CN117756866A - 含有n-乙酰半乳糖胺的靶向配体 - Google Patents
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- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Abstract
本发明提供一种包含N‑乙酰半乳糖胺的配体，其中所述配体包含式(X’)所示的缀合基团以及含有该靶向配体的核酸分子。本发明的N‑乙酰半乳糖胺的靶向配体可以实现各类siRNA分子的递送，根据所搭载siRNA分子的不同，可广泛用于人或动物的疾病治疗、疾病预防、林木育种、种子培育等领域。
Description
本申请是申请日为2023年01月29日、申请号为202380010110.3、发明名称为“含有N-乙酰半乳糖胺的靶向配体”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明属于医药领域，具体涉及含有N-乙酰半乳糖胺的靶向配体以及含有该靶向配体的核酸分子。
本发明的N-乙酰半乳糖胺的靶向配体可以实现各类siRNA分子的递送，根据所搭载siRNA分子的不同，可广泛用于人或动物的疾病治疗、疾病预防、林木育种、种子培育等领域。
背景技术
N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)能够特异性结合肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。将含有GalNAc的靶向配体与小干扰RNA(siRNA)偶联可以实现siRNA的肝靶向递送。
同时，根据所搭载siRNA分子的不同，可广泛用于人或动物的疾病治疗、疾病预防、林木育种、种子培育等领域。
现有技术中公开了含有GalNAc的靶向配体，但是本领域对具有更佳稳定性、靶向性等的靶向配体存在需求。
发明内容
本发明通过提供一种新的含有N-乙酰半乳糖胺的靶向配体。
在一个方面中，本发明涉及一种包含N-乙酰半乳糖胺的配体，其中所述配体包含式(X’)所示的缀合基团：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-C(O)-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一个方面中，本发明涉及一种包含N-乙酰半乳糖胺的配体，其中所述缀合基团如式(I’)所示：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-或-NHC(O)-；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一个方面中，本发明涉及一种包含N-乙酰半乳糖胺的配体，其中所述缀合基团如式(X’)所示：
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一个方面中，本发明涉及一种包含N-乙酰半乳糖胺的配体，其中所述缀合基团如式(X’)所示：
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-C(O)-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一个方面中，本发明涉及式(X)化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体：
其中，
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-C(O)-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一个方面中，本发明涉及式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体：
其中，
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-或-NHC(O)-；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一个方面中，本发明涉及式(X)化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其中：
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一个方面中，本发明涉及式(X)化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其中：
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-C(O)-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一个方面中，本发明涉及中间体化合物，其为式(V)化合物：
其中，
Pg为羟基保护基，例如选自以下：
Q’独立地为H、/>
其他基团如上文所定义。
在另一个方面中，本发明涉及一种制备式(I)化合物的方法，包括在脱除羟基保护基的条件下处理式(V)化合物：
其中各基团如上文所定义。
在另一个方面中，本发明涉及一种核酸分子，其包含核酸和与之连接的上文所定义的配体。
在另一个方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包含本文所述的核酸分子，和药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一个方面中，本发明涉及一种试剂盒，其包含本文所述的核酸分子。
在上述配体、化合物、中间体化合物和核酸分子的具体实施方案中，其中基团定义优选如下：
Q
在一个实施方案中，Q为H；在另一个实施方案中，Q为在另一个实施方案中，Q为/>在另一个实施方案中，Q为在另一个实施方案中，Q为在另一个实施方案中，Q为在另一个实施方案中，Q为在另一个实施方案中，Q为在另一个实施方案中，Q为以上基团的任意组合。
L1、L2、L3和L4
在一个实施方案中，L1为化学键；在另一个实施方案中，L1为-CH2-；在另一个实施方案中，L1为-CH2CH2-；在另一个实施方案中，L1为-C(O)-；在另一个实施方案中，L1为-CH2O-；在另一个实施方案中，L1为-CH2O-CH2CH2O-；在另一个实施方案中，L1为-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-。
在一个实施方案中，L2为化学键；在另一个实施方案中，L2为-CH2CH2C(O)-。
在一个实施方案中，L3为化学键；在另一个实施方案中，L3为-(NHCH2CH2)b-；在另一个实施方案中，L3为-(NHCH2CH2CH2)b-；在另一个实施方案中，L3为-C(O)CH2-。
在一个实施方案中，L4为-(OCH2CH2)c-；在另一个实施方案中，L4为-(OCH2CH2CH2)c-；在另一个实施方案中，L4为-(OCH2CH2CH2CH2)c-；在另一个实施方案中，L4为-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-；在另一个实施方案中，L4为-NHC(O)-(CH2)d-。
L、L’和T
在一个实施方案中，L为化学键；在另一个实施方案中，L为-CH2O-；在另一个实施方案中，L为-NHC(O)-。
在一个实施方案中，L’为化学键；在另一个实施方案中，L’为-C(O)NH-；在另一个实施方案中，L’为-NHC(O)-；在另一个实施方案中，L’为-O(CH2CH2O)e-。
在一个实施方案中，T为化学键；在另一个实施方案中，T为-CH2-；在另一个实施方案中，T为-C(O)-；在另一个实施方案中，T为-M-；在另一个实施方案中，T为-CH2-M-；在另一个实施方案中，T为-C(O)-M-。
在一个实施方案中，M为在另一个实施方案中，M为/>在另一个实施方案中，M为/>在另一个实施方案中，M为/>
R1、R2和R3
在一个实施方案中，R1和R2一起形成-CH2CH2O-，并且R3为H；在另一个实施方案中，R1和R2一起形成-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；在另一个实施方案中，R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H。
在一个实施方案中，R为-OR’；在另一个实施方案中，R为-CH2OR’；在另一个实施方案中，R为-CH2CH2OR’；在更具体的实施方案中，R’为H；在另一更具体的实施方案中，R’为羟基保护基；在另一更具体的实施方案中，R’为固相载体；在另一更具体的实施方案中，R’为-C(O)CH2CH2C(O)OH；在另一更具体的实施方案中，R’为4,4'-二甲氧基三苯甲基。
发明详述
定义
化学定义
下面更详细地描述具体官能团和化学术语的定义。
当列出数值范围时，既定包括每个值和在所述范围内的子范围。例如“C1-6烷基”包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C1-6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、C2-6、C2-5、C2-4、C2-3、C3-6、C3-5、C3-4、C4-6、C4-5和C5-6烷基。
“C1-6烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链饱和烃基团。在一些实施方案中，C1-4烷基和C1-2烷基是优选的。C1-6烷基的例子包括：甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、异丙基(C3)、正丁基(C4)、叔丁基(C4)、仲丁基(C4)、异丁基(C4)、正戊基(C5)、3-戊基(C5)、戊基(C5)、新戊基(C5)、3-甲基-2-丁基(C5)、叔戊基(C5)和正己基(C6)。术语“C1-6烷基”还包括杂烷基，其中一或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子被杂原子(例如，氧、硫、氮、硼、硅、磷)替代。烷基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。常规烷基缩写包括：Me(-CH3)、Et(-CH2CH3)、iPr(-CH(CH3)2)、nPr(-CH2CH2CH3)、n-Bu(-CH2CH2CH2CH3)或i-Bu(-CH2CH(CH3)2)。
“卤代”或“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。
因此，“C1-6卤代烷基”是指上述“C1-6烷基”，其被一个或多个卤素基团取代。在一些实施方案中，C1-4卤代烷基是特别优选的，更优选C1-2卤代烷基。示例性的所述卤代烷基包括但不限于：-CF3、-CH2F、-CHF2、-CHFCH2F、-CH2CHF2、-CF2CF3、-CCl3、-CH2Cl、-CHCl2、2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基，等等。卤代烷基基团可以在任何可用的连接点上被取代，例如，1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基。
“C1-6亚烷基”是指除去C1-6烷基的另一个氢而形成的二价基团，并且可以是取代或未取代的。在一些实施方案中，C1-4亚烷基、C2-4亚烷基和C1-2亚烷基是优选的。未取代的所述亚烷基包括但不限于：亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)、亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)、亚戊基(-CH2CH2CH2CH2CH2-)、亚己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)，等等。示例性的取代的所述亚烷基，例如，被一个或多个烷基(甲基)取代的所述亚烷基，包括但不限于：取代的亚甲基(-CH(CH3)-、-C(CH3)2-)、取代的亚乙基(-CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)-、-C(CH3)2CH2-、-CH2C(CH3)2-)、取代的亚丙基(-CH(CH3)CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH2CH(CH3)-、-C(CH3)2CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-、-CH2CH2C(CH3)2-)，等等。
其他定义
本文术语“siRNA”是一类双链RNA分子，其可以介导与其互补的靶RNA(例如mRNA，例如，编码蛋白质的基因的转录物)的沉默。siRNA通常是双链的，包括与靶RNA互补的反义链，和与该反义链互补的正义链。为方便起见，这样的mRNA在此也被称为有待被沉默的mRNA。这样的基因也称为靶基因。通常，有待被沉默的RNA是内源基因或病原体基因。另外，除了mRNA以外的RNA(例如tRNA)以及病毒RNA也可以被靶向。
“shRNA”是指短发夹RNA。shRNA包括两个短反向重复序列。克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。
术语“反义链”是指siRNA的这样一条链，所述链包含与靶序列完全、充分或基本互补的区域。术语“正义链”是指siRNA的这样一条链，所述链包括与作为在此定义的术语反义链的区域完全、充分或基本互补的区域。
术语“互补区域”是指反义链上与靶mRNA序列完全、充分或基本互补的区域。在互补区域与靶序列不完全互补的情况下，错配可以位于分子的内部或末端区域中。通常，最耐受的错配位于末端区域中，例如，在5’和/或3’端的5、4、3、2或1个核苷酸内。对错配最敏感的反义链部分被称为“种子区”。例如，在包含19nt的链的siRNA中，第19个位置(从5’向3’)可以耐受一些错配。
术语“互补”是指第一多核苷酸在某些条件例如严格条件下与第二多核苷酸杂交的能力。例如，严格条件可包括400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA在50℃或70℃下持续12-16小时。就满足以上相对于它们杂交的能力而言的要求来说，“互补”序列还可以包括或完全形成自非沃森-克里克碱基对和/或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G:U摇摆碱基配对或Hoogstein碱基配对。
与信使RNA(mRNA)的“至少部分互补”、“充分互补”或“基本上互补”的多核苷酸是指与感兴趣的mRNA的连续部分基本互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码PCSK9的mRNA的非中断部分基本上互补，则多核苷酸与PCSK9 mRNA的至少部分互补。在此的术语“互补”、“完全互补”、“充分互补”和“基本上互补”可以相对于siRNA的正义链与反义链之间，或siRNA试剂的反义链与靶序列之间的碱基配对使用。
“充分互补”是指为了维持分子的整体双链特征，正义链仅需要与反义链互补的程度。换言之，虽然通常需要完美的互补性，但在一些情况下，特别是在反义链中，可以包括一个或多个，例如6个、5个、4个、3个、2个或1个的错配(相对于靶标mRNA)，但是正义链与反义链仍可以维持分子的整体双链特征。
“核苷”是由嘌呤碱或嘧啶碱、以及核糖或脱氧核糖两种物质组成的化合物，“核苷酸”则是由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物，“寡核苷酸”是指例如具有少于100、200、300或400个核苷酸长度的核酸分子(RNA或DNA)。
“碱基”是合成核苷、核苷酸和核酸的基本组成单位，其组成元素中含有氮，也称“含氮碱基”。本文中，如无特别说明，大写字母A、U、T、G和C表示核苷酸的碱基组成，分别为腺嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶。
本文中所述核苷酸的“修饰”包括但不限于甲氧基修饰、氟代修饰、硫代磷酸酯基连接或常规保护基保护等。例如，所述氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2’位的羟基被氟取代形成的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2’-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
本文中“修饰的核苷酸”包括但不限于2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、肌苷核糖核苷酸、脱碱基核苷酸、反向无碱基脱氧核糖核苷酸、包含硫代磷酸酯基团的核苷酸、乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸、锁核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含核苷酸的非天然碱基、以及连接到胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基团上的末端核苷酸、脱氧核糖核苷酸或常规保护基保护等。例如，所述2'-氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2’位的羟基被氟取代形成的核苷酸。所述2'-脱氧-修饰的核苷酸指核糖基的2’-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
“羟基保护基”是指能够避免羟基遭受化学反应，又可以在特定条件下脱除以恢复羟基的基团。主要包括硅烷型保护基、酰基型保护基或醚型保护基，优选以下：
三甲基硅基(TMS)、三乙基硅基(TES)、二甲基异丙基硅基(DMIPS)、二乙基异丙基硅基(DEIPS)、叔丁基二甲基硅基(TBDMS)、叔丁基二苯基硅基(TBDPS)、三异丙基硅基(TIPS)、乙酰基(Ac)、氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基(TFA)、苯甲酰基、对甲氧基苯甲酰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、烯丙氧羰基(Alloc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(Troc)、苄氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)、苯甲基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、烯丙基、三苯基甲基(Tr)、双对甲氧基三苯甲基(DMTr)、甲氧基甲基(MOM)、苯氧基甲基(BOM)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、甲硫基甲基(MTM)、对甲氧基苄氧基甲基(PMBM)。
本文所用的术语“药学上可接受的盐”表示本发明化合物的那些羧酸盐、氨基酸加成盐，它们在可靠的医学判断范围内适用于与患者组织接触，不会产生不恰当的毒性、刺激作用、变态反应等，与合理的益处/风险比相称，就它们的预期应用而言是有效的，包括(可能的话)本发明化合物的两性离子形式。
本发明化合物可包括一个或多个不对称中心，且因此可以存在多种立体异构体形式，例如，对映异构体和/或非对映异构体形式。例如，本发明化合物可为单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体(例如顺式和反式异构体)，或者可为立体异构体的混合物的形式，包括外消旋体混合物和富含一种或多种立体异构体的混合物。异构体可通过本领域技术人员已知的方法从混合物中分离，所述方法包括：手性高压液相色谱法(HPLC)以及手性盐的形成和结晶；或者优选的异构体可通过不对称合成来制备。
本发明还包括同位素标记的化合物(同位素变体)，它们等同于式(I)所述的那些，但一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界常见的原子质量或质量数的原子所代替。可以引入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别例如2H、3H、13C、11C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F和36Cl。含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的本发明化合物、其前体药物和所述化合物或所述前体药物的药学上可接受的盐都属于本发明的范围。某些同位素标记的本发明化合物、例如引入放射性同位素(例如3H和14C)的那些可用于药物和/或底物组织分布测定。氚、即3H和碳-14、即14C同位素是特别优选的，因为它们容易制备和检测。进而，被更重的同位素取代，例如氘、即2H，由于代谢稳定性更高可以提供治疗上的益处，例如延长体内半衰期或减少剂量需求，因而在有些情况下可能是优选的。同位素标记的本发明式(I)化合物及其前体药物一般可以这样制备，在进行下述流程和/或实施例与制备例所公开的工艺时，用容易得到的同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂。
本发明具体涉及以下技术方案：
1.一种包含N-乙酰半乳糖胺的配体，其中所述配体包含式(X’)所示的缀合基团：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q独立地为H、/>
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-C(O)-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
2.技术方案1的配体，其中所述缀合基团如式(I’)所示：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-或-NHC(O)-；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
3.技术方案2的配体，其中，
Q独立地为H或
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-；
L’为化学键；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
4.技术方案2的配体，其中所述缀合基团如式(I’-1)、式(I’-2)或式(I’-3)所示：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q为
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-；
R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
5.技术方案2的配体，其中，
Q独立地为H、
其中L1为-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键或-C(O)NH-；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
6.技术方案5的配体，其中所述缀合基团如式(II’-1)或式(II’-2)所示：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q独立地为
其中L1为-CH2O-或-CH2O-CH2CH2O-；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-NHC(O)-；
L’为化学键或-C(O)NH-；
R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
7.技术方案2的配体，其中，
Q独立地为H、
其中L1为-CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键或-C(O)NH-；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
8.技术方案7的配体，其中所述缀合基团如式(II’-2)所示：
其中，
表示与生物分子连接的位置；/>
Q为 优选/>
L1为-CH2O-；
L3为-NHCH2CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-；
c＝1、2或3；
L为-NHC(O)-；
R’为H；
n＝6、7、8、9或10，优选7、8或9，更优选8。
9.技术方案7的配体，其中所述缀合基团如式(II’-2)所示：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q独立地为/>
其中L1为-CH2-或-C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
10.技术方案9的配体，其中所述缀合基团如式(II’-3)所示：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q1为 优选/>其中L1为-CH2-；/>
Q2为其中L1为-C(O)-；
L3为-NHCH2CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-；
c＝1、2或3；
L为-NHC(O)-；
R’为H；
n＝6、7、8、9或10，优选7、8或9，更优选8。
11.技术方案1的配体，其中：
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
12.技术方案11的配体，其中，
T为-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-，其中M为
13.技术方案11或12的配体，其中，
Q独立地为H或
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-CH2O-；
L’为化学键或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如技术方案11或12所定义。
14.技术方案13的配体，其中所述缀合基团如式(III’-1)、式(III’-2)或式(III’-3)所示：
其中，
Q为
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-CH2O-；
其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如技术方案11或12所定义。
15.技术方案11或12的配体，其中，
Q独立地为H、 />
其中L1为-CH2-、-CH2O-或-C(O)-；
L2为化学键；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-NHC(O)-；
L’为化学键；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如技术方案11或12所定义。
16.技术方案11或12的配体，其中所述缀合基团如式(IV’-1)或式(IV’-2)所示：
其中，
Q独立地为
其中L1为-CH2-、-CH2O-或-C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-NHC(O)-；
L’为化学键；
其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如技术方案11或12所定义。
17.技术方案1的配体，其中所述缀合基团如式(II’-3)所示：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q1为 优选/>其中L1为-CH2-；
Q2为 优选/>其中L1为化学键；
L3为-NHCH2CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-；
c＝1、2或3；
L为-NHC(O)-；
R’为H；
n＝6、7、8、9或10，优选7、8或9，更优选8。
18.技术方案1的配体，其中：
Q独立地为H、/>
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-C(O)-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
19.技术方案1的配体，其中所述缀合基团选自以下：
/>
/>
/>
/>
20.技术方案1的配体，其中所述缀合基团选自以下：
/>
/>
/>
/>
/>
21.技术方案1-20中任一项的配体，其靶向ASGPR。
22.一种核酸分子，其包含核酸和与之连接的技术方案1-21中任一项的配体。
23.技术方案22的核酸分子，其中所述核酸选自DNA、RNA和DNA/RNA杂合体。
24.技术方案23的核酸分子，其中所述核酸分子是单链的或双链的。
25.技术方案23的核酸分子，其中所述核酸分子选自小干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)。
26.技术方案23的核酸分子，其中所述核酸分子是双链RNA分子，其包含正义链和反义链，并且其中所述缀合基团连接至双链RNA分子的正义链的3’末端或5’末端，优选3’末端。
27.技术方案26的核酸分子，其中所述双链RNA分子的正义链和反义链各具有10至30个，优选15-25个，更优选20至25个核苷酸。
28.技术方案26或27的核酸分子，其中所述双链RNA分子的正义链和/或反义链中的一个或多个核苷酸包含化学修饰。
29.技术方案26或27的核酸分子，其中所述双链RNA分子的正义链和/或反义链中的一个或多个核苷酸被替换为核苷酸类似物。
30.技术方案22-29中任一项的核酸分子，其与肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异性结合。
31.一种药物组合物，其包含如技术方案22-30中任一项所述的核酸分子，和药学上可接受的载体或赋形剂。
32.一种试剂盒，其包含如技术方案22-30中任一项所述的核酸分子。
33.式(X)化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体：
其中，
Q独立地为H、/>
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-C(O)-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
34.技术方案33的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其具有式(I)：
其中，
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-或-NHC(O)-；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
35.技术方案34的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其中，
Q独立地为H或
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-；
L’为化学键；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
36.技术方案34的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其具有式(I-1)、式(I-2)或式(I-3)：
其中，
Q为
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-；
R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
37.技术方案34的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其中，
Q独立地为H、
其中L1为-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键或-C(O)NH-；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
38.技术方案37的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其具有式(II-1)或式(II-2)：
其中，
Q独立地为
其中L1为-CH2O-或-CH2O-CH2CH2O-；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-NHC(O)-；
L’为化学键或-C(O)NH-；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
39.技术方案34的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其中，
Q独立地为H、
其中L1为-CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键或-C(O)NH-；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
40.技术方案39的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其具有式(II-2)：
/>
其中，
Q为 优选/>
L1为-CH2O-；
L3为-NHCH2CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-；
c＝1、2或3；
L为-NHC(O)-；
R’为H；
n＝10至30个，优选15-25个，更优选8。
41.技术方案39的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其具有式(II-2)：
其中，
Q独立地为/>
其中L1为-CH2-或-C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
42.技术方案41的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其具有式(II-3)：
其中，
Q1为 优选/>其中L1为-CH2-；/>
Q2为其中L1为-C(O)-；
L3为-NHCH2CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-；
c＝1、2或3；
L为-NHC(O)-；
R’为H；
n＝10至30个，优选15-25个，更优选8。
43.技术方案33的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其中：
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
44.技术方案43的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其中，T为-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-，其中M为
45.技术方案43或44的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其中，
Q独立地为H或
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-CH2O-；
L’为化学键或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如技术方案43或44所定义。
46.技术方案45的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其具有式(III-1)、式(III-2)或式(III-3)：
其中，
Q为
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-CH2O-；
R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如技术方案43或44所定义。
47.技术方案43或44的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其中，
Q独立地为H、/>
其中L1为-CH2-、-CH2O-或-C(O)-；
L2为化学键；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-NHC(O)-；
L’为化学键；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如技术方案43或44所定义。
48.技术方案43或44的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其具有式(IV-1)或式(IV-2)：
其中，
Q独立地为
其中L1为-CH2-、-CH2O-或-C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-NHC(O)-；
L’为化学键；
R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如技术方案43或44所定义。
49.权利要求33的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其具有式(II-3)：
其中，
Q1为 优选/>其中L1为-CH2-；
Q2为 优选/>其中L1为化学键；
L3为-NHCH2CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-；
c＝1、2或3；
L为-NHC(O)-；
R’为H；
n＝10至30个，优选15-25个，更优选8。
50.技术方案33的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其中：
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-C(O)-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
51.技术方案33的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其中所述化合物选自：
/>
/>
/>
/>
/>
其中R’为H、-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基。
52.技术方案33的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素变体，其中所述化合物选自：
/>
/>
/>
/>
/>
53.中间体化合物，其为式(V)化合物：
其中，
Pg为羟基保护基，例如选自以下：
Q’独立地为H、
其他基团如技术方案33-50中任一项所定义。
54.中间体化合物，其选自：
/>
/>
/>
/>
55.中间体化合物，其选自：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
56.一种制备式(I)化合物的方法，包括在脱除羟基保护基的条件下处理式(V)化合物：
其中各基团如技术方案33-50中任一项所定义。
实施例
以下实施例用于例示本发明而非限制本发明的范围。
CbzCl：氯甲酸苄酯
CbzOSu：N-苄氧羰氧基丁二酰亚胺
DCI：二环己基碳二亚胺
DIEA/DIPEA：二异丙基乙胺
DMAP：二甲氨基吡啶
EDCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐
HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HBTU：O-苯并三氮唑-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HOBt：1-羟基苯并三唑
TEBA：苄基三乙基溴化铵
TEBAC：三乙基苄基氯化铵
TMSOTf：三氟甲磺酸三甲基硅酯
实施例中使用的序列信息：
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本文中，各缩写的意义如下：
A、U、G和C分布表示天然的腺嘌呤核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸和胞嘧啶核糖核苷酸。
m表示其左侧相邻的核苷酸是2’-OCH3修饰的核苷酸。例如，Am、Um、Gm和Cm表示2’-OCH3修饰的A、U、G和C。
f表示其左侧相邻的核苷酸是2’-F修饰的核苷酸。例如，Af、Uf、Gf和Cf分别表示2’-F修饰的A、U、G和C。
“s”或“s-”表示其左右相邻的两个核苷酸和/或递送载体通过硫代磷酸酯连接。
L96表示本领域熟知的以下结构的GalNAc递送载体，其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA连接的位置，可参见例如PCT公开号WO2009073809和WO2009082607。/>
NAG37表示本领域熟知的以下结构的GalNAc递送载体，其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA连接的位置，可参见例如PCT公开号WO2018044350。
IB表示反向无碱基脱氧核糖核苷酸，根据其在siRNA中所在位置/连接方式的不同可包括以下三种结构。IB是本领域熟知的，参见例如F.Czauderna,Nucleic Acids Res.,2003,31(11),2705-16以及PCT公开号WO2016011123和WO2019051402。
GL1-GL32的结构如上文所定义。
实施例1化合物E1的制备
1化合物3的制备
在25℃下将化合物1(100g,734mmol)加入到溶有氢氧化钠(176.28g,4.40mol)的水(176.28mL)中，然后加入TEBAC(83.65g,367mmol)和化合物2(564.83g,4.407mol)，氮气置换三次后，反应液在25℃下搅拌18小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1)显示化合物1消耗完全，薄层色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)显示有新产物点生成。将反应液用1000mL冰水稀释，用乙酸乙酯(500mL×3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥之后真空浓缩得到粗品，粗品进行柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝1/0-10/1)纯化得到无色油状液体化合物3(约56g)。1HNMR(400MHz,CD3OD)δ3.59(t,J＝6.4Hz,8H),3.36(s,8H),2.43(t,J＝6.4Hz,8H),1.47(s,36H).
