JP4086325B2 - 標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子の同定方法 - Google Patents
標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子の同定方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定する方法に関する。本発明の方法は、特に、ssrＡ−ＲＮＡのｔａｇ−コード配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下でポリソームの形成が可能な条件下でのインビトロ翻訳工程によって特徴づけられる。本発明はさらに、本発明を実行するのに有用なキットに関する。
進化的な方法は、現在合理的な設計の能力および精度を越える、タンパク質工学の改善をもたらし得る。進化は、“世代”の成功、即ち遺伝的多様性のサイクルと、その後の望ましい表現型へのダーウィン選択と定義づけることができる。古典的な実験では、核酸はインビトロにおける物理的性質について解明されてきた（Saffhill, R., Schneider-Bernloehr, H., Orgel, L. E. & Spiegelman, S.（1970）J. Mol. Biol. 51, 531-539）が、この場合において表現型を与える物質は、遺伝物質と同一であった。オリゴヌクレオチドリガンド、通常、一本鎖ＲＮＡは、ＳＥＬＥＸ（Gold, L., Polisky, B., Uhlenbeck, O. & Yarus, M.（1995）Annu. Rev. Biochem. 64, 763-797; Irvine, D., Tuerk, C. & Gold, L.（1991）J. Mol. Biol. 222, 739-761）によって多くの標的が同定されており、そこでは合成ＤＮＡライブラリーが転写され、結合についてＲＮＡが選択され、逆転写して数回のラウンドに渡って増幅される。明らかに、非常に広い応用範囲を有する、表現型の運搬体としてのタンパク質に関する初期の実験は、直接的にまたはファージまたはウイルスのいずれかによって、遺伝子とタンパク質との間のカップリングを起こさせるために生細胞に頼っていた（Phizicky, E. M. & Fields, S.（1995）Microbiol. Rev. 59, 94-123。このタイプの実験では、コードされたタンパク質の多様性の情報運搬体としてのＤＮＡライブラリーは、細菌または真核細胞に形質転換またはトランスフェクトしなければならないので、得ることのできる多様性はＤＮＡ取り込みの効率によって著しく制限される（Dower, W. J. & Cwirla, S. E.（1992）in Guide to Electroporation and Electrofusion, eds. Chang, D. C., Chassy, B. M., Saunders, J. A. & Sowers, A. E.（Academic Press, San Diego）, pp. 291-301）。さらに、それぞれの世代において、ＤＮＡライブラリーは、最初に複製可能な遺伝的パッケージにライゲーションしなければならず、それにより多様性がさらに減少する。さらに、多くの有望な変異体が宿主の環境に逆らって選択されなければならないであろう。面倒な、インビトロでの多様化とインビボでのスクリーニングの反復的な切り替えを必要とするので、ごく少数の研究（Yang, W. P., Green, K., Pinz-Sweeney, S., Briones, A. T., Burton, D. R. & Barbas 3rd., C. F.（1995）J. Mol. Biol. 254, 392-403）のみが、ファージディスプレイのような方法を用いて１世代以上にわたりタンパク質最適化を伝えた。
この方法を回避または改善することを目標にして、数多くの研究所が、翻訳中にｍＲＮＡと対応する（ポリ）ペプチドとが、すぐ間近くにあることと物理学的な関係とに基づいて新規のシステムを設計してきた。したがって、一連の研究によって、特異的なｍＲＮＡがポリソームの免疫沈降によって豊富化され得るということが示された（Schechter, I.（1973）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 2256-2260; Payvar, F. & Schimke, R. T.（1979）Eur. J. Biochem. 101, 271-282; Kraus, J. P. & Rosenberg, L. E.（1982）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 4015-4019）。最近、Mattheakisと共同研究者らは、インビトロで遺伝子型と表現型を関連付けるために、ポリソームを使用したライブラリー由来の短いペプチドのアフィニティー選択を報告した（Mattheakis, L. C., Bhatt, R. R. & Dower, W. J.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9022-9026; WO95/11922）。
このシステムは、好ましくインビトロ転写システムと組み合わせたインビトロ翻訳システムを利用する。翻訳システムは、（ポリ）ペプチドのための適当なスクリーニング工程後のポリソーム複合体におけるｍＲＮＡと（ポリ）ペプチドの同時の単離を可能にする。好ましくは、Mattheakisシステムにおける（ポリ）ペプチドは、２つの成分からなっている。１つは、スクリーニングされるペプチドであり、もう１つはｍＲＮＡに結合する繋ぎ留め（tether）断片である。ポリソーム複合体におけるｍＲＮＡと（ポリ）ペプチドの同時単離は、E. coliについてそのような配列の存在が依然として不明であるとしても、翻訳ストーリング（stalling）配列の助けにより可能にできるかもしれない。この配列は、翻訳速度を減速させることによりポリソーム複合体の全体の安定性を増大させ、それにより（ポリ）ペプチドと対応するｍＲＮＡの同時スクリーニングと単離に適当な条件を可能にし得る。
同様の研究が、前にGoldおよび同僚（WO93/03172）およびKwasakiおよび共同研究者（WO91/05058）によって報告された。上記のシステムは、前記核酸によってコードされるタンパク質の同定により核酸を特徴付ける手段を確立したけれども、生成しようとする（ポリ）ペプチドのリボソームディスプレイの効率に関して実際的な制限が存在する。したがって本発明の前に立ちはだかる技術的課題は、（i）安定なＲＮＡ分子のコレクションの合成と（ii）このＲＮＡ分子の翻訳の効率を増加させ、それによりスクリーニングにおけるポリソームの使用の効率の増加を達成することであった。この技術的課題の解決は、クレームにおいて特徴付けられる態様を提供することによって達成される。
したがって、本発明は、標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）正確なリーディングフレームにおける終止コドンを欠くｍＲＮＡの集団を、インビトロ翻訳システムにおいて翻訳する工程であって、該翻訳システムは、ポリソームの形成が可能な条件下で、ssrＡ−ＲＮＡのtag−配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはssrＡ−ＲＮＡを含まない工程；
（ｂ）形成したポリソームを前記標的分子と、前記ｍＲＮＡ分子によりコードされ該ポリソームによってディスプレイされる（ポリ）ペプチドと前記標的分子との相互作用が可能な条件下で、接触させる工程；
（ｃ）前記標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをディスプレイするポリソームを、そのような（ポリ）ペプチドをディスプレイしていないポリソームから分離する工程；および
（ｄ）前記標的分子と相互作用するポリソームにおいてディスプレイされた（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定する工程
を含む方法に関する。
本発明において使用される用語「（ポリ）ペプチド」は、ペプチドとポリペプチドの両方を意味する。該（ポリ）ペプチドは、天然のまたは組換え的に加工されたアミノ酸配列のいずれかを含むであろう。後者の代用物にはさらに、融合タンパク質も含まれる。
本発明によれば、用語「ポリソーム」は、翻訳の間に、少なくとも１つの好ましくはいくつかのリボソームとｍＲＮＡによって形成される複合体を意味する。
ｍＲＮＡ分子の集団は、様々な起源のものであってよい。例えば、ｃＤＮＡライブラリー由来のものであろう。別の態様では、細胞または組織から直接得られるものであろう。突然変異を起こさせた（ポリ）ペプチドに本発明を使用して改善された変異体を見つけることも特に有利である。別法として、合成タンパク質またはペプチドライブラリーまたは抗体ライブラリーを使用することができる。
「ssrＡ−ＲＮＡのtagコード配列」なる語は、アミノ酸配列ＡＡＮＤＥＮＹＡＬＡＡをコードする核酸配列を意味する。この配列は、Keilerら，Science 221（1996）, 1990-1993に記載されている。
本発明の方法において用いられる翻訳システムに含まれるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリソームの形成を可能にする条件下で、ssrＡ−ＲＮＡのtagコード配列にハイブリダイズし、その翻訳をブロックするに適当な長さのものである。
ssrＡ−ＲＮＡを含まない翻訳システムは、機能的なssrＡ遺伝子を欠いているE. coli株、例えば、Ｘ９０ssrＡ１::cat（Keiler et al., Science 221（1996）, 1990-1993）、Ｎ２２１１またはＮＭ１０１（Ｔuら，J. Biol. Chem. 270（1985）,9322-9326）、Ｗ３１１０ΔssrＡ（Komineら，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91（1994）,9223-9227）、Ｋ７８２３またはＫ６６７６（RetallackおよびFriedman, Cel 83（1995）227-235）などから得られるものである。
翻訳されたｍＲＮＡ分子によってコードされ該ポリソームによってディスプレイされる（ポリ）ペプチドと対応する標的分子との相互作用を可能にする条件は、過度の負担なしに当業者が確立し得る。例えば、そのような条件は、ＷＯ９５／１１９２２，ＷＯ９３／０３１７２およびＷＯ９１／０５０５８の教示から、または添付した実施例から得られる。当分野でよく知られているように、該条件は、前記相互作用を検出するために用いるスクリーニング方法にも依存する。
標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをディスプレイしているポリソームの、そのような（ポリ）ペプチドをディスプレイしていないポリソームからの分離は、既知の方法にしたがって行う。同様に、用いる分離技術は、使用するスクリーニングシステムによく依存し得る。前記のポリソームの分離のための便利な方法は、例えば、標的分子がカラム材料と結合するアフィニティークロマトグラフィーに基づいている。
選択した（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子の同定は、いずれかの適当な手段によって達成でき、ベクターへクローニングした後に、核酸分子を配列決定することにより、例えばｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子を配列決定することにより、最も便利に達成される。ｍＲＮＡの同定のために、ＥＤＴＡでの処置または酸溶出後、キットを用いた標準的なＲＮＡ精製（実施例３参照）により、または可溶性の標的分子を用いる競合的溶出後、キットを用いる標準的ＲＮＡ精製により、ｍＲＮＡをリボソームから脱離させることができる。
好ましくはおよびもっとも有利には、同定工程（ｄ）の前に、工程（ａ）および（ｃ）を２またはそれ以上の回数行う。この方法は、間違った陽性のポリソームおよび核酸を相伴って最小限にすることにより所望の核酸のあいまいな同定を少なくする。所望の核酸を同定するためのこの態様は、特異的に相互作用する（ポリ）ペプチド−標的分子対を単離するために数ラウンドの選択が必要である場合は特に好ましい。
本発明にしたがって、意外にも、ssrＡ−ＲＮＡのtagコード配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むことにより、ポリソームディスプレイの効率において数倍の増加がもたらされることが見い出された。上記の先行技術文献は、そのような至適条件を確立するために様々な経路や手段を既に試してきていたので、この結果はますます予想し得ないものである。
したがって、本発明は、（ポリ）ペプチドを有するリガンドのような標的分子好ましくは完全な、天然のタンパク質分子、の表現型選択のためのシステムを提供する。
本発明の好ましい態様では、ｍＲＮＡ分子は３’末端にステムループを含む。
本発明のこの態様では、エキソヌクレアーゼによるｍＲＮＡの分解は、有意の程度まで排除される。
最も好ましくは、スペーサーを（ポリ）ペプチドのリーディングフレームに融合して、リボソームの推定（ポリ）ペプチドチャネルに、新生の折り畳まれた（ポリ）ペプチドを繋ぎ留める。該スペーサーは、５７〜１１６個のアミノ酸を優先的にコードする。
リボソームの（ポリ）ペプチドチャネルへ新生の（ポリ）ペプチドを繋ぎ留めることは、ポリソームの解離を有意に遅くするだろうから、（ポリ）ペプチドと対応するｍＲＮＡの同時選択（co-selection）を可能にするためのさらに有利な手段である。
さらに最も好ましい態様では、ｍＲＮＡ分子の３’末端の前記ステムループ領域がこのスペーサーをコードする。その結果、スペーサー（タンパク質の段階で必要な）とステムループ（ＲＮＡの段階で必要な）の両方を同じＤＮＡによりコードすることができるならば、３’領域の全体の長さを最小限に保つことができる。
本発明のさらに好ましい態様は、前記ｍＲＮＡ分子がその５’末端でステムループ構造を含む上記の方法に関する。
３’末端のステムループ構造と同様に、ｍＲＮＡの５’末端のステムループは、ｍＲＮＡに対する有効なエキソヌクレアーゼ攻撃を回避する目的で働く。ｍＲＮＡが５’と３’末端のステムループ両方を含むことが特に好ましい。この態様では、ｍＲＮＡ分子は、天然のｍＲＮＡと構造的に似ているであろう。
本発明の方法のさらに好ましい態様では、前記インビトロ翻訳システムに、リボヌクレアーゼの阻害剤を加える。
好ましくは、前記リボヌクレアーゼ阻害剤は、トランジション状態アナログであり、最も好ましくはバナジルリボヌクレアーゼ複合体である。
本発明にしたがえば、特にバナジルリボヌクレアーゼ複合体は、リボソームディスプレイの効率をさらに増加させるために有利に使用できることが分かった。この複合体は同時にタンパク質合成を部分的に阻害するので、この結果は特に驚くべきものである。
本発明のさらなる好ましい態様は、
（ａ）ポリソームの形成後のマグネシウム塩、好ましくは酢酸マグネシウムの添加；および／または
（ｂ）ｍＲＮＡと対応する（ポリ）ペプチドとの間の架橋を形成させる手段；および／または
（ｃ）翻訳の後および／またはスクリーニング過程の間の低い温度
によって工程（ａ）および（ｃ）においてポリソームが安定化される方法に関する。
上記の手段は、ポリソームの安定性をさらに増大させることが分かっている。したがって、反応緩衝液中の５０ｍＭの酢酸マグネシウム濃度は、解離に対してリボソーム複合体を有意に安定化する。上記の文脈において「低い温度」なる語は、有効なスクリーニングが起きるのを可能にする温度を意味すると意図する。好ましくは、この低い温度は、０〜５℃の範囲内である。
好ましくは、翻訳は、原核生物の翻訳システムにおいて行う。特に好ましくは、Ｓ−３０E. coli翻訳システムのようなE. coliをベースとする翻訳システムである。
別法として、翻訳システムは、真核生物の翻訳システムにおいて実行してもよい。
本発明の方法のさらに好ましい態様では、工程（ｄ）は、
（ｄａ）前記ｍＲＮＡを逆転写し；
（ｄｂ）場合により、得られたｃＤＮＡを増幅し；
（ｄｃ）場合により、場合により増幅したｃＤＮＡをクローニングし；そして
（ｄｄ）前記ｃＤＮＡの配列を決定する
ことを含む。
ｍＲＮＡ分子の集団が大きすぎて１回のラウンドでは所望の分子種を同定できない場合、目的の核酸を同定するためのこの態様は好ましい。さらに、ｍＲＮＡ分子の集団がクローニングにより“不朽化（immortalized）”されるので、同定された分子の反復的で詳細な試験が可能である。
逆転写は、MaxamとGirbertniによって開発された、並びにSangerと同僚によって開発された最も便利なＤＮＡ配列決定技術（例えば、Sambrockら，“Molecular Cloning, A Laboratory Manual”，第２版，1989, CSH Press, Cold Spring Harborを参照）を用いる配列決定を可能にする。後で適当なベクターへのクローニングをするかまたはしない、好ましくはＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅は、所望の核酸分子の同定をさらに有意に容易にする。様々な場合において、核酸分子の増幅は、研究者が後でこの核酸分子を同定することを可能にするための必須条件であろう。
本発明の方法のさらなる好ましい態様では、工程（ａ）の前に、β−メルカプトエタノールおよび／またはＤＴＴのような還元剤の存在下で、ＤＮＡをｍＲＮＡに転写する。
β−メルカプトエタノールおよび／またはＤＴＴのような還元剤を反応緩衝液に含有させるとＤＮＡ−ポリメラーゼの安定性が増加することは知られている。したがって、緩衝液中の還元剤は、ｍＲＮＡの収率の増加に寄与し、それによってリボソームディスプレイ総体としての改善がもたらされる。
