MX2012013144A - Agonistas mejorados de receptor de muerte. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos y composiciones para el tratamiento de cáncer en pacientes humanos que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de polipéptido Fc de DR5 que tiene alta afinidad por FCGR3A. Se proporcionan métodos de elaboración de los polipéptidos Fc.

Description

AGONISTAS MEJORADOS DE RECEPTOR DE MUERTE CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con composiciones y métodos para mejorar el beneficio clínico obtenido de los agonistas de receptor de muerte en el tratamiento de cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La interacción entre el receptor 5 de muerte (DR5, por sus siglas en inglés) o el receptor 4 de muerte (DR4, por sus siglas en inglés) y su ligando que induce apoptosis de receptor TNF (TRAIL, por sus siglas en inglés juega un papel clave en la inducción de apoptosis de las células. TRAIL, también conocido como ligando Apo2, es un ligando homotrimérico que interactúa con cuatro miembros de la superfamilia del receptor TNF (receptores 1 a 4 de TRAIL) así como el receptor de osteoprotegerina soluble (OPG, por sus siglas en inglés) . La unión de TRAIL a DR4 o DR5 en la superficie de una célula cancerosa sensible activa una cascada apoptósica que primero requiere un proceso de reticulación para ejercer su efecto. La reticulación se considera que induce formación de grupos de los receptores de muerte y activación de la cascada de señalización lo que resulta en la inducción de apoptosis. Este proceso es mediado in vivo por el receptor Fcy IIIA (FCGR3A, por sus siglas en REF. : 236820 inglés) el cual se expresa principalmente en células citoliticas naturales (NK, por sus siglas en inglés) y, en menor grado en macrófagos. Cuando se agrupan, las proteínas intracelulares se reclutan al dominio de muerte intracelular del receptor, formando un complejo de señalización. A su vez, algunas caspasas intracelulares después se reclutan al complejo caracterizado porque se autoactivan y, a su vez, activan caspasas adicionales y la cascada de apoptosis intracelular lo que lleva a muerte celular. El reconocimiento del potencial terapéutico de apoptosis en el tratamiento del cáncer, los investigadores han desarrollado una diversidad de anticuerpos antagonistas para DR5 y DR . Lo que se necesita en el ámbito es un medio para mejorar adicionalmente el beneficio clínico de los agonistas de DR.

SUMARIO DE IA INVENCION En un aspecto, la presente invención se relaciona con Fc-polipéptido de alta afinidad agonística, tales como anticuerpos o pepticuerpos (peptibodies) que se unen específicamente a células que expresan DR4 y/o DR5 humano y que inducen apoptosis en células sensibles a inducción por apoptosis tales como células cancerosas humanas o células infectadas con virus. El Fe del Fe polipéptido de la invención tiene afinidad aumentada por el receptor FCGR3A en relación a Fe nativa. En algunas modalidades, el Fc-polipéptido es un anticuerpo IgGl completamente humano.

En algunas modalidades, el Fe está afucosilado o modificado en la posición 332 (por el índice EU de Kabat) .

La presente invención también incluye un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa humana in vitro o in vivo mediante la administración de una cantidad eficaz de un Fc-polpéptido de alta afinidad de la invención. En algunas modalidades, el Fc-polipéptido de alta afinidad se administra a un paciente humano que comprende el cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pulmonar amicrocítico . En algunas modalidades, el Fc-polipéptido se administra como monotratamiento mientras que en otras modalidades se administra con uno o más agentes quimioterapéuticos tales como carboplatino en combinación con paclitaxel. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un medio para seleccionar un paciente con cáncer humano, con probabilidad estadística aumentada de obtener un beneficio clínico a partir del traamiento con un Fc-polipéptido de alta afinidad de la invención. El paciente seleccionado es heterocigoto u homocigoto para el alelo F158 de FCGR3A. También se proporcionan composiciones y métodos para determinación de genotipo del polimorfismo FCGR3A en una muestra de ADN genómico humano.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En parte, la presente invención se relaciona con Fc-polipéptidos de alta afinidad que agonizan con DR5 (o DR4) en que se unen específicamente a DR5 (y/o DR4) sobre células humanas y que inducen apoptosis en células sensibles a inducción apoptósica mediada por DR5 (y/o DR4) . Se ha reportado que algunos anticuerpos de alta afinidad mejoran la citotoxicidad mediada por células, dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) . No obstante, de modo sorprendente, también se incrementa la actividad anticancerígena de los Fc-polipéptidos apoptósicos de la presente invención.

Los encabezados de sección se utilizan en la presente únicamente con propósitos de organización y no se deben considerar de modo alguno como limitantes de la materia objeto que se describe. La descripción de todas las patentes, solicitudes de patentes u otros documentos mencionados en la presente se incorporan expresamente en este documento como referencia en su totalidad. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con los procedimientos de laboratorio y técnicas de química analítica, química orgánica de síntesis y química medicinal y farmacéutica descritos en la presente son aquellos bien conocidos y utilizados habitualmente en el ámbito. Las técnicas estándar se pueden utilizar para síntesis química, análisis químico, preparaciones farmacéuticas, formulaciones y suministro y el tratamiento de pacientes.

DEFINICIONES Los términos usados en esta descripción se definen como sigue, a menos que se limite en otro sentido en instancias especificas.

El término "afucosilación" o "afucosilado" en el contexto de un Fe se refiere a una carencia sustancial de una fucosa unida covalentemente, directa o indirectamente, al residuo 297 de Fe de IgGl humana numerada de acuerdo con el índice EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, d. (1991)), o el residuo correspondiente en inmunoglobulinas que no son IgGl o que no son IgGl humanas. Así, en una composición que comprende una pluralidad de Fc-polipéptidos afucosilados por lo menos 70% de los Fc-polipéptidos no estarán fucosilados, directa o indirectamente (por ejemplo, por medio de azúcares intermedios) en el residuo 297 de Fe y en algunas modalidades por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% ó 99% no estarán fucosilados directa o indirectamente en el residuo 297 de Fe.

El término "agonista" o "agonístico" o "que es agonista" en el contexto de un Fc-polipéptido se refieren a una inducción de apoptosis mediada por DR4 y/o DR5 en una célula cancerosa de mamífero sensible a apoptosis, tal como una célula cancerosa humana, la cual expresa DR4 y/o DR5 sobre la superficie celular. Una célula cancerosa humana sensible ejemplar es Colo205 (ATCC CCL-222) . Un agonista de DR5 inducirá apoptosis via DR5, un agonista DR4 inducirá apoptosis via DR4, un agonista doble, DR5/DR4 (por ejemplo, el ligando TRAIL o un anticuerpo anti-DR4/DR5 agonista biespecifico) es capaz de inducir apoptosis a través de ambos, DR4 y/o DR5. Cuando la inducción apoptósica es mediada via DR5 y/o DR4 se puede determinar utilizando métodos y reactivos conocidos en el ámbito. Asi, por ejemplo, las lineas de células especificas DR sensibles a apoptosis se conocen en el ámbito. Una linea de células DR5 (+) /DR4 (-) ejemplar es WM35 (ATCC CRL-2807) . Una linea de células DR5(-)/DR(+) ejemplar es ST486 (ATCC CRL 1647).

