WO2007043715A9 - Rna結合ペプチド - Google Patents

Rna結合ペプチド

Info

Publication number
WO2007043715A9
WO2007043715A9 PCT/JP2006/320991 JP2006320991W WO2007043715A9 WO 2007043715 A9 WO2007043715 A9 WO 2007043715A9 JP 2006320991 W JP2006320991 W JP 2006320991W WO 2007043715 A9 WO2007043715 A9 WO 2007043715A9
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
rna
salt
derivative
gugaaa
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/320991
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2007043715A1 (ja
Inventor
Masaya Ishibashi
Kazuo Harada
Takayuki Hida
Tetsuro Suzuki
Kouji Ishii
Original Assignee
Advanced Science And Technolog
Jp Nat Inst Infectious Disease
Masaya Ishibashi
Kazuo Harada
Takayuki Hida
Tetsuro Suzuki
Kouji Ishii
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Advanced Science And Technolog, Jp Nat Inst Infectious Disease, Masaya Ishibashi, Kazuo Harada, Takayuki Hida, Tetsuro Suzuki, Kouji Ishii filed Critical Advanced Science And Technolog
Priority to JP2007540237A priority Critical patent/JPWO2007043715A1/ja
Publication of WO2007043715A1 publication Critical patent/WO2007043715A1/ja
Publication of WO2007043715A9 publication Critical patent/WO2007043715A9/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to an RNA binding peptide having binding activity to RNA containing a GUGAAA sequence.
  • the GUGAAA sequence is a sequence that is widely conserved among the 3 'untranslated regions of the hepatitis C virus genome + strand.
  • the X region is thought to be composed of SL1 ', which has a long hairpin structure, and SL2 and SL3, which have short hairpin structures.
  • the GUGAAA sequence is a sequence that forms the loop portion of the stem loop structure called SL2. (Yi, M. and Lemon, SM. J Virol. 77, 3557 * 3568, 2003).
  • the 3'X region of the HCV genome was tested by introducing 3'X region deletion mutants into cultured cells (Yi, M. and Lemon, SM. J Virol. 77, 3557.3568, 2003) and chimpanzee infection experiments ( Yanagi, M. et al. Proc Natl Acad Sci USA 96, 2291-2295, 1999) is considered indispensable for the replication of the HCV genome.
  • the virus protein NS5B is known to interact with the X region, including SL2.
  • NS5B protein has RNA-dependent RNA polymerase activity and plays an important role in replication of the C-type hepatitis virus genome (Oh, JW. Et al. J Biol Chem 275, 17710-17717, 2000).
  • An object of the present invention is to provide an RNA-binding peptide.
  • the present inventors have found a peptide that can bind to a base sequence having a GUGAAA loop sequence, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • the amino acid sequence represented by the above formula I includes an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added, and includes a base sequence represented by GUGAAA. Peptides capable of binding to all or part, derivatives thereof or salts thereof.
  • Arg is contained at least 5 residues or more, The peptide according to (1) or (2), a derivative thereof, or a salt thereof.
  • a transformant comprising the recombinant vector according to (7).
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide according to any one of (1) to (4), a derivative thereof, or a salt thereof.
  • An HCV detection reagent comprising the peptide according to any one of (1) to (4), a derivative thereof, or a salt thereof.
  • a diagnostic agent for hepatitis C comprising the peptide according to any one of (1) to (4), a derivative thereof, or a salt thereof.
  • RNA carrier comprising the peptide according to any one of (1) to (4), a derivative thereof, or a salt thereof.
  • RNA function promoter comprising the peptide according to any one of (1) to (4), a derivative thereof, or a salt thereof.
  • Figure 1 shows HCV 3 'X-tail (+) SL2 incorporated into reporter plasmid
  • FIG. 3 is a diagram of RNA secondary structure of terminal loop. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • RNA comprising a base sequence represented by GUGAAA
  • RNA binding peptides that can bind to all or part of the GUGAAA sequence.
  • the peptide of the present invention is a peptide rich in arginine.
  • RNA containing the GUGAAA sequence eg HCV genome
  • RNA (+) strand is inhibited. 1. Nucleic acid containing GUGAAA loop
  • the present inventor considered that a peptide capable of binding to the GUGAAA loop of the HCV genome (+) chain can be used as a medicine such as an antiviral agent, and as a result of diligent efforts, the present invention has been completed.
  • nucleic acids consisting of Sson-Crick base pairs is stabilized by hydrogen bonding between bases and stacking interactions between base pairs.
  • nucleic acids form non-base pair sites and multiple-stranded structures in addition to this double strand.
  • Non-base pair sites are classified into sites that do not form base pairs and sites that form base pairs x, and sites that do not form base pairs include bulge outs, internal loops, terminal mismatches, Hairpin loops, dangling ends, etc. are exemplified, and mismatched base pairs and the like are exemplified as sites forming base pairs.
  • a nucleic acid containing a terminal mismatch among such nucleic acids is provided (Fig. 1).
  • a nucleic acid containing a GUGAAA loop is composed of a GUGAAA loop and a stem sequence, and the sequence of the “GUGAAA” part enclosed in a box is
  • the stem sequence linked to the terminal loop sequence is a stem sequence formed by the base sequence indicated by “CCCGCU” and its complementary strand “GGUGGG” from the 5 ′ direction to the 3 ′ direction in FIG.
  • FIG. 1 specifically illustrates the base sequence of RNA (SEQ ID NO: 9), it may be a DNA sequence.
  • FIG. 1 is an illustration for explaining the present invention, and is not limited to the base sequence shown in FIG.
  • the length of the stem sequence does not need to be in a relationship to form a Toson-Crick complementary base pair (eg U for A or T, C for G) to each other as long as the stem is formed. Based on this relationship, it is sufficient to form a complementary strand by non-Toson-talic base pairs.
  • the length of the stem sequence is not particularly limited, but for example, 3 to 20 bases, preferably 3 to 10 bases, more preferably 3 to 8 bases, More preferably, it is 4 bases.
  • the stem sequence is preferably formed by a base sequence of 4 bases indicated by “CGCU” from the 5 ′ direction to the 3 ′ direction in FIG. 1 and its complementary strand “GGUG”.
  • the base sequence is designed so as to form the above-mentioned terminal loop and stem when expressed, and this is incorporated into a vector and used for a protein-RNA interaction detection system using anti-transcription termination reaction. it can.
  • the peptide of the present invention has at least the following formula I:
  • a peptide comprising the amino acid sequence represented by (SEQ ID NO: 1), a derivative thereof, or a salt thereof.
  • the above peptide is one of RNA-binding peptides and can bind to all or part of the GUGAAA loop.
  • the amino acid notation may be represented by a single letter such as “R” (arginine), “Q” (glutamine), and the like.
  • X represents any amino acid residue.
  • Arbitrary amino acid residues include 20 amino acid residues (Ala, Arg, Asp, Asn, Cys, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val).
  • peptide means a peptide in which two or more amino acids are linked by peptide bonds, and includes oligopeptides, polypeptides, and the like.
  • a polypeptide in which a polypeptide forms a three-dimensional structure is called a protein.
  • such a protein is also included in the “peptide”. Therefore, the RNA-binding peptide of the present invention means any oligopeptide, polypeptide, or protein as long as it can bind to all or part of the GUGAAA loop.
  • the peptide of the present invention contains an amino acid sequence of the above formula, and preferably has 11 to 23 amino acid sequences, more preferably 11 to 19 amino acid sequences.
  • peptides of the present invention are:
  • MAFHRNPNTRQRRRSRRAR SEQ ID NO: 2
  • MA FLRRINARQRRRQRRAR SEQ ID NO: 3
  • arginine rich domains Some amino acids in the peptides of the present invention form arginine rich domains (referred to as “arginine rich domains”). For example, in the peptide having 19 amino acid residues shown in SEQ ID NOs: 2 to 4, the 5th to 19th amino acids form an arginine-rich domain. In the peptide of the present invention, the number of arginines is at least five.
  • one or several amino acids of the amino acid sequence may have mutations such as deletion, substitution and addition. (They are referred to as “mutants” in the present invention.)
  • one or several, preferably 1 to 9, more preferably 1 of the amino acid sequence represented by Formula I are examples of the amino acid sequence represented by Formula I.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 2 to 4 Up to 5 amino acids may be substituted with other amino acids.
  • amino acid sequence having a length of 11 to 23 residues including the amino acid sequence represented by Formula I or the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2 to 4 peptides containing mutations such as the above deletion, substitution, addition As long as it can bind to all or part of the GUGAAA loop, it is included in the peptide of the present invention.
