BRPI1010873B1 - usos de um vetor de genes, de uma composição farmacêutica e de uma célula - Google Patents

Abstract

usos de um vetor de genes, de uma composição farmacêutica e de uma célula a presente invenção se refere a vetor de genes para uso em terapia genética, compreendendo pelo menos um alvo de sequência mirna operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeos tendo um mirna correspondente em uma célula progenitora hematopoiética (hspc) ou célula-tronco hematopoiética (hsc), que impede ou reduz a expressão da sequência de nucleotídeos em uma hspc ou hsc, mas não em uma célula diferenciada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USOS DE UM VETOR DE GENES, DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E DE UMA CÉLULA.

Campo da Invenção [0001] A presente invenção se refere a vetores genéticos para uso em aplicações de transferência e terapia de genes, e a métodos de produzi-los, e uso dos mesmos.

Antecedentes da Invenção [0002] Transplante de células hematopoiéticas (HCT) de doadores normais é uma terapia curativa para várias doenças hereditárias e adquiridas. No entanto, o transplante é limitado pela baixa disponibilidade de doadores compatíveis e a mortalidade associada ao procedimento alogênico (principalmente relacionada à doença do enxerto versus hospedeiro - GVHD). HCT tem uma eficácia muito baixa em algumas doenças, como as doenças de armazenamento lisossômico (LSD). A fim de melhorar a segurança e a eficácia de transplantes alogênicos e identificar protocolos alternativos para os pacientes sem um doador compatível, uma abordagem de terapia genética baseada no transplante de gene corrigido, células-tronco hematopoiéticas autólogas (HSC) são necessárias.

[0003] Como uma alternativa a HCT alogênica um defeito genético herdado pode ser corrigido nas células hematopoiéticas do próprio paciente por terapia genética. No entanto, a entrega de uma cópia funcional do gene relevante em todas as células afetadas do corpo é difícil. O conceito de terapia genética de célula-tronco é baseado na modificação genética de um número relativamente pequeno de célulastronco, que continuam em longo prazo no corpo submetendo-se a divisões de autorrenovação, e geram um grande número de progênies geneticamente corrigidos, garantindo assim um fornecimento contínuo de células corrigidas para o resto da vida do paciente. Células-tronco

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2/97 hematopoiéticas (HSC) constituem uma população-alvo excelente para a terapia genética, uma vez que podem ser facilmente e com segurança obtidas da medula óssea (BM) ou do sangue periférico mobilizado. As HSC isoladas podem ser geneticamente modificadas e retornadas ao paciente como um transplante autólogo. Benefícios a longo prazo requerem o transplante de um número suficientemente elevado de HSC de gene modificado, que pode repovoar a BM condicionada, dando origem a células do sangue corrigidas de todas as linhagens hematopoiéticas. HSC autóloga alogênica torna o procedimento de transplante disponível para todos os pacientes e evita problemas de compatibilidade imunológica levando a GvHD. Além disso, algumas doenças como immunodeficiências primárias exigem a correção de uma fração da HSC e seus descendentes. A intensidade do regime de condicionamento (os chamados não mieloablativo ou regime de condicionamento mini) é reduzida o que resulta em melhor tolerabilidade e menos efeitos colaterais para o paciente. Um regime de condicionamento reduzido é menos compatível com um transplante alogênico padrão, porque quimerismo de doador misto é geralmente instável no cenário alogênico devido ao antagonismo imunológico com derivados da células hospedeiras do sistema imunológico.

[0004] Modificação genética eficiente a longo prazo da HSC e seus descendentes requer uma tecnologia que permite a integração estável do DNA no genoma corretivo, sem afetar a função das HSC. Os sistemas de transporte mais eficientes são vetores virais.

[0005] Por exemplo, a transferência de genes e expressão em células progenitoras hematopoiéticas (HSPC) da enzima galactocerebrosidase lisossômica (faltando em Leucodistrofia Globoides - GLD - ou doença de Krabbe) causa apoptose e prejuízo funcional das células transduzidas, impedindo o desenvolvimento de abordagens terapêuticas de terapia ganética baseada em HSPC para o

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3/97 tratamento da doença (veja abaixo). Assim, cassetes de expressão futuros usados para a terapia genética deve assemelhar-se a padrões de expressão fisiológicos e evitar a expressão do transgene ectópico e/ou não fisiológico, que pode resultar na eliminação de toxicidade, ou mesmo na transformação maligna das células transduzidas. Isto é particularmente importante para as células-tronco, o tipo de célula alvo chave garantindo a eficácia a longo prazo da terapia genética, cuja biologia não deve ser perturbada pela intervenção genética.

[0006] Para resumir, estratégias atuais de terapia genética hematopoiética exigem transdução da HSC para garantir correção do sistema hematopoético a longo prazo, mas se beneficiariam significativamente a partir de cassetes de expressão de transgene regulado que não ectopicamente expressa o produto do transgene em HSC, mas se liga somente na progênie diferenciada, que são o alvo da doença genética, por exemplo, linfócitos no SCID, granulócitos no CGD e monócitos/macrófagos em GLD.

[0007] Uma maneira de conseguir isso é o uso de elementos de controle transcricional specíficos de linhagem, por exemplo, o promotor endógeno do locus, para aionar a expressão do gene terapêutico no vetor. No entanto, os promotores são muitas vezes distribuídos por uma longa série de DNA e mal caracterizados, e não podem assim ser facilmente reconstituídos na sua totalidade, uma construção do vetor. Além disso, os níveis de expressão de promotores de tecido específico reconstituído em vetores de transferência de genes muitas vezes não são suficientes para alcançar a correção fenotípica, provavelmente por causa da reconstituição imperfeita e/ou influência prejudicial da cromatina no local de integração de vetor semialeatório. Assim, as estratégias adicionais para regular um transgene são genialmente necessária.

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Declarações da Invenção [0008] De acordo com um aspecto da presente invenção é provido um vetor de genes para uso em terapia genética, compreendendo pelo menos uma sequência alvo de miRNA operavelmente ligada a uma sequência de nucleotídeos tendo um miRNA correspondente em uma célula progenitora hematopoiética (HSPC), que impede ou reduz a expressão da sequência de nucleotídeos em uma HSPC, mas não em uma célula diferenciada.

[0009] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um vetor de genes para uso em terapia genética, compreendendo pelo menos uma sequência alvo de miRNA operavelmente ligada a uma sequência de nucleotídeos tendo um miRNA correspondente em uma célula-tronco hematopoiética (HSC), que impede ou reduz a expressão da sequência de nucleotídeos em uma HSC, mas não em uma célula diferenciada.

[00010] Em outras palavras, a presente invenção provê um vetor de genes adequado para uso em terapia genética hematopoiética compreendendo pelo menos uma sequência de miRNA alvo para um miRNA que está presente em uma quantidade efetiva em uma célula progenitora hematopoiética ou células-tronco hematopoiéticas e, opcionalmente, um transgene. Pela quantidade eficaz diz-se a concentração do miRNA endógeno é suficiente para reduzir ou impedir a expressão de um transgene que é operavelmente ligado à sequência de miRNA alvo correspondente. Assim, a presente invenção emprega o uso de miRNA que é fortemente expresso em células, como HSPC e HSC, mas não na progênie diferenciada de, por exemplo, uma linhagem mieloide e linfoide, prevenção ou redução da expressão de um transgene potencialmente tóxico nas populações de células-tronco sensíveis, enquanto mantém expressão e eficácia terapêutica na progênie doente.

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5/97 [00011] O miRNA é operavelmente ligado ao transgene. O termo operavelmente ligado significa que os componentes descritos estão em um relacionamento que lhes permitem funcionar na sua forma pretendida.

[00012] Uma célula-tronco é capaz de se diferenciar em vários tipos de células. Uma célula que é capaz de se diferenciar em todos os tipos de células é conhecida como totipotentes. Nos mamíferos, apenas o zigoto e as células embrionárias anteriores são totipotentes. As célulastronco são células encontradas na maioria, senão em todos, os organismos multicelulares. Eles são caracterizados pela capacidade de renovar-se através da divisão celular mitótica e se diferenciar em uma vasta gama de tipos de células especializadas. Os dois grandes tipos de células-tronco de mamíferos são: células-tronco embrionárias que são isoladas da massa celular interna de blastocistos, e as célulastronco adultas que são encontradas em tecidos adultos. Em um embrião em desenvolvimento, as células-tronco podem se diferenciar em todos os tecidos embrionários especializados. Em organismos adultos, células-tronco e células progenitoras atuam como um sistema de reparo para o corpo, repondo células especializadas, mas também mantêm o volume normal de órgãos regenerativos, como sangue, pele ou tecidos intestinais.

[00013] Células-tronco hematopoiéticas (HSCs) são células-tronco multipotentes que dão origem a todos os tipos de células sanguíneas, incluindo linhagens mieloides (monócitos e macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrócitos, megacariócitos/plaquetas, células dendríticas), e linfoides (células-T, células-B, células-NK).

[00014] Células progenitoras têm uma capacidade de se diferenciar em um tipo específico de célula. Em contraste com as células-tronco, no entanto, elas já são muito mais específicas: elas são empurradas para diferenciar-se em sua célula alvo. A diferença mais importante

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6/97 entre as células-tronco e células progenitoras é que as células-tronco podem se replicar indefinidamente, enquanto que as células progenitoras podem se dividir apenas em um número limitado de vezes. HSPC pode ser rigorosamente distinguida da HSC funcional apenas por ensaio in vivo, ou seja, transplante e demonstração de que elas podem dar origem a todas as linhagens sanguíneas em períodos de tempo prolongados. A detecção de marcadores de superfície celular, tais como c-Kit (CD117), Sca-1 e a ausência de/baixa expressão de um painel de marcadores de linhagem, combinado com um conjunto de moléculas recentemente descrito pertencente à família dos receptores SLAM (CD150 e CD48), pode enriquecer de subpopulações de HSC e HSPC, chegando a uma pureza de 50% quando analisadas contra o ensaios funcionais padrão (Kiel et al).

[00015] Uma célula diferenciada é uma célula que se tornou mais especializada, em comparação com as células-tronco ou células progenitoras. Diferenciação ocorre durante o desenvolvimento de um organismo multicelular conforme o organismo muda a partir de um único zigoto para um sistema complexo de tecidos e tipos celulares. Diferenciação é também um processo comum em adultos: as célulastronco adultas se dividem e criam células filhas totalmente diferenciadas durante a reparação tecidual e durante a renovação celular normal. Diferenciação muda drasticamente o tamanho de uma célula, forma, potencial de membrana, atividade metabólica e capacidade de resposta aos sinais. Essas mudanças são em grande parte devido a modificações altamente controladas na expressão gênica. Em outras palavras uma célula diferenciada é uma célula que tem estruturas específicas e executa certas funções devido a um processo de desenvolvimento que envolve a ativação e desativação de genes específicos. Aqui, uma célula diferenciada inclui células diferenciadas da linhagem hematopoiética, tais como monócitos, macrófagos, neutrófilos,

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7/97 basófilos, eosinófilos, eritrócitos, megacariócitos/plaquetas, células dendríticas, células T, células B e células NK. Por exemplo, células diferenciadas da linhagem hematopoiética podem ser distinguidas da HSC e HSPC pela detecção de moléculas da superfície celular que não são ou são menos expressas nas células indiferenciadas. Exemplos de marcadores de linhagem adequada tais como CD11b, Gr1, CD19, Ter119 e CD3.

[00016] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provido um vetor de genes para uso em terapia genética, compreendendo pelo menos uma sequência de miRNA alvo corresponde a um miRNA selecionado a partir do grupo compreendendo mir-130a, mir-126 e mir-223 operavelmente ligados a uma sequência de nucleotídeos.

[00017] Blocos alvo de miR-126 exepressam mais eficazmente na HSPC mais primitiva e (em humanos) na linhagem eritroide. miR-126 seria particularmente adequado para aplicações de terapia genética contando com a expressão do transgene robusta na linhagem mieloide e linfoide.

[00018] Blocos alvo de miR-130a expressam mais eficazmente na HSPC mais primitiva (semelhante ao miR-126), miR-130a seria mais particularmente adequado para aplicações de terapia genética contando com a expressão do transgene robusta na linhagem mieloide, linfoide e eritroide.

[00019] miR-126 pode ser mais forte do que miR-130a em células

CD34 humanas, mas também pode ter atividade não específica na progênie diferenciada. Um alvo de combinação compreendendo sequências de miR-130aT (de preferência 2 - 4 cópias) e metade de miR-126T (de preferência 2 cópias) maximiza a janela operacional determinada pela razão da repressão na HSPC e expressão na progênie mieloide. Além disso, ao usar o alvo de combinação, regulação

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8/97 descendente de transgene em HSPC é assegurada por dois miRNAs independentes, e o risco de interferir com a regulação de miRNA endógeno é reduzido, aumentando assim a segurança e eficácia da sequência alvo. Blocos alvo de miR-223 expressam mais eficaz em progenitores comprometidos com mieloide e pelo menos parcialmente na HSPC mais primitiva. Em desacordo com miR-126 e mir-130a, miR223 alvo completa e fortemente bloqueia expressão em células mieloides diferenciada, incluindo granulócitos, monócitos, macrófagos, células mieloides dendríticas. miR-223-alvo seria particularmente adequado para aplicações de terapia genética contando com a expressão do transgene robusta na linhagem de linfoide ou eritroide. miR-223 alvo pode bloquear expressão também muito eficazmente na HSC humana.

[00020] De preferência, os alvos de sequência de miRNA correspondem a miR-130a e mir-126.

[00021] Em uma modalidade, o vetor de gene compreende a sequência de nucleotídeos que controla a expressão do vetor. Em outras palavras, o microRNA endógeno impede a expressão ou a proliferação do vírus em certos tipos de células (HSC e HSPC), mas permite a expressão ou a proliferação em outros tipos celulares. Por exemplo, mir-126, miR-130a e mir-223 impedem a expressão de um vetor de genes ou vírus onclóitico em uma célula-tronco hematopoiética ou células progenitoras.

[00022] Em uma modalidade, o vetor de gene compreende a sequência de nucleotídeos que é um transgene.

[00023] Em uma outra modalidade, o vetor de transferência de gene está na forma de um vetor de transferência não viral de genes. Nesta modalidade, o vetor de transferência de genes pode incluir, ou estar em forma de, um vetor de expressão ou plasmídeo que compreende a sequência alvo de miRNA operacionalmente ligada a uma sequência de

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9/97 nucleotídeos.

[00024] Vetores de expressão como aqui descritos compreendem as regiões de ácido nucléico contendo sequências capazes de serem transcritas. Assim, as sequências que codificam mRNA, tRNA e rRNA estão incluídas nessa definição.

[00025] O vetor de gene ou vetor de transferência de gene da presente invenção pode ser utilizado para prover um transgene para um sítio ou célula de interesse. O vetor da presente invenção pode ser entregue a um sítio de destino por um vetor viral ou não viral.

[00026] Um vetor é uma ferramenta que permite ou facilita a transferência de uma entidade de um ambiente para outro. A título de exemplo, alguns vetores usados em técnicas de DNA recombinante permitem que entidades, tal como um segmento de DNA (tal como um segmento de DNA heterólogo, tal como um segmento de cDNA heterólogo), sejam transferidas para uma célula alvo. Opcionalmente, uma vez dentro da célula alvo, o vetor pode então servir para manter o DNA heterólogo dentro da célula ou pode atuar como uma unidade de replicação do DNA. Exemplos de vetores usados em técnicas de DNA recombinante incluem plasmídeos, cromossomos, cromossomos artificiais ou vírus.

[00027] Sistemas não virais de entrega incluem, mas não estão limitados a métodos de transfecção de DNA. Aqui, transfecção inclui um processo utilizando um vetor não viral para entregar um gene a uma célula alvo de mamíferos.

[00028] Métodos de transfecção típicos incluem eletroporação, biolística de DNA, transfecção mediada por lipídios, transfecção mediada por DNA compactado, lipossomas, imunolipossomas, lipofectina, catiônicos de agente mediado, catiônicos anfifílicos faciais (CFAs) (Nature Biotechnology 1996 14; 556), e suas combinações. [00029] Em uma modalidade o vetor de gene é um vetor viral.

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10/97 [00030] Sistemas de entrega viral incluem mas não estão limitados a vetor de adenovírus, um vetor viral adeno-associado (AAV), um vetor viral de herpes, vetor retroviral, vetor lentiviral, vetor baculoviral. Outros exemplos de vetores incluem sistemas ex vivo de entrega, que incluem mas não estão limitados aos métodos de transfecção de DNA, tais como eletroporação, Biolística de DNA, transfecção mediada por lipídeo, transfecção mediada por DNA compactado.

[00031] O termo partícula de vetor se refere ao vetor retroviral empacotado, que é de preferência capaz de se ligar e entrar nas células alvo. Os componentes da partícula, como já discutido para o vetor, podem ser modificados com relação ao retrovírus do tipo selvagem. Por exemplo, as proteínas Env no revestimento protéico das partículas podem ser geneticamente modificadas, a fim de alterar a sua especificidade alvo ou alcançar alguma outra função desejada.

[00032] De preferência, o vetor viral preferencialmente transduz um tipo de célula ou certos tipos de células.

[00033] Mais de preferência, o vetor viral é um vetor alvo, ou seja tem um tropismo tissular, que é alterado em comparação com o vírus nativo, de modo que o vetor é direcionado para as células particulares.

[00034] Em uma modalidade preferida, o vetor de gene é derivável de um lentivírus.

[00035] Em uma modalidade, o vetor de gene compreende um promotor de tecido específico. De preferência, o promotor de tecido específico é selecionado a partir do grupo compreendendo CD11b e cFes, e promotores derivados do citocromo b-245 de cadeia pesada (CYBB, gp91 phox) locus e TEK (Tie2). Promotor TEK (Tie2) pode ser combinado com a sequência alvo de miR-126, esta combinação permitiria a expressão do transgene específico em um subconjunto de células mieloides infiltrantes em tumor.

[00036] Em uma modalidade o vetor de gene compreende um

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11/97 transgene que codifica uma enzima. De preferência, a enzima é selecionada a partir do grupo de enzima galactocerebrosidase lisossomal e gp91 phox. De acordo com a presente invenção pode ser usada para entregar moléculas imunomoduladoras, tal como o interferon-alfa. Preferencialmente esses vetores entregam as moléculas imunomoduladoras em células tumorais em transplante de medula óssea. Preferencialmente esses vetores contêm o promotor Tie2 mais uma sequência de miR-126T.

[00037] Importante, o promotor Tie2 possui atividade em célulastronco hematopoiéticas, e moléculas imunomoduladoras tal como o interferon-alfa são conhecidas por serem tóxicas para HSC. Assim, o uso de miRTs de HSC-específica, conforme descrito neste pedido de patente torna-se obrigatório, em vez de uma opção, a fim de entregar especificamente moléculas bioativas por expressão de Tie2, macrófagos infiltrantes de tumor sem interferir com a função HSC. Dado que o promotor Tie2 é mais fraco na HSC que o promotor PGK que tem sido utilizado em todos os nossos estudos, espera-se que as sequências 126T/130aT evitem totalmente a toxicidade de transgenes expressos a partir do promotor Tie2 na HSC.

[00038] De acordo com outro aspecto da invenção é provido um conjunto de construtos de DNA para a produção de uma partícula de vetor viral compreendendo um Construto de DNA que codifica um genoma de vetor viral empacotado compreendendo pelo menos um alvo de sequência de miRNA de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um transgene. Por genoma do vetor empacotado diz-se o genoma do vetor está em um ambiente onde ele pode ser empacotado em uma partícula de vetor viral. Isso geralmente requer a aprsentação de Gag-Pol e Env.

[00039] De acordo com outro aspecto da invenção é provido um processo para preparar uma partícula de vetor viral que compreende a

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12/97 introdução do conjunto de construtos de DNA da presente invenção em uma célula hospedeira, e obter a partícula de vetor viral.

[00040] Em uma modalidade, a célula hospedeira compreende o miRNA correspondente.

[00041] De acordo com outro aspecto da invenção é provido uma partícula de vetor viral produzida pelo processo da presente invenção.

[00042] De acordo com outro aspecto da invenção é provida uma composição farmacêutica compreendendo o vetor de genes ou partícula de acordo com a presente invenção, juntamente com um diluente farmaceuticamente aceitável, excipiente ou veículo.

[00043] De acordo com outro aspecto da invenção é provida uma célula infectada ou transduzida com o vetor de genes ou partícula de acordo com a presente invenção. A célula pode ser transduzida ou infectada em um cenário in vivo ou in vitro. A célula pode ser derivada ou fazer parte de um animal, de preferência um mamífero, tal como um ser humano ou camundongo. Assim, será apreciado que a presente invenção é útil no provimento de animais transgênicos, por exemplo, para uso como modelos em doenças. Em uma modalidade, o mamífero é um mamífero não humano.

[00044] Em uma modalidade, a célula é uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética.

[00045] De acordo com outro aspecto da invenção é provida uma combinação de pelo menos duas sequência de miRNAs diferentes alvos correspondentes a miRNAs selecionados a partir do grupo compreendendo mir-130a, mir-126 e mir-223.

[00046] Em uma modalidade os alvos de sequência de miRNA são para uso simultâneo, separado ou sequencial.

