KR20220029545A

KR20220029545A - Vegf에 대한 d-펩티드성 화합물

Info

Publication number: KR20220029545A
Application number: KR1020217034326A
Authority: KR
Inventors: 폴 마리넥; 카일 랜드그래프; 다나 울트-리케; 쿠르트 데샤예스; 마루티 찬드라 웁팔라파티; 시두 사차데브
Original assignee: 리플렉시온 파마슈티컬스, 인크.; 더 가버닝 카운슬 오브 더 유니버시티 오브 토론토
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2022-03-08
Also published as: CN114989298A; JP2022082754A; TWI820657B; US20210061861A1; KR20220044612A; WO2020198074A1; EP3941580A1; JP2022521353A; CN114174334A; TW202102532A; TW202241936A

Abstract

VEGF에 특이적으로 결합하는 D-펩티드 화합물이 제공된다. 또한, 연결 성분을 통해 연결된 도메인 중 2개 이상을 포함하는 다가 D-펩티드 화합물이 제공된다. 다가(예를 들어, 2가, 3가, 4가 등) 화합물은 표적 단백질 상의 상이한 결합 부위에 특이적으로 결합하여 VEGF 표적 단백질에 대한 높은 친화도 결합 및 이에 대한 강력한 활성을 제공하는 다수의 구별되는 도메인을 포함할 수 있다. 다가 화합물에 사용되는 D-펩티드 GA 및 Z 도메인이 또한 제공되며, 폴리펩티드는 VEGF(예: VEGF-A)에 특이적으로 결합하기 위한 특이성 결정 모티프(SDM)를 갖는다. 표적 단백질은 동종이량체(예: VEGF-A)이므로, D-펩티드 화합물은 유사하게 이량체일 수 있고, 다가(예: 2가) D-펩티드 화합물의 이량체를 포함할 수 있다. 또한, 대상체에서 VEGF 또는 혈관 신생과 관련된 질환 또는 병태, 예컨대 연령 관련 황반 변성(AMD) 또는 암을 치료하기 위한 방법이 제공된다.

Description

VEGF에 대한 D-펩티드성 화합물

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 3월 22일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/822,241호 및 2019년 6월 24일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/865,469호의 이익을 주장하며, 상기 출원은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF-A)는 정상 및 비정상적인 혈관 신생 또는 병리학적 혈관 신생의 주요 조절인자이다. 혈관 신생 및 혈관 형성에 있어서 혈관 신생 인자가 되는 것 외에도, VEGF는 내피 세포 생존, 혈관 투과성 및 혈관 확장, 단핵구 화학주성 및 칼슘 유입과 같은 다른 생리학적 과정에서 다수의 생물학적 효과를 나타내는 다면 발현성 성장 인자(pleiotropic growth factor)이다. 혈관 신생은 혈관 내피 세포가 증식하여 기존의 혈관 네트워크로부터 새로운 혈관을 형성하는 중요한 세포 이벤트이다. 혈관 신생은 종양, 증식성 망막병증, 연령 관련 황반 변성(AMD), 류마티스성 관절염(RA), 및 건선과 같은 다양한 장애의 발병기전에 연루되어 있다. 혈관 신생은 대부분의 원발성 종양이 성장하고, 이들 종양이 다양한 암으로 전이하는 데 필수적이다.

안액(eye fluids) 내 VEGF-A의 농도는 당뇨병 및 기타 허혈-관련 망막병증 환자에서 혈관의 활성 증식의 존재와 상관 관계가 있다. 또한, VEGF는 AMD에 걸린 환자의 맥락막 신생혈관막에 국소화된다. 습성 AMD는 건성 AMD가 선행하는데, 건성 AMD는 임의의 비정상적인 새로운 혈관 성장이 결여되어 있지만, 망막 조직의 가변적인 박화(thinning) 및 기능장애와 함께 망막 아래에 황백색 침착이 발생하는 것을 특징으로 하는 병태이다. 새로운 비정상적인 혈관이 망막을 침범할 때 건성 AMD는 습성 AMD로 전환된다. 이러한 비정상적인 새로운 혈관 성장은 맥락막 혈관신생(CNV)으로 불린다. 항-VEGF-A 약물은 습성 AMD의 치료에 사용된다.

VEGF-A 표적 요법은 다양한 암의 치료에 사용된다. 그러나, 일부 경우에, 환자는 결국 이러한 요법에 대한 내성을 갖게 된다. VEGF-A 및 하나 이상의 추가 암 표적을 표적으로 하는 병용 요법, 예를 들어, 예정 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 또는 예정 사멸 리간드 1(PD-L1)이 현재 관심을 받고 있다. 예를 들어, 베바시주맙과 아테졸리주맙을 사용해 VEGF-A와 PD-L1을 표적으로 하는 병용 요법은 PD-L1 양성 전이성 신 세포 암종 환자에서 질환 진행 또는 사망의 위험을 감소시킨 것으로 나타났다.

VEGF-A와 같은 단백질의 상호작용을 조작하는 능력은 기초 생물학 연구 및 치료제와 진단법의 개발 둘 다를 위해 관심을 받고 있다. 단백질 리간드는, 높은 특이성 및 친화도로 결합 이벤트를 유도하는 표적 분자에 대해 다수의 접촉을 가진 큰 결합 표면을 형성할 수 있다. 예를 들어, 항체는 다양한 표적 단백질에 대해 특이적이고 단단한 결합 리간드를 생성한 단백질의 부류이다. 추가로, Mandal 등("Chemical synthesis and X-ray structure of a heterochiral {D-protein antagonist plus VEGF} protein complex by racemic crystallography", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 14779-14784 (2012)) 및 Uppalapati 등("A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable and longer-circulating in vivo", ACS Chem Biol (2016))은 VEGF-A의 D-단백질 길항제를 기술하고 있다. 관심 표적 분자의 다양성 및 단백질 리간드의 결합 특성 때문에, 유용한 기능을 갖는 결합 단백질의 제조는 관심을 받고 있다.

혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF)에 특이적으로 결합하는 D-펩티드 화합물이 제공된다. 대상 화합물은 VEGF-A 결합 GA 도메인을 포함할 수 있다. 대상 화합물은 VEGF-A 결합 Z 도메인 모티프를 포함할 수 있다. 또한, 연결 성분을 통해 연결된 대상 D-펩티드 도메인 중 둘 이상을 포함하는 다가 화합물이 제공된다. 다가(예를 들어, 2가, 3가, 4가 등) D-펩티드 화합물은 VEGF 표적 단백질 상의 상이한 결합 부위에 특이적으로 결합하여 VEGF 표적 단백질에 대한 높은 친화도 결합을 제공하고 VEGF 표적 단백질에 대한 강력한 활성을 제공하는 다수의 구별되는 도메인을 포함할 수 있다. 다가 화합물에 사용되는 D-펩티드 GA 및 Z 도메인이 또한 제공되며, 폴리펩티드는 VEGF(예: VEGF-A)에 특이적으로 결합하기 위한 특이성 결정 모티프(SDM)를 갖는다. 표적 단백질은 동종이량체(예: VEGF-A)이므로, D-펩티드 화합물은 유사하게 이량체일 수 있고, 다가(예: 2가) D-펩티드 화합물의 이량체를 포함할 수 있다. 대상 D-펩티드 화합물은 VEGF-A 표적에 대한 특이적 결합이 요구되는 다양한 응용예에서 사용된다. 화합물을 사용하는 방법이 제공되며, 상기 방법에는 대상체에서 VEGF와 관련된 질환 또는 병태를 치료하거나 대상체에서 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태를 치료하기 위한 방법, 예컨대 연령 관련 황반 변성(AMD) 환자 또는 암 환자를 치료하는 방법이 포함된다.

도 1은 VEGF-A(채워진 공간으로 표시됨)와 복합체를 형성한 예시적인 화합물 1.1.1(c21a)(흰색 스틱으로 표시됨)의 X-선 결정 구조도를 보여준다. VEGF-A의 결합 부위 잔기는 분홍색으로 표시되어 있다. VEGF-A(8~109) 결합 부위 잔기는 굵은 글씨체로 표시되어 있다:
GQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKD (서열번호 88).
도 2는 VEGF-A(채워진 공간으로 표시됨)와 복합체를 형성한 예시적인 화합물 1.1.1(c21a)(흰색 스틱으로 표시됨)의 X-선 결정 구조에 Mandal 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 14779-14784 (2012))에 의해 기술된 D-단백질 길항제(자홍색 스틱으로 표시됨)가 겹쳐진 오버레이(overlay)를 보여준다. VEGF-A의 결합 부위 잔기는 분홍색으로 표시되어 있다. 상기 구조는 화합물 1.1.1(c21a)가 Mandal 등의 화합물과 동일한 길항제 부위에서 결합함을 보여준다.
도 3a~3b는 VEGF-A에 특이적으로 결합하는 예시적인 D-펩티드 화합물 및 L-단백질 GA 도메인의 3-나선 다발 구조를 나란히 비교해 보여준다. 도 3a는 L-단백질 GA 도메인(단백질 데이터 뱅크 구조 1tf0)의 X-선 결정 구조에 대한 하나의 도면 및 나선 1~3의 배열을 나타내는 개략도를 보여준다. 도 3b는 VEGF-A(이 도면에서는 미도시)와 복합체를 형성한 화합물 1.1.1(c21a)의 X-선 결정 구조에 대한 유사한 도면 및 나선 1~3의 배열을 나타내는 개략도를 보여준다.
도 4는 VEGF-A(이 도면에서는 미도시)와 복합체를 형성한 화합물 1.1.1(c21a)의 X-선 결정 구조에 대한 도면을 보여준다. 나선 1(201), 나선 2(202), 및 나선 3(203)은 천연 GA 도메인의 알파-나선 영역에 상응하는 D-펩티드 화합물의 알파-나선 영역이다. 206은 위치 31(f31)에 있는 페닐알라닌 잔기이다. 205, 207 및 210은 각각 위치 27(h27), 34(h34), 및 40(h40)에 있는 히스티딘 잔기이다. 209는 위치 37(y37)에 있는 티로신 잔기이다. 204 및 208은 각각 위치 26(p26) 및 36(p36)에 위치한 나선 2-종결 프롤린 잔기이다.
도 5는 예시적인 D-펩티드 화합물(1.1.1 (c21a); 스틱으로 표시됨)과 VEGF-A(채워진 공간으로 표시됨) 간의 결합 계면을 도시한 것으로서, 복합체의 X-선 결정 구조로부터 취한 것이다. 화합물의 잔기 f31(206)은 복합체의 결합 계면에서 VEGF-A의 결합 포켓 내로 돌출되어 있다. 위치 27(205), 34(207), 및 40(210)에 있는 히스티딘 잔기는 결합 계면에서 VEGF-A와 추가로 접촉한다. 잔기 y37(209)의 측쇄는 VEGF-A 표면을 향해 돌출되어 있지만 밀접하게 접촉하지는 않는다.
도 6a~6d는 3-나선 다발 구조에 기초한 대상 화합물에 대한 구조 모델을 도시한다. 도 6a는 천연 GA 도메인 내 3개 나선의 배열에 대한 개략도를 도시한다. 도 6b는 D-펩티드 GA 모티프 내 3개 나선의 배열에 대한 개략도를 도시한다. 도 6c는 헵타드 반복 단위의 소수성 패킹(hydrophobic packing)에 기초한 역평행 3-가닥 나선; 및 모티프의 특정 위치에서 특징적인 잔기를 갖는 나선형 분절을 형성하는 7개의 잔기 모티프(abcdef)n에 대한 Degrado의 구조 모델을 보여준다. 도 6d는 Degrado의 헵타드 반복 모델을 D-펩티드 3-나선 도메인 모티프에 적응시켜 보여준다.
도 7a~7b는 대상 D-펩티드 화합물에 대한 3-나선 다발 구조 모델을 도시한다. 도 7a는 GA 도메인 모티프에서 발견된 것과 같은 나선 1~3의 제1 배열을 도시한다. 도 7b는 대상 화합물의 3-나선 다발의 구조 모델을 보여준다.
도 8a~8d는 2-나선 복합체 구조에 기초한 대상 화합물에 대한 구조 모델을 도시한다. 도 8a는 GA 도메인 모티프에서 확인된 것과 일치하는 나선 A-B의 제1 배열을 측면도 및 상면도로 도시한 것으로서, 여기서 N 및 C는 펩티드 화합물의 N-말단 및 C-말단을 나타낸다. 도 8b는 VEGF-A와 접촉하는 g-g 면을 포함하는 대상 화합물의 2-나선 복합체에 대한 구조적 헵타드 반복 모델을 보여준다. 도 8c는 나선 A 및 나선 B에 의해 정의된 2-나선 복합체 헵타드 반복 모델(도 8b 참조)의 용매 노출 위치 c 및 g(청색)에 위치한 선택된 VEGF-A 접촉 잔기를 포함하는 변이체 모티프를 도시하며, 여기서 h*는 히스티딘 또는 이의 유사체이고, f*는 페닐알라닌 또는 이의 유사체이고, u는 비극성 아미노산 잔기이다. 도 8c에서, 밑줄("_")은 기저 스캐폴드 도메인의 위치를 나타내고, 파선은 잔기의 가능한 나선 간 접촉 또는 연결의 위치를 나타낸다.
도 9a~9c는 화합물 서열을 3-나선 다발 구조에 관련시키는 대상 화합물에 대한 구조 모델을 도시한다. 도 9a는 예시적인 화합물에 대한 헵타드 반복 모델의 일부분의 3차원 표현을 도시한다. 화합물 1.1.1(c21a)의 선택된 잔기는 헵타드 반복 단위 모델의 위치에 할당되는데, 이는 VEGF-A와 복합체를 형성한 화합물의 X-선 결정 구조와 일치한다. 나선 2 및 나선 3에 의해 정의된 화합물의 VEGF-A 결합 면은 헵타드 반복 모델의 g-g 면에 상응한다. 도 9b는 화합물 1.1.1(c21a)의 X-선 결정 구조의 도면을 도시하며, 3-나선 다발 구조의 코어에 패킹되는 헵타드 레지스터의 a 및 d 잔기는 적색으로 도시되어 있다. 도 9c는 서열의 선형 정렬을 도시하며, 코어 잔기가 포함된 3차 구조(H1 = 나선 1; H2 = 나선 2; H3 = 나선 3)의 헵타드 반복 모델은 적색으로 표시되어 있고, 선택된 VEGF-A 접촉 잔기는 청색으로 표시되어 있다. 도 9a에 도시된 구조 모델은 도 9c에 도시된 레지서터에 기초하여 나선 1~3 각각 내의 모든 잔기들을 나타내도록 연장될 수 있다. 간략화를 위해, 구조의 일부분만이 도시되어 있다.
도 10a~10b는 대상 화합물의 특이적 및 일반적인 헵타드 반복 모델의 추가적인 예시를 제공한다. 도 10a는 예시적인 화합물 1.1.1(c21a)의 서열 정렬을, 3-나선 다발의 나선들 사이의 코어 잔기의 소수성 접촉이 화살표로 도시된 3차 구조의 헵타드 반복 모델로 보여준다. 도 10b는 나선 2 및 나선 3에 의해 정의된 g-g 면(도 7b 및 도 8a 참조)의 용매 노출 위치 c 및 g에 위치된 선택된 VEGF-A 접촉 잔기를 포함하는 변이체 모티프를 도시하며, 여기서 h*는 히스티딘 또는 이의 유사체이고, f*는 페닐알라닌 또는 이의 유사체이고, u는 비극성 아미노산 잔기이다. 도 10b에서, 밑줄("_")은 기저 스캐폴드 도메인의 위치를 나타내고, 파선은 3-나선 다발의 나선들 사이의 코어 잔기의 가능한 소수성 접촉을 나타낸다.
도 11은 예시적인 D-펩티드 화합물(1.1.1(c21a))의 X-선 결정 구조의 일부분의 확대된 스틱도를 도시한 것으로서, VEGF-A(미도시)와의 결합 복합체로부터 취한 것이다. 단편은 위치 26~45에 걸쳐 있는 나선 2-링커 2-나선 3 영역의 일부에 상응한다. 202는 나선 2를 나타내고, 203은 링커 2에 의해 결합되는 나선 3을 나타낸다. 위치 32, 35, 41, 및 44에 있는 소수성 잔기는 나선 2-나선 3 분자내 접촉에 포함된다.
도 12는 L-단백질 GA 도메인(1tf0)의 X-선 결정 구조의 일부분을 확대한 리본도(ribbon view)를 보여준다. 본 도면은 위치 31~44에 걸쳐 있는 나선 2-나선 3 영역의 일부에 상응한다. 102 및 103은 나선 2(202) 및 나선 3(203) 영역에 각각 상응하는 천연 GA 도메인 구조의 알파-나선 영역이다. 링커 2는 연결 영역이다. 위치 32, 35, 41, 및 44에 있는 잔기들이 도시되어 있는데, 이들은 나선 2-나선 3 사이의 분자내 소수성 접촉의 일부이며, 도 12에 도시된 것들과 유사하다.
도 13은 단백질 G의 GA 도메인(예: 단백질 데이터 뱅크(PDB) 구조 1tf0)에 기반한 스캐폴드화 라이브러리 SCF32의 구조도 및 기저 서열(서열번호 2)을 보여주며, VEGF-A에 대한 미러 이미지 파지 디스플레이 스크리닝을 위해 랜덤화된 서열 위치(굵은 글씨체)가 포함되어 있다.
도 14는 관심 GA 스캐폴드 도메인(서열번호 6~21)과 GA 도메인 컨센서스 서열(서열번호 1)의 선택의 정렬을 보여주며(Johansson 등의 문헌["Structure, Specificity, and Mode of Interaction for Bacterial Albumin-binding Modules", J. Biol. Chem., Vol. 277, No. 10, pp. 8114-8120, 2002]의 도 1 참조), 이는 대상 화합물에서 스캐폴드 도메인으로서 사용하도록 구성될 수 있다.
도 15는 GA 스캐폴드 도메인(서열번호 2)와 예시적인 VEGF-A 결합 화합물의 정렬을 보여준다: 1 (서열번호 106), 1.1 (서열번호 22), 1.1.1 (서열번호 23), 및 1.1.1 (c21a) (서열번호 24).
도 16은 예시적인 화합물 1.1.1에 대한 용융 및 재접힘 곡선을 도시한다. 용융 온도는 대략 50℃인 것으로 결정하였다.
도 17은 예시적인 D-펩티드 화합물(1.1.1 (c21a); 스틱으로 표시됨)과 VEGF-A(채워진 공간으로 표시됨) 간의 이량체 복합체의 X-선 결정 구조의 도면을 보여준다.
도 18a~18b는 화합물 1.1.1(c21a)에 비해 절단된 N-말단을 갖는 예시적인 화합물((-)-TIDQW)의 설계를 도시한다. 도 18a는 예시적인 D-펩티드 화합물(1.1.1 (c21a); 스틱으로 표시됨)과 VEGF-A(채워진 공간으로 표시됨) 간의 복합체의 X-선 결정 구조의 확대도를 도시한 것으로서, 나선 1의 N-말단 잔기가 나선 2 또는 나선 3과 접촉하지 않는다는 것을 나타낸다. 일부 경우에, 선택 N-말단 잔기는 안정성 또는 결합 친화도의 상당한 손실 없이 나선 1로부터 절단될 수 있다. 도 18b는 절단된 (-) TIDQW 대 절단되지 않은 (+)-TIDQW 화합물 1.1.1(c21a)의 구조를 나란히 비교해 보여준다.
도 19a~19c는 친화도 성숙이 수행되거나 임의의 점 돌연변이가 통합되는 화합물 내 일련의 위치를 보여준다. 도 19a 및 도 19b는 단리되었거나(도 19a) VEGF-A와 복합체를 형성한(도 19b) 화합물 1.1.1(c21a)의 도면을 도시한 것으로서, X-선 결정 구조로부터 취한 것이다. 도 19c는 화합물 1.1.1(c21a) (서열번호 24)의 서열을 보여주고, 관심 돌연변이를 나타낸 것이다.
도 20은 복합체의 VEGF-A(채워진 공간으로 표시됨)와 복합체를 형성한 화합물 1.1.1(c21a)(스틱으로 표시됨)의 X-선 결정 구조의 확대도를 도시한 것으로서, 위치 31에 있는 페닐알라닌(f)은 황색이고, 복합체의 결합 계면에서 VEGF-A의 결합 포켓 내로 돌출하는 것으로 도시되어 있다.
도 21은 VEGF-A 결합 계면의 결합 포켓 내로 돌출하는 f31 잔기 측쇄의 확대도를 도시한 것으로서, 페닐 고리와 VEGF-A의 인접한 잔기 사이의 선택된 거리가 옹스트롬으로 표시되어 있다. 복합체 구조의 분석은, 다양한 페닐알라닌 유사체, 예를 들어 VEGF-A의 결합 포켓의 이용 가능한 공간(4.6 내지 5.3 옹스트롬)을 점유할 수 있는 페닐 고리의 3, 4, 및/또는 5개의 위치에서 치환기를 포함하는 유사체가 위치 31에서 용인된다는 것을 나타낸다.
도 22는 VEGF-A(채워진 공간으로 표시됨)와 복합체를 형성한 화합물 1.1.1(c21a)(스틱으로 표시됨)의 X-선 결정 구조의 확대도로서, 선택된 나선 2 접촉과 함께 도시한 것이다. 205 및 207은 각각 위치 27 및 34에 있는 히스티딘 잔기이다. 구조는 히스티딘 34(h34; 207)의 질소 원자와 VEGF-A의 인접 Asp90 사이의 약한 수소 결합(약 4.6 옹스트롬)을 보여준다. 209는 위치 37에 있는 화합물의 티로신 잔기로서, VEGF-A 표면을 향해 돌출한다. 복합체 구조의 분석은 다양한 히스티딘 유사체, 예를 들어, VEGF-A의 표면에서 이용 가능한 공간을 점유할 수 있고/있거나 VEGF-A의 인접 잔기에 대해 더 강한 수소 결합(예를 들어, 4.6 옹스트롬 미만의 길이)을 만들 수 있는 치환되거나 미치환된 아릴 또는 헤테로시클릭 고리를 포함하는 유사체가 위치 27 및 34에서 용인된다는 것을 나타낸다.
도 23은 VEGF-A(채워진 공간으로 표시됨)와 복합체를 형성한 화합물 1.1.1(c21a)(스틱으로 표시됨)의 X-선 결정 구조의 확대도로서, 선택된 나선 3 접촉과 함께 도시한 것이다. 구조는 히스티딘 40(h40; 210)의 질소 원자와 VEGF-A의 인접 잔기 Tyr48 사이의 중간 강도의 수소 결합(2.9 옹스트롬)을 보여준다. 복합체 구조의 분석은, 예를 들어 이용 가능한 공간을 점유할 수 있고 VEGF-A에 대한 수소 결합을 유지하거나 강화할 수 있는 유사체를 포함하여, 다양한 히스티딘 유사체가 위치 40에서 용인된다는 것을 나타낸다.
도 24는 VEGF-A(청록색 리본)와 복합체를 형성한 화합물 1.1.1(c21a)(분홍색 및 녹색 스틱으로 표시됨)의 X-선 결정 구조의 확대도를 도시한 것으로서, 링커 2의 위치 37(209)에 있는 티로신 (y) 잔기에 초점을 맞춘 것이다. VEGF-A 표면에 상주하는 y37 산소와 산소 간의 거리 또는 인접 잔기의 질소 원자들 간의 거리가 도시되어 있는데(예: 6.5 및 7.2 옹스트롬), 이는 다양한 티로신 유사체, 예를 들어, VEGF-A의 인접 잔기와 더 밀접한 접촉(예: 소수성 접촉 및/또는 수소 결합)을 만들 수 있는 치환 또는 미치환된 알킬-아릴 또는 알킬-헤테로아릴 연장 측쇄기를 포함하는 유사체가 위치 37에서 용인된다는 것을 나타낸다.
도 25는 VEGF-A(채워진 공간으로 표시됨)와 복합체를 형성한 화합물 1.1.1(c21a)(스틱으로 표시됨)의 X-선 결정 구조의 확대도로서, 위치 27(205)에 있는 히스티딘 잔기(h)에 초점을 맞춘 것이다. 구조의 분석은 위치 27에서 다양한 방향족 잔기 또는 히스티딘 유사체가 사용되어 VEGF-A의 표면 상의 동일한 포켓에 접촉할 수 있고, 일부 경우에는 바람직한 소수성 접촉을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 또한, [링커 1] 영역의 위치 25(e25, 211)에 글루탐산 잔기가 도시되어 있는데, 이는 VEGF-A와의 접촉을 만들며, 상기 접촉은 VEGF-A의 펩티드 백본의 주 사슬 카보닐기에 대한 수소 결합(2.5 옹스트롬)을 포함한다.
도 26은 D-VEGF-A 결합인자에 대한 파지 디스플레이 미러 이미지 스크리닝 도중 식별된 모든 클론의 선택된 위치의 서열 로고를 도시한 것으로서, 여기서 서열 로고는 화합물 1 서열 및 천연 GA 도메인(GA-wt)의 상응하는 잔기와 비교하여 정렬되어 있다.
도 27a~27b는 L-단백질 GA 도메인의 구조(도 27a)와 D-화합물 1.1.1(c21a)의 구조(도 27B)를 비교하여 도시한 것으로서, 나선 2와 3 간의 정렬 각도가 VEGF-A 결합 화합물에서 증가함을 증가함을 나타낸다.
도 28a~28b는 VEGF-A 동종이량체에 결합된 D-펩티드 화합물 11055의 X-선 결정 구조의 2개의 도면을 보여준다. 도 28a는 D-펩티드 화합물 11055가 화합물 11055의 변이체 GA 도메인의 나선 2(H2)의 결합 접촉을 통해 VEGF-A에 일차적으로 결합함을 보여준다. 도 28b는 도 28a의 구조를 보여주며, 여기서 D-펩티드 화합물 11055는 VEGF-A에 결합된 VEGFR2(도메인 2 및 3)의 구조와 중첩된, 공간 충진 모델로 표현되어 있다. 오버레이는 D-펩티드 화합물 11055가 VEGF-A에 대한 VEGFR2의 도메인 2(D2)의 결합을 차단함을 보여준다.
도 29a~29b는 화합물 11055의 변이체 GA 도메인 접힘을 안정화시키는 특정 위치에 있는 잔기를 스크리닝하고 식별하도록 설계된 친화도 성숙 라이브러리의 구조(도 29a) 및 서열(도 29b)의 도면을 보여준다. 나선 2(H2)와 나선 3(H3)을 연결하는 루프와 나선 1(H1) 사이의 패킹 계면에서 돌연변이를 위해 총 7개의 잔기를 선택하였다.
도 30a~30c는 고 친화도 VEGF-A 결합 화합물로서, 위치 7 및 38에서 시스테인 잔기를 갖는 컨센서스 서열 로고(도 30a)를 포함하는 화합물에 대한 스크리닝 결과; 및 선택된 관심 변이체 서열(도 30b)(서열번호 108~113)을 이들의 VEGF-A에 대한 결합 친화도 대 부모 화합물 11055에 대한 결합 친화도와 함께 도시한다. 도 30c는 부모 화합물 11055(도 29a)의 구조의 확대도를 도시한 것으로서, 변이체 아미노산 잔기 위치 l7c 및 v38c은 황색으로 도시되어 있고, 서로에 대해 근위에 있으므로(5.9 옹스트롬의 베타C-베타C 나선 간 거리), l7c 및 v38c 변이를 포함시키면 이들 잔기 간의 안정한 이황화 결합을 제공하게 된다.
도 31a~31b는 VEGF-A D-펩티드의 활성을 입증하는 데이터의 그래프를 보여준다. 도 31a는 VEGFR1 결합 ELISA에서 선택 화합물의 VEGF-A 길항 활성을 보여준다. 도 31b는 베바시주맙 대조군 대비 선택 화합물들에 의한 VEGF 신호 전달에 반응한 세포 증식 억제를 보여준다.
도 32a~32b는 부모 Z-도메인 스캐폴드에 기반한 파지 디스플레이 라이브러리의 구조(도 32a) 및 서열(도 32b)에 대한 예시를 보여준다. 랜덤화를 위해, 시스테인을 제외한 모든 아미노산을 나타내는 트리뉴클레오티드 코돈을 이용한 Kunkel 돌연변이 유발을 사용해 Z 도메인의 나선 1 내지 나선 2 이내에서 10개의 위치(X)를 선택하였다(도 32b).
도 33a~33b는 Z 도메인 파지 디스플레이 라이브러리를 사용한, VEGF-A에 대한 결합에 대한 미러 이미지 파지 디스플레이 스크리닝의 결과를 보여준다. 도 33a는 VEGF-A에 대한 결합을 제공하는 컨센서스 서열 로고를 보여준다. 도 33b는 선택된 관심 Z 도메인 서열(서열번호 114~118)을 천연 L-VEGF-A에 대한 이들의 결합 친화도와 함께 보여준다. NB는 결합하지 않음을 지칭한다.
도 34는 화합물 978336 및 11055에 추가 결합을 나타내는 표면 플라스몬 공명(SPR) 센서그램을 도시한 것으로서, 화합물 978336(변이체 Z 도메인 화합물)이, 화합물 11055(변이체 GA 도메인 화합물)의 결합 부위와 중첩하지 않고 독립적인 VEGF-A 상의 결합 부위에 결합함을 나타낸다.
도 35a~35g는 VEGF-A 동종이량체에 결합된 D-펩티드 화합물 978336의 X-선 결정 구조의 3개의 도면을 보여준다. 도 35a는 VEGF-A의 결합 부위에 결합된 2개의 단량체 D-펩티드 화합물 978336을 보여준다. 도 도 35b는 도 35a의 구조를 보여주며, 여기서 D-펩티드 화합물 978336은 VEGFR2(도메인 2 및 3)의 구조와 중첩된 공간 충진 모델로 표시되어 있다. 오버레이는 D-펩티드 화합물 978336이 VEGF-A에 대한 VEGFR2의 도메인 3(D3)의 결합을 차단함을 보여준다. 도 35c는 화합물의 VEGF-A 결합 면에서 978336의 구조만 단리된 모습으로 도시한 것으로서, Z 도메인 라이브러리로부터 선택된 변이체 아미노산 잔기는 적색으로 도시되어 있다. 도 35d는 결합 부위와 접촉된 변이체 아미노산의 구성(상단 패널)을 포함하여, 화합물 978336(서열번호 117)의 단백질 대 단백질 접촉(상단 패널) 및 상기 화합물의 VEGF-A 상의 결합 부위(하단 패널)를 보여준다. 도 35e~35g는 예시적인 VEGF-A 결합 화합물 978336(서열번호 117)의 친화도 성숙 연구, 식별된 컨센서스 서열(서열번호 158)(도 35f), 및 예시적인 화합물 980181(서열번호 119)의 서열을 도시한다.
도 36a~36b는 비스-말레이미드 PEG8 링커를 사용하여 N-말단 시스테인 잔기를 통해 접합된 화합물 11055 및 978336을 포함하는 예시적인 2가 화합물 접합체의 구조 기반 설계를 도시한다(도 36a). 도 36b는 비스말레이미드 PEG8 이기능성 링커와의 접합을 통한 N-말단 대 N-말단 결합을 포함하는 2가 화합물 979111의 서열을 도시한 것으로서, 상기 화합물은 SPR에 의해 측정했을 때 L-VEGF-A에 대해 1.7 nM의 결합 친화도를 나타냈다.
도 37a~37b는 부모 GA 도메인 스캐폴드(서열번호 2)에 기초한 파지 디스플레이 라이브러리(서열번호 159)의 구조(도 37a) 및 서열(도 37b)에 대한 도시를 보여준다. 랜덤화를 위해, 시스테인을 제외한 모든 아미노산을 나타내는 트리뉴클레오티드 코돈을 이용한 Kunkel 돌연변이 유발을 사용해 GA 도메인 스캐폴드의 나선 2 내지 나선 3 이내에서 11개의 위치(X)를 선택하였다.
도 38a~38e는 예시적인 이량체 2가(즉, 테트라도메인-함유) 화합물 980870 및 980871의 설계, 합성, 및 서열을 도시한다. 도 38a는 VEGF-A에 결합된 예시적인 화합물 11055 및 978336의 X-선 결정 구조의 도시, 및 예시적인 이량체 2가 VEGF-A 결합 화합물을 제조하기 위한 링커의 설계를 도시한다. 화합물 11055의 잔기 k19 및 화합물 978336의 잔기 k7은, 예를 들어, 대략 23 옹스트롬 이상의 길이의 링커를 통해 측쇄 아미노기를 통해 연결될 수 있다. 도 38b는 연결된 테트라도메인 화합물 980870 및 980871을 제조하는 데 사용하기 위한 합성 반응식을 보여준다. D-Pra는 -NH-PEG2-CO- 링커를 통해 화합물 980181의 k7의 아민 측쇄에 연결된 D-프로파르길글리신 잔기이다. 아지도-CH₂CONH-PEG2/3-CO- 기는 화합물 979110의 k19의 아민 측쇄에 연결되고, 이어서 클릭 화학을 사용하여 프로파르길기에 접합되어 도메인 간 링커를 형성한다. 도 38c는 도 38b의 반응식을 통해 제조한 예시적인 테트라도메인 화합물의 서열의 도시를 보여준다. 도 38d는 GA 도메인의 잔기 x19와 Z 도메인의 잔기 x7 사이에서 링커 L¹을 포함하는 예시적인 2가 화합물의 개략도이다. 도 38e는 GA 및 Z 도메인의 C-말단 잔기들 사이에서 제2 링커 L²를 포함하는 예시적인 이량체 2가 화합물의 개략도이다.
도 39a~39b는 1가 도메인 979110 및 980181 및 베바시주맙과 비교해, 예시적인 이량체 2가 (즉, 테트라도메인-함유) 화합물의 VEGF-A에 대한 시험관 내 길항 활성(도 39a) 및 세포 기반 길항 활성(도 39b)을 측정한 검정 결과의 그래프를 보여준다.
도 40a~40c는 미러 이미지 파지 디스플레이를 사용하여 개발된 D-단백질 VEGF-A 길항제에 대한 활성 데이터를 보여준다. (도 40a) D-VEGF-A 표적에 대한 GA-도메인 및 Z-도메인 히트의 파지 적정 ELISA로서, 적정 가능한 결합을 보여줌. (도 40b) D-VEGF-A에 대한 파지 결합을 변위시키기 위한 가용성 경쟁자로서 GA-도메인에 상응하는 합성 L-거울상 이성질체를 사용한 파지 경쟁 ELISA. (도 40c) VEGF-A 차단 ELISA에서 합성 D-단백질 RFX-11055 및 RFX-978336의 적정으로서, 베바시주맙에 비해 길항 활성을 나타냄.
도 41a~41f는 VEGF-A와 복합체를 형성한 D-단백질 RFX-11055 및 RFX-978336의 구조를 보여준다(도 41a 및 도 41b). VEGF-A 동종이량체(회색)의 원위 단부에서 구별되는 비-중첩 에피토프에 결합된 RFX-11055(자주색) 및 RFX-978336(청색)의 개요. (도 41c 및 도 41d) RFX-11055 및 RFX-978336에 대해 도시된 VEGF-A에 접촉하는 계면 D-아미노산 측쇄, 및 RFX-11055의 경우 나선 2와 3 이내, RFX-978336의 경우 나선 1과 2 이내에 있는 선택된 라이브러리 잔기(주황색) 및 원 스캐폴드 잔기(청색). VEGF-A는 양성(청색), 음성(적색), 및 중성 소수성(백색) 접촉 부위를 강조하기 위해 정전기 표면 전위로 도시되어 있다. (도 41e) VEGFR-1 수용체(연한 주황색)와 복합체를 형성한 이전에 보고된 VEGF-A의 결정 구조(회색). VEGFR-1의 Ig 도메인 2 및 3(D2 및 D3)을 단리하여 VEGF-A의 수용체 결합에서의 분자 상호작용을 강조한다(PDB 코드: 5T89)(24). (도 41f) VEGF-A 차단의 메커니즘으로서 D2 및 D3과의 직접 경쟁을 나타내기 위한 VEGF-A/VEGFR-1 복합체 상의 RFX-11055와 RFX-978336의 오버레이.
도 42a~42c는 RFX-11055 및 RFX-978336의 구조에 따라 안내된 친화도 성숙을 도시한다. (도 42a) VEGF-A(회색)에 결합된 RFX-11055(자주색)의 구조로서, 나선 1과 나선 2-3 결합 계면 사이의 패킹을 안정화시키기 위해 친화도 성숙 라이브러리에 대해 표적화된 7개의 잔기(주황색)를 나타냄. (도 42b) VEGF-A(회색)에 결합된 RFX-978336(청색)의 구조로서, 나선 1-2 결합 계면 및 소프트 랜덤화 라이브러리를 위해 선택된 4개의 잔기를 보여줌. (도 42c) VEGF 차단 ELISA에서 친화도 성숙된 D-단백질 RFX-979110 및 RFX-980181의 적정으로서, 베바시주맙에 대비 길항 활성을 보여줌.
도 43a~43b는 D-단백질 이종이량체 VEGF-A 길항제의 시험관 내 활성을 보여준다. (도 43a) VEGF-A 차단 ELISA에서, 베바시주맙 및 VEGFR1-Fc 가용성 유인 수용체 대비 친화도 성숙된 D-단백질 RFX-979110 및 고친화도 이종이량체 RFX-980869의 적정. (도 43b) RFX-980869가 VEGFR2를 통한 VEGF-A 신호 전달을 강력하게 차단하고, 효능은 베바시주맙과 유사함을 보여주는 세포 활성 검정.
도 44a~44b는 습성 AMD의 토끼 안구 모델에서 D-단백질 RFX-980869의 생체 내 활성을 보여준다. (도 44a) 각각의 약물의 투여 후 5일차 및 26일차에 VEGF-A165-유도 혈관 누출의 정도를 도시하는 대표적인 형광 혈관 조영술(FA) 이미지 (대조군 = 약물 치료 없음). (도 44b) 5일차 및 26일차에 개별 FA 점수의 도표. 점수는 다음과 같다: 0 = 대혈관은 곧고, 소혈관에서 일부 비틀림이 있고, 확장은 없음, 1 = 대혈관의 비틀림이 증가하고 약간 확장됨, 2 = 대혈관들 사이에서 누출이 있고 확장이 상당함, 3 = 대혈관과 소혈관 사이에서 누출이 있고, 소혈관은 여전히 보임, 4 = 대혈관과 소혈관 사이에서 누출이 있고, 소혈관은 잘 보이지 않거나 전혀 보이지 않음. N = 군 당 토끼 5마리 (10개의 안구). 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 도표화된다. (**** p < 0.0001, 맨-휘트니 검정)
도 45a~45d는 RFX-980869의 종양 성장 억제 활성 및 면역원성 결여를 보여준다. (도 45a) C57BL6 마우스를 대상으로 한 MC38 종양 성장 곡선으로, RFX-980869 및 니볼루맙 둘 다의 용량 의존적 효능을 나타냄. N=군 당 마우스 6마리. (도 45b) 15일차 종양 부피(* p < 0.05, 맨-휘트니 검정) (도 45c) 항원-특이적 혈청 IgG에 대한 ELISA를 사용하여 22일차 혈청 샘플에서 측정한 MC38 종양 연구의 항-약물-항체. (도 45d) BALB/c 마우스를 대상으로 상응하는 약물로 피하 면역화 후 42일차 혈청으로부터 측정한 항-약물-항체 역가. N=군 당 마우스 5마리. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로서 도표화된다.
도 46a~46c는 D-단백질의 파지 디스플레이 라이브러리 및 서열을 보여준다. (도 46a) 패닝에 사용된 GA-도메인 스캐폴드 서열 및 라이브러리. GA 라이브러리 내의 밑줄 친 잔기는 전체 아미노산 다양성에 대해 NNK 코돈으로 하드 랜덤화(hard-randomized)하였다. AM 라이브러리 내의 밑줄 친 잔기는 시스테인을 포함하는 15개의 아미노산 다양성에 대해 NNC 코돈을 사용해 하드 랜덤화하였다. RFX-11055 및 RFX-979110에 대한 소문자 아미노산은 D-아미노산을 나타낸다. 위에서 아래로의 서열: (서열번호 2; 서열번호108; 서열번호108; 서열번호 108; 서열번호 113) (도 46b) 패닝에 사용된 Z-도메인 스캐폴드 서열 및 라이브러리. GA 라이브러리 내의 밑줄 친 잔기는, 시스테인을 제외한 각 아미노산에 대한 트리뉴클레오티드 코돈을 사용해 전체 아미노산 다양성에 대해 하드 랜덤화하였다. AM 라이브러리 내의 밑줄 친 잔기는 코돈을 사용해 소프트 랜덤화하여 각 아미노산에 30%의 돌연변이율을 포함시켰다. RFX-978336 및 RFX-980181에 대한 소문자 아미노산은 D-아미노산을 나타낸다. 위에서 아래로의 서열: 서열번호 163; 서열번호 117; 서열번호 117; 서열번호 117; 서열번호 119). (도 46c) 이종이량체 길항제 980869에 대한 전체 D-아미노산 서열.
도 47은 D-단백질 및 베바시주맙에 대해 측정된 동역학 결합 파라미터의 SPR 센서그램을 보여준다.
도 48은 RFX-978336 및 RFX-11055의 SPR-기반 에피토프 맵핑을 보여준다. 제1 결합 단계에서, 5 μM의 RFX-978336을 사용해 칩 표면 상에서 VEGF-A를 포화시킨다. 제2 결합 단계에서, 5 μM의 RFX-978336과 함께 1 μM의 RFX-11055를 포함시키고 이는 VEGF-A에 대한 추가 결합을 나타내는데, 이는 RFX-11055에 대한 부위가 RFX-978336에 의해 차단되지 않음을 나타낸다. 두 가지 D-단백질 모두는 VEGF-A로부터 완전한 해리를 나타낸다.
도 49a~49b는 VEGF-A/VEGFR-1 접촉의 구조적 특성 분석을 도시한다. (도 49a) VEGFR-1(연 주황색)과 복합체를 형성한 VEGF-A(회색)에 대해 해결된 이전 구조로서, 원소별로 채색된(탄소 백색, 산소 적색, 질소 청색, 및 황 황색) VEGFR-1의 D2 및 D3 Ig-도메인에 의해 접촉된 VEGF-A 상의 에피토프를 도시함(PDB ID: 5T89, 24). (도 49b) (도 49a)의 오픈 북 표현으로서, D2 및 D3 도메인은 VEGF-A에서 먼 쪽으로 180도 회전되어 있고, 정전기 표면 전위가 두 분자 모두에 대해 표시되어 있음. D2 및 D3 결합 부위를 원으로 표시하여 D2 상호작용의 우세한 비극성 소수성 성질 및 D3 상호작용의 극성 친수성 성질을 강조하였다.
도 50a~50b는 이종이량체 D-단백질 RFX-980869의 설계 및 합성을 도시한다. (도 50a) VEGF-A에 결합된 RFX-11055(자주색) 및 RFX-978336(청색)의 구조 오버레이로서, 구체(sphere)로 표현된 리신 잔기(RFX-11055 상의 K19 및 RFX-978336 상의 K7) 및 제안된 PEG 연결에 대한 거리 측정을 보여줌. (도 50b) 고상 펩티드 합성을 사용해 D-단백질 이종이량체인 RFX-980869를 생성하기 위한 합성 반응식으로서, 펩티드 및 PEG 모이어티에는 '클릭' 화학 작용기가 구비됨.
도 51은 D-단백질 및 베바시주맙에 대한 SPR-유래 동역학 결합 파라미터가 요약된 표를 보여준다.
도 52는 비평형 ELISA에서 VEGFR1-Fc에 대한 VEGF-A121 결합을 차단하는 D-단백질 및 베바시주맙의 IC50 값을 요약한 표를 보여준다.
도 53은 VEGF/D-단백질 복합체에 대한 데이터 수집 및 정제 통계가 포함된 표를 보여준다.
도 54는 평형 결합 ELISA에서 VEGFR1-Fc에 대한 VEGF-121A 결합을 차단하는 D-단백질 및 베바시주맙의 IC50 값, 및 세포 신호 전달 검정에서 VEGF-A 신호 전달 억제에 대한 IC50 값을 요약한 표를 보여준다.
도 55는 D-펩티드 Z 도메인 VEGF-A 결합인자에 대한 파지 디스플레이 미러 이미지 스크리닝 도중 식별된 모든 클론의 선택된 위치의 서열 로고를 도시한 것으로서, 여기서 서열 로고는 천연 Z 도메인(Z-wt)의 상응하는 잔기와 비교하여 정렬되어 있다.

다가 D-펩티드 결합 화합물

위에서 요약한 바와 같이, 본 개시의 양태는 높은 친화도로 VEGF에 특이적으로 결합하는 다가 D-펩티드 화합물을 포함한다. 본 개시는 표적 단백질 상의 2개 이상의 구별되는 결합 부위에서 VEGF 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 다가 화합물의 부류를 제공한다. 용어 "다가(multivalent)"는 표적 단백질 분자의 2개 이상의 구별되는 별개의 부위에서 발생할 수 있는 화합물과 표적 단백질 간의 상호작용을 지칭한다. 다가 D-펩티드 화합물은 표적 단백질에 대한 높은 친화도 결합 및 표적 단백질의 기능에 대한 강력한 생물학적 효과를 제공하기 위해 협력적으로 발생할 수 있는 다수의 결합 상호작용을 할 수 있다. 용어 "다량체"는 2개(즉, 이량체), 3개(즉, 삼량체), 또는 그 이상의 단량체 펩티드 단위(예: 도메인)를 포함하는 화합물을 지칭한다. 다량체 화합물이 상동성인 경우, 각각의 펩티드 단위는 동일한 결합 특성을 가질 수 있다. 즉, 각각의 단량체 단위는 VEGF 표적 단백질 분자 상의 동일한 결합 부위(들)에 결합할 수 있다. 이러한 다량체 화합물은 자연적으로 발생하는 표적 단백질에 결합하는 데 동종이량체로서 사용되거나, 다량체화될 수 있다. 이량체 화합물은 VEGF 표적 단백질 동종이량체의 2개의 분자 상의 2개의 동일한 결합 부위에 동시에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 표적 단백질에 따라, 본 개시의 다가 D-펩티드 화합물은 다량체화될 수 있는데, 예를 들어, 이량체 2가 D-펩티드 화합물은 2개의 2가 D-펩티드 화합물로 이루어진 이량체를 포함할 수 있다. 소정의 경우에, 다량체 화합물은 이종성이며, 각각의 펩티드 단위(예: 도메인 또는 2가 단위)는 상이한 표적 부위 또는 단백질에 특이적으로 결합한다.

다가 펩티드 화합물은 적어도 2개의 펩티드 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 도메인은 결합 부위에서 특이적 단백질-단백질 상호작용의 계면을 제공하도록 구성된 변이체 아미노산으로 이루어진 특이성 결정 모티프를 갖는다. 다수의 펩티드 도메인이 함께 연결될 때, 이들은 동시에 표적 단백질과 접촉하여 다수의 결합 부위에서 다수의 계면을 제공할 수 있다. 다수의 단백질-단백질 결합 상호작용은 친화력 효과(avidity effect)를 통해 협력적으로 발생하여 어느 하나의 D-펩티드 도메인 단독으로 달성할 수 있는 것보다 상당히 높은 유효 친화도를 제공할 수 있다. 본 개시는, 다수의 표적 결합 부위에 결합하는 다수의 펩티드 도메인을 생산하기 위해 스캐폴드화 소 단백질 도메인 라이브러리를 사용하는 미러 이미지 파지 디스플레이 스크리닝의 용도를 개시하고, 이러한 도메인은 강한 친화력 효과를 나타내는 고 친화도 결합인자를 생산하도록 성공적으로 연결될 수 있다는 것을 개시한다. 본 발명자에 의해 입증된 다량체 화합물은 상응하는 항체 제제와 비슷하거나 더 양호한 친화도를 가지며, 생체 내에서 VEGF 표적 단백질에 대한 효과적인 생물학적 활성을 제공한다.

일반적으로, VEGF 표적 단백질은 자연적으로 발생하는 L-단백질이고 화합물은 D-펩티드 화합물이다. 본원에 기술된 D-펩티드 화합물 중 어느 하나에 대해, D-VEGF 표적 단백질에 특이적으로결합하는 화합물의 L-펩티드 버전도 본 개시에 포함되는 것으로 이해된다. 대상 펩티드 화합물은, 합성 D-VEGF 표적 단백질에 결합하기 위한 다양한 스캐폴드화 도메인 파지 디스플레이 라이브러리의 미러 이미지 스크리닝 방법을 사용하여 부분적으로 식별하였다.

D-펩티드 화합물은 L-폴리펩티드와 비교해 치료적 응용을 위한 다수의 바람직한 특성, 예컨대 단백질분해 안정성, 실질적으로 감소된 면역원성, 및 긴 생체 내 반감기를 제공할 수 있다. 본 개시의 D-펩티드 화합물은 일반적으로 VEGF에 대한 항체 제제와 비교해 그 크기가 상당히 작다. 일부 경우에, 대상 화합물의 특성과 더 작은 크기는 항체 기반 치료제보다 우월한 투여 경로, 조직 분포와 조직 침투, 및 투여 요법을 가능하게 한다.

본 개시는 적어도 제1 및 제2 D-펩티드 도메인을 포함하는 다가 D-펩티드 화합물을 제공한다. 제1 및 제2 D-펩티드 도메인은 표적 단백질의 구별되는 비중첩 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있고, (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 연결 성분을 통해 서로 연결될 수 있다. 연결 성분은 표적 단백질에 대한 동시 결합 또는 순차적 결합을 허용하도록 구성될 수 있다. "순차 결합"이란, 표적에 대한 제1 D-펩티드 도메인의 결합이 제2 D-펩티드 도메인에 의한 결합 가능성을 (결합이 동시에 일어나지 않는 경우에도) 증가시킬 수 있음을 의미한다.

제1 및 제2 D-펩티드 도메인은 서로에 대해 이종일 수 있다. 즉, 도메인은 상이한 도메인 유형이다. 예를 들어, 제1 D-펩티드 도메인은 변이체 GA 도메인일 수 있고, 제2 D-펩티드 도메인은 변이체 Z 도메인이거나, 그 반대일 수 있다. 2개의 상이한 스캐폴드화 도메인 라이브러리를 사용하는 VEGF의 미러 이미지 파지 디스플레이 스크리닝은 VEGF 상의 2개의 상이한 결합 부위를 향해 유도되는 변이체 도메인 결합인자를 제공한다.

다가 D-펩티드 화합물이 이러한 도메인을 2개만 포함하는 경우, 이를 2가(bivalent)로 지칭할 수 있다. 3가, 4가, 및 더 높은 다가(multivalences)도 가능하다. 3가 D-펩티드 화합물은, 2개의 연결 성분을 통해 선형으로 연결되거나 하나의 3가 연결 성분을 통해 연결된 3개의 D-펩티드 도메인을 포함할 수 있다. 3가 D-펩티드 화합물은 2개의 동일한 D-펩티드 화합물과 제3 D-펩티드 화합물, 및 연결 성분을 포함할 수 있으며, 2개의 동일한 D-펩티드 화합물은 각 D-펩티드 상의 2개의 시스테인 잔기들 간의 이황화 결합을 통해 연결되고, 연결 성분은 2개의 동일한 D-펩티드 화합물 중 하나와 제3 D-펩티드 화합물을 연결시킨다. 4가 및 더 높은 다가 화합물은 유사하게 연결될 수 있으며, 2가 연결 성분을 통해 선형으로 연결되거나, 하나 이상의 다가 또는 분지형 연결 성분을 통해 분지형 구성으로 연결될 수 있다.

연결 성분

용어 "연결 성분(linking component)"은 대상 화합물의 2개 이상의 D-펩티드 도메인 간에 공유 결합을 확립할 수 있는 다가 모이어티를 포함하는 것을 의미한다. 때때로, 연결 성분은 2가이다. 대안적으로, 연결 성분은 3가 또는 수지상이다. 연결 성분은 D-펩티드 도메인 폴리펩티드가 합성되는 동안, 또는 합성 후에, 예를 들어 이미 접힌 2개 이상의 D-펩티드 도메인의 접합을 통해 설치될 수 있다. 연결 성분은 이기능성 링커를 사용해 2개의 D-펩티드 도메인의 접합을 통해 대상 화합물에 설치될 수 있다. 연결 성분은, 예를 들어, 연결 성분이 그 자체가 펩티드이고 아미노산 잔기 서열의 고상 펩티드 합성(SPPS)을 통해 제조되는 경우, D-펩티드 도메인 폴리펩티드가 합성되는 동안에 혼입될 수 있도록 설계될 수도 있다. 또한, 화학선택적 작용기 및/또는 링커가 폴리펩티드가 합성되는 동안 설치되어 SPPS 후 D-펩티드 도메인의 용이한 접합을 제공할 수 있다.

임의의 편리한 연결기 또는 링커가 대상 다가 화합물에서 연결 성분으로서 사용하도록 구성될 수 있다. 관심 연결기 및 링커 단위는 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 아미노산 잔기(들), 폴리펩티드, PEG 단위, (PEG)n 링커(예를 들어, 여기서 n은 2~50, 예컨대 2~40, 2~30, 2~20 또는 2~10임), 말단-변형된 PEG(예를 들어, -NH(CH₂)_mO[(CH₂)₂O]_n(CH₂)_pCO- 연결기, 또는 -NH(CH₂)_mO[(CH_{2) 2}O]_n(CH₂)_mNH- 연결기, 또는 -CO(CH₂)_pO[(CH₂)₂O]_n(CH₂)_pCO- 연결기, 식 중 m은 2~6이고, p는 1~6이고 n은 1~50, 예컨대 1~20, 1~12, 또는 1~6임), C1-C6알킬 링커 또는 치환된 C1-C6알킬 링커, C2-C12알킬 링커 또는 치환된 C2-C12알킬 링커, 숙시닐(예를 들어, -COCH₂CH₂CO-) 단위, 디아미노에틸렌 단위(예를 들어, -NRCH₂CH₂NR-, 식 중 R은 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임), -CO(CH₂)_mCO-, -NR(CH_2)pNR-, -CO(CH₂)_mNR-, -CO(CH₂)_mO-, -CO(CH₂)_mS-(식 중 m은 1~6이고, p는 2~6이고, 각각의 R은 독립적으로 H, C(1-6)알킬 또는 치환된 C(1-6)알킬임), 및, 예를 들어, 아미드(예를 들어, -CONH- 또는 -CONR-, 여기서 R은 C1-C6알킬임), 설폰아미드, 카바메이트, 카보닐 (-CO-), 에테르, 티오에테르, 에스테르, 티오에스테르, 아미노 (-NH-) 등과 같은 연결 작용기를 통해 연결된 이들의 조합. 연결 성분은 펩티드, 예를 들어, 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 링커일 수 있다. 연결 성분은 화학식 -(L¹)_a-(L²)_b-(L³)_c-(L⁴)_d-(L⁵)_e-의 링커일 수 있으며, 여기서 L¹ 내지 L⁵는 각각 독립적으로 링커 단위이고, a, b, c, d, 및 e는 각각 독립적으로 0 또는 1이며, a, b, c, d, 및 e의 합계는 1 내지 5이다. 본원에 기술된 다량체 화합물에 도시된 것과 같은 다른 링커도 가능하다.

연결 성분은 임의의 편리한 연결 화학물질을 사용하여 D-펩티드 화합물에 연결되는 말단-변형 PEG 링커를 포함할 수 있다. PEG는 폴리에틸렌 글리콜이다. 용어 "말단-변형 PEG"는, 말단 중 하나 또는 둘 다가 예를 들어 또 다른 연결기 모이어티에 접합되거나 펩티드 화합물의 말단 또는 측쇄에 접합되기에 적합한 화학 선택성 작용기를 포함하도록 변형된, 임의의 편리한 길이를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 지칭한다. 실시예 섹션은, D-펩티드 도메인의 서열에 설치된 티올 잔기, 예컨대 시스테인 잔기에 화학선택적으로 접합하기 위한 말단 말레이미드 작용기를 갖는 몇몇 예시적인 말단-변형 PEG 이기능성 링커의 용도를 기술한다. D-펩티드 화합물은, 시스테인이나 리신과 같은 다가 연결기에 연결하기 위한 특정 연결인자 또는 연결 화학물질을 제공할 수 있는 하나 이상의 추가 아미노산 잔기를 포함하도록 GA 도메인 모티프의 N-말단 및/또는 C-말단에서 변형될 수 있다.

연결기를 통해 대상 펩티드 화합물을 연결하는 데 사용될 수 있는 화학선택적 반응성 작용기는 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 아미노기(예를 들어, N-말단 아미노 또는 리신 측쇄기), 아지도 기, 알키닐 기, 포스핀 기, 티올(예: 시스테인 잔기), C-말단 티오에스테르, 아릴 아지드, 말레이미드, 카보디이미드, N-하이드록시숙신이미드(NHS)-에스테르, 하이드라지드, PFP-에스테르, 하이드록시메틸 포스핀, 소랄렌, 이미도에스테르, 피리딜 이황화물, 이소시아네이트, 아미노옥시-, 알데히드, 케토, 클로로아세틸, 브로모아세틸, 및 비닐 설폰.

임의의 편리한 다가 링커가 대상 다량체에 사용될 수 있다. 다가(multivalent)란, 링커가 본원에 기술된 바와 같은 대상 화합물, 예를 들어, 펩티드 도메인의 성분에 부착되기에 적합한 2개 이상의 말단 기 또는 측쇄 기를 포함하는 것을 의미한다. 일부 경우에, 다가 링커는 2가 또는 3가이다. 일부 사례에서, 다가 링커는 덴드리머 스캐폴드(dendrimer scaffold)이다. 임의의 편리한 덴드리머 스캐폴드는 대상 다량체에 사용하도록 구성될 수 있다. 덴드리머 스캐폴드는 임의의 링커를 통해 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 연결하기에 적합한 적어도 하나의 분지점 및 2개 이상의 말단을 포함하는 분지된 분자이다. 덴드리머 스캐폴드는 2개 이상의 도메인의 바람직한 공간 배열을 제공하도록 선택될 수 있다. 일부 경우에, 2개 이상의 도메인의 공간 배열은 VEGF 표적 단백질에 대한 원하는 결합 친화도 및 선택성을 제공하도록 선택된다.