転写後、且つ工程（ａ）の前に、この還元剤を除去することが特に好ましい。本発明のこの方法は、スクリーニングされる（ポリ）ペプチドが、ジスルフィド結合の形成により天然のコンフォメーションをとっている分子種を含んでいるかもしれない場合に最も好ましい。そのような（ポリ）ペプチドの例は、免疫グロブリンスーパーファミリーの一員である。この好ましい態様を導入することにより、本発明は、組み合わせた転写／翻訳システムの使用を示唆する、上で引用した先行技術を直接否定する。
さらに、本発明は、
（ａ）正しいリーディングフレームにおける終止コドンを欠くＤＮＡ分子の集団を、還元剤の存在下で対応するｍＲＮＡ分子の集団に転写する工程；
（ｂ）前記ｍＲＮＡ分子の集団から前記還元剤を除去する工程；
（ｃ）ポリソームの形成が可能な条件下で、インビトロ翻訳システムにおいて前記ｍＲＮＡ分子の集団を翻訳すること；
（ｄ）形成したポリソームを、前記ｍＲＮＡ分子によってコードされ該ポリソームによってディスプレイされる（ポリ）ペプチドと該標的分子との相互作用が可能な条件下で接触させる工程；
（ｅ）前記標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをディスプレイしているポリソームを、そのような（ポリ）ペプチドをディスプレイしていないポリソームから分離する工程；および
（ｆ）前記標的分子と相互作用するポリソームにおいてディスプレイされた（ポリ）ペプチドをコードしている核酸分子を同定する工程
をさらに含む、標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定するための方法に関する。
好ましい態様では、工程（ａ）において使用する還元剤は、β−メルカプトエタノールおよび／またはＤＴＴである。
本発明の方法のさらに好ましい態様では、（ポリ）ペプチドは、免疫グロブリンスーパーファミリー、好ましくは免疫グロブリンファミリーのドメインを含む。たとえば、前記（ポリ）ペプチドには、完全なＴ細胞レセプターまたは抗体鎖または抗体のドメインなどの抗体鎖の一部、例えばＶHまたはＶL領域が含まれる。
（ポリ）ペプチドは、１本鎖の抗体またはそのような１本鎖の抗体を含む融合タンパク質であることが特に好ましい。融合タンパク質代替物においては、前記抗体鎖の融合のパートナーは、好ましくは、対応するｍＲＮＡに生成しようとしている（ポリ）ペプチドを繋ぐために用いられるｔａｇである。
さらに、本発明は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、酸化または還元されたグルタチオン、E. coliタンパク質ＤｓｂＡ、およびＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ、またはＧｒｏＥＳなどの分子シャペロンからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質が翻訳システムに添加されている方法に好ましく関する。
上記の化合物は、単独でまたは組み合わせて、生成しようとしている（ポリ）ペプチドの、安定性、溶解性および／または天然の折り畳み許容度を増強し得る。
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、細菌起源でも真核生物起源でもよい。システムに含まれる化合物／酵素は、当業者が、スクリーニングするタンパク質のタイプにしたがって選択する。たとえば、抗体ドメインを含むライブラリーをスクリーニングするならば、本発明の教示にしたがって、真核生物のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含有させる。本発明によって示されるように（添付の実施例参照）、ポリソームディスプレイシステムは、前記酵素を翻訳反応システムに組み込むことによって有意に改善される。
本発明の方法のさらに好ましい態様では、ポリソームを前記標的分子と接触させる工程中に形成した、ポリソームどうしの、および／またはポリソームと標的分子との間の、および／または場合によりポリソームと標的分子が固定化されているマトリックスとの間の非特異的な相互作用を、ブロッキング化合物の添加によって阻害または減少させる。
最も好ましい態様では、このブロッキング化合物は、ヘパリンなどのポリアニオン性の化合物である。ヘパリンをＲＮアーゼ阻害剤として含有させることは示唆されてきたが（ＷＯ ９１／０５０５８）、意外にも、本発明によれば、非特異的な結合もさらに減少させることが見い出された。ヘパリンは、ポリアニオン性化合物として、非特異的な結合部位に対するポリソーム複合体の一部として、ポリアニオン性のｍＲＮＡと競合すること考えられ、ポリソームディスプレイにおける、ヘパリンなどのポリアニオン性の化合物の添加は、非特異的な結合を減少させるために一般的に適用可能な方法になっている。
別の最も好ましい態様では、前記ブロッキング化合物は滅菌したミルクである。無脂肪ミルクの添加は、ポリソームディスプレイに関して既に示唆されている（ＷＯ９５／１１９２２）。しかしながら、本発明に従えば、ミルクをアフィニティー選択中に使用するときには、ＲＮＡを単離することができないことが分かった。意外にも、滅菌したミルクを使用したとき、ＲＮＡの単離は再び可能になり、非特異的な結合の量が実質的に減少した。
さらに、本発明は、
（ａ）ssrＡ−ＲＮＡのtag−コード配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド；
（ｂ）場合により、スクリーニングされる（ポリ）ペプチドをコードする核酸をクローニングするのに適当なベクター；
（ｃ）場合により、リボヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはトランジション状態アナログ、および最も好ましくはバナジルリボヌクレオシド複合体；
（ｄ）場合により、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、酸化または還元されたグルタチオン、E. coli ＤｓｂＡ、および分子シャペロンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物；および
（ｅ）場合により、５’もしくは３’ステムループ、スペーサーまたは終止コドンを含まないターミネーターをコードするオリゴヌクレオチド
を含むキットに関する。
好ましい態様では、本発明のキットはさらに、
（ｆ）Ｓ−３０翻訳抽出物
（ｇ）ＰＣＲ構成成分
（ｈ）逆転写酵素
（ｉ）ＲＮＡ配列決定キット
（ｊ）ＤＮＡ配列決定キット
を単独でまたは組み合わせて含んでいてもよい。
最後に、本発明は
（ａ）ssrＡ−ＲＮＡを含まないインビトロ無細胞翻訳抽出物；
（ｂ）場合により、スクリーニングされる（ポリ）ペプチドをコードする核酸をクローニングするのに適当なベクター；
（ｃ）場合により、リボヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはトランジション状態アナログ、および最も好ましくはバナジルリボヌクレオシド複合体；
（ｄ）場合により、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、酸化または還元されたグルタチオン、E. coli ＤｓｂＡ、および分子シャペロンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物；および
（ｅ）場合により、５’または３’ステムループ、スペーサーまたは終止コドンを有しないターミネーターをコードするオリゴヌクレオチド
を含むキットに関する。
好ましい態様では、本発明のキットはさらに、
（ｆ）ＰＣＲ構成成分；
（ｇ）逆転写酵素；
（ｈ）ＲＮＡ配列決定キット；
（ｉ）ＤＮＡ配列決定キット
を単独でまたは組み合わせてを含んでもよい。
本発明のキットは、本発明の方法を実行するために便利に使用することができる。
図面は、以下のことを示す：
図１ リガンド（抗原）結合について天然タンパク質（ｓｃＦｖ）ライブラリーをスクリーニングするためのインビトロリボソームディスプレイの原理。１、ＤＮＡｓｃＦｖライブラリーを最初にＰＣＲによって増幅し、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合部位およびステムループを導入し、ＲＮＡに転写する。２、精製したのち、ｍＲＮＡを、リボソーム複合体の安定性を増強し、リボソームにおけるｓｃＦｖ抗体の折り畳みを改善する種々の因子の存在下に、E. coli Ｓ−３０システムにおいてインビトロで翻訳する。氷で冷却することにより翻訳を停止し、マグネシウム濃度を増加させることによりリボソーム複合体を安定化させる。３、固定化された抗原への天然ｓｃＦｖの結合により、所望のリボソーム複合体を翻訳混合物からアフィニティー選択する。非特異的なリボソーム複合体を、徹底的な洗浄により除去する。４、次いで、結合したリボソーム複合体をＥＤＴＡにより解離させる（４ｂ）か、または複合体全体を抗原で特異的に溶出する（４ａ）。５、ＲＮＡを複合体から単離する。６、単離されたｍＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写し、ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅する。次いで、このＤＮＡを次の豊富化のサイクルに使用し、一部をクローニングと配列決定によりおよび／またはＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡにより分析する。
図２（Ａ）リボソームディスプレイに使用するｓｃＦｖ構築物の模式図。Ｔ７はＴ７プロモーターを、ＳＤはリボソーム結合部位を、ＦはＮ末端メチオニンを有する長さ３アミノ酸のＦＬＡＧ
を、ＶLおよびＶHは、ｓｃＦｖフラグメントの可変領域を、Ｌはリンカーを、ｓｐａｃｅｒは折り畳まれたｓｃＦｖをリボソームへ連結させるタンパク質構築物の一部を、５’slおよび３’slは、ｍＲＮＡの５’末端および３’末端のステムループを示す。矢印は、転写の開始を示す。ＰＣＲ増幅の手順を示す。
（Ｂ）ポリソーム複合体に結合したｓｃＦｖｈａｇ ｍＲＮＡの量は、その末端の二次構造と、折り畳まれたｓｃＦｖをリボソームへ連結するスペーサーの長さによって影響を受ける。ｓｃＦｖｈａｇ ｍＲＮＡの種々の構築物（構築物ｃ１〜ｃ９）を、１サイクルのリボソームディスプレイに使用した。それらのうちのいずれが終止コドンを含んでいなかった。それぞれの種類を個々に試験した。翻訳混合物１００μLからリボソーム複合体をアフィニティー選択した後、ｍＲＮＡを単離し、ノーザンハイブリダイゼーションによって解析した。５’ステムループの存在は（＋）または（−）で、３’ステムループの存在は、不在ならば（−）、ｌｐｐターミネーターに由来する場合は（ｌ）またはＴ３Ｔｅターミネーターに由来する場合は（ｔ）として示す。スペーサーの長さは、ｓｃＦｖに続き、ｓｃＦｖをリボソームへ連結している、翻訳されたステムループを含んでいるアミノ酸の数を示す。ｋｂで示したＲＮＡの長さは、ＲＮＡ分子量マーカーＩＩＩ（ベーリンガーマンハイム）から求める。棒グラフは、蛍光画像解析から得られた定量されたｍＲＮＡの量を示す。
（Ｃ）リボソーム複合体に結合したｍＲＮＡの量に対する添加物の効果。ｓｃＦｖｈａｇ構築物ｃ７のｍＲＮＡを、１サイクルのリボソームディスプレイに使用した。図２Ｂレーンｃ７および図２Ｃレーン６の試料は同一である。示した場合では、３．５ｍＭアンチｓｓｒＡオリゴヌクレオチドＯＮ１０（5’-TTAAGCTGCTAAAGCGTAGTTTTCGTCGTTTGCGACTA-3’）、３５ｍg／ｍLタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）または１ｍg／ｍLバナジルリボヌクレアーゼ複合体（ＶＲＣ）を翻訳に関与させた。翻訳は、Ｍg（Ａc）2を示した最終濃度（ｍＭ）で添加し、氷で冷却することにより停止した。１００μLの翻訳混合物からリボソーム複合体をアフィニティー選択した後、ｍＲＮＡを単離しノーザンハイブリダイゼーションにより解析した。棒グラフは、蛍光画像解析から定量されたｍＲＮＡの量を示す。
図３ アンチｓｓｒＡアンチセンスオリゴヌクレオチドＯＮ１０（図２Ｃ）は、最も長いタンパク質の分子量を減少させた（矢印）。インビトロ翻訳は、35Ｓ−メチオニンおよびｓｃＦｖｈａｇ ｃ７ｍＲＮＡを使用して行った。反応は、３．５ｍＭオリゴヌクレオチドＯＮ１０の非存在下（−）または存在下（＋）で行った。翻訳産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
図４（Ａ） リボソームディスプレイによるｓｃＦｖＡＬ２を含む混合物からのｓｃＦｖｈａｇリボソーム複合体の豊富化。ｓｃＦｖｈａｇ ｃ５のｍＲＮＡをｓｃＦｖＡＬ２のｍＲＮＡで１０8に希釈し、混合物をリボソームディスプレイに使用した。ｓｃＦｖｈａｇリボソーム複合体のアフィニティー選択の後、ｍＲＮＡを単離し、オリゴヌクレオチドＯＮ５を用いてｃＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡをオリゴヌクレオチドＯＮ３およびＯＮ７を使用するＰＣＲによって増幅し、アガロース電気泳動によって解析した。レーン１〜５はそれぞれ、第１〜第５ラウンドのリボソームディスプレイ後に増幅されたＰＣＲ産物であった。Ｍは、分子量マーカーとして使用した１ｋｂのＤＮＡラダー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）である。
ｓｃＦｖｈａｇおよびｓｃＦｖＡＬ２に対応するＰＣＲ産物を標識する。
（Ｂ）固定化された抗原の機能としてのリボソームディスプレイによる、ｓｃＦｖｈａｇ ｃ５またはｓｃＦｖＡＬ２リボソーム複合体いずれかの豊富化。ｓｃＦｖｈａｇおよびｓｃＦｖＡＬ２のｍＲＮＡを１：１の割合で混合し、１サイクルのリボソームディスプレイに使用した。アフィイティー選択の後、ｍＲＮＡを単離し、逆転写し、ＰＣＲによって増幅し、図４Ａのようにアガロースゲル電気泳動により解析した。同じ１：１混合物を、対照として固定化したトランスフェリン（ｔｒ）、アンピシリン−トランスフェリンコンジュゲート（ａｍｐ）、またはｈａｇ−ペプチド−トランスフェリン コンジュゲート（ｈａｇ）においてアフィニティー選択した。ｓｃＦｖｈａｇおよびｓｃＦｖＡＬ２に対応するＰＣＲ産物を標識する。
図５（Ａ）第３ラウンドのポリソームディスプレイ後のＲＮＡプールの解析：ＲＮＡプールのインビトロ翻訳および２％ミルクの存在下での標識したポリソーム複合体のＲＩＡアッセイ：（ａ）ＢＳＡに対する結合；（ｂ）ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｃ）１μＭ ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）による阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｄ）１μＭ ｈａｇペプチドによる阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｅ）１μＭフルオレセインによる阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合。
（Ｂ）第３ラウンドのポリソームディスプレイ後のＲＮＡプールの解析：ＲＮＡプールのインビトロ翻訳および２％ミルクの存在下での標識したポリソーム複合体のＲＩＡアッセイ：（ａ）ＢＳＡに対する結合；（ｂ）ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｃ）１μＭ ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）による阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｄ）１μＭ ｈａｇペプチドによる阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｅ）１μＭフルオレセインによる阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合。
（Ｃ）ＲＩＡによる第３ラウンドのポリソームディスプレイ後のＲＮＡプールの解析：ミルクの存在下（Ａ）、または不在下（Ｂ）で行った３ラウンドのアフィニティー選択後のＲＮＡプール：
ＲＮＡプールのインビトロ翻訳および２％ミルクの存在下での標識されたポリソーム複合体の結合アッセイ：（ａ）ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｂ）１μＭ ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）による阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合。
実施例は、本発明を説明する。
添付した実施例において、抗原に結合するためのその正しく構築された三次元構造に必要な、抗体のｓｃＦｖフラグメントは、リボソームディスプレイによって１０8倍に豊富化でき、その配列がこの過程の間に“進化”することが示される。
実施例１：ｓｃＦｖ抗体フラグメントの構築
ｓｃＦｖｈａｇ構築物ｃ７を、（Ｇly４Ｓer）3リンカーを含むｓｃＦｖ １７／９をディスプレイしているｆｄファージ
から，２工程で増幅した。第１の工程で、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を導入するオリゴヌクレオチドＯＮ１（5’-TTTCCCGAATTGTGAGCGGATAACAATAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAA GGAGATATATCCATGGACT ACAAAGA-3’）、およびＯＮ２（5’-TTTAAGCAGCTCGATAGCAGCAC-3’）を使用する。第２の工程では、Ｔ７プロモーターおよび５’ループを導入するＯＮ３（5’-ATATATGTCGACGAAATTAATACGACTCACTATAG GGAGACCACAACGGTTTC CCGAATTGTG-3’）と、終止コドンを除去した修飾されたｌｐｐターミネーターループを導入するＯＮ４（5’-AGACCCGTTTAGAGGCCCC AAGGGGTTATGGAATTCACCTTTAAGCAGCT C-3’）を使用した。ｓｃＦｖにＣ末端で融合したスペーサーを、繊維状ファージＭ１３ｍｐ１９
