CN115044587B - 特异性识别左旋咪唑的核酸适配体及其双模式纳米探针和应用 - Google Patents

特异性识别左旋咪唑的核酸适配体及其双模式纳米探针和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种特异性识别左旋咪唑的核酸适配体及其双模式纳米探针和应用，核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1‑3所示之一，对左旋咪唑具有高特异性和亲和力，并基于该核酸适配体开发了一种双模式纳米探针，包括核酸适配体、互补链、AuNPs/Cu‑TCPP(Fe)或AuNPs/Co‑TCPP(Fe)纳米片，在左旋咪唑检测中表现良好，具有高灵敏度和准确度。

Description

特异性识别左旋咪唑的核酸适配体及其双模式纳米探针和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种特异性识别左旋咪唑的核酸适配体及其双模式纳米探针和应用。
背景技术
驱虫药用于预防或治疗影响体重增加的寄生虫感染。目前，驱虫药已广泛用于人类和兽医学以控制寄生虫侵扰。其中一种药物左旋咪唑已获准用于治疗包括家禽在内的各种动物的体内寄生虫感染。左旋咪唑主要用于治疗传染性寄生虫病，是一种合成的高效低毒的广谱驱虫药。其抗虫治疗效果显著，药源充足，应用历史悠久且性质稳定，对牛、羊、猪、家禽等多种动物的胃肠道线虫和肺线虫有良好的驱虫活性，广泛用于兽医实践。其驱虫机理为抑制延胡索酸还原酶活性，干扰能量代谢和充当乙酰胆碱激动剂，麻痹虫体。此外，左旋咪唑在寄生虫神经系统中充当乙酰胆碱激动剂，导致线虫肌肉的去极化，发生持续性收缩而致麻痹，使虫体不能附着于肠壁，寄生虫随之排出体外。
由于左旋咪唑具有良好的驱虫作用和免疫调节功能，受到畜牧养殖企业的青睐，在我国动物养殖业中有着广泛的应用。为确保食品安全，我国、美国、欧盟和日本等许多国家或国际组织都针对动物源性左旋咪唑的含量制定了严格的限量标准，一般为10-100μg/kg。不合理地使用左旋咪唑或不遵守停药期，动物组织左旋咪唑含量可能超过规定的最大残留限量值，随食物链间接被人体摄入，最终对消费者身体健康造成不良影响。
当前左旋咪唑的测定方法以色谱法为主，也会使用与不同检测器相结合的色谱技术。包括气相色谱法(GC-MS)、液相色谱(LC-UV、LC-MS、 LC-MS/MS)、高效液相色谱(HPLC、RP-HPLC、HPLC-UV、HPLC-MS)等。色谱法定性准确，但需要色谱级的有机试剂作流动相，运行成本较高且废液容易造成环境污染，需要昂贵的设备或复杂的预处理及专业技术人员操作，实际应用范围较窄。适配体是一种以指数富集配体系统进化(SELEX)技术从寡核苷酸文库中经体外筛选得到的高亲和力特异性结合靶标的单链寡核苷酸分子(ssDNA或RNA)，通常由20-100个碱基组成，能与靶标特异性结合，被称为“化学抗体”。靶物质能够诱导适配体由自由构象折叠成G- 四链体、发夹、假结等三维空间结构，与适配体特定位点通过氢键、疏水作用力、范德华力等与适配体发生非共价结合。高亲和性高特异性适配体序列的获得是适配体技术的核心。SELEX技术是目前最常用的适配体筛选手段。与大多数需要将靶标固定在固相介质上的SELEX方法相比，Capture-SELEX 的主要优势是将DNA文库而不是靶标固定在固相介质上，能够针对无法固定的小分子靶标的适配体筛选，保持了靶标的原始结构。目前适配体在兽药残留检测中已有一定的应用，但尚未有关于左旋咪唑特异性适配体筛选研究的报道。基于此，开发一种灵敏、高效、简便针对左旋咪唑残留的适配体检测新技术具有非常重要的意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种特异性识别左旋咪唑的核酸适配体，具有特异性高、稳定性高、合成方便、易标记功能基团等特点，并基于该核酸适配体开发了一种双模式探针，可用于左旋咪唑的检测。
本发明的第一个目的是提供一种特异性识别左旋咪唑的核酸适配体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1-3所示之一，具体序列为：
LEV-5：
5′-AATCAAACGCTAAGGTCAAGGGAGAGTGCACCCATTCTTGGGG CCCCGGGCCAGCCCCGACACGCCGCCGAAGCTTGGTACCCGTATCGT-3 ′；
