TW202123973A - 用於肝臟遞送之GalNAc-寡核苷酸結合物及製造方法 - Google Patents

用於肝臟遞送之GalNAc-寡核苷酸結合物及製造方法 Download PDF

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Abstract

本發明係提供一種具有被期待於肝實質細胞中有藥理效果的核酸序列的寡核苷酸與2分支GalNAc單元的結合物或其製藥上可容許的鹽、含有其作為有效成分的醫藥等。

Description

用於肝臟遞送之GalNAc-寡核苷酸結合物及製造方法
本發明係關於2分支型N-乙醯基-D-半乳胺糖(N-Acetyl-D-galactosamine)(GalNAc)配位體-寡核苷酸結合物、及該結合物之製造方法。
已報告藉由共價鍵與作為能與去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor)(ASGPR)結合的配位體之N-乙醯基-D-半乳胺糖(GalNAc)等結合的核酸醫藥(反義(antisense)、siRNA等)之結合物，遞送寡核苷酸至肝臓之肝實質細胞的方法(非專利文獻1及專利文獻1～9)。在1個寡核苷酸結合有1至3個之GalNAc。又，就結合了2個GalNAc的例子而言，於非專利文獻2中有記載。
於寡核苷酸固相合成後之純化步驟中使用逆相HPLC的情形，於固相合成步驟中所生成的鏈長短的寡聚物之保持時間大多與目的之寡聚物之保持時間接近的情形，以大規模獲得高純度純化品係非常困難。於寡核苷酸之固相合成，通常因使用核苷之5’-羥基經4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保護的核酸單元而位於合成的寡核苷酸之5’末端的核苷之5’-羥基成為具有DMTr基。利用此DMTr基之高疏水性的逆相管柱純化(下文，亦稱為DMTr-on逆相管柱純化。「DMTr-on」係表示使用將DMTr基導入至5’末端的寡核苷酸)、及利用DMTr-on的離子交換管柱純化(下文，亦稱為DMTr-on離子交換管柱純化)之例記載於非專利文獻3及4。然而，通常GalNAc單元因於寡核苷酸之5’末端的羥基上將DMTr基脫保護而導入，合成的結合物未保有DMTr基。因此，與未接合GalNAc單元的寡核苷酸之分離・純化上必須要以需勞力及時間的HPLC進行純化(非專利文獻5)。迄今，尚未報告對GalNAc單元與寡核苷酸之結合物，活用DMTr-on逆相管柱純化、或DMTr-on離子交換管柱純化方法的例子。
如此，正冀望可有效率地遞送寡核苷酸至肝實質細胞，且具有由大量製造的面向來看亦為有利的結構的GalNAc單元、及其GalNAc單元與有疾病之治療效果的寡核苷酸之結合物之開發、及其有效率的製造方法。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2009/073809號 [專利文獻2]國際公開第2014/076196號 [專利文獻3]國際公開第2014/179620號 [專利文獻4]國際公開第2015/006740號 [專利文獻5]國際公開第2015/105083號 [專利文獻6]國際公開第2016/055601號 [專利文獻7]國際公開第2017/023817號 [專利文獻8]國際公開第2017/084987號 [專利文獻9]國際公開第2017/131236號 [非專利文獻]
[非專利文獻1] Methods in Enzymology、1999年、313卷、297～321頁 [非專利文獻2] Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 26 (2016) 3690-3693 [非專利文獻3] AKTAdesign Purification - User Manual 18-1124-23 Edition AD [非專利文獻4] Organic Process Research & Development 2005, 9, 212-215 [非專利文獻5] Molecules 2017, 22, 1356.
[發明之概要] [發明欲解決之課題]
於利用GalNAc單元而將合成核酸遞送至肝臓的研究中歷來使用的連接子係著重於配位體部位遠離核酸，並採用於非常長的骨架中的長直鏈烷基或具有環結構的結構，更於許多情形具有3分支以上的複雜結構。然而，於發明人等之研究新發現將採用此種歷來型之長鏈烷基連接子的結合物濃縮的結果，於高濃度溶液中有微胞形成，適當的用量調製為困難之課題。又，於歷來之方法，並未確立結合有GalNAc單元的寡核苷酸之管柱分離之方法，大量製造為困難。 [用以解決課題之手段]
本發明人等，為了解決上述課題，而不斷深入研究的結果發現，具有本發明之連接子結構的2分支GalNAc單元與寡核苷酸之結合物，保持對肝實質細胞的有效率的遞送能力，同時即使於高用量之溶液中亦顯示良好的溶解性。再者，發現與於GalNAc之6位羥基上具有高疏水性的保護基(例如，4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr))的GalNAc單元結合的寡核苷酸，可藉由疏水性樹脂管柱而以更良好效率進行純化，遂而完成本發明。據此，可期待該結合物之大量規模的離子交換管柱純化、或DMTr-on逆相管柱純化變得容易。
本發明之要點係如以下。 (A1)一種結合物或其製藥上可容許的鹽，其係具有被期待於肝實質細胞中有藥理效果的核酸序列的寡核苷酸與2分支GalNAc單元之結合物，其特徵為：於寡核苷酸之5’末端或3’末端，結合有下述式之2分支GalNAc單元，並於活體內被特異性遞送至肝實質細胞，
Figure 02_image001
[式中，W表示下式
Figure 02_image003
G表示5-乙醯胺-2-羥基甲基-3,4-二羥基四氫哌喃-6-基(GalNAc)，Z表示氧原子或硫原子，L1 及L2 係一者表示亞甲基(CH2 )，另一者表示未插入原子，o、q、r、及s各自獨立地表示0或1，n表示1～15之整數，m表示0～5之整數，v表示1～7。惟，n為1時，m為0～5之整數，n為2～15之整數時，m為0]。
(A2)如(A1)記載之結合物或其製藥上可容許的鹽，其中2分支GalNAc單元之式中o及q為0。
(A3)如(A1)或(A2)之結合物或其製藥上可容許的鹽，其中2分支GalNAc單元與寡核苷酸之5’末端結合。
(A4)如(A1)記載之結合物或其製藥上可容許的鹽，其中2分支GalNAc單元為以下之任一式所表示的基：
Figure 02_image005
Figure 02_image007
Figure 02_image009
Figure 02_image011
Figure 02_image013
。
(A5)一種醫藥，其包含(A1)～(A4)之任一者之結合物或其製藥上可容許的鹽。
又，本發明提供以下之製造方法及包含作為該製造方法之中間體使用的疏水性保護基加成型GalNac單元的化合物、結合物等。
(B1)一種寡核苷酸與GalNAc單元之結合物之製造方法，其包含以下之步驟： a：合成於寡核苷酸之5’末端或3’末端結合有包含下述式所表示的疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構的步驟，
Figure 02_image015
[式中，Ra 、Rb 及Rc 之中至少一者為疏水性保護基，其它者為氫原子或於游離條件下被去除的保護基；X1 及X2 各自獨立表示連接子結構，X1 與X2 之間可為分支；t為連接子結構中之分支鏈數，1～10之整數；Y表示透過磷酸基或硫代磷酸基而與寡核苷酸結合的結合肢]； b：將包含步驟a之產物的溶液通液於填充具有經由疏水性相互作用所致的吸附性的樹脂的管柱，並將該水性洗淨液通液於該管柱的步驟；及 c：使寡核苷酸自步驟b後之管柱溶析的步驟。
(B2)如(B1)之製造方法，其中疏水性保護基為於鹼性條件或酸性條件下被去除的保護基，適合地為於酸性條件下被去除的疏水性保護基，更適合地為可經取代的三苯甲基或可經取代的矽基。
(B3)如(B1)之製造方法，其特徵為包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構為與位於寡核苷酸之5’末端的核苷之5位羥基結合。
(B4)如(B1)之製造方法，其特徵為於包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構中，Ra 為疏水性保護基，Rb 及Rc 為氫原子，t為1～3之整數。
(B5)如(B1)之製造方法，其特徵為具有經由疏水性相互作用所致的吸附性的樹脂為選自苯乙烯-二乙烯基苯系吸附樹脂、苯乙烯-二乙烯基苯系修飾型吸附樹脂、甲基丙烯酸系吸附樹脂、及酚系吸附樹脂之任一者。
(B6)如(B1)之製造方法，其中填充了具有經由疏水性相互作用所致的吸附性的樹脂的管柱為離子交換管柱或逆相管柱。
(B7)如(B1)之製造方法，其特徵為步驟a包含以下之步驟， a1：使用可於3’末端至5’末端方向伸長寡核苷酸的支持體，重複位於5’末端的核苷之5’-羥基之保護基的脫保護、核苷之縮合而使寡核苷酸鏈伸長，於支持體上合成所冀望之寡核苷酸的步驟；此處，使用的核苷之5’-羥基之保護基以外的保護基，係選擇於寡核苷酸3’末端與支持體之結合的切斷條件下(以下，「游離條件」)經脫保護的保護基，就相同核苷之5’-羥基的保護基而言，選擇於游離條件下未經脫保護的保護基； a2：於位於支持體上所合成的寡核苷酸之5’末端的核苷之5’-羥基導入疏水性保護基加成型GalNAc單元的步驟：此處，疏水性保護基係選擇於游離條件下未經脫保護者；及 a3：將於步驟a2所獲得的支持體，以游離條件之溶液進行處理，而獲得疏水性保護基加成型GalNAc單元與寡核苷酸之結合物的溶液的步驟。
(B8)如(B1)之製造方法，其特徵為步驟b之後，對吸附於管柱的結合物施加疏水性保護基之脫保護，之後進行步驟c。
(B9)如(B1)之製造方法，其中游離條件為鹼性，疏水性保護基為於酸性下被去除的保護基。
(B10)如(B1)之製造方法，其中包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構為以下之式
Figure 02_image017
(式中，R1 表示於酸性條件下被去除的疏水性保護基，X表示連接子結構，Y表示透過磷酸基或硫代磷酸基而與寡核苷酸結合的結合肢。以下，於同一項中相同。)
Figure 02_image019
Figure 02_image021
Figure 02_image023
Figure 02_image025
Figure 02_image027
Figure 02_image029
Figure 02_image031
Figure 02_image033
Figure 02_image035
Figure 02_image037
之任一者所表示的(B1)之製造方法。
(B11)一種以下之式所表示的化合物或其鹽，
Figure 02_image015
[式中，Ra 、Rb 及Rc 之中至少一者為疏水性保護基，其餘為於游離條件下被去除的保護基。X1 及X2 各自獨立表示連接子結構，X1 與X2 之間可為分支。t為連接子結構中之分支數，為1～10之整數。Y為亞磷醯胺基(phosphoramidite) (適合地為-P(OCH2 CH2 CN)N(CH(CH3 )2 )2 或-P(OCH3 )N (CH(CH3 )2 )2 所表示的基)或H-膦酸酯基(H-phosphonate)( -PH(＝O)(OH))]。
(B12)如(B11)之化合物或其鹽，其中Ra 為於酸性條件下被去除的疏水性保護基，Rb 及Rc 為乙醯基，Y為亞磷醯胺基或H-膦酸酯基，t為1～3之整數。
(B13)以下之式
Figure 02_image040
[式中，R1 為於酸性條件下被去除的疏水性保護基，Y表示亞磷醯胺基或H-膦酸酯基。以下於同一項中相同。]
Figure 02_image042
Figure 02_image044
Figure 02_image046
Figure 02_image048
之任一者所表示的(B11)或(B12)之化合物或其鹽。
(B14)以下之式
Figure 02_image050
[式中，R1 表示於酸性條件下被去除的疏水性保護基，X表示連接子結構，Y表示亞磷醯胺基或H-膦酸酯基。以下，於同一項中相同。]
Figure 02_image052
Figure 02_image054
Figure 02_image056
Figure 02_image058
Figure 02_image060
之任一者所表示的(B11)或(B12)之化合物或其鹽。
(B15)如(B11)～(B14)之任一者之化合物或其鹽，其中疏水性保護基為可經取代的三苯甲基，亞磷醯胺基為-P(OCH2 CH2 CN)N(CH(CH3 )2 )2 、或-P(OCH3 )N(CH(CH3 )2 )2 。
(B16)一種結合物或其鹽，其係於寡核苷酸之5’末端或3’末端結合有包含下述式所表示的疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構而成的結合物或其鹽，
Figure 02_image015
[式中，Ra 、Rb 及Rc 之中至少一者為疏水性保護基，其它者為氫原子或於游離條件下被去除的保護基。X1 及X2 各自獨立表示連接子結構，X1 與X2 之間可為分支。t為連接子結構中之分支鏈數，為1～10之整數。Y表示透過磷酸基或硫代磷酸基而與寡核苷酸結合的結合肢]。
(B17)如(B16)之結合物或其鹽，其中包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構為以下之式
Figure 02_image029
[式中，R1 表示於酸性條件下被去除的疏水性保護基，Y表示透過磷酸基或硫代磷酸基而與寡核苷酸結合的結合肢。以下，於同一項中相同。]
Figure 02_image031
Figure 02_image033
Figure 02_image035
Figure 02_image037
之任一者所表示。
(B18)如(B16)之結合物或其鹽，其中包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構為以下之式
Figure 02_image017
[式中，R1 表示於酸性條件下被去除的疏水性保護基，X表示連接子結構，Y表示透過磷酸基或硫代磷酸基而與寡核苷酸結合的結合肢。以下，於同一項中相同。]
Figure 02_image019
Figure 02_image021
Figure 02_image023
Figure 02_image025
Figure 02_image027
之任一者所表示。
(B19)如(B16)～(B18)之任一者之結合物或其鹽，其中疏水性保護基為可經取代的三苯甲基，Y為透過磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵而與位於寡核苷酸之5’末端的核苷之5’-羥基結合的結合肢。 [發明之效果]
本發明之結合物對於各種寡核苷酸，實現了對肝臓的適當遞送、及高水溶性。又，藉由確立GalNAc單元與寡核苷酸之結合物的DMTr-on管柱純化方法，可以大規模進行製造。據此，能夠增加用以提高藥理效果的用量或調製用以適用於長期間持續製劑之高濃度藥液，而可設計因應於各種需求的核酸醫藥之製品。
[用以實施發明的形態]
以下，對於本發明之實施形態進行更詳細地說明。 於本說明書，「結合物」係意指GalNAc單元與寡核苷酸之5’末端及/或3’末端結合的化合物。
於本說明書，「GalNAc單元」係意指包含可與肝臓之肝實質細胞上的去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)結合的N-乙醯基-D-半乳胺糖(GalNAc)的部分結構。GalNAc單元中包含用以結合直鏈或分支的連接子結構與寡核苷酸之磷酸基或硫代磷酸基。有將包含一個用於此種結合之磷酸基或硫代磷酸基的結構單元稱為「GalNAc單元」的情形。於一個GalNac單元中所含的GalNac之數並無限制，只要未特別明示，可採用周知者及本說明書所揭示者等。只要維持對ASGPR的結合能力即可，GalNAc之結構可經修飾。又，於製造過程亦包含於GalNAc導入保護基者等。 於本說明書，2分支GalNAc單元，只要未特別言及，意指上述(A1)之式所表示的GalNAc單元。
於本說明書，「寡核苷酸」係指1股鏈長為100個鹼基以下之可合成的核酸，可為單股，亦可為雙股。採用的核酸係如後述，可因應目的而分別使用DNA、RNA、天然核酸、修飾核酸等，1股之寡核苷酸中可混存此等。
於本說明書，「游離條件」係意指於寡核苷酸之合成過程，將支持體與寡核苷酸之結合切斷，使寡核苷酸自支持體游離出之際所採用的處理條件。一般的固相合成中的游離條件為鹼性。
於本說明書，「疏水性保護基」係指可利用作為羥基之保護基，具有高疏水性的結構，且以游離條件未被去除的保護基。例如，游離條件為鹼性的情形，於酸性條件下被去除的保護基為較佳，游離條件為酸性的情形，於鹼性被去除的保護基為較佳。
於本說明書，「亞磷醯胺基(phosphoramidite)」係指-P(OR)N(CH(CH3 )2 )2 (此處，R為C1-C3烷基或氰基-C1-C3伸烷基)所表示的核酸合成中的Amidite試藥所採用的官能基。適合地可列舉-P(OCH2 CH2 CN)N(CH(CH3 )2 )2 、-P (OCH3 )N(CH(CH3 )2 )2 等，但未限定於此等。
於本說明書，「H-膦酸酯基(H-)」係指-PH(＝O) (OH)或其鹽所表示的核酸合成所採用的官能基。具有H-膦酸酯基的化合物能對-PH(＝O)(O- )形成鹽。就此種鹽而言，可列舉如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽的鹼金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽的鹼土金屬鹽；鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等的金屬鹽；如銨鹽的無機鹽；如三級辛基胺鹽、二苄胺鹽、
Figure 109130882-A0304-12-0020-6
啉基鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺(N-methylglucamine)鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、氯普魯卡因(chloroprocaine)鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙基胺鹽、哌
Figure 109130882-A0304-12-0000-4
鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽的有機鹽等的胺鹽；如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽的氫鹵酸鹽；硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等的無機酸鹽；如甲烷磺酸鹽、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽的低級鏈烷磺酸鹽；如苯磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽的芳基磺酸鹽；乙酸鹽、蘋果酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等的有機酸鹽；如甘胺酸鹽、離胺鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天門冬酸鹽的胺基酸鹽等，較佳為有機鹽，更佳為三乙基胺鹽。此等之鹽可以周知方法製造。
於本說明書，關於核苷酸彼此之鍵結或核苷酸與結合物之結構，「透過磷酸基的鍵結」、「包含磷酸基的結構」等的用語係意指2個結構單元為磷酸二酯鍵或其修飾形(例如，硫代磷酸酯(phosphorothioate)鍵)等之以於核酸合成中一般所使用的鍵結樣式的鍵結，包含此種結合樣式的結構。
＜1.寡核苷酸＞ 於本說明書，所謂「核酸」、「寡核苷酸」或「核苷酸」的用語，係指至少二個之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以單股、雙股或三股任一形式含有的聚合物。
除非另有特別指示，否則具體的核酸序列亦包含隱含其保存修飾的變異物(例如簡併性密碼子(degenerate codon)取代物)、對偶基因、異種同源物(ortholog)、SNP及互補的序列、以及明示指示的序列。
1-1.核酸之種類 本發明之核酸亦可包含所屬技術領域中具通常知識者已知的任一形態。就此種核酸形態之具體例而言，可列舉單股DNA、單股RNA、DNA與RNA混合的單股寡核苷酸。就其他形態之核酸之具體例而言，可列舉包含雙股DNA、雙股RNA、DNA-RNA之雜合多核苷酸、DNA與RNA混合的2種之寡核苷酸的雙股多核苷酸。
構成本發明之核酸的核苷或核苷酸除天然型之外，亦包含經化學修飾的修飾核苷或修飾核苷酸。就修飾核苷/核苷酸而言，可列舉例如，糖修飾核苷/核苷酸、核酸鹼基修飾核苷/核苷酸、骨格修飾核苷/核苷酸、或彼等之組合(例如，參照Nucleic Acid Research, 1997, Vol.25, No.22, 4429-4443)。
於本說明書，「天然型之核苷」係指2’-去氧腺苷、2’-去氧鳥苷、2’-去氧胞苷、2’-去氧-5-甲基胞苷、胸苷等之2’-去氧核苷、腺苷、鳥苷、胞苷、5-甲基胞苷、尿苷等之核糖核苷。又，「寡核苷酸」係指由核苷之糖部分與磷酸形成酯的化合物所構成的寡核苷酸。於本說明書，寡核苷酸與多核苷酸係以相同意義使用。
於本說明書，將2’-去氧腺苷表示為At ，將2’-去氧鳥苷表示為Gt ，將2’-去氧胞苷表示為Ct ，將2’-去氧-5-甲基胞苷表示為5meCt ，將胸苷表示為Tt ，將2’-去氧尿苷表示為Ut ，將腺苷表示為Art ，將鳥苷表示為Grt ，將胞苷表示為Crt ，將5-甲基胞苷表示為5meCrt ，將尿苷表示為Urt 。又，於本說明書中，亦有時將2’-去氧腺苷核苷酸表示為Ap ，將2’-去氧鳥苷核苷酸表示為Gp ，將2’-去氧胞苷核苷酸表示為Cp ，將2’-去氧-5-甲基胞苷核苷酸表示為5meCp ，將胸苷核苷酸表示為Tp ，將2’-去氧尿苷核苷酸表示為Up ，將腺苷核苷酸表示為Arp ，將鳥苷核苷酸表示為Grp ，將胞苷核苷酸表示為Crp ，將5-甲基胞苷核苷酸表示為5meCrp ，將尿嘧啶核苷酸表示為Urp 。
