JP2014533834A - トランスサイレチンおよびそのアイソフォームの定量化 - Google Patents

トランスサイレチンおよびそのアイソフォームの定量化 Download PDF

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Abstract

本発明は、トランスサイレチンおよびそのアイソフォームを検出するためのアッセイおよび方法に関する。具体的には、本発明のアッセイおよび方法は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を含む。本発明は、そのアッセイおよび方法において有用なユニークなペプチドおよびペプチド変異体にも関する。

Description

配列表の参照
本出願は、電子フォーマットで配列表と共にファイルされている。ＡＬＮ１６３ＰＣＴＳＥＱＬＳＴ．ｔｘｔというタイトルの配列表ファイルが、２０１２年１１月１５日に作製され、サイズは１２，０９９バイトである。配列表の電子フォーマットでの情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
関連出願の相互参照
本出願は、「トランスサイレチンおよびそのアイソフォームの定量化」というタイトルの２０１１年１１月１８日出願の米国仮特許出願第６１／５６１，３２８号明細書への優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、トランスサイレチンおよびそのアイソフォームを検出するためのアッセイおよび方法に関する。具体的には、本発明のアッセイおよび方法は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を包含する。本発明は、そのアッセイおよび方法において有用である、ユニークなペプチドおよびペプチド変異体にも関する。
プレアルブミンとしても知られるトランスサイレチン（ＴＴＲ）は、血漿および脳脊髄液で見られる四量体タンパク質である。トランスサイレチンの主な役割は、チロキシン−Ｔ４などの甲状腺ホルモンを輸送すること、かつレチノール結合タンパク質との結合を介してレチノールを輸送することである。トランスサイレチンは多くの点突然変異を有し、その結果、病理的症状に伴う配列の不均一が生じ、アミロイドーシスとして知られる、組織におけるアミロイド繊維の細胞外沈着が起こる。
凝集傾向種のトランスサイレチンの総濃度は、突然変異による四量体破壊の程度および血清中に存在する突然変異体トランスサイレチンの総濃度に応じて異なる。さらに、野生型および突然変異体トランスサイレチンの循環レベルは、臨床的発展における候補薬物の薬理活性を評価するための重要なバイオマーカーに相当する。したがって、薬物の開発および臨床結果を改善するために、正常な集団および疾患のある集団において野生型および突然変異体トランスサイレチン濃度を正確に決定することが必要とされる。本発明はかかる方法を包含する。
本発明は、対象においてトランスサイレチンを検出するための、液体クロマトグラフィーに続いて質量分析を用いるアッセイを提供する。本発明はさらに、対象において野生型トランスサイレチンとトランスサイレチンのアイソフォームの両方を定量化する方法も提供する。本発明は、トランスサイレチンを定量化するための、対象からの試料に関するアッセイを用いたキットも提供する。本発明はさらに、本発明のアッセイで使用されるペプチドを提供する。
一実施形態において、本発明は、対象から採取された試料であるトランスサイレチンのアイソフォームの濃度を決定する方法を提供する。この方法において、その試料は、試料中に含有されるトランスサイレチンの１種または複数種のアイソフォームを消化するために処理され、消化された試料の質量分析プロファイルおよびそのプロファイルは、配列番号１、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、およびその変異体からなる群から選択される少なくとも１つの較正標準の分析から作成された標準曲線と比較される。較正標準は、内標準として使用してもよい。次いで、試料中に含有されるトランスサイレチンの１種または複数種のアイソフォームの濃度の計算が可能である。消化された試料は、質量分析プロファイルの作成前に液体クロマトグラフィーにかけられてもよい。
場合により、対象から採取された試料は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１およびその変異体からなる群から選択される、既知の濃度の１種または複数種のペプチドでスパイクされ得る。試料をスパイクするために使用されるペプチドおよび／またはタンパク質は、内標準として、または較正標準として使用することができる。本明細書で開示されるペプチドは、検出可能な標識を含み得る。その検出可能な標識は、当技術分野における多数の検出可能な標識であり得る。それは蛍光または発光または放射性標識であり得る。放射性標識されたアミノ酸は、または複数の窒素１５、炭素１３またはジュウテリウムを有するアミノ酸を含み得る。
一実施形態において、トランスサイレチンのアイソフォームは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５を含み得る。
一実施形態において、対象から採取された試料は、約２０〜約３０倍の希釈率で希釈され得る。
一実施形態において、試料は、患者である対象から採取され得る。
一実施形態において、採取された試料は血清試料であり得る。その中に含有されるトランスサイレチンタンパク質の１種または複数種のアイソフォームを消化するために試料を処理する前に、血清試料に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥが行われてもよい。一実施形態において、試料を処理して、その中に含有されるトランスサイレチンのアイソフォームのタンパク質を消化する前に、少なくとも１種類の血清タンパク質を枯渇させるために、対象から採取された試料が処理されてもよい。試料中の枯渇される血清タンパク質は、アルブミンおよび免疫グロブリンＧを含み得る。
一実施形態において、トランスサイレチンのアイソフォームの発現を改変するであろう物質を対象に投与する前に、対象から試料が採取され得る。トランスサイレチンの改変されたアイソフォームは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５を含み得る。
一実施形態において、ペプチド濃度約５ｎｇ／ｍＬ〜約２５００ｎｇ／ｍＬの範囲内の少なくとも６個以上のデータポイントを使用して、標準曲線が作成されてもよい。標準曲線は、ペプチド濃度５ｎｇ／ｍＬの下限データポイントおよびペプチド濃度２５００ｎｇ／ｍＬの上限データポイントを有し得る。上限データポイントと下限データポイントの間に、標準曲線は少なくとも４つのデータポイントを有し得る。
一実施形態において、標準曲線は、２０％以下の最大バイアスを有する。
一実施形態において、対象から採取された試料の消化は、トリプシン、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃおよび／またはキモトリプシンを使用して行うことができる。
一実施形態において、質量分析プロファイルは、液体クロマトグラフィーに続いてタンデム型質量分析を行うことによって作成することができる。
一実施形態において、試料中のトランスサイレチンの１種または複数種のアイソフォームのレベルを定量化するためのキットが提供され得る。そのキットは、配列番号１、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７およびその変異体からなる群から選択される２つ以上の較正標準を含み得る。
一実施形態において、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択されるペプチドの少なくとも８個の隣接アミノ酸を有する、１０〜２５アミノ酸長さの合成単離ペプチドが提供される。
