JP2011167100A - Pqqgdh結合性アプタマー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】酵素活性に影響を及ぼさずに、PQQGDHと特異的に結合できる、PQQGDHの認識に重要なグアニン残基が8個連続する領域を持つアプタマーPGa4。又は該領域において1個の塩基が置換し、欠失し若しくは挿入された領域を含み、サイズが30mer以下であるアプタマー。PGa4は、このごく短い領域のみでもG四重鎖構造を形成してPQQGDHに結合できる。
【選択図】図3
Description
材料
本実験では、本願発明者らが過去に創製したPQQGDH結合性アプタマーPGa4(配列番号2)を用いた。このアプタマーは、30merのランダム配列にプライマー配列を付加したランダムssDNAライブラリー(配列番号1)からSELEX法によるスクリーニングを経て創製されたものである。具体的には、PQQGDHと競合タンパク質(C-reactive protein及びAlpha-fetoprotein)とを固定化したニトロセルロース膜を用いて、この膜に対してランダムライブラリーを反応させ、PQQGDHに結合したssDNAを回収する、という操作を6ラウンド繰り返すことにより創製されたものである(特許文献3)。
PGa4(20μM)及び短縮型変異体のCDスペクトルは、J-720分光偏光計(JASCO、日本国東京)により、0.1 cm光路長キュベットを用いて25℃、200-320 nmで測定した。
500 nMのFITC修飾オリゴヌクレオチドを0.1μM又は1μMのホロ化PQQGDHと共に室温で30分間インキュベートした。該混合物を10%アクリルアミドのnative PAGEに付した。Typhoon 8600(GEヘルスケア)で蛍光を検出した。
96ウェルマイクロタイタープレート上にホロ化PQQGDHを吸着させ、4%スキムミルクでブロッキングした。0.05%TBST(0.05%Tween20を含むTBSバッファー)でプレートを6回洗浄後、ビオチン修飾オリゴヌクレオチド又はFITC修飾オリゴヌクレオチドをプレートに加えてインキュベートした。洗浄後、プレートをHRP標識ニュートラアビジン又はHRP標識抗FITC抗体と共にインキュベートした。洗浄後、各ウェルにBMケミルミネッセンスELISA基質(POD)を加え、ARVO MX 1420マルチラベルリーダー(パーキンエルマー)で化学発光を測定した。
ストレプトアビジンを固定化した磁性粒子Magnosphere(商品名)MS300ストレプトアビジン100μgをTBSバッファーで洗浄し、各ビオチン修飾オリゴヌクレオチド200 pmolと共にインキュベートした後、4%スキムミルクでブロッキングした。ビーズを0.05% TBSTで5回洗浄後、100μg/mLホロ化PQQGDHと共に1時間インキュベートした。5回洗浄後、ビーズをTBSバッファー100μLに懸濁した。アプタマーに結合したPQQGDHの活性は、0.6 mMフェナジンメトサルフェート(PMS)及び0.06 mM 2,6-ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)を用いて、600 nmにおけるDCIPの吸光度の減少をモニターすることにより測定した。
モチーフ解析
最近接塩基対法を用いた核酸構造予測プログラムであるM-fold(商品名)ウェブサーバーver6(The Bioinformatics Center at Rensselaer and Wadsworth のウェブサイトからダウンロード可能)によりPGa4の二次構造を予測したところ、プライマー領域を含め3つのヘアピン構造を形成することが予測された。この二次構造に基づいていくつかの短縮型変異体を設計したが、PQQGDHに対する親和性が失われてしまった(データ省略)。
上記モチーフ解析に基づき、次の3種の短縮型変異体を設計した(表2)。
ΔPGa4-8:グアニンが8個連続する配列
ΔPGa4-14:PGa4のグアニンリッチ配列
ΔPGa4-29:PGa4からプライマー配列を除いた配列
ここで設計した短縮型変異体をラベリングに使用できるかどうかを調べるため、2通りの方法にてアプタマーを介してビーズ上に酵素を捕捉し、捕捉された酵素の活性を評価した。
Claims (12)
- GGGGGGGGから成る領域、又は該領域において1個の塩基が置換し、欠失し若しくは挿入された領域を含み、サイズが30mer以下であるPQQGDH結合性アプタマー。
- 前記領域がGGGGGGGGから成る領域である請求項1記載のアプタマー。
- 前記アプタマーは、前記領域と、該領域の片末端又は両末端に付加された少なくとも2merのリンカーから成る請求項1又は2記載のアプタマー。
- 前記リンカーがチミンから成る請求項3記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが配列表の配列番号8又は9に示された塩基配列から成る請求項4記載のアプタマー。
- 所望の他のポリヌクレオチドと連結された形態にある請求項1ないし5のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 請求項1ないし5のいずれか1項に記載のアプタマーと、任意の付加領域とから成るポリヌクレオチド。
- 前記付加領域が、固相に固定化されたポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを介して前記アプタマーを前記固相に固定化するための領域である請求項7記載のポリヌクレオチド。
- 前記付加領域が、任意の標的分子に特異的に結合するアプタマーの配列から成る請求項7記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1ないし5のいずれか1項に記載のアプタマーが連結された所望のポリヌクレオチドと、PQQGDHとを接触させることにより、前記アプタマーを介して前記所望のポリヌクレオチドにPQQGDHを結合させることを含む、ポリヌクレオチドをPQQGDH標識する方法。
- 請求項1ないし6のいずれか1項に記載のアプタマーが結合したPQQGDH。
- 請求項7ないし9のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドが結合したPQQGDH。
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JP2008237042A (ja) * | 2007-03-26 | 2008-10-09 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 血管内皮増殖因子結合性アプタマー |
JP2009124946A (ja) * | 2007-11-19 | 2009-06-11 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | Pqqgdh制御アプタマー及びその用途 |
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Non-Patent Citations (3)
Title |
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ELECTROANALYSIS, vol. 21, no. 11, JPN6014028216, 2009, pages 1303 - 1308, ISSN: 0002848644 * |
NUCLEIC ACIDS SYMPOSIUM SERIES, vol. 51, no. 1, JPN6014028213, 2007, pages 403 - 404, ISSN: 0002848643 * |
第7回日本蛋白質科学会年会プログラム・要旨集, JPN6014028219, 2007, pages 107 - 2, ISSN: 0003123553 * |
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