[00047] De acordo com outro aspecto da invenção é provido um vetor de genes de acordo com a presente invenção, uma partícula de acordo com a presente invenção, uma composição farmacêutica de acordo com

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13/97 a presente invenção, uma célula de acordo com as reivindicações da presente invenção, ou uma combinação de acordo com a presente invenção para prevenir ou reduzir a expressão de um transgene em uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética. [00048] De acordo com outro aspecto da invenção é provido um vetor de genes de acordo com a presente invenção, uma partícula de acordo com a presente invenção, uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, uma célula de acordo com as reivindicações da presente invenção, ou uma combinação de acordo com a presente invenção para tratar uma doença selecionada a partir de de Leucodistrofia de Células Globoides, doença granulomatosa crônica e Imunodeficiência Combinada Grave (SCID).

[00049] De acordo com outro aspecto da invenção é provido um vetor de genes de acordo com a presente invenção, uma partícula de acordo com a presente invenção, uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, uma célula de acordo com as reivindicações da presente invenção, ou uma combinação de acordo com a presente invenção para aumentar as chances de sobrevivência de uma célulatronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética em relação à terapia genética.

[00050] As chances de sobrevivência de uma HSC ou HSPC podem ser aumentadas especificamente desobjetivando a expressão de genes dessas células. Em particular, desobjetivar expressão de transgenes que são tóxicos para HSC ou HSPC poderia ser benéfico para a sobrevivência dessas células. Além disso, desobjetivar expressão de transgenes que poderia provocar uma reação indesejada imune do hospedeiro poderia resultar em uma maior probabilidade de sobrevivência da célula.

[00051] De acordo com outro aspecto da invenção é provido um vetor de genes de acordo com a presente invenção, uma partícula de acordo

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14/97 com a presente invenção, uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, uma célula de acordo com as reivindicações da presente invenção, ou uma combinação de acordo com a presente invenção para aumentar a segurança e/ou eficácia da terapia genética. [00052] Um aumento na segurança da terapia de gene inclui a prevenção ou redução de expressão indesejada de transgenes ou expressão do vetor em certos tipos de células, tais como HSC e HSPC. Desobjetivar expressão de um transgene ou vetor de tipos de células específicas pode reduzir reação indesejada ou efeitos colaterais que podem acompanhar a terapia genética. Um aumento de eficácia da terapia genética que inclui aqueles transgenes que são mais efetivamente expressos nos tipos celulares desejados, tais como células hematopoiéticas diferenciadas, porque essas células são mais efetivamente geradas a partir de células indiferenciadas de genes modificados que são protegidas de toxicidade transgene e reações imunes indesejáveis pela sequência alvo de microRNA. Em particular, a terapia genética envolvendo o transplante de HSC ou HSPC pode ser mais segura e mais eficiente se expressão do transgene puder ser evitada até que as células se diferenciem.

[00053] De acordo com outro aspecto da invenção é provido um vetor de genes de acordo com a presente invenção, uma partícula de acordo com a presente invenção, uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, uma célula de acordo com as reivindicações da presente invenção, ou uma combinação de acordo com a presente invenção para evitar a apoptose de uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética, em que a apoptose é causada pela expressão do transgene.

[00054] De acordo com outro aspecto da invenção é provido um vetor de genes de acordo com a presente invenção, uma partícula de acordo com a presente invenção, uma composição farmacêutica de acordo com

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15/97 a presente invenção, uma célula de acordo com as reivindicações da presente invenção, ou uma combinação de acordo com a presente invenção para o monitoramento de um estágio de diferenciação de uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética. [00055] A presença de mir-126, mir-223 e miR-130a é indicativo de uma HSC ou HSPC. Mais especificamente mir-126 é indicativo de HSPC primitiva e, em humanos, também de células da linhagem eritroide. MiR-130a é um indicativo da HSPC mais primitiva. Mir-223 é indicativa de células progenitoras mieloides autorizadas e a HSPC mais primitiva. Mir-223 também é indicativo de diferenciação das células mieloides, incluindo granulócitos, monócitos, macrófagos e células dendríticas mieloides.

[00056] Em uma modalidade o vetor de gene é para uso em terapia de células hematopoiéticas. Terapia com células hematopoiéticas inclui o transplante de células-tronco hematopoiéticas.

[00057] De acordo com outro aspecto da invenção é provido um alvo de sequência de miRNA que corresponde a um miRNA selecionado a partir do grupo de mir-130a, mir-126 e mir-223 para uso em terapia genética.

[00058] De acordo com outro aspecto da invenção é provido um método de determinação do estágio de diferenciação de uma célulatronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética, que compreende determinar o nível de expressão de um miRNA na célula, onde o miRNA corresponde a uma sequência alvo de miRNA operavelmente ligada a uma sequência de nucleotídeos, onde o miRNA impede ou reduz a expressão da sequência de nucleotídeos em uma célula progenitora hematopoiética (HSPC) ou uma célula-tronco hematopoiética (HSC), mas não em uma célula diferenciada. Por exemplo, a expressão de miR-130a e mir-126 indica que a célula é uma HSPC ou HSC, enquanto expressão de miR-223 indica filiação à

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16/97 linhagem mieloide, ou seja, granulócitos e monócitos, incluindo seus precursores e derivados.

[00059] De acordo com outro aspecto da invenção é provido um método de determinação do estágio de diferenciação de uma célulatronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética, que compreende determinar o nível de expressão de pelo menos dois miRNAs diferentes na célula, onde os miRNAs correspondem a sequências alvo de miRNA operavelmente ligadas a sequências de nucleotídeos, onde os miRNAs prevenem ou reduzem a expressão das sequências de nucleotídeos em uma célula progenitora hematopoiética (HSPC) ou uma célula-tronco hematopoiética (HSC), mas não em uma célula diferenciada e comparam o nível de expressão dos miRNAs diferentes. Além disso, a expressão de dois microRNAs pode ser analisada simultânea e independentemente uma da outra usando um vetor bidirecional que expressa dois genes marcadores, cada um contendo uma sequência alvo de microRNA diferente. Por exemplo, os micro RNAs diferentes podem estar ligados ao marcador diferente, tal como marcadores fluorescentes. Cores diferentes indicariam diferentes misturas de expressão dos microRNAs que representam diferentes estágios de diferenciações (por exemplo, marcador verde + miR-126T, marcador vermelho + miR-223T. Se as células são vermelhas ou pretas: -> HSPC; se as células são amarelas:. -> linfócitos; se as células são verdes: células da linhagem mieloide diferenciadas).

[00060] De acordo com outro aspecto da invenção é provido um método de determinação do estágio de diferenciação de uma célulatronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética, que compreende determinar o nível de expressão de um transgene em células-tronco hematopoiéticas ou em células progenitoras hematopoiéticas, onde o transgene é operavelmente ligado a uma sequência de miRNA-alvo, através do qual o miRNA correspondente

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17/97 impede ou reduz a expressão do transgene em células progenitoras hematopoiéticas (HSPC) ou uma célula-tronco hematopoiética (HSC), mas não em uma célula diferenciada.

[00061] Além disso, os vetores repórteres para miRNAs selecionados a partir do grupo contendo miR-126, miR-130a e miR-223 podem ser aplicados para identificar células-tronco hematopoiéticas e/ou seus precursores imediatos em sistemas de cultura visando a obtenção de células da linhagem hematopoiética a partir de células pluripotentes induzidas (iPS) ou célulastronco embrionárias (ES) [00062] Em uma modalidade da presente invenção os miRNAs usados nos métodos da presente invenção compreendem o miRNA selecionado a partir do grupo compreendendo mir-130a, mir-126 e mir223.

Algumas Outras Vantagens Principais da Invenção [00063] A invenção ensina como vetores genéticos adequados para a terapia genética podem ser projetados para ser regulamentados por miRNAs endógenos para HSC e HSPC para controlar a expressão do transgene para alcançar perfis de expressão específica do vetor. A invenção provê ampla aplicação desses vetores como eles irão ajudar a prevenir a toxicidade do transgene em HSC e HSPC e assim facilitar o desenvolvimento de estratégias de terapia genética para o tratamento de várias doenças. Os vetores são particularmente adequados para terapias genéticas que envolvem a expressão de um transgene que é tóxico para a HSC ou HSPC.

[00064] Os inventores proveem um novo método para o perfil da atividade de miRNAs selecionados em vários subconjuntos de células hematopoiéticas incluindo populações raras de HSPC, acrescentando assim uma nova dimensão para abordagens de expressão de perfis de miRNA convencionais, que são amplas, mas limitadas a uma população em massa previamente purificada. Este método é baseado na

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18/97 transdução de HSPC com vetores repórteres de miRNA lentiviral, que servem como um indicador genético de vida para a atividade de um miRNA, facilmente quantificável ao nível de única célula e nas populações de múltiplas células em paralelo por citometria de fluxo. Usando essa abordagem, os inventores identificaram dois miRNAs que são altamente funcionais em camindongo e HSPC humanoa, incluindo subconjuntos enriquecidos com as células-tronco mais primitivas. Após a diferenciação, um miRNA é rapidamente regulado no nível inicial de células progenitoras, enquanto o outro é adicionalmente induzido durante granulo e monopoiesis, mas fortemente regulado em linfócitos e durante a diferenciação megacariócito/eritrócito.

[00065] Além disso, os inventores aplicaram um dos dois miRNAs altamente expressos em HSPC para superar um grande problema impedindo o tratamento eficaz de leucodistrofia Globoides (GLD) (uma doença de depósito lisossômico, devido à deficiente atividade da enzima lisossômica galactocerebrosidase - GALC) no modelo murino por terapia de gene de células-tronco hematopoiéticas baseadas em vetor lentiviral. Em contraste com outras enzimas lisossomais, transferência de genes GALC e expressão em HSPC causas apoptose e comprometimento funcional das células transduzidas devido a um desequilíbrio do conteúdo intracelular em esfingolipídeos bioativos consequente à expressão da enzima. Células diferenciadas das linhagens mieloide e linfoide não são afetadas pela expressão GALC, sugerindo uma sensibilidade única de HSPC à toxicidade da enzima. As sequências de miRNA responsivo usada para os vetores repórteres permitiu regular o perfil de expressão do transgene GALC terapeuticamente relevante, desobjetivar expressão do transgene a partir de células onde o miRNA cognato é expresso (HSPC), permitindo ao mesmo tempo expressão terapêutica integral na progênie diferenciada, que não é afetada pela toxicidade de expressão GALC. A

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HSPC transduzida com os vetores lentivirais GALC de miRNA regulado foi protegida contra a toxicidade da enzima e manteve sua função tanto in vitro como in vivo. Os resultados preliminares indicam a eficácia terapêutica desta abordagem em corrigir as manifestações da doença no modelo de camundongo.

[00066] De preferência, as sequências alvo de miRNA seguintes são empregadas para alcançar a expressão do transgene regulado no sistema hematopoiético humano: aplicações de terapia de gene que requerem expressão na linhagem mieloide (por exemplo, doença granulomatosa crônica, doenças de depósito lisossômico, como a doença de Krabbe, leucodistrofia metacromática, adrenoleucodistrofia, etc.): 126T/130aT (2 + 2 sequências alvo) - otimizado para a repressão máxima em HSPC; 126T (2 sequências alvo) - otimizado para a atividade de fundo mínima na progênie mieloide.

[00067] Aplicações de terapia de gene que requerem expressão na linhagem eritroide (ex.: talassemia, eficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase, doença falciforme): 130aT (4 sequências alvo), ou 223T (2 ou 4 sequências alvo). O último alvo pode apresentar alguma atividade (< 5x) em BFU-E e CFU-E mais primitivas.

[00068] Aplicações de terapia de gene que requerem expressão na linhagem linfoide (por exemplo, deficiência de RAG1/RAG2, deficiência de BTK, X-SCID, ADA-SCID): 223T (2 ou 4 sequências alvo), possivelmente em combinação com 126T/130aT (2 + 2 sequências alvo) ou 126T (2 sequências alvo).

[00069] Vetores, tal como viral incluindo vetores lentivirais, para a expressão do transgene para a transferência de gene e terapia podem ser projetados com sequência alvo de miRNAs, a fim de ser reconhecidos por célula miRNAs endógenas para HSC e HSPC, regulando assim a expressão do transgene em um subconjunto de células. Além disso, as combinações de sequências alvo miRNA podem

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20/97 ser usadas para obter vetores com padrões de expressão celular altamente específicos.

[00070] A prática da presente invenção irá empregar, a menos que de outra maneira indicado, técnicas convencionais de química, biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, que estão dentro das capacidades de um versado na técnica. Tais técnicas são explicadas na literatura. Ver, por exemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Labocamundongory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Labocamundongory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Labocamundongory Manual: Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Labocamundongory Press, ISBN 087969-544-7); Antibodies: A Labocamundongory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Labocamundongory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855. Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); and Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Labocamundongory, ISBN 0-87969-630-3. Cada um desses textos gerais está aqui incorporado para referência.

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Descrição das Figuras [00071] A presente invenção será descrita adiante, a título de exemplo apenas, com referência às modalidades preferidas da mesma, como ilustradas nos desenhos que acompanham, em que:

[00072] Figura 1: Representação esquemática do vetores repórteres bidirecionais lentivirais regulados por miRNA. Aqui mostradas são estruturas representativas dos vetores bidirecionais regulados por miRNA (Bd.LVs), contendo a proteína verde fluorescente (GFP) como o repórter de miRNA e uma forma truncada do receptor do fator de crescimento do nervo de afinidade loe humano (NGFR) como um normalizador constitutivamente expresso. Enquanto Bd.LV-ctr não contém qualquer sequência alvo de miRNA (miRT), Bd.LV-223T e 126TBd.LV foram construídos por meio da adição de 4 repetições em tandem contendo 21 bp perfeitamente complementares a miR-223 ou miR-126, respectivamente.

[00073] Figura 2: Avaliação de Bd.LVs repórter de miRNA em linhagens celulares. a) Análise quantitativa de miR-223 e níveis de expressão de miR-126 (cópias/pg) em células HEK293T, U937 e HEK293T que ectopicamente expressam miR-126 por transdução com uma LV contendo o pri-mir-126 sob o controle de um promotor onipresente (HEK293T.LV.miR-126). b) Análise representativa de FACS de células HEK-293T, U937, HUVEC e HEK293T.LV.miR-126, transduzidas com as Bd.LVs reguladas por miRNA indicado. As células são analisadas para repórter de miRNA de GFP e expressão noramlizada de NGFR. c) Fórmula para o cálculo de repressão de duplicaçao mediada por miRNA da expressão do gene repórter no nível de proteína e no nível do RNA. Histogramas mostram atividade miR-223 e miR-126 em linhagens de células calculadas como valores GFP FR no nível de proteína. Diamantes representam FR GFP no nível de ARN. [00074] Figura 3: Avaliação de BdLVs de repórter de miRNA in vivo.

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22/97 células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPC) da medula óssea (BM) Lineage^-/low, foram transduzidas com vetores repórter bidirecionais lentivirais de miRNA (BdLVs) para miR-223 e miR-126 e transplantadas em camundongos destinatário. Células do sangue periférico de camundongos estavelmente enxertados com células que carregam o repórter de miRNA foram analisadas por FACS. a) estratégia Gating usada para identificar a maior população de leucócitos do sangue periférico de camundongos: granulócitos (CD11b+, SSChigh), monócitos (CD11b+, SSClow), células B (CD19+) e células T (CD11bCD19b-). b) Análise representativa de FACS de GFP e expressão de NGFR dentro de subconjuntos de sangue periférico de murino. c) Valores de GFP FR (média +/- SD) em subpopulações de sangue periférico de camundongos transplantados com HSPC transduzida com Bd.LV-ctr (n = 5), Bd.LV-223T (n = 6) ou Bd.LV- 126T (n = 4).

[00075] Figura 4: (a) Células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPC) da medula óssea (BM) Lineage^-/low foram transduzidas com vetores repórter bidirecionais lentivirais de miRNA (BdLVs) e transplantadas em camundongos letalmente irradiados. BdLVs coexpressam um repórter de GFP desestabilizado (d4GFP) tornado responsivo a um miRNA específico por 4 repetições em tandem de uma sequência alvo de miRNA perfeitamente complementar (miRT), e um gene marcador truncado NGFR (ANGFR). Camundongos foram sacrificados 8 - 12 semanas após o transplante, e múltiplas subpopulações de HSPC BM foram identificadas prospectivamente por imunofenotipagem, como mostrado (HSC: células-tronco hematopoiéticas; MPP: progenitores multipotentes; GMLP: progenitores granulócitos - monócitos - linfócitos; GMP: progenitores granulócitos monócitos; eMEP: progenitores megacariócito - eritrócito; EP: precursores de eritrócitos). (b) esquemas de FACS representativos mostram expressão da BdLV de Controle (sem miRT ou 133aT, um

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23/97 miRT específico de músculo) e BdLVs repórter para miR-126 (126T), miR-130a (130aT), miR-196b (196bT), miR-10a (10AT), miR-223 (223T), miR-19a (19aT), miR-93 (93T), miR-17 5p (17T) e let-7a (Let7aT) em subpopulações HSPC recém-isoladas da BM de camundongos transplantados, como descrito em (a). Cada linhagem mostra um padrão representativo de expressão repórter do BdLV indicado na HSPC dos estágios de diferenciação acima mencionados. Gráficos de barra à direita de cada linhagem mostram a repressão de duplicaçao média (FR) ± calculada a partir de intensidades médias de fluorescência repórter (controle: n = 9; 126T: n = 10; 130aT: n = 4; 196bT: n = 4; 10aT: n = 4 exceto HSC e MPP1 onde n = 1, portanto, as estatísticas n/a; 223T: n = 6, daquelas 5 com um repórter de eGFP; 19aT: n = 3; 93T: n = 2; 17T: n = 3; let7aT: n = 1 grupo de 3 camundongos). Comparações estatísticas de atividade de miRNA entre as subpopulações HSPC foram feitas por uma maneira de correção de pós-teste Anova e Bonferroni, usando EPs de cada grupo de BdLV repórter como referência (***: p <0,001; **: 0,01> p> 0,001; *: p <0,05). [00076] Figura 5: (a) a atividade hematopoiética de 8 miRNAs como medido pela repressão de duplicação média (FR) de BdLVs repórter indicado em várias populações de células isoladas de camundongos transplantados. Subconjuntos de BM Lineage^-: como descrito na Fig4; subconjuntos BM Lineage⁺: Pro B: CD19⁺ CD43⁺; CD43^-B: CD19⁺ CD43 , T Ly: CD3⁺; Mono: CD11b⁺ CD48⁺; Granu: CD11b⁺ CD48^lQ; sangue periférico: Granu: CD11b⁺ lado scatter^hi; Mono: CD11b⁺ lado scatter^; B Ly: CD19⁺; T Ly: CD3⁺. (b) Uma sequência alvo de combinação contendo 4 cópias de miR-130aT e 2 cópias de miR-126T (130a/126T; n = 4 camundongos) foi comparada com as mesmas 4 cópias de miR126T (126T; n = 10 camundongos) ou 4 cópias de miR-130aT (130aT; n = 4 camundongos). As barras mostram a repressão de duplicação ± sem obtida por essa sequência miRT em populações de medula óssea

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24/97 negativas de marcador Lineage (legenda como na Fig.4) e em leucócitos do sangue periférico. Note que o 130a/126T consegue uma melhor repressão em HSC do que 126T sozinho, enquanto a repressão de fundo em leucócitos PB é reduzida.

[00077] Figura 6: Regulação da expressão de um gene suicida por sequências alvo miRNA. (a) Sequências miRT perfeitamente complementares a miR-142, miR-223, miR-126, miR-130a ou foram adicionadas a uma transcrição timidina quinase desestabilizada (DTK). Vetores suicidas lentivirais monodirecionais (metade direita de cada desenho vetorial) foram utilizados para (b), enquanto vetores suicidas bidirecionais acoplando um marcador GFP ao TK regulado por miRNA, ou um marcador NGFR para o TK de controle foram utilizados em (c).