LEV-1：
5′-AATCAAACGCTAAGGTAAGGACGAGGTGCACCCATTCTTGGGC ACGCGGCACGCGCGAGGACGACCAGGCAAGCTTGGTACCCGTATCGT- 3′；
LEV-4：
5′-AATCAAACGCTAAGGTGATGGAGCAGTGCACCCATTCTTGGGC CGGCACGGACGCACGCAGAGACCCCGCAAGCTTGGTACCCGTATCGT -3′。
进一步地，核酸适配体的3′端或5′端修饰有功能基团或分子。
进一步地，功能基团或分子为同位素、电化学标记物、酶标记物、荧光基团、生物素、亲和配基或巯基。功能基团或分子用于提高适配体的稳定性、提供检测信号，或者用于连接适配体与其他物质形成组合物。
进一步地，特异性识别左旋咪唑的核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
构建初始文库及SEQ ID NO.4-5所示核苷酸序列的引物对，筛选得到具有高亲和力和高特异性的序列，得到所述特异性识别左旋咪唑的核酸适配体；
所述初始文库的序列在结构上符合下述通式所示的结构特征： 5′-AATCAAACGCTAAGG-N10-GTGCACCCATTCTTG-N30-AAGCTTGGTA CCCGTATCGT-3′，其中N代表碱基A、T、C、G中的任一个，N10代表随机片段长度为10个碱基，N30代表随机片段长度为30个碱基；
引物对的序列信息如下：
上游引物：5′-AATCAAACGCTAAGG-3′；
下游引物：5′-ACGATACGGGTACCAAGCTT-3′。
进一步地，采用文库固定、靶标游离的方法进行筛选。
与传统的SELEX相比，Capture-SELEX策略具有文库代替靶标固定化的特点，避免了靶标原始天然构象发生变化。同时，本发明创新性地设计了一个总长度为90nt的五段式文库，包括两端用于PCR扩增的引物序列，中间15nt的固定序列，以及介于引物序列和固定序列之间的两段随机序列。寡核苷酸文库通过固定序列被连接到链霉亲和素修饰的琼脂糖珠上。为了避免适配体能够结合靶标但不能进行结构转换，仍保持与固定化捕获探针结合的情况发生，固定序列被设计在文库序列的中间。另外这种两段随机序列的设计能创建更加灵活的单链区域，有助于随机序列来找到彼此，从而形成结构更为多样的适配体。本发明通过链霉亲和素修饰的琼脂糖珠和生物素修饰的捕获探针结合，将捕获探针固定在琼脂糖珠上，再通过碱基互补配对作用，将文库间接地固定到琼脂糖珠上。筛选以文库固定，靶标孵育，PCR扩增，单链制备为一个循环，重复进行多次，最终筛选出与左旋咪唑特异性结合的适配体。与目前现有的其他检测左旋咪唑的技术相比，基于Capture-SELEX 技术和独特设计的初始文库筛选出的核酸适配体能够高亲和力、高特异性的结合左旋咪唑。
本发明的第二个目的是提供一种基于左旋咪唑适配体的双模式纳米探针，所述双模式纳米探针包括上述核酸适配体、互补链和纳米片，所述纳米片为AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片或AuNPs/Co-TCPP(Fe)纳米片；
所述核酸适配体通过磁珠进行固定，所述互补链与核酸适配体部分互补，互补链5′端或3′端修饰巯基且通过Au-S共价键与纳米片连接。
进一步地，核酸适配体通过生物素-亲和素与磁珠连接，其中，亲和素优选为链霉亲和素。
进一步地，AuNPs/Cu-TCPP(Fe)或AuNPs/Co-TCPP(Fe)纳米片由金纳米粒子(AuNPs)负载于卟啉金属有机框架复合材料Cu-TCPP(Fe)或 Co-TCPP(Fe)上得到，通过氯金酸与Cu-TCPP(Fe)或Co-TCPP(Fe)在还原剂存在的条件下制备得到。
进一步地，还原剂包括但不限于柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。
进一步地，本发明的一实施例中，互补链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6 所示，为5′-ACGATACGGGTACCAAGC-3′，当然，本领域技术人员知晓，互补链可以根据需要选择与所用适配体部分互补的任一序列。