の遺伝子ＩＩＩのアミノ酸２１１〜２９９から得、翻訳されたｌｐｐターミネーターがさらに別の２４アミノ酸を追加する。
他の構築物は、以下のプライマーペアを用いてＰＣＲによりｃ７から調製した。ｃ１，ＯＮ５（5’-TCAGTAGCGACAGAATCAAG-3’）およびＯＮ６（5’-GAAATTAA TACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAGAAGGAGGTATATCCATGGACTACAAA GA-3’）、Ｔ７プロモーターおよび５’ステムループを含まないＲＢＳを導入する。スペーサーは遺伝子ＩＩＩのアミノ酸２１１〜２９４から得る；ｃ２，ＯＮ４およびＯＮ６、ｃ７と同じスペーサー；ｃ３，ＯＮ６およびＯＮ７（5’-GGCCCACCCGTGAA GGTGAGCCTCAGTAGCGACAG-3’）、スペーサーは、遺伝子ＩＩＩのアミノ酸２１１〜２９４から得、翻訳されたＴ３Ｔｅターミネーターの７個のアミノ酸が続く；ｃ４，ＯＮ３およびＯＮ５、ｃ１と同じスペーサー；ｃ５，ＯＮ３およびＯＮ７、ｃ３と同じスペーサー；ｃ６，ＯＮ２およびＯＮ３、スペーサーは、遺伝子ＩＩＩのアミノ酸２１１−２９９から得、ｌｐｐターミネーターの最初の４アミノ酸が続く；ｃ８，ＯＮ３およびＯＮ８（5’-TTTAAGCAGCTCATCAAA ATCACC-3’）、スペーサーは、遺伝子ＩＩＩのアミノ酸２１１−２６４から得、ｌｐｐターミネーターの最初の４アミノ酸が続く；ｃ９，ＯＮ３およびＯＮ４、スペーサーは遺伝子ＩＩＩのアミノ酸２１１−２６４から得、ｌｐｐターミネーターの２４アミノ酸が続く、ｃ８を鋳型として用いる。ｓｃＦｖＡＬ２構築物（ＶL−（Ｇly４Ｓer）4−ＶH）を２工程のＰＣＲによってプラスミドｐＡＫ２０２
から増幅した。最初にオリゴヌクレオチドＯＮ１とＯＮ７を使用し、第２の工程でＯＮ３とＯＮ７を使用する。スペーサーは、繊維状ファージＭ１３ｍｐ１９の遺伝子ＩＩＩのアミノ酸２４０〜２９４
から得、翻訳されたＴ３Ｔｅターミネーターはさらに７アミノ酸を追加する。
実施例２：ＲＴ−ＰＣＲおよびインビトロ転写
Superscript逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用い、製造元の推奨にしたがって逆転写を行った。ＰＣＲは、５％ＤＭＳＯの存在下でＴａｑポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて行った（９４℃で４分間、次いで９４℃で３０秒間の３サイクル、３７℃で３０秒間、７２℃で２分間、次いで３７℃の代わりに６０℃にする同様の１０サイクル、３７℃の代わりに６０℃にして１サイクルにつき７２℃で１５秒間の延長を行う同様の２０サイクル、７２℃にて１０分間で終了）。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により解析し、ゲルから精製し、量と質が十分でなければ再増幅するか、またはさらに精製することなく転写に直接使用した。インビトロ転写を記載のとおりに行った（Pokrovskaya, I. D. & Gurevich, V. V.（1994）Anal. Biochem. 220, 420-423）。
実施例３：モデルシステムおよびアフィニティー選択の収量の定量
モデルシステムとして、我々は、軽鎖の可変領域（ＶL）がフレキシブルなリンカーを介して重鎖の可変領域（ＶH）に連結している、抗体の１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを使用した（Huston, J. S., Levinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M. S., Novotny, J., Margolies, M. N., Ridge, R. J., Bruccoleri, R. E., Haber, E., Crea, R. & Oppermann, H.（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5879-5883）。折り畳まれたタンパク質をリボソームに繋ぎ留めるが、折り畳みには干渉しないようにするため、我々はスペーサーをｓｃＦｖフラグメントのＣ末端に融合した。抗体ドメインがジスルフィド結合を形成し、ＲＮＡポリメラーゼには最大限の安定性のためにβ−メルカプトエタノールが必要であるので、別の反応において転写を行う効果について調べた。さらに、翻訳中の酸化的タンパク質折り畳みの条件
を最適化した（以下参照）。
ポリペプチドの遊離は、E. coliにおいて３つのポリペプチド遊離因子（Grentzmann, G., Brechemier-Baey, D., Heurgue-Hamard, V. & Buckingham, R. H.（1995）J. Biol. Chem. 270, 10595-10600; Tuite, M. F. & Stansfield, I.（1994）Mol. Biol. Rep. 19, 171-181; Tate, W. P. & Brown, C. M.（1992）Biochemistry 31, 2443-2450）と、ｍＲＮＡを遊離する１つのリボソーム再生因子（Janosi, L., Shimizu, I. & Kaji, A.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 4249-4253）を必要とする活性な過程である。遊離因子結合の結果は、一般に、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ中心による、リボースと最後のアミノ酸との間のペプチジルｔＲＮＡの加水分解である（Tate, W. P. & Brown, C. M.（1992）Biochemistry 31, 2443-2450）。我々のシステムは終止コドンを欠いており、したがってポリペプチドの画分がｔＲＮＡを加水分解せず、リボソームに結合したまま残り、アフィニティー選択に適用可能である。
E. coli Ｓ−３０システムにおけるインビトロ翻訳は、ChenおよびZubay（Chen, H. Z. & Zubay, G.（1983）Methods Enzymol. 101, 674-690）に従い、いくつかの改良を加えて行った。翻訳は、以下の成分を含む１１０μLの反応物中、３７℃で１０分間行った：５０ｍＭ Tris−Ａc（pＨ７．５）、３０ｍＭ ＮＨ4Ａc、１２．３ｍＭ Ｍg（Ａc）2、０．３５ｍＭの各アミノ酸、２ｍＭ ＡＴＰ、０．５ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭｃＡＭＰ、０．５ｍg／ｍL E. coli ｔＲＮＡ、２０μg／ｍLギ酸、１００ｍＭ ＫＡc、３０ｍＭアセチルリン酸（Ryabova, L. A., Vinokurov, L. M., Shekhotsova, E. A., Alakhov, Y. B. & Spirin, A. S.（1995）Anal. Biochem. 226, 184-186）、１．５％ＰＥＧ８０００、３３μｇ／ｍLリファンピシン、１ｍg／ｍLバナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）、２３μLのE. coli ＭＲＥ６００抽出物（Chen, H. Z. & Zubay, G.（1983）Methods Enzymol. 101, 674-690）および９０μｇ／ｍLのｍＲＮＡ。
氷で冷却することにより翻訳を停止し、５０μＭ酢酸マグネシウムにより、さらにリボソーム複合体を解離に対して安定化する（Holschuh, K. & Gassen, H. G.（1982）J. Biol. Chem. 257, 1987-1992）。さらにリボソームストーリング（stalling）も誘発すると考えられる５０μＭ濃度のクロラムフェニコール（Mattheakis, L. C., Bhatt, R. R. & Dower, W. J.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9022-9026; Moazed, D. & Noller, H. F.（1987）Nature 327, 389-394）は、選択特性を改善しなかった（データは示さず）。合成されたタンパク質、リボソームおよびｍＲＮＡからなる複合体全体を、次いでアフィニティーマトリックスに結合し、洗浄し、競合リガンドで溶出するか、またはリボソームをＥＤＴＡにより解離させた（図１）。具体的には、試料を氷冷洗浄緩衝液（５０ｍＭ Tris−Ａc（pＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮaＣl、５０ｍＭ Ｍg（Ａc）2および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で４倍希釈し、４℃にて１０，０００×ｇで５分間遠心し、不溶性の成分を除いた。ｈａｇ−トランスフェリンコンジュゲートでコーティングしたマイクロタイタープレートを氷冷洗浄緩衝液で予め洗浄し、遠心した翻訳混合物から得た上清を入れ（マイクロタイターウェルあたり２００μL）、プレートを冷却した室内で１時間穏やかに振盪した。氷冷した洗浄緩衝液で５回洗浄したのち、残ったリボソーム複合体を、氷冷した溶出緩衝液（ウェルあたり１００μL；Tris−Ａc（pＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮaＣl、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０μg／ｍLのE. coli ｔＲＮＡ）により、冷却した室内で１０分間解離させ、遊離したｍＲＮＡをエタノール沈殿によりまたはＲｎｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる単離により回収した。
我々は、いずれかの段階において予備的にポリソームを単離する必要があるとは見い出さなかった。リボソームディスプレイの効率は、組み合わせたインビトロ転写−翻訳を用いたとき１００分の１になることが分かった（データは示さず）。我々は、最初にインビトロ転写、翻訳および折り畳みのために遺伝子構造に処理を施し、次に翻訳反応そのものを最適化することによる、２段階のリボソームディスプレイを開発した。各試験は、１０μｇの投入ｍＲＮＡで開始した。これは、約１．５×１０13個の分子に相当する。投入ｍＲＮＡを単ラウンドのアフィニティー選択：インビトロの翻訳、固定化された標的リガンド上でのリボソーム複合体の捕捉およびｍＲＮＡの遊離、に付した。次いで、遊離したｍＲＮＡをノーザン解析により定量した。
ノーザン解析は、ＲＮＡ電気泳動およびナイロン膜（Schleicher & Schuell）への移動をTurboblotter（Schleicher & Schuell）を用い、記載されているように行った（Goda, S. K. & Minton, N. P.（1995）Nucleic Acids Res. 23, 3357-3358）。ハイブリダイゼーションは、６０℃にて１２時間行った（Church, G. M. & Gilbert, W.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1991-1995）。ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドＯＮ９（5’-ACATGGTAACTTTTTCACCAGCGGTAACGG-3’）により行い、これをｓｃＦｖ ｍＲＮＡのＶL領域へアニーリングした。このオリゴヌクレオチドは、ＤＩＧオリゴヌクレオチドテイリングキット（ベーリンガーマンハイム）を用いて、ジゴキシゲニン-１１-ｄＵＴＰ／ｄＡＴＰによる３’テイリングにより標識した。洗浄条件は以下のとおりである：２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ（室温で５分間）；２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ（６０℃３０分間を２回）；０．１×ＳＳＣ（室温で１０分）。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを、ＤＩＧ ＤＮＡラベリングおよび検出キットを用いて、化学ルミネセンス基質ＣＳＰＤ（ベーリンガーマンハイム）を用いてＸ線フィルムに感光するか、または蛍光基質アトフォス（ベーリンガーマンハイム）により蛍光造影機（Molecular Dynamics）を用いて検出した。
実施例４：ｍＲＮＡ構造の収率に対する影響
リボソームディスプレイシステムの設計において、我々は最初にｓｃＦｖ遺伝子のフランキング領域を加工した（図２）。遺伝子は非常に効率よくＰＣＲ産物から転写され、そのｍＲＮＡはヌクレアーゼに対して安定である。５’末端のために、我々は、Ｔ７プロモーターと、ステムループ構造をｍＲＮＡのすぐ始めでコードする天然のＴ７遺伝子１０上流領域を用いた（Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J. & Dubendorff, J. W.（1990）Methods Enzymol. 185, 60-89）。３末端で、我々は、新生の、リボソームの推定ポリペプチドチャネルへ折り畳まれたポリペプチドを繋ぎ留め、折り畳みに干渉しない十分な距離を与えるために、ｓｃＦｖのリーディングフレームに５７〜１１６アミノ酸のスペーサー領域を融合した。ＲＮＡレベルでこのスペーサーは、３’ステムループ、即ちE. coliリポタンパク質のターミネーター（Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J. & Dubendorff, J. W.（1990）Methods Enzymol. 185, 60-89）（lpp term）またはファージＴ３の初期ターミネーター（Reynolds, R., Bermudez-Cruz, R. M. & Chamberlin, M. J.（1992）J. Mol. Biol. 224, 31-51）（Ｔ３Ｔｅ）のいずれかを、エンドヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの安定性を増加させるためにコードする。１ラウンドの翻訳と選択の後のフランキング領域の直接の比較（図２Ｂ）では、我々は、５’ループ（Ｔ７-ｇ１０由来）、３’ループ（ｌｐｐターミネーター由来）および最も長い１１６アミノ酸のスペーサーを有する構築物で最良の結果を得た。１ラウンドのリボソームディスプレイの後のｍＲＮＡの収率は、投入ｍＲＮＡの０．００１％未満から０．０１５％へ改善された（１５倍）。
実施例５：翻訳条件の収率に対する効果
次いで、我々は、翻訳中に存在する種々の化合物の効果を調べた。ヌクレアーゼは、トランジション状態アナログ（Berger, S. L.（1987）Methods Enzymol. 152, 227-234）として作用するバナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）によって効果的に阻害されることが分かった。タンパク質合成が部分的に阻害されるにもかかわらず（データは示さず）、翻訳中に存在するとき（図２Ｃ）１ｍg/ｍLのＶＲＣは、１ラウンドのアフィニティー選択後にリボソーム複合体からの単離されたｍＲＮＡの収率を最大にし、ＶＲＣが存在しないとき、リボソームディスプレイの効率の数倍の減少につながった（図２Ｃ）。対照的に、Ｒｎａｓｉｎ（Mattheakis, L. C., Bhatt, R. R. & Dower, W. J.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9022-9026）は、システムの効率には効果がなかった。遊離した生成物の長時間のインキュベーション（３００分までの）によって電気泳動パターンが変わらなかったので（データは示さず）、これらの条件下で合成したｓｃＦｖの有意のタンパク質加水分解に関する証拠は認められなかった。
分子シャペロンおよびジスルフィド形成触媒の存在下での可溶性scＦvフラグメントのインビトロ翻訳における系統的な研究から
我々は、ジスルフィド形成と再構成が、翻訳と折り畳みの間で起こることが可能ならばおよび可能な場合にのみ、結合活性が得られることを見い出した。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の非常に有益な効果が、タンパク質が遊離しないリボソームディスプレイシステムに関して立証された。ＰＤＩは、scＦvフラグメントのリボソームディスプレイの性能を３倍に改善したことが認められ（図２Ｃ）、リボソーム結合タンパク質におけるジスルフィド結合の形成と異性化を触媒している。
最近、ペプチド標識（tagging）システムがE. coli,において発見され、それによって終止コドンを欠くｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質が、ssrＡ−ＲＮＡによりコードされるＣ末端標識の付加により修飾され、リボソームから遊離し、分解についてマーキングされる（Keiler, K. C., Waller, P. R. & Sauer, R. T.（1996）Science 271,990-993）。本発明において、この分解がssrＡ-ＲＮＡのtagコード配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害し得ることが示された。さらに、意外にも、このような可能性のある阻害が、リボソームディスプレイ対して効果があるということが観察された。確かに、リボソームディスプレイに関して４倍も高い効率が、anti-ssrＡオリゴヌクレオチドの存在下で認められ（図２Ｃ）、最も長いタンパク質産物の分子量が減少しているが、これは恐らく分解標識の結合の阻止によるものであろう（図３）。ＰＤＩとanti-ssrＡオリゴヌクレオチドの混合は、リボソームディスプレイシステムの効率の１２倍の増加をもたらした（図２Ｃ）。