2化合物4的制备
在25℃下将化合物3(56g,87.372mmol)溶于DCM(400mL)，缓慢滴入TFA(100mL)，反应液在25℃下搅拌18小时。薄层色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)显示反应物消耗完全且有一个新点生成。将反应液浓缩至干燥得到粗品粉色油状液体化合物(约20g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.63(t,J＝6.0Hz,8H),3.36(s,8H),2.51(t,J＝6.4Hz,8H).
3化合物5的制备
在25℃下将化合物4(4.2g,9.896mmol)溶于DMF(21mL)，依次加入TEA(1.376mL,9.896mmol)和化合物4A(3.46g,9.896mmol)，加热至83℃，反应液在氮气氛围和83℃条件下搅拌24小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝8/1)显示化合物4消耗完全且有新点生成。LCMS显示有化合物5的MS值。将反应液真空浓缩得到粗品，粗品进行MPLC(二氯甲烷/甲醇＝1/0-10/1)纯化得到黄色油状液体化合物5(约6.6g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32-7.37(m,5H),5.14(s,2H),3.60-3.70(m,8H),3.35(s,8H),2.53–2.65(m,8H).LCMS:m/z＝515.0(M+H)+.
4化合物6的制备
在25℃下将化合物5(6.6g,12.827mmol)溶于DCM(200mL)，再依次加入化合物5A(11.81g,64.137mmol)和EDCI(12.30g,64.137mmol)，反应液在25℃下搅拌6小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝8/1)显示化合物5消耗完全，薄层色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)显示有新产物点生成。LCMS显示有化合物6的MS值。将反应液真空浓缩得到粗品，粗品进行MPLC(石油醚/乙酸乙酯＝1/0-5/1)纯化得到无色油状液体化合物6(约4.9g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32-7.37(m,5H),5.14(s,2H),3.74(t,J＝6.0Hz,6H),3.68(t,J＝6.4Hz,2H),3.36-3.45(m,8H),2.87(t,J＝6.0Hz,6H),2.62(t,J＝6.4Hz,2H).LCMS:m/z＝1013.2(M+H)+.
5化合物7的制备
将化合物6(3.0g,2.96mmol)和化合物6A(6.81g,11.8mmol，根据实施例23中间体3-4的方法制备)溶解在DCM(50.0mL)中，加入DIEA(3.91mL,23.7mmol)，氮气置换三次，反应液在20℃下反应16小时。薄层色谱(第一次展开：二氯甲烷：甲醇＝10/1；第二次展开：石油醚：乙酸乙酯＝3:1)显示原料消失，有新点生成。反应液用150毫升二氯甲烷稀释，用柠檬酸水溶液(50.0毫升x3)，饱和碳酸氢钠水溶液(50.0毫升x3)和饱和食盐水(50.0毫升x3)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，通过柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:1到8:1)得到白色固体产物化合物7(约400mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.29-7.39(m,5H),5.31-5.36(m,3H),5.16(s,2H),5.05-5.09(m,3H),4.61-4.68(m,3H),4.06-4.19(m,10H),4.00-4.05(m,3H),3.90-3.96(m,3H),3.58-3.76(m,33H),3.51-3.57(m,7H),3.35-3.41(m,8H),2.58-2.65(m,2H),2.42(t,J＝6.0Hz,6H),2.14(s,9H),2.03(s,9H),1.92-1.96(m,18H)
6化合物8的制备
在20℃下化合物7(5.00g,2.63mmol)溶解在MeOH(60.0mL)中加入质量分数为10％的Pd/C(1.50g)，H2置换三次，在20℃、15psi下搅拌14小时。薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝8/1)显示原料消失，有新点生成。反应液通过硅藻土过滤，滤液减压浓缩得到白色固体化合物8(约4.40g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.34(d,J＝2.8Hz,3H),5.04-5.11(m,3H),4.62-4.67(m,3H),4.08-4.20(m,9H),4.00-4.08(m,4H),3.91-3.98(m,3H),3.59-3.77(m,33H),3.53-3.59(m,7H),3.37-3.40(m,8H),2.49-2.53(m,2H),2.43(t,J＝6.0Hz,6H),2.15(s,9H),2.03(s,9H),1.93-1.97(m,18H)
7化合物10的制备
在20℃下将化合物8(1.50g,0.831mmol)，HATU(0.470g,1.24mmol)和DIEA(0.412mL,2.492mmol)依次溶解到无水DMF(15.0mL)中，氮气置换3次，在20℃下搅拌0.5小时，加入化合物9(0.130g,1.246mmol)，在20℃下搅拌2小时。LC/MS显示原料全部消失，有一个主峰生成。薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝8/1)显示原料消失，有新点生成。反应液用二氯甲烷(100mL)稀释，依次使用饱和碳酸氢钠水溶液(20.0mL x 3)和饱和食盐水(20.0mL x 3)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩得到粗产品。粗产品通过柱层析(二氯甲烷：甲醇＝10/1到8/1)纯化得到棕色固体产物化合物10(约1.00g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.31-5.35(m,3H),5.04-5.10(m,3H),4.63-4.67(m,3H),4.08-4.21(m,9H),4.01-4.08(m,4H),3.91-3.98(m,3H),3.83-3.90(m,2H),3.69-3.77(m,4H),3.59-3.69(m,27H),3.53-3.58(m,6H),3.36-3.41(m,15H),2.62-2.68(m,2H),2.40-2.46(m,6H),2.15(s,9H),2.03(s,9H),1.80-1.98(m,20H),1.35-1.53(m,2H).LCMS:m/z＝945.5(M/2+H)+.
8E1的制备
化合物10(1.00g,0.529mmol)用乙腈溶解后旋干除去化合物中的水，然后在氮气氛围下用DCM(10.0mL)溶解，加入DCI(0.03g,0.265mmol)，将化合物11(0.32g,1.06mmol)滴加到上述溶液中，在20℃下搅拌1小时。LCMS显示原料消失，有40.0％的产物。反应液冷却至0℃，滴加6毫升饱和碳酸氢钠水溶液和6毫升饱和食盐水，用150毫升二氯甲烷稀释，分液，有机相用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水1:1混合水溶液50毫升洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到粗产品。粗产品用15毫升二氯甲烷稀释，慢慢滴加到60毫升甲基叔丁基醚中，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤三次，滤饼用乙腈溶解后旋干除去化合物中的甲基叔丁基醚。得到黄色固体E1(615mg,0.252mmol,47.6％)。
LCMS(ESI):m/z＝1103.3((M+59*2)/2+H)+；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.86-7.93(m,3H),7.78-7.83(m,3H),5.19-5.23(m,3H),4.97(dd,J＝3.2,11.2Hz,3H),4.51-4.57(m,3H),3.99-4.06(m,10H),3.84-3.92(m,3H),3.75-3.82(m,3H),3.62-3.75(m,4H),3.45-3.62(m,34H),3.37-3.41(m,6H),3.17-3.23(m,13H),2.76(t,J＝6.0Hz,2H),2.53-2.57(m,2H),2.28(t,J＝6.4Hz,6H),2.12(s,9H),2.00(s,9H),1.9-1.89(s,9H),1.71-1.82(m,11H),1.38-1.60(m,2H),1.09-1.17(m,12H).
31P NMR(400MHz,DMSO-d6)δ-145.22.
实施例2化合物E2的制备
1化合物2的制备
在室温下将化合物1(2.60g,2.57mmol，根据实施例1化合物6的方法制备)溶解到DCM(60.0mL)中，向溶液中依次加入DIEA(2.12mL,12.8mmol)，化合物A1(4.46g,10.3mmol，根据实施例22中间体2-3的方法制备)，置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌18小时。液质联用检测到产物的MS响应。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1)显示原料完全消失且有新点生成。反应液在减压下浓缩，所得的粗产品经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝100/7～100/15)得到白色固体2(约4.1g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.28-7.41(m,5H),5.31-5.35(m,3H),5.15(s,2H),5.07-5.11(m,3H),4.61-4.65(m,3H),4.07-4.19(m,9H),4.00-4.04(m,3H),3.91-3.94(m,3H),3.64-3.76(m,8H),3.56-3.64(m,13H),3.52-3.56(m,6H),3.34-3.45(m,10H),2.60-2.64(m,2H),2.41-2.46(m,6H),2.14(s,9H),2.03(s,9H),1.94(d,J＝6.80Hz,18H).LCMS:m/z＝883.0(M/2+H)+.
2化合物3的制备
在室温下将化合物2(4.10g,2.33mmol)溶解到MeOH(100mL)中，向该溶液中加入质量分数为10％的湿Pd/C(0.50g,4.70mmol)，置换3次氢气，反应混合物在氢气氛围下(14.696psi)、25℃下搅拌18小时。液质联用检测到产物的MS响应，薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1，磷钼酸显色)显示原料已完全消耗且有新点生成。反应液过滤，滤液在减压下浓缩得到白色固体3(约3.87g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.30-5.36(m,3H),5.07-5.09(m,3H),4.60-4.66(m,3H),4.06-4.22(m,9H),4.01-4.06(m,3H),3.92-3.96(m,3H),3.69-3.75(m,3H),3.61-3.67(m,14H),3.48-3.60(m,7H),3.32-3.45(m,16H),2.49-2.51(m,2H),2.43-2.47(m,6H),2.15(s,9H),2.03(s,9H),1.95(d,J＝5.20Hz,18H).LCMS:m/z＝837.9(M/2+H)+.
3化合物5的制备
在25℃下将化合物3(1.54g,0.920mmol)溶于DMF(15.0mL)，依次加入HATU(0.52g,1.38mmol)，DIEA(0.456mL,2.76mmol)，反应液在25℃下搅拌30分钟，然后加入化合物4，反应液在25℃下搅拌2.5小时。LCMS显示化合物3消耗完全且有化合物5的MS值。将反应液用50mL DCM稀释，用饱和NaHCO3溶液(20mL X 3)洗涤，有机相再用饱和食盐水溶液(20mL X3)洗涤，然后将有机相用无水Na2SO4干燥，有机相旋干得到粗品。所得的粗产品经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝1/0～5/1)得到白色固体化合物5(约1.26g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.32-5.36(m,3H),5.06(dd,J＝3.2,11.2Hz,3H),4.61-4.66(m,3H),4.06-4.20(m,9H),4.01-4.05(m,3H),3.91-3.97(m,3H),3.70-3.76(m,3H),3.60-3.67(m,14H),3.50-3.57(m,7H),3.33-3.40(m,18H),2.66(t,J＝6.0Hz,2H),2.44(t,J＝6.0Hz,6H),2.15(s,9H),2.03(s,9H),1.92-1.98(m,18H),1.27-1.50(m,4H).LCMS:m/z＝879.5(M/2+H)+.
4E2的制备
在室温下将化合物5(1.26g,0.717mmol)溶解到DCM(10.0mL)中，向该溶液中加入化合物6(0.43g,1.43mmol)，DCI(0.08g,0.717mmol)，置换3次氮气，反应混合物在25℃下搅拌1小时。液质联用检测到产物的MS响应，反应液在冰盐浴下降温至0℃，向反应液中加入6mL饱和NaHCO3溶液和6mL饱和食盐水溶液，加入50mL DCM萃取，有机相再用饱和NaHCO3和饱和食盐水的1：1混合溶液(20mL X 3)洗涤，然后将有机相用Na2SO4干燥，有机相旋干得到粗品。粗品用15mL DCM溶解，将粗品溶液慢慢滴入干冰浴的MTBE中，过滤得到白色固体E2(640mg,收率45.60％，纯度77.02％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79-7.91(m,6H),5.20-5.23(m,3H),4.96-4.98(m,3H),4.51-4.56(m,3H),4.03(s,10H),3.65-3.92(m,11H),3.46-3.61(m,21H),3.34-3.42(m,8H),3.19-3.22(m,15H),2.74-2.76(m,2H),2.52-2.54(m,2H),2.27-2.29(m,6H),2.10(s,9H),2.00(s,9H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.12-1.16(m,12H)
31P NMR(400MHz,DMSO-d6)δ-145.243
LCMS:m/z＝1037.4(M/2+CH3COOH)+.
实施例3化合物E3的制备
1化合物3的制备
在室温下将化合物2(0.17g,1.43mmol)溶解到DMF(10.0mL)中，向该溶液中加入化合物1(1.20g,0.717mmol，根据实施例2化合物3的方法制备)，DIEA(0.178mL,1.08mmol)，HATU(0.41g,1.08mmol)，置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌1小时。液质联用检测到产物的MS响应。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝8/1)显示原料完全消失且有新点生成。反应液在减压下浓缩，所得的粗产品经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝10/1～8/1)得到白色固体3(0.96g).LCMS:m/z＝887.4(M/2+H)+.
2E3的制备
在室温下将化合物3(0.96g,0.542mmol)溶解到DCM(10.0mL)中，向该溶液中加入化合物4(0.33g,1.08mmol)，DCI(0.03g,0.271mmol)，置换3次氮气，反应混合物在25℃下搅拌1小时。液质联用检测到产物的MS响应。反应液在冰盐浴下降温至0℃，向反应液中依次加入6mL饱和NaHCO3溶液和6mL饱和食盐水溶液，加入50mL DCM萃取，有机相再用饱和NaHCO3和饱和食盐水的1：1混合溶液(20mL X 3)洗涤，有机相用Na2SO4干燥，有机相旋干得到粗品。粗品用15mL DCM溶解，将粗品溶液慢慢滴入干冰浴的MTBE中，过滤得到白色固体E3(520mg,收率48.67％，纯度85.29％)。
LCMS(ESI):m/z＝1045.3(M/2+CH3COOH)+；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.75-7.92(m,6H),5.19-5.22(m,3H),4.96-4.99(m,3H),4.52-4.57(m,3H),4.01-4.04(m,10H),3.73-3.92(m,11H),3.46-3.61(m,21H),3.37-3.41(m,8H),3.19-3.22(m,15H),2.75-2.78(m,3H),2.27-2.32(m,6H),2.06-2.13(m,11H),1.99-2.02(m,9H),1.86-1.90(m,9H),1.76-1.79(m,9H),1.12-1.15(m,12H)
31P NMR(400MHz,DMSO-d6)δ-147.960
实施例4化合物E4的制备
1化合物3的制备
在22℃下将化合物1(1.35g,0.748mmol，根据实施例1化合物8的方法制备)，HATU(0.43,g,1.12mmol)和DIEA(0.371mL,2.24mmol)依次溶解到无水DMF(15.0mL)中，氮气置换3次，在22℃下搅拌0.5小时，加入化合物2(42.0mg,0.415mmol)，在22℃下搅拌2小时。LC/MS显示原料全部消失，有一个主峰生成。薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝8/1)显示原料消失，有新点生成。反应液用二氯甲烷(100mL)稀释，依次使用饱和碳酸氢钠水溶液(20.0mL x 3)和饱和食盐水(20.0mL x 3)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩得到粗产品。粗产品通过柱层析(二氯甲烷：甲醇＝100/1-8/1)纯化得到白色固体化合物3(约950mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.34(d,J＝2.8Hz,3H),5.05-5.10(m,3H),4.61-4.68(m,3H),4.08-4.21(m,9H),4.01-1.20(m,4H),3.89-4.00(m,5H),3.59-3.77(m,33H),3.56(t,J＝5.6Hz,7H),3.34-3.42(m,15H),2.62-2.70(m,2H),2.43(t,J＝6.0Hz,6H),2.14(s,9H),2.03(s,9H),1.92-1.96(m,18H).LCMS:m/z＝953.3(M/2+H)+.
2E4的制备
化合物3(1.00g,0.525mmol)用乙腈溶解后旋干除去化合物中的水，然后在氮气氛围下用DCM(10.0mL)溶解，缓慢滴加化合物4(0.32g,1.05mmol)和DCI(0.03g,0.262mmol)，反应液在20℃反应1小时。LCMS显示原料消失，反应液冷却至0℃，滴加6毫升饱和碳酸氢钠水溶液和6毫升饱和食盐水，用100毫升二氯甲烷稀释，分液，有机相用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水1:1混合水溶液50毫升洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到粗产品。粗产品用15毫升二氯甲烷稀释，慢慢滴加到60毫升甲基叔丁基醚中，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤三次，滤饼用乙腈溶解后旋干除去化合物中的甲基叔丁基醚。得到黄色固体产物E4(712mg,0.339mmol,64.4％)。
LCMS(ESI):m/z＝1111.5((M+59*2)/2+H)+；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.86-7.94(m,3H),7.76-7.84(m,3H),5.19-5.26(m,3H),4.92-5.00(m,3H),4.51-4.57(m,3H),3.98-4.08(m,10H),3.82-3.93(m,5H),3.73-3.81(m,5H),3.45-3.63(m,36H),3.38-3.41(m,6H),3.15-3.26(m,15H),2.75-2.83(m,2H),2.52-2.54(m,2H),2.28(t,J＝6.4Hz,6H),2.10(s,9H),2.00(s,9H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.07-1.17(m,12H).
31P NMR(400MHz,DMSO-d6)δ-147.928,-148.145
实施例5化合物E5的制备
1化合物2的制备
在25℃下将化合物1(10g,22.349mmol，根据实施例25中间体1-3的方法制备)溶于二氯甲烷(300mL)，依次加入化合物2A(4.67g,26.819mmol)、HOBt(3.62g,26.819mmol)、EDCI(5.14g,26.819mmol)和DIEA(11.082mL,67.048mmol)，反应液在25℃下搅拌18小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1)显示化合物1消耗完全且有新点生成。LCMS显示有化合物2的MS值。将反应液用300mL二氯甲烷稀释，用饱和柠檬酸水溶液(30mL×3)洗涤，有机相再用饱和碳酸氢钠溶液(50mL×3)洗涤，然后将有机相用无水硫酸钠干燥，有机相旋干得到白色固体化合物2(约11.5g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.33-5.37(m,1H),5.07(dd,J＝3.2,11.2Hz,1H),4.54-4.62(m,1H),4.11-4.26(m,3H),4.00-4.06(m,1H),3.85-3.93(m,1H),3.48-3.60(m,1H),3.18-3.24(m,2H),3.05-3.11(m,2H),2.20(t,J＝7.2Hz,2H),2.16(s,3H),2.04(s,3H),1.92-1.98(m,6H),1.55-1.75(m,6H),1.45(s,9H).LCMS:m/z＝604.1(M+H)+.
2化合物3的制备
在25℃下将化合物2(10g,16.565mmol)溶于二氯甲烷(100mL)，缓慢滴入TFA(10mL)，反应液在25℃下搅拌18小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1)显示反应物消耗完全且有一个新点生成。将反应液浓缩至干燥得到粗品黄色油状液体化合物3(约20g)。1HNMR(400MHz,CD3OD)δ5.32-5.36(m,1H),5.04(dd,J＝3.2,11.2Hz,1H),4.50-4.55(m,1H),3.97-4.16(m,4H),3.85-3.92(m,1H),3.48-3.57(m,1H),3.26-3.30(m,2H),2.90-2.98(m,2H),2.24(t,J＝7.2Hz,2H),2.14(s,3H),2.02(s,3H),1.92-1.96(m,6H),1.80-1.88(m,2H),1.63-1.73(m,2H),1.57-1.62(m,2H).