本发明利用筛选所得适配体设计了比色和SERS双模式检测左旋咪唑的方法。以AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片为例，首先合成了磁珠与 AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片杂交形成的复合物。使用Cu(NO3)2和TCPP(Fe) 配体在80℃下合成Cu-TCPP(Fe)纳米片。随着氯金酸和还原剂的加入，金纳米颗粒(AuNPs)逐渐被还原至Cu-TCPP(Fe)纳米片的表面，形成 AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片。纳米金的还原为后续巯基修饰的互补链(SH- 互补链)的连接提供了结合位点，同时也可作为拉曼基底增强纳米片自身的拉曼强度。SH-互补链通过金巯键被Cu-TCPP(Fe)纳米片后，形成互补链 /AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片，作为信号探针。与此同时，亲和素修饰的磁珠和生物素修饰的适配体(Bio-适配体)通过亲和素和生物素之间的相互作用连接形成适配体/磁珠，作为捕获探针。最后，互补链/AuNPs/Cu-TCPP(Fe) 纳米片和适配体/磁珠通过互补链与适配体之间的碱基互补配对作用连接在一起。至此，已制备出磁珠-AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片复合物。在靶标左旋咪唑存在的情况下，由于捕获探针中的适配体/磁珠与靶标结合，磁珠 -AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片复合物中的互补链/AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片被重新释放到上清液中，磁分离后上清液的比色和SERS性能得到提高，且信号的强度与左旋咪唑的添加浓度呈正相关。比色与SERS检测模式可以相互验证和补充，与单一的比色法相比更灵敏，与单一的SERS法相比更直观，具有很强的实际应用价值。后续基于该核酸适配体的检测技术可实现对食品中左旋咪唑残留的直接检测。基于该适配体的检测方法无需大型昂贵的仪器设备，无需复杂的样品前处理，无需专业的技术人员操作，具有操作简单、成本低等优点。目前尚未有关于左旋咪唑适配体传感方法的报道，本发明填补了关于左旋咪唑适配体检测的空白。
本发明的第三个目的是提供上述基于左旋咪唑适配体的双模式纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氯金酸与Cu-TCPP(Fe)或Co-TCPP(Fe)混合，在还原剂存在的条件下制备得到AuNPs/Cu-TCPP(Fe)或AuNPs/Co-TCPP(Fe)纳米片；
(2)将巯基修饰的互补链与所述AuNPs/Cu-TCPP(Fe)或 AuNPs/Co-TCPP(Fe)纳米片孵育，使互补链与纳米片偶联，得到互补链/纳米片；
(3)将所述互补链/纳米片与磁珠固定的核酸适配体孵育，得到所述双模式纳米探针。
本发明的第四个目的是提供上述特异性识别左旋咪唑的核酸适配体或基于左旋咪唑适配体的双模式纳米探针在检测左旋咪唑中的应用。
进一步地，所述的应用为，向双模式纳米探针体系中加入待测物孵育，一段时间后进行比色检测和/或拉曼检测，根据检测结果对待测物中的左旋咪唑进行定性和定量分析。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明通过设计一种五段式的结构复杂的初始文库，并采用文库固定、靶标游离的筛选方法，得到了与左旋咪唑特异性结合的核酸适配体。本发明还基于该核酸适配体和二维双功能AuNPs/Cu-TCPP(Fe)或 AuNPs/Co-TCPP(Fe)纳米片，构建了比色和SERS双模式的适配体传感方法检测左旋咪唑，弥补左旋咪唑适配体检测方法的空白。所提出的方法与色谱法相比成本低、不需要依赖大型仪器设备和专业技术人员，并且具有较好的检测线性范围。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为PCR扩增轮数和电泳结果；
图2为筛选进程中的相对荧光回收率；
图3为LEV-1～5的等温滴定量热曲线；
