CN104774923A - 一种测定转录调控复合体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定转录调控复合体的方法，属于分子生物学领域。本发明测定转录调控复合体的方法包括以下步骤：诱饵DNA序列的制备、编码条形码蛋白的DNA序列制备、条形码蛋白库的构建、转录调控复合体的筛选、转录调控复合体的原位邻近连接捕获和转录调控复合体的鉴定。本发明结合cDNA展示技术与邻近连接技术，建立了一种测定转录调控复合体的新方法，转录调控复合体的测定涉及多种蛋白-蛋白和蛋白-DNA相互作用的同时测定，该方法可实现在同一实验体系中同时测定蛋白-蛋白和蛋白-DNA的多种相互作用，有效地解决了现有技术中蛋白-蛋白互作和蛋白-DNA互作测定方法的在同一实验体系中的不兼容性。

Description

一种测定转录调控复合体的方法

技术领域

本发明涉及一种测定转录调控复合体的方法，具体涉及一种在同一实验体系中同时测定转录调控复合体的方法。

背景技术

细胞是由不同生物分子间相互作用形成的一个有序的生命活动基本单元，细胞内重大生命活动的发生和调节是通过分子间相互作用完成的。随着后基因组时代的到来，以生命内组元件间动态相互关系为研究对象的相互作用组学成为当今系统生物学研究的热点之一。然而简单的两两相互作用研究并不符合生命的动态特征，应从整体角度系统地研究相互作用组网络，因此，深入研究各分子间相互作用，特别是利用高通量的研究方法构建相互作用组网络，不仅可以全面地认识生命体的生理功能，系统理解分子调控机理，发现分子间互相联系的内在规律，还可能发现许多未知蛋白质的功能线索，对于从网络层面上整体认识疾病发生机制，对于揭示生命活动奥秘有重要意义。

目前，研究蛋白质相互作用的方法主要有体内和体外两类检测方法，体内检测手段主要包括酵母双杂交技术、细菌双杂交技术，荧光共振能量转移，蛋白质片段互补等，体外检测方法主要有免疫共沉淀-质谱分析技术，蛋白质芯片，表面等离子共振，pull-down，噬菌体展示技术等；同样地，研究蛋白质核酸相互作用的方法也主要分为体内和体外两大类，体内方法主要有酵母单杂交，染色质免疫沉淀等，体外方法有SELEX核酸适配体技术，凝胶阻滞实验，DNase I足迹等。体内技术均是在活细胞水平检测蛋白质之间的互作以及核酸与蛋白质之间的互作，这些技术是基因水平的操作，无需蛋白质纯化分离步骤，操作相对简单，另外在体内蛋白质容易正确折叠，提高了检测灵敏度，可检测到蛋白质之间以及蛋白质-核酸之间微弱或者瞬时的相互作用。体外技术是在离体条件下进行互作的检测，靶分子范围广，库容量大，便于大规模平行检测。

近年来，核酸高通量测序技术飞速发展，如果可以将蛋白质测序技术转化为核酸测序技术，这将为高通量平行测定相互作用提供可能性。cDNA展示技术将基因型(核酸序列)与表现型(氨基酸序列)共价连接，实现了蛋白质序列测定与核酸序列测定的转换，因此我们可以基于该技术建立一种新的测定相互作用的方法。

cDNA展示技术(cDNA display)是Nemoto等于2009年在mRNA展示技术(mRNA display)基础上发展和完善起来的一种稳定性更强、更实用的体外定向进化技术。1997年，Yanagawa和Szostak先后独立提出mRNA展示技术。该技术通过嘌呤霉素连接子将mRNA与其翻译的蛋白质共价连接在一起，形成稳定的mRNA-肽融合体，可得到库容量在10¹²-10¹⁴的随机肽库。mRNA展示技术的高通量性以及其他特性为研究互作提供了很好的平台。Shen等人构建了人不同组织的蛋白质文库来筛选钙离子依赖-钙调蛋白的互作蛋白。通过两轮的循环，共获得269个已有注释或者预测的互作蛋白。2008年，他们又在秀丽线虫蛋白文库中做了类似的实验，获得9个已知的钙调蛋白的互作蛋白，47个未知的互作的蛋白。Miyamoto-Sato等人通过麦胚提取液表达系统共翻译诱饵蛋白Fos及不同组织的蛋白文库来研究其的互作蛋白，共富集到10种直接或者间接与Fos互作的蛋白质。Tateyama等采用串联的TPA响应元件作为诱饵DNA序列，在由小鼠脑组织cDNA构建的随机蛋白库中，进行了六轮筛选，获得了AP-1家族一系列转录因子，其中有c-jun，c-fos，junD，junB，atf2以及b-atf等，该结果表明采用mRNA展示技术可以进行核酸蛋白质相互作用的筛选，并且便于进行蛋白质复合物的筛选。

cDNA展示技术对mRNA展示技术进行了重要改进，设计了一种新型的嘌呤霉素连接子，从而可以快速有效地形成cDNA-肽融合体，进行后续的体外选择实验。同时，DNA的稳定性远好于RNA，因此cDNA展示技术可以在更苛刻的环境下(如高温、高pH)进行实验，非常适合检测各种相互作用。另一方面，cDNA展示技术在定向进化的受体选择方面已经有了初步应用，Naimuddin等将一种α-蛇神经毒素的受体结合部位残基进行了随机突变，构建突变文库后，与受体进行亲和性分析，发现大部分都具有特异性亲和，IC₅₀在纳摩级别范围。鉴于cDNA展示技术的各种优点，以及mRNA展示技术在PPI中的成功应用，我们认为cDNA展示技术是研究相互作用的合适的技术。

染色质构象捕获是由Job Deker在2002年建立的用于研究细胞内染色质间的相互作用，该方法通过甲醛固定蛋白质核酸复合物，限制性酶切核酸使其片段化，再通过连接酶将由蛋白质介导的相互邻近的核酸片段连接，从而测定核酸之间的交互。近年来在此基础上建立了一系列高通量技术，用于全局核酸相互作用的捕获。邻位连接技术(proximity ligation assay,PLA)是由Ulf Landegren在2002年建立的，该方法通过一对亲和探针对目的分子识别，在蛋白质介导的邻近效应下，使用连接酶对探针连接，继而产生可扩增的检测信号，从而将对蛋白质的检测转变成为对DNA的检测，实现了痕量蛋白的分析，其检测灵敏度是酶联免疫吸附法(ELISA)的1 000倍。邻近连接技术可以用于研究蛋白质互作，以及蛋白质核酸互作方面，Gustafsdottir等运用PLA分析血管上皮生长因子A(vascular endothelial growth factorA,VEGF-A)与其两种受体VEGF-1和VEGF-2的作用，检测结果与受体磷酸化分析结果一致，而检测操作简单，时间仅需3小时，并且可以建立剂量响应曲线，根据曲线计算蛋白间亲和能力(半数最高抑制浓度,IC50)。Gustafsdottir等在PLA的基础上，建立了分析核酸与蛋白质相互作用的新方法，针对特定的DNA结合蛋白，设计PLA亲和探针，探针3’端为互补双链，5’端为单链，便于后续Taq连接酶的连接，通过实时荧光PCR便可以直观地考察待测DNA结合蛋白与DNA之间的互作，其利用这一针对于与人类疾病相关的转录因子p53、HNF-4α、USF1进行了检测，结果表明该方法与先前结果一致，而且灵敏度更高。

