JP4738743B2 - 薬理学的活性ペプチド／タンパク質の血清中半減期を上昇させるためのトランスサイレチンペプチド／タンパク質融合物の使用 - Google Patents

Description

本出願は、本明細書中に参考として援用されている、２００２年４月４日出願の米国出願第１０／１１７，１０９号の一部継続出願である。

治療用途のためのタンパク質、ペプチド及び他の薬剤分子は、現在、主として組換えＤＮＡテクノロジーの進歩の結果として適切な形態で十分な量が入手可能である。そのようなペプチド及びタンパク質が入手できることは、タンパク質の製剤及び化学的修飾における進歩を生じさせた。生物学的に活性なペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド及び他の薬剤の血清中半減期を延長するために、そのような生物学的活性物質の化学的修飾が広汎に検討されてきた。そのような物質の血清中半減期を延長する能力は、薬剤の治療上の潜在的可能性が高用量及び高頻度の投与を必要とせずに実現されることを可能にする。

インビボでタンパク質の半減期を延長するために使用される化学的修飾は、対象タンパク質へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーの化学的複合体化を包含する。ポリエチレングリコール分子をタンパク質に結合するために（ペグ化）様々なアプローチが使用されてきた。例えば、Ｒｏｙｅｒ（米国特許第４，００２，５３１号）は、酵素へのポリエチレングリコール分子の結合のために還元的アルキル化を使用したと述べている。Ｄａｖｉｓら（米国特許第４，１７９，３３７号）は、例えば酵素とインスリンを含むＰＥＧ：タンパク質複合体を開示している。Ｓｈａｗ（米国特許第４，９０４，５８４号）は、反応性アミン基によるポリエチレングリコール分子の結合のための、タンパク質中のリシン残基数の変更を開示している。Ｈａｋｉｍｉら（米国特許第５，８３４，５９４号）は、例えばタンパク質である、ＩＬ−２、インターフェロンα及びＩＬ−１ｒａを含む、実質的に非免疫原性の水溶性ＰＥＧ：タンパク質複合体を開示している。Ｈａｋｉｍｉらの方法は、タンパク質中の様々な遊離アミノ基をＰＥＧに連結するためのユニークなリンカーの使用を含む。Ｋｉｎｓｔｌｅｒら（米国特許第５，８２４，７８４号及び同第５，９８５，２６５号）は、Ｇ−ＣＳＦ及びコンセンサスインターフェロンを含む、選択的Ｎ末端化学的修飾タンパク質及びその類似体を可能にする方法を教示している。

生物学的活性物質の血清中半減期を延長するために設計された他のアプローチは次のものを含む：あまりに大きすぎて腎ではろ過されない、大きく安定なタンパク質（例えば血清アルブミン）へのペプチドの複合体化；Ｇ．Ｄ．Ｍａｏら、Ｂｉｏｍａｔ．Ａｒｔ．Ｃｅｌｌｓ，Ａｒｔ．Ｏｒｇ．１７：２２９−２４４（１９８９）；輸送ビヒクルとして及び血清中半減期を上昇させるための低密度及び高密度リポタンパク質の使用；Ｐ．Ｃｈｒｉｓ ｄｅ Ｓｍｉｄｔら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９（１７）：４６９５−４７００（１９９１）；Ｆｃ−タンパク質融合物を生産するための免疫グロブリンのＦｃ領域の使用；ＰＣＴ国際公開公報第９８／２８４２７号（Ｍａｎｎら及びその中で引用される参考文献）；及び１以上の生物学的活性ペプチドのインビボでの半減期を上昇させるためのＦｃドメインの使用；ＰＣＴ国際公開公報第００／２４７８２号（Ｆｅｉｇｅら及びその中で引用される参考文献）。

トランスサイレチン（ＴＴＲ）（以前はプレアルブミンと呼ばれた）は、サイロキシン及びレチノール結合タンパク質の輸送体として重要な生理的役割を果たす５６ｋＤａの四量体血清タンパク質である；ＨａｍｉｌｔｏｎとＢｅｎｓｏｎ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，５８：１４９１−１５２１（２００１）及びその中で引用される参考文献。米国特許第５，７１４，１４２号においてＢｌａｎｅｙらは、投与する薬剤に、該タンパク質に特異的に結合しうる機能を付与することによるＴＴＲの利用を述べている。詳細には、Ｂｌａｎｅｙらは、トランスサイレチン選択的リガンドへのペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖又は他の薬剤の共有結合が、薬剤をＴＴＲに可逆的に結合させ、それによってＴＴＲに関するリガンドの親和性に基づき該薬剤の血清中半減期を上昇させることを明らかにしている。薬剤の内因性作用は有害な影響を受けず、生じる薬剤−ＴＴＲリガンド複合体はなお経口吸収されるのに十分なほど小さいと述べられている。

驚くべきことに及び重要なこととして、ＴＴＲ（又はＴＴＲ変異体）、特に、例えば水溶性ポリマーへの複合体化によって化学的に修飾されたＴＴＲ又はＴＴＲ変異体は、生物学的活性物質の血清中半減期を上昇させるために生物学的活性物質との融合パートナーとして使用できることが見出されている。従って、本発明は、選択した生物学的活性物質の血清中半減期を上昇させるための手段を提供する。

本発明は、それ故、ＴＴＲ（又はＴＴＲ変異体）−生物学的活性物質融合物及びＰＥＧ−ＴＴＲ（ＰＥＧ−ＴＴＲ変異体）−生物学的活性物質融合物の実質的に均質な製剤に関する。生物学的活性物質単独と比較して、ＴＴＲ−生物学的活性物質融合物及び／又はＰＥＧ−ＴＴＲ−生物学的活性物質融合物は実質的に上昇した血清中半減期を有する。

本発明はさらに、薬理的活性化合物を提供するための、医薬適合性の担体中のＴＴＲ−生物学的活性物質融合物及びＰＥＧ−ＴＴＲ−生物学的活性物質融合物に関する。

本発明はさらに、ＴＴＲ変異体の調製に関する。詳細には、ＴＴＲタンパク質を、システイン残基がＴＴＲタンパク質配列内に工作されるように修飾する。該ＴＴＲ変異体は高収率で回収可能であり、その後システイン残基での水溶性ポリマーの複合によって化学的修飾して、化学的修飾されたＴＴＲ変異体を提供し、次に選択した生物学的活性物質にそれを融合することができる。

本発明はさらに、薬理的活性化合物を調製する方法に関する。例えば、ＰＥＧ−ＴＴＲ−ペプチド融合物の実質的に均質な製剤を製造する方法の主要実施態様は、（ａ）ＴＴＲのアミノ酸配列内の特定アミノ酸位置にシステイン残基を工作して上記ＴＴＲの変異体を得ること；（ｂ）上記システイン残基での上記ＴＴＲ変異体にポリエチレングリコールを複合体化してＰＥＧ−ＴＴＲを得ること；（ｃ）上記ＰＥＧ−ＴＴＲを対象ペプチドに融合してＰＥＧ−ＴＴＲ−ペプチド融合物を得ること；及び（ｄ）上記ＰＥＧ−ＴＴＲ−ペプチド融合物を単離することを含む。

本発明はまた、上記のような薬理的活性化合物を使用した個体の治療方法に関する。

本発明を説明するために、次の用語は下記で述べるように定義される。

「生物学的活性物質」という用語は、予防、治療又は診断的適用のために有用な化学物質又は化合物を指す。「薬理的活性化合物」という用語は、所望の局所又は全身作用を誘導する、哺乳動物、好ましくはヒト個体への投与に適した化合物を指す。

「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、生物学的活性物質の種類を表わし、それらの用語は、天然に生じる、組換え生産された又は化学合成されたアミノ酸のポリマーを指すためにここでは交換可能に使用される。それらの用語は、２個という低い数のアミノ酸を含むペプチド分子、化学的修飾されたポリペプチド、コンセンサス分子、それらの類似体、誘導体又は組合せを包含することが意図される。

本発明に関連して任意の数のペプチドが使用しうる。特に興味深いのは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、レプチン、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、腫瘍増殖因子α及びβ（それぞれＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β）、及び成長ホルモンの作用を模倣するペプチドである。「ミメティックペプチド」及び「アゴニストペプチド」という用語は、対象とするタンパク質と相互作用するタンパク質（例えばＧＬＰ−１、ＰＴＨ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ等）に匹敵する生物学的活性を有するペプチドを指す。これらの用語はさらに、対象とするタンパク質の天然リガンドの作用を増強することなどによって、対象とするタンパク質の作用を間接的に模倣するペプチドを包含する。それ故、「ＥＰＯミメティックペプチド」という用語は、ＥＰＯミメティックの性質（ＥＰＯ−ｍｉｍｅｔｉｃ ｓｕｂｊｅｃｔ ｍａｔｔｅｒ）を有すると同定できる又は推論できるいかなるペプチドも包含する；例えばＷｒｉｇｈｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：４５８−６３（１９９６）；及びＮａｒａｎｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：７５６９−７４（１９９９）参照。当業者は、これらの参考文献の各々が、様々なペプチドライブラリーを用いて開示されている手順に従うことにより、その中で実際に開示されている以上の種々のペプチドを選択することを可能にすることを認識する。

「ＴＰＯミメティックペプチド」（ＴＭＰ）という用語は、ＴＰＯミメティックの性質を有すると同定できる又は推論できるペプチドを包含する；例えば、その全体が参考として本明細書中に援用されている、Ｃｗｉｒｌａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１６９６−９（１９９７）；米国特許第５，８６９，４５１号及び同第５，９３２，９４６号；及びＰＣＴ国際公開公報第００／２４７８２号（Ｌｉｕら、及びその中で引用される参考文献）参照。当業者は、これらの参考文献の各々が、様々なペプチドライブラリーを用いて開示されている手順に従うことにより、その中で実際に開示されている以上の種々のペプチドを選択することを可能にすることを認識する。

「Ｇ−ＣＳＦミメティックペプチド」という用語は、Ｇ−ＣＳＦミメティックの性質を有すると同定できるいかなるペプチドも包含する；例えばＰａｕｋｏｖｉｔｓら、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６５：３０３−１１（１９８４）参照。当業者は、これらの参考文献の各々が、様々なペプチドライブラリーを用いて開示されている手順に従うことにより、その中で実際に開示されている以上の種々のペプチドを選択することを可能にすることを認識する。

「ＣＴＬＡ４−ミメティックペプチド」という用語は、Ｆｕｋｕｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：２６７−７０（１９９８）に述べられているように同定できる又は推論できるいかなるペプチドも包含する。当業者は、これらの参考文献の各々が、様々なペプチドライブラリーを用いて開示されている手順に従うことにより、その中で実際に開示されている以上の種々のペプチドを選択することを可能にすることを認識する。

ペプチドアンタゴニストも興味の対象であり、特にＴＮＦ、レプチン、インターロイキンのいずれか及び補体活性化に関与するタンパク質（例えばＣ３ｂ）の作用に拮抗するものが興味深い。「アンタゴニストペプチド」又は「阻害剤ペプチド」という用語は、対象とする関連タンパク質の生物学的活性をブロックする又は何らかの方法で生物学的活性に干渉する、あるいは対象関連タンパク質の既知のアンタゴニスト又は阻害剤に匹敵する生物学的活性を有するペプチドを指す。それ故、「ＴＮＦアンタゴニストペプチド」という用語は、ＴＮＦ拮抗性の性質を有すると同定できる又は推論できるペプチドを包含する；例えば、Ｔａｋａｓａｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：１２６６−７０（１９９７）参照。当業者は、これらの参考文献の各々が、様々なペプチドライブラリーを用いて開示されている手順に従うことにより、その中で実際に開示されている以上の種々のペプチドを選択することを可能にすることを認識する。

「ＩＬ−１アンタゴニスト」及び「ＩＬ−１ｒａミメティックペプチド」という用語は、ＩＬ−１によるＩＬ−１受容体の活性化を阻害する又は下方調節するペプチドを包含する。ＩＬ−１受容体の活性化は、ＩＬ−１、ＩＬ−１受容体及びＩＬ−１受容体補助タンパク質（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）の間での複合体の形成から生じる。ＩＬ−１アンタゴニスト及びＩＬ−１ｒａミメティックペプチドは、ＩＬ−１、ＩＬ−１受容体又はＩＬ−１受容体補助タンパク質に結合して、複合体の任意の２つ又は３つの成分の間での複合体形成を妨げる。例示的なＩＬ−１アンタゴニスト及びＩＬ−１ｒａミメティックペプチドは、米国特許第５，６０８，０３５号、同第５，７８６，３３１号、同第５，８８０，０９６号に述べられているように同定する又は推論することができる。当業者は、これらの参考文献の各々が、様々なペプチドライブラリーを用いて開示されている手順に従うことにより、その中で実際に開示されている以上の種々のペプチドを選択することを可能にすることを認識する。

「ＶＥＧＦアンタゴニストペプチド」という用語は、ＶＥＧＦ拮抗性の性質を有すると同定できる又は推論できるペプチドを包含する；例えば、Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７：１７７５４−６４（１９９８）参照。当業者は、これらの参考文献の各々が、様々なペプチドライブラリーを用いて開示されている手順に従うことにより、その中で実際に開示されている以上の種々のペプチドを選択することを可能にすることを認識する。

「ＭＭＰ阻害剤ペプチド」という用語は、ＭＭＰ阻害性の性質を有すると同定できる又は推論できるペプチドを包含する；例えば、Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：７６８−７４（１９９９）参照。当業者は、これらの参考文献の各々が、様々なペプチドライブラリーを用いて開示されている手順に従うことにより、その中で実際に開示されている以上の種々のペプチドを選択することを可能にすることを認識する。

腫瘍ホーミングペプチド、膜輸送ペプチド等を含む、標的化ペプチドも興味深い。

例示的ペプチドは当技術分野において既知の様々な手法によってランダムに生成しうる。例えば、固相合成手法は当技術分野において周知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐ．３３５−６１（ＫａｔｓｏｙａｎｎｉｓとＰａｎａｙｏｔｉｓ編集）（１９７３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）；Ｄａｖｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．，１０：３９４−４１４（１９８５）；ＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９６９）；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎら、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第３版、２：１０５−２５３（１９７６）；及びＥｒｉｃｋｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第３版、２：２５７−５２７（１９７６）に述べられているものを包含する。固相合成は、小さなペプチドを作製する最もコスト効果的な方法であるので、個々のペプチドを作製する好ましい手法である。

ファージディスプレイは、本発明において使用するためのペプチドを作製する上でのもう１つの有用な方法である。ランダムなペプチドのライブラリーからのアフィニティー選択が、任意の遺伝子産物の任意の部位についてのペプチドリガンドを同定するために使用できることが記述されている；Ｄｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２３０２５−３０（１９９３）。ファージディスプレイは、細胞表面受容体又は線状エピトープを有する任意のタンパク質のような対象タンパク質に結合するペプチドを同定するのに特に適する；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４４：３１３−２９（１９９８）；Ｋａｙら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ，３：３７０−８（１９９８）。そのようなタンパク質は、本明細書中に参考として援用されている、Ｈｅｒｚら、Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＆ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｒｅｓ．，１７（５）：６７１−７７６（１９９７）において広く概説されている。

該ペプチドはまた、組換えＤＮＡ手法を用いて形質転換宿主細胞においても作製しうる。そのために、該ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を調製する。そのようなＤＮＡ及び／又はＲＮＡ分子を調製する方法は当技術分野において周知である。例えば、適切な制限酵素を使用して該ペプチドをコードする配列をＤＮＡから切り出すことができた。その後のクローニングのために有用な制限部位を含んだ関連する配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて創製することができた。あるいは、ホスホルアミダイト法などの化学合成手法を用いてＤＮＡ／ＲＮＡ分子を合成することができよう。また、これらの手法の組合せも使用しうる。