图4为左旋咪唑适配体的结合饱和曲线；
图5为左旋咪唑适配体特异性分析结果；
图6为LEV-5的二级结构示意图；
图7为比色和SERS双模式法检测左旋咪唑结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
一、与左旋咪唑特异性结合的核酸适配体的筛选
1.文库固定
(1)清洗链霉亲和素琼脂糖珠，以除去原有的保护液。将200μL链霉亲和素琼脂糖珠填充到重力离心柱中，加入等体积的SELEX反应缓冲液 (0.02M HEPES、1M NaCl、0.01MMgCl2、0.005M KCl，pH＝7.4)清洗。重复清洗5次，每次所用缓冲液体积与树脂用量相同。
(2)文库和捕获探针杂交。取一支1.5mL离心管，向其中加入1nmol 文库和1.5nmol的捕获序列，用STE缓冲液(0.01M Tris-HCl、0.1M NaCl、 0.001M EDTA)补齐至溶液总体积达500μL。文库和捕获探针在95℃下孵育5min后，取出离心管冷却至室温，此时文库与捕获探针杂交形成杂交双链。
(3)链霉亲和素琼脂糖珠与杂交双链结合。向清洗过的链霉亲和素琼脂糖珠中加入500μL上述杂交双链溶液，室温孵育10min，收集洗脱液，并再用此洗脱液重复孵育两次，以确保最大数量的文库固定到琼脂糖珠上。
(4)洗涤去除未结合在琼脂糖珠上的游离链。向重力离心柱中加入200 μL SELEX反应缓冲液清洗5次，以除去游离的核酸分子。缓冲液每次用量与树脂用量相同。如果重力柱中液体流速十分慢，可添加更多的缓冲液进行清洗。
根据Capture-SELEX进行适配体选择和扩增步骤，单链寡核苷酸文库首先与生物素修饰的捕获探针(5′-CAAGAATGGGTGCAC-Biotin-3′)杂交从而被固定在链霉亲和素修饰的琼脂糖珠上。
2.文库与靶标孵育
向重力柱中加入100μM的靶标溶液，孵育30min。与靶标特异性结合的序列随流出液流出被收集，未与靶标特异性结合的序列被留在柱子中，通过重力作用实现靶标特异性结合序列的分离。
3.PCR扩增
以与靶标特异性结合的DNA为扩增模板，FAM修饰的上游引物(FAM- 上游引物，5′-FAM-AATCAAACGCTAAGG-3′)和PolyA20修饰的下游引物 (PolyA20-下游引物，5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA/Spacer 18/ACGATACGGGTACCAAGCTT-3′)为两端引物，进行PCR扩增。PCR 扩增体系为H2O 40.5μL、10×PCR缓冲液5μL、dNTP 1μL、扩增模板2μL、 FAM-上游引物0.5μL、PolyA20-下游引物0.5μL、Taq聚合酶0.5μL，每个 PCR管中共加入50μL溶液。PCR扩增程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s。以变性、退火、延伸为一个循环扩增，直至在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示出单一明亮的条带。
靶标的加入会导致与靶标特异性结合的ssDNA脱落至溶液中，作为后续PCR扩增的模板DNA。为避免PCR过程中的非特异性扩增和副产物的生成，以与靶标特异性结合的ssDNA为模板，添加FAM修饰的上游引物和 PolyA20修饰的下游引物对扩增轮数进行优化。
PCR扩增轮数的优化电泳图(图1A)显示，第十二轮出现的条带单一明亮，因此选择12轮作为最终的循环轮数。
4.单链制备
(1)电泳分离。将扩增得到的多管含双链DNA的溶液转移到10mL 离心管中，加入等体积的2×TBE-Urea上样缓冲液稀释混匀，70℃水浴加热 5min使之充分变性后加入至预先制备好的8％变性聚丙烯酰胺凝胶上样孔中。上样缓冲液中含有尿素，使DNA保持单链构型。将凝胶连同玻璃板固定在电泳芯上，电泳槽中添加适量的1×TBE缓冲液(0.002M Tris、0.09M 硼酸、0.002M EDTA)，250V电压下电泳20min。
如图1B所示，电泳图显示了四条条带，由上到下依次为110nt的修饰了PolyA20的单链DNA，目标90nt的单链DNA，和两条引物片段。