일부 경우에, 다가 링커기는 제2 펩티드 도메인 상의 호환 가능한 작용기에 결합할 수 있는 화학선택적 반응성 작용기로부터 유래되거나 이를 포함한다. 소정의 경우에, 다가 링커기는 다가 결합 모이어티(예: 스트렙타비딘 또는 항체)에 특이적으로 결합할 수 있는 특이적 결합 모이어티(예: 비오틴 또는 펩티드 태그)이다. 소정의 경우에, 다가 링커기는 제2 화합물의 제2 특이적 결합 모이어티와 함께 동종이량체 또는 이종이량체를 직접 형성할 수 있는 특이적 결합 모이어티이다. 이와 같이, 화합물이 다가 링커기를 포함하는 관심 분자를 포함하는 일부 경우에, 화합물은 다량체의 일부일 수 있다. 대안적으로, 화합물은 하나 이상의 다른 화합물과 직접적으로 다량체화되거나, 다가 결합 모이어티에 대한 결합을 통해 간접적으로 다량체화될 수 있는 단량체일 수 있다.

예시적인 다가 D -펩티드 화합물

본 개시는 VEGF-A에 결합하는 다가 화합물을 제공한다. 다가 VEGF-A 결합 화합물은 2가일 수 있고, (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 연결 성분을 통해 연결된 2개의 구별되는 변이체 도메인을 포함할 수 있다. 표적 단백질 상의 2개의 상이한 결합 부위 중 하나에 결합하는 VEGF-A에 특이적으로 결합하는 예시적인 단일 D-펩티드 도메인이 본원에 개시된다. 도 36a는 표적 VEGF-A에 동시 결합된 2개의 이러한 단일 도메인의 결정 구조를 보여준다. VEGF-A의 제1 결합 부위에 결합하는 VEGF-A 특이적 변이체 GA 도메인 폴리펩티드가 본원에 기술된다. 일부 경우에, 제1 결합 부위는 VEGF-A의 아미노산 측쇄 F43, M44, Y47, Y51, N88, D89, L92, I72, K74, M107, I109, Q115, 및 I117에 의해 정의된다. 일부 경우에, VEGF-A 특이적 폴리펩티드는 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은) 잠김 변이체 GA 도메인(locked variant GA domain)이다. 대상 VEGF-A 특이적 D-펩티드 변이체 GA 도메인 폴리펩티드 중 어느 하나는 연결 성분을 통해 표적 VEGF-A의 제2 구별되는 결합 부위에 특이적으로 결합하는 제2 D-펩티드 도메인에 연결될 수 있다. 일부 경우에, 제2 결합 부위는 VEGF-A의 아미노산 측쇄 E90, F62, D67, I69, E70, K110, P111, H112, 및 Q113에 의해 정의된다. 예시적인 GA 도메인 폴리펩티드인 화합물 11055와 구별되는 부위에서 예시적인 Z 도메인 폴리펩티드 결합을 보여주는 도 36a 참조. 표적 결합 부위 중 적어도 하나 또는 둘 다는 길항제 활성을 제공하기 위해 VEGF-A 표적 단백질 상의 VEGFR2 결합 부위와 부분적으로 중첩되어야 한다. 예를 들어, 도 35b 참조.

VEGF-A 결합 2가 화합물을 제공하기 위해 D-펩티드 변이체 Z 도메인 폴리펩티드에 연결될 수 있는 D-펩티드 변이체 GA 도메인 폴리펩티드는 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 화합물 11055, 979102, 및 979107~979110, 및 이들의 변이체를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

VEGF-A 결합 2가 화합물을 제공하기 위해 D-펩티드 변이체 GA 도메인 폴리펩티드에 연결될 수 있는 D-펩티드 변이체 Z 도메인 폴리펩티드는 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 화합물 978333~978337, 980181, 980174~980180, 및 981188~981190, 및 이들의 변이체를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

도 36a에는, 2개의 D-펩티드 도메인의 N-말단들을 연결하는 하나의 가능한 연결 구성 성분의 개략가 도시되어 있다. 일부 경우에, N-말단 대 N-말단 링커는 (PEG)n 이기능성 링커이며, 여기서 n은 2~20, 예컨대 4~20 또는 8~20이다(예를 들어, n은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12임). 임의의 편리한 화학선택성 작용기는 접합을 제공하기 위해 연결되는 D-펩티드 도메인에 통합될 수 있다. 도메인간 연결은 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 친화성 화학선택성 작용기를 사용한 펩티드 합성 후에 달성될 수 있다. 연결 성분은 또한 고상 펩티드 합성(SPPS) 동안 대상 다가 화합물의 D-펩티드 폴리펩티드에 혼입될 수도 있다. 예를 들어, 도 50 참조.

일부 경우에, N-말단 대 N-말단 링커는, 동종 2기능성 PEG 링커를 포함하는 말레이미드에 접합을 가능하게 하는 시스테인 잔기를 포함하도록 도메인의 폴리펩티드 서열을 연장시킴으로써 설치될 수 있다. 예를 들어, 화합물 11055 및 978336 둘 다를 추가의 N-말단 시스테인 잔기와 화학적으로 합성하였는데, 이들은 N-말단 대 N-말단 연결을 제공하기 위한 종래의 방법을 사용해 비스-말레이미드 PEG8 링커로 접합시켰다(도 36a). 예를 들어, 표 5는 높은 친화도로 VEGF-A에 결합하는 예시적인 2가 화합물인 화합물 979111의 세부사항을 제공한다. 도 50a는 VEGF-A에 결합된 D-펩티드 도메인 11055 및 978336의 결정 구조, 및 VEGF-A에 결합하는 다양한 변이체 GA 도메인 및 Z 도메인 폴리펩티드로부터 2가 화합물을 제조하는 데 사용될 수 있는 대안적인 도메인 간 링커, 즉 변이체 GA 도메인의 k19에서 변이체 Z 도메인의 k7까지의 위치를 보여준다.

도 38d는 GA 도메인의 잔기 x19와 Z 도메인의 잔기 x7 사이에서 링커 L¹을 포함하는 예시적인 2가 화합물을 일반적인 구조를 보여준다. (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 임의의 예시적인 D-펩티드 GA 도메인 및 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) D-펩티드 Z 도메인은 도 38d에 도시된 것과 같은 연결 성분 L¹로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, x19 및 x7 잔기는 각각 독립적으로 리신 및 오르니틴이고, 링커는 다음 구조 중 하나를 가지며:

여기서 n 및 m은 독립적으로 1~12, 예컨대 1~6이고; p, q, 및 r은 각각 독립적으로 0~3, 예컨대 0 또는 1이고; s는 1~6, 예컨대 1~3이다. L¹의 일부 경우에, n+m은 2~6, 예컨대 3, 4 또는 5이다. L¹의 일부 경우에, n 및 m은 각각 2이다. L¹의 일부 경우에, n 및 m은 각각 3이다. L¹의 일부 경우에, p, q, 및 r은 각각 1이다. L¹의 일부 경우에, p는 0이다. L¹의 일부 경우에, q는 0이다. L¹의 일부 경우에, r은 0이다. L¹의 일부 경우에, s는 2이다. L¹의 일부 경우에, s는 3이다.

도 38e는 GA 및 Z 도메인의 C-말단 잔기들 사이에서 제2 링커 L²를 포함하는 예시적인 이량체 2가 화합물의 개략도이다. 도 38b는, 2개의 2가 화합물의 Z 도메인의 C-말단 잔기를 연결하는 데 사용되었고, SPPS 도중에 설치될 수 있는 예시적인 링커 L²를 보여준다. C-말단 대 C-말단 링커는 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 하나 이상의 아미노산 잔기 및 하나 이상의 연결 단위를 포함할 수 있으며, 이에는 아미노산을 분지화할 수 있고(예: 리신) 아미노산을 예를 들어 아미노산 측쇄와 알파-아미노기에 결합시킬 수 있는 적어도 하나의 잔기가 포함된다. C-말단 대 C-말단 링커는 하나 이상의 아미노산 잔기, 및 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 하나 이상의 연결 단위를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단백질 도메인이 VEGF 표적에 동시에 결합할 수 있게 하는 공유 결합을 제공하는 SPPS 도중에 하나 이상의 잔기가 도메인의 C-말단에 설치될 수 있다.

예시적인 다량체 다가 D-펩티드 화합물

본 개시의 양태는, 본원에 기술된 대상 변이체 도메인 폴리펩티드 및/또는 2가 화합물 중 어느 2개 이상을 포함하는 다량체(예: 이량체, 삼량체, 또는 사량체 등) D-펩티드 화합물을 포함한다. 본 개시의 다량체는 2개 이상의 상동성 도메인 또는 2개 이상의 상동성 2가 화합물을 갖는 화합물을 지칭할 수 있다. 이와 같이, 2가 화합물의 이량체는 연결 성분을 통해 연결된, 본원에 기술된 2가 화합물 중 어느 하나의 2개의 분자를 포함할 수 있다. 표적 분자 VEGF-A는 동종이량체일 수 있고, 상동성 이량체 화합물은 각각의 VEGF-A 표적 단량체 상의 유사한 부위에 대한 결합을 제공할 수 있다. 예를 들어, 도 36a는 VEGF-A 이량체에 결합된 도메인 11055의 2개의 분자 및 도메인 978336의 2개의 분자의 결정 구조의 오버레이를 보여준다. 4개의 도메인을 연결하기 위해 화학적 연결을 통합하기 위한 예시적인 부위가 표시되어 있다. 예시적인 연결 성분은 도 38b 및 38c에 상세히 표시되어 있다. 일부 경우에, 2가 화합물의 이량체화(11055+978336)는 도메인의 C-말단들 간의 펩티드 링커를 사용하여 달성된다. 예를 들어, 표 5 및 도 38c는 예시적인 VEGF-A 결합 이량체 2가 화합물 980870 및 980871의 서열 및 구성을 보여주는데, 이는 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같이) 임의의 편리한 연결기가 폴리펩티드 도메인의 C-말단에 연결되어 SPPS 도중에(도 38b) 또는 SPPS 후에 이량체화 연결 성분을 도입할 수 있음을 보여준다.

펩티드 도메인

임의의 편리한 펩티드 도메인이 대상 화합물에 사용될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 표적 단백질에 대한 미러 이미지 스크리닝 방법에 사용하도록 구성될 수 있는 다양한 소 단백질 도메인이 파지 디스플레이 스크리닝에 사용된다. 관심 소 펩티드 도메인은 25 내지 80개의 아미노산 잔기, 예컨대 30 내지 70개의 잔기, 40 내지 70개의 잔기, 40 내지 60개의 잔기, 45 내지 60개의 잔기, 50 내지 60개의 잔기, 또는 52 내지 58개의 잔기로 이루어진 단쇄 폴리펩티드 서열로 이루어질 수 있다. 펩티드 도메인은 1 내지 20 킬로달톤(kDa), 예컨대 2 내지 15kDa, 2 내지 10kDa, 2 내지 8kDa, 3 내지 8 kDa, 또는 4 내지 6 kDa의 분자량(MW)을 가질 수 있다.

펩티드 도메인은 3개의 나선 다발 도메인일 수 있다. 3개의 나선 다발 도메인은 루프 영역에 의해 결합된 2개의 평행 나선 및 1개의 역평행 나선으로 이루어진 구조를 갖는다. 관심 3개의 나선 다발 도메인은 GA 도메인, Z 도메인, 및 알부민-결합 도메인(ABD)을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

본 개시에 기초하여, 구조의 표적 결합 표면에 위치하지 않는 펩티드 도메인 모티프의 아미노산 잔기 중 몇 개는 생성된 변형된 화합물의 3차원 구조 또는 표적 결합 활성에 상당한 해로운 영향을 미치지 않고도 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이와 같이, 다음을 포함하되 이들로 한정되지는 않는 바람직한 특성을 화합물에 부여하기 위해, 필요에 따라, 몇 가지 아미노산 변형/돌연변이가 대상 화합물에 혼입될 수 있다: 증가된 수용성, 화학적 합성의 용이성, 합성 비용, 접합 부위, 나선 간 결합 부위, 안정성, 등전점(pI), 응집 저항성 및/또는 감소된 비특이적 결합. 돌연변이의 위치는, 표적 단백질에 대한 특이적 결합을 제공하는 표적 결합 도메인 모티프의 기저 3차원 구조 또는 특이성 결정 모티프(SDM)에 대한 임의의 파괴를 피하거나 최소화하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 원하는 변이체 아미노산 잔기를 도입하도록, 예를 들어, 용해도를 증가시키거나 바람직한 단백질 pI를 제공하거나, 접합 또는 결합 부위를 포함하도록 결합 표면으로부터 도메인 구조의 반대측에서 용매 노출 위치에서 돌연변이가 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 표적 결합 도메인 모티프의 3차원 구조에 기초하여, 돌연변이의 위치는 (예를 들어, 구조의 코어 패킹 잔기 내로 변이체 아미노산(들)을 도입하여) 안정성을 증가시키거나 (예를 들어, SDM에 변이체 아미노산(들)을 도입하여) 결합 친화도를 증가시키도록 선택될 수 있다. 일부 사례에서, 화합물은 VEGF 표적 단백질에 대한 결합 표면의 일부가 아닌 위치에서 2개 이상, 예컨대 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 표면 돌연변이를 포함한다.

VEGF-결합 Z 도메인

본 개시는 VEGF에 특이적으로 결합하는 D-펩티드 Z 도메인을 제공한다. Z 도메인은 Z 도메인의 위치 9, 10, 13, 14, 17, 24, 27, 28, 32, 및/또는 35에 위치한 5개 이상의 변이체 아미노산 잔기(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 변이체 아미노산 잔기)에 의해 정의된 VEGF 특이성 결정 모티프(SDM)를 포함할 수 있다. 다양한 기저 Z 도메인 스캐폴드 서열 또는 펩티드 프레임워크 서열이 Z 도메인의 특징적인 3차원 구조를 제공하는 데 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

용어 "Z 도메인"은, 단백질 A의 면역글로불린 G 결합 도메인과 관련된 3-나선 다발 3차 구조를 갖는 펩티드 도메인을 지칭한다. 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서, 구조 2spz는 예시적인 Z 도메인 구조를 제공한다. 천연 Z 도메인 구조 및 하나의 변형되지 않은 천연 Z 도메인의 예시적인 서열의 도시를 포함하는 도 32a 및 도 32b를 또한 참조. 용어 "Z 도메인 스캐폴드"는, 특징적인 3-나선 다발 구조를 제공하고 대상 화합물에 사용하도록 구성될 수 있는 기저 Z 도메인 서열을 지칭한다. "변이체 Z 도메인"은 표적 단백질에 대한 특이적 결합을 제공하는 3-나선 다발 삼차 구조의 선택 위치에서 변이체 아미노산을 포함하는 Z 도메인이다. Z 도메인 모티프는 일반적으로 다음 화학식에 의해 기술될 수 있으며:

[나선 3]-[링커 1]-[나선 2]-[링커 2]-[나선 1]

여기서 [링커 1] 및 [링커 2]는 독립적으로 1개 내지 10개의 잔기로 이루어진 펩티드 연결 서열이고, [나선 1], [나선 2], 및 [나선 3]은 GA 도메인에 대해 전술한 바와 같다.

관심 Z 도메인은 Nygren("Alternative binding proteins: Affibody binding proteins developed from a small three-helix bundle scaffold", FEBS Journal 275 (2008) 2668-2676), US20160200772, US9,469,670에 기술된 것들, 및 Tjhung 등(Front. Microbiol., 28 April 2015)에 의해 기술된 단백질 A의 33-잔기 최소화 Z-도메인을 포함하지만 이들로 한정되지 않으며, 상기 문헌의 개시 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

본 개시의 일부 예시적인 VEGF-A 특이적 Z 도메인들을 설명하기 위해, 도 36b의 넘버링된 57개의 잔기 스캐폴드를 사용한다. 일부 구현예에서, D-펩티드 Z 도메인은 다음 구조식의 3-나선 다발이며: [나선 1^(#8-18)]-[링커 1^(#19-24)]-[나선 2^(#25-36)]-[링커 2^(#37-40)]-[나선 3^(#41-54)]

여기서: #는 D-펩티드 GA 도메인에 포함된 아미노산 잔기의 기준 위치를 나타낸다. 나선 1-3은 나선의 말단에서 연장된 하나 이상의 추가 잔기를 포함하도록 정의될 수 있고, 이러한 말단에 위치한 잔기는 부분 나선형 구성을 가질 수 있고/있거나, 나선 1-3은 회전 또는 루프 영역의 시작 위치에 있을 수 있는 것으로 이해된다. 일부 경우에, Z 도메인의 나선 1은 N-말단에서 하나 이상의 추가 아미노산 잔기을 추가로 포함할 수 있고, 예를 들어, 위치 7에서 및 임의로 위치 6에서 나선형 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, Z 도메인의 나선 1은 위치 7에서 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, Z 도메인은 위치 8에 대한 N-말단에서 다음과 같은 원하는 특성을 제공할 수 이는 잔기들을 포함한다: 나선 1 안정화, 3-나선 다발의 안정화, 추가 VEGF 결합 접점, 나선 1 연장, 및 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은) 제2 도메인 또는 관심 모이어티에 대한 연결. 일부 경우에, Z 도메인은 위치 54에 대한 C-말단에서 다음과 같은 원하는 특성을 제공할 수 이는 잔기들을 포함한다: 나선 3 안정화, 3-나선 다발의 안정화, 추가 VEGF 결합 접점, 나선 3 연장, 및 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은) 제2 도메인 또는 관심 모이어티에 대한 연결.

D-펩티드 Z 도메인 화합물은 VEGF의 아미노산 측쇄 E90, F62, D67, I69, E70, K110, P111, H112, 및 Q113에 의해 정의된 결합 부위에서 VEGF-A에 특이적으로 결합할 수 있다.

예시적인 VEGF-A 결합 D-펩티드 Z 도메인은 표 4에 기술된 것들 및 화합물 978333 내지 978337 및 980181(서열번호 114~119), 980174~980180 및 981188~981190(서열번호 120~129)의 서열에 의한 것들을 포함한다. 본 개시에 기술된 구조 및 서열 변이체의 관점에서, VEGF-A에 대한 특이적 결합을 유지하면서 예시적인 화합물의 서열에 다수의 아미노산 치환이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. Z 도메인의 3차원 구조에 악영향을 미치지 않으면서 변동성이 용인되는 변이체 Z 도메인의 위치를 선택함으로써, 다수의 아미노산 치환이 통합될 수 있다.

이와 같이, 본 개시는 1~10개의 아미노산 치환(예를 들어, 1~8, 1~6, 또는 1~5개의 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환)을 갖는 978333 내지 978337 및 98011(서열번호 114~119), 980174~980180, 및 981188~981190(서열번호 120~129)의 서열을 포함한다. 1~10개의 아미노산 치환은, 예를 들어, 표 6에 따른 아미노산 측쇄의 물리적 특성에 기초한 아미노산에 대한 치환일 수 있다. 때때로, 978333 내지 978337 및 980181(서열 번호 114~119), 980174~980180 및 981188~981190(서열 번호 120~129)의 서열의 아미노산은 표 6에 따라 유사한 아미노산으로 치환된다. 일부 경우에, 치환은 표 6에 따른 보존적 아미노산 치환 또는 고도로 보존적 아미노산 치환에 대한 것이다.

본 개시는 978333 내지 978337 및 980181(서열 번호 114~119), 980174~980180, 및 981188~981190(서열 번호 120~129)의 서열과 80% 이상의 서열 동일성, 예컨대 85% 이상, 87% 이상, 89% 이상, 91% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 기술된 VEGF-A 결합 D-펩티드 Z 도메인을 포함한다.

VEGF-A 결합 D-펩티드 Z 도메인은 도 33a 및/또는 도 35f에 도시된 특이성-결정 모티프(SDM)에 의해 정의된 Z 도메인의 위치 9, 10, 13, 14, 17, 24, 27, 28, 32, 및 35에서 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 일부 경우에, 특이성 결정 모티프(SDM)는 다음의 서열 모티프에 의해 정의되며:

w⁹d¹⁰--w¹³x¹⁴--r¹⁷------x²⁴--k²⁷x²⁸---x³²--y³⁵(서열번호 160)

여기서: x¹⁴, x²⁴, x²⁸ 및 x³²는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이다. SDM의 소정의 경우에: x¹⁴는 l, r, 및 t로부터 선택되고; x²⁴는 h, i. l, r, 및 v로부터 선택되고; x²⁸은 G, r, 및 v로부터 선택되고; x³²는 a, r, h, s, 및 t로부터 선택된다. 소정의 경우에, 특이성 결정 모티프(SDM)는 다음과 같다:

w⁹d¹⁰--w¹³r¹⁴--r¹⁷------l²⁴--k²⁷r²⁸---s³²--y³⁵ (서열번호 161); 또는

w⁹d¹⁰--w¹³r¹⁴--r¹⁷------v²⁴--k²⁷r²⁸---r³²--y³⁵ (서열번호 162).

일부 구현예에서, VEGF에 특이적으로 결합하는 D-펩티드 화합물은 다음의 아미노산 잔기에 의해 정의된 VEGF 특이성 결정 모티프(SDM)를 포함하는 D-펩티드 Z 도메인을 포함하며:

식 중:

x¹⁴는 l, r 및 t로부터 선택되고;

x²⁴는 h, i, l, r 및 v로부터 선택되고;

x²⁸은 G, r 및 v로부터 선택되고;

x³²는 a, r, h, s 및 t로부터 선택되고;

x³⁵는 k 또는 y로부터 선택된다.

VEGF SDM의 일부 구현예에서, x¹⁴는 l이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x¹⁴는 r이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x¹⁴는 t이다.

VEGF SDM의 일부 구현예에서, x²⁴는 h이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x²⁴는 i이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x²⁴는 l이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x²⁴는 r이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x²⁴는 v이다.

VEGF SDM의 일부 구현예에서, x²⁸은 G이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x²⁸은 r이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x²⁸은 v이다.

VEGF SDM의 일부 구현예에서, x³²는 a이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x³²는 r이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x³²는 h이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x³²는 s이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x³²는 t이다.

VEGF SDM의 일부 구현예에서, x³⁵는 k이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x³⁵는 y이다.

일부 구현예에서, VEGF SDM은 다음 잔기에 의해 정의된다:

w⁹d¹⁰--w¹³r¹⁴--r¹⁷------l²⁴--k²⁷r²⁸---s³²--y³⁵(서열번호 161)

또는

w⁹d¹⁰--w¹³r¹⁴--r¹⁷------v²⁴--k²⁷r²⁸---r³²--y³⁵(서열번호 162).

GA 도메인의 일부 구현예에서, SDM 잔기는 다음의 아미노산 잔기에 의해 정의된 펩티드 프레임워크 잔기를 포함하는 펩티드 프레임워크 서열에 포함된다: --n¹¹a--e¹⁵i-h¹⁸lpnln-e²⁵q--a²⁹fi-s³³l- .

일부 구현예에서, GA 도메인은 다음 아미노산 서열과 80% 이상(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상)의 동일성을 갖는 SDM-함유 서열을 포함하며:

w⁹d¹⁰naw¹³x¹⁴eir¹⁷hlpnlnx²⁴eqk²⁷x²⁸afix³²sly³⁵ (서열번호 133)

식 중:

x¹⁴는 l, r 및 t로부터 선택되고;

x²⁴는 h, i, l, r 및 v로부터 선택되고;

x²⁸은 G, r 및 v로부터 선택되고;

x³²는 a, r, h, s 및 t로부터 선택되고;

x³⁵는 k 또는 y로부터 선택된다.

SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x¹⁴는 l이다. SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x¹⁴는 r이다. SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x¹⁴는 t이다.

SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x²⁴는 h이다. SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x²⁴는 i이다. SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x²⁴는 l이다. SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x²⁴는 r이다. SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x²⁴는 v이다.

SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x²⁸은 G이다. SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x²⁸은 r이다. SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x²⁸은 v이다.

SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x³²은 a이다. SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x³²는 r이다. SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x³²는 h이다. SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x³²는 s이다. SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x³²는 t이다.

SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x³⁵는 k이다. SDM-함유 서열의 일부 구현예에서, x³⁵는 y이다.

화합물의 일부 구현예에서, Z 도메인의 나선 3^(#41-54)은 펩티드 프레임워크 서열 s⁴¹anllaeakklnda⁵⁴ (서열번호 134)를 포함한다.

일부 구현예에서, D-펩티드 Z 도메인은 다음의 C-말단 펩티드 프레임워크 서열을 포함한다: d³⁶dpsqsanllaeakklndaqapk⁵⁸ (서열번호 135).

일부 구현예에서, D-펩티드 Z 도메인은 다음의 N-말단 펩티드 프레임워크 서열을 포함한다: v¹dnkfnke⁸ (서열번호 136).

VEGF-결합 GA 도메인

용어 "GA 도메인"은 및 "GA 도메인 모티프"는, 단백질 G의 알부민 결합 도메인과 관련된 3-나선 다발 3차 구조를 갖는 펩티드 도메인을 지칭한다. 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서, 구조 1tf0은 예시적인 GA 도메인 구조를 제공한다. 도 3, 도 7a~7b, 도 10a 및 도 10b는 천연 GA 도메인 구조 및 하나의 변형되지 않은 천연 GA 도메인의 예시적인 서열의 도시를 포함한다. 용어 "GA 도메인 스캐폴드"는, 특징적인 3-나선 다발 구조를 제공하고 대상 화합물에 사용하도록 구성될 수 있는 기저 펩티드 프레임워크 서열을 지칭한다. 일부 경우에, GA 도메인 스캐폴드 또는 펩티드 프레임워크 서열은 표 3에 정의된 바와 같은 컨센서스 서열을 갖는다. 표 3은 대상 화합물에 사용하도록 구성될 수 있는 예시적인 GA 도메인 스캐폴드 서열의 목록을 제공한다. 용어 "변이체 GA 도메인", "VEGF-결합 GA 도메인", 및 "VEGF에 결합하는 GA 도메인"은 상호 교환적으로 사용되며, 함께 VEGF 표적 단백질에 대한 특이적 결합을 제공하는 3-나선 다발 3차 구조의 선택 위치에 변이체 아미노산을 포함하는 GA 도메인을 지칭한다.

GA 도메인은 다음의 구조식에 의해 기술될 수 있으며:

[나선 1]-[링커 1]-[나선 2]-[링커 2]-[나선 3]

여기서, [나선 1], [나선 2], 및 [나선 3]은 펩티드 링커 [링커 1] 및 [링커 2]를 통해 연결된 특징적인 3-나선 다발의 나선 영역이다. 3-나선 다발에서, [나선 1], [나선 2], 및 [나선 3]은 연결된 펩티드 영역이며, 여기서 [나선 2]는 병렬 알파 나선 [나선 1] 및 [나선 3]의 2-나선 복합체에 대해 실질적으로 역평행으로 구성된다. [링커 1] 및 [링커 3]은 각각 독립적으로 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, [링커 1]은 [링커 3]보다 길이가 더 길다. GA 도메인은 30 내지 90개의 잔기, 예컨대 30 내지 80개의 잔기, 40 내지 70개의 잔기, 45 내지 60개의 잔기, 45 내지 60개의 잔기, 45 내지 60개의 잔기, 또는 45 내지 55개의 잔기의 펩티드 서열일 수 있다. 소정의 사례에서, GA 도메인 모티프는 35 내지 55개의 잔기, 예컨대 40 내지 55개의 잔기, 또는 45 내지 55개의 잔기의 펩티드 서열이다. 소정의 구현예에서, GA 도메인 모티프는 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 또는 53개의 잔기의 펩티드 서열이다.

일부 구현예에서, D-펩티드 GA 도메인은 다음 구조식의 3-나선 다발이며:

[나선 1^(#6-21)]-[링커 1^(#22-26)]-[나선 2^(#27-35)]-[링커 2^(#36-37)]-[나선 3^(#38-51)]

여기서: #는 D-펩티드 GA 도메인에 포함된 아미노산 잔기의 기준 위치, 예를 들어, 도 9c에 도시된 넘버링 방식에 따른 기준 위치를 나타낸다.

관심 GA 도메인은 Jonsson 등에 의해 기술된 것(문헌[Engineering of a femtomolar affinity binding protein to human serum albumin, Protein Engineering, Design & Selection, 21(8), 2008, 515-527])을 포함하며, 상기 문헌의 개신 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합되고, 스캐폴드의 위치 25, 27, 31, 34, 36, 37, 39, 40, 43, 44, 및 47에서 라이브러리 돌연변이를 포함하는 스캐폴드 서열(G148-GA3)을 갖는 파지 디스플레이 라이브러리 및 GA 도메인을 포함한다. 다른 관심 GA 도메인은 US6,534,628 및 US6,740,734에 기술된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 그 개시 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

본 개시의 변이체 GA 도메인은 25, 27, 30, 31, 34, 36, 37, 39, 40 및 42~48로부터 선택된 위치에서 5개 이상의 변이체 아미노산 잔기를 포함하는 특이성 결정 모티프(SDM)를 가질 수 있다. 일부 경우에, 특이성 결정 모티프(SDM)는 GA 도메인의 위치 28에서 변이체 아미노산을 추가로 포함한다.

잠금 GA 도메인

본 개시는 나선 1과 나선 3의 인접한 잔기 사이에서 나선 간 링커 또는 브릿지를 갖는 변이체 GA 도메인 화합물을 포함한다. 용어 "잠금 변이체 GA 도메인" 및 "잠금 GA 도메인"은 GA 도메인의 임의의 2개의 나선 사이에서 구조 안정화 링커를 포함하는 변이체 GA 도메인을 지칭한다. 때때로, 연결된 인접 잔기는 나선 1 및 3의 단부에 위치한다. 도 29a 및 37a는 3-나선 다발에서의 나선 1~3의 구성을 예시하는 GA 스캐폴드 도메인의 구조를 보여준다. 나선 간 링커(interhelix linker)는 도메인의 3차원 구조에서 서로 근위인 도메인의 위치 7(나선 1)과 38(나선 3)에 있는 아미노산 잔기들 사이에 위치할 수 있다. 위치 7 및 38은 구조의 소수성 코어와 안정화 접점을 만들 수 있는 나선의 단부에 위치한 코어 대면 잔기인 것으로 간주될 수 있다. 나선 간 링커는 연결된 아미노산 잔기들의 알파-탄소 사이에서 측정했을 때 3 내지 7개 원자 길이의 백본을 가질 수 있다. 예를 들어, 2개의 시스테인 잔기 간의 이황화 연결은 2개의 시스테인 아미노산 잔기의 알파-탄소 사이에서 4개 원자 길이의 백본(-CH₂-S-S-CH₂-)을 제공한다.

다양한 호환 가능한 천연 및 비-자연 발생 아미노산 잔기가 GA 도메인의 위치 7 및 38에 통합될 수 있고, 이들은 서로 접합되어 나선 간 링커를 제공할 수 있다. 호환 가능한 잔기는: 에스테르 또는 티오에스테르 연결을 통해 세린 또는 시스테인에 연결된 아스파르테이트 또는 글루타메이트, 아미드 연결을 통해 오르니틴 또는 리신에 연결된 아스파르테이트 또는 글루타메이트를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이와 같이, 나선 간 링커는 C_(1-6)알킬, 치환된 C_(1-6)알킬, -(CHR)_n-CONH-(CHR)_m-, 및 -(CHR)_n-S-S-(CHR)_m-으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, C_(1-6)알킬 또는 치환된 C_(1-6)알킬이고, n+m = 2, 3, 4, 또는 5이다. 임의의 편리한 비-자연 발생 잔기는 위치 7 및 38의 아미노산 잔기 측쇄에서 호환 가능한 화학 선택성 태그, 예를 들어, 폴리펩티드 합성 후 서로 접합될 수 있는 아지드 태그 및 알킨 태그와 같은 클릭 화학 태그를 통합시키는 데 사용될 수 있다.

도메인 내 링커의 통합은 VEGF 표적 단백질에 대한 안정성 및/또는 결합 친화도를 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, VEGF에 대한 D-펩티드 화합물의 결합 친화도(K_D)는 도메인 내 링커가 결여된 대조군 폴리펩티드보다 3배 이상(즉, K_D가 3배 더 낮음), 예를 들어 5배 이상, 10배 이상, 30배 이상, 또는 훨씬 더 강하다. VEGF-A에 특이적으로 결합하는 예시적인 잠금 변이체 GA 도메인 화합물은 이하에서 더욱 상세히 기술된다.

변이체 GA 도메인 폴리펩티드는 위치 1에서 위치 6까지의 N-말단 영역을 포함할 수 있는데, 이 영역은 접힌 3-나선 다발 구조의 인접한 나선 2-루프-나선 3 영역과의 접점에 직접적으로 관여하지 않기 때문에 나선 2 및 나선 3과 중첩되지 않는 것으로 간주될 수 있다(예를 들어, 도 32a 참조). 대상 D-펩티드 화합물에서, GA 도메인의 위치 1에서 5까지의 N-말단 영역은 서열 내에 임의로 유지되고 최적화되어 증가된 수용성, 안정성, 또는 친화도와 같은 바람직한 특성을 제공할 수 있다. 변이체 D-펩티드 화합물의 N-말단 영역은 화합물의 활성에 상당한 악영향을 미치지 않으면서 치환, 변형, 또는 절단될 수 있는 것으로 이해된다. N-말단 영역은 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 관심 분자 또는 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 또 다른 D-펩티드 도메인 또는 다가 화합물에 대한 접합 또는 연결을 제공하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에, N-말단 잔기는 나선 1의 연장된 나선 구조를 제공하는 나선성(helical propensity)을 갖는다. 대안적으로, N-말단 영역은 나선 1의 N-말단을 안정화시키는 나선 캡핑 잔기를 통합시킬 수 있다. 일부 경우에, 변이체 GA 도메인 화합물은, 도 32a에 도시된 것과 같은 부모 GA 도메인 구조에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개 잔기의 제거에 의해 N-말단에서 절단(즉, 위치 1~5가 절단)된다. 이러한 경우, 대상 화합물의 넘버링 방식은 도 32b에 표시된 바와 같이 유지된다. 유사하게, 나선 3의 말단에서 1개, 2개, 또는 3개의 C-말단 잔기가 3-나선 다발 구조의 안정성 및 표적 결합 능력에 악영향을 미치지 않으면서 절단될 수 있다.

도 29a~29b는 변이체 GA 도메인 화합물의 위치 1~3, 6, 7, 및 37~38에 초점을 맞춘 예시적인 친화도 성숙 라이브러리의 설계를 보여준다. 도 30a~30b는 스크리닝 결과; c7-c38 이황화 브릿지를 갖는 변이체 GA 도메인 화합물, 및 VEGF-A에 대한 개선된 결합 친화도를 보여준다. 다양한 변이체 아미노산 잔기가 화합물의 N-말단 영역의 위치 1~3에서 용인된다.

일부 구현예에서, D-펩티드 GA 도메인은 다음 분절 (I)~(II) 중 하나 이상(예: 둘 다)을 포함하며:

x¹x²x³qwx⁶x⁷ (I) (서열번호 142)

x³⁷x³⁸ (II)

식 중:

x¹ 내지 x³은 임의의 D-아미노산 잔기로부터 독립적으로 선택되고;

x⁶은 i 및 v로부터 선택되고;

x³⁷은 s 및 n으로부터 선택되며;

x⁷ 및 x³⁸은, 아미노산 잔기 x⁷ 및 x³⁸의 알파-탄소 사이에서 측정했을 때 3 내지 7개 원자 길이의 백본을 갖는 도메인 내 링커/나선 간 링커를 통해 연결된 아미노산 잔기이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, x¹ 내지 x³은 f, h, i, p, r, y, n, s, 및 v로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, x⁶은 v이다. 화학식 (II)의 일부 구현예에서, x³⁷은 n이다.

도메인 내 링커/나선 간 링커는 x⁷ 및x³⁸ 아미노산 잔기의 측쇄들 간의 이황화 브릿지 또는 연결로 구성될 수 있다. 임의의 편리한 천연 또는 비-자연 발생 티올 함유 아미노산이 도메인 내 링커를 제공하는 데 사용될 수 있다. 이황화 연결을 통해 연결될 수 있는 아미노산 잔기 x⁷ 및 x³⁸은: 이황화 시스테인⁷-시스테^{인 38}; 이황화 호모시스테인⁷-시스테인³⁸; 이황화 시스테인⁷-호모시스테인³⁸; 및 이황화 호모시스테인⁷-호모시스테인³⁸을 포함한다. 대안적으로, 도메인 내 링커/나선 간 링커는 x⁷ 및 x³⁸ 아미노산 잔기의 측쇄 사이에서 아미드 결합 연결을 포함할 수 있다. 아미노산을 함유하는 임의의 편리한 천연 또는 비-자연 발생 아민 및 카복시산이 도메인 내 링커를 제공하는 데 사용될 수 있다. 아미드 연결을 통해 연결될 수 있는 아미노산 잔기 x⁷ 및 x³⁸은 다음을 포함하며: Asp7-Dap38, Asp7-Dab38, Asp7-Orn38, Glu7-Dap38, Glu7-Dap38 및 Glu7-Orn38, 여기서 Dap는 α,β-디아미노프로피온산이고, Dab는 α,γ-디아미노부티르산이며, Orn은 오르니틴이다. x⁷ 및 x³⁸ 잔기의 쌍은 D-아미노산 잔기일 수 있다. 임의의 편리한 화학선택적 작용기 및 이의 접합체를 사용해, 아지드-알킨, 티올-말레이미드, 티올-할로아세틸, 티올-비닐 설폰, 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 에테르, 및 티오에테르를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 도메인 내 연결/나선 간 연결을 달성할 수 있다.

도 13은 GA 도메인 라이브러리의 도시를 보여주며, 본 도시에는 53개의 기저 잔기 스캐폴드 서열(서열번호 2); 및 스크리닝에 사용된 파지 디스플레이 라이브러리 중 하나를 정의하는, 스캐폴드의 위치 25, 27, 28, 31, 34, 36, 37, 39, 40, 43, 44, 및 47에서의 돌연변이 위치(굵은 글씨체)가 포함된다. 스캐폴드 도메인 라이브러리의 스크리닝에서 유래된 선택된 히트 화합물을 식별하였다. 대상 화합물은, 표적 단백질과 접촉하여 VEGF-A에 대한 특이적 결합을 제공하는 VEGF-A 결합 면을 제시하는 기저 스캐폴드 도메인을 포함한다. 선택된 GA 도메인 라이브러리 히트로부터 선택된 화합물을 대상으로 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 추가 친화도 성숙 연구 및 점 돌연변이 연구를 수행하여 GA 도메인 모티프의 여러 추가 위치, 예를 들어, 위치 26, 29, 및 30에서 변이체 아미노산을 평가하였다. VEGF-A와 복합체를 형성한 GA 도메인 스캐폴드를 갖는 예시적인 D-펩티드 화합물의 X-선 결정 구조가 본원에 기술되어 있는데, 이는 대상 VEGF-A 결합 화합물에 대한 구조 모델을 제공한다.

D-펩티드 변이체 GA 도메인 화합물은 VEGF-A의 아미노산 측쇄 F43, M44, Y47, Y51, N88, D89, L92, I72, K74, M107, I109, Q115, 및 I117에 의해 정의된 결합 부위에서 VEGF-A에 특이적으로 결합할 수 있다(도 28a~28b).

일부 경우에, VEGF-A 결합 모티프는, 서로 접촉하여 함께 VEGF-A 결합 면을 정의하는 적어도 2개의 역평행 나선 영역 [나선 A] 및 [나선 B]를 포함한다. [나선 A] 및 [나선 B]의 역평행 복합체를 포함하는 VEGF-A 결합 모티프의 해당 부분은 "2-나선 복합체" 구조로서 지칭될 수 있다. 도 8a~8b는 2-나선 복합체 구조에 대한 헵타드 반복 구조 모델을 도시한다. 일부 사례에서, 관심 VEGF-A 접촉 잔기는 2-나선 복합체의 표면 돌연변이 위치 또는 경계 돌연변이 위치, 예컨대 헵타드 반복의 c 또는 g 위치에 위치할 수 있다. 도 8c는 2-나선 복합체 구조의 g-g 면 상의 VEGF-A 접촉 잔기의 예시적인 하나의 배열을 보여준다. VEGF-A 결합 면은 4개 이상의 잔기, 예컨대 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 VEGF-A 접촉 잔기를 포함할 수 있으며, 여기서 잔기는 [나선 A] 및 [나선 B] 모두의 잔기를 포함한다. 소정의 경우에, VEGF-A 접촉 잔기는 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 비극성, 방향족, 헤테로시클릭, 및 카보시클릭 잔기로부터 독립적으로 선택된다. 2-나선 복합체의 2개의 나선은 [나선 A] 및 [나선 B]의 실질적으로 역평행 구성을 보존하는 임의의 편리한 연결을 통해 연결될 수 있다. 일부 경우에, [나선 A] 및 [나선 B]는 C(나선 A)-N(나선 B) 펩티드 링커에 연결된다. 일부 경우에, [나선 A] 및 [나선 B]는 C(나선 A)-N(나선 B) 펩티드 링커에 연결된다. 도 8a는 2-나선 복합체 구조에 대한 가능한 말단 연결(청색 실선)을 도시한다.

2-나선 복합체는 다음을 포함하되 이들로 한정되지 않는 임의의 편리한 방법에 의해 추가로 안정화될 수 있다: 용매 노출 위치에서 바람직한 나선-나선 패킹 상호작용 또는 친수성을 제공하는 잔기의 통합; 나선 간 연결의 통합; 나선 내 연결의 통합; 나선들을 연결하는 구속된 회전 또는 링커의 통합; 및 [나선 A] 및 [나선 B] 모두와의 접점을 안정화할 수 있는 제3 펩티드 영역에 대한 연결. 도 8b~8c는 다양한 나선 간 측쇄-측쇄 연결(예: 점선)을 도시하며, 이러한 연결은 임의의 2개의 편리한 잔기 사이에 설치될 수 있다. 유사하게, 안정화를 위한 나선 내 측쇄-측쇄 연결 또는 측쇄-말단 연결이 설치되어 화합물의 구조에 원하는 안정성을 제공할 수 있다. 대상 화합물에서 사용되는 관심 나선 간 연결 및 나선 내 연결을 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: Cys-Cys 이황화 연결; 스테이플링된 펩티드 연결; 및 비-천연 가교, 예컨대 고리-밀폐형 전이에 의해 제조된 연결들, 및 Douse 등(ACS Chem Biol. 2014 Oct 17;9(10):2204-9)에 의해 기술된 연결.

일부 구현예에서, 2-나선 복합체는, 화합물의 VEGF-A 결합 면의 반대측에서 [나선 A] 및 [나선 B] 둘 다와 접촉하고 함께 3-나선 다발을 정의하는 제3 나선(나선 C)에 의해 안정화될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "3-나선 다발(three-helix bundle)" 및 "3-나선 다발 모티프"는 3개의 실질적으로 평행 또는 역평행인 알파 나선을 포함하는 소 단백질 삼차 구조인 3-나선 다발을 지칭하도록 상호 교환적으로 사용된다. 3개의 나선은 3-나선 다발 구조 내에 평행-역평행-평행 구성으로 배열된, 연결된 나선 영역의 선형 서열에 기초한다.

DeGrado 등의 문헌[Analysis and design of three-stranded coiled coils and three-helix bundles", Folding & Design 1998, 3: R29-R40]은 3-가닥 코일드 코일 및 3-나선 다발의 어셈블리에 대한 모델을 제공하며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 3-나선 다발은, 비극성 코어에서 서로 규칙적인 접점을 갖는 나선들을 연결하는 루프가 포함된 단일 가닥 구조일 수 있다. 구조의 3개의 나선은 대략 7개의 잔기 반복 모티프를 나타낼 수 있는데, 이들은 이탤릭체 a에서 g까지, 즉 (abcdefg) _n 으로 지정되어 있다. 헵타드 명칭 a, c, d, e, f, 및 g는 특정 아미노산에 대한 1글자 코드에 상응하지 않고, 오히려 헵타드 서열에서의 위치에 상응한다. 비극성 잔기는, 구조의 중앙에 패킹되어 소수성 안정화를 제공하는 측쇄기를 포함하는 헵타드의 a 및 d 위치에서 발생할 수 있다. 비극성 a 및 d 잔기는 층 내로 패킹될 수 있다. 일부 경우에, 하전된 측쇄는 계면 e 및 g 위치에서 발생할 수 있으며, 여기서 측쇄의 비-극성 부분은 소수성 코어를 차폐할 수 있고 극성 부분은 정전기 또는 수소 결합 상호작용에 관여할 수 있다. 일부 경우에, 용매 노출 위치 b 및 c는 극성 잔기에 의해 점유될 수 있다. 일부 경우에, 위치 f는 고도로 용매에 노출되고 극성 또는 하전된 잔기에 의해 점유될 수 있다. 도 6d는 2개의 평행 나선과 1개의 역평행 나선을 보여주는 3-나선 다발의 D-펩티드 헵타드 반복 모델을 보여준다. 일부 경우에, 나선 2 및 3의 합쳐진 표면에 의해 형성된 g-g 면에 있는 잔기는, VEGF-A의 표면과 상호작용하여 특이적 결합을 제공하도록 구성된 VEGF-A 접촉 잔기를 포함하도록 변형된다. 도 6d에 도시된 구조 모델의 2-나선 복합체 버전이 가능한 것으로 이해되며, 이는 도 8b에 도시되어 있다. 임의의 편리한 안정화 요소가 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 대상 화합물에 사용되어, 2개의 나선의 원하는 배열, 및 VEGF-A에 대한 특이적 결합을 제공하는 VEGF-A 결합 잔기의 제시를 유지할 수 있다. 대상 화합물은, VEGF-A에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 표면을 제공하도록 변이체 아미노산 잔기가 통합되는 3-나선 다발 삼차 구조를 갖는 VEGF-A 결합 GA 도메인 모티프를 가질 수 있다. 도 1 내지 도 2는 예시적인 펩티드 화합물과 VEGF-A 사이의 결합 계면을 도시한다. 도 3a 및 도 3b는 L-단백질 GA 도메인 및 예시적인 D-펩티드 화합물의 3-나선 다발 X-선 결정 구조를 나란히 비교해 보여준다. 도 3a 및 도 3b의 비교는, 펩티드 화합물이 부모 GA 도메인의 염기성 3-나선 다발 구조 모티프를 보유할 수 있음을 나타낸다. 소정의 경우에, 화합물의 알파-나선 구조는 천연 GA 스캐폴드 도메인과 실질적으로 동일하다. 변형 변이체 아미노산은 GA 스캐폴드 도메인에 존재하지 않는 나선 2 영역의 말단에서 나선 종결 잔기를 포함할 수 있다. 나선 2 영역의 변이체 아미노산은 또한 3개 이상의 VEGF-A 접촉 잔기, 예를 들어 방향족 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 도 4는 예시적인 VEGF-A 결합 화합물의 나선 2 영역의 위치 26 및 36(p26; 204 및 p36; 208)에서의 나선-종결 프롤린 잔기, 위치 31(f31; 206)에서의 VEGF-A 접촉 페닐알라닌, 및 위치 27 및 34(h27; 205 및 h34; 207)에서의 히스티딘 잔기를 도시한다.

본원에 기술된 화합물의 소정의 구현예에서, 편의성과 간략화를 위해, 구조 내 특정 위치 및/또는 화합물의 서열, 예를 들어, 특정 관심 변이체 아미노산 잔기가 GA 스캐폴드 도메인에 통합되는 위치를 지칭하는 넘버링 방식이 사용된다. 이러한 넘버링 방식은 도 13에 도시된 53개 잔기의 GA 스캐폴드 도메인에 사용된 방식을 기반으로 한다. 관심 아미노산의 잔기에, 예를 들어 본원에 기술된 것과 같은 모티프 또는 구조 모델 내의 위치에 넘버링된 위치를 할당하기 위해, 임의의 편리한 정렬 방법을 사용해 대상 화합물의 특정 구현예를 도 15의 기준 넘버링 방식과 비교할 수 있는 것으로 이해된다. 도 14는 다양한 관심 GA 스캐폴드 도메인 서열의 예시적인 정렬을 도시하며, 이들 중 어느 하나는 대상 화합물에 대한 기저 부모 서열의 역할을 할 수 있다. 도 14는 또한 도 13의 넘버링 방식에 따른 서열을 참조한다. 추가로, 도 13에서의 1 내지 53의 넘버링 방식은 선형 화합물 서열의 아미노산 잔기의 총 수 또는 길이를 결정하는 측면에서, 또는 특정 화합물의 모든 잔기를 정의하는 측면에서 한정하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해할 것이다.

일부 경우에, 대상 화합물은 넘버링된 부모 서열에 비해 하나 이상의 변이, 예컨대 N-말단 절단(예: 위치 1에서부터), C-말단 절단(예: 위치 53에서부터), 결실(예: 부모 서열의 임의의 편리한 위치에서의 단일 잔기 위치의 결실), 삽입(예: 부모 서열의 넘버링된 2개의 특정 위치 사이에 1, 2, 3개 또는 그 이상의 인접 잔기의 삽입)을 포함한다. 소정의 경우에, 대상 화합물에 통합되는 이러한 변이는 표적에 대한 특이적 결합을 제공하는 3-나선 다발의 3차원 구조를 실질적으로 보존한다. 대상 화합물은, 예를 들어, 다음의 구현예에 기술된 바와 같이, 부모 구조 또는 서열의 하나 이상의 위치에서, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 또는 15개 이상의 위치에서 변이체 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이, 대상 화합물은, [나선 2] 및 [나선 3]의 특정 위치에 위치한 특정 용매 노출 변이체 아미노산이 VEGF-A와 접촉을 형성할 수 있는 3-나선 다발 구조를 가질 수 있다. 일부 경우에, [링커 2] 및/또는 [링커 1]의 특정 잔기에서 추가 접촉이 발생할 수 있다. 도 1은 예시적인 펩티드 화합물과 VEGF-A 사이의 결합 계면을 도시한 것으로서, 복합체의 X-선 결정 구조로부터 취한 것이다. 소정의 경우에, [나선 2], [나선 3], [링커 2], 및/또는 [링커 1]의 추가 위치에 위치한 변이체 아미노산은 변형된 3-나선 다발 구조의 바람직한 안정화를 제공한다. 예를 들어, 도 4에는, 일부 경우에 [나선 2]에 바람직한 증가된 안정화를 부여할 수 있는 예시적인 [나선 2] 종결 잔기(예: 프롤린 잔기 204 및 208)가 도시되어 있다. 소정의 사례에서, 변형된 3-나선 다발의 소수성 코어는 부모 GA 스캐폴드 도메인의 아미노산 잔기와 실질적으로 동일한 아미노산 잔기에 의해 정의된다. 예를 들어, 도 11은 예시적인 D-펩티드 화합물의 [나선 2]-[링커 2]-[나선 3] 구조의 일부분의 확대도를 도시한 것으로서, 바람직한 분자 내 소수성 접촉을 제공하는 [나선 2]의 인접한 소수성 잔기 i32(이소류신, 위치 32) 및 a35(알라닌, 위치 35) 및 [나선 3]의 인접한 소수성 잔기 v41(발린, 위치 41) 및 l44(류신, 위치 44)를 포함한다. 도 12에는, 천연 L-펩티드 GA 도메인의 유사한 영역의 확대도가 도시되어 있으며, 여기서 유사한 잔기 I32(이소류신, 위치 32), A35(알라닌, 위치 35), V41(발린, 위치 41), 및 L44(류신, 위치 44)는 GA 스캐폴드 도메인 3-나선 다발 구조의 특징인 유사한 바람직한 분자 내 소수성 접촉을 제공한다.

도 6c는 역평행 3-가닥 나선 구조의 데그라도(Degrado) 모델을 도시한 것이다. 반복하는 헵타드 단위에 기초한 역평행 3-가닥 나선의 데그라도 모델은, VEGF-A 결합 면을 포함하는 대상 화합물의 변형된 3-나선 다발 구조에 대상 화합물 서열 모티프를 관련시키는 구조적 모델을 제공하도록 본원에서 구성된 것이다. 3-나선 다발에 대한 이러한 구조적 모델은 천연 GA 도메인(예를 들어, 도 3a) 및 예시적인 VEGF-A 결합 화합물(도 3b)의 X-선 결정 구조와 일치한다. 도 9a 및 도 9c는 예시적인 화합물 1.1.1(c21a)에 적용된 모델을 도시한 것으로서, 여기서 화합물 서열의 아미노산 잔기(도 9c)는 헵타드 반복 모델의 다양한 위치와 연관되고 구조적으로 정렬되며, 이는 X-선 구조와 일치한다(도 9b). VEGF-A와 복합체를 형성한 화합물의 X-선 구조(예를 들어, 도 5 및 도 20의 도면 참조)와 도 9a의 모델의 비교는, 예시적인 화합물의 VEGF-A 결합 표면이 나선 2와 나선 3에 의해 정의되는 g-g 면에 위치함을 보여준다(도 9a). 선택된 아미노산 잔기는 대상 화합물의 VEGF-A 결합 표면에 위치하여 VEGF-A와 상호작용하도록 구성될 수 있다(예를 들어, 나선 2와 나선 3에 의해 정의된 g-g 면의 용매 노출 위치 c 및/또는 g에 위치함).

대상 화합물의 소수성 코어는 [나선 2]의 a 및 d 잔기를 포함할 수 있고, 이들은 [나선 3]의 상응하는 d 및 a 잔기와 접촉한다. 도 6b 및 도 10a는 예시적인 화합물 1.1.1(c21a)의 서열 정렬을 헵타드 반복 모델로 도시한 것으로서, 여기서 3-나선 다발의 나선들 사이의 코어 잔기의 소수성 접촉이 도시되어 있다. 이는 바람직한 분자 내 소수성 접촉을 제공하는 [나선 2]의 인접한 소수성 잔기 i32(이소류신, 위치 32) 및 a35(알라닌, 위치 35), 및 [나선 3]의 인접한 소수성 잔기 v41(발린, 위치 41) 및 l44(류신, 위치 44)를 포함하는 [나선 2]-[링커 2]-[나선 3] 영역의 도 11에 도시된 부분 구조와 일치한다. (예를 들어, 도 9a에 도시된 것과 같은) 모델은 정확히 평행하지는 않은 (즉, 예를 들어 본원에서 기술되고 도 27에 도시된 것과 같이 나선 간 각도가 0도를 초과하는) 나선 2와 3의 정렬을 허용한다.

도 5 및 도 27에 도시된 바와 같이, 일부 경우에, 나선 2와 3이 나선의 방향에 대해 실질적으로 역평행 구성을 가질 수 있고 이들 나선이 나선의 길이를 따라가며 서로 여러 개의 접촉을 만들기는 하지만, 나선들의 축은 0도를 초과하는 각도로, 예컨대 약 10도 이상, 약 15도 이상, 약 20도 이상, 약 25도 이상, 또는 약 30도 이상의 각도로 정렬될 수 있다. 이와 같이, 대상 화합물의 일부 사례에서, 링커 2는 링커 1보다 짧으므로, 나선 2와 3 사이의 각도는 나선의 링커 2 연결에서부터 측정된다. 일부 경우에, 나선의 링커 2 단부로부터 가장 멀리 떨어져 있는 "a" 및 "d" 잔기는 부분적으로 용매에 노출될 가능성이 더 높고/높거나 VEGF-A와 접촉을 만드는 데 이용될 수 있다.

소정의 사례에서, 대상 화합물은 나선 2와 3 사이의 각도를 증가시키는, 예를 들어 약 5도 이상, 예컨대 약 10도 이상, 또는 약 15도 이상 증가시키는 나선 종결 잔기를 포함한다. 예를 들어, 도 27b 대 도 27a를 참조한다.

일부 구현예에서, [나선 2]는 헵타드 반복 서열 [c ¹ d ¹ e ¹ f ¹ g ¹ a ² b ² c ² d ² ]를 포함하고 [나선 3]은 헵타드 반복 서열 [e ¹ f ¹ g ¹ a ² b ² c ² d ² e ² f ² g ² a ³ b ³ c ³ d ³ e ³ ]을 포함하며, 여기서 개별 헵타드 반복 잔기를 넘버링할 수 있다. [나선 2] 및 [나선 3]의 이러한 배열의 소정의 경우에, [나선 2]의 잔기 d ² , a ² , 및 d ¹ 은 [나선 3]의 잔기 a ² , d ² , 및 a ³ 과 상호작용하여 구조 안정화 상호작용의 네트워크를 형성한다. 소정의 경우에, [나선 2]의 잔기 c ² , g ¹ , 및 c ¹ 및 [나선 3]의 잔기 g ¹ 은 각각 독립적으로, VEGF-A와 접촉하도록 구성되는 방향족 잔기, 헤테로시클릭 잔기, 또는 카보시클릭 잔기이다.

대상 화합물의 VEGF-A 결합 표면은 헵타드 반복 모델의 c 및 g 위치에 위치한 방향족 아미노산 잔기의 구성에 의해 정의될 수 있고, 이들 잔기는 VEGF-A와 상호작용하도록 표면 상에 구성된다. 일부 경우에, VEGF-A 결합 표면은 헵타드 반복 서열의 c 및 g 위치에 위치한 2개 이상, 3개 이상의 방향족 아미노산 잔기, 예컨대 4개 이상, 또는 5개 이상의 방향족 아미노산 잔기를 포함한다. 도 8d 및 도 10b는 VEGF-A에 결합할 수 있는 [나선 2] 및 [나선 3]의 c 및 g 잔기의 구성을 포함하는 변이체 도메인 모티프의 구현예를 도시한다. 소정의 경우에, VEGF-A 결합 표면은 헵타드 반복의 c 및 g 위치에서, 예를 들어, 도 10b에 도시된 것과 같이 나선 3의 잔기 c 및/또는 g에서 비-극성 아미노산 잔기인 추가의 비-방향족 아미노산 잔기(들)를 포함한다. 소정의 경우에, VEGF-A 결합 표면은 헵타드 반복의 c 및 g 위치에서, 예를 들어, 나선 3의 c 및/또는 g 잔기에서 수소 결합 상호작용을 할 수 있는 극성 아미노산 잔기인 추가의 비-방향족 아미노산 잔기(들)를 포함한다. 본 개시에 기초하여, 구조의 VEGF-A 결합 표면에 위치하지 않는 GA 도메인 모티프의 아미노산 잔기 중 몇 개는 생성된 변형된 화합물의 VEGF-A 결합 활성에 해로운 영향을 미치지 않고도 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

화학식 (I)의 일부 구현예에서, [나선 2]는 다음 화학식의 서열을 포함하며:

ΛjxxΛjxΛj (서열번호 143)

화학식 (II)

식 중: 각각의 "Λ"는 독립적으로 D-방향족 아미노산이고; 각각의 j는 독립적으로 소수성 잔기이고; 각각의 x는 독립적으로 아미노산 잔기이다. 화학식 (II)에서 사용되는 관심 방향족 아미노산은 h, f, y, 및 w, 및 이들의 치환된 버전을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 화학식 (II)의 일부 사례에서, 제1 Λ는 h, f, 또는 y이다. 제2 Λ 잔기는 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴 고리를 포함하는 방향족 잔기(예를 들어, 화학식 -CH₂-Ar의 측쇄를 갖는 잔기 (식 중 Ar은 아릴 또는 치환된 아릴임))일 수 있다. 화학식 (II)의 일부 사례에서, 제2 Λ는 f 또는 y, 또는 이들의 치환된 버전이다. 제2 Λ 잔기는 VEGF-A 단백질과 상호작용하도록, 예를 들어, 도 20 및 도 21에 도시된 VEGF-A의 표면 상의 깊은 포켓 내로 돌출하도록, GA 도메인 모티프 구조의 결합 표면 상에 구성될 수 있다. 화학식 (II)의 일부 사례에서, 제2 Λ는 f 또는 이의 치환된 버전이다. 화학식 (II)의 일부 사례에서, 제3 Λ는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴 고리를 포함하는 방향족 잔기(예를 들어, VEGF-A에 수소 결합할 수 있는 측쇄기를 포함하는 방향족 잔기)이다. 화학식 (II)의 일부 사례에서, 각각의 j는 v, i, a, 및 l로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 (II)의 일부 사례에서, 제1 j 잔기는 발린이다. 화학식 (II)의 일부 구현예에서, [나선 2]는 다음 화학식의 서열을 포함한다: hv xxjxΛj.

