KR100682336B1 - Ｒｎａ 표적 분자에 대해 특이성이 향상된 헤테로 이합체및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 RNA 표적 분자에 대해 특이성이 향상된 헤테로 이합체 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 RNA 표적 분자에 보다 잘 결합할 수 있도록 기존의 스템(stem) 특이적인 화합물과 루프(loop) 특이적인 화합물을 공유결합으로 연결하여 제조한 헤테로 이합체 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 헤테로 이합체는 RNA의 스템과 루프를 동시에 인식하여 우수한 특이성을 나타내기 때문에 RNA-단백질 간 결합을 차단하는 저해제로서 약의 효능을 증진시킬 수 있으며 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항암제 등으로 사용될 수 있고, 더 나아가서는 RNA 기능 연구, 신약 개발 등에도 유용하게 이용될 수 있다.

헤테로 이합체, 아미노글리코사이드, 클로람페니콜, 리네졸리드

Description

ＲＮＡ 표적 분자에 대해 특이성이 향상된 헤테로 이합체 및 그의 제조방법{Heterodimeric conjugates having an enhanced specificity against RNA targets and method for preparing thereof}

도 1은 고체상에 존재하는 RNA와 형광 탐침분자를 이용한 헤테로 이합체의 결합상수 결정 개념도를 나타낸 것이다.

도 2는 RRE RNA의 풋프린팅 결과에 대한 방사능 사진을 나타낸 것이다.

(레인 1, intact RRE; 레인 2, 컨트롤 알칼라인 하이드롤리시스; 레인 3~12 0.01 unit RNase V1, RRE 500 nM 포함; 레인 3, RNase V1 control; 레인 4, 500 nM 네오마이신; 레인 5, 5 μM 네오마이신; 레인 6, 50 μM 네오마이신; 레인 7, 500 nM NC2; 레인 8, 5 μM NC2; 레인 9, 50 μM NC2; 레인 10, 500 nM NL; 레인 11, 5 μM NL; 레인 12, 50 μM NL; 레인 13~22 0.1 ㎍/ml RNase A 포함; 레인 13, RNase A 컨트롤; 레인 14, 500 nM 네오마이신; 레인 15, 5 μM 네오마이신; 레인 16, 50 μM 네오마이신; 레인 17, 500 nM NC2; 레인 18, 5 μM NC2; 레인 19, 50 μM NC2; 레인 20, 500 nM NL; 레인 21, 5 μM NL; 레인 22, 50 μM NL)

도 3은 TAR RNA의 풋프린팅 결과에 대한 방사능 사진을 나타낸 것이다.

(레인 1, intact TAR; 레인 2, 컨트롤 알칼라인 하이드롤리시스; 레인 3~12 0.1 unit RNase T1, TAR 500 nM 포함; 레인 3, RNase T1 컨트롤; 레인 4, 500 nM 네오마이신; 레인 5, 5 μM 네오마이신; 레인 6, 50 μM 네오마이신; 레인 7, 500 nM NC2; 레인 8, 5 μM NC2; 레인 9, 50 μM NC2; 레인 10, 500 nM NL; 레인 11, 5 μM NL; 레인 12, 50 μM NL; 레인 13~22 0.1 ㎍/ml RNase A 포함; 레인 13, RNase A 컨트롤; 레인 14, 500 nM 네오마이신; 레인 15, 5 μM; 레인 16, 50 μM 네오마이신; 레인 17, 500 nM NC2; 레인 18, 5 μM NC2; 레인 19, 50 μM NC2; 레인 20, 500 nM NL; 레인 21, 5 μM NL; 레인 22, 50 μM NL)

도 4 및 5는 헤테로 이합체(실시예 1-2)의 존재하에서 RNA의 분할(cleavage)에 대한 반응성을 나타낸 것이다.

(4a, RRE, Neo, RNAse A; 4b, RRE, NC2, RNAse A; 4c, RRE, Neo, RNAse V1; 4d, RRE, NC2, RNAse V1; 4e, TAR, Neo, RNAse A; 4f, TAR, NC2, RNAse A; 4g, TAR, NL, RNAse A; 4h, TAR, Neo, RNAse T1; 4i, TAR, NC2, RNAse T1; 4j, TAR, NL, RNAse T1)

본 발명은 RNA 표적 분자에 대해 특이성이 향상된 헤테로 이합체 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 RNA 표적 분자에 보다 잘 결합할 수 있도록 기존의 스템(stem) 특이적인 화합물과 루프(loop) 특이적인 화합물을 공유결합으로 연결하여 제조한 헤테로 이합체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로하는 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항암제에 관한 것이다.

일반적으로, 대부분의 약물은 유전자의 마지막 산물인 단백질을 표적 분자로 사용한다. 그러나, 유전체(genome)의 산물 중 하나인 RNA 분자가 약물의 표적이 될 수 있다는 것이 밝혀지면서, RNA에 작용할 수 있는 안티센스(anti-sense) 형태의 약물에 대한 관심이 높아지고 있다. 특히 RNA는 mRNA의 비번역 부위(untranslated region)에서 발견되는 2차 구조에 의하여 mRNA의 안정성, 번역의 효율성 및 mRNA의 위치선정에 중요한 영향을 받는다는 것이 밝혀지면서, 이와 같은 RNA의 2차 구조가 약물의 표적이 될 가능성이 높아졌다. 이러한 이유로, 현재 5∼10%의 약물이 RNA 또는 DNA를 표적으로 하고 있으며, 이와 같은 뉴클레오타이드에 작용하는 약물은 계속 늘어날 전망이다.

상기의 구조화된 mRNA는 2차 구조 또는 3차원적인 모양을 하고 있으며, RNA 결합 단백질에 의하여 인식되어 여러 가지 조절 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 지금까지 알려진 RNA 표적의 2차 구조는 모두 스템(stem)과 루프(loop)로 구성된 헤어핀(hairpin) 구조로 되어 있는데, RNA 결합 단백질들이 이들의 길이와 염기서열을 인지하여 특정한 RNA에 결합함으로써 생리학적인 현상을 일으키는 것으로 추정된다. 따라서, RNA의 2차 구조나 RNA 결합 단백질 모두 약물의 좋은 표적으로서 이용될 수 있으며, 이들 RNA와 단백질 간의 인식을 인위적으로 저해시켜 약효를 나타내게 된다. 그러나, 상기한 잇점에도 불구하고 이와 같은 RNA의 스템(stem)과 루프(loop)의 2중 구조에 특이적인 화합물의 부재로 그동안 RNA를 표적으로 한 의약품 연구에 어려움을 겪어왔다.

실제적으로, RNA-단백질 복합체에 작용하는 약에 대한 연구는 그리 많이 되어있지 않지만 rRNA에 작용하는 여러 가지 약물과 리보솜(ribosome) 자체의 3차 구조에 작용하는 약물이 최근 선진 연구진에 의하여 밝혀졌다(Targeting RNA: New opportunities to address drugless targets. Zaman GJ, Michiels PJ, van Boeckel CA, Drug Discov Today. 2003 Apr 1; 8(7):297-306). 이러한 연구 결과는 RNA가 단백질보다 오히려 좋은 표적분자가 될 수 있음을 시사하고 있다.

현재, RNA에 결합하는 화합물의 종류는 그리 많지는 않으나, 아미노글리코사이드(aminoglycoside)와 같이 rRNA에 작용하여 병원체를 제압하는 항생물질이 여러 종류가 존재하는 것으로 알려졌다. 아미노글리코사이드라는 일반명을 가진 항생제는 원래는 천연물로 존재했으나, 현재는 여러 가지 형태의 유도체들로 개발되어 왔다. 상기 유도체들은 생리적 pH에서 암모늄 이온 형태로 존재하여 RNA의 포스페이트 이온과 양이온-음이온 결합을 하게 되는데, 상기 결합은 한 개의 RNA 분자에서 여러 개가 일어나므로 RNA-아미노글리코사이드 간의 결합력은 비교적 강한 정도인 마이크로몰(microM) 단위로 나타난다. 그러나 상기 결합력에 있어 큰 단점은 특정 RNA에 대하여 특이적이지 못하다는 것인데, 이와 같은 비특이성이 아미노글리코사이드 화합물의 독성으로 나타난다는 것이 문제이다.

상기 특이적인 결합을 보이지 않는 아미노글리코사이드를 특이적 화합물로 만들려는 시도로서 여러가지가 진행되었는데, 그 첫째로 기존의 아미노글리코사이 드를 이합체(dimer)로 제조하는 것으로, 몇 개의 연구진들이 이와 같은 호모이합체(homodimer)를 만들어 특정 RNA에 특이적인 결합성을 높이는 연구를 진행하였다. 실제로, 결합력을 가진 두 개의 같은 부위는 일반적으로 강한 결합력을 나타내는 것으로 알려져 있으므로, 아미노글리코사이드의 호모이합체는 특정 RNA에 특이성이 증진된 형태를 나타낼 수 있으리라 기대하였으나, 그 결합 부위가 RNA에 2개 존재할 때 결합력이 증진되었을 뿐, 화합물이 가지는 특이성에는 큰 변화가 없어 성과를 보지 못했다.

둘째, 헤테로 이합체 (hetero-dimer) 아미노글리코사이드를 제조하는 것이다. 이것은 아미노글라이코사이드와 새로운 작용기를 가진 화합물을 결합하는 것으로, 헤테로 이합체는 두 개의 다른 부분을 인식할 수 있는 두 개의 분자를 연결하는 것이다. 토르(Tor) 연구팀이 최근 진행한 연구에 의하면, 아크리딘(acridine)이라는 조그마한 화합물과 아미노글리코사이드가 결합된 헤테로 이합체가 특정한 RNA(RRE motif)에 각각의 단일체에 비해 약 100배 정도의 특이성의 증진을 나타내었다. 이와 같은 특이성의 증가는 아미노글리코사이드에 연결한 아크리딘과 RNA 스템 부분에 돌출된 틈의 염기와의 인식에 의한 것으로 조사되었다(RNA-ligand interactions: affinity and specificity of aminoglycoside dimers and acridine conjugates to the HIV-1 Rev response element. Luedtke NW, Liu Q, Tor Y, Biochemistry. 2003 Oct 7;42(39):11391-403).

아미노글리코사이드의 작용점을 상세히 살펴보면 헤어핀 RNA를 구성하는 스템과 루프 두 개의 요소 중에 스템 부분에 용이하게 결합함을 알 수 있다. 이에 반하여 지금 까지 알려진 많은 항생제 중에 루프 부분에 결합하는 항생제도 많이 있는데 클로람페니콜, 리네졸리드 등이 대표적이다. 상기 아미노글리코사이드가 스템이라는 형태 특이적인 결합력을 지니기는 하지만, 염기서열에 대하여 특이적이지는 못하다. 따라서, 특정한 서열을 가진 RNA 모티프에 결합하는 화합물은 루프(loop) 특이적인 구조를 인식할 수 있는 화합물과 스템 특이적 결합을 하는 아미노글리코사이드가 연결된 헤테로 이합체 형태를 가지는 것이 바람직하며, 이를 제조하기 위한 두 화합물의 연결은 특이성 증진을 위하여 매우 중요하다.

