KR100450864B1

KR100450864B1 - Ｒｎａ 표적 분자에 대해 특이성이 향상된네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100450864B1
Application number: KR10-2001-0073358A
Authority: KR
Inventors: 유재훈; 이종국; 권미윤; 신계정
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2001-11-23
Filing date: 2001-11-23
Publication date: 2004-10-01
Also published as: AU2002221188A1; WO2003044034A1; US20050009765A1; US7022839B2; KR20030042632A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체, 그의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 네오마이신-클로람페니콜이 헤테로 이합체(heterodimer) 구조를 가짐으로써 RNA 모티프(motif)인 스템(stem)과 룹(loop)을 인식할 수 있으며, 특정의 RNA에 대해 우수한 결합력을 나타내어 약의 효능을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 비특이적 약물에 의한 부작용을 대폭적으로 감소시켜 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항암제에 유용하게 사용할 수 있다.

화학식 1

(상기 식에서, n은 명세서 내에서 정의한 바와 같다.)

Description

ＲＮＡ 표적 분자에 대해 특이성이 향상된 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체 및 그의 제조방법{Heterodimeric conjugates of neomycin-chloramphenicol to enhanced specificity against RNA targets and method for preparing thereof}

본 발명은 네오마이신(neomycin)과 클로람페니콜(chloramphenicol)이 스페이서(spacer)로 연결된 하기 화학식 1로 표시되는 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체, 그의 제조방법 및 그를 유효성분으로 하는 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항암제에 관한 것이다.

현재 대부분의 약은 유전자의 마지막 산물인 단백질을 표적 분자로 사용하는 것으로, 전체 약물의 70∼80 %를 점유하고 있다. 그러나, 유전체(genome)의 산물중 하나인 RNA(ribonucleic acid)에 분자가 약의 표적 분자가 될 수 있다는 것이 잘 알려지면서, RNA에 작용할 수 있는 안티센스(anti-sense) 형태의 약에 대한 관심이 높아지고 있다.

구체적으로, 상기 안티센스 형태의 약은 주로 RNA 분자를 표적 분자로 하는 것으로서, RNA 표적 분자의 염기서열을 알고 그것에 대해 왓슨-클릭(Watson-Click)의 짝염기(base pair)를 이룰 수 있는 안티센스 염기서열을 가진 올리고머(oligomer) RNA를 사용함으로서 특정 RNA를 제압할 수 있다고 생각하였다. 그러나, RNA 표적 분자에 대한 형태학적인 연구가 진행되면서, RNA 표적 분자가 항상 역동적으로 여러 가지 형태를 가지고 있지만, RNA 표적 분자가 스스로 가장 안정한 형태가 되기 위해서는 스스로가 폴딩(folding)되어 짝염기를 이루고 있어 안티센스 약의 효능이 높지 않음을 알 수 있었다.

또한, 짝염기의 형성은 DNA와는 다르게 짝염기를 이루지 못하는 부분인 룹 구조(loop structure)를 가지고 있으며, 이들 부분은 짝을 이룬 부분인 스템과 함께 독특한 2차 구조 또는 3차 구조를 이루고 있다는 것이 발견되었다. 이들의 3차 구조는 결국 염기서열 특이적인 3차원적인 구조를 형성하고, 작은 화합물들이 잘 결합할 수 있는 안정된 주머니 모양을 이루고 있다.

상기 주머니 모양의 RNA 구조는 최근에 연구되어지는 것으로, 생체 내의 단백질 생산 공장인 리보솜(ribosome)에서 쉽게 발견된다. 리보솜 전체 무게의 반 이상을 차지하는 RNA 분자인 리보소말 RNA(ribosomal RNA, 이하 "rRNA"라 칭한다.)는 염기서열 특이적인 2차원적 또는 3차원적인 구조를 하고 있으며, 또한 이처럼 염기서열 특이적 구조는 중요한 표적 분자로서 대두 될 수 있다. 최근까지 알려진 바에 의하면 대장균 등의 16S rRNA의 디코딩 지역 A 사이트(decoding region A site)의 20 여 개의 RNA 염기 서열은 매우 잘 보존되어 있으며, 이것이 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 라는 일반적인 RNA 결합 화합물의 작용점이 된다는 것을 밝혀내었다. rRNA와 아미노글리코사이드의 결합은 매우 특이적이며, 스템을 이루고 있는 RNA에 아미노글리코사이드가 결합함으로서, 스템의 구조가 약간 벌어진 형태의 넓어진 룹 형태(extended loop)를 이루고 있는 것이 밝혀졌다.

16S rRNA의 특정한 RNA 뿐만이 아니라 rRNA에는 특정한 염기서열을 가진 특정한 구조가 여러 가지 존재하고 있다. 따라서 이들은 매우 좋은, 또한 검증된 표적 분자이므로 이들에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물의 창출은 단백질 합성을 저해할 수 있는 새로운 선도물질 또는 후보물질로 개발될 수 있다. 또한, rRNA 뿐만이 아니라 특이적 염기서열과 이에 상응하는 RNA의 특이적 구조는 바이러스로부터 고등생물까지의 모든 부분에서 밝혀지고 있으며, HIV 바이러스의 경우에는 바이러스가 필요한 단백질을 생산하기 위한 메신저 RNA(messenger RNA, 이하 "mRNA"이라 칭한다.)의 일부에 이처럼 특이적인 염기서열과 그 입체적 구조(2차원적 또는 3차원적 구조)를 가지고 있다. Rev 결합 단백질(Rev binding protein) 또는 TAR 결합 단백질(TAR binding protein)들이 이와 같은 특이적인 RNA 모티프(motif)와 결합하는 단백질로 알려져 있으며, 결국 바이러스가 필요로 하는 단백질을 잘 만들기 위한 단백질 생합성(translation)을 활성화하는 역할을 하고 있다. 이와 같은 특이적 단백질이 결합할 수 있는 mRNA는 주로 생합성 되는 단백질의 5'-생합성 되지 않는 지역(5'-untranslated region, 이하 "5'-UTR"라 칭한다.) 또는 3'-생합성 되지 않는 지역(3'-untranslated region, 이하 "3'-UTR"라 칭한다.)에 존재하므로 단백질의 생합성 그 자체와는 큰 관계를 가지지 않는다. 일반적으로 이들의 역할은 HIV 바이러스의 경우와 마찬가지로 목표로 하는 단백질의 효율적인 생합성 과정을 돕는 것이라 할 수 있다. 그러나, 이처럼 특이적인 RNA 모티프를 5'-UTR에 갖게됨으로서 특이적인 단백질 생합성 조건을 만들어 줄 수 있다는 것이며, 따라서 단백질 생합성을 조절할 수 있는 한가지 방법으로 쓰이고 있다. 최근에 발견된 이들 예로는 피코나바이러스(picornavirus) 또는 HCV(hepatitis C virus)에 5'-UTR에 리보솜으로 들어가는 부분(internal ribosome entry site, 이하 "IRES"라 칭한다.)이라는 특이적인 RNA 모티프가 발견 되었다. 더구나, 이와 같은 IRES는 바이러스 등의 하등 생물에만 국한되지 않고, 많은 등뼈동물의 세포질 내에 존재하는 mRNA에서도 발견되고 있다. 예를 들어 인간 면역단백질 중쇄 결합 단백질(human immunoglobulin heavy chain binding protein, BiP), 열충격 단백질 70(heat shock protein 70, HSP70), 인간 섬유모세포 성장 인자 2(human fibroblast growth factor 2, FGF2), 내피 증식 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 등의 mRNA의 5'-UTR 에서도 이처럼 특징적인 구조를 가진 IRES가 발견되고 있다. 생물학적인 실험을 통하여 이들 세포질 단백질의 IRES를 변형시킨 mRNA를 넣은 세포에서, 정상에서는 감지되지 않는 생물학적인 여러 변화가 관찰되고 있다. 특히, 고등동물의 세포질에서 발견되는 IRES를 가진 단백질들은 그것의 세포 내의 농도가 그들의 활성을 결정하는데 결정적으로 중요하므로, 이들 단백질의 생합성이 전사 후 단계 (post-transcriptional stage)에서 조절된다는 의미를 가지고 있으므로 이들 세포질 단백질의 IRES도 매우 중요한 표적 RNA로 대두 될 가능성이 매우 크다.