一実施形態において、配列ＤＡＶＲＧＳＰＡＩＮＶＡＸＨＶＦ（配列番号２２）を有する、１３〜１８アミノ酸長さの合成単離ペプチドが提供され、Ｘは疎水性側鎖を有するアミノ酸であってもよく、疎水性側鎖を有するそのアミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、およびメチオニンからなる群から選択される。
一実施形態において、配列ＳＹＳＴＴＡＶＸＴＮＰＫＥ（配列番号２３）またはＧＳＰＡＩＮＶＡＸＨＶＦＲ（配列番号２４）を有する、１０〜１５アミノ酸長さの合成単離ペプチドが提供され、Ｘは疎水性側鎖を有するアミノ酸であってもよく、疎水性側鎖を有するそのアミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、およびメチオニンからなる群から選択される。
一実施形態において、配列ＴＳＥＳＧＥＬＨＧＬＴＸＥＥＥＦＶＥＧＩＹＫ（配列番号２７）を有する、２０〜２５アミノ酸長さの合成単離ペプチドが提供され、Ｘは、トレオニンまたはアラニンであるアミノ酸であり得る。
一実施形態において、配列ＹＴＩＡＡＬＬＳＰＹＳＹＳＴＴＡＶＸＴＮＰＫ（配列番号２５）を有する、２０〜２５アミノ酸長さの合成単離ペプチドが提供され、Ｘは疎水性側鎖を有するアミノ酸であってもよく、疎水性側鎖を有するそのアミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、およびメチオニンからなる群から選択される。
一実施形態において、配列ＩＤＴＫＸＹＷＫＡＬＧＩＳＰＦＨＥ（配列番号２６）を有する、１４〜１９アミノ酸長さの合成単離ペプチドが提供され、Ｘは、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸であってもよく、極性非荷電側鎖を有するそのアミノ酸は、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、チロシン、システインおよびチロシンからなる群から選択される。
一実施形態において、ペプチドは、１３〜２２アミノ酸長さであってもよい。そのペプチドはさらに、少なくとも１つの検出可能な標識を含み得る。その検出可能な標識は、当技術分野における多数の検出可能な標識であり得る。それは蛍光または発光または放射性標識であり得る。放射性標識されたアミノ酸は、または複数の窒素１５、炭素１３またはジュウテリウムを有するアミノ酸を含み得る。
検出可能な標識は、バリン、フェニルアラニンおよびプロリンからなる群から選択されるアミノ酸上に位置し得る。一実施形態において、検出可能な標識ジュウテリウムは、バリンのα炭素および／または側鎖炭素上に位置し得る。
一実施形態において、検出可能な標識ジュウテリウムは、バリンおよびフェニルアラニンのα炭素および／または側鎖炭素上に位置し得る。
一実施形態において、検出可能な標識ジュウテリウムは、バリンのα炭素および／または側鎖炭素上に位置してもよく、検出可能な標識炭素１３または窒素１５は、プロリン上に位置し得る。この場合には、検出可能な標識が炭素１３であるとすれば、標識はプロリンのα炭素および／または側鎖炭素上に位置してもよく；検出可能な標識が窒素１５であるとすれば、標識はプロリンの窒素上に位置し得る。
本発明は、液体クロマトグラフィーと共に使用されるタンデム型質量分析アッセイを提供する。本発明は、本発明の方法およびアッセイにおいて有用なキットおよびペプチドも提供する。これらのアッセイは、特定のタイプのトランスサイレチン（ＴＴＲ）関連病理的症状、特にトランスサイレチン媒介アミロイドーシス（ＡＴＴＲ）の研究および検出、診断、予後および治療に有用である。
トランスサイレチンは、血漿および脳脊髄液中で見られる四量体タンパク質である。多数の点突然変異によって、配列の不均一性が生じることから、それは広範に研究されている。これらの変異体の多くは、ＡＴＴＲなど、組織におけるアミロイド繊維の細胞外沈着を生じる病理的症状を伴う。ＡＴＴＲは、種々の組織および臓器においてアミロイド繊維として、野生型（ｗｔ）トランスサイレチンおよびその突然変異体の細胞外沈着を伴う。ＡＴＴＲの確定診断は、体内のトランスサイレチン変異体の検出および同定に依存する。
本発明は、対象からの試料における、野生型および突然変異体トランスサイレチンを含むトランスサイレチンのアイソフォームを定量化する新規な方法、ならびにこの新規な方法に有用な新規なペプチドサイン（ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）および標準を提供する。
本発明にしたがって、対象から採取された試料中に含有されるトランスサイレチンのアイソフォームの濃度は、試料中に含有されるトランスサイレチンタンパク質の１種または複数種のアイソフォームを消化するために、対象からの試料を処理することによって決定され得る。消化後、試料を質量分析によって分析して、質量分析プロファイルが得られ得る。次いで、消化試料の質量分析プロファイルを標準曲線と比較して、試料中に含有されるトランスサイレチンの１種または複数種のアイソフォームの濃度が計算される。質量分析プロファイルの作成前に、試料を分析する方法において、液体クロマトグラフィーも使用され得る。
本明細書で使用される、「トランスサイレチン」（ＴＴＲ）という用語は、甲状腺ホルモンチロキシンおよびレチノールのタンパク質担体を意味する。この用語は、切断型トランスサイレチン、トランスサイレチンの断片、変異型トランスサイレチン、修飾トランスサイレチンまたはトランスサイレチンのアイソフォームを含む。本明細書で使用される、「切断型」とは、短く切断されているタンパク質またはペプチドを意味する。「断片」という用語は、タンパク質またはペプチドの単離部分または不完全部分に関する。本明細書で使用される「変異型」とは、そのアミノ酸の少なくとも１つの変更または改変を受けている、タンパク質またはペプチドを意味する。「修飾」という用語は、化学的および／または構造的改変を受けているタンパク質またはペプチドを意味する。「アイソフォーム」という用語は、類似しているが、同一ではないアミノ酸配列を有する２種類以上の機能的に類似しているタンパク質またはペプチドに関する。トランスサイレチンの修飾は、酵素または化学修飾によるものであることができる。トランスサイレチンという用語は、トランスサイレチンの単量体または多量体型を示すためにも使用される。トランスサイレチンは、プレアルブミンとも呼ばれることもある。本明細書で使用される、「トランスサイレチンのアイソフォーム」とは、トランスサイレチンの天然型および合成型を含む。トランスサイレチンの天然型は、限定されないが、野生型変異体などの自然界に見られるトランスサイレチンの天然に産生される、天然変異体を含む。合成トランスサイレチンは、化学的に合成されたトランスサイレチンのあらゆる形態を含む。
本明細書で使用される、「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、トランスサイレチンの天然型と比較してそのアミノ酸配列が一部異なるタンパク質を意味する。アミノ酸配列変異体は、アミノ酸配列の特定の位置に置換、欠失および／または挿入を有し得る。通常、変異体は、天然配列に対して少なくとも約７０％の相同性を有し、好ましくはそれらは少なくとも８０％であり、より好ましくは、天然配列に対して少なくとも約９０％相同性である。変異体は、置換変異体、挿入変異体、および欠失変異体を含む。
アミノ酸配列に適用される「相同性」は、最大相同性％を達成するために、必要であれば配列をアラインメントし、ギャップを導入した後に、第２配列のアミノ酸配列における残基と同一である候補アミノ酸配列における残基のパーセンテージとして定義される。アラインメントの方法およびコンピューター・プログラムは当技術分野でよく知られている。相同性は、同一性％の計算に依存するが、ギャップおよびペナルティが計算に導入されるために値が異なり得る。
アミノ酸配列に適用される「ホモログ」とは、第２種の第２配列と実質的な同一性を有する他の種の相当する配列を意味する。
タンパク質に言及する場合に「置換変異体」とは、天然または開始配列において少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており、かつ同じ位置でその場所に異なるアミノ酸が挿入されているタンパク質である。その置換は、その分子においてアミノ酸１つのみが置換されている場合には、一置換であり得、同一分子において２個以上のアミノ酸が置換されている場合には複数置換であり得る。