適当なｍＲＮＡ二次構造と翻訳中に存在する種々の化合物の組み合わせによって、我々は１ラウンドのアフィニティー選択後のｍＲＮＡの収率を、投入ｍＲＮＡの０．００１％から０．２％へ２００倍に増加させることができた。この数字は、リボソームとの共有結合、タンパク質折り畳み、リガンド結合、リボソーム捕捉およびＲＮＡ遊離および増幅の総体としての効率を示すものである。
実施例６：複数ラウンドの選択による標的ｍＲＮＡの特異的豊富化
最適化したシステムの試験において、我々は、どのようにすれば２種類のタンパク質の混合物を機能に関して豊富化できるかについて調べた。図２Ａにしたがって同じようにして構築した、両方とも５’および３’Ｔ３Ｔｅループを有し、一方は抗ヘマグルチニンscＦv １７／９（Schulze-Gahmen, U., Rini, J. M. & Wilson, I. A.（1993）J. Mol. Biol. 234, 1098-1118）（scＦv hag）をコードし、もう一方は抗-β-ラクタム抗体 ＡＬ２
をコードする２つのscＦv抗体ｍＲＮＡを、１：１０8の割合で混合した。それらのＰＣＲ産物は、主にスペーサーの長さにおける違いのために、長さがわずかに異なっており容易に区別することができる（図４Ａ）。図１にしたがって５サイクル行った後、固定化されたhag-ペプチド上で選択を行い、９０％のリボソーム複合体がscＦv hagを含んでいた。したがって、我々は、これらの条件下での１サイクルあたりの豊富化が約１００倍の規模であると結論付けことができる。
アフィニティー選択によって実際に起こった豊富化を立証するために、我々は、両方のｍＲＮＡの１：１混合物を別の表面上で試験し、投入比率と変わらないことを認めた（図４Ｂ）。さらに、どちらの抗原がそこに固定化されるかによって、同じ１：１ｍＲＮＡ混合物からいずれか一方の抗体を豊富化することができた（図４Ｂ）。
実施例７：アフィニティー選択後のscＦv抗体フラグメントの解析
第５ラウンドの選択の後で、ＰＣＲ産物をベクターにライゲーションし、E. coliに形質転換し、単一のクローンを解析した。実験プロトコルは、以下のとおりである：第５ラウンドのリボソームディスプレイの後、ＰＣＲ産物をベクターｐＴＦＴ７４へクローニングした
システムにおけるインビトロ組み合わせ転写-翻訳を、以下の修飾を加えて上記と同様の条件下で50μg/mlのプラスミドＤＮＡを用いて行った。組み合わせ転写-翻訳を３７℃で３０分間行い、反応混合物には、2000 U/mlのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ並びに0.5mM UTPおよびTTPを加えた。混合物は５０μCi/mlの３５Ｓ-メチオニンおよび0.35mMのメチオニン以外の各アミノ酸抽出物を含有した。翻訳後、反応混合物をPBSで4倍に希釈し、マイクロタイターウェルにおいて固定化したhagペプチドに結合させた。穏やかに撹拌しながら60分間インキュベーションした後、マイクロタイターウェルをPBSTで５回洗浄し、結合した放射性タンパク質を0.1Mトリエチルアミンで溶出した。溶出したタンパク質をシンチレーションカウンターで定量した。配列決定した２０個のクローンのうち、１８個がscＦv hag配列を有し、２個がscＦvＡＬ２配列を有しており、１０8倍の豊富化が成功したことを示した。１８個のscＦv hagクローンのうち、１３個が野生型の４３〜１０２％のＥＬＩＳＡシグナルを与え、可溶性hagペプチドにより阻害可能であり、２個は結合が１４および１８％に減少し、そして３個が有意に結合が減少した（１０％未満）。恐らくＰＣＲ増幅の最終ラウンド中に入った誤りの結果であろう（表１）。したがって、ＰＣＲの誤りによる遺伝的多様性が起こっていることが関係しているとしても、結合および固定化された抗原からの溶出によって排除される、抗原結合を維持する選択圧が明らかに働いている。
配列解析は、クローンは３〜７の塩基の変化を含み、９０％がトランジションで１０％がトランスバージョンであることを示しており、知られているTaqポリメラーゼの誤り特性（Keohavong, P. & Thilly, W. G.（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 9253-9257）とよく一致している。各クローンを合計１６５サイクルのＰＣＲに付し、途中、結合に関して５回の表現型選択を行い、これらの条件下での誤りの割合は、選択後に生き残った突然変異体のみを数えた場合、３．３×１０-5であると計算できた。
タンパク質のレベルでは、選択されたクローンは０〜４個の交換されたアミノ酸を有し、それはＶL、ＶHおよびリンカーに分布していた。すべての突然変異体はお互いに独立しており（表１）、広い範囲での、機能に関して矛盾しない中立な突然変異、そして、場合によると、システムがそれについて選択される、機能についての改善を示した。選択された分子の正確な特性にはさらなる解析が必要であるが、我々は、リンカーの開始点での、必要なターン形成を促進し得るプロリンの選択（Tang, Y., Jiang, N., Parakh, C. & Hilvert, D.（1996）J. Biol. Chem. 271, 15682-15686）、および溶解性を増大させることが知られている酸性残基の選択
を認識している。
実施例８：ポリソームディスプレイライブラリーの構築
我々は、（Gly4Ser）4リンカーにより連結されている２つのドメインを有するVL-VH配向のscＦvsのライブラリーを構築した。スペーサー、即ちscＦvをリボソームに繋ぎ留め、リボソームにおいてscＦvの折り畳みを可能にするタンパク質を導入するために、我々は最初にライブラリーを、繊維状ファージM13mp19の遺伝子ＩＩＩのＣ末端部分に融合したscＦvsをタンパク質のレベルで生じさせるベクターpAK200
にライゲーションした。第２の工程で、我々は、RNアーゼに対してｍＲＮＡを安定化するステムループおよび他の重要な特徴をＰＣＲによって導入した。最終のライブラリー構築物はＴ７プロモーター，５’-ステムループおよびscＦvコード配列の上流のシャイン-ダルガノ配列および繊維状ファージM13mp19の遺伝子ＩＩＩの129塩基からなるスペーサー（アミノ酸250-293）、続いてファージＴ３の２１塩基の翻訳された初期ターミネーター（Ｔ３Ｔｅ）を含んでおり、同時にscＦvの下流の３’-ステムループを導入した。
ライブラリーのクローニングは文献に記載された方法にしたがった
簡潔には、ｍＲＮＡは、ＫＬＨに結合したＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）ペプチド（RMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGER）またはアビジンに結合したビオチニル化ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）のいずれかで免疫した６匹のマウスの脾臓細胞から抽出し、ランダムヘキサマープライマーを用いてcＤＮＡに転写した。VLおよびVH ＰＣＲ増幅、次いでアッセンブリーＰＣＲの後、SfiI反応緩衝液中でＰＣＲ産物を直接３倍に希釈し、消化して、アガロースゲル電気泳動を用いて分離した。SfiI消化したＤＮＡをアミコンスピンカラムでアガロースゲルから抽出し、イソプロパノール沈殿により濃縮し、滅菌水に溶解した。
精製したＰＣＲ産物（各150ng）を、16℃で一晩、pAK200ベクターのSfiI部位にライゲーションした（モル比 挿入物：ベクター＝1:2）。
ライブラリーのpAK200ベクターへのライゲーションは非常に効率的であった：アガロースゲル電気泳動および制限解析によれば、我々は100%のライブラリーscＦv ＤＮＡがベクターの少なくとも一端にライゲーションし、50%以上がプラスミドのスペーサー部分に連結したことを見い出した。
ポリソームディスプレイライゲーション混合物に必要な特徴を導入するために、第１の工程でリボソーム結合部位（RBS）を導入するオリゴヌクレオチドSDA（５’-AGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATCCATGGACTACAAAGA-３’）、および翻訳されたＴ３Ｔｅターミネーターを導入するＯＮ７（実施例１参照）を用い、第2の工程でＴ７プロモーターと５’-ループを導入するオリゴヌクレオチドＴ７Ｂ（５’-ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGG-３’）およびオリゴヌクレオチドＯＮ７を用いるＰＣＲによって、２段階で増幅した。ＰＣＲ産物は、さらに精製することなくインビトロ転写に使用し、ＲＮＡは、ＬｉＣl沈殿（Pokrovskaya, I. D. & Gurevich, V. V.（1994）Anal. Biochem. 220, 420-423）によって精製した。両方のミニライブラリーから得たＲＮＡを同じ割合でプールしポリソームディスプレイに使用した。
実施例９:scＦv抗体フラグメントのライブラリーのインビトロ翻訳
E. coli Ｓ−３０システムにおけるインビトロ翻訳を、若干の修飾を加えて実施例６に記載されたように行った。簡潔には、インビトロ翻訳を、以下の成分を含む220μlの反応物中で37℃にて8分間行った：50mM Tris-Ac, pH7.5, 30mM NH4Ac, 12.3mM Mg（Ac）2、0.35mMの各アミノ酸，2mM ATP, 0.5mM GTP, 1mM cAMP, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 20μg/mlギ酸，100mM KAc,30mMアセチルリン酸、1.5% PEG 8000、33μg/mlリファンピシン、1mg/mlバナジルリボヌクレオシド複合体（VRC）, 3.5mM anti-ssrＡオリゴヌクレオチド、0.3μM ＰＤＩ，51.4μlのE. coli MRE600抽出物および90μg/mlのｍＲＮＡ。
実施例１０：scＦvライブラリーのスクリーニング
ポリソーム複合体のアフィニティー選択およびＲＮＡ単離
最初の方法では、アフィニティー選択を、選択中にヘパリンを使用する改良を加えて実施例６に記載のように行った。我々は、ヘパリンによってポリソーム複合体の非特異的結合が、非特異的な表面（ミルクまたはBSA）と同じ位に特異的な表面（ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）-BSA）に対して減少することを観察した。
Mg（Ac）2を最終濃度50ｍＭまで加えることにより翻訳（実施例9参照）を停止し、翻訳混合物を氷で冷却した。試料を氷冷洗浄緩衝液（50mM Tris-Ac pH7.5, 150mM NaCl, 50mM Mg（Ac）2, 2.5mg/mlヘパリンおよび0.1% Tween-20）で4倍に希釈し、4℃にて10.000 x gで5分間遠心して可溶性の成分を除いた。ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）-BSAコンジュゲートでコーティングしたマイクロタイタープレートを氷冷洗浄緩衝液で予め洗浄し、遠心した翻訳混合物から得た上清を注ぎ（200μl／マイクロタイターウェル）プレートを冷却した室内で穏やかに１時間振盪した。ヘパリンを含まない氷冷洗浄緩衝液で５回洗浄したのち、残ったポリソーム複合体を氷冷溶出緩衝液（100μl perウェル; 50mM Tris-Ac, pH7.5, 150mM NaCl, 10mM EDTA, 50μg/ml of E. coli tRNA）により、冷却した室内で10分間解離させ、遊離したｍＲＮＡをRNeasyキット（Qiagen）を用いる単離により回収し、RT-ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ産物のインビトロ転写の後、ＲＮＡをＬｉＣl沈殿（Pokrovskaya, I. D. & Gurevich, V. V.（1994）Anal. Biochem. 220, 420-423）により精製し、ＲＩＡ解析（以下参照）かまたは次のラウンドのポリソームディスプレイのいずれかに使用した。アフィニティー選択をさらに改善するために、選択中の競合タンパク質の使用について評価した。ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）-ペプチドへのポリソーム複合体のアフィニティー選択中のミルクの使用は、恐らくミルクのRNアーゼ活性のために、ポリソームディスプレイサイクル後はＲＮＡが単離されなかった。純粋なタンパク質（例えばBSA，カゼインまたはトランスフェリン）は、非特異的な結合を減少しなかった。驚くべきことに、我々は、ミルクは、滅菌されているならば、ポリソーム複合体のアフィニティー選択中に使用できるということを観察した。したがって、ＲＮＡの安定性に対する影響はなく、表面に対する非特異的な結合を実質的に減少した。第２の方法では、２％の滅菌ミルクをアフィニティー選択中に緩衝液中に含有させる修飾を加え、上記の条件を使用した。
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
各ラウンドのポリソームディスプレイの後、回収されたプール全体のＲＮＡを、上記のライブラリーについて記載されたのと同様の条件を用い、以下の修飾を施してＳ−３０E. coliシステムにおいてインビトロで翻訳した：翻訳は37℃で30分間行い、反応混合物は50μCi/mlの35Ｓ-メチオニンおよび0.35ｍＭのメチオニン以外の各アミノ酸を含み、anti-ssrＡオリゴヌクレオチドならびにＰＤＩは含まない。翻訳後、反応混合物をPBST/ミルクで4倍に希釈して最終濃度２％ミルクにし、マイクロタイターウェルにおいて固定化したＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）ペプチドに結合させた。穏やかに振盪して３０分間インキュベーションした後、マイクロタイターウェルをPBSTで5回洗浄し、結合した放射性タンパク質を0.1Mトリエチルアミンで溶出した。溶出したタンパク質をシンチレーションカウンターで定量した。阻害ＲＩＡは、固定化した抗原に結合させる前に少なくとも１時間、室温で、PBST/２％ミルクに希釈した翻訳混合物を異なる濃度のＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）ペプチドとプレインキュベーションすることによって行った。
単一クローンのＥＬＩＳＡ
第３ラウンドのポリソームディスプレイの後、ＰＣＲ産物をベクターｐＴＦＴ７４
中にクローニングした。単一クローンのプラスミドを単離し、インビトロで翻訳し（3）、ＲＮＡをＬｉＣl沈殿（3）により精製し、以下の修飾を施し、上記のライブラリーについて記載した条件と同様の条件下でのＳ−３０E. coliシステムにおけるインビトロ翻訳に使用した：翻訳は37℃で３０分間行い、anti-ssrＡオリゴヌクレオチド、ＶＲＣ並びにＰＤＩは含まなかった。翻訳後、反応混合物をPBST/ミルクで最終濃度２％ミルクにし、異なる濃度のＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）ペプチド含む混合物とともに、１時間室温でプレインキュベーションした。マイクロタイターウェルにおける固定化したＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）ペプチドに対する結合は、穏やかに振盪しながら３０分間行った。結合したscＦvタンパク質をモノクローナル抗myc-tag抗体９Ｅ１０およびポリクローナル抗マウス／ペルオキシダーゼコンジュゲート（Pierce）を用いて検出した。
結果
ミルクの添加なしの第３ラウンドのポリソームディスプレイの後、我々は、ＲＩＡ（２％ミルクを使用する）によりＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）ペプチドに対する結合について結合体のプールを解析し、プールは結合し、1μMペプチドによってほぼ完全に阻害され得ることを見い出した。hagペプチド並びにフルオレセインによる阻害は観察されなかった（図５Ａ）。しかし、ＥＬＩＳＡ（２％ミルクを用いる）によるプールの単一のクローンの解析によって、24個のクローンのうち３個のみがＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）ペプチドと結合し、そのペプチドにより阻害されることが分かった（陽性クローン）。他の２１個のクローンは標的ペプチドに結合せず、恐らく表面に非特異的に結合した。さらなる２ラウンドのポリソームディスプレイは、プールのＲＩＡシグナルを増大させなかった。これは結合体のさらなる豊富化がなかったことを示している。我々は、ポリソーム複合体のアフィニティー選択中にミルクを使用せず、ファージディスプレイ実験からミルクがファージの表面への非特異的結合を減少させることを知っているので、我々は、ミルクの非存在下でプールのＲＩＡと単一のクローンのＥＬＩＳＡを繰り返した。ミルク非存在下でのプールのＲＩＡにより、プールは非特異的な結合体を同様に含んでいることが分かった（図５Ｂ）。単一のクローンの解析は、３個の陽性クローンが、ＥＬＩＳＡの間、２％ミルクの存在によって影響されなかった。一方、非特異的な結合体はミルクの非存在下で表面に結合したが、２％ミルクの存在下では全く結合しなかったことを示した。
２％ミルクを添加してアフィニティー選択を繰り返した。第３ラウンドの後、我々は、ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）ペプチドに対する結合について、ＲＩＡによりプールを再び解析した。この場合、プールは、ミルクなしで得たプールと比較して約４倍タンパク質と結合し、1μMペプチドによってほぼ完全に阻害された（図５Ｃ）。このプール由来の単一クローンのＥＬＩＳＡによる解析によって約75%のクローンが陽性であることが分かった。