使用のために考慮されるさらなる生物学的活性物質は、ヒト又は動物の組換え又は天然のタンパク質、ホルモン、サイトカイン、造血因子、成長因子、抗肥満因子、栄養因子、抗炎症因子及び酵素を含む。そのようなタンパク質は、インターフェロン（図面を含めて本明細書中に参考として援用されている、米国特許第５，３７２，８０８号、同第５，５４１，２９３号、同第４，８９７，４７１号及び同第４，６９５，６２３号参照）、インターロイキン（図面を含めて本明細書中に参考として援用されている、米国特許第５，０７５，２２２号参照）、エリスロポエチン（図面を含めて本明細書中に参考として援用されている、米国特許第４，７０３，００８号、同第５，４４１，８６８号、同第５，６１８，６９８号、同第５，５４７，９３３号及び同第５，６２１，０８０号参照）、顆粒球コロニー刺激因子（図面を含めて本明細書中に参考として援用されている、米国特許第４，８１０，６４３号、同第４，９９９，２９１号、同第５，５８１，４７６号、同第５，５８２，８２３号及びＰＣＴ国際公開公報第９４／１７１８５号参照）、幹細胞因子（図面を含めて本明細書中に参考として援用されている、ＰＣＴ国際公開公報第９１／０５７９５号、同第９２／１７５０５号及び同第９５／１７２０６号）、ＮＥＳＰ（図面を含めて本明細書中に参考として援用されている、ＰＣＴ国際公開公報第ＵＳ９４／０２９５７号）、オステオプロテゲリン（図面を含めて本明細書中に参考として援用されている、ＰＣＴ国際公開公報第９７／２３６１４号）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（Ｌ−１ｒａ）（図面を含めて本明細書中に参考として援用されている、ＰＣＴ国際公開公報第９１／０８２８５号及び同第９２／１６２２１号）及びレプチン（ＯＢタンパク質）（図面を含めて本明細書中に参考として援用されている、ＰＣＴ国際公開公報第９６／４０９１２号、同第９６／０５３０９号、同第９７／００１２８号、同第９７／０１０１０号及び同第９７／０６８１６号）を含むが、これらに限定されない。

さらに、生物学的活性物質はまた、インスリン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、モチリン、インターフェロン（α、β、γ）、インターロイキン類（ＩＬ−１からＩＬ−１２まで）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子結合タンパク質（ＴＮＦ−ｂｐ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経膠由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ３）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経栄養増殖因子（ＮＧＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）などの骨成長因子、インスリン様増殖因子（ＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、巨核球由来増殖因子（ＭＧＤＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、トロンボポエチン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、コロニー刺激増殖因子（ＣＳＦ）、骨誘導因子（ＢＭＰ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ及びカリクレインを含みうるが、これらに限定されない。

本発明における使用のための考慮されるトランスサイレチン（ＴＴＲ）は、Ｍｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２４（２）：５５８−５６４（１９８４）に報告されているＴＴＲのＤＮＡ及びアミノ酸配列を有する。これらの配列は、受入番号Ｋ０２０９１としてＧｅｎｂａｎｋに寄託されている。ここで使用する１２７アミノ酸のＴＴＲ配列は、Ｋ０２０９１配列のシグナル配列（アミノ酸１−２０）を含まず、配列番号１として下記に示す：

「ＴＴＲ変異体」という用語は、天然ＴＴＲの修飾形態である分子又は配列を指す。例えば、天然ＴＴＲは除去しうる部位を含む。それらは、構造的特徴を与えるか又は本発明の融合分子には必要とされない生物学的活性を提供するからである。それ故、「ＴＴＲ変異体」という用語は、１以上の天然ＴＴＲ部位又は残基を欠く、あるいは異なるアミノ酸で置換された１以上の天然ＴＴＲ部位又は残基を有する、あるいは該配列に付加された１以上の残基を有する分子又は配列を包含する。一例として、アミノ酸配列３７位のアラニン残基がシステイン残基で置換されたＴＴＲ変異体をＴＴＲ変異体（Ａ３７Ｃ）と称する；及びアミノ酸配列３７位のアラニン残基及びアミノ酸配列８３位のグリシン残基の両方がシステイン残基で置換されたＴＴＲ変異体をＴＴＲ変異体（Ａ３７Ｃ／Ｇ８３Ｃ）と称する。

１つの実施態様では、生物学的活性物質に融合したＴＴＲ又はＴＴＲ変異体を、ＴＴＲ−生物学的活性物質融合タンパク質をさらに安定化し、それによって、生じる融合物の血清中半減期を上昇させる、第三のタンパク質又はタンパク質フラグメントに融合しうる。そのような方法及び組成物において使用できる付加的タンパク質又はそのフラグメントの例は、免疫グロブリンのＦｃドメイン又はＣＨ２ドメイン、あるいは当業者がタンパク質の安定性を上昇させる性質を有すると認識する他の何らかのタンパク質ドメイン（例えば下記の実施例２９）を包含する。そのようなタンパク質群は、ＴＴＲ−生物学的活性物質融合タンパク質のカルボキシ又はアミノ末端に融合することができ、あるいはＴＴＲと生物学的活性物質の間に配置することができる。所望の活性を促進するために該融合タンパク質の各々のドメインの間に、必要に応じて、リンカー又はスペーサーを配置できることが意図される。

もう１つの実施態様では、本発明のＴＴＲ又はＴＴＲ変異体を生物学的活性物質に化学的に架橋することができる。タンパク質の架橋は、例えば確立された公表手順に従い、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を使用することによって実施できる。さらなる架橋剤は容易に入手可能であり、当業者によって同定されうる。上記手順の詳細については、例えばＫａｒｐｏｖｓｋｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０．１６８６−１７０１（１９８４）；Ｐｅｒｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ，３１６、３５４−３５６（１９８５）又はＴｉｔｕｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３９，３１５３−３１５８（１９８７）参照。

もう１つの実施態様では、安定性及び／又は血清中の半減期を上昇させるように、分子を該融合タンパク質に共有結合することができる。例えば、好ましいＴＴＲ又はＴＴＲ変異体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーを用いて化学的修飾されうる。ＰＥＧ基は、好都合ないかなる分子量であってもよく、直鎖又は分枝鎖のいずれでもよい。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２ｋＤａから約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ−約５０ｋＤａの範囲であり、最も好ましくは約２０ｋＤａである。

ＰＥＧ基は一般に、アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化あるいはペグ部分の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、エステル、チオール、ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）を通しての標的化合物上の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、エステル、チオール、ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）への他の化学選択的複合体化／連結法によって、本発明の化合物に結合される。

使用される他の水溶性ポリマーは、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）及びデキストランを含む。

対象ペプチド、対象タンパク質、ＴＴＲ又はＴＴＲ変異体をコードするＤＮＡ分子は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ［１９８９］）及び／又はＡｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．及びＷｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）に述べられているような周知の組換えＤＮＡテクノロジーを使用して作製できる。対象タンパク質又はそのフラグメントをコードする遺伝子又はｃＤＮＡは、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを適切なプローブでスクリーニングすることによって入手しうる。適切なプローブは、例えば、該プローブが選択されたハイブリダイゼーション条件下で対象タンパク質をコードする遺伝子とハイブリダイズするように、対象タンパク質をコードする遺伝子とある程度の相同性を有すると予想されるオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡフラグメント又はゲノムＤＮＡフラグメントを含む。ＤＮＡライブラリーをスクリーニングする代替的手段は、対象タンパク質をコードする遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応「ＰＣＲ」増幅によってである。ＰＣＲは、典型的には、少なくともプライマーの十分な部分が該遺伝子とハイブリダイズするように、増幅すべき遺伝子と十分な相同性を有すると考えられる配列を有するオリゴヌクレオチド「プライマー」を使用して実施される。

あるいは、対象ペプチド又は対象タンパク質をコードする遺伝子は、Ｅｎｇｅｌｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．，２８：７１６−７３４（１９８９）によって述べられているような当業者に周知の方法を用いた化学合成によって作製しうる。これらの方法は、中でも特に、核酸合成のためのホスホトリエステル、ホスホルアミダイト及びＨ−ホスホネート法を含む。そのような化学合成のための好ましい方法は、標準ホスホルアミダイト化学を使用したポリマー支持合成である。典型的には、対象タンパク質をコードするＤＮＡは数百ヌクレオチドの長さである。約１００ヌクレオチド以上の大きさの核酸は、これらの方法を用いていくつかのフラグメントとして合成できる。次にそれらのフラグメントを連結して、対象とする完全長タンパク質をコードする遺伝子を形成することができる。通常、ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、メチオニン残基をコードするＡＴＧを有する。このメチオニンは成熟形態の対象タンパク質上に存在してもよく又は存在しなくてもよい。該メチオニンは、細胞の内部で又は分泌過程の間に除去することができる。好ましいＴＴＲポリペプチドは、大腸菌における発現を最適化し、好都合な制限部位を導入するように変化した核酸配列を有するＴＴＲを含みうる。大腸菌における発現のためのコドン最適化についての一般的考察は、Ｋａｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６：４９４−５００（１９９５）に述べられている。

ひとたび対象タンパク質とＴＴＲポリペプチドをコードする遺伝子が得られれば、５’及び／又は３’末端で制限エンドヌクレアーゼ部位を創製する標準的方法を用いてそれらを修飾しうる。制限部位の創製は、該遺伝子が増幅及び／又は発現ベクターに適切に挿入されることを可能にする。制限部位の付加は典型的にはＰＣＲを用いて実施され、そこでは各々のＰＣＲ反応の１つのプライマーは、典型的には、中でも特に所望の制限部位のヌクレオチド配列を含む。

対象ペプチド又は対象タンパク質をコードする遺伝子又はｃＤＮＡは、宿主細胞における発現のために適切な発現ベクターに挿入することができる。該ベクターは、特に使用する宿主細胞において機能性であるように選択される（すなわち、該ベクターは、対象タンパク質をコードする遺伝子の増幅及び／又は発現が起こりうるように宿主細胞機構と適合性である）。

典型的には、宿主細胞のいずれかにおいて使用されるベクターは、プロモーター（「５’側隣接配列」とも称される）及び他の調節エレメントならびにエンハンサー、複製起点エレメント、転写終結エレメント、リボソーム結合部位エレメント、発現しようとするポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、及び選択マーカーエレメントを含む。これらのエレメントの各々は下記で論じる。場合により、該ベクターは「タグ」ＤＮＡ配列、すなわち、融合ＤＮＡ構築物の５’又は３’末端のいずれかに位置するオリゴヌクレオチド配列を含みうる。タグＤＮＡは、ヘキサＨｉｓ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などの分子又は別の小さな免疫原性配列をコードする。適切なリーディングフレーム内に置くとき、このタグは融合タンパク質と共に発現され、宿主細胞からの融合タンパク質の精製のためにアフィニティータグとして使用できる。場合により、該タグはその後、例えば選択したペプチダーゼを使用することなどの様々な手段によって精製融合タンパク質から除去することができる。

該プロモーターは、同種（すなわち宿主細胞と同じ種及び／又は株に由来）、異種（すなわち宿主細胞の種又は株以外の種に由来）、ハイブリッド（すなわち２つ以上のソースからのプロモーターの組合せ）、合成でありえ、あるいは天然の対象タンパク質プロモーターでありうる。さらに、該プロモーターは構成的又は誘導的プロモーターでありうる。それ故に、該プロモーターのソースは、該プロモーターが宿主細胞機構において機能性であり、宿主細胞機構によって活性化されうることを条件として、いかなる単細胞原核又は真核の生物、脊椎又は無脊椎生物、あるいはいかなる植物であってもよい。

本発明のベクターにおいて有用なプロモーターは、当技術分野において周知のいくつかの方法のいずれかによって入手しうる。典型的には、ここで有用なプロモーターは、マッピングによって及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によってあらかじめ同定され、それ故適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な組織ソースから単離されうる。一部の場合には、プロモーターの完全なヌクレオチド配列が既知であり得る。その場合は、核酸合成又はクローニングについて上述した方法を用いてプロモーターを合成しうる。

プロモーター配列の全部又は一部だけが既知である場合は、ＰＣＲを用いて及び／又は適切なオリゴヌクレオチド及び／又は同じ又は別の種からの５’側隣接配列フラグメントでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、完全なプロモーターを入手しうる。

本発明を実施するための適切なプロモーターは、ｌｕｘプロモーター、ｌａｃプロモーター、アラビノースプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｎａプロモーター、合成λプロモーター（バクテリオファージλから）、及びＴ５又はＴ７プロモーターなどの誘導的プロモーターである。好ましいプロモーターは、ｌｕｘ及びｌａｃプロモーターを含む。

複製起点エレメントは、典型的には、市販のものを購入するか又は使用者によって構築された原核生物発現ベクターの一部である。一部の場合には、ある一定コピー数へのベクターの増幅が対象タンパク質又はポリペプチドの最適発現のために重要でありうる。また別の場合には、不変のコピー数が好ましい。いずれの場合も、必要条件を満たす複製起点を有するベクターは当業者によって容易に選択されうる。選択ベクターが複製起点部位を含まない場合は、既知の配列に基づいて化学合成し、ベクターに連結しうる。

転写終結エレメントは、典型的には融合タンパク質ＤＮＡ構築物の末端の３’側に位置し、融合ポリペプチドをコードするＲＮＡメッセージの転写を終結させる働きをする。通常は、原核細胞内の転写終結エレメントは、Ｇ−Ｃに富むフラグメントとそれに続くポリＴ配列である。該エレメントはライブラリーから容易にクローン化されるか又はベクターの一部として市販のものが購入されるが、上述したような核酸合成のための方法を用いて容易に合成することもできる。

発現ベクターは、典型的には選択マーカーをコードする遺伝子を含む。この遺伝子は、選択培地において増殖する宿主細胞の生存と増殖のために必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば原核生物宿主細胞についてはアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール又はカナマイシンに対する耐性を付与する、（ｂ）該細胞の栄養要求性欠損を補う、又は（ｃ）複合培地からは得られない必須栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。

原核生物では一般にシャイン−ダルガーノ配列と呼ばれる、リボソーム結合エレメントは、ｍＲＮＡの翻訳の開始のために必要である。このエレメントは、典型的にはプロモーターの３’側及び融合タンパク質ＤＮＡ構築物のコード配列の５’側に位置する。シャイン−ダルガーノ配列は多様であるが、典型的にポリプリンである（すなわち高いＡ−Ｇ含量を有する）。多くのシャイン−ダルガーノ配列が同定されており、それらの各々が上述した方法を用いて容易に合成でき、原核生物ベクターにおいて使用される。

上述したエレメントの１つ以上が、使用するベクター内に既に存在しない場合は、それらを個々に入手して、ベクターに連結しうる。各々のエレメントを入手するために使用する方法は当業者に周知であり、上述した方法（すなわちＤＮＡの合成、ライブラリースクリーニング等）に匹敵する。

各々のエレメントは、連結するエレメントの末端とベクターの末端が連結のために適合性であるように、ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって個別にベクターに連結しうる。一部の場合には、十分な連結を得るために、連結する末端を「平滑化する」必要がありうる。平滑化は、最初に４つのヌクレオチドすべての存在下にクレノウＤＮＡポリメラーゼ又はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素を使用して「粘着末端」を充填することによって実施できる。この手順は当技術分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出に述べられている。

あるいは、ベクターに挿入する２以上のエレメントを最初に互いに連結して（それらを互いに隣接して位置付けようとする場合）、その後ベクターに連結しうる。

ベクターを構築するためのもう１つの方法は、様々なエレメントのすべての連結を１つの反応混合物中で同時に実施することである。この場合、エレメントの不適切な連結又は挿入により多くのナンセンス又は非機能性ベクターを生じることがあるが、選択マーカーの発現によって機能性ベクターを同定しうる。制限エンドヌクレアーゼによる消化又はＤＮＡ配列決定によって連結産物の正しい配列を確認することができる。

ベクターを構築し、融合タンパク質ＤＮＡ構築物をベクターの適切な部位に挿入した後、完成したベクターを融合タンパク質発現のために適切な宿主細胞に挿入しうる。

本発明に適する宿主細胞は細菌細胞である。例えば、大腸菌の様々な菌株（例えばＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＤＨ１０及びＭＣ１０６１）は、組換えポリペプチドの作製において使用するための周知の宿主細胞である。細菌株の選択は、典型的には菌株と使用する発現ベクターが適合性であるように行われる。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス種、他のバチルス種、ストレプトミセス種等の様々な菌株も、適切な発現ベクターと共に本発明の実施において使用しうる。

選択宿主細胞へのベクターの挿入（「形質転換」又は「トランスフェクション」とも称される）は、リン酸カルシウム沈殿又は電気穿孔などの方法を用いて実施しうる。選択される方法は、一部には使用する宿主細胞の種類に依存する。これらの方法及び他の適切な方法は当業者に周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出に述べられている。