본 발명자들은 전형적인 RNA의 구조인 헤어핀을 구성하는 두 개의 요소인 스템과 루프에 각각 결합하는 화합물을 연결하여 스템과 루프에 동시에 결합할 수 있도록 유도하면 지금까지의 존재하던 약에 비해 특이적이며, 강한 결합력을 가진 화합물을 제조할 수 있을 것으로 예상하였다.

특히 상기와 같은 헤테로 화합물을 제조하는데 있어, 각각 화합물의 가장 활성이 적은 부위를 찾아 이 부분으로 두 화합물을 연결하면, 활성이 있는 부위는 대부분 그대로 존재하기 때문에 활성을 그대로 유지한 채 두 분자의 접합력이 배가 될 수 있고, 또한 두 화합물이 RNA구조의 스템과 루프에 동시에 결합하므로 RNA의 구조도 이와 같은 헤테로 화합물과의 결합에 의하여 매우 안정한 모양을 할 가능성이 높다.

이에, 본 발명자들은 스템 특이적인 화합물로 아미노글리코사이드 종류를 활용하고, 루프 특이적인 화합물로 클로람페니콜, 리네졸리드, 펩타이드, PNA 또는 이들의 유도체들을 활용하여 상기 스템 특이적 화합물과 루프 특이적 화합물을 결합시켜 헤테로 이합체군을 만들어 이들의 결합 특이성을 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 헤테로 이합체의 RNA에 대한 결합력이 의도한 바와 같이 강력해지면서 특이적인 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 RNA의 스템과 루프를 동시에 인식하여 특이성이 우수하고 강한 결합력을 갖는 헤테로 이합체 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 헤테로 이합체를 유효성분으로 하는 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항암제를 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 RNA의 스템과 루프를 동시에 인식하여 특이성이 우수하고 강한 결합력을 갖는 헤테로 이합체 및 이의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 헤테로 이합체를 유효성분으로 하는 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항암제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 RNA의 스템과 루프를 동시에 인식하여 특이성이 우수하고 강한 결 합력을 갖는 헤테로 이합체 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 RNA의 스템과 루프를 동시에 인식하는 헤테로 이합체는 i) 스템 특이적인 화합물과 루프 특이적인 화합물을 결합시켜서 헤테로 이합체군을 형성하는 단계; ⅱ) 상기 헤테로 이합체군의 RNA에 대한 각각의 결합력을 측정하는 단계; 및 ⅲ) 상기 헤테로 이합체들의 RNA 결합 부위를 확인하는 단계로 선별하여 결정한다.

1) 헤테로 이합체의 설계

현재까지 알려진 RNA의 스템에 결합하는 화합물로서 아미노글리코사이드가 대표적이다. 스템의 그루브(groove) 부분에는 포스페이트 결합이 가능하도록 노출되어 있는데, 아미노글리코사이드는 상기한 그루브에 결합하게 되어 약으로서 효능을 나타내게 된다. 스템에 결합하는 화합물은 아미노글리코사이드가 유일한 반면에, 그의 구성이 3∼4 개의 당 고리 구조로 되어 있어, 여러가지 성질이 다른 화합물로의 조작이 가능하다. 특히, 당 고리에서 아미노기의 위치를 바꿀 수 있으면 그 다양성은 기하 급수적으로 늘어날 수 있다. 따라서 이와 같은 스템 특이적 화합물의 다양성은 무궁무진하게 창조할 수 있다. 상기에 기술한 바와 같이, 아미노글리코사이드와 스템 부분의 결합력은 비특이적 이지만 강한 결합력을 보이는 것이 특징이므로 아미노글리코사이드의 화학 구조를 조작하여 특이성을 증진시키면 다양한 성질의 스템 특이적인 화합물을 제조할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 스템 특이적인 화합물로서 전체적으로 네오마이신(Neomycin)을 이용하였는데, 경우에 따라서는 기존의 이미 합성된 네오마이신의 산(acid)을 제조하여 이들의 유도체들을 제한적으로 사용할 수 있다.

RNA의 루프에 결합하는 화합물로서는 아미노글리코사이드를 제외한 거의 모든 RNA 결합 화합물이 루프에 결합하는 것으로 알려져 있으므로 다양한 화합물이 이용될 수 있다. 이러한 화합물과 RNA 루프와의 인식은 비교적 약하지만 특이적으로 결합하는 것이 특징이다. 상기한 RNA 루프에 결합하는 화합물의 특이성은 루프에 있는 염기와 루프에 결합하는 화합물 간의 수소결합이나, 반데르 발스(van der Vaals) 결합 등에 의하여 형성되기 때문에, 루프에 결합하는 화합물이 아니라 하더라도 일반적으로 수소결합을 할 수 있는 주개와 받개 작용기를 가지고 있는 분자를 포함하는 것이라면 어느것이라도 루프 특이적인 화합물로 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 루프 특이적인 화합물로서 클로람페니콜(Chloramphenicol) 또는 리네졸리드(Linezolid)를 사용하였고, 상기에 기술한 바와 같이 루프 특이적인 화합물의 다양성을 증가시키기 위하여 고체 상 합성방법이 잘 확립되어 있는 펩타이드 또는 펩타이드 헥산(Peptide Nucleic Acid, 이하 "PNA"로 칭함)을 연결한 라이브러리(library)를 이용함으로써 여러가지 다양한 화합물들을 용이하게 제조하였다.

또한, 상기의 스템 특이적인 화합물과 루프 특이적인 화합물 간의 길이를 조작함으로써 헤테로 이합체의 다양성을 기하급수적으로 증가시킬 수 있다.

2) 헤테로 이합체의 RNA에 대한 결합력 측정

본 발명에서의 헤테로 이합체의 스크리닝과 RNA에 대한 결합력 측정은 기본방법과 화합물이 라이브러리로 준비되어 있는 경우로 나누어 하기와 같이 각각의 방법을 이용한다.

헤테로 이합체의 RNA에 대한 결합력의 측정은 기본적으로는 형광도(fluorescence intensity)와 형광 비등방성(fluorescence anisotropy) 방법을 이용한다. 이것은 표적 RNA를 제조한 후에 표적 RNA에 잘 결합하는 탐침분자를 결합시키는 것으로, 보통은 아미노글리코사이드에 로다민(rhodamine) 또는 플로레신(Fluorescein)이 결합된 화합물을 이용한다. 상기 방법은 탐침분자가 결합된 RNA에 제 3의 물질이 첨가되면 탐침분자가 RNA로부터 분리되는 것을 이용한 결합력의 측정방법이다.

결합력을 측정하고자 하는 화합물이 라이브러리로 준비되어 있으면, 상기한 방법과는 다소 다른 방법을 이용하게 된다. 첫째, 화합물 라이브러리가 비드(bead) 상에 부착되어 있는 경우 표적 RNA에 탐침 분자를 붙여서 이용하는 방법이 있다. 이때 RNA와 결합력이 센 분자가 달려있는 비드는 RNA를 끌어당기게 되므로 현미경으로 관찰하게 되면 밝은 형광을 띤 모습을 관찰할 수 있으며, 이를 분리한 후, 이 비드에 달려있는 펩타이드를 분석하면 RNA에 강력하게 결합하는 헤테로-화합물의 구조를 알 수 있게 된다. 상기 방법은 나중에 다시 헤테로 이합체를 용액상에서 합성하여 다시 표적 RNA와의 결합력을 측정해야 하는 번거로움이 있지만 400여개의 라이브러리를 한꺼번에 스크리닝 할 수 있는 장점을 가지고 있다. 둘째, 고체 상에 측정하고자 하는 표적 RNA를 붙인 스크리닝 방법도 도입될 수 있다. 상 기 방법은 스트렙타비딘(streptavidin) 비드를 이용해 바이오틴(biotin)이 연결된 표적 RNA를 만들어 붙임으로써 RNA가 비드 표면에 붙어 있게 된다. 이 후에 탐침 분자를 고체상에 연결된 RNA에 결합시켜 측정하고자 하는 화합물을 처리하게 된다. 만약 결합력이 강한 화합물이 있으면 경쟁관계에 있는 탐침분자를 밀어내, 이 탐침분자는 용액 상에 존재하게 되므로 형광의 세기를 용이하게 측정하여 화합물의 결합력을 측정할 수가 있다. 상기의 방법들을 이용한 본 발명의 실시예의 결과, 본 발명의 헤테로 이합체가 RNA 특이적이며 또한 화합물에도 특이적으로 확인되었다(표 1 및 표 2 참조).

3) 헤테로 이합체의 RNA 결합부위 확인

상기 결합력의 증가의 원인이 과연 헤테로 이합체에 의한 결합 부위의 확장 때문인지를 측정하여 본 발명의 유용성을 확인하였다. 첫번째 실험으로, 화합물에 의한 결합부위를 매핑(mapping)하는 방법으로 RNA 풋프린팅(footprinting) 방법을 수행하였다. 표적 RNA에 헤테로 이합체를 처리하여 RNA-헤테로 이합체의 복합체가 형성되면 여러 종류의 RNA 가수분해 효소가 RNA를 잘 자르지 못한다. 따라서 ³²P가 표지된 RNA를 쓰게 되면 헤테로 이합체가 결합된 부위는 잘 분해되지 않고, 결합 부위가 아닌 곳이 가수분해 효소에 의해 분해되어 RNA의 단편들이 떨어져 나오게 되는데, 이를 전기 영동하게 되면 어떤 부위에 화합물이 결합되어 있는 지를 알 수 있게 되는 것이다. 상기한 풋프린팅 결과에 의하면, 본 발명의 헤테로 이합체의 결 합부위는 아미노글리코사이드가 결합하는 스템 부분에 결합할 뿐만 아니라, 본 발명자들이 의도한 대로 루프 부분까지 확대됨을 쉽게 알 수 있었다. 또한 헤테로 이합체의 결합에 의하여 헤테로 이합체의 한 요소인 아미노글리코사이드만이 존재할 때와는 달리 RNA 구조도 변화된다. 두번째 실험으로, 표적 RNA의 루프에 존재하는 염기를 RNA의 2중 구조가 심각하게 변하지 않는 범위 안에서 다른 염기로 돌연변이 시키는 실험을 수행하였다. 이와 같은 돌연변이에 대한 헤테로-이합체의 결합력을 측정해 봄으로써 헤테로 이합체가 루프 부분의 특정한 염기와 결합하고 있음을 확인할 수 있었다(표 3 참조). 본 발명에서는 발명자의 의도처럼 루프 부분의 특정한 염기의 변화에 의하여 헤테로 이합체의 결합력은 변화가 매우 큰 반면에 스템 특이적인 화합물인 네오마이신은 결합력에 있어서 거의 변화가 없는 것을 확인하였다. 상기한 결과는 헤테로 이합체가 스템 부분 뿐만 아니라 루프 부분의 특정 염기를 직접 인식하고 있으며, 헤테로 이합체 중 그 결합 부위는 비-아미노글리코사이드 부분(돌연변이된 루프 부분)임을 의미한다. 따라서 아미노글리코사이드는 RNA의 스템 부분에 결합하며, 비-아미노글리코사이드 결합은 루프 부분이 결합한다는 사실을 확인하였다.

