JP7262105B2 - 細胞透過性配列を有するポリペプチド及びそれを含む組成物 - Google Patents
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Description
(1)下記式(I):
で表されるポリペプチド。
(2)R1及びR2がともにメチル基である、上記(1)に記載のポリペプチド。
(3)R4が、水素原子又はC1~C3のアルキル基である、上記(1)又は(2)に記載のポリペプチド。
(4)前記C末端が修飾されている、上記(1)~(3)のいずれかに記載のポリペプチド。
(5)前記N末端が修飾されている、上記(1)~(4)のいずれかに記載のポリペプチド。
(6)下記式(II):
-Y1-Y2-Y3- (II)
[式中、Y1はLys及びOrnからなる群から選択されるカチオン性アミノ酸であり、Y3はGly、Ala、Phe、Leu、Val及びIleからなる群から選択される非カチオン性アミノ酸であり、Y2は少なくとも1種の第四級炭素を含む非天然アミノ酸であり、2~20個存在するY1,Y2及びY3の各々は同一でも異なっていてもよく、前記ポリペプチドのN末端及びC末端はそれぞれ修飾されていてもよいし、又は非修飾であってもよい。]
で表されるトリペプチド単位を2~20個含むことを特徴とする、上記(1)~(5)のいずれかに記載のポリペプチド
(7)N末端及びC末端の少なくとも一方に、反応性官能基を有する、上記(1)~(6)のいずれかに記載のポリペプチド。
(8)上記(1)~(7)のいずれかに記載のポリペプチドと対象物質とを含み、前記対象物質は前記ポリペプチドと一体となって存在しているか、或いは前記ポリペプチドと独立して存在していることを特徴とする細胞内浸入性組成物。
(9)前記対象物質が、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、天然もしくは非天然核酸、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、miRNA、siRNA、プラスミド、低分子量化合物、糖、脂質、糖脂質、造影物質、薬物、ナノ粒子、及び量子ドットからなる群から選択される、上記(8)に記載の組成物。
(10)Lys、His及びArgから選ばれる1種又は2種以上のアミノ酸の組み合わせが、2以上連続するカチオン性配列を含む第2のポリペプチドをさらに含有する、上記(8)又は(9)に記載の組成物。
(11)前記第1のポリペプチドの少なくとも一部と、前記第2のポリペプチドの少なくとも一部とが結合している、上記(10)に記載の組成物。
(12)上記(1)~(7)のいずれかに記載のポリペプチドを含む細胞内デリバリーキット。
(13)上記(1)~(7)のいずれかに記載のポリペプチドを細胞に接触させることにより、前記ポリペプチドと一体になって存在する、及び/又は前記ポリペプチドとは独立して存在する少なくとも1種の対象物質を前記細胞内に導入することを含む、細胞内への物質輸送方法。
本発明のポリペプチドは、下記式(I):
で表されることを特徴とする。
-Y1-Y2-Y3- (II)
[式中、Y1はLys及びOrnからなる群から選択されるカチオン性アミノ酸であり、Y3はGly、Ala、Phe、Leu、Val及びIleからなる群から選択される非カチオン性アミノ酸であり、Y2は少なくとも1種の第四級炭素を含む非天然アミノ酸であり、2~20個存在するY1,Y2及びY3の各々は同一でも異なっていてもよく、前記ポリペプチドのN末端及びC末端はそれぞれ修飾されていてもよいし、又は非修飾であってもよい。]
で表されるトリペプチド単位を2~20個含むことを特徴とするポリペプチドである。
本発明のポリペプチドは、例えば以下の工程を含む方法によって合成することができる。
この工程では、上記式(II)のトリペプチドを作製する。