ベクターを含む宿主細胞（すなわち形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞）は、当業者に周知の１以上の標準培地を使用して培養しうる。選択された培地は、典型的には宿主細胞の増殖と生存のために必要なすべての栄養素を含む。大腸菌細胞を培養するための適切な培地は、例えばルリア肉汁（「ＬＢ」）、ＹＴ肉汁、ＳＯＢ、ＳＯＣ及び／又はテリフィック肉汁（「ＴＢ」）である。

ＴＴＲ遺伝子、対象ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子及び場合により、それら２個の遺伝子の間に位置するリンカーペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を作製するいくつかの方法が存在する。

１つの手順では、ＴＴＲ遺伝子と対象タンパク質をコードする遺伝子（「融合パートナー遺伝子」）をいずれかの方向で連結することができる（例えば構築物の５’又は３’末端でＴＴＲ遺伝子）。リンカーＤＮＡ分子を含めようとする場合は、最初にそれを融合パートナー遺伝子の１つに連結し、次にその構築物を他の融合パートナー遺伝子に連結することができる。連結は、典型的にはＤＮＡリガーゼ酵素を製造者の指示に従って使用して実施される。

別個の手順によって、選択されたベクターへの１つの融合パートナー遺伝子の最初の連結を行い、その後で他の融合パートナー遺伝子を、最初の融合パートナー遺伝子の３’側又は５’側のいずれかの位置でベクターに連結することができる。リンカーＤＮＡ分子を含めようとする場合は、その遺伝子をベクターに連結する前又は連結した後に、そのリンカーＤＮＡ分子をいずれかの融合パートナー遺伝子に連結しうる。

本発明のＴＴＲ−ＴＭＰは、既存の巨核球／血小板欠損又は予想される巨核球／血小板欠損（例えば予定されている手術又は血小板提供のため）を含むものとして一般的に知られる状態を治療するために使用できる。そのような状態は、通常、インビボでの活性Ｍｐ１リガンドの欠損（一時的又は永続的）の結果である。血小板欠損についての一般的用語は血小板減少症（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）であり、それ故本発明の方法及び組成物は一般に、それを必要とする患者において血小板減少症を治療するために使用しうる。血小板減少症（血小板欠損）は、化学療法及び様々な薬剤による他の療法、放射線治療、手術、偶発的血液損失及び他の同定疾患状態を含む、様々な理由のために存在しうる。

血小板減少症を含み、本発明に従って治療しうる例示的な具体的な疾患状態は：再生不良性貧血、特発性血小板減少症、血小板減少症をもたらす転移性腫瘍、全身性エリテマトーデス、巨脾腫、ファンコーニ症候群、ビタミンＢ１２欠損症、葉酸欠損症、メイ−ヘグリン異常、ヴィスコット−オールドリッチ症候群及び発作性夜間血色素尿症である。また、ＡＩＤＳのためのある種の治療も血小板減少症を生じさせる（例えばＡＺＴ）。ある種の創傷治癒障害も、血小板数の上昇に起因すると考えられる。

例えば将来の手術による、予想される血小板欠損に関しては、血小板が必要となる数日前から数時間前に本発明の化合物を投与することができる。急性状況、例えば偶発的な大量失血に関しては、本発明の化合物を血液又は精製血小板と共に投与することができる。

本発明のＴＭＰ化合物はまた、そのような細胞がＭｐ１受容体を発現することが認められる場合には、巨核球以外のある種の細胞型を刺激する上でも有用でありうる。Ｍｐ１リガンドによる刺激に対して応答性である、Ｍｐ１受容体を発現するそのような細胞に関連する状態も、本発明の範囲内である。

本発明のＴＭＰ化合物は、血小板又は血小板前駆細胞の産生が所望される、又はｃ−Ｍｐ１受容体の刺激が所望されるいかなる状況においても使用しうる。それ故例えば、本発明の化合物は、血小板、巨核球等の必要性が存在する哺乳動物において何らかの状態を治療するために使用しうる。そのような状態は次の例示的ソース：国際公開公報第９５／２６７４６号、国際公開公報第９５／２１９１９号、国際公開公報第９５／１８８５８号、国際公開公報第９５／２１９１０号に詳細に記述されており、本明細書中で援用されている。

本発明の化合物はまた、血小板及び／又は巨核球及び関連細胞の生存性又は保存寿命を維持する上でも有用でありうる。従って、そのような細胞を含む組成物中に１以上のそのような化合物の有効量を含めることは有用であり得る。

本発明の治療方法、組成物及び化合物はまた、血小板欠損のほかに他の症状によって特徴付けられる疾患状態の治療においても、単独であるいは他のサイトカイン、可溶性Ｍｐ１受容体、造血因子、インターロイキン、増殖因子又は抗体と組み合わせて使用しうる。本発明の化合物は、ＩＬ−３又はＧＭ−ＣＳＦなどの一般的な造血刺激物質と組み合わせて、一部の形態の血小板減少症を治療する上で有用であることが明らかになると予想される。他の巨核球刺激因子、すなわちｍｅｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病阻害剤（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）又は巨核球刺激作用を有する他の分子も、Ｍｐ１リガンドと共に使用しうる。そのような同時投与のためのさらなる例示的サイトカイン又は造血因子は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γを含む。さらに、ひとたび巨核球が成熟形態に達すれば、巨核球を血小板へと細分する作用を有すると思われる、可溶性の哺乳動物Ｍｐ１受容体の有効量を同時に又は連続的に投与することは有用であると考えられる。それ故、本発明の化合物の投与（成熟巨核球の数を高めるため）とそれに続く可溶性Ｍｐ１受容体の投与（リガンドを不活性化して成熟巨核球が血小板を産生することを可能にするため）は、血小板産生を刺激する特に有効な手段であると予想される。適切な用量は、治療組成物中のそのような付加的成分を相殺するように調整する。治療される患者の経過は従来の方法によってモニターすることができる。

２型糖尿病患者としても知られる、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）においては、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の投与は抗糖尿病特性を有する。しかし、ＧＬＰ−１は、インビボでのその放出後にジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）によって速やかに分解される。それ故、ＧＬＰ−１ペプチド又はその変異体を本発明のＴＴＲポリペプチドに融合してＧＬＰ−１を安定化し、インビボでその半減期を上昇させうることは本発明の利点である。従って、本発明のもう１つの実施態様では、ここで述べるＴＴＲ−ＧＬＰ１融合タンパク質を、ＩＩ型糖尿病としても知られるインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を含むことが一般的に知られる状態を治療するために使用することができる。

当業者は、ＧＬＰ−１ペプチドの配列は、そのインスリン向性作用を保持するように変化させうることを認識する。当技術分野で既知のそのような変異型の同定例は、例えば、ＧＬＰ−１（７−３４）、（７−３５）、（７−３６）又は（７−３７）、Ｇｌｎ^９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−Ｇｌｎ^９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｔｈｒ^１６−Ｌｙｓ^１８−ＧＬＰ−１（７−３７）及びＬｙｓ^１８−ＧＬＰ−１（７−３７）を含む。ＧＬＰ−１変異体のさらなる例は、本明細書中に参考として援用されている、米国特許第５，１１８，６６６号、同第５，５４５，６１８号、同第５，９７７，０７１号及び国際公開公報第０２／４６２２７号及びＡｄｅｌｈｏｒｓｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６２７５（１９９４）に述べられている。従って、いかなるＧＬＰ−１ペプチドも、該ＧＬＰ−１融合タンパク質がそのコグネイト受容体を通してシグナルに結合し、シグナルを誘導することができる限り、本発明の融合タンパク質を生成するために使用できる。受容体結合及び活性化は標準的アッセイによって測定できる（米国特許第５，１２０，７１２号）。

患者の血中グルコースを正常化するために有効な融合タンパク質の用量は、下記でより詳細に論じるように、被験者の体重、年齢、血中グルコースを調節する能力欠如の重症度、融合タンパク質の投与経路、バイオアベイラビリティー、薬物動態プロフィール及び製剤を含む多くの因子に依存する。

本発明の治療方法、組成物及び化合物はまた、単独で、あるいはインスリン、ＤＰＰＩＶ阻害剤等を含むがこれらに限定されない他の糖尿病治療と組み合わせて使用しうる。ＧＬＰ−１融合タンパク質の用量は、治療組成物中のそのような付加的成分を相殺するように調整する。治療される患者の経過は、例えば血中グルコースレベルのモニターなどの従来の方法によってモニターすることができる。

本発明はまた、本発明の化合物の医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は、注入投与用であるか、あるいは経口、経鼻、経皮あるいは、例えば静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、眼内、眼球後、肺内（例えばエーロゾル投与薬剤）又は皮下注射（長期放出のためのデポー投与を含む）による投与；舌下、肛門、膣による投与、あるいは例えば脾臓被膜下、脳又は角膜内に包埋する外科的移植による投与を含む他の形態の投与用でありうる。治療は、単回用量又は一定期間にわたる多回用量で構成されうる。一般に、医薬適合性の希釈剤、防腐剤、安定剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体と共に本発明の化合物の有効量を含有する医薬組成物は、本発明に包含される。そのような組成物は、様々な緩衝剤含量、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩等）；界面活性剤及び可溶化剤（例えばツイーン８０、ポリソルベート８０等）、抗酸化剤（例えばアルコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール）及び充填物質（例えばラクトース、マンニトール）などの添加物；ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のような高分子化合物の微粒子製剤又はリポソームへの物質の組込みを含む。ヒアルロン酸も使用でき、これは循環中の存在期間の持続を促進する作用を及ぼしうる。該医薬組成物は、場合により、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ステアリン酸マグネシウム、メチル及びプロピルヒドロキシベンゾエート、デンプン、スクロース、デキストロース、アカシアゴム、リン酸カルシウム、鉱物油、ココアバター及びカカオ脂を含むがこれらに限定されない、製薬ビヒクル、賦形剤又は媒質として働くさらなる他の医薬適合性の液体、半固体又は固体希釈剤を含有しうる。そのような組成物は、本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度及びインビボでのクリアランス速度に影響しうる。例えば、本明細書中に参考として援用されている、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４２）ｐ．１４３５−１７１２参照。該組成物は、液体形態で製造されるか、又は凍結乾燥形態のような乾燥粉末でありうる。経皮的製剤と同様に、移植可能な持続放出性製剤も考慮される。

制御放出製剤は望ましいと考えられる。拡散又は浸出機序による放出を可能にする不活性マトリックス、例えばゴムに薬剤を組み込むことができる。緩やかに変性するマトリックス、例えばアルギン酸塩、多糖類も製剤に組み込みうる。この治療薬の制御放出のもう１つの形態は、Ｏｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）に基づく方法による、すなわち水が入るのを許容し、浸透作用によって単一の小さな開口部を通して薬剤を押し出すことができる半透性膜に薬剤を入れる。一部の腸溶剤皮も遅延放出作用を有する。

またここでは、本発明のタンパク質（又はその誘導体）の肺への送達も考慮される。該タンパク質（又は誘導体）は、吸入される間に哺乳類の肺へと送達され、肺上皮内層を横切って血流に入る。（これについての他の報告は、Ａｄｊｅｉら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：５６５−５６９（１９９０）；Ａｄｊｅｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ６３：１３５−１４４（１９９０）（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １３（補遺５）：ｓ．１４３−１４６（１９８９）（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：２０６−２１２（１９８９）（１−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−１１４６（１９８９）（１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら、「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，１９９０年３月（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４０：３４８２−３４８８（１９８８）（インターフェロン及び腫瘍壊死因子）及びＰｌａｔｚら、米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）を含む）。

それらのすべてが当業者に周知である、ネブライザ、定量噴霧式吸入器及びパウダー式吸入器を含むがこれらに限定されない、治療製品の肺送達用に設計された広範囲の機械的装置が、本発明の実施における使用のために考慮される。

本発明の実施に適する市販装置の一部の同定例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉによって製造される、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザ；Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏによって製造される、Ａｃｏｒｎ ＩＩネブライザ；Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａによって製造される、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量噴霧式吸入器；及びＦｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって製造される、Ｓｐｉｎｈａｌｅｒパウダー式吸入器である。

そのような装置はすべて、本発明の化合物を配分するのに適した製剤の使用を必要とする。典型的には、各々の製剤は使用する装置の種類に特異的であり、治療において有用な希釈剤、アジュバント及び／又は担体に加えて、適切な推進剤の使用を含みうる。

本発明の化合物は、最も好都合には、遠位肺への最も有効な送達のために１０μｍ（又はミクロン）未満、最も好ましくは０．５から５μｍの平均粒径を有する微粒子形態で製造すべきである。

担体は、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース及びソルビトールなどの炭水化物を含む。製剤中での使用のための他の成分は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＣを含みうる。天然又は合成界面活性剤を使用してもよい。ポリエチレングリコールを使用してもよい（該タンパク質又は類似体を誘導体化する上でのその使用は別として）。シクロデキストランなどのデキストランを使用してもよい。胆汁酸塩及び他の関連エンハンサーが使用しうる。セルロース及びセルロース誘導体も使用しうる。緩衝製剤における使用のような、アミノ酸も使用しうる。

上述した状態を治療するための方法に関わる投与レジメは、薬剤の作用を変化させる様々な因子、例えば患者の年齢、状態、体重、性別及び食事、感染の重症度、投与時間及び他の臨床的因子を考慮して、主治医によって決定される。一般に、用量は、１日１回投与又は等しい用量をより長い又は短い間隔で、例えば１日おき、週に２回、週に１回、あるいは１日２回又は３回投与される、１日当り体重１キログラムにつき本発明の化合物０．１μｇから１００ｍｇ、好ましくは０．１から１０００μｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１から１５０μｇ／ｋｇの範囲内とすべきである。

本発明の化合物は、初回ボーラス及びそれに続く、薬剤製品の治療循環レベルを維持するための持続注入によって投与しうる。もう１つの例として、本発明の化合物は単回用量として投与しうる。当業者は、良質の医療のための原則及び個々の患者の臨床状態によって決定される、有効な用量及び投与レジメを容易に最適化する。投与頻度は、薬剤の薬物動態パラメータ及び投与経路に依存する。最適医薬製剤は、投与経路と所望用量に依存して当業者によって決定される。例えば、その開示が本明細書中に参考として援用されている、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４２）ｐ．１４３５−１７１２参照。投与経路に依存して、体重、体表面積又は器官の大きさに従って適切な用量を算定しうる。

適切な投与量は、適切な用量−反応データと共に、血清中レベルを測定するための確立されたアッセイの使用を通して確認しうる。最終的な投与レジメは、薬剤の作用を変化させる様々な因子、例えば薬剤の特異的活性、損傷の重症度及び患者の応答性、患者の年齢、状態、体重、性別及び食事、感染の重症度、投与時間及び他の臨床的因子を考慮して、主治医によって決定される。試験が実施されると共に、様々な疾患及び状態についての適切な用量レベル及び治療期間に関するさらなる情報がもたらされる。

下記の実施例は説明だけを目的とするものであり、いかなる意味においても本発明を限定すると解釈されるべきではない。

この実施例は、天然組換えヒトトランスサイレチン（ＴＴＲ）及び次のＴＴＲ変異体：ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ３７Ｃ）、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｄ３８Ｃ）、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ８１Ｃ）、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）、及びＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）についてのＤＮＡの作製を述べる。

発現プラスミドｐＡＭＧ２１は、１９９６年７月２４日に寄託された、受入番号９８１１３の下にＡＴＣＣより入手可能である（ｐＡＭＧ２１の説明については１９９７年７月３日公開のＰＣＴ国際公開公報第９７／２３６１４号参照）。ＴＴＲ、ＴＴＲ変異体又はＴＴＲ−ペプチド融合物をコードするＤＮＡ配列を、ｐＡＭＧ２１内のＬｕｘＰＲプロモーターの制御下に置いた。