可変領域およびリンカーにおいても同様に、抗体１７／９（Schulze-Gahmen, U., Rini, J. M. & Wilson, I. A.（1993）J. Mol. Biol. 234, 1098-1118）のscＦvにおける突然変異は、Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C.（1991）in Sequences of Proteins of Immunological Interest, vol. I.（US Department of Health and Human Services, 5th ed.）, pp. 151 and 464にしたがって番号を付けた。クローンは相対的ＲＩＡシグナルにしたがってソーティングする。野生型クローン２および６には星印を付けた。ＲＩＡは同量の完全長タンパク質に対して標準化し、0.1mM hagペプチド（+hagと略する）によって阻害し、結合特異性を確かめた。
進化的な方法は、現在合理的な設計の能力および精度を越える、タンパク質工学の改善をもたらし得る。進化は、“世代”の成功、即ち遺伝的多様性のサイクルと、その後の望ましい表現型へのダーウィン選択と定義づけることができる。古典的な実験では、核酸はインビトロにおける物理的性質について解明されてきた（Saffhill, R., Schneider-Bernloehr, H., Orgel, L. E. & Spiegelman, S.（1970）J. Mol. Biol. 51, 531-539）が、この場合において表現型を与える物質は、遺伝物質と同一であった。オリゴヌクレオチドリガンド、通常、一本鎖ＲＮＡは、ＳＥＬＥＸ（Gold, L., Polisky, B., Uhlenbeck, O. & Yarus, M.（1995）Annu. Rev. Biochem. 64, 763-797; Irvine, D., Tuerk, C. & Gold, L.（1991）J. Mol. Biol. 222, 739-761）によって多くの標的が同定されており、そこでは合成ＤＮＡライブラリーが転写され、結合についてＲＮＡが選択され、逆転写して数回のラウンドに渡って増幅される。明らかに、非常に広い応用範囲を有する、表現型の運搬体としてのタンパク質に関する初期の実験は、直接的にまたはファージまたはウイルスのいずれかによって、遺伝子とタンパク質との間のカップリングを起こさせるために生細胞に頼っていた（Phizicky, E. M. & Fields, S.（1995）Microbiol. Rev. 59, 94-123。このタイプの実験では、コードされたタンパク質の多様性の情報運搬体としてのＤＮＡライブラリーは、細菌または真核細胞に形質転換またはトランスフェクトしなければならないので、得ることのできる多様性はＤＮＡ取り込みの効率によって著しく制限される（Dower, W. J. & Cwirla, S. E.（1992）in Guide to Electroporation and Electrofusion, eds. Chang, D. C., Chassy, B. M., Saunders, J. A. & Sowers, A. E.（Academic Press, San Diego）, pp. 291-301）。さらに、それぞれの世代において、ＤＮＡライブラリーは、最初に複製可能な遺伝的パッケージにライゲーションしなければならず、それにより多様性がさらに減少する。さらに、多くの有望な変異体が宿主の環境に逆らって選択されなければならないであろう。面倒な、インビトロでの多様化とインビボでのスクリーニングの反復的な切り替えを必要とするので、ごく少数の研究（Yang, W. P., Green, K., Pinz-Sweeney, S., Briones, A. T., Burton, D. R. & Barbas 3rd., C. F.（1995）J. Mol. Biol. 254, 392-403）のみが、ファージディスプレイのような方法を用いて１世代以上にわたりタンパク質最適化を伝えた。
この方法を回避または改善することを目標にして、数多くの研究所が、翻訳中にｍＲＮＡと対応する（ポリ）ペプチドとが、すぐ間近くにあることと物理学的な関係とに基づいて新規のシステムを設計してきた。したがって、一連の研究によって、特異的なｍＲＮＡがポリソームの免疫沈降によって豊富化され得るということが示された（Schechter, I.（1973）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 2256-2260; Payvar, F. & Schimke, R. T.（1979）Eur. J. Biochem. 101, 271-282; Kraus, J. P. & Rosenberg, L. E.（1982）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 4015-4019）。最近、Mattheakisと共同研究者らは、インビトロで遺伝子型と表現型を関連付けるために、ポリソームを使用したライブラリー由来の短いペプチドのアフィニティー選択を報告した（Mattheakis, L. C., Bhatt, R. R. & Dower, W. J.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9022-9026; WO95/11922）。
このシステムは、好ましくインビトロ転写システムと組み合わせたインビトロ翻訳システムを利用する。翻訳システムは、（ポリ）ペプチドのための適当なスクリーニング工程後のポリソーム複合体におけるｍＲＮＡと（ポリ）ペプチドの同時の単離を可能にする。好ましくは、Mattheakisシステムにおける（ポリ）ペプチドは、２つの成分からなっている。１つは、スクリーニングされるペプチドであり、もう１つはｍＲＮＡに結合する繋ぎ留め（tether）断片である。ポリソーム複合体におけるｍＲＮＡと（ポリ）ペプチドの同時単離は、E. coliについてそのような配列の存在が依然として不明であるとしても、翻訳ストーリング（stalling）配列の助けにより可能にできるかもしれない。この配列は、翻訳速度を減速させることによりポリソーム複合体の全体の安定性を増大させ、それにより（ポリ）ペプチドと対応するｍＲＮＡの同時スクリーニングと単離に適当な条件を可能にし得る。
同様の研究が、前にGoldおよび同僚（WO93/03172）およびKwasakiおよび共同研究者（WO91/05058）によって報告された。上記のシステムは、前記核酸によってコードされるタンパク質の同定により核酸を特徴付ける手段を確立したけれども、生成しようとする（ポリ）ペプチドのリボソームディスプレイの効率に関して実際的な制限が存在する。したがって本発明の前に立ちはだかる技術的課題は、（i）安定なＲＮＡ分子のコレクションの合成と（ii）このＲＮＡ分子の翻訳の効率を増加させ、それによりスクリーニングにおけるポリソームの使用の効率の増加を達成することであった。この技術的課題の解決は、クレームにおいて特徴付けられる態様を提供することによって達成される。
したがって、本発明は、標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）正確なリーディングフレームにおける終止コドンを欠くｍＲＮＡの集団を、インビトロ翻訳システムにおいて翻訳する工程であって、該翻訳システムは、ポリソームの形成が可能な条件下で、ssrＡ−ＲＮＡのtag−配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはssrＡ−ＲＮＡを含まない工程；
（ｂ）形成したポリソームを前記標的分子と、前記ｍＲＮＡ分子によりコードされ該ポリソームによってディスプレイされる（ポリ）ペプチドと前記標的分子との相互作用が可能な条件下で、接触させる工程；
（ｃ）前記標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをディスプレイするポリソームを、そのような（ポリ）ペプチドをディスプレイしていないポリソームから分離する工程；および
（ｄ）前記標的分子と相互作用するポリソームにおいてディスプレイされた（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定する工程
を含む方法に関する。
本発明において使用される用語「（ポリ）ペプチド」は、ペプチドとポリペプチドの両方を意味する。該（ポリ）ペプチドは、天然のまたは組換え的に加工されたアミノ酸配列のいずれかを含むであろう。後者の代用物にはさらに、融合タンパク質も含まれる。
本発明によれば、用語「ポリソーム」は、翻訳の間に、少なくとも１つの好ましくはいくつかのリボソームとｍＲＮＡによって形成される複合体を意味する。
ｍＲＮＡ分子の集団は、様々な起源のものであってよい。例えば、ｃＤＮＡライブラリー由来のものであろう。別の態様では、細胞または組織から直接得られるものであろう。突然変異を起こさせた（ポリ）ペプチドに本発明を使用して改善された変異体を見つけることも特に有利である。別法として、合成タンパク質またはペプチドライブラリーまたは抗体ライブラリーを使用することができる。
「ssrＡ−ＲＮＡのtagコード配列」なる語は、アミノ酸配列ＡＡＮＤＥＮＹＡＬＡＡをコードする核酸配列を意味する。この配列は、Keilerら，Science 221（1996）, 1990-1993に記載されている。
本発明の方法において用いられる翻訳システムに含まれるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリソームの形成を可能にする条件下で、ssrＡ−ＲＮＡのtagコード配列にハイブリダイズし、その翻訳をブロックするに適当な長さのものである。
ssrＡ−ＲＮＡを含まない翻訳システムは、機能的なssrＡ遺伝子を欠いているE. coli株、例えば、Ｘ９０ssrＡ１::cat（Keiler et al., Science 221（1996）, 1990-1993）、Ｎ２２１１またはＮＭ１０１（Ｔuら，J. Biol. Chem. 270（1985）,9322-9326）、Ｗ３１１０ΔssrＡ（Komineら，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91（1994）,9223-9227）、Ｋ７８２３またはＫ６６７６（RetallackおよびFriedman, Cel 83（1995）227-235）などから得られるものである。
翻訳されたｍＲＮＡ分子によってコードされ該ポリソームによってディスプレイされる（ポリ）ペプチドと対応する標的分子との相互作用を可能にする条件は、過度の負担なしに当業者が確立し得る。例えば、そのような条件は、ＷＯ９５／１１９２２，ＷＯ９３／０３１７２およびＷＯ９１／０５０５８の教示から、または添付した実施例から得られる。当分野でよく知られているように、該条件は、前記相互作用を検出するために用いるスクリーニング方法にも依存する。
標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをディスプレイしているポリソームの、そのような（ポリ）ペプチドをディスプレイしていないポリソームからの分離は、既知の方法にしたがって行う。同様に、用いる分離技術は、使用するスクリーニングシステムによく依存し得る。前記のポリソームの分離のための便利な方法は、例えば、標的分子がカラム材料と結合するアフィニティークロマトグラフィーに基づいている。
選択した（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子の同定は、いずれかの適当な手段によって達成でき、ベクターへクローニングした後に、核酸分子を配列決定することにより、例えばｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子を配列決定することにより、最も便利に達成される。ｍＲＮＡの同定のために、ＥＤＴＡでの処置または酸溶出後、キットを用いた標準的なＲＮＡ精製（実施例３参照）により、または可溶性の標的分子を用いる競合的溶出後、キットを用いる標準的ＲＮＡ精製により、ｍＲＮＡをリボソームから脱離させることができる。
好ましくはおよびもっとも有利には、同定工程（ｄ）の前に、工程（ａ）および（ｃ）を２またはそれ以上の回数行う。この方法は、間違った陽性のポリソームおよび核酸を相伴って最小限にすることにより所望の核酸のあいまいな同定を少なくする。所望の核酸を同定するためのこの態様は、特異的に相互作用する（ポリ）ペプチド−標的分子対を単離するために数ラウンドの選択が必要である場合は特に好ましい。
本発明にしたがって、意外にも、ssrＡ−ＲＮＡのtagコード配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むことにより、ポリソームディスプレイの効率において数倍の増加がもたらされることが見い出された。上記の先行技術文献は、そのような至適条件を確立するために様々な経路や手段を既に試してきていたので、この結果はますます予想し得ないものである。
したがって、本発明は、（ポリ）ペプチドを有するリガンドのような標的分子好ましくは完全な、天然のタンパク質分子、の表現型選択のためのシステムを提供する。
本発明の好ましい態様では、ｍＲＮＡ分子は３’末端にステムループを含む。
本発明のこの態様では、エキソヌクレアーゼによるｍＲＮＡの分解は、有意の程度まで排除される。
最も好ましくは、スペーサーを（ポリ）ペプチドのリーディングフレームに融合して、リボソームの推定（ポリ）ペプチドチャネルに、新生の折り畳まれた（ポリ）ペプチドを繋ぎ留める。該スペーサーは、５７〜１１６個のアミノ酸を優先的にコードする。
リボソームの（ポリ）ペプチドチャネルへ新生の（ポリ）ペプチドを繋ぎ留めることは、ポリソームの解離を有意に遅くするだろうから、（ポリ）ペプチドと対応するｍＲＮＡの同時選択（co-selection）を可能にするためのさらに有利な手段である。
さらに最も好ましい態様では、ｍＲＮＡ分子の３’末端の前記ステムループ領域がこのスペーサーをコードする。その結果、スペーサー（タンパク質の段階で必要な）とステムループ（ＲＮＡの段階で必要な）の両方を同じＤＮＡによりコードすることができるならば、３’領域の全体の長さを最小限に保つことができる。
本発明のさらに好ましい態様は、前記ｍＲＮＡ分子がその５’末端でステムループ構造を含む上記の方法に関する。
３’末端のステムループ構造と同様に、ｍＲＮＡの５’末端のステムループは、ｍＲＮＡに対する有効なエキソヌクレアーゼ攻撃を回避する目的で働く。ｍＲＮＡが５’と３’末端のステムループ両方を含むことが特に好ましい。この態様では、ｍＲＮＡ分子は、天然のｍＲＮＡと構造的に似ているであろう。
本発明の方法のさらに好ましい態様では、前記インビトロ翻訳システムに、リボヌクレアーゼの阻害剤を加える。
好ましくは、前記リボヌクレアーゼ阻害剤は、トランジション状態アナログであり、最も好ましくはバナジルリボヌクレアーゼ複合体である。
本発明にしたがえば、特にバナジルリボヌクレアーゼ複合体は、リボソームディスプレイの効率をさらに増加させるために有利に使用できることが分かった。この複合体は同時にタンパク質合成を部分的に阻害するので、この結果は特に驚くべきものである。
本発明のさらなる好ましい態様は、
（ａ）ポリソームの形成後のマグネシウム塩、好ましくは酢酸マグネシウムの添加；および／または
（ｂ）ｍＲＮＡと対応する（ポリ）ペプチドとの間の架橋を形成させる手段；および／または
（ｃ）翻訳の後および／またはスクリーニング過程の間の低い温度
によって工程（ａ）および（ｃ）においてポリソームが安定化される方法に関する。
上記の手段は、ポリソームの安定性をさらに増大させることが分かっている。したがって、反応緩衝液中の５０ｍＭの酢酸マグネシウム濃度は、解離に対してリボソーム複合体を有意に安定化する。上記の文脈において「低い温度」なる語は、有効なスクリーニングが起きるのを可能にする温度を意味すると意図する。好ましくは、この低い温度は、０〜５℃の範囲内である。
好ましくは、翻訳は、原核生物の翻訳システムにおいて行う。特に好ましくは、Ｓ−３０E. coli翻訳システムのようなE. coliをベースとする翻訳システムである。
別法として、翻訳システムは、真核生物の翻訳システムにおいて実行してもよい。
本発明の方法のさらに好ましい態様では、工程（ｄ）は、
（ｄａ）前記ｍＲＮＡを逆転写し；
（ｄｂ）場合により、得られたｃＤＮＡを増幅し；
（ｄｃ）場合により、場合により増幅したｃＤＮＡをクローニングし；そして
（ｄｄ）前記ｃＤＮＡの配列を決定する
ことを含む。
ｍＲＮＡ分子の集団が大きすぎて１回のラウンドでは所望の分子種を同定できない場合、目的の核酸を同定するためのこの態様は好ましい。さらに、ｍＲＮＡ分子の集団がクローニングにより“不朽化（immortalized）”されるので、同定された分子の反復的で詳細な試験が可能である。
逆転写は、MaxamとGirbertniによって開発された、並びにSangerと同僚によって開発された最も便利なＤＮＡ配列決定技術（例えば、Sambrockら，“Molecular Cloning, A Laboratory Manual”，第２版，1989, CSH Press, Cold Spring Harborを参照）を用いる配列決定を可能にする。後で適当なベクターへのクローニングをするかまたはしない、好ましくはＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅は、所望の核酸分子の同定をさらに有意に容易にする。様々な場合において、核酸分子の増幅は、研究者が後でこの核酸分子を同定することを可能にするための必須条件であろう。
本発明の方法のさらなる好ましい態様では、工程（ａ）の前に、β−メルカプトエタノールおよび／またはＤＴＴのような還元剤の存在下で、ＤＮＡをｍＲＮＡに転写する。
β−メルカプトエタノールおよび／またはＤＴＴのような還元剤を反応緩衝液に含有させるとＤＮＡ−ポリメラーゼの安定性が増加することは知られている。したがって、緩衝液中の還元剤は、ｍＲＮＡの収率の増加に寄与し、それによってリボソームディスプレイ総体としての改善がもたらされる。
転写後、且つ工程（ａ）の前に、この還元剤を除去することが特に好ましい。本発明のこの方法は、スクリーニングされる（ポリ）ペプチドが、ジスルフィド結合の形成により天然のコンフォメーションをとっている分子種を含んでいるかもしれない場合に最も好ましい。そのような（ポリ）ペプチドの例は、免疫グロブリンスーパーファミリーの一員である。この好ましい態様を導入することにより、本発明は、組み合わせた転写／翻訳システムの使用を示唆する、上で引用した先行技術を直接否定する。
さらに、本発明は、
