WO2023176862A1 - トランスフェリン受容体２の発現を抑制するｓｉＲＮＡ - Google Patents

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WO2023176862A1
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誠 小泉
貴生 小路
大地 福永
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention provides an siRNA having an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect on mRNA encoding transferrin receptor 2 (TfR2), use of the siRNA, a method for suppressing TfR2 gene expression using the siRNA, and the siRNA. Regarding medicines, etc.
  • TfR2 transferrin receptor 2
  • siRNA against mRNA encoding TfR2 protein can suppress the expression of TfR2 mRNA and suppress the production of hepcidin, which plays a central role in iron metabolism.
  • iron metabolism it is expected that by activating iron metabolism in vivo, iron bioavailability by red blood cell progenitor cells will be promoted and anemia can be treated. Therefore, studies are underway to use siRNA to suppress TfR2 mRNA expression, targeting the suppression of hepcidin production.
  • Hepcidin is a peptide hormone consisting of 25 amino acids that is mainly produced from the liver and secreted into the blood, and plays a central role in iron metabolism in vivo. Hepcidin negatively regulates iron metabolism by binding to the iron transporter Ferroportin (SLC40A1) and promoting the proteolysis of Ferroportin, thereby suppressing iron absorption from the intestinal tract and iron release from macrophages. It has been known. It has been reported that increased hepcidin concentration in the blood contributes to various anemic diseases by suppressing iron metabolism and limiting the bioavailability of iron in red blood cell progenitor cells (Non-Patent Document 1). .
  • anemia diseases in which an increase in hepcidin in the blood is observed include anemia associated with chronic kidney disease, anemia associated with cancer, anemia induced by chemotherapy, and iron refractory iron deficiency anemia (IRIDA).
  • anemia of chronic disease (ACD) associated with chronic inflammation such as rheumatoid arthritis and Castleman's disease, Diamond-Blackfan anemia, aplastic anemia, ⁇ -thalassemia, sickle cell disease, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, autoimmunity
  • ACD chronic disease
  • aplastic anemia aplastic anemia
  • ⁇ -thalassemia ⁇ -thalassemia
  • sickle cell disease paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
  • autoimmunity examples include hemolytic anemia, anemia associated with myelodysplastic syndrome, chronic myelomonocytic leukemia, and anemia associated with myelofibrosis.
  • Non-Patent Document 2 patients with myelofibrosis may exhibit an increase in hepcidin concentration in the blood, which is correlated with the iron load associated with red blood cell transfusion and the chronic increase in inflammatory cytokines.
  • anemia caused mainly by a lack of red blood cell production capacity due to hematopoietic dysfunction in the bone marrow, such as in myelofibrosis the contribution of impaired iron utilization due to elevated hepcidin in the blood to the pathology is thought to be low.
  • no anemia therapeutic effect by suppressing the production of Hepcidin has been reported.
  • drugs such as ESA (erythropoiesis stimulating agent) are currently used to treat anemia associated with bone marrow dysfunction such as myelofibrosis, their therapeutic effects are limited.
  • Patent Document 1 discloses that as a result of administering TfR2 siRNA AD-52590 to monkeys, there was a decrease in TfR2 mRNA expression in the liver, a decrease in hepcidin mRNA expression, a decrease in hepcidin concentration in the blood, and an increase in the iron concentration in the blood. Discloses what has been approved. Furthermore, as a result of administering AD-47882 to rats exhibiting anemia associated with inflammation, there was a decrease in TfR2 mRNA expression in the liver, a decrease in hepcidin concentration in the blood, an increase in iron concentration in the blood, and an increase in hemoglobin levels. Discloses what has been approved.
  • Patent Document 1 shows the results of administering siRNA encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), and the administration route is limited to intravenous administration. Furthermore, the therapeutic effect of TfR2 siRNA disclosed in Patent Document 1 is limited to the therapeutic effect on anemia associated with inflammation, and the therapeutic effect on other anemias such as anemia associated with decreased bone marrow function is not disclosed.
  • RNA interference As a method of inhibiting the expression of a target gene within a cell, tissue, or individual, there is a method of introducing double-stranded RNA into the cell, tissue, or individual.
  • double-stranded RNA By introducing the double-stranded RNA, mRNA having homology to the sequence thereof is degraded, and expression of the target gene is inhibited. This effect is called "RNA interference" or "RNAi.”
  • Double-stranded RNA (small interfering RNA: siRNA) consisting of 21 nucleotides each in the sense and antisense strands with a 2-nucleotide overhang at the 3' end may have RNA interference effects in cultured cells of vertebrates. It has been reported (for example, see Non-Patent Document 3).
  • siRNA is useful for identifying gene functions, screening cell lines suitable for producing useful substances, regulating genes involved in diseases, etc.
  • it is difficult to maintain its activity in the body because it is easily degraded by RNA degrading enzymes. , has the disadvantage of high synthesis cost. Therefore, various chemical modifications have been attempted to develop oligonucleotides that retain RNAi activity and are highly stable against RNA degrading enzymes and can be produced at low cost.
  • siRNA employing sugar-modified nucleosides such as DNA, 2'-O-methyl nucleosides, 2'-deoxy-2'-fluoronucleosides, and 2'-O,4'-C crosslinked nucleosides as nucleosides, for example, It is disclosed in Patent Document 2, Patent Document 3, Patent Document 4, etc.
  • RNAi activity is attenuated or completely lost when all RNAs in one or both of the sense and antisense strands of siRNA are replaced with 2'-O-methyl nucleotides (e.g., (See Reference 7, Non-Patent Reference 8, Non-Patent Reference 9, etc.)
  • 2'-O-methyl nucleotides e.g., (See Reference 7, Non-Patent Reference 8, Non-Patent Reference 9, etc.
  • ENA (2'-O,4'-C-ethylene-bridged nuclear acids) is a modified nucleic acid that has stability against nucleases. It has been reported that RNAi activity decreases when ENA is introduced into two nucleotides at the terminal overhang site (see, for example, Non-Patent Document 12).
  • siRNA that combines multiple modified nucleic acids. For example, by introducing every other 2'-O-methyl nucleotide and 2'-F into the sense strand and antisense strand of siRNA, RNAi activity comparable to or higher than that of unmodified siRNA can be obtained. It has been reported that it remains relatively stable at temperatures (for example, see Non-Patent Document 13).
  • Double-stranded oligonucleotides combining DNA, 2'-O-methyl RNA, and 2'-F have been reported, and siRNA in which the 14th position from the 5' end of the antisense strand is 2'-F has been reported. It has been reported (for example, see Patent Documents 5 and 6).
  • double-stranded oligonucleotides that combine DNA, 2'-O-methyl RNA, 2'-F RNA, and LNA (2'-O,4'-C-methylene-bridged nuclear acids) have been reported.
  • the activity of siRNA in which the 2nd or 14th position from the 5' end of the antisense strand is 2'-F, DNA, or LNA has been reported (see, for example, Patent Document 5 and Patent Document 7). ).
  • TfR2 siRNA with high pharmacological activity that can prevent, improve, and/or treat anemia. Furthermore, there is a need for TfR2 siRNA that has low toxicity to cells and has excellent stability in blood and drug delivery properties.
  • An object of the present invention is to provide a novel siRNA that has an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect on mRNA encoding TfR2 (these effects are also referred to as a knockdown effect). Furthermore, the present invention aims to provide a novel TfR2 siRNA with improved cytotoxicity, stability, and/or drug delivery properties. Furthermore, the present invention aims to provide a novel pharmaceutical composition for treating or preventing diseases that can be treated or prevented by suppressing the expression of TfR2 mRNA.
  • TfR2 siRNA whose target sequence is a base sequence at a specific position in TfR2 mRNA, has an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect
  • Patent Document 1 It was found that the toxicity to cells observed with the target sequences of the present invention was not observed with the target sequences of the present invention.
  • siRNA having oligonucleotides appropriately combined with DNA, RNA, 2'-O-methyl RNA, 2'-F RNA, LNA, ENA, and 3'-O-methyl RNA can have RNA interference effects and/or gene expression. It was found that it has an inhibitory effect and is stable in vivo.
  • A Consists of a target-corresponding sequence substantially complementary to a target sequence consisting of 18 to 21 consecutive bases in the region between nucleotide numbers 2845 and 2867 or nucleotide numbers 1534 and 1556 of SEQ ID NO: 1;
  • the nucleoside at the 5' end of the target sequence is a nucleoside substantially complementary to the nucleoside at the 3' end of the target sequence, a nucleoside with adenine, or a nucleoside with uracil; /or an antisense strand region consisting of 18 to 31 bases in length, which may have an overhang structure of 5 bases or less added to the 3' end, and
  • B Contains a nucleotide sequence substantially complementary to the target
  • the target corresponding sequence of the antisense strand region is a nucleotide sequence that is completely complementary to the target sequence consisting of 19 bases of nucleotide numbers 2847 to 2865 of SEQ ID NO: 1 or nucleotide numbers 1536 to 1554, [1 ] to [3] or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Sugar modification includes 2'-deoxylation, 2'-O-alkylation, 2'-O-alkoxyalkylation, 2'-halogenation, and/or 2'-O, The oligonucleotide according to [6] or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is 4'-C-alkylenated.
  • the 2'-O-alkylation is 2'-O-methylation
  • the 2'-O-alkoxyalkylation is 2'-O-methoxyethylation
  • the 2'-halogenation is 2'-fluoro.
  • the oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of [5] to [8], wherein the modification of the phosphodiester bond is phosphorothioate.
  • Any of [5] to [9] characterized in that D-ribofuranose in the nucleoside at the 3' end of the sense strand region and/or antisense strand region is 3'-O-alkylated.
  • the sense strand region consists of an oligonucleotide shown in the following formula (I)
  • the antisense strand region consists of an oligonucleotide shown in the following formula (II)
  • the antisense strand region consists of an oligonucleotide shown in the following formula (a) to (g).
  • oligonucleotide according to [1] or a pharmaceutically acceptable salt thereof which has the following characteristics:
  • Sense strand region 5' S O5 -S a -S 19 -S 18 -S 17 -S 16 -S 15 -S 14 -S 13 -S 12 -S 11 -S 10 -S 9 -S 8 -S 7 -S 6 -S 5 -S 4 -S 3 -S 2 -S 1 -S O3 3'(I)
  • Antisense strand region 5' A O5 -A 1 -A 2 -A 3 -A 4 -A 5 -A 6 -A 7 -A 8 -A 9 -A 10 -A 11 -A 12 -A 13 -A 14 -A 15 -A 16 -A 17 -A 18 -A 19 -A a -A O3 3'(II)
  • S 1 is a 3'-modified nucleoside
  • Nucleosides are shown, each nucleoside independently representing 2'-OMe RNA, 2'-F RNA, DNA or a 2'-O,4'-C-bridged modified nucleoside.
  • the bond between each nucleoside represents a phosphodiester bond which may be chemically modified;
  • a 11 , A 12 , A 13 , A 14 and A 15 represent one nucleoside, of which at least one is DNA, RNA, 2'-O,4'-C-crosslinked modified nucleoside or 2 '-MOE RNA, and the others are 2'-OMe RNA or 2'-F RNA, where A 1 to A 10 and A 16 to A 19 represent one nucleoside, and each independently represents a 2' -OMe RNA, 2'-F RNA or DNA, A a represents 0 to 3 nucleosides, each nucleoside independently represents 2'-OMe RNA, 2'-F RNA or DNA, A O3 and A O5 each independently represent 0 to
  • the bond between each nucleoside represents a phosphodiester bond which may be chemically modified;
  • the nucleotide sequence between A 2 and A a consists of a nucleotide sequence that is substantially complementary to the target sequence, and A 1 has a nucleoside, adenine, that has a complementary base to the corresponding nucleoside of the target sequence. nucleoside, thymine-containing nucleoside, or uracil-containing nucleoside, where A O3 and A O5 are present, the nucleotide sequences of which are each independently selected, independently of the corresponding nucleoside of the target sequence.
  • the nucleotide sequence between S 1 and S a and the nucleotide sequence between A 1 and A a are nucleotide sequences that are substantially complementary to each other and form a double-stranded structure. There is; (e) if both S O5 and A O3 are present, S O5 and A O3 are nucleotide sequences that are not complementary to each other; (f) if both S O3 and A O5 are present, S O3 and A O5 are nucleotide sequences that are not complementary to each other; and (g) The 5' position of the 5' terminal nucleoside and/or the 3' position of the 3' terminal nucleoside or the 3' terminal nucleoside of the sense strand region and/or antisense strand region is a 3'-modified nucleoside.
  • the 2' position may be chemically modified.
  • S 1 is 3'-OMe RNA.
  • S 1 is 3'-OMe RNA.
  • S 1 is 3'-OMe RNA.
  • S 1 is 3'-OMe RNA.
  • S 1 is 3'-OMe RNA.
  • S 1 is 3'-OMe RNA.
  • S 1 is 3'-OMe RNA.
  • S 1 is 3'-OMe RNA.
  • two or more of A 11 , A 12 , A 13 , A 14 and A 15 may be the same or different, and DNA, RNA, 2'-O, 4'-C -
  • a 14 is RNA or a 2'-O,4'-C-bridged modified nucleoside.
  • a 13 is a 2'-O,4'-C-bridged modified nucleoside or 2'-OMe RNA
  • a 14 is RNA. or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a 11 -A 12 -A 13 -A 14 -A 15 is any of the following; A11 (2'-OMe RNA) -A12 (2'-OMe RNA) -A13 (ENA) -A14 (RNA) -A15 (2'-OMe RNA), A11 (2'-F RNA) -A12 (2'-OMe RNA) -A13 (ENA) -A14 (RNA) -A15 (2'-OMe RNA), A11 (2'-OMe RNA) -A12 (2'-F RNA) -A13 (ENA) -A14 (RNA) -A15 (2'-OMe RNA), A11 (2'-OMe RNA) -A12 (2'-OMe RNA) -A13 (LNA) -A14 (RNA) -A15 (2'-OMe RNA), A11 (2'-F RNA) -A12 (2'-OMe RNA) -A13 (LNA) -A14 (RNA)
  • a 12 is DNA and A 14 is a 2'-O,4'-C-crosslinked modified nucleoside, or the oligonucleotide according to [20] or a pharmaceutically acceptable oligonucleotide thereof. salt.
  • a 11 -A 12 -A 13 -A 14 -A 15 is any of the following; A11 (2'-F RNA) -A12 (DNA) -A13 (2'-OMe RNA) -A14 (ENA) -A15 (2'-OMe RNA), A 11 (2'-OMe RNA)-A 12 (DNA)-A 13 (2'-OMe RNA)-A 14 (ENA)-A 15 (2'-OMe RNA), A 11 (2'-F RNA) )-A 12 (DNA)-A 13 (2'-OMe RNA)-A 14 (LNA)-A 15 (2'-OMe RNA), or A11 (2'-OMe RNA) -A12 (DNA) -A13 (2'-OMe RNA) -A14 (LNA) -A15 (2'-OMe RNA), The oligonucleotide according to [23], or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a 2 , A 6 , A 8 , A 10 and A 16 are 2'-F RNA, and A 1 , A 3 to A 5 , A 7 , A 9 , A 17 to The oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to [26], wherein the nucleosides of A 19 and A a are 2'-OMe RNA.
  • S 11 , S 12 , S 13 and S 15 are 2'-F RNA, the oligonucleotide according to any one of [16] to [27] or a pharmaceutically acceptable oligonucleotide thereof salt.
  • RNA is employed in formula (II), the bond between the RNA and the nucleoside adjacent to its 3' side is a phosphorothioate bond, according to [16] to [29]. Any one of the oligonucleotides or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • each internucleoside bond in 2 to 5 nucleotides from the 5' end and 3' end of the oligonucleotide is a phosphorothioate bond.
  • oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof [32] The oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of [16] to [31], wherein the number of nucleosides of S O3 , S O5 , A O5 and A O3 is 0 to 2.
  • oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to [33], wherein the number of nucleosides in S O3 , S O5 and A O5 is 0, and the number of nucleosides in A O3 is 2.
  • the antisense strand region and the sense strand region each form a double-stranded oligonucleotide as independent oligonucleotides, according to any one of [1] to [34]. oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the dashed line indicates the bond, and the oxygen atom bonded to the phenyl group forms a phosphodiester bond or phosphorothioate bond with the 5'-phosphate group of the 5'-terminal nucleotide of the adjacent antisense chain region.
  • the methylene group at the other end is connected to the 3'-phosphate group of the nucleotide at the 3' end of the adjacent sense strand region (or the phosphate group at the 2' position in the case of a nucleotide modified at the 3' position).
  • the 5' position of the nucleoside at the 5' end of the oligonucleotide and/or the 3' position of the 3' end nucleoside, or the 2' position when the 3' end nucleoside is a 3'-modified nucleoside, is GalNAc.
  • the GalNAc unit is
  • the dashed line represents the phosphodiester bond between the 5'-end phosphate group and/or 3'-end phosphate group (for 3'-modified nucleotides, the 2'-position phosphate group) of the adjacent nucleotide. means to do something.
  • the sense strand region excluding the overhang structure is the following formula (I-1), and the antisense strand region excluding the overhang structure is any of the following formulas (II-1) to (II-10).
  • oligonucleotide form a double-stranded oligonucleotide as independent oligonucleotides, and the sense strand region and the antisense strand region each independently include an overhang structure.
  • [41] The oligonucleotide according to [40], or a pharmaceutical thereof, wherein an overhang structure of 3 bases or less is added to the 5' end and/or 3' end of the sense strand region and/or antisense strand region. Acceptable salt.
  • [42] The oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to [41], wherein the overhang structure is two bases.
  • [43] The oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to [42], wherein the overhang structure is a nucleoside containing two consecutive thymines or a nucleoside containing two consecutive uracils.
  • the broken line represents a phosphodiester bond with the 5'-phosphate group of the 5'-terminal nucleotide of the adjacent sense strand region.
  • the sense strand region has the following formula (I-2)
  • the antisense strand region has any of the following formulas (II-11) to (II-20)
  • the sense strand region and the antisense The oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to [1], wherein each chain region forms a double-stranded oligonucleotide as independent oligonucleotides.
  • (R) is RNA
  • (D) is DNA
  • (M) is 2'-OMe RNA
  • (3M) is 3'-OMe RNA
  • (F) is 2'-F RNA
  • (E) is ENA shows.
  • the anemia associated with chronic inflammation is anemia associated with autoimmune disease, anemia associated with infection, anemia associated with inflammatory bowel disease, anemia associated with heart failure, anemia associated with chronic kidney disease, cancerous anemia, or castle.
  • the pharmaceutical composition according to [50] which is anemia associated with Mann's disease.
  • the anemia associated with bone marrow dysfunction is an anemia associated with myelofibrosis, an anemia associated with myelodysplastic syndrome, an anemia associated with chronic myelomonocytic leukemia, an anemia associated with bone marrow suppression due to chemotherapy, [ 50].
  • the other drug is a therapeutic agent for anemia, a therapeutic agent for a disease that causes anemia, or a therapeutic agent for iron overload.
  • the anemia therapeutic agent is an erythropoiesis stimulating factor preparation, a HIFPHD (hypoxia inducible factor prolyl hydroxylase) inhibitor, an oral iron preparation, an intravenous iron preparation, luspatercept, or danazol.
  • the therapeutic agent for a disease that causes anemia is a myelofibrosis therapeutic agent, a myelodysplastic syndrome therapeutic agent, a chronic kidney disease therapeutic agent, or an anticancer agent.
  • the pharmaceutical composition according to [60], wherein the myelofibrosis therapeutic agent is a JAK2 inhibitor.
  • the chronic kidney disease therapeutic agent is an SGLT2 (sodium glucose co-transporter 2) inhibitor, a renin-angiotensin system inhibitor, a calcium antagonist, a diuretic, a diabetes drug, a hyperlipidemia drug, a steroid, or The pharmaceutical composition according to [60], which is an immunosuppressant.
  • the chemotherapeutic drug is cisplatin, carboplatin, doxorubicin, paclitaxel, or amrubicin.
  • the pharmaceutical composition according to [68], wherein the iron chelating agent is deferasirox, deferoxamine, or deferiprone.
  • a method for treating or preventing anemia which comprises administering to a subject an effective amount of the oligonucleotide or pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of [1] to [46].
  • a method for treating or preventing anemia comprising administering to a subject the pharmaceutical composition according to any one of [47] to [69].
  • the present invention provides the following.
  • [75] A pharmaceutical composition for the treatment or prevention of anemia associated with bone marrow dysfunction, which contains a compound having the effect of knocking down the transferrin receptor 2 gene as an active ingredient.
  • [76] The pharmaceutical composition according to [75], wherein the compound is an RNAi-oligonucleotide.
  • the siRNA of the present invention can suppress the expression of TfR2 mRNA. Furthermore, the siRNA of the present invention can suppress the expression of TfR2 mRNA in the liver in vivo, and can prevent, improve, and/or treat anemia.
  • the upper strand represents the sense strand (or passenger strand), the left end of the sense strand represents the 5' end, and the right end represents the 3' end.
  • the lower strand represents the antisense strand (or guide strand), the right end of the antisense strand represents the 5' end, and the left end represents the 3' end.
  • Each siRNA is represented by NNN-xxx, and the numbers and alphabets written after NNN-xxx represent the abbreviations of the modification patterns shown in FIGS. 1 to 6.
  • FIG. 3 is a diagram showing a modification pattern when A 14 of the antisense strand in double-stranded siRNA is DNA or RNA. Each symbol, arrangement, modification, etc. is displayed in the same format as in Figure 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing a modification pattern when A 8 and A 9 of the antisense strand in double-stranded siRNA are 2'-deoxy-2'-fluoroRNA. Each symbol, arrangement, modification, etc. is displayed in the same format as in Figure 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing a modification pattern when A 14 of the antisense strand in double-stranded siRNA is ENA. Each symbol, arrangement, modification, etc. is displayed in the same format as in Figure 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing a modification pattern in double-stranded siRNA when A 8 and A 9 of the antisense strand are 2'-deoxy-2'-fluoroRNA and A 13 of the antisense strand is ENA. Each symbol, arrangement, modification, etc.
  • FIG. 2 is a diagram showing a modification pattern when A 8 of the antisense strand is 2'-O-methyl RNA and A 9 is 2'-deoxy-2'-fluoro RNA in double-stranded siRNA. Each symbol, arrangement, modification, etc. is displayed in the same format as in Figure 1.
  • FIG. 7A is a diagram showing the change in plasma iron concentration due to treatment with nucleic acid lipid particles encapsulating TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 7B is a diagram showing the change in plasma hepcidin concentration due to treatment with LNP-encapsulated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 1 is a diagram showing the change in plasma iron concentration due to treatment with nucleic acid lipid particles encapsulating TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 7B is a diagram showing the change in plasma hepcidin concentration due to treatment
  • FIG. 7C is a diagram showing the change in hemoglobin value (hemoglobin, HGB) by treatment with LNP-encapsulated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 7D is a diagram showing the mean corpuscular hemoglobin (MCH) value by treatment with LNP-encapsulated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 7E is a diagram showing the hepatic Tfr2 (mTfr2) mRNA expression level by treatment with LNP-encapsulated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 7F is a diagram showing the hepatic Hepcidin (mHepcidin) mRNA expression level by treatment with LNP-encapsulated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 8A is a diagram showing the change in HGB value due to treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 8B is a diagram showing HGB values 3 days after drug treatment in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 8C is a diagram showing the hepatic mTfR2 mRNA expression level after treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 8D is a diagram showing HGB values in anemia model mice associated with decreased bone marrow function after treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 8E is a diagram showing MCH values by treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 8F is a diagram showing hematocrit (HCT) values in anemia model mice associated with decreased bone marrow function after treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 8G is a diagram showing the number of red blood cells (RBC) by treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 9A is a diagram showing the plasma iron concentration by treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 9B is a diagram showing the plasma hepcidin concentration in anemia-induced anemia model mice treated with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 9C is a diagram showing HGB values in anemia model mice associated with inflammation treated with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 9D is a diagram showing MCH values by treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 9A is a diagram showing the plasma iron concentration by treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 9B is a diagram showing the plasma hepcidin concentration in anemia-induced anemia model mice treated with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 9E is a diagram showing the number of RBCs by treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 9F is a diagram showing the hepatic mTfR2 mRNA expression level by treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 10A is a diagram showing the plasma iron concentration by treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 10B is a diagram showing HGB values in anemia model mice associated with inflammation treated with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 10C is a diagram showing the MCH value by treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 10D is a diagram showing the number of RBCs treated with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 10E is a diagram showing the hepatic mTfR2 mRNA expression level by treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation. It is a figure showing the cytotoxicity evaluation result of siRNA in HepG2 cells. It is a figure showing the hTfR2 knockdown activity of siRNA in HepG2 cells.
  • FIG. 10C is a diagram showing the MCH value by treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 10D is a diagram showing the number of RBCs treated with GalNAc-conjugated TfR2
  • FIG. 14A is a diagram showing HGB values before treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 14B is a diagram showing the plasma iron concentration before treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 14C is a diagram showing the plasma iron concentration 8 days after treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 14A is a diagram showing HGB values before treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 14B is a diagram showing the plasma iron concentration before treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 14C is a diagram showing the plasma iron concentration 8 days after treatment with GalNAc-conju
  • FIG. 14D is a diagram showing HGB values 9 days after treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 14E is a diagram showing MCH values 9 days after treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 14F is a diagram showing the number of RBCs 9 days after treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with decreased bone marrow function.
  • FIG. 15A is a diagram showing the change in plasma iron concentration due to treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 15A is a diagram showing the change in plasma iron concentration due to treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 15B is a diagram showing HGB values before treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 15C is a diagram showing HGB values 8 days after treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 15D is a diagram showing MCH values 8 days after treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 15E is a diagram showing the number of RBCs 8 days after treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 15F is a diagram showing the hepatic mTfR2 mRNA expression level 8 days after treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with inflammation.
  • FIG. 16A is a diagram showing the change in plasma iron concentration due to treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in MDS model mice.
  • FIG. 16B is a diagram showing the change in HGB value due to treatment with GalNAc conjugate TfR2 siRNA in MDS model mice.
  • FIG. 16C is a diagram showing HGB values in MDS model mice 8 weeks after starting treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 16D is a diagram showing MCH values in MDS model mice 8 weeks after starting treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 16E shows the number of RBCs in MDS model mice 8 weeks after starting treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 16F is a diagram showing the hepatic mTfR2 mRNA expression level in MDS model mice 8 weeks after the start of treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 17A is a diagram showing the plasma iron concentration before treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with chronic kidney disease.
  • FIG. 17B is a diagram showing HGB values before treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with chronic kidney disease.
  • FIG. 17C is a diagram showing the plasma iron concentration in anemia model mice associated with chronic kidney disease 6 weeks after the start of treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 17D is a diagram showing HGB values 6 weeks after starting treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with chronic kidney disease.
  • FIG. 17E is a diagram showing MCH values 6 weeks after starting treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice associated with chronic kidney disease.
  • FIG. 17F is a diagram showing the number of RBCs in anemia model mice associated with chronic kidney disease 6 weeks after the start of treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 17G is a diagram showing the hepatic mTfR2 mRNA expression level in anemia model mice associated with chronic kidney disease 6 weeks after the start of treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 18A is a diagram showing HGB values before treatment with GalNAc conjugated TfR2 siRNA in anemia model mice caused by Ruxolitinib.
  • FIG. 18B is a diagram showing the plasma iron concentration in Ruxolitinib-induced anemia model mice 3 weeks after starting treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 18C is a diagram showing HGB values in Ruxolitinib-induced anemia model mice 6 weeks after starting treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 18D is a diagram showing MCH values in Ruxolitinib-induced anemia model mice 6 weeks after starting treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 18E is a diagram showing the number of RBCs in Ruxolitinib-induced anemia model mice 6 weeks after starting treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 18F is a diagram showing the hepatic mTfR2 mRNA expression level in Ruxolitinib-induced anemia model mice 6 weeks after the start of treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 7 is a diagram showing the hepatic hTfR2 mRNA expression level in hTfR2 Tg mice 7 days after treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 2 is a diagram showing hTfR2 mRNA expression levels in human primary liver cells treated with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 21A is a diagram showing the Hepcidin mRNA expression suppressing activity of TfR2-019 and TfR2-039 in HepG2 cells.
  • FIG. 21B is a diagram showing the Hepcidin mRNA expression suppressing activity of TfR2-019.94DUG and TfR2-039.23DUG in HepG2 cells.
  • FIG. 2 is a diagram showing the base sequence of mRNA of the gene encoding human transferrin receptor 2 (hTfR2) (SEQ ID NO: 1).
  • the underlined sequence indicates the target sequence of TfR2-019
  • the double underlined sequence indicates the target sequence of TfR2-039.
  • 22-1 is a diagram showing a continuation of FIG. 22-1.
  • target gene refers to the mRNA for the gene encoding transferrin receptor 2 (transferrin receptor 2, TfR2), which is immature mRNA (pre-mRNA or pre-mRNA) before undergoing RNA processing. (also referred to as mRNA), or may be mRNA that has undergone RNA processing and matured.
  • RNA processing includes, for example, RNA splicing, formation of a cap structure at the 5' end, and formation of a polyA tail at the 3' end.
