JP2009124946A - Ｐｑｑｇｄｈ制御アプタマー及びその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｂ／Ｆ分離の操作をすることなく、疾病マーカーを簡便・迅速・高感度に検出するための手段を提供する。
【解決手段】ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ(ＰＱＱＧＤＨ)に結合しその酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子、該アプタマー分子の二次構造に基づいて構成される酵素制御アプタマー部位と、標的物質を認識して結合する認識アプタマー部位とを含むポリヌクレオチドであって、標的物質の認識アプタマー部位への結合により、酵素制御アプタマー部位がＰＱＱＧＤＨの酵素活性を変化させる能力が変化するポリヌクレオチド、並びに該ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの酵素制御アプタマー部位に結合したＰＱＱＧＤＨとを含む測定試薬。
【選択図】図１１

Description

本発明は、ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼに結合してその酵素活性を変化させることができるアプタマー分子及びその用途に関する。

様々な疾病の早期診断・早期治療を行う上で、疾病マーカーとなるペプチドや蛋白質の検出は極めて重要である。現在、最も一般的にこのような疾病マーカーを検出する技術として用いられているのが、抗体を利用したＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）である。この方法では、標的分子に結合する抗体を担体上に固定化し、標的分子と標的分子の異なる箇所に結合する二つ目の抗体を添加して担体固定化抗体にトラップさせる検出方法である。トラップされなかった抗体の分離操作は必要であるが、比較的高感度、簡便に検出することが可能な系である。

しかしながら、ELISAには次のような問題点がある。まず、一点目として、抗体は標的と結合した際に信号発信を行わないので、標的分子の異なる箇所に結合する二種類の抗体が必要となる点である。一つの標的分子の異なる箇所に結合する二種類の抗体を作製することは難しく、また抗体はそもそも作製に時間と労力がかかり、値段も高価である。二点目としては、一つの抗体に酵素などの分子を修飾することで信号発信を行うので、標的分子に結合しなかった抗体を除去する、Ｂ／Ｆ分離の操作が必須な点である。

疾病を早期治療するためには、早期診断が必須であり、その為には採取した血液をその場で測定することが可能な簡便・迅速な検出システムが求められる。しかし、ELISAでは分離操作が必要であるため、その分時間がかかり、迅速な系とは言えない。

一方、任意の分子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドであるアプタマーが知られている。アプタマーは、市販の核酸合成機を用いて化学的に全合成できるので、特異抗体に比べてはるかに安価であり、修飾が容易であるため、センシング素子としての応用が期待されている。所望の標的分子と特異的に結合するアプタマーは、SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)と呼ばれる方法により作出可能である(非特許文献１)。この方法では、標的分子を担体に固定化し、これに膨大な種類のランダムな塩基配列を有する核酸から成る核酸ライブラリを添加し、標的分子に結合する核酸を回収し、これをPCRにより増幅して再び標的分子を固定化した担体に添加する。この工程を１０回程度繰り返すことにより、標的分子に対して結合力の高いアプタマーを濃縮し、その塩基配列を決定して、標的分子を認識するアプタマーを取得する。なお、上記核酸ライブラリーは、核酸の自動化学合成装置により、ランダムにヌクレオチドを結合していくことにより容易に調製可能である。このように、ランダムな塩基配列を有する核酸ライブラリーを用いた、偶然を積極的に利用する方法により、任意の標的物質と特異的に結合するアプタマーを作出できる。

本願発明者らは、Ｂ／Ｆ分離の操作が不要な疾病マーカー検出技術として、特定の分子の検出を行う際に、その分子を認識するアプタマーと酵素制御アプタマー(酵素活性に変化を及ぼすアプタマー)を連結することで、アプタマーを酵素のサブユニットとして用いたセンシング技術であるＡＥＳ（Aptameric Enzyme Subunit)を構築している（特許文献１）。検出原理は、特定の分子が存在した場合、その分子に対するアプタマーが結合すると、連結されている酵素制御アプタマーの構造に影響を及ぼし、その結果酵素活性に変化が生じるので、その変化を測定するというものである。この検出法の利点として、ＥＬＩＳＡによる検出と異なり、標的分子の結合を直接、酵素活性のシグナルとして検出するため、Ｂ／Ｆ分離を必要としない、迅速で簡便な検出が可能である点があげられる。また、一度、酵素活性を阻害するアプタマーを獲得してしまえば、検出したい標的分子に結合するアプタマーは１種類でよく、様々な標的分子の検出に用いることも可能である。さらに、アプタマーは抗体に比べ、作成が簡単で安価である。

ただし、特許文献１に記載のＡＥＳは、分子認識アプタマーとしてアデノシンアプタマーを、酵素制御アプタマーとしてトロンビンアプタマーを用いたものであって、アデノシンをフィブリン凝固時間の変化により検出するものである。かかる検出方法は、測定に比較的時間がかかるため迅速性に欠けるという欠点がある。

ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ(ＰＱＱＧＤＨ)は、溶存酸素の影響を受けず、高い触媒活性を示すことから、市販の血糖値測定用グルコースセンサーに使用されている酵素である。本酵素の利点は、一点目として、およそ５０００Ｕ／ｍｇと高い触媒活性を有するためシグナル増幅が期待できる点、二点目として、血糖値測定に用いられているグルコースセンサーのセンシングシステムを適用できる点である。このような利点より、既存の酵素の中ではセンシング素子として非常に有効な酵素であると考えられる。ＡＥＳにＰＱＱＧＤＨを利用することができれば、さらに迅速な検出方法を提供することができる。

しかしながら、アプタマーの創製方法は、上記した通り偶然を積極的に利用する方法であるので、標的物質に対して高い結合能を有するアプタマーが得られるかどうかは、実際に膨大な実験を行なってみなければわからない。特に、ＡＥＳを構築する場合、酵素制御アプタマーとしては、センシング素子として利用する酵素との結合能を有し、かつ、分子認識アプタマーと対象分子との結合により、酵素活性に変化を生じさせることのできるアプタマーを創製しなければならないため、ＡＥＳの酵素制御アプタマーに利用し得るアプタマーを取得することは非常に困難である。

国際公開WO2005/049826号公報 Tuerk, C. and Gold L. (1990), Science, 249, 505-510

従って、本発明の目的は、Ｂ／Ｆ分離の操作をすることなく、疾病マーカーを簡便・迅速・高感度に検出するための手段を提供することにある。

本願発明者らは、ＰＱＱＧＤＨに結合し、その活性に影響を及ぼすアプタマーの探索をするに当たり、ランダムライブラリーからのアプタマーのスクリーニング工程において、(1)ＰＱＱＧＤＨ固定化担体として負に帯電している磁性ビーズを用いる手法、(2)担体としてニトロセルロース膜を用い、ＰＱＱＧＤＨと共に腫瘍マーカータンパク質を担体に固定化して競合させる手法の２種類の探索方法を用いて、ＰＱＱＧＤＨに対するアプタマーの探索を行うことにより、ＰＱＱＧＤＨへの高い結合能を有するアプタマーを取得し、さらに、該アプタマーの中から、ＰＱＱＧＤＨの活性を上昇又は阻害することができるアプタマーを見出し、本願発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下の(a)ないし(c)のいずれかの塩基配列から成るアプタマー分子であって、ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）に結合し、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子を提供する；(a) 配列表の配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列、(b) (a)の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が置換し、欠失し及び／又は挿入された塩基配列、(c) (a)又は(b)の塩基配列を部分配列として含む塩基配列。また、本発明は、配列番号２、３、１１、１２、１６、１８、２０、２４及び２９のいずれかに示される塩基配列から成りＰＱＱＧＤＨに結合する能力を有するアプタマー分子から選択される同一又は異なる２つのアプタマー分子が２つ連結された構造を有するアプタマー分子であって、ＰＱＱＧＤＨに結合し、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のアプタマー分子の二次構造に基づいて構成される酵素制御アプタマー部位と、標的物質を認識して結合する認識アプタマー部位とを含むポリヌクレオチドであって、標的物質の前記認識アプタマー部位への結合により、前記酵素制御アプタマー部位がＰＱＱＧＤＨの酵素活性を変化させる能力が変化するポリヌクレオチドを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの前記酵素制御アプタマー部位に結合したＰＱＱＧＤＨとを含む測定試薬を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の測定試薬を、標的物質を含み得る検体と接触させ、次いで、前記酵素制御アプタマー部位に結合した前記ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を測定し、該酵素活性を指標として検体中の標的物質を測定することを含む、標的物質の測定方法を提供する。