결론적으로, 본 발명에서 스템(stem) 특이적인 화합물과 루프(loop) 특이적인 화합물을 공유결합으로 연결하여 제조한 헤테로 이합체는, 이들의 RNA에 대한 결합력 측정과 결합 부위 확인 실험을 수행한 결과, RNA의 스템과 루프를 동시에 인식하여 우수한 특이성을 나타내기 때문에 RNA-단백질 간 결합을 차단하는 저해제로서 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항암제 등으로 사용될 수 있고, 더 나아가 서는 RNA 기능 연구, 신약 개발 등에도 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명한다.

하기의 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 네오마이신 - 클로람페니콜 이합체의 제조

본 발명에서는 3a-c로 표시되는 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(neomycin-chloramphenicol heterodimer)를 하기 반응식 1에 따라 제조하였다.

(상기식에서 n이 3, 6 또는 9일때, 각각 3a, 3b, 3c의 네오마이신-클로람페니콜 이합체를 나타낸다)

상기 화학식에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 네오마이신-클로람페니콜 헤테 로 이합체는 네오마이신과 클로람페니콜의 중심 골격을 적당한 길이의 탄소 사슬을 가진 스페이서로 연결되어 있는 구조를 가지고 있다.

또한, 본 발명의 상기 화학식 3a-c로 표시되는 네오마신-클로람페니콜 헤테로 이합체의 제조방법은,

i) 화학식 6의 클로람페니콜을 염기 존재하에 화학식 5a-c의 네오마이신과 반응시켜 화학식 7a-c의 화합물을 얻는 단계(단계 1); 및

ⅱ) 화학식 7a-c의 화합물의 실릴기를 탈보호화 하기 위해 테트라부틸암모늄프루오리드(tetrabutylamoniumfloride)를 첨가하여 화학식 8a-c의 화합물을 얻고, 이를 탈보호제와 반응시켜 상기 화학식 3a-c로 표시되는 네오마신-클로람페니콜 헤테로 이합체를 제조하는 단계(단계 2)를 포함한다.

구체적으로, 단계 1은 염기 존재하에 상기 화학식 6의 화합물과 화학식 5a-c의 화합물을 상온에서 5∼10 시간 동안 반응시켜 화학식 3a-c의 화합물을 얻는 것으로, 상기 염기는 K₂CO₃, Na₂CO₃ 또는 Cs₂CO₃ 를 사용하며, 바람직하게는 Cs₂CO₃를 사용한다. 이때 용매는 DMF(dimethylformamide), DMSO(dimethyl sulfoxide) 또는 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하며, 바람직하게는 DMF를 사용한다.

단계 2은 화학식 7a-c의 화합물의 실릴기를 탈보호화 하기 위해 테트라부틸암모늄프루오리드(tetrabutylamoniumfloride, 이하 "TBAF"라 칭함), 불산, 불산 피리딘염, 염산, 황산 또는 질산을 사용하며, 바람직하게는 TBAF를 사용한다. 또한, t-부틸옥시카르보닐기(t-butyloxycarbonyl)를 탈보호화 하기 위해 염산, 황산, 질 산, 초산 또는 삼불화초산을 사용하며, 바람직하게는 삼불화초산을 사용한다.

또한, 상기 반응식 1에 있어서, 화학식 6의 클로람페니콜과 화학식 5a-c의 네오마이신은 다양한 방법을 통하여 제조가 가능하다.

일예로, 상기 화학식 6의 화합물은, 하기 반응식 2와 같이,

i) (1R,2R)-(-)-2-아미노-1-(4-니트로페닐)-1,3-프로판디올과 9-플루오렌닐메틸 숙신이미도 카르보네이트를 반응시켜 9-플루오렌닐메틸옥시카르보닐로 보호된 화학식 10의 화합물을 얻는 단계(단계 1);

ⅱ) 얻어진 화학식 10의 화합물에 t-부틸디메틸실릴트리플레이트를 반응시켜 알콜기가 t-부틸디메틸실릴시로 보호된 화학식 11을 얻는 단계(단계 2),

ⅲ) 얻어진 화학식 11의 화합물에 피페리딘을 반응시켜 아민기만 탈보호된 화학식 12의 화합물을 얻는 단계(단계 3) 및,

ⅳ) 얻어진 화학식 12의 화합물을 염기 존재하에 아실화 시약과 반응시켜 화학식 6의 화합물을 얻는 단계(단계 4)를 거쳐서 제조할 수 있다.

(상기 식에서, TBS는 TBS는 t-부틸디메틸실릴기이다.)

단계 1은 아민기를 9-플루오렌닐메틸옥시카르보닐로 보호하는 반응에 있어서, 9-플루오렌닐메틸 크로로포르메이트 또는 9-플루오렌닐메틸 펜타플루오로페닐 카르보네이트를 사용할 수 있으나, 또한 9-플루오렌닐메틸 숙신이미도 카르보네이트를 에테르와 물의 혼합용액에서 염기로 NaHCO₃를 사용하는 것이 수율 및 반응성에서 바람직하다.

단계 2는 알콜기를 t-부틸디메틸실릴기로 보호하는 반응에 있어서, 일차 및 이차알콜기를 한번에 t-부틸디메틸실릴기로 보호하기 위하여 t-부틸디메틸실릴트리플레이트를 이염화탄소 존재하에, 0℃에서 반응시킨다.

단계 3은 9-플루오렌닐메틸옥시카르보닐로 보호된 아민기의 선택적인 탈보호화 반응에 있어서, 이염화탄소를 용매로 하고 용매에 대하여 20 % 농도의 피페리딘 을 사용하여 실온에서 반응을 진행시킨다.

단계 4는 이염화탄소 존재하여 0 ℃에서 아민기의 아실화 반응 시키는 것으로, 아실화 시약은 브로모아세틸브로미드, 브로모아세틸클로리드, 클로로아세틸브로미드 또는 클로로아세틸클로리드를 사용하며, 바람직하게는 브로모아세틸브로미드를 사용한다. 염기는 피리딘, 루티딘과 같은 방향족 아민이나 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민과 같은 지방족 아민을 사용하며, 바람직하게는 피리딘을 사용한다.

상기 화학식 5a-c의 화합물은 하기 반응식 3과 같이, 화학식 4의 화합물을 염기 존재하에 디메르캅토 화합물과 반응시켜 얻어진다.

(상기식에서, n은 2∼10의 정수이며, 바람직하게는 3, 6 또는 9이다.)

화학식 4로 표시되는 아민기가 t-부틸옥시카르보닐기로 보호되고 일차알콜기가 트리이소프로필술포닐기로 치환된 화합물은 네오마이신으로부터 종래 공지된 방법으로 제조하였다.

구체적으로, 화학식 5a-c의 화합물은 디메르캅토 화합물과 화학식 4의 화합물을 염기 존재하에 치환반응시켜 제조한다. 상기 디메르캅토 화합물은 1,3-프로판디티올, 1,6-헥산디티올 또는 1,9-노난디티올이 바람직하며, 염기는 K₂CO₃, Na₂ CO₃ 또는 Cs₂CO₃를 사용하며, 또한 용매는 DMF, DMSO 또는 아세토니트릴을 사용한다.

1) 클로람페니콜의 제조

상기 반응식 2에 나타낸 바와 같이 합성을 실시하였다.

(단계 1): (1R,2R)-2-(9-플루오렌닐메틸카바모일)-1-(4-니트로페닐)-1,3-프로판디올의 합성

3.00 g의 (1R,2R)-(-)-2-아미노-1-(4-니트로페닐)-1,3-프로판디올과 28 ㎖의 NaHCO₃ 수용액을 140 ㎖의 에테르와 혼합한 후, 4.77 g의 9-플루오렌닐메틸 숙신이미도 카르보네이트를 첨가하고 24시간 동안 교반하였다. 상기 반응시킨 혼합물을 1 N의 염산 수용액에 쏟아 붓는다. 이때 생성된 흰색의 침전물은 거름종이를 이용하여 제거하였다. 상기 침전물을 제거한 여액을 분배시켜 유층을 분리하고, 상기 유층을 염산 희석액과 포화된 소금물로 씻어주었다. 유층을 무수 MgSO₄로 건조시키고 감압하에 농축하여 흰색의 고체를 얻었다. 상기 흰색의 고체를 EtOAc/헥산 혼합 용매 시스템으로 재결정하여 5.83 g의 흰색의 결정인 (1R,2R)-2-(9-플루오렌닐메틸카바모일)-1-(4-니트로페닐)-1,3-프로판디올을 얻었다. 수율은 95%였다.

¹H NMR (CD₃OD, 300 MHz) δ8.13(d, J=8.7 Hz, 2H), 7.79(d, J=7.4 Hz, 2H), 7.62∼7.55(m, 4H), 7.39(t, J=7.3 Hz, 2H), 7.32∼7.26(m, 2H), 5.08(s, 1H), 4.30∼4.08(m, 3H), 3.91∼3.86(m, 1H), 3.80∼3.74(m, 1H), 3.59∼3.49(m, 1H).

(단계 2): (1R,2R)-2-(9- 플루오렌닐메틸카바모일 )-1-(4- 니트로페닐 )-1,3- t -부틸디메틸실릴옥시프로판의 합성

2.90 g의 (1R,2R)-2-(9-플루오렌닐메틸카바모일)-1-(4-니트로페닐)-1,3-프로판디올을 67 ㎖의 이염화탄소에 넣은 후 섞어 주었다. 상기 혼합물에 3.1 ㎖의 2,6-루티딘(2,6-lutidine)과 4.6 ㎖의 t-부틸디메틸실릴트리플레이트(t-butyldimethylsilyltriflate)를 0 ℃에서 넣고, 같은 온도에서 4 시간 동안 교반하였다. 상기 반응시킨 혼합물을 이염화탄소로 희석시킨 후, 염산 희석액과 포화된 소금물로 씻었다. 상기 혼합물을 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(EtOAc:hexane=1:10) 방법으로 정제하여 99 ㎎의 시럽같은 (1R,2R)-2-(9-플루오렌닐메틸카바모일)-1-(4-니트로페닐)-1,3-t-부틸디메틸실릴옥시프로판을 얻었다. 수율은 95%였다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ8.18(d, J=8.6 Hz, 2H), 7.79(d, J=7.5 Hz, 2H), 7.57∼7.28(m, 8H), 5.20(d, J=2.0 Hz, 1H), 5.11(d, J=9.0 Hz, 1H), 4.33(d, J=7.1 Hz, 2H), 4.20(d, J=6.9 Hz, 1H), 3.79∼3.75(m, 1H), 3.62(d, J=7.1 Hz, 2H), 0.98∼0.90(m, 18H), 0.14∼0.06(m, 6H).