  • TFR2 is a 2 -type membrane protein that is mainly expressed in the liver, and is known to be composed of intracellular, membrane penetration, and external areas (2). 003 ) 292-296). TfR2 is known to play a central role in the production of hepcidin, which plays an important role in iron metabolism, and in the control of iron metabolism (Front. Pharmacol., 06 March 2014, Haematologica 2011; 96 ( 4):500-506., Blood. 2011;117(10):2960-2966).
  • Anemia refers to a pathological condition in which the concentration of hemoglobin, which exists in red blood cells in the blood and has an oxygen-carrying ability, decreases. Anemia is associated with decreased physical activity and increased mortality rate (Ann NY Acad Sci. 2019 August; 1450(1): 15-31.). Anemia is classified into various types depending on its cause, clinical features, red blood cell index such as mean curpuscular volume (MCV), etc. (Journal of the Japanese Society of Internal Medicine, Vol. 104, No. 7: 1375-1382, Clinical Testing Guidelines JSLM2015) : 175-180). Anemia is thought to be caused by insufficient production of red blood cells, excessive destruction of red blood cells, and iron deficiency.
  • MCV mean curpuscular volume
  • Anemia associated with chronic inflammation includes, for example, anemia associated with autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis or systemic lupus erythematosus or autoimmune hemolytic anemia, anemia associated with infection, anemia associated with macrophage activation syndrome, and anemia associated with Castleman's disease.
  • Examples include anemia associated with inflammatory bowel disease such as inflammatory bowel disease, anemia associated with heart failure, anemia associated with chronic kidney disease, and cancerous anemia.
  • Cancer anemia includes, for example, anemia associated with cancer such as multiple myeloma, acute leukemia, chronic leukemia, lung cancer or breast cancer.
  • Anemia associated with bone marrow dysfunction results from severe impairment of red blood cell production ability due to some factor.
  • anemia associated with bone marrow dysfunction examples include anemia associated with myelodysplastic syndrome, anemia associated with myelofibrosis, anemia associated with chronic myelomonocytic leukemia (CMML), and anemia associated with bone marrow suppression due to chemotherapy.
  • Examples include anemia, aplastic anemia, Diamond-Blackfan anemia, and Fanconi anemia.
  • Myelofibrosis is an acquired gene mutation such as JAK2V617F in hematopoietic stem cells, which causes clones derived from abnormal hematopoietic stem cells to proliferate, and chronic inflammation and bone marrow fibrosis progress, leading to impaired bone marrow function. It is a disease that causes a decrease in the blood flow rate, and is known to present with severe anemia and splenomegaly (Am J Hematol. 2021; 96:145-162.).
  • nucleic acid or nucleic acid molecule is a general term for nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, and polynucleotides.
  • Nucleoside means a chemical structural moiety in which a base moiety, which is important for genetic information, and a sugar moiety, which is important for the physicochemical properties of the molecule, are bonded.
  • a “nucleotide” is a compound in which the hydroxyl group at the 3' position (2' position if the 3' position is modified) of the sugar moiety of a nucleoside forms an ester with a phosphate group.
  • oligonucleotide is a structure in which two or more nucleotides are bonded to the phosphate group of one nucleotide and the 5' hydroxyl group of the sugar moiety of another nucleotide (phosphodiester bond).
  • oligomers the 3' position of the nucleotide at the 3' end (the 2' position for nucleotides with a modified 3' position) and/or the 5' position of the nucleotide at the 5' end may be a phosphate group even if it is a hydroxyl group. They may also be chemically modified structures. Furthermore, the phosphodiester bonds between nucleosides may be chemically modified.
  • oligonucleotide and polynucleotide are used interchangeably.
  • the base portions of nucleic acids are adenine (A), guanine (G), cytosine (C), uracil (U), and thymine (T), and A and U or T, and G and C each form a Watson-like structure due to hydrogen bonding.
  • A adenine
  • G guanine
  • C cytosine
  • U uracil
  • T thymine
  • a and U or T A and U or T
  • G and C each form a Watson-like structure due to hydrogen bonding.
  • G and C each form a Watson-like structure due to hydrogen bonding.
  • the relationship between bases that form click base pairs and form base pairs is called "complementary.”
  • each base moiety may be chemically modified, even the modified base usually exhibits the same base pairing ability as the original base.
  • 5-methylcytosine (5C), 5-methyluracil (5U), etc. are known, and 5U has the same structure as T.
  • 5C is shown as C and 5U is shown as T
  • nucleic acids may be expressed as "base symbol (sugar moiety symbol)".
  • base symbol sugar moiety symbol
  • sugar moieties are explained below in the descriptions of various nucleosides.
  • the "modification pattern" of an oligonucleotide means the arrangement of the modification mode of the sugar moiety of each nucleoside constituting the oligonucleotide, regardless of the base sequence, unless otherwise specified. Moreover, when specifically mentioned, it also means the modification pattern combined with the bonding mode between each nucleoside.
  • the structure of the sugar moiety and the internucleoside bonds are factors that do not depend on the target sequence and affect the stability of the molecule and the binding performance caused by that stability. It is said that there is a high possibility that the same effect will be shown when the same modification pattern is applied to another target sequence (for example, Mol Ther. (2016) 26:708 -717).
  • natural nucleosides are 2'-deoxynucleosides or ribonucleosides.
  • the 2'-deoxynucleoside also referred to as "DNA”.
  • the symbol representing the sugar moiety is (D), and the base moiety is sometimes represented by a lowercase letter) corresponding to each base has a structure represented by the following formula.
  • 2'-deoxyadenosine is A(D) or a
  • 2'-deoxyguanosine is G(D) or g
  • 2'-deoxycytidine is C(D) or c
  • thymidine is T(D) or t
  • 2'-deoxy-5-methylcytidine may be written as 5C(D) or 5c
  • 2'-deoxyuridine may be written as U(D) or u.
  • 2'-deoxynucleoside whose base is not specified may be expressed as N(D).
  • RNA The ribonucleoside (also referred to as "RNA"; the symbol representing the sugar moiety is (R), and may also be represented by the base moiety in capital letters) corresponding to each base has a structure represented by the following formula.
  • adenosine may be written as A(R) or A
  • guanosine may be written as G(R) or G
  • cytidine may be written as C(R) or C
  • uridine may be written as U(R) or U.
  • ribonucleosides whose bases are not specified may be written as N(R).
  • modified nucleoside and “modified nucleotide” refer to a nucleoside or nucleotide containing at least one chemically modified structure in the base moiety, sugar moiety, or phosphodiester moiety of a natural nucleoside.
  • a phosphodiester bond that may be chemically modified means a phosphodiester bond employed as a natural internucleoside bond or a chemically modified phosphodiester bond.
  • a natural internucleoside bond is a phosphodiester bond represented by the following formula (P), and in the representation of the base sequence herein, the bond between nucleosides or between a nucleoside and an adjacent structural unit (for example, a GalNAc unit) ), a chemically modified structure (for example, the structure denoted by "2" described below), or a chemical linker or oligonucleotide linker (for example, the structure denoted by "Z” described later). Displayed without intervening.
  • chemically modified phosphodiester bond means a bonding mode in which the phosphorus atom contained in the phosphodiester bond is chemically modified.
  • chemically modified phosphodiester bonds include phosphorothioate bonds represented by the following formula (PS), phosphoroamidate bonds that are modified bonds in which a nitrogen atom is added to a phosphorus atom, and alkyl that can be substituted for a phosphorus atom.
  • An alkylphosphonate bond is a modified bond with a group added (for example, in the case of a methyl group, it becomes a methylphosphonate bond), and a modified bond is a modified bond with a substitutable alkyl group added to the non-covalently bonded oxygen atom of a phosphate group.
  • Examples include phosphotriester bonds.
  • the broken line indicates a bond, and one bond is the oxygen atom of the 3'-hydroxyl group of the nucleoside adjacent to the 5' side (for nucleosides modified at the 3' position, the oxygen atom at the 2' position) , represents an ester bond with an adjacent structural unit, chemical linker or oligonucleotide linker, and the other bond is the oxygen atom of the 5'-hydroxyl group of the nucleoside adjacent to the 3' side, the structural unit, or the chemical linker. Or it represents an ester bond with an oligonucleotide linker.
  • sugar-modified nucleoside refers to a nucleoside in which the sugar moiety of the nucleoside is modified.
  • Sugar-modified nucleosides include all modes of sugar modification known in the art to which the present invention pertains. Examples of sugar-modified nucleosides include 2'-modified nucleosides, 3'-modified nucleosides, 4'-thio-modified nucleosides, 4'-thio-2'-modified nucleosides and 2'-O,4'-C-crosslinked nucleosides. Examples include modified nucleosides.
  • Preferred sugar modifications include 2'-O-alkylation (methylation, ethylation, propylation, isopropylation, butylation, etc.), 2'-O-alkoxyalkylation (methoxyethylation, methoxypropylation, methoxybutyl 2'-halogenation (chlorination, fluorination, etc.), 3'-O-alkylation (methylation, ethylation, propylation, isopropylation, butylation, etc.), 3'-O-alkoxyalkyl (methoxyethylsilylation, methoxypropylation, methoxybutylation, etc.), 3'-halogenation (chlorination, fluorination, etc.), 2'-O,4'-C-crosslinking (alkylenization crosslinking, etc.), etc. be done.
  • 2'-modified nucleoside refers to a nucleoside in which the 2'-position of ribofuranose contained in the nucleoside has been chemically modified.
  • modifications include, for example, 2'-O-alkylated (methylated, ethylated, propylated, isopropylated, butylated, etc.) nucleosides, 2'-O-alkoxyalkylated (methoxyethylated, etc.) nucleosides.
  • Preferred 2'-modified nucleosides are 2'-O-alkylated nucleosides, 2'-O
  • examples of 2'-O-alkylated modifications include, for example, 2'-O-methyl nucleosides (represented as “2'-OMe RNA” or "2'-O-methyl RNA”)
  • the symbol representing the sugar moiety is (M).
  • the 2'-O-methyl nucleoside corresponding to each base has a structure represented by the following formula, with 2'-O-methyladenosine as A(M) and 2'-O-methylguanosine as G(M).
  • 2'-O-methylcytidine is C(M)
  • 2'-O-methyl-5-methylcytidine is 5C(M)
  • 2'-O-methyluridine is U(M)
  • 2'-O- Methyl-5-methyluridine is sometimes written as T(M).
  • 2'-O-methyl nucleoside whose base is not specified may be expressed as N(M).
  • 2'-O-alkoxyalkylation modifications include 2'-O-methoxyethyl nucleoside ("2'-MOE RNA", “2'-O-methoxyethyl RNA” or "2'-O-methoxyethyl RNA”). It may also be expressed as ⁇ methoxyethoxy RNA.'' The symbol representing the sugar moiety is (m).).
  • the 2'-O-methoxyethyl nucleoside corresponding to each base has a structure represented by the following formula, where 2'-O-methoxyethyladenosine is A(m) and 2'-O-methoxyethylguanosine is A(m).
  • G(m) 2'-O-methoxyethyl-5-methylcytidine is replaced by C(m) (the structure of the base is 5C, but for convenience it is expressed as C(m).Replace it with 2'-O-methoxyethylcytidine. ), 2'-O-methoxyethyl uridine may be expressed as U(m), and 2'-O-methoxyethyl-5-methyluridine may be expressed as T(m). Furthermore, 2'-O-methoxyethyl nucleoside, which does not specify the base, may be expressed as N(m).
  • 2'-halogenation modification for example, when expressed as 2'-deoxy-2'-fluoronucleoside ("2'-F RNA" or "2'-deoxy-2'-fluoro RNA")
  • the symbol representing the sugar moiety is (F).
  • the 2'-deoxy-2'-fluoronucleoside corresponding to each base has a structure represented by the following formula, and 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine is converted into A(F), 2'-deoxy- 2'-fluoroguanosine is G(F), 2'-deoxy-2'-fluorocytidine is C(F), 2'-deoxy-2'-fluoro-5-methylcytidine is 5mC(F), 2'- Deoxy-2'-fluorouridine is sometimes written as U(F), and 2'-deoxy-2'-fluoro-5-methyluridine is sometimes written as T(F). Furthermore, 2'-deoxy-2'-fluoronucleoside whose base is not specified may be expressed as N(F).
  • 3'-modified nucleoside refers to a nucleoside in which the 3' position of ribofuranose contained in the nucleoside has been chemically modified.
  • the hydroxyl group at the 2' position in the 3'-modified nucleoside may be modified.
  • 3'-modified nucleosides are 3'-O-alkylated nucleosides, 3'-O-alkoxyalkylated nucleosides, or 3'-halogenated nucleosides. etc. can be exemplified.
  • 3'-O-alkylated modifications include, for example, 3'-O-methyl nucleosides (sometimes expressed as "3'-OMe RNA". Symbols representing sugar moieties) is (3M).).
  • 3M 3'-O-methyl nucleoside corresponding to each base has a structure represented by the following formula, with 3'-O-methyladenosine being A(3M) and 3'-O-methylguanosine being G(3M).
  • 3'-O-methylcytidine to C 3M
  • 3'-O-methyl-5-methylcytidine to 5mC 3M
  • 3'-O-methyluridine to U 3M
  • 3'-O- Methyl-5-methyluridine is sometimes written as T(3M).
  • 3'-O-methyl nucleoside which does not specify the base, is sometimes written as N (3M).
  • 3'-O-alkoxyalkylation modifications include 3'-O-methoxyethyl nucleoside ("3'-MOE RNA”, “3'-O-methoxyethyl RNA”, or "3'-O-methoxyethyl RNA”). It may also be expressed as ⁇ methoxyethoxy RNA.'' The symbol representing the sugar moiety is (3m).).
  • the 3'-O-methoxyethyl nucleoside corresponding to each base is a methoxyethyl group in place of the methyl group bonded to the oxygen atom at the 3' position in the above structural diagram of the 3'-O-methyl nucleoside corresponding to each base. It has a structure in which these are combined.
  • the 3'-O-methoxyethyl nucleosides corresponding to each base are A (3m) for 3'-O-methoxyethyladenosine, G (3m) for 3'-O-methoxyethylguanosine, and G (3m) for 3'-O-methoxyethyl -5-methylcytidine to C(3m) (The structure of the base is 5C, but for convenience it is expressed as C(3m).
  • 3'-O-methoxyethylcytidine 3'-O- Methoxyethyl uridine is sometimes written as U (3m), and 3'-O-methoxyethyl-5-methyl uridine is sometimes written as T (3m).
  • 3'-O-methoxyethyl nucleoside which does not specify the base, may be expressed as N(3m).
  • 3'-halogenation modification for example, when expressed as 3'-deoxy-3'-fluoronucleoside ("3'-F RNA" or "3'-deoxy-3'-fluoro RNA")
  • the symbol representing the sugar moiety is (3F).
  • the 3'-deoxy-3'-fluoro nucleoside corresponding to each base has fluorine in place of the methoxy group bonded to the carbon atom at the 3' position. It has a structure in which atoms are bonded.
  • the 3'-deoxy-3'-fluoro nucleosides corresponding to each base are A (3F) for 3'-deoxy-3'-fluoroadenosine, G (3F) for 3'-deoxy-3'-fluoroguanosine, and G (3F) for 3'-deoxy-3'-fluoroguanosine.
  • '-Deoxy-3'-fluorocytidine is C (3F)
  • 3'-deoxy-3'-fluoro-5-methylcytidine is 5mC (3F)
  • 3'-deoxy-3'-fluorouridine is U (3F)
  • 3'-deoxy-3'-fluoro-5-methyluridine is sometimes expressed as T(3F).
  • 3'-deoxy-3'-fluoronucleoside whose base is not specified may be expressed as N(3F).
  • 4'-thio modified nucleoside refers to a nucleoside in which the oxygen atom at the 4' position of ribofuranose contained in the nucleoside is substituted with a sulfur atom.
  • 4'-thio modified nucleosides include ⁇ -D-ribonucleosides in which the 4'-oxygen atom is substituted with a sulfur atom (Hoshika, S. et al. FEBS Lett. 579, p. 3115 -3118, (2005); Dande, P. et al. J. Med. Chem. 49, p. 1624-1634 (2006); Hoshika, S. et al. ChemBioChem. 8, p.2133-2138, (2007 )).
  • 4'-thio-2'-modified nucleoside refers to a nucleoside in which the 2'-position of ribofuranose is chemically modified and the oxygen atom at the 4'-position of ribofuranose is a sulfur atom. Refers to substituted nucleosides.
  • Examples of 4'-thio-2'-modified nucleosides include 4'-thio-2'-modified nucleosides bearing 2'-H or 2'-O-methyl (Matsugami, et al. al. Nucleic Acids Res. 36, 1805 (2008)).
  • examples of 2'-O,4'-C-crosslinked modifications include 2'-O,4'-C-ethylene bridged nucleosides (indicated as "ENA” or "ENA unit”).
  • ENA 2'-O,4'-C-ethylene bridged nucleosides
  • the symbol representing the sugar moiety is (E).) (Morita, K. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 12, p. 73 (2002); Morita, K. et al. al. Bioorg. Med. Chem., 11, p. 2211 (2003).).
  • the 2'-O,4'-C-ethylene-bridged nucleoside corresponding to each base has a structure represented by the following formula, and 2'-O,4'-C-ethylene-bridged adenosine is converted into A(E).
  • 2'-O,4'-C-ethylene-bridged guanosine is G(E)
  • 2'-O,4'-C-ethylene-bridged-5-methylcytidine is C(E) (the base structure is 5C, but For convenience, it is expressed as C(E). It can also be used in place of 2'-O,4'-C-ethylene-bridged cytidine.)
  • 2'-O,4'-C-ethylene-bridged uridine is expressed as U(E).
  • 2'-O,4'-C-crosslinking modification for example, 2'-O,4'-C-methylene bridged nucleoside (when expressed as "LNA” or "LNA unit”
  • LNA 2'-O,4'-C-methylene bridged nucleoside
  • the 2'-O,4'-C-methylene-bridged nucleoside corresponding to each base has a structure represented by the following formula, and the 2'-O,4'-C-methylene-bridged adenosine is A(L). , 2'-O,4'-C-methylene bridged guanosine is G(L), 2'-O,4'-C-methylene bridged-5-methylcytidine is C(L) (the base structure is 5C, but For convenience, it is expressed as C(L).
  • 2'-O,4'-C-methylene-bridged cytidine 2'-O,4'-C-methylene-bridged uridine is expressed as U(L).
  • 2'-O,4'-C-methylene bridged-5-methyluridine is sometimes expressed as T(L).
  • a 2'-O,4'-C-methylene bridged nucleoside whose base is not specified may be expressed as N(L).
  • the oligonucleotide of the present invention or a salt thereof includes an antisense strand region (sometimes simply referred to as an antisense strand) having a nucleotide sequence substantially complementary to the nucleotide sequence of the target sequence, and a complementary region to the antisense strand region. It has a sense strand region (sometimes simply referred to as the sense strand) having a nucleotide sequence substantially complementary to the nucleotide sequence in .
  • the sense strand region and the antisense strand region form a double-stranded structure in the nucleotide sequence of the complementary region, but each may form a double-stranded oligonucleotide as an independent oligonucleotide, and the 5' end of one
  • the 5'-position of the nucleotide may be linked to the 3'-position (2'-position in the case of a nucleotide whose 3'-position is modified) of the other 3'-terminal nucleotide to form a single-stranded oligonucleotide. That is, the oligonucleotide of the present invention may be two molecules of oligonucleotide or one molecule of oligonucleotide.
  • the manner of linking the sense strand region and the antisense strand region is particularly limited as long as the oligonucleotide of the present invention has an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect.
  • the desired chemical linker or Examples include linking by oligonucleotide linkers. Examples of such a linker include the linker described in WO2012/074038, and preferably a linker represented by the following formula (Z). The linker represented by the following formula (Z) can be adjusted as appropriate according to WO2012/074038.
  • each phosphodiester bond formed may be a chemically modified phosphodiester bond such as a phosphorothioate bond.
  • the 3' position of the nucleotide at the 3' end (the 2' position in the case of a nucleotide modified at the 3' position) and/or the 5' position of the 5' end nucleotide is a hydroxyl group or a phosphate group.
  • They may also be chemically modified structures. Examples of the chemically modified structure include the structure shown in the following formula (2).
  • the broken line indicates a bond, and one bond indicates that it is bonded to an adjacent nucleotide, and when bonding to the 5'-terminal nucleotide, the 5'-phosphate group and the 3'-terminal nucleotide are bonded.
  • a phosphodiester bond is formed with the 3'-phosphate group (the 2'-position phosphate group in nucleotides modified at the 3' position), and the other bond is a hydrogen atom.
  • the phosphodiester bond formed may be a chemically modified phosphodiester bond such as a phosphorothioate bond.
  • substantially identical nucleotide sequence refers to a nucleotide sequence consisting of all the same bases, as well as a nucleotide sequence having 70% or more sequence identity to the target nucleotide sequence. It also includes nucleotide sequences that contain several non-identical bases but are capable of performing the desired function as oligonucleotides.
  • the term “same base” includes a base that is completely the same as the original base, as well as a base that has a base pairing ability equal to or higher than that of the original base.
  • Such bases include, for example, chemically modified bases that have base pairing ability equal to or higher than the original base (for example, C and 5C, U and T (5U)), which are the same bases. regarded as.
  • sequence identity preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, Refers to sequences having 97%, 98% or 99% identity, or a mismatch of 3 bases, 2 bases or 1 base.
  • Nucleotide sequence identity can be calculated using known genetic analysis software such as BLAST (registered trademark).
  • substantially complementary nucleotide sequence refers to a nucleotide sequence consisting of all complementary nucleotides to the target nucleotide sequence, as well as one or several (e.g., five, It also includes nucleotide sequences in which the oligonucleotides form base pairs, although the 4, 3, or 2 nucleotides are not complementary nucleotides.
  • a “complementary base” refers to a base that can form a Watson-Crick base pair with a target base, and may be an unmodified base or a chemically modified base. It may be. For example, 5-methyluracil and 5-methylcytosine are complementary bases to adenine and guanine, respectively.
  • double-stranded structure of an oligonucleotide refers to one in which substantially complementary nucleotide sequences form Watson-Crick base pairs to form a double-stranded structure.
  • the nucleotide sequences forming a double-stranded structure may be substantially complementary nucleotide sequences between two different oligonucleotide molecules, or may be substantially complementary nucleotide sequences within a single-stranded oligonucleotide. It may be.
  • the term "structural unit” refers to a chemical structural unit that imparts a desired function to an oligonucleotide. Desired functions to be imparted to oligonucleotides include, for example, the function of transporting the oligonucleotide to target tissues or target cells (also referred to as target tissues, etc.), the function of improving the in vivo dynamics of oligonucleotides, and the like.
  • the structural unit can be bound to an oligonucleotide by a known method. For example, by having an amidite structure in the structural unit, the 3' position of the nucleotide at the 3' end of the oligonucleotide (3' position is modified).
  • the oligonucleotide can be given transport ability to the target tissue.
  • examples include a GalNAc unit for transport to cells, and a fatty acid unit for transport to liver and muscle tissue.
  • a structural unit for imparting the ability to transport to a target tissue or the like may be particularly referred to as a "transport unit.”
  • RNAi-oligonucleotide refers to substantially complementary nucleotides contained in the sense strand region and antisense strand region that form Watson-Crick base pairs to form a double-stranded structure. It is an oligonucleotide that contains a complementary region and has an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect on a target gene. All bases in the complementary region contained in the RNAi-oligonucleotide do not need to form Watson-Crick base pairs, as long as it has an RNA interference effect and/or a gene expression suppression effect on the target gene.
  • RNAi-oligonucleotides may also be referred to as "siRNA.”
  • nucleotide sequence substantially identical to a target sequence refers to a nucleotide sequence that is identical to a target sequence, but in addition to a completely identical sequence, an RNAi-oligonucleotide can cause RNA interference with a target gene. Substantially the same nucleotide sequences are also included as long as they have the effect and/or suppress gene expression.
  • nucleotide sequence that is substantially complementary to a target sequence refers to a nucleotide sequence that is complementary to a target sequence. Substantially complementary nucleotide sequences are also included as long as they have an RNA interference effect and/or a gene expression suppression effect.
  • an oligonucleotide that includes a nucleotide sequence substantially complementary to a target sequence and has an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect on the target gene is referred to as an RNAi-oligonucleotide against the target gene.
  • the nucleotide sequence of the RNAi-oligonucleotide directed against the target gene is not particularly limited as long as it has an RNA interference effect and/or a gene expression suppression effect against the target gene, but, for example, computer software (e.g. GENETYX (registered trademark): GENETYX COORPORATION It can be determined based on a sequence predicted to have an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect on the target gene using the following methods. Furthermore, it can also be determined by confirming the RNA interference effect and/or gene expression suppression effect of an RNAi-oligonucleotide prepared based on the selected sequence.
  • computer software e.g. GENETYX (registered trademark): GENETYX COORPORATION
  • gene expression suppressing effect includes not only the effect of completely suppressing gene expression but also the effect of reducing gene expression compared to control. Included in suppressive action. Furthermore, in this specification, gene expression suppressing action and gene expression suppressing activity are used interchangeably.
  • RNA interference effect and/or the gene expression suppression effect can be confirmed by a method commonly used by those skilled in the art. This can be confirmed by quantifying the protein that is the translation product of the target gene after the passage of time by Western blot analysis and comparing the protein expression level with a control. It can also be confirmed by measuring the expression level of the target gene in real time after administering RNAi-oligonucleotide to the target gene using real-time PCR.
  • target sequence refers to a sequence of 18 or more nucleotides that may be any part of the nucleotide sequence of mRNA for the gene encoding transferrin receptor 2, which is a target gene, and - refers to the sequence targeted by the oligonucleotide. Further, when SNPs and the like are known in the target sequence, sequences having these mutations are also included in the target sequence.
  • the RNAi-oligonucleotide of the present invention includes a sequence substantially complementary to the target sequence (hereinafter referred to as "target-corresponding sequence") in at least a portion of the antisense strand region.
  • the term "complementary region” refers to a region in which the nucleotide sequences of the sense strand region and antisense strand region contained in an RNAi-oligonucleotide are substantially complementary to each other.
  • the sense strand region and the antisense strand region do not necessarily need to be completely complementary in their complementary regions, but at least the terminal bases in the complementary regions are complementary.
  • the complementary region of the antisense strand region includes a target corresponding sequence, but the 5' end and/or 3' end of the complementary region further extends to the sense strand region. Complementarity may be maintained.
  • the length of the target-corresponding sequence in the antisense strand region constituting the RNAi-oligonucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it has an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect, but may range from 18 nucleotides to open reading of the target gene. It can be any length up to the full length of the frame (ORF).
  • the length of the target corresponding sequence can be 18-29 nucleotides, preferably 18-24 nucleotides, 18-23 nucleotides, or 18-22 nucleotides, more preferably 18-21 nucleotides, and Preferably it is 18 or 19 nucleotides.
  • each complementary region in the sense strand region and antisense strand region constituting the RNAi-oligonucleotide of the present invention is not particularly limited, and may be of any length as long as it has an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect.
  • the length of the complementary region can be 19 to 29 nucleotides, preferably 19 to 24 nucleotides, 19 to 23 nucleotides, or 19 to 22 nucleotides, more preferably 19 to 21 nucleotides, and even more preferably is 19 nucleotides.
  • the length of the sense strand region and antisense strand region constituting the RNAi-oligonucleotide of the present invention is not particularly limited, and may be any length as long as it has an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect.
  • the length of the sense strand region can be, for example, 19 to 39 nucleotides, preferably 19 to 29 nucleotides, more preferably 19 to 24 nucleotides, 19 to 23 nucleotides, or 19 to 22 nucleotides. , more preferably 19 to 21 nucleotides, and most preferably 19 nucleotides.
  • the length of the antisense strand region can be, for example, 19 to 39 nucleotides, preferably 19 to 29 nucleotides, more preferably 19 to 24 nucleotides, 19 to 23 nucleotides, or 19 to 22 nucleotides. More preferably 21 to 23 nucleotides, most preferably 21 nucleotides.
  • RNAi-oligonucleotide of the present invention when the sense strand region and the antisense strand region are present in different oligonucleotide molecules, the entire structure does not need to be a double-stranded structure, and the nucleoside at the 5' and/or 3' end may have a partially protruding structure or an overhanging structure that does not form a double-stranded structure.
  • an overhang structure includes, for example, a structure consisting of 1 to 5 nucleosides, preferably 1 to 3 nucleosides, and more preferably 2 nucleosides. Further, the overhang structure may be present at all ends of the double-stranded oligonucleotide, or only at a portion thereof.
  • the overhang structure is expressed as SO5 at the 5' end of the sense strand region, SO3 at the 3' end, A O5 at the 5' end of the antisense strand region, and A O3 at the 3' end. Each may be displayed.
  • the base sequence of the overhang structure is not particularly limited, oligo T or oligo U can be employed.
  • the RNAi-oligonucleotide has at least one property selected from the following (i) to (iv).
  • (i) has an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect on the target gene;
  • (ii) is stable to RNA degrading enzymes and has an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect on the target gene;
  • (iii) is stable against exonucleases and has an RNA interference effect and/or gene expression suppression effect on the target gene;
  • (iv) is stable against RNA degrading enzymes and exonucleases, and has an RNA interference effect and/or gene expression suppression effect on target genes;
  • RNAi-oligonucleotide is a double-stranded oligonucleotide derived from a double-stranded oligonucleotide having an antisense strand region for a target gene and a sense strand region having a nucleotide sequence substantially complementary to the antisense strand region;
  • the 5' position of the nucleotide at the 5' end of the sense strand region and the 3' position of the nucleotide at the 3' end of the sense strand region (2' position for nucleotides modified at the 3' position) are each chemically modified. They may be bonded by a linker forming a phosphodiester structure.