(2)切胶回收。将扩增得到的产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电泳图显示上下两条条带。上端条带为PolyA20修饰的110nt的核酸序列，因修饰了PolyA20分子量较大，因此在电泳凝胶上移动较慢，下端条带为FAM修饰的90nt的核酸序列。选择性切下90nt的凝胶后，通过凝胶回收试剂盒回收目标单链，得到次级文库进入下一轮筛选。多次循环后，与靶标特异性结合的适配体不断富集。
二、循环筛选
为了提高适配体的亲和力，筛选过程中通过改变筛选条件(文库量、靶标浓度、时间等)来提高筛选压力，增加筛选所得适配体与靶标的亲和力。文库量从第一轮用到的1000pmol逐渐降低至100pmol，靶标浓度从第一轮的100μM降低至60μM，文库与靶标的孵育时间逐渐从120min降低至30 min。
为了提高适配体的特异性，在第7轮和第9轮加入靶标的结构类似物(地美硝唑)进行反筛。在加入反筛物质以除去与反筛物质结合的单链DNA之后，再加入靶标物质进行正向筛选，并不断提高筛选压力，以期得到高亲和力和高特异性的适配体序列。
三、筛选进程监测
因上游引物修饰了FAM基团，得到的次级文库也含有FAM修饰，因此可以通过相对荧光回收率来监测筛选进程。文库固定前初始荧光与文库固定后上清液(重力柱中流出的液体，包含有与靶标特异性结合而脱落的 ssDNA)剩余荧光之差为被固定在琼脂糖珠上的文库的荧光值，记为F0。靶标与文库孵育后，测量上清液的荧光值，记为F。F/F0即可得到相对荧光回收率。
如图2所示，当重复进行了6轮筛选后，相对荧光回收率稳步提高。为了提高筛选所得适配体的特异性，在第7轮和第9轮加入反筛物质进行反筛，此时由于反筛去掉了与反筛物质结合的部分DNA，故荧光强度略有下降。当相对荧光回收率再次提升到与之前相似的50％左右达到饱和时终止筛选程序。
四、高通量测序
首先使用无任何修饰的上游引物(5′-AATCAAACGCTAAGG-3′)和下游引物(5′-ACGATACGGGTACCAAGCTT-3′)将DNA序列扩增至相对荧光回收率达到饱和的轮数。以目标轮数的次级文库为扩增模板，无修饰的上游引物和无修饰的下游引物进行PCR扩增。然后进行PCR产物纯化试剂盒纯化。最后采用NanoDrop测定纯化过后DNA的浓度后，准备足够体积的DNA 溶液，送至安徽昂普拓迈公司进行高通量测序。第10轮产物经高通量测序后，选出测序出现次数最多的前5条序列作为候选适配体序列，命名为LEV 1-5，用于后续结合特性测定。候选适配体序列如表1所示。
表1高通量测序结果
Figure BDA0003657377190000111
五、亲和力特异性分析
SGI法分析适配体亲和力和特异性。亲和力测定实验中，将SGI染料加入一系列不同浓度的适配体溶液中，然后加入靶标溶液孵育2h。染料终浓度为1×，适配体终浓度为10、25、50、75、100、200、300nM，靶标溶液终浓度为1μM。空白组用缓冲溶液代替靶标溶液。设置激发波长为495nm、发射波长为530nm通过酶标仪测量荧光强度。样品组的荧光强度记为F，空白组的荧光强度记为F0。测定后，使用GraphPad Prism 9以适配体浓度为自变量，相对荧光强度(ΔF，ΔF＝F-F0)为因变量结合“one set of sites”模型来拟合曲线，进而得到Kd值。特异性测定实验中，分别使用靶标的结构类似物或共存物来代替靶标。其中，靶标所使用的类似物为地美硝唑、奥硝唑、甲硝唑、罗硝唑。
等温滴定量热法分析候选适配体亲和力。在滴定开始前，用10mM Tirs-HCl缓冲液溶解左旋咪唑的适配体和靶标溶液，然后将所有溶液8000 r/min离心脱气处理10min，以除去溶液中的微小气泡，以免影响滴定过程中的热量测定。滴定时，进样针装载100μM适配体溶液60μL，样品池中注入10μM靶标溶液240μL。设定进样针转速为750r/min，反应温度为25℃，以适配体溶液缓慢滴定靶标溶液。滴定后，以适配体与靶标的摩尔比为横轴，滴定峰的峰面积为纵轴，通过Malvern MicroCal PEAQ ITC分析软件自动拟合热动力学数据，得到拟合曲线，进而得到Kd值。