細菌宿主ＧＭ２２１は、初期ｅｂｇ領域内の温度感受性λリプレッサーｃＩ８５７ｓ７及び後期ｅｂｇ領域（６８分）内のｌａｃＩ^Ｑリプレッサーの両方を含むように改変された大腸菌Ｋ−１２株である。これら２個のリプレッサー遺伝子の存在は、この宿主を多様な発現系と共に使用することを可能にするが、これらのリプレッサーは共にｌｕｘＰ_Ｒからの発現には無関係である。非形質転換宿主は抗生物質耐性を持たない。ｃＩ８５７ｓ７遺伝子のリボソーム結合部位を、強化（ｅｎｈａｎｃｅｄ）ＲＢＳを含むように修飾した。それを、介在ｅｂｇ配列を欠失させてＧｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ６４４４１Ｇｂ＿Ｂａにおいて番号付けられているヌクレオチド１１７０位と１４１１位の間のｅｂｇオペロンに挿入した。この構築物を、Ｆ’ｔｅｔ／３９３へのＭＭｅｂｇ−ｃＩ８５７ｓ７強化ＲＢＳ Ｎｏ．４と呼ばれる組換えファージを使用して染色体に送達した。組換えと分離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）後、上述した染色体挿入物だけが細胞内に残る。これを新たにＦ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１と命名した。次に介在ｅｂｇ配列を欠失させてＧｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ６４４４１Ｇｂ＿Ｂａにおいて番号付けられているヌクレオチド２４９３位と２９３７位の間のｅｂｇオペロンにｌａｃＩ^Ｑ構築物を送達することによってＦ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１を修飾した。その構築物を、Ｆ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１へのＡＧｅｂｇ−ｌａｃＩ^Ｑ Ｎｏ．５と呼ばれる組換えファージを使用して染色体に送達した。組換えと分離後、上述した染色体挿入物だけが細胞内に残る。これを新たにＦ’ｔｅｔ／ＧＭ２２１と命名した。Ｆ’ｔｅｔエピソームを、ＬＢ中２５μｇ／ｍｌの濃度のアクリジンオレンジを使用して該菌株からキュアリングした。キュアリングした菌株をテトラサイクリン感受性と同定し、ＧＭ２２１として保存した。

オリゴヌクレオチド（各々１．０ｎｍ）をホスホルアミダイト法によって合成した。ヌクレオチドを、一部の場合は、大腸菌における最適発現のために変性させた。これらのコドン変化はアミノ酸配列の変化を生じさせなかった。この実施例において使用した各々のオリゴヌクレオチドを表１に列記する。

Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のプロトコールに従って使用してＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって確認し、精製して、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。発現ベクターｐＡＭＧ２１を同様に消化して、その後で子ウシ腸ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理した。ベクターと挿入物をアガロースゲルから精製し、その後で混合して、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって連結した。連結は４℃で２時間実施した。各々の連結混合物を、Ｂｉｏｒａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をギャップ長約２ｍｍのキュベット中２．５Ｖ、２５μＦＤ及び２００オームで使用して、電気穿孔によって上述した宿主菌株ＧＭ２２１に形質転換した。電気穿孔後、ルリア肉汁（ＬＢ）１ｍｌ中３７℃で約１時間、静かに振とうしながら細胞を回収した。形質転換混合物の全体を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天上にプレートした。隣接ベクター配列に対するオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲにより、所望される分子量の存在に関してコロニーをスクリーニングした。そのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって評価した。陽性クローンを、組換えタンパク質産物を生産する能力に関してさらにスクリーニングし、ヌクレオチド配列決定によって最終的に確認した。

ＴＴＲのＤＮＡ及びアミノ酸配列は既知である（Ｍｉｔａ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２４（２）：５５８−５６４［１９８４］）。これらの配列は受入番号Ｋ０２０９１としてＧｅｎｂａｎｋに寄託されている。シグナルペプチドを除く天然ＴＴＲのｃＤＮＡを、ヒト肝から誘導したｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からクローン化した。詳細には、ＴＴＲの５’末端の８個のコドンをコードするオリゴヌクレオチド（オリゴ２６９３−７９）及び終止コドンを含むＴＴＲ３’末端の７個のコドンをコードするオリゴヌクレオチド（オリゴ２６９３−８０）を合成し、ヒト肝ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用してＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇポリメラーゼで完全長成熟ＴＴＲを増幅するために使用した。生じたＰＣＲフラグメントをＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、ゲル精製して、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限発現ベクターｐＡＭＧ２１と連結した。４℃で２時間後、連結混合物を電気穿孔によってＧＭ２２１細胞に導入した。単一コロニーを採取し、プラスミドＤＮＡを作製して配列決定した。１個の生じたプラスミド（菌株Ｎｏ．５３１６）は、天然ＴＴＲの正しいＤＮＡ配列（プラスＮ末端のメチオニン）を有することを示し、それを発現のために使用した。このＤＮＡ配列を配列番号２に同定する。

上記オリゴヌクレオチド２６９３−８０とオリゴヌクレオチド２８２０−８８を使用することによって突然変異体ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）を作製した（１０番目の位置のコドンＣｙｓがＡｌａに置換された天然ＴＴＲの最初の１１個のコドンを含む）。ＰＣＲ手順及び発現菌株を選択するための工程は上述したのと同様であった。生じた菌株（菌株Ｎｏ．５６１９）は、配列番号３に同定するＤＮＡ配列を有していた。

プラスミド５６１９を、次の位置：Ａ３７、Ｄ３８、Ａ８１及びＧ８３のアミノ酸をシステインのアミノ酸で置換することによってさらに修飾した。下記で述べるように、所望突然変異を内包する相補的オリゴヌクレオチドの各々の対を、部位特異的突然変異誘発のために設計された標準的な２段階ＰＣＲ手順において、上述したＴＴＲ５’及び３’プライマーと共に使用した。菌株５６１９由来のプラスミドを鋳型として使用する２０サイクルのＰＣＲにおいて、フォワードプライマーの各々をＴＴＲ３’プライマーと共に使用し、リバースプライマーの各々をＴＴＲ５’プライマーと共に使用した。生じたＰＣＲ増幅５’及び３’フラグメントを混合し、完全長突然変異体を生成するための第二段階ＰＣＲのための鋳型として使用した。その後のクローニング及び配列決定手順は既に述べたものと同様であった。次のオリゴヌクレオチドを使用した：ＴＴＲ（Ａ３７Ｃ）フォワード（オリゴ２８２３−９１）；ＴＴＲ（Ａ３７Ｃ）リバース（オリゴ２８２３−９２）；ＴＴＲ（Ｄ３８Ｃ）フォワード（オリゴ２８２３−９３）；ＴＴＲ（Ｄ３８Ｃ）リバース（オリゴ２８２３−９４）；ＴＴＲ（Ａ８１Ｃ）フォワード（オリゴ２８２３−９５）；ＴＴＲ（Ａ８１Ｃ）リバース（オリゴ２８２３−９６）；ＴＴＲ（Ｇ８３Ｃ）フォワード（オリゴ２８２３−９７）；ＴＴＲ（Ｇ８３Ｃ）リバース（オリゴ２８２３−９８）。該プラスミドを含む生じた大腸菌株は次のように説明される：ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ３７Ｃ）（菌株５６４１）は配列番号４に同定するＤＮＡ配列を有していた。ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｄ３８Ｃ）（菌株５６４２）は配列番号５に同定するＤＮＡ配列を有していた。ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ８１Ｃ）（菌株５６４３）は配列番号６に同定するＤＮＡ配列を有していた。ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）（菌株５６５１）は配列番号７に同定するＤＮＡ配列を有していた。

菌株５６５１の１５位のＬｙｓを、菌株５６４１、５６４２、５６４３及び５６５１について述べたのと同様の手順により、オリゴヌクレオチド２９５３−６７及び２９５３−６８を使用してさらにＡｌａに突然変異誘発した。生じた菌株、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）（菌株５８９５）は配列番号８に同定するＤＮＡ配列を有していた。

この実施例は、様々なＴＭＰ−ＴＴＲ融合物の作製を述べる。ＴＴＲとＴＭＰを含むいくつかの融合タンパク質を作製した。この実施例において使用した各々のオリゴヌクレオチドを表２に列記する。

ＴＭＰを含むフラグメントを、最初に、ＴＭＰの最初の７個のコドンに加えてＮｄｅＩ部位を含む１２ヌクレオチドの５’延長部をコードするオリゴヌクレオチド２７４３−９６、及び天然ＴＴＲの最初の７個のコドンと対象ＴＭＰの最後の７個のコドンをコードするオリゴヌクレオチド２７４３−９７を使用して、完全長ＴＭＰ−Ｆｃ融合物をコードするプラスミドを内包する菌株から増幅した（ＰＣＴ国際公開公報第００／２４７７０号参照）。生じたＰＣＲフラグメントを菌株５６１９由来のプラスミドと混合し、その混合物をオリゴヌクレオチドプライマー２７４３−９６及び２６９３−８０のための鋳型として使用して、完全長ＴＭＰ−ＴＴＲを増幅した。クローニング及び発現については上述したのと同様の手順を用いた。生じた菌株、ＴＴＲ−ＴＭＰ（菌株５５１３）は配列番号９に同定するＤＮＡ配列を有していた。

次に、ＴＭＰをそれぞれ菌株５６４１、５６４２、５６４３及び５６５１のＮ末端に導入した。プラスミド５５１３をＸｂａＩで消化し、生じたＴＭＰ及びＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）の最初の１８個のコドンを含むＸｂａＩ／ＸｂａＩ挿入物をゲル精製し、５６４１、５６４２、５６４３及び５６５１由来の、ＸｂａＩで切断し、ホスファターゼ処理してゲル精製したベクターと連結した。各々の融合物について正しい方向を選択するためにＤＮＡ塩基配列決定を実施した。該プラスミドを含む生じた大腸菌株は次のように説明される：ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ３７Ｃ）（菌株５７０４）は配列番号１０に同定するＤＮＡ配列を有していた。ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｄ３８Ｃ）（菌株５７０５）は配列番号１１に同定するＤＮＡ配列を有していた。ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ８１Ｃ）（菌株５７０６）は配列番号１２に同定するＤＮＡ配列を有していた。ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）（菌株５７０７）は配列番号１３に同定するＤＮＡ配列を有していた。

この実施例は、ＰＴＨ（１−３４）−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）融合物の作製を述べる。この実施例において使用した各々のオリゴヌクレオチドを表３に列記する。

２個の新しいオリゴヌクレオチド、ヒトＰＴＨの最初の７個のコドンをコードするオリゴヌクレオチド２６９４−０１、及びＴＴＲの最初の７個のコドンとＰＴＨのアミノ酸２８−３４をコードするオリゴヌクレオチド２６９４−０３を合成して、融合物を作製した。オリゴヌクレオチド２６９４−０１及び２６９４−０３を上述したように２０サイクルのＰＣＲ手順において使用して、ＴＴＲリンカーを有するＰＴＨ（１−３４）を増幅した。この反応のための鋳型は、ＰＴＨ１−３４−Ｆｃ融合物をコードするプラスミドを内包する菌株であった（ＰＣＴ国際公開公報第０１／８１４１５号参照）。生じたＰＣＲ混合物を菌株５８９５と混合して、プライマー２６９４−０１及び２６９３−８０を用いて完全長ＰＴＨ（１−３４）−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）を増幅するための鋳型として使用した。配列確認後、この新しいプラスミドを含む生じた発現菌株をＰＴＨ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）（菌株５９２０）と称した。この菌株は配列番号１４に同定するＤＮＡ配列を有していた。

この実施例は、ＩＬ−１ｒａ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）融合物及びＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）−ＧＳＧＳ−ＩＬ−１ｒａ融合物の作製を述べる。この実施例において使用した各々のオリゴヌクレオチドを表４に列記する。

ＩＬ−１ｒａ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）融合物を作製するために、２個のオリゴヌクレオチド、ヒトタンパク質ＩＬ−１ｒａの最初の７個のコドンをコードするオリゴヌクレオチド２８２３−１３、及びＩＬ−１ｒａの最後の７個のアミノ酸とＴＴＲの最初の７個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチド２８２３−１４を合成した。ＩＬ−１ｒａを発現する菌株由来のプラスミド（ＰＣＴ国際公開公報第９１／０８２８５号参照）を、オリゴヌクレオチド２８２３−１３及び２８２３−１４を用いて増幅した。生じたＰＣＲ産物を、菌株５６１９から精製したプラスミドと混合し、オリゴヌクレオチドプライマー２８２３−１３及び２６９３−８０を用いて完全長ＩＬ−１−ｒａ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）を増幅するための鋳型として使用した。ＰＣＲ産物を上述したようにクローン化し、配列決定して、発現させた。この新しいプラスミドを含む生じた菌株をＩＬ−１ｒａ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）（菌株５６４４）と称した。この菌株は配列番号１５に同定するＤＮＡ配列を有していた。

ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）−ＩＬ−１ｒａを作製するために、次の２個のオリゴヌクレオチド、すなわち、その間にＧＳＧＳリンカーを導入した、ＴＴＲの最後の７個のアミノ酸とＩＬ−１−ｒａの最初の７個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチド２７８７−３２及びＩＬ−１−ｒａの最後の７個のコドンをコードするオリゴヌクレオチド２７８７−３３を合成した。これら２個のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてプラスミド２６９３を増幅し、生じたＰＣＲ産物をプラスミド５６１９と混合して、これらを共に、プライマー２７８７−３３及び２６９３−７９を用いて完全長ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）−ＩＬ−１ｒａを増幅するための鋳型として使用した。ＰＣＲ産物を上述したようにクローン化し、配列決定して、発現させた。この新しいプラスミドを含む生じた菌株をＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）−ＩＬ−１ｒａ（菌株５６４５）と称した。この菌株は配列番号１６に同定するＤＮＡ配列を有していた。

この実施例は、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）−ブラジキニンの作製を述べる。この実施例において使用した各々のオリゴヌクレオチドを表５に列記する。

菌株５６５１から精製したプラスミドを、オリゴヌクレオチドプライマー２６９３−７９及びＰｓｔＩ制限部位を含むＴＴＲ３’プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマー２９４３−４７によるＰＣＲのために使用した。このＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで制限消化した。生じたＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化したＡＭＧ２１、及びＧＳＧＳＧリンカーをコードするアニーリングしたオリゴヌクレオチド２９４３−４８、及びＰｓｔＩ５’とＸｈｏＩ３’重複末端を有するブラジキニンアンタゴニストペプチドＫＲＰＰＧＦＳＰＬをコードするオリゴヌクレオチド２９４３−４９を含む連結混合物中で使用した。ＧＭ１２１をこの連結産物で形質転換し、ＤＮＡをカナマイシン耐性コロニーから精製した。次に該耐性コロニーにおいてＤＮＡ配列を確認した。確認した菌株を３０℃で増殖させ、下記に述べる１０リットル発酵物において発現を誘導した。その新しい菌株をＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）−ブラジキニン（菌株５９１４）と称した。この菌株は配列番号１７に同定するＤＮＡ配列を有していた。

この実施例は、大腸菌におけるＴＴＲ及びＴＴＲ融合構築物の組換え発現を述べる。新たに構築したＴＴＲ又はＴＴＲ融合物の各々を、最初に１６℃から３７℃の範囲の温度で可溶性発現に関して検査した。この目的のために、ＴＴＲ又はＴＴＲ融合物の各々を発現するＧＭ２２１の培養物（２５ｍｌ）を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補足したＬＢ肉汁中３７℃で、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．５から１．０に達するまで増殖させた。次に培養物を、それぞれ１６℃、２０℃、２５℃、３０℃、３４℃及び３７℃の温度設定で振とう機に入れた。合成自己誘導物質Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリンラクトンを最終濃度２０ｎｇ／ｍｌまで培地に添加した後、ｌｕｘＰＲプロモーターからの遺伝子産物発現の誘導を実施した。６時間後、細菌培養物を封入体の存在に関して顕微鏡で検査した。ＴＴＲ及びその融合物のために培養物を３０℃未満の温度で増殖させることにより、しばしば可溶性又は部分的可溶性の発現を達成することができ、この温度を大量発現のために使用した。可溶性発現が達成できなかった場合は、発現のレベルが最も高かった温度を大量振とう機又は発酵槽のために使用した。

大量発現は、通常は４リットルフラスコで実施した。ＬＢ１リットルを含む４〜８台の４リットル振とう機にＴＴＲ又はその融合株の一晩培養物を接種した。発現は基本的に上述したように実施した。細胞を遠心分離によって収集した。

無菌手法を用いる発酵段階は、無菌ルリア肉汁５００ｍＬを含む振とうフラスコにおいて生産した菌株の種培養（ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）からの接種で開始する。この培養物が適切な細胞密度（６００ｎｍで０．８−２）に達したとき、その内容物を使用して、複合ベースの増殖培地１０リットルを含む２０リットル発酵槽に接種した。発酵槽を３０℃、ｐＨ７に維持し、溶解酸素レベルを３０％飽和に保持する。細胞密度が６００ｎｍで１０−１２ＯＤ単位の光学密度に達したとき、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）ホモセリンラクトンの添加によって培養物を誘導した。誘導後６時間目に遠心分離によって発酵槽から細胞を収集した。