  • the binding activity between the peptide of the present invention and all or part of the GUGAAA loop is based on the expression level of the reporter gene in the intracellular protein RNA interaction detection system using anti-transcription termination reaction. It can be measured by performing quantitative quantification and evaluation.
  • the dissociation constant of the peptide of the present invention is ⁇ ⁇ : ⁇ .
  • the present invention includes derivatives thereof in addition to the above peptides.
  • “Derivative” refers to a derivative derived from the peptide of the present invention, wherein the number of amino acids is reduced to 3 or more, or some amino acids are replaced with other amino acids including unnatural products.
  • the derivative may be a part of a natural product modified or a peptide containing a modified residue synthesized by chemical synthesis.
  • the peptides of the present invention include those in which a part of the amino acid sequence is chemically modified.
  • “Chemical modification” refers to the reaction of a chemical reagent with a protein, mainly changing the chemical structure of the side chain of an amino acid residue.
  • the chemical modification employs a method of reacting a reagent (for example, polyethylene glycol) that specifically modifies an amino acid that is expected to be present in the active site or in the vicinity of the active site of the peptide of the present invention. Affinity labeling may be performed for chemical modification.
  • Chemically modified products include those obtained by methylating the ⁇ -carbon of amino acids. Chemical modification methods are well known in the field (Sonori Ohno, Yu Kanaoka, Fumio Sakiyama, Hiroshi Maeda, Biochemical Experimental Method 12, Chemical Modification of Proteins (.
  • the modified portion of the peptide containing a chemically modified amino acid sequence does not affect the peptide's original activity but acts as another effect (Yamaguchi, H. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. , 67 (10), 2269-2272, 2003).
  • the peptide derivatives of the present invention also include their retroenantiomers.
  • “Retroenantiomer” means that the amino acid sequence of the peptide is reversed (forms an enantiomer). That is, it means that the N-terminal of the peptide is the C-terminal, the C-terminal is the N-terminal, and each amino acid is a sequence composed of .D amino acids.
  • Such V troenantiomers are also included in the present invention as long as they have binding activity to all or part of the sequence of the GUGAAA loop.
  • the present invention relates to 65% or more, preferably 70% of the amino acid sequence constituting the peptide (for example, a peptide containing the amino acid sequence shown in Formula I or SEQ ID NOs: 2 to 4), a variant thereof, or a derivative thereof. More preferably, peptides, derivatives thereof or salts thereof containing 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more are provided.
  • the region of 65% or more for example, among the sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 4, the 5th to 19th (arginine rich domain) Examples include areas.
  • Examples of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 4 include regions of 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more amino acids.
  • the DNA can be obtained by constructing and expressing the DNA encoding the amino acid sequence, or by chemically synthesizing the peptide. Can do.
  • the peptide salt of the present invention is preferably a physiologically acceptable acid addition salt or basic salt.
  • acid addition salts include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid and sulfuric acid, or acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid,
  • organic acids such as citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid.
  • Examples of basic salts include salts with inorganic bases such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, magnesium hydroxide, and organic bases such as caffeine, piperidine, trimethylamine, and pyridine. Of the salt.
  • Salts can be prepared using acids such as hydrochloric acid or bases such as sodium hydroxide.
  • acids such as hydrochloric acid or bases such as sodium hydroxide.
  • it can be prepared by treatment using standard protocols in water, or in a liquid containing an inert water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol or dioxane. 3.
  • an inert water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol or dioxane. 3.
  • the peptide of the present invention When the peptide of the present invention is chemically synthesized, it can be synthesized by a well-known method of peptide synthesis. Examples include an azide method, an acid chloride method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydrous method, a DCC method, an active ester method, a carboimidazole method, and a redox method.
  • a well-known method of peptide synthesis examples include an azide method, an acid chloride method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydrous method, a DCC method, an active ester method, a carboimidazole method, and a redox method.
  • solid phase synthesis either solid phase synthesis or liquid phase synthesis can be applied.
  • a commercially available peptide synthesizer such as PSSM-8 manufactured by Shimadzu Corporation may be used.
  • the peptide of the present invention can be purified by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. 4. Polynucleotide encoding the peptide
  • the polynucleotide encoding the peptide of the present invention can be obtained by genetically designing the peptide of the present invention.
  • a base sequence may be designed and synthesized based on the amino acid sequence of the peptide of the present invention.
  • the polynucleotide include DNA and RNA, and DNA is preferred.
  • a polypeptide encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 is prepared by mutating by a site-specific sudden mutagenesis method well known in the art. can do.
  • site-specific mutagenesis kits may be used (for example, TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System. (Mutan-K :, Mutan. Super Express Km, etc .: manufactured by Tacarano Kuyo)).
  • a polynucleotide encoding a peptide having binding activity to all or a part of is also included in the present invention.
  • the “stringent conditions” are the conditions for washing after hybridization, with a salt concentration of 300 to l000mM, a temperature of 40 to 75 ° C, and preferably a salt concentration of 600. It means ⁇ 900mM, and the temperature is 65 ° C. For example, conditions such as 50 ° C can be given for 2XSSC.
  • RNA containing a GUGAAA sequence for example,
  • RNA having a base sequence represented by CGCUGUGAAAGGUG SEQ ID NO: 5
  • the GUGAAA sequence forms a terminal loop
  • the peptide of the present invention can bind to all or part of the GUGAAA sequence.
  • DNA encoding the RNA is also included in the present invention. 5.
  • a recombinant vector for protein expression can be obtained by ligating the above-mentioned polynucleotide or DNA to an appropriate vector, and a transformant can be used as a host so that the target gene can be expressed by the recombinant vector of the present invention.
  • a phage or plasmid capable of autonomously growing in a host microorganism.
  • the plasmid DNA include Escherichia coli, Bacillus subtilis, or yeast-derived plasmid
  • examples of the phage DNA include ⁇ phage.
  • animal virus and insect virus vectors can also be used.
  • the recombinant vector can be prepared by cleaving the purified DNA with an appropriate restriction enzyme, inserting it into an appropriate vector restriction enzyme site, etc., and ligating the vector.
  • the host used for transformation is not particularly limited as long as it can express the target gene. Examples include bacteria (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), yeast, animal cells (COS cells, CHO cells, etc.), and insect cells.
  • Methods for introducing a recombinant vector into a host include any method (for example, a method using calcium ions, an electoporet method, a spheroplast method, a lithium acetate method, a calcium phosphate method, a ribofesion method, etc.).
  • the peptide of the present invention can be obtained by culturing the transformant and collecting it from the culture. “Culture” means any of (a) culture supernatant, (b) cultured cells or cultured cells, or crushed material thereof. '
  • the target peptide When the target peptide is produced in cells or cells after culturing, the peptide is extracted by disrupting the cells or cells. When the target peptide is produced outside the cells or cells, use the culture medium as it is or remove the cells or cells by centrifugation or the like. After that, common biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange By using chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in combination, the desired peptide can be isolated and purified.
  • peptide synthesis by in vitro translation can be employed. In this case, two methods can be used: a method of making RNA into a cage and a method of making DNA into a cage (transcription / translation).