於本說明書，關於硫代磷酸酯之酯替換核苷酸之磷酸酯而成的硫代磷酸酯之酯，亦有時將對應Ap 者表示為As ，對應Gp 者表示為Gs ，對應Cp 者表示為Cs ，對應5meCp 者表示為5meCs ，對應Tp 者表示為Ts ，對應Up 者表示為Us ，對應Arp 者表示為Ars ，對應Grp 者表示為Grs ，對應Crp 者表示為Crs ，對應5meCrp 者表示為5meCrs ，對應Urp 者表示為Urs 。
本說明書中的「糖修飾核苷」係指核苷之糖部分經修飾的核苷。就糖修飾核苷而言，可列舉例如，2’-O-甲基核苷、2’-O,4’-C-伸乙基核苷(ENA)、2’-O,4’-C-亞甲基核苷酸(BNA/LNA)。
其中，就2’-O-甲基修飾之例而言，有2’-O-甲基核苷及2’-O-甲基核苷酸，作為對應Art 者，表示為Am1t ，作為對應Grt 者表示為Gm1t ，作為對應Crt 者表示為Cm1t ，作為對應5meCrt 者表示為5meCm1t ，作為對應Urt 者表示為Um1t ，作為對應Arp 者表示為Am1p ，作為對應Grp 者表示為Gm1p ，作為對應Crp 者表示為Cm1p ，作為對應5meCrp 者表示為5meCm1p ，作為對應Urp 者表示為Um1p ，作為對應Ars 者表示為Am1s ，作為對應Grs 者表示為Gm1s ，作為對應Crs 者表示為Cm1s ，作為對應5meCs 者表示為5meCm1s ，作為對應Urs 者表示為Um1s 。
於本說明書附隨的序列表，各序列之＜223＞之項目中，「cm」表示2’-O-甲基胞苷(2’-O-Methylcytidine)，「um」表示2’-O-甲基尿苷(2’-O-Methyluridine)，「gm」表示2’-O-甲基鳥苷(2’-O-Methylguanosine)。
於本說明書，2’-O,4’-C-伸乙基核苷酸單元及「ENA單元」係指於上述之各核苷、各核苷酸，具有ENA者，亦有作為對應At 者之A2t ，作為對應Ap 者之Ae2p ，對於As 為Ae2s ，作為對應Gt 者之G2t ，作為對應Gp 者之Ge2p ，作為對應Gs 者之Ge2s ，作為對應5meCt 者之C2t ，作為對應5meCp 者之Ce2p ，對於5meCs 為Ce2s ，作為對應Tt 者之T2t ，作為對應Tp 者之Te2p ，對Ts 稱為Te2s 之表示具有ENA單元的核苷及核苷酸。
本說明書中2’-O,4’-C-亞甲基核苷酸單元及「2’、4’-BNA/LNA單元」係指於上述之各核苷、各核苷酸具有2’、4’-BNA/LNA者，亦有作為對應At 者之A1t ，作為對應Ap 者之Ae1p ，作為對應As 之Ae1s ，作為對應Gt 之G1t ，作為對應Gp 之Ge1p ，作為對應Gs 之Ge1s ，作為對應5meCt 之C1t ，作為對應5meCp 之Ce1p ，作為對應5meCs 之Ce1s ，作為對應Tt 之T1t ，作為對應Tp 之Te1p ，對於Ts 稱為Te1s 之表示具有2’、4’-BNA/LNA單元的核苷及核苷酸。
1-2.標的基因 於本說明書，「標的基因」係指於導入其之細胞、組織、或個體(以下，有時將其稱為「被導入體」)，只要為RNA則未特別限制，可為被轉譯為蛋白質的mRNA，亦可為未被轉譯為蛋白質的非編碼RNA。就非編碼RNA而言，為機能性RNA，可列舉例如，mRNA之非轉譯區域、tRNA、rRNA、mRNA型ncRNA(mRNA樣非編碼 RNA)、長鏈ncRNA(長的非編碼RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(小核仁RNA)、miRNA(微RNA)等。具體而言，可於導入的被導入體中內在性者，亦可為藉由基因導入等之手法而被導入的外來性者。又，可為染色體上存在的基因，亦可為染色體外者。就外來性之基因而言，可列舉例如，可感染被導入體的病毒、細菌、真菌或源自原生動物者，但未被限定於此等。關於基因之機能，可為已知者，亦可為未知者。
就此種標的基因之例而言，可列舉於具有肝臓中的特定疾病的患者中特異性地於肝臓表現上升及/或特異性地變異的基因。就疾病而言，可列舉例如，循環器官疾病(例如，高血壓症、心肥大、心絞痛、動脈硬化症、高膽固醇血症等)、癌(例如，肝臓癌等)、呼吸器疾病(例如，肺炎、支氣管炎、氣喘、慢性閉塞性肺疾病、肺硬化等)、糖尿病、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、貧血(例如，伴隨慢性疾病的貧血、對鐵劑不反應的缺鐵性貧血(iron refractory iron deficiency anemia)等)、老化性黃斑變性症、免疫系統疾病(例如，自體免疫疾病、免疫不全、白血病等)、肝臓・膽囊疾病(例如，非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝炎、肝衰竭、膽汁鬱積症、結石等)、消化道疾病(例如，潰瘍、腸炎、吸收不良等)、感染症、肥胖、纖維化(例如，肝纖維化等)。
就此等疾病之原因基因而言，可列舉例如，紡錘體驅動蛋白(kinesin spindle protein(KSP))、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor(VEGF))、轉甲狀腺素蛋白(transthyretin(TTR))、前蛋白轉化酶枯草溶菌素/kexin 9型(proprotein convertase subtilisn/kexin type 9(PCSK9))、polo樣激酶1(polo-like kinase 1(PLK-1))、ApoB-100、核糖核苷酸還原酶M2 次單元(ribonucleotide reductase M2 subunit(RRM2))、叢生蛋白(clusterin)、熱休克蛋白27(heat shock protein 27(Hsp27))、存活蛋白(survivin)、真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor-4E(eIF-4E))、介白素4受體的α次單元(IL-4R-alpha)、第XI因子、第VII因子、N-ras、H-ras、K-ras、bcl-2、bcl-xL、Her-1、Her-2、Her-3、Her-4、MDR-1、人類β-連環蛋白(Human β-catenin)基因、DDX3(DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)盒多肽 3，X-連接的)、髓樣細胞白血病序列1(Myeloid Cell Leukemia Sequence 1(MCL1))基因、PKR(Eif2ak2)、Hsp47(Serpinh1)、鐵調素(Hepcidin)、活性化蛋白C(APC)、轉錄訊息傳遞及活化子蛋白(signal tranducer and activator of transcription(STAT3))、第I型膠原蛋白α-1(Col1A1)、ApoC-III、血管生成素樣3蛋白(angiopoietin-like 3 protein (ANGPTL3))、生長激素受體(GHr)、前激肽釋放酶(prekallikrein(PKK))、跨膜蛋白酶絲胺酸6(transmembrane protease, serine 6 (TMPRSS6))、脂蛋白(a)、升糖素受體(glucagon receptors)、或甘油二酸酯醯基轉移酶2(diacylglycerol acyltransferase 2(DGAT2))、血管收縮素原(angiotensinogen)、補體因子B(complement factor B (FB))、胺基乙醯丙酸合成酶1(aminolevulinic acid synthase 1 (ALAS1))、抗凝血酶(antithrombin (AT))、第1型原發型高草酸鹽尿症(Primary Hyperoxaluria Type 1 (PH1))、補體之C5補體、α1-抗胰蛋白酶(alpha-1 antitrypsin (AAT))、B型肝炎病毒(HBV)基因體，但未限定於此等。
1-3.雙股寡核苷酸 於本發明之核酸為對標的基因具有RNA干擾作用的核酸的情形，只要核酸具有RNA干擾作用，對其結構及化學修飾則無限制，可列舉例如，siRNA(例如，參照WO2002/044321、Current Opinion in Chemical Biology 570-579)、由RNA與2’-OMeRNA交互結合的寡核苷酸而成的AtuRNAi(例如參照WO2004/015107)、於以下之3-4-1項目中說明的DNA與2’-OMeRNA交互結合的寡核苷酸中正義(sense)鏈與反義(antisense)鏈為不同種類之核酸以Watson-Crick鹼基對形成雙股的雙股寡核苷酸(例如，參照WO2010/001909)、於以下之3-4-2項中說明的寡核苷酸之末端為經修飾的核酸(例如，參照WO2010/052715)、及於以下之3-4-3項中說明的反義鏈多核苷酸之5’末端與正義鏈寡核苷酸之3’末端的各自透過連接子結合而成為單股，進而於分子內形成Watson-Crick鹼基對而具有雙股結構的單股寡核苷酸(例如，參照WO2012/074038)等。
於本說明書中，「包含與標的基因相同的核苷酸序列而成」係指包含與標的基因之至少一部分的核苷酸序列相同的序列，除了完全相同的序列之外，只要於對標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，亦包含實質上相同的序列。「包含與標的基因互補的核苷酸序列」係指包含與標的基因之至少一部分之核苷酸序列互補的序列，除了完全互補的序列之外，只要對標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，亦包含實質上相同的序列。又，於標的基因已知SNPs等的情形，具有彼等之變異的序列亦包含於相同之核苷酸序列。於本說明書中，將包含與標的基因互補的核苷酸序列且對標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用的多核苷酸稱為針對標的基因的寡核苷酸。
本發明之核酸之核苷酸序列只要具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，則未特別限制，例如，藉由使用電腦軟體(例如，GENETYX(註冊商標)：GENETYX COORPORATION製等)而基於預測具有針對標的基因的RNA干擾作用的序列而決定正義鏈及反義鏈之序列，亦可進一步基於選擇的序列而確認製作的寡核苷酸之RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，藉此決定。
具有RNA干擾作用的雙股寡核苷酸之正義鏈及反義鏈的鏈長，只要具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用即可，由10個核苷酸至標的基因之開讀框(ORF)之全長為止的任一長度，較佳為18個核苷酸至標的基因之開讀框(ORF)之全長為止的任一長度，更佳為10至100個核苷酸，進一步較佳為15～30個核苷酸。
就具有RNA干擾作用的雙股寡核苷酸而言，使用於DNA與2’-OMeRNA交互結合的寡核苷酸中正義鏈與反義鏈為不同種類之核酸進行Watson-Crick結合的雙股寡核苷酸(WO2010/001909)的情形，就正義鏈而言，18～21個之鏈長者為較佳，18～19個之鏈長者為更佳。就反義鏈而言，19～21個之鏈長者為較佳，21個鏈長者為更佳。又不需要其全體為雙股結構，亦包含5’及/或3’末端為一部分突出者，該突出末端為1～5個核苷酸，較佳為1～3個核苷酸，進一步較佳為2個核苷酸。又，就最佳例而言，可列舉反義鏈之寡核苷酸的3’末端具有2個核苷酸突出(外伸(overhang)結構)結構，並形成18個鹼基對的多核苷酸。
1-3-1.DNA與2’-OMeRNA交互結合的寡核苷酸 就本發明之核酸脂質粒子所含的核酸之一例而言，可列舉於DNA與2’-OMeRNA交互結合的寡核苷酸中正義鏈與反義鏈為以不同的種類的核酸進行Watson-Crick結合的雙股寡核苷酸。
就如此雙股寡核苷酸之具體例而言，可列舉例如，WO2010/001909等記載的雙股寡核苷酸。
1-3-2.修飾雙股寡核苷酸 於使用作為含於核酸脂質粒子的核酸之具有RNA干擾作用的核酸的情形，於只要具有RNA干擾作用方面，寡核苷酸之末端為經修飾的核酸亦可作為其例而列舉。例如，於siRNA、AtuRNAi、DNA與2’-OMeRNA交互結合的寡核苷酸中，以正義鏈與反義鏈為不同種類的核酸進行Watson-Crick結合的雙股寡核苷酸(例如，參照WO2010/001909)等之具有RNA干擾作用的雙股寡核苷酸，可列舉反義鏈之5’末端的磷酸基經5’芳基磷酸基修飾的雙股寡核苷酸(例如，參照WO2010/ 052715)。
就如此修飾雙股寡核苷酸之具體例而言，可列舉例如，WO2010/052715、WO2015/005253記載的修飾雙股寡核苷酸。
1-4.單股寡核苷酸 1-4-1.RNA干擾單股核苷酸 就於本發明使用的核酸而言，對於只要具有RNA干擾作用，為具有針對標的基因的正義鏈寡核苷酸、及具有與該正義鏈寡核苷酸互補的鹼基序列的反義鏈寡核苷酸的寡核苷酸，亦包含各自於該反義鏈寡核苷酸之5’末端與該正義鏈寡核苷酸之3’末端，具有藉由形成磷酸二酯結構的連接子而結合的單股結構的寡核苷酸(例如，參照WO2012/074038)。
就此種化合物之具體例而言，可列舉例如，WO2012/074038、WO2015/005253記載者。
1-4-2.反義核苷酸 反義核苷酸，於適用於目的為於起因於基因變異的疾病之治療中，藉由正常化或抑制該變異基因的表現而可治療的疾病之治療。抑制基因表現的情形，使用具有對標的基因之mRNA的一部分為互補的序列，該序列之約中間的核酸為DNA的核苷酸。如此表現抑制用反義核苷酸，與標的基因之mRNA形成雙股。形成的雙股體中之RNA/DNA雙股結構，因藉由活體內的RNaseH而特異性被分解，標的基因之mRNA被特異性的破壞，其結果抑制標的基因的表現。
就以基因表現正常化為目的之反義核苷酸而言，有抑制異常剪接者、將基因上的變異處回復為正常序列者等。使基因上的變異回復為正常序列的情形，於反義核苷酸之3‘側，具有針對標的基因之正義鏈中的變異處的5‘側區域的反義序列，於該5‘側具有構成核酸酶會合的髮夾結構(2處之彼此互補的序列藉由中間之連接子/環序列連接的序列)的序列。藉由此種核苷酸，3’側之反義區域產生引導RNA作用而將核酸酶導入至標的基因(mRNA或基因體DNA的正義鏈)之變異處。此現象與已知為CRISPR-Cas系統的基因體編集技術類似，可使用於各式各樣的基因編集係廣為人知。
由於基因變異而有異常剪接發生的機制，由pre-mRNA至成熟mRNA的剪接過程，經由變異，於正常的pre-mRNA未結合的處所，剪接因子會錯誤辨識，藉由結合，藉由接受異常剪接的mRNA表現，於由標的基因表現的蛋白質發生機能不良或表現不良。於此變異pre-mRNA上的剪接因子錯誤辨識的區域有反義核苷酸結合時，剪接因子無法辨識該區域，異常的剪接被抑制。就起因於此種基因變異所致的異常剪接的疾病而言，可列舉下述詳述的抑制肝醣儲積症1a型之起因於G6PC基因中的c.648G＞T變異的異常剪接的反義寡核苷酸，其他周知之各式各樣疾病治療用之反義寡核苷酸。
本發明係提供一種寡核苷酸或其製藥上可容許的鹽，其將肝醣儲積症Ia型患者之中具有c.648G＞T變異的G6PC基因於mRNA水平上進行修復，可使正常G6PC蛋白質表現。本發明之寡核苷酸為由與具有c.648G＞T變異的G6PC基因之cDNA互補的核苷酸序列而成的鹼基數15～30之寡核苷酸，由與包含具有c.648G＞T變異的G6PC基因之外顯子5之5’末端起第82號至92號之任一者的部位的區域互補的序列而成。
於本發明，肝醣儲積症Ia型患者之中，可以具有c.648G＞T變異的患者為對象。不僅能以c.648G＞T變異之同型接合的患者為對象，亦能以c.648G＞T變異與其他之變異的複合異型接合的患者為對象。
G6PC基因之c.648G＞T變異係智人葡萄糖-6-磷酸酶催化性次單元(Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit ，G6PC)，轉錄變體1(transcript variant 1)，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之G至T的變異。位於外顯子5之自5’末端的第86號。本發明之寡核苷酸係由與包含具有c.648G＞T變異的G6PC基因之外顯子5之自5’末端起第86號至第92號之任一部位的區域互補的序列而成為宜，由與包含第92號的部位的區域互補的序列而成者為較佳。
由與具有c.648G＞T變異的G6PC基因之cDNA互補的核苷酸序列而成的鹼基數15～30之寡核苷酸，作為由與包含具有c.648G＞T變異的G6PC基因之外顯子5之5’末端起第82號至第92號之任一部位的區域互補的序列而成的前述寡核苷酸，可例示包含序列識別號1～32、40～42、44～48之任一序列(惟，序列中之t或T可為u或U，u或U可為t或T)之全部或一部分者。於本發明，「序列之一部分」係指通常該序列全體之80%以上，適合地為85%，更適合地為90%，最適合地為94%。本發明之寡核苷酸之鹼基數係15～30為適當，15～21為較佳，15～18為更佳。
構成本發明之寡核苷酸的核苷酸可為天然型DNA、天然型RNA、DNA/RNA之嵌合體、此等之修飾體之任一者，但較佳為至少1個為修飾核苷酸。
就本發明中的修飾核苷酸而言，可例示糖經修飾者(例如，D-核呋喃糖經2’-O-烷基化者、D-核呋喃糖經2’-O, 4’-C-伸烷基化者、D-核呋喃糖經2’-,4’-交聯者)、磷酸二酯鍵經修飾者(例如，硫代酸酯(thioate)化)、鹼基經修飾者、組合彼等者等。構成反義寡核苷酸的至少1個之D-核呋喃糖經2’-O-烷基化者及經2’-O,4’-C-伸烷基化者係對RNA的結合力高，對核酸酶的耐性高，因而可期待較天然型之核苷酸(即，寡DNA、寡RNA)更高的治療效果。又，構成寡核苷酸的至少1個之磷酸二酯鍵經硫化者，對核酸酶的耐性高，因而可期待較天然型之核苷酸(即，寡DNA、寡RNA)更高的治療效果。包含如上述的經修飾的糖與經修飾的磷酸二酯鍵之兩者的寡核苷酸，對核酸酶的耐性更高，因而可期待更高的治療效果。
於本發明之寡核苷酸，就糖之修飾之例而言，可列舉D-核呋喃糖之2’-O-烷基化(例如，2’-O-甲基化、2’-O-胺基乙基化、2’-O-丙基化、2’-O-烯丙基化、2’-O-甲氧基乙基化、2’-O-丁基化、2’-O-戊基化、2’-O-炔丙基化等)、D-核呋喃糖之2’-O,4’-C-伸烷基化(例如，2’-O,4’-C-伸乙基化、2’-O,4’-C-亞甲基化、2’-O,4’-C-伸丙基化、2’-O,4’-C-四亞甲基化、2’-O,4’-C-五亞甲基化等)、D-核呋喃糖之2’-去氧-2’-C,4’-C-亞甲基氧基亞甲基化、S-cEt(2’,4’-受約束乙基(2’,4’-constrained ethyl))、AmNA(醯胺-橋連核酸(Amide-bridged nucleic acid))、3’-去氧-3’-胺基-2’-去氧-D-核呋喃糖、3’-去氧-3’-胺基-2’-去氧-2’-氟-D-核呋喃糖等。
於本發明之寡核苷酸，就糖之2’-,4’-交聯修飾之例而言，可列舉D-核呋喃糖之2’-O,4’-C-伸烷基化(例如，2’-O,4’-C-伸乙基化、2’-O,4’-C-亞甲基化、2’-O,4’-C-伸丙基化、2’-O,4’-C-四亞甲基化、2’-O,4’-C-五亞甲基化等)、D-核呋喃糖之2’-去氧-2’-C,4’-C-亞甲基氧基亞甲基化、S-cEt(2’,4’-受約束乙基)、AmNA等。
於本發明之寡核苷酸，就磷酸二酯鍵之修飾之例而言，可列舉硫代磷酸酯(phosphorothioate)鍵、甲基膦酸酯(methylphosphonate)鍵、甲基硫代膦酸酯鍵、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)鍵、亞磷醯胺(phosphoramidate)鍵等。
於本發明，就鹼基之修飾之例而言，可列舉胞嘧啶之5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化、N4-甲基化、胸腺嘧啶之5-去甲基化(尿嘧啶)、5-氟化、5-溴化、5-碘化、腺嘌呤之N6-甲基化、8-溴化、鳥嘌呤之N2-甲基化、8-溴化等。
本發明之寡核苷酸可使用市售之合成機(例如，PerkinElmer公司之例用亞磷醯胺法(phosphoramidite method)的模型392)等，依據文獻(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))記載之方法而合成。此時所使用的核苷亞磷醯胺試藥，於天然型之核苷及2’-O-甲基核苷(即，2’-O-甲基鳥苷、2’-O-甲基腺苷、2’-O-甲基胞苷、2’-O-甲基尿苷)，可使用市售之試藥。關於烷基之碳數為2～6個之2’-O-烷基鳥苷、腺苷、胞苷及尿苷，係如以下。
2’-O-胺基乙基鳥苷、腺苷、胞苷、尿苷可按照文獻(Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.)而合成。
2’-O-丙基鳥苷、腺苷、胞苷、尿苷可按照文獻(Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.)而合成。
2’-O-烯丙基鳥苷、腺苷、胞苷、尿苷可使用市售之試藥。
2’-O-甲氧基乙基鳥苷、腺苷、胞苷、尿苷可按照專利(US6261840)或文獻(Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.)而合成。
2’-O-丁基鳥苷、腺苷、胞苷、尿苷可按照文獻(Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.)而合成。
2’-O-戊基鳥苷、腺苷、胞苷、尿苷可按照文獻(Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.)而合成。
2’-O-炔丙基鳥苷、腺苷、胞苷、尿苷可使用市售之試藥。
關於2’-O, 4’-C-亞甲基鳥苷、腺苷、胞苷、5-甲基胞苷及胸苷，可按照WO99/14226記載之方法，關於伸烷基之碳數為2～5個之2’-O, 4’-C-伸烷基鳥苷、腺苷、胞苷、5-甲基胞苷及胸苷，可按照WO00/47599記載之方法而製造。
D-核呋喃糖之經2’-去氧-2’-C,4’-C-亞甲基氧基亞甲基化的核苷可按照文獻(Wang,G. et al. Tetrahedron (1999), 55, 7707-7724)而合成。
S-cEt(受約束乙基(constrained ethyl))可按照文獻(Seth,P.P. et al. J.Org.Chem (2010), 75, 1569-1581.)而合成。
