JPS61172899A - ペプチド及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、その構造がヒト−カルシトニン遺伝子に由
来する新規なペプチド、すなわち、いわゆる“カルシト
ニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）”、及びその塩；
対応するＤＮＡ配列、及びこれらのＤＮＡ配列を含有し
そしてこれらのペプチドの製造のための中間体としてこ
の発明のペプチドを製造することができる微生物；これ
らのペプチド又はＤＮＡ配列を製造するための方法；前
記ペプチド又はその塩を含有する医薬製剤；並びに、こ
れらのペプチド又はそれらの塩の医薬としての使用に関
する。

（発明の概要〕 すなわち、第１にこの発明は特に、９０個以下のアミノ
酸残基を有する大きなペプチドの部分配列として、又は
それのみとして、次の式（り、−Ａ　１　ａＣｙｓＡｓ
ｎＴｈｒＡ　１　ａＴｈｒＣｙｓＶａ　Ｉ　ＴｈｒＲｉ
ｓ　ＡｒｇＬｅｕＡ　１　ａＧｌ　ｙ−Ｌｅｕ　Ｌｅｕ
ＳｅｒＡｒｇＳｅｒＧ　Ｉ　ｙＧ　ｌ　ｙＭｅ　ｔＶａ
　ＩＬｙｓＳｅｒＡｓ　ｎ　ＰｈｅＶａ　Ｉ　−Ｐｒｏ
ＴｈｒＡｓｎＶａｌＧＩｙＳｅｒＬｙｓＡＩａＰｈｅ−
で示されるアミノ酸配列（式中、システィン残基は分子
内−又は分子間−ジスルフィド橋を形成することができ
る）を有するペプチド、並びにアミド化された末端カル
ボキシ基及び／又はアシル化された末端アミノ基を有す
るそれらの誘導体、並びにこれらの塩に関する。

前記の大きなペプチドは、特に９０個以下、特に８０個
以下、例えば７２個以下のアミノ酸残基を有する。好ま
しくは、このものは、次の式（Ｉｆ）、−ＡｓｐＴｙｒ
ＶａｌＧ１ｎＭｅｔＬｙｓＡ１ａＳｅｒＧ１ｕＬｅｕＬ
ｙｓＧｌｒ＋Ｇｌｕ−ＧｌｎＧｌｕＴｈｒＧｌｎＳｅｒ
ＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｌａＡｌａＧｌｎＬｙｓＡｒｇ−
ＡｌａＣｙｓＡｓｎＴｈｒＡｌａＴｈｒＣｙｓＶａｌＴ
ｈｒＨｉｓＡｒｇＬｅｕＡｌａ−ＧｌｙＬｅｕＬｅｕＳ
ｅｒＡｒｇＳｅｒＧｌｙＧｌｙＭｅｔＶａｌＬｙｓＳｅ
ｒＡｓｎ−ＰｈｅＶａｌＰｒｏＴｈｒＡｓｎＶａｌＧｌ
ｙＳｅｒＬｙｓＡＩａＰｈｅＧｌｙＡｒｇ−ＡｒｇＡｒ
ｇＳｅｒＡｓｐＬｅｕＧｌｕＡｌａ−（ｎ） で表わされるアミノ酸配列を有するか、又は少なくとも
１個の追加のアミノ酸残基に加えて式（Ｉ）の配列を有
する該アミノ酸配列の断片を有する。

好ましくは、２個のシスティン残基は相互に分子内シス
チン残基を形成する。しかしながら、分子間ジスルフィ
ド橋を介して、２個のペプチドが相互に頭対頭で連結さ
れるか、又は好ましくは頭対尾で連結されて、二量体が
形成されることも可能である。

末端アミノ基は、好ましくは遊離しているが、しかしま
たアシル化、例えば特にアセチル化されていてもよい。

末端カルボキシ基がアミド化された形態、すなわち特に
カルバモイル基の形態で存在する上記のペプチドが薬理
学的に活性である。末端カルボキシ基が遊離しているか
又は塩の形である上記のペプチドもまた、薬理学的に活
性なアミドの製造のための中間体として、この発明の部
分を構成する。

この発明は、第１にそして特に、次の式（ＩＩＩ）、Ｌ
ｓｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒ
ｇ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−
Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐ
ｈｅ−ＮＨ。

（ｍ） で表わされるペプチドアミド（ＣＧＲＰ　ｎ）及びその
塩に関する。

さらに、この発明はまた、次の式（■ａ）、Ｈｉｓ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−５ｅ
ｒ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ
−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−
Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ−Ｐｈｅ−ＮＨｚ（Ｉ［［ａ） で表わされるＮ−アセチル化ペプチド−アミドに関する
。

この発明はまた、次の式（Ｉ［［ｂ）、Ｌｅｕ−Ａｌａ
−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−３ｅｒ−
Ｇｌｙ−にｌｙ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＳ　
−０Ｈ（ＩＩ［ｂ） Ｃ式中、ＡＳ”　は、式＜ｍ）のペプチドペプチド−ア
ミドの末端アミド基のＮ　Ｈｚ基に酵素的に分解され得
るか、又は適当な酵素の存在下でアンモニアにより置換
され得るアミノ酸、例えば、好ましくはグリシン又はチ
ロシンである、〕で表わされるペプチド、及び末端アミ
ノ基がアセチル化されているその誘導体に関する。

〔具体的な説明〕

国際的に認められた命名法に従って、この明細書中のア
ミノ酸の略号、例えば今まで記載した略号は遊離酸を示
し、そして特にことわらない限りＬ−配置を示す、α−
アミノ基は略号の左側に存在し、そしてカルボキシ基は
右側に存在すると考えるべきである。α−アミノ基中の
Ｈ原子の不存在はそのアミノ酸の略号の左に位置するハ
イホンによって示される。カルボキシ基中のＨＯ基の不
存在は右側に位置するハイホンにより示される。

アミノ酸の側鎖中の置換基はアミノ酸記号のすぐ後のカ
ッコ内に記載され、又はアミノ酸記号の上方又は下方に
垂直に伸びる線によりアミノ酸記号に連結される。

この発明のペプチドが天然に、すなわち例えば人体中に
、それ自体として存在するか否かはまだ知られていない
、しかしながら、もしそうだとすれば、この発明は特に
、天然に存在するよりも、又は知られているであろう抽
出物中よりも高濃度の上記のペプチド及びその塩に関す
る。特に、この発明は、単離され又は精製された形の、
純粋な又は実質上純粋な形の、天然に存在するのと異る
環境での、すなわち他の混合物例えば混合された医薬担
体を伴う、医薬用途に適当な形での、特徴付けられた形
での、そして／又は生体もしくは死体の、器官の、細胞
の、組織の、もしくは体液の外での、上記のペプチドに
関する。この発明は特に、合成的に又は遺伝子的に製造
されたペプチド及びそれらの塩に関する。

上記の事項に関し、“単離される°なる語は、他の物質
から、特にこの発明の化合物と一緒に天然に存在する他
の化合物から分離されることを意味する。“精製される
”なる語は、化学的及び／又は物理的精製手段にかけら
れることを意味する。

“実質的に純粋な１という表現は、５０％より高い純度
を意味する。

この発明はまた、この発明のペプチドの塩、特に医薬と
して許容される無毒性塩に関する。上記のペプチドは、
酸付加塩、例えば無機酸、特に鉱酸、例えば塩酸、硫酸
もしくはリン酸との酸付加塩、あるいは有機カルボン酸
、スルホン酸もしくはスルホン酸との塩、例えば酢酸、
プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、
ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、
リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マン
デル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェ
ノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンポン酸
、ニコチン酸もしくはイソニコチン酸、さらにはアミノ
酸、さらにはメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２
−ヒドロキシェタンスルホン酸、エタン−１，２−ジス
ルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンス
ルホン酸もしくはナフタレン−２−スルホン酸、又は他
の酸塩有機化合物、例えばアスコルビン酸との塩を形質
することができる。

少なくとも１個のカルボキシ基及び少なくとも１個の塩
基性基、例えばアミノ基を有する上記のペプチドは内部
塩を形成することができる。

少なくとも１個のｉｎカルボキシ基を含をする前記のペ
プチドは、特にそれらが塩基性基より多数のカルボキシ
基を有する場合、金属塩又はアンモニウム塩、例えばア
ルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、例えばナトリウ
ム塩、カリウム塩、マグネシウム塩又はカルシウム塩、
さらには、アンモニア又は適当な有機アミンとのアンモ
ニウム塩を形成し、そして特に、脂肪族、脂環族、脂環
脂肪族又は芳香脂肪族の第一級、第二級又は第三級モノ
−、ジー又はポリ−アミン、そしてさらに脂環式塩基、
例えば低級アルギルアミン、例えばトリエチルアミン、
ヒドロキシ−低級アルキルアミン、例えば２−ヒドロキ
シエチルアミン、ビス−（２−ヒドロキシエチル）−ア
ミン、２−ヒドロキシエチル−ジエチルアミン又はトリ
ー（２−ヒドロキシエチル）−アミン、カルボン酸の塩
基性脂肪族エステル、例えば４−アミノ安息香酸２−ジ
エチルアミノエチルエステル、低級アルキレンアミン、
例えば１−エチルピペリジン、シクロアルキルアミン、
例えばジシルロヘキシルアミン、又はベンジルアミン、
例えばＮ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、さらに
ピリジン型の塩基、例えばピリジン、コリジン又はキノ
リンとの塩を挙げることができる　ＩＱ−Ｉ　Ｓモルの
投与量において、この発明のペプチドアミドは血管拡張
作用を有し、そして血圧の低下、並びに心拍数及び心筋
の収縮性の上昇をもたらす、これらの作用は交感神経系
の遮断剤、例えばメトプロロール〔１−イソプロピルア
ミノ−３−（４−（２−メトキシエチル）−フェノキシ
）−プロパン−２−オール〕及びトランデート（Ｔｒａ
ｎｄａｔｅ）　（商標）（ラベタロール塩酸塩）により
影響されず、他方、血清中のノルアドレナリン及びアド
レナリンの作用はこれらの物質により抑制される。

この発明のペプチド−アミド、例えばＣＧＲＰ　ｎの約
１００〜１１０００ｎのポルス（ｂｏｌｕｓ）注入は、
４μｓ／ｍｌのノルアドレナリンの注入によりあらかじ
め収縮された、ラットの摘出され潅流された腸管膜層に
おいて、濃度の間数として、血管拡張を誘導する。血管
拡張は約５３００Ｐａｓ　（４０＋＊ｗＨｇ）までの潅
流圧の低下において現われる。

を髄を除去した（ｄｅｓｐｉｎａｌｉｓｅｄ）ラット（
Ｇｉｌｌｅａｂｉｅ及びＭｕｉｒＳＢｒｉｔ、　Ｊ、　
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　３０．８８−９８（Ｉ９６７）
）において、１μｇ／ｋｇ／分の投与量で、この発明の
ペプチド−アミド、例えばＣＧＲＰ　ｎは、血圧を低下
せしめ、心拍数を約４０／分増加し、そして交感神経系
の電気刺激により、及びアンジオテンシンパ又はアドレ
ナリン静脈内注射により惹起された昇圧効果を阻害する
。

この発明のペプチド−アミドは、基礎的に、そしてさら
にベタネコール（ｂｅｔｈａｎｅｃｈｏｌ）又はヒスタ
ミンによる刺激の後に、胃液の分泌（分泌容量並びに酸
及びペプシンの放出）を抑制する。これらはまた、中枢
神経系にも作用する。

前記ペプチド−アミドはまたカルシウム低下活性を有す
る。すなわち、これらは血液中のカルシウム含量を低下
せしめ、そして鉱物質の損失から骨を保護する。

上記の薬理学的活性のため、この発明のペプチド−アミ
ドは、医薬として、特に血管を拡張しそして組織血流を
増加せしめるため、並びに狭心症、高血圧、心臓不全又
は他の冠循環疾患に対して使用することができ、さらに
ヒト−カルシトニン、例えば商業的に入手可能なシバカ
ルジン（Ｃｉｂａｃａｌｃｉｎ）　（商標）を使用する
のと同じ症状、例えば骨代謝不全、例えば骨粗に症又は
ページエンド病のために、使用することができる。

投与量は約０．１〜５０μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約
１〜１０μｇ／ｋｇ体重である。

約７０ｋｇの体重の温血動物、特にヒトに投与すべき量
は、１日当り約１μｇ〜約１０００μｇ５好ましくは約
１０μｇ〜約１００μｇ１例えば約４０μｇである。

投与は好ましくは非経腸的投与、例えば静脈内投与であ
り、１週間に５日、３箇月にわたって行う。

この発明の化合物は、それ自体公知の方法により製造す
ることができる。

上記のペプチド、ペプチド−アミド、又はアシル化され
た末端アミノ基を有するそれらの誘導体の、この発明の
製造方法は次の変法により特徴付けられる。

ｔａ＞　　遊離カルボキシル基を有する前記化合物の断
片又はその反応性カルボン酸誘導体と、遊離アミノ基を
有する補完的断片又はその反応性誘導体とを反応せしめ
る（前記の断片中の遊離官能基は、反応に関与する２個
の基を除き、所望により保護された形で存在する）こと
により前記化合物中に存在するアミド結合を形成せしめ
、そして存在するかもしれない保護基を除去し；あるい
は、 （ｂｌ　　分子内−又は分子間ジスルフィド橋を有する
前記化合物のいずれかを製造するために、システィン残
基のメルカプト基が遊離の形で存在するか、又はシステ
ィン残基のメルカプト基が反応条件下で除去される保護
基により保護されている前記化合物のいずれかを適当な
酸化剤により酸化し；あるいは、 （Ｃ１少なくとも１個の官能基が保護された形で存在す
る前記のペプチド、ペプチド−アミド、又はそれらのＮ
−アシル化誘導体において、存在する保ｉＪ基を除去し
；あるいは、 （ｄ）　　前記のペプチドを製造するために、目的アミ
ノ酸配列をコードしそして発現制御配列により制御され
るＤＮＡ配列を含有する発現ベクターにより形質転換さ
れた宿主細胞を資化性の炭素源及び窒素源を含有する液
体栄養培地中で培養し、生成物を所望により宿主細胞か
ら遊離せしめそして単離し、そして必要であれば、得ら
れるかもしれない２量体又は多量体をジスルフィド結合
を開裂せしめるのに適当な還元剤と反応せしめ、そして
必要であれば、得られる還元された生成物をジスルフィ
ド結合の新たな形成に適当な酸化剤で処理し；あるいは
、 ｔｅｌ　　前記のペプチド−アミドのいずれかを製造す
るために、目的ペプチド−アミドのアミノ酸配列に加え
て、該目的ペプチド−アミドの末端アミド基のＮ　Ｈを
基に酵素的に分解され得るか又は適当な酵素の存在下で
アンモニアにより置換され得るアミノ酸ＡＳＡをＣ−末
端に有するペプチドを、場合によってはアンモニアの存
在下で、適当な酵素により処理し； 前記変法［ａ）〜（ｅ）いずれかを実施した後で、得ら
れた塩を遊離化合物に、又は得られた遊離化合物をその
塩に転換する。

次に、上記の変法を詳細に説明する。

１１粧 この方法に従えば、最終生成物の合成における反応の最
終段階として分子の任意の位置でアミド結合が形成され
る。遊離カルボキシ基を有する前記の断片は、単一のア
ミノ酸、又はジー、オリゴ−もしくはポリペプチドのい
ずれであってもよく、あるいはアシル化された末端アミ
ノ基を有する誘導体である場合には、アシル化用カルポ
ジ酸、例えば特に酢酸であってもよい、遊離アミノ基を
有する前記の断片は単一のアミノ酸、ジー、オリゴ−も
しくはポリペプチドであり、又はペプチド−アミドをｍ
ｌ造する場合にはさらにアミン、例えば特にアンモニア
である。

好ましくは、この反応は一方の断片の反応性カルボン酸
誘導体と遊離アミノ基を有する補完断片とを反応せしめ
ることによって行われ、カルボン酸誘導体のカルボキシ
基の活性化はその場で行うことができる。

反応性カルボン酸誘導体は特に、反応性活性化エステル
又は反応性無水物、さらには反応性環状アミドであり、
反応性酸誘導体はその場で形成することもできる。

酸の活性化されたエステルは、特にエステル化基の連結
炭素原子において不飽和のエステル、例えば真のビニル
エステル（これらは、例えば、対応するエステルと酢酸
ビニルとのエステル交換により得ることができる；活性
化ビニルエステル法）、カルバモイルビニルエステル（
これらは、例えば、対応する酸をイソキサゾリウム試薬
で処理することにより得ることができる：１．２−オキ
サシリウム法、又はウードワート法）、又は１−低級ア
ルコキシビニルエステル（これらは、例えば、対応する
酸を低級アルコキシアセチレンで処理することによって
得ることができる；エトキシアセチレン法）、あるいは
アミジノタイプのエステル、例えばＮ、Ｎ’−ジ置換ア
ミジノエステル（これらは、例えば、対応する酸を適当
なＮ、Ｎ’−ジ置換カルボジイミド、例えばＮ、Ｎ’−
ジシクロへキシルカルボジイミドで処理することによっ
て得ることができる；カルボジイミド法）、又はＮ。

Ｎ′−ジ置換アミジノエステル（これらは、例えば、対
応する酸をＮ、Ｎ’−ジ置換シアンアミドで処理するこ
とによって得ることができる；シアンアミド法）、適当
な了り−ルエステル、特に電子吸引性置換基により適切
に置換されたフェニルエステル（これらは、例えば、対
応する酸を適当に置換されたフェノール、例走ば４−ニ
トロフェノール、４−メチルスルホニルフェノール、２
゜４．５−）リクロロフェノール、２　、３　、４　、
５゜６−ペンタクロロフェノールもしくは４−フェニル
ジ、アゾフェノールにより、縮合剤、例えばＮ。

Ｎ′−ジシクロへキシルカルボジイミドの存在化で処理
することにより得ることができる；活性化アリールエス
テル法）、シアノメチルエステル（これらは、例えば、
対応する酸を塩基の存°在下でクロロアセトニトリルで
処理することにより得ることができる；シアノメチルエ
ステル法）、チオエステル、特に、例えばニトロにより
置換されている場合があるフェニルチオエステル（これ
らは、例えば、対応する酸を、場合によっては例えばニ
トロにより置換されているチオフェノールにより、特に
無水物法又はカルボジイミド法の助けにより処理するこ
とによって得ることができる；活性化チオールエステル
法）、アミノ又はアミドエステル（これらは、例えば、
対応する酸をＮ−ヒドロキシアミノ又はＮ−ヒトヒドロ
キシアミド化合物、例えばＮ−ヒドロキシサクシンイミ
ド、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシフタリ
ミド又は１−ヒドロキシベンゾトリアゾールにより、例
えば無水物法又はカルボジイミド法に従って処理するこ
とにより得ることができる；活性化Ｎ−ヒドロキシエス
テル法）、又はシリルエステル（これらは、例えば、対
応する酸をシリル化剤、例えばヘキサメチルジシラザン
で処理することによって得ることができ、そしてこれら
はヒドロキシ基とは容易に反応するがアミノ基とは反応
しない）である。

酸無水物は、これらの酸の対称無水物又は混合無水物で
あり、例えば無機酸との無水物、例えば酸ハライド、特
に酸クロリド（これらは例えば、対応する酸を塩化チオ
ニル、五塩化リン又は塩化オキサリルで処理することに
より得られる；酸ハライド法）、アジド（これらは例え
ば、対応する酸エステルから対応するヒドラジドを介し
て、そしてこれを亜硝酸で処理することにより得られる
；アジド法）、炭酸手誘導体、例えば対応するエステル
、例えば炭酸低級アルキル半エステルとの無水物（これ
らは例えば、対応する酸をハロ蟻酸例えばクロロ蟻酸低
級アルキルエステルにより、又は１−低級アルコキシ力
ルボニルー２−低級アルコキシ−１，２−ジヒドロキノ
リン、例えば！−低級アルコキシカルボニルー２−エト
箪シー１゜２−ジヒドロキノリンで処理することにより
得られる；混合０−アルキル炭酸無水物法〕、又はジハ
ロゲン化、特にジ塩化リン酸との無水物（これらは例え
ば、対応する酸をオキシ塩化リンで処理することにより
得られる；オキシ塩化リン法）、又はｆ４１酸との無水
物、例えば有機カルボン酸との無水物（これらは例えば
、対応する酸を、置換されている場合がある低級アルカ
ンカルボン酸ハライド又はフェニルアルカンカルボン酸
ハライド、例えばフェニル酢酸、ピバリン酸又はトリフ
ルオロ酢酸クロリドで処理することにより得られる；混
合カルボン酸無水物法）、又はｆ機スルホン酸との無水
物（これらは例えば、対応する酸の塩、例えばアルカリ
金属塩を、適当な有機スルホン酸ハライド、例えば低級
アルカンスルホン酸クロリド又はアリールスルホン酸ク
ロリド、例えばメタン−又はｐ−トルエン−スルホン酸
クロリドで処理することにより得られる；混合スルホン
酸無水物法）、さらには対称無水物（これらは例えば、
カルボジイミド又は１−ジエチルアミノプロビンの存在
下での対応する酸の縮合により得られる；対称無水物法
）である。

適当な環状アミドは特に、芳香族性の５員ジアザ環との
アミド、例えばイミダゾール類、例えばイミダゾールと
のアミド（これらは例えば、対応する酸をＮ、Ｎ’−カ
ルボニルジイミダゾールで処理することにより得られる
；イミダゾリド法）、又はピラゾール類、例えば３．５
−ジメチルピチゾールとのアミド（これらは例えば、ア
セチルアセトンで処理することにより酸ヒドラジドを介
して得られる；ピラゾール類）である。

前記のように、カルボン酸誘導体はまた、その場合で形
成することもできる０例えば、遊離アミノ基を有する補
完断片と遊離カルボン酸を有するペプチド断片との混合
物を適当なＮ、Ｎ’−ジ置換カルボジイミド、例えばＮ
、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で反
応せしめることにより、Ｎ、Ｎ’−ジ置換アミジノエス
テルをその場で生成せしめることができる。さらに、Ｎ
。

Ｎ′−ジ置換カルボジイミド、例えばＮ、Ｎ’−ジシク
ロへキシルカルボジイミドの存在下で、そしてＮ−ヒド
ロキシアミン又はＮ−ヒドロキシアミド、例えばＮ−ヒ
ドロキシサクシンイミドの存在下で、場合によっては適
当な塩基、例えば４−ジメチルアミノピリジンの存在下
で、対応する酸出発＠ＩＪ！及びアミノ出発物質の混合
物を反応せしめることにより、アシル化されるべきアミ
ンの存在下で酸のアミノ又はアミドエステルを形成する
ことができる。

上記の方法に代えて、変法（ａ）はまた、遊離カルボキ
シ基を有する断片をアミノ酸が反応性形で存在する補完
断片と反応せしめることによっても実施することができ
る。アミノ基は、例えばホスフィト、例えばジエチルク
ロロホスフィト、１．１−フェニレンクロロホスフィト
、エチルジクロロホスフィト、エチレンクロロホスフィ
ト又はテトラエチルビロホスフイトとの反応により活性
化することができる。

アミノ基はまた、ハロカルボニル、例えばクロロカルボ
ニルへの結合により活性化することができ、又はイソシ
アナート基の形で活性化することができる。

前記の断片中の遊離官能基は特にカルボキシ基、アミノ
基、ヒドロキシ基、及びメルカプト基であり、これらは
、反応に関与すべきでない場合には、保護された形で存
在するのが好ましい。

保護基、並びにその導入及び除去の方法は、例えば、”
　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇ
ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉ−ｓ　ｔｒｙ”、プレナムプレス
、ロンドン、ニューヨーク、　１９７３年；　”Ｍｅｔ
ｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅ
ｍｉｅ’　。

ホーベン−ウニイル、第４版、Ｖｏｌ　４５／１、ゲオ
ルグーチーメーフエルラーク、スタンニル基、１９７４
　；及びＴｈｅｏｄｏｒａ　Ｈ，Ｇｒｅｅｎｓ　”Ｐｒ
ｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ
　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ”　、ジョンウイレー・アンド・
ソング、ニューヨーク、１９８１年、中に記載されてい
る。容易に、すなわち不所望の二次反応が生ずることな
く、例えば加溶媒分解、還元もしくは光分解により、又
は生理的条件下で除去され得ることが保護基の特徴であ
る。

ヒドロキシ−保護基は、例えばアシル基、例えば場合に
よっては置換されている、例えばハロ置換されている低
級アルカノイル、例えば２，２−ジクロロアセチル、又
は炭酸半エステルのアシル基、特にｔｅｒｔ−ブトキシ
カルボニル、場合によっては置換されているベンジルオ
キシカルボニル又はジフェニルメトキシカルボニル、例
えば４−二トロペンジルオキシカルボニル、又は２−ハ
ロー低級アルコキシカルボニル、例えば２，２．２−ト
リクロロエトキシカルボニル、さらにトリチル又はホル
ミル、又は有機シリルもしくはスタンニル基、さらには
容易に除去され得るエーテル化基、例えばｔｅｒｔ−低
級アルキル、例えばｔｅｒｔ−ブチル、２−オキサ−も
しくは２−チア−脂肪族−もしくは−脂環族炭化水素基
、特にｌ−低級アルコキシー低級アルキルもしくは１−
低級アルキルチオー低級アルキル、例えばメトキシメチ
ル、ｌ−メトキシエチル、１−エトキシエチル、メチル
チオメチル、１−メチルチオエチルもしくは１−エチル
チオエチル、又は５個もしくは６個の環原子を有する２
−オキサ−もしくは２−チア−シクロアルキル、テトラ
ヒドロフリルもしくは２−ヒドラヒドロピラニル、もし
くは対応するチア類似体、そしてさらに場合によっては
置換されているｌ−フェニル低級アルキル、例えば場合
によっては置換されているベンジル又はジフェニルメチ
ル（フェニル基の置換としては、例えばハロゲン、例え
ば塩素、低級アルコキシ、例えばメトキシ、及び／又は
ニトロが好ましい）である。