现行的各种检测相互作用的技术，均有其独特的优势及应用范围，但是针对于蛋白质互作和核酸蛋白质互作而言，其检测体系是相互独立的，并不能兼容，即不能在一个相同的体系里面同时检测蛋白互作以及蛋白核酸互作。现有研究方法在构建多组分相互作用组网络比如转录调控网络时存在一定的局限性，其将蛋白质互作(转录因子形成复合物)与核酸-蛋白质互作(转录因子与DNA结合位点)割裂开研究，获得的信息无法全面反应真实情况，因此建立新的分析方法十分必要。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷而提供一种测定转录调控复合体的新方法，该方法可实现在同一实验体系中同时测定转录调控复合体。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种测定转录调控复合体的方法，包括以下步骤：

诱饵DNA序列的制备：先进行重叠延伸PCR，再以重叠延伸PCR的产物为模板，扩增全长的诱饵DNA序列，最后以脱硫生物素修饰的碱基序列为引物进行扩增，得到带有脱硫生物素位点的DNA双链，即为诱饵DNA序列；

编码条形码蛋白的DNA序列制备：以cDNA文库为模板进行PCR扩增，采用两步PCR或连接Adapter的方法在PCR扩增产物上添加通用序列，获得全长编码条形码蛋白的DNA序列文库；其中，通用序列5’端包含体外转录元件、体外翻译元件、增强子元件和酶切位点，3’端包含纯化标签序列、间隔序列和接头的互补序列；

条形码蛋白库的构建：以构建的全长编码条形码蛋白的DNA序列文库为模板进行体外转录生成mRNA，降解模板DNA，mRNA与嘌呤霉素接头连接，进行体外翻译，形成核酸-蛋白质二元复合物，再反转录得到mRNA/cDNA-蛋白复合物，即cDNA/mRNA杂交双链的条形码蛋白；降解mRNA/cDNA杂交双链，加入带有脱硫生物素修饰的引物，使用Klenow Fragment合成cDNA第II链，形成cDNA-蛋白融合体，即cDNA双链条形码蛋白；使用纯化标签进行预筛选，去除多余的核酸以及由于移码突变造成错误或者截短翻译的蛋白，获得纯化的全长条形码蛋白库；

转录调控复合体的筛选：采用固相筛选或液相筛选的方法筛选转录调控复合体；

转录调控复合体的原位邻近连接捕获：先通过脱硫生物素修饰的诱饵DNA序列纯化条形码蛋白库，去除未发生互作的条形码蛋白，将筛选后的诱饵DNA序列及条形码蛋白的cDNA序列使用DNA聚合酶补齐末端，用DNA连接酶进行邻近连接，降解蛋白质；然后通过条形码蛋白中cDNA第II链的脱硫生物素进行第二次纯化，去除未发生连接的诱饵DNA序列；

转录调控复合体的鉴定：采用巢式PCR扩增邻近连接捕获的产物，然后检测PCR扩增产物。

本发明基于cDNA展示与邻位连接技术，建立测定转录调控复合体的新方法。本发明采用cDNA展示技术，将转录调控蛋白与其编码cDNA共价连接，形成蛋白-cDNA融合体，即条形码蛋白；该条形码蛋白与调控的诱饵DNA序列分子互作形成转录调控复合体，条形码蛋白的cDNA与调控的DNA片段在空间位置上相互邻近，在由相互作用介导的各组分邻近效应下，通过DNA连接酶的连接反应形成可扩增DNA标签序列；该标签序列将蛋白质的序列信息转换成了核酸序列信息，因而可以通过核酸序列信息推断蛋白-蛋白互作以及蛋白-DNA互作的分子种类。

本发明编码条形码蛋白的DNA序列要制备成cDNA展示的模式，cDNA展示用DNA文库的序列由可变区和通用序列区组成，其中可变区DNA序列可以是一系列已知的基因，可以是特定细胞或组织的cDNA文库，也可以是人工合成的随机文库。编码条形码蛋白的DNA序列制备中，cDNA展示用文库的通用序列区5’端的酶切位点置于起始密码ATG前。通用序列区的添加根据可变区文库的类型，以简便原则进行添加方法的选择，当可变区为特定的基因时，可选用两步PCR的方法，通过设计引物进行5’/3’端保守区的添加，当可变区为cDNA文库时，选择连接Adapter的方式，以减少PCR的循环数，提高文库的多样性。

本发明条形码蛋白库的构建中，可依据保守区设计的启动子序列，选用相应的RNA聚合酶进行体外转录；根据DNA文库的类型以及序列长度，优化体外转录条件，获得高浓度的RNA。在进行体外翻译后，优选加入高浓度盐(例如KCl/MgCl₂)，形成高盐环境，稳定核酸蛋白质二元复合物的形成。

本发明重复多次进行诱饵DNA序列的制备、编码条形码蛋白的DNA序列制备、条形码蛋白库的构建和转录调控复合体的筛选后，采用固相原位邻近连接的方式对相互作用复合物进行邻近连接捕获；转录调控复合体的原位邻近连接捕获中，进行了两次纯化，其目的在于降低背景噪声，提高转录调控复合体的特异性。转录调控复合体的鉴定中，优选先采用巢氏PCR的方法，进行两次低循环数PCR，扩增发生互作的核酸片段；然后根据初始DNA文库的类型，选择测序方式。

作为本发明所述测定转录调控复合体的方法的优选实施方式，所述诱饵DNA序列的制备中，将诱饵DNA序列进行荧光基团或量子点修饰。进行荧光基团或量子点修饰，以便于观察富集情况。

作为本发明所述测定转录调控复合体的方法的优选实施方式，在诱饵DNA序列3’端添加Mme I酶切位点或者为EcoP15 I酶切位点，以便用于高通量测序。

作为本发明所述测定转录调控复合体的方法的优选实施方式，所述编码条形码蛋白的DNA序列制备中，体外转录元件为T7 RNA聚合酶位点或SP6 RNA聚合酶位点；所述增强子元件为ε增强子；所述酶切位点为Mme I酶切位点或EcoP15 I酶切位点；所述纯化标签序列为His-tag；所述接头的互补序列为嘌呤霉素连接子互补序列LHR。编码互作蛋白的DNA序列制备中，体外翻译元件根据选用体外表达系统的不同而设定，也可以为通过体外筛选方式获得的有利于体外转录及体外表达的序列。