  • cocoon type RNA examples include the polynucleotide described in the above item 4.
  • the cocoon type DNA includes the above polynucleotide having a promoter and a ribosome binding site upstream of the translation initiation point, or the translation initiation point. Examples include a polynucleotide in which a promoter necessary for transcription is incorporated upstream.
  • a commercially available system such as Expressway TM system (Invitrogen), PURESYSTEM (registered trademark; Post Genome Research Institute), TNT. system (registered trademark; Promega), etc. can be used. After peptide synthesis by an in vitro translation system, the desired peptide can be isolated and purified by using the above general biochemical methods alone or in combination.
  • composition comprising GUGAAA loop binding peptide or salt thereof
  • the peptide of the present invention can suppress the proliferation of cells or viruses. Therefore, the peptide of the present invention can be used as a pharmaceutical composition such as an antibiotic, an antibacterial agent, an anticancer agent or an antiviral agent, or as an experimental reagent.
  • an HCV growth inhibitor or infection preventive agent anti-HCV agent
  • it can be used as a specific purpose for treating or preventing HCV virus-positive healthy individuals.
  • it can be used for the purpose of preventing infection of healthy subjects.
  • These diseases may be single, concomitant, or complications other than the above, and any of them can be used as a target for using the peptide of the present invention. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered systemically or locally orally or parenterally.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be any of tablets, capsenoles, granules, powders, pills, troches, liquids for internal use, suspensions, emulsions, syrups, etc. It can be a dry product that is re-dissolved when used.
  • parenterally intravenous injection (infusion) ), Intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, etc., and in the case of an injectable preparation, it is provided in the form of a unit dose ampoule or a multi-dose container.
  • compositions include excipients, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, surfactants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, preservatives that are commonly used in pharmaceutical preparations.
  • a flavoring agent, a soothing agent, a stabilizer, a tonicity agent and the like are appropriately selected and can be produced by a conventional method.
  • the above-mentioned various preparations may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive together.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or additive examples include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, sodium alginate, water-soluble dextran, carboxymethy starch sodium, pectin, xanthan gum, gum arabic, force zein Gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, norafine, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, ratatoose and the like.
  • the additive to be used is appropriately selected or combined from the above according to the dosage form of the present invention.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the age of administration subject, administration route, and number of administrations, and can be varied over a wide range.
  • the effective amount to be administered as a combination of an effective amount of the peptide of the present invention and an appropriate diluent and a pharmacologically usable carrier is a dose in the range of 10 to: L000 mg body, preferably 50 to 500 mg / body.
  • the dose is administered once or several times a day for 1 day or more.
  • the peptide of the present invention can bind to the SL2 region of HCV, it can be used as a reagent for detecting HCV or a diagnostic agent for hepatitis C.
  • RNA binding peptide and RNA are obtained from blood collected from a subject, and this is reacted with the peptide of the present invention.
  • Peptide fluorescent labels Fluoresein, rhodamine, and the like
  • a test sample signal by the label is obtained is HCV positive or hepatitis C determination can do.
  • the present invention provides a complex of the peptide of the present invention and RNA that binds thereto.
  • the complex of the present invention can be used to increase the activity of the RNA having a physiological effect.
  • the peptide of the present invention, a derivative thereof, or a salt thereof constituting a part of the complex functions as an RNA carrier, and the presence of this carrier increases (promotes) the function of the RNA. Is possible. Therefore, the peptide of the present invention, a derivative thereof, or a salt thereof is useful as an RNA function promoter.
  • adding a GUGAAA loop to a linker that binds an oligo RNA duplex designed as an siRNA that can suppress the expression of a specific gene, and binding the peptide of the present invention further improves RNA activity. be able to.
  • siRNA when siRNA is bound to the peptide of the present invention, the function of the siRNA is promoted. As a result, it is possible to suppress the function of the target nucleic acid or protein.
  • the present invention provides a method for suppressing the function of a target nucleic acid or protein of RNA by binding the above peptide, derivative thereof or salt thereof to RNA.
  • the complex of the present invention can suppress the function of a specific target gene. Therefore, the complex of the present invention can be used as a pharmaceutical composition such as antibiotics, antibacterial agents, anticancer agents or antiviral agents, and still as an experimental reagent.
  • the use form when the complex of the present invention is used as a pharmaceutical composition is the same as that described in the above section 6.
  • the use form when the complex of the present invention is used as a reagent is the above described section 7. This is the same as that described in.
  • the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • Example 1 Example 1
  • the reporter plasmid was prepared using T4 DNA ligase using the Pst I and BamHI sites with pACL and pACK plasmid (1) as the parent plasmid.
  • a DNA fragment encoding the N protein containing the test peptide sequence at the N-terminus was treated with Ncol and Bsml, and purified by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to prepare an insert DNA.
  • the pBR vector was prepared by subjecting pBR ⁇ to Nco I treatment and Bsml treatment, followed by phenol extraction and ethanol precipitation, followed by SAP treatment.
  • a ligation reaction was performed using insert DNA and T4 DNA ligase to obtain a test plasmid. After transformation with these test plasmid mixtures, approximately 10% of the cells are transformed with the parent plasmid without the library and the remaining 90% are transformed with the test plasmid. It becomes.
  • the pACL and pACK reporter plasmid prepared as described in (1) above were introduced into N567 cells by the heat shock method to prepare reporter cells.
  • the pACL reporter N567 cells were used as a combi- nation cell based on the general method for preparing a heat shock combi- nation cell.
  • the pACK reporter N567 cell was used as a combi- nation cell based on a general method for producing a cell for electroporation.
  • the detection test process is as follows.
  • the pBR plasmid (0.25 ⁇ 1) obtained by screening was applied to the target pAC LacZ reporter N567 cell (10 ⁇ ) and pAC. RRE LacZ reporter N567 cell (10 ⁇ ), respectively, by two types of heat shock. After transformation, 500 ⁇ each of tryptone mesium was carved and cultured at 37 ° C for 1 hour. The plate that spreads E. coli is ampicillin
  • Each transformed cell cultured was plated on a plate of ⁇ . In order to compare the color development of two types of cells on one plate, we divided the two places to be visited. This was cultured at 37 ° C for 24 hours and then at 24 ° C for 72 hours, and the color of the blue color was observed.
  • SL2 HCV 3
  • RRE HIV RRE reporter cell.
  • Table 1 shows that the peptide of the present invention specifically binds to SL2.
  • SL2 Since HCV can proliferate when SL2 binds to its NS5B protein, SL2 is an essential factor for HCV proliferation. When the peptide of the present invention is bound to SL2, SL2 cannot be transferred to NS5B.
  • the peptide of the present invention is useful as an antiviral agent (anti-HCV agent). Sequence listing free text
  • Sequence number 1 Xaa represents arbitrary amino acid residues (location: 2, 5, 8).
  • Sequence number 2 Synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 6 synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 7 synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 8 synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 10 synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 10: Xaa represents an arbitrary amino acid residue (location: 3, 4).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本発明は、HCVゲノム（+）鎖のGUGAAAループへの結合活性を有するRNA結合ペプチドを提供する。また、GUGAAAループで示される塩基配列を含むRNAのうち当該GUGAAAループへの結合活性を有するRNA結合ペプチド、例えば、1：MAFHRNPNTRQRRRSRRAR（配列番号２）2：MA FLRRINARQRRRQRRAR（配列番号３）3：MA SYSNARQRRRARRAQGR（配列番号４）　で示されるアミノ酸配列を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩を提供する。

