KR100911267B1 - 표적 ｒｎａ에 특이적으로 결합하는 아크리딘-알파 나선형펩티드 결합체 - Google Patents

표적 ｒｎａ에 특이적으로 결합하는 아크리딘-알파 나선형펩티드 결합체

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Abstract

본 발명은 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 이용한 RNA 특이 결합 펩티드의 탐색방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 양면성 알파 나선형 펩티드에 아크리딘을 포함시켜 합성함으로써 헤어핀 구조의 표적 RNA에 특이적이며 강력한 결합력을 갖는 펩티드의 탐색방법에 관한 것이다. 본 발명의 아크리딘을 포함하는 알파 나선형 펩티드는 RNA 특이 결합 펩티드를 탐색하는 방법을 제공함으로써 표적 RNA에 특이 결합하는 화합물 선별과 표적 RNA의 기능 탐구 및 신약의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

표적 ＲＮＡ에 특이적으로 결합하는 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체{Acridine-alpha helix peptide conjugate for target RNA specific binding}
본 발명은 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 이용한 RNA 특이 결합 펩티드의 탐색방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 양면성 알파 나선형 펩티드에 아크리딘을 포함시켜 합성함으로써 헤어핀 구조의 표적 RNA에 특이적이며 강력한 결합력을 가진 펩티드의 탐색방법에 관한 것이다.
인간과 여러 가지 동식물의 게놈사업 완성과 바이오 인포매틱스의 발전으로 인하여 RNA는 DNA가 가지는 유전적인 정보를 단백질로 전달해 주는 전달자(messenger) 이상의 역할인 유전자 발현의 조절기능을 하고 있는 여러 증거가 밝혀지고 있다. 마이크로 RNA 진핵세포에서의 (microRNA, miRNA) 또는 이것의 전구물질인 pre-miRNA가 유전자의 10-20%의 기능을 제어하는 역할을 하는 것이 2000년대 들어 급격하게 알려지고 있고, 원핵세포에서는 mRNA의 일부에 대사체가 직접 결합함으로써 대사체 관련 단백질의 기능을 조절하는 리보스윗치가 발견되었다. 또한 고등동물의 mRNA의 비번역 부분(untranslated region)의 2차 구조 등이 mRNA의 안정성 및 번역의 효율성을 조절하고 있는 것이 보고되고 있다.
상기에서 언급한 자연에 존재하는 조절기능을 가진 RNA는 상당한 수가 있으며 구조적으로 기본 모티프인 스템(stem, DNA와 같은 이중 가닥 구조) 부분과 루프(loop) 부분이 연속적으로 배열되는 헤어핀(hairpin) 구조의 연속으로 구성된다. 자연에 내생하는 miRNA 및 생물학적인 의미를 가진 mRNA 또는 리보스윗치의 화합물 결합부위의 크기를 고려해 보면, 30 nt 이하인 특이적인 스템-루프(헤어핀) 구조가 활성부위(pharmacophore)일 가능성이 크게 제시되고 있다.
모든 mRNA가 2차 구조로 되어 있음에도, 지금까지 발굴된 표적 mRNA 헤어핀 구조는 HIV-1의 Rev Response Element(RRE), HIV-1의 trans-activation response element(TAR), 각종 암 세포의 Thymidylate Synthase mRNA, 철 이온의 항상성 및 치매에 관여하는 Ion Responsive Element(IRE) 등 손에 꼽을 정도로 적은데, 이는 결국 생물학적인 방법론 부재 및 RNA-결합단백질 정보부족, 헤어핀 구조의 정보부족에서 기인한다. 하지만, 상기 구조의 여러 표적 RNA가 발굴될 가능성이 매우 크며, 헤어핀 구조의 표적 RNA에 대한 리간드 발굴에 많은 노력을 기울여야 할 시점이다.
RNA에 잘 결합하는 것으로 알려진 종래의 아미노글리코사이드 화합물을 모방하여 아민기가 여러 개 존재하는 폴리아민(polyamines)을 만들고 상기 폴리아민이 헤어핀 구조의 표적 RNA에 결합함을 확인하였다(Lawton et al., J. Am. Chem. Soc., 126: 12762-12763, 2004). 또한 칼리산린(calixalene)과 같이 구조화된 모양의 한쪽에 아민기를 배열하여 RNA 특이적 분자를 만든 예를 볼 수 있다. 하지만 상기의 인공적인 화합물들은 그 다양성을 창출하는데 어려움이 많아 극히 제한적으로 사용될 수밖에 없는 단점이 있다.
이에 비하여 자연에 존재하는 RNA결합 단백질에는 많은 알파 나선형의 펩티드에 아민기가 다수로 존재하고 있다. 특히 상기의 아민기의 메틸화가 많이 진행되어 있어서 펩티드의 메틸화와 RNA 결합에 상관관계가 있음을 보여주고 있다(Das and Frankel, Biopolymers, 70: 80-85, 2003). 자연에 존재하는 여러 가지 RNA 결합 단백질 및 결합 펩티드를 조사해 본 결과 아민기가 긴 라이신 또는 아르기닌이 펩티드에 다수로 포함되어 있었으며, 상기 단백질 또는 펩티드는 메틸화가 많이 진행된 상태임이 보고되었고(Tan and Fankel, Proc Natl Acad Sci USA. 92, 5282-5286, 1995), RNA 결합 단백질에 존재하는 아르기닌의 메틸화에 따르는 RNA와의 결합력을 조사한 결과, 메틸화가 진행되면 결합력이 직접적으로 증가함을 보고되었다(Liu and Dreyfuss, Mol Cell Biol.15, 2800-2808, 1995). 더불어, 최근에 본 발명자는 표적 RNA에 특이적으로 결합하는 펩티드를 얻기 위하여, 라이신이 7개 함유된 15개의 아미노산으로 구성되는 알파 나선형의 펩티드를 제조하는 한편, 상기 펩티드에 메틸화된 라이신을 조합적으로 사용하여 RRE RNA 등의 헤어핀 구조 RNA에 대한 결합력이 증진되는 특이적인 라이브러리를 제조한 바 있다. 상기의 결과로 알파 나선형 펩티드가 양면성을 가지면서 아민기를 다수로 가질 경우, RNA에 특이적이며 강력하게 결합할 수 있는 가능성을 보여주었다.
