JPS61172899A - ペプチド及びその製造方法 - Google Patents
ペプチド及びその製造方法Info
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- JPS61172899A JPS61172899A JP61006159A JP615986A JPS61172899A JP S61172899 A JPS61172899 A JP S61172899A JP 61006159 A JP61006159 A JP 61006159A JP 615986 A JP615986 A JP 615986A JP S61172899 A JPS61172899 A JP S61172899A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、その構造がヒト−カルシトニン遺伝子に由
来する新規なペプチド、すなわち、いわゆる“カルシト
ニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)”、及びその塩;
対応するDNA配列、及びこれらのDNA配列を含有し
そしてこれらのペプチドの製造のための中間体としてこ
の発明のペプチドを製造することができる微生物;これ
らのペプチド又はDNA配列を製造するための方法;前
記ペプチド又はその塩を含有する医薬製剤;並びに、こ
れらのペプチド又はそれらの塩の医薬としての使用に関
する。
来する新規なペプチド、すなわち、いわゆる“カルシト
ニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)”、及びその塩;
対応するDNA配列、及びこれらのDNA配列を含有し
そしてこれらのペプチドの製造のための中間体としてこ
の発明のペプチドを製造することができる微生物;これ
らのペプチド又はDNA配列を製造するための方法;前
記ペプチド又はその塩を含有する医薬製剤;並びに、こ
れらのペプチド又はそれらの塩の医薬としての使用に関
する。
(発明の概要〕
すなわち、第1にこの発明は特に、90個以下のアミノ
酸残基を有する大きなペプチドの部分配列として、又は
それのみとして、次の式(り、−A 1 aCysAs
nThrA 1 aThrCysVa I ThrRi
s ArgLeuA 1 aGl y−Leu Leu
SerArgSerG I yG l yMe tVa
ILysSerAs n PheVa I −Pro
ThrAsnValGIySerLysAIaPhe−
で示されるアミノ酸配列(式中、システィン残基は分子
内−又は分子間−ジスルフィド橋を形成することができ
る)を有するペプチド、並びにアミド化された末端カル
ボキシ基及び/又はアシル化された末端アミノ基を有す
るそれらの誘導体、並びにこれらの塩に関する。
酸残基を有する大きなペプチドの部分配列として、又は
それのみとして、次の式(り、−A 1 aCysAs
nThrA 1 aThrCysVa I ThrRi
s ArgLeuA 1 aGl y−Leu Leu
SerArgSerG I yG l yMe tVa
ILysSerAs n PheVa I −Pro
ThrAsnValGIySerLysAIaPhe−
で示されるアミノ酸配列(式中、システィン残基は分子
内−又は分子間−ジスルフィド橋を形成することができ
る)を有するペプチド、並びにアミド化された末端カル
ボキシ基及び/又はアシル化された末端アミノ基を有す
るそれらの誘導体、並びにこれらの塩に関する。
前記の大きなペプチドは、特に90個以下、特に80個
以下、例えば72個以下のアミノ酸残基を有する。好ま
しくは、このものは、次の式(If)、−AspTyr
ValG1nMetLysA1aSerG1uLeuL
ysGlr+Glu−GlnGluThrGlnSer
SerSerSerAlaAlaGlnLysArg−
AlaCysAsnThrAlaThrCysValT
hrHisArgLeuAla−GlyLeuLeuS
erArgSerGlyGlyMetValLysSe
rAsn−PheValProThrAsnValGl
ySerLysAIaPheGlyArg−ArgAr
gSerAspLeuGluAla−(n) で表わされるアミノ酸配列を有するか、又は少なくとも
1個の追加のアミノ酸残基に加えて式(I)の配列を有
する該アミノ酸配列の断片を有する。
以下、例えば72個以下のアミノ酸残基を有する。好ま
しくは、このものは、次の式(If)、−AspTyr
ValG1nMetLysA1aSerG1uLeuL
ysGlr+Glu−GlnGluThrGlnSer
SerSerSerAlaAlaGlnLysArg−
AlaCysAsnThrAlaThrCysValT
hrHisArgLeuAla−GlyLeuLeuS
erArgSerGlyGlyMetValLysSe
rAsn−PheValProThrAsnValGl
ySerLysAIaPheGlyArg−ArgAr
gSerAspLeuGluAla−(n) で表わされるアミノ酸配列を有するか、又は少なくとも
1個の追加のアミノ酸残基に加えて式(I)の配列を有
する該アミノ酸配列の断片を有する。
好ましくは、2個のシスティン残基は相互に分子内シス
チン残基を形成する。しかしながら、分子間ジスルフィ
ド橋を介して、2個のペプチドが相互に頭対頭で連結さ
れるか、又は好ましくは頭対尾で連結されて、二量体が
形成されることも可能である。
チン残基を形成する。しかしながら、分子間ジスルフィ
ド橋を介して、2個のペプチドが相互に頭対頭で連結さ
れるか、又は好ましくは頭対尾で連結されて、二量体が
形成されることも可能である。
末端アミノ基は、好ましくは遊離しているが、しかしま
たアシル化、例えば特にアセチル化されていてもよい。
たアシル化、例えば特にアセチル化されていてもよい。
末端カルボキシ基がアミド化された形態、すなわち特に
カルバモイル基の形態で存在する上記のペプチドが薬理
学的に活性である。末端カルボキシ基が遊離しているか
又は塩の形である上記のペプチドもまた、薬理学的に活
性なアミドの製造のための中間体として、この発明の部
分を構成する。
カルバモイル基の形態で存在する上記のペプチドが薬理
学的に活性である。末端カルボキシ基が遊離しているか
又は塩の形である上記のペプチドもまた、薬理学的に活
性なアミドの製造のための中間体として、この発明の部
分を構成する。
この発明は、第1にそして特に、次の式(III)、L
su−Ala−Gly−Leu−Leu−Ser−Ar
g−5er−Gly−Gly−Met−Val−Lys
−Ser−Asn−Phe−Val−Pro−Thr−
Asn−Val−Gly−5er−Lys−Ala−P
he−NH。
su−Ala−Gly−Leu−Leu−Ser−Ar
g−5er−Gly−Gly−Met−Val−Lys
−Ser−Asn−Phe−Val−Pro−Thr−
Asn−Val−Gly−5er−Lys−Ala−P
he−NH。
(m)
で表わされるペプチドアミド(CGRP n)及びその
塩に関する。
塩に関する。
さらに、この発明はまた、次の式(■a)、His−A
rg−Leu−Ala−Gly−Leu−Leu−5e
r−Arg−5er−Gly−Gly−Met−Val
−Lys−3er−Asn−Phe−Val−Pro−
Thr−Asn−Val−Gly−Ser−Lys−A
la−Phe−NHz(I[[a) で表わされるN−アセチル化ペプチド−アミドに関する
。
rg−Leu−Ala−Gly−Leu−Leu−5e
r−Arg−5er−Gly−Gly−Met−Val
−Lys−3er−Asn−Phe−Val−Pro−
Thr−Asn−Val−Gly−Ser−Lys−A
la−Phe−NHz(I[[a) で表わされるN−アセチル化ペプチド−アミドに関する
。
この発明はまた、次の式(I[[b)、Leu−Ala
−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg−3er−
Gly−にly−Met−Val−Lys−Ser−A
sn−Phe−Val−Pro−Thr−Asn−Va
l−Gly−Ser−Lys−Ala−Phe−AS
−0H(II[b) C式中、AS” は、式<m)のペプチドペプチド−ア
ミドの末端アミド基のN Hz基に酵素的に分解され得
るか、又は適当な酵素の存在下でアンモニアにより置換
され得るアミノ酸、例えば、好ましくはグリシン又はチ
ロシンである、〕で表わされるペプチド、及び末端アミ
ノ基がアセチル化されているその誘導体に関する。
−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg−3er−
Gly−にly−Met−Val−Lys−Ser−A
sn−Phe−Val−Pro−Thr−Asn−Va
l−Gly−Ser−Lys−Ala−Phe−AS
−0H(II[b) C式中、AS” は、式<m)のペプチドペプチド−ア
ミドの末端アミド基のN Hz基に酵素的に分解され得
るか、又は適当な酵素の存在下でアンモニアにより置換
され得るアミノ酸、例えば、好ましくはグリシン又はチ
ロシンである、〕で表わされるペプチド、及び末端アミ
ノ基がアセチル化されているその誘導体に関する。
国際的に認められた命名法に従って、この明細書中のア
ミノ酸の略号、例えば今まで記載した略号は遊離酸を示
し、そして特にことわらない限りL−配置を示す、α−
アミノ基は略号の左側に存在し、そしてカルボキシ基は
右側に存在すると考えるべきである。α−アミノ基中の
H原子の不存在はそのアミノ酸の略号の左に位置するハ
イホンによって示される。カルボキシ基中のHO基の不
存在は右側に位置するハイホンにより示される。
ミノ酸の略号、例えば今まで記載した略号は遊離酸を示
し、そして特にことわらない限りL−配置を示す、α−
アミノ基は略号の左側に存在し、そしてカルボキシ基は
右側に存在すると考えるべきである。α−アミノ基中の
H原子の不存在はそのアミノ酸の略号の左に位置するハ
イホンによって示される。カルボキシ基中のHO基の不
存在は右側に位置するハイホンにより示される。
アミノ酸の側鎖中の置換基はアミノ酸記号のすぐ後のカ
ッコ内に記載され、又はアミノ酸記号の上方又は下方に
垂直に伸びる線によりアミノ酸記号に連結される。
ッコ内に記載され、又はアミノ酸記号の上方又は下方に
垂直に伸びる線によりアミノ酸記号に連結される。
この発明のペプチドが天然に、すなわち例えば人体中に
、それ自体として存在するか否かはまだ知られていない
、しかしながら、もしそうだとすれば、この発明は特に
、天然に存在するよりも、又は知られているであろう抽
出物中よりも高濃度の上記のペプチド及びその塩に関す
る。特に、この発明は、単離され又は精製された形の、
純粋な又は実質上純粋な形の、天然に存在するのと異る
環境での、すなわち他の混合物例えば混合された医薬担
体を伴う、医薬用途に適当な形での、特徴付けられた形
での、そして/又は生体もしくは死体の、器官の、細胞
の、組織の、もしくは体液の外での、上記のペプチドに
関する。この発明は特に、合成的に又は遺伝子的に製造
されたペプチド及びそれらの塩に関する。
、それ自体として存在するか否かはまだ知られていない
、しかしながら、もしそうだとすれば、この発明は特に
、天然に存在するよりも、又は知られているであろう抽
出物中よりも高濃度の上記のペプチド及びその塩に関す
る。特に、この発明は、単離され又は精製された形の、
純粋な又は実質上純粋な形の、天然に存在するのと異る
環境での、すなわち他の混合物例えば混合された医薬担
体を伴う、医薬用途に適当な形での、特徴付けられた形
での、そして/又は生体もしくは死体の、器官の、細胞
の、組織の、もしくは体液の外での、上記のペプチドに
関する。この発明は特に、合成的に又は遺伝子的に製造
されたペプチド及びそれらの塩に関する。
上記の事項に関し、“単離される°なる語は、他の物質
から、特にこの発明の化合物と一緒に天然に存在する他
の化合物から分離されることを意味する。“精製される
”なる語は、化学的及び/又は物理的精製手段にかけら
れることを意味する。
から、特にこの発明の化合物と一緒に天然に存在する他
の化合物から分離されることを意味する。“精製される
”なる語は、化学的及び/又は物理的精製手段にかけら
れることを意味する。
“実質的に純粋な1という表現は、50%より高い純度
を意味する。
を意味する。
この発明はまた、この発明のペプチドの塩、特に医薬と
して許容される無毒性塩に関する。上記のペプチドは、
酸付加塩、例えば無機酸、特に鉱酸、例えば塩酸、硫酸
もしくはリン酸との酸付加塩、あるいは有機カルボン酸
、スルホン酸もしくはスルホン酸との塩、例えば酢酸、
プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、
ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、
リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マン
デル酸、サリチル酸、4−アミノサリチル酸、2−フェ
ノキシ安息香酸、2−アセトキシ安息香酸、エンポン酸
、ニコチン酸もしくはイソニコチン酸、さらにはアミノ
酸、さらにはメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2
−ヒドロキシェタンスルホン酸、エタン−1,2−ジス
ルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4−メチルベンゼンス
ルホン酸もしくはナフタレン−2−スルホン酸、又は他
の酸塩有機化合物、例えばアスコルビン酸との塩を形質
することができる。
して許容される無毒性塩に関する。上記のペプチドは、
酸付加塩、例えば無機酸、特に鉱酸、例えば塩酸、硫酸
もしくはリン酸との酸付加塩、あるいは有機カルボン酸
、スルホン酸もしくはスルホン酸との塩、例えば酢酸、
プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、
ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、
リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マン
デル酸、サリチル酸、4−アミノサリチル酸、2−フェ
ノキシ安息香酸、2−アセトキシ安息香酸、エンポン酸
、ニコチン酸もしくはイソニコチン酸、さらにはアミノ
酸、さらにはメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2
−ヒドロキシェタンスルホン酸、エタン−1,2−ジス
ルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4−メチルベンゼンス
ルホン酸もしくはナフタレン−2−スルホン酸、又は他
の酸塩有機化合物、例えばアスコルビン酸との塩を形質
することができる。
少なくとも1個のカルボキシ基及び少なくとも1個の塩
基性基、例えばアミノ基を有する上記のペプチドは内部
塩を形成することができる。
基性基、例えばアミノ基を有する上記のペプチドは内部
塩を形成することができる。
少なくとも1個のinカルボキシ基を含をする前記のペ
プチドは、特にそれらが塩基性基より多数のカルボキシ
基を有する場合、金属塩又はアンモニウム塩、例えばア
ルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、例えばナトリウ
ム塩、カリウム塩、マグネシウム塩又はカルシウム塩、
さらには、アンモニア又は適当な有機アミンとのアンモ
ニウム塩を形成し、そして特に、脂肪族、脂環族、脂環
脂肪族又は芳香脂肪族の第一級、第二級又は第三級モノ
−、ジー又はポリ−アミン、そしてさらに脂環式塩基、
例えば低級アルギルアミン、例えばトリエチルアミン、
ヒドロキシ−低級アルキルアミン、例えば2−ヒドロキ
シエチルアミン、ビス−(2−ヒドロキシエチル)−ア
ミン、2−ヒドロキシエチル−ジエチルアミン又はトリ
ー(2−ヒドロキシエチル)−アミン、カルボン酸の塩
基性脂肪族エステル、例えば4−アミノ安息香酸2−ジ
エチルアミノエチルエステル、低級アルキレンアミン、
例えば1−エチルピペリジン、シクロアルキルアミン、
例えばジシルロヘキシルアミン、又はベンジルアミン、
例えばN、N’−ジベンジルエチレンジアミン、さらに
ピリジン型の塩基、例えばピリジン、コリジン又はキノ
リンとの塩を挙げることができる IQ−I Sモルの
投与量において、この発明のペプチドアミドは血管拡張
作用を有し、そして血圧の低下、並びに心拍数及び心筋
の収縮性の上昇をもたらす、これらの作用は交感神経系
の遮断剤、例えばメトプロロール〔1−イソプロピルア
ミノ−3−(4−(2−メトキシエチル)−フェノキシ
)−プロパン−2−オール〕及びトランデート(Tra
ndate) (商標)(ラベタロール塩酸塩)により
影響されず、他方、血清中のノルアドレナリン及びアド
レナリンの作用はこれらの物質により抑制される。
プチドは、特にそれらが塩基性基より多数のカルボキシ
基を有する場合、金属塩又はアンモニウム塩、例えばア
ルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、例えばナトリウ
ム塩、カリウム塩、マグネシウム塩又はカルシウム塩、
さらには、アンモニア又は適当な有機アミンとのアンモ
ニウム塩を形成し、そして特に、脂肪族、脂環族、脂環
脂肪族又は芳香脂肪族の第一級、第二級又は第三級モノ
−、ジー又はポリ−アミン、そしてさらに脂環式塩基、
例えば低級アルギルアミン、例えばトリエチルアミン、
ヒドロキシ−低級アルキルアミン、例えば2−ヒドロキ
シエチルアミン、ビス−(2−ヒドロキシエチル)−ア
ミン、2−ヒドロキシエチル−ジエチルアミン又はトリ
ー(2−ヒドロキシエチル)−アミン、カルボン酸の塩
基性脂肪族エステル、例えば4−アミノ安息香酸2−ジ
エチルアミノエチルエステル、低級アルキレンアミン、
例えば1−エチルピペリジン、シクロアルキルアミン、
例えばジシルロヘキシルアミン、又はベンジルアミン、
例えばN、N’−ジベンジルエチレンジアミン、さらに
ピリジン型の塩基、例えばピリジン、コリジン又はキノ
リンとの塩を挙げることができる IQ−I Sモルの
投与量において、この発明のペプチドアミドは血管拡張
作用を有し、そして血圧の低下、並びに心拍数及び心筋
の収縮性の上昇をもたらす、これらの作用は交感神経系
の遮断剤、例えばメトプロロール〔1−イソプロピルア
ミノ−3−(4−(2−メトキシエチル)−フェノキシ
)−プロパン−2−オール〕及びトランデート(Tra
ndate) (商標)(ラベタロール塩酸塩)により
影響されず、他方、血清中のノルアドレナリン及びアド
レナリンの作用はこれらの物質により抑制される。
この発明のペプチド−アミド、例えばCGRP nの約
100〜11000nのポルス(bolus)注入は、
4μs/mlのノルアドレナリンの注入によりあらかじ
め収縮された、ラットの摘出され潅流された腸管膜層に
おいて、濃度の間数として、血管拡張を誘導する。血管
拡張は約5300Pas (40+*wHg)までの潅
流圧の低下において現われる。
100〜11000nのポルス(bolus)注入は、
4μs/mlのノルアドレナリンの注入によりあらかじ
め収縮された、ラットの摘出され潅流された腸管膜層に
おいて、濃度の間数として、血管拡張を誘導する。血管
拡張は約5300Pas (40+*wHg)までの潅
流圧の低下において現われる。
を髄を除去した(despinalised)ラット(
Gilleabie及びMuirSBrit、 J、
Pharmacol、 30.88−98(I967)
)において、1μg/kg/分の投与量で、この発明の
ペプチド−アミド、例えばCGRP nは、血圧を低下
せしめ、心拍数を約40/分増加し、そして交感神経系
の電気刺激により、及びアンジオテンシンパ又はアドレ
ナリン静脈内注射により惹起された昇圧効果を阻害する
。
Gilleabie及びMuirSBrit、 J、
Pharmacol、 30.88−98(I967)
)において、1μg/kg/分の投与量で、この発明の
ペプチド−アミド、例えばCGRP nは、血圧を低下
せしめ、心拍数を約40/分増加し、そして交感神経系
の電気刺激により、及びアンジオテンシンパ又はアドレ
ナリン静脈内注射により惹起された昇圧効果を阻害する
。
この発明のペプチド−アミドは、基礎的に、そしてさら
にベタネコール(bethanechol)又はヒスタ
ミンによる刺激の後に、胃液の分泌(分泌容量並びに酸
及びペプシンの放出)を抑制する。これらはまた、中枢
神経系にも作用する。
にベタネコール(bethanechol)又はヒスタ
ミンによる刺激の後に、胃液の分泌(分泌容量並びに酸
及びペプシンの放出)を抑制する。これらはまた、中枢
神経系にも作用する。
前記ペプチド−アミドはまたカルシウム低下活性を有す
る。すなわち、これらは血液中のカルシウム含量を低下
せしめ、そして鉱物質の損失から骨を保護する。
る。すなわち、これらは血液中のカルシウム含量を低下
せしめ、そして鉱物質の損失から骨を保護する。
上記の薬理学的活性のため、この発明のペプチド−アミ
ドは、医薬として、特に血管を拡張しそして組織血流を
増加せしめるため、並びに狭心症、高血圧、心臓不全又
は他の冠循環疾患に対して使用することができ、さらに
ヒト−カルシトニン、例えば商業的に入手可能なシバカ
ルジン(Cibacalcin) (商標)を使用する
のと同じ症状、例えば骨代謝不全、例えば骨粗に症又は
ページエンド病のために、使用することができる。
ドは、医薬として、特に血管を拡張しそして組織血流を
増加せしめるため、並びに狭心症、高血圧、心臓不全又
は他の冠循環疾患に対して使用することができ、さらに
ヒト−カルシトニン、例えば商業的に入手可能なシバカ
ルジン(Cibacalcin) (商標)を使用する
のと同じ症状、例えば骨代謝不全、例えば骨粗に症又は
ページエンド病のために、使用することができる。
投与量は約0.1〜50μg/kg体重、好ましくは約
1〜10μg/kg体重である。
1〜10μg/kg体重である。
約70kgの体重の温血動物、特にヒトに投与すべき量
は、1日当り約1μg〜約1000μg5好ましくは約
10μg〜約100μg1例えば約40μgである。
は、1日当り約1μg〜約1000μg5好ましくは約
10μg〜約100μg1例えば約40μgである。
投与は好ましくは非経腸的投与、例えば静脈内投与であ
り、1週間に5日、3箇月にわたって行う。
り、1週間に5日、3箇月にわたって行う。
この発明の化合物は、それ自体公知の方法により製造す
ることができる。
ることができる。
上記のペプチド、ペプチド−アミド、又はアシル化され
た末端アミノ基を有するそれらの誘導体の、この発明の
製造方法は次の変法により特徴付けられる。
た末端アミノ基を有するそれらの誘導体の、この発明の
製造方法は次の変法により特徴付けられる。
ta> 遊離カルボキシル基を有する前記化合物の断
片又はその反応性カルボン酸誘導体と、遊離アミノ基を
有する補完的断片又はその反応性誘導体とを反応せしめ
る(前記の断片中の遊離官能基は、反応に関与する2個
の基を除き、所望により保護された形で存在する)こと
により前記化合物中に存在するアミド結合を形成せしめ
、そして存在するかもしれない保護基を除去し;あるい
は、 (bl 分子内−又は分子間ジスルフィド橋を有する
前記化合物のいずれかを製造するために、システィン残
基のメルカプト基が遊離の形で存在するか、又はシステ
ィン残基のメルカプト基が反応条件下で除去される保護
基により保護されている前記化合物のいずれかを適当な
酸化剤により酸化し;あるいは、 (C1少なくとも1個の官能基が保護された形で存在す
る前記のペプチド、ペプチド−アミド、又はそれらのN
−アシル化誘導体において、存在する保iJ基を除去し
;あるいは、 (d) 前記のペプチドを製造するために、目的アミ
ノ酸配列をコードしそして発現制御配列により制御され
るDNA配列を含有する発現ベクターにより形質転換さ
れた宿主細胞を資化性の炭素源及び窒素源を含有する液
体栄養培地中で培養し、生成物を所望により宿主細胞か
ら遊離せしめそして単離し、そして必要であれば、得ら
れるかもしれない2量体又は多量体をジスルフィド結合
を開裂せしめるのに適当な還元剤と反応せしめ、そして
必要であれば、得られる還元された生成物をジスルフィ
ド結合の新たな形成に適当な酸化剤で処理し;あるいは
、 tel 前記のペプチド−アミドのいずれかを製造す
るために、目的ペプチド−アミドのアミノ酸配列に加え
て、該目的ペプチド−アミドの末端アミド基のN Hを
基に酵素的に分解され得るか又は適当な酵素の存在下で
アンモニアにより置換され得るアミノ酸ASAをC−末
端に有するペプチドを、場合によってはアンモニアの存
在下で、適当な酵素により処理し; 前記変法[a)〜(e)いずれかを実施した後で、得ら
れた塩を遊離化合物に、又は得られた遊離化合物をその
塩に転換する。
片又はその反応性カルボン酸誘導体と、遊離アミノ基を
有する補完的断片又はその反応性誘導体とを反応せしめ
る(前記の断片中の遊離官能基は、反応に関与する2個
の基を除き、所望により保護された形で存在する)こと
により前記化合物中に存在するアミド結合を形成せしめ
、そして存在するかもしれない保護基を除去し;あるい
は、 (bl 分子内−又は分子間ジスルフィド橋を有する
前記化合物のいずれかを製造するために、システィン残
基のメルカプト基が遊離の形で存在するか、又はシステ
ィン残基のメルカプト基が反応条件下で除去される保護
基により保護されている前記化合物のいずれかを適当な
酸化剤により酸化し;あるいは、 (C1少なくとも1個の官能基が保護された形で存在す
る前記のペプチド、ペプチド−アミド、又はそれらのN
−アシル化誘導体において、存在する保iJ基を除去し
;あるいは、 (d) 前記のペプチドを製造するために、目的アミ
ノ酸配列をコードしそして発現制御配列により制御され
るDNA配列を含有する発現ベクターにより形質転換さ
れた宿主細胞を資化性の炭素源及び窒素源を含有する液
体栄養培地中で培養し、生成物を所望により宿主細胞か
ら遊離せしめそして単離し、そして必要であれば、得ら
れるかもしれない2量体又は多量体をジスルフィド結合
を開裂せしめるのに適当な還元剤と反応せしめ、そして
必要であれば、得られる還元された生成物をジスルフィ
ド結合の新たな形成に適当な酸化剤で処理し;あるいは
、 tel 前記のペプチド−アミドのいずれかを製造す
るために、目的ペプチド−アミドのアミノ酸配列に加え
て、該目的ペプチド−アミドの末端アミド基のN Hを
基に酵素的に分解され得るか又は適当な酵素の存在下で
アンモニアにより置換され得るアミノ酸ASAをC−末
端に有するペプチドを、場合によってはアンモニアの存
在下で、適当な酵素により処理し; 前記変法[a)〜(e)いずれかを実施した後で、得ら
れた塩を遊離化合物に、又は得られた遊離化合物をその
塩に転換する。
次に、上記の変法を詳細に説明する。
11粧
この方法に従えば、最終生成物の合成における反応の最
終段階として分子の任意の位置でアミド結合が形成され
る。遊離カルボキシ基を有する前記の断片は、単一のア
ミノ酸、又はジー、オリゴ−もしくはポリペプチドのい
ずれであってもよく、あるいはアシル化された末端アミ
ノ基を有する誘導体である場合には、アシル化用カルポ
ジ酸、例えば特に酢酸であってもよい、遊離アミノ基を
有する前記の断片は単一のアミノ酸、ジー、オリゴ−も
しくはポリペプチドであり、又はペプチド−アミドをm
l造する場合にはさらにアミン、例えば特にアンモニア
である。
終段階として分子の任意の位置でアミド結合が形成され
る。遊離カルボキシ基を有する前記の断片は、単一のア
ミノ酸、又はジー、オリゴ−もしくはポリペプチドのい
ずれであってもよく、あるいはアシル化された末端アミ
ノ基を有する誘導体である場合には、アシル化用カルポ
ジ酸、例えば特に酢酸であってもよい、遊離アミノ基を
有する前記の断片は単一のアミノ酸、ジー、オリゴ−も
しくはポリペプチドであり、又はペプチド−アミドをm
l造する場合にはさらにアミン、例えば特にアンモニア
である。
好ましくは、この反応は一方の断片の反応性カルボン酸
誘導体と遊離アミノ基を有する補完断片とを反応せしめ
ることによって行われ、カルボン酸誘導体のカルボキシ
基の活性化はその場で行うことができる。
誘導体と遊離アミノ基を有する補完断片とを反応せしめ
ることによって行われ、カルボン酸誘導体のカルボキシ
基の活性化はその場で行うことができる。
反応性カルボン酸誘導体は特に、反応性活性化エステル
又は反応性無水物、さらには反応性環状アミドであり、
反応性酸誘導体はその場で形成することもできる。
又は反応性無水物、さらには反応性環状アミドであり、
反応性酸誘導体はその場で形成することもできる。
酸の活性化されたエステルは、特にエステル化基の連結
炭素原子において不飽和のエステル、例えば真のビニル
エステル(これらは、例えば、対応するエステルと酢酸
ビニルとのエステル交換により得ることができる;活性
化ビニルエステル法)、カルバモイルビニルエステル(
これらは、例えば、対応する酸をイソキサゾリウム試薬
で処理することにより得ることができる:1.2−オキ
サシリウム法、又はウードワート法)、又は1−低級ア
ルコキシビニルエステル(これらは、例えば、対応する
酸を低級アルコキシアセチレンで処理することによって
得ることができる;エトキシアセチレン法)、あるいは
アミジノタイプのエステル、例えばN、N’−ジ置換ア
ミジノエステル(これらは、例えば、対応する酸を適当
なN、N’−ジ置換カルボジイミド、例えばN、N’−
ジシクロへキシルカルボジイミドで処理することによっ
て得ることができる;カルボジイミド法)、又はN。
炭素原子において不飽和のエステル、例えば真のビニル
エステル(これらは、例えば、対応するエステルと酢酸
ビニルとのエステル交換により得ることができる;活性
化ビニルエステル法)、カルバモイルビニルエステル(
これらは、例えば、対応する酸をイソキサゾリウム試薬
で処理することにより得ることができる:1.2−オキ
サシリウム法、又はウードワート法)、又は1−低級ア
ルコキシビニルエステル(これらは、例えば、対応する
酸を低級アルコキシアセチレンで処理することによって
得ることができる;エトキシアセチレン法)、あるいは
アミジノタイプのエステル、例えばN、N’−ジ置換ア
ミジノエステル(これらは、例えば、対応する酸を適当
なN、N’−ジ置換カルボジイミド、例えばN、N’−
ジシクロへキシルカルボジイミドで処理することによっ
て得ることができる;カルボジイミド法)、又はN。
N′−ジ置換アミジノエステル(これらは、例えば、対
応する酸をN、N’−ジ置換シアンアミドで処理するこ
とによって得ることができる;シアンアミド法)、適当
な了り−ルエステル、特に電子吸引性置換基により適切
に置換されたフェニルエステル(これらは、例えば、対
応する酸を適当に置換されたフェノール、例走ば4−ニ
トロフェノール、4−メチルスルホニルフェノール、2
゜4.5−)リクロロフェノール、2 、3 、4 、
5゜6−ペンタクロロフェノールもしくは4−フェニル
ジ、アゾフェノールにより、縮合剤、例えばN。
応する酸をN、N’−ジ置換シアンアミドで処理するこ
とによって得ることができる;シアンアミド法)、適当
な了り−ルエステル、特に電子吸引性置換基により適切
に置換されたフェニルエステル(これらは、例えば、対
応する酸を適当に置換されたフェノール、例走ば4−ニ
トロフェノール、4−メチルスルホニルフェノール、2
゜4.5−)リクロロフェノール、2 、3 、4 、
5゜6−ペンタクロロフェノールもしくは4−フェニル
ジ、アゾフェノールにより、縮合剤、例えばN。
N′−ジシクロへキシルカルボジイミドの存在化で処理
することにより得ることができる;活性化アリールエス
テル法)、シアノメチルエステル(これらは、例えば、
対応する酸を塩基の存°在下でクロロアセトニトリルで
処理することにより得ることができる;シアノメチルエ
ステル法)、チオエステル、特に、例えばニトロにより
置換されている場合があるフェニルチオエステル(これ
らは、例えば、対応する酸を、場合によっては例えばニ
トロにより置換されているチオフェノールにより、特に
無水物法又はカルボジイミド法の助けにより処理するこ
とによって得ることができる;活性化チオールエステル
法)、アミノ又はアミドエステル(これらは、例えば、
対応する酸をN−ヒドロキシアミノ又はN−ヒトヒドロ
キシアミド化合物、例えばN−ヒドロキシサクシンイミ
ド、N−ヒドロキシピペリジン、N−ヒドロキシフタリ
ミド又は1−ヒドロキシベンゾトリアゾールにより、例
えば無水物法又はカルボジイミド法に従って処理するこ
とにより得ることができる;活性化N−ヒドロキシエス
テル法)、又はシリルエステル(これらは、例えば、対
応する酸をシリル化剤、例えばヘキサメチルジシラザン
で処理することによって得ることができ、そしてこれら
はヒドロキシ基とは容易に反応するがアミノ基とは反応
しない)である。
することにより得ることができる;活性化アリールエス
テル法)、シアノメチルエステル(これらは、例えば、
対応する酸を塩基の存°在下でクロロアセトニトリルで
処理することにより得ることができる;シアノメチルエ
ステル法)、チオエステル、特に、例えばニトロにより
置換されている場合があるフェニルチオエステル(これ
らは、例えば、対応する酸を、場合によっては例えばニ
トロにより置換されているチオフェノールにより、特に
無水物法又はカルボジイミド法の助けにより処理するこ
とによって得ることができる;活性化チオールエステル
法)、アミノ又はアミドエステル(これらは、例えば、
対応する酸をN−ヒドロキシアミノ又はN−ヒトヒドロ
キシアミド化合物、例えばN−ヒドロキシサクシンイミ
ド、N−ヒドロキシピペリジン、N−ヒドロキシフタリ
ミド又は1−ヒドロキシベンゾトリアゾールにより、例
えば無水物法又はカルボジイミド法に従って処理するこ
とにより得ることができる;活性化N−ヒドロキシエス
テル法)、又はシリルエステル(これらは、例えば、対
応する酸をシリル化剤、例えばヘキサメチルジシラザン
で処理することによって得ることができ、そしてこれら
はヒドロキシ基とは容易に反応するがアミノ基とは反応
しない)である。
酸無水物は、これらの酸の対称無水物又は混合無水物で
あり、例えば無機酸との無水物、例えば酸ハライド、特
に酸クロリド(これらは例えば、対応する酸を塩化チオ
ニル、五塩化リン又は塩化オキサリルで処理することに
より得られる;酸ハライド法)、アジド(これらは例え
ば、対応する酸エステルから対応するヒドラジドを介し
て、そしてこれを亜硝酸で処理することにより得られる
;アジド法)、炭酸手誘導体、例えば対応するエステル
、例えば炭酸低級アルキル半エステルとの無水物(これ
らは例えば、対応する酸をハロ蟻酸例えばクロロ蟻酸低
級アルキルエステルにより、又は1−低級アルコキシ力
ルボニルー2−低級アルコキシ−1,2−ジヒドロキノ
リン、例えば!−低級アルコキシカルボニルー2−エト
箪シー1゜2−ジヒドロキノリンで処理することにより
得られる;混合0−アルキル炭酸無水物法〕、又はジハ
ロゲン化、特にジ塩化リン酸との無水物(これらは例え
ば、対応する酸をオキシ塩化リンで処理することにより
得られる;オキシ塩化リン法)、又はf41酸との無水
物、例えば有機カルボン酸との無水物(これらは例えば
、対応する酸を、置換されている場合がある低級アルカ
ンカルボン酸ハライド又はフェニルアルカンカルボン酸
ハライド、例えばフェニル酢酸、ピバリン酸又はトリフ
ルオロ酢酸クロリドで処理することにより得られる;混
合カルボン酸無水物法)、又はf機スルホン酸との無水
物(これらは例えば、対応する酸の塩、例えばアルカリ
金属塩を、適当な有機スルホン酸ハライド、例えば低級
アルカンスルホン酸クロリド又はアリールスルホン酸ク
ロリド、例えばメタン−又はp−トルエン−スルホン酸
クロリドで処理することにより得られる;混合スルホン
酸無水物法)、さらには対称無水物(これらは例えば、
カルボジイミド又は1−ジエチルアミノプロビンの存在
下での対応する酸の縮合により得られる;対称無水物法
)である。
あり、例えば無機酸との無水物、例えば酸ハライド、特
に酸クロリド(これらは例えば、対応する酸を塩化チオ
ニル、五塩化リン又は塩化オキサリルで処理することに
より得られる;酸ハライド法)、アジド(これらは例え
ば、対応する酸エステルから対応するヒドラジドを介し
て、そしてこれを亜硝酸で処理することにより得られる
;アジド法)、炭酸手誘導体、例えば対応するエステル
、例えば炭酸低級アルキル半エステルとの無水物(これ
らは例えば、対応する酸をハロ蟻酸例えばクロロ蟻酸低
級アルキルエステルにより、又は1−低級アルコキシ力
ルボニルー2−低級アルコキシ−1,2−ジヒドロキノ
リン、例えば!−低級アルコキシカルボニルー2−エト
箪シー1゜2−ジヒドロキノリンで処理することにより
得られる;混合0−アルキル炭酸無水物法〕、又はジハ
ロゲン化、特にジ塩化リン酸との無水物(これらは例え
ば、対応する酸をオキシ塩化リンで処理することにより
得られる;オキシ塩化リン法)、又はf41酸との無水
物、例えば有機カルボン酸との無水物(これらは例えば
、対応する酸を、置換されている場合がある低級アルカ
ンカルボン酸ハライド又はフェニルアルカンカルボン酸
ハライド、例えばフェニル酢酸、ピバリン酸又はトリフ
ルオロ酢酸クロリドで処理することにより得られる;混
合カルボン酸無水物法)、又はf機スルホン酸との無水
物(これらは例えば、対応する酸の塩、例えばアルカリ
金属塩を、適当な有機スルホン酸ハライド、例えば低級
アルカンスルホン酸クロリド又はアリールスルホン酸ク
ロリド、例えばメタン−又はp−トルエン−スルホン酸
クロリドで処理することにより得られる;混合スルホン
酸無水物法)、さらには対称無水物(これらは例えば、
カルボジイミド又は1−ジエチルアミノプロビンの存在
下での対応する酸の縮合により得られる;対称無水物法
)である。
適当な環状アミドは特に、芳香族性の5員ジアザ環との
アミド、例えばイミダゾール類、例えばイミダゾールと
のアミド(これらは例えば、対応する酸をN、N’−カ
ルボニルジイミダゾールで処理することにより得られる
;イミダゾリド法)、又はピラゾール類、例えば3.5
−ジメチルピチゾールとのアミド(これらは例えば、ア
セチルアセトンで処理することにより酸ヒドラジドを介
して得られる;ピラゾール類)である。
アミド、例えばイミダゾール類、例えばイミダゾールと
のアミド(これらは例えば、対応する酸をN、N’−カ
ルボニルジイミダゾールで処理することにより得られる
;イミダゾリド法)、又はピラゾール類、例えば3.5
−ジメチルピチゾールとのアミド(これらは例えば、ア
セチルアセトンで処理することにより酸ヒドラジドを介
して得られる;ピラゾール類)である。
前記のように、カルボン酸誘導体はまた、その場合で形
成することもできる0例えば、遊離アミノ基を有する補
完断片と遊離カルボン酸を有するペプチド断片との混合
物を適当なN、N’−ジ置換カルボジイミド、例えばN
、N’−ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で反
応せしめることにより、N、N’−ジ置換アミジノエス
テルをその場で生成せしめることができる。さらに、N
。
成することもできる0例えば、遊離アミノ基を有する補
完断片と遊離カルボン酸を有するペプチド断片との混合
物を適当なN、N’−ジ置換カルボジイミド、例えばN
、N’−ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で反
応せしめることにより、N、N’−ジ置換アミジノエス
テルをその場で生成せしめることができる。さらに、N
。
N′−ジ置換カルボジイミド、例えばN、N’−ジシク
ロへキシルカルボジイミドの存在下で、そしてN−ヒド
ロキシアミン又はN−ヒドロキシアミド、例えばN−ヒ
ドロキシサクシンイミドの存在下で、場合によっては適
当な塩基、例えば4−ジメチルアミノピリジンの存在下
で、対応する酸出発@IJ!及びアミノ出発物質の混合
物を反応せしめることにより、アシル化されるべきアミ
ンの存在下で酸のアミノ又はアミドエステルを形成する
ことができる。
ロへキシルカルボジイミドの存在下で、そしてN−ヒド
ロキシアミン又はN−ヒドロキシアミド、例えばN−ヒ
ドロキシサクシンイミドの存在下で、場合によっては適
当な塩基、例えば4−ジメチルアミノピリジンの存在下
で、対応する酸出発@IJ!及びアミノ出発物質の混合
物を反応せしめることにより、アシル化されるべきアミ
ンの存在下で酸のアミノ又はアミドエステルを形成する
ことができる。
上記の方法に代えて、変法(a)はまた、遊離カルボキ
シ基を有する断片をアミノ酸が反応性形で存在する補完
断片と反応せしめることによっても実施することができ
る。アミノ基は、例えばホスフィト、例えばジエチルク
ロロホスフィト、1.1−フェニレンクロロホスフィト
、エチルジクロロホスフィト、エチレンクロロホスフィ
ト又はテトラエチルビロホスフイトとの反応により活性
化することができる。
シ基を有する断片をアミノ酸が反応性形で存在する補完
断片と反応せしめることによっても実施することができ
る。アミノ基は、例えばホスフィト、例えばジエチルク
ロロホスフィト、1.1−フェニレンクロロホスフィト
、エチルジクロロホスフィト、エチレンクロロホスフィ
ト又はテトラエチルビロホスフイトとの反応により活性
化することができる。
アミノ基はまた、ハロカルボニル、例えばクロロカルボ
ニルへの結合により活性化することができ、又はイソシ
アナート基の形で活性化することができる。
ニルへの結合により活性化することができ、又はイソシ
アナート基の形で活性化することができる。
前記の断片中の遊離官能基は特にカルボキシ基、アミノ
基、ヒドロキシ基、及びメルカプト基であり、これらは
、反応に関与すべきでない場合には、保護された形で存
在するのが好ましい。
基、ヒドロキシ基、及びメルカプト基であり、これらは
、反応に関与すべきでない場合には、保護された形で存
在するのが好ましい。
保護基、並びにその導入及び除去の方法は、例えば、”
Protective Groups in Org
anic Chemi−s try”、プレナムプレス
、ロンドン、ニューヨーク、 1973年; ”Met
hoden der organischen Che
mie’ 。
Protective Groups in Org
anic Chemi−s try”、プレナムプレス
、ロンドン、ニューヨーク、 1973年; ”Met
hoden der organischen Che
mie’ 。
ホーベン−ウニイル、第4版、Vol 45/1、ゲオ
ルグーチーメーフエルラーク、スタンニル基、1974
;及びTheodora H,Greens ”Pr
otective Groupsin Organic
5ynthesis” 、ジョンウイレー・アンド・
ソング、ニューヨーク、1981年、中に記載されてい
る。容易に、すなわち不所望の二次反応が生ずることな
く、例えば加溶媒分解、還元もしくは光分解により、又
は生理的条件下で除去され得ることが保護基の特徴であ
る。
ルグーチーメーフエルラーク、スタンニル基、1974
;及びTheodora H,Greens ”Pr
otective Groupsin Organic
5ynthesis” 、ジョンウイレー・アンド・
ソング、ニューヨーク、1981年、中に記載されてい
る。容易に、すなわち不所望の二次反応が生ずることな
く、例えば加溶媒分解、還元もしくは光分解により、又
は生理的条件下で除去され得ることが保護基の特徴であ
る。
ヒドロキシ−保護基は、例えばアシル基、例えば場合に
よっては置換されている、例えばハロ置換されている低