(b) HSPC Lineage-/low foi transduzida com os vetores lentivirais indicados, e laminados a +/- ganciclovir (GCV) em meio semissólido (LV-GFP: n = 2; CTRL-TK: n = 8; TK-142T: n = 4; TK-223T: n = 6; TK126T: n = 4; TK-130aT: n = 2). Depois 10d, o número de colônias mieloide (CFU-GM, CFU-G, CFU-GM) e eritroide (BFU-E, CFU-E) foi contado. Esquema de caixa e bigodes mostram o número de colônias nas culturas contendo GCV dividido pela contagem de colônias em culturas de controle respectivas sem GCV (10°-90° percentil). Pontuações de dados sem GCV mostram a variabilidade de laminação (contagem de colônia de cada cultura tratada sem GCV dividido pelo número de colônias média de todas as culturas tratadas som GCV; n = 26). Comparações estatísticas foram feitas contra o GCV-tratados, grupo LV-GFP; ns não significativamente diferente; **, 0,001 <p <0,01: ***, p <0,001. (c) HSPC Lineage-/low a partir de camundongos CD45.1 + foram transduzidas ou com um vetor TK de controle (NGFR marcado) ou um vetor TK regulado por miRNA (GFP-marcado; Exp # 1: TK. 126T; Exp # 2: TK.142T). LV.NGFR/TK de controle e células transduzidas LV.GFP/TK-miRT- foram misturados na proporção de 1:1 e

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25/97 transplantados em camundongos CD45.2+ congênicos que foram tratados com GCV (Exp # 1: n = 6 camundongos; Exp # 2: n = 5 camundongos) por 7 - 14d a partir do dia 3 após o transplante, ou não tratados (Exp # 1: n = 4; Exp # 2: n = 3). Esquemas representativos de FACS mostram quimerismo GFP/NGFR dentro de células CD45.1+ do doador. Os gráficos mostram a fração de células que expressam GFP dentro de células derivadas de doador, transduzidas no sangue para camundongos GCV tratados (vermelhos) e não tratados (pretos), para cada tipo de célula sanguínea ao longo de um período de tempo de 7 8 meses. Note-se que significativamente mais células são GFP+ no grupo GCV (***: p <0,001, 2-way Anova), indicando proteção contra vantagem seletiva e suicida de HSC transduzida por GFP/TK.126T ou GFP/TK.142T. Assim, a sequência de miR-126T adicionada a um transgene supera toxicidade HSPC decorrente de transgenes altamente tóxicos, mesmo quando expressa dos promotores onipresentes, carregando um potencial significativo para melhorar a segurança e a eficácia da terapia genétca baseada em HSPC. Além disso, estes resultados provam formalmente que miR-126 está ativo em longo prazo enxertando células-tronco hematopoiéticas, como demonstrado por um ensaio de repovoamento funcional.

[00078] Figura 7: (a) Para lidar com a segurança da exploração de regulação de miR-126 para a terapia genética, uma linhagem de camundongo transgênico contendo um repórter miR-126 (Tg.126T) foi criado por microinjeção do LV ilustrado no espaço perivitelino de zigotos. Análise de FACS da medula óssea de camundongos transgênicos jovens, adultos demonstraram que a expressão GFP foi menor em células marcador- Kit+ Sca+ Lineage (KSL) (gráfico azul no histograma), enquanto expressão GFP ligada em progenitores Kit + Sca-Lin- (gráfico preto e vermelho no histograma). GFP MFI de camundongos Tg.126T e camundongos de controle GFP transgênicos

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26/97 foi medida para calcular o FR do repórter miR-126 nas subpopulações HSPC indicadas (média ± sem = 10 camundongos Tg.126T; ***: p <0,001; **: 0,01 > p> 0,001, em comparação com EP). (b) Considerandose que os camundongos com dois alelos knockout para miR-126 manifestaram letalidade significativa embrionária devido a defeitos angiogênico, criação de nossa colônia Tg.126T resultou do tamanho da ninhada normal e uma distribuição de número de cópias do vetor esperada (VCN) na prole refletindo uma das gerações de pais, sugerindo que a expressão moderada de sequências miR-126T a partir de um promotor PGK não interfere com a regulação de alvos miR-126 naturais durante o desenvolvimento. (c) Células BM a partir de camundongos CD45.2+ Tg126T e camundongos CD45.1 + tipo selvagem (WT) foram enriquecidas com HSPC por seleção positiva para CD117 e competitivamente transplantada (1:1) em CD45.2+ letalmente irradiados destinatários (n = 4). Camundongos transplantados foram sangrados em intervalos regulares, e quimerismo CD45.1/CD45.2 foi determinado nas várias linhagens de células do sangue periférico (Granu: CD11 b+ lado scatter^hi; Mono: CD11b+ lado scatter^low; células B: CD19 +; células T: CD3 +). Estes dados indicam que há uma janela terapêutica para a segurança confortável explorando regulaçao de miR126 regulamento.

[00079] Figura 8: (A) HSPC CD34+ foram purificadas do sangue da medula humana (CB) e transduzida com o BdLV de controle (Controle) ou BdLVs repórter de miRNA de miR-126 (126T), miR-130a (130aT) ou miR223 (223T) (n = 3 replicações biológicas por grupo). As células foram mantidas em cultura líquida em condições suportando a manutenção de curto prazo de HSPC, e Expressão do marcador BdLV foi medida 2 dias após a transdução de HSPC CD34+ CD38- progenitores CD34+ e CD38+ (2 primeiras colunas à esquerda). As células foram, então, diferenciadas, em cultura de líquido durante 6 dias (células CD34-CD38+; coluna do meio), ou

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27/97 em meio semissólido por 16 dias (células mieloides CD13 +, células CD235 + eritroide). Esquemas representativos de FACS são mostrados. Gráficos de barras na parte inferior da mostram quantificação de atividade miR-126, miR130a e miR-223 nas subpopulações respectivas (n = 3; repressão de duplicação média+/- SEM; **, 0,001 <p <0,01: ***, p <0,001). (B) células CD34+ do sangue do cordão umbilical foram transduzidas com controle ou vetores suicidas bidirecionais regulados por miRNA contendo sequências alvo miRNA de miR-223 (TK-223T) ou miR-126 (TK-126T, vide também Figura 2), e banhados em ensaios CFC em quatro vias, seja na presença ou ausência do GCV pró-fármacos. O número de eritroide GFP+ (CFU-E, BFUE) ou colônias mieloide (CFU-G, CFU-M, CFU-GM) foi contado 14 dias após o plaqueamento, e normalizado para o número contado na cultura sem GCV'. Esquemas de caixa e bigode mostram 10° ao 90° percentil. GCV impediu completamente o crescimento de colônias transduzidas CTR-TK. (C) Combinações de sequências miR-126T e miR-130aT (4 + 4 e 2 + 2 repetições em tandem, respectivamente), bem como duas repetições em tandem de miR-126T sozinho foram comparados com o projeto miRT padrão, utilizando quatro repetições em tandem de miR-126T ou miR-130aT, respectivamente. Células sanguíneas humanas da medula foram transduzidas com os respectivos BdLVs repórter, e repressão de duplicaçao do repórter foi determinada no compartimento progenitoras estaminal/primitivas (CD34+ CD38-) e do compartimento progenitoras (CD34+ CD38+) dois dias de pós transdução, bem como na progênie mieloide (CD13 +) e descendentes eritroide (CD235 +) 10-14 dias pós transdução. 126T (4 alvos), 126T/130aT (4 + 4 metas) e 126T/130aT (2 + 2 alvos) suprimir igualmente bem no compartimento estaminal/progenitor. No entanto, 126T/130aT (4 + 4 alvos) tem uma maior atividade de fundo supressiva na progênie mieloide. (D) a atividade de supressão de 126T (4 alvos), 126T/130aT (2 + 2 alvos) e 126T (2 alvos) no compartimento primitivo (como em C), e no final dos estágios de diferenciação mieloide (mielócitos:

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CD11b+/CD16-; metamielócitos: CD11b+/CD16+/SSClow; granulócitos: CD11b+/CD16+/SSChigh) sobre G-CSF induzida na diferenciação in vitro. Os estágios de diferenciação foram verificados em amostras de citospina manchadas conm May-Grunwald/Giemsa a partir da cultura. O índice de regulação (gráfico à direita) é calculado dividindo-se a repressão de duplicação do respectivo miRT do compartimento multipotente/estaminal CD34+/CD38- pela repressão de duplicação nos metamielócitos. A melhor liberação de expressão do transgene na progênie mieloide é obtido pela 126T (2 alvos), enquanto a supressão no compartimento haste/progenitor é similar ao 130aT (4 alvos) - um pouco menos em relação ao 126T (4 alvos) e 126T/130aT (2 + 2 alvos). Quanto a estas últimas duas sequências alvo, 126T/130aT (2 + 2 alvos) é preferível 126T (4 alvos), pois oferece o índice de maior regulamentação. Além disso, regulação de transgene é assegurada por dois miRNAs independentes, e o risco de interferir com a regulação miRNA endógena é ainda mais reduzido, aumentando assim a segurança e eficácia do miRT.

[00080] Figura 9: Sobre-expressão de enzima lisossômica em HSPC. Nível de expressão enzimática, normalizado para o tipo selvagem, em mHSPC (A) e hHSPC (B) sobre transdução de LV. Expressão GALC foi significativamente menor em comparação com ARSA e IDUA.

[00081] Figura 10: O mau funcionamento de HSPC de murino sobre expressão GALC mediada por LV. (A) ensaio CFC sobre mHSPC transduzida com GALC e LV controle. O número (#) de colônias/placa (eixo Y à esquerda, colunas) foi contado e o número de cópias/célula LV integradas (VCN) (eixo Y direita, pontos) foi medido. GALC.LV transduzido por -/- mHSPC (n = 12 experimentos independentes) produziu um número significativamente menor de colônias, em comparação para células transduzidas GFP.LV (n = 10) e ARSA.LV (n = 8). Este comprometimento não foi observado quando foram mHSPC transduzidas com o GALC.LV mirl42T (n = 6). * P <OOO1 em one-Way

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Anova para tanto o número de colônias/placa e VCN. Os valores médios ± DP são mostrados. Resultados similares foram obtidos com -/- e +/+ mHSPC. (B) atividade GALC medida em mHSPC transduzidas. Depois de transdução GALC.LV GALC -/- (doravante -/-) (n = 5) e GALC +/+ (doravante +/+) (n = 5) mHSPC mostrou um aumento de 2 vezes na atividade GALC acima dos níveis de tipo selvagem (+/+ mHSPC transduzidas com GFP.LV, n = 5). Nenhum aumento na atividade foi detectado em mHSPC transduzida com uma GALC.LV regulada por mirl42 (mirl42T) (n = 3).

[00082] Figura 11: O mau funcionamento da HSPC de humano sobre Expressão GALC mediada por LV. (A) Ensaio CFC sobre hHSPC transduzida com GALC e LV controle. O número (#) de colônias/placa (eixo Y à esquerda, colunas) foi contado e o número de cópias LV integradas/ célula (VCN) (eixo Y direita, pontos) foi medido. GALC.LV transduzida n.d. (n = 4) e HHSPC GLD (n = 4) mostrou uma piora significativa na formação de colônias em relação às células de controle (n = 5), que não foi observado após transdução de GALC.LV mirl42T (n = 4). Colônias obtidas a partir de hHSPC transduzidas por GALC.LV mostrou um conteúdo de vetor significativamente mais baixo, quando comparado aos controles GFP/ARSA/GALCmir142T.LV. * P <0,001 no One-Way Anova para ambos o número de colônias/placa e VCN. Os valores médios ± DP são mostrados. (B) atividade GALC medida em hHSPC transduzida. Transdução GALC.LV permitiu a reconstituição da atividade GALC em níveis n.d. em HHSPC GLD (n = 3), enquanto transdução de n.d. hHSPC (n = 4 para n = CB e 3 para BM) levou a sobre-expressão da enzima acima de níveis de GFP.LV transduzidos (n = 3). Nenhum aumento na atividade foi detectado em hHSPC transduzida com um GALC.LV regulado por mirl42 (mirl42T) (n = 3).

[00083] Figura 12: Sobrevida de camundongos twi em HSCT. (A) Representação esquemática de GFP.LV e GALC.LV. (B) A média de

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30/97 sobrevida de camundongos twi recebendo HSCT. Camundongos Twi transplantados com BM total (TBM) (n = 12) ou com GFP.LV transduzido + 1 + mHSPC e progenitores scal não traduzidos (GFP.LV + 1 + Lin- & +1 + scal-, n = 7) ou com GFP.LV transduzido +1 + mHSPC e Progenitores scal traduzidos por GFP.LV (GFP.LV +1 + Lin- & GFP.LV +1+ Scal, n = 5) alcançaram maior sobrevida em relação aos controles não tratados (UT) (n = 10). Camundongos que receberam -I-mHSPC traduzido por GALC.LV e +1 + progenitores Scal- (n = 7) mostraram uma vida útil significativamente maior em relação a TBM ou +1 + Lin- & camundongos transplantados Scal. Pelo contrário, o transplante com -ILin-&-I-scal traduzido por GALC.LV (n = 13) não resultou em uma vida útil prolongada. Grupos de controle: camundongos transplantados com GFP.LV transduzido 1 + HSPC (1 + Lin-) (n = 10); camundongos transplantados com GFP.LV transduzido + 1 + progenitores Scal- (n = 8). * P < O. O1 em um teste-Way Anova. (C) Esquema representativo mostrando o percentual de células GFP+ enxertadas no sangue periférico de um camundongo twi transplantado com GFP.LV transduzido 1 + mHSPC e progenitores Scal-. Figura 13. Prejudicada em função de mHSPC vivo em FVB/twi camundongos. A média de sobrevivência dos camundongos que receberam mTransplante de HSPC, conforme indicado. -/- Camundongos transplantados com GFP.LV transduzido +/+ mHSPC (n = 11) alcançaram maior sobrevida em relação aos controles não tratados (UT), ao contrário, -/- (n = 9) e +/(°) (n = 5) camundongos transplantados com GALC.LV transduzidas -/mHSPC não sobreviveu após a irradiação letal. Tabela 2. Significa VCN SD detectado na BM de -/- ou +/- camundongos transplantados com o mHSPC listado (transduzido com GALC.LV ou GFP.LV) em 20 e 120 dias após o transplante (n = 3 ponto no tempo). (°)+/- Hospedeiro. (§) Resultados similares foram obtidos usando +/+ mHSPC.

[00084] Figura 14: Apoptose de GALC expressando HSPC murina e

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31/97 humana. (A-B) ensaio de TUNEL em -/- mHSPC (esquerda) e hHSPC (direita) (de n.d. e CB BM GLD) aos 2 e 5 dias após a transferência de genes. % de núcleos TUNEL + sobre o número total de células nucleadas é relatado. 8 campos e 100 células foram condição contada. Resultados similares foram obtidos usando +/+ mHSPC. (A) A grande maioria do GALC.LV transduzido m- e hHSPC TUNEL foram positivos, tanto aos 2 quanto aos 5 dias após a transdução. (B) ensaio TUNEL (vermelho) e coloração ToPro (TPIII, azul) para núcleos de m- e hHSPC aos 2 e (mHSPC) dias após transdução com o LV indicado: imagens representativas (imagens foram obtidas por microscópio confocal de três lasers - Radição 2100, BioRad; sinais fluorescentes de única seções óptica foram sequencialmente adquiridos e analisados pelo software Adobe Photoshop CS; aumento de 100x). (C) análise Citofluorimétrica de colocração anexina V em m- (painéis superiores) (de -/- camundongos doador) e hHSPC (painéis inferiores) (de n.d. CB). A fração de células apoptóticas é maior entre mHSPC e hHSPC transduzidas por GALC.LV em comparação com controles traduzidos por GFP. CMT = controle positivo tratado com Camptotecina. Aquisição foi realizada com FACS Calibur 2, Beckton Dickinson. Pelo menos 10.000 eventos foram marcados e os dados foram processados pelo programa FlowJo 8.5.3. Dados de -/- mHSPC e n.d. CB (e GLD BM para TUNEL) são mostrados, mas resultados similares foram obtidos na sequência de transdução GALC de +/+ mHSPC em comparação com /- células e em n.d. BM (TUNEL e Anexina V) e GLD BM (anexina V) hHSPC em comparação com células CB.

[00085] Figura 15: Tratamento com IGF1 impede a apoptose de GALC expressando HSPC. (A) Ensaio CFC sobre GALC.LV e ARSA.LV mHSPC transduzida tratados ou não com IGF 1. O número (#) de colônias/placa (eixo Y à esquerda, bares) foi contado e o número de cópias de vetor integrados lentivirais/célula (VCN) (eixo Y direita,

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32/97 pontos) foi medido. crescimento induzido por tratamento com IGF 1 de um número maior de colônia, em comparação com células tansduzidas com GALC.LV não tratadas (n = 4 experimentos independentes). Após tratamento com anti-apoptóticos, VCN de Células transduzidas por GALC.LV que se aproximou de Células transduzidas por ARSA.LV controle (para tanto o número de CFC e VCN One-Way Anova: * = p <0,001 para a comparação a MHSPC transduzida com GALC tratado com células transduzidas por GALC.LV não tratado; p> 0,05 para a comparação de MHSPC transduzida com GALC.LV tratado com células transduzidas por ARSA.LV). (B) As colônias cultivadas a partir de mHSPC tratada também mostrou um aumento no tamanho (fotos à direita, ampliação de 5x). (C) ensaio de TUNEL em mHSPC transduzidas com GALC.LV e ARSA.LV tratados ou não com campos IGF1. 8 e 100 células foram condição contada. A grande maioria das células tratadas foi negativa para TUNEL (One-Way Anova: p <0,001 para a comparação com células transduzidas por GALC.LV não tratado; p> 0,05 para a comparação com células transduzidas por ARSA.LV). (D) atividade GALC medida em mHSPC transduzida de -/- ou +/+ camundongos. tratamento com IGF1 não afetou significativamente os níveis de expressão GALC (n = 3) quando comparado com controles transduzidos não tratados (n = 6). Os valores médios de SD são mostrados.

[00086] Figura 16: Análise de ativação de catepsina D de células transduzidas. Analise de Western Blot para catepsina D em GFP.LV ou GALC.LV traduziiu mHSPC e células U937 em diferentes intervalos após a transferência de genes, como indicado. Forma ativada corresponde a isoforma ligada à membrana 30kDa, como indicado pela seta. Nenhuma acumulação significativa da forma ativa da catepsina D foi observada em Células transduzidas por GALC.LV após a transferência de genes, em comparação com Células transduzidas por

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GFP.LV. O precursor (48kDa, seta) acumulado nas Células transduzidas por GFP após 7 dias de cultura (GFP 7d), enquanto a sua acumulação foi menos pronunciada na presença de GALC (GALC 5d), culminando com o desaparecimento de ambos precursor e formas maduras após 7 dias. Uma antiactina foi utilizada como controle para o carregamento de proteína.

[00087] Figura 17: Atividade GALC basal em diferentes tipos celulares. Atividade GALC basal normalizada ao nível mHSPC do tipo selvagem. Oligodendrócitos tipo selvagem primários (n = 4) e microglia (n = 4) mostraram uma maior atividade GALC em comparação com mHSPC.

[00088] Figura 18: Sensibilidade à expressão de GALC novo em células mieloides. Resultados de ensaio TUNEL (% TUNEL + células sobre o total de células nucleadas, em Y esquerda, barra), determinação da atividade GALC (no eixo Y direita, pontos) e, quando possível, colorações dedicadas, realizadas em (A) monócitos humanos, (B) linhagem celular monocítica humana U(C) macrófagos murinos e D) microglia de murino, cinco dias após a transdução. Em todas as condições testadas, coloração TUNEL demonstrou a ocorrência de menor/nenhuma apoptose (> 6 campos e > 250 células foram contadas por condição), apesar de transdução eficiente (avaliada pela coloração anti-HA em macrófagos em (C)) e expressão GALC sustentada acima dos níveis basais de todas as outras amostras (células transduzidas por ARSA.LV ou GFP.LV), foram obtidas. Os valores médios ± DP são mostrados. Imagens (C e D) Imagens representativas de ensaio TUNEL em macrofagos trnasduzidos por GALC/GALC-HA.LV ou GFP.LV (C) e microglia (D). Imagens foram obtidas por microscópio confocal de três lasers (Radiação 2100, BioRad). Sinais fluorescentes de única seção óptica foram sequencialmente adquiridos e analisados pelo software Adobe Photoshop CS. Ampliação: 80x em C, Loox em D.

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34/97 [00089] Figura 19: Sensibilidade à expressão GALC de novo em linfócitos. Resultados de ensaio de TUNEL (% TUNEL + células sobre o total de células nucleadas, em Y esquerda, barra), determinação da atividade GALC (no eixo Y direita, pontos), realizado em linfócitos T e B, cinco dias após a transdução. Coloração TUNEL demonstrou a ocorrência de menor/nenhuma apoptose (> 6 campos e > 250 células foram contadas por condição), apesar de transdução eficiente (vide a expressão GALC sustentada acima dos níveis basais). Os valores médios ± DP são mostrados.

[00090] Figura 20: Sensibilidade à expressão GALC de novo em oligodendrócitos. (A) ensaio TUNEL (% TUNEL + células sobre o total de células nucleadas, em Y esquerda, barra), determinação da atividade GALC (no eixo Y direita, pontos), realizada cinco dias após a transdução. Coloração TUNEL demonstrou a ocorrência de menor/nenhuma apoptose (> 6 campos e > 250 células foram contadas por condição), apesar de transdução eficiente (vide a expressão GALC sustentada acima dos níveis basais). Os valores médios ± DP são mostrados. (B) Imagens representativas do ensaio TUNEL sobre oligodendrócitos transduzidos por GALC.LV ou GFP.LV. A pureza da preparação de oligodendrócitos foi verificada por NG2 e coloração Gal Cer- de células não transduzidas (UT), enquanto microglia foi corada com F4/80 em células transduzidas por GALC.LV; ToPro (TPIII) foi usado para manchar núcleos. Imagens foram obtidas por microscópio confocal de três lasers (Radiação 2100, BioRad). Sinais fluorescentes de única seção óptica foram sequencialmente adquiridos e analisados pelo software Adobe Photoshop CS. Ampliação: 40x.