화학식 (I) 및 (II)의 일부 구현예에서, [나선 2]는 화학식 (III)의 서열을 포함하며:

h*jxxf*jxh*j (서열번호 151)

화학식 (III)

식 중:

각각의 h*는 독립적으로 히스티딘 또는 이의 유사체이고;

f*는 페닐알라닌 또는 이의 유사체이고;

각각의 j는 독립적으로 소수성 잔기이고;

각각의 x는 독립적으로 아미노산 잔기이다.

화학식 (III)의 일부 구현예에서, [나선 2]는 다음 화학식의 서열을 포함한다: hvxxf*jxh*j. 화학식 (III)의 잔기 f*는 VEGF-A 단백질과 상호작용하도록, 예를 들어, 도 21에 도시된 VEGF-A의 표면 상의 깊은 포켓 내로 돌출하도록, GA 도메인 모티프 구조의 결합 표면 상에 구성될 수 있다. 도 20은 복합체의 X-선 구조의 확대도를 도시한 것으로서, 예시적인 화합물 1.1.1(c21a)의 나선 2 내의 잔기 f31(페닐알라닌, 위치 31)은 VEGF-A의 표면 상의 포켓 내로 돌출하는 것으로 표지되고 도시되어 있다. 도 21은 VEGF-A 결합 계면에서 포켓 내로 돌출하도록 구성된 f31의 확대도를 도시한다. 페닐알라닌 페닐 고리의 원자와 VEGF-A의 인접한 잔기 사이의 선택된 거리는 옹스트롬으로 표시되어 있다. 결정 구조의 분석은, 3-나선 다발 구조 상의 해당 위치에서 다양한 방향족 잔기가, f31이 돌출하는 동일한 깊은 포켓 내로 돌출하도록 사용되어, 일부 경우에 VEGF-A 포켓과의 바람직한 소수성 접촉을 증가시킬 수 있다. 소정의 경우에, 페닐알라닌 유사체는 페닐 고리 상에 치환기(들)를 포함한다. 화학식 (III)의 일부 사례에서, f*는 페닐알라닌이다. 화학식 (III)의 일부 사례에서, f*는 페닐알라닌의 치환된 유도체이다. 관심 페닐알라닌 유도체는 4-할로겐 치환된 페닐알라닌(예를 들어, 4-클로로 또는 4-플루오로), 3-할로겐 치환된 페닐알라닌(예를 들어, 클로로, 브로모, 또는 플루오로), 3,5-할로겐 이치환된 페닐알라닌(예를 들어, 클로로 또는 플루오로), 3,4-할로겐 이치환된 페닐알라닌(예를 들어, 클로로 또는 플루오로), 4-메틸 치환된 페닐알라닌, 4-트리플루오로메틸-페닐 알라닌, 및 4-에틸 치환된 페닐 알라닌을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 위치 31에서 페닐알라닌 유사체를 포함하는 다양한 화합물을 제조하였고, 활성인 것으로 나타났다.

도 22 및 도 25는 VEGF-A 표면과 접촉하는 예시적인 화합물 1.1.1(c21a)의 잔기 h27(205)의 확대도를 도시한다. 결정 구조의 분석은, 3-나선 다발 구조 상의 위치 27에서 다양한 방향족 잔기 또는 히스티딘 유사체가, h27이 접촉하는 동일한 표면 포켓과 접촉하도록 사용되어, 일부 경우에 VEGF-A 표면과의 바람직한 접촉을 증가시킬 수 있다. 화학식 (III)의 일부 사례에서, 제1 h*는 히스티딘, 예를 들어, 위치 27에서의 잔기이다. 화학식 (III)의 일부 사례에서, 제1 및/또는 제2 h*는 히스티딘 유사체(예를 들어, -알킬-시클로펜틸 또는 알킬-시클로헥실과 같은 알킬-시클로알킬기 또는 이의 치환된 버전을 포함하는 측쇄를 갖는 잔기)이다. 화학식 (III)의 일부 사례에서, 제1 h*는 VEGF와 주로 소수성으로 접촉할 수 있는 방향족 잔기이다. 화학식 (III)의 일부 사례에서, 제1 h*는 f 또는 y이다.

도 22는 VEGF-A 표면과 접촉하는 예시적인 화합물 1.1.1(c21a)의 잔기 h34(207)의 확대도를 도시한다. 복합체 구조의 분석은 다양한 히스티딘 유사체, 예를 들어, VEGF-A의 표면에서 이용 가능한 공간을 점유할 수 있고/있거나 VEGF-A의 인접 잔기에 대해 더 강한 수소 결합(예를 들어, 4.6 옹스트롬 미만의 길이)을 만들 수 있는 치환되거나 미치환된 아릴 또는 헤테로시클릭 고리를 포함하는 유사체가 위치 34에서 용인된다는 것을 나타낸다. 화학식 (III)의 일부 사례에서, 제2 h*는 히스티딘, 예를 들어, 위치 34에서의 잔기이다. 화학식 (III)의 일부 경우에, 제2 h*는 VEGF와 수소 결합할 수 있는 방향족 잔기이다. 화학식 (III)의 일부 구현예에서, 제2 h*는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴 고리를 포함하는 방향족 잔기(예를 들어, VEGF-A에 수소 결합할 수 있는 측쇄기를 포함하는 방향족 잔기)이다.

화학식 (II) 및 화학식 (III)의 소정의 구현예에서, h*²⁷, f*³¹, 및 h*³⁴는 각각 변이체 잔기이다. 화학식 (II) 및 화학식 (III)의 소정의 구현예에서, j²⁸및 x²⁹는 각각 변이체 잔기이다. 화학식 (II) 및 화학식 (III)의 소정의 구현예에서, j²⁸, x²⁹, 및 x³⁰은 각각 변이체 잔기이다. 화학식 (II) 및 (III)의 일부 사례에서, 각각의 j는 a, i, l, 및 v로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 (II) 및 (III)의 일부 사례에서, 제1 j 잔기는 발린이다. 일부 경우에, 화학식 (II) 및 (III)의 헵타드 반복 레지스터는 b'a'gfedcba이다.

화학식 (III)의 일부 구현예에서, [나선 2]는 3-나선 다발의 위치 26 내지 36까지의 다음의 나선 모티프에 의해 기술되며:

z²⁶h*jxxf*jxh*jz³⁶(서열번호 144)

화학식 (IV)

식 중: 각각의 h*, f*, 각각의 j 및 각각의 x는 위에서 정의된 바와 같고; z²⁶ 및 z³⁶은 각각 독립적으로 나선-종결 잔기이다. 일부 경우에, 나선-종결 잔기는 구조의 나선형 잔기로 간주되지 않지만, [나선 2] 영역의 종결 및 회전 또는 루프 구조의 시작을 단순히 정의하는 것으로 이해된다. f* 잔기 및 각각의 h* 잔기는, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이, 표적 VEGF-A 단백질과 특이적 접촉을 만들도록 GA 도메인 모티프 구조의 결합 표면 상에 구성될 수 있다. 화학식 (IV)의 일부 구현예에서, [나선 2]는 다음의 화학식의 서열을 포함한다: z²⁶hvxxf*jxh*jp³⁶ (서열번호 145).

용어 "나선-종결 잔기"는 유사한 알라닌 잔기에 비해 나선 구조를 형성하기 위한 높은 유리 에너지 패널티를 갖는 아미노산 잔기를 지칭한다. 일부 경우에, 높은 유리 에너지 나선 페널티는 나선성 값으로서 지칭되고, 값이 높을수록 페널티가 증가함을 나타내는 Pace와 Scholtz의 방법("A Helix Propensity Scale Based on Experimental Studies of Peptides and Proteins", Biophysical Journal Volume 75 July 1998 422-427)에 의해 정의했을 때 0.5 kcal/mol 이상이다. 일부 경우에, 나선-종결 잔기는 자연적으로 발생하는 잔기로서, 0.5 (kcal/mol) 이상, 예컨대 0.55 이상, 0.60 이상, 0.65 이상, 또는 0.70 이상의 나선성 값을 갖는다. 예를 들어, 프롤린은 표 1에 나타낸 바와 같이, 3.16 kcal/mol의 나선성 값을 가지며, 글리신은 1.00 kcal/mol의 나선성 값을 갖는다. 비-자연 발생 나선-종결 잔기의 나선성 값은 구조적 유사체인 측쇄기를 갖는 가장 근사한 자연 발생 잔기의 값을 사용하여 추정할 수 있다. 화학식 (IV)의 일부 사례에서, 나선-종결 잔기 z²⁶ 및 z³⁶은 d, n, G, 및 p로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 (IV)의 일부 사례에서, 나선-종결 잔기는 d, G, 및 p로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 (IV)의 일부 사례에서, 나선-종결 잔기는 G 및 p로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 (IV)의 일부 사례에서, 나선-종결 잔기 z²⁶ 및 z³⁶은 각각 p이다. 화학식 (IV)의 일부 사례에서, z³⁶은 p이다.

자연 발생 아미노산 알파-나선성
3 글자	1 글자	나선 경향 값(kcal/mol)*
Ala	A	0
Arg	R	0.21
Asn	N	0.65
Asp	D	0.69
Cys	C	0.68
Glu	E	0.40
Gln	Q	0.39
Gly	G	1.00
His	H	0.61
Ile	I	0.41
Leu	L	0.21
Lys	K	0.26
Met	M	0.24
Phe	F	0.54
Pro	P	3.16
Ser	S	0.50
Thr	T	0.66
Trp	W	0.49
Tyr	Y	0.53
Val	V	0.61

*임의로 0으로 설정된 알라닌에 대한 유리 에너지의 추정된 차이로서, 알파-나선 구성에서 잔기 당 kcal/mol로 추정됨. 수가 높을수록 (양의 유리 에너지가 더 많을수록) 덜 선호된다. 일부 경우에, 이웃하는 잔기의 동일성에 따라, 이들 평균 수 대비 편차가 생길 수 있다.

화학식 (IV)의 소정의 구현예에서, z²⁶은 프레임워크 잔기, 예를 들어, 스캐폴드 도메인 모티프의 잔기에 상응하는 잔기이다. 화학식 (IV)의 소정의 경우에, z²⁶은 변이체 잔기, 예를 들어, 서열번호 1~21 중 하나 이상과 같은 스캐폴드 도메인 모티프의 상응하는 잔기와 상이한 잔기이다. 화학식 (IV)의 소정의 사례에서, z³⁶은 변이체 잔기이다. 화학식 (IV)의 소정의 구현예에서, h*²⁷, f^*31 및 h^*34는 각각 변이체 잔기이다. 화학식 (IV)의 일부 구현예에서, j²⁸ 및 x²⁹는 각각 변이체 잔기이다. 화학식 (IV)의 일부 사례에서, j²⁸, x²⁹, 및 x³⁰은 각각 변이체 잔기이다. 화학식 (IV)의 소정의 구현예에서, h*²⁷은 h, y, 및 f로부터 선택된다. 화학식 (IV)의 소정의 구현예에서, h^*34은 h, y, 및 f로부터 선택된다.

화합물의 일부 구현예에서, [나선 2]는 다음의 화학식의 서열에 의해 정의되며:

p²⁶hjjxfjxhjp³⁷(서열번호 93)

화학식 (V)

식 중: 각각의 j는 독립적으로 소수성 잔기이고; 각각의 x는 아미노산 잔기이다. 소정의 사례에서, 각각의 j는 a, i, f, l, 및 v로부터 독립적으로 선택된 잔기이다. 소정의 사례에서, 각각의 j는 a, i, l, 및 v로부터 독립적으로 선택된 잔기이다. 소정의 경우에, 각각의 j는 a, i, 및 v로부터 독립적으로 선택된 잔기이다. 화학식 (V)의 소정의 경우에, j²⁸은 v이다. 화학식 (V)의 소정의 사례에서, j²⁹는 a, l, 또는 v이다. 화학식 (V)의 일부 구현예에서, j²⁹는 i이다. 화학식 (V)의 일부 사례에서, j³²는 i이다. 화학식 (V)의 소정의 경우에, j³⁶은 a이다. 화학식 (V)의 소정의 사례에서, x³⁰은 극성 잔기이다. 화학식 (V)의 일부 경우에, x³³은 극성 잔기이다. 화학식 (V)의 소정의 구현예에서, x³⁰ 및 x³³은 d, e, k, n, r, s, t, 및 q로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 (V)의 소정의 사례에서, x³⁰ 및 x³³은 s 및 n으로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 (V)의 소정의 사례에서, x³⁰은 s이다. 화학식 (V)의 소정의 사례에서, x³³은 n이다. 화학식 (V)의 일부 구현예에서, [나선 2]는 화학식 p²⁶hvjxfjxhjp³⁷(서열번호 137)의 서열을 포함한다.

화합물의 일부 구현예에서, [나선 2]는 다음 화학식 (VI)의 서열에 의해 정의되며:

z²⁶hvj²⁹x³⁰fix³³haz³⁷(서열번호 94)

화학식 (VI)

식 중:

z²⁶은 d, p, 및 G로부터 선택되고;

j²⁹는 f 및 i로부터 선택되고;

x³⁰은 n 및 s로부터 선택되고;

x³³은 n 및 s로부터 선택되며;

z³⁷은 p 및 G로부터 선택된다.

화학식 (V)의 일부 사례에서, z²⁶은 p이다. 화학식 (V)의 일부 사례에서, j²⁹는 i이다. 화학식 (VI)의 소정의 사례에서, x³⁰은 s이다. 화학식 (VI)의 일부 구현예에서, x³³은 n이다. 화학식 (VI)의 일부 사례에서, z³⁷은 p이다.

화합물의 일부 사례에서, [나선 2]는 다음으로부터 선택된 서열에 의해 정의되며:

a) phvj²⁹x³⁰fix³³hap 화학식 (VII) (서열번호 95) (식 중: j²⁹는 f 및 i로부터 선택되고; x³⁰ 및 x³³은 독립적으로 극성 아미노산 잔기임); 및

b) a)에서 정의된 화학식 (VII)의 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 a)에 정의된 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.

a)에서 정의된 화학식 (VII)의 서열의 일부 사례에서, x³⁰ 및 x³³은 n, s, d, e, 및 k로부터 독립적으로 선택된다. a)에서 정의된 화학식 (VII)의 서열의 일부 사례에서, j²⁹는 i이다. a)에서 정의된 화학식 (VII)의 서열의 일부 사례에서, x³⁰은 s 또는 n이다. a)에서 정의된 화학식 (VII)의 서열의 일부 사례에서, x³³은 n이다. a)에서 정의된 화학식 (VII)의 서열의 일부 사례에서, x²⁹는 i이고; x³⁰은 s 또는 n이고; x³³은 n이다.

화합물의 일부 구현예에서, [나선 2]는 서열번호 74의 서열과 66% 이상의 동일성, 예컨대 서열번호 74의 서열과 77% 이상의 동일성 또는 88% 이상의 동일성을 갖는다.

화학식 (I)의 일부 구현예에서, [나선 3]은 다음 화학식의 서열을 포함하며:

Λjxujxxuj (서열번호 146)

화학식 (VIII)

식 중: 각각의 "Λ"는 독립적으로 D-방향족 아미노산이고; 각각의 j는 독립적으로 소수성 잔기이고; 각각의 u는 독립적으로 비-극성 아미노산 잔기이고; 각각의 x는 독립적으로 아미노산 잔기이다. 일부 사례에서, 화학식 (VIII)의 헵타드 반복 레지스터는 edcbag'f'e'd'이다. 화학식 (VIII)의 일부 사례에서, Λ는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴 고리를 포함하는 방향족 잔기(예를 들어, VEGF-A에 수소 결합할 수 있는 측쇄기를 포함하는 방향족 잔기)이다. 소정의 사례에서, Λ는 히스티딘 또는 이의 치환된 버전이다. 도 23은 예시적인 화합물의 h40(210)의 질소 원자 및 인접한 VEGF-A의 Tyr48 간의 중간 강도의 수소 결합(2.9 옹스트롬)을 보여준다. 복합체 구조의 분석은, 이용 가능한 공간을 점유하고 VEGF-A에 대한 수소 결합을 유지하거나 강화할 수 있는 유사체를 포함하여, 다양한 히스티딘 유사체가 위치 40에서 내성이 있음을 나타낸다. 화학식 (VIII)의 일부 사례에서, 각각의 u는 독립적으로 H, 저급 알킬, 및 치환된 저급 알킬로부터 선택된 측쇄를 갖는 비극성 잔기이다. 화학식 (VIII)의 일부 사례에서, 각각의 u는 G 및 a로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 (VIII)의 일부 사례에서, 제1 u는 G이다. 화학식 (VIII)의 일부 사례에서, 제2 u는 a이다. 소정의 사례에서, 각각의 j는 a, i, f, l, 및 v로부터 독립적으로 선택된 잔기이다. 소정의 사례에서, 각각의 j는 a, i, l, 및 v로부터 독립적으로 선택된 잔기이다. 화학식 (VIII)의 소정의 구현예에서, j²⁸은 v이다. 화학식 (VIII)의 소정의 구현예에서, j²⁹는 a, l, 또는 v이다.

화학식 (I) 또는 (VIII)의 일부 구현예에서, [나선 3]은 화학식 (IX)의 서열을 포함하며:

x³⁸xh*jxujxxujx⁴⁹(서열번호 96)

화학식 (IX)

식 중 j, x, u는 위에서 정의된 바와 같고, h*는 히스티딘 또는 이의 유사체이다. 일부 경우에, 화학식 (IX)의 헵타드 반복 레지스터는 gfedcbag'f'e'd'c'이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, h*는 히스티딘이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, h*는 히스티딘 유사체(예를 들어, -알킬-시클로펜틸 또는 알킬-시클로헥실과 같은 알킬-시클로알킬기 또는 이의 치환된 버전을 포함하는 측쇄를 갖는 잔기)이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, h*는 치환된 히스티딘이다. 화학식 (XI)의 일부 사례에서, u⁴³은 G이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, u⁴⁷은 a이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, x³⁸은 v이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, x³⁹는 s이다. 화학식 (IX)의 소정의 사례에서, 각각의 j는 a, i, f, l, 및 v로부터 독립적으로 선택된 잔기이다. 화학식 (IX)의 소정의 구현예에서, j⁴¹은 v이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, j⁴⁴는 l이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, j⁴⁸은 i이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, x⁵¹은 소수성 잔기이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, x⁵¹은 a이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, x⁴²는 n이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, x⁴⁵는 r이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, x⁴⁵는 k이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, x⁴⁶은 n이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, x⁴⁹는 l이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, 나선 3은 잔기의 C-말단 서열로 캡핑된다. 소정의 사례에서, 화학식 (IX)의 나선 3은 추가 잔기 x⁵⁰x⁵¹을 포함하며, 식 중 x는 아미노산 잔기이다. 일부 경우에, x⁵⁰은 k 또는 r이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, x⁵⁰은 k이고 x⁵¹은 a이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, x⁵⁰은 e이고 x⁵¹은 d이다. 화학식 (IX)의 일부 사례에서, x⁵⁰은 G이고 x⁵¹은 r이다. 소정의 사례에서, 화학식 (IX)의 나선 3은 서열번호 85~87 중 하나로부터 선택된 C-말단 영역을 포함한다. 일부 경우에, [나선 3]은 gfedcbag'f'e'd'c'b'a'의 헵타드 반복 레지스터를 포함한다. 다양한 절단(예: 1, 2, 또는 3개의 잔기의 절단) 및 연장(예: 1, 2, 3개 또는 그 이상의 잔기의 연장)은 예를 들어, 도 9b에 도시된 바와 같이, 3개의 나선 다발 구조 또는 변이체 도메인을 유의하게 파괴하지 않고도 [나선 3]의 C-말단에서 활용될 수 있는 것으로 이해된다.

화학식 (IX)의 일부 사례에서, [나선 3]은 다음으로부터 선택된 서열에 의해 정의된다:

a) x³⁸x³⁹hvx⁴²Glx⁴⁵x⁴⁶aix⁴⁹ 화학식 (X) (서열번호 97) (식 중: x³⁸은 v, e, k, r로부터 선택되고; x³⁹, x⁴², 및 x⁴⁶은 극성 아미노산 잔기로부터 독립적으로 선택되고; x⁴⁵ 및 x⁴⁹는 l, k, r, 및 e로부터 독립적으로 선택됨); 및

b) a)에서 정의된 화학식 (X)의 서열과 75% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 a)에서 정의된 서열과 83% 또는 그 이상의 동일성 또는 91% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.

a) x³⁸x³⁹hvx⁴²Glx⁴⁵x⁴⁶aix⁴⁹x⁵⁰a 화학식 (XI) (서열번호 98) (식 중: x³⁸은 v, e, k, r로부터 선택되고; x³⁹, x⁴², x⁴⁶, 및 x⁵⁰은 극성 아미노산 잔기로부터 독립적으로 선택되고; x⁴⁵ 및 x⁴⁹는 l, k, r, 및 e로부터 독립적으로 선택됨); 및

b) a)에서 정의된 화학식 (XI)의 서열과 78% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 a)에서 정의된 서열과 85% 또는 그 이상의 동일성 또는 92% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.

화학식 (X)~(XI)의 일부 사례에서, x³⁹, x⁴², x⁴⁶, 및 x⁵⁰은 n, s, d, e, 및 k로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 (X)~(XI)의 일부 사례에서, x³⁸은 v이다. 화학식 (X)~(XI)의 일부 사례에서, x⁴⁵는 k이다. 화학식 (X)~(XI)의 일부 사례에서, x⁴⁹는 l이다. 화학식 (X)~(XI)의 일부 사례에서, x³⁹는 s이다. 화학식 (X)~(XI)의 일부 사례에서, x⁴²는 n이다. 화학식 (X)~(XI)의 일부 사례에서, x⁴⁶은 n이다. 화학식 (XI)의 일부 사례에서, x⁵⁰은 k이다.

화합물의 일부 구현예에서, [나선 3]은 서열번호 79의 서열과 65% 이상의 동일성, 예컨대 서열번호 79의 서열과 75% 이상의 동일성, 83% 이상의 동일성, 또는 91% 이상의 동일성을 갖는다. 화합물의 일부 구현예에서, [나선 3]은 서열번호 82의 서열과 70% 이상의 동일성, 예컨대 서열번호 82의 서열과 78% 이상의 동일성, 85% 이상의 동일성, 또는 92% 이상의 동일성을 갖는다.

화학식 (I)에서, [링커 2]는 [나선 2]와 [나선 3]을 연결하고 VEGF-A의 표면과 임의로 추가 접촉할 수 있는 펩티드 링커이다. [링커 2]는 임의의 편리한 길이일 수 있다. 일부 경우에, [링커 2]는 [링커 1]보다 짧은 링커이다. [나선 2]에 인접한 [링커 2]의 N-말단 잔기는, 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 나선-종결 잔기로서 간주될 수 있다. 일부 경우에, [나선 3]에 인접한 [링커 2]의 C-말단 잔기는, 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 나선-종결 잔기로서 간주될 수 있다. 일부 경우에, [링커 2]는 4개 이하의 아미노산 잔기, 예컨대 3개 이하 또는 2개 이하의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 사례에서, [링커 2]는 천연 GA 스캐폴드 도메인의 상응하는 나선-연결 루프 영역과 동일한 수의 잔기를 갖는다. 화학식 (I)의 소정의 구현예에서, [링커 2]는 zx이고, 여기서 z는 나선 2-종결 잔기이고 x는 아미노산 잔기이다. [링커 2]의 일부 사례에서, z는 p 또는 G이다. [링커 2]의 일부 사례에서, z는 p이다. [링커 2]의 일부 사례에서, x는 VEGF-A 접촉 잔기이다. [링커 2]의 일부 사례에서, x는 방향족 잔기이다. [링커 2]의 일부 사례에서, x는 w 또는 h 잔기, 또는 이의 치환된 버전이다. [링커 2]의 일부 사례에서, x는 티로신 또는 이의 유사체이다. 소정의 사례에서, [링커 2]는, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 나선 2 대 나선 3의 변형된 나선 간 각도(즉, 나선들의 축 간 각도)를 제공하는 나선 종결 프롤린 잔기를 포함한다. 도 27 참조.

티로신 유사체, 예를 들어, VEGF-A의 인접한 잔기와 더 밀접한 접촉을 (예를 들어, 소수성 접촉 및/또는 수소 결합을) 만들 수 있는 치환되거나 치환되지 않은 알킬-아릴 또는 알킬-헤테로아릴 연장된 측쇄기를 포함하는 유사체가 링커 2의 위치 37에 통합될 수 있다. 도 23은 화합물 (1.1.1(c21a))와 VEGF-A 사이의 결합 계면을 도시한 것으로서, VEGF-A 표면을 향해 돌출하는 잔기 y37(209)의 페놀 산소가 인접한 VEGF-A 잔기로부터 6.5 내지 7.2 옹스트롬 떨어져 있음을 보여준다. 일부 경우에, x는 다음 화학식의 측쇄를 갖는 티로신 유사체이며: -(CH₂)_n-Ar, 식 중 n은 1, 2, 3 또는 4이고; Ar은 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 또는 치환된 헤테로아릴이다. x의 소정의 사례에서, Ar은 치환된 페닐이다. x의 소정의 사례에서, Ar은 치환된 페닐이고, n은 2 또는 3이다. x의 소정의 사례에서, Ar은 인접한 VEGF-A 잔기에 수소 결합하도록 구성된 수소 결합 공여자 또는 수용체 함유 기로 치환된 페닐이다.

화학식 (I)의 일부 구현예에서, [나선 2]-[링커 2]-[나선 3]은 VEGF-A 결합 표면을 정의하는 화학식 (XII)의 서열을 포함하며:

z²⁶h*jxxf*jxh*jzy*xxh*jxujxxujx⁴⁹(서열번호 99)

화학식 (XII)

식 중:

각각의 z는 나선-종결 잔기이고;

y*는 티로신 또는 이의 유사체이고;

각각의 h*는 독립적으로 히스티딘 또는 이의 유사체이고;

f*는 페닐알라닌 또는 이의 유사체이고;

각각의 u는 독립적으로 비극성 잔기이고;

각각의 j는 독립적으로 소수성 잔기이고;

각각의 x는 독립적으로 아미노산 잔기이다.

소정의 사례에서, 화학식 (XII)의 나선 3은 추가 잔기 x⁵⁰x⁵¹을 포함하며, 여기서 x는 아미노산 잔기이다. 일부 경우에, x⁵⁰은 k 또는 r이다. 연장된 화학식 (XII)의 일부 사례에서, x⁵⁰은 k이고 x⁵¹은 a이다. 연장된 화학식 (XII)의 일부 경우에, x⁵⁰은 e이고 x⁵¹은 d이다. 화학식 (XII)의 일부 사례에서, x⁵⁰은 G이고 x⁵¹은 r이다. 소정의 사례에서, 화학식 (XII)의 나선 3은 서열번호 85~87 중 하나로부터 선택된 C-말단 영역을 포함한다. 연장된 화학식 (XII)의 일부 구현예에서, x⁵¹은 프레임워크 잔기이다. 연장된 화학식 (XII)의 일부 구현예에서, x⁵¹은 비극성 잔기(u)이다. 연장된 화학식 (XII)의 일부 구현예에서, x⁵¹은 소수성 잔기이다.

화합물의 일부 구현예에서, [나선 2]-[링커 2]-[나선 3]은 서열 번호 80의 서열에 대해 70% 이상의 동일성, 예컨대 서열번호 80의 서열에 대해 75% 이상의 동일성, 83% 이상의 동일성, 87% 이상의 동일성, 91% 이상의 동일성, 또는 95% 이상의 동일성을 갖는다. 화합물의 일부 구현예에서, [나선 2]-[링커 2]-[나선 3]은 서열 번호 83의 서열에 대해 70% 이상의 동일성, 예컨대 서열번호 83의 서열에 대해 80% 이상의 동일성, 84% 이상의 동일성, 88% 이상의 동일성, 92% 이상의 동일성, 또는 96% 이상의 동일성을 갖는다.

화학식 (I)의 소정의 사례에서, [링커 1]은 다음 화학식의 서열을 가지며:

z(x)_nx'z (서열번호 147)

화학식 (XIII)

식 중: x'는 극성 잔기이고; 각각의 x는 아미노산이고 n은 1 내지 6의 정수이고; 각각의 z는 독립적으로 나선-종결 잔기이다(예를 들어, 제1 z는 나선 1-종결 잔기이고, 제2 z는 나선 2-종결 잔기임). 소정의 사례에서, x'는 VEGF-A에 수소 결합할 수 있는 극성 잔기이다. 일부 경우에, x'은 d, e, n, q, 오르니틴, 2-아미노-3-구아니디노프로피온산, 및 시트룰린으로부터 선택된다. 소정의 경우에, n은 1, 2, 또는 3이다. 화학식 (XIII)의 소정의 사례에서, [링커 1]은 화학식 (XIV)의 서열을 가지며:

z(x)_ne*z (서열번호 148)

화학식 (XIV)

식 중: 각각의 x는 아미노산이고 n은 1, 2, 또는 3이고; 각각의 z는 독립적으로 나선-종결 잔기이고; e*는 글루탐산 또는 이의 유사체이다. 화학식 (XIII) 및 (XIV)의 일부 사례에서, 각각의 z는 G 및 p로부터 선택된다. 화학식 (XIII) 및 (XIV)의 일부 사례에서, n은 2이다.

화학식 (I)의 소정의 사례에서, [링커 1]-[나선2]-[링커 2]-[나선3]은 다음 화학식의 서열을 포함하며:

z²²xxe*zh*jxxf*jxh*jzy*xxh*jxujxxujxxx⁵¹(서열번호 100)

화학식 (XV)

식 중:

e*는 글루탐산 또는 이의 유사체이고;

각각의 z는 독립적으로 나선-종결 잔기이고;

y*는 티로신 또는 이의 유사체이고;

각각의 j는 독립적으로 소수성 잔기이고;

각각의 u는 독립적으로 비극성 아미노산 잔기이고;

각각의 x는 독립적으로 아미노산 잔기이다.

화학식 (I), (XII), 및 (XV)의 일부 사례에서, [나선 2]는 화학식 (XVI)의 서열에 의해 정의되며:

z²⁶hj²⁸xxfj³²xhj³⁵z³⁶(서열번호 101)

화학식 (XVI)

식 중:

z²⁶은 d, p, 및 G로부터 선택되고;

z³⁶은 p 및 G로부터 선택되고;

j²⁸, j³², 및 j³⁵는 각각 독립적으로 소수성 잔기이고;

각각의 x는 독립적으로 아미노산 잔기이다.

소정의 사례에서, j²⁸, j³², 및 j³⁵는 서열번호 1~21로부터 선택된 GA 스캐폴드 도메인의 상응하는 잔기이다. 일부 경우에, j²⁸, j³², 및 j³⁵는 a, i, l, 및 v로부터 독립적으로 선택된다.

화학식 (I), (XII), (XV), 및 (XVI)의 일부 사례에서, [나선 2]는 다음으로부터 선택된 서열에 의해 정의된다: a) phvx²⁹x³⁰fix³³hap 화학식 (XVII) (서열번호 102)

(식 중: x²⁹는 f 및 i로부터 선택되고; x³⁰ 및 x³³은 극성 아미노산 잔기로부터 독립적으로 선택됨); 및

b) a)에서 정의된 화학식 (XVII)의 서열과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 90% 이상의 동일성)을 갖는 아미노산 서열.

화학식 (XVI)~(XVII)의 일부 사례에서, x³⁰ 및 x³³은 n, s, d, e, 및 k로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 (XVI)~(XVII)의 일부 사례에서, x²⁹는 i이다. 화학식 (XVI)~(XVII)의 일부 사례에서, x³⁰은 s 또는 n이다. 화학식 (XVI)~(XVII)의 일부 사례에서, x³³은 n이다. 화학식 (XVI)~(XVII)의 일부 사례에서, x²⁹는 i이고; x³⁰은 s 또는 n이고; x³³은 n이다.

화학식 (I), (XII), 및 (XV)의 일부 사례에서, [나선 3]은 화학식 (XVIII)의 서열에 의해 정의되며:

xxhj⁴¹xuj⁴⁴xxuj⁴⁸xxx⁵¹(서열번호 103)

화학식 (XVIII)

식 중:

j⁴¹, j⁴⁴, 및 j⁴⁸은 각각 독립적으로 소수성 잔기이고;

각각의 u는 독립적으로 비극성 아미노산 잔기이고;

각각의 x는 독립적으로 아미노산 잔기이다.

일부 경우에, x⁵⁰은 k 또는 r이다. 화학식 (XVIII)의 일부 사례에서, x⁵⁰은 k이고 x⁵¹은 a이다. 화학식 (XVIII)의 일부 사례에서, x⁵⁰은 e이고 x⁵¹은 d이다. 화학식 (XVIII)의 일부 사례에서, x⁵⁰은 G이고 x⁵¹은 r이다. 소정의 사례에서, 화학식 (XVIII)의 나선 3은 서열번호 85~87 중 하나로부터 선택된 C-말단 영역을 포함한다. 화학식 (XVIII)의 일부 구현예에서, x⁵¹은 프레임워크 잔기이다. 화학식 (XVIII)의 일부 구현예에서, x⁵¹은 비극성 잔기(u)이다. 화학식 (XVIII)의 일부 구현예에서, x⁵¹은 소수성 잔기이다. 화학식 (XVIII)의 일부 구현예에서, j⁴¹, j⁴⁴, 및 j⁴⁸은 a, i, l, 및 v로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 (XVIII)의 일부 구현예에서, j⁴¹, j⁴⁴, 및 j⁴⁸은 서열번호 1~21로부터 선택된 GA 스캐폴드 도메인의 상응하는 잔기이다.

화학식 (I), (XII), 및 (XV)의 일부 사례에서, [나선 3]은 다음으로부터 선택된 서열에 의해 정의된다: a) x³⁸x³⁹hvx⁴²Glx⁴⁵x⁴⁶aix⁴⁹x⁵⁰a 화학식 (XIX) (서열번호 104)

식 중:

x³⁸은 v, e, k, r로부터 선택되고;

x³⁹, x⁴², x⁴⁶, 및 x⁵⁰은 극성 아미노산 잔기로부터 독립적으로 선택되고;

x⁴⁵ 및 x⁴⁹는 l, k, r, 및 e로부터 독립적으로 선택됨); 및

b) a)에서 정의된 화학식 (XIX)의 서열과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 90% 이상의 동일성)을 갖는 아미노산 서열.

화학식 (XIX)의 일부 사례에서, x³⁹, x⁴², x⁴⁶, 및 x⁵⁰은 n, s, d, e, 및 k로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 (XIX)의 일부 사례에서, x³⁸은 v이다. 화학식 (XIX)의 일부 사례에서, x⁴⁵는 k이다. 화학식 (XIX)의 일부 사례에서, x⁴⁹는 l이다. 화학식 (XIX)의 일부 사례에서, x³⁹는 s이다. 화학식 (XIX)의 일부 사례에서, x⁴²는 n이다. 화학식 (XIX)의 일부 사례에서, x⁴⁶은 n이다. 화학식 (XIX)의 일부 사례에서, x⁵⁰은 k이다.

소정의 경우에, [나선 1]은 다음의 컨센서스 서열을 포함하며: l⁷..a¹⁰ke.ai.elk..²¹, 여기서 위치 8, 9, 13, 16, 20, 및 21에 있는 잔기는 표 3의 GA 도메인 서열의 상응하는 잔기 중 어느 하나에 의해 정의된다. 소정의 경우에, [나선 1]은 다음 서열에 대해 66% 이상의 동일성, 예컨대 73% 이상, 80% 이상, 86% 이상, 또는 93% 이상의 동일성을 갖는 15개 잔기의 서열을 포함한다: l⁶lknakedaiaelkk²⁰.

화합물의 일부 구현예에서, [링커 1]-[나선 2]-[링커 2]-[나선 3]은 서열 번호 81의 서열에 대해 70% 이상의 동일성, 예컨대 서열번호 81의 서열에 대해 78% 이상의 동일성, 82% 이상의 동일성, 85% 이상의 동일성, 89% 이상의 동일성, 92% 이상의 동일성, 또는 96% 이상의 동일성을 갖는다. 화합물의 일부 구현예에서, [링커 1]-[나선 2]-[링커 2]-[나선 3]은 서열 번호 84의 서열에 대해 70% 이상의 동일성, 예컨대 서열번호 84의 서열에 대해 80% 이상의 동일성, 83% 이상의 동일성, 86% 이상의 동일성, 90% 이상의 동일성, 93% 이상의 동일성, 또는 96% 이상의 동일성을 갖는다. 84.

관심 GA 도메인의 임의의 편리한 N-말단 알파-나선 분절은 대상 화합물에 사용하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, [나선 1]은 대략 위치 6에서 최대 대략 위치 20까지 N-말단 잔기의 서열을 포함한다. 도 18b는 예시적인 화합물의 N-말단 절단된 유도체를 도시하며, 여기서 1~5개의 잔기는 3-나선 다발을 안정화시키는 화합물의 분자내 소수성 접촉에 상당히 악영향을 미치지 않고도 화합물로부터 제거될 수 있다. 소정의 사례에서, 대상 화합물은 본원에 기술된 1~53으로 예시된 넘버링 시스템에 비해 6개 이하의 잔기, 예컨대 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개의 잔기만큼 N-말단에서 절단된다. 소정의 사례에서, 대상 화합물의 위치 1~5에서의 잔기 중 하나 이상은, 예를 들어, 생성된 화합물에게 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 나선 캡핑, 증가된 수용성, 또는 관심 분자에 대한 연결과 같은 바람직한 특성을 부여하도록 결실되거나 변형된다.

소정의 경우에, [나선 1]은 다음의 컨센서스 서열을 포함하며: l⁷..a¹⁰ke.ai.elk..²¹(서열번호 105), 여기서 위치 8, 9, 13, 16, 20, 및 21에 있는 잔기는 서열번호 2~21의 서열의 상응하는 잔기 중 어느 하나에 의해 정의된다. 소정의 경우에, [나선 1]은 다음 서열에 대해 66% 이상의 동일성, 예컨대 73% 이상, 80% 이상, 86% 이상, 또는 93% 이상의 동일성을 갖는 15개 잔기의 서열을 포함한다: l⁶lknakedaiaelkk²⁰ (서열번호 74)

펩티드 프레임워크 잔기의 기저 서열에 포함된 변이체 아미노산 잔기의 구성에 의해 정의된 VEGF 특이성 결정 모티프(SDM)를 갖는 D-펩티드 GA 도메인이 본원에 기술된다. 본 개시에 기초하여, SDM 및 펩티드 프레임워크 잔기/서열 중 어느 하나의 변이도 본 개시에 포함되는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, GA 도메인은 본원에 정의된 SDM 잔기 및/또는 펩티드 프레임워크 잔기의 구현예 중 어느 하나와 50% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 예컨대 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 VEGF SDM을 포함한다. 일부 구현예에서, GA 도메인은 본원에 정의된 SDM 잔기 및/또는 펩티드 프레임워크 잔기의 구현예 중 어느 하나에 비해 1개 내지 5개, 예를 들어, 1개 내지 4개, 또는 1개 내지 3개의 아미노산 잔기 치환(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 치환)을 갖는 VEGF SDM을 포함한다. 소정의 구현예에서, 1 내지 3개의 아미노산 잔기 치환은 표 6에 따른 유사한, 보존적인, 또는 고도로 보존적인 아미노산 잔기 치환으로부터 선택된다.

VEGF에 특이적으로 결합하는 D-펩티드 화합물의 일부 구현예에서, D-펩티드 GA 도메인은 다음 아미노산 잔기에 의해 정의된 VEGF 특이성 결정 모티프(SDM)를 포함하며:

e²⁵phvisf--h³⁴-p³⁶x³⁷-s³⁹h--G⁴³---a⁴⁷(서열번호 149)

여기서 x³⁷은 s, n, 및 y로부터 선택된다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x³⁷은 s이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x³⁷은 n이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x³⁷은 y이다.

일부 구현예에서, VEGF SDM은 다음 잔기에 의해 추가로 정의되며:

c⁷-----------------e²⁵phvisf--h³⁴-p³⁶x³⁷c³⁸sh--G⁴³---a⁴⁷(서열번호 150)

여기서 x³⁷은 s 및 n으로부터 선택된다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x³⁷은 s이다. VEGF SDM의 일부 구현예에서, x³⁷은 n이다.

GA 도메인의 일부 구현예에서, 나선 1^(#6-21)은 다음 펩티드 프레임워크 서열을 포함하며: x⁶x⁷knakedailkka²¹ (서열번호 138)

여기서: x⁶은 l, v, 및 i로부터 선택되고; x⁷은 l 및 c로부터 선택된다.

나선 1의 일부 구현예에서, x⁶은 l이다. 나선 1의 일부 구현예에서, x⁶은 v이다. 나선 1의 일부 구현예에서, x⁶은 i이다.

일부 구현예에서, GA 도메인은 N-말단 펩티드 프레임워크 서열을 포함하며:

x¹x²x³qwx⁶x⁷knakedaiaelkkaGit²⁴ (서열번호 139)

식 중:

x¹은 t, y, f, i, p, 및 r로부터 선택되고;

x²는 i, h, n, p, 및 s로부터 선택되고;

x³은 d, i, 및 v로부터 선택되고;

x⁶은 l, v, 및 i로부터 선택되고;

x⁷은 l 및 c로부터 선택된다.

펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x¹은 t이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x¹은 y이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x¹은 f이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x¹은 i이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x¹은 p이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x¹은 r이다.

펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x²는 i이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x²는 h이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x²는 n이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x²는 p이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x²는 s이다.

펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x³은 d이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x³은 i이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x³은 v이다.

펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x⁶은 l이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x⁶은 v이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x⁶은 i이다.

펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x⁷은 l이다. 펩티드 프레임워크 서열의 일부 구현예에서, x⁷은 c이다.

일부 구현예에서, D-펩티드 GA 도메인은 C-말단 펩티드 프레임워크 서열: ilkaha (서열번호 140)를 포함한다.

일부 구현예에서, D-펩티드 GA 도메인은 다음 서열을 포함하며:

x¹x²x³qwx⁶x⁷knakedaiaelkkagitephvisfinhapx³⁷x³⁸shvnGlknailkaha⁵³ (서열번호 141)

식 중:

x¹은 t, y, f, i, p, 및 r로부터 선택되고;

x²는 i, h, n, p, 및 s로부터 선택되고;

x³은 d, i, 및 v로부터 선택되고;

x⁶은 l, v, 및 i로부터 선택되고;

x⁷은 l 및 c로부터 선택되고;

x³⁷은 t, y, n, 및 s로부터 선택되고;

x³⁸은 v 및 c로부터 선택되고;

x³⁹는 e 및 c로부터 선택되고;

x⁴⁰은 h 및 e로부터 선택되고;

x⁴³은 g 및 a로부터 선택되고;

x⁴⁷은 a 및 e로부터 선택되는, D-펩티드 화합물.

일부 구현예에서, x¹은 t이다. 일부 구현예에서, x¹은 y이다. 일부 구현예에서, x¹은 f이다. 일부 구현예에서, x¹은 i이다. 일부 구현예에서, x¹은 p이다. 일부 구현예에서, x¹은 r이다. 일부 구현예에서, x²는 i이다. 일부 구현예에서, x²는 h이다. 일부 구현예에서, x²는 n이다. 일부 구현예에서, x²는 p이다. 일부 구현예에서, x²는 s이다. 일부 구현예에서, x³은 d이다. 일부 구현예에서, x³은 i이다. 일부 구현예에서, x³은 v이다. 일부 구현예에서, x⁶은 l이다. 일부 구현예에서, x⁶은 v이다. 일부 구현예에서, x⁶은 i이다. 일부 구현예에서, x⁷은 l이다. 일부 구현예에서, x⁷은 c이다. 일부 구현예에서, x³⁷은 t이다. 일부 구현예에서, x³⁷은 y이다. 일부 구현예에서, x³⁷은 n이다. 일부 구현예에서, x³⁷은 s이다. 일부 구현예에서, x³⁸은 v이다. 일부 구현예에서, x³⁸은 c이다. 일부 구현예에서, x³⁹는 e이다. 일부 구현예에서, x³⁹는 s이다. 일부 구현예에서, x⁴⁰은 h이다. 일부 구현예에서, x⁴⁰은 e이다. 일부 구현예에서, x⁴³은 g이다. 일부 구현예에서, x⁴³은 a이다. 일부 구현예에서, x⁴⁷은 a이다. 일부 구현예에서, x⁴⁷은 e이다.

일부 구현예에서, D-펩티드 화합물은 화합물 11055, 979102 및 979107~979110(서열번호 108~113) 중 하나로부터 선택된 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, D-펩티드 화합물은 화합물 11055, 979102 및 979107~979110(서열번호 108~113) 중 하나와 80% 이상(예: 90% 이상)의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, D-펩티드 화합물은 화합물 11055, 979102 및 979107~979110(서열번호 108~113) 중 하나에 대해 1개 내지 10개의 아미노산 잔기 치환(예: 1개 내지 9개, 1개 내지 8개, 1개 내지 7개, 1개 내지 6개, 1개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 예컨대 1개 또는 2개의 아미노산 잔기 치환)을 갖는 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기 치환은 예를 들어 표 6에 따른 유사한, 보존적인, 또는 고도로 보존적인 아미노산 잔기 치환으로부터 선택된다.

GA 스캐폴드 도메인

본 개시에 기초하여, 구조의 VEGF-A 결합 표면에 위치하지 않는 GA 도메인 모티프의 아미노산 잔기 중 몇 개는 생성된 변형된 화합물의 VEGF-A 결합 활성에 해로운 영향을 미치지 않고도 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이와 같이, 임의의 편리한 아미노산이 대상 화합물에 통합되어, 증가된 수용성, 화학적 합성의 용이성, 비용, 생체접합 부위, 안정성, pI, 응집, 제2 표적 단백질에 대한 비특이적 결합 및/또는 특이적 결합의 감소를 포함하지만 이에 한정되지 않는 바람직한 특성을 부여할 수 있다. 돌연변이의 위치는, 예를 들어, VEGF-A 결합 표면으로부터 구조의 반대측 상의 위치를 선택함으로써, VEGF-A 결합 GA 도메인 모티프의 구조 또는 표적 VEGF-A 단백질에 대한 특이적 결합에 대한 임의의 파괴를 최소화하도록 선택될 수 있다. 일부 사례에서, 화합물은 표적 VEGF-A 단백질에 대한 결합 표면의 일부가 아닌 위치에서 2개 이상, 예컨대 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 표면 돌연변이를 포함한다.

예를 들어, 일부 경우에, 나선 1의 c, f, 및 b 잔기 및 나선 2와 3의 c 및 f 잔기 중 하나 이상이 변형될 수 있는데, 이는 이들 잔기가 VEGF-A 결합 및 용매 노출에 직접적으로 관여하지 않기 때문이다(도 3b의 헵타드 모델 참조). 소정의 경우에, 변이체 아미노산 잔기는, 예를 들어, 알려진 자연 발생 단백질 내의 유사한 위치에서 알려진 아미노산의 발생 백분율에 따라 특정 헵타드 반복 위치에서 대상 화합물에 통합되도록 선택될 수 있다. 표 2는 변이체 아미노산 잔기, 예를 들어 발생 백분율이 2% 이상(예: 5% 이상, 10% 이상, 또는 그 이상)인 아미노산 잔기를 선택하는 데 사용될 수 있는 3-가닥 코일드-코일 헵타드 위치에 대한 아미노산 발생 백분율의 목록을 제공한다. 일부 경우에, 표면 돌연변이는, 예를 들어 화합물에 바람직한 가용성을 부여하는 극성 잔기로 잔기를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 표면 돌연변이는, 예를 들어 화합물에 바람직한 가용성을 부여하는 하전된 잔기로 잔기를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 표면 돌연변이는 잔기를 염기성 잔기(예를 들어, k 또는 h)로 돌연변이시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 표면 돌연변이는, 예를 들어 화합물에 바람직한 pI를 부여하는 산성 잔기(예: d 또는 e)로 잔기를 돌연변이시키는 것을 포함한다.

* M은 헵타드 위치에서 특정 아미노산이 발견되는 총 횟수이다. N은 해당 헵타드 위치에서 계수된 잔기의 총 수이다. DeGrado 등의 문헌의 표 3 참조.

일부 경우에, GA 스캐폴드 도메인과 통합된 여러 가지 변이체 아미노산을 포함하도록, 대상 펩티드 화합물을 GA 스캐폴드 도메인에 기반하여 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택하여 (예를 들어, 추가의 친화도 성숙 및/또는 점 돌연변이를 통해) 추가로 개발하였다. 변이체 모티프는 변이체 아미노산을 포함하며, 대상 화합물의 VEGF-A 결합 표면을 정의할 수 있다. 서열번호 25는 예시적인 화합물 1.1.1(c21a)의 변이체 모티프를 나타낸다. 대상 화합물의 VEGF-A 결합 표면의 양태는 위에 기술되어 있다. 다양한 기저 GA 스캐폴드 도메인 서열이 대상 화합물에 사용되어 변이체 도메인이 통합된 3-나선 다발 스캐폴드 구조를 제공할 수 있는 것으로 이해된다. 대상 화합물의 구조는 변이체 및 프레임워크 도메인의 조합에 의해 정의될 수 있다. 대상 화합물의 서열은 변이체 및 프레임워크 잔기의 조합에 의해 정의될 수 있다. 이와 같이, 일부 사례에서, 구조 또는 서열 모티프의 프레임워크 잔기는 스캐폴드 도메인 구조 또는 서열의 상응하는 잔기에 의해 정의될 수 있다.

예를 들어, 스캐폴드 SCF32(서열번호 2)와 화합물 1.1.1(c21a)(서열번호 24)의 비교는 변이체 모티프(서열번호 25) 및 프레임워크 도메인(서열번호 26)을 제공한다. 변이체 모티프의 양태는 본원에 기술되어 있다. 3-나선 다발 구조 또는 VEGF-A 결합 표면에 상당한 악영향을 미치지 않고도 다양한 변형이 프레임워크 도메인에 통합될 수 있는 것으로 이해된다. 도 3 및 도 4는 대상 화합물의 헵타드 반복 구조 모델 상에 정렬된 예시적인 서열 및 모티프를 보여준다. 용매 노출되고 소수성 코어 상호작용에 관여하지 않는 나선 1의 잔기는 극성 잔기를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 편리한 아미노산 잔기일 수 있다. 일부 경우에, 대상 화합물의 나선 1의 b, c, 및/또는 f 잔기(예를 들어, 도 6b 참조)는 화합물의 VEGF-A 결합 활성에 악영향을 미치지 않으면서 변경될 수 있고, 소정의 경우에는 바람직한 특성을 제공한다. 일부 경우에, 나선 1의 e 및 g 잔기도 변경될 수 있다. 소정의 구현예에서, 나선 2 및/또는 나선 3의 f 잔기는 화합물의 VEGF-A 결합 활성에 악영향을 미치지 않고 가변될 수 있고, 소정의 경우에는 바람직한 특성을 제공할 수 있다. 소정의 사례에서, 절단 또는 연장과 같은 C-말단 변형이 나선 3에 (예를 들어, 나선 3의 위치 50~53에 위치한 잔기에) 포함될 수 있다(도 10a 참조). 대상 화합물은 서열번호 2~21 중 하나에 의해 정의된 것과 같은 프레임워크 도메인 모티프를 가질 수 있다. 일부 경우에, 화합물의 프레임워크 도메인 모티프는 서열번호 1에 의해 정의된다.

일부 경우에, GA 스캐폴드 도메인의 소수성 코어와 접촉을 형성하는 잔기(예를 들어, 도 7b에 도시된 것과 같은 헵타드 반복 모델의 a 및 d 잔기)에 대한 변형은 별로 바람직하지 않은데, 이는 이들 잔기가 3-나선 다발을 안정화하는 나선-나선 소수성 접촉과 관련되어 있기 때문이다. 그러나, 다양한 비-극성 또는 소수성 잔기가 대상 화합물의 3-나선 다발의 소수성 코어에 사용될 수 있다. 도 9a~9c는 예시적인 화합물의 서열 및 구조를 도시하며, 여기서, 나선 간 소수성 상호작용을 형성할 수 있는 헵타드 반복 모델의 a 및 d 잔기의 구성은 적색으로 표시되어 있다. 소정의 사례에서, 나선 영역의 말단에 위치한 나선 3 헵타드 반복의 C-말단 e 잔기는, 예를 들어, 나선 캡핑, 나선 절단, 또는 연결기에 대한 연장을 제공하도록 변형될 수 있다. 소정의 사례에서, 나선 영역의 말단에 위치한 나선 1 헵타드 반복의 N-말단 잔기(들)(예를 들어, 도 10a의 N-말단 단기) 중 1개, 2개, 또는 그 이상은, 예를 들어, 나선 캡핑, 나선 절단, 또는 연결기에 대한 연장을 제공하도록 변형될 수 있다. 소정의 구현예에서, 대상 화합물의 a 및 d 잔기는 서열번호 1~21 중 어느 하나의 상응하는 소수성 코어 잔기로부터 선택될 수 있다.

소정의 사례에서, [나선 2]의 각각의 a 및 d 잔기는 대상 화합물의 변형된 3-나선 다발 구조에 안정성을 부여할 수 있는 잔기이다. 소정의 경우에, 예를 들어, [나선 2]의 위치 28, 32, 및 35에 있는 대상 화합물의 a 및 d 잔기 중 하나 이상은 화합물의 소수성 코어를 부분적으로 정의하는 분자내 접촉을 제공한다. [나선 2]의 소정의 구현예에서, 각각의 a 및 d 잔기는 독립적으로 소수성 잔기이다. [나선 2]의 소정의 경우에, 각각의 a 및 d 잔기는 a, f, m, l, 및 v로부터 선택된다. [나선 2]의 일부 구현예에서, 각각의 a 및 d 잔기는 a, i, f, l, 및 v로부터 선택된다. [나선 2]의 소정의 사례에서, 각각의 a 및 d 잔기는 a, i, l, 및 v로부터 선택된다. [나선 2]의 일부 사례에서, 위치 32 및 35에 있는 a 및 d 잔기는 스캐폴드 도메인의 일부(예를 들어, 스캐폴드 도메인 모티프의 상응하는 잔기와 동일한 동일성을 갖는 프레임워크 잔기)이다.

소정의 사례에서, VEGF-A와 접촉하는 구조의 g-g 면에 가장 가까운 [나선 2] 및 [나선 3]의 "d" 잔기들은 단백질과 접촉할 수 있다. 이러한 경우에, VEGF-A와 접촉하는 "d" 잔기는 경계 잔기로서 지칭될 수 있다. 　

표 3은 예시적인 스캐폴드 도메인, 예시적인 화합물, 및 예시적인 관심 화합물 영역의 서열 목록을 제시한다. 화학식 (I)~(XIX)의 일부 구현예에서, 잔기는 표 3에 제시된 서열번호 22~71 중 하나의 동일한 위치에 위치한 잔기에 상응한다. 화학식 (I)의 소정의 구현예에서, 화합물은 서열번호 22~71 중 하나에 대해 85% 이상의 동일성, 예컨대 88% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 또는 98% 이상의 동일성을 갖는 잔기의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 서열 동일성 비교는 동일한 길이를 갖는, 예를 들어, 길이가 48개의 잔기, 49개의 잔기, 50개의 잔기, 51개의 잔기, 52개의 잔기, 또는 53개의 잔기인 서열 영역을 기반으로 한다. 이들 대상 화합물은 표적 VEGF-A 단백질과의 접촉에 관여하지 않는 GA 도메인 모티프의 표면 위치에서 잔기를 통합하도록 추가로 돌연변이될 수 있다. 잔기는 생성된 변형된 화합물에게 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 바람직한 특성을 부여하도록 선택될 수 있다.