タンパク質に言及する場合に「挿入変異体」とは、天然または開始配列において特定の位置で、１つのアミノ酸のすぐ隣に１つまたは複数のアミノ酸が挿入されているタンパク質である。１つのアミノ酸の「すぐ隣に」とは、そのアミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ官能基のいずれかに連結していることを意味する。
タンパク質に言及する場合に「欠失変異体」とは、天然または開始アミノ酸配列において１つまたは複数のアミノ酸が除去されているタンパク質である。通常、欠失変異体は、その分子の特定領域において１つまたは複数のアミノ酸が欠失している。
かかる修正形態は当業者の範囲内であり、過度の実験なく行われる。
場合により、対象から採取された試料中で決定されるトランスサイレチンの濃度は、トランスサイレチンの１種または複数種のアイソフォームから選択され得る。トランスサイレチンのアイソフォームは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５から選択され得る。配列番号１は、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＭ＿０００３７１）に記載される、野生型トランスサイレチンのアミノ酸２１〜１４７であり、シグナルペプチド（アミノ酸１〜２０）は示されていない。配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５は、その配列に単一アミノ酸置換を有する、配列番号１の置換変異体である。配列番号２は、Ｖ３０Ｍとして知られる置換変異体であり、野生型トランスサイレチン配列（配列番号１）の３０位で、バリンがメチオニンに単一アミノ酸置換されている。配列番号３はＶ１２２Ｉとして知られる置換変異体であり、野生型トランスサイレチン配列（配列番号１）の１２２位で、バリンがイソロイシンに単一アミノ酸置換されている。配列番号４はＴ６０Ａとして知られる置換変異体であり、野生型トランスサイレチン配列（配列番号１）の６０位でトレオニンがアラニンに単一アミノ酸置換されている。配列番号５はＳ７７Ｙとして知られる置換変異体であり、野生型トランスサイレチン配列（配列番号１）の７７位で、セリンがチロシンに単一アミノ酸置換されている。
本発明の方法において、試料は対象から採取され得る。その試料はタンパク質分析に対して修正可能なあらゆる試料を含み得るが、血清試料が最も多く使用される。患者である対象から、試料を採取することができる。本明細書で使用される、「対象」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは霊長類、またさらに好ましくはヒトを意味する。
患者である対象から、試料を採取することができる。本明細書で使用される「患者」とは、治療を求め得るまたは治療を必要とし得る、治療を要する、治療を受けている、治療を受けるであろう対象、あるいは特定の疾患または症状に対して訓練を受けた専門家によるケアを受けている対象を意味する。本明細書で使用される「治療」という用語は、腫瘍の増殖、腫瘍の転移、または他のトランスサイレチン関連病理的症状を一部または完全に改善し、回復し、緩和し、その進行を抑える、または予防する効果を有する、あらゆることを意味する。本明細書で使用される「治療する」という用途は、別段の指定がない限り、治療を施す行動を意味する。
本明細書で使用される、「試料」という用語は、その組織、細胞または構成成分（例えば、体液、限定されないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液および精液など）のサブセットを意味する。試料はさらに、生物全体またはその組織、細胞または構成成分のサブセットから調製されたホモジネート、ライセートまたは抽出物、あるいはその画分またはその一部、限定されないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外部セクション、気道、腸管、尿生殖路、涙、唾液、乳、血球、腫瘍、臓器などを含み得る。試料はさらに、タンパク質または核酸分子などの細胞成分を含有し得る、栄養ブロスまたはゲルなどの培地を意味する。
本発明に従って、対象から採取された後に試料は、酵素消化にかけられ得る。本明細書で使用される「消化」という用語は、短いペプチドへと分解することを意味する。本明細書で使用される「タンパク質を消化するために試料を処理する」というフレーズは、試料中のタンパク質を分解するように、試料を操作することを意味する。本発明において、トランスサイレチンタンパク質の１種または複数種のアイソフォームが酵素を用いて消化され得る。これらの酵素としては、限定されないが、トリプシン、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃおよびキモトリプシンが挙げられる。
対象から採取された試料は、既知の濃度の１種または複数種のペプチドまたはタンパク質でスパイクすることもできる。本明細書で使用される、「スパイクまたはスパイクする」とは、既知の化合物を添加することを意味する。対象から採取された試料をスパイクするために使用されるペプチドまたはタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、およびその変異体からなる群から選択され得る。
配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号１９のペプチドは、野生型トランスサイレチン（配列番号１）の一部である。配列番号６は、Ｇｅｎｂａｎｋに記載の野生型トランスサイレチン配列（ＮＭ＿０００３７１）のアミノ酸１８〜２２に相当し、配列番号８は、アミノ酸１１５〜１２７に相当し、配列番号１０は、アミノ酸２２〜３４に相当し、配列番号１２は、アミノ酸４９〜７０に相当し、配列番号１４は、アミノ酸１０５〜１２６に相当し、配列番号１６は、アミノ酸７３〜８９に相当し、配列番号１８は、アミノ酸１８〜４０に相当し、配列番号１９は、アミノ酸１０６〜１２７も相当する。
配列番号７、配列番号１１および配列番号２０のペプチドは、野生型トランスサイレチンタンパク質のＶ３０Ｍ置換変異体（配列番号２）の一部である。配列番号７は、Ｖ３０Ｍのアミノ酸１８〜３３に相当し、配列番号１１は、アミノ酸２２〜３４に相当し、配列番号２０は、アミノ酸１８〜４０に相当する。配列番号９、配列番号１５および配列番号２１のペプチドは、野生型トランスサイレチンタンパク質のＶ１２２Ｉ置換変異体（配列番号３）の一部である。配列番号９は、Ｖ１２２Ｉのアミノ酸１１５〜１２７に相当し、配列番号１５は、アミノ酸１０５〜１２６に相当し、配列番号２１は、アミノ酸１０６〜１２７に相当する。配列番号１３は、野生型トランスサイレチンタンパク質のＴ６０Ａ置換変異体（配列番号４）のアミノ酸４９〜７０に相当する。配列番号１７は、野生型トランスサイレチンのＳ７７Ｙ置換変異体（配列番号５）のアミノ酸７３〜８９に相当する。
使用されるペプチドは、野生型トランスサイレチンタンパク質（配列番号１）の変異体であってもよい。配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５は、配列番号１の変異体ペプチドであり、Ｘは、疎水性側鎖を有するアミノ酸であり得る。アミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、およびメチオニンの群から選択され得る。配列番号２６は、配列番号１の変異体ペプチドであり、Ｘは、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸であり得る。そのアミノ酸は、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、チロシン、システイン、およびチロシンから選択され得る。配列番号２７は、配列番号１の変異体ペプチドであり、Ｘはトレオニンまたはアラニンであり得る。