この実施例は、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）−ブラジキニンの精製を述べる。−８０℃で保存したクローン５９１４からの大腸菌ペースト約１９３ｇを、５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０ １４４７ｍｌ中で解凍した。Ｓｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤カクテル１−８７３−５８０（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）５０錠を細胞懸濁液に溶解し、該懸濁液を１２，０００ＰＳＩで１１０−Ｙ型マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に２回通した。その溶解産物（図１、レーン２）を１１，３２５×ｇ、４℃で５０分間遠心分離した。上清を可溶性分画として採取した。該可溶性分画をポリプロピレンボトル中６５℃水浴で３０分間加熱し、その時点で内容物の温度は６３℃であった。該可溶性分画を１１，３２５×ｇ、４℃で５０分間遠心分離した。上清を熱可溶物（Ｈｅａｔ Ｓｏｌｕｂｌｅ）として採取した（図１、レーン３）。該熱可溶性分画を、２つのプレフィルターを備えた０．４５μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過し、室温（約２３℃）で、Ｑ緩衝液Ａ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で平衡させた２４０ｍｌ Ｑセファロース・ファーストフロー（Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）（内径５ｃｍ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に２０ｍｌ／分で負荷した。カラムを２０ｍｌ／分のＱ緩衝液Ａ約２３００ｍｌで洗った。Ｑカラムを、６０％Ｑ緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）への１５カラム容積の直線勾配、次いで１００％Ｑ緩衝液Ｂへの２カラム容積段階で溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定したＴＴＲ融合物を含む分画を単一Ｑプール（１１５０ｍｌ）（図１、レーン４）に貯留し、ＤＴＴ１．７７ｇを加えた。そのＱプールを室温（約２３℃）で３０分間静かに攪拌した。該Ｑプールに、３．８Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ７．０ ４１０ｍｌを緩やかに加え、１Ｍ ＨＣｌの緩やかな添加によってｐＨを約７．５から７．０に低下させた。次に該Ｑプールの約２分の１を、１０ｍｌ／分でＰ緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０）中８４ｍｌフェニルセファロース高速カラム（内径２．６ｃｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に負荷した。カラムをＰ緩衝液Ａ約１７０ｍｌで洗い、次いで５０％、８０％及び１００％Ｐ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０）を用いて３段階溶出させた。次に、該Ｑプールの残りの半分を最初の半分と同じプロトコールを用いて処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定したＴＴＲ融合物を含む分画を単一Ｐプール（２６０ｍｌ）（図１、レーン５）に貯留し、そのＰプールを、直径２０．４ｍｍの８ｋＤａカットオフ透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ）を使用して室温（約２３℃）で２時間、ＨＡ緩衝液Ａ（１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０）４Ｌに透析した。透析緩衝液を新鮮なＨＡ緩衝液Ａ４Ｌに交換し、さらに約１５時間透析を継続した。該Ｐプールを透析から取り出し、１Ｍ ＤＴＴ ６００μｌを加え、その後室温（約２３℃）で約１時間インキュベートした。Ｐプールを、ＨＡ緩衝液Ａ中１０ｍｌ／分で１０５ｍｌ（２．６ｃｍ）１型セラミックヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に負荷した。カラムを１０ｍｌ／分のＨＡ緩衝液Ａ約２１０ｍｌで洗い、次いで１２．５％、２５％、５０％及び１００％ＨＡ緩衝液Ｂ（４００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０）の４段階で溶出させた。そのフロースルーをＨＡプール（３４０ｍｌ）（図１、レーン６）として貯留し、ＤＴＴ ５２４ｍｇを加えて、その後室温（約２３℃）で１時間インキュベートした。

該ＨＡプールの約２分の１を、１０ｍｌ／分で４７ｍｌソース１５Ｑカラム（内径２．６ｃｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に負荷し、次にＱ−緩衝液Ａ約２５０ｍｌで洗った。１０％から５０％Ｑ緩衝液Ｂへの２０カラム容積の直線勾配、次いで２カラム容積の１００％Ｑ緩衝液Ｂの段階でカラムを溶出させた。該ＨＡプールの残りの半分を最初の半分と同じプロトコールを用いて処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定したＴＴＲ融合物を含む分画を単一Ｑ２プール（２６０ｍｌ）に貯留し、１０ｋＤａ膜を有する攪拌式セルを用いて約７５ｍｌに濃縮した。次にＱ２プール（図１、レーン７）を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過し、算定比吸光係数１８，４５０ Ｍ^−１ ｃｍ^−１を用いてタンパク質濃度を１６．９ｍｇ／ｍｌと判定した。発熱物質レベルは、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｙｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅアッセイ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）を用いて＜１ＥＵ／ｍｇタンパク質と判定された。核酸含量は、２６０ｎｍ対２８０ｎｍの吸光度比が０．５２と測定されたので、無視しうると判定した。

この実施例は、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）のＣ末端又はＮ末端のいずれかにペプチドを融合することがそのオリゴマー構造に有意の影響を及ぼさないことを明らかにする。２０ｍＭトリスｐＨ８．０及び約２５０ｍＭ ＮａＣｌ中のＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）、ＰＴＨ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）及びＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）−ブラジキニンを室温（約２３℃）で約１時間、９ｍＭ ＤＴＴで還元した。還元したＴＴＲ約５０μｇを、１ｍｌ／分でＳＥＣ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７）中Ｂｉｏｓｅｐ−Ｓｅｃ−Ｓ ３０００カラム（内径７．８ｍｍ×３００ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に注入した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ分子量標準物質（１５１−１９０１）を使用してカラムをカリブレートし、注入した試料のおよその分子サイズを算定した。図２からわかるように、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）は、４９ｋＤａの分子サイズに相当する約８．８分で溶出し、これは５５ｋＤａの四量体の算定分子量に匹敵する。ＰＴＨ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）は、６７ｋＤａの分子サイズに相当する約８．６分で溶出し、これは該四量体について算定される７１ｋＤａに近い。ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）−ブラジキニンは、５７ｋＤａの分子サイズに相当する約８．７分で溶出し、これも該四量体について算定される６０ｋＤａに近い。

この実施例は、ジスルフィド結合を含むタンパク質をＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）のＣ末端又はＮ末端のいずれかに融合することがそのオリゴマー構造に有意の影響を及ぼさないことを明らかにする。ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）、ＩＬ−１−ｒａ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）及びＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）−ＩＬ−１−ｒａの各々約５０μｇを、１ｍｌ／分でＳＥＣ緩衝液中Ｂｉｏｓｅｐ−Ｓｅｃ−Ｓ ３０００カラム（内径７．８ｍｍ×３００ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に注入した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ分子量標準物質（１５１−１９０１）を使用してカラムをカリブレートし、注入した試料のおよその分子サイズを算定した。図３からわかるように、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）は、５５ｋＤａの四量体の算定分子量に匹敵する４９ｋＤａの分子サイズに相当する、約８．８分で溶出する。ＩＬ−１−ｒａ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）融合物は、１８８ｋＤａの分子サイズに相当する約７．９分で溶出し、これは１２４ｋＤａという該四量体についての予想分子量よりも著しく大きい。同様に、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）−ＩＬ−１−ｒａは、該四量体について予想される１２４ｋＤａと比較して、やはり１８８ｋＤａの分子サイズに相当する約７．９分で溶出した。サイズ排除クロマトグラフィーは形状依存的であり、標準物質を球状タンパク質についてカリブレートしているので、これらの大きさのずれはおそらく分子の形状の相違によるものである。

この実施例は、ヒト免疫グロブリンＦｃ（Ｆｃ−ＴＭＰ）のカルボキシ末端に融合したＴＭＰ配列とＴＭＰ（ｍ）−ＴＴＲの、可溶性ヒト骨髄増殖性白血病（ＭＰＬ）受容体への結合を比較する。加えて、この実施例は、天然ＴＴＲシステインのペグ化がＴＭＰ融合物のＭＰＬ受容体への結合に及ぼす作用を示す。ペグ化ＴＴＲ融合物の作製は実施例１３において詳細に述べる。

この実施例のために、ヒトＭＰＬ受容体を、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を製造者（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓｕｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の指示に従って使用して、Ｒ_Ｌ＝１３００Ｒ_ＵでＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５チップに共有結合した。すべての試料を、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン及び０．００５％Ｐ２０（ポリオキシエチレンソルビタン）を含むダルベッコのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中５０μｌ／分で該チップに通した。平衡エンドポイントは注入後３分とした。図４からわかるように、Ｆｃ−ＴＭＰはＴＭＰ（ｍ）−ＴＴＲと比較してより優れた結合特性を示す。さらに、この図は、天然ＴＴＲシステイン（Ｃｙｓ１０）のペグ化がＴＭＰのＭＰＬ受容体への結合を妨げることを明らかにする。ＴＭＰ（ｍ）−ＴＴＲ−ＰＥＧ５Ｋの結合は、その非ペグ化対応物と比較して有意に低い結合応答を示し、ＴＭＰ（ｍ）−ＴＴＲ−ＰＥＧ２０Ｋはさらに一層強い阻害を示した。これは、システイン１０上のＰＥＧの存在が、おそらく融合ＴＭＰからＭＰＬ受容体の結合に関して立体障害を引き起こし、より大きなＰＥＧはより大きな障害を生じさせることを示唆する。

この実施例は、マウスへのＴＭＰ（ｍ）−ＴＴＲの注入が血液中の血小板数に及ぼす作用を示す。この実施例のために、５０匹のＢＤＦ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を５群に分け、希釈剤（０．１％ウシ血清アルブミンを含むダルベッコのＰＢＳ）又は希釈剤と供試タンパク質５０μｇ／ｋｇ動物のいずれかを皮下注射した（０日目）。各々の群を半分ずつに分けて、交互の時点で（０日目、３日目、５日目、７日目、１１日目、１２日目、１４日目及び１７日目）採血した（１４０μｌ）。採血の前にマウスをイソフルランで麻酔した。

採集した血液を、ＡＤＶＩＡ １２０自動血液分析器をネズミ用ソフトウエア（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）と共に使用して完全血球算定及び白血球分画に関して分析した。図５からわかるように、Ｆｃ−ＴＭＰは、５日目に４．３×１０^１２血小板 Ｌ^−１の血小板数ピークに達する最大応答を示し、これは基線値である１．２×１０^１２血小板 Ｌ^−１の３．４倍以上である。ＴＭＰ（ｍ）−ＴＴＲ−ＰＥＧ５Ｋは、基線値の２倍を少しだけ下回る２．３×１０^１２血小板 Ｌ^−１でピークに達する中等度の応答を示した。非ペグ化形態のＴＭＰ（ｍ）−ＴＴＲは、基線値を２０％だけ上回る１．５×１０^１２血小板 Ｌ^−１という極めて低い応答を示す。非ペグ化形態のＴＭＰ（ｍ）−ＴＴＲは、インビトロではそのペグ化対応物よりも良好な結合を示すが（図４）、インビボではＴＭＰ（ｍ）−ＴＴＲ−ＰＥＧ５Ｋと比較して低い成績である。これは、ＴＴＲ構築物の生物学的半減期を改善するためにはＰＥＧが必要であること、及びそれは受容体に対する低い親和性を補って余りあることを示唆する。

この実施例は、ＴＴＲ上のシステイン１０のアラニンへの突然変異、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）がそのオリゴマー構造に有意に影響を及ぼさないことを明らかにする。ＴＴＲ及びＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）の各々約５０μｇを１ｍｌ／分でＳＥＣ緩衝液中Ｂｉｏｓｅｐ−Ｓｅｃ−Ｓ ３０００カラム（内径７．８ｍｍ×３００ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に注入した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ分子量標準物質（１５１−１９０１）を使用してカラムをカリブレートし、注入した試料のおよその分子サイズを算定した。図６からわかるように、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）は、５５ｋＤａの四量体の算定分子量と同様の５７ｋＤａの分子サイズに相当する、約８．８分で溶出する。両方の形態のＴＴＲが６５℃で沈殿に対して抵抗性であるという所見（データは示していない）と合わせてこのデータは、システイン１０のアラニンへの突然変異はＴＴＲの構造又は安定性に有意の影響を及ぼさないことを示唆する。

この実施例は、システイン１０からアラニンへの突然変異のバックグラウンドにおけるアラニン３７のシステインへの突然変異、ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ３７Ｃ）、アスパラギン酸３８のシステインへの突然変異、ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｄ３８Ｃ）、アラニン８１のシステインへの突然変異、ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ８１Ｃ）、又はグリシン８３のシステインへの突然変異、ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）がＴＴＲのオリゴマー構造に有意の影響を及ぼさないことを明らかにする。加えて、この実施例は、これらの突然変異体形態のＴＴＲの５Ｋ又は２０Ｋ ＰＥＧによるペグ化が、非ペグ化形態よりも有意に大きい分子サイズを有する２つの異なる種のＴＴＲを生じることを明らかにする。ＴＴＲのペグ化は、最初にＴＴＲ（７．２８ｇ／ｍｌ）約８ｍｌを、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５の存在下に３０℃で３０分間、１０ｍＭ ＤＴＴで還元することによって実施した。還元したＴＴＲを、次に、２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５中２．５ｍｌ／分で２６ｍｌ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５ミディアムカラム（内径２．６ｃｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して脱塩した。次に、還元ＴＴＲの吸光度を２８０ｎｍで測定し、算定比吸光係数（ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ３７Ｃ）については２９，４５０ Ｍ^−１）を使用することによって濃度を判定した（５．１４ｍｇ／ｍｌ）。その後、還元試料の２分の１（４．６ｍｌ）を直ちに５ｍＭメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド５Ｋ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）８１０μｌと混合し、残りの半分を２．５ｍＭメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド２０Ｋ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１６２０μｌと混合した。この反応を３０℃で３０分間進行させ、１Ｍ ＤＴＴ４６μｌを加えてクエンチした。次に各々のペグ化試料を２．５ｍｌ／分で５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｑ−セファロースカラムに負荷し、５ｍｌ／分で数カラム容積のＱ緩衝液Ａ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０）で洗った。カラムを、４０％Ｑ緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）への直線勾配、次いで１００％Ｑ緩衝液Ｂへの２カラム容積段階で溶出させた。ピーク分画をプールし、２８０ｎｍでプールの吸光度を測定することによって濃度を判定した。各々の試料約５０μｇを１ｍｌ／分でＳＥＣ緩衝液中Ｂｉｏｓｅｐ−Ｓｅｃ−Ｓ ３０００カラム（内径７．８ｍｍ×３００ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に注入した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ分子量標準物質（１５１−１９０１）を使用してカラムをカリブレートし、注入した試料のおよその分子サイズを算定した。図７からわかるように、４つの非ペグ化ＴＭＰ−ＴＴＲ構築物の見かけ分子サイズは、予想される７０ｋＤａ四量体よりも著しく低い、４０−４５ｋＤａの間である。この遅延した溶出時間はおそらく、いくつかの他のＴＭＰ構築物に関して認められた（データは示していない）、サイズ排除樹脂とＴＭＰ−ＴＴＲ構築物のわずかな相互作用によるものと考えられる。５Ｋ ＰＥＧとの複合後、見かけ分子サイズは、予想される９０ｋＤａよりもはるかに大きい、４２１−４２８ｋＤａの間に上昇する（非ペグ化対応物よりも１．５３−１．６４分早い溶出）。サイズ排除クロマトグラフィーでのペグ化分子の誇張された分子量の所見はしばしば認められる現象である（データは示していない）。２０Ｋ ＰＥＧ構築物は、最大カリブレート標準物質（６７０ｋＤａ）よりも早く溶出し、それらの５Ｋペグ化対応物よりも１．２８−１．４０分早い溶出を示した。総合してこのデータは、４つの工作した突然変異体形態のＴＭＰ−ＴＴＲすべてが、ペグ化されてそれらの見かけ分子サイズを劇的に上昇させうることを明らかにしている。

ペグ化ＴＭＰ−ＴＴＲ構築物約２μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図８）。この図は、ＴＭＰ−ＴＴＲ単量体の大部分が１個のみのメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドによって修飾されたこと、及びその反応はほぼ完全であって非修飾単量体をほとんど残さなかったことをゲルシフトによって明らかにしている。