Description

明細書
RNA結合べプチド 技術分野
本発明は、 GUGAAA配列を含む RNAへの結合活性を有する RNA結合べ プチドに関する。 背景技術
GUGAAA配列は、 C型肝炎ウィルスゲノム +鎖の 3'非翻訳領域のうち、 塩 基配列が広ぐ保存されている. X镇域に含まれてレ、る配列である。 X領域は長 いヘアピン構造をもつ SL1、' 並びに短いヘアピン構造の SL2及ぴ SL3で構成 されていると考えられ、 GUGAAA配列は、 このうち SL2と呼ばれるステム ループ構造のループ部分を形成する配列である （Yi, M. and Lemon, SM. J Virol. 77, 3557*3568， 2003) 。
HCVゲノムの 3'X領域は、 3'X領域欠失変異体を培養細胞に導入した実験 (Yi, M. and Lemon, SM. J Virol. 77， 3557.3568, 2003) およびチンパンジー への感染実験 （Yanagi, M. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 2291-2295， 1999) から HCVゲノムの複製に欠かせないと考えられている。 また、 ウィル スタンパク質 NS5Bは、 SL2を含む X領域と相互作用することが知られてい る。 NS5Bタンパク質は RNA依存性 RNAポリメラーゼ活性をもち、 C型肝 炎ウィルスゲノムの複製に重要な役割を果たしている （Oh, JW. et al. J Biol Chem 275, 17710-17717, 2000) 。
これらの知見から、 HCVゲノムの複製を当該ループへの結合により阻害す ることで、 HCVの増殖を抑制する事ができる可能性がある。 し力 しながら、 この目的にかなうぺプチドまたはタンパク質は NS5B以外に未だ知られてい ない。 発明の開示
本発明は、 RNA結合ペプチドを提供することを目的とする。 本発明者は、 上記課題を解決するため、 鋭意研究を行った結果、 GUGAAA ループ配列を有する塩基配列に結合することができるぺプチドを見出し、 本発 明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
( 1 ) GUGAAAで示される塩基配列を含む RNAのうち当該 GUGAAA配列 の全部又は一部に結合することができるぺプチド、 その誘導体又はこれらの塩。 (2) 以下の (a)又は (b)のペプチド、 その誘導体又はこれらの塩。
次式 I： .
Asn-X-Arg-Gln- X-Arg-Arg -Χ-Arg-Arg-Ala (I)
(Xは任意のアミノ酸残基を表す。 ） .
で示されるアミノ酸配列を含むぺプチド、 その誘導体又はこれらの塩
(b)上記式 Iで示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 GUGAAAで示され る塩基配列を含む RNAのうち当該 GUGAAA配列の全部又は一部に結合する ことができるペプチド、 その誘導体又はこれらの塩。
(3) Argが少なくとも 5残基以上含まれることを特徴とする （1) 又は (2) 記載のペプチド、 その誘導体又はこれらの塩。
(4) アミノ酸配列の一部に化学修飾が施された、 （1) 〜 （3) のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこれらの塩。
(5) (2) 記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド.。
(6) DNAである （5) 記載のポリヌクレオチド。
(7) (5) 又は （6) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
(8) (7) 記載の組換えベクターを含む形質転換体。
(9) (1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこれ らの塩を含む医薬組成物。
(10) (1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこ れらの塩を含む HCV検出用試薬。
(11) (1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこ れらの塩を含む C型肝炎の診断薬。
(12) 抗ウィルス剤として使用するための （9) 記載の医薬組成物。 (13) 抗 HCV剤として使用するための （9) 記載の医薬組成物。
(14) CGCUGUGAAAGGUGで示される塩基配列を有する RNAo
(15) GUGAAA配列がターミナルループ配列である （14) 記載の RNA。
(16) ( 14 ) 又は （ 15 ) 記載の RNAをコードする DNAo
(17) (16) 記載の DNAを含む組換えベクター。
(18) (17) 記載の組換えベクターを含む形質転換体。
(19)- (1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこ れらの塩と、 これに結合する RNAとの複合体。
(20) (19) 記載の複合体を含む医薬組成物。
(21) (19) 記載の複合体を含む H.CVの研究用試薬。
(22) (1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこ れらの塩を含む、 RNAの担体。
(23) (1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこ れらの塩を含む、 RNAの機能促進剤。
(24) (1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこ れらの塩と RNAとを結合させることを特徴とする、 当該 RNAの標的となる . 核酸又はタンパク質の機能を抑制する方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 レポータープラスミ ドに組み込んだ HCV 3' X-tail(+) SL2
terminal loopの RNA 2次構造の図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 なお、 本明細書において引用した刊行物及 ぴ特許文献は、 参照として本明細書に組み込むものとする。 本発明は、 GUGAAAで示される塩基配列を含む RNAのうち、 当該
GUGAAA配列の全部又は一部に結合することができる RNA結合べプチドに 関する。 本発明のペプチドは、 アルギニンに富むペプチドであり、 当該べプチ ドによって、 例えば GUGAAA配列を含む RNA (例えば HCVゲノム
RNA(+)鎖） の機能を阻害するというものである。 1 . GUGAAAループを含む核酸
本発明者は、 HCVゲノム （+) 鎖の GUGAAAループに結合することができ るペプチドが抗ウィルス剤等の医薬品として利用できるものと考え、 鋭意努力 の結果、 本発明を完成するに至った。
—般に、 ヮ卜ソン-クリックの塩基対からなる核酸の二重ちせん構造は、 塩 基間の水素結合と、 塩基対間のスタツキング相互作用によって安定化される。 さらに、 核酸は、 この二重鎖以外にも非塩基対部位や多重鎖構造を形成する。 非塩基対部位は、 塩基対を形成していない部位と、 塩基対を形成している部位 に分類さ x、 塩基対を形成していない部位として、 バルジアウト、 インタ^ナ ルループ、 ターミナルミスマッチ、 ヘアピンループ、 ダングリングエンドなど が例示され、 塩基対を形成する部位として、 ミスマッチ塩基対などが例示され る。'本発明においては、 このような核酸のうちターミナルミスマッチを含む核 酸を提供する （図 1 ) 。
図 1に例示するとおり、 GUGAAAループを含む核酸は、 GUGAAAループ とステム配列により構成され、 枠で囲った 「GUGAAA」 部分の配列が
GUGAAAループであり、 ターミナルループ （ターミナルミスマッ^) を形成 する。 ターミナルループの配列に連結するステム配列は、 図 1において 5'方 向から 3'方向に向かって 「CCCGCU」 で示される塩基配列とその相補鎖 「GGUGGG」 により形成されるステム配列である。
図 1は、 具体的に RNAの塩基配列 （配列番号 9 ) を例示してあるが、 DNA配列であってもよい。 また、 図 1は本発明を説明するための例示であつ て、 図 1に示す塩基配列に限定されるものではない。
ステム配列の長さは、 ステムを形成する限り互いにヮトソン-クリックの相 補塩基対 （例えば Aに対して U又は T、 Gに対して C)を形成する関係にある 必要はなく、 力学的エネルギーの関係により非ヮトソン-タリック塩基対によ る相補鎖を形成すればよい。 ステム配列の長さは、 特に限定されるものではな いが、 例えば 3〜20塩基、 好ましくは 3〜： 10塩基、 より好ましくは 3〜8塩基、 さらに好ましくは 4塩基である。 本発明において、 ステム配列は、 図 1にお いて 5'方向から 3'方向に向かって 「CGCU」 で示される 4塩基の塩基配列と その相補鎖 「GGUG」 により形成されることが好ましい。
本発明においては、 発現させたときに上記ターミナルループとステムを形成 するように塩基配列を設計し、 これをベクターに組み込んで、 抗転写終結反応 を用いた蛋白 RNA相互作用検出系に供することができる。
