜上具有高CD47表現。在特定實施例中，慢病毒載體在CD47高 HEK 293T細胞中產生，其中該HEK 293T在細胞膜上具有高CD47表現。在一些實施例中，HEK 293T細胞經修飾以相對於未修飾之HEK 293T細胞具有增加之CD47表現。在某些實施方案中，CD47為人類CD47。
在一些實施例中，慢病毒載體幾乎表面不表現主要組織相容性複合物I類(MHC-I)。表面表現之MHC-I顯示來自細胞內之「非自體」蛋白質的肽片段，諸如指示感染之蛋白質片段，促進針對細胞之免疫反應。在一些實施例中，慢病毒載體在MHC-I低 細胞中產生，其中該細胞在細胞膜上具有減少之MHC-I表現。在一些實施例中，慢病毒載體在MHC-I- (或「MHC-I無 」、「MHC-1neg 」或「MHC陰性」)細胞中產生，其中該細胞缺乏MHC-I之表現。
在特定實施例中，慢病毒載體包含包括高濃度CD47多肽且缺乏MHC-I多肽之脂質包衣。在某些實施例中，慢病毒載體在CD47高 /MHC-I低 細胞株，例如CD47高 /MHC-I低 HEK 293T細胞株中產生。在一些實施例中，慢病毒載體在CD47高 /MHC-I無 細胞株，例如CD47高 /MHC-I無 HEK 293T細胞株中產生。
慢病毒載體之實例揭示於美國專利第9,050,269號及國際公開案第WO9931251號、第W09712622號、第W09817815號、第W09817816號及第WO9818934號中，該等案以引用之方式整體併入本文中。
在一些實施例中，本發明提供一種包含經分離之核酸分子的慢病毒載體，該經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791或(ii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；且其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性。
在一些實施例中，核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第二核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374；(ii)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374；(iii)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374；或(iv)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374；且其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性。
在一些實施例中，本發明提供一種包含經分離之核酸分子之慢病毒載體，該經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 1之核苷酸58-2277及2320-4374至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列且可操作地連接於啟動子、標靶序列或兩者。在其他實施例中，核酸序列包含(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 1之核苷酸58-2277及2320-4374。
在一些實施例中，本發明提供一種包含經分離之核酸分子之慢病毒載體，該經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)SEQ ID NO: 2之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸58-2277及2320-4374至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列且可操作地連接於啟動子、標靶序列或兩者。在其他實施例中，核酸序列包含(i)SEQ ID NO: 2之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸58-2277及2320-4374。
在一些實施例中，本發明提供一種包含經分離之核酸分子之慢病毒載體，該經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)SEQ ID NO: 70之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 70之核苷酸58-2277及2320-4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列且可操作地連接於啟動子、標靶序列或兩者。在其他實施例中，核酸序列包含(i)SEQ ID NO: 70之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 70之核苷酸58-2277及2320-4374。
在一些實施例中，本發明提供一種包含經分離之核酸分子之慢病毒載體，該經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)SEQ ID NO: 71之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 71之核苷酸58-2277及2320-4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列且可操作地連接於啟動子、標靶序列或兩者。在其他實施例中，核酸序列包含(i)SEQ ID NO: 71之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 71之核苷酸58-2277及2320-4374。
在一些實施例中，本發明提供一種包含經分離之核酸分子之慢病毒載體，該經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-4374至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列且可操作地連接於啟動子、標靶序列或兩者。在其他實施例中，核酸序列包含(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-4374。
在一些實施例中，本發明提供一種包含經分離之核酸分子之慢病毒載體，該經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-2277及2320-4374至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列且可操作地連接於啟動子、標靶序列或兩者。在其他實施例中，核酸序列包含(i)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-2277及2320-4374。
在一些實施例中，本發明提供一種包含經分離之核酸分子之慢病毒載體，該經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)SEQ ID NO: 5之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 5之核苷酸58-2277及2320-4374至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列且可操作地連接於啟動子、標靶序列或兩者。在其他實施例中，核酸序列包含(i)SEQ ID NO: 5之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 5之核苷酸58-2277及2320-4374。
在一些實施例中，本發明提供一種包含經分離之核酸分子之慢病毒載體，該經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)SEQ ID NO: 6之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 6之核苷酸58-2277及2320-4374至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列且可操作地連接於啟動子、標靶序列或兩者。在其他實施例中，核酸序列包含(i)SEQ ID NO: 6之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 6之核苷酸58-2277及2320-4374。
本發明之慢病毒載體在以5×1010 TU/kg或更低、109 TU/kg或更低或108 TU/kg或更低之劑量投與時為治療有效的。本發明之慢病毒載體以此類劑量投與可引起有需要之個體中之血漿FVIII活性相對於個體中之基礎水準，相對於投與包含SEQ ID NO: 16之參考核酸分子之個體中的水準、相對於投與包含參考核酸分子之參考病毒載體之個體中的水準或相對於在投與由參考核酸分子編碼之多肽之後個體中之水準增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍、至少約100倍、至少約110倍、至少約120倍、至少約130倍、至少約140倍、至少約150倍、至少約160倍、至少約170倍、至少約180倍、至少約190倍或至少約200倍。

IV. 組織特異性表現
在某些實施例中，在慢病毒載體內包括一或多種例如可操作地連接於優化FVIII轉殖基因之miRNA標靶序列將為有用的。因此，本發明亦提供至少一種可操作地連接於優化FVIII核苷酸序列或以其他方式插入慢病毒載體內之miRNA序列標靶。慢病毒載體中包括之超過一個複製之miRNA標靶序列可增加系統之有效性。
亦包括不同miRNA標靶序列。舉例而言，表現超過一種轉殖基因之慢病毒載體可使轉殖基因處於超過一種可相同或不同之miRNA標靶序列的控制下。miRNA標靶序列可串聯，但亦包括其他排列。含有miRNA標靶序列之轉殖基因表現卡匣亦可呈反義取向插入慢病毒載體內。反義取向可用於產生病毒粒子以避免可能對生產細胞另外具有毒性之基因產物表現。
在其他實施例中，慢病毒載體包含相同或不同miRNA標靶序列之1、2、3、4、5、6、7或8個複製。然而，在某些其他實施例中，慢病毒載體不包括任何miRNA標靶序列。是否包括miRNA標靶序列(及多少)之選擇將根據諸如意欲組織標靶、所需表現水準等已知參數。
在一個實施例中，標靶序列為miR-223標靶，已報導miR-223標靶最有效地阻斷在骨髓定向祖細胞中之表現且至少部分阻斷在更原始之HSPC中的表現。miR-223標靶可阻斷在包括顆粒球、單核球、巨噬細胞、髓樣樹突狀細胞之分化骨髓細胞中之表現。miR-223標靶亦適合於依賴於淋巴樣或類紅血球譜系中穩固轉殖基因表現的基因療法應用。miR-223標靶亦可極有效地阻斷人類HSC中之表現。
在另一實施例中，標靶序列為miR142標靶(tccataaagt aggaaacact aca(SEQ ID NO: 43))。在一個實施例中，慢病毒載體包含4個複製之miR-142標靶序列。在某些實施例中，造血特異性微型RNA，諸如miR-142(142T)之互補序列併入慢病毒載體之3’非轉譯區，使得編碼轉殖基因之轉錄產物對miRNA介導之下調敏感。藉由此方法，可防止轉殖基因在造血譜系抗原呈遞細胞(APC)中表現，同時維持在非造血細胞中表現(Brown等人, Nat Med 2006)。此策略可對轉殖基因表現施以嚴格轉錄後控制，因此能夠穩定遞送轉殖基因及長期表現轉殖基因。在一些實施例中，miR-142調控防止免疫介導之轉導細胞清除，及/或誘導抗原特異性調控T細胞(T reg)且介導對編碼轉殖基因之抗原的穩固免疫耐受性。
在一些實施例中，標靶序列為miR181標靶。Chen C-Z及Lodish H, Seminars in Immunology (2005) 17 (2):155-165揭示miR-181，其為一種在小鼠骨髓內之B細胞中特異性表現的miRNA(Chen及Lodish, 2005)。其亦揭示一些人類miRNA與白血病有關。
標靶序列可完全或部分與miRNA互補。術語「完全互補」意謂標靶序列之核酸序列與識別其之miRNA之序列100%互補。術語「部分互補」意謂標靶序列與識別其之miRNA之序列僅僅部分互補，其中miRNA仍識別部分互補序列。換言之，在本發明之上下文中部分互補標靶序列有效識別對應miRNA及實現表現該miRNA之細胞中轉殖基因表現之預防或減少。miRNA標靶序列之實例描述於以引用之方式整體併入本文中之WO2007/000668、WO2004/094642、
WO2010/055413或WO2010/125471中。

V. 編碼 FVIII 蛋白質之多核苷酸序列
本發明係針對慢病毒基因療法，其中該慢病毒載體包含經密碼子優化之核酸分子，該經密碼子優化之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的多核苷酸(核酸)序列。在一些實施例中，經密碼子優化之核酸分子編碼全長FVIII多肽。在其他實施例中，經密碼子優化之核酸分子編碼B結構域缺失(BDD)FVIII多肽，其中FVIII之所有或一部分B結構域缺失。
在一特定實施例中，核酸分子編碼胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 17(圖1J)至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之多肽或其片段。在一個實施例中，核酸分子編碼具有SEQ ID NO: 17之胺基酸序列之多肽或其片段。
在一些實施例中，核酸分子編碼包含信號肽之FVIII多肽或其片段。在其他實施例中，核酸分子編碼缺乏信號肽之FVIII多肽。在一些實施例中，信號肽包含SEQ ID NO: 17之胺基酸1-19。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791或(ii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；且其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性。
在一特定實施例中，第一核酸序列具有與SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在另一實施例中，第一核酸序列具有與SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在其他實施例中，第一核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791或SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791。
在其他實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791或(ii)SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；且其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性。
在一個實施例中，第一核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791或SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791。在另一實施例中，第二核苷酸序列具有與SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-4374或SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-4374至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一特定實施例中，第二核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之1792-4374或SEQ ID NO: 4之1792-4374。
在又一實施例中，第二核苷酸序列具有與SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-2277及2320-4374或SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸的SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-4374或SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-4374)至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
在一特定實施例中，第二核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-2277及2320-4374或SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之核苷酸的SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-4374或SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-4374)。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374或(ii)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；且其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性。
在某些實施例中，第二核酸序列具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在其他實施例中，第二核酸序列具有與SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
在一特定實施例中，第二核酸序列包含SEQ ID NO: 5之1792-4374或SEQ ID NO: 6之1792-4374。在一些實施例中，連接於以上所列之第二核酸序列的第一核酸序列具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸58-1791或SEQ ID NO: 6之核苷酸58-1791至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
在其他實施例中，連接於以上所列之第二核酸序列的第一核酸序列具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸1-1791或SEQ ID NO: 6之核苷酸1-1791至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
在其他實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)或(ii)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；且其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性。
在某些實施例中，第二核酸序列具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在其他實施例中，第二核酸序列具有與SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
在一特定實施例中，第二核酸序列包含SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374或SEQ ID NO: 6之1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374或SEQ ID NO: 6之1792-4374)。在一些實施例中，連接於以上所列之第二核酸序列的第一核酸序列具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸58-1791或SEQ ID NO: 6之核苷酸58-1791至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
在其他實施例中，連接於以上所列之第二核酸序列的第一核酸序列具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸1-1791或SEQ ID NO: 6之核苷酸1-1791至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸58-1791、(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸58-1791、(iii)SEQ ID NO: 70之核苷酸58-1791或(iv)SEQ ID NO: 71之核苷酸58-1791至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；且其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性。在其他實施例中，第一核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之核苷酸58-1791、SEQ ID NO: 2之核苷酸58-1791、(iii)SEQ ID NO: 70之核苷酸58-1791或(iv)SEQ ID NO: 71之核苷酸58-1791。
在其他實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸1-1791、(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸1-1791、(iii)SEQ ID NO: 70之核苷酸1-1791或(iv)SEQ ID NO: 71之核苷酸1-1791至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；且其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性。
在一個實施例中，第一核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之核苷酸1-1791、SEQ ID NO: 2之核苷酸1-1791、(iii)SEQ ID NO: 70之核苷酸1-1791或(iv)SEQ ID NO: 71之核苷酸1-1791。在另一實施例中，連接於第一核苷酸序列之第二核苷酸序列具有與SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-4374、SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-4374、(iii)SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-4374或(iv)SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-4374至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
在一特定實施例中，連接於第一核苷酸序列之第二核苷酸序列包含(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-4374、(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-4374、(iii)SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-4374或(iv)SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-4374。在其他實施例中，連接於第一核苷酸序列之第二核苷酸序列具有與(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-2277及2320-4374、(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-2277及2320-4374、(iii)SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-2277及2320-4374或(iv)SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-2277及2320-4374至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一個實施例中，第二核苷酸序列包含(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-2277及2320-4374、(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-2277及2320-4374、(iii)SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-2277及2320-4374或(iv)SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-2277及2320-4374。
在另一實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-4374、(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-4374、(iii)SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-4374或(iv)SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-4374至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；且其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性。
在一特定實施例中，第二核酸序列包含(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-4374、(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-4374、(iii)SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-4374或(iv)SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-4374。在一些實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第二核酸序列具有與(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-2277及2320-4374、(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-2277及2320-4374、(iii)SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-2277及2320-4374或(iv)SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-4374、SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-4374、SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-4374或SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-4374)至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；且其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性。
在一個實施例中，第二核酸序列包含(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-2277及2320-4374、(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-2277及2320-4374、(iii)SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-2277及2320-4374或(iv)SEQ ID N.O: 71之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1之核苷酸1792-4374、SEQ ID NO: 2之核苷酸1792-4374、SEQ ID NO: 70之核苷酸1792-4374或SEQ ID NO: 71之核苷酸1792-4374)。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 1之核苷酸58至4374至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。
在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 1之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1之核苷酸58-4374)至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。
在其他實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 1至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 1之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之核苷酸1-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 1之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 2之核苷酸58至4374至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 2之核苷酸58-2277及2320-4374至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。
在其他實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 2至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 2之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 2之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之核苷酸1-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 2之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 2之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 70之核苷酸58至4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。
在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 70之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 70之核苷酸58-4374)至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。
在其他實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 70至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 70之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 70之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 70之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 70之核苷酸1-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 70之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 70之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 71之核苷酸58至4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。
在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 71之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 71之核苷酸58-4374)至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。在其他實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 71至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 71之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 71之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 71之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 71之核苷酸1-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 71之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 71之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 3之核苷酸58至4374至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 3之核苷酸58-4374)至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。
在某些實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 3至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 3之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 3之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 3之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 3之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 4之核苷酸58至4374至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。
在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 4之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 4之核苷酸58-4374)至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。
在其他實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 4至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 4之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 4之核苷酸58至4374。在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之核苷酸1-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 4之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 4之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸58至4374至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。
在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 5之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 5之核苷酸58-4374)至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。
在某些實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 5至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 5之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 5之核苷酸58至4374。
在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之核苷酸1-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 5之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 5之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 6之核苷酸58至4374至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。
在其他實施例中，核苷酸序列包含具有與SEQ ID NO: 6之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 6之核苷酸58-4374)至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核酸序列。
在某些實施例中，核酸序列具有與SEQ ID NO: 6至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
在一些實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 6之核苷酸58-4374)或SEQ ID NO: 6之核苷酸58至4374。
在其他實施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之核苷酸1-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 6之核苷酸1-4374)或SEQ ID NO: 6之核苷酸1至4374。
在一些實施例中，核苷酸序列包含編碼信號肽之核酸序列。在某些實施例中，信號肽為FVIII信號肽。在一些實施例中，編碼信號肽之核酸序列經密碼子優化。
在一特定實施例中，編碼信號肽之核酸序列具有與以下各者至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸1至57；(ii)SEQ ID NO: 2之核苷酸1至57；(iii)SEQ ID NO: 3之核苷酸1至57；(iv)SEQ ID NO: 4之核苷酸1至57；(v)SEQ ID NO: 5之核苷酸1至57；(vi)SEQ ID NO: 6之核苷酸1至57；(vii)SEQ ID NO: 70之核苷酸1至57；(viii)SEQ ID NO: 71之核苷酸1至57；或(ix)SEQ ID NO: 68之核苷酸1至57。
SEQ ID NO: 1-6、70及71為起始或「親本」或「野生型」FVIII核苷酸序列SEQ ID NO: 16之優化型式。SEQ ID NO: 16編碼B結構域缺失之人類FVIII。雖然SEQ ID NO: 1-6、70及71源自於FVIII之特定B結構域缺失形式(SEQ ID NO: 16)，但應瞭解本發明之慢病毒基因療法方法亦針對編碼FVIII之其他型式的核酸之優化型式。舉例而言，FVIII之其他型式可包括全長FVIII、FVIII之其他B結構域缺失(如下所述)或保留FVIII活性之FVIII之其他片段。
除非另作說明，否則如本文所用之「具有FVIII活性之多肽」意謂在凝血中發揮正常作用之功能FVIII多肽。術語具有FVIII活性之多肽包括保留全長野生型因子VIII在凝血路徑中之功能的其功能片段、變異體、類似物或衍生物。
「具有FVIII活性之多肽」可與FVIII蛋白質、FVIII多肽或FVIII互換使用。FVIII功能之實例包括(但不限於)活化凝血之能力、充當因子IX之輔因子的能力或在Ca2+ 及磷脂存在下與因子IX形成液化酶複合物、接著將因子X轉化成活化形式Xa的能力。
在一個實施例中，具有FVIII活性之多肽包含兩個多肽鏈，第一鏈具有FVIII重鏈且第二鏈具有FVIII輕鏈。在另一實施例中，具有FVIII活性之多肽為單鏈FVIII。單鏈FVIII可在與成熟FVIII序列對應之胺基酸殘基1645及/或1648處含有一或多個突變或取代。參見國際申請案第PCT/US2012/045784號，以引用之方式整體併入本文中。FVIII蛋白質可為人類、豬科、犬科、大鼠或鼠科FVIII蛋白質。另外，來自人類及其他物種之FVIII之間的比較已鑑別出可能為功能所需要之保守殘基(Cameron等人,Thromb. Haemost . 79:317-22(1998)；US 6,251,632)。
如本文所用之FVIII之「B結構域」與本領域中已知之B結構域相同，由內部胺基酸序列一致性及凝血酶進行蛋白水解裂解之位點界定，例如全長人類FVIII之殘基Ser741-Arg1648。其他人類FVIII結構域由以下胺基酸殘基界定：A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；A3，殘基Ser1690-Ile2032；C1，殘基Arg2033-Asn2172；C2，殘基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括殘基Ser1690-Tyr2332。剩餘序列殘基Glu1649-Arg1689通常稱為FVIII輕鏈活化肽。豬科、小鼠及犬科FVIII之包括B結構域之所有結構域的邊界位置亦為本領域中已知。BDD FVIII之一實例為REFACTO® 重組BDD FVIII(Wyeth Pharmaceuticals公司)。
「B結構域缺失FVIII」可具有美國專利第6,316,226號、第6,346,513號、第7,041,635號、第5,789,203號、第6,060,447號、第5,595,886號、第6,228,620號、第5,972,885號、第6,048,720號、第5,543,502號、第5,610,278號、第5,171,844號、第5,112,950號、第4,868,112號及第6,458,563號(各以引用之方式整體併入本文中)中揭示之完全或部分缺失。在一些實施例中，本發明之B結構域缺失FVIII序列包含美國專利第6,316,226號(亦在US 6,346,513中)之第4欄第4行至第5欄第28行及實例1-5揭示的任一缺失。
在一些實施例中，本發明之B結構域缺失FVIII序列具有美國專利第5,789,203號(亦在US 6,060,447、US 5,595,886及US 6,228,620中)之第2欄第26-51行及實例5-8揭示的缺失。在一些實施例中，B結構域缺失FVIII具有以下中描述之缺失：美國專利第5,972,885號之第1欄第25行至第2欄第40行；美國專利第6,048,720號之第6欄第1-22行及實例1；美國專利第5,543,502號之第2欄第17-46行；美國專利第5,171,844號之第4欄第22行至第5欄第36行；美國專利第5,112,950號之第2欄第55-68行、圖2及實例1；美國專利第4,868,112號之第2欄第2行至第19欄第21行及表2；美國專利第7,041,635號之第2欄第1行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄第67行、第7欄第43行至第8欄第26行及第11欄第5行至第13欄第39行；或美國專利第6,458,563號之第4欄第25-53行。
在一些實施例中，B結構域缺失之FVIII缺失大部分B結構域，但仍含有對主要轉譯產物在活體內蛋白水解加工成兩個多肽鏈而言不可或缺的B結構域之胺基端序列，如以引用之方式整體併入本文中之WO 91/09122中所揭示。在一些實施例中，B結構域缺失之FVIII經構築缺失胺基酸747-1638，亦即實際上完全缺失B結構域。Hoeben R.C.等人,J. Biol. Chem. 265(13): 7318-7323(1990)，以引用之方式整體併入本文中。B結構域缺失之FVIII亦可缺失FVIII之胺基酸771-1666或胺基酸868-1562。Meulien P.等人,Protein Eng. 2(4): 301-6(1988)，以引用之方式整體併入本文中。
作為本發明之一部分的其他B結構域缺失包括例如缺失胺基酸982至1562或760至1639(Toole等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1986)83, 5939-5942))、797至1562(Eaton等人,Biochemistry( 1986)25:8343-8347))、741至1646(Kaufman (PCT公開申請案第WO 87/04187號))、747-1560(Sarver等人,DNA( 1987)6:553-564))、741至1648(Pasek(PCT申請案第88/00831號))、816至1598或741至1689(Lagner(Behring Inst. Mitt. (1988)No 82:16-25, EP 295597))，各以引用之方式整體併入本文中。任何FVIII序列中可形成各前述缺失。
許多功能FVIII分子，包括B-結構域缺失，揭示於以下專利中：均頒予Baxter之US 6,316,226及US 6,346,513；頒予In2Gen之US 7,041,635；頒予Chiron之US 5,789,203、US 6,060,447、US 5,595,886及US 6,228,620 ；頒予Biovitrum之US 5,972,885及US 6,048,720、頒予Novo Nordisk之US 5,543,502及US 5,610,278；頒予Immuno Ag之US 5,171,844；頒予Transgene S.A.之US 5,112,950；頒予Genetics Institute之US 4,868,112，各以引用之方式整體併入本文中。