（ａ）正しいリーディングフレームにおける終止コドンを欠くＤＮＡ分子の集団を、還元剤の存在下で対応するｍＲＮＡ分子の集団に転写する工程；
（ｂ）前記ｍＲＮＡ分子の集団から前記還元剤を除去する工程；
（ｃ）ポリソームの形成が可能な条件下で、インビトロ翻訳システムにおいて前記ｍＲＮＡ分子の集団を翻訳すること；
（ｄ）形成したポリソームを、前記ｍＲＮＡ分子によってコードされ該ポリソームによってディスプレイされる（ポリ）ペプチドと該標的分子との相互作用が可能な条件下で接触させる工程；
（ｅ）前記標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをディスプレイしているポリソームを、そのような（ポリ）ペプチドをディスプレイしていないポリソームから分離する工程；および
（ｆ）前記標的分子と相互作用するポリソームにおいてディスプレイされた（ポリ）ペプチドをコードしている核酸分子を同定する工程
をさらに含む、標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定するための方法に関する。
好ましい態様では、工程（ａ）において使用する還元剤は、β−メルカプトエタノールおよび／またはＤＴＴである。
本発明の方法のさらに好ましい態様では、（ポリ）ペプチドは、免疫グロブリンスーパーファミリー、好ましくは免疫グロブリンファミリーのドメインを含む。たとえば、前記（ポリ）ペプチドには、完全なＴ細胞レセプターまたは抗体鎖または抗体のドメインなどの抗体鎖の一部、例えばＶHまたはＶL領域が含まれる。
（ポリ）ペプチドは、１本鎖の抗体またはそのような１本鎖の抗体を含む融合タンパク質であることが特に好ましい。融合タンパク質代替物においては、前記抗体鎖の融合のパートナーは、好ましくは、対応するｍＲＮＡに生成しようとしている（ポリ）ペプチドを繋ぐために用いられるｔａｇである。
さらに、本発明は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、酸化または還元されたグルタチオン、E. coliタンパク質ＤｓｂＡ、およびＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ、またはＧｒｏＥＳなどの分子シャペロンからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質が翻訳システムに添加されている方法に好ましく関する。
上記の化合物は、単独でまたは組み合わせて、生成しようとしている（ポリ）ペプチドの、安定性、溶解性および／または天然の折り畳み許容度を増強し得る。
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、細菌起源でも真核生物起源でもよい。システムに含まれる化合物／酵素は、当業者が、スクリーニングするタンパク質のタイプにしたがって選択する。たとえば、抗体ドメインを含むライブラリーをスクリーニングするならば、本発明の教示にしたがって、真核生物のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含有させる。本発明によって示されるように（添付の実施例参照）、ポリソームディスプレイシステムは、前記酵素を翻訳反応システムに組み込むことによって有意に改善される。
本発明の方法のさらに好ましい態様では、ポリソームを前記標的分子と接触させる工程中に形成した、ポリソームどうしの、および／またはポリソームと標的分子との間の、および／または場合によりポリソームと標的分子が固定化されているマトリックスとの間の非特異的な相互作用を、ブロッキング化合物の添加によって阻害または減少させる。
最も好ましい態様では、このブロッキング化合物は、ヘパリンなどのポリアニオン性の化合物である。ヘパリンをＲＮアーゼ阻害剤として含有させることは示唆されてきたが（ＷＯ ９１／０５０５８）、意外にも、本発明によれば、非特異的な結合もさらに減少させることが見い出された。ヘパリンは、ポリアニオン性化合物として、非特異的な結合部位に対するポリソーム複合体の一部として、ポリアニオン性のｍＲＮＡと競合すること考えられ、ポリソームディスプレイにおける、ヘパリンなどのポリアニオン性の化合物の添加は、非特異的な結合を減少させるために一般的に適用可能な方法になっている。
別の最も好ましい態様では、前記ブロッキング化合物は滅菌したミルクである。無脂肪ミルクの添加は、ポリソームディスプレイに関して既に示唆されている（ＷＯ９５／１１９２２）。しかしながら、本発明に従えば、ミルクをアフィニティー選択中に使用するときには、ＲＮＡを単離することができないことが分かった。意外にも、滅菌したミルクを使用したとき、ＲＮＡの単離は再び可能になり、非特異的な結合の量が実質的に減少した。
さらに、本発明は、
（ａ）ssrＡ−ＲＮＡのtag−コード配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド；
（ｂ）場合により、スクリーニングされる（ポリ）ペプチドをコードする核酸をクローニングするのに適当なベクター；
（ｃ）場合により、リボヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはトランジション状態アナログ、および最も好ましくはバナジルリボヌクレオシド複合体；
（ｄ）場合により、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、酸化または還元されたグルタチオン、E. coli ＤｓｂＡ、および分子シャペロンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物；および
（ｅ）場合により、５’もしくは３’ステムループ、スペーサーまたは終止コドンを含まないターミネーターをコードするオリゴヌクレオチド
を含むキットに関する。
好ましい態様では、本発明のキットはさらに、
（ｆ）Ｓ−３０翻訳抽出物
（ｇ）ＰＣＲ構成成分
（ｈ）逆転写酵素
（ｉ）ＲＮＡ配列決定キット
（ｊ）ＤＮＡ配列決定キット
を単独でまたは組み合わせて含んでいてもよい。
最後に、本発明は
（ａ）ssrＡ−ＲＮＡを含まないインビトロ無細胞翻訳抽出物；
（ｂ）場合により、スクリーニングされる（ポリ）ペプチドをコードする核酸をクローニングするのに適当なベクター；
（ｃ）場合により、リボヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはトランジション状態アナログ、および最も好ましくはバナジルリボヌクレオシド複合体；
（ｄ）場合により、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、酸化または還元されたグルタチオン、E. coli ＤｓｂＡ、および分子シャペロンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物；および
（ｅ）場合により、５’または３’ステムループ、スペーサーまたは終止コドンを有しないターミネーターをコードするオリゴヌクレオチド
を含むキットに関する。
好ましい態様では、本発明のキットはさらに、
（ｆ）ＰＣＲ構成成分；
（ｇ）逆転写酵素；
（ｈ）ＲＮＡ配列決定キット；
（ｉ）ＤＮＡ配列決定キット
を単独でまたは組み合わせてを含んでもよい。
本発明のキットは、本発明の方法を実行するために便利に使用することができる。
図面は、以下のことを示す：
図１ リガンド（抗原）結合について天然タンパク質（ｓｃＦｖ）ライブラリーをスクリーニングするためのインビトロリボソームディスプレイの原理。１、ＤＮＡｓｃＦｖライブラリーを最初にＰＣＲによって増幅し、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合部位およびステムループを導入し、ＲＮＡに転写する。２、精製したのち、ｍＲＮＡを、リボソーム複合体の安定性を増強し、リボソームにおけるｓｃＦｖ抗体の折り畳みを改善する種々の因子の存在下に、E. coli Ｓ−３０システムにおいてインビトロで翻訳する。氷で冷却することにより翻訳を停止し、マグネシウム濃度を増加させることによりリボソーム複合体を安定化させる。３、固定化された抗原への天然ｓｃＦｖの結合により、所望のリボソーム複合体を翻訳混合物からアフィニティー選択する。非特異的なリボソーム複合体を、徹底的な洗浄により除去する。４、次いで、結合したリボソーム複合体をＥＤＴＡにより解離させる（４ｂ）か、または複合体全体を抗原で特異的に溶出する（４ａ）。５、ＲＮＡを複合体から単離する。６、単離されたｍＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写し、ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅する。次いで、このＤＮＡを次の豊富化のサイクルに使用し、一部をクローニングと配列決定によりおよび／またはＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡにより分析する。
図２（Ａ）リボソームディスプレイに使用するｓｃＦｖ構築物の模式図。Ｔ７はＴ７プロモーターを、ＳＤはリボソーム結合部位を、ＦはＮ末端メチオニンを有する長さ３アミノ酸のＦＬＡＧ
（Ｂ）ポリソーム複合体に結合したｓｃＦｖｈａｇ ｍＲＮＡの量は、その末端の二次構造と、折り畳まれたｓｃＦｖをリボソームへ連結するスペーサーの長さによって影響を受ける。ｓｃＦｖｈａｇ ｍＲＮＡの種々の構築物（構築物ｃ１〜ｃ９）を、１サイクルのリボソームディスプレイに使用した。それらのうちのいずれが終止コドンを含んでいなかった。それぞれの種類を個々に試験した。翻訳混合物１００μLからリボソーム複合体をアフィニティー選択した後、ｍＲＮＡを単離し、ノーザンハイブリダイゼーションによって解析した。５’ステムループの存在は（＋）または（−）で、３’ステムループの存在は、不在ならば（−）、ｌｐｐターミネーターに由来する場合は（ｌ）またはＴ３Ｔｅターミネーターに由来する場合は（ｔ）として示す。スペーサーの長さは、ｓｃＦｖに続き、ｓｃＦｖをリボソームへ連結している、翻訳されたステムループを含んでいるアミノ酸の数を示す。ｋｂで示したＲＮＡの長さは、ＲＮＡ分子量マーカーＩＩＩ（ベーリンガーマンハイム）から求める。棒グラフは、蛍光画像解析から得られた定量されたｍＲＮＡの量を示す。
（Ｃ）リボソーム複合体に結合したｍＲＮＡの量に対する添加物の効果。ｓｃＦｖｈａｇ構築物ｃ７のｍＲＮＡを、１サイクルのリボソームディスプレイに使用した。図２Ｂレーンｃ７および図２Ｃレーン６の試料は同一である。示した場合では、３．５ｍＭアンチｓｓｒＡオリゴヌクレオチドＯＮ１０（5’-TTAAGCTGCTAAAGCGTAGTTTTCGTCGTTTGCGACTA-3’）、３５ｍg／ｍLタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）または１ｍg／ｍLバナジルリボヌクレアーゼ複合体（ＶＲＣ）を翻訳に関与させた。翻訳は、Ｍg（Ａc）2を示した最終濃度（ｍＭ）で添加し、氷で冷却することにより停止した。１００μLの翻訳混合物からリボソーム複合体をアフィニティー選択した後、ｍＲＮＡを単離しノーザンハイブリダイゼーションにより解析した。棒グラフは、蛍光画像解析から定量されたｍＲＮＡの量を示す。
図３ アンチｓｓｒＡアンチセンスオリゴヌクレオチドＯＮ１０（図２Ｃ）は、最も長いタンパク質の分子量を減少させた（矢印）。インビトロ翻訳は、35Ｓ−メチオニンおよびｓｃＦｖｈａｇ ｃ７ｍＲＮＡを使用して行った。反応は、３．５ｍＭオリゴヌクレオチドＯＮ１０の非存在下（−）または存在下（＋）で行った。翻訳産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
図４（Ａ） リボソームディスプレイによるｓｃＦｖＡＬ２を含む混合物からのｓｃＦｖｈａｇリボソーム複合体の豊富化。ｓｃＦｖｈａｇ ｃ５のｍＲＮＡをｓｃＦｖＡＬ２のｍＲＮＡで１０8に希釈し、混合物をリボソームディスプレイに使用した。ｓｃＦｖｈａｇリボソーム複合体のアフィニティー選択の後、ｍＲＮＡを単離し、オリゴヌクレオチドＯＮ５を用いてｃＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡをオリゴヌクレオチドＯＮ３およびＯＮ７を使用するＰＣＲによって増幅し、アガロース電気泳動によって解析した。レーン１〜５はそれぞれ、第１〜第５ラウンドのリボソームディスプレイ後に増幅されたＰＣＲ産物であった。Ｍは、分子量マーカーとして使用した１ｋｂのＤＮＡラダー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）である。
ｓｃＦｖｈａｇおよびｓｃＦｖＡＬ２に対応するＰＣＲ産物を標識する。
（Ｂ）固定化された抗原の機能としてのリボソームディスプレイによる、ｓｃＦｖｈａｇ ｃ５またはｓｃＦｖＡＬ２リボソーム複合体いずれかの豊富化。ｓｃＦｖｈａｇおよびｓｃＦｖＡＬ２のｍＲＮＡを１：１の割合で混合し、１サイクルのリボソームディスプレイに使用した。アフィイティー選択の後、ｍＲＮＡを単離し、逆転写し、ＰＣＲによって増幅し、図４Ａのようにアガロースゲル電気泳動により解析した。同じ１：１混合物を、対照として固定化したトランスフェリン（ｔｒ）、アンピシリン−トランスフェリンコンジュゲート（ａｍｐ）、またはｈａｇ−ペプチド−トランスフェリン コンジュゲート（ｈａｇ）においてアフィニティー選択した。ｓｃＦｖｈａｇおよびｓｃＦｖＡＬ２に対応するＰＣＲ産物を標識する。
図５（Ａ）第３ラウンドのポリソームディスプレイ後のＲＮＡプールの解析：ＲＮＡプールのインビトロ翻訳および２％ミルクの存在下での標識したポリソーム複合体のＲＩＡアッセイ：（ａ）ＢＳＡに対する結合；（ｂ）ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｃ）１μＭ ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）による阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｄ）１μＭ ｈａｇペプチドによる阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｅ）１μＭフルオレセインによる阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合。
（Ｂ）第３ラウンドのポリソームディスプレイ後のＲＮＡプールの解析：ＲＮＡプールのインビトロ翻訳および２％ミルクの存在下での標識したポリソーム複合体のＲＩＡアッセイ：（ａ）ＢＳＡに対する結合；（ｂ）ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｃ）１μＭ ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）による阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｄ）１μＭ ｈａｇペプチドによる阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｅ）１μＭフルオレセインによる阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合。
（Ｃ）ＲＩＡによる第３ラウンドのポリソームディスプレイ後のＲＮＡプールの解析：ミルクの存在下（Ａ）、または不在下（Ｂ）で行った３ラウンドのアフィニティー選択後のＲＮＡプール：
ＲＮＡプールのインビトロ翻訳および２％ミルクの存在下での標識されたポリソーム複合体の結合アッセイ：（ａ）ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合；（ｂ）１μＭ ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）による阻害下での、ＢＳＡ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）に対する結合。
実施例は、本発明を説明する。
添付した実施例において、抗原に結合するためのその正しく構築された三次元構造に必要な、抗体のｓｃＦｖフラグメントは、リボソームディスプレイによって１０8倍に豊富化でき、その配列がこの過程の間に“進化”することが示される。
実施例１：ｓｃＦｖ抗体フラグメントの構築
ｓｃＦｖｈａｇ構築物ｃ７を、（Ｇly４Ｓer）3リンカーを含むｓｃＦｖ １７／９をディスプレイしているｆｄファージ
他の構築物は、以下のプライマーペアを用いてＰＣＲによりｃ７から調製した。ｃ１，ＯＮ５（5’-TCAGTAGCGACAGAATCAAG-3’）およびＯＮ６（5’-GAAATTAA TACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAGAAGGAGGTATATCCATGGACTACAAA GA-3’）、Ｔ７プロモーターおよび５’ステムループを含まないＲＢＳを導入する。スペーサーは遺伝子ＩＩＩのアミノ酸２１１〜２９４から得る；ｃ２，ＯＮ４およびＯＮ６、ｃ７と同じスペーサー；ｃ３，ＯＮ６およびＯＮ７（5’-GGCCCACCCGTGAA GGTGAGCCTCAGTAGCGACAG-3’）、スペーサーは、遺伝子ＩＩＩのアミノ酸２１１〜２９４から得、翻訳されたＴ３Ｔｅターミネーターの７個のアミノ酸が続く；ｃ４，ＯＮ３およびＯＮ５、ｃ１と同じスペーサー；ｃ５，ＯＮ３およびＯＮ７、ｃ３と同じスペーサー；ｃ６，ＯＮ２およびＯＮ３、スペーサーは、遺伝子ＩＩＩのアミノ酸２１１−２９９から得、ｌｐｐターミネーターの最初の４アミノ酸が続く；ｃ８，ＯＮ３およびＯＮ８（5’-TTTAAGCAGCTCATCAAA ATCACC-3’）、スペーサーは、遺伝子ＩＩＩのアミノ酸２１１−２６４から得、ｌｐｐターミネーターの最初の４アミノ酸が続く；ｃ９，ＯＮ３およびＯＮ４、スペーサーは遺伝子ＩＩＩのアミノ酸２１１−２６４から得、ｌｐｐターミネーターの２４アミノ酸が続く、ｃ８を鋳型として用いる。ｓｃＦｖＡＬ２構築物（ＶL−（Ｇly４Ｓer）4−ＶH）を２工程のＰＣＲによってプラスミドｐＡＫ２０２
実施例２：ＲＴ−ＰＣＲおよびインビトロ転写