級アルカノイル、例えば2,2−ジクロロアセチル、又
は炭酸半エステルのアシル基、特にtert−ブトキシ
カルボニル、場合によっては置換されているベンジルオ
キシカルボニル又はジフェニルメトキシカルボニル、例
えば4−二トロペンジルオキシカルボニル、又は2−ハ
ロー低級アルコキシカルボニル、例えば2,2.2−ト
リクロロエトキシカルボニル、さらにトリチル又はホル
ミル、又は有機シリルもしくはスタンニル基、さらには
容易に除去され得るエーテル化基、例えばtert−低
級アルキル、例えばtert−ブチル、2−オキサ−も
しくは2−チア−脂肪族−もしくは−脂環族炭化水素基
、特にl−低級アルコキシー低級アルキルもしくは1−
低級アルキルチオー低級アルキル、例えばメトキシメチ
ル、l−メトキシエチル、1−エトキシエチル、メチル
チオメチル、1−メチルチオエチルもしくは1−エチル
チオエチル、又は5個もしくは6個の環原子を有する2
−オキサ−もしくは2−チア−シクロアルキル、テトラ
ヒドロフリルもしくは2−ヒドラヒドロピラニル、もし
くは対応するチア類似体、そしてさらに場合によっては
置換されているl−フェニル低級アルキル、例えば場合
によっては置換されているベンジル又はジフェニルメチ
ル(フェニル基の置換としては、例えばハロゲン、例え
ば塩素、低級アルコキシ、例えばメトキシ、及び/又は
ニトロが好ましい)である。
よっては置換されている、例えばハロ置換されている低
級アルカノイル、例えば2,2−ジクロロアセチル、又
は炭酸半エステルのアシル基、特にtert−ブトキシ
カルボニル、場合によっては置換されているベンジルオ
キシカルボニル又はジフェニルメトキシカルボニル、例
えば4−二トロペンジルオキシカルボニル、又は2−ハ
ロー低級アルコキシカルボニル、例えば2,2.2−ト
リクロロエトキシカルボニル、さらにトリチル又はホル
ミル、又は有機シリルもしくはスタンニル基、さらには
容易に除去され得るエーテル化基、例えばtert−低
級アルキル、例えばtert−ブチル、2−オキサ−も
しくは2−チア−脂肪族−もしくは−脂環族炭化水素基
、特にl−低級アルコキシー低級アルキルもしくは1−
低級アルキルチオー低級アルキル、例えばメトキシメチ
ル、l−メトキシエチル、1−エトキシエチル、メチル
チオメチル、1−メチルチオエチルもしくは1−エチル
チオエチル、又は5個もしくは6個の環原子を有する2
−オキサ−もしくは2−チア−シクロアルキル、テトラ
ヒドロフリルもしくは2−ヒドラヒドロピラニル、もし
くは対応するチア類似体、そしてさらに場合によっては
置換されているl−フェニル低級アルキル、例えば場合
によっては置換されているベンジル又はジフェニルメチ
ル(フェニル基の置換としては、例えばハロゲン、例え
ば塩素、低級アルコキシ、例えばメトキシ、及び/又は
ニトロが好ましい)である。
カルボキシ基は一般にエステル化形で保護され、このよ
うなエステル基は穏和な条件下で容易に開裂され得る。
うなエステル基は穏和な条件下で容易に開裂され得る。
この態様で保護されているカルボキシ基は、エステル化
基として特に、1−位において分枝しているか、又はl
−位もしくは2−位において適切に置換されている低級
アルキル基を含有する。エステル化された形の好ましい
カルボキシ基は特に、tert−低級アルコキシカルボ
ニル、例えばtert−ブトキシカルボニル、1個もし
くは2個の了り−ル基を有する了り−ルメトキシ力ルボ
ニル(このアリール基は、場合によっては、1級アルキ
ルにより、例えばtert−低級アルキル、例えばte
rt−ブチルにより、低級アルコキシ、例えばメトキシ
により、ヒドロキシ、ハロゲン、例えば塩素、そして/
又はニトロによりモノ−又はポリ−置換されている)、
例えば上記のように置換されている場合があるベンジル
オキシカルボニル、例えば4−メトキシベンジルオキシ
カルボニルもしくは4−ニトロベンジルオキシカルボニ
ル、又は場合によっては例えば前記のように置換されて
いるジフェニルメトキシカルボニル、例えばジフェニル
メトキシカルボニルもしくはジー(4−メトキシフェニ
ル)−メトキシカルボニル、1−低級アルコキシー低級
アルコキシカルボニル、例えばメトキシメトキシカルボ
ニル、1−メトキシエトキシカルボニルもしくは1−エ
トキシメトキシカルボニル、1−低級アルキルチオー低
級アルコキシカルボニル、例えばl−メチルチオメトキ
ジカルボニルもしくはl−エトキシチオエトキシカルボ
ニル、アロイルメトキシカルボニル(70イル基は、場
合によってはハロゲン、例えば臭素により置換されてい
るベンゾイルである)、例えばフェナシルオキシカルボ
ニル、2−ハロー低級アルコキシカルボニル、例えば2
.2.2−)リクロロエトキシカルボニル、2−ブロモ
エトキシカルボニルもしくは2−ヨードエトキシカルボ
ニル、又は2−(トリ置換シリル)−エトキシカルボニ
ル(ここで、各置換基は、他とは独立に、場合によって
は例えば低級アルキル、低級アルコキシ、アリール、ハ
ロゲン及び/又はニトロにより置換されている、脂肪族
、芳香−脂肪族、脂環族、脂環族又は芳香族炭化水素基
、例えば、場合によっては置換されている対応する低級
アルキル、フェニル−低級アルキル、シクロアルキル又
はフェニルである)、例えば2−トリー低級アルキルシ
リルエトキシカルボニル、例えば2−トリメチルシリル
エトキシカルボニルもしくは2−(ジ−n−ブチルメチ
ルシリル)−エトキシカルボニル、又は2−トリアリー
ルシリルエトキシカルボニル、例えば2−トリフェニル
シリルエトキシカルボニルで、ある。
基として特に、1−位において分枝しているか、又はl
−位もしくは2−位において適切に置換されている低級
アルキル基を含有する。エステル化された形の好ましい
カルボキシ基は特に、tert−低級アルコキシカルボ
ニル、例えばtert−ブトキシカルボニル、1個もし
くは2個の了り−ル基を有する了り−ルメトキシ力ルボ
ニル(このアリール基は、場合によっては、1級アルキ
ルにより、例えばtert−低級アルキル、例えばte
rt−ブチルにより、低級アルコキシ、例えばメトキシ
により、ヒドロキシ、ハロゲン、例えば塩素、そして/
又はニトロによりモノ−又はポリ−置換されている)、
例えば上記のように置換されている場合があるベンジル
オキシカルボニル、例えば4−メトキシベンジルオキシ
カルボニルもしくは4−ニトロベンジルオキシカルボニ
ル、又は場合によっては例えば前記のように置換されて
いるジフェニルメトキシカルボニル、例えばジフェニル
メトキシカルボニルもしくはジー(4−メトキシフェニ
ル)−メトキシカルボニル、1−低級アルコキシー低級
アルコキシカルボニル、例えばメトキシメトキシカルボ
ニル、1−メトキシエトキシカルボニルもしくは1−エ
トキシメトキシカルボニル、1−低級アルキルチオー低
級アルコキシカルボニル、例えばl−メチルチオメトキ
ジカルボニルもしくはl−エトキシチオエトキシカルボ
ニル、アロイルメトキシカルボニル(70イル基は、場
合によってはハロゲン、例えば臭素により置換されてい
るベンゾイルである)、例えばフェナシルオキシカルボ
ニル、2−ハロー低級アルコキシカルボニル、例えば2
.2.2−)リクロロエトキシカルボニル、2−ブロモ
エトキシカルボニルもしくは2−ヨードエトキシカルボ
ニル、又は2−(トリ置換シリル)−エトキシカルボニ
ル(ここで、各置換基は、他とは独立に、場合によって
は例えば低級アルキル、低級アルコキシ、アリール、ハ
ロゲン及び/又はニトロにより置換されている、脂肪族
、芳香−脂肪族、脂環族、脂環族又は芳香族炭化水素基
、例えば、場合によっては置換されている対応する低級
アルキル、フェニル−低級アルキル、シクロアルキル又
はフェニルである)、例えば2−トリー低級アルキルシ
リルエトキシカルボニル、例えば2−トリメチルシリル
エトキシカルボニルもしくは2−(ジ−n−ブチルメチ
ルシリル)−エトキシカルボニル、又は2−トリアリー
ルシリルエトキシカルボニル、例えば2−トリフェニル
シリルエトキシカルボニルで、ある。
前記の及び後記の有機シリル基又はスタンニル基は、珪
素原子又は錫原子の置換基として、好ましくはアルキル
、特にメチルを含有する。対応するシリル又はスタンニ
ル基は、特にトリー低級アルキルシリル、特にトリメチ
ルシリル、さらにジメチル−tert−ブチルシリル、
又は対応して置換されたスタンニル、例えばトリーn−
ブチルスタンニルである。
素原子又は錫原子の置換基として、好ましくはアルキル
、特にメチルを含有する。対応するシリル又はスタンニ
ル基は、特にトリー低級アルキルシリル、特にトリメチ
ルシリル、さらにジメチル−tert−ブチルシリル、
又は対応して置換されたスタンニル、例えばトリーn−
ブチルスタンニルである。
好ましい保護されたカルボキシ基ばtert−低級アル
コキシカルボニル、例えばLert−ブトキシカルボニ
ル、そして特に、例えば前記のように置換されている場
合があるベンジルオキシカルボニル又はジフェニルメト
キシカルボニル、例えば4−ニトロベンジルオキシカル
ボニル、そして特に2−(トリメチルシリル)−エトキ
シカルボニル、さらには4−ベンジルオキシカルボニル
ベンジルオキシカルボニルであり、ここで最初に記載し
たベンジルオキシカルボニル基はポリマーに、すなワチ
例えばジビニルベンゼンにより架橋されたポリスチレン
に連結されている。
コキシカルボニル、例えばLert−ブトキシカルボニ
ル、そして特に、例えば前記のように置換されている場
合があるベンジルオキシカルボニル又はジフェニルメト
キシカルボニル、例えば4−ニトロベンジルオキシカル
ボニル、そして特に2−(トリメチルシリル)−エトキ
シカルボニル、さらには4−ベンジルオキシカルボニル
ベンジルオキシカルボニルであり、ここで最初に記載し
たベンジルオキシカルボニル基はポリマーに、すなワチ
例えばジビニルベンゼンにより架橋されたポリスチレン
に連結されている。
保護されたアミノ基は、例えば、容易に開裂され得るア
シルアミノ、了り−ルメチルアミノ、エーテル化メルカ
プトアミノ、2−アシル−低級アルカ−1−エニルアミ
ノ、シリルアミノ又はスタンニルアミノ基の形、又はア
ジド基の形であることができる。
シルアミノ、了り−ルメチルアミノ、エーテル化メルカ
プトアミノ、2−アシル−低級アルカ−1−エニルアミ
ノ、シリルアミノ又はスタンニルアミノ基の形、又はア
ジド基の形であることができる。
対応するアシルアミノ基において、アシルは例えば、炭
素原子数が例えば18個以下である有機カルボン酸のア
シル基、特に、場合によっては例えばハロゲンもしくは
アリールにより置換されているアルカンカルボン酸のア
シル基、場合によっては例えばハロゲン、低級アルコキ
シもしくはニトロにより置換されている安息香酸のアシ
ル基、又は炭酸半エステルのアシル基である。このよう
なアシル基は例えば、低級アルカノイル、例えばホルミ
ル、アセチルもしくはプロピオニル、ハロー低級アルカ
ノイル、例えば2−ハロアセチル、特に2−クロロ−1
2−ブロモー、2−ヨード、2.2.2−)リフルオロ
−もしくは2,2.2−トリクロロ−アセチル、場合に
よっては例えばハロゲン、低級アルコキシもしくはニト
ロにより置換されているベンゾイル、例えばベンゾイル
、4−クロロベンゾイル、4−メトキシベンゾイルもし
くは4−ニトロベンゾイル、又は低級アルキル基の1−
位において分枝しているか又は1−位もしくは2、位に
おいて適切に置換されている低級アルコキシカルボニル
、特にter を−低級アルコキシカルボニル、例えば
tert−ブトキシカルボニル、アリールメトキシカル
ボニル(これは1個又は2個の7リール基を有し、この
アリール基は、場合によっては低級アルキル、特にte
r を−低級アルキル、例えばtert−ブチル、低級
アルコキシ、例えばメトキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、
例えば塩素、及び/又はニトロによりモノ−又はポリ−
置換されているフェニルである)、例えば場合によって
は置換されているベンジルオキシカルボニル、例えば4
−ニトロベンジルオキシカルボニル、又は置換されたジ
フェニルメトキシカルボニル、例えばベンズヒドリルオ
キシカルボニル又はジー(4−メトキシフェニル)−メ
トキシカルボニル、アロイルメトキシカルボニル(ここ
で、アロイル基は好ましくは、場合によってはハロゲン
、例えば臭素により置換されているベンゾイルである)
、例えばフェナシルオキシカルボニル、2−ハロー低級
アルコキシカルボニル、例えば2.2.2−トリクロロ
エトキシカルボニル、2−ブロモエトキシカルボニルも
しくは2−ヨードエトキシカルボニル、又は2−(トリ
ー置換シリル)−エトキシカルボニル(ここで、各置換
基は、他とは独立に、脂肪族、芳香−脂肪族、脂環族又
は芳香族の炭化水素基であり、この基は15個以下の炭
素原子を有しそして場合によっては例えば低級アルキル
、低級アルコキシ、アリール、ハロゲンモジくはニトロ
により置換されており、そして例えば、場合によっては
置換されている低級アルキル、フェニル低級アルキル、
シクロアルキル又はフェニルである)、例えばトリーア
ルキルシリルエトキシカルボニル、例えば2−トリメチ
ルシリルエトキシカルボニルもしくは2−(ジ−n−ブ
チルメチルシリル)−エトキシカルボニル、又は2−ト
リアリールシリルエトキシカルボニル、例えば2−トリ
フェニルシリルエトキシカルボニルである。
素原子数が例えば18個以下である有機カルボン酸のア
シル基、特に、場合によっては例えばハロゲンもしくは
アリールにより置換されているアルカンカルボン酸のア
シル基、場合によっては例えばハロゲン、低級アルコキ
シもしくはニトロにより置換されている安息香酸のアシ
ル基、又は炭酸半エステルのアシル基である。このよう
なアシル基は例えば、低級アルカノイル、例えばホルミ
ル、アセチルもしくはプロピオニル、ハロー低級アルカ
ノイル、例えば2−ハロアセチル、特に2−クロロ−1
2−ブロモー、2−ヨード、2.2.2−)リフルオロ
−もしくは2,2.2−トリクロロ−アセチル、場合に
よっては例えばハロゲン、低級アルコキシもしくはニト
ロにより置換されているベンゾイル、例えばベンゾイル
、4−クロロベンゾイル、4−メトキシベンゾイルもし
くは4−ニトロベンゾイル、又は低級アルキル基の1−
位において分枝しているか又は1−位もしくは2、位に
おいて適切に置換されている低級アルコキシカルボニル
、特にter を−低級アルコキシカルボニル、例えば
tert−ブトキシカルボニル、アリールメトキシカル
ボニル(これは1個又は2個の7リール基を有し、この
アリール基は、場合によっては低級アルキル、特にte
r を−低級アルキル、例えばtert−ブチル、低級
アルコキシ、例えばメトキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、
例えば塩素、及び/又はニトロによりモノ−又はポリ−
置換されているフェニルである)、例えば場合によって
は置換されているベンジルオキシカルボニル、例えば4
−ニトロベンジルオキシカルボニル、又は置換されたジ
フェニルメトキシカルボニル、例えばベンズヒドリルオ
キシカルボニル又はジー(4−メトキシフェニル)−メ
トキシカルボニル、アロイルメトキシカルボニル(ここ
で、アロイル基は好ましくは、場合によってはハロゲン
、例えば臭素により置換されているベンゾイルである)
、例えばフェナシルオキシカルボニル、2−ハロー低級
アルコキシカルボニル、例えば2.2.2−トリクロロ
エトキシカルボニル、2−ブロモエトキシカルボニルも
しくは2−ヨードエトキシカルボニル、又は2−(トリ
ー置換シリル)−エトキシカルボニル(ここで、各置換
基は、他とは独立に、脂肪族、芳香−脂肪族、脂環族又
は芳香族の炭化水素基であり、この基は15個以下の炭
素原子を有しそして場合によっては例えば低級アルキル
、低級アルコキシ、アリール、ハロゲンモジくはニトロ
により置換されており、そして例えば、場合によっては
置換されている低級アルキル、フェニル低級アルキル、
シクロアルキル又はフェニルである)、例えばトリーア
ルキルシリルエトキシカルボニル、例えば2−トリメチ
ルシリルエトキシカルボニルもしくは2−(ジ−n−ブ
チルメチルシリル)−エトキシカルボニル、又は2−ト
リアリールシリルエトキシカルボニル、例えば2−トリ
フェニルシリルエトキシカルボニルである。
アミノ−保護基としての他のアシル基はさらに、を機リ
ン酸、ホスホン酸又はホスフィン酸の対応する基、例え
ばジー低級アルキルホスホリル、例えばジメチルホスホ
リル、ジエチルホスホリル、ジ−n−プロピルホスホリ
ルもしくはジイソプロピルホスホリル、ジシクロアルキ
ルホスホリル、例えばジシクロへキシルホスホリル、場
合によっては置換されているジフェニルホスホリル、例
えばジフェニルホスホリル、場合によっては例えばニト
ロにより置換されているジー(フェニル−低級アルキル
)−ホスホリル、例えばジベンジルホスホリルもしくは
ジー(4−ニトロベンジル)−ホスホリル、場合によっ
ては置換されているフェノキシフェニルホスホリル、例
えばフェノキシフェニルホスホリル、ジー低級アルキル
ホスフィニル、例えばジエチルホスフィニル、例えば場
合によっては置換されているジフェニルホスフィニル、
例えばジフェニルホスフィニルを挙げることができる。
ン酸、ホスホン酸又はホスフィン酸の対応する基、例え
ばジー低級アルキルホスホリル、例えばジメチルホスホ
リル、ジエチルホスホリル、ジ−n−プロピルホスホリ
ルもしくはジイソプロピルホスホリル、ジシクロアルキ
ルホスホリル、例えばジシクロへキシルホスホリル、場
合によっては置換されているジフェニルホスホリル、例
えばジフェニルホスホリル、場合によっては例えばニト
ロにより置換されているジー(フェニル−低級アルキル
)−ホスホリル、例えばジベンジルホスホリルもしくは
ジー(4−ニトロベンジル)−ホスホリル、場合によっ
ては置換されているフェノキシフェニルホスホリル、例
えばフェノキシフェニルホスホリル、ジー低級アルキル
ホスフィニル、例えばジエチルホスフィニル、例えば場
合によっては置換されているジフェニルホスフィニル、
例えばジフェニルホスフィニルを挙げることができる。
モノ−、ジー、又は特にトリーアリールメチルアミノ基
である了り−・ルメチルアミノ基において了り−ル基は
特に、置換されている場合があるフェニル基である。こ
のような基は、例えばベンジルアミノ、ジフェニルメチ
ルアミノ、及び特にトリチル了ミノである。
である了り−・ルメチルアミノ基において了り−ル基は
特に、置換されている場合があるフェニル基である。こ
のような基は、例えばベンジルアミノ、ジフェニルメチ
ルアミノ、及び特にトリチル了ミノである。
エーテル化メルカプト基により保護されたアミノ基中の
エーテル化メルカプ)Mは特にアリールチオ基又はアリ
ール−低級アルキルチオ基であり、ここでアリールは特
に、場合によっては例えば低級アルキル、例えばメチル
もしくはtert−ブチル、低級アルコキシ、例えばメ
トキシ、ハロゲン、例えば塩素、及び/又はニトロによ
り置換されているフェニルである。対応するアミノ保護
基は例えば4−ニトロフェニルチオである。
エーテル化メルカプ)Mは特にアリールチオ基又はアリ
ール−低級アルキルチオ基であり、ここでアリールは特
に、場合によっては例えば低級アルキル、例えばメチル
もしくはtert−ブチル、低級アルコキシ、例えばメ
トキシ、ハロゲン、例えば塩素、及び/又はニトロによ
り置換されているフェニルである。対応するアミノ保護
基は例えば4−ニトロフェニルチオである。
アミノ保護基として使用することができる2−アシル−
低級アルカ−1−エン−1−イル基において、アシルは
例えば低級アルカンカルボン酸のアシル基、安息香酸(
これは場合によっては例えば低級アルキル、例えばメチ
ルもしくはtert−ブチル、低級アルコキシ、例えば
メトキシ、ハロゲン、例えば塩素、及び/又はニトロに
より置換されている)のアシル基、又は特に炭酸半エス
テル、例えば炭酸低級アルキル半エステルのアシル基で
ある。対応する保護基は特に、1−低級アルカノイルプ
ロプ−l−エン−2−イル、例えばl−アセチルプロプ
−1−エン−2−イル、又は1−低級アルコキシカルボ
ニルプロプ−1−エン−2−イル、例えば1−エトキシ
−カルボニルプロプ−1−エン−2−イルである。
低級アルカ−1−エン−1−イル基において、アシルは
例えば低級アルカンカルボン酸のアシル基、安息香酸(
これは場合によっては例えば低級アルキル、例えばメチ
ルもしくはtert−ブチル、低級アルコキシ、例えば
メトキシ、ハロゲン、例えば塩素、及び/又はニトロに
より置換されている)のアシル基、又は特に炭酸半エス
テル、例えば炭酸低級アルキル半エステルのアシル基で
ある。対応する保護基は特に、1−低級アルカノイルプ
ロプ−l−エン−2−イル、例えばl−アセチルプロプ
−1−エン−2−イル、又は1−低級アルコキシカルボ
ニルプロプ−1−エン−2−イル、例えば1−エトキシ
−カルボニルプロプ−1−エン−2−イルである。
アミノ基はまたプロトン化形で保護することができ、対
応する陰イオンとして特に、強無機酸の陰イオン、例え
ば塩素イオンもしくは臭素イオン、又は有機スルホン酸
は、例えばp−トルエンスルホン酸の陰イオンが挙げら
れる。
応する陰イオンとして特に、強無機酸の陰イオン、例え
ば塩素イオンもしくは臭素イオン、又は有機スルホン酸
は、例えばp−トルエンスルホン酸の陰イオンが挙げら
れる。
好ましいアミノ−保ffMは、炭酸半エステルのアシル
基、特にter t−ブトキシカルボニル、又はベンジ
ルオキシカルボニルもしくはジフェニルメトキシカルボ
ニル(これらのそれぞれは、場合によっては例えば前記
のように置換されている)、例えば4−ニトロベンジル
オキシカルボニル、又は2−ハロー低級アルコキシカル
ボニル、例えば2.2.2−トリクロロエトキシカルボ
ニル、さらにはトリチル又はホルミルである。
基、特にter t−ブトキシカルボニル、又はベンジ
ルオキシカルボニルもしくはジフェニルメトキシカルボ
ニル(これらのそれぞれは、場合によっては例えば前記
のように置換されている)、例えば4−ニトロベンジル
オキシカルボニル、又は2−ハロー低級アルコキシカル
ボニル、例えば2.2.2−トリクロロエトキシカルボ
ニル、さらにはトリチル又はホルミルである。
メルカプト基、例えばシスティン中のメルカプト基は、
場合によっては置換されているアルキル基によるS−ア
ルキル化によって、チオアセタール形成によって、S−
アシル化によって、又は非対称ジスルフィド基の形成に
よって保護することができる。好ましいメルカプト−保
護基は、例えば、場合によってはフェニル基において例
えばメトキシもしくはニトロにより置換されているベン
ジル基、例えば4−メトキシベンジル、場合によっては
フェニル成分において例えばメトキシにより置換されて
いるジフェニルメチル、例えば4゜4′−ジメトキシ−
ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、トリメチルシ
リル、ベンジルチオメチル、テトラヒドロピラニル、ア
シルアミツメチク、例えばアセチルアミノメチル、ベン
ゾイル、ベンジルオキシカルボニル又はアミノカルボニ
ル、例えばエチルアミノカルボニルである。
場合によっては置換されているアルキル基によるS−ア
ルキル化によって、チオアセタール形成によって、S−
アシル化によって、又は非対称ジスルフィド基の形成に
よって保護することができる。好ましいメルカプト−保
護基は、例えば、場合によってはフェニル基において例
えばメトキシもしくはニトロにより置換されているベン
ジル基、例えば4−メトキシベンジル、場合によっては
フェニル成分において例えばメトキシにより置換されて
いるジフェニルメチル、例えば4゜4′−ジメトキシ−
ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、トリメチルシ
リル、ベンジルチオメチル、テトラヒドロピラニル、ア
シルアミツメチク、例えばアセチルアミノメチル、ベン
ゾイル、ベンジルオキシカルボニル又はアミノカルボニ
ル、例えばエチルアミノカルボニルである。
第一カルボン酸アミド基(−CONH*)は、例えばN
−(9−キサンセニル)誘導体の形で、又はN−(モノ
−、ジー又はトリーアリールメチル)誘導体の形で保護
され、ここでアリールは特に非置換フェニル、又は5個
以下の同一の又は異る置換基により置換されたフェニル
である。このようなフェニル置換基は好ましくは低級ア
ルキル、例えばメチル、低級アルコキシ、例えばメトキ
シ、又はさらにポリマー担体である。このような了り−
ルメチル保護基の例として4−メトキシベンジル、2.
4.6−)リメトキシベンジル、ジフェニルメチル、ジ
ー(4゛−メトキシフェニル)−メチル、ジー(4−メ
チルフェニル)−メチル、及び(4−メチルフェニル)
−((ポリマー担体〕−フェニル)−メチルを挙げるこ
とができる。
−(9−キサンセニル)誘導体の形で、又はN−(モノ
−、ジー又はトリーアリールメチル)誘導体の形で保護
され、ここでアリールは特に非置換フェニル、又は5個
以下の同一の又は異る置換基により置換されたフェニル
である。このようなフェニル置換基は好ましくは低級ア
ルキル、例えばメチル、低級アルコキシ、例えばメトキ
シ、又はさらにポリマー担体である。このような了り−
ルメチル保護基の例として4−メトキシベンジル、2.
4.6−)リメトキシベンジル、ジフェニルメチル、ジ
ー(4゛−メトキシフェニル)−メチル、ジー(4−メ
チルフェニル)−メチル、及び(4−メチルフェニル)
−((ポリマー担体〕−フェニル)−メチルを挙げるこ
とができる。
グアニジノ基は例えばトルエンスルホネートの形で保護
される。
される。
この明細書において、保護基、例えば特にカルボキシ保
護基、さらに保護されるべき官能基例えば特にカルボキ
シ基と結合するポリマー担体は、容易に除去することが
でき、例えばメリフィールド合成のために適当なものと
して理解される。このタイプの適当なポリマー担体は、
例えば、ジビニルベンゼンとの共重合により弱く架橋さ
れたポリスチレン樹脂であり、この樹脂はペプチド残基
の可逆的結合のために適当な棚要素を担持する。
護基、さらに保護されるべき官能基例えば特にカルボキ
シ基と結合するポリマー担体は、容易に除去することが
でき、例えばメリフィールド合成のために適当なものと
して理解される。このタイプの適当なポリマー担体は、
例えば、ジビニルベンゼンとの共重合により弱く架橋さ
れたポリスチレン樹脂であり、この樹脂はペプチド残基
の可逆的結合のために適当な棚要素を担持する。
反応はそれ自体既知の方法で行うことができ、反応条件
は特に反応に関与するカルボキシ基が活性化されている
か否か、そしていかに活性化されているかに依存し、通
常は適当な溶剤もしくは稀釈剤又はこれらの混合物の存
在下で、そして必要であれば縮合剤(これは例えば、反
応に関与するカルボキシ基が無水物の形で存在すれば、
さらに酸結合剤であってもよい)の存在下で、冷却又は
加熱しながら、例えば約−30℃〜約+150℃の温度
範囲において、密閉反応容器中でそして/又は不活性ガ
ス、例えば窒素の雰囲気中で行う、一般的縮合剤は、例
えばカルボジイミド、例えばN。
は特に反応に関与するカルボキシ基が活性化されている
か否か、そしていかに活性化されているかに依存し、通
常は適当な溶剤もしくは稀釈剤又はこれらの混合物の存
在下で、そして必要であれば縮合剤(これは例えば、反
応に関与するカルボキシ基が無水物の形で存在すれば、
さらに酸結合剤であってもよい)の存在下で、冷却又は
加熱しながら、例えば約−30℃〜約+150℃の温度
範囲において、密閉反応容器中でそして/又は不活性ガ
ス、例えば窒素の雰囲気中で行う、一般的縮合剤は、例
えばカルボジイミド、例えばN。
N′−ジエチル−1N、N’−ジプロピル、N。
N′−ジシクロへキシル−もしくはN−エチル−N’−
(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、適当
なカルボニル化合物、例えばカルボニルジイミダゾール
、又は1.2−オキサシリウム化合物、例えば2−エチ
ル−5−フェニル−1゜2−オキサシリウム−3′−ス
ルホネート及び2−tert−ブチル−5−メチルーイ
ソオキサゾルリウムパークロレート、又は適当なアシル
アミノ化合物、例えば2−エトキシ−!−エトキシカル
ボニルー1.2−ジヒドロキノリンである。一般的酸結
合縮合剤は、例えばアルカリ金属の炭酸塩又は炭酸水素
塩、例えばナトリウム又はカリウムの炭酸塩又は炭酸水
素塩(通常は硫酸塩と共に)、又は有機塩基、例えば一
般的に、立体障害されたトリー低級アルキルアミン、例
えばN、N’−ジイソプロピル−N−エチルアミンであ
る。
(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、適当
なカルボニル化合物、例えばカルボニルジイミダゾール
、又は1.2−オキサシリウム化合物、例えば2−エチ
ル−5−フェニル−1゜2−オキサシリウム−3′−ス
ルホネート及び2−tert−ブチル−5−メチルーイ
ソオキサゾルリウムパークロレート、又は適当なアシル
アミノ化合物、例えば2−エトキシ−!−エトキシカル
ボニルー1.2−ジヒドロキノリンである。一般的酸結
合縮合剤は、例えばアルカリ金属の炭酸塩又は炭酸水素
塩、例えばナトリウム又はカリウムの炭酸塩又は炭酸水
素塩(通常は硫酸塩と共に)、又は有機塩基、例えば一
般的に、立体障害されたトリー低級アルキルアミン、例
えばN、N’−ジイソプロピル−N−エチルアミンであ
る。
保護基、例えばカルボキシ−、アミノ−、ヒドロキシ−
、カルボン酸アミド−又はメルカプト−保護基の除去は
、それ自体既知の方法により、例えば加溶媒分解により
、特に加水分解、アルコール分解もしくは酸分解により
、又は還元により、特に水素化もしくは化学的還元によ
り、場合によっては複数段階で又は同時的に行われる。
、カルボン酸アミド−又はメルカプト−保護基の除去は
、それ自体既知の方法により、例えば加溶媒分解により
、特に加水分解、アルコール分解もしくは酸分解により
、又は還元により、特に水素化もしくは化学的還元によ
り、場合によっては複数段階で又は同時的に行われる。
さらに、酵素的方法を用いることも可能である。
すなわち、tar を−低級アルコキシカルボニル、又
は2−位において有機シリル基によりもしくは1−位に
おいて低級アルコキシもしくは低級アルキルチオにより
置換されている低級アルコキシカルボニル、又は場合に
よっては置換されているジ 。
は2−位において有機シリル基によりもしくは1−位に
おいて低級アルコキシもしくは低級アルキルチオにより
置換されている低級アルコキシカルボニル、又は場合に
よっては置換されているジ 。
フェニルメトキシカルボニルは、例えば適当な酸、例え
ば蟻酸又はトリフルオロ酢酸で処理することにより、場
合によってはa核性化合物、例えばフェノール又はアニ
ソールを添加して、遊離のカルボキシに転換することが
できる。場合によっては置換されているベンジルオキシ
カルボニルは、例えば水素化分解により、すなわち、金
属性水素化触媒、例えばパラジウム触媒の存在下で水素
で処理することにより、遊離せしめることができる。
ば蟻酸又はトリフルオロ酢酸で処理することにより、場
合によってはa核性化合物、例えばフェノール又はアニ
ソールを添加して、遊離のカルボキシに転換することが
できる。場合によっては置換されているベンジルオキシ
カルボニルは、例えば水素化分解により、すなわち、金
属性水素化触媒、例えばパラジウム触媒の存在下で水素
で処理することにより、遊離せしめることができる。
さらに、適切に1F換されたベンジルオキシカルボニル
、例えば4−ニトロベンジルオキシカルボニルはまた、
化学還元により、例えばアルカリ金属ジチオニド、例え
ばナトリウムジチオニドで、又は還元性金属塩、例えば
クロム(■)塩、例えば塩化クロム(n)で処理するこ
とにより、通常は、水素を生成しそして金属と共に発生
期の水素を発生することができる薬剤、例えば、場合に
よっては例えばヒドロキシにより置換されている低級ア
ルカンカルボン酸、例えば酢酸、蟻酸、グリコール酸、
ジフェニルグリコール酸、乳酸、マンデル酸、4−クロ
ロマンデル酸もしくは酒石酸、又はアルコールもしくは
チオール(水を添加するのが好ましい)の存在下で、遊
離カルボキシに転換することもできる。上記のように、
還元性金属又は金属塩で処理することにより、2−ハロ
ー低級フルコキシカルボニル(場合によっては2−ブロ
モ−低級アルコキシカルボニル基を対応する2−ヨード
−低級アルコキシカルボニル基に転換した後)又はアロ
イルメトキシカルボニルを遊離カルボキシに転換するこ
とが可能であり、アロイルメトキシカルボニルはまた、
親核性の好ましくは塩形成性の試薬、例えばナトリウム
チオフェルレート又はヨウ化ナトリウムで処理すること
によっても開裂せしめることができる。置換された2−
シリルエトキシカルボニルはまた、弗素陰イオンをもた
らす弗化水素酸の塩、例えば弗化アルカリ金属、例えば
弗化ナトリウム又は弗化カリウムで処理することにより
、巨還ポリエーテル(“クラウンエーテル”)の存在下
で、あるいは有機第四塩基の弗化物、例えばテトラエチ
ルアンモニウムフルオリド又はテトラブチルアンモニウ
ムフルオリドで処理することにより、非プロトン性極性
溶剤、例えばジメチルスルホキシド又はN、N’−ジメ
チルアセトアミドの存在下で、遊離カルボキシに転換す
ることができる。
、例えば4−ニトロベンジルオキシカルボニルはまた、
化学還元により、例えばアルカリ金属ジチオニド、例え
ばナトリウムジチオニドで、又は還元性金属塩、例えば
クロム(■)塩、例えば塩化クロム(n)で処理するこ
とにより、通常は、水素を生成しそして金属と共に発生
期の水素を発生することができる薬剤、例えば、場合に
よっては例えばヒドロキシにより置換されている低級ア
ルカンカルボン酸、例えば酢酸、蟻酸、グリコール酸、
ジフェニルグリコール酸、乳酸、マンデル酸、4−クロ
ロマンデル酸もしくは酒石酸、又はアルコールもしくは
チオール(水を添加するのが好ましい)の存在下で、遊
離カルボキシに転換することもできる。上記のように、
還元性金属又は金属塩で処理することにより、2−ハロ
ー低級フルコキシカルボニル(場合によっては2−ブロ
モ−低級アルコキシカルボニル基を対応する2−ヨード
−低級アルコキシカルボニル基に転換した後)又はアロ
イルメトキシカルボニルを遊離カルボキシに転換するこ
とが可能であり、アロイルメトキシカルボニルはまた、
親核性の好ましくは塩形成性の試薬、例えばナトリウム
チオフェルレート又はヨウ化ナトリウムで処理すること
によっても開裂せしめることができる。置換された2−
シリルエトキシカルボニルはまた、弗素陰イオンをもた
らす弗化水素酸の塩、例えば弗化アルカリ金属、例えば
弗化ナトリウム又は弗化カリウムで処理することにより
、巨還ポリエーテル(“クラウンエーテル”)の存在下
で、あるいは有機第四塩基の弗化物、例えばテトラエチ
ルアンモニウムフルオリド又はテトラブチルアンモニウ
ムフルオリドで処理することにより、非プロトン性極性
溶剤、例えばジメチルスルホキシド又はN、N’−ジメ
チルアセトアミドの存在下で、遊離カルボキシに転換す
ることができる。
保護されたアミノ基は、それ自体既知の方法により、そ
して保護基の性質に依存して、種々の方法により、しか
し好ましくは加溶媒分解又は還元により遊離せしめる。
して保護基の性質に依存して、種々の方法により、しか
し好ましくは加溶媒分解又は還元により遊離せしめる。
2−ハロー低級アルコキシカルボニルアミノ(場合によ
っては2−ブロモ−低級アルコキシカルボニルアミノ基
を2−ヨウドー低級アルコキシカルボニルアミノ基に転
換した後)、アロイルメトキシカルボニルアミノ、又は
4−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノは、例えば
適当な化学還元剤、例えば適当なカルボン酸、例えば水
性酢酸の存在下での亜鉛で処理することにより、開裂せ
しめることができる。アロイルメトキシカルボニルアミ
ノはまた、親核性の好ましくは塩形成性の試薬、例えば
ナトリウムチオフェノラートで処理することにより、そ
して4−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノはまた
、アルカリ金属ジチオニド、例えばナトリウムジチオニ
ドで処理することにより開裂せしめることができる。場
合によっては置換されているジフェニルメトキシカルボ
ニルアミノ、ter を−低級アルコキシカルボニルア
ミノ、又は2−トリ置換シリルエトキシカルボニルアミ
ノは、適当な酸、例えば蟻酸又はトリフルオロ酢酸で処
理することにより開裂せしめることができ、場合によっ
ては置換されているベンジルオキシカルボニルアミノは
、例えば水素化分解により、すなわち適当な水素化触媒
、例えばパラジウム触媒の存在下で水素で処理すること
により開裂せしめることができ、場合によっては置換さ
れているトリアリールメチルアミノ又はホルミルアミノ
は、例えば酸で処理することにより、例えば鉱酸、例え
ば塩酸、又は有機酸、例えばm酸、酢酸又はトリフルオ
ロ酢酸で処理することにより、場合によっては水の存在
下で開裂せしめることができ、そしてを機シリル基によ
り保護されたアミノ基は、例えば加水分解又はアルコー
ル分解により遊離せしめることができる。ハロアセチル
、例えば2−クロロアセチルにより保護されたアミノ基
は、塩基の存在下でチオ尿素で処理することにより、又
はチオ尿素のチオレート塩、例えばアルカリ金属チオレ
ートで処理し、続いて、得られた縮合生成物を加溶媒分
解、例えばアルコール分解もしくは加水分解にかけるこ
とにより、遊離せしめることができる。2−置換シリル
エトキシカルボニルにより保護されたアミノ基はまた、
対応して保護されたカルボキシ基の遊離化に関して前記
したように、弗素陰イオンをもたらす弗化水素酸の塩で
処理することにより、遊離アミノ基に転換することがで
きる。
っては2−ブロモ−低級アルコキシカルボニルアミノ基
を2−ヨウドー低級アルコキシカルボニルアミノ基に転
換した後)、アロイルメトキシカルボニルアミノ、又は
4−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノは、例えば
適当な化学還元剤、例えば適当なカルボン酸、例えば水
性酢酸の存在下での亜鉛で処理することにより、開裂せ
しめることができる。アロイルメトキシカルボニルアミ
ノはまた、親核性の好ましくは塩形成性の試薬、例えば
ナトリウムチオフェノラートで処理することにより、そ
して4−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノはまた
、アルカリ金属ジチオニド、例えばナトリウムジチオニ
ドで処理することにより開裂せしめることができる。場
合によっては置換されているジフェニルメトキシカルボ
ニルアミノ、ter を−低級アルコキシカルボニルア
ミノ、又は2−トリ置換シリルエトキシカルボニルアミ
ノは、適当な酸、例えば蟻酸又はトリフルオロ酢酸で処
理することにより開裂せしめることができ、場合によっ
ては置換されているベンジルオキシカルボニルアミノは
、例えば水素化分解により、すなわち適当な水素化触媒
、例えばパラジウム触媒の存在下で水素で処理すること
により開裂せしめることができ、場合によっては置換さ
れているトリアリールメチルアミノ又はホルミルアミノ
は、例えば酸で処理することにより、例えば鉱酸、例え
ば塩酸、又は有機酸、例えばm酸、酢酸又はトリフルオ
ロ酢酸で処理することにより、場合によっては水の存在
下で開裂せしめることができ、そしてを機シリル基によ
り保護されたアミノ基は、例えば加水分解又はアルコー
ル分解により遊離せしめることができる。ハロアセチル
、例えば2−クロロアセチルにより保護されたアミノ基
は、塩基の存在下でチオ尿素で処理することにより、又
はチオ尿素のチオレート塩、例えばアルカリ金属チオレ
ートで処理し、続いて、得られた縮合生成物を加溶媒分
解、例えばアルコール分解もしくは加水分解にかけるこ
とにより、遊離せしめることができる。2−置換シリル
エトキシカルボニルにより保護されたアミノ基はまた、
対応して保護されたカルボキシ基の遊離化に関して前記
したように、弗素陰イオンをもたらす弗化水素酸の塩で
処理することにより、遊離アミノ基に転換することがで
きる。
アジド基の形で保護されたアミノは、例えば還元により
、例えば水素化触媒、例えば酸化白金、パラジウムもし
くはラネーニッケルの存在下での水素による触媒的水素
化により、あるいは他の方法として、酸、例えば酢酸の
存在下で亜鉛で処理することにより、遊離アミノに転換
することができる。触媒的水素化は不活性溶剤、例えば
ハロゲン化水素、例えば塩化メチル中で、又は水中、も
しくは水と有機溶剤、例えばアルコールもしくはジオキ
サンとの混合物中で、約20℃〜25℃において、又は
冷却もしくは加熱しながら実施するのが好ましい。
、例えば水素化触媒、例えば酸化白金、パラジウムもし
くはラネーニッケルの存在下での水素による触媒的水素
化により、あるいは他の方法として、酸、例えば酢酸の
存在下で亜鉛で処理することにより、遊離アミノに転換
することができる。触媒的水素化は不活性溶剤、例えば
ハロゲン化水素、例えば塩化メチル中で、又は水中、も
しくは水と有機溶剤、例えばアルコールもしくはジオキ
サンとの混合物中で、約20℃〜25℃において、又は
冷却もしくは加熱しながら実施するのが好ましい。
適当なアシル基により、有機シリル基により、又は場合
によっては置換されている1−フェニル−低級アルキル
により保護されているヒドロキシ又はメルカプトは、対
応して保護されたアミノ基と同様にして遊離せしめる。
によっては置換されている1−フェニル−低級アルキル
により保護されているヒドロキシ又はメルカプトは、対
応して保護されたアミノ基と同様にして遊離せしめる。
2.2−ジクロロアセチルにより保護されたヒドロキシ
又はメルカプト基は例えば塩基性加水分解により遊離し
、そしてter を−低級アルキルにより又は2−オキ
サ−もしくは2−チア−脂肪族もしくは一脂環族炭化水
素基によりエーテル化されたヒドロキシ又はメルカプト
基は、酸分解により、例えば、鉱酸又は強カルボン酸、
例えばトリフルオロ酢酸で処理することにより遊離する
。好ましくは置換されているメチレン基により、例えば
低級アルキリデン、例えばイソプロピリデン、シクロア
ルキリデン、例えばシクロへキシリデン、又はベンジリ
デンにより一緒に保護されている2個のヒドロキシ基は
、酸加溶媒分解により、特に鉱酸又は強有機酸の存在下
で遊離せしめることができる。
又はメルカプト基は例えば塩基性加水分解により遊離し
、そしてter を−低級アルキルにより又は2−オキ
サ−もしくは2−チア−脂肪族もしくは一脂環族炭化水
素基によりエーテル化されたヒドロキシ又はメルカプト
基は、酸分解により、例えば、鉱酸又は強カルボン酸、
例えばトリフルオロ酢酸で処理することにより遊離する
。好ましくは置換されているメチレン基により、例えば
低級アルキリデン、例えばイソプロピリデン、シクロア
ルキリデン、例えばシクロへキシリデン、又はベンジリ
デンにより一緒に保護されている2個のヒドロキシ基は
、酸加溶媒分解により、特に鉱酸又は強有機酸の存在下
で遊離せしめることができる。
9−キサンセニルにより保護されたカルボン酸アミド基
は例えば、木酢酸中臭化水素により、又はアニソールの
存在下での弗化水素により遊離する。
は例えば、木酢酸中臭化水素により、又はアニソールの
存在下での弗化水素により遊離する。
モノ−、ジー又はトリーアリールメチルにより保護され
たカルボン酸アミド基は例えば、アニソールの存在下で
弗化水素により遊離せしめることができ、さらに、ジフ
ェニルメチル保護基は例えば、炭素上パラジウム触媒の
存在下での水素化分解により除去することができ、そし
てジー(4−メトキシフェニル)メチル保護基又は2.