El término "anticuerpo" incluye referencia a formas aisladas de inmunoglobulinas glucosiladas y no glucosiladas de cualquier isotipo o subclase que incluyen cualquier combinación de: 1) anticuerpos humanos (por ejemplo injertados por CDR) , humanizados y quiméricos, 2) anticuerpos monoespecificos (por ejemplo, DR5 o DR4) o multiespecificos (por ejemplo, DR4 y DR5), y 3) anticuerpos monoclonales o policlonales sin importar si tales anticuerpos son producidos, en su totalidad o en parte, por inmunización, a través de tecnología recombinante, por medio de un medio de síntesis in vitro o por algún otro medio. De esta manera, el término "anticuerpo" incluye a anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejepmlo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir del mismo, (b) anticuerpos aislados de una célula hospedadora transfectada para expresar el anticuerpo (por ejemplo, a partir de un transíectoma) , (c) anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante, combinatoria de anticuerpos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por otros medios que involucran el empalme de secuencias de genes para inmunoglobulina u otras secuencias de ADN. Los anticuerpos también son incluyentes de fragmentos de anticuerpos tales como Fab, F(ab' )2, scFv (Fv de cadena sencilla) y derivados tales como diacuerpos (diabodies) . En algunas modalidades, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales tales como anticuerpos monoclonales humanizados o completamente humanos. Típicamente, los anticuerpos de la presente invención serán anticuerpos de la subclase IgGl o Ig2. El anticuerpo se puede unir a su objetivo con una Kd de menos de aproximadamente 10 nM, 5 nM, 1 nM o 500 pM.

Los términos "derivación" o "derivados" se refieren a una modificación de un Fc-polipéptido (tal como un anticuerpo) y/o agente quimioterapéutico al unirlo covalentemente, directa o indirectamente, de manera que modifiquen sus características tales como vida media, biodisponibilidad, inmunogenicidad, solubilidad o propiedades de hipersensibilidad mientras que retienen su efecto terapéutico. Los derivados se pueden elaborar por glucosilación, pegilación y lipidación o por conjugación con proteínas. Los agentes derivatizantes ejemplares incluyen un polímero lineal (por ejemplo polietilenglicol (PEG), polilisina, dextrano, etc.); un polímero de cadena ramificada (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,289,872 para Denkenwalter et al., expedida el 15 de septiembre de 1981; patente de E.U.A. No. 5,229, 490 para Tam, expedida el 20 de julio de 1993; WO 93/21259 por Frechet et al., publicada el 28 de octubre de 1993) ; un lípido o liposoma; un grupo colesterol (tal como esteroide) ; un carbohidrato u oligosacárido .

Los términos "DR4" o "receptor 4 de muerte" o "TRAIL-R1" o "TR-1" se refieren a un polipéptido de 468 aminoácidos como se establece en la SEC ID NO: 2 de la patente de E.U.A. No. 6,342,363 (incorporado en la presente como referencia) así como los polipéptidos humanos nativos (es decir, naturales) relacionados tales como variantes alélicas, variantes de empalme y formas maduras del polipéptido (es decir, que carecen de una secuencia líder) .

Los términos "DR5" o TRAIL-R" o "Apo-2" o "TR-2" o "TRAIL Receptor-2" se refieren al polipéptido de 440 aminoácidos que se establece en la SEC ID NO: 2 de la patente de E.U.A. No. 7,528,239 así como los polipéptidos humanos nativos (es decir, naturales) relacionados tales como las variantes alélicas o variantes de empalme tales como, pero sin limitarse a la isoforma de 441 aminoácidos que se establece en la SEC ID NO: 1 en la patente de E.U.A. No. 6, 342,369 y en la SEC ID NO: 2 de la patente de E.U.A. No. 6,743,625 (cada patente se incorpora en la presente como referencia) que incluyen las formas maduras del polipéptido (es decir, que carecen de una secuencia líder) .

Los términos "agonista de DR5" se refiere a una molécula que se une específicamente a DR5 humano nativo sobre células que lo expresan y por medio de este receptor activa una cascada apoptósica que resulta en un incremento estadísticamente significativo en la muerte celular (es decir, apoptosis) medido en por lo menos una línea de células sensibles al agonista DR5 (que incluye pero que no se limitan a la línea de células de carcinoma de colon humano Coló 205 o la línea de células de carcinoma de pulmón humano H2122) . El término "agonista de DR4" se refiere a una molécula que se une específicamente a DR4 humano nativo sobre células que lo expresen y vía este receptor activa una cascada apoptósica que resulta en un incremento estadísticamente significativo en muerte celular (es decir, apoptosis) medido en por lo menos una línea de células sensibles a agonista DR4 (que incluye, pero que no se limita a línea de célula de carcinoma de colon humano Coló 205 o la línea de célula de carcinoma de pulmón humano H2122) . En algunas modalidades, el agonista DR5 y/o DR4 es un Fc-polipéptido tal como un anticuerpo, pepticuerpo (peptibody) , TRAIL humano (véanse las patentes de E.U.A. Nos. 6,284,236; 6,998,116, ambos de los cuales se incorporan en la presente como referencia) , fusión del ligando Fc-humano TRAIL o una molécula no polimérica, no proteinácea de menos de aproximadamente 1000 Daltones (una "molécula pequeña") tal como por ejemplo, el agonista de molécula pequeña DR5 de USSN 11/866,162 (Srivastava et al.) o un Fe unido covalentemente a una molécula pequeña DR5.

Los términos "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren a una cantidad y/o concentración de un Fc-polipéptido que, cuando se administra ex vivo (en contacto con una célula cancerosa de un paciente humano) o in vivo (por administración en un paciente humano) para tratamiento de un cáncer sensible a DR5 (y/o DR4) ya sea solo (es decir, como monoterapia) o en combinación con un agente quimioterapéutico (es decir, como un tratamiento combinado) proporciona inhibición estadísticamente significativa de progreso de cáncer. Como se utiliza en la presente, los términos "tratamiento" o "inhibir", "inhibiendo" o "inhibición" de cáncer se refiere a por lo menos uno de: una disminución estadísticamente significativa en la velocidad de crecimiento de tumor, o cese del crecimiento de tumor o una reducción en el tamaño, masa, actividad metabólica o volumen del tumor, medido por criterios estándar tales como, pero sin limitarse a Criterios de Evaluación de Respuesta para Tumores Sólidos (RECIST, por sus siglas en inglés) o un incremento estadísticamente significativo en la supervivencia sin progreso (PFS, por sus siglas en inglés) o la supervivencia general (OS, por sus siglas en inglés) .

El término "Fe" en el contexto de un "Fc-polipéptido" se refiere al Fe (fragmento cristalizable) de una inmunoglobulina que se une específicamente a FCGR3A humano. Un Fe es un Fe de IgGl humana generalmente como se encuentra de manera natural ("nativa") pero que también incluye formas truncadas de Fe de IgGl ("Fe truncada") que se unen específicamente a FCGR3A, o variantes de Fe IgGl como se encuentra de modo natural ("variantes de Fe") elaboradas por sustitución, supresión o adición de residuos aminoácidos caracterizado porque el Fe variante se une específicamente a FCGR3A. Un Fe truncado puede ser por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de Fe de longitud completa. El número de sustituciones, supresiones o adiciones de un Fe truncado o una variante de Fe puede ser de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ó 20. La unión específica de Fe truncado o una variante de Fe para FCGR3A generalmente es de por lo menos 80%, 85%, 90% ó 95% de unión específica de Fe nativa .

Los términos "FCGR3A" o "CDl6a" "receptor IIIA de FCY" O "FCYRIIIA" significa el receptor Fe humano de la misma designación. Se puede distribuir un polimorfismo bialélico del receptor IgG humano FCYRIIIA (CD16a) denominado "F158V" en virtud de la presencia del aminoácido valina (V) o fenilalanina (F) en el locus identificado en la base de datos del polimorfismo de nucleótido único (SNP, por sus siglas en inglés) del National Center for Biotechnology Information (NCBI) en el reporte de conjunto rs396991. Estas dos formas alélicas se denominan comúnmente en la literatura y en la presente como "valina 158" o "V158" para el polimorfismo que tiene el residuo valina en el locus SNP de rs396991 de FCYRIIIA humano y "fenilalanina 158" o "F158" para el polimorfismo que tiene el residuo fenilalanina en el locus SNP rs396991 de FcyRIIIA humano. Véase también Leppers-van de Straat et al., J. Immunological Methods, 242: 127-132 (2000) y Ravetch y Perussia, J. Exp. Med., 170:481-497 (1989).