관심 스캐폴드 및 화합물의 서열
스캐폴드 명칭	서열	서열 번호
GA 도메인 공통	......l⁷..a¹⁰ke.ai.elk.²⁰.Gi.sd.y..³⁰.inkaktve.⁴⁰v.alk.eil⁴⁹….	1
SCF32	t¹idqwllknakedaiaelkkaGitsdfyfnainkaktveevnalkneilkaha⁵³	2
SCF32 고정 도메인 1	tidqwllknakedaiaelkkaGit.d..fn.in.a..v..vn..kn.ilkaha	3
SCF32 고정 도메인 2	tidqwllknakedaiaelkk.Git.......in.a..v..vn..kn.ilkaha	4
SCF32 고정 도메인 3	tidqwllkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGit......³⁰.in.a..v..⁴⁰vn.lkn.ilkaha	5
ALB8-GA	t¹idqwll⁷knakedaiaelkkaGitsdfyfnainkaktveevnalkneilkaha⁵³	6
ALB1-GA	l⁷knakedaiaelkkaGitsdfyfnainkaktveGanalkneilka⁵¹	7
ALB8-uGA	l⁷kltkeeaekalkklGitsefilnqidkatsreGleslvqtikqs⁵¹	8
ALB1B-uGA	l⁷qeakdkaiqeakanGltsklllknienaktpesaksfaeeliks⁵¹	9
L3316-GA1	l⁷knakeeaikelkeaGitsdlyfslinkaktveGvealkneilka⁵¹	10
L3316-GA2	l⁷knakedaikelkeaGissdiyfdainkaktveGvealkneilka⁵¹	11
L3316-GA3	l⁷knakeaaikelkeaGitaeylfnlinkaktveGveslkneilka⁵¹	12
L3316-GA4	l⁷knakedaikelkeaGitsdiyfdainkaktieGvealkneilka⁵¹	13
G148-GA1	l⁷akakadalkefnkyGv-sdyyknlinnaktveGvkdlqaqvves⁵¹	14
G148-GA2	l⁷aeakvlanreldkyGv-sdyhknlinnaktveGvkdlqaqvves⁵¹	15
G148-GA3	l⁷aeakvlanreldkyGv-sdyyknlinnaktveGvkalideilaalp⁵³	16
DG12-GA1	l⁷dnaknaalkefdryGv-sdyyknlinkaktveGimelqaqvves⁵¹	17
DG12-GA2	l⁷seakemaireldanGv-sdfykdkiddaktveGvvalkdlilns⁵¹	18
MAG-GA1	l⁷aklaadtdldldvakiind-yttkvenaktaedvkkifee--sq⁵¹	19
MAG-GA2	l⁷akakadaieilkkyGi-GdyyiklinnGktaeGvtalkdeil--⁵¹	20
ZAG-GA	l⁷leakeaainelkqyGi-sdyyvtlinkaktveGvnalkaeilsa⁵¹	21

화합물 명칭	서열	서열 번호
1	tidqwllknakedaiaelkkaGitsdhvfnfinyapyvsdvnalkneilkaha	107
1.1	tidqwllknakedaiaelkkaGitedhvfnfinhapyvshvnGlknailkaha	22
1.1.1	tidqwllknakedaiaelkkcGitephvisfinhapyvshvnGlknailkaha	23
1.1.1(c21a)	tidqwllkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephvis³⁰finhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	24
1.1.1(c21a) 변이체 모티프	---------¹⁰----------²⁰----ephvis³⁰f--h-py-sh⁴⁰--G---a---⁵⁰---	25
1.1.1(c21a) 프레임워크 도메인	tidqwllkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGit……³⁰.in.a..v..⁴⁰vn.lkn.ilk⁵⁰aha	26
1.1.1(c21a) 프레임워크 도메인 N/C 절단됨	llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGit……³⁰.in.a..v..⁴⁰vn.lkn.ilk⁵⁰a	27
1.1.1(c21a) 변이체 모티프 + GA 도메인 공통	------l⁷--a¹⁰ke-ai-elk-²⁰-Gi-ephvis³⁰finhapyvsh⁴⁰v-Glk-ail⁴⁹----	28
1.1.1(c21a) 절단됨 (-)TIDQW	llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephvis³⁰finhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	29
1.1.1(c21a): Ile15에서 소수성 (f, i, l, m 또는 v)로	llkna¹⁰keda-aelkk²⁰aGitephvis³⁰finhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	30
1.1.1(c21a): Ile29에서 소수성 (f, i, l, m 또는 v)로	llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephv-s³⁰finhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	31
1.1.1(c21a): Ile15/29에서 소수성 (f, i, l, m 또는 v)로	llkna¹⁰keda-aelkk²⁰aGitephv-s³⁰finhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	32
1.1.1(c21a): Trp5 돌연변이 (NNK)	tidq-llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephvis³⁰finhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	33
1.1.1(c21a): Tyr37 소프트 랜덤화 (NNK)	tidqwllkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephvis³⁰finhap-vsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	34
1.1.1(c21a): Trp5 및 Tyr 돌연변이	tidq-llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephvis³⁰finhap-vsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	35
1.1.1(c21a) : 절단됨 (-) TID	qwllkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephvis³⁰finhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	36
1.1.1(c21a): AVC로 돌연변이된 Gln4에서 (t, n 또는 s)로	-wllkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephvis³⁰finhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	37
1.1.1(c21a): Trp5 돌연변이 (NNK)	--llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephvis³⁰finhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	38
1.1.1(c21a): Ile15에서 소수성 (f, i, l, m 또는 v)로	--llkna¹⁰keda-aelkk²⁰aGitephvis³⁰finhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	39
1.1.1(c21a): Ile29에서 소수성 (f, i, l, m 또는 v)로	--llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephv-s³⁰finhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	40
1.1.1(c21a): His27 돌연변이	llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitep-vis³⁰finhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	41
1.1.1(c21a): His34 돌연변이	llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephvis³⁰fin-apyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	42
1.1.1(c21a): His40 돌연변이	llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephvis³⁰finhapyvs-⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	43
1.1.1(c21a): His27, His 34, 및/또는 His 40 돌연변이	llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitep-vis³⁰fin-apyvs-⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	44
1.1.1(c21a): Phe31에서 Phe 유사체로 (*)	llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephvis³⁰f*inhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	45
1.1.1(c21a): Tyr37에서 Tyr 유사체로 (*)	llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephvis³⁰finhapy*vsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	46
1.1.1(c21a): Phe31 + Tyr37에서 유사체로 (*)	llkna¹⁰kedaiaelkk²⁰aGitephvis³⁰finhapyvsh⁴⁰vnGlknailk⁵⁰aha	47
1.1.1.2	tidqwllknakedaiaelkkaGitedhvfnfinhapyvshvnGlknailGrtvp	48
1.1.1.2 (pis)	tidqwllknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailGrtvp	49
1.1.1.2 (pis, asc)	tidqwllknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailGrtvpasc	50
1.1.1.2 (pa, pis)	pallknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailGrtvp	51
1.1.1.2 (pa, pis, asc)	pallknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailGrtvpasc	52
1.1.1.3	tidqwllknakedaiaelkkaGitedhvfnfinhapyvshvnGlknailedwyl	53
1.1.1.3 (pis)	tidqwllknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailedwyl	54
1.1.1.3 (pis, asc)	tidqwllknakedaiaelkkagitephvisfinhapyvshvnglknailedwylasc	55
1.1.1.3 (-tidqw/pa, pis)	pallknakedaiaelkkagitephvisfinhapyvshvnglknailedwyl	56
1.1 (-kaha, adfl)	tidqwllknakedaiaelkkaGitedhvfnfinhapyvshvnGlknailadfl	57
1.1 (-kaha, edyl)	tidqwllknakedaiaelkkaGitedhvfnfinhapyvshvnGlknailedyl	58
1.1 (-kaha, Grtvp)	tidqwllknakedaiaelkkaGitedhvfnfinhapyvshvnGlknailGrtvp	59
1.1 (-kaha, edwyl)	tidqwllknakedaiaelkkaGitedhvfnfinhapyvshvnGlknailedwyl	60
1.1 (-kaha, GehGsp)	tidqwllknakedaiaelkkaGitedhvfnfinhapyvshvnGlknailGehGsp	61
1.1.1(c21a) (-kaha, Grtvp)	tidqwllknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailGrtvp	62
1.1.1(c21a) (-tidqw, -kaha, Grtvp)	llknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailGrtvp	63
1.1.1(c21a) (-tidqw, pa, -kaha, Grtvp)	pallknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailGrtvp	64
1.1.1(c21a) (-tidqw, pa, -kaha, Grtvpasc)	pallknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailGrtvpasc	65
1.1.1(c21a) (-kaha, edwyl)	tidqwllknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailedwyl	66
1.1.1(c21a) (-tidqw, -kaha, edwyl)	llknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailedwyl	67
1.1.1(c21a) (-tidqw, pa, -kaha, edwyl)	pallknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailedwyl	68
1.1.1(c21a) (-kaha, edwylasc)	tidqwllknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailedwylasc	69
1.1.1(c21a) (p26d)	tidqwllknakedaiaelkkaGitedhvisfinhapyvshvnGlknailkaha	70
1.1.1(c21a) (c(Ac)54)	tidqwllknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailkahac(acetyl)	71
화학식 (I)의 화합물 영역	서열	서열 번호
N-말단	t¹idqw⁵	72
N-말단	q⁴w⁵	73
나선 1	l⁶lknakedaiaelkka²¹	74
링커 1	G²²itep²⁶	75
나선 2	h²⁷visfinha³⁵	76
캡핑된 나선 2	p²⁶hvisfinhap³⁶	77
링커 2	p³⁶y³⁷	78
나선 3	v³⁸shvnGlknail⁴⁹	79
[나선 2]-[링커 2]-[나선 3]	h²⁷visfinhapyvshvnGlknail⁴⁹	80
[링커 1]-[나선 2]-[링커 2]-[나선 3]	G²²itephvisfinhapyvshvnGlknail⁴⁹	81
나선 3	v³⁸shvnGlknailka⁵¹	82
[나선 2]-[링커 2]-[나선 3]	h²⁷visfinhapyvshvnGlknailka⁵¹	83
[링커 1]-[나선 2]-[링커 2]-[나선 3]	G²²itephvisfinhapyvshvnGlknailka⁵¹	84
C-말단	k⁵⁰aha⁵³	85
C-말단	e⁵⁰dwyl⁵⁴	86
C-말단	G⁵⁰rtvp⁵⁴	87

VEGF에 결합하는 예시적인 D-펩티드 Z 및 GA 도메인
화합물 #	서열	VEGF 결합 친화도 (K _D , nM)	서열번호
GA도메인 wt	tidqwllknakedaiaelkkaGitsdfyfnainkaktveevnalkneilkaha	결합 없음	2
11055	tidqwllknakedaiaelkkaGitephvisfinhapyvshvnGlknailkaha	43	108
979102	fniqwicknakedaiaelkkaGitephvisfinhapscshvnGlknailkaha	5.2	109
979107	ipiqwvcknakedaiaelkkaGitephvisfinhapscshvnGlknailkaha	5.2	110
979108	psvqwicknakedaiaelkkaGitephvisfinhapscshvnGlknailkaha	5.8	111
979109	rniqwvcknakedaiaelkkaGitephvisfinhapncshvnGlknailkaha	3.7	112
979110	yhiqwvcknakedaiaelkkaGitephvisfinhapncshvnGlknailkaha	2.3	113
978333	vdnkfnkewdnawleirhlpnlnheqkrafisslyddpsqsanllaeakklndaqapk	2430	114
978334	vdnkfnkewdnawreirhlpnlnheqkrafisslyddpsqsanllaeakklndaqapk	1050	115
978335	vdnkfnkewdnawreirhlpnlnleqkGafiaslyddpsqsanllaeakklndaqapk	3010	116
978336	vdnkfnkewdnawreirhlpnlnleqkrafisslyddpsqsanllaeakklndaqapk	168	117
978337	vdnkfnkewdnawteirhlpnlnreqkvafitslyddpsqsanllaeakklndaqapk	1360	118
980174	vdnkfnkewdnawkeirhlpnlnveqkrafihslyddpsqsanllaeakklndaqapk	138	120
980175	vdnkfnkewdnawreirhlpnlnieqkrafihslyddpsqsanllaeakklndaqapk	110	121
980176	vdnkfnkewdnawreirhlpnlnieqkrafirslyddpsqsanllaeakklndaqapk	86	122
980177	vdnkfnkewdnawreirhlpnlnieqkrafiyslyddpsqsanllaeakklndaqapk	118	123
980178	vdnkfnkewdnawreirhlpnlnleqkrafirslyddpsqsanllaeakklndaqapk	102	124
980179	vdnkfnkewdnawreirhlpnlnreqklafihslyddpsqsanllaeakklndaqapk	87	125
980180	vdnkfnkewdnawreirhlpnlnveqkrafikslyddpsqsanllaeakklndaqapk	120	126
980181	vdnkfnkewdnawreirhlpnlnveqkrafirslyddpsqsanllaeakklndaqapk	17.6	119
981188	vdnkfdkewdnawreirrlpnlnleqkrafisslyddpsqsanllaeakklndaqapk	61	127
981189	vdnkfnkewdnawreirrlpnlnleqkrafisslyddpsqsanllaeakklndaqapk	50	128
981190	vdnkfnkewdnawreirrlpnlnveqkrafisslyddpsqsanllaeakklndaqapk	59	129

예시적인 다가 VEGF-결합 D-펩티드 화합물
화합물 #	도메인 1	연결 성분	도메인 2
979111	11055 N-말단 시스테인	말레이미드-PEG8-말레이미드 시스테인-말레이미드 접합을 통한 N-말단 대 N-말단	978336 N-말단 시스테인
980870	k19로 980181에 연결되는 979110	{[yhiqwvcknakedaiaelk¹⁹(아지도아세틸-PEG2)kaGitephvisfinhapncshvnGlknailkaha-NH₂(c 대 c 이황화 브리지)]-도메인 간 클릭-[vdnkfnk⁷(D-Pra-PEG2)ewdnawreirhlpnlnveqkrafirslyddpsqsanllaeakklndaqapk]}₂-ak(-)NH₂	k7로 979110에 연결되는 980181. -ak(-)NH₂ 말단 잔기를 통해 이량체화됨.
980871	k19로 980181에 연결되는 979110	{[yhiqwvcknakedaiaelk¹⁹(아지도아세틸-PEG3)kaGitephvisfinhapncshvnGlknailkaha-NH₂(c 대 c 이황화 브리지)]-도메인 간-[vdnkfnk⁷(D-Pra-PEG2)ewdnawreirhlpnlnveqkrafirslyddpsqsanllaeakklndaqapk]}₂-ak(-)NH₂	k7로 979110에 연결되는 980181. -ak(-)NH₂ 말단 잔기를 통해 이량체화됨.
980868	k19로 980181에 연결되는 979110	[yhiqwvcknakedaiael-k¹⁹(아지도아세틸-PEG2)kaGitephvisfinhapncshvnGlknailkaha-NH2(c 대 c 이황화 브리지)]-도메인 간-[vdnkfn-k⁷(DPra-PEG2)-ewdnawreirhlpnlnveqkrafirslyddpsqsanllaeakklndaqapk-NH₂]	k7로 979110에 연결되는 980181
980869	k19로 980181에 연결되는 979110	[yhiqwvcknakedaiael-k¹⁹(아지도아세틸-PEG3)kaGitephvisfinhapncshvnGlknailkaha-NH2(c 대 c 이황화 브리지)]-도메인 간-[vdnkfn-k⁷(DPra-PEG2)-ewdnawreirhlpnlnveqkrafirslyddpsqsanllaeakklndaqapk-NH₂]	k7로 979110에 연결되는 980181

본 개시의 양태는 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 화합물, 이의 염(예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 염), 및/또는 이의 용매화물 또는 수화물 형태를 포함한다. 염, 용매화물, 및 수화물의 모든 순열(permutation)은 본 개시에 포함되는 것으로 의도됨을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 대상 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 제공된다. 아민 기 및/또는 질소 함유 헤테로아릴 기를 함유하는 화합물은 본질적으로 염기성일 수 있으며, 따라서 임의의 수의 무기산 및 유기산과 반응하여 약학적으로 허용 가능한 산 부가염을 형성할 수 있다. 이러한 염을 형성하기 위해 일반적으로 사용되는 산은 무기 산(예: 염산, 브롬화수소산, 황산, 및 인산)뿐만 아니라 유기 산(예: 파라-톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 옥살산, 파라-브로모페닐설폰산, 탄산산, 숙신산, 구연산, 벤조산, 및 아세트산), 및 관련 무기산 및 유기산을 포함한다. 따라서, 약학적으로 허용 가능한 이러한 염은 황산염, 피로황산염, 중황산염, 아황산염, 중아황산염, 인산염, 일수소인산염, 이수소인산염, 메타인산염, 피로인산염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 아세트산염, 프로피온산염, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포름산염, 이소부티레이트, 카프르산염, 헵타노에이트, 프로피오레이트, 옥살산염, 말로네이트, 숙신산염, 수베르산염, 세바스산염, 푸마르산염, 말레산염, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레파탈레이트, 설폰산염, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피온산염, 페닐부티레이트, 구연산염, 젖산염, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레산염, 타르타르산염, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델산염, 마뇨산염, 글루콘산염, 락토바이온산염, 및 유사한 염을 포함한다. 소정의 특정 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 산 부가염은 염산 및 브롬화수소산과 같은 무기산으로 형성된 것들, 및 푸마르산 및 말레산과 같은 유기산으로 형성된 것들을 포함한다.

화합물 특성

대상 다가 화합물의 변이체 D-펩티드 도메인은 높은 기능적 친화도(예: 평형 해리 상수(K_D)) 및 특이성(예: 300 nM 이하, 예컨대 100 nM, 30 nM 이하, 10 nM 이하, 3 nM 이하, 1 nM 이하, 300 pM 이하, 또는 그 이하)의 단백질-단백질 상호작용을 형성하기에 적합한 크기의 결합 표면적을 정의할 수 있다. 변이체 D-펩티드 도메인은 각각 600 내지 1800 Å², 예컨대 800 내지 1600 Å², 1000 내지 1400 Å², 1100 내지 1300 Å², 또는 약 1200 Å²의 표면적을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 다가 D-펩티드 화합물은, 표적 단백질에 대한 제1 및 제2 D-펩티드 도메인 단독의 각각의 결합 친화도보다 10배 이상, 예컨대 30배 이상, 100배 이상, 300배 이상, 1000배 이상, 또는 그 이상으로 강한 결합 친화도(K_D)로 표적 단백질에 특이적으로 결합한다. 표적 단백질에 대한 펩티드 화합물의 친화도는 임의의 편리한 방법에 의해, (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) SPR 결합 검정 또는 ELISA 결합 검정을 사용해 결정될 수 있다. 소정의 경우에, 다가 D-펩티드 화합물은 표적 단백질에 대해 3 nM 이하, 예컨대 1 nM 이하, 300 pM 이하, 100 pM 이하의 결합 친화도(K_D)를 가지며, 표적 단백질에 대한 제1 및 제2 D-펩티드 도메인 단독의 결합 친화도는 각각 독립적으로 100 nM 이상, 예컨대 200 nM 이상, 300 nM 이상, 400 nM 이상, 500 nM 이상, 또는 1 uM 이상이다. 전체적으로 다가 D-펩티드 화합물의 효과적인 결합 친화도는 바람직한 생물학적 효능 및/또는 생체 내 반감기와 같은 다른 특성을 제공하도록 최적화될 수 있다. 표적 결합 부위에 대한 특정 개별 친화도를 갖는 개별 D-펩티드 도메인을 필요에 따라 선택함으로써, 다가 D-펩티드 화합물의 전반적인 기능적 친화도를 최적화할 수 있다.

화합물의 효능은 임의의 편리한 검정을 사용해, 예컨대 본원의 실험 섹션에서 기술된 것과 같이 IC50을 측정하는 ELISA 검정을 통해 평가할 수 있다. 일부 사례에서, 대상 다가 화합물은 표적 단백질에 대한 시험관 내 길항 활성을 가지며, 이는 제1 및 제2 D-펩티드 도메인 단독 각각의 효능보다 적어도 10배, 예컨대 적어도 30배, 적어도 100배, 적어도 300배, 적어도 1000배 더 강력하다.

소정의 구현예에서, 대상 펩티드 화합물은, 예를 들어, SPR 결합 검정 또는 ELISA 검정에 의해 결정했을 때, 높은 친화도로 VEGF-A 표적 단백질에 특이적으로 결합한다. 대상 화합물은 1 uM 이하, 예컨대 300 nM 이하, 100 nM 이하, 30 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 1 nM 이하, 600 pM 이하, 300 pM 이하, 또는 그 이하의 VEGF-A에 대한 친화도를 나타낼 수 있다.

대상 D-펩티드 화합물은, 예를 들어, VEGF-A 단백질에 대한 화합물의 친화도를 기준 단백질(예: 알부민 단백질)에 대한 친화도와 비교해 결정했을 때, 5:1 이상, 10:1 이상, 예컨대 30:1 이상, 100: 1 이상, 300:1 이상, 1000:1 이상, 또는 심지어 그 이상인 VEGF-A에 대한 특이성을 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 특이성은 결합 친화도에 있어서 10³ 이상, 예컨대 10⁴ 이상, 10⁵ 이상,10⁶ 이상, 또는 그 이상의 인자만큼의 차이일 수 있다. 일부 경우에, 펩티드 화합물은 단백질 접힘, 프로테아제 안정성, 열안정성, 약학적 제형과의 호환성 등과 같은 임의의 바람직한 특성에 대해 최적화될 수 있다. 구조-활성 관계(SAR) 분석, 친화도 성숙 방법, 또는 파지 디스플레이 방법과 같은 임의의 편리한 방법을 사용해 D-펩티드 화합물을 선택할 수 있다.

높은 열 안정성을 갖는 D-펩티드 화합물이 또한 제공된다. 일부 경우에, 높은 열 안정성을 갖는 화합물은 50℃ 이상, 예컨대 60℃ 이상, 70℃ 이상, 80℃ 이상, 또는 심지어 90℃ 이상의 용융 온도를 갖는다. 높은 프로테아제 안정성을 갖는 D-펩티드 화합물이 또한 제공된다. 대상 D-펩티드 화합물은 프로테아제에 저항성이며, 긴 혈청 및/또는 타액 반감기를 가질 수 있다. 긴 생체 내 반감기를 갖는 D-펩티드 화합물이 또한 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "반감기"는 측정된 파라미터에 필요한 시간, 예컨대 화합물의 효능, 활성, 및 유효 농도가 원래 수준의 절반(예를 들어, 0시간 시점의 원래 효능, 활성, 또는 유효 농도의 절반)까지 떨어지는 데 필요한 시간을 지칭한다. 따라서, 폴리펩티드 분자의 효능, 활성, 또는 유효 농도와 같은 파라미터는 일반적으로 시간 경과에 따라 측정된다. 본원의 목적을 위해, 반감기는 시험관 내 또는 생체 내에서 측정될 수 있다. 일부 경우에, 펩티드 화합물은 1시간 이상, 예컨대 2시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 1일 이상, 2일 이상, 7일 이상, 또는 더 긴 반감기를 갖는다. 인간 혈액에서의 안정성은 임의의 편리한 방법에 의해, 예를 들어, 지정된 시간 동안 인간 EDTA 혈액 또는 혈청에서 화합물을 인큐베이션하고, 혼합물의 샘플을 퀀칭하고, 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 HPLC-MS, 활성 분석에 의해 화합물의 양 및/또는 활성에 대해 샘플을 분석함으로써 측정할 수 있다.

낮은 면역원성을 갖는, 예를 들어 비-면역원성인 D-펩티드 화합물이 또한 제공된다. 소정의 구현예에서, D-펩티드 화합물은 L-펩티드 화합물과 비교하여 낮은 면역원성을 갖는다. 소정의 구현예에서, D-펩티드 화합물의 면역원성은 Dintzis 등의 문헌["A Comparison of the Immunogenicity of a Pair of Enantiomeric Proteins" Proteins: Structure, Function, and Genetics 16:306-308 (1993)]에 기술된 것과 같은 면역원성 검정에서 L-펩티드 화합물 대비 10% 이하, 20% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 70% 이하, 또는 90% 이하이다.

또한, VEGF-A에 대한 결합 친화도 및 특이성이 친화성 성숙에 의해 최적화된 D-펩티드 화합물, 예를 들어, VEGF-A에 결합하는 부모 화합물을 기반으로 2세대 D-펩티드 화합물이 제공된다. 일부 구현예에서, 대상 화합물의 친화도 성숙은, 변이체 아미노산 위치의 분획을 고정된 위치로서 유지시키고, 나머지 변이체 아미노산 위치들은 각 위치에서 최적의 아미노산이 선택되도록 가변시키는 것을 포함할 수 있다. 부모 D-펩티드 화합물은 친화도 성숙 화합물을 위한 스캐폴드로서 선택될 수 있다. 일부 경우에, 부모의 변이체 아미노산 위치의 한정된 서브세트에서 돌연변이를 포함하는 다수의 친화도 성숙 화합물이 제조되고, 나머지 변이체 위치들은 고정된 위치로서 유지된다. 모든 변이체 위치에 있는 돌연변이가 표시되고 다양한 범위의 아미노산(예: 20개의 모든 자연 발생 아미노산)이 모든 위치에서 치환되도록, 스캐폴드 서열을 통해 돌연변이의 위치를 타일화하여 일련의 화합물을 생산할 수 있다. 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 삽입을 포함하는 돌연변이가 친화도 성숙 화합물의 변이체 위치에 포함될 수도 있다. 친화도 성숙 화합물을 제조하고 임의의 편리한 방법(예: 파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝)을 사용해 스크리닝하여 특성이 개선된 (예: 표적 분자에 대한 결합 친화도, 단백질 접힘, 프로테아제 안정성, 열안정성, 약학적 제형과의 호환성 등이 증가된) 2세대 화합물을 식별할 수 있다.

일부 구현예에서, 대상 화합물의 친화도 성숙은 변이체 아미노산 위치의 대부분 또는 전부를 부모 화합물의 가변 영역에서 고정된 위치로서 유지시키고, 이들 가변 영역에 인접한 위치에 연속 돌연변이를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 원래 GA 스캐폴드 도메인 내에서 이전에 고정된 위치로서 간주된 부모 화합물 내의 위치에 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이는, 단백질 접힘, 프로테아제 안정성, 열안정성, 약학적 제형과의 호환성 등과 같은 임의의 바람직한 특성에 대해 화합물 변이체를 최적화하는 데 사용될 수 있다.

본 개시의 양태는 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 화합물, 이의 염(예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 염), 및/또는 이의 용매화물, 수화물 및/또는 프로드러그 형태를 포함한다. 염, 용매화물, 수화물, 및 프로드러그의 모든 순열은 본 개시에 포함되는 것으로 의도됨을 이해할 것이다.

일부 구현예에서, 대상 화합물은 또는 이의 프로드러그 형태는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 제공된다. 아민 기 또는 질소 함유 헤테로아릴 기를 함유하는 화합물은 본질적으로 염기성일 수 있으며, 따라서 임의의 수의 무기산 및 유기산과 반응하여 약학적으로 허용 가능한 산 부가염을 형성할 수 있다. 이러한 염을 형성하기 위해 일반적으로 사용되는 산은 무기 산(예: 염산, 브롬화수소산, 황산, 및 인산)뿐만 아니라 유기 산(예: 파라-톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 옥살산, 파라-브로모페닐설폰산, 탄산산, 숙신산, 구연산, 벤조산, 및 아세트산), 및 관련 무기산 및 유기산을 포함한다. 따라서, 약학적으로 허용 가능한 이러한 염은 황산염, 피로황산염, 중황산염, 아황산염, 중아황산염, 인산염, 일수소인산염, 이수소인산염, 메타인산염, 피로인산염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 아세트산염, 프로피온산염, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포름산염, 이소부티레이트, 카프르산염, 헵타노에이트, 프로피오레이트, 옥살산염, 말로네이트, 숙신산염, 수베르산염, 세바스산염, 푸마르산염, 말레산염, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레파탈레이트, 설폰산염, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피온산염, 페닐부티레이트, 구연산염, 젖산염, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레산염, 타르타르산염, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델산염, 마뇨산염, 글루콘산염, 락토바이온산염, 및 유사한 염을 포함한다. 소정의 특정 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 산 부가염은 염산 및 브롬화수소산과 같은 무기산으로 형성된 것들, 및 푸마르산 및 말레산과 같은 유기산으로 형성된 것들을 포함한다.

다량체 화합물

(예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 ) 임의의 편리한 D-펩티드 화합물을 다량체화하여 D-펩티드 화합물의 다량체를 제공할 수 있다. 소정의 구현예에서, 다량체는 2개 이상의 D-펩티드 화합물, 예컨대 2개(예: 이량체), 3개(예: 삼량체), 또는 4개 이상(예: 사량체 또는 덴드리머 등)의 화합물을 포함한다. 일부 경우에, 다량체는 다음 식에 의해 기술되며:

Y-(GA)_n

식 중: Y는 다가 연결기이고; n은 1보다 큰 정수이고; GA는 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) GA 도메인 모티프를 포함하는 D-펩티드 화합물이다. 소정의 경우에, n은 2이다. 소정의 경우에, n은 3이다.

소정의 경우에, 다량체는 다음 화학식 중 하나의 이량체이며:

및

식 중 각각의 GA는 독립적으로 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) D-펩티드 화합물이고; Y는 화합물의 N-말단(N-GA) 또는 C-말단(GA-C)에 연결된 링커이다. 소정의 경우에, 이량체는 각각 VEGF-A에 특이적으로 결합하는 2개의 동일한 GA 도메인 모티프의 동종이량체이다. 소정의 경우에, 이량체는 이종이량체이다. 이종이량체는 각각 VEGF-A에 특이적으로 결합하는 2개의 구별되는 GA 도메인 모티프의 이량체이거나, 대상 D-펩티드 화합물 및 제2 D-펩티드 결합 도메인의 이량체일 수 있다.

임의의 편리한 연결기가 대상 다량체에서 사용될 수 있다. 용어 "링커(linker)", "연결(linkage)" 및 "연결기(linking group)"는 상호 교환적으로 사용되고, 둘 이상의 화합물을 공유 연결하는 연결 모이어티를 지칭한다. 일부 경우에, 링커는 2가이다. 소정의 경우에, 링커는 분지형 또는 3가 연결기이다. 일부 경우에, 링커는 길이가 200 원자 이하(예컨대, 100 원자 이하, 80 원자 이하, 60 원자 이하, 50 원자 이하, 40 원자 이하, 30 원자 이하, 또는 심지어 20 원자 이하)인 선형 또는 분지형 백본을 갖는다. 　 연결 모이어티는 2개의 기를 연결하는 공유 결합이거나, 길이가 1 내지 200 원자(예를 들어, 길이가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 또는 200개의 탄소 원자)인 선형 또는 분지형 사슬일 수 있으며, 여기서 링커는 선형, 분지형, 환형이거나 단일 원자일 수 있다. 소정의 경우에, 링커 백본의 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 또는 그 이상의 탄소 원자가 황, 질소, 또는 산소 헤테로원자로 임의 치환될 수 있다. 소정의 사례에서, 링커가 PEG기를 포함할 때, 링커 백본의 해당 분절의 원자는 3개마다 1개씩 산소로 치환된다. 백본 원자들 간의 결합은 포화되거나 불포화될 수 있고, 링커 백본에는 일반적으로 1개, 2개, 또는 3개 이하의 불포화 결합이 존재하게 된다. 링커는 하나 이상의 치환기, 예를 들어 알킬, 아릴, 또는 알케닐기를 포함할 수 있다. 　 링커는 올리고(에틸렌 글리콜), 에테르, 티오에테르, 이황화물, 아미드, 카보네이트, 카바메이트, 3차 아민, 알킬을 제한 없이 포함할 수 있는데, 이들은 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 1-메틸에틸(이소프로필), n-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸에틸(t-부틸) 등과 같이 직선형 또는 분지형일 수 있다. 링커 백본은 환형기, 예를 들어 아릴, 헤테로환, 또는 시클로알킬기를 포함할 수 있으며, 여기서 환형기의 2개 이상의 원자(예를 들어, 2개, 3개 또는 4개의 원자)가 백본에 포함된다. 링커는 절단되거나 절단되지 않을 수 있다. 링커는 펩티드, 예를 들어, 잔기의 연결 서열일 수 있다.

Y는 다음을 포함하되 이들로 한정되지 않는 임의의 편리한 기(들) 또는 링커 단위를 포함할 수 있다: 아미노산 잔기(들), PEG, 변형된 PEG(예를 들어, -NH(CH₂)_mO[(CH₂)₂O]_n(CH₂)_pCO- 연결 기, 식 중 m은 2~6이고, p는 1~6이고, n은 1~50, 예컨대 1~12 또는 1~6임), -CO-CH2CH2CO- 단위, 및 (예를 들어, 아미드 결합, 설폰아미드 결합, 카바메이트, 에테르 결합, 에스테르 결합, 또는 -NH-와 같은 작용기를 통해 연결된) 이들의 조합. 일부 경우에, Y는 펩티드이다. 일부 구현예에서, Y는 -(L1)a-(L2)b-(L3)c-(L4)d-(L5)e-를 포함하는 링커이며, 식 중 L1, L2, L3, L4, 및 L5는 각각 링커 유닛이고, a, b, c, d, 및 e는 각각 독립적으로 0 또는 1이고, a, b, c, d, 및 e의 합은 1 내지 5이다. 본원에 기술된 다량체 화합물에 도시된 것과 같은 다른 링커도 가능하다.

일부 사례에서, Y는 연결 성분은 임의의 편리한 연결 화학물질을 사용하여 D-펩티드 화합물에 연결되는 변형된 PEG 링커를 포함한다. PEG는 폴리에틸렌 글리콜 또는 변형된 폴리에틸렌 글리콜이다. 변형형된 PEG란, 말단 중 하나 또는 둘 다가 예를 들어 또 다른 연결기 모이어티에 접합되거나 펩티드 화합물의 말단 또는 측쇄에 접합되기에 적합한 화학 선택성 작용기를 포함하도록 변형된, 임의의 편리한 길이를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 의미한다. 표 9 및 실시예 섹션은 화합물의 N-말단 또는 C-말단을 통해 연결된 화합물 1.1.1(c21a)의 여러 가지 예시적인 동종이량체를 기술한다. D-펩티드 화합물은, 시스테인이나 리신과 같은 Y 기에 연결하기 위한 특정 연결인자 또는 연결 화학물질을 제공할 수 있는 하나 이상의 추가 아미노산 잔기를 포함하도록 GA 도메인 모티프의 N-말단 및/또는 C-말단에서 변형될 수 있다.

임의의 편리한 다가 링커가 대상 다량체에 사용될 수 있다. 다가(multivalent)란, 링커가 본원에 기술된 것과 같은 대상 화합물에 부착되기에 적합한 2개 이상의 말단 기를 포함하는 것을 의미한다. 일부 경우에, 다가 링커는 2가 또는 3가이다. 일부 사례에서, 다가 링커 Y는 덴드리머 스캐폴드이다. 임의의 편리한 덴드리머 스캐폴드는 대상 다량체에 사용하도록 구성될 수 있다. 덴드리머 스캐폴드는 임의의 링커를 통해 GA 도메인 모티프의 N-말단 또는 C-말단에 연결하기에 적합한 적어도 하나의 분지점 및 2개 이상의 말단을 포함하는 분지된 분자이다. 덴드리머 스캐폴드는 2개 이상의 GA 도메인 모티프의 바람직한 공간 배열을 제공하도록 선택될 수 있다. 일부 경우에, 2개 이상의 GA 도메인 모티프의 공간 배열은 표적 단백질에 대한 원하는 결합 친화도 및 선택성을 제공하도록 선택된다. 도 17은 2개의 VEGF-A 분자 및 2개의 화합물을 포함하는 복합체를 포함하는 화합물 1.1.1(c21a)의 X-선 결정 구조를 보여준다. 도시된 구조의 관점에서, N-말단(약 60 옹스트롬)과 C-말단(약 70 옹스트롬) 사이의 거리는 점선으로 표시되어 있다. 일부 경우에, 이량체는 길이가 약 60 옹스트롬 이상인 N-N 연결된 Y 기를 포함한다. 일부 경우에, 이량체는 길이가 약 70 옹스트롬 이상인 C-C 연결된 Y 기를 포함한다.

일부 경우에, D-펩티드 화합물은 각각 독립적으로 특이적 결합 모이어티(예: 비오틴 또는 펩티드 태그)를 포함하며, 여기서 D-펩티드 화합물은 특이적 결합 모이어티에 특이적으로 결합하는 다가 결합 모이어티(예: 스트렙타비딘, 아비딘, 또는 항체)를 통해 서로 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 전술한 것과 같은 2개 이상의 D-펩티드 화합물은 비오틴 모이어티인 특이적 결합 모이어티를 각각 포함한다. 소정의 구현예에서, 특이적 결합 모이어티는 임의의 링커를 통해 화합물의 N-말단 또는 C-말단에 연결된 말단 비오틴 모이어티이다. 소정의 경우에, 말단 비오틴 모이어티는 비오틴-(Gly)_n-이거나 (여기서 n은 1 내지 6임) 비오틴-Ahx-이다 (여기서 Ahx = 6-아미노헥사논산 잔기임).

변형된 화합물

임의의 편리한 관심 분자 또는 모이어티가 대상 D-펩티드 화합물에 부착될 수 있다. 관심 분자는 펩티드 또는 비-펩티드 분자, 자연 발생 분자, 또는 합성 분자일 수 있다. 대상 화합물과 함께 사용하기에 적합한 관심 분자는 추가의 단백질 도메인, 폴리펩티드 또는 아미노산 잔기, 펩티드 태그, 특이적 결합 모이어티, 중합체 모이어티(예: 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 탄수화물, 덱스트란, 또는 폴리아크릴레이트), 링커, 반감기 연장 모이어티, 약물, 독소, 검출 가능한 표지, 및 고형 지지체를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 일부 경우에, 관심 분자는 다음을 포함하되 이들로 한정되지 않는 강화된 및/또는 변형된 특성 및 기능을 생성된 펩티드 화합물에 부여할 수 있다: 증가된 수용성, 용이한 화학 합성, 비용, 생체접합 부위, 안정성, 등전점(pI), 응집, 예를 들어 본원에 기술된 것과 같은 제2 표적 단백질에 대한 비특이적 결합 및/또는 특이적 결합의 감소.

본원에 기술된 VEGF-A 결합 GA 도메인 모티프 서열 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 모티프는 서열의 N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 추가 잔기, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 그 이상의 추가 잔기를 포함하도록 연장될 수 있다. 이러한 추가 잔기는 VEGF-A 결합 상호작용을 제공하지 않더라도 GA 도메인 모티프의 일부로서 간주될 수 있다. 임의의 편리한 잔기가 VEGF-A 결합 GA 도메인 모티프의 N-말단 및/또는 C-말단에 포함되어 원하는 특성 또는 기, 예컨대 수용성 기를 통해 증가된 용해도, 이량체화 또는 다량체화를 위한 연결, 표지 또는 특이적 결합 모이어티에 대한 연결을 제공할 수 있다.

일부 경우에, 변형된 대상 화합물은 다음 화학식에 의해 기술되며:

X-L-Z

식 중 X는 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) VEGF-A 결합 GA 도메인 모티프이고; L은 임의의 연결기이고; Z는 관심 분자이며, L은 임의의 편리한 위치에서 (예를 들어, N-말단, C-말단에서; 또는 표적에 대한 결합에 관여하지 않는 표면 잔기의 측쇄를 통해) X에 부착된다.

D-펩티드 화합물은 하나 이상의 관심 분자, 예를 들어, N-말단 모이어티 및/또는 C-말단 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 사례에서, 관심 분자는 N-말단 잔기의 알파-아미노기를 통해 공유 부착되거나, C-말단 잔기의 알파-카복실산기에 공유 부착된다. 다른 사례에서, 관심 분자는 잔기의 측쇄기를 통해(예를 들어, c, k, d, 또는 e 잔기를 통해) 모티프에 부착된다.

관심 분자는 폴리펩티드 또는 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 관심 폴리펩티드 및 단백질 도메인은 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: gD 태그, c-Myc 에피토프, FLAG 태그, His 태그, 형광 단백질(예: GFP), 베타-갈락토시다아제 단백질, GST, 알부민, 면역글로불린, Fc 도메인, 또는 유사한 항체-유사 단편, 류신 지퍼 모티프, 코일드 코일 도메인, 소수성 영역, 친수성 영역, 2개 이상의 다량체화 도메인 사이에서 분자 간 이황화 결합을 형성하는 유리 티올을 포함하는 폴리펩티드, "돌기-공동 형성(protuberance-into-cavity)" 도메인, 베타-락토글로불린, 또는 이들의 단편.

관심 분자는 반감기 연장 모이어티를 포함할 수 있다. 용어 "반감기 연장 모이어티"는 대상 화합물에 공유 연결되거나 접합된 약학적으로 허용 가능한 모이어티, 도메인, 또는 "비히클"로서, 대상 화합물의 접합되지 않은 형태와 비교했을 때, 생체 내에서 대상 화합물의 단백질 분해 또는 다른 활성을 감쇠하는 화학적 변형을 방지하거나 완화시키고, 반감기 또는 다른 약동학적 특성(예: 흡수 속도)을 증가시키고, 독성을 감소시키고, 가용성을 개선하고, 관심 표적에 대해 대상 화합물의 생물학적 활성 및/또는 표적 선택성을 증가시키고, 제조 가능성을 높이고, 및/또는 대상 화합물의 면역원성을 감소시키는 약학적으로 허용 가능한 모이어티, 도메인, 또는 비히클을 지칭한다.

소정의 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 면역글로불린(예: IgG) 또는 혈청 알부민(예: 인간 혈청 알부민(HSA))과 같은 혈청 단백질에 결합하는 폴리펩티드이다. 폴리에틸렌 글리콜은 유용한 반감기 연장 모이어티의 일례이다. 예시적인 반감기 연장 모이어티는 폴리알킬렌 글리콜 모이어티(예: PEG), 혈청 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 이의 트랜스페린 결합 부분, 및 생체 내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 모이어티, 에틸렌 글리콜의 공중합체, 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(예: 폴리리신), 덱스트란 n-비닐 피롤리돈, 폴리 n-비닐 피롤리돈, 프로필렌 글리콜 단일중합체, 프로필렌 옥사이드 중합체, 에틸렌 옥사이드 중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐 알코올, 당화된 선형 또는 분지형 사슬, 폴리시알산, 폴리아세탈, 장쇄 지방산, 장쇄 소수성 지방족 기, 면역글로불린 Fc 도메인(예를 들어, 미국 특허 제6,660,843호 참조), 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민; 예를 들어, 미국 특허 제6,926,898호 및 US 2005/0054051; 미국 특허 제6,887,470호 참조), 트랜스티레틴(TTR; 예를 들어, US 2003/0195154; 2003/0191056 참조), 또는 티록신-결합 글로불린(TBG)을 포함한다.

연장된 반감기는, 예를 들어 Gilbert S. Banker 및 Christopher T. Rhodes에 의해 문헌[Sustained and controlled release drug delivery system. In Modern Pharmaceutics, Fourth Edition, Revised and Expanded, Marcel Dekker, New York, 2002, 11]에 기술된 바와 같이 대상 화합물의 조절 방출 또는 서방출 투여 형태에 의해 달성될 수도 있다. 이는 리포좀 및 약물-중합체 접합체를 포함하는 다양한 제형을 통해 달성될 수 있다.

소정의 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 지방산이다. 임의의 편리한 지방산이 변형된 대상 화합물에 사용될 수 있다. 예를 들어, Chae 등의 문헌["The fatty acid conjugated exendin-4 analogs for type 2 antidiabetic therapeutics", J. Control Release. 2010 May 21;144(1):10-6] 참조.

소정의 구현예에서, 화합물은 특이적 결합 모이어티를 포함하도록 변형된다. 특이적 결합 모이어티는 제2 모이어티에 특이적으로 결합할 수 있는, 즉 제2 모이어티에 대해 상보적인 모이어티이다. 일부 경우에, 특이적 결합 모이어티는 적어도 10^-7M의 친화도로 (예를 들어, K_D로 측정했을 때 100 nM 이하, 예컨대 30 nM 이하, 10 nM 이하, 3 nM 이하, 1 nM 이하, 300 pM 이하, 또는 100 pM 이하의 K_D로) 상보적인 제2 모이어티에 결합한다. 특이적 결합 모이어티의 상보적 결합 모이어티 쌍은 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 리간드 및 수용체, 항체 및 항원, 상보적 폴리뉴클레오티드, 상보적 단백질 동종이량체 또는 이종이량체, 앱타머 및 저분자, 폴리히스티딘 태그 및 니켈, 및 (반응성 티올기가 마이클 첨가 반응을 겪을 수 있는) 화학선택적 반응 기(예: 티올) 및 친전자성 기. 특이적 결합 쌍은 원래 특이적 결합 구성원의 유사체, 유도체, 및 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 항원에 대해 유도된 항체는 에피토프가 존재하는 한 펩티드 단편, 화학적으로 합성되어 표지된 단백질, 유도체화된 단백질 등을 인식할 수도 있다. 특이적 결합 모이어티로서 사용되는 관심 단백질 도메인은 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: Fc 도메인 또는 유사한 항체-유사 단편, 류신 지퍼 모티프, 코일드 코일 도메인, 소수성 영역, 친수성 영역, 둘 이상의 다량체화 도메인 사이에서 분자 간 이황화 결합을 형성하는 유리 티올을 포함하는 폴리펩티드, 또는 "돌기-공동 형성" 도메인(예를 들어, WO 94/10308; 미국 특허 제5,731,168호, Lovejoy 등의 문헌[(1993), Science 259: 1288-1293]; Harbury 등의 문헌[(1993), Science 262: 1401-05]; Harbury 등의 문헌[(1994), Nature 371:80-83]; Hakansson 등의 문헌[(1999), Structure 7: 255-64] 참조).

소정의 구현예에서, 관심 분자는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 연결된 특이적 결합 모이어티이다. 연결된 특이적 결합 모이어티는 항체, 항체 단편, 앱타머, 또는 제2 D-펩티드 결합 도메인일 수 있다. 연결된 특이적 결합 모이어티는 임의의 편리한 표적 단백질, 예를 들어, 대상 치료 방법에서 VEGF-A와 함께 표적화하기에 바람직한 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 관심 표적 단백질은 PDGF (예: PDGF-B), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, EGF, EGFR, Her2, PD-1, PD-L1, OX-40, 및 LAG3을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 소정의 사례에서, 연결된 특이적 결합 모이어티는 PDGF-B를 표적으로 하는 제2 D-펩티드 결합 도메인이다.

소정의 구현예에서, 특이적 결합 모이어티는 비오틴 모이어티와 같은 친화도 태그이다. 예시적인 비오틴 모이어티는 비오틴, 데스티오비오틴, 옥시비오틴, 2'-이미노비오틴, 디아미노비오틴, 비오틴 설폭시드, 비오시틴 등을 포함한다. 일부 경우에, 비오틴 모이어티는 고정 아비딘, 뉴트라비딘, 또는 스트렙타비딘을 함유하는 크로마토그래피 지지체에 높은 친화도로 특이적으로 결합할 수 있다. 비오틴 모이어티는 적어도 10^-8 M의 친화도로 스트렙타비딘에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 비오틴-함유 화합물에 중간 친화도로 특이적으로 결합하도록 단량체 아비딘 지지체가 사용되어, 결합된 화합물이 나중에 비오티닐화되지 않은 폴리펩티드가 세척에 의해 제거된 후 지지체로부터 (예를 들어, 2 mM 비오틴 용액을 사용해) 경쟁적으로 용리되도록 할 수 있다. 소정의 사례에서, 비오틴 모이어티는 용액 중에서 아비딘, 뉴트라비딘, 또는 스트렙타비딘과 결합하여 다량체 화합물, 예를 들어, 아비딘, 뉴트라비딘, 또는 스트렙타비딘과 D-펩티드 화합물의 이량체, 또는 사량체 복합체를 형성할 수 있다. 비오틴 모이어티는 또한 링커, 예를 들어, *비오틴, *비오틴, *비오틴, 또는 *_n-비오틴을 포함할 수 있으며, 여기서 n은 3~12이다(Pierce Biotechnology로부터 상업적으로 입수 가능함).

소정의 구현예에서, 화합물은 검출 가능한 표지를 포함하도록 변형된다. 검출 가능한 표지의 예는 대상 펩티드 화합물의 존재를 직접적으로 간접적으로 측정할 수 있게 하는 표지를 포함한다. 화합물을 직접적으로 측정할 수 있게 하는 표지의 예는 방사성 표지, 형광단, 염료, 비드, 나노입자(예: 양자점), 화학발광체, 콜로이드 입자, 상자성 표지 등을 포함한다. 방사성 표지는 ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, ⁶⁴Cu, 및 ¹³¹I와 같은 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 대상 화합물은, Coligen (Ed) 등의 문헌[Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)]에 기술된 것과 같은 임의의 편리한 기술을 사용해 방사성 동위원소로 표지될 수 있고, 방사성은 섬광 계수 또는 양전자 방출을 사용해 측정할 수 있다. 변형된 화합물의 존재를 간접적으로 측정할 수 있게 하는 검출 가능한 표지의 예는 효소를 포함하며, 이 경우 기질이 착색된 생성물 또는 형광 생성물을 제공할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 적절한 기질을 첨가한 후 검출 가능한 생성물 신호를 제공할 수 있는 공유 결합된 효소를 포함할 수 있다. 효소를 화합물에 공유 결합시키는 대신에, 화합물은 효소에 접합된 특이적 결합 쌍의 제2 구성원과 특이적으로 결합하는 특이적 결합 쌍의 제1 구성원을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 화합물은 비오틴에 공유 결합되고 효소는 스트렙타비딘에 접합될 수 있다. 접합체에 사용하기에 적합한 효소의 예는 서양 고추냉이 과산화효소, 알칼리 인산분해효소, 말산 탈수소효소 등을 포함한다. 상업적으로 이용할 수 없는 경우, 이러한 효소 접합체는 임의의 편리한 기술에 의해 쉽게 생산될 수 있다.

소정의 구현예에서, 검출 가능한 표지는 형광단이다. 용어 "형광단(fluorophore)"은, 선택된 파장을 갖는 광으로 여기시켰을 때 상이한 파장의 광을 방출하는 분자를 지칭하며, 형광단은 여기 후 즉시 광을 방출하거나 지연시켜 방출할 수 있다. 형광단은 플루오르세인 염료, 예를 들어 5-카복시플루오르세인 (5-FAM), 6-카복시플루오로세인 (6-FAM), 2',4',1,4,-테트라클로로플루오르세인 (TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오르세인 (HEX), 및 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카복시플루오르세인 (JOE); 시아닌 염료, 예를 들어 Cy3, CY5, Cy5.5, QUASARTM 염료 등; 단실 유도체; 로다민 염료, 예를 들어, 6-카복시테트라메틸로다민 (TAMRA), CAL FLUOR 염료, 테트라프로파노-6-카복시로다민 (ROX), BODIPY 형광단, ALEXA 염료, Oregon Green, 피렌, 페릴렌, 벤조피렌, 스쿠아린 염료, 쿠마린 염료, 발광 전이 금속, 및 란타니드 복합체 등을 제한 없이 포함한다. 형광단(fluorophore)이란 용어는 이러한 염료의 엑시머(excimer) 및 엑시플렉스(exciplex)를 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물은 방사성 표지와 같은 검출 가능한 표지를 포함한다. 소정의 구현예에서, 방사성 표지는 PET, SPECT, 및/또는 MR 영상화에 사용하기에 적합하다. 소정의 구현예에서, 방사성 표지는 PET 이미징 표지이다. 소정의 경우에, 화합물은 ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ⁹⁹mTc, 또는 ⁸⁶Y로 방사성 표지된다.

검출 가능한 표지는 임의의 편리한 위치에서 및 임의의 편리한 화학물질을 통해 펩티드 화합물에 부착될 수 있다. 관심 물질 및 방법은 미국 특허 제8,545,809호; Meares 등의 문헌[1984, Acc Chem Res 17:202-209]; Scheinberg 등의 문헌[1982, Science 215:1511-13]; Miller 등의 문헌[2008, Angew Chem Int Ed 47:8998-9033]; Shirrmacher 등의 문헌[2007, Bioconj Chem 18:2085-89]; Hohne 등의 문헌[2008, Bioconj Chem 19:1871-79]; Ting 등의 문헌[2008, Fluorine Chem 129:349-58]에 기술된 것들; 및 Poethko 등의 문헌[J. Nucl. Med. 2004; 45: 892-902]에 기술된 표지 방법으로서, 4-[18F]플루오로벤즈알데히드를 먼저 합성하여 정제하고(Wilson 등의 문헌[J. Labeled Compounds and Radiopharm. 1990; XXVIII: 1189-1199] 참조), 그런 다음 펩티드에 접합시키고, 숙신이미딜 [18F]플루오로벤조에이트 (SFB)로 표지하거나(예를 들어, Vaidyanathan 등의 문헌[1992, Int. J. Rad. Appl. Instrum. B 19:275] 참조), 다른 아실 화합물로 표지하거나(Tada 등의 문헌[1989, Labeled Compd. Radiopharm. XXVII:1317]; Wester 등의 문헌[1996, Nucl. Med. Biol. 23:365]; Guhlke 등의 문헌[1994, Nucl. Med. Biol 21:819] 참조), 클릭 화학 부가물로 표지하는(Li 등의 문헌[2007, Bioconj Chem. 18:1987] 참조) 방법을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

임의의 편리한 합성 방법 또는 생체접합 방법이 변형된 대상 D-펩티드 화합물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 소정의 경우에, 검출 가능한 표지는 임의 링커를 통해 화합물에 연결된다. 소정의 구현예에서, 검출 가능한 표지는 화합물의 N-말단에 연결된다. 소정의 구현예에서, 검출 가능한 표지는 화합물의 C-말단에 연결된다. 소정의 구현예에서, 검출 가능한 표지는, 예를 들어, 측쇄 모이어티를 통해 화합물의 비-말단 잔기에 연결된다. 소정의 구현예에서, 검출 가능한 표지는 임의 링커를 통해 화합물의 N-말단 펩티드 연장 모이어티에 연결된다. 일부 경우에, N-말단 펩티드 연장 모이어티는 방사성 표지를 함유하는 모이어티의 호환 가능한 작용기와 반응할 수 있는 반응성 작용기를 포함하도록 변형된다. 임의의 편리한 반응성 작용기, 화학물질, 및 방사성 표지 함유 모이어티는, 클릭 화학, 아지드, 알킨, 시클로옥틴, 구리-무함유 클릭 화학, 니트론, (예를 들어, DOTA, TETA, NOTA, NODA, (터트-부틸)₂NODA, NETA, C-NETA, L-NETA, S-NETA, NODA-MPAA, 및 NODA-MPAEM으로부터 선택된) 킬레이트화 기, 프로파길-글리신 잔기 등을 포함하되 이들로 한정되지 않는 화합물에 검출 가능한 표지를 부착하는 데 사용될 수 있다.

소정의 사례에서, 관심 분자는 제2 활성제, 예를 들어, 대상 치료 방법에서 VEGF-A의 표적화와 함께 사용되는 활성제 또는 약물이다. 소정의 사례에서, 관심 분자는 저분자, 화학요법, 항체, 항체 단편, 앱타머, 또는 L-단백질이다. 일부 구현예에서, 화합물은 약학적 성분으로서 유용한 모이어티(예: 단백질, 핵산, 유기 저분자 등)를 포함하도록 변형된다. 예시적인 약학적 단백질은, 예를 들어, 사이토카인, 항체, 케모카인, 성장 인자, 인터류킨, 세포 표면 단백질, 세포외 도메인, 세포 표면 수용체, 세포독소 등을 포함한다. 예시적인 저분자 약학적 성분은 저분자 독소 또는 치료제를 포함한다.

(예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 임의의 편리한 치료제 또는 진단제는 D-펩티드 화합물에 접합될 수 있다. 항암제, 항증식제, 세포독성제, 및 화학요법제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 치료제가 병용 요법이란 제목의 아래 섹션이 기술되어 있으며, 이들 중 어느 하나는 변형된 대상 화합물에 사용하도록 구성될 수 있다. 예시적인 관심 화학요법제는, 예를 들ㅇ, 젬시타빈(Gemcitabine), 도세탁셀(Docetaxel), 블레오마이신(Bleomycin), 엘로티닙(Erlotinib), 게피티닙(Gefitinib), 라파티닙(Lapatinib), 이마티닙(Imatinib), 다사티닙(Dasatinib), 닐로티닙(Nilotinib), 보수티닙(Bosutinib), 크리조티닙(Crizotinib), 세리티닙(Ceritinib), 트라메티닙(Trametinib), 베바시주맙(Bevacizumab), 수니티닙(Sunitinib), 소라페닙(Sorafenib), 트라스투주맙(Trastuzumab), 아도-트라스투주맙 엠탄신(Ado-trastuzumab emtansine), 리툭시맙(Rituximab), 이필리무맙(Ipilimumab), 라파마이신(Rapamycin), 템시롤리무스(Temsirolimus), 에버롤리무스(Everolimus), 메토트렉세이트(Methotrexate), 독소루비신(Doxorubicin), 아브락산(Abraxane), 폴피리녹스(Folfirinox), 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 테이수노(Teysumo), 파클리탁셀(Paclitaxel), 프레드니손(Prednisone), 레보티록신(Levothyroxine), 페메트렉시드(Pemetrexed), 나비토클락스(navitoclax), ABT-199를 포함한다. ADC에서 사용되는 임의의 예시적인 세포독성제는 변형된 대상 D-펩티드 화합물에서 사용되도록 구성될 수 있다. 관심 세포 독성제는 아루리스타틴(auristatins)(예: MMAE, MMAF), 메이탄신(maytansines), 돌라스타틴(dolastatins), 칼리키마이신(calicheamicins), 듀오카마이신(duocarmycins), 피롤로벤조디아제핀(pyrrolobenzodiazepines, PBD), 센타마이신(centanamycin, ML-970; 인돌카복스아미드(indolecarboxamide)), 독소루비신(doxorubicin), 알파-아마니틴(α-Amanitin), 및 이들의 유도체 및 유사체를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 소정의 구현예에서, 화합물은 세포 침투 펩티드(예: tat)를 포함할 수 있다. 세포 침투 펩티드는 분자의 세포 흡수를 용이하게 할 수 있다. 임의의 편리한 태그 폴리펩티드 및 이들의 각 항체가 사용될 수 있다. 예로는 폴리-히스티딘 (poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그; 플루 HA 태그 폴리펩티드 및 이의 항체 12CA5 [Field 등의 Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7, 및 9E10 항체[Evan 등의 Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; 및 단순 포진 바이러스 당단백 D (gD) 태그 및 이의 항체[Paborsky 등의 Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]가 포함된다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드[Hopp 등의 BioTechnology 6:1204-1210 (1988)]; KT3 에피토프 펩티드[Martin 등의 Science 255:192-194 (1992)]; 튜불린 에피토프 펩티드[Skinner 등의 J. Biol. Chem. 266:15163-15166 (1991)]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그[Lutz-Freyermuth 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:6393-6397 (1990)]를 포함한다.

소정의 구현예에서, 화합물은 세포 침투 펩티드(예: tat)를 포함할 수 있다. 세포 침투 펩티드는 분자의 세포 흡수를 용이하게 할 수 있다. 임의의 편리한 태그 폴리펩티드 및 이들의 각 항체가 사용될 수 있다. 예로는 폴리-히스티딘 (poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그; 플루 HA 태그 폴리펩티드 및 이의 항체 12CA5 [Field 등의 Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7, 및 9E10 항체[Evan 등의 Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; 및 단순 포진 바이러스 당단백 D (gD) 태그 및 이의 항체[Paborsky 등의 Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]가 포함된다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드[Hopp 등의 BioTechnology 6:1204-1210 (1988)]; KT3 에피토프 펩티드[Martin 등의 Science 255:192-194 (1992)]; 튜불린 에피토프 펩티드[Skinner 등의 J. Biol. Chem. 266:15163-15166 (1991)]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그[Lutz-Freyermuth 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:6393-6397 (1990)]를 포함한다.