4.6−ドリメトキシベンジル保II基は例えば、トリ
フルオロ酢酸により除去することができる。さらに、1
個のアリール保護基がポリマー担体に連結されているジ
アリールメチル保護基はアニソールの存在下で弗化水素
により除去することができる。
たカルボン酸アミド基は例えば、アニソールの存在下で
弗化水素により遊離せしめることができ、さらに、ジフ
ェニルメチル保護基は例えば、炭素上パラジウム触媒の
存在下での水素化分解により除去することができ、そし
てジー(4−メトキシフェニル)メチル保護基又は2.
4.6−ドリメトキシベンジル保II基は例えば、トリ
フルオロ酢酸により除去することができる。さらに、1
個のアリール保護基がポリマー担体に連結されているジ
アリールメチル保護基はアニソールの存在下で弗化水素
により除去することができる。
所望により、複数の保護された官能基が存在する場合に
は、例えば酸分解により、例えばトリフルオロ酢酸もし
くは蟻酸で処理することにより、又は還元により、例え
ば亜鉛及び酢酸で処理することにより、もしくは水素及
び水素化触媒、例えば炭素上パラジウム触媒で処理する
ことにより、前記の保護基の複数が同時に除去され得る
ように、保護基を選択する。
は、例えば酸分解により、例えばトリフルオロ酢酸もし
くは蟻酸で処理することにより、又は還元により、例え
ば亜鉛及び酢酸で処理することにより、もしくは水素及
び水素化触媒、例えば炭素上パラジウム触媒で処理する
ことにより、前記の保護基の複数が同時に除去され得る
ように、保護基を選択する。
反応変法(Jl)はさらに、ペプチド−アミドの製造方
法の次のようなり様を含む、この態様においては、ペプ
チドの末端カルボキシ基がアンモニアによってポリマー
担体から除去され、そしてこの過程で、すなわちその場
で、アミドに転換される。
法の次のようなり様を含む、この態様においては、ペプ
チドの末端カルボキシ基がアンモニアによってポリマー
担体から除去され、そしてこの過程で、すなわちその場
で、アミドに転換される。
この場合、アンモニアは遊離アミノ基を有する補完断片
である。
である。
笈胤皿
ジスルフィド結合を形成するためにメルカプト基を酸化
するために適当な酸化剤は例えば、大気中酸素〔場合に
よっては触媒量の遷移金属の塩、例えば硫酸鉄(■)、
塩化鉄(I![)又は硫酸銅 。
するために適当な酸化剤は例えば、大気中酸素〔場合に
よっては触媒量の遷移金属の塩、例えば硫酸鉄(■)、
塩化鉄(I![)又は硫酸銅 。
(II)が添加されているポリペプチドの水溶液に、大
気中酸素を通すのが好ましい〕 ;ヨウ素〔さらにはヨ
ウ化カリウムアダクトKljO形で、これは、アルコー
ル性溶液、例えばメタノール性、又は水性アルコール性
、例えば水性メタノール性溶液として使用するのが好ま
しい〕 ;水溶液中フェリ CIII)シアン化カリウ
ム:1,2−シイオドエタン、又はアゾジカルボン酸ジ
メチルエステルもしくはジエチルエステル(これらは、
水中で、又は水と水溶相性アルコール、例えばメタノー
ルとの混合物中で反応する)である、酸化は好ましくは
室温において実施する。
気中酸素を通すのが好ましい〕 ;ヨウ素〔さらにはヨ
ウ化カリウムアダクトKljO形で、これは、アルコー
ル性溶液、例えばメタノール性、又は水性アルコール性
、例えば水性メタノール性溶液として使用するのが好ま
しい〕 ;水溶液中フェリ CIII)シアン化カリウ
ム:1,2−シイオドエタン、又はアゾジカルボン酸ジ
メチルエステルもしくはジエチルエステル(これらは、
水中で、又は水と水溶相性アルコール、例えばメタノー
ルとの混合物中で反応する)である、酸化は好ましくは
室温において実施する。
反応条件下で除去することができ、そして方法(blの
ために適当なメルカプト−保護基は、例えばアセチルア
ミノメチルである。アセチルアミノメチル保護基の場合
、方法(blは、少量の塩酸が添加された酢酸中で、酸
化剤としてヨウ素を用いて、例えば例に記載するように
してを利に行われる。
ために適当なメルカプト−保護基は、例えばアセチルア
ミノメチルである。アセチルアミノメチル保護基の場合
、方法(blは、少量の塩酸が添加された酢酸中で、酸
化剤としてヨウ素を用いて、例えば例に記載するように
してを利に行われる。
1汰竺
考慮すべき官能基、それらの保護、及び保護基を除去す
ることによる脱保護は方法(a)に記載されている。方
法(C)はまた、例えばメリフィールド合成において使
用され得る担体に結合した保r!i基の除去を含む、従
ってこの場合、方法(C)は担体からのペプチド又はペ
プチドアミドの除去を含む。
ることによる脱保護は方法(a)に記載されている。方
法(C)はまた、例えばメリフィールド合成において使
用され得る担体に結合した保r!i基の除去を含む、従
ってこの場合、方法(C)は担体からのペプチド又はペ
プチドアミドの除去を含む。
五五辿
形質転換に適当な宿主細胞は、例えば微生物、例えば酵
母、例えばサツカロミセス・セレビシェ−(Sacch
arom ces cerevisiae ) 、
及び特に、限酵素又は修飾酵素を有しない細菌株、特に
ニジエリシーt−’コリ(Escherichia
coli)の株、例えばE、コリ(E、coli) X
1776、E、コリHBIOI 、E。
母、例えばサツカロミセス・セレビシェ−(Sacch
arom ces cerevisiae ) 、
及び特に、限酵素又は修飾酵素を有しない細菌株、特に
ニジエリシーt−’コリ(Escherichia
coli)の株、例えばE、コリ(E、coli) X
1776、E、コリHBIOI 、E。
コリ賀3110 % E、コリHBIOI/LM103
5、E、コリJA221 (J、C1arke及びJ
、Carbon、 JoMol、Biol 滋、517
(I97B) ) 、又はE、コリに12株294、バ
シルス・ズブチリス(Bacillus 5ubtil
is) 、バシルス・ステアロサーモフィルス(Bac
illus Stearothermo−」旦旦旦、シ
ュードモナス(Pseudmonas) 、ヘモフィル
ス(ハ!並肛ハ蛙、ストレプトコッカス(Stre t
ococcus)、及び他の微生物、並びに高等生物の
細胞、特に樹立されたヒト又は動物のセルラインである
。好ましい宿主細胞はE、コリの上記の株、特にE、コ
リI(8101、及びE、コリJA221である。
5、E、コリJA221 (J、C1arke及びJ
、Carbon、 JoMol、Biol 滋、517
(I97B) ) 、又はE、コリに12株294、バ
シルス・ズブチリス(Bacillus 5ubtil
is) 、バシルス・ステアロサーモフィルス(Bac
illus Stearothermo−」旦旦旦、シ
ュードモナス(Pseudmonas) 、ヘモフィル
ス(ハ!並肛ハ蛙、ストレプトコッカス(Stre t
ococcus)、及び他の微生物、並びに高等生物の
細胞、特に樹立されたヒト又は動物のセルラインである
。好ましい宿主細胞はE、コリの上記の株、特にE、コ
リI(8101、及びE、コリJA221である。
原理的には、この発明のアミノ酸配列をコードするこの
発明の異種性DNA配列を選択された宿主中で複製しそ
して発現することができるすべてのベクターが適当であ
る。
発明の異種性DNA配列を選択された宿主中で複製しそ
して発現することができるすべてのベクターが適当であ
る。
E、コリの株中でCGRP遺伝子を発現するのに適当な
ベクターの例は、バクテリオファージ、例えばバクテリ
オファージλの誘導体、又は好ましくはプラスミド、例
えば特にプラスミドcolE1及びそ)誘導体、例えば
pMB9、psF2124 、pBR317又はpBR
322である。この発明の好ましいベクターはプラスミ
ドpBR322に由来する。適当なベクターは、完全な
レプリコン、並びに表現型特徴により、発現プラスミド
で形質転換された微生物の選択及び同定を可能にするマ
ーカー遺伝子を含有する。
ベクターの例は、バクテリオファージ、例えばバクテリ
オファージλの誘導体、又は好ましくはプラスミド、例
えば特にプラスミドcolE1及びそ)誘導体、例えば
pMB9、psF2124 、pBR317又はpBR
322である。この発明の好ましいベクターはプラスミ
ドpBR322に由来する。適当なベクターは、完全な
レプリコン、並びに表現型特徴により、発現プラスミド
で形質転換された微生物の選択及び同定を可能にするマ
ーカー遺伝子を含有する。
適切なマーカー遺伝子は、例えば重金属、抗生物質等に
対する耐性を微生物に付与する。さらに、この発明の好
ましいベクターは、レプリコン及びマーカー遺伝子領域
のほかに、この発明のアミノ酸配列をコードするD N
A配列及び場合によっては発現制御配列を挿入するこ
とができるように制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含
有する。好ましいベクターであるプラスミドpBR32
2は、無傷のレプリコン、テトラサイタリン及びアンピ
シリンに対する耐性を付与するマーカー遺伝子(tet
”及びamp” ) 、並びに制限エンドヌクレアーゼ
・例えばPstr(aψp1遺伝子中で開裂せしめ、t
et”・ 遺伝子を無傷のまま残す)、Ram)II、
旧ndlll、Sal I (tet”遺伝子中で開
裂せしめ、amp”遺伝子を無傷のまま残す)、Nru
I及びEcoRIの1個のみ存在する一連の認識配列を
含有する。
対する耐性を微生物に付与する。さらに、この発明の好
ましいベクターは、レプリコン及びマーカー遺伝子領域
のほかに、この発明のアミノ酸配列をコードするD N
A配列及び場合によっては発現制御配列を挿入するこ
とができるように制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含
有する。好ましいベクターであるプラスミドpBR32
2は、無傷のレプリコン、テトラサイタリン及びアンピ
シリンに対する耐性を付与するマーカー遺伝子(tet
”及びamp” ) 、並びに制限エンドヌクレアーゼ
・例えばPstr(aψp1遺伝子中で開裂せしめ、t
et”・ 遺伝子を無傷のまま残す)、Ram)II、
旧ndlll、Sal I (tet”遺伝子中で開
裂せしめ、amp”遺伝子を無傷のまま残す)、Nru
I及びEcoRIの1個のみ存在する一連の認識配列を
含有する。
C0RPの発現を制御するために複数の発現制御配列を
使用することができる。特に、形質転換されるべき宿主
の強く発現される遺伝子の発現制御配列が使用される。
使用することができる。特に、形質転換されるべき宿主
の強く発現される遺伝子の発現制御配列が使用される。
バイブリドベクターとしてρBR322を使用しそして
宿主微生物としてE、コリを使用する場合、適当な発現
制御配列(これらは特に、プロモーター及びリボゾーム
結合部位を含有する)は、ラクトースオペロン、トリプ
トファンオペロン、アラビノースオペロン等の発m 制
?11配列、並びにβ−ラクタマーゼ遺伝子の発現制御
配列、ファージスN−遺伝子又はファージfd一層蛋白
質遺伝子の対応する配列等である。β−ラクタマーゼ遺
伝子(β−1ac−gene)のプロモーターはプラス
ミドpBR322中にすでに含まれているが、他の発現
制御配列がこのプラスミド中に導入されなければならな
い、この発明においては、好ましい発現間?n配列はト
リプトファンオペロン(trpop)のそれである。
宿主微生物としてE、コリを使用する場合、適当な発現
制御配列(これらは特に、プロモーター及びリボゾーム
結合部位を含有する)は、ラクトースオペロン、トリプ
トファンオペロン、アラビノースオペロン等の発m 制
?11配列、並びにβ−ラクタマーゼ遺伝子の発現制御
配列、ファージスN−遺伝子又はファージfd一層蛋白
質遺伝子の対応する配列等である。β−ラクタマーゼ遺
伝子(β−1ac−gene)のプロモーターはプラス
ミドpBR322中にすでに含まれているが、他の発現
制御配列がこのプラスミド中に導入されなければならな
い、この発明においては、好ましい発現間?n配列はト
リプトファンオペロン(trpop)のそれである。
酵母での複製及び発現のために適当なベクターは酵母−
複製開始点及び酵母用選択遺伝子マーカーを含む、酵母
複製開始点、例えば染色体性自律複製セグメント(ar
s)を含有するバイブリドベクターは、形質転換の後酵
母細胞内で染色体外に維持され、そして有糸分裂の間に
自律的に複製される。さらに、酵母2μプラスミドDN
Aに相同な配列を含有するバイブリドベクターも使用す
ることができる。このようなバイブリドベクターは、細
胞中にすでに存在する2μプラスミドに組換により組み
込まれるか、又は自律的に複製する。2μ配列は、高形
質転換頻度を有するプラスミドのために特に適当であり
、そして高コピー数を許容する。酵母のために適当なマ
ーカー遺伝子は特に、宿主に抗生物質耐性を付与するも
の、又は栄養要求酵母変異株の場合には宿主の傷害を補
完するものである。対応する遺伝子は例えば、抗生物質
シクロへキシミドに対する耐性を付与し、又は栄養要求
性酵母変異株に原栄養性、例えば皿、囮、HIS3、又
は特にTRP I遺伝子を提供する。好ましくは、酵母
バイブリドベクターはさらに、バイブリドベクター及び
それらの前駆体の造成及びクローニングを1つの細菌宿
主中で行うことができるように、m菌宿主、特にE、コ
リのための複製開始点及びマーカー遺伝子を含有する。
複製開始点及び酵母用選択遺伝子マーカーを含む、酵母
複製開始点、例えば染色体性自律複製セグメント(ar
s)を含有するバイブリドベクターは、形質転換の後酵
母細胞内で染色体外に維持され、そして有糸分裂の間に
自律的に複製される。さらに、酵母2μプラスミドDN
Aに相同な配列を含有するバイブリドベクターも使用す
ることができる。このようなバイブリドベクターは、細
胞中にすでに存在する2μプラスミドに組換により組み
込まれるか、又は自律的に複製する。2μ配列は、高形
質転換頻度を有するプラスミドのために特に適当であり
、そして高コピー数を許容する。酵母のために適当なマ
ーカー遺伝子は特に、宿主に抗生物質耐性を付与するも
の、又は栄養要求酵母変異株の場合には宿主の傷害を補
完するものである。対応する遺伝子は例えば、抗生物質
シクロへキシミドに対する耐性を付与し、又は栄養要求
性酵母変異株に原栄養性、例えば皿、囮、HIS3、又
は特にTRP I遺伝子を提供する。好ましくは、酵母
バイブリドベクターはさらに、バイブリドベクター及び
それらの前駆体の造成及びクローニングを1つの細菌宿
主中で行うことができるように、m菌宿主、特にE、コ
リのための複製開始点及びマーカー遺伝子を含有する。
酵母での発現のために適当な発現制御配列は例えば皿、
j型上、ADHII 、基ノー又は■匹遺伝子のそれ、
そしてさらに解糖に関与するプロモーター、例えば匹し
及びGAPDFrプロモーターである。
j型上、ADHII 、基ノー又は■匹遺伝子のそれ、
そしてさらに解糖に関与するプロモーター、例えば匹し
及びGAPDFrプロモーターである。
この発明のアミノ酸配列の1つをコードするDNA配列
及び発現制御配列を含有し、複製及び発現型選択が可能
な発現ベクターであって、該DNA配列が転写開始及び
停止シグナル並びに翻訳開始及び終止シグナルと共に、
該発現プラスミド中に、該発現制御配列の@御を伴って
、この発明の注目のアミノ酸配列が前記発現プラスミド
により形質転換された宿主細胞中で発現されるように配
列されている0発現ベクターが特に適当である。
及び発現制御配列を含有し、複製及び発現型選択が可能
な発現ベクターであって、該DNA配列が転写開始及び
停止シグナル並びに翻訳開始及び終止シグナルと共に、
該発現プラスミド中に、該発現制御配列の@御を伴って
、この発明の注目のアミノ酸配列が前記発現プラスミド
により形質転換された宿主細胞中で発現されるように配
列されている0発現ベクターが特に適当である。
効果的な発現を達成するため、この発明のアミノ酸配列
の1つをコードする遺伝子を発現制御配列と正しく (
相を合わせて)配置しなければならない。
の1つをコードする遺伝子を発現制御配列と正しく (
相を合わせて)配置しなければならない。
発現制御I領領域主mRN^起点と該発現制御配列に天
然に連結されている遺伝子コード配列(例えばβ−1a
cプロモーターを使用する場合にはβ−1acコード配
列)のAT(I,との間に、目的のアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子〔この遺伝子は好ましくは自らの翻訳開始
シグナル及び翻訳終止シグナル(例えばTAG)を有す
る〕に連結するのが有利である。こうして効果的な転写
及び翻訳が保証される。
然に連結されている遺伝子コード配列(例えばβ−1a
cプロモーターを使用する場合にはβ−1acコード配
列)のAT(I,との間に、目的のアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子〔この遺伝子は好ましくは自らの翻訳開始
シグナル及び翻訳終止シグナル(例えばTAG)を有す
る〕に連結するのが有利である。こうして効果的な転写
及び翻訳が保証される。
例えば、ベクター、特にpBR322を制限エンドヌク
レアーゼで開裂せしめ、そして場合によっては生ずる線
状化されたベクターを変形した後、対応する制限末端が
設けられた発現vI′a配列を導入する0発現制御配列
は3′−末:tB(翻訳の方向に)に制限エンドヌクレ
アーゼのL2m配列を含有し、その結′果、すでに発現
制御配列を含有するベクターをその制限酵母で消化し、
この発明の目的のアミノ酸配列をコードする、一致する
末端が設けられた遺伝子を挿入することができる。それ
ぞれ正しい方向に、及び正しくない方向に遺伝子を含有
する211のバイブリドプラスミドの混合物が得られる
。すでに発現制御配列を含有するベクターをベクターD
NA内で第2の制限エンドヌクレアーゼ開裂せしめ、そ
して生じたベクター断片に、この発明の目的のシミノ酸
配列をコードする、正しい末端が設けられた遺伝子を挿
入するのが好ましい、ベクターに対するすべての操作は
、レプリコン及び少なくとも1個のマーカー遺伝子の機
能が害されないような態様で行うのが好ましい。
レアーゼで開裂せしめ、そして場合によっては生ずる線
状化されたベクターを変形した後、対応する制限末端が
設けられた発現vI′a配列を導入する0発現制御配列
は3′−末:tB(翻訳の方向に)に制限エンドヌクレ
アーゼのL2m配列を含有し、その結′果、すでに発現
制御配列を含有するベクターをその制限酵母で消化し、
この発明の目的のアミノ酸配列をコードする、一致する
末端が設けられた遺伝子を挿入することができる。それ
ぞれ正しい方向に、及び正しくない方向に遺伝子を含有
する211のバイブリドプラスミドの混合物が得られる
。すでに発現制御配列を含有するベクターをベクターD
NA内で第2の制限エンドヌクレアーゼ開裂せしめ、そ
して生じたベクター断片に、この発明の目的のシミノ酸
配列をコードする、正しい末端が設けられた遺伝子を挿
入するのが好ましい、ベクターに対するすべての操作は
、レプリコン及び少なくとも1個のマーカー遺伝子の機
能が害されないような態様で行うのが好ましい。
この発明の好ましい態様においては、発現制御配列、特
に、3′−末端(主mRNA起点と第1^TGとの間)
に好ましくは接着末端を形成する制限エンドヌクレアー
ゼ例えばEcoRIのための認識配列を担持するトリプ
トファンオペロン(trp op)の発現制御配列を含
有するpBR322由来のベクターを前記の制限エンド
ヌクレアーゼで消化し、そしてベクター断片中で、平滑
末端又は好ましくは接着末端を形成する第2の制限エン
ドヌクレアーゼ、例えばBa5alで消化し、この後、
こうして線状化されたベクターを、この発明のアミノ酸
配列の1つをコードする、対応する末端(例えば、AT
G開始コドンの前のEcoRI末端、及び翻訳終止コド
ンの後のBa−)II末端)を有する遺伝子と連結する
。
に、3′−末端(主mRNA起点と第1^TGとの間)
に好ましくは接着末端を形成する制限エンドヌクレアー
ゼ例えばEcoRIのための認識配列を担持するトリプ
トファンオペロン(trp op)の発現制御配列を含
有するpBR322由来のベクターを前記の制限エンド
ヌクレアーゼで消化し、そしてベクター断片中で、平滑
末端又は好ましくは接着末端を形成する第2の制限エン
ドヌクレアーゼ、例えばBa5alで消化し、この後、
こうして線状化されたベクターを、この発明のアミノ酸
配列の1つをコードする、対応する末端(例えば、AT
G開始コドンの前のEcoRI末端、及び翻訳終止コド
ンの後のBa−)II末端)を有する遺伝子と連結する
。
この連結は既知の方法により、相補的末端(接着末端)
を対合せしめ、そして例えば↑eDNAリガーゼにより
連結することにより行う。
を対合せしめ、そして例えば↑eDNAリガーゼにより
連結することにより行う。
合成的に又は5RNAルートにより、ゲノムDNAから
得られ、そして対応する接着末端(特にEcoRI及び
BawH1末端)を設けられたCGRP遺伝子はまた、
例えば配列分析のために多量のCGRP遺伝子を得るた
めに、ベクター、例えばpBR322にクローン化する
ことができる。バイブリドプラスミドを含有するクロー
ンの単離は、例えばCGRP−特異的な、放射性ラベル
されたオリボデオキヌクレオチドプローブにより行われ
る。 CGRPの遺伝子の特徴付けは、例えば、Max
am及びG11bertの方法(A、M、Maxas及
び11.G11bert s Proc、 Natl、
Acad、 Sci、 USAs74 560 (
I977) :さらに±旦、シ区已、並、499(I
980)を参照のこと〕に従って行われる。
得られ、そして対応する接着末端(特にEcoRI及び
BawH1末端)を設けられたCGRP遺伝子はまた、
例えば配列分析のために多量のCGRP遺伝子を得るた
めに、ベクター、例えばpBR322にクローン化する
ことができる。バイブリドプラスミドを含有するクロー
ンの単離は、例えばCGRP−特異的な、放射性ラベル
されたオリボデオキヌクレオチドプローブにより行われ
る。 CGRPの遺伝子の特徴付けは、例えば、Max
am及びG11bertの方法(A、M、Maxas及
び11.G11bert s Proc、 Natl、
Acad、 Sci、 USAs74 560 (
I977) :さらに±旦、シ区已、並、499(I
980)を参照のこと〕に従って行われる。
この発明の発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は例
えば、文献、例えばS、セレビシェ−についてはA、
Hinnew等、Proc、 Natl、 Acad、
Sci。
えば、文献、例えばS、セレビシェ−についてはA、
Hinnew等、Proc、 Natl、 Acad、
Sci。
用虹、互、1929(I978) ; B 、ズブチリ
スについてはAnagnostopoulus等、J、
Bacteriol、、81.741(I961) ;
そしてE、コリについてはn、nandel等、J、M
o1. Biol、 53.159 (I970)に
記載されている方法により行われる。形質転換された宿
主細胞の単離は、発現プラスミドに含有されるマーカー
遺伝子がそれに対して耐性を付与する殺生物剤が添加さ
れている選択栄養培地から有利に行われる。
スについてはAnagnostopoulus等、J、
Bacteriol、、81.741(I961) ;
そしてE、コリについてはn、nandel等、J、M
o1. Biol、 53.159 (I970)に
記載されている方法により行われる。形質転換された宿
主細胞の単離は、発現プラスミドに含有されるマーカー
遺伝子がそれに対して耐性を付与する殺生物剤が添加さ
れている選択栄養培地から有利に行われる。
好ましくは、発現ベクターがamp’遺伝子を含有する
場合には、栄養培地にアンピシリンが添加される0発現
プラスミドを含有しない細胞はこのような培地中で破壊
される。
場合には、栄養培地にアンピシリンが添加される0発現
プラスミドを含有しない細胞はこのような培地中で破壊
される。
この発明また、この発明のペプチドを生産することがで
きる、前記の方法により得られる形質転換された細胞に
関する。
きる、前記の方法により得られる形質転換された細胞に
関する。
方法(d)に従うこの発明の形質転換された細胞の培養
はそれ自体既知の方法で行われる0例えば、この発明の
形質転換された宿主微生物の培養のために種々の炭素源
を使用することができる。好ましい炭素源の例は、責化
性の炭水化物、例えばグルコース、マルトース、マンニ
トールもしくはラクトース、又は単独でもしくは適当な
混合物として使用され得る酢酸塩である。適当な窒素源
は例えば、アミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプチド、及
び蛋白質及びその分解生成物、例えばトリプトン、ペプ
トンもしくは肉エキス;さらには酵毒エキス、マルトエ
キス、そしてさらにアンモニウム塩、例えば塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム又は硝酸アンモニウムであり
、これらは単独で又は適当な混合物として使用すること
ができる。やはり使用され得る無機塩は例えば、ナトリ
ウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩
、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩である。
はそれ自体既知の方法で行われる0例えば、この発明の
形質転換された宿主微生物の培養のために種々の炭素源
を使用することができる。好ましい炭素源の例は、責化
性の炭水化物、例えばグルコース、マルトース、マンニ
トールもしくはラクトース、又は単独でもしくは適当な
混合物として使用され得る酢酸塩である。適当な窒素源
は例えば、アミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプチド、及
び蛋白質及びその分解生成物、例えばトリプトン、ペプ
トンもしくは肉エキス;さらには酵毒エキス、マルトエ
キス、そしてさらにアンモニウム塩、例えば塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム又は硝酸アンモニウムであり
、これらは単独で又は適当な混合物として使用すること
ができる。やはり使用され得る無機塩は例えば、ナトリ
ウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩
、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩である。
さらに、栄養培地は例えば、増殖促進物質、例えば微量
元素、例えば鉄、亜鉛及びマンガン、並びに好ましくは
選択圧を生じさせそして発現プラスミドを喪失した細胞
の増殖を防止する物質を含有する。すなわち、例えば、
発現プラスミドがamp’遺伝子を含有する場合にはア
ンピシリンが培地に添加される。抗生活性物質のこのよ
うな添加はまた、抗生物!怒受性微生物を破壊する効果
を有する。
元素、例えば鉄、亜鉛及びマンガン、並びに好ましくは
選択圧を生じさせそして発現プラスミドを喪失した細胞
の増殖を防止する物質を含有する。すなわち、例えば、
発現プラスミドがamp’遺伝子を含有する場合にはア
ンピシリンが培地に添加される。抗生活性物質のこのよ
うな添加はまた、抗生物!怒受性微生物を破壊する効果
を有する。
培養は、それ自体既知の方法に従って行われる。
培養条件、例えば温度、培地のpH値、及び発酵時間は
、この発明のペプチドの最大力価が得られるように選択
する。すなわち、E、コリ又は酵母菌株は好ましくは、
液体培養中好気的条件下で、振とう又は攪拌しながら、
例えば20℃〜40℃、好ましくは30℃の温度におい
て、そして4〜9のpH値、好ましくはpH7にて、約
4〜20時間、好ましくは8〜12時間培養する。培養
中、発現生成物(CGI?P)は細胞内に蓄積する。
、この発明のペプチドの最大力価が得られるように選択
する。すなわち、E、コリ又は酵母菌株は好ましくは、
液体培養中好気的条件下で、振とう又は攪拌しながら、
例えば20℃〜40℃、好ましくは30℃の温度におい
て、そして4〜9のpH値、好ましくはpH7にて、約
4〜20時間、好ましくは8〜12時間培養する。培養
中、発現生成物(CGI?P)は細胞内に蓄積する。
N−末端メチオニンは、ある宿王細胞においては、翻訳
後に除去され得る。さらに、ある宿主細胞においてはN
−末端アミノ酸がアセチル化され得る。
後に除去され得る。さらに、ある宿主細胞においてはN
−末端アミノ酸がアセチル化され得る。
細胞濃度が適当な値に達したとき、培養を停止し、そし
てこの発明のペプチドを微生物の細胞から遊離せしめる
。この目的のために、細胞を例えば洗剤、例えばSDS
又はトリトンで処理することにより破壊し、あるいはリ
ゾチーム又は同様に作用する酵素により溶解する。前記
の方法に代えて、又は前記の方法に加えて、機械的力、
例えば剪断力(例えばX−プレス、フレンチプレス、グ
イノーミル)、又はガラスピーズもしくは酸化アルミニ
ウムを伴う振とう、又は例えば液体窒素中での凍結と例
えば30〜40℃の解凍の反復、及び超音波を用いて細
胞を破壊することができる。蛋白質、核酸及び他の細胞
成分を含有する得られた混合物を遠心分離した後、それ
自体既知の方法により、この発明のペプチドを包含する
蛋白質成分について濃縮する。すなわち、例えば、非蛋
白質成分のほとんどどがポリエチレンイミン処理により
除去すれ、そしてこの発明のペプチドを包含する蛋白質
は例えば硫酸アンモニウム又は他の塩により溶液を飽和
することによって沈澱する。細菌蛋白質はまた、酢酸で
酸性化する(例えば0.1%、pH4〜5)ことによっ
て沈澱せしめることができる。この発明のペプチドのこ
れ以上の濃縮は酢酸上清液をn−ブタノールで抽出する
ことによって達成することができる。他の精製段階は例
えば、ゲル電気泳動、クロマトグラフ法、例えばイオン
交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィ
ー、)IPLC,逆相)IPLc等、混合物の構成成分
の適当なセファデックス(商標)カラムによる分離、透
析、例えば抗体特にモノクローナル抗体を用いるアフィ
ニティークロマトグラフィー、及び他の方法、特に文献
から知られる方法を包含する。
てこの発明のペプチドを微生物の細胞から遊離せしめる
。この目的のために、細胞を例えば洗剤、例えばSDS
又はトリトンで処理することにより破壊し、あるいはリ
ゾチーム又は同様に作用する酵素により溶解する。前記
の方法に代えて、又は前記の方法に加えて、機械的力、
例えば剪断力(例えばX−プレス、フレンチプレス、グ
イノーミル)、又はガラスピーズもしくは酸化アルミニ
ウムを伴う振とう、又は例えば液体窒素中での凍結と例
えば30〜40℃の解凍の反復、及び超音波を用いて細
胞を破壊することができる。蛋白質、核酸及び他の細胞
成分を含有する得られた混合物を遠心分離した後、それ
自体既知の方法により、この発明のペプチドを包含する
蛋白質成分について濃縮する。すなわち、例えば、非蛋
白質成分のほとんどどがポリエチレンイミン処理により
除去すれ、そしてこの発明のペプチドを包含する蛋白質
は例えば硫酸アンモニウム又は他の塩により溶液を飽和
することによって沈澱する。細菌蛋白質はまた、酢酸で
酸性化する(例えば0.1%、pH4〜5)ことによっ
て沈澱せしめることができる。この発明のペプチドのこ
れ以上の濃縮は酢酸上清液をn−ブタノールで抽出する
ことによって達成することができる。他の精製段階は例
えば、ゲル電気泳動、クロマトグラフ法、例えばイオン
交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィ
ー、)IPLC,逆相)IPLc等、混合物の構成成分
の適当なセファデックス(商標)カラムによる分離、透
析、例えば抗体特にモノクローナル抗体を用いるアフィ
ニティークロマトグラフィー、及び他の方法、特に文献
から知られる方法を包含する。
例えば、この発明の発現されたペプチドの単離は次の段
階を含んで成る。
階を含んで成る。
◎ 遠心分離による、培養液からの細胞の分離;■ 例
えば細胞溶解酵素による処理及び/又は凍結と解凍の反
復による、細胞の破壊による粗抽出物の調製; ■ 遠心分・離による不要性成分の除去;◎ ポリエチ
レンイミンの添加によるDNAの沈澱; ◎ 硫酸アンモニウムによる、この発明のペプチドを包
含する蛋白質の沈澱; ■ モノクローナル抗−CGRP抗体カラム上での、前
記沈澱物を溶解した溶液した溶液のアフィニティークロ
マトグラフィー; ■ 透析又はセファデックスG25上でのクロマトグラ
フィーによる、得られた溶液からの塩の除去。
えば細胞溶解酵素による処理及び/又は凍結と解凍の反
復による、細胞の破壊による粗抽出物の調製; ■ 遠心分・離による不要性成分の除去;◎ ポリエチ
レンイミンの添加によるDNAの沈澱; ◎ 硫酸アンモニウムによる、この発明のペプチドを包
含する蛋白質の沈澱; ■ モノクローナル抗−CGRP抗体カラム上での、前
記沈澱物を溶解した溶液した溶液のアフィニティークロ
マトグラフィー; ■ 透析又はセファデックスG25上でのクロマトグラ
フィーによる、得られた溶液からの塩の除去。
上記の方法に代えて、DNAを分離除去した後、細菌蛋
白質を0.1%酢酸により沈澱せしめ、そしてこの発明
のペプチドを酸性上清液からn−ブタノールにより抽出
し、あるいは酸性上清液をイオン交換クロマトグラフィ
ー(例えばカルボキシメチルセルロース)に直接かける
ことができる。他の精製段階はセファデックスG50(
又はG75)上でのゲル濾過、及び逆相HPLCを包含
する。塩の除去はやはりセファデックスG25上で行わ
れる。
白質を0.1%酢酸により沈澱せしめ、そしてこの発明
のペプチドを酸性上清液からn−ブタノールにより抽出
し、あるいは酸性上清液をイオン交換クロマトグラフィ
ー(例えばカルボキシメチルセルロース)に直接かける
ことができる。他の精製段階はセファデックスG50(
又はG75)上でのゲル濾過、及び逆相HPLCを包含
する。塩の除去はやはりセファデックスG25上で行わ
れる。
この発明のペプチドを検出するために、抗−CGRP抗
体(例えば、ラビットからの抗体又は/%イブリドーマ
細胞から得られるモノクローナル抗体)による試験を使
用することができる。
体(例えば、ラビットからの抗体又は/%イブリドーマ
細胞から得られるモノクローナル抗体)による試験を使
用することができる。
1広兜
目的ペプチド−アミドの末端アミド基のNHI基に酵素
的に分解することができるアミノ酸ASAは例えばグリ
シンである。この場合に適当な酵素は、A、F、Bra
dburys M、D、A、Finnie及びり、G、
Smyth、Nature、 298.686−68
8(I982)に記載されているようにして、脳下垂体
、好ましくはハトの脳下垂体から得ることができる。
的に分解することができるアミノ酸ASAは例えばグリ
シンである。この場合に適当な酵素は、A、F、Bra
dburys M、D、A、Finnie及びり、G、
Smyth、Nature、 298.686−68
8(I982)に記載されているようにして、脳下垂体
、好ましくはハトの脳下垂体から得ることができる。
適当な酵素の存在下でアンモニアにより置換され得るア
ミノ酸AS1 は例えばチロシンである。
ミノ酸AS1 は例えばチロシンである。
この場合に適当な酵素は、例えばカルボキシペプチダー
ゼY(カールスベルグ・バイオチミストリー社、コペン
ハーゲン、デンマーク)〔例えば、Klaus Bre
dda+s等、Carlsber Res、Comm
、 46゜121−128 (I981)を参照のこ
と〕である。
ゼY(カールスベルグ・バイオチミストリー社、コペン
ハーゲン、デンマーク)〔例えば、Klaus Bre
dda+s等、Carlsber Res、Comm
、 46゜121−128 (I981)を参照のこ
と〕である。
1皿旦11
式(I)の(部分)配列を有しそして塩形成基を有する
化合物の塩は、それ自体既知の方法により製造すること
ができる0例えば、塩基性基より多数の酸性基を含有す
る式(I)の部分配列を有する化合物の塩は、例えば、
金属化合物、例えば適当なカルボン酸のアルカリ金属塩
、例えばα−エチルカプロン酸のナトリウム塩、又は無
機アルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩、例えば
炭酸水素ナトリウムで処理することにより、あるいはア
ンモニア又は適当な有機アミンブ処理することにより形
成することができ、この場合好ましくは理論量の又はわ
ずかに過剰量の塩形成剤を使用する0式(I)の配列を
有する化合物の酸付加塩は、常法に従って、例えば酸又
は適当な陰イオン交換側で処理することにより得られる
0例えば遊離カルボキシ基及び遊離アミノ基を有する、
式(I)の部分配列を有する化合物の内部塩は、例えば
、塩、例えば酸付加塩を、弱塩基によって、又は液体イ
オン交換体で処理することによって、等電点まで中和す
ることにより形成することができる。
化合物の塩は、それ自体既知の方法により製造すること
ができる0例えば、塩基性基より多数の酸性基を含有す
る式(I)の部分配列を有する化合物の塩は、例えば、
金属化合物、例えば適当なカルボン酸のアルカリ金属塩
、例えばα−エチルカプロン酸のナトリウム塩、又は無
機アルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩、例えば
炭酸水素ナトリウムで処理することにより、あるいはア
ンモニア又は適当な有機アミンブ処理することにより形
成することができ、この場合好ましくは理論量の又はわ
ずかに過剰量の塩形成剤を使用する0式(I)の配列を
有する化合物の酸付加塩は、常法に従って、例えば酸又
は適当な陰イオン交換側で処理することにより得られる
0例えば遊離カルボキシ基及び遊離アミノ基を有する、
式(I)の部分配列を有する化合物の内部塩は、例えば
、塩、例えば酸付加塩を、弱塩基によって、又は液体イ
オン交換体で処理することによって、等電点まで中和す
ることにより形成することができる。
塩は常法に従って遊離化合物に転換することができる。
金属塩又はアンモニウム塩は例えば適当な酸で処理する
ことにより遊離化合物に転換することができ、そして酸
付加塩は例えば適当な塩基性剤で処理することにより遊
離化合物に転換することができる。
ことにより遊離化合物に転換することができ、そして酸
付加塩は例えば適当な塩基性剤で処理することにより遊
離化合物に転換することができる。
この発明はまた、この発明のペプチドのアミノ酸配列を
コードするDNA配列に関する。
コードするDNA配列に関する。
この発明のDNA配列は、大配列の部分配列として次の
式(IV)、 d (GCETGYAAYACXGCEACXTGYG
TXACXCAYNGKYTZGCE−AlaCysA
snThrAlaThrCysValThr)lisA
rgLeuAla−GnχYTZYTZQRSNGK G]yLeuLeuSerArg QRSGGXGGχATGGTXAAMQR5AAYT
TLGTXCCXACrAAY−SerGlyGlyM
etValLysSerAsnPheValProTh
rAsn−GTXGGXQR5AA??GCETτL)
ValGlySerLysAlaPhe(IV) (配列中、5′−末端から始まるコード鎖のデオキシヌ
クレオチド配列、及びその下方に各トリブレンドがコー
ドするアミノ酸が示してあり;そして、 Aはアデノシルであり、 Tはチミジルであり、 Gはグアノシルであり、 Cはシチジルであり、 EはA、T、C,又はGであり、 NがCである場合、KはAXT、C,又はGであり;あ
るいは、 NがAである場合、KはA1又はGであり、LはT、又
はCであり、 MはA1又はGであり、 NはA1又はCであり、 QはT1又はAであり、 R及びSに関しては、QがTである場合、RはCであり