  • "Oligonucleotide 3'" refers to a structure that does not have a hydrogen atom on the hydroxyl group at the 3' position of the nucleotide at the 3' end of the oligonucleotide (2' position in the case of a modified nucleotide at the 3' position);
  • '-Oligonucleotide' indicates a structure that does not have a hydrogen atom on a hydroxyl group at the 5' position of the nucleotide at the 5' end of the oligonucleotide.
  • Such a linker is described, for example, in WO2012/074038, etc., and can be synthesized with reference to the descriptions in these documents.
  • the nucleosides constituting the RNAi-oligonucleotide may be natural nucleosides or sugar-modified nucleosides.
  • the internucleoside bond is a phosphodiester bond that may be chemically modified, and for example, a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond can be appropriately selected.
  • the RNAi-oligonucleotide of the present invention can suppress the expression of TfR2 mRNA. Furthermore, the RNAi-oligonucleotide of the present invention has low toxicity to cells and can be applied to highly safe pharmaceutical products. Furthermore, the RNAi-oligonucleotide of the present invention can suppress the production of hepcidin, which plays a central role in iron metabolism, by suppressing the expression of TfR2 mRNA. Furthermore, the RNAi-oligonucleotide of the present invention can increase plasma iron concentration and/or HGB level by suppressing the expression of TfR2 mRNA.
  • the RNAi-oligonucleotide of the present invention can be used to treat or prevent diseases that can be treated or prevented by suppressing TfR2 mRNA expression and/or hepcidin production. Such diseases include, for example, anemia.
  • diseases include, for example, anemia.
  • the mechanism of action is not particularly limited, the RNAi-oligonucleotide of the present invention can treat or prevent anemia by increasing HGB levels, for example.
  • the RNAi-oligonucleotides of the present invention can reduce the frequency and/or amount of blood cell transfusions for anemic patients who require blood cell transfusions.
  • blood cell transfusions for anemic patients over a period of time e.g., 1 day, 1 week, 2 weeks, 4 weeks, 8 weeks, 12 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 6 months, or 1 year
  • the frequency and/or amount of blood transfusion may be reduced by about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, or about 100%.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing anemia containing the RNAi-oligonucleotide of the present invention as an active ingredient, a method for treating or preventing anemia comprising administering an effective amount of the oligonucleotide, and Pharmaceutical use inventions are provided, such as the oligonucleotide for use in treatment or prevention, the use of the RNAi-oligonucleotide of the present invention in the manufacture of a pharmaceutical composition for treatment or prevention of anemia, etc.
  • Anemia that can be treated or prevented by the RNAi-oligonucleotide of the present invention includes, for example, anemia of chronic disease (ACD), anemia associated with bone marrow dysfunction, iron deficiency anemia, and iron-unresponsive anemia ( iron deficiency anemia (IRIDA), erythropoietin stimulating agent (ESA) resistant anemia, chemotherapy-induced anemia, aplastic anemia , Diamond Blackfan anemia, and beta thalassemia or sickle Includes hereditary hemoglobinopathies such as hemocytosis.
  • ACD anemia of chronic disease
  • IRIDA iron deficiency anemia
  • ESA erythropoietin stimulating agent
  • chemotherapy-induced anemia chemotherapy-induced anemia
  • aplastic anemia aplastic anemia
  • Diamond Blackfan anemia and beta thalassemia or sickle
  • hereditary hemoglobinopathies such as hemocytosis.
  • Anemia associated with chronic inflammation includes, for example, anemia associated with autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis or systemic lupus erythematosus or autoimmune hemolytic anemia, anemia associated with infections, and anemia associated with inflammatory bowel diseases such as inflammatory bowel disease.
  • autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis or systemic lupus erythematosus or autoimmune hemolytic anemia
  • anemia associated with infections and anemia associated with inflammatory bowel diseases such as inflammatory bowel disease.
  • Anemia associated with chronic kidney disease includes, for example, kidney disease with diabetes, kidney disease with hypertension, nephrotic syndrome (e.g., Finnish congenital nephrotic syndrome, diffuse mesangial sclerosis, minimal change nephrotic syndrome, focal segmental nephrotic syndrome).
  • nephrotic syndrome e.g., Finnish congenital nephrotic syndrome, diffuse mesangial sclerosis, minimal change nephrotic syndrome, focal segmental nephrotic syndrome.
  • kidney disease associated with chronic glomerulonephritis e.g., IgA nephropathy, mesangial proliferative glomerulonephritis, membranous glomerulonephritis, etc.
  • sexual proliferative glomerulonephritis purpuric nephritis, antiglomerular basement membrane nephritis (Goodpasture syndrome), Alport syndrome, Epstein syndrome, lupus nephritis, microscopic polyangiitis, atypical hemolytic uremia syndrome, Nail-Patella syndrome (nail-patella syndrome), fibronectin nephropathy, lipoprotein glomerulopathy, etc.
  • renal disease accompanied by chronic tubulointerstitial nephritis e.g., IgA nephropathy, mesangial proliferative glomerulonephritis, membranous glomerulonephritis, etc.
  • kidney disease with amyloid deposition includes, for example, anemia associated with cancer such as multiple myeloma, acute leukemia, chronic leukemia, lung cancer or breast cancer.
  • Anemia associated with bone marrow dysfunction includes, for example, anemia associated with myelofibrosis, anemia associated with myelodysplastic syndrome, anemia associated with chronic myelomonocytic leukemia (CMML), and anemia associated with bone marrow suppression due to chemotherapy.
  • CMML chronic myelomonocytic leukemia
  • CMML chronic myelomonocytic leukemia
  • RNAi-oligonucleotide of the present invention can be preferably used for the treatment or prevention of anemia associated with chronic inflammation, anemia associated with bone marrow dysfunction, and more preferably rheumatoid arthritis or systemic lupus erythematosus or autoimmune hemolytic anemia.
  • anemia associated with autoimmune diseases such as, anemia associated with infectious diseases, anemia associated with inflammatory bowel diseases such as inflammatory bowel disease, anemia associated with heart failure, anemia associated with chronic kidney disease, anemia associated with cancer, and Castleman's disease.
  • It can be used to treat or prevent anemia, anemia associated with myelofibrosis, anemia associated with myelodysplastic syndrome, anemia associated with chronic myelomonocytic leukemia, and anemia associated with bone marrow suppression due to chemotherapy.
  • RNAi-oligonucleotide of the present invention provides a method for treating or preventing anemia, which comprises using the RNAi-oligonucleotide of the present invention in combination with one or more other drugs.
  • the RNAi-oligonucleotide of the present invention may be used in combination with one or more other drugs as long as the effects of the present invention are achieved.
  • the RNAi-oligonucleotide of the present invention can be used in combination with other drugs having different mechanisms of action against anemia symptoms to provide a greater therapeutic effect.
  • ESA erythropoiesis stimulating agent
  • erythropoiesis stimulating agent which has a mechanism of action that treats anemia by promoting red blood cell proliferation
  • red blood cell differentiation treats anemia by promoting red blood cell differentiation.
  • Drugs such as Luspatercept, which has a mechanism of action that suppresses DNA methylation
  • drugs such as Azacytidine, which has a mechanism of action that inhibits DNA methylation and kills abnormal cells
  • TfR2 siRNA have different mechanisms of action. Therefore, the combination of these drugs and TfR2 siRNA may provide greater therapeutic effects against MDS than single agents.
  • drugs such as ESA and HIFPHD (hypoxia inducible factor prolyl hydroxylase) inhibitors, which have a mechanism of action that treats anemia by promoting the proliferation of red blood cells, may be prescribed.
  • these drugs and TfR2 siRNA have different mechanisms of action. Therefore, the combination of these drugs and TfR2 siRNA may provide a greater therapeutic effect than a single agent for anemia associated with chronic kidney disease.
  • Ruxolitinib is known to exhibit therapeutic effects on myelofibrosis, mainly symptoms such as splenomegaly (N Engl J Med 2012; 366:799-807).
  • Ruxolitinib has a certain therapeutic effect on symptoms other than anemia in myelofibrosis, the combination of Ruxolitinib and TfR2 siRNA provides a useful therapeutic effect on anemia in myelofibrosis. It is possible.
  • JAK2 inhibitors include, for example, Fedratinib, Pacritinib, Momelotinib, and the like.
  • the order in which the RNAi-oligonucleotide of the present invention is administered is not particularly limited as long as the effects of the present invention are achieved, but the order in which the RNAi-oligonucleotide of the present invention is administered is not particularly limited. It may be administered before or after administration of other concomitant drugs.
  • drugs that can be used in combination with the RNAi-oligonucleotide of the present invention include other drugs for treating anemia or drugs for treating diseases that cause anemia.
  • Examples of other anemia therapeutics include ESA, HIFPHD (hypoxia inducible factor prolyl hydroxylase) inhibitors, oral iron preparations, intravenous iron preparations, Danazol, Luspatercept, and the like.
  • ESA include epoetin alfa, epoetin beta, epoetin beta pegol, epoetin kappa, darbepoetin alfa, and the like.
  • Examples of HIFPHD inhibitors include roxadustat, vadadustat, daprodustat, enalodustat, molidustat, and the like.
  • Examples of oral iron preparations include ferrous citrate, ferric citrate, ferrous fumarate, soluble ferric pyrophosphate, and dry iron sulfate.
  • Examples of intravenous iron preparations include ferric carboxymaltose, sugar-containing iron oxide, and the like.
  • examples of therapeutic agents for diseases that cause anemia include myelofibrosis therapeutic agents, myelodysplastic syndrome therapeutic agents, chronic kidney disease therapeutic agents, anticancer agents, and the like.
  • Examples of myelofibrosis therapeutic agents include JAK2 inhibitors.
  • Examples of JAK2 inhibitors include Ruxolitinib, Fedratinib, Pacritinib, Momelotinib, and the like, and combination use with Ruxolitinib is preferred.
  • Examples of therapeutic agents for myelodysplastic syndrome include Azacitidine, Lenalidomide, etc., and combination use with Azacitidine or Lenalidomide is preferred.
  • Examples of therapeutic drugs for chronic kidney disease include SGLT2 (sodium glucose co-transporter 2) inhibitors, renin-angiotensin system inhibitors (e.g., angiotensin II receptor antagonists (ARB), angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors, etc.) , calcium antagonists, diuretics, antidiabetic agents, antihyperlipidemic agents, steroids, immunosuppressants, and the like.
  • Anticancer drugs include chemotherapy drugs, such as cisplatin, carboplatin, doxorubicin, paclitaxel, amrubicin, and the like.
  • RNAi-oligonucleotide of the present invention may be used in combination with a therapeutic agent for iron overload.
  • iron overload When blood cell transfusion is performed as a treatment for anemia, iron overload may develop due to chronic blood cell transfusion. Iron overload is a pathological condition that occurs when iron from transfused blood cells accumulates in tissues such as the liver and heart, leading to liver failure, heart failure, diabetes, joint pain, hypothyroidism, and hypopituitary function. , or sexual dysfunction. Therefore, iron overload therapeutic agents may be used to treat or prevent iron overload in the treatment of anemia, and can be suitably used in combination with the RNAi-oligonucleotide of the present invention.
  • therapeutic drugs for iron overload include iron chelating agents, and iron chelating agents include deferasirox, deferoxamine, deferiprone, and the like.
  • the sense strand region consists of an oligonucleotide shown by the following formula (I)
  • the antisense strand region consists of an oligonucleotide shown by the following formula (II)
  • the following (a) to (g) are further provided.
  • RNAi-oligonucleotide (hereinafter referred to as "S3M-oligonucleotide") or a pharmaceutically acceptable salt thereof having the characteristics indicated:
  • Sense strand region 5' S O5 -S a -S 19 -S 18 -S 17 -S 16 -S 15 -S 14 -S 13 -S 12 -S 11 -S 10 -S 9 -S 8 -S 7 -S 6 -S 5 -S 4 -S 3 -S 2 -S 1 -S O3 3'
  • Antisense strand region 5' A O5 -A 1 -A 2 -A 3 -A 4 -A 5 -A 6 -A 7 -A 8 -A 9 -A 10 -A 11 -A 12 -A 13 -A 14 -A 15 -A 16 -A 17 -A 18 -A 19 -A a -A O3 3' (II)
  • S a is 0-10 nucleosides, preferably 0-5 or 0-4, more preferably 0-3, 0-2, or 0-1 nucleosides.
  • S 2 O3 and S 2 O5 are each independently 0-5, preferably 0-4, more preferably 0-3, 0-2, or 0-1 nucleosides.
  • the bond between each nucleoside represents a phosphodiester bond which may be chemically modified;
  • a 1 to A 19 each represent one nucleoside, and at least one of A 11 , A 12 , A 13 , A 14 and A 15 is DNA, RNA, 2'-O,4'- C-bridged nucleoside or 2'-MOE RNA.
  • a a is 0-10 nucleosides, preferably 0-5 or 0-4, more preferably 0-3, 0-2, or 0-1 nucleosides.
  • a O3 and A O5 are each independently 0-5, preferably 0-4, more preferably 0-3, 0-2, or 0-1 nucleosides.
  • the bond between each nucleoside represents a phosphodiester bond which may be chemically modified;
  • the nucleotide sequence between A 2 and A a consists of a nucleotide sequence that is substantially complementary to the target sequence (target-compatible sequence), and A 1 has a base that is complementary to the corresponding nucleoside of the target sequence.
  • a nucleoside, an adenine-containing nucleoside, a thymine-containing nucleoside, or a uracil-containing nucleoside, and when A O3 and A O5 are present, their nucleotide sequences are each independently independent of the corresponding nucleoside of the target sequence. is a selected nucleotide sequence; (d) The nucleotide sequence between S 1 and S a and the nucleotide sequence between A 1 and A a are complementary regions consisting of nucleotide sequences that are substantially complementary to each other, and have a double-stranded structure.
  • the sense strand region of the S3M-oligonucleotide refers to the region represented by the above formula (I), ie, S O5 to S O3 .
  • the complementary regions in the sense strand region of the S3M-oligonucleotide are indicated as S 1 to S 19 numbered from the 3'-terminal nucleoside, and S a located on the 5' side of the complementary region. That is, the complementary region in the sense strand of the S3M-oligonucleotide is the region S 1 to S a in the above formula (I).
  • S 1 to S 19 each represent one nucleoside, and S a is 0 to 5, preferably 0 to 4, more preferably 0 to 3, 0 to 2, or 0 to 1. Represents a nucleoside. Furthermore, regarding the overhang structure of the sense strand region, the one added to the 5' end is indicated as SO5 , and the one added to the 3' end is indicated as S O3 , and each has 0 to 5, preferably 0 to 4, or more. Preferably, it represents 0 to 3, 0 to 2, or 0 to 1 nucleosides.
  • the S3M-oligonucleotide is characterized in that the nucleoside located at the 3' end of the complementary region in the sense strand region (ie, S 1 in formula (I) above) is a 3'-modified nucleoside.
  • Such 3'-modified nucleosides are not particularly limited as long as the S3M-oligonucleotide has an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect, but preferably 3'-deoxy-3'-fluoroRNA (3' -F RNA), 3'-OMe RNA, or 3'-MOE RNA, more preferably 3'-OMe RNA.
  • the 2' position of this 3'-modified nucleoside is a hydroxyl group, an optionally modified alkoxy group (preferably a methoxy group, an ethoxy group, a methoxyethoxy group), or an optionally modified phosphate group (
  • it may be a phosphoric acid group (thiophosphoric acid group, dithiophosphoric acid group, methyl phosphoric acid group, ethyl phosphoric acid group), and is bonded to the 5' position of the nucleoside of the overhang structure (i.e., S O3 in the above formula (I)).
  • it may be combined with a linker structure.
  • the 2' position is a hydroxyl group.
  • nucleosides other than S 1 in the complementary region in the sense strand region of the S3M-oligonucleotide are not particularly limited, and various natural nucleosides or sugar-modified nucleosides can be employed, but preferably each 2' -OMe RNA, 2'-F RNA or DNA.
  • One embodiment of the complementary region in the sense strand region of the S3M-oligonucleotide is the 11th, 12th, 13th, and 15th nucleoside from the 3' end (i.e., S 11 , S 12 , S 13 and S in formula (I) above). At least one of 15 ) is 2'-F RNA, and the other nucleosides are 2'-OMe RNA, 2'-F RNA, DNA, or a combination thereof.
  • S 11 , S 12 , S 13 and S 15 are all 2'-F RNA.
  • the complementary region in the sense strand region of the S3M-oligonucleotide is that the nucleosides of S 2 to S 10 , S 14 , S 16 to S 19 and S a of the complementary region in the sense strand region are each independently , 2'-OMe RNA, 2'-F RNA, or DNA, or a modification pattern in which two types selected from these are arranged alternately, and more preferably, each independently 2'-OMe RNA, DNA, or the like. are alternating modification patterns, even more preferably all of them are 2'-OMe RNA.
  • the number of nucleosides in S a can be appropriately selected from 0 to 10, and if necessary, from the 3' side, S 20 , S 21 , S 22 , S 23 , S 24 , S 25 , S 26 , S27 , S28 , and S29 .
  • nucleotide sequence of the complementary region in the sense strand region of the S3M-oligonucleotide is the same as the complementary region in the antisense region (i.e., A 1 to A in the above formula (II)).
  • a nucleotide sequence substantially complementary to a is the same as the complementary region in the antisense region (i.e., A 1 to A in the above formula (II).
  • the sense strand region of the S3M-oligonucleotide may have an overhang structure (ie, S O3 and S O5 in the above formula (I)) at the 3' end and/or 5' end of its complementary region.
  • S O3 and S O5 each independently represent 0 to 5 (preferably 4, 3, 2, 1 or 0) nucleosides, and each nucleoside independently represents 2'-OMe RNA, 2 '-F RNA, DNA or 2'-O,4'-C-bridged modified nucleoside.
  • S O3 and S O5 are not present.
  • the base is not particularly limited as long as it functions as an overhang, but is preferably oligo U or oligo T.
  • S O5 (N(M)) and S a (N(M)) represent nucleosides consisting of 0 to 3 2'-OMe RNAs.
  • Two internucleoside bonds between the 5' and 3' ends of each oligonucleotide are phosphorothioate bonds, and the other internucleoside bonds are phosphodiester bonds. That is, each oligonucleotide has a total of four phosphorothioate bonds, two each at the 3' and 5' ends. ]
  • the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide refers to the region represented by the above formula (II), ie, A O5 to A O3 .
  • the complementary regions in the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide are indicated as A 1 to A 19 numbered from the 5'-terminal nucleoside, and A a located on the 3' side of the complementary region. That is, the complementary region of the antisense strand is the region A 1 to A a in the above formula (II).
  • the nucleotide sequence of the complementary region in the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide may be any nucleotide sequence that is substantially complementary to the target sequence, for example, a mismatch of 5, 4, 3, 2, or 1 base with the target sequence. may be included, preferably fully complementary.
  • a 1 to A 19 each represent one nucleoside, and A a represents 0 to 5 nucleosides.
  • the overhang structure of the antisense strand region is expressed as A O5 when added to the 5' end, and A O3 when added to the 3' end.
  • a 1 may be a base that is substantially complementary to the corresponding base of the target sequence, and may be adenine, uracil, or thymine independently of the target sequence. It is described in patent US 10093923 and the like that good RNA interference activity is exhibited when the 3'-terminal base in the complementary region of the sense strand of siRNA is adenine or uracil, regardless of the target sequence. Additionally, the literature (Nature 465, 818-822 (2010)) shows that the nucleoside at the 5' end of the antisense strand binds to Ago2 protein, which is involved in RNA interference activity, and does not bind to target mRNA. .
  • nucleoside at the 5' end of the antisense strand is adenine or uracil nucleoside, it binds more strongly to Ago2 protein than when it is guanine or cytosine.
  • the ' terminus is preferably an adenine or uracil nucleoside.
  • At least one (preferably two or more) of complementary regions A 11 , A 12 , A 13 , A 14 and A 15 in the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide is DNA, RNA, 2'- Any one selected from the group consisting of O,4'-C-bridged modified nucleosides and 2'-MOE RNA.
  • the 2'-O,4'-C-crosslinked modified nucleoside used here is not particularly limited, but is preferably LNA or ENA.
  • nucleosides other than the nucleosides identified above are not particularly limited, and various natural nucleosides or sugar-modified nucleosides can be employed, but preferably, each independently 2'- OMe RNA, 2'-F RNA or DNA.
  • an oligonucleotide in which A 14 of the complementary region in the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide is RNA.
  • Such oligonucleotide modification patterns include, for example, types 56 and 57 in FIG. 2, types 61, 62, 66, and 67 in FIG. 3, types 75 to 83 in FIG. 5, and types 91 in FIG. Examples include, but are not limited to, those shown in Types 1 to 95.
  • A13 is a 2'-O, 4'-C-bridged modified nucleoside, 2'-OMe RNA or 2'-F RNA. , more preferably a 2'-O, 4'-C-crosslinked modified nucleoside, and even more preferably ENA or LNA (types 76 to 83 in Figure 5 and types 91 to 93 in Figure 6).
  • the modification pattern of A 11 -A 12 -A 13 -A 14 -A 15 is preferably one of the following formulas (IIIa) to (IIIh).
  • an oligonucleotide in which A 14 of the complementary region in the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide is a 2'-O,4'-C-bridged modified nucleoside.
  • the 2'-O,4'-C-bridged modified nucleoside is preferably ENA or LNA.
  • Examples of such oligonucleotide modification patterns include, but are not limited to, those shown in types 70 to 74 in FIG. 4 and types 88 to 90 in FIG. 6.
  • a 12 is DNA.
  • the modification pattern of A 11 -A 12 -A 13 -A 14 -A 15 in the antisense strand complementary region is preferably one of the following formulas (IIIi) to (IIIl). .
  • an oligonucleotide is provided in which A 14 of the complementary region in the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide is DNA.
  • Examples of such oligonucleotide modification patterns include, but are not limited to, those shown in types 58 and 59 in FIG. 2 and types 63, 64, 68, and 69 in FIG. 3. .
  • an oligonucleotide in which A 15 of formula (II) in the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide is 2'-MOE RNA.
  • Examples of such oligonucleotide modification patterns include, but are not limited to, those shown in types 79 and 83 in FIG. 5.
  • any one of the 11th to 13th nucleosides (A 11 , A 12 , A 13 in formula (II)) from the 5' end of the complementary region in the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide is 2' Oligonucleotides that are -O,4'-C-bridged modified nucleosides are provided.
  • modification patterns of such oligonucleotides include ENA types 43 and 45 in Figure 1, types 75 to 84 in Figure 4, types 85, 86, and types 91 to 93 in Figure 6;
  • Examples of the LNA include types 44 and 46 in FIG. 1, and types 67 and 69 in FIG. 3, but the LNA is not limited to these.
  • any of the 11th to 13th nucleosides (A 11 , A 12 , A 13 in formula (II)) from the 5' end of the complementary region in the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide is DNA.
  • Certain oligonucleotides are provided. Examples of such oligonucleotide modification patterns include, but are not limited to, types 41 and 42 in Figure 1, types 71 in Figure 4, and types 87 to 90 in Figure 6. Not done.
  • any one of the 11th to 13th nucleosides (A 11 , A 12 , A 13 in formula (II)) from the 5' end of the complementary region in the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide is 2' -
  • An oligonucleotide is provided that is MOE RNA. Examples of such oligonucleotide modification patterns include, but are not limited to, types 47 and 48 in FIG. 1, and type 74 in FIG. 4.
  • nucleosides other than the nucleosides specified above can be appropriately selected, but preferably A 2 , A 6 and A 16 At least one (preferably all) nucleosides of is 2'-F RNA.
  • a more preferred antisense strand region is one in which, in addition to A 2 , A 6 and A 16 , one or two nucleosides selected from the group consisting of A 8 , A 9 and A 10 are 2'-F RNA.
  • nucleosides other than those specified above eg, A 1 , A 3 -A 5 , A 7 , A 17 -A 19 and A a ) are 2'-OMe RNA or DNA.
  • Preferred modification patterns for regions other than A 11 to A 15 in the complementary region in the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide of the present invention are illustrated, for example, in Table A-1 and Table A-2 below.
  • (M) is 2'-OMe RNA
  • (F) is 2'-F RNA.
  • a a is 0 to 5 nucleosides, and all cases other than 0 are the same nucleosides.
  • a O3 is 0 to 5 nucleosides, all other than 0 being the same nucleoside.
  • a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond is appropriately selected as the internucleoside bond.
  • the antisense strand region contained in the S3M-oligonucleotide has an overhang structure (i.e., A O3 and A O5 in the above formula (II)) at the 3' end and/or 5' end of its complementary region. You can leave it there.
  • a O3 and A O5 each independently represent 0 to 5 (preferably 3, 2, 1 or 0) nucleosides, and each nucleoside independently represents 2'-OMe RNA, 2'- F RNA, DNA or 2'-O,4'-C-bridged modified nucleoside.
  • a O3 is an overhang consisting of 2 or 3 2'-OMe RNAs, or alternatively 1 or 2 2'-OMe RNAs and 1 or 2 2'-O,4' -C-crosslinked modified nucleoside, and AO5 is not present.
  • the base is not particularly limited as long as it functions as an overhang, but is preferably oligo U or oligo T.
  • the bonding mode between each nucleoside of the S3M-oligonucleotide of the present invention can be appropriately selected from a phosphodiester bond which may be chemically modified, and is preferably a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond.
  • a phosphodiester bond which may be chemically modified
  • Each can be used alone or in combination.
  • it is a combination of phosphodiester bonds or phosphorothioate bonds, and the content of phosphorothioate bonds is 50% or less, 40% or less, or 30% or less in the internucleoside bonds contained in the sense strand region and the antisense strand region, respectively. , 29% or less, 28% or less, 27% or less, 26% or less, or 25% or less.
  • the bond between the nucleoside and the nucleoside adjacent to its 3' side may be a phosphorothioate bond.
  • the bond between the nucleoside and its 3'-adjacent nucleoside is a phosphorothioate bond.
  • the 1st, 2nd, 3rd, 4th, or 5th internucleoside bond from the 5' end and/or 3' end of the oligonucleotide (1, 2, 3, or 4 locations) is preferably a phosphorothioate bond.
  • each of the 1, 2, 3, 4, or 5 nucleosides from the 5' end and 3' end of the sense strand region and the 1st, 2nd, 3rd, 4th, or 5th internucleotide bond from the 5' end and 3' end of the antisense strand region may be a phosphorothioate bond, preferably, the 5' end of the sense strand region
  • Each of the 1st, 2nd, and 3rd internucleoside bonds from the end and 3' end (2 locations in terms of the number of bonds between nucleosides), and each of the 1st, 2nd, and 3rd from the 5' end of the antisense strand region
  • the method for preparing the oligonucleotide of the present invention is not particularly limited as long as the desired oligonucleotide can be synthesized, but known chemical synthesis methods (phosphotriester method, phosphoramidite method, H-phosphonate method, etc.) may be used. Can be used. For example, it can be synthesized using a commercially available nucleic acid synthesizer and reagents used for commercially available DNA/RNA synthesis.
  • Oligonucleotides having the desired nucleotide sequence are prepared by the usual phosphoramidite method using a DNA synthesizer, such as PerkinElmer's model 392 using the phosphoramidite method, as described in the literature (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)). ) can be synthesized according to the method described in .
  • Amidite reagents compatible with various nucleosides may be purchased and used commercially, or they may be synthesized according to known methods.
  • the oligonucleotide of the present invention can be prepared by the method described in the literature (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) using a commercially available synthesizer (for example, PerkinElmer's model 392 based on the phosphoramidide method). It can be synthesized according to the same method.
  • the phosphoramidite reagents used in this case include natural nucleosides and 2'-O-methyl nucleosides (i.e., 2'-O-methylguanosine, 2'-O-methyladenosine, 2'-O-methylcytidine, For 2'-O-methyluridine), commercially available phosphoramidite reagents can be used.
  • 2'-O-methoxyethylguanosine, 2'-O-methoxyethyladenosine, 2'-O-methoxyethyl-5-methylcytidine, 2'-O-methoxyethyl-5-methyluridine can synthesize the corresponding phosphoramidite reagent according to the patent (US6261840) or the literature (Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.), using commercially available phosphoramidite reagents. You can also do that.
  • 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine
  • 2'-deoxy-2'-fluorocytidine 2'-deoxy-2'-fluorouridine
  • 2'-deoxy-2'-fluorouridine can synthesize the corresponding phosphoramidite reagent according to the literature (J. Med. Chem. 36, 831 (1993)), and commercially available phosphoramidite reagents can also be used.
  • 3'-deoxy-3'-fluoroguanosine is 3'-deoxy-3'-fluoroguanosine according to WO2017027645
  • 3'-deoxy-3'-fluoroadenosine is 3'-deoxy-3'- according to WO2018198076.
  • Fluorouridine can be synthesized into the corresponding phosphoramidite reagent according to US2011/0196141. Further, 3'-deoxy-3'-fluorocytidine can be synthesized with reference to known methods such as the above-mentioned literature.
  • 3'-OMe RNA which is a 3'-modified nucleoside
  • 3'-O-methylguanosine, 3'-O-methyladenosine, 3'-O-methylcytidine, and 3'-O-methyluridine are commercially available phosphorus. It can be synthesized using Roamidite reagent.