관심 분자는 임의의 편리한 방법을 통해 변형된 대상 화합물에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 관심 분자는 공여 접합을 통해, 예를 들어, 아미노 말단 또는 카복시산 말단에서 말단 아미노산 잔기에 부착된다. 관심 분자는 단일 결합 또는 적절한 링커(예: PEG 링커, 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커, 또는 포화 탄화수소 링커)를 통해 펩티드 GA 도메인 모티프에 부착될 수 있다. (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은) 다양한 링커가 변형된 대상 화합물에 사용된다. 임의의 편리한 시약 및 방법, 예를 들어, G. T. Hermanson의 문헌["Bioconjugate Techniques" Academic Press, 2nd Ed., 2008]에 기술된 것과 같은 접합 방법, 고상 펩티드 합성 방법, 또는 융합 단백질 발현 방법이 대상 GA 도메인 모티프에 관심 분자를 포함시키는 데 사용될 수 있다. 임의의 링커를 통해 도메인에 공유 결합하여 변형된 화합물을 생산하는 데 사용될 수 있는 작용기는 하이드록실, 설프하이드릴, 아미노 등을 포함한다. 관심 분자 및/또는 GA 도메인 모티프 상의 소정의 모이어티는 편리한 차단기를 사용해 보호될 수 있다(예를 들어, Green & Wuts의 문헌[Protective Groups in Organic Synthesis (John Wiley & Sons) 3rd Ed. (1999)] 참조). 특정 관심 분자 및 GA 도메인 모티프에 대한 부착 부위는, 예를 들어 표적 VEGF-A 단백질에 대해 바람직한 결합 활성을 실질적으로 부정적으로 방해하지 않도록 선택될 수 있다.

관심 분자는 펩티드일 수 있다. 관심 분자는 비오틴 모이어티 및/또는 링커를 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 비-펩티드기를 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 임의의 편리한 단백질 도메인은 변형된 대상 펩티드 화합물에서 관심 분자로서 구성되어 사용될 수 있다. 관심 단백질 도메인은 임의의 편리한 혈청 단백질, 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민; 예를 들어, 미국 특허 제6,926,898호 및 US 2005/0054051; 미국 특허 제6,887,470호 참조), 트랜스페린 수용체 또는 이의 트랜스페린 결합 부분, 면역글로불린(예: IgG), 면역글로불린 Fc 도메인(예를 들어, 미국 특허 제6,660,843호 참조), 트랜스티레틴(TTR; 예를 들어, US 2003/0195154; 2003/0191056 참조), 티록신-결합 글로불린(TBG), 또는 이들의 단편을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

다량체화 기는, 예를 들어, 2개 이상의 화합물 사이의 결합을 (예를 들어, 직접적으로 또는 다가 결합 모이어티를 통해 간접적으로) 매개하거나, 공유 연결을 통해 2개 이상의 화합물을 연결함으로써 다량체(예를 들어, 이량체, 삼량체, 또는 덴드리머)를 형성할 수 있는 임의의 편리한 기이다. 일부 경우에, 다량체화 기 Z는 제2 D-펩티드 화합물 상의 호환 가능한 작용기에 접합될 수 있는 화학선택적 반응성 작용기이다. 다른 경우에, 다량체화 기는 다가 결합 모이어티(예: 스트렙타비딘 또는 항체)에 특이적으로 결합하는 특이적 결합 모이어티(예: 비오틴 또는 펩티드 태그)이다. 일부 경우에, 화합물은 다량체화 기를 포함하며, 아직 다량체화되지 않은 단량체이다.

대상 펩티드 화합물에 포함하기 위한 화학선택적 반응성 작용기는 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 아지도 기, 알키닐 기, 포스핀 기, 시스테인 잔기, C-말단 티오에스테르, 아릴 아지드, 말레이미드, 카보디이미드, N-하이드록시숙신이미드(NHS)-에스테르, 하이드라지드, PFP-에스테르, 하이드록시메틸 포스핀, 소랄렌, 이미도에스테르, 피리딜 이황화물, 이소시아네이트, 아미노옥시-, 알데히드, 케토, 클로로아세틸, 브로모아세틸, 및 비닐 설폰.

폴리뉴클레오티드

본원에 기술된 것과 같은 대상 펩티드 화합물에 상응하는 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 D-VEGF-A 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 L-펩티드 화합물을 암호화할 수 있다.

일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 30 내지 80개의 잔기, 40 내지 70개의 잔기, 45 내지 60개의 잔기, 45 내지 60개의 잔기, 또는 45 내지 55개의 잔기를 포함하는 펩티드 화합물을 암호화한다. 소정의 사례에서, 폴리뉴클레오티드는 35 내지 55개의 잔기, 예컨대 40 내지 55개의 잔기, 또는 45 내지 55개의 잔기의 펩티드 화합물 서열을 암호화한다. 소정의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 또는 53개의 잔기의 펩티드 화합물 서열을 암호화한다.

소정의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 단백질 발현 시스템에서 발현될 수 있는 L-펩티드 화합물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 복제 가능한 발현 벡터이다. 소정의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 유전자 융합을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 복제 가능한 발현 벡터이며, 여기서 유전자 융합은 바이러스 외피 단백질의 전부 또는 일부에 융합된 L-펩티드 화합물을 포함하는 융합 단백질을 암호화한다.

소정의 구현예에서, 대상 폴리뉴클레오티드는 세포 기반 또는 무세포 디스플레이 시스템에서 발현되고 디스플레이될 수 있다. 대상 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 L-펩티드 화합물은 세포 기반 디스플레이 기술 및 무세포 디스플레이 기술과 같은 임의의 편리한 디스플레이 방법을 사용하여 디스플레이할 수 있다. 소정의 구현예에서, 세포 기반 디스플레이 기술은 파지 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 효모 디스플레이, 및 포유류 세포 디스플레이를 포함한다. 소정의 구현예에서, 무세포 디스플레이 기술은 mRNA 디스플레이 및 리보솜 디스플레이를 포함한다.

방법

본원에 기술된 화합물은 다양한 방법에 사용될 수 있다. 하나의 이러한 방법은 VEGF-A의 결합에 적합한 조건 하에서 대상 화합물을 VEGF-A 표적 단백질과 접촉시켜 복합체를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 D-펩티드 화합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 화합물은 대상체에서 VEGF-A에 결합한다.

대상 화합물은 VEGF-A 표적의 적어도 하나의 활성을 10% 내지 100% 범위, 예를 들어, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상의 범위에서 억제할 수 있다. 소정의 검정에서, 대상 화합물은 1 x 10^-5 M 이하(예: 1 x 10^-6 M 이하, 1 x 10^-7 M 이하, 1 x 10^-8 M 이하, 1 x 10^-9 M 이하, 1 x 10^-10 M 이하, 또는 1 x 10^-11 M 이하)의 IC₅₀으로 이의 VEGF-A 표적을 억제할 수 있다. 소정의 검정에서, 대상 화합물은 1 x 10^-6 M 이하(예: 500 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 30 nM 이하, 10 nM 이하, 3nM 이하, 또는 1 nM 이하)의 IC₂₀으로 이의 VEGF-A 표적을 억제할 수 있다. 소정의 검정에서, 대상 화합물은 1 x 10^-6 M 이하(예: 500 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 30 nM 이하, 10 nM 이하, 3nM 이하, 또는 1 nM 이하)의 IC₁₀으로 이의 VEGF-A 표적을 억제할 수 있다. 마우스가 사용되는 검정에서, 대상 화합물은 마우스 당 1 μg 미만(예: 마우스 당 1 ng 내지 약 1 μg)의 ED₅₀을 가질 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 시험관 내 방법으로서, 높은 친화도로 표적 분자에 특이적으로 결합하는 대상 화합물과 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이다. 소정의 구현예에서, 샘플은 표적 분자를 함유하는 것으로 의심되며, 본 발명의 방법은 화합물이 표적 분자에 특이적으로 결합하는지 여부를 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 구현예에서, 표적 분자는 자연 발생 L-단백질이고 화합물은 D-펩티드이다. 소정의 구현예에서, 대상 화합물은 표지(예를 들어 형광 표지)를 포함하는 변형된 화합물이고, 본 발명의 방법은 표지가 존재하는 경우, 예를 들어, 광학 검출을 사용하여 표지를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 구현예에서, 화합물은 화합물에 결합하지 않는 임의의 샘플이 (예를 들어, 세척에 의해) 제거될 수 있도록 지지체로 변형된다. 그런 다음, 특이적으로 결합된 표적 단백질이 존재하는 경우, 임의의 편리한 수단을 사용해, 예컨대 표지된 표적 특이적 프로브의 결합을 사용하거나 형광 단백질 반응 시약을 사용해 이를 검출할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 샘플은 표적 단백질을 함유하는 것으로 알려져 있다. 소정의 구현예에서, 표적 VEGF-A 단백질은 합성 D-단백질이고 화합물은 L-펩티드이다. 소정의 구현예에서, 표적 VEGF-A 단백질은 L-단백질이고 화합물은 D-펩티드이다.

소정의 구현예에서, 대상 화합물은 VEGF-A의 존재 하에 세포와 접촉될 수 있고, 세포의 VEGF-A 반응 표현형이 모니터링될 수 있다. 예시적인 VEGF-A 검정은 무세포 시스템에서 단리된 단백질을 사용하는 검정, 배양된 세포를 사용하는 시험관 내 검정, 또는 생체 내 검정을 포함한다. 예시적인 VEGF-A 검정은 수용체 티로신 키나아제 억제 검정(예를 들어, Cancer Research Jun 15, 2006; 66:6025-6032 참조), 시험관 내 HUVEC 증식 검정(FASEB Journal 2006; 20: 2027-2035; Wells 등의 문헌[Biochemistry 1998, 37, 17754-17764]), 생체 내 고형 종양 질환 검정(USPN 6,811,779) 및 생체 내 혈관신생 검정(FASEB Journal 2006; 20: 2027-2035)을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 이들 검정에 대한 설명은 참조로서 본원에 통합된다. 이들 방법에 사용될 수 있는 프로토콜은 많으며, 무세포 검정(예: 결합 검정); 세포 표현형이 측정되는 세포 검정(예: 유전자 발현 검정); 및 특정 동물(소정의 구현예에서는 표적과 관련된 병태에 대한 동물 모델일 수 있음)을 포함하는 생체 내 검정을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 소정의 경우에, 검정은 혈관형성(vascularization) 검정일 수 있다. 소정의 구현예에서, 표적 단백질은 VEGF-A이고, 대상 화합물은 VEGF-A 의존성 혈관신생을 억제한다. 소정의 구현예에서, 표적 단백질은 VEGF-A이고, 대상 화합물은 VEGF-A 의존성 세포 증식을 억제한다. 소정의 사례에서, 표적 단백질은 VEGF-A이고 화합물은 VEGFR2 인산화를 억제한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 생체 내 방법이며, 표적 분자에 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 D-펩티드 화합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 화합물은 약학적 제제로서 투여된다. 본 발명의 방법에 따라 다양한 대상체를 치료할 수 있다. 일반적으로 이러한 대상체는 "포유동물(mammals)" 또는 "포유류(mammalian)"이며, 여기서 이들 용어는 식육목(예: 개 및 고양이), 설치목(예: 마우스, 기니피그, 및 랫트), 및 영장목(예: 인간, 침팬지, 및 원숭이)을 포함하는 포유강에 포함되는 유기체를 기술하도록 광범위하게 사용된다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 (예를 들어, 본원에서 기술된 것과 같은) 대상체에서 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체일 수 있다.

대상 화합물은 VEGF-A에 결합하여 이를 억제할 수 있고, 따라서 혈관신생과 관련된 질환 및 병태의 치료하고, 생체 내에서 진단하고 영상화하는 데 유용할 수 있다. 용어 "혈관신생과 관련된 질환 및 병태"는 본원에서 언급된 질환 및 병태를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 이와 관련해서는 WO 98/47541를 또한 참조한다. 혈관신생과 관련된 질환 및 병태는 상이한 형태의 암 및 전이, 예를 들어, 유방암, 피부암, 대장암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 또는 난소암을 포함한다. 혈관신생과 관련된 다른 질환 및 병태는 염증(예를 들어, 만성 염증), 동맥경화증, 류마티스성 관절염, 및 치은염이다. 혈관신생과 관련된 추가의 질환 및 병태는 동정맥 기형, 성상세포종, 융모막암종, 교아세포종, 신경교종, 혈관종(아동, 모세혈관), 간종, 과형성 자궁내막, 허혈성 심근, 자궁내막증, 카포시 육종, 황반 변성, 흑색종, 신경아세포종, 폐색성 말초 동맥 질환, 골관절염, 건선, (당뇨병성, 증식성) 망막증, 경피증, 생식 세포종, 및 궤양성 대장염이다. 일부 경우에, 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태는 암(예: 유방암, 피부암, 대장암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 또는 난소암), 염증성 질환, 죽상경화증, 류마티스성 관절염, 황반 변성, 및 망막병증이다. 특정 관심 분야는 당뇨병성 황반 부종(DME) 또는 연령 관련 황반 변성(AMD)의 치료이다.

VEGF-A 결합 대상 화합물은 다양한 신생물 및 비신생물 질환 및 장애의 치료에 유용하다. 치료가 가능한 신생물 및 관련 병태는 유방 암종, 폐 암종, 위 암종, 식도 암종, 대장 암종, 간 암종, 난소 암종, 포막종, 남성배세포종, 자궁경부 암종, 자궁내막 암종, 자궁내막 증식증, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막 암종, 두경부암, 비인두 암종, 후두 암종, 간모세포종, 카포시 육종, 흑색종, 피부 암종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관모세포종, 췌장 암종, 망막아종, 성상세포종, 교아세포종, 신경초종, 희돌기아교세포종, 수모세포종, 신경아세포종, 횡문근육종, 골육종, 평활근육종, 요로 암종, 갑상선 암종, 빌름스 종양, 신세포 암종, 전립선 암종, 모반증과 관련된 비정상적인 혈관 증식, 부종(예컨대, 뇌 종양과 관련된 부종), 및 메이그 증후군을 포함한다.

치료가 가능한 비-신생물 병태는 류마티스성 관절염, 건선, 죽상경화증, 미숙아 망막병증을 포함하는 당뇨병성 및 기타 증식성 망막병증, 후수정체 섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 연령 관련 황반 변성, 갑상선 과형성(그레이브스병 포함), 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 신증후군, 자간전증, 복수, 심낭 삼출액(심막염과 관련된 삼출액 등), 및 흉막 삼출을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "치료(treating 또는 treatment)"는 포유동물(예: 인간)과 같은 환자에게서 질환 또는 병태의 치료 또는 치료하는 것을 의미하며, 이에는 다음이 포함된다: (a) 질환 또는 병태의 발생을 방지하는 것, 예컨대 대상체의 예방적 치료; (b) 질환 또는 병태를 개선하는 것, 예컨대 환자에게서 질환 또는 병태를 제거하거나 퇴행시키는 것; (c) 질환 또는 병태를 억제하는 것, 예를 들어, 환자에게서 질환 또는 병태의 발생을 늦추거나 정지시킴으로써 억제하는 것; 또는 (d) 환자에게서 질환 또는 병태의 증상을 완화시키는 것. 이와 같이, 치료는 병리 조건 또는 적어도 이와 관련된 증상이 완전히 억제되는 상황, 예를 들어, 병리 조건 또는 적어도 이와 관련된 증상의 발생이 예방되거나, 중단되거나, 예를 들어 종결되어, 대상체가 병리 조건을 더 이상 앓지 않거나, 병리 조건을 특징짓는 적어도 증상을 더 이상 앓지 않게 되는 상황을 또한 포함한다. 치료는, 예를 들어 전술한 것과 같이, 질환 상태의 대리 마커를 조절하는 형태로 나타날 수도 있다.

본 개시의 양태는 AMD, 예컨대 습성 연령 관련 황반 변성(AMD)을 예방하거나 치료하는 방법을 포함한다. 연령 관련 황반 변성(AMD)은 고령 모집단에서 심각한 시력 상실의 주요 원인이다. AMD의 삼출 형태는 맥락막 신생혈관 및 망막 색소 상피 세포 박리를 특징으로 한다. 맥락막 혈관신생은 예후의 극적인 악화와 관련이 있기 때문에, 대상 VEGF 결합 화합물은 AMD의 중증도를 감소시키는 데 사용된다. 소정의 사례에서, 대상체는 건성 AMD 환자이며, 본 발명의 방법에 따른 화합물의 투여는 대상체에게서 습성 AMD의 발생을 방지하거나 중증도를 감소시킨다.

소정의 구현예에서, 본 발명의 방법은 VEGF-A 결합 화합물과 같은 화합물을 투여한 다음, 투여한 화합물이 이의 표적 단백질에 결합된 후 이를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 방법에서, 동일한 화합물이 치료 화합물 및 진단 화합물 둘 다의 역할을 할 수 있다.

본 개시의 VEGF-A 결합 화합물은, VEGF-A 단백질 또는 이의 단편의 제거, 억제, 또는 감소에 의해 개선, 완화, 억제, 또는 예방되는 임의의 질환 또는 병태를 치료하는 데 치료적으로 유용하다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 혈관신생을 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 VEGF-A 단백질에 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 대상 화합물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 상기 방법은 대상체에서 질환 상태의 존재를 진단하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 구현예에서, 질환 상태는 혈관신생을 강화함으로써 치료될 수 있는 병태이다. 소정의 구현예에서, 질환 상태는 혈관신생을 감소시킴으로써 치료될 수 있는 병태이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 방법은 혈관신생을 억제하는 방법이고, 화합물은 VEGF-A 길항제이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 세포 증식성 질환 상태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 VEGF-A 단백질에 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 대상 화합물의 유효량을 대상체에게 투여하여, 세포 증식성 질환 상태에 대해 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 VEGF-A 단백질에 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 대상 화합물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 종양은 고형 종양이다. 소정의 구현예에서, 종양은 비-고형 종양이다.

투여되는 화합물의 양은 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체, 또는 비히클과 함께 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양인 것으로, 임의의 편리한 방법에 의해 결정될 수 있다. 본 개시의 단위 투여 형태에 대한 사양은 사용되는 특정 화합물 및 달성할 효과, 및 대상체에서 각 화합물과 연관된 약력학에 따라 달라질 것이다.

일부 구현예에서, 대상 화합물의 유효량은 약 50 ng/ml 내지 약 50 μg/ml 범위(예를 들어, 약 50 ng/ml 내지 약 40 μg/ml, 약 30 ng/ml 내지 약 20 μg/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 10 μg/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 1 μg/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 800 ng/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 700 ng/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 600 ng/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 400 ng/ml, 약 60 ng/ml 내지 약 400 ng/ml, 약 70 ng/ml 내지 약 300 ng/ml, 약 60 ng/ml 내지 약 100 ng/ml, 약 65 ng/ml 내지 약 85 ng/ml, 약 70 ng/ml 내지 약 90 ng/ml, 약 200 ng/ml 내지 약 900 ng/ml, 약 200 ng/ml 내지 약 800 ng/ml, 약 200 ng/ml 내지 약 700 ng/ml, 약 200 ng/ml 내지 약 600 ng/ml, 약 200 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 약 200 ng/ml 내지 약 400 ng/ml, 또는 약 200 ng/ml 내지 약 300 ng/ml 범위)의 양이다.

일부 구현예에서, 대상 화합물의 유효량은 약 10 pg 내지 약 100 mg 범위의 양, 예를 들어, 약 10 pg 내지 약 50 pg, 약 50 pg 내지 약 150 pg, 약 150 pg 내지 약 250 pg, 약 250 pg 내지 약 500 pg, 약 500 pg 내지 약 750 pg, 약 750 pg 내지 약 1 ng, 약 1 ng 내지 약 10 ng, 약 10 ng 내지 약 50 ng, 약 50 ng 내지 약 150 ng, 약 150 ng 내지 약 250 ng, 약 250 ng 내지 약 500 ng, 약 500 ng 내지 약 750 ng, 약 750 ng 내지 약 1 μg, 약 1 μg 내지 약 10 μg, 약 10 μg 내지 약 50 μg, 약 50 μg 내지 약 150 μg, 약 150 μg 내지 약 250 μg, 약 250 μg 내지 약 500 μg, 약 500 μg 내지 약 750 μg, 약 750 μg 내지 약 1 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 1 mg 내지 약 100 mg, 또는 약 50 mg 내지 약 100 mg 범위의 양이다. 양은 1회 투여량이거나, 일일 총량일 수 있다. 일일 총량은 10 pg 내지 100 mg의 범위이거나, 100 mg 내지 약 500 mg의 범위이거나, 500 mg 내지 약 1000 mg의 범위일 수 있다.

일부 구현예에서, 대상 화합물의 1회 투여량이 투여된다. 다른 구현예에서, 대상 화합물의 다수의 투여량이 투여된다. 다수의 투여량이 일정 기간에 걸쳐 투여되는 경우, D-펩티드 화합물은 일정 기간에 걸쳐 1일 2회(qid), 1일 1회(qd), 2일 1회(qod), 3일마다 1회, 1주 3회(tiw), 또는 1주 2회(biw) 투여된다. 예를 들어, 화합물은 1일 내지 약 2년 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 qid, qd, qod, tip, 또는 biw로 투여된다. 예를 들어, 화합물은 다양한 인자에 따라, 1주, 2주, 1개월, 2개월, 6개월, 1년, 또는 2년 또는 그 이상 동안 전술한 빈도 중 어느 하나의 빈도로 투여된다.

다양한 방법 중 어느 하나를 사용하여 치료 방법이 효과적인지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법으로 치료를 받은 개체로부터 수득된 생물학적 샘플은 혈관신생의 존재 및/또는 정도에 대해 검정될 수 있다. 대상체에 대한 치료 방법의 효능 평가는 임의의 편리한 방법을 사용하여, 치료 전, 치료 도중, 및/또는 치료 후에 대상체를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 양태는 치료에 대한 대상체의 치료 반응을 평가하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은) 치료 중인 관심 질환 또는 병태와 연관된 대상체의 하나 이상의 증상을 진단하거나 평가하는 것을 포함하여, 대상체의 병태를 평가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하고, 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 관심 질환 또는 병태와 연관된 혈관신생의 존재에 대해 샘플을 검정하는 단계를 포함한다. 샘플은 세포 샘플일 수 있다. 일부 경우에, 샘플은 생검이다. 본 발명의 방법의 평가 단계(들)는 임의의 편리한 방법을 사용하여, 대상 화합물의 투여 전, 투여 도중, 및/또는 투여 후에 1회 이상 수행될 수 있다.

일부 경우에, 예를 들어, 본원에서 정의된 것과 같은 대상 화합물 또는 이의 염은 의약에 사용되고, 특히 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태를 예를 들어 PET에 의해 생체 내에서 진단 또는 영상화하는 데 사용된다. 소정의 구현예에서, 화합물은 검출 가능한 표지를 포함하는 변형된 화합물이고, 상기 방법은 대상체에게서 표지를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 표지의 선택은 검출 수단에 따라 달라진다. 임의의 편리한 표지 및 검출 시스템이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다(예를 들어,Baker의 문헌["The whole picture," Nature, 463, 2010, p977-980] 참조). 소정의 구현예에서, 화합물은 광학 검출에 적합한 형광 표지를 포함한다. 소정의 구현예에서, 화합물은 양전자 방출 단층촬영(PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)을 사용하는 검출을 위한 방사성 표지를 포함한다. 일부 경우에, 화합물은 단층촬영 검출에 적합한 상자성 표지를 포함한다. 일부 방법에서는 화합물이 표지되지 않고 보조 표지화제가 이미징에 사용되지만, 대상 화합물은 전술한 바와 같이 표지될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 방법은 표지된 유전자좌의 수, 크기, 및/또는 강도를 상응하는 베이스라인 값과 비교함으로써 대상체에서 질환 상태를 진단하는 단계를 포함한다. 베이스라인 값은 질환이 없는 대상체의 모집단에서의 평균 수준, 또는 동일한 대상체에서 결정된 이전 수준을 나타낼 수 있다.

일부 경우에, 방사성 표지된 화합물은 PET 영상화를 위해 원하는 신호를 생성하기에 충분한 양으로 대상체에게 투여될 수 있다. 소정의 사례에서, 방사성 핵종 투여량은 체중 70 kg당 충분한 0.01 내지 100 mCi, 예컨대 0.1 내지 50 mCi, 또는 1 내지 20 mCi이다. 따라서, 방사성 표지된 화합물은 임의의 편리한 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용해 투여되도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 부형제가 임의로 첨가된 화합물을 수성 매질에 현탁시키거나 용해시킨 다음, 생성된 용액 또는 현탁액을 멸균할 수 있다. 또한, 생체 내 영상화 방법(예: PET 영상화), 예컨대 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태의 영상화에 사용하기 위한 방사성 의약품의 제조를 위한 본원에 기술된 것과 같은 방사성 표지된 화합물 또는 이의 염의 용도가 제공되며; 상기 영상화 방법은, 인간 또는 동물 신체에 방사성 의약품의 투여하고, 상기 신체의 적어도 일부분의 이미지의 생성하는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 혈관신생과 연관된 질환 또는 병태를 생체 내에서 진단하거나 영상화하는 방법이며, 상기 방법은 방사성의약품을 상기 신체에, 예를 들어 혈관계 내로 투여하고, PET를 사용하여 상기 방사성의약품이 분포한 상기 신체의 적어도 일부의 이미지를 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 방사성의약품은 방사성표지된 화합물 또는 이의 염을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 혈관신생과 관련된 병태(예: 암)과 싸우는 인간 또는 동물 신체에 대한 약물(예: 세포독성제)에 의한 치료 효과를 모니터링하는 방법이며, 상기 방법은 방사성 표지된 화합물 또는 이의 염을 상기 신체에 투여하고, 내피 세포 수용체와 같은 세포 수용체(예: 알파.v.베타.3 수용체)에 의한 화합물의 흡수를 검출하는 단계를 포함하고, 투여와 검출은 반복적으로, 예를 들어 상기 약물에 의한 치료 이전, 도중, 및 이후에 수행된다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 혈관 신생과 관련된 질환 또는 병태의 생체 내 진단 또는 영상화를 위한 방법이며, 상기 방법은 D-펩티드 화합물을 대상체에게 투여하고, 및 대상체의 적어도 일부를 영상화하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 영상화하는 단계는 PET 영상화를 포함하고, 투여하는 단계는 화합물을 대상체의 혈관계에 투여하는 것을 포함한다. 일부 사례에서, 상기 방법은 세포 수용체에 의한 화합물의 흡수를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 사례에서, 표적은 VEGF-A이고 대상체는 인간이다. 소정의 구현예에서, 상기 방법은 치료 항체(예: 아바스틴)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 질환 또는 병태는 암과 관련된 병태이다.

본 발명의 방법은 특정 세포, 조직, 또는 혈청에서 표적 단백질의 발현을 시험관 내 또는 생체 내에서 검출하기 위한 진단 방법일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 방법은 대상체에서 표적 단백질의 생체 내 영상화를 위한 방법이다. 상기 방법은 표적 단백질과 관련된 질환 상태의 증상을 나타내는 대상체에게 화합물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 무증상이다. 본 발명의 방법은 이전에 질환을 진단받은 적인 대상체에서 질환 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 모니터링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

대상 VEGF-A 결합 화합물은 친화도 정제제로서 사용될 수 있다. 이러한 공정에서, 화합물은 임의의 편리한 방법을 사용하여, Sephadex 수지 또는 여과지와 같은 고상에 고정된다. 대상 VEGF-A 결합 화합물을 정제해야 할 VEGF-A 단백질(또는 이의 단편)이 포함된 샘플과 접촉시킨 후, 적절한 용매로 지지체를 세척하는데, 상기 용매는 고정된 화합물에 결합된 VEGF 단백질을 제외한 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거하게 된다. 마지막으로, 또 다른 적절한 용매(예컨대, 글리신 완충액, pH 5.0)로 지지체를 세척하는데, 상기 용매는 고정된 화합물로부터 VEGF-A 단백질을 방출시키게 된다.

대상 VEGF-A 결합 화합물은 VEGF-A 단백질에 대한 진단 분석에, 예를 들어, 특정 세포, 조직, 또는 혈청에서 VEGF-A 단백질의 발현을 검출하는 데 유용할 수도 있다. 이러한 진단 방법은 암 진단에 유용할 수 있다. 진단에 적용하기 위해, 대상 화합물을 전술한 바와 같이 변형할 수 있다.

병용 요법

일부 구현예에서, 대상 화합물은 하나 이상의 추가 활성제 또는 요법과 병용으로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 표적화되는 질환을 치료하는 데 유용한 화합물을 포함하는 임의의 편리한 제제가 사용될 수 있다. 용어 "제제", "화합물", 및 "약물"은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 추가 활성제 또는 요법은 저분자, 항체, 항체 단편, 앱타머, L-단백질, 제2 D-펩티드 화합물과 같은 제2 표적 결합 분자, 화학요법제, 수술, 카테터 장치, 및 방사선을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 병용 요법은 대상 화합물 및 하나 이상의 추가 제제를 함유하는 단일 약학적 투여 제형을 투여하는 것 뿐만 아니라; 대상 화합물 및 하나 이상의 추가 제제(들) 그 자체를 별도의 약학적 투여 제형으로서 투여하는 것도 포함한다. 예를 들어, 대상 화합물 및 세포독성제, 화학요법제 또는 성장 억제제가 단일 투여량 조성물(예: 합쳐진 제형)로 함께 환자에게 투여되거나, 각각의 제제가 별도의 투여 제형으로 투여될 수 있다. 별도의 투여 제형이 사용되는 경우, 대상 화합물 및 하나 이상의 추가 제제는 동시에 투여되거나, 별도로 시차를 두고 (예를 들어, 순차적으로) 투여될 수 있다.

용어 "공동 투여(co-administration)" 및 "병용(in combination with)"은 2가지 이상의 치료제(예: D-펩티드 화합물 및 제2 제제)를 동시에, 공동으로, 또는 특정 시간 제한 없이 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 세포 또는 대상체의 신체에 동시에 존재하거나, 이들의 생물학적 또는 치료적 효과를 동시에 발휘한다. 일 구현예에서, 치료제는 동일한 조성물 또는 단위 투여 형태 내에 있다. 다른 구현예에서, 치료제는 별도의 조성물 또는 단위 투여 형태 내에 있다. 특정 구현예에서, 제1 제제(예를 들어, D-펩티드 화합물)는 제2 치료제의 투여 이전에 (예를 들어, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 이전에), 제2 치료제와 동시에, 또는 제2 치료제의 투여에 이어서(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후에) 투여될 수 있다.

알려진 치료제와 본 개시의 약학적 조성물의 "병용 투여(concomitant administration)"는 알려진 약물과 본 개시의 조성물 모두가 치료 효과를 갖도록 하는 시간에 D-펩티드 화합물 및 제2 제제를 투여하는 것을 의미한다. 이러한 병용 투여는 대상 D-펩티드 화합물의 투여와 관련하여 약물을 동시에(즉, 같은 시간에), 이전에, 또는 이후에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 두 제제의 투여 경로는 다를 수 있으며, 대표적인 투여 경로는 이하에서 더욱 상세히 기술된다. 당업자는 본 개시의 특정 약물 및 화합물에 대한 적절한 투여 시기, 순서, 및 투여량을 결정하는 데 어려움이 없을 것이다.

일부 구현예에서, 화합물(예: 대상 D-펩티드 화합물 및 제2 제제)은 서로 24시간 이내에, 예컨대 서로 12시간 이내에, 서로 6시간 이내에, 서로 3시간 이내에, 또는 서로 1시간 이내에 대상체에게 투여된다. 소정의 구현예에서, 화합물은 서로 1시간 이내에 투여된다. 소정의 구현예에서, 화합물은 실질적으로 동시에 투여된다. 실질적으로 동시에 투여된다는 것은, 화합물들이 서로 약 10분 이하, 예컨대 5분 이하, 또는 서로 1분 이하 이내에 대상체에게 투여되는 것을 의미한다.

또한, 대상 화합물 및 제2 활성제의 약학적 제제가 제공된다. 약학적 투여 형태에 있어서, 화합물들은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 투여되거나 단독으로 사용될 수도 있고, 다른 약학적으로 활성인 화합물과 적절히 함께 사용될 뿐만 아니라 병용으로 사용될 수도 있다.

체중 kg당 1일 약 0.01 mg에서 약 140 mg/까지 순서의 투여량 수준, 또는 대안적으로 환자당 1일 약 0.5 mg 내지 약 7 g의 투여량 수준이 대표적인 구현예에서 유용하다. 당업자는 투여량 수준이 특정 화합물, 증상의 중증도, 및 부작용에 대한 대상체의 감수성의 함수로서 달라질 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 주어진 화합물에 대한 투여량은 다양한 수단에 의해 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

단일 투여 형태를 생산하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 인간에게 경구 투여하기 위한 제형은 담체 물질의 적절하고 편리한 양과 화합된 0.5 mg 내지 5 g의 활성제를 함유할 수 있으며, 담체 물질의 양은 전체 조성물의 약 5%에서 약 95%까지 가변할 수 있다. 투여 단위 형태는 일반적으로 약 1 mg 내지 약 500 mg, 예컨대 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 800 mg, 또는 1000 mg의 활성 성분을 함유하게 된다.

그러나, 임의의 특정 환자에 대한 특정 투여량 수준은 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 식단, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도, 병용 약물, 및 치료 중인 특정 질환의 중증도를 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다.

임의의 편리한 제2 제제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 제2 활성제는 다음으로부터 선택된 표적 단백질에 특이적으로 결합한다: 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, EGF, EGFR, Her2, PD-1, PD-L1, OX-40, LAG3, Ang2, IL-1, IL-6, 및 IL-17. 관심 제2 활성제는 페그플레라닙(pegpleranib) (Fovista), 라니비주맙(ranibizumab) (Lucentis), 트라스투주맙(trastuzumab) (Herceptin), 베바시주맙(Bevacizumab) (Avastin), 애플리버셉트(aflibercept) (Eylea), 니볼루맙(nivolumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 더발루맙(Durvalumab), 게피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 및 펨블롤리주맙(Pembrolizumab)을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

암 치료를 위해, 대상 화합물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학요법제와 병용 투여될 수 있다: 탁산, 뉴클레오시드 유사체, 스테로이드, 안트라시클린, 갑상선 호르몬 대체 약물, 티미딜레이트 표적 약물, 키메라 항원 수용체/T 세포 요법, 키메라 항원 수용체/NK 세포 요법, 세포자멸사 조절인자 억제제(예: B 세포 CLL/림프종 2(BCL-2) BCL-2 유사 1(BCL-XL) 억제제), CARP-1/CCAR1 (세포 분열 주기 및 세포자멸사 조절인자 1) 억제제, 콜로니-자극 인자-1 수용체(CSF1R) 억제제, CD47 억제제, 암 백신(예: Th17-유도성 수지상 세포 백신), 및 기타 세포 요법. 특정 화학요법제는, 예를 들어, 젬시타빈(Gemcitabine), 도세탁셀(Docetaxel), 블레오마이신(Bleomycin), 엘로티닙(Erlotinib), 게피티닙(Gefitinib), 라파티닙(Lapatinib), 이마티닙(Imatinib), 다사티닙(Dasatinib), 닐로티닙(Nilotinib), 보수티닙(Bosutinib), 크리조티닙(Crizotinib), 세리티닙(Ceritinib), 트라메티닙(Trametinib), 베바시주맙(Bevacizumab), 수니티닙(Sunitinib), 소라페닙(Sorafenib), 트라스투주맙(Trastuzumab), 아도-트라스투주맙 엠탄신(Ado-trastuzumab emtansine), 리툭시맙(Rituximab), 이필리무맙(Ipilimumab), 라파마이신(Rapamycin), 템시롤리무스(Temsirolimus), 에베롤리무스(Everolimus), 메토트렉세이트(Methotrexate), 독소루비신(Doxorubicin), 아브락산(Abraxane), 폴피리녹스(Folfirinox), 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 테이수모(Teysumo), 파클리탁셀(Paclitaxel), 프레드니손(Prednisone), 레보티록신(Levothyroxine), 페메트렉시드(Pemetrexed), 나비토클락스(navitoclax), ABT-199를 포함한다.

암(예: 흑색종, 비소세포 폐암, 또는 호지킨 림프종과 같은 림프종)의 치료를 위해, 대상 화합물은 면역 관문 억제제와 병용 투여될 수 있다. 세포독성 T-림프구 관련 항원 4(CTLA-4) 억제제, 예정 사멸 1 (PD-1) 억제제, 및 PD-L1 억제제를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 편리한 관문 억제제가 사용될 수 있다. 예시적인 관심 관문 억제제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙, 및 니볼루맙을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 소정의 구현예에서, 암 및/또는 염증성 질환의 치료를 위해, 대상 화합물은 콜로니-자극 인자-1 수용체(CSF1R) 억제제와 병용 투여될 수 있다. 관심 CSF1R 억제제는 에막투주맙을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

임의의 편리한 암 백신 요법 및 제제는 본 발명의 면역 조절 폴리펩티드 조성물 및 방법과 병용으로 사용될 수 있다. 암(예: 난소암)의 치료를 위해, 대상 화합물은 백신접종 요법, 예를 들어 Th1/Th17 면역을 촉진하는 수지상 세포(DC) 백신제와 변용 투여될 수 있다. Th17 세포 침윤은 난소암 환자에서 현저하게 연장된 전체 생존기간과 상관 관계가 있다. 일부 경우에, 면역조절 폴리펩티드는 Th17-유도성 백신접종과 병용하는 보조 치료제로서 사용된다.

또한, Rishi 등의 문헌[Journal of Biomedical Nanotechnology, Volume 11, Number 9, September 2015, pp. 1608-1627(20)]에 기술된 것들을 포함하되 이들로 한정되지 않는 CARP-1/CCAR1 (세포 분열 주기 및 세포 사멸 조절인자 1) 억제제, 및 Hu5F9-G4와 같은 항-CD47 항체 제제를 포함하되 이에 한정되지 않는 CD47 억제제인 제제가 관심을 받고 있다.

유용성

예를 들어 전술한 것과 같은 본 발명의 화합물은 다양한 응용예에서 사용된다. 관심 응용예는 치료 응용예, 연구 응용예, 및 스크리닝 응용예를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 상이한 응용예의 각각을 이제 아래에서 더 자세히 검토한다.

치료 응용예

본 발명의 화합물은 다양한 치료 응용예에서 사용된다. 관심 치료 응용예는 표적의 활성이 질환 진행의 원인 또는 복합 인자인 응용예들을 포함한다. 이와 같이, 대상 화합물은 숙주에서 표적 활성의 조절이 바람직한 다양한 상이한 병태의 치료에 사용된다.

대상 화합물은 이의 표적 VEGF-A와 관련된 장애를 치료하는 데 유용하다. 본 발명의 화합물로 치료될 수 있는 질환 상태의 예는 위에 기술되어 있다.

특정 구현예에서, 질환 상태는 암, 혈관신생의 억제 및 전이, 골관절통, 만성 요통, 암 관련 통증, 연령 관련 황반 변성(AMD), 당뇨병성 황반 부종(DME), 특발성 폐 섬유증(IPF), 및 이식된 각막의 이식편 생존을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

일 구현예에서, 본 개시는 VEGF-A 관련 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 VEGF-A 관련 장애를 가진 대상체에게 대상 화합물을 VEGF-A 관련 장애의 적어도 하나의 증상을 치료하기에 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다. VEGF-A 관련 병태는 일반적으로 과도한 혈관 내피 세포 증식, 혈관 투과성, 부상과 관련된 뇌 부종과 같은 부종 또는 염증, 뇌졸중 또는 종양; 류마티스 관절염을 포함하는 관절염 또는 건선과 같은 염증성 장애와 관련된 부종; 천식; 화상과 관련된 전신 부종; 종양, 염증 또는 외상과 관련된 복수 및 흉막 삼출; 만성 기도 염증; 모세관 누출 증후군; 패혈증; 단백질 누출 증가와 관련된 신장 질환; 및 안구 장애, 예컨대 연령 관련 황반 변성 및 당뇨성 망막병증을 특징으로 한다. 이러한 병태는 유방암, 폐암, 대장암, 및 신암을 포함한다.

연구 응용예

본 발명의 화합물 및 방법은 다양한 연구 응용예에서 사용된다. 대상 화합물 및 방법은 혈관신생, 염증, 세포 성장, 대사, 전사 조절, 및 인산화 조절을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 생물학적 과정을 조절하는 데 있어서 표적 단백질의 역할을 분석하는 데 사용될 수 있다. 항체와 같은 다른 표적 단백질 결합 분자는 유사한 생물학적 연구에서 유사하게 유용하다. 예를 들어, Sidhu 및 Fellhouse의 문헌["Synthetic therapeutic antibodies," Nature Chemical Biology, 2006, 2(12), 682-688] 참조. 이러한 방법은 대상 화합물 및 방법의 다양한 연구 응용예에 사용하도록 쉽게 변형될 수 있다.

진단 응용예

대상 화합물 및 방법은 임상 진단, 예를 들어, 시험관 내 진단 또는 생체 내 종양 촬상제의 개발을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 진단 응용예에서 사용된다. 이러한 응용예는 질환 상태 또는 이에 대한 감수성을 진단하거나 진단을 확인하는 데 유용하다. 상기 방법은 이전에 질환으로 진단받은 적인 환자에서 질환 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 모니터링하는 데에도 유용하다.

관심 진단 응용예는 암, 혈관신생의 억제 및 전이, 골관절통, 만성 요통, 암 관련 통증, 연령 관련 황반 변성(AMD), 당뇨병성 황반 부종(DME), 특발성 폐 섬유증(IPF), 및 이식된 각막의 이식편 생존을 포함하지만 이에 한정되지 않는 질환 상태, 예컨대 전술한 병태들의 진단을 포함한다. 일부 방법에서, 동일한 화합물이 치료 및 진단 시약 둘 다의 역할을 할 수 있다.

앱타머 및 항체와 같은 다른 표적 단백질 결합 분자도 임상 진단의 개발에 사용되어 왔다. 이러한 방법은 대상 화합물 및 방법의 다양한 진단 응용예에 사용하도록 쉽게 변형될 수 있다. 예를 들어, Jayasena의 문헌["Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics," Clinical Chemistry, 1999, 45, 1628-1650] 참조.

약학적 제제

약학적 제제가 또한 제공된다. 약학적 제제는 약학적으로 허용 가능한 비히클에 존재하는 화합물을 (단독으로 또는 하나 이상의 추가 활성제의 존재 하에) 포함하는 조성물이다. "약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 인간과 같은 포유동물에게 사용하도록 미국 연방 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거되어 있음을 의미한다. 용어 "비히클"은 본 발명의 화합물이 포유동물에게 투여되도록 함께 제형화되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 담체를 지칭한다. 이러한 약학적 비히클은 물 및 오일과 같은 액체일 수 있으며, 이에는 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등이 포함된다. 약학적 비히클은 식염수, 검 아카시아, 젤라틴, 전분 페이스트, 탈크, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 우레아 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 윤활제, 및 착색제가 사용될 수 있다. 포유동물에게 투여될 때, 본 발명의 화합물 및 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 비히클, 부형제, 또는 희석제는 멸균 상태일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 화합물이 정맥내 투여되는 경우, 물, 식염수, 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액과 같은 수성 매질이 비히클로서 사용된다.

약학적 조성물은 캡슐, 정제, 알약, 펠릿, 캔디, 분말, 과립, 시럽, 엘릭서, 용액, 현탁액, 유화액, 좌제, 또는 이들의 서방형 제형의 형태를 치하거나, 포유동물에게 투여하기에 적합한 임의의 다른 형태를 취할 수 있다. 일부 사례에서, 약학적 조성물은 인간에게 경구 또는 정맥 내 투여에 적합한 약학적 조성물로서 일상적인 절차에 따라 투여되도록 제형화된다. 적절한 약학적 비히클 및 이의 제형화 방법의 예는 참조로서 본원에 통합된 Remington의 문헌[The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, Pa., 19th ed., 1995, Chapters 86, 87, 88, 91, and 92]에 기술되어 있다.

부형제의 선택은 특정 화합물에 의해서 뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해서도 부분적으로 결정될 것이다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물의 매우 다양한 적절한 제형이 있다.

본 개시의 화합물의 투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 소정의 구현예에서, 포유동물에 대한 투여는 본 발명의 화합물의 전신 방출(예를 들어, 혈류 내로의 방출)을 초래할 것이다. 투여 방법은 구강, 설하, 및 직장과 같은 경구 경로; 경피 및 피내와 같은 국소 투여; 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 적절한 비경구 경로는 피하 바늘 또는 카테터를 통한 주사(예: 정맥내, 근육내, 피하, 피부내, 복강내, 동맥내, 뇌실내, 경막내, 및 카메라내 주사); 및 비-주사 경로(예: 질내, 직장, 또는 비강 투여)를 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 경구 투여된다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물을 치료를 필요로 하는 영역에 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어, 수술 중 국소 주입, (예를 들어, 수술 후 상처를 드레싱하면서) 국소 도포에 의하거나, 주사에 의하거나, 카테터에 의하거나, 좌제에 의하거나, 임플란트에 의해 달성될 수 있으며, 상기 임플란트는 막(예: 실라스틱 막) 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴성 물질이다.

대상 화합물은 이들을 수성 또는 비수성 용매(예: 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방족 산 글리세리드, 지방산이 높은 에스테르, 또는 폴리에틸렌 글리콜)에 용해, 현탁, 또는 유화시키고; 필요에 따라, 가용화제, 등장화제, 현탁제, 유화제, 안정화제, 및 보존제와 같은 종래의 첨가제와 함께 주사용 제제로 제형화할 수 있다.

일부 구현예에서, 경구 투여에 적합한 제형은 (a) 용액, 예컨대 물이나 식염수와 같은 희석제에 화합물의 유효량을 용해시킨 것; (b) 각각 소정의 양의 활성 성분을 고형분 또는 과립으로서 함유하는 캡슐, 주머니, 또는 정제; (c) 적절한 액체 중의 현탁액; 및 (d) 적절한 유화액을 포함할 수 있다. 정제 형태는 락토오스, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 미정질 셀룰로오스, 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 크로스카멜로오스 나트륨, 탈크, 스테아린산 마그네슘, 스테아르산, 및 기타 부형제, 착색제, 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제, 향미제, 및 약리학적으로 호환 가능한 부형제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 캔디 형태는 향미제(일반적으로, 수크로오스 및 아카시아 또는 트라가칸스임) 중에 활성 성분을 포함할 수 있을 뿐 아니라, 불활성 염기(예: 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아) 중에 활성 성분을 포함할 수도 있고, 활성 성분 외에 본원에 기술된 것과 같은 부형제를 함유하는 유화액, 겔 등을 포함할 수 있다.

대상 제형은 흡입을 통해 투여하기 위한 에어로졸 제형으로 만들어질 수 있다. 이들 에어로졸 제형은 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 가압된 허용 가능한 분사제 내에 배치될 수 있다. 이들은, 예컨대 네블라이저 또는 분무기에 사용하기 위한 비-가압식 제제용 약제로서 제형화될 수도 있다.

일부 구현예에서, 비경구 투여에 적합한 제형은, 항산화제, 완충제, 박테리오스타트, 및 의도된 피치료자의 혈액과의 등장성을 제형에 부여하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성, 등장성 멸균 주사 용액; 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 앰플 및 바이알과 같은 시일된 단위 투여량 또는 다회 투여량 용기에 제공될 수 있고, 동결 건조된(동결 건조된) 상태로 보관될 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 부형제(예를 들어, 주사수)만 첨가하면 된다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기술된 종류의 멸균 분말, 과립, 및 정제로 제조할 수 있다.

국소 투여에 적합한 제형은 활성 성분 이외에 적절한 담체를 함유하는 크림, 겔, 페이스트, 또는 발포체로서 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 국소 제형은 구조화제, 증점제 또는 겔화제, 및 연화제 또는 윤활제로부터 선택된 하나 이상의 성분을 함유한다. 빈번하게 사용되는 구조화제(structuring agent)는 장쇄 알코올(예: 스테아릴 알코올), 및 글리세릴 에테르 또는 에스테르 및 올리고(에틸렌 옥사이드) 에테르 또는 이의 에스테르를 포함한다. 증점제 및 겔화제는, 예를 들어, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 이의 에스테르, 폴리아크릴아미드, 및 자연 발생 증점제(예: 한천, 카라기난, 젤라틴, 및 구아 검)를 포함한다. 연화제의 예는 중성지방 에스테르, 지방산 에스테르 및 아미드, 밀랍과 같은 왁스, 경랍(spermaceti), 또는 카르나우바 왁스, 인지질(예: 레시틴), 및 스테롤 및 이의 지방산 에스테르를 포함한다. 국소 제형은 다른 성분, 예를 들어, 수렴제, 방향제, 색소, 피부 침투 강화제, 차광제(예: 자외선 차단제) 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 개시의 화합물은 경구 투여용으로도 제형화될 수 있다. 경구 약학적 제형의 경우, 적절한 부형제는 만니톨, 락토오스, 글루코스, 수크로오스, 전분, 셀룰로오스, 젤라틴, 스테아린산 마그네슘, 사카린 나트륨, 및/또는 탄산마그네슘과 같은 약학적 등급의 담체를 포함한다. 경구 액체 제형에 사용하기 위해, 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 또는 시럽으로서 제조될 수 있고, 예를 들어, 식염수 용액, 덱스트로스 용액, 글리세롤 용액, 글리세롤, 또는 에탄올, 바람직하게는 물 또는 보통의 식염수와 같은 수성 담체 중에서 수화시키기에 적합한 고형분 또는 액체 형태로 공급될 수 있다. 원하는 경우, 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대 습윤제, 유화제, 또는 완충제를 함유할 수도 있다. 본 발명의 화합물은 종래에 이용 가능한 것과 같은 기존의 건강기능식품 제형에 통합될 수도 있고, 여기에 약초 추출물을 포함할 수도 있다.

경구 또는 직장 투여용 단위 투여 형태(예: 시럽, 엘릭서 및 현탁액)가 제공될 수 있으며, 여기서 각각의 투여 단위(예: 티스푼 단위, 테이블스푼 단위, 정제, 또는 좌제)는 하나 이상의 억제제를 함유하는 소정의 양의 조성물을 함유한다. 유사하게, 주사 또는 정맥내 투여용 단위 투여 형태는 멸균수, 보통의 식염수, 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 담체 중의 용액으로서 억제제(들)를 조성물에 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "단위 투여 형태"는 인간 및 동물 대상체를 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 이산된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체, 또는 비히클과 함께 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된 소정의 양의 본 발명의 화합물을 함유한다. 본 발명의 신규한 단위 투여 형태에 대한 사양은 사용되는 특정 화합물 및 달성할 효과, 및 숙주에서 각 화합물과 연관된 약력학에 따라 달라질 것이다.

투여량 수준은 특정 화합물, 전달 비히클의 성질 등의 함수로서 달라질 수 있다. 주어진 화합물에 대한 바람직한 투여량은 다양한 수단에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본 발명의 맥락에서 동물, 특히 인간에게 투여되는 투여량은, 예를 들어, 후술되는 바와 같이, 합리적인 기간에 걸쳐 동물에서 예방적 또는 치료적 반응에 생성하기에 충분해야 한다. 투여량은 사용된 특정 화합물의 강도, 동물의 병태, 및 동물의 체중뿐만 아니라 질환의 중증도 및 질환의 병기를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라지게 된다. 투여량의 크기는 특정 화합물의 투여에 수반될 수 있는 임의의 해로운 부작용의 존재, 성질, 및 정도에 의해서도 결정된다.

약학적 투여 형태에 있어서, 화합물들은 유리 염기 형태, 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 투여되거나 단독으로 사용될 수도 있고, 다른 약학적으로 활성인 화합물과 적절히 함께 사용될 뿐만 아니라 병용으로 사용될 수도 있다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 표적 단백질에 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 대상 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 비히클을 포함한다. 소정의 구현예에서, 표적 단백질은 VEGF 단백질이고 대상 화합물은 VEGF 길항제이다.

키트

본 개시의 화합물을 포함하는 키트가 또한 제공된다. 본 개시의 키트는 화합물의 1회 이상의 투여량, 및 임의로 하나 이상의 추가 활성제의 1회 이상의 투여량을 포함할 수 있다. 편리하게는, 제형은 단위 투여량 포맷으로 제공될 수 있다. 이러한 키트에는, 제형(들)(예: 단위 투여량)이 담기는 용기에 추가하여, 본 발명의 방법에서 대상 제형의 용도를 기술하는 정보 패키지 삽입물, 예를 들어, 병원성 혈관신생과 관련된 세포 질환을 치료하기 위해 대상 단위 투여량을 사용하기 위한 지침이 포함된다. 키트라는 용어는 포장된 활성제(들)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상 시스템 또는 키트는 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은) 대상 화합물의 투여량 및 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은) 제2 활성제의 투여량을 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은) 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태에 대해 대상체를 치료하기에 효과적인 양으로 포함한다.

전술한 구성 요소에 추가하여, 대상체 키트는, 예를 들어, 본 발명의 방법을 실시하기 위해 키트의 구성 요소를 사용하기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 지침은 일반적으로 적절한 기록 매체 상에 기록된다. 예를 들어, 지침은 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기판 상에 인쇄될 수 있다. 이와 같이, 지침은 패키지 삽입물로서 키트에 존재하거나, 키트 또는 이의 구성 요소의 용기 상의 라벨링으로서 (즉, 포장 또는 하위 포장과 결합된 상태로) 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 지침은 적절한 컴퓨터 판독 가능 저장 매체, 예를 들어 CD-ROM, 디스켓, 하드 디스크 드라이브(HDD), 휴대용 플래시 드라이브 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 또 다른 구현예에서, 실제 지침은 키트에 존재하지 않지만, 예를 들어, 인터넷을 통해 원격 소스로부터 지침을 얻기 위한 수단이 제공된다. 본 구현예의 일례는, 지침을 볼 수 있고/있거나 지침을 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 지침과 마찬가지로, 지침을 얻기 위한 이러한 수단은 적절한 기판 상에 기록된다.

일부 구현예에서, 키트는 대상 약학적 조성물의 제1 투여량 및 대상 약학적 조성물의 제2 투여량을 포함한다. 소정의 구현예에서, 키트는 제2 혈관신생 조절제를 추가로 포함한다.

본 발명은 기술된 특정 구현예에 한정되지 않으며, 물로 이와 같이 변경될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정될 것이므로, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 한정하도록 의도되지 않는다는 것도 이해해야 한다.

값의 범위가 제공되는 경우, 해당 범위의 상한과 하한 사이에 있는 각각의 개재된 값 및 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 또는 개재된 값은, 문맥상 명시적으로 달리 표시되지 않는 한, 하한 단위의 10분의 1 단위까지 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 본 발명에 포함되며, 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 상한/하한이 적용된다. 언급된 범위가 상한과 하한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 상한/하한 중 하나 또는 둘 다를 배제한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.

소정의 범위는 용어 "약"이 선행하는 수치 값으로 본원에서 제시된다. 용어 "약"은 이 용어가 선행하는 정확한 수 뿐만 아니라, 이 용어가 선행하는 수에 가깝거나 대략적으로 해당하는 수를 말 그대로 뒷받침하도록 본원에서 사용된다. 수가 구체적으로 인용된 수에 가깝거나 대략 해당하는지 여부를 결정할 때, 가깝거나 대략적으로 해당하는 인용되지 않은 수는, 이 수가 제시되는 맥락에서, 구체적으로 인용된 수의 실질적인 동등성을 제공하는 수일 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있지만, 대표적인 예시적인 방법 및 물질이 이제부터 기술된다.　

본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조로서 통합되는 것으로 표시된 것처럼 본원에 참조로서 통합되고, 인용된 간행물과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기술하도록 참조로서 본원에 통합된다. 임의의 공개 문헌을 인용하는 것은 출원일 전에 개시를 위한 것이며, 본 발명이 이전 발명으로 인해 이러한 공개를 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공된 공개 날짜는 독립적으로 확인되어야 할 필요가 있는 실제 공개 날짜와 다를 수 있다.

본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백히 달리 지시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다. 추가로, 청구범위는 임의의 임의 요소를 배제하도록 초안이 작성될 수 있다는 것에 유의해야 한다. 이와 같이, 본 명세서는 청구 요소의 인용 또는 "부정적인" 제한의 사용과 관련하여 "전적으로", "오직" 등과 같은 배타적인 용어 사용에 대한 선행 근거로서의 역할을 한다.

본 개시를 읽을 때 당업자에게 명백해지는 바와 같이, 본원에 기술되고 예시된 각각의 개별 구현예는 본 발명의 범주 또는 사상을 벗어나지 않고도 다른 여러 구현예 중 어느 하나의 특징과 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 이산적 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 이벤트의 순서로 수행되거나 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.

장치 및 방법은 기능적 설명과 함께 문법적 유동성을 위해 기술되었거나 기술될 것이지만, 35 U.S.C. §112에 따라 명시적으로 공식화되지 않는 한, 청구범위는 "수단" 또는 "단계" 제한의 구성에 의해 어떤 식으로도 필수적으로 제한되는 것으로 해석되는 것이 아니라, 사법적 균등론에 따라 청구범위에 의해 제공된 정의의 의미와 균등의 전체 범위를 따라야 하며, 35 U.S.C. §112에 따라 청구범위가 명시적으로 공식화된 경우, 35 U.S.C. §112에 따라 완전한 법적 등가성이 부여되어야 한다.