本発明により、ＰＱＱＧＤＨへの高い結合能を有し、且つ、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を変化させることができるアプタマーが初めて提供された。さらに、該アプタマー構造を利用した標的物質測定システムも構築された。本発明のアプタマーと、疾病マーカー等の所望の標的物質を認識する他のアプタマーとを組み合わせれば、ＰＱＱＧＤＨの高い触媒活性を利用して、高感度に標的物質を測定するシステムを構築することができる。アプタマーはDNA合成機を用いて化学的に合成することができるため、抗体に比べると作製に労力がかからず、費用も安価であり、測定キットそのものの価格を下げることが可能である。迅速・簡便・安価に疾病マーカーの検出を行うことができる本検出システムは、疾病の早期診断への極めて大きな貢献が期待できる。また、ＰＱＱＧＤＨは市販のグルコースセンサーにも使用されている酵素であり、これらのグルコースセンサーの検出システムをそのまま応用することが可能であるから、実用化の面でも極めて有利である。

本発明のアプタマー分子は、ＰＱＱＧＤＨに結合し、その酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子である。該アプタマー分子は、一本鎖のポリヌクレオチドから成るものであり、下記いずれかの塩基配列から成る。
(a) 配列表の配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列。
(b) (a)の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が置換し、欠失し及び／又は挿入された塩基配列。
(c) (a)又は(b)の塩基配列を部分配列として含む塩基配列。

ポリヌクレオチドは、DNAでもＲＮＡでもよく、またＰＮＡ等の人工核酸でもよいが、安定性の観点からDNAが好ましい。

「酵素活性を変化させる」とは、本発明のアプタマー分子が結合していない状態のＰＱＱＧＤＨと比較して、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性が上昇又は低下することをいう。以下、本明細書において、このような酵素活性を変化させる能力のことを「酵素制御能」といい、酵素制御能を有するアプタマーを「酵素制御アプタマー」という。

本発明のアプタマーの結合能は、ＰＱＱＧＤＨへの結合能がある限り、ＰＱＱＧＤＨ以外の他のタンパク質にも結合し得るものであってよいが、ＰＱＱＧＤＨへの特異性及び親和性が高く、他のタンパク質への結合が全くないかあるとしても相対的に無視できるほど少量しか結合しないことが好ましい。

配列表の配列番号２〜３３にそれぞれ示される塩基配列は、下記実施例に記載される30merのランダム領域を含むssDNAライブラリー（配列番号１）のスクリーニングにより、ＰＱＱＧＤＨ制御アプタマーの候補として取得されたssDNAの塩基配列である。これらのうち、配列番号２、３及び２９は、ＰＱＱＧＤＨへの結合能を有し、かつ、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させる能力を有するアプタマー（それぞれMag1、Mag2及びPGa9）の塩基配列である（実施例１−４及び２−６参照）。これらのアプタマーが所定の条件下（フォールディング条件下）で形成する二次構造は、コンピューターを用いた常法により容易に決定することができる。最近接塩基対法を用いた周知の核酸構造予測プログラムであるm-fold（商品名、Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003)、The Bioinformatics Center at Rensselaer and Wadsworth のウェブサイトからダウンロード可能）を用いて決定した、Mag1、Mag2及びPGa9の二次構造を、それぞれ図５及び図８(C)中に示す。なお、「フォールディング条件」とは、１分子のアプタマーの一部の領域同士が分子内で塩基対合して二本鎖から成るステム部を形成する条件であり、公知の通常のアプタマーの使用条件でもある。通常、室温下で、所定の塩濃度を有し、カルシウムキレート剤、さらに所望により界面活性剤を含む水系緩衝液中である。例えば、下記実施例で採用した、10mM MOPS及び1mM CaCl₂を含む水溶液や、20mM Tris-HCl及び150mM NaClを含む水溶液中で、室温下にてフォールディングを行なうことができる。なお、本明細書において、「フォールディングする」という語は、アプタマー分子の分子内における塩基対合によりステム部を形成することのみならず、複数のポリヌクレオチド分子の分子間における塩基対合も包含する意味で用いる。

酵素制御アプタマーは、その二次構造においてステム部及びループ部の位置関係及びサイズが等しいものであれば、同様のアプタマー活性（結合能及び酵素制御能）を発揮し得る。例えば、末端から少数の塩基を欠失させても、もとのアプタマー活性を維持し得る。ステム部を形成する塩基については、対合する塩基の位置を相互に入れ替えた塩基配列としてもよいし、また、対合する塩基対を例えばa-t対からg-c対に置き換えてもよい。具体的には、例えば、配列番号２９に示す塩基配列から成るアプタマーPGa9では、4ntのcと20ntのgが対合してステム部を構成するが、4ntをgとして20ntをcにしてもよいし、また、4ntと20ntのg-c対をa-t対に変えてもよい。また、ループ部を形成する塩基については、その位置に同じサイズのループが形成される限り、他の塩基配列を採用してもよい。また、下記実施例にもある通り、標的タンパク質との結合に重要ではないループ構造であれば、該ループ構造内に任意の塩基配列を付加させても、アプタマー活性を維持できる。下記実施例では、アプタマーをループ部で分断し、互いに相補な塩基配列をその分断部位に連結させているが、このような分割アプタマーでもアプタマー活性が維持されているため、互いに相補な領域を持つ塩基配列をループ構造内に挿入させた場合であっても、同様にアプタマー活性が維持されると考えられる。従って、配列番号２、３及び２９の塩基配列のうち、１ないし数個（好ましくは１又は２個）の塩基が上記に例示したように置換し、欠失し及び／又は挿入された塩基配列から成るアプタマーも、もとの塩基配列から成るアプタマーと同様のアプタマー活性を有し得るので、本発明の範囲に包含される。

また、アプタマーの一端又は両端に任意の塩基配列を付加させても、アプタマー領域においてステム部及びループ部の位置関係及びサイズが等しい限り、同様のアプタマー活性を有し得る。従って、配列番号２、３又は２９の塩基配列を部分配列として含む塩基配列から成るアプタマーも、本発明の範囲に包含される。任意の付加配列のサイズは特に限定されないが、あまりに長いとアプタマー合成の手間とコストがかかる。従って、付加配列のサイズは、通常、合計で40塩基程度以下、好ましくは10塩基程度以下、より好ましくは１〜２塩基程度である。ただし、付加配列が他のアプタマー配列である場合にはこの限りではなく、付加されるアプタマー配列の鎖長に応じてサイズが定まる。

なお、本発明において、「Ｘnt」（Ｘは数字）は、その配列における、5'末端からＸ番目の塩基を示す。また、「mer」はヌクレオチド数を示す。

また、本発明は、配列番号２、３、１１、１２、１６、１８、２０、２４及び２９のいずれかに示される塩基配列から成りＰＱＱＧＤＨに結合する能力を有するアプタマー分子（以下「モノマーアプタマー」ということがある）から選択される同一又は異なる２つのアプタマー分子が２つ連結された構造を有するアプタマー分子であって、ＰＱＱＧＤＨに結合し、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子（以下「ダイマーアプタマー」ということがある）を提供する。ＰＱＱＧＤＨはダイマー構造の酵素であるため、上記モノマーアプタマーの結合部位はＰＱＱＧＤＨ分子上に２箇所存在する。従って、アプタマーをダイマー化することにより、アプタマー１分子でＰＱＱＧＤＨ分子上の２箇所の結合部位に結合することができるようになるため、モノマーアプタマーよりも結合能を高めることができ、ひいては、モノマー状態では発揮できなかった酵素制御能を発揮させることができるようになる。例えば、下記実施例に具体的に記載される通り、モノマーアプタマーPGa4（配列番号２４）はスクリーニング前のランダムライブラリーと同程度の酵素活性上昇作用を示すのみで、ＰＱＱＧＤＨに対する酵素制御能は有さないといえるが、これをダイマー化することにより（D-PGa4、配列番号３４、図８(C)）、結合能が高まり、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を半分程度にまで低下させることができるようになる（下記実施例２−５及び２−６）。

連結するモノマーアプタマーは同一でも異なっていてもよい。モノマーアプタマーがＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させるものである場合には、かかるモノマーをダイマー化することにより、酵素活性を上昇させる割合がさらに高まると考えられる。連結する際には、必要に応じアデニン又はチミンのいずれかのみから成るリンカーを介して連結することができる。すなわち、5'上流側のモノマーアプタマーの3'末端領域及び／又は3'下流側のモノマーアプタマーの5'末端領域にステムループ構造が存在する場合には、直接連結させるとステムループ構造が望ましく形成されないおそれがあるため、かかる場合にはリンカーを介して連結させることが好ましい。リンカーの鎖長は、ダイマーアプタマー中の各モノマー領域が所期の二次構造をとるために十分なだけのスペースを確保できる鎖長であればよく、特に限定されないが、通常は1mer〜20mer程度、好ましくは5mer〜15mer程度である。