El término " Fc-polipéptido" se refiere al producto de una unión covalente entre un Fe y por lo menos un polipéptido que se une específicamente a DR4 y/o DR5. La fusión de Fe y el polipéptido puede ser vía un enlace covalente directo (vía un enlace peptídico) o enlace covalente indirecto (vía un enlace químico hecho por el hombre.

Típicamente, el Fc-polipéptido es un Fc-polipéptido agonista. Los Fc-polipéptidos ejemplares incluyen, anticuerpos, pepticuerpos (peptibodies ) ( O 2000/24782, incorporada en la presente como referencia) , anticuerpos conjugados a péptidos dirigidos (véase, por ejemplo, el documento de E.ü.A. 7,521,425, incorporado en la presente como referencia) o una citotoxina o una fusión de ligando Fc-humano TRAIL. En algunas modalidades, el Fc-polipéptido es divalente. En algunas modalidades, el Fc-polipéptido es divalente y específico. En algunas modalidades, el Fc-polipéptido es un homodímero que comprende dos Fe de IgGl y en algunas modalidades el Fc-polipéptido es un heterodímero que comprende un Fe de IgGl y un Fe diferente de IgGl. En algunas modalidades, el homodímero y los heterodímeros son anticuerpos completamente humanos.

El término "alta afinidad" en el contexto de un Fc-polipéptido significa que el Fe está modificado o construido de manera que se une específicament ea FCGR3A humano expresado por una célula nativa (por ejemplo una célula NK humana) que es homocigoto para el alelo F158 con por lo menos la misma afinidad que por lo menos uno de: un Fc-polipéptido humano idéntico para afucosilado (por ejemplo, un anticuerpo) o un Fc-polipéptido humano idéntico que comprende una modificación para incrementar la afinidad por FCGR3A en el residuo 332 (por el índice EU de Kabat; véase patente de E.U.A. No. 7,317,091 y/o la patente de E.U.A. No. 7,662,925) tal como una sustitución de isoleucina a ácido glutámico. Generalmente, un Fc-polipéptido de alta afinidad se une específicamente a FCGR3A humano con por lo menos la misma afinidad que el Fc-polipéptido fucosilado nativo que se une específicamente a FCGR3A humano expresado por una célula nativa homocigota para el alelo V158. En el ámbito se conocen los medios para medir la afinidad de unión e incluyen pero no se limitan a análisis de competencia tales como un análisis ELISA AlphaLISAMR (Perkin Elmer, altham, Mass. USA) ELISA assay. Véase, Poulsen, J. , et al. 2007. J. Biomol Screen. 12:240; Cauchon, E., et al. 2009. Anal Biochem.

El término "célula hospedadora" se refiere a una célula que puede ser utilizada para expresar un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico de la presente invención. Una célula hospedadora puede ser una procariota, por ejemplo E. coli, o puede ser una eucariota, por ejemplo una eucariota de una sola célula (por ejemplo, una levadura u otro hongo) , una célula vegetal (por ejemplo, una célula de tabaco o de planta de tomate) , una célula animal (por ejemplo, una célula humana, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón o una célula de un insecto) o un hibridoma. Los ejemplos de células hospedadoras incluyen células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) o sus derivados tales como Veggie CHO y lineas de células relacionadas las cuales crecen en medio sin suero (véase Rasmussen et al., Cytotechnology 28: 31, 1998) o CHO cepa DX-B11, la cual es deficiente en DHFR (véase Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1980) .

El término "anticuerpo humano" o "anticuerpo completamente humano" se refiere a un anticuerpo en el cual ambas de las regiones constantes y la infraestructura consisten de secuencias completa o sustancialmente humanas de manera que el anticuerpo humano típicamente no induce reacción inmunogénica sustancial contra sí mismo cuando se administra a un humano y, preferiblemente, no induce una respuesta inmunogénica detectable. De esta manera, los términos definidos contemplan modificaciones menores de aminoácidos (con frecuencia no mayores de 1, 2, 3 ó 4 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos) realizadas en relación a la secuencia de anticuerpo humano nativa para permitir, por ejemplo, formulación mejorada o susceptibilidad a fabricación (por ejemplo, eliminación de residuos cisteína no pareados) .

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo aislado en el cual sustancialmente la totalidad de la región constante se deriva o corresponde a inmunoglobulinas humanas mientras que la totalidad o parte de una o más regiones variables se derivan de otras especies, por ejemplo de un ratón.

El término "aislado" se refiere a un compuesto que: (1) está purificado sustancialmente (por ejemplo, por lo menos 60%, 70%, 80% ó 90%) separado de los componentes celulares con los cuales se mezcla en su estado expresado de manera que es la especie predominante presente, (2) está conjugado a un polipéptido o polinucleótido u otra porción a la cual no está unido en la naturaleza, (3) no se presenta en la naturaleza como parte de un polipéptido mayor o de una secuencia polinucleotidica (4) se combina con otros agentes químicos o biológicos que tienen especificidades diferentes en una composición bien definida, o (5) comprende una secuencia manipulada humana que de otra manera no se encuentra en la naturaleza.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo aisladas de composición molecular únicas (sin importar heterogeneidades menores que resulten, por ejemplo, de modificación postraduccional tal como glucosilación y/o separación de la secuencia de señal) , típicamente- codificados por la misma molécula de ácido nucleico. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta una especificidad de unión única y afinidad por un epítopo particular. En algunas modalidades, los anticuerpos monoclonales se producen por un hibridoma único u otra línea celular (por ejemplo, un transceptoma) o por un mamífero transgénico. El término "monoclonal" no se limita a un método particular para elaborar un anticuerpo.

El término "que se encuentra de modo natural" o "nativo" , cuando se utiliza en relación con materiales biológicos tales como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos , células hospedadoras y similares, se refiere a aquellas las cuales se encuentran en la naturaleza y no están modificadas por un humano.

Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótidos" se refieren a un polímero desoxirribonucleotídico o ribonucleotídico o quimeras de los mismos y, a menos que se limite en otro sentido, abarcan la cadena complementaria de la secuencia a la que se hace referencia. Una secuencia de ácido nucleico está "unida operablemente" a una secuencia reguladora si la secuencia reguladora altera la expresión (por ejemplo, el nivel, sincronización o ubicación de expresión) de una secuencia nucleica. Una "secuencia reguladora" es un ácido nucleico que afecta la expresión (por ejemplo el nivel, sincronización o ubicación de expresión) de un segundo ácido nucleico. De esta manera, una secuencia reguladora y una segunda secuencia están unidas operablemente si un enlace funcional entre la secuencia reguladora y una segunda secuencia es tal que la secuencia reguladora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) . Los ejemplos adicionales de secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA y Barón et al., Nucleic Acids Res. 23: 3605-3606, 1995.

Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente y se refieren a una molécula que comprende dos o más residuos aminoácidos unidos entre si por enlaces peptídicos. Los términos "polipéptidos" , "péptido" y "proteína" también incluyen modificaciones las cuales incluyen, pero no se limitan a glucosilación, unión lipídica, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación .

El término "pepticuerpo" (peptibody) se refiere a un péptido que se une específicamente a un objetivo designado y en el cual el péptido está unido covalentemente (por ¦ ejemplo, vía un enlace peptídico) a la parte terminal N o C de un Fe de anticuerpo tal como Fe de IgGl humana. La producción de pepticuerpos generalmente se describe en la publicación PCT WO 00/24782 publicada el 4 de mayo del 2000, incorporada en la presente como referencia. Los péptidos ejemplares se pueden generar por cualquiera de los métodos que se establecen en la presente tales como los transportados en una biblioteca peptidica (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fago) generado por síntesis química, derivado por digestión de proteínas o generado utilizando técnicas de ADN recombinante .