3化合物5的制备
在25℃下将化合物4(4.37g,4.315mmol，根据实施例1化合物6的方法制备)溶于二氯甲烷(150mL)，依次加入化合物3(8.7g,17.277mmol)和DIEA(6mL,36.302mmol)，反应液在25℃下搅拌18小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1)显示化合物4消耗完全)，薄层色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)显示有新产物点生成。LCMS显示有化合物5的MS值。将反应液用100mL二氯甲烷稀释，用饱和柠檬酸水溶液(30mL×3)洗涤，有机相再用饱和碳酸氢钠溶液(30mL×3)洗涤，然后将有机相用无水硫酸钠干燥，有机相旋干得到粗品。粗品进行MPLC(石油醚/乙酸乙酯＝1/0-10/1)纯化得到白色固体化合物5(约7.1g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.30-7.40(m,5H),5.31–5.36(m,3H),5.15(s,2H),5.06(dd,J＝3.2,11.2Hz,3H),4.52-4.58(m,3H),4.10-4.32(m,12H),3.83-3.90(m,3H),3.67-3.73(m,1H),3.62-3.66(m,2H),3.56-3.61(m,6H),3.48-3.55(m,3H),3.33-3.36(m,5H),3.17-3.24(m,13H),2.60(t,J＝6.0Hz,2H),2.39(t,J＝6.0Hz,6H),2.20(t,J＝7.2Hz,6H),2.14(s,9H),2.02(s,9H),1.91-1.96(m,18H),1.62-1.73(m,13H),1.52-1.62(m,6H).LCMS:m/z＝987.6(M/2+H)+.
4化合物6的制备
在25℃下将化合物5(7.1g,3.602mmol)溶于甲醇(100mL)，加入质量分数为10％的Pd/C(0.5g,4.698mmol)，反应液在氢气(14.696psi)氛围以及25℃条件下搅拌18小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝8/1)显示化合物5消耗完全且有一个新点生成。将反应液过滤，滤液旋干得到化合物6(约6.7g)。
5化合物8的制备
/>
化合物6(1.50g,0.797mmol)，HATU(0.450g,1.196mmol)，DIEA(0.395mL,2.392mmol)加入到DMF(15.0mL)中，氮气置换三次，在20℃下反应30分钟后加入化合物7(0.120g,1.19mmol)。反应液在20℃下反应2小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝8/1)显示原料消失，有新点生成。反应液用二氯甲烷(100mL)稀释，依次使用饱和碳酸氢钠水溶液(30.0mL x 3)和饱和食盐水(30.0mL x 3)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩得到粗产品。粗产品通过柱层析(二氯甲烷：甲醇＝100/1-8/1)纯化得到黄色固体化合物8(约1.00g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.31-5.36(m,3H),5.06(dd,J＝3.2,11.2Hz,3H),4.50-4.58(m,3H),4.07-4.23(m,10H),3.98-4.06(m,4H),3.84-3.92(m,5H),3.60-3.65(m,8H),3.50-3.56(m,3H),3.33-3.36(m,8H),3.18-3.26(m,13H),2.60-2.68(m,2H),2.41(t,J＝6.0Hz,6H),2.21(t,J＝7.2Hz,6H),2.14(s,9H),2.03(s,9H),1.90-1.98(m,20H),1.56-1.74(m,20H).LCMS:m/z＝983.1(M/2+H)+.
6E5的制备
在25℃下将化合物8(1g,0.509mmol)溶于二氯甲烷(10mL)，依次加入DCI(0.03g,0.255mmol)和化合物9(0.31g,1.018mmol)，反应液在氮气氛围和25℃条件下搅拌2小时。LCMS显示化合物8消耗完全且有E5的MS值。反应液在冰盐浴下降温至0℃，往反应液中加入6mL饱和碳酸氢钠溶液和6mL饱和食盐水溶液，然后加入50mL二氯甲烷，有机相再用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水的1：1混合溶液(20mL×3)洗涤，然后将有机相用无水硫酸钠干燥，有机相旋干得到粗品。粗品用15mL二氯甲烷溶解，将粗品溶液慢慢滴入干冰浴的甲基叔丁基醚中，析出白色固体，过滤得到白色固体E5(722mg,0.222mmol,43.61％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.80-7.85(m,6H),7.70-7.76(m,3H),5.19-5.23(m,3H),4.93-5.00(m,3H),4.45-4.51(m,3H),3.99-4.05(m,10H),3.83-3.90(m,3H),3.64-3.74(m,6H),3.56-3.62(m,2H),3.47-3.55(m,9H),3.36-3.44(m,4H),3.21(s,8H),2.98-3.07(m,13H),2.76(t,J＝6.0Hz,2H),2.53-2.58(m,2H),2.26(t,J＝6.0Hz,6H),2.10(s,9H),2.04(t,J＝7.2Hz,6H),2.00(s,9H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.38-1.55(m,22H),1.06-1.17(m,12H).
31P NMR(400MHz,DMSO-d6)δ-145.243
LCMS:m/z＝1041.7((M-83)/2+H)+.
实施例6化合物E6的制备
1化合物3的制备
将化合物1(1.50g,0.797mmol，根据实施例5化合物6的方法制备)，HATU(0.450g,1.19mmol)，DIEA(0.395mL,2.39mmol)加入到DMF(15.0mL)中，氮气置换三次，在20℃下反应30分钟后加入化合物2(0.180g,1.19mmol)。反应液在20℃下反应2小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝8/1)显示原料消失，有新点生成。反应液用二氯甲烷(100mL)稀释，依次使用饱和碳酸氢钠水溶液(30.0mL x 3)和饱和食盐水(30.0mL x 3)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩得到粗产品。粗产品通过柱层析(二氯甲烷/甲醇＝100/1-8/1)纯化。得到黄色固体化合物3(约800mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.33(d,J＝3.2Hz,3H),5.02-5.10(m,3H),4.55(d,J＝8.4Hz,3H),4.07-4.20(m,9H),3.99-4.06(m,4H),3.94-3.98(m,1H),3.85-3.90(m,3H),3.48-3.68(m,15H),3.34(s,8H),3.18-3.27(m,13H),2.62-2.69(m,2H),2.40(t,J＝6.0Hz,6H),2.21(t,J＝7.2Hz,6H),2.14(s,9H),2.03(s,9H),1.91-1.96(m,18H),1.54-1.74(m,20H).LCMS:m/z＝990.7(M/2+H)+.
2E6的制备
在25℃下将化合物3(800mg,0.404mmol)溶于二氯甲烷(10mL)，依次加入DCI(23.86mg,0.202mmol)和化合物4(0.31g,1.018mmol)，反应液在氮气氛围和25℃条件下搅拌2小时。LCMS显示化合物3消耗完全且有E6的MS值。反应液在冰盐浴下降温至0℃，往反应液中加入6mL饱和碳酸氢钠溶液和6mL饱和食盐水溶液，然后加入50mL二氯甲烷，有机相再用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水的1：1混合溶液(20mL×3)洗涤，然后将有机相用无水硫酸钠干燥，有机相旋干得到粗品。粗品用15mL二氯甲烷溶解，将粗品溶液慢慢滴入干冰浴的甲基叔丁基醚中，析出白色固体，过滤得到白色固体E6(595mg,0.117mmol,29.07％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79-7.86(m,6H),7.70-7.77(m,3H),5.21(d,J＝3.2Hz,3H),4.96(dd,J＝3.2,11.2Hz,3H),4.48(d,J＝8.0Hz,3H),4.02(s,9H),3.80-3.92(m,5H),3.66-3.79(m,6H),3.47-3.65(m,13H),3.36-3.45(m,5H),3.21(s,8H),2.96–3.07(m,13H),2.74-2.81(m,2H),2.54-2.56(m,2H),2.26(t,J＝6.0Hz,6H),2.10(s,9H),2.04(t,J＝7.2Hz,6H),2.00(s,9H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.41-1.53(m,18H),1.14(d,J＝6.4Hz,12H).
31P NMR(400MHz,DMSO-d6)δ-147.942
LCMS:m/z＝1049.4(M/2+H)+.
实施例7化合物E7的制备
1化合物3的制备
在室温下将化合物1(2.00g,1.87mmol，根据实施例24中间体3-3的方法制备)溶解到DCM(20.0mL)中，向溶液中依次加入DIEA(0.135mL,0.814mmol)，化合物2(0.550g,0.814mmol)，置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌16小时。液质联用检测到产物的MS响应，薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝5/1)显示原料消失且有新点生成。反应液在减压下浓缩，所得的粗产品经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝5/1)得到白色固体3(约780mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.28-7.42(m,5H),5.30-5.34(m,4H),5.04-5.14(m,6H),4.63-4.67(m,4H),4.36-4.44(m,2H),4.00-4.20(m,23H),3.91-3.95(m,4H),3.69-3.77(m,9H),3.52-3.67(m,32H),3.34-3.43(m,9H),2.29-2.31(m,4H),2.14(s,12H),2.03(s,12H),1.92-1.96(m,24H).LCMS:m/z＝1221.6(M/2+H)+.
2化合物4的制备
在室温下将化合物3(1.10g,0.451mmol)溶解到MeOH(10.0mL)中，向该溶液中加入质量分数为10％的湿Pd/C(0.050g,0.451mmol)，置换3次氢气，反应混合物在氢气氛围下(14.696psi)、25℃下搅拌18小时。液质联用检测到产物的MS响应，薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1，磷钼酸显色)显示原料已完全消耗且有新点生成。反应液过滤，滤液在减压下浓缩得到白色固体4(约840mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.32-5.34(m 4H),5.06-5.10(m,4H),4.63-4.65(m,4H),4.38-4.40(m,2H),3.99-4.20(m,20H),3.90-3.97(m,4H),3.69-3.76(m,6H),3.50-3.68(m,36H),3.35-3.44(m,11H),2.28-2.38(m,4H),2.15(s,12H),2.03(s,12H),1.90-1.94(m,24H).LCMS:m/z＝1154.7(M/2+H)+.
3化合物6的制备
在室温下将化合物5(232mg,0.364mmol，根据实施例13的化合物Int-6的方法制备)溶解到DCM(10.0mL)中，向溶液中依次加入HBTU(207mg,0.546mmol)，DIEA(0.181mL,1.09mmol))和化合物4(840mg,0.364mmol)，置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌1小时。液质联用检测到原料消失，薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝5/1)显示原料消失且有新点生成。反应液在减压下浓缩，所得的粗产品经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝8/1～5/1)得到白色固体6(约620mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.41-7.43(m,2H),7.23-7.34(m,7H),6.83-6.90(m,4H),5.31-5.35(m,4H),5.01-5.12(m,4H),4.63-4.65(m,4H),4.41-4.45(m,2H),4.31-4.33(m,1H),3.99-4.22(m,22H),3.87-3.97(m,6H),3.58-3.81(m,45H),3.34-3.43(m,10H),2.19-2.40(m,10H),2.14(s,12H),2.02(s,12H),1.92-1.96(mz,24H),1.48-1.63(m,4H),1.28-1.38(m,8H).LCMS:m/z＝1460.0(M/2+H)+.
4E7的制备
在室温下将化合物6(300mg,0.103mmol)溶解到DCM(10.0mL)中，向溶液中依次加入DIEA(0.102mL,0.618mmol)，化合物7(10.3mg,0.103mmol)和DMAP(12.6mg,0.103mmol)，置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌2小时。液质联用检测到原料消失。反应液在减压下浓缩，所得的粗产品经制备型高效液相色谱制备(制备型-HPLC,柱：Waters Xbridge BEHC18 100*30mm*10um；流动相:水-ACN；B％:17％-57％,5min)分离得到白色固体E7(53.0mg,收率17.08％,纯度78.94％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.41-7.45(m,2H),7.17-7.34(m,7H),6.85-6.89(m,4H),5.32-5.36(m,4H),5.03-5.13(m,4H),4.63-4.67(m,4H),4.38-4.47(m,2H),4.32-4.34(m,1H),4.01-4.26(m,22H),3.88-4.00(m,6H),3.77-3.81(m,7H),3.49-3.76(m,45H),3.33-3.47(m,10H),2.56-2.62(m,2H),2.45-2.55(m,3H),2.21-2.38(m,7H),2.14(s,12H),2.05-2.11(m,2H),2.02(s,12H),1.92-1.96(m,24H),1.47-1.68(m,4H),1.28-1.34(m,8H)
MS:m/z＝3022.36(M+H)+.
实施例8化合物E8的制备
1化合物1的制备
在25℃下将化合物1A(5.00g,17.8mmol)加入DCM(200mL)中，再依次加入化合物五氟苯酚(8.18g,44.4mmol)和EDCI(10.2g,53.3mmol)，反应液在25℃下搅拌14小时。薄层色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)显示有新点生成。反应液真空浓缩得到粗品，粗品进行柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/0-5/1)纯化得到白色固体化合物1(约9.00g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34-7.38(m,5H),5.39-5.41(m,1H),5.19(s,2H),4.87-4.92(m,1H),2.86-2.97(m,2H),2.55-2.58(m,1H),2.28-2.34(m,1H).
2化合物3的制备
将化合物1(800mg,1.30mmol)溶解在DCM(20.0mL)中，加入DIEA(421mg,3.26mmol)和化合物2(2076mg,3.26mmol，根据实施例24中间体5的方法制备)，反应液在25℃下搅拌18小时，LC/MS检测到产品该有的MS响应，点板(DCM：MeOH＝10：1)显示原料已反应完全，反应液直接浓缩过正相硅胶柱,MeOH:DCM＝0：1到1:10洗脱，得到淡黄色固体化合物3(约1.3g).LCMS:m/z＝1290.4(M+H)+.
3化合物4的制备
将化合物3(1.30g,1.01mmol)溶解在MeOH(30mL)中，加入质量分数为10％的Pd/C(0.20g,1.88mmol)，置换3次氢气，反应液在25℃H2(15psi)氛围下反应18小时。LC/MS检测到产物该有的MS响应，反应液过滤除去Pd/C，用甲醇洗涤，滤液合并浓缩得到黄色油状化合物4(约1.08g)。LCMS:m/z＝1156.9(M+H)+.
4化合物6的制备
将化合物4(1080mg,0.934mmol)溶解在DCM(20mL)，加入化合物5(302.2mg，0.449mmol，根据实施例7化合物2的方法制备)和DIEA(0.17mL,0.934mmol)，反应液在25℃下搅拌18小时。LC/MS检测到产物该有的MS响应，TLC(DCM:MeOH＝10:1)显示有新点生成，反应液直接浓缩过柱(从DCM:MeOH＝1:0到DCM:MeOH＝10:1)得到化合物6(约820mg)。LCMS:m/z＝1309.5(M/2+H)+.
5化合物7的制备
将化合物6(800mg,0.306mmol)溶解在MeOH(10mL)中，加入质量分数为10％的Pd/C(100mg,0.940mmol)，置换3次氢气，反应液在25℃H2(15psi)氛围下反应18小时。LC/MS检测到产物该有的MS响应，反应液过滤除去Pd/C，用甲醇洗涤，滤液合并浓缩得到白色固体化合物7(约700mg)。LCMS:m/z＝1242.4(M/2+H)+.
6化合物9的制备
将化合物7(700mg,0.282mmol)溶解在DCM(20mL)中，依次加入HBTU试剂(160mg,0.423mmol)、DIEA(0.140mL,0.846mmol)和化合物8(180mg,0.282mmol，根据实施例13的化合物Int-6的方法制备)，反应液在25℃下搅拌18小时。LC/MS检测到产物该有的MS响应。TLC(DCM:MeOH＝10:1)显示原料已反应完全，有新点生成。反应液用20ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，二氯甲烷(20ml x 2)萃取，有机相合并浓缩，过正相柱(DCM:MeOH＝1:0至10:1)得到白色固体化合物9(约750mg)。LCMS:m/z＝1399.1[(M-DMTr)/2+H]+.
7E8的制备
将化合物9(500mg,0.161mmol)溶解在DCM(5mL)中，加入化合物10(96.9mg,0.968mmol)、DIEA(0.160mL,0.968mmol)和DMAP(19.7mg,0.161mmol)，反应液在25℃下搅拌18小时。LCMS检测到产物该有的MS响应。反应液直接旋干，加5ml乙腈溶解，通过制备型-HPLC(色谱柱:Waters Xbridge BEH C18 100*30mm*10um；流动相:水-乙腈]；B％:20％-50％,11min；流速：50ml/min)得到白色固体化合物E8。LCMS(ESI):m/z＝1449.0[(M-DMTr)/2+H]+；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.43(d,J＝8.0Hz,2H),7.30-7.32(m,6H),7.20-7.25(m,1H),6.85-6.89(m,4H),5.33(d,J＝3.2Hz,4H),5.06(dd,J＝11.2,3.2Hz,4H),4.66(d,J＝8.8Hz,4H),4.33-4.43(m,4H),4.09-4.17(m,12H),4.01-4.04(m,8H),3.89-3.94(m,4H),3.79(d,J＝2.0Hz,6H),3.71-3.76(m,9H),3.60-3.66(m,48H),3.52-3.58(m,8H),3.37-3.40(m,8H),2.54-2.60(m,4H),2.26-2.31(m,8H),2.14(s,12H),2.02(s,12H),1.96-2.00(m,2H),1.94(d,J＝4.0Hz,24H),1.53-1.61(m,4H),1.29-1.38(m,10H).
实施例9化合物E9的制备
/>
1化合物1C的制备
在室温条件下，将化合物1A(10g，82.6mmol)、化合物1B(42.3g，330mmol)和NaOH(5M，1.65mL)依次加入DMSO(300mL)中，在24℃下反应12小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1)显示有新点生成。反应液加入水(1000mL)稀释，随后二氯甲烷萃取(500ml x 3)，有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩得到无色油状化合物1C(45g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.62-3.70(m,6H)3.25-3.49(m,6H),2.41-2.52(m,6H),1.45(s,27H)
2化合物1的制备
在室温条件下，将化合物1C(30.0g，59.3mmol)，CbzOSu(17.8g，71.2mmol)，DIEA(11.5g，89mmol)依次加入到DCM(300mL)中。在25℃下反应14小时。薄层色谱(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)显示有新点生成。反应液加入水(500mL)稀释，随后二氯甲烷萃取(200ml x 3)，有机相减压浓缩，粗产品柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝30/1-2/1)得到无色油状化合物1(约19.0g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.29-7.39(m,5H),5.30(s,1H),5.04(s,2H),3.57-3.72(m,12H),2.44(t,J＝6.4Hz,6H),1.44(s,27H)
3化合物2的制备
在室温下将化合物1(8.00g,21.083mmol)溶解到DCM(30mL)中，加入TFA(10mL,130.591mmol)，25℃下搅拌15小时。液质联用显示原料反应完全，有产物生成。反应液直接减压浓缩得到无色油状物2的粗品(约7.27g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.26-7.38(m,5H),5.03(s,2H),3.59-3.70(m,12H),2.51(t,J＝6.0Hz,6H).LCMS:m/z＝472.1(M+H)+.
4化合物4的制备
在室温下将化合物2(1.00g,2.121mmol)溶解到DMF(30mL)中，加入EDCI(2.44g,12.726mmol)、化合物3(2.34g,12.726mmol)，25℃下搅拌2小时。薄层色谱(石油醚：乙酸乙酯＝5：1)显示原料消失，有新点生成。反应液减压浓缩得到粗产品，再经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝20/3～5/1)。得到白色固体4(约1.24g,)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.26-7.38(m,5H),4.98(s,2H),3.80(t,J＝5.6Hz,6H),3.72(s,6H),2.93(t,J＝5.2Hz,6H)
5化合物5的制备
在室温下将化合物4(1.24g,1.279mmol)溶解到DMF(40mL)中，加入化合物A2(1.84g,3.837mmol，根据实施例23中间体3-4的方法制备)和DIEA(2.114mL,12.789mmol)，25℃下搅拌15小时。薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝10：1，磷钼酸显色)显示原料消失，有新点生成。反应液减压浓缩，粗产品再经柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝25/2～10/1)。得到白色固体5(约1.60g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.27-7.41(m,5H),5.34(d,J＝3.6Hz,3H),5.07(dd,J＝3.2,11.2Hz,3H),5.04(s,2H),4.64(d,J＝8.4Hz,3H),4.06-4.19(m,9H),4.00-4.05(m,3H),3.90-3.96(m,3H),3.70-3.75(m,3H),3.59-3.70(m,30H),3.51-3.56(m,6H),3.34-3.39(m,6H),2.43(t,J＝6.0Hz,6H),2.14(s,9H),2.03(s,9H),1.95(s,9H),1.93(s,9H)
6化合物6的制备
在室温下将化合物5(1.6g,0.864mmol)溶解到MeOH(20mL)中，加入质量分数为10％的Pd/C(0.3g,2.819mmol),用H2置换3遍，25℃下搅拌15小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1)显示原料消失，有新点生成。液质联用显示原料反应完全，有产物生成。反应液用硅藻土过滤，滤液减压浓缩得到无色透明固体6(约1.40g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.34(d,J＝2.8Hz,3H),5.07(dd,J＝3.2,11.2Hz,3H),4.65(d,J＝8.4Hz,3H),4.06-4.20(m,9H),4.01-4.06(m,3H),3.90-3.98(m,3H),3.72-3.76(m,3H),3.52-3.70(m,30H),3.36-3.41(m,12H),2.46(t,J＝6.0Hz,6H),2.15(s,9H),2.03(s,9H),1.95(s,9H),1.94(s,9H).LCMS:m/z＝860.1(M/2+H)+.
7化合物7的制备
在25℃下将化合物7A(20g,98.888mmol)加入DCM(500mL)中，再依次加入化合物7B(45.51g,247.3219mmol)和EDCI(56.87g,296.663mmol)，反应液在25℃下搅拌18小时。薄层色谱(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)显示反应物消耗完全，薄层色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)显示有新产物点生成。反应液真空浓缩得到粗品，粗品进行MPLC纯化得到白色固体化合物7(约48.7g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.68(t,J＝7.6Hz,4H),1.72-1.87(m,4H),1.34-1.51(m,8H).