정의

용어 "펩티드(peptidic)"는 폴리펩티드로서 함께 연결된 아미노산 잔기로 주로 구성되는 모이어티를 지칭한다. 용어 "펩티드"는 종래의 폴리펩티드 서열의 하나, 둘, 또는 그 이상의 잔기가 펩티드모방체로 치환된 화합물을 포함하는 것을 의미한다. 펩티드모방체는 펩티드 또는 아미노산 잔기를 모방하도록 설계된 작은 유기 기이다. 펩티드 모이어티의 펩티드모방 기는 종래의 폴리펩티드 백본에 연결된 비-자연 발생 또는 합성 백본 기 및 임의의 편리한 관심 아미노산 잔기의 측쇄 기를 모방하는 임의의 측쇄 기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 주로 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드 화합물은 부모 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 10개당 2개 이하의 잔기가 펩티드모방체 모이어티로 치환된 것이다. 임의의 편리한 펩티드모방체 기 및 화학물질이 대상 펩티드 화합물에 사용될 수 있다. 용어 펩티드는 또한 2개 이상의 관심 펩티드 화합물이 공유 결합되어 있는 다량체 펩티드 화합물을 포함하는 것을 의미한다. 용어 펩티드는 또한 비-단백질성 모이어티가 화합물에 공유 결합된, 변형된 펩티드 화합물을 포함하는 것을 의미한다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭하도록 상호 교환적으로 사용된다. 달리 명시되지 않는 한, "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 유전적으로 암호화된 아미노산 및 비-암호화된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 백본을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 용어는 하나 이상의 종래의 아미노산이 비-자연 발생 또는 합성 아미노산으로 대체된 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 임의의 길이, 예를 들어, 2개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 20개 이상의 아미노산, 30개 이상의 아미노산, 40개 이상의 아미노산, 50개 이상의 아미노산, 60개 이상의 아미노산, 100개 이상의 아미노산, 300개 이상의 아미노산, 500개 이상의 아미노산, 또는 1000개 이상의 아미노산의 길이일 수 있다.

본원에 도시된 폴리펩티드 서열 및 모티프의 경우, 달리 언급되지 않는 한, 대문자 코드는 L-아미노산 잔기를 지칭하고 소문자 코드는 D-아미노산 잔기를 지칭한다. 아미노산 잔기 글리신은 G 또는 Gly로서 표시된다. "a"는 알라닌이다. "c"는 시스테인이다. "d"는 아스파르트산이다. "e"는 글루탐산이다. "f"는 페닐알라닌이다. "h"는 히스티딘이다. "i"는 이소류신이다. "k"는 리신이다. "l"은 류신이다. "m"은 메티오닌이다. "n"은 아스파라긴이다. "o"는 오르니틴이다. "p"는 프롤린이다. "q"는 글루타민이다. "r"은 아르기닌이다. "s"는 세린이다. "t"는 트레오닌이다. "v"는 발린이다. "w"는 트립토판이다. "y"는 티로신이다. 본원에 기술된 임의의 서열 및 모티프, 예를 들어, VEGF-A에 특이적으로 결합하는 펩티드 화합물을 정의하는 서열의 경우, VEGF-A의 미러 이미지에 특이적으로 결합하는 미러 이미지 화합물도 포함되는 것으로 이해된다. 본 개시는 대상 화합물의 두 버전, 예를 들어, D-VEGF-A에 특이적으로 결합하는 L-펩티드 화합물 및 L-VEGF-A에 특이적으로 결합하는 D-펩티드 화합물 모두를 포함하는 것을 의미한다. D-VEGF-A 단백질은 주로 다양한 시험관 내 응용예에서 표적화될 수 있는 반면, L-VEGF-A 단백질은 다양한 시험관 내 및/또는 생체 내 응용예에서 표적화될 수 있는 것으로 이해된다.

아미노산 잔기의 "유사체"라는 용어는 기준 아미노산 잔기의 측쇄기의 구조적 및/또는 기능적 유사체인 측쇄기를 갖는 잔기를 지칭한다. 일부 경우에, 아미노산 유사체는 하나 이상의 천연 아미노산의 백본 구조 및/또는 측쇄 구조를 공유하며, 차이(들)는 분자에서 하나 이상의 변형된 기이다. 이러한 변형은 원자(예컨대, N)가 관련 원자(예컨대, S)로 치환되는 것, 기(예컨대, 메틸, 또는 하이드록실 등) 또는 원자(예컨대, F, Cl, 또는 Br 등)의 첨가, 기의 결실, 공유 결합의 치환(예컨대, 단일 결합이 이중 결합으로 치환되는 것), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 아미노산 유사체는 α-하이드록시산, 및 α-아미노산 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 아미노산 잔기의 유사체는 아미노산의 치환된 버전이다. 아미노산 잔기의 "치환된 버전"이란 용어는 기준 아미노산 잔기의 측쇄에 존재하지 않는 하나 이상의 추가 치환기를 측쇄기 상에 포함하는 측쇄기를 갖는 잔기를 지칭한다.

용어 "방향족 아미노산" 및 "방향족 잔기"는 측쇄기가 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴기를 포함하는 아미노산 잔기를 지칭하도록 상호 교환적으로 사용된다. 일부 경우에, 측쇄기는 아릴-알킬, 치환된 아릴-알킬, 헤테로아릴-알킬, 또는 치환된 헤테로아릴-알킬기이다. 상기 용어는 자연 발생 및 비-자연 발생 알파-아미노산을 포함하는 것을 의미한다. 관심 자연 발생 방향족 잔기는 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 및 히스티딘을 포함한다.

용어 "카보시클릭 아미노산" 및 "카보시클릭 잔기"는 측쇄기가 아릴 또는 포화 탄소고리기를 포함하는 아미노산 잔기를 지칭하도록 상호 교환적으로 사용된다. 일부 경우에, 측쇄기는 시클로알킬-알킬 또는 치환된 시클로알킬-알킬기이다. 관심 비-자연 발생 측쇄기는 시클로헥실-CH₂-, 시클로펜틸-CH₂, 시클로헥실-(CH₂)₂-, 및 시클로펜틸-(CH₂)₂-를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

용어 "헤테로시클릭 아미노산" 및 "헤테로시클릭 잔기"는 측쇄기가 헤테로아릴기 또는 포화 헤테로시클릭기와 같은 헤테로시클릭기를 포함하는 아미노산 잔기를 지칭하도록 상호 교환적으로 사용된다. 일부 경우에, 측쇄기는 헤테로고리-알킬 또는 치환된 헤테로고리-알킬기이다. 상기 용어는 자연 발생 및 비-자연 발생 알파-아미노산을 포함하는 것을 의미한다. 관심 자연 발생 헤테로시클릭 잔기는 트립토판 및 히스티딘을 포함한다.

용어 "비극성 아미노산 잔기" 및 "비극성 잔기"는 수소(즉, G) 또는 비극성 기인 측쇄를 포함하는 아미노산 잔기를 지칭한다. 일부 경우에, 비극성 아미노산 측쇄는 소수성 기이다. 상기 용어는 자연 발생 및 비-자연 발생 알파-아미노산을 포함하는 것을 의미한다. 관심 자연 발생 비극성 아미노산 잔기는 자연 발생 소수성 잔기를 포함한다.

용어 "소수성 아미노산" 및 "소수성 잔기"는 측쇄 기가 소수성 기인 아미노산 잔기를 지칭하도록 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어는 자연 발생 및 비-자연 발생 알파-아미노산을 포함하는 것을 의미한다. 관심 자연 발생 소수성 잔기는 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 프롤린, 및 발린을 포함한다.

용어 "극성 아미노산" 및 "극성 잔기"는 측쇄 기가 극성 기 또는 하전된 기를 포함하는 아미노산 잔기를 지칭하도록 상호 교환적으로 사용된다. 소정의 경우에, 극성 기는 수소 결합 공여자 또는 수용자가 될 수 있다. 상기 용어는 자연 발생 및 비-자연 발생 알파-아미노산을 포함하는 것을 의미한다. 관심 자연 발생 극성 잔기는 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 글루탐산, 글루타민, 및 트립토판을 포함한다.

용어 "스캐폴드" 및 "스캐폴드 도메인"은 상호 교환적으로 사용되며, 대상 펩티드 화합물이 생성된 기준 펩티드 프레임워크 모티프, 또는 대상 펩티드 화합물이 예를 들어 서열 또는 구조 정렬 방법을 통해 비교될 수 있는 기준 펩티드 프레임워크 모티프를 지칭한다. 스캐폴드 도메인의 구조 모티프는 자연 발생 단백질 도메인 구조를 기반으로 할 수 있다. 특정 단백질 도메인 구조 모티프의 경우, 여러 개의 관련된 기저 서열이 이용 가능할 수 있으며, 이들 중 어느 하나는 스캐폴드 도메인의 특정 3차원 구조를 제공할 수 있다. 스캐폴드 도메인은 특징적인 컨센서스 서열 모티프의 관점에서 정의될 수 있다. 도 14는 GA 스캐폴드 도메인의 3-나선 다발 구조 모티프를 제공하는 16개의 관련된 자연 발생 단백질 도메인 서열의 정렬 및 비교에 기초하여 GA 스캐폴드 도메인에 대해 하나의 가능한 컨센서스 서열을 보여준다.

용어 "부모 아미노산 서열", "부모 서열" 및 "부모 폴리펩티드"는 변이체 펩티드 화합물이 생성되고, 변이체 펩티드 화합물이 비교되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 부모 폴리펩티드는 본원에 개시된 변형 또는 변이체 아미노산 중 하나 이상이 결여되어 있고, 본원에 개시된 변이체 펩티드 화합물과 비교하여 기능이 상이할 수 있다. 부모 폴리펩티드는 천연 도메인 서열(예를 들어, 서열번호 2~21), 기존 아미노산 서열 변형(예를 들어, 원하는 물리적 특성을 도메인에 부여하는 것으로 알려진 임의의 편리한 점 돌연변이 또는 절단, 예를 들어, 증가된 안정성 또는 용해도)을 갖는 천연 도메인 스캐폴드 서열, 또는 비-자연 발생 컨센서스 서열(예를 들어, 몇 가지 관심 천연 도메인을 기반으로 한 컨센서스 모티프의 서열, 예를 들어, 도 14 참조)일 수 있다.

용어 "상응 잔기" 및 "상응하는 잔기"는, 예를 들어 도 13에 도시된 GA 도메인 넘버링 방식에 의해 정의했을 때, 변이체 서열 및 부모 서열의 동등한 위치에 위치한 아미노산 잔기를 지칭하도록 사용된다. 도 13의 넘버링 방식은 대상 화합물의 서열에 반드시 포함되어야 하는 잔기의 최소 또는 최대 수를 정의하려는 것이 아님을 이해할 것이다. 53개 잔기의 넘버링 방식에 기반하여 대상 화합물은 3-나선 다발 구조 모티프를 유지하기에 충분한 임의의 편리한 수의 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 대상 화합물은 예를 들어 본원에 기술된 것과 같이 N-말단 및/또는 C-말단 절단 서열을 포함하여 53개 미만의 잔기를 포함한다.

용어 "변이체 아미노산" 및 "변이체 잔기"는 기저 스캐폴드 도메인과의 비교했을 때 변형되거나 돌연변이되는 대상 화합물의 특정 잔기를 지칭하도록 상호 교환적으로 사용된다. 변이체 잔기는 표적에 특이적으로 결합하는 바람직한 도메인 모티프 구조를 제공하도록 (예를 들어, 미러 이미지 스크리닝, 친화도 성숙, 및/또는 점 돌연변이(들)를 통해) 선택된 잔기들을 포함한다. 스캐폴드 도메인과 비교했을 때, 화합물이 특정 위치에서 아미노산 돌연변이 또는 변형을 포함하는 경우, 이러한 특정 위치에 위치한 펩티드 화합물의 아미노산 잔기는 "변이체 아미노산"으로 지칭된다. 이러한 변이체 아미노산은 생성된 펩티드 화합물에 상이한 기능, 예컨대 표적 단백질에 대한 특이적 결합, 증가된 수용성, 화학적 합성 용이성, 대사 안정성 등을 부여할 수 있다. 본 개시의 양태는, GA 스캐폴드 도메인에 기초하여 (예를 들어, 추가적인 친화도 성숙 및/또는 점 돌연변이를 통해) 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택되어 추가로 개발된 펩티드 화합물을 포함하며, 이와 같이, GA 스캐폴드 도메인과 통합된 여러 변이체 아미노산을 포함한다.

용어 "변이체 도메인" 및 "변이체 모티프"는 스캐폴드 도메인의 특정 위치에 통합된 변이체 아미노산의 배열을 지칭한다. 변이체 모티프는 잔기의 연속 및/또는 불연속 서열을 포함할 수 있다. 변이체 모티프는 화합물 구조의 일 면에 위치한 변이체 아미노산을 포함할 수 있다. 변이체 도메인은 기저 스캐폴드 도메인 구조 또는 서열에 통합되거나, 이와 통합된 것으로 간주될 수 있다. 대상 화합물에서, 스캐폴드 도메인은, 예를 들어, 자연 발생 단백질 도메인의 안정한 3차원 단백질 구조 모티프를 제공할 수 있는 반면, 변이체 도메인은 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 구조의 변형된 표면에서 변이체 잔기의 특징적인 최소 수의 배열에 의해 정의될 수 있다.

용어 "프레임워크 잔기"는 펩티드 화합물의 스캐폴드 도메인의 잔여 아미노산 잔기로서, 변이체 아미노산이 아닌 잔기를 지칭한다. 이와 같이, 프레임워크 잔기로 구성된 구조 또는 서열 모티프는 기저 스캐폴드 도메인 구조 또는 서열의 상응하는 잔기 배열에 의해 정의된다. 대상 화합물의 서열 및 구조는 변이체 및 프레임워크 잔기의 조합에 의해 정의될 수 있다.

용어 "돌연변이"는 기준 서열(예: 스캐폴드 서열)에 비해 아미노산(들) 잔기 또는 뉴클레오티드(들) 잔기의 결실, 삽입, 또는 치환을 지칭한다.

용어 "도메인"은 아미노산 잔기의 연속 또는 불연속 서열을 지칭한다. 도메인은 하나 이상의 영역 또는 분절을 포함할 수 있다. 용어 "영역" 및 "분절"은, 일부 경우에, 특정 이차 구조 특징부를 정의할 수 있는 아미노산 잔기의 연속 서열을 지칭하도록 상호 교환적으로 사용된다.

용어 "비-코어 돌연변이"는 펩티드 화합물의 아미노산 돌연변이로서, 구조의 소수성 코어의 일부가 아닌 구조 내의 위치에 위치하는 아미노산 돌연변이를 지칭한다. 펩티드 화합물의 소수성 코어 내의 아미노산 잔기는 상당히 용매에 노출되지 않고 오히려 분자내 소수성 접촉을 형성하는 경향이 있다. 소수성 코어 잔기를 지정하는 데 사용되는 방법론은 Dahiyat 등의 문헌["Probing the role of packing specificity in protein design,"　Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 10172-10177]에 기술되어 있는데, 여기서는 PDB 구조를 사용해, 어느 측쇄가 그 표면적의 10% 미만을 용매에 노출시키는지 계산하였다. 일부 경우에, 도 6에 도시된 바와 같이, Degrado의 헵타드 반복 모델(DeGrado 등의 문헌["Analysis and design of three-stranded coiled coils and three-helix bundles", Folding & Design 1998, 3: R29-R40])을 사용해 소수성 코어의 "a" 및 "d" 잔기를 정의할 수 있다. 이러한 방법은 GA 도메인 스캐폴드와 함께 사용하기 위해 수정될 수 있다.

용어 "표면 돌연변이"는 스캐폴드 도메인에서의 아미노산 돌연변이로서, 구조 내에서 용매 노출 위치에 위치하는 아미노산 돌연변이를 지칭한다. D-펩티드 화합물의 표면 위치에 있는 이러한 변이체 아미노산 잔기는 표적 분자와 직접 상호작용할 수 있으며, 이러한 상호작용의 발생 여부는 상관하지 않는다. 일부 경우에, 도 6에 도시된 바와 같이, Degrado의 헵타드 반복 모델을 사용해 고도로 용매 노출되는 "c" 및 "g" 잔기를 정의할 수 있다.

용어 "경계 돌연변이"는 스캐폴드 내의 아미노산 돌연변이로서, 구조 내에서 소수성 코어와 용매 노출 표면 사이에 있는 위치에 위치한 아미노산 돌연변이를 지칭한다. 펩티드 화합물의 경계 위치에 있는 이러한 변이체 아미노산 잔기는 소수성 코어 잔기와 부분적으로 접촉하고/하거나 부분적으로 용매 노출되어 표적 분자와 약간의 상호작용을 할 수 있으며, 이러한 상호작용의 발생 여부는 상관하지 않는다. 구조의 코어, 표면, 및 경계 잔기를 기술하기 위한 하나의 기준이 Mayo 등의 문헌[Nature Structural Biology, 5(6), 1998, 470-475]에 기술되어 있다. 일부 경우에, 도 6 및 도 7b에 도시된 바와 같이, Degrado의 헵타드 반복 모델을 사용해 적어도 부분적으로 용매 노출되는 "c" 및 "g" 잔기를 정의할 수 있다. 이러한 방법 및 기준은 대상 화합물과 함께 사용하기 위해 변형될 수 있다.

용어 "연결 서열"은 2개의 펩티드 모티프 또는 영역을 연결하는 아미노산 잔기 또는 이의 유사체의 연속 서열을 지칭한다. 소정의 경우에, 연결 서열은 2개의 역평행 나선형 영역을 연결하는 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은) 루프 또는 회전 영역이다.

용어 "안정한(stable)"은 화합물이 그의 정상적인 기능적 활성(예를 들어 표적 단백질에 대한 결합) 중 적어도 하나를 유지하도록 특정 온도에서 생리학적 조건 하에 접힌 상태를 유지할 수 있는 것을 지칭한다. 화합물의 안정성은 표준 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 화합물의 "열안정성"은 열 용융("Tm") 온도를 측정함으로써 결정할 수 있다. Tm은, 화합물의 절반이 펼쳐지게 되는 섭씨 온도이다. 일부 경우에, Tm이 높을수록, 화합물은 더 안정하다.

용어 "유사한", "보존적" 및 "고도로 보존적" 아미노산 치환은 아래 표 6에 나타낸 바와 같이 정의된다. 아미노산 잔기 치환이 유사하거나, 보존적이거나, 고도로 보존적인지 여부를 결정하는 것은 폴리펩티드 백본이 아니라 아미노산 잔기의 측쇄를 기반으로 할 수 있다.

아미노산 치환의 분류
대상 폴리펩티드 중의 아미노산	유사 아미노산 치환	보존적 아미노산 치환	고 보존적 아미노산 치환
글리신 (G)	A,S,N	A	n/a
알라닌 (A)	S,G,T,V,C,P,Q	S,G,T	S
세린 (S)	T,A,N,G,Q	T,A,N	T,A
트레오닌 (T)	S,A,V,N,M	S,A,V,N	S
시스테인 (C)	A,S,T,V,I	A	n/a
프롤린(P)	A,S,T,K	A	n/a
메티오닌 (M)	L,I,V,F	L,I,V	L,I
발린 (V)	I,L,M,T,A	I,L,M	I
류신 (L)	M,I,V,F,T,A	M,I,V,F	M,I
이소류신 (I)	V,L,M,F,T,C	V,L,M,F	V,L,M
페닐알라닌 (F)	W,Y,L,M,I,V	W,L	n/a
티로신 (Y)	F,W,H,L,I	F,W	F
트립토판 (W)	F,L,V	F	n/a
아스파라긴 (N)	Q	Q	Q
글루타민(Q)	N	N	N
아스파르트산 (D)	E	E	E
글루탐산 (E)	D	D	D
히스티딘 (H)	R,K	R,K	R,K
리신 (K)	R,H,O	R,H,O	R,O
아르기닌 (R)	K,H,O	K,H,O	K,O
오르니틴 (O)	R, H, K	R, H, K	K, R

“특이성 결정 모티프(specificity determining motif)”는 표적 단백질에 대한 변이체 도메인의 특이적 결합을 제공하는, 변이체 스캐폴드 도메인의 특정 위치에 통합된 변이체 아미노산의 배열을 지칭한다. 모티프는 잔기의 연속 및/또는 불연속 서열을 포함할 수 있다. 모티프는, 화합물 구조의 일 면에 위치하고 표적 단백질과 접촉할 수 있는 변이체 아미노산을 포함할 수 있거나; 표적과 접촉을 제공하지 않고, 오히려 표적에 대한 결합을 향상시키는 천연 도메인 구조에 대한 변형을 제공하는 변이체 잔기를 포함할 수 있다. 모티프는 기저 스캐폴드 도메인 구조 또는 서열(예: 자연 발생 GA 또는 Z 도메인의 3-나선 다발)에 통합되거나, 이와 통합된 것으로 간주될 수 있다.

에피토프 또는 표적 단백질의 결합 부위에 “특이적으로 결합하는” 화합물은 당업계에서 잘 이해되는 용어이며, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 화합물이 대안적인 세포 또는 물질과 회합하는 것보다 더 빈번하게, 더 신속하게, 더 긴 기간 동안 및/또는 더 큰 친화도로 특정 세포 또는 물질(표적 단백질)과 회합하는 경우, 화합물은 “특이적 결합”을 나타낸다. D-펩티드 화합물이 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 친화성으로 더 쉽게 및/또는 더 긴 기간 동안 결합하는 경우, D-펩티드 화합물은 표적에 “특이적으로 결합한다”. 예를 들어, VEGF 에피토프 또는 부위에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 화합물은 다른 VEGF 에피토프 또는 비-VEGF 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 친화성으로 더 쉽게 및/또는 더 긴 기간 동안 이러한 에피토프 또는 부위에 결합하는 항체이다. 본 정의를 읽음으로써, 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 화합물은 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있다는 것도 이해할 수 있을 것이다. 이와 같이, “특이적 결합”은 배타적 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하는 것은 아니다. 반드시 그렇지는 않지만, 일반적으로 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미한다.

화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 절대 입체화학의 측면에서 아미노산 및 폴리펩티드에 대한 (R)- 또는 (S)- 또는 (D)- 또는 (L)-로서 정의될 수 있는 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 및 기타 입체 이성질체 형태를 생성할 수 있다. 본 개시는 이러한 모든 가능한 이성질체뿐만 아니라 이들의 라세미체, 부분입체 이성질체, 및 광학적으로 순수한 형태를 포함하도록 의도된다. 본원에 기술된 화합물이 올레핀 이중 결합 또는 다른 기하학적 비대칭 중심을 함유하는 경우, 달리 명시되지 않는 한, 화합물은 E 및 Z 기하학적 이성질체 모두를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 모든 호변이성질체 형태도 포함되도록 의도된다.

용어 “표적 단백질”은 표적 계열의 모든 구성원 및 이의 단편 및 거울상 이성질체 및 이의 단백질 모방체를 지칭한다. 명시적으로 달리 기술되지 않는 한, 본원에 기술된 관심 표적 단백질은 표적 계열의 모든 구성원 및 이의 단편 및 거울상 이성질체 및 이의 단백질 모방체를 포함하도록 의도된다. 표적 단백질은 임의의 관심 단백질, 예컨대 치료 또는 진단 표적일 수 있다. 용어 “표적 단백질”은 재조합 및 합성 분자뿐만 아니라 표적 분자를 함유하는 융합 단백질을 비롯하여 합성 L- 또는 D-단백질도 포함하도록 의도되는데, 재조합 및 합성 분자는 임의의 편리한 재조합 발현 방법을 사용하여 제조하거나, 임의의 편리한 합성 방법을 사용하여 제조하거나, 상업적으로 구입할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 “VEGF” 또는 그의 원래 형태인 “혈관 내피 성장 인자”는 VEGF 유전자에 의해 암호화된 단백질 산물을 지칭한다. VEGF라는 용어는 VEGF 계열의 모든 구성원, 예컨대 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, 및 이의 단편 및 거울상 이성질체를 포함한다. 용어 VEGF는 재조합 및 합성 VEGF 분자뿐만 아니라 VEGF 분자를 함유하는 융합 단백질을 비롯하여 합성 L- 또는 D-단백질도 포함하도록 의도되는데, 재조합 및 합성 VEGF 분자는 임의의 편리한 재조합 발현 방법을 사용하여 제조하거나, 임의의 편리한 합성 방법을 사용하여 제조하거나, 상업적으로 구입할 수 있다(예: R & D Systems, Catalog No. 210-TA, Minneapolis, Minn.). VEGF는 혈관형성(배아 순환계의 새로운 형성) 및 혈관신생(기존 혈관 구조로부터의 혈관 성장) 모두에 관여하며, 림프관 신생으로 알려진 과정에서 림프관의 성장에도 관여할 수 있다. VEGF 계열의 구성원은 세포 표면에서 티로신 키나아제 수용체(VEGFR)에 결합하여 이를 이량체화시키고, 트랜스포스포릴화를 통해 활성 상태로 만들어 세포 반응을 자극한다. VEGF 수용체는 7개의 면역글로불린 유사 도메인을 함유하는 세포외 부분, 단일 막관통 걸침 영역, 및 분리된 티로신-키나아제 도메인을 함유하는 세포내 부분을 갖는다. VEGF-A는 VEGFR-1 (Flt-1) 및 VEGFR-2 (KDR/Flk-1)에 결합한다. VEGFR-2는 VEGF에 대한 세포 반응 중 몇 가지를 매개하는 것으로 보인다. VEGF, 이의 생물학적 활성, 및 이의 수용체는 잘 연구되어 Matsumoto 등의 문헌[VEGF receptor signal transduction Sci STKE. 2001:RE21] 및 Marti 등의 문헌[Angiogenesis in ischemic disease. Thromb Haemost. 1999 Suppl 1:44-52]에 기술되어 있다. 예시적인 VEGF의 아미노산 서열은 NCBI의 Genbank 데이터베이스에서 확인할 수 있으며, VEGF 단백질 및 다양한 질환 및 병태에서 이 단백질의 역할에 대한 완전한 설명은 NCBI의 온라인 멘델 유전(Online Mendelian Inheritance)의 인류 데이터베이스(Man database)에서 확인할 수 있다.

예시적인 구현예

본 개시의 양태는 아래에 제시된 조항 및 예시적인 구현예에서 구현된다.

조항 1. VEGF-A에 특이적으로 결합하는 D-펩티드 화합물로서, GB1 도메인 스캐폴드를 포함하지 않는, D-펩티드 화합물.

조항 2. 조항 1에 있어서, 비극성, 방향족, 헤테로시클릭, 및 카보시클릭 잔기로부터 독립적으로 선택된 6개 이상의 VEGF-A 접촉 잔기를 포함하는 VEGF-A 결합 면을 함께 정의하는 적어도 2개의 항평행 나선 영역 [나선 A] 및 [나선 B]를 포함하는 VEGF-A 결합 2-나선 복합체를 포함하는, D-펩티드 화합물.

조항 3. 조항 2에 있어서, [나선 A] 및 [나선 B]는 각각 헵타드 반복 서열(abcdefg)_n을 포함하고, 6개 이상의 VEGF-A 접촉 잔기는 헵타드 반복 서열의 c 및 g 위치에 위치하는, D-펩티드 화합물.

조항 4. 조항 1에 있어서,

헵타드 반복 서열(abcdefg)_n을 각각 포함하고, a 및 d 잔기를 실질적으로 포함하는 소수성 코어를 정의하도록 구성된 나선 영역 [나선 1], [나선 2], 및 [나선 3]을 각각 포함하는 VEGF-A 결합 3-나선 다발을 포함하되,

[나선 2] 및 [나선 3]은 서로에 대해 역평행으로 구성되고, 비극성, 방향족, 헤테로시클릭, 및 카보시클릭 잔기로부터 독립적으로 선택된 6개 이상의 VEGF-A 접촉 잔기를 포함하는 3-나선 다발의 VEGF-A 결합 g-g 면을 함께 정의하는, D-펩티드 화합물.

조항 5. 조항 4에 있어서, 3-나선 다발은 식 (I)의 GA 도메인 모티프이고:

[나선 1]-[링커 1]-[나선 2]-[링커 2]-[나선 3]

식 (I)

식 중 [링커 1] 및 [링커 2]는 독립적으로 1 내지 10개 잔기의 펩티드 연결 서열인, D-펩티드 화합물.

조항 6. 조항 4 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 6개 이상의 VEGF-A 접촉 아미노산 잔기는, VEGF-A와 접촉하도록 구성되고 g-g 면의 c 및 g 용매 노출 위치에 위치하는 4개 이상의 방향족 아미노산 잔기를 포함하는, D-펩티드 화합물.

조항 7. 조항 4 내지 6 중 어느 하나에 있어서, [나선 2]는 헵타드 반복 서열 [c ¹ d ¹ e ¹ f ¹ g ¹ a ² b ² c ² d ² ]를 포함하고, [나선 3]은 헵타드 반복 서열 [e ¹ f ¹ g ¹ a ² b ² c ² d ² e ² f ² g ² a ³ b ³ c ³ d ³ e ³ ]을 포함하며, 여기서:

[나선 2]의 잔기 d ² , a ² , 및 d ¹ 은 [나선 3]의 잔기 a ² , d ² , 및 a ³ 과 상호작용하고;

[나선 2]의 잔기 c ² , g ¹ , 및 c ¹ 및 [나선 3]의 잔기 g ¹ 은 각각 독립적으로 방향족, 헤테로시클릭 또는 카보시클릭 잔기인, D-펩티드 화합물.

조항 8. 조항 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서, VEGF-A 결합 표면은 나선 A 및 나선 B의 헵타드 반복 서열의 c 및 g 위치에 위치한 VEGF-A 접촉 잔기의 다음 구성을 포함하며:

식 중:

각각의 h*는 독립적으로 히스티딘 또는 이의 유사체이고;

f*는 페닐알라닌 또는 이의 유사체이고;

각각의 u는 독립적으로 비극성 아미노산 잔기이고;

조항 9. 조항 4 내지 5 중 어느 하나에 있어서,

[나선 2]는 다음 식의 서열을 포함하고:

h*jxxf*jxh*j (서열번호 151)

[나선 3]은 다음 식의 서열을 포함하며:

h*jxujxxuj (서열번호 152)

식 중:

각각의 h*는 독립적으로 히스티딘 또는 이의 유사체이고;

f*는 페닐알라닌 또는 이의 유사체이고;

각각의 u는 독립적으로 비극성 아미노산 잔기이고;

각각의 j는 독립적으로 소수성 잔기이고;

각각의 x는 독립적으로 아미노산 잔기인, D-펩티드 화합물.

조항 10. 조항 9에 있어서, [나선 2]는 다음 식의 서열에 의해 정의되며:

zh*jxxf*jxh*jz (서열번호 153)

여기서 각각의 z는 독립적으로 나선-종결 잔기인, D-펩티드 화합물.

조항 11. 조항 10에 있어서, 각각의 나선-종결 잔기(z)는 d, p, 및 G로부터 독립적으로 선택되는, D-펩티드 화합물.

조항 12. 조항 5 내지 11 중 어느 하나에 있어서, [링커 2]는 그 길이가 2개 아미노산 잔기 이하이고, 티로신 잔기 또는 이의 유사체를 포함하는, D-펩티드 화합물.

조항 13. 조항 5 내지 12 중 어느 하나에 있어서, [나선 2]-[링커 2]-[나선 3]은 다음 식의 서열을 포함하며:

zh*jxxf*jxh*jzy*xxh*jxujxxujx (서열번호 154)

식 중:

y*는 티로신 또는 이의 유사체이고;

각각의 h*는 독립적으로 히스티딘 또는 이의 유사체이고;

f*는 페닐알라닌 또는 이의 유사체이고;

각각의 u는 독립적으로 비극성 아미노산 잔기이고;

각각의 j는 독립적으로 소수성 잔기이고;

각각의 x는 독립적으로 아미노산 잔기인, D-펩티드 화합물.

조항 14. 조항 5 내지 13 중 어느 하나에 있어서, [링커 1]은 다음 식의 서열을 포함하며:

z(x)_ne*z (서열번호 148)

식 중:

각각의 x는 아미노산이고, n은 1, 2, 또는 3이고;

각각의 z는 독립적으로 나선-종결 잔기(예: G 또는 p)이고;

e*는 글루탐산 또는 이의 유사체인, D-펩티드 화합물.

조항 15. 조항 5 내지 14 중 어느 하나에 있어서, [링커 1]-[나선2]-[링커 2]-[나선3]은 다음 식의 서열을 포함하며:

zxxe*zh*jxxf*jxh*jzy*xxh*jxujxxujx (서열번호 155)

식 중:

e*는 글루탐산 또는 이의 유사체이고;

각각의 z는 독립적으로 나선-종결 잔기이고;

y*는 티로신 또는 이의 유사체이고;

각각의 j는 독립적으로 소수성 잔기이고;

각각의 u는 독립적으로 비극성 아미노산 잔기이고;

각각의 x는 독립적으로 아미노산 잔기인, D-펩티드 화합물.

조항 16. 조항 4 내지 15 중 어느 하나에 있어서, [나선 2]는 다음 식의 서열에 의해 정의되며:

z²⁶hj²⁸xxfj³²xhj³⁵z³⁶(서열번호 101).

식 중:

z²⁶은 d, p, 및 G로부터 선택되고;

z³⁶은 p 및 G로부터 선택되고;

j²⁸, j³², 및 j³⁵는 각각 독립적으로 소수성 잔기이고;

각각의 x는 독립적으로 아미노산 잔기인, D-펩티드 화합물.

조항 17. 조항 16에 있어서, j²⁸, j³², 및 j³⁵는 a, i, l, 및 v로부터 독립적으로 선택되는, D-펩티드 화합물.

조항 18. 조항 17에 있어서, j²⁸, j³², 및 j³⁵는 2019년 6월 24일에 출원된 미국 특허 제62/865,469호의 서열번호 1~21 중 어느 하나로부터 선택된 GA 스캐폴드 도메인의 상응 잔기인, D-펩티드 화합물.

조항 19. 조항 4 내지 18 중 어느 하나에 있어서, [나선 2]는 다음으로부터 선택된 서열에 의해 정의되는, D-펩티드 화합물:

a) phvx²⁹x³⁰fix³³hap (서열번호 102)

식 중:

x²⁹는 f 및 i로부터 선택되고;

x³⁰ 및 x³³은 극성 아미노산 잔기로부터 독립적으로 선택됨); 및

b) a)에 정의된 서열에 대해 80% 이상의 동일성(예: 2개의 잔기 변화)을 갖는 아미노산 서열.

조항 20. 조항 19에 있어서,

x²⁹는 i이고;

x³⁰은 s 또는 n이고;

x³³은 n인, D-펩티드 화합물.

조항 21. 조항 4 내지 20 중 어느 하나에 있어서, [나선 3]은 다음 식의 서열에 의해 정의되며:

xxhj⁴¹xuj⁴⁴xxuj⁴⁸xxx (서열번호 103)

식 중:

j⁴¹, j⁴⁴, 및 j⁴⁸은 각각 독립적으로 소수성 잔기이고;

각각의 u는 독립적으로 비극성 아미노산 잔기이고;

각각의 x는 독립적으로 아미노산 잔기인, D-펩티드 화합물.

조항 22. 조항 21에 있어서, j⁴¹, j⁴⁴, 및 j⁴⁸은 a, i, l, 및 v로부터 독립적으로 선택되는, D-펩티드 화합물.

조항 23. 조항 21에 있어서, j⁴¹, j⁴⁴, 및 j⁴⁸은 2019년 6월 24일에 출원된 미국 특허 제62/865,469호의 서열번호 1~21로부터 선택된 GA 스캐폴드 도메인의 상응 잔기인, D-펩티드 화합물.

조항 24. 조항 21에 있어서, [나선 3]은 다음으로부터 선택된 서열에 의해 정의되는, D-펩티드 화합물:

a) x³⁸x³⁹hvx⁴²Glx⁴⁵x⁴⁶aix⁴⁹x⁵⁰a (서열번호 98)

식 중:

x³⁸은 v, e, k, r로부터 선택되고;

x³⁹, x⁴², x⁴⁶, 및 x⁵⁰은 친수성 아미노산 잔기(예를 들어, n, s, d, e 및 k)로부터 독립적으로 선택되고;

x⁴⁵ 및 x⁴⁹는 l, k, r, 및 e로부터 독립적으로 선택됨); 및

조항 25. 조항 24에 있어서, x³⁸은 v이고; x³⁹는 s이고; x⁴²는 n이고; x⁴⁵는 k이고, x⁴⁶은 n이고; x⁴⁹는 l이고; x⁵⁰은 k인, D-펩티드 화합물.

조항 26. 조항 4 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 화합물의 VEGF-A 결합 도메인은 기준 GA 스캐폴드 서열에 비해 6개 이상의 변이체 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서 6개 이상의 변이체 아미노산은 다음으로부터 선택되는, D-펩티드 화합물: 위치 25에 있는 e; 위치 26에 있는 p; 위치 27에 있는 h; 위치 28에 있는 v; 위치 29에 있는 i; 위치 30에 있는 s; 위치 31에 있는 f; 위치 34에 있는 h; 위치 36에 있는 p; 위치 37에 있는 y; 위치 39에 있는 s; 위치 40에 있는 h; 위치 43에 있는 G; 및 위치 47에 있는 a.

조항 27. 조항 26에 있어서, 화합물은 위치 26에 있는 p, 위치 31에 있는 f, 및 위치 36에 있는 p를 포함하는, D-펩티드 화합물.

조항 28. 조항 26에 있어서, 화합물은 다음 변이체 아미노산을 포함하는, D-펩티드 화합물: 위치 26에 있는 p, 위치 29에 있는 i, 및 위치 30에 있는 s.

조항 29. 조항 26 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 위치 27, 34, 및 40에 있는 h를 포함하는, D-펩티드 화합물.

조항 30. 조항 26 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 위치 43에 있는 G; 및 위치 47에 있는 a를 포함하는, D-펩티드 화합물.

조항 31. 조항 26 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 위치 28에 있는 v를 포함하는, D-펩티드 화합물.

조항 32. 조항 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, D-펩티드 화합물:

a) llknakedaiaelkkcGitephvisfinhapyvshvnGlknailka; 및

b) a)에 정의된 서열에 대해 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.

조항 33. 조항 4 내지 32 중 어느 하나에 있어서, [나선 1]은 다음으로부터 선택된 서열을 포함하는, D-펩티드 화합물: a)l⁶lknakedaiaelkka²¹(서열번호 74); 및 b) a)에서 정의된 서열에 대해 75% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.

조항 34. 조항 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 다음으로부터 선택된 서열을 포함하는, D-펩티드 화합물: a) G²²itephvisfinhapyvshvnGlknailka⁵¹(서열번호 84); 및 b) a)에서 정의된 서열에 대해 75% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.

조항 35. 조항 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 다음으로부터 선택된 펩티드 프레임워크 서열을 포함하는, D-펩티드 화합물: a) l⁶lknakedaiaelkkaGit????.in.a..v..vn..kn.ilka⁵¹(서열번호 156); 및 b) a)에서 정의된 서열에 대해 88% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.

조항 36. 조항 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 다음으로부터 선택된 펩티드 프레임워크 서열을 포함하는, D-펩티드 화합물: a) t¹idqwllknakedaiaelkkaGit????.in.a..v..vn..kn.ilkaha⁵³(서열번호 157); 및 b) a)에서 정의된 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.

조항 37. 조항 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 2019년 6월 24일에 출원된 미국 특허 제62/865,469호의 서열번호 22~71로부터 선택된 서열을 포함하는, D-펩티드 화합물:

조항 38. 조항 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 연결된 비-단백질성 중합체 모이어티를 추가로 포함하는, D-펩티드 화합물.

조항 39. 조항 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 연결된 특이적 결합 모이어티를 추가로 포함하는, D-펩티드 화합물.

조항 40. 조항 39에 있어서, 연결된 특이적 결합 모이어티는 제2 D-펩티드 결합 도메인인, D-펩티드 화합물.

조항 41. 조항 39 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 VEGF-결합 GA 도메인의 다량체 구성을 포함하는, D-펩티드 화합물.

조항 42. 조항 40 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 동종이량체이고 2개의 연결된 VEGF-A-결합 GA 도메인을 포함하는, D-펩티드 화합물.

조항 43. 조항 42에 있어서, VEGF-A-결합 GA 도메인은 중합체 링커를 통해 N-말단 잔기에 의해 연결되는, D-펩티드 화합물.

조항 44. 조항 42에 있어서, VEGF-A-결합 GA 도메인 모티프는 펩티드 링커를 통해 N-말단 잔기에 의해 연결되는, D-펩티드 화합물.

조항 45. 조항 40 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 이종이량체인, D-펩티드 화합물.

조항 46. 조항 45에 있어서, 제2 D-펩티드 결합 도메인은 PDGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, EGF, EGFR, Her2, Her3, PD-1, PD-L1, CTLA4, OX-40, DR3, Ang-2, LAG3, HSA, 및 Ig로부터 선택된 표적 단백질에 특이적으로 결합하는, D-펩티드 화합물.

조항 47. 조항 1 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 100 nM 이하의 K_D 값(예를 들어, 30 nM 이하, 10 nM 이하, 3 nM 이하, 1 nM 이하 등)으로 VEGF-A 단백질에 특이적으로 결합하는, D-펩티드 화합물.

조항 48. 조항 1 내지 47 중 어느 하나에 있어서, VEGF-결합 GA 도메인은 45개 내지 60개의 잔기(예를 들어, 46개 내지 55개의 잔기, 50개 내지 54개의 잔기 등)를 포함하는, D-펩티드 화합물.

조항 49. 조항 1 내지 48 중 어느 하나의 D-펩티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.

조항 50. 조항 49에 있어서, 조성물은 안 질환 또는 병태의 치료를 위해 제형화되는, 약학적 조성물.

조항 51. 대상체에서 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 조항 1 내지 48 중 어느 하나에 따른 화합물의 유효량 또는 조항 49 내지 50 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

조항 52. 조항 51에 있어서, 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태는 암(예: 유방암, 피부암, 대장암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 또는 난소암), 염증성 질환, 죽상경화증, 류마티스성 관절염, 황반 변성, 망막병증, 및 피부 질환(예: 주사)인, 방법.

조항 53. 조항 51에 있어서, 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태는 당뇨병성 황반 부종(DME)인, 방법.

조항 54. 조항 51에 있어서, 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태는 연령 관련 황반 변성(AMD)인, 방법.

조항 55. 조항 51 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 제2 활성제의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

조항 56. 조항 55에 있어서, 제2 활성제는 D-펩티드 화합물인, 방법.

조항 57. 조항 55에 있어서, 제2 활성제는 저분자, 화학요법제, 항체, 항체 단편, 앱타머, 또는 L-단백질인, 방법.

조항 58. 조항 55 내지 57 중 어느 한 항에 있어서, 제2 활성제는 다음으로부터 선택된 표적 단백질에 특이적으로 결합하는, 방법: 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, EGF, EGFR, Her2, Her3, PD-1, PD-L1, CTLA4, OX-40, DR3, LAG3, Ang2, IL-1, IL-6, 및 IL-17.

조항 59. 조항 55에 있어서, 제2 활성제는 PDGF-B에 특이적으로 결합하는, 방법.

조항 60. 조항 55에 있어서, 제2 활성제는 다음으로부터 선택되는, 방법: 페그플레라닙(Fovista), 라니비주맙(Lucentis), 트라스투주맙(Herceptin), 베바시주맙(Avastin), 애플리버셉트(Eylea), 니볼루맙, 아테졸리주맙, 더발루맙, 게피티닙, 엘로티닙, 및 펨브롤리주맙.

조항 61. 혈관 신생과 관련된 질환 또는 병태의 생체 내 진단 또는 영상화를 위한 방법으로서, 조항 1 내지 49 중 어느 하나에 따른 D-펩티드 화합물을 대상체에게 투여하는 단계; 및 대상체의 적어도 일부를 영상화하는 단계를 포함하는, 방법.

조항 62. 조항 61에 있어서, 영상화하는 단계는 PET 영상화를 포함하고, 투여하는 단계는 화합물을 대상체의 혈관계에 투여하는 것을 포함하는, 방법.

조항 63. 조항 61에 있어서, 세포 수용체에 의한 화합물의 흡수를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

조항 64. 조항 61에 있어서, 대상체에게 아바스틴(avastin)을 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 질환 또는 병태는 암과 관련된 병태인, 방법.

다음의 실시예는 예시로서 제공되며 제한하기 위한 것은 아니다.

실시예

다음 실시예는 당업자에게 본 발명을 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 발명자가 스스로의 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하도록 의도되지 않으며, 아래의 실험이 수행된 모든 실험이거나 유일한 실험임을 나타내도록 의도되지도 않는다. 사용된 숫자(예: 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력을 기울였지만, 일부 실험 오차 및 편차를 고려해야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압이거나 대기압에 가깝다.

분자 및 세포 생화학에서의 일반적인 방법은 다음과 같은 표준 교재에서 확인할 수 있으며: [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook 등, HaRBor Laboratory Press 2001)]; [Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel 등(eds.), John Wiley & Sons 1999)]; [Protein Methods (Bollag 등, John Wiley & Sons 1996)]; [Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner 등(eds.), Academic Press 1999)]; [Viral Vectors (Kaplift & Loewy(eds.), Academic Press 1995)]; [Immunology Methods Manual (I. Lefkovits (ed.), Academic Press 1997); 및 [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)], 그 개시 내용은 참조로서 본원에 통합된다. 본 개시에서 참조하였거나 본 개시와 관련된 방법을 위한 시약, 클로닝 벡터, 세포, 및 키트는 BioRad, Agilent Technologies, Thermo Fisher Scientific, Sigma-Aldrich, New England Biolabs (NEB), Takara Bio USA, Inc., 등과 같은 상업적 공급처뿐만 아니라, Addgene, Inc., American Type Culture Collection (ATCC) 등과 같은 저장소로부터 입수 가능하다.

실시예 1: D-펩티드 화합물의 선택

대상 화합물은, WO2014/140882에서 Uppalapati 등에 의해 기술된 방법을 사용해, 합성 D-VEGF-A 표적 단백질에 대한 결합에 대한 스캐폴드 GA 도메인 파지 디스플레이 라이브러리의 미러 이미지 스크리닝을 통해 식별하였다. 도 13은 53개의 기저 잔기 스캐폴드 서열(서열번호 2)을 포함하는 GA 도메인 라이브러리 및 스캐폴드의 위치 25, 27, 28, 31, 34, 36, 37, 39, 40, 43, 44, 및 47에서 굵은 글씨체로 표시된 돌연변이 위치에 대한 도시를 보여주는데, 상기 위치들은 파지 디스플레이 라이브러리에서 변이를 정의한다.

간략하게, 5 ug/ml의 D-VEGFA를 NUNC Maxisorp 플레이트에 코팅하였다. 차단 후, GA 도메인 라이브러리를 포함하는 8개의 스캐폴드 라이브러리 풀을, 고갈 시킨 후의 빈 웰 상의 플레이트에 첨가하였다. 결합된 파지를 용리하고 OmniMax2 T1R 세포에서 밤새 증폭시켰다. 2회차에서 용리물 농도가 너무 높았기 때문에, 3회차 및 4회차의 경우, 약 1 x 10¹³ cfu/ml의 표준 농도와 비교하여 더 낮은 농도의 증폭된 파지 풀(약 5 x 10¹¹ cfu/ml)을 사용하였다. GA 도메인 라이브러리로부터 17개의 상이한 서열을 포함하는 다양한 라이브러리로부터 여러 개의 히트를 얻었다. 클론 간의 서열 동일성에 기초하여, 화합물 1을 포함하는 3개의 대표적인 클론(도 15 참조)을 선택하여 추가로 최적화시켰다. 화합물 1은 친화도 성숙을 위해 p3-융합 벡터로 클로닝 시 D-VEGFA에 대한 결합을 유지하였다.

친화도 성숙의 1회차를 위해, 소프트-랜덤화 전략을 사용하였는데(Fairbrother 등의 1998 문헌), 여기서는 랜덤화된 위치 25, 27, 28, 31, 34, 36, 37, 39, 40, 43, 44, 및 47의 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 손으로 혼합한 염기로 도핑하여 천연 뉴클레오티드를 70%로 염기화하고 다른 3개의 뉴클레오티드는 10% 빈도로 발생시켰다. 이를 통해 이들 위치 각각에서 화합물 1의 부모 서열에서 발견되는 아미노산의 40%를 유지시킬 수 있다. 친화도 성숙 라이브러리는 다음의 올리고뉴클레오티드 및 GA 도메인 기원 서열의 ssDNA를 템플릿으로 사용하여 부위-유도성 돌연변이 유발 프로토콜(Fellouse 등)에 의해 작제하였다.

AAGGCTGGTATCACC (N4)(N2)(N4) GAC (N2)(N1)(N4) (N3)(N4)(N4) TTCAAC (N4)(N4)(N4) ATCAAT (N4)(N1)(N4) GCG (N2)(N2)(N4) (N4)(N1)(N4) GTG (N4)(N2)(N4) (N3)(N1)(N4) GTTAAC (N3)(N2)(N1) (N2)(N4)(N3) AAGAAC (N3)(N1)(N3) ATCCTGAAAGCTCAC (서열번호 130)

여기서 N1은 70% A, 10% C, 10% G, 및 10% T의 혼합물이고

N2는 10% A, 70% C, 10% G, 및 10% T의 혼합물이고

N3은 10% A, 10% C, 70% G, 및 10% T의 혼합물이고

N4는 10% A, 10% C, 10% G, 및 70% T의 혼합물이다.

표준 절차(Fellouse 등)를 사용하여 친화도 성숙 라이브러리를 D-VEGFA에 대해 패닝하고, 3회차의 24개의 클론을 분석하였고, 경쟁 ELISA를 수행하여 친화도에 따라 이들의 순위를 매겼다. 이 목록으로부터 화합물 1.1을 관심 클론으로서 선택하였다. 모든 클론의 선택된 위치의 서열 로고가 화합물 1 및 천연 GA 도메인(GA-wt)과 비교하여 도 26에 도시되어 있다. 본 연구에서, 위치 27, 28, 31, 36, 및 44는 His27, Val28, Phe31, Pro36, 및 Leu44로서 모든 클론에서 고도로 보존되거나 유지되었다. 방향족 잔기 His, Tyr, 및 Phe는 위치 34에서 우세하였다. His 또는 Asp 잔기는 위치 40에서 우세하였다. Glu 또는 Ala는 위치 47에서 우세하였다.

2회차의 친화도 성숙을 수행하여 화합물 1.1의 친화도 및 안정성을 개선하였다. Pro 잔기가 위치 36에서 고도로 보존되었음을 고려하면, 백본 형태의 변화는 코어 잔기에 대해 나선2의 배향을 변경할 수 있고, 어쩌면 선택된 화합물 1.1의 안정성에 영향을 미칠 수도 있다. 또한, C-말단 근처에 있는 표면 노출 잔기는 추가 접촉을 형성할 수 있다. 따라서, 코어 및 표면 노출 위치를 포함하는 다음의 위치를 추가 최적화를 위해 선택하였다: 위치 15, 18, 19, 21, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 47, 48, 49, 50, 51 및 52. 다시, 부위 유도형 돌연변이유발을 위해 다음의 올리고뉴클레오티드와 함께 소프트 랜덤화 전략을 사용하였다.

GCGAAAGAAGATGCT (N1)(N4)(N4) GCAGAA (N2)(N4)(N2) (N1)(N1)(N1) AAG (N2)(N2)(N4) GGT (N1)(N4)(N2) ACC (N2)(N1)(N1) (N2)(N1)(N2) CAT (N2)(N4)(N4) (N4)(N4)(N2) (N1)(N1)(N2) TTTATCAATCACGCGC (SEQ ID NO: 131)

GTTAACGGGCTGAAGAAC (N2)(N2)(N2) (N1)(N4)(N2) (N2)(N4)(N2) (N1)(N1)(N1) (N2)(N2)(N4) (N2)(N1)(N2) GCCGGGAGCTCTGGAG (서열번호 132)

라이브러리를 작제하고, 수정된 프로토콜을 이용해 D-VEGFA에 대해 패닝하였다. D-VEGF-A가 매우 안정적이고 3M 구아니딘 염산염(GuHCl)에서도 접힘을 유지한다면, 저-중 농도의 변성제의 존재 하에 결합성분의 선택을 통해 친화도 및 안정성이 개선된 클론을 선택할 수 있다는 가설을 세웠다. 이 절차에서, 라이브러리 또는 증폭된 파지 풀을 각각의 선택 회차마다 변성 구아니딘 염산염(GuHCl)의 농도를 달리하면서 PBT 완충액(PBS, 0.2% BSA, 0.05% Tween20)에 재현탁시켰다. 평형화를 위해 파지를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 선택도 37℃에서 수행하였다. 각 라운드마다 다음 조건을 사용하였다.

4회차의 친화도 성숙 후, 여러 개의 클론을 시퀀싱하고, 경쟁 ELISA 검정에 의한 평가를 통해 화합물 1.1.1을 관심 클론으로서 선택하였다. Cys21을 방관자 돌연변이로서 식별하여 (예를 들어, 이황화 이량체화의 가능성을 제거하기 위해) Ala로 되돌려서 관심 주요 화합물인 화합물 1.1.1(C21A)을 수득하였다.

또한, WO2014/140882에서 Uppalapati 등에 의해 기술된 다양한 스캐폴드 파지 디스플레이 라이브러리를 합성 D-VEGF-A 표적 단백질에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 스캐폴드화 도메인 라이브러리 중 몇 개는 파지 디스플레이 스크리닝 연구 도중에 히트 클론을 생성하였는데, 이는 VEGF-A에 특이적으로 결합하는 대상 D-펩티드 화합물이 다양한 기저 스캐폴드 도메인 중 하나를 가질 수 있음을 나타낸다. 먼저, 추가 조사를 위해 GA 도메인 스캐폴드화 라이브러리로부터의 히트 클론을 선택하였다.

D-VEGPA에 대한 히트를 생성한 스캐폴드 목록

SCF2- DGCR8 이량체화 도메인-56aa

SCF3- Get5 C-말단 도메인-41aa

SCF7- KorB C-말단 도메인-58aa

SCF8- Lsr2 이량체화 도메인-55aa

SCF15- Symfoil 4P (설계된 베타-트레포일)-42aa

SCF24- Golgin245의 GRIP 도메인-51aa

SCF28- Ku의 C-말단 도메인-51aa

SCF 32- 단백질 G의 GA 도메인-53aa

SCF29- Cue2의 Cue 도메인-49aa

SCF37- PEM1 유사 단백질-44aa

SCF40 - 뉴클레오티드 교환 인자 C-말단 도메인-60aa

SCF42 - 전사 인자 항-종결 단백질-59aa

SCF44 - 이 단백질-65aa

SCF53 - Rhodnin kazal억제제 -51aa

SCF55 - 항-TRAP-48aa

SCF56 - TNF 수용체17(BCMA) -39aa

SCF63 - Fyn SH3 -61aa

SCF64 - E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 UBR5-65aa

SCF65 - DNA 복구 엔도뉴클레아제 XPF-63aa

SCF66 - rad23 hom.B, xpcb 도메인-61aa

SCF70 - 에머린의 LEM 도메인-47aa

SCF75 - GspC-68aa

SCF95 - 단백질 Z-58aa

SCF96 - 단백질 G의 B1 도메인(GB1)-55aa

실시예 2: D-펩티드 화합물의 합성 및 접힘

선택된 화합물을 종래의 Fmoc 고상 펩티드 합성 방법을 사용하여 합성하고 정제하였다. 일부 경우에, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 추가의 점돌연변이를 포함시켰다. 화합물을 완충액에서 접고 본원에 기술된 바와 같이 VEGF-A 억제 활성에 대해 평가하였다.

실시예 3: VEGF-A 복합체의 X-선 결정 구조

L-VEGF-A와의 복합체를 형성한 화합물 1.1.1(C A)의 X-선 결정 구조를 수득하였다. 도 1은 VEGF-A(채워진 공간으로 표시됨)와 복합체를 형성한 예시적인 화합물 1.1.1(c21a)(백색 스틱으로 표시됨)의 X-선 결정 구조의 도면을 보여준다. 복합체는 이량체이다. 도 1 및 2에서, 화합물과 접촉하는 VEGF-A의 결합 부위 잔기는 분홍색으로 도시되어 있다. VEGF-A(8~109) 결합 부위 잔기는 굵은 글씨체로 표시되어 있으며:

GQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKD (서열번호 88);

여기서, 이량체 내의 단일 결합 부위는 다음의 잔기에 의해 정의된다:

사슬 A: KFMDVYQRSY (서열번호 89) 및 NDEGL (서열번호 90); 및

사슬 B: YIFKP (서열번호 91) 및 IMRIKPHQGQHI (서열번호 92).

실시예 4: 선택된 화합물의 효능 평가

VEGF-A에 대한 관심 화합물의 결합 친화도는 표면 플라스몬 공명(SPR) 검정을 사용하여 측정하였다.

경쟁 파지 ELISA 검정에서 관심 화합물을 VEGF-A 결합에 대해 평가하였다.

예시적인 L-펩티드 화합물의 D-VEGF-A 결합 활성
화합물	IC₅₀ (nM)
1.1	100~105
1.1.1	20~34
1.1 (-kaha, adfl)	12
1.1 (-kaha, edyl)	5
1.1 (-kaha, Grtvp)	1~1.1
1.1 (-kaha, edwyl)	5~5.4
1.1 (-kaha, GehGsp)	14
1.1.1 (c21a)	7
1.1.1(c21a) (-kaha, Grtvp)	0.27~0.30
1.1.1(c21a) (-tidqw, -kaha, Grtvp)	0.42~0.66
1.1.1(c21a) (-kaha, edwyl)	0.31~0.66
1.1.1(c21a) (-tidqw, -kaha, edwyl)	0.86~1.1

옥텟 검정에서 관심 화합물을 VEGF-A:VEGFR1의 억제에 대해 평가하였다. 예시적인 조건: 10 nM의 VEGF-A, nM 농도의 억제제; VEGF-A:VEGFR1 K_d = 25 pM.

실시예 5: 이량체 화합물의 제조 및 평가

시스테인 말레이미드 또는 이황화 접합 화학을 사용하여 화합물의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 PEG 기반 링커를 접합함으로써 다양한 길이의 링커를 갖는 일련의 변형된 화합물 1.1.1(c21a)의 이량체를 제조하였다. 시스테인 잔기를 화합물의 C-말단 또는 N-말단에 혼입시키고, 변형된 이작용성 PEG 링커를 이용한 시스테인-말레이미드 접합 화학을 통해 이량체화를 달성하였다. 예시적인 이량체 화합물의 구조는 아래에 나타나 있다:

생성된 이량체 화합물을 옥텟 검정에서 VEGF-A 억제 활성에 대해 분석하였다.

Octet 검정에 의한 VEGFR1 수용체에 대한 VEGF-A 결합의 억제
링커	N-N 이량체화	C-C 이량체화
이황화물		35.3
PEG (3 단위)	93.4	102.7
PEG (6 단위)	95.7	101.7
PEG (11 단위) (약 60 Å 길이)	95.6*	95.4*
PEG (1000K MW) (대략 100 Å 길이)	94.3*	67.8*
PEG (2000K MW) (대략 180 Å 길이)	95.7*	98.9*

조건: 10 nM의 VEGF-A, 20 nM(또는 25 nM*)의 억제제; VEGF-A:VEGFR1 K_d = 25 pM.

