KR100780405B1 - 알파 나선형 펩티드를 이용한 ｒｎａ 특이적 결합 펩티드탐색 방법 - Google Patents

알파 나선형 펩티드를 이용한 ｒｎａ 특이적 결합 펩티드탐색 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알파 나선형 펩티드를 이용하여 RNA에 특이적으로 결합하는 펩티드를 탐색하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 알파 나선형 펩티드를 이용하여 RNA 특이적 결합 펩티드를 탐색하는 방법을 제공함으로써 특정한 모양과 염기서열 RNA에 특이적이며 강력한 결합력을 가진 펩티드를 선별할 수 있고, 선별된 펩티드를 이용하여 RNA의 기능 탐구에도 사용될 수 있고 자연에 존재하는 펩티드보다 강력하고 특이적으로 RNA 표적에 결합하는 인공적인 펩티드를 이용한 신약의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
RNA 표적, 알파 나선 펩티드, 메틸화 라이신, RRE RNA, HIV-1

Description

알파 나선형 펩티드를 이용한 ＲＮＡ 특이적 결합 펩티드 탐색 방법{A Process for screening of a binding peptides specific for specific RNA and RNA binding peptides therefrom}
도 1은 설계된 알파 나선형을 하고 있는 펩티드의 모양을 나타낸 그림이다.
본 발명은 알파 나선형 펩티드를 이용하여 HIV-1의 표적 중의 하나인 RRE RNA에 특이적 결합 펩티드를 탐색하는 방법에 관한 것이다.
인간과 여러 가지 동식물의 게놈사업 완성과 바이오 인포매틱스의 발전으로 인하여 mRNA는 DNA가 가지는 유전적인 정보를 단백질로 전달해 주는 전달자(messenger) 이상의 역할 즉 유전자 발현의 조절기능을 하고 있는 여러 증거가 밝혀지고 있다.
그 중에는 마이크로 RNA(micro RNA, miRNA) 또는 이것의 전구물질인 pre- miRNA가 유전자의 10-20%의 기능을 제어하는 역할을 하는 것이 2000년대 들어 급격하게 알려지고 있다. 원핵세포에서는 mRNA의 일부에 대사체가 직접 결합함으로써 대사체 관련 단백질의 기능을 조절하는 리보스윗치가 발견되었다. 또한, 고등동물의 mRNA의 비번역 부분의 2차 구조 등이 mRNA의 안정성 및 번역의 효율성을 조절하고 있는 것이 밝혀지고 있다.
상기에서 언급한 자연에 존재하는 조절기능을 가진 RNA는 상당한 수로 존재하며 구조적으로 기본 모티프인 스템(stem) 부분과 루프(loop) 부분이 연속적으로 배열되는 헤어핀(hairpin) 구조의 연속으로 구성된다. 자연에 내생하는 miRNA 및 생물학적인 의미를 가진 mRNA 또는 리보스윗치의 화합물 결합부위의 크기를 고려해 보면, 30nt 이하인 특이적인 스템-루프(헤어핀) 구조가 활성부위(pharmacophore)일 가능성이 크게 제시되고 있다.
모든 mRNA가 2차 구조로 되어 있음에도, 지금까지 발굴된 표적 mRNA 헤어핀 구조는 HIV-1의 Rev Response Element (RRE), HIV-1의 trans-activation response element (TAR), 각종 암 세포의 Thymidylate Synthase mRNA, 철 이온의 항상성 및 치매에 관여하는 Ion Responsive Element(IRE) 등 손에 꼽을 정도도로 적은데, 이는 결국 생물학적인 방법론 부재 및 RNA-결합단백질 정보부족, 헤어핀 구조의 정보부족에서 기인한다. 하지만, 상기 구조를 가진 다수의 RNA 표적은 앞으로 표적으로 등장할 가능성이 매우 크며, 이처럼 홍수와도 같은 RNA 표적에 대한 리간드 발굴에 많은 노력을 기울여야 할 시점이다.
종래에 RNA에 잘 결합하는 아미노글리코사이드 화합물을 모방하기 위하여 아 민기가 여러 개 존재하는 폴리아민(Polyamines)을 만들고 상기 폴리아민이 모양을 갖춘 여러 개의 RNA 표적에 결합함을 확인하고(Lawton et al., J. Am. Chem. Soc., 126: 12762-12763, 2004), 자연에 존재하는 RNA결합 단백질에 존재하는 아민기를 가진 아미노산의 메틸화에 따르는 단백질의 모양변화를 관찰하였다(Das and Frankel, Biopolymers, 70: 80-85, 2003). 또한, 자연에 존재하는 여러 가지 RNA 결합 단백질 및 결합 펩티드를 조사해 본 결과 아민기가 많은 라이신 또는 아르기닌이 펩티드에 다수로 포함되어 있었으며, 이들 단백질 또는 펩티드는 메틸화가 많이 진행된 상태였음이 보고되고 있고(Tan and Fankel, Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5282-5286, 1995), RNA 결합 단백질에 존재하는 아르기닌이 메틸화에 따르는 RNA와의 결합력을 조사하여 메틸화가 진행되면 결합력이 증가함을 보고하고 있다(Liu and Dreyfuss, Mol Cell Biol.15, 2800-2808, 1995).