AmNA可按照文獻(Yahara,A. et al. ChemBioChem (2012), 13, 2513-2516.)或WO2014/109384而合成。
於本發明，核酸鹼基序列可各自將腺嘌呤記載為(A)或(a)，將鳥嘌呤記載為(G)或(g)，將胞嘧啶記載為(C)或(c)，將胸腺嘧啶記載為(T)或(t)，及將尿嘧啶記載為(U)或(u)。可使用5-甲基胞嘧啶替代胞嘧啶。核酸鹼基中，尿嘧啶(U)或(u)與胸腺嘧啶(T)或(t)有互換性。尿嘧啶(U)或(u)與胸腺嘧啶(T)或(t)之任一者皆可使用於與互補鏈之腺嘌呤(A)或(a)的鹼基對形成。
將核苷亞磷醯胺試藥偶合後，藉由使硫、二硫化四乙基秋蘭姆(tetraethylthiuram disulfide)(TETD、Applied Biosystems公司)、Beaucage試藥(Glen Research公司)、或氫化黃原素(xanthane hydride)等的試藥反應，可合成具有硫代磷酸酯鍵的反義寡核苷酸(Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198)。
就於合成機使用的可控孔度玻璃(Controlled pore glass (CPG))而言，2’-O-甲基核苷之結合者可利用市售者。又，關於2’-O,4’-C-亞甲基鳥苷、腺苷、5-甲基胞苷及胸苷，可按照WO99/14226記載之方法，關於伸烷基之碳數為2～5個之2’-O, 4’-C-伸烷基鳥苷、腺苷、5-甲基胞苷及胸苷，可將按照WO00/47599記載之方法而製造的核苷，按照文獻(Oligonucleotide Synthesis, Edited by M.J.Gait, Oxford University Press, 1984)，與CPG結合。藉由使用經修飾的CPG(記載於日本特開平7-87982之實施例12b)，可合成於3’末端結合有2-羥基乙基磷酸基的寡核苷酸。又，若使用3’-胺基-修飾基C3 CPG、3’-胺基-修飾基C7 CPG、Glyceryl CPG(Glen Research)、3’-間隔基 C3 SynBase CPG 1000、3’-間隔基 C9 SynBase CPG 1000(link technologies)，則可合成於3’末端結合有羥基烷基磷酸基、或胺基烷基磷酸基的寡核苷酸。
＜2.GalNAc單元＞ 於本發明之結合物中，寡核苷酸係GalNAc可經由連接子及磷酸基結合。
本發明中的GalNAc單元係指結合有GalNAc結合的連接子的磷酸基，再者可具有1個結合肢。GalNAc單元之磷酸基可與寡核苷酸之5’末端及/或3’末端結合，適合地為與寡核苷酸之5’末端結合。GalNAc單元具有結合肢的情形，該結合肢可與羥基、GalNAc、GalNAc結合的連接子、其他之GalNAc單元之磷酸基、或寡核苷酸之3’末端之磷酸基結合。就1個GalNAc單元中所含有的GalNAc之數目而言，為2個。
於結合物，可為1個GalNAc單元與寡核苷酸結合，亦可為複數個GalNAc單元連續而結合，並與寡核苷酸結合。就與1個寡核苷酸結合的GalNAc單元之數而言，適合地為1至7個，更適合地為1至5個，特別適合地為1至3個，最適個數為1個。
本發明中，將2個GalNAc單元導入至寡核苷酸之5’末端的情形，將對稱雙倍體亞磷醯胺(Symmetric Doubler Phosphoramidite)(1,3-雙-[5-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)戊醯胺基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(1,3-bis-[5-(4,4’-dimethoxytrityloxy)pentylamido]propyl-2-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)，Glen Research)）等使用於寡核苷酸合成時，將3個GalNAc單元導入寡核苷酸之5’末端的情形，可藉由將三倍體亞磷醯胺(Trebler Phosphoramidite)(參-2,2,2-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基氧甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(Tris-2,2,2-[3-(4,4’-dimethoxytrityloxy) propyloxymethyl] ethyl-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]- phosphoramidite)，Glen Research)、或長三倍體亞磷醯胺(Long Trebler Phosphoramidite)(參-2,2,2-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙氧基甲基]亞甲氧基丙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(Tris-2,2,2-[3-(4,4’-dimethoxytrityloxy)propyloxymethyl]methyleneoxypropyl-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)，Glen Research)等用於寡核苷酸合成時而合成。將4個之GalNAc單元導入至寡核苷酸之5’末端的情形，藉由將對稱雙倍體亞磷醯胺等於寡核苷酸合成時使用2次偶合而可合成。將5個之GalNAc單元導入寡核苷酸之5’末端的情形，藉由將對稱雙倍體亞磷醯胺、及三倍體亞磷醯胺或長三倍體亞磷醯胺，於寡核苷酸合成時使用1次偶合，而可合成。將5個以上之GalNAc單元導入寡核苷酸之5’末端的情形，藉由適當組合對稱雙倍體亞磷醯胺、三倍體亞磷醯胺或長三倍體亞磷醯胺，而可合成。
於本發明，將GalNAc單元導入至寡核苷酸之3’末端的情形，可藉由於寡核苷酸合成時使用非對稱雙倍體(Lev)亞磷醯胺(Asymmetric Doubler (Lev) Phosphoramidite)(1-[5-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)戊醯胺]-3-[5-乙醯丙氧基戊醯胺]-丙基-2-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(1-[5-(4,4’-dimethoxytrityloxy)pentylamido]-3-[5-levulinyloxypentylamido]-propyl-2-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)，Glen Research)等而合成。具體而言，於市售之Unylinker Support(例如，Glen UnySuppor 1000、Glen Research)偶合非對稱雙倍體(Lev)亞磷醯胺，去除DMTr基後，進行目的之寡核苷酸的鏈伸長。達到目的鏈長後，按照非對稱雙倍體(Lev)亞磷醯胺試藥所附的手續，levulinyl基使用肼等之試藥而脫保護，可藉由將GalNAc單元偶合而導入於寡核苷酸之3’末端中。
於本發明，於與GalNAc單元結合的寡核苷酸之5’末端及/或3’末端，可具有與表現藥效的寡核苷酸不同的鹼基序列之包含磷酸二酯鍵且於活體內可被切斷的附加的寡核苷酸序列。就可被切斷寡核苷酸之鏈長而言，1至6個核苷酸為適合的，更適合地為1至3個核苷酸。可被切斷寡核苷酸若為可被切斷者即可，未特別限定，可列舉全部為由DNA而成的天然型寡去氧核苷酸、及全部由RNA而成的天然型寡核苷酸等。就鹼基序列而言，若為可被切斷序列，則未特別限定，但可列舉5’-TCATCA-3’、5’-CATCA-3’、5’-ATCA-3’5’-TCA-3’、5’-CA-3’、5’-A-3’等。
於一態樣，本發明中的2分支GalNAc單元為下述式所表示的基：
Figure 02_image001
[式中，W為下式所表示的基：
Figure 02_image003
，
G表示5-乙醯胺-2-羥基甲基-3,4-二羥基四氫哌喃-6-基(GalNAc)，Z表示氧原子或硫原子，L1 及L2 係一者表示亞甲基(CH2 )，另一者表示未插入原子，o、q、r及s各自獨立地表示0或1，n表示1～15之整數，m表示0～5之整數，v表示1～7。惟，n為1時，m為0～5之整數，n為2～15之整數時，m為0]，適合地，o及q為0。
於上述式，L1 及L2 ，適合地L2 表示亞甲基(CH2 )，L1 未插入原子。n適合地表示1～10之整數，更適合地表示2～7之整數，更適合地為2～4之整數。m適合地為0～3之整數。v適合地為1～5之整數。更適合地為於上述式中，s為1，n為2～7之整數，m為0、1或2，v為1～5之整數的基，更適合地為，於上述式中，s為1，n為2或3，m為0，v為1～3之整數的基。
本發明之適合的2分支GalNAc單元係距磷酸基3個原子以內具有2分支結構，各自分支結構具有甘油結構，於各自之分支鏈的末端各自具有GalNac，由分支點至GalNac為止之連接子結構幾乎相同，連接GalNAc部與磷酸基部的連接子骨架為15個原子以下之長度，雜原子之含有率高，且藉由連續的烷基鏈長為C5以下，顯示對水良好的溶解性。
就本發明之2分支GalNAc單元之具體例而言，可列舉以下之式所表示的基。
Figure 02_image005
Figure 02_image007
Figure 02_image009
Figure 02_image011
Figure 02_image013
＜3.結合物之製造方法＞ 本發明之GalNAc單元所結合的寡核苷酸，可藉由將GalNAc單元所含的亞磷醯胺體與核苷之亞磷醯胺試藥同樣地使用，使用市售之合成機(例如，PerkinElmer公司之利用亞磷醯胺法的模型392)等，按照文獻(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))記載之方法而合成。
含有GalNAc單元的亞磷醯胺之合成法 本發明之含有GalNAc單元的亞磷醯胺或H-膦酸酯，可按照後述的A法或B法而製造。於A法或B法，各反應結束後，按照通常方法，可自反應混合物採取各反應之目的化合物。例如，將反應混合物適當中和，又，於有不溶物存在的情形，藉由過濾而去除後，添加如乙酸乙酯與水不混合的有機溶媒，將含有目的物的有機層分離，以水等洗淨後，以無水硫酸鈉等乾燥後，藉由餾除溶劑而獲得。獲得的化合物，若需要，可藉由通常方法，例如能以矽膠管柱層析進行分離・純化。或者，可藉由再沉澱、再結晶而純化。惟，r=0之情形，使用C法替代A法、B法。
[A法] A法係利用化合物(3)，而用以製造分支型之化合物(7)及化合物(7’)的方法。化合物(1)之立體配置(configuration)未限定。藉由使用化合物(3)，可適當選擇GalNAc部分之6位羥基之保護基。r＝0之情形，使用C法。
Figure 02_image080
(式中R13 為羥基之一般的保護基，但冀望為苄基。式中R14 為羥基之一般的保護基，但冀望為乙醯基、或疏水性保護基(更冀望為4,4’-二甲氧基三苯甲基)。式中R15 為羰基之一般的保護基，但冀望為苄基。式中，-P(R3 )R4 表示[R3 及R4 係相同或相異，表示羥基、經保護的羥基、巰基、經保護的巰基、胺基、碳數1至4個之烷氧基、碳數1至4個之烷硫基、碳數1至5個之氰基烷氧基或經碳數1至4個之烷基取代的胺基]。式中X為碳或氧。式中n為1～15之整數，m為0～5之整數。惟，n為1時，m為0～5之整數，n為2～15之整數時，m為0。式中r獨立為0或1。式中v為1～7。
步驟A-1為胺甲酸酯化的步驟，惰性溶媒中，活化劑、鹼之存在下，將化合物(1)變換為活性酯後，與化合物(2)反應，而胺甲酸酯化。
就上述反應所使用的惰性溶媒而言，可列舉例如，烴類、芳香族烴類、鹵化烴類、醚類等，較佳為二氯甲烷。
就上述反應所使用的活化劑而言，形成活性化酯者即可，未特別限定，可列舉例如，碳酸雙(五氟苯基)酯、碳酸雙(4-硝基苯基)酯、氯甲酸4-硝基苯酯等。較佳為氯甲酸4-硝基苯酯。
就上述反應所使用的鹼而言，可列舉例如，三乙基胺、N,N-二異丙基乙基胺、吡啶、4-二甲基胺基吡啶等，較佳為調製活性酯之際，使用吡啶，接著與胺反應之際，追加N,N-二異丙基乙基胺。
反應溫度係依活化劑、鹼、惰性溶媒等而異，但通常為-20℃至回流溫度。較佳為10℃至30℃。
反應時間係依活化劑、鹼、惰性溶媒、反應溫度等而異，但通常為15分鐘至24小時，較佳為1小時至4小時。
步驟A-2為去除保護基R13 及R15 的步驟。保護基之去除係依其種類而異，但一般而言可按照有機合成化學之技術中周知之方法，例如，如T.H.Greene, P.G.Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999年, John Wiley & Sons, Inc.等記載的方法的通常方法而進行。
步驟A-3為於惰性溶媒中、縮合劑、鹼之存在下，與化合物(3)進行醯胺縮合的步驟。
上述反應所使用的惰性溶媒可依使用的縮合劑種類而適當選擇。例如，可列舉水、醇類、非質子性極性溶媒等，較佳為二氯甲烷或N,N-二甲基甲醯胺。
就上述反應所使用的鹼而言，可列舉例如，三乙基胺、N,N-二異丙基乙基胺、吡啶、4-二甲基胺基吡啶等，較佳為N,N-二異丙基乙基胺。
就上述反應所使用的縮合劑而言，可列舉例如，碳二亞胺系縮合劑之WSC(1-[3-(二甲基胺基)丙基]-3-乙基碳二亞胺)、DIC(N,N’-二異丙基碳二亞胺)、咪唑系縮合劑之CDI(N,N’-羰基二咪唑)、三
Figure 109130882-A0304-12-0000-4
系縮合劑之DMT-MM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三
Figure 109130882-A0304-12-0000-4
-2-基)-4-甲基
Figure 109130882-A0304-12-0020-6
啉鎓＝氯化物n水合物)、脲鎓(uronium)系縮合劑之HATU(O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽)、TSTU(O-(N-琥珀醯亞胺基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓 四氟硼酸鹽)、鏻系縮合劑之PyBOP(1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯啶鏻 六氟磷酸鹽)等，較佳為WSC或HATU。又，視需要，可添加添加劑之HOAt(1-羥基-7-氮雜苯并三唑)，HOBt(1-羥基苯并三唑)、Oxyma(乙基(羥基亞胺基)氰基乙酸酯)。
反應溫度依縮合劑、鹼、溶媒等而異，通常為-20℃至回流溫度。較佳為10℃至30℃。
反應時間依縮合劑、鹼、溶媒、反應溫度等而異，通常為15分鐘至72小時，較佳為1小時至24小時。
步驟A-4為製造化合物(7)的步驟，惰性溶媒中，2-氰基乙基二異丙基氯亞磷醯胺與鹼之存在下，於化合物(6)之二級羥基導入-P(R3 )R4 。
就於上述反應所使用的惰性溶媒而言，可列舉例如，烴類、芳香族烴類、鹵化烴類、醚類、乙腈等，較佳為二氯甲烷。
就上述反應所使用的鹼而言，可列舉例如，三乙基胺、N,N-二異丙基乙基胺、吡啶、4-二甲基胺基吡啶等，較佳為N,N-二異丙基乙基胺。
反應溫度依鹼、惰性溶媒等而異，通常為-20℃至回流溫度。較佳為10℃至30℃。
反應時間依鹼、惰性溶媒、反應溫度等而異，通常為15分鐘至24小時，較佳為1小時至4小時。
步驟A-5係自化合物(7)合成化合物(8)的步驟，僅去除為保護基的R15 。保護基之去除係依其種類而異，但可按照一般有機合成化學之技術中周知之方法進行，例如，按照如T.H.Greene, P.G.Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999年, John Wiley & Sons, Inc.等記載的方法的通常方法進行。
步驟A-6係將化合物(8)醯胺化的步驟。可與前述之步驟A-3同樣地進行。
步驟A-7係將為保護基的R13 去除的步驟。保護基之去除雖依其種類而異，但可按照一般有機合成化學之技術中周知之方法進行，例如，按照如T.H.Greene, P.G.Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999年, John Wiley & Sons, Inc.等記載的方法的通常方法進行。
步驟A-8係自化合物(6)合成為H-膦酸酯體的化合物(7’)的步驟。可於惰性溶劑中，使化合物(6)，與替代亞磷醯胺化試藥之例如預先按照文獻(B.C.Freohler,P.G.Ng and MD.Matteucci,Nucleic Acids Res.,14 5399(1986))自三氯化磷與1,2,4-三唑調製的參-(1,2,4-三唑基)亞磷酸酯反應後，添加水而停止反應，進行後處理，因而獲得H-膦酸酯體。就使用的溶媒而言，只要不阻礙反應則未特別限定，適合地為如二氯甲烷的鹵化烴。反應溫度為-20°～100℃為止，未特別限定，但通常於室溫下實施。反應時間依使用的溶媒、反應時間而異，二氯甲烷中於室溫下反應的情形為30分鐘。
[B法] B法係利用化合物(3)，而用以製造分支型之化合物(14)及化合物(14’)之方法。化合物(10)之立體配置未限定。藉由使用化合物(3)，可適當選擇GalNAc部分之6位羥基的保護基。r＝0之情形，使用C法。
Figure 02_image082
R12 為羥基之一般的保護基，冀望為苄基。式中R3 、R4 、X、n、m、r、v、R14 及R15 表示與前述同意義。
步驟B-1係將化合物(10)胺甲酸酯化的步驟，可與前述之步驟A-1同樣地進行。
步驟B-2係將為保護基的R12 及R15 去除的步驟。可與前述之步驟A-2同樣地進行。
步驟B-3係將化合物(12)醯胺化的步驟，可與前述之步驟A-3同樣地進行。
步驟B-4係於化合物(13)之羥基導入-P(R3 )R4 的步驟，可與前述之步驟A-3同樣地進行。
步驟B-5係自化合物(11)合成化合物(15)的步驟，僅去除為保護基的R15 。可與前述之步驟A-5同樣地進行。
步驟B-6係將化合物(15)醯胺化的步驟。可與前述之步驟A-6同樣地進行。
步驟B-7係去除為保護基的R12 的步驟。可與前述之步驟A-7同樣地進行。
步驟B-8係自化合物(13)合成化合物(14’)的步驟。可與前述之步驟A-8同樣地進行。
[C法] C法係利用化合物(3)，用以製造分支型之化合物(19)或化合物(22)、及化合物(19’)或化合物(22’)的方法。化合物(1)及化合物(10)之立體配置未限定。藉由使用化合物(3)，可適當選擇GalNAc部分之6位羥基之保護基。
Figure 02_image084
式中R3 、R4 、X、n、m、r、R12 、R13 及R14 表示與前述同意義。
步驟C-1係將化合物(1)或化合物(10)胺甲酸酯化的步驟，可使用化合物(3)替代化合物(2)，與前述之步驟A-1同樣地進行。
步驟C-2係去除為保護基的R12 或R13 的步驟。保護基之去除雖依其種類而異，但可按照一般有機合成化學之技術中周知之方法進行，例如，按照如T.H.Greene, P.G.Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999年, John Wiley & Sons, Inc.等記載的方法的通常方法進行。
步驟C-3係於化合物(19)或化合物(22)之羥基導入-P(R3 )R4 的步驟，可與前述之步驟A-3同樣地進行。
步驟C-4係自化合物(18)合成化合物(19’)，或自化合物(21)合成化合物(22’)的步驟。可與前述之步驟A-8同樣地進行。
＜4.使用疏水性保護基的製造方法＞ 本發明係提供使GalNAc部位之3位、4位、6位之任一個以上之羥基上導入疏水性高的保護基的GalNAc單元與合成寡核苷酸之5’末端或3’末端結合，並藉由使吸附於具有經由疏水性相互作用所致的吸附性的樹脂而將不純物分離，而製造GalNAc單元與寡核苷酸之結合物的方法及包含於該製造方法作為中間體使用的疏水性保護基加成型GalNAc的結合用化合物(亞磷醯胺、H-膦酸酯)、結合物等。
本發明之製造方法包含以下步驟。 a：合成於寡核苷酸之5’末端或3’末端結合有包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構的結合物的步驟； b：將包含步驟a之產物的溶液通液於填充具有經由疏水性相互作用所致的吸附性的樹脂的管柱，並將水性洗淨液通液於該管柱的步驟；及 c：使寡核苷酸自步驟b後之管柱溶析的步驟。
於本製造方法，就疏水性保護基而言，只要符合前述定義，可採用各式各樣者。於通常之核酸合成，因以氨水等的鹼性處理使寡核苷酸自支持體游離，可利用以酸性條件處理而去除的保護基，例如，可經取代的三苯甲基、可經取代的矽基等。就此種可經取代的三苯甲基之具體例而言，為三苯甲基、一甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基。又就可經取代的矽基之例而言，為三苯基矽基、三級丁基二甲基矽基、三級丁基二苯基矽基等，較佳為4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr基)。
就於鹼性條件被去除的疏水性保護基而言，可採用各式各樣的種類之酯基，但較佳例示乙醯基、苄醯基。
於本發明，「包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構」係指以下之式所表示的結構。
Figure 02_image015
上述式中，為GalNAc上之羥基之取代基的Ra 、Rb 及Rc 係至少一者為疏水性保護基，其它者為氫原子或於游離條件下被去除的保護基。可全部為疏水性保護基，亦可為任2者為疏水性保護基，僅任一者為疏水性保護基。適合地為Ra 為疏水性保護基(更適合地為於酸性條件下被去除的疏水性保護基，更適合地為可經取代的三苯甲基，最適合地為DMTr基)，Rb 及Rc 為氫原子。此取代基不為疏水性保護基的情形，可結合於游離條件下被去除的保護基，寡核苷酸之自支持體切出的過程中此等保護基被去除，於步驟a所使用的階段，成為氫原子(GalNAc上為羥基)。
X1 及X2 各自獨立表示連接子結構，X1 與X2 之間可為分支。就此處採用的連接子結構而言，可採用烷基鏈、PEG鏈、肽鏈等之多種骨架。此連接子結構藉由於途中進行分支，可含有複數之GalNAc。連接子結構中之分支鏈的數目(t)為1～10左右，適合地為1～3。具有2以上之分支鏈的情形，分支點與GalNAc之間的連接子結構可為相同，亦可各自為不同結構。含有複數之GalNAc的情形，各自之GalNAc與至少一個之疏水性保護基結合。