カルボキシ基は一般にエステル化形で保護され、このよ
うなエステル基は穏和な条件下で容易に開裂され得る。

この態様で保護されているカルボキシ基は、エステル化
基として特に、１−位において分枝しているか、又はｌ
−位もしくは２−位において適切に置換されている低級
アルキル基を含有する。エステル化された形の好ましい
カルボキシ基は特に、ｔｅｒｔ−低級アルコキシカルボ
ニル、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、１個もし
くは２個の了り−ル基を有する了り−ルメトキシ力ルボ
ニル（このアリール基は、場合によっては、１級アルキ
ルにより、例えばｔｅｒｔ−低級アルキル、例えばｔｅ
ｒｔ−ブチルにより、低級アルコキシ、例えばメトキシ
により、ヒドロキシ、ハロゲン、例えば塩素、そして／
又はニトロによりモノ−又はポリ−置換されている）、
例えば上記のように置換されている場合があるベンジル
オキシカルボニル、例えば４−メトキシベンジルオキシ
カルボニルもしくは４−ニトロベンジルオキシカルボニ
ル、又は場合によっては例えば前記のように置換されて
いるジフェニルメトキシカルボニル、例えばジフェニル
メトキシカルボニルもしくはジー（４−メトキシフェニ
ル）−メトキシカルボニル、１−低級アルコキシー低級
アルコキシカルボニル、例えばメトキシメトキシカルボ
ニル、１−メトキシエトキシカルボニルもしくは１−エ
トキシメトキシカルボニル、１−低級アルキルチオー低
級アルコキシカルボニル、例えばｌ−メチルチオメトキ
ジカルボニルもしくはｌ−エトキシチオエトキシカルボ
ニル、アロイルメトキシカルボニル（７０イル基は、場
合によってはハロゲン、例えば臭素により置換されてい
るベンゾイルである）、例えばフェナシルオキシカルボ
ニル、２−ハロー低級アルコキシカルボニル、例えば２
．２．２−）リクロロエトキシカルボニル、２−ブロモ
エトキシカルボニルもしくは２−ヨードエトキシカルボ
ニル、又は２−（トリ置換シリル）−エトキシカルボニ
ル（ここで、各置換基は、他とは独立に、場合によって
は例えば低級アルキル、低級アルコキシ、アリール、ハ
ロゲン及び／又はニトロにより置換されている、脂肪族
、芳香−脂肪族、脂環族、脂環族又は芳香族炭化水素基
、例えば、場合によっては置換されている対応する低級
アルキル、フェニル−低級アルキル、シクロアルキル又
はフェニルである）、例えば２−トリー低級アルキルシ
リルエトキシカルボニル、例えば２−トリメチルシリル
エトキシカルボニルもしくは２−（ジ−ｎ−ブチルメチ
ルシリル）−エトキシカルボニル、又は２−トリアリー
ルシリルエトキシカルボニル、例えば２−トリフェニル
シリルエトキシカルボニルで、ある。

前記の及び後記の有機シリル基又はスタンニル基は、珪
素原子又は錫原子の置換基として、好ましくはアルキル
、特にメチルを含有する。対応するシリル又はスタンニ
ル基は、特にトリー低級アルキルシリル、特にトリメチ
ルシリル、さらにジメチル−ｔｅｒｔ−ブチルシリル、
又は対応して置換されたスタンニル、例えばトリーｎ−
ブチルスタンニルである。

好ましい保護されたカルボキシ基ばｔｅｒｔ−低級アル
コキシカルボニル、例えばＬｅｒｔ−ブトキシカルボニ
ル、そして特に、例えば前記のように置換されている場
合があるベンジルオキシカルボニル又はジフェニルメト
キシカルボニル、例えば４−ニトロベンジルオキシカル
ボニル、そして特に２−（トリメチルシリル）−エトキ
シカルボニル、さらには４−ベンジルオキシカルボニル
ベンジルオキシカルボニルであり、ここで最初に記載し
たベンジルオキシカルボニル基はポリマーに、すなワチ
例えばジビニルベンゼンにより架橋されたポリスチレン
に連結されている。

保護されたアミノ基は、例えば、容易に開裂され得るア
シルアミノ、了り−ルメチルアミノ、エーテル化メルカ
プトアミノ、２−アシル−低級アルカ−１−エニルアミ
ノ、シリルアミノ又はスタンニルアミノ基の形、又はア
ジド基の形であることができる。

対応するアシルアミノ基において、アシルは例えば、炭
素原子数が例えば１８個以下である有機カルボン酸のア
シル基、特に、場合によっては例えばハロゲンもしくは
アリールにより置換されているアルカンカルボン酸のア
シル基、場合によっては例えばハロゲン、低級アルコキ
シもしくはニトロにより置換されている安息香酸のアシ
ル基、又は炭酸半エステルのアシル基である。このよう
なアシル基は例えば、低級アルカノイル、例えばホルミ
ル、アセチルもしくはプロピオニル、ハロー低級アルカ
ノイル、例えば２−ハロアセチル、特に２−クロロ−１
２−ブロモー、２−ヨード、２．２．２−）リフルオロ
−もしくは２，２．２−トリクロロ−アセチル、場合に
よっては例えばハロゲン、低級アルコキシもしくはニト
ロにより置換されているベンゾイル、例えばベンゾイル
、４−クロロベンゾイル、４−メトキシベンゾイルもし
くは４−ニトロベンゾイル、又は低級アルキル基の１−
位において分枝しているか又は１−位もしくは２、位に
おいて適切に置換されている低級アルコキシカルボニル
、特にｔｅｒ　を−低級アルコキシカルボニル、例えば
ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリールメトキシカル
ボニル（これは１個又は２個の７リール基を有し、この
アリール基は、場合によっては低級アルキル、特にｔｅ
ｒ　を−低級アルキル、例えばｔｅｒｔ−ブチル、低級
アルコキシ、例えばメトキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、
例えば塩素、及び／又はニトロによりモノ−又はポリ−
置換されているフェニルである）、例えば場合によって
は置換されているベンジルオキシカルボニル、例えば４
−ニトロベンジルオキシカルボニル、又は置換されたジ
フェニルメトキシカルボニル、例えばベンズヒドリルオ
キシカルボニル又はジー（４−メトキシフェニル）−メ
トキシカルボニル、アロイルメトキシカルボニル（ここ
で、アロイル基は好ましくは、場合によってはハロゲン
、例えば臭素により置換されているベンゾイルである）
、例えばフェナシルオキシカルボニル、２−ハロー低級
アルコキシカルボニル、例えば２．２．２−トリクロロ
エトキシカルボニル、２−ブロモエトキシカルボニルも
しくは２−ヨードエトキシカルボニル、又は２−（トリ
ー置換シリル）−エトキシカルボニル（ここで、各置換
基は、他とは独立に、脂肪族、芳香−脂肪族、脂環族又
は芳香族の炭化水素基であり、この基は１５個以下の炭
素原子を有しそして場合によっては例えば低級アルキル
、低級アルコキシ、アリール、ハロゲンモジくはニトロ
により置換されており、そして例えば、場合によっては
置換されている低級アルキル、フェニル低級アルキル、
シクロアルキル又はフェニルである）、例えばトリーア
ルキルシリルエトキシカルボニル、例えば２−トリメチ
ルシリルエトキシカルボニルもしくは２−（ジ−ｎ−ブ
チルメチルシリル）−エトキシカルボニル、又は２−ト
リアリールシリルエトキシカルボニル、例えば２−トリ
フェニルシリルエトキシカルボニルである。

アミノ−保護基としての他のアシル基はさらに、を機リ
ン酸、ホスホン酸又はホスフィン酸の対応する基、例え
ばジー低級アルキルホスホリル、例えばジメチルホスホ
リル、ジエチルホスホリル、ジ−ｎ−プロピルホスホリ
ルもしくはジイソプロピルホスホリル、ジシクロアルキ
ルホスホリル、例えばジシクロへキシルホスホリル、場
合によっては置換されているジフェニルホスホリル、例
えばジフェニルホスホリル、場合によっては例えばニト
ロにより置換されているジー（フェニル−低級アルキル
）−ホスホリル、例えばジベンジルホスホリルもしくは
ジー（４−ニトロベンジル）−ホスホリル、場合によっ
ては置換されているフェノキシフェニルホスホリル、例
えばフェノキシフェニルホスホリル、ジー低級アルキル
ホスフィニル、例えばジエチルホスフィニル、例えば場
合によっては置換されているジフェニルホスフィニル、
例えばジフェニルホスフィニルを挙げることができる。

モノ−、ジー、又は特にトリーアリールメチルアミノ基
である了り−・ルメチルアミノ基において了り−ル基は
特に、置換されている場合があるフェニル基である。こ
のような基は、例えばベンジルアミノ、ジフェニルメチ
ルアミノ、及び特にトリチル了ミノである。

エーテル化メルカプト基により保護されたアミノ基中の
エーテル化メルカプ）Ｍは特にアリールチオ基又はアリ
ール−低級アルキルチオ基であり、ここでアリールは特
に、場合によっては例えば低級アルキル、例えばメチル
もしくはｔｅｒｔ−ブチル、低級アルコキシ、例えばメ
トキシ、ハロゲン、例えば塩素、及び／又はニトロによ
り置換されているフェニルである。対応するアミノ保護
基は例えば４−ニトロフェニルチオである。

アミノ保護基として使用することができる２−アシル−
低級アルカ−１−エン−１−イル基において、アシルは
例えば低級アルカンカルボン酸のアシル基、安息香酸（
これは場合によっては例えば低級アルキル、例えばメチ
ルもしくはｔｅｒｔ−ブチル、低級アルコキシ、例えば
メトキシ、ハロゲン、例えば塩素、及び／又はニトロに
より置換されている）のアシル基、又は特に炭酸半エス
テル、例えば炭酸低級アルキル半エステルのアシル基で
ある。対応する保護基は特に、１−低級アルカノイルプ
ロプ−ｌ−エン−２−イル、例えばｌ−アセチルプロプ
−１−エン−２−イル、又は１−低級アルコキシカルボ
ニルプロプ−１−エン−２−イル、例えば１−エトキシ
−カルボニルプロプ−１−エン−２−イルである。

アミノ基はまたプロトン化形で保護することができ、対
応する陰イオンとして特に、強無機酸の陰イオン、例え
ば塩素イオンもしくは臭素イオン、又は有機スルホン酸
は、例えばｐ−トルエンスルホン酸の陰イオンが挙げら
れる。

好ましいアミノ−保ｆｆＭは、炭酸半エステルのアシル
基、特にｔｅｒ　ｔ−ブトキシカルボニル、又はベンジ
ルオキシカルボニルもしくはジフェニルメトキシカルボ
ニル（これらのそれぞれは、場合によっては例えば前記
のように置換されている）、例えば４−ニトロベンジル
オキシカルボニル、又は２−ハロー低級アルコキシカル
ボニル、例えば２．２．２−トリクロロエトキシカルボ
ニル、さらにはトリチル又はホルミルである。

メルカプト基、例えばシスティン中のメルカプト基は、
場合によっては置換されているアルキル基によるＳ−ア
ルキル化によって、チオアセタール形成によって、Ｓ−
アシル化によって、又は非対称ジスルフィド基の形成に
よって保護することができる。好ましいメルカプト−保
護基は、例えば、場合によってはフェニル基において例
えばメトキシもしくはニトロにより置換されているベン
ジル基、例えば４−メトキシベンジル、場合によっては
フェニル成分において例えばメトキシにより置換されて
いるジフェニルメチル、例えば４゜４′−ジメトキシ−
ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、トリメチルシ
リル、ベンジルチオメチル、テトラヒドロピラニル、ア
シルアミツメチク、例えばアセチルアミノメチル、ベン
ゾイル、ベンジルオキシカルボニル又はアミノカルボニ
ル、例えばエチルアミノカルボニルである。

第一カルボン酸アミド基（−ＣＯＮＨ＊）は、例えばＮ
−（９−キサンセニル）誘導体の形で、又はＮ−（モノ
−、ジー又はトリーアリールメチル）誘導体の形で保護
され、ここでアリールは特に非置換フェニル、又は５個
以下の同一の又は異る置換基により置換されたフェニル
である。このようなフェニル置換基は好ましくは低級ア
ルキル、例えばメチル、低級アルコキシ、例えばメトキ
シ、又はさらにポリマー担体である。このような了り−
ルメチル保護基の例として４−メトキシベンジル、２．
４．６−）リメトキシベンジル、ジフェニルメチル、ジ
ー（４゛−メトキシフェニル）−メチル、ジー（４−メ
チルフェニル）−メチル、及び（４−メチルフェニル）
−（（ポリマー担体〕−フェニル）−メチルを挙げるこ
とができる。

グアニジノ基は例えばトルエンスルホネートの形で保護
される。

この明細書において、保護基、例えば特にカルボキシ保
護基、さらに保護されるべき官能基例えば特にカルボキ
シ基と結合するポリマー担体は、容易に除去することが
でき、例えばメリフィールド合成のために適当なものと
して理解される。このタイプの適当なポリマー担体は、
例えば、ジビニルベンゼンとの共重合により弱く架橋さ
れたポリスチレン樹脂であり、この樹脂はペプチド残基
の可逆的結合のために適当な棚要素を担持する。

反応はそれ自体既知の方法で行うことができ、反応条件
は特に反応に関与するカルボキシ基が活性化されている
か否か、そしていかに活性化されているかに依存し、通
常は適当な溶剤もしくは稀釈剤又はこれらの混合物の存
在下で、そして必要であれば縮合剤（これは例えば、反
応に関与するカルボキシ基が無水物の形で存在すれば、
さらに酸結合剤であってもよい）の存在下で、冷却又は
加熱しながら、例えば約−３０℃〜約＋１５０℃の温度
範囲において、密閉反応容器中でそして／又は不活性ガ
ス、例えば窒素の雰囲気中で行う、一般的縮合剤は、例
えばカルボジイミド、例えばＮ。

Ｎ′−ジエチル−１Ｎ、Ｎ’−ジプロピル、Ｎ。

Ｎ′−ジシクロへキシル−もしくはＮ−エチル−Ｎ’−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、適当
なカルボニル化合物、例えばカルボニルジイミダゾール
、又は１．２−オキサシリウム化合物、例えば２−エチ
ル−５−フェニル−１゜２−オキサシリウム−３′−ス
ルホネート及び２−ｔｅｒｔ−ブチル−５−メチルーイ
ソオキサゾルリウムパークロレート、又は適当なアシル
アミノ化合物、例えば２−エトキシ−！−エトキシカル
ボニルー１．２−ジヒドロキノリンである。一般的酸結
合縮合剤は、例えばアルカリ金属の炭酸塩又は炭酸水素
塩、例えばナトリウム又はカリウムの炭酸塩又は炭酸水
素塩（通常は硫酸塩と共に）、又は有機塩基、例えば一
般的に、立体障害されたトリー低級アルキルアミン、例
えばＮ、Ｎ’−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミンであ
る。

保護基、例えばカルボキシ−、アミノ−、ヒドロキシ−
、カルボン酸アミド−又はメルカプト−保護基の除去は
、それ自体既知の方法により、例えば加溶媒分解により
、特に加水分解、アルコール分解もしくは酸分解により
、又は還元により、特に水素化もしくは化学的還元によ
り、場合によっては複数段階で又は同時的に行われる。

さらに、酵素的方法を用いることも可能である。

すなわち、ｔａｒ　を−低級アルコキシカルボニル、又
は２−位において有機シリル基によりもしくは１−位に
おいて低級アルコキシもしくは低級アルキルチオにより
置換されている低級アルコキシカルボニル、又は場合に
よっては置換されているジ　。

フェニルメトキシカルボニルは、例えば適当な酸、例え
ば蟻酸又はトリフルオロ酢酸で処理することにより、場
合によってはａ核性化合物、例えばフェノール又はアニ
ソールを添加して、遊離のカルボキシに転換することが
できる。場合によっては置換されているベンジルオキシ
カルボニルは、例えば水素化分解により、すなわち、金
属性水素化触媒、例えばパラジウム触媒の存在下で水素
で処理することにより、遊離せしめることができる。

さらに、適切に１Ｆ換されたベンジルオキシカルボニル
、例えば４−ニトロベンジルオキシカルボニルはまた、
化学還元により、例えばアルカリ金属ジチオニド、例え
ばナトリウムジチオニドで、又は還元性金属塩、例えば
クロム（■）塩、例えば塩化クロム（ｎ）で処理するこ
とにより、通常は、水素を生成しそして金属と共に発生
期の水素を発生することができる薬剤、例えば、場合に
よっては例えばヒドロキシにより置換されている低級ア
ルカンカルボン酸、例えば酢酸、蟻酸、グリコール酸、
ジフェニルグリコール酸、乳酸、マンデル酸、４−クロ
ロマンデル酸もしくは酒石酸、又はアルコールもしくは
チオール（水を添加するのが好ましい）の存在下で、遊
離カルボキシに転換することもできる。上記のように、
還元性金属又は金属塩で処理することにより、２−ハロ
ー低級フルコキシカルボニル（場合によっては２−ブロ
モ−低級アルコキシカルボニル基を対応する２−ヨード
−低級アルコキシカルボニル基に転換した後）又はアロ
イルメトキシカルボニルを遊離カルボキシに転換するこ
とが可能であり、アロイルメトキシカルボニルはまた、
親核性の好ましくは塩形成性の試薬、例えばナトリウム
チオフェルレート又はヨウ化ナトリウムで処理すること
によっても開裂せしめることができる。置換された２−
シリルエトキシカルボニルはまた、弗素陰イオンをもた
らす弗化水素酸の塩、例えば弗化アルカリ金属、例えば
弗化ナトリウム又は弗化カリウムで処理することにより
、巨還ポリエーテル（“クラウンエーテル”）の存在下
で、あるいは有機第四塩基の弗化物、例えばテトラエチ
ルアンモニウムフルオリド又はテトラブチルアンモニウ
ムフルオリドで処理することにより、非プロトン性極性
溶剤、例えばジメチルスルホキシド又はＮ、Ｎ’−ジメ
チルアセトアミドの存在下で、遊離カルボキシに転換す
ることができる。

保護されたアミノ基は、それ自体既知の方法により、そ
して保護基の性質に依存して、種々の方法により、しか
し好ましくは加溶媒分解又は還元により遊離せしめる。

２−ハロー低級アルコキシカルボニルアミノ（場合によ
っては２−ブロモ−低級アルコキシカルボニルアミノ基
を２−ヨウドー低級アルコキシカルボニルアミノ基に転
換した後）、アロイルメトキシカルボニルアミノ、又は
４−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノは、例えば
適当な化学還元剤、例えば適当なカルボン酸、例えば水
性酢酸の存在下での亜鉛で処理することにより、開裂せ
しめることができる。アロイルメトキシカルボニルアミ
ノはまた、親核性の好ましくは塩形成性の試薬、例えば
ナトリウムチオフェノラートで処理することにより、そ
して４−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノはまた
、アルカリ金属ジチオニド、例えばナトリウムジチオニ
ドで処理することにより開裂せしめることができる。場
合によっては置換されているジフェニルメトキシカルボ
ニルアミノ、ｔｅｒ　を−低級アルコキシカルボニルア
ミノ、又は２−トリ置換シリルエトキシカルボニルアミ
ノは、適当な酸、例えば蟻酸又はトリフルオロ酢酸で処
理することにより開裂せしめることができ、場合によっ
ては置換されているベンジルオキシカルボニルアミノは
、例えば水素化分解により、すなわち適当な水素化触媒
、例えばパラジウム触媒の存在下で水素で処理すること
により開裂せしめることができ、場合によっては置換さ
れているトリアリールメチルアミノ又はホルミルアミノ
は、例えば酸で処理することにより、例えば鉱酸、例え
ば塩酸、又は有機酸、例えばｍ酸、酢酸又はトリフルオ
ロ酢酸で処理することにより、場合によっては水の存在
下で開裂せしめることができ、そしてを機シリル基によ
り保護されたアミノ基は、例えば加水分解又はアルコー
ル分解により遊離せしめることができる。ハロアセチル
、例えば２−クロロアセチルにより保護されたアミノ基
は、塩基の存在下でチオ尿素で処理することにより、又
はチオ尿素のチオレート塩、例えばアルカリ金属チオレ
ートで処理し、続いて、得られた縮合生成物を加溶媒分
解、例えばアルコール分解もしくは加水分解にかけるこ
とにより、遊離せしめることができる。２−置換シリル
エトキシカルボニルにより保護されたアミノ基はまた、
対応して保護されたカルボキシ基の遊離化に関して前記
したように、弗素陰イオンをもたらす弗化水素酸の塩で
処理することにより、遊離アミノ基に転換することがで
きる。

アジド基の形で保護されたアミノは、例えば還元により
、例えば水素化触媒、例えば酸化白金、パラジウムもし
くはラネーニッケルの存在下での水素による触媒的水素
化により、あるいは他の方法として、酸、例えば酢酸の
存在下で亜鉛で処理することにより、遊離アミノに転換
することができる。触媒的水素化は不活性溶剤、例えば
ハロゲン化水素、例えば塩化メチル中で、又は水中、も
しくは水と有機溶剤、例えばアルコールもしくはジオキ
サンとの混合物中で、約２０℃〜２５℃において、又は
冷却もしくは加熱しながら実施するのが好ましい。

適当なアシル基により、有機シリル基により、又は場合
によっては置換されている１−フェニル−低級アルキル
により保護されているヒドロキシ又はメルカプトは、対
応して保護されたアミノ基と同様にして遊離せしめる。

２．２−ジクロロアセチルにより保護されたヒドロキシ
又はメルカプト基は例えば塩基性加水分解により遊離し
、そしてｔｅｒ　を−低級アルキルにより又は２−オキ
サ−もしくは２−チア−脂肪族もしくは一脂環族炭化水
素基によりエーテル化されたヒドロキシ又はメルカプト
基は、酸分解により、例えば、鉱酸又は強カルボン酸、
例えばトリフルオロ酢酸で処理することにより遊離する
。好ましくは置換されているメチレン基により、例えば
低級アルキリデン、例えばイソプロピリデン、シクロア
ルキリデン、例えばシクロへキシリデン、又はベンジリ
デンにより一緒に保護されている２個のヒドロキシ基は
、酸加溶媒分解により、特に鉱酸又は強有機酸の存在下
で遊離せしめることができる。

９−キサンセニルにより保護されたカルボン酸アミド基
は例えば、木酢酸中臭化水素により、又はアニソールの
存在下での弗化水素により遊離する。

モノ−、ジー又はトリーアリールメチルにより保護され
たカルボン酸アミド基は例えば、アニソールの存在下で
弗化水素により遊離せしめることができ、さらに、ジフ
ェニルメチル保護基は例えば、炭素上パラジウム触媒の
存在下での水素化分解により除去することができ、そし
てジー（４−メトキシフェニル）メチル保護基又は２．
４．６−ドリメトキシベンジル保ＩＩ基は例えば、トリ
フルオロ酢酸により除去することができる。さらに、１
個のアリール保護基がポリマー担体に連結されているジ
アリールメチル保護基はアニソールの存在下で弗化水素
により除去することができる。

所望により、複数の保護された官能基が存在する場合に
は、例えば酸分解により、例えばトリフルオロ酢酸もし
くは蟻酸で処理することにより、又は還元により、例え
ば亜鉛及び酢酸で処理することにより、もしくは水素及
び水素化触媒、例えば炭素上パラジウム触媒で処理する
ことにより、前記の保護基の複数が同時に除去され得る
ように、保護基を選択する。

反応変法（Ｊｌ）はさらに、ペプチド−アミドの製造方
法の次のようなり様を含む、この態様においては、ペプ
チドの末端カルボキシ基がアンモニアによってポリマー
担体から除去され、そしてこの過程で、すなわちその場
で、アミドに転換される。

この場合、アンモニアは遊離アミノ基を有する補完断片
である。

笈胤皿 ジスルフィド結合を形成するためにメルカプト基を酸化
するために適当な酸化剤は例えば、大気中酸素〔場合に
よっては触媒量の遷移金属の塩、例えば硫酸鉄（■）、
塩化鉄（Ｉ！［）又は硫酸銅　　。

（ＩＩ）が添加されているポリペプチドの水溶液に、大
気中酸素を通すのが好ましい〕　；ヨウ素〔さらにはヨ
ウ化カリウムアダクトＫｌｊＯ形で、これは、アルコー
ル性溶液、例えばメタノール性、又は水性アルコール性
、例えば水性メタノール性溶液として使用するのが好ま
しい〕　；水溶液中フェリ　ＣＩＩＩ）シアン化カリウ
ム：１，２−シイオドエタン、又はアゾジカルボン酸ジ
メチルエステルもしくはジエチルエステル（これらは、
水中で、又は水と水溶相性アルコール、例えばメタノー
ルとの混合物中で反応する）である、酸化は好ましくは
室温において実施する。

反応条件下で除去することができ、そして方法（ｂｌの
ために適当なメルカプト−保護基は、例えばアセチルア
ミノメチルである。アセチルアミノメチル保護基の場合
、方法（ｂｌは、少量の塩酸が添加された酢酸中で、酸
化剤としてヨウ素を用いて、例えば例に記載するように
してを利に行われる。

１汰竺 考慮すべき官能基、それらの保護、及び保護基を除去す
ることによる脱保護は方法（ａ）に記載されている。方
法（Ｃ）はまた、例えばメリフィールド合成において使
用され得る担体に結合した保ｒ！ｉ基の除去を含む、従
ってこの場合、方法（Ｃ）は担体からのペプチド又はペ
プチドアミドの除去を含む。

五五辿 形質転換に適当な宿主細胞は、例えば微生物、例えば酵
母、例えばサツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍ　ｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）　　、
及び特に、限酵素又は修飾酵素を有しない細菌株、特に
ニジエリシーｔ−’コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　
ｃｏｌｉ）の株、例えばＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｘ
１７７６、Ｅ、コリＨＢＩＯＩ　、Ｅ。