한편, RNA를 표적으로 이에 잘 결합하는 화합물 중 상기 아미노글리코사이드 계열이 천연물에서 발견되었다. 이들의 구조의 특이성은 여러 개의 육탄당 고리화합물로 구성되어 있으며, 각각의 육탄당에 적어도 한 개의 아미노 작용기를 가지고있다. 실제로 가장 RNA와 결합을 잘하는 네오마이신의 경우, 6 개의 아미노산을 가지고 있으며, 하이드록실기도 여러 개 존재한다. 여러 가지 형태의 아미노글리코사이드가 가능한데, 이들은 아미노기나 하이드록실기의 위치나 갯수들이 조금씩 다른 형태를 하고 있다. 이들 아미노글리코사이드와 목표 RNA의 결합은 생리학적 pH에서 양이온 하전된(positively charged) 아미노기와 음이온으로 하전된(negatively charged) RNA 골격의 포스페이트(phosphate) 음이온 간의 전하간 인식(electrostatic interaction)으로 알려져 있다. 또한, 히드록실기 또는 아미드 작용기가 RNA 내에 있는 여러 작용기와 수소 결합을 이루어, 목표 분자인 RNA와 아미노글리코사이드 두 분자간의 강한 결합력을 나타낸다. 여러 가지 아니모글리코사이드 중 비교적 결합력이 강한 네오마이신의 경우, 대부분의 RNA 모티프에 마이크로몰(microM) 정도의 결합력을 나타내지만, 결합력의 특이성은 비교적 없는 것으로 조사되고 있다. 실제오 이와 같은 네오마이신이 좀 더 좋은 약이 되기 위해서는 마이코로몰 정도의 결합력을 100∼1000 배 향상 시켜 나노몰 정도의 결합력을 가지리 수 있게 하는 전략이 필요하다.

일반적으로, 특이성이 적은 화합물을 특이성 있게 만드는 노력이 여러 방면으로 진행 중이며, 특이적인 결합을 보이지 않는 아미노글리코사이드를 특이적 화합물로 만들려는 시도가 진행되고 있다. 첫 번째, 기존의 아미노글라이코사이드의 호모-이합체(homo-dimer)를 제조하는 것으로, 선진국의 연구진들이 이와 같은 아미노글라이코사이드 호모-이합체를 만들어 특정 RNA에 특이적인 결합성을 높이는 연구를 진행하였다. 결합력을 가진 두 개의 같은 부위는 일반적으로 강한 결합력을나타내는 것으로 알려져 있으므로, 아미노글루코사이드의 호모이합체(homodimer)는 특정 RNA에 특이성이 증진된 형태를 나타낼 수 있으리라 예상하고 있다. 그러나, 아미노글리코사이드 호모-이합체는 그 결합 부위가 RNA에 2 개 이상 존재할 때 만이 큰 결합력 변화가 관측되었을 뿐, 화합물이 가지는 특이성에는 큰 변화가 없었다. 둘째는 헤테로-이합체(heteo-dimer) 아미노글리코사이드를 제조하는 것으로, 아미노글라이코사이드와 새로운 작용기를 가진 화합물을 결합하는 것이다. 스크립스 연구소(Scripps Research Institute)의 토르와 그 연구진(Tor Group) 이 최근 진행한 연구에 의하면, 아크리딘(acridine) 이라는 조그마한 화합물을 아미노글리코사이드에 붙인 화합물을 만들었을 때, RRE RNA 모티프에 기존의 아미노글리코사이드에 비하여 약 100배 정도의 특이성의 증진을 가져 온 것을 발견하였다. 더구나 이와 같은 특이성의 증가가 아미노글리코사이드에 연결한 아크리딘과 RNA 스템 부분에 돌출된 틈의 염기와의 인식에 의하여 기인되는 것으로 조사되었다. 상기 결과는 RNA에 있는 두 개의 다른 부분을 인식할 수 있는 두 개의 분자를 연결하는 화합물의 제조 즉, 헤테로-이합체 제조는 RNA와 화합물간의 특이성과 선택성을 증가시키는 기본적인 전략이며, 본 발명자는 이와 같은 전략을 확대함으로서 RNA에 특이적인 약을 개발할 수 있을 것으로 예상하고 있다.

이에, 본 발명자들은 클로람페니콜과 네오마이신을 스페이서로 결합시킨 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체를 합성하였으며, 본 발명의 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체가 특정의 RNA에 대한 결합력이 우수하였으며, RNA의 스템과 룹을 동시에 인식하며, 또한 염기서열 특이적 특성을 가지고 있음을 알아내어본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 특정 RNA의 스템과 룹을 동시에 인식하며, 특정 RNA에 대해 결합력이 우수한 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체, 그의 제조방법 및 그의 용도를 제공하는 것이다.