  • 3'-MOE RNA which is a 3'-modified nucleoside, 3'-O-methoxyethylguanosine, 3'-O-methoxyethyladenosine, 3'-O-methoxyethyl-5-methylcytidine, 3'-O- Methoxyethyl-5-methyluridine can be used to synthesize the corresponding phosphoramidite reagent according to US2003/0096979.
  • the corresponding phosphoramidite reagents can be prepared according to the method described in WO99/14226.
  • the 2'-deoxy-2'-C,4'-C-methyleneoxymethylenated nucleoside of D-ribofuranose was prepared according to the literature (Wang, G. et al. Tetrahedron (1999), 55, 7707-7724).
  • the corresponding phosphoramidite reagents can be synthesized.
  • S-cEt relaxed ethyl
  • S-cEt relaxed ethyl
  • the corresponding phosphoramidite reagent can be synthesized according to the literature (Yahara, A. et al. ChemBioChem (2012), 13, 2513-2516.) or WO2014/109384.
  • antisense with a phosphorothioate bond can be prepared by reacting with a reagent such as sulfur, tetraethylthiuram disulfide (TETD, Applied Biosystems), Beaucage reagent (Glen Research), or xanthan hydride.
  • a reagent such as sulfur, tetraethylthiuram disulfide (TETD, Applied Biosystems), Beaucage reagent (Glen Research), or xanthan hydride.
  • Oligonucleotides can be synthesized (Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198).
  • CPG controlled pore glass
  • Nucleosides prepared according to the described method can be coupled to CPG according to the literature (Oligonucleotide Synthesis, Edited by M.J. Gait, Oxford University Press, 1984). Alternatively, it can be synthesized by binding the above-mentioned phosphoramidite reagent using a universal resin. Furthermore, by using a modified CPG (described in Example 12b of JP-A-7-87982), an oligonucleotide having a 2-hydroxyethyl phosphate group bonded to the 3' end can be synthesized.
  • this method it is possible to synthesize oligonucleotides with a hydroxyalkyl phosphate group or an aminoalkyl phosphate group attached to the 3' end.
  • thioating oligonucleotide analogs in addition to sulfur, tetraethylthiuram disulfide (TETD, Applied Biosystems), Beaucage reagent, phenylacetyl disulfide/pyridine-acetonitrile (1:1 v/v) solution (Ravikumar, Using reagents such as V.T. et al. Bioorg. Med. Chem. . Chem. The thioate derivative can be obtained according to the method described in Soc., 112, 1253 (1990).
  • a silyl-based protecting group such as t-butyldimethylsilyl (TBS) group is used as a protecting group for the 2'-hydroxyl group of RNA, tetrabutylammonium fluoride (TBAF), HF-pyridine, or HF- Deprotection can be performed using triethylamine or the like.
  • TBS t-butyldimethylsilyl
  • TBAF tetrabutylammonium fluoride
  • HF-pyridine HF-pyridine
  • HF- Deprotection can be performed using triethylamine or the like.
  • the preferred solution is concentrated ammonia water or a mixed solution of concentrated ammonia water and ethanol (3:1 V/V).
  • the oligonucleotide of the present invention can be obtained by purification using a purification procedure commonly used for purifying nucleic acids, such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography (including high performance liquid chromatography), and other various chromatography techniques. can.
  • a purification procedure commonly used for purifying nucleic acids such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography (including high performance liquid chromatography), and other various chromatography techniques. can.
  • the oligonucleotide of the present invention includes an oligonucleotide bound to a transport unit for transporting the oligonucleotide to a target tissue or target cell.
  • a transport unit for transporting the oligonucleotide to a target tissue or target cell.
  • a unit having an aminoalkyl phosphate group for example, the alkyl has 3 to 9 carbon atoms
  • an oligonucleotide to which such a transport unit is bound for example, a unit having an aminoalkyl phosphate group (for example, the alkyl has 3 to 9 carbon atoms) introduced into the desired chemical structure can be used as an oligonucleotide.
  • Examples include oligonucleotides bound to the 5' position of the nucleotide at the 5' end of the nucleotide and/or the 3' position of the 3' end nucleotide (or the 2' position for nucleotides whose 3' position is modified).
  • Such transport units include, for example, GalNAc units that bind to the asialoglycoside receptor (ASGRP) of liver parenchymal cells, fatty acids (such as myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidin acid) for transport to the liver and muscle tissue. acid, behenic acid, etc.) units (for example, see Nucleic Acids Res. (2020) 47, 6029-6044, WO2017/19267, etc.), etc. can be appropriately employed.
  • ASGRP asialoglycoside receptor
  • the GalNAc unit is a structural unit containing N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc) that can bind to ASGRP, and can be used to deliver the oligonucleotide of the present invention to the liver.
  • the GalNAc unit may have a linear or branched linker structure, for example, a linear chain, 2 or more branches, 3 or more branches, or 4 or more branches, or 4 or less branches, 3 branches or less, or 2 branches. It may have the following branched linker structure.
  • the GalNAc unit may also contain a phosphate or thiophosphate group for binding to oligonucleotides.
  • GalNAc unit that can be used in the oligonucleotide of the present invention include WO2021/049504, WO2009/073809, WO2014/076196, WO2014/179620, WO2015/006740, and WO2015/105083.
  • Publication, WO2016/0556012017/023817, WO2017/084987, WO2017/131236, Methods in Enzymology, 1999, Volume 313, Pages 297-321, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 26 (2 016) 3690-3693 , etc. can be appropriately employed.
  • GalNAc unit As a GalNAc unit that can be adopted, one of the following formula can be mentioned, and it can be adjusted as appropriate according to the method described in WO2021/049504.
  • the broken line indicates the bond, and the oxygen atom of the bond indicates that it is bonded to the adjacent nucleotide.
  • the 5'-phosphate group and the 3' end When bonding with a nucleotide of The bond may be a chemically modified phosphodiester bond such as a phosphorothioate bond.
  • the oligonucleotides of the present invention include oligonucleotides in which cholesterol units, lipid units, or vitamin E units are introduced (for example, Lorenz, C. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, p. 4975- 4977 (2004); Soutschek, J., et al. Nature, 432, p. 173-178, (2004); Wolfrum, C. et al. Nature Biotech. 25, p.1149-1157, (2007)) Kubo , T. et al. Oligonucleotides, 17, p. 1-20, (2007); Kubo, T. , et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 365, p.
  • oligonucleotides in which an aptamer, which is a nucleic acid molecule that binds to a protein, is attached to the end of the oligonucleotide.
  • the oligonucleotides of the present invention also include oligonucleotides conjugated with monoclonal antibodies (or suitable binding portions thereof) or proteins (or suitable oligopeptide fragments thereof) (see, for example, Song, et al. Nature Biotech. 23, p. 709-717 (2005); Xia et al. Pharm. Res. 24, p. 2309-2316 (2007); .
  • the oligonucleotides of the present invention include those made into positively charged complexes by adding a cationic polymer to the oligonucleotides (as an example of achieving distribution to organs and cells, Leng et al. J. Gen. Med. 7, p. 977-986 (2005), Baigude et al. 2, p. 237-241, ACS Chem. Biol. (2007), Yadava et al. Oligonucleotide 17, p. .213-222 (2007)).
  • the oligonucleotides of the present invention include any pharmaceutically acceptable salts, esters, or salts of such esters of the oligonucleotides described above.
  • Pharmaceutically acceptable salts of the oligonucleotide of the present invention are preferably alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts, and lithium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts, and aluminum salts.
  • metal salts such as iron salts, zinc salts, copper salts, nickel salts, cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts, t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholine salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts , ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N,N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt , amine salts such as organic salts such as piperazine salts, tetramethylammonium salts, tris(hydroxymethyl)aminomethane salts; such as hydrofluoride, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide.
  • Inorganic acid salts such as hydrohalides, nitrates, perchlorates, sulfates, and phosphates; lower alkanesulfonates such as methanesulfonates, trifluoromethanesulfonates, and ethanesulfonates; Aryl sulfonates such as benzenesulfonate, p-toluenesulfonate, acetate, malate, fumarate, succinate, citrate, tartrate, oxalate, maleate. and amino acid salts such as glycine salt, lysine salt, arginine salt, ornithine salt, glutamate, and aspartate.
  • the oligonucleotide of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can suppress the expression of TfR2 mRNA. Furthermore, the oligonucleotide of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can suppress the production of hepcidin, which plays a central role in iron metabolism, by suppressing the expression of TfR2 mRNA. Although the mechanism of action is not particularly limited, the oligonucleotide of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be used to treat or prevent diseases that can be treated or prevented by suppressing the expression of TfR2 mRNA and/or the production of hepcidin. Can be used.
  • the expression of TfR2 mRNA when administered to an anemic patient, can be suppressed, and an improvement effect on anemia symptoms can be expected.
  • the oligonucleotide of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can also be used as a pharmaceutical composition containing the oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • compositions containing the oligonucleotides of the present invention may be combined with other molecules, molecules, e.g. as liposomes, receptor targeting molecules, oral, rectal, topical or other formulations to aid in uptake, distribution and/or absorption.
  • Other molecules, molecules e.g. as liposomes, receptor targeting molecules, oral, rectal, topical or other formulations to aid in uptake, distribution and/or absorption.
  • Mixed, encapsulated, conjugated with a structure or mixture of compounds may be used as a prophylactic or therapeutic agent for a disease
  • the oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be used as such or in an appropriate pharmaceutically acceptable excipient.
  • excipients e.g. sugar derivatives such as lactose, sucrose, glucose, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, potato starch, alpha starch, dextrin; cellulose derivatives such as crystalline cellulose; Gum arabic; dextran; organic excipients such as pullulan; and silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, calcium silicate, and magnesium aluminate metasilicate; phosphates such as calcium hydrogen phosphate; carbonic acid carbonates such as calcium; inorganic excipients such as sulfates such as calcium sulfate); lubricants (e.g.
  • metal stearates such as stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate); Salt; talc; colloidal silica; waxes such as beeswax and gay wax; boric acid; adipic acid; sulfates such as sodium sulfate; glycol; fumaric acid; sodium benzoate; DL leucine; sodium lauryl sulfate, magnesium lauryl sulfate lauryl sulfates such as; silicic acids such as silicic anhydride and silicic acid hydrate; and the above-mentioned starch derivatives.
  • disintegrants e.g., cellulose derivatives such as low-substituted hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose, calcium carboxymethylcellulose, internally crosslinked sodium carboxymethylcellulose; Chemically modified starches and celluloses such as carboxymethyl starch, sodium carboxymethyl starch, cross-linked polyvinylpyrrolidone), emulsifiers (e.g. colloidal clays such as bentonite and vegum; magnesium hydroxide, water Metal hydroxides such as aluminum oxide; anionic surfactants such as sodium lauryl sulfate and calcium stearate; cationic surfactants such as benzalkonium chloride; and polyoxyethylene alkyl ethers and polyoxyethylene sorbitan.
  • disintegrants e.g., cellulose derivatives such as low-substituted hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose, calcium carboxymethylcellulose, internally crosslinked sodium carboxymethylcellulose; Chemically modified starches and celluloses such as carboxymethyl starch,
  • Nonionic surfactants such as fatty acid esters, sucrose fatty acid esters), stabilizers (paraoxybenzoate esters such as methylparaben and propylparaben; chlorobutanol, benzyl alcohol, phenylethyl alcohol, etc.) benzalkonium chloride; phenols such as phenol and cresol; thimerosal; dehydroacetic acid; and sorbic acid. ), flavoring agents (for example, commonly used sweeteners, acidulants, fragrances, etc.), diluents, and other additives.
  • the term "introduced object” means a cell, tissue, or individual.
  • Cells into which the oligonucleotide of the present invention is introduced include germ line cells, somatic cells, totipotent cells, multipotent cells, dividing cells, non-dividing cells, parenchymal cells, epithelial cells, immortalized cells, and plasma cells. They may be any of transformed cells, nerve cells, or immune cells.
  • Tissues include single-cell embryos, constitutive cells, multi-cell embryos, fetal tissues, etc.
  • examples of the differentiated cells include adipocytes, fibroblasts, muscle cells, cardiomyocytes, endothelial cells, nerve cells, glia, blood cells, megakaryocytes, lymphocytes, macrophages, neutrophils, eosinophils, Examples include basophils, mast cells, leukocytes, granulocytes, keratinocytes, chondrocytes, osteoblasts, osteoclasts, hepatocytes, and endocrine or exocrine gland cells.
  • CHO-K1 cells RIKEN Cellbank
  • Drosophila S2 cells Schottamper cells
  • human HeLa cells ATCC: CCL-2
  • human HEK293 cells ATCC: CRL-1573
  • oligonucleotide of the present invention include those belonging to plants, animals, protozoa, viruses, bacteria, and fungi.
  • Plants may be monocots, dicots or gymnosperms, and animals may be vertebrates or invertebrates.
  • Preferred vertebrates are mammals including mice, rats, monkeys, dogs and humans.
  • Methods for introducing the oligonucleotide of the present invention into a transfectant include calcium phosphate method, electroporation method, lipofection method, viral infection, and 3L5-oligonucleotide solution when the transfectant is a cell or tissue. immersion, transformation method, etc. are used.
  • methods for introducing it into embryos include microinjection, electroporation, virus infection, and the like.
  • methods such as injection or perfusion into the body cavity or interstitial cells of the plant, or spraying are used.
  • systemic introduction methods such as oral, local, subcutaneous, intramuscular and intravenous administration, parenteral, vaginal, rectal, nasal, ocular, and transmembrane administration; Alternatively, electroporation, virus infection, etc. may be used.
  • oral introduction it is also possible to use a method in which the oligonucleotide of the present invention is directly mixed with the food of the organism.
  • colloidal dispersion systems are expected to have the effect of increasing the in-vivo stability of compounds and the effect of efficiently transporting compounds to specific organs, tissues, or cells.
  • Colloidal dispersions include, but are not limited to, commonly used lipid-based polymer complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and oil-in-water emulsifiers, micelles, mixed micelles, and liposomes.
  • Examples include dispersed systems, preferably liposomes, artificial membrane vesicles, which have the effect of efficiently transporting compounds to specific organs, tissues or cells (Mannino et al., Biotechniques, 1988 , 6, p. 682-; Blume and Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, 1990, 1029, p. 91-; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, p. 119-; Chonn and Cullis, Current Op.Biotech., 1995, 6, p.698-).
  • Unilamellar liposomes with a size range of 0.2-0.4 ⁇ m can encapsulate a significant proportion of an aqueous buffer containing macromolecules, and the compounds are encapsulated in this aqueous inner membrane and biologically It is transported to brain cells in active form (Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 1981, 6, p. 77-).
  • composition of liposomes is usually a complex of a lipid, especially a phospholipid, especially a phospholipid with a high phase transition temperature, with one or more steroids, especially cholesterol.
  • lipids useful in liposome production include phosphatidyl compounds such as phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, sphingolipids, phosphatidylethanolamine, cerebrosides, and gangliosides.
  • diacylphosphatidylglycerols in which the lipid moiety contains 14-18 carbon atoms, especially 16-18 carbon atoms, and is saturated (a double bond within the 14-18 carbon atom chain).
  • Representative phospholipids include phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, and distearoylphosphatidylcholine.
  • Targeting of colloidal dispersions, including liposomes can be either passive or active.
  • Passive targeting is achieved by exploiting the natural tendency of liposomes to distribute to the reticuloendothelial system cells of organs containing sinusoidal capillaries.
  • active targeting includes, for example, viral protein coat (Morishita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 1993, 90, p. 8474-), monoclonal antibodies, (or suitable binding moieties thereof), sugars, glycolipids or proteins (or suitable oligopeptide fragments thereof) to liposomes, or organs and cells other than their naturally occurring localized sites.
  • viral protein coat Menishita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 1993, 90, p. 8474-
  • monoclonal antibodies or suitable binding moieties thereof
  • sugars or glycolipids or proteins (or suitable oligopeptide fragments thereof)
  • liposomes or organs and cells other than their naturally occurring localized sites.
  • examples include techniques for modifying liposomes by changing their composition in order to achieve distribution in different types.
  • the surface of the targeted colloidal dispersion can be modified in a variety of ways.
  • lipid groups can be incorporated into the lipid bilayer of liposomes to maintain the targeting ligand in tight association with the lipid bilayer.
  • a variety of linking groups may be used to link the lipid chain with the targeting ligand.
  • a targeting ligand that binds to a particular cell surface molecule found predominantly on cells to which delivery of an oligonucleotide of the invention is desired may include, for example: (1) predominantly expressed by the cells to which delivery is desired; (2) a polyclonal or monoclonal antibody that specifically binds to a hormone, growth factor or appropriate oligopeptide fragment thereof that binds to a particular cell receptor, or (2) to an antigenic epitope predominantly found on the target cell. , or a suitable fragment thereof (eg, Fab; F(ab')2).
  • Two or more bioactive agents can also be complexed and administered within a single liposome.
  • the amount of the oligonucleotide of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof to be used varies depending on symptoms, age, etc., but in the case of oral administration, the lower limit is 1 mg (preferably 30 mg) and the upper limit is 2000 mg (preferably).
  • the lower limit is 0.5 mg (preferably 5 mg) and the upper limit is 1000 mg (preferably 250 mg)
  • the lower limit is 0.5 mg (preferably 5 mg) and the upper limit is 500 mg (preferably 250 mg) per dose
  • the lower limit is 0.05 mg (preferably 0.5 mg) per dose.
  • the upper limit of 10 mg (preferably 5 mg) is preferably administered to adults 1 to 3 times per day depending on the symptoms.
  • the upper limit of 10 mg preferably 5 mg
  • the upper limit of 10 mg is preferably administered to adults 1 to 3 times per day depending on the symptoms.
  • the upper limit of 10 mg is preferably administered to adults 1 to 3 times per day depending on the symptoms.
  • the upper limit of 10 mg is preferably administered to adults 1 to 3 times per day depending on the symptoms.
  • the upper limit of 10 mg preferably 5 mg
  • the upper limit of 10 mg is preferably administered to adults 1 to 3 times per day depending on the symptoms.
  • the upper limit of 10 mg preferably 5 mg
  • compositions and formulations for topical administration include transdermal patches, ointments, lotions, creams, gels, lozenges, suppositories, sprays, liquids, and powders.
  • the oligonucleotide of the present invention can suppress the expression of TfR2 mRNA. Moreover, the oligonucleotide of the present invention has low toxicity to cells and can be applied to highly safe pharmaceutical products. Moreover, the oligonucleotide of the present invention can suppress the production of hepcidin, which plays a central role in iron metabolism, by suppressing the expression of TfR2 mRNA. Moreover, the oligonucleotide of the present invention can increase plasma iron concentration and/or HGB level by suppressing the expression of TfR2 mRNA.
  • the oligonucleotide of the present invention can be used to treat or prevent diseases that can be treated or prevented by suppressing TfR2 mRNA expression and/or hepcidin production. Such diseases include, for example, anemia.
  • diseases include, for example, anemia.
  • the mechanism of action is not particularly limited, the RNAi-oligonucleotide of the present invention can treat or prevent anemia by increasing HGB levels, for example.
  • the RNAi-oligonucleotides of the present invention can reduce the frequency and/or amount of blood cell transfusions for anemic patients who require blood cell transfusions.
  • blood cell transfusions for anemic patients over a period of time e.g., 1 day, 1 week, 2 weeks, 4 weeks, 8 weeks, 12 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 6 months, or 1 year
  • the frequency and/or amount of blood transfusion may be reduced by about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, or about 100%.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing anemia containing the oligonucleotide of the present invention as an active ingredient, a method for treating or preventing anemia comprising administering an effective amount of the oligonucleotide, and a method for treating or preventing anemia.
  • Pharmaceutical use inventions are provided, such as the oligonucleotide for use in prophylaxis, the use of the oligonucleotide of the present invention in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of anemia, and the like.
  • Anemias that can be treated or prevented by the oligonucleotides of the present invention include, for example, anemia of chronic disease (ACD), anemia associated with bone marrow dysfunction, iron deficiency anemia, and iron refractory anemia.
  • iron deficiency anemia IRIDA
  • ESA erythropoietin stimulating agent
  • Anemia associated with chronic inflammation includes, for example, anemia associated with autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis or systemic lupus erythematosus or autoimmune hemolytic anemia, anemia associated with infections, and anemia associated with inflammatory bowel diseases such as inflammatory bowel disease.
  • autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis or systemic lupus erythematosus or autoimmune hemolytic anemia
  • anemia associated with infections and anemia associated with inflammatory bowel diseases such as inflammatory bowel disease.
  • Anemia associated with chronic kidney disease includes, for example, kidney disease with diabetes, kidney disease with hypertension, nephrotic syndrome (e.g., Finnish congenital nephrotic syndrome, diffuse mesangial sclerosis, minimal change nephrotic syndrome, focal segmental nephrotic syndrome).
  • nephrotic syndrome e.g., Finnish congenital nephrotic syndrome, diffuse mesangial sclerosis, minimal change nephrotic syndrome, focal segmental nephrotic syndrome.
  • kidney disease associated with chronic glomerulonephritis e.g., IgA nephropathy, mesangial proliferative glomerulonephritis, membranous glomerulonephritis, etc.
  • sexual proliferative glomerulonephritis purpuric nephritis, antiglomerular basement membrane nephritis (Goodpasture syndrome), Alport syndrome, Epstein syndrome, lupus nephritis, microscopic polyangiitis, atypical hemolytic uremia syndrome, Nail-Patella syndrome (nail-patella syndrome), fibronectin nephropathy, lipoprotein glomerulopathy, etc.
  • renal disease accompanied by chronic tubulointerstitial nephritis e.g., IgA nephropathy, mesangial proliferative glomerulonephritis, membranous glomerulonephritis, etc.
  • kidney disease with amyloid deposition includes, for example, anemia associated with cancer such as multiple myeloma, acute leukemia, chronic leukemia, lung cancer or breast cancer.
  • Anemia associated with bone marrow dysfunction includes, for example, anemia associated with myelofibrosis, anemia associated with myelodysplastic syndrome, anemia associated with chronic myelomonocytic leukemia (CMML), and anemia associated with bone marrow suppression due to chemotherapy.
  • CMML chronic myelomonocytic leukemia
  • CMML chronic myelomonocytic leukemia
  • the oligonucleotide of the present invention can be preferably used for the treatment or prevention of anemia associated with chronic inflammation, anemia associated with bone marrow dysfunction, and more preferably for rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, or autoimmune hemolytic anemia.
  • Anemia associated with autoimmune diseases anemia associated with infectious diseases, anemia associated with inflammatory bowel diseases such as inflammatory bowel disease, anemia associated with heart failure, anemia associated with chronic kidney disease, anemia associated with cancer, anemia associated with Castleman's disease, It can be used to treat or prevent anemia associated with myelofibrosis, anemia associated with myelodysplastic syndrome, anemia associated with chronic myelomonocytic leukemia, and anemia associated with bone marrow suppression due to chemotherapy.
  • the present invention provides a method for treating or preventing anemia, which includes using the oligonucleotide of the present invention in combination with one or more other drugs.
  • the oligonucleotide of the present invention may be used in combination with one or more other drugs as long as the effects of the present invention are achieved.
  • the oligonucleotide of the present invention can be used in combination with another drug having a different mechanism of action against anemia symptoms to provide a greater therapeutic effect.
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • ESA erythropoiesis stimulating agent
  • Drugs such as Luspatercept, which has a mechanism of action that suppresses DNA methylation, and drugs such as Azacytidine, which has a mechanism of action that inhibits DNA methylation and kills abnormal cells, may be prescribed.
  • TfR2 siRNA have different mechanisms of action. Therefore, the combination of these drugs and TfR2 siRNA may provide greater therapeutic effects against MDS than single agents.
  • drugs such as ESA and HIFPHD (hypoxia inducible factor prolyl hydroxylase) inhibitors which have a mechanism of action that treats anemia by promoting the proliferation of red blood cells, may be prescribed.
  • these drugs and TfR2 siRNA have different mechanisms of action.
  • Ruxolitinib is known to exhibit therapeutic effects on myelofibrosis, mainly symptoms such as splenomegaly (N Engl J Med 2012; 366:799-807). However, it is known that the effect on anemia symptoms is limited or ineffective, or that it worsens anemia (Journal of Hematology & Oncology 2013, 6:79). The mechanism by which anemia is exacerbated by Ruxolitinib is thought to be that EPO signals, which are required for the proliferation of red blood cells, are suppressed by inhibiting JAK2.
  • Ruxolitinib has a certain therapeutic effect on symptoms other than anemia in myelofibrosis
  • the combination of Ruxolitinib and TfR2 siRNA provides a useful therapeutic effect on anemia in myelofibrosis. It is possible.
  • combinations with other JAK2 inhibitors other than Ruxolitinib may also provide useful therapeutic effects for anemia in myelofibrosis.
  • Other JAK2 inhibitors include, for example, Fedratinib, Pacritinib, Momelotinib, and the like.
  • the order in which the RNAi-oligonucleotide of the present invention is administered is not particularly limited as long as the effects of the present invention are achieved; It may also be administered before or after administration of other concomitant drugs.
  • drugs that can be used in combination with the RNAi-oligonucleotide of the present invention include other drugs for treating anemia or drugs for treating diseases that cause anemia.
  • Other anemia therapeutics include, for example, ESA, HIFPHD (hypoxia inducible factor prolyl hydroxylase) inhibitors, oral iron preparations, intravenous iron preparations, Danazol, Luspatercept, and the like.
  • ESA examples include epoetin alfa, epoetin beta, epoetin beta pegol, epoetin kappa, darbepoetin alfa, and the like.
  • HIFPHD inhibitors examples include roxadustat, vadadustat, daprodustat, enalodustat, molidustat, and the like.
  • oral iron preparations include ferrous citrate, ferric citrate, ferrous fumarate, soluble ferric pyrophosphate, and dry iron sulfate.
  • intravenous iron preparations examples include ferric carboxymaltose, sugar-containing iron oxide, and the like.
  • examples of therapeutic agents for diseases that cause anemia include myelofibrosis therapeutic agents, myelodysplastic syndrome therapeutic agents, chronic kidney disease therapeutic agents, anticancer agents, and the like.
  • examples of myelofibrosis therapeutic agents include JAK2 inhibitors.
  • Examples of JAK2 inhibitors include Ruxolitinib, Fedratinib, Pacritinib, Momelotinib, and the like, and combination use with Ruxolitinib is preferred.
  • examples of therapeutic agents for myelodysplastic syndrome include Azacitidine, Lenalidomide, etc., and combination use with Azacitidine or Lenalidomide is preferred.
  • therapeutic drugs for chronic kidney disease include SGLT2 (sodium glucose co-transporter 2) inhibitors, renin-angiotensin system inhibitors (e.g., angiotensin II receptor antagonists (ARB), angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors, etc.) , calcium antagonists, diuretics, antidiabetic agents, antihyperlipidemic agents, steroids, immunosuppressants, and the like.
  • Anticancer drugs include chemotherapy drugs, such as cisplatin, carboplatin, doxorubicin, paclitaxel, amrubicin, and the like.
  • the oligonucleotide of the present invention may be used in combination with a therapeutic agent for iron overload.
  • iron overload When blood cell transfusion is performed as a treatment for anemia, iron overload may develop due to chronic blood cell transfusion. Iron overload is a pathological condition that occurs when iron from transfused blood cells accumulates in tissues such as the liver and heart, leading to liver failure, heart failure, diabetes, joint pain, hypothyroidism, and hypopituitary function. , or sexual dysfunction. Therefore, iron overload therapeutic agents may be used to treat or prevent iron overload in the treatment of anemia, and can be suitably used in combination with the oligonucleotide of the present invention.
  • therapeutic drugs for iron overload include iron chelating agents, and iron chelating agents include deferasirox, deferoxamine, deferiprone, and the like.
  • Examples 1 to 82 The compounds of Examples 1 to 82 shown in Table 1 are double-stranded oligonucleotides composed of a sense strand region and an antisense strand region, each of which is an independent oligonucleotide.
  • the complementary regions are composed entirely of naturally occurring RNA (ie, A(R), G(R), C(R), and U(R)).
  • each internucleoside bond is a phosphodiester bond that is not chemically modified.
  • the antisense strand region of the compound of each example has a complementary region consisting of a sequence that is completely complementary to each target sequence (base sequence of the region sandwiched between the start position and the end position) listed in Table 1.
  • the sense strand region of the compound of each example has a complementary region consisting of a nucleotide sequence completely complementary to the nucleotide sequence in the complementary region of the corresponding antisense strand region, and an overhang at the 3' end of the complementary region. It is an oligonucleotide with a structure in which two consecutive T(D)s are linked.
  • AD-47826 which is an siRNA against human TfR2 (hTfR2) described in WO2012/177921, are natural RNA, and the sense strand region and antisense strand region are Two consecutive T(D)s are bonded to each 3' end of the region as an overhang structure.
  • Target sequence start position and target sequence end position in the table each indicate the base position in the base sequence of human TfR2 mRNA shown in SEQ ID NO: 1.
  • the compounds of each example are double-stranded oligonucleotides whose target sequence is the base sequence sandwiched between them. That is, the antisense strand region of each example has a sequence complementary to the base sequence sandwiched between the start and end positions of the target sequence, and the sense strand region has a sequence complementary to the antisense strand region.
  • the sequence of the complementary region of the sense strand region in the compound of Example 19 is 5' CGUGGAGUUUCAAUAUCAA 3' (SEQ ID NO: 43), and the sequence of the complementary region of the antisense strand region is 5' UUGAUAUUGAAACUCCACG. 3' (SEQ ID NO: 44).