2 . GUGAAAループの全部又は一部に結合することができるぺプチド又はそ の塩
本発明のペプチドは、 少なくとも次式 I：
Asn-X-Arg-Gln- X-Are-Arg -X-Arg-Arg-Ala (I)
で示されるアミノ酸配列 （配列番号 1 ) を含むペプチド、 その誘導体又は これらの塩である。
上記ペプチドは RNA結合ペプチドの一つであり、 GUGAAAループの全部 又は一部に結合することができる。 なお、 本明細書において、 アミノ酸表記は 「R」 （アルギニン） 、 「Q」 （グルタミン） などめ 1文字表記をする場合も ある。 Xは任意のアミノ酸残基を表す。 任意のアミノ酸残基は、 20種類のァ ミノ酸残基 (Ala, Arg, Asp, Asn, Cys, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser， Thr， Trp, Tyr, Val)から選ばれる。
本発明において、 「ペプチド」 とは、 2個以上のアミノ酸がペプチド結合に よって結合したものを意味し、 オリゴペプチド、 ポリペプチドなどが含まれる。 また、 ポリペプチドが立体構造を形成したものはタンパク質と呼ばれるが、 本 発明においては、 このようなタンパク質も上記 「ペプチド」 に含まれる。 従つ て、 本発明の RNA結合ペプチドは、 GUGAAAループの全部又は一部に結合 することができる限り、 オリゴペプチド、 ポリペプチド、 タンパク質のいずれ をも意味するものである。
本発明のぺプチドは、 上記式のァミノ酸配列を含み、 好ましくは 11〜23個、 さらに好ましくは 11〜： 19個のアミノ酸配列を有する。
より具体的には、 本発明のぺプチドは、
(1)： MAFHRNPNTRQRRRSRRAR (配列番号 2 ) (2)： MA FLRRINARQRRRQRRAR (配列番号 3 )
(3)： MA SYSNAEQRRRAERAQGR (配列番号 4 )
で示されるアミノ酸配列又はその変異体を含む。
本発明のぺプチド中のいくつかのアミノ酸はアルギニンに富むドメイン ( 「アルギニンリッチドメイン」 という） を形成する。 例えば、 上記配列番号 2〜4に示す 19アミノ酸残基を有するペプチドは、 その中の 5番目から 19 番目がアルギニンリッチドメインを形成する。 そして、 本発明の プチドにお いて、 アルギニンの数は、 少なくとも 5,個である。
また、 本発明のぺプチドが GUGAAAループの全部又は一部に結合するこ とができる限り、 当該アミノ酸配列の 1 個又は数個のアミノ酸に欠失、 置換、 付加等の変異が生じてもよ,い （これらを本発明において 「変異体」 という） 。 例えば、 式 Iで示されるアミノ酸配列 （配列番号 1 ) 又は配列番号 2〜4で表 わされるアミノ酸配列の 1個又は数個、 好ましくは 1〜9個、 さらに好ましく は 1〜5個のアミノ酸が欠失してもよく、 式 Iで示されるアミノ酸配列又は配 列 号 2〜4で表わされるアミノ酸配列に 1個又は数個、 好ましくは 1〜9個、 さらに好ましくは 1〜5個のアミノ酸が付カ卩してもよく、 あるいは、 式 Iで示.. されるアミノ酸配列又は配列番号 2〜4で表わされるアミノ酸配列の 1個又は 数個、 好ましくは 1〜9個、 さらに好ましくは 1〜5個のアミノ酸が他のアミ ノ酸に置換してもよい。 また、 式 Iで示されるアミノ酸配列又は配列番号 2〜 4に示されるアミノ酸配列を含む 11〜23残基の長さのアミノ酸配列において、 上記欠失、.置換、 付加等の変異を含むペプチドも、 GUGAAAループの全部又 は一部に結合することができる限り、 本発明のぺプチドに含まれる。
本発明のペプチドと GUGAAAループの全部又は一部との結合活性は、 抗 転写終結反応を用いた細胞内蛋白 RNA相互作用検出系おけるレポーター遺伝 子の発現量を基に、 既知のペプチドとの相対的定量化を行い評価することによ り測定することができる。 この測定系において、 本発明のペプチドの解離定数 は ΙμΜ〜： ΙΟ ηΜである。
本発明は、 上記ペプチドのほかにその誘導体も含まれる。 「誘導体」 とは、 本発明のペプチドを起源とし、 3以上のアミノ酸にまでアミノ酸の数を減らし たり、 一部のアミノ酸を非天然の物を含んだ他のアミノ酸に置換したものをい う。 また、 上記誘導体は、 天然物の一部を修飾したものであっても、 化学合成 により合成された修飾残基を含むぺプチドであってもよい。
本発明のぺプチドは、 アミノ酸配列の一部に化学修飾が施されたものも含む。 「化学修飾」 とは、 化学試薬をタンパク質に反応させ、 主にアミノ酸残基側鎖 の化学構造を変えることをいう。 例えば、 化学修飾には、 本発明のペプチドの 活性部位又は活性部位近傍に存在すると予想されるアミノ酸を特異的に修飾す る試薬 （例えばポリエチレングリコール） を反応させる 法などが採用される。 化学修飾のためにァフィ二ティラベルを行ってもよい。 また、 化学修飾体には アミノ酸の α炭素をメチル化したものも含む。 化学修飾法は、 当分野におい て周知である （大野素徳'金岡祐ー ·崎山文夫 ·前田浩著、 生物化学実験法 12、 蛋白質の化学修飾 （ . 、 学会出版センター） 。
なお、 化学修飾されたァミノ酸配列を含むぺプチドの修飾部分は、 ぺプチド 本来の活性には影響せず、 他の効果として作用する (Yamaguchi, H. et al.， Biosci. Biotechnol. Biochem., 67 (10)， 2269-2272, 2003)。
ft換、 欠失等の変異が導入されているかどうかは、 アミノ酸配列の配列決定、 分子進化的工学や X線や NMRなどによる構造解析を用いて確認することが できる。
また、 本発明のぺプチドの誘導体には、 そのレトロェナンチォマーも含む。 「レトロェナンチォマー」 とは、 上記ペプチドのアミノ酸配列の向きが逆にな ること （鏡像体を形成すること） を意味する。 すなわち、 ペプチドの N末端 が C末端となり、 C末端が N末端となり、 かつ各アミノ酸が. Dアミノ酸によ つて構成されている配列となることを意味する。 このような Vトロェナンチォ マーも、 GUGAAAループの全部又は一部の配列への結合活性を有する限り本 発明に含まれる。
さらに、 本発明は、 上記ペプチド （例えば式 Iや配列番号 2〜 4に示すアミ ノ酸配列を含むペプチド） 、 その変異体、 又はその誘導体を構成するアミノ酸 配列の 65%以上、 好ましくは 70%以上、 より好ましくは 80%以上、 さらに 好ましくは 90%以上、 最も好ましくは 95%以上を含むぺプチド、 その誘導体 又はこれらの塩を提供する。 上記 65%以上の領域としては、 例えば配列番号 2〜4に示す配列のうち、 5番目〜 19番目 （アルギニンリッチドメイン） の 領域などが挙げられる。 また、 配列番号 2〜 4に示すアミノ酸配列のうち、 70%以上、 80%以上、 90%以上又は 95%以上のアミノ酸の領域を例示するこ とができる。
上記のとおり本発明のペプチドのアミノ酸配列が決定されると、 その後は、 当該アミノ酸配列をコードする DNAを構築し、 これを発現させることにより、 あるいは上記べプチドを化学合成することにより、 得ることができる。
本発明のぺプチドの塩としては、 生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性 塩が好ましい。 酸付加塩としては、 例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸 などの無機酸との塩、 .あるいは酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイ ン酸、 コノヽク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスル ホン酸、 ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。 塩基性塩とし ては、 例えば、 水酸化ナトリウム、 水酸化カリウム、 水酸化アンモニゥム、 水 酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、 あるいはカフェイン、 ピぺリジン、 トリメチルァミン、 ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
塩は、 塩酸などの酸、 あるいは水酸化ナトリウムなどの塩基を用いて調製す ることができる。 例えは'、 水中、 又はメタノール、 エタノール若しくはジォキ サンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、 標準的なプロトコルを 用いて処理することにより調製し得る。 3 . ペプチドの化学合成
本発明のぺプチドの化学合成を行う場合は、 ぺプチドの合成の周知方法によ つて合成できる。 例えば、 アジド法、 酸クロライ ド法、 酸無水物法、 混合酸無 水物法、 DCC法、 活性エステル法、 カルボイミダゾール法、 酸化還元法等が 挙げられる。 また、 その合成は、 固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用 することができる。 市販のペプチド合成装置 （島津製作所製 PSSM-8など） を使用してもよい。