구체적으로, 본 발명의 목적은 네오마이신과 클로람페니콜이 스페이서로 연결된 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 네오마신-클로람페니콜 헤테로 이합체의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 네오마신-클로람페니콜 헤테로 이합체를 유효성분으로 하는 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항암제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 네오마이신과 클로람페니콜이 스페이서로 연결된 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체를 제공한다.

본 발명은 상기 네오마신-클로람페니콜 헤테로 이합체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 네오마신-클로람페니콜 헤테로 이합체를 유효성분으로 하는 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항암제를 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(neomycin-chloramphenicol heterodimer)를 포함한다.

(상기식에서 n은 2∼10의 정수이며,

바람직하게는 3, 6 또는 9이다.)

상기 화학식 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체는 네오마이신과 클로람페니콜의 중심 골격을 적당한 길이의 탄소 사슬을 가진 스페이서로 연결되어 있는 구조를 가지고 있다.

구체적으로, RNA의 룹에 잘 결합하는 화합물로 알려진 클로람페니콜과 아미노글리코사이드 중에서 RNA에 대한 결합력이 가장 뛰어난 네오마이신을 상기 두 화합물의 약효 중 가장 덜 영향을 미치는 부위를 선택하여 스페이서를 이용하여 결합하였다. 상기 스페이서는 디메르캅토 화합물을 이용하였으며, 바람직하게는 스페이서의 탄소수가 3, 6 또는 9개이다.

본 발명의 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체는 RNA의 구조에서 흔히 발견되는 스템과 룹을 동시에 인식할 수 있다. 하기 실시예에 따르면, 기존에 잘 알려진 2차 구조와 3차 구조를 가진 RNA인 16S RNA, HIV의 표적 RNA로 알려진 RRE RNA 및 고등동물의 메타볼리즘(metabolism)에 중요한 역할을 하는 TS RNA에 대해 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체의 결합력을 측정한 결과, 종래 네오마이신에 비해 강한 결합력을 보였으며, 특히 n이 6인 하기 실시예에 2의 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체는 16S rRNA에 특이적으로 결합하여 약 10 nM 이하의 강한 결합력을 나타내었으며, 네오마이신(2 microM)과 비교하여 200 배의 특이성의 증진을 확인할 수 있었다. 상기 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체의 특이성의 증가는 다른 RNA 모티프에서는 관측되지 않았으며, 이는 스텝과 룹을 동시에 인식시키는 일반적인 결합력의 증가에서 기인된 것이 아니라 16S rRNA가 소유하고 있는 스텝과 룹을 이루는 특이적 염기서열에 의하여 결정됨을 알 수 있다.

본 발명은 하기 반응식 1로 표시되는 네오마신-클로람페니콜 헤테로 이합체의 제조방법을 포함한다.

구체적으로,

(1R,2R)-2-(9-브로모아세틸아미도-1-(4-니트로페닐)-1,3-t-부틸디메틸실릴옥시프로판(화학식 2)를 염기 존재하에 화학식 3의 화합물과 반응시켜 화학식 8의 화합물을 얻는 단계(단계 1), 및

얻어진 화학식 8의 화합물과 탈보호제를 반응시켜 상기 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체를 제조한다.

(상기 식에서, X는 할로겐 원소이며,

n은 2∼10의 정수이며, 바람직하게는 3, 6 또는 9이다.)

단계 1은 염기 존재하에 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 상온에서 5∼10 시간 동안 반응시켜 화학식 8의 화합물을 얻는 것으로, 상기 염기는 K₂CO₃, Na₂CO₃또는 Cs₂CO₃를 사용하며, 바람직하게는 Cs₂CO₃를 사용한다. 이때 용매는 DMF(dimethylformamide), DMSO(dimethyl sulfoxide) 또는 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하며, 바람직하게는 DMF를 사용한다.

단계 2은 화학식 8의 화합물의 실릴기를 탈보호화 하기 위해 테트라부틸암모늄프루오리드(tetrabutylamoniumfloride), 불산, 불산 피리딘염, 염산, 황산 또는 질산을 사용하며, 바람직하게는 테트라부틸암모늄프루오리드를 사용한다. 또한,t-부틸옥시카르보닐기(t-butyloxycarbonyl)를 탈보호화 하기 위해 염산, 황산, 질산, 초산 또는 삼불화초산을 사용하며, 바람직하게는 삼불화초산을 사용한다.

또한, 상기 반응식 1에서 보는 바와 같이, 화학식 2의 화합물 및 화학식 3의 화합물은 다양한 방법을 통하여 제조가 가능하다.

일예로, 상기 화학식 2의 화합물은, 하기 반응식 2와 같이,

(1R,2R)-(-)-2-아미노-1-(4-니트로페닐)-1,3-프로판디올과 9-플루오렌닐메틸 숙신이미도 카르보네이트를 반응시켜 9-플루오렌닐메틸옥시카르보닐로 보호된 화학식 4의 화합물을 얻는 단계(단계 1),

얻어진 화학식 4의 화합물에t-부틸디메틸실릴트리플레이트를 반응시켜 알콜기가 t-부틸디메틸실릴시로 보호된 화학식 5를 얻는 단계(단계 2),

얻어진 화학식 5의 화합물에 피페리딘을 반응시켜 아민기만 탈보호된 화학식6의 화합물을 얻는 단계(단계 3) 및,

얻어진 화학식 6의 화합물을 염기 존재하에 아실화 시약과 반응시켜 화학식 2의 화합물을 얻는 단계(단계 4)로 제조한다.

(상기 식에서, TBS는 TBS는t-부틸디메틸실릴기이며,

X는 할로겐이다.)

단계 1은 아민기를 9-플루오렌닐메틸옥시카르보닐로 보호하는 반응에 있어서, 9-플루오렌닐메틸 크로로포르메이트 또는 9-플루오렌닐메틸 펜타플루오로페닐 카르보네이트를 사용할 수 있으나, 또한 9-플루오렌닐메틸 숙신이미도 카르보네이트를 에테르와 물의 혼합용액에서 염기로 NaHCO₃를 사용하는 것이 수율 및 반응성에서 바람직하다.

단계 2는 알콜기를t-부틸디메틸실릴기로 보호하는 반응에 있어서, 일차 및 이차알콜기를 한번에t-부틸디메틸실릴기로 보호하기 위하여t-부틸디메틸실릴트리플레이트를 이염화탄소 존재하에, 0℃에서 반응시킨다.

단계 3은 9-플루오렌닐메틸옥시카르보닐로 보호된 아민기의 선택적인 탈보호화 반응에 있어서, 이염화탄소를 용매로 하고 용매에 대하여 20 % 농도의 피페리딘을 사용하여 실온에서 반응을 진행시킨다.