本発明はまた、上記した本発明のＰＱＱＧＤＨ制御アプタマー分子の二次構造に基づいて構成される酵素制御アプタマー部位と、標的物質を認識して結合する認識アプタマー部位とを含むポリヌクレオチド（以下「酵素制御ポリヌクレオチド」と呼ぶ）を提供する。酵素制御ポリヌクレオチドは、１分子又は２分子のポリヌクレオチド鎖から成り（以下、1分子からなるものを「1分子性酵素制御ポリヌクレオチド」、2分子からなるものを「２分子性酵素制御ポリヌクレオチド」ということがある）、標的物質が認識アプタマー部位へ結合することにより、酵素制御アプタマー部位がＰＱＱＧＤＨの酵素活性を変化させる能力が変化することを特徴とする。酵素制御アプタマー部位が有する酵素活性を変化させる能力の変化は、該部位に結合したＰＱＱＧＤＨの活性の変化を調べることで知ることができる。酵素制御アプタマー部位に結合しているＰＱＱＧＤＨは、該部位の作用により、酵素活性が上昇又は低下した状態にあるが、この状態で、認識アプタマー部位に標的物質が結合すると、酵素活性がさらに変化する（すなわち、酵素制御アプタマー部位が有する「酵素活性を変化させる能力」が変化する）。通常は、酵素制御アプタマー部位に結合しているＰＱＱＧＤＨの酵素活性は、活性が上昇又は低下した状態から、もとの活性に戻る（すなわち、酵素制御アプタマー部位が有する「酵素活性を変化させる能力」が低下する）。この、酵素活性を変化させる能力の低下の原理は、例えば、図１１に示されるように、認識アプタマー部位への標的物質の結合により、酵素制御ポリヌクレオチドの立体構造が変化し、制御アプタマー部位からＰＱＱＧＤＨが離脱することによるものと考えられるが、これに限定されない。

具体的には、例えば、酵素制御アプタマー部位がＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させる能力を有する場合、標的物質が認識アプタマー部位に結合することにより、通常、酵素活性を上昇させる能力が低下し、制御アプタマー部位に結合しているＰＱＱＧＤＨの酵素活性は、認識アプタマー部位への標的物質の結合により低下することになる。また、酵素制御アプタマー部位がＰＱＱＧＤＨの酵素活性を低下させる能力を有する場合、標的物質が認識アプタマー部位に結合することにより、通常、酵素活性を低下させる能力が低下し、制御アプタマー部位に結合しているＰＱＱＧＤＨの酵素活性は、認識アプタマー部位への標的物質の結合により上昇することになる。従って、上記本発明のポリヌクレオチドの酵素制御アプタマー部位にＰＱＱＧＤＨを結合させて調製した酵素−ポリヌクレオチド複合体を用いれば、ＰＱＱＧＤＨ活性の変化を指標として、検体中の標的物質の測定を行なうことができる。すなわち、本発明は、上記した本発明の酵素制御ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの酵素制御アプタマー部位に結合したＰＱＱＧＤＨとを含む標的物質測定試薬をも提供する。なお、本発明において、「測定」には検出、定量及び半定量が包含される。

「アプタマー分子の二次構造に基づいて構成される」とは、上記酵素制御ポリヌクレオチド中で酵素制御アプタマー部位がとる二次構造が、１分子で構成される本発明のアプタマー分子がとる二次構造と近似するようにして構成されることをいう。従って、酵素制御アプタマー部位を構成する領域は、上記酵素制御ポリヌクレオチドを構成するポリヌクレオチド鎖中において、必ずしも連続する１つの領域として存在する必要はなく、１分子又は２分子のポリヌクレオチド鎖中に分断して存在するものであってもよい。分断して存在していても、ポリヌクレオチド鎖をフォールディング条件下でハイブリダイズさせ、分子内及び／又は分子間の適当な部位において塩基対を形成させることにより、それらの領域が組み合わされて、もとにしたアプタマー分子の二次構造と近似した二次構造を形成することが可能な限り、酵素制御アプタマー部位の構成態様として許容される。具体的には、例えば下記実施例に記載されるように、Mag2（配列番号３）の塩基配列を1nt〜31ntと32nt〜65ntの2つの領域に分断し、これらの断片を2分子のポリヌクレオチド鎖に分けて含ませた構成（配列番号３６及び３７）としてもよい。このように構成しても、酵素制御ポリヌクレオチド中で望ましく酵素制御能を発揮できる。

本発明のアプタマー分子の塩基配列を分断する位置としては、ループ構造内のいずれかの部位が好ましい。ループ構造内で分断すれば、分断後の断片をそれぞれ含む２分子のポリヌクレオチド鎖を調製しても、これらのポリヌクレオチド鎖をフォールディング条件下で塩基対合させることにより、ステム部分が望ましく形成され、もとにしたアプタマー分子の二次構造を再現できる（もとにしたアプタマー分子の二次構造と近似した二次構造を形成する）可能性が高く、ひいては酵素制御アプタマー部位がもとのアプタマー分子の有する結合能及び酵素制御能を維持する可能性が高くなる（以下、このような、もとの1分子のアプタマーと近似した二次構造をとり得る、2分子のポリヌクレオチド鎖から成るポリヌクレオチドを「分割アプタマー」と呼ぶことがある)。例えば、上述した通り、実施例ではMag2（配列番号３）を31ntと32ntの間で分断しているが、Mag2のループ構造を形成する領域は25nt〜39ntの領域であり、これはループ構造内での分断である。このようにして構築した2分子性の酵素制御ポリヌクレオチドは、後述するとおり、認識アプタマー部位への標的物質の結合により、酵素制御アプタマー部位がＰＱＱＧＤＨの酵素活性を変化させる能力を好ましく低下させることができる。なお、アプタマー分子がとる二次構造は、上述の通りコンピューターを用いた常法により容易に決定することができる（図５、図８参照）。

上記認識アプタマー部位は、標的物質に対し特異的に結合する能力を有するアプタマー部位である。認識アプタマー部位として利用できるアプタマーは、ピロロキノリンキノン及びＰＱＱＧＤＨ以外の物質を標的とする限り、特に限定されず、公知の種々のアプタマーを利用することができるし、所望の標的物質に対して新規に創製したアプタマーを利用することもできる。ただし、複数のステムを持つ複雑な構造のアプタマーについては本発明の酵素制御ポリヌクレオチドの調製が困難な場合があるので、ステム部の少ない（好ましくは１〜３箇所程度）二次構造を有するアプタマーがより好ましい。具体的には、例えば下記実施例に記載のアデノシンアプタマー（配列番号３５）等を利用することができる。標的物質は、それに対するアプタマーが調製できるものであれば特に限定されず、ピロロキノリンキノン及びＰＱＱＧＤＨ以外の物質であればいかなるものであってもよい。

酵素制御ポリヌクレオチド分子中において、認識アプタマー部位を設ける位置は特に限定されず、酵素制御アプタマー構造の末端部であってもよく、また、酵素制御アプタマー部位のループ構造に付加するようにして設けてもよい。例えば、ループ構造内で分断した分割アプタマーの、一方のポリヌクレオチド鎖の分断部位側末端に認識アプタマーを連結させることにより、酵素制御アプタマーのループ構造部に認識アプタマー部位を設定した、2分子性の酵素制御ポリヌクレオチドを得ることができる。この際、他方の断片の分断部位側末端に、該認識アプタマー配列中の少なくとも一部の領域と相補的な配列から成る断片を連結させると、認識アプタマーと該相補配列断片とがハイブリダイズして塩基対を形成するので、酵素制御アプタマー部位の二次構造を安定させることができ好ましい。該相補配列断片のサイズは、採用する認識アプタマーのサイズに応じて、該認識アプタマーの全長と同一以下の任意のサイズを選択することができ、特に限定されないが、通常3mer以上20mer以下（ないしは認識アプタマーの全長の半分以下）程度である。このように、ループ構造内で分断した酵素制御アプタマーを用いて調製した本発明の2分子性の酵素制御ポリヌクレオチドは、後述するとおり、認識アプタマー部位の構造変化を効率的に酵素制御アプタマーに伝えることができるため、1分子の酵素制御アプタマーの末端に認識アプタマーを連結して調製される1分子性の酵素制御ポリヌクレオチドよりも好ましい。