、そしてSはA、T、、C,又はGであり;あるいは、 QがAである場合、RはGであり、そしてSはT1又は
Cであり、 XはA、T、C,又はGであり、 YはT1又はCであり、そして、 YがCである場合、ZはA、TSC,又はGであり、あ
るいは、YがTである場合、ZはA1又はGでありi カッコの前にある1d@は、カッコ内に示されたヌクレ
オチドが2−デオキシ−リボヌクレオシドであることを
意味する) で表わされる。
式(IV)、 d (GCETGYAAYACXGCEACXTGYG
TXACXCAYNGKYTZGCE−AlaCysA
snThrAlaThrCysValThr)lisA
rgLeuAla−GnχYTZYTZQRSNGK G]yLeuLeuSerArg QRSGGXGGχATGGTXAAMQR5AAYT
TLGTXCCXACrAAY−SerGlyGlyM
etValLysSerAsnPheValProTh
rAsn−GTXGGXQR5AA??GCETτL)
ValGlySerLysAlaPhe(IV) (配列中、5′−末端から始まるコード鎖のデオキシヌ
クレオチド配列、及びその下方に各トリブレンドがコー
ドするアミノ酸が示してあり;そして、 Aはアデノシルであり、 Tはチミジルであり、 Gはグアノシルであり、 Cはシチジルであり、 EはA、T、C,又はGであり、 NがCである場合、KはAXT、C,又はGであり;あ
るいは、 NがAである場合、KはA1又はGであり、LはT、又
はCであり、 MはA1又はGであり、 NはA1又はCであり、 QはT1又はAであり、 R及びSに関しては、QがTである場合、RはCであり
、そしてSはA、T、、C,又はGであり;あるいは、 QがAである場合、RはGであり、そしてSはT1又は
Cであり、 XはA、T、C,又はGであり、 YはT1又はCであり、そして、 YがCである場合、ZはA、TSC,又はGであり、あ
るいは、YがTである場合、ZはA1又はGでありi カッコの前にある1d@は、カッコ内に示されたヌクレ
オチドが2−デオキシ−リボヌクレオシドであることを
意味する) で表わされる。
この発明のDNA配列は、コード鎖中に、好ましくは2
90以下の、特に230以下の、特に200以下の、そ
して好ましくは150以下の、例えば136個のデオキ
シヌクレオチドを含有する。
90以下の、特に230以下の、特に200以下の、そ
して好ましくは150以下の、例えば136個のデオキ
シヌクレオチドを含有する。
有利には、この発明のDNA配列の末端には、その製造
工程で容易に、ベクターへの挿入を可能にする基が設け
られ、例えば、開始コドンATC及び終始コドン、例え
ばTAGと共に制限エンドヌクレアーゼの認識配列が設
けられる。後でペプチド−アミドを製造することが意図
される場合には、ペプチド−アミドの末端アミド基のN
)1.iがそれから生ずるように後で酵素的に分解され
得るアミノ酸をコードするコドンを前記DNA配列に設
けることができる。このように分解され得るアミノ酸は
例えばグリシンである。上記の方法に代えて、後でペプ
チド−アミドを製造するために、適当な酵素、例えば特
に適当なエキソペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチ
ダーゼYの存在下でアンモニアにより置換され得るアミ
ノ酸、例えば特にチロシン、をコードするコドンをDN
A配列に設けることができる。
工程で容易に、ベクターへの挿入を可能にする基が設け
られ、例えば、開始コドンATC及び終始コドン、例え
ばTAGと共に制限エンドヌクレアーゼの認識配列が設
けられる。後でペプチド−アミドを製造することが意図
される場合には、ペプチド−アミドの末端アミド基のN
)1.iがそれから生ずるように後で酵素的に分解され
得るアミノ酸をコードするコドンを前記DNA配列に設
けることができる。このように分解され得るアミノ酸は
例えばグリシンである。上記の方法に代えて、後でペプ
チド−アミドを製造するために、適当な酵素、例えば特
に適当なエキソペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチ
ダーゼYの存在下でアンモニアにより置換され得るアミ
ノ酸、例えば特にチロシン、をコードするコドンをDN
A配列に設けることができる。
この発明に特に、E、コリにより好まれそしてこの発明
のペプチドのアミノ酸配列をコードするトリブレッドを
含有する上記のDNA配列に関する。、このようなトリ
ブレッドは特に次のものである。
のペプチドのアミノ酸配列をコードするトリブレッドを
含有する上記のDNA配列に関する。、このようなトリ
ブレッドは特に次のものである。
アラニン(Ala) GCTアルギニン
(Arg) CG?グリシン(Gly)
GGTシスティン(Cys)
TGCバリン(Val) G
TTロイシン(Leu) CTGセリ
ン(Set) TCTスレオニン(
Thr) ACCフェニルアラニン(Ph
e) TTCチロシン(Tyr)
TACメチオニン(Met) AT
Gアスパラギン酸(Asp) GACグルタミ
ンfJ1(Glu) GAAリジン(Ly
s) AAAイソロイシン(I I
e) ATCヒスチジン(Ins)
CACプロリン(Pro)
CCGグルタミン(Gin) CAG
アスパラギン(Asn) AAC好ましい
終止コドン(NON)ばコドンTAGである。
(Arg) CG?グリシン(Gly)
GGTシスティン(Cys)
TGCバリン(Val) G
TTロイシン(Leu) CTGセリ
ン(Set) TCTスレオニン(
Thr) ACCフェニルアラニン(Ph
e) TTCチロシン(Tyr)
TACメチオニン(Met) AT
Gアスパラギン酸(Asp) GACグルタミ
ンfJ1(Glu) GAAリジン(Ly
s) AAAイソロイシン(I I
e) ATCヒスチジン(Ins)
CACプロリン(Pro)
CCGグルタミン(Gin) CAG
アスパラギン(Asn) AAC好ましい
終止コドン(NON)ばコドンTAGである。
コード鎖中に200以下、例えば136のデオキシヌク
レオチドを有し、次のDNA配列(IVa)を含をする
DNA配列が好ましい、この配列においては5′−末端
から始まるコード鎖のみが示されており、そして一層よ
く理解できるように各トリブレッドがコードするアミノ
酸も示されている。
レオチドを有し、次のDNA配列(IVa)を含をする
DNA配列が好ましい、この配列においては5′−末端
から始まるコード鎖のみが示されており、そして一層よ
く理解できるように各トリブレッドがコードするアミノ
酸も示されている。
AIaCysAsn丁hrAla丁hrCysValT
hr旧sArgLeuA!a−d (GCCTGCAA
CACTGCCACCTGTGTGACTCATCGG
CTにGCA−GIyLeuLeuSerArg GGCTTGCTGAGCAGA SerGlyGIyMetValLysSerAsnP
heValProThrAsn−TCAGGGGGCA
TGGTGAAGAGCAACTTCGTGCCCAC
CAAT−ValGIySerLysAIaPheGT
GGGTTCCAAAGCCTT丁)(I’l/a) コード鎖中に200以下、例えば136デオキシヌクレ
オチドを存し、次のDNA配列(IVb)を含有するD
NA配列が好ましい、この配列においては5′−末端か
ら始まるコード鎖のみが示されており、そして一層よく
理解できるように各トリプレットがコードするアミノ酸
も示されている。
hr旧sArgLeuA!a−d (GCCTGCAA
CACTGCCACCTGTGTGACTCATCGG
CTにGCA−GIyLeuLeuSerArg GGCTTGCTGAGCAGA SerGlyGIyMetValLysSerAsnP
heValProThrAsn−TCAGGGGGCA
TGGTGAAGAGCAACTTCGTGCCCAC
CAAT−ValGIySerLysAIaPheGT
GGGTTCCAAAGCCTT丁)(I’l/a) コード鎖中に200以下、例えば136デオキシヌクレ
オチドを存し、次のDNA配列(IVb)を含有するD
NA配列が好ましい、この配列においては5′−末端か
ら始まるコード鎖のみが示されており、そして一層よく
理解できるように各トリプレットがコードするアミノ酸
も示されている。
A]aCysAsnThrA1aThrCysValT
hrHisArgLeuAIa−d(GCT丁GCAA
CACCGCTACCTGCGTTACCCACC(、
TCTGGC丁−GlyLeuLeuSerArg GGTCTGC丁GTCTCGT SerGlyGlyMetValLysSerAsnP
heValProThrAsn−TCTGGTGGTI
TGGTTAAATCTAACTTCGTTCCGAC
CAAC−Va IG l ySerLysA 1aP
heGTTGGTTCTAAAGCTTTC)(IVb
) この発明のDNA配列はそれ自体既知の方法により製造
される。
hrHisArgLeuAIa−d(GCT丁GCAA
CACCGCTACCTGCGTTACCCACC(、
TCTGGC丁−GlyLeuLeuSerArg GGTCTGC丁GTCTCGT SerGlyGlyMetValLysSerAsnP
heValProThrAsn−TCTGGTGGTI
TGGTTAAATCTAACTTCGTTCCGAC
CAAC−Va IG l ySerLysA 1aP
heGTTGGTTCTAAAGCTTTC)(IVb
) この発明のDNA配列はそれ自体既知の方法により製造
される。
DNAを合成する方法はS、A、Narangs丁et
rahed−・ユon 、34.3(I983)により
要約されている。既知の合成法は、良好な収量で、高純
度で、そして比較的短時間に、20@基までの長さを有
するポリデオキシヌクレオチドの製造を可能にする。適
切に保護されたデオキシヌクレオチドがホスホジエステ
ル法(K、L、^garwa1等、7..84,489
(I972) )により、又は一層効果的なホスホジエ
ステル法(C,B−Reese+丁etrahedro
n 、34.3143(I972)又はホスフィトト
リエステル法〔Rルルetsinger及びW、B、L
un5ford、 J、Aw、Che−、Soc、 +
91L 3655(I976) )により相互に連結さ
れる。オリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシヌ
クレオチドの合成の単純化が面相法により可能にされ、
この方法においてはデオキシヌクレオチド鎮が適当なポ
リマーに結合される。 )(,1takura等、J、
Am、Chem。
rahed−・ユon 、34.3(I983)により
要約されている。既知の合成法は、良好な収量で、高純
度で、そして比較的短時間に、20@基までの長さを有
するポリデオキシヌクレオチドの製造を可能にする。適
切に保護されたデオキシヌクレオチドがホスホジエステ
ル法(K、L、^garwa1等、7..84,489
(I972) )により、又は一層効果的なホスホジエ
ステル法(C,B−Reese+丁etrahedro
n 、34.3143(I972)又はホスフィトト
リエステル法〔Rルルetsinger及びW、B、L
un5ford、 J、Aw、Che−、Soc、 +
91L 3655(I976) )により相互に連結さ
れる。オリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシヌ
クレオチドの合成の単純化が面相法により可能にされ、
この方法においてはデオキシヌクレオチド鎮が適当なポ
リマーに結合される。 )(,1takura等、J、
Am、Chem。
と虹、匪、706(I981)は、固相合成において、
個々のデオキシヌクレオチドではな(、ホスホトリエス
テル法により連結されたトリデオキシヌクレオチドを使
用し、次にこれを短時間で良好な収率で縮合せしめて、
例えば31塩基を有するポリデオキシヌクレオチドを形
成することができる。化学的に製造された短所片から酵
素的に確かな2本gDNAを組立てることができる。
l、にJhorana等、J、Bioi−Chem、、
251 .565(I976)は、この目的のために両
DNAfl[からのオーバーランプポリデオキシヌクレ
オチド配列を使用する。これらは塩基対合によって正し
い配置に一緒に保持され、そして次に酵素DNANカリ
ゼによって化学的に連結される。他の可能な方法は、2
本のDNA1iのそれぞれからの、短いオーバーランプ
セグメントを有する1本ずつのポリデオキシヌクレオチ
ドを4種類の必要なデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ートの存在下で、DNAポリメラーゼ、例えばDNAポ
リメラーゼ!、ポリメラーゼエのKlenow断片、T
、DNAポリメラーゼ、又はAMU(鳥類骨髄芽球症ウ
ィルス)逆転写酵素と共にインキヤベートすることを含
んで成る。この方法においては、2つのポリデオキシヌ
クレオチド配列が塩基対合によって正しい配置に一緒に
保持され、そして酵素により必要なデオキシヌクレオチ
ドで補完されて完全な2本11DNAが形成される(S
、A、Narang等、Anal、Biochem、
+ 121 + 3569226 (I982)は、こ
の原理に基いて、ヒト白血球インターフェロンα8−遺
伝子の132塩基対の長さのセグメントをDNAポリメ
ラーゼI (Klenow断片)の存在下で、39〜4
2塩基の長さを有する化学合成された4個の断片から組
み立てることができる方法を記載する。この方法におい
ては、リガーゼのみを用いる上記の方法に比べて、化学
合成の40%の節約が達成される。
個々のデオキシヌクレオチドではな(、ホスホトリエス
テル法により連結されたトリデオキシヌクレオチドを使
用し、次にこれを短時間で良好な収率で縮合せしめて、
例えば31塩基を有するポリデオキシヌクレオチドを形
成することができる。化学的に製造された短所片から酵
素的に確かな2本gDNAを組立てることができる。
l、にJhorana等、J、Bioi−Chem、、
251 .565(I976)は、この目的のために両
DNAfl[からのオーバーランプポリデオキシヌクレ
オチド配列を使用する。これらは塩基対合によって正し
い配置に一緒に保持され、そして次に酵素DNANカリ
ゼによって化学的に連結される。他の可能な方法は、2
本のDNA1iのそれぞれからの、短いオーバーランプ
セグメントを有する1本ずつのポリデオキシヌクレオチ
ドを4種類の必要なデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ートの存在下で、DNAポリメラーゼ、例えばDNAポ
リメラーゼ!、ポリメラーゼエのKlenow断片、T
、DNAポリメラーゼ、又はAMU(鳥類骨髄芽球症ウ
ィルス)逆転写酵素と共にインキヤベートすることを含
んで成る。この方法においては、2つのポリデオキシヌ
クレオチド配列が塩基対合によって正しい配置に一緒に
保持され、そして酵素により必要なデオキシヌクレオチ
ドで補完されて完全な2本11DNAが形成される(S
、A、Narang等、Anal、Biochem、
+ 121 + 3569226 (I982)は、こ
の原理に基いて、ヒト白血球インターフェロンα8−遺
伝子の132塩基対の長さのセグメントをDNAポリメ
ラーゼI (Klenow断片)の存在下で、39〜4
2塩基の長さを有する化学合成された4個の断片から組
み立てることができる方法を記載する。この方法におい
ては、リガーゼのみを用いる上記の方法に比べて、化学
合成の40%の節約が達成される。
この明細書に記載するこの発明のDNA配列合成方法は
次の段階により特徴付けられる。
次の段階により特徴付けられる。
α)適切に保護されたデオキシヌクレオチドを固体単体
に結合せしめ; β)適切に保護されたジー、トリー、又はテトラ−デオ
キシヌクレオチドをホスホトリエステル法又はホスフィ
ト法により製造し;T)担体に結合したデオキシヌクレ
オチド又ははオリゴデオキシヌクレオチドを、ホスホト
リエステル法又はホスフィト法に従って、適切に保護さ
れたモノ−デオキシヌクレオチド、又はジー、トリーも
しくはテトラーデオキシヌクレオチド〔(β)に従って
製造されたもの〕と連結し; δ)担体に結合しておりそして所望の数の塩基を有する
(r)に従って得られるオリゴデオキシヌクレオチドを
担体から切り離し、所望により精製し、保護基を除去し
、そして遊離の5′−末端ヒドロキシ基をリン酸化し;
t> 3個以下そして好ましくは8〜15個のオーバー
ラツプ塩基対を有する、コード鎖及び相補鎖からの、δ
)に従って得られた2つのオリゴデオキシヌクレオチド
を、4種類のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの
存在下でDNAポリメラーゼを用いて補完してCGRP
遺伝子を含有する2末鎖DNA断片を形成し、そしてリ
ガーゼを用いて連結して目的の構造遺伝子を形成する。
に結合せしめ; β)適切に保護されたジー、トリー、又はテトラ−デオ
キシヌクレオチドをホスホトリエステル法又はホスフィ
ト法により製造し;T)担体に結合したデオキシヌクレ
オチド又ははオリゴデオキシヌクレオチドを、ホスホト
リエステル法又はホスフィト法に従って、適切に保護さ
れたモノ−デオキシヌクレオチド、又はジー、トリーも
しくはテトラーデオキシヌクレオチド〔(β)に従って
製造されたもの〕と連結し; δ)担体に結合しておりそして所望の数の塩基を有する
(r)に従って得られるオリゴデオキシヌクレオチドを
担体から切り離し、所望により精製し、保護基を除去し
、そして遊離の5′−末端ヒドロキシ基をリン酸化し;
t> 3個以下そして好ましくは8〜15個のオーバー
ラツプ塩基対を有する、コード鎖及び相補鎖からの、δ
)に従って得られた2つのオリゴデオキシヌクレオチド
を、4種類のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの
存在下でDNAポリメラーゼを用いて補完してCGRP
遺伝子を含有する2末鎖DNA断片を形成し、そしてリ
ガーゼを用いて連結して目的の構造遺伝子を形成する。
従って、式(IV)のDNA配列の合成は、例えば、固
相法に従って成長中のヌクレオチド配列上に段階的にト
リヌクレオチドブロックを縮合せしめることにより2種
類のオリゴデオキシヌクレオチド、すなわちおよそ同じ
数の塩基を有する負鎖及び正M(これらのオリゴデオキ
シヌクレオチド。
相法に従って成長中のヌクレオチド配列上に段階的にト
リヌクレオチドブロックを縮合せしめることにより2種
類のオリゴデオキシヌクレオチド、すなわちおよそ同じ
数の塩基を有する負鎖及び正M(これらのオリゴデオキ
シヌクレオチド。
は部分領域において相互に水素結合を形成する能力を有
する)を形成し、個々のヌクレオチド鎖を固体担体から
切り離し、存在するすべての保il!基を除去し、例え
ばゲル電気泳動によって精製を行い、そしてキナーゼ処
理及びバイブリド形成を行った後、好ましくはDNAポ
リメラーゼI (Klenow断片)により完全なりN
Aデュブレフクスを組み立てることにより実施すること
ができる。
する)を形成し、個々のヌクレオチド鎖を固体担体から
切り離し、存在するすべての保il!基を除去し、例え
ばゲル電気泳動によって精製を行い、そしてキナーゼ処
理及びバイブリド形成を行った後、好ましくはDNAポ
リメラーゼI (Klenow断片)により完全なりN
Aデュブレフクスを組み立てることにより実施すること
ができる。
段階(α)において、多数の固体担体材料、例えば種々
の架橋及び膨潤特性を有するポリスチレン、ポリアクリ
ルアミド、ポリアクリルアミドコポリマー、例えばシリ
カゲル、もしくはアロックスのごとき無機材料上に保持
されたポリアミド、又は官能化されたシラン、を使用す
ることができる。好ましい態様においては、使用される
固体担体材料は架橋されたポリスチレンであり、これは
、それ自体既知の方法により、1〜5個の極性2価官能
基、例えばイミノ、オキソ、チオ、オキソカルボニル又
はアミドカルボニルにより中断された2〜12個の炭素
原子を有するアルキレン基のごとき“スペーサー”によ
り、適切に保護されたデオキシヌクレオシドの5 ’
−OH基に連結される。
の架橋及び膨潤特性を有するポリスチレン、ポリアクリ
ルアミド、ポリアクリルアミドコポリマー、例えばシリ
カゲル、もしくはアロックスのごとき無機材料上に保持
されたポリアミド、又は官能化されたシラン、を使用す
ることができる。好ましい態様においては、使用される
固体担体材料は架橋されたポリスチレンであり、これは
、それ自体既知の方法により、1〜5個の極性2価官能
基、例えばイミノ、オキソ、チオ、オキソカルボニル又
はアミドカルボニルにより中断された2〜12個の炭素
原子を有するアルキレン基のごとき“スペーサー”によ
り、適切に保護されたデオキシヌクレオシドの5 ’
−OH基に連結される。
5′−位において、及び場合によっては塩基成分におい
て保護されている式(V)のヌクレオシドと無水コハク
酸との反応が特に好ましい(スキーム1)、この式にお
いて、R1は酸によって除去され得る保護基、例えばト
リアリールメチル保護基、例えば4−メトキシトリチル
基もしくは4゜4′−ジメトキシトリチル基、又はトリ
ー低級アルキルシリル保護基、例えばtart−ブチル
ジメチルシリル基であり、そしてBaはチミル、シトシ
ル、アデニル及びグアニルから成る群から選択される場
合によっては保護されている塩基である。
て保護されている式(V)のヌクレオシドと無水コハク
酸との反応が特に好ましい(スキーム1)、この式にお
いて、R1は酸によって除去され得る保護基、例えばト
リアリールメチル保護基、例えば4−メトキシトリチル
基もしくは4゜4′−ジメトキシトリチル基、又はトリ
ー低級アルキルシリル保護基、例えばtart−ブチル
ジメチルシリル基であり、そしてBaはチミル、シトシ
ル、アデニル及びグアニルから成る群から選択される場
合によっては保護されている塩基である。
スキーム1においては、場合によっては塩基、例えばピ
リジン、トリエチルアミン又はジメチルアミノピリジン
の存在下で前記の反応を行い、次に、カルボン酸基を活
性化する試薬、好ましくはN−ヒドロキシサクシンイミ
ド又はp−ニトロフェノール、及び脱水剤、例えばカル
ボジイミド、例えばジシクロへキシルカルボジイミドの
助けにより、0.5〜2%のジビニルベンゼンにより架
橋されたアミノメチル化ポリスチレンと反応せしめる。
リジン、トリエチルアミン又はジメチルアミノピリジン
の存在下で前記の反応を行い、次に、カルボン酸基を活
性化する試薬、好ましくはN−ヒドロキシサクシンイミ
ド又はp−ニトロフェノール、及び脱水剤、例えばカル
ボジイミド、例えばジシクロへキシルカルボジイミドの
助けにより、0.5〜2%のジビニルベンゼンにより架
橋されたアミノメチル化ポリスチレンと反応せしめる。
スキームl及びその後において、デオキシリボース残基
はしばしば習慣的に縮めた形で示される。
はしばしば習慣的に縮めた形で示される。
反応は、不活性非プロトン性溶剤、例えばピリジン、テ
トラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸エチル、クロロホ
ルム、塩化メチレン、ジメチルホルムアミドもしくはジ
エチルアセタミド、又はこれらの混合物中で、室温にて
又はわずかに上昇もしくは低下した温度にて、例えば約
−10℃〜約50℃の温度範囲内で、好ましくは室温に
て行われる。
トラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸エチル、クロロホ
ルム、塩化メチレン、ジメチルホルムアミドもしくはジ
エチルアセタミド、又はこれらの混合物中で、室温にて
又はわずかに上昇もしくは低下した温度にて、例えば約
−10℃〜約50℃の温度範囲内で、好ましくは室温に
て行われる。
脱水剤の存在下での反応は一層低い温度、例えば約0℃
にて行うことができる。
にて行うことができる。
以下東白
スキーム1
(Vl)
段階(β)におけるジー、トリー、又はテトラ−ヌクレ
オチドのこの発明に従う製造(スキーム2)においては
、5′−位において、そして場合によっては塩基成分に
おいて保護されておりR1及びBaが前記の意味を有す
る式(V)のヌクレオチドを、場合によっては脱水剤の
存在下又は塩基の存在下で、式(■)の活性化されたリ
ン酸エステルと反応せしめる0式中XI及びXtは相互
に独立にヒドロキシもしくはそれに由来する塩、ハロゲ
ン、イミダゾリル、1.2.4−トリアゾール−1−イ
ル、テトラゾリル、又は1−ベンズトリアアゾリルオキ
シであり、X8はさらに2−シアノエトキシ、2−トリ
ハロエトキシ、2−了り−ルスルホニルエトキシ、2−
低級アルキルチオエチル、2−アリールチオエトキシ、
又は2−(4−ニトロフェニル)−エトキシであり、そ
してR3は塩基により又は′tlt核性化合物により、
例えば水酸化アンモニウム、チオフェノラートもしくは
アリールアルドキシメートにより除去され得る保護基、
例えば場合によってはハロゲン、ニトロ及び/又は低級
アルキルにより置換されているフェニル、メチル、又は
場合によってはニトロにより置換されているベンジルで
あり、あるいは金属イオンにより除去され得る保護基例
えば8−キノリル、又は5−クロロ−8−キノリルであ
る。
オチドのこの発明に従う製造(スキーム2)においては
、5′−位において、そして場合によっては塩基成分に
おいて保護されておりR1及びBaが前記の意味を有す
る式(V)のヌクレオチドを、場合によっては脱水剤の
存在下又は塩基の存在下で、式(■)の活性化されたリ
ン酸エステルと反応せしめる0式中XI及びXtは相互
に独立にヒドロキシもしくはそれに由来する塩、ハロゲ
ン、イミダゾリル、1.2.4−トリアゾール−1−イ
ル、テトラゾリル、又は1−ベンズトリアアゾリルオキ
シであり、X8はさらに2−シアノエトキシ、2−トリ
ハロエトキシ、2−了り−ルスルホニルエトキシ、2−
低級アルキルチオエチル、2−アリールチオエトキシ、
又は2−(4−ニトロフェニル)−エトキシであり、そ
してR3は塩基により又は′tlt核性化合物により、
例えば水酸化アンモニウム、チオフェノラートもしくは
アリールアルドキシメートにより除去され得る保護基、
例えば場合によってはハロゲン、ニトロ及び/又は低級
アルキルにより置換されているフェニル、メチル、又は
場合によってはニトロにより置換されているベンジルで
あり、あるいは金属イオンにより除去され得る保護基例
えば8−キノリル、又は5−クロロ−8−キノリルであ
る。
次に、R1,XI及びxlLが前記の意味を有する得ら
れた式(■)の化合物をまず場合によっては2−置換エ
タノール(これは、基X2を基OR’に転換する。ここ
でR3はシアノエチル、2−トリハロエチル、2−アリ
ールスルホニルエチル、2−低級アルキルチオエチル、
2−アリールチオエチル又は2−(4−ニトロフェニル
)−エチルである)と反応せしめ、そして次に保護基R
1を除去し、そして式(IX)の生じた化合物を、場合
によっては脱水剤の存在下又は塩基の存在下で、式(■
)の他の化合物と反応せしめてジヌクレオチドXを形成
する(スキーム2)、場合によっては、式(■)の化合
物を、塩基及び水との反応によりXtがヒドロキシ又は
それに由来する塩である式(■)の異る化合物に転換す
る。
れた式(■)の化合物をまず場合によっては2−置換エ
タノール(これは、基X2を基OR’に転換する。ここ
でR3はシアノエチル、2−トリハロエチル、2−アリ
ールスルホニルエチル、2−低級アルキルチオエチル、
2−アリールチオエチル又は2−(4−ニトロフェニル
)−エチルである)と反応せしめ、そして次に保護基R
1を除去し、そして式(IX)の生じた化合物を、場合
によっては脱水剤の存在下又は塩基の存在下で、式(■
)の他の化合物と反応せしめてジヌクレオチドXを形成
する(スキーム2)、場合によっては、式(■)の化合
物を、塩基及び水との反応によりXtがヒドロキシ又は
それに由来する塩である式(■)の異る化合物に転換す
る。
反応は上記の不活性溶剤のいずれかの中で、室温して、
又はわずかに上昇もしくは低下した温度において、例え
ば室温において行う。
又はわずかに上昇もしくは低下した温度において、例え
ば室温において行う。
保護基R1の除去は、例えば酸、例えば鉱酸、例えば塩
酸もしくは硫酸、カルボン酸、例えば酢酸、トリクロロ
酢酸もしくは蟻酸、スルホン酸、例えばメタンスルホン
酸、もしくはp−トルエンスルホン酸、又は特にルイス
酸、例えば塩化亜鉛、臭化亜鉛、塩化アルミニウム、ジ
アルキルアルミニウムハライド、例えばジプチル−もし
くはジエチル−アルミニウムクロリド、又は三弗化ホウ
素により、10℃〜50℃にて、特に室温にて行う、ジ
アルキルアルミニウムハライドを使用する場合、除去は
親脂性溶剤、特にトルエン中で行う、そして他の上記の
ルイス酸を用いる場合、ハロゲン化炭化水素、例えば塩
化メチレンと低級アルカノール、例えばエタノール又は
イソプロパツールとから成る溶剤混合物中で行う。
酸もしくは硫酸、カルボン酸、例えば酢酸、トリクロロ
酢酸もしくは蟻酸、スルホン酸、例えばメタンスルホン
酸、もしくはp−トルエンスルホン酸、又は特にルイス
酸、例えば塩化亜鉛、臭化亜鉛、塩化アルミニウム、ジ
アルキルアルミニウムハライド、例えばジプチル−もし
くはジエチル−アルミニウムクロリド、又は三弗化ホウ
素により、10℃〜50℃にて、特に室温にて行う、ジ
アルキルアルミニウムハライドを使用する場合、除去は
親脂性溶剤、特にトルエン中で行う、そして他の上記の
ルイス酸を用いる場合、ハロゲン化炭化水素、例えば塩
化メチレンと低級アルカノール、例えばエタノール又は
イソプロパツールとから成る溶剤混合物中で行う。
以下余白
スキーム2
(■)(■) (■)(■)
式(X)のジヌクレオチドはまた、R1及びBaが前記
の意味を有する式(V)のヌクレオチドを式(■A)の
ホスフィトと反応せしめることによっても製造すること
ができる。ここでXI はハロゲン、特に塩素であり、
X3はハロゲン、特に塩素、又はジー低級アルキルアミ
ノ、特にジメチルアミノもしくはジイソプロピルアミノ
、又はモルホリノ、ピペリジノ又はピロリジノであり、
そしてR8は式(■)についての前記の意味を有し、特
にメチルである。前記の反応は場合によっては適当な塩
基の存在下で行われる(スキーム3)。
の意味を有する式(V)のヌクレオチドを式(■A)の
ホスフィトと反応せしめることによっても製造すること
ができる。ここでXI はハロゲン、特に塩素であり、
X3はハロゲン、特に塩素、又はジー低級アルキルアミ
ノ、特にジメチルアミノもしくはジイソプロピルアミノ
、又はモルホリノ、ピペリジノ又はピロリジノであり、
そしてR8は式(■)についての前記の意味を有し、特
にメチルである。前記の反応は場合によっては適当な塩
基の存在下で行われる(スキーム3)。
式(■A)の生ずる化合物を2−置換エタノール(これ
は基x1を基OR”に転換する。ここでR3は上記の意
味を有する)と反応せしめ、そして次に酸化剤、例えば
塩基の存在下でのヨウ素で酸化してホスフェートを形成
し、そして保護基R1を除去して式CIりの化合物を得
るか、あるいは式(IX)の化合物と反応せしめ、次に
酸化剤、例えば塩基の存在下でのヨウ素で酸化して(X
)の化合物を形成する。
は基x1を基OR”に転換する。ここでR3は上記の意
味を有する)と反応せしめ、そして次に酸化剤、例えば
塩基の存在下でのヨウ素で酸化してホスフェートを形成
し、そして保護基R1を除去して式CIりの化合物を得
るか、あるいは式(IX)の化合物と反応せしめ、次に
酸化剤、例えば塩基の存在下でのヨウ素で酸化して(X
)の化合物を形成する。
以下東向
スキーム3
トリヌクレオチドの製造のために、R’、R”及びR3
が前記の意味を有しモしてRa’及びBa”が相互に独
立にチミル、シトシル、アデニル又はグアニルである式
(X)のジヌクレオチド中の保gl基R1を除去し、そ
して生ずる化合物を、場合によっては脱水剤の存在下又
は塩基の存在下で式(■)の化合物と反応せしめるか、
あるいは式(■A)の化合物と反応せしめそして次に酸
化して式(XI)の化合物を得る(スキ゛−ム4)、保
護基R1の除去、及び式(XI)のトリヌクレオチドを
形成するための縮合は、式(X)のジヌクレオチドの製
造について記載したのと同様にして行われる。
が前記の意味を有しモしてRa’及びBa”が相互に独
立にチミル、シトシル、アデニル又はグアニルである式
(X)のジヌクレオチド中の保gl基R1を除去し、そ
して生ずる化合物を、場合によっては脱水剤の存在下又
は塩基の存在下で式(■)の化合物と反応せしめるか、
あるいは式(■A)の化合物と反応せしめそして次に酸
化して式(XI)の化合物を得る(スキ゛−ム4)、保
護基R1の除去、及び式(XI)のトリヌクレオチドを
形成するための縮合は、式(X)のジヌクレオチドの製
造について記載したのと同様にして行われる。
スキーム4
テトラヌクレオチドの製造のため、式(Xりのトリヌク
レオチドを、式(X)のジヌクレオチドについて前記し
たようにして反応せしめる。
レオチドを、式(X)のジヌクレオチドについて前記し
たようにして反応せしめる。
好ましい配置においては、保護5R1として4−メトキ
シトリチル基を、保護基Rtとして塩素で置換されたフ
ェニル基を、そして保護基R3として2−シアノエチル
基を使用する0式(■)の化合物中の5XI及びx8と
して1−ベンズトリアゾリルオキシが好ましい。
シトリチル基を、保護基Rtとして塩素で置換されたフ
ェニル基を、そして保護基R3として2−シアノエチル
基を使用する0式(■)の化合物中の5XI及びx8と
して1−ベンズトリアゾリルオキシが好ましい。
式(XI)のトリヌクレオチドは好ましくは、式(X)
のジヌクレオチドから保護基R1を除去し、そして生じ
る化合物を、X3がヒドロキシ又はそれに由来する塩で
ある式(■)の化合物と、脱水剤の存在下で反応せしめ
る(スキーム4)ことにより製造される。この発明の脱
水剤は例えば、2.4.6−)リメチルベンゼンスルホ
ニル又はトリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド
、イミダゾール、テトラゾール、又は1.2.4−トリ
アゾール(場合によってはニトロにより置換されている
)である、1− (2,4,6−ドリノチルベンゼンス
ルホニル)−3−二トロー1,2゜4−トリアゾール(
Xll)が脱水剤として好ましい。
のジヌクレオチドから保護基R1を除去し、そして生じ
る化合物を、X3がヒドロキシ又はそれに由来する塩で
ある式(■)の化合物と、脱水剤の存在下で反応せしめ
る(スキーム4)ことにより製造される。この発明の脱
水剤は例えば、2.4.6−)リメチルベンゼンスルホ
ニル又はトリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド
、イミダゾール、テトラゾール、又は1.2.4−トリ
アゾール(場合によってはニトロにより置換されている
)である、1− (2,4,6−ドリノチルベンゼンス
ルホニル)−3−二トロー1,2゜4−トリアゾール(
Xll)が脱水剤として好ましい。
使用されるヌクレオチドは好ましくは遊離アミノ基が塩
基成分において保護されているものである。好ましい保
護基は、アテエンのためにはベンゾイルであり、シトシ
ンのためにはベンゾイル又は4−メトキシベンゾイルで
あり、そしてグアニンのためにはイソブチリル又はジフ
ェニルアセチルである。チミンは、好ましくは保!なし
で使用される。
基成分において保護されているものである。好ましい保
護基は、アテエンのためにはベンゾイルであり、シトシ
ンのためにはベンゾイル又は4−メトキシベンゾイルで
あり、そしてグアニンのためにはイソブチリル又はジフ
ェニルアセチルである。チミンは、好ましくは保!なし
で使用される。
段R(y)に従うオリゴヌクレオチドの製造において、
溶剤及び試薬のために、半自動的又は全自動的マイクロ
プロセサー副扉供給系を有するそれ自体既知の装置が使
用される0段階(α)に従って製造された式(Vr)の
化合物中の保護基R1を上記のようにして除去し、そし
て次に、生じる化合物を、場合によっては脱水剤の存在
下又は塩基の存在下で式(■)の化合物と反応せしめる
か、あるいは式(■A)と反応せしめるか、あるいは式
(X)又は(XI)の化合物と反応せしめる。この場合
、保護基R3は塩基によりあらかじめ除去しておく(R
3としての基2−シアノエチルは例えば、トリー低級ア
ルキルアミン、例えばトリエチルアミンにより、前記の
不活性溶剤又は溶剤混合物のいずれかの中で、lO℃〜
40℃、特に室温にて除去される)0式(X)のジヌク
レオチド又は式(XI)のトリヌクレオチドの代りに、
段階(β)に従って製造されたテトラヌクレオチドを使
用することが可能である0式(■A)のホスフィトを使
用する場合、次に、酸化剤、例えば塩基の存在下でのヨ
ウ素により処理する Rl 、 Rを及び、Baが前記
の意味を有し、そしてnが1〜4の整数である、このよ
うにして製造された式(Xllr)の化合物を、式(X
I)の化合物(nは整数である)の製造のために必要な
だけ、式(Vl)の化合物について記載した反応段階(
R1の除去: (■)、(■A)、(x)、(XI)又
は対応するテトラヌクレオチドとの反応;場合によって
は後酸化処理〕にかける。
溶剤及び試薬のために、半自動的又は全自動的マイクロ
プロセサー副扉供給系を有するそれ自体既知の装置が使
用される0段階(α)に従って製造された式(Vr)の
化合物中の保護基R1を上記のようにして除去し、そし
て次に、生じる化合物を、場合によっては脱水剤の存在
下又は塩基の存在下で式(■)の化合物と反応せしめる
か、あるいは式(■A)と反応せしめるか、あるいは式
(X)又は(XI)の化合物と反応せしめる。この場合
、保護基R3は塩基によりあらかじめ除去しておく(R
3としての基2−シアノエチルは例えば、トリー低級ア
ルキルアミン、例えばトリエチルアミンにより、前記の
不活性溶剤又は溶剤混合物のいずれかの中で、lO℃〜
40℃、特に室温にて除去される)0式(X)のジヌク
レオチド又は式(XI)のトリヌクレオチドの代りに、
段階(β)に従って製造されたテトラヌクレオチドを使
用することが可能である0式(■A)のホスフィトを使
用する場合、次に、酸化剤、例えば塩基の存在下でのヨ
ウ素により処理する Rl 、 Rを及び、Baが前記
の意味を有し、そしてnが1〜4の整数である、このよ
うにして製造された式(Xllr)の化合物を、式(X
I)の化合物(nは整数である)の製造のために必要な
だけ、式(Vl)の化合物について記載した反応段階(
R1の除去: (■)、(■A)、(x)、(XI)又
は対応するテトラヌクレオチドとの反応;場合によって
は後酸化処理〕にかける。
以下余白
この発明の好ましい態様においては、保i5R’として
4−メトキシトリチルを使用し、そしてこの基の除去は
CH−又はNH−酸化合物、特に1゜2.4−)リアゾ
ール又はテトラゾールの存在下での臭化亜鉛により行わ
れる。4−メトキシトリチル保r!1基を除去するため
の例えば1.2.4−トリアゾールの使用は新規であり
、そして驚くべきことに急速で且つ副反応を伴わない高
収率の除去をもたらす、非プロトン性溶剤とアルコール
、例えば塩化メチレンと2−プロパツールとから成る溶
剤混合物中で20: 1−100: 1のモル比の臭化
亜鉛及び1.2.4−1−リアゾールを使用するのが好
ましい。
4−メトキシトリチルを使用し、そしてこの基の除去は
CH−又はNH−酸化合物、特に1゜2.4−)リアゾ
ール又はテトラゾールの存在下での臭化亜鉛により行わ
れる。4−メトキシトリチル保r!1基を除去するため
の例えば1.2.4−トリアゾールの使用は新規であり
、そして驚くべきことに急速で且つ副反応を伴わない高
収率の除去をもたらす、非プロトン性溶剤とアルコール
、例えば塩化メチレンと2−プロパツールとから成る溶
剤混合物中で20: 1−100: 1のモル比の臭化
