KR101989679B1 - 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 - Google Patents

노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환경호르몬인 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 단일가닥 DNA 앱타머는 표적물질인 노닐페놀 에톡실레이트에 대해 높은 결합력과 선택성을 지니고 있어 짧은 시간 내에 반응이 완료되고, 항체에 비해서 구조적으로 보다 안정한바, 현장에서 실시간으로 손쉽게 노릴페놀 에톡실레이트를 검출하는 장치, 센서 또는 키트로 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 노닐페놀 에톡실레이트에 대한 높은 결합력을 바탕으로 자성비드 등의 나노물질과의 결합을 통하여 표적물질만을 분리해내는 기술에도 이용가능할 것으로 기대된다.

Description

노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이의 용도{DNA aptamer specifically binding to nonylphenol ethoxylate and uses thereof}
본 발명은 환경호르몬인 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 많은 종류의 세정제가 개발되어 사용되고 있는 가운데 계면활성제로서 적절한 물성을 지닌 노닐페놀을 전구체로 이용하여 합성한 노닐페놀 에톡실레이트(Nonylphenol ethoxylate)가 많이 이용되고 있다. 그러나 이러한 노닐페놀 에톡실레이트의 경우, 인체 내에서 유사에스트로젠 역할을 하고 또한 분해가 되어 노닐페놀로 변하게 된다. 분해된 노닐페놀 또한 체내에서 노닐페놀 에톡실레이트보다도 강하게 유사에스트로젠으로써 작용하여 내분비계를 교란시키는 역할을 하며, 극미량 존재하는 경우에도 생물축적으로 생식기능 저하, 성장장애, 기형 또는 암 등을 유발하는 심각한 장애를 일으킬 수 있다는 유해성이 알려지면서 최근에는 제한적 사용을 하는 추세에 있다. 일반적인 인체노출은 노닐페놀 에톡실레이트를 포함하는 세정제를 이용한 후 용기에 잔류한 세정성분과 접촉한 식품의 섭취 등을 통해서 일어나게 된다.
현재 이러한 노닐페놀 에톡실레이트를 검출하는데 가장 많이 이용되는 검출법은 크로마토그래피 기법을 이용하여 시료를 완벽하게 액체상이나 기체상으로 만들어 준 후, 특수한 장비를 이용하여 표적물질을 정성적, 정량적으로 매우 정밀하게 측정하는 방법이다. 하지만, 상기 종래의 방법은 사용 편의성 및 장비 사용에 있어서의 공간적 제약, 그리고 결과를 확인하기 까지 시간이 많이 걸린다는 문제점이 있다.
또한, 최근까지 대사물질, 환경 오염물 및 독소와 같은 저분자량을 갖는 분석물의 분석은 일반적으로 GC/MS 또는 HPLC와 같은 복잡한 실험으로 진행되어 왔는데, 이는 숙련된 작업자조차도 오랜 시간이 걸리고 현장에서 바로 검출하기 어렵다는 문제점이 있었다. 더욱이, 표적물질의 특이적이고 민감한 검출을 위해서는 항체와 같은 표적물질에 특이적으로 결합하는 시약이 요구되나, 저분자량의 작은 물질의 경우 통상 동물에서 항체를 발생시키기에는 너무 작거나 너무 독성이 강하여 항체를 생성할 수 없기 때문에, 작은 분자를 타겟팅하기 어렵다는 문제가 있다. 뿐만 아니라, 항체를 이용한 진단용 바이오센서의 문제점은 분자 구조가 큰 항체로 인해 항체를 생산하는데 어려움이 있으며 변형 또한 용이하지 못하다는 문제가 있다. 항체는 동물이나 세포를 이용하여 만들기 때문에 대량 생산에 많은 시간과 비용이 들고, 만든 시기에 따라 기능성이 달라질 수 있다는 단점이 있어 항체 기반의 바이오센서의 정확도에 많은 영향을 미친다. 더욱이, 항체는 실온에서 보관이나 운반이 어려워 장시간 또는 반복 사용이 요구되는 진단용 바이오센서로 사용하는데 문제가 있다.