酵素制御アプタマー部位と認識アプタマー部位とは、直接連結してもよいが、リンカーを介して連結させてもよい。例えば、酵素制御アプタマーと認識アプタマーとをそれぞれの末端部で連結させて1分子性の酵素制御ポリヌクレオチドを調製する場合には、ダイマーアプタマーについて上述したように、連結部近傍の二次構造を保持する観点から、適当な鎖長のリンカーを介して連結させてもよい。また、ループ部で分断した分割アプタマーを用いて2分子性の酵素制御ポリヌクレオチドを調製する場合にも、認識アプタマーをリンカーを介して分断部末端に連結させることができる。リンカーを介する場合、上記相補配列断片には、リンカーと相補的な領域を含ませることが好ましい。なお、相補配列断片の連結もリンカーを介するものであってよい。リンカーは、アデニンのみ又はチミンのみから成ることが好ましい。リンカーの鎖長は、酵素制御アプタマーと認識アプタマーとを末端部で連結させる場合には、上記したダイマーアプタマーにおけるリンカーの条件と同様に、通常は1mer〜20mer程度、好ましくは5mer〜15mer程度である。また、分割アプタマーを用いてループ部分に認識アプタマーを設ける場合には、特に限定されないが、通常1mer〜10mer程度、好ましくは1mer〜5mer程度である。

認識アプタマー部位を構成する領域は、標的物質との結合能を有するアプタマー配列のみから成るものであってもよく、また、酵素制御ポリヌクレオチド分子中で認識アプタマー部位の二次構造を安定化させるため等に有用な任意の塩基配列をさらに含ませてもよい。例えば、下記実施例で用いているアデノシンアプタマーは、配列番号３５に示される塩基配列から成るアプタマーであるが、その二次構造はバルジ型であり、図１１(A)に示す通り5'末端のgと3'末端のcが対合してステム部を構成する。この場合には、アデノシンと結合したときのアデノシンアプタマー部位の立体構造をより安定化する観点から、アデノシンアプタマー断片のうち分割アプタマーと連結していないフリーの末端部（図１１(B)の例においてはアデノシンアプタマー断片の3'末端部）に、リンカーと相補的な塩基を1ないし数個程度付加させてもよい。

酵素制御アプタマー部位のループ構造に認識アプタマー部位を連結した2分子性のポリヌクレオチドにＰＱＱＧＤＨを結合させた、本発明の標的物質測定試薬の想定される測定スキームを図１１(B)に示す。図１１(B)中に例示する本発明の試薬は、酵素制御アプタマー部位としてMag2の分割アプタマー、認識アプタマー部位としてアデノシンアプタマーを用いたものであり、測定対象となる標的物質はアデノシンである。Mag2は上述した通りＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させる作用を有する。アデノシンの非存在下では、アデノシンアプタマーが部分相補鎖とハイブリ形成して、Ｍａｇ２は安定した構造をとり、ＰＱＱＧＤＨを活性化する。一方で、アデノシン存在下ではアデノシンアプタマーがアデノシンと結合し、リジットな構造を形成することで、連結しているＭａｇ２の構造が不安定になり、ＰＱＱＧＤＨ活性化能が減少する。即ち、アデノシンをＰＱＱＧＤＨ活性の減少で検出する系が想定される。

本発明の標的物質測定試薬は、本発明の酵素制御ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチド中の酵素制御アプタマー部位に結合したＰＱＱＧＤＨとを含むものである。該ＰＱＱＧＤＨは、上記した通り、試薬中の認識アプタマー部位への標的物質の結合により、酵素活性が変化する。具体的には、酵素制御ポリヌクレオチドに採用される酵素制御アプタマーが、ＰＱＱＧＤＨの活性を上昇させる作用を有する場合、標的物質測定試薬では、認識アプタマー部位への標的物質の結合により、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性が低下する。これとは逆に、採用される酵素制御アプタマーがＰＱＱＧＤＨの活性を低下させる作用を有する場合、標的物質測定試薬では、認識アプタマー部位への標的物質の結合により、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性が上昇する。従って、標的物質を含み得る検体と本発明の試薬を接触させ、試薬のＰＱＱＧＤＨの酵素活性の変化を調べることにより、標的物質を測定することができる。標的物質の濃度が既知の試料を用いて酵素活性を調べ、検量線を作成すれば、検体中の標的物質を定量することも可能である。ＰＱＱＧＤＨの酵素活性は、例えば、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）及び2,6−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）等の適当な活性試薬を含む溶液中で、基質であるグルコースを反応させ、吸光度を測定することにより、容易に測定することができる。

本発明のアプタマー分子及び酵素制御ポリヌクレオチドは、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に調製することができる。また、標的物質測定試薬は、下記実施例に詳述されるように、酵素制御ポリヌクレオチドをフォールディング後、ホロ化させたＰＱＱＧＤＨと混合し、室温で5分〜30分程度インキュベートすることにより、容易に調製することができる。

本発明のＰＱＱＧＤＨ制御アプタマー分子の主な用途は、バイオセンサーのセンシング素子としての利用であり、具体的には、本発明の酵素制御ポリヌクレオチドや測定試薬への適用のような、特許文献１記載のＡＥＳへの利用を挙げることができる。ただし、本発明のアプタマー分子の用途はこれらに限定されず、ＰＱＱＧＤＨへの結合能を利用して、それ自体周知の方法により、ＰＱＱＧＤＨの測定に使用することもできる。この場合には、ＰＱＱＧＤＨ制御アプタマーは、アプタマーによる周知の通常の方法に従って使用することができ、例えば抗体の代わりに本発明のアプタマーを利用した免疫測定法を行なうことができる。また、下記実施例に記載されるアプタマーブロッティングや、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）等の周知の方法によってもＰＱＱＧＤＨの測定を行なうことができる。被検試料としてはＰＱＱＧＤＨを含む溶液であればいかなるものであってもよい。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１−１ アプタマーのスクリーニングに適したＰＱＱＧＤＨ固定担体の検討
ＰＱＱＧＤＨに対して高い親和性と特異的を有するＤＮＡアプタマーを効率よくスクリーニングするために、ＰＱＱＧＤＨでなく、ＰＱＱＧＤＨの固定担体に非特異的に吸着してしまうＤＮＡ量を最小限に抑える必要がある。そこで、より溶液系に近い自由度の高い環境で非特異的に吸着したＤＮＡを洗浄、除去するためにＰＱＱＧＤＨの固定担体として、磁性ビーズを用いることとした。さらに、ＤＮＡのリン酸骨格が負電荷を帯びていることに着目し、負のゼータ電位を帯びている磁性ビーズを用いると静電的な反発により、ＤＮＡの磁性ビーズへの非特異吸着を抑えることができると考えた。

ＤＮＡと静電的相互作用を示すと考えられる正のゼータ電位を帯びたビーズ１と、ＤＮＡと静電的に反発すると考えられる負のゼータ電位を帯びたビーズ２、ビーズ３の計３種類の同粒径(５００〜７５０ｎｍ)のビーズで検討を行った。まず、スクリーニングで用いるライブラリーである、FITC修飾66mer ssDNA（18merのプライマー配列を30merのランダム配列の両末端に付加したもの、配列番号１）を１５μＭとなるようにBinding Buffer（10mM MOPS、1mM CaCl₂、pH 7.0）で調製したものを２５０μｌ用意した。その後、５００ ｍｇ／ｍｌのビーズ溶液を２０μｌ添加し、１時間室温で振とうした後、上清を除き、Binding bufferで１５分間、５分間、５分間、５分間ずつ洗浄を行った。５００μｌの7M ureaを加え、８０℃で７分振等することで吸着ＤＮＡを溶出する作業を２回行った。溶出ＤＮＡをエタノール沈殿させ、真空乾燥させた後、２０μｌのMilliQ水でペレットを溶解し、１０倍希釈して、蛍光分光測定（Ex:495nm、Em:520nm）により各ビーズの非特異吸着ＤＮＡ量を比較した。

その結果、ゼータ電位が＋３０ｍＶで正に帯電しているビーズ１は、負に帯電しているビーズ２、ビーズ３に比べると圧倒的に高い蛍光強度を示した。これより、ビーズ1と核酸が静電的相互作用を示したため、核酸が大幅に非特異吸着してしまったと考えられる。一方で、負に帯電しているビーズ２、ビーズ３はビーズ１と比較すると蛍光強度が著しく低い値を示した。これより、ビーズ２、３と核酸が静電的に反発して、核酸の非特異吸着量が低下したと考えられる。さらに、ビーズ２とビーズ３を比較するとゼータ電位はそれぞれ、−６０ｍＶ、−５０ｍＶであり、負の絶対値のより大きいビーズ２はビーズ３と比べ、さらに低い蛍光強度を示し、今回比較したビーズの中で、最も核酸の非特異吸着量が低いビーズであるといえる。また、ビーズ２は負に帯電しているので、スクリーニング時のｐＨ７．０で正に帯電するＰＱＱＧＤＨを固定する際に静電的に物理吸着させることも可能である。これらより、ビーズ２が今回の目的であるＰＱＱＧＤＨに対するアプタマーのスクリーニングに最も適していると考えられる。