RNA와 아민기를 다수로 포함하는 펩티드의 결합 가능성 또는 아민기의 메틸화에 따른 결합력을 보고한 예 및 특이적인 RNA에 결합하는 자연 펩티드 및 펩티드 메틸화에 대한 보고는 많이 있으나, 인공적인 펩티드 및 메틸화된 펩티드의 특정한 RNA 결합은 보고되고 있지 않다. 이에 본 발명자는 RNA에 특이적으로 결합하는 펩티드를 획득하기 위하여, 알파 나선형인 라이신이 7개 함유된 15개의 아미노산으로 구성되는 펩티드를 제조하는 한편, 상기 펩티드의 다양성을 확보하기 위하여 메틸화된 라이신을 조합적으로 사용하여 라이브러리를 제조하고, 상기 라이브러리로부터 합성된 각각의 펩티드 중 HIV-1의 RRE RNA에 가장 강력하게 결합하는 펩티드를 선별함으로써 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 펩티드는 RRE RNA에 강력하게 결합 할 뿐만 아니라, 특이적으로 결합함을 확인함으로써 강력한 AIDS 치료제로 사용될 것이다.
본 발명의 목적은 인공적으로 제조된 알파 나선형 펩티드를 이용하여 RNA 특이적 결합 펩티드를 탐색하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인공적으로 제조된 알파 나선형 펩티드를 이용하여 RNA 특이적 결합 펩티드를 탐색하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 복수의 염기성 아미노산을 포함하는 합성 알파 나선형 펩티드 또는 상기 합성 알파 나선형 펩티드의 상기 염기성 아미노산 중 하나 이상이 메틸화된 변형 알파 나선형 펩티드를 포함하는 알파 나선형 펩티드 라이브러리를 제공한다. 상기 염기성 아미노산은 이에 제한되는 것은 아니지만, 라이신, 아르기닌, 히스티딘 또는 5-히드록시 라이신인 것을 특징한다. 상기 합성 알파 나선형 펩티드는 안정한 2차 구조인 나선형을 갖기 위하여 적어도 14-150개 이상 소수성을 가진 아미노산과 아민기를 가진 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 한다. 상기 합성 알파 나선형 펩티드는 상기 염기성 아미노산이 나선형 펩티드의 일측면에 나란히 배열되도록 상기 염기성 아미노산이 상기 합성 알파 나선형 펩티드 서열의 매 3번째 혹은 매 4번째 아미노산 위치에 배열하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 알파 나선형 펩티드 라이브러리를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 45 중 하나 이상의 알파 나선형 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 알파 나선형 펩티드 라이브러리를 제공한다.
본 발명은 상기 알파 나선형 펩티드 라이브러리를 이용하여 RNA 특이적 결합 펩티드를 탐색하는 방법을 제공한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 알파 나선형 펩티드 라이브러리를 이용하여 RNA 특이적 결합 펩티드를 탐색하는 방법을 제공한다:
(i) 알파 나선형 펩티드 라이브러리를 제조하고 펩티드를 정제하는 단계;
(ii) 결합하고자 하는 특정 RNA를 합성하는 단계;
(iii) 펩티드, 특정 RNA 및 탐침 분자를 혼합하여 형광광도계로 형광이등방성을 측정하여 RNA와 펩티드의 결합강도를 산출하는 단계; 및
(iv) 특정 RNA에 대해 결합력이 강한 펩티드를 선택하는 단계.
상기 특정 RNA는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 실시예에서는 HIV-1의 RRE RNA를 이용하였다. 상기 탐침 분자는 결합 펩티드와 경쟁하여 RNA에 결합할 수 있는 형광광도계에서 검출할 수 있는 태그로 표지되어 있는 화합물은 모두 가능하며, 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, CRP(5- carboxytetramethylrhodamine labeled paromomycin)인 것이 바람직하다.
본 발명은 알파 나선형 펩티드 라이브러리를 이용하여 RNA 특이적 결합 펩티드를 탐색하는 방법에 의해 탐색된 특정 RNA에 특이적 결합 펩티드를 제공한다.