8化合物8的制备
在室温下将化合物6(1.00g,0.582mmol)溶解到DMF(20mL)中，加入7(0.93g,1.745mmol)和DIEA(0.481mL,2.909mmol)，在25℃下反应15小时。薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝10：1)显示原料消失，有新点生成。反应液减压浓缩,粗产品再经柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝25/2～10/1)，得到无色油状液体8(约809mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.34(d,J＝2.8Hz,3H),5.07(dd,J＝3.2,11.2Hz,3H),4.65(d,J＝8.4Hz,3H),4.06-4.18(m,9H),4.01-4.05(m,3H),3.90-3.98(m,3H),3.61-3.76(m,35H),3.54-3.58(m,6H),3.36-3.41(m,6H),2.73(t,J＝7.2Hz,2H),2.45(t,J 6.0Hz,6H),2.14(s,9H),2.03(s,9H),1.90-1.97(m,18H),1.70-1.84(m,2H),1.52-1.65(m,2H),1.30-1.35(m,8H).1H NMR:RW0008-15-P1A(400MHz,CD3OD)
9化合物10的制备
在室温下将化合物8(350mg,0.169mmol)溶解到DCM(2.00mL)中，加入化合物9(76.1mg,0.169mmol)和DIEA(0.112mL,0.677mmol)，反应12小时，薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1)显示原料消失，有新点生成。反应液用水稀释(10mL)，二氯甲烷萃取(10mL x 3)，有机相经硫酸钠干燥、过滤，滤液减压浓缩得到无色油状物10(约388mg)。1H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ7.43(d,J＝8.4Hz,2H),7.20-7.35(m,7H),6.82-6.92(m,4H),5.34(d,J＝2.8Hz,3H),5.07(dd,J＝3.6,11.2Hz,3H),4.65(d,J＝8.4Hz,3H),4.06-4.17(m,9H),3.99-4.05(m,3H),3.90-3.96(m,4H),3.79(d,J＝2.8Hz,6H),3.58-3.75(m,39H),3.53-3.57(m,7H),3.38(t,J＝5.6Hz,8H),3.22-3.24(m,1H),2.45(t,J＝6.0Hz,6H),2.15-2.20(m,2H),2.13-2.15(m,9H),2.02-2.04(m,9H),1.91-1.96(m,18H),1.49-1.61(m,4H),1.27-1.35(m,8H)
10E9的制备
在室温下将化合物10(388mg,0.166mmol)溶解到DCM(4mL)中，加入DIEA(0.165mL,0.997mmol)、DMAP(5.08mg,0.042mmol)和化合物11(99.79mg,0.997mmol)，在25℃下反应3小时。LCMS显示原料反应完全，有产物生成。加入二氯甲烷稀释(30mL)，再用饱和NaCl溶液(10mL x 3)洗涤有机相3遍,再用无水硫酸钠干燥。反应液减压浓缩，所得到粗产品经制备型高效液相色谱制备(制备型-HPLC,柱：Welch Xtimate C18150*25mm*5um；流动相:水-ACN；B％:20％-50％,11min)分离得到白色固体E9(78.0mg,收率19.28％，纯度76.01％)。LCMS:m/z＝1216.1(M/2+H)+；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.43(d,J＝8.0Hz,2H),7.22-7.35(m,7H),6.80-6.92(m,4H),5.34(d,J＝3.2Hz,3H),5.08(dd,J＝3.2,11.2Hz,3H),4.65(d,J＝8.4Hz,3H),4.05-4.18(m,10H),4.00-4.04(m,3H),3.90-3.97(m,4H),3.79(d,J＝2.4Hz,6H),3.58-3.75(m,39H),3.55(t,J＝5.2Hz,7H),3.32-3.42(m,8H),3.20-3.24(m,1H),2.56(dd,J＝5.6,18.8Hz,4H),2.44(t,J＝6.0Hz,6H),2.16-2.21(m,2H),2.14(s,9H),2.02(s,9H),1.90-1.98(m,18H),1.48-1.61(m,4H),1.31(d,J＝13.2Hz,8H)
实施例10化合物E10的制备
1化合物1A的制备
将化合物1C(20g,73.8mmol)溶解在无水甲苯(200mL)中，依次加入四丁基硫酸氢铵(3.75g,11.0mmol)、溴乙酸叔丁酯(85.9g,442.8mmol)、30％NaOH(160mL)，反应液在45℃下搅拌18小时。TCL板(PE：EA＝1:1，UV254 nm)显示有原料已消耗完全，有新点生成。反应液冷却到室温，静置分层、分液，下层碱水相用甲基叔丁基醚萃取(200ml x 2)，有机相合并浓缩，过正相柱(硅胶,PE：EA＝1：0到PE：EA＝3:1)得到化合物1A(约28.5g)。
2化合物1B的制备
向THF(100mL)中搅拌下加入LiAlH4(1.67g,44.0mmol)，置换氮气后用冰浴冷却到0℃，将化合物1A(10.0g,20.0mmol)溶解在20ml THF中，0℃下用注射器缓慢滴加到上述溶液中，反应液在0℃下搅拌2小时。LC/MS检测到原料已消耗完全，且有产物该有的MS响应。搅拌下向反应液中依次滴加2ml水，2ml 15％ NaOH水溶液，6ml水，充分搅拌后加入无水硫酸钠粉末，搅拌15分钟后过滤，有机相浓缩得到无色油状化合物1B(约6.60g)。LCMS:m/z＝360.3(M+H)+.
3化合物1的制备
将化合物1B(6.60g,18.4mmol)溶解在无水甲苯(100mL)中，依次加入四丁基硫酸氢铵(1.25g,3.67mmol)、溴乙酸叔丁酯(21.5g,110mmol)、30％NaOH(80mL)，反应液在45℃下搅拌18小时。LC/MS检测到产物该有的MS响应，TCL板(PE：EA＝3:1，UV254 nm)显示有原料已消耗完全，有新点生成。反应液冷却到室温，静置分层、分液，下层碱水相用甲基叔丁基醚萃取(50ml x 2)，有机相合并浓缩，过正相柱(Silica,PE：EA＝1：0到PE：EA＝3:1)得到化合物1(约9.6g)。LCMS:m/z＝589.9(M+H)+.
4化合物2的制备
将化合物1(9.60g,16.4mmol)溶解在EtOH(50mL)中，加入质量分数为10％的Pd/C(1g,9.40mmol)，置换3次氢气，反应液在45℃H2(15psi)氛围下反应18小时。LC/MS检测到产物该有的MS响应，反应液过滤除去钯碳，浓缩得到化合物2(约6.60g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.04(s,4H),3.68-3.70(m,4H),3.62-3.64(m,4H),3.50-3.54(m,2H),3.40-3.44(m,2H),3.06-3.12(m,1H),1.48(s,18H).LCMS:m/z＝408.7(M+H)+.
5化合物3的制备
将化合物2(6.60g,16.4mmol)溶解在DCM(100mL)，先加入DIEA(5.41mL,32.7mmol)，搅拌下再滴加氯甲酸苄酯(2.53mL,18.0mmol)，反应液在25℃下搅拌18小时。LC/MS检测到产物该有的MS响应。TLC(PE:EA＝3:1，PMA)显示原料已反应完全，有新的点生成，反应液直接浓缩过正相柱(PE：EA＝1:0至3:1)得到无色油状化合物3(约7.5g).1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.29-7.35(m,5H),5.08(s,2H),4.02(s,4H),3.87-3.92(m,1H),3.63-3.67(m,8H),3.55-3.56(m,4H),1.47(s,18H).LCMS:m/z＝542.3(M+H)+.
6化合物4的制备
将化合物3(3.7g,6.88mmol)溶解在DCM(18mL)中，加入TFA(6mL)，反应液在25℃下搅拌18小时。LC/MS检测到产物该有的MS响应，反应液直接浓缩得到黄色油状化合物4(约4.3g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.28-7.35(m,5H),5.08(s,2H),4.12(s,4H),3.87-3.93(m,1H),3.63-3.68(m,8H),3.55-3.56(m,4H).LCMS:m/z＝430.1(M+H)+.
7化合物6的制备
将化合物4(1g,2.33mmol)溶解在DCM(30mL)中，加入DIEA(4.06mL,23.3mmol)和化合物5(1.96g,6.99mmol)，反应液在25℃下搅拌1小时，LC/MS检测到产物该有的MS响应。TLC(PE：EA＝3:1)显示原料已反应完全，且有新点生成。反应液直接浓缩过正相柱(PE:EA＝1:0到PE:EA＝3:1)得到白色固体化合物6(约900mg)。LCMS:m/z＝762.6(M+H)+.
8化合物8的制备
将化合物6(1132mg,1.16mmol)溶解在DCM(10mL)中，加入DIEA(0.26mL,1.58mmol)和化合物7(400mg,0.53mmol，根据实施例12化合物6的方法制备)，反应液在25℃下搅拌18小时。TLC(DCM：MeOH＝10:1)显示原料已反应完全，且有新点生成，LCMS检测到产物该有的MS响应。反应液直接浓缩过正相柱(DCM：MeOH＝1:0至10：1)得到无色油状化合物8(约1100mg).LCMS:m/z＝1177.4(M/2+H)+.
9化合物9的制备
将化合物8(1100mg,0.467mmol)溶解在MeOH(20mL)中，加入质量分数为10％的Pd/C(100mg,0.940mmol)，置换3次氢气，反应液在25℃H2(15psi)氛围下反应18小时。LC/MS检测到产物该有的MS响应，反应液过滤除去Pd/C，用甲醇洗涤，滤液合并浓缩得到白色固体化合物9(约960mg)。LCMS:m/z＝1110.3(M/2+H)+.
10化合物11的制备
将化合物9(960mg,0.433mmol)溶解在DMF(20mL)中，依次加入HBTU试剂(246mg,0.649mmol)、DIEA(0.214mL,1.30mmol)和化合物10(277mg,0.433mmol，根据实施例13的化合物Int-6的方法制备)，反应液在25℃下搅拌18小时。LC/MS检测到产物该有的MS响应。TLC(DCM:MeOH＝10:1)显示原料已反应完全，有新点生成。反应液用20ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，二氯甲烷(20ml x 2)萃取，有机相合并浓缩，过正相柱(DCM:MeOH＝1:0至10:1)得到白色固体化合物11(约1060mg)。LCMS:m/z＝1266.9[(M-DMTr)/2+H]+.
11E10的制备
将化合物11(500mg,0.161mmol)溶解在DCM(5mL)中，加入四氢呋喃-2,5-二酮(96.86mg,0.968mmol)、DIEA(0.160mL,0.968mmol)和DMAP(19.7mg,0.161mmol)，反应液在25℃下搅拌18小时。LCMS检测到产物该有的MS响应。反应液直接旋干，加5ml乙腈溶解，通过制备型-HPLC(色谱柱:Waters Xbridge BEH C18 100*30mm*10um；流动相:水-乙腈]；B％:20％-50％,11min；流速：50ml/min.得到白色固体E10(56mg,0.018mmol,10.9％)。LCMS(ESI):m/z＝1317.0[(M-DMTr)/2+H]+；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.43(d,J＝8.0Hz,2H),7.27-7.32(m,6H),7.18-7.24(m,1H),6.85-6.89(m,4H),5.34(d,J＝3.6Hz,4H),5.07-5.12(m,4H),4.62-4.67(m,4H),4.42-4.48(m,2H),4.20-4.24(m,2H),3.98-4.17(m,22H),3.90-3.94(m,4H),3.79(d,J＝2.0Hz,6H),3.69-3.74(m,12H),3.62-3.63(m,14H),3.52-3.55(m,8H),3.35-3.40(m,8H),3.20(s,2H),2.48-2.60(m,4H),2.28-2.34(m,5H),2.20-2.28(m,2H),2.14(s,12H),2.06-2.11(m,2H),2.02(s,12H),1.97-1.99(m,2H),1.94(d,J＝5.2Hz,24H),1.53-1.59(m,4H),1.28-1.38(m,12H).
实施例11化合物E11的制备
1化合物2的制备
在室温下将化合物1(5.00g,11.2mmol，根据实施例25中间体1-3的方法制备)溶解到DCM(100mL)中，向溶液中依次加入HOBt(1.81g,13.4mmol),EDCI(2.57g,13.4mmol),DIEA(2.77mL,16.8mmol)和化合物2A(2.34g,13.4mmol)，置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌16小时。液质联用检测到产物的MS响应。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1)显示原料已完全消耗且有新点生成。反应液用二氯甲烷(300mL)稀释，并依次用饱和的柠檬酸溶液(30.0mL)、碳酸氢钠(30.0mL)、食盐水(30.0mL)和水洗涤，有机相经硫酸钠干燥、过滤，滤液悬干得到浅黄色油状物2的粗品(约6.80g)，直接用于下一步反应。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.33-5.35(m,1H),5.05-5.07(m,1H),4.52-4.61(m,1H),3.98-4.22(m,4H),3.85-3.93(m,1H),3.52-3.56(m,1H),3.17-3.26(m,2H),3.06-3.10(m,2H),2.19-2.25(m,2H),2.12-2.19(m,3H),2.04(s,3H),1.90-1.96(m,6H),1.56-1.74(m,6H),1.45(s,9H).LCMS:m/z＝604.4(M+H)+.
2化合物3的制备
在室温下将化合物2(6.80g,11.3mmol)溶解到DCM(50.0mL)中，向溶液中加入HCl/EtOAc(20.0mL)，反应混合物在25℃下搅拌1小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1,磷钼酸显色)显示原料已完全消耗且有新点生成。反应液在减压下浓缩，得到白色固体3的粗品(约6.90g)，未经纯化直接用于下一步反应。
3化合物5的制备
在室温下将化合物3(6.80g,13.5mmol)溶解到DCM(20.0mL)中，向溶液中依次加入DIEA(2.23mL,13.5mmol)和化合物4(3.61g,6.08mmol)，置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌18小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1)显示原料已完全消耗且有新点生成。反应液在减压下浓缩，所得的粗产品经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝12/1～10/1)得到白色固体5(约6.00g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.3-5.34(m,2H),5.04-5.08(m,2H),4.54-4.58(m,2H),3.97-4.21(m,9H),3.81-3.92(m,2H),3.51-3.53(m,2H),3.14-3.28(m,9H),2.25-2.32(m,2H),2.19-2.23(m,4H),2.14(s,6H),2.03(s,6H),1.94(d,J＝9.2Hz,12H),1.62-1.75(m,9H),1.56-1.62(m,4H),1.44(s,9H)
4化合物6的制备
在室温下将化合物5(1.0g,0.821mmol)溶解到DCM(10.0mL)中，向溶液中加入HCl/EtOAc(1.00mL)，反应混合物在25℃下搅拌16小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1,磷钼酸显色)显示原料已完全消耗且有新点生成。反应液在减压下浓缩，得到白色固体6(约1.57g)的粗品。粗品未经纯化直接用于下一步反应。
5化合物8的制备
在室温下将化合物6(1.57g,0.772mmol)溶解到DCM(20.0mL)中，向溶液中依次加入DIEA(0.255mL,1.544mmol)，化合物7(0.21g,0.309mmol)，置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌16小时。液质联用检测到产物的MS响应，薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝5/1)显示原料消失且有新点生成。反应液在减压下浓缩，所得的粗产品经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝5/1)得到白色固体8(约780mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.25-7.42(m,5H),5.30-5.33(m,4H),5.04-5.06(m,4H),4.54-4.56(m,4H),4.30-4.40(m,2H),3.96-4.19(m,21H),3.83-3.90(m,4H),3.67-3.76(m,4H),3.50-3.52(m,4H),3.11-3.27(m,18H),2.25-2.33(m,4H),2.18-2.20(m,8H),2.14(s,12H),2.02(s,12H),1.94(d,J＝9.20Hz,24H),1.56-1.70(m,24H).LCMS:m/z＝1272.5(M/2+H)+.
6化合物9的制备
在室温下将化合物8(380mg,0.150mmol)溶解到MeOH(10.0mL)中，向溶液中依次加入质量分数为10％的湿Pd/C(100mg,0.940mmol),置换3次氢气，反应混合物在氢气氛围下(14.696psi)、25℃下搅拌18小时。液质联用检测到产物的MS响应，薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1，磷钼酸显色)显示原料已完全消耗且有新点生成。反应液过滤，滤液在减压下浓缩得到白色固体9(约330mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.31-5.35(m,4H),5.04-5.06(m,4H),4.53-4.56(m,4H),4.34-4.36(m,2H),3.99-4.16(m,21H),3.85-3.90(m,4H),3.51-3.56(m,4H),3.18-3.22(m,18H),2.28-2.33(m,4H),2.19-2.22(m,8H),2.14(s,12H),2.03(s,12H),1.94(d,J＝8.8Hz,24H),1.58-1.71(m,24H).LCMS:m/z＝1204.9(M/2+H)+.
7化合物11的制备
在室温下将化合物9(170mg,0.071mmol)溶解到DCM(10.0mL)中，向溶液中依次加入化合物10(45.2mg,0.071mmol，根据实施例13的化合物Int-6的方法制备),DIEA(0.035mL,0.212mmol),HBTU(40.2mg,0.106mmol),DMAP(8.63mg,0.071mmol),置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌1小时。液质联用检测到原料消失。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝5/1)显示原料消失且有新点生成。反应液在减压下浓缩，所得的粗产品经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝8/1～5/1)共得到白色固体11(约340mg)。
8E11的制备
在室温下将化合物11(340mg,0.112mmol)溶解到DCM(10.0mL)中，向溶液中依次加入DIEA(14.5mg,0.112mmol)，化合物12(11.3mg,0.112mmol)和DMAP(6.84mg,0.056mmol),置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌1小时。液质联用检测到原料消失。反应液在减压下浓缩，所得的粗产品经制备型高效液相色谱制备(制备型-HPLC,柱：Waters Xbridge BEHC18 100*30mm*10um；流动相:水-ACN；B％:19％-49％,3min)分离得到白色固体E11(72.3mg,收率20.59％，纯度80.47％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.41-7.43(m,2H),7.29-7.31(m,J＝8.8Hz,6H),7.17-7.26(m,1H),6.83-6.90(m,4H),5.31-5.34(m,4H),5.02-5.08(m,4H),4.50-4.56(m,4H),4.32-4.40(m,3H),4.20-4.25(m,1H),4.09-4.19(m,10H),4.05-4.09(m,7H),3.95-4.04(m,6H),3.83-3.90(m,5H),3.76-3.80(m,6H),3.58-3.75(m,8H),3.48-3.52(m,4H),3.18-3.23(m,15H),2.56-2.62(m,2H),2.48-2.54(m,2H),2.24-2.35(m,8H),2.18-2.20(m,8H),2.14(s,12H),2.09-2.11(m,2H),2.02(s,12H),1.90-1.98(m,28H),1.55-1.72(m,28H),1.28-1.32(m,8H)
实施例12化合物E12的制备
1化合物14的制备
在室温下将化合物13(9.29g,21.4mmol，根据实施例22中间体2-3的方法制备)溶解到无水二氯甲烷中(100mL)中，向溶液中依次加入DIEA(15.4mL,92.9mmol)，化合物12(5.70g,9.29mmol，根据实施例8化合物1的方法制备)，置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌16小时。液质联用检测到产物的MS响应，薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1)显示原料已完全消耗且有新点生成。反应液用二氯甲烷(300mL)稀释，依次用柠檬酸水溶液(50.0mL)和饱和食盐水(30.0mL X 3)洗涤，萃取，收集有机相，将有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在减压下浓缩，所得的粗产品经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝12/1～10/1)得到白色固体化合物14(约9.6g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.24-7.44(m,5H),5.32-5.34(m,2H),5.01-5.17(m,4H),4.60-4.70(m,2H),3.99-4.21(m,9H),3.87-3.96(m,2H),3.67-3.76(m,2H),3.60-3.64(m,4H),3.47-3.57(m,4H),3.33-3.37(m,6H),2.27-2.39(m,2H),2.10(s,6H),2.02(s,6H),1.92-1.96(m,12H).LCMS:m/z＝1114.7(M+H)+.
2化合物6的制备
在室温下将化合物14(5.00g,4.49mmol)溶解到甲醇(100mL)中，向该溶液中加入质量分数为10％的湿Pd/C(1.00g,9.40mmol)，置换3次氢气，反应混合物在氢气氛围下(14.696psi)、25℃下搅拌18小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1，磷钼酸显色)显示原料已完全消耗且有新点生成。反应液过滤，滤液在减压下浓缩得到白色固体化合物6(约4.2g)。1H NMR(400MHz,CH3OD)δ5.32-5.34(m,2H),5.07-5.11(m,2H),4.631-4.63(m,2H),4.01-4.17(m,9H),3.92-3.96(m,2H),3.68-3.75(m,2H),3.61-3.66(m,4H),3.54-3.56(m,4H),3.32-3.43(m,6H),2.25-2.34(m,2H),2.15(s,6H),2.03(s,6H),1.92-1.96(m,12H)
3化合物2的制备
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将化合物1(10.0g,20.0mmol)溶解在乙醇中(100mL)中，加入质量分数为10％的Pd/C(1.00g,9.39mmol)，置换3次氢气，反应液在45℃、H2(15psi)氛围下反应18小时。液质联用检测到产物该有的MS响应，反应液通过硅藻土过滤除去Pd/C，用乙醇洗涤三次(10.0mlx 3)，滤液合并浓缩得到黄色油状产品2。LCMS:m/z＝320.3(M+H)+.
4化合物3的制备
在25℃下将化合物2(1.00g,3.17mmol)溶于四氢呋喃(10.0mL)和H2O(10.0mL)中，将碳酸氢钠(798mg,9.51mmol)，CbzCl(1.18g,4.75mmol)加入其中。反应液在25℃下搅拌1小时。液质联用显示原料反应完全，目标产物MS值出现。薄层色谱(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)显示原料反应完全，有新点生成。向反应液中加入150.0ml乙酸乙酯溶液，混合液用盐水洗涤三次(15.0ml x 3)。有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩得到粗品。粗品经柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)得到无色油状化合物3(约770mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.25-7.39(m,5H),5.08(s,2H),4.00(s,4H),3.88-3.93(m,1H),3.62(d,J＝5.6Hz,4H),1.47(s,18H).LCMS:m/z＝454.3(M+H)+.
5、化合物4的制备
在25℃下化合物3(770mg,1.71mmol)溶于无水二氯甲烷中(6.00mL)中，将TFA(3.00mL,39.1mmol)加入其中。反应液在25℃搅拌12小时。液质联用显示原料反应完全，生成产物MS值。薄层色谱(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)显示原料反应完全。将反应液直接减压浓缩得到无色油状产物4(约770mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.24-7.39(m,5H),5.08(s,2H),4.10(s,4H),3.90-3.95(m,1H),3.57-3.68(m,4H).LCMS:m/z＝342.1(M+H)+.