作为本发明所述测定转录调控复合体的方法的优选实施方式，所述编码条形码蛋白的DNA序列制备中，编码条形码蛋白的DNA序列文库的通用序列3’端还添加了Mme I酶切位点或EcoP15 I酶切位点。添加酶切位点，便于较大条形码蛋白的制备。

作为本发明所述测定转录调控复合体的方法的优选实施方式，所述条形码蛋白库的构建中，体外翻译在无细胞翻译系统中进行。更优选地，体外翻译在大肠杆菌S30无细胞翻译系统中进行。

作为本发明所述测定转录调控复合体的方法的优选实施方式，所述转录调控复合体的筛选中，固相筛选的方法为：先将条形码蛋白与固相载体孵育，去除与固相载体非特异结合的条形码蛋白，保留上清，再将诱饵DNA序列固定于带有链霉亲和素的固相载体上，并与上清中条形码蛋白孵育，获得特异互作的转录调控复合体；然后，通过生物素竞争性结合释放相互作用转录调控复合体，利用条形码蛋白所带的纯化标签序列进行纯化。固相筛选中，借助诱饵DNA序列中的脱硫生物素与链霉亲和素的特异亲和能力去除与固相载体非特异结合的条形码蛋白，借助条形码蛋白质的亲和纯化标签可除去非特异结合的诱饵DNA序列。该过程中，固相载体用量根据诱饵DNA序列的种类及长度进行计算，优选地，固相载体负载量为1/3左右；利用条形码蛋白所带的纯化标签序列进行纯化时，纯化介质用量优选为其负载量的1/10左右。固相筛选有助于降低背景噪声。

作为本发明所述测定转录调控复合体的方法的优选实施方式，所述固相载体为磁珠或凝胶。更优选地，所述磁珠为Dynabead MyONE C1磁珠或者琼脂糖微珠。

作为本发明所述测定转录调控复合体的方法的优选实施方式，所述转录调控复合体的筛选中，液相筛选的方法是通过凝胶阻滞进行消减筛选。液相筛选的方法优选为：将诱饵DNA序列、条形码蛋白、及诱饵DNA序列与条形码蛋白一起孵育后的三个样品同时进行非变性聚丙烯酰胺电泳，银染或者荧光成像观测不同样品条带的位置，通过与Maker比较，记录相对位置，切取胶上特定区域。通过凝胶阻滞进行消减筛选，针对要求保持天然构象的蛋白质。

作为本发明所述测定转录调控复合体的方法的优选实施方式，所述转录调控复合体的原位邻近连接捕获中，DNA聚合酶为T4 DNA聚合酶，DNA连接酶为T4 DNA连接酶。

作为本发明所述测定转录调控复合体的方法的优选实施方式，所述转录调控复合体的鉴定中，采用单克隆测序或高通量测序检测PCR扩增产物。其中，高通量测序检测PCR扩增产物的优选方法为：将PCR产物进行MmeI酶切(诱饵DNA序列以及蛋白的核酸序列均含有MmeI酶切位点，如果发生了相互作用，邻近连接后，两个酶切位点将以头对头的方式向两侧进行酶切)，获得固定长度的核酸片段，便于后续建库测序，测序结果进行生物信息学分析，绘制互作网络。

本发明的有益效果为：本发明结合邻近连接技术与cDNA展示技术，建立了一种测定转录调控复合体的新方法，该方法可实现在同一实验体系中同时测定蛋白-蛋白和蛋白-DNA的多种相互作用，有效地缓解了现有技术中蛋白-蛋白互作和蛋白-DNA互作测定方法的不兼容性。运用本发明的方法可以在一次实验中高效检测转录调控复合体的多种复杂相互作用，构建互作网络，有利于全面认识生命体系的调控机制。本发明的方法方便、快捷，且其为体外测定方法，蛋白、DNA的库容量较大，因而可以开展相互作用组的高通量测定，显著提高测定效率。

此外，本发明还具有下述优点：(1)本发明采用Klenow Fragment聚合酶，使用脱硫生物素修饰的引物进行cDNA第II链的合成，形成cDNA双链，增加了条形码蛋白的稳定性，可以在更严格的实验环境中进行操作；(2)现有技术仅采用单一筛选方式，适用范围有限，本发明提供固相筛选和液相筛选两种不同的筛选方式，可以针对不同样品进行筛选富集优化，从而获得专一性的转录调控复合体；(3)对连接技术而言，现有技术采用传统的夹板式连接，效率较低，本发明采用平末端双链的邻近连接技术对转录调控复合体进行捕获，这样也有利于降低背景噪音；(4)本发明采用巢氏PCR方法对连接核酸片段进行PCR，与现有技术对比，提高了特异性。

附图说明

图1为本发明采用cDNA展示技术制备条形码蛋白的流程图；

图2为本发明所述转录调控复合体的原位邻近连接捕获的流程图；

图3为本发明采用琼脂糖凝胶检测PCR扩增所得全长编码条形码蛋白的DNA序列文库的结果图；

图4为本发明采用琼脂糖凝胶检测全长编码条形码蛋白的DNA序列文库体外转录生成的mRNA的结果图；

图5为本发明所述液相筛选过程中凝胶阻滞检测图；

图6为本发明固相/液相筛选一轮后Polit-PCR检测图；

图7为本发明PCR检测转录调控复合体中核酸与蛋白质互作的结果图；

图8为本发明PCR检测转录调控复合体中蛋白质与蛋白质互作的结果图；

图9为本发明不同引物对PCR检测转录调控复合体中蛋白质与蛋白质互作的结果图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面以c-Fos/c-Jun转录调控复合体(以六次串联的TRE片段(TRE即佛波酯反应元件，是转录因子AP-1的结合位点，其序列为5`-TGACTCA-3`，如SEQ ID NO：21所示)作为诱饵DNA序列，c-Jun/c-Fos作为DNA结合蛋白)为例，对本发明作进一步说明。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

本发明中，“互作”即指相互作用。

转录调控复合体：由不同转录因子及其顺式作用元件，通过蛋白蛋白互作，及蛋白-DNA互作，形成的执行转录调控功能的复合物。

cDNA展示：指将基因型(核酸序列)与其表现型(氨基酸序列)共价连接的技术。

条形码蛋白：通过cDNA展示产生的cDNA-蛋白融合体，以其共价连接的cDNA作为条形码，从而对不同蛋白进行区分。

诱饵DNA序列：在转录调控复合体中，将顺式作用元件，即DNA序列定义为诱饵DNA序列。

诱饵DNA序列库：由诱饵DNA序列与对照DNA序列混合构成的DNA序列混合物，称为诱饵DNA序列库。

DNA：脱氧核糖核酸的缩写，一类带有遗传信息的生物大分子。由4种主要的脱氧核苷酸(dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成。它们的组成和排列不同，显示不同的生物功能，如编码功能、复制和转录的调控功能等,是生物遗传信息的载体。