  • the sequence of the complementary region of the sense strand region in the compound of Example 39 is 5' ACCUCAAAGCCGUAGUGUA 3' (SEQ ID NO: 45), and the sequence of the complementary region of the antisense strand region is 5' UACACUACGGCUUUGAGGU 3' (SEQ ID NO: 46).
  • T(D)s are bonded as an overhang structure to the 3' end of each complementary region in the sense strand region and antisense strand region of the compounds of each Example in Table 1.
  • the 5'-position of the 5'-terminal nucleotide and the 3'-position of the 3'-terminal nucleotide of each oligonucleotide are hydroxyl groups in which a hydrogen atom is bonded to an oxygen atom in the structural diagram of each nucleoside described above.
  • "molecular weight" in the table indicates an actual value measured by negative ion ESI mass spectrometry.
  • Examples 83-184 The compounds of Examples 83 to 133 shown in Table 2 are located at the 3' position of the nucleotide at the 3' end of the sense strand region (at the 2' position for nucleotides modified at the 3' position) and at the 5' end of the antisense strand region. It is a single-stranded oligonucleotide in which the 5' position of the nucleotide is connected by a linker represented by the above-mentioned formula (Z), and the complementary region of the sense strand region and the complementary region of the antisense strand region form a double-stranded structure. is forming. Further, the compounds of Examples 134 to 184 shown in Table 3 are double-stranded oligonucleotides having a sense strand region and an antisense strand region, each of which is an independent oligonucleotide.
  • Example 180 TfR2-019.94DUG.s1 and Example 181 (TfR2-019.94DUG.s2) have a 3' end of the antisense strand region in the compound of Example 169 (TfR2-019.94DUG). siRNA in which each overhang structure is one nucleotide or is absent.
  • the compounds of Example 182 (TfR2-019.94DUG.e1) and Example 183 (TfR2-019.94DUG.e2) are similar to the target sequence (i.e., 2847 of SEQ ID NO: 1) in the compound of Example 19 (TfR2-019).
  • -2865th sequence is extended by 1 or 2 nucleotides at the 5' end (i.e., the 2846th to 2865th sequences and the 2845th to 2865th sequences of SEQ ID NO: 1, respectively) as target sequences.
  • siRNAs whose complementary regions have chain lengths of 20 bp and 21 bp, respectively.
  • the compound of Example 184 (TfR2-019.94DUG.e3) has a G(M)U(M) overhang structure at the 3' end of the antisense strand region in the compound of Example 169 (TfR2-019.94DUG). This is siRNA.
  • Examples 83 to 184 shown in Tables 2 and 3 were also synthesized in the same manner as Examples 1 to 82.
  • synthesizing the "2" part in the sequence use DMT-ethane-Diol phosphoramidite (ChemGene, catalog number: CLP-2250), and when synthesizing the "Z” part, use WO2012/074038.
  • the method described in Example 12 was used.
  • the "2'-O-methyl nucleoside” portion was synthesized using the phosphoramidite described in Nucleic Acids Research 17, 3373 (1989).
  • the "DNA” portion was synthesized using the phosphoramidite described in Nucleic Acids Research 11, 4539 (1984).
  • the "3'-O-methyl nucleoside” part is 3'-O-Methyl Adenosine (n-bz) CED phosphoramidite (ChemGene, catalog number: ANP-2901), 3'-O-Methyl Cytidine (n-bz) CED phosphoramidite (ChemGene, catalog number: ANP-2902), 3'-O-Methyl Guanosine (n-ibu) CED phosphoramidite (ChemGene, catalog number: ANP-2903), or 3'-O-Methyl Uridine CED phosphoramidite ( Synthesized using ChemGene, catalog number: ANP-2904).
  • the "2'-O,4'-C-methylene nucleoside” portion was synthesized using the phosphoramidite described in WO99/14226.
  • the "2'-deoxy-2'-fluoronucleoside” moiety was synthesized using the phosphoramidite described in J. Med. Chem. 36, 831 (1993).
  • the "2'-O-methoxyethyl nucleoside” moiety was synthesized using the phosphoramidite described in Helv. Chim. Acta 78, 486-504 (1995).
  • the "GN” portion was synthesized using the phosphoramidite described in Reference Example 41 of WO2019/172286.
  • the base sequences of the sense strand region are shown in Tables 3-1 to 3-5, and the base sequences of the antisense strand region are shown in Tables 3-6 to 3-10, respectively.
  • the base sequences of the sense strand region are shown in Table 3-11, and the base sequences of the antisense strand region are shown in Table 3-12.
  • the compounds of Examples 134 to 184 were prepared by placing equimolar amounts of the sense strand region and antisense strand region in one tube, annealing them, and then forming double-stranded oligonucleotides using native gel or HPLC. I confirmed that there is.
  • N(R) is RNA
  • N(D) is DNA
  • N(M) is 2'-OMe RNA
  • N(m) is 2'-MOE RNA
  • N(3M) is 3 '-OMe RNA
  • N(F) indicates 2'-F RNA
  • N(L) indicates LNA
  • N(E) indicates ENA.
  • the structure of each nucleoside is represented by each of the above-mentioned structural formulas.
  • GN in the table indicates a GalNAc unit represented by the above-mentioned formula (GN).
  • “2" in the table is -O(CH 2 ) 2 O- (represented by the above formula (2))
  • the 5'-position of the 5'-terminal nucleotide and the 3'-position of the 3'-terminal nucleotide of each oligonucleotide are hydrogen atoms, as shown in the structural diagram of each nucleoside described above. It is a hydroxyl group bonded to the oxygen atom inside.
  • the hydrogen atom becomes a hydroxyl group bonded to the oxygen atom on the bond side that is not bonded to the oligonucleotide.
  • " ⁇ " is the terminal, the hydroxyl group is bonded to the phosphorus atom in the structural diagram of "PS” mentioned above.
  • GN no hydrogen atom bond is required.
  • Test Example 1 Screening of HepG2 cells by forward transfection of TfR2 siRNA The following experiments were conducted using the compounds of Examples 1 to 82 as TfR2 siRNA. The day before transfection, place 2.5 x 10 ⁇ 4 HepG2 cells per well in a 96-well plate (Corning) in 100 ⁇ L of DMEM medium (Gibco) supplemented with 10% FBS (Gibco). Sowed. On the day of transfection, 2 wells of siRNA samples per type, 2 wells of negative control (NT) using distilled water instead of siRNA, and 2 wells of TfR2-061 (Example 61) as positive control were prepared.
  • DMEM medium Gibco
  • NT negative control
  • TfR2-061 Example 61
  • RNAiMAX manufactured by Thermo Fisher Scientific
  • RNA extraction was performed using RNeasy Mini Kit (manufactured by QUAGEN) according to the kit protocol. 300 ng of the obtained RNA was subjected to a reverse transcription reaction using a High Capacity RNA to cDNA kit (manufactured by Applied Biosystems) to synthesize cDNA. Using the obtained cDNA, the amount of endogenous hTfR2 mRNA was measured by quantitative PCR. As a housekeeping gene, the amount of mRNA of human 18S ribosomal RNA (h18S) was measured.
  • Quantitative PCR was performed as follows using IDT Prime Time Gene Expression Master Mix (manufactured by Integrated DNA Technologies). The obtained cDNA was diluted 10 times using distilled water (15 ⁇ L of cDNA and 135 ⁇ L of distilled water were mixed).
  • the mRNA expression level of hTfR2 was normalized with the mRNA expression level of h18S, a housekeeping gene.
  • the relative hTfR2 mRNA expression level of the specimen treated with each siRNA was calculated and expressed as a relative value when the hTfR2 mRNA expression level in the negative control was set to 1.0. The results are shown in Table 4 below.
  • Test Example 1-1 Evaluation of cytotoxicity using HepG2 cells In the same manner as in Test Example 2, cytotoxicity was evaluated 4 days after introducing siRNA into HepG2 cells using the reverse transfection method. .
  • TfR2-061 Example 61
  • TfR2-019 Example 19
  • TfR2-039 Example 39
  • cytotoxicity of siRNA to liver cells was tested using cell counting kit-8 (CCK8, Dojindo Laboratories). After removing the culture supernatant, a solution of 10 ⁇ L of CCK8 reagent prepared per 100 ⁇ L of DMEM containing 10% FBS was added at 110 ⁇ L/well. Cells were then incubated in a CO2 incubator at 37°C for 30 minutes. Thereafter, OD450nm absorbance was measured using a microplate reader. The OD450nm value in the well treated with each siRNA was calculated and expressed as a relative value when the OD450nm value in the negative control (NT) was set to 1.0. The results are shown in FIG.
  • TfR2-019 and TfR2-039 in particular have low toxicity to liver cells.
  • Test Example 2 Screening of HepG2 cells by reverse transfection of TfR2 siRNA The following experiment was conducted using the compounds of each Example as TfR2 siRNA.
  • siRNA was screened by reverse transfection method as follows. On the day of transfection, 2 wells of siRNA sample per type, 2 wells of negative control (NT) using distilled water instead of siRNA, and positive control as described in TfR2-061 (Example 61) or WO2012/177921. Two wells of siRNA (AD-52590) against hTfR2 were prepared.
  • siRNA was added to a mixture of 14.8 ⁇ L of Opti-MEM and 0.2 ⁇ L of RNAiMAX per well, and incubated at room temperature for 20 minutes.
  • a negative control reagent 5 ⁇ L of distilled water was added instead of siRNA to a mixed solution of Opti-MEM and RNAiMAX.
  • a positive control reagent 5 ⁇ L of TfR2-061 (Example 61) or AD-52590 was added to a mixed solution of Opti-MEM and RNAiMAX.
  • 20 ⁇ L of a mixture containing siRNA, negative control, or positive control was added to a 96-well cell culture plate (manufactured by SUMIRON).
  • HepG2 cells (2 x 10 ⁇ 4 cells/mL) prepared using DMEM containing 10% FBS pre-warmed to 37°C were seeded at 80 ⁇ L per well.
  • the final concentration of siRNA was adjusted to a 10-fold or 50-fold common ratio from 10 nM.
  • cDNA was synthesized by performing RNA extraction and reverse transcription reaction according to the protocol of the kit. Using the obtained cDNA, the amount of endogenous hTfR2 mRNA expression was measured by quantitative PCR. As a housekeeping gene, the mRNA expression level of h18S was measured.
  • Quantitative PCR was performed as follows using IDT Prime Time Gene Expression Master Mix (manufactured by Integrated DNA Technologies). The obtained cDNA was used as a stock solution. Per well of a 384-well PCR plate (manufactured by Applied Biosystems), 5 ⁇ L of IDT Prime Time Gene Expression Master Mix, 0.25 ⁇ L of hTfR2 primer (Hs.PT.58.20599 434, Integrated DNA Technologies) or 0. Mix 25 ⁇ L of h18S primer (Hs.PT.39a.22214856.g, Integrated DNA Technologies), 2.75 ⁇ L of distilled water, and 2 ⁇ L of cDNA (10 ⁇ L in total), and add 2 wells for each cDNA.
  • hTfR2 and h18S were prepared and subjected to quantitative PCR.
  • the mRNA expression levels of hTfR2 and h18S were measured as the average value between two wells.
  • the mRNA expression level of hTfR2 was normalized with the mRNA expression level of h18S, a housekeeping gene.
  • the relative hTfR2 mRNA expression level of the specimen treated with each siRNA was calculated and expressed as a relative value when the hTfR2 mRNA expression level in the negative control was set to 1.0. The results are shown in Tables 5 to 20 below.
  • Test Example 2-1 hTfR2 knockdown activity using HepG2 cells Evaluation of hTfR2 mRNA expression level 2 days after introducing siRNA into HepG2 cells using the reverse transfection method in the same manner as Test Example 2 I did it.
  • TfR2-019 (Example 19) and TfR2-019.94DUG (Example 169) were used as siRNA.
  • the relative hTfR2 mRNA expression level of the specimen treated with each siRNA was calculated and expressed as a relative value when the hTfR2 mRNA expression level in the negative control (NT) was set as 1.0. The results are shown in FIG.
  • TfR2-019.94DUG in particular has high knockdown activity against hTfR2 mRNA.
  • Test Example 3 Single administration test of TfR2 siRNA to male cynomolgus monkeys Plasma after subcutaneous administration of TfR2-039.5G (Example 127) or TfR2-039.23DUG (Example 144) at a dose of 30 mg/kg Medium iron concentration and plasma hepcidin concentration were measured. Plasma iron concentration was measured using a metalloassay iron measurement kit (manufactured by Metallogenics). Plasma hepcidin concentration was measured using LC/MS. The results of administering TfR2-039.5G (Example 127) are shown in Table 21, and the results of administering TfR2-039.23DUG (Example 144) are shown in Table 22.
  • Test Example 4 Preparation of siRNA-encapsulated nucleic acid-lipid particles using TfR2 siRNA (1) Preparation of siRNA-encapsulated nucleic acid-lipid particles Distearoyl phosphatidylcholine (1,2-Disteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine: hereinafter referred to as DSPC, NOF) CORPORATION), cholesterol (hereinafter referred to as Chol, Sigma-Aldrich, Inc.), acetic acid (7R,9Z)-18-( ⁇ [3-(dimethylamino)propyloxy]carbonyl ⁇ oxy)octacos-9-ene -7-yl (compound described in Example 28 of WO2015/005253) (hereinafter referred to as LP), and 1,2-dimyristoyl-sn-glycerol methoxypolyethylene glycol (1,2- Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Methoxypolyethylene Glycol (herein
  • lipid solution and siRNA solution are mixed in a microchannel using NanoAssemblr BenchTop (Precision Nanosystems Inc.) so that the total lipid weight ratio to siRNA is 11 and the volume ratio is 1:3, A crude dispersion of nucleic acid lipid particles was obtained. Ethanol was removed by dialyzing the dispersion of nucleic acid and lipid particles against approximately 25 to 50 times the amount of phosphate buffer for 12 to 18 hours (Float-A-Lyzer G2, MWCO: 1,000 kD, Spectra/Por). A dispersion of purified siRNA-encapsulated nucleic acid and lipid particles was obtained. Note that LP was synthesized according to the method described in Example 28 of WO2015/005253.
  • the nucleic acid/lipid particle dispersion was diluted with ethanol, and the amount of each lipid in the nucleic acid/lipid particle dispersion was measured by reverse phase chromatography (System: DIONEX UltiMate 3000, Column: XSelect CSH C18 (130 ⁇ , 3 .5 ⁇ m, 3.0mm x 150mm) (Waters catalog # 186005263), Buffer A: 0.2% formic acid, Buffer B: 0.2% formic acid, methanol, (B%): 75-95% (15min), 95 % (2 min), Flow Rate: 0.45 mL/min, Temperature: 50°C, Detection: Corona CAD (Charged Aerosol Detector)).
  • the ratio of total lipid amount to siRNA was calculated using the following formula.
  • Total lipid amount for siRNA (wt/wt) [total lipid concentration] / [siRNA concentration] (wt/wt)
  • nucleic acid lipid particles had about 95% of the siRNA encapsulated within the lipid particles and had an average particle diameter of about 90 nm.
  • Test Example 5 Drug efficacy evaluation test of nucleic acid lipid particles encapsulating TfR2 siRNA in anemia model mice associated with bone marrow dysfunction AD-47882 (described in WO2012/177921 for mouse TfR2 The following experiment was conducted using nucleic acid lipid particles encapsulating siRNA). Nucleic acid lipid particles were prepared in the same manner as in Test Example 4. In order to induce a decline in bone marrow function, 100 mg/kg of carboplatin (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) was administered intraperitoneally (ip) to male C57BL/6NJcl mice (manufactured by CLEA Japan Co., Ltd.).
  • the drug was 0.5 mg/kg (0.5mpk) and 0.25 mg/kg (0.25mpk) of AD-47882, each administered once intravenously (i.v.) as nucleic acid lipid particles. Ta.
  • the vehicle target group received PBS i.p. instead of drugs. v. administered.
  • Plasma iron concentration and plasma hepcidin concentration were measured before administration of AD-47882 (Day 0), 3 days after administration (Day 3), and 7 days after administration (Day 7). Plasma iron concentration was measured using a metalloassay iron measurement kit (manufactured by Metallogenics). Plasma hepcidin concentration was measured using LC/MS.
  • FIG. 7A and FIG. 7B The results of plasma iron concentration and plasma hepcidin concentration are shown in FIG. 7A and FIG. 7B, respectively.
  • 11 days after the AD-47882 treatment Day 11
  • blood was collected from the abdominal vena cava under isoflurane anesthesia, and mean corpuscular hemoglobin (MCH ) values were measured.
  • MCH mean corpuscular hemoglobin
  • mice were euthanized by exsanguination, the livers were collected and the mRNA expression levels of mouse TfR2 (mTfR2) and mouse Hepcidin (mHepcidin) were measured.
  • RNA extraction was performed using RNeasy Mini Kit (manufactured by QUAGEN) according to the kit protocol. Endogenous mouse TfR2 and Hepc were determined by quantitative PCR using cDNA obtained by reverse transcription reaction of the obtained 5000 ng RNA using High Capacity RNA to cDNA kit (manufactured by Applied Biosystems). idin's The amount of mRNA was measured.
  • Quantitative PCR was performed as follows using IDT Prime Time Gene Expression Master Mix (manufactured by Integrated DNA Technologies). The obtained cDNA was diluted 10 times using distilled water (15 ⁇ L of cDNA and 135 ⁇ L of distilled water were mixed).
  • mouse ⁇ -actin (mActb) primer (Mm.PT.39a.22214843.g, manufactured by Integrated DNA Technologies) was used, mixed in the proportions described above, and Two wells were prepared and quantitative PCR was performed. The mRNA amounts of mTfR2, mHepcidin, and mActb were measured as average values between two wells. The mRNA expression levels of mTfR2 and mHepcidin were normalized with the mRNA expression level of mActb, a housekeeping gene.
  • the relative mRNA amount in the vehicle group and AD-47882 treatment group is calculated and expressed as a relative value when the mRNA amount in the control group that does not induce a decline in bone marrow function is 1.0 (mean value ⁇ standard error) did.
  • the results of mRNA expression levels of mTfR2 and mHepcidin in the liver are shown in FIG. 7E and FIG. 7F, respectively.
  • TfR2 siRNA increases HGB levels by suppressing TfR2 mRNA expression, and has a therapeutic effect on anemic diseases such as anemia associated with bone marrow dysfunction, for example, anemia associated with myelofibrosis. This shows the possibility of providing
  • Test Example 6 Drug efficacy evaluation test of GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mouse associated with bone marrow decline The following experiment was conducted using AD47882.23DUG (Example 171) as GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • Carboplatin at 100 mg/kg was administered intraperitoneally (i.p.) to induce a decline in bone marrow function.
  • PBS was administered i.p. in place of Carboplatin.
  • the GalNAc conjugated TfR2 siRNA treatment group was administered subcutaneously once at a dose of 3 mg/kg (3mpk).
  • ActRIIB-Fc Fc-conjugated ActRIIB
  • ActRIIB-Fc Fc-conjugated ActRIIB
  • ActRIIB-Fc a drug that traps the ligand of activin receptor type IIB
  • ActRIIB-Fc is a protein preparation that combines the extracellular domain of Luspatercept (ACE-536) with the Fc domain of mouse IgG2a (WO2016090188, Blood.
  • Tail vein blood was collected before drug treatment (Day 0), 3 days after treatment (Day 3), and 8 days after treatment (Day 8), and HGB values were measured using QuantiChrom Whole Blood HB kit (manufactured by Bioassay Systems). .
  • the results of HGB values are shown in Figure 8A (mean ⁇ standard error).
  • FIG. 8B shows the results of HGB values 3 days after drug treatment, showing the combined effect of GalNAc conjugate TfR2 siRNA and ActRIIB-Fc.
  • HGB value, MCH value, hematocrit (HCT ) value and the number of red blood cells (RBC) were measured.
  • FIGS. 8D to 8G mean value ⁇ standard error.
  • the liver was collected and the amount of mTfR2 mRNA expression was measured.
  • RNA extraction and quantitative PCR were performed as described in Test Example 5.
  • the mRNA expression level of mTfR2 was normalized with the mRNA expression level of mActb, a housekeeping gene.
  • the results of the mTfR2 mRNA expression level are shown in FIG. 8C. Relative mRNA amounts in other groups were calculated and expressed as relative values when the mRNA amount in the control group in which no reduction in bone marrow function was induced was 1.0 (mean value ⁇ standard error).
  • Test Example 7 Drug efficacy evaluation test of GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mouse associated with inflammation As GalNAc-conjugated TfR2 siRNA, AD47882.5G (Example 131), AD47882.23G (Example 132), AD47882.23sG The following experiment was conducted using the compounds AD47882.23DUG (Example 133), AD47882.23DUG (Example 171), and AD47882.23sDUG (Example 172). Each GalNAc conjugate TfR2 siRNA was administered once at a dose of 1 mg/kg (1 mpk) to male C57BL/6NJcl mice (manufactured by CLEA Japan) (Day 0).
  • turpentine Six days after the first administration of turpentine (Day 11), turpentine was subcutaneously administered again at 150 ⁇ L/mouse. Two days after the second administration of turpentine (Day 13), blood was collected from the abdominal vena cava under isoflurane anesthesia, and HGB values, MCH values, The number of RBCs was measured. The results are shown in FIGS. 9C to 9E, respectively. In addition, after the mice were euthanized by exsanguination, the liver was collected and the amount of mTfR2 mRNA expression was measured. RNA extraction and quantitative PCR were performed as described in Test Example 5.
  • the mRNA expression level of mTfR2 was normalized with the mRNA expression level of mActb, a housekeeping gene. The results of the mTfR2 mRNA expression level are shown in FIG. 9F.
  • the relative mRNA amount in other groups was calculated and expressed as a relative value when the mRNA amount in the control group in which inflammation was not induced was set to 1.0 (mean value ⁇ standard error).
  • Test Example 8 Drug efficacy evaluation test of GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mouse associated with inflammation As GalNAc-conjugated TfR2 siRNA, AD47882.41DUG (Example 173), AD47882.88DUG (Example 174), AD47882.89DUG The following experiment was conducted using AD47882.91DUG (Example 175), AD47882.91DUG (Example 176), AD47882.92DUG (Example 177), and AD47882.93DUG (Example 178).
  • Each GalNAc conjugate TfR2 siRNA was administered once at a dose of 1 mg/kg (1 mpk) to male C57BL/6NJcl mice (manufactured by CLEA Japan) (Day 0).
  • PBS was administered subcutaneously.
  • turpentine was subcutaneously administered at 150 ⁇ L/mouse to induce inflammation.
  • PBS was administered s.c. instead of turpentine. c. administered.
  • n 5/group.
  • Two days after the first administration of turpentine (Day 6), plasma iron concentration was measured. Plasma iron concentration was measured using a metalloassay iron measurement kit (manufactured by Metallogenics). The results are shown in FIG. 10A.
  • turpentine Seven days after the first administration of turpentine (Day 11), turpentine was subcutaneously administered again at 150 ⁇ L/mouse. Three days after the second administration of turpentine (Day 14), blood was collected in the abdominal vena cava under isoflurane anesthesia, and HGB values, MCH values, The number of RBCs was measured. The results are shown in FIGS. 10B to 10D, respectively. In addition, after the mice were euthanized by exsanguination, the liver was collected and the amount of mTfR2 mRNA expression was measured. RNA extraction and quantitative PCR were performed as described in Test Example 5.
  • the mRNA expression level of mTfR2 was normalized with the mRNA expression level of mActb, a housekeeping gene. The results of the mTfR2 mRNA expression level are shown in FIG. 10E.
  • the relative mRNA amount in other groups was calculated and expressed as a relative value when the mRNA amount in the control group in which inflammation was not induced was set to 1.0 (mean value ⁇ standard error).
  • Test Example 9 Screening of HepG2 cells by reverse transfection of TfR2 siRNA
  • TfR2-019.94DUG Example 169
  • TfR2-019.94DUG. s1 Example 180
  • TfR2-019.94DUG. s2 Example 181
  • TfR2-019.94DUG. e1 Example 182
  • TfR2-019.94DUG. e2 Example 183
  • TfR2-019.94DUG. hTfR2 mRNA expression level was tested using e3 (Example 184).
  • the relative hTfR2 mRNA expression level of the specimen treated with each siRNA was calculated and expressed as a relative value when the hTfR2 mRNA expression level in the negative control (NT) was set to 1.0.
  • the results are shown in Table 24 below.
  • Test Example 10 Pharmaceutical efficacy evaluation test of GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in normal mice The following experiment was conducted using AD47882.5G (Example 131) and AD47882.94DUG (Example 179) as GalNAc-conjugated siRNA. .
  • metalloassay iron measurement kit manufactured by Metallogenix
  • AD47882.94DUG stably suppresses the expression level of TfR2 mRNA and increases the plasma iron concentration in vivo.
  • AD47882.88DUG compound of Example 174
  • AD47882.89DUG compound of Example 175
  • AD47882.91DUG compound of Example 176
  • AD47882.92DUG compound of Example 177
  • Test Example 11 Drug efficacy evaluation test of GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mouse associated with bone marrow decline AD47882.23DUG (Example 171) and AD47882.94DUG (Example 179) were used as GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • the GalNAc conjugated TfR2 siRNA treatment group was administered once subcutaneously (s.c.) at a dose of 3 mg/kg (3mpk). For the vehicle group, PBS was subcutaneously administered once.
  • FIG. 14A shows the results of HGB values before drug treatment.
  • FIG. 14B shows the results of plasma iron concentration 8 days after drug treatment (Day 8).
  • Test Example 12 Pharmaceutical efficacy evaluation test of GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mouse associated with inflammation The following was performed using AD47882.92DUG (Example 177) and AD47882.94DUG (Example 179) as GalNAc-conjugated TfR2 siRNA. An experiment was conducted. To induce inflammation, turpentine was administered subcutaneously (s.c.) at 150 ⁇ L/mouse three times a week to male C57BL/6NJcl mice (manufactured by CLEA Japan). As a control group that did not induce inflammation, PBS was subcutaneously administered instead of turpentine.
  • Plasma iron concentration was measured using a metalloassay iron measurement kit (manufactured by Metallogenics).
  • HGB value was measured using QuantiChrom Whole Blood HB kit (manufactured by Bioassay Systems). The results are shown in FIGS. 15A and 15B, respectively (mean value ⁇ standard error).
  • the GalNAc conjugated TfR2 siRNA treatment group was administered subcutaneously once at a dose of 3 mg/kg (3mpk).
  • PBS was subcutaneously administered once.
  • Tail vein blood was collected 4 days after the drug treatment (Day 4) and 8 days after the treatment (Day 8), and the plasma iron concentration was measured using a metalloassay iron measurement kit (manufactured by Metallogenics). The results are shown in FIG. 15A (mean value ⁇ standard error).
  • 8 days after the drug treatment blood was collected from the abdominal vena cava under isoflurane anesthesia, and the HGB value, MCH value, and RBC count were measured using a multi-item automatic blood cell analyzer XT2000 (manufactured by Sysmex Corporation). did.
  • FIGS. 15C to 15E mean value ⁇ standard error.
  • mice were euthanized by exsanguination under isoflurane anesthesia, the livers were collected, and the amount of mTfR2 mRNA expression was measured.
  • RNA extraction and quantitative PCR were performed as described in Test Example 5.
  • the mRNA expression level of mTfR2 was normalized with the mRNA expression level of mActb, a housekeeping gene.
  • the results of the mTfR2 mRNA expression level are shown in FIG. 15F.
  • the relative mRNA amount in other groups was calculated and expressed as a relative value when the mRNA amount in the control group in which inflammation was not induced was set to 1.0 (mean value ⁇ standard error).
  • Test Example 13 Drug efficacy evaluation test of GalNAc conjugate TfR2 siRNA in NUP98-HOXD13 mice
  • NUP98-HOXD13 mice were used as a model mouse for myelodysplastic syndrome (MDS), which is characterized by ineffective hematopoiesis and insufficient red blood cell differentiation and maturation.
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • AD47882.23DUG Example 171 was used as the compound.
  • the GalNAc conjugate TfR2 siRNA treatment group was administered subcutaneously (s.c.) once a week at a dose of 5 mg/kg (5 mpk).
  • PBS was subcutaneously administered once a week.
  • Tail vein blood was collected 2, 4, and 8 weeks after the start of drug treatment, and plasma iron concentration was measured using a metalloassay iron measurement kit (manufactured by Metallogenics). The results are shown in FIG. 16A (mean value ⁇ standard error).
  • tail vein blood was collected 2 weeks, 4 weeks, 6 weeks, and 8 weeks after starting drug treatment, and HGB values were measured using QuantiChrom Whole Blood HB kit (manufactured by Bioassay Systems).
  • FIG. 16B mean value ⁇ standard error.
  • Eight weeks after starting drug treatment blood was collected from the abdominal vena cava under isoflurane anesthesia, and HGB value, MCH value, RBC count, and was measured. The respective results are shown in FIGS.
  • mice were euthanized by exsanguination under isoflurane anesthesia, the livers were collected, and the amount of mTfR2 mRNA expression was measured. RNA extraction and quantitative PCR were performed as described in Test Example 5. The mRNA expression level of mTfR2 was normalized with the mRNA expression level of mActb, a housekeeping gene. The results of the mTfR2 mRNA expression level are shown in FIG. 16F. Relative mRNA amounts in other groups were calculated and expressed as relative values when the mRNA amount in the vehicle group was set to 1.0 (mean value ⁇ standard error).