於上述式，Y表示透過磷酸基或硫代磷酸基而與寡核苷酸結合的結合肢。與寡核苷酸之5’末端結合的情形，該末端之核苷的5’-羥基與磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯結合。此種結合係可將包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構之Y為亞磷醯胺結構、或H-膦酸酯結構的化合物(疏水性保護基加成型GlcNAc單元Amidite樣化合物)，於寡核苷酸之固相合成，接著藉由與核苷亞磷醯胺試藥同樣地使用，而合成。對應本發明之2分支GalNAc單元的疏水性保護基加成型GalNAc單元Amidite樣化合物之具體例係記載於上述(B13)。
本發明之製造方法未限定於上述本發明之2分支GalNAc單元，亦可適用周知之GalNAc單元(例如，專利文獻1～9、非專利文獻1、2等記載者)與寡核苷酸之結合物之製造。此情形，作為疏水性保護基加成型GlcNAc單元亞磷醯胺、或H-膦酸酯，採用周知之對應GlcNAc單元的結構之化合物。就此等之周知之對應GalNAc單元的Amidite樣化合物而言，可例示例如，以下之化合物。
以下之化合物可參考J. Med. Chem. 2016, 59, 2718-2733及其引用文獻等而製造。
關於Tris系GalNAc單元
Figure 02_image052
關於三酸系GalNAc單元
Figure 02_image050
關於新戊四醇系GalNAc單元
Figure 02_image089
關於Lys系GalNAc單元
Figure 02_image056
以下之式所表示的疏水性保護基加成型GalNAc單元亞磷醯胺可參考WO19027009而製造。
關於芳基系GalNAc單元
Figure 02_image058
以下之化合物可參考J. Med. Chem. 2016, 59, 2718-2733及其引用文獻等而製造。
關於羥脯胺醇(Hydroxyprolinol)系GalNAc單元/哌啶系GalNAc單元
Figure 02_image060
對應上述之周知之GlcNAc單元的Amidite樣化合物之式中，R1 表示疏水性保護基。X表示連接子結構，適合地為C3～C6烷基直鏈。Y表示亞磷醯胺基、或H-膦酸酯基。
對應周知之GlcNAc單元的疏水性保護基加成型GalNAc單元―亞磷醯胺或疏水性保護基加成型GalNAc單元―H-膦酸酯，於該GalNAc單元之合成過程，藉由適當使用上述之A法至C法記載的該當化合物(3)的GalNAc衍生物，而可合成。3位、4位及6位之羥基中至少一者為經疏水性保護基保護的GalNAc衍生物，例如，參考實施例1之方法，可合成各式各樣者。
將如上述的疏水性保護基加成型GalNAc單元Amidite樣化合物，同樣地使用核苷Amidite試藥，按照上述之方法，藉由導入至合成的寡核苷酸之5’末端或3’末端，可合成具有包含疏水性保護基加成型GalNAc-磷酸基的結構(上述之式中，Y表示透過磷酸基或硫代磷酸基而與寡核苷酸結合的結合肢)的結合物。就如此合成的結合物之例而言，可列舉(B17)及(B18)記載的結合物。
就用於將疏水性保護基加成型GalNAc單元―H-膦酸酯化合物導入至合成的寡核苷酸之5’末端或3’末端的反應的溶媒而言，只要不阻礙反應即可，未特別限定，適合地使用無水之乙腈。就使用作為縮合劑的試藥而言，使用羧酸或磷酸的酸氯化物，但適合地為使用三甲基乙醯氯。就將H-膦酸鍵氧化成磷酸二酯鍵的氧化劑而言，通常只要氧化反應所使用者即可，未特別限定，可列舉如過錳酸鉀、二氧化錳的氧化錳類；如四氧化釕的氧化釕類；如二氧化硒的硒化合物；如氯化鐵的鐵化合物；如四氧化鋨的鋨化合物；如氧化銀的銀化合物；如乙酸汞的汞化合物；如氧化鉛、四氧化鉛的氧化鉛化合物；如鉻酸鉀、鉻酸-硫酸錯合物、鉻酸-吡啶錯合物的鉻酸化合物；如硝酸鈰銨(CAN)的鈰化合物等之無機金屬氧化劑；如氯分子、溴分子、碘分子的鹵素分子；如過碘酸鈉的過碘酸類；臭氧；過氧化氫水；如亞硝酸的亞硝酸化合物；如亞氯酸鉀、亞氯酸鈉的亞氯酸化合物；如過硫酸鉀、過硫酸鈉的過硫酸化合物等之無機氧化劑；DMSO氧化所使用的試藥類(二甲亞碸與二環己基碳二亞胺、草醯氯、乙酸酐或五酸化磷之錯合物或吡啶-乙酸酐之錯合物)；如三級丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide)的過氧化物類；如三苯基甲基陽離子的安定陽離子類；如N-溴琥珀醯亞胺的琥珀醯亞胺類；如次亞氯酸三級丁酯的次亞氯酸化合物；如偶氮二甲酸甲酯的偶氮二甲酸化合物；如二硫二甲烷、二硫化二苯、二硫化二吡啶的二硫化物類與三苯基膦；如亞硝酸甲酯的亞硝酸酯類；如四溴甲烷的四鹵化碳；如2,3-二氯-5,6-二氰基-p-苯醌(DDQ)的醌化合物等之有機氧化劑，適合地為碘分子。就使用的去氧劑而言，可列舉如吡啶、二甲基胺基吡啶的雜環胺類；如三甲基胺、三乙基胺、二異丙基乙基胺的脂肪族胺類，但適合地為雜環胺類(尤其是吡啶)。使硫代磷酸酯鍵形成的情形，只要為可與H-膦酸鍵反應而形成硫代磷酸酯鍵的試藥即可，未特別限定，有硫、四乙基二硫化四乙基秋蘭姆、Beaucage試藥、苯基乙醯基二硫化物等，適合地為硫。合成的結合物可以與通常之寡核苷酸之DMTr-on純化相同之方法，保持疏水性保護基的同時，自支持體游離。
具有此種包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構的結合物，可以與通常之寡核苷酸之DMTr-on純化同樣之方法將疏水性保護基保持的同時自支持體游離。通常，寡核苷酸之3’末端與支持體的結合係以氨水切斷，於鹼性條件下寡核苷酸游離。因此，就疏水性保護基而言，選擇於鹼性未被去除的保護基，例如，於酸性條件下被去除者。另一方面，作為此寡核苷酸之3’末端與支持體的結合樣式，採用於酸性條件被切斷的結合樣式的情形，因寡核苷酸之游離條件成為酸性，作為疏水性保護基，選擇於酸性條件未被去除的保護基，例如，於鹼性條件被去除的保護基。
如此獲得的疏水性保護基加成型GalNAc單元-寡核苷酸結合物，可使吸附於填充了具有經由疏水性相互作用所致的吸附性的樹脂的管柱後，藉由以水性洗淨液將管柱洗淨，而分離不具有疏水性保護基的不純物。
「具有經由疏水性相互作用所致的吸附性的樹脂」係只要為使用疏水性高的成分於基材的樹脂，則未特別限定，可使用各式各樣者，例如，可列舉苯乙烯-二乙烯基苯系吸附樹脂、苯乙烯-二乙烯基苯系修飾型吸附樹脂、甲基丙烯酸系吸附樹脂或酚系吸附樹脂等。
就使疏水性保護基加成型GalNAc單元-寡核苷酸結合物吸附於管柱之際所使用的填充液而言，冀望不包含大量有機溶媒的鹼性水溶液。例如，可利用固相合成後自支持體切出寡聚物所利用的濃氨水、或將該氨水以適當量之溶媒(水、緩衝液等)稀釋的鹼性水溶液。
就自管柱去除不純物所使用的洗淨液而言，只要為疏水性保護基不脫保護，維持與樹脂的疏水性相互作用的性質之溶液即可，可採用各式各樣者。就此種洗淨液而言，藉由使用含有維持與樹脂的疏水性相互作用的程度的低濃度之有機溶媒的水溶液，不純物之去除效率提升。就疏水性保護基為DMTr基的情形之洗淨液而言，具體地，可使用含有適量鹽的水溶液或含有乙腈的水溶液等。
與GalNAc結合的疏水性保護基，可於因應採用的保護基的脫保護條件下處理結合物，進行脫保護。接續一般的寡核苷酸合成而適用本製造方法的情形，由於採用於如DMTr基的酸性條件下經脫保護的疏水性保護基，因而利用酸性溶液的處理進行脫保護。
脫保護處理係藉由有結合物吸附的管柱上適切地進行脫保護處理，使來自保護基的不純物直接吸附於管柱上，可取得經脫保護的GalNAc-寡核苷酸結合物。
又，將未脫保護而自管柱溶析的疏水性保護基加成型GalNAc-寡核苷酸結合物作脫保護處理，將處理後之溶液藉由再次通液至同樣之疏水性相互作用吸附樹脂管柱，可將源自保護基的不純物與經脫保護的結合物加以分離。
保持了結合物的管柱，藉由利用因應採用的樹脂的適當梯度溶析法，能以高純化度將GalNAc-寡核苷酸結合物分劃。未將疏水性保護基而自管柱溶析的情形，藉由使有機溶媒含量增加的梯度溶析，抑制疏水性保護基與吸附樹脂之間的疏水性相互作用，可使結合物溶析。
以吸附於管柱的狀態進行脫保護處理的情形，因應經脫保護的結合物之對管柱的保持樣式，可適當選擇適當的溶析條件。
使用具有藉由疏水性相互作用的吸附性的離子交換管柱的情形，結合物以吸附於管柱的狀態進行脫保護處理，自管柱的GalNAc-寡核苷酸結合物的溶析，可利用溶析液中之鹽濃度，而按照自離子交換管柱的溶析所採用的通常方法，進行溶析・分劃。具體而言，於管柱使用RESOURCE Q(GE HEALTHCARE製)的情形，於氫氧化鈉/氯化鈉水溶液混合液，可利用梯度溶析液使氯化鈉含量由0緩緩增加至2M(2mol/L)。
使用逆相管柱的情形，自管柱的GalNAc-寡核苷酸結合物之溶析，可使用適當有機溶媒，按照自逆相管柱的溶析所採用的通常方法而進行溶析・分劃。具體而言，於管柱使用Clarity QSP(Phenomenex製)的情形，可利用含有適當量之乙腈的參羥基甲基胺基甲烷(Tris)-鹽酸緩衝液。
於目的物之檢測可利用核酸之檢測波長260nm的吸光度。對於前述之管柱的通過液，經時地測量260nm之吸光度，藉由回收於溶析步驟所檢測的劃分，可取得目的物。
＜5.醫藥＞ 本發明之結合物可使用作為用以治療所含寡核苷酸為目的的疾病之醫藥。治療亦包含預防及事後治療之任一者。
本發明之結合物可使用製藥上可容許的鹽之形態。「製藥上可容許的鹽」係指寡核苷酸之鹽，就此種鹽而言，可列舉如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽的鹼金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽的鹼土金屬鹽；如鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等的金屬鹽；如銨鹽的無機鹽；如三級辛基胺鹽、二苄胺鹽、
Figure 109130882-A0304-12-0020-6
啉基鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙基胺鹽、哌
Figure 109130882-A0304-12-0000-4
鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽的有機鹽等的胺鹽；如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽的鹵化氫酸鹽；如硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等的無機酸鹽；如甲烷磺酸鹽、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽的低級烷磺酸鹽；如苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽的芳基磺酸鹽；如乙酸鹽、蘋果酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等的有機酸鹽；如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天門冬酸鹽的胺基酸鹽等；較佳為鹼金屬鹽，更佳為鈉鹽。此等之鹽能以周知之方法製造。
又，結合物及其製藥上可容許的鹽有時亦呈溶媒合物(例如，水合物)存在，且可為此種溶媒合物。於本發明，此種溶媒合物作為包含於寡核苷酸或結合物的鹽者來處理。
將本發明之結合物或其製藥上可容許的鹽使用於醫藥品的情形，可將其本身或與適當製藥上可容許容的賦形劑、稀釋劑等混合，藉由錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑或糖漿劑等經口或藉由注射劑、栓劑、貼附劑或外用劑等而非經口投予。
此等之製劑可使用賦形劑(例如，如乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇的糖衍生物；如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、α澱粉、糊精的澱粉衍生物；如結晶纖維素的纖維素衍生物；阿拉伯膠；聚葡萄糖；如聚三葡萄糖(pullulan)的有機系賦形劑；如輕質無水矽酸、合成矽酸鋁、矽酸鈣、偏矽酸鋁酸鎂的矽酸鹽衍生物；如磷酸氫鈣的磷酸鹽；如碳酸鈣的碳酸鹽；如硫酸鈣的硫酸鹽等的無機系賦形劑等)；潤滑劑(例如，如硬脂酸；硬脂酸鈣、硬脂酸鎂的硬脂酸金屬鹽；滑石；膠質氧化矽；如蜂蠟、鯨蠟的蠟類；硼酸；己二酸；如硫酸鈉的硫酸鹽；二醇；反丁烯二酸；苯甲酸鈉；DL白胺酸；如月桂基硫酸鈉、月桂基硫酸鎂的月桂基硫酸鹽：如無水矽酸、矽酸水合物的矽酸類；上述澱粉衍生物等)、結合劑(例如，羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯二醇(macrogol)、與前述賦形劑同樣的化合物等)、崩解劑(例如，如低取代度羥基丙基纖維素、羧基甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈣、內部交聯羧基甲基纖維素鈉的纖維素衍生物；如羧基甲基澱粉、羧基甲基澱粉鈉、交聯聚乙烯吡咯啶酮的化學修飾的澱粉・纖維素類等)、乳化劑(例如，如膨土、矽酸鎂鋁(veegum)的膠態性黏土；如氫氧化鎂、氫氧化鋁的金屬氫氧化物；如月桂基硫酸鈉、硬脂酸鈣的陰離子界面活性劑；如氯化苄烷銨的陽離子界面活性劑；如聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯的非離子界面活性劑等)、安定劑(如對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯的對羥基苯甲酸酯類；如氯丁醇、苄基醇、苯基乙醇的醇類；氯化苄烷銨；如酚、甲酚的酚類；乙汞硫柳酸鈉(thimerosal)；去氫乙酸；山梨酸等)、矯味矯臭劑(例如，通常使用的甘味料、酸味料、香料等)、稀釋劑等的添加劑而以周知方法製造。
本發明之治療藥可含有0.1～250μmoles/mL之寡核苷酸(反義寡核苷酸)，較佳為1～50μmoles/mL之寡核苷酸或其製藥上可容許的鹽，可含有0.02～10%w/v之碳水化物或多元醇及0.01～0.4%w/v之製藥上可容許容的界面活性劑。
就上述碳水化物而言，特佳為單糖類或雙糖類。就此等碳水化物及多元醇之例而言，可列舉葡萄糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇及山梨糖醇。此等可單獨使用，亦可併用。
又，就本發明中的界面活性劑之較佳例而言，可列舉聚氧乙烯山梨醇酐一～三酯、烷基苯基聚氧乙烯、牛磺膽酸鈉、膽酸鈉、及多元醇酯。此等中特佳者為聚氧乙烯山梨醇酐一～三酯，此處中作為酯之特佳者為油酸酯、月桂酸酯、硬脂酸酯及棕櫚酸酯。此等可單獨使用，亦可併用。
又，本發明之治療藥更佳為可含有0.03～0.09M之製藥上可容許的中性鹽，例如，氯化鈉、氯化鉀及/或氯化鈣。
又，本發明之治療藥更佳為可含有0.002～0.05M之製藥上可容許的緩衝劑。就較佳的緩衝劑之例而言，可列舉檸檬酸鈉、甘胺酸鈉、磷酸鈉、參(羥基甲基)胺基甲烷。此等之緩衝劑可單獨使用，亦可併用。
再者，上述之治療藥能以溶液狀態供給。然而，因有某期間保存的必要的情形等，以安定化寡核苷酸而防止治療效果降低的目的，通常較佳進行冷凍乾燥，此情形於使用時以溶解液(注射用蒸餾水等)進行再構成(reconstruction)，即使用成被投予的液體狀態即可。因此，本發明之治療藥亦包含用於以溶解液再構成各成分指定的濃度範圍而使用之冷凍乾燥的狀態者。於促進冷凍乾燥物之溶解性的目的，進一步含有白蛋白、甘胺酸等之胺基酸為宜。
本發明之結合物可使用國際公開第2015/005253記載的脂質等而封入，呈如國際公開第2015/005253等記載的核酸脂質奈米粒子或脂質體而投予。
將本發明之結合物或其製藥上可容許的鹽投予人類的情形，例如，成人每1日約0.01～100mg/kg(體重)，較佳為0.1～20mg/kg(體重)之投予量，1次或分數次而進行皮下注射、點滴靜脈注射、或靜脈注射為宜，其投予量、投予次數可依疾病的種類、症狀、年齡、投予方法等而適當變更。 [實施例]
以下，藉由實施例而具體地說明本發明。又，此等實施例係用以說明本發明，並非限定本發明之範圍者。 作為核酸自動合成機，使用「ABI 392 DNA/RNA Synthesizer」(Applied Biosystems製)「ABI 394 DNA/RNA Synthesizer」(Applied Biosystems製)、AKTA Oligopilot(GE Healthcare製)、nS-8II Synthesizer (Gene Design Inc.)之任一者，使用亞磷醯胺法(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))，因應合成規模的合成程序。
作為縮合活化劑，使用活化劑溶液-3(0.25 mol/L 5-苄硫基-1H-四唑・乙腈溶液、和光純藥工業製、產品編號013-20011)。
作為封端試藥(capping agent)，使用AKTA 用CAP A(1-甲基咪唑・乙腈溶液、Sigma-Aldrich製、產品編號L040050)、AKTA 用Cap B1(乙酸酐・乙腈溶液、Sigma-Aldrich製、產品編號L050050)、AKTA用 Cap B2(吡啶・乙腈溶液、Sigma-Aldrich製、產品編號L050150)。
作為解封劑(deblock)，使用DCA Deblock(二氯乙酸・甲苯溶液、Sigma-Aldrich製、產品編號L023050)、或解封溶液-1(3w/v% 三氯乙酸・二氯甲烷溶液、富士軟片和光純藥工業、產品編號042-28921)。
作為用以形成硫代磷酸酯鍵的硫化試藥，使用乙腈(脫水、關東化學製、產品編號01837-05)、吡啶(脫水、關東化學製、產品編號11339-05)1：1(v/v)溶液，將苯基乙醯基二硫化物(phenylacetyldisulfide)(CARBOSYNTH製、產品編號FP07495)溶解成0.2M而使用。
作為氧化劑，使用OXDIZER 0.05M(Sigma-Aldrich製、產品編號L560250-04)、或使用四氫呋喃(脫水、關東化學製、產品編號40993-05)、吡啶(脫水、關東化學製、產品編號11339-05)、蒸餾水78：20：2(v/v/v)溶液，將碘(關東化學製、產品編號20035-00)溶解成0.02 M而使用。
作為核苷亞磷醯胺試藥，2’-O-Me核苷之亞磷醯胺(腺苷體產品編號ANP-5751, 胞苷體產品編號ANP-5752、鳥苷體產品編號ANP-5753、尿苷體產品編號ANP-5754)為使用ChemGenes製者。
非天然型核苷之亞磷醯胺係使用日本特開2000-297097之實施例14(5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O,4’-C-伸乙基-6-N-苄醯基腺苷-3’-O-(2-氰基乙基 N,N-二異丙基)亞磷醯胺)、實施例27(5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O,4’-C-伸乙基-2-N-異丁醯基鳥苷-3’-O-(2-氰基乙基 N,N-二異丙基)亞磷醯胺)、實施例22(5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O,4’-C-伸乙基-4-N-苄醯基-5-甲基胞苷-3’-O-(2-氰基乙基 N,N-二異丙基)亞磷醯胺)、實施例9(5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O,4’-C-伸乙基-5-甲基尿苷-3’-O-(2-氰基乙基 N,N-二異丙基)亞磷醯胺)之化合物。
作為固相撐體，配合合成規模而適當選擇NittoPhase UnyLinker 100, 10μmol(日東電工製)、Primer Support 5G UnyLinker 350,10 μmol(GE Healthcare製)、Primer Support 5G Unylinker 350, 100μmol(GE Healthcare製)、或Glen UnySupport CPG 500, 1μmol(GlenResearch製)。
(實施例1) 疏水性保護基加成型GalNAc之合成 (1A)乙酸[(2R,3R,4R,5R)-5-乙醯胺-3,4-二乙醯氧基-6-[3-(苄氧基羰基胺基)丙氧基]四氫哌喃-2-基]甲酯 (化合物1A)之合成
Figure 02_image094
於N-(3-羥基丙基)胺甲酸苄酯(6.4g, 30.8mmol)、與文獻已知化合物之乙酸[(2R,3R,4R,5R)-5-乙醯胺-3,4,6-三乙醯氧基-四氫哌喃-2-基]甲酯(WO2011053614)(10 g, 25.7 mmol)的二氯甲烷(200ml)懸浮溶液中，添加三氟甲烷磺酸(450 μl, 5.1 mmol)，並於45度攪拌4小時。反應結束後，將溶媒減壓餾除約一半而進行濃縮。將有機層以飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉進行乾燥、過濾，將溶媒減壓餾除而獲得粗生成物。添加異丙基醚(100m)，並攪拌3小時。將獲得的固形物過濾，而獲得目的物1A(11.9 g)。其不需進一步純化即可用於下一反應。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.43-7.29 (5H, m), 6.26 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.36-5.29 (1H, m), 5.12 (1H, d, J = 12.1 Hz), 5.08 (1H, d, J = 12.1 Hz), 5.03-4.95 (2H, m), 4.33 (1H, d, J = 9.1 Hz), 4.21-4.06 (3H, m), 4.01-3.93 (1H, m), 3.80-3.73 (1H, m), 3.62-3.49 (1H, m), 3.44-3.35 (1H, m), 3.14-3.04 (1H, m), 2.15 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.95 (3H, s), 1.88-1.75 (1H, m), 1.69-1.56 (1H, m). 計算之C25 H34 N2 O11 ： [M+H]+ 539，實測539.