一般的なペプチド合成法(例えばMerrifield法(Merrifield, Recent Progress in Hormone Res.,23:451(1967))によってトリペプチドを作製する。この方法は、側鎖を保護したα-アミノ酸を不溶性樹脂担体(固相)に順次結合させることを含む。固相に結合したリンカーに側鎖を保護した第1のα-アミノ酸のカルボキシ基を結合したのち、α-アミノ基の脱保護を行い、側鎖を保護した第2のα-アミノ酸(但しカルボキシ基を活性基で修飾する。)を結合(カップリング)し、同様に脱保護したのち、第3の側鎖を保護したα-アミノ酸をカップリングし、最後に、脱保護とリンカーの切断を行い、合成されたトリペプチドを回収し、精製することを含む。
この工程では、第1工程で合成したトリペプチドのC末端カルボキシ基をエステル化(例えばメチルもしくはエチルエステル化)し、必要であればリシン(Lys)のεアミノ基を保護したのち、トリペプチド(例えば約0.05~約0.5mM)を、例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などの緩衝液(pH7~8)中、パパイン、プロテイナーゼK、トリプシン、カテプシンB、プラスミン、ブロメライン、キモトリプシンなどのプロテアーゼ(例えば約1~約200mg/mL)の存在下、約40~約60℃で約10分~約4時間、酵素重合反応を行い、精製した沈殿を遠心分離によって回収し、純水で十分に洗浄し、白色固体を得ることを含む。もしリシン(Lys)のεアミノ基を保護した場合、最終産物から保護基を除去する操作が追加されうる。保護基が,例えばBoc基である場合、トリフルオロ酢酸又は塩酸-酢酸エチルなどの酸性条件下で保護基を除去可能である。
本発明はまた、上記1節に記載のポリペプチドと、対象物質とを含み、前記対象物質は前記ポリペプチドと一体となって存在しているか、又は前記ポリペプチドと独立して存在していることを特徴とする細胞内浸入性組成物を提供する。
本発明はさらに、上記1節に記載のポリペプチドを含む細胞内デリバリーキットを提供する。
本発明はさらに、上記1節に記載のポリペプチドを細胞に接触させることにより、前記ポリペプチドと一体になって存在する、及び/又は前記ポリペプチドとは独立して存在する少なくとも1種の対象物質を前記細胞内に導入することを含む、細胞内への物質輸送方法を提供する。
<材料>
以下の実施例では、渡辺化学工業株式会社、東京化成工業株式会社、富士フイルム和光純薬株式会社、又はシグマアルドリッチ社から入手した材料を用いた。
1H(500MHz)及び13C(125MHz)NMRスペクトルは、VARIAN NMR装置で測定した。
以下の合成例において、Bocはtert-ブトキシカルボニル基を表し、任意のアミノ酸に付記された場合は、当該アミノ酸のアミノ基がBoc(tert-ブチトキシカルボニル基)で保護されていることを表し、Zはベンジルオキシカルボニル基を表し、任意のアミノ酸に付記された場合は、当該アミノ酸のアミノ基がZで保護されていることを表し、また、任意のアミノ酸に付記されたOEtは、当該アミノ酸のカルボン酸がEt(エチル)エステルになっていることを表す。
Boc-Aib(4.06g,20.0mmol),HCl・Gly-OEt(2.79 g,20mmol)及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール・一水和物(HOBt・H2O)(2.97g,22.0mmol)を、フラスコ内でスターラーバーで撹拌しつつ混合し、0℃の窒素雰囲気下でクロロホルム(CHCl3)に溶解した。トリエチルアミン(2.79mL,20.0mmol)を添加した後、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC・HCl)(4.22g,22.0mmol)のクロロホルム溶液を約30分間かけて滴下添加した。溶液を0℃で1時間及び25℃で24時間撹拌した。溶液を、5%Na2CO3水溶液で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥した。MgSO4をろ別後、有機溶媒をロータリーエバポレータによって濃縮したところ、白色固体を得た。白色固体をジクロロメタンに0℃で溶解した。TFA(11.5mL,150mmol)を溶液に添加し、混合物を25℃で撹拌した。24時間後、有機溶媒を減圧下で除去した。粘着性の固体を定量的収率で得た。