コリ賀３１１０　％　Ｅ、コリＨＢＩＯＩ／ＬＭ１０３
５、Ｅ、コリＪＡ２２１　　（Ｊ、Ｃ１ａｒｋｅ及びＪ
、Ｃａｒｂｏｎ、　ＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ　滋、５１７
（Ｉ９７Ｂ）　）　、又はＥ、コリに１２株２９４、バ
シルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ）　、バシルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ−」旦旦旦、シ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ）　、ヘモフィル
ス（ハ！並肛ハ蛙、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅ　ｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ）、及び他の微生物、並びに高等生物の
細胞、特に樹立されたヒト又は動物のセルラインである
。好ましい宿主細胞はＥ、コリの上記の株、特にＥ、コ
リＩ（８１０１、及びＥ、コリＪＡ２２１である。

原理的には、この発明のアミノ酸配列をコードするこの
発明の異種性ＤＮＡ配列を選択された宿主中で複製しそ
して発現することができるすべてのベクターが適当であ
る。

Ｅ、コリの株中でＣＧＲＰ遺伝子を発現するのに適当な
ベクターの例は、バクテリオファージ、例えばバクテリ
オファージλの誘導体、又は好ましくはプラスミド、例
えば特にプラスミドｃｏｌＥ１及びそ）誘導体、例えば
ｐＭＢ９、ｐｓＦ２１２４　、ｐＢＲ３１７又はｐＢＲ
３２２である。この発明の好ましいベクターはプラスミ
ドｐＢＲ３２２に由来する。適当なベクターは、完全な
レプリコン、並びに表現型特徴により、発現プラスミド
で形質転換された微生物の選択及び同定を可能にするマ
ーカー遺伝子を含有する。

適切なマーカー遺伝子は、例えば重金属、抗生物質等に
対する耐性を微生物に付与する。さらに、この発明の好
ましいベクターは、レプリコン及びマーカー遺伝子領域
のほかに、この発明のアミノ酸配列をコードするＤ　Ｎ
　Ａ配列及び場合によっては発現制御配列を挿入するこ
とができるように制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含
有する。好ましいベクターであるプラスミドｐＢＲ３２
２は、無傷のレプリコン、テトラサイタリン及びアンピ
シリンに対する耐性を付与するマーカー遺伝子（ｔｅｔ
”及びａｍｐ”　）　、並びに制限エンドヌクレアーゼ
・例えばＰｓｔｒ（ａψｐ１遺伝子中で開裂せしめ、ｔ
ｅｔ”・　遺伝子を無傷のまま残す）、Ｒａｍ）ＩＩ、
旧ｎｄｌｌｌ、Ｓａｌ　Ｉ　　（ｔｅｔ”遺伝子中で開
裂せしめ、ａｍｐ”遺伝子を無傷のまま残す）、Ｎｒｕ
Ｉ及びＥｃｏＲＩの１個のみ存在する一連の認識配列を
含有する。

Ｃ０ＲＰの発現を制御するために複数の発現制御配列を
使用することができる。特に、形質転換されるべき宿主
の強く発現される遺伝子の発現制御配列が使用される。

バイブリドベクターとしてρＢＲ３２２を使用しそして
宿主微生物としてＥ、コリを使用する場合、適当な発現
制御配列（これらは特に、プロモーター及びリボゾーム
結合部位を含有する）は、ラクトースオペロン、トリプ
トファンオペロン、アラビノースオペロン等の発ｍ　制
？１１配列、並びにβ−ラクタマーゼ遺伝子の発現制御
配列、ファージスＮ−遺伝子又はファージｆｄ一層蛋白
質遺伝子の対応する配列等である。β−ラクタマーゼ遺
伝子（β−１ａｃ−ｇｅｎｅ）のプロモーターはプラス
ミドｐＢＲ３２２中にすでに含まれているが、他の発現
制御配列がこのプラスミド中に導入されなければならな
い、この発明においては、好ましい発現間？ｎ配列はト
リプトファンオペロン（ｔｒｐｏｐ）のそれである。

酵母での複製及び発現のために適当なベクターは酵母−
複製開始点及び酵母用選択遺伝子マーカーを含む、酵母
複製開始点、例えば染色体性自律複製セグメント（ａｒ
ｓ）を含有するバイブリドベクターは、形質転換の後酵
母細胞内で染色体外に維持され、そして有糸分裂の間に
自律的に複製される。さらに、酵母２μプラスミドＤＮ
Ａに相同な配列を含有するバイブリドベクターも使用す
ることができる。このようなバイブリドベクターは、細
胞中にすでに存在する２μプラスミドに組換により組み
込まれるか、又は自律的に複製する。２μ配列は、高形
質転換頻度を有するプラスミドのために特に適当であり
、そして高コピー数を許容する。酵母のために適当なマ
ーカー遺伝子は特に、宿主に抗生物質耐性を付与するも
の、又は栄養要求酵母変異株の場合には宿主の傷害を補
完するものである。対応する遺伝子は例えば、抗生物質
シクロへキシミドに対する耐性を付与し、又は栄養要求
性酵母変異株に原栄養性、例えば皿、囮、ＨＩＳ３、又
は特にＴＲＰ　Ｉ遺伝子を提供する。好ましくは、酵母
バイブリドベクターはさらに、バイブリドベクター及び
それらの前駆体の造成及びクローニングを１つの細菌宿
主中で行うことができるように、ｍ菌宿主、特にＥ、コ
リのための複製開始点及びマーカー遺伝子を含有する。

酵母での発現のために適当な発現制御配列は例えば皿、
ｊ型上、ＡＤＨＩＩ　、基ノー又は■匹遺伝子のそれ、
そしてさらに解糖に関与するプロモーター、例えば匹し
及びＧＡＰＤＦｒプロモーターである。

この発明のアミノ酸配列の１つをコードするＤＮＡ配列
及び発現制御配列を含有し、複製及び発現型選択が可能
な発現ベクターであって、該ＤＮＡ配列が転写開始及び
停止シグナル並びに翻訳開始及び終止シグナルと共に、
該発現プラスミド中に、該発現制御配列の＠御を伴って
、この発明の注目のアミノ酸配列が前記発現プラスミド
により形質転換された宿主細胞中で発現されるように配
列されている０発現ベクターが特に適当である。

効果的な発現を達成するため、この発明のアミノ酸配列
の１つをコードする遺伝子を発現制御配列と正しく　（
相を合わせて）配置しなければならない。

発現制御Ｉ領領域主ｍＲＮ＾起点と該発現制御配列に天
然に連結されている遺伝子コード配列（例えばβ−１ａ
ｃプロモーターを使用する場合にはβ−１ａｃコード配
列）のＡＴ（Ｉ，との間に、目的のアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子〔この遺伝子は好ましくは自らの翻訳開始
シグナル及び翻訳終止シグナル（例えばＴＡＧ）を有す
る〕に連結するのが有利である。こうして効果的な転写
及び翻訳が保証される。

例えば、ベクター、特にｐＢＲ３２２を制限エンドヌク
レアーゼで開裂せしめ、そして場合によっては生ずる線
状化されたベクターを変形した後、対応する制限末端が
設けられた発現ｖＩ′ａ配列を導入する０発現制御配列
は３′−末：ｔＢ（翻訳の方向に）に制限エンドヌクレ
アーゼのＬ２ｍ配列を含有し、その結′果、すでに発現
制御配列を含有するベクターをその制限酵母で消化し、
この発明の目的のアミノ酸配列をコードする、一致する
末端が設けられた遺伝子を挿入することができる。それ
ぞれ正しい方向に、及び正しくない方向に遺伝子を含有
する２１１のバイブリドプラスミドの混合物が得られる
。すでに発現制御配列を含有するベクターをベクターＤ
ＮＡ内で第２の制限エンドヌクレアーゼ開裂せしめ、そ
して生じたベクター断片に、この発明の目的のシミノ酸
配列をコードする、正しい末端が設けられた遺伝子を挿
入するのが好ましい、ベクターに対するすべての操作は
、レプリコン及び少なくとも１個のマーカー遺伝子の機
能が害されないような態様で行うのが好ましい。

この発明の好ましい態様においては、発現制御配列、特
に、３′−末端（主ｍＲＮＡ起点と第１＾ＴＧとの間）
に好ましくは接着末端を形成する制限エンドヌクレアー
ゼ例えばＥｃｏＲＩのための認識配列を担持するトリプ
トファンオペロン（ｔｒｐ　ｏｐ）の発現制御配列を含
有するｐＢＲ３２２由来のベクターを前記の制限エンド
ヌクレアーゼで消化し、そしてベクター断片中で、平滑
末端又は好ましくは接着末端を形成する第２の制限エン
ドヌクレアーゼ、例えばＢａ５ａｌで消化し、この後、
こうして線状化されたベクターを、この発明のアミノ酸
配列の１つをコードする、対応する末端（例えば、ＡＴ
Ｇ開始コドンの前のＥｃｏＲＩ末端、及び翻訳終止コド
ンの後のＢａ−）ＩＩ末端）を有する遺伝子と連結する
。

この連結は既知の方法により、相補的末端（接着末端）
を対合せしめ、そして例えば↑ｅＤＮＡリガーゼにより
連結することにより行う。

合成的に又は５ＲＮＡルートにより、ゲノムＤＮＡから
得られ、そして対応する接着末端（特にＥｃｏＲＩ及び
ＢａｗＨ１末端）を設けられたＣＧＲＰ遺伝子はまた、
例えば配列分析のために多量のＣＧＲＰ遺伝子を得るた
めに、ベクター、例えばｐＢＲ３２２にクローン化する
ことができる。バイブリドプラスミドを含有するクロー
ンの単離は、例えばＣＧＲＰ−特異的な、放射性ラベル
されたオリボデオキヌクレオチドプローブにより行われ
る。　ＣＧＲＰの遺伝子の特徴付けは、例えば、Ｍａｘ
ａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔの方法（Ａ、Ｍ、Ｍａｘａｓ及
び１１．Ｇ１１ｂｅｒｔ　ｓ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡｓ７４　５６０　　（
Ｉ９７７）　　：さらに±旦、シ区已、並、４９９（Ｉ
９８０）を参照のこと〕に従って行われる。

この発明の発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は例
えば、文献、例えばＳ、セレビシェ−についてはＡ、　
Ｈｉｎｎｅｗ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ。

用虹、互、１９２９（Ｉ９７８）　；　Ｂ　、ズブチリ
スについてはＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｕｓ等、Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、８１．７４１（Ｉ９６１）　；
そしてＥ、コリについてはｎ、ｎａｎｄｅｌ等、Ｊ、Ｍ
ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　　５３．１５９　（Ｉ９７０）に
記載されている方法により行われる。形質転換された宿
主細胞の単離は、発現プラスミドに含有されるマーカー
遺伝子がそれに対して耐性を付与する殺生物剤が添加さ
れている選択栄養培地から有利に行われる。

好ましくは、発現ベクターがａｍｐ’遺伝子を含有する
場合には、栄養培地にアンピシリンが添加される０発現
プラスミドを含有しない細胞はこのような培地中で破壊
される。

この発明また、この発明のペプチドを生産することがで
きる、前記の方法により得られる形質転換された細胞に
関する。

方法（ｄ）に従うこの発明の形質転換された細胞の培養
はそれ自体既知の方法で行われる０例えば、この発明の
形質転換された宿主微生物の培養のために種々の炭素源
を使用することができる。好ましい炭素源の例は、責化
性の炭水化物、例えばグルコース、マルトース、マンニ
トールもしくはラクトース、又は単独でもしくは適当な
混合物として使用され得る酢酸塩である。適当な窒素源
は例えば、アミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプチド、及
び蛋白質及びその分解生成物、例えばトリプトン、ペプ
トンもしくは肉エキス；さらには酵毒エキス、マルトエ
キス、そしてさらにアンモニウム塩、例えば塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム又は硝酸アンモニウムであり
、これらは単独で又は適当な混合物として使用すること
ができる。やはり使用され得る無機塩は例えば、ナトリ
ウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩
、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩である。

さらに、栄養培地は例えば、増殖促進物質、例えば微量
元素、例えば鉄、亜鉛及びマンガン、並びに好ましくは
選択圧を生じさせそして発現プラスミドを喪失した細胞
の増殖を防止する物質を含有する。すなわち、例えば、
発現プラスミドがａｍｐ’遺伝子を含有する場合にはア
ンピシリンが培地に添加される。抗生活性物質のこのよ
うな添加はまた、抗生物！怒受性微生物を破壊する効果
を有する。

培養は、それ自体既知の方法に従って行われる。

培養条件、例えば温度、培地のｐＨ値、及び発酵時間は
、この発明のペプチドの最大力価が得られるように選択
する。すなわち、Ｅ、コリ又は酵母菌株は好ましくは、
液体培養中好気的条件下で、振とう又は攪拌しながら、
例えば２０℃〜４０℃、好ましくは３０℃の温度におい
て、そして４〜９のｐＨ値、好ましくはｐＨ７にて、約
４〜２０時間、好ましくは８〜１２時間培養する。培養
中、発現生成物（ＣＧＩ？Ｐ）は細胞内に蓄積する。

Ｎ−末端メチオニンは、ある宿王細胞においては、翻訳
後に除去され得る。さらに、ある宿主細胞においてはＮ
−末端アミノ酸がアセチル化され得る。

細胞濃度が適当な値に達したとき、培養を停止し、そし
てこの発明のペプチドを微生物の細胞から遊離せしめる
。この目的のために、細胞を例えば洗剤、例えばＳＤＳ
又はトリトンで処理することにより破壊し、あるいはリ
ゾチーム又は同様に作用する酵素により溶解する。前記
の方法に代えて、又は前記の方法に加えて、機械的力、
例えば剪断力（例えばＸ−プレス、フレンチプレス、グ
イノーミル）、又はガラスピーズもしくは酸化アルミニ
ウムを伴う振とう、又は例えば液体窒素中での凍結と例
えば３０〜４０℃の解凍の反復、及び超音波を用いて細
胞を破壊することができる。蛋白質、核酸及び他の細胞
成分を含有する得られた混合物を遠心分離した後、それ
自体既知の方法により、この発明のペプチドを包含する
蛋白質成分について濃縮する。すなわち、例えば、非蛋
白質成分のほとんどどがポリエチレンイミン処理により
除去すれ、そしてこの発明のペプチドを包含する蛋白質
は例えば硫酸アンモニウム又は他の塩により溶液を飽和
することによって沈澱する。細菌蛋白質はまた、酢酸で
酸性化する（例えば０．１％、ｐＨ４〜５）ことによっ
て沈澱せしめることができる。この発明のペプチドのこ
れ以上の濃縮は酢酸上清液をｎ−ブタノールで抽出する
ことによって達成することができる。他の精製段階は例
えば、ゲル電気泳動、クロマトグラフ法、例えばイオン
交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィ
ー、）ＩＰＬＣ，逆相）ＩＰＬｃ等、混合物の構成成分
の適当なセファデックス（商標）カラムによる分離、透
析、例えば抗体特にモノクローナル抗体を用いるアフィ
ニティークロマトグラフィー、及び他の方法、特に文献
から知られる方法を包含する。

例えば、この発明の発現されたペプチドの単離は次の段
階を含んで成る。

◎　遠心分離による、培養液からの細胞の分離；■　例
えば細胞溶解酵素による処理及び／又は凍結と解凍の反
復による、細胞の破壊による粗抽出物の調製； ■　遠心分・離による不要性成分の除去；◎　ポリエチ
レンイミンの添加によるＤＮＡの沈澱； ◎　硫酸アンモニウムによる、この発明のペプチドを包
含する蛋白質の沈澱； ■　モノクローナル抗−ＣＧＲＰ抗体カラム上での、前
記沈澱物を溶解した溶液した溶液のアフィニティークロ
マトグラフィー； ■　透析又はセファデックスＧ２５上でのクロマトグラ
フィーによる、得られた溶液からの塩の除去。

上記の方法に代えて、ＤＮＡを分離除去した後、細菌蛋
白質を０．１％酢酸により沈澱せしめ、そしてこの発明
のペプチドを酸性上清液からｎ−ブタノールにより抽出
し、あるいは酸性上清液をイオン交換クロマトグラフィ
ー（例えばカルボキシメチルセルロース）に直接かける
ことができる。他の精製段階はセファデックスＧ５０（
又はＧ７５）上でのゲル濾過、及び逆相ＨＰＬＣを包含
する。塩の除去はやはりセファデックスＧ２５上で行わ
れる。

この発明のペプチドを検出するために、抗−ＣＧＲＰ抗
体（例えば、ラビットからの抗体又は／％イブリドーマ
細胞から得られるモノクローナル抗体）による試験を使
用することができる。

１広兜 目的ペプチド−アミドの末端アミド基のＮＨＩ基に酵素
的に分解することができるアミノ酸ＡＳＡは例えばグリ
シンである。この場合に適当な酵素は、Ａ、Ｆ、Ｂｒａ
ｄｂｕｒｙｓ　Ｍ、Ｄ、Ａ、Ｆｉｎｎｉｅ及びり、Ｇ、
Ｓｍｙｔｈ、Ｎａｔｕｒｅ、　　２９８．６８６−６８
８（Ｉ９８２）に記載されているようにして、脳下垂体
、好ましくはハトの脳下垂体から得ることができる。

適当な酵素の存在下でアンモニアにより置換され得るア
ミノ酸ＡＳ１　は例えばチロシンである。

この場合に適当な酵素は、例えばカルボキシペプチダー
ゼＹ（カールスベルグ・バイオチミストリー社、コペン
ハーゲン、デンマーク）〔例えば、Ｋｌａｕｓ　Ｂｒｅ
ｄｄａ＋ｓ等、Ｃａｒｌｓｂｅｒ　　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ
、　　４６゜１２１−１２８　（Ｉ９８１）を参照のこ
と〕である。

１皿旦１１ 式（Ｉ）の（部分）配列を有しそして塩形成基を有する
化合物の塩は、それ自体既知の方法により製造すること
ができる０例えば、塩基性基より多数の酸性基を含有す
る式（Ｉ）の部分配列を有する化合物の塩は、例えば、
金属化合物、例えば適当なカルボン酸のアルカリ金属塩
、例えばα−エチルカプロン酸のナトリウム塩、又は無
機アルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩、例えば
炭酸水素ナトリウムで処理することにより、あるいはア
ンモニア又は適当な有機アミンブ処理することにより形
成することができ、この場合好ましくは理論量の又はわ
ずかに過剰量の塩形成剤を使用する０式（Ｉ）の配列を
有する化合物の酸付加塩は、常法に従って、例えば酸又
は適当な陰イオン交換側で処理することにより得られる
０例えば遊離カルボキシ基及び遊離アミノ基を有する、
式（Ｉ）の部分配列を有する化合物の内部塩は、例えば
、塩、例えば酸付加塩を、弱塩基によって、又は液体イ
オン交換体で処理することによって、等電点まで中和す
ることにより形成することができる。

塩は常法に従って遊離化合物に転換することができる。

金属塩又はアンモニウム塩は例えば適当な酸で処理する
ことにより遊離化合物に転換することができ、そして酸
付加塩は例えば適当な塩基性剤で処理することにより遊
離化合物に転換することができる。

この発明はまた、この発明のペプチドのアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ配列に関する。

この発明のＤＮＡ配列は、大配列の部分配列として次の
式（ＩＶ）、 ｄ　（ＧＣＥＴＧＹＡＡＹＡＣＸＧＣＥＡＣＸＴＧＹＧ
ＴＸＡＣＸＣＡＹＮＧＫＹＴＺＧＣＥ−ＡｌａＣｙｓＡ
ｓｎＴｈｒＡｌａＴｈｒＣｙｓＶａｌＴｈｒ）ｌｉｓＡ
ｒｇＬｅｕＡｌａ−ＧｎχＹＴＺＹＴＺＱＲＳＮＧＫ Ｇ］ｙＬｅｕＬｅｕＳｅｒＡｒｇ ＱＲＳＧＧＸＧＧχＡＴＧＧＴＸＡＡＭＱＲ５ＡＡＹＴ
ＴＬＧＴＸＣＣＸＡＣｒＡＡＹ−ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＭ
ｅｔＶａｌＬｙｓＳｅｒＡｓｎＰｈｅＶａｌＰｒｏＴｈ
ｒＡｓｎ−ＧＴＸＧＧＸＱＲ５ＡＡ？？ＧＣＥＴτＬ）
ＶａｌＧｌｙＳｅｒＬｙｓＡｌａＰｈｅ（ＩＶ） （配列中、５′−末端から始まるコード鎖のデオキシヌ
クレオチド配列、及びその下方に各トリブレンドがコー
ドするアミノ酸が示してあり；そして、 Ａはアデノシルであり、 Ｔはチミジルであり、 Ｇはグアノシルであり、 Ｃはシチジルであり、 ＥはＡ、Ｔ、Ｃ，又はＧであり、 ＮがＣである場合、ＫはＡＸＴ、Ｃ，又はＧであり；あ
るいは、 ＮがＡである場合、ＫはＡ１又はＧであり、ＬはＴ、又
はＣであり、 ＭはＡ１又はＧであり、 ＮはＡ１又はＣであり、 ＱはＴ１又はＡであり、 Ｒ及びＳに関しては、ＱがＴである場合、ＲはＣであり
、そしてＳはＡ、Ｔ、、Ｃ，又はＧであり；あるいは、 ＱがＡである場合、ＲはＧであり、そしてＳはＴ１又は
Ｃであり、 ＸはＡ、Ｔ、Ｃ，又はＧであり、 ＹはＴ１又はＣであり、そして、 ＹがＣである場合、ＺはＡ、ＴＳＣ，又はＧであり、あ
るいは、ＹがＴである場合、ＺはＡ１又はＧでありｉ カッコの前にある１ｄ＠は、カッコ内に示されたヌクレ
オチドが２−デオキシ−リボヌクレオシドであることを
意味する） で表わされる。

この発明のＤＮＡ配列は、コード鎖中に、好ましくは２
９０以下の、特に２３０以下の、特に２００以下の、そ
して好ましくは１５０以下の、例えば１３６個のデオキ
シヌクレオチドを含有する。

有利には、この発明のＤＮＡ配列の末端には、その製造
工程で容易に、ベクターへの挿入を可能にする基が設け
られ、例えば、開始コドンＡＴＣ及び終始コドン、例え
ばＴＡＧと共に制限エンドヌクレアーゼの認識配列が設
けられる。後でペプチド−アミドを製造することが意図
される場合には、ペプチド−アミドの末端アミド基のＮ
）１．ｉがそれから生ずるように後で酵素的に分解され
得るアミノ酸をコードするコドンを前記ＤＮＡ配列に設
けることができる。このように分解され得るアミノ酸は
例えばグリシンである。上記の方法に代えて、後でペプ
チド−アミドを製造するために、適当な酵素、例えば特
に適当なエキソペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチ
ダーゼＹの存在下でアンモニアにより置換され得るアミ
ノ酸、例えば特にチロシン、をコードするコドンをＤＮ
Ａ配列に設けることができる。

この発明に特に、Ｅ、コリにより好まれそしてこの発明
のペプチドのアミノ酸配列をコードするトリブレッドを
含有する上記のＤＮＡ配列に関する。、このようなトリ
ブレッドは特に次のものである。

アラニン（Ａｌａ）　　　　　　　　ＧＣＴアルギニン
（Ａｒｇ）　　　　　　　ＣＧ？グリシン（Ｇｌｙ）　
　　　　　　　　ＧＧＴシスティン（Ｃｙｓ）　　　　
　　　ＴＧＣバリン（Ｖａｌ）　　　　　　　　　　Ｇ
ＴＴロイシン（Ｌｅｕ）　　　　　　　　　ＣＴＧセリ
ン（Ｓｅｔ）　　　　　　　　　　ＴＣＴスレオニン（
Ｔｈｒ）　　　　　　　ＡＣＣフェニルアラニン（Ｐｈ
ｅ）　　　　ＴＴＣチロシン（Ｔｙｒ）　　　　　　　
　　ＴＡＣメチオニン（Ｍｅｔ）　　　　　　　　ＡＴ
Ｇアスパラギン酸（Ａｓｐ）　　　　　ＧＡＣグルタミ
ンｆＪ１（Ｇｌｕ）　　　　　　　ＧＡＡリジン（Ｌｙ
ｓ）　　　　　　　　　　ＡＡＡイソロイシン（Ｉ　Ｉ
ｅ）　　　　　　　ＡＴＣヒスチジン（Ｉｎｓ）　　　
　　　　　ＣＡＣプロリン（Ｐｒｏ）　　　　　　　　
　ＣＣＧグルタミン（Ｇｉｎ）　　　　　　　　ＣＡＧ
アスパラギン（Ａｓｎ）　　　　　　　ＡＡＣ好ましい
終止コドン（ＮＯＮ）ばコドンＴＡＧである。

コード鎖中に２００以下、例えば１３６のデオキシヌク
レオチドを有し、次のＤＮＡ配列（ＩＶａ）を含をする
ＤＮＡ配列が好ましい、この配列においては５′−末端
から始まるコード鎖のみが示されており、そして一層よ
く理解できるように各トリブレッドがコードするアミノ
酸も示されている。

ＡＩａＣｙｓＡｓｎ丁ｈｒＡｌａ丁ｈｒＣｙｓＶａｌＴ
ｈｒ旧ｓＡｒｇＬｅｕＡ！ａ−ｄ　（ＧＣＣＴＧＣＡＡ
ＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＡＴＣＧＧ
ＣＴにＧＣＡ−ＧＩｙＬｅｕＬｅｕＳｅｒＡｒｇ ＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＧＡ ＳｅｒＧｌｙＧＩｙＭｅｔＶａｌＬｙｓＳｅｒＡｓｎＰ
ｈｅＶａｌＰｒｏＴｈｒＡｓｎ−ＴＣＡＧＧＧＧＧＣＡ
ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＡＣ
ＣＡＡＴ−ＶａｌＧＩｙＳｅｒＬｙｓＡＩａＰｈｅＧＴ
ＧＧＧＴＴＣＣＡＡＡＧＣＣＴＴ丁）（Ｉ’ｌ／ａ） コード鎖中に２００以下、例えば１３６デオキシヌクレ
オチドを存し、次のＤＮＡ配列（ＩＶｂ）を含有するＤ
ＮＡ配列が好ましい、この配列においては５′−末端か
ら始まるコード鎖のみが示されており、そして一層よく
理解できるように各トリプレットがコードするアミノ酸
も示されている。