実施例１−２ 磁性ビーズを用いたＰＱＱＧＤＨに対するＤＮＡアプタマーの探索
６６ｍｅｒイニシャルライブラリーをBinding buffer（10mM MOPS、1mM CaCl₂、pH7.0）で1nmol/100μLに調製し、95℃で3分間加熱した後、30分間で室温の25℃まで徐々に冷却することにより、フォールディングさせた。一ラウンド目に限り、15 mgのビーズに100μg（1 nmol相当）のビーズを固定化し、5μM、500μMのライブラリーとインキュベートし、（GDH : ssDNA = 1nmol : 2.5nmol）、2ラウンド目以降は2ｍｇの磁性ビーズに１０μｇのＰＱＱＧＤＨを固定化したものを０．５μＭ、１００μｌのフォールディングさせた６６ｍｅｒイニシャルライブラリーと１時間室温にてインキュベート（GDH : ssDNA = 100pmol : 50 pmol）した後、Binding buffer（10mM MOPS、1mM CaCl₂、pH7.0）で１５分間、３回洗浄した。その後、フェノール／クロロホルムでＰＱＱＧＤＨに結合したｓｓＤＮＡを抽出し、イソプロパノール沈殿により生じたペレットを３０μｌのTE bufferに溶かした。そのうちの一部を３０サイクルでＰＣＲ増幅し、一本鎖を調製した。その後、イソプロパノール沈殿により生じたペレットを３０μｌのTE bufferに溶かし、次のラウンドのライブラリーとした。同様の操作をＰＱＱＧＤＨを固定化していない等量のビーズに対しても行い、ビーズに親和性の高いｓｓＤＮＡが濃縮されていないかどうか検討した。以上の操作を１ラウンドとし、合計６ラウンド行なった。なお、ライブラリーに含まれていたｓｓＤＮＡのモル数に対する、ＰＱＱＧＤＨに吸着したｓｓＤＮＡのモル数の割合を回収率として算出した。また、一本鎖調製は具体的には次のようにして行った。すなわち、PCR産物に、その1/10倍量の×50 TE Bufferおよび1/5倍量の5 M NaClを添加し、この溶液をアビジン固定化アガロースに加え、30分インキュベートした。その後、上清を取り除き、Column buffer (30 mM HEPES、500 mM NaCl、5mM EDTA、pH7.0)で2回洗浄した。上清を取り除いた後、0.15 M NaOHを加えて10分間攪拌し、上清を回収する操作を2回繰り返し行うことにより、ssDNAを溶出させた。ssDNAを含む上清を2M HClで中和し、エタノール沈殿によりssDNAを回収した。

６ラウンド目までの回収率の変遷を図１に示す。ＰＱＱＧＤＨを固定化していない磁性ビーズに対する回収率はラウンドを重ねてもほとんど変化が見られず、また、ＰＱＱＧＤＨを固定化したものより回収率が低いので、ビーズに対して親和性の高いｓｓＤＮＡは濃縮されていないと考えられる。一方、ＰＱＱＧＤＨを固定化したものはラウンドを重ねるごとに回収率が上昇していることがわかる。６ラウンド目では、回収率が２０％程度まで上昇したので、ＰＱＱＧＤＨに対して親和性の高いアプタマーが濃縮されていると考えられたので、６ラウンド目に抽出したｓｓＤＮＡのシーケンス解析を行った。結果を表１に示す。配列の収束及び相同性の高い領域は見られなかった。なお、表１中には両末端のプライマー配列を省略したランダム領域の配列のみを示す。

実施例１−３ シーケンシングの結果得られた各クローンのＰＱＱＧＤＨに対する結合能の評価
各クローンのＰＱＱＧＤＨに対する結合能の評価は、(1)アプタマーブロッティング、(2)ＳＰＲで評価した。

(1) アプタマーブロッティングでの評価
ＰＱＱＧＤＨ、血清を１×２ｃｍ^２のニトロセルロース膜に滴下し、片面で２５０ｎｇ（ＰＱＱＧＤＨ ２．５ｐｍｏｌに相当）を固定化した。その後、４％スキムミルクを用いて、室温で１時間ブロッキングを行った。Binding-T（10mM MOPS、1mM CaCl₂、0.05% Tween、pH7.0）で洗浄した後、１ｎＭのＦＩＴＣ修飾した１９本それぞれのｓｓＤＮＡ溶液３ｍｌとインキュベートさせ、洗浄した。ＨＲＰ修飾した坑ＦＩＴＣ抗体とインキュベートさせ、洗浄した後、各タンパク質に結合したＤＮＡ量を化学発光により検出した。なお、結合能の比較を行うために、イニシャルライブラリーと１９本のクローンを等量ずつ混ぜた（終濃度１ｎＭ）Ｍｉｘライブラリーを用いて同様の操作を行った。

検出結果を図２に示す。１９本のクローンのうち、ほとんどのクローンにおいてＰＱＱＧＤＨへの結合を示すスポットがイニシャルライブラリーのスポットよりも強度が強く検出された。これより、多くのクローンがＰＱＱＧＤＨに対し、高い親和性をもつことが示された。しかし、全てのクローンにおいて、血清に対するスポットも検出されており、また、多くのクローンで、ＰＱＱＧＤＨと血清に対するスポットの強度に違いが見られなかった。各クローンが血清中の正電荷に富んだタンパク質に結合してしまった可能性が考えられる。化学発光強度解析の結果、ＰＱＱＧＤＨに対する親和性が高く、さらに血清よりもＰＱＱＧＤＨに対する親和性が高いクローンである、Ｍａｇ１、Ｍａｇ２、Ｍａｇ３、Ｍａｇ７、Ｍａｇ１０、Ｍａｇ１１、Ｍａｇ１３、Ｍａｇ１５、Ｍａｇ１７、Ｍａｇ１９などが有力であると考えられた。

(2) ＳＰＲでの評価
アプタマーブロッティングでの結合能の評価の結果からＰＱＱＧＤＨへの結合能が比較的高いと考えられる７つのクローン（Ｍａｇ１、２、１０、１１、１５、１７、１９）に関して、ＳＰＲでの結合能の評価を試みた。まず、ＣＭ５チップにアミンカップリングでＰＱＱＧＤＨを２２０００ＲＵ固定化した後、各クローンを1、0.5、0.25、0.13、0.06、0.03、0.015、0.0075μＭの８点の濃度に振って、それぞれ流速１０μｌ／ｍｉｎで４０μｌインジェクトした。なお、チップの再生化は２５０ｍＭのＮａＣｌで行った。イニシャルライブラリーに関しても同様に測定を行った。

C richであるＭａｇ１０、１１、１５、１７、１９に関してはイニシャルライブラリーと同程度のシグナルしか得られなかった。一方で、G richであるＭａｇ１、２に関しては、アプタマーブロッティングの結果と同様に、どのＤＮＡ濃度においても、イニシャルライブラリーの３倍程度のＳＰＲシグナルが確認された。特にＭａｇ２のＰＱＱＧＤＨに対する結合能が最も優れていることが示され、スキャッチャードを作成し算出された解離定数はおよそ２００ｎＭ程度であった。図３にイニシャルライブラリーとＭａｇ２の各ＤＮＡ濃度におけるＳＰＲシグナルを示す。

実施例１−４ 各クローンのＰＱＱＧＤＨ活性に与える影響の評価
アプタマーブロッティングでの結合能の評価の結果からＰＱＱＧＤＨへの結合能が比較的高いと考えられる7つのクローン（Ｍａｇ１、２、１０、１１、１５、１７、１９）が、ＰＱＱＧＤＨ活性に与える影響の評価を試みた。

酵素活性の測定は、ＰＭＳ-ＤＣＩＰ系を用い、ＤＣＩＰの６００ｎｍにおける吸光度変化を３０秒間追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。

まず、終濃度３．８ｎＭ ＰＱＱＧＤＨ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１μＭ ＰＱＱとなる混合溶液２０μｌをBinding bufferを用いて調製し、１０分間室温でインキュベートしてＰＱＱＧＤＨをホロ化した。その後、ホロ化したＰＱＱＧＤＨ溶液にフォールディングしたクローン溶液をそれぞれＰＱＱＧＤＨの１０倍量となるように１０μｌ加え、混合溶液３０μｌとし、これを１５分間室温でインキュベートして、ｓｓＤＮＡとＰＱＱＧＤＨを結合させた。インキュベート後の溶液に１４１μｌのBinding buffer、９μｌの活性試薬（終濃度 ０．６ｍＭ ＰＭＳ、０．０６ｍＭ ＤＣＩＰ）、２０μｌグルコース（終濃度 ２０ｍＭ）を加え、３０秒間、吸光度測定を行った。各クローンのＰＱＱＧＤＨ活性に与える影響を調べるために、クローン溶液のかわりに等量のBinding bufferとインキュベートしたサンプル（ｎｏ ＤＮＡサンプル）の酵素活性を測定した。