RNA：核糖核酸的缩写，一种分子，组成单元为核糖核苷酸(含一个含氮碱基、一个核糖和一个磷酸基)。RNA是具有细胞结构的生物的遗传讯息中间载体，并参与蛋白质合成；还参与基因表达调控。

cDNA：具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA的缩写，与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶(反转录酶)的作用而合成。

mRNA：由DNA经转录而来带着相应的遗传讯息，为下一步翻译成蛋白质提供所需的讯息的RNA。

碱基：指嘌呤和嘧啶的衍生物，是核酸、核苷、核苷酸的成分。杂环化合物，其氮原子位于环上或取代氨基上，其中一部分(取代氨基，以及嘌呤环的1位氮、嘧啶环的3位氮)直接参与碱基配对。常见的核碱基共有5种：胞嘧啶(缩写C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T，通常为DNA专有)和尿嘧啶(U，通常为RNA专有)。

AP-1：激活子蛋白-1(activator protein 1,AP-1)由c-jun蛋白和c-fos蛋白家族成员组成，是细胞内归属于bZIP(Basic Leucine Zipper)类DNA结合蛋白的一种重要的转录因子。c-jun蛋白家族和c-fos蛋白家族成员之间相互作用而形成多种形式的同源二聚体或异源二聚体AP-1，存在于多种细胞中，可被激素、生长因子、细胞因子、神经介质、热休克、电休克、紫外线、氧应激、以及过表达的癌基因等多种刺激所诱导。

TRE：TPA responsive element，佛波酯反应元件，是转录因子AP-1的结合位点，其序列为5`-TGACTCA-3`。TRE可与经TPA活化的PKC诱导的AP-1结合。

c-Jun：c-jun蛋白家族成员含c-jun、jun B和junD。其氨基酸序列中均存在着若干个周期性的亮氨酸并具有螺旋结构，因而可通过LZ形式，以1:1的比例构成同源二聚体或异源二聚体复合物。

c-Fos：c-fos蛋白家族成员包括c-fos、fos B、foral和fraz。其氨基酸序列中亦存在着若干个周期性的亮氨酸并具有螺旋结构,可与jun蛋白家族形成稳定的异源二聚体复合物但不能形成同源二聚体。

BSA：牛血清白蛋白，又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent；在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。

PCR：聚合酶链锁反应，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段，由高温变性，低温退火，以及延伸三步反应组成，循环进行，特异扩增DNA片段。

巢式PCR：是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

RT-PCR：RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)即逆转录PCR，是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。

生物素：又称维生素H、维生素B7、辅酶R(Coenzyme R)等，它是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质。是一种维持人体自然生长、发育和正常人体机能健康必要的营养素，生物素与链霉亲和素可以发生特异性结合。

链霉亲和素：又称为链霉抗生物素蛋白，是从细菌阿维丁链霉菌中纯化出的一种60kDa的蛋白质。链霉抗生物素蛋白同源四聚体对生物素(即维生素B7)具有极高的亲和力。生物素与链霉抗生物素蛋白的结合是已知自然界中最强的非共价相互作用之一，其解离常数(Kd)大约是10-14mol/L。因为链霉抗生物素蛋白-生物素复合物对有机溶剂、变性剂(如盐酸胍)、洗涤剂(如SDS与曲拉通)、蛋白水解酶类及极端温度和pH具有良好耐受力，故链霉抗生物素蛋白被广泛用于分子生物学与生物纳米技术中。

嘌呤霉素：是一种蛋白质合成抑制剂,它具有与tRNA分子末端类似的结构，能够同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合，并掺入到生长的肽链中。虽然嘌呤霉素能够同A位点结合，但是不能参与随后的任何反应，因而导致蛋白质合成的终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟的多肽。

亲和层析：将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。

Pull-Down：即将靶蛋白与标签融合表达，并将蛋白固化在固相载体上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。

定向进化：又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解蛋白质的空间结构，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造基因，并定向选择出所需性质的突变蛋白。

此外，下述实施例中，未注明具体条件的实验方法(例如：PCR扩增)，按照常规分子生物学条件进行操作；或者有产品说明书时，按照产品说明书所建议的条件进行实验。

实施例中，采用cDNA展示技术制备条形码蛋白的流程如图1所示，本发明所述转录调控复合体的原位邻近连接捕获的流程如图2所示。图1中，(1)表示含有cDNA/mRNA杂交双链的条形码蛋白，用于液相筛选过程，(2)表示含有cDNA双链的条形码蛋白，用于固相筛选及原位邻近连接步骤。图1和图2中，SA表示链霉亲和素磁珠。

实施例一：固相筛选

本发明测定转录调控复合体的方法的一种实施例，本实施例所述测定转录调控复合体的方法包括以下步骤：1.诱饵DNA序列的制备；2.编码条形码蛋白的DNA序列制备；3.条形码蛋白库的构建；4.转录调控复合体的固相筛选；5.转录调控复合体的原位邻近连接捕获；6.转录调控复合体的鉴定。具体步骤如下：

1.诱饵DNA序列的制备

首先采用重叠延伸PCR的方式获得DNA双链。在50μL反应体系中依次加入1μL MDF，1μL MDR，23μL H₂O，25μL premix(Takara)，退火温度为60℃，8个循环，2％琼脂糖凝胶检测，PCR产物使用High pure PCR product purification(Roche)试剂盒进行纯化，以纯化之后的产物作为模板，以OPDF/MR为引物进行PCR扩增，为了添加脱硫生物素位点，再使用DIB/MR为引物，进行5轮扩增，获得全长的诱饵DNA序列；另外，为了更好地体现发明方法的特异性，我们在后续筛选过程中会加入对照DNA序列,其与c-Fos/c-Jun无结合能力,制备方式与诱饵DNA序列的制备方式相同,使用的引物分别为CDF/CDR,COPD/MR。在筛选过程中诱饵DNA序列与对照DNA序列按照1:10的比例进行混合，构成诱饵DNA序列库。其中，MDF的序列为：5′-TGATGACTCATCTCCTATGACTCATCCATTGCATGACTCAGACTTGATGAGTCAGCCGA-3′(如SEQ ID NO：11所示)；MDR的序列为：5′-TCTGAGCTCAGGCAAGGTGTCTGACTCATGCTCGGCTGACTCATCAAGTCTGAGTCATG-3′(如SEQ ID NO：12所示)；MR的序列为：5′-TCTGAGCTCAGGCAAGGTGTCTGACTCATG-3′(如SEQ ID NO：18所示)OPDF的序列为：5′-CAAGTCCATTGACGATACTCCAACTGATGACTCATCT-3′(如SEQ ID NO：13所示)；CDF的序列为:5′-TGAGGAAATGACCGAATTTCTCCTACCGAATTTCCATTGCACCGAATTGACTTGACCGA-3′(如SEQ ID NO：15所示)；CDR的序列为:5′-TCAATTCGGGGCAAGGTGTCAATTCGGTGCTCGGCAATTCGGTCAAGTCAATTCGGTGC-3′(如SEQ ID NO：16所示)；COPD的序列为:5′-CAAGTCCATTGACGATACTCCAACTGAGGAAATGA-3′(如SEQ ID NO：17所示)；DIB的序列为：5′-CAAGTCCATTGACGATACTCCAAC-3′,其5’端进行了脱硫生物素修饰(如SEQ ID NO：19所示)。