ITC法对左旋咪唑候选适配体的亲和力进行测定结果如图3所示，其中， (A)为LEV-1，(B)为LEV-2，(C)为LEV-3，(D)为LEV-4，(E) 为LEV-5。5条候选适配体与左旋咪唑结合的Kd值依次为3.41×10-6M (LEV-1)、4.33×10-6M(LEV-2)、5.06×10-6M(LEV-3)、0.824×10-6M (LEV-4)、1.78×10-6M(LEV-5)。同时采用SGI法对左旋咪唑候选适配体的亲和力进行分析，结果如图4所示(相对荧光强度＝荧光强度靶标+适配体-荧光强度缓冲液+适配体)，Kd值依次为115.3±16.93nM(LEV-1)、 130.3±25.58nM(LEV-2)、257.21±65.11nM(LEV-3)、43.68±5.206nM (LEV-4)、66.15±11.86nM(LEV-5)。Kd值越小，适配体与靶标的亲和力越高，虽然这两种方法所测得Kd值的具体数值不同，但亲和力都表现出 LEV-4>LEV-5>LEV-1>LEV-2>LEV-3的趋势。综合两种亲和力测定结果，选择Kd值较小的前3条适配体(LEV-4、LEV-5、LEV-1)进行后续特异性分析。
SGI检测法进行特异性分析结果如图5所示。可知，LEV-1对地美硝唑和甲硝唑的交叉反应率较低(在10％左右)，LEV-4对奥硝唑和甲硝唑的交叉反应率也低于30％，LEV-5对左旋咪唑的4种结构类似物(地美硝唑、奥硝唑、甲硝唑、罗硝唑)的交叉反应率(归一化荧光强度＝荧光强度结构类似物/荧光强度靶标×100％)均低于33％，优于LEV-1和LEV-4，因此确定 LEV-5是与左旋咪唑具有高亲和力高特异性的适配体序列(LEV-5的二级结构见图6)，并用于后续左旋咪唑检测方法的构建。
实施例2基于二维纳米片对左旋咪唑进行比色-拉曼双模式检测
一、Cu-TCPP(Fe)纳米片的合成
合成步骤如下：准确称取2.4mg Cu(NO3)2·3H2O、10.0mg PVP于带盖玻璃瓶中，向其中加入1.0M的三氟乙酸40μL，再向瓶中添加N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(9.0mL)和无水乙醇(3.0mL)混合溶液。然后在搅拌的状态下将溶解在DMF(3mL)和乙醇(1mL)的混合物中的4.4mg TCPP(Fe) 缓慢滴入溶液中。之后将瓶盖上盖子并超声处理15min，然后将瓶在80℃下水浴加热4h。最后，将得到的Cu-TCPP(Fe)纳米片用乙醇洗涤两次，以 11000r/min的速度离心10min后，将获得的Cu-TCPP(Fe)纳米片重新分散在水中备用。
二、AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片的合成
将100μL HAuCl4(10mM)添加到10mL Cu-TCPP(Fe)纳米片(0.1 mg/mL)的水溶液中后，搅拌此混合溶液1min，然后加入25μL新鲜制备的冷的NaBH4(0.1M)水溶液，立即用水洗涤混合物两次，之后以11000r/min 离心10min收集纳米片。最后，将AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片重新分散在水中备用。
三、互补链与AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片的偶联
纳米片的大尺寸可能会影响传感性能。因此，AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片在使用前应进行强超声波处理以获得分散溶液。
将500nM巯基修饰的互补链(SH-互补链， 5′-ACGATACGGGTACCAAGC-SH-3′)添加到0.1mg/mL的 AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片溶液(100μL)中，互补链与AuNPs/Cu-TCPP(Fe) 纳米片在37℃下偶联3h，其中SH-互补链已预先与TCEP(1mM)孵育1h。最后，10000r/min离心10min并用水洗涤以去除多余的互补链，获得互补链/AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片。
四、生物素修饰的适配体与链霉亲和素修饰的磁珠的偶联
向200μL的磁珠中加入等体积的缓冲液重悬，磁分离1min后弃上清。彻底清洗磁珠3次。将500nM生物素修饰的适配体(Bio-适配体， 5′-AATCAAACGCTAAGGTCAAGGGAGA GTGCACCCATTCTTGGGGCCCCGGGCCAGCCCCGACACGCCGCCGAA GCTTGGTACCCGTATCGT-Biotin-3′)添加到洗涤过后的链霉亲和素修饰的磁珠中。孵育30min后，磁力架吸附混合溶液，清洗磁珠以去除游离的适配体。最后将适配体/磁珠重新分散在水中。