A. 密碼子優化
在一個實施例中，本發明之慢病毒載體包含經分離之核酸分子，該經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核酸序列已進行密碼子優化。在另一實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽且進行密碼子優化之起始核酸序列為SEQ ID NO: 16。在一些實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的序列針對人類表現進行密碼子優化。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的序列針對鼠科表現進行密碼子優化。SEQ ID NO: 1-6、70及71為SEQ ID NO: 16之密碼子優化型式，針對人類表現進行優化。
術語「密碼子優化」在其提及用於多種宿主轉化之核酸分子之基因或編碼區時係指在不改變由DNA編碼之多肽下核酸分子之基因或編碼區中的密碼子改變，從而反映宿主生物體之典型密碼子使用。此類優化包括用在該生物體之基因中較頻繁使用之一或多個密碼子替換至少一個或超過一個或相當數目之密碼子。
包含編碼任何多肽鏈之胺基酸之密碼子的核苷酸序列之偏差允許編碼該基因之序列變化。因為各密碼子由三個核苷酸組成，且包含DNA之核苷酸限於四種特定鹼基，所以存在64種核苷酸可能組合，其中61種編碼胺基酸(剩餘三種密碼子編碼終止轉譯之信號)。顯示哪個密碼子編碼哪個胺基酸之「遺傳密碼」在本文中再現為表1。因此，許多胺基酸由超過一種密碼子表示。舉例而言，胺基酸丙胺酸及脯胺酸由四種三聯體編碼，絲胺酸及精胺酸由六種三聯體編碼，而色胺酸及甲硫胺酸由僅僅一種三聯體編碼。此簡併允許DNA鹼基組成在廣泛範圍內變化，而不改變由該DNA編碼之蛋白質的胺基酸序列。
許多生物體顯示偏好使用特定密碼子進行編碼以使特定胺基酸插入生長中之肽鏈中。生物體之間的密碼子使用之密碼子偏愛或密碼子偏好差異由遺傳密碼之簡併提供，且在許多生物體間充分證明。密碼子偏好常與信使RNA(mRNA)之轉譯效率相關，咸信該轉譯效率又視尤其所轉譯密碼子之性質及特定轉移RNA(tRNA)分子之可用性而定。細胞中所選tRNA之優勢一般反映在肽合成中最頻繁使用之密碼子。因此，可針對在既定生物體中之最佳基因表現，基於密碼子優化，對基因進行修改。
假定可獲得多種動物、植物及微生物物種之大量基因序列，已計算密碼子使用之相對頻率。密碼子使用表可例如在可得自www.kazusa.or.jp/codon/(2012年6月18日訪問)之「密碼子使用資料庫」獲得。參見Nakamura, Y.等人, Nucl. Acids Res. 28:292(2000)。
可藉由計算各胺基酸之密碼子頻率，接著隨機分配密碼子給多肽序列，以優化頻率手動隨機分配密碼子以編碼既定多肽序列。另外，多種算法及電腦軟體程式可用於計算最佳序列。
在一些實施例中，核酸分子包含一或多種性質：(a)核酸分子或其一部分之人類密碼子適應指數相對於SEQ ID NO: 16增加；(b)核苷酸序列或其一部分之最佳密碼子之頻率相對於SEQ ID NO: 16增加；(c)核苷酸序列或其一部分含有比SEQ ID NO: 16中G/C核苷酸之百分比高的G/C核苷酸之百分比；(d)核苷酸序列或其一部分之相對同義密碼子使用度相對於SEQ ID NO: 16增加；(e)核苷酸序列或其一部分之有效密碼子數目相對於SEQ ID NO: 16減少；(f)核苷酸序列相對於SEQ ID NO: 16含有更少MARS/ARS序列(SEQ ID NO: 21及22)；(g)核苷酸序列相對於SEQ ID NO: 16含有更少去穩定元件(SEQ ID NO : 23及24)；(i)核苷酸序列不含多聚-T序列；(j)核苷酸序列不含多聚-A序列；或(k)其任何組合。在一些實施例中，核酸分子含有(a)至(j)之特徵中的至少兩個特徵、至少三個特徵、至少四個特徵、至少五個特徵、至少六個特徵、至少七個特徵、至少八個特徵、至少九個特徵或十個特徵。

B. 密碼子適應指數
在一個實施例中，經分離之核酸分子包含本文所述之編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中人類密碼子適應指數相對於SEQ ID NO: 16增加。舉例而言，核苷酸序列之人類密碼子適應指數可為至少約0.75(75%)、至少約0.76(76%)、至少約0.77(77%)、至少約0.78(78%)、至少約0.79(79%)、至少約0.80(80%)、至少約0.81(81%)、至少約0.82(82%)、至少約0.83(83%)、至少約0.84(84%)、至少約0.85(85%)、至少約0.86(86%)、至少約0.87(87%)、至少約0.88(88%)、至少約0.89(89%)、至少約0.90(90%)、至少約0.91(91%)、至少約0.92(92%)、至少約0.93(93%)、至少約0.94(94%)、至少約0.95(95%)、至少約0.96(96%)、至少約0.97(97%)、至少約0.98(98%)或至少約0.99(99%)。在一些實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.88(88%)。在其他實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.91(91%)。在其他實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.91(97%)。
在一特定實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii)SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv)SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列之人類密碼子適應指數相對於SEQ ID NO: 16增加。
在一些實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.75(75%)、至少約0.76(76%)、至少約0.77(77%)、至少約0.78(78%)、至少約0.79(79%)、至少約0.80(80%)、至少約0.81(81%)、至少約0.82(82%)、至少約0.83(83%)、至少約0.84(84%)、至少約0.85(85%)、至少約0.86(86%)、至少約0.87(87%)、至少約0.88(88%)、至少約0.89(89%)、至少約0.90(90%)或至少約0.91(91%)。在一特定實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.88(88%)。在另一實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.91(91%)。
在另一實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第二核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374或(ii)SEQ ID NO: 6 1792-2277及2320-4374；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列之人類密碼子適應指數相對於SEQ ID NO: 16增加。
在一些實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.75(75%)、至少約0.76(76%)、至少約0.77(77%)、至少約0.78(78%)、至少約0.79(79%)、至少約0.80(80%)、至少約0.81(81%)、至少約0.82(82%)、至少約0.83(83%)、至少約0.84(84%)、至少約0.85(85%)、至少約0.86(86%)、至少約0.87(87%)或至少約0.88(88%)。在一特定實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.83(83%)。在另一實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.88(88%)。
在其他實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列；且其中該核苷酸序列之人類密碼子適應指數相對於SEQ ID NO: 16增加。在一些實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.75(75%)、至少約0.76(76%)、至少約0.77(77%)、至少約0.78(78%)、至少約0.79(79%)、至少約0.80(80%)、至少約0.81(81%)、至少約0.82(82%)、至少約0.83(83%)、至少約0.84(84%)、至少約0.85(85%)、至少約0.86(86%)、至少約0.87(87%)或至少約0.88(88%)。
在一特定實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.75(75%)。在另一實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.83(83%)。在另一實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.88(88%)。在另一實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.91(91%)。在另一實施例中，核苷酸序列之人類密碼子適應指數為至少約0.97(97%)。
在一些實施例中，經分離之核酸分子之最佳密碼子之頻率(FOP)相對於SEQ ID NO: 16增加。在某些實施例中，經分離之核酸分子之FOP為至少約40、至少約45、至少約50、至少約55、至少約60、至少約64、至少約65、至少約70、至少約75、至少約79、至少約80、至少約85或至少約90。
在其他實施例中，經分離之核酸分子之相對同義密碼子使用度(RCSU)相對於SEQ ID NO: 16增加。在一些實施例中，經分離之核酸分子之RCSU超過1.5。在其他實施例中，經分離之核酸分子之RCSU超過2.0。在某些實施例中，經分離之核酸分子之RCSU為至少約1.5、至少約1.6、至少約1.7、至少約1.8、至少約1.9、至少約2.0、至少約2.1、至少約2.2、至少約2.3、至少約2.4、至少約2.5、至少約2.6或至少約2.7。
在其他實施例中，經分離之核酸分子之有效密碼子數目相對於SEQ ID NO: 16減少。在一些實施例中，經分離之核酸分子之有效密碼子數目小於約50、小於約45、小於約40、小於約35、小於約30或小於約25。在一特定實施例中，經分離之核酸分子之有效密碼子數目為約40、約35、約30、約25或約20。

C. G/C 含量優化
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含本文所述之編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列含有比SEQ ID NO: 16中G/C核苷酸之百分比高的G/C核苷酸之百分比。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的G/C含量為至少約45%、至少約46%、至少約47%、至少約48%、至少約49%、至少約50%、至少約51%、至少約52%、至少約53%、至少約54%、至少約55%、至少約56%、至少約57%、至少約58%、至少約59%或至少約60%。
在一特定實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii)SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv)SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列含有比SEQ ID NO: 16中G/C核苷酸之百分比高的G/C核苷酸之百分比。
在一些實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的G/C含量為至少約45%、至少約46%、至少約47%、至少約48%、至少約49%、至少約50%、至少約51%、至少約52%、至少約53%、至少約54%、至少約55%、至少約56%、至少約57%或至少約58%。在一特定實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的G/C含量為至少約58%。
在另一實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第二核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374；(ii)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374；(iii)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)或(iv)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列含有比SEQ ID NO: 16中G/C核苷酸之百分比高的G/C核苷酸之百分比。
在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的G/C含量為至少約45%、至少約46%、至少約47%、至少約48%、至少約49%、至少約50%、至少約51%、至少約52%、至少約53%、至少約54%、至少約55%、至少約56%或至少約57%。在一特定實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的G/C含量為至少約52%。在另一實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的G/C含量為至少約55%。在另一實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的G/C含量為至少約57%。
在其他實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之(i)核苷酸58-4374或(ii)核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列且其中該核苷酸序列含有比SEQ ID NO: 16中G/C核苷酸之百分比高的G/C核苷酸之百分比。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的G/C含量為至少約45%。
在一特定實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的G/C含量為至少約52%。在另一實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的G/C含量為至少約55%。在另一實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的G/C含量為至少約57%。在另一實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的G/C含量為至少約58%。在又一定實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的G/C含量為至少約60%。
「G/C含量」(或鳥嘌呤-胞嘧啶含量)或「G/C之百分比」係指DNA分子中係鳥嘌呤或胞嘧啶之含氮鹼基之百分比。可使用下式計算G/C含量：
人類基因之G/C含量高度不均勻，其中一些基因之G/C含量低至20%，且其他基因之G/C含量高達95%。一般而言，富含G/C之基因更高度表現。事實上，已證明增加基因之G/C含量可增加基因之表現，主要因為轉錄增加及穩態mRNA水準更高。參見Kudla等人,PLoS Biol ., 4(6): e180(2006)。

D. 基質附著區樣序列
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含本文所述之編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16更少之MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多6個、至多5個、至多4個、至多3個或至多2個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多1個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列不含有MARS/ARS序列。
在一特定實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii)SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv)SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16更少之MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多6個、至多5個、至多4個、至多3個或至多2個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多1個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列不含MARS/ARS序列。
在另一實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第二核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374；(ii)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374；(iii)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)；或(iv)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16更少之MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多6個、至多5個、至多4個、至多3個或至多2個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多1個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列不含MARS/ARS序列。
在其他實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70或71之核苷酸58-4374或(ii)SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70或71之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列；且其中該核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16更少之MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多6個、至多5個、至多4個、至多3個或至多2個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多1個MARS/ARS序列。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列不含MARS/ARS序列。
已鑑別出人類FVIII核苷酸序列中與釀酒酵母自主複製序列(ARS)及核基質附著區(MAR)共享序列相似性的富含AT之元件(Fallux等人,Mol. Cell. Biol. 16:4264-4272 (1996)。已經顯示此等元件之一在活體外結合核因子且抑制氯黴素乙醯轉移酶(CAT)報導基因之表現。同前。已假設此等序列可促進人類FVIII基因之轉錄抑制。因此，在一個實施例中，在本發明之FVIII基因中消除所有MAR/ARS序列。親本FVIII序列(SEQ ID NO: 16)中存在四個MAR/ARS ATATTT序列(SEQ ID NO: 21)及三個MAR/ARS AAATAT序列(SEQ ID NO: 22)。優化FVIII序列(SEQ ID NO: 1-6)中所有此等位點均突變以破壞MAR/ARS序列。優化序列中此等元件每一者之位置及對應核苷酸之序列展示於以下表2中。

E. 去穩定序列
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含本文所述之編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16更少之去穩定元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個或至多5個去穩定元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個或至多1個去穩定元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列不含去穩定元件。
在一特定實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii)SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv)SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16更少之去穩定元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個或至多5個去穩定元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個或至多1個去穩定元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列不含去穩定元件。
在另一實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第二核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374；(ii)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374；(iii)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)；或(iv)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16更少之去穩定元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個或至多5個去穩定元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個或至多1個去穩定元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列不含去穩定元件。
在其他實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列；且其中該核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16更少之去穩定元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個或至多5個去穩定元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個或至多1個去穩定元件。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列不含去穩定元件。
親本FVIII序列(SEQ ID NO: 16)中存在十個去穩定元件：六個ATTTA序列(SEQ ID NO: 23)及四個TAAAT序列(SEQ ID NO: 24)。在一個實施例中，在優化FVIII SEQ ID NO: 1-6、70及71中此等位點之序列進行突變以破壞去穩定元件。優化序列中此等元件每一者之位置及對應核苷酸之序列展示於表2中。

F. 潛在啟動子結合位點
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含本文所述之編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16更少之潛在啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個或至多5個潛在啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個或至多1個潛在啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列不含潛在啟動子結合位點。
在一特定實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii)SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv)SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16更少之潛在啟動子結合位點。
在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個或至多5個潛在啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個或至多1個潛在啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列不含潛在啟動子結合位點。
在另一實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第二核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374；(ii)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374；(iii)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)；或(iv)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16更少之潛在啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個或至多5個潛在啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個或至多1個潛在啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列不含潛在啟動子結合位點。
在其他實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列；且其中該核苷酸序列含有相對於SEQ ID NO: 16更少之潛在啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多9個、至多8個、至多7個、至多6個或至多5個潛在啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列含有至多4個、至多3個、至多2個或至多1個潛在啟動子結合位點。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列不含潛在啟動子結合位點。
TATA盒為常在真核生物之啟動子區域中發現之調控序列。其用作TATA結合蛋白(TBP，一種通用轉錄因子)之結合位點。TATA盒通常包含序列TATAA(SEQ ID NO: 28)或密切變異體。然而，編碼序列內之TATA盒可抑制全長蛋白質之轉譯。野生型BDD FVIII序列(SEQ ID NO: 16)中存在十個潛在啟動子結合序列：五個TATAA序列(SEQ ID NO: 28)及五個TTATA序列(SEQ ID NO: 29)。在一些實施例中，本發明之FVIII基因中消除至少1個、至少2個、至少3個或至少4個啟動子結合位點。在一些實施例中，本發明之FVIII基因中消除至少5個啟動子結合位點。在其他實施例中，本發明之FVIII基因中消除至少6個、至少7個或至少8個啟動子結合位點。在一個實施例中，本發明之FVIII基因中消除至少9個啟動子結合位點。在一特定實施例中，本發明之FVIII基因中消除所有啟動子結合位點。優化序列中每一潛在啟動子結合位點之位置及對應核苷酸之序列展示於表2中。

G. 其他順式作用負調控元件
除上述MAR/ARS序列、去穩定元件及潛在啟動子位點外，在野生型BDD FVIII序列(SEQ ID NO: 16)中可鑑別出若干其他可能抑制序列。在未優化BDD FVIII序列中可鑑別兩個富含AU序列元件(ARE)(ATTTTATT(SEQ ID NO: 30)；及ATTTTTAA(SEQ ID NO: 31)以及多聚-A位點(AAAAAAA；SEQ ID NO: 26)、多聚-T位點(TTTTTT；SEQ ID NO: 25)及剪接位點(GGTGAT；SEQ ID NO: 27)。此等元件中之一或多個可自優化FVIII序列移除。優化序列中此等位點每一者之位置及對應核苷酸之序列展示於表2中。
在某些實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii)SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv)SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列不含一或多個順式作用負調控元件，例如剪接位點、多聚-T序列、多聚-A序列、ARE序列或其任何組合。
在另一實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第二核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374；(ii)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374；(iii)SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-4374)；或(iv)SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-4374)；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列不含一或多個順式作用負調控元件，例如剪接位點、多聚-T序列、多聚-A序列、ARE序列或其任何組合。
在其他實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列；且其中該核苷酸序列不含一或多個順式作用負調控元件，例如剪接位點、多聚-T序列、多聚-A序列、ARE序列或其任何組合。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii)SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv)SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列不含剪接位點GGTGAT(SEQ ID NO: 27)。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii)SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv)SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列不含多聚-T序列(SEQ ID NO: 25)。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii)SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv)SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列不含多聚-A序列(SEQ ID NO: 26)。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含包括編碼FVIII多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列的核苷酸序列；其中該第一核酸序列具有與以下各者至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：(i)SEQ ID NO: 3之核苷酸58-1791；(ii)SEQ ID NO: 3之核苷酸1-1791；(iii)SEQ ID NO: 4之核苷酸58-1791；或(iv)SEQ ID NO: 4之核苷酸1-1791；其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性；且其中該核苷酸序列不含ARE元件(SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 31)。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列；且其中該核苷酸序列不含剪接位點GGTGAT(SEQ ID NO: 27)。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列；且其中該核苷酸序列不含多聚-T序列(SEQ ID NO: 25)。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列；且其中該核苷酸序列不含多聚-A序列(SEQ ID NO: 26)。
在一些實施例中，經分離之核酸分子包含編碼具有FVIII活性之多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含具有與(i)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-4374或(ii)選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70及71之胺基酸序列之核苷酸58-2277及2320-4374(亦即無編碼B結構域或B結構域片段之SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、70或71之核苷酸58-4374)至少約80%、至少約85%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的核酸序列；且其中該核苷酸序列不含ARE元件(SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 31)。
在其他實施例中，本發明之優化FVIII序列不包含抗病毒基元、莖環結構及重複序列中之一或多者。
在其他實施例中，包圍轉錄起始位點之核苷酸變為科紮克一致序列(GCCGCCACCATG C(SEQ ID NO: 32)，其中加下劃線之核苷酸為起始密碼子)。在其他實施例中，可添加或移除限制位點以促進選殖過程。