이에, 현장에서 빠르고 실시간으로 쉽게 검출하기 위한 프로브의 개발이 필요한 상황이고, 이를 위한 다양한 연구가 시도되고 있으나(KR 10-2015-0113936 A 등), 아직 미미한 실정이다.
본 발명자들은 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 압타머를 발굴하기 위하여 연구노력한 결과, 특정의 핵산 서열을 갖는 압타머가 노닐페놀 에톡실레이트에 대하여 높은 결합력 및 특이도를 나타냄을 확인하고, 이에 기초하여, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진, 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는 노닐페놀 에톡실레이트 검출용 조성물, 노닐페놀 에톡실레이트 검출용 키트, 노닐페놀 에톡실레이트 검출용 센서, 또는 상기 DNA 압타머를 이용한 노닐페놀 에톡실레이트 검출 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진, 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는, 노닐페놀 에톡실레이트 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는, 노닐페놀 에톡실레이트 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는, 노닐페놀 에톡실레이트 검출센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 노닐페놀 에톡실레이트가 존재하는 것으로 의심되는 시료와 상기 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 상기 노닐페놀 에톡실레이트와 상기 DNA 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 노닐페놀 에톡실레이트 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 압타머는 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나로 표지될 수 있다.
본 발명의 단일가닥 DNA 앱타머는 표적물질인 노닐페놀 에톡실레이트에 대해 높은 결합력과 선택성을 지니고 있어 짧은 시간 내에 반응이 완료되고, 항체에 비해서 구조적으로 보다 안정한바, 현장에서 실시간으로 손쉽게 노릴페놀 에톡실레이트를 검출하는 장치, 센서 또는 키트로 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 노닐페놀 에톡실레이트에 대한 높은 결합력을 바탕으로 자성비드 등의 나노물질과의 결합을 통하여 노닐페놀 에톡실레이트만을 분리해내는 기술에도 이용가능할 것으로 기대된다.
도 1은 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합하는 압타머를 스크리닝하기 위하여 SELEX 과정의 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 단일가닥 DNA 압타머의 노닐페놀 에톡실레이트에 대한 결합력을 알아보기 위하여, 압타머와 환원 그래핀 산화물을 기반으로 한 분석법에 대한 과정을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 단일가닥 DNA 압타머와 노닐페놀 에톡실레이트의 결합력 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 단일가닥 DNA 압타머의 결합 특이도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
압타머는 검출분석 시스템에서 분자를 인식할 수 있는 바이오센서의 일 요소로 이용될 수 있어 항체의 대체물질로 인식되어 오고 있다.　특히, 압타머는 항체와 달리 독소를 비롯한 다양한 유기물 및 무기물의 표적 분자로 이용될 수도 있다. 이에, 본 발명자들은 환경호르몬인 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적인 단일가닥 압타머를 발굴하기 위해 SELEX 과정을 통해 연구노력한 결과, 노닐페놀 에톡실레이트에 대하여 높은 결합력 및 특이도를 나타내는 단일가닥 DNA 압타머를 선별하고, 이에 기초하여, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진, 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "DNA 압타머(aptamer)"는 특정 분자에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미하는 것으로서, 단일 가닥인 DNA 핵산 분자를 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "압타머(aptamer)"는 저분자 탐침으로써 특정 화합물부터 단백질까지 다양한 종류의 표적 리간드에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특성을 가지는 짧은 길이(20~60 뉴클레오티드)의 단일가닥 핵산 조각을 뜻한다. 압타머의 개발은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)라는 방법을 통해 생체 외(In Vitro)에서 이루어질 수 있다.