反応後は、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグラフィー、 液体クロマトダラ フィ一、 再結晶などの通常の精製法を組み合わせて本発明のぺプチドを精製す ることができる。 4 . ペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明のぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドは、 本発明のぺプチドを遺 伝子工学的に設計し、 得ることができる。 例えば、 本発明のペプチドのァミノ 酸配列をもとに塩基配列を設計し、 合成すればよい。 ポリヌクレオチドとして は DNA、 RNAなどが挙げられるが、 DNAであることが好ましい。
変異体のぺプチドを遺伝子工学的に得るには、 配列番号 1〜 4に示すァミノ 酸配列をコードするポリペプチドを、 当分野において周知の部位特異的突然変 異誘発法によって変異させることにより作製することができる。 市販の部位特 異的突然変異誘発用キットを用いてもよい （例えば TaKaRa Site -Directed Mutagenesis System. (Mutan-K：、 Mutan.Super Express Km等：タカラノく ィォ社製） ） 。
さらに、 本発明においては、 本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチ ドに相補的な配列に対し、 ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、 か つ、 GUGAAAで示される塩基配列を含む RNAのうち当該 GUGAAA配列の 全部又は一部への結合活性を有するぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドも、 本発明に含まれる。 「ス トリンジヱン卜な条件」.とは、 ハイブリダィゼーショ ン後の洗浄時の条件であって塩濃度が 300〜： l000mM、 温度が 40〜75°C、 好 ましくは塩濃度が 600〜900mM、 温度が 65°Cの条伴を意味する。 例えば、 2XSSCで 50°C等の条件を挙げることができる。 当業者であ ば、 このような バッファーの塩濃度、 温度等の条件に加えて、 反応時間等の諸条件を加味し、 本発明のポリヌクレオチドを得るための条件を設定することができる。 ハイブ リダイゼーション法の詳細な手順については、 Molecular Cloning, A
Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等 を参照することができる。
さらに、 本発明においては、 GUGAAA配列を含む RNA、 例えば
CGCUGUGAAAGGUG (配列番号 5 ) で示される塩基配列を有する RNA 提供される。 この RNAは、 GUGAAA配列がターミナルループを形成し、 GUGAAA配列の全部又は一部に本発明のぺプチドが結合することができる。 当該 RNAをコードする DNAも本発明に含まれる。 5 . 組換えベクター、 形質転換体及びペプチド
タンパク質発現用組換えベクターは、 上記ポリ.ヌクレオチド又は DNAを適 当なベクターに連結することにより得ることができ、 形質 換体は、 本発明の 組換えベクターを、 目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ り得ること力できる （Sambrook J and Russel D. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001)。
ベクターには、 宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミ ドが 使用される。 プラスミ ド DNAとしては、 大腸菌、 枯草菌又は酵母由来のブラ スミ ドなどが挙げられ、 ファージ DNAとしては λファージが挙げられる。 さ らに、 動物ウィルス、 昆虫ウィルスベクターを用いることもできる。
組換えベクターの作製は、 精製された DNAを適当な制限酵素で切断し、 適 当なベクタ一 DNAの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。 形質転換に使用する宿主としては、 目的の遺伝子を発現できるものであれば 特に限定されるものではない。 例えば、 細菌 （大腸菌、 枯草菌等） 、 酵母、 動 物細胞 （COS細胞、 CHO細胞等） 、 昆虫細胞が挙げられる。
宿主への組換えベクターの導入方法は公知であり、 任意の方法 （例えばカル シゥムイオンを用いる方法、 エレクト口ポレーシヨン法、 スフエロプラスト法、 酢酸リチウム法、 リン酸カルシウム法、 リボフェグシヨン法等） が挙げられる。 本発明において、 本発明のペプチドは、 前記形質 ¾換体を培養し、 その培養 物から採取することにより得るこどもできる。 「培養物」 とは、 （a)培養上清、 (b)培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものであ . る。 '
培養法は、 当分野において周知である （前記 Sambrookら、 Molecular Cloningを参照） 。
培養後、 目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、 菌体又は 細胞を破砕することによりペプチドを抽出する。 また、 目的ペプチドが菌体外 又は細胞外に生産される場合には、 培養液をそのまま使用するか、 遠心分離等 により菌体又は細胞を除去する。 その後、 タンパク質の単離精製に用いられる 一般的な生化学的方法、 例えば硫酸アンモユウム沈殿、 ゲル濾過、 イオン交換 クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィ一等を単独で又は適宜 組み合わせて用いることにより、 目的のぺプチドを単離精製することができる。 本発明においては、 in vitro翻訳によるべプチド合成を採用することができ る。 この場合は、 RNAを铸型にする方法と DNAを铸型にする方法 （転写/ 翻訳） の 2通りの方法を用いることができる。 鎵型 RNAとしては、 前記 4項 に記載のポリヌクレオチドが挙げられ、 铸型 DNAとしては、 翻訳開始点の上 流にプロモーターとリボゾーム結合部位を有している上記ポリヌクレオチド、 あるいは翻訳開始点の上流に転写に必要なプロモーター等が組み込まれたポリ ヌクレオチドが挙げられる。 in vitro翻訳システムは、 市販のシステム、 例え ば Expressway™システム （Invitrogen社） 、 PURESYSTEM (登録商標； ポストゲノム研究所） 、 TNT .システム (登録商標； Promega社)などを用いる ことができる。 in vitro翻訳システムによるペプチド合成後は、 上記の一般的 な生化学的方法を単独又は組み合わせることにより、 目的のぺプチドを単離精 製することができる。
6 . GUGAAAループ結合べプチド又はその塩を含む医薬組成物
さらに、 本発明のペプチドは、 細胞又はウィルスの増殖を抑制することがで きる。 従って、 本発明のペプチドを抗生物質、 抗菌 、 抗癌剤又は抗ウィルス 剤などの医薬組成物として、 または実験用試薬として、 使用することができる。 本発明のペプチドを例えば HCVの増殖抑制剤又は感染予防剤 （抗 HCV 剤） として使用する場合は、 HCVウィルス陽性の健常者に対して治療又は予. 防を特異目的として用いることができる。 また、 健常者に対して、 感染予防の 目的で使用することができる。 これらの疾患は、 単独であっても、 併発したも のであっても、 上記以外の他の疾病を併発したものであってもよく、 いずれも 本発明のペプチドを使用する対象とすることができる。
また、 本発明の医薬組成物は、 経口又は非経口的に全身又は局所投与するこ とができる。 本発明の医薬組成物を経口投与する場合は、 錠剤、 カプセノレ剤、 顆粒剤、 散剤、 丸剤、 トローチ剤、 内用水剤、 懸濁剤、 乳剤、 シロップ剤等の いずれのものであってもよく、 使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしても よい。 また、 本発明の医薬組成物を非経口投与する場合は、 静脈内注射 （点滴 を含む） 、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射、 坐剤などの製剤形態を選択す ることができ、 注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状 態で提供される。
これらの各種製剤は、 製剤上通常用いられる賦形剤、 増量剤、 結合剤、 湿潤 剤、 崩壊剤、 潤滑剤、 界面活性剤、 分散剤、 緩衝剤、 保存剤、 溶解補助剤、 防 腐剤、 矯味矯臭剤、 無痛化剤、 安定化剤、 等張化剤等などを適宜選択し、 常法 により製造することができる。