H. 異源核苷酸序列
在一些實施例中，經分離之核酸分子進一步包含異源核苷酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸分子進一步包含至少一個異源核苷酸序列。異源核苷酸序列可在5’末端、3’末端與本發明之優化BDD-FVIII核苷酸序列連接，或插入優化BDD-FVIII核苷酸序列之中間。因此，在一些實施例中，由異源核苷酸序列編碼之異源胺基酸序列連接於由該核苷酸序列編碼之FVIII胺基酸序列之N端或C端，或插入FVIII胺基酸序列之兩個胺基酸之間。在一些實施例中，異源胺基酸序列可在選自表3之一或多個插入位點處插入兩個胺基酸之間。在一些實施例中，異源胺基酸序列可在國際公開案第WO 2013/123457 A1號及第WO 2015/106052 A1號或美國公開案第2015/0158929 A1號(以引用之方式整體併入本文中)中揭示之任何位點處插入由本發明之核酸分子編碼之FVIII多肽內。
在一些實施例中，由異源核苷酸序列編碼之異源胺基酸序列插入B結構域或其片段內。在一些實施例中，異源胺基酸序列緊鄰與成熟人類FVIII(SEQ ID NO: 15)之胺基酸745對應之胺基酸的下游插入FVIII內。在一特定實施例中，FVIII包含與成熟人類FVIII(SEQ ID NO: 15)對應之胺基酸746-1646之缺失，且由異源核苷酸序列編碼之異源胺基酸序列緊鄰與成熟人類FVIII(SEQ ID NO: 15)對應之胺基酸745的下游插入。
在其他實施例中，經分離之核酸分子進一步包含兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個異源核苷酸序列。在一些實施例中，所有異源核苷酸序列一致。在一些實施例中，至少一個異源核苷酸序列與其他異源核苷酸序列不同。在一些實施例中，本發明可包含兩個、三個、四個、五個、六個或超過七個串聯之異源核苷酸序列。
在一些實施例中，異源核苷酸序列編碼胺基酸序列。在一些實施例中，由異源核苷酸序列編碼之胺基酸序列為可增加FVIII分子之半衰期之異源部分(「半衰期」延長子)。
在一些實施例中，異源部分為具有在併入本發明之蛋白質中時與延長活體內半衰期相關之非結構化或結構化特徵的肽或多肽。非限制性實例包括白蛋白、白蛋白片段、免疫球蛋白之Fc片段、人類絨毛膜促性腺激素之β子單元之C端肽(CTP)、HAP序列、XTEN序列、轉鐵蛋白或其片段、PAS多肽、聚甘胺酸連接子、聚絲胺酸連接子、白蛋白結合部分或此等多肽之任何片段、衍生物、變異體或組合。在一特定實施例中，異源胺基酸序列為免疫球蛋白恆定區或其一部分、轉鐵蛋白、白蛋白或PAS序列。
在一些態樣中，異源部分包括馮威里氏因子或其片段。在其他相關態樣中，異源部分可包括諸如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、聚唾液酸或此等元件之任何衍生物、變異體或組合之非多肽部分的附接位點(例如半胱胺酸胺基酸)。在一些態樣中，異源部分包含充當諸如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、聚唾液酸或此等元件之任何衍生物、變異體或組合之非多肽部分的附接位點的半胱胺酸胺基酸。
在一特定實施例中，第一異源核苷酸序列編碼作為本領域中已知之延長半衰期之分子的第一異源部分，且第二異源核苷酸序列編碼亦可作為本領域中已知之延長半衰期之分子的第二異源部分。在某些實施例中，第一異源部分(例如第一Fc部分)及第二異源部分(例如第二Fc部分)彼此締合，形成二聚體。在一個實施例中，第二異源部分為第二Fc部分，其中該第二Fc部分與第一異源部分，例如第一Fc部分連接或締合。舉例而言，第二異源部分(例如第二Fc部分)可藉由連接子與第一異源部分(例如第一Fc部分)連接或藉由共價鍵或非共價鍵與第一異源部分締合。
在一些實施例中，異源部分為包含至少約10個、至少約100個、至少約200個、至少約300個、至少約400個、至少約500個、至少約600個、至少約700個、至少約800個、至少約900個、至少約1000個、至少約1100個、至少約1200個、至少約1300個、至少約1400個、至少約1500個、至少約1600個、至少約1700個、至少約1800個、至少約1900個、至少約2000個、至少約2500個、至少約3000個或至少約4000個胺基酸、基本上由其組成或由其組成之多肽。
在其他實施例中，異源部分為包含約100至約200個胺基酸、約200至約300個胺基酸、約300至約400個胺基酸、約400至約500個胺基酸、約500至約600個胺基酸、約600至約700個胺基酸、約700至約800個胺基酸、約800至約900個胺基酸或約900至約1000個胺基酸、基本上由其組成或由其組成之多肽。
在某些實施例中，異源部分改善FVIII蛋白質之一或多種藥物動力學性質，不會顯著影響其生物活性或功能。
在某些實施例中，異源部分增加本發明之FVIII蛋白質之活體內及/或活體外半衰期。在其他實施例中，異源部分促進本發明之FVIII蛋白質或其片段(例如在FVIII蛋白質之蛋白水解裂解之後包含異源部分之片段)的目測或定位。本發明之FVIII蛋白質或其片段之目測及/或定位可在活體內、活體外、離體或其組合。
在其他實施例中，異源部分增加本發明之FVIII蛋白質或其片段(例如在FVIII蛋白質之蛋白水解裂解之後包含異源部分之片段)的穩定性。如本文所用，術語「穩定性」係指本領域中公認的關於FVIII蛋白質之一或多種物理特性回應於環境條件(例如溫度升高或降低)之維持情況的量度。在某些態樣中，物理特性可為FVIII蛋白質之共價結構之維持(例如不存在蛋白水解裂解、不必要之氧化或去醯胺基)。在其他態樣中，物理特性亦可為存在處於適當摺疊狀態下之FVIII蛋白質(例如不存在可溶性或不溶性聚集物或沈澱物)。
在一個態樣中，FVIII蛋白質之穩定性藉由分析FVIII蛋白質之生物物理性質，例如熱穩定性、pH展開概況、糖基化之穩定移除、溶解性、生物化學功能(例如結合於蛋白質、受體或配位體之能力))等及/或其組合來量測。在另一個態樣中，生物化學功能藉由相互作用之結合親和力來證明。在一個態樣中，蛋白質穩定性之量度為熱穩定性，亦即對熱激發之抵抗性。穩定性可使用本領域中已知之方法量測，該等方法諸如HPLC(高效液相層析法)、SEC(空間排阻層析法)、DLS(動態光散射)等等。量測熱穩定性之方法包括(但不限於)差示掃描量熱法(DSC)、差示掃描螢光法(DSF)、圓二色性(CD)及熱激發分析法。
在某些態樣中，由本發明之核酸分子編碼之FVIII蛋白質包含至少一個半衰期延長子，亦即一種異源部分，其相對於缺乏此類異源部分之對應FVIII蛋白質的活體內半衰期，增加FVIII蛋白質之活體內半衰期。FVIII蛋白質之活體內半衰期可藉由本領域之技術人員已知的任何方法，例如活性分析(顯色分析或一步凝血aPTT分析)、ELISA、ROTEMTM 等等來測定。
在一些實施例中，一或多種半衰期延長子之存在引起FVIII蛋白質之半衰期相比於缺乏此一或多種半衰期延長子之對應蛋白質的半衰期增加。包含半衰期延長子之FVIII蛋白質之半衰期比缺乏此類半衰期延長子之對應FVIII蛋白質的活體內半衰期長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。
在一個實施例中，包含半衰期延長子之FVIII蛋白質之半衰期比缺乏此類半衰期延長子之對應蛋白質的活體內半衰期長約1.5倍至約20倍、約1.5倍至約15倍或約1.5倍至約10倍。在另一實施例中，包含半衰期延長子之FVIII蛋白質之半衰期延長比缺乏此類半衰期延長子之對應蛋白質的活體內半衰期長約2倍至約10倍、約2倍至約9倍、約2倍至約8倍、約2倍至約7倍、約2倍至約6倍、約2倍至約5倍、約2倍至約4倍、約2倍至約3倍、約2.5倍至約10倍、約2.5倍至約9倍、約2.5倍至約8倍、約2.5倍至約7倍、約2.5倍至約6倍、約2.5倍至約5倍、約2.5倍至約4倍、約2.5倍至約3倍、約3倍至約10倍、約3倍至約9倍、約3倍至約8倍、約3倍至約7倍、約3倍至約6倍、約3倍至約5倍、約3倍至約4倍、約4倍至約6倍、約5倍至約7倍或約6倍至約8倍。
在其他實施例中，包含半衰期延長子之FVIII蛋白質之半衰期為至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。
在其他實施例中，包含半衰期延長子之FVIII蛋白質之半衰期為約15小時至約兩週、約16小時至約一週、約17小時至約一週、約18小時至約一週、約19小時至約一週、約20小時至約一週、約21小時至約一週、約22小時至約一週、約23小時至約一週、約24小時至約一週、約36小時至約一週、約48小時至約一週、約60小時至約一週、約24小時至約六天、約24小時至約五天、約24小時至約四天、約24小時至約三天或約24小時至約兩天。
在一些實施例中，包含半衰期延長子之FVIII蛋白質之每個個體平均半衰期為約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時(1天)、約25小時、約26小時、約27小時、約28小時、約29小時、約30小時、約31小時、約32小時、約33小時、約34小時、約35小時、約36小時、約40小時、約44小時、約48小時(2天)、約54小時、約60小時、約72小時(3天)、約84小時、約96小時(4天)、約108小時、約120小時(5天)、約六天、約七天(一週)、約八天、約九天、約10天、約11天、約12天、約13天或約14天。
一或多種半衰期延伸子可與FVIII之C端或N端融合或插入FVIII內。

1. 免疫球蛋白恆定區或其一部分
在另一個態樣中，異源部分包含一或多個免疫球蛋白恆定區或其一部分(例如Fc區)。在一個實施例中，本發明之經分離之核酸分子進一步包含編碼免疫球蛋白恆定區或其一部分之異源核酸序列。在一些實施例中，免疫球蛋白恆定區或其一部分為Fc區。
免疫球蛋白恆定區由稱為CH(恆定重鏈)結構域(CH1、CH2等)之結構域構成。視同型(亦即IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)而定，恆定區可由三個或四個CH結構域構成。一些同型(例如IgG)恆定區亦含有鉸鏈區。參見Janeway等人 2001,Immunobiology , Garland Publishing, N.Y., N.Y。
用於產生本發明之FVIII蛋白質的免疫球蛋白恆定區或其一部分可自許多不同來源獲得。在一個實施例中，免疫球蛋白恆定區或其一部分源自於人類免疫球蛋白。然而，應瞭解免疫球蛋白恆定區或其一部分可源自於包括例如囓齒類動物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人類靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種之另一哺乳動物物種的免疫球蛋白。此外，免疫球蛋白恆定區或其一部分可源自於任何免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，及任何免疫球蛋白同型，包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在一個實施例中，使用人類同型IgG1。
多種免疫球蛋白恆定區基因序列(例如人類恆定區基因序列)可呈公眾可得到之寄存物形式獲得。可選擇具有特定效應功能(或缺乏特定效應功能)或具有特定修飾以降低免疫原性之恆定區結構域序列。已公開抗體及抗體編碼基因之許多序列，且使用本領域公認之技術，可自此等序列得到合適Ig恆定區序列(例如鉸鏈、CH2及/或CH3序列或其一部分)。接著使用任一上述方法獲得之遺傳物質可改變或合成以獲得本發明之多肽。進一步瞭解本公開之範疇涵蓋恆定區DNA序列之等位基因、變異體及突變。
免疫球蛋白恆定區或其一部分之序列可例如使用聚合酶鏈反應及經選擇以擴增所關注結構域之引子來選殖。為自抗體選殖免疫球蛋白恆定區或其一部分之序列，可自雜交瘤、脾或淋巴細胞分離mRNA，逆轉錄成DNA，且藉由PCR擴增抗體基因。PCR擴增方法詳細描述於美國專利第4,683,195號、第4,683,202號、第4,800,159號、第4,965,188號及例如以下中：「PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications」 Innis等人編輯, Academic Press, San Diego, CA(1990)；Ho等人 1989. Gene 77:51；Horton等人1993.Methods Enzymol. 217:270)。可藉由一致恆定區引子，或基於所公開之重鏈及輕鏈DNA及胺基酸序列，藉由更特定引子，起始PCR。PCR亦可用於分離編碼抗體輕鏈及重鏈之DNA純系。在此情況下，文庫可藉由一致引子或較大同源探針，諸如小鼠恆定區探針來篩選。適合於擴增抗體基因之許多引子組為本領域中已知(例如基於純化抗體之N端序列，5’引子(Benhar及Pastan. 1994.Protein Engineering 7:1509)；cDNA末端快速擴增(Ruberti, F.等人 1994.J. Immunol. Methods 173:33)；抗體前導序列(Larrick等人 1989Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250)。抗體序列之選殖進一步描述於Newman等人於1995年1月25日申請之美國專利第5,658,570號(其以引用之方式併入本文中)。
本文中使用之免疫球蛋白恆定區可包括所有結構域及鉸鏈區或其一部分。在一個實施例中，免疫球蛋白恆定區或其一部分包含CH2結構域、CH3結構域及鉸鏈區，亦即Fc區或FcRn結合搭配物。
如本文所用，術語「Fc區」定義為與天然Ig之Fc區對應，亦即如由兩個重鏈之相應Fc結構域之二聚締合所形成的多肽部分。天然Fc區與另一Fc區形成同源二聚體。相比之下，如本文所用之術語「基因融合之Fc區」或「單鏈Fc區」(scFc區)係指由在遺傳上連接在單一多肽鏈內(亦即在單一相鄰遺傳序列中編碼)之Fc結構域構成的合成二聚Fc區。參見以引用之方式整體併入本文中的國際公開案第WO 2012/006635號。
在一個實施例中，「Fc區」係指在鉸鏈區中緊鄰木瓜蛋白酶裂解位點(亦即IgG中之殘基216，取重鏈恆定區之第一殘基為114)上游開始且終止於抗體之C端的單一Ig重鏈部分。因此，完整Fc區包含至少一個鉸鏈結構域、CH2結構域及CH3結構域。
免疫球蛋白恆定區或其一部分可為FcRn結合搭配物。FcRn在成人上皮組織中為活性的，且在腸內腔、肺氣道、鼻表面、陰道表面、結腸及直腸表面中表現(美國專利第6,485,726號)。FcRn結合搭配物為結合於FcRn之免疫球蛋白之一部分。
已自包括人類之若干哺乳動物物種分離FcRn受體。已知人類FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn及小鼠FcRn之序列(Story等人 1994, J. Exp. Med. 180:2377)。在相對較低pH值下FcRn受體結合IgG(而非其他免疫球蛋白，諸如IgA、IgM、IgD及IgE)，在內腔至漿膜方向上跨細胞主動輸送IgG，接著在間隙流體中發現之相對較高pH值下釋放IgG。其在成人上皮組織(美國專利第6,485,726號、第6,030,613號、第6,086,875號；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，包括肺及腸上皮細胞(Israel等人1997,Immunology 92:69)、腎近端腎小管上皮細胞(Kobayashi等人. 2002,Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358)以及鼻上皮細胞、陰道表面及膽系表面中表現。
可用於本發明之FcRn結合搭配物涵蓋可由FcRn受體特異性結合之分子，包括整個IgG、IgG之Fc片段及包括FcRn受體之完整結合區之其他片段。已基於X射線結晶學描述結合於FcRn受體之IgG之Fc部分區域(Burmeister等人 1994,Nature 372:379)。Fc與FcRn之主要接觸區域靠近CH2及CH3結構域之接合點。Fc-FcRn接觸均在單個Ig重鏈內。FcRn結合搭配物包括(但不限於)整個IgG、IgG之Fc片段及包括FcRn之完整結合區的IgG之其他片段。主要接觸位點包括CH2結構域之胺基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314及CH3結構域之胺基酸殘基385-387、428及433-436。對免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或區域之胺基酸編號的提及均基於Kabat等人1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md。
結合於FcRn之Fc區或FcRn結合搭配物可藉由FcRn有效跨過上皮障壁，因此為全身投與所需治療分子提供一種非侵入式方式。另外，包含Fc區或FcRn結合搭配物之融合蛋白由表現FcRn之細胞內吞。但代替標記用於降解，此等融合蛋白再次再循環於循環中，因此增加此等蛋白質之活體內半衰期。在某些實施例中，免疫球蛋白恆定區之部分為通常經由二硫鍵及其他非特定相互作用與另一Fc區或另一FcRn結合搭配物締合形成二聚體及更高級別多聚體的Fc區或FcRn結合搭配物。
兩種FcRn受體可結合單一Fc分子。結晶學資料表明各FcRn分子結合Fc同源二聚體之單一多肽。在一個實施例中，FcRn結合搭配物，例如IgG之Fc片段連接於生物活性分子可提供一種經口、經頰、舌下、經直腸、經陰道、呈經鼻投與之氣溶膠或經由肺途徑或經由眼睛途徑遞送生物活性分子的方式。在另一實施例中，FVIII蛋白質可侵入性投與，例如皮下、靜脈內。
FcRn結合搭配物區域為可由FcRn受體特異性結合，隨後由Fc區之FcRn受體主動輸送的分子或其一部分。特異性結合係指兩個分子形成在生理條件下相對穩定之複合物。特異性結合之特徵在於高親和力及低至中度容量，此與通常具有低親和力及中度至高容量之非特異性結合不同。通常，當親合常數KA高於106 M-1 或高於108 M-1 時結合視為特異性的。必要時，可在實質上不影響特異性結合下藉由變化結合條件來減少非特異性結合。諸如分子濃度、溶液離子強度、溫度、允許用於結合之時間、阻斷劑(例如血清白蛋白、乳酪蛋白濃度)等適當結合條件可藉由熟練技術人員使用常規技術最佳化。
在某些實施例中，由本發明之核酸分子編碼的FVIII蛋白質包含一或多個截短Fc區，儘管如此，其仍足夠賦予Fc區以Fc受體(FcR)結合性質。舉例而言，結合於FcRn之Fc區部分(亦即FcRn結合部分)包含EU編號IgG1之約胺基酸282-438(主要接觸位點為CH2結構域之胺基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314及CH3結構域之胺基酸殘基385-387、428及433-436。因此，本發明之Fc區可包含FcRn結合部分或由FcRn結合部分組成。FcRn結合部分可源自於任何同型之重鏈，包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在一個實施例中，使用來自人類同型IgG1之抗體之FcRn結合部分。在另一實施例中，使用來自人類同型IgG4之抗體之FcRn結合部分。
可自許多不同來源獲得Fc區。在一個實施例中，多肽之Fc區源自於人類免疫球蛋白。然而，應瞭解Fc部分可源自於包括例如囓齒類動物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人類靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種之另一哺乳動物物種的免疫球蛋白。此外，Fc結構域或其一部分之多肽可源自於任何免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，及任何免疫球蛋白同型，包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在另一實施例中，使用人類同型IgG1。
在某些實施例中，Fc變異體改變包含該野生型Fc結構域之Fc部分所賦予之至少一種效應功能(例如提高或降低Fc區結合於Fc受體(例如FcγRI、FcγRII或 FcγRIII)或補體蛋白(例如C1q)之能力，或觸發抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、吞噬作用或補體依賴性細胞毒性(CDCC))。在其他實施例中，Fc變異體提供經工程改造之半胱胺酸殘基。
本發明之Fc區可採用本領域中公認之已知賦予效應功能及/或FcR或FcRn結合改變(例如增強或減少)之Fc變異體。特定而言，本發明之Fc區可包括例如以下中揭示之一或多個胺基酸位置上之改變(例如取代)：國際PCT公開案WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、
WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、
WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、
WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、
WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、
WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、
WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、
WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、
WO06/019447A1、WO06/047350A2及WO06/085967A2；美國專利公開案第US2007/0231329號、第US2007/0231329號、第US2007/0237765號、第US2007/0237766號、第
US2007/0237767號、第US2007/0243188號、第
US2007/0248603號、第US2007/0286859號、第
US2008/0057056號；或美國專利5,648,260、5,739,277、
5,834,250、5,869,046、6,096,871、6,121,022、6,194,551、
6,242,195、6,277,375、6,528,624、6,538,124、6,737,056、
6,821,505、6,998,253、7,083,784、7,404,956及7,317,091，各以引用之方式併入本文中。在一個實施例中，可在所揭示之一或多個胺基酸位置上進行特定改變(例如本領域中揭示之一或多個胺基酸之特定取代)。在另一實施例中，可在所揭示之一或多個胺基酸位置上進行不同改變(例如本領域中揭示之一或多個胺基酸之不同取代)。
IgG之Fc區或FcRn結合搭配物可根據充分認識之程序，諸如定點突變誘發及其類似程序進行修飾，產生將由FcRn結合之經修飾之IgG或Fc片段或其一部分。此類修飾包括遠離FcRn接觸位點之修飾以及保持或甚至增強與FcRn之結合的接觸位點內之修飾。舉例而言，可在不顯著喪失對FcRn之Fc結合親和力下取代人類IgG1 Fc(Fcγ1)中之以下單一胺基酸殘基：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A及K447A，其中例如P238A表示在位置編號238上經丙胺酸取代之野生型脯胺酸。舉例而言，特定實施例併入N297A突變，移除高度保守之N-糖基化位點。除丙胺酸外，其他胺基酸可取代以上指定之位置上的野生型胺基酸。突變可單獨引入至Fc中，產生超過一百種與天然Fc不同之Fc區。另外，此等個別突變中之兩者、三者或更多者之組合可一起引入，產生數百種Fc區。
某些以上突變可賦予Fc區或FcRn結合搭配物以新功能。舉例而言，一個實施例併入N297A，移除高度保守之N-糖基化位點。此突變之作用係降低免疫原性，從而增加Fc區之循環半衰期，且使Fc區無法結合於FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB及FcγRIIIA，而不損害對FcRn之親和力(Routledge等人1995,Transplantation 60:847；Friend等人1999,
Transplantation 68:1632；Shields等人 1995,J. Biol. Chem . 276:6591)。作為由上述突變產生之新功能之另一實例，在一些情況下對FcRn之親和力可增加超過野生型。此增加之親和力可反映「締合」速率增加，「解離」速率減小，或「締合」速率增加與「解離」速率減小。咸信賦予增加之對FcRn之親和力的突變之實例包括(但不限於)T256A、T307A、E380A及N434A(Shields等人 2001,J. Biol. Chem . 276:6591)。
另外，至少三種人類Fcγ受體似乎識別IgG上之下部鉸鏈區內之結合位點，一般為胺基酸234-237。因此，新功能之另一實例及潛在降低之免疫原性可由此區域突變產生，如例如藉由人類IgG1「ELLG」(SEQ ID NO: 45)之胺基酸233-236替換成來自IgG2「PVA」(缺失一個胺基酸)之對應序列。已顯示當引入此類突變時介導多種效應功能之FcγRI、FcγRII及FcγRIII不結合於IgG1。Ward及Ghetie 1995,Therapeutic Immunology 2:77及Armour等人 1999,Eur. J. Immunol . 29:2613。
在另一實施例中，免疫球蛋白恆定區或其一部分在鉸鏈區或其一部分中包含與第二免疫球蛋白恆定區或其一部分形成一或多個二硫鍵之胺基酸序列。第二免疫球蛋白恆定區或其一部分可連接於第二多肽，使FVIII蛋白質與第二多肽在一起。在一些實施例中，第二多肽為強化子部分。如本文所用，術語「強化子部分」係指能夠增強FVIII之促凝血活性之分子、其片段或多肽組分。強化子部分可為輔因子，諸如可溶性組織因子(sTF)或促凝血肽。因此，在活化FVIII時，強化子部分可用來增強FVIII活性。
在某些實施例中，由本發明之核酸分子編碼的FVIII蛋白質包含對免疫球蛋白恆定區或其一部分進行之胺基酸取代(例如Fc變異體)，該取代改變Ig恆定區之與抗原無關之效應功能、尤其蛋白質之循環半衰期。

2. scFc 區
在另一個態樣中，異源部分包含scFc(單鏈Fc)區。在一個實施例中，本發明之經分離之核酸分子進一步包含編碼scFc區之異源核酸序列。scFc區在同一線性多肽鏈內包含至少兩個免疫球蛋白恆定區或其部分(例如Fc部分或結構域(例如2、3、4、5、6或更多個Fc部分或結構域))，該等區域能夠摺疊(例如分子內或分子間摺疊)形成由Fc肽連接子連接之一個功能scFc區。舉例而言，在一個實施例中，本發明之多肽能夠經由其scFc區結合於至少一個Fc受體(例如FcRn、FcγR受體(例如FcγRIII)或補體蛋白(例如C1q))以改善半衰期或觸發免疫效應功能(例如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、吞噬作用或補體依賴性細胞毒性(CDCC)及/或改善可製造性)。