試料中にスパイクされる本発明のペプチドまたはタンパク質は、少なくとも１つの検出可能な標識も含み得る。検出可能な標識は、窒素１５、ジュウテリウム、および炭素１３から選択され得る。場合により、スパイクは内標準として使用されてもよい。本明細書で使用される「内標準」とは、試料、ブランクおよび較正標準に一定量で添加される化学物質を意味する。
対象から採取された試料は、ある希釈率で希釈もされ得る。本明細書で使用される、「希釈された」とは、試料を手を加えることによって、または試料に他の要素を加えることによって、試料の力、内容、または値を弱くすることを意味する。「希釈率」という用語は、試料の初期体積で割られた、希釈試料の最終体積の割合を意味する。試料に含有されるトランスサイレチンのアイソフォームのタンパク質を消化するために試料を処理する前、または試料中のタンパク質の消化が起こった後に、試料が希釈されてもよい。試料は、約２０〜約３０倍の範囲の希釈率で希釈されてもよい。
一例には、トランスサイレチンの少なくとも１つのアイソフォームの発現を改変し得る物質を対象に投与する前に、対象から試料が採取され得る。本明細書で使用される、「発現を改変する」というフレーズは、発現の特徴または構成を変化させる、または発現の特徴または構成の変化が生じ得ることを意味する。その物質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択されるトランスサイレチンのアイソフォームの発現を改変し得る。トランスサイレチンの少なくとも１つのアイソフォームの発現を改変し得る物質を対象に投与した後に、対象から試料が採取され得る。改変されたトランスサイレチンアイソフォームは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５の群から選択され得る。
血清試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにもかけられてもよい。本明細書で使用される、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」とは、その電気泳動移動度に従ってタンパク質を分離する、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を意味する。試料中に含有されるトランスサイレチンの１種または複数種のアイソフォームを消化するために試料を処理する前に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが血清で行われ得る。次に、試料中に含有されるトランスサイレチンタンパク質の１種または複数種のアイソフォームを消化するために試料を処理する前に、トランスサイレチンバンドが切り取られてもよい。
対象から採取された血清試料は、試料中に含有される少なくとも１種類の血清タンパク質を枯渇させるためにも処理され得る。「血清タンパク質」という用語は、血清中に見られる任意のタンパク質を意味する。本明細書で使用される、「枯渇」という用語は、試料における物質の濃度の低減を意味する。その物質は試料において最低限に低減されても、試料から完全に除去されてもよい。特定の場合において、試料中に含有される非トランスサイレチンタンパク質の量を最低限に抑えることは有利である。これらのタンパク質としては、限定されないが、アルブミンおよび免疫グロブリンＧが挙げられる。
対象から採取された試料は血清試料であり得る。試料中に含有されるトランスサイレチンを濃縮するために、トランスサイレチンポリクローナル抗体カラムに試料をローディングしてもよい。血清試料は、血清試料中に含有されるトランスサイレチンを濃縮にするために、トランスサイレチンポリクローナル抗体ビーズ上に試料をローディングしてもよい。次いで、試料が分析され得る前に、濃縮された試料を処理して、試料に含有されるトランスサイレチンの１種または複数種のアイソフォームを消化させてもよい。消化された試料は、液体クロマトグラフィーに続いて質量分析によって分析され得る。
本発明は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１の、少なくとも８個の隣接アミノ酸を有する、１０〜２５アミノ酸長さの合成単離ペプチドを提供する。場合により、本発明のペプチドは１３〜２２アミノ酸長さである。
本明細書で使用される、「タンパク質」とは、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸残基のポリマーを意味する。本明細書で使用されるその用語は、あらゆるサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを意味する。しかしながら一般に、タンパク質は少なくとも５０アミノ酸長さである。場合により、コードされるタンパク質は、約５０個未満のアミノ酸であり、ポリペプチドはペプチドと呼ばれる。タンパク質がペプチドである場合、それは少なくとも約１０アミノ酸残基長さである。タンパク質は、天然、組換え、合成、タンパク質、またはこれらのいずれかの組み合わせであり得る。タンパク質は、天然タンパク質またはペプチドの断片も含み得る。タンパク質は単一分子であるか、または二量体、三量体または四量体などの多分子複合体であり得る。タンパク質という用語は、１種または複数種のアミノ酸残基が、相当する天然アミノ酸の人工的化学的類自体である、アミノ酸ポリマーにも当てはまり得る。
本発明のいずれのペプチドまたはタンパク質も、１種または複数種の検出可能な標識を含有し得る。それらは一部標識されても、全体にわたって完全に標識されてもよい。本明細書で使用される、「検出可能な標識」とは、Ｘ線撮影、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度等の当技術分野で公知の方法によって容易に検出される、もう１つの実体に結合される、組み込まれる、または会合される、１種または複数種のマーカー、シグナル、または部位を意味する。検出可能な標識としては、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン、量子ドット等が挙げられる。検出可能な標識は、本明細書で開示されるペプチドまたはタンパク質のあらゆる位置に位置付けることができる。標識は、アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質内にあるか、またはＮ末端またはＣ末端に位置し得る。さらに標識は、アミノ酸のα炭素または側鎖上にあり得る。場合により、検出可能な標識は、ラジオアイソトープ窒素１５、炭素１３およびジュウテリウムから選択される。本明細書で使用される、「窒素１５」とは、陽子７個および中性子８個を有する窒素の、安定な非放射性同位体を意味する。窒素１５は、「重窒素」とも呼ばれ得る。「炭素１３」という用語は、陽子７個および中性子６個を有する炭素の、天然の安定な同位体を意味する。「ジュウテリウム」（Ｄ）という用語は、その核に陽子１個と中性子１個を有し、かつ通常の水素の２倍の質量を有する、水素の同位体を意味する。ジュウテリウムは、重水素とも呼ばれ得る。
一部の実施形態において、検出可能な標識は、バリン、フェニルアラニンおよびプロリンからなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸上に位置し得る。場合により、検出可能な標識ジュウテリウムは、アミノ酸バリンまたはフェニルアラニンのα炭素および／または側鎖炭素上に位置し得る。本明細書で使用される、「α炭素」とは、ペプチド結合におけるカルボン酸に先行する最初の炭素を意味する。「側鎖炭素」という用語は、α炭素に結合する側鎖（またはＲ基）における任意の炭素を意味する。
場合により、検出可能な標識は、アミノ酸バリン上に、かつフェニルアラニンおよびプロリンから選択される他のもう１つのアミノ酸上に位置する。検出可能な標識がジュウテリウムである場合には、アミノ酸バリンおよびフェニルアラニンのα炭素および／または側鎖炭素上に標識が位置し得る。検出可能な標識が炭素１３および／または窒素１５である場合には、検出可能な標識はプロリン上に位置する。検出可能な標識炭素１３は、プロリンのα炭素および／または側鎖炭素に結合されてもよく、検出可能な標識窒素１５はプロリンの窒素上に位置する。検出可能な標識窒素１５を使用してペプチドを標識することもでき、その検出可能な標識は、ペプチド内の窒素それぞれに位置し得る。