亜鉛及び1.2.4−1−リアゾールを使用するのが好
ましい。
好ましいLi様においては、保護基R1が除去されてい
る式(Vl)又は式(XI[[)の化合物と保護基R″
が除去されている式(Xりのトリヌクレオチドとを、脱
水剤、例えば2.4.6−)リメチルベンゼンスルホニ
ルクロリドもしくはトリイソプロピルベンゼンスルホニ
ルクロリド、イミダゾール、テトラゾール又は場合によ
ってはニトロにより置換されている1、2.4−1−リ
アゾールの存在下で反応せしめる。1− (2,4,6
−トリメチルベンゼンスルホニル)−3−二) ”−1
+2.4−トリアゾール(XII)が特に好ましい。
る式(Vl)又は式(XI[[)の化合物と保護基R″
が除去されている式(Xりのトリヌクレオチドとを、脱
水剤、例えば2.4.6−)リメチルベンゼンスルホニ
ルクロリドもしくはトリイソプロピルベンゼンスルホニ
ルクロリド、イミダゾール、テトラゾール又は場合によ
ってはニトロにより置換されている1、2.4−1−リ
アゾールの存在下で反応せしめる。1− (2,4,6
−トリメチルベンゼンスルホニル)−3−二) ”−1
+2.4−トリアゾール(XII)が特に好ましい。
保護基R1として4−モノメトキシトリチル基を使用し
、R1を除去するために1.14−トリアゾールの存在
下で臭化亜鉛を使用し、そして保護基が除去されている
式(X m)のオリゴヌクレオチド−ポリスチレン樹脂
と保護基が除去されている式(XI)のトリヌクレオチ
ドとの反応のための脱水剤として式(XI[)のトリア
ゾールを使用することを含んで成る特に好ましい組合わ
せにより、短時間で、高収率で、そして高純度で、長い
ヌクレオチドを製造す、ることが可能となる。
、R1を除去するために1.14−トリアゾールの存在
下で臭化亜鉛を使用し、そして保護基が除去されている
式(X m)のオリゴヌクレオチド−ポリスチレン樹脂
と保護基が除去されている式(XI)のトリヌクレオチ
ドとの反応のための脱水剤として式(XI[)のトリア
ゾールを使用することを含んで成る特に好ましい組合わ
せにより、短時間で、高収率で、そして高純度で、長い
ヌクレオチドを製造す、ることが可能となる。
担体からオリゴヌクレオチドを切り離すため、及び段階
(δ)に従って保護基を除去するために、それ自体既知
の方法が使用される。担体からの切り離し、及び好まし
い2−クロロフェニル保護基の除去のための特に好まし
い試薬はアリールアルドキシメート、例えば1.1.3
.3−テトラメチルグアニジニウム2−ニトロベンザル
ドキシメートである0反応は、幾らかの水が添加された
上記の不活性溶剤のいずれか、例えば95%濃度のピリ
ジン中で、室温にて行われる0次に、室温又は上昇した
温度、例えば20℃〜70℃、特に50℃において水性
アンモニアとの反応を行う。
(δ)に従って保護基を除去するために、それ自体既知
の方法が使用される。担体からの切り離し、及び好まし
い2−クロロフェニル保護基の除去のための特に好まし
い試薬はアリールアルドキシメート、例えば1.1.3
.3−テトラメチルグアニジニウム2−ニトロベンザル
ドキシメートである0反応は、幾らかの水が添加された
上記の不活性溶剤のいずれか、例えば95%濃度のピリ
ジン中で、室温にて行われる0次に、室温又は上昇した
温度、例えば20℃〜70℃、特に50℃において水性
アンモニアとの反応を行う。
オリゴデオキシヌクレオチドの連結のために、段階(δ
)に従って5′−末端ヒドロキシ基にリン酸基を導入す
る。リン酸基の導入(リン酸化)は、それ自体既知の方
法で、A T Pの存在下でT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて行う。
)に従って5′−末端ヒドロキシ基にリン酸基を導入す
る。リン酸基の導入(リン酸化)は、それ自体既知の方
法で、A T Pの存在下でT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて行う。
コードDNA[及び相補DNAff1から成る、上記の
ようにして製造されたオリゴヌクレオチドは3個以上、
そして好ましくは8〜15個のオーバラップする塩基対
から成るオーバーランプ配列を含有する。このようなオ
リゴヌクレオチド対は、混合中に水素結合により一緒に
保持される。突出する単鎖末端は、段階(6)に従って
、4種類のデオキシヌクレオシドトリホスフェート(d
ATP。
ようにして製造されたオリゴヌクレオチドは3個以上、
そして好ましくは8〜15個のオーバラップする塩基対
から成るオーバーランプ配列を含有する。このようなオ
リゴヌクレオチド対は、混合中に水素結合により一緒に
保持される。突出する単鎖末端は、段階(6)に従って
、4種類のデオキシヌクレオシドトリホスフェート(d
ATP。
dCTP、 dGTP、及びTTP)の存在下でDNA
ポリメラーゼ、例えばDNAポリメラーゼI、DNAポ
リメラーゼIの)[1enow断片もしくはTオDNA
ポリメラーゼ、又はAMV逆転写酵素を用いて行う相補
鎖の合成のためのマトリクス(鋳型)として機能する。
ポリメラーゼ、例えばDNAポリメラーゼI、DNAポ
リメラーゼIの)[1enow断片もしくはTオDNA
ポリメラーゼ、又はAMV逆転写酵素を用いて行う相補
鎖の合成のためのマトリクス(鋳型)として機能する。
補完の間に形成されたデユプレツクスDNAは平滑末端
を有する。
を有する。
段階(ε)従って得られるDNA配列はその末端に制限
エンドヌクレアーゼにより認識されそして開裂され得る
ヌクレオチド配列を有する。ヌクレオチド配列、そして
それ故に制限エンドヌクレアーゼの選択に依存して、開
裂の間に完全塩基対合束@(平滑末端)、又はオーバー
ラツプDNA護を有する末端(接着末端)が形成される
。
エンドヌクレアーゼにより認識されそして開裂され得る
ヌクレオチド配列を有する。ヌクレオチド配列、そして
それ故に制限エンドヌクレアーゼの選択に依存して、開
裂の間に完全塩基対合束@(平滑末端)、又はオーバー
ラツプDNA護を有する末端(接着末端)が形成される
。
この発明はまた医薬製剤に関し、この医薬製剤は活性成
分として育効量の、特に前記の疾患の治療のために有効
な量のこの発明のペプチド−アミドのいずれか又はその
塩を、存意量の、すなわち50重量%以上の、好ましく
は95重量%以上の、特に99重量%以上の医薬担体と
共に含んで成り、このような製剤は、特に、温血動物、
例えば特にヒトに鼻内的又は非経腸的に、例えば筋肉内
又は静脈内に投与するためのものである。
分として育効量の、特に前記の疾患の治療のために有効
な量のこの発明のペプチド−アミドのいずれか又はその
塩を、存意量の、すなわち50重量%以上の、好ましく
は95重量%以上の、特に99重量%以上の医薬担体と
共に含んで成り、このような製剤は、特に、温血動物、
例えば特にヒトに鼻内的又は非経腸的に、例えば筋肉内
又は静脈内に投与するためのものである。
活性成分の投与量は温血動物の種、体重、年齢、固体の
状態、治療されるべき疾患、及び投与の態様に依有する
。
状態、治療されるべき疾患、及び投与の態様に依有する
。
非経腸投与のためのこの新規な医薬製剤は、すぐに使用
するための形態において、約0.0001fE量%〜約
1重量%、好ましくは約o、ooos重量%〜約0、1
31量%の活性成分を含有する。この発明の医薬製剤は
例えば単位投与形、例えばアンプルの形であることがで
きる。
するための形態において、約0.0001fE量%〜約
1重量%、好ましくは約o、ooos重量%〜約0、1
31量%の活性成分を含有する。この発明の医薬製剤は
例えば単位投与形、例えばアンプルの形であることがで
きる。
好ましくは、活性成分の溶液、そしてさらに懸濁液、特
に等張水性溶液又は懸濁液が使用され、そしてこれらは
、例えば、それ自体として又は担体、例えばマンニトー
ルと共に活性成分を含有する凍結乾燥製剤の場合には、
使用する前に調製することができる。特に鼻内投与のた
めには、油中懸濁液が特に適当である。医薬製剤は無菌
化することができ、モして/又は添加剤、例えば防腐剤
、安定剤、湿潤剤及び/又は乳化剤、溶解剤、浸透圧調
整塩及び/又は緩衝剤を含有することができ、そしてそ
れ自体既知の方法により、例えば常用の溶解及び凍結乾
燥技法により製造される。前記の溶液又は懸濁液は増粘
剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニル
ピロ111’ン、又は好ましくはゼラチンを含有するこ
とができる。
に等張水性溶液又は懸濁液が使用され、そしてこれらは
、例えば、それ自体として又は担体、例えばマンニトー
ルと共に活性成分を含有する凍結乾燥製剤の場合には、
使用する前に調製することができる。特に鼻内投与のた
めには、油中懸濁液が特に適当である。医薬製剤は無菌
化することができ、モして/又は添加剤、例えば防腐剤
、安定剤、湿潤剤及び/又は乳化剤、溶解剤、浸透圧調
整塩及び/又は緩衝剤を含有することができ、そしてそ
れ自体既知の方法により、例えば常用の溶解及び凍結乾
燥技法により製造される。前記の溶液又は懸濁液は増粘
剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニル
ピロ111’ン、又は好ましくはゼラチンを含有するこ
とができる。
油中懸濁液は、油状成分として注射用として一般的な植
物油、合成油又は半合底油を含有する。
物油、合成油又は半合底油を含有する。
酸成分として8〜22個、特に12〜20個の炭素原子
を有する長鎖脂肪酸、例えばラウリン酸、トリデシル酸
、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マル
ガリン酸、ステアリン酸、アラキシン酸、ベヘン酸又は
対応する不飽和酸、例えばオレイン酸、エライジン酸、
エルシン酸、ブランジン酸又はリルン酸を含有する液体
脂肪酸エステルを特に挙げることができる。アルコール
成分は最高6個の炭素原子を有し、そして−価アルコー
ル又は多価アルコール、例えば−価アルコール、二価ア
ルコール又は三価アルコール、例えばメタノール、エタ
ノール、プロパツール、ブタノールもしくはペンタノー
ル又はこれらの異性体、しかし特にグリコール又はグリ
セリンである。従って例えば、脂肪酸エステルとして、
オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミ
チン酸イソプロピル、’Labrafil M 273
5 ” ()リオレイン酸ポリオキシエチレングリセ
リン、メスルス・ガテフォセ、パリ) 、’Migly
ol 812 ” (Cm 〜C1!の鎖長を有する
飽和脂肪酸のトリグリセライド、メスルス・チミッシエ
・ベルチ、リアテン/ルール、独)、シかし特に植物油
、例えば綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ヒマシ油
、ゴマ油、大豆油、及び特にピーナツ油を挙げることが
できる。
を有する長鎖脂肪酸、例えばラウリン酸、トリデシル酸
、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マル
ガリン酸、ステアリン酸、アラキシン酸、ベヘン酸又は
対応する不飽和酸、例えばオレイン酸、エライジン酸、
エルシン酸、ブランジン酸又はリルン酸を含有する液体
脂肪酸エステルを特に挙げることができる。アルコール
成分は最高6個の炭素原子を有し、そして−価アルコー
ル又は多価アルコール、例えば−価アルコール、二価ア
ルコール又は三価アルコール、例えばメタノール、エタ
ノール、プロパツール、ブタノールもしくはペンタノー
ル又はこれらの異性体、しかし特にグリコール又はグリ
セリンである。従って例えば、脂肪酸エステルとして、
オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミ
チン酸イソプロピル、’Labrafil M 273
5 ” ()リオレイン酸ポリオキシエチレングリセ
リン、メスルス・ガテフォセ、パリ) 、’Migly
ol 812 ” (Cm 〜C1!の鎖長を有する
飽和脂肪酸のトリグリセライド、メスルス・チミッシエ
・ベルチ、リアテン/ルール、独)、シかし特に植物油
、例えば綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ヒマシ油
、ゴマ油、大豆油、及び特にピーナツ油を挙げることが
できる。
注射剤の製造、アンプル又はバイアルへのその導入、及
び容器の密封は常法に従って無菌条件下で行われる。
び容器の密封は常法に従って無菌条件下で行われる。
次に、例によりこの発明を説明する。温度は℃で示す。
Rt値は、特にことわらない限り、又は文脈から明らか
でない限り、次の溶剤系■ニ ジクロロメタン/メタノール(9: 1)において、1
層シリカゲルプレート上で確認されたものである。
でない限り、次の溶剤系■ニ ジクロロメタン/メタノール(9: 1)において、1
層シリカゲルプレート上で確認されたものである。
従って、例えばRt (r)は溶剤系Tにおいてt!
認されたR、値を示す。
認されたR、値を示す。
一咀一豆−
Ac■ ファセタミドメチル
Boc = tert−ブトキシカルボニルBSA
−ウシ血清アルブミン BZL 票ベンジル 2CZ −2−クロロベンジルオキシカルボニルd
−デオキシ 0肝 璽ジメチルホルムアミド D丁T 諺1,4−ジチオスレイトール(I,4−ジメ
ルカプト−2,3−ブタンジオール)ED?A −エ
チレンジアミン四酢酸EtBr −エチジウムプロミ
ド FAB −急速原子衝撃 F+woc =9−フルオレニルメトキシカルボニル
)IPLC −高圧液体クロマトグラフィーiBu
−イソブチリル M −モル濃度 ?IB)IA −モノ−(4−メチル)−ベンズヒド
リルアミン ?fe Wメチル mmtx(モノ−4−メトキシ)−トリチルMOB
−4−メトキシベンジル MS 鱈マススペクトル 以下余白 Mtr −4−メトキシ−2,3,6−ドリメチルベ
ンゼンスルホニル N −規定濃度 OD −光学濃度 SOS −ドデシル硫酸ナトリウム tBU =tert−ブチル TNE =100+wM NaC1,50+mM t
ris、Hcl(pH7,5)及び5mM HDTAを
含有する溶液 TO5−4−)ルエンスルホニル tris=)リス−(ヒドロキシメチル)−アミノメタ
ン tris、Hcl = trisの一塩酸塩ν又はvo
l、−容積(体積) χANT −9−キサンセニル ■上 ’l、Qmlの50%酢酸中15++g (3,8、c
r膳o1)のAla−Cys (Acm)−Asn−τ
hr−Ala−丁hr−Cys(Acs+)−Val−
Thr−His −Arg−Leu−A Ia−G I
y−Leu−Leu−5er−Arg−5er−Gl
y−G ly−Me t−Va 1−Lys−3er
−Asn−Phe−Val −Pro−Thr−Asn
−Val−Gly−5er−Lys−Ala−Phe−
NHzの溶液を、室温にて5分間以内に、攪拌しながら
、氷酢酸中0.1Mヨウ素0.26m!!、50%の酢
酸0.33mj!及び16μlの0.1 N HCIの
混合物に満願する。室温にて10分間置いた後、混合物
を40μlの1Mアスコルビン酸水溶液の添加によって
脱色し、そして50%酢酸中セファデックス(商標)
G−25に通して濾過する。溶出液を真空中で約1mj
!に濃縮し、そして後記述のようにして)IPLC精製
にかける。
−ウシ血清アルブミン BZL 票ベンジル 2CZ −2−クロロベンジルオキシカルボニルd
−デオキシ 0肝 璽ジメチルホルムアミド D丁T 諺1,4−ジチオスレイトール(I,4−ジメ
ルカプト−2,3−ブタンジオール)ED?A −エ
チレンジアミン四酢酸EtBr −エチジウムプロミ
ド FAB −急速原子衝撃 F+woc =9−フルオレニルメトキシカルボニル
)IPLC −高圧液体クロマトグラフィーiBu
−イソブチリル M −モル濃度 ?IB)IA −モノ−(4−メチル)−ベンズヒド
リルアミン ?fe Wメチル mmtx(モノ−4−メトキシ)−トリチルMOB
−4−メトキシベンジル MS 鱈マススペクトル 以下余白 Mtr −4−メトキシ−2,3,6−ドリメチルベ
ンゼンスルホニル N −規定濃度 OD −光学濃度 SOS −ドデシル硫酸ナトリウム tBU =tert−ブチル TNE =100+wM NaC1,50+mM t
ris、Hcl(pH7,5)及び5mM HDTAを
含有する溶液 TO5−4−)ルエンスルホニル tris=)リス−(ヒドロキシメチル)−アミノメタ
ン tris、Hcl = trisの一塩酸塩ν又はvo
l、−容積(体積) χANT −9−キサンセニル ■上 ’l、Qmlの50%酢酸中15++g (3,8、c
r膳o1)のAla−Cys (Acm)−Asn−τ
hr−Ala−丁hr−Cys(Acs+)−Val−
Thr−His −Arg−Leu−A Ia−G I
y−Leu−Leu−5er−Arg−5er−Gl
y−G ly−Me t−Va 1−Lys−3er
−Asn−Phe−Val −Pro−Thr−Asn
−Val−Gly−5er−Lys−Ala−Phe−
NHzの溶液を、室温にて5分間以内に、攪拌しながら
、氷酢酸中0.1Mヨウ素0.26m!!、50%の酢
酸0.33mj!及び16μlの0.1 N HCIの
混合物に満願する。室温にて10分間置いた後、混合物
を40μlの1Mアスコルビン酸水溶液の添加によって
脱色し、そして50%酢酸中セファデックス(商標)
G−25に通して濾過する。溶出液を真空中で約1mj
!に濃縮し、そして後記述のようにして)IPLC精製
にかける。
次の式(III)のCGRP Irが得られる。
Leu−A Ia−G Iy−Lau−Leu−Ser
−Arg−5er−G I y−G ly−Me t−
Val−Lys−5er−Asn−Phe−Val−P
ro−Thr−^5n−Val−Gly−5er−Ly
s−Ala−Phe−NHICIll) 出発物質は次のようにして得られる。
−Arg−5er−G I y−G ly−Me t−
Val−Lys−5er−Asn−Phe−Val−P
ro−Thr−^5n−Val−Gly−5er−Ly
s−Ala−Phe−NHICIll) 出発物質は次のようにして得られる。
没1ムよ
30.0 gのクロロメチルポリスチレン(20,1m
s+olのCI)を、6.1 g (40,2mmol
)のp−ヒドロキシメチル安息香酸と共に、150mf
f1の脱気したジメチルホルムアミド中に導入し、そし
て3分間にわたり6.0 mll (40,2auwo
l)の1.8−ジアザビシクロ(5、4、0)−ウンデ
ク−7−エン(I、5。
s+olのCI)を、6.1 g (40,2mmol
)のp−ヒドロキシメチル安息香酸と共に、150mf
f1の脱気したジメチルホルムアミド中に導入し、そし
て3分間にわたり6.0 mll (40,2auwo
l)の1.8−ジアザビシクロ(5、4、0)−ウンデ
ク−7−エン(I、5。
5)を加える0反応混合物を50℃にて20時間攪拌す
る。得られる樹脂を吸引濾過し、150m1ずつのジメ
チルホルムアミド、ジメチルホルムアミド/水(9:
1) 、メタノール、塩化メチレン及びメタノールで、
各場合に3回ずつ洗浄する。
る。得られる樹脂を吸引濾過し、150m1ずつのジメ
チルホルムアミド、ジメチルホルムアミド/水(9:
1) 、メタノール、塩化メチレン及びメタノールで、
各場合に3回ずつ洗浄する。
この樹脂を重量が一定になるまで高真空下で乾燥し、こ
うしてヒドロキシベンジル−p−カルボニルオキシメチ
ルポリスチレン合成樹脂を得る。
うしてヒドロキシベンジル−p−カルボニルオキシメチ
ルポリスチレン合成樹脂を得る。
段■1主
1、1 g (4mmol)のBoc−Phe及び段階
1.1で得られた樹脂3.0g(約2mmol)を、室
温にてゆるやかに撹拌しながら約5分間、20m1の塩
化メチレン及び1.5ml!のジメチルホルムアミド中
に懸濁する。この混合物をO℃〜5℃に冷却し、そして
1.8mjの塩化メチレン中865* (4,2m5o
l)のジシクロへキシルカルボジイミドを3回に分けて
5分間以内に加える。さらに5分間の後、24try
(0,2ma+ol)のジメチルアミノピリジン、及び
10分間後、1mlの塩化メチレン中220μlのN−
メチルモルホリン(2mmol)を加える。この混合物
を0℃に1時間保持し、そして次に室温にて20時間保
持する。この樹脂を濾取し、約50m!ずつの塩化メチ
レン、ジメチルホルムアミド、メタノール、塩化メチレ
ン及びメタノールにより、各場合に5回ずつ洗浄する。
1.1で得られた樹脂3.0g(約2mmol)を、室
温にてゆるやかに撹拌しながら約5分間、20m1の塩
化メチレン及び1.5ml!のジメチルホルムアミド中
に懸濁する。この混合物をO℃〜5℃に冷却し、そして
1.8mjの塩化メチレン中865* (4,2m5o
l)のジシクロへキシルカルボジイミドを3回に分けて
5分間以内に加える。さらに5分間の後、24try
(0,2ma+ol)のジメチルアミノピリジン、及び
10分間後、1mlの塩化メチレン中220μlのN−
メチルモルホリン(2mmol)を加える。この混合物
を0℃に1時間保持し、そして次に室温にて20時間保
持する。この樹脂を濾取し、約50m!ずつの塩化メチ
レン、ジメチルホルムアミド、メタノール、塩化メチレ
ン及びメタノールにより、各場合に5回ずつ洗浄する。
このものは、高真空下で乾燥した後3.34 gの重量
を有する。未反応のヒドロキシ基をブロックするため、
樹脂を2Qmlの塩化メチレンに懸濁し、1mjFのピ
リジンを加え、そして水浴中で冷却した後、これに1m
lの塩化ベンゾイルを加える。0℃にて15分間及び室
温にて1時間置いた後、樹脂を吸引濾取し、そして50
mjjずつの塩化メチレン、ジメチルホルムアミド、メ
タノール、塩化メチレン及びメタノールにより、各場合
に2回ずつ、次々と洗浄する。
を有する。未反応のヒドロキシ基をブロックするため、
樹脂を2Qmlの塩化メチレンに懸濁し、1mjFのピ
リジンを加え、そして水浴中で冷却した後、これに1m
lの塩化ベンゾイルを加える。0℃にて15分間及び室
温にて1時間置いた後、樹脂を吸引濾取し、そして50
mjjずつの塩化メチレン、ジメチルホルムアミド、メ
タノール、塩化メチレン及びメタノールにより、各場合
に2回ずつ、次々と洗浄する。
この樹脂を、重量が一定なるまで高真空下で乾燥する。
N含量からアミノ酸負荷を0.35m−0l/gと算定
する。
する。
塁1上ユ
1.0gのBoc−Phe樹脂(0,35−mol)を
、半自動ペプチド合成機中で、次の操作(すべての洗浄
操イ乍は、各場合に約29m1により行う)に力1番す
て、Boc基を除去し、第2アミノ酸Boc−Alaに
カップリングせしめ、そしてそのBociを除去する。
、半自動ペプチド合成機中で、次の操作(すべての洗浄
操イ乍は、各場合に約29m1により行う)に力1番す
て、Boc基を除去し、第2アミノ酸Boc−Alaに
カップリングせしめ、そしてそのBociを除去する。
IXl、0分間 イソプロパツール、
3XO,F1間 エチレンジクロリド、3 x 5.0
分間、lX15分間 Boc基を除去するためトリフルオ ロ酢酸/エチレンクロリド、 3 x 0.5分間 エチレンジクロリド、1x2,0
分間 イソプロパツール、 2 x 0.5分間 エチレンジクロリド、2 x 0
15分間 脱気したジメチルアセタミド、3 X 2.
0分間 ジエチルアセタミド中2%ジイソプロピルエチ
ルアミン、 2xO,s分間 エチレンジクロリド、3 X 0.5
分間 蒸留したジメチルアセタミド、1X120分間
カンブリング:1.5m5olのBoc−Ala。
分間、lX15分間 Boc基を除去するためトリフルオ ロ酢酸/エチレンクロリド、 3 x 0.5分間 エチレンジクロリド、1x2,0
分間 イソプロパツール、 2 x 0.5分間 エチレンジクロリド、2 x 0
15分間 脱気したジメチルアセタミド、3 X 2.
0分間 ジエチルアセタミド中2%ジイソプロピルエチ
ルアミン、 2xO,s分間 エチレンジクロリド、3 X 0.5
分間 蒸留したジメチルアセタミド、1X120分間
カンブリング:1.5m5olのBoc−Ala。
221w(I,5m+*ol)のヒドロキシヘンシトリ
アゾール、320■(I,6 +am+ol)のジシクロへキシルカルボジイミド(0
,32mtのエチレンジクロリド及び3.5eilのジ
メチルアセタミド中);20分間室温にて、 100分間45°にて、 IX2.0分間 10■lの無水酢酸/ピリジン/ジメ
チルアセタミド(I0: 10 : 80、V/V)(
未反応アミノ基をブロッ クするため)、 I X O,5分間 脱気したジメチルアセタミド、I
Xl、0分間 イソプロパツール、 2 X O,5分間 エチレンジクロリド、2 X 0
.5分間 脱気したジメチルアセタミド、IXl、0分
間 インプロパツール、 3 x 0.5分間 エチレンジクロリド、3 X l
0分間、lX15分間 トリフルオロ酢酸/エチレンクロ リド(Boc基を除去するため)、 3×0.5分間 エチレンジクロリド、I X 2.0
分間 イソプロパツール、2×0.5分間 エチレンジ
クロリド、2 X 0.5分間 脱気したジメチルアセ
タミド、3 X 2.0分間 ジメチルアセタミド中2
%ジイソプロピルエチルアミン、 2 x 0.5分間 エチレンジクロリド、3 x 0
.5分間 蒸留したジメチルアセタミド、ユ1上工 前記のペプチド合成機中で、段階1.3に従って得られ
た生成物に次のアミノ酸を次々と縮合せしめる。
アゾール、320■(I,6 +am+ol)のジシクロへキシルカルボジイミド(0
,32mtのエチレンジクロリド及び3.5eilのジ
メチルアセタミド中);20分間室温にて、 100分間45°にて、 IX2.0分間 10■lの無水酢酸/ピリジン/ジメ
チルアセタミド(I0: 10 : 80、V/V)(
未反応アミノ基をブロッ クするため)、 I X O,5分間 脱気したジメチルアセタミド、I
Xl、0分間 イソプロパツール、 2 X O,5分間 エチレンジクロリド、2 X 0
.5分間 脱気したジメチルアセタミド、IXl、0分
間 インプロパツール、 3 x 0.5分間 エチレンジクロリド、3 X l
0分間、lX15分間 トリフルオロ酢酸/エチレンクロ リド(Boc基を除去するため)、 3×0.5分間 エチレンジクロリド、I X 2.0
分間 イソプロパツール、2×0.5分間 エチレンジ
クロリド、2 X 0.5分間 脱気したジメチルアセ
タミド、3 X 2.0分間 ジメチルアセタミド中2
%ジイソプロピルエチルアミン、 2 x 0.5分間 エチレンジクロリド、3 x 0
.5分間 蒸留したジメチルアセタミド、ユ1上工 前記のペプチド合成機中で、段階1.3に従って得られ
た生成物に次のアミノ酸を次々と縮合せしめる。
Fmoc−Lys(Boc)、 Fmoc−Ser(t
Bu)、 Fa+oc−Gly、 Fmoc−Val、
Fmoc−Asn、 Fmoc−Thr(tBu
)、 Fmoc−Pro+ Fmoc−Val、
Fmoc−Phe、 Fsoc−Asn、 F+
woc−Ser(tBu)、 Fmoc−Lys(B
oc)、 Fmoc−Val、 Fmoc−Met、
Fmoc−Gly、 Fmoc−Glyl Fmoc−
3er(tBu)、 Fmoc−Arg(Mtr)+
Fmoc−Set(tBu)、 Fmoc−Leu
+ Fmoc−Leu、 Fmoc−Gly、 Fs+
oc−A]a+Fmoc−Leu、 Fmoc−Arg
(Mtr)、 Fmoc−His(Fmoc)、 Fa
+oc−Thr(tBu)、 Fmoc−Val、
F+oc−Cys(Acm)、 Fsoc−Thr
(tBu)、 Fmoc−Ala、 Fmoc−丁
hr(tBu)、 Fmoc−Asn+ Fmoc
−Cys (Acm)及びBoc−A1a*このため、
各場合に次の操作サイクルを行う。
Bu)、 Fa+oc−Gly、 Fmoc−Val、
Fmoc−Asn、 Fmoc−Thr(tBu
)、 Fmoc−Pro+ Fmoc−Val、
Fmoc−Phe、 Fsoc−Asn、 F+
woc−Ser(tBu)、 Fmoc−Lys(B
oc)、 Fmoc−Val、 Fmoc−Met、
Fmoc−Gly、 Fmoc−Glyl Fmoc−
3er(tBu)、 Fmoc−Arg(Mtr)+
Fmoc−Set(tBu)、 Fmoc−Leu
+ Fmoc−Leu、 Fmoc−Gly、 Fs+
oc−A]a+Fmoc−Leu、 Fmoc−Arg
(Mtr)、 Fmoc−His(Fmoc)、 Fa
+oc−Thr(tBu)、 Fmoc−Val、
F+oc−Cys(Acm)、 Fsoc−Thr
(tBu)、 Fmoc−Ala、 Fmoc−丁
hr(tBu)、 Fmoc−Asn+ Fmoc
−Cys (Acm)及びBoc−A1a*このため、
各場合に次の操作サイクルを行う。
各場合に先行するアミノ酸からFmoc保護基が除去さ
れる。
れる。
IXl、0分間 インプロパツール、
2 ’X O,5分間 エチレンジクロリド、IXo、
5分間 脱気したジメチルアセタミド、IXl、0分間
イソプロパツール、 3 X 0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、4
X 2.0分間 ジメチルアセタミド中20 (Vo
l)%ピペリジン、 2 X 0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、2
X 1.0分間 水/過酸化物不含育ジオキサン(I
:2 v/v)、 2 X 0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、2
X 0.5分間 エチレンジクロリド、3 X 0.
5分間 蒸留したジメチルアセタミド、以下余白 atx 120分間 カップリング: 1.5 nmo
lのFmoc −アミノ酸、又は末端においてBoc− Ala 、 221w (I,5mmol)のヒドロ
キシベンゾトリアゾール、320 ■(I,61laol)のジシクロへキシルカルボジイ
ミド(0,32m1のエ チレンジクロリド及び3.5s+1のジメチルアセタミ
ド中):20分間 室温にて、100分間45℃にて、 lX2.0分間 10■Iの無水酢酸/ピリジン/ジメ
チルアセタミド(I0: 10 : 80、V / V
)、 IXo、5分間 脱気したジメチルアセタミド、I X
1.0分間 インプロパツール、3 X 0.5分間
エチレンジクロリド、及び2 X 0.5分間 脱気
したジメチルアセタミド。
5分間 脱気したジメチルアセタミド、IXl、0分間
イソプロパツール、 3 X 0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、4
X 2.0分間 ジメチルアセタミド中20 (Vo
l)%ピペリジン、 2 X 0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、2
X 1.0分間 水/過酸化物不含育ジオキサン(I
:2 v/v)、 2 X 0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、2
X 0.5分間 エチレンジクロリド、3 X 0.
5分間 蒸留したジメチルアセタミド、以下余白 atx 120分間 カップリング: 1.5 nmo
lのFmoc −アミノ酸、又は末端においてBoc− Ala 、 221w (I,5mmol)のヒドロ
キシベンゾトリアゾール、320 ■(I,61laol)のジシクロへキシルカルボジイ
ミド(0,32m1のエ チレンジクロリド及び3.5s+1のジメチルアセタミ
ド中):20分間 室温にて、100分間45℃にて、 lX2.0分間 10■Iの無水酢酸/ピリジン/ジメ
チルアセタミド(I0: 10 : 80、V / V
)、 IXo、5分間 脱気したジメチルアセタミド、I X
1.0分間 インプロパツール、3 X 0.5分間
エチレンジクロリド、及び2 X 0.5分間 脱気
したジメチルアセタミド。
力゛フプリング反応の完了はニンヒドリンによる未反応
アミノ基の検出(Kaiserテスト)により定性的に
試験する。この試験が陽性であれば樹脂をエチレンクロ
リド洗浄し、そして3.8 m lのエチレンジクロリ
ド/トリフルオロエタノール(75:25)中1.5
m+++olのアミノ酸誘導体及び7.5111101
のダシ。クロヘキシルカルボジイミドを用いる次のカン
プリング反応を室温にて120分間行う、最後のカンプ
リングの後、樹脂をジメチルアセタミド、エチレンジク
ロリド及びイソプロパツールで十分に洗浄し、そして高
真空下で乾燥する。
アミノ基の検出(Kaiserテスト)により定性的に
試験する。この試験が陽性であれば樹脂をエチレンクロ
リド洗浄し、そして3.8 m lのエチレンジクロリ
ド/トリフルオロエタノール(75:25)中1.5
m+++olのアミノ酸誘導体及び7.5111101
のダシ。クロヘキシルカルボジイミドを用いる次のカン
プリング反応を室温にて120分間行う、最後のカンプ
リングの後、樹脂をジメチルアセタミド、エチレンジク
ロリド及びイソプロパツールで十分に洗浄し、そして高
真空下で乾燥する。
段U
taU及びBoc保rtL基を除去するため、段階1.
4に従って得られた生成物を室温にて次のようにして処
理する(各場合に30mjり。
4に従って得られた生成物を室温にて次のようにして処
理する(各場合に30mjり。
2×2分間 塩化メチレン、
IX5分間 トリフルオロ酢酸/塩化メチレン/1.2
−エタンジチオール/m−ク レゾール(50:43: 2 : 5)、lX30分間
トリフルオロ酢酸/塩化メチレン/1.2−エタンジ
チオール/m−ク レゾール(50:43: 2 : 5)、lX60分間
トリフルオロ酢酸/塩化メチレン/1.2−エタンジ
チオール/m−ク レゾール(50:43:2 : 5)、2×2分間 塩
化メチレン及び 2×2分間 メタノール。
−エタンジチオール/m−ク レゾール(50:43: 2 : 5)、lX30分間
トリフルオロ酢酸/塩化メチレン/1.2−エタンジ
チオール/m−ク レゾール(50:43: 2 : 5)、lX60分間
トリフルオロ酢酸/塩化メチレン/1.2−エタンジ
チオール/m−ク レゾール(50:43:2 : 5)、2×2分間 塩
化メチレン及び 2×2分間 メタノール。
我J1−影
樹脂からペプチドを切り離すため及び末端カルボキシ基
をアミド化するため、段階1.5に従って得られた生成
物を、高真空下で乾燥した後、30m1のジメチルホル
ムアミドに懸濁する。−70℃において約10mjのア
ンモニアを凝縮させる。
をアミド化するため、段階1.5に従って得られた生成
物を、高真空下で乾燥した後、30m1のジメチルホル
ムアミドに懸濁する。−70℃において約10mjのア
ンモニアを凝縮させる。
−過剰のアンモニアを0℃にて蒸発除去し、そして混合
物を圧力容器中で室温にて20時間撹拌する。
物を圧力容器中で室温にて20時間撹拌する。
樹脂を濾去し、水で2回(20rrj!ずつ)、メタノ
ール/水(I: 1)で3回、及びトリフルオロエタノ
ール/水(I: 1)で10回洗浄し、そして濾液を蒸
発濃縮する。残渣を30ml1の酢酸/水(9:1)に
溶解し、そして凍結乾燥する。
ール/水(I: 1)で3回、及びトリフルオロエタノ
ール/水(I: 1)で10回洗浄し、そして濾液を蒸
発濃縮する。残渣を30ml1の酢酸/水(9:1)に
溶解し、そして凍結乾燥する。
且1上ユ
Mtr基を除去するため、段階1.6に従って得られた
凍結乾燥物を、20mj!のトリフルオロ酢酸/1.2
−エタンジチオール(99:1)中に溶解する*t、5
mlのm−クレゾールを加え、そして混合物を50℃に
て2時間保持する。粗ジーAcggペプチドを100m
jのジエチルエーテルの添加によって沈澱せしめ、濾取
し、そしてジエチルエーテルで洗浄する。生成物を25
m1の酢酸/水(I:1)に溶解し、濁りを濾去し、そ
して濾液をHPLC中での分析的分離のために使用する
。
凍結乾燥物を、20mj!のトリフルオロ酢酸/1.2
−エタンジチオール(99:1)中に溶解する*t、5
mlのm−クレゾールを加え、そして混合物を50℃に
て2時間保持する。粗ジーAcggペプチドを100m
jのジエチルエーテルの添加によって沈澱せしめ、濾取
し、そしてジエチルエーテルで洗浄する。生成物を25
m1の酢酸/水(I:1)に溶解し、濁りを濾去し、そ
して濾液をHPLC中での分析的分離のために使用する
。
HPLCは次の条件下で行う。
カラム:ヌクレオシル(Nucleocil) 10
11 mC+w(マセレイ・ナーゲル、デュレン、西独
)、200X 4.8 tm、B液O%〜90%、60
分間の直線グラジェント、A:水中0.1%トリフルオ
ロ酢酸;Bニアセトニトリル中0.1%トリフルオロ酢
酸。
11 mC+w(マセレイ・ナーゲル、デュレン、西独
)、200X 4.8 tm、B液O%〜90%、60
分間の直線グラジェント、A:水中0.1%トリフルオ
ロ酢酸;Bニアセトニトリル中0.1%トリフルオロ酢
酸。
主ピークに対応する物質を集め、そしてそれと目的生成
物との同一性をFAB−MSにより確認する(マスピー
ク: 3937.6) 。
物との同一性をFAB−MSにより確認する(マスピー
ク: 3937.6) 。
少量調製分離=100■の粗生成物を250X21nカ
ラムで分離する。集めた両分を真空蒸発せしめる。残渣
を2mlの水に溶解し、濾過し、そして凍結乾燥する。
ラムで分離する。集めた両分を真空蒸発せしめる。残渣
を2mlの水に溶解し、濾過し、そして凍結乾燥する。
五1
次の式(X IV)、
d (GAATTCA丁GGCTTGCAACACCG
CTACCTGCGTTACCCACCGTCTGGC
Td (CTTAAG丁ACCGAACGTTGTGG
CGATGGACGCAATGGにTGGCAGACC
GAGGTCTGCTGTCTCGTTCTGGTGG
TATGGTTAAATCTAACTTCGTTCCG
ACCCCAGA CGACAGAGCA AGACC
ACCATACCAATTTAG ATTGA A G
CA AGGCTGGAACGTTGGTTCTAAA
GCTTTCTAC丁AGGATCC)TTGCAAC
CAAGATTTCGAAAGATGATCCTAGG
)(XrV) で表わされるDNA挿入部を有するプラスミドを含有す
るエフシェリシャ・コリのクローンを5mlのし培地中
で、−夜(I6時間)、37℃にて250回/分で壇養
する。L培地の組成は次の通りである。
CTACCTGCGTTACCCACCGTCTGGC
Td (CTTAAG丁ACCGAACGTTGTGG
CGATGGACGCAATGGにTGGCAGACC
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ACCCCAGA CGACAGAGCA AGACC
ACCATACCAATTTAG ATTGA A G
CA AGGCTGGAACGTTGGTTCTAAA
GCTTTCTAC丁AGGATCC)TTGCAAC
CAAGATTTCGAAAGATGATCCTAGG
)(XrV) で表わされるDNA挿入部を有するプラスミドを含有す
るエフシェリシャ・コリのクローンを5mlのし培地中
で、−夜(I6時間)、37℃にて250回/分で壇養
する。L培地の組成は次の通りである。
バクトドリプトン Logバクト酵母エキ
ス 5g NaC15g グルコース 5g アンピシリン 0.1gこの一夜培養
物1mlを、次の日に25m1のM9培地に移す、M9
培地の組成は次の通りである。
ス 5g NaC15g グルコース 5g アンピシリン 0.1gこの一夜培養
物1mlを、次の日に25m1のM9培地に移す、M9
培地の組成は次の通りである。
NaJPO4・7Ht8 13.25 g
KW!P0. 3.0 gNaC
l 0.5 gNH,CI
1.0 gCaCIt ・2
Ht0 0.015 g門gso、・7
Ht0 0.25gカザミノ酸
2.5gビタミンB +
0.0099 gグルコース 5.