100% = PEG11 링커로 C-C-연결된 100 nM의 (1.1.1 (c21a)) 이량체

실시예 6: 페닐알라닌 31 및/또는 티로신 37 아미노산 유사체를 포함하는 합성 점 돌연변이의 제조 및 평가

도 21 및 24에 도시된 바와 같은 X-선 결정 구조의 분석에 기초하여, 예시적인 화합물 1.1.1(c21a)에 혼입시키기 위한 페닐알라닌 31 및 티로신 37의 다양한 비-자연 발생 아미노산 유사체를 선택하였다. 화합물 1.1.1(c21a)-PEG6 N-N 연결된 이량체의 일련의 유사체를 본원에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 화합물의 활성은 다음 조건에 따라 억제 검정에서 평가한다. 표 13은 20 nM의 기준 화합물 1.1.1(c21a)-PEG6 N-N 연결된 이량체에 대비 20 nM 화합물, 10 nM VEGF-A의 억제율(%)을 보여준다.

실시예 7: VEGF-A의 D -펩티드 길항제의 친화도 최적화

D-펩티드 VEGF-A 길항제는 GA-도메인 라이브러리의 미러 이미지 파지 디스플레이 스크리닝을 사용하여 식별하였다. 2018년 6월 21일에 Uppalapati 등에 의해 출원된, 발명의 명칭이 "D-Peptidic VEGF-A Binding Compounds and Methods for Using the Same"인 US 62/688,272를 참조한다. 예시적인 화합물 11055(도 3b)는 플라스몬 공명(SPR)에 의해 결정했을 때 31 nM의 VEGF-A 결합 친화도를 나타냈다. 이는 임상적으로 승인된 VEGF-A 길항제로서, VEGF-A에 대해 준-나노몰 결합을 나타내고 생체 내에서 그 생물학적 활성을 차단할 수 있는 베바시주맙(Avastin)보다 상당히 약하다. 본 개시는 VEGF-A의 강력한 길항제인 11055의 고 친화도 변이체를 제공하기 위한 파지 디스플레이 기반 친화도 성숙의 용도를 기술한다.

11055의 고 친화도 변이체를 조작하기 위해, VEGF-A에 결합된 화합물 11055의 X-선 결정 구조의 분석에 기초하여 pIII 융합 파지 디스플레이 라이브러리를 설계하였다. 2.3 옹스트롬 해상도의 11055의 구조는 현적 방법을 사용해 VEGF-A와의 복합체에서 풀었다. 회절 품질의 결정을 0.1 M 트리스 pH 8.5, 0.2 M 염화칼슘, 18% w/v PEG 4000 중에서 성장시켰다. 구조는 분자 치환에 의해 풀었다. 결정 구조는 VEGF-A 동종이량체에 결합된 11055의 2개의 분자를 보여주는데, 이들은 VEGF-A 단량체 상의 동일한 결합 부위를 점유하고, 이들 부위는 VEGF-A의 VEGFR2 수용체 결합 부위와 중첩된다(도 28a 및 도 28b).

이러한 구조에 기초하여, 변이체 GA 도메인 3-나선 구조를 추가로 안정화시키도록 라이브러리를 설계하였다. 나선 2(H2)와 나선 3(H3)을 연결하는 루프와 나선 1(H1) 사이의 패킹 계면에서 랜덤화를 위해 총 7개의 아미노산 잔기를 선택하였다(도 29a). Kunkel 돌연변이유발을 사용해 라이브러리를 제조하고, 동시에 15개의 가능한 AA 치환을 나타내는 NNC 퇴화 코돈으로 각각의 선택된 잔기를 랜덤화하였다(도 29b). 생성된 파지 라이브러리는 1 x 10¹⁰개를 초과하는 개별 변이체를 함유하였고, 미러 이미지 파지 디스플레이 방법을 사용해 재접힘된 D-VEGF-A 표적에 대한 결합에 대해 상기 라이브러리를 스크리닝하였다. 예를 들어, Mandal 등의 문헌[PNAS (2012), 109(37), 14779-14784] 참조. 간략하게, 비오닐화된 D-VEGF-A 표적에 대해 4회의 패닝을 수행하였다. 각 회차마다, 인산 완충 식염수(PBS) 중에서 파지 라이브러리를 표적과 함께 인큐베이션하고, 표적에 결합된 파지를 스트렙타비딘이 코팅된 비드에 포획하고, 세척하고, 다음 회차의 감염 및 파지 증폭을 위해 용리시켰다. 각 회차 동안, 결합된 파지 클론을 점점 더 엄격한 온도 및 세척 조건에 노출시켜 표적에 높은 친화도 결합제를 생성하기 위한 선택적 압력을 증가시켰다. 4회차 선택 후, 개별 파지 클론을 시퀀싱하고, 변이체 GA 도메인의 위치 7 및 38에 고정된 2개의 시스테인 잔기 및 위치 1, 2, 3, 6 및 37에 있는 바람직한 아미노산 잔기를 함유하는 바람직한 컨센서스 모티프를 식별하였다(도 30a).

전술한 X-선 결정 구조에 따르면(도 29a), 위치 7 및 38에서의 시스테인 돌연변이는 분자-내 이황화 결합을 형성하기에 충분한 근위에 측쇄 설프히드릴기를 배치하는 것으로 보인다(도 30c). 3차원 구조의 이러한 분석은 컨센서스 모티프 결과에서 보이는 위치 7 및 38에서 쌍을 이룬 시스테인의 고정적인 보존과 일치한다(도 30a). 5개의 대표적인 변이체(서열번호 21~25)를 D-거울상 이성질체로서 합성하고, 천연 L-VEGF-A에 대한 이들의 결합 친화도를 SPR을 사용하여 측정하였다(도 30b). 변이체 979110의 VEGF-A 친화도가 가장 높았는데, 측정된 평형 해리 상수(K_D)가 3.6 nM이었다. 따라서, 친화도 최적화는 11055에 비해 VEGF 결합을 거의 10배 개선시켰다.

친화도 성숙된 D-펩티드 화합물의 길항 활성을 측정하기 위해, VEGF-A 차단 ELISA에서 특성을 분석하였다. 여기서, VEGFR1-Fc 융합체를 PBS 중에서 Maxisorp 플레이트 상에 1 μg/mL로 밤새 코팅하였다. 1 nM 비오티닐화-VEGF-A를 길항제 적정과 혼합하고, VEGFR1-Fc에 대한 비오티닐화-VEGF-A의 결합을 스트렙타비딘-HRP로 검출하였다. 변이체 화합물 979110은 VEGFR1에 대한 VEGF-A 결합을 차단하고, 이 검정에서는 3.5 nM의 억제 상수(IC50)를 나타냈는데, 이는 11055(52 nM)보다 14.8배 더 양호한 것이며, 개선된 결합 친화도와 일치한다(도 31a).

HUVEC 세포 증식 검정을 사용하여 D-펩티드 화합물이 VEGF-A 신호 전달을 차단하는 능력을 평가하였다. 여기서, HUVEC 세포 증식은 재조합 VEGF-A의 존재 하에 증가하며, VEGF-A 신호 전달을 차단하는 길항 화합물은 HUVEC 세포 증식을 감소시킨다. HUVEC 검정에서 화합물 979110의 겉보기 IC₅₀은 131 nM이었는데, 이는 부모 화합물 11055보다 4배 더 강력하지만, 베바시주맙(Avastin)보다 185배 더 약하게 유지된다(도 31b). 이들 데이터는 11055 대비 979110의 결합 친화도의 개선이 베바시주맙(Avastin)과 비슷한 효능으로 생체 내에서 VEGF-A 생물학적 활성을 차단하기에 충분하지 않을 수 있음을 시사한다.

실시예 8A: VEGF-A 상의 비-중첩 에피토프에 대한 D-펩티드 길항제의 조작

VEGF 수용체인 VEGFR1 및 VEGFR2와 복합체를 형성한 VEGF-A의 구조는 이용 가능하고, VEGFR1 또는 VEGFR2의 Ig 유사 도메인과 VEGF-A 동종이량체 상의 2개의 동일한 결합 부위 사이의 다가 상호작용을 보여준다(Markovic-Mueller 등의 문헌[Structure (2017), 25, 341-352)(Brozzo et al., Blood (2012), 119(7), 1781-1788]). VEGFR2와 화합물 11055/VEGF-A 복합체 구조의 오버레이는 VEGFR2의 Ig 유사 도메인 중 하나(도메인 2, D2)와 11055 결합 에피토프 사이의 상당한 중첩이 있음을 강조하는데(도 28b 참조), 이는 11055의 길항 활성과 일치한다(도 31a). 그러나, VEGFR2의 제2 Ig 유사 도메인(도메인 3, D3)은 11055 결합 부위와 별개인 VEGF-A 상의 추가 결합 부위에 결합한다(도 28b). 우리는 VEGF-A 상의 VEGFR2 D3 결합 부위에 결합하게 될 제2 D-펩티드 길항제를 조작하여, 11055와 무관하게 추가 수용체 결합 부위를 차단하고자 하였다.

Z-도메인 스캐폴드에 기초한 새로운 파지 디스플레이 라이브러리를 M13 파지에 대한 pVIII-융합으로서 생성하였다. 시스테인을 제외한 모든 아미노산을 나타내는 트리뉴클레오티드 코돈을 이용한 Kunkel 돌연변이유발을 사용해 랜덤화하기 위해 Z-도메인 내에서 10개의 위치를 선택하였다(도 32a 및 도 32b). 생성된 라이브러리를 미러 이미지 파지 디스플레이 방법을 사용해 재접힘된 D-VEGF-A 표적에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 간략하게, 점점 더 엄격한 세척 조건 하에서 비오티닐화 D-VEGF-A에 대한 3회의 패닝을 수행하였다. 3회차 후, 파지 풀을 pIII-융합으로 옮겨 파지 입자 상의 카피 수를 감소시키고, 옮긴 파지는 2회의 추가 패닝을 거쳤다. P3 상에서의 마지막 선택 회차 후, 개별 파지 클론을 시퀀싱하고, 위치 9, 10, 13, 17, 27 및 35에서 고정된 아미노산 W, D, W, R, K 및 Y를 각각 함유하는 바람직한 컨센서스 모티프를 식별하였다(도 33a). 5개의 대표적인 변이체 D-펩티드 화합물(서열번호 26~31)을 합성하고, 천연 L-VEGF-A에 대한 이들의 결합 친화도를 SPR을 사용하여 측정하였다(도 33b). 변이체 978336의 VEGF-A 친화도가 가장 높았는데, 측정된 K_D가 500 nM이었다. SPR을 사용하여 에피토프 맵핑을 수행하여 화합물 978336 및 화합물 11055가 VEGF-A 상의 비-중첩 결합 부위에 결합했는지 여부를 결정하였다. 여기서, 비오티닐화 VEGF-A를 SPR 칩 상에 포획하고, 이의 결합 부위를 포화시키기 위해 5 μM의 화합물 978336을 제1 결합 단계에서 결합시켰다. 제2 결합 단계에서, 5 μM 화합물 978336을 1 μM 11055와 혼합하고, 정태 결합의 변화를 측정하였다. 센서그램 데이터는 화합물 11055 결합으로 인해 반응 단위가 증가함을 나타냈는데, 이는 화합물 978336의 포화 반응 수준보다 높았으며, 이는 화합물 978336과 화합물 11055의 추가 결합을 나타낸다(도 34). 마지막으로, VEGF-A 차단 ELISA에서, 화합물 978336은 VEGF-A와 VEGFR1 사이의 상호작용을 길항할 수 있었으며, 측정된 IC₅₀은 935 nM이었다(도 31a). 이들 데이터는 978336이 11055 부위와는 무관하게 비-중첩 에피토프에 결합하고 VEGF-A 길항제임을 나타낸다.

화합물 978336의 VEGF-A 결합 부위를 추가로 특성화하기 위해, 2.9 옹스트롬 해상도 결정 구조를 978336과 복합체를 형성한 L-VEGF-A로 풀었다. 현적 방법을 사용하여 0.1 M Bis-Tris, pH 5.5, 0.15 M 염화마그네슘, 25% w/v PEG 3350 중에서 회절 품질의 결정들을 성장시켰다. 구조는 분자 치환에 의해 풀었다. 978336의 2개의 분자를 단일 VEGF-A 동종이량체 상의 동일한 결합 부위에 결합시켰다(도 3a). 구조는 화합물 978336이 VEGF-A 상의 D3 결합 부위와 직접 중첩한다는 것을 보여주고(도 35b), 11055 및 978336이 VEGF-A 상의 D2 및 D3 부위 모두를 직접 차단하는 비-중첩 에피토프를 각각 갖는다는 것을 확인시켜 준다(도 28b 및 도 35b).

실시예 8B: 화합물 978336의 친화도 포화 스크리닝

구조 기반 친화도 성숙 방법을 사용해 화합물 978336의 VEGF-A에 대한 결합 친화도를 개선시켰다. 도 6a에서 정의된 VEGF-A 결합 폴리뉴클레오티드의 컨센서스 서열에 따르면, 4개의 잔기 위치(14, 24, 28 및 32)는 강한 컨센서스가 결여되어 있고 상당한 변이(즉, r14, l24, r28 및 s32)를 나타냈다. VEGF-A에 결합된 978336의 결정 구조에서(도 35e) 이들 4개의 잔기는 매립된 계면 접촉이 아니었으나, 전체적으로 약하고 최적화되지 않은 상호작용을 만드는 것으로 보인다. 구체적으로, 잔기 r14 및 s28은 VEGF와 직접 접촉하지 않으며, l24는 산성 패치 근처에 위치하는 소수성 측쇄이고, r28은 임의의 산성 측쇄로부터 너무 떨어져 있어서 최적의 염다리(4 옹스트롬 미만)를 형성할 수 없다. 이들 부위는 Kunkel 돌연변이유발을 사용하여 소프트 랜덤화를 위해 선택하였다(도 35g). 생성된 pIII 파지 라이브러리(서열번호 158)를 전술한 것과 유사한 고-엄격 조건을 사용하여 패닝하여 D-VEGF-A에 대한 개선된 결합제를 식별하였다. 3회차 선택 후, 부모 화합물 978336(서열번호 117)과 비교하여 2개의 우세한 돌연변이 L24V 및 S32R을 함유하는 바람직한 컨센서스 모티프를 식별하였다(도 35f). 대표적인 클론인 변이체 Z 도메인 980181(도 35g; 서열번호 119)를 새로운 D-단백질 결합제로서 합성하였는데, 이는 SPR에 의해 측정했을 때 66 nM의 VEGF-A 친화도를 나타냈다(도 35g). 따라서, 친화도 최적화는 부모 화합물 978336에 비해 약 8배만큼 VEGF 결합 친화도를 개선시켰다.

실시예 9: VEGF-A의 2가 D-펩티드 길항제

D-펩티드 길항 화합물 11055 및 978336이 VEGF-A 상의 비-중첩 에피토프에 결합하고 D2 및 D3 결합 부위 둘 다를 직접 차단한다는 점을 고려하여, 표적에 대한 결합 및 길항 활성에 대한 전반적인 효과를 평가하기 위해 화합물 11055 및 978336의 화학적으로 연결된 접합체를 조작하였다. 화합물 11055 및 978336 둘 다를 추가의 N-말단 시스테인 잔기와 화학적으로 합성하였는데, 이들은 N-말단 대 N-말단 연결을 제공하기 위한 종래의 방법을 사용해 비스-말레이미드 PEG8 링커로 접합시켰다(도 36a).

Bis-Mal-PEG(n) 이작용성 링커, 여기서 n은 3, 6 또는 8임

새로운 이종이량체인 화합물 979111은 SPR에 의해 측정했을 때 1.7 nM의 VEGF-A 결합 친화도를 나타냈다(도 9b). 이는 2개의 독립적인 결합제를 단일 이종이량체로 연결하는 것이 어느 하나의 결합제 단독보다 높은 친화도를 갖는 분자를 생성하는 친화성 효과와 일치한다. 중요하게는, HUVEC 세포 증식 검정에서 이종이량체 979111은 Avastin과 유사한 VEGF-A 차단 활성을 나타냈다. VEGF 신호 전달에 반응하여 세포 증식을 억제하는 IC50은 979111의 경우 1.1 nM이었고, Avastin의 경우 0.7 nM이었는데, 이는 11055에 비해 500배보다 더 개선되었음 나타낸다(도 31b). 이들 결과는 VEGF-A의 이종이량체 D-펩티드 길항제가 세포 기반 검정에서 신호 전달 활성을 효과적으로 차단할 수 있고 VEGF 길항제로서 치료적 잠재력을 가질 수 있음을 함께 보여준다.

실시예 10: VEGF-A의 테트라도메인 D -펩티드 길항제

D-펩티드 화합물의 친화도 및 효능 둘 다를 추가로 개선하기 위해, 단량체 D-단백질 길항제를 이량체 2가 길항제로 화학적으로 결합시키기 위한 계획을 고안하였다. 개념적으로, 2개의 980181 폴리펩티드를 이들의 탄소 말단을 통해 서로 테더링한 다음, 폴리펩티드 979110을 이량체 내의 980181 폴리펩티드들 각각에 부위 특이적으로 접합시켜, VEGF 수용체 결합을 모방하는 테트라도메인 D-단백질을 수득하였다. 도 38a는 VEGF-A 이량체에 결합된 두 화합물 11055 및 978336의 구조의 오버레이를 도시하며, 여기서 도메인의 화학적 연결을 위한 예시적인 부위는 PEG 유도체를 사용해 표시되어 있(도 38a). 구체적으로, 978336 탄소 말단들은 서로 약 15 옹스트롬 이내에 있고, 2개의 리신 측쇄인 11055의 k19 및 978336의 k7은 약 23 옹스트롬 이내에 있다.

고상 펩티드 합성 방법을 사용해 두 가지 성분을 병렬로 합성하고, 단일 클릭 접합 단계를 통해 최종 정제용 완전한 테트라도메인 화합물을 조립하는 합성 전략을 개발하였다(도 38b). D-단백질 979110을 리신 19로부터 연장되는 PEG2-아지드 또는 PEG3-아지드 유도체 중 하나를 함유하는 단량체로서 합성하고, c7-c38 사이의 산화된 분자내 이황화 결합을 형성하였다. 980181을 aa 탄소-말단 결합 링커 수지로부터 합성하고, 합성 도중에 동종이량체를 생성하였다. 또한, PEG2-알킨 유도체를 리신 7에 혼입시켜 979110에 대한 접합을 용이하게 하였다. 최종 접합 단계에서, 979110의 2개의 카피를 클릭 화학을 사용해 980181 동종이량체에 연결하여 PEG2/PEG2 (980870) 또는 링커 길이의 PEG3/PEG2 (980871) 조합을 갖는 테트라도메인 D-단백질 유도체를 수득하였다(도 38c). 사량체 D-단백질의 SPR 적정은 매우 높은 결합 친화도를 나타냈는데, K_D 측정치는 980870의 경우 0.32 nM였고, 980871의 경우 0.42 nM이었다.

D-단백질 테트라도메인 화합물은 준-나노몰 단위로 VEGF-A에 결합할 수 있으므로, VEGF-A의 준-나노몰 농도 및 긴 인큐베이션 평형 결합 조건을 사용해 VEGF-A/VEGFR1 차단 ELISA에서 이의 길항 활성에 대한 보다 정확한 특성 분석을 할 수 있었다. 구체적으로, 150 pM의 VEGF-A를 길항제 적정과 함께 밤새 인큐베이션한 다음, VEGFR1-Fc가 코팅된 플레이트 상에서 5시간 동안 인큐베이션하여 임의의 유리 VEGF-A를 수용체에 결합시켰다. 이러한 조건 하에서, 친화도 성숙 단량체 979110은 7 nM의 IC50을 갖는 반면, D-단백질 테트라도메인 화합물은 128 pM (980870) 및 163 pM (980871)의 강력한 IC₅₀를 나타냈으며, 이는 이들의 준-나노몰 결합 친화도와 일치하였다(도 39a). 중요하게는, D-단백질 테트라도메인 화합물은 701 pM의 IC50을 갖는 베바시주맙보다 약 4배 더 강력하였고, 가용성 미끼 수용체인 VEGFR1-Fc(220 pM의 IC50)보다 약간 더 양호하였다.

이러한 소견을 VEGF 신호전달 차단으로 번역하기 위해, 293 루시페라아제 리포터 세포주에서 VEGFR2 신호전달에 대한 세포 기반 검정을 사용하였다. 여기서, VEGF-A는 293 세포에서 VEGFR2 신호 전달을 활성화하여 루시페라아제 발현을 기능적 판독으로 생성한다. 이 시스템에서, VEGF-A 신호 전달의 억제는 루시페라아제 신호를 상실시켰다. ELISA 조건을 모방하기 위한 노력으로, 150 pM의 VEGF-A를 사용하여 측정 가능한 루시페라아제 신호를 유도하고, 길항제를 적정하여 이러한 활성을 차단하였다. 여기서, 979110은 6.1 nM의 IC50을 나타낸 반면, 테트라도메인 D-단백질은 180 pM (980870) 및 90 pM (980871)의 준-나노몰 IC₅₀를 나타냈고, 이는 시험관 내 ELISA 결과와 매우 일치하였다(도 39b). 또한, 이러한 환경에서 D-단백질 테트라도메인 화합물은 VEGF의 활성을 차단하는 데 있어서 베바시주맙(530 pM의IC₅₀)보다 3~6배 더 강력하였는데, 이는 합성 D-단백질이 항체 유사 활성을 달성할 수 있는 가능성을 입증하였다.

실시예 11: 혈관 내피 성장 인자의 강력한 비면역원성 D-단백질 길항제는 망막 혈관 누출을 예방하고 종양 성장을 억제한다

화학적으로 합성한 D-단백질은 항체와 유사한 효능으로 VEGF 신호 전달을 차단하고, 안과 및 종양학 질환 모델에서 효능을 나타내며, 체액 항-약물 항체 반응을 회피한다.

미러 이미지 파지 디스플레이 및 구조-안내형 최적화를 사용하여 수용체 모방 메커니즘을 사용하여 VEGF-A를 길항시키는 완전한 합성 D-단백질을 조작하였다. 미러 이미지 D-VEGF-A에 대한 파지 패닝을 통해 정준 수용체 상호작용 부위에 결합된 독립적인 단백질을 수득하였다. 결정 구조를 통해 친화성 성숙 및 화학적 연결의 설계를 안내하여, 천연 VEGF-A에 단단히 결합된 이종이량체 D-단백질을 생성함으로써, 피코몰 농도에서 신호 전달 활성을 억제하였다. 총 화학적 합성에 의해 제조된 본원에 기술된 D-단백질 VEGF 길항제는 습성 연령 관련 황반 변성의 토끼 안구 모델에서 혈관 누출을 방지하였고, MC38 동계 마우스 종양 모델에서 종양 성장을 지연시켰으며, 치료 동안 또는 피하 면역화 후 비-면역원성이었다.

본문:

D-단백질은 전적으로 D-아미노산 및 아키랄 아미노산 글리신으로 이루어진 미러 이미지 분자이다. D-단백질은 내인성 프로테아제에 의한 분해에 저항하여, 면역학적 제시에 필요한 펩티드로의 단편화를 피하고(1, 4, 8), 강한 보조제에서 유화되고 피하 주사에 의해 반복 투여되는 경우에도(1, 2) 면역 반응을 자극하지 않는 것으로 보고된다.

본원에 기술된 바와 같은 VEGF의 길항제는 습성 AMD의 토끼 안구 모델에서 VEGF-A에 의해 유도된 혈관 누출을 완전히 차단할 수 있었다. 또한, 인간 및 쥣과 VEGF-A에 대한 교차 종 활성은 MC38 동계 마우스 모델에서 종양 성장 억제 및 치료 후 면역원성의 결여를 입증할 수 있게 하였다. 또한, 보조제에서 유화시킨 D-단백질 길항제를 반복적으로 피하 투여하여 면역화한 후, 체액성 항체 반응이 전혀 없었다.

미러 이미지 단백질 파지 디스플레이

다가 D-단백질 길항제를 개발하기 위해, VEGF-A 상의 비-중첩 에피토프에 대한 단백질 결합제를 식별하였다. 박테리아 단백질 G 및 단백질 A로부터 각각 유래된 53-잔기 GA 도메인 및 58-잔기 Z 도메인 단백질(22, 23)을 파지 디스플레이를 위한 2개의 상이한 3-나선 다발 스캐폴드로서 선택하였는데, 이는 이들의 높은 안정성, 작은 크기, 및 화학적 합성의 용이성 때문이었다. 각각 10개 및 12개의 하드 랜덤화 라이브러리 위치를 함유하는 Z 및 GA 도메인 스캐폴드에 대해 M13 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하였다(도 46a 내지 도 46c). 표적 D-VEGF-A(8-109)의 비오티닐화된 형태를 총 화학 합성에 의해 제조하고, 각 파지 라이브러리를 점점 더 엄격한 표적 농도 및 세척 조건(Sup 방법) 하에 D-VEGF-A-비오틴에 대해 별도로 패닝하였다. 정성적 결합 ELISA에서, GA 및 Z 도메인 둘 다에 대한 컨센서스 히트를 나타내는 파지 클론은 농도 의존적 방식으로 D-VEGF-A에 결합하였다(도 40a). GA 결합제를 L-단백질로서 합성하고, 파지 경쟁 ELISA에서 경쟁자로서 사용하여, D-단백질로서 히트를 합성하기 전에 가역적 결합을 확인하였다. GA 결합제는 그의 부모 파지 클론이 280 nM의 IC50으로 D-VEGF-A에 결합하는 것을 직접적으로 차단하였지만, Z-도메인 파지 클론의 결합에는 영향을 미치지 않았는데(도 40b), 이는 2개의 단백질이 VEGF-A 상에서 독립적으로 에피토프를 표적화함을 시사한다.

VEGF-A의 천연 L-단백질 형태에 대한 결합제로서의 추가 특성화를 위해, GA 및 Z 도메인 히트 모두를 D-단백질(각각, RFX-11055 및 RFX-978336)로서 합성하였다. 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 L-VEGF-A에 대해 수행된 D-단백질 결합제의 적정을 통해, Z-도메인 결합제 RFX-11055의 경우 43 nM 및 Z-도메인 결합제 RFX-978336의 경우 168 nM의 결합 친화도를 밝혀냄으로써(도 47 및 도 51), D-거울상이성질체가 특이적 결합 활성을 유지한다는 것을 입증하였다. 또한, SPR-기반 에피토프 맵핑 연구는, RFX-11055 및 RFX-978336이 VEGF-A에 동시에 및 추가적으로 결합할 수 있음을 보여주어(도 48), 이들이 독립적인 비-중첩 에피토프에 결합한다는 것을 확인하였다.

VEGF-A 신호 전달의 길항제는 대칭 VEGF-A 동종이량체의 계면에서 형성된 2개의 결합 부위와 VEGF 수용체가 상호 작용하는 것을 차단할 필요가 있다(16, 24). VEGF 길항작용을 평가하기 위해, 비평형 VEGF-A121 차단 ELISA를 사용하여 비오티닐화 VEGF-A 이소형 121(VEGF-A121-biot)이 플레이트 상에 코팅된 VEGFR1-Fc에 결합하는 것을 측정하였다(Sup 방법). RFX-11055 및 RFX-978336 둘 다는 VEGFR1에 대한 VEGF-A121 결합의 억제를 나타냈으며, 겉보기 IC50 값은 각각 52 nM 및 935 nM이었다(도 40c 및 도 52). 이들 D-단백질은 명백한 억제 활성을 나타냈다.

D-단백질 VEGF-A 길항제의 구조-안내 친화도 성숙

D-단백질 길항제의 추가 최적화를 안내하기 위해, 각각 2.3 Å 및 2.9 Å으로 RFX-11055 및 RFX-978336과 복합체를 형성한 VEGF-A의 2개의 독립적인 결정 구조를 풀었다(도 53). 두 경우 모두에서, D-단백질은 VEGF-A의 원위 말단에 있는 결합 부위들과 대칭적으로 상호작용한다(도 41a 및 도 41b). RFX-11055는 패닝을 통해 선택된 우세하게 소수성이고 극성인 잔기들(h27, v28, f31, h34, p36, y37, h40, l44 및 a47)을 사용해 VEGF-A 상에서 약 800 A2 표면적과 상호작용한다(도 41c). 대조적으로, D-단백질 RFX-978336은 몇 개의 극성 접촉(w9, w13 및 y35) 외에 고 염기성 접촉(r14, r17, k27 및 r28)을 사용해 VEGF-A 상의 산성 패치와 상호작용하여, 궁극적으로 약 450 A2의 더 작은 표면적을 포함한다(도 41d). VEGFR1 및 VEGFR2와 복합체를 형성한 VEGF-A의 구조 및 동종이량체 다중 Ig 도메인 수용체 및 VEGF-A 사이에 형성된 상호작용의 세부 사항이 기술되었다(16, 24). 구체적으로, 수용체 Ig 유사 도메인 2 및 3(D2 및 D3)은 C2 대칭을 갖는 동종이량체 VEGF-A 단백질 분자의 원위 단부 상의 2개의 동일한 부위에 결합한다(도 41e). 결합된 RFX-11055 및 RFX-978336와 VEGF- A/VEGFR1 구조의 오버레이는 VEGFR1의 D2 및 D3과 D-단백질 간의 직접 중첩을 강조하여, 수용체 결합 억제의 경쟁적 메커니즘을 보여준다(도 41f). 흥미롭게도, RFX-11055에 의한 소수성 접촉 및 RFX-978336에 의한 극성 접촉의 주된 사용은 VEGF-A와 D2 및 D3에 의해 만들어진 특이적 상호작용의 성질을 밀접하게 모방한다(도 49a 내지 도 49b).

RFX-11055의 3-나선 다발 구조에 기초하여, N-말단 나선 1과 나선 2~3 루프 사이의 패킹을 안정화시키기 위해 7-잔기 소프트 랜덤화 라이브러리를 설계하였다(도 42a). Kunkel 돌연변이유발을 사용해 15개의 가능한 시스텐인 치환을 나타내는 NNC 퇴화 코돈으로 각각의 선택된 잔기를 동시에 랜덤화하였다. D-VEGF-A에 대한 경쟁 단백질로서 L-RFX-11055를 사용한 매우 엄격한 패닝을 4회 수행한 후, 위치 L7 및 V38에서 2개의 고정된 시스테인 잔기를 함유하는 컨센서스 모티프를 식별하였다(도 46a 내지 도 46c). 위치 7 및 38에서 보존된 시스테인 돌연변이는 측쇄 설프하이드릴기를 근접하게 배치하여 분자내 이황화 결합을 형성하는 것으로 보일 것이다. 산화된 이황화 결합을 이용해 D-단백질로서 합성된 컨센서스 변이체인 RFX-979110은 SPR에 의해 2.3 nM의 결합 친화도를 가졌는데, 이는 RFX-11055에 비해 친화도가 19배 개선되었음을 나타낸다(도 47 및 도 51).

RFX-978336의 친화도 성숙은, 추가 조사를 위해, 소프트 랜덤화를 사용해 최소 보존을 나타내는 VEGF-A 접촉 잔기를 초기 패닝으로부터 선택하는 단계를 포함하였다. 총 4개의 잔기를 선택하였고, Kunkel 돌연변이유발을 사용해 각각의 잔기를 소프트 랜덤화하였다(도 42b 및 도 46a 내지 도 46c). 합성된 L-RFX-978336을 경쟁자로서 사용해 유사한 고-엄격 패닝 접근법을 사용하였다. 3회의 선택 후, L24V 및 S32R 돌연변이를 함유하는 바람직한 컨센서스 모티프를 식별하였다(도 42b). Z 돔인 컨센서스 변이체 RFX-980181를 D-단백질로서 합성하였고, 18 nM의 측정된 결합 친화도를 나타냈는데, 이는 RFX-978336 대비 친화도가 9배 개선되었음을 나타낸다(도 47 및 도 51).

친화도 성숙된 D-단백질을 비평형 VEGF-A121 차단 ELISA에서 평가하여 이들의 길항 활성을 측정하였다. RFX-979110은 3.5 nM의 IC50으로 VEGFR1-Fc에 대한 VEGF-A121 결합을 차단하였는데, 이는 RFX-11055에 비해 15배 개선되었고, 이 검정에서 1.8 nM의 IC50을 가진 베바시주맙의 효능에 근접하였다(도 42c 및 도 52). RFX-979110과 대조적으로, RFX-980181에 대한 개선된 결합 친화도는 이의 길항 활성에 영향을 미치지 않았다(IC50은 1,658 nM이며, 동일한 검정에서 측정된 원래의 주요 RFX-978336의 실험적 불확실성 범위 이내임)(도 52). 이전 연구가 VEGF-A의 VEGFR1 결합이 주로 고 친화도 D2 도메인(15)에 의해 유도된다는 것을 나타냈음을 감안할 때, D3 도메인 부위의 차단이 전반적인 수용체 결합에 부수적인 영향을 미친다는 설명이 가능하다.

VEGF-A 신호 전달의 이종이량체 D-단백질 길항제의 총 화학적 합성

단량체 D-단백질의 친화도 및 효능은 이들을 화학적으로 함께 연결하고, VEGF 수용체 D2 및 D3 도메인과 VEGF-A 사이의 상호작용을 재현함으로써 강화시켰다. VEGF-A에 결합된 RFX-11055 및 RFX-978336의 구조, 및 RFX-979110 및 RFX-980181에 대한 유사성에 기초하여, 클릭 반응을 사용하여, 화학적으로 변형된 리신 측쇄 K19 및 K7 각각을 통해 이들 사이의 부위 특이적으로 연결하여, 천연 수용체 결합을 모방하도록 설계된 이종이량체 D-단백질 작제물을 생성하였다(도 50a 및 도 50b). 총 화학 합성을 사용함으로써, RFX-979110을 Lys19의 측쇄로부터 연장된 PEG3-아지드 유도체를 함유하는 단량체로서 합성하고, Cys7-Cys38 간의 분자내 이황화 결합을 형성하였다. D-단백질 RFX-980181을 합성하고, PEG2-알킨 유도체를 Lys7의 측쇄 상에서 RFX-980181 내에 혼입시켜, PEG-아지드가 장착된 RFX-979110에 대한 접합을 용이하게 하였다. 최종 연결 단계에서, 클릭 화학을 사용해 RFX-979110을 RFX-980181과 반응시켜, PEG3/PEG2 링커가 포함된 13 kDa의 이종이량체 D-단백질(RFX-980869)을 수득하였다(보충 방법, 도 46c 및 도 50b). RFX-980869는 이어지는 화학적 합성 및 정제를 위해 LC/MS 스펙트럼을 특성화하였다.

이종이량체 D-단백질 RFX-980869의 SPR 적정은 매우 높은 결합 친화도를 입증하였는데, 측정된 KD는 0.07 nM으로서 0.16 nM인 베바시주맙의 KD와 유사하였다(도 47 및 도 51). 유사한 조건 하에 베바시주맙 항체를 적정하였고, 준-나노몰 농도 범위에서의 친화도를 정확하게 결정하는 것이 측정 한계에 도달한 것으로 결론을 내렸다. 관찰된 이례적으로 높은 결합 친화도는 개별 D-단백질을 이종이량체로 화학적으로 연결함으로써 가능해진 다가 상호작용과 일치한다.

이의 길항 활성을 추가로 특성화하기 위해, 긴 인큐베이션 평형 결합 조건 하에 준-나노몰 농도의 VEGF-A121를 사용해 VEGF-A121/VEGFR1 차단 ELISA를 사용하였다(보충 방법). 이러한 조건 하에서, 친화도 성숙 단량체 RFX-979110은 7.6 nM의 IC50을 나타낸 반면, D-단백질 이종이량체는 0.31 nM의 IC50 값을 나타냈는데, 이는 SPR에 의해 측정된 친화도와 상당히 일치한다(도 43a 및 도 54). 특히, D-단백질 이종이량체의 IC50 값은 베바시주맙(0.70 nM의 IC50)보다 낮았고, 0.23 nM의 IC50 값을 갖는 가용성 미끼 수용체 VEGFR1-Fc와 유사하였다. 합성 이종이량체 및 가용성 미끼 수용체에 대해 측정된 IC50 값은 검정에서 VEGF-A121의 농도에 근접하였는데, 이는 이들의 효능이 본 검정에서 측정될 수 있는 것보다 높을 수 있음을 나타냈다.

이들 D-단백질 길항제가 VEGF 신호 전달에 미치는 영향을 입증하기 위해, VEGFR2 수용체 활성화에 의해 유도된 세포 기반 루시페라아제 리포터 검정을 사용하였다. 본 검정에서, 150 pM의 VEGF-A는 VEGFR2 신호 전달을 활성화하여 루시페라아제 발현의 증가를 유발하는 반면, VEGF-A의 억제는 루시페라아제 발현의 감소를 초래한다. 단량체 D-단백질 RFX-979110은 6.1 nM의 IC50을 가진 반면, 이종이량체 D-단백질 RFX-980869는 0.49 nM의 준-나노몰 IC50 값을 나타냈는데, 이는 VEGFR2 신호 전달을 차단함에 있어서 베바시주맙(0.53 nM의 IC50)과 동등하다(도 43b 및 도 54). 요약하면, 이들 데이터는 총 화학 합성을 사용한 단량체 D-단백질의 화학적 연결이 VEGF-A와 이의 수용체 사이의 매우 높은 친화도 상호작용을 파괴할 수 있는 이종이량체를 형성하였음을 입증한다.

RFX-980869는 생체 내에서 강력한 활성을 나타내며, 비-면역원성이다

안과 질환과 종양학 질환 모두에서의 응용예를 각각 입증하기 위해, 습성 AMD에 대한 토끼 안구 모델 및 동계 마우스 종양 모델에서 RFX-980869의 활성을 조사하였다. 습성 AMD에 대한 토끼 안구 모델에서, 외인성 VEGF-A165를 이용한 유리체내 접종은 망막의 혈관 누출을 유도하는데, 이는 형광 혈관 조영술(FA)을 사용하여 모니터링할 수 있다. VEGF-A 차단은 플루오레세인이 안구 내로 확산 누출하는 것을 방지할 수 있는데, 이는 효능의 척도로서 작용한다. 여기서, 애플리버셉트와 비교하여 RFX-980869의 투여량 의존적 효능 및 지속성을 시험하였다. 눈 하나당 0.25 mg 또는 1.0 mg의 RFX-980869의 1회 유리체 내 투여한 후, 1개월의 기간에 걸쳐 외인성 VEGF-A를 토끼에게 2회 투여하고(2일차 및 23일차), 3일 후(5일차 및 26일차) 그들의 눈을 검사하였다. 특히, 0.25 mg 또는 1 mg의 RFX-980869의 1회 투여한 경우, VEGF의 2회 접종 후 대조군 눈에서 관찰된 혈관 누출을 유의하게 차단할 수 있었다(도 43c). 또한, 26일차에 1.0 mg의 RFX-980869의 투여량은 1.0 mg의 애플리버셉트와 마찬가지로 혈관 누출을 완전히 차단한 반면, 0.25 mg의 투여량은 효능의 감소를 보였는데, 이는 플루오레세인 누출 및 혈관 비틀림 증가를 특징으로 한다(도 43c). 이들 결과는 26일차에 연구에 관련된 모든 눈에서 FA 이미지의 상세한 검사 및 채점에 의해 확인하였으며(도 44a 내지 도 44b), 이는 RFX-980869를 사용한 치료의 명확한 용량 의존적 지속성을 입증한다.

RFX-980869의 종양 성장 억제 능력을 평가하기 위해, 마우스 VEGF-A(데이터 미도시)와 RFX-980869의 교차 반응성을 연구하고, 동계 MC38 마우스 종양 모델을 사용하였다. MC38 결장암 종양은 인간 PD-1을 유전자 이식한 C57BL6 마우스에서 확립되었으며, 치료 개시 전에 82 mm³에 도달하였다. 동계 MC38 종양 모델에서 VEGF-A 길항제의 효능에 대해 공개된 선례를 찾을 수 없었기 때문에 니볼루맙을 양성 대조군으로 사용하였다. 2주 동안 매일 6 mg/kg으로 투여한 RFX-980869는 2주마다 3 mg/kg으로 투여한 니볼루맙과 유사한 종양 성장의 억제를 나타냈다(도 44a). 2 mg/kg의 RFX-980869와 1 mg/kg의 니볼루맙 둘 다는 모두 비히클 대조군과 관련하여 종양 성장 억제를 나타내지 못하여, 이러한 환경에서 두 가지 치료제의 투여량 의존적 효능이 있음을 확인하였다. 15일차에, RFX-980869의 일일 투여를 종료한 후, 종양 성장 억제는 6 mg/kg의 RFX-980869의 경우 31%였고, 3 mg/kg의 니볼루맙의 경우 48%였다(도 44b).

이종이량체 D-단백질 길항제의 비-면역원성 능력을 강조하기 위해, 종양 연구가 종료된 후 항-약물-항체(ADA)에 대해 마우스 혈청을 분석하였다. 이러한 완전한 면역-유능 마우스 종양 모델에서, RFX-980869 저 투여량 및 고 투여량 치료군 모두의 혈장은 RFX-980869에 대한 IgG 역가 반응의 완전한 결여를 나타낸 반면, 니볼루맙 치료군의 IgG 역가는 포화 수준이었다(도 45c). 따라서, 두 제제가 완전한 외래 항원임에도 불구하고, 니볼루맙만이 강력한 ADA 반응을 유도했다. 이들의 상이한 종양 성장 억제 메커니즘을 감안하여, 보조제에서 유화시킨 RFX-980869, 니볼루맙, 또는 베바시주맙을 반복적으로 피하 주사하여 마우스에게 직접 면역화하는 별도의 연구를 수행하여, 비-면역원성이 RFX-980869의 고유 특성인지 여부를 결정하였다. 단클론 항체를 이용한 면역화는 42일 후에 강한 IgG 역가를 생성하였지만, RFX-980869는 체액 항체 반응을 완전히 회피하였다(도 45d). 종합하면, 생체 내 결과는 안과 및 종양학 환경 모두에서 합성 VEGF-A 길항제의 강력한 활성을 입증할 뿐만 아니라, 이의 면역원성 결여와 관련하여 단클론 항체에 비해 명확한 차별화도 보여준다.

논의

미러 이미지 단백질 파지 디스플레이 및 구조-가이드형 최적화를 사용하여 2개의 상이한 3-나선 다발을 VEGF-A 상의 D2 및 D3 결합 부위를 점유한 D-단백질 길항제로 독립적으로 성숙시켰다(도 41f). 단량체의 측쇄-선택적 화학적 결합을 통해, 생성된 13 kDa D-단백질은 대략 1,250 Å²의

VEGF-A 표면적에 결합할 수 있어서, VEGF 수용체 결합과 매우 유사한 메커니즘을 복제하면서 피코몰 수준의 친화도를 달성하였다. VEGF-A 상의 4개의 수용체 상호작용 부위를 모두 차단함으로써, VEGF-A의 결과적인 중화는 생체 내 전환 및 제거의 시간 척도에서 비가역적일 가능성이 있다. VEGF-A를 차단하기 위해 수용체 미끼 메커니즘을 이용하는 애플리버셉트와 마찬가지로(25, 26), 본원에 기술된 이종이량체 D-단백질 VEGF 길항제도 수용체 모방체를 사용하여, 훨씬 더 작긴 하지만 화학적으로 합성된 D-단백질 포맷인 VEGF-A 상의 VEGF 수용체 결합 부위 모두를 차단한다.

본원에 기술된 이종이량체 D-단백질 VEGF 길항제는 브롤루시주맙 크기의 절반이고, PBS(pH 7.4)에 쉽게 용해되며, 고 투여량 제형으로 만들기 쉽다. 크기가 작으면 망막 침투가 양호해지고, 눈을 떠난 후에는 전신에서 신속하게 제거될 수 있다. 또한, 증가된 단백질 분해 안정성 및 면역원성 결여를 포함하는 특성은 치료 반응의 지속성, 염증 감소, 및 장기 만성 치료에 따른 ADA의 부재에 있어서 추가적인 이점을 제공한다.

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재료 및 방법

단백질 합성 시약

Fmoc-D-아미노산은 Chengdu Zhengyuan Company, Ltd 및 Chengdu Chengnuo New-Tech Company, Ltd.로부터 구입하였다. Fmoc-D-Ile-OH는 Chemimpex International, Inc.로부터 구입하였다. Fmoc-D-프로파길글리신 (Fmoc-D-Pra-OH)은 Haiyu Biochem으로부터 구입하였다. MBHA 수지는 Sunresin New Materials Co. Ltd., Xian으로부터 구입하였다. 린크 아미드 링커(Rink Amide linker)는 Chengdu Tachem Company, Ltd.로부터 구입하였다. 클로로-(2-Cl)-트리틸-수지는 Tianjin Nankai Hecheng Science and Technology Company, Ltd.로부터 구입하였다. Fmoc-NH2(PEG)n-COOH 및 기타 PEG 링커들은 Biomatrik Inc.로부터 구입하였다. 2-아지도아세트산은 Amatek Scientific Company Ltd.로부터 구입하였다. 아스코르브산나트륨은 TCI (Shanghai) Ltd.로부터 구입하였다. 황산구리 오수화물(CuSO4·5H2O)은 Energy Chemical로부터 구입하였다.

D- VEGF-A 합성 및 재접힘

D-VEGF-A 폴리펩티드 사슬(COOH 산, 잔기 8~109 (33))을 고상 펩티드 합성(SPPS) 및 천연 화학 결찰을 사용해 화학적으로 합성하고, 이를 이전 작업(21)에서 맞게 구성한 방법을 사용해 접어서 단백질 공유 동종이량체를 형성하였다. 1에 상응하는 개별 펩티드 단편: Gly1-to- D-Tyr18, 2: D-Cys19-to- D-Arg49, 3: D-

단계적 SPPS에 대한 표준 Fmoc 화학 프로토콜을 사용해 Cys50-to- D-Asp102를 합성하였다. 단편 1과 2는 NH₂NH-(2-Cl)트리틸-수지를 이용해 합성하였고, 단편 3은 미리 로딩된 왕 수지(Wang Resin)로 합성하였다. 간략하게, 먼저 미리 로딩된 Fmoc-아미노아실-왕 수지를 1시간 동안 DMF(10 mL/g)에서 불린 다음, 20% 피페리딘/DMF로 처리하여(30분) Fmoc기를 제거하고 DMF로 다시 세척하였다(5회). 보호된 아미노산(DMF 중 0.4 M), 디이소프로필카보디이미드(DIC), 및 하이드록시벤조트리아졸(HOBt)의 미리 활성화된 용액(각각 3당량)을 수지에 첨가하여 Fmoc-D-아미노산 잔기를 결합시켰다. 1~2시간 후, 닌하이드린 시험을 통해 반응 완료를 확인하고, 수지를 DMF로 세척하였다(3회). Fmoc기를 제거하기 위해, 피페리딘(DMF 중 20%)을 수지에 30분 동안 첨가하였다. 최종 Fmoc 기를 제거한 후, 수지를 DMF(3회) 및 MeOH(2회)로 헹구고, 진공 하에 건조시킨 다음, 절단을 위해 85% TFA, 5% 티오아니솔, 5% EDT, 2.5% 페놀, 및 2.5% 물에 용해시켰다. 2시간 후, 수지를 TFA로 세척하고, 용리된 펩티드를 버블링 질소 가스로 농축시켰다. 미정제 펩티드를 차가운 에테르로 침전시키고, 원심분리에 의해 펠릿화하고, 차가운 에테르로 2회 세척한 후, 진공 하에 건조시켰다. 펩티드 잔류물을 물에 용해시키고, 분취 역상 HPLC로 정제하고, HPLC 및 MS로 분석하였다.

D-펩티드-하이드라지드 단편과 D-Cys-펩티드 단편 사이의 연결을 다음과 같이 수행하였다: D-펩티드-하이드라지드를 완충액 A(6 M GnHCl이 포함된 0.2 M 인산나트륨, pH 3.0)에 용해시키고, 빙염 조에서 -15℃까지 냉각시키고, 자기 교반기로 부드럽게 교반하였다. NaNO₂(7당량)를 첨가하고, 용액을 20분 동안 교반하여 D-펩티드-하이드라지드를 펩티드-아지드로 산화시켰다. 완충액 B(6 M GnHCl이 포함된 0.2 M 인산나트륨, pH 7.0)에 용해된 4-메르캅토페닐 아세트산(MPAA)(50당량)의 용액을, 새로 형성된 D-펩티드-아지드(동일 부피)가 포함된 용액에 신속하게 첨가하여 과량의 NaNO₂를 제거하고 펩티드-아지드를 펩티드-MPAA 티오에스테르로 변환시켰다. 그런 다음, 완충액 B 중 D-Cys-펩티드의 용액(동일 부피)을 새롭게 형성된 펩티드-MPAA 티오에스테르가 포함된 용액에 첨가하였다. 그리고, NaOH로 반응 혼합물을 pH 7까지 조절하여 밤새 천연 화학 결합을 개시하였다. 분석 RP-HPLC에 의해 반응 진행을 완료 시까지 모니터링한 다음, HPLC 정제 전에 TCEP로 처리하였다.

연결된 펩티드 생성물의 정제는 21.2Х250 mm / 20.0Х250 mm 치수의 컬럼이 구비된 Phenomenex C18/YMC C4 실리카를 이용해 CXTHLC6000/Hanbon NU3000 분취 시스템 상에서 수행하였다. 미정제 펩티드를 분취 컬럼 상에 로딩하고, 용매 A(물 중 0.1% TFA) 중 증가하는 농도의 용매 B(80% 아세토니트릴 중 0.1% TFA)의 얕은 구배로 5 mL/분의 유속으로 용리하였다. 정제된 표적 펩티드를 함유하는 분획을 분석 LC-MS로 식별하고, 합치고, 동결 건조시켰다.

최종 선형 D-VEGF-A 펩티드를 글루타티온 환원(2 mM)/글루타티온 산화(0.4 mM)의 산화-환원쌍을 함유하는 수성 Gu·HCl(0.15 M) 중 pH 8.4에서 접고, 완료될 때까지 5일 동안 교반하였다(21). 접힌 D-VEGF-A를 RP-HPLC로 정제하였다.

파지 디스플레이 라이브러리 및 패닝

미노출 GA- 및 Z-도메인 스캐폴드 라이브러리를 이전에 기술된 방법에 의해 N-말단 유전자 8 주요 외피 단백질에 대한 융합으로서 작제하였다(34). 트리뉴클레오티드 올리고를 이용한 Kunkel 돌연변이 유발(35)을 사용해 원하는 라이브러리 위치의 랜덤화(도 46a 내지 도 46c)를 수행하여 시스테인을 제외한 모든 천연 아미노산을 혼입시켰다. 생성된 라이브러리는 >1010개의 고유 구성원을 포함하였다. 친화도 성숙 라이브러리의 경우, 표적화된 NNC 또는 소프트 랜덤화 올리고를 각각 사용하여 RFX-11055 또는 RFX-978336 부모 서열 상에서 Kunkel 돌연변이 유발을 수행하였다. 친화도 성숙을 위해 표적화된 위치는 도 S1에 강조되어 있다.

모든 파지 선택은 이전에 확립된 프로토콜(34)에 따라 수행하였다. 간략하게, 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드(Promega)로 포획된 비오티닐화 D-VEGF를 사용하여 펩티드 라이브러리를 이용한 선택을 수행하였다. 초기에, D-VEGF(2.0 mM, 1.0 mM, 및 0.5 mM)의 양을 감소시키면서 3회의 선택을 완료되었다. 그런 다음, 파지 풀을 N-말단 유전자 3 마이너 외피 단백질 디스플레이 벡터에 옮기고, D-VEGF(200 nM, 100 nM, 및 50 nM)의 양을 감소시키고 세척 시간을 늘이면서 추가로 3회의 패닝을 수행하였다. 그런 다음, 개별 파지 클론을 시퀀싱 분석을 위해 전달하였다.

D - 단백질 결합제의 합성

친화도 성숙된 D-단백질 RFX-979110 및 RFX-98018의 폴리펩티드 사슬(도 46a 내지 도 46c)을 린크 아미드(Rink Amide) MBHA 수지를 이용해 Fmoc 화학 단계적 SPPS에 의해 수동으로 제조하였다. 아미노산에 대한 측쇄 보호는 다음과 같았다: D-Arg(Pbf), D-Asp(OtBu), D- Glu(OtBu), D-Asn(Trt), D-Gln(Trt), D-Ser(tBu), D-Thr(tBu), D-Tyr(tBu), D-His(Trt), D- Lys(Boc), D-Trp(Boc). D-폴리펩티드의 사슬 조립이 완료되고 최종 Fmoc 기가 제거된 후, 생성된 D-펩티드를 2.5% 트리이소프로필실란 및 2.5% H2O를 함유하는 TFA로 실온에서 2.5시간 동안 처리하여 상기 D-펩티드의 측쇄를 탈보호시킴과 동시에 수지 지지체로부터 절단하였다. 미정제 D-폴리펩티드 생성물을 여과에 의해 수지로부터 회수하여, 침전시키고, 냉각된 디에틸 에테르로 분쇄한 다음 진공 하에 건조시켰다. 적절한 완충액에서 용해시켜 D-폴리펩티드 사슬이 자발적으로 접히게 하여, 기능적 D-단백질 결합제 분자를 수득하였다.

D-단백질 이종이량체의 합성

1단계: 아지도-PEG3- D -979110 수지의 제조.

Fmoc-아미노아실-린크 아미드 MBHA 수지를 DMF(10~15 mL/g 수지) 중에서 1시간 동안 불렸다. 현탁액을 여과하고, 20% 피페리딘을 함유하는 DMF로 교환하고, 연속 질소 가스 관류 하에 0.5시간 동안 실온에서 유지하였다. 그런 다음, 수지를 DMF로 5회 세척하였다. Fmoc-D-아미노산-OH, DIC, HOBt, 및 DMF를 수지에 첨가하였다. 질소 스트림이 현탁액을 통과하도록 버블링시키면서 현탁액을 실온에서 1시간 동안 유지시켰다. 닌하이드린 시험을 사용해 완료 시까지 결합 반응을 모니터링하였다. 친화도 성숙된 D-단백질 RFX-979110에 상응하는 나머지 D-아미노산을 펩티딜 수지에 순차적으로 결합시켰다. 아지도-PEG3-COOH를 Lys19의 일차 아민에 결합시켰다. 보호된 RFX-979110 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열을 조립한 후, 20% 피페리딘을 함유하는 DMF로 처리하여 최종 Fmoc 기를 제거하였다. 펩티딜-수지를 DMF(5회), MeOH(2회), DCM(2회) 및 MeOH(2회)로 세척한 다음 진공 하에 밤새 건조시켰다.

2단계: 아지도-PEG3- D -979110-수지의 절단 및 탈보호.

절단 용액(TFA/티오아니솔/EDT/페놀/H₂O = 87.5/5/2.5/2.5/2.5 v/v, 10 mL/g 펩티드 수지)을 건조된 아지도-PEG3-D-979110-수지에 첨가하였다. 현탁액을 3시간 동안 진탕시키고, 여과하고, 여액을 수집하였다. 여액에 차가운 에테르를 첨가하여 펩티드를 침전시키고, 이를 원심분리에 의해 회수하였다. 백색 침전물을 에테르로 2회 세척한 다음, 진공 하에 밤새 건조시켜 미정제 아지도-PEG3-D-979110을 백색 고형분으로서 수득하였다.

3단계: 산화 및 정제. I ₂ 를 사용해 미정제 아지도-PEG3-D-979110을 산화시켰다.

간략하게, 펩티드(23.5 mg)를 11 mL의 30% ACN에 용해시키고 330 μL의 CH₃COOH와 혼합하였다. I₂/MeOH 용액을 혼합물이 담황색이 될 때까지 적가한 다음, 수성 아스코르브산 나트륨을 적가하여 과량의 I₂를퀀칭시켰다. 산화된 아지도-PEG3-D-979110의 정제는 21.2Х250 mm 치수의 컬럼이 구비된 Phenomenex C18 실리카를 이용해 CXTH LC6000/Hanbon NU3000 분취 시스템 상에서 수행하였다. 미정제 펩티드를 분취 컬럼 상에 로딩하고, 용매 A(물 중 0.1% TFA) 중 증가하는 농도의 용매 B(물 중 80% 아세토니트릴 중 0.1% TFA)의 얕은 구배로 5 mL/분의 유속으로 용리하였다. 순수 표적 펩티드를 함유하는 분획을 분석 LC-MS에 의해 식별하고, 합치고, 동결 건조시켜 이어지는 (알키닐-PEG2)-D-980181와의 클릭 반응을 위한 정제된 아지도-PEG3-D-979110을 수득하였다.

4단계: 알키닐-PEG2- D -980181 수지의 제조.

Fmoc-아미노아실-린크 아미드 MBHA 수지를 DMF(10~15 mL/g 수지) 중에서 1시간 동안 불렸다. 현탁액을 여과하고, 20% 피페리딘을 함유하는 DMF로 교환하고, 연속 질소 가스 관류 하에 0.5시간 동안 실온에서 유지하였다. 그런 다음, 수지를 DMF로 5회 세척하였다. Fmoc-D-아미노산-OH, DIC, HOBt, 및 DMF를 수지에 첨가하였다. 질소 스트림이 현탁액을 통과하도록 버블링시키면서 현탁액을 실온에서 1시간 동안 유지시켰다. 닌하이드린 시험을 사용해 완료 시까지 결합 반응을 모니터링하였다. 친화도 성숙된 D-단백질 980181 폴리펩티드 사슬에 상응하는 나머지 D-아미노산을 순차적으로 첨가하였다. 알키닐-PEG2-COOH를 Lys7의 일차 아민에 결합시켰다. 보호된 RFX-979181 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열을 조립한 후, 20% 피페리딘을 함유하는 DMF로 처리하여 최종 Fmoc 기를 제거하였다.

펩티딜-수지를 DMF(5회), MeOH(2회), DCM(2회) 및 MeOH(2회)로 세척한 다음 진공 하에 밤새 건조시켰다.

5단계: 알키닐-PEG2- D -980181의 절단 및 탈보호.

절단 용액(TFA/TIS/H₂O 95/2.5/2.5v/v, 10 mL/g 펩티드 수지)을 알키닐-PEG2-D-980181 동종이량체 수지에 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 진탕시키고 여액을 수집하였다. 여액에 차가운 에테르를 첨가하여 펩티드를 침전시키고, 이를 원심분리에 의해 수집하였다. 백색 침전물을 에테르로 2회 세척한 다음, 진공 하에 밤새 건조시켜 미정제 알키닐-PEG2-D-980181 동종이량체를 백색 고형분으로서 수득하였다.