한편 RNA의 스템 부분에 결합하는 리간드를 개량하기 위한 노력도 많이 진행되고 있는데 인터칼레이션을 통하여 DNA 또는 RNA에 결합하는 것으로 알려진 화합물들이 항암제나 항말라리아 약 등으로 사용되고 있고 이 중 네오마이신에 인터칼레이션 할 수 있는 아크리딘을 결합시킨 결합체 화합물을 제조함으로써 네오마이신 단독에 비하여 100 배 정도 결합력이 증진된 예를 볼 수 있었다(Kirk SR et al., J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 980-981). 이는 아크리딘이 RNA의 벌쥐화(bulge)된 루프 염기와 특이적인 인터칼레이션을 이루고 있는 반면에 네오마이신은 RNA의 스템 부분에 결합함으로써 RNA의 두 부분에 동시에 결합할 수 있는 결합체 화합물들이 RNA 리간드로서 많은 주목을 받게 되었다. 더 확장하여 RNA의 구성요소인 스템, 루프, 벌쥐 부분을 각각 인식할 수 있는 활성부위를 찾고 이들을 공유결합으로 연결하는 결합체 화합물의 제조가 RNA의 리간드를 개발하기 위한 일반적인 전략이 되었다. 따라서 아크리딘과 같은 간단한 분자뿐만이 아니라 루프 부분에 결합할 수 있는 화합물과 스템 부분에 결합할 수 있는 결합체의 제조 등이 활발하게 진행되고 있다.
이에 본 발명자들은 RNA 스템에 결합하는 양면성 알파 나선형 펩티드에 아크리딘을 포함시켜 합성함으로써 헤어핀 구조의 스템 및 벌지에 동시에 결합하는 표적 RNA에 특이적이며 강력한 결합력을 가진 새로운 화합물의 탐색방법 및 선별된 상기 화합물의 효용성을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인공적으로 결합된 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 이용하여 표적 RNA 특이적 결합 펩티드를 탐색하는 방법과 상기의 펩티드를 포함하는 표적 RNA 관련 질병의 치료제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아크리딘이 인공적으로 결합된 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 아크리딘이 인공적으로 결합된 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체 라이브러리를 제공한다.
또한, 본 발명은 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 이용한 표적 RNA 특이 결합 리간드의 탐색 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 유효성분으로 포함하는 RNA 활성 저해제 및 AIDS 치료제를 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 인공적으로 결합된 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체 및 상기 결합체로 구성된 라이브러리를 제공한다.
본 발명의 펩티드는 한 개 또는 두 개의 소수성 아미노산과 염기성 아미노산이 한 개 또는 두 개 씩 상기 펩티드 서열의 가운데에 교대로 배열됨으로써 알파 나선형 구조가 될 때에 펩티드의 일측면에 나란히 배열되는 합성된 양면성 알파 나선형 펩티드이다(예를 들어, 서열번호 31로 기재되는 펩티드, LKKLLKLLKKLLKLKG). 또한, 염기성, 소수성 아미노산 이외에 헤어핀 구조의 RNA와 결합하도록 펩티드의 한쪽 끝에 친수성 아미노산을 배열한 합성된 양면성 펩티드이다. 아울러, RNA와의 결합력을 극대화하기 위해서 염기성 아미노산에 아크리딘이 결합한 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체인 것을 특징으로 한다.
상기의 결합체는 안정한 2차 구조인 나선형이 되기 위하여, 적어도 14 내지 21개의 아미노산으로 구성된 펩티드로 구성되는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 상기 염기성 아미노산(예를 들어, Lysine, Lys, K)의 위치를 제외한 서열이 다른 어떤 소수성 아미노산(예를 들어, Leucine, Leu, L)으로 치환되더라도 나선형으로 구성될 수 있다면 모두 적용 가능하다. 상기의 알파 나선형은 헤어핀 RNA의 스템과 같은 이중 나선 모양을 하고 있는 부분에 결합하는 요소가 된다. 또한, 상기의 친수성 아미노산(예를 들어, Glycine, Gly, G)은 펩티드의 한쪽 끝에 위치하여 헤어핀 구조 RNA와의 결합을 돕는다. 아울러, 소수성을 띄는 아크리딘을 소수성 아미노산과 연결하는 것이 알파 나선형을 깨지 않고 결합체를 이루는 방법으로 고려될 수 있지만, RNA와 결합체의 친수성 아미노산이 결합하므로, 본 발명은 RNA와의 결합력을 극대화하기 위해서, 염기성 아미노산에 아크리딘을 결합하여 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 합성하는 것이 유리한 것으로 사료되었다. 더욱 상세하게는, 상기의 아크리딘은 헤어핀 구조 RNA의 벌지화된 루프와 결합할 수 있는 요소가 된다. 즉, 상기의 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체는 헤어핀 구조 RNA의 스템과 벌지화된 루프에 동시에 결합할 수 있으므로, 결합력의 증가가 향상된다.
상기의 염기성 아미노산은 히스티딘, 리신 및 아르기닌 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 소수성 아미노산은 알라닌, 페닐알라닌, 이소루신, 루신, 메티오닌, 프롤린, 발린 및 트립토판 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 친수성 아미노산은 시스테인, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 염기성 아미노산은 라이신, 5-히드록시 라이신, 오르니틴(라이신 대체 화합물), 알지닌 또는 히스티딘으로 치환가능하며, 상기의 치환으로 결합체의 다양성을 높임으로써 더욱 강력한 표적 RNA 결합 펩티드 스크리닝 라이브러리를 구성할 수 있다. 상기의 아크리딘은 염기성 아미노산과 결합하여 상기의 알파 나선형 펩티드의 염기성 아미노산 위치에 1 개 내지 7 개, 바람직하게는 2 개 내지 3 개를 배열하여, 결합체의 다양성을 높이고 표적 RNA와의 결합력을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 상기의 방법에 의한 결합체들은 그 특이성이 많이 달라서 표적 RNA(예를 들어, RRE RNA)에 대한 결합력의 정도는 나노 몰라보다 낮아 수백 또는 수십 피코몰라에 이르며, 뉴클레오타이드와 인터킬레이션하는 것으로 잘 알려진 네오마이신에 비해 결합력이 무려 10,000 배 이상 증가한 것을 보여주었다. 따라서 상기의 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체는 잠재적인 신약으로 개발할 수 있는 가능성이 매우 높다.