3. CTP
在另一個態樣中，異源部分包含人類絨毛膜促性腺激素之β子單元之一個C端肽(CTP)或其片段、變異體或衍生物。已知插入重組蛋白中之一或多種CTP肽增加該蛋白質在活體內之半衰期。參見例如美國專利第5,712,122號，以引用之方式整體併入本文中。
例示性CTP肽包括
DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO: 33)或SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO: 34)。參見例如美國專利申請公開案第US 2009/0087411 A1號，以引用之方式併入。

4. XTEN 序列
在一些實施例中，異源部分包含一或多個XTEN序列、片段、變異體或衍生物。如本文所用，「XTEN序列」係指具有非天然存在之實質上不重複序列的長度延長之多肽，其主要由小的親水性胺基酸構成，其中在生理條件下該序列具有低程度或無二級或三級結構。作為異源部分，XTEN可用作半衰期延長部分。另外，XTEN可提供合乎需要之性質，包括(但不限於)增強之藥物動力學參數及溶解性特徵。
包含XTEN序列之異源部分併入本發明之蛋白質中可賦予該蛋白質一或多種以下有利性質：構形可撓性、增強之水溶性、高度蛋白酶抗性、低免疫原性、與哺乳動物受體之弱結合或增加之流體動力學(或斯托克斯(Stokes))半徑。
在某些態樣中，XTEN序列可增加藥物動力學性質，諸如更長之活體內半衰期或增加之曲線下面積(AUC)，使得本發明之蛋白質與相同但無XTEN異源部分之蛋白質相比，保持在活體內及具有促凝血活性之時段增加。
在一些實施例中，可用於本發明之XTEN序列為具有超過約20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、550個、600個、650個、700個、750個、800個、850個、900個、950個、1000個、1200個、1400個、1600個、1800個或2000個胺基酸殘基之肽或多肽。在某些實施例中，XTEN為具有超過約20至約3000個胺基酸殘基、超過30至約2500個殘基、超過40至約2000個殘基、超過50至約1500個殘基、超過60至約1000個殘基、超過70至約900個殘基、超過80至約800個殘基、超過90至約700個殘基、超過100至約600個殘基、超過110至約500個殘基或超過120至約400個殘基之肽或多肽。在一特定實施例中，XTEN包含長度長於42個胺基酸且短於144個胺基酸之胺基酸序列。
本發明之XTEN序列可包含具有5至14(例如9至14)個胺基酸殘基之一或多個序列基元或與序列基元至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，其中該基元包含選自由以下組成之群的4至6類胺基酸(例如5種胺基酸)、基本上由其組成或由其組成：甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)。參見US 2010-0239554 A1。
在一些實施例中，XTEN包含不重疊序列基元，其中序列之約80%或至少約85%或至少約90%或約91%或約92%或約93%或約94%或約95%或約96%或約97%或約98%或約99%或約100%由多個單元的自選自表4之單一基元家族選出之不重疊序列組成，產生家族序列。
如本文所用，「家族」意謂XTEN具有僅僅自來自表4之單一基元類別選擇的基元；亦即，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD XTEN，且選擇XTEN中之並非來自家族基元之任何其他胺基酸以實現所需性質，以便允許編碼核苷酸併入限制位點、裂解序列之併入或實現更佳之與FVIII之連接。在XTEN家族之一些實施例中，XTEN序列包含多個單元之AD基元家族或AE基元家族或AF基元家族或AG基元家族或AM基元家族或AQ基元家族或BC家族或BD家族之不重疊序列基元，其中所得到之XTEN展現上述同源性範圍。在其他實施例中，XTEN包含多個單元之來自表4之兩個或更多個基元家族的基元序列。
此等序列可經選擇以實現所需物理/化學特性，包括諸如淨電荷、親水性、缺乏二級結構或缺乏重複之特性，該等特性係由基元之胺基酸組成賦予的，下文更全面地描述。在此段落中描述之以上實施例中，併入XTEN中之基元可使用本文所述之方法來選擇及組裝以實現具有約36至約3000個胺基酸殘基之XTEN。
可用作本發明之嵌合蛋白中之異源部分之XTEN序列的實例揭示於例如美國專利公開案第2010/0239554 A1號、第2010/0323956 A1號、第2011/0046060 A1號、第2011/ 0046061 A1號、第2011/0077199 A1號或第2011/0172146 A1號或國際專利公開案第WO 2010/091122 A1號、第WO 2010/ 144502 A2號、第WO 2010/144508 A1號、第WO 2011/028228 A1號、第WO 2011/028229 A1號或第WO 2011/028344 A2號(各以引用之方式整體併入本文中)中。
XTEN可具有變化長度供插入FVIII中或與FVIII連接。在一個實施例中，基於有待在融合蛋白中實現之特性或功能，選擇XTEN序列之長度。視所需特性或功能而定，XTEN可為可用作載劑之短或中等長度序列或更長序列。在某些實施例中，XTEN包括具有約6至約99個胺基酸殘基之短區段、具有約100至約399個胺基酸殘基之中等長度及具有約400至約1000及長達約3000個胺基酸殘基之更長長度。因此，插入FVIII中或與FVIII連接之XTEN可具有長約6個、約12個、約36個、約40個、約42個、約72個、約96個、約144個、約288個、約400個、約500個、約576個、約600個、約700個、約800個、約864個、約900個、約1000個、約1500個、約2000個、約2500個或多達約3000個胺基酸殘基的長度。在其他實施例中，XTEN序列長度為約6至約50個、約50至約100個、約100至150個、約150至250個、約250至400個、約400至約500個、約500至約900個、約900至1500個、約1500至2000個或約2000至約3000個胺基酸殘基。
插入FVIII中或與FVIII連接之XTEN的確切長度可在對FVIII之活性無不利影響下變化。在一個實施例中，本文中所用之一或多個XTEN長度為42個胺基酸、72個胺基酸、144個胺基酸、288個胺基酸、576個胺基酸或864個胺基酸且可選自一或多個XTEN家族序列；亦即AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD。
在一些實施例中，用於本發明中之XTEN序列與選自由以下組成之群的序列至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致：AE42、AG42、AE48、AM48、AE72、AG72、AE108、AG108、AE144、AF144、AG144、AE180、AG180、AE216、AG216、AE252、AG252、AE288、AG288、AE324、AG324、AE360、AG360、AE396、AG396、AE432、AG432、AE468、AG468、AE504、AG504、AF504、AE540、AG540、AF540、AD576、AE576、AF576、AG576、AE612、AG612、AE624、AE648、AG648、AG684、AE720、AG720、AE756、AG756、AE792、AG792、AE828、AG828、AD836、AE864、AF864、AG864、AM875、AE912、AM923、AM1318、BC864、BD864、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、AG948、AG1044、AG1140、AG1236、AG1332、AG1428、AG1524、AG1620、AG1716、AG1812、AG1908、AG2004及其任何組合。參見US 2010-0239554 A1。在一特定實施例中，XTEN包含AE42、AE72、AE144、AE288、AE576、AE864、AG 42、AG72、AG144、AG288、AG576、AG864或其任何組合。
可用作本發明之嵌合蛋白質中之異源部分的例示性XTEN序列包括XTEN AE42-4(SEQ ID NO: 46，由SEQ ID NO: 47編碼；分別圖11C及11D)、XTEN 144-2A(SEQ ID NO: 48，由SEQ ID NO: 49編碼；分別圖11E及11F)、XTEN A144-3B(SEQ ID NO: 50，由SEQ ID NO: 51編碼；分別圖11G及11H)、XTEN AE144-4A(SEQ ID NO: 52，由SEQ ID NO: 53編碼；分別圖11I及11J)、XTEN AE144-5A(SEQ ID NO: 54，由SEQ ID NO: 55編碼；分別圖11K及11L)、XTEN AE144-6B(SEQ ID NO: 56，由SEQ ID NO: 57編碼；分別圖11M及11N)、XTEN AG144-1(SEQ ID NO: 58，由SEQ ID NO: 59編碼；分別圖11O及11P)、XTEN AG144-A(SEQ ID NO: 60，由SEQ ID NO: 61編碼；分別圖11Q及11R)、XTEN AG144-B(SEQ ID NO: 62，由SEQ ID NO: 63編碼；分別圖11S及11T)、XTEN AG144-C(SEQ ID NO: 64，由SEQ ID NO: 65編碼；分別圖11U及11V)及XTEN AG144-F(SEQ ID NO: 66，由SEQ ID NO: 67編碼；分別圖11W及11X)。在一特定實施例中，XTEN由SEQ ID NO: 18編碼。
在一些實施例中，少於100%之XTEN胺基酸係選自甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)，少於100%之序列由來自表4之序列基元或本文提供之XTEN序列組成。在此類實施例中，XTEN之剩餘胺基酸殘基係選自其他14種天然L-胺基酸中之任一種，但可優先選自親水性胺基酸，使得XTEN序列含有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少約99%親水性胺基酸。
結合構築體中所用之XTEN中之疏水性胺基酸的含量可小於5%，或小於2%，或小於1%疏水性胺基酸含量。在構築XTEN中不太有利之疏水性殘基包括色胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸及甲硫胺酸。另外，XTEN序列可含有少於5%或少於4%或少於3%或少於2%或少於1%或不含以下胺基酸：甲硫胺酸(例如避免氧化)或天冬醯胺酸及麩醯胺酸(避免去醯胺)。
因此，一或多個XTEN序列可在由該核苷酸序列編碼之胺基酸序列之C端或N端插入，或插入在由核苷酸序列編碼之胺基酸序列中的兩個胺基酸之間。舉例而言，XTEN可在選自表3之一或多個插入位點處插入兩個胺基酸之間。可允許XTEN插入之FVIII內位點之實例可見於例如國際公開案第WO 2013/123457 A1號或美國公開案第2015/0158929 A1號(以引用之方式整體併入本文中)。

5. 白蛋白或其片段、衍生物或變異體
在一些實施例中，異源部分包含白蛋白或其功能片段。人類血清白蛋白(HSA或HA)為全長形式之具有609個胺基酸之蛋白質，其負責顯著比例之血清滲透壓力且亦充當內源性及外源性配位體之載劑。如本文所用之術語「白蛋白」包括全長白蛋白或其功能片段、變異體、衍生物或類似物。白蛋白或其片段或變異體之實例揭示於美國專利公開案第2008/0194481A1號、第2008/0004206 A1號、第2008/ 0161243 A1號、第2008/0261877 A1號或第2008/0153751 A1號或PCT申請公開案第WO 2008/033413 A2號、第WO 2009/ 058322 A1號或第WO 2007/021494 A2號，該等公開案以引用之方式整體併入本文中。
在一個實施例中，由本發明之核酸分子編碼之FVIII蛋白質包含進一步連接於選自由以下組成之群之第二異源部分的白蛋白、其片段或變異體：免疫球蛋白恆定區或其部分(例如Fc區)、PAS序列、HES及PEG。

6. 白蛋白結合部分
在某些實施例中，異源部分為白蛋白結合部分，其包含白蛋白結合肽、細菌白蛋白結合域、白蛋白結合抗體片段或其任何組合。
舉例而言，白蛋白結合蛋白可為細菌白蛋白結合蛋白、抗體或抗體片段，包括域抗體(參見美國專利第6,696,245號)。白蛋白結合蛋白例如可為細菌白蛋白結合域，諸如鏈球菌蛋白G之一(Konig, T.及Skerra, A.(1998)J. Immunol. Methods 218, 73-83)。可用作結合搭配物之白蛋白結合肽的其他實例為例如具有Cys-Xaa1 -Xaa2 -Xaa3 -Xaa4 -Cys一致序列之肽，其中Xaa1 為Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa2 為Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys；Xaa3 為Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；且Xaa4 為Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr，如美國專利申請公開案第2003/0069395號或Dennis等人(Dennis等人(2002)J. Biol. Chem. 277, 35035-35043)中所述。
如Kraulis等人,FEBS Lett. 378:190-194(1996)及Linhult等人,Protein Sci. 11:206-213(2002)揭示之來自鏈球菌蛋白G之結構域3為細菌白蛋白結合域之一實例。白蛋白結合肽之實例包括具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO: 35)之一系列肽。參見例如Dennis等人,J. Biol. Chem . 2002, 277: 35035-35043(2002)。白蛋白結合抗體片段之實例揭示於Muller及Kontermann,Curr. Opin. Mol. Ther . 9:319-326 (2007)；Roovers等人,Cancer Immunol. Immunother . 56:303-317(2007)及Holt等人,Prot. Eng. Design Sci ., 21:283-288 (2008)中，其以引用之方式整體併入本文中。此類白蛋白結合部分之一實例為如Trussel等人,Bioconjugate Chem. 20:2286-2292(2009)揭示之2-(3-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁醯胺基)己酸酯(「Albu」標籤)。
脂肪酸，尤其長鏈脂肪酸(LCFA)及長鏈脂肪酸樣白蛋白結合化合物可用於延長本發明之FVIII蛋白質之活體內半衰期。LCFA樣白蛋白結合化合物之一實例為16-(1-(3-(9-(((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基氧基)羰基氧基)-甲基)-7-磺基-9H-茀-2-基胺基)-3-側氧基丙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基硫基)十六酸(參見例如WO 2010/140148)。

7. PAS 序列
在其他實施例中，異源部分為PAS序列。如本文所用之PAS序列意謂主要包含丙胺酸及絲胺酸殘基或主要包含丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸殘基之胺基酸序列，該胺基酸序列在生理條件下形成無規捲曲構形。因此，PAS序列為包含丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸、基本上由其組成或由其組成的建構嵌段、胺基酸聚合物或序列卡匣，其可用作嵌合蛋白中異源部分之一部分。然而，熟練技術人員清楚，當除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸以外之殘基作為PAS序列中之次要成分添加時胺基酸聚合物亦可形成無規捲曲構形。
如本文所用之術語「次要成分」意謂除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸以外之胺基酸可在一定程度上添加於PAS序列中，例如至多約12%，亦即PAS序列之100個胺基酸中約12個；至多約10%，亦即PAS序列之100個胺基酸中約10個；至多約9%，亦即100個胺基酸中約9個；至多約8%，亦即100個胺基酸中約8個；約6%，亦即100個胺基酸中約6個；約5%，亦即100個胺基酸中約5個；約4%，亦即100個胺基酸中約4個；約3%，亦即100個胺基酸中約3個；約2%，亦即100個胺基酸中約2個；約1%，亦即100個胺基酸中約1個。不同於丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸之胺基酸可選自由以下組成之群：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr及Val。
在生理條件下，PAS序列延伸形成無規捲曲構形，從而可介導FVIII蛋白質之活體內及/或活體外穩定性的增加。因為無規捲曲結構域自身未採用穩定結構或功能，所以基本上保持由FVIII蛋白質介導之生物活性。在其他實施例中，形成無規捲曲結構域之PAS序列為生物學上惰性的，尤其在血漿中之蛋白質水解、免疫原性、等電點/靜電行為、結合於細胞表面受體或內化方面，但仍然為生物可降解的，此提供清晰的優於諸如PEG之合成聚合物的優點。
形成無規捲曲構形之PAS序列之非限制性實例包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：
ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO: 36)、
AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO: 37)、
APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO: 38)、
APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO: 39)、
SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO: 40)、
AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO: 41)及
ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO: 42)或其任何組合。PAS序列之其他實例自例如美國專利公開案第2010/0292130 A1號及PCT申請公開案第WO 2008/155134 A1號獲知。

8. HAP 序列
在某些實施例中，異源部分為富含甘胺酸之同型胺基酸聚合物(HAP)。HAP序列可包含甘胺酸之重複序列，其具有至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、120個胺基酸、140個胺基酸、160個胺基酸、180個胺基酸、200個胺基酸、250個胺基酸、300個胺基酸、350個胺基酸、400個胺基酸、450個胺基酸或500個胺基酸長。在一個實施例中，HAP序列能夠延長與HAP序列融合或連接之部分的半衰期。HAP序列之非限制性實例包括(但不限於)(Gly)n ,(Gly4 Ser)n 或S(Gly4 Ser)n ，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一個實施例中，n為20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一個實施例中，n為50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。

9. 轉鐵蛋白或其片段
在某些實施例中，異源部分為轉鐵蛋白或其片段。任何轉鐵蛋白可用於製造本發明之FVIII蛋白質。舉例而言，野生型人類TF(TF)為679個胺基酸之蛋白質，大約75 Kda (不考慮糖基化)，具有兩個主要結構域N(約330個胺基酸)及C(約340個胺基酸)，該等結構域似乎來源於基因重複。參見GenBank寄存編號NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM 039847及S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，均以引用之方式整體併入本文中。轉鐵蛋白包含結構域N結構域及C結構域。N結構域包含兩個子結構域，N1結構域及N2結構域，且C結構域包含兩個子結構域，C1結構域及C2結構域。
在一個實施例中，轉鐵蛋白異源部分包括轉鐵蛋白剪接變異體。在一個實例中，轉鐵蛋白剪接變異體可為人類轉鐵蛋白之剪接變異體，例如Genbank寄存編號AAA61140。在另一實施例中，嵌合蛋白之轉鐵蛋白部分包括轉鐵蛋白序列之一或多個結構域，例如N結構域、C結構域、N1結構域、N2結構域、C1結構域、C2結構域或其任何組合。

10. 清除受體
在某些實施例中，異源部分為清除受體、其片段、變異體或衍生物。LRP1為600 kDa膜主體蛋白，其與受體介導之諸如因子X之多種蛋白質的清除有關。參見例如Narita等人,Blood 91:555-560(1998)。

11. 馮威里氏因子或其片段
在某些實施例中，異源部分為馮威里氏因子(VWF)或其一或多個片段。
VWF(亦稱F8VWF)為存在於血漿中且在內皮(懷布爾-帕拉得小體(Weibel-Palade bodies))、巨核細胞(血小板之α-顆粒)及內皮下結締組織中組成性產生的大型多聚體糖蛋白。基礎VWF單體為2813個胺基酸之蛋白質。每個單體含有許多具有特定功能之特定結構域，D’及D3結構域(一起結合於因子VIII)、A1結構域(結合於血小板GPIb-受體、肝素及/或可能膠原蛋白)、A3結構域(結合於膠原蛋白)、C1結構域(其中當經活化時RGD結構域結合於血小板整合素αIIbβ3)及在蛋白質之C端末端的「半胱胺酸結」結構域(VWF與血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子-β(TGFβ)及β-人類絨毛膜促性腺激素(βHCG)共享)。
人類VWF之2813單體胺基酸序列在Genbank中報導為寄存編號NP000543.2。編碼人類VWF之核苷酸序列在Genbank中報導為寄存編號NM000552.3。SEQ ID NO: 44(圖11B)為由SEQ ID NO: 43編碼之胺基酸序列。D’結構域包括SEQ ID NO: 44之胺基酸764至866。D3結構域包括SEQ ID NO: 44之胺基酸867至1240。
血漿中，95%-98% FVIII呈與全長VWF之緊密非共價複合物循環。此複合物之形成對於維持活體內FVIIII之適當血漿水準而言係重要的。Lenting等人,Blood. 92(11): 3983-96(1998)；Lenting等人,J. Thromb. Haemost . 5(7): 1353-60(2007)。當FVIII由於重鏈中位置372及740處及輕鏈中位置1689處的蛋白質水解而活化時，自活化FVIII移除結合於FVIII之VWF。
在某些實施例中，異源部分為全長馮威里氏因子。在其他實施例中，異源部分為馮威里氏因子片段。如本文所用，在本文中使用之術語「VWF片段」或「VWF片段」意謂與FVIII相互作用且保留通常由全長VWF提供給FVIII之至少一種或更多性質的任何VWF片段，該等性質例如防止過早活化成FVIIIa、防止過早蛋白質水解、防止與磷脂膜締合而可能引起過早清除、防止結合於可結合裸FVIII而非VWF結合之FVIII的FVIII清除受體及/或穩定FVIII重鏈及輕鏈相互作用。在一特定實施例中，異源部分為包含VWF之D’結構域及D3結構域之(VWF)片段。包含D’結構域及D3結構域之VWF片段可進一步包含選自由以下組成之群的VWF結構域：A1結構域、A2結構域、A3結構域、D1結構域、D2結構域、D4結構域、B1結構域、B2結構域、B3結構域、C1結構域、C2結構域、CK結構域、其一或多個片段及其任何組合。與VWF片段融合之具有FVIII活性之多肽的其他實例揭示於2012年7月3日申請之美國臨時專利申請案第61/667,901號及美國公開案第2015/0023959 A1號(均以引用之方式整體併入本文中)。