然后，使用Qubit 2.0对于DNA序列进行精确定量，计算固相载体DynabeadsMyone C1的用量；最后按照Dynabeads Myone C1的说明书进行诱饵DNA序列的固定。对照DNA序列的制备及固定与诱饵DNA序列的制备方式相同。

另外，在诱饵DNA序列制备时，可以采用修饰引物PCR的方式对诱饵DNA序列进行荧光基团(FAM、FITC等基团)或量子点修饰，从而便于观测富集效率。

2.编码条形码蛋白的DNA序列制备

以小鼠脑组织cDNA文库(康为世纪)为模板，MFJun/SRJun，MFFos/SRFos为引物进行PCR扩增获得c-Jun/c-Fos的DNA结合域序列，以pGEX-4T-1质粒为模板，MFGST/SRGST为引物进行PCR扩增获得GST序列，GST作为阴性对照。为了能够制备成cDNA展示用的DNA模式，要随后进行两次PCR，在5/3’端引入保守区。将第一次PCR获得的产物，作为第二次PCR的模板，以MT7/SR作为引物，进行第二次PCR，PCR产物进行纯化，再以此为模板，以MT7/LHR-59引物，进行第三次PCR，获得全长编码条形码蛋白的DNA序列文库，其中5’端包含T7 RNA聚合酶启动子序列,ε增强子,核糖体结合位点SD序列和Mme I酶切位点；3’区域包含His-tag，间隔区序列和嘌呤霉素连接子互补序列LHR。连接入pMD-18T载体，随机挑取单克隆送测序，比对序列。

采用琼脂糖凝胶检测PCR扩增所得全长编码条形码蛋白的DNA序列文库，实验结果如图3所示。图中，M表示DL500maker，1表示构建cDNA展示用c-Fos全长片段PCR产物，2表示构建cDNA展示用c-Jun全长片段PCR产物，3表示构建cDNA展示用GST全长片段PCR产物。

上述PCR扩增过程中，所用引物的序列如下：

MFJun：5′-GGAGGACTCCACCATGGAGATGCCGGGAGAGACG-3′(如SEQ IDNO：1所示)；SRJun：5′-AGCATACTTCCGACAAACGTTTGCAAC-3′(如SEQID NO：2所示)；

MFFos：5′-GGAGGACTCCACCATGGGCAGAGCGCAGAGCATC-3′(如SEQ IDNO：3所示)；

SRFos：5′-CAGCATACTTCCGACGAAGCCAAGGTC-3′(如SEQ ID NO：4所示)；MFGST：5′-GGAGGACTCCACCATGTCCCCTATACTAGG-3′(如SEQ IDNO：5所示)；SRGST：5′-CAGCATACTTCCGACATCAAGAGCGTC-3′(如SEQID NO：6所示)；MT7：

5′-TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAGTAAGGAGGACTCCACCATG-3′(如SEQ ID NO：7所示)；

SR：5′-GGCTGCCTCCCCCGCACGATGACAGCATACTTCC-3′(如SEQ ID NO：8所示)；LHR-59：

5′-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGATGATGATGATGGCTGCCTCCC-3′(如SEQ ID NO：10所示)；

3.条形码蛋白库的构建

1)将测序质量合格的三种蛋白c-JUN/c-FOS/GST，按照1:1:10的比例混合，使用T7 RNA聚合酶试剂盒进行转录反应，在50μL反应体系中依次加入5×buffer 10μL、rNTP 10μL、RRI 1μL、Enzyme mix 5μL、DNA模板24μL(其中模板先65℃，10min，再4℃，3min，轻微离心后加入反应体系)，30℃反应约8h。

2)将转录产物从30℃水浴锅取出，加入2μL RQ1 DNase，37℃，15min，降解模板DNA，1.5％琼脂糖凝胶检测转录产物，检测结果如图4所示；图中，M表示DL500 maker，1表示c-Fos转录生成的mRNA，2表示c-Jun转录生成的mRNA，3表示GST转录生成的mRNA。

3)转录产物的纯化按照OMEGA RNA纯化试剂盒说明书操作。纯化产物，稀释10倍之后，使用EON进行定量。

4)mRNA与嘌呤霉素接头的连接反应：首先在80μL反应体系中加入转录产物10μL、10×RNA连接酶缓冲液4.8μL、BSA 4μL、嘌呤霉素接头0.3μL、RNase-free H₂O 47.9μL，共71μL，(将混合溶液于4℃，5,000rpm稍作离心，然后依次于90℃加热2min、72℃加热1min、4℃加热5min)，反应结束后，将产物置于冰上依次加入RNA酶抑制剂3μL、T4 RNA连接酶3μL、T4多聚核苷酸激酶3μL(将混合溶液于4℃，5,000rpm稍作离心。25℃，20min)。

5)样品超滤：将80μL连接产物补RNase-free水至总体积为400μL，然后4℃，7,400g使用30K超滤管离心30min，至体积为30μL左右，最后将超滤管倒置，1,000g离心1min，保存滤液。

6)条形码蛋白库体外翻译：在反应体系中依次加入超滤产物10μL、RNA酶抑制剂2μL、预混翻译体系40μL(15μL S30翻译提取物、5μL氨基酸、20μL预混缓冲液)，30℃水浴20min，反应结束后，再依次加入3mol/L KCl 20μL、1mol/L MgCl₂6μL,充分混匀后，37℃水浴1h，反应结束后，-20℃保存

7)条形码蛋白库的翻译后处理：-20℃取出翻译产物，冰上融化，每管翻译产物(75μL×4)中加入40μL(10μL×4)0.5mol/L EDTA，混匀，冰上5min，加入300μL 2×结合缓冲液(Binding Buffer),混匀。4℃,3000r/min,离心30s，出现少许白色沉淀，轻弹混匀。

8)Myone C1磁珠处理：吸取Myone T1 300μL，置磁力架2min，弃保存液。加入500μL 1×结合缓冲液(Binding Buffer)，冲洗beads 2次，每次孵育2min。300μL缓冲液A洗两次；300μL缓冲液B洗一次(20r/min，2min)。

9)将经过翻译后处理的蛋白溶液，共600μL，加入磁珠，室温下20r/min,30min。

10)使用500μL 1×结合缓冲液(Binding Buffer)，冲洗磁珠3次，每次孵育2min。

11)使用300μL的1×核糖体释放缓冲液(460μL DEPC水，40μL0.5MEDTA，500μL 2×Binding Buffer)，冲洗beads 1次，使用相同缓冲液重悬磁珠，室温下20r/min,20min。