압타머는 표적물질에 대해 나노몰 내지 피코몰 수준의 높은 결합력과 선택성을 지니고 있다는 점에서 항체와 유사한 특성을 가지는 핵산 분자로 여겨지고 있다. 한편 항체와 비교할 때 압타머는 다음과 같은 여러 가지 장점을 가지고 있다: (1) 화학적 합성이 용이하며 또한 비교적 작고 단순한 분자이므로 여러 가지 필요한 변형이 가능하고, (2) SELEX 과정을 통해 선택성과 친화도를 극대화할 수 있으며, (3) 화학적 합성으로 만들어지므로 순도가 높고, (4) 동물에 주입하여 항체를 생성하기 어려운 독소 등에 대한 압타머의 개발이 가능하며, (5) 열에 안정하여 실온에서 장기간 보존도 가능하고, (6) 생체 내 면역반응을 거의 일으키지 않고, (7) 항체와 달리 독소를 비롯한 다양한 유기물 및 무기물의 표적 분자로 이용될 수 있으며, (8) 일단 특정 물질에 특이적으로 결합하는 압타머를 분리해내면 자동화된 올리고머 합성 방법으로 낮은 비용과 일관성으로 재생산이 가능하여 경제적이다. 압타머 선별 과정에는 일반적으로 1014 - 1015 정도의 서로 다른 서열, 즉 다양성을 가지는 라이브러리로부터 단일 가닥 DNA 풀(pool)을 얻는 과정이 필요하다. 이를 위한 방법으로 여러 가지 방법이 이용되고 있으나 일반적으로 비대칭 PCR을 사용하여 한쪽 가닥만을 증폭시키는 방법, 이중 가닥 DNA의 한 가닥 끝 부분에 비오틴(biotin)을 붙인 후 스트렙타비딘(streptavidin)으로 감싼 비드(bead)를 이용하여 한 가닥만을 선택적으로 분리하는 방법, 그리고 λ-exonuclease를 이용하여 5' 말단에 인산기가 달린 가닥을 분해하여 단일가닥만을 남기는 방법이 가장 많이 이용되고 있다. 본 발명에서는 비대칭 PCR을 이용하여 단일가닥 DNA pool을 확보하였다.
이렇게 만들어진 라이브러리를 표적 리간드에 결합시켜 결합력이 높은 압타머를 골라내는 선택 과정을 진행하게 된다. 표적물질이 저분자인 경우에는 보통 비드나 레진(resin), 또는 플레이트(plate)에 공유결합을 통해 고정화한 후 이들을 이용한 친화도 컬럼(affinity column)이나 고정화작업이 완료된 플레이트를 만들게 된다. 이 컬럼에 핵산 라이브러리를 흘려 결합을 유도한 후 버퍼로 씻어내려 표적물질에 결합하지 않는 핵산들을 제거한다. 플레이트(Plate)의 경우에도 마찬가지로 핵산 라이브러리와 표적물질의 결합을 유도한 후 버퍼로 씻어내어 표적물질에 결합하지 않는 핵산들을 제거한다. 컬럼 및 플레이트에 고정되어 있는 표적물질에 결합한 압타머들은 낮은 염도를 가지는 버퍼나 리간드가 포함된 용액으로 씻어내거나 pH를 급격히 바꿔서 압타머 구조의 변화를 통해 표적물질과 분리시킨 후 획득하게 된다. 표적물질이 단백질인 경우에는 보통 니트로셀룰로오스 필터(nitrocellulose filer)를 이용하여 단백질에 결합한 압타머를 분리한다. 이러한 방법들을 사용하여 리간드에 대해 친화도를 가지는 압타머들을 얻을 수 있다. 보통 5-15 사이클(cycle)의 선별-증폭 과정을 반복하면 높은 친화도를 가지는 압타머를 얻을 수 있다. 선별 과정이 종료되면 증폭한 DNA를 클로닝한 후 개개의 클론으로부터 서열 분석을 통해 그 서열을 확인하고, 압타머를 합성하여 대상물질과의 친화도 및 결합력을 측정하게 된다.