五、互补链/AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片与适配体/磁珠的连接
在成功制备适配体/磁珠和互补链/AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片探针的基础上，通过碱基配对杂交形成复合物。将上述步骤中成功制备的适配体/磁珠和互补链/AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片探针混合在一起。2mg/mL的适配体 /磁珠与0.1mg/mL的互补链/AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片混合并孵育过夜。最后，通过在磁力架中分离1min并用水洗涤来去除多余的游离的纳米片。
六、比色和SERS双模式法检测左旋咪唑
首先，将不同终浓度的100μL左旋咪唑标准溶液(0、1、5、10、25、 50、100、200μM)添加到100μL磁珠-AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片中。接下来，将混合物在37℃下再孵育30min，磁力架吸附后测量上清液的SERS 强度和比色强度。比色检测具体如下：在10μL含有AuNPs/Cu-TCPP(Fe) 纳米片的上清液中加入100μL TMB单组份显色溶液孵育15min，然后加入 25μL 2％H2SO4溶液停止显色。之后，用酶标仪测定450nm处的吸光度。表面增强拉曼光谱仪的参数设置为激光强度6mW和采集时间4s。添加不同浓度的左旋咪唑来评估适配体传感方法的性能。结果如图7所示，其中， (A)为不同浓度左旋咪唑的紫外可见光谱响应，(B)为450nm处相对吸光度与左旋咪唑浓度的标准曲线，(C)为不同浓度左旋咪唑的SERS光谱响应，(D)为1361cm-1处相对SERS强度与左旋咪唑浓度的标准曲线。
对于比色模式，图7显示了适配体传感方法的比色强度随着左旋咪唑浓度的增加而增加，这是由于适配体与靶标结合后，纳米片与磁珠分离，从而被重新释放到上清液中，上清液的比色和SERS强度提高。理论上讲，所加入的靶标浓度与检测强度成正比，因为高浓度的左旋咪唑引起了更多 AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片的释放。在5nM～100nM的范围内，450nm处的吸光度变化值与左旋咪唑浓度之间呈线性关系(图7B)。线性回归方程可以拟合为y＝0.00432x+0.00157(R2＝0.98949)，LOD为5nM(3σ/k，σ和k是空白测量的标准偏差(n＝5)和校准曲线的斜率)。
同样，对于SERS模式，SERS强度也随着左旋咪唑浓度的升高而逐渐增加(图7C)，选择AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片在1361cm-1处的拉曼峰建立曲线，结果如图7D所示，相对SERS强度(样品组和空白组的SERS强度之差)在1nM～200nM范围内与左旋咪唑浓度呈正比。线性回归方程为 y＝26.22586x+152.91798(R2＝0.99245)，LOD为1.12nM(n＝5)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 江南大学
<120> 特异性识别左旋咪唑的核酸适配体及其双模式纳米探针和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 90
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
aatcaaacgc taaggtcaag ggagagtgca cccattcttg gggccccggg ccagccccga 60
cacgccgccg aagcttggta cccgtatcgt 90
<210> 2
<211> 90