또한 본 발명은
1) 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 제조하고 정제하여 표적 RNA 특이 리간드 탐색용 라이브러리를 구성하는 단계;
2) 특이 결합 리간드를 탐색하고자 하는 표적 RNA를 합성하는 단계;
3) 표적 RNA와 탐침 분자를 혼합하여 결합하도록 한 후, 형광이등방성을 측정하는 단계;
4) 단계 3의 혼합물에 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 혼합하여 경쟁적으로 표적 RNA에 결합하도록 한 후, 형광이등방성을 측정하는 단계;
5) 단계 3 내지 4의 측정 결과로부터 단계 1의 결합체와 단계 2의 표적 RNA 간의 결합강도를 하기 수학식 1에 적용하여 산출하는 단계;
6) 단계 5의 산출값을 비교, 평가하여 표적 RNA에 특이적인 리간드를 선택하는 단계; 및
7) 단계 6의 선택된 리간드의 특이성을 증명하는 단계로 이루어진 단계 1의 라이브러리 내 표적 RNA 특이 결합 리간드의 탐색 방법을 제공한다.
상기의 표적 RNA의 예에는 제한은 없으나, 본 발명에서는 헤어핀 구조가 밝혀진 HIV-1의 Rev Response Element(이하, RRE) RNA를 표적으로 하였다. 상기의 탐침 분자에는 특별한 제한이 없으며, 형광을 띄고 결합체와 경쟁하여 RNA에 결합할 수 있는 태그로 표지되어 있는 화합물은 모두 가능하나, 본 발명에서는 로다민 염료(rhodamine dye)가 알파 나선형 펩티드인 LKKLLKLLKKLLKLKG에 결합된 형태의 것을 사용하였다. 표적 RNA와 탐침 분자가 결합하면, 이때의 형광 이등방성(Fluorescence anisotropy) 값은 증가하게 된다. 이후에 탐침 분자와 경쟁적으로 표적 RNA에 결합하는 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 혼합하면서 이등방성 값의 변화를 측정하고 표적 RNA와 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체 간의 결합 세기는 하기 수학식 1에 의해 KaleidaGraph로 정했다.
[Conjg]는 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체의 농도; [RNA]는 표적 RNA의 농도; [Probe]0는 탐지 분자의 농도; A는 단계 4의 형광이등방성 값; Amax는 단계 3의 형광이등방성(totally bound tracer; 전체 결합 추적자) 값; A0는 RNA에 결합하지 않은 탐지 분자의 형광이등방성(totally free tracer; 전체 자유 추적자) 값; 및, Kd는 정해진 양의 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체의 표적 RNA에 대한 결합력을 나타낸다. 실험예 <1-2>에 의해 측정된 본 발명의 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체 라이브러리의 RRE RNA에 대한 결합력은 수백 내지 수십 피코몰라로 다양했으며(표 3 참고), RRE RNA에 대하여 가장 강력한 결합력을 나타내는 결합체는 RRE RNA의 특이 결합 리간드로 선택되었다. 또한, 선택된 리간드의 표적 RNA에 대한 특이성을 증명하기 위해, 세포 내에서 흔하게 발견되는 RNAmix(여러 가지 RNA의 혼합물)에 대한 리간드의 결합력과 표적 RNA에 대한 리간드의 결합력을 비교함으로써 본 발명의 표적 RNA 특이 결합 리간드 탐색 방법의 유효성을 증명한다.
또한 본 발명은 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 유효성분으로 포함하는 RNA 활성 저해제 및 AIDS 치료제를 제공한다.
다양한 화합물이 여러 단백질의 구조를 구별하여 약제로 쓰이고 있다는 사실은 단백질보다 다양하지 않은 RNA 구조는 다양한 화합물에 의하여 비교적 쉽게 구분될 수 있음을 나타낸다. RNA 결합 펩티드의 대표적인 물질인 아미노글리코사이드 종류는 6각형의 당이 3 내지 4개 이어진 형태이며, 6 내지 7 개의 아민 작용기가 있는 것이 특징이다. 아미노글리코사이드는 비록 자연에서 얻은 RNA 결합 물질이기는 하지만, 특이성이 좋지 못한 단점 및 화학적으로 다루기가 어려운 점이 있다. 그렇기 때문에, RNA를 표적으로 하는 신약의 개발을 위해서는 상기의 특징을 지닌 아미노글리코사이드 대체제를 창출해야만 한다. 알파 나선형 펩티드는 결합력에 있어 충분히 아미노글리코사이드를 대체할 수 있으며, 아크리딘이 결합함으로써 더욱 강력하고 특이적인 표적 RNA 결합 리간드를 개발할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 아크리딘이 달려 있는 라이신을 1 개, 2 개 또는 3 개를 알파 나선형 펩티드에 배열하여 7 개, 42(7×6) 개 또는 210(7×6×5) 개의 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 만들고, 이 결합체를 HIV-1의 RRE RNA 특이 결합 리간드 스크리닝에 사용하여 가장 결합력이 강한 리간드를 선택하였다. 상기 펩티드 결합체는 AIDS 발생에 있어 중요한 역할을 하는 Rev RNA에 결합하여 그 기능을 억제할 수 있으므로 AIDS 치료제로 사용될 수 있을 것이다. 또한, 선택된 리간드의 표적 RNA에 대한 특이성을 증명하기 위해, 세포 내에서 흔하게 발견되는 tRNAmix(여러 가지 tRNA의 혼합물)에 대한 리간드의 결합력과 표적 RNA에 대한 리간드의 결합력을 비교한 결과, 높은 특이성을 나타냄으로써 본 발명의 펩티드가 표적 RNA에 특이적임을 확인하였다(표 3 참조).