12. 連接子部分
在某些實施例中，異源部分為肽連接子。
如本文所用，術語「肽連接子」或「連接子部分」係指連接多肽鏈之線性胺基酸序列中之兩個結構域的肽或多肽序列(例如合成肽或多肽序列)。
在一些實施例中，編碼肽連接子之異源核苷酸序列可插入本發明之優化FVIII多核苷酸序列與編碼例如上述異源部分(諸如白蛋白)之一的異源核苷酸序列之間。肽連接子可為嵌合多肽分子提供可撓性。連接子通常不裂解，然而，此類裂解可為合乎需要的。在一個實施例中，在加工期間不移除此等連接子。
可存在於本發明之嵌合蛋白質中的一種類型連接子為蛋白酶可裂解連接子，其包含裂解位點(亦即蛋白酶裂解位點受質，例如因子XIa、Xa或凝血酶裂解位點)且其可在裂解位點之N端或C端或者兩側上包括其他連接子。此等可裂解連接子在併入本發明之構築體中時產生具有異源裂解位點之嵌合分子。
在一個實施例中，由本發明之核酸分子編碼之FVIII多肽包含兩個或更多個Fc結構域或部分，該等Fc結構域或部分經由cscFc連接子連接而形成包含在單一多肽鏈中之Fc區。cscFc連接子側接至少一個細胞內加工位點，亦即胞內酶裂解位點。多肽在該至少一個細胞內加工位點之裂解產生包含至少兩個多肽鏈之多肽。
其他肽連接子可視情況用於本發明之構築體中，例如以將FVIII蛋白質連接於Fc區。可結合本發明使用之一些例示性連接子包括例如以下更詳細地描述之包含GlySer胺基酸之多肽。
在一個實施例中，肽連接子為合成的，亦即非天然存在的。在一個實施例中，肽連接子包括包含將胺基酸之第一線性序列與其在自然界中非天然連接或遺傳上融合之胺基酸之第二線性序列連接或遺傳上融合的胺基酸序列的肽(或多肽)(可或不可天然存在)。舉例而言，在一個實施例中，肽連接子可包含呈天然存在之多肽之經修飾形式的非天然存在之多肽(例如包含突變，諸如添加、取代或缺失)。在另一實施例中，肽連接子可包含非天然存在之胺基酸。在另一實施例中，肽連接子可包含在自然界中不存在之線性序列中存在的天然存在之胺基酸。在又一實施例中，肽連接子可包含天然存在之多肽序列。
舉例而言，在某些實施例中，肽連接子可用於融合一致Fc部分，從而形成同二聚體scFc區。在其他實施例中，肽連接子可用於融合不同Fc部分(例如野生型Fc部分及Fc部分變異體)，從而形成雜二聚體scFc區。
在另一實施例中，肽連接子包含gly-ser連接子或由其組成。在一個實施例中，scFc或cscFc連接子包含免疫球蛋白鉸鏈之至少一部分及gly-ser連接子。如本文所用，術語「gly-ser肽連接子」係指由甘胺酸及絲胺酸殘基組成之肽。在某些實施例中，該gly-ser連接子可插入肽連接子之兩個其他序列之間。在其他實施例中，gly-ser連接子在肽連接子之另一序列之一個或兩個末端連接。在其他實施例中，兩個或更多個gly-ser連接子串聯併入肽連接子中。在一個實施例中，本發明之肽連接子包含上鉸鏈區之至少一部分(例如源自於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子)、中間鉸鏈區之至少一部分(例如源自於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子)及一系列gly/ser胺基酸殘基。
本發明之肽連接子係至少一個胺基酸長且可具有變化長度。在一個實施例中，本發明之肽連接子為約1至約50個胺基酸長。如此上下文中所用，術語「約」指示+/-兩個胺基酸殘基。因為連接子長度必須為正整數，所以約1至約50個胺基酸長之長度意謂1-3至48-52個胺基酸長之長度。在另一實施例中，本發明之肽連接子為約10至約20個胺基酸長。在另一實施例中，本發明之肽連接子為約15至約50個胺基酸長。在另一實施例中，本發明之肽連接子為約20至約45個胺基酸長。在另一實施例中，本發明之肽連接子為約15至約35或約20至約30個胺基酸長。在另一實施例中，本發明之肽連接子為約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、500個、1000個或2000個胺基酸長。在一個實施例中，本發明之肽連接子為約20個或30個胺基酸長。
在一些實施例中，肽連接子可包含至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸。在其他實施例中，肽連接子可包含至少200個、至少300個、至少400個、至少500個、至少600個、至少700個、至少800個、至少900個或至少1,000個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子可包含至少約10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1100個、1200個、1300個、1400個、1500個、1600個、1700個、1800個、1900個或2000個胺基酸。肽連接子可包含1-5個胺基酸、1-10個胺基酸、1-20個胺基酸、10-50個胺基酸、50-100個胺基酸、100-200個胺基酸、200-300個胺基酸、300-400個胺基酸、400-500個胺基酸、500-600個胺基酸、600-700個胺基酸、700-800個胺基酸、800-900個胺基酸或900-1000個胺基酸。
肽連接子可使用本領域中已知之技術引入多肽序列中。可藉由DNA序列分析證實修飾。質體DNA可用於轉化宿主細胞以穩定產生所產生之多肽。

I. 單體 - 二聚體混雜物
在一些實施例中，進一步包含異源核苷酸序列的本發明之經分離之核酸分子編碼包含FVIII之單體-二聚體混雜分子。
本文中所用之術語「單體-二聚體混雜物」係指包含藉由二硫鍵彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈的嵌合蛋白，其中第一鏈包含因子VIII及第一Fc區，且第二鏈包含第二Fc區、基本上由其組成或由其組成，無FVIII。因此單體-二聚體混雜物構築體為包含僅僅具有凝血因子之單體態樣及具有兩個Fc區之二聚體態樣的混雜物。

J. 表現控制元件
在一些實施例中，本發明之核酸分子或載體進一步包含至少一個表現控制序列。如本文所用之表現控制序列為促進其可操作地連接之編碼核酸之有效轉錄及轉譯的任何調控核苷酸序列，諸如啟動子序列或啟動子-強化子組合。舉例而言，本發明之經分離之核酸分子可操作地連接於至少一個轉錄控制序列。
基因表現控制序列可例如為哺乳動物或病毒啟動子，諸如組成型或誘導型啟動子。組成性哺乳動物啟動子包括(但不限於)針對以下基因之啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)、腺苷脫胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子及其他組成型啟動子。在真核細胞中組成性起作用之例示性病毒啟動子包括例如來自巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒(例如SV40)、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺陷性病毒(HIV)、勞氏肉瘤病毒、巨細胞病毒、莫洛尼氏白血病毒之長末端重複序列(LTR)及其他反轉錄病毒的啟動子及單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動子。
本領域之一般技術人員已知其他組成型啟動子。可用作本發明之基因表現序列之啟動子亦包括誘導型啟動子。誘導型啟動子在誘導劑存在下表現。舉例而言，金屬硫蛋白啟動子在某些金屬離子存在下經誘導而促進轉錄及轉譯。本領域之一般技術人員已知其他誘導型啟動子。
在一個實施例中，本發明包括在組織特異性啟動子及/或強化子的控制下表現轉殖基因。在另一實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性地增強轉殖基因在肝細胞中之表現。肝臟特異性啟動子之實例包括(但不限於)小鼠甲狀腺素啟動子(mTTR)、內源性人類因子VIII啟動子(F8)、人類α-1-抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)、人類白蛋白最小啟動子及小鼠白蛋白啟動子。在一個特定實施例中，啟動子包含mTTR啟動子。mTTR啟動子描述於R. H. Costa等人, 1986,Mol. Cell. Biol . 6:4697中。F8啟動子描述於Figueiredo及Brownlee, 1995,J. Biol. Chem . 270:11828-11838中。
表現水準可使用一或多個強化子進一步增強以實現治療效能。一或多個強化子可單獨提供或者與一或多個啟動子元件一起提供。通常，表現控制序列包含複數個強化子元件及組織特異性啟動子。在一個實施例中，強化子包含α-1-小球蛋白/尿抑胰酶素強化子之一或多個複製(Rouet等人, 1992,J. Biol. Chem . 267:20765-20773；Rouet等人, 1995,Nucleic Acids Res . 23:395-404；Rouet等人, 1998,Biochem. J . 334:577-584；Ill等人, 1997,Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30)。在另一實施例中，強化子源自於肝臟特異性轉錄因子結合位點，諸如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6，具有Enh1，包含HNF1、(有義)-HNF3、(有義)-HNF4、(反義)-HNF1、(反義)-HNF6、(有義)-EBP、(反義)-HNF4(反義)。
在一特定實例中，可用於本發明之啟動子包含SEQ ID NO: 69(亦即ET啟動子；圖11Y)，其亦稱為GenBank No. AY661265。亦參見Vigna等人,Molecular Therapy 11(5) :763(2005)。其他合適載體及基因調控元件之實例描述於WO 02/092134、EP1395293或美國專利第6,808,905號、第7,745,179號或第7,179,903號(以引用之方式整體併入本文中)中。
一般而言，根據需要，表現控制序列可包括分別與轉錄及轉譯之開始相關5’非轉錄及5’非轉譯序列，諸如TATA盒、封端序列、CAAT序列及其類似物。特別地，此類5’非轉錄序列將包括啟動子區，該啟動子區包括用於可操作地接合之編碼核酸之轉錄控制的啟動子序列。基因表現序列根據需要視情況包括強化子序列或上游活化序列。

VI. 醫藥組合物
含有本文揭示之慢病毒基因療法載體或本發明之宿主細胞(例如用本文揭示之慢病毒基因療法載體靶向的肝細胞)的組合物可含有合適的醫藥學上可接受之載劑。舉例而言，其可含有促進活性化合物加工成設計用於遞送至作用部位之製劑的賦形劑及/或助劑。
醫藥組合物可經調配用於藉由彈丸注射(bolus injection)進行非經腸投與(亦即靜脈內、皮下或肌肉內)。用於注射之調配物可呈單位劑型呈現，例如添加防腐劑之安瓿或多劑量容器。組合物可採取諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式，且含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑之調配劑。可替代地，活性成分可呈粉末形式以用例如無熱原質水之合適媒劑復原。
適用於非經腸投與之調配物亦包括呈水溶性形式之活性化合物之水溶液，例如水溶性鹽。另外，可投與呈適當油性注射懸浮液之活性化合物懸浮液。合適親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，例如芝麻油或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏性之物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇及右旋糖苷。視情況，懸浮液亦可含有穩定劑。脂質體亦可用於囊封本發明之分子以遞送至細胞或胞間隙。例示性醫藥學上可接受之載劑為生理學上相容之溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑、水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、丙三醇、乙醇及其類似物。在一些實施例中，組合物包含等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。在其他實施例中，組合物包含醫藥學上可接受之物質，諸如潤濕劑或少量輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其加強活性成分之存放期或有效性。
本發明之組合物可呈多種形式，包括例如液體(例如可注射及可注入溶液)、分散液、懸浮液、半固體及固體劑型。較佳形式視投與模式及治療應用而定。
組合物可調配成溶液、乳液、分散液、脂質體或適於高藥物濃度之其他有序結構。無菌可注射溶液可藉由將需要量之活性成分併入根據需要具有以上列舉之一種成分或成分組合的適當溶劑中，接著過濾滅菌來製備。一般地，分散液藉由將活性成分併入含有基礎分散介質及來自以上列舉之成分的所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及凍乾，此自先前無菌過濾之溶液產生活性成分加上任何額外所需成分的粉末。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持溶液之適當流動性。可藉由在組合物中包括例如單硬脂酸鹽及明膠之延遲吸收劑，延長可注射組合物之吸收。
活性成分可調配成控制釋放調配物或裝置。此類調配物及裝置之實例包括植入物、經皮貼片及微囊封遞送系統。可使用生物可降解之生物相容性聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物及裝置之方法為本領域中已知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson編輯, Marcel Dekker公司, New York, 1978。
可注射儲積調配物可藉由形成藥物於生物可降解之聚合物(諸如聚交酯-聚乙醇酸交酯)中的微囊封基質而製成。視藥物與聚合物之比率及所採用之聚合物之性質而定，可控制藥物釋放速率。其他例示性生物降解可之聚合物為聚原酸酯及聚酐。可注射儲積調配物亦可藉由將藥物包封在脂質體或微乳液中來製備。
補充活性化合物可併入組合物中。在一個實施例中，本發明之嵌合蛋白與另一凝血因子或其變異體、片段、類似物或衍生物一起調配。舉例而言，凝血因子包括(但不限於)因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原、血纖維蛋白原、馮威里氏因子或重組可溶性組織因子(rsTF)或前述任一者之活化形式。止血劑之凝血因子亦可包括抗血纖維蛋白溶解藥物，例如ε-胺基己酸、凝血酸。
可調整給藥方案以提供最佳所需反應。舉例而言，可投與單一彈丸，可隨時間投與若干分次劑量，或劑量可根據治療情況之急迫按比例降低或增加。宜調配非經腸組合物成單位劑型以便於投與及劑量均一性。參見例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.公司, Easton, Pa. 1980)。
除活性化合物外，液體劑型可含有惰性成分，諸如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油類、丙三醇、四氫糠醇、聚乙二醇及脫水山梨糖醇之脂肪酸酯。
合適醫藥載劑之非限制性實例亦描述於E. W. Martin之Remington’s Pharmaceutical Sciences中。賦形劑之一些實例包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、丙三醇、丙烯、二醇、水、乙醇及其類似物。組合物亦可含有pH緩衝試劑及潤濕劑或乳化劑。
對於經口投與，醫藥組合物可採取藉由習知方式製備之錠劑或膠囊的形式。組合物亦可製備成液體，例如糖漿或懸浮液。液體可包括懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)、乳化劑(卵磷脂或阿拉伯膠)、非水性媒劑(例如杏仁油、油酯、乙醇或分餾植物油)及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。製劑亦可包括調味劑、著色劑及甜味劑。可替代地，組合物可呈乾燥產物呈現，供用水或另一合適媒劑復原。
對於經頰投與，組合物可採取根據習知方案製備之錠劑或口含錠的形式。
對於藉由吸入投與，根據本發明之供使用之化合物宜呈有或無賦形劑之霧化氣溶膠形式遞送，或呈來自加壓包裝或噴霧器之氣溶膠噴舞形式遞送，視情況利用推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他合適氣體。在加壓氣溶膠情況下，劑量單位可藉由提供閥以遞送計量之量來決定。例如用於吸入器或吹入器之明膠的膠囊及藥筒可調配成含有化合物與合適粉末基質，諸如乳糖或澱粉之粉末混合物。
醫藥組合物亦可調配成栓劑或保留灌腸，例如含有習知栓劑基質，諸如可可脂或其他甘油酯，用於直腸投與。
在一個實施例中，醫藥組合物包含包括編碼具有因子VIII活性之多肽之優化核酸分子的慢病毒載體及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥組合物包含宿主細胞(例如肝細胞)及醫藥學上可接受之載劑，該宿主細胞包含包括編碼具有因子VIII活性之多肽之優化核酸分子的慢病毒載體。
在一些實施例中，組合物藉由選自由以下組成之群的途徑投與：局部投與、眼內投與、非經腸投與、鞘內投與、硬膜下投與及經口投與。非經腸投與可為靜脈內或皮下投與。
在其他實施例中，組合物用於治療有需要之個體之出血疾病或病狀。出血疾病或病狀係選自由以下組成之群：出血性凝血障礙、關節積血、肌肉出血、口腔出血、大出血、大出血至肌肉、口腔大出血、外傷、頭部外傷、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸廓內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後隙出血、髂腰肌鞘出血及其任何組合。在其他實施例中，個體預定進行外科手術。在其他實施例中，治療為預防性的或根據需求的。
本文所述之多個態樣、實施例及選擇全部可以任何及所有變化組合。
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用之方式併入本文中，其引用程度如同特別且個別地指示各個別公開案、專利或專利申請案以引用之方式併入一般。
本公開已大體上予以描述，可藉由參考本文提供之實例作進一步瞭解。此等實例僅僅出於例示之目的，且不意欲限制。

實例
實例 1. 密碼子優化策略
藉由控制密碼子使用偏好建立八種密碼子優化BDD FVIII變異體，包括coFVIII-3(SEQ ID NO: 1；圖1A)、coFVIII-4(SEQ ID NO: 2；圖1B)、coFVIII-5(SEQ ID NO: 70；圖1C)、coFVIII-6(SEQ ID NO: 71；圖 1D)、coFVIII-52(SEQ ID NO: 3；圖1E)、coFVIII-62(SEQ ID NO: 4；圖1F)、coFVIII-25(SEQ ID NO: 5；圖1G)及coFVIII-26(SEQ ID NO: 6；圖1H)。如先前所述，使用線上工具Eugene促進密碼子優化(參見Gaspar等人, 「EuGene: maximizing synthetic gene design for heterologous expression」,Bioinformatics 28 :2683-84(2012))且監測若干密碼子使用參數，諸如密碼子適應指數(CAI)及相對同義密碼子使用度(RSCU)(表5)。所有變異體調成CAI ≥83%及RSCU ≥ 1.63，而親本B-結構域缺失FVIII序列在優化前具有74%之CAI及1.12之RSCU(表5)。
相對於未優化BDD FVIII序列，除CAI總體增加外，基於CAI跨越編碼區之分佈將八種變異體設計成三個類別，如圖2中所說明(圖2A)。第一類包含高CAI跨越整個編碼區均勻分佈之BDD FVIII變異體(參見圖2C-2F)。第一類包括coFVIII-3(圖2C)、coFVIII-4(圖2D)、coFVIII-5(圖2E)、coFVIII-6(圖2F)以及先前描述之coFVIII-1(參見國際公開案第WO 2014/127215號(SEQ ID NO: 1))(圖2B)。第二類包含在編碼序列之N端半部具有較低CAI且在編碼序列之C端半部具有較高CAI的BDD-FVIII變異體(參見圖2G及2H)。第二類包括coFVIII-52(圖2G)及coFVIII-62(圖2H)。第三類包含在編碼序列之N端半部具有較高CAI且在編碼序列之C端半部具有較低CAI的BDD-FVIII變異體(參見圖2I及2J)。第三類包括coFVIII-25(圖2I)及coFVIII-26(圖2J)。
不受任何理論限制，推測較高CAI可能與更快蛋白質轉譯相關，且此三類可表示不同的自開始至結束之蛋白質合成速率。舉例而言，具有較低CAI之區域的轉譯相對於具有較高CAI之區域的轉譯可緩慢進行。若如此，則例如具有較低CAI之coFVIII-52或coFVIII-62的N端半部之轉譯最初可緩慢進行，接著具有較高CAI之C端半部更快速轉譯。在不減慢總的蛋白質合成下，此對於轉譯期間蛋白質摺疊及轉譯後修飾而言可為較佳。對於在N端半部具有較高CAI且在C端半部具有較低CAI之coFVIII-25及coFVIII-26變異體，可見到相反作用。
為確保mRNA之穩定性，對所有FVIII密碼子優化變異體進行調整以避免許多位點，包括隱蔽剪接位點、過早多聚A位點、RNA不穩定性基元(ARE)及重複序列，且調整GC含量(參見表2)。

實例 2. coFVIII 變異體自 pcDNA3 質體之選殖及表現
含有多種FVIII變異體之表現質體經設計以用於活體內表現。將未優化BDD FVIII(圖1I；SEQ ID NO: 16)及coFVIII-1(圖11Z；SEQ ID NO: 68)多核苷酸選殖至pcDNA3主鏈(Invitrogen)，其中CMV啟動子經ET啟動子替代(參見圖3)。所得質體FVIII-311(BDD FVIII)及FVIII-303(coFVIII-1)分別驅動未優化BDD FVIII及coFVIII-1之表現。
在Hem A小鼠中，藉由每隻小鼠經流體動力學注射5 μg FVIII-303或FVIII-311之DNA，評估FVIII-311及FVIII-303之活體內表現。在注射後24小時、48小時及72小時收集血漿樣品，且藉由FVIII特異性顯色分析來測定FVIII活性。
如圖4所示，在注射後72小時，用FVIII-311 (BDD FVIII；正方形)處理之小鼠的血漿FVIII活性為74±43 mU/mL，而在注射後72小時，用FVIII-303(coFVIII-1；圓形)處理之小鼠的血漿FVIII活性為452±170 mU/mL(圖4)。此表示相對於未優化BDD FVIII，coFVIII-1之表現增加大約六倍。

實例 3. 使用慢病毒載體系統選殖及表現 coFVIII 變異體
為進一步評定密碼子優化BDD FVIII變異體之表現水準，將編碼序列選殖至慢病毒質體中處於ET啟動子控制下(參見Amendola等人, 「Coordinate dual-gene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters」,Nature Biol. 23 :108-16(2005)；國際公開案第WO 2000/066759 A1號)。pLV-coFVIII-52之質體圖展示於圖5中；且含有未優化BDD FVIII(LV-2116)、coFVIII-1(LV-coFVIII-1)、coFVIII-3(LV-coFVIII-3)、coFVIII-4(LV-coFVIII-4)、
coFVIII-5(LV-coFVIII-5)及coFVIII-6(LV-coFVIII-6)、
coFVIII-62(LV-coFVIII-62)、coFVIII-25(LV-coFVIII-25)及coFVIII-26(LV-coFVIII-26)之質體以相同方式構築，除了coFVIII-52片段使用NheI及SalI位點經各指示之編碼序列替代(表6)。
在Hem A小鼠中，藉由每隻小鼠經流體動力學注射5 μg DNA(圖6A、6B)或20 μg DNA(圖 6C)之劑量，評估慢病毒密碼子優化FVIII變異體。如圖6所示，coFVIII-3(圖6A；三角形)、coFVIII-4(圖6A；倒三角形)、coFVIII-5(圖6A；菱形)、coFVIII-6(圖6A；空心圓形)、coFVIII-25(圖6B；三角形)、coFVIII-26(圖6B；倒三角形)、coFVIII-52(圖6C；正方形)及coFVIII-62(圖6C；實心圓形)每一者展現比coFVIII-1(圖6A，圓形；圖6B，圓形；及圖6C，三角形)高的 FVIII活性。詳言之，coFVIII-25及coFVIII-26在注射後72小時展現類似表現水準，達到比coFVIII-1高約3倍之活性(圖6B)，此轉化為與未優化親本BDD FVIII相比高24倍FVIII活性(參見圖4)。coFVIII-52(正方形)與coFVIII-62(實心圓形)在注射後72小時均實現甚至更高表現，展現分別比coFVIII-1(三角形)大6倍及4倍之表現，及分別比未優化親本BDD FVIII(空心圓形)大50倍及30倍表現(圖6C)。此等資料指示在編碼序列之N端半部的較低CAI與在編碼序列之C端半部的較高CAI的組合與CAI之反向分佈相比可更有益於FVIII表現。