Z-Lys(Boc)(3.80g,10mmol),HCl・AibGly-OEt(2.25g,10.0mmol)及びHOBt・H2O(1.49g,11.0mmol)をフラスコ内でスターラーバーで撹拌しつつ混合し、0℃の窒素雰囲気下でクロロホルム(CHCl3)10mLに溶解した。トリエチルアミン(1.39mL,10.0mmol)を添加した後、EDC・HCl(2.11g,11.0mmol)のクロロホルム溶液を約30分間かけて滴下添加した。溶液を0℃で1時間及び25℃で24時間撹拌した。溶液を、5%Na2CO3水溶液で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥した。MgSO4をろ別後、有機溶媒をロータリーエバポレータによって濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルを溶出液として用いて、粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィによって精製した。Z-Lys(Boc)AibGly-OEtを白色固体として得た。Z-Lys(Boc)AibGly-OEtをメタノール(47.5mL)中に溶解した。溶液に窒素ガスを15分間バブリングした後、カーボン(0.525g,10wt%)に担持されたパラジウムを注意深く添加した。窒素雰囲気を水素雰囲気で置き換えた後、25℃で溶液を48時間撹拌した。溶液をセライトでろ過し、ろ過物を減圧下で濃縮した。得られた粘性固体を水中に分散して、凍結乾燥した。Lys(Boc)AibGly-OEtを白色固体として得た。収率は69%であった。
13C NMR(132MHz,CDCl3):δ14.1,21.6,23.5,26.5,28.3,30.0,30.4,40.9,52.3,56.3,60.3,77.4,155.6,168.0,169.8,173.9
IR(neat):3296,3217,3047,2980,2939,2873,1168,1529,1456,1392,1366,1252,1173,1018,935,864,781cm-1.
出発原料としてBoc-Aib及びHCl・Ala-OEtを用いた以外は、HCl・AibGly-OEtと同様にして、HCl・AibAla-OEtを合成した。HCl・AibAla-OEtを白色粘着性固体として定量的収率で得た。
出発原料としてHCl・AibGly-OEtを用いた以外は、Lys(Boc)AibGly-OEtと同様にして、Lys(Boc)AibAla-OEtを合成した。Lys(Boc)AibAla-OEtを白色粘着性の固体として得た。収率は84%であった。
13C NMR(132MHz,CDCl3):δ14.0,16.8,21.6,23.5,26.2,28.3,30.0,47.9,52.3,56.2,60.3,66.4,77.4,155.6,168.0,172.6,173.2
IR(neat):3381,3244,2982,2940,2874,1688,1520,1454,1391,1366,1271,1250,1215,1175,1053,1020,866cm-1.
出発原料としてBoc-Aib及びHCl・Leu-OEtを用いた以外は、HCl・AibGly-OEtと同様にして、HCl・AibLeu-OEtを合成した。HCl・AibLeu-OEtを白色粘着性固体として定量的収率で得た。
出発原料としてHCl・AibLeu-OEtを用いた以外は、Lys(Boc)AibGly-OEtと同様にして、Lys(Boc)AibLeu-OEtを合成した。Lys(Boc)AibLeu-OEtを白色粘着性固体として得た。収率は51%であった。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ14.1,21.0,21.3,23.0,23.9,26.2,28.3,30.3,50.5,50.8,52.3,56.3,60.3,60.6,77.3,155.5,168.0,172.0,173.3
IR (neat):3331,3208,3046,2959,2870,1682,1516,1456,1386,1366,1271,1252,1173,1030,945,864,777cm-1.