이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체 라이브러리의 합성
<1-1> Fmoc-아크리딘 라이신 모노머의 합성
고체 페놀 5.0 g(53 mmol)을 60 내지 80℃에서 완전히 녹인 후, Novabiochem(USA)에서 구입한 Fmoc-라이신 0.92 g(2.5 mmol) 과 9-클로로아크리딘(9-Chloroacridine) 1.064 g(5 mmol, 2 당량), N,N-다이이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine) 872.5 ㎕(5.0 mmol, 2 당량)을 넣은 뒤, 30 분 동안 교반하고, 용액을 상온으로 식혔다. 그 결과물로부터 실리카겔컬럼크로마토그래피(메탄올:염화메틸렌, v:v =10:90)를 이용하여 Fmoc-아크리딘 라이신을 분리해 냈다[Rf(Retardation Factor); 대략 0.1]. 분리한 Fmoc-아크리딘 라이신은 질량분석(Mass spectroscopy)과 1H NMR로 확인했다[Mass(M+H); 546.2(calcd.), 546.3(obsd.); calcd.: calculated(계산 값), obsd.: observed(관찰 값)].
<1-2> 펩티드 라이브러리의 합성
Fmoc-라이신, Fmoc-루신, Fmoc-글리신 등은 Novabiochem에서 구입한 것을 사용하였다. 상기의 펩티드와 실시예 <1-1>의 Fmoc-아크리딘 라이신으로 0.25 μM 농도의 표 1의 아미노산 서열을 가진 펩티드의 합성을 수행하였다.
고체상 펩티드 합성방법을 사용하여, 우선 Rink Amide MBHA 고체상 레진 ((Novabiochem, Germany) 100 ㎎(0.064 mmol)을 용기에 담고, 1 ㎖의 염화메틸렌(methylene chloride)과 DMF(dimethylformamide) 1 ㎖를 각각 가하여 레진을 수화시켰다. 상기 레진을 DMF에 녹인 20% piperidine 1 ㎖로 5 분씩 3회 반복하여 탈보호(deprotection)한 후, DMF 1 ㎖로 다섯 번 세척하였다.
그 후, 탈보호한 상기의 레진에 Fmoc으로 보호된 아미노산 6 당량, PyBop[(benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate] 6당량(198 ㎎) 및 DIPEA(diisopropylethylamine)(이상 Sigma-Aldrich, Germany) 12 당량(133 ㎕)을 첨가한 용액을 만들고 2 시간 동안 교반하였다. 단, Fmoc-아크리딘 라이신의 경우는 다른 시약은 모두 동일한 상태에서 아미노산만 2 당량 넣고 반응하였다. 아마이드 결합 반응이 완결된 후, DMF 1 ㎖로 세 번 세척하였고, 반응의 완결 여부는 TNBS 시험을 통하여 확인하였다. 즉, DMF에 녹인 10% DIPEA 한 방울과 DMF에 녹인 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid(TNBS) 한 방울을 샘플에 각각 떨어뜨리고, 무색이면 반응이 완결된 것으로 하였다. 상기 방법으로 한 차례의 아마이드 결합 반응이 완결되면, 계획된 서열에 맞는 Fmoc-아미노산을 순차적으로 이용하여 이와 같은 작업을 16 번 반복함으로써, 16-머 펩티드를 합성하였다. 마지막 커플링(coupling)이 끝난 후, 레진은 DMF 1 ㎖와 메탄올 1 ㎖로 각각 3 차례씩 세척하고, 진공에서 건조시켰다. 고체상 펩티드 합성법에 의해 합성된 펩티드가 달려있는 레진 200 ㎎을 절단 용액(cleavage solution)[2.5% TIS(triisopropylsilane), 2.5% 물, 95% TFA(trifluoroacetic acid)] 5 ㎖에 넣고 2 시간 동안 교반함으로써, 레진으로부터 합성된 펩티드를 분리하였다.
상기 결과물로부터 레진을 여과하고, 질소를 이용해 과량의 TFA을 제거한 후, 0℃로 미리 냉각시켜 둔 n-헥산 : diethyl ether(V:V= 1:1) 용액 50 ㎖을 첨가하여 합성된 펩티드를 용출시켰다.
<1-3> 펩티드 정제
용출된 펩티드를 다이메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide)에 녹인 후 C18 컬럼을 사용해 HPLC로 정제하였다. HPLC 용매로는 0.1% TFA가 첨가된 물과 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하였다. 더욱 상세하게는 정제되지 않은 펩티드를 약 10 ㎎/㎖ 농도로 디메틸설폭시드에 녹여 한번에 100 ㎕씩 HPLC에 주입하였고, 10%의 아세토니트릴로부터 45%의 아세토니트릴까지 40 분 동안 용매의 조성을 변화시켜 펩티드를 정제하였다. 이때의 유속은 3 ㎖/min이었고 검출 파장은 220 ㎚였으며, 펩티드는 20 내지 30 분에 분리 회수된 후, 감압하여 아세토니트릴을 증발시키고 동결 건조하였다. 상기의 방법으로 정제된 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체는 MOLDI-TOF 질량분석기(Mass spectrometry)로 분자량을 측정하여 동정하였다.