단계 4는 이염화탄소 존재하여 0 ℃에서 아민기의 아실화 반응 시키는 것으로, 아실화 시약은 브로모아세틸브로미드, 브로모아세틸클로리드, 클로로아세틸브로미드 또는 클로로아세틸클로리드를 사용하며, 바람직하게는 브로모아세틸브로미드를 사용한다. 염기는 피리딘, 루티딘과 같은 방향족 아민이나 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민과 같은 지방족 아민을 사용하며, 바람직하게는 피리딘을 사용한다.

상기 화학식 3의 화합물은 하기 반응식 3과 같이, 화학식 7의 화합물을 염기 존재하에 디메르캅토 화합물과 반응시켜 얻어진다.

(상기식에서, n은 2∼10의 정수이며, 바람직하게는 3, 6 또는 9이다.)

화학식 7로 표시되는 아민기가t-부틸옥시카르보닐기로 보호되고 일차알콜기가 트리이소프로필술포닐기로 치환된 화합물은 네오마이신으로부터 종래 공지된 방법으로 제조하였다.

구체적으로, 화학식 3의 화합물은 디메르캅토 화합물과 화학식 7의 화합물을 염기 존재하에 치환반응시켜 제조한다. 상기 디메르캅토 화합물은 1,3-프로판디티올, 1,6-헥산디티올 또는 1,9-노난디티올이 바람직하며, 염기는 K₂CO₃, Na₂CO₃또는 Cs₂CO₃를 사용하며, 또한 용매는 DMF, DMSO 또는 아세토니트릴을 사용한다.

또한, 본 발명은 상기 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체를 유효성분으로 하는 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항암제를 포함한다.

화학식 1의 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체는 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 화학식 1의 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 ㎏당 화학식 1의 화합물을 0.1∼50 ㎎의 양으로 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으며, 바람직하기로는 0.1∼10 ㎎이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.

단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1> (1R,2R)-2-브로모아세틸아미도-1-(4-니트로페닐)-1,3-t-부틸디메틸실릴옥시프로판의 제조

하기 반응식 3에 나타낸 바와 같이 합성을 실시하였다.

(단계 1) (1R,2R)-2-(9-플루오렌닐메틸카바모일)-1-(4-니트로페닐)-1,3-프로판디올의 합성

3.00 g의 (1R,2R)-(-)-2-아미노-1-(4-니트로페닐)-1,3-프로판디올과 28 ㎖의 NaHCO₃수용액을 140 ㎖의 에테르와 혼합한 후, 4.77 g의 9-플루오렌닐메틸 숙신이미도 카르보네이트를 첨가하고 24시간 동안 교반하였다. 상기 반응시킨 혼합물을 1 N의 염산 수용액에 쏟아 붓는다. 이때 생성된 흰색의 침전물은 거름종이를 이용하여 제거하였다. 상기 침전물을 제거한 여액을 분배시켜 유층을 분리하고, 상기 유층을 염산 희석액과 포화된 소금물로 씻어주었다. 유층을 무수 MgSO₄로 건조시키고 감압하에 농축하여 흰색의 고체를 얻었다. 상기 흰색의 고체를 EtOAc/헥산 혼합 용매 시스템으로 재결정하여 5.83 g의 흰색의 결정인 (1R,2R)-2-(9-플루오렌닐메틸카바모일)-1-(4-니트로페닐)-1,3-프로판디올을 얻었다. 수율은 95%였다.

¹H NMR (CD₃OD, 300 MHz) δ8.13(d, J=8.7 Hz, 2H), 7.79(d, J=7.4 Hz, 2H), 7.62∼7.55(m, 4H), 7.39(t, J=7.3 Hz, 2H), 7.32∼7.26(m, 2H), 5.08(s, 1H), 4.30∼4.08(m, 3H), 3.91∼3.86(m, 1H), 3.80∼3.74(m, 1H), 3.59∼3.49(m, 1H).

(단계 2) (1R,2R)-2-(9-플루오렌닐메틸카바모일)-1-(4-니트로페닐)-1,3- t -부틸디메틸실릴옥시프로판의 합성

2.90 g의 (1R,2R)-2-(9-플루오렌닐메틸카바모일)-1-(4-니트로페닐)-1,3-프로판디올을 67 ㎖의 이염화탄소에 넣은 후 섞어 주었다. 상기 혼합물에 3.1 ㎖의 2,6-루티딘(2,6-lutidine)과 4.6 ㎖의t-부틸디메틸실릴트리플레이트(t-butyldimethylsilyltriflate)를 0 ℃에서 넣고, 같은 온도에서 4 시간 동안 교반하였다. 상기 반응시킨 혼합물을 이염화탄소로 희석시킨 후, 염산 희석액과 포화된 소금물로 씻었다. 상기 혼합물을 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(EtOAc:hexane=1:10) 방법으로 정제하여 99 ㎎의 시럽같은 (1R,2R)-2-(9-플루오렌닐메틸카바모일)-1-(4-니트로페닐)-1,3-t-부틸디메틸실릴옥시프로판을 얻었다. 수율은 95%였다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ8.18(d, J=8.6 Hz, 2H), 7.79(d, J=7.5 Hz, 2H), 7.57∼7.28(m, 8H), 5.20(d, J=2.0 Hz, 1H), 5.11(d, J=9.0 Hz, 1H), 4.33(d, J=7.1 Hz, 2H), 4.20(d, J=6.9 Hz, 1H), 3.79∼3.75(m, 1H), 3.62(d, J=7.1 Hz, 2H), 0.98∼0.90(m, 18H), 0.14∼0.06(m, 6H).

(단계 3): (1R,2R)-2-아미노-1-(4-니트로페닐)-1,3- t -부틸디메틸실릴옥시프로판의 합성

3.79 g의 (1R,2R)-2-(9-플루오렌닐메틸카바모일)-1-(4-니트로페닐)-1,3-t-부틸디메틸실릴옥시프로판과 4.0 ㎖의 피페리딘(piperidine)을 16.0 ㎖의 DMF(dimethylformamide)에 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응시킨 혼합물을 물에 쏟아 붇고 150 ㎖의 에틸아세테이트로 3번 반복하여 유기층을 추출하였다. 추출된 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 상기 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(EtOAc:hexane=1:10)방법으로 정제하여 2.47 g의 시럽같은 (1R,2R)-2-아미노-1-(4-니트로페닐)-1,3-t-부틸디메틸실릴옥시프로판을 얻었다. 수율은 98%이었다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ8.21(d, J=8.6 Hz, 2H), 7.49(d, J=8.7 Hz,2H), 4.90(d, J=4.4 Hz, 2H), 3.55(dd, J=10.0, 6.3 Hz, 1H), 3.40(dd, 10.0, 5.1 Hz, 1H), 2.77∼2.71(m, 1H), 0.94(s, 9H), 0.93(s, 9H), 0.09(s, 3H), 0.07(s, 6H), -0.13(s, 3H).