6、化合物5的制备
在25℃将化合物4(770mg,2.25mmol)溶于无水二氯甲烷中(6.00mL)中，加入五氟苯酚(913mg,4.96mmol)、EDCI(432mg,2.25mmol)。混合液在25℃下搅拌1小时。液质联用显示产物MS生成。薄层色谱(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)显示有新点生成。反应液在减压条件下浓缩得到粗品，粗品经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)得到无色油状化合物5(约500mg)。1HNMR(400MHz,CD3OD)δ7.20-7.44(m,5H),5.08(s,2H),4.58(s,4H),3.95-4.05(m,1H),3.71-3.81(m,4H).LCMS:m/z＝674.0(M+H)+.
7、化合物7的制备
在25℃下将化合物5(500mg,0.742mmol)，化合物6(2.72g,1.86mmol)溶于DMF(6.00mL)中，将DIEA(0.123mL,0.742mmol)加入其中。混合液在25℃下搅拌12小时。液质联用显示原料反应完全，产物生成。薄层色谱(石油醚:乙酸乙酯＝3:1，T1)显示原料反应完全。反应液在减压条件下浓缩得到粗品。粗品经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝10:1，T2)得到黄色固体化合物7(约860mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.25-7.45(m,5H),5.34(d,J＝3.2Hz,4H),5.07-5.11(m,4H),4.60-4.71(m,4H),4.35-4.44(m,2H),4.13-4.16(m,6H),4.10(d,J＝3.6Hz,2H),4.08(d,J＝3.6Hz,2H),4.00-4.06(m,9H),3.88-3.96(m,4H),3.67-3.75(m,15H),3.61-3.62(m,8H),3.47-3.56(m,9H),3.34-3.40(m,8H),2.25-2.35(m,4H),2.14(s,12H),2.01-2.04(m,13H),1.94(d,J＝7.6Hz,25H).LCMS:m/z＝1133.3(M/2+H)+.
8、化合物8的制备
在25℃下将化合物7(350mg,0.155mmol)溶于乙醇(6.00mL)中，加入质量分数为10％的Pd/C(500mg,4.70mmol)，混合液在25℃下搅拌12小时。液质联用显示原料反应完全。反应液用硅藻土过滤，滤液在减压条件下浓缩得到黄色油状化合物8(约200mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.34(s,4H),5.07-5.11(m,4H),4.65(dd,J＝9.6,11.2Hz,4H),4.36-4.45(m,2H),4.12-4.20(m,8H),4.00-4.12(m,13H),3.91-3.95(m,5H),3.69-3.74(m,5H),3.62-3.63(m,12H),3.53-3.56(m,10H),3.36-3.42(m,8H),2.29-2.40(m,4H),2.15(s,12H),2.03(s,12H),1.90-1.97(m,24H).LCMS:m/z＝1066.3(M/2+H)+.
9化合物10的制备
在25℃下将化合物8(450mg,0.211mmol)溶于DMF(6.00mL)中，加入HBTU(104mg,0.274mmol)，DIEA(0.105mL,0.633mmol)，最后将化合物9(135mg,0.211mmol，根据实施例13的化合物Int-6的方法合成)加入其中。混合液在25℃下搅拌12小时。薄层色谱(二氯甲烷:甲醇＝10:1)显示新点生成。向混合液中加入二氯甲烷(100ml),饱和碳酸氢钠(5ml x 3)，盐水分别洗涤三次(5ml x 3)。有机相用无水硫酸钠干燥，在减压条件下浓缩得到粗产品。粗品经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝10:1)得到黄色油状化合物10(约350mg)。LCMS:m/z＝1371.8(M/2+H)+.
10、E12的制备
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在25摄氏度下将化合物10(350mg,0.127mmol)溶于无水二氯甲烷(5.00mL)中，将化合物11(76.5mg,0.765mmol)加入其中，依次将DIEA(0.126mL,0.765mmol)，DMAP(3.89mg,0.032mmol)加入到上述混合液中。反应液在25摄氏度下搅拌3小时。液质联用显示原料反应完全，产物生成。向混合液中加入二氯甲烷200ml，用饱和食盐水洗涤三次(15.0ml x 3),有机相经无水硫酸钠干燥后，在减压条件下浓缩得到粗产品。粗产品经高效液相色谱分离法(色谱柱：Waters Xbridge BEH C18 100*30mm*10um；流动相：水-ACN；梯度：17％-57％/11min；流速：50ml/min)得到白色固E12(35mg,0.012mmol,9.65％)。
LCMS(ESI):m/z＝1422.0(M/2+H)+；
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.42-7.44(m,2H),7.19-7.35(m,7H),6.81-6.92(m,4H),5.32-5.34(m,4H),5.06-5.12(m,4H),4.59-4.68(m,4H),4.40-4.42(m,2H),4.30-4.34(m,1H),4.18-4.28(m,2H),4.11-4.18(m,8H),3.99-4.11(m,14H),3.82-3.99(m,7H),3.78-3.79(m,6H),3.67-3.75(m,8H),3.65-3.66(m,1H),3.60-3.62(m,10H),3.52-3.54(m,8H),3.47-3.49(m,1H),3.37-3.38(m,7H),3.11-3.18(m,2H),2.50-2.61(m,4H),2.21-2.41(m,10H),2.14(s,12H),2.02(s,12H),1.93-1.94(m,24H),1.49-1.66(m,4H),1.29-1.31(m,8H).
实施例13化合物E13的制备
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1化合物1-2的制备
室温条件下，将化合物1-1(38.0g,231mmol)，TsNHBoc(75.4g,278mmol)，K2CO3(6.40g,46.3mmol)，TEBA(5.27g,23.1mmol)加入到三口瓶中。在95℃下反应2小时，随后降温到25℃，TLC(PE/EA＝2/1,UV 254nm)显示反应完成，反应液加水(500mL)稀释，二氯甲烷(200mL x 3)萃取，有机相减压浓缩，粗产品柱分离纯化(PE/EA＝10/1-3/1)得到无色油状化合物1-2(40.0g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.72(d,J＝8.4Hz,2H),7.28-7.39(m,7H),4.72-4.86(m,2H),4.42-4.56(m,2H),3.52-3.61m,2H),3.14-3.39(m,2H),2.43(s,3H),1.47(s,9H)
2、化合物1-4的制备
将化合物1-2(79.0g,181mmol)，化合物1-3(4.21g,30.5mmol)，TEBA(3.47g,15.2mmol)，95℃反应3小时，TLC(PE/EA＝2/1,UV 254nm)显示反应完成，反应液加水(500mL)稀释，二氯甲烷(200mL x 3)萃取，有机相减压浓缩，粗产品柱分离纯化(PE/EA＝10/1-3/1)得到无色油状化合物1-4(约40.0g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.64-7.77(m,2H),7.27-7.38(m,13H),5.05-5.16(m,1H),4.50-4.59(m,4H),4.03-4.11(m,1H),3.62-3.76(m,2H),3.44-3.58(m,3H),3.25-3.33(m,2H),3.15-3.20(m,1H),2.42(s,3H),1.46(s,9H)
3、化合物1-5的制备
冰浴条件下，将化合物1-4(77.0g,128mmol)，Et3N(28.6mL,205mmol)，依次加入到二氯甲烷(800mL)中，缓慢滴加甲烷磺酰氯(24.2g,212mmol)。在25℃下反应2小时，LCMS显示反应完成。反应液加入水(800mL)洗涤，有机相减压浓缩得到无色油状化合物1-5(约90.0g)。LCMS(ESI):m/z＝700.1(M+Na)+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(d,J＝8.4Hz,2H),7.28-7.39(m,12H),5.10-5.20(m,1H),4.93-5.02(m,1H),4.52-4.61(m,4H),3.72-3.88(m,2H),3.52-3.67(m,4H),3.27-3.36(m,1H),3.15-3.22(m,1H),3.04(s,3H),2.43(s,3H),1.43(s,9H).LCMS:m/z＝700.1(M+Na)+.
4、化合物1-6的制备
室温条件下，将化合物1-5(90.0g,133mmol)，碳酸钾(91.8g,664mmol)加入到MeOH(900mL)中。在66℃下反应2小时，TLC(PE/EA＝2/1,UV 254nm)显示有新点生成，有机相减压浓缩，反应液加水(200mL)稀释，二氯甲烷(200mL x 3)萃取,有机相减压浓缩，粗产品柱分离纯化(PE/EA＝30/1-2/1)得到白色固体化合物1-6(约64.0g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.62(d,J＝8.4Hz,2H),7.27-7.39(m,12H),4.48-4.62(m,4H),3.93-4.08(m,2H),3.55-3.69(m,4H),2.84-3.10(m,4H),2.44(s,3H)
5、化合物1-7的制备
室温条件下，将化合物1-6(69.0g,143mmol)，镁屑(54.7g,2.28mol)加入到MeOH(400mL)中，在66℃下反应1小时。TLC(DCM/MeOH＝10/1,UV 254nm)显示原料反应完全且有新点生成。反应液加水(3000mL)和饱和氯化铵水溶液(3000mL)稀释,二氯甲烷萃取(1000mLx3)，有机相使用饱和碳酸氢钠(300mL X 3)洗涤，有机相减压浓缩得到无色油状化合物1-7(约32.0g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.27-7.40(m,10H),4.57(s,4H),3.90-4.00(m,2H),3.59-3.69(m,4H),2.77-3.04(m,4H)
6、化合物1-8的制备
室温条件下，将化合物1-7(8.00g,24.4mmol)加入到HCl(100mL,12M)中，50℃下反应2小时，反应液减压浓缩得到无色油状化合物1-8(约3.60g,HCl盐)，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.12-4.22(m,2H),3.78(d,J＝4.4Hz,4H),3.17-3.30(m,4H)
7、化合物Int-1的制备
室温下，将化合物1-8(8.29g,24.5mmol)加到吡啶(50mL,618mmol)中，再加入DMTrCl(4.77g,12.3mmol)。该反应体系在25℃反应18小时，TLC(DCM/MeOH＝10/1,UV254nm)显示产物生成。反应液减压浓缩，加饱和氯化铵(200mL)稀释，DCM(100mLx3)萃取，有机相减压浓缩。粗品柱层析(DCM/MeOH＝99/1-10/1),分离得到黄色固体Int-1(约2.6g,5.78mmol,23.6％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38-7.50(m,2H),7.25-7.36(m,6H),7.18-7.25(m,1H),6.87(d,J＝8.8Hz,4H),4.26-4.40(m,1H),3.94-4.05(m,1H),3.85(d,J＝4.4Hz,2H)3.73-3.82(m,6H),3.34-3.41(m,1H),3.23-3.30(m,3H),3.05-3.23(m,2H)
8、化合物3的制备
在25℃下将化合物1(1.00g,3.05mmol)溶解到无水N,N-二甲基甲酰胺中(10.0mL)，依次加入HOBt(0.54g,3.97mmol)，EDCI(0.76g,3.97mmol)，DIEA(1.51mL,9.16mmol)，之后将化合物2(0.79g,3.66mmol)加入其中。混合液在25℃搅拌2小时。液质联用显示原料反应完全，产物生成。薄层色谱板(二氯甲烷：甲醇＝10：1)显示原料反应完全，产物生成。向混合液中加入二氯甲烷(200ml),混合液用饱和柠檬酸溶液(20ml x 3)，饱和碳酸氢钠溶液(20ml x 3)，饱和盐水分别洗涤三次(20ml x 3)。有机相用无水硫酸钠干燥，在减压条件下浓缩得到粗产品。粗品经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝10:1)得到黄色油状化合物3(约1.00g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.21-7.41(m,10H),4.47-4.60(m,4H),3.88-4.01(m,2H),3.75(dd,J＝3.2,13.2Hz,1H),3.63-3.65(m,3H),3.40-3.63(m,7H),2.27-2.34(m,4H),1.50-1.60(m,4H),1.28-1.34(m,8H)
LCMS:m/z＝526.8(M+H)+.
9、化合物4的制备
在25℃下将化合物3(380mg,0.20mmol)溶于无水甲醇中(10.0mL)，将质量分数为10％的湿Pd/C(500mg,4.70mmol)加入到其中。反应液在50℃下搅拌12小时。液质联用显示产物生成。反应液通过硅藻土过滤，滤液在减压条件下浓缩得到黄色油状化合物4(约600mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.79-3.89(m,2H),3.73(dd,J＝3.6,13.2Hz,1H),3.64-3.68(m,5H),3.57-3.62(m,2H),3.48-3.56(m,2H),3.38-3.47(m,1H),1.58-1.62(m,5H),1.34(d,J＝2.8Hz,11H),1.30-1.37(m,1H).LCMS:m/z＝346.5(M+H)+.
10、化合物5的制备
在25℃下将化合物4(600mg,1.74mmol)溶于吡啶(3.00mL)中，将DMTrCl(883mg,2.61mmol)加入其中。反应液在25℃下搅拌1小时。液质联用显示产物生成。薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝10：1)显示原料反应完全，产物生成。向混合液中加入二氯甲烷(200ml),混合液用饱和碳酸氢钠溶液(20ml x 3)，盐水分别洗涤三次(20ml x 3)。有机相用无水硫酸钠干燥，在减压条件下浓缩得到粗产品。粗品经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)得到无色液体化合物5(约475mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.41-7.43(m,2H),7.16-7.34(m,7H),6.83-6.87(m,4H),3.88-4.04(m,2H),3.77-4.09(m,7H),3.61-3.68(m,4H),3.43-3.58(m,3H),3.33-3.38(m,1H),3.14-3.20(m,1H),3.05(dd,J＝8.4,13.2Hz,1H),2.20-2.42(m,4H),1.51-1.60(m,4H),1.25-1.39(m,8H).LCMS:m/z＝648.3(M+H)+.
11、化合物Int-6的制备
在25℃下将化合物5(475mg,0.73mmol)溶于四氢呋喃(8.00mL)和H2O(2.00mL)中，向其中加入一水合氢氧化锂(36.9mg,0.89mmol)。反应液在25摄氏度下搅拌12小时。薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝10：1)显示原料反应完全，产物生成。将反应液减压条件下浓缩后，在冻干机上直接冻干得到白色固体产物化合物6(约430mg)。
12、化合物7的制备
在25℃下将化合物Int-6(100mg,0.156mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(3.00mL)中，依次加入HBTU试剂(89.0mg,0.234mmol)，DIEA(0.078mL,0.47mmol)，中间体C(254mg,0.156mmol，根据实施例26中间体2-2的方法合成)。反应液在25℃下搅拌12小时。薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝10：1)显示新点生成。向混合液中加入二氯甲烷(200ml)，混合液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次(20ml x 3)，盐水洗涤三次(20ml x 3)。有机相用无水硫酸钠干燥，在减压条件下浓缩得到粗产品。粗产品经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝10:1)得到黄色油状产物化合物7(约140mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.43(d,J＝8.4Hz,2H),7.18-7.34(m,7H),6.81-6.91(m,4H),5.34(d,J＝2.8Hz,3H),5.09-5.11(m,3H),4.62-4.66(m,3H),4.27-4.35(m,2H),4.07-4.17(m,9H),4.00-4.07(m,4H),3.89-3.98(m,5H),3.79(d,J＝2.4Hz,6H),3.69-3.75(m,5H),3.60-3.64(m,9H),3.52-3.56(m,10H),3.43-3.50(m,4H),3.39-3.40(m,1H),2.25-2.40(m,8H),2.13-2.15(m,9H),2.02(s,9H),1.94-1.96(m,18H),1.48-1.66(m,4H),1.21-1.36(m,11H)
13、E13的制备
将化合物7(400mg,0.187mmol)溶于无水二氯甲烷(5.00mL)中，依次加入DIEA(0.18mL,1.12mmol)，DMAP(5.71mg,0.047mmol)，最后将化合物8(112mg,1.12mmol)加入其中。混合液在25℃下搅拌3小时。薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝10：1)显示新点生成。向混合液中加入二氯甲烷(200ml)，用饱和食盐水洗涤三次(15.0ml x 3),有机相经无水硫酸钠干燥后，在减压条件下浓缩得到粗产品。粗产品经高效液相色谱分离(色谱柱：Welch XtimateC18 150*25mm*5um；流动相：水-ACN；梯度：27％-57％/11min；流速：25ml/min)得到白色固体化合物E13(74.8mg,0.033mmol,收率17.9％)。LCMS(ESI):m/z＝1149.5(M/2+H)+；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.42-7.44(m,2H),7.18-7.34(m,7H),6.83-6.90(m,4H),5.33-5.34(m,3H),5.08-5.11(m,3H),4.61-4.68(m,3H),4.27-4.36(m,2H),4.19-4.27(m,1H),4.10-4.19(m,7H),4.08(s,2H),4.00-4.07(m,4H),3.90-3.94(m,4H),3.83-3.89(m,1H),3.79(d,J＝2.4Hz,6H),3.70-3.72(m,4H),3.53-3.54(m,15H),3.44-3.48(m,3H),3.35-3.40(m,4H),3.10-3.23(m,2H),2.53-2.63(m,4H),2.22-2.40(m,8H),2.11-2.16(m,9H),2.05-2.10(m,2H),2.02(s,9H),1.90-1.97(m,19H),1.48-1.65(m,4H),1.29-1.32(m,8H)
实施例14化合物E14的制备
1化合物3的制备
在室温下将化合物1(800mg,0.446mmol，根据实施例27中间体1-2的方法制备)溶解到DCM(5mL)中，加入化合物2(252.28mg,0.398mmol，根据实施例13化合物Int-6的方法制备)、HBTU(253.69mg,0.669mmol)和DIEA(0.221mL,1.338mmol)，在25℃下反应15小时。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝8/1)显示原料消失，有新点生成。液质联用显示原料反应完全，有产物生成。加入二氯甲烷稀释反应液(20mL),再用饱和NaHCO3溶液(10mLX3)和饱和NaCl溶液(10mLX3)依次洗涤有机相3遍,无水硫酸钠干燥。反应液减压浓缩得到粗产品，经柱层析(二氯甲烷/甲醇＝8/1)纯化，得到白色固体3(约612mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.43(d,J＝8.4Hz,2H),7.30(d,J＝7.6Hz,5H),7.17-7.26(m,2H),6.81-6.90(m,4H),5.33(d,J＝3.2Hz,3H),5.06(dd,J＝3.2,11.2Hz,3H),4.55(d,J＝8.4Hz,3H),4.04-4.18(m,10H),3.97-4.04(m,4H),3.82-3.96(m,5H),3.79(d,J＝2.8Hz,6H),3.59-3.70(m,15H),3.49-3.56(m,5H),3.17-3.27(m,15H),2.42(t,J＝6.0Hz,6H),2.16-2.24(m,8H),2.12-2.15(m,9H),2.01-2.03(m,9H),1.94(d,J＝7.53Hz,18H),1.64-1.71(m,12H),1.52-1.62(m,10H),1.24-1.34(m,8H).LCMS:m/z＝1203.5((M+H)/2)+.
2化合物E14的制备
在室温下将化合物3(612mg,0.254mmol)溶解到DCM(5mL)中，加入DIEA(0.252mL,1.524mmol)、DMAP(7.76mg,0.063mmol)和4(152.49mg,1.524mmol)，在25℃下反应3小时。液质联用显示原料反应完全，有产物生成。加入二氯甲烷(30mL)稀释反应液,用饱和NaCl溶液(30mLX3)洗涤有机相3遍,无水硫酸钠干燥。反应液减压浓缩，所得到粗产品经制备型高效液相色谱(制备型-HPLC,柱：Waters Xbridge BEH C18 100*30mm*10um；流动相:水-ACN；B％:17％-57％,12min)分离得到白色固体E14(160.1mg,收率25.1％，纯度73.34％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.43(d,J＝8.0Hz,2H),7.31(d,J＝8.8Hz,5H),7.17-7.27(m,2H),6.85-6.90(m,4H),5.33(d,J＝3.2Hz,3H),5.06(dd,J＝3.6,11.2Hz,3H),4.56(d,J＝8.4Hz,3H),4.05-4.20(m,10H),3.94-4.03(m,5H),3.80-3.94(m,5H),3.79(d,J＝2.4Hz,6H),3.57-3.72(m,15H),3.40-3.57(m,4H),3.18-3.26(m,15H),2.48-2.61(m,4H),2.42(t,J＝6.0Hz,6H),2.16-2.25(m,8H),2.14(s,9H),2.02(s,9H),1.92-1.96(m,18H),1.62-1.71(m,12H),1.51-1.62(m,10H),1.30(d,J＝13.2Hz,8H)
LCMS:m/z＝1283.5((M+59)/2)+.
实施例15化合物E15的制备
1化合物2_3的制备
将化合物2_1(11.6g,58.59mmol)和化合物2_2(4.5g,29.29mmol)溶入到MeOH(100mL)中。反应液在20℃下反应2小时，然后向反应物中加入氰基硼氢化钠(7.37g,117.180mmol)。反应液在20℃下反应16小时。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示有新点生成。向反应液中加入60mL DCM和40mL水，反应液分液，水相用DCM(55mL*1)萃取。合并的有机相用饱和食盐水洗涤(50mL*1),无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到粗产品。粗产品通过柱层析纯化(DCM/MeOH＝1/0-10/1)得到白色固体化合物2_3(约2.6g)。1HNMR(400MHz,MeOD-d4)δ4.11(br d,J＝13.6Hz,2H),3.86-3.93(m,1H),3.42-3.77(m,5H),2.92(br d,J＝11.2Hz,1H),2.69-2.86(m,3H),2.24-2.19-2.51(m,2H),2.00-2.12(m,1H),1.79-1.97(m,2H),1.39-1.52(m,10H)
2化合物2的制备
将化合物2_3(6.5g,21.6mmol)溶在DCM(50mL)中，加入HCl/EtOAc(20mL)。反应液在20摄氏度下反应1小时。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示有新点生成。反应液旋干得到白色固体粗产品化合物2(约5.1g).1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ4.14-4.22(m,1H),3.90-4.04(m,2H),3.53-3.73(m,7H),2.98-3.24(m,4H),2.42-2.54(m,2H),2.03-2.17(m,2H).