活性測定結果を図４に示す。C richであるＭａｇ１０、１１、１５、１７、１９に関してはイニシャルライブラリーと同様に、ほとんどＰＱＱＧＤＨ活性に影響を与えないことが示された。一方でG-richであるＭａｇ１、２に関しては、ＰＱＱＧＤＨ活性を向上させる傾向が見られた。特に、Ｍａｇ２はＰＱＱＧＤＨ活性を３０％程度向上させることが示された。mfoldで予測したMag1、2の二次構造を図５に示す。

実施例２−１ ＰＱＱＧＤＨを標的としたＳＥＬＥＸを始めるにあたっての、固定化タンパク質量とブロッキング溶液の検討
本実施例では、ＰＱＱＧＤＨに対するＳＥＬＥＸを始めるにあたり、担体に固定化するタンパク質量及びブロッキング溶液の種類、濃度の検討をAptamer blotting法により行った。なお、血清中でＧＤＨに対するアプタマーを利用することを考えているため、血清中の他のタンパク質には結合しないように、血清をブロッキング溶液として用いることを試みた。

より具体的には、ＧＤＨを１０ｍＭ ＭＯＰＳで希釈し、12.5、2.5、0.5、0.1ｇ／ｌの濃度の溶液を調製した。各々をＰＱＱ、ＣａＣｌ_２を終濃度１μＭ、１ｍＭとなるように添加してホロ化した後、1 cm×1 cm四方のニトロセルロース膜に片面1μlずつＰＱＱＧＤＨを滴下し乾燥させた。その後、４％スキムミルクまたは４％、２０％、１００％の血清のいずれかを用いて、室温で１時間ブロッキングを行った。ＴＢＳ−Ｔ(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.05% Tween、1mM EDTA、pH 7.4)で洗浄を行った後、1μMのＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）修飾した一本鎖ＤＮＡランダムライブラリー（配列番号１）溶液１．５ ｍｌとインキュベートさせ、洗浄し、さらにＨＲＰ（horseradish peroxidase）修飾した抗ＦＩＴＣ抗体とインキュベートさせ、再び洗浄を行った。タンパク質に結合したＤＮＡ量を確認するため、ＨＲＰに対する基質用溶液を添加して化学発光により検出した。

その結果、４％スキムミルクを用いてブロッキングを行った膜に比べ、血清を用いた膜ではタンパク質を固定化していない部分に対する結合が少なかった。１００％、２０％、４％の各血清では、検出結果に大きな違いが見られず、4％でも十分にブロッキングが行えていると考えられる。また、固定化するタンパク質量については、２５、５、１μgで検出できることが明らかになった。よって、ＳＥＬＥＸでは、４％の血清を用いてブロッキングを行い、加えるＤＮＡとの比が１：１となるように２５μgのＧＤＨを固定化し、１ラウンド目を行うこととした。

実施例２−２ ＰＱＱＧＤＨを標的としたアプタマーの探索
本実施例においては、ＰＱＱＧＤＨに対してＳＥＬＥＸを７ラウンド行った。競合タンパク質として大腸癌の腫瘍マーカーであるＣＲＰ(C-reactive protein)、肝細胞癌の腫瘍マーカーであるＡＦＰ(Alpha-fetoprotein)を用いた。また、一本鎖ＤＮＡランダムライブラリーは１８残基のプライマー配列と３０残基のランダム配列を有する合計６６残基の長さのものを用いた（配列番号１）。

具体的な方法について以下に示す。ＧＤＨを１０ｍＭ ＭＯＰＳで希釈し、任意の濃度の溶液を調製した後に、ＰＱＱ、ＣａＣｌ_２を終濃度１μＭ、１ｍＭとなるように添加してホロ化をした。その後、ニトロセルロース膜にＰＱＱＧＤＨ、ＣＲＰ、ＡＦＰを各々滴下し（表２に示す通り、１ラウンド目は25μg、２ラウンド目は5μgというように各ラウンドにおいて、各タンパク質の固定化量を変化させた）乾燥させ、4％血清を用いて室温で1時間ブロッキングを行った。ＴＢＳ−Ｔ(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.05% Tween、1mM EDTA、pH 7.4)で洗浄をし、1μMのＦＩＴＣ修飾した一本鎖ＤＮＡランダムライブラリー溶液２５０μｌとインキュベートさせ、再度洗浄した。タンパク質が固定化された膜の一部を切り取り、結合したＤＮＡを回収し、ＰＣＲ増幅して次のラウンドのライブラリーとした。以上の操作を１ラウンドとし、計７ラウンドを行った。また、各ラウンドにおいて、タンパク質に結合したＤＮＡ量を確認するために、上記と同様の方法で検出用の膜を用意し、ＤＮＡとインキュベートさせた後に、二次抗体として抗ＦＩＴＣ抗体を用いてタンパク質に結合するＤＮＡ量を化学発光により確認した。

７ラウンド目において、ＰＱＱＧＤＨを固定化した部分にのみ一本鎖ＤＮＡの結合が確認された（図６参照）。１ラウンド目に用いた、ラウンドを重ねていないランダムライブラリー（イニシャル）ではＰＱＱＧＤＨに対してＤＮＡの結合が見られないことから、ＰＱＱＧＤＨに特異的に結合する一本鎖ＤＮＡの濃縮が起こっていると考えられる。

実施例２−３ ＳＥＬＥＸで得られたＰＱＱＧＤＨに結合する一本鎖ＤＮＡの配列解析
本実施例においては、６ラウンド目に回収したＤＮＡの配列の解析を行った。

具体的な方法を以下に示す。6ラウンド目に回収した一本鎖ＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ＤＮＡの精製を行った。その後、ＴＡクローニング、形質転換、培養を行い、得られた４５個の白色コロニーをＬＢ培地で一晩培養した後、プラスミドを抽出した。抽出したプラスミドは、プライマーを用いて目的の断片をＰＣＲ増幅し、コロニーＰＣＲで目的の断片を確認した。目的の断片が挿入されていることが確認されたプラスミドは、塩基配列をダイデオキシ法により決定した。

配列解析の結果を表３に示す。得られた４５本のクローンのうち、重複するものが複数見られ、最終的に１３本の配列を得ることが出来た。配列間には、相同的な領域が見られるものもあり、ＰＱＱＧＤＨに特異的に結合する配列の濃縮が起こっていたと考えられた。なお、表３中には両末端のプライマー配列を省略したランダム領域の配列のみを示す。

実施例２−４ Aptamer blotting法による１３個のアプタマーの結合能評価
本実施例においては、得られた１３種類のアプタマーのＰＱＱＧＤＨに対する結合能の評価をAptamer blotting法により行った。

具体的な方法を以下に示す。ＰＱＱＧＤＨ、ＣＲＰ、ＡＦＰをニトロセルロース膜に滴下し固定化させた（PQQGDH:1.25μg、CRP:5μg、AFP:0.35μg）。その後、１０％血清を用いて、室温で1時間ブロッキングを行った。ＴＢＳ−Ｔ（20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.05% Tween、1 mM EDTA、pH 7.4)で洗浄を行った後、ビオチン修飾した一本鎖ＤＮＡ溶液とインキュベートし、さらにＨＲＰ修飾したアビジンとインキュベートして、化学発光により蛋白質に結合したＤＮＡを検出した。

ＰＱＱＧＤＨに対する各アプタマーの検出結果を図７に示す。ＰＧａ４アプタマーでは、ＰＱＱＧＤＨに対して強度の強いスポットが検出され、競合させたＣＲＰ、ＡＦＰに対してはＤＮＡの結合が見られなかった。ＰＧａ９アプタマーにおいても、ＰＱＱＧＤＨに対する強度の強いスポットが検出されたが、ＣＲＰに対しても結合が見られた。よって、ＰＧａ４、ＰＧａ９ともにＰＱＱＧＤＨに結合するが、特異性はＰＧａ４のほうが高いことが明らかになった。残りの１１種類の配列については、強度の強いスポットは検出されなかったため、ＰＱＱＧＤＨに対する結合能は低いと考えられる。