一部の実施形態において、本発明のペプチドまたはタンパク質は、同位体富化されるか、または同位体的に改変され得る。その同位体は、ジュウテリウムまたはトリチウムなどの水素同位体、またはペプチドまたはタンパク質で見られる元素の他の同位体を含み得る。
場合により、ペプチドは、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５からなる群から選択される配列を有する、１０〜２５アミノ酸長さであってもよく、Ｘは、疎水性側鎖を有するアミノ酸として定義される。疎水性側鎖は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、およびメチオニンからなる群から選択され得る。配列番号２２を有するペプチドは、１３〜１８アミノ酸長さであってもよく、Ｘは、バリンまたはイソロイシンから選択されるアミノ酸であり、配列番号２３および配列番号２４を有するペプチドは、１０〜１５アミノ酸長さであり得る。配列番号２３の疎水性側鎖を有するアミノ酸は、バリンまたはイソロイシンから選択されてもよく、配列番号２４において、アミノ酸はバリンまたはメチオニンから選択され得る。配列番号２５を有するペプチドは、２０〜２５アミノ酸長さであってもよく、Ｘは、バリンまたはイソロイシンから選択されるアミノ酸であり得る。
ペプチドは、配列番号２７を有する、２０〜２５アミノ酸長さのペプチドであってもよく、Ｘは、トレオニンまたはアラニンから選択されるアミノ酸であり得る。一例において、ペプチドは、配列番号２６を有する１４〜１９アミノ酸長さのペプチドであってもよく、Ｘは、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸であり得る。極性側鎖は、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、チロシン、システインおよびチロシンからなる群から選択され得る。
質量分析プロファイルを作成するために、液体クロマトグラフィーを行い、続いてタンデム型質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を行う。本明細書で使用される「タンデム型」とは、実質的に端と端を繋いで配置される、２つ以上の目的、プロセス、方法、手順または工程の配置を意味する。
本明細書で使用される、「液体クロマトグラフィー」（ＬＣ）という用語は、流体が均一に、微細な物質のカラムを通って、またはキャピラリー通路を通って浸出する場合の、流体溶液の１種または複数種の成分の選択的遅延のプロセスを意味する。その遅延は、この流体が固定相に対して移動する際に、１種または複数種の固定相とバルク流体（つまり、移動相）との混合物の成分の分布から生じる。ＬＣとしては、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および高速乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）が挙げられる。
「質量分析プロファイル」という用語は、質量分析計による試料の分析から得られる結果を意味する。「質量分析計」という用語は、気相イオンの質量対電荷比へと変換することができるパラメーターを測定する気相イオン分光計を意味する。質量分析計は一般に、イオン源と質量分析器とを含む。質量分析計の例は、飛行時間型、磁場型、４重極子、イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴、静電セクター分析器およびこれらのハイブリッドである。「質量分析」（ＭＳ）とは、気相イオンを検出するための質量分析計の使用を意味する。質量分析計によって得られた結果は、質量スペクトル、質量クロマトグラフ、または質量対電荷比がｘ軸上にあり、強度がｙ軸上にあり、時間などの更なるパラメーターがｚ軸上にある、三次元等高線図によって表され得る。質量スペクトルとしての結果は、化学分析を意味する、質量対電荷比に対する強度のプロットである。質量クロマトグラフは、強度対時間のクロマトグラムにおける質量分析データの図である。質量クロマトグラフの種類としては、選択イオン検出（ＳＩＭ）、総イオン電流（ＴＩＣ）、および選択反応検出クロマトグラム（ＳＲＭ）が挙げられる。
本発明で使用される標準曲線は、少なくとも１つの較正標準を用いて作成することができる。較正曲線を作成するために使用される較正標準は、配列番号１、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７およびその変異体からなる群から選択され得る。本明細書で使用される「較正標準」という用語は、既知の濃度の検体を含有する試料を意味する。「標準曲線」というフレーズは、試料の分析と同じ方法を使用して、少なくとも２つの較正標準を分析することによって作成された曲線を意味する。
標準曲線は、較正標準におけるペプチド濃度の約５〜約２５００ｎｇ／ｍＬの範囲内の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８個のデータポイントを使用して作成することができる。一例において、標準曲線は少なくとも６個のデータポイントを使用して作成される。標準曲線は、約５ｎｇ／ｍＬの下限データポイント、２５００ｎｇ／ｍＬの上限データポイント、およびペプチド濃度約５〜約２５００ｎｇ／ｍＬの範囲内の少なくとも４個のデータポイントも有し得る。本発明において作成される標準曲線は、２０％以下の最大バイアスも有し得る。本明細書で使用される「バイアス」とは、等式［（平均濃度計算値−濃度期待値）／濃度期待値］×１００から計算されるパーセンテージを意味する。
試料中のトランスサイレチンのアイソフォームの濃度は、トランスサイレチン関連病理的症状の治療を対象が受ける前に決定され得る。トランスサイレチンのアイソフォームの濃度は、トランスサイレチン関連病理的症状の治療を対象が受けた後にも決定され得る。次いで、治療前および治療後の対象におけるトランスサイレチンのアイソフォームの濃度を比較して、トランスサイレチン関連病理的症状に対する、受けた治療の影響を決定することができる。
一例において、キットを使用して、試料中に含有される１種または複数種のトランスサイレチンのアイソフォームのレベルを定量化することができる。そのキットは、配列番号１、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７およびその変異体の群から選択される２つ以上の較正標準を含み得る。
特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の、または等しい方法および材料が、本発明で特徴付けられるｉＲＮＡおよび方法の実施および試験で使用されることができるが、適切な方法および材料を以下に示す。すべての出版物、特許出願、特許、および本明細書に記載の他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書がコントロールする。さらに、材料、方法、および実施例は単なる実例であり、限定することを意図するものではない。
実施例１．標準曲線の作成
液体クロマトグラフィーに続いてタンデム型質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて、トランスサイレチンの各アイソフォームに関して、検体濃度対検体ピーク面積比（検体／内標準）の標準曲線を作成した。表１に示す安定な標識化ペプチドを使用して、濃度範囲５ｎｇ／ｍＬ〜２５００ｎｇ／ｍＬにわたって標準曲線を作製した。２５００、１０００、５００、２５０、１００、５０、２０、１０および５ｎｇ／ｍＬの濃度を選択して、安定な標識化ペプチドの標準曲線を作成した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって各濃度を２回実施し、各濃度のデータポイントのセットを作成した。線形回帰（重み（ｗｅｉｇｈｉｎｇ）１／ｘ２）を使用して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析から得たデータポイントを処理し、標準曲線を作成した。