[00091] Figura 21: Regulação da expressão GALC por miRNA 126. (A) Representação esquemática de GALC.miRNAl26Tag.LV. (B-C) ensaio de atividade GALC e ensaio CFC realizado em -I- mHSPC transduzida com GALC.miRNAl26Tag.LV (GALC.l26miT) ou com

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GALC.LV ou GFP.miRNAl26Tag.LV. (B) A atividade foi normalizada com uma relação a +1+ níveis (primeiro coluna). Células transduzidas com GALC.miRNAl26Tag.LV sobre-expressam GALC em níveis suprafisiológicos. (C) O número (#) de colônias/placa (eixo Y à esquerda, barra) foi contado e o número de cópias de vetroes lentivirais integrados/célula (VCN) (eixo Y direita, pontos) foi medido. Repressão de expressão GALC por crescimento permitido por miRNA126 de um número maior de colônia, em comparação com células transduzidas por GALC.LV (n = 4 experimentos independentes). * P <0.0l, um teste-Way Anova.

[00092] Figura 22: Regulação de miRNA126 de expressão GALC impede a apoptose de mHSPC. (A) ensaio de TUNEL em GALC.miRNAl26Tag.LV ou GALC.LV e mHSPC transduzida por GFP.miRNAl26Tag.LV-. > 8 campos e > 100 células foram contadas por condição. A grande maioria das células transduzidas por GALC.miRNAl26Tag.LV foi negativa para TUNIEL. (B) Ensaio TUNEL (vermelho) e coloração ToPro (TPIII, azul) de núcleos GALC.miRNAl26Tag.LV ou mHSPC transduzida por GALC.LV -/ - 5 dias após a transdução: imagens representativas (imagens foram obtidas por microscópio confocal de três laser - Radiação 2100, BioRad; sinais fluorescentes de única seção óptica foram sequencialmente adquiridos e analisados pelo software Adobe Photoshop CS; aumento 40x).

[00093] Figura 23: Toxicidade de expressão GALC de novo em HSPC e salvamento por regulação de miR-126. Os LVs indicados (A) foram utilizados para transduzir HSPC murina e humana obtida a partir de Galc-/ - (-/-) e camundongos do tipo selvagem (+/+), bem como sangue do cordão umbilical (CB) e da medula óssea (BM) de dadores saudáveis, respectivamente. Atividade GALC (B) e número de cópia de vetores (VCN) (C) foram medidos na progênie de cultura in vitro do murino transduzido (painéis superiores) e HSPC de humano (painéis de

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36/97 fundo) (dados agrupados de -/- e +/+ HSPC são mostrados no painel superior). (D) O número (#) das colônias recuperadas de ensaios clonogênicos (CFC) realizados no final de transdução com o LV indicado na HSPC de murino -/- (painel superior) e humanas (painel inferior) é relatado. (E) ensaio de TUNEL foi realizado dois dias após transdução com o LV indicado na HSPC de murino -/- (painel superior) e células CD34+ de CB e BM de doadores normais (painel inferior). A frequência de apoptose entre as células transduzidas foi avaliada (% TUNEL + células). Cada ponto representa uma amostra individual (B-E). Em E, > 8 campos e > 100 células foram contadas para cada amostra. *: P <0,05 **: p <0,01; ***: p <0,001. (F) Representante coloração TUNEL em GFP LV e LV-GALC transduzidas HSPC é mostrado. Aumento de 100X.

[00094] Figura 24: Melhora da sobrevida de camundongos GLD após a terapia genética de HSC. HSPC de Galc-/ - ou +/+ murino foi transduzida com os vetores indicados e por via intravenosa transplantada em camundongos Trs de acordo com o esquema experimental em (A). Sobrevivência média ±SD e enxerto médio das células transduzidas, medidos como % das células GFP+ ou VCN detectado na BM de camundongos transplantados (±SD) em 120 dias ou na morte, são mostradas (n = 4-26 por grupo). (§) Resultados similares foram obtidos usando +/+ mHSPC. A sobrevivência de camundongos GLD não tratados é mostrada na primeira linhagem (* = Não irradiados; n.a. = não aplicável). (B) Monócitos primários humanos, linfócitos B e T e microglia murina foram transduzidos com os vetores indicados. Atividade GALC (expressa como dplicação para células não transduzidas - UT) foi medida em células cultivadas > 5 dias póstransdução (painel central) e ensaio TUNEL (expresso em % de células TUNEL+) foi realizada dois dias pós-transdução (painel direito). Dados de HSPC murina e humana trnaduzidos por GALC (a partir da Figura 5) e células % TUNEL+ na microglia transduzida por GFP são relatados

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37/97 para comparação. Cada ponto representa uma amostra individual, em que campos e > 6 > 250 células foram contadas. (C) Imagens representativas de coloração TUNEL em células de microglia transduzidas com GALC LV LV ou GFP, como indicado, e manchadas com o marcador de microglia F4/80 (células transduzidas por GALC) ou GFP. Núcleos foram marcados com ToprolII (TPIII). Aumento de 100X. (D) as curvas de sobrevivência Kaplan-Meier de camundongos Trs transplantados com um Galc-/ - HSPC transduzida por GALC-126T LV (n = 26) ou Galc +/+ HSPC transduzida por GFP LV (n = 10) e de controles afetados não tratados (UT) (n = 15). GALC-126T contra GFP em testes de classificação log para comparação par a par: p = 0,002; GALC-126 contra UT: p <0,0001. (E) camundongos transplantados por GALC-126T foram divididos em dois grupos de acordo com a VCN medida sobre o total de células BM no momento da morte. Sobrevivência é mostrada para animais carregando menos (média ± DP = 67 ± 13 dias) ou mais (média ± DP = 117 ± 43 dias) do que 5 cópias LV em células BM, sendo 5 a VCN média medida na BM de toda a população de camundongos tratados. (F-I) Atividade GALC (luz azul) foi avaliada qualitativamente em seções do cérebro de camundongos de controle e transplantado com GALC-126T. Seções representantes do hipocampo (F, G) e ponte (H, I) de camundongos transplantados com GALC-126T, em comparação com camundongos WT e Trs não tratados são mostradas. Ensaio GALC foi acoplado ao marcador Iba1 de microglia/macrófagos (F, G) e ao marcador CD45 hematopoiético (H, I). Uma infiltração acentuada de células hematopoiéticas ativadas está presente em camundongos Trs transplantados com GALC-126T e não tratados, este último mostrando atividade GALC tanto na progênie hematopoiética de HSPC transduzida (pontas de seta em G e I mostrando co-coloração de GALC [em azul] e Iba1 [G] e CD45 [I] em marrom) quanto em células não hematopoiéticas CD45, Iba1^-.

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Ampliação de 20x em (F, H) e 40x em (G, I).

MicroRNAs (miRNAs) [00095] Tem sido um dogma central da biologia que a informação genética flui do DNA para o mRNA pela proteína. Em outras palavras, foi assumido que os genes codificam proteínas, e proteínas que cumprem todas as funções celulares, incluindo a regulamentação dos programas de expressão gênica. No entanto, apenas uma minoria de RNA transcrito (2-3%) codifica proteínas em eucariotos superiores, chamando atenção para a questão do dogma central de que as proteínas são os efetores apenas da função das células (Mercer et al., 2009). Na verdade, há agora novas provas de que uma classe de pequenos RNAs não codificadores, chamados de microRNAs, desempenham um papel fundamental na regulação da expressão gênica. MicroRNAs (miRNAs) são (Biffi et al., 2004; Sadelain M., 2006; Sadelain et al., 2005; Gaziev et al., 2005; Yesilipek MA, 2006; Abonour et al., 2000) nucleotídeos de comprimento, RNAs não codificadores que regulam a expressão gênica negativamente no nível pós-transcricional, desencadeando um processo chamado interferência de RNA (RNAi, veja abaixo) (Bartel DP., 2004). MicroRNAs foram constatados em Caenorhabditis elegans na forma de lin-4 e let-7, e eles foram mostrados para regular o tempo de desenvolvimento da larva. (Lee et al., 1993; Reinhart et al., 2000). Esta constatação levou à busca de RNAs não codificadores similares que controlam a expressão gênica em eucariotos superiores. A constatação de que todos os organismos expressam miRNAs, muitos dos quais são filogeneticamente conservados entre espécies, foi concebida como uma revolução no campo da biologia. De acordo com o banco de dados de microRNA de referência (http://microrna.sanger.ac.uk/) 695 diferentes miRNAs foram identificados em humanos no momento da escrita. MicroRNAs têm sido implicados em quase todos os processos biológicos, incluindo o

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39/97 desenvolvimento, diferenciação, proliferação e apoptose (Xiao e Rajewsky, 2009). Eles também desempenham um papel importante em doenças como câncer, insuficiência cardíaca e doenças metabólicas (Xiao et al., 2009; Divaka et al., 2008; Krutzfeldt et al., 2006).

[00096] Genes de MicroRNA estão espalhados em todos os cromossomos humanos, com exceção do cromossomo Y. Eles podem ser localizados em regiões não codificantes do genoma ou dentro de íntrons de genes codificadores de proteínas. Cerca de 50% dos miRNAs aparecem em clusters, que são transcritos como transcrições primária policistrônicas (Lagos-Quintana et al., 2003). Semelhante ao genes codificadores de proteínas, miRNAs são geralmente transcritos a partir de promotores de polimerase II, gerando a chamada transcrição de miRNA primário (pri-miRNA). Este pri-miRNA é processado através de uma série de etapas de clivagem endonucleolítica, realizada por duas enzimas pertencentes à família RNAse Tipo III, Drosha e Dicer. A partir da pri-miRNA, um circuito em caule de cerca de 60 nucleotídeos de comprimento, chamado de precursor mirna (pre-miRNA), é retirado por um complexo nuclear específico, composto pelo gene de região crítica da síndrome de Drosha e DiGeorge (DGCR8), que filamentos de caldos de cultura perto da base do circuio de caule principal e deixa uma saliência de 5'fosfato e 2 bp de comprimento. O pre-mirna é então transportado ativamente do núcleo para o citoplasma por RAN-GTP e Exportin (Yi et al., 2003; Lund et al., 2004). Então, Dicer realiza um duplo filamento cortado no final do loop-tronco não definido pelo corte Drosha, gerando um dúplex de 19-24 pb, que é composto do miRNA maduro e da filamento oposto do dúplex, chamado de miRNA* (Bartel DP., 2004). De acordo com a regra de assimetria termodinâmica, apenas um filamento do dúplex é seletivamente carregado no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) e acumula como o microRNA maduro. Este filamento é normalmente aquele cuja extremidade 5' é

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40/97 menos bem emparelhada com o seu complemento, como foi demonstrado por desajustes de único nucleotídeo introduzidos na extremidade 5' de cada filamento de dúplexes de siRNA (Tomari et al., 2005). No entanto, existem alguns miRNAs que suportam o acúmulo de ambos os filamentos dúplex na medida similar (Schwarz et al., 2003). [00097] RNAi acionador de MicroRNAs, muito parecido com pequenos RNAs de interferência (siRNA), que estão largamente sendo usados para o gene experimental knockdown. A principal diferença entre miRNA e siRNA é a sua biogênese. Uma vez carregado em RISC, o filamento guia da molécula de pequeno RNA interage com sequências alvo de mRNA preferencialmente encontradas na região 3' não traduzida (3' UTR) de genes codificadores de proteínas. Tem sido demonstrado que nucleotídeos 2 - 8 contados a partir da extremidade 5' do miRNA, a assim chamada sequência de sementes, são essenciais para desencadear RNAi (Brennecke et al., 2005). Se toda a sequência de filamento guia for perfeitamente complementar ao mRNA-alvo, como é normalmente o caso dos siRNAs e miRNAs de plantas, o mRNA é endonucleoliticamente clivado pelo envolvimento da proteína Argonaute (Ago), também chamada de slicer do dúplex de RNA pequeno para o Complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). DGRC (gene 8 da região crítica da síndrome de DiGeorge) e TRBP (TAR (HIV) proteína de ligação de RNA 2) são proteínas de ligação de RNA de duplo filamento que facilitam a biogênese de miRNA maduro por enzimas de Drosha e Dicer RNase III, respectivamente. O filamento guia do dúplex miRNA é incorporado ao complexo RISC efetor, que reconhece alvos específicos através de pareamento de base imperfeita e induz silenciamento silenciamento de gene pós-transcricional. Vários mecanismos têm sido propostos para este modo de regulação: miRNAs podem induzir a repressão de iniciação da tradução, marcam mRNAs alvo para degradação por deadenilação, ou sequestram alvos no

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41/97 citoplasma de corpo-P ic.

[00098] Por outro lado, se apenas a semente for perfeitamente complementar ao mRNA alvo, mas as bases restantes mostram o pareamnto incompleto, RNAi atua por meio de múltiplos mecanismos levando a repressão translacional (DP Bartel, 2004; Pillai RS, 2005; Bartel DP., 2009). Degradação de mRNA eucarióticos ocorre principalmente através do encurtamento da cauda poliA na extremidade 3' do mRNA, e desnivelamento na extremidade 5', seguido por digestão de 5'-3' exonuclease e acumulação do miRNA em discretas áreas citoplasmática, o chamado P-corpos, enriquecido em componentes do percurso de decadência de mRNA (Lui et al., 2005).

[00099] MiRNAs que são úteis na presente invenção são miRNAs que são expressos em tronco hematopoiéticos e/ou células progenitoras, mas que não são expressos extensivamente em células diferenciadas. Exemplos preferidos incluem mir-130a, mir-126 e mir223. Outros microRNAs adequados incluem microRNAs expressos em células-tronco embrionárias e as células chamadas iPS. Por exemplo, miR-302a, miR-373 e miR-292 são especificamente expressos em células pluripotentes (ES, iPS), mas não nas células-tronco do tipo adultas ou células diferenciadas. microRNAs da família let-7 são expressos em todas as células, exceto daquelas pluripotentes (ES, iPS). miR-124 é especificamente expresso em neurônios.

Vetores de Gene [000100] O miRNA pode ser usado com um vetor de genes adequado, ou seja, um vetor adequado para a entrega de um gene (transgene) de interesse, como um vetor viral. Vetores virais adequados para a terapia genética são bem conhecidos na técnica. Exemplos de vetores virais úteis para a presente invenção são descritos em WO2007/000668.

[000101] Vírus provenientes de várias famílias diferentes foram modificados para gerar vetores virais para entrega de gene. Vírus que

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42/97 podem ser usados na presente invenção incluem retrovirus, lentivírus, adenovirus, vírus adeno-associados, vírus herpes simplex, picornavírus, e alfavírus. A presente invenção de preferência emprega retrovírus, incluindo lentivírus.

[000102] A presente invenção pode ser usada para controlar a expressão de um transgene incluído no vetor. A invenção também pode ser usada para controlar a expressão do vetor. Por exemplo, um vetor que pode ser controlado pelos mir-RNAs da presente invenção é um vírus oncolítico.

Transplante de Células-tronco Hematopoiéticas [000103] Transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) é o transplante de células-tronco derivadas da medula óssea (neste caso, conhecido como transplante de medula óssea) ou do sangue. O transplante de células-tronco é um procedimento médico nas áreas de hematologia e oncologia, na maioria das vezes realizado por pessoas com doenças de sangue, medula óssea, ou certos tipos de câncer.

[000104] Com a disponibilidade de GM-CSF e G-CSF de fatores de crescimento de célula-tronco, a maioria dos procedimentos de transplante de células tronco hematopoiéticas é agora realizada com células-tronco coletadas do sangue periférico, em vez de a partir da medula óssea. Coleta de células-tronco do sangue periférico proporciona um maior enxerto, não exige que o doador seja submetido à anestesia geral para recolher o enxerto, resulta em um menor tempo para o enxerto, e pode prever uma menor taxa de recaída de longo prazo.

[000105] Transplante de células-tronco hematopoiéticas continua a ser um procedimento arriscado, com muitas complicações possíveis, tem sido tradicionalmente reservado para pacientes com doenças potencialmente fatais. Embora ocasionalmente usado experimentalmente em indicações não malignas e não hematológicas

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43/97 grave incapacitantes, como doenças autoimunes e doenças cardiovasculares, o risco de complicações fatais parece alto demais para ganhar uma maior aceitação.

[000106] Muitos receptores de HSCTs são pacientes com mieloma múltiplo ou com leucemia que não se beneficiariam do tratamento prolongado com quimioterapia, ou já estão resistentes à ela. Candidatos para HSCTs incluem casos pediátricos, onde o paciente tem um defeito congênito, tal como imunodeficiência combinada grave ou neutropenia congênita com células-tronco com defeito, e também crianças ou adultos com anemia aplástica que perderam suas células-tronco após o nascimento. Outras condições tratadas com transplantes de célulastronco incluem anemia falciforme, síndrome mielodisplásica, neuroblastoma, linfomas, Sarcoma de Ewing, tumor de células redondas pequenas desmoplásicas e doença de Hodgkin. Mais recentemente não mieloablativos, ou os chamados mini-transplantes, os procedimentos foram desenvolvidos os quais necessitam de doses menores de quimio preparativa e radioterapia. Isto tem permitido que HSCT seja realizado nos pacientes idosos e em outras pessoas que de outra forma seriam consideradas muito fracas para resistir a um regime de tratamento convencional. A presente invenção tem como objetivo ampliar a aplicação terapêutica de tais tratamentos, melhorando a sua segurança e/ou eficácia.

Doenças [000107] A presente invenção é particularmente útil em terapia genética. Em particular as terapias que envolvem a expressão de um transgene potencialmente tóxico. Doenças que podem ser tratadas de acordo com a presente invenção incluem doenças de depósito lisossômico (LSD), tais como Leucodistrofia de Células Globoides (GLD). Outro exemplo de uma doença tratável pela presente invenção é doença granulomatosa crônica (CGD).

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44/97 [000108] Leucodistrofia de Células Globoides (GLD) ou a doença de Krabbe é causada por mutações no gene GALC, o que provoca uma deficiência de uma enzima chamada galactosilceramidase. O acúmulo de lipídios não metabolizados afeta o crescimento da bainha de mielina do nervo de proteção (cobertura que isola muitos nervos) e provoca a degeneração severa de habilidades motoras. Como parte de um grupo de distúrbios conhecidos como leucodistrofias, a doença de Krabbe resulta do crescimento e desenvolvimento imperfeito da mielina. Um tratamento de terapia genética de GLD envolve induzir o gene GALC no paciente. Por exemplo, o GALC poderia ser introduzido em HSPC ou HSC, que é então transplantado para o paciente. Os presentes inventores encontraram toxicidade e prejuízo funcional in vitro e in vivo de HSPC murina e humana após Transferência de genes GALC mediada por LV e expressão. Esta toxicidade pode ser superada usando os vetores de gene da presente invenção.

[000109] A entrega de um ou mais genes terapêuticos por um sistema de vetores de acordo com a presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com outros tratamentos ou componentes do tratamento.

[000110] Por exemplo, o vetor da presente invenção pode ser usado para prover um ou mais transgenes úteis no tratamento dos distúrbios listados em WO-A-98/05635. Para facilidade de referência, parte dessa lista agora é fornecida: câncer, inflamação ou doenças inflamatórias, doenças dermatológicas, febre, efeitos cardiovasculares, hemorragia, coagulação e resposta de fase aguda, caquexia, anorexia, infecção aguda, infecção pelo HIV, estados de choque, reações de enxerto versus hospedeiro, doenças autoimunes, lesão de reperfusão, meningite, enxaqueca e antitrombose dependente de aspirina, crescimento tumoral, invasão e propagação, angiogênese, metástases, malignas, ascite e derrame pleural maligno; isquemia cerebral, doença

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45/97 isquêmica do coração, artrose, artrite reumatoide, osteoporose, asma, esclerose múltipla, neurodegeneração, doença de Alzheimer, arteriosclerose, acidente vascular cerebral, vasculite, doença de Crohn e colite ulcerosa; periodontite, gengivite, psoríase, dermatite atópica, úlceras crônicas, epidermólise bolhosa; ulceração corneana, retinopatia e ferida cirúrgica; conjuntivite, rinite alérgica, eczema, anafilaxia; reestenose, insuficiência cardíaca congestiva, endometriose, aterosclerose, ou endosclerose.

[000111] Além disso, ou na alternativa, o vetor da presente invenção pode ser usado para prover um ou mais transgenes úteis no tratamento de distúrbios listados em WO-A-98/07859. Para facilidade de referência, parte dessa lista agora é fornecida: citocinas e proliferação celular/atividade de diferenciação; atividade imunossupressora ou imunoestimulante (por exemplo, para o tratamento da deficiência imunológica, incluindo a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana; regulação do crescimento de linfócitos; tratamento de câncer e muitas doenças autoimunes, e para evitar rejeição de transplantes ou induzir imunidade a tumor); regulação da hematopoiese, por exemplo, tratamento de doenças mieloide ou linfoide, promovendo o crescimento do osso, cartilagem, tendões, ligamentos e nervos, por exemplo, para curar feridas, tratamento de queimaduras, úlceras e doença periodontal e neurodegeneração; inibição ou ativação do hormônio estimulante de folículo (modulação da fertilidade); atividade quimiotática/quimiocinética (por exemplo, para a mobilização de tipos de células específicas para locais de lesão ou infecção); atividade hemostática e trombolítica (por exemplo, para o tratamento de hemofilia e acidente vascular cerebral); atividade antiinflamatória (para o tratamento de choque séptico por exemplo, ou doença de Crohn), como agentes antimicrobianos e moduladores de, por exemplo metabolismo ou o comportamento, como analgésicos, tratar distúrbios de deficiência específica; no tratamento

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46/97 de, por exemplo psoríase, em medicina humana ou veterinária.