Superscript逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用い、製造元の推奨にしたがって逆転写を行った。ＰＣＲは、５％ＤＭＳＯの存在下でＴａｑポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて行った（９４℃で４分間、次いで９４℃で３０秒間の３サイクル、３７℃で３０秒間、７２℃で２分間、次いで３７℃の代わりに６０℃にする同様の１０サイクル、３７℃の代わりに６０℃にして１サイクルにつき７２℃で１５秒間の延長を行う同様の２０サイクル、７２℃にて１０分間で終了）。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により解析し、ゲルから精製し、量と質が十分でなければ再増幅するか、またはさらに精製することなく転写に直接使用した。インビトロ転写を記載のとおりに行った（Pokrovskaya, I. D. & Gurevich, V. V.（1994）Anal. Biochem. 220, 420-423）。
実施例３：モデルシステムおよびアフィニティー選択の収量の定量
モデルシステムとして、我々は、軽鎖の可変領域（ＶL）がフレキシブルなリンカーを介して重鎖の可変領域（ＶH）に連結している、抗体の１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを使用した（Huston, J. S., Levinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M. S., Novotny, J., Margolies, M. N., Ridge, R. J., Bruccoleri, R. E., Haber, E., Crea, R. & Oppermann, H.（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5879-5883）。折り畳まれたタンパク質をリボソームに繋ぎ留めるが、折り畳みには干渉しないようにするため、我々はスペーサーをｓｃＦｖフラグメントのＣ末端に融合した。抗体ドメインがジスルフィド結合を形成し、ＲＮＡポリメラーゼには最大限の安定性のためにβ−メルカプトエタノールが必要であるので、別の反応において転写を行う効果について調べた。さらに、翻訳中の酸化的タンパク質折り畳みの条件
ポリペプチドの遊離は、E. coliにおいて３つのポリペプチド遊離因子（Grentzmann, G., Brechemier-Baey, D., Heurgue-Hamard, V. & Buckingham, R. H.（1995）J. Biol. Chem. 270, 10595-10600; Tuite, M. F. & Stansfield, I.（1994）Mol. Biol. Rep. 19, 171-181; Tate, W. P. & Brown, C. M.（1992）Biochemistry 31, 2443-2450）と、ｍＲＮＡを遊離する１つのリボソーム再生因子（Janosi, L., Shimizu, I. & Kaji, A.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 4249-4253）を必要とする活性な過程である。遊離因子結合の結果は、一般に、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ中心による、リボースと最後のアミノ酸との間のペプチジルｔＲＮＡの加水分解である（Tate, W. P. & Brown, C. M.（1992）Biochemistry 31, 2443-2450）。我々のシステムは終止コドンを欠いており、したがってポリペプチドの画分がｔＲＮＡを加水分解せず、リボソームに結合したまま残り、アフィニティー選択に適用可能である。
E. coli Ｓ−３０システムにおけるインビトロ翻訳は、ChenおよびZubay（Chen, H. Z. & Zubay, G.（1983）Methods Enzymol. 101, 674-690）に従い、いくつかの改良を加えて行った。翻訳は、以下の成分を含む１１０μLの反応物中、３７℃で１０分間行った：５０ｍＭ Tris−Ａc（pＨ７．５）、３０ｍＭ ＮＨ4Ａc、１２．３ｍＭ Ｍg（Ａc）2、０．３５ｍＭの各アミノ酸、２ｍＭ ＡＴＰ、０．５ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭｃＡＭＰ、０．５ｍg／ｍL E. coli ｔＲＮＡ、２０μg／ｍLギ酸、１００ｍＭ ＫＡc、３０ｍＭアセチルリン酸（Ryabova, L. A., Vinokurov, L. M., Shekhotsova, E. A., Alakhov, Y. B. & Spirin, A. S.（1995）Anal. Biochem. 226, 184-186）、１．５％ＰＥＧ８０００、３３μｇ／ｍLリファンピシン、１ｍg／ｍLバナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）、２３μLのE. coli ＭＲＥ６００抽出物（Chen, H. Z. & Zubay, G.（1983）Methods Enzymol. 101, 674-690）および９０μｇ／ｍLのｍＲＮＡ。
氷で冷却することにより翻訳を停止し、５０μＭ酢酸マグネシウムにより、さらにリボソーム複合体を解離に対して安定化する（Holschuh, K. & Gassen, H. G.（1982）J. Biol. Chem. 257, 1987-1992）。さらにリボソームストーリング（stalling）も誘発すると考えられる５０μＭ濃度のクロラムフェニコール（Mattheakis, L. C., Bhatt, R. R. & Dower, W. J.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9022-9026; Moazed, D. & Noller, H. F.（1987）Nature 327, 389-394）は、選択特性を改善しなかった（データは示さず）。合成されたタンパク質、リボソームおよびｍＲＮＡからなる複合体全体を、次いでアフィニティーマトリックスに結合し、洗浄し、競合リガンドで溶出するか、またはリボソームをＥＤＴＡにより解離させた（図１）。具体的には、試料を氷冷洗浄緩衝液（５０ｍＭ Tris−Ａc（pＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮaＣl、５０ｍＭ Ｍg（Ａc）2および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で４倍希釈し、４℃にて１０，０００×ｇで５分間遠心し、不溶性の成分を除いた。ｈａｇ−トランスフェリンコンジュゲートでコーティングしたマイクロタイタープレートを氷冷洗浄緩衝液で予め洗浄し、遠心した翻訳混合物から得た上清を入れ（マイクロタイターウェルあたり２００μL）、プレートを冷却した室内で１時間穏やかに振盪した。氷冷した洗浄緩衝液で５回洗浄したのち、残ったリボソーム複合体を、氷冷した溶出緩衝液（ウェルあたり１００μL；Tris−Ａc（pＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮaＣl、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０μg／ｍLのE. coli ｔＲＮＡ）により、冷却した室内で１０分間解離させ、遊離したｍＲＮＡをエタノール沈殿によりまたはＲｎｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる単離により回収した。
我々は、いずれかの段階において予備的にポリソームを単離する必要があるとは見い出さなかった。リボソームディスプレイの効率は、組み合わせたインビトロ転写−翻訳を用いたとき１００分の１になることが分かった（データは示さず）。我々は、最初にインビトロ転写、翻訳および折り畳みのために遺伝子構造に処理を施し、次に翻訳反応そのものを最適化することによる、２段階のリボソームディスプレイを開発した。各試験は、１０μｇの投入ｍＲＮＡで開始した。これは、約１．５×１０13個の分子に相当する。投入ｍＲＮＡを単ラウンドのアフィニティー選択：インビトロの翻訳、固定化された標的リガンド上でのリボソーム複合体の捕捉およびｍＲＮＡの遊離、に付した。次いで、遊離したｍＲＮＡをノーザン解析により定量した。
ノーザン解析は、ＲＮＡ電気泳動およびナイロン膜（Schleicher & Schuell）への移動をTurboblotter（Schleicher & Schuell）を用い、記載されているように行った（Goda, S. K. & Minton, N. P.（1995）Nucleic Acids Res. 23, 3357-3358）。ハイブリダイゼーションは、６０℃にて１２時間行った（Church, G. M. & Gilbert, W.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1991-1995）。ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドＯＮ９（5’-ACATGGTAACTTTTTCACCAGCGGTAACGG-3’）により行い、これをｓｃＦｖ ｍＲＮＡのＶL領域へアニーリングした。このオリゴヌクレオチドは、ＤＩＧオリゴヌクレオチドテイリングキット（ベーリンガーマンハイム）を用いて、ジゴキシゲニン-１１-ｄＵＴＰ／ｄＡＴＰによる３’テイリングにより標識した。洗浄条件は以下のとおりである：２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ（室温で５分間）；２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ（６０℃３０分間を２回）；０．１×ＳＳＣ（室温で１０分）。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを、ＤＩＧ ＤＮＡラベリングおよび検出キットを用いて、化学ルミネセンス基質ＣＳＰＤ（ベーリンガーマンハイム）を用いてＸ線フィルムに感光するか、または蛍光基質アトフォス（ベーリンガーマンハイム）により蛍光造影機（Molecular Dynamics）を用いて検出した。
実施例４：ｍＲＮＡ構造の収率に対する影響
リボソームディスプレイシステムの設計において、我々は最初にｓｃＦｖ遺伝子のフランキング領域を加工した（図２）。遺伝子は非常に効率よくＰＣＲ産物から転写され、そのｍＲＮＡはヌクレアーゼに対して安定である。５’末端のために、我々は、Ｔ７プロモーターと、ステムループ構造をｍＲＮＡのすぐ始めでコードする天然のＴ７遺伝子１０上流領域を用いた（Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J. & Dubendorff, J. W.（1990）Methods Enzymol. 185, 60-89）。３末端で、我々は、新生の、リボソームの推定ポリペプチドチャネルへ折り畳まれたポリペプチドを繋ぎ留め、折り畳みに干渉しない十分な距離を与えるために、ｓｃＦｖのリーディングフレームに５７〜１１６アミノ酸のスペーサー領域を融合した。ＲＮＡレベルでこのスペーサーは、３’ステムループ、即ちE. coliリポタンパク質のターミネーター（Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J. & Dubendorff, J. W.（1990）Methods Enzymol. 185, 60-89）（lpp term）またはファージＴ３の初期ターミネーター（Reynolds, R., Bermudez-Cruz, R. M. & Chamberlin, M. J.（1992）J. Mol. Biol. 224, 31-51）（Ｔ３Ｔｅ）のいずれかを、エンドヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの安定性を増加させるためにコードする。１ラウンドの翻訳と選択の後のフランキング領域の直接の比較（図２Ｂ）では、我々は、５’ループ（Ｔ７-ｇ１０由来）、３’ループ（ｌｐｐターミネーター由来）および最も長い１１６アミノ酸のスペーサーを有する構築物で最良の結果を得た。１ラウンドのリボソームディスプレイの後のｍＲＮＡの収率は、投入ｍＲＮＡの０．００１％未満から０．０１５％へ改善された（１５倍）。
実施例５：翻訳条件の収率に対する効果
次いで、我々は、翻訳中に存在する種々の化合物の効果を調べた。ヌクレアーゼは、トランジション状態アナログ（Berger, S. L.（1987）Methods Enzymol. 152, 227-234）として作用するバナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）によって効果的に阻害されることが分かった。タンパク質合成が部分的に阻害されるにもかかわらず（データは示さず）、翻訳中に存在するとき（図２Ｃ）１ｍg/ｍLのＶＲＣは、１ラウンドのアフィニティー選択後にリボソーム複合体からの単離されたｍＲＮＡの収率を最大にし、ＶＲＣが存在しないとき、リボソームディスプレイの効率の数倍の減少につながった（図２Ｃ）。対照的に、Ｒｎａｓｉｎ（Mattheakis, L. C., Bhatt, R. R. & Dower, W. J.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9022-9026）は、システムの効率には効果がなかった。遊離した生成物の長時間のインキュベーション（３００分までの）によって電気泳動パターンが変わらなかったので（データは示さず）、これらの条件下で合成したｓｃＦｖの有意のタンパク質加水分解に関する証拠は認められなかった。
分子シャペロンおよびジスルフィド形成触媒の存在下での可溶性scＦvフラグメントのインビトロ翻訳における系統的な研究から
最近、ペプチド標識（tagging）システムがE. coli,において発見され、それによって終止コドンを欠くｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質が、ssrＡ−ＲＮＡによりコードされるＣ末端標識の付加により修飾され、リボソームから遊離し、分解についてマーキングされる（Keiler, K. C., Waller, P. R. & Sauer, R. T.（1996）Science 271,990-993）。本発明において、この分解がssrＡ-ＲＮＡのtagコード配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害し得ることが示された。さらに、意外にも、このような可能性のある阻害が、リボソームディスプレイ対して効果があるということが観察された。確かに、リボソームディスプレイに関して４倍も高い効率が、anti-ssrＡオリゴヌクレオチドの存在下で認められ（図２Ｃ）、最も長いタンパク質産物の分子量が減少しているが、これは恐らく分解標識の結合の阻止によるものであろう（図３）。ＰＤＩとanti-ssrＡオリゴヌクレオチドの混合は、リボソームディスプレイシステムの効率の１２倍の増加をもたらした（図２Ｃ）。
適当なｍＲＮＡ二次構造と翻訳中に存在する種々の化合物の組み合わせによって、我々は１ラウンドのアフィニティー選択後のｍＲＮＡの収率を、投入ｍＲＮＡの０．００１％から０．２％へ２００倍に増加させることができた。この数字は、リボソームとの共有結合、タンパク質折り畳み、リガンド結合、リボソーム捕捉およびＲＮＡ遊離および増幅の総体としての効率を示すものである。
実施例６：複数ラウンドの選択による標的ｍＲＮＡの特異的豊富化
最適化したシステムの試験において、我々は、どのようにすれば２種類のタンパク質の混合物を機能に関して豊富化できるかについて調べた。図２Ａにしたがって同じようにして構築した、両方とも５’および３’Ｔ３Ｔｅループを有し、一方は抗ヘマグルチニンscＦv １７／９（Schulze-Gahmen, U., Rini, J. M. & Wilson, I. A.（1993）J. Mol. Biol. 234, 1098-1118）（scＦv hag）をコードし、もう一方は抗-β-ラクタム抗体 ＡＬ２
アフィニティー選択によって実際に起こった豊富化を立証するために、我々は、両方のｍＲＮＡの１：１混合物を別の表面上で試験し、投入比率と変わらないことを認めた（図４Ｂ）。さらに、どちらの抗原がそこに固定化されるかによって、同じ１：１ｍＲＮＡ混合物からいずれか一方の抗体を豊富化することができた（図４Ｂ）。
実施例７：アフィニティー選択後のscＦv抗体フラグメントの解析
第５ラウンドの選択の後で、ＰＣＲ産物をベクターにライゲーションし、E. coliに形質転換し、単一のクローンを解析した。実験プロトコルは、以下のとおりである：第５ラウンドのリボソームディスプレイの後、ＰＣＲ産物をベクターｐＴＦＴ７４へクローニングした
配列解析は、クローンは３〜７の塩基の変化を含み、９０％がトランジションで１０％がトランスバージョンであることを示しており、知られているTaqポリメラーゼの誤り特性（Keohavong, P. & Thilly, W. G.（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 9253-9257）とよく一致している。各クローンを合計１６５サイクルのＰＣＲに付し、途中、結合に関して５回の表現型選択を行い、これらの条件下での誤りの割合は、選択後に生き残った突然変異体のみを数えた場合、３．３×１０-5であると計算できた。
タンパク質のレベルでは、選択されたクローンは０〜４個の交換されたアミノ酸を有し、それはＶL、ＶHおよびリンカーに分布していた。すべての突然変異体はお互いに独立しており（表１）、広い範囲での、機能に関して矛盾しない中立な突然変異、そして、場合によると、システムがそれについて選択される、機能についての改善を示した。選択された分子の正確な特性にはさらなる解析が必要であるが、我々は、リンカーの開始点での、必要なターン形成を促進し得るプロリンの選択（Tang, Y., Jiang, N., Parakh, C. & Hilvert, D.（1996）J. Biol. Chem. 271, 15682-15686）、および溶解性を増大させることが知られている酸性残基の選択