본 발명에서, 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 서열번호 4의 염기서열이, 상기 염기서열을 구성하는 개별 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상이 화학적 또는 물리적으로 변형(modification)된 형태로 포함될 수도 있다. 예를 들어, 상기 서열번호 4의 염기서열을 구성하는 개별 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상이 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 또는 디아미노퓨린 등으로 구성될 수 있다.
또한, 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 서열번호 4의 염기서열들의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변이체는 상기 서열번호 4의 염기서열들과 서열은 상이하지만, 상기 염기서열들과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열로서, 상기 서열번호 4과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상, 가장 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성(homology)을 가지는 염기서열일 수 있다.
본 발명의 단일가닥 DNA 압타머는 검출가능한 표지가 부착될 수 있다. 단일가닥 DNA 압타머에 검출가능한 표지를 부착시킴으로 인하여, 타겟과 단일가닥 DNA 압타머의 결합 여부 및 결합 정도를 손쉽게 관찰 및 측정하는 것이 가능하다. 상기 검출가능한 표지는 발색효소(퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 등), 형광물질(FITC, RITC, 로다민 (rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 크로모포어(chromophore) 및 방사성 동위원소(124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는, SELEX 방법에 의해 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합할 수 있는 단일가닥 DNA 압타머를 선별하고, 노닐페놀 에톡실레이트에 대한 결합력과 특이도를 확인한 결과, 본 발명에 따른 DNA 압타머는 나노몰(Nano molarity, nM) 수준의 결합력을 보이며, 구조적으로 유사한 비스페놀 A(BPA), 노닐페놀(NP), 다이뷰틸 프탈레이트(DBP), 페니페놀(PP)과 대비하여 현저히 높은 반응성을 나타냄을 직접적으로 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 단일가닥 DNA 압타머는 환경호르몬인 노닐페놀 에톡실레이트의 신규 탐침으로서 유용하게 사용될 수 있다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는 노닐페놀 에톡실레이트 검출용 조성물, 노닐페놀 에톡실레이트 검출용 키트, 또는 노닐페놀 에톡실레이트 검출용 센서를 제공한다. 또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 노닐페놀 에톡실레이트가 존재하는 것으로 의심되는 시료와 상기 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 상기 노닐페놀 에톡실레이트와 상기 DNA 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 노닐페놀 에톡실레이트 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 압타머가 검출센서로 이용되는 경우, 구체적으로 "전기화학기반 바이오센서" 또는 "형광분석 기반 바이오센서"로 이용될 수 있다. 전기화학 기반 바이오센서는, 전극에 압타머를 고정시킨 후 노닐페놀 에톡실레이트가 압타머와 결합하였을 때에 발생하는 전류의 변화나 저항 변화를 측정하는 시스템이다. 형광분석 기반 바이오센서는, 형광물질을 이용하여 압타머와 노닐페놀 에톡실레이트의 결합을 정량적으로 검출하는 시스템을 말한다. 압타머에 형광 물질을 표지하여 바이오센서로 이용하거나 압타머와 노닐페놀 에톡실레이트를 결합시킨 후에 형광 물질을 첨가하여 바이오센서로 이용할 수도 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머 스크리닝 ( SELEX )
1-1. PCR을 통한 단일가닥 DNA 라이브러리의 합성
대략 7.2 × 1014개의 서로 다른 DNA 서열들로 구성된 무작위 단일가닥 DNA 라이브러리(Bioneer, Deajeon, Korea)로부터 환경호르몬인 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합할 수 있는 단일가닥 DNA 압타머를 SELEX 방법에 의해 선별하였다. 노닐페놀 에톡실레이트를 이용하여 특이적 결합 압타머를 발굴하기 위해서는, 가장 먼저 랜덤 DNA 라이브러리가 필요하다. 이를 위해 총 60개 염기에서 30개는 랜덤으로 구성된 염기서열((N)30)을 포함한 단일가닥 DNA 라이브러리(5‘-ATGCGGATCCCGCGC(N)30GCGCGAAGCTTGCGC-3’)(서열번호 1)를 이용하였다. 주형(template) DNA 라이브러리를 증폭시키기 위하여 두 개의 프라이머를 제작하고 합성하였으며, 구체적인 프라이머 서열 정보는 하기와 표 1에 나타내었다.