この実施例は、Ｆｃ−ＴＭＰ、ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ３７Ｃ）、ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｄ３８Ｃ）、ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ８１Ｃ）、及びＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）がインビトロでのヒトＭＰＬ受容体への結合に関して類似の親和性を有することを明らかにする。この実施例のために、Ｆｃ−ＴＭＰを、製造者（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓｕｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の指示に従って高密度でＢＩＡｃｏｒｅプロテインＧチップに結合した。供試タンパク質を、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン及び０．００５％Ｐ２０（ポリオキシエチレンソルビタン）を含む結合緩衝液（ダルベッコのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））中で５ｎＭ ＭＰＬ受容体と共に室温（約２３℃）で２時間以上プレインキュベートした。非ペグ化タンパク質については、非特異的結合を防ぐために０．１ｍｇ／ｍｌヘパリンを添加した。すべての試料を、結合緩衝液中５０μｌ／分で該チップに通した。平衡エンドポイントは注入後３分とした。図９からわかるように、すべてのＴＴＲ構築物はＭＰＬ受容体に対して同様の親和性を示し、０．８８１−２．３３３ｎｍの範囲の親和性であったのに対し、Ｆｃ−ＴＭＰ構築物は３．２７６−５．３６９ｎｍの範囲の親和性を有していた。

この実施例は、ペグ化ＴＭＰ−ＴＴＲ構築物のマウスへの注入が血液中の血小板数に及ぼす作用を示す。この実施例のために、１７０匹のＢＤＦ１マウスを１７群に分け、供試タンパク質５０μｇ／ｋｇ動物（ＴＭＰ融合構築物、Ｆｃ−ＴＭＰ又はＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）対照）を皮下注射した（０日目）。各々の群を半分ずつに分けて、交互の時点で（０日目、３日目、５日目、７日目、１０日目、１２日目及び１４日目）採血した（１４０μｌ）。採血の前にマウスをイソフルランで麻酔した。

採集した血液を、ＡＤＶＩＡ １２０自動血液分析器をネズミ用ソフトウエア（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）と共に使用して完全血球算定及び白血球分画に関して分析した。図１０Ａに認められるように、Ｆｃ−ＴＭＰは、５日目に４．２×１０^１２血小板 Ｌ^−１以上に達する血小板数で最大応答を示し、これは基線値である１．４×１０^１２血小板 Ｌ^−１の３倍である。４つの非ペグ化ＴＭＰ−ＴＴＲ構築物はすべて対照よりも良好な成績であったが、Ｆｃ−ＴＭＰほど良好ではなく、Ｆｃ−ＴＭＰは、５日目に基線値に比べて２９％から１０７％の改善である１．８から２．９×１０^１２血小板 Ｌ^−１の血小板数を示した。図１０Ｂに認められるように、４つのＴＭＰ−ＴＴＲ構築物すべての工作されたシステインへの５Ｋ ＰＥＧ基の付加は、３．７から４．４×１０^１２血小板 Ｌ^−１（基線値の２．８から３．４倍）の血小板数を伴って実質的に効果を改善する。

同様に図１０Ｃに認められるように、ＴＭＰ−ＴＴＲへの２０Ｋ ＰＥＧの複合体化は、４．２から４．６×１０^１２血小板 Ｌ^−１（基線値の３．２から３．５倍）の血小板数を伴って、付加的な、しかしそれほど劇的ではない効果の改善を生じさせる。ＴＭＰ融合構築物のすべてがインビトロでＭＰＬに関して類似の結合親和性を有していたので、この差はおそらく、構築物の有効生物学的半減期を上昇させるＰＥＧ複合体化の影響によるものであると考えられる。

この実施例は、ペグ化ＰＴＨ−ＴＴＲ構築物のマウスへの注入が血液中のイオン化カルシウム放出に及ぼす作用を示す。この実施例のために、６０匹の雄性ＢＤＦ１、４週齢マウスを１２群に分け、供試タンパク質８．９１ｍｇ／ｋｇ動物（ＰＴＨ融合構築物、ＰＴＨ−Ｆｃ又はＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）対照）を皮下注射した（０日目）。各々の群を０、２４、４８及び７２時間目の時点で採血した（７５μｌ）。採血の前にマウスをイソフルランで麻酔した。

採集した血液を、Ｃｉｂａ^＊Ｃｏｒｎｉｎｇ ６３４ Ｃａ＋＋／ｐＨ分析器を用いてイオン化カルシウムに関して分析した。図１１に認められるように、ＰＴＨ−Ｆｃ、ＰＴＨ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ａ３７Ｃ）（ＰＥＧ５Ｋ）、ＰＴＨ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ａ３７Ｃ）（ＰＥＧ２０Ｋ）、ＰＴＨ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）（ＰＥＧ５Ｋ）及びＰＴＨ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）（ＰＥＧ２０Ｋ）は、注射後２４時間目に２．２から２．７ｍｍｏｌ Ｌ^−１に上るイオン化カルシウムレベルの最大応答を示し、これは基線値である１．３ｍｍｏｌ Ｌ^−１の１．７倍である。注射後７２時間目に、１．８から１．９ｍｍｏｌ Ｌ^−１の増大したイオン化カルシウムレベルを維持したＰＴＨ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ａ３７Ｃ）（ＰＥＧ５Ｋ）、ＰＴＨ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）（ＰＥＧ５Ｋ）及びＰＴＨ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）（ＰＥＧ２０Ｋ）処置群を除いて、すべての群のイオン化カルシウムレベルが基線値に戻った。非ペグ化ＰＴＨ−ＴＴＲ構築物は、血清中イオン化カルシウムレベルの上昇においてＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）対照と同等であるか又はそれよりわずかに良好であった。

この実施例は、プラスミドを含むＰＴＨ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ａ８１Ｃ）の構築を述べる。５９２０のＸｂａＩ／ＸｂａＩフラグメントを、プラスミド５６４３（実施例１に述べられている）をＸｂａＩで消化して誘導した精製ベクターに連結した。生じたプラスミドを含む大腸菌株を５９３３ ＰＴＨ−ＴＴＲＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ａ８１Ｃと称する。

この実施例は、ＧＬＰ−１−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）融合物及びＧＬＰ−１−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）融合物の作製を述べる。実施例１に述べられているプラスミドｐＡＭＧ２１を使用してこれらの構築物をクローン化した。この実施例において使用した各々のオリゴヌクレオチドを表６に列記する。

細菌宿主ＧＭ１２１は、後期ｅｂｇ領域（６８分）内のｌａｃＩ^Ｑリプレッサーを含むように改変された大腸菌Ｋ−１２株である。このリプレッサー遺伝子の存在は、この宿主を様々な発現系と共に使用することを可能にするが、このリプレッサーはｌｕｘＰＲからの発現には無関係である。非形質転換宿主は抗生物質耐性を持たない。詳細には、ｌａｃＩ^Ｑ構築物を、介在ｅｂｇ配列を欠失させてＧｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ６４４４１Ｇｂ＿Ｂａにおいて番号付けられているヌクレオチド２４９３位と２９３７位の間のｅｂｇオペロンに送達することによってＦ’ｔｅｔ／３９３を修飾した。この構築物を、ＡＧｅｂｇ−ｌａｃＩ^Ｑ Ｎｏ．５と呼ばれる組換えファージを用いて染色体に送達した。

組換えと分離後、上述した染色体挿入物だけが細胞内にとどまる。これを新たにＦ’ｔｅｔ／ＧＭ１２０と命名した。次にＦ’ｔｅｔ／ＧＭ１２０を、ｈｓｄＲ遺伝子においてそれを不活性化するように突然変異させた。これを新たにＦ’ｔｅｔ／ＧＭ１２１と命名した。Ｆ’ｔｅｔエピソームを該菌株からキュアリングし、テトラサイクリン感受性であることを確認して、ＧＭ１２１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０２１７４）として保存した。

ＧＬＰ−１配列及びリンカーを増幅するために、ミニプレッププラスミドＤＮＡ鋳型２−４μｌ、各々のオリゴヌクレオチド１μＭ、各々のオリゴヌクレオチド０．２ｍＭ、５％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２Ｕを含む反応物８０μｌ中、Ｒｏｃｈｅ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（カタログ番号１ ５７８ ５５３）でＰＣＲを実施した。反応サイクルは、９４℃、５分間、次いで［９４℃、２０秒間、４５℃、３０秒間、７２℃、１分間］の３５サイクルであった。ＰＣＲ産物を、製造者（ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコールに従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した。次にＰＣＲ産物とベクターをＮｄｅＩ及びＫｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。

消化したＤＮＡをアガロースゲルから精製し、その後混合して、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって室温で１．５−２時間連結した。各々の連結混合物を、ギャップ長２ｍｍのキュベット中２．５ＫＶでＢｉｏｒａｄ大腸菌Ｐｕｌｓｅｒを使用して、電気穿孔によって上述した宿主菌株ＧＭ１２１に形質転換した。テリフィック肉汁（ＴＢ）２ｍｌ中３７℃、２５０ｒｐｍで約３時間、細胞を回収した。回収培養物７０−１００μｌを、４０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天上にプレートした。ＤＮＡミニプレップを作製し、ヌクレオチド配列決定によって正しいクローンを確認した。

ＧＬＰ−１−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）融合物を作製するために、２個のオリゴヌクレオチド、すなわち、ｌｕｘＲプロモーター領域に結合するオリゴヌクレオチド１２０９−８５、及び融合リンカーの最後の１２個のアミノ酸とＴＴＲの最初の８個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチド３１３１−６３を合成した。Ｎ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ開始点とそれに続くニッケルカラム精製のための７ヒスチジン配列を有するＧＬＰ−１配列、カスパーゼによるＧＬＰ−１の最初のヒスチジンの前での開裂のためのアスパラギン酸−グルタミン酸−バリン−アスパラギン酸配列、ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）配列、及び２７アミノ酸の融合リンカーを発現する菌株由来のｐＡＭＧ２１プラスミドを、オリゴヌクレオチド１２０９−８５及び３１３１−６３を用いて増幅した。そのＰＣＲ産物を上述したようにクローン化し、配列決定した。新しいプラスミドを含む生じた菌株をＧＬＰ−１−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）（菌株６２９８）と称した。この菌株は配列番号４７に同定するＤＮＡ配列を有していた。

ＧＬＰ−１−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）融合物を作製するために、２個のオリゴヌクレオチド、すなわち、ＮｄｅＩ部位を含み、上述した精製及び開裂配列に加えてＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）の最初の６個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチド３１８３−８３、及び融合リンカーの最後の６個のアミノ酸とＴＴＲの最初の８個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチド３１８３−８４を合成した。

Ｎ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ開始点とそれに続くニッケルカラム精製のための７ヒスチジン配列を有するＧＬＰ−１配列、カスパーゼによるＧＬＰ−１の最初のヒスチジンの前での開裂のためのアスパラギン酸−グルタミン酸−バリン−アスパラギン酸配列、ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）配列、及び２５アミノ酸の融合リンカーを発現する菌株由来のｐＡＭＧ２１プラスミドを、オリゴヌクレオチド３１８３−８３及び３１８３−８４を用いて増幅した。そのＰＣＲ産物を上述したようにクローン化し、配列決定した。新しいプラスミドを含む生じた菌株をＧＬＰ−１−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）（菌株６４５０）と称した。この菌株は配列番号４８に同定するＤＮＡ配列を有していた。

この実施例は、ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−Ｋ−Ｆｃ融合物の作製を述べる。この構築物は、ｌｕｘタンパク質及びプロモーターがｌａｃＩ結合部位及びＩＰＴＧ誘導プロモーターで置換されていること及びリボソーム結合部位配列がより短いこと（ＡａｔＩＩとＣｌａＩ認識部位の間の配列が

で置換されており、ＳａｃＩＩ認識部位の後の配列の一部が欠失していること（

が残存する）においてｐＡＭＧ２１と異なる、プラスミドｐＡＭＧ３３^＊を使用してクローン化した。この実施例において使用した各々のオリゴヌクレオチドを表７に列記する。

ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−Ｆｃ融合物を作製するために、２個のオリゴヌクレオチド、すなわち、ＮｄｅＩ部位を含み、上述した精製及び開裂配列に加えてＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）の最初の８個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチド２９８５−９２、及びＦｃのアミノ酸１８から２３をコードするオリゴヌクレオチド２６８７−５０を合成した。Ｎ末端Ｍｅｔ開始点を有するＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）配列、２７アミノ酸リンカー及びＦｃ配列を発現する菌株由来のｐＡＭＧ３３^＊プラスミドを、オリゴヌクレオチド２９８５−９２及び２６８７−５０を用いて増幅した。そのＰＣＲ産物を、使用した酵素がＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩであったことを除いて上述したようにクローン化し、配列決定した。上流ベクター配列及び挿入物を導入した５Ｈｉｓ−アスパラギン酸配列に対するオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって挿入物の存在を確認する、コロニースクリーニング段階を含めた。新しいプラスミドを含む生じた菌株をＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−Ｋ−Ｆｃ（菌株５９４５）と称した。この菌株は配列番号５１に同定するＤＮＡ配列を有していた。

この実施例は、ＴＭＰ−ＣＨ２−ＴＴＲＣ１０Ａ及びＴＴＲＣ１０Ａ−ＣＨ２−ＴＭＰを作製するための、免疫グロブリン分子のＣＨ２ドメインのＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）へのクローニングを述べる。

ＴＭＰ−Ｆｃから誘導したＣＨ２ドメインを、２段階ＰＣＲ手順によってＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）、すなわち菌株５６１９のＣ末端に連結した。そのＣＨ２ドメイン（５’から３’まで：ＴＴＲの最後の７個のコドン、ＣＨ２及びＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩリンカーを含む）を最初に次のオリゴヌクレオチドによって増幅した：
２９３３−７７：
ＧＴＣ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＡＴ ＣＣＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＧＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＣＣ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＧＧ ＧＧＡ ＣＣＧ ＴＣＡ ＧＴＴ ＴＴＣ ＣＴＣ（配列番号５３）、及び
２９７３−７８：
ＣＣＧ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＴＴ ＡＧＧ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＣ ＣＣＣ ＣＴＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＴＧＧ ＡＧＡ ＴＧＧ Ｔ（配列番号５４）。

次にこのフラグメントを、オリゴヌクレオチド２９７３−７８及び
２９７３−７９：
ＧＡＧ ＧＡＡ ＴＡＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＧＴ ＣＣＡ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＧＴ ＧＡＡ ＴＣＣ ＡＡＧ（配列番号５５）
によるその後のＰＣＲにおいて５６１９に融合し、次いでＮｄｅＩ／ＸｈｏＩで消化して、同様に制限切断したｐＡＭＧ２１にクローニングした。生じたプラスミドを６０１７（ＴＴＲＣ１０Ａ−ＣＨ２）と称する：

６０１７のＸｂａＩ／ＸｂａＩフラグメントを上述した５７０４の対応するフラグメントで置換し、ＴＭＰ−ＴＴＲＣ１０Ａ−ＣＨ２（菌株６０２４）を構築した：

ＴＴＲＣ１０Ａ−ＣＨ２−ＴＭＰの構築を次のように実施した：５’ＢａｍＨＩリンカーと３’ＸｈｏＩリンカーを含むＴＭＰフラグメントを、オリゴヌクレオチド２６９４−１９及び
２９７４−７０：
ＧＡＧ ＧＡＡ ＴＡＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＴＣ ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＣＧ ＡＣＴ ＣＴＧ ＣＧ（配列番号５８）
によって増幅した。

増幅したフラグメントをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、その後同様に制限切断した６０１７と連結した。生じたクローンを菌株６１０４（ＴＴＲＣ１０Ａ−ＣＨ２−ＴＭＰ）と称する。

この融合物のもう１つの立体配置をＴＭＰ−ＣＨ２−ＴＴＲ２として作製した。ＴＭＰ−Ｆｃから誘導したＣＨ２ドメインを、最初に２段階ＰＣＲによってＴＴＲＣ１０ＡのＮ末端に連結した。そのＣＨ２ドメイン（５’から３’まで：ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩリンカー、ＣＨ２及びＴＴＲＣ１０Ａの最初の７個のコドンを含む）を、最初にオリゴヌクレオチド：

によって増幅した。

このフラグメントをオリゴヌクレオチド２９７４−６６及び２６９３−８０によるその後のＰＣＲにおいて５６１９に融合し（実施例１）、次いでＮｄｅＩ／ＸｈｏＩで制限消化して、同様に制限切断したｐＡＭＧ２１にクローニングした。生じたクローンを６０１６（ＣＨ２−ＴＴＲＣ１０Ａ）と称する：