(1B) N-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基丙基]胺甲酸苄酯 (化合物1B)之合成
Figure 02_image096
於步驟(1A)所合成的化合物(12.4g, 23mmol)之乙醇(200ml)懸浮溶液中，添加28%甲醇鈉甲醇溶液(0.85ml)，於室溫攪拌。隨著反應的進行，一度成為透明的溶液。放置60分鐘時獲得沉澱物。過濾沉澱物，以乙醇、二異丙基醚洗淨後，減壓下乾燥。獲得呈固體之含有目的物1B的粗生成物 (10g)。其不需進一步純化即可用於下一反應。1 H-NMR (DMSO-D6 ) δ： 7.60 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.40-7.17 (5H, m), 5.01 (2H, s), 4.62-4.55 (2H, m), 4.49 (1H, d, J = 4.2 Hz), 4.20 (1H, d, J = 8.5 Hz), 3.76-3.27 (6H, m), 3.08-2.99 (2H, m), 1.81 (3H, s), 1.66-1.56 (2H, m). 計算之C19 H28 N2 O8 ： [M+Na]+ 435，實測435.
(1C)N-[(2R,3R,4R,5R,6R)-2-(3-胺基丙氧基)-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-3-基]乙醯胺 鹽酸鹽(化合物1C)之合成
Figure 02_image098
將於步驟(1B)所合成的化合物(22.8g, 55.3mmol)溶解於四氫呋喃(280ml)/1N鹽酸(61ml)。添加10%鈀/碳(濕)(5.56g)，氫氣環境下，於室溫劇烈攪拌3.5小時。反應結束後，進行過濾，將獲得的通過液進行減壓餾除。添加適量的乙醇而將生成的固形物過濾，以乙醇、二乙基醚洗淨後，減壓下乾燥。獲得包含目的物1C的粗生成物(17g)。其不需進一步純化即可用於下一反應。1 H-NMR (D2 O) δ： 4.27 (1H, d, J = 8.5 Hz), 3.90-3.50 (8H, m), 2.93 (2H, t, J = 7.0 Hz), 1.89 (3H, s), 1.82-1.75 (2H, m).
(1D)N-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基丙基]胺甲酸9H-茀-9-基甲酯(化合物1D)之合成
Figure 02_image100
將於步驟(1C)所合成的化合物(16.4g, 52.1mmol)溶解於四氫呋喃(200ml)/純水(50ml)，添加N,N-二異丙基乙基胺(12.7mL, 72.9mmol)。冰冷下，添加N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基氧基]琥珀醯亞胺(21.1g, 62.5mmol)，於室溫攪拌1.5小時。反應結束後，減壓餾除溶媒。添加二乙基醚(100ml)，並攪拌1小時。固形物依序以乙醇、乙酸乙酯、二乙基醚洗淨後，減壓下乾燥，獲得包含目的物1D的粗生成物(22.9g)。1 H-NMR (DMSO-D6 ) δ： 7.89 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.69 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.61 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.42 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.33 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.24 (1H, t, J = 5.7 Hz), 4.60-4.57 (2H, m), 4.49 (1H, d, J = 4.2 Hz), 4.31-4.18 (4H, m), 3.76-3.28 (8H, m), 3.05-2.97 (2H, m), 1.81 (3H, s), 1.62-1.57 (2H, m). 計算之C26H32N2O8： [M+Na]+ 523，實測523.
(1E)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-4-乙醯氧基-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[3-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)丙氧基]四氫哌喃-3-基]酯 (化合物1E)之合成
Figure 02_image102
於步驟(1D)所合成的化合物(1.56g, 3.1mmol)之吡啶(20ml)懸浮液中，添加4,4’-二甲氧基三苯氯甲烷(1.27 g , 3.7mmol)，於室溫攪拌30分鐘。接著，添加乙酸酐(1.18ml, 12.5mmol)，於室溫攪拌20小時。反應結束後，添加N,N-二異丙基乙基胺(1.1mL, 6.2mmol)、乙醇(2ml)，減壓餾除溶媒，獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯＝75：25-0：100, v/v、含有1%三乙基胺)純化，獲得非晶質狀之目的物1E(2.8 g、定量)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.77 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.62 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.43-7.18 (13H, m), 6.83-6.79 (4H, m), 6.03 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.55 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.14-5.03 (2H, m), 4.46-4.43 (3H, m), 4.24-4.04 (2H, m), 3.97-3.91 (1H, m), 3.85-3.82 (1H, m), 3.77 (6H, s), 3.72-3.71 (1H, m),3.54-3.33 (3H, m), 3.09-3.04 (2H, m), 2.03 (3H, s), 1.89 (6H, s), 1.65-1.56 (2H, m). 計算之C52 H55 NO12 ： [M+Na]+ 908，實測909.
(1F)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-4-乙醯氧基-6-(3-胺基丙氧基)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-3-基]酯 (化合物1F)之合成
Figure 02_image104
於步驟(1E)所合成的化合物(2.49g, 2.8mmol)之二氯甲烷(8ml)溶液中，添加哌啶(0.45ml,4.5mmol)，並於室溫攪拌。反應未結束的情形，適當追加哌啶。反應結束後，減壓餾除溶媒，獲得粗生成物。將其以NH-矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇＝100：0-85：15, v/v)純化，獲得非晶質狀之目的物1F(1.48 g、產率79%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.39-7.18 (9H, m), 6.83-6.80 (4H, m), 5.55 (1H, d, J = 3.0 Hz), 5.51 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.27 (1H, dd, J  = 11.2, 3.3 Hz), 4.64 (1H, d, J = 8.5 Hz), 3.98-3.90 (2H, m), 3.84-3.82 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.75-3.74 (1H, m), 3.58-3.56 (1H, m), 3.35 (1H, dd, J = 9.1, 5.4 Hz), 3.07 (1H, t, J = 8.5 Hz), 2.82-2.74 (4H, m), 2.01 (3H, s), 1.96 (3H, s), 1.89 (3H, s), 1.74-1.69 (2H, m). 計算之C37 H45 NO10 ： [M+Na]+ 687，實測687.
(實施例2) 對應GalNAc單元X18 的Amidite試藥(具有疏水性保護基加成型GalNAc-磷酸基的化合物)之合成 (2A)2-[[2-苄氧基-3-[(2-苄氧基-2-側氧基-乙基)胺甲醯氧基]丙氧基]羰基胺基]乙酸苄酯(化合物2A)之合成
Figure 02_image106
使2-苄氧基-1,3-丙二醇(2.5g,14mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(5.8g, 29mmol)溶解於四氫呋喃(100ml)，添加吡啶(5.0ml,61.8mmol)，於室溫攪拌20分鐘。過濾析出的固體後，添加四氫呋喃(70ml)。接著，添加甘胺酸苄酯 TFA鹽(9.2g,33mmol)及N,N-二異丙基乙基胺(9.6mL, 55mmol)，於室溫攪拌整夜。反應結束後，減壓餾除溶媒，獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯＝100：0-40：60, v/v)純化，獲得膠狀之目的物2A(6.5 g、產率84%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.37-7.33 (15H, m), 5.48 (2H, t, J = 5.4 Hz), 5.18 (4H, s), 4.64 (2H, s), 4.23 (4H, d, J = 5.4 Hz), 3.99 (4H, d, J = 5.4 Hz), 3.84 (1H, t, J = 5.4 Hz). 計算之C30 H32 N2 O9 ： [M+H]+ 565，實測565, [M+Na]+ 587，實測587
(2B)2-[[3-(羧基甲基胺甲醯氧基)-2-羥基-丙氧基]羰基胺基]乙酸 (化合物2B)之合成
Figure 02_image108
溶解於步驟(2A)所合成的化合物2A(7.3g, 2.8mmol)之四氫呋喃(200ml)/純水(50ml)。添加20%氫氧化鈀-活性碳(含約50%水)(3g)，氫氣環境下，於室溫劇烈攪拌5小時。反應結束後，進行過濾，將獲得的通過液進行減壓餾除，獲得包含目的物2B的粗生成物(3.2g)。其不需進一步純化即可用於下一反應。1 H-NMR (D2 O) δ： 4.21-4.14 (5H, m), 3.86 (4H, s).
(2C)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-6-[3-[[2-[[3-[[2-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基l-甲氧基]甲基]四氫哌喃-2-基]氧基丙基胺基]-2-側氧基-乙基]胺甲醯氧基]-2-羥基-丙氧基]羰基胺基]乙醯基]胺基]丙氧基]-4-乙醯氧基-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-3-基]酯 (化合物2C)之合成
Figure 02_image110
於步驟(2B)所合成的化合物2B (0.31g,1.05mmol)、步驟(1E)所合成的化合物1F(1.47g,2.21mmol)、N,N-二異丙基乙基胺(0.91mL, 5.27mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(9ml)溶液中，添加1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯(11.3g, 29.6mmol)，於室溫攪拌3小時。反應結束後，將反應液滴加至二乙基醚(計185ml)。去除上清液之溶媒後，將獲得的凝膠狀之粗生成物以矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇＝100：0-15：85, v/v、含有1%三乙基胺)純化，獲得呈固體之目的物2C(1.05 g、產率63%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.39-7.17 (18H, m), 6.83-6.80 (8H, m), 6.70-6.27 (2H, m), 5.56-5.54 (2H, m), 5.10 (2H, d, J = 10.9 Hz), 4.49-3.02 (44H, m), 2.01 (6H, s), 1.96 (6H, s), 1.90 (6H, s), 1.80-1.63 (4H, m). 計算之C81 H98 N6 O27 ： [M+Na]+ 1611，實測1611
(2D)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-6-[3-[[2-[[3-[[2-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-2-基]氧基丙基胺基]-2-側氧基-乙基]胺甲醯氧基]-2-[2-氰基乙氧基-(二異丙基胺基)磷烷基]氧基-丙氧基]羰基胺基]乙醯基]胺基]丙氧基]-4-乙醯氧基-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-3-基]酯 (化合物2D)之合成
Figure 02_image112
將步驟(2C)所合成的化合物2C(0.47g, 0.30 mmol)以適量之乙酸乙酯/甲苯(1/1)共沸後，溶解於二氯甲烷(3ml)。添加N,N-二異丙基乙基胺(210μl, 1.18 mmol)、2-氰基乙基二異丙基氯亞磷醯胺(79μl, 0.36mmol)，於室溫攪拌1小時。進一步，添加2-氰基乙基二異丙基氯亞磷醯胺(20μl, 0.09mmol)，於室溫攪拌15分鐘。反應結束後，減壓餾除溶媒，獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析(乙酸乙酯：甲醇＝100：0-85：15, v/v、含有1%三乙基胺)純化，獲得非晶質狀之目的物2D(0.34g、產率64%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.39-7.17 (18H, m), 6.87-6.70 (8H, m), 6.29-6.06 (2H, m), 5.55 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.11 (2H, d, J = 10.9 Hz), 4.47-3.02 (47H, m), 2.63 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.02 (6H, s), 1.96 (6H, s), 1.90 (6H, s), 1.80-1.64 (4H, m), 1.17 (12H, d, J = 6.7 Hz).
(實施例3)對應GalNAc單元X19 的Amidite試藥(具有疏水性保護基加成型GalNAc-磷酸基的化合物)之合成 (3A) 2-[[3-苄氧基-2-[(2-苄氧基-2-側氧基-乙基)胺甲醯氧基]丙氧基]羰基胺基]乙酸苄酯(化合物3A)之合成
Figure 02_image114
使用(+/-)-3-苄氧基-1,2-丙二醇(1.0g,5.5mmol)替代2-苄氧基-1,3-丙二醇，與步驟(2A)同樣地進行，獲得目的物3A(2.8 g、產率90%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.39-7.30 (15H, m), 5.37-5.35 (2H, m), 5.17-5.12 (5H, m), 4.56-4.51 (2H, m), 4.33-4.30 (2H, m), 4.03-3.94 (4H, m), 3.61 (2H, d, J = 5.4 Hz). 計算之C30 H32 N2 O9 ： [M+Na]+ 587，實測587
(3B)2-[[2-(羧基甲基胺甲醯氧基)-3-羥基-丙氧基]羰基胺基]乙酸 (化合物3B)之合成
Figure 02_image116
使用化合物3A(2.8g,5.0mmol)替代化合物2A，與步驟(2B)同樣地進行，獲得包含目的物3B的粗生成物(1.2g)。1 H-NMR (D2 O) δ： 4.32-4.19 (3H, m), 3.94-3.87 (4H, m), 3.81-3.71 (2H, m).
(3C)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-6-[3-[[2-[[2-[[2-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-2-基]氧基丙基胺基]-2-側氧基-乙基]胺甲醯氧基]-3-羥基-丙氧基]羰基胺基]乙醯基]胺基]丙氧基]-4-乙醯氧基-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基l-甲氧基]甲基]四氫哌喃-3-基]酯 (化合物3C)之合成
Figure 02_image118
使用化合物3B(0.31g,1.05mmol)替代化合物2B，與步驟(2C)同樣地進行，獲得目的物3C(0.74 g、產率44%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.40-7.18 (18H, m), 6.81 (8H, dd, J = 9.1, 3.0 Hz), 6.70-6.50 (1H, m), 6.16-6.02 (1H, m), 5.56-5.54 (2H, br), 5.11-5.00 (2H, m), 4.53-2.99 (44H, m), 2.01 (6H, s), 1.95 (6H, s), 1.88 (6H, s), 1.77-1.68 (4H, m). 計算之C81 H98 N6 O27 ： [M+Na]+ 1611，實測1611
(3D)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-6-[3-[[2-[[2-[[2-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-2-基]氧基丙基胺基]-2-側氧基-乙基]胺甲醯氧基]-3-[2-氰基乙氧基-(二異丙基胺基)磷烷基]氧基-丙氧基]羰基胺基]乙醯基]胺基]丙氧基]-4-乙醯氧基-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-3-基]酯 (化合物3D)之合成
Figure 02_image120
使用化合物3C(0.31g,1.05mmol)替代化合物2C，與步驟(2D)同樣地進行，獲得目的物3D(0.60g、產率72%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.38-7.18 (18H, m), 7.13-6.97 (1H, m), 6.83-6.81 (8H, m), 6.58-6.36 (1H, m), 5.56-5.52 (2H, m), 5.10-5.04 (2H, m), 4.46-2.97 (47H, m), 2.65-2.63 (2H, m), 2.02 (6H, s), 1.95 (3H, s), 1.94 (3H, s), 1.90 (3H, s), 1.89 (3H, s), 1.77-1.67 (4H, m), 1.20-1.16 (12H, m).
(實施例4) 對應GalNAc單元X20 的Amidite試藥(具有疏水性保護基加成型GalNAc-磷酸基的化合物)之合成 (4A)3-[[2-苄氧基-3-[(3-苄氧基-3-側氧基-丙基)胺甲醯氧基]丙氧基]羰基胺基]丙酸苄酯(化合物4A)之合成
Figure 02_image122
使用3-胺基丙酸苄酯TFA鹽(2.4g,8.17mmol)替代步驟(2A)所使用的甘胺酸苄酯 TFA鹽，與步驟(2A)同樣地進行，獲得目的物4A(1.62g、產率80%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.39-7.27 (15H, m), 5.21 (2H, br s), 5.14 (4H, s), 4.63 (2H, s), 4.24-4.10 (4H, m), 3.79-3.74 (1H, m), 3.48-3.44 (4H, m), 2.59 (4H, t, J = 6.0 Hz).計算之C32 H36 N2 O9 ： [M+H]+ 593，實測593, [M+Na]+ 615，實測615
(4B)3-[[3-(2-羧基乙基胺甲醯氧基)-2-羥基-丙氧基]羰基胺基]丙酸(化合物4B)之合成
Figure 02_image124
使用化合物4A(1.62g,2.73mmol)替代步驟(2B)所使用的化合物2A，與步驟(2B)同樣地進行，獲得目的物4B(0.89g、定量)。1 H-NMR (D2O) δ： 4.22-4.04 (5H, m), 3.46-3.32 (4H, m), 2.57 (4H, t, J = 6.7 Hz).
(4C)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-2-基]氧基丙基胺基]-3-側氧基-丙基]胺甲醯氧基]-2-羥基-丙氧基]羰基胺基]丙醯基胺基]丙氧基]-4-乙醯氧基-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-3-基]酯(化合物4C)之合成
Figure 02_image126
使用化合物4B(300mg,0.93mmol)替代步驟(2C)所使用的化合物2B，與步驟(2C)同樣地進行，獲得目的物4C(950mg、產率63%)。1 H-NMR (CDCl3) δ： 7.32-7.24 (18H, m), 6.82-6.80 (8H, m), 6.64-6.61 (1H, br), 6.27-6.24 (1H, br), 5.91-5.88 (1H, br), 5.56 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.10 (2H, d, J = 11.5 Hz), 4.46-3.05 (43H, m), 2.47-2.37 (4H, m), 2.02 (6H, s), 1.98 (6H, s), 1.90 (6H, s), 1.78-1.67 (4H, m). 計算之C83 H102 N6 O27 ： [M+Na]+ 1638，實測1638
(4D)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-2-基]氧基丙基胺基]-3-側氧基-丙基]胺甲醯氧基]-2-[2-氰基乙氧基-(二異丙基胺基)磷烷基l]氧基-丙氧基]羰基胺基]丙醯基胺基]丙氧基]-4-乙醯氧基-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-3-基]酯(化合物4D)之合成
Figure 02_image128
使用化合物4C(945mg,0.58mmol)替代步驟(2D)所使用的化合物2C，與步驟(2D)同樣地進行，獲得目的物4D(638mg、產率60%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.39-7.18 (18H, m), 6.85-6.78 (8H, m), 6.73-6.64 (1H, m), 6.40-6.23 (1H, m), 5.83-5.72 (1H, m), 5.56 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.13-5.04 (2H, m), 4.45-4.35 (2H, m), 4.22-3.30 (40H, m), 3.22-3.03 (4H, m), 2.64 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.54-2.32 (4H, m), 2.02 (6H, s), 2.00-1.95 (6H, m), 1.90 (6H, s), 1.83-1.59 (4H, m), 1.20-1.10 (12H, m).
(實施例5)對應GalNAc單元X21 的Amidite試藥(具有疏水性保護基加成型GalNAc-磷酸基的化合物)之合成 (5A)4-[[2-苄氧基-3-[(4-苄氧基-4-側氧基-丁基)胺甲醯氧基]丙氧基]羰基胺基]丁酸苄酯(化合物5A)之合成
Figure 02_image130
使用4-胺基丁酸苄酯TFA鹽(1.30g,4.21mmol)替代步驟(2A)所使用的甘胺酸苄酯 TFA鹽，與步驟(2A)同樣地進行，獲得目的物5A(0.85g、產率78%)。1 H-NMR (CDCl3) δ： 7.38-7.27 (15H, m), 5.11 (4H, s), 4.80 (2H, br s), 4.63 (2H, s), 4.19-4.15 (4H, m), 3.77-3.75 (1H, m), 3.23-3.18 (4H, m), 2.40 (4H, t, J = 7.3 Hz), 1.88-1.81 (4H, m). 計算之C34 H40 N2 O9 ： [M+H]+ 621，實測622, [M+Na]+ 643，實測644
(5B)4-[[3-(3-羧基丙基胺甲醯氧基)-2-羥基-丙氧基]羰基胺基]丁酸(化合物5B)之合成
Figure 02_image132
使用化合物5A(0.85g,1.4mmol)替代步驟(2B)所使用的化合物2A，與步驟(2B)同樣地進行，獲得目的物5B(0.49g、定量)。1 H-NMR (D2O) δ： 4.19-4.05 (5H, m), 3.19-3.12 (4H, m), 2.36-2.27 (4H, m), 1.83-1.73 (4H, m).
(5C)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-6-[3-[4-[[3-[[4-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-2-基]氧基丙基胺基]-4-側氧基-丁基]胺甲醯氧基]-2-羥基-丙氧基]羰基胺基]丁醯基胺基]丙氧基]-4-乙醯氧基-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-3-基]酯(化合物5C)之合成
Figure 02_image134
使用化合物5B(300mg,0.86mmol)替代步驟(2C)所使用的化合物2B，與步驟(2C)同樣地進行，獲得目的物5C(1.16g、產率82%)。1 H-NMR (CDCl3) δ： 7.31-7.24 (18H, m), 6.82-6.80 (8H, m), 6.68-6.65 (3H, m), 5.91-5.84 (1H, m), 5.56 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.10 (2H, d, J = 10.9 Hz), 4.45 (2H, d, J = 8.5 Hz), 4.23-3.12 (40H, m), 2.31-2.22 (4H, m), 2.01 (6H, s), 1.98 (6H, s), 1.90 (6H, s), 1.81-1.68 (8H, m). 計算之C85 H106 N6 O27 ： [M+Na]+ 1666，實測1667
(5D)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-2-基]氧基丙基胺基]-4-側氧基-丁基]胺甲醯氧基]-2-[2-氰基乙氧基-(二異丙基胺基)磷烷基]氧基-丙氧基]羰基胺基]丁醯基胺基]丙氧基]-4-乙醯氧基-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氫哌喃-3-基]酯(化合物5D)之合成
Figure 02_image136
使用化合物5C(1.16g,0.71mmol)替代步驟(2D)所使用的化合物2C，與步驟(2D)同樣地進行，獲得目的物5D(795mg、產率61%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.40-7.17 (18H, m), 6.85-6.77 (8H, m), 6.72-5.65 (5H, m), 5.56 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.11-5.03 (2H, m), 4.46-4.35 (2H, m), 4.25-3.02 (42H, m), 2.65 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.39-2.16 (4H, m), 2.02 (6H, s), 1.99-1.94 (6H, m), 1.90 (6H, s), 1.87-1.59 (8H, m), 1.18 (12H, d, J = 6.7 Hz).