표 1: 합성된 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체의 MOLDI-TOF 질량분석 결과
번호 서열 Mass (M+H)
계산 값 관찰 값
1 LK*KLLKLLKKLLKLKG 2052.4 2052.4
2 LKK*LLKLLKKLLKLKG 2052.4 2052.3
3 LKKLLK*LLKKLLKLKG 2052.4 2052.5
4 LKKLLKLLK*KLLKLKG 2052.4 2052.4
5 LKKLLKLLKK*LLKLKG 2052.4 2052.5
6 LKKLLKLLKKLLK*LKG 2052.4 2052.2
7 LKKLLKLLKKLLKLK*G 2052.4 2052.4
8 LK*K*LLKLLKKLLKLKG 2229.5 2229.7
9 LK*KLLK*LLKKLLKLKG 2229.5 2229.7
10 LK*KLLKLLK*KLLKLKG 2229.5 2229.7
11 LK*KLLKLLKK*LLKLKG 2229.5 2229.7
12 LK*KLLKLLKKLLK*LKG 2229.5 2229.6
13 LK*KLLKLLKKLLKLK*G 2229.5 2229.3
14 LKK*LLK*LLKKLLKLKG 2229.5 2229.7
15 LKK*LLKLLK*KLLKLKG 2229.5 2229.4
16 LKK*LLKLLKK*LLKLKG 2229.5 2229.7
17 LKK*LLKLLKKLLK*LKG 2229.5 2229.3
18 LKK*LLKLLKKLLKLK*G 2229.5 2229.8
19 LKKLLK*LLK*KLLKLKG 2229.5 2229.7
20 LKKLLK*LLKK*LLKLKG 2229.5 2229.5
21 LKKLLK*LLKKLLK*LKG 2229.5 2229.4
22 LKKLLK*LLKKLLKLK*G 2229.5 2229.7
23 LKKLLKLLK*K*LLKLKG 2229.5 2229.7
24 LKKLLKLLK*KLLK*LKG 2229.5 2229.7
25 LKKLLKLLK*KLLKLK*G 2229.5 2229.2
26 LKKLLKLLKK*LLK*LKG 2229.5 2229.8
27 LKKLLKLLKK*LLKLK*G 2229.5 2229.7
28 LKKLLKLLKKLLK*LK*G 2229.5 2229.6
29 LK*KLLKLLK*KLLKLK*G 2406.6 2406.7
30 LK*K*LLKLLKKLLK*LKG 2406.6 2406.4
31 LKKLLKLLKKLLKLKG 1877.2 1877.5
※ K*는 아크리딘 라이신임.
<1-4> 합성된 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체의 원평이색성(circular dichroism, CD) 측정
원평이색성은 20℃에서 JASCO model J700 분광편광계(spectropolarimeter, JASCO Europe, Italy)를 이용하여 측정했다. 190 내지 250nm 파장대를 1 nm의 띠너비(bandwidth), 0.5 nm의 데이터피치(datapitch) 및 100 nm/min의 속도로 3 번 스캐닝(scanning) 후, 그 값을 평균하여 CD 데이터를 얻었다. 스펙트럼은 배경 스펙트럼을 측정하여 보정하였으며, CD 신호를 평균잔기 타원율(mean residue ellipticity), [Q]로 변조하여 기록하였다. 알파 나선의 백분율(fn)은 다음 식으로 나타낼 수 있다.
[Q] = Qobs[MRW/(10lc)]
MRW = 평균 잔기 질량(mean residue weight, 분자량/펩티드 결합수)
fn = ([Q]222-[Q]coil)/([Q]helix-[Q]coil)
[Q]helix = -40,000(1-2.5n) + 100t
[Q]coil = 640 - 45t
l= 경로 길이(cm); c= 농도(mg/mL); [Q]222 =222 nm에서 평균잔기 타원율(deg cm2mol-1); [Q]helix = 펩티드의 완전 나선 형태의 타원율; [Q]coil = 펩티드의 완전 무작위 코일 형태의 타원율; n = 아미노산의 수; t = 섭씨 온도이다.
아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체의 알파 나선 정도(100% 완충용액을 사용했을 때의 알파나선 정도)를 조사한 결과는 표 2에 나타내었다.
표 2: 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체의 알파 나선 정도
서열번호 알파 나선 정도(%) 서열번호 알파 나선 정도(%) 서열번호 알파 나선 정도(%)
1 17 11 18 21 23
2 18 12 25 22 17
3 18 13 25 23 28
4 36 14 13 24 24
5 25 15 19 25 27
6 15 16 20 26 23
7 46 17 18 27 21
8 18 18 23 28 18
9 16 19 26 29 20
10 36 20 22 30 19
<실험예 1> RRE RNA 특이 결합 펩티드의 스크리닝
<1-1> HIV-1의 RRE RNA 제조
T7 프로모터가 연결되어 있는 단일 가닥 RRE DNA(센스: 서열번호 32, 안티센스: 서열번호 33)를 이중 가닥 DNA로 만들기 위하여 RRE DNA 센스 가닥과 RRE DNA 안티센스 가닥(Sigma-Aldrich, Germany)을 각각 100 pmol씩 섞어 95℃에서 5 분간 반응시킨 후 상온에서 서서히 식혀주었다.
상기와 같이 이중가닥 RRE DNA를 제작한 후 전사반응을 실시하여 RRE RNA를 수득하였다. 전사반응은 이중 가닥 RRE DNA 100 pmol, 5×완충액(200 mM Tris-Cl, (pH7.5), 10 mM spermidin, 30 mM MgCl2, 25 mM NaCl) 20 ㎕, 100 mM DTT(dithiothreitol) 10 ㎕, 2.5 mM NTP(ribonucleoside triphosphate) mix 20 ㎕, 및 T7 RNA 중합효소 5 ㎕를 이용했다. 상기 혼합용액을 37℃에서 4 시간 반응시킨 후, 1 ㎕의 RQ1 RNase-free DNase(1 unit/㎕)(PROMEGA, USA)를 첨가하여 1 시간 동안 동일 조건에서 반응시켰다. 이후 결과 반응액과 동량의 페놀 혼합물(Phenol: Chloroform:Isoamyl alcohol = 25:24:1)을 이용하여 단백질을 제거한 후, -70℃에서 1 시간 에탄올을 이용하여 침전시켰다. 이후 7 M의 UREA가 포함된 15% 변성(denaturation) PAGE 겔에 적재하여 30-머의 정확한 크기의 밴드만 잘라서 500 ㎕의 용리(elution) 완충액(0.5 M ammonium acetate, 1 mM EDTA, 0.2% SDS, pH 8.0)이 든 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 넣고 37℃에서 4 시간 동안 방치한 후, 용액만 새 에펜도르프 튜브로 옮겨서 위와 같은 방법으로 페놀 추출(phenol extraction)하였다. RNA가 들어있는 수용액 층을 에탄올에 의해 다시 한번 침전시킨 후 얻은 RNA를 UV로 정량하였다.