[000112] Além disso, ou na alternativa, o vetor retroviral da presente invenção pode ser usado para prover um ou mais transgenes úteis no tratamento de distúrbios listados em WO-A-98/09985. Para facilidade de referência, parte dessa lista agora é fornecida: atividade inibidora de macrófagos e/ou a atividade inibidora das células T e, portanto, atividade antiinflamatória, atividade antiimune, isto é, efeitos inibitórios contra uma resposta celular e/ou imune humoral, incluindo um resposta não associada à inflamação; inibição da capacidade de macrófagos e células T de aderir a componentes de matriz extracelular e fibronectina, bem como expressão do receptor fas sobre-regulada nas células T; inibição da reação imune e inflamação indesejável, incluindo artrite, incluindo artrite reumatoide, inflamação associada com a hipersensibilidade, reações alérgicas, asma, lúpus eritematoso sistêmico, doenças do colágeno e outras doenças autoimunes, inflamação associada com arteriosclerose, aterosclerose, doença cardíaca aterosclerótica, lesão de reperfusão, parada cardíaca, infarto do miocárdio, distúrbios vascular inflamatório, síndrome do desconforto respiratório ou outros doenças cardiopulmonares, inflamação associada com úlcera péptica, colite ulcerativa e outras doenças do trato gastrointestinal, fibrose hepática, cirrose hepática ou outras doenças hepáticas, tireoidite ou outras doenças glandulares, glomerulonefrite ou outras doenças renais e urológicas, otite ou outras doenças oto-rinolaringológicas, dermatite ou outras doenças dérmicas, doenças periodontais e outras doenças bucais, orquite ou epididimo-orquite, infertilidade, trauma ou outras doenças orquidais imunológicas relacionadas com testicular, disfunção placentária, insuficiência placentária, aborto habitual, eclampsia, pré-eclampsia e outras doenças ginecológicas associadas xom o imunológico e/ou inflamatórias relacionadas, uveíte posterior, uveíte intermediária, uveíte anterior,

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47/97 conjuntivite, coriorretinite, neurite, uveoretinite óptica, inflamação intraocular, por exemplo, retinite ou edema macular cistoide, oftalmia simpática, esclerite, retinite pigmentosa, imunológico e componentes inflamatórios da doença fondus degenerativa, componentes inflamatórios da inflamação ocular do trauma ocular, causada por infecção, proliferativa vítreo-retinopatia, neuropatia óptica isquêmica aguda, cicatrização excessiva, por exemplo, operação de filtração após glaucoma, reação imune e/ou inflamação ocular contra implantes e outras doenças oftalmológicas imunes e inflamatórias relacionadas, inflamação associada a doenças autoimunes ou condições ou distúrbios, onde, tanto no sistema nervoso central (SNC) ou em qualquer outro órgão, supressão imune e/ou de inflamação seria benéfica, doença de Parkinson, complicação e/ou efeitos colaterais do tratamento da doença de Parkinson, Encefalopatia relacionada a HIV complexo de demência relacionada a AIDS, doença de Devic, coréia de Sydenham, a doença de Alzheimer e outras doenças degenerativas, condições ou distúrbios do SNC, componentes inflamatórios de AVC, síndrome pós-pólio, imunológico e componentes inflamatórios de transtornos psiquiátricos, mielite, encefalite, subaguda esclerosante pan-encefalite, encefalomielite, neuropatia aguda, subaguda neuropatia crônica, neuropatia, Guillaim-Barré, Sydenham chora, miastenia gravis, tumor pseudo-cerebral, Síndrome de Down, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, componentes inflamatórios do SNC compressão ou trauma do SNC ou infecções do SNC, componentes inflamatórios de atrofias musculares e distrofias, e imunológica e doenças inflamatórias relacionadas, as condições ou distúrbios do sistema nervoso central e periférico, inflamação pós-traumática, choque séptico, doenças infecciosas, as complicações inflamatórias ou efeitos secundários da cirurgia de transplante de medula, ossos ou outras complicações do transplante e/ou efeitos colaterais, complicações

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48/97 inflamatórias e/ou imunes e lateral efeitos da terapia de gene, por exemplo, devido a uma infecção viral com um portador, ou inflamação associada com a AIDS, para suprimir ou inibir uma resposta humoral e/ou imune celular, para tratar ou amenizar monócitos leucócitos ou doenças proliferativas, por exemplo, leucemia, reduzindo a quantidade de monócitos ou linfócitos, para a prevenção e/ou tratamento de rejeição do enxerto em casos de transplante de células natural ou artificial, tecidos e órgãos como a córnea, medula óssea, órgãos, lentes, pacemakers, natural ou artificial tecido da pele.

[000113] A presente invenção também provê uma composição farmacêutica para o tratamento de um indivíduo por terapia genética, em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do vetor da presente invenção compreendendo um ou mais transgenes de diagnóstico e/ou terapêuticos entregues ou uma partícula viral produzida por ou obtida a partir do mesmo. A composição farmacêutica pode ser para uso em humano ou animal. Tipicamente, um médico irá determinar a dosagem real que será mais adequada para um sujeito individual e irá variar com a idade, peso e resposta do indivíduo em particular.

[000114] A composição pode opcionalmente compreender um veículo farmaceuticamente aceitável, diluente, excipiente ou adjuvante. A escolha de veículo, excipiente ou diluente farmacêuticos pode ser selecionada no que se refere à rota pretendida de administração e prática farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas podem compreender como - ou além de - um veículo, excipiente, diluente ou qualquer aglutinante adequado (s), lubrificante (s), agente de suspensão (s), agente de revestimento (s), agente de solubilização (s), e outros agentes veículos que podem auxiliar ou aumentar a entrada viral no sítio de destino (como por exemplo um sistema de entrega de lipídios).

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49/97 [000115] Se necessário, as composições farmacêuticas podem ser administradas por qualquer um ou mais dos seguintes: inalação, na forma de um supositório ou pessário, topicamente na forma de uma loção, solução, creme, pomada ou talco, pelo uso de um adesivo de pele, por via oral na forma de comprimidos contendo excipientes como o amido ou a lactose, ou em cápsulas ou óvulos ou sozinho ou em mistura com excipientes, ou na forma de elixires, soluções ou suspensões contendo os agentes aromatizantes ou corantes, ou podem ser injetadas por via parenteral, por exemplo intracavernosamente, por via intravenosa, via intramuscular ou subcutânea. Para administração parenteral, as composições podem ser melhor utilizadas na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo sais suficientes ou monossacarídeos para tornar a solução isotônica com o sangue. Para administração bucal ou sublingual as composições podem ser administradas sob a forma de comprimidos ou pastilhas, que podem ser formulados de uma forma convencional.

[000116] A entrega de um ou mais genes terapêuticos por um sistema de vetores de acordo com a invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com outros tratamentos ou componentes do tratamento. Doenças que podem ser tratadas incluem, mas não estão limitadas a: câncer, doenças neurológicas, doenças hereditárias, doenças cardíacas, derrame, artrite, infecções virais e doenças do sistema imunológico. Genes terapêuticos adequados incluem aqueles que codificam proteínas supressoras de tumor, enzimas, enzimas de ativaçao de pró-fármacos, moléculas imunomoduladoras, anticorpos, moléculas tipo engenharia de imunoglobulina, proteínas de fusão, hormônios, proteínas da membrana, proteínas ou peptídeos vasoativos, citocinas, quimiocinas, proteínas antivirais, RNA antissentido e ribozimas.

Exemplos

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50/97 [000117] Sequências de nucleotídeos: em negrito: sequência alvo complementar ao miRNA. Em geral, usa-se 4 cópias de alvos de miRNA separados por um ligante de 4-6 nucleotídeos. Isso pode, no entanto, ser otimizado.

miR-126: UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG (SEQ ID NO:1) sequência miR-126T:

GCATTATTACTCACGGTACGACGATGCATTATTACTCAC GGTACGAACGCGTGCATTATTACTCACGGTACGATCACGCATTAT TACTCACGGTACGA (SEQ ID NO:2) miR-130a: CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU (SEQ ID NO:3) sequência miR-130aT:

ATGCCCTTTTAACATTGCACTGTTCGAAATGCCCTTTTA ACATTGCACTGACGCGTATGCCCTTTTAACATTGCACTGATGCATA TGCCCTTTTAACATTGCACTG (SEQ ID NO:4) miR-223: UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA (SEQ ID NO:5) sequência miR-223T: (SEQ ID NO:6)

GGGGTATTTGACAAACTGACACGATGGGGTATTTGACA AACTGACAACCGGTGGGGTATTTGACAAACTGACATCACGGGGTA TTTGACAAACTGACA

Combinação 126T/130aT 2/2:

GCATTATTACTCACGGTACGACGATGCATTATTACTCAC GGTACGAACGCGTATGCCCTTTTAACATTGCACTGATGCATATGC CCTTTTAACATTGCACTG (SEQ ID NO:7)

126T (2 alvos):

GCATTATTACTCACGGTACGACGATGCATTATTACTCACGGTACGA (SEQ ID NO:8)

Alvo de combinação tripla (126T/130aT/223T, 2 alvos cada):

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GCATTATTACTCACGGTACGACGATGCATTATTACTCAC GGTACGAACGCGTATGCCCTTTTAACATTGCACTGATGCATATGC CCTTTTAACATTGCACTGCCCCGGTGGGGTATTTGACAAACTGAC ATCACGGGGTATTTGACAAACTGACA (SEQ ID NO:9)

Exemplo 1

Construção e validação de vetores repórter de microRNA lentiviral [000118] A fim de determinar a atividade de miRNAs em células hematopoiéticas, incluindo populações raras e pouco caracterizadas como HSC, aproveitou-se a observação anterior de que transgenes expressos de vetores lentivirais podem ser regulados por miRNA endógenos aos quais sítios de ligação artificiais (miRT, sítios de destino miRNA) são adicionados a cassete de transgene (Brown BD., 2006). Portanto, visou-se a construção de vetores repórter de miRNA lentiviral lendo atividade de miRNA em tempo real e com resolução de única célula. Vetores lentivirais bidirecionais (Bd.LV) permitem a expressão de coordenadas de dois genes repórter conduzidso por um promotor constitutivo com a atividade bidirecional, composto de promotor fosfoglicerato quinase humano (PGK) fundido a uma TATA-box na forma de um promotor mínimo de citomegalovírus (CMV) na orientação oposta (Amendola M., 2005). Uma vez que este projeto permite que ambos os repórteres expressem duas transcrições independentes, um deles pode ser sensível à atividade de miRNA adicionando miRT ao 3'UTR (repórter miRNA), enquanto o outro, não equipado com miRT, não será afetado pelo miRNA e servirá como um controle interno (normalizador). Foi clonado um painel de tal Bd.LVs contendo a proteína verde fluorescente (GFP) como o repórter de miRNA e uma versão truncada do receptor de fator de crescimento de nervo de baixa afinidade (NGFR) como um normalizador constitutivamente expresso.

[000119] Optou-se por investigar dois miRNAs pensados para ser expressos no tecido hematopoiético, miR-223 e miR-126-3p. miR-223

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52/97 foi relatado para ser altamente e especificamente expresso em células mieloides diferenciadas, mas ausente nos linfócitos (Fazi F., 2005), o que permite testar o desempenho de Bd.LVs repórteres em linhagens bem caracterizadas. Além disso, quis-se explorar como miR-223 foi expresso em populações de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPC). De uma perspectiva de terapia genética, seria altamente relevante identificar miRNAs que são fortemente expressos em HSPC, mas não na progênie diferenciada, a fim de impedir desobjetivação expressão do transgene em populações de célulastronco sensíveis mantendo integralmente correção terapêutica da progênie doente. Clonagem de miRNA em larga escala sugeriu que miR-126 pudesse cumprir estes critérios, como foi detectado especificamente em HSPC CD34+ humana, mas não em outras populações de células hematopoiéticas (Landgraf et al., 2007).

[000120] Produziu-se Bd.LVs repórter para miR-223 e miR-126-3p (Bd.LV-223T e 126T-Bd.LV, respectivamente), bem como um Bd.LV de controle não contendo qualquer miRT (figura 1). Estes vetores foram então avaliados em um painel de diferentes tipos de células (figura 2). Células embrionárias de rim HEK293T, células monocíticas U937 e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram transduzidas com doses combinadas de Bd.LV-ctr, Bd.LV-223T e 126TBd.LV, e analisadas para a expressão repórter por citometria de fluxo (FACS) vários dias após a transdução. Células HEK293T expressam baixa para níveis indetectáveis de miR-223 ou miR-126, enquanto as células U937 fortemente expressam miR-223, mas não miR-126 (Fig.2a) e HUVECs expressam miR-126, mas não miR-223 (Kuehbacher et al., 2007). Como um controle adicional, foi projetado para células HEK293T ectopicamente expressar miR-126 (figura 2) por transdução com um LV contendo o pri-mir-126 sob o controle de um promotor ubíquo (agora conhecido como HEK293T.LV.miR-126, em

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53/97 oposição às células do tipo selvagem HEK293T).

[000121] Em células HEK293T, a intensidade média de fluorescência GFP (MFI) de Células transduzidas expressando NGFR foi idêntica para todos os três Bd.LVs (figura 2b, coluna da esquerda), confirmando que nem o miR-223 nem o miR-126-3p foram expressos nessas células. Em agudo contraste, as células U937 transduzidas com Bd.LV.223T mostraram uma redução substancial em comparação com GFP MFI Bd.LV.126T ou Bd.LV.ctrl, indicando que miR-223, mas não miR-126, foi biologicamente ativo em células U937. Pelo contrário, HUVECs mostrou uma repressão de GFP especificamente para Bd.LV-126T quando comparado com o vetor de controle. Da mesma forma, células HEK293T.LV.miR-126 transduzidas com o repórter Bd.LV-126T fortemente regularam expressão de GFP em comparação com as células do tipo selvagem HEK293T (comparar último a primeiro esquema da terceira linhagem da figura 2b).

[000122] Para descrever a atividade de miRNA em termos mais quantitativos, foi calculado um valor de Repressão de Duplicação de Proteína (FR), com base em intensidades médias de fluorescência normalizada (MFI) do miRNA repórter Bd.LV em relaçao ao Bd.LV de controle (figura 2c). Par dar conta de diferentes níveis de transferência de genes entre grupos de vetor, fez-se uso do normalizador interno, NGFR, que é transcrito em quantidades estequiométricas com o repórter miRNA, GFP. Assim, pegou-se a análise do FACS nas células NGFR positivas, e foi calculada uma relação de transgene (TGR), dividindo-se o MFI NGFR pelo IMF GFP para cada Bd.LV. O TGR obtido para os vetores de miRNA repórter (ou Bd.LV.223T Bd.LV.126T, respectivamente) foram então divididos por TGR do Bd.LV de controle. Este quociente, que foi chamdo de repressão de duplicação a partir de agora, é independente da dose do vetor e de nível de transdução (pelo menos dentro da porção linear do vetor curva dose-resposta) e provê

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54/97 uma leitura quantitativa para a atividade de miRNA nas células analisadas (figura 2c). O miRT foi projetado para ser perfeitamente complementar ao miRNA cognato. Espera-se, portanto, que as transcrições reconhecidas pelo miRNA sejam degradadas. Para provar isso, foi medido NGFR e transcrições de mRNA por RT-GFP QPCR em U937 e células HEK293T.LV.miR-126, e calculada uma repressão de duplicação de RNA, conforme descrito na Fig. 2c. Na verdade, transcrições de GFP foram reduzidas em relação às transcrições de NGFR em células U937.Bd.LV.223T bem como em células HEK293T.LV.miR-126.Bd.LV.126T, como mostrado pelos valores de Repressão de Duplicação de RNA calculados de 7 e 14, respectivamente (figura 2c, diamantes).

[000123] Tomados em conjunto, esses resultados indicam que os Bd.LVs regulados por miRNA fielmente relataram a atividade de miRNA em linhagens de células, de acordo com os nossos próprios e previamente publicados dados de expressão de miRNA. Além das técnicas convencionais de perfis de miRNA, nossos vetores relataram não apenas a presença de um miRNA, mas também sua bioatividade. Análise de FACS de células que carregam nosso Bd.LV repórter permite avaliar a atividade de miRNA no nível de única célula e, portanto, adequado para análise de misturas heterogêneas de células, que podem ser subdivididas por imunofenotipagem.

Caracterização de atividade de miR-223 e miR-126 no sistema hematopoiético do camundongo [000124] Uma vez demonstrada a confiabilidade dos Bd.LVs repórter em medir a atividade de miRNA em linhagens de células, o estudo mudou-se para investigar a atividade dos miRNAs referidos nas células hematopoiéticas primárias. Para tal, foi aproveitado o modelo murino, porque é amplamente disponível, facilmente manipulado em um ambiente experimental e bem caracterizado. Na verdade, quando com

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55/97 o objetivo de definir a atividade de miRNA em populações raras de HSPC, o sistema hematopoiético murino, bem caracterizado pelos marcadores de superfície, representa uma grande vantagem. Esta abordagem experimental foi enriquecer HSPC de murino da medula óssea, esgotando células positivas marcadoras de inhagem, para transduzir-las com vetores repórter lentivirais de miRNA e transplante destas células em camundongos letalmente irradiados destinatários congênitos. A atividade de microRNA foi então monitorada em leucócitos do sangue periférico ao longo do tempo para determinar a sua atividade em células diferenciadas. Após o enxerto estável ter sido alcançado, os camundongos foram sacrificados, e atividade de miRNA foi determinada em várias populações de medula óssea definidas por imunofenotipagem superfície. Desta forma, quer-se-ia avaliar se esses miRNAs foram expressos em HSPC identificada prospectivamente. Em particular, quer-se-ia determinar se miR-126 está presente no compartimento de HSC mais primitiva. O primeiro conjunto de camundongos foi transplantado com HSPC transduzida pelos Bd.LVs repórter descritos anteriormente (vide Fig.1; Bd.LV-ctr, n = 5 camundongos transplantados; Bd.LV-223T, n = 6 camundongos, ou Bd. LV-126T, n = 4 camundongos).

[000125] Sangue periférico (PB) foi amostrado oito semanas após o transplante, e as populações de leucócitos foram classificadas de acordo com parâmetros físicos e marcadores de superfície em granulócitos (CD11b+ lado scatterhi SSChi), monócitos (CD11b+ SSClo), células B (CD19 +) e células T (CD11b -CD19-) (figura 3). GFP repórter de miRNA e expressão normalizadora de NGFR foram quantificados dentro desses subconjuntos de leucócitos por FACS (figura 3b). Enquanto GFP foi expressa de forma semelhante em todos os subgrupos de leucócitos derivados de Bd.LV-ctr e HSPC transduzida por Bd.LV-126T,foi notado uma profunda regulação de GFP

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56/97 especificamente nas células mieloides PB, mas não nos linfócitos dentro do grupo Bd.LV -223T. Quantificação de miR-223 indicou uma atividade de repressão de 30 vezes e 17 vezes em granulócitos e monócitos, respectivamente, enquanto que miR-126 não foi ativo em leucócitos PB (figura 3c). A fim de caracterizar o perfil de miR-223 e miR-126 em diferentes subconjuntos de HSPC, camundongos repórter Bd.LV foram savrificados e submetidos a sua medula óssea para uma análise de imunofenotipagem multi-cor, a fim de prospectivamente identificar subpopulações de progenitor e células-tronco distintas. Isso foi feito com os camundongos descritos acima, mas também em um experimento subsequente sobre camundongos transplantados com HSPC expressando um repórter de miRNA mais sensível com base em uma variante GFP desestabilizado. Este repórter contém uma sequência de prolina-glutamato-serina-treonina-enriquecida (PEST) fundida ao Cterminal de GFP. O motivo PEST media degradação proteosomal rápida e rotatividade rápida da proteína, encurtando a meia-vida de GFP de cerca de 26 h para 4h (Kitsera et al., 2007). Esta meia-vida curta de DGFP nos permitiu detectar com mais precisão as alterações na expressão de miRNA, o que possivelmente ocorre durante o trânsito de HSC para progenitores comprometidos. A fim de determinar com fiabilidade o sinal DGFP, que é menor do que o GFP padrão, autofluorescência em cada subpopulação individual foi subtraída de MFI GFP, incluindo um grupo de camundongos carregando um vetor Bd.LVNGFR que não contêm o gene GFP. Os esquemas FACS na figura 4 seguinte foram obtidos a partir da BM de camundongos transplantados com os vetores Bd.dGFP mais sensíveis. No entanto, a determinação da atividade de miRNA nos camundongos portadores do GFP repórter padrão deu resultados muito similares, de modo que a repressão de duplicação na figura 3c poderia ser calculada com os dados mesclados dos dois experimentos independentes realizados (Bd-ctr, n = 10; Bd Petição 870190140146, de 27/12/2019, pág. 67/117

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223T, n = 9; Bd-126T, n = 13 camundongos).