Los términos "fragmento de pepticuerpo" o "fragmento de anticuerpo" se refieren a un péptido o un pepticuerpo o anticuerpo el cual comprende un pepticuerpo o anticuerpo intacto menor que uno completo pero que retiene la capacidad de unirse específicamente a su molécula objetivo (es decir, DR5 o DR4 humano) . Los fragmentos ejemplares incluyen los fragmentos F(ab) o F(ab')2. Estos fragmentos pueden surgir, por ejemplo, a partir de un corte en la parte amino terminal, un corte en la parte carboxilo terminal y/o una supresión interna de uno o varios residuos de la secuencia de aminoácidos. Los fragmentos pueden resultar de empalme alternativo de ARN o a partir de actividad de proteasa in vivo o in vitro. Estos fragmentos también se pueden construir por métodos de síntesis peptidica química o por modificación de un polinucleótido que codifica para un anticuerpo o pepticuerpo.

Los términos "polinucleótido", "oligonucleótido" y "ácido nucleico" se utilizan de manera intercambiable en la presente e incluyen moléculas de ADN (por ejemplo ADNc o ADN genómico) , moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) e híbridos de las mismas. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de cadena doble.

El término "se une específicamente" se refiere a la capacidad de un Fc-polipéptido de la presente invención, bajo condiciones de unión específicas, para unirse a un objetivo (por ejemplo, DR5 humano, DR4 humano o FCGR3A humano) de manera que su afinidad es por lo menos 10 veces tan grande, pero opcionalmente 50 veces tan grande, 100, 250 ó 500 veces tan grande o incluso por lo menos 1000 veces tan grande como la afinidad promedio de la misma molécula a una colección de péptidos o polipéptidos aleatorios de tamaño estadístico suficiente. Un Fc-polipéptido no necesita unirse exclusivamente a una molécula objetivo único sino que se puede unir específicamente a una molécula no objetivo debido a similitud en conformación estructural entre el objetivo y el que no lo es (por ejemplo paralogos u ortólogos) . Aquellas personas expertas reconocerán que la unión específica a una molécula que tiene la misma función en una especie diferente de animal (es decir, un ortólogo) o a una molécula que tiene un epítopo sustancialmente similar que la molécula objetivo (por ejemplo, un paralogo) están dentro del alcance del término "unión específica" la cual se determina en relación a una representación estadísticamente válida de no objetivos únicos (por ejemplo, polipéptidos aleatorios) . De esta manera, un Fc-polipéptido anti-DR5 de la invención puede unirse específicamente a más de una especie distinta de molécula objetivo tal como unión específica tanto a DR5 como a DR4. Se pueden utilizar inmunoanálisis ELISA en fase sólida para determinar la unión específica. Generalmente, la unión específica se lleva a cabo con una constante de asociación de por lo menos aproximadamente 1 x 107 M_1 y con frecuencia por lo menos 1 X 108 M"1, 1 x 10"9 M"1 o 1 x 1010 M"1.

El término "vector" se refiere a un ácido nucleico utilizado en la introducción de un polinucleótido de la presente invención en una célula hospedadora. Los vectores son con frecuencia replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertado en el mismo cuando está presente en una célula hospedadora adecuada o bajo condiciones adecuadas in vitro.

Fc-POLIPEPTIDOS La presente invención proporciona Fc-polipéptidos con actividad anticancerígena mejorada. Estructuralmente, estos Fc-polipéptidos combinan una afinidad aumentada (una "alta afinidad") por FCGR3A humano con una función agonista DR4 y/o DR5. Como agonistas, los Fc-polipéptidos de la invención inducen apoptosis de células cancerosas humanas sensibles mediante unión específica a, y mediación de apoptosis a través de DR4 humano y/o DR5 humano.

De esta manera, la presente invención proporciona Fc-polipéptidos de alta afinidad agonistas caracterizado porque el Fe está afucosilado para incrementar la afinidad por FCGR3A humano. En algunas modalidades, el Fe es un Fe de IgGl completamente humana afucosilado. En algunas modalidades, el Fc-polipéptido es un anticuerpo monoclonal de IgGl completamente humana afucosilado. En algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal de IgGl completamente humana afucosilado se une específicamente a DR5 humano y/o DR4 humano. De esta manera, en algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal IgGl humana completamente afucosilado es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a DR5 humano y DR4 humano. En algunas modalidades, el Fc-polipéptido es un anticuerpo monoclonal IgGl completamente humano que se une específicamente a DR5 humano pero que no se une específicamente a (es decir, que no produce reacción cruzada con) DR4 humano. En algunas modalidades, el Fc-polipéptido se une específicamente a DR4 humano pero no se une específicamente (es decir, no product reacción cruzada con) DR5 humano. Se conocen en el ámbito los métodos para crear péptidos afucosilados o anticuerpos o péptidos de Fc-fusión e incluyen, pero no se limitan a expresión recombinante utilizando medios genéticos (por ejemplo, ARNsi) o químicos para inhibir la función o expresión de fucosiltransferasa celular utilizando células hospedadoras que han perdido el gen para fucosiltransferasa (por ejemplo, con bloqueo en la expresión de fut8) , o que desfucosilan el Fe mediante medios químicos o enzimáticos in vitro. Véase, por ejemplo, la patente de E.Ü.A. No. 6,946,292, incorporada en la presente como referencia. Los expertos reconocerán que las composiciones que comprenden una pluralidad de Fc-polipéptidos de alta afinidad de la invención no necesitan estar 100% afucosilados para presentar actividad anticancerígena aumentada sino que generalmente comprenderán por lo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ó 99% de Fc-polipéptidos afucosilados.

La presente invención también proporciona un Fc-péptido de alta afinidad agonista caracterizado porque el Fe comprende por lo menos una sustitución de aminoácidos que proporciona afinidad aumentada por FCGR3A, como se describe en la patente de E.U.A. No. 7,317,091 (incorporada en la presente como referencia) . En algunas modalidades, el Fe comprende una sustitución de aminoácidos mencionada antes que es una Fe de IgGl humana. En algunas modalidades, el Fc-polipéptido comprende por lo menos una sustitución de aminoácidos para incrementar la unión a FCGR3A en un anticuerpo monoclonal IgGl completamente humano. En algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal IgGl completamente humano se une específicamente a DR5 humano y/o DR4 humano. Así, en algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal IgGl completamente humano es un anticuerpo biespecífico que se une biespecíficamente a DR5 humano y DR4 humano. En algunas modalidades, el Fc-polipéptido es un anticuerpo monoclonal IgGl completamente humano que se une específicamente a DR5 humano pero que no se une específicamente a (es decir, no produce reacción cruzada con) DR4 humano. En algunas modalidades, el Fc-polipéptido se une específicamente a DR4 humano pero no se une específicamente a (es decir, no proporciona reacción cruzada con) DR5 humano. En algunas modalidades, el Fe comprende una sustitución de por lo menos uno de los residuos: 230, 233, 234, 235, 239, 240, 243, 264, 266, 272, 274, 275, 276, 278, 302, 318, 324, 325, 326, 328, 330, 332 y 335, caracterizado porque la numeración de los residuos en la región Fe es la del índice EU como en Kabat . En algunas modalidades, el Fe comprende por lo menos una sustitución de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: P230A, E233D, L234E, L234Y, L234I, L235D, L235S, L235Y, L235I, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239T, V240I, V240 , F243L, V264I, V264T, V264Y, V266I, E272Y, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275 , N276L, Y278T, V302I, E318R, S324D, S324I, S324V, N325T, K326I, K326T, L328 , L328I, L328Q, L328D, L238V, L328T, A330Y, A330L, A330I, I332D, I332E, I332N, I332Q, T335D, T335R y T335Y, caracterizado porque la letra que precede al número representa en el código de aminoácidos de una letra el residuo de sustitución, el número indica el residuo de la Fe numerada por el índice EU como en Kabat y la letra siguiente al número indica el residuo nativo. En algunas modalidades, el Fc-polipéptido de alta afinidad comprende tanto un Fe afucosilado como una sustitución de aminoácidos para incrementar la afinidad de FCGR3A, como se describe en lo anterior. En algunas modalidades, el Fe del Fc-polipéptido comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 de las sustituciones para incrementar la afinidad por FCGR3A.