Z-Aib(6.17g,26.0mmol),HCl・Lys(Boc)-OMe(7.71g,26.0mmol)及びHOBt・H2O(3.86g,28.6mmol)をフラスコ中でスターラーバーで混合し、0℃、窒素雰囲気下で、CHCl3(25mL)に溶解した。トリエチルアミンを添加した後、EDC・HCl(5.48g,28.6mmol)の溶液を、滴下により約30分間で添加した。溶液を0℃で1時間及び25℃で24時間撹拌した。溶液を5%Na2CO3水溶液で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥した。MgSO4をろ別後、有機溶媒をロータリーエバポレータで濃縮した。得られた粘着性固体をメタノール(130mL)中に溶解した。溶液に窒素ガスを15分間バブリングした後、カーボン(1.25g,10wt%)に担持されたパラジウムを注意深く添加した。窒素雰囲気を水素雰囲気で置き換えた後、25℃で溶液を48時間撹拌した。溶液をセライトでろ過し、ろ過物を減圧下で濃縮した。HCl・AibLys(Boc)-OMeを白色粘着性固体として定量的収率で得た。
Z-Lys(Boc)(9.21g,24.2mmol),HCl・AibLys(Boc)-OMe(8.35g,24.2mmol)及びHOBt・H2O(3.60g,26.6mmol)をフラスコ中でスターラーバーで混合し、0℃、窒素雰囲気下で、CHCl3(25mL)に溶解した。溶液を0℃で1時間及び25℃で24時間撹拌した。溶液を5%Na2CO3水溶液で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥した。MgSO4をろ別後、有機溶媒をロータリーエバポレータで濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルを溶出液として用いて、粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィによって精製した。Z-Lys(Boc)AibLys(Boc)-OEtを白色固体として得た。白色固体をMeOH(60mL)中に溶解した。溶液に窒素ガスを15分間バブリングした後、カーボン(0.864g,10 wt%)に担持されたパラジウムを注意深く添加した。窒素雰囲気を水素雰囲気で置き換えた後、25℃で溶液を48時間撹拌した。溶液をセライトでろ過し、ろ過物を減圧下で濃縮した。得られた粘性固体を水中に分散して、凍結乾燥した。Lys(Boc)AibLys(Boc)-OMeを白色固体として得た。収率は63%であった。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ26.3,28.3,29.0,38.2,56.3,77.3,155.5,168.0,172.7,173.4
IR(neat):3331,2976,2934,2866,1682,1514,1445,1391,1366,1271,1250,1171,1040,1007,866,781cm-1.
出発原料として、Boc-Aib及びHCl・Phe-OEtを用いた以外は、HCl・AibGly-OEtと同様にして、HCl・AibPhe-OEtを製造した。HCl・AibPhe-OEtを白色粘着性固体として、定量的収率で得た。
HCl・AibPhe-OEtを出発原料として、Lys(Boc)AibGly-OEtと同様にして、Lys(Boc)AibPhe-OEtを合成した。Lys(Boc)AibPhe-OEtを白色粘着性固体として得た。収率は63%であった。
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ13.9,21.6,24.0,25.6,28.3,30.6,36.7,52.3,54.1,56.3,60.4,77.4,126.4,128.2,129.2,137.6,155.6,168.1,171.4,173.3
IR(neat):3379,3285,3059,2980,2938,2870,1724,1688,1651,1518,1443,1389,1366,1350,1275,1217,1171,1140,1030,995,864,743,700cm-1
いずれの重合も、ガラス管中で行った。いずれの重合でも、基本的には、パパイン又はプロテイナーゼK(50mg/mL)の溶液を、リン酸緩衝液(1M,pH8.0)のトリペプチドエステル([M]0=0.1-0.2mM)溶液に添加し、得られた溶液を、40又は60℃で10-60分間撹拌し、その後、遠心分離(9,000rpm,15min)により、沈殿物を収集し、ミリQ水で2回洗浄した。凍結乾燥後、各ポリペプチドを白色粉末として、9-54%の収率で得た。