結合が確認されたＰＧａ４、ＰＧａ９の二次構造をｍｆｏｌｄを用いて予測したところ、図８(A)、(B)で見られるように、いくつかのステムループを形成していることが分かった。また、プライマー配列も構造の形成には必要であることが明らかになった。

実施例２−５ ＳＰＲによるアプタマーの結合能評価
本実施例では、実施例２−４においてＰＱＱＧＤＨに高い結合能を有することが明らかになったＰＧａ４について、ＳＰＲを用いて解離定数の算出を行った。さらに、ＰＧａ４を二つつなげたダイマーアプタマー（Ｄ−ＰＧａ４、配列番号３４）を作製し、結合能がモノマーよりも高くなることを期待して、同様に解離定数の算出を行った。ｍｆｏｌｄを用いて予測したＤ−ＰＧａ４の二次構造を図８(C)に示す。

以下に詳細な方法を示す。各アプタマーを、ＴＢＳバッファー（20mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH 7.4)で 5 pmol/100μLに調製し、95℃で3分間加熱した後、30分間で室温の25℃まで徐冷することにより、フォールディングさせた。調製したアプタマーのうち10μLを流速5μL/minで添加し、Sensor chip SAに固定化した。その後、２μＭ〜２５０ｎＭのＰＱＱＧＤＨを調製し、各々をホロ化した後に１００μｌインジェクトし、アプタマーとＰＱＱＧＤＨの相互作用を観察した。ＳＰＲの測定は、室温、流速１０μｌ／ｍｉｎで行い、アプタマーとＰＱＱＧＤＨの調製及びＳＰＲの固定化buffer、Running bufferは、TBS buffer（20mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH 7.4)を、再生化bufferは0.5%SDSを用いた。

ＰＧａ４を２４０ＲＵ、Ｄ−ＰＧａ４を２９６ＲＵセンサーチップ上に固定化し、その後の評価を行った。各アプタマーの測定結果を図９に示す。ＰＧａ４−６５、Ｄ−ＰＧａ４ともに、ＰＱＱＧＤＨ濃度依存的なシグナルの上昇が観察され、この結果をもとにスキャッチャードプロットから解離定数を算出したところ、ＰＧａ４は１μＭ程度であった。一方、Ｄ-ＰＧａ４については、BIAevaluation 3.1によりグローバルフィッテイングを行い、結合カイネティックパラメーターを算出した（図９参照）。フィッテイングには、１：２（Heteroligand）モードを用いた。Ｄ-ＰＧａ４では２３０〜２８０ｎＭ程度の値となり、ＰＧａ４の解離定数が１μＭ程度であることから、アプタマーをダイマー化することで結合能が上がる可能性が示唆された。

実施例２−６ ＰＧａ４、Ｄ-ＰＧａ４、ＰＧａ９のＰＱＱＧＤＨに対する阻害能の評価
本実施例では、実施例２−５で解離定数を算出したＰＧａ４、Ｄ-ＰＧａ４、また実施例２−４でＰＱＱＧＤＨへの結合が確認できているＰＧａ９を用い、ＰＱＱＧＤＨの活性に与える影響について評価を行った。

詳細な実験方法について以下に記載する。酵素活性測定は、ＴＢＳ中においてｍＰＭＳ-ＤＣＩＰ系を用いて行った（終濃度１ ｍＭ ＤＣＩＰ、６ｍＭ ｍ-ＰＭＳ）。ＰＱＱＧＤＨに対して、ＣａＣｌ_２、ＰＱＱを終濃度１ｍＭ、１μＭとなるように加え、１０μｌスケールで５分間インキュベートすることによりホロ化を行った。その後、フォールディングした１０μｌのアプタマーを添加し、１５分間インキュベートした。そこに、活性試薬１０μｌを添加し、１分間インキュベートした後に、終濃度６０ｍＭとなるようにグルコースを添加し、攪拌してインキュベートした。１分後、１２５μｌの８Ｍ ｕｒｅａを添加し、攪拌した後に氷中で酵素反応をとめ、６００ｎｍの吸光度を測定することで活性測定を行った。また、アプタマーの代わりにランダムライブラリー（イニシャル）でも同様の実験を行った。

各アプタマーの酵素活性に与える影響について図１０に示す。なお、アプタマー非存在下におけるＰＱＱＧＤＨの６０ｍＭグルコースに対する比活性値を１００％とし、各アプタマー存在下における残存活性を示した。結果より、終濃度２．５μＭにおいて、ＰＧａ４では活性値の若干の上昇が見られた。しかし、ランダムラリブラリーにおいても同程度の上昇が見られたことから、ＰＧａ４はＰＱＱＧＤＨの酵素活性に影響を及ぼさないと考えられる。一方、終濃度２．５μＭのＤ-ＰＧａ４については、活性値の５０％前後の低下が見られ、酵素活性を阻害する可能性が示された。

一方、ＰＧａ９は終濃度１μＭにおいて、活性値の４０％程度の上昇が見られた。ランダムラリブラリーでも活性値の上昇が見られたが、２０％程度の差があることから、ＰＧａ９はＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させる作用があることが示唆された。

実施例３−１ ＰＱＱＧＤＨ活性を指標にしたＡＥＳセンサーシステムの構築
本願発明者らはトロンビン阻害アプタマーとアデノシンアプタマーを連結させたセンサー素子であるＡＥＳ（aptameric enzyme subunit）のセンサーシステムを報告している（特許文献１）。本研究ではより高感度なセンサーの構築を目指し、トロンビンよりも酵素活性の高いＰＱＱＧＤＨを用いた系でＡＥＳを確立することを試みた。実施例１のスクリーニングの結果得られた、結合能が高く、ＰＱＱＧＤＨ活性を向上させるＭａｇ２をこの新規ＡＥＳの構築に用いることとした。ＰＱＱＧＤＨの活性を指標にしたＡＥＳが構築できた場合、市販のグルコースセンサーへ即応用が可能になると考えられるので、血液を一滴採取するだけで、種々の疾患マーカーの検出が行えると期待される。本研究では、構築したＡＥＳセンサーシステムでモデル標的分子としてアデノシンの検出が行えるかどうか検討した。

Ｍａｇ２の全長の二次構造予測結果で、ステムループを形成すると考えられる部位のループ領域（配列番号３中の25nt〜39nt）中の31ntと32ntの間でＭａｇ２を二分割した。この分割部位にそれぞれアデノシンアプタマーとその部分相補鎖を連結させて分離型のＡＥＳを設計することが可能になると考えられる。予想される検出スキームを図１１に示す。

アデノシンアプタマーとその１１ｍｅｒの部分相補鎖を、分割したＭａｇ２にそれぞれ連結したサンプルを等量ずつ混合した溶液（この混合溶液をＡＥＳとする）を、Binding buffer（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．０）中でフォールディングさせた。ＰＱＱＧＤＨ １０μｌ（終濃度 ０．４ｎＭ）とＣａＣｌ_２とＰＱＱの混合液１０μｌを混合し、１０分間室温でインキュベートしてＰＱＱＧＤＨをホロ化した。その後、ホロ化したＰＱＱＧＤＨ溶液に、ＡＥＳを１０μｌ（終濃度 １２ｎＭ）を加えて、すぐに、アデノシン溶液を１０μｌ（終濃度 ５００μＭ）加え、混合溶液４０μｌとし、これを１５分間室温でインキュベートした。インキュベート後の溶液に１３１μｌのBinding buffer（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．０）、９μｌの活性試薬（終濃度 ０．６ｍＭ ＰＭＳ、０．０６ｍＭ ＤＣＩＰ）、２０μｌのグルコース（終濃度 ２０ｍＭ）を加え、３０秒間、６００ｎｍの吸光度変化を測定した。なお、アデノシンアプタマーとその部分相補鎖を連結していない、分割したＭａｇ２の混合サンプル（この混合溶液をｄｉｖＭａｇ２とする）に関しても、同様の測定を行った。

Ｍａｇ２を用いたＡＥＳにアデノシンを加えると、ＰＱＱＧＤＨ活性が低下する傾向を示した。一方で、アデノシンアプタマーとその部分相補鎖を連結していないＭａｇ２の分割体では、ＡＥＳと比較してアデノシン添加時のＰＱＱＧＤＨ活性の減少率が小さかった（図１２）。これより、構築したＡＥＳを用いて、ＰＱＱＧＤＨ活性を指標にしたアデノシンの検出が可能であると考えられる。