0gアンピシリン 0.1g培養は37
℃、250回/分にて、細@懸濁液が約0.9〜1.0
の光学濃度(001″)に達するまで行う0次に、細胞
を収得しく5mlの増殖培地)、そしてこの細菌を50
mM tris−Hcl(pH8)及び30 mM
NaC1の溶液0.5mjに再懸濁する。
KW!P0. 3.0 gNaC
l 0.5 gNH,CI
1.0 gCaCIt ・2
Ht0 0.015 g門gso、・7
Ht0 0.25gカザミノ酸
2.5gビタミンB +
0.0099 gグルコース 5.
0gアンピシリン 0.1g培養は37
℃、250回/分にて、細@懸濁液が約0.9〜1.0
の光学濃度(001″)に達するまで行う0次に、細胞
を収得しく5mlの増殖培地)、そしてこの細菌を50
mM tris−Hcl(pH8)及び30 mM
NaC1の溶液0.5mjに再懸濁する。
次にこの懸濁液を1w/mj!リゾチーム(ベーリンガ
ー)に対して標準化し、そして水中に30分間置く、こ
の懸濁液の液体窒素中での凍結及び37℃での解凍を反
復することにより、w1菌を破砕する。この方法を5回
反復し、そして混合物を16.000回/分、4℃にて
30分間遠心分離する。
ー)に対して標準化し、そして水中に30分間置く、こ
の懸濁液の液体窒素中での凍結及び37℃での解凍を反
復することにより、w1菌を破砕する。この方法を5回
反復し、そして混合物を16.000回/分、4℃にて
30分間遠心分離する。
上清をHPLC及び抗体によりCGRP U a含量に
ついて試験する。
ついて試験する。
別の方法として、上記の細菌懸濁液を次のようにして処
理する。
理する。
細胞を、8000回/分以上で遠心分離することにより
培養液から分離し、そして次にグイノーミル中で機械的
に破砕し、又はリゾチームにより溶解緩衝1(pH8)
中で酵素的に破砕する。
培養液から分離し、そして次にグイノーミル中で機械的
に破砕し、又はリゾチームにより溶解緩衝1(pH8)
中で酵素的に破砕する。
そして、次の段階を順次実施する。
1、酢酸(最終濃度1%、pH4,0’)による細面性
蛋白質のpH−沈澱、 CGRPffは上清に残り、沈
澱物は分離除去する。
蛋白質のpH−沈澱、 CGRPffは上清に残り、沈
澱物は分離除去する。
2、 回分法において、粗ペプチドをイオン交換体カラ
ム(CH52、ワットマン)上に吸着せしめ、そして1
0mM酢酸アンモニウム(p)14.5 )から300
mM (pH6,5)までの塩グラジェントにより溶出
する。蒸留水からの凍結乾燥を反復することにより、又
は透析濾過により主成分を脱塩する。
ム(CH52、ワットマン)上に吸着せしめ、そして1
0mM酢酸アンモニウム(p)14.5 )から300
mM (pH6,5)までの塩グラジェントにより溶出
する。蒸留水からの凍結乾燥を反復することにより、又
は透析濾過により主成分を脱塩する。
3、生成物を、0.1%酢酸/n−ブタノール(I:
1)の2相系(200移行)において、Craigの多
段分配法により精製する。溶剤をロータリーエバポレー
ターで除去し、そして集めた百分を凍結乾燥する。
1)の2相系(200移行)において、Craigの多
段分配法により精製する。溶剤をロータリーエバポレー
ターで除去し、そして集めた百分を凍結乾燥する。
4、すべての残留蛋白質及び低分子成分を、セファデッ
クスG50(ファルマシア)上でのゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより分離する。溶出は2%酢酸、1%β−メ
ルカプトエタノールにより行う、あるいは、溶剤グラジ
ェントによるヌクレオシルC−18カラム(Dydac
300人、15〜20μm)上でのウォーターズ製の
調製用装置(LC−Prep 500)での逆相)IP
LCにより分離を行う。
クスG50(ファルマシア)上でのゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより分離する。溶出は2%酢酸、1%β−メ
ルカプトエタノールにより行う、あるいは、溶剤グラジ
ェントによるヌクレオシルC−18カラム(Dydac
300人、15〜20μm)上でのウォーターズ製の
調製用装置(LC−Prep 500)での逆相)IP
LCにより分離を行う。
次の式(XV)、
Leu−A Ia−G Iy−Leu−Leu−5er
−Arg−5er−Gl y−G Iy−Met−Va
l −Lys −5er−Asn−Phe−Va l
−Pro−Thr−Asn−シal−Gly−3er
−Lys−Ala−Phe−Tyr−OH(X V) で示されるCGRP El aが得られる。
−Arg−5er−Gl y−G Iy−Met−Va
l −Lys −5er−Asn−Phe−Va l
−Pro−Thr−Asn−シal−Gly−3er
−Lys−Ala−Phe−Tyr−OH(X V) で示されるCGRP El aが得られる。
出発材料として使用したE、コリのクローンは次のよう
にして得られる。
にして得られる。
段11上
750■の無水コハク酸及び910*の4−ジメチルア
ミノピリジンを、20m1の純ピリジン中3.05 g
(5mmol)の5’−(4−モノメトキシトリチル
)−N−イソブチリル−デオキシグアノシンに加え、そ
して全体を16時間室温に保持する。
ミノピリジンを、20m1の純ピリジン中3.05 g
(5mmol)の5’−(4−モノメトキシトリチル
)−N−イソブチリル−デオキシグアノシンに加え、そ
して全体を16時間室温に保持する。
ピリジン溶液を濃縮した後、残渣を200mj!の酢酸
エチルに入れ、各場合に10mj!の飽和塩化ナトリウ
ム溶液を加えて200 m jの0.1 Mリン#I緩
衝液と共に振とうすLことにより2回抽出し、飽和塩化
ナトリウム溶液で再度洗浄し、乾燥し、濃縮し、そして
ヘキサンを満願する。沈澱した生成物を分離し、ジエチ
ルエーテルと共に2回すりつぶし、次に300mjの酢
酸エチルに溶解し、そして0℃にて180mJの0.1
M硫酸水素カリウム(p)12.5)と共に振とうす
ることにより抽出する。
エチルに入れ、各場合に10mj!の飽和塩化ナトリウ
ム溶液を加えて200 m jの0.1 Mリン#I緩
衝液と共に振とうすLことにより2回抽出し、飽和塩化
ナトリウム溶液で再度洗浄し、乾燥し、濃縮し、そして
ヘキサンを満願する。沈澱した生成物を分離し、ジエチ
ルエーテルと共に2回すりつぶし、次に300mjの酢
酸エチルに溶解し、そして0℃にて180mJの0.1
M硫酸水素カリウム(p)12.5)と共に振とうす
ることにより抽出する。
水で2回洗浄した後、酢酸エチル?8液を硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、濾過し、これにQ、 5 m lのピリジ
ンを加え、そして全体を4k”Hし、モしてヘキサンを
満願して稀釈する。沈澱したコハクeII誘導体を濾取
する。
ムで乾燥し、濾過し、これにQ、 5 m lのピリジ
ンを加え、そして全体を4k”Hし、モしてヘキサンを
満願して稀釈する。沈澱したコハクeII誘導体を濾取
する。
1.15gのこの化合物を190■のN−ヒドロキシサ
クシンイミドと共に4mlの酢酸エチル及び2mlのジ
メチルホルムアミド中に溶解し、モして0℃にて370
■のN、N’−ジシクロへキシルカルボイミドを加える
。凍蔵庫中で一夜静置した後、沈澱したN、N’−ジシ
クロヘキシル尿素を濾去し、濾液を酢酸エチルで稀釈し
、冷0.1M炭酸水素ナトリウム及び水で抽出し、乾燥
し、そして真空蒸発により乾燥する。残渣を酢酸エチル
を用いてシリカゲル上でクロマトグラフ分析する。TL
C: Rr−o、ss、ジクロロメタン/メタノール(
9:1)中。
クシンイミドと共に4mlの酢酸エチル及び2mlのジ
メチルホルムアミド中に溶解し、モして0℃にて370
■のN、N’−ジシクロへキシルカルボイミドを加える
。凍蔵庫中で一夜静置した後、沈澱したN、N’−ジシ
クロヘキシル尿素を濾去し、濾液を酢酸エチルで稀釈し
、冷0.1M炭酸水素ナトリウム及び水で抽出し、乾燥
し、そして真空蒸発により乾燥する。残渣を酢酸エチル
を用いてシリカゲル上でクロマトグラフ分析する。TL
C: Rr−o、ss、ジクロロメタン/メタノール(
9:1)中。
100■のこのN−サクシンイミドイルコハク酸エステ
ルを’1mlのジクロロエタン及び4mjのジメチルホ
ルムアミド中1gのアミノメチルポリスチレン(アミン
含量110μmol/ g )と共に攪拌する。ポリマ
ー樹脂を濾去し、そしてジメチルホルムアミド、メタノ
ール、ジクロロメタン及びメタノールで洗浄する。乾燥
した後、1mfの無水酢酸及び100■の4−ジメチル
アミノピリジンと共に5mlのピリジン中で樹脂を30
分間攪拌することにより、未反応のアミノ基をアセチル
化する。5’−(4−モノメトキシトリチル)−N−イ
ソブチリル−デオキシグアノシル−3’−0−サクシニ
ル基がアミノメチルポリスチレンに連結されている、生
じたポリマー樹脂をジクロロメタン、ジメチルホルムア
ミド、メタノール及びジクロロメタンにより洗浄し、そ
して重量が一定になるまで乾燥する0分光的メトキシト
リチル分析は32μs+ol/ gの負荷を示す。
ルを’1mlのジクロロエタン及び4mjのジメチルホ
ルムアミド中1gのアミノメチルポリスチレン(アミン
含量110μmol/ g )と共に攪拌する。ポリマ
ー樹脂を濾去し、そしてジメチルホルムアミド、メタノ
ール、ジクロロメタン及びメタノールで洗浄する。乾燥
した後、1mfの無水酢酸及び100■の4−ジメチル
アミノピリジンと共に5mlのピリジン中で樹脂を30
分間攪拌することにより、未反応のアミノ基をアセチル
化する。5’−(4−モノメトキシトリチル)−N−イ
ソブチリル−デオキシグアノシル−3’−0−サクシニ
ル基がアミノメチルポリスチレンに連結されている、生
じたポリマー樹脂をジクロロメタン、ジメチルホルムア
ミド、メタノール及びジクロロメタンにより洗浄し、そ
して重量が一定になるまで乾燥する0分光的メトキシト
リチル分析は32μs+ol/ gの負荷を示す。
ユ■又又
7.73 g (I5+mol)の5’−(4−モノメ
トキシトリチル)−チミジンを純ピリジンと共に蒸発せ
しめることにより2回濃縮する。残渣を20mj!の純
テトラヒドロフランに溶解し、そしてこの溶液を、攪拌
しながらそして湿気を排除しながら、テトラヒドロフラ
ン中2−クロロフェニル−ジー(I−ベンゾトリアゾリ
ル)−ホスフェートの0.2M溶液80mj!に満願し
、そして反応混合物を室温にて1時間攪拌する。2−ク
ロロフェニル−1−ベンゾトリアゾル−5’−(4−モ
ノメトキシトリチル)−チミジン3′−ホスフェートの
得られる溶液を3つに分ける。
トキシトリチル)−チミジンを純ピリジンと共に蒸発せ
しめることにより2回濃縮する。残渣を20mj!の純
テトラヒドロフランに溶解し、そしてこの溶液を、攪拌
しながらそして湿気を排除しながら、テトラヒドロフラ
ン中2−クロロフェニル−ジー(I−ベンゾトリアゾリ
ル)−ホスフェートの0.2M溶液80mj!に満願し
、そして反応混合物を室温にて1時間攪拌する。2−ク
ロロフェニル−1−ベンゾトリアゾル−5’−(4−モ
ノメトキシトリチル)−チミジン3′−ホスフェートの
得られる溶液を3つに分ける。
(α) トリエチルアンモニウム2−クロロフェニル−
5’−(4−モノメトキシトリチル)−チミジン3′−
ホスフェートへの加水分解 2−クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾール−5’−
(4−モノメトキシトリチル)4−ミジン3′−ホスフ
ェートの上記溶液の3分の1に、冷却しながら、100
m Aの0.5M炭酸水素トリエチルアンモニウムを
加える。15分間の後、ジクロロメタンにより抽出する
。ジクロロメタン溶液を水で洗浄し、濃縮し、そしてこ
れに石油エーテルを満願する。生ずる沈澱を吸引濾取し
、ジエチルエーテル/石油エーテル(I: I)で洗浄
し、そして真空乾燥する。
5’−(4−モノメトキシトリチル)−チミジン3′−
ホスフェートへの加水分解 2−クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾール−5’−
(4−モノメトキシトリチル)4−ミジン3′−ホスフ
ェートの上記溶液の3分の1に、冷却しながら、100
m Aの0.5M炭酸水素トリエチルアンモニウムを
加える。15分間の後、ジクロロメタンにより抽出する
。ジクロロメタン溶液を水で洗浄し、濃縮し、そしてこ
れに石油エーテルを満願する。生ずる沈澱を吸引濾取し
、ジエチルエーテル/石油エーテル(I: I)で洗浄
し、そして真空乾燥する。
T L C: Rf−0,35、ジクロロメタン/メタ
ノール/水(75:22:3)中。
ノール/水(75:22:3)中。
(β)2−シアノエチル−2−クロロフェニル−5’−
(4−モノメトキシトリチル)−チアミン3′−ホスフ
ェートへのエステル化、及び4−モノメトキシトリチル
保護基の除去 2−クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−5’−
(4−モノメトキシトリチル)−チミジン3′−ホスフ
ェートの溶液の3分の1に、1.3mlの2−シアノエ
タノール及び2mlのピリジンを加える。この混合物を
室温にして一夜保持する。溶剤を真空蒸留により除去し
、モして残渣を酢酸エチルに溶解し、そして0.1 M
リン酸緩衝液(p)17)及び水と共に振とうすること
により数回抽出する。有機相を乾燥し、濃縮し、そして
ヘキサンに満願する。沈澱を濾出し、59mj!のジク
ロロメタン/メタノール(7: 3)に?8解し、そし
て0℃にてこれに75mjのジクロロメタン/メタノー
ル(7: 3)中3.8gのp−)ルエンスルホン酸−
水和物の溶液を加える。2時間後、反応溶液をジクロロ
メタンで稀釈し、そして冷炭酸水素ナトリウム溶液と共
に振とうすることにより抽出する。有機相を濃縮し、そ
してこれにヘキサンを加える。沈澱した2−シアノエチ
ル−2−クロロフェニル−チミジン3′−ホスフェート
を、ジクロロメタン/メタノール(96:4)を用いて
シリカゲル上でクロマトグラフ分析する。TLC:Re
−0,45、ジクロロメタン/メタノール(9:1)中
。
(4−モノメトキシトリチル)−チアミン3′−ホスフ
ェートへのエステル化、及び4−モノメトキシトリチル
保護基の除去 2−クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−5’−
(4−モノメトキシトリチル)−チミジン3′−ホスフ
ェートの溶液の3分の1に、1.3mlの2−シアノエ
タノール及び2mlのピリジンを加える。この混合物を
室温にして一夜保持する。溶剤を真空蒸留により除去し
、モして残渣を酢酸エチルに溶解し、そして0.1 M
リン酸緩衝液(p)17)及び水と共に振とうすること
により数回抽出する。有機相を乾燥し、濃縮し、そして
ヘキサンに満願する。沈澱を濾出し、59mj!のジク
ロロメタン/メタノール(7: 3)に?8解し、そし
て0℃にてこれに75mjのジクロロメタン/メタノー
ル(7: 3)中3.8gのp−)ルエンスルホン酸−
水和物の溶液を加える。2時間後、反応溶液をジクロロ
メタンで稀釈し、そして冷炭酸水素ナトリウム溶液と共
に振とうすることにより抽出する。有機相を濃縮し、そ
してこれにヘキサンを加える。沈澱した2−シアノエチ
ル−2−クロロフェニル−チミジン3′−ホスフェート
を、ジクロロメタン/メタノール(96:4)を用いて
シリカゲル上でクロマトグラフ分析する。TLC:Re
−0,45、ジクロロメタン/メタノール(9:1)中
。
(r)5’−(4−メトキシトリチル)−3’−シアノ
エチル)−ビスチミジンジヌクレオチドへの縮合 2.2gの2−シアンエチル−2−クロロフェニル−チ
ミジン3′−ホスフェートを、純ピリジンとの蒸発によ
り2回濃縮することによって脱水し、20mjの純テト
ラヒドロフランに溶解し、そして2−クロロフェニル−
1−ベンゾトリアゾリル−5’−(4−モノメトキシト
リチル)−チミジン3′−ホスフェートの溶液の残りの
3分の1に加える。室温にて18時間装いた後、氷冷し
ながら、反応溶液にIon、jの水及び200mjの酢
酸エチルを加える。有機相を炭酸水素ナトリウム及び水
で数回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして小体積
に濃縮する。リン酸成分中で並びに5′−及び3′−末
端で保護されているジヌクレオチドを、ジエチルエーテ
ル/ヘキサン(I: 1)に満願することにより沈澱せ
しめる。 Rt −0,48、ジクロロメタン/メタノ
ール(9: 1)中。
エチル)−ビスチミジンジヌクレオチドへの縮合 2.2gの2−シアンエチル−2−クロロフェニル−チ
ミジン3′−ホスフェートを、純ピリジンとの蒸発によ
り2回濃縮することによって脱水し、20mjの純テト
ラヒドロフランに溶解し、そして2−クロロフェニル−
1−ベンゾトリアゾリル−5’−(4−モノメトキシト
リチル)−チミジン3′−ホスフェートの溶液の残りの
3分の1に加える。室温にて18時間装いた後、氷冷し
ながら、反応溶液にIon、jの水及び200mjの酢
酸エチルを加える。有機相を炭酸水素ナトリウム及び水
で数回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして小体積
に濃縮する。リン酸成分中で並びに5′−及び3′−末
端で保護されているジヌクレオチドを、ジエチルエーテ
ル/ヘキサン(I: 1)に満願することにより沈澱せ
しめる。 Rt −0,48、ジクロロメタン/メタノ
ール(9: 1)中。
ユtm
9.20g (I5mmol)の5’−(4−モノメト
キシトリチル)−N−イソブチリル−デオキシグアノシ
ンを、純ピリジンとの7発により2回濃縮する。残渣を
20mj!の純テトラヒドロフランに溶解し、そしてこ
の溶液を、攪拌しながらそして湿気を排除しながら、テ
トラヒドロフラン中2−クロロフェニル−ジー(l−ベ
ンゾトリアゾリル)−ホスフエートの0.2M溶液75
mfに満願し、そして反応混合物を室温にて1時間攪拌
する。2−’コロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−
5’−(4−モノメトキシトリチル)−N−イソブチリ
ル−グアノシル3′−ホスフェートの生ずる溶液を、段
階2.4によりさらに処理する。
キシトリチル)−N−イソブチリル−デオキシグアノシ
ンを、純ピリジンとの7発により2回濃縮する。残渣を
20mj!の純テトラヒドロフランに溶解し、そしてこ
の溶液を、攪拌しながらそして湿気を排除しながら、テ
トラヒドロフラン中2−クロロフェニル−ジー(l−ベ
ンゾトリアゾリル)−ホスフエートの0.2M溶液75
mfに満願し、そして反応混合物を室温にて1時間攪拌
する。2−’コロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−
5’−(4−モノメトキシトリチル)−N−イソブチリ
ル−グアノシル3′−ホスフェートの生ずる溶液を、段
階2.4によりさらに処理する。
段階2.4
十分に保護された上記のジヌクレオチド1.17g(I
mmol)を30rnlのジクロロメタン/メタノール
(7: 3)に溶解し、氷冷しながら、これに20mj
のジクロロメタン/メタノール(7: 3)中1.9g
のp−トルエンスルホン酸−水和物の溶液を加える。2
時間後、氷冷した炭酸水素ナトリウム溶液を加え、そし
てジクロロメタンで抽出する。有機相を乾燥し、濃縮し
、そしてヘキサン中に満願して導入する。遊離5′−ヒ
ドロキシ基を有する沈澱した粗ジヌクレオチドをシリカ
ゲル上でジクロロメタ792%〜8%メタノールのグラ
ジェントによりクロマトグラフ処理する。R,−0.3
3、ジクロロメタン/メタノール(9: l)中。
mmol)を30rnlのジクロロメタン/メタノール
(7: 3)に溶解し、氷冷しながら、これに20mj
のジクロロメタン/メタノール(7: 3)中1.9g
のp−トルエンスルホン酸−水和物の溶液を加える。2
時間後、氷冷した炭酸水素ナトリウム溶液を加え、そし
てジクロロメタンで抽出する。有機相を乾燥し、濃縮し
、そしてヘキサン中に満願して導入する。遊離5′−ヒ
ドロキシ基を有する沈澱した粗ジヌクレオチドをシリカ
ゲル上でジクロロメタ792%〜8%メタノールのグラ
ジェントによりクロマトグラフ処理する。R,−0.3
3、ジクロロメタン/メタノール(9: l)中。
この5′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド900gを、ピ
リジンとの薫発によって2回濃縮し、次に5mItの純
テトラヒドロフラン中に溶解し、そしてこれに段階2.
3で得られた溶液10mjを加える。2時間後、’1m
lの氷冷水を加え、そしてさらに1時間後、ジクロロメ
タンで抽出する。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和溶液
及び水で洗浄し、乾燥し、そして濃縮し、そしてこれに
エーテルを加える。沈澱したトリヌクレオチドをシリカ
ゲルクロマトグラフィーにより精製する。 Rf −0
,45、ジクロロメタン/メタノール(9: 1)中。
リジンとの薫発によって2回濃縮し、次に5mItの純
テトラヒドロフラン中に溶解し、そしてこれに段階2.
3で得られた溶液10mjを加える。2時間後、’1m
lの氷冷水を加え、そしてさらに1時間後、ジクロロメ
タンで抽出する。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和溶液
及び水で洗浄し、乾燥し、そして濃縮し、そしてこれに
エーテルを加える。沈澱したトリヌクレオチドをシリカ
ゲルクロマトグラフィーにより精製する。 Rf −0
,45、ジクロロメタン/メタノール(9: 1)中。
役1ムエ
段階2.2.2.3、及び2.4と同様にして、次の−
a式(XV[)で示される保護されたトリヌクレオチド
を製造する。
a式(XV[)で示される保護されたトリヌクレオチド
を製造する。
(XVI)
式中・B a ’ s B a ”及びBa’は、相互
に独立に、次のヌクレオシドのいずれがの2価基である
。
に独立に、次のヌクレオシドのいずれがの2価基である
。
N −ヘア 7”イル−デオキシアデノシン(A′)N
−ベンゾイル−デオキシシチジン(C′)N−イソブチ
リル−デオキシグアノシン(G′)、又はチミジン(T
)。
−ベンゾイル−デオキシシチジン(C′)N−イソブチ
リル−デオキシグアノシン(G′)、又はチミジン(T
)。
以下余白
殺fl虹
段階2.4及び2.5において記載したトリヌクレオチ
ドのそれぞれを次のようにして処理して2−シアノエチ
ル保!1基を除去する。湿気を排除しながら、10μm
ofのトリヌクレオチドを60μlのピリジン/アセト
ニトリル/トリエチルアミン(I: 1 : 1)中に
溶解する。室温にて1時間置いた後、0.7mj!の過
酸化物不含有ジエチルエーテルを満月し、そして沈澱を
遠心分離する。粗トリエチルアンモニウム塩を50μl
のピリジンに溶解し、そして0.5mj!のジエチルエ
ーテルにより再度沈澱せしめ、遠心分離し、そして高真
空下で15時間乾燥する。
ドのそれぞれを次のようにして処理して2−シアノエチ
ル保!1基を除去する。湿気を排除しながら、10μm
ofのトリヌクレオチドを60μlのピリジン/アセト
ニトリル/トリエチルアミン(I: 1 : 1)中に
溶解する。室温にて1時間置いた後、0.7mj!の過
酸化物不含有ジエチルエーテルを満月し、そして沈澱を
遠心分離する。粗トリエチルアンモニウム塩を50μl
のピリジンに溶解し、そして0.5mj!のジエチルエ
ーテルにより再度沈澱せしめ、遠心分離し、そして高真
空下で15時間乾燥する。
段1ム1
段階2.6により得られた部分的に保護されたトリヌク
レオチドと、段階2.1に従って得られた保護されたグ
アノシン−ポリスチレン樹脂とのカップリングを、次の
ようにして行う。
レオチドと、段階2.1に従って得られた保護されたグ
アノシン−ポリスチレン樹脂とのカップリングを、次の
ようにして行う。
すべての操作は湿気を排除して150μ!容積の反応容
器中で、マイクロプロセサーで溶剤及び試薬を添加しな
がら行う、15■(0,48μmol)のグアノシン−
ポリスチレン樹脂(段階2.1)を反応容器に入れ、そ
して次の操作にかける。
器中で、マイクロプロセサーで溶剤及び試薬を添加しな
がら行う、15■(0,48μmol)のグアノシン−
ポリスチレン樹脂(段階2.1)を反応容器に入れ、そ
して次の操作にかける。
1、塩化メチレン:2m1l1分、4分間;2、塩化メ
チレン/イソプロパツール(85: 15) :’1m
11分、2分間: 3、塩化メチレン/イソプロパツール(85: 15)
中1M臭化亜鉛及び0.02M 1 、2 、4−トリ
アゾール:’1m11分、2〜3.5分間;4、塩化メ
チレン/イソプロパツール(85: 15) :2ml
/分、4分間; 5、DMF中0.5 M酢酸トリエチルアンモニウム:
2rrl1分、5分間; 6、分子篩で乾燥したピリジン:’1m11分、3分間
; 7、テトラヒドロフラン(過酸化物不含有、分子篩で乾
燥)72ml1分、3分間: 8、窒素流、10分間; 9、 150μlのピリジンに溶解したlOμ+mol
のトリヌクレオチド(下記参照のこと)及び8.9w(
30μmol)の1−メシチレンスルホニル−3−二ト
ロー1.2.4−1−リ、アゾール(MSNT)の注入
; 10.45℃、20分間; 11、ピリジン;2ml1/分、4分間;12、ピリジ
ン中5%の無水酢酸及び25%の4−ジメチルアミノピ
リジン:2mj!/分、4分間; 13、ピリジン:2mf/分、4分間;14、ピリジン
/イソプロパツール(I:1):2mj!/分、3分間
。
チレン/イソプロパツール(85: 15) :’1m
11分、2分間: 3、塩化メチレン/イソプロパツール(85: 15)
中1M臭化亜鉛及び0.02M 1 、2 、4−トリ
アゾール:’1m11分、2〜3.5分間;4、塩化メ
チレン/イソプロパツール(85: 15) :2ml
/分、4分間; 5、DMF中0.5 M酢酸トリエチルアンモニウム:
2rrl1分、5分間; 6、分子篩で乾燥したピリジン:’1m11分、3分間
; 7、テトラヒドロフラン(過酸化物不含有、分子篩で乾
燥)72ml1分、3分間: 8、窒素流、10分間; 9、 150μlのピリジンに溶解したlOμ+mol
のトリヌクレオチド(下記参照のこと)及び8.9w(
30μmol)の1−メシチレンスルホニル−3−二ト
ロー1.2.4−1−リ、アゾール(MSNT)の注入
; 10.45℃、20分間; 11、ピリジン;2ml1/分、4分間;12、ピリジ
ン中5%の無水酢酸及び25%の4−ジメチルアミノピ
リジン:2mj!/分、4分間; 13、ピリジン:2mf/分、4分間;14、ピリジン
/イソプロパツール(I:1):2mj!/分、3分間
。
14のすべての操作を24回反復し、トリエチルアンモ
ニウム塩(段階2.6を参照のこと)の形の次のデオキ
シトリヌクレオチドを、9番目の操作において次々に使
用する。 d(A’A’C’、C’A’G’。
ニウム塩(段階2.6を参照のこと)の形の次のデオキ
シトリヌクレオチドを、9番目の操作において次々に使
用する。 d(A’A’C’、C’A’G’。
C’A’C”、 TA’C’、 C’C’A’、 TA
’A’、 A’T丁、 TA’G’。
’A’、 A’T丁、 TA’G’。
A’G’T、 C’G’A”、 G″A’A’、
TC’G’、 T″G’G’、 C’G’丁。
TC’G’、 T″G’G’、 C’G’丁。
C’A’A”、A’A’C’、 TA’G’、 C’T
T、 A’A″G’、 A’G’A’。
T、 A’A″G’、 A’G’A’。
A’G’T、 C’C’T、 C’A’?及びG’TC
’)。
’)。
平均カンプリング収率は97%である。最終生成物は次
の構造を有し、2−クロロフェニル保護基はなお存在す
る。
の構造を有し、2−クロロフェニル保護基はなお存在す
る。
d(mat−G’TC’C’A’TC’C’T^’G’
T’A’G’A’A’A’G’C’TT丁A’ G’
A’A’C’C’ A’ A’C’ G’ TTG’G
’ TC’ G’G’ A’ A’C’ G’ A’
A’G’TTA’G’A’TTT^゛A“C’C’A’
TA’C’C’A’C’C’A’G”A’ A’C’C
’G’)−ポリスチレン合成樹脂ユ隆ム1 段階2.7に従って得られたポリデオキシヌクレオチド
−ポリスチレン合成樹脂を次のようにして処理して担体
からポリヌクレオチドを除去し、そして保護基を除去す
る。
T’A’G’A’A’A’G’C’TT丁A’ G’
A’A’C’C’ A’ A’C’ G’ TTG’G
’ TC’ G’G’ A’ A’C’ G’ A’
A’G’TTA’G’A’TTT^゛A“C’C’A’
TA’C’C’A’C’C’A’G”A’ A’C’C
’G’)−ポリスチレン合成樹脂ユ隆ム1 段階2.7に従って得られたポリデオキシヌクレオチド
−ポリスチレン合成樹脂を次のようにして処理して担体
からポリヌクレオチドを除去し、そして保護基を除去す
る。
35.0w (約0.35μmol)のポリデオキシヌ
クレオチド合成樹脂64 /73を、400μlの95
%ピリジン中66■(0,04mmol)の0−ニトロ
ペンザルドキシム及び50 ill (0,40mm
ol)の1.1.3゜3−テトラメチルグアニジンと一
緒に50℃にて3時間そして室温にて12時間保持する
。ピリジンを窒素により吹き飛ばした後、残渣に1.6
rrlの水性アンモニア(33%)を加え、そして全体
を密閉容器中で50℃にて24時間保持する。
クレオチド合成樹脂64 /73を、400μlの95
%ピリジン中66■(0,04mmol)の0−ニトロ
ペンザルドキシム及び50 ill (0,40mm
ol)の1.1.3゜3−テトラメチルグアニジンと一
緒に50℃にて3時間そして室温にて12時間保持する
。ピリジンを窒素により吹き飛ばした後、残渣に1.6
rrlの水性アンモニア(33%)を加え、そして全体
を密閉容器中で50℃にて24時間保持する。
分離した液相から真空中でアンモニアを除去し、3ml
ずつの過酸化物不含有ジエチルエーテルにより3回洗浄
する。バイオゲルP6カラム(I00〜200メツシユ
、3 X65es、 0.01M炭酸水素トリメチルア
ンモニウム、pH7,5,1,5mj!/分)により低
分子成分を除去した後、2500D (260nm)の
ポリデオキシヌクレオチドを単離する。
ずつの過酸化物不含有ジエチルエーテルにより3回洗浄
する。バイオゲルP6カラム(I00〜200メツシユ
、3 X65es、 0.01M炭酸水素トリメチルア
ンモニウム、pH7,5,1,5mj!/分)により低
分子成分を除去した後、2500D (260nm)の
ポリデオキシヌクレオチドを単離する。
1(PLCカラム(PRP−1/ハミルトン、250X
4.6+++m)により合計600Dを分離する。A
中30%のBからA中60%Bまでのグラジェント(溶
液A : 0.05M酢酸トリエチルアンモニウム、p
H7,O: 溶液B:溶液A/アセトニトリル1:1)
で、50℃にて20分間、’1m11分で溶出する。親
脂性主ピーク(保持時間約14分間)を集め、DE52
−セルロース(ワットマン)カラムで濃縮し、溶出し、
そしてエタノールで沈澱せしめる。4−メトキシトリチ
ル保護基を除去するため、沈澱を50μlの酢酸/Ht
O(4: 1)に溶解し、そして室温にて45分間保持
する0反応生成物を凍結乾燥し、エタノールで沈澱せし
め、そして精製のため8%ボリアクリルアミドゲル(7
M尿素)上での電気泳動により分離する.予想されるポ
リヌクレオチドの大きさに対応するバンドを切り取り、
そして生、 成物を電気溶出し、DE52−セルロース
上で濃縮し、そして次の構造: d(GTCCATCC
TAGTAGAAAGC丁TTAGAACCAACGT
TGG丁CGGAACGAAGTTAGATTTAAC
CATACCACCAGAACG)のポリデオキシヌク
レオチド64/73をエタノアルで沈澱せしめる. 五11エ 段階2.7及び2.8と同様にしてポリデオキシヌクレ
オチド(I/73) d(C丁GGAATTCATGG
CTTGCAACACCGCTACCTGCGTT.A
CCCA CCGTCTGGCTGGTCTGCTGT
CTCGTTCTCGTG)を得る. 段■又刊 段階2.8及び2.9に従って得られたポリヌクレオチ
ド(64/73、及び相補的1/73)を、Molec
ularC夏oning. A Laborat
ory Manual (T. Maniat
is 等により発表) Cold Sp.ring
}larbor Lab. 1982.125頁に記載
されているようにして、(T−3!p)ATP,及びT
4ポリヌクレオチドキナーゼ(べ一リンガー、西独)を
用いて、5′一末端を放射性リン酸化する. 我1し■ユ 段階2.10に従って得られたキナーゼ処理されたポリ
ヌクレオチドを重合せしめてデュプレ7クスを形成する
ため、50ps+olずつのキナーゼ処理された断片1
/73及びキナーゼ処理された断片64/73を24μ
lの水に溶解し、この溶液を90℃にて3分間加熱し、
そして5分間以内に12℃に冷却する.4ttlのエン
ド−Rlli街液( 0. I M Tris ・}1
cI Sp}!7. 5、6 6 mM MgC1g,
6 6 mM β−メルカブトエタノール、0.
6 M NaCI)、IOulのデオキシヌクレオシド
トリホスフエート混合物(dATP, dCTP, d
GTP, TTP(それぞれ2×lO弓M)、NIf3
にてpH7.0に調製〕、及び2μl (I0ユニット
)のDNAポリメラーゼIKlen咋断片(ベーリンガ
ー)を加えた後、12℃にて30分間インキユベートす
る.90℃に3分間加熱することにより反応を停止し、
そしてさらに処理するまで混合物を−80℃にて貯蔵す
る. 得られるDNA−デエブレックスは次の構造を有する. d (CTGGAATTCATGGCTτGCAACA
CCGCTACCTGCGTTACCCACd (GA
CC丁丁AAGTACCGAACGTTGTGGCGA
TGGACGCAATGGGTGCGTCTGGCTG
GTCTGCTGTCTCGTTCTGGTGGTAT
GGTTAA^GCAGACCGACCAGACGAC
AGAGCAAGACCACCATACCAATTTT
CTAACTTCGT丁CCGACCAACGTTGG
TTCTAAAGC丁TTCTACAGATTGAAG
C^^GGCTGGTTGCAACCAACATTTC
GAAAGATGTAGGATCCTG) ATCCTAGGAC) このデュブレフクスを以後“Fo”と称する.段p 10μgのブラスミドpBRHtrp (独国出願公
開3,111,405(ゼネンテフク)〕を50ユニッ
トのEcoRI(ビオラブス)により377−にて60
分間開裂せしめ、そしてフェノール抽出の後、消化混合
物をTST41 (コントロンAC)ローター中で50
mM tris−HCf(pH8. 0 ) 、l m
M EDTA中シエークロース密度グラジエント(5%
〜23%)により分画する.遠心分離を40,000回
/分、15℃にて14時間続ける,lmj!/分にて、
I SCOグラジエントコレクターにより0.3mj!
の画分を集める.小断片を含有する両分を一緒にし、こ
のfiI液をTNEに対して標準化し、そして−20℃
にて2容量のエタノールで沈澱せしめる.エフベンドル
フ遠心機中で遠心した後、DNAを100μlの1
0+Mtris − HCI(pH7.5 ) 、
0.5 mM EDTA に溶解する.5μg
のこのDNA断片を5ユニットのBgln(ビオラブス
)により37℃にて60分間開裂せしめる.反応混合物
をフェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてDNA
を2容量のエタノールと共に−80℃にてlO分間イン
キユベートし、そしてDNAを遠心分離により集め、そ
して再度50ttlの5 0 mM tris−MCI
(pH8. 0 )に溶解する.この溶液の2μlを取
り (0.2μgのDNA)、そして5 0mM t
ris−}1cI(pH8.0)中10r+g/μlの
D N A tj4度にて、1ユニ7トのウシ腸アルカ
リホスファターゼ(ベーリンガー)と共に37℃にて3
0分間インキュベートする。
4.6+++m)により合計600Dを分離する。A
中30%のBからA中60%Bまでのグラジェント(溶
液A : 0.05M酢酸トリエチルアンモニウム、p
H7,O: 溶液B:溶液A/アセトニトリル1:1)
で、50℃にて20分間、’1m11分で溶出する。親
脂性主ピーク(保持時間約14分間)を集め、DE52
−セルロース(ワットマン)カラムで濃縮し、溶出し、
そしてエタノールで沈澱せしめる。4−メトキシトリチ
ル保護基を除去するため、沈澱を50μlの酢酸/Ht
O(4: 1)に溶解し、そして室温にて45分間保持
する0反応生成物を凍結乾燥し、エタノールで沈澱せし
め、そして精製のため8%ボリアクリルアミドゲル(7
M尿素)上での電気泳動により分離する.予想されるポ
リヌクレオチドの大きさに対応するバンドを切り取り、
そして生、 成物を電気溶出し、DE52−セルロース
上で濃縮し、そして次の構造: d(GTCCATCC
TAGTAGAAAGC丁TTAGAACCAACGT
TGG丁CGGAACGAAGTTAGATTTAAC
CATACCACCAGAACG)のポリデオキシヌク
レオチド64/73をエタノアルで沈澱せしめる. 五11エ 段階2.7及び2.8と同様にしてポリデオキシヌクレ
オチド(I/73) d(C丁GGAATTCATGG
CTTGCAACACCGCTACCTGCGTT.A
CCCA CCGTCTGGCTGGTCTGCTGT
CTCGTTCTCGTG)を得る. 段■又刊 段階2.8及び2.9に従って得られたポリヌクレオチ
ド(64/73、及び相補的1/73)を、Molec
ularC夏oning. A Laborat
ory Manual (T. Maniat
is 等により発表) Cold Sp.ring
}larbor Lab. 1982.125頁に記載
されているようにして、(T−3!p)ATP,及びT
4ポリヌクレオチドキナーゼ(べ一リンガー、西独)を
用いて、5′一末端を放射性リン酸化する. 我1し■ユ 段階2.10に従って得られたキナーゼ処理されたポリ
ヌクレオチドを重合せしめてデュプレ7クスを形成する
ため、50ps+olずつのキナーゼ処理された断片1
/73及びキナーゼ処理された断片64/73を24μ
lの水に溶解し、この溶液を90℃にて3分間加熱し、
そして5分間以内に12℃に冷却する.4ttlのエン
ド−Rlli街液( 0. I M Tris ・}1
cI Sp}!7. 5、6 6 mM MgC1g,
6 6 mM β−メルカブトエタノール、0.