(단계 4): (1R,2R)-2-브로모아세틸아미도-1-(4-니트로페닐)-1,3- t -부틸디메틸실릴옥시프로판의 합성

1.67 g의 (1R,2R)-2-아미노-1-(4-니트로페닐)-1,3-t-부틸디메틸실릴옥시프로판을 12.6 ㎖의 이염화탄소에 녹인 후, 이 용액에 0.77 ㎖의 피리딘(pyridine)과 0.43 ㎖의 브로모아세틸 브로미드(bromoacetyl bromide)를 0 ℃에서 첨가하였다 상기 온도에서 1시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸아세테이트로 희석하고 포화된 소금물로 씻어 주었다. 상기 씻겨진 용액을 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(EtOAc:hexane=1:10)방법으로 정제하여 2.00 g의 시럽같은 (1R,2R)-2-브로모아세틸아미도-1-(4-니트로페닐)-1,3-t-부틸디메틸실릴옥시프로판을 얻었다. 수율은 94%이었다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ8.18(d, J=8.7 Hz, 2H), 7.47(d, J=8.6 Hz, 2H), 7.07(d, J=8.9 Hz, 1H), 5.21(d, J=2.2 Hz, 1H), 3.98∼3.90(m, 1H), 3.85(d, J=14.2 Hz, 1H), 3.75(d, J=14.2 Hz, 1H), 3.63∼3.52(m, 2H), 0.95(s, 9H), 0.93(s, 9H), 0.12(s, 3H), 0.10(s, 3H), 0.08(s, 3H), -0.15(s, 3H).

<제조예 2> 아민기가 t -부틸옥시카르보닐기로 보호되고 일차알콜기가 메르캅토기를 함유하는 탄소사슬로 치환된 네오마이신의 합성

본 발명의 반응식 3에 나타낸 바와 같이 반응을 실시하였다.

(n=3인 경우)

880 ㎎의 화학식 7의 화합물을 11.8 ㎖의 DMF에 녹인 다음, 0.48 ㎖의 1.3-프로판디티올(1,3-propane-di-thiol)과 365 ㎎의 Cs₂CO₃를 상온에서 첨가하였다. 9시간 동안 상온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 물에 쏟아 부었다. 그리고, 100 ㎖의 EtOAc로 3번 반복하여 추출하였다. 추출한 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 680 ㎎의 흰색의 고체인 화학식 3의 화합물(n=3)을 88%의 수율로 얻었다.

¹H NMR (CD₃OD, 300 MHz) δ6.43(br s, 1H), 5.38(s, 1H), 5.14(s, 1H), 4.93(s, 1H), 4.25(s, 1H), 4.11(d, J=4.8 Hz, 1H), 3.90∼3.82(m, 2H), 3.76∼3.68(m, 2H), 3.58∼3.19(m, 15H), 3.11(t, J=6.6 Hz, 1H), 2.75(t, J=6.9 Hz, 2H), 2.63(t, J=6.9 Hz, 2H), 2.03∼1.75(m, 3H), 1.47∼1.29 (m, 55H).

(n=6인 경우)

1.00 g의 화학식 7의 화합물을 13.4 ㎖의 DMF에 녹인 다음, 0.82 ㎖의 1.6-헥산디티올(1,6-hexane-di-thiol)과 414 ㎎의 Cs₂CO₃를 상온에서 첨가하였다. 9시간 동안 상온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 물에 쏟아 부었다. 그리고, 100 ㎖의 EtOAc로 3번 반복하여 추출하였다. 추출한 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 773 ㎎의 흰색의 고체인 화학식 3의 화합물(n=6)을 85%의 수율로 얻었다.

1H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ6.20(br s, 1H), 5.14(s, 1H), 5.05(s, 1H), 4.96(s, 1H), 4.13∼3.15(m, 25H), 2.72∼2.60(m, 2H), 2.50∼2.40(m, 4H), 1.66∼1.30(m, 64H).

(n=9인 경우)

1.00 g의 화학식 7의 화합물을 13.4 ㎖의 DMF에 녹인 다음, 1.1 ㎖의 1.9-노난디티올(1,9-nonane-di-thiol)과 414 ㎎의 Cs₂CO₃를 상온에서 첨가하였다. 9시간 동안 상온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 물에 쏟아 부었다. 그리고, 100 ㎖의 EtOAc로 3번 반복하여 추출하였다. 추출한 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 706 ㎎의 흰색의 고체인 화학식 3의 화합물(n=9)을 76%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 300 MHz) δ6.06∼5.90(m, 2H), 5.50∼4.84(m, 8H), 4.03∼2.95(m, 25H), 2.72∼2.20(m, 6H), 1.52∼1.11(m, 70H).

<실시예 1> 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(n=3)의 합성 1

(단계 1): 보호된 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체의 합성

450 ㎎의 화학식 3의 화합물(n=3)과 168 ㎎의 Cs₂CO₃를 3.4 ㎖의 DMF에 넣고 섞어 주었다. 상기 혼합물에 1 ㎖의 DMF에 녹아있는 300 ㎎의 화학식 2의 화합물을 넣고 상온에서 72시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 쏟아 붇고 70 ㎖의 EtOAc로 3번 반복하여 추출하였다. 추출한 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 192 ㎎의 흰색의 고체인 화학식 8로 표시되는 보호된 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(n=3)를 31%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 300 MHz) δ8.18 (d, J=8.6 Hz, 2H), 7.47(d, J=8.6 Hz, 2H), 7.33(d, J=8.6 Hz, 1H), 6.15(d, J=8.5 Hz, 1H), 5.98(br s, 1H), 5.51(br s, 2H), 5.25(s, 1H), 5.14(s. 1H), 5.08(s, 1H), 4.96(s, 1H), 4.15∼3.10(m, 18H), 2.85∼2.30(m, 8H), 2.01∼1.79(m, 3H), 1.45∼1.41(m, 55H), 0.97(s, 9H),0.93(s, 9H), 0.12(s, 3H), 0.11(s, 3H), 0.09(s, 3H), -0.12(s, 3H).