<1-2> 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체 라이브러리의 RRE RNA에 대한 결합력 측정
상기 실시예 <1-1>에서 제조한 RRE RNA는 10 mM의 농도로 100 ㎖를 준비하여 65℃에서 10 분 방치한 후 상온에서 서서히 식혀 주어 접힘(folding)이 일어나도록 하였다. 펩티드는 각각 10 μM과 30 μM의 농도로 준비하였으며 0℃를 유지했다. 10 μM의 N-말단에 로드아민이 결합한 LKKLLKLLKKLLKLKG 펩티드를 탐침 분자로 준비했으며, 완충용액은 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-Ethanesulfonic Acid, pH 7.4)의 조성으로 준비했다. 완충용액 450 ㎖에 탐침 분자를 200 nM이 되도록 넣은 후 RRE RNA를 넣어주어 탐침 분자와 RNA를 결합시켰다. 결합하면 형광 이등방성(Fluorescence anisotropy) 값은 증가하게 된다. 이후에 탐침 분자와 경쟁적으로 표적 RNA에 결합하는 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 혼합하면서 이등방성 값의 변화를 측정하고 표적 RNA와 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체 간의 결합 세기는 하기 수학식 1에 의해 KaleidaGraph로 정했다. 형광이등방성(Fluorescence Anisotropy)은 형광광도계(Luminescence Spectrometer, PerkinElmer, USA)를 이용하여 20℃에서 측정하였다.
<수학식 1>
[Conjg]는 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체의 농도; [RNA]는 표적 RNA의 농도; [Probe]0는 탐지 분자의 농도; A는 단계 4의 형광이등방성 값; Amax는 단계 3의 형광이등방성(totally bound tracer; 전체 결합 추적자) 값; A0는 RNA에 결합하지 않은 탐지 분자의 형광이등방성(totally free tracer; 전체 자유 추적자) 값; 및, Kd는 정해진 양의 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체의 표적 RNA에 대한 결합력을 나타낸다.
아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체 라이브러리의 RRE RNA에 대한 결합력(Kd) 측정 결과를 표 3에 기재하였고, 그 오차는 대략 20% 내외이다.
표 3: 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체 라이브러리의 RRE RNA에 대한 결합력(Kd)
서열 번호 Kd(nM) 서열 번호 Kd(nM) 서열 번호 Kd(nM)
1 0.12 11 0.18 21 0.21
2 0.44 12 0.26 22 0.19
3 0.6 13 0.019 23 0.23
4 0.36 14 0.15 24 0.22
5 0.55 15 0.13 25 0.040
6 0.14 16 0.19 26 0.11
7 0.21 17 0.26 27 0.22
8 0.11 18 0.25 28 0.18
9 0.15 19 0.33 29 0.20
10 0.034 20 0.20 30 0.33
표 3의 결과에서 아크리딘이 하나 치환되어 있는 펩티드(서열번호 1 내지 7) 중에 RRE RNA에 1 nM 보다 센 결합력을 가진 서열번호 1 또는 6으로 기재되는 펩티드를 발견하게 되었으며, 이는 아크리딘이 결합하지 않은 알파 나선형 펩티드(22 nM)에 비하여 무려 220 배 정도 증가한 강도를 가진다. 아크리딘이 두 개 결합한 서열번호 8 내지 28도 많은 경우에 100 pM이 되지 않는 강력한 결합을 하는 경우가 많았으며, 특히 서열번호 10으로 기재되는 펩티드(34 pM), 서열번호 13으로 기재되는 펩티드(19 pM), 서열번호 25로 기재되는 펩티드(40 pM) 등이 가장 강력한 결합을 하고 있는 것으로 조사되었다. 세 개의 아크리딘이 치환된 것은 두 개(서열번호 29, 30으로 기재되는 펩티드)만을 만들어 보았으나 결합력이 단일 치환 또는 이중 치환된 것에 비하여 좋지 않은 결과를 보여주었다.
하나 또는 두 개의 아크리딘의 치환에 의한 펩티드의 RRE RNA에 대한 결합력의 증가는 헤어핀 구조를 갖는 RNA에 특이적인 결합을 위해서 두 가지 이상의 RNA 결합 요소(예를 들어 DNA와 같은 스템 구조, 단일 가닥으로 구성된 루프 구조, 하나 또는 두 개의 염기로 구성이 되어 있는 kink 또는 벌지 구조)에 대응하는 분자 구조를 가져야 한다는 기존에 알려진 사실과 일치한다(Kirk SR, Luedtke, NW, Tor Y, J. Am. Chem. Soc., 122, 980-981, 2000). 즉, RNA 스템 부분과 같은 이중 나선 모양으로 하고 있는 부분에 결합하는 요소가 알파 나선을 가진 펩티드라면 RNA 벌지화된 루프 부분과 결합할 수 있는 요소는 아크리딘 분자이므로, 펩티드-아크리딘을 연결한 분자는 RNA의 스템 부분과 벌지화된 루프 부분에 동시에 결합할 수 있다. RNA의 특성화된 두 부분에 결합하는 요소를 펩티드에 배열하면 결합력의 증가가 놀랍게 향상되는 것이다. 본 발명에서 22 nM 정도의 결합력이 있는 펩티드(서열번호 31로 기재되는 펩티드)에 아크리딘을 하나 연결하여 120 pM(치환 되지 않은 펩티드에 비하여 약 200 배)과 아크리딘을 두 개 연결하여 19 pM(치환되지 않은 펩티드에 비하여 약 1,000 배)의 결합력의 증가를 나타내었다. 펩티드에 두 개 정도의 아크리딘이 이상적으로 배열되었을 때 가장 결합력이 좋은 결과를 주므로, 펩티드에 아크리딘의 치환 정도 보다는, 두 개의 치환된 아크리딘의 RNA와의 상대적인 위치에 따라, 헤어핀 구조를 가진 RNA에 대한 결합력의 세기 및 특이성이 결정되는 것으로 보인다.