구분 서열(5'-3')
정방향 프라이머 ATGCGGATCCCGCGC (BamH Ⅰ site 포함) (서열번호 2)
역방향 프라이머 GCGCAAGCTTCGCGC (Hind Ⅲ site 포함) (서열번호 3)
단일가닥 DNA 만을 얻기 위해 100uM의 정방향 프라이머, 10uM의 역방향 프라이머를 사용하여 비대칭 PCR로 주형 DNA 라이브러리를 증폭시켰다. PCR 산물은 2.5% 아가로즈 겔에 전기영동 하여 산물을 확인하였다.
1-2. 단일가닥 DNA 라이브러리의 추출
PCR 수행 후 단일가닥 DNA 라이브러리를 분리하기 위하여 Crush and Soak 방법을 이용하였다. 상기 실시예 1-1에 의해 수득된 PCR 산물을 12% 네이티브젤에 전기영동하여 이중가닥과 단일가닥 DNA를 분리하였다. 전기영동 후 EtBr로 DNA를 염색 후 단일가닥 DNA 밴드를 잘라낸 후, 잘라낸 젤을 분쇄하여 Crush and Soak buffer(500 mM NH4OAc, 0.1% SDS, 0.1 mM EDTA)를 이용하여 단일가닥 DNA를 침출하였다. 침출물을 원심분리하여 고형젤을 분리 후 에탄올 침전 등을 통하여 정제 후 UV 분광광도계를 사용하여 정량하여 SELEX에 사용하였다.
1-3. 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합하는 앱타머 선별
상기 실시예 1-2에 의해 추출된 단일가닥 DNA를 이용하여 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합하는 압타머를 스크리닝하기 위하여 올리고뉴클레오타이드의 인비트로 셀렉션(In Vitro selection of oligonucleotide)인 SELEX를 수행하였고, 개략적인 계획도를 도 1에 도시하였다.
보다 구체적으로, 용액에 녹아 있는 노닐페놀 에톡실레이트의 유사구조체와 압타머를 튜브 상에서 반응시킨 후, 결합하지 않은 압타머를 환원 그래핀 산화물 (reduced graphene oxide, rGO)을 이용하여 결합시키고, 원심분리기를 이용하여 노닐페놀 에톡실레이트의 유사구조체와 결합한 압타머들을 제거하였다. 세척과정을 통하여 튜브와 약하게 결합한 압타머 또한 제거를 하였다. 그 후 노닐페놀 에톡실레이트를 첨가하여 환원 그래핀 산화물에 붙어 있는 압타머와 결합시켜 특이적 결합 가능성이 있는 서열들을 용출하였다. 원심분리기를 이용하여 환원 그래핀 산화물과 용출된 압타머를 분리하였다. 용출된 압타머를 PCR을 통해 증폭하여 12% 네이티브 DNA 전기영동을 통하여 압타머만을 얻고 다음 라운드를 진행하였다. 이 때 노닐페놀 에톡실레이트와 단일가닥 DNA를 결합시킬 때 버퍼 조건에 따른 표적물질, 결합시간 등의 변화를 준 결합조건을 통하여 극한 조건에서도 노닐페놀 에톡실레이트에 높은 결합력으로 결합할 것으로 예상되는 단일가닥 DNA를 확보하였으며, 구체적인 선별조건은 하기 표 2에 나타내었다.
Figure 112017075026271-pat00001
매 라운드 과정에서는 단일가닥 DNA의 비특이적 결합을 최소화하기 위해서 노닐페놀 에톡실레이트 유사 구조체 (비스페놀A, 페닐페놀, 비스페놀F)와 결합하는 단일가닥 DNA를 제거하였다. 노닐페놀 에톡실레이트 유사 구조체를 첨가하여 노닐페놀 에톡실레이트 유사 구조체와 결합하지 않은 단일가닥 DNA를 분리하여 다음 단계에서 사용하여 발굴한 압타머의 특이도를 증가시켰다.