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
aatcaaacgc taaggtaagg acgaggtgca cccattcttg ggcacgcggc acgcgcgagg 60
acgaccaggc aagcttggta cccgtatcgt 90
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
aatcaaacgc taaggtgatg gagcagtgca cccattcttg ggccggcacg gacgcacgca 60
gagaccccgc aagcttggta cccgtatcgt 90
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
aatcaaacgc taagg 15
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
acgatacggg taccaagctt 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
acgatacggg taccaagc 18

Claims (10)

1.一种特异性识别左旋咪唑的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1-3所示之一。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体的3′端或5′端修饰有功能基团或分子。
3.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于：所述功能基团或分子为同位素、电化学标记物、酶标记物、荧光基团、生物素、亲和配基或巯基。
4.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的筛选方法包括以下步骤：构建初始文库及SEQ ID NO.4-5所示核苷酸序列的引物对，进行亲和力筛选和特异性筛选，得到所述特异性识别左旋咪唑的核酸适配体；
所述初始文库的序列在结构上符合下述通式所示的结构特征：5′-AATCAAACGCTAAGG-N10-GTGCACCCATTCTTG-N30-AAGCTTGGTACCCGTATCGT-3′，其中N代表碱基A、T、C、G中的任一个，N10代表随机片段长度为10个碱基，N30代表随机片段长度为30个碱基。
5.一种基于左旋咪唑适配体的双模式纳米探针，其特征在于：所述双模式纳米探针包括权利要求1-4任一项所述的核酸适配体、互补链和纳米片，所述纳米片为AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片或AuNPs/Co-TCPP(Fe)纳米片；
所述核酸适配体通过磁珠进行固定，所述互补链与核酸适配体部分互补，互补链5′端或3′端修饰巯基且通过Au-S共价键与纳米片连接。
6.根据权利要求5所述的双模式纳米探针，其特征在于：所述AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片或AuNPs/Co-TCPP(Fe)纳米片由金纳米粒子负载于卟啉金属有机框架Cu-TCPP(Fe)或Co-TCPP(Fe)上得到。
7.根据权利要求5所述的双模式纳米探针，其特征在于：所述核酸适配体通过生物素、亲和素与磁珠连接。
8.根据权利要求5所述的双模式纳米探针，其特征在于：所述互补链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
9.权利要求5-8任一项所述的双模式纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将氯金酸与Cu-TCPP(Fe)或Co-TCPP(Fe)混合，在还原剂存在的条件下制备得到所述纳米片；
(2)将巯基修饰的互补链与所述纳米片孵育，得到互补链/纳米片；
(3)将所述互补链/纳米片与磁珠固定的核酸适配体孵育，得到所述双模式纳米探针。
10.权利要求1-4任一项所述的核酸适配体或权利要求5-8任一项所述的双模式纳米探针在检测左旋咪唑中的应用。
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