(단계 2): 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체의 합성

74 ㎎의 화학식 8의 화합물(n=3)을 0.8 ㎖의 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran)에 녹인 용액에 0.12 ㎖의 1.0 M 테트라히드로퓨란 용액인 테트라부틸암모늄플루오리드(tetrabutylamoniumfluoride)를 첨가한 후 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하여 농축한 후 EtOAc를 넣어 녹이고, 이 용액을 0.5 N의 염산 수용액과 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 51 ㎎의 흰색의 고체를 얻었다. 얻어진 화합물에 1 ㎖의 삼불화초산을 넣고 상온에서 1시간 동안 교반한 후 감압하여 농축시켰다. 농축물을 실리카겔 관을 이용하여 거른다음, semiprep-HPLC(RP-C18 컬럼, 0.1 % TFA 함유된 H₂O: 0.1 % TFA MeCN=70:30)를 이용하여 정제하여 30 ㎎의 흰색의 고체인 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체 삼불화초산염(n=3)을 36%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(D₂O, 300 MHz) δ8.06 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.47(d, J=8.7 Hz, 2H), 5.87(d, J=3.7 Hz, 1H), 5.21(d, J=2.1 Hz, 1H), 5.13(s, 1H), 5.02(d, J=2.3 Hz, 1H), 4.24∼4.04(m, 6H), 3.95∼2.80(m, 22H), 2.68∼2.44(m, 2H), 2.37∼2.23(m,3H), 2.14∼1.90(m, 2H), 1.82∼1.43(m, 3H), 1.13∼1.03(m, 1H);

¹³C NMR(D₂O, 75 MHz) δ172.8, 163.4(q, J=35.2 Hz), 150.1, 147.3, 127.4, 124.0, 116.8(q, J=289.9 Hz), 110.8, 96.1, 95.4, 86.0, 80.6, 79.1, 76.2, 74.2, 73.0, 71.2, 71.1, 70.5, 69.8, 68.5, 68.0, 67.8, 61.8, 56.9, 54.1, 51.3, 50.2, 48.9, 40.9, 40.7, 35.2, 34.6, 30.8, 30.7, 28.3.

<실시예 2> 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(n=6)의 합성 2

326 ㎎의 화학식 3의 화합물(n=6)과 98 ㎎의 Cs₂CO₃를 3.0 ㎖의 DMF에 넣고 섞어 주었다. 이 혼합물에 1 ㎖의 DMF에 녹아있는 170 ㎎의 화학식 2의 화합물을 넣고 상온에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 쏟아 붇고 70 ㎖의 EtOAc로 3번 반복하여 추출하였다. 추출한 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그라피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 383 ㎎의 흰색의 고체인 화학식 8로 표시되는 보호된 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(n=6)를 87%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 300 MHz) δ8.16(d, J=8.7 Hz, 2H), 7.46(d, J=8.6 Hz, 2H), 7.39(d, J=8.6 Hz, 1H), 6.15∼5.90(m, 2H), 5.25(s, 1H), 5.13∼5.11(m, 2H),4.95(s, 1H), 4.15∼3.00(m, 25H), 2.79∼2.18(m, 8H), 1.79∼1.33(m, 64H), 0.96(s, 9H), 0.93(s, 9H), 0.12(s, 3H), 0.11(s, 3H), 0.08(s, 3H), -0.13(s, 3H).

(단계 2): 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체의 합성

245 ㎎의 화학식 8의 화합물(n=6)을 2.6 ㎖의 테트라히드로퓨란에 녹인 용액에 0.40 ㎖의 1.0 M 테트라히드로퓨란 용액인 테트라부틸암모늄플루오리드를 넣고, 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하여 농축한 후 EtOAc를 넣어 녹이고, 이 용액을 0.5 N의 염산 수용액과 포화된 소금물로 씻은 후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 184 ㎎의 흰색의 고체를 얻었다. 얻어진 화합물에 3 ㎖의 삼불화초산을 넣고 상온에서 1시간 동안 교반한 후 감압하여 농축시켰다. 농축물을 실리카겔 관을 이용하여 거른 후 semiprep-HPLC (RP-C18 컬럼, 0.1 % TFA 함유된 H₂O:0.1 % TFA 함유된 MeCN=70:30)를 이용하여 정제하여 117 ㎎의 흰색의 고체인 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체 삼불화초산염(n=6)을 49%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(D₂O, 300 MHz) δ8.17(d, J=8.7 Hz, 2H), 7.58(d, J=8.7 Hz, 2H), 6.05(d, J=3.9 Hz, 1H), 5.35(s, 1H), 5.24(s, 1H), 5.14(d, J=2.0Hz, 1H),4.39(s, 2H), 4.30∼4.16(m, 4H), 4.08∼3.22(m, 19H), 3.17∼3.11(m, 2H), 3.04∼2.99(m, 2H), 2.82∼2.75(m, 1H), 2.54(t, J=7.2 Hz, 2H), 2.43∼2.39(m, 1H), 2.16∼2.07(m, 1H), 1.97∼1.83(m, 2H), 1.50∼1.45(m, 2H), 1.32∼1.11(m, 8H);

¹³C NMR(D₂O, 75 MHz) δ173.1, 163.3(q, J=35.1Hz), 150.0, 147.3, 127.4, 124.0, 116.9(q, J=290.7 Hz), 110.9, 96.0, 95.3, 85.9, 80.6, 79.0, 75.4, 74.1, 72.9, 71.6, 71.0, 70.6, 69.9, 68.4, 68.0, 67.7, 61.8, 56.8, 54.1, 51.3, 50.2, 49.3, 48.9, 40.9, 35.3, 34.7, 32.1, 32.0, 30.4, 29.2, 28.4, 27.9.

<실시예 3> 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(n=9)의 합성 3

255 ㎎의 화학식 3의 화합물(n=9)과 78 ㎎의 Cs₂CO₃를 2.0 ㎖의 DMF에 넣고 섞어 주었다. 이 혼합물에 1 ㎖의 DMF에 녹아있는 135 ㎎의 화학식 2의 화합물을 넣고 상온에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 쏟아 붇고 70 ㎖의 EtOAc로 3번 반복하여 추출하였다. 추출한 유기층을 모은 후 포화된 소금물로 씻고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 383 ㎎의 흰색의 고체인 화학식 8로 표시되는 보호된 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체(n=9)를 74%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 300 MHz) δ8.12(d, J=8.5 Hz, 2H), 7.47(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.44(d, J=7.8 Hz, 1H), 6.18(br s, 2H), 5.82(br s, 1H), 5.50∼4.95(m, 8H), 4.15∼2.88(m, 25H), 2.68∼2.29(m, 7H), 1.65∼1.23(m, 70H), 0.97(s, 9H), 0.94(s, 9H), 0.13(s, 3H), 0.12(s, 3H), 0.09(s, 3H), -0.13(s, 3H).