3化合物3的制备
将化合物1(1500mg,0.896mmol)，HATU(511mg,1.34mmol)和DIEA(0.741mL,4.48mmol)溶在DMF(15.0mL)中。反应在20摄氏度下反应30分钟。然后加入化合物2(269mg,1.34mmol).反应在20摄氏度下反应2小时。LCMS显示有产物的MS值生成。TLC(DCM/MeOH＝5/1)显示有新点生成。向反应液中加入15mL DCM和20mL饱和碳酸氢钠水溶液，反应液分液，水相用DCM(15.0mL x 1)萃取。合并的有机相用饱和食盐水洗涤(25mL x 1)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到粗产品。粗产品通过柱层析纯化(DCM/MeOH＝1/0-5/1)得到黄色固体产物化合物3(约850mg)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79-7.95(m,6H),5.21(d,J＝3.2Hz,3H),4.98(dd,J＝3.2,11.2Hz,3H),4.65(s,1H),4.55(d,J＝8.4Hz,3H),4.37(d,J＝12.0Hz,1H),4.03(s,9H),3.72-3.95(m,8H),3.45-3.66(m,18H),3.37-3.42(m,8H),3.08-3.27(m,16H),2.93-3.06(m,1H),2.76-2.89(m,1H),2.62-2.75(m,1H),2.53-2.59(m,3H),2.29(t,J＝6.4Hz,6H),2.12(s,9H),2.00(s,9H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.23-1.30(m,6H).LCMS:m/z＝929.1(M/2+H)+.
4E15的制备
化合物3(850mg,0.458mmol)用乙腈溶解后旋干除去化合物中的水，然后在氮气氛围下用DCM(10.0mL)溶解，加入DCI(27.0mg,0.229mmol)，缓慢滴加化合物4(276mg,0.916mmol)，反应液在20℃反应1小时。LCMS显示原料消失，反应液冷却至0℃，滴加6毫升饱和碳酸氢钠水溶液和6毫升饱和食盐水，用100毫升二氯甲烷稀释，分液，有机相用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水1:1混合水溶液50毫升洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到粗产品。粗产品用15毫升二氯甲烷稀释，慢慢滴加到60毫升甲基叔丁基醚中，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤三次，滤饼用乙腈溶解后旋干除去化合物中的甲基叔丁基醚。得到黄色固体产物E15(555mg,0.269mmol,58.9％)。
LCMS(ESI):m/z＝1087.0((M+59*2)/2+H)+；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.85-7.90(m,3H),7.75-7.84(m,3H),5.20-5.24(m,3H),4.98(dd,J＝3.6,11.2Hz,3H),4.51-4.58(m,3H),3.98-4.07(m,10H),3.83-3.91(m,4H),3.69-3.82(m,6H),3.47-3.62(m,23H),3.35-3.42(m,8H),3.15-3.26(m,15H),2.95-3.02(m,1H),2.73-2.84(m,3H),2.63-2.65(m,1H),2.36-2.42(m,2H),2.29(t,J＝6.4Hz,6H),2.10-2.13(m,1H),2.10(s,9H),2.00(s,9H),1.89(s,9H),1.69-1.79(m,11H),1.24-1.39(m,2H),1.03-1.17(m,12H).
31P NMR(400MHz,DMSO-d6)δ-147.834
实施例16化合物E16的制备
1化合物3的制备
化合物1(1.35g,0.748mmol，根据实施例1化合物8的方法制备)，HATU(0.430g,1.12mmol)和DIEA(0.371mL,2.24mmol)加入到DMF(2.00mL)中，氮气置换三次，在20℃下，反应0.5小时，化合物2(0.270g,1.12mmol，根据实施例15化合物2的方法制备)被加入，在20℃下，反应1.5小时。LC/MS显示原料全部消失，有一个主峰生成。薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝8/1)显示原料消失，有新点生成。反应液用二氯甲烷(100mL)稀释，依次使用饱和碳酸氢钠水溶液(20.0mL x 3)和饱和食盐水(20.0mL x 3)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩得到粗产品。粗产品通过柱层析(二氯甲烷：甲醇＝100/1到8/1)纯化得到棕色固体化合物3(约850mg)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.32-5.36(m,3H),5.05-5.11(m,3H),4.63-4.67(m,3H),4.08-4.20(m,10H),4.01-4.07(m,4H),3.91-3.97(m,4H),3.69-3.77(m,4H),3.60-3.68(m,29H),3.53-3.59(m,9H),3.35-3.41(m,15H),2.62-2.72(m,3H),2.48-2.55(m,1H),2.43(t,J＝6.0Hz,6H),2.27-2.37(m,1H),2.15(s,9H),2.03(s,9H),1.91-1.97(m,20H),1.29-1.39(m,2H).LCMS:m/z＝994.9(M/2+H)+.
2E16的制备
化合物3(850mg,0.428mmol)用乙腈溶解后旋干除去水，然后用DCM(10.0mL)溶解，加入DCI(25.2mg,0.214mmol)，在氮气氛围下加入化合物4(257mg,0.855mmol)，氮气置换三次，在20℃反应1小时。LCMS显示原料消失，反应液冷却至0℃，滴加6毫升饱和碳酸氢钠水溶液和6毫升饱和食盐水，用100毫升二氯甲烷稀释，分液，有机相用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水1:1混合水溶液50毫升洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到粗产品。粗产品用15毫升二氯甲烷稀释，慢慢滴加到60毫升甲基叔丁基醚中，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤三次，滤饼用乙腈溶解后旋干除去化合物中的甲基叔丁基醚。得到黄色固体产物E16(591mg,0.270mmol,63.17％)。
LCMS(ESI):m/z＝2246.3(M+59+H)+；LCMS:m/z＝1053.7((M-83)/2+H)+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.87-7.93(m,3H),7.78-7.84(m,3H),5.19-5.24(m,3H),4.93-5.01(m,3H),4.53-4.58(m,3H),3.96-4.08(m,10H),3.83-3.92(m,4H),3.69-3.82(m,6H),3.44-3.64(m,37H),3.37-3.41(m,6H),3.14-3.26(m,15H),2.92-3.00(m,1H),2.72-2.84(m,3H),2.63-2.68(m,1H),2.35-2.44(m,2H),2.28(t,J＝6.0Hz,6H),2.16-2.22(m,1H),2.10(s,9H),2.00(s,9H),1.89(s,9H),1.69-1.80(m,11H),1.20-1.40(m,2H),1.00-1.17(m,12H).
31P NMR(400MHz,DMSO-d6)δ-147.815.
实施例17化合物E17的制备
1化合物3的制备
将化合物1(1500mg,0.797mmol，根据实施例5化合物6的方法制备)，HATU(454mg,1.19mmol)和DIEA(0.659mL,3.98mmol)溶在DMF(20mL)中。反应在20摄氏度下搅拌0.5小时。然后加入化合物2(239mg,1.196mmol，根据实施例15化合物2的方法制备)。反应在20摄氏度下搅拌2小时。LCMS显示有产物的MS值生成。TLC(DCM/MeOH＝5/1)显示有新点生成。向反应液中加入15mL DCM和20mL饱和碳酸氢钠水溶液，反应液分液，水相用DCM(15mL x 1)萃取。合并的有机相用饱和食盐水洗涤(25mL x 1),无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到粗产品。粗产品通过柱层析纯化(DCM/MeOH＝1/0-5/1)得到黄色油状产物化合物3(约840mg)。LCMS:m/z＝1032.7(M/2+H)+.
2E17的制备
化合物3(890mg,0.431mmol)用乙腈溶解后旋干除去化合物中的水，然后在氮气氛围下用DCM(10.0mL)溶解，加入DCI(25.4mg,0.216mmol)，缓慢滴加化合物4(260mg,0.863mmol)，反应液在20℃反应1小时。LCMS显示原料消失，反应液冷却至0℃，滴加6毫升饱和碳酸氢钠水溶液和6毫升饱和食盐水，用100毫升二氯甲烷稀释，分液，有机相用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水1:1混合水溶液50毫升洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到粗产品。粗产品用15毫升二氯甲烷稀释，慢慢滴加到60毫升甲基叔丁基醚中，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤三次，滤饼用乙腈溶解后旋干除去化合物中的甲基叔丁基醚。得到黄色固体产物E17(708mg,0.313mmol,72.51％)。
LCMS(ESI):m/z＝2246.3((M+59*2)/2+H)+；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.78-7.86(m,6H)7.71-7.76(m,3H),5.21(d,J＝3.2Hz,3H),4.96(dd,J＝3.2,11.2Hz,3H),4.48(d,J＝8.4Hz,3H),3.99-4.06(m,10H),3.82-3.91(m,4H),3.65-3.79(m,6H),3.37-3.58(m,18H),3.21(s,8H),3.00-3.09(m,13H),2.86-2.99(m,2H),2.73-2.86(m,3H),2.62-2.69(m,1H),2.54-2.59(m,2H),2.26(t,J＝6.0Hz,6H),2.15-2.20(m,1H),2.10(s,9H),2.04(t,J＝6.8Hz,6H),1.99(s,9H),1.89(s,9H),1.68-1.78(m,11H),1.41-1.55(m,20H),1.03-1.17(m,12H).
31P NMR(400MHz,DMSO-d6)δ-147.834
实施例18化合物E18的制备
1、化合物3的制备
在25摄氏度下将化合物1(1.42g,6.58mmol)和化合物2(1.0g,6.58mmol)加入到DMF(10.0mL)中，依次加入HOBt(1.22g,9.02mmol)，EDCI(1.73g,9.02mmol)，DIEA(3.44mL,20.8mmol)。混合液体在25℃下搅拌3小时。LCMS显示产物生成，TLC(DCM/MeOH＝10/1，PMA)显示新点生成。向反应液体中加入DCM(150ml)，依次用饱和柠檬酸溶液(20.0ml x 3)，碳酸氢钠溶液(20.0ml x 3)，和饱和食盐水(15ml x 3)洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥后，在减压条件下浓缩，得到粗品化合物。粗品经TLC层析纯化(DCM/MeOH＝10/1至5/1)，得到黄色油状化合物3(1.10g,3.49mmol,收率50.3％)。
LCMS:m/z＝316.1(M+H)+.
2、化合物4的制备
在25℃下将化合物3(1.10g,3.49mmol)溶于吡啶(20.0mL)中，加入DMTrCl(1.18g,3.488mmol)的DCM(10.0mL)溶液。混合液体在25℃下搅拌2小时。LCMS显示产物生成。向混合液中加入DCM(200ml)，混合液用饱和碳酸氢钠(20.0ml x 3)，饱和盐水分别洗涤三次(20mlx 3)。有机相用无水硫酸钠干燥，在减压条件下浓缩得到粗产品。粗品经TLC纯化(DCM/MeOH＝10/1至5/1)，得到黄色油状化合物4(560mg,0.928mmol,收率26.6％)，由LCMS表征。
LCMS:m/z＝640.2(M+H)+.
3、化合物Int-5的制备
将化合物4(560mg,0.906mmol)加入到THF(3.00mL)和H2O(1.50mL)中，加入氢氧化锂(57.05mg,1.360mmol)，在20℃反应12小时。TLC(二氯甲烷：甲醇＝8:1)显示原料消失，有新点生成。反应液旋干后加入5mL水，冻干得到白色固体锂盐产物化合物Int-5(630mg,1.033mmol,113.99％)。
4、化合物7的制备
在25℃将化合物6(根据实施例7化合物4的方法制备，190mg,0.08mmol)溶于DCM(5.00mL)中，依次加入Int-5(50.2mg,0.08mmol)，HBTU(39.0mg,0.10mmol)，DIEA(0.04mL,0.25mmol)。混合液体在25℃下搅拌12小时。LCMS显示产物生成。向反应液体中加入二氯甲烷(60.0ml)后，用饱和碳酸氢钠溶液(10.0ml x 3)，饱和食盐水洗涤三次(10ml x 3)，有机相用无水硫酸钠干燥后，在减压条件浓缩，得到粗品化合物7(270mg,粗品)。直接用于下一步。
LCMS:m/z＝1445.2(M/2+H)+.
5、化合物E18的制备
在25℃下将化合物7(270mg，粗品)，和化合物8(56.0mg,0.56mmol)加入到DCM(5.00mL)中，依次加入DIEA(0.093mL,0.56mmol)，DMAP(2.85mg,0.023mmol)。混合液体在25℃下搅拌12小时，LCMS显示原料消失。向反应液体中加入二氯甲烷(100ml)，依次用饱和碳酸氢钠溶液(15.0ml x 3)和饱和食盐水(15.0ml x 3)洗涤三次。有机相用无水硫酸钠干燥后，在减压条件下浓缩，得到粗产品，粗产品经prep-HPLC(色谱柱：Waters Xbridge BEHC18 150*25mm*5um；流动相：TEAA-ACN；梯度：20％-53％/15min；流速：15ml/min)分离，得到白色固体产物E18(74mg,0.025mmol,26.49％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.38(d,J＝7.2Hz,2H),7.17-7.32(m,7H),6.78-6.94(m,4H),5.34(d,J＝2.80Hz,4H),5.05-5.11(m,4H),4.65(dd,J＝3.2,8.8Hz,4H),4.08-4.45(m,14H),3.88-4.08(m,13H),3.75-3.83(m,7H),3.66-3.74(m,8H),3.58-3.66(m,24H),3.48-3.58(m,9H),3.32-3.48(m,11H),3.11-3.21(m,24H),3.07(d,J＝7.2Hz,1H),2.51-2.59(m,2H),2.44-2.51(m,2H),2.19-2.40(m,9H),2.14(s,12H),2.05-2.12(m,3H),2.02(s,13H),1.95(s,12H),1.92(s,13H),1.61(s,3H),1.16-1.38(m,44H)
实施例19化合物E19的制备
1.化合物3的制备
在25℃下将化合物2(630mg,3.15mmol)和化合物1(1.42g,3.15mmol)溶于MeOH(20.0mL)中，加入Et3N(0.874mL,6.29mmol)，反应液在25℃下搅拌12小时。加入NaBH3CN(593mg,9.44mmol)，反应液在25℃下搅拌24小时。LCMS显示有化合物3的MS值。薄层色谱(DCM/MeOH＝10/1)显示反应物消耗完全且有新点生成。往反应液中加入100mL二氯甲烷稀释，用饱和NaHCO3溶液(10.0mL*3)洗涤，再用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用Na2SO4干燥，旋干得到粗品。粗品经过MPLC(DCM/MeOH＝1/0-10/1)纯化，得到黄色油状液体化合物3(970mg,收率48.65％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.38-7.47(m,2H),7.16-7.34(m,7H),6.85(dd,J＝8.8,1.6Hz,4H),3.93-4.01(m,1H),3.77(s,6H),3.64-3.71(m,2H),3.64(s,3H),3.60-3.60(m,1H),3.52-3.59(m,1H),3.38(dd,J＝9.2,6.0Hz,1H),3.16-3.23(m,1H),2.35-2.53(m,3H),2.14-2.32(m,5H),1.53-1.64(m,2H),1.40-1.49(m,2H),1.26-1.36(m,10H).
2化合物4的制备
在25℃下将化合物3(570mg,0.899mmol)溶于THF(4.00mL)和H2O(2.00mL)的混合溶剂中，加入LiOH(25.9mg,1.08mmol)，反应液在40℃条件下搅拌反应18hrs。薄层色谱(DCM/MeOH＝10/1)显示反应物消耗完全且有新点生成。将反应液旋干，然后用1.00mL乙腈和4.00mL水将其溶解，溶液冷冻干燥得到白色固体产品，经LCMS确证为化合物4(510mg,收率90.63％)。
3化合物6的制备
在25℃下将化合物4(54.4mg,0.087mmol)溶于DCM(10.0mL)，依次加入HBTU(41.2mg,0.109mmol)和DIEA(0.086mL,0.522mmol)，反应液在25℃下搅拌0.5小时，然后加入化合物5(根据实施例7化合物4的方法制备，200mg,0.087mmol)，反应液在25℃下搅拌17.5小时。将反应液用DCM(20.0mL)稀释，用饱和NaHCO3水溶液(5.00mL X 3)洗涤，有机相再用饱和食盐水溶液(5.00mL X 3)洗涤，然后将有机相用Na2SO4干燥，有机相旋干得到化合物6的粗品(270mg)。粗品不进行纯化直接用于下一步。
4.化合物E19的制备
在25℃下将化合物6(270mg,0.093mmol)溶于DCM(10.0mL)，依次加入DIEA(0.092mL,0.557mmol)、DMAP(4.54mg,0.037mmol)和化合物7(55.7mg,0.557mmol)，反应液在25℃下搅拌18小时。LCMS显示有产物的MS值。将反应液旋干得到粗品，粗品通过反相柱(色谱柱：Waters Xbridge BEH C18 100*25mm*5um；流动相：TEAA-ACN；B％：20％-60％，18min；流速：15ml/min)分离，得到白色固体化合物E19(64.0mg,收率22.92％，纯度95.34％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.41-7.47(m,2H),7.17-7.35(m,7H),6.83-6.90(m,4H),5.32-5.36(m,4H),5.05-5.11(m,4H),4.64-4.68(m,4H),4.28-4.45(m,4H),4.00-4.21(m,21H),3.86-3.99(m,6H),3.79(s,6H),3.67-3.77(m,8H),3.59-3.67(m,24H),3.55(q,J＝5.2Hz,8H),3.34-3.50(m,10H),3.08(q,J＝7.2Hz,17H),2.56-2.63(m,2H),2.42-2.51(m,4H),2.21-2.36(m,10H),2.12-2.16(m,12H),2.06-2.12(m,2H),2.00-2.05(m,13H),1.98(s,1H),1.58-1.66(m,2H),1.41-1.49(m,2H),1.21-1.35(m,35H).
实施例20化合物E20的制备
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1.化合物3的制备
在25℃下将化合物1(1.60g,7.20mmol)溶于DCM(60mL)，再依次加入化合物2(3.31g,18.0mmol)和EDCI(4.14g,21.6mmol)，反应液在25℃下搅拌18小时。LCMS显示有产物的MS值，薄层色谱(PE/EA＝5/1)显示有一个新点生成。反应液真空浓缩得到粗品，粗品进行MPLC(PE/EA＝1/0-5/1)纯化，得到黄色油状化合物3(1.70g,收率42.59％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.54-4.57(m,4H),3.83-3.87(m,4H),3.74-3.79(m,4H).
2化合物6的制备
在25℃下将化合物4(根据实施例24中间体3-3的方法制备，2.30g,2.15mmol)溶于DCM(20.0mL)，依次加入化合物5(0.690g,1.03mmol)和DIEA(0.508mL,3.08mmol)，反应液在25℃下搅拌10小时。LCMS显示反应生成了目标化合物，薄层色谱(DCM/MeOH＝8/1)显示反应物消耗完全且有新点生成。直接将反应液旋干过柱，洗脱剂为DCM/MeOH，MeOH为10％-15％时产品洗脱出来，得到白色固体化合物6(1.93g,收率77.09％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.29-7.40(m,5H),5.31-5.36(m,4H),5.05-5.13(m,6H),4.62-4.68(m,4H),4.36-4.43(m,2H),4.00-4.20(m,22H),3.89-3.96(m,4H),3.67-3.76(m,9H),3.49-3.66(m,34H),3.34-3.42(m,8H),2.27-2.35(m,4H),2.12-2.16(m,12H),2.01-2.04(m,12H),1.90-1.96(m,24H).
3化合物7的制备
在25℃下将化合物6(930mg,0.381mmol)溶于THF(10.0mL)，先后加入TFA(47.8mg,0.419mmol)和Pd/C 10％(100mg,0.940mmol)，反应液在氢气(14.696psi)氛围以及25℃条件下搅拌反应18小时。薄层色谱(DCM/MeOH＝8/1)显示反应物消耗完全且有新点生成。将反应液过滤，滤液旋干得到白色固体化合物7(830mg,收率94.44％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.33-5.36(m,4H),5.09(d,J＝3.6Hz,2H),5.06(d,J＝2.4Hz,2H),4.60-4.67(m,4H),4.36-4.43(m,2H),4.00-4.19(m,22H),3.92-3.98(m,4H),3.69-3.77(m,9H),3.55-3.67(m,34H),3.35-3.45(m,8H),2.34-2.43(m,4H),2.15(s,12H),2.03(s,12H),1.93-1.97(m,24H).
4.化合物8的制备
在25℃下将化合物3溶于DCM(10.0mL)，依次加入化合物7(400mg,0.173mmol)和TEA(0.144mL,1.04mmol)，反应液在25℃下搅拌18小时。LCMS显示有产物的MS值。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示原料反应完全且有新点生成。反应液真空浓缩得到粗品，粗品进行MPLC(DCM/MeOH＝1/0-5/1)纯化，得到白色固体化合物8(340mg,收率78.09％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.32-5.36(m,4H),5.06-5.12(m,4H),4.64-4.69(m,4H),4.38-4.47(m,3H),4.03-4.18(m,22H),3.90-3.96(m,6H),3.68-3.75(m,16H),3.61-3.66(m,24H),3.53-3.58(m,8H),3.35-3.43(m,8H),2.27-2.34(m,4H),2.13-2.17(m,12H),2.08-2.12(m,2H),2.02-2.04(m,12H),1.97-2.01(m,2H),1.93-1.96(m,23H).
5.化合物10的制备
在25℃下将化合物8(310mg,0.123mmol)溶于DCM(10mL)，再依次加入HBTU(140mg,0.370mmol)和DIEA(0.122mL,0.741mmol)，反应液在25℃下搅拌0.5小时，最后加入化合物9(166mg,0.370mmol)，反应液在25℃下搅拌17.5小时。LCMS显示有产物的MS值，原料消耗完全。将反应液旋干得到粗品。粗品通过反相柱制备分离(色谱柱：01-Waters Xbridge BEHC18 19*150mm；流动相：TEAA-ACN；B％：20％-58％，15min；流速：15ml/min)，得到白色固体化合物10(170mg,收率46.80％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.41-7.45(m,2H),7.25-7.34(m,7H),6.87(t,J＝8.0Hz,4H),5.34(d,J＝3.2Hz,4H),5.08(ddd,J＝11.2,3.2,1.6Hz,4H),4.65(dd,J＝8.4,3.2Hz,4H),4.58(br s,4H),4.39-4.44(m,3H),4.00-4.19(m,24H),3.93(dt,J＝11.2,4.4Hz,4H),3.79(s,6H),3.69-3.76(m,11H),3.58-3.67(m,34H),3.51-3.57(m,9H),3.34-3.41(m,8H),3.15(q,J＝7.2Hz,11H),2.27-2.34(m,4H),2.14(s,12H),2.06-2.12(m,2H),2.02(s,12H),1.96-2.00(m,2H),1.94(d,J＝6.8Hz,24H),1.29(t,J＝7.2Hz,15H).