(단계 3): (1R,2R)-2-아미노-1-(4-니트로페닐)-1,3- t -부틸디메틸실릴옥시프로판의 합성

3.79 g의 (1R,2R)-2-(9-플루오렌닐메틸카바모일)-1-(4-니트로페닐)-1,3-t-부틸디메틸실릴옥시프로판과 4.0 ㎖의 피페리딘(piperidine)을 16.0 ㎖의 DMF(dimethylformamide)에 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응시킨 혼합물을 물에 쏟아 붇고 150 ㎖의 에틸아세테이트로 3번 반복하여 유기층을 추출하였다. 추출된 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 상기 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(EtOAc:hexane=1:10)방법으로 정제하여 2.47 g의 시럽같은 (1R,2R)-2-아미노-1-(4-니트로페닐)-1,3-t-부틸디메틸실릴옥시프로판을 얻었다. 수율은 98%이었다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ8.21(d, J=8.6 Hz, 2H), 7.49(d, J=8.7 Hz, 2H), 4.90(d, J=4.4 Hz, 2H), 3.55(dd, J=10.0, 6.3 Hz, 1H), 3.40(dd, 10.0, 5.1 Hz, 1H), 2.77∼2.71(m, 1H), 0.94(s, 9H), 0.93(s, 9H), 0.09(s, 3H), 0.07(s, 6H), -0.13(s, 3H).

(단계 4): (1R,2R)-2-브로모아세틸아미도-1-(4-니트로페닐)-1,3- t -부틸디메틸실릴옥시프로판의 합성

1.67 g의 (1R,2R)-2-아미노-1-(4-니트로페닐)-1,3-t-부틸디메틸실릴옥시프로판을 12.6 ㎖의 이염화탄소에 녹인 후, 이 용액에 0.77 ㎖의 피리딘(pyridine)과 0.43 ㎖의 브로모아세틸 브로미드(bromoacetyl bromide)를 0 ℃에서 첨가하였다 상기 온도에서 1시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸아세테이트로 희석하고 포화된 소금물로 씻어 주었다. 상기 씻겨진 용액을 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(EtOAc:hexane=1:10)방법으로 정제하여 2.00 g의 시럽같은 (1R,2R)-2-브로모아세틸아미도-1-(4-니트로페닐)-1,3-t-부틸디메틸실릴옥시프로판을 얻었다. 수율은 94%이었다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ8.18(d, J=8.7 Hz, 2H), 7.47(d, J=8.6 Hz, 2H), 7.07(d, J=8.9 Hz, 1H), 5.21(d, J=2.2 Hz, 1H), 3.98∼3.90(m, 1H), 3.85(d, J=14.2 Hz, 1H), 3.75(d, J=14.2 Hz, 1H), 3.63∼3.52(m, 2H), 0.95(s, 9H), 0.93(s, 9H), 0.12(s, 3H), 0.10(s, 3H), 0.08(s, 3H), -0.15(s, 3H).

2) 네오마이신의 합성

본 발명의 반응식 3에 나타낸 바와 같이 반응을 실시하였다.

(n=3인 경우)

880 ㎎의 화학식 7의 화합물을 11.8 ㎖의 DMF에 녹인 다음, 0.47 ㎖의 1.3-프로판디티올(1,3-propane-di-thiol)과 364 ㎎의 Cs₂CO₃를 상온에서 첨가하였다. 9시간 동안 상온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 물에 쏟아 부었다. 그리고, 100 ㎖ 의 EtOAc로 3번 반복하여 추출하였다. 추출한 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 680 ㎎의 흰색의 고체인 화학식 5a의 화합물(n=3)을 88%의 수율로 얻었다.

¹H NMR (CD₃OD, 300 MHz) δ6.55(br s, 1H), 5.38(s, 1H), 5.14(s, 1H), 4.93(s, 1H), 4.25-3.00(m, 22H), 2.75(t, J=7.0 Hz, 2H), 2.63(t, J=6.9 Hz, 2H), 2.00∼1.75(m, 3H), 1.55∼1.20 (m, 55H).

(n=6인 경우)

1.00 g의 화학식 4의 화합물을 13.4 ㎖의 DMF에 녹인 다음, 0.82 ㎖의 1.6-헥산디티올(1,6-hexane-di-thiol)과 414 ㎎의 Cs₂CO₃를 상온에서 첨가하였다. 9시간 동안 상온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 물에 쏟아 부었다. 그리고, 100 ㎖의 EtOAc로 3번 반복하여 추출하였다. 추출한 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 773 ㎎의 흰색의 고체인 화학식 5b의 화합물(n=6)을 85%의 수율로 얻었다.

1H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ6.20-4.96(m, 9H), 4.13-2.80(m, 27H), 2.72∼ 2.60(m, 2H), 2.50∼2.40(m, 4H), 1.66∼1.30(m, 64H).

(n=9인 경우)

1.00 g의 화학식 7의 화합물을 13.4 ㎖의 DMF에 녹인 다음, 1.1 ㎖의 1.9-노난디티올(1,9-nonane-di-thiol)과 414 ㎎의 Cs₂CO₃를 상온에서 첨가하였다. 9시간 동안 상온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 물에 쏟아 부었다. 그리고, 100 ㎖의 EtOAc로 3번 반복하여 추출하였다. 추출한 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 706 ㎎의 흰색의 고체인 화학식 5c의 화합물(n=9)을 76%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 300 MHz) δ6.02∼4.84(m, 9H), 4.20∼2.90(m, 27H), 2.70∼2.10(m, 6H), 1.60∼1.10(m, 70H).

3) 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(n=3)의 합성 1

(단계 1): 보호된 네오마이신 - 클로람페니콜 헤테로 이합체의 합성

450 ㎎의 화학식 5a의 화합물(n=3), 64 mg의 Bu₄N⁺I^-와 168 ㎎의 Cs₂ CO₃를 3.4 ㎖의 DMF에 넣고 섞어 주었다. 상기 혼합물에 1 ㎖의 DMF에 녹아있는 300 ㎎의 화학식 6의 화합물을 넣고 상온에서 72시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 쏟아 붓고 70 ㎖의 EtOAc로 3번 반복하여 추출하였다. 추출한 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 199 ㎎의 흰색의 고체인 화학식 7a-c로 표시되는 보호된 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(n=3)를 32%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 300 MHz) δ 8.18 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.47 (d, J= 8.6 Hz, 2H), 7.32 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 6.20-5.85 (m, 2H), 5.60-5.30 (m, 2H), 5.24 (s, 1H), 5.20-5.05 (m, 3H), 4.96 (s, 1H), 4.30-3.05 (m, 29H), 2.90-2.30 (m, 9H), 2.00-1.75(m, 4H), 1.50-1.30 (m, 54H), 0.85 (s, 9H), 0.82 (s, 9H), 0.01 (s, 3H), 0.00 (s, 3H), -0.02(s, 3H), -0.23 (s, 3H)

(단계 2): 탈보호된 네오마이신 - 클로람페니콜 헤테로 이합체의 합성

74 ㎎의 화학식 7a의 화합물(n=3)을 0.8 ㎖의 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran)에 녹인 용액에 0.12 ㎖의 1.0 M 테트라히드로퓨란 용액인 테트라부틸암모늄플루오리드(tetrabutylamoniumfluoride)를 첨가한 후 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하여 농축한 후 EtOAc를 넣어 녹이고, 이 용액을 0.5 N의 염산 수용액과 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방 법으로 정제하여 52 ㎎의 흰색의 고체를 얻었다(수율 81%). 얻어진 화합물에 1 ㎖의 삼불화초산(TFA)을 넣고 상온에서 40분 동안 교반한 후 감압하여 농축시켰다. 농축물을 실리카겔 관을 이용하여 거른다음(CH₂Cl₂:MeOH=15:1), prep-HPLC(RP-C18 컬럼, 0.1 % TFA 함유된 H₂O: 0.1 % TFA MeCN=70:30)를 이용하여 정제하여 화학식 3a로 나타낸 41 ㎎의 흰색의 고체인 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체 삼불화초산염 (n=3)를 75%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(D₂O, 300 MHz) δ8.06 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.47(d, J=8.7 Hz, 2H), 5.87(d, J=3.7 Hz, 1H), 5.21(d, J=2.1 Hz, 1H), 5.13(s, 1H), 5.02(d, J=2.3 Hz, 1H), 4.24∼4.04(m, 6H), 3.95∼2.80(m, 22H), 2.68∼2.44(m, 2H), 2.37∼2.23(m, 3H), 2.14∼1.90(m, 2H), 1.82∼1.43(m, 3H), 1.13∼1.03(m, 1H);

¹³C NMR(D₂O, 75 MHz) δ172.8, 163.4(q, J=35 Hz), 150.1, 147.3, 127.4, 124.0, 116.8(q, J=289.9 Hz), 110.8, 96.1, 95.4, 86.0, 80.6, 79.1, 76.2, 74.2, 73.0, 71.2, 71.1, 70.5, 69.8, 68.5, 68.0, 67.8, 61.8, 56.9, 54.1, 51.3, 50.2, 48.9, 40.9, 40.7, 35.2, 34.6, 30.8, 30.7, 28.3.

4) 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(n=6)의 합성 2

(단계 1): 보호된 네오마이신 - 클로람페니콜 헤테로 이합체의 합성

326 ㎎의 화학식 3의 화합물(n=6)과 98 ㎎의 Cs₂CO₃를 3.0 ㎖의 DMF에 넣고 섞어 주었다. 이 혼합물에 1 ㎖의 DMF에 녹아있는 170 ㎎의 화학식 2의 화합물을 넣고 상온에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 쏟아 붇고 70 ㎖의 EtOAc로 3번 반복하여 추출하였다. 추출한 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 383 ㎎의 흰색의 고체인 화학식 7b로 표시되는 보호된 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(n=6)를 87%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 300 MHz) δ8.16(d, J=8.7 Hz, 2H), 7.46(d, J=8.6 Hz, 2H), 7.39(d, J=8.6 Hz, 1H), 6.15∼5.90(m, 2H), 5.25(s, 1H), 5.13∼5.11(m, 2H), 4.95(s, 1H), 4.15∼3.00(m, 25H), 2.79∼2.18(m, 8H), 1.79∼1.33(m, 64H), 0.96(s, 9H), 0.93(s, 9H), 0.12(s, 3H), 0.11(s, 3H), 0.08(s, 3H), -0.13(s, 3H).