6단계: 정제.

미정제 알키닐-PEG2-D-980181 동종이량체의 정제는 21.2Х250 mm 치수의 컬럼이 구비된 YMC C4 실리카를 이용해 CXTH LC6000/Hanbon NU3000 분취 시스템 상에서 수행하였다. 미정제 펩티드를 분취 컬럼 상에 로딩하고, 용매 A(물 중 0.1% TFA) 중 증가하는 농도의 용매 B(물 중 80% 아세토니트릴 중 0.1% TFA)의 얕은 구배로 10 mL/분의 유속으로 용리하였다. 순수 표적 펩티드를 함유하는 분획을 분석 LCMS에 의해 식별하고, 합치고, 동결 건조시켜 아지도-PEGn-D-979110과의 클릭 반응에 사용될 정제된 알키닐-PEG2-D-980181을 수득하였다.

7단계: 클릭 반응 및 정제.

아지도-PEG3-D-979110 및 알키닐-PEG2-D-980181을 에탄올:H₂O(v/v, 1:1)에 용해시킨 다음, 0.2 M CuSO₄를 반응 혼합물에 첨가하고, 이어서 0.2 M의 아스코르브산나트륨을 첨가하고, 반응 혼합물을 30℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 추가의 검사 없이 RP-HPLC 상에 로딩하고, 전술한 바와 같은 구배 용리에 의해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 LCMS에 의해 식별하고, 합치고, 동결 건조시켰다. 관찰된 질량(LC-MS): 13174.0 Da; 계산된 질량(평균 동위원소 조성): 13176.8 Da.

D -단백질의 LC-MS 분석

분석 RP-HPLC를 Waters C4/Phenomenex C18 실리카 컬럼(4.6Х150 mm, 3.5 μm/4.6Х150 mm, 5.0μm 입자 크기)이 구비된 HP 1090 시스템 상에서 1.0 mL/분의 유속(50℃ 컬럼 온도)으로 수행하였다. 물/0.1% TFA(용매 A) 대 물/0.1% TFA 중 80% 아세토니트릴(용매 B)의 구배를 사용해(1.0% B/분) 펩티드를 컬럼으로부터 용리시켰다. 펩티드 질량은 Agilent 6120 LC/MSD 이온 트랩을 사용하여 인라인 전기분무 MS 검출에 의해 수득하였다.

표면 플라스몬 공명 친화도 측정

표면 플라스몬 공명(SPR) 결합 측정을 Biacore S200(GE) 상에서 수행하였다. 비오틴 포획 칩(biotin CAPture chip, GE) 상에 비오티닐화 VEGF-A(8-109)를 고정시키고, D-단백질의 연속 희석물을 영동 완충액(10 mM Hepes, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% P20) 중에서 30 μL/분의 유속으로 칩 위로 흘렸다. 결합 반응은 RFX-11055, -978336, -979110 및 -980181의 경우 60초였고, RFX-980869의 경우 120초였다. 해리 반응은 영동 완충액 중에서 120초(RFX-11055, -978336, -979110, -980181) 또는 360초(RFX-980869) 동안 수행하였다. 모든 측정은 25℃에서 수행하였다. SPR 데이터는 다수의 독립적인 적정을 나타낸다. 전체 단일 부위 결합 모델을 사용하여 Biacore 소프트웨어를 사용하여 동역학 피팅을 수행하였다.

결정학을 위한 VEGF-A의 발현 및 정제

VEGF-A (8-109) 폴리펩티드 사슬에 대한 유전자 서열을 His₆-태그 TEV 절단 부위 서열이 N-말단에 추가된 발현 벡터 pET21b 내로 클로닝하였다. 재조합 플라스미드를 대장균(E. coli) BL21-Gold로 형질전환시키고, 암피실린(100 μg/ml)이 보충된 LB 배지에서 성장시키고, His-태그된 단백질의 발현을 0.3 mM 이소프로필-b-D-티오갈락토시드(IPTG)에 의해 16℃에서 밤새 유도하였다. 원심분리에 의해 세포를 수확한 다음, -80℃에서 보관하였다.

30 L의 배양물로부터 펠릿화한 세포를 1L 완충액 A(20 mM Tris, pH 8.0, 400 mM NaCl)에 재현탁한 다음, 고압 균질화를 통과시켰다(3 사이클). 상청액으로부터 His-태그된 단백질을 Ni-NTA 수지 컬럼(30 ml) 상에 포획하였다. 컬럼을 20 mM 이미다졸을 함유하는 20 CV의 완충액 A, 5 CV의 완충액 C(20 mM Tris, pH 8.0, 1M NaCl) 및 50 mM 이미다졸을 함유하는 10 CV의 완충액 A로 세척하였다. His₆-태그된 -TEV 부위- VEGF-A 단백질을 완충액 A(5 CV) 중에서 고농도의 이미다졸(0.25 M)로 용리하였다. 용리된 단백질을 1:20 비율(TEV: 단백질)로 TEV 프로테아제와 함께 분해하고, 4℃에서 밤새 5 L 완충액(20 mM Tris, pH 8.0, 50mM NaCl)에 대해 투석하였다. 절단된 샘플을 두 번째 Ni-NTA 컬럼 상에 로딩하여 유리 His-태그를 제거하였다. 용리된 VEGF-A 단백질을 Resource Q 컬럼(6 ml)을 이용해 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 최종 SEC 연마 단계는 완충액 A로 평형화된 HiLoad 16/60 Superdex 75 pg 컬럼을 사용하여 수행하였다. 단분산 VEGF-A 피크 분획을 280 nm에서의 흡광도로 식별하여 합치고, 완충액 A 중에서 10~15 mg/mL까지 농축시켰다. 최종 정제된 VEGF-A(8-109) 단백질은 SDS-PAGE 분석에 의해 평가했을 때 95% 순수했으며, 분자량은 직접 주입 MS에 의해 확인하였다.

VEGF-A/ D- 단백질 복합체의 결정학

VEGF-A/RFX-11055 복합체. VEGF-A/RFX-11055에 대한 결정을 18℃에서 현적 증기 확산에 의해 성장시켰다. 현적(drop)은 0.2 M 염화칼슘, 0.1 M Tris pH 8.5, 18% w/v PEG 4000을 함유하는 0.8 μl의 결정화 용액과 1:1로 혼합된 0.8 μL의 VEGF-A/D-단백질 복합체(2.72 mg/ml VEGF-A 및 0.5 mM RFX-11055)로 구성하였다. 결정화 용액 + 20% (v/v) 글리세롤을 함유하는 동결-보호 용액에 결정를 침지시키고, 액체 질소 중에서 급속 냉동시켰다. 회절 데이터는 Shanghai Synchrotron Radiation Facility 빔 라인 BL19U1에서 2.31 옹스트롬 해상도로 수집하고, XDS를 사용하여 공간 기 P2₁2₂2₁에서 처리하였다. VEGF 구조가 포함된 Phaser(PDB ID: 3QTK)를 검색 모델로서 사용하여 분자 치환에 의해 구조를 풀었다. 최기 모델에 대한 구조 정제 및 모델 구축을 Refmac5와 Coot 사이에서 반복적으로 수행하였다. 비대칭 단위에는 {VEGF-A + RFX-11055} 복합체의 카피 2개가 있다. 상세한 데이터 처리 및 구조 정제 통계는 도 53에 나열되어 있다.

VEGF-A/RFX-978336 복합체.

VEGF-A/RFX-978336에 대한 결정을 18℃에서 현적 증기 확산에 의해 성장시켰다. 현적은 0.15 M 염화마그네슘, 0.1 M Bis-Tris pH 5.5, 25% w/v PEG 3350을 함유하는 0.8 μl의 결정화 용액과 1:1로 혼합된 0.8 μL의 VEGF-A/D-단백질 복합체(5.44 mg/ml VEGF-A 및 0.46 mM RFX-978336)로 구성하였다. 결정화 용액 + 10% (v/v) 글리세롤을 함유하는 동결-보호 용액에 결정를 침지시키고, 액체 질소 중에서 급속 냉동시켰다. 회절 데이터를 ALS 빔 라인 8.3.1에서 2.9 옹스트롬의 해상도로 수집하고 XDS를 사용하여 공간 기 P2₁2₁2₁에서 인덱싱하였다. VEGF 구조가 포함된 Phaser(PDB ID: 3QTK)를 검색 모델로서 사용하여 분자 치환에 의해 구조를 풀었다. 최기 모델에 대한 구조 정제 및 모델 구축을 Refmac5와 Coot 사이에서 반복적으로 수행하였다. 비대칭 단위에는 {VEGF_A + RFX-978336} 복합체의 카피 4개가 있다. 상세한 데이터 처리 및 구조 정제 통계는 도 53에 나열되어 있다. 모든 구조적 이미지는 Pymol(Schrodinger)을 사용하여 렌더링하였다.

VEGF-A121/VEGFR1-Fc 결합 ELISA

비오티닐화 인간 VEGF-A121(이소형 121)은 Acro Biosystems(cat# VE1-H82E7)로부터 구입하였다. VEGFR-1-Fc는 R&D Systems(cat# 3516-FL-050)로부터 구입하였다.

베바시주맙은 Genentech Inc.에 의해 제조되었다. (로트# 3067997). 모든 경우에, 1 μg/mL의 VEGFR1-Fc를 4℃에서 밤새 MaxiSorp 플레이트 상에 코팅하였다. 다음 날, 코팅된 웰을 Super Block(Rockland)으로 실온에서 진탕하면서 2시간 동안 차단하였다. 비균형 ELISA의 경우, D-단백질 및 베바시주맙의 적정을 1.0 nM의 비오티닐화 VEGF-A121과 함께 30분 동안 인큐베이션한 후, 차단된 VEGFR1-Fc가 코팅된 웰에 첨가하였다.

길항제/VEGF-A121 혼합물을 실온에서 진탕하면서 VEGFR1-Fc 웰에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척 완충액(PBS, 0.05% Tween 20)으로 3회 세척하고, 결합된 비오티닐화 VEGF-A121을 스트렙타비딘-HRP(ThermoFisher)로 검출하였다. 평형 결합 ELISA의 경우, D-단백질, 베바시주맙, 및 가용성 VEGFR1-Fc의 적정을 0.15 nM의 비오티닐화 VEGF-A121과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 차단된 VEGFR1-Fc가 코팅된 웰에 첨가하였다. 길항제/VEGF-A121 혼합물을 VEGFR1-Fc 웰 상에서 실온에서 진탕하면서 5시간 동안 인큐베이션하고 전술한 바와 같이 개발하였다. 도표화된 데이터는 3회 측정의 평균 ± 표준 편차이다. IC₅₀ 값은 Prism(GraphPad)을 사용하여 3-파라미터 피팅으로부터 유도하였고, 보고된 오차는 피팅으로부터 유도한다.

VEGF 세포 신호 전달 검정

VEGF 세포 신호 전달의 측정은 VEGF Bioassay(Promega)를 사용하여 수행하였다. 간략하게, HEK293 세포를 루시페라아제 반응 요소에 결합된 VEGFR-2를 발현하도록 조작한다(KDR/NFAT-RE HEK293). VEGFR-2를 통한 VEGF 신호 전달은 생물발광을 사용하여 정량화할 수 있는 루시페라아제의 발현을 매개한다. 도말된 세포를 0.15 nM VEGF-A165 + D-단백질 또는 베바시주맙 적정의 존재 하에 인큐베이션하고, 37℃, 5% CO₂에서 6시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 제조사의 프로토콜에 따라 Bio-Glo를 웰에 첨가하고, PerkinElmer 2300 Enspire Multimode 플레이트 판독기 상에서 상대 발광 단위(RLU)를 측정하였다. 도표화된 데이터는 3회 측정의 평균 ± 표준 편차이다. IC₅₀ 값은 Prism(GraphPad)을 사용하여 3-파라미터 피팅으로부터 유도하였고, 보고된 오차는 피팅으로부터 유도한다.

토끼 습성 AMD 모델

더치 벨티드 토끼(1.5~2.5 kg)는 Oregon Rabbit Company로부터 구입하였다. 애플리버셉트는 Regeneron Pharmaceuticals로부터 구입하였다. 0일차에, 토끼를 치료군(군 당 N = 5)에 무작위 배정하고, RFX-980869(0.25 mg 또는 1.0 mg) 또는 아일리아(Eylea)(1.0 mg)를 1회 유리체 내 주사(눈 당 25 μL)하기 전에 베이스라인 안과 검사를 수행하였다. 2일차 및 23일차에 토끼의 두 눈에 1 μg의 VEGF-A₁₆₅를 접종하였다. 5일차 및 26일차에, 두 눈에 대해 형광 혈관조영술을 수행하고, 이미지를 촬영하여 혈관 누출을 평가하였다. FA 영상에 기초한 혈관 누출의 채점을 5일차 및 26일차에 수행하였다(도 44b).

C57BL6 마우스에서의 MC38 동계 종양 모델

인간 PD-1을 유전자 이식한 암컷 C57BL6 마우스(12~13주령)를 Beijing Biocytogen Co.로부터 구입하였다. 니볼루맙은 Bristol Myers Squibb(로트 #AAY1999)으로부터 구입하였다. MC38 종양 세포(1 x10⁶)를 우측 전방 옆구리에 피하 이식하고, 종양의 평균 부피가 82 mm³가 될 때까지 종양을 확립시켰다. 0일차에 치료를 개시할 때, 마우스를 치료군(군 당 N = 6)에 무작위 배정하였다. 2 mg/kg 또는 6 mg/kg의 RFX-980869를 2주 동안 매일 i.p. 주사(14회 투여)하고, 1 mg/kg 또는 3 mg/kg의 니볼루맙을 2주마다 1회씩 6회 i.p. 주사하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로서 도표화된다.

BALB/c 마우스의 피하 면역화

보조제는 TiterMax로부터 구입하였다. 베바시주맙은 Genentech/Roche로부터 구입하였다. 0일차에 암컷 BALB/c 마우스(6~8주령)를 면역화 군으로 무작위 배정하였다(군 당 n = 5). 면역화는 0, 21, 35일차에 25 μg의 항원을 피하 주사하여 수행하였다. 0일차에 항원을 주사용으로 보조제(TiterMax)에서 유화시키고, 21일차 및 35일차에 PBS에 투여하였다. 면역화에 앞서, 0, 21, 35일차에 혈청 사전 채혈을 수행하였다. 최대 역가 반응을 위한 최종 채열은 42일차에 수행하였다.

이해의 명확성을 위해 특정 구현예를 예시와 예로서 일부 상세히 기술하였지만, 첨부된 청구범위의 사상 또는 범주를 벗어나지 않고도 소정의 변경 및 변형이 이에 이루어질 수 있다는 것이 본 발명의 교시를 고려하여 쉽게 자명하다.

따라서, 전술한 내용은 본 발명의 원리를 단지 예시한 것이다. 본원에서 명시적으로 기술되거나 도시되지는 않았지만, 본 발명의 원리를 구현하고 본 발명의 사상 및 범주 내에 포함되는 다양한 배열이 고안될 수 있다. 또한, 본원에 인용된 모든 실시예 및 조건부 언어는 원칙적으로 독자가 본 발명의 원리 및 발명자가 기여하는 개념을 이해하여 당해 기술을 발전시키는 데 도움을 주도록 의도된 것이며, 구체적으로 인용된 이러한 실시예 및 조건에 한정되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 또한, 본 발명의 원리, 양태, 및 구현예를 언급하는 본원의 모든 진술을 비롯하여 이의 특정 실시예는 본 발명의 구조적 및 기능적 등가물 모두를 포함하도록 의도된다. 또한, 이러한 등가물은 현재 공지된 등가물 및 미래에 개발되는 등가물, 즉, 구조에 관계없이 동일한 기능을 수행하는 임의의 개발된 요소를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 범주는 본원에 도시되고 기술된 예시적인 구현예에 한정되도록 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범주 및 사상은 첨부된 청구범위에 의해 구현된다.

SEQUENCE LISTING <110> Reflexion Pharmaceuticals, Inc. Marinec, Paul Landgraf, Kyle Ault-Riche, Dana Deshayes, Kurt Uppalapati, Maruti Sidhu, Sachdev S <120> D-PEPTIDIC COMPOUNDS FOR VEGF <130> 36311-44996/WO <150> 62/822,241 <151> 2019-03-22 <150> 62/865,469 <151> 2019-06-24 <160> 169 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (29)..(31) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> 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amino acid <400> 27 Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala Glu Leu Lys Lys Ala 1 5 10 15 Gly Ile Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Asn Xaa Ala Xaa Xaa 20 25 30 Val Xaa Xaa Val Asn Xaa Leu Lys Asn Xaa Ile Leu Lys Ala 35 40 45 <210> 28 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(53) <223> Xaa is any amino acid <400> 28 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Ala Lys Glu Xaa Ala Ile Xaa 1 5 10 15 Glu Leu Lys Xaa Xaa Gly Ile Xaa Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Asn His Ala Pro Tyr Val Ser His Val Xaa Gly Leu Lys Xaa Ala Ile 35 40 45 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 50 <210> 29 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 29 Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala Glu Leu Lys Lys Ala 1 5 10 15 Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile Asn His Ala Pro Tyr 20 25 30 Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu Lys Ala His Ala 35 40 45 <210> 30 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is any amino acid <400> 30 Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Xaa Ala Glu Leu Lys Lys Ala 1 5 10 15 Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile Asn His Ala Pro Tyr 20 25 30 Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu Lys Ala His Ala 35 40 45 <210> 31 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa is any amino acid <400> 31 Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala Glu Leu Lys Lys Ala 1 5 10 15 Gly Ile Thr Glu Pro His Val Xaa Ser Phe Ile Asn His Ala Pro Tyr 20 25 30 Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu Lys Ala His Ala 35 40 45 <210> 32 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa is any amino acid <400> 32 Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Xaa Ala Glu Leu Lys Lys Ala 1 5 10 15 Gly Ile Thr Glu Pro His Val Xaa Ser Phe Ile Asn His Ala Pro Tyr 20 25 30 Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu Lys Ala His Ala 35 40 45 <210> 33 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <400> 33 Thr Ile Asp Gln Xaa Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly 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Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala Glu Leu Lys Lys Ala 1 5 10 15 Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile Asn His Ala Pro Tyr 20 25 30 Val Ser Xaa Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu Lys Ala His Ala 35 40 45 <210> 44 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> Xaa is any amino acid <400> 44 Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala Glu Leu Lys Lys Ala 1 5 10 15 Gly Ile Thr Glu Pro Xaa Val Ile Ser Phe Ile Asn Xaa Ala Pro Tyr 20 25 30 Val Ser Xaa Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu Lys Ala His Ala 35 40 45 <210> 45 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> F is phenylalanine or an analog thereof <400> 45 Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala Glu Leu Lys Lys Ala 1 5 10 15 Gly 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Ile Ser Phe Ile Asn His Ala 20 25 30 Pro Tyr Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu Glu Asp 35 40 45 Trp Tyr Leu 50 <210> 69 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 69 Thr Ile Asp Gln Trp Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Asn His Ala Pro Tyr Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile 35 40 45 Leu Glu Asp Trp Tyr Leu Ala Ser Cys 50 55 <210> 70 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 70 Thr Ile Asp Gln Trp Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Glu Asp His Val Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Asn His Ala Pro Tyr Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile 35 40 45 Leu Lys Ala His Ala 50 <210> 71 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 71 Thr Ile Asp Gln Trp Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Asn His Ala Pro Tyr Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile 35 40 45 Leu Lys Ala His Ala Cys 50 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 72 Thr Ile Asp Gln Trp 1 5 <210> 73 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 73 Gln Trp 1 <210> 74 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 74 Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala Glu Leu Lys Lys Ala 1 5 10 15 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 75 Gly Ile Thr Glu Pro 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 76 His Val Ile Ser Phe Ile Asn His Ala 1 5 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 77 Pro His Val Ile Ser Phe Ile Asn His Ala Pro 1 5 10 <210> 78 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 78 Pro Tyr 1 <210> 79 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 79 Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu 1 5 10 <210> 80 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 80 His Val Ile Ser Phe Ile Asn His Ala Pro Tyr Val Ser His Val Asn 1 5 10 15 Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu 20 <210> 81 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 81 Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile Asn His Ala Pro Tyr 1 5 10 15 Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu 20 25 <210> 82 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 82 Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu Lys Ala 1 5 10 <210> 83 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 83 His Val Ile Ser Phe Ile Asn His Ala Pro Tyr Val Ser His Val Asn 1 5 10 15 Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu Lys Ala 20 25 <210> 84 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 84 Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile Asn His Ala Pro Tyr 1 5 10 15 Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu Lys Ala 20 25 30 <210> 85 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 85 Lys Ala His Ala 1 <210> 86 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 86 Glu Asp Trp Tyr Leu 1 5 <210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 87 Gly Arg Thr Val Pro 1 5 <210> 88 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 88 Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg 1 5 10 15 Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr 20 25 30 Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met 35 40 45 Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr 50 55 60 Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln 65 70 75 80 Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu 85 90 95 Cys Arg Pro Lys Lys Asp 100 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 89 Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr 1 5 10 <210> 90 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 90 Asn Asp Glu Gly Leu 1 5 <210> 91 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 91 Tyr Ile Phe Lys Pro 1 5 <210> 92 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 92 Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile 1 5 10 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa is a hydrophobic amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is a hydrophobic amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is a hydrophobic amino acid residue <400> 93 Pro His Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa His Xaa Pro 1 5 10 <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is d, p or G <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is f or i <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is n or s <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is n or s <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is p or G <400> 94 Xaa His Val Xaa Xaa Phe Ile Xaa His Ala Xaa 1 5 10 <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is f or i <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is a polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is a polar amino acid residue <400> 95 Pro His Val Xaa Xaa Phe Ile Xaa His Ala Pro 1 5 10 <210> 96 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> H is a histidine or a histidine analog <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is a, i, l, or v <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is a non-polar residue having a sidechain selected from H, a lower alkyl and a substituted lower alkyl <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is a, i, l, or v <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is a non-polar residue having a sidechain selected from H, a lower alkyl and a substituted lower alkyl <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is a, i, l, or v <400> 96 Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 97 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is v, e, k, or r <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is a polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is a polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is l, k, r, or e <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is a polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is l, k, r, or e <400> 97 Xaa Xaa His Val Xaa Gly Leu Xaa Xaa Ala Ile Xaa 1 5 10 <210> 98 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is v, e, k, or r <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is a polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is a polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is l, k, r, or e <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is a polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is l, k, r, or e <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is a polar amino acid residue <400> 98 Xaa Xaa His Val Xaa Gly Leu Xaa Xaa Ala Ile Xaa Xaa Ala 1 5 10 <210> 99 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is a helix-terminating residue <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> H is a histidine or histidine analog <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> f is phenylalanine or an phenylalanine analog <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> H is a histidine or histidine analog <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> y is a tyrosine or a tyrosine analog <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> H is a histidine or histidine analog <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is a non-polar residue <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa is a non-polar residue <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa is any amino acid <400> 99 Xaa His Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa His Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa His Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 100 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> e is glutamic acid or glutamic acid analog <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is a helix-terminating residue <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is a helix-terminating residue <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> y is a tyrosine or tyrosine analog <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is a helix-terminating residue <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa is a non-polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa is a helix-terminating residue <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa is a non-polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa is a helix-terminating residue <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> Xaa is any amino acid <400> 100 Xaa Xaa Xaa Glu Xaa His Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa His Xaa Xaa Tyr 1 5 10 15 Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 101 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is d, p, or G <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is p or G <400> 101 Xaa His Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa His Xaa Xaa 1 5 10 <210> 102 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is f or i <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is a polar amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is a polar amino acid <400> 102 Pro His Val Xaa Xaa Phe Ile Xaa His Ala Pro 1 5 10 <210> 103 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is a non-polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is a non-polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is any amino acid <400> 103 Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 104 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is v, e,, k, or r <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is a polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is a polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is l, k, r, or e <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is a polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is l, k, r, or e <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is a polar amino acid residue <400> 104 Xaa Xaa His Val Xaa Gly Leu Xaa Xaa Ala Ile Xaa Xaa Ala 1 5 10 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa is any amino acid <400> 105 Leu Xaa Xaa Ala Lys Glu Xaa Ala Ile Xaa Glu Leu Lys Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 106 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 106 Thr Ile Asp Gln Trp Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Ser Asp His Val Phe Asn Phe Ile 20 25 30 Asn Tyr Ala Pro Tyr Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Lys Asn Glu Ile 35 40 45 Leu Lys Ala His Ala 50 <210> 107 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 107 Thr Ile Asp Gln Trp Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Ser Asp His Val Phe Asn Phe Ile 20 25 30 Asn Tyr Ala Pro Tyr Val Ser Asp Val Asn Ala Leu Lys Asn Glu Ile 35 40 45 Leu Lys Ala His Ala 50 <210> 108 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 108 Thr Ile Asp Gln Trp Leu Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Asn His Ala Pro Tyr Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile 35 40 45 Leu Lys Ala His Ala 50 <210> 109 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 109 Phe Asn Ile Gln Trp Ile Cys Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Asn His Ala Pro Ser Cys Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile 35 40 45 Leu Lys Ala His Ala 50 <210> 110 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 110 Ile Pro Ile Gln Trp Val Cys Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Asn His Ala Pro Ser Cys Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile 35 40 45 Leu Lys Ala His Ala 50 <210> 111 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 111 Pro Ser Val Gln Trp Ile Cys Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Asn His Ala Pro Ser Cys Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile 35 40 45 Leu Lys Ala His Ala 50 <210> 112 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 112 Arg Asn Ile Gln Trp Val Cys Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Asn His Ala Pro Asn Cys Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile 35 40 45 Leu Lys Ala His Ala 50 <210> 113 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 113 Tyr His Ile Gln Trp Val Cys Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Asn His Ala Pro Asn Cys Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile 35 40 45 Leu Lys Ala His Ala 50 <210> 114 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 114 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Leu Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Asn His Glu Gln Lys Arg Ala Phe Ile Ser 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 115 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 115 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Asn His Glu Gln Lys Arg Ala Phe Ile Ser 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 116 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 116 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Leu Glu Gln Lys Gly Ala Phe Ile Ala 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 117 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 117 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Leu Glu Gln Lys Arg Ala Phe Ile Ser 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 118 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 118 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Thr Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Arg Glu Gln Lys Val Ala Phe Ile Thr 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 119 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 119 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Lys Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Val Glu Gln Lys Arg Ala Phe Ile His 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 120 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 120 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Ile Glu Gln Lys Arg Ala Phe Ile His 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 121 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 121 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Ile Glu Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 122 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 122 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Ile Glu Gln Lys Arg Ala Phe Ile Tyr 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 123 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 123 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Leu Glu Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 124 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 124 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Arg Glu Gln Lys Leu Ala Phe Ile His 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 125 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 125 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Val Glu Gln Lys Arg Ala Phe Ile Lys 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 126 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 126 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Val Glu Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 127 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 127 Val Asp Asn Lys Phe Asp Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg Arg Leu Pro Asn Leu Asn Leu Glu Gln Lys Arg Ala Phe Ile Ser 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 128 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 128 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg Arg Leu Pro Asn Leu Asn Leu Glu Gln Lys Arg Ala Phe Ile Ser 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 129 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 129 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg Arg Leu Pro Asn Leu Asn Val Glu Gln Lys Arg Ala Phe Ile Ser 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 130 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 70% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n is mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 70% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 70% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 70% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 70% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (83)..(83) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 70% G and 10% T <400> 130 aaggctggta tcaccnnnga cnnnnnnttc aacnnnatca atnnngcgnn nnnngtgnnn 60 nnngttaacn nnnnnaagaa cnnnatcctg aaagctcac 99 <210> 131 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <400> 131 gcgaaagaag atgctnnngc agaannnnnn aagnnnggtn nnaccnnnnn ncatnnnnnn 60 nnntttatca atcacgcgc 79 <210> 132 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is a mix of 10% A, 10% C, 10% G and 70% T <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a mix of 70% A, 10% C, 10% G and 10% T <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is a mix of 10% A, 70% C, 10% G and 10% T <400> 132 gttaacgggc tgaagaacnn nnnnnnnnnn nnnnnngccg ggagctctgg ag 52 <210> 133 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is l, r, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is h, i, l, r, or v <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is G, r, or V <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa is a, r, h, s, or t <400> 133 Trp Asp Asn Ala Trp Xaa Glu Ile Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Xaa 1 5 10 15 Glu Gln Lys Xaa Ala Phe Ile Xaa Ser Leu Tyr 20 25 <210> 134 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 134 Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 1 5 10 <210> 135 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 135 Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 1 5 10 15 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 20 <210> 136 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 136 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 1 5 <210> 137 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is any amino acid <400> 137 Pro His Val Xaa Xaa Phe Xaa Xaa His Xaa Pro 1 5 10 <210> 138 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is l, v, or i <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is l or c <400> 138 Xaa Xaa Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala Glu Leu Lys Lys Ala 1 5 10 15 <210> 139 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is t, y, f, i, p, or r <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is i, h, n, p, or s <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is d, i, or v <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is l, v, or i <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is l or c <400> 139 Xaa Xaa Xaa Gln Trp Xaa Xaa Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr 20 <210> 140 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 140 Ile Leu Lys Ala His Ala 1 5 <210> 141 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is t, y, f, i, p and r <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is i, h, n, p, and s <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is d, i, and v <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is l, v, and i <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is l and c <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> Xaa is t, y, n, and s <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> Xaa is v or c <400> 141 Xaa Xaa Xaa Gln Trp Xaa Xaa Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Asn His Ala Pro Xaa Xaa Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile 35 40 45 Leu Lys Ala His Ala 50 <210> 142 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is any D-amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is any D-amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is any D-amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is i or v <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is s or n <400> 142 Xaa Xaa Xaa Gln Trp Xaa Xaa 1 5 <210> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is any a D-aromatic amino acid <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is any D-aromatic amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is any D-aromatic amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is a hydrophobic residue <400> 143 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 144 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is a helix-terminating residue <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is a, i, l, or v <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is a, i, l, or v <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is a, i, l, or v <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is a helix-terminating residue <400> 144 Xaa His Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa His Xaa Xaa 1 5 10 <210> 145 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is a helix-terminating residue <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is a, i, l, or v <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is a, i, l, or v <400> 145 Xaa His Val Xaa Xaa Phe Xaa Xaa His Xaa Pro 1 5 10 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is a D-aromatic amino acid <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is a non-polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is a hydrophobic residue <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is a non-polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is a hydrophobic residue <400> 146 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 147 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is a helix-terminating residue <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is a polar amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is a helix-terminating residue <400> 147 Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 148 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is a helix-terminating residue <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is a helix-terminating residue <400> 148 Xaa Xaa Glu Xaa 1 <210> 149 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is s, n, or y <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa is any amino acid <400> 149 Glu Pro His Val Ile Ser Phe Xaa Xaa His Xaa Pro Xaa Xaa Ser His 1 5 10 15 Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Ala 20 <210> 150 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> Xaa is s or n <220> <221> misc_feature <222> 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<222> (26)..(26) <223> Xaa is any amino acid <400> 160 Trp Asp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 20 25 <210> 161 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa is any amino acid <400> 161 Trp Asp Xaa Xaa Trp Arg Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Xaa Xaa Lys Arg Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Tyr 20 25 <210> 162 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is any 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57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 163 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 1 5 10 15 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser 20 25 30 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 35 40 45 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 164 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 164 Gly Cys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Cys Thr Asn 1 5 10 15 Asn Asn Gly Cys Ala Gly Ala Ala Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ala Ala 20 25 30 Gly Asn Asn Asn Gly Gly Thr Asn Asn Asn Ala Cys Cys Asn Asn Asn 35 40 45 Asn Asn Asn Cys Ala Thr Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Thr 50 55 60 Thr Thr Ala Thr Cys Ala Ala Thr Cys Ala Cys Gly Cys Gly Cys Gly 65 70 75 80 Thr Thr Ala Ala Cys Gly Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala 85 90 95 Cys Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn 100 105 110 Asn Asn Asn Gly Cys Cys Gly Gly Gly Ala Gly Cys Thr Cys Thr Gly 115 120 125 Gly Ala Gly 130 <210> 165 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 165 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 166 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> 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Ala 85 90 95 Pro Tyr Val Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile Leu Lys Ala 100 105 110 His Ala <210> 168 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 168 Tyr His Ile Gln Trp Val Cys Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Asn His Ala Pro Asn Cys Ser His Val Asn Gly Leu Lys Asn Ala Ile 35 40 45 Leu Lys Ala His Ala Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn 50 55 60 Ala Trp Arg Glu Ile Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Val Glu Gln Lys 65 70 75 80 Arg Ala Phe Ile Arg Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn 85 90 95 Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 100 105 110 <210> 169 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 169 Tyr His Ile Gln Trp Val Cys Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu Lys Lys Ala Gly Ile Thr Glu Pro His Val Ile Ser Phe Ile 20 25 30 Asn His Ala Pro Asn Cys Ser His Val Asn Gly Leu Lys Ala Ile Leu 35 40 45 Lys Ala His Ala Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Asp Asn Ala 50 55 60 Trp Arg Glu Ile Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Val Glu Gln Lys Arg 65 70 75 80 Ala Phe Ile Arg Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu 85 90 95 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 100 105 110

Claims

VEGF에 특이적으로 결합하는 다가 D-펩티드 화합물로서,
VEGF의 제1 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 D-펩티드 Z 도메인; 및
VEGF의 제2 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 D-펩티드 GA 도메인을 포함하는, D-펩티드 화합물.
제1항에 있어서,
제1 결합 부위는 VEGF의 아미노산 측쇄 E90, F62, D67, I69, E70, K110, P111, H112, 및 Q113을 포함하고;
제2 결합 부위는 VEGF의 아미노산 측쇄 F43, M44, Y47, Y51, N88, D89, L92, I72, K74, M107, I109, Q115, 및 I117을 포함하고;
제1 및 제2 결합 부위는 VEGF 표적 단백질 상의 VEGFR2 결합 부위와 적어도 부분적으로 중첩되는, D-펩티드 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, D-펩티드 Z 도메인은 9, 10, 13, 14, 17, 24, 27, 28, 32, 및 35로부터 선택된 위치에서 5개 이상(예: 6개 이상, 예컨대 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 변이체 아미노산 잔기를 포함하는 VEGF 특이성 결정 모티프(SDM)를 포함하는, D-펩티드 화합물.
제2항에 있어서, D-펩티드 Z 도메인은 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 것인, D-펩티드 화합물.
제1항 또는 제3항에 있어서, D-펩티드 GA 도메인은 25, 27, 30, 31, 34, 36, 37, 39, 40, 및 42~48로부터 선택된 위치에서 5개 이상(예: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16)의 변이체 아미노산 잔기를 포함하는 VEGF 특이성 결정 모티프(SDM)를 포함하는, D-펩티드 화합물.
제4항에 있어서, D-펩티드 GA 도메인은 제42항 내지 제60항 중 어느 한 항에 따른 것인, D-펩티드 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, D-펩티드 Z 및 GA 도메인을 공유 연결하는 연결 성분을 추가로 포함하는, D-펩티드 화합물.
제7항에 있어서, 연결 성분은 D-펩티드 Z 도메인의 말단 아미노산 잔기를 D-펩티드 GA 도메인의 말단 아미노산 잔기에 연결하는 링커(예를 들어, N-말단-N-말단 링커 또는 C-말단-C-말단 링커)인, D-펩티드 화합물.
제8항에 있어서, 연결 성분은 N-말단-N-말단 링커인, D-펩티드 화합물.
제9항에 있어서, N-말단-N-말단 링커는 D-펩티드 Z 및 GA 도메인의 N-말단 아미노산 잔기들을 연결하는 (PEG)n 이작용성 링커이고, 여기서 n은 2~20인 (예를 들어, n은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12인), D-펩티드 화합물.
제7항에 있어서, 연결 성분은:
D-펩티드 Z 및 GA 도메인이 표적 단백질에 동시에 결합될 때 서로 근위에 있게 되는 D-펩티드 Z 도메인의 아미노산 측쇄 및 D-펩티드 GA 도메인의 말단 아미노산 잔기를 연결하는 링커; 또는
D-펩티드 Z 및 GA 도메인이 표적 단백질에 동시에 결합될 때 서로 근위에 있게 되는 D-펩티드 Z 도메인의 말단 아미노산 잔기 및 D-펩티드 GA 도메인의 아미노산 측쇄를 연결하는 링커인, D-펩티드 화합물.
제11항에 있어서, 연결 성분은 D-펩티드 Z 및 GA 도메인이 VEGF에 동시에 결합될 때 서로 근위에 있게 되는 D-펩티드 Z 도메인의 아미노산 측쇄 및 D-펩티드 GA 도메인의 아미노산 측쇄를 연결하는 링커인, D-펩티드 화합물.
제12항에 있어서, 링커는 D-펩티드 Z 도메인의 위치 7에 있는 아미노산 잔기의 측쇄 및 D-펩티드 GA 도메인의 위치 19에 있는 아미노산 잔기의 측쇄를 연결하는, D-펩티드 화합물.
제13항에 있어서, D-펩티드 GA 및 Z 도메인은 D-펩티드 Z 도메인의 k⁷ 잔기와 D-펩티드 GA 도메인의 k¹⁹ 잔기 사이에서 링커를 통해 연결되는, D-펩티드 화합물.
제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 연결 성분은 D-펩티드 Z 도메인의 N-말단을 D-펩티드 GA 도메인의 근위 잔기(예: k¹⁹, k²⁰, 또는 k⁵⁰ 잔기)의 측쇄에 연결하는, D-펩티드 화합물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, D-펩티드 GA 도메인은 상기 도메인의 위치 7 및 38에 있는 근위 아미노산 잔기들 사이에서 나선 간 링커를 포함하는, D-펩티드 화합물.
제16항에 있어서, 나선 간 링커는 근위 아미노산 잔기의 알파-탄소 사이에서 측정했을 때 길이가 3 내지 7개 원자인 백본을 갖는, D-펩티드 화합물.
제16항 또는 제17항에 있어서, 나선 간 링커는 C_(1-6)알킬, 치환된 C_(1-6)알킬, -(CHR)_n-CONH-(CHR)_m-, 및 -(CHR)_n-S-S-(CHR)_m-으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하고, 각각의 R은 독립적으로 H, C_(1-6)알킬 또는 치환된 C_(1-6)알킬이고, n+m = 0~5인 (예를들어 n+m = 2, 3, 4, 또는 5인), D-펩티드 화합물.
제7항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 연결 성분은 D-펩티드 GA 및 Z 도메인을 연결시키도록 구성되고, 이에 의해 도메인들은 VEGF-A에 동시에 결합할 수 있는, D-펩티드 화합물.
제7항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 연결 성분은 아미노산 잔기, 폴리펩티드, (PEG)_n 링커(예를 들어, n은 2~50, 3~50, 4~50, 6~50, 또는 6~20임), 변형된 PEG 모이어티, C_(1-6)알킬 링커, 치환된 C_(1-6)알킬 링커, -CO(CH₂)_mCO-, -NR(CH₂)_pNR-, -CO(CH₂)_mNR-, -CO(CH₂)_mO-, -CO(CH₂)_mS-, 및 연결된 화학선택성 작용 기(예를 들어, -CONH-, -OCONH-, 클릭 화학 접합체, 예컨대 1,2,3-트리아졸, 말레이미드-티올 접합체 티오숙신이미드, 할로아세틸-티올 접합체 티오에스테르, 등)로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하며, 여기서 m은 1 내지 6이고, p는 2 내지 6이고, 각각의 R은 독립적으로 H, C_(1-6)알킬, 또는 치환된 C_(1-6)알킬인, D-펩티드 화합물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 2가인, D-펩티드 화합물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 3가인, D-펩티드 화합물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 4가인, D-펩티드 화합물.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 제1 D-펩티드 Z 도메인과 상동인 제2 D-펩티드 Z 도메인을 추가로 포함하는, D-펩티드 화합물.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 제1 D-펩티드 GA 도메인과 상동인 제2 D-펩티드 GA 도메인을 추가로 포함하는, D-펩티드 화합물.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 각각 D-펩티드 Z 및 GA 도메인을 포함하는 2개의 2가 D-펩티드 화합물의 이량체로서 구성된 4개의 D-펩티드 도메인을 포함하는, D-펩티드 화합물.
제26항에 있어서, 각각의 D-펩티드 화합물의 D-펩티드 Z 및 GA 도메인은 D-펩티드 Z 도메인의 k⁷ 잔기와 D-펩티드 GA 도메인의 k¹⁹ 잔기 사이에서 링커를 통해 연결되는, D-펩티드 화합물.
제17항에 있어서, 링커는:

이고, 식 중 n 및 m은 독립적으로 1~6(예를 들어, 1, 2, 또는 3)인, D-펩티드 화합물.
제28항에 있어서, 2개의 2가 D-펩티드 화합물은 2가 D-펩티드 화합물의 D-펩티드 Z 도메인의 C-말단 아미노산 잔기들 사이에서 링커를 통해 공유 결합되는, D-펩티드 화합물.
제29항에 있어서, C-말단-C-말단 링커는 다음을 포함하고:
*-알라닌-리신(-*)
식 중 각각의 -*는 D-펩티드 도메인에 대한 연결인, D-펩티드 화합물.
VEGF에 특이적으로 결합하는 D-펩티드 화합물로서,
D-펩티드 Z 도메인을 포함하고, D-펩티드 Z 도메인은
(a) 다음 아미노산 잔기에 의해 정의되는 VEGF 특이성 결정 모티프(SDM):
w⁹d¹⁰--w¹³x¹⁴--r¹⁷------x²⁴--k²⁷x²⁸---x³²--y³⁵(서열번호 160)
(여기서:
x¹⁴는 l, r 및 t로부터 선택되고;
x²⁴는 h, i, l, r 및 v로부터 선택되고;
x²⁸은 G, r 및 v로부터 선택되고;
x³²는 a, r, h, s 및 t로부터 선택되고;
x³⁵는 k 또는 y로부터 선택됨);
(b) (a)에서 정의된 SDM 잔기와 80% 이상(예를 들어, 90% 이상)의 동일성을 갖는 VEGF SDM; 또는
(c) (a)에서 정의된 SDM 잔기에 비해 1 내지 3개의 아미노산 잔기 치환을 갖는 VEGF SDM을 포함하되, 1 내지 3개의 아미노산 잔기 치환은
i) 표 6에 따른 유사한 아미노산 잔기 치환;
ii) 표 6에 따른 보존적 아미노산 잔기 치환;
iii) 표 6에 따른 고도로 보존된 아미노산 잔기 치환; 및
iv) 도 33a에서 정의된 모티프에 따른 아미노산 잔기 치환으로부터 선택되는, D-펩티드 화합물.
제31항에 있어서, (a)에서 정의된 상기 SDM 잔기는:
w⁹d¹⁰--w¹³r¹⁴--r¹⁷------l²⁴--k²⁷r²⁸---s³²--y³⁵(서열번호 161)
또는
w⁹d¹⁰--w¹³r¹⁴--r¹⁷------v²⁴--k²⁷r²⁸---r³²--y³⁵(서열번호 162)인, D-펩티드 화합물.
제32항에 있어서, VEGF SDM은 다음 잔기에 의해 정의되는, D-펩티드 화합물:
w⁹d¹⁰--w¹³r¹⁴--r¹⁷------l²⁴--k²⁷r²⁸---s³²--y³⁵(서열번호 161)
또는
w⁹d¹⁰--w¹³r¹⁴--r¹⁷------v²⁴--k²⁷r²⁸---r³²--y³⁵(서열번호 162).
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, SDM 잔기는 펩티드 프레임워크 서열에 포함되고, 펩티드 프레임워크 서열은:
a) 다음 아미노산 잔기에 의해 정의된 펩티드 프레임워크 잔기:
--n¹¹a--e¹⁵i-h¹⁸lpnln-e²⁵q--a²⁹fi-s³³l- ;
b) (a)에서 정의된 잔기와 80% 이상(예를 들어, 90% 이상)의 동일성을 갖는 펩티드 프레임워크 잔기; 또는
c) (a)에서 정의된 잔기에 비해 1 내지 3개의 아미노산 잔기 치환을 갖는 펩티드 프레임워크 잔기를 포함하되, 1 내지 3개의 아미노산 잔기 치환은
i) 표 6에 따른 유사한 아미노산 잔기 치환;
ii) 표 6에 따른 보존적 아미노산 잔기 치환; 및
iii) 표 6에 따른 고도로 보존된 아미노산 잔기 치환으로부터 선택되는, D-펩티드 화합물.
제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 아미노산 서열과 80% 이상(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상)의 동일성을 갖는 SDM-함유 서열을 포함하되:
w⁹d¹⁰naw¹³x¹⁴eir¹⁷hlpnlnx²⁴eqk²⁷x²⁸afix³²sly³⁵ (서열번호 133)
여기서:
x¹⁴는 l, r 및 t로부터 선택되고;
x²⁴는 h, i, l, r 및 v로부터 선택되고;
x²⁸은 G, r 및 v로부터 선택되고;
x³²는 a, r, h, s 및 t로부터 선택되고;
x³⁵는 k 또는 y로부터 선택되는, D-펩티드 화합물.
제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, D-펩티드 Z 도메인은 다음 구조식의 3-나선 다발이고:
[나선 1^(#8-18)]-[링커 1^(#19-24)]-[나선 2^(#25-36)]-[링커 2^(#37-40)]-[나선 3^(#41-54)]
식 중:
#는 D-펩티드 GA 도메인에 포함된 아미노산 잔기의 기준 위치를 나타내고;
나선 3^(#41-54)는
a) s⁴¹anllaeakklnda⁵⁴ (서열번호 134);
b) (a)에서 제시된 서열과 70% 이상(예를 들어, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상)의 동일성을 갖는 서열; 또는
c) (a)에서 제시된 서열에 비해 1 내지 5개의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열로부터 선택된 펩티드 프레임워크 서열을 포함하되, 1 내지 5개의 아미노산 잔기 치환은
i) 표 6에 따른 유사한 아미노산 잔기 치환;
ii) 표 6에 따른 보존적 아미노산 잔기 치환; 및
iii) 표 6에 따른 고도로 보존된 아미노산 잔기 치환으로부터 선택되는, D-펩티드 화합물.
제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, D-펩티드 Z 도메인은 다음으로부터 선택된 C-말단 펩티드 프레임워크 서열을 추가로 포함하는, D-펩티드 화합물:
a) d³⁶dpsqsanllaeakklndaqapk⁵⁸ (서열번호 135); 및
b) (a)에서 제시된 서열에 비해 70% 이상(예를 들어, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상)의 동일성을 갖는 서열.
제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, D-펩티드 Z 도메인은 다음으로부터 선택된 N-말단 펩티드 프레임워크 서열을 추가로 포함하는, D-펩티드 화합물:
a) v¹dnkfnke⁸ (서열번호 136); 및
b) (a)에서 제시된 서열에 비해 60% 이상(예를 들어, 75% 이상, 85% 이상)의 동일성을 갖는 서열.
제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 화합물 978333 내지 978337(서열번호 114~118), 980181(서열번호 119), 980174 내지 980180(서열번호 120~126), 및 981188 내지 981190(서열번호 127~129) 중 하나로부터 선택된 서열;
(b) (a)에서 정의된 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열; 또는
(c) (a)에서 정의된 서열에 비해 1 내지 10개의 아미노산 치환을 갖는 서열을 포함하되, 1 내지 10개의 아미노산 잔기 치환은
i) 표 6에 따른 유사한 아미노산 치환;
ii) 표 6에 따른 보존적 아미노산 치환; 또는
iii) 표 6에 따른 고도로 보존적인 아미노산 치환인, D-펩티드 화합물.
제39항에 있어서, 화합물 978333 내지 978337 및 980181(서열번호 114~119) 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는, D-펩티드 화합물.
제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 이량체인, D-펩티드 화합물.
제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 제1 D-펩티드 Z 도메인과 상동인 제2 D-펩티드 Z 도메인을 추가로 포함하는, D-펩티드 화합물.
VEGF에 특이적으로 결합하는 D-펩티드 화합물로서,
D-펩티드 GA 도메인을 포함하고, D-펩티드 GA 도메인은
a) (a) 다음 아미노산 잔기에 의해 정의되는 VEGF 특이성 결정 모티프(SDM):
e²⁵phvisf--h³⁴-p³⁶x³⁷-s³⁹h--G⁴³---a⁴⁷ (서열번호 149)
(여기서 x³⁷은 s, n, 및 y로부터 선택됨);
b) (a)에서 정의된 SDM 잔기와 80% 이상(예를 들어, 90% 이상)의 동일성을 갖는 VEGF SDM; 또는
c) (a)에서 정의된 SDM 잔기에 비해 1 내지 3개의 아미노산 잔기 치환을 갖는 VEGF SDM을 포함하되, 1 내지 3개의 아미노산 잔기 치환은
i) 표 6에 따른 유사한 아미노산 잔기 치환;
ii) 표 6에 따른 보존적 아미노산 잔기 치환;
iii) 표 6에 따른 고도로 보존된 아미노산 잔기 치환; 및
iv) 도 26에 정의된 모티프에 따른 아미노산 잔기 치환으로부터 선택되는, D-펩티드 화합물.
제43항에 있어서, (a)에서 정의된 VEGF SDM은 다음 잔기에 의해 추가로 정의되고:
c⁷-----------------e²⁵phvisf--h³⁴-p³⁶x³⁷c³⁸sh--G⁴³---a⁴⁷(서열번호 150)
여기서 x³⁷은 s 및 n으로부터 선택되는, D-펩티드 화합물.
제43항 또는 제44항에 있어서, 다음 분절 (I)~(II)를 추가로 포함하되:
x¹x²x³qwx⁶x⁷ (I)
x³⁷x³⁸ (II)
여기서:
x¹ 내지 x³은 임의의 D-아미노산 잔기로부터 독립적으로 선택되고;
x⁶은 i 및 v로부터 선택되고;
x³⁷은 s 및 n으로부터 선택되며;
x⁷ 및 x³⁸은 아미노산 잔기 x⁷ 및 x³⁸의 알파-탄소 사이에서 측정했을 때 3 내지 7개 원자 길이의 백본을 갖는 도메인 내 링커를 통해 연결된 아미노산 잔기인, D-펩티드 화합물.
제45항에 있어서, x¹ 내지 x³은 f, h, i, p, r, y, n, s, 및 v로부터 독립적으로 선택되는, D-펩티드 화합물.
제45항 또는 제46항에 있어서, x⁶은 v인, D-펩티드 화합물.
제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, x³⁷은 n인, D-펩티드 화합물.
제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, x⁷ 및 x³⁸ 아미노산 잔기는 이황화 도메인 내 연결을 통해 연결되고,
시스테인⁷-시스테인³⁸ 이황화물;
호모시스테인⁷-시스테인³⁸ 이황화물;
시스테인⁷-호모시스테인³⁸ 이황화물; 및
호모시스테인⁷-호모시스테인³⁸ 이황화물로부터 선택되는, D-펩티드 화합물.
제49항에 있어서, x⁷ 및 x³⁸은 각각 시스테인이고, 도메인 내 링커는 c⁷ 및 c³⁸ 아미노산 잔기 사이에서 이황화 연결을 포함하는, D-펩티드 화합물.
제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 도메인 내 링커는 x⁷ 및 x³⁸ 아미노산 잔기의 측쇄들 사이에서 아미드 결합 연결을 포함하는, D-펩티드 화합물.
제51항에 있어서, 아미드 결합 연결은 다음 x⁷ 및 x³⁸ D-아미노산 잔기의 쌍 중 하나의 사이에 있고:
아스파르트산7 및 Dap38;
아스파르트산7 및 Dab38;
아스파르트산7 및 오르니틴-38;
글루탐산7 및 Dap38;
글루탐산7 및 Dap38; 및
글루탐산7 및 오르니틴38;
여기서 Dap는 α,β-디아미노프로피온산이고, Dab는 α,γ-디아미노부티르산인, D-펩티드 화합물.
제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 도메인 내 링커가 결여된 대조군 화합물보다 VEGF에 대한 결합 친화도(K_D)가 3배 이상 더 강한 (즉, K_D가 3배 더 낮은), D-펩티드 화합물.
제43항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, D-펩티드 GA 도메인은 다음 구조식의 3-나선 다발을 포함하되:
[나선 1^(#6-21)]-[링커 1^(#22-26)]-[나선 2^(#27-35)]-[링커 2^(#36-37)]-[나선 3^(#38-51)]
식 중:
#는 D-펩티드 GA 도메인에 포함된 아미노산 잔기의 기준 위치를 나타내고;
나선 1^(#6-21)은 다음으로부터 선택된 펩티드 프레임워크 서열을 포함하는, D-펩티드 화합물:
a) x⁶x⁷knakedaiaelkka²¹ (서열번호 138)
(여기서:
x⁶은 l, v, 및 i로부터 선택되고;
x⁷은 l 및 c로부터 선택됨); 및
b) (a)에서 정의된 서열에 비해 70% 이상(예를 들어, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상)의 동일성을 갖는 서열.
제54항에 있어서, D-펩티드 GA 도메인은 다음으로부터 선택된 N-말단 펩티드 프레임워크 서열을 포함하는, D-펩티드 화합물:
a) x¹x²x³qwx⁶x⁷knakedaiaelkkaGit²⁴ (서열번호 139)
(여기서:
x¹은 t, y, f, i, p, 및 r로부터 선택되고;
x²는 i, h, n, p, 및 s로부터 선택되고;
x³은 d, i, 및 v로부터 선택되고;
x⁶은 l, v, 및 i로부터 선택되고;
x⁷은 l 및 c로부터 선택됨); 및
b) (a)에서 정의된 서열에 비해 70% 이상(예를 들어, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상)의 동일성을 갖는 서열.
제43항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, D-펩티드 GA 도메인은 다음으로부터 선택된 C-말단 펩티드 프레임워크 서열을 추가로 포함하는, D-펩티드 화합물:
a) ilkaha (서열번호 140); 및
b) (a)에서 정의된 서열에 비해 50% 이상(예를 들어, 65% 이상, 또는 80% 이상)의 동일성을 갖는 서열.
제56항에 있어서, D-펩티드 GA 도메인은 다음 서열을 포함하고
x¹x²x³qwx⁶x⁷knakedaiaelkkagitephvisfinhapx³⁷x³⁸shvnGlknailkaha⁵³ (서열번호 141)
여기서:
x¹은 t, y, f, i, p, 및 r로부터 선택되고;
x²는 i, h, n, p, 및 s로부터 선택되고;
x³은 d, i, 및 v로부터 선택되고;
x⁶은 l, v, 및 i로부터 선택되고;
x⁷은 l 및 c로부터 선택되고;
x³⁷은 t, y, n, 및 s로부터 선택되고;
x³⁸은 v 및 c로부터 선택되고;
x³⁹는 e 및 c로부터 선택되고;
x⁴⁰은 h 및 e로부터 선택되고;
x⁴³은 g 및 a로부터 선택되고;
x⁴⁷은 a 및 e로부터 선택되는, D-펩티드 화합물.
제43항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 화합물 11055, 979102 및 979107~979110(서열번호 108~113) 중 하나로부터 선택된 서열;
(b) (a)에서 정의된 서열에 비해 80% 이상(예를 들어, 90% 이상)의 동일성을 갖는 서열; 또는
(c) (a)에서 정의된 서열에 비해 1 내지 10개의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열을 포함하되, 1 내지 10개의 아미노산 잔기 치환은
i) 표 6에 따른 유사한 아미노산 잔기 치환;
ii) 표 6에 따른 보존적 아미노산 잔기 치환; 및
iii) 표 6에 따른 고도로 보존된 아미노산 잔기 치환으로부터 선택되는, D-펩티드 화합물.
제58항에 있어서, 화합물 11055, 979102 및 979107~979110 (서열번호 108~113) 중 하나를 포함하는, D-펩티드 화합물.
제43항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 D-펩티드 GA 도메인과 상동인 제2 D-펩티드 GA 도메인을 추가로 포함하는, D-펩티드 화합물.
제43항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 이량체인, D-펩티드 화합물.
약학적 조성물로서,
제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 따른 D-펩티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및
약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
제62항에 있어서, 조성물은 안구 질환 또는 병태의 치료를 위해 제형화되는, 약학적 조성물.
대상체에서 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 VEGF에 특이적으로 결합하는 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 따른 D-펩티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제64항에 있어서, 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태는 암(예를 들어, 유방암, 피부암, 대장암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 또는 난소암), 염증성 질환, 죽상경화증, 류마티스성 관절염, 황반 변성, 망막병증, 및 피부 질환(예를 들어, 주사)인, 방법.
제64항에 있어서, 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태는 당뇨병성 황반 부종(DME)인, 방법.
제64항에 있어서, 혈관신생과 관련된 질환 또는 병태는 연령 관련 황반 변성(AMD)인, 방법.
제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 활성제의 유효량을 대상체에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제68항에 있어서, 제2 활성제는 D-펩티드 화합물인, 방법.
제68항에 있어서, 제2 활성제는 저분자, 화학요법제, 항체, 항체 단편, 앱타머, 및 L-단백질로부터 선택되는, 방법.
제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 활성제는 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, EGF, EGFR, Her2, Her3, PD-1, PD-L1, CTLA4, OX-40, DR3, LAG3, Ang2, IL-1, IL-6, FcRn, CD3, BCMA, 및 IL-17로부터 선택된 표적 단백질에 특이적으로 결합하는, 방법.
제71항에 있어서, 제2 활성제는 페그플레라닙(Fovista), 라니비주맙(Lucentis), 트라스투주맙(Herceptin), 베바시주맙(Avastin), 애플리버셉트(Eylea), 니볼루맙(Opdivo), 아테졸리주맙, 더발루맙, 게피티닙, 엘로티닙, 및 펨브롤리주맙(Keytruda)으로부터 선택되는, 방법.
제68항에 있어서, 제2 활성제는 PD-1의 길항제인 D-펩티드 화합물인, 방법.
혈관 신생과 관련된 질환 또는 병태의 생체 내 진단 또는 영상화를 위한 방법으로서,
VEGF에 특이적으로 결합하는 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 따른 D-펩티드 화합물을 대상체에게 투여하는 단계; 및
대상체의 적어도 일부를 영상화하는 단계를 포함하는, 방법.
제74항에 있어서, 영상화하는 단계는 PET 영상화를 포함하고, 투여하는 단계는 화합물을 대상체의 혈관계에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제74항에 있어서, 세포 수용체에 의한 화합물의 흡수를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제74항에 있어서, 베바시주맙을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 혈관신생과 연관된 질환 또는 병태는 암인, 방법.