최종 5라운드의 SELEX 과정을 통해 얻은 단일가닥 DNA의 서열을 분석하고자 클로닝 과정을 진행하였다. 동일한 농도의 프라이머를 사용하여 단일가닥 DNA를 dsDNA로 증폭 후 서열 분석을 위해 T7 Promoter를 갖고 있는 박테리아 발현용 벡터인 pET 28a vector에 삽입하고자 하였다. 제한효소는 각각 BamHⅠ과 Hind Ⅲ를 선택하여 처리하였으며, 발현 벡터에 유전자 서열의 삽입을 위해 DNA ligase를 이용하여 재조합 플라스미드를 확보하였다. 노닐페놀 에톡실레이트에 대한 총 5번의 선별 및 증폭 과정을 통하여 최종적으로 1개의 단일가닥 DNA 압타머를 선별하였고, 선별된 압타머의 염기서열은 하기 표 3에 나타내었다.
Name Sequence (5'-3') Frequency Size
Aptamer ATGCGGATCCCGCGCCGGGCCACAGGGTGCGCGAAGCTTGCGC (서열번호 4) 6 43
실시예 2: 선별된 DNA 압타머와 노닐페놀 에톡실레이트의 결합력 분석
상기 실시예 1에 의해 선별된 단일가닥 DNA 압타머의 노닐페놀 에톡실레이트에 대한 결합력을 알아보기 위해 압타머와 환원 그래핀 산화물을 기반으로 한 분석법을 이용하였고, 개략적인 분석 방법 및 원리는 도 2에 도시하였다.
환원 그래핀 산화물은 탄소들로 이루어진 육각 고리구조가 반복적으로 전개되어 생성된 판 구조로 이루어져있는데 이는 단일가닥 핵산 압타머의 고리 구조와 π-π 결합을 이루어 고정시키게 된다. 이러한 경우 여러 가지 방법으로 단일가닥 핵산 압타머를 환원 그래핀 산화물로부터 분리할 수 있는데, 그 원리는 압타머의 육각 고리구조를 결합력이 더 강한 물질을 첨가하여 가리는 것이다. 압타머는 일반적으로 표적 물질과 결합을 하게 되면 전체적인 구조가 변하는 것으로 알려져 있다. 그 결과 환원 그래핀 산화물에 결합된 압타머의 전체적인 구조가 표적 물질을 첨가함으로써 변하게 되어 내부 고리구조의 환원 그래핀 산화물과의 결합력이 약해져 떨어져 나오게 된다. 또한 환원 그래핀 산화물은 그 전기적 특성에 의해 형광물질에 대한 강한 소광 능력을 갖는다. 앞서 언급한 압타머에 형광물질을 결합시키면 환원 그래핀 산화물에 결합되어 있을 경우, 형광신호는 나오지 않고 표적물질을 첨가하여 환원 그래핀 산화물로부터 분리되면 신호를 발하게 된다. 이러한 원리를 이용하여 일정한 농도의 표적물질에 대하여 형광신호가 회복되는 것을 확인하여 그 특성을 분석하였다.