Atividade de microRNA impressa em HSPC de murino e sua progênie [000126] Em seguida, foram quantificados os níveis de proteína de BdLV repórter em múltiplas, subpopulações hematopoiéticas prospectivamente identificadas isoladas de camundongos reconstituídos. O compartimento de HSPC foi definido como células da medula óssea (BM) tendo um imunofenótipo de marcadores^-/low Lineage c-Kit^hi, e subdividido em frações com auto-renovação e potencial de diferenciação diferentes com base em expressão de Sca-1, CD150, CD48 e CD45. De nota, 3 das 5 células com o imunofenótipo c-Kit+ Sca1+ Lin- (KSL) CD150^hi CD48- foram relatadas para ter potencial de repovoamento de multilinhagens de longo prazo, sobre transplante de células individuais, e, portanto, representam HSC bona fide (Kiel MJ., 2005). Além disso, com base na literatura (Pronk CJ., 2007) e nos nossos próprios resultados, subdividiu-se células Kit+ Sca- Lineage- em subconjuntos enriquecidos para progenitores granulócitos/monócitos (BPF) vs progenitores de eritrócitos e megacariócitos (EP), e expressão de miRNA avaliada. Curiosamente, miR-126, miR-130a e miR-196b mostraram a maior atividade em frações enriquecidas com a HSC mais primitiva, e essa atividade foi perdida durante os primeiros estágios de diferenciação (figura 4). Importante, miR-126, miR-130a e miR-196b são em grande parte inativos em células diferenciadas das linhagens linfoide e mieloide, com exceção dos granulócitos terminalmente diferenciados, que parecem reestabelecer algum grau de atividade miR-126. miR-223 foi expresso na maioria das células KSL, e em todos os progenitores mieloides (BPF), mas foi fortemente regulado em EPs. Como esperado, miR-223 foi progressivamente regulado para cima durante diferenciação mieloide, enquanto B e linfócitos T foram desprovidos dele (figura 5a). Além disso, os membros dos clusters miR-17 ~ 92 (miR-19, miR-93a, miR-17-5p) resultaram em HSPC altamente expressa. No entanto, sua

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58/97 atividade supressiva foi mantida durante a diferenciação adicional, e diminuída para algum grau apenas em células B terminalmente diferenciadas e granulócitos (figura 5a). Finalmente, let-7a reteve atividade supressora substancial em todos os tipos de células hematopoiéticas, incluindo HSC bona fide, consistente com o seu padrão de expressão ubíquo.

Proteção da HSC de suicídio condicional por miR-126 [000127] As impressões de atividade miRNA acima mencionadas foram baseadas em isolamento potencial de populações de células hematopoiéticas de acordo com imunofenótipo. A fim de estabelecer de forma conclusiva a atividade de miRNAs selecionados em subpopulações de células funcionalmente definidas, foi planejado um sistema de suicídio condicional com base em vetores lentivirais expressando o gene timidina quinase do vírus herpes simplex (TK) regulado por sequências miRT diferentes (figura 6a). Como TK é muito estável com uma meia-vida de aproximadamente 35 horas, que desestabilizou a proteína TK (agora chamada de DTK) pela fusão do domínio PEST de d4GFP com o C-terminal de TK. HSPC foi transduzida com um dos vetores de suicídio indicados ou um vetor de controle de GFP, e foi semeada em meio semissólido, seja na presença ou ausência de GCV (figura 6b). HSPC transduzida com o vetor TK de controle não dá origem a colônias na presença de GCV. Adicionando sequências miR-142T à transcrição de DTK completamente resgatou formação de colônias, em linhagem com a expressão pan-hematopoiéticas deste miRNA (Brown BD., 2006). Em vez disso, miR-223T, pelo menos, parcialmente restaurou o crescimento de colônias mieloides, enquanto váras colônias eritroides foram significativamente reduzidas (p <0,001) e não diferiram estatisticamente das células transduzidas por TK de controle. Um resgate parcial de colônias mieloides também foi obtido com o miR-126T, embora a um nível inferior ao obtido com miR-223T.

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GCV impediu totalmente o crescimento de colônias de ambas as colônias mieloide e eritroide nos grupos de miR-130aT, em linhagem com a forte regulação do miR-130a durante as etapas iniciais de diferenciação.

[000128] Em seguida, foi desenvolvido um ensaio de suicídio in vivo para demonstrar a atividade de miRNA na HSC funcionalmente definida. O sistema de suicídio de TK/GCV requer a divisão celular, a fim de tornarem-se tóxicos. As experiências piloto de co-transplante de células transduzidas por TK com células de suporte de BM não transduzidas indicou que um curso de tempo de 1 semana de GCV dado nas primeiras 2 semanas de enxerto de forma eficiente elimina HSC de repovoamento transduzida por TK de longo prazo (dados não mostrados). Em seguida, HSPC transduzida com qualquer um vetor suicida bidirecional miRNA-regulado expressa DTK-126T ou 142T e DTK-GFP, ou um vetor de controle de suicídio bidirecional de controle expressando dTK e NGFR. Células transduzidas com o vetor de controle ou um dos vetores de miRNA-regulado foram, então cotransplantadas em camundongos congênitos, que receberam ou não GCV durante a fase de enxerto (figura 6c). Análise de longo prazo de quimerismo de sangue periférico indicou que a maioria das células NGFR+ foram eficientemente eliminadas em camundongos tratados com GCV, enquanto que as células GFP+ persistiram em maiores números relativos. Isso foi observado em várias linhagens (granulócitos, monócitos, e linfócitos B- e T) e durante um período > 7 meses, tanto para células transduzidas or DTK-126T quanto 142T-DTK. Esses dados estabelecem que tanto miR-126 e miR-142 são expressos em HSC de repovoamen to de longo prazo a níveis suficientes para evitar expressão da proteína TK e morte celular induzida por GCV.

Segurança de exploração de regulação de miR-126 para a terapia genética

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60/97 [000129] Em seguida, derivou-se uma linhagem de camundongos transgênicos (camundongos Tg.126T) que abriga integrações germinativas de um vetor lentiviral expressando a transcrição de d4GFP.126T do mesmo promotor utilizado nos estudos BdLV descritos acima. Análise FACS de células Lin^-BM de camundongos adultos jovens Tg.126T mostrou um padrão semelhante de atividade miR-126 como observado nos camundongos transplantados (figura 7a). Isto confirma que miR-126 é fisiologicamente expresso em HSC. miR-126 é conhecido por ser expresso em células endoteliais, e perda de função durante o desenvolvimento fetal resultou em mortalidade devido a defeito de angiogênese (JE Fish., 2008). Quaisquer anormalidades fenotípicas brutas estiveram presentes em camundongos Tg.126T. Quando camundongos Tg.126 foram intercruzados, macas de tamanho normal que mantiveram o número médio de integrações de vetor de seus pais foram obtidos (figura 7b). Estes dados indicam que a expressão das sequências de miR-126T do promotor quinase fosfoglicerato 1 (PGK) não interferiu com o desenvolvimento do camundongo, e argumenta contra a hipótese de que expressão miR126T possa interferir com a regulação dos alvos miR-126 naturais em células endoteliais células sob estas circunstâncias. Para continuar a descartar esta última questão em células hematopoiéticas, foi montado um experimento de repovoamento competitivo. HSPC CD45.1 + foi coinjetada com igual número de HSPC CD45.2 + de camundongos Tg.126T em recipientes letalmente irradiados CD45.1 +. Quimerismo de sangue periférico foi estável e mantido por pelo menos um ano (o último momento da análise) em torno de 40-50% de células CD45.2 + (n = 4) para todas as linhagens de sangue principais (figura 7c). Juntos, esses dados indicam que miR-126 é expresso em HSC primitiva e a abordagem de biossensor provê um poderoso, meio não tóxico para identificar células hematopoiéticas no nível de única célula com base na

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61/97 expressão de miRNA.

Caracterização da atividade de miRNA candidato em células hematopoiéticas [000130] Nossa caracterização de atividade miR-223, miR-130a e miR-126 no sistema hematopoiético murino propôs esses miRNAs como promissores reguladores endógenos para limitar a toxicidade do transgene em HSPC, permitindo a expressão terapêutica em células mieloide e linfoides diferenciadas. A seguir, procurou-se investigar a atividade desses miRNAs em células hematopoiéticas, que são os alvos reais para a terapia genética. Transduziu-se célula CB CD34+ humana com Bd.LVs repórter miR-126, mir-130a, miR-223 (figura 8A). Células foram cultivadas in vitro em condições que oferecem suporte para manutenção de curto prazo de HSPC, e subpopulações com base na expressão de CD34/CD38 foram identificadas por citometria de fluxo. Diferenciação mieloide (CD13 +) e eritroide (CD235 +) foi avaliada utilizando o ensaio de metilcelulose. miR-126, miR-130a e miR-223 todos suprimiram suas respectivas transcrições repórter na população HSPC CD34+. Após a diferenciação, miR-223 manteve a atividade na linhagem mieloide, enquanto diminuiu durante a diferenciação eritroide. Pelo contrário, miR-126 perdeu a sua atividade durante a diferenciação mieloide, mas a manteve na progênie eritroide. Estes padrões de expressão eram funcionalmente verificados por ensaio suicídio condicional (figura 8b). miR-130a perdeu a sua atividade em ambas as linhagens mieloide e eritroide. Quantificação da atividade de miRNA nas respectivas populações (figura 8A) indicou que, dentre os miRNAs testados, miR-126 foi o miRNA mais potente nas frações CB CD34+ CD38- enriquecidas com HSPC primitiva. A figura 8c/d mostra uma maior otimização da sequência miRT através da combinação das sequências miR-126T e miR-130aT.

Exemplo 2

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Expressão GALC Forçada em HSPC [000131] A fim de avaliar a viabilidade de sobre-expressão de GALC em HSPC de murino (mHSPC), foram isoladas células de camundongos Lin-FVB/twi (GALC -/-). mHSPC foi transduzida em MOI 100 com GALC.LV na presença de uma combinação de citocinas otimizada (Biffi et al., 2004). Depois de transdução, as células foram cultivadas in vitro 10-14 dias para avaliar a atividade enzimática e o número de cópias do vetor (VCN) por Q-PCR. Foi comparado o nível de expressão de GALC com a expressão excessiva de outras enzimas lisossomais, Arilsulfatase A (ARSA) e -iduronidase (IDUA), obtida por transdução de mHSPC com o vetor de controle e ARSA.LV IDUA.LV. Todos os vetores expressaram o transgene do mesmo cassete de expressão contendo o promotor PGK humano. Uma vez que nosso objetivo foi comparar a sobre-expressão de enzima em -/-HSPC transduzida com relação a níveis de enzimas fisiológicas no HSPC tipo selvagem, mHSPC obtida de camundongos ARSA KO e de camundongos IDUA KO foi usada para a transdução de ARSA.LV e IDUA.LV, respectivamente. Transdução de mHSPC reconstituiu atividade da enzima lisossomal em células -/- e levou a sobre-expressão de enzima com relação aos níveis de tipo selvagem na progênie cultivada de -/- mHSPC transduzida (figura 9A). No entanto, o aumento na expressão GALC (2 vezes acima do tipo selvagem) foi significativamente menor em comparação com o aumento de IDUA e ARSA obtidos por IDUA.LV e ARSA.LV de controle (320 e 5,6 vezes mais do tipo selvagem, respectivamente), apesar de VCN similares.

[000132] Um experimento semelhante foi realizado em HSPC de humano (hHSPC), isolado por meio de seleção CD34+ a partir da CB obtida de doadores normais (n.d.). hHSPC foi transduzida em MOI 100 com GALC.LV, ARSA.LV e IDUA.LV, usando protocolos de transdução anteriormente otimizados 105. Da mesma forma que mHSPC, foi

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63/97 avaloiada a reconstituição da enzima de atividade e VCN sobre o cultivo in vitro das células transduzidas. Transdução GALC.LV de HSPC de n.d. CB (n = 4) levou a expressão limitada ao longo da enzima na progênie de células cultivadas em comparação com Controles de IDUA.LV (n = 3) e ARSA.LV (n = 6) (figura 9B).

Função in vitro prejudicada de GALC expressando HSPC ao expressar GALC mediada por LV [000133] Os efeitos de transdução e expressão da enzima em potencial clonogênico de mHSPC foram avaliados através do teste de CFC. Igual número de mHSPC transduzida or GALC/GFP/ARSA.LV foi semeado para o ensaio de colônia. ARSA foi escolhida como enzima lisossomal de controle uma vez que ela foi mostrada previamente como não afetando a função de HSPC (Capontondo et al., 2007). Em 12 experimentos independentes -/- e +/+ mHSPC transduzida por GALC.LV deu origem a uma redução significativa do número de colônias, em comparação com células transduzidas por ARSA.LV e GFP.LV (figura 10A para células GALC -/-). Colônias provenientes de mHSPC transduzida por GALC.LV eram de tamanho muito reduzido quando comparadas as de controle (figura 24B). Estes resultados sugerem que sobre-expressão de GALC ao transduzir LV prejudicou potencial clonogênico de mHSPC. A proporção relativa de colônias eritroide e mieloide sobre transdução de GALC.LV foi semelhante a de controle (não mostrada), sugerindo que a expressão da enzima prejudizou as diferentes linhagens hematopoiéticas, na mesma medida. [000134] O potencial clonogênico reduzido de mHSPC transduzida por GALC.LV poderia resultar da morte de GALC altamente transduzida sobre-expressando progenitores hematopoiéticos. A fim de investigar a possível ocorrência de uma seleção negativa mHSPC altamente transduzida, quantificação de VCN de colônias por Q-PCR. Q-PCR foi realizada em DNA extraído de cada conjunto de quatro colônias (grupos

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64/97 foram feitos a fim de ter uma quantidade suficiente de material para a análise). Colônias obtidas de mHSPC transduzida por GALC.LV mostraram um conteúdo de vetor significativamente menor quando comparadas a de controle (figura 10A), sugerindo a ocorrência de seleção negativa progenitores altamente transduzidos.

[000135] De acordo com estes dados, não se pôde discriminar se o comprometimento funcional e seleção in vitro foram devido a um efeito tóxico de transdução ou à presença de contaminantes liberados por células produtoras de vetor e co-purificadas com o vetor. Deve ser mencionado que, durante a produção de GALC.LV, células 293T se destacam a partir de placas, sugerindo que a expressão de GALC é tóxica também para essas células. Por esta razão, a incorporação de moléculas tóxicas decorrentes de células 293T mortas na preparação de vetor não pode ser excluída. Para resolver este problema, foi gerado um vetor de controle regulado por um microRNA hematopoiético específico, GALCmir142T.LV 56. Quatro sequências alvo do microRNA 142 incorporados a jusante do transgene permitem suprimir a expressão em mHSPC e na sua descendência, sem prejudicar a expressão GALC em células não hematopoiéticas, tais como células produtoras LV 293T. Esta tecnologia é baseada na regulação pós-transcricional de microRNA: microRNA 142, expresso apenas por células hematopoiéticas, reconhece a sua sequência alvo a jusante do transgene e inibe a tradução da transcrição e expressão do transgene. Como esperado, a transdução de mHSPC com GALCmir142T.LV não foi associada a um aumento da atividade GALC (figura 10B). Além disso, mHSPC transduzida com GALCmir142T.LV (n = 6) mostrou potencial clonogênico afetado e conteúdo de vetor similares, confirmando assim o comprometimento observado anteriormente sendo dependente de expressão de GALC (figura 10A).

[000136] Investigou-se o efeito de sobre-expressão de GALC também

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65/97 em HSPC de humano. hHSPC foi isolada de n.d. CB e BM e de BM coletada de um paciente GLD que estava programado para ser descartado. Um número igual de hHSPC foi transduzido com GALC.LV ou ARSA.LV ou vetores de controle GFP.LV foram semeados para ensaio de CFC, a fim de avaliar o potencial clonogênico de hHSPC transduzida. Como no caso de células de camundongo, GALC.LV transduziu n.d. e GLD HHSPC mostrou um potencial clonogênico prejudicado (figura 11A). Colônias de hHSPC transduzidas por GALC.LV mostrou um conteúdo de vetor significativamente mais baixo, quando comparado aos controles, um tamanho reduzido e proporção eritroide-mieloide conservada, novamente sugerindo seleção negativa dos progenitores altamente transduzidos (figura 11A). Também neste caso, o vetor de controle GALCmir142T.LV foi usado para excluir um efeito tóxico inespecífico de transdução. Como no caso de células de camundongo, hHSPC transduzidas por GALCmir142T.LV (n = 4) apresentaram atividade GALC e potencial clonogênico similares aos observados nas células de controle (figura 11A e B).

[000137] Em geral estes dados indicam que expressão GALC de novo forçada ao transduzir LV exerce um efeito negativo tanto na HSPC de murino e de humano, levando a seleção negativa de GALC que sobreexpressam células e comprometimento funcional.

[000138] Função in vivo prejudicada de HSPC ao expressar GALC mediada por LV. Realizou-se experimentos in vivo, com o objetivo de avaliar o potencial de repovoamento de expressão de m- e hHSPC sobre transdução de GALC.LV e GALC de novo. Estudos in vivo foram realizados em camundongos twi e FVB/twi para mHSPC, e em camundongos Rag2c para hHSPC.

[000139] Nossos experimentos iniciais foram realizados em camundongos twi, um modelo grave de GLD, como descrito na seção Métodos. Um primeiro conjunto de experimentos foi dedicado a definir a

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66/97 condição para o HCT em camundongos twi. Transplante de BM total de doadores do tipo selvagem foi realizado nesses camundongos, resultando em um aumento significativo de sua vida útil de até 100 dias, conforme relatado anteriormente por 115. Esses experimentos preliminares permitiram definir a dose de irradiação ideal. O uso de HSC de doadores portadores do alelo CD45.1 permitiu avaliar o enxerto de células do doador, desde que camundongos twi portem o alelo CD45.2. Pois nosso objetivo foi o de transdução de HSC twi, tentou-se ajustar o transplante de Lin-HSPC, a fim de reduzir o número de células a serem transduzidas e transplantadas em comparação com o uso de células BM totais. HSPC de camundongos (+/+)tipo selvagem foi transduzida em MOI 100 com PGK_GFP.LV (GFP.LV), na presença de uma combinação de citocinas otimizadas (Biffi et al., 2004) (figura 12A). Depois de transdução, as células foram transplantadas em camundongos twi com oito dias de idade letalmente irradiados ou +/controle. Grupos de controle também incluíram camundongos twi transplantados com células BM tipo selvagem ou -Lin. Deforma surpreendente, e diferentemente de animais de controle, camundongos -/- twi transplantados com HSPC não sobreviveram após o condicionamento letal, sugerindo que as células Lin- por si só não poderiam repovoar os camundongos twi (figura 12b).

[000140] Portanto, decidiu-se apoiar enxerto HSPC transduzido por GFP.LV por co-transplante de progenitores acometidos com hematopoiéticas derivadas de BM, suprimidas de HSC. Estas células foram obtidas pela depleção magnética de células Scal+ da BM total de camundongos+/+. Curiosamente, os camundongos twi transplantados com células +/+ lin- e transduzidas por GFP.LV e células +/+ scalatingiram sobrevivência similar à obtida com transplante de BM total +/+ (figura 12b). O enxerto de HSPC transduzida com GFP.LV foi avaliado por citometria de fluxo em sangue periférico. Cinco e seis semanas após

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67/97 o transplante, a análise descreveu um enxerto citofluorimétrico elevado de células derivadas GFP+ HSPC (figura 12C). Assim, co-transplante de progenitores +/+ SCA1- resgatou o enxerto com defeito de HSPC purificada e permitiu o prolongamento de vida útil e melhoria do fenótipo de camundongos twi similares aos obtidos com um transplante de BM total de +/+ (Yeager et al., 1993; Wu et al., 2000).

[000141] Uma vez que os procedimentos de transplante foram otimizados com +/+ HSPC e GFP.LV, camundongos twi foram transplantados com HSPC transduzida com -/- GALC.LV e com um +/+ ou Células -/- Scal- transduzidas por GALC.LV. Camundongos Twi que receberam HSPC transduzida com -/- GALC.LV e células +/+ não transduidas sobreviveram significativamente mais do que os camundongos transplantados com +/+ BM total ou com +/+ HSPC e SCA1-progenitores, e mostrou melhora de seu fenótipo e progressão mais lenta da doença (figura 12B). Estes dados sugerem que Transplante de HSPC sobre-expressanso GALC provê um benefício terapêutico único, em comparação com o transplante convencional. No entanto, quando avaliou-se a presença de células GALC.LV transduzidas na BM desses camundongos por Q-PCR, encontrou-se um número de cópia de vetor baixo (VCN), entre 0,8 e 1, sugerindo que apenas células transduzidas por GALC.LV com VCN baixo foram capazes de enxertar.

[000142] No entanto, os camundongos twi que receberam células Scal- e -/- Lin, tanto transduzidas com GALC.LV, morreram após condicionamento letal ou tinham uma expectativa de vida semelhante a camundongos não tratados. Estes resultados sugerem que progenitores transduzidos por GALC.LV não conseguiram suportar enxerto de HSPC, resultando em insuficiência de enxerto autóloga e reconstituição da hematopoiese.

[000143] Decidiu-se usar camundongos FVB/twi em vez do modelo twi

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68/97 usual de GLD para tirar vantagem do modelo um pouco menos grave: experiências anteriores nos mostraram que o transplante bem sucedido de células Lin- sem a necessidade de Células Scal- de suporte foi possível neste modelo. Além disso, camundongos FVB/twi têm ninhadas maiores, permitindo-nos ter um número maior de camundongos -/- para isolar mHSPC.