得られたポリペプチドを表1に示す。
各ポリペプチドを、フラスコ中で、25℃で、TFAに溶解した。24時間後、溶媒を減圧下で除去した。得られた生成物を凍結乾燥し、白色粉末として脱保護されたポリペプチドを得た。収率は11-55%であった。
各ペプチドを以下の方法に従ってテトラメチルローダミン(TAMRA)で標識した。
<円二色性(CD)分光法>
CDスペクトルは、JASCO J-820分光偏光計で測定した。測定には、光路長0.1cmの石英キュベットを用いた。スペクトルは190nmから240nmまで測定した。0.1wt%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を添加した各ペプチド(P(LysAibXaa):Xaa=Gly,Ala,Leu,Lys及びPhe)の30μM溶液について、20℃、窒素雰囲気下で測定した。データは、平均残留質量楕円率(mean residual mass ellipticity(deg cm2 dmol-1))として示す。ペプチド溶液の濃度は、各ペプチドの繰り返し単位の濃度から調整した。
上記CDスペクトル測定結果から、本発明の式(I)のP(LysAibGly)はランダムな二次構造を形成するが、P(LysAibAla)は範囲外のP(LysAibLys)と比較して、ヘリックス構造を多く含む二次構造を形成することが分かった。
蛍光偏光を用いて、TAMRA標識された各ペプチドとヘパリン硫酸との親和性を評価した。NaCl(150mM)を含む4mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH=7.2)中のポリペプチド及びヘパリン硫酸を、このアッセイのために調製した。ペプチド溶液をヘパリン硫酸溶液と混合した。ポリペプチドの最終濃度は、543nm(Δε=88,000cm-1M-1)の吸光度により決定される50nMに調整した。混合物を、25℃で30分間インキュベーションした後、570nmの蛍光異方性を、偏光子(490nmで励起)を用いた蛍光スペクトルを用いて測定した。データを正規化するために、ヘパリン硫酸の非存在下での蛍光異方性を標準とした。
各ポリペプチド(1mg/mL)を含む10mMリン酸緩衝液(pH=7.2)、及びトリプシン(10μg/mL)を含む10mMリン酸緩衝液(pH=7.2)を、37℃でインキュベーションし、1000rpmで撹拌して混合した。数時間後、60μLのペプチド溶液を、150μLの1%TFAに注ぎ、トリプシンを失活させた。30μLのBoc-Gly溶液を内部標準として添加した後、混合物を13,500rpmで遠心分離し、失活トリプシンを沈殿させた。上清を、RP-HPLC分析に使用し、ピーク面積を計算することによって、残留ポリペプチドの量を決定した。
HEK 293細胞を24ウェル培養プレートに播種し(20,000細胞/ウェル)、FBSを含む1mLのDMEM中、37℃、5%CO2下でインキュベーションした。24時間後、培地を、10%FBS及び5μMの各ポリペプチド試料を含有する500μLの新鮮培地と交換した。各インキュベーション時間の後、培地を除去し、細胞を400μLのトリプシン-EDTAで15分間トリプシン処理した。剥離した細胞を、4℃、1,600rpmで3分間遠心分離して収集した。細胞ペレットをPBS中に分散させて、4℃、1,600rpmで3分間遠心分離した。細胞溶解緩衝液で処理した後、細胞ペレットをホモジナイザーで均一化した。細胞片を13,500rpmの遠心分離で除去し、上清を各測定に用いた。マイクロプレートリーダーを用いて、570nmにおける各溶解物の蛍光強度を測定した。タンパクの重量によって、相対蛍光単位(RFU)を標準化するために、各ウェル中のタンパク量を決定するのにブラッドフォードタンパクアッセイキット(Bradford protein assay kit)を用いた。
上記結果から、本発明の式(I)のP(LysAibGly)、P(LysAibAla)は、従来の細胞透過性配列であるTatやR9と比較して長時間にわたって高い細胞内侵入性能(インターナリゼーション)を示すことが分かった。すなわち、高い酵素分解耐性により長期的に細胞内への導入が可能な細胞透過性ペプチドとして機能することが分かった。