  • Test Example 14 Drug efficacy evaluation test of GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mouse associated with chronic kidney disease The following experiment was conducted using the compound AD47882.94DUG (Example 179) as GalNAc-conjugated TfR2 siRNA. .
  • AD47882.94DUG Example 179
  • GalNAc-conjugated TfR2 siRNA To induce chronic kidney disease and associated anemia, male C57BL/6NJcl mice (manufactured by CLEA Japan) were fed a diet containing 0.2% adenine (WAKO product, 010-11513). gave to. Two weeks after the intervention with a 0.2% adenine diet, blood was collected from the tail vein and the plasma iron concentration and HGB value were measured.
  • Plasma iron concentration was measured using a metalloassay iron measurement kit (manufactured by Metallogenics). Moreover, the HGB value was measured using QuantiChrom Whole Blood HB kit (manufactured by Bioassay Systems). The results are shown in FIGS. 17A and 17B, respectively (mean value ⁇ standard error).
  • GalNAc-conjugated TfR2 siRNA treatment groups were administered subcutaneously once a week at a dose of 3 mg/kg (3mpk) or 1 mg/kg (1mpk) or 0.3 mg/kg (0.3mpk).
  • PBS was subcutaneously administered once a week.
  • a diet containing no 0.2% adenine was given.
  • RNA extraction and quantitative PCR were performed as described in Test Example 5.
  • the mRNA expression level of mTfR2 was normalized with the mRNA expression level of mActb, a housekeeping gene.
  • the results of the mTfR2 mRNA expression level are shown in FIG. 17G. Relative mRNA amounts in other groups were calculated and expressed as relative values when the mRNA amount in the vehicle group was set to 1.0 (mean value ⁇ standard error).
  • Test Example 15 Drug efficacy evaluation test of GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in anemia model mouse associated with administration of Ruxolitinib (JAK1/JAK2 inhibitor) In order to verify the effect of TfR2 siRNA on anemia due to administration of Ruxolitinib, TfR2 siRNA conjugated with GalNAc was used. The following experiment was conducted using the compound AD47882.23DUG (Example 171).
  • the GalNAc conjugate TfR2 siRNA treatment group was administered subcutaneously (s.c.) once a week at a dose of 3 mg/kg (3 mpk).
  • PBS was subcutaneously administered once a week.
  • a diet containing no 0.1% Ruxolitinib was given.
  • RNA extraction and quantitative PCR were performed as described in Test Example 5.
  • the mRNA expression level of mTfR2 was normalized with the mRNA expression level of mActb, a housekeeping gene.
  • the results of the mTfR2 mRNA expression level are shown in FIG. 18F.
  • the relative mRNA amount in other groups was calculated and expressed as a relative value when the mRNA amount in the control group not fed with 0.1% Ruxolitinib-containing food was set to 1.0 (mean value ⁇ standard error).
  • Test Example 16 Drug efficacy evaluation test of GalNAc conjugate TfR2 siRNA in human TfR2-expressing mice Using male or female TfR2 humanized mice having the human TfR2 gene locus, which were created at Special Immunology Institute Co., Ltd., In order to verify the effect of GalNAc-conjugated TfR2 siRNA, the following experiment was performed.
  • the TfR2 humanized mouse was created using a BAC (bacterial artificial chromosome) clone (RP11-264N5) harboring the human TFR2 gene locus.
  • TfR2- 019.94DUG As TfR2 siRNA conjugated with GalNAc, TfR2-019.88DUG (compound of Example 162), TfR2-019.92DUG (compound of Example 167), TfR2-019.93DUG (compound of Example 168), TfR2- 019.94DUG (compound of Example 169) was used.
  • mice Seven days after the start of drug treatment, the mice were euthanized by exsanguination under isoflurane anesthesia, the livers were collected, and the amount of hTfR2 mRNA expression was measured. RNA extraction and quantitative PCR were performed as described in Test Example 5. The mRNA expression level of hTfR2 was normalized with the mRNA expression level of mActb, a housekeeping gene. The primers for hTfR2 described in Test Examples 1 and 2 were used. The results of hTfR2 mRNA expression level are shown in FIG. 19. Relative mRNA amounts in other groups were calculated and expressed as relative values when the mRNA amount in the vehicle group was set to 1.0 (mean value ⁇ standard error).
  • Test Example 17 Drug efficacy evaluation test of GalNAc-conjugated TfR2 siRNA using human primary liver cells
  • GalNAc-conjugated siRNA can be taken into the liver via ASGPR (asialoglycoprotein receptor 1) expressed in liver hepatocytes.
  • ASGPR asialoglycoprotein receptor 1
  • GalNAc-conjugated TfR2 siRNA was conducted using human primary liver cells.
  • TfR2 siRNA conjugated with GalNAc includes TfR2-019.88DUG (Example 162), TfR2-019.89DUG (Example 163), TfR2-019.90DUG (Example 164), and TfR2-019.91DUG (Example 164).
  • 166 TfR2-019.92DUG (Example 167), TfR2-019.93DUG (Example 168), TfR2-019.94DUG (Example 169), TfR2-019.95DUG (Example 170), Using.
  • Human primary liver cells (manufactured by LIFE TECHNOLOGIES, HMCPIS) stored in a liquid nitrogen tank were thawed using a 37°C hot bath, and then added to 10 mL of Cryopreserved Hepatocytes Recovery Medium (CHRM) previously warmed at 37°C.
  • CHRM Cryopreserved Hepatocytes Recovery Medium
  • the mixture was poured into a CM7000 (manufactured by LIFE TECHNOLOGIES) and mixed by inversion. Thereafter, centrifugation (100 g, 10 minutes) was performed, and after removing the supernatant, a cell suspension was prepared using 5 mL of cell seeding medium pre-warmed to 37°C.
  • CM3000 Hepatocyte Plating Supplement Pack
  • William's Medium E A1217601, a LIFE TECHNOLOGIES product
  • CM3000 Hepatocyte Plating Supplement Pack
  • A1217601 a LIFE TECHNOLOGIES product
  • a cell seeding medium to give 5x10 ⁇ 5 cells/mL
  • cells to 5x10 ⁇ 4 cells per well of a collagen-coated 96-well plate The cells were seeded and cultured in a CO2 incubator for 4 to 6 hours, and adhesion of the cells to the plate was confirmed using a microscope. Thereafter, an experiment of adding GalNAc conjugated TfR2 siRNA was performed.
  • GalNAc conjugated TfR2 siRNA A medium containing GalNAc conjugated TfR2 siRNA was prepared using a cell culture medium that had been prewarmed at 37°C. Two wells of each type of siRNA sample were prepared, and two wells of a negative control (NT) using distilled water instead of siRNA were prepared. The final concentration of siRNA was adjusted to a 5-fold common ratio in the range from 10,000 nM to 4.8 nM.
  • the cell culture medium is William's Medium E (LIFE TECHNOLOGIES product, A1217601) and Hepatocyte Maintenance Supplement Pack (LIFE TECHNOLOGIES product, CM4000).
  • RNA extraction, qPCR RNA extraction and quantitative PCR were performed as described in Test Example 1.
  • the mRNA expression levels of hTfR2 and h18S were measured as the average value between two wells.
  • the mRNA expression level of hTfR2 was normalized with the mRNA expression level of h18S, a housekeeping gene.
  • the relative hTfR2 mRNA expression level of the specimen treated with each siRNA was calculated and expressed as a relative value when the hTfR2 mRNA expression level in the negative control (NT) was set to 1.0 (mean value ⁇ standard error).
  • NT negative control
  • Test Example 18 Effect of TfR2 siRNA on Hepcidin gene expression using HepG2 cells Hepcidin mRNA expression level 2 days after introducing siRNA into HepG2 cells using the reverse transfection method in the same manner as Test Example 2 was evaluated.
  • As a primer for Hepcidin Hs00221783_m1 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was used.
  • siRNA TfR2-019 (Example 19), TfR2-039 (Example 39), TfR2-019.94DUG (Example 169), and TfR2-039.23DUG (Example 144) were used.
  • the relative Hepcidin mRNA expression level of the specimen treated with each siRNA was calculated and expressed as a relative value when the Hepcidin mRNA expression level in the negative control (NT) was set to 1.0. The results are shown in FIG.
  • the siRNA of the present invention can suppress the expression of TfR2 mRNA, and can further suppress the production of hepcidin, which plays a central role in iron metabolism.
  • the siRNA of the present invention is useful for treating or preventing diseases that can be treated or prevented by suppressing TfR2 mRNA expression and/or hepcidin production.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of hTfR2 mRNA
  • SEQ ID NO: 2-24 Nucleotide sequence of single-stranded oligonucleotide
  • SEQ ID NO: 25-28 Nucleotide sequence of sense strand region of double-stranded oligonucleotide
  • SEQ ID NO: 29-35 Double-stranded Nucleotide sequence of the antisense strand region of the oligonucleotide SEQ ID NO: 36, 37: Nucleotide sequence of the sense strand region of the double-stranded oligonucleotide SEQ ID NO: 38-42: Nucleotide sequence of the antisense strand region of the double-stranded oligonucleotide SEQ ID NO: 43 : Nucleotide sequence of the complementary region of the sense strand region in TfR2-019
  • SEQ ID NO: 44 Nucleotide sequence of the complementary region of the antisense strand

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Abstract

ＴｆＲ２をコードするｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する新規なｓｉＲＮＡを提供することなど。 ＴｆＲ２をコードするｍＲＮＡにおける標的配列と実質的に相補的な標的対応配列を含むアンチセンス鎖領域、及び、前記アンチセンス鎖領域の標的対応配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖領域、からなるトランスフェリン受容体２のｍＲＮＡに対するノックダウン作用を有するオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩など。

Description

トランスフェリン受容体２の発現を抑制するｓｉＲＮＡ
　本発明は、トランスフェリン受容体２（ＴｆＲ２）をコードするｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するｓｉＲＮＡ、該ｓｉＲＮＡの使用、該ｓｉＲＮＡを用いたＴｆＲ２遺伝子発現抑制方法、該ｓｉＲＮＡを含有する医薬等に関する。
　ＴｆＲ２蛋白質をコードするｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは、ＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現を抑制し、鉄代謝において中心的な役割を担っているヘプシジン（ｈｅｐｃｉｄｉｎ）の産生を抑制することができる。その結果、生体内における鉄代謝を活性化させることで赤血球前駆細胞による鉄バイオアベイラビリティが促進され貧血を治療できることが期待される。そこで、ｈｅｐｃｉｄｉｎ産生の抑制を標的にして、ＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現を抑制するためのｓｉＲＮＡを用いる検討がなされている。
　Ｈｅｐｃｉｄｉｎは、主に肝臓から産生されて血液中に分泌される、２５個のアミノ酸から成るペプチドホルモンであり、生体内の鉄代謝において中心的な役割を担う。Ｈｅｐｃｉｄｉｎは、鉄輸送トランスポーターのＦｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ（ＳＬＣ４０Ａ１）に結合し、Ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎの蛋白質分解を促進することによって、腸管からの鉄吸収とマクロファージからの鉄放出を抑制することで鉄代謝を負に制御することが知られている。血液中のＨｅｐｃｉｄｉｎ濃度の上昇は、鉄代謝を抑制することによって、赤血球前駆細胞における鉄のバイオアベイラビリティを制限することで、様々な貧血疾患に寄与することが報告されている（非特許文献１）。
　血液中のＨｅｐｃｉｄｉｎの上昇が認められる貧血疾患としては、例えば、慢性腎臓病に伴う貧血、癌に伴う貧血、化学療法によって誘導される貧血、鉄剤不応答性貧血（ｉｒｏｎ　ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　ｉｒｏｎ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ａｎｅｍｉａ、ＩＲＩＤＡ）、関節リウマチやキャッスルマン病などの慢性炎症に伴う貧血（ａｎｅｍｉａ　ｏｆ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＣＤ）、ダイヤモンドブラックファン貧血、再生不良性貧血、βサラセミア、鎌状赤血球症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、自己免疫性溶血性貧血、骨髄異形成症候群に伴う貧血、慢性骨髄単球性白血病、骨髄線維症に伴う貧血等が挙げられる。また、骨髄線維症患者では、赤血球輸血に伴う鉄の負荷や慢性的な炎症性サイトカインの上昇に相関して、血液中のＨｅｐｃｉｄｉｎ濃度の上昇を呈し得る（非特許文献２）。しかしながら、骨髄線維症のように骨髄における造血機能不全によって赤血球産生能力自体の不足に主に起因する貧血では、血液中のＨｅｐｃｉｄｉｎの上昇に伴う鉄利用障害の病態への寄与は低いと考えられ、これまでにＨｅｐｃｉｄｉｎの産生抑制による貧血治療効果は報告されていない。骨髄線維症等の骨髄機能不全に伴う貧血の治療薬としては、現在のところＥＳＡ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）等の薬が使用される場合があるものの、その治療効果は限定的である。
　特許文献１は、ＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡのＡＤ－５２５９０をサルに投与した結果、肝臓におけるＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現の減少、ｈｅｐｃｉｄｉｎのｍＲＮＡ発現の減少、血液中のｈｅｐｃｉｄｉｎ濃度の減少、血液中の鉄濃度の上昇が認められたことを開示している。また、炎症性に伴う貧血病態を呈したラットにＡＤ－４７８８２を投与した結果、肝臓におけるＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現の減少、血液中のｈｅｐｃｉｄｉｎ濃度の減少、血液中の鉄濃度の上昇、ヘモグロビン値の上昇が認められたことを開示している。しかしながら、特許文献１は、ｓｉＲＮＡをｌｉｐｉｄ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ＬＮＰ）に封入したものを投与した結果を示したものであり、また投与経路は静脈内投与に限定されている。また、特許文献１が開示するＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの治療効果は、炎症に伴う貧血に対する治療効果に限定されており、骨髄機能低下に伴う貧血などその他の貧血に対する治療効果は開示されていない。
　細胞、組織、あるいは個体内の標的遺伝子の発現を阻害する方法として、当該細胞、組織、あるいは個体内に２本鎖ＲＮＡを導入する手法がある。２本鎖ＲＮＡの導入によって、その配列に相同性を持つｍＲＮＡが分解され、標的遺伝子の発現が阻害される。この効果は「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」と呼ばれている。３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれ２１ヌクレオチドからなる２本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）は、脊椎動物の培養細胞において、ＲＮＡ干渉作用を有することが報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。
　ｓｉＲＮＡは遺伝子機能の同定、有用物質生産に適した細胞株のスクリーニング、疾患に関与する遺伝子の制御等に有用であるが、ＲＮＡ分解酵素によって容易に分解されるため、体内での活性持続が難しい、合成コストが高額になるという欠点を有する。そのため、ＲＮＡ分解酵素に対する安定性が高く、安価に製造できる、ＲＮＡｉ活性を保持したオリゴヌクレオチドの開発のために、様々な化学修飾が試みられてきた。
　オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のリン酸基の非架橋酸素原子を硫黄原子に置き換えたホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、ヌクレアーゼに耐性になることが知られている。しかしながら、オリゴヌクレオチド中のＰＳ結合の数を増やすと２本鎖ＲＮＡの熱力学的不安定化及び非特異的なタンパク質との結合が起きるので好ましくないと報告されている（例えば、非特許文献４参照。）。
　また、ヌクレオシドとして、ＤＮＡ、２’－Ｏ－メチルヌクレオシド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド、２’－Ｏ，４’－Ｃ架橋ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシドを採用したｓｉＲＮＡは、例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４等に開示されている。
　天然型のＲＮＡを修飾ＲＮＡに置換することによって安定なｓｉＲＮＡを取得する試みもなされている。例えば、ＲＮＡの２’－ＯＨ基をアルキル化しＲＮａｓｅの基質にならないようにした２’－Ｏ－アルキルヌクレオシドとした数多くの誘導体が報告されている。２’－Ｏ－メチルヌクレオチドはｔＲＮＡの中にも見られる天然に存在する修飾ヌクレオチドで、アンチセンス研究の初期の頃から研究されている（例えば、非特許文献５参照。）。
　ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の一方、または両方のすべてのＲＮＡを２’－Ｏ－メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が減弱又は完全に失われるとの報告（例えば、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９等参照。）また、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを３つ連続して導入するとセンス鎖への導入では活性低下が見られないが、アンチセンス鎖への導入では、活性低下が認められて、特にセンス鎖の５’末端に導入した場合に著しく活性が低下することが報告されている（例えば、非特許文献１０参照。）。
　人工的に合成された修飾ＲＮＡである、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド（２’－Ｆ、または、２’－Ｆ　ＲＮＡ）を有するオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドと同じＮ型配座を優先して形成し、ＲＮＡとの親和性も高くなるが、リン酸ジエステル結合からなるものはヌクレアーゼ抵抗性がないので、ホスホロチオエート結合とし、ヌクレアーゼ抵抗性を持たせる必要がある（例えば、非特許文献１１参照。）。
　ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）は、ヌクレアーゼに対する安定性を有している修飾核酸であるが、ｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖の一方または両方の３’末端のオーバーハング部位の２ヌクレオチドにＥＮＡを導入した場合、ＲＮＡｉ活性が低下することが報告されている（例えば、非特許文献１２参照。）。
　複数の修飾核酸を組み合わせたｓｉＲＮＡについて多くの報告がある。例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドと２’－Ｆを１つおきにｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖に導入し、未修飾ｓｉＲＮＡと比較して同程度以上のＲＮＡｉ活性が得られ、血清中での比較的安定に保たれることが報告されている（例えば、非特許文献１３参照。）。
　ＤＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、及び、２’－Ｆを組み合わせた２本鎖オリゴヌクレオチドが報告されており、特にアンチセンス鎖の５’末端から１４番目が２’－ＦであるｓｉＲＮＡが報告されている（例えば、特許文献５、６参照。）。また、ＤＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、及び、ＬＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）を組み合わせた２本鎖オリゴヌクレオチドが報告されており、特にアンチセンス鎖の５’末端から２、あるいは、１４番目が２’－Ｆ、ＤＮＡ、あるいは、ＬＮＡであるｓｉＲＮＡの活性が報告されている（例えば、特許文献５、特許文献７参照。）。
国際公開第２０１２／１７７９２１号パンフレット 米国特許第ＵＳ９，３９９，７７５号公報 米国特許第ＵＳ９，７９６，９７４号公報 米国特許第ＵＳ１０，６１２，０２４号公報 国際公開第２０１２／０５８２１０号パンフレット 国際公開第２０１３／０７４９７４号パンフレット及び米国特許第ＵＳ９，３９９，７７５号公報、米国特許第ＵＳ９，７９６，９７４号公報 国際公開第２０１６／０２８６４９号パンフレット、米国特許第ＵＳ１０，６１２，０２４号公報
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　２０１９，　１２，　１７０ Ａｍ．　Ｊ．　Ｈｅｍａｔｏｌ．　８８：３１２－３１６，　２０１３． Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、第４１１巻、ｐ．４９４－４９８ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、　２０００年、第１０巻、ｐ．１１７－１２１ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８７年、第１５巻、ｐ．６１３１－６１４８ ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ、２００１年、第２０巻、ｐ．６８７７－６８８８ ＲＮＡ、第９巻、２００３年、ｐ．１０３４－１０４８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、第４２巻、ｐ．７９６７－７９７５ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、第３１巻、ｐ．２７０５－２７１６ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５年、第４８巻、ｐ．４２４７－４２５３ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９３年、第３６巻、　ｐ．８３１－８４１ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００２年、　第１２巻、ｐ．３０１－３０９ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．、２００５年、第４８巻、ｐ．９０１－９０４
　貧血を予防、改善、及び／又は治療し得る、高い薬理活性を持つＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡが求められている。また、細胞に対する毒性が低く、血液中における安定性や薬物送達性に優れたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡが求められている。
　慢性炎症に伴う貧血においてＨｅｐｃｉｄｉｎの上昇が認められる場合、血液中のＨｅｐｃｉｄｉｎの産生を抑制することで治療効果が得られるが、これは赤血球の産生異常というよりもＨｅｐｃｉｄｉｎの上昇による鉄利用障害が生じていることに主に起因している。しかしながら、骨髄線維症等の骨髄機能不全に伴う貧血は、多くの場合赤血球の産生が低下していることに起因しているため、Ｈｅｐｃｉｄｉｎの上昇が認められる場合であってもＨｅｐｃｉｄｉｎの産生を抑制することで治療効果が得られることは期待できず、そのような報告もない。そのため、骨髄線維症等の骨髄機能不全に伴う貧血に対する新規の有効な治療薬が特に求められている。また、本発明者らの研究において、特許文献１のＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの標的配列については、配列特異的な細胞毒性が確認されたことから、先行技術のｓｉＲＮＡには安全性の懸念がある。
　本発明は、ＴｆＲ２をコードするｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用（これらの作用をノックダウン作用ということもある。）を有する新規なｓｉＲＮＡを提供することを目的とする。また、本発明は、細胞毒性、安定性、及び／又は薬物送達性が改善された新規なＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを提供することを目的とする。さらに、本発明は、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することで治療又は予防可能な疾患の治療又は予防のための新規な医薬組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究を行ったところ、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡにおける特定の位置の塩基配列を標的配列とするＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有し、かつ、特許文献１の標的配列で観察された細胞に対する毒性が本発明の標的配列では観察されなかったことを見出した。また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ、３’－Ｏ－メチルＲＮＡを適宜組み合わせたオリゴヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡが、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有し、生体内において安定的であることを見出した。また、ｓｉＲＮＡにＧａｌＮＡｃ等の輸送用ユニットを付加することにより薬物送達性が改善されることを見出した。さらに本発明者らは、ＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを用いてＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することで、炎症に伴う貧血モデルマウスだけでなく、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおいて貧血症状の改善が認められること等を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下を提供する。
［１］　トランスフェリン受容体２のｍＲＮＡに対するノックダウン作用を有する、以下の（Ａ）のアンチセンス鎖領域及び（Ｂ）のセンス鎖領域を含むオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩；
（Ａ）配列番号１のヌクレオチド番号２８４５から２８６７、又は、ヌクレオチド番号１５３４から１５５６の間の領域において連続する１８～２１塩基からなる標的配列と実質的に相補的な標的対応配列からなり、該標的対応配列の５’末端のヌクレオシドは、該標的配列の３’末端のヌクレオシドと実質的に相補的なヌクレオシド、アデニンを有するヌクレオシド、又はウラシルを有するヌクレオシドであり、該標的対応配列の５’末端及び／又は３’末端に５塩基以下のオーバーハング構造が付加していてもよい、１８～３１塩基長からなるアンチセンス鎖領域、及び、
（Ｂ）前記アンチセンス鎖領域の標的対応配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含有し、さらに該ヌクレオチド配列の５’末端及び／又は３’末端に５塩基以下のオーバーハング構造が付加していてもよい、１８～３１塩基長からなるセンス鎖領域。
［２］　前記標的配列が、配列番号１のヌクレオチド番号２８４７～２８６５、又はヌクレオチド番号１５３６～１５５４の１９塩基からなるヌクレオチド配列である、［１］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［３］　前記アンチセンス鎖領域の標的対応配列における５’末端のヌクレオシドが、アデニン又はウラシルを有するヌクレオシドである、［１］又は［２］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［４］　前記アンチセンス鎖領域の標的対応配列が、配列番号１のヌクレオチド番号２８４７～２８６５、又はヌクレオチド番号１５３６～１５５４の１９塩基からなる標的配列と完全に相補的なヌクレオチド配列である、［１］～［３］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［５］　オリゴヌクレオチドを構成する糖及び／又はリン酸ジエステル結合の少なくとも１個が修飾されている、［１］～［４］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［６］　オリゴヌクレオチドを構成する糖がＤ－リボフラノースであり、糖の修飾がＤ－リボフラノースの２’位の水酸基の修飾である、［５］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［７］　糖の修飾が、Ｄ－リボフラノースの２’－デオキシ化、２’－Ｏ－アルキル化、２’－Ｏ－アルコキシアルキル化、２’－ハロゲン化、及び／又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－アルキレン化である、［６］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［８］　前記２’－Ｏ－アルキル化が２’－Ｏ－メチル化、前記２’－Ｏ－アルコキシアルキル化が２’－Ｏ－メトキシエチル化、前記２’－ハロゲン化が２’－フルオロ化、並びに、前記２’－Ｏ，４’－Ｃ－アルキレン化が２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン化及び／又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン化である、［７］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［９］　リン酸ジエステル結合の修飾がホスホロチオエートである、［５］～［８］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１０］　センス鎖領域及び／又はアンチセンス鎖領域の３’末端のヌクレオシドにおけるＤ－リボフラノースが３’－Ｏ－アルキル化されていることを特徴とする、［５］～［９］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１１］　前記３’－Ｏ－アルキル化が３’－Ｏ―メチル化である、［１０］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１２］　センス鎖領域及び／又はアンチセンス鎖領域の５’末端及び／又は３’末端に、３塩基以下のオーバーハング構造が付加している、［１］～［１１］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１３］　オーバーハング構造が２塩基である、［１２］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１４］　オーバーハング構造が、２個の連続したチミンを含むヌクレオシド、又は２個の連続したウラシルを含むヌクレオシドである、［１３］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１５］　オーバーハング構造が、アンチセンス鎖領域の３’末端に付加した２個の連続したＵ（Ｍ）である、［１４］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１６］　センス鎖領域が以下の式（Ｉ）に示すオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖領域が以下の式（ＩＩ）に示すオリゴヌクレオチドからなり、さらに以下の（ａ）乃至（ｇ）に示される特徴を有する、［１］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩：
センス鎖領域：５’　ＳＯ５－Ｓａ－Ｓ１９－Ｓ１８－Ｓ１７－Ｓ１６－Ｓ１５－Ｓ１４－Ｓ１３－Ｓ１２－Ｓ１１－Ｓ１０－Ｓ９－Ｓ８－Ｓ７－Ｓ６－Ｓ５－Ｓ４－Ｓ３－Ｓ２－Ｓ１－ＳＯ３　３’（Ｉ）
アンチセンス鎖領域：５’　ＡＯ５－Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８－Ａ９－Ａ１０－Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５－Ａ１６－Ａ１７－Ａ１８－Ａ１９－Ａａ－ＡＯ３　３’（ＩＩ）
（ａ）Ｓ１は３’－修飾ヌクレオシドであり、Ｓ２～Ｓ１９は１個のヌクレオシドを示し、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡであり、Ｓａは０～３個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、ＳＯ３及びＳＯ５はそれぞれ独立して、０～３個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドを示す。各ヌクレオシド間の結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を示す；
（ｂ）Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４及びＡ１５は１個のヌクレオシドを示し、そのうち少なくとも１つはＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシド又は２’－ＭＯＥ　ＲＮＡであり、それ以外は２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ又は２’－Ｆ　ＲＮＡであり、Ａ１～Ａ１０及びＡ１６～Ａ１９は１個のヌクレオシドを示し、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、Ａａは０～３個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、ＡＯ３及びＡＯ５はそれぞれ独立して、０～３個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドを示す。各ヌクレオシド間の結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を示す；
（ｃ）Ａ２～Ａａの間のヌクレオチド配列は、標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列からなり、Ａ１は標的配列の対応するヌクレオシドと相補的な塩基を有するヌクレオシド、アデニンを有するヌクレオシド、チミンを有するヌクレオシド、又はウラシルを有するヌクレオシドであり、ＡＯ３とＡＯ５が存在する場合、そのヌクレオチド配列は、それぞれ独立して、標的配列の対応するヌクレオシドとは独立に選択されるヌクレオチド配列である；