[000144] MHSPC transduzidas foram transplantadas para recipintes letalmente irradiados de oito dias de idade FVB/twi -/- e heterozigotos (+/-) (figura 13). A fim de reduzir a variabilidade biológica, foi transplantado pequenos pares -/- e +/-. Camundongos do grupo de controle foram transplantados com células +/+ transduzidas por GFP.LV. Para esse grupo de controle, a eficiência de transdução foi avaliada por citofluorimetria 7 dias após a transdução na cultura in vitro, enquanto que o enxerto de células transduzidas foi avaliado por citofluorimetria em sangue periférico de 6 semanas após o transplante. A eficiência de transdução foi muito alta, variando entre 75% e 93% de células GFP+. Todos os animais transplatado com GFP mostraram um alto enxerto de células transplantadas (entre 63% e 85%), e todos os controles de irradiação (camundongos letalmente irradiados que não receberam TCTH) morreram dentro de três semanas após o condicionamento, confirmando assim a configuração correta de condições HSCT. Camundongos -/- que receberam +/+ mHSPC transduzida por GFP.LV alcançaram sobrevivência prolongada após condicionamento letal (até 150 dias), em comparação com camundongos não transplantados de controle. A sobrevivência de camundongos FVB/twi não tratadas e transplantados com GFP foi maior com relação à observada nos respectivos grupos de camundongos twi, confirmando assim a influência da herança genética da gravidade do fenótipo. O enxerto de mHSPC transduzida também foi avaliada por Q - PCR em DNA extraído de BM de camundongos transplantados em

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69/97 sacrifício. Um enxerto significativo de MHSPC transduzida com GFP.LV, medido como VCN por genoma, foi observado (tabela 2). Surpreendentemente, ambos os camundongos -/- e +/- transplantados com -/- ou +/+ mHSPC transduzidas com GALC.LV não sobreviveram à radiação letal (morte dentro de 21 dias, semelhante a de controle de irradiação) (figura 13 e dados não mostrados). Q-PCR descreveu muito baixo para VCN indetectável na sua BM (Tabela 2). Estes resultados indicaram uma deficiência funcional de mHSPC transduzida com GALC, que se tornou incapaz de repovoar uma série letalmente condicionada. Apoptose de GALC expressando HSPC de murino e humano.

[000145] Tendo detectado uma deficiência funcional de HSPC transduzida por GALC.LV, foi avaliado se isto poderia ser devido à apoptose das células transduzidas mediadas pela expressão de novo GALC. A ocorrência de apoptose foi avaliada em dois momentos diferentes, 2 e 5 dias após a transdução, quando a expressão do transgene presumivelmente atinge o estado de equilíbrio (vide a expressão GFP na figura 14B) por coloração de anexina V e ensaio TUNEL. A primeira técnica rotula células apoptóticas precoces, e a segunda uma células apoptóticas tradias. m- e hHSPC foram transduzidas por GALC.LV e GFP/ARSA.LV de controle. Depois de transdução e lavagem, as células foram semeadas em lamínulas revestidas com Matrigel para ensaio de TUNEL ou cultivadas em placas de costume e coradas para anexina V e TUNEL. À microscopia confocal, a grande maioria da mHSPC transduzida por GALC.LV foi positiva para TUNEL e exibiu núcleos aumentados, com cromatina condensada, demonstrando a ocorrência generalizada de apoptose em ambas as ocasiões (figura 14A-B). Pelo contrário, células transduzidas por ARSA/GFP.LV eram em sua maioria negativas para TUNEL. Coloração com Anexina V confirmou a ocorrência de apoptose, mostrando uma maior fração de células apoptóticas entre m e hHSPC transduzidas por

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GALC, em comparação as de controles (figura 14C).

Sensibilidade à toxicidade de expressão GALC é dependente de diferenciação e linhagem celular [000146] Macrófagos e microglia representam a progênie efetora de HSPC reconstituindo atividade da enzima nos tecidos afetados, incluindo o sistema nervoso, nas abordagens de terapia genética HSPC para LSD. Foi avaliado se uma linhagem celular monocítica protótipa (U937), monócitos humanos primários, macrófagos murinos primários e microglia podem sofrer toxicidade de expressão GALC ao transferir gene mediado por LV. Além disso, para dissecar ainda mais a especificidade da apoptose induzida por GALC juntamente com diferenciação hematopoiética, foram testados linfócitos T e B. Para permitir a imunodetecção de GALC e eficiência de transdução de estimativa, em alguns experimentos foi utilizado um transgene Cterminal marcado, em que o gene é fundido no quadro com a sequência que codifica o peptídeo HA da proteína hemaglutinina do vírus da gripe humana. A enzima rotulada HA tinha uma atividade específica comparável com a da enzima não modificada, e foi devidamente classificada para o compartimento lisossomal (dados não mostrados). Depois de transdução, foi avaliada, em diferentes pontos no tempo, a ocorrência de apoptose por ensaio TUNEL e atividade GALC. Como esperado, todos os tipos de células analisadas apresentaram um nível diferente de atividade GALC basal (figura 17).

[000147] Macrófagos murinos foram obtidos como a fração aderente de coleta de células peritoneal. Culturas primárias de microglia foram isoladas do cérebro de camundongos +/+ e -/- FVB/twi por protocolos estabelecidos (RC Armstrong, 1998; Gritti et al., 1996). Além disso, testou-se ambos os monócitos primários e linhagem celular monocítica U937. Monócitos humanos foram isolados de PBMC por seleção positiva para o marcador CD14 monocítico. Condições de transdução

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71/97 foram criadas usando GFP.LV e analisano a eficiência de transdução por citofluorimetria (quando possível) ou por microscopia confocal. Uma vez que o protocolo de transdução havia sido otimizado, microglia e macrófagos foram eficientemente transduzidos com GALC.LV/GALCHA.LV e vetores de controle em MOI 50 e 200, respectivamente, e expressou GALC acima dos níveis basais (figura 18). Mesmo quando os níveis de expressão elevados (até 40 vezes o nível em peso) foram atingidos, ensaio de TUNEL demonstrou baixa frequência ou nenhuma apoptose seguinte a transdução GALC.LV e superexpressão GALC em todas as células testadas (figura 18). Não foi observada diferença entre +/+ e -/- microglia (figura 18 e outros dados não mostrados). Estes resultados demonstram que as células efetoras de terapia genética HSC não são sensíveis à toxicidade GALC, sugerindo que, a fim de desenvolver uma estratégia de terapia genética para HSC GLD, expressão GALC deve ser evitada em HSPC, que deve ser promovida em células hematopoiéticas mieloides diferenciadas, capazes de atingir a enzima nos tecidos afetados.

[000148] Linfócitos humanos T e B foram obtidos mediante estimulação PHA e transformação EBV de PBMC total, respectivamente. Da mesma forma que os experimentos com monócitos e macrófagos, transdução foi otimizada usando GFP.LV e citometria de fluxo. Linfócitos B foram eficientemente transduzidos com GALC.LV/GALC-HA.LV e vetores de controle em MOI 100, enquanto dois hits no MOI 100 foram usados para linfócitos T. Apesar de aumento sustentado na atividade GALC sobre transdução, nenhuma apoptose foi detectada em todos os pontos de tempo analisados (figura 19), assim, um maior apoio à noção de que células hematopoiéticas diferenciadas não são detectavelmente sensíveis a sobre-expressão de GALC. Regulação in vitro na expressão GALC por miRNA126.

[000149] A fim de avaliar o efeito de expressão GALC regulada por

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72/97 miRNA126 em HSPC, foi transduzido mHSPC com GALC.miR126T.LV ou com GFP.miR126T.LV ou GALC.LV em MOI 100. Após a lavagem, as células foram semeadas para Ensaio CFC ou cultivadas in vitro por duas semanas para ensaio de atividade GALC e Q-PCR. Transdução com GALC.miR126T.LV permitiu uma reconstituição da atividade GALC em níveis suprafisiológicos na progênie diferenciada mHSPC, até 2 vezes nos níveis de tipo selvagem (figura 35B). Importante, o número de colônias obtido a partir de mHSPC transduzidas com GALC.miR126T.LV foi semelhante aos controles e era quase duas vezes com relação a colônias GALC.LV (figura 21C), sugerindo que a regulação da expressão GALC por miRNA126 permitiu preservar o potencial clonogênico de mHSPC transduzida. Estes resultados encorajadores nos levou a avaliar se o potencial clonogênico afetado deveu-se ao resgate da apoptose de mHSPC transduzida por GALC.miR126T.LV. Depois de transdução, mHSPC foi semeada em lamela revestida por Matrigel e ensaio de TUNEL foi realizado após 2 e 5 dias de cultura. O nível de apoptose foi avaliado por microscopia confocal. Ensaio TUNEL em células GALC.miR126T.LV transduzidas mostrou apoptose menor ou nula em ambos os pontos de tempo (1% 1 e 3% 2 em 2 e 5 dias, respectivamente), similarmente a que foi observada em células transduzidas com o LV de controle (figura 22AB). Esses dados demonstram que a supressão da expressão GALC por miRNA126 poderia resgatar mHSPC de apoptose induzida por GALC. Regulação in vivo na expressão GALC por miRNA126 [000150] O efeito da expressão GALC regulada por miRNA126 sobre o potencial de repovoamento de mHSPC foi avaliado em camundongos+/- FVB/twi. Camundongos letalmente irradiados de oito dias de idade foram transplantados com -/- mHSPC transduzida por GALC.miR126T.LV ou com células PGK transduzidas por GALC.LV e sobrevivência foi avaliada em ambos os de curto e longo prazo.

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Similarmente ao que foi observado em CD11b_GALC.LV, camundongos +/- FVB/twi transplantados com mHSPC transduzida por GALC.miR126T.LV foram resgatados de letalidade e sobreviveram a longo prazo (mais de três meses após o transplante), diferentemente do camundongos transplantados com PGK_GALC.LV que não sobreviveram após o condicionamento letal. Quando os camundongos transplantados com LV mHSPC transduzida por GALC. miR126T foram sacrificados com a idade de 80 dias e Q-PCR foi realizada em BM, encontrou-se uma média de VCN de 5, confirmando assim a presença de células transduzidas na BM de longo prazo após HCT.

[000151] Em geral, estes resultados juntamente com os observados com Células transduzidas por CD11 b_GALC.LV, mostram resgate bem sucedido da deficiência GALC e proteção contra a expressão de novo GALC em HSPC pelas melhores estratégias de terapia genética regulada.

Expressão GALC Forçada é tóxica para HSPC mas não para células hematopoiéticas diferenciadas [000152] Para desenvolver um modelo de terapia genética, foi transduzida HSPC de tipo selvagem e camundongos GLD, carregando uma mutação de ponto resultando em < 5% da atividade enzimática residual (Trs)⁴⁵, com um vetor lentiviral expressando GALC ou GFP (figura 23A). Transdução com o vetor GALC reconstituiu atividade GALC na progênie de cultura de células GLD, levando a uma sobre-expressão de ~ 2 vezes em relação a de células transduzidas por GFP de tipo selvagem (figura 23B). Níveis de expressão similares foram observados no momento da transdução de HSPC tipo selvagem murino, bem como HSPC CD34+ humana da CB normal ou BM (figura 23B). Inesperadamente, a expressão forçada GALC prejudicou atividade clonogênica de ambas a HSPC de murino e humano, em comparação com células transduzidas por GFP (figura 23D e dados não mostrados).

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Ensaio de TUNEL realizado dois dias após a transdução mostrou que a maioria dos HSPC transduzida com GALC, mas não GFP- foi positiva para TUNEL e exibiu núcleos aumentados, com cromatina condensada (figura 23E e F). Estes achados sugerem que o comprometimento clonogênico de HSPC transduzida por GALC deveu-se à indução de apoptose, como também confirmado por coloração anexina V (não mostrada). Comprometimento funcional da HSPC foi diretamente causado pela expressão forçada/de novo GALC e não por toxicidade relacionada com a preparação do vetor, como HSPC transduzida com um vtor lentiviral regulado por miR-142, de codificação de GALC mostrou atividade clonogênica normal e ausência de apoptose. De fato, a sequência 142T suprimimiu a expressão da enzima GALC em células hematopoiéticas, mas não em células³³ produtoras LV (figura 23B). Expressão de GALC forçado/de novo foi também tóxica para células de enxerto de longo praz, assim como HSPC transduzida por GALC de murino não conseguiu resgatar os camundongos Trs da irradiação letal (figura 24A).

[000153] Após o transplante HSC, macrófagos e microglia são a progênie efetora responsável pela reconstituição de atividade GALC nos tecidos afetados. Para testar se a toxicidade de expressão GALC forçada/de novo também afetou células diferenciadas, foram transduzidos monócitos humanos primários, linfócitos T e B, bem como células de microglia de camundongo com vetores GALC ou de controle (figura 24B). Enquanto transdução eficiente e sobre-expressão GALC foram alcançados em todos os tipos de células, ensaio de TUNEL mostrou apoptose baixa ou nenhuma nas culturas (figura 24B e C). Assim, a sensibilidade à expressão GALC é uma característica única da HSPC, que não foi observada em células hematopoiéticas maduras.

Regulação miR-126 resgata HSPC da toxicidade de expressão GALC e permite terapia genética de GLD

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75/97 [000154] A toxicidade seletiva da expressão de novo GALC em HSPC destaca a necessidade de bem regular a expressão do transgene em HSPC para a terapia genética bem-sucedida de GLD. Portanto, testouse a eficácia do nosso novo sistema regulador baseado em miR-126 e comparou-se a uma estratégia com base na transcrição do promotor CD11b de mieloide específico para alcançar expressão GALC para progênie diferenciada de HSPC. Ambas as estratégias resgataram a HSPC transduzida de GALC induzida por toxicidade (vide figura 23B-E). No entanto, a atividade reconstituída de GALC foi substancialmente maior (até 2 vezes o nível de tipo selvagem) na progênie das células transduzidas com lentivetor GALC-126T (em que a expressão GALC é conduzida pelo promotor PGK) do que em células transduzidas CD11bGALC, mesmo quando as culturas transduzidas para número de cópia de vetor semelhante foram comparadas (figura 23B e C). Também verificou-se que o vetor GALC.126T lentiviral eficazmente protegeu HSPC de humano de toxicidade GALC (figura 23C e D). Dada o provável benefício da atividade enzimática supra-fisiológica em células hematopoiéticas maduras, foi selecionado o vetor regulado por miRNA para estudos in vivo da terapia GLD.

[000155] HSPC de camundongos Trs foi transduzida com o vetor GALC-126T lentiviral e transplantada em camundongos Trs recémnascidos. Os camundongos transplantados foram enxertados com sucesso (figura 24A) e mostraram uma sobrevida significativamente maior não só em relação aos camundongos Trs não tratados (p <0,0001), mas também em relação aos camundongos transplantados com HSPC transduzida por GFP tipo selvagem (p = 0,002; figura 24A e D). Além disso, quando a terapia genética estratificada tratou camundongos de acordo com o número de cópias do vetor medido na BM, os animais com o maior conteúdo de vetor mostraram uma sobrevida significativamente maior (figura 6E), sugerindo fortemente

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76/97 que expressão da enzima supra-fisiológica nas células hematopoiéticas aumenta a eficácia terapêutica de transplante de HSC. Na verdade, a entrega efetiva da enzima funcional GALC para o cérebro afetado e reconstituição da atividade com defeito foram observados no cérebro de camundongos Trs tratados com a terapia genética (figura 24F-I). No sistema nervoso central de camundongos tratados, atividade GALC foi detectada dentro de células hematopoiéticas de infiltrção Iba1 +, CD45 +, e dentro células não hematopoiéticas Iba1, CD45- (figura 24F-I), demonstrando correção cruzada de células residentes provavelmente devido à secreção de enzimas pela progênie da HSPC transplantada e transduzida. Importante, a reconstituição da atividade enzimática e aumento de sobrevida foram associados a um fenótipo significativamente melhorado dos camundongos tratados, em comparação com controles afetados não tratados, com a capacidade de locomoção preservada e twitching reduzida (tremores intencionais associados a GLD).

DISCUSSÃO

Estudos de perfis profundos de expressão de miRNA no sistema hematopoiético [000156] Os vetores de miRNA repórter utilizados neste trabalho oferecem a oportunidade para medir a bioatividade de miRNA em vez de confiar somente em níveis de expressão de miRNA, proporcionando assim uma leitura biologicamente significativa, quantitativa da função miRNA. Brown et al. propuseram que um limite de expressão de miRNA deve ser alcançado para a atividade de supressão significativa contra alvos miRNA para ocorrer, o que pode ser o resultado de um mecanismo de RNAi limitando disponível dentro de uma célula (Brown et al., 2007). Se pequenos RNAs competirem por complexos efetores de RNAi limitados, um nível suficientemente elevado de expressão pode ser necessário para garantir a incorporação do miRNA em um RISC ativo.

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Assim, essas espécies miRNA, que são expressas em níveis muito baixos, pode ter pouca ou nenhuma atividade, porque eles não fazem parte de um RISC de funcionamento. Estudos de perfis de miRNA muitas vezes consideram apenas as diferenças na expressão relativa de miRNA e podem, portanto, indicar diferenças estatisticamente significativas que podem ser, no entanto, irrelevantes para a regulação dos genes. Combinando a amplitude da análise de expressão do genoma amplo miRNA (por exemplo, micromatrizes ou sequenciamento de profundidade) com a abordagem de Bd.LV repórter miRNA acrescenta outra dimensão ao estudo de microRNAs. Isto permite rigorosamente validar o significado biológico da expressão diferencial de miRNA e pode ser usado para estudo longitudinal da expressão de um miRNA selecionado entre as populações de múltiplas células, com resolução de única célula e em células vivas. Usou-se essa abordagem para estudar a expressão de miRNAs selecionados nas populações de células raras e de difícil acesso como HSC. Nosso vetor repórter de miRNA estuda não só dados confirmados sobre perfis de expressão miR-223 e miR-126 descritos na literatura, mas acrescentou mais informações sobre a atividade desses miRNA em subpopulações de HSPC altamente puras e sua progênie. miR-223 tem sido descrito para ser abundantemente expresso na linhagem mieloide de camundongos e humanos (Chen et al., 2004; Fazi et al., 2005; Rosa et al., 2007). De fato, nossos dados de vetor repórter encontraram a mais alta atividade de miR-223 em granulócitos. Além disso, atividade de miR-223 também foi revelada em monócitos e em uma hierarquia de HSPC, em especial progenitores comprometidos com a linhagem de granulócitos e monócitos. Nossos dados sugerem que pelo menos algumas células pluripotentes hematopoiéticas expressam miR-223, em ambos os camundongos e humanos. Uma possibilidade é que essas células são preparadas para um destino de granulócitos e monócitos. Nosso vetor

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78/97 repórter bidirecional permite fracionamento dessas populações de HSPC de acordo com expressão de miR-223 e sonda o seu potencial de diferenciação. Estes estudos podem prover uma nova maneira de identificar prospectivamente progenitores mieloides não confiando apenas em marcadores de superfície e, possivelmente, investigar os primeiros passos de compromisso linhagem.

[000157] A expressão de miR-126 no sistema hematopoiético foi mal caracterizada até agora. Um estudo de perfil de miRNA baseado em sequenciamento amplo e profundo, amplamente atribuiu isso a HSPC CD34+. Agora será mostrado que miR-126 é ativo em HSPC de murinos e humanos, e em particular no dentro de subconjuntos enriquecidos com a HSC mais primitiva. Durante as etapas iniciais de diferenciação, atividade de miR-126 diminui progressivamente. A associação de miR126 com HSC humana é corroborada por uma análise da CB HSPC transduzida por BdLV.126T recém-isolada de camundongos NOD/SCID realizada por nosso colaborador em UHN, Toronto (Lechman et al., 2008, ASH Abstract). Nossos dados suportam um padrão de expressão específico de progenitor precoce/células-trono para miR-126, com o silenciamento na maioria das linhagens a jusante.

[000158] Curiosamente, um subgrupo da leucemia mieloide aguda (LMA) caracterizo por mutações no fator central de ligação (CBF) expressa altos níveis de miR-126 121. Os autores identificaram pololike kinase (PLK-2as um alvo validado de miR-1 26. PLK-2 tem sido reconhecido como um regulador do ciclo celular e pode agir como um gene supressor tumoral em neoplasias hematológicas. Dada a associação apertada de miR-126 com a HSC, estuda-se, em colaboração com o grupo de John Dick em UHN, Toronto, a atividade de miR-126 em células-tronco leucêmicas (LSC), uma subpopulaçãoque permanece no ápice da hierarquia de desenvolvimento da AML, que acha-se ser a responsável pela

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79/97 resistência à quimioterapia e recaída (Barabe et al., 2007; Kennedy et al., 2007). Resultados preliminares sugerem que as amostras AML, em especial as que pertencem a subgrupos diferentes de CBF-AML, manifestam um gradiente de expressão miR-126, sendo mais alta na fração CD34 +38- enriquecida com LSC e pobre em frações não enxertadas. Este padrão de atividade miR-126 é mantido após transplante de LSC em camundongos NOD/SCID camundongos. Assim, atividade miR- 126, visualizada por um Bd.LV repórter lentiviral, poderia servir como um biomarcador novo e potencialmente alvo terapêutico para as células-tronco leucêmicas AML (Lechman et al., 2008, ASH Abstract).