實例 4 ：密碼子優化 FVIII 變異體在 HemA 小鼠中之長期慢病毒表現
針對藉由慢病毒載體介導之基因轉移的長期FVIII表現，評估經鑑別在流體動力學注射後72小時驅動FVIII在HemA小鼠中高表現的變異體。在293T細胞中藉由短暫轉染產生慢病毒載體，且藉由超速離心濃縮至約5E9 TU/ml。接著藉由以每隻小鼠1E8 TU之劑量進行眼眶後注射，將慢病毒載體投與12-14日齡HemA小鼠。在慢病毒注射後21天，注射LV-2116(BDD FVIII；圖7)之小鼠的平均血漿FVIII活性為約0.04 IU/ml。在注射後21天coFVIII-1、coFVIII-5、coFVIII-52、coFVIII-6及coFVIII-62每一者相對於LV-2116(未優化B結構域缺失FVIII)對照物，產生更高循環FVIII水準。詳言之，在注射後21天coFVIII-1及coFVIII-5注射產生約1.8 IU/mL之FVIII血漿活性水準，coFVIII-52產生約4.9 IU/mL之FVIII血漿活性水準，coFVIII-6產生約4.6 IU/mL之FVIII血漿活性水準，且coFVIII-62產生約2.5 IU/mL之FVIII血漿活性水準(圖7)。在注射LV-coFVIII-6及LV-coFVIII-52之小鼠中分別觀察到的FVIII血漿水準4.6 IU/ml及4.9 IU/ml比在注射LV-2116(未優化BDD-FVIII)對照物之小鼠中觀察到的血漿水準高超過100倍。

實例 5. coFVIII-XTEN 融合構築體
測試XTEN提高穩態FVIII表現之能力。首先，將144個胺基酸之XTEN的編碼序列(「XTEN144 」；SEQ ID NO: 18)插入coFVIII-52及coFVIII-1之核苷酸1193處(或在編碼多肽之起始764個胺基酸之後)，以分別產生coFVIII-52-XTEN(圖8A；SEQ ID NO: 19)及coFVIII-1-XTEN(圖8B；SEQ ID NO: 20)。接著如上所述，將coFVIII-1-XTEN序列選殖至pcDNA3主鏈(Invitrogen)中處於ET啟動子控制下，產生FVIII-306表現質體；且如上所述，將coFVIII-52-XTEN序列選殖至慢病毒質體中處於ET啟動子控制下，產生pLV-coFVIII-52-XTEN(圖9)。藉由流體動力學注射，FVIII-306(coFVIII-1-XTEN)以每隻小鼠5 μg DNA投與HemA小鼠。與FVIII-303(coFVIII-1；圖10A，小圓)及FVIII-311(BDD FVIII；圖10A，正方形)相比，XTEN144 與coFVIII-1(FVIII-306；圖10A，大圓)之融合使得HemA小鼠中在注射後72小時FVIII表現分別高約5倍及33倍。亦使用慢病毒載體，在HemA小鼠中評估XTEN插入對FVIII表現之作用(圖10B)。藉由眼眶後注射，LV-coFVIII-52-XTEN以每隻小鼠1E8 TU投與12-14日齡HemA小鼠。與LV-coFVIII52及LV-2116(BDD-FVIII)相比，XTEN144 與coFVIII-52之融合(圖10B)使得HemA小鼠中在注射後21天FVIII表現分別高約4倍及450倍。
將如上所述製造包含與XTEN144 融合及與ET啟動子融合之coFVIII-3、co-FVIII-4、coFVIII-5、coFVIII-6、coFVIII-62、coFVIII-25及coFVIII-26之每一者的慢病毒載體。將測試載體之FVIII蛋白質表現。

實例 6. coFVIII 構築體之表現
如圖9中所說明，藉由標準分子選殖技術，將密碼子優化FVIII變異體選殖至慢病毒質體中。接著在HEK293細胞中經由短暫轉染，產生慢病毒載體，且藉由超速離心來分離。
藉由靜脈內注射，以1.5E10 TU/kg LV-FVIII變異體之劑量，將FVIII慢病毒載體投與14日齡HemA小鼠幼崽。在LV-FVIII處理後第21天，量測FVIII血漿活性，且在於LV-FVIII處理後第150天自經LV-FVIII處理之動物收集的肝臟屍檢樣品中，量測每個細胞之載體複製數(VCN)。雖然不管所投之LV-FVIII變異體如何，在所有動物中VCN值均相似(圖12B)，但用coFVIII變異體處理之動物中的FVIII活性水準比用wtBDD-FVIII處理之動物中高30至100倍(圖12A及12C；表7)。此等資料指示FVIII密碼子優化提高慢病毒載體背景下FVIII表現。

實例 7. HemA 小鼠中慢病毒處理後 FVIII 轉殖基因表現介導之免疫反應
針對長期FVIII表現及抗FVIII抗體形成，評估實例6之LV-FVIII處理之小鼠。如藉由FVIII血漿活性所證明，在相同處理組內之動物之間FVIII表現有所變化(圖13A)。舉例而言，用表現coFVIII-5變異體之慢病毒載體處理之三隻小鼠(指定為1、2及3)在大約16週期間顯示一致FVIII表現，而用相同慢病毒載體處理之三隻同窩出生仔畜(指定為4、5及6)顯示截至處理後約10週FVIII血漿活性水準急劇下降(圖13A)。在小鼠1、2及3中觀察到的一致FVIII血漿活性與抗FVIII抗體之無法偵測或極低水準相關(圖13B；小鼠1、2及3)。相反地，展現FVIII血漿活性急劇下降之小鼠亦展現增加之抗FVIII抗體水準(圖13B；小鼠4、5及6)。此等資料表明在動物子集中FVIII轉殖基因表現誘發抗FVIII抗體形成，且所得抗FVIII抗體將轉殖基因FVIII蛋白質自循環中消除。
評定FVIII表現與抗FVIII抗體形成之間的關係。將實例6之LV-FVIII處理小鼠分成兩組：抗FVIII抗體陰性小鼠及抗FVIII抗體陽性小鼠。如圖14所示，生理學水準之轉殖基因FVIII表現不誘發對轉殖基因FVIII之免疫反應(圖14，圓形)。然而，高於生理學水準之FVIII表現似乎誘發抗FVIII抗體形成，使得FVIII表現水準愈高，誘發抗FVIII抗體之可能性愈高。此等資料表明在經受FVIII基因療法治療之患者中維持生理學水準之FVIII表現可為有益的。
為確定FVIII表現誘發之免疫反應是否導致表現轉殖基因之肝細胞的損失，評估來自抗FVIII抗體陽性及陰性小鼠之肝臟屍檢樣品中的載體複製數(圖15)及FVIII RNA轉錄水準(圖16)。如圖15所示，在抗FVIII抗體陽性及陰性小鼠中載體複製數之分佈相同，此表明儘管抗FVIII抗體發展，仍維持整合LV-FVIII之細胞。此表明LV-FVIII介導之FVIII轉殖基因表現不誘發針對表現FVIII之肝細胞的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應。為進一步證實此等結果，藉由RNA原位雜交評定FVIII RNA轉錄(圖16C及16D)。在收穫肝臟時，小鼠coFVIII-52-B無可偵測之循環FVIII且具有高水準之抗FVIII抗體(圖16A及16B)。然而，來自coFVIII-52-B小鼠之肝臟組織中RNA轉錄信號及FVIII-RNA陽性細胞之數目與FVIII-52-A小鼠相當，FVIII-52-A小鼠在屍檢時具有約4 IU/ml之循環FVIII。因此在實驗HemA小鼠中FVIII表現未誘發CTL反應。

實例 8. LV-FVIII 處理之 HemA 小鼠初生仔畜中 FVIII 長期表現
為評定使用慢病毒系統經由靶向肝臟治療兒科HemA患者之功效，藉由顳部靜脈注射約1.5 E10 TU/kg LV-coFVIII-52XTEN、LV-coFVIII6-XTEN或表現wtBDD-FVIII之慢病毒載體，投與2日齡HemA小鼠。對變異體與對照物觀察到一致長期FVIII表現，此證明所處理小鼠之分裂肝細胞中維持整合之FVIII表現級聯(圖17)。此等資料表明LV-FVIII可用於治療兒科與成人HemA患者。

實例 9. 在 HemA 小鼠初生仔畜中評估 LV-FVIII
利用慢病毒載體(LV)進行基因替代之離體基因療法已證明對多種適應症之臨床功效且在所治療患者中之多年隨訪顯示無腫瘤發生跡象。LV-FIX之全身遞送介導持久FIX表現且在血友病動物模型中耐受良好。在臨床前及臨床背景下顯示的大包裝容量、經由基因整合維持長期轉殖基因表現之能力、人類群體中預先存在之抗LV抗體(ab)的缺乏及鼓舞人心之活體內概況使得LV成為有望用於活體內基因遞送、特別是具有大cDNA尺寸之候選基因，諸如FVIII的媒劑。
為評估LV-FVIII用於治療A型血友病(HemA)之潛在用途，將置於肝細胞特異性啟動子下的密碼子優化人類FVIII(hFVIII)變異體嵌入含有多個複製微型RNA-142標靶序列之LV系統中以將抗原呈遞細胞中之FVIII表現減至最少且降低誘發抗FVIII抗體之可能性。藉由短暫轉染293T細胞產生LV-hFVIII載體，接著藉由超速離心濃縮1000倍且在HemA小鼠模型中評估。在靜脈內投與LV-hFVIII後，藉由FVIII活性及抗原分析監測循環hFVIII水準，藉由經由定量PCR量測LV DNA複製及經由原位雜交量測轉殖基因RNA來評定肝臟中之LV轉導效率，藉由總抗hFVIII抗體ELISA量測抗hFVIII抗體。
觀察到所有LV-hFVIII變異體在初生階段進行處理之HemA小鼠中持久之FVIII表現。在1.5E10轉導單位/公斤劑量下，編碼密碼子優化hFVIII之LV(LV-cohFVIII)使得循環FVIII比編碼野生型hFVIII之LV高30至100倍(圖12C)，而所有測試組中肝細胞中之載體複製數及FVIII RNA陽性細胞之百分比相當(圖12B)。密碼子優化與XTEN之組合(LV-cohFVIII-XTEN)(推測藉由增加有效負載之流體動力學尺寸而改善循環半衰期的未結構化親水性多肽)在血漿中產生30-50 IU/mL FVIII活性，表示正常循環FVIII水準之3,000至5,000%(圖12A、圖17)。此外，僅僅在具有超越生理學水準之hFVIII的小鼠中偵測到抗hFVIII ab(圖14)，但在抗hFVIII抗體陽性小鼠中未觀察到針對LV轉導細胞之細胞毒性T淋巴細胞反應(圖15及16A-16D)。結果證明LV-FVIII進一步發展用於A型血友病之活體內基因療法。

實例 10 ： HemA 小鼠中 LV-FVIII 處理之劑量反應
為測定HemA小鼠中LV-FVIII處理之劑量反應，藉由眼眶後注射，將12-14日齡HemA幼崽用LV-coFVIII-6或LV-coFVIII-6-XTEN以如下四個劑量水準處理：1.3×1010 TU/kg、4.5×109 TU/kg、1.5×109 TU/kg及8.3×108 TU/kg。
經處理小鼠中LV-FVIII介導之FVIII表現水準藉由FVIII顯色分析量測，且峰值FVIII表現水準在圖18A(LV-coFVIII-6)及圖18B(LV-coFVIII-6-XTEN)中繪圖。
LV-FVIII處理後，1.3 E10 TU/kg、4.5×109 TU/kg、1.5×109 TU/kg及8.3×108 TU/kg處理組之平均峰值FVIII表現水準分別為LV-coFVIII-6之正常水準的882%、662%、15%及12%；分別為LV-coFVIII-6-XTEN之正常水準的1793%、431%、10%及10%。
對於當前FVIII替換療法，FVIII預防之靶向水準介於正常水準之1-3%之間，此為A型血友病患者提供顯著保護。在8.3×108 TU/kg(最低測試LV-FVIII劑量)下，LV-coFVIII-6與LV-coFVIII-6-XTEN處理均使得HemA小鼠中≥10%正常循環FVIII，表明1×109 TU/kg LV-FVIII處理對於A型血友病患者而言可為治療有益的。

實例 11 ：在豬尾獼猴 (Pigtail Macaque) 中兩種慢病毒載體之探索性單次劑量 IV 輸注研究
1. 目的： 此研究之目標為相對應地確定豬尾獼猴中慢病毒載體(LV)因子VIII基因療法用於治療A型血友病之劑量/反應關係。
2. 測試系統及合理性： 豬尾獼猴(豚尾猴(M. nemestrina))，未處理，雄性，1至5歲，2至5 kg。豬尾獼猴為用於LV基因療法之此劑量/反應研究的適當藥理學活性模型。此時，要求在實驗動物中之研究支持監管申報，且較低級物種不考慮為研究LV劑量反應關係之可行模型。待使用之動物的數目為產生有意義結果所需之最小數目。
3. 動物照護、圈養及環境條件： 動物照護及圈養之一般程序將符合AAALAC國際建議、「Guide for Care and Use of Laboratory Animals」(National Research Council, 最新版)中所述之現行要求、如美國農業部(the U.S. Department of Agriculture)經由動物福利法(Animal Welfare Act)要求(修訂版)所述的現行要求，且將遵照測試機構SOP。在研究開始前，研究設計經實驗動物照護與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)審閱及批准。
3.1 隔離及馴化： NHP將隔離及馴化。所有動物將進行糞便檢驗、TB測試、身體檢驗及臨床病理學健康篩選(僅僅血液學及血清化學)，以確保僅僅健康NHP進行給藥。在隔離期間，亦將動物放血兩次，相隔大約1週。
將具有約4 mL目標體積之全血樣品收集在含有檸檬酸鈉之管中且置於濕冰上，直至離心。視體積而定，血漿將分成4個等分試樣之目標，每份等分試樣約500 μL，且立即在液氮上冷凍。將具有約1 mL目標體積之全血樣品收集至不含抗凝劑但可含有血清分離凝膠之管(SST管)中。將使SST管在室溫下凝固至少30分鐘，接著離心，獲得大約300 μL血清(視體積而定)之目標。血清一旦分離，立即在乾冰上冷凍。所有管均將在1300相對離心力(RCF)之設置下離心至少10分鐘。將檸檬酸鈉管在設定至4℃之溫度的冷凍離心機中加工，且將SST管在設定至室溫之離心機中加工，且將所有樣品在設定成維持-85至-60℃之冷凍機中加工之後冷凍，直至裝運用於分析。
在開始給藥前NHP將習慣於限制椅。將NHP逐漸馴化至少3個事件以接受連續長達1小時之椅子限制。注意動物可在椅子中長達超過1小時又20分鐘，以允許足夠量之時間使其返回其棲息籠。
3.2 動物圈養及環境條件： 在研究期間NHP將成對或三個一組圈養。若事件(明顯臨床徵象、對籠中伴侶進行重大攻擊等)批准分離，則在研究期間NHP可單個圈養。單個圈養之任何動物可接受由獸醫學工作人員決定之加強富集。
研究室之溫度及濕度範圍將分別設定成維持64至84℉及50±20%。燈循環將設定成維持12小時開/12小時關。每年藉由外聘顧問監測換氣及加壓讀數至少兩次，以確保環境控制提供每小時最少10次新鮮空氣更換。
3.3. 餵養： 除指定禁食時期期間或當動物自其棲息籠離去用於研究事件時(例如當置於限制椅中用於劑量投與及血液收集時)外，猴每日餵養經PMI認證之靈長類動物飲食5048兩次。飲食亦補充新鮮水果及/或新鮮蔬菜及/或補充劑。
每批PMI認證之靈長類動物飲食的分析報告由製造商提供。將審閱分析報告以確保可能干擾研究目的或研究進行之污染物的可接受標準及免除可能干擾研究目的或進行之水準的污染物。將在測試機構記錄中保留分析結果。飲食補充劑不需要分析。
3.4 水： 除在限制時期期間(例如在血液收集、椅子循環及給藥期間等)外，動物將經由自動灌溉系統，自West Jefferson城市供水隨意取用淡水。
將週期性地分析供水以確保可能干擾研究目的或進行之污染物的可接受標準及免除可能干擾研究目的或進行之水準的污染物。將在測試機構記錄中保留結果。
4. 測試及對照物品：
4.3 測試及對照物品組分之保存樣品： 因為持續時間超過4週，所以在此研究時將自各測試物品取目標1 mL保存樣品用於編檔保存。
4.4 未用大量測試物品之處置： 任何未用之調配測試物品可保留用於未來研究，裝運至發起人授權之實驗室，處理，或返回。
4.5 調配物製備、處置及儲存： 測試物品將準備好使用調配物。在此研究時未製備調配物。
4.6 調配物分析及穩定性： 此研究將不進行調配物分析或穩定性。
5. 實驗設計
5.1 組分配及鑑別： 在組分配前，動物藉由其紋身鑑別。待用於給藥之動物將基於體重資料使用分層隨機化程式(Provantis)隨機分配。
在分配至劑量組之後，將分配各動物在研究內獨特之動物鑑別編號且用籠卡片鑑別。各籠卡片將含有包括(但不限於)研究編號、組分配及動物鑑別編號之資訊。紋身將用於匹配籠卡片上之研究動物編號。
5.2 劑量投與： 在如下各動物相應第1天給藥前動物將投與(經由緩慢彈丸注射)術前用藥方案：
動物將以下列各目標劑量水準投與測試物品。
各動物將在頭部或隱靜脈血管中插入導管且使用注射泵(例如KDS220或同等物)以相應劑量水準接受靜脈內給藥(目標1毫升/分鐘)一次，接著為0.4至0.8 mL 0.9%氯化鈉溶液沖洗。沖洗時間將視為給藥時間結束。
5.3 臨床觀察： 將在接收當日及屍檢當日對所有動物進行死亡率及/或瀕死狀態之觀察至少一次，且此後在隔離、馴化及研究時期期間一週7天每日觀察兩次。
自動物接收及繼續至生命最後一日，每日將進行籠側臨床觀察至少一次，每個給藥日除外，此時在給藥前進行籠側臨床觀察最少一次且給藥後2小時(+/-15分鐘)至少一次。
5.4 體重： 在隔離期間將記錄所有動物之個別體重至少一次，且在選擇動物進行組分配前(第-1週)一次，在第1天、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天、第43天、第50天及第53天記錄體重。在第1天記錄之各相應組之體重將用於確定劑量體積以進行給藥。
5.5 臨床病理學： 根據以下時程收集用於臨床病理學(血液學、臨床化學及凝血)評估之樣品。在各收集時間間隔前所有NHP將禁食隔夜。
將自股動脈血管或其他合適外周血管收集用於血液學、臨床化學及凝血評估之血液(目標1.5至3.0毫升/樣品)。注意血液容量可進行調整以順應IACUC指南。用於血液學之管將含有K3 EDTA作為抗凝劑。用於血清化學測定之管將不含抗凝劑但可含有血清分離凝膠。用於凝血之管將含有檸檬酸鈉作為抗凝劑。
若可能，可自瀕死動物收集血液，必要時用於臨床病理學評估。臨床病理學結果及臨床病理學家之報告將包括在最終報告中。
5.5.1 血液學： 待評估之血液學參數為：
在分析後將棄去血液學樣品(殘餘血液)。
5.5.2 臨床化學： 待評估之臨床化學參數為：
在研究結束前將丟棄分析後之殘餘血清。
5.5.3 凝血： 待評估之凝血參數為：
在分析後將丟棄凝血樣品(殘餘血液)。
5.6 生物分析及藥物動力學評估
5.6.1 血液樣品收集： 根據以下時程收集用於生物分析之血液樣品且加工成血漿及血清。至第8天收集之血漿及血清樣品將裝運至章節4.3中所列出之PI，其中將自血漿測定因子VIII之表現且可自血漿及血清測定潛在細胞介素評估。
(i)禁食要求： 除非與用於其他程序之禁食同時，否則在血液收集前動物不禁食。
(ii) 將具有約1 mL目標體積之全血樣品收集在含有檸檬酸鈉之管中且置於濕冰上，直至離心。視體積而定，將血漿分成4個等分試樣之目標，每份等分試樣約100 μL，且立即在液氮上冷凍，接著在設定成維持-85至-60℃之冷凍機中儲存，直至裝運用於分析。
(iii) 將具有約1 mL目標體積之全血樣品收集至不含抗凝劑但可含有血清分離凝膠之管(SST管)中。將使SST管在室溫下凝固至少30分鐘，接著離心，獲得大約200 μL血清(視體積而定)之2個等分試樣之目標。血清一旦分離立即在乾冰上冷凍，接著在設定成維持-85至-60℃之冷凍機中儲存，直至裝運用於分析。
(iv) 所有管均將在1300相對離心力(RCF)之設置下離心至少10分鐘。將檸檬酸鈉管在設定至4℃之溫度的冷凍離心機中加工，且將SST管在設定至室溫之離心機中加工。
(v)收集部位： 股動脈血管或另一合適血管
(vi)最終儲存： 冷凍(-85至-60℃)