実施例３−２ 構築したＡＥＳセンサーシグナルの濃度依存性の検討
分割したＭａｇ２に、アデノシンアプタマーとその１１ｍｅｒの部分相補鎖をそれぞれ連結したサンプルを等量ずつ混合した溶液（この混合溶液をＡＥＳとする）をフォールディングさせた。アポ型のＰＱＱＧＤＨ溶液をＰＱＱ、ＣａＣｌ_２と１０分間室温でインキュベートして４ｎＭのホロ化ＰＱＱＧＤＨ溶液を調製し、氷上に静置した。Protein lo bind tubeに、調製したＰＱＱＧＤＨ 溶液を２０μｌ（終濃度 ０.４ｎＭ）、ＡＥＳｄｉｖ２を１０μｌ（終濃度 １２ｎＭ）、様々な濃度のアデノシンまたはシチジン溶液を１０μｌ（それぞれ終濃度0、0.25、0.35、0.5、1.0、1.25mM）を順次加え、５分間室温でインキュベートした。インキュベート後の溶液に１３１μｌのBinding buffer、９μｌの活性試薬（終濃度 ０．６ｍＭ ＰＭＳ、０．０６ｍＭ ＤＣＩＰ）、２０μｌのグルコース（終濃度 ２０ｍＭ）を加え、２０秒間、６００ｎｍの吸光度変化を測定した。

図１３に、アデノシンの添加時のＡＥＳシグナル値を同濃度のシチジン添加時のＡＥＳシグナル値で割ってノーマライズした、ＡＥＳシグナルのアデノシン濃度依存性を示す。値のばらつきが大きく、また、ＡＥＳシグナル強度も小さいが、アデノシン濃度依存的なシグナルが得られていると考えられる。

実施例１におけるアプタマーのスクリーニング工程の各ラウンドにおける、ＰＱＱＧＤＨに結合したDNAの回収率の変遷を示すグラフである。 実施例１のスクリーニングで取得した各ssDNAとＰＱＱＧＤＨとの結合反応をアプタマーブロッティングにより測定した結果を示す図である。 実施例１のスクリーニングで取得したMag2とＰＱＱＧＤＨとの結合反応をＳＰＲで測定した結果を、ランダムライブラリーと比較して示す図である。 実施例１のスクリーニングで取得したssDNAがＰＱＱＧＤＨの活性に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。 実施例１で取得した(A)Mag1及び(B)Mag2の二次構造を示す図である。 実施例２におけるアプタマーのスクリーニング工程の7ラウンド目における、ＰＱＱＧＤＨに結合するssDNAの検出結果を示す図である。 実施例２のスクリーニングで取得した各ssDNAとＰＱＱＧＤＨとの結合反応をアプタマーブロッティングにより測定した結果を示す図である。 実施例２で取得した(A)PGa4及び(B)PGa9、並びにダイマー化により作製した(C)D-PGa4の二次構造を示す図である。 実施例２で取得したアプタマーとＰＱＱＧＤＨとの結合について、ＳＰＲを用いて測定し、解離定数を算出した結果を示す図である。（A）PGa4を用いた際のＳＰＲセンサーグラムとΔＲＵのＰＱＱＧＤＨ濃度依存性曲線、（B）D-PGa4を用いた際のＳＰＲセンサーグラム、ΔＲＵのＰＱＱＧＤＨ濃度依存性曲線、及び算出されたカイネティックパラメーター。 ＰＧａ４、Ｄ-ＰＧａ４、ＰＧａ９がＰＱＱＧＤＨの活性に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。(A)イニシャル、(B)PGa4、(C)D-PGa4、(D)PGa9。「-DNA」はDNAを添加していないＰＱＱＧＤＨの活性値を示しており、この値を１００％としている。 実施例３で構築したＡＥＳについての図である。(A)用いたアデノシンアプタマーの二次構造、(B)構築したＡＥＳの想定されるセンシングスキームを示す。 実施例３で構築したＡＥＳによる、ＰＱＱＧＤＨ活性を指標としたアデノシン検出の検討結果を示す図である。(A)アデノシンの有無での、想定されるＡＥＳの構造（左）とMag2分割体の構造（右）、(B)アデノシン非存在下におけるＰＱＱＧＤＨ活性でノーマライズした、アデノシン存在下のＰＱＱＧＤＨ活性を示す（左：ＡＥＳ、右：Mag2分割体(divMag2)）。a)ＰＱＱＧＤＨ＋ＡＥＳ、b)ＰＱＱＧＤＨ＋ＡＥＳ＋アデノシン、c)ＰＱＱＧＤＨ＋Mag2分割体、d)ＰＱＱＧＤＨ＋Mag2分割体＋アデノシン。 実施例３で構築したＡＥＳについて、ＡＥＳシグナルのアデノシン濃度依存性を検討した結果を示す（アデノシンと同濃度のシチジン添加時に得られたバックグラウンドシグナルでノーマライズしたもの）。

Claims (17)

1. 以下の(a)ないし(c)のいずれかの塩基配列から成るアプタマー分子であって、ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）に結合し、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子。
   (a) 配列表の配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列。
   (b) (a)の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が置換し、欠失し及び／又は挿入された塩基配列。
   (c) (a)又は(b)の塩基配列を部分配列として含む塩基配列。
2. 前記(b)の塩基配列が、(a)の塩基配列のうち１又は２個の塩基が置換し、欠失し及び／又は挿入された塩基配列である請求項１記載のアプタマー分子。
3. 前記(c)の塩基配列が、(a)又は(b)の塩基配列の一端又は両端に１又は２個の塩基が付加された塩基配列である請求項１又は２記載のアプタマー分子。
4. 配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列、又は該塩基配列を部分配列として含む塩基配列から成る請求項１又は３記載のアプタマー分子。
5. 配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列から成る請求項４記載のアプタマー分子。
6. 配列番号２、３、１１、１２、１６、１８、２０、２４及び２９のいずれかに示される塩基配列から成りＰＱＱＧＤＨに結合する能力を有するアプタマー分子から選択される同一又は異なる２つのアプタマー分子が２つ連結された構造を有するアプタマー分子であって、ＰＱＱＧＤＨに結合し、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子。
7. 配列番号２４に示される塩基配列から成るアプタマー分子が２つ連結された構造を有する請求項６記載のアプタマー分子。
8. 1mer〜20merの塩基から成るリンカーを介して前記２つのアプタマー分子が連結される請求項６又は７記載のアプタマー分子。
9. 配列表の配列番号３４に示される塩基配列から成る請求項８記載のアプタマー分子。
10. 請求項１ないし９のいずれか１項に記載のアプタマー分子の二次構造に基づいて構成される酵素制御アプタマー部位と、標的物質を認識して結合する認識アプタマー部位とを含むポリヌクレオチドであって、標的物質の前記認識アプタマー部位への結合により、前記酵素制御アプタマー部位がＰＱＱＧＤＨの酵素活性を変化させる能力が変化するポリヌクレオチド。
11. 請求項１ないし９のいずれか１項に記載のアプタマー分子のループ構造内のいずれかの部位で分断して得られる断片をそれぞれ含む２分子のポリヌクレオチド鎖から成り、一方のポリヌクレオチド鎖の分断側末端には前記認識アプタマー部位を形成する認識アプタマー分子がリンカーを介して又は介さずに連結され、他方のポリヌクレオチド鎖の分断側末端には該認識アプタマー分子中の少なくとも一部と相補的な領域がリンカーを介して又は介さずに連結され、２分子のポリヌクレオチド鎖の分子内及び／又は分子間ハイブリダイゼーションにより酵素制御アプタマー部位の二次構造が形成される請求項１０記載のポリヌクレオチド。
12. 配列表の配列番号３に示される塩基配列中の25nt〜39ntの領域で形成されるループ構造内のいずれかの部位で該塩基配列を分断して得られる断片をそれぞれ含む２分子のポリヌクレオチド鎖から成る請求項１１記載のポリヌクレオチド。
13. 分断される前記ループ構造内の部位が、配列番号３に示される塩基配列中の31ntと32ntの間である請求項１２記載のポリヌクレオチド。
14. 前記認識アプタマー分子は、配列表の配列番号３５に示される塩基配列から成るアデノシンアプタマーであり、前記断片の一方とリンカーを介して連結される請求項１１ないし１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
15. 配列表の配列番号３６に示される塩基配列から成るポリヌクレオチド鎖と、配列番号３７に示される塩基配列から成るポリヌクレオチド鎖から成る請求項１４記載のポリヌクレオチド。
16. 請求項１０ないし１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの前記酵素制御アプタマー部位に結合したＰＱＱＧＤＨとを含む測定試薬。
17. 請求項１６記載の測定試薬を、標的物質を含み得る検体と接触させ、次いで、前記酵素制御アプタマー部位に結合した前記ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を測定し、該酵素活性を指標として検体中の標的物質を測定することを含む、標的物質の測定方法。