6 M NaCI)、IOulのデオキシヌクレオシド
トリホスフエート混合物(dATP, dCTP, d
GTP, TTP(それぞれ2×lO弓M)、NIf3
にてpH7.0に調製〕、及び2μl (I0ユニット
)のDNAポリメラーゼIKlen咋断片(ベーリンガ
ー)を加えた後、12℃にて30分間インキユベートす
る.90℃に3分間加熱することにより反応を停止し、
そしてさらに処理するまで混合物を−80℃にて貯蔵す
る. 得られるDNA−デエブレックスは次の構造を有する. d (CTGGAATTCATGGCTτGCAACA
CCGCTACCTGCGTTACCCACd (GA
CC丁丁AAGTACCGAACGTTGTGGCGA
TGGACGCAATGGGTGCGTCTGGCTG
GTCTGCTGTCTCGTTCTGGTGGTAT
GGTTAA^GCAGACCGACCAGACGAC
AGAGCAAGACCACCATACCAATTTT
CTAACTTCGT丁CCGACCAACGTTGG
TTCTAAAGC丁TTCTACAGATTGAAG
C^^GGCTGGTTGCAACCAACATTTC
GAAAGATGTAGGATCCTG) ATCCTAGGAC) このデュブレフクスを以後“Fo”と称する.段p 10μgのブラスミドpBRHtrp (独国出願公
開3,111,405(ゼネンテフク)〕を50ユニッ
トのEcoRI(ビオラブス)により377−にて60
分間開裂せしめ、そしてフェノール抽出の後、消化混合
物をTST41 (コントロンAC)ローター中で50
mM tris−HCf(pH8. 0 ) 、l m
M EDTA中シエークロース密度グラジエント(5%
〜23%)により分画する.遠心分離を40,000回
/分、15℃にて14時間続ける,lmj!/分にて、
I SCOグラジエントコレクターにより0.3mj!
の画分を集める.小断片を含有する両分を一緒にし、こ
のfiI液をTNEに対して標準化し、そして−20℃
にて2容量のエタノールで沈澱せしめる.エフベンドル
フ遠心機中で遠心した後、DNAを100μlの1
0+Mtris − HCI(pH7.5 ) 、
0.5 mM EDTA に溶解する.5μg
のこのDNA断片を5ユニットのBgln(ビオラブス
)により37℃にて60分間開裂せしめる.反応混合物
をフェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてDNA
を2容量のエタノールと共に−80℃にてlO分間イン
キユベートし、そしてDNAを遠心分離により集め、そ
して再度50ttlの5 0 mM tris−MCI
(pH8. 0 )に溶解する.この溶液の2μlを取
り (0.2μgのDNA)、そして5 0mM t
ris−}1cI(pH8.0)中10r+g/μlの
D N A tj4度にて、1ユニ7トのウシ腸アルカ
リホスファターゼ(ベーリンガー)と共に37℃にて3
0分間インキュベートする。
溶液を65℃にて60分間加熱することにより酵素を不
活性化する。 0.04μgのDNAを取り、そして2
0ttlの反応容積中で、50 mM tris ・
HCI (pH9,4) 、10mM MgC1を及
び5mMDTT中lOμCiのCr−”P〕−ATP
(>5000(i/mmol、アマ−ジャム)及び5ユ
ニツトのT4ポリヌクレオチドキナーゼ(P−Lビオケ
ミカルス)と共に37℃にて30分間インキュベートす
ることにより5′−末端を放射性リン酸化する。放射性
サンプルを未ラベルサンプル(上記を参照のこと)と混
合し、そしてDNA断片をTST60ローター中で、5
0mM tris−Hcl(p)18.0) 、1mM
EDTA中5%−23%シェークロース勾配を通して分
画する。遠心を60,000回/分、15℃にて5時間
行つ、 0.2 mj!の画分を集める。セレンコツ放
射を測定することによって各百分の放射能を決定し、そ
してこれによって断片を同定する。/J%DN八断片を
へ有する目的の画分を一緒にし、DNAを2容量のエタ
ノールで沈澱せしめ、そして遠心分離の後、20ttl
の10 mM tris ・HCI(pH7,5) 、
0.5mM EDTA中に再度溶解する。
活性化する。 0.04μgのDNAを取り、そして2
0ttlの反応容積中で、50 mM tris ・
HCI (pH9,4) 、10mM MgC1を及
び5mMDTT中lOμCiのCr−”P〕−ATP
(>5000(i/mmol、アマ−ジャム)及び5ユ
ニツトのT4ポリヌクレオチドキナーゼ(P−Lビオケ
ミカルス)と共に37℃にて30分間インキュベートす
ることにより5′−末端を放射性リン酸化する。放射性
サンプルを未ラベルサンプル(上記を参照のこと)と混
合し、そしてDNA断片をTST60ローター中で、5
0mM tris−Hcl(p)18.0) 、1mM
EDTA中5%−23%シェークロース勾配を通して分
画する。遠心を60,000回/分、15℃にて5時間
行つ、 0.2 mj!の画分を集める。セレンコツ放
射を測定することによって各百分の放射能を決定し、そ
してこれによって断片を同定する。/J%DN八断片を
へ有する目的の画分を一緒にし、DNAを2容量のエタ
ノールで沈澱せしめ、そして遠心分離の後、20ttl
の10 mM tris ・HCI(pH7,5) 、
0.5mM EDTA中に再度溶解する。
5tp−ラベルされたEcoRI−BglllDNA断
片を、50μl容量中で0.2ユニツトのTaql(ビ
オラプス)により37℃にて10分間部分開裂せしめる
0反応混合物を0.2%SDS、10%グリセリン、1
0mMEDT^、O,OS%プTel L 7 x /
−ルブルーに対して標準化し、そしてDNA断片をt
ris−ボレート−EDTA中6%ポリアクリルアミド
ゲル上で分離する〔^、C,Peacook等、Bio
chemy−stry6.181B (I967) )
−目的とするEcoRr −Taql断片(最も大き
な部分断片)を含有するバンドをオートラジオグラフ上
で同定する。この断片をゲルから抽出し、そして精製し
く116M1iller等、J、 Mo1. Biol
、、 124343 (I97B) )そして10tt
lの10 mM Tris−HCI(pF!7.5 )
、1 mMEDTAに溶解する。
片を、50μl容量中で0.2ユニツトのTaql(ビ
オラプス)により37℃にて10分間部分開裂せしめる
0反応混合物を0.2%SDS、10%グリセリン、1
0mMEDT^、O,OS%プTel L 7 x /
−ルブルーに対して標準化し、そしてDNA断片をt
ris−ボレート−EDTA中6%ポリアクリルアミド
ゲル上で分離する〔^、C,Peacook等、Bio
chemy−stry6.181B (I967) )
−目的とするEcoRr −Taql断片(最も大き
な部分断片)を含有するバンドをオートラジオグラフ上
で同定する。この断片をゲルから抽出し、そして精製し
く116M1iller等、J、 Mo1. Biol
、、 124343 (I97B) )そして10tt
lの10 mM Tris−HCI(pF!7.5 )
、1 mMEDTAに溶解する。
C1ar及びEcoRIで開裂されたpBR322を受
容体プラスミドとして使用する。2μgのpBR322
を、4ユニ7)のC1al(ビオラプス)により20μ
lの反応容量中で37℃にて60分間消化する。蛋白質
をフェノールで抽出し、そして次にDNAを2容積のエ
タノールにより一80℃にて10分間沈澱せしめる。D
NAを遠心分離により集め、そして次に10ユニツトの
EcoRT (ビオラプス)により37℃にて30分
間、20μlの反応容積中に消化する0次に、この溶液
に2容量の0.1 Mtris−)1cI (pH8,
7)を加え、そして全体を1ユニツトのウシアルカリホ
スファターゼ(ベーリンガー)と共に37℃にて30分
間インキュベートする。次に、65゛Cにて60分間イ
ンキュベートすることによりホスファターゼを不活性化
する。
容体プラスミドとして使用する。2μgのpBR322
を、4ユニ7)のC1al(ビオラプス)により20μ
lの反応容量中で37℃にて60分間消化する。蛋白質
をフェノールで抽出し、そして次にDNAを2容積のエ
タノールにより一80℃にて10分間沈澱せしめる。D
NAを遠心分離により集め、そして次に10ユニツトの
EcoRT (ビオラプス)により37℃にて30分
間、20μlの反応容積中に消化する0次に、この溶液
に2容量の0.1 Mtris−)1cI (pH8,
7)を加え、そして全体を1ユニツトのウシアルカリホ
スファターゼ(ベーリンガー)と共に37℃にて30分
間インキュベートする。次に、65゛Cにて60分間イ
ンキュベートすることによりホスファターゼを不活性化
する。
100nHの受容体プラスミドを、10 mM MgC
1z、20mMtris−HCI(pH7,8> 、I
OmM DTT。
1z、20mMtris−HCI(pH7,8> 、I
OmM DTT。
Q、5mM ATP中、15μlの反応容積中で、5
μlの断片L−DNAと共に、反応容積μl当り30ユ
ニツトのT、DNAリガニゼ(ビオラフ゛ス)を用いて
2時間インキュベートする。
μlの断片L−DNAと共に、反応容積μl当り30ユ
ニツトのT、DNAリガニゼ(ビオラフ゛ス)を用いて
2時間インキュベートする。
5μlのこの溶液を、200μlの全容積中、10 m
M MgC1t、10 mM CaC1を及び10m
Mtris−HCI (pH7,5)中で、塩化カルシ
ウムで処理されたE、コリ88101細胞(I4) 1
50μlを含む溶合物に加える。この混合物を20分間
氷冷し、42℃にて1分間加熱し、そして20t’にて
10分間インキュベートする。1mlのトリプトン培地
〔11の蒸留水中10gのバタトートリプトン(ディフ
コ)、Igの酵母エキス(ディフコ)、1gのグルコー
ス、8gのNaC1及び294■のCaC1t・2uz
o)を加え、そしてこの混合物を、300回/分で振と
うしながら37℃にて30分間インキュベートする。こ
の混合物を、5cIg/mlのアンピシリン(シグマ)
を補充した寒天プレート(マンコンキー寒天、ディフコ
、0.6ml/プレート)2枚にプレートする。このプ
レートを37℃にて12〜17時間インキュベートする
。
M MgC1t、10 mM CaC1を及び10m
Mtris−HCI (pH7,5)中で、塩化カルシ
ウムで処理されたE、コリ88101細胞(I4) 1
50μlを含む溶合物に加える。この混合物を20分間
氷冷し、42℃にて1分間加熱し、そして20t’にて
10分間インキュベートする。1mlのトリプトン培地
〔11の蒸留水中10gのバタトートリプトン(ディフ
コ)、Igの酵母エキス(ディフコ)、1gのグルコー
ス、8gのNaC1及び294■のCaC1t・2uz
o)を加え、そしてこの混合物を、300回/分で振と
うしながら37℃にて30分間インキュベートする。こ
の混合物を、5cIg/mlのアンピシリン(シグマ)
を補充した寒天プレート(マンコンキー寒天、ディフコ
、0.6ml/プレート)2枚にプレートする。このプ
レートを37℃にて12〜17時間インキュベートする
。
10個の異るコロニーのプラスミドDNAを次のように
して単離する。
して単離する。
上記ノコロニーを使用して、25m1のエルレンマイヤ
ーフラスコ中のlQmIlのトリプトン培地(50μg
/ m Itチアンシリンが補充されている)に接種
する。培養物を、37℃、300回/分にて15〜18
時間振とうする。tR胞を遠心分M(ツルパル、MS−
40−ター、10分間、400回/分、4℃)により収
得する。約0.1gの細胞を得、そしてこれを1mlの
50 mM tris−HCI CpH8,0)に再
懸濁する。Q、25mAのりゾチーム溶液(50mM
tris−HCI(pH8,0)中10w/ml 。
ーフラスコ中のlQmIlのトリプトン培地(50μg
/ m Itチアンシリンが補充されている)に接種
する。培養物を、37℃、300回/分にて15〜18
時間振とうする。tR胞を遠心分M(ツルパル、MS−
40−ター、10分間、400回/分、4℃)により収
得する。約0.1gの細胞を得、そしてこれを1mlの
50 mM tris−HCI CpH8,0)に再
懸濁する。Q、25mAのりゾチーム溶液(50mM
tris−HCI(pH8,0)中10w/ml 。
リゾチームはシグマから販売〕を加え、モして0℃にて
10分間インキュベートした後、0.15mA’の0.
5 M EDTA(pH7,5)を加える。0℃にてさ
らに10分間装いた後、60μlの2%トリトンX−1
00(メルク)を加える。0℃にて30分分間−た後、
サンプルを、ツルパル5A−600ローター中で15.
000回/分、4℃にて30分間遠心分離する。
10分間インキュベートした後、0.15mA’の0.
5 M EDTA(pH7,5)を加える。0℃にてさ
らに10分間装いた後、60μlの2%トリトンX−1
00(メルク)を加える。0℃にて30分分間−た後、
サンプルを、ツルパル5A−600ローター中で15.
000回/分、4℃にて30分間遠心分離する。
上清を、l容積のフェノールCTNE中に飽和)により
脱蛋白する。 5ooo回/分、4℃にて10分間遠心
分離する(ツルパルHB−40−ター)ことにより相を
分離する。上相を1容積のクロロホルムで2回抽出する
。最終ン;度が20μg / m j!となるまですい
v&RNAゼA(シグマ、TNE中10■/mIl、8
5℃にて10分間前加熱)を加え、混合物を37℃にて
40分間インキュベートする。
脱蛋白する。 5ooo回/分、4℃にて10分間遠心
分離する(ツルパルHB−40−ター)ことにより相を
分離する。上相を1容積のクロロホルムで2回抽出する
。最終ン;度が20μg / m j!となるまですい
v&RNAゼA(シグマ、TNE中10■/mIl、8
5℃にて10分間前加熱)を加え、混合物を37℃にて
40分間インキュベートする。
次に、溶液をI M NaC1及び10%ポリエチレン
グリコール6000 (フル力、120℃にて20分間
オートクレーブ処理したもの)に対して標準化し、そし
て−10℃にて2時間インキュベートする。
グリコール6000 (フル力、120℃にて20分間
オートクレーブ処理したもの)に対して標準化し、そし
て−10℃にて2時間インキュベートする。
ツルパルHB−40−ター中で沈澱を集め(I0,00
0回/分、0℃にて20分間)、そして再度100μl
のTNEに溶解する。DNA溶液を1容積のフェノール
により抽出し、そしてDNAを2容積のエタノールによ
り一80℃にて10分間沈澱せしめる。エソペンドルフ
遠心機中での遠心分離により沈澱を集め、そしてDNA
を再度20μlのlOm M tris−HCI (
pH7,5)及び0.5 mM EDTAに溶解する。
0回/分、0℃にて20分間)、そして再度100μl
のTNEに溶解する。DNA溶液を1容積のフェノール
により抽出し、そしてDNAを2容積のエタノールによ
り一80℃にて10分間沈澱せしめる。エソペンドルフ
遠心機中での遠心分離により沈澱を集め、そしてDNA
を再度20μlのlOm M tris−HCI (
pH7,5)及び0.5 mM EDTAに溶解する。
lQmIlの培養物から8〜10μgのプラスミドDN
Aが得られる。
Aが得られる。
プラスミドDNAを、次のようにして制限酵素で消化す
ることにより分析する。
ることにより分析する。
各場合に0.5μCのプラスミドDNAを、酵素の製造
者により特定された方法により、Hpal(ビオラプス
)により、そしてさらにHpaI(ビオラプス)及びE
coRI (ビオラプス)により、そしてC1aI(
ビオラプス)により開裂せしめる。
者により特定された方法により、Hpal(ビオラプス
)により、そしてさらにHpaI(ビオラプス)及びE
coRI (ビオラプス)により、そしてC1aI(
ビオラプス)により開裂せしめる。
DNAを、40mM tris・アセテート(pH7
,8)−1mM EDTA及び0.5gg/m4xチジ
ウムブロミド中1%アガロースゲル上で分画する。目的
とするプラスミドはHpa1部位を含有し、そして3回
消化した後火DNA断片のほかにpBR322の小Ec
oRI −C1a I fr片より大きな2個の小断片
をもたらす、これらのプラスミドの1つをp159と命
名する。
,8)−1mM EDTA及び0.5gg/m4xチジ
ウムブロミド中1%アガロースゲル上で分画する。目的
とするプラスミドはHpa1部位を含有し、そして3回
消化した後火DNA断片のほかにpBR322の小Ec
oRI −C1a I fr片より大きな2個の小断片
をもたらす、これらのプラスミドの1つをp159と命
名する。
殺11■1
2ugのp159 D N Aを10ユニツトのEco
RI(ビオラプス)により37℃にて30分間消化する
。DNAをフェノールにより消化し、エタノールにより
沈澱せしめ、そして遠心分離した後10piの10mM
tris−Hcl(pH7,5,) 、0.5mM
EDTAにより溶解する0次に、EcoRIで消化され
たDNAを、5ユニツトのDNAポリメラーゼ(Kle
now断片)(ベーリンガー)により、10mMMgC
1t −10mM β−メルカプトエタノール、50
nM NaCl So、1mM dATP(P&Lビ
オラプス) 、0.1 mM d(TTP)(P &
Lビオラプス)中で15分間12℃にてさらに処理する
0次に、85℃にて5分間インキエベートすることによ
りこのポリメラーゼを不活性化する0反応混合物を20
mM tris−Hcl(pH7,8) 、10mM
MgC1z、10mM DTT、0.5mM A
TP (シグマ)中に稀釈し、そして反応混合物μl当
り30ユニツトのT、DNAリガーゼと共に15℃にで
1時間インキュベートする。
RI(ビオラプス)により37℃にて30分間消化する
。DNAをフェノールにより消化し、エタノールにより
沈澱せしめ、そして遠心分離した後10piの10mM
tris−Hcl(pH7,5,) 、0.5mM
EDTAにより溶解する0次に、EcoRIで消化され
たDNAを、5ユニツトのDNAポリメラーゼ(Kle
now断片)(ベーリンガー)により、10mMMgC
1t −10mM β−メルカプトエタノール、50
nM NaCl So、1mM dATP(P&Lビ
オラプス) 、0.1 mM d(TTP)(P &
Lビオラプス)中で15分間12℃にてさらに処理する
0次に、85℃にて5分間インキエベートすることによ
りこのポリメラーゼを不活性化する0反応混合物を20
mM tris−Hcl(pH7,8) 、10mM
MgC1z、10mM DTT、0.5mM A
TP (シグマ)中に稀釈し、そして反応混合物μl当
り30ユニツトのT、DNAリガーゼと共に15℃にで
1時間インキュベートする。
50nHのDNAをE、コリ中に形質転換(前記のよう
にして)し、そして50μg/mlのアンピシリンを補
充したマンコンキー寒天プレート上にプレートする。
にして)し、そして50μg/mlのアンピシリンを補
充したマンコンキー寒天プレート上にプレートする。
10個の異るコロニーのプラスミドDNAを前記のよう
にして単離する。プラスミドをEcoRIで消化するこ
とにより分析する。この分析は前記のようにして行う、
目的とするプラスミドの1つをHRi145と命名する
。
にして単離する。プラスミドをEcoRIで消化するこ
とにより分析する。この分析は前記のようにして行う、
目的とするプラスミドの1つをHRi145と命名する
。
我p
2μgのpi(Ri145 D N Aを5ユニツトの
C1al(ベーリンガー)で37℃にて60分間処理し
、そしてフェノール抽出により脱蛋白する。DNAをエ
タノールで沈澱せしめ、そして次に20μlの10mM
tris−Hcl(pH7,5) 、0.5mM
EDTAに熔解する。突出末端を上記のようにしてDN
AポリメラーゼI (Kleno−断片)により補完
する。
C1al(ベーリンガー)で37℃にて60分間処理し
、そしてフェノール抽出により脱蛋白する。DNAをエ
タノールで沈澱せしめ、そして次に20μlの10mM
tris−Hcl(pH7,5) 、0.5mM
EDTAに熔解する。突出末端を上記のようにしてDN
AポリメラーゼI (Kleno−断片)により補完
する。
但しdATP及びdTTPをdCTP(P&Lビオケミ
カルス)及びdGTPCP&Lビオケミカルス)で置き
換える。
カルス)及びdGTPCP&Lビオケミカルス)で置き
換える。
85℃にて5分間インキュベートすることによりポリメ
ラーゼを不活性化する。2容積の0.IMtris−H
CI (pH8,7)を反応混合物に加え、そして全体
を0.5ユニツトのウシホスファターゼ(べ−リンガ−
)と共に37℃にて30分間インキュベートする0反応
混合物をフェノール抽出により脱蛋白する。DNAをエ
タノールにより沈澱せしめ、そして8μ!の10 mM
tris−HCj! (pH7,5)。
ラーゼを不活性化する。2容積の0.IMtris−H
CI (pH8,7)を反応混合物に加え、そして全体
を0.5ユニツトのウシホスファターゼ(べ−リンガ−
)と共に37℃にて30分間インキュベートする0反応
混合物をフェノール抽出により脱蛋白する。DNAをエ
タノールにより沈澱せしめ、そして8μ!の10 mM
tris−HCj! (pH7,5)。
0、5 m M EDTA中にfiI解する。
次の式:
%式%
で表わされる化学合成したDNAリンカ−を、0、1
m M rATP(シグマ) 、5 QmM tri
s−HCj!(pH9,5) 、10mM MgCjt
、5mM DTT及び2ユニツトのT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ(P&Lビオケミカルス)を含有する8
μlの反応容積中で、8 pIIolの該リンカ−と5
μCiの〔γ−”P )−ATP(5500Ci・−1
101−’%アマージャム)とを37℃にて30分間イ
ンキュベートすることにより、5′−末端においてリン
酸化する。
m M rATP(シグマ) 、5 QmM tri
s−HCj!(pH9,5) 、10mM MgCjt
、5mM DTT及び2ユニツトのT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ(P&Lビオケミカルス)を含有する8
μlの反応容積中で、8 pIIolの該リンカ−と5
μCiの〔γ−”P )−ATP(5500Ci・−1
101−’%アマージャム)とを37℃にて30分間イ
ンキュベートすることにより、5′−末端においてリン
酸化する。
次に、この放射性ラベルされたリンカ−を1μgのC1
al及びホスファターゼで処理し、そして0、5 m
M rATPCシダ?) 、10mM DTT (カ
ルビオケム) 、20mM tris−Hll(pH
7,8)、1mMMgCjt及び800ユニyトのT、
DNAリガーゼ(ビオラプス)を含有する20μlの反
応溶液中でpHR1145D N A (前記)と連結
する。
al及びホスファターゼで処理し、そして0、5 m
M rATPCシダ?) 、10mM DTT (カ
ルビオケム) 、20mM tris−Hll(pH
7,8)、1mMMgCjt及び800ユニyトのT、
DNAリガーゼ(ビオラプス)を含有する20μlの反
応溶液中でpHR1145D N A (前記)と連結
する。
15℃にて2時間インキエベートする。85℃にて10
分間インキュベートすることによりリガーゼを不活性化
する0次に、2容積の水を加え、塩化ナトリウム濃度を
10mMに調整し、そして20ユニントのKpnI(ビ
オラプス)を37℃にて30分間にわたって加える。フ
ェノール及びクロロホルムで抽出した後、この混合物を
、40mMtris・アセテート(pH7,8) 、1
mM EDTA及び0.5μg / m 1エチジウ
ムプロミド中で0.9%低融アガロースゲル(ビオラド
)を通して分画する。同じサイズのマーカーDNAと同
じ移動度を示すUv−照射により可視化されるバンドを
ビンセットで切り取る。ゲル片を65℃にて5分間熔融
せしめ、そして37℃に冷却する。約20μlの容積が
得られる。この溶液の5μlを取り、そして0.5mM
ATP、10mM DTT、10 mM MgC
1t 、20 mM tris−HCl (pH7,
8)に対して標準化された10μlの反応容積中で40
0ユニツトのT4リガーゼ(ビオラプス)と共に15℃
にて12時間インキュベートする。
分間インキュベートすることによりリガーゼを不活性化
する0次に、2容積の水を加え、塩化ナトリウム濃度を
10mMに調整し、そして20ユニントのKpnI(ビ
オラプス)を37℃にて30分間にわたって加える。フ
ェノール及びクロロホルムで抽出した後、この混合物を
、40mMtris・アセテート(pH7,8) 、1
mM EDTA及び0.5μg / m 1エチジウ
ムプロミド中で0.9%低融アガロースゲル(ビオラド
)を通して分画する。同じサイズのマーカーDNAと同
じ移動度を示すUv−照射により可視化されるバンドを
ビンセットで切り取る。ゲル片を65℃にて5分間熔融
せしめ、そして37℃に冷却する。約20μlの容積が
得られる。この溶液の5μlを取り、そして0.5mM
ATP、10mM DTT、10 mM MgC
1t 、20 mM tris−HCl (pH7,
8)に対して標準化された10μlの反応容積中で40
0ユニツトのT4リガーゼ(ビオラプス)と共に15℃
にて12時間インキュベートする。
Loom M tris−ICI! (pH7,5)、
100m M CaCl 2及びLoom M MgC
l 、を含有する溶液1/10容積をリガーゼ混合物(
I5℃にて固化)に加え、そして65℃にて5分間イン
キュベートする0次にこの溶液を用いて、前記のように
して、カルシウムにより処理しておいたE、コリHBI
OI細胞を形質転換する。50μg / m lのアン
ピシリンを補充されたマツコンキー寒天プレート上にプ
レートする。
100m M CaCl 2及びLoom M MgC
l 、を含有する溶液1/10容積をリガーゼ混合物(
I5℃にて固化)に加え、そして65℃にて5分間イン
キュベートする0次にこの溶液を用いて、前記のように
して、カルシウムにより処理しておいたE、コリHBI
OI細胞を形質転換する。50μg / m lのアン
ピシリンを補充されたマツコンキー寒天プレート上にプ
レートする。
10個の異るコロニーのプラスミドDNAを前記のよう
にして単離し、そしてDNAを次の制限酵素分析にかけ
る。各場合に0.5μgのプラスミドDNAを、酵素の
製造者の指示に従って、Kpnl(ビオラプス) 、N
eo T (ビオラプス)及びEcoRI (ビオ
ラプス)により次々と開裂せしめる。この開裂生成物を
、40mM tris・アセテ−)(pH7,8)
、1 mM EDTA 、 0.5 u g/ml7
mlエチジウムプロミド9ガロースゲル上で分画する。
にして単離し、そしてDNAを次の制限酵素分析にかけ
る。各場合に0.5μgのプラスミドDNAを、酵素の
製造者の指示に従って、Kpnl(ビオラプス) 、N
eo T (ビオラプス)及びEcoRI (ビオ
ラプス)により次々と開裂せしめる。この開裂生成物を
、40mM tris・アセテ−)(pH7,8)
、1 mM EDTA 、 0.5 u g/ml7
mlエチジウムプロミド9ガロースゲル上で分画する。
すべてのプラスミドは目的通りに、それぞれこれらの酵
素開裂部位の1つを示す、1つをHRilJ8と命名す
る。
素開裂部位の1つを示す、1つをHRilJ8と命名す
る。
プラスミド)lRi148はトリプトファン−プロモー
タ/オペレーター及びリボゾーム結合部位からATGま
で(これを含む)を含有し、そして広範囲の用途を有す
る発現プラスミドである・段1又」L pHR118のプラスミドDNA5μgを制限エンドヌ
クレアーゼEcoRI及びBa+mH1で消化する。切
断した後、ベクターpHR114B/EcoRI /B
amHIを密度勾配遠心法により単離する。
タ/オペレーター及びリボゾーム結合部位からATGま
で(これを含む)を含有し、そして広範囲の用途を有す
る発現プラスミドである・段1又」L pHR118のプラスミドDNA5μgを制限エンドヌ
クレアーゼEcoRI及びBa+mH1で消化する。切
断した後、ベクターpHR114B/EcoRI /B
amHIを密度勾配遠心法により単離する。
得られる線状化されたベクターの製造はまたHans
Rink等s Nucleic Ac1ds Re5e
arch 、 12 。
Rink等s Nucleic Ac1ds Re5e
arch 、 12 。
6369−6387 (I984) ’に記載されてお
り、この文献においてはこの明細書において、pHR1
148と称されるプラスミドがpHR14Bと呼ばれて
いる。
り、この文献においてはこの明細書において、pHR1
148と称されるプラスミドがpHR14Bと呼ばれて
いる。
段11」L
段階2.11に従って得られる20pgのDNA配列F
oを、50μlの10mM tris−H(I(pH
7,5) 、50mM NaC1及び100μg /
m lのゼラチンの50μlの溶液の内の20μl中で
、制限酵素EcoR1及びBamH1により次々に消化
する。
oを、50μlの10mM tris−H(I(pH
7,5) 、50mM NaC1及び100μg /
m lのゼラチンの50μlの溶液の内の20μl中で
、制限酵素EcoR1及びBamH1により次々に消化
する。
溶?&をTNHに対して標準化し、そして次に30pg
(=50nm/の末端)のベクターDNApHR11
48/EcoRI /Bawl 1を加える。溶液をフ
ェノール/クロロホルムで抽出し、そしてDNAをアル
コールにより沈澱せしめる。DNA沈澱物を50mM
tris−Hcj’(pH7,8) 、10mMPI
gc1t 110mM DTT、0.5mM AT
P及び100μg / m lゼラチンの溶液20μl
中で、25ユニツト/μlのT、DNAリガーゼ(ビオ
ラプス)により、15℃にて3時間処理する。こうして
、組換プラスミド(pML1050)が溶液中に形成さ
れる。
(=50nm/の末端)のベクターDNApHR11
48/EcoRI /Bawl 1を加える。溶液をフ
ェノール/クロロホルムで抽出し、そしてDNAをアル
コールにより沈澱せしめる。DNA沈澱物を50mM
tris−Hcj’(pH7,8) 、10mMPI
gc1t 110mM DTT、0.5mM AT
P及び100μg / m lゼラチンの溶液20μl
中で、25ユニツト/μlのT、DNAリガーゼ(ビオ
ラプス)により、15℃にて3時間処理する。こうして
、組換プラスミド(pML1050)が溶液中に形成さ
れる。
丑JLL工し
段階2.16に従って得られたプラスミドpML105
0によるE、コリHBIOIの形質転換を次のようにし
て行う。
0によるE、コリHBIOIの形質転換を次のようにし
て行う。
形質転換に必要とされるカルシウム処理されたE、コリ
HB101細胞をMandel等、J、Mo1.B11
o、 + 53゜159 (I970)に記載されてい
るようにして調製する。
HB101細胞をMandel等、J、Mo1.B11
o、 + 53゜159 (I970)に記載されてい
るようにして調製する。
組換プラスミドpML1050を含有する段階2.16
に従って得られた溶液を、65℃にて10分間加熱して
TaDNAリガーゼを不活性化し、そして次に37℃に
冷却する。この反応混合物10μlを、10 mM M
gCj! z−及び10 mM tris −HCl
(pH7,5)中力ルシウム処理されたE、コリ1(B
IOI細胞150μlに加えて全容積200μlにする
0次に、この混合物を30分間氷冷し、42℃にて2分
間加熱し、そして次に1mI!のL培地(例2の最初の
記載を参照のこと)中に37℃にて50分間放置する0
次に、混合物のQ、 2m lのアリコートを、60p
g / m lのアンピシリン(セルバ)を含をする5
枚のプレート(マツコンキー寒天、ディフコ)に通用す
る。寒天プレートを37℃にて16〜18時間保持する
。形質転換されたE、コリHBIOIのアンピシリン耐
性コロニー109個が得られる。
に従って得られた溶液を、65℃にて10分間加熱して
TaDNAリガーゼを不活性化し、そして次に37℃に
冷却する。この反応混合物10μlを、10 mM M
gCj! z−及び10 mM tris −HCl
(pH7,5)中力ルシウム処理されたE、コリ1(B
IOI細胞150μlに加えて全容積200μlにする
0次に、この混合物を30分間氷冷し、42℃にて2分
間加熱し、そして次に1mI!のL培地(例2の最初の
記載を参照のこと)中に37℃にて50分間放置する0
次に、混合物のQ、 2m lのアリコートを、60p
g / m lのアンピシリン(セルバ)を含をする5
枚のプレート(マツコンキー寒天、ディフコ)に通用す
る。寒天プレートを37℃にて16〜18時間保持する
。形質転換されたE、コリHBIOIのアンピシリン耐
性コロニー109個が得られる。
段1」2卦一
段階2.17に従って得られた形質転換されたコロニー
30個を、段階2.11のDNA配列FOの断片の含有
につき、次のようにして試験する。
30個を、段階2.11のDNA配列FOの断片の含有
につき、次のようにして試験する。
形質転換されたコロニーをニトロセルロースフィルター
885 (Schleicher及び5chill)上
に押し付ける。 Grunstein及びHognes
、 Proc、Natl。
885 (Schleicher及び5chill)上
に押し付ける。 Grunstein及びHognes
、 Proc、Natl。
Acad、Sci、USA 、 72 、3960(I
979)に従って、コロニーを溶解し、そしてそれらの
変性されたDNAをフィルターに固定する。20mβ
(フィルター当り)の4XSET (30mM tr
is−Hcl(pH8)、150mM NaC1、1m
M EDTAのt8液) 、0. tw/v%フイ:7
−ル400(7y7Lz7シ7) 、0.5%SDS。
979)に従って、コロニーを溶解し、そしてそれらの
変性されたDNAをフィルターに固定する。20mβ
(フィルター当り)の4XSET (30mM tr
is−Hcl(pH8)、150mM NaC1、1m
M EDTAのt8液) 、0. tw/v%フイ:7
−ル400(7y7Lz7シ7) 、0.5%SDS。
50pg / m 1の変性されたウシ胸腺DNA中で
、64℃にて4時間フィルターの前ハイブリダイゼーシ
ョンヲ行つ0次に、ニトロセルロースフィルターを、2
0mJ (フィルター当り)の5XSET(W/V)
7 イコール400.0.2%SDS及び50pg /
m lの変性されたウシ胸腺DNA中で、64℃にて
16時間、22p−放射性標識プローブ(フィルター当
す約10”〜10’セレンコフcpm)で処理する。オ
リゴデオキシヌクレオチド64/73 (段階2.10
を参照のこと)をプローブとして用いる。
、64℃にて4時間フィルターの前ハイブリダイゼーシ
ョンヲ行つ0次に、ニトロセルロースフィルターを、2
0mJ (フィルター当り)の5XSET(W/V)
7 イコール400.0.2%SDS及び50pg /
m lの変性されたウシ胸腺DNA中で、64℃にて
16時間、22p−放射性標識プローブ(フィルター当
す約10”〜10’セレンコフcpm)で処理する。オ
リゴデオキシヌクレオチド64/73 (段階2.10
を参照のこと)をプローブとして用いる。
次に、フィルターを2XSET、0.2%SDS中で室
温にて2回、そして2XSET、0.5%SDS中で6
0℃にて2回(最初30分間、次に60分間)洗浄する
0次に、フィルターを3MMペーパー(ワットマン)の
間で乾燥し、そして−80℃にてX−線フィルム(フジ
)上に、強化スクリーン(イルフォード)と共に1〜2
日間置く。
温にて2回、そして2XSET、0.5%SDS中で6
0℃にて2回(最初30分間、次に60分間)洗浄する
0次に、フィルターを3MMペーパー(ワットマン)の
間で乾燥し、そして−80℃にてX−線フィルム(フジ
)上に、強化スクリーン(イルフォード)と共に1〜2
日間置く。
得られるオートラジオグラフは、さらに処理することが
できる陽性コロニー(クローン)20個を示す、これら
の内5個をpML1050%pM口051 。
できる陽性コロニー(クローン)20個を示す、これら
の内5個をpML1050%pM口051 。
pML1052 、pML1053 、及びp阿L10
54と命名する。
54と命名する。
ユg
段階2.18に従って得られたクローンpML1050
中の挿入されたDNA配列、すなわちDNA挿入部の特
徴付けを次のようにして行う、。
中の挿入されたDNA配列、すなわちDNA挿入部の特
徴付けを次のようにして行う、。
組換プラスミドpML1050のDNAを、Ish−H
or−owitz、Mo1ecular Cloni
ng+A Laboratory Manual(
T、Maniatis等により発表) 、Co1b S
pringHarbor Lab、1982 、368
頁、に従って単離する。
or−owitz、Mo1ecular Cloni
ng+A Laboratory Manual(
T、Maniatis等により発表) 、Co1b S
pringHarbor Lab、1982 、368
頁、に従って単離する。
FoDNA挿入部のヌクレオチド配列をMaxa+m及
びG11bert (Proc、Acad、Sci、U
SA 、 74 、560(I977):さらにMet
h、 Enz m、 、 65 、499(I980)
を参照のこと)に従って決定する。この目的のため、p
ML1050のプラスミドDNAl0μgをEcoRI
及びBamHI制限エンドヌクレアーゼにより開裂せし
め、そして線状化されたDNAをアガロースゲルからゲ
ル−熔出により単離する。この目的のため、線状化され
たDNAを、tris−アセテート−EDTA緩衝液(
pH8)中1%低融アガロース(ビオラド)上で′のゲ
ル−電気泳動により精製する。アガロースゲル中でE
tBrによりDNAを着色した後、DNAバンドを含有
するゲルの領域をゲルから切り出し、そして65℃にて
10分間液化する。このDNA溶液に20容積のTNE
を加え、DE−52クロマトグラフイーによりMuel
ler等(J、MIo、Biol、。
びG11bert (Proc、Acad、Sci、U
SA 、 74 、560(I977):さらにMet
h、 Enz m、 、 65 、499(I980)
を参照のこと)に従って決定する。この目的のため、p
ML1050のプラスミドDNAl0μgをEcoRI
及びBamHI制限エンドヌクレアーゼにより開裂せし
め、そして線状化されたDNAをアガロースゲルからゲ
ル−熔出により単離する。この目的のため、線状化され
たDNAを、tris−アセテート−EDTA緩衝液(
pH8)中1%低融アガロース(ビオラド)上で′のゲ
ル−電気泳動により精製する。アガロースゲル中でE
tBrによりDNAを着色した後、DNAバンドを含有
するゲルの領域をゲルから切り出し、そして65℃にて
10分間液化する。このDNA溶液に20容積のTNE
を加え、DE−52クロマトグラフイーによりMuel
ler等(J、MIo、Biol、。
124 、343(I978) ) ニ従ってDNAを
精製し、フェノール/クロロホルムで抽出し、そしてD
NAをアルコールにより一20℃にて一夜沈澱せしめる
。DNA沈澱物を50ttlの0.OIM tris
・HCI (pH8) 、0.1 mM EDT^に
溶解し、そして使用するまで一20℃に貯蔵する0次に
、単離されたDNAをアルカリホスファターゼで消化し
、そしてDE−52上でクロマトグラフ処理する。
精製し、フェノール/クロロホルムで抽出し、そしてD
NAをアルコールにより一20℃にて一夜沈澱せしめる
。DNA沈澱物を50ttlの0.OIM tris
・HCI (pH8) 、0.1 mM EDT^に
溶解し、そして使用するまで一20℃に貯蔵する0次に
、単離されたDNAをアルカリホスファターゼで消化し
、そしてDE−52上でクロマトグラフ処理する。
次に、このDNAを、〔γ−”P)ATP (比活性>
5000Ci/++uiol、アマ−ジャム)及びT、
ポリヌクレオチドキナーゼ(P−L−ビオチミカルス)
を用いて、5′−末端において放射性ラベルする。
5000Ci/++uiol、アマ−ジャム)及びT、
ポリヌクレオチドキナーゼ(P−L−ビオチミカルス)
を用いて、5′−末端において放射性ラベルする。
次に、放射性ラベルされたDNAを第2の制限エンドヌ
クレアーゼ、例えばPvuIr及びPstlで開裂せし
める。生ずるDNA断片をゲル−溶出によりアガロース
から単離する0次に、PvuII −EcoRビ断片及
びPst I −BamHI ”断片から、FoDNA
のヌクレオチド配列を決定する。(′″は放射性ラベル
されたDNA末端を示す、)・ 凍結乾燥形の純CI
JPn(3■)(例1に従って製造されたもの)を少量
の0.1%酢酸に溶解し、そして次にリン酸覆衝化塩化
ナトリウム溶液により3 m lにする。 pHを7.