Ａ］ａＣｙｓＡｓｎＴｈｒＡ１ａＴｈｒＣｙｓＶａｌＴ
ｈｒＨｉｓＡｒｇＬｅｕＡＩａ−ｄ（ＧＣＴ丁ＧＣＡＡ
ＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＴＧＣＧＴＴＡＣＣＣＡＣＣ（、
ＴＣＴＧＧＣ丁−ＧｌｙＬｅｕＬｅｕＳｅｒＡｒｇ ＧＧＴＣＴＧＣ丁ＧＴＣＴＣＧＴ ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＭｅｔＶａｌＬｙｓＳｅｒＡｓｎＰ
ｈｅＶａｌＰｒｏＴｈｒＡｓｎ−ＴＣＴＧＧＴＧＧＴＩ
ＴＧＧＴＴＡＡＡＴＣＴＡＡＣＴＴＣＧＴＴＣＣＧＡＣ
ＣＡＡＣ−Ｖａ　ＩＧ　ｌ　ｙＳｅｒＬｙｓＡ　１ａＰ
ｈｅＧＴＴＧＧＴＴＣＴＡＡＡＧＣＴＴＴＣ）（ＩＶｂ
　） この発明のＤＮＡ配列はそれ自体既知の方法により製造
される。

ＤＮＡを合成する方法はＳ、Ａ、Ｎａｒａｎｇｓ丁ｅｔ
ｒａｈｅｄ−・ユｏｎ　、３４．３（Ｉ９８３）により
要約されている。既知の合成法は、良好な収量で、高純
度で、そして比較的短時間に、２０＠基までの長さを有
するポリデオキシヌクレオチドの製造を可能にする。適
切に保護されたデオキシヌクレオチドがホスホジエステ
ル法（Ｋ、Ｌ、＾ｇａｒｗａ１等、７．．８４，４８９
（Ｉ９７２）　）により、又は一層効果的なホスホジエ
ステル法（Ｃ，Ｂ−Ｒｅｅｓｅ＋丁ｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ　　、３４．３１４３（Ｉ９７２）又はホスフィトト
リエステル法〔Ｒルルｅｔｓｉｎｇｅｒ及びＷ、Ｂ、Ｌ
ｕｎ５ｆｏｒｄ、　Ｊ、Ａｗ、Ｃｈｅ−、Ｓｏｃ、　＋
９１Ｌ　３６５５（Ｉ９７６）　）により相互に連結さ
れる。オリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシヌ
クレオチドの合成の単純化が面相法により可能にされ、
この方法においてはデオキシヌクレオチド鎮が適当なポ
リマーに結合される。　）（，１ｔａｋｕｒａ等、Ｊ、
Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

と虹、匪、７０６（Ｉ９８１）は、固相合成において、
個々のデオキシヌクレオチドではな（、ホスホトリエス
テル法により連結されたトリデオキシヌクレオチドを使
用し、次にこれを短時間で良好な収率で縮合せしめて、
例えば３１塩基を有するポリデオキシヌクレオチドを形
成することができる。化学的に製造された短所片から酵
素的に確かな２本ｇＤＮＡを組立てることができる。　
ｌ、にＪｈｏｒａｎａ等、Ｊ、Ｂｉｏｉ−Ｃｈｅｍ、、
２５１　．５６５（Ｉ９７６）は、この目的のために両
ＤＮＡｆｌ［からのオーバーランプポリデオキシヌクレ
オチド配列を使用する。これらは塩基対合によって正し
い配置に一緒に保持され、そして次に酵素ＤＮＡＮカリ
ゼによって化学的に連結される。他の可能な方法は、２
本のＤＮＡ１ｉのそれぞれからの、短いオーバーランプ
セグメントを有する１本ずつのポリデオキシヌクレオチ
ドを４種類の必要なデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ートの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポ
リメラーゼ！、ポリメラーゼエのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ
、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＡＭＵ（鳥類骨髄芽球症ウ
ィルス）逆転写酵素と共にインキヤベートすることを含
んで成る。この方法においては、２つのポリデオキシヌ
クレオチド配列が塩基対合によって正しい配置に一緒に
保持され、そして酵素により必要なデオキシヌクレオチ
ドで補完されて完全な２本１１ＤＮＡが形成される（Ｓ
、Ａ、Ｎａｒａｎｇ等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
＋　１２１　＋　３５６９２２６　（Ｉ９８２）は、こ
の原理に基いて、ヒト白血球インターフェロンα８−遺
伝子の１３２塩基対の長さのセグメントをＤＮＡポリメ
ラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ断片）の存在下で、３９〜４
２塩基の長さを有する化学合成された４個の断片から組
み立てることができる方法を記載する。この方法におい
ては、リガーゼのみを用いる上記の方法に比べて、化学
合成の４０％の節約が達成される。

この明細書に記載するこの発明のＤＮＡ配列合成方法は
次の段階により特徴付けられる。

α）適切に保護されたデオキシヌクレオチドを固体単体
に結合せしめ； β）適切に保護されたジー、トリー、又はテトラ−デオ
キシヌクレオチドをホスホトリエステル法又はホスフィ
ト法により製造し；Ｔ）担体に結合したデオキシヌクレ
オチド又ははオリゴデオキシヌクレオチドを、ホスホト
リエステル法又はホスフィト法に従って、適切に保護さ
れたモノ−デオキシヌクレオチド、又はジー、トリーも
しくはテトラーデオキシヌクレオチド〔（β）に従って
製造されたもの〕と連結し； δ）担体に結合しておりそして所望の数の塩基を有する
（ｒ）に従って得られるオリゴデオキシヌクレオチドを
担体から切り離し、所望により精製し、保護基を除去し
、そして遊離の５′−末端ヒドロキシ基をリン酸化し；
ｔ＞　３個以下そして好ましくは８〜１５個のオーバー
ラツプ塩基対を有する、コード鎖及び相補鎖からの、δ
）に従って得られた２つのオリゴデオキシヌクレオチド
を、４種類のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの
存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて補完してＣＧＲＰ
遺伝子を含有する２末鎖ＤＮＡ断片を形成し、そしてリ
ガーゼを用いて連結して目的の構造遺伝子を形成する。

従って、式（ＩＶ）のＤＮＡ配列の合成は、例えば、固
相法に従って成長中のヌクレオチド配列上に段階的にト
リヌクレオチドブロックを縮合せしめることにより２種
類のオリゴデオキシヌクレオチド、すなわちおよそ同じ
数の塩基を有する負鎖及び正Ｍ（これらのオリゴデオキ
シヌクレオチド。

は部分領域において相互に水素結合を形成する能力を有
する）を形成し、個々のヌクレオチド鎖を固体担体から
切り離し、存在するすべての保ｉｌ！基を除去し、例え
ばゲル電気泳動によって精製を行い、そしてキナーゼ処
理及びバイブリド形成を行った後、好ましくはＤＮＡポ
リメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ断片）により完全なりＮ
Ａデュブレフクスを組み立てることにより実施すること
ができる。

段階（α）において、多数の固体担体材料、例えば種々
の架橋及び膨潤特性を有するポリスチレン、ポリアクリ
ルアミド、ポリアクリルアミドコポリマー、例えばシリ
カゲル、もしくはアロックスのごとき無機材料上に保持
されたポリアミド、又は官能化されたシラン、を使用す
ることができる。好ましい態様においては、使用される
固体担体材料は架橋されたポリスチレンであり、これは
、それ自体既知の方法により、１〜５個の極性２価官能
基、例えばイミノ、オキソ、チオ、オキソカルボニル又
はアミドカルボニルにより中断された２〜１２個の炭素
原子を有するアルキレン基のごとき“スペーサー”によ
り、適切に保護されたデオキシヌクレオシドの５　’　
−ＯＨ基に連結される。

５′−位において、及び場合によっては塩基成分におい
て保護されている式（Ｖ）のヌクレオシドと無水コハク
酸との反応が特に好ましい（スキーム１）、この式にお
いて、Ｒ１は酸によって除去され得る保護基、例えばト
リアリールメチル保護基、例えば４−メトキシトリチル
基もしくは４゜４′−ジメトキシトリチル基、又はトリ
ー低級アルキルシリル保護基、例えばｔａｒｔ−ブチル
ジメチルシリル基であり、そしてＢａはチミル、シトシ
ル、アデニル及びグアニルから成る群から選択される場
合によっては保護されている塩基である。

スキーム１においては、場合によっては塩基、例えばピ
リジン、トリエチルアミン又はジメチルアミノピリジン
の存在下で前記の反応を行い、次に、カルボン酸基を活
性化する試薬、好ましくはＮ−ヒドロキシサクシンイミ
ド又はｐ−ニトロフェノール、及び脱水剤、例えばカル
ボジイミド、例えばジシクロへキシルカルボジイミドの
助けにより、０．５〜２％のジビニルベンゼンにより架
橋されたアミノメチル化ポリスチレンと反応せしめる。

スキームｌ及びその後において、デオキシリボース残基
はしばしば習慣的に縮めた形で示される。

反応は、不活性非プロトン性溶剤、例えばピリジン、テ
トラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸エチル、クロロホ
ルム、塩化メチレン、ジメチルホルムアミドもしくはジ
エチルアセタミド、又はこれらの混合物中で、室温にて
又はわずかに上昇もしくは低下した温度にて、例えば約
−１０℃〜約５０℃の温度範囲内で、好ましくは室温に
て行われる。

脱水剤の存在下での反応は一層低い温度、例えば約０℃
にて行うことができる。

以下東白 スキーム１ （Ｖｌ） 段階（β）におけるジー、トリー、又はテトラ−ヌクレ
オチドのこの発明に従う製造（スキーム２）においては
、５′−位において、そして場合によっては塩基成分に
おいて保護されておりＲ１及びＢａが前記の意味を有す
る式（Ｖ）のヌクレオチドを、場合によっては脱水剤の
存在下又は塩基の存在下で、式（■）の活性化されたリ
ン酸エステルと反応せしめる０式中ＸＩ及びＸｔは相互
に独立にヒドロキシもしくはそれに由来する塩、ハロゲ
ン、イミダゾリル、１．２．４−トリアゾール−１−イ
ル、テトラゾリル、又は１−ベンズトリアアゾリルオキ
シであり、Ｘ８はさらに２−シアノエトキシ、２−トリ
ハロエトキシ、２−了り−ルスルホニルエトキシ、２−
低級アルキルチオエチル、２−アリールチオエトキシ、
又は２−（４−ニトロフェニル）−エトキシであり、そ
してＲ３は塩基により又は′ｔｌｔ核性化合物により、
例えば水酸化アンモニウム、チオフェノラートもしくは
アリールアルドキシメートにより除去され得る保護基、
例えば場合によってはハロゲン、ニトロ及び／又は低級
アルキルにより置換されているフェニル、メチル、又は
場合によってはニトロにより置換されているベンジルで
あり、あるいは金属イオンにより除去され得る保護基例
えば８−キノリル、又は５−クロロ−８−キノリルであ
る。

次に、Ｒ１，ＸＩ及びｘｌＬが前記の意味を有する得ら
れた式（■）の化合物をまず場合によっては２−置換エ
タノール（これは、基Ｘ２を基ＯＲ’に転換する。ここ
でＲ３はシアノエチル、２−トリハロエチル、２−アリ
ールスルホニルエチル、２−低級アルキルチオエチル、
２−アリールチオエチル又は２−（４−ニトロフェニル
）−エチルである）と反応せしめ、そして次に保護基Ｒ
１を除去し、そして式（ＩＸ）の生じた化合物を、場合
によっては脱水剤の存在下又は塩基の存在下で、式（■
）の他の化合物と反応せしめてジヌクレオチドＸを形成
する（スキーム２）、場合によっては、式（■）の化合
物を、塩基及び水との反応によりＸｔがヒドロキシ又は
それに由来する塩である式（■）の異る化合物に転換す
る。

反応は上記の不活性溶剤のいずれかの中で、室温して、
又はわずかに上昇もしくは低下した温度において、例え
ば室温において行う。

保護基Ｒ１の除去は、例えば酸、例えば鉱酸、例えば塩
酸もしくは硫酸、カルボン酸、例えば酢酸、トリクロロ
酢酸もしくは蟻酸、スルホン酸、例えばメタンスルホン
酸、もしくはｐ−トルエンスルホン酸、又は特にルイス
酸、例えば塩化亜鉛、臭化亜鉛、塩化アルミニウム、ジ
アルキルアルミニウムハライド、例えばジプチル−もし
くはジエチル−アルミニウムクロリド、又は三弗化ホウ
素により、１０℃〜５０℃にて、特に室温にて行う、ジ
アルキルアルミニウムハライドを使用する場合、除去は
親脂性溶剤、特にトルエン中で行う、そして他の上記の
ルイス酸を用いる場合、ハロゲン化炭化水素、例えば塩
化メチレンと低級アルカノール、例えばエタノール又は
イソプロパツールとから成る溶剤混合物中で行う。

以下余白 スキーム２ （■）（■）　　　　　（■）（■） 式（Ｘ）のジヌクレオチドはまた、Ｒ１及びＢａが前記
の意味を有する式（Ｖ）のヌクレオチドを式（■Ａ）の
ホスフィトと反応せしめることによっても製造すること
ができる。ここでＸＩ　はハロゲン、特に塩素であり、
Ｘ３はハロゲン、特に塩素、又はジー低級アルキルアミ
ノ、特にジメチルアミノもしくはジイソプロピルアミノ
、又はモルホリノ、ピペリジノ又はピロリジノであり、
そしてＲ８は式（■）についての前記の意味を有し、特
にメチルである。前記の反応は場合によっては適当な塩
基の存在下で行われる（スキーム３）。

式（■Ａ）の生ずる化合物を２−置換エタノール（これ
は基ｘ１を基ＯＲ”に転換する。ここでＲ３は上記の意
味を有する）と反応せしめ、そして次に酸化剤、例えば
塩基の存在下でのヨウ素で酸化してホスフェートを形成
し、そして保護基Ｒ１を除去して式ＣＩりの化合物を得
るか、あるいは式（ＩＸ）の化合物と反応せしめ、次に
酸化剤、例えば塩基の存在下でのヨウ素で酸化して（Ｘ
）の化合物を形成する。

以下東向 スキーム３ トリヌクレオチドの製造のために、Ｒ’、Ｒ”及びＲ３
が前記の意味を有しモしてＲａ’及びＢａ”が相互に独
立にチミル、シトシル、アデニル又はグアニルである式
（Ｘ）のジヌクレオチド中の保ｇｌ基Ｒ１を除去し、そ
して生ずる化合物を、場合によっては脱水剤の存在下又
は塩基の存在下で式（■）の化合物と反応せしめるか、
あるいは式（■Ａ）の化合物と反応せしめそして次に酸
化して式（ＸＩ）の化合物を得る（スキ゛−ム４）、保
護基Ｒ１の除去、及び式（ＸＩ）のトリヌクレオチドを
形成するための縮合は、式（Ｘ）のジヌクレオチドの製
造について記載したのと同様にして行われる。

スキーム４ テトラヌクレオチドの製造のため、式（Ｘりのトリヌク
レオチドを、式（Ｘ）のジヌクレオチドについて前記し
たようにして反応せしめる。

好ましい配置においては、保護５Ｒ１として４−メトキ
シトリチル基を、保護基Ｒｔとして塩素で置換されたフ
ェニル基を、そして保護基Ｒ３として２−シアノエチル
基を使用する０式（■）の化合物中の５ＸＩ及びｘ８と
して１−ベンズトリアゾリルオキシが好ましい。

式（ＸＩ）のトリヌクレオチドは好ましくは、式（Ｘ）
のジヌクレオチドから保護基Ｒ１を除去し、そして生じ
る化合物を、Ｘ３がヒドロキシ又はそれに由来する塩で
ある式（■）の化合物と、脱水剤の存在下で反応せしめ
る（スキーム４）ことにより製造される。この発明の脱
水剤は例えば、２．４．６−）リメチルベンゼンスルホ
ニル又はトリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド
、イミダゾール、テトラゾール、又は１．２．４−トリ
アゾール（場合によってはニトロにより置換されている
）である、１−　（２，４，６−ドリノチルベンゼンス
ルホニル）−３−二トロー１，２゜４−トリアゾール（
Ｘｌｌ）が脱水剤として好ましい。

使用されるヌクレオチドは好ましくは遊離アミノ基が塩
基成分において保護されているものである。好ましい保
護基は、アテエンのためにはベンゾイルであり、シトシ
ンのためにはベンゾイル又は４−メトキシベンゾイルで
あり、そしてグアニンのためにはイソブチリル又はジフ
ェニルアセチルである。チミンは、好ましくは保！なし
で使用される。

段Ｒ（ｙ）に従うオリゴヌクレオチドの製造において、
溶剤及び試薬のために、半自動的又は全自動的マイクロ
プロセサー副扉供給系を有するそれ自体既知の装置が使
用される０段階（α）に従って製造された式（Ｖｒ）の
化合物中の保護基Ｒ１を上記のようにして除去し、そし
て次に、生じる化合物を、場合によっては脱水剤の存在
下又は塩基の存在下で式（■）の化合物と反応せしめる
か、あるいは式（■Ａ）と反応せしめるか、あるいは式
（Ｘ）又は（ＸＩ）の化合物と反応せしめる。この場合
、保護基Ｒ３は塩基によりあらかじめ除去しておく（Ｒ
３としての基２−シアノエチルは例えば、トリー低級ア
ルキルアミン、例えばトリエチルアミンにより、前記の
不活性溶剤又は溶剤混合物のいずれかの中で、ｌＯ℃〜
４０℃、特に室温にて除去される）０式（Ｘ）のジヌク
レオチド又は式（ＸＩ）のトリヌクレオチドの代りに、
段階（β）に従って製造されたテトラヌクレオチドを使
用することが可能である０式（■Ａ）のホスフィトを使
用する場合、次に、酸化剤、例えば塩基の存在下でのヨ
ウ素により処理する　Ｒｌ　、　Ｒを及び、Ｂａが前記
の意味を有し、そしてｎが１〜４の整数である、このよ
うにして製造された式（Ｘｌｌｒ）の化合物を、式（Ｘ
Ｉ）の化合物（ｎは整数である）の製造のために必要な
だけ、式（Ｖｌ）の化合物について記載した反応段階（
Ｒ１の除去：　（■）、（■Ａ）、（ｘ）、（ＸＩ）又
は対応するテトラヌクレオチドとの反応；場合によって
は後酸化処理〕にかける。

以下余白 この発明の好ましい態様においては、保ｉ５Ｒ’として
４−メトキシトリチルを使用し、そしてこの基の除去は
ＣＨ−又はＮＨ−酸化合物、特に１゜２．４−）リアゾ
ール又はテトラゾールの存在下での臭化亜鉛により行わ
れる。４−メトキシトリチル保ｒ！１基を除去するため
の例えば１．２．４−トリアゾールの使用は新規であり
、そして驚くべきことに急速で且つ副反応を伴わない高
収率の除去をもたらす、非プロトン性溶剤とアルコール
、例えば塩化メチレンと２−プロパツールとから成る溶
剤混合物中で２０：　１−１００：　１のモル比の臭化
亜鉛及び１．２．４−１−リアゾールを使用するのが好
ましい。

好ましいＬｉ様においては、保護基Ｒ１が除去されてい
る式（Ｖｌ）又は式（ＸＩ［［）の化合物と保護基Ｒ″
が除去されている式（Ｘりのトリヌクレオチドとを、脱
水剤、例えば２．４．６−）リメチルベンゼンスルホニ
ルクロリドもしくはトリイソプロピルベンゼンスルホニ
ルクロリド、イミダゾール、テトラゾール又は場合によ
ってはニトロにより置換されている１、２．４−１−リ
アゾールの存在下で反応せしめる。１−　（２，４，６
−トリメチルベンゼンスルホニル）−３−二）　”−１
＋２．４−トリアゾール（ＸＩＩ）が特に好ましい。

保護基Ｒ１として４−モノメトキシトリチル基を使用し
、Ｒ１を除去するために１．１４−トリアゾールの存在
下で臭化亜鉛を使用し、そして保護基が除去されている
式（Ｘ　ｍ）のオリゴヌクレオチド−ポリスチレン樹脂
と保護基が除去されている式（ＸＩ）のトリヌクレオチ
ドとの反応のための脱水剤として式（ＸＩ［）のトリア
ゾールを使用することを含んで成る特に好ましい組合わ
せにより、短時間で、高収率で、そして高純度で、長い
ヌクレオチドを製造す、ることが可能となる。

担体からオリゴヌクレオチドを切り離すため、及び段階
（δ）に従って保護基を除去するために、それ自体既知
の方法が使用される。担体からの切り離し、及び好まし
い２−クロロフェニル保護基の除去のための特に好まし
い試薬はアリールアルドキシメート、例えば１．１．３
．３−テトラメチルグアニジニウム２−ニトロベンザル
ドキシメートである０反応は、幾らかの水が添加された
上記の不活性溶剤のいずれか、例えば９５％濃度のピリ
ジン中で、室温にて行われる０次に、室温又は上昇した
温度、例えば２０℃〜７０℃、特に５０℃において水性
アンモニアとの反応を行う。

オリゴデオキシヌクレオチドの連結のために、段階（δ
）に従って５′−末端ヒドロキシ基にリン酸基を導入す
る。リン酸基の導入（リン酸化）は、それ自体既知の方
法で、Ａ　Ｔ　Ｐの存在下でＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて行う。

コードＤＮＡ［及び相補ＤＮＡｆｆ１から成る、上記の
ようにして製造されたオリゴヌクレオチドは３個以上、
そして好ましくは８〜１５個のオーバラップする塩基対
から成るオーバーランプ配列を含有する。このようなオ
リゴヌクレオチド対は、混合中に水素結合により一緒に
保持される。突出する単鎖末端は、段階（６）に従って
、４種類のデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄ
ＡＴＰ。

ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、及びＴＴＰ）の存在下でＤＮＡ
ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポ
リメラーゼＩの）［１ｅｎｏｗ断片もしくはＴオＤＮＡ
ポリメラーゼ、又はＡＭＶ逆転写酵素を用いて行う相補
鎖の合成のためのマトリクス（鋳型）として機能する。

補完の間に形成されたデユプレツクスＤＮＡは平滑末端
を有する。

段階（ε）従って得られるＤＮＡ配列はその末端に制限
エンドヌクレアーゼにより認識されそして開裂され得る
ヌクレオチド配列を有する。ヌクレオチド配列、そして
それ故に制限エンドヌクレアーゼの選択に依存して、開
裂の間に完全塩基対合束＠（平滑末端）、又はオーバー
ラツプＤＮＡ護を有する末端（接着末端）が形成される
。

この発明はまた医薬製剤に関し、この医薬製剤は活性成
分として育効量の、特に前記の疾患の治療のために有効
な量のこの発明のペプチド−アミドのいずれか又はその
塩を、存意量の、すなわち５０重量％以上の、好ましく
は９５重量％以上の、特に９９重量％以上の医薬担体と
共に含んで成り、このような製剤は、特に、温血動物、
例えば特にヒトに鼻内的又は非経腸的に、例えば筋肉内
又は静脈内に投与するためのものである。

活性成分の投与量は温血動物の種、体重、年齢、固体の
状態、治療されるべき疾患、及び投与の態様に依有する
。

非経腸投与のためのこの新規な医薬製剤は、すぐに使用
するための形態において、約０．０００１ｆＥ量％〜約
１重量％、好ましくは約ｏ、ｏｏｏｓ重量％〜約０、１
３１量％の活性成分を含有する。この発明の医薬製剤は
例えば単位投与形、例えばアンプルの形であることがで
きる。

好ましくは、活性成分の溶液、そしてさらに懸濁液、特
に等張水性溶液又は懸濁液が使用され、そしてこれらは
、例えば、それ自体として又は担体、例えばマンニトー
ルと共に活性成分を含有する凍結乾燥製剤の場合には、
使用する前に調製することができる。特に鼻内投与のた
めには、油中懸濁液が特に適当である。医薬製剤は無菌
化することができ、モして／又は添加剤、例えば防腐剤
、安定剤、湿潤剤及び／又は乳化剤、溶解剤、浸透圧調
整塩及び／又は緩衝剤を含有することができ、そしてそ
れ自体既知の方法により、例えば常用の溶解及び凍結乾
燥技法により製造される。前記の溶液又は懸濁液は増粘
剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニル
ピロ１１１’ン、又は好ましくはゼラチンを含有するこ
とができる。

油中懸濁液は、油状成分として注射用として一般的な植
物油、合成油又は半合底油を含有する。

酸成分として８〜２２個、特に１２〜２０個の炭素原子
を有する長鎖脂肪酸、例えばラウリン酸、トリデシル酸
、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マル
ガリン酸、ステアリン酸、アラキシン酸、ベヘン酸又は
対応する不飽和酸、例えばオレイン酸、エライジン酸、
エルシン酸、ブランジン酸又はリルン酸を含有する液体
脂肪酸エステルを特に挙げることができる。アルコール
成分は最高６個の炭素原子を有し、そして−価アルコー
ル又は多価アルコール、例えば−価アルコール、二価ア
ルコール又は三価アルコール、例えばメタノール、エタ
ノール、プロパツール、ブタノールもしくはペンタノー
ル又はこれらの異性体、しかし特にグリコール又はグリ
セリンである。従って例えば、脂肪酸エステルとして、
オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミ
チン酸イソプロピル、’Ｌａｂｒａｆｉｌ　Ｍ　２７３
５　”　　（）リオレイン酸ポリオキシエチレングリセ
リン、メスルス・ガテフォセ、パリ）　、’Ｍｉｇｌｙ
ｏｌ　８１２　”　　（Ｃｍ　〜Ｃ１！の鎖長を有する
飽和脂肪酸のトリグリセライド、メスルス・チミッシエ
・ベルチ、リアテン／ルール、独）、シかし特に植物油
、例えば綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ヒマシ油
、ゴマ油、大豆油、及び特にピーナツ油を挙げることが
できる。