５’末端にＮｄｅＩリンカー及び３’末端にＢａｍＨＩリンカーを含むＴＭＰフラグメントを、オリゴヌクレオチド：

によって増幅した。

次にこのフラグメントをＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、菌株６０１６由来の同様に制限切断してゲル精製したベクターと連結した。生じたクローンを６１１０（ＴＭＰ−ＣＨ２−ＴＴＲＣ１０Ａ）と称する：

この実施例は、ＴＴＲＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ−ＴＭＰ、ＴＴＲＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ａ８１Ｃ−ＴＭＰ及びＴＴＲＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ−ＴＭＰの構築を述べる。

ＴＭＰをＴＴＲ及びその変異体のＣ末端でもクローン化した。そのＮ末端に５アミノ酸リンカー（ｇｓｇｓｇ）プラスｗｔ ＴＴＲの最後の７個のアミノ酸を含む完全長ＴＭＰを、標準ＰＣＲ手順において次のセットのオリゴヌクレオチドによって増幅した。

このＰＣＲフラグメントを、さらに、実施例１で述べたようにオリゴヌクレオチド２６９４−１９及び２６９３−７９を用いる第二のＰＣＲによってｗｔ ＴＴＲの３’末端に連結した。生じたクローンを配列確認し、菌株５３６５（ＴＴＲ−ＴＭＰ）と称する：

５３６５のＸｂａＩ／ＸｂａＩフラグメントを、上述したように菌株５８９５の対応するＸｂａＩ／ＸｂａＩフラグメントで置換して、菌株５９２１（ＴＴＲＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ−ＴＭＰ）を作製した：

プラスミド５９２１を、その後、次の位置：Ａ３７、Ａ８１及びＧ８３のアミノ酸を、実施例１で突然変異オリゴヌクレオチド（２６９３−８０）と共に使用したＴＴＲ３’オリゴヌクレオチドを２６９４−１９に置き換えたことを除いて、実施例１で述べたようにシステインアミノ酸で置換することによって修飾し、ＴＴＲＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ａ３７Ｃ−ＴＭＰ（配列番号７０）を含む菌株５９８２、ＴＴＲＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ａ８１Ｃ−ＴＭＰ（配列番号７１）を含む菌株５９８３、及びＴＴＲＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ−ＴＭＰ（配列番号７２）を含む菌株５９８４を生成した。

この実施例は、ＴＭＰ−ＴＴＲＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ａ８１Ｃ及びＴＭＰ−ＴＴＲＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ａ３７Ｃの構築を述べる。次の方法により、菌株５７０４、５７０６及び５７０７においてＴＴＲの１５位のＬｙｓをＡｌａに突然変異させた。プラスミド５５１３をＮｄｅＩ／ＫｐｎＩで消化し、ＴＭＰフラグメントとＴＴＲの最初の６個のアミノ酸を内包する挿入物を精製して、ＮｄｅＩ／ＫｐｎＩで制限消化してゲル精製した菌株５８９５由来のベクターと連結した。生じたプラスミドを含む細菌株を５９１９（ＴＭＰ−ＴＴＲＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）と称する。次にプラスミド５９１９をＸｂａＩで消化し、ＴＭＰ及びＣ１０ＡとＫ１５Ａ突然変異を含むＴＴＲの最初の１８個のコドンを含む、生じたＸｂａＩ／ＸｂａＩフラグメントをゲル精製し、ＸｂａＩ消化してホスファターゼ処理し、ゲル精製した菌株５７０４及び５７０６由来のベクターと連結した。新しい菌株を５９１８（ＴＭＰ−ＴＴＲＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ａ８１Ｃ）及び６０２３（ＴＭＰ−ＴＴＲＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ａ３７Ｃ）と称する。

この実施例は、大腸菌におけるＧＬＰ−１融合タンパク質の発現を述べる。飽和一晩培養物２５−１００ｍｌを使用して、２５０ｍｌバフルフラスコ中で２０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＴＢ５０ｍｌに接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。これらの一晩培養物１０−３５ｍｌを使用して、２Ｌバフルフラスコ中で２０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＴＢ１Ｌに接種し、６００ｎｍでの光学密度が約０．７に達するまで３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。次にその培養物を、ｐＡＭＧ２１の場合は３０μｇ／ｍｌ Ｎ−（Ｂ−ケトカプロイル）−ＤＬ−ホモセリンラクトン（Ｓｉｇｍａ）を含むエタノール１ｍｌの添加、あるいはｐＡＭＧ３３^＊の場合は０．１ｍＭまでのＩＰＴＧの添加によって、組換えタンパク質を発現するように誘導した。さらに２−４時間インキュベーションを継続し、遠心分離によって細胞を収集した。

この実施例は、ＰＴＨ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ａ８１Ｃ）の精製を述べる。−８０℃で保存したクローン５９３３からの大腸菌ペースト約１９７ｇを、５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０ １４８０ｍｌ中で解凍した。Ｓｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤カクテル１−８７３−５８０（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）６０錠を細胞懸濁液に溶解し、その懸濁液を１４，０００ＰＳＩで１１０−Ｙ型マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に２回通した。その溶解産物を１１，３２５×ｇ、４℃で５０分間遠心分離した。上清を可溶性分画として採取した。その可溶性分画をポリプロピレンボトル中６５℃水浴で３０分間加熱し、その時点で内容物の温度は６３℃であった。該可溶性分画を１１，３２５×ｇ、４℃で５０分間遠心分離した。上清を熱可溶物（Ｈｅａｔ Ｓｏｌｕｂｌｅ）として採取した。該熱可溶性分画を、２つのプレフィルターを備えた０．４５μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過し、室温（約２３℃）で、Ｑ緩衝液Ａ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で平衡させた２４０ｍｌ Ｑセファロース・ファーストフロー（内径５ｃｍ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に２５ｍｌ／分で負荷した。カラムを３０ｍｌ／分のＱ緩衝液Ａ約２２００ｍｌで洗った。Ｑカラムを、６０％Ｑ緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）への１５カラム容積の直線勾配、次いで１００％Ｑ緩衝液Ｂへの２カラム容積段階で溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定したＴＴＲ融合物を含む分画を単一Ｑプール（１３００ｍｌ）に貯留した。そのＱプールに、３．８Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ７．２ ４６４ｍｌを緩やかに加えた。その溶液を１１，３２５×ｇ、４℃で５０分間遠心分離した。上清を硫酸アンモニウム可溶性分画として採取し、廃棄して、ペレットを、室温で約３０分間静かに攪拌することによって１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０ ４５０ｍｌに再懸濁した。その溶液を１１，３２５×ｇ、４℃で５０分間遠心分離した。上清をリン酸緩衝液可溶性分画として採取し、０．４５μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過した。該リン酸緩衝液可溶性分画に１Ｍジチオトレイトール２４０μｌを加え、ＨＡ緩衝液Ａ中１０ｍｌ／分で１０５ｍｌ（２．６ｃｍ）１型セラミックヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に負荷した。カラムを１０ｍｌ／分のＨＡ緩衝液Ａ約２１０ｍｌで洗い、次いで２５％、５０％及び１００％ＨＡ緩衝液Ｂ（４００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０）の３段階で溶出させた。５０％溶出からの分画をＨＡプール（７２５ｍｌ）として貯留し、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過した。ジチオトレイトール１．１６ｇをＨＡプールに加え、トリス塩基を使用してそのｐＨを８．０に上げ、その後室温で約３０分間インキュベートした。水７５０ｍｌで希釈したＨＡプールを、１０ｍｌ／分で５０ｍｌソース１５Ｑ（内径２．６ｃｍ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に負荷し、その後Ｑ緩衝液Ａ約２５０ｍｌで洗った。１０％から６０％Ｑ緩衝液Ｂへの２０カラム容積の直線勾配、次いで２カラム容積の１００％Ｑ緩衝液Ｂの段階でカラムを溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定したＴＴＲ融合物を含む分画を単一Ｑ２プール（１７０ｍｌ）に貯留し、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過した。算定比吸光係数２３，９５０ Ｍ^−１ ｃｍ^−１を用いてタンパク質濃度を３．７ｍｇ／ｍｌと判定した。発熱物質レベルは、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｙｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅアッセイ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）を用いて＜１ＥＵ／ｍｇタンパク質と判定された。核酸含量は、２６０ｎｍ対２８０ｎｍの吸光度比が０．６１と測定されたので、無視しうると判定した。

この実施例は、ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｄ３８Ｃ）の精製を述べる。−８０℃で保存したクローン５７０５からの大腸菌ペースト約１７０ｇを、５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０ １２７５ｍｌ中で解凍した。Ｓｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤カクテル１−８７３−５８０（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）５０錠を細胞懸濁液に溶解し、その懸濁液を１４，０００ＰＳＩで１１０−Ｙ型マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に２回通した。その溶解産物を１１，３２５×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を可溶性分画として採取し、廃棄した。組織粉砕器を使用してペレットを水１２００ｍｌに再懸濁し、さらに２０錠のＳｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤錠剤を加えた。その懸濁液を１１，３２５×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。上清をＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ａフィルターでろ過し、ジチオトレイトール２．１ｇを加えて、その後７℃で３０分間インキュベートした。還元した試料を、７℃で、Ｑ緩衝液Ａ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ８．０）中で平衡させた３０ｍｌ／分の２４０ｍｌ Ｑセファロース・ファーストフロー（内径５ｃｍ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に負荷した。カラムを３０ｍｌ／分のＱ緩衝液Ａ約１９２０ｍｌで洗った。Ｑカラムを、２０％、３５％及び１００％Ｑ緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ８．０）の３段階で溶出させた。５００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ １３ｍｌをＱカラムからのフロースルーに加え、１１，３２５×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを４Ｍ尿素７００ｍｌ、２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０に再懸濁した。尿素で可溶化したペレットをＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ａフィルターでろ過し、７℃でＱ緩衝液Ａ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ８．０）中で平衡させた２４０ｍｌ Ｑセファロース・ファーストフロー（内径５ｃｍ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に３０ｍｌ／分で負荷した。カラムを３０ｍｌ／分のＱ緩衝液Ａ約１９２０ｍｌで洗った。Ｑカラムを、１５ｍｌ／分の２０％、３５％及び１００％Ｑ緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ８．０）の３段階で溶出させた。３５％溶出ピークを含む分画を貯留し、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過し、ジチオトレイトール（最終濃度１０ｍＭ）０．５ｇを加えて、その後７℃で３０分間インキュベートした。次にその３５％Ｑプールを、７℃で２０ｍＭトリスＨＣｌ、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中、５ｍｌ／分で４５ｍｌ（２．６ｃｍ）１型セラミックヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に負荷した。カラムを、５ｍｌ／分の２０ｍＭトリスＨＣｌ、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０ 約７０ｍｌ、次いで２．５％、２５％及び１００％ＨＡ緩衝液Ｂ（４００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０）の３段階で洗った。２．５％溶出からの分画をＨＡプール（８０ｍｌ）として貯留し、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過した。算定比吸光係数２９，４５０ Ｍ^−１ ｃｍ^−１を用いてタンパク質濃度を６．８ｍｇ／ｍｌと判定した。発熱物質レベルは、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｙｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅアッセイ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）を用いて＜１ＥＵ／ｍｇタンパク質と判定された。核酸含量は、２６０ｎｍ対２８０ｎｍの吸光度比が０．５４と測定されたので、無視しうると判定した。

この実施例は、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）−ＣＨ２−ＴＭＰのリフォールディングと精製を述べる。−８０℃で保存したクローン６１０４からの大腸菌ペースト約２３ｇを、５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０ ２００ｍｌ中で解凍した。Ｓｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤カクテル１−８７３−５８０（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）５０錠を細胞懸濁液に溶解し、その懸濁液を１２，０００ＰＳＩで１１０−Ｙ型マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に２回通した。その溶解産物を１５，３４４×ｇ、４℃で５０分間遠心分離した。上清を洗浄液として採取し、廃棄した。組織粉砕器を使用してペレットを５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０ ５０ｍｌに再懸濁した。その懸濁液を１５，３４４×ｇ、４℃で５０分間遠心分離した。上清を洗浄液として採取し、廃棄した。組織粉砕器を使用してペレットを５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０ ５０ｍｌに再懸濁した。その懸濁液を１４，０００×ｇ、室温で１０分間遠心分離した。上清を洗浄液として採取し、廃棄した。超音波処理装置を約１分間使用してペレットを８ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０ ５０ｍｌに溶解した。溶解したタンパク質を、１Ｍ ＤＴＴ ５００μｌを加えることによって室温で３０分間還元した。還元したタンパク質を２０℃、２７，２１６×ｇで３０分間遠心分離した。その後、上清を２ｍｌ／分で５０ｍＭトリス塩基、１６０ｍＭアルギニン塩基、１Ｍ尿素、１ｍＭシスタミン、４ｍＭシステイン、ｐＨ９．５ ４Ｌに加え、４℃で約１６時間インキュベートした。次に再生したタンパク質をＧｅｌｌｍａｎ ＳＵＰＯＲＣＡＰ（登録商標）５０でろ過し、その後Ｐａｌｌ Ｆｉｒｔｒｏｎ３平方フィートＹＭ１０膜接線型フローシステム（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて約５００ｍｌに濃縮して、２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０ ２Ｌにろ過透析した。次に濃縮タンパク質を１８ｍｌ／分で４５ｍｌソース１５Ｑ（内径２．６ｃｍ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に負荷し、その後Ｑ緩衝液Ａ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０）約１５０ｍｌで洗った。０％から６０％Ｑ緩衝液Ｂへの２０カラム容積の直線勾配、次いで２カラム容積の１００％Ｑ緩衝液Ｂの段階でカラムを溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定したＴＴＲ融合物を含む分画を単一Ｑプール（２９ｍｌ）に貯留した。次にそのＱプールをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ（登録商標）１０を用いて約６．３ｍｌに濃縮し、１ｍｌ／分でＰａｌｌ ＡＣＲＯＤＩＳＣ（商標）ＭＵＳＴＡＮＧ（登録商標）Ｅ膜フィルターに通した。算定比吸光係数４６，４１０ Ｍ^−１ ｃｍ^−１を用いてタンパク質濃度を１０．５ｍｇ／ｍｌと判定した。発熱物質レベルは、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｙｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅアッセイ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）を用いて＜１ＥＵ／ｍｇタンパク質と判定された。核酸含量は、２６０ｎｍ対２８０ｎｍの吸光度比が０．５１と測定されたので、無視しうると判定した。