(단계 2): 탈보호된 네오마이신 - 클로람페니콜 헤테로 이합체의 합성

245 ㎎의 화학식 7b의 화합물(n=6)을 2.6 ㎖의 테트라히드로퓨란에 녹인 용액에 0.40 ㎖의 1.0 M 테트라히드로퓨란 용액인 테트라부틸암모늄플루오리드(TBAF)를 넣고, 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하여 농축한 후 EtOAc를 넣어 녹이고, 이 용액을 0.5 N의 염산 수용액과 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 184 ㎎의 흰색의 고체를 얻었다(수율 86%). 얻어진 화합물에 3 ㎖의 삼불화초산(TFA)을 넣고 상온에서 1시간 동안 교반한 후 감압하여 농축시켰다. 농축물을 실리카겔 관을 이용하여(CH₂Cl₂:MeOH=4:1) 거른 후 prep-HPLC (RP-C18 컬럼, 0.1 % TFA 함유된 H₂O:0.1 % TFA 함유된 MeCN=70:30)를 이용하여 정제하여 화학식 3b로 나타낸 117 ㎎의 흰색의 고체인 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체 삼불화초산염(n=6)을 60%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(D₂O, 300 MHz) δ8.17(d, J=8.7 Hz, 2H), 7.58(d, J=8.7 Hz, 2H), 6.05(d, J=3.9 Hz, 1H), 5.35(s, 1H), 5.24(s, 1H), 5.14(d, J=2.0Hz, 1H), 4.39(s, 2H), 4.30∼4.16(m, 4H), 4.08∼3.22(m, 19H), 3.17∼3.11(m, 2H), 3.04∼2.99(m, 2H), 2.82∼2.75(m, 1H), 2.54(t, J=7.2 Hz, 2H), 2.43∼2.39(m, 1H), 2.16∼2.07(m, 1H), 1.97∼1.83(m, 2H), 1.50∼1.45(m, 2H), 1.32∼1.11(m, 8H);

¹³C NMR(D₂O, 75 MHz) δ173.1, 163.3(q, J=35.1Hz), 150.0, 147.3, 127.4, 124.0, 116.9(q, J=290.7 Hz), 110.9, 96.0, 95.3, 85.9, 80.6, 79.0, 75.4, 74.1, 72.9, 71.6, 71.0, 70.6, 69.9, 68.4, 68.0, 67.7, 61.8, 56.8, 54.1, 51.3, 50.2, 49.3, 48.9, 40.9, 35.3, 34.7, 32.1, 32.0, 30.4, 29.2, 28.4, 27.9.

5) 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(n=9)의 합성 3

(단계 1): 보호된 네오마이신 - 클로람페니콜 헤테로 이합체의 합성

255 ㎎의 화학식 5c의 화합물(n=9)과 78 ㎎의 Cs₂CO₃를 2.0 ㎖의 DMF에 넣고 섞어 주었다. 이 혼합물에 1 ㎖의 DMF에 녹아있는 135 ㎎의 화학식 6의 화합물을 넣고 상온에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 쏟아 붓고 70 ㎖의 EtOAc로 3번 반복하여 추출하였다. 추출한 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 254 ㎎의 흰색의 고체인 화학식 7c로 표시되는 보호된 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(n=9)를 74%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 300 MHz) δ8.12(d, J=8.5 Hz, 2H), 7.47(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.44(d, J=7.8 Hz, 1H), 6.18(br s, 2H), 5.82(br s, 1H), 5.50∼4.95(m, 8H), 4.15∼2.88(m, 25H), 2.68∼2.29(m, 7H), 1.65∼1.23(m, 70H), 0.97(s, 9H), 0.94(s, 9H), 0.13(s, 3H), 0.12(s, 3H), 0.09(s, 3H), -0.13(s, 3H).

(단계 2): 탈보호된 네오마이신 - 클로람페니콜 헤테로 이합체의 합성

157 ㎎의 화학식 7c의 화합물(n=9)을 1.7 ㎖의 테트라히드로퓨란에 녹인 용액에 0.25 ㎖의 1.0 M 테트라히드로퓨란 용액인 테트라부틸암모늄플루오리드(TBAF) 를 넣고, 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하여 농축한 후 EtOAc를 넣어 녹이고, 이 용액을 0.5 N의 염산 수용액과 포화된 소금물로 씻고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 114 ㎎의 흰색의 고체를 얻었다(수율 83%). 얻어진 화합물에 1 ㎖의 삼불화초산(TFA)를 넣고 상온에서 40분 동안 교반한 후 감압하여 농축시켰다. 농축물을 실리카겔 관을 이용하여 거른 후 prep-HPLC (RP-C18 컬럼, 0.1 % TFA 함유된 H₂O:0.1 % TFA 함유된 MeCN=70:30)를 이용하여 정제하여 74 ㎎의 흰색의 고체인 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체 삼불화초산염(n=9)을 62%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(D₂O, 300 MHz) δ8.17(d, J=8.7 Hz, 2H), 7.58(d, J=8.7 Hz, 2H), 6.01(d, J=3.8 Hz, 1H), 5.34(s, 1H), 5.24(s, 1H), 5.14(d, J=2.4 Hz, 1H), 4.36∼4.37(m, 7H), 4.03∼3.76(m, 7H), 3.67∼3.00(m, 12H), 2.82∼2.75(m, 1H), 2.59(t, J=7.2 Hz, 2H), 2.44∼2.24(m, 1H), 2.18∼1.83(m, 4H), 2.56∼1.49(m, 2H), 1.29∼1.09(m, 14H);

¹³C NMR(D₂O, 75 MHz) δ173.1, 163.4 (q, J=35.2 Hz), 149.9, 147.3, 127.4, 124.0, 116.8(q, J=289.9 Hz), 111.0, 96.0, 95.5, 85.9, 80.6, 79.0, 75.5, 74.1, 72.9, 71.5, 71.0, 70.5, 70.0, 68.4, 68.0, 67.8, 61.7, 56.8, 54.1, 51.3, 50.1, 48.8, 41.0, 40.9, 35.3, 32.2, 32.1, 29.3, 28.8, 28.6, 28.5, 28.4, 28.3, 28.2

< 실시예 2> 네오마이신 - 리네졸리드 이합체의 제조

본 발명은 하기 반응식 4의 화합물 14로 표시되는 네오마이신-리네졸리드 헤테로 이합체(neomycin-linezolid heterodimer) 및 이의 제조방법을 포함한다.

(상기식에서, n이 2∼10의 정수이며, 바람직하게는 6이며, X는 플루오로, 클로로 또는 브롬이며, Ac는 아세틸기이며, Boc는 t-부틸옥시카르보닐기를 나타낸 것이다.)

상기 화학식 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 네오마이신-리네졸리드 헤테로 이합체는 네오마이신과 리네졸리드의 중심 골격을 적당한 길이의 탄소 사슬을 가진 스페이서로 연결되어 헤테로 이합체의 구조를 형성한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 14로 표시되는 네오마이신-리네졸리드 헤테로 이합체의 제조방법은, 상기 반응식 4에서 보는 바와 같이

i) 화학식 15의 화합물(리네졸리드)을 염기 존재하에 화학식 5b의 화합물(네오마이신)과 반응시켜 화학식 16의 보호된 화합물을 얻는 단계(단계 1); 및

ⅱ) 상기 얻어진 화학식 16의 화합물과 탈보호제를 반응시켜 화학식 14의 화합물을 얻는 것을 단계(단계 2)를 포함한다.

단계 1은 염기존재하에 화학식 15의 화합물과 화학식 5b의 화합물을 상온에서 5∼10 시간동안 반응시켜 화학식 16의 화합물을 얻는 것으로, 상기 염기는 K₂CO₃, Na₂CO₃ 또는 Cs₂CO₃를 사용하며, 바람직하게는 Cs₂CO₃를 사용한다. 이때 용매는 DMF(dimethylformamide), DMSO(dimethyl sulfoxide) 또는 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하며, 바람직하게는 DMF를 사용한다.

단계 2는 얻어진 화학식 16의 화합물의 t-부틸옥시카르보닐기(t-butyloxycarbonyl, Boc)를 탈보호하기 위해 염산, 황산, 질산, 초산 또는 삼불화초산을 사용하며, 바람직하게는 삼불화초산을 사용한다.

또한, 상기 화학식 15의 화합물은 하기 반응식 5와 같이, 하기 화학식 13의 화합물을 염기 존재하에 반응시켜 얻어진다. 바람직하게 상기 반응시 염기는 피리딘을 사용하며, 용매는 CH₂Cl₂를 사용한다. 또한, 반응온도는 0℃이며, 반응시간은 2 시간이 바람직하다.

(상기식에서, Ac는 아세틸기를 나타낸 것이다.)

또한, 상기 화학식 5b의 화합물(네오마이신)은 상기 반응식 3과 같이, 화학식 4의 화합물을 염기 존재하에 디메르캅토 화합물과 반응시켜 얻어진다. 네오마이신의 제조방법은 <실시예 1>에서의 n = 6 일때의 방법과 동일하다.

1) 리네졸리드의 제조

상기 반응식 4에 나타낸 바와 같이 합성을 실시하였다.

34 ㎎(0.10 m㏖)의 화학식 13의 옥사졸리디논(Oxazolidinone)에 이염화탄소 (2.0 ㎖)를 첨가한 현탁액에 피리딘(0.025 ㎖, 0.31 m㏖)과 브로모아세틸 브로마이드(bromoacetyl bromide; 0.013 ㎖, 0.15 m㏖)를 0 ℃에서 첨가하였다. 얻어진 반응혼합물을 같은 온도에서 1시간 동안 교반한 후 에틸 아세테이트(EtOAc)로 희석시켰다. 얻어진 혼합물을 소금물로 세척한 후 유층을 무수 Na₂SO₄로 건조시키고 감압농축하였다. 얻어진 농축물을 실리카겔 크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=10:1)로 정제하여 흰색의 고체인 화학식 15의 화합물(33 ㎎, 72 %)를 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 300 ㎒) δ7.50 (dd, J=14.2, 2.5 ㎐, 1H), 7.10 (dd, J=8.8, 2.4 ㎐, 1H), 6.99 (t, J=9.0 ㎐, 1H), 6.13 (t, J=6.1 ㎐, 1H), 4.82∼4.76 (m, 1H), 4.13∼3.51 (m, 10H), 3.16 (t, J=4.9 ㎐, 2H), 3.08 (t, J=5.0 ㎐, 2H), 2.04 (s, 3H).

¹³C NMR (CD₃SOCD₃, 75 MHz) δ 170.0, 164.9, 154. 7 (d, J = 243 Hz), 154.1,135.1 (d, J = 9 Hz), 133.8 (d, J = 10 Hz), 119.9, 114.1, 106.6 (d, J = 26 Hz), 71.6, 50.4, 50.2, 47.3, 46.1, 41.6, 41.4, 27.8, 22.5

2) 네오마이신의 합성

본 발명의 <실시예 1>에 기재된 반응식 3 에 나타난 n = 6 인 경우와 동일한 방법으로 네오마이신을 합성하였다.