(단계 2): 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체의 합성

157 ㎎의 화학식 8의 화합물(n=9)을 1.7 ㎖의 테트라히드로퓨란에 녹인 용액에 0.25 ㎖의 1.0 M 테트라히드로퓨란 용액인 테트라부틸암모늄플루오리드를 넣고, 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하여 농축한 후 EtOAc를 넣어 녹이고, 이 용액을 0.5 N의 염산 수용액과 포화된 소금물로 씻고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 감압하여 농축하였다. 농축물을 실리카겔 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1) 방법으로 정제하여 99 ㎎의 흰색의 고체를 얻었다. 얻어진 화합물에 3 ㎖의 삼불화초산을 넣고 상온에서 1시간 동안 교반한 후 감압하여 농축시켰다. 농축물을 실리카겔 관을 이용하여 거른 후 semiprep-HPLC (RP-C18 컬럼, 0.1 % TFA 함유된 H₂O:0.1 % TFA 함유된 MeCN=70:30)를 이용하여 정제하여 32 ㎎의 흰색의 고체인 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체 삼불화초산염(n=9)을 37%의 수율로 얻었다.

¹H NMR(D₂O, 300 MHz) δ8.17(d, J=8.7 Hz, 2H), 7.58(d, J=8.7 Hz, 2H), 6.01(d, J=3.8 Hz, 1H), 5.34(s, 1H), 5.24(s, 1H), 5.14(d, J=2.4 Hz, 1H), 4.36∼4.37(m, 7H), 4.03∼3.76(m, 7H), 3.67∼3.00(m, 12H), 2.82∼2.75(m, 1H), 2.59(t, J=7.2 Hz, 2H), 2.44∼2.24(m, 1H), 2.18∼1.83(m, 4H), 2.56∼1.49(m, 2H), 1.29∼1.09(m, 14H);

¹³C NMR(D₂O, 75 MHz) δ173.1, 163.4 (q, J=35.2 Hz), 149.9, 147.3, 127.4, 124.0, 116.8(q, J=289.9 Hz), 111.0, 96.0, 95.5, 85.9, 80.6, 79.0, 75.5, 74.1, 72.9, 71.5, 71.0, 70.5, 70.0, 68.4, 68.0, 67.8, 61.7, 56.8, 54.1, 51.3, 50.1, 48.8, 41.0, 40.9, 35.3, 32.2, 32.1, 29.3, 28.8, 28.6, 28.5, 28.4, 28.3, 28.2.

<제조예 3> 특이적 RNA의 실험관적 제법

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA의 센스 DNA와 서열번호 2로 기재되는 16S rRNA의 안티센스 DNA,

서열번호 3으로 기재되는 RRE RNA의 센스 DNA와 서열번호 4로 기재되는 RRE RNA의 안티센스 DNA, 및

서열번호 5로 기재되는 TS RNA의 센스 DNA와 서열번호 6으로 기재되는 TS RNA의 안티센스 DNA를 사용하여 RNA를 제조하였다.

구체적으로, 상기 두 가닥의 DNA(센스(sense)와 안티센스(anti-sense) 각각2.5 nanomole), 5 ×완충용액(200 mM Tris-HCl, 30 mM MgCl₂, 10 mM 스퍼미딘(spermidine), 50 mM NaCl, pH 7.9; 20 ㎕), 100 mM DL-다이타이오트레이톨(dithiotheitol, DTT; 20 ㎕), 네 개의 2.5 mM 뉴클레오타이드 트라이 포스페이트 혼합물(NTP mixture, 20 ㎕), T7 RNA 폴리머라제(50 units/mL; 1 ㎕) 그리고 증류된 물(34 ㎕)을 37 ℃에서 2 시간 배양하였다. 이후, 1 ㎕의 RNA 분해효소가 들어있지 않은(RNase-free) RQ1 DNA 분해효소(DNase, 1 unit/㎖)를 넣어 10 분간 37 ℃에서 배양하였다. 상기 용액에 100 ㎕의 PCI 혼합액(페놀:클로로포름:이소프로판올=25:24:1)을 넣고 5 분간 상온에서 혼합시킨 후 14000 rpm에서 10 분간 원심 분리하였다. 상등액을 새로운 튜브에 넣고 에탄올 침전에 의하여 RNA를 농축시켰다. 상기 얻어진 RNA는 20 mA 의 전기를 걸어 30 분간 7.0 M 유레아(urea)가 함유된 6% 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)에서 전기영동하여 정제하였다. UV 손전등에 의하여 밝혀진 RNA 밴드(band)를 자르고 새로운 튜브에 옮겨 500 ㎕의 용출 완충용액(elution buffer, 0.5 M 암모니움 아세테이트, 1 mM EDTA, 0.2 % SDS, pH 8.0)을 넣고 37 ℃에서 4 시간 방치하였다. 용출된 RNA를 새로운 튜브로 옮기고 페놀추출법 및 에탄올 침전법에 의하여 정제하였다. 정제된 RNA의 양은 260 ㎚ UV 스펙트럼으로 확인하였다.

<실험예 1> 특이적 RNA 에 결합하는 상수의 결정

테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine)이 결합된 파로모마이신(paromomycin, 하기 "CRP"라 칭한다.)을 형광 발광화합물(fluorescentprobe)로 사용하였다. 형광 비등방성(anisotropy) 측정은 Perkin-Elmer LS-50B 형광(luminescence) 분광측정기에 20 ℃의 항온조를 설치하여 수행하였다. CRP의 형광흡수는 510 ㎚, 또한 그 형광발광은 550 ㎚에서 관찰하였다. 데이터 한점을 얻는데 적어도 7번의 측정을 수행하였으며, 그 중 가장 큰 값과 가장 작은 값을 제거하고 다섯 개의 평균값을 데이터로 이용하였다. 형광의 측정은 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 및 20 mM HEPES pH 7.5를 이용한 완충용액에서 수행하였다. CRP와 제조된 RNA간의 결합상수(Kd)를 측정하는 식은 하기 수학식 1과 같이 주어진다:

(상기식에서,

A는 RNA가 있을 때의 CRP의 형광 이등방성 값이며,

A₀는 RNA가 없을 때의 CRP의 형광 이등방성 값이며,

DA는 여러 RNA 농도에서 RNA가 없을 때의 형광 이등방성의 값을 뺀 숫자이며,

[RNA]₀는 RNA의 초기 농도이며,

[CRP]₀는 CRP의 초기 농도이며,

K_d는 결합상수이다.)