El polipéptido de un Fc-polipéptido de alta afinidad de la invención se une específicamente y es agonista de DR4 humano y/o DR5 humano por lo que induce apoptosis en células cancerosas humanas sensibles. Los métodos para cribado de Fc-polipéptidos para determinar la capacidad para respuesta agonista a DR5 y/o DR4 se conocen por aquellos habitualmente expertos en el ámbito. El polipéptido de un Fc-polipéptido de la invención se puede obtener de numerosas fuentes por ejemplo, mediante cribado de una biblioteca de fagos por péptidos que se unen específicamente al objetivo DR4 y/o DR5. Los métodos de elaboración y cribado de bibliotecas peptídicas son bien conocidos en el ámbito. Los péptidos que tengan las propiedades de unión específicas deseadas se pueden unir covalentemente, de modo directo o indirecto (es decir, por medio de un enlazante) a un Fe para proporcionar el Fc-polipéptido. En algunas modalidades, el Fe es Fe de IgGl humana. En otras modalidades, el polipéptido es un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-DR4 y/o anti-DR5 que comprende regiones determinadoras de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) : CDR1, CDR2 y/o CDR3 del anticuerpo. Convenientemente, las cadenas pesada variable y ligera variable de una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo que se une específicamente a DR4 humano y/o DR5 se pueden utilizar en un Fc-polipéptido de la invención. De esta manera, en algunas modalidades, el Fc-polipéptido en sí mismo es un anticuerpo IgGl divalente, tal como un anticuerpo monoclonal completamente humano que se une específicamente a DR5 y/o DR4 humano. En algunas modalidades, el polipéptido del Fc-polipéptido es un scFv (Fv de cadena sencilla), un fragmento Fab o F(ab')2 de un anticuerpo que se une específicamente a DR4 humano y/o DR5 humano, o un péptido aptámero que se une específicamente a DR4 humano y/o DR5 humano. Los Fc-polipéptidos representativos que se pueden modificar de acuerdo con los métodos de la invención para proporcionar un Fc-polipéptido de alta afinidad con actividad anticancerígena aumentada incluyen los anticuerpos agonistas anti-DR5 conatumumab (Amgen Inc.), lexatumumab (Human Genome Sciences, Inc.), drozitumab (Genentech, Inc.) y tigatuzumab (Daiichi Sankyo, Inc.) y el anticuerpo agonista anti-DR4 mapatumumab (Human Genome Sciences, Inc.). En otras modalidad, el polipéptido de un Fc-polipéptido de la invención es el ligando humano TRAIL (ligando que induce apoptosis del receptor-TNF) . En una modalidad particular, el Fc-polipéptido es un Fc-polipéptido divalente caracterizado porque el polipéptido es un ligando TRAIL humano.

El Fe de un Fc-polipéptido de la invención se puede obtener por una diversidad de métodos bien conocidos en el ámbito que incluyen, pero que no se limitan a métodos de expresión recombinante, método de síntesis de péptido en fase sólida, aislados de fuentes naturales tales como inmunoglobulinas humanas o combinaciones de estos métodos. En algunas modalidades, el Fe es una IgG humana. En alguna modalidades, el Fe de un isotipo se convierte en un isotipo diferente por conmutación de isotipos. Los métodos de conmutación de isotipos incluyen, pero no se limitan a técnicas recombinantes directas y técnicas de fusión célula-célula (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,916,771), entre otros. En algunas modalidades, un Fe se convierte a partir de una subclase de IgG2, IgG3 o IgG4 humana a una subclase IgGl humana. Los expertos en el ámbito reconocerán que con el fin de optimizar solubilidad, susceptibilidad a fabricación, estabilidad y otros factores relevantes a la elaboración de sustancias biofarmacéuticas, varios residuos aminoácidos de la IgGl humana nativa se pueden modificar y aún así estar dentro de la definición de IgGl humana. Generalmente, un máximo de un total de hasta 15 residuos se suprimen, agregan y/o sustituyen y con frecuencia un máximo de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1. El Fe de un Fc-polipéptido, no obstante, puede estar unido directa indirectamente con marcas, toxinas, medicamentos, agentes de unión específicos de tejido y similares para incrementar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del Fc-polipéptido .

En algunas modalidades, dos o más Fc-polipéptidos pueden estar unidos covalentemente entre si por ejemplo mediante enlaces disulfuro cisteína-cisteína, para crear una estructura divalente (es decir, dos sitios de unión a antígeno) , trivalente o estructuras de orden superior de Fc-polipéptidos. Un Fc-polipéptido divalente, tal como un anticuerpo, puede ser monoespecífico y se puede unir específicamente a un epítopo único del objetivo, o biespecífico de manera que se une específicamente a dos epítopos únicos en el mismo objetivo (por ejemplo DR5 humano o DR4 humano) o dos epítopos únicos de objetivos diferentes (por ejemplo, DR4 humano y DR5 humano) . En modalidades adicionales, dos o más polipéptidos que se unen específicamente a DR4 humano y/o DR5 humano se unen covalentemente a un Fe único para formar un Fc-polipéptido de la invención. Así, en algunas modalidades, 2, 3 ó 4 de estos polipéptidos están unidos covalentemente a un Fe único. Los Fc-polipéptidos pueden ser dimerizados (por ejemplo, mediante enlaces disulfuro entre cadenas Fe para formar un Fc-polipéptido divalente) , trimerizados, etc. El polipéptido puede estar unido directa o indirectamente a un Fe en o cerca de la parte N o C terminal del Fe o en un residuo dentro del Fe. En otras modalidades, un segundo polipéptido o polipéptido adicional que se une específicamente a DR4 humano y/o DR5 humano está unido covalentemente a un polipéptido que en si mismo está unido covalentemente al Fe. De esta manera, los Fc-polipéptidos pueden comprender polipéptidos múltiples unidos covalentemente, directa o indirectamente al Fe o al polipéptido que en si mismo está unido covalentemente de modo directo o indirecto al Fe.

En algunas modalidades, un Fc-polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) de la invención se puede construir utilizando métodos recombinantes . Por lo tanto, otro aspecto de la invención es un polinucleótido que codifica para un Fc-polipéptido de la invención. En otro aspecto, la presente invención comprende un vector de expresión que comprende el polinucleótido que codifica para un Fc-polipéptido. En algunas modalidades, los vectores de expresión comprenden secuencias de control (por ejemplo, promotores, mejoradores) que están unidos operablemente a un polinucleótido que codifica para un Fc-polipéptido de manera que soporta la expresión en una célula hospedadora adecuada. En alguna modalidades, el vector de expresión también comprende secuencias polinucleotídicas que permiten la replicación independiente de cromosoma en la célula hospedadora. Los vectores ejemplares incluyen, pero no se limitan a plásmidos, cósmidos e YACS. En otro aspecto adicional, la invención comprende una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la invención. Los métodos de transfeccion de las células hospedadoras adecuadas (por ejemplo, células CHO) con el vector de expresión de la invención y el cultivo de las células hospedadoras transfectadas bajo condiciones adecuadas para expresión de un Fc-polipéptido se conocen en el ámbito. El procedimiento de transfeccion utilizado puede depender del hospedador que va a ser transformado. Algunos métodos para introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero se conocen en el ámbito e incluyen, pero no se limitan a transfeccion mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfeccion mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de uno o varios de los polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos. Algunas líneas de células de mamífero disponibles como hospedadores para expresión se conocen en el ámbito e incluyen, pero- no se limitan a muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de American Type Culture Collection (ATCC) que incluyen pero que no se limitan a células de ovario de hámster Chino (CHO, por sus siglas en inglés) , células E5, células de riñon de hámster bebé (BHK, por sus siglas en inglés) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y muchas de otras lineas celulares. En algunas modalidades, las lineas de células se pueden seleccionar mediante determinación de cuales lineas de células tienen los niveles de expresión altos y producen Fc-polipéptidos con propiedades deseadas de unión a antigeno.