본 발명은 알파 나선형 펩티드 라이브러리를 이용하여 RNA 특이적 결합 펩티드를 탐색하는 방법에 의해 탐색된 서열번호 1, 3, 7, 16, 18, 25 또는 33으로 기재되는 RRE RNA와 결합하는 펩티드 또는 상기 펩티드의 유사체를 제공한다. 상기 펩티드의 유사체는 염기성 아미노산이 아르기닌, 히스티딘 또는 5-히드록시 라이신으로 치환되거나, 염기성 아미노산을 제외한 소수성 아미노산이 다른 소수성 아미노산으로 치환된 기능적으로 동등한 펩티드를 의미한다.
본 발명은 알파 나선형 펩티드 라이브러리를 이용하여 RNA 특이적 결합 펩티드를 탐색하는 방법에 의해 탐색된 측정 RNA에 특이적 결합 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 RNA 활성 저해제를 제공한다.
본 발명은 알파 나선형 펩티드 라이브러리를 이용하여 RNA 특이적 결합 펩티드를 탐색하는 방법에 의해 탐색된 서열번호 1, 3, 7, 16, 18, 25 또는 33으로 기재되는 RRE RNA와 결합하는 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 AIDS 치료제를 제공한다.
다양한 화합물이 여러 단백질의 구조를 구별하여 약으로 쓰이고 있다는 사실은 적어도 다양성에 있어서 화합물이 단백질을 능가할 수 있음을 보여주고 있으며, 단백질보다도 다양하지 않은 RNA 구조는 이론적으로는 다양한 화합물에 의하여 비 교적 쉽게 구분될 수 있을 가능성이 크다.
RNA 결합 펩티드의 대표적인 물질로서 아미노글리코사이드 종류가 대표적이며, 이들은 6각형의 당이 3-4개 이어진 형태이며 6-7개의 아민 작용기가 있는 것이 특징이다. 아미노글리코사이드는 비록 자연이 만든 RNA 결합 물질이기는 하지만, 특이성이 좋지 못한 단점이 있으며, RNA를 표적으로 한 신약의 개발을 위해서는 이와 같은 특이성 있는 RNA 결합 펩티드를 창출해야만 한다.
자연에 존재하는 RNA 결합 펩티드가 많이 연구된 바 있으며 대부분의 펩티드가 알파 나선형을 하며, 아민기를 가진 아르기닌/라이신 등을 다수로 함유하고 있는 것이 많다.
인공적인 RNA 결합 펩티드를 합성하기 위한 설계에도 이 점을 이용하여 많은 개수의 라이신을 포함한 펩티드를 설계할 수 있으며, 펩티드가 적어도 안정한 2차 구조인 나선형을 갖기 위하여 적어도 14-150개 이상의 아미노산으로 구성된 펩티드를 구성하면 RNA에 특이적으로 잘 결합할 수 있다. 아민기를 나선형 펩티드의 한 면으로 모으기 위해서 라이신을 한 번 또는 두 번 걸러 2개씩 넣은 펩티드(LKKLLKLLKKLLKLKG) 등을 설계할 수 있다. 본 발명은 상기 서열에 한정되는 것이 아니며, 알파 나선을 형성하며 상기 염기성 아미노산의 위치를 제외한 서열이 다른 어떤 소수성 아미노산으로 치환되더라도 헬릭스가 구성될 수 있다면 모두 적용 가능하다.
하지만, 이와 같은 라이신 및 아르기닌만을 가지고 RNA에 특이적으로 결합하는 펩티드를 도출하기에는 펩티드의 다양성에 미흡한 점이 있다. 상기 펩티드를 다 양화하여, 여러 가지 종류의 펩티드를 제조하고 이 펩티드를 특정 표적 RNA에 대한 검색과정을 거쳐 가장 특이적인 펩티드를 골라내는 방법을 사용하면, RNA 특이적 리간드를 도출할 수 있다.
라이신 또는 아르기닌과 같은 염기성 아미노산의 메틸화가 RNA와의 결합력의 증진을 가지고 온다는 결과들이 많이 있음을 감안하면, 메틸화된 라이신/아르기닌을 가진 펩티드가 RNA와 특이적인 결합을 할 가능성이 크다. 라이신을 이용하여 펩티드를 만드는 대신에 라이신 끝 아민에 메틸화된 라이신을 이용하여 펩티드를 만들어 펩티드의 다양성이 크게 늘어난다. 라이신의 메틸화는 3가지의 가능성(모노, 다이, 트라이)을 가지고 있으므로, 상기 9개의 라이신에 각각 메틸화되지 않은 것을 포함한 모든 가능성을 넣으면 49= 262,000여 개의 다양성을 가진 펩티드 라이브러리를 제조할 수 있고, 이처럼 다양한 펩티드 라이브러리를 제조하고 이를 이용하여 특이 RNA 분자에 대한 펩티드를 선택하여, 특이적 RNA 리간드를 얻게 됨을 확인하였다.