상기 RNA와 CRP의 결합을 유도한 후에 새롭게 제조된 화합물을 용액에 넣으면, 경쟁적인 결합 반응에 의하여 CRP는 RNA로부터 분리되고 측정하고자 하는 화합물은 RNA에 결합하여 KD값을 가지게 된다. 이 KD 값을 산출하는 식은 하기 수학식 2와 같으며, K_d와 KD는 일직선이 아닌 커브 맞춤(non-linerar curve fitting) 방법에 의하여 산출하였다. 결과는 하기표 1에 나타내었다.

(상기 식에서,

KD는 RNA와 새로운 aminoglycoside 와의 결합상수이며,

[Aminoglycoside]₀는 측정하고자 하는 아미노글리코사이드의 초기농도이며,

A는 측정도중 형광 이등방성 값이며,

A∞는 모두 결합되어 있을 때 형광 이등방성 값이며,

A₀는 모두 자유로울때의 형광 이등방성 값이다.)

각 RNA에 대한 헤테로-이합체의 결합력 비교(KD) (단위 microM)

	네오마이신	실시예 1	실시예 2	실시예 3
16S rRNA	> 2	0.20	0.01	0.40
RRE RNA	> 2	0.4	0.2	0.5
TS RNA	> 2	2.0	2.0	2.0

상기표 1에 나타낸 바와 같이, 헤테로-이합체 화합물(실시예 1∼3)은 16S rRNA 또는 RRE RNA 에 네오마이신에 비하여 증진된 결합력을 나타내어, 일반적인이합체 결합력의 증진이 본 발명에서도 관찰된다. 또한, TS RNA의 경우에는 결합강도의 변화가 전혀 없음이 관측되며, 헤테로-이합체에 의한 결합력의 변화가 관찰되는 RNA도 그 종류에 따라 결합력 향상의 크기가 매우 다르게 나타나고 있다. 즉, 16S rRNA 의 경우에는 실시예 2의 화합물이 네오마이신에 비하여 200 배 이상의 결합력의 증진을 가져왔으며, RRE RNA 의 경우 약 10 배의 결합력 증가가 관측되었다. 이와 같은 결과는 16S rRNA, RRE RNA 및 TS RNA 모티프가 모두 스템과 룹을 가지고 있으며, 그 중에서도 특이적인 염기서열을 가진 16S rRNA가 헤테로-이합체에 의한 가장 우수한 결합력 증가를 보여주고 있다.

또한, 헤테로-이합체 사이의 스페이서의 길이에 따른 변화도 큰 폭으로 관측되었다. 대체로 스페이서의 길이가 6 개의 탄소로 이루어진 실시예 2의 화합물에서 가장 큰 결합력의 증가를 보였다. 하지만 이와 같은 경향도 16S rRNA에서 가장 극대화 된 형태로 나타나서, 실시예 2의 화합물이 실시예 1 또는 실시예 3의 화합물에 비하여 적어도 20 배 이상의 특이성을 가지고 목표 분자인 RNA 에 결합하는 것으로 나타났다.

이와 같은 헤테로-이합체 사이의 길이에 대한 특이성 결과, 헤테로-이합체의 특이성이 RNA 모티프의 모양 특이적이라기 보다는 그 RNA 모양을 구성하고 있는 모양과 염기서열 특이적인 결과를 보여주고 있다.

<실험예 2> 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성 실험

화학식 1의 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성 실험을 실시하였다. 본 발명의 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체를 1 ㎖의 생리식염수에 현탁하여 1 ㎎/㎏의 용량으로 상기 랫트 2 마리의 근육내 주사 투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

실험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상 증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 실험된 화합물은 랫트에서 10 ㎎/㎏ 까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 비경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 10 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 네오마이신-클로람페니콜 헤테로-이합체는 단위체인 네오마이신 또는 클로람페니콜에 비하여 16S rRNA, RRE RNA 및 TS RNA에 대해 결합력이 우수하며, RNA 모티프인 스템과 룹을 동시에 인식할 수 있으며, 또한 RNA를 이루는 염기서열 특이적인 특성을 가지고 있다. 따라서, RNA를 인식할 수 있는 상기와 같은 특이성의 증가는 약의 효능을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 비특이적 약물에 의한 부작용을 대폭적으로 감소시켜 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항암제에 유용하게 사용할 수 있다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Heterodimeric conjugates of neomycin-chloramphenicol to enhanced specificity against RNA targets and method for preparing thereof <130> 1p-10-33c <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S sense <400> 1 aatttaatac gactcactat agggcgtcac accttcgggt gaagtggcc 49 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S antisense <400> 2 ggccacttca cccgaaggtg tgacgcccta tagtgagtcg tattaaatt 49 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RRE RNA sense <400> 3 aatttaatac gactcactat agggtgggcg cagcttcggc tgacggtaca cc 52 <210> 4 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RRE RNA antisense <400> 4 ggtgtaccgt cagccgaagc tgcgcccacc ctatagtgag tcgtattaaa tt 52 <210> 5 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TS RNA sense <400> 5 aatttaatac gactcactat aggggccccc ccgccgcgcc atgcctgtgg ccggtcgg 58 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TS RNA antisense <400> 6 ccgaccggcc acaggcatgg cgcggcgggg gggcccctat agtgagtcgt attaaatt 58

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체.

화학식 1

(상기 식에서, n은 2∼10인 정수이다.)
제 1항에 있어서, 상기 n이 3, 6 또는 9인 것을 특징으로 하는 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체.
제 1항에 있어서, 상기 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체가 16S rRNA 또는 RRE RNA와 특이적인 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체.
제 3항에 있어서, 상기 특이적인 결합이 RNA의 스템과 룹을 동시에 인식하는 것을 특징으로 하는 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체.
제 3항에 있어서, 상기 특이적인 결합이 RNA를 이루는 염기서열 특이적인 결합인 것을 특징으로 하는 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체.
하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,

(1R,2R)-2-(9-브로모아세틸아미도-1-(4-니트로페닐)-1,3-t-부틸디메틸실릴옥시프로판(화학식 2)을 염기 존재하에 화학식 3의 화합물과 반응시켜 화학식 8의 화합물을 얻는 단계(단계 1), 및

얻어진 화학식 8의 화합물과 탈보호제를 반응시키는 것을 특징으로 하는 제 1항의 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체의 제조방법.

반응식 1

(상기 식에서, n은 2∼10인 정수이다.)
제 6항에 있어서, 상기 단계 1의 염기가 K₂CO₃, Na₂CO₃또는 Cs₂CO₃인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 2의 탈보호화제가 테트라부틸암모늄플루오리드,불산, 불산 피리딘염, 염산, 황산, 질산, 초산 또는 삼불화초산인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항의 네오마이신-클로람페니콜 헤테로 이합체를 유효성분으로 하는 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항암제.