Figure 2014533834
実施例２．試料におけるタンパク質の消化
トランスサイレチンアイソフォーム濃度に関して試料を評価する前に、試料中のタンパク質の消化を行った。プールされた血清を最初に、ミリＱ水で希釈して、２５倍希釈液を生成した。次いで、希釈血清をヒートブロック内で１００℃で１０分間変性させ、次いで即座に氷で１０分間急冷し、続いて熱変性を行った。試料チューブの側面上の凝縮物を回収するために、各チューブにジチオスレイトール（ＤＴＴ）を還元のために液体水平面上に添加する前に、チューブを手短に回転させた。手でわずかに攪拌した後に、ヨードアセトアミドを各チューブに添加する前、試料を室温で３０分間インキュベートし、暗所で室温にて３０分間インキュベートした（アルキル化）。次いで、ヒートブロック内で再び１００℃で１０分間試料を変性させ、即座に氷で１０分間急冷し、続いて熱変性を行った。試料を３０℃で３時間インキュベートする前に、１Ｍトリス塩酸塩（トリスＨＣｌ）１５μＬ、２００ｍＭ Ｃａ２Ｃｌ ８μＬおよび１μｇ／μＬキモトリプシン５μＬの順序で３つの試薬を変性試料に添加した。インキュベート後、試料をアセトニトリル２４０μＬで沈殿させ、ボルテックス混合し、次いで１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心した。それぞれ１７５μＬのアリコート２つを上澄から抜き取り、安定した窒素ストリーム下で乾燥させる前に２つのディープウェルプレートに移した。
実施例３．ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法
試料中に含有されるトランスサイレチンのアイソフォームのタンパク質を消化するために試料を処理した後に、アセトニトリル２４０μＬで試料を抽出する。上澄のアリコート（１７５μＬ）２つをディープウェルプレートにおいて安定した窒素ストリーム下で乾燥させる。１つのプレートは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた分析のために、移動相Ａ（ギ酸０．１％と共に、水９５体積％とアセトニトリル５体積％）５０μＬ中で再構成される。２番目のプレートはバックアップとして−８０℃で保存する。
液体クロマトグラフィーによって４０℃で加熱されたＶａｒｉａｎ Ｍｅｔａｓｉｌ Ｃ１８ ２×５０ｍｍカラムを使用して、消化された試料の１つのアリコートを最初に分析した。表２に示す勾配で流量０．６ｍＬ／分にて、移動相Ｂ（ギ酸０．１％と共に、メタノール５０体積％およびアセトニトリル５０体積％）および移動相Ａを有するカラムに、消化試料２０μＬを通した。液体クロマトグラフィーによる消化試料の分析は０．０１分で始まり、４．５０分で終了した。次の試料を分析する前に、ギ酸１％を含む水７５％とアセトニトリル２５％の溶液で試料の針を洗浄した。
Figure 2014533834
消化試料のアリコートを液体クロマトグラフィーによって分析した後、次いでタンデム型質量分析によって試料を分析した。消化試料を分析するために使用された質量分析計は、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＡＢ ＳＣＩＥＸによるＡＰＩ５０００ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムであった。イオン源は、６０Ｖのデクラスタリング電位と共に電圧５０００Ｖでのターボイオンスプレーであった。タンデム型質量分析の極性は正であり、供給源の温度は５００℃であった。試料中のトランスサイレチンのアイソフォームを定量化するために使用される消化試料の質量分析データは、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）によって獲得された。
実施例４．試料の定量化
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで試料を実行する前に、対象から採取された血清試料を処理して、トランスサイレチンのアイソフォームを消化させた。ピーク面積比（検体／内標準）を用いて、各検体について確立された標準曲線に対する検体の濃度を計算した。タンデム型質量分析計によって質量分析プロファイルを作成し、時間対強度のグラフ上のピークが示された。試料中に含有されるトランスサイレチンのアイソフォームのピーク面積は、曲線下面積を計算することによって決定された。次いで、ピーク面積比を計算するために、試料のピーク面積を、同じトランスサイレチンのアイソフォームの内部標準ピーク面積で割った。次いで、試料中に含有されるトランスサイレチンのアイソフォームに相当する標準曲線と、そのピーク面積比を比較して、試料におけるアイソフォームの実際の濃度を計算した。
実施例５．治療効果の評価
本発明を用いて、治療的処置がトランスサイレチンアイソフォームの発現を改変するかどうかを決定することができる。トランスサイレチンの少なくとも１種類のアイソフォームの発現を改変する物質を患者に投与する前に、患者から試料を採取する。次いで、トランスサイレチンの少なくとも１種類のアイソフォームの発現を改変する物質を投与した後に、同じ患者から試料を採取する。次いで、どちらも試料にもＬＣ／ＭＳ／ＭＳを実施し、試料中に含有されるトランスサイレチンのアイソフォームの濃度を決定する。モニターされたペプチドのピーク面積比を用いて、それに相当する標準曲線をベースとして、トランスサイレチンのアイソフォームの濃度を計算した。物質の投与によって、患者におけるトランスサイレチンのアイソフォームの濃度が変化する場合には、２つの試料中に含有されるアイソフォームの濃度の比較を示すことができる。
実施例６．ペプチドおよびタンパク質の窒素１５による標識化
未標識細菌懸濁液の形成
Ｍｅｔ−ｈＴＴＲ（Ｎ末端メチオニン残基が付加されたヒトトランスサイレチン）を発現するｐｅｔ４１プラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（株：ＢＬ２１（ＤＥ３））凍結ストックで、ＬＢおよびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）寒天平板を画線し、３７℃で一晩インキュベートした。ＬＢ約５０ｍｌおよびカナマイシン５０μｇ／ｍｌに寒天平板からの細菌を接種し、３７℃および２２０ｒｐｍにて振盪機上でインキュベートした。６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６００）が約０．１〜０．５に達した際に、ＬＢおよびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）培養物１．０Ｌに、スターター培養物約１５ｍｌを接種し、３７℃および２２０ｒｐｍにて振盪機上でインキュベートした。その１．０Ｌ培養物のＯＤが約０．６である場合には、０．２μｍフィルターに通された１Ｍイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．３５ｍｌを培養物に添加し、２０℃および２２０ｒｐｍにて振盪機上で一晩インキュベートした。
誘発して１６〜２０時間後、８Ｋ×ｇ（重力の８０００倍）で１０分間遠心することによって細胞を収集し、細菌懸濁液が形成された。
標識化細菌懸濁液の形成
Ｍｅｔ−ｈＴＴＲ（Ｎ末端メチオニン残基が付加されたヒトトランスサイレチン）を発現するｐｅｔ４１プラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（株：ＢＬ２１（ＤＥ３））凍結ストックで、ＬＢおよびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）寒天平板を画線し、３７℃で一晩インキュベートした。できるだけ少ない材料（細胞および培地）を使用して、最少培地約５０ｍｌに１つの細菌コロニーを接種し、次いで２５℃および２２０ｒｐｍにて振盪機上で一晩インキュベートした。その一晩培養液を１００倍に希釈して新たな最少培地１．０Ｌを形成し、その培地を接種前に予熱し、次いで３７℃および２２０ｒｐｍにて振盪機上でインキュベートした。