注射剤の製造、アンプル又はバイアルへのその導入、及
び容器の密封は常法に従って無菌条件下で行われる。

次に、例によりこの発明を説明する。温度は℃で示す。

Ｒｔ値は、特にことわらない限り、又は文脈から明らか
でない限り、次の溶剤系■ニ ジクロロメタン／メタノール（９：　１）において、１
層シリカゲルプレート上で確認されたものである。

従って、例えばＲｔ　　（ｒ）は溶剤系Ｔにおいてｔ！
認されたＲ、値を示す。

一咀一豆− Ａｃ■　ファセタミドメチル Ｂｏｃ　　＝　ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルＢＳＡ　
　−ウシ血清アルブミン ＢＺＬ　　票ベンジル ２ＣＺ　　−２−クロロベンジルオキシカルボニルｄ　
　−デオキシ ０肝　璽ジメチルホルムアミド Ｄ丁Ｔ　諺１，４−ジチオスレイトール（Ｉ，４−ジメ
ルカプト−２，３−ブタンジオール）ＥＤ？Ａ　　−エ
チレンジアミン四酢酸ＥｔＢｒ　　−エチジウムプロミ
ド ＦＡＢ　　−急速原子衝撃 Ｆ＋ｗｏｃ　　＝９−フルオレニルメトキシカルボニル
）ＩＰＬＣ　　−高圧液体クロマトグラフィーｉＢｕ　
　−イソブチリル Ｍ　　−モル濃度 ？ＩＢ）ＩＡ　　−モノ−（４−メチル）−ベンズヒド
リルアミン ？ｆｅ　　　Ｗメチル ｍｍｔｘ（モノ−４−メトキシ）−トリチルＭＯＢ　　
−４−メトキシベンジル ＭＳ　　　鱈マススペクトル 以下余白 Ｍｔｒ　　−４−メトキシ−２，３，６−ドリメチルベ
ンゼンスルホニル Ｎ　　−規定濃度 ＯＤ　　　−光学濃度 ＳＯＳ　　−ドデシル硫酸ナトリウム ｔＢＵ　　＝ｔｅｒｔ−ブチル ＴＮＥ　　＝１００＋ｗＭ　ＮａＣ１，５０＋ｍＭ　ｔ
ｒｉｓ、Ｈｃｌ（ｐＨ７，５）及び５ｍＭ　ＨＤＴＡを
含有する溶液 ＴＯ５−４−）ルエンスルホニル ｔｒｉｓ＝）リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタ
ン ｔｒｉｓ、Ｈｃｌ　＝　ｔｒｉｓの一塩酸塩ν又はｖｏ
ｌ、−容積（体積） χＡＮＴ　　−９−キサンセニル ■上 ’ｌ、Ｑｍｌの５０％酢酸中１５＋＋ｇ　（３，８、ｃ
ｒ膳ｏ１）のＡｌａ−Ｃｙｓ　（Ａｃｍ）−Ａｓｎ−τ
ｈｒ−Ａｌａ−丁ｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｓ＋）−Ｖａｌ−
Ｔｈｒ−Ｈｉｓ　−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉ
　ｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｇｌ
　ｙ−Ｇ　ｌｙ−Ｍｅ　ｔ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−３ｅｒ
−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ
−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−
ＮＨｚの溶液を、室温にて５分間以内に、攪拌しながら
、氷酢酸中０．１Ｍヨウ素０．２６ｍ！！、５０％の酢
酸０．３３ｍｊ！及び１６μｌの０．１　Ｎ　ＨＣＩの
混合物に満願する。室温にて１０分間置いた後、混合物
を４０μｌの１Ｍアスコルビン酸水溶液の添加によって
脱色し、そして５０％酢酸中セファデックス（商標）　
Ｇ−２５に通して濾過する。溶出液を真空中で約１ｍｊ
！に濃縮し、そして後記述のようにして）ＩＰＬＣ精製
にかける。

次の式（ＩＩＩ）のＣＧＲＰ　Ｉｒが得られる。

Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌａｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｇ　ｌｙ−Ｍｅ　ｔ−
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｌｙ
ｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＮＨＩＣＩｌｌ） 出発物質は次のようにして得られる。

没１ムよ ３０．０　ｇのクロロメチルポリスチレン（２０，１ｍ
ｓ＋ｏｌのＣＩ）を、６．１　ｇ　（４０，２ｍｍｏｌ
）のｐ−ヒドロキシメチル安息香酸と共に、１５０ｍｆ
ｆ１の脱気したジメチルホルムアミド中に導入し、そし
て３分間にわたり６．０　ｍｌｌ　（４０，２ａｕｗｏ
ｌ）の１．８−ジアザビシクロ（５、４、０）−ウンデ
ク−７−エン（Ｉ、５。

５）を加える０反応混合物を５０℃にて２０時間攪拌す
る。得られる樹脂を吸引濾過し、１５０ｍ１ずつのジメ
チルホルムアミド、ジメチルホルムアミド／水（９：　
１）　、メタノール、塩化メチレン及びメタノールで、
各場合に３回ずつ洗浄する。

この樹脂を重量が一定になるまで高真空下で乾燥し、こ
うしてヒドロキシベンジル−ｐ−カルボニルオキシメチ
ルポリスチレン合成樹脂を得る。

段■１主 １、１　ｇ　（４ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｐｈｅ及び段階
１．１で得られた樹脂３．０ｇ（約２ｍｍｏｌ）を、室
温にてゆるやかに撹拌しながら約５分間、２０ｍ１の塩
化メチレン及び１．５ｍｌ！のジメチルホルムアミド中
に懸濁する。この混合物をＯ℃〜５℃に冷却し、そして
１．８ｍｊの塩化メチレン中８６５＊　（４，２ｍ５ｏ
ｌ）のジシクロへキシルカルボジイミドを３回に分けて
５分間以内に加える。さらに５分間の後、２４ｔｒｙ　
（０，２ｍａ＋ｏｌ）のジメチルアミノピリジン、及び
１０分間後、１ｍｌの塩化メチレン中２２０μｌのＮ−
メチルモルホリン（２ｍｍｏｌ）を加える。この混合物
を０℃に１時間保持し、そして次に室温にて２０時間保
持する。この樹脂を濾取し、約５０ｍ！ずつの塩化メチ
レン、ジメチルホルムアミド、メタノール、塩化メチレ
ン及びメタノールにより、各場合に５回ずつ洗浄する。

このものは、高真空下で乾燥した後３．３４　ｇの重量
を有する。未反応のヒドロキシ基をブロックするため、
樹脂を２Ｑｍｌの塩化メチレンに懸濁し、１ｍｊＦのピ
リジンを加え、そして水浴中で冷却した後、これに１ｍ
ｌの塩化ベンゾイルを加える。０℃にて１５分間及び室
温にて１時間置いた後、樹脂を吸引濾取し、そして５０
ｍｊｊずつの塩化メチレン、ジメチルホルムアミド、メ
タノール、塩化メチレン及びメタノールにより、各場合
に２回ずつ、次々と洗浄する。

この樹脂を、重量が一定なるまで高真空下で乾燥する。

Ｎ含量からアミノ酸負荷を０．３５ｍ−０ｌ／ｇと算定
する。

塁１上ユ １．０ｇのＢｏｃ−Ｐｈｅ樹脂（０，３５−ｍｏｌ）を
、半自動ペプチド合成機中で、次の操作（すべての洗浄
操イ乍は、各場合に約２９ｍ１により行う）に力１番す
て、Ｂｏｃ基を除去し、第２アミノ酸Ｂｏｃ−Ａｌａに
カップリングせしめ、そしてそのＢｏｃｉを除去する。

ＩＸｌ、０分間　イソプロパツール、 ３ＸＯ，Ｆ１間　エチレンジクロリド、３　ｘ　５．０
分間、ｌＸ１５分間 Ｂｏｃ基を除去するためトリフルオ ロ酢酸／エチレンクロリド、 ３　ｘ　０．５分間　エチレンジクロリド、１ｘ２，０
分間　イソプロパツール、 ２　ｘ　０．５分間　エチレンジクロリド、２　ｘ　０
１５分間　脱気したジメチルアセタミド、３　Ｘ　２．
０分間　ジエチルアセタミド中２％ジイソプロピルエチ
ルアミン、 ２ｘＯ，ｓ分間　エチレンジクロリド、３　Ｘ　０．５
分間　蒸留したジメチルアセタミド、１Ｘ１２０分間　
カンブリング：１．５ｍ５ｏｌのＢｏｃ−Ａｌａ。

２２１ｗ（Ｉ，５ｍ＋＊ｏｌ）のヒドロキシヘンシトリ
アゾール、３２０■（Ｉ，６ ＋ａｍ＋ｏｌ）のジシクロへキシルカルボジイミド（０
，３２ｍｔのエチレンジクロリド及び３．５ｅｉｌのジ
メチルアセタミド中）；２０分間室温にて、 １００分間４５°にて、 ＩＸ２．０分間　１０■ｌの無水酢酸／ピリジン／ジメ
チルアセタミド（Ｉ０：　１０　：　８０、Ｖ／Ｖ）（
未反応アミノ基をブロッ クするため）、 Ｉ　Ｘ　Ｏ，５分間　脱気したジメチルアセタミド、Ｉ
Ｘｌ、０分間　イソプロパツール、 ２　Ｘ　Ｏ，５分間　エチレンジクロリド、２　Ｘ　０
．５分間　脱気したジメチルアセタミド、ＩＸｌ、０分
間　インプロパツール、 ３　ｘ　０．５分間　エチレンジクロリド、３　Ｘ　ｌ
　０分間、ｌＸ１５分間 トリフルオロ酢酸／エチレンクロ リド（Ｂｏｃ基を除去するため）、 ３×０．５分間　エチレンジクロリド、Ｉ　Ｘ　２．０
分間　イソプロパツール、２×０．５分間　エチレンジ
クロリド、２　Ｘ　０．５分間　脱気したジメチルアセ
タミド、３　Ｘ　２．０分間　ジメチルアセタミド中２
％ジイソプロピルエチルアミン、 ２　ｘ　０．５分間　エチレンジクロリド、３　ｘ　０
．５分間　蒸留したジメチルアセタミド、ユ１上工 前記のペプチド合成機中で、段階１．３に従って得られ
た生成物に次のアミノ酸を次々と縮合せしめる。

Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、　Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ
Ｂｕ）、　Ｆａ＋ｏｃ−Ｇｌｙ、　Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、
　　Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、　　Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ
）、　　Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ＋　　Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、　
　Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、　　Ｆｓｏｃ−Ａｓｎ、　　Ｆ＋
ｗｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、　　Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂ
ｏｃ）、　Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、　Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、　
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、　Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙｌ　Ｆｍｏｃ−
３ｅｒ（ｔＢｕ）、　　Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）＋
　　Ｆｍｏｃ−Ｓｅｔ（ｔＢｕ）、　Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ
＋　Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、　Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、　Ｆｓ＋
ｏｃ−Ａ］ａ＋Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、　Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ
（Ｍｔｒ）、　Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｆｍｏｃ）、　Ｆａ
＋ｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、　　Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、　
　Ｆ＋ｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、　　Ｆｓｏｃ−Ｔｈｒ
（ｔＢｕ）、　　Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、　　Ｆｍｏｃ−丁
ｈｒ（ｔＢｕ）、　　Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ＋　　Ｆｍｏｃ
−Ｃｙｓ　（Ａｃｍ）及びＢｏｃ−Ａ１ａ＊このため、
各場合に次の操作サイクルを行う。

各場合に先行するアミノ酸からＦｍｏｃ保護基が除去さ
れる。

ＩＸｌ、０分間　インプロパツール、 ２　’Ｘ　Ｏ，５分間　エチレンジクロリド、ＩＸｏ、
５分間　脱気したジメチルアセタミド、ＩＸｌ、０分間
　イソプロパツール、 ３　Ｘ　０．５分間　脱気したジメチルアセタミド、４
　Ｘ　２．０分間　ジメチルアセタミド中２０　（Ｖｏ
ｌ）％ピペリジン、 ２　Ｘ　０．５分間　脱気したジメチルアセタミド、２
　Ｘ　１．０分間　水／過酸化物不含育ジオキサン（Ｉ
：２　　ｖ／ｖ）、 ２　Ｘ　０．５分間　脱気したジメチルアセタミド、２
　Ｘ　０．５分間　エチレンジクロリド、３　Ｘ　０．
５分間　蒸留したジメチルアセタミド、以下余白 ａｔｘ　１２０分間　カップリング：　１．５　ｎｍｏ
ｌのＦｍｏｃ　−アミノ酸、又は末端においてＢｏｃ− Ａｌａ　、　　２２１ｗ　（Ｉ，５ｍｍｏｌ）のヒドロ
キシベンゾトリアゾール、３２０ ■（Ｉ，６１ｌａｏｌ）のジシクロへキシルカルボジイ
ミド（０，３２ｍ１のエ チレンジクロリド及び３．５ｓ＋１のジメチルアセタミ
ド中）：２０分間 室温にて、１００分間４５℃にて、 ｌＸ２．０分間　１０■Ｉの無水酢酸／ピリジン／ジメ
チルアセタミド（Ｉ０：　１０　：　８０、Ｖ　／　Ｖ
　）、 ＩＸｏ、５分間　脱気したジメチルアセタミド、Ｉ　Ｘ
　１．０分間　インプロパツール、３　Ｘ　０．５分間
　エチレンジクロリド、及び２　Ｘ　０．５分間　脱気
したジメチルアセタミド。

力゛フプリング反応の完了はニンヒドリンによる未反応
アミノ基の検出（Ｋａｉｓｅｒテスト）により定性的に
試験する。この試験が陽性であれば樹脂をエチレンクロ
リド洗浄し、そして３．８　ｍ　ｌのエチレンジクロリ
ド／トリフルオロエタノール（７５：２５）中１．５　
ｍ＋＋＋ｏｌのアミノ酸誘導体及び７．５１１１１０１
のダシ。クロヘキシルカルボジイミドを用いる次のカン
プリング反応を室温にて１２０分間行う、最後のカンプ
リングの後、樹脂をジメチルアセタミド、エチレンジク
ロリド及びイソプロパツールで十分に洗浄し、そして高
真空下で乾燥する。

段Ｕ ｔａＵ及びＢｏｃ保ｒｔＬ基を除去するため、段階１．
４に従って得られた生成物を室温にて次のようにして処
理する（各場合に３０ｍｊり。

２×２分間　塩化メチレン、 ＩＸ５分間　トリフルオロ酢酸／塩化メチレン／１．２
−エタンジチオール／ｍ−ク レゾール（５０：４３：　２　：　５）、ｌＸ３０分間
　トリフルオロ酢酸／塩化メチレン／１．２−エタンジ
チオール／ｍ−ク レゾール（５０：４３：　２　：　５）、ｌＸ６０分間
　トリフルオロ酢酸／塩化メチレン／１．２−エタンジ
チオール／ｍ−ク レゾール（５０：４３：２　：　５）、２×２分間　塩
化メチレン及び ２×２分間　メタノール。

我Ｊ１−影 樹脂からペプチドを切り離すため及び末端カルボキシ基
をアミド化するため、段階１．５に従って得られた生成
物を、高真空下で乾燥した後、３０ｍ１のジメチルホル
ムアミドに懸濁する。−７０℃において約１０ｍｊのア
ンモニアを凝縮させる。

−過剰のアンモニアを０℃にて蒸発除去し、そして混合
物を圧力容器中で室温にて２０時間撹拌する。

樹脂を濾去し、水で２回（２０ｒｒｊ！ずつ）、メタノ
ール／水（Ｉ：　１）で３回、及びトリフルオロエタノ
ール／水（Ｉ：　１）で１０回洗浄し、そして濾液を蒸
発濃縮する。残渣を３０ｍｌ１の酢酸／水（９：１）に
溶解し、そして凍結乾燥する。

且１上ユ Ｍｔｒ基を除去するため、段階１．６に従って得られた
凍結乾燥物を、２０ｍｊ！のトリフルオロ酢酸／１．２
−エタンジチオール（９９：１）中に溶解する＊ｔ、５
ｍｌのｍ−クレゾールを加え、そして混合物を５０℃に
て２時間保持する。粗ジーＡｃｇｇペプチドを１００ｍ
ｊのジエチルエーテルの添加によって沈澱せしめ、濾取
し、そしてジエチルエーテルで洗浄する。生成物を２５
ｍ１の酢酸／水（Ｉ：１）に溶解し、濁りを濾去し、そ
して濾液をＨＰＬＣ中での分析的分離のために使用する
。

ＨＰＬＣは次の条件下で行う。

カラム：ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｃｉｌ）　　１０
１１　ｍＣ＋ｗ（マセレイ・ナーゲル、デュレン、西独
）、２００Ｘ　４．８　ｔｍ、Ｂ液Ｏ％〜９０％、６０
分間の直線グラジェント、Ａ：水中０．１％トリフルオ
ロ酢酸；Ｂニアセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢
酸。

主ピークに対応する物質を集め、そしてそれと目的生成
物との同一性をＦＡＢ−ＭＳにより確認する（マスピー
ク：　３９３７．６）　。

少量調製分離＝１００■の粗生成物を２５０Ｘ２１ｎカ
ラムで分離する。集めた両分を真空蒸発せしめる。残渣
を２ｍｌの水に溶解し、濾過し、そして凍結乾燥する。

五１ 次の式（Ｘ　ＩＶ）、 ｄ　（ＧＡＡＴＴＣＡ丁ＧＧＣＴＴＧＣＡＡＣＡＣＣＧ
ＣＴＡＣＣＴＧＣＧＴＴＡＣＣＣＡＣＣＧＴＣＴＧＧＣ
Ｔｄ　（ＣＴＴＡＡＧ丁ＡＣＣＧＡＡＣＧＴＴＧＴＧＧ
ＣＧＡＴＧＧＡＣＧＣＡＡＴＧＧにＴＧＧＣＡＧＡＣＣ
ＧＡＧＧＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧ
ＴＡＴＧＧＴＴＡＡＡＴＣＴＡＡＣＴＴＣＧＴＴＣＣＧ
ＡＣＣＣＣＡＧＡ　ＣＧＡＣＡＧＡＧＣＡ　ＡＧＡＣＣ
ＡＣＣＡＴＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧ　ＡＴＴＧＡ　Ａ　Ｇ
ＣＡ　ＡＧＧＣＴＧＧＡＡＣＧＴＴＧＧＴＴＣＴＡＡＡ
ＧＣＴＴＴＣＴＡＣ丁ＡＧＧＡＴＣＣ）ＴＴＧＣＡＡＣ
ＣＡＡＧＡＴＴＴＣＧＡＡＡＧＡＴＧＡＴＣＣＴＡＧＧ
）（ＸｒＶ） で表わされるＤＮＡ挿入部を有するプラスミドを含有す
るエフシェリシャ・コリのクローンを５ｍｌのし培地中
で、−夜（Ｉ６時間）、３７℃にて２５０回／分で壇養
する。Ｌ培地の組成は次の通りである。

バクトドリプトン　　　　　　　Ｌｏｇバクト酵母エキ
ス　　　　　　　５ｇ ＮａＣ１５ｇ グルコース　　　　　　　　　　５ｇ アンピシリン　　　　　　　　　０．１ｇこの一夜培養
物１ｍｌを、次の日に２５ｍ１のＭ９培地に移す、Ｍ９
培地の組成は次の通りである。

ＮａＪＰＯ４・７Ｈｔ８　　　　　　　１３．２５　ｇ
ＫＷ！Ｐ０．　　　　　　　　　　　３．０　ｇＮａＣ
ｌ　　　　　　　　　　　　　０．５　ｇＮＨ，ＣＩ　
　　　　　　　　　　　　１．０　ｇＣａＣＩｔ　・２
Ｈｔ０　　　　　　　　０．０１５　ｇ門ｇｓｏ、・７
Ｈｔ０　　　　　　　　０．２５ｇカザミノ酸　　　　
　　　　　２．５ｇビタミンＢ　＋　　　　　　　　　
　０．００９９　ｇグルコース　　　　　　　　　５．
０ｇアンピシリン　　　　　　　　０．１ｇ培養は３７
℃、２５０回／分にて、細＠懸濁液が約０．９〜１．０
の光学濃度（００１″）に達するまで行う０次に、細胞
を収得しく５ｍｌの増殖培地）、そしてこの細菌を５０
ｍＭ　　ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８）及び３０　ｍＭ　
ＮａＣ１の溶液０．５ｍｊに再懸濁する。

次にこの懸濁液を１ｗ／ｍｊ！リゾチーム（ベーリンガ
ー）に対して標準化し、そして水中に３０分間置く、こ
の懸濁液の液体窒素中での凍結及び３７℃での解凍を反
復することにより、ｗ１菌を破砕する。この方法を５回
反復し、そして混合物を１６．０００回／分、４℃にて
３０分間遠心分離する。

上清をＨＰＬＣ及び抗体によりＣＧＲＰ　Ｕ　ａ含量に
ついて試験する。

別の方法として、上記の細菌懸濁液を次のようにして処
理する。

細胞を、８０００回／分以上で遠心分離することにより
培養液から分離し、そして次にグイノーミル中で機械的
に破砕し、又はリゾチームにより溶解緩衝１（ｐＨ８）
中で酵素的に破砕する。

そして、次の段階を順次実施する。

１、酢酸（最終濃度１％、ｐＨ４，０’）による細面性
蛋白質のｐＨ−沈澱、　ＣＧＲＰｆｆは上清に残り、沈
澱物は分離除去する。

２、　回分法において、粗ペプチドをイオン交換体カラ
ム（ＣＨ５２、ワットマン）上に吸着せしめ、そして１
０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐ）１４．５　）から３００
ｍＭ　（ｐＨ６，５）までの塩グラジェントにより溶出
する。蒸留水からの凍結乾燥を反復することにより、又
は透析濾過により主成分を脱塩する。

３、生成物を、０．１％酢酸／ｎ−ブタノール（Ｉ：　
１）の２相系（２００移行）において、Ｃｒａｉｇの多
段分配法により精製する。溶剤をロータリーエバポレー
ターで除去し、そして集めた百分を凍結乾燥する。

４、すべての残留蛋白質及び低分子成分を、セファデッ
クスＧ５０（ファルマシア）上でのゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより分離する。溶出は２％酢酸、１％β−メ
ルカプトエタノールにより行う、あるいは、溶剤グラジ
ェントによるヌクレオシルＣ−１８カラム（Ｄｙｄａｃ
　３００人、１５〜２０μｍ）上でのウォーターズ製の
調製用装置（ＬＣ−Ｐｒｅｐ　５００）での逆相）ＩＰ
ＬＣにより分離を行う。

次の式（ＸＶ）、 Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ
−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｍｅｔ−Ｖａ
　ｌ　−Ｌｙｓ　−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ　ｌ
　−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−シａｌ−Ｇｌｙ−３ｅｒ
−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＯＨ（Ｘ　Ｖ） で示されるＣＧＲＰ　Ｅｌ　ａが得られる。

出発材料として使用したＥ、コリのクローンは次のよう
にして得られる。

段１１上 ７５０■の無水コハク酸及び９１０＊の４−ジメチルア
ミノピリジンを、２０ｍ１の純ピリジン中３．０５　ｇ
　（５ｍｍｏｌ）の５’−（４−モノメトキシトリチル
）−Ｎ−イソブチリル−デオキシグアノシンに加え、そ
して全体を１６時間室温に保持する。

ピリジン溶液を濃縮した後、残渣を２００ｍｊ！の酢酸
エチルに入れ、各場合に１０ｍｊ！の飽和塩化ナトリウ
ム溶液を加えて２００　ｍ　ｊの０．１　Ｍリン＃Ｉ緩
衝液と共に振とうすＬことにより２回抽出し、飽和塩化
ナトリウム溶液で再度洗浄し、乾燥し、濃縮し、そして
ヘキサンを満願する。沈澱した生成物を分離し、ジエチ
ルエーテルと共に２回すりつぶし、次に３００ｍｊの酢
酸エチルに溶解し、そして０℃にて１８０ｍＪの０．１
　Ｍ硫酸水素カリウム（ｐ）１２．５）と共に振とうす
ることにより抽出する。

水で２回洗浄した後、酢酸エチル？８液を硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、濾過し、これにＱ、　５　ｍ　ｌのピリジ
ンを加え、そして全体を４ｋ”Ｈし、モしてヘキサンを
満願して稀釈する。沈澱したコハクｅＩＩ誘導体を濾取
する。

１．１５ｇのこの化合物を１９０■のＮ−ヒドロキシサ
クシンイミドと共に４ｍｌの酢酸エチル及び２ｍｌのジ
メチルホルムアミド中に溶解し、モして０℃にて３７０
■のＮ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボイミドを加える
。凍蔵庫中で一夜静置した後、沈澱したＮ、Ｎ’−ジシ
クロヘキシル尿素を濾去し、濾液を酢酸エチルで稀釈し
、冷０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム及び水で抽出し、乾燥
し、そして真空蒸発により乾燥する。残渣を酢酸エチル
を用いてシリカゲル上でクロマトグラフ分析する。ＴＬ
Ｃ：　Ｒｒ−ｏ、ｓｓ、ジクロロメタン／メタノール（
９：１）中。

１００■のこのＮ−サクシンイミドイルコハク酸エステ
ルを’１ｍｌのジクロロエタン及び４ｍｊのジメチルホ
ルムアミド中１ｇのアミノメチルポリスチレン（アミン
含量１１０μｍｏｌ／　ｇ　）と共に攪拌する。ポリマ
ー樹脂を濾去し、そしてジメチルホルムアミド、メタノ
ール、ジクロロメタン及びメタノールで洗浄する。乾燥
した後、１ｍｆの無水酢酸及び１００■の４−ジメチル
アミノピリジンと共に５ｍｌのピリジン中で樹脂を３０
分間攪拌することにより、未反応のアミノ基をアセチル
化する。５’−（４−モノメトキシトリチル）−Ｎ−イ
ソブチリル−デオキシグアノシル−３’−０−サクシニ
ル基がアミノメチルポリスチレンに連結されている、生
じたポリマー樹脂をジクロロメタン、ジメチルホルムア
ミド、メタノール及びジクロロメタンにより洗浄し、そ
して重量が一定になるまで乾燥する０分光的メトキシト
リチル分析は３２μｓ＋ｏｌ／　ｇの負荷を示す。