上記各種製剤は、 医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであつ てもよい。 このような担体及び添加物の例として、 水、 医薬的に許容される有 機溶剤、 コラーゲン、 アルギン酸ナトリウム、 水溶性デキストラン、 カルボキ シメチ スターチナトリウ.ム、 ぺ'クチン、 キサンタンガム、 アラビアゴム、 力 ゼイン、 ゼラチン、 寒天、 グリセリン、 プロピレングリコール、 ポリエチレン グリコール、 ワセリン、 ノ ラフィン、 ステアリルアルコール、 ステアリン酸、 ヒ ト血清アルブミン、 マンニトール、 ソルビトール、 ラタ トースなどが挙げら れる。 使用される添加物は、 本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み 合わせて選択される。
本発明の医薬組成物の投与量は、 投与対象の年齢、 投与経路、 投与回数によ り異なり、 広範囲に変えることができる。 本発明のペプチドの有効量と適切な 希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、 10〜： L000mg body、 好ましくは 50〜500mg/bodyの範囲の投与量を選ぶこと ができ、 1日 1回から数回に分けて 1日以上投与される。
7 . HCVの検出用試薬および診断薬
本発明のぺプチドは、 HCVの SL2領域に結合することができるため、 HCVの検出用試薬又は C型肝炎の診断薬として使用することができる。
例えば、 被験者から採取した血液から血漿を得、 これと本発明のペプチドと を反応させる。 本発明のペプチドに蛍光標識 （フルォレセイン、 ローダミン 等） 又は放射標識等 （32P、 35S) をしておくと、 標識によりシグナルが得られ た被検試料は HCV陽性又は C型肝炎であると判定することができる。 8 . RNA結合べプチドと RNAの複合体
本発明は、 本発明のペプチドとそれに結合する RNAとの複合体を提供する。 本発明の複合体は、 生理作用を持つ当該 RNAの活性をより高くさせるために 使用することができる。 言い換えると、 複合体の一部を構成する本発明のぺプ チド、 その誘導体又はこれらの塩は、 RNAの担体として機能し、 この担体の 存在によって、 当該 RNAの機能を上昇 （促進） させることが可能となる。 従 つて、 本発明のペプチド、 その誘導体又はこれらの塩は、 RNAの機能促進剤 として有用であ,る。
'例えば、 特定の遺伝子の発現を抑制しうる siRNAとしてデザインされたォ リゴ RNA二重鎖を結合するリンカーに GUGAAAループを付加し、 本発明の ペプチドを結合させると、 RNAの活性を更に向上させることができる。 具体 的には、 本発明のペプチドに siRNAを結合させると、 その siRNAの機能が 促進される。 その結果、 当該 siRNAの標的となる核酸又はタンパク質め機能 を抑制することが可能である。 従って、 本発明においては、 上記ペプチド、 そ の誘導体又はこれらの塩と RNAとを結合させることにより、 当該 RNAの標 的となる核酸又はタンパク質の機能を抑制する方法を提供する。
本発明の複合体は、 標的となる特定の遺伝子の機能を抑制することができる。 従って、 本発明の複合体を抗生物質、 抗菌剤、 抗癌剤又は抗ウィルス剤などの 医薬組成物として、 まだは実験用試薬として、 使用することができる。 本発明 の複合体を医薬組成物として使用するときの使用形態は前記 6項で説明したも のと同様であり、 本発明の複合体を試薬として使用するときの使用形態は、 前 記 7項で説明したものと同様である。 以下、.実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれ ら実施例に限定されるものではない。 実施例 1
ぐ材料と方法 >
( 1 ) プラスミ ドの作製 レポ一タープラスミ ドは、 pACLと pACKプラスミ ド （1) を親プラスミ ド として、 Pst I、 BamH Iサイトを利用し、 T4 DNA ligaseを用いて作製した。 試験べプチドの配列を N端に含む N蛋白をコードする DNA断片を、 Nco l 及び Bsm l処理し、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （PAGE) により精製 して、 インサート DNAを作製した。 pBRベクターは、 pBR Ν·を Nco I処理、 Bsm l処理を行った後、 フエノール抽出とエタノール沈殿後、 SAP処理して 作製した。 インサート DNAと T4 DNA ligaseを用いてライゲーシヨン反応 を行い、 試験プラスミ ドを得た。 これらの試験プラスミ ド混合物を用いて形質 転換した後、 ライブラリーの導入されていない親プラスミ ドにより形質転換さ れる細胞は約 10%であり、 残り 90%が試験プラスミ ドにより形質転換された 細胞となる。
( 2 ) レポーター細胞の作成
前項 （1 ) のようにして作成した pACLと pACKレポータープラスミ ドを ヒートショック法により N567細胞に導入しレポーター細胞を作製した。
pACLレポーター N567細胞は、 一般的なヒートショック用のコンビテントセ ル作成法に基づいてコンビテントセル化し使用した。 また、 pACKレポータ 一 N567細胞も、 一般的なエレクトロポレーシヨン用のコンビテントセル作成 法に基づいてコンビテントセル化し使用した。
( 3 ) 検出試験 （特異性試験）
- 検出試験の工程は以下のとおりである。 スクリーニングして得られた pBR プラスミ ド (0.25 μ1)を標的の pAC LacZレポーター N567細胞 (10 μΐ)と pAC . RRE LacZレポーター N567細胞 (10 μΐ)それぞれ 2種類のレポーター細胞にヒ —トショック法により形質転換し、 tryptone mesiumを各 500 μΐをカロえ、 37°Cにおいて一時間培養を行った。 大腸菌を撒くプレートはアンピシリン
(100 mg/L) 、 クロラムフエ二コール （20 mg/L) 、 IPTG (0.05 mM) 、 X- gal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-6-Galactopyranoside 80 mg/L) を- s' 。 培養したそれぞれのトランスフォーメーションした細胞を ΙΟ μΙずつ 1枚のプ レートに撒いた。 このとき 1枚のプレート上で 2種類の細胞の発色を比較する ために撒く場所を 2つに分けて撒いた。 これを 37°Cにおいて 24時間、 その後 24°Cで 72時間培養しコロ二一の青色の発色を観察した。 このような特異性試験において、 スクリーニングして得ちれた pBRプラス ミ ドを pAC標的 LacZレポ一ター N567細胞に導入すると X-galの分解による 青い発色を呈するが、 pAC RRE LacZレポ一ター N567細胞に導入しても X- galの分解による青い発色を呈さなかった場合、 スクリーニングして得られた pBRプラスミ ドは標的の. pAC LacZレポーター N567細胞が発現する RNAと 特異的な結合をしていることになる。 こうして標的 RNAに特異的に結合する ポリペプチドを発現する pBRを選別する。 またこの特異性試験で両方のレポ 一ター細胞で青色を呈した場合は非特異的なクローン、 両方とも発色が見られ なかった場合は疑似陽性なク口ーンを選別したという.結果となる。
文献：
1) Peled-Zehavi, H.， Horiya, S.'， Das, C, Harada, K, Frankel, A. D. (2003) Selection of RRE RNA binding peptides using a kanamycin antitermination assay. RNA 9, 252-61. く結果〉
( 1 ) RNA結合ポリぺプチドの ARPL2からの細胞内選択
HCV 3' X-tail(+) SL2 terminal loopレポータープラスミ ドを標的とし、 RNA結合べプチドの 3種類の検出試験を行った。 これら 3クローンの特異性 試験の結果を表 1に記す "
¾ 1 colonv color assay
Figure imgf000016_0001
SL2： HCV 3，X-tail(+) SL2 terminal loo レポーター細胞，RRE :HIV RRE レポーター細胞。
37°C 24時間培養後、 室温 2 4時間培養したコロニーの青色の度合を +の数 で評価した。
表 1より、 本発明のペプチドは、 SL2に特異的に結合することが示された。 産業上の利用可能性
HCVは、 その NS5Bタンパク質に SL2が結合することにより増殖するこ とができるため、 SL2は HCVの増殖に必須の因子である。 SL2に本発明のぺ プチドが結合すると、 SL2は NS5Bに转合することができなくなるため、
HCVの増殖が阻害される。，従って、 本発明のペプチドは、 抗ウィルス剤 （抗 HCV剤） として有用である。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 ：合成ペプチド
配列番号 1 : Xaaは任意のアミノ酸残基を表す （存在位置： 2、 5、 8 ) 。 配列番号 2 ：合成ペプチド
配列番号 3 ：合成ペプチド
配列番号 4 ：合成ペプチド
配列番号 5 ：合成 RNA
配列番号 6 :合成ペプチド
配列番号 7 :合成ペプチド
配列番号 8 :合成ペプチド
配列番号 9：合成 RNA
配列番号 10：合成べプチド
配列番号 10 : Xaaは任意のアミノ酸残基を表す （存在位置： 3、 4 ) 。