APLICACIONES TERAPEUTICAS Un Fc-polipéptido de la invención (una "composición terapéutica") se utilizan para inhibir el crecimiento de células de cáncer humanas como un monotratamiento (es decir, como un agente único) en combinación con por lo menos un agente quimioterapéutico (es decir, un tratamiento combinado) y/o en combinación con radioterapia. Una cantidad eficaz de una composición terapéutica se administra para inhibir, detener o revertir el progreso de cánceres que son sensibles a apoptosis mediada por DR4 y/o DR5. Las células de cáncer humano pueden ser tratadas in vivo o ex vivo. En el tratamiento ex vivo de un paciente humano, el tejido o fluidos que contienen células cancerosas se tratan fuera del cuerpo y después el tejido de los fluidos se reintroduce nuevamente en el paciente. En algunas modalidades el cáncer es tratado en un paciente humano in vivo mediante administración de la composición terapéutica en el paciente. De esta manera, la presente invención proporciona métodos ex vivo e in vivo para inhibir, detener o revertir el progreso de un tumor o que de alguna otra manera resultan en un incremento estadísticamente significativo en la supervivencia sin progreso (es decir, el período de tiempo durante y después del tratamiento en el cual un paciente vive con cáncer pancreático y no empeora) o la supervivencia total (también denominada "tasa de supervivencia"; es decir, el porcentaje de personas en un estudio o grupo de tratamiento quienes están vivos durante cierto período de tiempo después de que se les ha diagnosticado con o se ha tratado para cáncer) en relación al tratamiento con un control.

Los tipos de cáncer que pueden ser tratados por los métodos de la invención incluyen pero no se limitan a cáncer hepático, cáncer cerebral, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer pancreático (adenocarcinoma) , cáncer colorrectal, cáncer de pulmón (cáncer de pulmón microcítico y cáncer de pulmón amicrocítico) , cáncer de bazo, cáncer del timo o células de la sangre (es decir, leucemia) , cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de ovario, cáncer uterino, carcinoma gástrico, carcinoma de células escamosas de vías respiratorias y digestivas altas, melanoma y linfoma. En algunas modalidades el cáncer es cáncer pulmonar amicrocítico (NSCLC, por sus siglas en inglés) .

COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Las composiciones terapéuticas de la invención (es decir, Fc-polipéptido) pueden ser administradas cada una sola como un monotratamiento o como un tratamiento combinado, es decir, combinado con otros agentes (por ejemplo, agentes antiangiogénicos , agentes quimioterapéuticos , radioterapia). Los agentes quimioterapéuticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a adriamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina, ciclofosfamida, tiotepa, docetaxel, busulfano, citoxina, taxol, paclotaxel, metotrexato, gemcitabina, cisplatino, melfalano, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas, melfalano y otras mostazas nitrogenadas relacionadas.

Un agente quimioterapéutico de la presente invención se puede administrar antes de y/o subsecuente (de modo colectivo, "tratamiento secuencial") y/o simultáneamente con ("tratamiento concurrente") un agente de unión especifico de la presente invención. El tratamiento secuencial (tal como el pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento superpuesto) de la combinación también incluye regímenes en los cuales los medicamentos están alternados o caracterizado porque un componente se administra a largo plazo y uno o varios adicionales se administran de modo intermitente. Los componentes de la combinación se pueden administrar en composiciones iguales o separadas y por vias de administración iguales o diferentes.

Los tratamientos ejemplares contra el cáncer, los cuales pueden ser coadministrados con una composición terapéutica de la invención incluyen HERCEPTINMR ( trastuzumab) el cual se puede utilizar para tratar cáncer de mama u otras formas de cáncer, RITUXANMR (rituximab) , ZEVALINMR (ibritumomab tiuxetan) y LYMPHOCIDEMR (epratuzumab) el cual se puede utilizar para tratar linfoma no hodgkiniano y/u otras formas de cáncer, GLEEVECMR (mesilato de imatinib) el cual se puede utilizar para tratar leucemia mieloide crónica y tumores estromales gastrointestinales; y BEXXARMR ( tositumomab) , el cual se puede utilizar para tratamiento de linfoma no hodgkiniano. Algunos anticuerpos ejemplares tamnbién incluyen ERBITUXMR; VECTIBIXMR, IMC-C225; IRESSAMR (gefitinib) ; TARCEVAMR (ertinolib) ; inhibidores de KDR (siglas en inglés para receptor de dominio de cinasa) ; y anticuerpos anti-VEGF y antagonistas (por ejemplo AVASTINMR y trampas para VEGF) ; anticuerpos receptores anti-VEGF (siglas en inglés para factor de crecimiento endotelial vascular) , pepticuerpos (peptibodies) y regiones que unen antigeno; anticuerpos anti-Ang-1 y Ang-2, pepticuerpos (por ejemplo, AMG 386, Amgen Inc) , y regiones que unen antigeno; anticuerpos para Tie-2 y otros receptores Ang-1 y Ang-2; ligandos Tie-2; anticuerpos contra inhibidores de cinasa Tie-2 y CAMPATHMR (alemtuzumab) .

FORMULACION FARMACEUTICA Una composición farmacéutica que comprende una composición terapéutica de la presente invención puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, tasa de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. El vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección o solución salina fisiológica, posiblemente suplementada con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. La solución salina amortiguada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos ejemplares adicionales. Otras composiciones farmacéuticas ejemplares comprenden amortiguador Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5 o amortiguador acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5 el cual puede incluir adicionalmente sorbitol o un sustituto adecuado para el mismo. En una modalidad de la presente invención, las composiciones de agente de unión se pueden preparar para almacenamiento al mezclar la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con reactivos de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa.

Adicionalmente, el producto de agente de unión puede formularse como un liofilizado utilizando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Los componentes de formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, se utilizan amortiguadores para mantener la composición en un pH fisiológico o un pH ligeramente menor, habitualmente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. Un vehículo particularmente adecuado para administración parenteral es agua destilada estéril en la cual el agente de unión se formula como una solución isotónica estéril preservada adecuadamente. Otra preparación adicional puede involucrar la formulación de la molécula deseada con un agente tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (ácido poliláctico, ácido poliglicólico) , esferas o liposomas que proporcionan liberación controlada o sostenida del producto el cual después se puede suministrar por medio de una inyección de deposición.

En otro aspecto, las formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en amortiguadores compatibles fisiológicamente tal como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina amortiguada fisiológicamente. Las suspensiones para inyección acuosa pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en el ámbito, incluyendo formulaciones que involucran moléculas de agente de unión en formulaciones de suministro sostenido o controlado. Las técnicas para formulación a una diversidad de otros medios de suministros sostenidos o controlados tales como portadores de liposoma, microparticulas bioerosionables o esferas porosas e inyecciones de deposición también son conocidas por los expertos en el ámbito. La composición farmacéutica para ser utilizada para administración in vivo típicamente debe ser estéril. Esto se puede llevar a cabo por filtración a través de membranas de filtración estéril. Cuando la composición es liofilizada, la esterilización utilizando este método se puede llevar a cabo ya sea antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición para administración parenteral se puede almacenar en forma liofilizada o en solución. Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja para inyección hipodérmica.

Una vez que se ha formulado en la composición farmacéutica se puede almacenar en frascos estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o un polvo deshidratado o liofilizado. Las formulaciones se pueden almacenar ya sea en una forma lista para su uso o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere reconstitución antes de su administración. Una cantidad eficaz de una composición farmacéutica para ser utilizada terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto y objetivos terapéuticos. Una persona experta en el ámbito apreciará que los niveles de dosificación apropiados para tratamiento de esta manera variarán dependiendo, en parte, de la molécula suministrada, la indicación para la cual la molécula del agente de unión se está utilizando, la via de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de órgano) y condición (la edad y salud general) del paciente. En consecuencia, el médico puede ajustar la dosificación y modificar la via de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación típica puede variar de aproximadamente 0.1 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg o mayor, dependiendo de los factores mencionados antes. En algunas modalidades, la dosificación puede ser de 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25 ó 30 mg/kg.

Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede calcular inicialmente ya sea en análisis de cultivo celular o en modelos en animales tales como ratones, ratas, conejos, perros, cerdos o monos. También se puede utilizar un modelo animal para determinar el intervalo de concentración apropiado y la vía de administración. Esta información se puede utilizar para determinar dosis y vías para administración útiles en humanos. La dosificación exacta se determinará en base en factores relacionados con el sujeto quien requiere el tratamiento. La dosificación de administración se ajustan para proporcionar concentraciones suficientes del compuesto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que pueden ser tomados en cuenta incluyen la gravedad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, peso o sexo del sujeto, en tiempo y la frecuencia de administración, una o varias combinaciones de medicamentos, sensibilidades de reacción y respuesta al tratamiento. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se pueden administrar cada 3 a 4 días, cada semana o quincenalmente, dependiendo de la vida media y la velocidad de depuración de la formulación particular. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la molécula de agente de unión en la formulación utilizada. Típicamente, se administra una composición hasta que se alcanza una dosificación que proporciona el efecto deseado. La composición por lo tanto se puede administrar como una dosis única o como dosis múltiples (en concentraciones/dosificaciones iguales o diferentes) con el tiempo o como una infusión continua. Habitualmente se realiza un ajuste adicional de la dosificación apropiada. Las dosificaciones apropiadas se pueden determinar mediante el uso de datos de dosis-respuesta.

DETERMINACION DEL GENOTIPO DE FCGR3A La presente invención proporciona un método para identificar a un paciente (o pacientes) humanos en quienes es más probable obtener un beneficio clínico a partir del tratamiento con el Fc-polipéptido de alta afinidad agonista de la presente invención (en relación a un control) como se vuelve evidente por una respuesta aumentada, estadísticamente significativa, en la supervivencia sin progreso y/o la supervivencia general. Estos pacientes son heterocígotos (F158/V158) u homocigotos (F158/F158) para el polimorfismo F158 de FCGR3A. Los pacientes pueden ser clasificados en base en esta diferencia alélica y aquellos identificados que tienen una o dos copias del alelo que codifica para el alelo F158 de FCGR3A después pueden ser tratados por la composición terapéutica que se describe en la presente. La identificación de un paciente que tiene un polimorfismo V158 y F158 se puede obtener utilizando métodos analíticos conocidos por aquellos expertos en el ámbito tales como los métodos basados en PCR (Leppers-van de Straat et al., J. Immunological Methods, 242: 127-132 (2000) ) . Convenientemente, un médico puede identificar a estos pacientes utilizando los servicios de laboratorios externos para llevar a cabo estos métodos. Los kits para identificar pacientes que tienen 0, 1 ó 2 copias del alelo V158 o F158 de FCGR3A en pacientes con cáncer también están dentro del alcance de la presente invención. Estos kits opcionalmente pueden contener instrucciones escritas que identifican las formas alélicas de pacientes quienes es más probable que respondan a una composición terapéutica de Fe de alta afinidad (es decir, pacientes F158/V158 y F158/F158).

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con composiciones y métodos de determinación de genotipo por PCR (siglas en inglés para reacción en cadena de polimerasa) en tiempo real de ADN genómico humano para polimorfismos en FCGR3A, F158 y V158 utilizando un análisis de discriminación alélica. Se conocen en el ámbito métodos para aislar y purificar el ADN genómico humano. En el método, los cebadores de PCR amplifican específicamente una región que contiene el polimorfismo nucleotídico único (SNP, por sus siglas en inglés) de FCGR3A denominado comúnmente como F158V (SNP ID: rs396991) . En el método el cebador directo comprende la secuencia 5 ' -TTCCAAAAGCCACACTCAAACAC-3 ' (SEC ID NO: 1) mientras que el cebador inverso comprende: 5 ' -TGGTGATGTTCACAGTCTCTGAAGA-3 ' (SEC ID NO: 2). El cebador indirecto se reasocia específicamente hacia el extremo 5' del SNP en una región con una diferencia nucleotídica única entre los genes FCGR3A y FCGR2A. Además, se incorpora un mal pareamiento en los tres nucleótidos del cebador directo desde el extremo 3' para maximizar la potencia diferenciadora del extremo 3'. El cebador inverso se reasocia hacia el extremo 3' del SNP en una región que es exactamente la misma secuencia tanto en FCGR3A como en FCGR2A. Por lo tanto, el análisis se basa en el cebador directo para la especificidad de gen. Los cebadores amplifican un amplicón de 93 pares de bases) .

Posterior a la amplificación por PCR, un par de sondas de marcado doble determinan el genotipo del donador. Las sondas se reasocian específicamente, bajo condiciones de reasociación específicas, a la región interna del amplicón con el SNP localizado cerca del centro de la región de hibridación. Los expertos en el ámbito conocen los métodos y composiciones para reasociación específica. Una sonda es específica para cada uno de los dos alelos SNP medidos. En algunas modalidades la sonda está marcada. En una modalidad, una sonda se marca en el extremo 5' con el colorante indicador de fluorescencia fluoresceína amidita (FA , por sus siglas en inglés) . Se puede obtener FAM comercialmente de numerosas fuentes. Véase, por ejemplo Glen Research, Sterling, VA, Estados Unidos) . La otra sonda se marca con un colorante indicador diferente. En una modalidad la sonda se marca con amarillo Yakima (YAK) . Véase Eurogentee, San Diego, CA, Estados Unidos) . Ambas sondas se pueden modificar en el extremo 3' con un extintor tal como un extintor de orificio negro (BHQ, por sus siglas en inglés) . BHQ está disponible comercialmente de numerosas fuentes. Véase, por ejemplo, Glen Research, Sterling, VA, Estados Unidos) . Asi, en algunas modalidades, una sonda es especifica para V158 y comprende la secuencia: 5 ' -<FAM>TTACTCCCAAAAAGCCCCCTGCA-3 ' <BHQ> (SEC ID NO: 3) y la otra sonda es especifica para el alelo F158 y comprende la secuencia: 51 <YAK>TACTCCCAACAAGCCCCCTGCA-31 <BHQ> (SEC ID NO: 4) .

Cuando la sonda está intacta, la fluorescencia del colorante indicador se extingue por la proximidad del colorante extintor. Durante la fase de extensión de cada ciclo de PCR, la ADN polimerasa separa la sonda reasociada, liberando el colorante indicador de la sonda lo que resulta en un incremento en la fluorescencia. Las sondas compiten por hibridación durante los ciclos de PCR y la fluorescencia se genera únicamente a partir de la sonda complementaria al alelo SNP presente en el ADN. En el caso de una condición heterocigota se genera fluorescencia en ambas sondas. Los niveles de fluorescencia se miden después de un número suficiente de ciclos de amplificación, por ejemplo 40 ciclos de PCR. De esta manera, este análisis de SNP clasifica una muestra de ADN genómico humano como F158/F158 (homocigoto) , V158/V158 (homocigoto) y F158/V158 (heterocigoto) .

Los listados anteriores son únicamente a modo de ejemplo y no impiden el uso de otros compuestos o tratamientos los cuales pueden ser utilizados de modo concurrente con los compuestos descritos en la presente y que son conocidos por los expertos en el ámbito o a los que se puede llegar por aquellos expertos en el ámbito utilizando las lineas de guia establecidas en esta descripción.

EJEMPLO 1 El ejemplo 1 describe un estudio fase lb/2 de conatumumab en combinación con paclitaxel y carboplatino para el tratamiento de primera linea de cáncer avanzado de pulmón amicrocitico .

El objetivo primario es determinar la eficacia de conatumumab (AMG 655) determinada por el tiempo de supervivencia sin progreso (a dos dosis seleccionadas en la fase Ib: 3 mg/kg y 15 mg/kg) en combinación con paclitaxel/carboplatino .