HEK 293細胞を、FBSを含む100μLのDMEM 中で、96ウェル培養プレート上に播種した(2,500細胞/ウェル)。プレートを37℃,5%CO2でインキュベートした。24時間のインキュベート後、培地を5μMの各ポリペプチド試料を含有する100μLの新鮮培地と交換した。各インキュベーション時間の後、培地を除去し、細胞を100μLの新鮮な培地で2回洗浄した。最後に、各ウェルを100μLの新鮮培地で満たし、20μLの「CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent」(登録商標;プロメガ株式会社)を各ウェルに添加した。37℃、5%CO2下での2時間のインキュベーション後、490nmでの各ウェルの吸光度を、96ウェルプレートリーダーを用いて測定した。
図5から、本発明の式(I)のP(LysAibGly)、P(LysAibAla)は、従来の細胞透過性配列であるTatやR9と同様に、細胞侵入(インターナリゼーション)性能を示す濃度領域において細胞毒性は全く示さないことが理解できる。
FBSを含む1mLのDMEM培地中のHEK293細胞を3.5cm皿上に播種した。24時間のインキュベーション後、培地をFBS及び各ポリペプチド試料を含有する500μLの新鮮培地と交換した。ポリペプチドの最終濃度を5μMとした。2,8,及び16時間のインキュベーションの後、各ウェル中の培地を除去し、細胞を、Hoechst33342を含有する500μLの新鮮なDMEMとともに、37℃で15分間インキュベーションした。培地を除去し、皿を新鮮なDMEMで充填した。Hoechst33342核メーカ及び各テトラメチルローダミン標識化ポリペプチドの蛍光シグナルを、それぞれ405nm及び555nm(ダイオード)の励起波長で、共焦点レーザー走査顕微鏡LSM700(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)を用いて観察した。顕微鏡写真の共局在化分析はオペレーティングソフトウェア「Zen2011」を用いて行った。
図6、7、8から、本発明の式(I)のP(LysAibAla)は、既知の細胞透過性配列Tatと比較して、長期間にわたり効率的に細胞内へ導入されることが分かった。
細胞質内に黄色タンパク質(YFP)を発現しているシロイヌナズナAlabidopsis thaliana(YFPox)の葉を、直径1cmの円状に切断した。この葉の切片を、1.5mLのチューブに入れ、0.08MPaで1分間お及び-0.08MPaで1分間、100μLのTAMRA-標識された各ポリペプチド(50μM)に浸漬した。処理後の葉の切片を、暗所条件で、25℃、3時間インキュベーションした。CSLMを用いて、この葉の切片について、ポリペプチド内在化の定量的評価を行った。TAMRA標識化ポリペプチドの細胞内分布は、555nm(ダイオード)の励起波長で直接観察された。
図9から、本発明の式(I)のP(LysAibAla)は、既知の細胞透過性配列Tatと比較して、TAMRA-標識由来の蛍光を示す部位が黄色タンパク質の存在する細胞質とほぼ一致しており、植物細胞においても効果的に細胞内へ導入されることが分かった。
<カチオン性キャリアペプチドの合成>
スペーサー(テトラエチレングリコール,TEG)を介してマレイミド基(MAL)と結合した2種類のカチオン性キャリアペプチド、
MAL-TEG-(KH)14(配列部分:KHKHKHKHKHKHKHKHKHKHKHKHKHKH(配列番号3))、及び
MAL-TEG-(RH)14(配列部分:RHRHRHRHRHRHRHRHRHRHRHRHRHRH(配列番号4))
を、それぞれFmoc固相法により合成した。ペプチドの純度および分子量は,逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF-MS)によりそれぞれ確認した。
なお、Kはリシン、Hはヒスチジン、Rはアルギニンを意味する。
モノマーLysAibAlaのトリペプチドであって、リシンのN末端にシステイン(C)が結合したC-(LysAibAla)3(配列:CKXaaAKXaaAKXaaA、Xaa=Aib(配列番号5))をFmoc固相法により合成し、純度および分子量をRP-HPLCおよびMALDI-TOF-MSによりそれぞれ確認した。
トゲオキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼ(NanoLuc)をコードするプラスミドDNA(pDNA、p35S-NanoLuc-tNos)を準備した。20μgのpDNAを含む水溶液に、上記で調製した、2mg/mLのMAL-TEG-(KH)14あるいはMAL-TEG-(RH)14の水溶液を、N/P比(カチオン性キャリアペプチドに含まれる正に帯電した窒素とpDNAに含まれる負に帯電したリンのモル比)2の割合で混合し,全量が800μLとなるように調製した。これらの混合溶液をそれぞれ、4℃で30分間インキュベートすることにより、カチオン性キャリアペプチド-DNA複合体、即ち、MAL-TEG-(KH)-14/pDNAおよびMAL-TEG-(RH)14/pDNA、をそれぞれ得た。
カチオン性キャリアペプチドが有するマレイミド基と、C-(LysAibAla)3が有するシステイン(C)のチオール基とを付加反応させることで、上記で得られた各複合体を、上記ポリペプチドで修飾した。具体的には、以下の通りである。
試料溶液(800μL)をキャピラリーセル(DTS1070,Malalvern Panalytical社製)に移し、ゼータ電位計(Zetasizer Nano-ZS,Malalvern Panalytical社製)を用いてDLS測定を行った。
モデル植物としてベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)を選択した。ベンサミアナタバコは以下の手順で準備した。
Claims (11)
- 前記対象物質が、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、天然もしくは非天然核酸、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、miRNA、siRNA、プラスミド、低分子量化合物、糖、脂質、糖脂質、造影物質、薬物、ナノ粒子、及び量子ドットからなる群から選択される、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記C末端が、C1~C10のアルコキシ基、C1~C10のモノアルキルアミノ基もしくはジアルキルアミノ基、又はアミノ基により修飾されている、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 前記N末端が、アシル基(-C=O-OR;RはC1~C10のアルキル基)、アルコキシカルボニル基(-C=O-OR;RはC1~C10のアルキル基)、又はC1~10のアルキル基(前記アルキル基は、炭素鎖中の1以上の炭素が、酸素、窒素、硫黄によって置換されていてもよい)により修飾されている、請求項1~3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記反応性官能基が、マレイミド基を含む修飾基又はチオール基を含む修飾基である、請求項1~4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載のポリペプチド(第1のポリペプチド)と対象物質とを含み、前記対象物質は前記ポリペプチドと一体となって存在しているか、或いは前記ポリペプチドと独立して存在していることを特徴とする細胞内浸入性組成物。
- 前記対象物質が、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、天然もしくは非天然核酸、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、miRNA、siRNA、プラスミド、低分子量化合物、糖、脂質、糖脂質、造影物質、薬物、ナノ粒子、及び量子ドットからなる群から選択される、請求項6に記載の組成物。
- Lys、His及びArgから選ばれる1種又は2種以上のアミノ酸の組み合わせが、2以上連続するカチオン性配列を含む第2のポリペプチドをさらに含有する、請求項6又は7に記載の組成物。
- 前記第1のポリペプチドの少なくとも一部と、前記第2のポリペプチドの少なくとも一部とが結合している請求項8に記載の組成物。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む細胞内デリバリーキット。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載のポリペプチドをインビトロで細胞に接触させることにより、前記ポリペプチドと一体になって存在する、及び/又は前記ポリペプチドとは独立して存在する少なくとも1種の対象物質を前記細胞内に導入することを含む、細胞内への物質輸送方法。
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