(實施例6) 對應GalNAc單元X22 的Amidite試藥之合成 (6A) 乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-3,4-二乙醯氧基-6-[5-(苄氧基羰基胺基)戊氧基]四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物6A)之合成
Figure 02_image138
於文獻已知化合物之N-苄氧基羰基-1-羥基戊基-5-胺(J. Am. Chem. Soc.,2006,128,4058-4073.)(8.05g, 33.9mmol)與文獻已知化合物之乙酸[(2R,3R,4R,5R)-5-乙醯胺-3,4,6-三乙醯氧基-四氫哌喃-2-基]甲酯(WO2011053614)(12.0g, 30.8mmol)的二氯甲烷(200mL)懸浮溶液中，添加三氟甲烷磺酸(450μL, 5.23mmol)，並於45℃整夜攪拌。反應結束後，將溶媒減壓餾除至約一半而進行濃縮，添加至乙酸乙酯/飽和碳酸氫鈉水溶液之混合溶液中。將有機層以飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水/磷酸緩衝液(pH7.0)洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥、過濾，將溶媒減壓餾除而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯＝100：0-0：100, v/v)純化，獲得非晶質狀之目的物6A(17.0g、產率94%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.37-7.32 (5H, m), 5.69 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.35 (1H, d, J = 2.4 Hz), 5.29 (1H, d, J = 11.5 Hz), 5.10 (2H, s), 4.94 (1H, br), 4.68 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.20-4.09 (2H, m), 3.97-3.86 (3H, m), 3.49-3.44 (1H, m), 3.20-3.17 (2H, m), 2.14 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.93 (3H, s), 1.66-1.34 (6H, m). 計算之C27 H38 N2 O11 ： [M+H]+ 567，實測567.
(6B)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-3,4-二乙醯氧基-6-(5-胺基戊氧基)四氫哌喃-2-基]甲酯 鹽酸鹽(化合物6B)之合成
Figure 02_image140
將步驟(6A)所合成的化合物6A(3.87 g, 6.83 mmol)溶解於四氫哌喃(32ml)/1N鹽酸(8ml)。添加10%鈀/碳(濕)(2g)，並於氫氣環境下，於室溫劇烈攪拌。反應結束後、過濾，將獲得的通過液進行減壓餾除，獲得目的物6B(3.1g、產率97%)之粗生成物。其不需進一步純化即可用於下一反應。 計算之C19 H32 N2 O9 ： [M+H]+ 433，實測433.
(6C)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-6-[5-[[3-[5-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基戊基胺甲醯氧基]-2-苄氧基-丙氧基]胺甲醯基胺基]戊氧基]-3,4-二乙醯氧基-四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物6C)之合成
Figure 02_image142
使2-苄氧基-1,3-丙二醇(600mg,3.29mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(1.39g, 6.91mmol)溶解於四氫呋喃(22ml)，添加吡啶(1.1ml,13.2mmol)，於室溫攪拌15分鐘。過濾析出的固體後，添加四氫呋喃(16ml)。接著，添加步驟(6B)所合成的化合物(6B)(3.09g,6.59mmol)之四氫呋喃(15ml)/二氯甲烷(5ml)溶液與N,N-二異丙基乙基胺(3.4mL, 19.8mmol)，於40℃攪拌2小時。反應結束後，減壓餾除溶媒。添加二氯甲烷，將有機層以0.5N鹽酸、飽和食鹽水、0.2N氫氧化鈉水溶液、飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥、過濾，將溶媒減壓餾除，獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇＝100：0-90：10, v/v)純化，獲得主要包含目的物6C的混合物(2.1 g)。 計算之C50 H74 N4 O23 ： [M+H]+ 1099，實測1099. [M+Na]+ 1121，實測1121.
(6D)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-6-[5-[[3-[5-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基戊基胺甲醯氧基]-2-羥基-丙氧基]羰基胺基]戊氧基]-3,4-二乙醯氧基-四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物6D)之合成
Figure 02_image144
將包含步驟(6C)所獲得的6C的混合物(2.1 g)溶解於四氫哌喃(20ml)/純水(1ml)。添加1N鹽酸(0.38ml)、10%鈀/碳(濕)(1g)，並於氫氣環境下，於室溫劇烈攪拌。反應結束後，進行過濾，將獲得的通過液進行減壓餾除，獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析(乙酸乙酯：甲醇＝100：0-90：15, v/v)純化，獲得呈固體之目的物6D(1.38 g、產率72%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 6.10-5.96 (1H, m), 5.38-4.94 (6H, m), 4.70-4.64 (2H, m), 4.23-3.44 (19H, m), 3.20-3.15 (4H, m), 2.15 (6H, s), 2.05 (6H, s), 2.01 (6H, s), 1.97 (6H, s), 1.67-1.38 (12H, m). 計算之C43 H68 N4 O23 ： [M+H]+ 1009，實測1009. [M+Na]+ 1031，實測1031.
(6E)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-6-[5-[[3-[5-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基戊基胺甲醯氧基]-2-[2-氰基乙氧基-(二異丙基胺基) 磷烷基]氧基-丙氧基]胺甲醯基胺基]戊氧基]-3,4-二乙醯氧基-四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物6E)之合成
Figure 02_image146
使用化合物6D(1.38g,1.37mmol)替代步驟(2D)所使用的化合物2C，與步驟(2D)同樣地進行，獲得目的物6E(850mg、產率51%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 5.95-5.89 (1H, m), 5.38-5.26 (4H, m), 5.20-5.16 (1H, m), 5.00-4.95 (1H, m), 4.71-4.68 (2H, m), 4.36-3.44 (22H, m), 3.15 (4H, q, J = 6.4 Hz), 2.67 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.15 (6H, s), 2.05 (6H, s), 2.01 (6H, s), 1.96 (6H, s), 1.67-1.33 (12H, m), 1.18 (12H, d, J = 6.7 Hz).
(實施例7)對應GalNAc單元X20 的Amidite試藥之合成 (7A)乙酸[(2R,3R,4R,5R)-5-乙醯胺-3,4-二乙醯氧基-6-(3-胺基丙氧基)四氫哌喃-2-基]甲酯 鹽酸鹽(化合物7A)之合成
Figure 02_image148
將步驟(1A)所合成的化合物1A(10 g, 18.6 mmol)溶解於四氫呋喃(200ml)/1N鹽酸(20ml)。添加10%鈀/碳(濕)(1g)，並於氫氣環境下，於室溫劇烈攪拌1小時。反應結束後，進行過濾，將獲得的通過液進行減壓餾除，獲得包含目的物7A的粗生成物(8.97g)。其不需進一步純化即可用於下一反應。 計算之C17 H28 N2 O9 ： [M+H]+ 405，實測405.
(7B)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基丙基胺基]-3-側氧基-丙基]胺甲醯氧基]-2-羥基-丙氧基]羰基胺基]丙醯基胺基]丙氧基]-3,4-二乙醯氧基-四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物7B)之合成
Figure 02_image150
於步驟(4B)所合成的化合物4B(200mg, 0.62mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(2ml)溶液中，添加O-(N-琥珀醯亞胺基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(411mg,1.37mmol)、N,N-二異丙基乙基胺(0.32ml,1.86mmol)，並於室溫攪拌20分鐘。將此反應液添加至步驟(37B)所合成的化合物37B(657mg,1.49mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(2ml)溶液中後，添加N,N-二異丙基乙基胺(0.32ml,1.86mmol)，並於室溫攪拌60分鐘。反應結束後，將反應液滴加至二乙基醚(計80ml)。將去除上清溶媒後獲得的凝膠狀之粗生成物以矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇＝100：0-75：25, v/v)純化，獲得非晶質狀之目的物7B(408mg、產率60%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 6.76 (2H, br), 6.69-6.63 (2H, m), 5.96 (1H, br), 5.36 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.13-5.08 (2H, m), 4.53 (2H, d, J = 8.5 Hz), 4.25-3.07 (27H, m), 2.51-2.44 (4H, m), 2.17 (6H, s), 2.06 (6H, s), 2.02 (6H, s), 2.00 (6H, s), 1.86-1.73 (4H, m). 計算之C45 H70 N6 O25 ： [M+H]+ 1095，實測1096. [M+Na]+ 1117，實測1117.
(7C)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基丙基胺基]-3-側氧基-丙基]胺甲醯氧基]-2-[2-氰基乙氧基-(二異丙基胺基)磷烷基]氧基-丙氧基]羰基胺基]丙醯基胺基]丙氧基]-3,4-二乙醯氧基-四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物7C)之合成
Figure 02_image152
使用化合物7B(1.53g,1.40mmol)替代步驟(2D)所使用的化合物2C，與步驟(2D)同樣地進行，獲得目的物7C(510mg、產率28%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 6.60-6.44 (4H, m), 5.76-5.68 (1H, m), 5.36 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.09-5.05 (2H, m), 4.50-4.45 (2H, m), 4.26-3.37 (28H, m), 3.17 (2H, br), 2.67 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.52-2.42 (4H, m), 2.17 (6H, s), 2.05 (6H, s), 2.02 (6H, s), 1.99 (6H, s), 1.81-1.70 (4H, m), 1.18 (12H, d, J = 6.7 Hz).
(實施例8) X18 -Am1s -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Te2s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1t -H(序列識別號40) 於核酸自動合成裝置，將ABI 392 DNA/RNA Synthesizer(Applied Biosystems製)作為固相撐體，使用NittoPhase UnyLinker 100, 10μmol(日東電工製)，以亞磷醯胺法(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))合成寡核苷酸序列15e_001後，進一步使用實施例2所合成的2D作為GlcNAc單元Amidite，進行1次縮合。藉由將經保護的寡核苷酸類似物以6mL濃氨水處理而將寡聚物自支持體切出的同時，將磷原子上之保護基氰基乙基與核酸鹼基上之保護基脫離。使用Clarity QSP(Phenomenex製)，按照附隨的規程進行純化。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端起第92號至106號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6247.96)
(實施例9) X18 -Am1s -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1t -H(序列識別號40) 使用為上述序列的15e_001.5替代實施例8所使用的序列，與實施例8同樣地進行合成。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端第92號至第106號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6233.97)
(實施例10) X18 -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1s -Ce2t -H(序列識別號44) 使用為上述序列的15e_005.5替代實施例8所使用的序列，與實施例8同樣地進行合成。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端91號至第105號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6235.97)
(實施例11) X18 -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1s -Ce2s -Um1t -H(序列識別號45) 使用為上述序列之15e_006.5替代實施例8所使用的序列，與實施例8同樣地進行合成。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端第90號至第104號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6200.94)
(實施例12) X18 -Am1s -Am1s -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1t -H(序列識別號42) 使用為上述之序列的16e_001.5替代實施例8所使用的序列，與實施例8同樣地進行合成。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端92號至第107號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6593.02)
(實施例13) X18 -Am1s -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1s -Ce2t -H(序列識別號47) 使用為上述之序列的16e_002.5替代實施例8所使用的序列，與實施例8同樣地進行合成。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端91號至第106號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6595.01)
(實施例14) X18 -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1s -Ce2s -Um1t -H(序列識別號48) 使用為上述序列的16e_003.5替代實施例8所使用的序列，與實施例8同樣地進行合成。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端90號至第105號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6571.98)
(實施例15) X20 -Am1s -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1t -H(序列識別號40) 藉由使用實施例4製作的化合物4D替代作為GalNAc單元Amidite之化合物2D，將X18 之部分與X20 置換，與實施例8同樣地進行合成。使用的序列為上述序列15e_001.5。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端92號至第106號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6261.98)
(實施例16) X20 -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1s -Ce2t -H(序列識別號44) 將序列設為上述序列15e_005.5，與實施例15同樣地進行合成。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端91號至第105號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6264.00)
(實施例17) X20 -Am1s -Am1s -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1t -H(序列識別號42) 將序列設為上述序列16e_001.5，與實施例15同樣地進行合成。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端92號至第107號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6621.04)
(實施例18) X20 -Am1s -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1s -Ce2t -H(序列識別號47) 將序列設為上述序列16e_002.5，與實施例15同樣地進行合成。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端91號至第106號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6623.05)
(實施例19) X21 -Am1s -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1t -H(序列識別號40) 藉由使用實施例5所合成的化合物5D作為GalNAc單元Amidite，將X18 之部分與X21 置換，與實施例8同樣地進行合成。使用的序列為上述序列15e_001.5。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端92號至第106號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6290.02)
(實施例20) X22 -Am1s -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1t -H(序列識別號40) 藉由使用實施例6所合成的化合物6D作為GalNAc單元Amidite，將X18 之部分置換為X22 ，與實施例8同樣地進行合成。使用的序列為上述序列15e_001.5。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端92號至第106號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6175.96)
(實施例21) X22 -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1s -Ce2t -H(序列識別號44) 將序列設為上述序列15e_005.5，與實施例20同樣地進行合成。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端91號至第105號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6177.98)
(實施例22) X22 -Am1s -Am1s -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1t -H(序列識別號42) 將序列設為上述序列16e_001.5，與實施例20同樣地進行合成。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端92號至第107號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6535.03)
(實施例23) X22 -Am1s -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Ae2s -Um1s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1s -Ce2t -H(序列識別號47) 將序列與上述序列16e_002.5置換，與實施例20同樣地進行合成。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因的外顯子5之自5’末端91號至第106號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6537.05)
(實施例24) X20 -Ge2s -Ce2s -As -Ts -Ts -Gs -Gs -Ts -As -Ts -Te2s -Ce2s -Ae2t -H (序列識別號96) 使用與人類脂蛋白元B(human apolipoprotein B，APOB) GenBank登錄號NM_000384.2之核酸序列10177-10189互補的上述序列替代實施例15所使用的序列，與實施例15同樣地合成GalNAc單元與寡核苷酸之結合物(ApoB-ASO結合物)。又，於相同方法，於有上述序列之寡核苷酸合成的階段中結束合成，進行切出・回收，而合成未結合GalNAc單元的寡核苷酸(ApoB-ASO)。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：5296.83(ApoB-ASO結合物)、4392.50(ApoB-ASO))
(試驗例1)使用培養細胞之利用實施例化合物的異常剪接的修復評價 (1-1)293A細胞(人類胎兒腎細胞)之培養 如以下方式，進行293A細胞(R705-07 invitrogen)之培養。 將293A細胞於維持培養基(DMEM、10%FBS)維持培養。於實驗，以2x105 個細胞/孔密度於6孔盤中接種細胞，以1x105 個細胞/孔之密度於12孔盤接種細胞，次日，如後述同時導入實施例之化合物、及質體載體(plasmid vector)，並用於評價。
(1-2)人類G6PC全長質體載體製作 如以下方式，製作人類G6PC全長質體載體(pcDNA hG6PC,pcDNA hG6PC (c.648G＞T) + Int4)。 將人多組織(Human Multiple Tissue)cDNA板作為模板，使用下述G6PC cDNA擴增引子而將G6PC cDNA擴增後，再以G6PC cDNA IF引子進行擴增。利用InFusion系統，將經擴增的片段插入至pcDNA3.1之BamHI位(pcDNA hG6PC)。
G6PC cDNA擴增引子： 正向引子 5’-ATAGCAGAGCAATCACCACCAAGCC-3’ (序列識別號49) 反向引子5’-ATTCCACGACGGCAGAATGGATGGC-3’ (序列識別號50) G6PC IF引子： 正向引子5’-TACCGAGCTCGGATCCACCACCAAG CCTGGAATAACTGC-3’(序列識別號51)、 反向引子5’-CTGGACTAGTGGATCCTGGCATGGTTG TTGACTTTAAAC-3’(序列識別號52)
將人類基因體DNA作為模板，使用下述G6PC Int4擴增引子而將一部分包含G6PC內含子4與外顯子5的區域進行擴增，再將G6PC內含子4以G6PC Int4 IF引子進行擴增。又，將STEP1-1作成之pcDNA hG6PC使用下述hG6PC載體IF引子而擴增。又，InFusion引子中導入外顯子5內之c.648G＞T變異。利用InFusion系統將兩片段連結，將G6PC內含子4序列插入於pcDNA hG6PC內(pcDNA hG6PC (c.648G＞T) + Int4)。
G6PC Int4擴增引子： 正向引子 5’-TCTGGGCTGTGCAGCTGAATGTCTG-3’ (序列識別號53) 反向引子5’-GTAGGGGATGACACTGACGGATGCC-3’ (序列識別號54)
G6PC Int4 IF引子： 正向引子 5’-CTGGAGTCCTGTCAGGTATGGGC-3’ (序列識別號55) 反向引子5’-AGCTGAAAAGGAAGAAGGTAATGAG-3’ (序列識別號56)