ユ■又又 ７．７３　ｇ　（Ｉ５＋ｍｏｌ）の５’−（４−モノメ
トキシトリチル）−チミジンを純ピリジンと共に蒸発せ
しめることにより２回濃縮する。残渣を２０ｍｊ！の純
テトラヒドロフランに溶解し、そしてこの溶液を、攪拌
しながらそして湿気を排除しながら、テトラヒドロフラ
ン中２−クロロフェニル−ジー（Ｉ−ベンゾトリアゾリ
ル）−ホスフェートの０．２Ｍ溶液８０ｍｊ！に満願し
、そして反応混合物を室温にて１時間攪拌する。２−ク
ロロフェニル−１−ベンゾトリアゾル−５’−（４−モ
ノメトキシトリチル）−チミジン３′−ホスフェートの
得られる溶液を３つに分ける。

（α）　トリエチルアンモニウム２−クロロフェニル−
５’−（４−モノメトキシトリチル）−チミジン３′−
ホスフェートへの加水分解 ２−クロロフェニル−１−ベンゾトリアゾール−５’−
（４−モノメトキシトリチル）４−ミジン３′−ホスフ
ェートの上記溶液の３分の１に、冷却しながら、１００
　ｍ　Ａの０．５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウムを
加える。１５分間の後、ジクロロメタンにより抽出する
。ジクロロメタン溶液を水で洗浄し、濃縮し、そしてこ
れに石油エーテルを満願する。生ずる沈澱を吸引濾取し
、ジエチルエーテル／石油エーテル（Ｉ：　Ｉ）で洗浄
し、そして真空乾燥する。

Ｔ　Ｌ　Ｃ：　Ｒｆ−０，３５、ジクロロメタン／メタ
ノール／水（７５：２２：３）中。

（β）２−シアノエチル−２−クロロフェニル−５’−
（４−モノメトキシトリチル）−チアミン３′−ホスフ
ェートへのエステル化、及び４−モノメトキシトリチル
保護基の除去 ２−クロロフェニル−１−ベンゾトリアゾリル−５’−
（４−モノメトキシトリチル）−チミジン３′−ホスフ
ェートの溶液の３分の１に、１．３ｍｌの２−シアノエ
タノール及び２ｍｌのピリジンを加える。この混合物を
室温にして一夜保持する。溶剤を真空蒸留により除去し
、モして残渣を酢酸エチルに溶解し、そして０．１　Ｍ
リン酸緩衝液（ｐ）１７）及び水と共に振とうすること
により数回抽出する。有機相を乾燥し、濃縮し、そして
ヘキサンに満願する。沈澱を濾出し、５９ｍｊ！のジク
ロロメタン／メタノール（７：　３）に？８解し、そし
て０℃にてこれに７５ｍｊのジクロロメタン／メタノー
ル（７：　３）中３．８ｇのｐ−）ルエンスルホン酸−
水和物の溶液を加える。２時間後、反応溶液をジクロロ
メタンで稀釈し、そして冷炭酸水素ナトリウム溶液と共
に振とうすることにより抽出する。有機相を濃縮し、そ
してこれにヘキサンを加える。沈澱した２−シアノエチ
ル−２−クロロフェニル−チミジン３′−ホスフェート
を、ジクロロメタン／メタノール（９６：４）を用いて
シリカゲル上でクロマトグラフ分析する。ＴＬＣ：Ｒｅ
−０，４５、ジクロロメタン／メタノール（９：１）中
。

（ｒ）５’−（４−メトキシトリチル）−３’−シアノ
エチル）−ビスチミジンジヌクレオチドへの縮合 ２．２ｇの２−シアンエチル−２−クロロフェニル−チ
ミジン３′−ホスフェートを、純ピリジンとの蒸発によ
り２回濃縮することによって脱水し、２０ｍｊの純テト
ラヒドロフランに溶解し、そして２−クロロフェニル−
１−ベンゾトリアゾリル−５’−（４−モノメトキシト
リチル）−チミジン３′−ホスフェートの溶液の残りの
３分の１に加える。室温にて１８時間装いた後、氷冷し
ながら、反応溶液にＩｏｎ、ｊの水及び２００ｍｊの酢
酸エチルを加える。有機相を炭酸水素ナトリウム及び水
で数回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして小体積
に濃縮する。リン酸成分中で並びに５′−及び３′−末
端で保護されているジヌクレオチドを、ジエチルエーテ
ル／ヘキサン（Ｉ：　１）に満願することにより沈澱せ
しめる。　Ｒｔ　−０，４８、ジクロロメタン／メタノ
ール（９：　１）中。

ユｔｍ ９．２０ｇ　（Ｉ５ｍｍｏｌ）の５’−（４−モノメト
キシトリチル）−Ｎ−イソブチリル−デオキシグアノシ
ンを、純ピリジンとの７発により２回濃縮する。残渣を
２０ｍｊ！の純テトラヒドロフランに溶解し、そしてこ
の溶液を、攪拌しながらそして湿気を排除しながら、テ
トラヒドロフラン中２−クロロフェニル−ジー（ｌ−ベ
ンゾトリアゾリル）−ホスフエートの０．２Ｍ溶液７５
ｍｆに満願し、そして反応混合物を室温にて１時間攪拌
する。２−’コロフェニル−１−ベンゾトリアゾリル−
５’−（４−モノメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリ
ル−グアノシル３′−ホスフェートの生ずる溶液を、段
階２．４によりさらに処理する。

段階２．４ 十分に保護された上記のジヌクレオチド１．１７ｇ（Ｉ
ｍｍｏｌ）を３０ｒｎｌのジクロロメタン／メタノール
（７：　３）に溶解し、氷冷しながら、これに２０ｍｊ
のジクロロメタン／メタノール（７：　３）中１．９ｇ
のｐ−トルエンスルホン酸−水和物の溶液を加える。２
時間後、氷冷した炭酸水素ナトリウム溶液を加え、そし
てジクロロメタンで抽出する。有機相を乾燥し、濃縮し
、そしてヘキサン中に満願して導入する。遊離５′−ヒ
ドロキシ基を有する沈澱した粗ジヌクレオチドをシリカ
ゲル上でジクロロメタ７９２％〜８％メタノールのグラ
ジェントによりクロマトグラフ処理する。Ｒ，−０．３
３、ジクロロメタン／メタノール（９：　ｌ）中。

この５′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド９００ｇを、ピ
リジンとの薫発によって２回濃縮し、次に５ｍＩｔの純
テトラヒドロフラン中に溶解し、そしてこれに段階２．
３で得られた溶液１０ｍｊを加える。２時間後、’１ｍ
ｌの氷冷水を加え、そしてさらに１時間後、ジクロロメ
タンで抽出する。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和溶液
及び水で洗浄し、乾燥し、そして濃縮し、そしてこれに
エーテルを加える。沈澱したトリヌクレオチドをシリカ
ゲルクロマトグラフィーにより精製する。　Ｒｆ　−０
，４５、ジクロロメタン／メタノール（９：　１）中。

役１ムエ 段階２．２．２．３、及び２．４と同様にして、次の−
ａ式（ＸＶ［）で示される保護されたトリヌクレオチド
を製造する。

（ＸＶＩ） 式中・Ｂ　ａ　’　ｓ　Ｂ　ａ　”及びＢａ’は、相互
に独立に、次のヌクレオシドのいずれがの２価基である
。

Ｎ　−ヘア　７”イル−デオキシアデノシン（Ａ′）Ｎ
−ベンゾイル−デオキシシチジン（Ｃ′）Ｎ−イソブチ
リル−デオキシグアノシン（Ｇ′）、又はチミジン（Ｔ
）。

以下余白 殺ｆｌ虹 段階２．４及び２．５において記載したトリヌクレオチ
ドのそれぞれを次のようにして処理して２−シアノエチ
ル保！１基を除去する。湿気を排除しながら、１０μｍ
ｏｆのトリヌクレオチドを６０μｌのピリジン／アセト
ニトリル／トリエチルアミン（Ｉ：　１　：　１）中に
溶解する。室温にて１時間置いた後、０．７ｍｊ！の過
酸化物不含有ジエチルエーテルを満月し、そして沈澱を
遠心分離する。粗トリエチルアンモニウム塩を５０μｌ
のピリジンに溶解し、そして０．５ｍｊ！のジエチルエ
ーテルにより再度沈澱せしめ、遠心分離し、そして高真
空下で１５時間乾燥する。

段１ム１ 段階２．６により得られた部分的に保護されたトリヌク
レオチドと、段階２．１に従って得られた保護されたグ
アノシン−ポリスチレン樹脂とのカップリングを、次の
ようにして行う。

すべての操作は湿気を排除して１５０μ！容積の反応容
器中で、マイクロプロセサーで溶剤及び試薬を添加しな
がら行う、１５■（０，４８μｍｏｌ）のグアノシン−
ポリスチレン樹脂（段階２．１）を反応容器に入れ、そ
して次の操作にかける。

１、塩化メチレン：２ｍ１ｌ１分、４分間；２、塩化メ
チレン／イソプロパツール（８５：　１５）　：’１ｍ
１１分、２分間： ３、塩化メチレン／イソプロパツール（８５：　１５）
中１Ｍ臭化亜鉛及び０．０２Ｍ　１　、２　、４−トリ
アゾール：’１ｍ１１分、２〜３．５分間；４、塩化メ
チレン／イソプロパツール（８５：　１５）　：２ｍｌ
／分、４分間； ５、ＤＭＦ中０．５　Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム：
２ｒｒｌ１分、５分間； ６、分子篩で乾燥したピリジン：’１ｍ１１分、３分間
； ７、テトラヒドロフラン（過酸化物不含有、分子篩で乾
燥）７２ｍｌ１分、３分間： ８、窒素流、１０分間； ９、　１５０μｌのピリジンに溶解したｌＯμ＋ｍｏｌ
のトリヌクレオチド（下記参照のこと）及び８．９ｗ（
３０μｍｏｌ）の１−メシチレンスルホニル−３−二ト
ロー１．２．４−１−リ、アゾール（ＭＳＮＴ）の注入
； １０．４５℃、２０分間； １１、ピリジン；２ｍｌ１／分、４分間；１２、ピリジ
ン中５％の無水酢酸及び２５％の４−ジメチルアミノピ
リジン：２ｍｊ！／分、４分間； １３、ピリジン：２ｍｆ／分、４分間；１４、ピリジン
／イソプロパツール（Ｉ：１）：２ｍｊ！／分、３分間
。

１４のすべての操作を２４回反復し、トリエチルアンモ
ニウム塩（段階２．６を参照のこと）の形の次のデオキ
シトリヌクレオチドを、９番目の操作において次々に使
用する。　ｄ（Ａ’Ａ’Ｃ’、Ｃ’Ａ’Ｇ’。

Ｃ’Ａ’Ｃ”、　ＴＡ’Ｃ’、　Ｃ’Ｃ’Ａ’、　ＴＡ
’Ａ’、　Ａ’Ｔ丁、　ＴＡ’Ｇ’。

Ａ’Ｇ’Ｔ、　　Ｃ’Ｇ’Ａ”、　Ｇ″Ａ’Ａ’、　　
ＴＣ’Ｇ’、　　Ｔ″Ｇ’Ｇ’、　　Ｃ’Ｇ’丁。

Ｃ’Ａ’Ａ”、Ａ’Ａ’Ｃ’、　ＴＡ’Ｇ’、　Ｃ’Ｔ
Ｔ、　Ａ’Ａ″Ｇ’、　Ａ’Ｇ’Ａ’。

Ａ’Ｇ’Ｔ、　Ｃ’Ｃ’Ｔ、　Ｃ’Ａ’？及びＧ’ＴＣ
’）。

平均カンプリング収率は９７％である。最終生成物は次
の構造を有し、２−クロロフェニル保護基はなお存在す
る。

ｄ（ｍａｔ−Ｇ’ＴＣ’Ｃ’Ａ’ＴＣ’Ｃ’Ｔ＾’Ｇ’
Ｔ’Ａ’Ｇ’Ａ’Ａ’Ａ’Ｇ’Ｃ’ＴＴ丁Ａ’　Ｇ’　
Ａ’Ａ’Ｃ’Ｃ’　Ａ’　Ａ’Ｃ’　Ｇ’　ＴＴＧ’Ｇ
’　ＴＣ’　Ｇ’Ｇ’　Ａ’　Ａ’Ｃ’　Ｇ’　Ａ’　
Ａ’Ｇ’ＴＴＡ’Ｇ’Ａ’ＴＴＴ＾゛Ａ“Ｃ’Ｃ’Ａ’
ＴＡ’Ｃ’Ｃ’Ａ’Ｃ’Ｃ’Ａ’Ｇ”Ａ’　Ａ’Ｃ’Ｃ
’Ｇ’）−ポリスチレン合成樹脂ユ隆ム１ 段階２．７に従って得られたポリデオキシヌクレオチド
−ポリスチレン合成樹脂を次のようにして処理して担体
からポリヌクレオチドを除去し、そして保護基を除去す
る。

３５．０ｗ　（約０．３５μｍｏｌ）のポリデオキシヌ
クレオチド合成樹脂６４　／７３を、４００μｌの９５
％ピリジン中６６■（０，０４ｍｍｏｌ）の０−ニトロ
ペンザルドキシム及び５０　ｉｌｌ　　（０，４０ｍｍ
ｏｌ）の１．１．３゜３−テトラメチルグアニジンと一
緒に５０℃にて３時間そして室温にて１２時間保持する
。ピリジンを窒素により吹き飛ばした後、残渣に１．６
ｒｒｌの水性アンモニア（３３％）を加え、そして全体
を密閉容器中で５０℃にて２４時間保持する。

分離した液相から真空中でアンモニアを除去し、３ｍｌ
ずつの過酸化物不含有ジエチルエーテルにより３回洗浄
する。バイオゲルＰ６カラム（Ｉ００〜２００メツシユ
、３　Ｘ６５ｅｓ、　０．０１Ｍ炭酸水素トリメチルア
ンモニウム、ｐＨ７，５，１，５ｍｊ！／分）により低
分子成分を除去した後、２５００Ｄ　（２６０ｎｍ）の
ポリデオキシヌクレオチドを単離する。

１（ＰＬＣカラム（ＰＲＰ−１／ハミルトン、２５０Ｘ
　４．６＋＋＋ｍ）により合計６００Ｄを分離する。Ａ
中３０％のＢからＡ中６０％Ｂまでのグラジェント（溶
液Ａ　：　０．０５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐ
Ｈ７，Ｏ：　溶液Ｂ：溶液Ａ／アセトニトリル１：１）
で、５０℃にて２０分間、’１ｍ１１分で溶出する。親
脂性主ピーク（保持時間約１４分間）を集め、ＤＥ５２
−セルロース（ワットマン）カラムで濃縮し、溶出し、
そしてエタノールで沈澱せしめる。４−メトキシトリチ
ル保護基を除去するため、沈澱を５０μｌの酢酸／Ｈｔ
Ｏ（４：　１）に溶解し、そして室温にて４５分間保持
する０反応生成物を凍結乾燥し、エタノールで沈澱せし
め、そして精製のため８％ボリアクリルアミドゲル（７
Ｍ尿素）上での電気泳動により分離する．予想されるポ
リヌクレオチドの大きさに対応するバンドを切り取り、
そして生、　成物を電気溶出し、ＤＥ５２−セルロース
上で濃縮し、そして次の構造：　ｄ（ＧＴＣＣＡＴＣＣ
ＴＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣ丁ＴＴＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＴ
ＴＧＧ丁ＣＧＧＡＡＣＧＡＡＧＴＴＡＧＡＴＴＴＡＡＣ
ＣＡＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＧ）のポリデオキシヌク
レオチド６４／７３をエタノアルで沈澱せしめる． 五１１エ 段階２．７及び２．８と同様にしてポリデオキシヌクレ
オチド（Ｉ／７３）　ｄ（Ｃ丁ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧ
ＣＴＴＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＴＧＣＧＴＴ．Ａ
ＣＣＣＡ　ＣＣＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＴ
ＣＴＣＧＴＴＣＴＣＧＴＧ）を得る． 段■又刊 段階２．８及び２．９に従って得られたポリヌクレオチ
ド（６４／７３、及び相補的１／７３）を、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣ夏ｏｎｉｎｇ．　　　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ　　　（Ｔ．　　Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　　等により発表）　Ｃｏｌｄ　Ｓｐ．ｒｉｎｇ　
｝ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　１９８２．１２５頁に記載
されているようにして、（Ｔ−３！ｐ）ＡＴＰ，及びＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（べ一リンガー、西独）を
用いて、５′一末端を放射性リン酸化する． 我１し■ユ 段階２．１０に従って得られたキナーゼ処理されたポリ
ヌクレオチドを重合せしめてデュプレ７クスを形成する
ため、５０ｐｓ＋ｏｌずつのキナーゼ処理された断片１
／７３及びキナーゼ処理された断片６４／７３を２４μ
ｌの水に溶解し、この溶液を９０℃にて３分間加熱し、
そして５分間以内に１２℃に冷却する．４ｔｔｌのエン
ド−Ｒｌｌｉ街液（　０．　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　・｝１
ｃＩ　Ｓｐ｝！７．　５、６　６　ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ，
　６　６　ｍＭ　　β−メルカブトエタノール、０．　
６　Ｍ　ＮａＣＩ）、ＩＯｕｌのデオキシヌクレオシド
トリホスフエート混合物（ｄＡＴＰ，　ｄＣＴＰ，　ｄ
ＧＴＰ，　ＴＴＰ（それぞれ２×ｌＯ弓Ｍ）、ＮＩｆ３
にてｐＨ７．０に調製〕、及び２μｌ　（Ｉ０ユニット
）のＤＮＡポリメラーゼＩＫｌｅｎ咋断片（ベーリンガ
ー）を加えた後、１２℃にて３０分間インキユベートす
る．９０℃に３分間加熱することにより反応を停止し、
そしてさらに処理するまで混合物を−８０℃にて貯蔵す
る． 得られるＤＮＡ−デエブレックスは次の構造を有する． ｄ　（ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴτＧＣＡＡＣＡ
ＣＣＧＣＴＡＣＣＴＧＣＧＴＴＡＣＣＣＡＣｄ　（ＧＡ
ＣＣ丁丁ＡＡＧＴＡＣＣＧＡＡＣＧＴＴＧＴＧＧＣＧＡ
ＴＧＧＡＣＧＣＡＡＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＴＧＧＣＴＧ
ＧＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＡＴ
ＧＧＴＴＡＡ＾ＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＣＡＧＡＣＧＡＣ
ＡＧＡＧＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴ
ＣＴＡＡＣＴＴＣＧＴ丁ＣＣＧＡＣＣＡＡＣＧＴＴＧＧ
ＴＴＣＴＡＡＡＧＣ丁ＴＴＣＴＡＣＡＧＡＴＴＧＡＡＧ
Ｃ＾＾ＧＧＣＴＧＧＴＴＧＣＡＡＣＣＡＡＣＡＴＴＴＣ
ＧＡＡＡＧＡＴＧＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧ） ＡＴＣＣＴＡＧＧＡＣ） このデュブレフクスを以後“Ｆｏ”と称する．段ｐ １０μｇのブラスミドｐＢＲＨｔｒｐ　　（独国出願公
開３，１１１，４０５（ゼネンテフク）〕を５０ユニッ
トのＥｃｏＲＩ（ビオラブス）により３７７−にて６０
分間開裂せしめ、そしてフェノール抽出の後、消化混合
物をＴＳＴ４１　（コントロンＡＣ）ローター中で５０
ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣｆ（ｐＨ８．　０　）　、ｌ　ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ中シエークロース密度グラジエント（５％
〜２３％）により分画する．遠心分離を４０，０００回
／分、１５℃にて１４時間続ける，ｌｍｊ！／分にて、
Ｉ　ＳＣＯグラジエントコレクターにより０．３ｍｊ！
の画分を集める．小断片を含有する両分を一緒にし、こ
のｆｉＩ液をＴＮＥに対して標準化し、そして−２０℃
にて２容量のエタノールで沈澱せしめる．エフベンドル
フ遠心機中で遠心した後、ＤＮＡを１００μｌの１　　
０＋Ｍｔｒｉｓ　　−　ＨＣＩ（ｐＨ７．５　）　　、
　０．５　　ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　に溶解する．５μｇ
のこのＤＮＡ断片を５ユニットのＢｇｌｎ（ビオラブス
）により３７℃にて６０分間開裂せしめる．反応混合物
をフェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＤＮＡ
を２容量のエタノールと共に−８０℃にてｌＯ分間イン
キユベートし、そしてＤＮＡを遠心分離により集め、そ
して再度５０ｔｔｌの５　０　ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＭＣＩ
（ｐＨ８．　０　）に溶解する．この溶液の２μｌを取
り　（０．２μｇのＤＮＡ）、そして５　０ｍＭ　　ｔ
ｒｉｓ−｝１ｃＩ（ｐＨ８．０）中１０ｒ＋ｇ／μｌの
Ｄ　Ｎ　Ａ　ｔｊ４度にて、１ユニ７トのウシ腸アルカ
リホスファターゼ（ベーリンガー）と共に３７℃にて３
０分間インキュベートする。

溶液を６５℃にて６０分間加熱することにより酵素を不
活性化する。　０．０４μｇのＤＮＡを取り、そして２
０ｔｔｌの反応容積中で、５０　ｍＭ　　ｔｒｉｓ　・
ＨＣＩ　　（ｐＨ９，４）　、１０ｍＭ　ＭｇＣ１を及
び５ｍＭＤＴＴ中ｌＯμＣｉのＣｒ−”Ｐ〕−ＡＴＰ　
（＞５０００（ｉ／ｍｍｏｌ、アマ−ジャム）及び５ユ
ニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌビオケ
ミカルス）と共に３７℃にて３０分間インキュベートす
ることにより５′−末端を放射性リン酸化する。放射性
サンプルを未ラベルサンプル（上記を参照のこと）と混
合し、そしてＤＮＡ断片をＴＳＴ６０ローター中で、５
０ｍＭ　ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐ）１８．０）　、１ｍＭ
ＥＤＴＡ中５％−２３％シェークロース勾配を通して分
画する。遠心を６０，０００回／分、１５℃にて５時間
行つ、　０．２　ｍｊ！の画分を集める。セレンコツ放
射を測定することによって各百分の放射能を決定し、そ
してこれによって断片を同定する。／Ｊ％ＤＮ八断片を
へ有する目的の画分を一緒にし、ＤＮＡを２容量のエタ
ノールで沈澱せしめ、そして遠心分離の後、２０ｔｔｌ
の１０　ｍＭ　ｔｒｉｓ　・ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　、
０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ中に再度溶解する。

５ｔｐ−ラベルされたＥｃｏＲＩ−ＢｇｌｌｌＤＮＡ断
片を、５０μｌ容量中で０．２ユニツトのＴａｑｌ（ビ
オラプス）により３７℃にて１０分間部分開裂せしめる
０反応混合物を０．２％ＳＤＳ、１０％グリセリン、１
０ｍＭＥＤＴ＾、Ｏ，ＯＳ％プＴｅｌ　Ｌ　７　ｘ　／
　−ルブルーに対して標準化し、そしてＤＮＡ断片をｔ
ｒｉｓ−ボレート−ＥＤＴＡ中６％ポリアクリルアミド
ゲル上で分離する〔＾、Ｃ，Ｐｅａｃｏｏｋ等、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｙ−ｓｔｒｙ６．１８１Ｂ　（Ｉ９６７）　）
　−目的とするＥｃｏＲｒ　−Ｔａｑｌ断片（最も大き
な部分断片）を含有するバンドをオートラジオグラフ上
で同定する。この断片をゲルから抽出し、そして精製し
く１１６Ｍ１ｉｌｌｅｒ等、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ
、、　１２４３４３　（Ｉ９７Ｂ）　）そして１０ｔｔ
ｌの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＦ！７．５　）
　、１　ｍＭＥＤＴＡに溶解する。

Ｃ１ａｒ及びＥｃｏＲＩで開裂されたｐＢＲ３２２を受
容体プラスミドとして使用する。２μｇのｐＢＲ３２２
を、４ユニ７）のＣ１ａｌ（ビオラプス）により２０μ
ｌの反応容量中で３７℃にて６０分間消化する。蛋白質
をフェノールで抽出し、そして次にＤＮＡを２容積のエ
タノールにより一８０℃にて１０分間沈澱せしめる。Ｄ
ＮＡを遠心分離により集め、そして次に１０ユニツトの
ＥｃｏＲＴ　　（ビオラプス）により３７℃にて３０分
間、２０μｌの反応容積中に消化する０次に、この溶液
に２容量の０．１　Ｍｔｒｉｓ−）１ｃＩ　（ｐＨ８，
７）を加え、そして全体を１ユニツトのウシアルカリホ
スファターゼ（ベーリンガー）と共に３７℃にて３０分
間インキュベートする。次に、６５゛Ｃにて６０分間イ
ンキュベートすることによりホスファターゼを不活性化
する。

１００ｎＨの受容体プラスミドを、１０　ｍＭ　ＭｇＣ
１ｚ、２０ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，８＞　、Ｉ
　ＯｍＭ　　ＤＴＴ。

Ｑ、５ｍＭ　　ＡＴＰ中、１５μｌの反応容積中で、５
μｌの断片Ｌ−ＤＮＡと共に、反応容積μｌ当り３０ユ
ニツトのＴ、ＤＮＡリガニゼ（ビオラフ゛ス）を用いて
２時間インキュベートする。