보다 구체적으로, 1.5ml 튜브에 증류수 50ul, 5x 결합버퍼 20ul, 5mg/ml로 증류수에 녹인 환원 그래핀 산화물과 압타머를 농도별로 10ul씩 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 원심분리기를 14000rpm 속도로 30분 동안 이용하여 상층액을 제거하고 1x 결합버퍼를 이용하여 같은 방법으로 2차례 세척을 진행하였다. 마지막 세척에서 상층액을 제거한 후 100ul의 1x 결합버퍼를 넣고 100mM 농도의 표적물질을 0.2ul 첨가한 후 1시간 동안 반응을 진행하였다. 원심분리기를 위와 같은 조건으로 이용하여 상층액을 분리하였고 이를 96 well opaque plate에 옮겨 대조군의 값을 0으로 기준 삼고 회복된 형광신호의 세기를 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 DNA 압타머는 Kd 값이 100.9 nM으로 측정되어, 나노몰(Nano molarity, nM) 수준의 결합력을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 선별된 DNA 압타머의 결합 특이도 확인
노닐페놀은 노닐페놀 에톡실레이트의 전구체로써 알킬기를 포함한 고리구조에 있어 구조적 유사성을 보이고 있고, 비스페놀 A, 페닐페놀은 모두 하이드록시페닐 구조를 포함하여 노닐페놀 에톡실레이트가 인체 내에서 분해되어 생성되는 노닐페놀과 구조적으로 유사하다. 더욱이, 다이뷰틸 프탈레이트는 노닐페놀 및 노닐페놀 에톡실레이트와 마찬가지로 환경호르몬으로써 법적으로 관찰물질로 지정되어 있다.
이에, 상기 실시예 1에 의해 선별된 단일가닥 DNA 압타머의 노닐페놀 에톡실레이트에 대한 특이적 결합(specificity)을 확인하기 위하여, 특정 압타머 농도 조건 하에서 상기 DNA 압타머와 노닐페놀 에톡실레이트, 비스페놀 A(BPA), 노닐페놀(NP), 다이뷰틸 프탈레이트(DBP), 페니페놀(PP)의 신호값 분석을 통하여 특이도를 분석하였다.
보다 구체적으로, 측정방법은 1.5ml 튜브에 증류수 50ul, 5x 결합버퍼 20ul, 5mg/ml로 증류수에 녹인 환원 그래핀 산화물과 압타머를 농도별로 10ul씩 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 원심분리기를 14000rpm 속도로 30분 동안 이용하여 상층액을 제거하고 1x 결합버퍼를 이용하여 같은 방법으로 2차례 세척을 진행하였다. 마지막 세척에서 상층액을 제거한 후 100ul의 1x 결합버퍼를 넣고 100mM 농도의 표적물질을 0.2ul 첨가한 후 1시간 동안 반응을 진행하였다. 원심분리기를 위와 같은 조건으로 이용하여 상층액을 분리하였고 이를 96 well opaque plate에 옮겨 대조군의 값을 0으로 기준 삼고 회복된 형광신호의 세기를 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 DNA 압타머는 비스페놀 A(BPA), 노닐페놀 (NP), 다이뷰틸 프탈레이트(DBP) 및 페닐페놀(PP)에 비하여 노닐페놀 에톡실레이트(NPE)에서 유의적으로 높은 형광신호가 수집되었음을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 DNA 압타머는 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합함을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> DNA aptamer specifically binding to nonylphenol ethoxylate and uses thereof <130> PD17-075 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA library template sequence <400> 1 atgcggatcc cgcgcnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngcgcg aagcttgcgc 60 60 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for the library amplification <400> 2 atgcggatcc cgcgc 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the library amplification <400> 3 gcgcaagctt cgcgc 15 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer for nonylphenol ethoxylate <400> 4 atgcggatcc cgcgccgggc cacagggtgc gcgaagcttg cgc 43

Claims (6)

  1. 노닐페놀 에톡실레이트에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머로서, 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, DNA 압타머.
  2. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나로 표지된 것을 특징으로 하는, DNA 압타머.
  3. 제1항의 DNA 압타머를 포함하는, 노닐페놀 에톡실레이트 검출용 조성물.
  4. 제1항의 DNA 압타머를 포함하는, 노닐페놀 에톡실레이트 검출용 키트.
  5. 제1항의 DNA 압타머를 포함하는, 노닐페놀 에톡실레이트 검출센서.
  6. 노닐페놀 에톡실레이트가 존재하는 것으로 의심되는 시료와 제1항의 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
    상기 노닐페놀 에톡실레이트와 상기 DNA 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 노닐페놀 에톡실레이트 검출 방법.
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