12)将磁珠置于磁力架上，弃1×核糖体释放缓冲液，使用300μL 1×反转录缓冲液，冲洗三次(共800μL)。

13)反转录合成cDNA-蛋白融合体：首先是cDNA第I链合成，向反应体系中加入5×反转录缓冲液30μL，dNTP 12μL，RNA酶抑制剂(Takara)5μL，DEPC水97μL，反转录酶(Prime Script，Takara)6μL，42℃，水浴1h,每隔5min轻弹一次(避免沉淀)；接着使用RNase H降解mRNA/DNA杂交双链，37℃,水浴30min，将磁珠置于磁力架，弃上清，使用Klenow Fragment缓冲液重悬磁珠；然后加入dNTP 5μL，T7BP 5μL，Klenow Fragment 5μL，37℃,水浴60min，合成cDNA第II链，将磁珠放于磁力架，室温静置2min，弃上清，除去多余的T7BP；最后RNase T1缓冲液重悬磁珠，吸取10μL，使用Qubit 2.0进行核酸以及蛋白质的分别定量。其中，T7BP的序列如SEQ ID NO：20所示，具体为：5′-TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAGTAAGGAG-3′，该序列的第十位碱基T进行了脱硫生物素修饰。

14)RNase T1酶切释放cDNA-蛋白融合体：向上述反应体系中分别加入DEPC水180μL，10×RNase T1缓冲液10μL，RNase T1 10μL，37℃,水浴30min(每隔5min弾一次)，将离心管置于磁力架，将300μL溶液吸取到另一新的离心管管中，加150μL DEPC水进行冲洗，合并两次液体，混匀，共计500μL(冰上保存)。

15)移码突变序列的去除：首先准备磁珠His–Mag beads，吸取2管150μLHis-Mag beads，置于磁力架上，弃保存液，加入600μL冲洗缓冲液(20mM咪唑)，室温孵育5min，弃冲洗缓冲液，重复上述步骤两次；接着将14)中的产物分别在两个管子中进行纯化，室温，20r/min，孵育30min；然后冲洗杂蛋白，将磁珠置于磁力架，弃上清，每管中加1ml含90mM咪唑的缓冲液，室温孵育2min，洗2次；最后洗脱含有His-tag的蛋白，将磁珠置于磁力架，弃上清，0.2mL含250mM咪唑缓冲液重悬磁珠，室温孵育5min，洗脱两次，共收集0.4mL洗脱液。

需说明的是，当制备的分子量大于4KD蛋白库(大于300个氨基酸)时，其编码的cDNA长度将达到1000bp左右，其与诱饵DNA序列(130bp左右)长度差别较大，不便于进行原位邻近连接，我们可以在制备编码条形码蛋白的DNA文库时，在其3’端添加Mme I或者EcoP 15I酶切位点，当制备完成cDNA双链条形码蛋白库后，进行Mme I或者EcoP 15I酶切，使用20bp左右的编码条形码蛋白的DNA序列来表示全长编码条形码蛋白的DNA，从而进行高效原位邻近连接。

4.转录调控复合体的固相筛选

1)Millproe 3K超滤管置换缓冲液：向cDNA-蛋白中加入9.6mL预冷转录调控复合体筛选缓冲液(DNA-Binding Protein selection buffer，由20mmol/LTris-HCL(pH 7.5)、4mmol/L MgCl₂、50mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、0.1％triton X-100、5mmol/L DTT和2％甘油组成)，3K超滤管进行超滤，4℃，4500g-4800g 30min至1mL，补齐10mL，继续超滤至1mL，重复操作两次。

2)将置换缓冲液后的条形码蛋白与链霉亲和素磁珠混合，在4℃置于旋转仪上缓慢振动，孵育2h，置于磁力架上，吸取上清，进行下面的转录调控复合体的筛选(这一步的目的是去除与固相介质非特异结合的条形码蛋白)。

3)第一次纯化，去除未结合的条形码蛋白：将2)中的上清与固相化诱饵DNA片段库(由诱饵DNA序列库固定于固相载体所得到)孵育在4℃置于旋转仪上缓慢振动，孵育2h，转录调控复合体筛选缓冲液冲洗磁珠，重复两次，洗脱未结合蛋白。

3)生物素竞争性结合释放互作复合物：将磁珠置于磁力架，弃上清，加入含有2mg/mL生物素的转录调控复合体筛选缓冲液，重悬磁珠，在4℃置于旋转仪上缓慢振动1h。置于磁力架上，吸取上清，进行透析，去除多余的游离生物素。

4)第二次纯化，去除未结合DNA序列的：利用条形码蛋白所带His-tag纯化标签，进行第二次纯化，将3)中的上清，通过透析置换缓冲液，使用His-Mag磁珠进行纯化，以纯化后的转录调控复合体作为模板，进行PCR扩增，分别获得富集的诱饵DNA序列，互作条形码蛋白的编码DNA片段，进行下一轮的固相筛选。

固相筛选过程中，筛选一轮后采用MT7/LHR-59进行Polit-PCR检测，检测结果如图6中1、3、5所示，图中，M表示DL500maker，1表示10循环PCR产物，3表示15循环PCR产物，5表示20循环PCR产物，箭头所示为c-jun/c-fos混合物，较大条带为gst。

5.转录调控复合体的邻近连接捕获

进行多轮固相筛选后，通过荧光检测或者挑克隆检测，诱饵DNA片段及条形码蛋白均有富集时，可以进行邻近连接。在进行邻近连接时，要重复上述1-4的步骤后，进行下列操作：

1)将第二次纯化后的转录调控复合体使用T4 DNA聚合酶补齐末端：200μL体系进行核酸片段末端补齐，10×T4 DNA聚合酶缓冲液20μL，dNTP 4μL，水172μL，T₄ DNA聚合酶4μL，11℃静置20min，加入0.5M EDTA 5μL混匀后室温静置3min使酶失活，将磁珠置于磁力架，弃上清，T4 DNA连接酶缓冲液重悬。

2)T4 DNA连接酶邻近连接：200μL的连接体系进行邻近连接反应，加入155μL dd H₂O，20μL 10×T4 DNA连接酶缓冲液，20μL PEG-4000，5μL T4DNA Ligase，16℃连接6h，缓慢振荡使得磁珠处于悬浮状态，磁珠沉积会影响连接效率，连接结束后，加入5μL 0.5M EDTA，室温放置5min，终止反应，将样品置于磁力架上，置换缓冲液。

3)生物素竞争性结合释放转录调控复合体：将磁珠置于磁力架，弃上清，加入含有2mg/mL生物素的转录调控复合体筛选缓冲液，重悬磁珠，在4℃置于旋转仪上缓慢振动1h。置于磁力架上，吸取上清，进行透析，去除多余的游离生物素。

4)降解蛋白：向3)中透析后的溶液中加入蛋白酶K 5μL，65℃水浴12h，再补加2μL蛋白酶K，继续反应超过2h，PCR产物回收试剂盒进行纯化。

5)未结合互作DNA片段5’末端脱硫生物素修饰的去除：加入4μL T4 DNA聚合酶，室温孵育30min，利用其的外切酶活性，切去核酸片段5端的脱硫生物素修饰。

6)生物素化连接片段捕获：50μL Dynabeads Myone C1磁珠进行带有生物素片段的捕获，100μL 1×Binding buffer冲洗2次，50μL 1×Binding buffer重悬磁珠，作为PCR的模板。