[000159] Fora do sistema hematopoiético, miR-126 tem sido amplamente descrito como um regulador positivo da sinalização angiogênica em células endoteliais. Angiogênese descreve a formação de novos vasos sanguíneos através do crescimento de vasos preexistentes. Sinais de promover a angiogênese incluem o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF), que ativam proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e cascata de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), motilidade regulação e proliferação de células endoteliais e consequente germinação em frasco. miR-126 tem dois alvos validados envolvidos no processo angiogênico, domínio de EVH1 relacionado a Sprouty contendo proteína (Spred1) e uma subunidade reguladora de PI3K, ambos os reguladores negativos da sinalização VEFG/FGF. Células endoteliais faltosas em miR-126 não respondem aos sinais angiogenéticos. Knockdown de miR-126 no peixe-zebra resultou na perda da integridade vascular e hemorragia durante o desenvolvimento embrionário (Fish et al., 2008), enquanto exclusão de miR-126 em camundongos provoca constrição dos vasos com vazamentos, hemorragias e letalidade embrionária parcial, devido a uma perda da

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80/97 integridade vascular e defeitos na proliferação das células endoteliais, migração e angiogênese (Wang et al., 2008).

[000160] Em resumo, miR-126 é expresso em níveis biologicamente relevantes em células endoteliais angiogênicas, bem como célulastronco hematopoiéticas e sua progênie imediata. Curiosamente, a expressão de miR-126 é outro fator que as células endoteliais e HSC têm em comum. Na verdade, durante o desenvolvimento embrionário, o aparecimento simultâneo de células endoteliais e hematopoiéticas (glóbulos vermelhos) no saco vitelino, e o surgimento sucessivo de células HSC e endoteliais na região aorta-gonado-mesonefro (AGM) sublinham a origem comum de essas duas linhagens, resultantes de uma população celular chamada hemangioblasto. Não surpreendentemente, há uma lista crescente de genes, originalmente pensada para ser exclusivamente expressa no endotélio vascular, que apareceu no HSC e fatores de transcrição e receptores de membrana, tal como o receptor Tie2, Sca-1, VEGFR-(Flt-1), VEGFR-(Flk-1) e CD31. [000161] Dada a associação anatômica e funcional entre microvasculatura e HSC através do desenvolvimento e na medula óssea de adultos, miR-126 pode contribuir para a homeostase do nicho hematopoiético e regula a proliferação de ambos os seus componentes endoteliais e HSC.

Interferência de LV regulado por miRNA com função de miRNA [000162] Uma preocupação quanto à exploração da regulação miRNA é a possibilidade de interferir com a regulação dos lavos miRNA naturais que sobre-expressam transcrições contendo sequências alvo miRNA. A fim de compreender a biologia e a segurança de LV regulado por microRNA, quantificou-se a dose necessária para saturar uma atividade de miRNA (Gentner et al., 2009). Medir a perda de regulação dos repórteres sensíveis e um alvo miRNA naturais ao desafiar as células com doses crescentes de transcrições contendo sequências alvo

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81/97 miRNA, constatou-se que o limite para interferir com a regulação fisiológica de miRNA é geralmente elevado e só pode ser alcançado durante a condução de expressão a partir de promotores virais fortes. Sequências alvo miRNA expressas a partir de um promotor moderado como o promotor fosfoglicerato quinase (PGK) não saturam a atividade de miRNA, mesmo com elevado número de cópias de vetor (até 50 integrações). Isto sugeriu que a regulação miRNA poderia ser explorada de forma segura para a terapia genética HSC ao expressar a transcrição miRNA regulada a partir de um promotor moderado e de um número limitado de integrações por célula. No entanto, constatou-se que lentivirais podem ser projetados para deliberadamente interferir com a atividade de miRNA e, portanto, ser usados como uma ferramenta para caracterizar função de miRNA.

[000163] Ao sobre-expressar sequências de miRNA alvo a partir dos promotores fortes, demonstrou-se que a atividade de miRNA poderia ser saturada, resultando na perda da regulação dos alvos naturais para aquela miRNA 126. Além disso, constatou-se que a saturação pode ser favorecida alterando o projeto de nossas sequências alvo. Para os nossos vetores reguadores de genes, tais como os descritos nesta tese, explorou-se sítio de ligação de miRNA perfeitamente complementares que resultam principalmente na degradação do mRNA transcrito (vide figura 2c), similar ao modo de ação do siRNA (Brown et al., 2007). Como este processo está ocorrendo com cinética rápida (Haley et al., 2004), o complexo de miRNA-RISC, na verdade funciona como uma enzima com alta taxa de rotatividade, o que o torna inerentemente difícil de ser saturado. Por outro lado, ao introduzir uma incompatibilidade entre os nucleotídeos 9 e 11 do miRNA para a sequência alvo miRNA, a degradação de transcrição é prejudicada 57, redirecionando o complexo miRISC/mRNA para o percurso de repressão translacional que também é usado principalmente por miRNAs naturais em células

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82/97 animais. Uma vez que a repressão de translação provavelmente ocorre em um ritmo mais lento do que a degradação, mostrou-se que alvos imperfeitos foram mais eficiente em bloquear competitivamente a atividade de miRNA com relação a alvos perfeitamente complementares (Gentner et al., 2009). De forma importante, a tecnologia baseada em vetor lentiviral permite a integração estável de cassetes de expressão projetados para knockdown miRNA no genoma, representando assim uma plataforma, que permite a interferência com a atividade estável miRNA. Explorou-se com êxito essa tecnologia para obter um knockdown estável de miR-223. Camundongos transplantados com células BM transduzidas com um vetor knockdown miR-223 para número de cópias de vetor elevado resultou em uma expansão de células mieloides, sugerindo que o miR-223 atua sobre precursores de granulócitos de monócitos como um regulador negativo da mielopoese. Além disso, encontrou-se patologia pulmonar inflamatória em camundongos que foram reconstituídos com BM contendo o vetor knockdown miR-223, sugerindo funções adicionais de miR-223 na regulação de células inflamatórias mieloide (Gentner et al., 2009). Surpreendentemente, estes camundongos fenocopiaram uma linhagem de camundongo miR-223 knockout recentemente descrita (Johnnidis et al., 2008). Além de nocautes genéticos, estudos de perda de função de miRNA foram limitados até agora para transfecção transitória de moléculas miRNA antisentido quimicamente modificadas chamadas antagomirs (Krutzfeldt et al., 2005). Apesar de eficaz, seu uso está limitado às células, que podem facilmente ser transfectadas, que não é o caso para a maioria das células primárias. Além disso, o knockdown é transitório e, portanto, não facilmente aplicável a sistemas de modelo genético. Encarou-se amplas aplicações para LV mediar knockdown miRNA estável. Elas constituem ferramentas importantes para investigar o papel fisiológico do miRNA.

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Aplicações de vetores regulados por microRNA para terapia genética de células-tronco hematopoiéticas [000164] O padrão de expressão do gene repórter que descreveu-se neste trabalho também tem implicações relevantes para a terapia de gene. A maioria das construções de terapia genética clínica contém expressão de promotores que garantem a expressão robusta do transgene nos tipos de célula alvo, mas também resultam em expressão sem alvo. Esta expressão ectópica pode resultar em toxicidade, contrasseleção de células modificadas por gene, desencadeamento de uma resposta imune contra o produto transgene, ou mesmo a transformação oncogênica (Weil et al., 1997; Ott et al., 2006; Brown et al., 2006; Brown et al., 2007;. Woods et al., 2006).

[000165] Adicionar sequências de miR-223 alvo à um transgene terapêutico entregue a HSC impediria expressão na progênie mieloide, incluindo progenitores de granulócitos e monócitos e pelo menos uma subfração de HSC. De forma importante, essa estratégia resultaria na expressão terapêutica integral na linhagem de células linfoides e vermelhas.

[000166] A identificação de miR-126, que é fortemente expresso em HSPC, mas não na progênie diferenciada da linhagem mieloide e linfoide, permite impedir a expressão de um transgene potencialmente tóxico nas populações de células-tronco sensíveis, mantendo a expressão e a eficácia terapêutica na progênie doente.

Toxicidade de expressão GALC de novo [000167] Substituição de enzimas e aplicações de terapia genética em pacientes LSD (Rohrbach et al., 2007; Brady et al., 2004) e em modelos animais (Biffi et al., 2006; Sano et al., 2005; Hofling et al., 2004; Sands et al., 1997) geralmente têm demonstrado a falta de toxicidade da administração da enzima lisossomal e expressão acima dos níveis normais. No caso de Leucodistrofia Metacromática (MLD), a segurança

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84/97 da sobre-expressão de ARSA mediada por LV, catalisando a etapa a montante de GALC no metabolismo de sulfatida, foi demonstrada em mHSPC, hHSPC e camundongos transgênicos (Biffi et al., 2004.; Capontondo et al., 2007), o que levou os testes clínicos de terapia genética de HSPC para esta doença. Aqui, relatou-se a constatação inesperada de toxicidade evidente e comprometimento funcional in vitro e in vivo da HSPC de murinos e humanos após transferência e expressão de genes GALC mediada por LV. HSPC de murino transduzida por GALC.LV mostrou potencial clonogênico prejudicado e falha em enxertar e repovoar em longo prazo destinatários transplantados mieloablatstados. Isso foi associado à seleção negativa e apoptose de HSPC altamente transduzida. A falta de apoptose e comprometimento funcional observados em HSPC de murinos e humanos, transduzidos com um vetor de controle em que a expressão GALC é regulada pelo microRNA (Mechtcheriakova et al., 2007). (Exclusivamente expresso em células da linhagem hematopoiética) ((Brown et al., 2006), confirmaram o papel único de GALC expresso em determinar a morte das células transduzidas.

Células diferenciadas são menos sensíveis à toxicidade relacionada com GALC [000168] Percebeu-se que células diferenciadas da linhagem hematopoiética (linfócitos, monócitos, macrófagos e microglia) e células de outras linhagens (oligodendrócitos, bem como progenitores neurais) (Gritti et al., Personal Communicaition), não são afetados por sobreexpressão de GALC mediada por LV. Portanto, HSPC parece ter uma sensibilidade única para controle mediado por GALC e esfingolipídio por célula de sobrevivência, que é aparentemente perdida durante a diferenciação mieloide nas células T e B maduras, e que é restrita à linhagem hematopoiética. Uma possível explicação para isso, pode ser a atividade GALC basal muito baixa detectada em HSPC, em

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85/97 comparação com outros tipos de células, tais como microglia ou oligodendrócitos. Além disso, o papel do metabolismo de esfingolipídios e as consequências de uma alteração no conteúdo de Cer e moléculas derivadas, tais como So e S1P, pode variar de acordo com os tipos de células e os estágios de diferenciação. Por exemplo, o efeito de acumulação intracelular Cer em oligodendrócitos foi estudado em profundidade, com resultados conflitantes. Um estudo recente relatou que a indução da esfingomielinase ácida, que é responsável pela produção de Cer a partir da degradação esfingomielina, resultou na acumulação de Cer e indução de apoptose (Chudakova et al., 2008). O mesmo caminho parece estar envolvido na morte da célula oligodendrocítica induzida pelo estresse oxidativo ou por acúmulo de peptídeo beta-amiloide na doença de Alzheimer (Jana et al., 2007; Lee et al., 2004). No entanto, oligodendrócitos maduros também foram descritos como sendo resistentes a alguns estímulos pró-apoptóticos, induzindo acúmulo de Cer. Da mesma forma, uma resposta diferencial à estimulação de TNF pró-apoptótica foi observada em precursores oligodendrocíticos, onde um alto nível de apoptose foi observado e em oligodendrócitos maduros, que pareciam ser resistentes à estimulação apoptótica (Scurlock et al., 1999). Oligodendrócitos maduros são também resistentes à apoptose induzida por administração de IL-1 (Brogi et al., 1997). Isto sugere que o aumento da Cer intracelular pode ser gerido de formas diferentes, de acordo com as vias ativadas naquele tipo de célula em particular e naquele estágio de diferenciação particular. Suportando esta hipótese, foi relatado que o aumento da Cer intracelular no tecido neural, é gerido pela atividade elevada de ácido ceramidase (Huang et al., 2004). Esta enzima catalisa a degradação de Cer para So, que, por sua vez, é fosforilada para S1P. S1 P resgata as células de apoptose induzida por Cer (Betito et al., 2006) e induz a proliferação de células progenitoras neurais (Harada et al., 2004).

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Poderia ser hipotetizado que um mecanismo semelhante foi o responsável pela sensibilidade reduzida de oligodendrócitos para sobreexpressão GALC relacionada com a apoptose. A via metabólica de esfingoliípdeo também é muito ativa em oligodendrócitos, que são envolvidos na mielinização, a fim de produzir os glicoesfingolipídios de mielina (GalCer e Sulfatide). Além disso, essas moléculas participam de interações carboidratos em carboidratos, formando glicosinapses (para uma revisão vide (Boggs et al., 2008).

[000169] A sensibilidade reduzida a apoptose induzida por expressão de GALC de novo observada em monócitos e macrófagos pode ser explicada tanto pela atividade de ceramidase e sua ação secretora. Relatórios mostram que, em células endoteliais e células do sistema imunológico, Cer é rapidamente convertido em So e S1P, que são secretados. No plasma, estas moléculas se ligam a albumina e agem como sinais para os receptores específicos dos linfócitos (para uma revisão vide 78 143Hannun 142 et al., 2008; Mechtcheriakova et al., 2007; Rivera et al., 2008).

Regulação pós-transcricional da expressão GALC para a terapia genética segura e eficaz de GLD [000170] A regulação da expressão do transgene é de grande interesse no campo da terapia genética. Em particular, a possibilidade de regulação pós-transcricional por micro RNA (miRNA), foi recentemente aberta novas perspectivas para ajustar o nível de expressão do transgene, de acordo com tipo de célula e diferenciação (Gentner et al., 2008). Neste estudo, aplicou-se essa tecnologia inovadora, a fim de suprimir a expressão GALC em HSPC, que têm se mostrado as células mais sensíveis à toxicidade de sobre-expressão GALC, permitindo a sobre-expressão da enzima nas células diferenciadas, que são responsáveis por secreção GALC e correção cruzada de oligodendrócitos. Em particular, foram selecionados o

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87/97 microRNA126, que foi relatado ser mais altamente expresso em HSPC, em comparação com as células mononucleares do sangue periférico 145. Nossos dados demonstraram que a regulação da expressão GALC por miRNA126 específico de HSC, protege HSPC de apoptose induzida por GALC de novo in vitro e Transdução de GALC -/- HSPC com GALC.miR126T.LV permitiu a reconstituição da atividade enzimática em sua progênie diferenciada em níveis supra-fisiológicos, sem prejudicar o potencial clonogênico dos progenitores multipotentes, avaliados pelo ensaio CFC. Estes dados confirmaram que miRNA126 suprime a expressão GALC apenas em HSPC e não em sua progênie diferenciada. O potencial clonogênico afetado pode indicar que a expressão GALC é reprimida não só em HSC, mas também em células progenitoras multipotentes responsáveis pela formação das colônias hematopoiéticas em ensaio de CFC.

[000171] Além disso, o transplante de HSPC transduzidas por GALC.miR126T.LV em camundongos GALC +/-FVB/twi, resultou na sobrevivência a longo prazo dos animais tratados. Estes dados demonstram que a supressão da atividade GALC em HSC mais primitiva por miRNA126, permite o seu repovoamento de longo prazo e potencial de diferenciação, ser preservado. A presença de células altamente transduzidas na BM 10 semanas após o transplante, confirmou ainda que HSC de longo prazo foi resgatada de apoptose de sobre-expressão GALC.

[000172] Importante, a regulação pós-transcricional por miRNA específico de HSC, permitiu o uso de um promotor forte, tal como PGK, atingindo assim o mesmo nível de expressão do transgene na progênie diferenciada de HSPC, como aquele obtido com PGK_GALC.LV não regulado. Como discutido acima, o nível de expressão GALC necessário para a terapia genética de HSC para ser eficaz, não é conhecido. No entanto, mesmo se um baixo nível de expressão de enzima puder ser

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88/97 suficiente para obter um benefício clínico, o uso de um forte promotor pode permitir que o número de cópias do vetor seja reduzido, mas alcance a expressão enzimática desejada. Esta questão poderia ser relevante para a segurança de tradução clínica da terapia genética de HSC.

CONCLUSÕES [000173] A plataforma de vetor lentiviral representa uma ferramenta versátil e muito útil para estudar a função de microRNA. Os vetores repórteres de miRNA bidirecionais desenvolvidos permitem medir a atividade de miRNA no nível de célula única em misturas complexas de célula, acrescentando uma nova dimensão a abordagens de estudo de perfil de expressão de miRNA convencionais. Usando essa abordagem, dissecou-se a expressão de vários miRNAs em populações de células tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) com resolução sem precedentes. Mudar promotor e projeto de alvo miRNA pode resultar em lentivirais capazes de realizar knockdown miRNA estável, útil para gerar a perda de função de fenótipos como base para elaborar o papel fisiológico de um miRNA. Análise proteômica após knockdown de miRNA estável permitirá a identificação de objetivos-chave para que miRNA sejam modulados no cenário natural.

[000174] Além de abordar estas questões de biologia básica, vetores regulados por miRNA têm potencial terapêutico significativo. Adicionadas ao 3'UTR de um transgene terapêutico, sequências alvo de miRNA podem reduzir a expressão do transgene ectópico e, assim, aliviar ou evitar a toxicidade de transgene. Em particular, a biologia de células tronco hematopoiéticas (HSC) não deve ser perturbada pelo tratamento de terapia genética, como HSC representa o mantedor de correção da doença de longo prazo através do fornecendo contínuo de células-filhas modificadas por gene. Os miRNAs caracterizados aqui, expressão do transgene restrito a miR-126, miR-130a e miR-223 não

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89/97 desejados em HSPC, enquanto permite na progênie diferenciada, e continuará a ser desenvolvida em protocolos clínicos de terapia genética.

[000175] Cada um dos pedidos e patentes mencionados neste documento, e cada documento citado ou referenciado em cada um dos pedidos e patentes acima, inclusive durante o julgamento de cada um dos pedidos e patentes (documentos citados em pedido ) e quaisquer instruções do fabricante ou catálogos para todos os produtos citados ou mencionados em cada um dos pedidos e patentes e em qualquer um dos documentos citados em pedidos, são pelo presente aqui incorporados por referência. Além disso, todos os documentos citados neste texto, e todos os documentos citados ou referenciados em documentos citados neste texto, e instruções de qualquer fabricante ou catálogos para todos os produtos citados ou mencionados neste texto, são pelo presente aqui incorporados por referência.

[000176] Várias modificações e variações dos métodos descritos e sistema da invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica sem se afastar do escopo e espírito de invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades preferidas específicas, deve-se compreender que a invenção, tal como alegada não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para a realização da invenção que são óbvias para aqueles especializados em biologia molecular ou áreas afins têm a intenção de estar dentro do escopo das reivindicações.

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Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uso de um vetor de genes, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento de terapia gênica para prevenir ou reduzir a expressão de um transgene em uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética, mas não em uma célula diferenciada, em que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo de miRNA correspondendo a mir-130a e mir-126 operavelmente ligado a um transgene, em que o transgene codifica para interferon-alfa, a enzima lisossomal galactocerebrosidase ou gp91 phox.
2. 2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende pelo menos uma sequência alvo de miRNA correspondendo a mir-130a e pelo menos uma sequência alvo de miRNA correspondendo a mir-126.
3. 3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o número de cópias da sequência alvo de miRNA correspondendo a mir-130a é duas vezes o número de cópias da sequência alvo de miRNA correspondente a mir-126.
4. 4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   3, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral.
5. 5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   4, caracterizado pelo fato de que o vetor é derivável a partir de um lentivírus.
6. 6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   5, caracterizado pelo fato de que o vetor inclui um promotor de tecido específico.
7. 7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o promotor de tecido específico é um promotor CD11b, cFes, CYBB ou TEK.
8. 8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

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   7, caracterizado pelo fato de que o promotor de tecido específico é um promotor mieloide específico.
9. 9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   8, caracterizado pelo fato de que o transgene é interferon-alfa e o vetor compreende um promotor TEK (Tie2).
10. 10. Uso de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento de terapia gênica para prevenir ou reduzir a expressão de um transgene em uma célulatronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética, mas não em uma célula diferenciada, em que a composição farmacêutica compreende o vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
11. 11. Uso de uma célula, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento de terapia gênica para prevenir ou reduzir a expressão de um transgene em uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoéitica, mas não em uma célula diferenciada, em que a célula foi infectada ou transfectada com o vetor, como definido em qualquer umas das reivindicações 1 a 9.
12. 12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética.
13. 13. Uso de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar uma doença selecionada de Leucodistrofia Celular Globoide, Doença Granulomatosa Crônica, Imunodeficiência Combinada Severa (SCID) e tumores sólidos.
14. 14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para aumentar as chances de sobrevivência de uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética em relação à

    Petição 870190140146, de 27/12/2019, pág. 110/117

    3/3 terapia genética.
15. 15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para aumentar a segurança e/ou eficácia da terapia gênica.
16. 16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para prevenir apoptose de célula-tronco hematopoiética ou de célula progenitora hematopoiética, em que a apoptose é causada pela expressão do transgene.
17. 17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para terapia de célula hematopoiética.