더불어, 표 2와 표 3의 결과를 비교하여, 결합체의 RRE에 대한 결합력과 알파나선 정도는 아크리딘이 하나 치환된 펩티드의 경우(펩티드 1 내지 7) 반비례하는 경향성을 보이나, 아크리딘이 두 개 이상 들어간 펩티드에 대해서는 결합력과 알파나선 정도의 상관 관계는 파악할 수 없었다. 즉, 아크리딘이 하나 치환되어 있을 때의 펩티드의 안정성은 아크리딘의 위치에 크게 의존하여 나타나지만, 두 개 이상의 아크리딘이 펩티드에 결합되어 있을때에는 큰 변화가 없다. 아크리딘이 하나 치환되어 있을 때에는 오히려 알파 나선이 적은 것이 헤어핀 RNA에 강력한 결합을 하는 경향성이 있으므로 이는 유도된 맞춤 (induced fit) 기작에 의해 RNA와 펩티드가 결합하는 것으로 사료된다. 실제로 약간의 RNA(0.1 당량)을 펩티드 용액에 섞어주게 되면 펩티드의 알파 나선 정도가 많이 증가하는 것을 관측하였다.
<1-3> 선택된 RRE RNA 특이 결합 팹티드의 특이성 검증
실험예 <1-2>에 의해 측정된 본 발명의 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체 라이브러리의 RRE RNA에 대한 결합력은 수백 내지 수십 피코몰라로 다양했으며, RRE RNA에 대하여 가장 강력한 결합력을 나타내는 결합체는 RRE RNA의 특이 결합 리간드로 선택되었다. 선택된 리간드는 아크리딘이 결합하지 않은 알파 나선형 펩티드에 비해 결합력이 대략 200 내지 대략 1,000 배 정도 증가하는 놀라운 효과를 보였다. 본 발명은 상기 선택된 리간드의 RRE RNA에 대한 특이성을 검증하였다.
결합력이 증가한 아크리딘 펩티드의 특이성 증가 여부를 알아보기 위하여 RNA 중에 세포 내에서 가장 흔하게 발견되는 tRNAmix(Sigma-Aldrich, Germany)에 대한 결합력을 측정하고 이것과 RRE에 대한 결합력을 비교함으로써 차별비 (discrimination ratio; tRNA에 대한 Kd/RRE RNA에 대한 Kd)를 정하였다. 즉, 일반적인 RNA인 tRNA에 비하여 RRE RNA에 대해 결합력이 좋은 펩티드는 높은 차별비를 가지게 되므로 아크리딘으로 치환된 펩티드들의 특이성 증가를 볼 수 있다. 가장 결합력이 좋게 나타난 서열번호 1로 기재되는 펩티드(단일 아크리딘으로 치환된 결합체 중)과 서열번호 13으로 기재되는 펩티드(이중 아크리딘으로 치환된 결합체 중)에 대한 tRNAmix에 대한 결합력을 실험예 <1-2>의 RRE RNA의 결합력 측정과 같은 방법으로 실시하였다. 그 결과 서열번호 1로 기재되는 펩티드와 서열번호 13으로 기재되는 펩티드의 tRNAmix에 대한 결합력은 각각 1,100 pM과 330 pM로 나타났고, 차별비는 각각 8.6 과 17로 나타났다. 이는 아크리딘을 결합시키지 않은 서열번호 31로 기재되는 펩티드의 차별비인 2.8을 훨씬 능가하는 수준이므로, 아크리딘을 펩티드에 결합시켜 새로운 결합체를 구성함으로써 헤어핀 RNA에 대한 특이성의 상당한 향상을 나타내었다.
본 발명은 아크리딘을 포함하는 알파 나선형 펩티드를 이용한 RNA 특이 결합 펩티드를 탐색하는 방법을 제공함으로써 표적 RNA에 특이 결합하는 화합물 선별과 표적 RNA의 기능 탐구 및 신약의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 아크리딘을 포함한 알파 나선형 펩티드 1의 나타낸 도이며,
도 2는 아크리딘을 포함하는 알파 나선형 펩티드와 RRE RNA의 복합체의 컴퓨터 시뮬레이션도이다.
<110> YU, jaehoon <120> Acridine-alpha helix peptide conjugate for target RNA specific binding <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (2) <223> acridine conjugated lysine <400> 1 Leu Xaa Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (3) <223> acridine conjugated lysine <400> 2 Leu Lys Xaa Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (6) <223> acridine conjugated lysine <400> 3 Leu Lys Lys Leu Leu Xaa Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (9) <223> acridin conjugated lysine <400> 4 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (10) <223> acridin conjugated lysine <400> 5 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Xaa Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (13) <223> acridin conjugated lysine <400> 6 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Xaa Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (15) <223> acridin conjugated lysine <400> 7 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (2)..(3) <223> acridin conjugated lysine <400> 8 Leu Xaa Xaa Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (2) <223> acridin conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (6) <223> acridin conjugated lysine <400> 9 Leu Xaa Lys Leu Leu Xaa Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (2) <223> acridin conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (9) <223> acridin conjugated lysine <400> 10 Leu Xaa Lys Leu Leu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (2) <223> acridin conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (10) <223> acridin conjugated lysine <400> 11 Leu Xaa Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Xaa Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (2) <223> acridin conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (13) <223> acridin conjugated lysine <400> 12 Leu Xaa Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Xaa Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (2) <223> acridin conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (15) <223> acridin conjugated lysine <400> 13 Leu Xaa Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (3) <223> acridine conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (6) <223> acridine conjugated lysine <400> 14 Leu Lys Xaa Leu Leu Xaa Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (3) <223> acridine conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (9) <223> acridine conjugated lysine <400> 15 Leu Lys Xaa Leu Leu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (3) <223> acridine conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (10) <223> acridine conjugated lysine <400> 16 Leu Lys Xaa Leu Leu Lys Leu Leu Lys Xaa Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (3) <223> acridine conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (13) <223> acridine conjugated lysine <400> 17 Leu Lys Xaa Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Xaa Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> 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acridine conjugated lysine <400> 21 Leu Lys Lys Leu Leu Xaa Leu Leu Lys Lys Leu Leu Xaa Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (6) <223> acridine conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (15) <223> acridine conjugated lysine <400> 22 Leu Lys Lys Leu Leu Xaa Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (9)..