hG6PC載體IF引子： 正向引子 5’-TCTTCCTTTTCAGCTTCGCCATCGG-3’ (序列識別號57) 反向引子5’-CTGACAGGACTCCAGCAACAAC-3’ (序列識別號58)
(1-3)實施例之化合物、及質體載體之共轉染 如以下方式，將實施例之化合物及質體載體進行共轉染。 製作下述A液與B液後，進行混合。 於6孔盤實施的情形，對於每1孔，準備作為A液之250μL Opti-MEM 培養基(gibco)、0.50μL質體載體(1mg/mL)、4.0μL(最終： 20nM)實施例所製造的化合物(12.5μM)，作為B液之250 μL Opti-MEM 培養基(gibco)、6.0μL Lipofectamine2000 (Invitrogen)，將A液與B液混合。於12孔盤實施的情形，對於每1孔，準備作為A液之125 μL Opti-MEM 培養基(gibco)、0.25 μL質體載體(1mg/mL)、2.0μL(最終： 20nM)實施例所製造的化合物(12.5μM)，作為B液之125μL Opti-MEM 培養基(gibco)、3.0μL Lipofectamine 2000(Invitrogen)，將A液與B液混合。 將上述之混合液，於室溫培養20分鐘後，添加至繼代次日之細胞(共轉染)。添加6小時後與新鮮的維持培養基進行交換，自上述混合液添加後於CO2 恒溫箱中培養24小時。
(1-4)利用RT-PCR的mRNA的評價 [1]RNA提取(活體外) 如以下方式進行RNA的抽取。 將共轉染後培養24小時的細胞，以冷PBS洗淨1次。將RNeasy 迷你套組或RNeasy 96 套組(Qiagen)之細胞溶解液，各添加300μL於1孔中，於室溫培養5分鐘後回收。對於回收液，按照含有DNase處理的套組的規程進行RNA純化。DNase處理係使用RNase-Free DNase套組(Qiagen 89254)。純化・溶析的RNA進行後述之反轉錄反應。
[2]反轉錄反應 如以下方式進行反轉錄反應。 將抽取RNA調整為25～100mg/mL後，使用高容量 (High Capacity)RNA-to-cDNA 套組(Applied biosystems)，以每1樣品成為10μL 緩衝液混合物(Buffer mix)、1μL 酶混合物(Enzyme mix)、9μL純水、＋抽取RNA之方式混合，而進行反轉錄反應(37℃60分鐘，95℃ 5分鐘，4℃維持)。 相對於反轉錄反應產物20μL，以純水80μL進行5倍稀釋，保存於-30℃。
[3]qRT-PCR(SYBR Green) 如下述，設計qRT PCR引子(SYBR Green)。 修復的hG6PC引子(SYBR)： 正向引子 5’-TTGTGGTTGGGATTCTGGGC-3’ (序列識別號59) 反向引子5’-ATGCTGTGGATGTGGCTGAA-3’ (序列識別號60) hActin引子(SYBR)： 正向引子 5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’ (序列識別號61) 反向引子5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’ (序列識別號62) 又將PCR反應液每1孔，懸浮5μL 2x FAST SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)、2μL純水、1μL引子混合物(Primer mix)(10μM)、2μLcDNA(已5倍稀釋)，以viia7(Applied Biosystems)進行PCR反應(程序：SYBR Green 試劑，FAST，包括熔解曲線))。
[4]qRT-PCR(Taqman試驗) 如下述，設計修復的hG6PC引子組、總hG6PC引子組，調整20x引子探針混合物(primer probe mix)(引子濃度： 1000nM；探針濃度： 250nM)。hActin引子組、mActin引子組直接使用母料原液。 修復的hG6PC引子組 (Taqman)： 正向引子 5’-GCTGCTCATTTTCCTCATCAAGTT-3’ (序列識別號63) 反向引子5’-TGGATGTGGCTGAAAGTTTCTGTA-3’ (序列識別號64) 探針5’-TCCTGTCAGGCATTGC-3’ FAM (序列識別號65) hActin引子組(Taqman)：ABI Hs01060665_g1 FAM mActin引子組(Taqman)： ABI Mm02619580_g1 FAM 18s引子組(Taqman)： ABI Hs99999901_s1 FAM 又於每1孔懸浮5μL 2x Taqman Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems)、2.5μL純水、0.5μL 20x引子探針混合物(10μM)、2μL cDNA (已5倍稀釋)，調整PCR反應液(每1管)，以viia7或Quantstadio7(Applied Biosystems公司)進行PCR反應(程序：Taqman試劑，FAST)。
(1-5)使用人類G6PC全長質體載體(pcDNA hG6PC (c.648G＞T) + Int4)的利用實施例之寡核苷酸的G6PC mRNA之異常剪接的修復評價 進行人類G6PC全長質體載體(pcDNA hG6PC (c.648G＞T) + Int4)與寡核苷酸(15e_001、15e_002、及作為對照之國際公開第2004/048570之實施例93之化合物)之共轉染，以qRT-PCR(SYBR Green)評價是否修復因G6PC (c.648G＞T)所致的異常剪接。其結果，於15e_001、15e_002之化合物，辨視到G6PC mRNA之異常剪接的正常化。
(試驗例2)使用模型小鼠的利用實施例化合物的異常剪接之修復評價 (2-1)小鼠之作出 載體之作成 按照下述順序，製作G6PC KI載體。 將小鼠基因體DNA作為模板，使用下述mG6PC 5’ 臂擴增引子，將G6PC 5’ 臂區域擴增。再者以mG6PC 5’ 臂 IF引子擴增後，插入至pBluescriptII(+/-)之XhoI 位(G6PC 5’ 臂載體)。 mG6PC 5’ 臂擴增引子： 正向引子 5’-GGGAAACATGCATGAAGCCCTGGGC-3’ (序列識別號67) 反向引子5’-TCCCTTGGTACCTCAGGAAGCTGCC-3’ (序列識別號68) mG6PC 5’ 臂 IF引子： 正向引子 5’-CGGGCCCCCCCTCGAAAACTAGGCCTG AAGAGATGGC-3’ (序列識別號69) 反向引子5’-TACCGTCGACCTCGAGGGTTGGCCTTG ATCCCTCTGCTA-3’ (序列識別號70)
接著將小鼠基因體DNA作為模板，使用下述mG6PC 3’ 臂擴增引子，將G6PC 3’ 臂區域擴增。再者以mG6PC 3’ 臂 IF引子擴增後，插入至G6PC 5’ 臂載體之NotI位(G6PC 5’+3’ 臂載體)。 mG6PC 3’ 臂擴增引子： 正向引子 5’-GGTTGAGTTGATCTTCTACATCTTG-3’ (序列識別號71) 反向引子5’-GCAAGAGAGCCTTCAGGTAGATCCC-3’ (序列識別號72) mG6PC 3’ 臂 IF引子： 正向引子 5’-AGTTCTAGAGCGGCCGCCCATGCAAA GGACTAGGAACAAC-3’ (序列識別號73) 反向引子5’-ACCGCGGTGGCGGCCAATGTTGCCTG TCTTCCTCAATC-3’ (序列識別號74)
將先前所述之pcDNA hG6PC (c.648G＞T) + Int4作為模板，使用下述hG6PC + Int4 IF引子而將hG6PC (c.648G＞T)+內含子4進行擴增。又，將G6PC 5’+3’ 臂載體作為模板，使用下述臂載體IF引子而擴增。將兩片段使用InFusion系統連結而作成G6PC KI載體。 hG6PC + Int4 IF引子： 正向引子 5’-GGCCAACCCTGGAATAACTGCAAGGG CTCTG-3’ (序列識別號75) 反向引子5’-TTGCATGGTTGTTGACTTTAAACACCG AAGA-3’ (序列識別號76) 臂載體IF引子： 正向引子 5’-TCAACAACCATGCAAAGGACTAGG AACAAC-3’ (序列識別號77) 反向引子5’-ATTCCAGGGTTGGCCTTGATCCCTCTG CTA-3’ (序列識別號78) 於pSPgRNA(addgene)之gRNA序列導入區域中，導入下述KI 5’ gRNA、KI 3’ gRNA序列而製作pSPgRNA(KI 5’)、pSPgRNA(KI 3’)。 KI 5’ gRNA：5’-GGGATCAAGGCCAACCGGCTGG-3’ (序列識別號79) KI 3’ gRNA：5’-TAAAGTCAACCGCCATGCAAAGG-3’ (序列識別號80)
(2-2)顯微注射 使用滅菌蒸餾水，以最終濃度為G6PC KI載體10ng/μL、pSPgRNA(KI 5’) 5ng/μL、pSPgRNA(KI 3’) 5ng/μL、pSPCas9(addgene)5ng/μL之方式調整各種載體後，注射通過MILLEX-GV針筒過濾器(Millipore)者直到C57BL/6J小鼠受精卵之前核充分膨脹的程度為止(約2pL)。將該受精卵移植至接受者C57BL/6J小鼠的輸卵管，取得F0小鼠。
(2-3)基因分型(Genotyping)、F1系統化 以下列順序實施基因分型，並進行F1系統化。 使用核酸自動抽取裝置(PI-200 KURABO)及專用套組，自F0小鼠之尾組織抽取基因體DNA。將抽取DNA使用Amplitaq Gold Master mix (Thermo fisher)及下述KI篩選引子而擴增(95℃ 10分鐘、(95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒) 35次循環，72 ℃ 2分鐘，4℃維持)。 KI篩選引子： 正向引子 5’-TACGTCCTCTTCCCCATCTG-3’ (序列識別號81)、 反向引子5’-CTGACAGGACTCCAGCAACA-3’ (序列識別號82) 對於上述PCR產物，實施膠體電泳，將於433bp附近觀察到帶的個體之基因體DNA作為模板，使用PrimeSTAR GXL(takara)及下述KI 基因分型引子而進行擴增(98℃ 2分鐘、(95℃ 15秒、68℃ 5分鐘) 38次循環，68 ℃ 7分鐘、15℃維持)。 KI 基因分型引子 (5’)： 正向引子 5’-TTCCTTCCAAAGCAGGGACTCTCTATG T-3’ (與序列識別號83相同(1)) 反向引子5’-CTTGCAGAAGGACAAGACGTAGAAG ACC-3’ (與序列識別號84相同(2)) KI 基因分型引子 (3’)： 正向引子 5’-GAGTCTATATTGAGGGCAGGCTGGA GTC-3’ (序列識別號85)、 反向引子5’-TAGTCTGCCTGCTCACTCAACCTC TCCT-3’ (序列識別號86) 對於上述PCR產物實施膠體電泳。使用基因分析儀(Gentetic analyzer)(Lifetechnology)及下述KI定序引子，對 使用KI 基因分型引子(5’)及KI基因分型引子(3’)之任一者均觀察到擴增為所期待的序列長度(4705bp、4026bp)的個體之基因體DNA的KI 基因分型引子(5’)的PCR產物進行直接定序。將可確認到所期待的序列之KI者設為KI陽性F0。 KI定序引子 (5’)： 5’-GAGTCTATATTGAGGGCAGG CTGGAGTC-3’ (序列識別號87) 將KI陽性F0與C57BL/6J交配而取得F1。由F1之耳殼組織，使用DNeasy 96血液及組織套組(DNeasy 96 Blood & Tissue Kit)(Qiagen)而抽取基因體DNA，使用PrimeSTAR GXL(takara)及先前所述KI 基因分型引子(5’)而擴增(98℃ 2分鐘，(95℃ 15秒，68℃ 5分鐘) 38次循環、68 ℃ 7分鐘，15℃維持)。 對於上述PCR產物實施膠體電泳，將觀察到擴增為所期待的序列長度(4705b)的個體設為KI陽性F1。將自KI陽性F1之中篩選的1株進行繁殖，作為hG6PC (c.648G＞T) + Int4 KI系統。
(2-4)hG6PC (c.648G＞T) + Int4系統之基因分型 使用DNeasy 96 血液及組織 套組(Qiagen)，由耳殼組織，抽取基因體DNA，使用KOD FX(TOYOBO)及下述KI 基因分型引子、mG6PC WT引子，進行複合擴增(98℃ 2分鐘，(95℃ 15秒，68℃ 5.5分鐘) 32 循環、68 ℃ 5分鐘，4℃維持)。 KI 基因分型引子 (5’)： 正向引子 5’-TTCCTTCCAAAGCAGGGACTCT CTATGT-3’ (與序列識別號83相同(1)) 反向引子5’-CTTGCAGAAGGACAAGACGTAG AAGACC-3’ (與序列識別號84相同(2)) mG6PC WT引子 ： 正向引子 5’-TAAATTTGACCAATGAGCACTGG AGGTC-3’ (序列識別號88) 反向引子5’-AAAATCATGTGTATGCGTGCCTTT CCTA-3’ (序列識別號89)’ 對於上述PCR產物進行膠體電泳，將4705b附近的擴增設為KI對偶基因，將2536 bp附近的擴增作為mG6PC WT對偶基因，判斷後代之基因分型(WT、Ht、Homo)。
(2-5)小鼠之材料收集 如以下方式進行小鼠之材料收集。 於材料收集前日之傍晚，設置用以避免食糞的地網後，開始絕食。次日，於麻醉導入下進行開腹，充分放血後，摘出肝臓、腎臓。各臓器以冰冷PBS洗淨後，修整成適當大小，保存於事先已置入均質小珠(Nikkato)的試管。各臓器以液態氮瞬間冷卻後，於-80℃保存。
(2-6)利用qRTPCR的mRNA之評價 [1]RNA抽取(活體內) 如以下方式進行RNA的抽取。 每一組織保存管，各添加600 μL之RNeasy 迷你套組或Qiacube系統(Qiagen)之細胞溶解液，以tissue lyserII (Qiagen)以25kHz均質化2分鐘。冰冷下培養10分鐘後，以8000G於室溫離心10分鐘，回收上清液。對於上清液，按照包含DNase處理的各套組之規程，進行RNA純化。於DNase處理使用RNase-Free DNase套組 (Qiagen)。經純化・溶析的RNA係進行先前所述的反轉錄反應，按照先前所述之qRT-PCR(Taqman分析)，進行修復G6PC mRNA之定量。
(2-7)使用hG6PC (c.648G＞T) + Int4 Ht KI小鼠的利用實施例化合物的異常剪接之修復評價 對於hG6PC (c.648G＞T) + Int4 Ht KI小鼠，將實施例8～14之化合物溶解於大塚生食注，並以成為30mg/kg的方式實施皮下投予。投予7日後，於絕食一晩條件下採取小鼠之肝臓組織，以qRT-PCR(Taqman)評價是否修復因G6PC (c.648G＞T)所致的異常剪接，結果如圖1所示，藉由實施例8～14之化合物，於hG6PC (c.648G＞T) + Int4 Ht KI小鼠之肝臓中，可觀察到mRNA之異常剪接的正常化。 又，對於實施例15～23之化合物同樣地評價，結果如圖2所示，藉由實施例15～23之化合物，於hG6PC (c.648G＞T) + Int4 Ht KI小鼠之肝臓中，可觀察到mRNA之異常剪接的正常化。
(試驗例3) 利用ApoB Knock down試驗的GalNAc單元結合物所致的對肝臓細胞之寡核苷酸遞送性能評價 (3-1)人類初代肝細胞之培養 如以下方式，進行人類初代肝細胞之培養。 於改良的Lanford培養基(日水製藥)中添加FBS (Gibco)使成為10%，調製附著培養基。自液態氮槽取出人類冷凍初代肝細胞(Gibco、Hu8105)，於37℃融解後，立即注入CHRM (Invitrogen)中，溫和地混和後，於室溫離心(100 g, 10分鐘)。以吸引器去除上清液後，添加加熱至37℃的附著培養基而調製細胞懸浮液。活細胞數以自動計數器(BioRAD)計數後，將細胞接種於經膠原蛋白塗覆的24孔盤(接種活細胞數：1.4～2.1 x 105 個細胞/孔)。CO2 恒溫箱中培養4～5小時後，以顯微鏡確認細胞附著，進行後述之化合物添加實驗。
(3-2)實施例化合物之添加 如以下方式，對人類初代肝細胞進行實施例化合物之添加。 含有10%FBS的經改良的Lanford培養基中添加未結合有GalNAc衍生物的參考例45之化合物、或結合有GalNAc衍生物的實施例208之化合物，調製含有目的濃度(以下記載的ApoB mRNA表現評價(1)中100 nM，ApoB mRNA表現評價(2)中10 nM及100 nM)之化合物的培養基。吸引去除24孔盤培養的人類初代肝細胞之各自孔的培養基後，各添加含有化合物的培養基0.5 mL，開始培養。72小時後，進行後述的RNA抽取實驗。
(3-3)利用qRT-PCR的mRNA的評價 [1]RNA抽取(活體外) 如以下方式進行RNA的抽取。 吸引去除培養後之人類初代肝細胞之各孔的含有化合物的培養基後，以冰冷的PBS(0.5 mL)洗淨。將於RNeasy 迷你QIAcube 套組 (Qiagen)之RLT緩衝液中添加1/100量之2-巰乙醇者作為細胞溶解液，於每1孔各添加400μL細胞溶解液，於室溫培養5分鐘後回收。自回收液350 μL，使用QIAcube，以RNeasy迷你-動物組織及細胞-DNase消化(RNeasy Mini - Animal tissues and cells - DNase digest)之規程進行RNA純化。於DNase處理使用RNase-Free DNase 套組(Qiagen)。經純化・溶析的RNA進行後述之反轉錄反應。
[2]反轉錄反應 如以下方式進行反轉錄反應。 將抽取RNA調整為25～100 mg/mL後，使用高容量 RNA-to-cDNA 套組(Applied biosystems)，以每1樣品成為10μL 緩衝液混合物、1μL 酶混合物、9μL純水、＋抽取RNA之方式混合而進行反轉錄反應(37℃60分鐘、95℃ 5分鐘、4℃維持)。對反轉錄反應產物20μL以純水80μL進行5倍稀釋而保存於-30℃，或進行以下之qRT-PCR評價。
[3]qRT-PCR(Taqman試驗) 使用以下之ApoB引子探針組(x20)、Actinb引子探針組(x20)。 ApoB引子探針組(x20)(Taqman)：ABI Hs00181142_m1 FAM Actinb引子探針組(x20)(Taqman)：ABI Hs01060665_g1 FAM 又於每1孔懸浮5μL 2x Taqman Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems)、2.5μL純水、0.5μL 20x引子探針混合物(10μM)、2μL cDNA (已5倍稀釋)，調整PCR反應液(每1管)，以Quantstadio7(Applied Biosystems公司)進行PCR反應(95℃20秒，(95℃ 1秒，60℃20秒) 40次循環，4℃維持)。將Actinb作為內在性對照，將ApoB mRNA的表現量進行相對評價。
(3-4)使用人類肝培養細胞的利用實施例化合物所致的ApoB mRNA表現抑制評價(2) 與人類初代肝細胞之接種同時添加調整為10 nM及100 nM的實施例24所合成的化合物，培養72小時後的細胞ApoB mRNA的表現以qRT-PCR(Taqman分析)評價。將化合物無添加之4孔之ApoB mRNA的表現平均設為100%時，如圖3所示，使用10 nM的情形，ApoB-ASO顯示4.4%的表現抑制，ApoB-ASO結合物顯示30.3%的表現抑制。使用100 nM的情形，ApoB-ASO表示41.2%的表現抑制，ApoB-ASO結合物顯示68.6%的表現抑制。此係表示結合有GalNAc衍生物的化合物，較未結合有GalNAc衍生物的化合物可更強地抑制表現。
(實施例25)GalNAc部位之6位羥基上與具有4,4’-二甲氧基三苯甲基的GalNAc單元結合的寡核苷酸之DMTr-on離子交換管柱純化 (1)寡聚物之合成與混合液之調製 進行實施例16記載的化合物之合成。惟，於核酸自動合成裝置使用AKTA Oligopilot(GE Healthcare製)，使用作為固相撐體之Primer Support 5G Unylinker 350, 390μmol(GE Healthcare製)，使用適合規模的合成程序。合成結束後，獲得具有目的之寡核苷酸序列，且GalNAc部位之6位羥基經4,4’-二甲氧基三苯甲基保護的結合物與寡核苷酸類似物之混合物。將獲得的混合物分割成2份，藉由各自以25mL的濃氨水進行處理，將寡核苷酸自支持體切出的同時，脫除磷原子上之保護基氰基乙基與核酸鹼基上之保護基，使用附過濾器的試管進行過濾，獲得含有目的之結合物的寡核苷酸之混合液(25mL)(2管)。 於純化裝置使用AKTA pure150(GE HEALTHCARE製)，將填充劑SOURCE 15Q (96mL)(GE HEALTHCARE製)填充至管柱FineLINE Pilot(35mm x 100mm)(GE HEALTHCARE製)，以下列之方法，將上述寡核苷酸混合物分2次進行純化。將UV檢測波長設定為(260nm、280nm、350nm)，將以下之3個步驟使用作為一個純化程序。此等之步驟中，管柱通過液之檢測，將檢測長260nm及350nm之吸收的層析圖示於圖5。
(i)DMTr-on寡核苷酸之對管柱的吸附步驟 將流速設定為40ml/min，使緩衝液A1(10mM 氫氧化鈉水溶液)以1CV流通。流速變更為10ml/min，將寡核苷酸混合物(25mL)添加至管柱上部，將緩衝液A1(10mM 氫氧化鈉水溶液)進行170mL分流。接著，將流速設定為40ml/min，將緩衝液A1(10mM 氫氧化鈉水溶液)以1CV流通。接著，藉由將緩衝液A1(10mM氫氧化鈉水溶液)：緩衝液B1(10mM 氫氧化鈉/2M氯化鈉水溶液)(35：65)以6CV流通，將未結合有X20 的寡核苷酸及不純物洗出。最後，將緩衝液A1(10mM 氫氧化鈉水溶液)以2CV流通。
(ii)管柱上之脫DMTr化步驟 將流速設定為40ml/min，將緩衝液A2(0.4% 三氟乙酸水溶液)以1CV流通。接著，將流速變更為20ml/min，藉由以6.25CV流通，進行吸附於管柱填充劑上的X20 結合的寡核苷酸之脫DMTr化。
(iii)目的物之溶析步驟 將流速設定為40ml/min，將緩衝液A1(10mM 氫氧化鈉水溶液)以3CV流通，而進行平衡化。緩衝液A1(10mM 氫氧化鈉水溶液)：緩衝液B1(10mM 氫氧化鈉/2M氯化鈉水溶液)自(75：25)至(25：75)之梯度(15CV)後，將緩衝液B1(10mM氫氧化鈉/2M氯化鈉水溶液)以2CV流通，將經脫DMTr化的寡核苷酸分劃(將分劃量設為48mL)。
溶析中，對於經UV檢測(260nm)的劃份，使用微量分光光度計Xpose(Trinean製)而確認，獲得劃份溶液(第1次：432ml、第2次：480ml)(圖5)。 使用管柱一次後，於進行下一次純化之前，使用含有30%異丙基醇的2M氯化鈉水溶液進行洗淨。
(2)濃縮、透析、冷凍乾燥 將劃份溶液(第1次：432ml、第2次：480ml)收集成1個，添加適量之乙酸，調製為pH7.5-8.0。之後，使用裝載Xampler ultrafiltration cartridge3K, 140cm2 (GE HEALTHCARE)的KR2i TFF系統(Repligen)而濃縮後，以大塚蒸餾水進行透析後，冷凍乾燥。獲得標題目的物之冷凍乾燥粉末(計1.14g)。
(比較例1)寡核苷酸附近導入DMTr基的結合物之DMTr-on離子交換管柱純化 為了與實施例25比較，將以下所示經X13 構成的GalNAc結合物進行DMTr-on離子交換管柱純化。能將X13 所含的GalNAc上之3位羥基、4位羥基、6位羥基之保護基統一為乙醯基。據此，因於合成步驟不需區別保護基，GalNAc單元部分之合成變得容易。再者，於固相合成合成步驟中藉由調整與寡核苷酸5’末端側的偶合次數，可簡便地增減GalNAc數。然而，寡聚物之固相合成結束後，僅可殘留1個4,4’-二甲氧基三苯甲基。
[比較例1-1]對應X13的GalNAc單元Amidite(化合物Ref1F)之合成 (Ref1A) N-[2-[2-[(2R)-3-苄氧基-2-羥基-丙氧基]乙氧基]乙基]胺甲酸9H-茀-9-基甲酯(化合物Ref1A)之合成
Figure 02_image154
使文獻已知化合物之N-[2-(2-羥基乙氧基)乙基]胺甲酸9H-茀-9-基甲酯(Bioconjugate Chemistry,2000,11,755-761)(3.11g, 10mmol)與苄基(S)-(+)-環氧丙基醚(0.8g, 5mmol)溶解於二氯甲烷(30mL)，添加三氟化硼-二乙基醚錯合物(0.1mL, 1mmol)，於室溫攪拌16小時。反應結束後，添加飽和碳酸氫鈉水溶液。將有機層以飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥、過濾，將溶媒減壓餾除而獲得粗生成物。以矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯＝80：20-0：100, v/v)純化，獲得油狀之目的物Ref1A(0.74g、產率30%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.76 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.60 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.42-7.37 (2H, m), 7.35-7.27 (7H, m), 5.40 (1H, s), 4.53 (2H, s), 4.39 (2H, d, J = 6.7 Hz), 4.25-4.19 (1H, m), 4.04-3.97 (1H, m), 3.69-3.35 (12H, m). 計算之C29 H33 NO6 ： [M+H]+ 492，實測492.
(Ref1B)(2R)-1-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]-3-苄氧基-丙烷-2-醇、三氟乙酸鹽(化合物Ref1B)之合成
Figure 02_image156
將步驟(Ref1A)所合成的化合物Ref1A(13.8g, 28.1mmol)溶解於乙醇/四氫呋喃(50mL/50mL)，添加1N氫氧化鈉水溶液(100mL)，於室溫攪拌2小時。反應結束後，減壓餾除有機溶媒，添加1N鹽酸(100mL)。藉由過濾去除生成的固形物。將為通過液的水層中所含的副生成物以乙酸乙酯抽取，減壓餾除後所獲得的殘渣中加入乙腈並過濾。將通過液進行減壓餾除而獲得粗生成物。以將0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶離液的逆相HPLC(GL SCIENCE、Inertsil ODS-3)進行分離純化，收集含目的物的劃份，將溶媒減壓餾除，獲得油狀之目的物Ref1B(7.1g、產率66%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.38-7.27 (5H, m), 4.55 (2H, s), 4.07-3.99 (1H, m), 3.77-3.48 (10H, m), 2.96-2.88 (2H, m).