6.化合物E20的制备
在25℃下将化合物10(170mg,0.058mmol)溶于DCM(6.00mL)，再依次加入DIEA(0.057mL,0.347mmol)、DMAP(2.82mg,0.023mmol)和化合物11(34.7mg,0.347mmol)，反应液在25℃下搅拌18小时。LCMS显示有产物的MS值。反应液旋干得到粗品，粗品通过反相柱分离(色谱柱：C18；流动相：H2O(0.1％TEA)-ACN；B％：30％-70％，20min；流速：20ml/min)，得到白色固体化合物E20(96mg,收率54.61％,纯度90.93％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.44(brd,J＝8.0Hz,2H),7.19-7.34(m,7H),6.88(br dd,J＝8.0,6.4Hz,4H),5.34(d,J＝3.2Hz,4H),5.05-5.11(m,4H),4.65(dd,J＝8.4,2.8Hz,4H),4.38-4.45(m,3H),4.20-4.31(m,3H),4.01-4.19(m,24H),3.90-3.95(m,4H),3.79(s,6H),3.45-3.77(m,53H),3.34-3.42(m,9H),3.18(q,J＝7.2Hz,5H),2.57-2.63(m,2H),2.48-2.54(m,2H),2.27-2.34(m,4H),2.08-2.20(m,13H),2.02(s,13H),1.94(d,J＝5.6Hz,23H),1.30(t,J＝7.2Hz,8H).
实施例21化合物E21的制备
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1化合物6的制备
在氮气气氛和25℃下向化合物4B(5.30g,18.8mmol,1.00eq)和化合物3-3(49.0g,41.4mmol,2.20eq,TFA盐，根据实施例24中间体3-3的方法制备)的DCM溶液中一次性加入DIPEA(16.0g,124mmol,21.6mL,6.60eq)。将溶液在25℃下搅拌30分钟。在25℃下向溶液中加入HBTU(17.8g,47.1mmol,2.50eq)。将混合物在25℃下搅拌16小时。LCMS检测到新化合物。在40℃下真空浓缩混合物。将残留物溶解在DCM(500mL)中，在20℃下向混合物加入0.5MHCl(200mL x 2)。使用DCM(3x 500mL)萃取，使用饱和NaHCO3(3x 500mL)和盐水(3x 500mL)清洗混合物，使用Na2SO4干燥并真空浓缩。残留物通过柱色谱(SiO2,DCM:MeOH＝100/1至8/1)和prep-MPLC(柱:800g Agela C18；移动相:[水-ACN]；15-45％25min；45％10min)纯化，获得棕色油状的化合物6(45.0g,粗品)。
2中间体3-2的制备
向化合物6(37.0g,15.5mmol,1.00eq)的DME(740mL)溶液中加入TFA(1.77g,15.54mmol,1.15mL,1.00eq)和Pd/C(3.70g,10％纯度)。将悬浮液脱气并置换三次氢气。在15℃和H2(15Psi)下将混合物搅拌16小时。LCMS显示反应完全。通过硅藻土过滤，减压浓缩滤液以除去溶剂，获得白色固体状的中间体3-2(77.2g,粗品,TFA盐)。
1H NMR:ET53345-86-P1A(400MHz,DMSO)
δ8.9(m,1H),8.40-8.20(m,6H),7.83-7.81(m,6H),5.32(d,J＝3.2Hz,1H),5.21(d,J＝2.8Hz,4H),4.96(dd,J＝3.2Hz,2H),4.55(d,J＝8.4Hz,4H),4.35(m,1H),4.20(m,1H),4.02(s,12H),3.86-3.77(m,10H),3.61-3.49(m,42H),3.42-3.19(m,10H),2.15-2.10(m,18H),1.99(s,12H),1.89(s,14H),1.77-1.74(m,21H).
3化合物3的制备
将中间体3-2(500mg,0.222mmol)溶解在DCM(10.0mL)中，依次加入HBTU(127mg,0.334mmol)、DIEA(0.110mL,0.667mmol)和化合物2(142mg,0.222mmol)，反应液在25℃下搅拌18小时。LCMS检测到产物的MS响应。薄层色谱(DCM/MeOH＝10/1)显示原料已反应完全，有新点生成。反应液用饱和碳酸氢钠水溶液(20.0mL)洗涤，二氯甲烷(10.0mL x 2)萃取，有机相合并浓缩，过正相柱(DCM/MeOH＝1:0～10:1)，得到白色固体3(545mg,收率85.56％)。
4化合物E21的制备
将化合物3(545mg,0.190mmol)溶解在DCM(20.0mL)中，加入化合物4(114mg,1.14mmol)、DIEA(0.189mL,1.14mmol)和DMAP(23.3mg,0.190mmol)，反应液在25℃下搅拌18小时。LCMS检测到产物的MS响应。反应液直接旋干，加乙腈(5.00mL)溶解，通过prep-HPLC(色谱柱:Waters Xbridge BEH C18 100*30mm*10um；流动相:水-乙腈]；B％:17％-57％,12min；流速:50ml/min)，得到白色固体化合物E21(50.0mg,收率7.47％,纯度84.29％)。LCMS(ESI):m/z＝2962.3(M+H)+；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.43(d,J＝8.0Hz,2H),7.27-7.32(m,6H),7.18-7.25(m,1H),6.85-6.88(m,4H),5.32-5.34(m,4H),5.06-5.09(m,4H),4.64-4.67(m,4H),4.32-4.39(m,2H),4.02-4.21(m,20H),3.83-3.99(m,6H),3.79(d,J＝2.0Hz,6H),3.69-3.74(m,5H),3.58-3.67(m,28H),3.51-3.57(m,6H),3.35-3.41(m,8H),3.14-3.23(m,2H),2.51-2.60(m,4H),2.30-2.40(m,8H),2.20-2.23(m,2H),2.14(s,12H),2.06-2.09(m,2H),2.02-2.03(m,12H),1.94(d,J＝5.2Hz,24H),1.54-1.59(m,4H),1.29-1.38(m,12H).
实施例22中间体2-3的制备
1化合物8的制备
在10-15℃下经0.5小时向化合物7(100g,256mmol)的DCM(300mL)溶液中逐滴加入TMSOTf(68.5g,308mmol,55.7mL)。随后将化合物在25℃下搅拌12小时。TLC(乙酸乙酯)显示化合物7(Rf＝0.3)消耗完全且化合物8(Rf＝0.4)形成。将化合物冷却至0℃，在0-5℃下缓慢倒入NaHCO3水溶液(100g溶解在1.00L水中)中，使用DCM(200mL x 3)分离有机相并萃取水相，合并有机层并使用盐水(50.0mL)洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩以获得黄色油状的化合物8(约83.0g)。1H NMR:(400MHz,DMSO-d6).δ6.03(d,J＝7.2Hz,2H),5.24-5.22(m,1H),4.89-4.86(m,1H),4.26-4.24(m,1H),4.13-4.05(m,2H),4.04-3.94(m,1H),2.06(s,3H),1.99(d,J＝3.2Hz,6H),1.98(s,3H).
2化合物2A的制备
两个反应平行进行。
在0℃下向化合物2A-1(450g,4.28mol,428mL)的2-甲基-THF(1.80L)的溶液中逐滴加入THF(450mL)中的化合物2A-2(365g,2.14mol,304mL)。加入后将化合物在氮气气氛中25℃下搅拌12小时。TLC(乙酸乙酯，化合物2A-2Rf＝0.9，化合物2A Rf＝0.3)显示化合物2A-2消耗完全且化合物2A形成。合并两个反应。向反应混合物中加入HCl/EtOAc(1M,900mL)并搅拌30分钟，通过celite过滤出去白色固体，真空浓缩滤液以得到无色油状的化合物2A(约990g)。1H NMR:(400MHz,CDCl3).δ7.26-7.21(m,5H),5.56(s,1H),5.00(s,2H),3.62-3.59(m,2H),3.45-3.23(m,4H),3.29(s,2H).
3化合物9的制备
在0-10℃下向在DCM(500mL)中的化合物8(83.0g,252mmol)和化合物2A(42.2g,176mmol)的混合物中逐滴加入TMSOTf(28.0g,126mmol,22.8mL)，并将化合物在20℃下搅拌12小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝0/1)显示化合物8消耗完全且化合物9(Rf＝0.3)形成。LCMS(化合物9:RT＝0.744min)显示化合物8消耗完全。在0-5℃下将反应混合物倒入饱和NaHCO3水溶液(200mL)中并用盐水(200mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过柱色谱纯化残留物(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝1/0至0/1)。在25℃下用石油醚/乙酸乙酯＝1/1(100mL)磨碎粗产物30分钟以获得白色固体状的化合物9(约59.0g)。1H NMR:(400MHz,DMSO-d6).δ7.82(d,J＝9.2Hz,1H),7.40-7.28(m,5H),5.23(d,J＝3.2Hz,1H),5.26-4.98(m,3H),4.56(d,J＝8.4Hz,1H),4.05(s,3H),3.93-3.86(m,1H),3.81-3.76(m,1H),3.63-3.48(m,3H),3.43-3.40(m,2H),3.35-3.15(m,2H),2.11(s,3H),2.01(s,3H),1.91(s,3H),1.79(s,3H).
4中间体2-3(TFA盐)的制备
在氩气气氛下向THF(475mL)的Pd/C(9.50g,10％含量)中加入化合物9(95.0g,167mmol)和TFA(19.0g,167mmol,12.4mL)。将反应混合物用氩气置换三次后再使用氢气置换三次，然后将混合物在25℃和H2(45psi)氛围下搅拌3小时。TLC(二氯甲烷/甲醇＝10/1)显示化合物9(Rf＝0.5)消耗完全且中间体2-3(TFA盐)(Rf＝0.2)形成。将反应混合物减压浓缩得到类白色固体状中间体2-3(TFA盐)(55.53g,产率：57.9％,纯度：95.7％)。1H NMR:(400MHz,CDCl3).δ8.00-7.97(m,5H),5.29(d,J＝3.2Hz,1H),5.07(d,J＝3.6Hz,1H),4.63(d,J＝8.4Hz,1H),4.10(s,3H),3.97-3.95(m,1H),3.89-3.88(m,1H),3.70-3.63(m,5H),3.04(s,2H),2.17(s,3H),2.07(s,3H),1.96(s,3H),1.85(s,3H),.
实施例23中间体3-4的制备
1化合物2的制备
在15℃下向化合物1(300g,2.01mol)的DCM(1.80L)中缓慢加入苄基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯并逐滴加入TEA(203g,2.01mol,280mL)。加入后，将混合物在25℃下搅拌16小时。TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1)显示反应物1(Rf＝0.32)保留且检测到一个重要新点(Rf＝0.52)。使用饱和碳酸氢钠溶液洗涤反应混合物(1.00L x 2)，使用盐水(1.00L)洗涤有机相，用无水Na2SO4干燥并真空浓缩。不经纯化，化合物2(约385g)为黄色油状。
2化合物2A的制备
在0-15℃下向化合物4(350g,1.62mol,HCl)和Ac2O(994g,9.74mol,912mL)的吡啶(1.75L)溶液中一次性加入DMAP(19.8g,162mmol)并逐滴加入TEA(164g,1.62mol,226mL)。将混合物在25℃下搅拌16小时。LCMS(产物:RT＝0.687min)显示起始反应物消耗完全。在25℃下向混合物中添加EtOAc(1.40L)并搅拌30分钟，随后过滤混合物并使用EtOAc(300mL)清洗滤饼。在25℃下用水(1.45L)磨碎滤饼30分钟。过滤混合物并使用水(175mL x 3)清洗滤饼，收集滤饼以获得白色固体状的化合物2A(约580g)。
3化合物2B的制备
三次反应平行进行。
在10-15℃下经0.5小时向化合物2A(200g,514mmol)的DCM(800mL)溶液中逐滴加入TMSOTf(137g,616mmol,111mL)。随后将混合物在25℃下搅拌3小时。TLC(二氯甲烷:甲醇＝20:1)显示化合物2A(Rf＝0.54)消耗完全且新点(Rf＝0.24)形成。合并三次反应。将混合物冷却至0-15℃，在0-5℃下缓慢倒入NaHCO3的溶液(300g溶解在3.00L水)中，分离有机相并用DCM(1.00L x 3)萃取水相，合并有机层，用Na2SO4,干燥，过滤并真空浓缩。不经纯化，获得黄色油状的化合物2B(约507g)用于下一步骤。
4化合物3的制备
在0-10℃下向在DCM(1.00L)中的化合物2B(250g,759mmol)和化合物2(151g,531mmol)的混合物中逐滴加入TMSOTf(84.4g,380mmol,69.0mL)并将混合物在20℃搅拌12小时。TLC(二氯甲烷:甲醇＝20:1)显示化合物2(Rf＝0.33)消耗完全且形成新点(Rf＝0.03)。将合并的反应物冷却至0-5℃，随后将反应物倒入NaHCO3(水溶液，100g溶于1L水)中并在5-10℃下搅拌10分钟，分离相。使用DCM(500mL x 2)萃取水相，合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩滤液。不经纯化，化合物3(约360g)为黄色油状。1H NMR:(400MHz,DMSO).δ7.79-7.37(m,1H),7.35-7.26(m,5H),5.21-5.20(m,1H),5.00-4.95(m,3H),4.55-4.53(m,1H),4.03-3.86(m,3H),3.61-3.59(m,1H),3.59-3.57(m,1H),3.48-3.40(m,6H),3.39-3.31(m,2H),3.14-3.13(m,2H),2.09(s,3H),1.99(s,3H),1.88(s,3H),1.76-1.74(m,3H).
5中间体3-4(TFA盐)的制备
三次反应平行进行。
在氩气气氛下向在THF(1.80L)中的Pd/C(18.0g,16.3mmol,10％含量)的混合物中加入化合物3(180g,293mmol)和TFA(33.5g,293mmol,21.8mL)。对混悬液排气并使用氢气通气三次。在H2(50Psi)和30℃下将混合物搅拌2小时。LCMS(产物:RT＝0.697min)显示化合物3消耗且检测到产物峰。合并三次反应。通过celite过滤混合物，减压浓缩滤液以除去溶剂。不经纯化，获得黄色固体状的中间体3-4(TFA盐)(393g,660mmol,74.8％产率,99.6％纯度,TFA)。
1H NMR:(400MHz,DMSO-d6)
δ＝7.92(d,J＝9.1Hz,4H),5.27-5.17(m,1H),5.03-4.91(m,1H),4.60-4.50(m,1H),4.09-3.97(m,4H),3.85(s,2H),3.65-3.46(m,10H),3.04-2.92(m,2H),2.10(s,3H),2.00(s,3H),1.94-1.86(m,3H),1.82-1.71(m,4H).
实施例24中间体3-3和中间体5的制备
1化合物5的制备
在25℃下向化合物4B(10.0g,35.5mmol,1.00eq)和化合物3-4(46.3g,78.2mmol,2.20eq,TFA)的DCM(1.00L)溶液中一次性加入DIEA(30.3g,234mmol,40.8mL,6.60eq)。25℃搅拌半小时。向混合物中加入HBTU(30.3g,234mmol,40.8mL,6.60eq)。25℃搅拌16小时。LCMS(产物:RT＝0.681mins)显示反应完成，真空浓缩混合物。在20℃下向混合物中加入0.50N HCl(200mL x 2)，并用DCM(3x 500mL)萃取，合并有机层并用饱和NaHCO3(3x 800mL)清洗直至pH＝8，用盐水(3x 500mL)清洗，用Na2SO4干燥并真空浓缩纯化。通过柱色谱(SiO2,DCM:MeOH＝50:1-15:1)纯化残留物。在40℃下真空浓缩残留物并通过制备型-MPLC(柱:800g Agela C18；流动相:[水-ACN]；15-45％25min；45％10min)纯化。真空干燥以获得黄色固体状的化合物5(约180g+75.0g+87.0g+40.0g+38.0g)。
417.0g的化合物3-4通过9批次被转换为化合物5。
2中间体3-3的制备
在氩气气氛下向Pd/C(3.00g,10％含量)的THF(300mL)中加入化合物5(73.0g,61.7mmol,1.00eq)和TFA(7.04g,61.7mmol,4.57mL,1.00eq)。对悬浮液脱气并使用氢气通气三次。在H2(20Psi)和20℃下搅拌16小时。TLC(二氯甲烷:甲醇＝8:1,Rf＝0.0)显示反应完成。通过celite过滤混合物，加压浓缩滤液以除去溶剂以获得白色固体状的化合物3-3(约33.4g+129g+75.0g)。
1H NMR:(400MHz,DMSO)
δ8.53(t,J＝5.2Hz,1H),8.18(d,J＝2.4Hz,3H),8.03(t,J＝5.2Hz,1H),7.84(dd,J＝3.6Hz,2H),5.22(d,J＝3.2Hz,2H),4.96(dd,J＝3.2Hz,2H),4.55(d,J＝8.4Hz,2H),4.02(t,J＝8.8Hz,6H),3.77-3.59(m,5H),3.58-3.45(m,21H),3.40-3.20(m,4H),2.18(t,J＝7.6Hz,2H),2.17(d,J＝8.0Hz,6H),2.10(s,6H),1.99(s,6H),1.90-1.80(m,8H),1.77(s,6H).
3化合物2的制备
在0℃下向化合物1(90.0g,465mmol,1.00eq)的DCM(540mL)溶液中加入TEA(47.1g,465mmol,64.8mL,1.00eq)和Cbz-OSu(110g,442mmol,0.95eq)。将混合物在20℃下搅拌16小时。LCMS(产物:RT＝0.625mins)显示反应完成。使用饱和碳酸氢钠溶液(450mL x2)清洗反应混合物，使用盐水(500mL)清洗有机相，用无水Na2SO4干燥并浓缩以获得黄色油状的化合物2(约136g)。
4化合物3的制备
在20℃下向化合物2(51.0g,155mmol,1.00eq)的DCE(300mL)溶液中加入化合物2A(84.9g,218mmol,1.40eq)和Sc(OTf)3(12.0g,62.3mmol,0.40eq)。在85℃下搅拌3小时。LCMS(产物:RT＝0.783mins)显示反应完成。将反应混合物冷却至15℃并在15～20℃下通过加入饱和NaHCO3(300mL)冷却并通过DCM(300mL)萃取。使用1M HCl(50.0mL)和盐水(300mL)清洗合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤并45℃下在减压浓缩以获得棕色油状的化合物3(84.0g)。
5中间体5的制备
在氩气气氛下向Pd/C(7.00g,10％含量)的THF(300mL)中加入化合物3(70.0g,109mmol,1.00eq)和TFA(12.5g,109mmol,8.14mL,1.00eq)。对悬浮液脱气并使用氢气通气三次。在H2(40Psi)和30℃下将混合物搅拌2小时。TLC(二氯甲烷:甲醇＝8:1)显示反应完成。通过celite过滤混合物，加压浓缩滤液以除去溶剂以获得黄色油状的化合物5(66.0g,103mmol,94.29％产率,TFA)。
1H NMR:(400MHz,DMSO)
δ7.86-7.84(m,4H),5.22(d,J＝3.6Hz,1H),4.97(dd,J＝3.2Hz,1H),4.54(d,J＝8.4Hz,1H),4.03(s,3H),3.77-3.60(m,3H),3.60-3.51(m,15H),3.00-2.97(m,2H),2.10(s,3H),2.00(s,3H),1.89(s,3H),1.81(s,3H).
实施例25中间体1-3的制备
在-5～0℃下向DCM(100mL),ACN(100mL)和H2O(300mL)的混合物中一次性加入NaIO4(224g,1.05mol)和RuCl3(966mg,4.66mmol)。将化合物1溶解在DCM(100mL)和ACN(100mL)的混合物中，随后在-5～0℃下将溶液逐滴加入上述反应混合物中。将反应混合物在15℃下搅拌12小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1/1，产物Rf＝0.20)显示新点形成。使用NaHCO3(50.0g)将反应混合物调节至pH＝8，并使用DCM(500mL x 4)萃取混合物。使用柠檬酸(100g)将水相调节至pH＝3。随后使用DCM(500mL x 4)萃取混合物。分离有机相，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以形成残留物。在15℃.下从EtOAc(1.00L)中通过重结晶纯化残留物。粗产物使用EtOAc(1.00L)洗涤。获得灰白色固体状的中间体1-3(55.3g,52.2％产率,98.4％纯度)。
1HNMR:(400MHz DMSO-d6)
11.9(s,1H),7.80(d,J＝9.2Hz,9H),5.20(d,J＝3.6Hz 1H),4.97-4.93(m,1H),4.48(d,J＝8.8Hz,1H),4.02(s,3H),3.90-3.83(m,1H),3.73-3.69(m,1H),3.44-3.39(m,1H),2.19(t,J＝6.8Hz,2H),2.10(s,3H),1.99(s,3H),1.88(s,3H),1.76(s,3H),1.49-1.48(m,4H).
实施例26中间体2-2的制备
1化合物3的制备
4次反应平行进行。
向化合物1(250g,741mmol)的THF(1.75L)溶液中加入4-甲基吗啉(434g,4.30mol,472mL)，随后冷却至0℃。在10分钟内向反应混合物中加入氯甲酸异丁酯(243g,1.78mol,233mL)，维持反应温度小于4.0℃。加入后，将混合物搅拌40分钟或更久，在10分钟内向反应混合物中逐次加入化合物2(526g,1.78mol)，维持反应温度小于4.0℃。加入后，移除冰浴，随后允许反应物升温至室温，持续2小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1/1,化合物1Rf＝0.43)显示化合物1消耗完全且形成新点。合并4次反应。将反应溶液倒入搅拌中的冷的(0℃)0.50M HCl(aq.)(12.0L)溶液中并搅拌约10分钟。随后加入EtOAc(4.00L x 3)，搅拌一段时间，分层，并使用盐水(10.0L)洗涤有机相，用Na2SO4干燥，真空浓缩，产生稠的无色油状物。向搅拌的油状物中加入己烷(1.20L)。溶液中出现白色烟雾，并随后在进一步搅拌后消失。加入晶种(1.20g,0.10wt％)，此时白色晶体缓慢形成。在20分钟内，悬浮液足够稠以阻碍搅拌，此时加入额外的己烷(6.00L)，搅拌12小时。过滤悬浮液，使用己烷(1.20L)清洗并干燥以获得白色固体状的化合物3(约1.20kg)。
1H NMR:(400MHz DMSO)
δ8.10-8.08(m,1H),7.62-7.60(m,1H),7.38-7.31(m,5H),5.11-4.94(m,2H),4.12-4.09(m,1H),3.92-3.87(m,1H),2.25-2.19(m,4H),1.90-1.88(m,2H),1.73-1.67(m,2H),1.40-1.39(m,27H).