6.转录调控复合体的鉴定

1)针对于核酸蛋白互作以及蛋白互作，使用上一步6)中最后一步的产物作为模板，不同的引物对进行巢氏PCR，核酸蛋白互作使用BMD/SR进行第一轮PCR，以第一轮PCR产物为模板，NMD/NSR为引物进行第二轮PCR，蛋白互作时使用SR作为引物进行第一轮PCR，再以NSR为引物进行第二次PCR，要根据序列的类型进行PCR条件及体系的优化。其中，SR的序列为：

5′-GGCTGCCTCCCCCGCACGATGACAGCATACTTCC-3′(如SEQ ID NO：8所示)；BMD的序列为：

5′-TGCATGACTCAGACTTGATGACTCATCTCCTATGACTCA-3′(如SEQ IDNO：22所示)；NMD的序列为：5′-TGATGACTCATCTCCTATGACTCA-3′(如SEQ ID NO：14所示)；NSR的序列为：5′-GCACGATGACAGCATACTTCCGA-3′(如SEQ ID NO：9所示)。

2)PCR产物检测：1.5％琼脂糖凝胶检测PCR产物，EON定量后，转入pMD-18T载体，进行克隆测序，分析测序结果。

PCR检测转录调控复合体中核酸与蛋白质互作的结果如图7中1和2所示，其中，M表示DL500maker，1表示加入模板量为5ng，2表示加入模板量为10ng；PCR检测转录调控复合体中蛋白质与蛋白质互作的结果如图8所示，图8中，M表示DL500maker，1表示PCR产物；不同引物对PCR检测转录调控复合体中蛋白质与蛋白质互作的结果如图9所示，图9中，M表示DL500maker，1表示NSR/SRJun(一端用特异引物，另一端用通用引物)进行扩增后产物，2表示SRJun/SRFos(两端均用特异引物)进行扩增后产物，3表示NSR(两端均为通用引物)进行扩增后产物。

实施例二 液相筛选

本发明测定转录调控复合体的方法的一种实施例，本实施例所述测定转录调控复合体的方法包括以下步骤：1.诱饵DNA序列的制备；2.编码条形码蛋白的DNA序列制备；3.条形码蛋白库的构建；4.转录调控复合体的液相筛选；5.转录调控复合体的邻近连接捕获；6.转录调控复合体的鉴定。其中，步骤1、2、3、6分别与实施例一(固相相筛选)中的步骤1、2、3、6相同，步骤4、5存在区别，其步骤4、5如下：

4.转录调控复合体的液相筛选

1)Millproe 3K超滤管置换缓冲液：向cDNA-蛋白融合体中加入9.6mL预冷转录调控复合体筛选缓冲液(由20mmol/L Tris-HCL(pH 7.5)、4mmol/LMgCl₂、50mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、0.1％triton X-100、5mmol/L DTT和2％甘油组成)，3K超滤管进行超滤，4℃，4500g-4800g 30min至1mL，补齐10mL，继续超滤至1mL，重复操作两次。

2)将置换缓冲液后的条形码蛋白与诱饵DNA序列库(由诱饵DNA序列与对照DNA序列混合构成的DNA序列混合物)孵育，为了提高互作特异性，在4℃置于旋转仪上缓慢振动，孵育2h。

3)孵育后转录调控复合体进行凝胶阻滞实验，进行消减筛选，消减筛选的具体步骤如下述a～i；液相筛选过程中凝胶阻滞检测图如图5所示，图中，M表示DL500maker，1表示mRNA与嘌呤霉素接头连接产物，2表示纯化之后的连接产物，3表示c-Fos mRNA，4表示互作DNA片段。

a.非变性聚丙烯酰胺凝胶配制，配制体系如表1所示，室温放置2h后备用；

表1

b.使用六一24DN电泳槽恒流10mA，电泳1h，注意观测电压变化；

c.样品加入上样缓冲液，充分混匀，10mA恒流电泳约40min；

d.染胶及切胶：0.5ug/mL EB溶液染胶15min，根据Maker的位置，以及单独诱饵DNA片段，条形码蛋白的位置，使用干净刀片切下500bp以上的片段(包含互作复合物)，1.5mL离心管收集切下的凝胶；

e.将步骤d中切下的部分碾碎(可用枪头)，加700μL溶液A(天恩泽PAGE胶回收试剂盒)，混匀。室温20r/min，过夜(超过8h)；

f.室温，最大转速(14,000g)离心30min，小心吸取上清；

g.加1/10体积3mol/L醋酸钠，混匀，加4μL核酸沉淀剂(宝生物)，混匀，加5被体积预冷(-20℃)无水乙醇，充分混匀；

h.4℃，最大转速(14,000g)离心30min，弃上清，保留沉淀；加1ml预冷(-20℃)，70％乙醇，充分混匀。4℃，最大转速(14,000g)离心6min，洗2遍；

i.弃上清，室温空干1min(去除乙醇，空干时间不宜过长)，加50μL ddH₂O溶解，用于PCR。

液相筛选过程中，筛选一轮后采用MT7/LHR-59进行Polit-PCR检测，检测结果如图6中2、4、6所示，图中，M表示DL500maker，2表示10循环PCR产物，4表示15循环PCR产物，6表示20循环PCR产物，箭头所示为c-jun/c-fos混合物，较大条带为gst。通过比较固相与液相筛选一轮后Polit-PCR检测图，发现固相筛选和液相筛选效果相近。

5.转录调控复合体的邻近连接捕获

针对于液相筛选，在进行多轮筛选富集后，对于转录调控复合体的邻近捕获，为了提高特异性，将转录调控复合体进行原位固相连接，在进行邻位连接时，要先进行上述1-3，再进行如下步骤：

1)Millproe 3K超滤管置换缓冲液：加入9.6mL预冷化转录调控复合体筛选缓冲液(由20mmol/L Tris-HCL(pH 7.5)、4mmol/L MgCl₂、50mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、0.1％triton X-100、5mmol/L DTT和2％甘油),3K超滤管进行超滤，4℃，4500g-4800g 30min至1mL，补齐10mL，继续超滤至1mL，重复操作两次。

2)将置换缓冲液后的条形码蛋白与固相载体链霉亲和素磁珠，在4℃置于旋转仪上缓慢振动，孵育2h，置于磁力架上，吸取上清，进行下面的转录调控复合体筛选(这一步的目的是去除与固相介质非特异结合的条形码蛋白)。

3)第一次纯化，去除未互作的条形码蛋白，将2)中的上清与固相化诱饵DNA片段库在4℃置于旋转仪上缓慢振动，孵育2h，转录调控复合体筛选缓冲液冲洗磁珠，重复两次，洗脱未结合蛋白。