この実施例は、ＧＬＰ−１−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ８３Ｃ）の精製を述べる。−８０℃で保存したクローン６４５０からの大腸菌ペースト約３０ｇを、５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０ ２５０ｍｌ中で解凍した。細胞懸濁液を１２，０００ＰＳＩでマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に２回通した。その溶解産物を１５，３４４×ｇ、４℃で５０分間遠心分離した。上清を可溶性分画として廃棄し、組織粉砕器を使用してペレットをデオキシコレート２００ｍｌに再懸濁した。その懸濁液を１５，３４４×ｇ、４℃で５０分間遠心分離した。上清を洗浄液として廃棄し、組織粉砕器を使用してペレットを水２００ｍｌに再懸濁した。上清を１５，３４４×ｇ、４℃で５０分間遠心分離した。上清を洗浄液として廃棄し、組織粉砕器を使用してペレットを水１００ｍｌに再懸濁した。上清を２７，２１６×ｇ、室温で３０分間遠心分離した。上清を洗浄液として廃棄し、ペレットの約２／３を約１５分間攪拌することによって８ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０ ７５ｍｌに溶解した。上清を２７，２１６×ｇ、室温で３０分間遠心分離し、その上清を水１８ｍｌで希釈した。次に試料を、５ｍｌ／分で５０ｍｌキレート化セファロースファーストフローカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に負荷し、ＮｉＣｌ_２で充填した。１０ｍｌ／分のＮｉ緩衝液Ａ（６ＭグアニジンＨＣｌ、３７．５ｍｌトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０）約１５０ｍｌで洗浄した後、１０％及び１００％Ｎｉ緩衝液Ｂ（６ＭグアニジンＨＣｌ、３７．５ｍＭトリスＨＣｌ、４００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）の２段階で溶出させた。融合構築物を含むピークをＮｉプール（４０ｍｌ）として混合し、比吸光係数２５，４４０ Ｍ^−１を用いて８ＭグアニジンＨＣｌ中２８０ｎｍでの吸光度を観察することにより、タンパク質濃度を６．４ｍｇ／ｍｌと判定した。５００ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０ ８００μｌを加え、ペグ化反応のためにタンパク質８０ｍｇを採取した。１Ｍ ＤＴＴ ２３０μｌを加え、３０℃で３０分間インキュベートした。２０ｍＭトリスＨＣｌ、６Ｍ尿素、ｐＨ８．５中８ｍｌ／分で、１３０ｍｌ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ２５ミディアムカラム（内径２．６ｃｍ）に負荷した。２８０ｎｍでの吸光度によって測定したタンパク質ピークをプールし（２２ｍｌ）、比吸光係数２５，４４０ Ｍ^−１を用いて２０ｍＭトリスＨＣｌ、６Ｍ尿素、ｐＨ８．５中２８０ｎｍでの吸光度を観察することにより、タンパク質濃度を３．２ｍｇ／ｍｌと判定した。緩衝液を交換した該物質の４５％を、３０℃で１４０分間、５ｍＭメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド５Ｋ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）９５０μｌと反応させた。各々の反応物に１Ｍ ２−メルカプトエタノール１００μｌを加えてクエンチした。Ｐｉｅｒｃｅ １０ｋＤａ Ｓｌｉｄｅａｌｙｚｅｒを使用して室温で２時間、反応物を２５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３Ｍ尿素、ｐＨ７．２５ １Ｌに透析した。透析緩衝液を２５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０％スクロース、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２５に交換し、室温で約１６時間インキュベートした。５％ＣＨＡＰＳ１４０μｌ及び２−メルカプトエタノール７．２８μｌ及び３ｍｇ／ｍｌカスパーゼ３ ０．４７５ｍｌを加え、その後室温で２時間インキュベートした。反応混合物を、２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中１ｍｌ／分で、５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に負荷し、その後同じ緩衝液約１５ｍｌで洗った。次に６０％２０ｍＭトリスＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０への直線勾配、次いで１００％溶出緩衝液への段階を使用して５ｍｌ／分でカラムを展開した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定したＴＴＲ融合物を含む分画を単一Ｑプールに貯留した（９．５ｍｌ）。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ（登録商標）３０ｋＤａを用いてＱプールを３．２ｍｌに濃縮し、約１ｍｌ／分でＰａｌｌ ＭＵＳＴＡＮＧ（登録商標）Ｅ膜に通してろ過した。Ｑプールを水で６．５ｍｌに希釈し、アセトニトリル３７５μｌを加えた。９５％ＲＰ緩衝液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸）及び５％ＲＰ緩衝液Ｂ（９５％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）中、５ｍｌ／分でＶｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ １０×２５０ｍｍ Ｃ_４カラム（Ｖｙｄａｃ，Ｈｉｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）に注入した。１００％ＲＰ緩衝液Ｂへの直線勾配に通してカラムを展開した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ（登録商標）３０ｋＤａを用いてタンパク質ピークを約３ｍｌに濃縮し、２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０を使用して１５ｍｌに希釈した。緩衝液交換をさらに３回反復した後、約１ｍｌ／分でＰａｌｌ ＭＵＳＴＡＮＧ（登録商標）Ｅ膜に通した。算定比吸光係数２５，４４０ Ｍ^−１ ｃｍ^−１を用いてタンパク質濃度を７．７ｍｇ／ｍｌと判定した。発熱物質レベルは、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｙｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅアッセイ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）を用いて＜１ＥＵ／ｍｇタンパク質と判定された。核酸含量は、２６０ｎｍ対２８０ｎｍの吸光度比が０．５４と測定されたので、無視しうると判定した。

この実施例は、マウスへのペグ化ＧＬＰ１−ＴＴＲ構築物の注入が血中グルコースレベルに及ぼす作用を示す。この実施例のために４０匹の雄性、ｄｂ／ｄｂ、９週齢マウスを４群に分け、各動物当り７．４−１６．６ｍｇの供試タンパク質（すべての群について５３８ｐｍｏｌ単量体）（５Ｋペグ化ＧＬＰ１−ＴＴＲ融合構築物１０ｍｇ、２０Ｋペグ化ＧＬＰ１−ＴＴＲ融合構築物１０ｍｇ、ＧＬＰ１−Ｆｃ１６．６ｍｇ及びＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）対照７．４ｍｇ）を腹腔内注射した（０時間目）。各々の群を注射後０時間目（基線測定）、１、４、６、１２、２４及び４８時間目に採血した。実験の最初の６時間はマウスに食餌を与えず、６時間目の採血後に食餌を再開した。

各時点で採取した各々の血液を、Ｏｎｅ Ｔｏｕｃｈ Ｐｒｏｆｉｌｅグルコース測定器を用いてグルコース含量に関して分析し、その結果を図１２に示す。

この実施例は、融合抗体ＣＨ２ドメインを有するＴＭＰ−ＴＴＲ構築物のマウスへの注入が血液中の血小板数に及ぼす作用を示す。この実施例のために５０匹の雌性ＢＤＦ１マウスを５群に分け、各動物ｋｇ当り供試タンパク質５０ｍｇ（ＴＭＰ融合構築物、Ｆｃ−ＴＭＰ又はＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）対照）を皮下注射した（０日目）。各々の群を半分ずつに分けて、交互の時点で（０日目、３日目、５日目、７日目及び１０日目）採血した（１４０ｍｌ）。採血の前にマウスをイソフルランで麻酔した。

採集した血液を、ＡＤＶＩＡ １２０自動血液分析器をネズミ用ソフトウエア（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）と共に使用して完全血球算定及び白血球分画に関して分析した。図１３からわかるように、Ｆｃ−ＴＭＰは、５日目に４．２×１０^１２血小板 Ｌ^−１以上に達する血小板数で最大応答を示し、これは基線値の１．４×１０^１２血小板 Ｌ^−１の３倍である。ＣＨ２融合ＴＭＰ−ＴＴＲ構築物はすべて対照よりも良好な成績であったが、５日目に、基線値に比べて６４％から８６％の改善にあたる、２．３×１０^１２から２．６×１０^１２血小板 Ｌ^−１の血小板数を示したＦｃ−ＴＭＰほどではなかった。

この実施例は、ペグ化ＴＴＲのカルボキシ末端に融合したＴＭＰとのペグ化ＴＴＲ構築物のマウスへの注入が血液中の血小板数に及ぼす作用を示す。この実施例のために８０匹のＢＤＦ１マウスを８群に分け、各動物ｋｇ当り供試タンパク質５０ｍｇ（ＴＭＰ融合構築物、Ｆｃ−ＴＭＰ又はＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）対照）を皮下注射した（０日目）。各々の群を半分ずつに分けて、交互の時点で（０日目、３日目、５日目、７日目、１０日目及び１２日目）採血した（１４０ｍｌ）。採血の前にマウスをイソフルランで麻酔した。

採集した血液を、ＡＤＶＩＡ １２０自動血液分析器をネズミ用ソフトウエア（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）と共に使用して完全血球算定及び白血球分画に関して分析した。図１４からわかるように、Ｆｃ−ＴＭＰ及び３つのアミノ末端（ＴＭＰ−ＴＴＲ）融合物は、５日目に、基線値の１．３×１０^１２血小板 Ｌ^−１の３倍以上である、４．３×１０^１２から４．６×１０^１２血小板 Ｌ^−１に達する血小板数で最大応答を示した。３つのカルボキシ末端（ＴＴＲ−ＴＭＰ）構築物はすべて対照よりも良好な成績であった。

この実施例は、Ｋ１５Ａ変化を含むペグ化ＴＴＲ−ＴＭＰ構築物のマウスへの注入が血液中の血小板数に及ぼす作用を示す。この実施例のために１２０匹のＢＤＦ１マウスを１２群に分け、各動物ｋｇ当り供試タンパク質５０ｍｇ（ＴＭＰ融合構築物、Ｆｃ−ＴＭＰ又はＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）対照）を皮下注射した（０日目）（この試験は２つのバッチ（一方においてはＰＥＧ２０Ｋ及び他方ではＰＥＧ５Ｋ及び非ペグ化試料）に分け、対照を反復して別々の時点で実施した）。各々の群を半分ずつに分けて、交互の時点で（０日目、３日目、５日目、７日目、１０日目及び１２日目）採血した（１４０ｍｌ）。採血の前にマウスをイソフルランで麻酔した。

採取した血液を、ＡＤＶＩＡ １２０自動血液分析器をネズミ用ソフトウエア（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）と共に使用して完全血球算定及び白血球分画に関して分析した。図１５Ａからわかるように、２つの非ペグ化構築物は基線（１．３×１０^１２血小板 Ｌ^−１）よりも良好な成績であり、５日目に１．８×１０^１２から２．０×１０^１２血小板 Ｌ^−１に上る血小板応答を示した。図１５Ｂからわかるように、Ｆｃ−ＴＭＰと３つの５Ｋペグ化融合物は、基線（１．３×１０^１２血小板 Ｌ^−１）の少なくとも２．７倍である、３．５×１０^１２から４．４×１０^１２血小板 Ｌ^−１に達する血小板数で、５日目に同等の応答を示した。図１５Ｃからわかるように、Ｆｃ−ＴＭＰと３つの２０Ｋペグ化融合物は、基線値の１．３×１０^１２血小板 Ｌ^−１の３倍以上である、４．３×１０^１２から４．６×１０^１２血小板 Ｌ^−１に達する血小板数で、５日目に同等の応答を示した。

加えて、２０Ｋペグ化ＴＴＲ構築物は、３．１×１０^１２血小板 Ｌ^−１のＦｃ−ＴＭＰに比べて、７日目に３．７×１０^１２から４．９×１０^１２血小板 Ｌ^−１の範囲の血小板数を示し、改善された持続性応答を有すると思われる。この持続性応答は、３つの２０Ｋペグ化ＴＴＲ構築物に関しては１０日目にも維持され、血小板数は、２．０×１０^１２血小板 Ｌ^−１のＦｃ−ＴＭＰに比べて２．３×１０^１２から３．１×１０^１２血小板 Ｌ^−１の範囲であった。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された組換えヒトトランスサイレチン（ＴＴＲ）変異体（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）の、ＴＴＲのＣ末端に融合したブラジキニンペプチドによる精製を示すＳＤＳゲルである。レーン１は、Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ １２分子量標準物質を含み、レーン２−７はそれぞれ次のものを含む：細胞溶解産物、加熱後上清、Ｑセファロースクロマトグラフィー段階からのプール、フェニルセファロースクロマトグラフィー段階からのプール、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー段階からのプール、及びソースＱクロマトグラフィー段階からのプール。 ＴＴＲ変異体、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）のアミノ末端又はカルボキシ末端へのペプチドの融合がそのオリゴマー構造を変化させないことをサイズ排除クロマトグラフィーによって明らかにする。実線はＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）、破線はＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）のアミノ末端に融合した副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、及び点線はＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）のカルボキシ末端に融合したブラジキニンである。 ＴＲ変異体、ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）のアミノ末端又はカルボキシ末端へのタンパク質の融合がそのオリゴマー構造を変化させないことをサイズ排除クロマトグラフィーによって明らかにする。実線はＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）、破線はＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）のカルボキシ末端に融合したＩＬ−１−ｒａ、及び点線はＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）のアミノ末端に融合したＩＬ−１−ｒａである。 ＢＩＡｃｏｒｅを使用して認められた、ヒトＭＰＬ受容体への様々なＴＰＯ−ミメティックペプチド（ＴＭＰ）構築物の結合を示す：

ＴＭＰ（ｍ）−ＴＴＲ−ＰＥＧ５Ｋの注入がマウスにおいて血小板形成を誘導することを示す。次の記号はその対応する構築物に相当する：

天然ＴＴＲ及びＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）が同様のオリゴマー立体配置（見かけ上の四量体）を維持することをサイズ排除クロマトグラフィーによって明らかにしている。実線は天然ＴＴＲであり、破線はＴＴＲ（Ｃ１０Ａ）である。 ＴＴＲへのＰＥＧの複合体化が予測可能に一様にその分子サイズを上昇させることをサイズ排除クロマトグラフィーによって明らかにする。実線はＰＥＧ複合体化なし、破線は５Ｋ ＰＥＧ融合、及び点線は２０Ｋ ＰＥＧ融合を示す。次の構築物を使用した：Ａ）ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ３７Ｃ）、Ｂ）ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｄ３８Ｃ）、Ｃ）ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ８１Ｃ）、及びＤ）ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）。 ４つの異なる位置の１つに工作された非天然システインを有するＴＴＲ変異体を含む様々なＴＭＰ−ＴＴＲ構築物のペグ化の程度を示すＳＤＳゲルである。レーン１はＮｏｖｅｘ Ｍａｒｋ １２分子量標準物質を含む；レーン２は非ペグ化ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ３７Ｃ）である；レーン３−６は、それぞれＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ３７Ｃ）、ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｄ３８Ｃ）、ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ８１Ｃ）及びＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）の５Ｋペグ化型である；レーン７−１０は、それぞれＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ３７Ｃ）、ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｄ３８Ｃ）、ＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ａ８１Ｃ）及びＴＭＰ−ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｇ８３Ｃ）の２０Ｋペグ化型である。 図９Ａ−Ｃは、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によるヒトＭＰＬへのＦｃ−ＴＭＰとＴＭＰ−ＴＴＲの競合的結合を比較している。

図１０Ａ−Ｃは、工作したシステインに複合体化したＰＥＧを伴うＴＭＰ−ＴＴＲの注入がマウスにおいて血小板形成を誘導することを示す。

工作されたシステインに複合体化したＰＥＧを伴うＰＴＨ−ＴＴＲの注入がマウスにおいてイオン化カルシウム放出を誘導することを示す。次の記号はその対応する構築物に相当する：

工作されたシステインに複合体化したＰＥＧを伴うグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）−ＴＴＲの注入がマウスにおいて血中グルコースレベルを低下させることを示す。次の記号はその対応する構築物に相当する：

融合ＣＨ２ドメインを有するＴＭＰ−ＴＴＲ複合体の注入がマウスにおいて血清中の血小板レベルを上昇させることを示す。次の記号はその対応する構築物に相当する：

ペグ化ＴＴＲとＴＭＰのカルボキシ末端融合物の注入がマウスにおいて血中血小板数を上昇させることを示す。次の記号はその対応する構築物に相当する：

図１５Ａ−Ｃは、Ｋ１５Ａ変化を含むペグ化ＴＭＰ−ＴＴＲ融合物の注入がマウスにおいて血中血小板数を上昇させることを示す。次の記号はその対応する構築物に相当する：

配列表

Claims (13)

1. 生物学的に活性なタンパク質がトランスサイレチン（ＴＴＲ）変異体に融合している融合タンパク質であって、
   前記融合タンパク質は、ＴＴＲ変異体を欠く前記生物学的に活性なタンパク質よりも長い血清半減期を有し、
   前記ＴＴＲ変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に１〜３個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＴＴＲ変異体であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１０位のシステインが別のアミノ酸で置換されており、
   前記ＴＴＲ変異体が、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリビニルアルコールからなる群より選択される化学物質で化学的に修飾されている、前記融合タンパク質。
2. 配列番号１の１０位のシステインがアラニンで置換されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 配列番号１の１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
4. システインで置換されるアミノ酸が、配列番号１のＡ３７、Ｄ３８、Ａ８１及びＧ８３からなる群より選択される、請求項３に記載の融合タンパク質。
5. システインで置換されるアミノ酸が配列番号１のＡ８１である、請求項４に記載の融合タンパク質。
6. システインで置換されるアミノ酸が配列番号１のＧ８３である、請求項４に記載の融合タンパク質。
7. 配列番号１の１個又は複数のリシンが別のアミノ酸で置換されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
8. 配列番号１の１５位のリシンが別のアミノ酸で置換されている、請求項７に記載の融合タンパク質。
9. 配列番号１の１５位のリシンがアラニンで置換されている、請求項８に記載の融合タンパク質。
10. 前記ＴＴＲ変異体がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で化学的に修飾されている、請求項９に記載の融合タンパク質。
11. 前記ポリエチレングリコールが１ｋＤ〜１００ｋＤの分子量を有する、請求項１０に記載の融合タンパク質。
12. 前記ポリエチレングリコールが５ｋＤ〜３０ｋＤの分子量を有する、請求項１１に記載の融合タンパク質。
13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。

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