2化合物4的制备
5次反应平行进行。
将化合物3(240g,415mmol)的HCOOH(2.40L)溶液在45℃下搅拌2小时。LCMS(化合物4＝0.570min)显示化合物3消耗完全且出现所需m/z的主峰。合并5次反应。使用甲苯和ACN(各1.50L)稀释并浓缩。使用1:1ACN和甲苯(500mL)和ACN三次(各500mL)共沸除去甲酸。高真空干燥化合物4。随后使用DCM(500mL)搅拌残留物并倒去有机层，随后使用ACN(400mL)共沸干燥两次，真空干燥，随后使用甲苯(400mL)共沸9次以得到白色固体状的化合物4(约800g)。
1H NMR:(400MHz DMSO)
δ12.4-12.2(m,2H),8.12-8.10(m,1H),7.62-7.60(m,1H),7.38-7.34(m,5H),5.07-5.02(m,2H),4.22-4.17(m,1H),3.99-3.96(m,1H),2.31-2.21(m,4H),2.00-1.93(m,2H),1.76-1.75(m,2H).
3化合物6的制备
向化合物4(80.0g,194mmol)和化合物2-3(384g,700mmol,TFA)的搅拌的DMF(2.00L)溶液中依次加入HOBT(103g,760mmol)、EDCI(146g,760mmol)和DIEA(113g,877mmol,153mL)。将反应物在20℃下搅拌2小时。TLC(二氯甲烷/甲醇＝5/1,化合物6Rf＝0.43)显示化合物4消耗完全并形成新点。将反应混合物缓慢倒入搅拌的冷的0.5M HCl水溶液(230mL)中，搅拌10分钟，形成白色固体并过滤，使用DCM(1.50L)萃取水相两次。使用5％NaHCO3(aq.)(200mL)清洗合并的有机相，之后干燥(Na2SO4)，然后加压蒸发浓缩。通过柱色谱(SiO2,二氯甲烷/甲醇＝5/1,化合物6Rf＝0.43)纯化残留物以得到黄色固体状的化合物6(约180g)。
1H NMR:(400MHz DMSO)
δ7.95-7.91(m,3H),7.82-7.80(m,4H),7.39-7.31(m,6H),5.21-5.01(m,3H),5.00-4.96(m,5H),4.56-4.53(m,3H),4.02(s,1H),3.88(s,9H),3.85(s,4H),3.76(s,3H),3.50-349(m,9H),3.39-3.36(m,6H),3.19-3.15(m,6H),2.15-2.05(m,12H),1.99(s,9H),1.89-1.77(m,21H).
4中间体2-2的制备
在氩气气氛下向干燥的氢化瓶中加入Pd(OH)2/C(4.94g,3.52mmol,10％含量)，加入MeOH(350mL)并依次加入化合物6(47.4g,28.5mmol)、TFA(3.26g,28.5mmol,2.11mL)，在H2(50psi)和20℃下搅拌3小时。通过TLC(二氯甲烷/甲醇＝5/1,中间体2-2Rf＝0.25)监测反应，显示化合物6消耗。过滤反应混合物并真空浓缩滤液以获得白色固体状的中间体2-2(TFA盐)(46.3g,94.6％产率,95.7％纯度,TFA)。
1H NMR:(400MHz DMSO)
δ8.56-8.50(m,1H),8.14-8.05(m,4H),7.99(s,1H),7.88-7.82(m,4H),5.22-5.21(m,3H),4.99-4.96(m,3H),4.55-4.53(m,3H),4.09(s,1H),4.03(s,9H),3.87-3.79(m,6H),3.59-3.52(m,1H),3.51-347(m,9H),3.39-3.37(m,5H),3.17-3.16(m,6H),2.22-2.10(m,12H),1.99(s,9H),1.93-1.73(m,21H).
实施例27中间体1-2的制备
1化合物3的制备
向化合物1(500g,4.13mol)的DMSO(800mL)溶液中加入NaOH(5M,82.6mL)，随后在25℃下加入化合物2(2.12kg,16.5mol)。在40℃下将混合物搅拌12小时。在80℃下将混合物回流3.5小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝3/1,化合物3Rf＝0.49)显示反应完成。向混合物中加入MTBE(1.00L)，随后用水(1.00L x 2)和盐水(300mL)清洗。用Na2SO4干燥有机相，过滤并减压浓缩以获得粗产物。通过柱色谱(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝1/0至5/1,化合物3Rf＝0.49)纯化残留物以得到黄色油状的化合物3(约690g)。
1H NMR:(400MHz,DMSO-d6)
δ3.53-3.56(m,6H),3.71(s,6H),2.39(t,J＝6.0Hz,6H),1.40(s,27H),1.29(s,2H).
2化合物4的制备
2次反应平行进行。
在25℃下向化合物3(365g,722mmol)的DCM(1.25L)溶液中加入NaHCO3(121g,1.44mol,56.2mL)的水(1.25L)溶液，随后逐滴加入CbzCl(185g,1.08mol,154mL)并搅拌12小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝5/1.化合物4Rf＝0.46)显示化合物3消耗完全。合并2次反应。使用DCM(1.00L x 2)萃取反应混合物并使用盐水(200mL)洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥并真空浓缩以获得残留物。通过柱色谱(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝1/0至5/1，化合物4Rf＝0.46)纯化残留物以获得黄色油状的化合物4(约735g)。
1H NMR:(400MHz,DMSO-d6)
δ7.31-7.35(m,5H),4.97(s,2H),3.49-.3.45(m,12H),2.37-2.40(m,6H),1.39(s,27H).
3化合物5的制备
在25℃下向化合物4(735g,1.15mol)中加入HCOOH(2.20L)。随后在25℃下将溶液搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝5/1,化合物5Rf＝0.1)显示反应完成。真空浓缩反应物以形成残留物。使用甲苯(200ml)和乙腈(200mL)稀释残留物并真空浓缩以得到黄色油状的化合物5(约545g,粗品)。
1H NMR:(400MHz,DMSO-d6)
δ12.2(s,3H),7.30-7.39(m,5H),4.98(s,2H),3.54-3.57(m,6H),3.49(s,6H),2.40-2.50(m,6H).
4化合物7的制备
向化合物5(520g,1.10mol)的DCM(600mL)溶液中加入DIPEA(570g,4.41mol),HBTU(1.38kg,3.64mol)和化合物6(634g,3.64mol)。在25℃下将混合物搅拌12小时。TLC(二氯甲烷/甲醇＝10/1,化合物7Rf＝0.22)显示反应完成。使用饱和NaHCO3溶液(500mL x 3)和盐水(200mL)清洗反应物，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩以获得残留物。通过柱色谱(SiO2,二氯甲烷/甲醇＝1/0至5/1,二氯甲烷/甲醇＝10/1,化合物7Rf＝0.22)纯化残留物以得到黄色油状的化合物7(约361g)。
1H NMR:(400MHz,DMSO-d6)
δ7.80-7.83(m,3H),7.29-7.35(m,5H),6.76-6.77(m,3H),4.97(s,2H),3.52-3.55(m,6H),3.47(s,6H),2.99-3.04(m,6H),2.87-2.92(m,6H),2.25-2.28(m,6H),1.46-1.50(m,6H),1.36(s,27H).
5化合物8的制备
在25℃下向化合物7(360g,382.9mmol)的DCM(1.00L)溶液中加入TFA(1.66kg,14.6mol,1.08L)。在25℃下将反应物搅拌12小时。TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1,化合物8Rf＝0.0)显示反应完成。将溶液真空浓缩以获得残留物。使用甲苯(500mL)稀释残留物并真空浓缩以获得黄色油状的化合物8(约245g)。
6化合物9的制备
向化合物1-3(302g,675mmol)的DCM(720mL)溶液中加入DIPEA(339g,2.63mol)和HBTU(256g,675mmol)并将混合物在25℃下搅拌30分钟。随后，向混合物加入化合物8(120g,188mmol)并将混合物在25℃下搅拌12小时。LCMS(化合物9RT＝1.737min)显示反应完成。使用饱和NaHCO3水溶液(400mL x 3)和盐水(200mL)清洗溶液，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以获得残留物。通过柱色谱(SiO2,二氯甲烷/甲醇＝1/0至5/1,化合物9Rf＝0.35)纯化残留物以获得粗产物。通过反向HPLC(MeCN/H2O)纯化粗产物以获得黄色油状的化合物9(约200g)。
1H NMR:(400MHz,DMSO-d6)
δ7.81-7.84(m,6H),7.72-7.75(m,3H),7.33-7.35(m,5H),5.20-5.21(m,3H),4.94-4.97(m,5H),4.46-4.49(m,3H),4.02(s,9H),3.83-.3.90(m,3H),3.67-3.72(m,3H),3.52-3.55(m,6H),3.47(s,5H),3.34-3.42(m,3H),2.99-3.05(m,12H),2.27(t,J＝6.4Hz,6H),2.10(s,9H),2.03(t,J＝7.2H),1.99(s,9H),1.88(s,9H),1.77(s,9H),1.72-1.53(m,14H).
7中间体1-2的制备
在15℃和氩气下向化合物9(109g,56.5mmol)的THF(654mL)的溶液中加入TFA(6.45g,56.5mmol,4.19mL)和Pd/C(21.8g,10％含量)。将混合物在H2(15Psi)和15℃下搅拌12小时。LCMS(中间体1-2RT＝0.696min)显示反应完成。将混合物过滤并真空浓缩滤液以获得灰白色固体状的中间体1-2(84.2g,73.3％产率,94.1％纯度,TFA)。
1H NMR:(400MHz,DMSO-d6)
δ7.76-7.91(m,9H),5.21(d,J＝3.6Hz,3H),4.94-4.98(m,3H),4.48(d,J＝8.4Hz,3H),3.99-4.04(m,9H),3.83-3.90(m,3H),3.67-3.72(m,3H),3.57-3.64(m,9H),3.58-3.65(m,9H),3.44(s,5H),3.01-3.07(m,12H),2.34(t,J＝6.0Hz,6H),2.10(s,9H),2.02-2.06(m,6H),1.99(s,9H),1.88(s,9H),1.77(s,9H),1.46-1.53(m,17H).
实施例28siRNA的制备
使用本领域熟知的固相亚磷酰胺法制备本发明的siRNA。具体方法可参见例如PCT公开号WO2016081444和WO2019105419，并简述如下。
1.配体与CPG载体的连接
以下以化合物E7为例阐述配体与CPG载体的连接，本发明的其他GalNAc配体可以使用类似的方法与CPG载体连接。
将化合物E7(53mg，0.018mmol)和HBTU(13.3mg，0.035mmol)混合后，加入乙腈(5mL)震荡溶解，随后加入DIEA(9.0mg，0.07mmol)和DMAP(2.1mg，0.018mmol)，震荡溶解直至变得清澈。称取空白载体Resin(550mg，CPG孔径)加入到反应液中，控温20℃，摇床反应过夜。取样并监测，进行薄层色谱TLC，其中展开剂为DCM/甲醇＝4/1，用磷钼酸显色，结果显示反应完全。使用砂芯漏斗进行过滤，滤饼用无水乙腈洗涤(20mL*5)，取滤饼，使用油泵减压抽滤6h，得到类白色固体530mg。
将上述缩合后的产品530mg放于50mL的圆底瓶中，依次加入CapC(DMAP/乙腈)，CapB(N-甲基咪唑/吡啶/乙腈)，CapA(醋酐/乙腈)，室温下摇床过夜。过滤，滤饼用乙腈洗涤(20mL*4)，取滤饼，油泵减压抽滤8h后，得到类白色固体200mg，用于固相合成。
2.正义链(SS链)和反义链(AS链)的合成
通过固相亚磷酰胺合成法，利用空白的CPG固相载体或根据上文步骤1连接GalNAc配体的CPG固相载体做为起始循环，按照核苷酸排布顺序，自3’-5’方向逐一连接核苷单体或GalNAc配体。每连接一个核苷单体都包含了脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫代四步反应。合成规模为5umol的寡核酸合成条件如下：
核苷单体以0.05mol/L的乙腈溶液提供，每一步反应的条件相同，即温度为25度，脱保护使用3％的三氯乙酸-二氯甲烷溶液，脱保护3次；偶联反应使用的活化剂为0.25mol/L的ETT-乙腈溶液，偶联2次；盖帽使用10％醋酐-乙腈和吡啶/N-甲基咪唑/乙腈(10:14:76,v/v/v)，盖帽2次；氧化使用0.05mol/L的碘的四氢呋喃/吡啶/水(70/20/10,v/v/v)溶液，氧化2次；硫代使用0.2mol/L PADS的乙腈/3-甲基吡啶(1/1,v/v)，硫代2次。
3.寡核苷酸的纯化与退火
3.1氨解
将合成好的固相载体(正义链或者反义链)加入到5mL的离心管中，加入3％的二乙胺/氨水(v/v)，35度(或者55度)恒温水浴下反应16小时(或者8小时)，过滤，固相载体用乙醇/水洗涤三次，每次1mL，滤液离心浓缩后将粗品进行纯化。
3.2纯化
纯化和脱盐的方法是本领域人员所熟知的。例如，可采用强阴离子填料装柱，氯化钠-氢氧化钠体系进行洗脱纯化，产品收集并管，可采用凝胶填料纯化柱进行脱盐，洗脱体系是纯水。
3.3退火
将正义链(SS链)与反义链(AS链)以摩尔比(SS链/AS链＝1/1.05)混合，水浴锅加热至70-95度，保持3-5min，自然冷却至室温，将体系冻干得到产品。
实施例29在C57BL/6小鼠模型中验证本发明化合物的药效长效性
将C57BL/6小鼠(雄性，18～21g,6～8周)进行随机分组，每只动物根据体重计算给药剂量，采用皮下注射方式单次给药，siRNA缀合物以1mg/mL的溶液(0.9％氯化钠水溶液作为溶剂)给药；具体地，在实验前，用0.9％氯化钠水溶液将siRNA缀合物溶解且定容至所需浓度和体积，生理盐水(对照组)和siRNA缀合物的给药体积为5mL/kg。
分别于给药前(记为第0天)，及给药后第7、14、21、28、35、42、56和70天取肝脏10mg放于RNAlaterTM溶液中，-80℃冻存，用于检测肝脏mTTR mRNA。
检测肝脏mTTR mRNA：
按照高通量组织RNA提取试剂盒(凡知医疗，FG0412)的操作方案，使用核酸提取仪(杭州奥盛，Auto-pure96)进行细胞RNA提取；参考PrimeScriptTMII 1st Strand cDNASynthesis Kit(Takara，6210B)反转录；参考TaqManTMFast Advanced Master Mix(ABI，4444965)20μL体系进行荧光定量PCR反应(ABI，QuantStudio3)检测，引物见表1。
表1：引物信息
数据统计和分析
计算2-△△Ct值并换算成百分比以得到剩余抑制率；
△△Ct＝[(Ct实验组目的基因-Ct实验组内参)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参)]。
其中目的基因为mTTR，内参为mGAPDH
表2化合物信息
| 化合物信息 | 给药剂量 | |
| 1 | 生理盐水 | / |
| 2 | DR002234 | 1mpk |
| 3 | DR002235 | 1mpk |
| 4 | DR002238 | 1mpk |
| 5 | DR002240 | 1mpk |
| 6 | DR002242 | 1mpk |
| 7 | DR002243 | 1mpk |
| 8 | DR002244 | 1mpk |
| 9 | DR002245 | 1mpk |
| 10 | DR002246 | 1mpk |
| 11 | DR002248 | 1mpk |
| 12 | DR002247 | 1mpk |
| 13 | DR002249 | 1mpk |
| 14 | DR002220 | 1mpk |
表3化合物在C57BL/6小鼠模型的药效长效性实验结果
其中“/”表示未测试。
实施例30在C57BL/6小鼠模型中验证本发明化合物的药效长效性
参考实施例29的实验步骤，验证受试化合物(见表4)在C57BL/6小鼠模型中的药效长效性。每只动物根据体重计算给药剂量，采用皮下注射方式单次给药，siRNA缀合物以1mg/mL的溶液(0.9％氯化钠水溶液作为溶剂)给药，给药剂量为1mpk，在各个时间点取肝脏10mg放于RNAlaterTM溶液中，-80℃冻存，用于检测肝脏mTTR mRNA，实验结果见表5。
表4化合物信息
表5化合物在C57BL/6小鼠模型的药效长效性实验结果
实施例31在C57BL/6小鼠模型中验证本发明化合物的药效长效性
参考实施例29的实验步骤，验证受试化合物(见表6)在C57BL/6小鼠模型中的药效长效性。
每只动物根据体重计算给药剂量，采用皮下注射方式单次给药，siRNA缀合物以1mg/mL的溶液(0.9％氯化钠水溶液作为溶剂)给药，给药剂量为1mpk，在各个时间点眼眶取血后用ELISA试剂盒(Abcam,ab282297)检测血清mTTR蛋白，实验结果见表7。
表6化合物信息
表7化合物在C57BL/6小鼠模型的药效长效性实验结果
实施例32在HDI小鼠模型中的活性检测(APOC3)
1.HDI动物造模
使用尾静脉高压注射的方法，将六至八周龄雌性Balb/c小鼠用双基因稳定转染系统进行体内转染造模，经由尾静脉，在5-7秒内通过27规格针头将含有不同质量比例的靶标基因cDNA序列的Piggy-Bac转座子质粒和辅助质粒的Delivery Solution(总体积为10％动物体重，Mirusbio-MIR 5240)注射至小鼠体内，注射后放回笼中观察30min。以造模日为第0天，在造模之后的各个时间点(Day7-Day35)检测SEAP表达水平。
2.检测SEAP表达
试剂盒(Phospha-LightTMSEAP报告基因检测系统，Invitrogen，T1016)标准品按照15mU/mL开始2倍稀释，共7个浓度点。
将CSPD底物按1:20比例与反应缓冲稀释液混合成反应液；
用不含RNase的DNase蒸馏水将5×缓冲稀释液稀释到1×缓冲稀释液；
在离心管中将血清与1×缓冲稀释液混合成样本稀释液，将样本稀释液在65℃孵育30min，然后冷却至室温；
将50μL样本稀释液加入96孔板中，然后每孔加入50μL分析缓冲液，室温孵育5min；
每孔加入50μL反应液，室温孵育20min，在酶标仪(Tecan，Infinite 200)上读取SEAP化学发光值。
3.活性检测
选择质量比为1:1的Piggy-Bac辅助质粒和Piggy-Bac转座子重组质粒，质粒总量50ug造模。造模后在第15天，根据表10，向各小鼠给予单次皮下施用：200μl含有3mg/kg(mpk)Apoc3 RNAi试剂的生理盐水；或200μl不含Apoc3 RNAi试剂的生理盐水用作对照。HDI模型实验筛选结果见表11。
表10小鼠单次皮下施用RNAi试剂剂量
表11RNAi试剂在HDI稳转质粒小鼠模型的实验结果
注：血清SEAP标准化至给药前，给药前定为100％
实施例33在HDI小鼠模型中的活性检测(ANGPTL3)
参考实施例32的实验步骤，本次实验选取六至八周龄雌性Balb/c小鼠进行HDI模型构建和给药检测，选择质量比为1:1的Piggy-Bac辅助质粒和Piggy-Bac转座子重组质粒，质粒总量100ug造模。造模后在第14天，根据表14，向各小鼠给予单次皮下施用：200μl含有1mg/kg(mpk)ANGPTL3RNAi试剂的生理盐水；或200μl不含ANGPTL3 RNAi试剂的生理盐水用作对照。HDI模型实验筛选结果见表15。
表14小鼠单次皮下施用RNAi试剂剂量
| 编号 | 组别 | 给药剂量 |
| 1 | 生理盐水 | / |
| 2 | DR005685 | 1mpk |
| 3 | DR005686 | 1mpk |
| 4 | DR005687 | 1mpk |
表15RNAi试剂在HDI稳转质粒小鼠模型的实验结果
注：血清SEAP标准化至给药前，给药前定为100％
实施例34体内活性检测(PCSK9)
实验动物：40只人源化PCSK9 Tg小鼠，雄性，11-12周。
动物于给药前D-12(即给药前第12天，下同)、D-5通过ELISA测定PCSK9蛋白基线水平，定义该基线水平为100％。
D0经皮下给予待测化合物；3mg/kg，单次给药，详见表19。
表19体内活性筛选的给药详情
分别于给药后D7、D14、D21、D28取全血，于常温静置后，离心获取血清，通过ELISA测定PCSK9蛋白的水平，结果如表20所示。
表20体内活性筛选的结果
/>
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种包含N-乙酰半乳糖胺的配体，其中所述配体包含式(X’)所示的缀合基团：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-C(O)-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
2.权利要求1的配体，其中所述缀合基团如式(I’)所示：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-或-NHC(O)-；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
3.权利要求2的配体，其中所述缀合基团如式(I’-1)、式(I’-2)或式(I’-3)所示：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q为
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-；
R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
4.权利要求5的配体，其中所述缀合基团如式(II’-1)或式(II’-2)所示：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q独立地为
其中L1为-CH2O-或-CH2O-CH2CH2O-；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-NHC(O)-；
L’为化学键或-C(O)NH-；
R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
5.权利要求2的配体，其中所述缀合基团如式(II’-3)所示：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q1为 优选/>其中L1为-CH2-；
Q2为其中L1为-C(O)-；
L3为-NHCH2CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-；
c＝1、2或3；
L为-NHC(O)-；
R’为H；
n＝6、7、8、9或10，优选7、8或9，更优选8。
6.权利要求1的配体，其中：
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
7.权利要求6的配体，其中，
T为-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-，其中M为
8.权利要求1的配体，其中所述缀合基团如式(III’-1)、式(III’-2)或式(III’-3)所示：
其中，
Q为
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-CH2O-；
其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如权利要求6或7所定义。
9.权利要求1的配体，其中所述缀合基团如式(IV’-1)或式(IV’-2)所示：
其中，
Q独立地为
其中L1为-CH2-、-CH2O-或-C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-NHC(O)-；
L’为化学键；
其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如权利要求6或7所定义。
10.权利要求1的配体，其中所述缀合基团如式(II’-3)所示：
其中，
表示与生物分子连接的位置；
Q1为 优选/>其中L1为-CH2-；
Q2为 优选/>其中L1为化学键；
L3为-NHCH2CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-；
c＝1、2或3；
L为-NHC(O)-；
R’为H；
n＝6、7、8、9或10，优选7、8或9，更优选8。
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