Claims

請求の範囲
I . GUGAAAで示される塩基配列を含む RNAのうち当該 GUGAAA配列の 全部又は一部に結合することができるぺプチド、 その誘導体又はこれらの塩。
2 . 以下の (a)又は (b)のペプチド、 その誘導体又はこれらの塩。,
(a)次式 I：
Asn-X-Arg-Gln- X-Arg-Arg -Χ-Arg-Arg-Ala (I)
(Xは任意のアミノ酸残基を表す。 ）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド、 その誘導体又はこれらの塩
(b)上記式 Iで示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加さ たアミノ酸配列を含み、 かつ、 GUGAAAで示さ れる塩基配列を含む RNA 'のうち当該 GUGAAA配列の全部又は一部に結合 することができるペプチド、 その誘導体又はこれらの塩。
3 . Argが少なくとも 5残基以上含まれることを特徴とする請求項 1又は 2記 載のペプチド、 その誘導体又はこれらの塩。
4 . アミノ酸配列の一部に化学修飾が施された、 請求項 1〜 3のいずれか 1項 に記載のペプチド、 その誘導体又はこれらの塩。
5 . 請求項 2記載のペプチドをコードするポリヌグレオチド。
6 . DNAである請求項 5記載のポリヌクレオチド。—'
7 . 請求項 5又は 6記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
8 . 請求項 7記載の組換えベクターを含む形質転換体。
9 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこれら の塩を含む医薬組成物。
1 0 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこれら の塩を含む HCV検出用試薬。
I I . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこれら の塩を含む C型肝炎の診断薬。
1 2 . 抗ウィルス剤として使用するための請求項 9記載の医薬組成物。
1 3 . 抗 HCV剤として使用するための請求項 9記載の医薬組成物。
1 4 . CGCUGUGAAAGGUGで示される塩基配列を有する RNAo
1 5 . GUGAAA配列がターミナルループ配列である請求項 14記載の RNAo
1 6 . 請求項 14又は 15記載の RNAをコードする DNAo
1 7 . 請求項 16記載の DNAを含む組換えベクター。
1 8 . 請求項 17記載の組換えベクターを含む形質転換体。
1 9 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこれら の塩と、 これに結合する RNAとの複合体。
2 0 . 請求項 19記載の複合体を含む医薬組成物。
2 1 . 請求項 19記載の複合体を含む HCVの研究用試薬。
2 2 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこれら の塩を含む、 RNAの担体.。
2 3 . 請求項：！〜 4のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこれら の塩を含む、 RNAの機能促進剤。
2 4 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこれら の塩と RNAとを結合させることを特徴とする、 当該 RNAの標的となる核 酸又はタンパク質の機能を抑制する方法。
PCT/JP2006/320991 2005-10-14 2006-10-16 Rna結合ペプチド WO2007043715A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007540237A JPWO2007043715A1 (ja) 2005-10-14 2006-10-16 Ｒｎａ結合ペプチド

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005300350 2005-10-14
JP2005-300350 2005-10-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2007043715A1 WO2007043715A1 (ja) 2007-04-19
WO2007043715A9 true WO2007043715A9 (ja) 2007-06-07

Family

ID=37942926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/320991 WO2007043715A1 (ja) 2005-10-14 2006-10-16 Rna結合ペプチド

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2007043715A1 (ja)
WO (1) WO2007043715A1 (ja)

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2007043715A1 (ja) 2009-04-23
WO2007043715A1 (ja) 2007-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0600866B1 (en) Compositions and methods for identifying biologically active molecules
JP4086325B2 (ja) 標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子の同定方法
Liang et al. DNA sequence preferences of GAL4 and PPR1: how a subset of Zn2Cys6 binuclear cluster proteins recognizes DNA
Meshi et al. Nucleotide sequence of a cloned cDNA copy of TMV (cowpea strain) RNA, including the assembly origin, the coat protein cistron, and the 3′ non-coding region
SU1644720A3 (ru) Способ получени антигенной детерминанты вируса СПИД
EP0610448B1 (en) Peptide library and screening method
JP6074574B2 (ja) 方法及び組成物
CN107208096A (zh) 基于crispr的组合物和使用方法
AU714424B2 (en) In vivo selection of RNA-binding peptides
JP2024038496A (ja) ペプチド
JPS63502560A (ja) ストレプトアビジンをコ−ドするｄｎａ、該ｄｎａから産生されるストレプトアビジン、ストレプトアビジン中に存在するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、並びにその使用
JPS61172899A (ja) ペプチド及びその製造方法
Dengler et al. Display Selection of a Hybrid Foldamer–Peptide Macrocycle
JP2004528802A (ja) Ｄｎａおよびタンパク質を結合する小型タンパク質
CA2544764A1 (en) Protein binding miniature proteins
Entelis et al. Import of nuclear encoded RNAs into yeast and human mitochondria: experimental approaches and possible biomedical applications
JPS60192592A (ja) エグリン及びその製造方法並びにそれを含有する医薬
US20090163410A1 (en) Novel Peptides and the Biological Use Thereof
WO2007043715A9 (ja) Rna結合ペプチド
Nam et al. DNA light-strand preferential recognition of human mitochondria transcription termination factor mTERF
Kolb et al. Selection by phage display of peptides targeting the HIV-1 TAR element
JP2001503603A (ja) カンディダ アルビカンスからの新規ｔａｔａ―結合タンパク質、それをコード化する核酸配列、及びカンディダ アルビカンス増殖の阻害のためのスクリーニング方法
JPH10500311A (ja) 核タンパク質と相互作用する因子
US8163521B2 (en) Self-assembled proteins and related methods and protein structures
JPWO2005007686A1 (ja) Ｒｎａ結合ペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase in:

Ref document number: 2007540237

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase in:

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06822017

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1