본 발명의 실시예에서는 라이신 및 메틸화된 라이신(mono-, di- 또는 tri-methylated lysine)을 이용하여 262,000여 개의 펩티드 라이브러리를 합성하는 대신에 라이신 및 두 개의 메틸기가 붙은 라이신을 이용하여 9 개의 라이신 위치에 라이신 및 디메틸화 라이신을 사용하여 29 = 512 개의 펩티드 라이브러리를 부분적으로 합성한 실험과 상기 라이브러리를 특이적 HIV-1의 RRE RNA에 스크리닝하여 가장 결합력이 강한 펩티드를 선택한 검색한 실험으로 구성된다.
본 발명의 실시예에서는 메틸화된 라이신을 사용하면 다양한 모양의 펩티드 가 만들어질 수 있으며, 이들 펩티드는 의외로 그 특이성이 많이 달라 RRE RNA에 결합하는 특이적인 펩티드를 찾을 수 있다. 결합력의 정도는 나노 몰라보다 낮은 수준이며, 지금까지 잘 알려진 네오마이신에 비하면 결합력이 무려 1,000배 이상의 증가를 가져왔다. 네오마이신의 결합력이 비교적 강한 것으로 알려져 있으므로, 이와 같은 펩티드들은 잠재적인 신약으로 진화할 수 있는 가능성이 매우 크다.
펩티드 16(서열번호 16)의 자세한 특이성에 대한 조사는 본 발명에서 실시하지는 않았으나, 스템-루프를 가지는 일반적인 펩티드인 TAR RNA 및 tRNA에 대한 결합력을 실험 한 결과(fluorescence anisotropy 방법), 이들에는 수백-수십 마이크로몰 정도의 나쁜 결합력을 보이고 있음을 감안하면, 펩티드 16(서열번호 16)과 RRE RNA와의 결합력은 상당한 특이성을 가진 것으로 보인다.
따라서, 본 발명에선 이처럼 메틸화된 라이신을 이용한 펩티드 라이브러리를 제조하고 표적 RNA에 대해 결합력이 강한 펩티드를 선택함으로써, RNA 표적에 대한 특이적인 리간드를 도출하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 펩티드 라이브러리의 합성
Fmoc-라이신, Fmoc-디메텔화 라이신, 루신 등은 모두 Novagen(USA)에서 구입 하여 사용하였다. 모든 펩티드는 0.25μM 스케일로 LKKLLKLLKKLLKLKG의 아미노산 서열을 가진 펩티드의 합성을 시도했다. 고체상 펩티드 합성방법으로 Rink Amide MBHA 레진(novabiochem, Germany) 100mg(0.064mmol)을 용기에 담고, 1㎖의 염화메틸렌(methylene chloride)을 넣고 5 분간 부풀렸다. DMF(dimethylformamide) 1㎖를 넣어 5 분간 부풀렸다. 레진(Resin)을 1㎖의 20% piperidine(in DMF)으로 5분 간(3회 반복) 탈보호(deprotection)한 후, DMF 1㎖로 다섯 번 세척하였다. 6 당량의 Fmoc이 탈보호기된 아미노산과 PyBop[(benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate] 6당량(198mg), DIPEA(diisopropylethylamine) 12당량(133㎕)을 첨가한 용액을 2시간 동안 흔들었다. 반응이 완결된 후, DMF 1㎖로 세 번 세척하였다. 아마이드 결합 반응의 완료 여부는 Kaiser 시험(닌히드린 에탄올 100mL에 5g, 20㎖ 에탄올에 80g 액화 페놀 및 포타슘 시아나이드 2㎖ 0.001M 수성 용액을 98㎖ pyridine에 첨가한 용액의 각 각을 샘플에 3방울씩 떨어뜨리고 100℃에서 5 분간 가열하고 무색이면 반응이 완결된 것으로 봄)을 통하여 확인하였다. 한 사이클의 아마이드 결합 반응이 완결되면 이와 같은 작업을 16번 반복하여 16머-펩티드를 합성하였다. 마지막 커플링(coupling)이 끝난 후, 레진은 DMF 1㎖와 메탄올 1㎖ 각각 3차례씩 세척하였다. 그 후 레진을 진공에서 잘 말렸다. 고체상 펩티드 합성법에 의해 합성된 펩티드가 달려있는 레진 200mg을 절단 용액(cleavage solution)[2.5% TIS (triisopropylsilane), 2.5% 물, 95% TFA(trifluoroacetic acid)] 5㎖에 넣고 2 시간 동안 교반하였다. 레진을 여과하여 얻은 용액에 질소를 이용해 과량의 TFA를 제 거한 후, 0℃로 미리 냉각시켜 둔 (n-hexane: diethyl ether = 1:1) 용액 50mL 첨가하여 합성된 펩티드를 용출시켰다. 용출된 펩티드를 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide)에 녹여 C18 컬럼을 사용해 HPLC로 정제하였다. HPLC 용매로는 0.1% TFA가 첨가된 물과 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하였다.