3) 네오마이신-리네졸리드 헤테로 이합체의 제조

(단계 1): 보호된 네오마이신 - 리네졸리드 헤테로 이합체의 제조

DMF(1.5 ㎖)에 화학식 5b의 화합물(97 ㎎, 0.072 m㏖)과 화학식 15의 화합물(33 ㎎, 0.072 m㏖)를 용해한 후 Cs₂CO₃(24 ㎎, 0.074 m㏖)를 첨가하였다. 얻어진 반응혼합물을 15시간 동안 교반한 후 반응혼합물을 물에 부었다. 에틸 아세테이트(100 ㎖)로 추출한 후 유층을 소금물로 세척하였다. 상기 유층을 무수 Na₂SO₄로 건 조시킨 후 감압농축하였다. 얻어진 농축물을 실리카겔 크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=10:1)로 정제하여 흰색의 고체인 화학식 4의 화합물(101 ㎎, 81%)을 얻었다.

¹H NMR(CD₃OD, 300 ㎒) δ7.53 (dd, J=14.5, 2.4 ㎐, 1H), 7.18 (dd, J=8.8 ㎐, 2.1 ㎐, 1H), 7.07 (t, J=9.1 ㎐, 1H), 6.68 (br d, J=6.68 ㎐, 1H), 6.49 (br d, J=6.3 ㎐, 1H), 5.32 (br s, 1H), 5.19 (br s, 1H), 4.94 (br s, 1H), 4.83∼4.75 (m, 1H), 4.23∼2.60 (m, 39 H), 1.97 (s, 3H), 1.65∼1.24 (m, 64H)

(단계 2): 탈보호된 네오마이신 - 리네졸리드 헤테로 이합체의 제조

상기 화학식 16의 화합물(101 ㎎, 0.059 m㏖)과 삼불화초산(TFA; 1.5 ㎖)을 혼합하고 30분간 상온에서 교반하였다. 얻어진 반응혼합물을 감압농축한 후 얻어진 농축물을 prep-HPLC (RP-C18 column, 0.1 % TFA를 함유한 H₂O:0.1 % TFA를 함유한 MeCN=70:30)로 정제하고 동결건조하여 흰색의 고체인 화학식 14의 네오마이신-리네졸리드 헤테로 이합체(70 ㎎, 62 %)를 얻었다.

¹H NMR(D₂O, 300 ㎒) δ7.09 (dd, J=14.0, 1.9 ㎐, 1H), 6.91∼6.87 (m, 2H), 5.70 (d, J=4.0 ㎐, 1H), 5.04 (d, J=2.0 ㎐, 1H), 4.94 (d, J=1.4 ㎐, 1H), 4.04∼2.69 (m, 38H), 2.45 (dd, J=13.4, 7.6 ㎐, 1H), 2.27 (q, J=7.3 ㎐, 4H), 2.17∼2.11 (m, 1H), 1.62 (s, 3H), 1.54 (q, J=12.6 ㎐, 1H), 1.29∼1.18 (m, 4H), 1.05∼1,01 (m, 4H).

¹³C NMR(D₂O, 75 MHz) δ175.2, 171.2, 163.9 (q, J=35 ㎐), 157.0, 134.7, 120.9, 116.7 (q, J=290 ㎐), 116.2, 110.8, 109.0, 108.7, 96.0, 95.5, 85.8, 80.5, 78.9, 75.4, 74.1, 73.2, 72.8, 71.3, 70.4, 69.8, 68.3, 68.0, 67.7, 54.0, 51.4, 51.2, 51.0, 50.0, 48.7, 48.6, 46.2, 42.1, 40.8, 40.7, 34.6, 33.0, 32.1, 31.9, 29.1, 28.7, 28.3, 27.9, 27.7, 22.1

< 실시예 3> 네오마이신 - 디펩타이드 이합체의 제조

본 발명은 하기 반응식 6에 도시된 바와 같은 네오마이신-디펩타이드(dipeptide) 헤테로 이합체 및 이의 제조방법을 포함한다.

1) 네오마이신 산의 합성

상기 반응식 7에서 보는 바와 같이, 이미 합성이 보고된 상기 화학식 1의 Boc-보호된 네오마이신(K. Michael, H. Wang, Y. Tor, Bioorg. Med. Chem. 7, 1361-1371, 1999)을 출발물질로 하여 화학식 2의 네오마이신 유도체를 합성하였다. 상기 출발물질 2 g을 DMF에 녹여 둥근 바닥 플라스크에 넣은 뒤, 여기에 350 mg(1.5 당량)의 브로모아세트산(bromoacetic acid)과 3.2 g(6 당량)의 탄산세슘(cesium carbonate)을 차례로 집어넣는다. 이렇게 만들어진 혼합물은 자성 교반기(magnetic stirrer)를 이용하여 상온에서 밤새 저어준다. 이후, 용매를 저압 로터리 증발기를 이용하여 제거하여 용액의 부피를 줄인 후, 원하는 네오마이신 산 250 mg(수율 12%)을 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리해 내었다(CH₂Cl₂:MeOH = 5:1, 4:1). Rf : 0.21 (CH₂Cl₂:MeOH = 5:1).

¹H NMR (500 MHz, MeOD-d3) delta 5.35 (s, 1H), 5.14 (br, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.25-3.00 (m, 24H), 1.57-1.20 (m,56H).

¹³C NMR (125 MHz, MeOD-d3) delta 177.78, 172.99, 158.92, 158.40, 158.28, 157.84, 109.12, 100.03, 99.41, 88.33, 83.79, 83.14, 80.18, 76.03, 74.88, 73.19, 72.91, 72.40, 71.63, 71.06, 69.14, 63.39, 58.73, 57.17, 53.50, 53.30, 51.81, 49.62, 49.44, 49.27, 49.10, 48.93, 42.59, 41.68, 35.86, 29.04, 28.98, 28.89, 28.79, 28.83. HRMS (FAB) : C₅₅H₉₆N₆O₂₇Na, 1295.6221 (계산값), 1295.6210 (측정값).

2) 네오마이신-디펩타이드 라이브러리 구축

상기 네오마이신-디펩타이드 라이브러리 구축을 위한 고체 지지상으로TentaGel S NH2 레진(resin) (130 마이크로몰, 0.27 mmol/g)이 사용되었고, 펩타이드 합성을 위해서 Fmoc 커플링 프로토콜(coupling protocol)이 사용되었다. 고체상 반응은 50 마이크로몰 의 비드(bead) 와 Met(메티오닌), Lys(라이신), Ile(이소루이신), Cys(시스테인) 을 제외한 16가지 종류의 아미노산을 가지고 수행하였다. 라이브러리 합성시 앞부분에는 6개의 아미노산(MRBBBB)으로 이루어진 링커(linker)가 도입되었는데, 상기 링커는 나중에 말디-토프(MALDI-TOF ; Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight)를 이용한 질량분석시 일정한도 이상의 질량을 가지게 함으로써 분석을 보다 용이하게 하고, 또한 고체 지지상으로부터 네오마이신-디펩타이드 부분을 멀리 떨어지게 함으로써 상기 헤테로 이합체가 RNA와 상호 작용시 고체 지지상의 방해를 최소화하였다.

스플릿 앤 풀(split-and-pool)방법과 부분적 종결을 통한 표지 방법(P. M. et al., J. Am. Chem. Soc. 120, 13312-13320, 1998; M. Xian et al., J. Comb. Chem. 6, 126-134, 2004)을 이용하여 서열 위에 무작위로 두곳의 위치에 아미노산을 넣어주었다. 상기 레진은 링커 합성이 끝난 직후부터 16개의 각각 다른 용기에 나누어 담았다. 레진은 20 % 피페리딘으로 20 분동안 탈보호시킨 후 DMF로 다섯번 세척하였다. 16개의 각 용기에 3당량의 Fmoc-보호된 아미노산과 PyBop(3 당량), HOBT(3 당량), DIPEA(6 당량)을 첨가하였고, 이외에 부분적 종결을 위해서 넣어준 총 Fmoc 아미노산의 10 % 양의 N-Boc 글라이신(glycine)을 각각에 넣어 같이 커플 링(coupling) 반응을 4시간 동안 수행하였다. 반응의 완료 여부는 카이저(Kaiser) 시험을 통하여 확인하였다.

상기 커플링 반응 후 레진은 다시 한 용기에 모아서 잘 흔들어서 골고루 섞이게 하여 탈보호시킨 뒤, 다시 16개의 용기에 분배를 하였다. 이와 같은 작업을 반복하여 두 번 진행한 다음, 레진을 한 용기에 모아서 β-알라닌(alanine)과 네오마이신 산을 차례로 연결하여 라이브러리를 완성하였다.

마지막 네모마이신의 커플링 반응이 끝난 후, 레진은 DMF와 MeOH로 차례로 씻어 주고 진공에서 건조시켰다. 펩타이드의 옆가지 부분의 탈보호를 위해서 레진은 탈보호 용액 (TFA:Thioanisole:H2O = 95:2.5:2.5) 1 ml를 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 마찬가지로 MeOH로 레진을 잘 씻어준 후 진공에서 건조시켰다.

< 실시예 4> 네오마이신 (혹은 카나마이신 )- PNA 이합체의 제조

본 발명은 하기 반응식 8과 같이, 네오마이신(혹은 카나마이신)-PNA 헤테로 이합체 및 이의 제조방법을 포함한다.

1) 네오마이신, 카나마이신의 합성

아미노글리코사이드와 PNA의 헤테로 화합물은 알려진 PNA의 고체상 합성 프로토콜(solid phase synthesis protocol)을 따라 수행했다. 계획한 화합물은 우선 네오마이신 B와 카나마이신 A를 아미노글리코사이드 부위로 하였고, 여기에 PNA를 접합하여 헤테로 이합체를 합성하였다. 또한, PNA 단량체(monomer), 이합체(dimer), 또는 삼량체(trimer)를 합한 총 84종류의 PNA간의 조합으로 라이브러리를 구축했다.

네오마이신, 카나마이신의 합성은 상기 <실시예 3>에 기술된 바와 같은 방법으로 각각 하기 반응식 9, 10에 나타난 절차대로 실시하여, 화학식 1의 네오마이신 B와 화학식 2의 카나마이신 A를 얻었다.

2) 고체상(Solid support)에서의 아미노글리코사이드와 PNA간의 헤테로 이합 체의 합성

Soild support에 부착된 PNA 단량체(monomer), 이합체(dimer), 또는 삼량체(trimer) 주식회사 파나진에서 주문 제작되었다. 각각의 레진 50 mg을 핵산 합성 칼럼(nucleic acid synthesis column)에 넣고, 메틸렌 클로라이드 1 mL, 디메틸 포름아미드 1 mL로 각각 10분씩 레진을 팽창시킨다. HBTU 4.9 당량, HOBt 5 당량, 디이소프로필 에틸아민 10 당량, 브로모 아세테이트 5 당량을 디메틸 포름아미드에 0.15 M 농도가 되도록 녹이고, 팽창된 레진에 가하여 3시간 30분 동안 실온에서 반응시킨다. 이 반응 단계는 카이저(Kaiser) 시험 방법으로 확인한다. 반응후 디메틸 포름아미드 1 mL로 3번씩, 메틸렌 클로라이드로 동일하게 레진을 씻어주었다.