5.6.2 因子 VIII 表現及細胞介素評估： 因子VIII之表現將由血漿測定，且潛在細胞介素評估將由血清測定。
5.6.3 外周血單核細胞 (PBMC) ：自約10 mL(在第30天僅僅約4 mL)自各猴收集之血液分離PBMC。用1體積PBS稀釋血液且在15 cc錐形管中用1體積Ficoll輕輕覆蓋其。在20℃下將管以650×g離心30分鐘，制動關閉。收集PBMC層，用DPBS洗滌，在20℃下以450×g離心10分鐘(制動)且使細胞集結粒再懸浮於氯化銨(1-3 mL)且培育5分鐘以使紅血球溶解，用DPBS洗滌兩次，在20℃下以150×g離心10分鐘(制動)，接著再懸浮於冷凍介質(90% FBS/10% DMSO)中。分離之PBMC將儲存在設定成維持-85℃至-60℃之冷凍機中。
5.7 屍檢
5.7.1 計劃外屍檢： 將對在計劃外時間間隔死亡或終止之所有研究動物進行完整屍檢。除非嚴重自體溶解，否則發現死亡之動物將具有完整屍檢。所有計劃外屍檢將由委員會認證之可進行諮詢之獸醫學病理學家(可能時)進行。在安樂死前，可行情況下嘗試收集用於臨床病理學之血液樣品。若收集，則組織將固定在適當固定劑中且將決定其中之任一者是否將加工用於組織病理學評估或丟棄。
5.7.2 計劃屍檢： 動物將在第53天實施安樂死。將在屍檢前稱重動物，用氯胺酮(10 mg/kg，經由IM注射)鎮靜，以輸送至屍檢，且藉由投與過度劑量巴比妥酸鹽人道地終止，且接著放血。
所有計劃屍檢將由委員會認證之可進行諮詢之獸醫學病理學家(可能時)進行。各屍檢將包括檢查身體外表面及所有孔口；顱腔、胸腔、腹腔及盆腔及其內含物；及收集組織。
以下列出之組織在存在時將自所有動物收集且加工。
組織病理學： 將收集肝臟及脾之切片且置於10%中性緩衝福馬林(NBF)中。將保留猴鑑別，其中在屍檢期間獲取組織。
不收集器官重量資料。
DNA 及 RNA 樣品收集： 對於肝、右葉、肝左葉、肝中葉、肝方葉、肝尾狀葉及脾：
對於腦(皮層)、左心室、右心室、右腎、右腋窩淋巴結、肺、右睾丸、左睾丸、胸腺、肌肉(右側腓腸肌)：
未用於組織病理學評估之肝臟樣品及脾樣品將如上所述速凍，且裝運至PI以可萃取DNA及RNA及進行分子分析。
所有其他組織及屍體將丟棄。
5.7.3 組織加工： 收集用於組織病理學評估之肝臟及脾切片將進行修整，按常規進行加工，包埋於石蠟中，以大約5微米切片，安放在載玻片上且用蘇木精與曙紅染色。
5.7.4. 組織病理學評估： 研究病理學家將用顯微鏡檢查所製備之各載玻片。在計劃外屍檢(在研究期間死亡之動物)中鑑別之任何宏觀病變將用顯微鏡檢查。將進行內部同行審查。解剖病理學敍述將包括在研究文件及最終報告中。
6. 統計分析： 將針對測試物品作用，藉由參數或非參數方差分析(ANOVA)分析在Battelle使用Provantis系統收集之所有適當之定量生命資料。對於所有資料，將藉由夏皮羅-維爾克檢驗(Shapiro-Wilks test)測定正態性且藉由萊文檢驗(Levene’s test)測定方差齊性。資料可經對數轉化以符合參數假設。對於確定為正態分佈且在組間齊性之參數資料，ANOVA F檢驗將用於確定組平均值間是否存在差異。若ANOVA F檢驗顯著，則將使用調整以求多重比較之鄧尼特檢驗(Dunnett’s test)進行對照與各比較組之間的差異檢驗。對非正態分佈及/或非齊性之非參數資料，將使用克魯斯凱-沃利斯檢驗(Kruskal-Wallis test)確定組平均值間是否存在差異。若克魯斯凱-沃利斯檢驗顯著，則將使用威爾卡森檢驗(Wilcoxon test)及邦費羅尼-霍爾姆法(Bonferroni-Holm method)校正多重比較，進行對照與各比較組之間的差異檢驗。在指示情況下說明多重比較之後所有統計檢驗將在0.05顯著性水準(p＜0.05)下進行。

實例 12 ：豬尾獼猴中單次劑量 LV-coFVIII6XTEN 研究
將三隻雄性豬尾獼猴(體重為3.5-4.3 kg)用自CD47高 /MHC-I無 293T細胞產生之LV-coFVIII-6-XTEN以3E9 TU/kg劑量，經由靜脈內(IV)輸注以1.5毫升/分鐘之輸注速率處理。為控制抗人類FVIII抗體形成，自LV處理之第-1天至第7天，將動物用每日肌肉內注射SOLU-MEDROL ® (甲基潑尼松龍)以10 mg/kg之劑量處理。在LV處理前三十(30)分鐘，亦將動物用Polaramine(右氯苯那敏)之IV注射以4 mg/kg之劑量處理以控制可能過敏反應。在LV處理後第7天、第10天及第14天收集血漿樣品，且分析人類FVIII活性及抗原水準。測得三隻動物中之峰值血漿水準為FVIII活性之正常值的102%、54%及67%(圖20A)，分別與187 ng/mL、75 ng/mL及131 ng/mL之人類FVIII抗原水準對應(圖20B)。此等資料證明可在相對較低之LV劑量水準下實現在非人類靈長類動物中治療有益之人類FVIII表現。

實例 13 ：豬尾獼猴中試點 LV-coFVIII6 及 LV-coFVIII6XTEN 劑量反應研究
將十隻雄性豬尾獼猴(體重為3.5-4.3 kg)用自CD47高/MHC-I無 293T細胞產生之LV-coFVIII-6或LV-coFVIII-6-XTEN，經由靜脈內(IV)輸注以1.5毫升/分鐘之輸注速率處理。LV-coFVIII-6之劑量為3E9 TU/kg或6E9 TU/kg，且LV-coFVIII-6-XTEN之劑量為1E9 TU/kg或3E9 TU/kg。為控制抗人類FVIII抗體形成，自LV處理之第-1天至第7天，將動物用每日肌肉內注射SOLU-MEDROL ® (甲基潑尼松龍)以10 mg/kg之劑量處理。在LV處理前三十(30)分鐘，亦將動物用Polaramine(右氯苯那敏)之IV注射以4 mg/kg之劑量處理以控制可能過敏反應。在LV處理後第0天、第1天、第3天、第7天、第14天、第21天、第28天、第45天及第60天收集血漿樣品，且分析人類FVIII活性及抗原水準。LV-coFVIII-6處理後，3E9或6E9 TU/kg處理組之峰值血漿水準平均值分別為針對FVIII活性之正常值的5%或12%(圖21A)，分別對應於5 ng/mL或9 ng/mL之平均FVIII抗原水準(圖21B)。LV-coFVIII-6-XTEN處理後，1E9或3E9 TU/kg處理組之峰值血漿水準平均值分別為針對FVIII活性之正常值的20%或75%(圖22A)，分別對應於31 ng/mL或140 ng/mL之平均FVIII抗原水準(圖22B)。此等資料證明LV-coFVIII-6與LV-coFVIII-6-XTEN可在非人類靈長類動物中實現治療有益之人類FVIII表現。
特定實施例之以上描述將充分揭露本發明之一般性質，使得別人可藉由應用本領域技能範圍內之知識，在不進行過度實驗下，在不脫離本發明之一般概念下，容易針對多種應用來修改及/或改變此類特定實施例。因此，基於本文中所呈現之教示及指導，此類改變及修改意欲在所揭示之實施例之同等物的含義及範圍內。應瞭解本文中之用語或術語係出於描述之目的而非限制，使得熟練技術人員按照該等教示及指導將解釋本說明書之術語或用語。
本領域之技術人員，根據對本說明書之考慮及對本文揭示之本發明的實施，將顯而易見本發明之其他實施例。意欲本說明書及實例僅僅視為例示性的，本發明之真實範疇及精神由以下申請專利範圍指示。
本文中引用之所有專利及公開案以引用之方式整體併入本文中。
圖1A-1J提供編碼B結構域缺失之因子VIII的密碼子優化之核苷酸序列。圖1A顯示coFVIII-3之核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。圖1B顯示coFVIII-4之核苷酸序列(SEQ ID NO: 2)。圖1C顯示coFVIII-5之核苷酸序列(SEQ ID NO: 70)。圖1D顯示coFVIII-6之核苷酸序列(SEQ ID NO: 71)。圖1E顯示coFVIII-52之核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)。圖1F顯示coFVIII-62之核苷酸序列(SEQ ID NO: 4)。圖1G顯示coFVIII-25之核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)。圖1H顯示coFVIII-26之核苷酸序列(SEQ ID NO: 6)。圖1I及1J分別顯示B結構域缺失之(BDD-FVIII)的未進行密碼子優化之核苷酸及胺基酸序列(分別為SEQ ID NO: 16及17)。
圖2A-2J顯示編碼BDD-FVIII之密碼子優化之核苷酸序列中的密碼子使用偏好調整。圖2A顯示編碼BDD-FVIII之野生型核苷酸序列(在密碼子優化前)，例如未優化之BDD-FVIII中密碼子之相對頻率。未優化之BDD-FVIII序列之人類密碼子適應指數(CAI)為74%。圖2B顯示coFVIII-1變異序列中密碼子之相對頻率，其具有88%之人類CAI。圖2C顯示coFVIII-3變異序列中密碼子之相對頻率，其具有91%之人類CAI。圖2D顯示coFVIII-4變異序列中密碼子之相對頻率，其具有97%之人類CAI。圖2E顯示coFVIII-5變異序列中密碼子之相對頻率，其具有83%之人類CAI。圖2F顯示coFVIII-6變異序列中密碼子之相對頻率，其具有83%之人類CAI。圖2G顯示coFVIII-52變異序列中密碼子之相對頻率，其具有91%之人類CAI。圖2H顯示coFVIII-62變異序列中密碼子之相對頻率，其具有91%之人類CAI。圖2I顯示coFVIII-25變異序列中密碼子之相對頻率，其具有88%之人類CAI。圖2J顯示coFVIII-26變異序列中密碼子之相對頻率，其具有88%之人類CAI。
圖3提供FVIII-303之質體圖，其在pcDNA3主鏈中包含coFVIII-1，在ET增強之轉甲狀腺素蛋白啟動子控制下，該啟動子位於coFVIII-1轉譯開始位點上游且包含合成強化子、mTIR強化子及mTIR啟動子。
圖4顯示HemA小鼠中在流體動力學注射5 μg FVIII-303(coFVIII-1；圓形)或5 μg FVIII-311(BDD-FVIII；正方形)之後FVIII血漿活性之圖示。藉由FVIII特異性顯色分析，在注射後24小時、48小時及72小時，測定FVIII血漿活性。顯示72小時之相對活性水準，其相對於FVIII-311之表現水準標準化。
圖5顯示pLV-coFVIII-52之質體圖，其在慢病毒質體中包含coFVIII-52，在ET啟動子控制下，該啟動子位於coFVIII-52轉譯開始位點上游且包含合成強化子、mTTR強化子及mTTR啟動子。
圖6A-6C顯示HemA小鼠中在流體動力學注射多種編碼FVIII之核苷酸後FVIII血漿活性之圖示。藉由FVIII特異性顯色分析，在注射後24小時、48小時及72小時，測定FVIII血漿活性。圖6A顯示HemA小鼠中在流體動力學注射5 μg LV-coFVIII-1(實心圓形)、5 μg LV-coFVIII-3(三角形)、5 μg LV-coFVIII-4(倒三角形)、5 μg LV-coFVIII-5(菱形)或5 μg LV-coFVIII-6(空心圓形)後的FVIII血漿活性。圖6B顯示HemA小鼠中在流體動力學注射5 μg LV-coFVIII-1(圓形)、5 μg LV-coFVIII-25(三角形)或5 μg LV-coFVIII-26(倒三角形)後的FVIII血漿活性。圖6C顯示HemA小鼠中在流體動力學注射20 μg LV-2116(未進行密碼子優化(WT)之BDD-FVIII核苷酸序列；空心圓形)、20 μg LV-coFVIII-1(三角形)、20 μg LV-coFVIII-52(正方形)或20 μg LV-coFVIII-62(實心圓形)後的FVIII血漿活性。顯示各質體之72小時之相對活性水準，如所指示，其相對於LV-coFVIII-1(圖6A、6B及6C)及/或LV-2116(圖6C)之表現水準標準化。
圖7顯示與LV-2116(BDD-FVIII)對照物相比且如藉由FVIII特異性顯色分析所量測，HemA小鼠中在注射1E8 TU/小鼠之包含coFVIII-1、coFVIII-5、coFVIII-52、coFVIII-6或coFVIII-62之慢病毒載體之後24天的血漿FVIII活性。誤差線指示標準偏差。
圖8A-8C提供編碼與XTEN融合之BDD-FVIII的多種密碼子優化之核苷酸序列。圖8A顯示coFVIII-52-XTEN之核苷酸序列(SEQ ID NO: 19)，其中編碼具有144個胺基酸之XTEN之核苷酸序列(「XTEN144 」；SEQ ID NO: 18；加下劃線)插入coFVIII-52核苷酸序列內。圖8B顯示coFVIII-1-XTEN之核苷酸序列(SEQ ID NO: 20)，其中編碼具有144個胺基酸之XTEN之核苷酸序列(「XTEN144 」；SEQ ID NO: 18；加下劃線)插入coFVIII-1核苷酸序列內。圖8C顯示coFVIII-6-XTEN之核苷酸序列(SEQ ID NO: 72)，其中編碼具有144個胺基酸之XTEN之核苷酸序列(「XTEN144 」；SEQ ID NO: 18；加下劃線)插入coFVIII-6核苷酸序列內(例如與成熟FVIII序列對應之胺基酸殘基745)。
圖9提供pLV-coFVIII-52-XTEN之質體圖，其在慢病毒載體中包含coFVIII-52-XTEN，在ET啟動子控制下。包含編碼如本文所述之具有FVIII活性之多肽的剩餘密碼子優化之核酸分子每一者的慢病毒載體用與pLV-coFVIII-52-XTEN相同之方法構築，其中相同XTEN序列插入以替換FVIII之B結構域。
圖10A及10B顯示HemA小鼠中在注射質體DNA(圖10A)或包含編碼BDD-FVIII之多種密碼子優化之核苷酸序列的慢病毒載體(圖10B)後的FVIII活性。圖10A顯示HemA小鼠中在流體動力學注射5 μg FVIII-311(編碼BDD-FVIII之未進行密碼子優化之核苷酸序列；正方形)、5 μg FVIII-303(coFVIII-1；小圓形)或FVIII-306(coFVIII-1-XTEN144 ；大圓形)後的FVIII血漿活性之圖示。顯示各質體之72小時之相對活性，其相對於FVIII-311標準化。圖10B顯示與LV-2116(BDD-FVIII)對照物相比且如藉由FVIII特異性顯色分析所量測，HemA小鼠中在注射1E8 TU/小鼠之包含coFVIII-52或coFVIII-52-XTEN之慢病毒載體之後21天的血漿FVIII活性。誤差線指示標準偏差。
圖11A顯示全長成熟人類因子VIII之胺基酸序列。圖11B顯示全長人類馮威里氏因子(von Willebrand Factor)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 44)。圖11C及11D分別顯示具有42個胺基酸之XTEN多肽之胺基酸及核苷酸序列(XTEN AE42-4；分別為SEQ ID NO: 46及47)。具有144個胺基酸之多種XTEN多肽之胺基酸序列顯示於圖11E、11G、11I、11K、11M、11O、11Q、11S、11U及11W(分別為SEQ ID NO: 48、50、52、54、56、58、60、62、64及66)，且對應核苷酸序列顯示於圖11F、11H、11J、11L、11N、11P、11R、11T、11V及11X(分別為SEQ ID NO: 49、51、53、55、57、59、61、63、65及67)。圖11Y顯示ET啟動子之核苷酸序列(SEQ ID NO: 69)。圖11Z顯示coFVIII-1之核苷酸序列(SEQ ID NO: 68)(參見國際公開案第WO 2014/127215號，SEQ ID NO: 1)。
圖12A為14日齡之HemA小鼠中在IV投與約1.5×1010 TU/kg LV-wtBDD-FVIII(圓形)、LV-coFVIII-6(正方形)或LV-coFVIII-6XTEN(三角形)後的FVIII血漿活性(IU/mL)之圖示。圖12B為在藉由IV投與約1.5×1010 TU/kg表現wtBDD-FVIII、coFVIII-1、coFVIII-3、coFVIII-4、coFVIII-5、coFVIII-6、coFVIII-52、coFVIII-62、coFVIII-25或coFVIII-26之慢病毒載體的14日齡之HemA小鼠的處理後150天載體複製數(VCN)之圖示。圖12C為在藉由IV投與約1.5×1010 TU/kg表現wtBDD-FVIII、coFVIII-1、coFVIII-3、coFVIII-4、coFVIII-5、coFVIII-6、coFVIII-52、coFVIII-62、coFVIII-25或coFVIII-26之慢病毒載體的14日齡之HemA小鼠的處理後21天FVIII血漿活性(IU/mL)之圖示。
圖13A及13B為說明用表現coFVIII-5變異體之慢病毒處理之五隻HemA小鼠中的FVIII血漿活性水準(圖13A)及抗FVIII抗體水準(圖13B)的圖示。藉由靜脈內注射向十四日齡之HemA同窩出生仔畜投與大約1.5×1010 TU/kg之表現coFVIII-5變異體之慢病毒。各小鼠由數字(亦即1、2、3、4及5；圖13A及13B)表示。
圖14為如藉由慢病毒處理後21天之FVIII血漿活性證明的LV-FVIII表現水準與抗FVIII抗體之存在之間的相關性的圖示。各數據點對應於單個HemA小鼠。藉由靜脈內注射本文揭示之表現coFVIII變異體之一的慢病毒，各小鼠接受1.5×1010 TU/kg劑量。水平線指示平均FVIII血漿活性。
圖15為慢病毒處理後150天之每個細胞之載體複製數(VCN)與抗FVIII抗體之存在之間的相關性的圖示。各數據點對應於單個HemA小鼠。藉由靜脈內注射本文揭示之表現coFVIII變異體之一的慢病毒，各小鼠接受1.5×1010 TU/kg劑量。水平線指示平均VCN。
圖16A及16B為說明用表現coFVIII-52變異體之慢病毒處理之兩隻HemA小鼠(coFVIII-52-A及coFVIII-52-B)中的FVIII血漿活性水準(圖16A)及抗FVIII抗體水準(圖16B)的圖示。藉由靜脈內注射向十四日齡之HemA同窩出生仔畜投與大約1.5×1010 TU/kg之表現coFVIII-52變異體之慢病毒。圖16C及16D為顯示自圖16A及16B之coFVIII-52-A(圖16C)及coFVIII-52-B(圖16D)小鼠收集之肝臟組織中針對FVIII表現之RNA原位雜交染色(暗染色)的影像。
圖17為顯示用表現野生型B結構域缺失之FVIII(wtBDD-FVIII；三角形)、coFVIII-52-XTEN(圓形)或coFVIII-6-XTEN(倒三角形)變異體之慢病毒處理的HemA新生小鼠中長期FVIII表現的圖示。新生HemA小鼠藉由靜脈內注射大約1.5×1010 TU/kg之表現wtBDD-FVIII、coFVIII-52-XTEN或coFVIII-6-XTEN之慢病毒投與。在大約16週內量測FVIII血漿活性。
圖18A-18B顯示與用表現coFVIII-6(圖18A)或coFVIII-6-XTEN(圖18B)之慢病毒處理HemA小鼠對應的劑量-反應結果之圖示。
圖19提供用於靶向肝臟之基因療法之慢病毒載體的示意圖。SD：剪接供體位點；SA：剪接受體位點；GA：截短gag序列；RRE：Rev反應元件；ET：增強轉甲狀腺素蛋白；FVIII：因子VIII；142T：miR-142之標靶序列；Wpre：突變旱獺肝炎病毒轉錄後調控元件；Ψ(包裝信號)。
圖20A-20B為投與3×109 TU/kg表現由CD47高 /MHC-I無 293T細胞產生之coFVIII-6-XTEN之慢病毒的雄性豬尾獼猴中峰值循環FVIII水準之圖示，該等峰值循環FVIII水準如藉由FVIII血漿活性(圖20A)及FVIII血漿抗原水準(圖20B)量測。
圖21A-21B為投與3×109 TU/kg或6×109 TU/kg表現coFVIII-6之慢病毒的雄性豬尾獼猴中人類FVIII活性(圖21A)及人類FVIII抗原水準(圖21B)之峰值血漿水準的圖示。
圖22A-22B顯示投與1×109 TU/kg或3×109 TU/kg表現coFVIII-6-XTEN之慢病毒的雄性豬尾獼猴中人類FVIII活性(圖22A)及平均人類FVIII抗原水準(圖22B)之峰值血漿水準的圖示。

Claims (47)