(10) <223> acridine conjugated lysine <400> 23 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Xaa Xaa Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (9) <223> acridine conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (13) <223> acridine conjugated lysine <400> 24 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu Leu Xaa Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (9) <223> acridine conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (15) <223> acridine conjugated lysine <400> 25 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu Leu Lys Leu Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (10) <223> acridine conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (13) <223> acridine conjugated lysine <400> 26 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Xaa Leu Leu Xaa Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (10) <223> acridine conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (15) <223> acridine conjugated lysine <400> 27 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Xaa Leu Leu Lys Leu Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (13) <223> acridine conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (15) <223> acridine conjugated lysine <400> 28 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Xaa Leu Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (2) <223> acridine conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (9) <223> acridine conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (15) <223> acridine conjugated lysine <400> 29 Leu Xaa Lys Leu Leu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu Leu Lys Leu Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acridine conjugated alpha helix peptide <220> <221> SITE <222> (2)..(3) <223> acridine conjugated lysine <220> <221> SITE <222> (13) <223> acridine conjugated lysine <400> 30 Leu Xaa Xaa Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Xaa Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha helix peptide <400> 31 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 32 <211> 50 <212> DNA <213> HIV-1 RRE DNA Sense strand <400> 32 ccgtaatacg actcactata ggtgggcgca gcttcggctg acggtacacc 50 <210> 33 <211> 50 <212> DNA <213> HIV-1 RRE DNA anti-Sense strand <400> 33 ggtgtaccgt cagccgaagc tgcgcccacc tatagtgagt cgtattacgg 50

Claims (17)

  1. 알파나선형 펩티드의 염기성 아미노산인 라이신(Lysine, Lys, K)의 아민기가 아크리딘의 링에 직접 연결된 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체.
  2. 제 1항에 있어서, 알파 나선형 펩티드는 염기성 아미노산인 라이신, 친수성 아미노산 및 소수성 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 결합체.
  3. 제 1항에 있어서, 알파 나선형 펩티드는 안정한 2차 구조인 나선형을 구성하기 위하여 적어도 14 내지 21개의 아미노산으로 구성된 펩티드인 것을 특징으로 하는 결합체.
  4. 제 1항에 있어서, 알파 나선형은 한 개 또는 두 개의 소수성 아미노산과 염기성 아미노산인 라이신이 한 개 또는 두 개 씩 상기 펩티드 서열의 가운데에 교대로 배열됨으로써 알파 나선형 구조가 될 때에 펩티드의 일측면에 나란히 배열되는 것을 특징으로 하는 결합체.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 2항에 있어서, 소수성 아미노산은 류신(Leucine, Leu, L)인 것을 특징으로 하는 결합체.
  8. 제 2항에 있어서, 친수성 아미노산은 헤어핀 구조의 RNA와 결합하도록 펩티드의 한쪽 끝에 배열한 것임을 특징으로 하는 결합체.
  9. 제 2항에 있어서, 친수성 아미노산은 글라이신(Glycine, Gly, G)인 것을 특징으로 하는 결합체.
  10. 제 1항에 있어서, 아크리딘은 제 2항의 염기성 아미노산인 라이신에 연결된 형태로 1 개 내지 7 개가 배열되는 것을 특징으로 하는 결합체.
  11. 제 1항에 있어서, 아크리딘은 제 2항의 염기성 아미노산인 라이신에 연결된 형태로 2 개 내지 3 개가 배열되는 것을 특징으로 하는 결합체.
  12. 알파나선형 펩티드의 염기성 아미노산인 라이신의 아민기가 아크리딘의 링에 직접 연결된 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체 라이브러리.
  13. 1) 제 1항의 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 제조하고 정제하여 표적 RNA 특이 리간드 탐색용 라이브러리를 구성하는 단계;
    2) 특이 결합 리간드를 탐색하고자 하는 표적 RNA를 합성하는 단계;
    3) 표적 RNA와 탐침 분자를 혼합하여 결합하도록 한 후, 형광이등방성을 측정하는 단계;
    4) 단계 3의 혼합물에 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체를 혼합하여 경쟁적으로 표적 RNA에 결합하도록 한 후, 형광이등방성을 측정하는 단계;
    5) 단계 3 내지 4의 측정 결과로부터 단계 1의 결합체와 단계 2의 표적 RNA 간의 결합강도를 하기 수학식 1에 적용하여 산출하는 단계;
    6) 단계 5의 산출값을 비교, 평가하여 표적 RNA에 특이적인 리간드를 선택하는 단계; 및
    7) 단계 6의 선택된 리간드의 특이성을 증명하는 단계로 이루어진 단계 1의 라이브러리 내 표적 RNA 특이 결합 리간드의 탐색 방법.
    <수학식 1>
    [Conjg]는 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체의 농도; [RNA]는 표적 RNA의 농도; [Probe]0는 탐지 분자의 농도; A는 단계 4의 형광이등방성 값; Amax는 단계 3의 형광이등방성(totally bound tracer; 전체 결합 추적자) 값; A0는 RNA에 결합하지 않은 탐지 분자의 형광이등방성(totally free tracer; 전체 자유 추적자) 값; 및, Kd는 정해진 양의 아크리딘-알파 나선형 펩티드 결합체의 표적 RNA에 대한 결합력.
  14. 제 13항에 있어서, 탐침 분자는 형광을 띄고 결합체와 경쟁하여 RNA에 결합할 수 있는 태그로 표지되어 있는 화합물인 것을 특징으로 하는 탐색 방법.
  15. 표적 RNA가 Rev RNA 일 때, 제 13항의 방법에 의해 탐색된 서열 1 내지 30 중에서 어느 하나인 펩티드 RRE RNA 특이 결합 리간드.
  16. 제 15항의 RRE RNA 특이 결합 리간드를 유효성분으로 포함하는 RNA 활성 저해제.
  17. 제 15항의 RRE RNA 특이 결합 리간드를 유효성분으로 포함하는 AIDS 치료제.
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