상기 반응식 9, 10에서 각각 얻어진 아미노글리코사이드 부분과 Cs₂CO₃를 각각 3 당량씩 가한 디메틸 포름아미드 0.15 M 용액을 레진에 가하여 1 시간 동안 반응시켰다. 반응후 레진을 씻는 과정은 위에서의 브로모 아세테이트 결합과 같은 방법으로 수행하였다. TFA:m-Cresol=5:1 용액 0.3 mL를 레진에 넣고 실온에서 10분간 방치했다. 이 용액을 여과하여 얻어진 여액에 공기를 주입하여 TFA를 대부분 제거하고 차갑게 냉각한 에테르와 헥산 1:1 용액을 1 mL 가하여 하얀색 부유물을 형성시켰다. 얻어진 하얀색 고체 화합물을 원심분리기에서 원심분리하여 침전시킨 후 상층액을 제거했다. 여기에 에테르:헥산 1:1 용액 1 mL를 가하여 이 과정을 2번 더 처리한다. 얻어진 하얀색 고체 침전물을 공기중에서 건조시킨 후 디메틸 설폭시드 소량에 녹이고 HPLC로 정제하고 말디토프(MALDI-TOF)로 각각의 화합물 네오마이신- PNA, 카나마이신-PNA 이합체를 확인하였다. HPLC 조건은 C18; solvent A = water. 0.1% v/v TFA; solvent B = MeCN. 0.1% v/v TFA, 기울기는 0% B 5 분, 0-5% B 3 min, 5-20% B 10분, 20-100% B 20분 순으로 하였다. 각각 얻어진 아미노글리코사이드-PNA 헤테로 화합물은 DEPC 처리된 물에 녹여 UV 흡광도로 그 농도를 구하였다.

< 실험예 1> 실시예 1 ∼ 4 화합물의 특정 RNA에 대한 결합력 측정

본 발명에서 실시예 1∼4의 화합물의 결합력을 측정하기 위해 RNA는 RRE(Rev Response Element), HIV-1의 TAR(trans-activating region), TS(thymidine synthase) mRNA, 및 IRE(Iron Responsive Element)을 사용하였다. 상기 표적분자들은 잘 형성된 스템-루프 구조를 가지고 있어 본 발명의 이합체와의 결합력이 안정적이다. 상기 RNA들의 합성과 정제방법은 이전에 공지된 바와 같은 절차로 수행하였다(Kwon, M. et al., Mol . Cells 11, 303-311, 2001).

1) 특이적 RNA 에 결합하는 상수의 결정(실시예 1-2)

테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine)이 결합된 파로모마이신(paromomycin, 하기 "CRP"라 칭한다)을 형광 발광화합물(fluorescent probe)로 사용하였다. 형광 비등방성(anisotropy) 측정은 Perkin-Elmer LS-50B 형광(luminescence) 분광측정기에 20 ℃의 항온조를 설치하여 수행하였다. CRP의 형광흡수는 510 ㎚, 또한 그 형광발광은 550 ㎚에서 관찰하였다. 데이터 한점을 얻는데 적어도 7번의 측정을 수행하였으며, 그 중 가장 큰 값과 가장 작은 값을 제거하 고 다섯 개의 평균값을 데이터로 이용하였다. 형광의 측정은 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 및 20 mM HEPES pH 7.5를 이용한 완충용액에서 수행하였다. CRP와 제조된 RNA간의 결합상수(Kd)를 측정하는 식은 하기 수학식 1과 같이 주어진다:

(상기식에서,

A는 RNA가 있을 때의 CRP의 형광 이등방성 값이며,

A₀는 RNA가 없을 때의 CRP의 형광 이등방성 값이며,

DA는 여러 RNA 농도에서 RNA가 없을 때의 형광 이등방성의 값을 뺀 숫자이며,

[RNA]₀는 RNA의 초기 농도이며,

[CRP]₀는 CRP의 초기 농도이며,

K_d는 결합상수이다.)

상기 RNA와 CRP의 결합을 유도한 후에 새롭게 제조된 화합물을 용액에 넣으면, 경쟁적인 결합 반응에 의하여 CRP는 RNA로부터 분리되고 측정하고자 하는 화합물은 RNA에 결합하여 KD값을 가지게 된다. 이 KD 값을 산출하는 식은 하기 수학식 2와 같으며, K_d와 KD는 일직선이 아닌 커브 맞춤(non-linerar curve fitting) 방법에 의하여 산출하였다. 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

(상기 식에서,

KD는 RNA와 새로운 aminoglycoside 와의 결합상수이며,

[Aminoglycoside]₀는 측정하고자 하는 아미노글리코사이드의 초기농도이며,

A는 측정도중 형광 이등방성 값이며,

A∞는 모두 결합되어 있을 때 형광 이등방성 값이며,

A₀는 모두 자유로울때의 형광 이등방성 값이다.)

각 RNA에 대한 헤테로 이합체의 결합력 비교(KD) (단위 microM)

RNA	네오마이신 (Neo)	실시예 1(a) :NC1	실시예 1(b) :NC2	실시예 1(c) :NC3	실시예 2 NL
RRE	0.18	0.063	0.022	0.031	0.54
TAR	0.18	0.40	0.041	0.19	0.047
TS	0.33	0.049	0.22	2.1	0.33
IRE	0.31	0.079	0.50	>4.0	0.12

* a,b,c는 각각 네오마이신-클로람페니콜 이합체의 스페이서 수가 3, 6, 9 일때를 나타낸다.

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 헤테로 이합체 화합물(실시예 1-2)의 RNA에 대한 결합력은, 이들의 이합체의 구조적 특성에 기인하며, 네오마이신에 비하여 증진된 결합력을 나타내어, 일반적인 이합체 결합력의 증진이 본 발명에서도 관찰된다. 또한, TS RNA의 경우 실시예 1(b)에 대하여 결합강도의 변화가 전혀 없음이 관측되며, 헤테로 이합체에 의한 결합력의 변화가 관찰되는 RNA도 그 종류에 따라 결합력 향상의 크기가 매우 다르게 나타나고 있다. RRE RNA 의 경우 실시예 1(b)의 화합물은 네오마이신에 비해 약 10 배의 결합력 증가가 관측되었다. 이와 같은 결과는 이합체 중에서 네오마이신이 아닌 부분, 즉 루프 특이적인 화합물에 의한 결합력의 증대 때문이다.

또한, 헤테로 이합체 사이의 스페이서의 길이에 따른 결합력의 변화도 큰 폭으로 관측되었다. 실시예 1(a)의 화합물은 TS RNA와 IRE RNA에 대해서 가장 높은 결합력을 나타냈으며, 실시예 1(b)의 화합물은 TAR RNA에 대해서 가장 높은 결합력을 나타냈다. 이같은 결과는 클로람페니콜 부분이 목표 분자인 RNA에 대해서 특이적 결합을 담당하는 것을 의미한다. 마지막으로, 실시예 1(b)와 실시예 2는 스페이서의 길이가 같음에도 불구하고 RNA에 대한 결합력에 현격한 차이를 나타냈다. 이러한 결과는 결합력의 증진이 루프 특이적인 화합물에 기인한다는 것을 의미한다.

2) 라이브러리 화합물에 대한 스크리닝과 접합상수 결정(실시예 3-4)

라이브러리 화합물로 준비된 네오마이신-디펩타이드 헤테로 이합체와 네오마 이신-PNA 헤테로 이합체에 대해서는, RRE RNA에 대한 고속 고효율 스크리닝을 실시하였고, 이에 따라 선택된 화합물에 대해서 접합 상수를 결정하였다.

A. RRE RNA의 합성

RRE RNA는 플로레신(fluorescein)이 연결된 dT 단량체 (Glen Research) 를 이용하여 합성되었다. 모든 RNA의 합성은 0.2 micromol 양으로 고체상에서 RNA 합성을 위해 사용되는 표준 포스포아미디트 프로토콜(phosphoramidite protocol)을 이용하여 수행하였다. 고체 지지상(CPG) 에서 RNA를 떼내면서 탈보호하기 위해서 고체 지지상을 암모니아:에탄올(3:1) 용액에 55 ℃에서 16 시간 동안 반응을 시켰다. 주사기 거름기를 이용해서 액체상만 얻어낸 다음 저압 회전 증발기를 이용해서 용매를 제거하였다. 남은 물질에 1 M의 THF 1 ml를 가한 후, 하루 밤 동안 자성 교반기를 이용하여 섞어주었다. 용매를 저압 회전 증발기를 이용해 제거한 후 Sep-Pak C18 column (Waters사)를 이용하여 탈염(desalting)을 한 번 해준뒤, 역상 HPLC(C18)로 원하는 화합물을 분리 하였다. 분리된 화합물은 모두 3차 증류수에 녹여서 보관하였고, 15% denaturing PAGE를 이용하여 순도를 확인하였다. 자외선 분광기를 이용하여 260 nm에서 흡광도를 측정한 뒤 정량을 하였다.

B. 네오마이신 - 디펩타이드 라이브러리 스크리닝 및 접합상수 결정

합성된 라이브러리에서 약 300개의 비드를 취하여 플로레신이 달린 RRE RNA (4 마이크로몰)가 포함된 버퍼에 집어 넣어주고, 3 시간 동안 어두운 곳에서 흔들어주면서 배양을 하였다. 똑같은 버퍼로 3번 씻어 준 후 공기 중에서 잘 말린 다음 형광 현미경을 사용하여 형광을 띄는 비드를 골라 내었다.

상기 선택된 비드들은 브라인(brine;짠물)으로 씻어 준 다음 다시 증류수로 씻어 주었다. 각각 비드들을 하나 씩 다른 에펜도르프 튜브에 옮겨 담은 다음 CNBr 용액(20 mg의 CNBr을 1 ml의 70 % TFA H₂O 에 녹인 것) 50 micro L를 가해 준다. 각각의 튜브는 어두운 곳에서 15 시간 동안 배양을 한 후 용매는 질소 가스를 불어주는 방법으로 날려보냈다. 남은 물질을 10 microl MALDI-TOF matrix (10 mg의 alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid를 1 ml의 0.1 % TFA 에 녹인 것)인 후 말디토프(MALDI-TOF) 질량 분석을 하였다.