  1. 一種治療有需要之個體之出血病症的方法，該方法包括向該個體投與至少一個劑量之5×1010 或更少轉導單位/公斤(TU/kg)之慢病毒載體，該慢病毒載體包含包括編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列的經分離之核酸分子，其中該核苷酸序列具有： (i) 與SEQ ID NO: 1之核苷酸58-2277及2320-4374至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性； (ii) 與SEQ ID NO: 2之核苷酸58-2277及2320-4374至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性； (iii) 與SEQ ID NO: 70之核苷酸58-2277及2320-4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性； (iv) 與SEQ ID NO: 71之核苷酸58-2277及2320-4374至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性； (v) 與SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-4374至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性； (vi) 與SEQ ID NO: 4之核苷酸58-2277及2320-4374至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性； (vii) 與SEQ ID NO: 5之核苷酸58-2277及2320-4374至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性； (viii) 與SEQ ID NO: 6之核苷酸58-2277及2320-4374至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；或 (ix) 或(i)至(viii)之任何組合。
  2. 一種治療有需要之個體之出血病症的方法，該方法包括向該個體投與至少一個劑量之5×1010 或更少轉導單位/公斤(TU/kg)之慢病毒載體，該慢病毒載體包含包括如下核苷酸序列之經分離之核酸分子，該核苷酸序列包含編碼因子VIII (FVIII)多肽之N端部分之第一核酸序列及編碼FVIII多肽之C端部分之第二核酸序列； (a) 其中該第一核酸序列具有： (i) 與SEQ ID NO: 3之核苷酸58-2277及2320-1791至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性； (ii) 與SEQ ID NO: 4之核苷酸58-2277及2320-1791至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性； (iii) 與SEQ ID NO: 5之核苷酸58-1791至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性； (iv) 與SEQ ID NO: 6之核苷酸58-1791至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性； (b) 其中該第二核苷酸序列具有： (i) 與SEQ ID NO: 3之核苷酸1792-2277及2320-4374至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性； (ii) 與SEQ ID NO: 4之核苷酸1792-2277及2320-4374至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性； (iii) 與SEQ ID NO: 5之核苷酸1792-2277及2320-4374至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；或 (iv) 與SEQ ID NO: 6之核苷酸1792-2277及2320-4374至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性；或 (c) (a)與(b)之任何組合；且 其中該N端部分與該C端部分一起具有FVIII多肽活性。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該劑量為約5×1010 TU/kg、約4.5×1010 TU/kg、約4×1010 TU/kg、約3.5×1010 TU/kg、約3×1010 TU/kg、約2.5×1010 TU/kg、約2×1010 TU/kg、約1.5×1010 TU/kg、約1×1010 TU/kg、約9.5×109 TU/kg、約9×109 TU/kg、約8.5×109 TU/kg、約8×109 TU/kg、約7.5×109 TU/kg、約7×109 TU/kg、約6.5×109 TU/kg、約6×109 TU/kg、約5.5×109 TU/kg、約5×109 TU/kg、約4.5×109 TU/kg、約4×109 TU/kg、約3.5×109 TU/kg、約3×109 TU/kg、約2.5×109 TU/kg、約2×109 TU/kg、約1.5×109 TU/kg、約1×109 TU/kg、約9.5×108 TU/kg、約9×108 TU/kg、約8.5×108 TU/kg、約8×108 TU/kg、約7.5×108 TU/kg、約7×108 TU/kg、約6.5×108 TU/kg、約6×108 TU/kg、約5.5×108 TU/kg、約5×108 TU/kg、約4.5×108 TU/kg、約4×108 TU/kg、約3.5×108 TU/kg、約3×108 TU/kg、約2.5×108 TU/kg、約2×108 TU/kg、約1.5×108 TU/kg或約1×108 TU/kg。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該劑量少於約5×1010 TU/kg、少於約4.5×1010 TU/kg、少於約4×1010 TU/kg、少於約3.5×1010 TU/kg、少於約3×1010 TU/kg、少於約2.5×1010 TU/kg、少於約2×1010 TU/kg、少於約1.5×1010 TU/kg、少於約1×1010 TU/kg、少於約9.5×109 TU/kg、少於約9×109 TU/kg、少於約8.5×109 TU/kg、少於約8×109 TU/kg、少於約7.5×109 TU/kg、少於約7×109 TU/kg、少於約6.5×109 TU/kg、少於約6×109 TU/kg、少於約5.5×109 TU/kg、少於約5×109 TU/kg、少於約4.5×109 TU/kg、少於約4×109 TU/kg、少於約3.5×109 TU/kg、少於約3×109 TU/kg、少於約2.5×109 TU/kg、少於約2×109 TU/kg、少於約1.5×109 TU/kg、少於約1×109 TU/kg、少於約9.5×108 TU/kg、少於約9×108 TU/kg、少於約8.5×108 TU/kg、少於約8×108 TU/kg、少於約7.5×108 TU/kg、少於約7×108 TU/kg、少於約6.5×108 TU/kg、少於約6×108 TU/kg、少於約5.5×108 TU/kg、少於約5×108 TU/kg、少於約4.5×108 TU/kg、少於約4×108 TU/kg、少於約3.5×108 TU/kg、少於約3×108 TU/kg、少於約2.5×108 TU/kg、少於約2×108 TU/kg、少於約1.5×108 TU/kg或少於約1×108 TU/kg。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該劑量介於1×108 與5×1010 TU/kg之間、1×108 與5×109 TU/kg之間、1×108 與1×109 TU/kg之間、1×108 與1×1010 TU/kg之間、1×109 與5×1010 TU/kg之間、2×109 與5×1010 TU/kg之間、3×109 與5×1010 TU/kg之間、4×109 與5×1010 TU/kg之間、5×109 與5×1010 TU/kg之間、6×109 與5×1010 TU/kg之間、7×109 與5×1010 TU/kg、8×109 與5×1010 TU/kg之間、9×109 與5×1010 TU/kg之間、1010 與5×1010 TU/kg之間、1.5×1010 與5×1010 TU/kg之間、2×1010 與5×1010 TU/kg之間、2.5×1010 與5×1010 TU/kg之間、3×1010 與5×1010 TU/kg之間、3.5×1010 與5×1010 TU/kg之間、4×1010 與5×1010 TU/kg或4.5×1010 與5×1010 TU/kg之間。
  6. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該劑量介於1×109 與5×1010 TU/kg之間、1×109 與4.5×1010 TU/kg之間、1×109 與4×1010 TU/kg之間、1×109 與3.5×1010 TU/kg之間、1×109 與3×1010 TU/kg之間、1×109 與2.5×1010 TU/kg之間、1×109 與2×1010 TU/kg之間、1×109 與1.5×1010 TU/kg之間、1×109 與1×1010 TU/kg之間、1×109 與9×109 TU/kg之間、1×109 與8×109 TU/kg之間、1×109 與7×109 TU/kg之間、1×109 與6×109 TU/kg之間、1×109 與5×109 TU/kg之間、1×109 與4×109 TU/kg之間、1×109 與3×109 TU/kg之間及1×109 與2×109 TU/kg之間。
  7. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該劑量介於1×1010 與2×1010 TU/kg之間、1.1×1010 與1.9×1010 TU/kg之間、1.2×1010 與1.8×1010 TU/kg之間、1.3×1010 與1.7×1010 TU/kg之間或1.4×1010 與1.6×1010 TU/kg之間。
  8. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該劑量為約1.5×1010 TU/kg。
  9. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該劑量為約1.0×109 TU/kg。
  10. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該劑量為約3.0×109 TU/kg。
  11. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該劑量為約6.0×109 TU/kg。
  12. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該劑量為約1×108 TU/kg、約8.3×108 TU/kg、約1.5×109 TU/kg、約4.5×109 TU/kg或約1.3×1010 TU/kg。
  13. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該劑量介於2.5×109 TU/kg與3.5×109 TU/kg之間、2.6 ×109 TU/kg與3.4×109 TU/kg之間、2.7×109 TU/kg與3.3×109 TU/kg之間、2.8×109 TU/kg與3.2×109 TU/kg之間或2.9×109 TU/kg與3.1×109 TU/kg之間。
  14. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該劑量介於5.5×109 TU/kg與6.5×109 TU/kg之間、5.6 ×109 TU/kg與6.4×109 TU/kg之間、5.7×109 TU/kg與6.3×109 TU/kg之間、5.8×109 TU/kg與6.2×109 TU/kg之間或5.9×109 TU/kg與6.1×109 TU/kg之間。
  15. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之方法，其中在投與該慢病毒載體後24小時至48小時血漿FVIII活性相對於投與包含包括SEQ ID NO: 16之核酸分子之參考載體的個體增加。
  16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該血漿FVIII活性增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍、至少約110倍、至少約120倍、至少約130倍、至少約140倍、至少約150倍、至少約160倍、至少約170倍、至少約180倍、至少約190倍或至少約200倍。
  17. 如申請專利範圍第1項至第16項中任一項之方法，其中該慢病毒載體係呈單個劑量或多個劑量投與。
  18. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之方法，其中該慢病毒載體係經由靜脈內注射投與。
  19. 如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之方法，其中該個體係兒科個體。
  20. 如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之方法，其中該個體係成人個體。
  21. 如申請專利範圍第1項至第20項中任一項之方法，其中該慢病毒載體包含組織特異性啟動子。
  22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該組織特異性啟動子選擇性地增強該具有FVIII活性之多肽在標靶肝臟細胞中之表現。
  23. 如申請專利範圍第22項之方法，其中選擇性地增強該具有FVIII活性之多肽在標靶肝臟細胞中之表現的該組織特異性啟動子包含mTTR啟動子。
  24. 如申請專利範圍第22項或第23項之方法，其中該標靶肝臟細胞為肝細胞。
  25. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該經分離之核酸分子穩定地整合至該肝細胞之基因組中。
  26. 如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之方法，其中該出血病症為A型血友病。
  27. 如申請專利範圍第1項至第26項中任一項之方法，其中該經分離之核酸分子包含LV-coFVIII-6 (SEQ ID NO:71)。
  28. 如申請專利範圍第1項至第26項中任一項之方法，其中該經分離之核酸分子包含LV-coFVIII-6-XTEN (SEQ ID NO:72)。
  29. 如申請專利範圍第1項至第28項中任一項之方法，其中慢病毒載體之該劑量一次投與或分成至少兩個亞劑量。
  30. 如申請專利範圍第1項至第28項中任一項之方法，其中慢病毒載體之該劑量重複至少兩次。
  31. 如申請專利範圍第1項至第30項中任一項之方法，其中該編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列進一步包含編碼信號肽之核酸序列，其中該編碼信號肽之核酸序列具有與以下各者至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (i) SEQ ID NO: 1之核苷酸1至57； (ii) SEQ ID NO: 2之核苷酸1至57； (iii) SEQ ID NO: 3之核苷酸1至57； (iv) SEQ ID NO: 4之核苷酸1至57； (v) SEQ ID NO: 5之核苷酸1至57； (vi) SEQ ID NO: 6之核苷酸1至57； (vii) SEQ ID NO: 70之核苷酸1至57； (viii) SEQ ID NO: 71之核苷酸1至57；或 (ix) SEQ ID NO: 68之核苷酸1至57。
  32. 如申請專利範圍第1項至第31項中任一項之方法，其中編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列包含一或多種選自由以下組成之群的性質： (a) 該核酸分子或其部分之人類密碼子適應指數相對於SEQ ID NO: 16增加； (b) 該核苷酸序列或其部分之最佳密碼子之頻率相對於SEQ ID NO: 16增加； (c) 該核苷酸序列或其部分含有比SEQ ID NO: 16中G/C核苷酸之百分比高的G/C核苷酸之百分比； (d) 該核苷酸序列或其部分之相對同義密碼子使用度相對於SEQ ID NO: 16增加； (e) 該核苷酸序列或其部分之有效密碼子數目相對於SEQ ID NO: 16減少； (f) 該核苷酸序列相對於SEQ ID NO: 16含有更少MARS/ARS序列(SEQ ID NO: 21及22)； (g) 該核苷酸序列相對於SEQ ID NO: 16含有更少去穩定元件(SEQ ID NO: 23及24)；及 (h) 其任何組合。
  33. 如申請專利範圍第1項至第32項中任一項之方法，其中該編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列進一步包含編碼異源胺基酸序列之異源核苷酸序列。
  34. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該異源胺基酸序列為免疫球蛋白恆定區或其部分、XTEN、轉鐵蛋白、白蛋白或PAS序列。
  35. 如申請專利範圍第33項或第34項之方法，其中該異源胺基酸序列連接於由編碼具有FVIII活性之多肽之核苷酸序列編碼的胺基酸序列之N端或C端或者在選自表3之一或多個插入位點處插入由該核苷酸序列編碼之該胺基酸序列中的兩個胺基酸之間。
  36. 如申請專利範圍第1項至第35項中任一項之方法，其中該FVIII多肽為全長FVIII或B結構域缺失之FVIII。
  37. 如申請專利範圍第1項至第36項中任一項之方法，其中該慢病毒載體包含脂質包衣。
  38. 如申請專利範圍第37項之方法，其中該脂質包衣包含一或多種CD47多肽。
  39. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該CD47多肽為人類CD47多肽。
  40. 如申請專利範圍第37項至第39項中任一項之方法，其中該脂質包衣包含高濃度CD47多肽。
  41. 如申請專利範圍第37項至第40項中任一項之方法，其中該脂質包衣不包含MHC-I多肽。
  42. 如申請專利範圍第37項至第41項中任一項之方法，其中該脂質包衣包含高濃度CD47多肽且不包含MHC-I多肽。
  43. 如申請專利範圍第1項至第42項中任一項之方法，其中該慢病毒載體係在宿主細胞中產生。
  44. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該宿主細胞表現CD47。
  45. 如申請專利範圍第43項或第44項之方法，其中該宿主細胞不表現MHC-I。
  46. 如申請專利範圍第43項至第45項中任一項之方法，其中該宿主細胞為CD47高 /MHC-I- 。
  47. 如申請專利範圍第43項至第46項中任一項之方法，其中該宿主細胞為CD47高 /MHC-I- HEK 293T細胞。
TW108103837A 2018-02-01 2019-01-31 表現因子ｖｉｉｉ之慢病毒載體之使用 TW201946929A (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862625145P 2018-02-01 2018-02-01
US62/625,145 2018-02-01
US201862671915P 2018-05-15 2018-05-15
US62/671,915 2018-05-15
US201962793158P 2019-01-16 2019-01-16
US62/793,158 2019-01-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201946929A true TW201946929A (zh) 2019-12-16

Family

ID=65409653

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108103837A TW201946929A (zh) 2018-02-01 2019-01-31 表現因子ｖｉｉｉ之慢病毒載體之使用

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20210038744A1 (zh)
EP (1) EP3746136A1 (zh)
JP (2) JP2021512126A (zh)
KR (1) KR20200118089A (zh)
CN (1) CN111918674A (zh)
AU (1) AU2019215063A1 (zh)
BR (1) BR112020015228A2 (zh)
CA (1) CA3090136A1 (zh)
CO (1) CO2020010376A2 (zh)
IL (1) IL276402A (zh)
MX (1) MX2020008152A (zh)
SG (1) SG11202007114VA (zh)
TW (1) TW201946929A (zh)
WO (1) WO2019152692A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2959747T3 (es) 2013-02-15 2024-02-28 Bioverativ Therapeutics Inc Gen del factor VIII optimizado
LT3411478T (lt) 2016-02-01 2022-09-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimizuoti viii faktoriaus genai
EP3235908A1 (en) 2016-04-21 2017-10-25 Ecole Normale Superieure De Lyon Methods for selectively modulating the activity of distinct subtypes of cells
KR20200034668A (ko) 2017-05-08 2020-03-31 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 막 융합을 촉진시키기 위한 조성물 및 그의 용도
SG11202011015QA (en) * 2018-05-15 2020-12-30 Flagship Pioneering Innovations V Inc Fusosome compositions and uses thereof
WO2021067389A1 (en) * 2019-09-30 2021-04-08 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
CN111808863B (zh) * 2020-06-23 2021-05-28 康霖生物科技（杭州）有限公司 一种密码子优化的凝血因子viii基因及其构建体
KR20230074703A (ko) * 2020-06-24 2023-05-31 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 유리 인자 viii을 상기 단백질이 발현되도록 변형된 렌티바이러스 벡터의 제제로부터 제거하는 방법
EP4320242A1 (en) 2021-04-08 2024-02-14 Sana Biotechnology, Inc. Cd8-specific antibody constructs and compositions thereof
EP4083217A1 (en) * 2021-04-26 2022-11-02 Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas O.A., M.P. (CIEMAT) In vivo lentiviral gene therapy for the treatment of primary hyperoxaluria type 1
CN113234673A (zh) * 2021-05-14 2021-08-10 上海赛笠生物科技有限公司 一种优化的食蟹猴单个核细胞分离方法

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4868112A (en) 1985-04-12 1989-09-19 Genetics Institute, Inc. Novel procoagulant proteins
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
WO1987004187A1 (en) 1986-01-03 1987-07-16 Genetics Institute, Inc. METHOD FOR PRODUCING FACTOR VIII:c-TYPE PROTEINS
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5610278A (en) 1986-06-24 1997-03-11 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5171844A (en) 1987-06-12 1992-12-15 Gist-Brocades N.W. Proteins with factor viii activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
EP0461200B1 (en) 1989-02-21 1997-01-22 Washington University Modified forms of reproductive hormones
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
EP0918872B1 (en) 1996-08-02 2008-02-20 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
GB9621680D0 (en) 1996-10-17 1996-12-11 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral vectors
DE69703974T2 (de) 1996-10-17 2001-07-19 Oxford Biomedica Ltd Retrovirale vektoren
GB9622500D0 (en) 1996-10-29 1997-01-08 Oxford Biomedica Ltd Therapeutic gene
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
CA2225189C (en) 1997-03-06 2010-05-25 Queen's University At Kingston Canine factor viii gene, protein and methods of use
US6207455B1 (en) 1997-05-01 2001-03-27 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
JP4979851B2 (ja) 1999-04-29 2012-07-18 ジービーピー アイピー リミテッド ライアビリティ カンパニー 高いタイターで安全な組換えレンチウイルスベクターの作製方法
AU2001259063A1 (en) 2000-04-12 2001-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
DK1355919T3 (da) 2000-12-12 2011-03-14 Medimmune Llc Molekyler med længere halveringstider, sammensætninger og anvendelser deraf
JP4336771B2 (ja) 2001-03-09 2009-09-30 モルフォシス アーゲー 血清アルブミン結合部分
EP1395293B1 (en) 2001-05-14 2009-07-22 Gbp Ip, Llc Lentiviral vectors encoding clotting factors for gene therapy
KR101271635B1 (ko) 2001-12-21 2013-06-12 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 알부민 융합 단백질
EP1463751B1 (en) 2001-12-21 2013-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
AU2003209446B2 (en) 2002-03-01 2008-09-25 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
CN100343393C (zh) 2002-03-15 2007-10-17 布赖汉姆妇女医院 适合治疗剂全身性递送的中央气道给药
US6615782B1 (en) 2002-04-12 2003-09-09 Delphi Technologies, Inc. Two-step finger follower rocker arm
ATE536188T1 (de) 2002-08-14 2011-12-15 Macrogenics Inc Fcgammariib-spezifische antikörper und verfahren zur verwendung davon
DK2345671T3 (en) 2002-09-27 2016-02-15 Xencor Inc Optimized Fc variants and methods for their formation
AU2003286467B2 (en) 2002-10-15 2009-10-01 Abbvie Biotherapeutics Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
GB2395337B (en) 2002-11-14 2005-12-28 Gary Michael Wilson Warning Unit
WO2004063351A2 (en) 2003-01-09 2004-07-29 Macrogenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
ES2298745T3 (es) 2003-04-24 2008-05-16 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Promotores bidireccionales de sintesis y utilizacion de los mismos.
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
GB0325379D0 (en) * 2003-10-30 2003-12-03 Oxford Biomedica Ltd Vectors
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
BRPI0506771A (pt) 2004-01-12 2007-05-22 Applied Molecular Evolution anticorpo, e, composição farmacêutica
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
CN101987870B (zh) 2004-07-15 2013-07-03 赞科股份有限公司 优化的Fc变体
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
KR20130114758A (ko) 2005-05-27 2013-10-17 오스페달레 산 라파엘 에스.알.엘. Ｍｉ-ｒｎａ를 포함하는 유전자 벡터
JP2009504157A (ja) 2005-08-12 2009-02-05 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
US8048848B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Prolor Biotech Ltd. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
WO2008033413A2 (en) 2006-09-14 2008-03-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20080260738A1 (en) 2007-04-18 2008-10-23 Moore Margaret D Single chain fc, methods of making and methods of treatment
BRPI0811857A2 (pt) 2007-05-14 2014-10-21 Biogen Idec Inc Regiões fc (scfc) de cadeia simples, polipeptídeos de aglutinação que as compreendem e métodos relacionados.
SI2173890T1 (sl) 2007-06-21 2011-06-30 Univ Muenchen Tech Biološko aktivni proteini, ki imajo povečano in vivo in/ali in vitro stabilnost
WO2010055413A1 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Gene vector for inducing transgene-specific immune tolerance
MX362028B (es) 2009-02-03 2019-01-04 Amunix Pharmaceuticals Inc Polipeptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos.
US8680050B2 (en) 2009-02-03 2014-03-25 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same
US8703717B2 (en) 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
US9050269B2 (en) 2009-03-10 2015-06-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Protection of virus particles from phagocytosis by expression of CD47
BRPI1010873B1 (pt) 2009-04-30 2020-04-14 Fond Centro San Raffaele Del Monte Tabor usos de um vetor de genes, de uma composição farmacêutica e de uma célula
US20120134977A1 (en) 2009-06-01 2012-05-31 Yeda Research And Development Co. Ltd. Prodrugs containing albumin binding probe
MX354555B (es) 2009-06-08 2018-03-09 Amunix Operating Inc Polipeptidos de la hormona de crecimiento y metodos de preparacion y su uso.
ES2705249T3 (es) 2009-06-08 2019-03-22 Amunix Operating Inc Polipéptidos reguladores de glucosa y métodos para su producción y uso
GB0911870D0 (en) * 2009-07-08 2009-08-19 Ucl Business Plc Optimised coding sequence and promoter
AU2010290077C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
WO2011028344A2 (en) 2009-08-25 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same
MX2013000301A (es) 2010-07-09 2013-05-09 Biogen Idec Hemophilia Inc Factores quimericos de coagulacion.
BR112014017165B1 (pt) 2012-01-12 2023-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica compreendendo uma proteína de fator viii, composição farmacêutica, e seus usos
EP3549953A1 (en) 2012-02-15 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
ES2771208T3 (es) 2012-02-15 2020-07-06 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
ES2959747T3 (es) 2013-02-15 2024-02-28 Bioverativ Therapeutics Inc Gen del factor VIII optimizado
CN106456718A (zh) 2014-01-10 2017-02-22 比奥根Ma公司 因子viii嵌合蛋白及其用途
GB201412494D0 (en) * 2014-07-14 2014-08-27 Ospedale San Raffaele And Fond Telethon Vector production
LT3411478T (lt) * 2016-02-01 2022-09-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimizuoti viii faktoriaus genai

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019215063A1 (en) 2020-09-03
CO2020010376A2 (es) 2021-01-29
US20210038744A1 (en) 2021-02-11
BR112020015228A2 (pt) 2020-12-29
RU2020128705A (ru) 2022-03-01
CA3090136A1 (en) 2019-08-08
JP2023179463A (ja) 2023-12-19
EP3746136A1 (en) 2020-12-09
JP2021512126A (ja) 2021-05-13
IL276402A (en) 2020-09-30
CN111918674A (zh) 2020-11-10
KR20200118089A (ko) 2020-10-14
SG11202007114VA (en) 2020-08-28
MX2020008152A (es) 2020-11-24
WO2019152692A1 (en) 2019-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240124555A1 (en) Optimized factor viii genes
TW201946929A (zh) 表現因子ｖｉｉｉ之慢病毒載體之使用
US20210115425A1 (en) Optimized factor ix gene
US11787851B2 (en) Optimized factor VIII gene
TW202003554A (zh) 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
US20210113634A1 (en) Lentiviral vector formulations
JP2022514465A (ja) 第ｉｘ因子を発現するレンチウイルスベクターの使用
RU2803163C2 (ru) Применение лентивирусных векторов, экспрессирующих фактор viii