培養物のＯＤ６００が約０．６に達した場合には、０．２μｍフィルターに通された１Ｍイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．３５ｍｌを培養物に添加し、２０℃および２２０ｒｐｍにて振盪機上で一晩インキュベートした。
誘発して１６〜２０時間後、８Ｋ×ｇ（重力の８０００倍）で１０分間遠心することによって細胞を収集し、細菌懸濁液が形成された。
ペプチドおよびタンパク質の精製
２０ｍＭ ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＢＭＥ（β−メルカプトエタノール）、およびリゾチームから調製された溶解バッファーに細菌懸濁液を再懸濁し、その結果、収集される細胞培養液１リットル当たりバッファー約５０ｍｌとなった。次いで、懸濁液を−２０℃で凍結し、−８０℃で保存した。細菌懸濁液を室温で解凍し、液体窒素で再び凍結した。懸濁液が粘性になるまで、室温で再解凍し、インキュベートした。デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮアーゼＩ）を最初に、１Ｍ塩化マグネシウム１ｍｌに溶解し、粘性ペレットに添加した。室温で約１時間、または粘度がなくなるまで、かつ試料が１６Ｋ×ｇにて４℃で３０分間遠心される前に、ペレットおよびＤＮアーゼＩをインキュベートした。次いで、試料をデカントし、上澄を保持した。０．１ｍＭに達するようにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を上澄に添加し、次いで、上澄み液を混合する前に最終濃度２ｍＭに達するように、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を添加した。溶液が飽和度４５％に達するまで、攪拌によって、溶液に固体硫酸アンモニウムをゆっくりと添加し、次いでその溶液を室温で３時間攪拌した。上澄み液をデカントし、溶液を攪拌しながら、溶液が飽和度９０％に達するまで、固体硫酸アンモニウムを添加した。溶液を１６Ｋ×ｇにて４℃で２０分間遠心する前に、飽和度９０％の溶液を室温で１時間攪拌した。
１０Ｋ ＭＷＣＯ（１０，０００分子量カットオフ）透析チューブ内で４℃にて一晩、４Ｌの５ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＢＭＥに対して透析する前に、遠心した溶液を２０ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に可溶化した。透析試料の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけて、精製手順を評価した。精製をチェックした後、透析液を回収し、１６Ｋ×ｇで１５分間遠心する前に６０℃で３０分間加熱した。次いで上澄を０．２μｍフィルターに通し、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ陰イオン交換カラム上にローディングした。以下のスキーム：２カラム体積（ｃｖ）に対して溶出バッファー０〜１０％、１ｃｖは約５５ｍｌであり；１５ｃｖに対して溶出バッファー１０〜４０％；１ｃｖに対して溶出バッファー１００％；分画サイズ１１ｍｌをすべての工程で使用する；を用いて、溶出バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１Ｍ塩化ナトリウム）を有するカラムから、濾過した上澄を溶出した。
画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、同じ純度の他の画分と合わせた。次いで、３．５Ｋ×ｇおよび４℃にて、１０Ｋ ＭＷＣＯ遠心濃縮器を使用して、合わせた画分を濃縮した。画分をフェニルセファロースＨＰ疎水性相互作用カラム上にローディングする前に、約１．５Ｍに達するように濃縮画分に固体硫酸アンモニウムを添加した。ローディングバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１．５Ｍ硫酸アンモニウム）２ｃｖでカラムを洗浄し；画分８ｍｌをこの工程中に回収した。以下のスキーム：２ｃｖに対して溶出バッファー０〜４０％（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））、画分サイズ８ｍｌ、１ｃｖは約２０ｍｌであり；１５ｃｖに対して溶出バッファー４０〜６２％、画分サイズ５ｍｌ；５ｃｖに対して溶出バッファー１００％、画分サイズ５ｍｌ；を用いて、濃縮画分を溶出した。
画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、３．５Ｋ×ｇおよび４℃にて１０Ｋ ＭＷＣＯ濃縮器を使用して濃縮する前に、同じ純度の他の画分と合わせた。１０Ｋ ＭＷＣＯ透析チューブ内で４℃にて一晩、４Ｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＢＭＥに対して濃縮画分を透析した。次いで、透析した試料をＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ陰イオン交換カラムにローディングし、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含むバッファーで洗浄した。次いで、以下のスキーム：１ｃｖに対して溶出バッファー０〜１０％、画分サイズ５ｍｌ、１ｃｖは約６ｍｌであり；３０ｃｖに対して溶出バッファー１０〜３０％、画分サイズ３ｍｌ；３ｃｖに対して溶出バッファー３０〜１００％；分画サイズ５ｍｌ；を用いて、溶出バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および１Ｍ塩化ナトリウム）で濃縮画分を溶出した。
次いで、画分のＵＶ吸光度シグナル当たりの相対濃度に基づいて、得られた画分を合わせた。次いで、１０Ｋ ＭＷＣＯ遠心濃縮器を３．５Ｋ×ｇおよび４℃で使用して、画分を濃縮し、その結果、最終体積１０ｍｌ未満となった。次いで、１×ＰＢＳ、０．０１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＤＴＴのバッファー中で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ ２６／６０カラムに濃縮画分をローディングした。平衡バッファーを使用して試料を溶出し、４ｍｌ画分で回収し、そのＵＶ吸光度シグナルに対するその相対濃度に基づいて合わせた。次いで、合わせた画分を０．２μｍフィルターを通して濾過し、４℃で保存した。ＰＢＳの吸光係数が１．４１（ｍｇ／ｍｌ）−１ｃｍ−１である、ＵＶ／ＶＩＳ吸収分光法によって、画分の濃度を測定した。濃度が決定されたら、試料をアリコートし、−８０℃で保存した。１×ＰＢＳのバッファーを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００カラム）によって、濃縮画分の純度を評価した。分析の証明が完了する前に、最終試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にかけた。

Claims (47)

  1. （ａ）対象から試料を採取する工程；
    （ｂ）その中に含まれるトランスサイレチンタンパク質の１種または複数種のアイソフォームを消化するために前記試料を処理する工程：
    （ｃ）工程（ｂ）の消化試料の質量分析プロファイルを作成する工程；
    （ｄ）工程（ｃ）からの前記質量分析プロファイルを標準曲線と比較する工程であって、前記標準曲線が、配列番号１、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７およびその変異体からなる群から選択される少なくとも１つの較正標準を使用して作成されている、工程；
    （ｅ）前記標準曲線をベースとして、前記対象から採取された試料中のトランスサイレチンの前記１種または複数種のアイソフォームの濃度を計算する工程；
    を含む、試料中のトランスサイレチンのアイソフォームの濃度を決定する方法。