선택된 화합물의 합성을 위해서 링크 아마이드 레진(Rink amide resin;Novabiochem)을 고체 지지상으로 한 고체상 합성을 하였다. 고체 지지상 10 mg(6 micromol)에 대하여 표준적인 Fmoc 프로토콜을 사용하여 합성하였다. 펩타이드 부분의 합성이 완결된 후에는 네오마이신 산(5 당량) 와 PyBop(3 당량), HOBT (3 당량), DIPEA(6 당량)을 넣어준 후 밤새 커플링 반응을 시켰다. 탈보호과 축합(cleavage)를 위해서 고체 지지상을 DMF와 MeOH로 잘 씻어 준 뒤, 에펜도르프 튜브로 옮겨 담은 뒤 탈보호 용액 (TFA:Thioanisole = 60/1) 1 ml에서 2시간 동안 반응을 시켰다. 반응 혼합물을 필터를 이용하여 거른 후 걸러진 용액을 저압 회전 증발기를 이용하여 용매를 제거한다. 남겨진 물질을 0.5 ml의 증류수에 녹인 후, HPLC (C18 역상)를 사용하여 원하는 화합물을 분리해 내었다. 분리해 낸 화합물은 다른 컬럼(C8 역상)를 이용하여 순도를 검사하였다. 얻어진 화합물은 말디토프(MALDI-TOF) 질량 분석기를 이용하여 원하는 화합물을 확정하였다. 화합물의 정량은 이미 공지된 플로레스카민(fluorescamine)을 이용하는 방법(M. Weigele et al., J. Am. Chem. Soc. 94, 5927, 1972)을 사용하여 정량을 하였다.

C. 네오마이신 - PNA 헤테로 화합물 라이브러리의 스크리닝과 접합상수 결정

토르(Tor)가 개발한 고체상을 이용한 형광도(fluorescence intensity) 측정을 바탕으로 접합상수를 결정하였다(Tor, Y. ChemBioChem, 4, 998, 1007, 2003). ImmunoPure immobilized Streptavidin 50% 용액을 100 ㎕ 취하고 3 배의 반응 버퍼를 가하고 30초간 1000 rpm으로 원심분리하여 비드를 침전시켜 비드를 씻어준다. 이 과정을 3번 더 처리했다. 75 ㎕의 반응 버퍼를 비드에 가하고 540 nM biotinylated RRE 30 ㎕ 가했다. 실온에서 90 분간 인큐베이션하여 RNA가 비드에 붙도록 했다. 반응 후 상등액의 UV 흡광도를 측정하여 그 부착 정도를 확인했다. 반응 버퍼로 위에서와 동일하게 비드를 씻은 후 120 ㎕의 반응 버퍼를 가하고 1 당량의 CFP를 가하고 30%의 용액이 되도록 한 후 실온에서 1시간 인큐베이션했다. 실리콘으로 코팅된 튜브에 200 ㎕의 반응 버퍼를 각각 넣고 30 ㎕의 위의 30% 용액을 가했다. 각각의 용액에 일정량의 준비된 아미노글리코사이드 - PNA 헤테로 화합물을 가하고 실온에서 90 분간 인큐베이션 했다. 1000 rpm에서 30초간 원심분리하고 그 상등액 220 ㎕ 취하여 780 ㎕의 정량 버퍼에 가한 후 얻어진 각 용액의 형광을 VICTOR² 형광 스펙트럼을 이용하여 측정하였다. 얻어진 형광 강도를 이용하여 각 화합물의 접합상수를 계산하였다. 형광 강도를 이용한 화합물의 접합상수를 계산하는 개념은 도 1에 잘 나타나 있다.

하기 표 2에 네오마이신-디펩타이드의 RRE RNA에 대한 결합력을 나타내었다.

비아코어(Biacore)로 측정된 억제제들의 Kd 수치(μM)

	RevF1	네오마이신	NM-1	NM-2	NM-3	NM-4	NM-5
Kd	0.057	0.88	0.64	0.49	0.72	0.49	0.52

< 실험예 2> 실시예 1 ∼ 2 화합물의 특정 RNA에 대한 결합 부위 확인

1) 풋프린팅( Footprinting)

5'-End 표지

10 μg의 RNA와 10 유니트(units)의 포스파타아제(phosphatase,New England Biolabs)를 200 μL의 반응 버퍼(100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7.9)에 넣고 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 이후, RNA는 에탄올 침전에 의해 정제되었고, 정제된 RNA와 ³²P가 표지된 감마 ATP(Amersham Pharmacia Biotech)의 혼합액을 50 유니트의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(polynucleotide kinase,New England Biolabs)로 반응버퍼(70 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl2, 5mM DTT)에서 한시간 동안 배양하였다. 상기의 RNA를 에탄올 침전에 의해 정제한 후 20%의 아크릴아마이드(acrylamide)-7 M 우레아(urea) 상에서 겔 전기영동을 실시하였다. 의도했던 크기의 RNA를 겔에서 절단하여 용출 버퍼(0.5 M ammonium acetate, 10 mM magnesium acetate, 0.1% sodium dodesyl sulfate)로 녹여서 분리해 내었다.

RNA 풋프린팅(foot-printing)

500 nM의 5'-³²P end 표지된 RRE (또는 TAR) RNA를 버퍼(20 mM N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설포닉산; HEPES), 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 at pH 7.4)에 넣고 65℃에서 5분간 가열한 후, 상온에서 냉각시켰다. 다양한 양으로 첨가된 네오마이신(1, 10, 100 fold 농도) 혹은 헤테로 이합체(실시예 1,2)들을 준비된 RNA 용액에 첨가하여 상온에서 10분간 배양하였다. 상기 배양액에 1 μL의 RNAse(RRE; 0.1 μg/mL의 RNAse A 또는 0.01 unit/μL의 RNAse V1 , TAR; 0.1 μg/mL의 RNAse A 또는 0.1 unit/μL의 RNase T1)를 첨가하여 37℃에서 10분간 배양하였다. 이후, 에탄올 침전에 의해 RNA 절편을 수득하고 이를 건조시켰다. 상기의 수득된 RNA를 다시 5 μL의 겔 로딩 버퍼(Gel Loading Buffer II, Ambion)에 용해시키고 65℃에서 5분간 가열하였다. 상기 반응액의 반을 15%의 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 7M 우레아(urea) 겔에 로딩시키고 이를 1,500V에서 3시간동안 반응시켰다. 상기 겔을 흡입기(aspirator)를 이용하여 80℃에서 2시간동안 건조시켰다. 상기 각 밴드(band)의 방사능(Radioactivity)은 BAS 2000 Phosphorimager(Fujix)를 이용하여 검출하였고, Image Reader(Ver. 1.3.E)와 Image Gauge(Ver. 3.3, Fuji photo)프로그램을 이용하여 결과를 분석하였다.

RNA 풋프린팅 결과

RRE RNA와 TAR RNA의 풋프린팅 결과에 대한 방사능 사진이 도면 2, 3에 나타 나 있고, 도면 4 및 5의 막대그래프는 본 발명의 헤테로 이합체(실시예 1-2)의 존재하에서 RNA의 분할(cleavage)에 대한 반응성을 나타낸 것이다. 분할 패턴(Cleavage pattern)은 이전에 공지된 방법에 의하여 이루어졌다(Kirk, S.R. et al., J. Am. Chem. Soc. 122, 980-981, 2000).

2) 변이(mutation)에 의한 실시예 1,2 화합물의 결합부위 확인

RRE RNA와 TAR RNA의 루프 부분에 대해서 RNA의 2중 구조가 심각하게 변하지 않는 범위 안에서 다른 염기로 돌연변이 시키는 실험을 수행하였다. 본 발명의 헤테로 이합체의 돌연변이된 RNA에 대한 결합력은 앞서 실시한 형광 비등방성 방법을 이용하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

돌연변이된 RRE	네오마이신	실시예 1(B)	실시예 1(c)
와일드 타입	0.18	0.022	0.031
U13A	0.18	0.22	0.14
G24A	0.22	0.023	0.087
돌연변이된 TAR	네오마이신	실시예 1(B)	실시예 2
와일드 타입	0.16	0.041	0.047
U10C	0.16	1.1	1.1
C15A	0.27	0.033	0.40

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 헤테로 이합체는 루프 부분이 돌연변이 되었을때에는 결합력이 와일드 타입의 RNA에 비해서 떨어지는 것으로 나타났다. 반면에 네오마이신의 경우는 와일드 타입의 RNA나 돌연변이된 RNA에 대해서 결합력에 있어서 차이가 없었다. 이것은 헤테로 이합체가 루프 부분의 특정 염기와 접촉하고 있기 때문이며, 네오마이신의 경우에는 스템에 결합하고 있기 때문에 RNA가 돌연변 이 되었을 경우에도 결합력에 변함이 없다.

< 실험예 3> 실시예 1 ∼ 4 화합물의 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성 실험

본 발명의 실시예 1∼4의 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성 실험을 실시하였다. 본 발명의 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체를 1 ㎖의 생리식염수에 현탁하여 1 ㎎/㎏의 용량으로 상기 랫트 2 마리의 근육내 주사 투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

실험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상 증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 실험된 화합물은 랫트에서 10 ㎎/㎏ 까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 비경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 10 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 RNA의 스템과 루프를 동시에 인식할 수 있는 헤테로 이합체는 이를 구성하는 단위체에 비하여 특정 RNA에 대한 결합력이 우수하며, RNA에 대한 염기서열 특이적인 결합 특성을 가지고 있다. 이와 같이,본 발명에 의한 헤테로 이합체는, RNA를 인식할 수 있는 상기와 같은 특이성의 증가로 인해 약의 효능을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 비특이적인 약물에 의한 부작용을 대폭 감소시킬 수 있어 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항암제에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

1. RNA 2차 구조의 스템(stem)에 결합하는 아미노글리코사이드 또는 그의 유도체 화합물과 루프(loop)에 결합하는 클로람페니콜, 리네졸리드, 디펩타이드 및 PNA(Peptide nucleic acid) 중에서 선택된 화합물이 결합된 헤테로 이합체.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 아미노글리코사이드는 네오마이신 또는 카나마이신인 것을 특징으로 하는 헤테로 이합체.
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 RNA는 RRE(Rev Response Element), HIV-1의 TAR(trans-activating region), TS(thymidine synthase) mRNA, 및 IRE(Iron Responsive Element)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA인 것을 특징으로 하는 헤테로 이합체.
6. 제 1항에 있어서, 루프(loop)에 결합하는 화합물은 RNA 루프를 이루는 염기서열과 수소 결합 또는 반데르 발스 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 헤테로 이합체.
7. 삭제
8. 하기의 단계로 구성되는 청구항 제 1항의 헤테로 이합체를 제조하는 방법:

   i) RNA 2차 구조의 스템(stem)에 결합하는 글리코사이드 또는 그의 유도체 화합물과 루프(loop)에 결합하는 클로람페니콜, 리네졸리드, 디펩타이드 및 PNA(Peptide nucleic acid) 중에서 선택된 화합물을 결합시켜서 헤테로 이합체군을 형성하는 단계;

   ii) 상기 헤테로 이합체군의 RNA에 대한 각각의 결합력을 측정하는 단계;

   iii) 상기 헤테로 이합체들의 RNA 결합 부위를 확인하는 단계.

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