< 실시예 2> 펩티드 정제
정제되지 않은 펩티드를 약 10 mg/㎖ 농도로 디메틸설폭시드에 녹여 한번에 100 ㎕씩 HPLC에 주입하였고 10%의 아세토니트릴로부터 45%의 아세토니트릴까지 40 분 동안 용매의 조성을 변화시켜 펩티드를 정제하였다. 이때의 유속은 4㎖/min이고 검출된 파장은 220nm였다. 펩티드는 20-30 분대에서 분리 회수되었다. 회수된 펩티드 용액은 감압하여 아세토니트릴을 증발시키고 동결 건조하였다. 합성된 펩티드는 MULDI-TOF 질량분석기(Mass spectrometry)로 분자량을 측정하여 동정하였다.
< 실시예 2-1> 펩티드1 ~45의 합성 및 분자량
LKKLLKLLKKLLKLKG (펩티드 1: 서얼번호 1)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1877.5 (calcd.), 1877.2 (obsvd.).
LK*KLLKLLKKLLKLKG (펩티드 2: 서열번호 2)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1905.6 (calcd.), 1905.6 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKK*LLKLLKKLLKLKG (펩티드 3: 서열번호 3)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1905.6 (calcd.), 1905.3 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLK*LLKKLLKLKG (펩티드 4: 서열번호 4)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1905.6 (calcd.), 1905.4 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLKLLK*KLLKLKG (펩티드 5: 서열번호 5)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1905.6 (calcd.), 1905.4 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLKLLKK*LLKLKG (펩티드 6: 서열번호 6)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1905.6 (calcd.), 1905.5 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLKLLKKLLK*LKG (펩티드 7: 서열번호 7)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1905.6 (calcd.), 1905.5 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLKLLKKLLKLK*G (펩티드 8: 서열번호 8)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1905.6 (calcd.), 1905.3 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*K*LLKLLKKLLKLKG (펩티드 9: 서열번호 9)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.1 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLK*LLKKLLKLKG (펩티드 10: 서열번호 10)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1932.1 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLKLLK*KLLKLKG (펩티드 11: 서열번호 11)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1932.1 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLKLLKK*LLKLKG (펩티드 12: 서열번호 12)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1932.1 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLKLLKKLLK*LKG (펩티드 13: 서열번호 13)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1932.1 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLKLLKKLLKLK*G (펩티드 14: 서열번호 14)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.5 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKK*LLK*LLKKLLKLKG (펩티드 15: 서열번호 15)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.4 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKK*LLKLLK*KLLKLKG (펩티드 16: 서열번호 16)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.4 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKK*LLKLLKK*LLKLKG (펩티드 17: 서열번호 17)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.2 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKK*LLKLLKKLLK*LKG (펩티드 18: 서열번호 18)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.3 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKK*LLKLLKKLLKLK*G (펩티드 19: 서열번호 19)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.7 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLK*LLK*KLLKLKG (펩티드 20: 서열번호 20)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.8 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLK*LLKK*LLKLKG (펩티드 21: 서열번호 21)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.7 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLK*LLKKLLK*LKG (펩티드 22: 서열번호 22)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.5 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLK*LLKKLLKLK*G (펩티드 23: 서열번호 23)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.5 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLKLLK*K*LLKLKG (펩티드 24: 서열번호 24)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.3 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLKLLK*KLLK*LKG (펩티드 25: 서열번호 25)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.6 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLKLLK*KLLKLK*G (펩티드 26: 서열번호 26)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1932.6 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLKLLKK*LLK*LKG (펩티드 27: 서열번호 27)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.6 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLKLLKK*LLKLK*G (펩티드 28: 서열번호 28)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1934.1 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLKLLKKLLK*LK*G (펩티드 29: 서열번호 29)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1933.6 (calcd.), 1933.5 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLK*LLK*KLLKLKG (펩티드 30: 서열번호 30)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1961.7 (calcd.), 1961.4 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLK*LLKKLLK*LKG (펩티드 31: 서열번호 31)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1961.7 (calcd.), 1961.5 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLK*LLKKLLKLK*G (펩티드 32: 서열번호 32)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1961.7 (calcd.), 1961.4 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLKLLK*KLLK*LKG (펩티드 33: 서열번호 33)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1961.7 (calcd.), 1961.4 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLKLLK*KLLKLK*G (펩티드 34: 서열번호 34)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1961.7 (calcd.), 1961.2 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLKLLKKLLK*LK*G (펩티드 35: 서열번호 35)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1961.7 (calcd.), 1961.6 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLK*LLKK*LLK*LKG (펩티드 36: 서열번호 36)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1961.7 (calcd.), 1961.8 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLK*LLKK*LLKLK*G (펩티드 37: 서열번호 37)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1961.7 (calcd.), 1961.5 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLK*LLKKLLK*LK*G (펩티드 38: 서열번호 38)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1961.7 (calcd.), 1961.7 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLKLLK*KLLK*LK*G (펩티드 39: 서열번호 39)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1961.7 (calcd.), 1961.5 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLK*LLKK*LLK*LKG (펩티드 40: 서열번호 40)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1989.8 (calcd.), 1989.6 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLKLLKK*LLK*LK*G (펩티드 41: 서열번호 41)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1989.8 (calcd.), 1989.1 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLK*LLKKLLK*LK*G (펩티드 42: 서열번호 42)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1989.8 (calcd.), 1989.0 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLK*LLK*KLLKLK*G (펩티드 43: 서열번호 43)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1989.8 (calcd.), 1989.9 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LKKLLK*LLK*KLLK*LK*G (펩티드 44: 서열번호 44)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 1989.8 (calcd.), 1989.6 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
LK*KLLK*LLK*KLLK*LK*G (펩티드 45: 서열번호 45)를 위 방법으로 합성하였다. Mass (M+H); 2017.9 (calcd.), 2017.9 (obsvd.) K*는 dimethylated 라이신임.
< 실시예 3> HIV -1의 RRE RNA 준비
T7 프로모터가 붙어있는 단일 가닥(single-stranded) RRE DNA(센스: 5'-CCg TAA TAC gAC TCA CTA TAg gTg ggC gCA gCT TCg gCT gAC ggT ACA CC-3', 안티센스: 5'-ggT gTA CCg TCA gCC gAA gCT gCg CCC ACC TAT AgT gAg TCg TAT TAC gg-3')를 이중 가닥(double-stranded) DNA로 만들기 위하여 RRE 센스 DNA가닥과 RRE 안티센스 DNA가닥을 각각 100pmol씩 섞어 95℃에서 5분 반응시킨 후 상온에서 서서히 식혀주었다.
전사반응은 이중 가닥 RRE DNA 100pmol, 20㎕의 5X 완충액(200mM Tris-Cl, (pH7.5), 10mM spermidin, 30mM MgCl2, 25mM NaCl), 10㎕의 100mM DTT(dithiothreitol), 20㎕의 2.5mM NTP(ribonucleoside triphosphate) mix, 및 5㎕의 T7 RNA 중합효소를 이용했다. 상기 혼합용액을 37℃에서 4 시간 반응시킨 후, 1㎕의 RQ1 RNase-free DNase(1 unit/㎕)(PROMEGA, USA)를 첨가하여 1 시간 동안 동일 조건에서 반응시켰다. 이후 동량의 페놀 혼합물(Phenol: Chloroform:Isoamyl alcohol = 25:24:1)을 이용하여 단백질을 제거한 후, -70℃에서 1 시간 에탄올을 이용하여 침전시켰다. 이후 7M의 UREA가 포함된 15% 변성(denaturation) PAGE 겔에 적재하여 30-머의 정확한 크기의 밴드만 잘라서 500㎕의 용리(elution) 완충액 (0.5M ammonium acetate, 1mM EDTA, 0.2% SDS, pH 8.0)이 든 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 넣고 37℃에서 4 시간 동안 방치한 후, 용액만 새 에펜도르프 튜브로 옮겨서 위와 같은 방법으로 페놀 추출(phenol extraction)하였다. RNA는 들어있는 수용액 층을 에탄올에 의해 다시 한번 침전시킨 후 얻은 RNA를 UV로 정량했다.