実施例８：ポリソームディスプレイライブラリーの構築
我々は、（Gly4Ser）4リンカーにより連結されている２つのドメインを有するVL-VH配向のscＦvsのライブラリーを構築した。スペーサー、即ちscＦvをリボソームに繋ぎ留め、リボソームにおいてscＦvの折り畳みを可能にするタンパク質を導入するために、我々は最初にライブラリーを、繊維状ファージM13mp19の遺伝子ＩＩＩのＣ末端部分に融合したscＦvsをタンパク質のレベルで生じさせるベクターpAK200
ライブラリーのクローニングは文献に記載された方法にしたがった
精製したＰＣＲ産物（各150ng）を、16℃で一晩、pAK200ベクターのSfiI部位にライゲーションした（モル比 挿入物：ベクター＝1:2）。
ライブラリーのpAK200ベクターへのライゲーションは非常に効率的であった：アガロースゲル電気泳動および制限解析によれば、我々は100%のライブラリーscＦv ＤＮＡがベクターの少なくとも一端にライゲーションし、50%以上がプラスミドのスペーサー部分に連結したことを見い出した。
ポリソームディスプレイライゲーション混合物に必要な特徴を導入するために、第１の工程でリボソーム結合部位（RBS）を導入するオリゴヌクレオチドSDA（５’-AGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATCCATGGACTACAAAGA-３’）、および翻訳されたＴ３Ｔｅターミネーターを導入するＯＮ７（実施例１参照）を用い、第2の工程でＴ７プロモーターと５’-ループを導入するオリゴヌクレオチドＴ７Ｂ（５’-ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGG-３’）およびオリゴヌクレオチドＯＮ７を用いるＰＣＲによって、２段階で増幅した。ＰＣＲ産物は、さらに精製することなくインビトロ転写に使用し、ＲＮＡは、ＬｉＣl沈殿（Pokrovskaya, I. D. & Gurevich, V. V.（1994）Anal. Biochem. 220, 420-423）によって精製した。両方のミニライブラリーから得たＲＮＡを同じ割合でプールしポリソームディスプレイに使用した。
実施例９:scＦv抗体フラグメントのライブラリーのインビトロ翻訳
E. coli Ｓ−３０システムにおけるインビトロ翻訳を、若干の修飾を加えて実施例６に記載されたように行った。簡潔には、インビトロ翻訳を、以下の成分を含む220μlの反応物中で37℃にて8分間行った：50mM Tris-Ac, pH7.5, 30mM NH4Ac, 12.3mM Mg（Ac）2、0.35mMの各アミノ酸，2mM ATP, 0.5mM GTP, 1mM cAMP, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 20μg/mlギ酸，100mM KAc,30mMアセチルリン酸、1.5% PEG 8000、33μg/mlリファンピシン、1mg/mlバナジルリボヌクレオシド複合体（VRC）, 3.5mM anti-ssrＡオリゴヌクレオチド、0.3μM ＰＤＩ，51.4μlのE. coli MRE600抽出物および90μg/mlのｍＲＮＡ。
実施例１０：scＦvライブラリーのスクリーニング
ポリソーム複合体のアフィニティー選択およびＲＮＡ単離
最初の方法では、アフィニティー選択を、選択中にヘパリンを使用する改良を加えて実施例６に記載のように行った。我々は、ヘパリンによってポリソーム複合体の非特異的結合が、非特異的な表面（ミルクまたはBSA）と同じ位に特異的な表面（ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）-BSA）に対して減少することを観察した。
Mg（Ac）2を最終濃度50ｍＭまで加えることにより翻訳（実施例9参照）を停止し、翻訳混合物を氷で冷却した。試料を氷冷洗浄緩衝液（50mM Tris-Ac pH7.5, 150mM NaCl, 50mM Mg（Ac）2, 2.5mg/mlヘパリンおよび0.1% Tween-20）で4倍に希釈し、4℃にて10.000 x gで5分間遠心して可溶性の成分を除いた。ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）-BSAコンジュゲートでコーティングしたマイクロタイタープレートを氷冷洗浄緩衝液で予め洗浄し、遠心した翻訳混合物から得た上清を注ぎ（200μl／マイクロタイターウェル）プレートを冷却した室内で穏やかに１時間振盪した。ヘパリンを含まない氷冷洗浄緩衝液で５回洗浄したのち、残ったポリソーム複合体を氷冷溶出緩衝液（100μl perウェル; 50mM Tris-Ac, pH7.5, 150mM NaCl, 10mM EDTA, 50μg/ml of E. coli tRNA）により、冷却した室内で10分間解離させ、遊離したｍＲＮＡをRNeasyキット（Qiagen）を用いる単離により回収し、RT-ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ産物のインビトロ転写の後、ＲＮＡをＬｉＣl沈殿（Pokrovskaya, I. D. & Gurevich, V. V.（1994）Anal. Biochem. 220, 420-423）により精製し、ＲＩＡ解析（以下参照）かまたは次のラウンドのポリソームディスプレイのいずれかに使用した。アフィニティー選択をさらに改善するために、選択中の競合タンパク質の使用について評価した。ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）-ペプチドへのポリソーム複合体のアフィニティー選択中のミルクの使用は、恐らくミルクのRNアーゼ活性のために、ポリソームディスプレイサイクル後はＲＮＡが単離されなかった。純粋なタンパク質（例えばBSA，カゼインまたはトランスフェリン）は、非特異的な結合を減少しなかった。驚くべきことに、我々は、ミルクは、滅菌されているならば、ポリソーム複合体のアフィニティー選択中に使用できるということを観察した。したがって、ＲＮＡの安定性に対する影響はなく、表面に対する非特異的な結合を実質的に減少した。第２の方法では、２％の滅菌ミルクをアフィニティー選択中に緩衝液中に含有させる修飾を加え、上記の条件を使用した。
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
各ラウンドのポリソームディスプレイの後、回収されたプール全体のＲＮＡを、上記のライブラリーについて記載されたのと同様の条件を用い、以下の修飾を施してＳ−３０E. coliシステムにおいてインビトロで翻訳した：翻訳は37℃で30分間行い、反応混合物は50μCi/mlの35Ｓ-メチオニンおよび0.35ｍＭのメチオニン以外の各アミノ酸を含み、anti-ssrＡオリゴヌクレオチドならびにＰＤＩは含まない。翻訳後、反応混合物をPBST/ミルクで4倍に希釈して最終濃度２％ミルクにし、マイクロタイターウェルにおいて固定化したＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）ペプチドに結合させた。穏やかに振盪して３０分間インキュベーションした後、マイクロタイターウェルをPBSTで5回洗浄し、結合した放射性タンパク質を0.1Mトリエチルアミンで溶出した。溶出したタンパク質をシンチレーションカウンターで定量した。阻害ＲＩＡは、固定化した抗原に結合させる前に少なくとも１時間、室温で、PBST/２％ミルクに希釈した翻訳混合物を異なる濃度のＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）ペプチドとプレインキュベーションすることによって行った。
単一クローンのＥＬＩＳＡ
第３ラウンドのポリソームディスプレイの後、ＰＣＲ産物をベクターｐＴＦＴ７４
結果
ミルクの添加なしの第３ラウンドのポリソームディスプレイの後、我々は、ＲＩＡ（２％ミルクを使用する）によりＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）ペプチドに対する結合について結合体のプールを解析し、プールは結合し、1μMペプチドによってほぼ完全に阻害され得ることを見い出した。hagペプチド並びにフルオレセインによる阻害は観察されなかった（図５Ａ）。しかし、ＥＬＩＳＡ（２％ミルクを用いる）によるプールの単一のクローンの解析によって、24個のクローンのうち３個のみがＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）ペプチドと結合し、そのペプチドにより阻害されることが分かった（陽性クローン）。他の２１個のクローンは標的ペプチドに結合せず、恐らく表面に非特異的に結合した。さらなる２ラウンドのポリソームディスプレイは、プールのＲＩＡシグナルを増大させなかった。これは結合体のさらなる豊富化がなかったことを示している。我々は、ポリソーム複合体のアフィニティー選択中にミルクを使用せず、ファージディスプレイ実験からミルクがファージの表面への非特異的結合を減少させることを知っているので、我々は、ミルクの非存在下でプールのＲＩＡと単一のクローンのＥＬＩＳＡを繰り返した。ミルク非存在下でのプールのＲＩＡにより、プールは非特異的な結合体を同様に含んでいることが分かった（図５Ｂ）。単一のクローンの解析は、３個の陽性クローンが、ＥＬＩＳＡの間、２％ミルクの存在によって影響されなかった。一方、非特異的な結合体はミルクの非存在下で表面に結合したが、２％ミルクの存在下では全く結合しなかったことを示した。
２％ミルクを添加してアフィニティー選択を繰り返した。第３ラウンドの後、我々は、ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）ペプチドに対する結合について、ＲＩＡによりプールを再び解析した。この場合、プールは、ミルクなしで得たプールと比較して約４倍タンパク質と結合し、1μMペプチドによってほぼ完全に阻害された（図５Ｃ）。このプール由来の単一クローンのＥＬＩＳＡによる解析によって約75%のクローンが陽性であることが分かった。
Claims (27)
- 標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定する方法であって、
（ａ）正確なリーディングフレームにおける終止コドンを欠くｍＲＮＡの集団を、原核生物のインビトロ翻訳システムにおいて翻訳する工程であって、該翻訳システムは、ポリソームの形成が可能な条件下で、ssrＡ−ＲＮＡのtag−配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはssrＡ−ＲＮＡを含まない工程；
（ｂ）形成したポリソームを前記標的分子と、前記ｍＲＮＡ分子によりコードされ該ポリソームによってディスプレイされる（ポリ）ペプチドと前記標的分子との相互作用が可能な条件下で、接触させる工程；
（ｃ）前記標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをディスプレイするポリソームを、そのような（ポリ）ペプチドをディスプレイしていないポリソームから分離する工程；および
（ｄ）前記標的分子と相互作用するポリソームにおいてディスプレイされた（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定する工程
を含む方法。 - 前記ｍＲＮＡ分子が３’末端にステムループを含む、請求項１記載の方法。
- ５７〜１１６個のアミノ酸を優先的にコードするスペーサーを（ポリ）ペプチドのリーディングフレームに融合して、リボソームの推定（ポリ）ペプチドチャネルへ折り畳まれた新生の（ポリ）ペプチドを繋ぎ留める、請求項２記載の方法。
- 前記ｍＲＮＡ分子の３’末端の前記ステムループが、前記スペーサーをコードしている、請求項２または３記載の方法。
- 前記ＲＮＡ分子が、５’末端のステムループ構造を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 前記インビトロ翻訳システムが、リボヌクレアーゼの阻害剤を含有する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 前記リボヌクレアーゼの阻害剤がトランジション段階のアナログである、請求項６記載の方法。
- 前記トランジション段階のアナログがバナジルリボヌクレアーゼ複合体である、請求項７記載の方法。
- （ａ）ポリソームの形成後のマグネシウム塩＿の添加；および／または
（ｂ）ｍＲＮＡと対応する（ポリ）ペプチドとの間の架橋を形成させる手段；および／または
（ｃ）翻訳の後および／またはスクリーニング過程の間の低い温度
によってポリソームが工程（ａ）〜（ｃ）において安定化されている、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 - 前記マグネシウム塩が酢酸マグネシウムである、請求項９記載の方法。
- 工程（ｄ）が、
（ｄａ）前記ｍＲＮＡを逆転写し；
（ｄｂ）場合により、得られたｃＤＮＡを増幅し；
（ｄｃ）場合により、場合により増幅したｃＤＮＡをクローニングし；そして
（ｄｄ）前記ｃＤＮＡの配列を決定することを含む、
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。 - 工程（ａ）の前に還元剤の存在下にＤＮＡをｍＲＮＡに転写する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
- 還元剤を工程（ａ）の前に除去する、請求項１２記載の方法。
- （ポリ）ペプチドが、免疫グロブリンスーパーファミリー＿の領域を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
- （ポリ）ペプチドが、免疫グロブリンファミリーの領域を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
- （ポリ）ペプチドが一本鎖の抗体である、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
- ジスルフィドイソメラーゼまたは還元されたグルタチオン、E. coli タンパク質ＤｓｂＡ、および分子シャペロンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物が翻訳システムに添加されている、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
- ポリソームどうしの、および／またはポリソームと標的分子との間の、および／または場合によりポリソームと標的分子が固定化されるマトリックスとの間の、ポリソームと前記標的分子と接触させる工程の間に形成した非特異的な相互作用をブロッキング化合物の添加によって阻害または減少させる、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
- 前記ブロッキング化合物がヘパリンまたは滅菌されたミルクである、請求項１８記載の方法。
- （ａ）ssrＡ−ＲＮＡのtag−コード配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド；および以下からなる群から選択される少なくとも１つ
（ｂ）＿スクリーニングされる（ポリ）ペプチドをコードする核酸をクローニングするための適当なベクター；
（ｃ）＿リボヌクレアーゼ阻害剤＿；
（ｄ）＿タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、酸化されたまたは還元されたグルタチオン、E. coliタンパク質ＤｓｂＡ、および分子シャペロンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物；および
（ｅ）＿５’または３’ステムループ＿、スペーサーおよび／または終止コドンを有しないターミネーターをコードするオリゴヌクレオチド
を含む、標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定するためのキット。 - 前記リボヌクレアーゼ阻害剤が、トランジション状態アナログである請求項２０記載のキット。
- 前記リボヌクレアーゼ阻害剤が、バナジルリボヌクレオシド複合体である請求項２０記載のキット。
- さらに、
（ｆ）Ｓ−３０翻訳抽出物
（ｇ）ＰＣＲ構成成分
（ｈ）逆転写酵素
（ｉ）ＲＮＡ配列決定キット
（ｊ）ＤＮＡ配列決定キット
を単独でまたは組み合わせて含む、請求項２０〜２２のいずれかに記載のキット。 - （ａ）ssrＡ−ＲＮＡを含まない原核生物インビトロ無細胞翻訳抽出物および以下からなる群から選択される少なくとも１つ
（ｂ）＿スクリーニングされる（ポリ）ペプチドをコードする核酸をクローニングするための適当なベクター；
（ｃ）＿リボヌクレアーゼ阻害剤＿；
（ｄ）＿タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、酸化されたまたは還元されたグルタチオン、E. coliタンパク質ＤｓｂＡ、および分子シャペロンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物；および
（ｅ）＿５’または３’ステムループ＿、スペーサーおよび／または終止コドンを有しないターミネーターをコードするオリゴヌクレオチド
を含む、標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定するためのキット。 - 前記リボヌクレアーゼ阻害剤が、トランジション状態アナログである請求項２４記載のキット。
- 前記リボヌクレアーゼ阻害剤が、バナジルリボヌクレオシド複合体である請求項２４記載のキット。
- さらに、
（ｆ）ＰＣＲ構成成分
（ｇ）逆転写酵素
（ｈ）ＲＮＡ配列決定キット
（ｉ）ＤＮＡ配列決定キット
を単独でまたは組み合わせて含む、請求項２４〜２６のいずれかに記載のキット。
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