4)将纯化后的转录调控复合物使用T4 DNA聚合酶补齐末端：200μL体系进行核酸片段末端补齐，10×T4 DNA聚合酶缓冲液20μL，dNTP 4μL，水172μL，T4 DNA聚合酶4μL，11℃静置20min，加入0.5M EDTA 5μL混匀后室温静置3min使酶失活，将磁珠置于磁力架，弃上清，T4 DNA连接酶缓冲液重悬。

5)T4 DNA连接酶邻近连接：200μL的连接体系进行邻近连接反应，加入155μL dd H2O，20μL 10×T4 DNA Ligase缓冲液，20μL PEG-4000，5μL T4 DNALigase，16℃连接6h，缓慢振荡使得磁珠处于悬浮状态，磁珠沉积会影响连接效率，连接结束后，加入5μL 0.5mol/L EDTA，室温放置5min，终止反应，将样品置于磁力架上，置换缓冲液。加入蛋白酶K 5μL，65℃水浴12h，再补加2μL蛋白酶K，继续反应超过2h，PCR产物回收试剂盒进行纯化。

6)生物素竞争性结合释放转录调控复合体：将磁珠置于磁力架，弃上清，加入含有2mg/mL生物素的转录调控复合体筛选缓冲液，重悬磁珠，在4℃置于旋转仪上缓慢振动1h。置于磁力架上，吸取上清，进行透析，去除多余的游离生物素。

7)未结合互作DNA片段5’末端脱硫生物素修饰的去除：加入4μL T4 DNA聚合酶，室温孵育30min，利用其的外切酶活性，切去核酸片段5端的脱硫生物素修饰。

8)生物素化连接片段捕获：50μL Dynabeads Myone C1磁珠进行带有生物素片段的捕获，100μL 1×Binding buffer冲洗2次，50μL 1×Binding buffer重悬磁珠，作为PCR的模板。

液相筛选过程中，其转录调控复合体的鉴定(步骤6，具体操作同固相筛选的步骤6)中，PCR检测转录调控复合体中核酸与蛋白质互作的结果如图7中3和4所示，其中，M表示DL500maker，3表示加入模板量为5ng，4表示加入模板量为10ng；PCR检测转录调控复合体中蛋白质与蛋白质互作的结果如图8所示，图8中，M表示DL500maker，2和3表示PCR产物；不同引物对PCR检测转录调控复合体中蛋白质与蛋白质互作的结果如图9所示，图9中，M表示DL500maker，1表示NSR/SRJun(一端用特异引物，另一端用通用引物)进行扩增后产物，2表示SRJun/SRFos(两端均用特异引物)进行扩增后产物，3表示NSR(两端均为通用引物)进行扩增后产物。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种测定转录调控复合体的方法，其特征在于：包括以下步骤：

诱饵DNA序列的制备：先进行重叠延伸PCR，再以重叠延伸PCR的产物为模板，扩增全长的诱饵DNA序列，最后以脱硫生物素修饰的碱基序列为引物进行扩增，得到带有脱硫生物素位点的DNA双链，即为诱饵DNA序列；

编码条形码蛋白的DNA序列制备：以cDNA文库为模板进行PCR扩增，采用两步PCR或连接Adapter的方法在PCR扩增产物上添加通用序列，获得全长编码条形码蛋白的DNA序列文库；其中，通用序列5’端包含体外转录元件、体外翻译元件、增强子元件和酶切位点，3’端包含纯化标签序列、间隔序列和接头的互补序列；

条形码蛋白库的构建：以构建的全长编码条形码蛋白的DNA序列文库为模板进行体外转录生成mRNA，降解模板DNA，mRNA与嘌呤霉素接头连接，进行体外翻译，形成核酸-蛋白质二元复合物，再反转录得到mRNA/cDNA-蛋白复合物；降解mRNA/cDNA杂交双链，加入带有脱硫生物素修饰的引物，使用Klenow Fragment合成cDNA第II链，形成cDNA-蛋白融合体；使用纯化标签进行预筛选，去除多余的核酸以及由于移码突变造成错误或者截短翻译的蛋白，获得纯化的全长条形码蛋白库；

转录调控复合体的筛选：采用固相筛选或液相筛选的方法筛选转录调控复合体；

转录调控复合体的原位邻近连接捕获：先通过脱硫生物素修饰的诱饵DNA序列纯化条形码蛋白库，去除未发生互作的条形码蛋白，将筛选后的诱饵DNA序列及条形码蛋白的cDNA序列使用DNA聚合酶补齐末端，用DNA连接酶进行邻近连接，降解蛋白质；然后通过条形码蛋白中cDNA第II链的脱硫生物素进行第二次纯化，去除未发生连接的诱饵DNA序列；

转录调控复合体的鉴定：采用巢式PCR扩增邻近连接捕获的产物，然后检测PCR扩增产物。

2.如权利要求1所述的测定转录调控复合体的方法，其特征在于：所述诱饵DNA序列的制备中，将诱饵DNA序列进行荧光基团或量子点修饰。

3.如权利要求1所述的测定转录调控复合体的方法，其特征在于：所述编码条形码蛋白的DNA序列制备中，体外转录元件为T7RNA聚合酶位点或SP6RNA聚合酶位点；所述增强子元件为ε增强子；所述酶切位点为Mme I酶切位点或EcoP15I酶切位点；所述纯化标签序列为His-tag；所述接头的互补序列为嘌呤霉素连接子互补序列LHR。

4.如权利要求1所述的测定转录调控复合体的方法，其特征在于：所述编码条形码蛋白的DNA序列制备中，编码条形码蛋白的DNA序列文库的通用序列3’端还添加了Mme I酶切位点或EcoP15I酶切位点。

5.如权利要求1所述的测定转录调控复合体的方法，其特征在于：所述条形码蛋白库的构建中，体外翻译在无细胞翻译系统中进行。

6.如权利要求1所述的测定转录调控复合体的方法，其特征在于：所述转录调控复合体的筛选中，固相筛选的方法为：先将条形码蛋白与固相载体孵育，去除与固相载体非特异结合的条形码蛋白，保留上清，再将诱饵DNA序列固定于带有链霉亲和素的固相载体上，并与上清中条形码蛋白孵育，获得特异互作的转录调控复合体；然后，通过生物素竞争性结合释放相互作用转录调控复合体，利用条形码蛋白所带的纯化标签序列进行纯化。

7.如权利要求6所述的测定转录调控复合体的方法，其特征在于：所述固相载体为磁珠或凝胶。

8.如权利要求1所述的测定转录调控复合体的方法，其特征在于：所述转录调控复合体的筛选中，液相筛选的方法是通过凝胶阻滞进行消减筛选。

9.如权利要求1所述的测定转录调控复合体的方法，其特征在于：所述转录调控复合体的邻近连接捕获中，DNA聚合酶为T4DNA聚合酶，DNA连接酶为T4DNA连接酶。

10.如权利要求1所述的测定转录调控复合体的方法，其特征在于：所述转录调控复合体的鉴定中，采用单克隆测序或高通量测序检测PCR扩增产物。