< 실시예 4> RRE RNA 에 대한 펩티드의 결합력 측정
RRE RNA는 10mM의 농도로 100㎖를 준비하여 65℃에서 10분 방치한 후 상온에서 서서히 식혀 주어 폴딩(folding)이 되도록 했다. 펩티드는 각각 100mM과 1.0mM의 농도로 준비하였으며 0℃를 유지했다. 탐침 분자로는 10mM CRP(5-carboxytetramethylrhodamine labeled paromomycin)를 준비했으며, 완충용액은 140mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl2, 20mM HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-Ethanesulfonic Acid, pH 7.4)의 조성으로 준비했다. 형광이등방성(Fluorescence Anisotropy)은 AMINCO-Bowman Series 형광광도계(Luminescence Spectrometer)를 이용하여 20℃에서 측정하였다. 완충용액 450mL에 CRP를 10nM이 되도록 넣은 후 RRE RNA를 넣어주어 CRP와 RNA를 결합시켰다. 이때의 이등방성(anisotropy) 값은 증가하게 된다. 이후에 CRP와 경쟁적으로 결합하는 펩티드를 넣어주면서 이방성 값의 변화를 측정하였다. RRE RNA와 펩티드의 결합의 세기는 다음과 같이 KaleidaGraph에 의하여 정했다.
[Peptide] = Kd(Amax - A)/[Kd(A - A0) + 1]*[RNA] - Kd(A - A0)/(Amax - A) [CRP]0(A - A0)/(Amax - A0)
[Peptide]는 펩티드의 농도를 나타내고, [RNA]는 RNA의 농도를, [CRP]는 CRP의 농도를 의미한다. A는 샘플의 형광이방성 값이며, Amax는 전체 결합한 추적자(totally bound tracer)의 값이고, A0는 전체 자유 추적자(totally free tracer)의 값을 나타낸다.
정해진 펩티드들의 RRE RNA에 대한 결합력 (Kd)은 다음과 같이 나타났다:
펩티드 1, 0.0058μM; 펩티드 2, 0.20μM; 펩티드 3, 0.16μM;
펩티드 4, 0.28μM; 펩티드 5, 0.34μM; 펩티드 6, 0.16μM;
펩티드 7, 0.24μM; 펩티드 8, 0.54μM; 펩티드 9, 0.32μM;
펩티드 10, 0.16μM; 펩티드 11, 0.16μM; 펩티드 12, 0.16μM;
펩티드 13, 0.18μM; 펩티드 14, 0.19μM; 펩티드 15, 0.17μM;
펩티드 16, 0.00052μM; 펩티드 17, 0.19μM; 펩티드 18, 0.042μM;
펩티드 19, 0.19μM; 펩티드 20, 0.23μM; 펩티드 21, 0.29μM;
펩티드 22, 0.23μM; 펩티드 23, 0.40μM; 펩티드 24, 0.32μM;
펩티드 25, 0.039μM; 펩티드 26, 0.23μM; 펩티드 27, 0.32μM;
펩티드 28, 0.33μM; 펩티드 29, 0.18μM; 펩티드 30, 0.17μM;
펩티드 31, 0.19μM; 펩티드 32, 0.23μM; 펩티드 33, 0.044μM;
펩티드 34, 0.18μM; 펩티드 35, 0.32μM; 펩티드 36, 0.44μM;
펩티드 37, 0.20μM; 펩티드 38, 0.23μM; 펩티드 39, 0.16μM;
펩티드 40, 0.20μM; 펩티드 41, 0.24μM; 펩티드 42, 0.19μM; 및
펩티드 43, 0.40μM; 펩티드 44, 0.20μM; 펩티드 45, 0.17μM.
위의 실험으로 RRE RNA에 1nM 보다 센 결합력을 가진 펩티드 16(서열번호 16)을 발견하게 되었으며, 이에 버금가는 강도를 가진 펩티드 다수를 발견하였다.
< 실시예 5> 선택된 펩티드의 원평이색성 ( circular dichroism , CD ) 측정
CD는 20℃에서 JASCO model J715 분광편광계(spectropolarimeter)를 이용하여 측정했다. 190-260nm 파장대를 1 nm의 bandwidth, 0.5 nm의 datapitch, 100 nm/min의 속도로 3번의 스캐닝(scanning)을 평균하여 CD 데이터를 얻었다. 스펙트럼은 배경 스펙트럼을 측정하여 보정하였으며, CD 신호를 평균잔기 타원율(mean residue ellipticity), [Q]로 변조하여 기록하였다. 알파 나선의 백분율(fn)은 다음 식으로 나타낼 수 있다.
[Q] = Qobs[MRW/(10lc)]
MRW = 평균 잔기 질량(mean residue weight)(분자량을 펩티드 결합의 수로 나눈 것, l= 경로 길이(cm), c= 농도(mg/mL).
fn = ([Q]222-[Q]coil)/([Q]helix-[Q]coil)
[Q]helix = -40,000(1-2.5n) + 100t
[Q]coil = 640 - 45t
[Q]222 =222 nm에서 평균잔기 타원율(deg cm2mol-1), [Q]helix = 펩티드의 완전 나선 형태의 타원율, [Q]coil = 펩티드의 완전 무작위 코일 형태의 타원율, n = 아미 노산의 수, t = 섭씨 온도.