（ｄ）Ｓ１～Ｓａの間のヌクレオチド配列と、Ａ１～Ａａの間のヌクレオチド配列とは、互いに実質的に相補的なヌクレオチド配列であり、かつ、２本鎖構造を形成している；
（ｅ）ＳＯ５とＡＯ３の両方が存在する場合、ＳＯ５及びＡＯ３は、互いに相補的ではないヌクレオチド配列である；
（ｆ）ＳＯ３とＡＯ５の両方が存在する場合、ＳＯ３及びＡＯ５は、互いに相補的ではないヌクレオチド配列である；並びに、
（ｇ）センス鎖領域及び／又はアンチセンス鎖領域の、５’末端のヌクレオシドの５’位及び／又は３’末端のヌクレオシドの３’位もしくは３’末端のヌクレオシドが３’－修飾ヌクレオシドである場合はその２’位、が化学修飾されていてもよい。
［１７］　式（ＩＩ）において、Ｓ１が３’－ＯＭｅ　ＲＮＡである［１６］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１８］　２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡ又はＥＮＡである、［１６］又は［１７］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１９］　式（ＩＩ）において、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４及びＡ１５の２つ以上が同一又はそれぞれ異なっていてもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシド又は２’－ＭＯＥ　ＲＮＡである［１６］～［１８］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２０］　式（ＩＩ）において、Ａ１４がＲＮＡ又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドである、［１９］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２１］　式（ＩＩ）において、Ａ１３が２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシド又は２’－ＯＭｅ　ＲＮＡであり、Ａ１４がＲＮＡである、［２０］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２２］　式（ＩＩ）において、Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５が以下のいずれか；
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、又は、
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
である、［２１］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２３］　式（ＩＩ）において、Ａ１２がＤＮＡであり、Ａ１４が２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドである、［２０］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２４］　式（ＩＩ）において、Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５が以下のいずれか；
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(ENA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(ENA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(LNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、又は、
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(LNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
である、［２３］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２５］　式（ＩＩ）において、Ａ２、Ａ６及びＡ１６が２’－Ｆ　ＲＮＡである、［１６］～［２４］のいずれ１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２６］　式（ＩＩ）において、更に、Ａ８、Ａ９及びＡ１０からなる群から選択される１又は２個のヌクレオシドが２’－Ｆ　ＲＮＡであり、Ａ１、Ａ３～Ａ５、Ａ７、Ａ１７～Ａ１９及びＡａのヌクレオシドが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである、［２５］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２７］　式（ＩＩ）において、Ａ２、Ａ６、Ａ８、Ａ１０及びＡ１６が２’－Ｆ　ＲＮＡであり、Ａ１、Ａ３～Ａ５、Ａ７、Ａ９、Ａ１７～Ａ１９及びＡａのヌクレオシドが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである、［２６］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２８］　式（Ｉ）において、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３及びＳ１５が２’－Ｆ　ＲＮＡである［１６］～［２７］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２９］　式（Ｉ）において、Ｓ２～Ｓ１０、Ｓ１４、Ｓ１６～Ｓ１９及びＳａが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである［２８］のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［３０］　式（ＩＩ）においてＲＮＡが採用される場合、当該ＲＮＡとその３’側に隣接するヌクレオシドとの間の結合がホスホロチオエート結合であることを特徴とする、［１６］～［２９］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［３１］　前記オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端から２～５ヌクレオチドにおいて、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であることを特徴とする、［１６］～［３０］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［３２］　ＳＯ３、ＳＯ５、ＡＯ５及びＡＯ３のヌクレオシド数が０～２である、［１６］～［３１］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［３３］　ＳＯ３のヌクレオシド数が０である、［３２］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［３４］　ＳＯ３、ＳＯ５及びＡＯ５のヌクレオシド数が０であり、ＡＯ３のヌクレオシド数が２である、［３３］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［３５］　前記アンチセンス鎖領域及びセンス鎖領域が、それぞれ独立したオリゴヌクレオチドとして２本鎖オリゴヌクレオチドを形成していることを特徴とする、［１］～［３４］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［３６］　前記アンチセンス鎖領域の５’末端のヌクレオシドとセンス鎖領域の３’末端のヌクレオシドとがリンカー構造により連結されていることを特徴とする、［１］～［３４］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［３７］　前記リンカー構造が、下記式
 [式中、破線は結合手を示し、フェニル基に結合している酸素原子は、隣接するアンチセンス鎖領域の５’末端のヌクレオチドの５’－リン酸基とリン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合することを表し、他方の末端のメチレン基は、隣接するセンス鎖領域の３’末端のヌクレオチドの３’－リン酸基（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位のリン酸基）とリン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合することを表す。]
で表される構造である、［３６］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［３８］　オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオシドの５’位及び／又は３’末端のヌクレオシドの３’位もしくは３’末端のヌクレオシドが３’－修飾ヌクレオシドである場合はその２’位、がＧａｌＮＡｃユニットで化学修飾されていることを特徴とする、［１］～［３７］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［３９］　前記ＧａｌＮＡｃユニットが、
 [式中、破線は隣接するヌクレオチドの５’末端のリン酸基及び／又は３’末端のリン酸基（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位のリン酸基）とリン酸ジエステル結合することを表す。]
で表されるユニットであることを特徴とする、［３８］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［４０］　オーバーハング構造を除くセンス鎖領域が以下の式（Ｉ－１）であり、オーバーハング構造を除くアンチセンス鎖領域が以下の式（ＩＩ－１）～（ＩＩ－１０）のいずれかであり、前記センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域がそれぞれ独立したオリゴヌクレオチドとして２本鎖オリゴヌクレオチドを形成しており、前記センス鎖領域及び前記アンチセンス鎖領域はそれぞれ独立してオーバーハング構造を含んでいてもよい、［１］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（式）
５’　C(M)G(M)U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(3M)　３’　（Ｉ－１）
５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－１）
５’　U(M)U(F)G(M)A(F)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－２）
５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－３）
５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(F)G(M)　３’　（ＩＩ－４）
５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－５）
５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－６）
５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－７）
５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－８）
５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－９）
５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－１０）
[核酸の塩基についてAはアデニン、Uはウラシル、Tはチミン、Gはグアニン、Cはシトシン（ただし、CがＥＮＡのときは２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋－５－メチルシチジンを示す）を示し、核酸について(R)はRNA、(D)はDNA、(M)は2'-OMe RNA、(3M)は3'-OMe RNA、(F)は2'-F RNA、(E)はENAを示す。また、式中、「^」はヌクレオシド間の結合がホスホロチオエート結合（-P(=S)(OH)-）であること示し、特に記載のない場合はヌクレオシド間の結合がリン酸ジエステル結合（-P(=O)(OH)-）であることを示すが、特に記載のない場合であってもセンス鎖領域の５’末端及び３’末端から３個のヌクレオシドにおける２か所のヌクレオシド間結合、並びに、アンチセンス鎖領域の５’末端から３個のヌクレオシドにおける２か所のヌクレオシド間結合及び３’末端から４個のヌクレオシドにおける３か所のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。]
［４１］　センス鎖領域及び／又はアンチセンス鎖領域の５’末端及び／又は３’末端に、３塩基以下のオーバーハング構造が付加している、［４０］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［４２］　オーバーハング構造が２塩基である、［４１］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［４３］　オーバーハング構造が、２個の連続したチミンを含むヌクレオシド、又は２個の連続したウラシルを含むヌクレオシドである、［４２］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［４４］　オーバーハング構造が、アンチセンス鎖領域の３’末端に付加した２個の連続したＵ（Ｍ）である、［４３］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［４５］　センス鎖領域の５’末端が以下の式
 [式中、破線は隣接するセンス鎖領域の５’末端のヌクレオチドの５’－リン酸基とリン酸ジエステル結合することを表す。]
で表されるＧａｌＮＡｃユニットで化学修飾されていることを特徴とする、［４０］～［４４］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［４６］　センス鎖領域が以下の式（Ｉ－２）であり、アンチセンス鎖領域が以下の式（ＩＩ－１１）～（ＩＩ－２０）のいずれかであり、前記センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域がそれぞれ独立したオリゴヌクレオチドとして２本鎖オリゴヌクレオチドを形成している、［１］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
（式）
５’　GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)　３’　（Ｉ－２ ）
５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１１） 
５’　U(M)^U(F)^G(M)A(F)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１２） 
５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１３） 
５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(F)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１４） 
５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１５） 
５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１６） 
５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１７） 
５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１８） 
５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１９） 
５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－２０） 
[式中、「GN」は下記式
（式中、破線は隣接するセンス鎖領域の５’末端のヌクレオチドの５’－リン酸基とリン酸ジエステル結合していることを表す。）で表されるＧａｌＮＡｃユニットを示し、核酸の塩基についてAはアデニン、Uはウラシル、Tはチミン、Gはグアニン、Cはシトシン（ただし、CがＥＮＡのときは２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋－５－メチルシチジンを示す）を示し、核酸について(R)はRNA、(D)はDNA、(M)は2'-OMe RNA、(3M)は3'-OMe RNA、(F)は2'-F RNA、 (E)はENAを示す。また、式中、「^」はヌクレオシド間の結合がホスホロチオエート結合（-P(=S)(OH)-）であること示し、特に記載のない場合はヌクレオシド間の結合がリン酸ジエステル結合（-P(=O)(OH)-）であることを示す。センス鎖領域の３’末端のヌクレオチドの３’位、アンチセンス鎖領域の５’末端のヌクレオチドの５’位、及びアンチセンス鎖領域の３’末端のヌクレオチドの３’位はそれぞれ水酸基である。]
［４７］　［１］～［４６］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
［４８］　トランスフェリン受容体２の発現を抑制することにより治療又は予防可能な疾患の治療又は予防のための、［４７］に記載の医薬組成物。
［４９］　貧血の予防又は治療のための、［４８］に記載の医薬組成物。
［５０］　貧血が、慢性炎症に伴う貧血又は骨髄機能不全に伴う貧血である、［４９］に記載の医薬組成物。
［５１］　前記慢性炎症に伴う貧血が、自己免疫疾患に伴う貧血、感染症に伴う貧血、炎症性腸疾患に伴う貧血、心不全に伴う貧血、慢性腎臓病に伴う貧血、癌性貧血、又はキャッスルマン病に伴う貧血である、［５０］に記載の医薬組成物。
［５２］　前記骨髄機能不全に伴う貧血が、骨髄線維症に伴う貧血、骨髄異形成症候群に伴う貧血、又は慢性骨髄単球性白血病に伴う貧血、化学療法による骨髄抑制に伴う貧血である、［５０］に記載の医薬組成物。
［５３］　他の薬剤による治療を受けている患者を対象とする、［４７］～［５２］記載の医薬組成物。
［５４］　前記他の薬剤が、貧血治療薬、貧血の原因となる疾患の治療薬、又は鉄過剰症治療薬である、［５３］記載の医薬組成物。
［５５］　前記貧血治療薬が、赤血球造血刺激因子製剤、ＨＩＦＰＨＤ（ｈｙｐｏｘｉａ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｐｒｏｌｙｌ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）阻害薬、経口鉄剤、静注鉄剤、ルスパテルセプト、又はダナゾールである、［５４］記載の医薬組成物。
［５６］　前記赤血球造血刺激因子製剤が、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンベータペゴル、エポエチンカッパ、又はダルベポエチンアルファである、［５５］記載の医薬組成物。
［５７］　前記ＨＩＦＰＨＤ（ｈｙｐｏｘｉａ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｐｒｏｌｙｌ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）阻害薬が、ロキサデュスタット、バダデュスタット、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、又はモリデュスタットである、［５５］記載の医薬組成物。
［５８］　前記経口鉄剤が、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、フマル酸第一鉄、溶性ピロリン酸第二鉄、乾燥硫酸鉄である、［５５］記載の医薬組成物。
［５９］　前記が静注鉄剤、カルボキシマルトース第二鉄、含糖酸化鉄である、［５５］記載の医薬組成物。
［６０］　前記貧血の原因となる疾患の治療薬が、骨髄線維症治療薬、骨髄異形成症候群治療薬、慢性腎臓病治療薬又は抗がん剤である、［５４］記載の医薬組成物。
［６１］　前記骨髄線維症治療薬がＪＡＫ２阻害薬である、［６０］記載の医薬組成物。
［６２］　前記ＪＡＫ２阻害薬が、ルキソリチニブ、フェドラチニブ、パクリチニブ又はモメロチニブである、［６１］記載の医薬組成物。
［６３］　前記骨髄異形成症候群治療薬がアザシチジン又はレナリドミドである、［６０］記載の医薬組成物。
［６４］　前記慢性腎臓病治療薬が、ＳＧＬＴ２（ｓｏｄｉｕｍ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｃｏ―ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ２）阻害薬、レニン・アンジオテンシン系阻害薬、カルシウム拮抗薬、利尿薬、糖尿病治療薬、高脂血症治療薬、ステロイド、又は免疫抑制薬である、［６０］記載の医薬組成物。
［６５］　前記レニン・アンジオテンシン系阻害薬が、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬又はアンジオテンシン変換酵素阻害薬である、［６４］記載の医薬組成物。
［６６］　前記抗がん剤が化学療法薬である、［６０］記載の医薬組成物。
［６７］　前記化学療法薬が、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、又はアムルビシンである、［６６］記載の医薬組成物。
［６８］　前記鉄過剰症治療薬が鉄キレート剤である、［５４］記載の医薬組成物。
［６９］　前記鉄キレート剤が、デフェラシロクス、デフェロキサミン、又はデフェリプロンである、［６８］記載の医薬組成物。
［７０］　対象に、［１］～［４６］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩の有効量を投与することを含む、貧血を治療又は予防する方法。
［７１］　対象に、［４７］～［６９］のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与することを含む、貧血を治療又は予防する方法。
［７２］　貧血の治療または予防における使用のための［１］～［４６］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［７３］　［４７］～［６９］のいずれか１つに記載の医薬組成物の有効成分としての使用のための［１］～［４６］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［７４］　［４７］～［６９］のいずれか１つに記載の医薬組成物の製造における［１］～［４６］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩の使用。
　また、ある一態様において、本発明は以下を提供する。
［７５］　トランスフェリン受容体２遺伝子をノックダウンする効果を有する化合物を有効成分とする、骨髄機能不全に伴う貧血の治療又は予防のための医薬組成物。
［７６］　前記化合物が、ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドである、［７５］に記載の医薬組成物。
　本発明のｓｉＲＮＡは、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することができる。また、本発明のｓｉＲＮＡは生体内において肝臓におけるＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することができ、貧血を予防、改善、及び／又は治療することができる。
[規則91に基づく訂正 03.04.2023]
２本鎖ｓｉＲＮＡの修飾パターンを示す図である。図中、黒丸は２’－Ｏ－メチルＲＮＡを表し、白丸は２’－デオキシ－２’－フルオロＲＮＡを表し、黒三角形はＤＮＡを表し、白三角形は３’－Ｏ－メチルＲＮＡを表し、白ひし形はＥＮＡを表し、黒ひし形はＲＮＡを表し、縦の棒が入った白丸はＬＮＡを表し、横の棒が入った白丸は２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡを表し、マークとマークを繋ぐ線はリン酸ジエステル結合を表し、マークとマークを繋ぐ線に「ｓ」が記載されている場合はホスホロチオエート結合を表す。図中、上部の鎖はセンス鎖（またはパッセンジャー鎖）を表し、センス鎖の左側の末端が５’末端、右側の末端が３’末端を表す。下部の鎖はアンチセンス鎖（またはガイド鎖）を表し、アンチセンス鎖の右側の末端が５’末端、左側の末端が３’末端を表す。各ｓｉＲＮＡは、ＮＮＮ－ｘｘｘで表し、ＮＮＮ－ｘｘｘの後に記載されている数字とアルファベットは、図１乃至６に記載の修飾パターンの略号を示す。 ２本鎖ｓｉＲＮＡにおけるアンチセンス鎖のＡ１４がＤＮＡ又はＲＮＡの場合の修飾パターンを示す図である。各記号、配置、修飾などは、図1と同じ様式で表示される。 ２本鎖ｓｉＲＮＡにおける、アンチセンス鎖のＡ８及びＡ９が２’－デオキシ－２’－フルオロＲＮＡの場合の修飾パターンを示す図である。各記号、配置、修飾などは、図1と同じ様式で表示される。 ２本鎖ｓｉＲＮＡにおける、アンチセンス鎖のＡ１４がＥＮＡの場合の修飾パターンを示す図である。各記号、配置、修飾などは、図1と同じ様式で表示される。 ２本鎖ｓｉＲＮＡにおける、アンチセンス鎖のＡ８及びＡ９が２’－デオキシ－２’－フルオロＲＮＡ、かつ、アンチセンス鎖のＡ１３がＥＮＡの場合の修飾パターンを示す図である。各記号、配置、修飾などは、図1と同じ様式で表示される。 ２本鎖ｓｉＲＮＡにおける、アンチセンス鎖のＡ８が２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、及びＡ９が２’－デオキシ－２’－フルオロＲＮＡの場合の修飾パターンを示す図である。各記号、配置、修飾などは、図1と同じ様式で表示される。 図７Ａは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを封入した核酸脂質粒子の処置による血漿中鉄濃度の推移を示す図である。図７Ｂは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＬＮＰ封入ＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による血漿中ｈｅｐｃｉｄｉｎ濃度の推移を示す図である。図７Ｃは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＬＮＰ封入ＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるヘモグロビン値（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，　ＨＧＢ）の推移を示す図である。図７Ｄは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＬＮＰ封入ＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるｍｅａｎ　ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＭＣＨ）値を示す図である。図７Ｅは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＬＮＰ封入ＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による肝臓Ｔｆｒ２（ｍＴｆｒ２）　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。図７Ｆは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＬＮＰ封入ＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による肝臓Ｈｅｐｃｉｄｉｎ（ｍＨｅｐｃｉｄｉｎ）　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。 図８Ａは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるＨＧＢ値の推移を示す図である。図８Ｂは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおける、薬剤処置して３日後のＨＧＢ値を示す図である。図８Ｃは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による肝臓ｍＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。図８Ｄは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるＨＧＢ値を示す図である。 図８Ｅは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるＭＣＨ値を示す図である。図８Ｆは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ（ＨＣＴ）値を示す図である。図８Ｇは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるｒｅｄ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ（ＲＢＣ）数を示す図である。 図９Ａは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による血漿中鉄濃度を示す図である。図９Ｂは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による血漿中ｈｅｐｃｉｄｉｎ濃度を示す図である。図９Ｃは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるＨＧＢ値を示す図である。図９Ｄは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるＭＣＨ値を示す図である。図９Ｅは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるＲＢＣ数を示す図である。図９Ｆは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による肝臓ｍＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。 図１０Ａは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による血漿中鉄濃度を示す図である。図１０Ｂは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるＨＧＢ値を示す図である。図１０Ｃは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるＭＣＨ値を示す図である。図１０Ｄは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるＲＢＣ数を示す図である。図１０Ｅは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による肝臓ｍＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。 ＨｅｐＧ２細胞におけるｓｉＲＮＡの細胞毒性評価結果を示す図である。 ＨｅｐＧ２細胞におけるｓｉＲＮＡのｈＴｆＲ２ノックダウン活性を示す図である。 正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による血漿中鉄濃度の推移を示す図である。 図１４Ａは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置前におけるＨＧＢ値を示す図である。図１４Ｂは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置前における血漿中鉄濃度を示す図である。図１４Ｃは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを処置して８日後の血漿中鉄濃度を示す図である。図１４Ｄは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを処置して９日後のＨＧＢ値を示す図である。図１４Ｅは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを処置して９日後のＭＣＨ値を示す図である。図１４Ｆは、骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを処置して９日後のＲＢＣ数を示す図である。 図１５Ａは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による血漿中鉄濃度の推移を示す図である。図１５Ｂは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置前におけるＨＧＢ値を示す図である。図１５Ｃは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを処置して８日後におけるＨＧＢ値を示す図である。図１５Ｄは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを処置して８日後におけるＭＣＨ値を示す図である。図１５Ｅは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを処置して８日後におけるＲＢＣ数を示す図である。図１５Ｆは、炎症に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを処置して８日後における肝臓ｍＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。 図１６Ａは、ＭＤＳモデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による血漿中鉄濃度の推移を示す図である。図１６Ｂは、ＭＤＳモデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるＨＧＢ値の推移を示す図である。図１６Ｃは、ＭＤＳモデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して８週間後におけるＨＧＢ値を示す図である。図１６Ｄは、ＭＤＳモデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して８週間後におけるＭＣＨ値を示す図である。図１６Ｅは、ＭＤＳモデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して８週間後におけるＲＢＣ数を示す図である。図１６Ｆは、ＭＤＳモデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して８週間後における肝臓ｍＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。 図１７Ａは、慢性腎臓病に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置前の血漿中鉄濃度を示す図である。図１７Ｂは、慢性腎臓病に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置前におけるＨＧＢ値を示す図である。図１７Ｃは、慢性腎臓病に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して６週間後における血漿中鉄濃度を示す図である。図１７Ｄは、慢性腎臓病に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して６週間後におけるＨＧＢ値を示す図である。 図１７Ｅは、慢性腎臓病に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して６週間後におけるＭＣＨ値を示す図である。図１７Ｆは、慢性腎臓病に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して６週間後におけるＲＢＣ数を示す図である。図１７Ｇは、慢性腎臓病に伴う貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して６週間後における肝臓ｍＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。 図１８Ａは、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂによる貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置前におけるＨＧＢ値を示す図である。図１８Ｂは、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂによる貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して３週間後における血漿中鉄濃度を示す図である。図１８Ｃは、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂによる貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して６週間後におけるＨＧＢ値を示す図である。図１８Ｄは、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂによる貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して６週間後におけるＭＣＨ値を示す図である。図１８Ｅは、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂによる貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して６週間後におけるＲＢＣ数を示す図である。図１８Ｆは、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂによる貧血モデルマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置を開始して６週間後における肝臓ｍＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。 ｈＴｆＲ２　Ｔｇマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを処置して７日後における肝臓ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。 ヒト初代肝臓細胞におけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。 図２１Ａは、ＨｅｐＧ２細胞におけるＴｆＲ２－０１９及びＴｆＲ２－０３９のＨｅｐｃｉｄｉｎ　ｍＲＮＡ発現抑制活性を示す図である。図２１Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞におけるＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ及びＴｆＲ２－０３９．２３ＤＵＧのＨｅｐｃｉｄｉｎ　ｍＲＮＡ発現抑制活性を示す図である。 ヒトトランスフェリン受容体２（ｈＴｆＲ２）をコードする遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号１）を示す図である。下線の配列（２８４７～２８６５番目の配列）はＴｆＲ２－０１９の標的配列を示し、二重下線の配列（１５３６～１５５４番目の配列）はＴｆＲ２－０３９の標的配列を示す。 図２２－１の続きを示す図である。
＜１．用語の説明＞
　本明細書において、「標的遺伝子」とは、トランスフェリン受容体２（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２、ＴｆＲ２）をコードする遺伝子に対するｍＲＮＡをいい、ＲＮＡプロセシングを受ける前の未成熟なｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体、又はｐｒｅ－ｍＲＮＡともいう）であってもよく、ＲＮＡプロセシングを受けて成熟したｍＲＮＡであってもよい。ＲＮＡプロセシングには、例えば、ＲＮＡスプライシング、５’末端のキャップ構造形成、及び３’末端のポリＡ尾部形成等が含まれる。
　ＴｆＲ２は主に肝臓に発現している２型膜蛋白質であり、細胞内領域、膜貫通領域、細胞外領域から構成されることが知られている（Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３５　（２００３）　２９２－２９６）。ＴｆＲ２は、鉄代謝において重要な役割をもつｈｅｐｃｉｄｉｎの産生、及び鉄代謝の制御において中心的な役割を担っていることが知られている（Ｆｒｏｎｔ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　０６　Ｍａｒｃｈ　２０１４、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ　２０１１；９６（４）：５００－５０６．、Ｂｌｏｏｄ．　２０１１；１１７（１０）：２９６０－２９６６）。
　貧血とは、血液中の赤血球中に存在し、酸素運搬能を有するヘモグロビンの濃度が低下する病態を指す。貧血は、身体活動の低下や、死亡率の上昇に関与する（Ａｎｎ　Ｎ　Ｙ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．　２０１９　Ａｕｇｕｓｔ　；　１４５０（１）：　１５－３１．）。貧血は、その原因、臨床像、平均赤血球容積（ｍｅａｎ　ｃｕｒｐｕｓｃｕｌａｒ　ｖｏｌｕｍｅ，　ＭＣＶ）などの赤血球指数等によって種々の分類がなされる（日本内科学会雑誌１０４巻７号：　１３７５－１３８２、臨床検査のガイドライン　ＪＳＬＭ２０１５：　１７５－１８０）。貧血は、赤血球の産生不足や赤血球の過剰な破壊、鉄欠乏等が主な原因の一つと考えられており、これらには例えば、慢性炎症などに伴う鉄利用障害や、骨髄機能不全など多様な病態が複雑に関与することが知られている（Ａｎｎ　Ｎ　Ｙ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．　２０１９　Ａｕｇｕｓｔ　；　１４５０（１）：　１５－３１．）。
　慢性炎症に伴う貧血においては、インターロイキン　６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　６、ＩＬ６）などの炎症性サイトカインの慢性的な上昇により、鉄代謝において主要な役割を担うｈｅｐｃｉｄｉｎの血液中濃度が上昇することによって鉄利用障害が引き起こされることで造血機能が低下することが知られている（Ｍｅｄ　Ｃｌｉｎ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ．　２０１７　Ｍａｒｃｈ　；　１０１（２）：　２８５－２９６．）。そのような慢性炎症の原因としては、例えば、自己免疫性疾患、感染症、炎症性腸疾患、心不全、慢性腎臓病、癌等の慢性疾患が挙げられる。慢性炎症に伴う貧血としては、例えば、関節リウマチもしくは全身性エリテマトーデスもしくは自己免疫性溶血性貧血等の自己免疫疾患に伴う貧血、感染症に伴う貧血、マクロファージ活性化症候群に伴う貧血、キャッスルマン病に伴う貧血、炎症性大腸炎等の炎症性腸疾患に伴う貧血、心不全に伴う貧血、慢性腎臓病に伴う貧血、及び癌性貧血等が挙げられる。癌性貧血には、例えば、多発性骨髄腫、急性白血病、慢性白血病、肺癌又は乳癌などの癌に伴う貧血が含まれる。
　骨髄機能不全に伴う貧血は、何らかの要因により赤血球産生能が著しく障害を受けることで貧血に至る。骨髄機能不全に伴う貧血としては、例えば、骨髄異形成症候群に伴う貧血、骨髄線維症に伴う貧血、慢性骨髄単球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ　ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＭＭＬ）に伴う貧血、化学療法による骨髄抑制に伴う貧血、再生不良性貧血、ダイヤモンドブラックファン貧血、ファンコニ貧血等が挙げられる。骨髄線維症とは、造血幹細胞に後天的にＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆなどの遺伝子変異が生じることで、異常な造血幹細胞由来のクローンが増殖し、慢性的な炎症の亢進および骨髄線維化が進行することで骨髄機能が低下する疾患であり、重度な貧血や脾臓腫大などを呈することが知られている（Ａｍ　Ｊ　Ｈｅｍａｔｏｌ．　２０２１；９６：１４５－１６２．）。
　本明細書において、核酸又は核酸分子とは、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドの総称である。
　「ヌクレオシド」とは、遺伝情報に重要な塩基部分と分子の物理化学的性質に重要な糖部分が結合した化学構造部分を意味する。
　「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖部分の３’位（３’位が修飾されている場合は２’位）の水酸基がリン酸基とエステルを形成している化合物である。
　「オリゴヌクレオチド」とは、２以上のヌクレオチドがその中の１つのヌクレオチドのリン酸基部分と別のヌクレオチドの糖部分の５’位の水酸基が結合した構造（リン酸ジエステル結合）から構成されるオリゴマーのことをいう。但し、３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）、及び/又は、５’末端のヌクレオチドの５’位は、水酸基であってもリン酸基であってもよく、それらが化学修飾された構造であってもよい。また、ヌクレオシド間のリン酸ジエステル結合は化学修飾されていてもよい。本明細書においては、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドとは同一の意味で用いている。