(Ref1C) 乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-3,4-二乙醯氧基-6-[2-[2-[2-[(2R)-3-苄氧基-2-羥基-丙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物Ref1C)之合成
Figure 02_image158
將文獻已知化合物之2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙酸(WO2012037254)(6g, 14.8mmol)、1-(-3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺 鹽酸鹽(3.4g, 17.8mmol)、3H-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶-3-醇(2.0g, 14.8mmol)、N,N-二異丙基乙基胺(9.0mL, 51.8mmol)、步驟(Ref1B)所合成的化合物Ref1B(6.7g, 17.5mmol)溶解於二氯甲烷(130mL)，於室溫攪拌4小時。反應結束後，將有機層以1N鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥、過濾，將溶媒減壓餾除而獲得粗生成物。減壓餾除溶媒，獲得粗生成物。以矽膠管柱層析(乙酸乙酯：甲醇＝100：0-90：10, v/v)純化，獲得非晶質狀之目的物Ref1C(7.9g、產率81%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.39-7.28 (5H, m), 7.00-6.93 (1H, m), 6.50-6.44 (1H, m), 5.33-5.29 (1H, m), 5.16 (1H, dd, J = 11.5, 3.6 Hz), 4.63-4.53 (3H, m), 4.34 (1H, d, J = 15.1 Hz), 4.22-3.83 (5H, m), 3.73-3.26 (13H, m), 2.15 (3H, s), 2.05 (3H, s), 1.99 (6H, s). 計算之C30 H44 N2 O14 ： [M+H]+ 657，實測657.
(Ref1D)乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-3,4-二乙醯氧基-6-[2-[2-[2-[(2R)-2,3-二羥基丙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物Ref1D)之合成
Figure 02_image160
將步驟(Ref1C)所合成的化合物Ref1C(7.9g, 12mmol)溶解於乙醇(80mL)。添加20%氫氧化鈀/碳(濕)(2.0g)，氫氣環境下，於50℃劇烈攪拌8小時。反應結束後、過濾，將獲得的通過液減壓餾除。獲得非晶質狀之目的物Ref1D(6.7g、產率98%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.03-6.98 (1H, m), 6.43 (1H, d, J = 9.1 Hz), 5.35 (1H, d, J = 3.3 Hz), 5.15 (1H, dd, J = 11.2, 3.3 Hz), 4.58 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.35 (1H, d, J = 15.7 Hz), 4.28-3.82 (5H, m), 3.77-3.34 (13H, m), 2.18 (3H, s), 2.06 (3H, s), 2.03 (3H, s), 2.01 (3H, s). 計算之C23 H38 N2 O14 ： [M+H]+ 568，實測568.
(Ref1E) 乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-3,4-二乙醯氧基-6-[2-[2-[2-[(2S)-3-[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]-2-羥基-丙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物Ref1E)之合成
Figure 02_image162
於步驟(Ref1D)所合成的化合物Ref1D(6.8g, 12mmol)中添加適量之吡啶，減壓下，進行共沸。使溶解於吡啶(40mL)，添加4,4’-二甲氧基三苯氯甲烷(4.5g, 13mmol)，於室溫攪拌2小時。反應結束後，將溶媒減壓餾除。添加適量之甲苯並共沸後，獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析(乙酸乙酯：乙酸乙酯/甲醇(5/1)＝100：0-50：50, v/v、含有1%三乙基胺)純化，獲得非晶質狀之目的物Ref1E(6.9g、產率66%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.42 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.33-7.19 (7H, m), 7.01-6.94 (1H, m), 6.83 (4H, d, J = 9.1 Hz), 6.37 (1H, d, J = 8.5 Hz), 5.33 (1H, d, J = 3.3 Hz), 5.15 (1H, dd, J = 11.2, 3.3 Hz), 4.58 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.32 (1H, d, J = 15.7 Hz), 4.22-3.86 (5H, m), 3.79 (6H, s), 3.66-3.12 (13H, m), 2.13 (3H, s), 2.03 (3H, s), 1.97 (3H, s), 1.95 (3H, s). 計算之C44 H56 N2 O16 ： [M+Na]+ 893，實測892.
(Ref1F) 乙酸[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-3,4-二乙醯氧基-6-[2-[2-[2-[(2S)-3-[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]-2-[2-氰基乙氧基-(二異丙基胺基)磷烷基]氧基-丙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基-乙氧基]四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物Ref1F)之合成
Figure 02_image164
將步驟(Ref1E)所合成的化合物Ref1E(6.9g, 7.9mmol)以適量甲苯共沸後，溶解於二氯甲烷(80mL)。添加N,N-二異丙基乙基胺(5.5mL, 32mmol)、2-氰基乙基二異丙基氯亞磷醯胺(2.1mL, 9.5mmol)，並於室溫攪拌1小時。反應結束後，將溶媒減壓餾除，獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析(乙酸乙酯：乙酸乙酯/甲醇(5/1)＝100：0-50：50, v/v、1%三乙基胺含有)純化，獲得非晶質狀之目的物Ref1F(6.6g、產率78%)。1 H-NMR (CDCl3 ) δ： 7.47-7.40 (2H, m), 7.35-7.17 (7H, m), 6.98-6.91 (1H, m), 6.85-6.78 (4H, m), 6.05-5.89 (1H, m), 5.37-5.33 (1H, m), 5.17-5.07 (1H, m), 4.59-4.49 (1H, m), 4.37-4.30 (1H, m), 4.23-3.06 (28H, m), 2.69-2.42 (2H, m), 2.15 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.02-1.98 (3H, m), 1.97-1.94 (3H, m), 1.30-1.00 (12H, m).
[比較例1-2]導入有X13的結合物之合成 HO-X13 -X13 -X13 -Am1s -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Te2s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1t -H (序列識別號40) 藉由使用化合物Ref1F作為GalNAc單元Amidite而將X18 之部分置換為X13 ，與實施例8同樣地進行合成。惟，GalNAc單元Amidite之付加反應係重複3次，使3個X13結合。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因之外顯子5自5’末端第92號至第106號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6878.11)。
[比較例1-3]於5’末端側與具有4,4’-二甲氧基三苯甲基的GalNAc單元結合的寡核苷酸之DMTr-on離子交換管柱純化 (1)寡聚物之合成與混合液之調製 HO-X13 -X13 -X13 -Am1s -Ae2s -Um1s -Cm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Te2s -Gm1s -Gm1s -Ce2s -Gm1s -Am1s -Ae2s -Gm1t -H (序列識別號40) 於核酸自動合成裝置使用AKTA Oligopilot(GE Healthcare製)，使用Primer Support 5G Unylinker 350, 390μmol(GE Healthcare製)作為固相撐體，並使用適合規模的合成程序。 使用獲得的固相撐體之中10μmol，以ABI 392 DNA/RNA Synthesizer(Applied Biosystems製)縮合3次GalNAc單元X13。合成結束後，獲得具有目的之寡核苷酸序列，且於5’末端側與具有4,4’-二甲氧基三苯甲基的GalNAc單元結合的寡核苷酸類似物之混合物。藉由以6mL之濃氨水進行處理，而自支持體切出寡核苷酸的同時，移除磷原子上之保護基氰基乙基與核酸鹼基上之保護基。
純化方法1：Clarity QSP(Phenomenex製)純化 與實施例8同樣地純化時，獲得標題目的物。 本化合物之鹼基序列為與智人葡萄糖-6-磷酸酶催化次單元(G6PC)，轉錄變體1，mRNA (NCBI-GenBank登錄號NM_000151.3)之核苷酸第728號之自G變異成T之c.648G＞T變異G6PC基因之外顯子5之自5’末端第92號至第106號互補的序列。化合物利用負離子ESI質量分析進行鑑定(實測值：6878.11)。
純化方法2：DMTr-on離子交換管柱純化 將寡核苷酸混合物進行DMTr-on離子交換管柱純化前，取代為10mM 氫氧化鈉水溶液。
於純化裝置使用AKTA pure150(GE HEALTHCARE製)，於純化管柱使用RESOURCE Q 6mL (GE HEALTHCARE製)，藉由以下之方法，純化上述寡核苷酸混合物。將UV檢測波長設定為(260nm)，使用以下之3個步驟作為一個純化程序。將此等步驟中之管柱通過液之檢測波長260nm的層析圖示於圖6。
(i)DMTr-on寡核苷酸之對離子交換管柱的吸附步驟 以流速3ml/min將緩衝液A1(10mM 氫氧化鈉水溶液)以2CV流通。以流速2ml/min將寡核苷酸混合物(1.5mL、10mM 氫氧化鈉水溶液)添加至管柱上部，將緩衝液A1(10mM 氫氧化鈉水溶液)以2.5CV流通。接著，於流速3ml/min將緩衝液A1(10mM 氫氧化鈉水溶液)以1CV流通後，以流速2.4ml/min流通緩衝液A1(10mM 氫氧化鈉水溶液)：緩衝液B1(10mM 氫氧化鈉/2M氯化鈉水溶液)(40：60～25：75以2CV、25：75以4CV)流通。
(ii)離子交換管柱上之脫DMTr化步驟 以流速1.2ml/min將緩衝液A2(0.4% 三氟乙酸水溶液)以7CV流通。
(iii)目的物之溶析步驟 以流速3ml/min將緩衝液A1(10mM 氫氧化鈉水溶液)以5CV流通而進行平衡化。接著，以流速3ml/min進行緩衝液A1(10mM 氫氧化鈉水溶液)：緩衝液B1(10mM 氫氧化鈉/2M氯化鈉水溶液)(30：70)至(0：100)之梯度(10CV)後，將緩衝液B1(10mM 氫氧化鈉/2M氯化鈉水溶液)以2CV流通。
圖6之結果，由於於脫保護後之溶析步驟未檢測260nm之吸收，得知DMT-on結合物於最初之吸附步驟中未吸附於管柱，而通過。因此，無法將目的物進行離子交換管柱純化。因此，為了將GalNAc單元與寡核苷酸之結合物進行DMTr-on管柱純化，認為疏水性保護基結合於GalNAc上、及/或一個之GalNAc單元中所含的疏水性保護基之數與GalNAc的數量相同或其以上者為重要的。
又，於本說明書，At 、Gt 、5meCt 、Ct 、Tt 、Ut 、Ap 、Gp 、5meCp 、Cp 、Tp 、Up 、As 、Gs 、5meCs 、Cs 、Ts 、Us 、Am1t 、Gm1t 、Cm1t 、5meCm1t 、Um1t 、Am1p 、Gm1p 、Cm1p 、5meCm1p 、Um1p 、Am1s 、Gm1s 、Cm1s 、5meCm1s 、Um1s 、A2t 、G2t 、C2t 、T2t 、Ae2p 、Ge2p 、Ce2p 、Te2p 、Ae2s 、Ge2s 、Ce2s 、Te2s 、A1t 、G1t 、C1t 、T1t 、Ae1p 、Ge1p 、Ce1p 、Te1p 、Ae1s 、Ge1s 、Ce1s 、Te1s 、Am2t 、Gm2t 、5meCm2t 、Tm2t 、Am2p 、Gm2p 、5meCm2p 、Tm2p 、Am2s 、Gm2s 、5meCm2s 、Tm2s 、X、X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 、X8 、X9 、X10 、X11 、X12 、X13 、X14 、X15 、X16 、X17 、X18 、X19 、X20 、X21 、X22 係具有下述所示的結構的基。
Figure 02_image166
Figure 02_image168
Figure 02_image170
Figure 02_image172
Figure 02_image174
  
Figure 02_image176
Figure 02_image178
Figure 02_image180
將本說明書中所引用的全部刊物、日本專利及日本專利申請案直接作為參考而併入本說明書中。 [產業上利用之可能性]
本發明可利用於肝醣儲積症Ia型之治療。 [序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1～48、93～96：表示反義寡核苷酸之序列。構成反義寡核苷酸的核苷酸可為天然型DNA、天然型RNA、DNA/RNA之嵌合物、此等之修飾體之任一者，但較佳為至少1個為修飾核苷酸。 序列識別號49～65、67～92：表示引子之序列。 序列識別號66：表示肽之序列。
無。
圖1為呈示將實施例8～14之化合物對異型基因植入小鼠(hetero-knockin mouse)投予之際之肝臓中的G6PC mRNA的異常剪接之校正效果的圖。將異型基因植入小鼠肝臓中的異常剪接被校正的G6PC mRNA量，以qRT-PCR進行相對定量評價(以肌動蛋白之mRNA量進行補正)。Y軸為於正常G6PC mRNA之表現量，將食鹽水(saline)投予組設為1的情形之各投予組中的相對值(RQ： 相對定量(relative quantification)；mpk： mg/kg)。 圖2為呈示將實施例15～23之化合物對異型基因植入小鼠投予之際之肝臓中的G6PC mRNA的異常剪接之校正效果的圖。異型基因植入小鼠肝臓中的異常剪接被校正的G6PC mRNA量，以qRT-PCR進行定量評價(以肌動蛋白之mRNA量進行補正)。Y軸與圖1相同。RQ： 相對定量；mpk： mg/kg。 圖3為呈示將ApoB-ASO(白色柱)及ApoB-ASO結合物(塗黑柱)添加至人類初代培養肝細胞之際的細胞中之ApoB mRNA之分解效果的圖。將細胞中之ApoB mRNA量，以qRT-PCR進行相對定量評價(以肌動蛋白之mRNA量進行補正)。Y軸為將無處理之人類初代培養肝細胞中之ApoB mRNA量設為100%的情形之各添加組中的相對值(%)。 圖4為DMTr-on離子交換管柱純化時之各步驟與層析圖表之相關圖。 圖5為於GalNAc之羥基具有DMTr基的結合物之DMTr-on離子交換管柱純化時之層析圖(檢測波長260nm)。 圖6為寡核苷酸之附近具有DMTr基的結合物之DMTr-on離子交換管柱純化時之層析圖(檢測波長260nm)。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
無。

Claims (24)

  1. 一種結合物或其製藥上可容許的鹽，其係具有被期待於肝實質細胞中有藥理效果的核酸序列的寡核苷酸與2分支GalNAc單元之結合物，其特徵為：於寡核苷酸之5’末端或3’末端，結合有下述式之2分支GalNAc單元，並於活體內被特異性遞送至肝實質細胞，
    Figure 03_image001
    [式中，W表示下式
    Figure 03_image003
    ， G表示5-乙醯胺-2-羥基甲基-3,4-二羥基四氫哌喃-6-基(GalNAc)，Z表示氧原子或硫原子，L1 及L2 係一者表示亞甲基(CH2 )，另一者表示未插入原子，o、q、r、及s各自獨立地表示0或1，n表示1～15之整數，m表示0～5之整數，v表示1～7；惟，n為1時，m為0～5之整數，n為2～15之整數時，m為0]。
  2. 如請求項1之結合物或其製藥上可容許的鹽，其中2分支GalNAc單元之式中o及q為0。
  3. 如請求項1或2之結合物或其製藥上可容許的鹽，其中2分支GalNAc單元與寡核苷酸之5’末端結合。
  4. 如請求項1之結合物或其製藥上可容許的鹽，其中2分支GalNAc單元為以下之任一式所表示的基：
    Figure 03_image005
    Figure 03_image007
    Figure 03_image009
    Figure 03_image011
    Figure 03_image013
    。
  5. 一種醫藥，其包含如請求項1至4中任一項之結合物或其製藥上可容許的鹽。
  6. 一種寡核苷酸與GalNAc單元之結合物之製造方法，其包含以下之步驟： a：合成於寡核苷酸之5’末端或3’末端結合有包含下述式所表示的疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構的結合物的步驟，
    Figure 03_image015
    [式中，Ra 、Rb 及Rc 之中至少一者為疏水性保護基，其它者為氫原子或於游離條件下被去除的保護基；X1 及X2 各自獨立表示連接子(linker)結構，於X1 與X2 之間可為分支；t為連接子結構中之分支鏈數，為1～10之整數；Y表示透過磷酸基或硫代磷酸基而與寡核苷酸結合的結合肢]； b：將包含步驟a之產物的溶液通液於填充具有經由疏水性相互作用所致的吸附性的樹脂的管柱，並將水性洗淨液通液於該管柱的步驟；及 c：使寡核苷酸自步驟b後之管柱溶析的步驟。
  7. 如請求項6之製造方法，其中疏水性保護基為於鹼性條件或酸性條件下被去除的保護基。
  8. 如請求項6之製造方法，其中包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構係與位於寡核苷酸之5’末端的核苷之5’位羥基結合。
  9. 如請求項6之製造方法，其中於包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構中，Ra 為疏水性保護基，Rb 及Rc 為氫原子，t為1～3之整數。
  10. 如請求項6之製造方法，其中具有經由疏水性相互作用所致的吸附性的樹脂為選自苯乙烯-二乙烯基苯系吸附樹脂、苯乙烯-二乙烯基苯系修飾型吸附樹脂、甲基丙烯酸系吸附樹脂及酚系吸附樹脂之任一者。
  11. 如請求項6之製造方法，其中填充具有經由疏水性相互作用所致的吸附性的樹脂的管柱為離子交換管柱或逆相管柱。
  12. 如請求項6之製造方法，其中步驟a包含以下之步驟： a1：使用可於3’末端至5’末端方向伸長寡核苷酸的支持體，重複位於5’末端的核苷之5’-羥基之保護基的脫保護、核苷之縮合而使寡核苷酸鏈伸長，且於支持體上合成所冀望之寡核苷酸的步驟；此處，使用的核苷之5’-羥基之保護基以外的保護基，係選擇於寡核苷酸3’末端與支持體之結合的切斷條件(以下，「游離條件」)經脫保護的保護基，就相同核苷之5’-羥基的保護基而言，選擇於游離條件下未經脫保護的保護基； a2：於位於支持體上所合成的寡核苷酸之5’末端的核苷之5’-羥基導入疏水性保護基加成型GalNAc單元的步驟：此處，疏水性保護基係選擇於游離條件下未經脫保護者；及 a3：將於步驟a2所獲得的支持體以游離條件之溶液進行處理，而獲得疏水性保護基加成型GalNAc單元與寡核苷酸之結合物的溶液的步驟。
  13. 如請求項6之製造方法，其中步驟b之後，對吸附於管柱的結合物施加疏水性保護基之脫保護，之後進行步驟c。
  14. 如請求項6之製造方法，其中游離條件為鹼性，疏水性保護基為於酸性被去除的保護基。
  15. 如請求項6之製造方法，其中包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構為以下之式之任一者所表示，
    Figure 03_image017
    (式中，R1 表示於酸性條件下被去除的疏水性保護基，X表示連接子結構，Y表示透過磷酸基或硫代磷酸基而與寡核苷酸結合的結合肢；以下，於同一項中相同)
    Figure 03_image019
    Figure 03_image021
    Figure 03_image023
    Figure 03_image025
    Figure 03_image027
    Figure 03_image029
    Figure 03_image031
    Figure 03_image033
    Figure 03_image035
    Figure 03_image037
    。
  16. 一種以下之式所表示的化合物或其鹽，
    Figure 03_image015
    [式中，Ra 、Rb 及Rc 之中至少一者為疏水性保護基，其餘為於游離條件下被去除的保護基；X1 及X2 各自獨立表示連接子結構，X1 與X2 之間可為分支；t為連接子結構中之分支鏈數，為1～10之整數；Y表示亞磷醯胺基(phosphoramidite)或H-膦酸酯基(phosphonate)]。
  17. 如請求項16之化合物或其鹽，其中Ra 為於酸性條件下被去除的疏水性保護基，Rb 及Rc 為乙醯基，Y為亞磷醯胺基或H-膦酸酯基，t為1～3之整數。
  18. 如請求項16或17之化合物或其鹽，其為以下之式之任一者所表示，
    Figure 03_image040
    [式中，R1 為於酸性條件下被去除的疏水性保護基，Y表示亞磷醯胺基或H-膦酸酯基；以下於同一項中相同]
    Figure 03_image042
    Figure 03_image044
    Figure 03_image046
    Figure 03_image048
    。
  19. 如請求項16或17之化合物或其鹽，其為以下之式之任一者所表示，
    Figure 03_image050
    [式中，R1 表示於酸性條件下被去除的疏水性保護基，X表示連接子結構，Y表示亞磷醯胺基或H-膦酸酯基；以下，於同一項中相同]
    Figure 03_image052
    Figure 03_image054
    Figure 03_image056
    Figure 03_image058
    Figure 03_image060
    。
  20. 如請求項16至19中任一項之化合物或其鹽，其中疏水性保護基為可經取代的三苯甲基，亞磷醯胺基為-P(OCH2 CH2 CN)N(CH(CH3 )2 )2 、或-P(OCH3 )N(CH(CH3 )2 )2 。
  21. 一種結合物或其鹽，其係於寡核苷酸之5’末端或3’末端結合有包含下述式所表示的疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構的結合物或其鹽，
    Figure 03_image015
    [式中，Ra 、Rb 及Rc 之中至少一者為疏水性保護基，其它者為氫原子或於游離條件下被去除的保護基；X1 及X2 各自獨立表示連接子結構，X1 與X2 之間可為分支；t為連接子結構中之分支鏈數，為1～10之整數。Y表示透過磷酸基或硫代磷酸基而與寡核苷酸結合的結合肢]。
  22. 如請求項21之結合物或其鹽，其中包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構為以下之式之任一者所表示，
    Figure 03_image029
    [式中，R1 表示於酸性條件下被去除的疏水性保護基，Y表示透過磷酸基或硫代磷酸基而與寡核苷酸結合的結合肢；以下，於同一項中相同]
    Figure 03_image031
    Figure 03_image033
    Figure 03_image035
    Figure 03_image037
    。
  23. 如請求項21之結合物或其鹽，其中包含疏水性保護基加成型GalNAc單元-磷酸基的結構為以下之式之任一者所表示，
    Figure 03_image017
    [式中，R1 表示於酸性條件下被去除的疏水性保護基，X表示連接子結構，Y表示透過磷酸基或硫代磷酸基而與寡核苷酸結合的結合肢；以下，於同一項中相同]
    Figure 03_image019
    Figure 03_image021
    Figure 03_image023
    Figure 03_image025
    Figure 03_image027
    。
  24. 如請求項21至23中任一項之結合物或其鹽，其中疏水性保護基為可經取代的三苯甲基，Y表示透過磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯(phosphorothioate)鍵而與位於寡核苷酸之5’末端的核苷之5’-羥基結合的結合肢。
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