강한 결합력을 보이는 7 개의 펩티드에 대한 알파 나선 정도를 조사한 결과는 다음과 같았으며 괄호 안의 숫자는 Rev 펩티드(RRE RNA의 자연에서의 결합 펩티드)와의 비교를 나타낸 것이다.
펩티드 1, 15 (2.2); 펩티드 7, 2.7 (0.40); 펩티드 3, 4.9 (0.72); 펩티드 25, 6.6 (1.0); 펩티드 18, 4.9 (0.71); 펩티드 16, 13 (2.0); 펩티드 33, 7.5 (1.1).
상기 결과를 볼 때, 펩티드 1을 제외하고는 펩티드 16이 가장 높은 알파 나선 구조 백분율을 보이고 있으므로, 알파 나선의 구조가 많을수록 펩티드의 모양이 안정화되어 RRE RNA와 특이적인 결합을 보이고 있음을 알 수 있다. 메틸화의 정도가 너무 증가한 곳에서는 오히려 강하지 않은 결합을 보임을 감안하면, 라이신의 메틸화된 펩티드와 RNA의 염기 사이의 인식이 상당히 특이적인 것으로 해석할 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 알파 나선형 펩티드를 이용하여 RNA 특이적 결합 펩티드를 탐색하는 방법을 제공함으로써 특정한 모양과 염기서열 RNA에 특이적이며 강력한 결합력을 가진 펩티드를 선별할 수 있고, 선별된 펩티드를 이용하여 RNA의 기능 탐구에도 사용될 수 있고 또한, 자연에 존재하는 펩티드보다 강력하고 특이적으로 RNA 표적에 결합하는 인공적인 펩티드를 이용한 신약의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

  1. 라이신, 아르기닌, 히스티딘 및 5-히드록시라이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기성 아미노산이 알파 나선형 펩티드의 일측면에 나란히 배열되도록 상기 염기성 아미노산이 상기 알파 나선형 펩티드 서열의 매 3번째 또는 매 4번째 아미노산 위치에 배열된 합성 알파 나선형 펩티드 또는 상기 합성 알파 나선형 펩티드의 상기 염기성 아미노산 중 하나 이상이 메틸화된 변형 알파 나선형 펩티드를 포함하는 알파 나선형 펩티드 라이브러리.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 메틸화는 모노, 다이 또는 트라이 메틸화인 것을 특징으로 하는 알파 나선형 펩티드 라이브러리.
  4. 제 1항에 있어서, 합성 알파 나선형 펩티드는 안정한 2차 구조인 나선형을 갖기 위하여 14-150개의 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 알파 나선형 펩티드 라이브러리.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 합성 알파 나선형 펩티드는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 알파 나선형 펩티드 라이브러리.
  7. 제 1항에 있어서, 서열번호 1 내지 45로 기재되는 펩티드 중 하나 이상의 알파 나선형 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 알파 나선형 펩티드 라이브러리.
  8. (i) 제 1항의 알파 나선형 펩티드 라이브러리를 제조하고 펩티드를 정제하는 단계;
    (ii) 결합하고자 하는 특정 RNA를 합성하는 단계;
    (iii) 상기 펩티드, 특정 RNA 및 탐침 분자를 혼합하여 형광광도계로 형광이방성을 측정하여 RNA와 펩티드의 결합강도를 산출하는 단계; 및
    (iv) 특정 RNA에 대해 결합력이 강한 펩티드를 선택하는 단계를 포함하는 제 1항의 알파 나선형 펩티드 라이브러리를 이용하여 상기 특정 RNA에 특이적으로 결합하는 펩티드를 탐색하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제 8항에 있어서, 특정 RNA는 HIV-1의 RRE RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 탐침 분자는 CRP(5-carboxytetramethylrhodamine labeled paromomycin)인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 삭제
  13. 제 10항의 방법에 의해 탐색된, RRE RNA와 결합하며 서열번호 1, 3, 7, 16, 18 25 및 33으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
  14. 제 10항의 방법에 의해 선별된 서열번호 16으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 RRE RNA와 결합하는 펩티드.
  15. 제 13 또는 제14항의 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 RNA 활성 저해제.
  16. 제 13항 또는 제 14항의 펩티드 또는 상기 펩티드의 유사체를 유효 성분으로 포함하는 AIDS 치료제.
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