５μｌのこの溶液を、２００μｌの全容積中、１０　ｍ
　Ｍ　ＭｇＣ１ｔ、１０　ｍＭ　ＣａＣ１を及び１０ｍ
Ｍｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）中で、塩化カルシ
ウムで処理されたＥ、コリ８８１０１細胞（Ｉ４）　１
５０μｌを含む溶合物に加える。この混合物を２０分間
氷冷し、４２℃にて１分間加熱し、そして２０ｔ’にて
１０分間インキュベートする。１ｍｌのトリプトン培地
〔１１の蒸留水中１０ｇのバタトートリプトン（ディフ
コ）、Ｉｇの酵母エキス（ディフコ）、１ｇのグルコー
ス、８ｇのＮａＣ１及び２９４■のＣａＣ１ｔ・２ｕｚ
ｏ）を加え、そしてこの混合物を、３００回／分で振と
うしながら３７℃にて３０分間インキュベートする。こ
の混合物を、５ｃＩｇ／ｍｌのアンピシリン（シグマ）
を補充した寒天プレート（マンコンキー寒天、ディフコ
、０．６ｍｌ／プレート）２枚にプレートする。このプ
レートを３７℃にて１２〜１７時間インキュベートする
。

１０個の異るコロニーのプラスミドＤＮＡを次のように
して単離する。

上記ノコロニーを使用して、２５ｍ１のエルレンマイヤ
ーフラスコ中のｌＱｍＩｌのトリプトン培地（５０μｇ
　／　ｍ　Ｉｔチアンシリンが補充されている）に接種
する。培養物を、３７℃、３００回／分にて１５〜１８
時間振とうする。ｔＲ胞を遠心分Ｍ（ツルパル、ＭＳ−
４０−ター、１０分間、４００回／分、４℃）により収
得する。約０．１ｇの細胞を得、そしてこれを１ｍｌの
５０　ｍＭ　　ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ＣｐＨ８，０）に再
懸濁する。Ｑ、２５ｍＡのりゾチーム溶液（５０ｍＭ　
　ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）中１０ｗ／ｍｌ　。

リゾチームはシグマから販売〕を加え、モして０℃にて
１０分間インキュベートした後、０．１５ｍＡ’の０．
５　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）を加える。０℃にてさ
らに１０分間装いた後、６０μｌの２％トリトンＸ−１
００（メルク）を加える。０℃にて３０分分間−た後、
サンプルを、ツルパル５Ａ−６００ローター中で１５．
０００回／分、４℃にて３０分間遠心分離する。

上清を、ｌ容積のフェノールＣＴＮＥ中に飽和）により
脱蛋白する。　５ｏｏｏ回／分、４℃にて１０分間遠心
分離する（ツルパルＨＢ−４０−ター）ことにより相を
分離する。上相を１容積のクロロホルムで２回抽出する
。最終ン；度が２０μｇ　／　ｍ　ｊ！となるまですい
ｖ＆ＲＮＡゼＡ（シグマ、ＴＮＥ中１０■／ｍＩｌ、８
５℃にて１０分間前加熱）を加え、混合物を３７℃にて
４０分間インキュベートする。

次に、溶液をＩ　Ｍ　ＮａＣ１及び１０％ポリエチレン
グリコール６０００　（フル力、１２０℃にて２０分間
オートクレーブ処理したもの）に対して標準化し、そし
て−１０℃にて２時間インキュベートする。

ツルパルＨＢ−４０−ター中で沈澱を集め（Ｉ０，００
０回／分、０℃にて２０分間）、そして再度１００μｌ
のＴＮＥに溶解する。ＤＮＡ溶液を１容積のフェノール
により抽出し、そしてＤＮＡを２容積のエタノールによ
り一８０℃にて１０分間沈澱せしめる。エソペンドルフ
遠心機中での遠心分離により沈澱を集め、そしてＤＮＡ
を再度２０μｌのｌＯｍ　Ｍ　　ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（
ｐＨ７，５）及び０．５　ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解する。

ｌＱｍＩｌの培養物から８〜１０μｇのプラスミドＤＮ
Ａが得られる。

プラスミドＤＮＡを、次のようにして制限酵素で消化す
ることにより分析する。

各場合に０．５μＣのプラスミドＤＮＡを、酵素の製造
者により特定された方法により、Ｈｐａｌ（ビオラプス
）により、そしてさらにＨｐａＩ（ビオラプス）及びＥ
ｃｏＲＩ　　（ビオラプス）により、そしてＣ１ａＩ（
ビオラプス）により開裂せしめる。

ＤＮＡを、４０ｍＭ　　ｔｒｉｓ・アセテート（ｐＨ７
，８）−１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．５ｇｇ／ｍ４ｘチジ
ウムブロミド中１％アガロースゲル上で分画する。目的
とするプラスミドはＨｐａ１部位を含有し、そして３回
消化した後火ＤＮＡ断片のほかにｐＢＲ３２２の小Ｅｃ
ｏＲＩ　−Ｃ１ａ　Ｉ　ｆｒ片より大きな２個の小断片
をもたらす、これらのプラスミドの１つをｐ１５９と命
名する。

殺１１■１ ２ｕｇのｐ１５９　Ｄ　Ｎ　Ａを１０ユニツトのＥｃｏ
ＲＩ（ビオラプス）により３７℃にて３０分間消化する
。ＤＮＡをフェノールにより消化し、エタノールにより
沈澱せしめ、そして遠心分離した後１０ｐｉの１０ｍＭ
　　ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７，５，）　、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡにより溶解する０次に、ＥｃｏＲＩで消化され
たＤＮＡを、５ユニツトのＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片）（ベーリンガー）により、１０ｍＭＭｇＣ
１ｔ　−１０ｍＭ　　β−メルカプトエタノール、５０
　ｎＭ　ＮａＣｌ　Ｓｏ、１ｍＭ　ｄＡＴＰ（Ｐ＆Ｌビ
オラプス）　、０．１　ｍＭ　ｄ（ＴＴＰ）（Ｐ　＆　
Ｌビオラプス）中で１５分間１２℃にてさらに処理する
０次に、８５℃にて５分間インキエベートすることによ
りこのポリメラーゼを不活性化する０反応混合物を２０
ｍＭ　　ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７，８）　、１０ｍＭ
　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　　Ａ
ＴＰ　（シグマ）中に稀釈し、そして反応混合物μｌ当
り３０ユニツトのＴ、ＤＮＡリガーゼと共に１５℃にで
１時間インキュベートする。

５０ｎＨのＤＮＡをＥ、コリ中に形質転換（前記のよう
にして）し、そして５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補
充したマンコンキー寒天プレート上にプレートする。

１０個の異るコロニーのプラスミドＤＮＡを前記のよう
にして単離する。プラスミドをＥｃｏＲＩで消化するこ
とにより分析する。この分析は前記のようにして行う、
目的とするプラスミドの１つをＨＲｉ１４５と命名する
。

我ｐ ２μｇのｐｉ（Ｒｉ１４５　Ｄ　Ｎ　Ａを５ユニツトの
Ｃ１ａｌ（ベーリンガー）で３７℃にて６０分間処理し
、そしてフェノール抽出により脱蛋白する。ＤＮＡをエ
タノールで沈澱せしめ、そして次に２０μｌの１０ｍＭ
　　ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７，５）　、０．５ｍＭ　
ＥＤＴＡに熔解する。突出末端を上記のようにしてＤＮ
ＡポリメラーゼＩ　　（Ｋｌｅｎｏ−断片）により補完
する。

但しｄＡＴＰ及びｄＴＴＰをｄＣＴＰ（Ｐ＆Ｌビオケミ
カルス）及びｄＧＴＰＣＰ＆Ｌビオケミカルス）で置き
換える。

８５℃にて５分間インキュベートすることによりポリメ
ラーゼを不活性化する。２容積の０．ＩＭｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　（ｐＨ８，７）を反応混合物に加え、そして全体
を０．５ユニツトのウシホスファターゼ（べ−リンガ−
）と共に３７℃にて３０分間インキュベートする０反応
混合物をフェノール抽出により脱蛋白する。ＤＮＡをエ
タノールにより沈澱せしめ、そして８μ！の１０　ｍＭ
　　ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）。

０、５　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ中にｆｉＩ解する。

次の式： ％式％ で表わされる化学合成したＤＮＡリンカ−を、０、１　
ｍ　Ｍ　ｒＡＴＰ（シグマ）　、５　ＱｍＭ　　ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ９，５）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｊｔ
　、５ｍＭ　　ＤＴＴ及び２ユニツトのＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｐ＆Ｌビオケミカルス）を含有する８
μｌの反応容積中で、８　ｐＩＩｏｌの該リンカ−と５
μＣｉの〔γ−”Ｐ　）−ＡＴＰ（５５００Ｃｉ・−１
１０１−’％アマージャム）とを３７℃にて３０分間イ
ンキュベートすることにより、５′−末端においてリン
酸化する。

次に、この放射性ラベルされたリンカ−を１μｇのＣ１
ａｌ及びホスファターゼで処理し、そして０、５　ｍ　
Ｍ　ｒＡＴＰＣシダ？）　、１０ｍＭ　　ＤＴＴ　（カ
ルビオケム）　、２０ｍＭ　　ｔｒｉｓ−Ｈｌｌ（ｐＨ
７，８）、１ｍＭＭｇＣｊｔ及び８００ユニｙトのＴ、
ＤＮＡリガーゼ（ビオラプス）を含有する２０μｌの反
応溶液中でｐＨＲ１１４５Ｄ　Ｎ　Ａ　（前記）と連結
する。

１５℃にて２時間インキエベートする。８５℃にて１０
分間インキュベートすることによりリガーゼを不活性化
する０次に、２容積の水を加え、塩化ナトリウム濃度を
１０ｍＭに調整し、そして２０ユニントのＫｐｎＩ（ビ
オラプス）を３７℃にて３０分間にわたって加える。フ
ェノール及びクロロホルムで抽出した後、この混合物を
、４０ｍＭｔｒｉｓ・アセテート（ｐＨ７，８）　、１
　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．５μｇ　／　ｍ　１エチジウ
ムプロミド中で０．９％低融アガロースゲル（ビオラド
）を通して分画する。同じサイズのマーカーＤＮＡと同
じ移動度を示すＵｖ−照射により可視化されるバンドを
ビンセットで切り取る。ゲル片を６５℃にて５分間熔融
せしめ、そして３７℃に冷却する。約２０μｌの容積が
得られる。この溶液の５μｌを取り、そして０．５ｍＭ
　　ＡＴＰ、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、１０　ｍＭ　ＭｇＣ
１ｔ　、２０　ｍＭ　　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７，
８）に対して標準化された１０μｌの反応容積中で４０
０ユニツトのＴ４リガーゼ（ビオラプス）と共に１５℃
にて１２時間インキュベートする。

Ｌｏｏｍ　Ｍ　ｔｒｉｓ−ＩＣＩ！　（ｐＨ７，５）、
１００ｍ　Ｍ　ＣａＣｌ　２及びＬｏｏｍ　Ｍ　ＭｇＣ
ｌ　、を含有する溶液１／１０容積をリガーゼ混合物（
Ｉ５℃にて固化）に加え、そして６５℃にて５分間イン
キュベートする０次にこの溶液を用いて、前記のように
して、カルシウムにより処理しておいたＥ、コリＨＢＩ
ＯＩ細胞を形質転換する。５０μｇ　／　ｍ　ｌのアン
ピシリンを補充されたマツコンキー寒天プレート上にプ
レートする。

１０個の異るコロニーのプラスミドＤＮＡを前記のよう
にして単離し、そしてＤＮＡを次の制限酵素分析にかけ
る。各場合に０．５μｇのプラスミドＤＮＡを、酵素の
製造者の指示に従って、Ｋｐｎｌ（ビオラプス）　、Ｎ
ｅｏ　Ｔ　　（ビオラプス）及びＥｃｏＲＩ　　（ビオ
ラプス）により次々と開裂せしめる。この開裂生成物を
、４０ｍＭ　　ｔｒｉｓ・アセテ−）（ｐＨ７，８）　
、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　　０．５　ｕ　ｇ／ｍｌ７
ｍｌエチジウムプロミド９ガロースゲル上で分画する。

すべてのプラスミドは目的通りに、それぞれこれらの酵
素開裂部位の１つを示す、１つをＨＲｉｌＪ８と命名す
る。

プラスミド）ｌＲｉ１４８はトリプトファン−プロモー
タ／オペレーター及びリボゾーム結合部位からＡＴＧま
で（これを含む）を含有し、そして広範囲の用途を有す
る発現プラスミドである・段１又」Ｌ ｐＨＲ１１８のプラスミドＤＮＡ５μｇを制限エンドヌ
クレアーゼＥｃｏＲＩ及びＢａ＋ｍＨ１で消化する。切
断した後、ベクターｐＨＲ１１４Ｂ／ＥｃｏＲＩ　／Ｂ
ａｍＨＩを密度勾配遠心法により単離する。

得られる線状化されたベクターの製造はまたＨａｎｓ　
Ｒｉｎｋ等ｓ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　、　１２　。

６３６９−６３８７　（Ｉ９８４）　’に記載されてお
り、この文献においてはこの明細書において、ｐＨＲ１
１４８と称されるプラスミドがｐＨＲ１４Ｂと呼ばれて
いる。

段１１」Ｌ 段階２．１１に従って得られる２０ｐｇのＤＮＡ配列Ｆ
ｏを、５０μｌの１０ｍＭ　　ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｉ（ｐＨ
７，５）　、５０ｍＭ　ＮａＣ１及び１００μｇ　／　
ｍ　ｌのゼラチンの５０μｌの溶液の内の２０μｌ中で
、制限酵素ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１により次々に消化
する。

溶？＆をＴＮＨに対して標準化し、そして次に３０ｐｇ
　（＝５０ｎｍ／の末端）のベクターＤＮＡｐＨＲ１１
４８／ＥｃｏＲＩ　／Ｂａｗｌ　１を加える。溶液をフ
ェノール／クロロホルムで抽出し、そしてＤＮＡをアル
コールにより沈澱せしめる。ＤＮＡ沈澱物を５０ｍＭ　
　ｔｒｉｓ−Ｈｃｊ’（ｐＨ７，８）　、１０ｍＭＰＩ
ｇｃ１ｔ　１１０ｍＭ　　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　　ＡＴ
Ｐ及び１００μｇ　／　ｍ　ｌゼラチンの溶液２０μｌ
中で、２５ユニツト／μｌのＴ、ＤＮＡリガーゼ（ビオ
ラプス）により、１５℃にて３時間処理する。こうして
、組換プラスミド（ｐＭＬ１０５０）が溶液中に形成さ
れる。

丑ＪＬＬ工し 段階２．１６に従って得られたプラスミドｐＭＬ１０５
０によるＥ、コリＨＢＩＯＩの形質転換を次のようにし
て行う。

形質転換に必要とされるカルシウム処理されたＥ、コリ
ＨＢ１０１細胞をＭａｎｄｅｌ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ１１
ｏ、　＋　５３゜１５９　（Ｉ９７０）に記載されてい
るようにして調製する。

組換プラスミドｐＭＬ１０５０を含有する段階２．１６
に従って得られた溶液を、６５℃にて１０分間加熱して
ＴａＤＮＡリガーゼを不活性化し、そして次に３７℃に
冷却する。この反応混合物１０μｌを、１０　ｍＭ　Ｍ
ｇＣｊ！　ｚ−及び１０　ｍＭ　　ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ
（ｐＨ７，５）中力ルシウム処理されたＥ、コリ１（Ｂ
ＩＯＩ細胞１５０μｌに加えて全容積２００μｌにする
０次に、この混合物を３０分間氷冷し、４２℃にて２分
間加熱し、そして次に１ｍＩ！のＬ培地（例２の最初の
記載を参照のこと）中に３７℃にて５０分間放置する０
次に、混合物のＱ、　２ｍ　ｌのアリコートを、６０ｐ
ｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリン（セルバ）を含をする５
枚のプレート（マツコンキー寒天、ディフコ）に通用す
る。寒天プレートを３７℃にて１６〜１８時間保持する
。形質転換されたＥ、コリＨＢＩＯＩのアンピシリン耐
性コロニー１０９個が得られる。

段１」２卦一 段階２．１７に従って得られた形質転換されたコロニー
３０個を、段階２．１１のＤＮＡ配列ＦＯの断片の含有
につき、次のようにして試験する。

形質転換されたコロニーをニトロセルロースフィルター
８８５　（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｉｌｌ）上
に押し付ける。　Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓ
　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、　７２　、３９６０（Ｉ
９７９）に従って、コロニーを溶解し、そしてそれらの
変性されたＤＮＡをフィルターに固定する。２０ｍβ　
（フィルター当り）の４ＸＳＥＴ　（３０ｍＭ　　ｔｒ
ｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ　ＮａＣ１、１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡのｔ８液）　、０．　ｔｗ／ｖ％フイ：７
−ル４００（７ｙ７Ｌｚ７シ７）　、０．５％ＳＤＳ。

５０ｐｇ　／　ｍ　１の変性されたウシ胸腺ＤＮＡ中で
、６４℃にて４時間フィルターの前ハイブリダイゼーシ
ョンヲ行つ０次に、ニトロセルロースフィルターを、２
０ｍＪ　（フィルター当り）の５ＸＳＥＴ（Ｗ／Ｖ）　
７　イコール４００．０．２％ＳＤＳ及び５０ｐｇ　／
　ｍ　ｌの変性されたウシ胸腺ＤＮＡ中で、６４℃にて
１６時間、２２ｐ−放射性標識プローブ（フィルター当
す約１０”〜１０’セレンコフｃｐｍ）で処理する。オ
リゴデオキシヌクレオチド６４／７３　（段階２．１０
を参照のこと）をプローブとして用いる。

次に、フィルターを２ＸＳＥＴ、０．２％ＳＤＳ中で室
温にて２回、そして２ＸＳＥＴ、０．５％ＳＤＳ中で６
０℃にて２回（最初３０分間、次に６０分間）洗浄する
０次に、フィルターを３ＭＭペーパー（ワットマン）の
間で乾燥し、そして−８０℃にてＸ−線フィルム（フジ
）上に、強化スクリーン（イルフォード）と共に１〜２
日間置く。

得られるオートラジオグラフは、さらに処理することが
できる陽性コロニー（クローン）２０個を示す、これら
の内５個をｐＭＬ１０５０％ｐＭ口０５１　。

ｐＭＬ１０５２　、ｐＭＬ１０５３　、及びｐ阿Ｌ１０
５４と命名する。

ユｇ 段階２．１８に従って得られたクローンｐＭＬ１０５０
中の挿入されたＤＮＡ配列、すなわちＤＮＡ挿入部の特
徴付けを次のようにして行う、。

組換プラスミドｐＭＬ１０５０のＤＮＡを、Ｉｓｈ−Ｈ
ｏｒ−ｏｗｉｔｚ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ＋Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ（
Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ等により発表）　、Ｃｏ１ｂ　Ｓ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、１９８２　、３６８
頁、に従って単離する。

ＦｏＤＮＡ挿入部のヌクレオチド配列をＭａｘａ＋ｍ及
びＧ１１ｂｅｒｔ　（Ｐｒｏｃ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ　、　７４　、５６０（Ｉ９７７）：さらにＭｅｔ
ｈ、　Ｅｎｚ　ｍ、　、　６５　、４９９（Ｉ９８０）
を参照のこと）に従って決定する。この目的のため、ｐ
ＭＬ１０５０のプラスミドＤＮＡｌ０μｇをＥｃｏＲＩ
及びＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼにより開裂せし
め、そして線状化されたＤＮＡをアガロースゲルからゲ
ル−熔出により単離する。この目的のため、線状化され
たＤＮＡを、ｔｒｉｓ−アセテート−ＥＤＴＡ緩衝液（
ｐＨ８）中１％低融アガロース（ビオラド）上で′のゲ
ル−電気泳動により精製する。アガロースゲル中でＥ　
ｔＢｒによりＤＮＡを着色した後、ＤＮＡバンドを含有
するゲルの領域をゲルから切り出し、そして６５℃にて
１０分間液化する。このＤＮＡ溶液に２０容積のＴＮＥ
を加え、ＤＥ−５２クロマトグラフイーによりＭｕｅｌ
　ｌｅｒ等（Ｊ、ＭＩｏ、Ｂｉｏｌ、。

１２４　、３４３（Ｉ９７８）　）　ニ従ってＤＮＡを
精製し、フェノール／クロロホルムで抽出し、そしてＤ
ＮＡをアルコールにより一２０℃にて一夜沈澱せしめる
。ＤＮＡ沈澱物を５０ｔｔｌの０．ＯＩＭ　　ｔｒｉｓ
　・ＨＣＩ　（ｐＨ８）　、０．１　ｍＭ　ＥＤＴ＾に
溶解し、そして使用するまで一２０℃に貯蔵する０次に
、単離されたＤＮＡをアルカリホスファターゼで消化し
、そしてＤＥ−５２上でクロマトグラフ処理する。

次に、このＤＮＡを、〔γ−”Ｐ）ＡＴＰ　（比活性＞
５０００Ｃｉ／＋＋ｕｉｏｌ、アマ−ジャム）及びＴ、
ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌ−ビオチミカルス）
を用いて、５′−末端において放射性ラベルする。

次に、放射性ラベルされたＤＮＡを第２の制限エンドヌ
クレアーゼ、例えばＰｖｕＩｒ及びＰｓｔｌで開裂せし
める。生ずるＤＮＡ断片をゲル−溶出によりアガロース
から単離する０次に、ＰｖｕＩＩ　−ＥｃｏＲビ断片及
びＰｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　”断片から、ＦｏＤＮＡ
のヌクレオチド配列を決定する。（′″は放射性ラベル
されたＤＮＡ末端を示す、）・　　凍結乾燥形の純ＣＩ
ＪＰｎ（３■）（例１に従って製造されたもの）を少量
の０．１％酢酸に溶解し、そして次にリン酸覆衝化塩化
ナトリウム溶液により３　ｍ　ｌにする。　ｐＨを７．
２に調整する。この抗原溶液の部分を同じ体積の完全フ
ロインドアジュバント又はリン酸緩衝化塩溶液と混合す
る。

雌性Ｂａ１ｂ／ｃマウス（８遇齢、ティールファーム・
シンセルン、スイスから入手）に、緩衝化塩溶液中１０
０μｇのＣＧＲＰ　ｎ溶液を静脈内注射する。４日　後
、牌臓を摘出して融合のために用いる。

Ｂ）ハイブリドーマの１゜　　び　　。

得られた牌細胞と骨ｔａ腫細胞系Ｘ６３−Ａｇ３．６．
５．３（Ｊ、Ｆ、Ｋｅａｒｎｅｙ等、　Ｊ、ｌ１１１＋
＊ｕｎｏ１．　、１２３，１５４８（Ｉ９７９））との
融合によりハイブリドーマ細胞を製造する。

このために１０’個の牌細胞及び１０７個の骨髄腫細胞
を使用する。融合は、Ｓ、Ａｌｋａｎ等、Ｍｏ１．　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ。

２０　、２０３（Ｉ９８３）に記載されているようにし
て行う。

ハイブリドーマの上清中の抗−ＣＯＲＰ　ＩＩ活性の決
定はラジオニムノアフセイにより行う（ＲＩＡ、Ｔ。

Ｃｈａｒｄ、Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　
Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄｒｅｌａｔ
ｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｎａｒｔｈ　Ｈｏ１ｌ
ａｎｄ　Ｐｕｂｌ、　Ｃｏｍｐ、。

アムステルダム、　１９７８）　。

Ｃ）　　からの　−ＣＧＲＰ　ｎ−の単離　び享Ｈａ　
１　ｂ／ｃマウスを、Ｑ、　４　ｍ　ｌのブリスタン（
カール・ロス）により腹腔内部処理する。゛１週間後、
２〜５Ｘ１０’個のクローン化ハイブリドーマ細胞を腹
腔的注射する。各マウスから繰り返し腹水を採取し、そ
して−８０℃にて凍結する。集めた液体を解凍し、そし
て４℃にて３０分間１６．０００■／分、遠心分離する
。脂肪を吸引濾去し、そして０℃で攪拌しながら、細胞
片を含まない上清液に、０．９容積の飽和硫酸アンモニ
ウム溶液をゆっくり滴加する。生じた粗免疫グロブリン
画分を、０．１Ｍ　　ｔｒｉｓ−Ｈｃｊ！（ｐＨ８，２
）を用いながら、製造者により記載されているようにし
てセファクリルＧ２０００　（ファルマシア）に通す、
活性画分を集め、そしてアミコンＸＭ５０フィルター（
アミコン）により濃縮する。

例３ａＣに従って製造した抗−ＣＧＲＰ　ＩＩｎ抗体溶
液をリンｉｌ！２緩衝化塩？８ｉｆ（ＰＢＳ溶液）によ
り稀釈してｌμｇ／ｌｏｏμｌの濃度とする。この溶液
１００μｌを小形のプラスチックチューブ中又はプラス
チック製ミクロタイタープレート士で３７℃にて２時間
インキエベートし、抗体をプラスチック表面上に非特異
的に吸着せしめる。プラスチック表面上のなお遊離して
いる活性部位を飽和するため、ウシ血清アルブミン溶液
（ＢＳＡ溶液）により後処理を行う。

サンプル溶液の又は標準溶液のＢＳＡ溶液中一連の稀釈
物のそれぞれを、既知の方法で放射性ｌｔｓヨウ素によ
りラベルされそして１０．０００ｃｐｍ１５０μＥの活
性を有するＣＧＲＰ■の溶液５０μｌに加え、そして次
にプラスチック表面上で３７℃にて２時間インキエベー
トし、そして次に４℃にて１２時間インキエベートする
。小形チューブ又はミクロタイタープレートをリン酸緩
衝化塩溶液で洗浄し、そして放射能を測定する。標準溶
液を用いて調製した換算曲線によりサンプル中のＣＧＲ
Ｐ　ｎの濃度を決定する。

前記のラジオイムノアッセイ用試験キットは次のものを
含む。

◎　Ｉ＝１０ｑ／ｍｊ！の濃度の、例３ａＣからの抗−
ＣＧＲＰ　ｎ抗体の溶液：　’１ｍｌ　；◎　リン酸緩
衝化塩溶液（ＰＢＳ溶液）　　：　　１００ｌＨ ◎　Ｐ　Ｂ　Ｓ　？Ｖ液中０．３％ウシ血清アルブミン
及び０．１％ナトリウムアジド：１００ｒｒ／！；◎　
２００．０００ｃｐｎ＋　／　ｍ　１の活性を有する放
射性ＣＧＲＰ　Ｉｔの溶液：　２ｍｌ　； ◎　１００■／ｍｌのＣＧＲＩｔを含有する標準溶液：
２ｍ１； ◎　プラスチック材料製の小形チューブ又はミクロタイ
タープレート。