2に調整する。この抗原溶液の部分を同じ体積の完全フ
ロインドアジュバント又はリン酸緩衝化塩溶液と混合す
る。
クレアーゼ、例えばPvuIr及びPstlで開裂せし
める。生ずるDNA断片をゲル−溶出によりアガロース
から単離する0次に、PvuII −EcoRビ断片及
びPst I −BamHI ”断片から、FoDNA
のヌクレオチド配列を決定する。(′″は放射性ラベル
されたDNA末端を示す、)・ 凍結乾燥形の純CI
JPn(3■)(例1に従って製造されたもの)を少量
の0.1%酢酸に溶解し、そして次にリン酸覆衝化塩化
ナトリウム溶液により3 m lにする。 pHを7.
2に調整する。この抗原溶液の部分を同じ体積の完全フ
ロインドアジュバント又はリン酸緩衝化塩溶液と混合す
る。
雌性Ba1b/cマウス(8遇齢、ティールファーム・
シンセルン、スイスから入手)に、緩衝化塩溶液中10
0μgのCGRP n溶液を静脈内注射する。4日 後
、牌臓を摘出して融合のために用いる。
シンセルン、スイスから入手)に、緩衝化塩溶液中10
0μgのCGRP n溶液を静脈内注射する。4日 後
、牌臓を摘出して融合のために用いる。
B)ハイブリドーマの1゜ び 。
得られた牌細胞と骨ta腫細胞系X63−Ag3.6.
5.3(J、F、Kearney等、 J、l111+
*uno1. 、123,1548(I979))との
融合によりハイブリドーマ細胞を製造する。
5.3(J、F、Kearney等、 J、l111+
*uno1. 、123,1548(I979))との
融合によりハイブリドーマ細胞を製造する。
このために10’個の牌細胞及び107個の骨髄腫細胞
を使用する。融合は、S、Alkan等、Mo1. I
mmunol。
を使用する。融合は、S、Alkan等、Mo1. I
mmunol。
20 、203(I983)に記載されているようにし
て行う。
て行う。
ハイブリドーマの上清中の抗−CORP II活性の決
定はラジオニムノアフセイにより行う(RIA、T。
定はラジオニムノアフセイにより行う(RIA、T。
Chard、An Introduction to
Radioimmunoassay andrelat
ed Techniques、 Narth Ho1l
and Publ、 Comp、。
Radioimmunoassay andrelat
ed Techniques、 Narth Ho1l
and Publ、 Comp、。
アムステルダム、 1978) 。
C) からの −CGRP n−の単離 び享Ha
1 b/cマウスを、Q、 4 m lのブリスタン(
カール・ロス)により腹腔内部処理する。゛1週間後、
2〜5X10’個のクローン化ハイブリドーマ細胞を腹
腔的注射する。各マウスから繰り返し腹水を採取し、そ
して−80℃にて凍結する。集めた液体を解凍し、そし
て4℃にて30分間16.000■/分、遠心分離する
。脂肪を吸引濾去し、そして0℃で攪拌しながら、細胞
片を含まない上清液に、0.9容積の飽和硫酸アンモニ
ウム溶液をゆっくり滴加する。生じた粗免疫グロブリン
画分を、0.1M tris−Hcj!(pH8,2
)を用いながら、製造者により記載されているようにし
てセファクリルG2000 (ファルマシア)に通す、
活性画分を集め、そしてアミコンXM50フィルター(
アミコン)により濃縮する。
1 b/cマウスを、Q、 4 m lのブリスタン(
カール・ロス)により腹腔内部処理する。゛1週間後、
2〜5X10’個のクローン化ハイブリドーマ細胞を腹
腔的注射する。各マウスから繰り返し腹水を採取し、そ
して−80℃にて凍結する。集めた液体を解凍し、そし
て4℃にて30分間16.000■/分、遠心分離する
。脂肪を吸引濾去し、そして0℃で攪拌しながら、細胞
片を含まない上清液に、0.9容積の飽和硫酸アンモニ
ウム溶液をゆっくり滴加する。生じた粗免疫グロブリン
画分を、0.1M tris−Hcj!(pH8,2
)を用いながら、製造者により記載されているようにし
てセファクリルG2000 (ファルマシア)に通す、
活性画分を集め、そしてアミコンXM50フィルター(
アミコン)により濃縮する。
例3aCに従って製造した抗−CGRP IIn抗体溶
液をリンil!2緩衝化塩?8if(PBS溶液)によ
り稀釈してlμg/looμlの濃度とする。この溶液
100μlを小形のプラスチックチューブ中又はプラス
チック製ミクロタイタープレート士で37℃にて2時間
インキエベートし、抗体をプラスチック表面上に非特異
的に吸着せしめる。プラスチック表面上のなお遊離して
いる活性部位を飽和するため、ウシ血清アルブミン溶液
(BSA溶液)により後処理を行う。
液をリンil!2緩衝化塩?8if(PBS溶液)によ
り稀釈してlμg/looμlの濃度とする。この溶液
100μlを小形のプラスチックチューブ中又はプラス
チック製ミクロタイタープレート士で37℃にて2時間
インキエベートし、抗体をプラスチック表面上に非特異
的に吸着せしめる。プラスチック表面上のなお遊離して
いる活性部位を飽和するため、ウシ血清アルブミン溶液
(BSA溶液)により後処理を行う。
サンプル溶液の又は標準溶液のBSA溶液中一連の稀釈
物のそれぞれを、既知の方法で放射性ltsヨウ素によ
りラベルされそして10.000cpm150μEの活
性を有するCGRP■の溶液50μlに加え、そして次
にプラスチック表面上で37℃にて2時間インキエベー
トし、そして次に4℃にて12時間インキエベートする
。小形チューブ又はミクロタイタープレートをリン酸緩
衝化塩溶液で洗浄し、そして放射能を測定する。標準溶
液を用いて調製した換算曲線によりサンプル中のCGR
P nの濃度を決定する。
物のそれぞれを、既知の方法で放射性ltsヨウ素によ
りラベルされそして10.000cpm150μEの活
性を有するCGRP■の溶液50μlに加え、そして次
にプラスチック表面上で37℃にて2時間インキエベー
トし、そして次に4℃にて12時間インキエベートする
。小形チューブ又はミクロタイタープレートをリン酸緩
衝化塩溶液で洗浄し、そして放射能を測定する。標準溶
液を用いて調製した換算曲線によりサンプル中のCGR
P nの濃度を決定する。
前記のラジオイムノアッセイ用試験キットは次のものを
含む。
含む。
◎ I=10q/mj!の濃度の、例3aCからの抗−
CGRP n抗体の溶液: ’1ml ;◎ リン酸緩
衝化塩溶液(PBS溶液) : 100lH ◎ P B S ?V液中0.3%ウシ血清アルブミン
及び0.1%ナトリウムアジド:100rr/!;◎
200.000cpn+ / m 1の活性を有する放
射性CGRP Itの溶液: 2ml ; ◎ 100■/mlのCGRItを含有する標準溶液:
2m1; ◎ プラスチック材料製の小形チューブ又はミクロタイ
タープレート。
CGRP n抗体の溶液: ’1ml ;◎ リン酸緩
衝化塩溶液(PBS溶液) : 100lH ◎ P B S ?V液中0.3%ウシ血清アルブミン
及び0.1%ナトリウムアジド:100rr/!;◎
200.000cpn+ / m 1の活性を有する放
射性CGRP Itの溶液: 2ml ; ◎ 100■/mlのCGRItを含有する標準溶液:
2m1; ◎ プラスチック材料製の小形チューブ又はミクロタイ
タープレート。
■玉 亙jJ≦d1浪
CGRP nの無菌濾過した水溶液を、加熱しながら、
無菌条件下で、防腐剤としてフェノールを含有する無菌
ゼラチン溶液と混合して、1.0 m lの溶液が次の
組成を有するようにする。・ 以下余白 CGRP II 10.Ou
gゼラチン 150.0LIf フエノール 4.7■ 蒸留水 1.0 m lとなる量。
無菌条件下で、防腐剤としてフェノールを含有する無菌
ゼラチン溶液と混合して、1.0 m lの溶液が次の
組成を有するようにする。・ 以下余白 CGRP II 10.Ou
gゼラチン 150.0LIf フエノール 4.7■ 蒸留水 1.0 m lとなる量。
この混合物を無菌条件下で1.0 m lのバイアルに
導入する。
導入する。
■】 牲1団I劃!乾旦」L
5μgのCGRP■を20mj!のマンニトールを含有
する1mlの水溶液に溶解する。この溶液を無菌濾過し
、そして無菌条件下で、2rnlのアンプルに入れ、深
冷凍結し、そして凍結乾燥する。使用前に、この凍結乾
燥物を1mlの蒸留水又は1mlの生理食塩水に溶解す
る。この溶液は筋肉内又は静脈内に投与される。この溶
液はまた、2型室シリンジアンプルに導入することもで
きる。
する1mlの水溶液に溶解する。この溶液を無菌濾過し
、そして無菌条件下で、2rnlのアンプルに入れ、深
冷凍結し、そして凍結乾燥する。使用前に、この凍結乾
燥物を1mlの蒸留水又は1mlの生理食塩水に溶解す
る。この溶液は筋肉内又は静脈内に投与される。この溶
液はまた、2型室シリンジアンプルに導入することもで
きる。
開i 五血囚プ上二
200μgの微粉砕した(<5.0μ)CGRPI[を
、3、5 m lの“旧glyol 812 ”と0.
08gのベンジルアルコールとの混合物中に懸濁する。
、3、5 m lの“旧glyol 812 ”と0.
08gのベンジルアルコールとの混合物中に懸濁する。
この懸濁液を、計量バルブで有する容器に導入する0次
に5、 Om 1の°Freon 12”を、バルブを
通して加圧下に容器に入れる。“Freon″は、振と
うによりMiglyol/ベンジルアルコール混合物中
に溶解する。
に5、 Om 1の°Freon 12”を、バルブを
通して加圧下に容器に入れる。“Freon″は、振と
うによりMiglyol/ベンジルアルコール混合物中
に溶解する。
±1
0.6M酢酸アンモニウム10.IM KC1/1m
MEDTAの溶液2mj!を曙アンモニア溶液によりp
H8に調整し、そして100μjのl M CGRP
If a水性溶液(例2を参照のこと)と混合する0次
に0.7曙のカルボキシペプチダーゼY(カールスベル
グ・ビオテクノロジー社、コペンハーゲン、デンマーク
)を加える。25℃にて30分間置いた後、全体を6M
HCIにてpH1に酸性化する。
MEDTAの溶液2mj!を曙アンモニア溶液によりp
H8に調整し、そして100μjのl M CGRP
If a水性溶液(例2を参照のこと)と混合する0次
に0.7曙のカルボキシペプチダーゼY(カールスベル
グ・ビオテクノロジー社、コペンハーゲン、デンマーク
)を加える。25℃にて30分間置いた後、全体を6M
HCIにてpH1に酸性化する。
反応生成物を精製し、そして段階1.7に記載した条件
下で)IPLcにより単離する0式(III)のCGR
P [[が得られ、これは例1に従って得られた生成物
と同一である。
下で)IPLcにより単離する0式(III)のCGR
P [[が得られ、これは例1に従って得られた生成物
と同一である。
炎1
例2と同様にして、次の式(X■)、
d (CTTAAGTACCGAACGTTGT[1G
CGATGGACGCAATGGGT[iGにA(X■
) で表わされるDNA配列を有するプラスミドを含有する
エフセリシ+・コリ (Escherichia co
li)のクローンを培養し、そして同様に処理すること
によって、次の式(XIX)、 Leu−A 1a−G 1y−Leu−Leu−5er
−Arg−Ser−G Iy−Gly−Me t−Va
l−Lys−Ser−^5n−Phe−Val−Pro
−Thr−Asn−Val−Gly−5er−Lys−
Ala−Phe−GJy−ON(XIX) で表わされるCGRPnbを得る。
CGATGGACGCAATGGGT[iGにA(X■
) で表わされるDNA配列を有するプラスミドを含有する
エフセリシ+・コリ (Escherichia co
li)のクローンを培養し、そして同様に処理すること
によって、次の式(XIX)、 Leu−A 1a−G 1y−Leu−Leu−5er
−Arg−Ser−G Iy−Gly−Me t−Va
l−Lys−Ser−^5n−Phe−Val−Pro
−Thr−Asn−Val−Gly−5er−Lys−
Ala−Phe−GJy−ON(XIX) で表わされるCGRPnbを得る。
出発材料は例2と同様にして得られる。
以下金白
五1
4 q(I’)CGRPII b (例8を参照ノコと
)を、37℃にて、l m 1の20 m M NaC
1及び5mMリン酸ナトリウム中で、pH7にて20時
間、A、F。
)を、37℃にて、l m 1の20 m M NaC
1及び5mMリン酸ナトリウム中で、pH7にて20時
間、A、F。
Bradbury、 M、D、A、 Finnie及び
り、G、Smyth 。
り、G、Smyth 。
Nature 298.686−688(I982)
に記載されているようにしてブタの脳下垂体100gか
ら単離されたアミド化酵素と共にインキュベートする0
次に、100μlのIM)ICfを用いて酸性化する0
段階1.7に記載した条件下でHPLCにより反応生成
物を精製し、そして単離する。弐(]I[)のCGRP
Ifが得られ、これは例1に従って得られる生成物と
同一である。
に記載されているようにしてブタの脳下垂体100gか
ら単離されたアミド化酵素と共にインキュベートする0
次に、100μlのIM)ICfを用いて酸性化する0
段階1.7に記載した条件下でHPLCにより反応生成
物を精製し、そして単離する。弐(]I[)のCGRP
Ifが得られ、これは例1に従って得られる生成物と
同一である。
例10゜
次の式、
Thr(tBu)−H4s−Arg(Mtr)−Leu
−Ala−Gly−Leu−Leu−3er(tBu)
−Arg(Mtr)−Set(tBu)−Gly−Gl
y−門et−Val−Lys (Boc) −5er
(tBu) −Asn−Phe−Va 1−Pro−T
hr (tBu) −Asn−Val−Gly−Ser
(tau) −Lys (Boc) −Ala−Phe
−N)1gで表わされる、段階10.2において得られ
たペプチド−アミドを2.8 m lのトリフルオロ酢
酸/水(9: 1)に溶解し、そして1.5時間室温に
置いた後、30m1の冷ジエチルエーテルで沈澱せしめ
、そして吸引濾過する。濾過残渣を5.2m lのトリ
フルオロ酢酸/水(95:5)に溶解し、そして50℃
にて50分間置き、室温に冷却し、そして60ttlの
1Mヨウ化アンモニウムを加えた後、室温にて10分間
置<、30mJ!の冷ジエチルエーテルに滴加すること
によりペプチド−アミドを沈澱せしめる。吸引濾過し、
そして乾燥した後、ペプチド−アミドを3 m lの0
.1 M酢酸に溶解し、そしてなお存在する痕跡のヨウ
素を15μlの1Mチオ硫酸ナトリウムの添加により還
元する。得られた溶液をイオン交換カラム〔アンバーラ
イト(商標”) ) IRA92 、アセテート形、1
.2X3cm)に通して濾過し、そして0.1M酢酸に
より溶出する。蒸発により乾燥するまで濃縮した後、残
渣を3mlの再蒸留水に熔解し、アルゴンのもとで室温
にて一夜!き、この溶液を用いて次の条件下で調製用)
IPLcで精製する。カラム: Vydac 5 p
mCl 8.250 XIO寵(ザ・セパレージ町ンズ
・グループ、ヘスベリア、カリホルニア、アメリカ);
溶液A(水中0.1容量九のトリフルオロ酢酸と25〜
30容量九のB(アセトニトリル中0.1容量%のトリ
フルオロ酢酸からなるグラジェント30分間、及びさら
にA及び30〜40容量%のBからなるグラジェント;
流速4mj/分:検出: 210nm。
−Ala−Gly−Leu−Leu−3er(tBu)
−Arg(Mtr)−Set(tBu)−Gly−Gl
y−門et−Val−Lys (Boc) −5er
(tBu) −Asn−Phe−Va 1−Pro−T
hr (tBu) −Asn−Val−Gly−Ser
(tau) −Lys (Boc) −Ala−Phe
−N)1gで表わされる、段階10.2において得られ
たペプチド−アミドを2.8 m lのトリフルオロ酢
酸/水(9: 1)に溶解し、そして1.5時間室温に
置いた後、30m1の冷ジエチルエーテルで沈澱せしめ
、そして吸引濾過する。濾過残渣を5.2m lのトリ
フルオロ酢酸/水(95:5)に溶解し、そして50℃
にて50分間置き、室温に冷却し、そして60ttlの
1Mヨウ化アンモニウムを加えた後、室温にて10分間
置<、30mJ!の冷ジエチルエーテルに滴加すること
によりペプチド−アミドを沈澱せしめる。吸引濾過し、
そして乾燥した後、ペプチド−アミドを3 m lの0
.1 M酢酸に溶解し、そしてなお存在する痕跡のヨウ
素を15μlの1Mチオ硫酸ナトリウムの添加により還
元する。得られた溶液をイオン交換カラム〔アンバーラ
イト(商標”) ) IRA92 、アセテート形、1
.2X3cm)に通して濾過し、そして0.1M酢酸に
より溶出する。蒸発により乾燥するまで濃縮した後、残
渣を3mlの再蒸留水に熔解し、アルゴンのもとで室温
にて一夜!き、この溶液を用いて次の条件下で調製用)
IPLcで精製する。カラム: Vydac 5 p
mCl 8.250 XIO寵(ザ・セパレージ町ンズ
・グループ、ヘスベリア、カリホルニア、アメリカ);
溶液A(水中0.1容量九のトリフルオロ酢酸と25〜
30容量九のB(アセトニトリル中0.1容量%のトリ
フルオロ酢酸からなるグラジェント30分間、及びさら
にA及び30〜40容量%のBからなるグラジェント;
流速4mj/分:検出: 210nm。
画分中の主ピークを集め、そしてその純度を次の条件下
で分析用HPLCにより決定する。カラム:Vydac
5 、ljmc 18.250X4.6m;A及びB
:45分間中に20〜45%BAA及びBは前記の通り
。
で分析用HPLCにより決定する。カラム:Vydac
5 、ljmc 18.250X4.6m;A及びB
:45分間中に20〜45%BAA及びBは前記の通り
。
純粋な百分を蒸発濃縮する。トリフルオロ酢酸を上記の
ようにしてイオン交換により除去し、そして式(III
)のCGRP IIを凍結により、得る。上記分析用H
PLCの保持時間:24分: FAR/MS:III”
3794(計算上の分子量3793.4) 、 Rf
(シリカゲル)=0.57 (n−ブタノール/ピ
リジン/氷酢酸/水(35:35: 7 :23) 、
Rf (セルロース)−0,64(n−ブタノール/
ピリジン/氷酢#/水(38:24: 8 :30)
、Rf (セルe)−ス) −0,55(n −ブタ
ノール/ピリジン/濃アンモニア/水(42:24:
4 :30) 。
ようにしてイオン交換により除去し、そして式(III
)のCGRP IIを凍結により、得る。上記分析用H
PLCの保持時間:24分: FAR/MS:III”
3794(計算上の分子量3793.4) 、 Rf
(シリカゲル)=0.57 (n−ブタノール/ピ
リジン/氷酢酸/水(35:35: 7 :23) 、
Rf (セルロース)−0,64(n−ブタノール/
ピリジン/氷酢#/水(38:24: 8 :30)
、Rf (セルe)−ス) −0,55(n −ブタ
ノール/ピリジン/濃アンモニア/水(42:24:
4 :30) 。
出発物質は次のようにして得られる。
殺1ユ虹」−
例11段階1.4に従って得られたペプチド樹脂を次の
ように処理して樹脂から保護されたペプチドを切り離し
、そして末端カルボキシ基をアミド化する。
ように処理して樹脂から保護されたペプチドを切り離し
、そして末端カルボキシ基をアミド化する。
325■のペプチド樹脂及びl Qmjのジメチルホル
ムアミドをオートクレーブに入れ、−70℃で6gのア
ンモニアを凝縮せしめ、そして全体を室温にて20時間
反応せしめる。アンモニアを蒸留除去した後、残りの懸
濁液に5 Qmjのジエチルエーテルを加える。0℃に
て2時間置いた後、沈澱を吸引濾過する。保護されたペ
プチド−アミドを樹脂から氷酢酸により抽出しく5m&
で5回)、酢酸を凍結乾燥により除去し、モして残渣を
20m1のメタノール/水(9: 1)中に懸濁する。
ムアミドをオートクレーブに入れ、−70℃で6gのア
ンモニアを凝縮せしめ、そして全体を室温にて20時間
反応せしめる。アンモニアを蒸留除去した後、残りの懸
濁液に5 Qmjのジエチルエーテルを加える。0℃に
て2時間置いた後、沈澱を吸引濾過する。保護されたペ
プチド−アミドを樹脂から氷酢酸により抽出しく5m&
で5回)、酢酸を凍結乾燥により除去し、モして残渣を
20m1のメタノール/水(9: 1)中に懸濁する。
保護されたペプチド−アミドを遠心分離し、洗浄し、そ
して乾燥して、その77■を得る。
して乾燥して、その77■を得る。
段1ユ虹」−
ジスルフィドに転換するため、14m1の氷酢酸/水(
4: 1)中段階10.1に従って得られた生成物69
弯の溶液を、室温にて攪拌しながら、34m1の氷酢酸
及び16mAの水中164gのヨウ素の溶液に、4分間
にわたり滴加する。さらに10分間装いた後、1.4
m j!の1M酢酸ナトリウム及び0.68m jの1
Mアスコルビン酸を添加することにより反応を停止する
。ビオゲルP2カラム(2,5X34国、氷酢酸/水(
6: 4)中〕で塩を分離する。濃縮した後、ペプチド
含有画分を凍結乾燥し、残渣を5 m lのメタノール
に懸濁し、そして不溶性の保護されたペプチド−アミド
を遠心分離及び乾燥により得る。
4: 1)中段階10.1に従って得られた生成物69
弯の溶液を、室温にて攪拌しながら、34m1の氷酢酸
及び16mAの水中164gのヨウ素の溶液に、4分間
にわたり滴加する。さらに10分間装いた後、1.4
m j!の1M酢酸ナトリウム及び0.68m jの1
Mアスコルビン酸を添加することにより反応を停止する
。ビオゲルP2カラム(2,5X34国、氷酢酸/水(
6: 4)中〕で塩を分離する。濃縮した後、ペプチド
含有画分を凍結乾燥し、残渣を5 m lのメタノール
に懸濁し、そして不溶性の保護されたペプチド−アミド
を遠心分離及び乾燥により得る。
■1上・
1gのH−Ala−Cys(MOB)−Asn(XAN
T)−Thr(BZL)−Ala−Thr(BZL)−
Cys(MOB)−Val−Thr (BZL) −H
is (TOS) −Arg(TOS)−Leu−Al
a−Gly−Leu−Leu−Ser(BZL)−Ar
g(丁OS)−Set(BZL)−Gly−Gly−M
et−Val−Lys(2CZ)−5et(BZL)−
Asn(XANT)−Phe−Val−Pro−Thr
(BZい−Asn (XANT) −Val −G I
y−5er (BZL) −Lys (2CZ) −A
la−Phe−MBHA樹脂、及び1mlのアニソ−
りを、10mj!の乾燥HFと共にテフロン装置中で0
℃にて1時間攪拌する。HFをN留除去しそして高真空
下で乾燥した後、残渣を10mj!のジエチルエーテル
で5回抽出する。ペプチドを樹脂から、脱気した0、
I N酢酸により抽出し、脱気した水により500m1
に稀釈し、そしてアンモニアによりpHを8.4に調整
する。室温にて一夜攪拌した後、遊離メルカプト基は検
出され得ない、溶液を高度に濃縮しそして凍結乾燥し、
そして例10に記載したようにして残渣を調製用HPL
Cにより精製する。得られる百分を、シリカゲル上n−
ブタノール/ピリジン/氷酢酸/水(35:35: 7
:23)系中で、薄層クロマトグラムでのそれらの純
度について試験する。−緒にした純粋な百分を真空蒸発
により濃縮し、そして残渣を水から凍結乾燥する0式(
III)のCGRP IIが得られる。Rf(セルロー
ス) −0,64(n−ブタノール/ピリジン/氷酢酸
/水(38:24:8 :30) 。
T)−Thr(BZL)−Ala−Thr(BZL)−
Cys(MOB)−Val−Thr (BZL) −H
is (TOS) −Arg(TOS)−Leu−Al
a−Gly−Leu−Leu−Ser(BZL)−Ar
g(丁OS)−Set(BZL)−Gly−Gly−M
et−Val−Lys(2CZ)−5et(BZL)−
Asn(XANT)−Phe−Val−Pro−Thr
(BZい−Asn (XANT) −Val −G I
y−5er (BZL) −Lys (2CZ) −A
la−Phe−MBHA樹脂、及び1mlのアニソ−
りを、10mj!の乾燥HFと共にテフロン装置中で0
℃にて1時間攪拌する。HFをN留除去しそして高真空
下で乾燥した後、残渣を10mj!のジエチルエーテル
で5回抽出する。ペプチドを樹脂から、脱気した0、
I N酢酸により抽出し、脱気した水により500m1
に稀釈し、そしてアンモニアによりpHを8.4に調整
する。室温にて一夜攪拌した後、遊離メルカプト基は検
出され得ない、溶液を高度に濃縮しそして凍結乾燥し、
そして例10に記載したようにして残渣を調製用HPL
Cにより精製する。得られる百分を、シリカゲル上n−
ブタノール/ピリジン/氷酢酸/水(35:35: 7
:23)系中で、薄層クロマトグラムでのそれらの純
度について試験する。−緒にした純粋な百分を真空蒸発
により濃縮し、そして残渣を水から凍結乾燥する0式(
III)のCGRP IIが得られる。Rf(セルロー
ス) −0,64(n−ブタノール/ピリジン/氷酢酸
/水(38:24:8 :30) 。
出発物質は次のようにして得られる。
ユm
1gのMBHA−ポリスチレンヒドロクロリド〔幾つか
のフェニル基がアミノ−(4−メチルフェニル)−メチ
ル置換基を担持している、ジビニルベンゼンにより架橋
されたポリスチレン樹脂〕を、例11段!1.2に記載
した機械中で、次のようにして処理する。
のフェニル基がアミノ−(4−メチルフェニル)−メチ
ル置換基を担持している、ジビニルベンゼンにより架橋
されたポリスチレン樹脂〕を、例11段!1.2に記載
した機械中で、次のようにして処理する。
3 X 0.5分間 脱気したジメチルアセタミド;3
×2分間 ジメチルアセタミド中10%ジイソプロピ
ルエチルアミン; s x o、 s分間 蒸留したジメチルアセタミド:
l X 120分間 カップリング= 455q(I
,7Mmol)のBoa−Phe+ 230*のヒドロ
キシベンゾトリアゾール、385■の ジシクロへキシルカルボジイミ ド(0,36m lのエチレンクロリ ド及び4 m Itのジメチルアセタ ミド中):室温にて120分間; IX5分間 10mlの無水酢酸/ピリジン/ジメチ
ルアセタミド(I0:10 :80); I X 0.5分間 脱気したジメチルアセタミ′ド;
IXI分間 インプロパツール; 2 X 0.5分間 エチレンクロリド:2 X 0.
5分間 ジメチルアセタミド;1×1分間 イソプロ
パツール; 3 X 0.5分間 エチレンクロリド/エタンジチオ
ール(99:l): 2×5分間、1xis分間 Boa基を除去するため、トリフ ルオロ酢酸/エチレンクロリド /エタンジチオール(50:49: 1);3 X 0
.5分間 エチレンクロリド/エタンジチオール(99
:l)。
×2分間 ジメチルアセタミド中10%ジイソプロピ
ルエチルアミン; s x o、 s分間 蒸留したジメチルアセタミド:
l X 120分間 カップリング= 455q(I
,7Mmol)のBoa−Phe+ 230*のヒドロ
キシベンゾトリアゾール、385■の ジシクロへキシルカルボジイミ ド(0,36m lのエチレンクロリ ド及び4 m Itのジメチルアセタ ミド中):室温にて120分間; IX5分間 10mlの無水酢酸/ピリジン/ジメチ
ルアセタミド(I0:10 :80); I X 0.5分間 脱気したジメチルアセタミ′ド;
IXI分間 インプロパツール; 2 X 0.5分間 エチレンクロリド:2 X 0.
5分間 ジメチルアセタミド;1×1分間 イソプロ
パツール; 3 X 0.5分間 エチレンクロリド/エタンジチオ
ール(99:l): 2×5分間、1xis分間 Boa基を除去するため、トリフ ルオロ酢酸/エチレンクロリド /エタンジチオール(50:49: 1);3 X 0
.5分間 エチレンクロリド/エタンジチオール(99
:l)。
このサイクルを最初から繰り返し始める。
次のアミノ酸を次々と縮合せしめる。
Boc−Ala、 Boc−Lys (2CZ) *
Boc−5er (tlZL) 、 Boc−Gly。
Boc−5er (tlZL) 、 Boc−Gly。
Boc−Val、Boc−Asn(XANT)+ Bo
a−丁hr(BZL)、Boc−Pro。
a−丁hr(BZL)、Boc−Pro。
Boc−Val + Boa−Phe、 Boc−As
n (XANT)、Boc−5et(BZL)。
n (XANT)、Boc−5et(BZL)。
Boc−Lys (2CZ) 、 Boa−Val 、
Boc−Me t、 Boc−G Iy、 Boc−
Gly。
Boc−Me t、 Boc−G Iy、 Boc−
Gly。
Boc−Ser (BZL) 、 Boc−Arg (
TO5) 、 Boc−Ser (BZL) *Boc
−Leu、 Boc−Leu、 Boc−Gly、 B
oc−^1a、Boc’−Leu。
TO5) 、 Boc−Ser (BZL) *Boc
−Leu、 Boc−Leu、 Boc−Gly、 B
oc−^1a、Boc’−Leu。
Boc−Arg(↑O5)、Boc−His(丁O5)
、Boc−Thr(BZL)。
、Boc−Thr(BZL)。
Boc−Val、Boc−Cys(MOB)、Boc−
丁hr(BZL)、Boc−A1a+Boc−Thr
(BZL) 、 Boc−Asn (XANT) 、
Boc−Lys (MOB)及びBoc−AIa m カップリング反応の完了をカイゼル試験を用いて定性的
に試験する。試験が陽性であればカンプリングを反復す
る。最後のアラニンから8oc基を除去した後、高真空
下で樹脂を乾燥する。
丁hr(BZL)、Boc−A1a+Boc−Thr
(BZL) 、 Boc−Asn (XANT) 、
Boc−Lys (MOB)及びBoc−AIa m カップリング反応の完了をカイゼル試験を用いて定性的
に試験する。試験が陽性であればカンプリングを反復す
る。最後のアラニンから8oc基を除去した後、高真空
下で樹脂を乾燥する。
以下余日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、90個以下のアミノ酸残基を有する大きなペプチド
の部分配列として、又はそれのみとして、次の式( I
)、 【アミノ酸配列があります】 ( I ) で示されるアミノ酸配列(式中、システイン残基は分子
内−又は分子間−ジスルフィド橋を形成することができ
る)を有するペプチド、並びにアミド化された末端カル
ボキシ基及び/又はアシル化された末端アミノ基を有す
るそれらの誘導体、並びにこれらの塩。 2、72個以下のアミノ酸残基を有する特許請求の範囲
第1項記載のペプチド、並びにC−末端カルバモイル基
及び/又はN−末端アセチルアミノ基を有するそれらの
誘導体、並びにそれらの塩。 3、次の式(III)、 【アミノ酸配列があります】 (III) で表わされる特許請求の範囲第2項記載のペプチドアミ
ド、及びその塩。 4、次の式(XV)、 【アミノ酸配列があります】 (XV) で表わされる特許請求の範囲第2項記載のペプチド、及
びその塩。 5、次の式(XIV)、 【アミノ酸配列があります】 (XIX) で表わされる特許請求の範囲第2項記載のペプチド、及
びその塩。 6、特許請求の範囲第1項〜第5項に記載の合成的に又
は遺伝子的に製造された化合物及びその塩。 7、50%以上の純度を有する特許請求の範囲第1項〜
第5項のいずれか1項に記載の化合物及びその塩。 8、特許請求の範囲第1項〜第7項のいずれか1項に記
載の医薬として許容される塩。 9、ヒト又は動物の体の医療的処置のための方法におい
て使用するための、特許請求の範囲第1項〜第3項、第
6項、及び第7項のいずれか1項に記載のペプチドアミ
ド、又はその医薬として許容される塩。 10、90個以下のアミノ酸残基を有する大きなペプチ
ドの部分配列として、又はそれのみとして、次の式(
I )、 【アミノ酸配列があります】 ( I ) で示されるアミノ酸配列(式中、システイン残基は分子
内−又は分子間−ジスルフィド橋を形成することができ
る)を有するペプチド、又はアミド化された末端カルボ
キシ及び/又はアシル化された末端アミノ酸基を有する
それらの誘導体、又はこれらの塩を、95%以上の医薬
担体と共に含んで成る医薬製剤。 11、冠循環疾患の治療のための、特許請求の範囲第1
項〜第3項、第6項及び第7項のいずれか1項に記載の
ペプチドアミド、又はその医薬として許容される塩の使
用。 12、冠循環疾患の治療において使用するための医薬製
剤の製造のための、特許請求の範囲第1項〜第3項、第
6項及び第7項のいずれか1項に記載のペプチドアミド
、又はその医薬として許容される塩の使用。 13、90個以下のアミノ酸残基を有する大きなペプチ
ドの部分配列として、又はそれのみとして、次の式(
I )、 【アミノ酸配列があります】 ( I ) で示されるアミノ酸配列(式中、システイン残基は分子
内−又は分子間−ジスルフィド橋を形成することができ
る)を有するペプチド、並びにアミド化された末端カル
ボキシ基及び/又はアシル化された末端アミノ基を有す
るそれらの誘導体、並びにこれらの塩の製造方法であっ
て、 (a)遊離カルボキシル基を有する前記化合物の断片又
はその反応性カルボン酸誘導体と、遊離アミノ基を有す
る補完的断片又はその反応性誘導体とを反応せしめる(
前記の断片中の遊離官能基は、反応に関与する2個の基
を除き、所望により保護された形で存在する)ことによ
り前記化合物中に存在するアミド結合を形成せしめ、そ
して存在するかもしれない保護基を除去し;あるいは、 (b)分子内−又は分子間ジスルフィド橋を有する前記
化合物のいずれかを製造するために、システイン残基の
メルカプト基が遊離の形で存在するか、又はシステイン
残基のメルカプト基が反応条件下で除去される保護基に
より保護されている前記化合物のいずれかを適当な酸化
剤により酸化し;あるいは、 (c)少なくとも1個の官能基が保護された形で存在す
る前記のペプチド、ペプチド−アミド、又はそれらのN
−アシル化誘導体において、存在する保護基を除去し;
あるいは、 (d)前記のペプチドを製造するために、目的アミノ酸
配列をコードしそして発現制御配列により制御されるD
NA配列を含有する発現ベクターにより形質転換された
宿主細胞を資化性の炭素源及び窒素源を含有する液体栄
養培地中で培養し、生成物を所望により宿主細胞から遊
離せしめそして単離し、そして必要であれば、得られる
かもしれない2量体又は多量体をジスルフィド結合を開
裂せしめるのに適当な還元剤と反応せしめ、そして必要
であれば、得られる還元された生成物をジスルフィド結
合の新たな形成に適当な酸化剤で処理し;あるいは、 (e)前記のペプチド−アミドのいずれかを製造するた
めに、目的ペプチド−アミドのアミノ酸配列に加えて、
該目的ペプチド−アミドの末端アミド基のNH_2基に
酵素的に分解され得るか又は適当な酵素の存在下でアン
モニアにより置換され得るアミノ酸AS^■をC−末端
に有するペプチドを、場合によってはアンモニアの存在
下で、適当な酵素により処理し; そして処理により、前記変法(a)〜(e)いずれかを
実施した後で、得られた塩を遊離化合物に、又は得られ
た遊離化合物をその塩に転換する、ことを特徴とする方
法。 14、単鎖中に290以下のデオキシヌクレオチドを有
する大配列中の部分配列として、次の式(IV)、【遺伝
子配列があります】 (IV) (配列中、5′−末端から始まるコード鎖のデオキシヌ
クレオチド配列、及びその下方に各トリプレットがコー
ドするアミノ酸が示してあり;そして、 Aはアデノシルであり、 Tはチミジルであり、 Gはグアノシルであり、 Cはシチジルであり、 EはA、T、C、又はGであり、 NがCである場合、KはA、T、C、又はGであり;あ
るいは、 NがAである場合、KはA、又はGであり、LはT、又
はCであり、 MはA、又はGであり、 NはA、又はCであり、 QはT、又はAであり、 R及びSに関しては、QがTである場合、RはCであり
、そしてSはA、T、C、又はGであり;あるいは、 QがAである場合、RはGであり、そしてSはT、又は
Cであり、 XはA、T、C、又はGであり、 YはT、又はCであり、そして、 YがCである場合、ZはA、T、C、又はGであり、あ
るいは、YがTである場合、ZはA、又はGであり; カッコの前にある“d”は、カッコ内に示されたヌクレ
オチドが2−デオキシ−リボヌクレオシドであることを
意味する、) で表わされる配列を含有するDNA配列。 15、コード鎖中に150以下のデオキシヌクレオチド
を有し、そして次の式(IVb) 【遺伝子配列があります】 (IVb) (式中、5′−末端から始まるコード鎖のみ、及び一層
よく理解できるように各トリプレットがコードするアミ
ノ酸が示されている) で表わされるDNA配列を含有する特許請求の範囲第1
4項記載のDNA配列。 16、単鎖中に290以下のデオキシヌクレオチドを有
する大配列中の部分配列として、次の配列(IV)、 【遺伝子配列があります】 (IV) (配列中、5′−末端から始まるコード鎖のデオキシヌ
クレオチド配列、及びその下方に各トリプレットがコー
ドするアミノ酸が示してあり;そして、 Aはアデノシルであり、 Tはチミジルであり、 Gはグアノシルであり、 Cはシチジルであり、 EはA、T、C、又はGであり、 NがCである場合、KはA、T、C、又はGであり;あ
るいは、 NがAである場合、KはA、又はGであり、LはT、又
はCであり、 MはA、又はGであり、 NはA、又はCであり、 QはT、又はAであり、 R及びSに関しては、QがTである場合、RはCであり
、そしてSはA、T、C、又はGであり;あるいは、 QがAである場合、RはGであり、そしてSはT、又は
Cであり、 XはA、T、C、又はGであり、 YはT、又はCであり、そして、 YがCである場合、ZはA、T、C、又はGであり、あ
るいは、YがTである場合、ZはA、又はGであり; カッコの前にある“d”は、カッコ内に示されたヌクレ
オチドが2−デオキシ−リボヌクレオシドであることを
意味する、) で表わされる配列を含有するDNA配列を含有し、そし
て90個以下のアミノ酸残基を有する大きなペプチドの
部分配列として、又はそれのみとして、次の式( I )
、 【アミノ酸配列があります】 ( I ) で示されるアミノ酸配列(式中、システイン残基は分子
内−又は分子間−ジスルフィド橋を形成することができ
る)を有するペプチド、並びにアミド化された末端カル
ボキシ基及び/又はアシル化された末端アミノ基を有す
るそれらの誘導体、並びにこれらの塩を製造することが
できる微生物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CH188/85-7 | 1985-01-16 | ||
CH18885 | 1985-01-16 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61172899A true JPS61172899A (ja) | 1986-08-04 |
JPH0780908B2 JPH0780908B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=4181264
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61006159A Expired - Lifetime JPH0780908B2 (ja) | 1985-01-16 | 1986-01-14 | ペプチド及びその製造方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4720483A (ja) |
EP (1) | EP0188400B1 (ja) |
JP (1) | JPH0780908B2 (ja) |
AT (1) | ATE78040T1 (ja) |
CA (1) | CA1339365C (ja) |
DE (1) | DE3685885D1 (ja) |
DK (1) | DK17986A (ja) |
ES (2) | ES8707974A1 (ja) |
FI (1) | FI86547C (ja) |
GR (1) | GR860081B (ja) |
IE (1) | IE58190B1 (ja) |
PT (1) | PT81837B (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008149814A (ja) * | 2006-12-15 | 2008-07-03 | Yamaha Marine Co Ltd | 船舶 |
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DE3888357T2 (de) * | 1987-06-22 | 1994-09-15 | Merck & Co Inc | Cyclosporin-Derivate, die eine modifizierte Aminosäure auf Stellung 8 tragen. |
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