  2. 前記質量分析プロファイルを作成する前に、工程（ｂ）の前記試料を液体クロマトグラフィーにかける、請求項１に記載の方法。
  3. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、およびその変異体からなる群から選択される、既知の濃度の１種または複数種のペプチドまたはタンパク質で（ａ）の前記試料をスパイクする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記１種または複数種のペプチドまたはタンパク質が、検出可能な標識を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記検出可能な標識が、窒素１５、炭素１３およびジュウテリウムからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. トランスサイレチンの前記１種または複数種のアイソフォームが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  7. 約２０〜約３０倍の希釈率で、（ａ）で得られた試料を希釈する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記希釈率が２５倍である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記対象が患者である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記試料が血清である、請求項１に記載の方法。
  11. 工程（ｂ）での消化前に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが行われる、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記対象から採取された試料が、消化前にその中に含まれる少なくとも１種類の血清タンパク質を枯渇させるために処理される、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記少なくとも１種類の血清タンパク質がアルブミンおよび／または免疫グロブリンＧである、請求項１２に記載の方法。
  14. トランスサイレチンの少なくとも１種または複数種のアイソフォームの発現を改変する物質が前記対象に投与される前に、前記試料が前記対象から採取される、請求項１に記載の方法。
  15. トランスサイレチンの前記１種または複数種のアイソフォームが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. ペプチド濃度約５〜約２５００ｎｇ／ｍＬの範囲内の少なくとも６個のデータポイントを用いて、前記標準曲線が作成される、請求項１に記載の方法。
  17. 前記標準曲線が、ペプチド濃度約５ｎｇ／ｍＬの下限データポイントおよびペプチド濃度約２５００ｎｇ／ｍＬの上限データポイントを有する、請求項１６に記載の方法。
  18. ペプチド濃度約５ｎｇ／ｍＬの下限データポイント、ペプチド濃度約２５００ｎｇ／ｍＬの上限データポイント、およびペプチド濃度約５〜約２５００ｎｇ／ｍＬの範囲内の少なくとも４個のデータポイントを有する前記標準曲線が作成される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記標準曲線が、２０％以下の最大バイアスを有する、請求項１に記載の方法。
  20. トリプシンを使用して、消化が行われる、請求項１に記載の方法。
  21. エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃを使用して、消化が行われる、請求項１に記載の方法。
  22. キモトリプシンを使用して、消化が行われる、請求項１に記載の方法。
  23. 前記質量分析がタンデム型質量分析である、請求項１に記載の方法。
  24. 試料中のトランスサイレチンの１種または複数種のアイソフォームのレベルを定量化するために使用するキットであって、配列番号１、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７およびその変異体からなる群から選択される２つ以上の較正標準を含む、キット。
  25. 配列番号１、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択される、ペプチドの少なくとも８個の隣接アミノ酸を有する、１０〜２５アミノ酸長さの合成単離ペプチド。
  26. 前記ペプチドが、１３〜２２アミノ酸長さである、請求項２５に記載のペプチド。
  27. 少なくとも１種類の検出可能な標識をさらに含む、請求項２５に記載のペプチド。
  28. 前記少なくとも１種類の検出可能な標識が、窒素１５、炭素１３およびジュウテリウムからなる群から選択される、請求項２７に記載のペプチド。
  29. 前記少なくとも１種類の検出可能な標識が、バリン、フェニルアラニンおよびプロリンからなる群から選択されるアミノ酸上に位置する、請求項２７に記載のペプチド。
  30. 前記少なくとも１種類の検出可能な標識が、バリン上に位置する、請求項２９に記載のペプチド。
  31. 前記少なくとも１種類の検出可能な標識が、ジュウテリウムである、請求項３０に記載のペプチド。
  32. 前記ジュウテリウムが、バリンのα炭素および／または側鎖炭素上に位置する、請求項３１に記載のペプチド。
  33. 前記少なくとも１種類の検出可能な標識が、バリンおよびフェニルアラニン上に位置する、請求項２９に記載のペプチド。
  34. 前記少なくとも１種類の検出可能な標識が、ジュウテリウムである、請求項３３に記載のペプチド。
  35. 前記ジュウテリウムが、バリンおよびフェニルアラニンのα炭素および／または側鎖炭素上に位置する、請求項３４に記載のペプチド。
  36. 前記少なくとも１種類の検出可能な標識が、バリンおよびプロリン上に位置する、請求項２９に記載のペプチド。
  37. バリン上の前記少なくとも１種類の検出可能な標識がジュウテリウムであり、かつプロリン上の前記少なくとも１種類の検出可能な標識が炭素１３および／または窒素１５である、請求項３６に記載のペプチド。
  38. 前記ジュウテリウムが、バリンのα炭素および／または側鎖炭素上に位置し、前記炭素１３が、プロリンのα炭素および／または側鎖炭素上に位置し、かつ前記窒素１５が、プロリンの窒素上に位置する、請求項３７に記載のペプチド。
  39. 配列ＤＡＶＲＧＳＰＡＩＮＶＡＸＨＶＦ（配列番号２２）を有する、１３〜１８アミノ酸長さの合成単離ペプチドであって、Ｘは、疎水性側鎖を有するアミノ酸である、合成単離ペプチド。
  40. Ｘがバリンまたはメチオニンである、請求項３９に記載のペプチド。
  41. 配列ＳＹＳＴＴＡＶＸＴＮＰＫＥ（配列番号２３）またはＧＳＰＡＩＮＶＡＸＨＶＦＲ（配列番号２４）を有する、１０〜１５アミノ酸長さの合成単離ペプチドであって、Ｘは、疎水性側鎖を有するアミノ酸である、合成単離ペプチド。
  42. Ｘがバリンまたはメチオニンである、請求項４１に記載のペプチド。
  43. 配列ＴＳＥＳＧＥＬＨＧＬＴＸＥＥＥＦＶＥＧＩＹＫ（配列番号２７）を有する、２０〜２５アミノ酸長さの合成単離ペプチドであって、Ｘが、トレオニンまたはアラニンから選択されるアミノ酸である、合成単離ペプチド。
  44. 配列ＹＴＩＡＡＬＬＳＰＹＳＹＳＴＴＡＶＸＴＮＰＫ（配列番号２５）を有する、２０〜２５アミノ酸長さの合成単離ペプチドであって、Ｘが、疎水性側鎖を有するアミノ酸である、合成単離ペプチド。
  45. Ｘがバリンまたはイソロイシンである、請求項４４に記載のペプチド。
  46. 配列ＩＤＴＫＸＹＷＫＡＬＧＩＳＰＦＨＥ（配列番号２６）を有する、１４〜１９アミノ酸長さの合成単離ペプチドであって、Ｘが、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸である、合成単離ペプチド。
  47. Ｘがセリンまたはチロシンである、請求項４６に記載のペプチド。
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