■玉　亙ｊＪ≦ｄ１浪 ＣＧＲＰ　ｎの無菌濾過した水溶液を、加熱しながら、
無菌条件下で、防腐剤としてフェノールを含有する無菌
ゼラチン溶液と混合して、１．０　ｍ　ｌの溶液が次の
組成を有するようにする。・ 以下余白 ＣＧＲＰ　ＩＩ　　　　　　　　　　　　１０．Ｏｕ　
ｇゼラチン　　　　　１５０．０ＬＩｆ フエノール　　　　　４．７■ 蒸留水　　　　　　　１．０　ｍ　ｌとなる量。

この混合物を無菌条件下で１．０　ｍ　ｌのバイアルに
導入する。

■】　牲１団Ｉ劃！乾旦」Ｌ ５μｇのＣＧＲＰ■を２０ｍｊ！のマンニトールを含有
する１ｍｌの水溶液に溶解する。この溶液を無菌濾過し
、そして無菌条件下で、２ｒｎｌのアンプルに入れ、深
冷凍結し、そして凍結乾燥する。使用前に、この凍結乾
燥物を１ｍｌの蒸留水又は１ｍｌの生理食塩水に溶解す
る。この溶液は筋肉内又は静脈内に投与される。この溶
液はまた、２型室シリンジアンプルに導入することもで
きる。

開ｉ　五血囚プ上二 ２００μｇの微粉砕した（＜５．０μ）ＣＧＲＰＩ［を
、３、５　ｍ　ｌの“旧ｇｌｙｏｌ　８１２　”と０．
０８ｇのベンジルアルコールとの混合物中に懸濁する。

この懸濁液を、計量バルブで有する容器に導入する０次
に５、　Ｏｍ　１の°Ｆｒｅｏｎ　１２”を、バルブを
通して加圧下に容器に入れる。“Ｆｒｅｏｎ″は、振と
うによりＭｉｇｌｙｏｌ／ベンジルアルコール混合物中
に溶解する。

±１ ０．６Ｍ酢酸アンモニウム１０．ＩＭ　　ＫＣ１／１ｍ
ＭＥＤＴＡの溶液２ｍｊ！を曙アンモニア溶液によりｐ
Ｈ８に調整し、そして１００μｊのｌ　Ｍ　ＣＧＲＰ　
Ｉｆ　ａ水性溶液（例２を参照のこと）と混合する０次
に０．７曙のカルボキシペプチダーゼＹ（カールスベル
グ・ビオテクノロジー社、コペンハーゲン、デンマーク
）を加える。２５℃にて３０分間置いた後、全体を６Ｍ
　　ＨＣＩにてｐＨ１に酸性化する。

反応生成物を精製し、そして段階１．７に記載した条件
下で）ＩＰＬｃにより単離する０式（ＩＩＩ）のＣＧＲ
Ｐ　［［が得られ、これは例１に従って得られた生成物
と同一である。

炎１ 例２と同様にして、次の式（Ｘ■）、 ｄ　（ＣＴＴＡＡＧＴＡＣＣＧＡＡＣＧＴＴＧＴ［１Ｇ
ＣＧＡＴＧＧＡＣＧＣＡＡＴＧＧＧＴ［ｉＧにＡ（Ｘ■
） で表わされるＤＮＡ配列を有するプラスミドを含有する
エフセリシ＋・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）のクローンを培養し、そして同様に処理すること
によって、次の式（ＸＩＸ）、 Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ
−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅ　ｔ−Ｖａ
ｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾５ｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−
Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＧＪｙ−ＯＮ（ＸＩＸ） で表わされるＣＧＲＰｎｂを得る。

出発材料は例２と同様にして得られる。

以下金白 五１ ４　ｑ（Ｉ’）ＣＧＲＰＩＩ　ｂ　（例８を参照ノコと
）を、３７℃にて、ｌ　ｍ　１の２０　ｍ　Ｍ　ＮａＣ
１及び５ｍＭリン酸ナトリウム中で、ｐＨ７にて２０時
間、Ａ、Ｆ。

Ｂｒａｄｂｕｒｙ、　Ｍ、Ｄ、Ａ、　Ｆｉｎｎｉｅ及び
り、Ｇ、Ｓｍｙｔｈ　。

Ｎａｔｕｒｅ　　２９８．６８６−６８８（Ｉ９８２）
に記載されているようにしてブタの脳下垂体１００ｇか
ら単離されたアミド化酵素と共にインキュベートする０
次に、１００μｌのＩＭ）ＩＣｆを用いて酸性化する０
段階１．７に記載した条件下でＨＰＬＣにより反応生成
物を精製し、そして単離する。弐（］Ｉ［）のＣＧＲＰ
　Ｉｆが得られ、これは例１に従って得られる生成物と
同一である。

例１０゜ 次の式、 Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｈ４ｓ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ（ｔＢｕ）
−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｓｅｔ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−門ｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）　−５ｅｒ　
（ｔＢｕ）　−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｔ
ｈｒ　（ｔＢｕ）　−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
（ｔａｕ）　−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）　−Ａｌａ−Ｐｈｅ
−Ｎ）１ｇで表わされる、段階１０．２において得られ
たペプチド−アミドを２．８　ｍ　ｌのトリフルオロ酢
酸／水（９：　１）に溶解し、そして１．５時間室温に
置いた後、３０ｍ１の冷ジエチルエーテルで沈澱せしめ
、そして吸引濾過する。濾過残渣を５．２ｍ　ｌのトリ
フルオロ酢酸／水（９５：５）に溶解し、そして５０℃
にて５０分間置き、室温に冷却し、そして６０ｔｔｌの
１Ｍヨウ化アンモニウムを加えた後、室温にて１０分間
置＜、３０ｍＪ！の冷ジエチルエーテルに滴加すること
によりペプチド−アミドを沈澱せしめる。吸引濾過し、
そして乾燥した後、ペプチド−アミドを３　ｍ　ｌの０
．１　Ｍ酢酸に溶解し、そしてなお存在する痕跡のヨウ
素を１５μｌの１Ｍチオ硫酸ナトリウムの添加により還
元する。得られた溶液をイオン交換カラム〔アンバーラ
イト（商標”）　）　ＩＲＡ９２　、アセテート形、１
．２Ｘ３ｃｍ）に通して濾過し、そして０．１Ｍ酢酸に
より溶出する。蒸発により乾燥するまで濃縮した後、残
渣を３ｍｌの再蒸留水に熔解し、アルゴンのもとで室温
にて一夜！き、この溶液を用いて次の条件下で調製用）
ＩＰＬｃで精製する。カラム：　Ｖｙｄａｃ　５　ｐ　
ｍＣｌ　８．２５０　ＸＩＯ寵（ザ・セパレージ町ンズ
・グループ、ヘスベリア、カリホルニア、アメリカ）；
溶液Ａ（水中０．１容量九のトリフルオロ酢酸と２５〜
３０容量九のＢ（アセトニトリル中０．１容量％のトリ
フルオロ酢酸からなるグラジェント３０分間、及びさら
にＡ及び３０〜４０容量％のＢからなるグラジェント；
流速４ｍｊ／分：検出：　２１０ｎｍ。

画分中の主ピークを集め、そしてその純度を次の条件下
で分析用ＨＰＬＣにより決定する。カラム：Ｖｙｄａｃ
　５　、ｌｊｍｃ　１８．２５０Ｘ４．６ｍ；Ａ及びＢ
：４５分間中に２０〜４５％ＢＡＡ及びＢは前記の通り
。

純粋な百分を蒸発濃縮する。トリフルオロ酢酸を上記の
ようにしてイオン交換により除去し、そして式（ＩＩＩ
）のＣＧＲＰ　ＩＩを凍結により、得る。上記分析用Ｈ
ＰＬＣの保持時間：２４分：　ＦＡＲ／ＭＳ：ＩＩＩ”
　３７９４（計算上の分子量３７９３．４）　、　Ｒｆ
　　（シリカゲル）＝０．５７　（ｎ−ブタノール／ピ
リジン／氷酢酸／水（３５：３５：　７　：２３）　、
Ｒｆ　　（セルロース）−０，６４（ｎ−ブタノール／
ピリジン／氷酢＃／水（３８：２４：　８　：３０）　
、Ｒｆ　　（セルｅ）−ス）　−０，５５（ｎ　−ブタ
ノール／ピリジン／濃アンモニア／水（４２：２４：　
４　：３０）　。

出発物質は次のようにして得られる。

殺１ユ虹」− 例１１段階１．４に従って得られたペプチド樹脂を次の
ように処理して樹脂から保護されたペプチドを切り離し
、そして末端カルボキシ基をアミド化する。

３２５■のペプチド樹脂及びｌ　Ｑｍｊのジメチルホル
ムアミドをオートクレーブに入れ、−７０℃で６ｇのア
ンモニアを凝縮せしめ、そして全体を室温にて２０時間
反応せしめる。アンモニアを蒸留除去した後、残りの懸
濁液に５　Ｑｍｊのジエチルエーテルを加える。０℃に
て２時間置いた後、沈澱を吸引濾過する。保護されたペ
プチド−アミドを樹脂から氷酢酸により抽出しく５ｍ＆
で５回）、酢酸を凍結乾燥により除去し、モして残渣を
２０ｍ１のメタノール／水（９：　１）中に懸濁する。

保護されたペプチド−アミドを遠心分離し、洗浄し、そ
して乾燥して、その７７■を得る。

段１ユ虹」− ジスルフィドに転換するため、１４ｍ１の氷酢酸／水（
４：　１）中段階１０．１に従って得られた生成物６９
弯の溶液を、室温にて攪拌しながら、３４ｍ１の氷酢酸
及び１６ｍＡの水中１６４ｇのヨウ素の溶液に、４分間
にわたり滴加する。さらに１０分間装いた後、１．４　
ｍ　ｊ！の１Ｍ酢酸ナトリウム及び０．６８ｍ　ｊの１
Ｍアスコルビン酸を添加することにより反応を停止する
。ビオゲルＰ２カラム（２，５Ｘ３４国、氷酢酸／水（
６：　４）中〕で塩を分離する。濃縮した後、ペプチド
含有画分を凍結乾燥し、残渣を５　ｍ　ｌのメタノール
に懸濁し、そして不溶性の保護されたペプチド−アミド
を遠心分離及び乾燥により得る。

■１上・ １ｇのＨ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（ＭＯＢ）−Ａｓｎ（ＸＡＮ
Ｔ）−Ｔｈｒ（ＢＺＬ）−Ａｌａ−Ｔｈｒ（ＢＺＬ）−
Ｃｙｓ（ＭＯＢ）−Ｖａｌ−Ｔｈｒ　（ＢＺＬ）　−Ｈ
ｉｓ　（ＴＯＳ）　−Ａｒｇ（ＴＯＳ）−Ｌｅｕ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ＢＺＬ）−Ａｒ
ｇ（丁ＯＳ）−Ｓｅｔ（ＢＺＬ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍ
ｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（２ＣＺ）−５ｅｔ（ＢＺＬ）−
Ａｓｎ（ＸＡＮＴ）−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
（ＢＺい−Ａｓｎ　（ＸＡＮＴ）　−Ｖａｌ　−Ｇ　Ｉ
ｙ−５ｅｒ　（ＢＺＬ）　−Ｌｙｓ　（２ＣＺ）　−Ａ
　ｌａ−Ｐｈｅ−ＭＢＨＡ樹脂、及び１ｍｌのアニソ−
りを、１０ｍｊ！の乾燥ＨＦと共にテフロン装置中で０
℃にて１時間攪拌する。ＨＦをＮ留除去しそして高真空
下で乾燥した後、残渣を１０ｍｊ！のジエチルエーテル
で５回抽出する。ペプチドを樹脂から、脱気した０、　
Ｉ　Ｎ酢酸により抽出し、脱気した水により５００ｍ１
に稀釈し、そしてアンモニアによりｐＨを８．４に調整
する。室温にて一夜攪拌した後、遊離メルカプト基は検
出され得ない、溶液を高度に濃縮しそして凍結乾燥し、
そして例１０に記載したようにして残渣を調製用ＨＰＬ
Ｃにより精製する。得られる百分を、シリカゲル上ｎ−
ブタノール／ピリジン／氷酢酸／水（３５：３５：　７
　：２３）系中で、薄層クロマトグラムでのそれらの純
度について試験する。−緒にした純粋な百分を真空蒸発
により濃縮し、そして残渣を水から凍結乾燥する０式（
ＩＩＩ）のＣＧＲＰ　ＩＩが得られる。Ｒｆ（セルロー
ス）　−０，６４（ｎ−ブタノール／ピリジン／氷酢酸
／水（３８：２４：８　：３０）　。

出発物質は次のようにして得られる。

ユｍ １ｇのＭＢＨＡ−ポリスチレンヒドロクロリド〔幾つか
のフェニル基がアミノ−（４−メチルフェニル）−メチ
ル置換基を担持している、ジビニルベンゼンにより架橋
されたポリスチレン樹脂〕を、例１１段！１．２に記載
した機械中で、次のようにして処理する。

３　Ｘ　０．５分間　脱気したジメチルアセタミド；３
×２分間　　ジメチルアセタミド中１０％ジイソプロピ
ルエチルアミン； ｓ　ｘ　ｏ、　ｓ分間　蒸留したジメチルアセタミド：
ｌ　Ｘ　１２０分間　カップリング＝　　４５５ｑ（Ｉ
，７Ｍｍｏｌ）のＢｏａ−Ｐｈｅ＋　２３０＊のヒドロ
キシベンゾトリアゾール、３８５■の ジシクロへキシルカルボジイミ ド（０，３６ｍ　ｌのエチレンクロリ ド及び４　ｍ　Ｉｔのジメチルアセタ ミド中）：室温にて１２０分間； ＩＸ５分間　　１０ｍｌの無水酢酸／ピリジン／ジメチ
ルアセタミド（Ｉ０：１０　：８０）； Ｉ　Ｘ　０．５分間　脱気したジメチルアセタミ′ド；
ＩＸＩ分間　　インプロパツール； ２　Ｘ　０．５分間　エチレンクロリド：２　Ｘ　０．
５分間　ジメチルアセタミド；１×１分間　　イソプロ
パツール； ３　Ｘ　０．５分間　エチレンクロリド／エタンジチオ
ール（９９：ｌ）： ２×５分間、１ｘｉｓ分間 Ｂｏａ基を除去するため、トリフ ルオロ酢酸／エチレンクロリド ／エタンジチオール（５０：４９：　１）；３　Ｘ　０
．５分間　エチレンクロリド／エタンジチオール（９９
：ｌ）。

このサイクルを最初から繰り返し始める。

次のアミノ酸を次々と縮合せしめる。

Ｂｏｃ−Ａｌａ、　Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　（２ＣＺ）　＊　
Ｂｏｃ−５ｅｒ　（ｔｌＺＬ）　、　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ。

Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ａｓｎ（ＸＡＮＴ）＋　Ｂｏ
ａ−丁ｈｒ（ＢＺＬ）、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ。

Ｂｏｃ−Ｖａｌ　＋　Ｂｏａ−Ｐｈｅ、　Ｂｏｃ−Ａｓ
ｎ　（ＸＡＮＴ）、Ｂｏｃ−５ｅｔ（ＢＺＬ）。

Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　（２ＣＺ）　、　Ｂｏａ−Ｖａｌ　、
　Ｂｏｃ−Ｍｅ　ｔ、　Ｂｏｃ−Ｇ　Ｉｙ、　Ｂｏｃ−
Ｇｌｙ。

Ｂｏｃ−Ｓｅｒ　（ＢＺＬ）　、　Ｂｏｃ−Ａｒｇ　（
ＴＯ５）　、　Ｂｏｃ−Ｓｅｒ　（ＢＺＬ）　＊Ｂｏｃ
−Ｌｅｕ、　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、　Ｂ
ｏｃ−＾１ａ、Ｂｏｃ’−Ｌｅｕ。

Ｂｏｃ−Ａｒｇ（↑Ｏ５）、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（丁Ｏ５）
、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（ＢＺＬ）。

Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＭＯＢ）、Ｂｏｃ−
丁ｈｒ（ＢＺＬ）、Ｂｏｃ−Ａ１ａ＋Ｂｏｃ−Ｔｈｒ　
（ＢＺＬ）　、　Ｂｏｃ−Ａｓｎ　（ＸＡＮＴ）　、　
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　（ＭＯＢ）及びＢｏｃ−ＡＩａ　　ｍ カップリング反応の完了をカイゼル試験を用いて定性的
に試験する。試験が陽性であればカンプリングを反復す
る。最後のアラニンから８ｏｃ基を除去した後、高真空
下で樹脂を乾燥する。

以下余日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、９０個以下のアミノ酸残基を有する大きなペプチド
   の部分配列として、又はそれのみとして、次の式（ I
   ）、 【アミノ酸配列があります】 （ I ） で示されるアミノ酸配列（式中、システイン残基は分子
   内−又は分子間−ジスルフィド橋を形成することができ
   る）を有するペプチド、並びにアミド化された末端カル
   ボキシ基及び／又はアシル化された末端アミノ基を有す
   るそれらの誘導体、並びにこれらの塩。 ２、７２個以下のアミノ酸残基を有する特許請求の範囲
   第１項記載のペプチド、並びにＣ−末端カルバモイル基
   及び／又はＮ−末端アセチルアミノ基を有するそれらの
   誘導体、並びにそれらの塩。 ３、次の式（III）、 【アミノ酸配列があります】 （III） で表わされる特許請求の範囲第２項記載のペプチドアミ
   ド、及びその塩。 ４、次の式（ＸＶ）、 【アミノ酸配列があります】 （ＸＶ） で表わされる特許請求の範囲第２項記載のペプチド、及
   びその塩。 ５、次の式（ＸIV）、 【アミノ酸配列があります】 （ＸIX） で表わされる特許請求の範囲第２項記載のペプチド、及
   びその塩。 ６、特許請求の範囲第１項〜第５項に記載の合成的に又
   は遺伝子的に製造された化合物及びその塩。 ７、５０％以上の純度を有する特許請求の範囲第１項〜
   第５項のいずれか１項に記載の化合物及びその塩。 ８、特許請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記
   載の医薬として許容される塩。 ９、ヒト又は動物の体の医療的処置のための方法におい
   て使用するための、特許請求の範囲第１項〜第３項、第
   ６項、及び第７項のいずれか１項に記載のペプチドアミ
   ド、又はその医薬として許容される塩。 １０、９０個以下のアミノ酸残基を有する大きなペプチ
   ドの部分配列として、又はそれのみとして、次の式（
   I ）、 【アミノ酸配列があります】 （ I ） で示されるアミノ酸配列（式中、システイン残基は分子
   内−又は分子間−ジスルフィド橋を形成することができ
   る）を有するペプチド、又はアミド化された末端カルボ
   キシ及び／又はアシル化された末端アミノ酸基を有する
   それらの誘導体、又はこれらの塩を、９５％以上の医薬
   担体と共に含んで成る医薬製剤。 １１、冠循環疾患の治療のための、特許請求の範囲第１
   項〜第３項、第６項及び第７項のいずれか１項に記載の
   ペプチドアミド、又はその医薬として許容される塩の使
   用。 １２、冠循環疾患の治療において使用するための医薬製
   剤の製造のための、特許請求の範囲第１項〜第３項、第
   ６項及び第７項のいずれか１項に記載のペプチドアミド
   、又はその医薬として許容される塩の使用。 １３、９０個以下のアミノ酸残基を有する大きなペプチ
   ドの部分配列として、又はそれのみとして、次の式（
   I ）、 【アミノ酸配列があります】 （ I ） で示されるアミノ酸配列（式中、システイン残基は分子
   内−又は分子間−ジスルフィド橋を形成することができ
   る）を有するペプチド、並びにアミド化された末端カル
   ボキシ基及び／又はアシル化された末端アミノ基を有す
   るそれらの誘導体、並びにこれらの塩の製造方法であっ
   て、 （ａ）遊離カルボキシル基を有する前記化合物の断片又
   はその反応性カルボン酸誘導体と、遊離アミノ基を有す
   る補完的断片又はその反応性誘導体とを反応せしめる（
   前記の断片中の遊離官能基は、反応に関与する２個の基
   を除き、所望により保護された形で存在する）ことによ
   り前記化合物中に存在するアミド結合を形成せしめ、そ
   して存在するかもしれない保護基を除去し；あるいは、 （ｂ）分子内−又は分子間ジスルフィド橋を有する前記
   化合物のいずれかを製造するために、システイン残基の
   メルカプト基が遊離の形で存在するか、又はシステイン
   残基のメルカプト基が反応条件下で除去される保護基に
   より保護されている前記化合物のいずれかを適当な酸化
   剤により酸化し；あるいは、 （ｃ）少なくとも１個の官能基が保護された形で存在す
   る前記のペプチド、ペプチド−アミド、又はそれらのＮ
   −アシル化誘導体において、存在する保護基を除去し；
   あるいは、 （ｄ）前記のペプチドを製造するために、目的アミノ酸
   配列をコードしそして発現制御配列により制御されるＤ
   ＮＡ配列を含有する発現ベクターにより形質転換された
   宿主細胞を資化性の炭素源及び窒素源を含有する液体栄
   養培地中で培養し、生成物を所望により宿主細胞から遊
   離せしめそして単離し、そして必要であれば、得られる
   かもしれない２量体又は多量体をジスルフィド結合を開
   裂せしめるのに適当な還元剤と反応せしめ、そして必要
   であれば、得られる還元された生成物をジスルフィド結
   合の新たな形成に適当な酸化剤で処理し；あるいは、 （ｅ）前記のペプチド−アミドのいずれかを製造するた
   めに、目的ペプチド−アミドのアミノ酸配列に加えて、
   該目的ペプチド−アミドの末端アミド基のＮＨ＿２基に
   酵素的に分解され得るか又は適当な酵素の存在下でアン
   モニアにより置換され得るアミノ酸ＡＳ＾■をＣ−末端
   に有するペプチドを、場合によってはアンモニアの存在
   下で、適当な酵素により処理し； そして処理により、前記変法（ａ）〜（ｅ）いずれかを
   実施した後で、得られた塩を遊離化合物に、又は得られ
   た遊離化合物をその塩に転換する、ことを特徴とする方
   法。 １４、単鎖中に２９０以下のデオキシヌクレオチドを有
   する大配列中の部分配列として、次の式（IV）、【遺伝
   子配列があります】 （IV） （配列中、５′−末端から始まるコード鎖のデオキシヌ
   クレオチド配列、及びその下方に各トリプレットがコー
   ドするアミノ酸が示してあり；そして、 Ａはアデノシルであり、 Ｔはチミジルであり、 Ｇはグアノシルであり、 Ｃはシチジルであり、 ＥはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり、 ＮがＣである場合、ＫはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり；あ
   るいは、 ＮがＡである場合、ＫはＡ、又はＧであり、ＬはＴ、又
   はＣであり、 ＭはＡ、又はＧであり、 ＮはＡ、又はＣであり、 ＱはＴ、又はＡであり、 Ｒ及びＳに関しては、ＱがＴである場合、ＲはＣであり
   、そしてＳはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり；あるいは、 ＱがＡである場合、ＲはＧであり、そしてＳはＴ、又は
   Ｃであり、 ＸはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり、 ＹはＴ、又はＣであり、そして、 ＹがＣである場合、ＺはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり、あ
   るいは、ＹがＴである場合、ＺはＡ、又はＧであり； カッコの前にある“ｄ”は、カッコ内に示されたヌクレ
   オチドが２−デオキシ−リボヌクレオシドであることを
   意味する、） で表わされる配列を含有するＤＮＡ配列。 １５、コード鎖中に１５０以下のデオキシヌクレオチド
   を有し、そして次の式（IVｂ） 【遺伝子配列があります】 （IVｂ） （式中、５′−末端から始まるコード鎖のみ、及び一層
   よく理解できるように各トリプレットがコードするアミ
   ノ酸が示されている） で表わされるＤＮＡ配列を含有する特許請求の範囲第１
   ４項記載のＤＮＡ配列。 １６、単鎖中に２９０以下のデオキシヌクレオチドを有
   する大配列中の部分配列として、次の配列（IV）、 【遺伝子配列があります】 （IV） （配列中、５′−末端から始まるコード鎖のデオキシヌ
   クレオチド配列、及びその下方に各トリプレットがコー
   ドするアミノ酸が示してあり；そして、 Ａはアデノシルであり、 Ｔはチミジルであり、 Ｇはグアノシルであり、 Ｃはシチジルであり、 ＥはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり、 ＮがＣである場合、ＫはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり；あ
   るいは、 ＮがＡである場合、ＫはＡ、又はＧであり、ＬはＴ、又
   はＣであり、 ＭはＡ、又はＧであり、 ＮはＡ、又はＣであり、 ＱはＴ、又はＡであり、 Ｒ及びＳに関しては、ＱがＴである場合、ＲはＣであり
   、そしてＳはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり；あるいは、 ＱがＡである場合、ＲはＧであり、そしてＳはＴ、又は
   Ｃであり、 ＸはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり、 ＹはＴ、又はＣであり、そして、 ＹがＣである場合、ＺはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり、あ
   るいは、ＹがＴである場合、ＺはＡ、又はＧであり； カッコの前にある“ｄ”は、カッコ内に示されたヌクレ
   オチドが２−デオキシ−リボヌクレオシドであることを
   意味する、） で表わされる配列を含有するＤＮＡ配列を含有し、そし
   て９０個以下のアミノ酸残基を有する大きなペプチドの
   部分配列として、又はそれのみとして、次の式（ I ）
   、 【アミノ酸配列があります】 （ I ） で示されるアミノ酸配列（式中、システイン残基は分子
   内−又は分子間−ジスルフィド橋を形成することができ
   る）を有するペプチド、並びにアミド化された末端カル
   ボキシ基及び／又はアシル化された末端アミノ基を有す
   るそれらの誘導体、並びにこれらの塩を製造することが
   できる微生物。