Los criterios de inclusión en el estudio incluyen: Cáncer confirmado de pulmón amicrocitico por medio histológico o citológico.

Los sujetos deben presentar cáncer avanzado de pulmón amicrocitico definido como etapa IIIB con efusión plural maligna o etapa IV o enfermedad recurrente.

Se elabora un plan para recibir hasta 6 ciclos de quimioterapia.

Se requiere una calificación de grupo de oncología cooperativo oriental (ECOG, por sus siglas en inglés) de 0 ó 1 demográfico.

Hombres o mujeres > 18 años de edad Función adecuada hematológica, renal, hepática y de coagulación Las dosis de conatumumab para la fase 2 se determinan durante la porción de la fase Ib del estudio. La porción de fase 2 de este estudio es un estudio controlado por placebo, tipo doble ciego, aleatorizado, de centros múltiples con un tamaño de muestra total planeado de 150 sujetos. Los sujetos se distribuyeron aleatoriamente a una relación 1:1:1 a 1 de 3 brazos de tratamiento: brazo 1: paclitaxel/carboplatino más 15 mg/kg de conatumumab brazo 2: paclitaxel/carboplatino más 3 mg/kg de conatumumab brazo 3: paclitaxel/carboplatino más placebo La distribución aleatoria se estratificó por el estado de desempeño del grupo de oncología cooperativo oriental (ECOG, por sus siglas en inglés) 0 ó 1) y etapa de enfermedad (Illb o IV/recurrente) .

Después de su instrucción en el estudio se administraron paclitaxel (200 mg/m2) y carboplatino (AUC (área bajo la curva) = 6 mg/ml»minuto) en combinación con conatumumab (brazo 1 y brazo 2) o placebo (brazo 3) en el día 1 de cada ciclo de 21 días de hasta un máximo de 6 ciclos. Los sujetos quienes completaron hasta 6 ciclos de paclitaxel/carboplatino o quienes suspendieron paclitaxel/carboplatino debido a toxicidad relacionada con la quimioterapia continuaron recibiendo conatumumab o monotratamiento con placebo hasta el progreso de la enfermedad, intolerabilidad al medicamento (conatumumab o placebo) , suspensión con consentimiento o hasta 30 meses a partir de la primera administración del tratamiento de estudio, lo que ocurriera primero. Los sujetos quienes suspendieron el tratamiento con conatumumab o placebo, debido a una supuesta intolerabilidad al medicamento se retiraron de todo tratamiento de estudio.

Después de la última administración de todos los tratamientos especificados en el protocolo a cada sujeto se le programó para tener una visita de seguimiento de seguridad 30 días (+ 3 días) después. Los sujetos después entraron a un seguimiento a largo plazo durante el cual se verificó el estado de supervivencia cada 3 meses (± 2 semanas) .

Se realizó determinación de imagen radiológica para evaluar la respuesta de tumor cada seis semanas (± 7 días) desde el día 1 de estudio independiente del ciclo de tratamiento hasta el progreso de enfermedad documentado (determinado clínica o radiológicamente por RECIST modificado o por el investigador que realiza el tratamiento) . En general, los sujetos con síntomas sugerentes de progreso de enfermedad (progreso clínico) también fueron evaluados radiológicamente para determinar el estado de enfermedad en el momento en que se produjeron los síntomas. Cualquier sujeto que suspendió el tratamiento de estudio antes del progreso de la enfermedad o por muerte continuó presentado generación de imagen radiológica realizada cada seis semanas (± 7 días) durante el período de seguimiento a largo plazo para determinar el estado de enfermedad hasta el progreso de la enfermedad, hasta el inicio de un tratamiento nuevo, si se producía la muerte, si se retiraba concientemente, por decisión administrativa o por finalización del estudio, lo que sucediera primero. El análisis primario se realizó cuando 120 sujetos habían documentado el progreso de la enfermedad o la muerte, determinados por el investigador.

Los resultados muestran que no hay mejora en la PFS (supervivencia sin progreso). No obstante, un tendencia que sugiere mejora en las curvas OS (supervivencia general) surgió después de aproximadamente 7 meses; poco después del inicio de la fase de monotratamiento (conatumumab) o del tratamiento. Los pacientes se encontraban en la fase de monotratamiento, después de completar 6 ciclos de quimioterapia + conatumumab o placebo (aproximadamente 4.2 meses) . El monotratamiento se produjo en 51% de sujetos después de la quimioterapia combinada. El resultado del paciente se ajusta por sexo, ECOG, edad e histología (escamosa) y se asocia con el genotipo FCGR3A se observa una respuesta que depende de la dosis para pacientes heterocigotos y homocigotos para V158. Como se indica la tendencia de supervivencia asociada con F158/V158 o con el genotipo V158/V158 del polimorfismo FCGR3A produjo una relación peligrosa (HR) de 0.72 en comparación con 1.37 para pacientes de homocigotos F158. Además, la HR de pacientes FV (F158/V158) y VV (V158/V158) muestra un efecto dosis-respuesta con una HR de 0.63 para la dosis de 15 mg/kg en oposición con 0.85 la dosis de 3 mg/kg.

La tabla 1 a continuación muestra la relación de peligro (HR) y los intervalos de confianza a 95% (95% CI) .

TABLA 1 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un Fc-polipéptido de alta afinidad caracterizado porque se une específicamente a y antagoniza DR4 o DR5 humano.

2. El Fc-polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el Fc-polipéptido es un anticuerpo.

3. El Fc-polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo anti-DR5.

4. El Fc-polipéptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo IgGl completamente humano.

5. El Fc-polipéptido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo está afucosilado.

6. El Fc-polipéptido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo comprende un aminoácido en la posición 332 de Fe numerado de acuerdo con el índice EU, caracterizado porque el aminoácido incrementa la afinidad del Fc-polipéptido por FCGR3A humano.

7. Un método para inhibir el crecimiento de cáncer en un paciente humano, caracterizado porque comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un Fc-polipéptido de alta afinidad de conformidad con la reivindicación 4.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el cáncer es cáncer de pulmón amicrocitico (NSCLC) .

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el Fc-polipéptido de alta afinidad se administra como un monotratamiento .

10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el paciente humano es heterocigoto u homocigoto para el alelo F158 de FCGR3A.

11. Un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa humana caracterizado porque comprende administrar a la célula una cantidad eficaz de un Fc-polipéptido de alta afinidad de conformidad con la reivindicación 4.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la célula cancerosa es cáncer de pulmón amicrocitico.

13. Un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa humana caracterizado porque comprende administrar a la célula una cantidad eficaz de un Fc-polipéptido de alta afinidad de conformidad con la reivindicación 5.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el cáncer es cáncer de pulmón amicrocítico.

15. Un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa humana caracterizado porque comprende administrar a la célula una cantidad eficaz del Fc-polipéptido de alta afinidad de conformidad con la reivindicación 6.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el cáncer es cáncer de pulmón amicrocítico.

17. Un método para seleccionar a un paciente con cáncer para tratamiento con un Fc-polipéptido de alta afinidad que se une específicamente y que antagoniza a DR4 o DR5 humanos, caracterizado porque el paciente tiene por lo menos un alelo F158 de FCGR3A.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el paciente tiene dos alelos F158 de FCGR3A.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el paciente tiene cáncer de pulmón amicrocítico.

20. Un método para establecer el genotipo para el polimorfismo de FCGR3A F158V en una muestra de ADN genómico humano, caracterizado porque comprende amplificar una región que comprende el polimorfismo de FCGR3A en la muestra de ADN genómico utilizando un cebador directo de la SEC ID NO: 1 y un cebador inverso de la SEC ID NO: 2, y determinar el genotipo de la muestra de ADN para condición homocigota o condición heterocigota del polimorfismo F158V con una sonda de la SEC ID NO: 3 y la SEC ID NO: 4.