　核酸の塩基部分は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、チミン（Ｔ）であり、ＡとＵ又はＴ、ＧとＣは、それぞれ水素結合によりワトソン－クリック塩基対を形成し、塩基対を形成する関係にある塩基同士の関係を「相補的」という。それぞれの塩基部分は化学修飾される場合があるが、修飾された塩基であっても、通常は元の塩基と同じ塩基対形成能を示す場合もある。代表的な修飾塩基としては、５－メチルシトシン（５Ｃ）、５－メチルウラシル（５Ｕ）等が知られており、５ＵはＴと同一の構造である。本明細書に添付する配列表において、５ＣはＣとして、５ＵはＴ又はＵとして表示される。
　本明細書において、核酸の標記方法は、「塩基の記号（糖部分の記号）」として表示される場合がある。糖部分の記号については、以下の各種ヌクレオシドの記載箇所で説明される。
　本明細書において、オリゴヌクレオチドの「修飾パターン」とは、特に言及がない限り、塩基の配列とは無関係に、オリゴヌクレオチドを構成する各ヌクレオシドの糖部分の修飾様式の配置を意味する。また、特に言及された場合、更に各ヌクレオシド間の結合様式と組み合わせた修飾パターンを意味する。糖部分の構造やヌクレオシド間結合は、標的配列に依存せず、分子としての安定性や、その安定性に起因する結合性能に影響を与える要素であることから、ある標的配列に対して確認された修飾パターンによる作用効果が、別の標的配列に対して同じ修飾パターンを適用した場合にも同様の作用効果が示される蓋然性が高いとされている（例えば、Mol Ther. (2018) 26:708-717を参照）。
　本明細書において、「天然型のヌクレオシド」とは、２’－デオキシヌクレオシド又はリボヌクレオシドである。各塩基に対応する２’－デオキシヌクレオシド（「ＤＮＡ」ともいう。糖部分を表す記号は（Ｄ）であり、塩基部分の小文字標記で表す場合もある。）は以下の式で表される構造を有し、２’－デオキシアデノシンはＡ（Ｄ）またはａ、２’－デオキシグアノシンはＧ（Ｄ）またはｇ、２’－デオキシシチジンはＣ（Ｄ）またはｃ、チミジンはＴ（Ｄ）またはｔ、２’－デオキシ－５－メチルシチジンは５Ｃ（Ｄ）または５ｃ、２’－デオキシウリジンはＵ（Ｄ）またはｕ、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない２’－デオキシヌクレオシドはＮ（Ｄ）と表記する場合がある。
（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　各塩基に対応するリボヌクレオシド（「ＲＮＡ」ともいう。糖部分を表す記号は（Ｒ）であり、塩基部分の大文字標記で表す場合もある。）は以下の式で表される構造を有し、アデノシンはＡ（Ｒ）またはＡ、グアノシンはＧ（Ｒ）またはＧ、シチジンはＣ（Ｒ）またはＣ、ウリジンはＵ（Ｒ）またはＵ、と表記する場合もある。また、塩基を特定しないリボヌクレオシドはＮ（Ｒ）と表記する場合がある。
（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　本明細書において、「修飾ヌクレオシド」及び「修飾ヌクレオチド」とは、天然のヌクレオシドの塩基部分、糖部分又はリン酸ジエステル部分に少なくとも一つの化学修飾された構造を含むヌクレオシド又はヌクレオチドを意味する。
　本明細書において、「化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合」とは、天然のヌクレオシド間結合に採用されるリン酸ジエステル結合、又は化学修飾されたリン酸ジエステル結合を意味する。天然のヌクレオシド間結合は、下記式（P）で表されるリン酸ジエステル結合であり、本明細書における塩基配列の表示においては、ヌクレオシド間、あるいは、ヌクレオシドと、隣接する構造ユニット（例えばＧａｌＮＡｃユニット）、化学修飾構造（例えば、後述する「２」で表示される構造）、又は、化学リンカーもしくはオリゴヌクレオチドリンカー（例えば、後述する「Ｚ」で表示される構造）との間に文字および記号を挟まずに表示される。また、本明細書において、「化学修飾されたリン酸ジエステル結合」とは、リン酸ジエステル結合に含まれるリン原子が化学修飾された結合様式を意味する。化学修飾されたリン酸ジエステル結合の例としては、下記式（ＰＳ）で表されるホスホロチオエート結合、リン原子に窒素原子が付加した修飾結合であるホスホロアミデート結合、リン原子に置換可能なアルキル基が付加した修飾結合であるアルキルホスホネート結合（例えば、メチル基の場合は、メチルホスホネート結合となる）、リン酸基の非共有結合の酸素原子に置換可能なアルキル基が付加した修飾結合であるリン酸トリエステル結合が挙げられる。ホスホロチオエート結合が採用される場合、本明細書における塩基配列の表示においては、ヌクレオシド間、あるいは、ヌクレオシドと、その隣接する構造ユニット（例えばＧａｌＮＡｃユニット）、化学修飾構造（例えば、後述する「２」で表示される構造）、又は、化学リンカーもしくはオリゴヌクレオチドリンカー（例えば、後述する「Ｚ」で表示される構造）との間に「＾」が表示される。
（上記各式中、破線は結合手を示し、一方の結合手は５’側に隣接するヌクレオシドの３’-水酸基の酸素原子（３’位が修飾されたヌクレオシドでは２’位の酸素原子）、隣接する構造ユニット、又は、化学リンカーもしくはオリゴヌクレオチドリンカーとエステル結合することを表し、他方の結合手は３’側に隣接するヌクレオシドの５’-水酸基の酸素原子、構造ユニット、又は、化学リンカーもしくはオリゴヌクレオチドリンカーとエステル結合することを表す。）
　本明細書において、「糖修飾ヌクレオシド」とは、ヌクレオシドの糖部分が修飾されているヌクレオシドをいう。糖修飾ヌクレオシドには、本発明の属する技術分野で知られている糖修飾の全ての様式を含む。糖修飾ヌクレオシドの例としては、２’－修飾ヌクレオシド、３’－修飾ヌクレオシド、４’－チオ修飾ヌクレオシド、４’－チオ－２’－修飾ヌクレオシド及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドなどが挙げられる。好ましい糖修飾としては、２’－Ｏ－アルキル化（メチル化、エチル化、プロピル化、イソプロピル化、ブチル化など）、２’－Ｏ－アルコキシアルキル化（メトキシエチル化、メトキシプロピル化、メトキシブチル化など）、２’－ハロゲン化（クロロ化、フルオロ化など）、３’－Ｏ－アルキル化（メチル化、エチル化、プロピル化、イソプロピル化、ブチル化など）、３’－Ｏ－アルコキシアルキル化（メトキエチルシ化、メトキシプロピル化、メトキシブチル化など）、３’－ハロゲン化（クロロ化、フルオロ化など）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化（アルキレン化架橋等）などが例示される。
　本明細書において、「２’－修飾ヌクレオシド」とは、ヌクレオシドに含まれるリボフラノースの２’位が化学修飾されたヌクレオシドをいう。そのような修飾の例としては、例えば、２’－Ｏ－アルキル化（メチル化、エチル化、プロピル化、イソプロピル化、ブチル化など）ヌクレオシド、２’－Ｏ－アルコキシアルキル化（メトキシエチル化、メトキシプロピル化、メトキシブチルなど）ヌクレオシド、２’－ハロゲン化（クロロ化、フルオロ化など）ヌクレオシド、２’－アリル化ヌクレオシド、２’－アミノ化ヌクレオシド、２’－アジド化ヌクレオシド、２’－Ｏ－アリル化ヌクレオシド、２’－ＯＣＦ３ヌクレオシド、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３ヌクレオシド、２’－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）ヌクレオシド、又は２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）ヌクレオシド（各ＲｍとＲｎは個別にＨ、アミノ保護基、又は置換あるいは非置換Ｃ１－Ｃ１０アルキルである）等を例示することができる。好ましい２’－修飾ヌクレオシドは、２’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシド、２’－Ｏ－アルコキシアルキル化ヌクレオシド、又は２’－ハロゲン化ヌクレオシドである。
　糖修飾ヌクレオシドのうち、２’－Ｏ－アルキル化修飾の例としては、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオシド（「２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ」又は「２’－Ｏ－メチルＲＮＡ」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（Ｍ）である。）が挙げられる。各塩基に対応した２’－Ｏ－メチルヌクレオシドは、以下の式で表される構造を有し、２’－Ｏ－メチルアデノシンをＡ（Ｍ）、２’－Ｏ－メチルグアノシンをＧ（Ｍ）、２’－Ｏ－メチルシチジンをＣ（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル－５－メチルシチジンを５Ｃ（Ｍ）、２’－Ｏ－メチルウリジンをＵ（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジンをＴ（Ｍ）、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない２’－Ｏ－メチルヌクレオシドは、Ｎ（Ｍ）と表記する場合がある。
（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　また、２’－Ｏ－アルコキシアルキル化修飾の例としては、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシド（「２’－ＭＯＥ　ＲＮＡ」、「２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ」又は「２’－メトキシエトキシＲＮＡ」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（ｍ）である。）が挙げられる。各塩基に対応した２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドは、以下の式で表される構造を有し、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシンをＡ（ｍ） 、２’－Ｏ－メトキシエチルグアノシンをＧ（ｍ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジンをＣ（ｍ）（塩基の構造は５Ｃだが、便宜上Ｃ（ｍ）と表示する。２’－Ｏ－メトキシエチルシチジンに置き換えて用いることもできる。）、２’－Ｏ－メトキシエチルウリジンをＵ（ｍ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジンをＴ（ｍ）、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドはＮ（ｍ）と表記する場合がある。
（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　また、２’－ハロゲン化修飾の例としては、例えば、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド（「２’－Ｆ　ＲＮＡ」又は「２’－デオキシ－２’－フルオロＲＮＡ」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（Ｆ）である。）が挙げられる。各塩基に対応した２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシドは、以下の式で表される構造を有し、２’－デオキシ－２’－フルオロアデノシンをＡ（Ｆ）、２’－デオキシ－２’－フルオログアノシンをＧ（Ｆ）、２’－デオキシ－２’－フルオロシチジンをＣ（Ｆ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－メチルシチジンを５ｍＣ（Ｆ）、２’－デオキシ―２’－フルオロウリジンをＵ（Ｆ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－メチルウリジンをＴ（Ｆ）、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシドはＮ（Ｆ）と表記する場合がある。
（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　本明細書において、「３’－修飾ヌクレオシド」とは、ヌクレオシドに含まれるリボフラノースの３’位が化学修飾されたヌクレオシドをいう。３’－修飾ヌクレオシドにおける２’位の水酸基は修飾されていてもよい。そのような修飾の例としては、例えば、３’－Ｏ－アルキル化（メチル化、エチル化、プロピル化、イソプロピル化、ブチル化など）ヌクレオシド、３’－Ｏ－アルコキシアルキル化（メトキシエチル化、メトキシプロピル化、メトキシブチル化など）ヌクレオシド、３’－ハロゲン化（クロロ化、フルオロ化など）ヌクレオシド、３’－アリル化ヌクレオシド、３’－アミノ化ヌクレオシド、３’－アジド化ヌクレオシド、３’－Ｏ－アリル化ヌクレオシド、３’－ＯＣＦ３ヌクレオシド、３’－Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３ヌクレオシド、３’－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）ヌクレオシド、又は３’－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）ヌクレオシド（各ＲｍとＲｎは個別にＨ、アミノ保護基、又は置換あるいは非置換Ｃ１－Ｃ１０アルキルである）等を例示することができる。好ましい３’－修飾ヌクレオシドは、３’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシド、３’－Ｏ－アルコキシアルキル化ヌクレオシド、又は３’－ハロゲン化ヌクレオシドである。等を例示することができる。
　３’－修飾ヌクレオシドのうち、３’－Ｏ－アルキル化修飾の例としては、例えば、３’－Ｏ－メチルヌクレオシド（「３’－ＯＭｅ　ＲＮＡ」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（３Ｍ）である。）が挙げられる。各塩基に対応した３’－Ｏ－メチルヌクレオシドは、以下の式で表される構造を有し、３’－Ｏ－メチルアデノシンをＡ（３Ｍ） 、３’－Ｏ－メチルグアノシンをＧ（３Ｍ）、３’－Ｏ－メチルシチジンをＣ（３Ｍ）、３’－Ｏ－メチル－５－メチルシチジンを５ｍＣ（３Ｍ）、３’－Ｏ－メチルウリジンをＵ（３Ｍ）、３’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジンをＴ（３Ｍ）、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない３’－Ｏ－メチルヌクレオシドはＮ（３Ｍ）と表記する場合がある。
（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　また、３’－Ｏ－アルコキシアルキル化修飾の例としては、例えば、３’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシド（「３’－ＭＯＥ　ＲＮＡ」、「３’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ」又は「３’－メトキシエトキシＲＮＡ」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（３ｍ）である。）が挙げられる。各塩基に対応した３’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドは、各塩基に対応した３’－Ｏ－メチルヌクレオシドの上記構造図において、３’位の酸素原子に結合したメチル基に代わってメトキシエチル基が結合した構造を有する。各塩基に対応した３’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドは、３’－Ｏ－メトキシエチルアデノシンをＡ（３ｍ） 、３’－Ｏ－メトキシエチルグアノシンをＧ（３ｍ）、３’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジンをＣ（３ｍ）（塩基の構造は５Ｃだが、便宜上Ｃ（３ｍ）と表示する。３’－Ｏ－メトキシエチルシチジンに置き換えて用いることもできる。）、３’－Ｏ－メトキシエチルウリジンをＵ（３ｍ）、３’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジンをＴ（３ｍ）、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない３’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドはＮ（３ｍ）と表記する場合がある。
　また、３’－ハロゲン化修飾の例としては、例えば、３’－デオキシ－３’－フルオロヌクレオシド（「３’－Ｆ　ＲＮＡ」又は「３’－デオキシ－３’－フルオロＲＮＡ」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（３Ｆ）である。）が挙げられる。各塩基に対応した３’－デオキシ－３’－フルオロヌクレオシドは、各塩基に対応した３’－Ｏ－メチルヌクレオシドの上記構造図において、３’位の炭素原子に結合したメトキシ基に代わってフッ素原子が結合した構造を有する。各塩基に対応した３’－デオキシ－３’－フルオロヌクレオシドは、３’－デオキシ－３’－フルオロアデノシンをＡ（３Ｆ） 、３’－デオキシ－３’－フルオログアノシンをＧ（３Ｆ）、３’－デオキシ－３’－フルオロシチジンをＣ（３Ｆ）、３’－デオキシ－３’－フルオロ－５－メチルシチジンを５ｍＣ（３Ｆ）、３’－デオキシ－３’－フルオロウリジンをＵ（３Ｆ）、３’－デオキシ－３’－フルオロ－５－メチルウリジンをＴ（３Ｆ）と表すこともある。また、塩基を特定しない３’－デオキシ－３’－フルオロヌクレオシドはＮ（３Ｆ）と表記する場合がある。
　本明細書において、「４’－チオ修飾ヌクレオシド」とは、ヌクレオシドに含まれるリボフラノースの４’位の酸素原子が硫黄原子で置換されたヌクレオシドをいう。４’－チオ修飾ヌクレオシドの例としては、４’－酸素原子が硫黄原子で置換されたβ－Ｄ－リボヌクレオシドを挙げることができる（Ｈｏｓｈｉｋａ，Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．５７９，ｐ．３１１５－３１１８，（２００５）；　Ｄａｎｄｅ，　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９，　ｐ．１６２４－１６３４（２００６）；Ｈｏｓｈｉｋａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．　８，　ｐ．２１３３－２１３８，（２００７））。
　本明細書において、「４’－チオ－２’－修飾ヌクレオシド」とは、ヌクレオシドに含まれるリボフラノースの２’位が化学修飾され、かつ、リボフラノースの４’位の酸素原子が硫黄原子で置換されたヌクレオシドをいう。４’－チオ－２’－修飾ヌクレオシドの例としては、２’－Ｈ、又は、２’－Ｏ－メチルを保持する４’－チオ－２’－修飾ヌクレオシドを挙げることができる（Ｍａｔｓｕｇａｍｉ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　３６，　１８０５　（２００８））。
　糖修飾ヌクレオシドのうち、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾の例としては、例えば、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋ヌクレオシド（「ＥＮＡ」又は「ＥＮＡユニット」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（Ｅ）である。）（Ｍｏｒｉｔａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　Ｌｅｔｔ．，　１２，　ｐ．７３（２００２）．；　Ｍｏｒｉｔａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．，　１１，ｐ．２２１１（２００３）．）が挙げられる。各塩基に対応した２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋ヌクレオシドは、以下の式で表される構造を有し、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋アデノシンをＡ（Ｅ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋グアノシンをＧ（Ｅ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋－５－メチルシチジンをＣ（Ｅ）（塩基の構造は５Ｃだが、便宜上Ｃ（Ｅ）と表示する。２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋シチジンに置き換えて用いることもできる。）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋ウリジンをＵ（Ｅ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋－５－メチルウリジンをＴ（Ｅ）、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋ヌクレオシドはＮ（Ｅ）と表記する場合がある。
（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　また、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾の別の例としては、例えば、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋ヌクレオシド（「ＬＮＡ」又は「ＬＮＡユニット」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（Ｌ）である。）（Ｏｂｉｋａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，　３８，　ｐ．８７３５－　（１９９７）．；　Ｏｂｉｋａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，　３９，　ｐ．５４０１－　（１９９８）．；　Ａ．　Ａ．　Ｋｏｓｈｋｉｎ，　Ａ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，　５４，　ｐ．３６０７（１９９８）．；　Ｏｂｉｋａ，　Ｓ．　Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．，　９，ｐ．１００１（２００１）．）が挙げられる。各塩基に対応した２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋ヌクレオシドは、以下の式で表される構造を有し、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋アデノシンをＡ（Ｌ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋グアノシンをＧ（Ｌ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋－５－メチルシチジンをＣ（Ｌ）（塩基の構造は５Ｃだが、便宜上Ｃ（Ｌ）と表示する。２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋シチジンに置き換えて用いることもできる。）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋ウリジンをＵ（Ｌ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋－５－メチルウリジンをＴ（Ｌ）と表すこともある。また、塩基を特定しない２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋ヌクレオシドはＮ（Ｌ）と表記する場合がある。
　（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　本発明のオリゴヌクレオチド又はその塩は、標的配列のヌクレオチド配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖領域（単にアンチセンス鎖ということもある）、及び該アンチセンス鎖領域の相補領域におけるヌクレオチド配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖領域（単にセンス鎖ということもある）を有する。センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域は、相補領域のヌクレオチド配列において２本鎖構造を形成するが、それぞれが独立したオリゴヌクレオチドとして２本鎖オリゴヌクレオチドを形成していてもよく、一方の５’末端のヌクレオチドの５’位と他方の３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）とが連結されて１本鎖オリゴヌクレオチドを形成していてもよい。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドは２分子のオリゴヌクレオチドでもよく、１分子のオリゴヌクレオチドでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドが１分子のオリゴヌクレオチドである場合、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の連結様式としては、本発明のオリゴヌクレオチドがＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り特に限定されないが、例えば、一方の５’末端のヌクレオチドの５’位と他方の３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）との、所望の化学リンカー又はオリゴヌクレオチドリンカーによる連結が挙げられる。そのようなリンカーとしては、例えば、ＷＯ２０１２／０７４０３８に記載のリンカーが挙げられ、好ましくは、下記式（Ｚ）で示されるリンカーが挙げられる。下記式（Ｚ）で示されるリンカーはＷＯ２０１２／０７４０３８にしたがって適宜調整できる。
（上記式中、破線は結合手を示し、フェニル基に結合している酸素原子は、隣接するアンチセンス鎖領域の５’末端のヌクレオチドの５’－リン酸基とリン酸ジエステル結合することを表し、他方の末端のメチレン基は隣接するセンス鎖領域の３’末端のヌクレオチドの３’－リン酸基（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位のリン酸基）とリン酸ジエステル結合することを表し、形成される各リン酸ジエステル結合は、ホスホロチオエート結合などの化学修飾されたリン酸ジエステル結合であってもよい。）
　本発明のオリゴヌクレオチドにおける、３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）及び／又は５’末端のヌクレオチドの５’位は、水酸基又はリン酸基であってもよく、それらが化学修飾された構造であってもよい。化学修飾された構造としては、例えば、下記式（２）に示す構造が挙げられる。
（上記式中、破線は結合手を示し、一方の結合手は、隣接するヌクレオチドと結合することを表し、５’末端のヌクレオチドと結合する場合は５’-リン酸基と、３’末端のヌクレオチドと結合する場合は３’－リン酸基（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位のリン酸基）と、リン酸ジエステル結合を形成することを表し、他方の結合手は水素原子と結合して水酸基となることを表し、形成されるリン酸ジエステル結合は、ホスホロチオエート結合などの化学修飾されたリン酸ジエステル結合であってもよい。）
　本明細書における、「実質的に同一のヌクレオチド配列」とは、対象となるヌクレオチド配列に対して、全て同一の塩基からなるヌクレオチド配列に加え、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列、１又は数個の同一ではない塩基を含むが、オリゴヌクレオチドとして所望の機能を発揮することができるヌクレオチド配列も含む。ここで、「同一の塩基」とは、元の塩基と完全に同一の塩基に加えて、元の塩基と同等以上の塩基対形成能を有する塩基が含まれる。そのような塩基としては、例えば、化学修飾塩基であって、元の塩基と同等以上の塩基対形成能を有する塩基（例えば、Cと5C、UとT（5U））は、それぞれ同一の塩基とみなす。配列の同一性について、対象となるヌクレオチド配列に対して、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性、或いは、３塩基、２塩基又は１塩基のミスマッチを有する配列のことをいう。ヌクレオチド配列の同一性はＢＬＡＳＴ（登録商標）等の公知の遺伝子解析ソフトウエアを用いて計算することが出来る。
　本明細書における、「実質的に相補的なヌクレオチド配列」とは、対象となるヌクレオチド配列に対して、全てが相補的なヌクレオチドからなるヌクレオチド配列に加え、１又は数個（例えば、５個、４個、３個、又は２個）のヌクレオチドが相補的なヌクレオチドではないが、オリゴヌクレオチド同士が塩基対を形成するヌクレオチド配列も含む。また、本明細書において、「相補的な塩基」とは、対象となる塩基に対してワトソン－クリック塩基対を形成できる塩基をいい、未修飾の塩基であってもよく、化学修飾された塩基であってもよい。例えば、５－メチルウラシルはアデニンと、５－メチルシトシンはグアニンと、それぞれ互いに相補的な塩基である。
　本明細書におけるオリゴヌクレオチドの「２本鎖構造」とは、互いに実質的に相補的なヌクレオチド配列同士がワトソン－クリック塩基対を形成して２本鎖の構造を有しているものをいう。２本鎖構造を形成するヌクレオチド配列は、２分子の異なるオリゴヌクレオチド間における実質的に相補的なヌクレオチド配列同士であってもよく、１本鎖オリゴヌクレオチドの内部における実質的に相補的な配列同士であってもよい。
　本明細書において、「構造ユニット」とは、オリゴヌクレオチドに所望の機能を付与する化学構造単位をいう。オリゴヌクレオチドに付与する所望の機能としては、例えば、オリゴヌクレオチドを標的組織もしくは標的細胞（標的組織等ともいう）に輸送する機能、オリゴヌクレオチドの体内動態を改善する機能、等が挙げられる。構造ユニットは、公知の方法でオリゴヌクレオチドに結合させることができるが、例えば、構造ユニット中にアミダイト構造を有することで、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）又は５’末端のヌクレオチドの５’位に結合させることができる。また、構造ユニット中に、リガンドなどの標的組織等への輸送を促進する構造を有することで、標的組織等に対する輸送能をオリゴヌクレオチドに付与することができるが、そのような構造としては、肝細胞に輸送するためのＧａｌＮＡｃユニット、肝臓や筋組織に輸送するための脂肪酸ユニット等が挙げられる。本明細書において、このような標的組織等に対する輸送能を付与するための構造ユニットを、特に「輸送用ユニット」ということがある。
＜２．ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチド＞
　本明細書において、「ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチド」とは、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域に含まれる実質的に相補的なヌクレオチド同士がワトソン－クリック塩基対を形成し、２本鎖構造を形成する相補領域を含み、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するオリゴヌクレオチドである。標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り、ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドに含まれる相補領域の全ての塩基がワトソン－クリック塩基対を形成していなくてもよい。本明細書において、ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、「ｓｉＲＮＡ」と記載される場合もある。
　本明細書において、「標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列」とは、標的配列と同一のヌクレオチド配列をいうが、完全に同一の配列に加えて、ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドが標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて、実質的に同一のヌクレオチド配列も含む。
　本明細書において、「標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列」とは、標的配列と相補的なヌクレオチド配列をいうが、完全に相補的な配列に加え、ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドが標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて、実質的に相補的なヌクレオチド配列も含む。
　本明細書において、標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するオリゴヌクレオチドを標的遺伝子に対するＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドという。
　標的遺伝子に対するＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて特に制限されないが、例えば、コンピュータソフトウエア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）：ＧＥＮＥＴＹＸ　ＣＯＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等。）を用いて標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有すると予想された配列に基づいて決定することができる。さらに選択された配列に基づいて作製したＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドのＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を確認することによって決定することもできる。
　本明細書中において遺伝子発現抑制作用とは、遺伝子の発現を完全に抑制する作用の他に、コントロールに比して遺伝子の発現を減少させる作用も含まれ、遺伝子抑制（gene silencing）も遺伝子発現抑制作用に含まれる。また、本明細書においては、遺伝子発現抑制作用と遺伝子発現抑制活性を同じ意味に用いている。
　ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用は、当業者が通常行う方法で確認することができるが、例えば、標的遺伝子が発現している細胞に標的遺伝子に対するＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを投与して一定時間経過後の標的遺伝子の翻訳産物であるタンパク質をウエスタンブロット解析によって定量しタンパク質の発現量をコントロールと比較することによって確認することが出来る。また、リアルタイムＰＣＲの手法により標的遺伝子に対するＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチド投与後の標的遺伝子の発現量をリアルタイムで測定することによっても確認することができる。
　本明細書において、「標的配列」とは、標的遺伝子であるトランスフェリン受容体２をコードする遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列のうち、いずれの部分でもよい１８ヌクレオチド以上の配列であって、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドが標的とする配列を意味する。また、標的配列にＳＮＰｓ等が知られている場合、それらの変異を有する配列も標的配列に含まれる。本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドにおいては、アンチセンス鎖領域の少なくとも一部に標的配列と実質的に相補的な配列（以下、「標的対応配列」）を含む。
　本明細書において、「相補領域」とは、ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドに含まれるセンス鎖領域とアンチセンス鎖領域のヌクレオチド配列が、互いに実質的に相補的である領域を意味する。センス鎖領域とアンチセンス鎖領域は、その相補領域において、必ずしも完全に相補的である必要はないが、少なくとも相補領域における末端の塩基同士は相補的である。本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドにおいて、アンチセンス鎖領域の相補領域は、標的対応配列を包含するが、相補領域の５’末端及び／又は３’末端がさらに延長された領域においてセンス鎖領域との相補性を維持していてもよい。
　本発明におけるＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを構成するアンチセンス鎖領域における標的対応配列の鎖長は、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り特に限定されないが、１８ヌクレオチドから、標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までのいかなる長さでもよい。例えば、標的対応配列の鎖長は１８～２９ヌクレオチドとすることができ、好ましくは１８～２４ヌクレオチド、１８～２３ヌクレオチド、又は１８～２２ヌクレオチドであり、より好ましくは１８～２１ヌクレオチドであり、さらに好ましくは１８又は１９ヌクレオチドである。
　本発明におけるＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを構成するセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域における各相補領域の鎖長は、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り特に限定されず、いかなる長さでもよい。例えば、相補領域の鎖長は１９～２９ヌクレオチドとすることができ、好ましくは１９～２４ヌクレオチド、１９～２３ヌクレオチド、又は１９～２２ヌクレオチドであり、より好ましくは１９～２１ヌクレオチドであり、さらに好ましくは１９ヌクレオチドである。
　本発明におけるＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを構成するセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の鎖長は、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り特に限定されず、いかなる長さでもよい。センス鎖領域の鎖長としては、例えば、１９～３９ヌクレオチドとすることができ、好ましくは１９～２９ヌクレオチドであり、より好ましくは１９～２４ヌクレオチド、１９～２３ヌクレオチド、又は１９～２２ヌクレオチドであり、さらに好ましくは１９～２１ヌクレオチドであり、最も好ましくは１９ヌクレオチドである。アンチセンス鎖領域の鎖長としては、例えば、１９～３９ヌクレオチドとすることができ、好ましくは１９～２９ヌクレオチドであり、より好ましくは１９～２４ヌクレオチド、１９～２３ヌクレオチド、又は１９～２２ヌクレオチドであり、さらに好ましくは２１～２３ヌクレオチドであり、最も好ましくは２１ヌクレオチドである。
　本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドにおいて、センス鎖領域とアンチセンス鎖領域が異なるオリゴヌクレオチド分子に存在する場合、その全体が２本鎖構造である必要はなく、５’及び／又は３’末端のヌクレオシドが一部突出した、又は、２本鎖構造を形成しないオーバーハング構造を有していてもよい。そのようなオーバーハング構造は、例えば、１～５個のヌクレオシド、好ましくは１～３個のヌクレオシド、さらに好ましくは２個のヌクレオシドからなる構造が挙げられる。また、オーバーハング構造は、２本鎖オリゴヌクレオチドの全ての末端に存在していてもよく、その一部のみであってもよい。本明細書において、オーバーハング構造の表示として、センス鎖領域の５’末端をＳＯ５、３’末端をＳＯ３、アンチセンス鎖領域の５’末端をＡＯ５、３’末端をＡＯ３、とそれぞれ表示する場合がある。オーバーハング構造の塩基配列は特に限定されないが、オリゴＴ又はオリゴＵを採用することができる。
　ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、下記の（i）～（iv）から選択される少なくともいずれか一つの性質を有する。
（i）標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ii）ＲＮＡ分解酵素に安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（iii）エキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（iv）ＲＮＡ分解酵素、エキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
　ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドの一例としては、標的遺伝子に対するアンチセンス鎖領域、及び該アンチセンス鎖領域に実質的に相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖領域を有する２本鎖オリゴヌクレオチドを由来とし、このアンチセンス鎖領域の５’末端のヌクレオチドの５’位及びセンス鎖領域の３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）が、各々において化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル構造を形成したリンカーによって結合されていてもよい。このようなオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド３’－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－［リンカー］－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－５’－オリゴヌクレオチド、の構造を形成している［ここで、『オリゴヌクレオチド３’』は、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）に水酸基上の水素原子を持たない構造を表し、『５’－オリゴヌクレオチド』は、オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドの５’位に水酸基上の水素原子を持たない構造を示す。］オリゴヌクレオチドを挙げることができる。このようなリンカーは、例えばＷＯ２０１２／０７４０３８等に記載されており、これら文献の記載を参考にして合成することができる。
　ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシドは、天然型ヌクレオシドであってもよく、糖修飾ヌクレオシドを採用してもよい。また、ヌクレオシド間結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合であり、例えば、リン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合を適宜選択することができる。
　本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することができる。また、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、細胞に対する毒性が小さく、安全性が高い医薬品に適用し得る。また、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することで、鉄代謝において中心的な役割を担っているｈｅｐｃｉｄｉｎの産生を抑制し得る。また、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することで、血漿中鉄濃度及び／又はＨＧＢ値を上昇し得る。作用機序は特に限定されないが、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現及び／又はｈｅｐｃｉｄｉｎの産生を抑制することにより治療又は予防可能な疾患の治療又は予防に用いることができる。そのような疾患としては、例えば、貧血が挙げられる。作用機序は特に限定されないが、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、例えば、ＨＧＢ値を上昇させることで貧血を治療又は予防し得る。また、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、血液細胞輸血が必要な貧血患者に対して、血液細胞輸血の頻度及び／又は輸血量を軽減し得る。例えば、貧血患者に対して一定期間（例えば、１日、１週間、２週間、４週間、８週間、１２週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月又１年）における血液細胞輸血の頻度及び／又は輸血量を約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％軽減し得る。
　本発明は、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する貧血の治療又は予防に用いる医薬組成物、当該オリゴヌクレオチドの有効量を投与することを含む貧血を治療又は予防する方法、貧血の治療又は予防に使用するための当該オリゴヌクレオチド、貧血の治療又は予防用医薬組成物の製造における本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドの使用、等の医薬用途発明を提供する。本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドが治療又は予防し得る貧血には例えば、慢性炎症に伴う貧血（ａｎｅｍｉａ　ｏｆ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＣＤ）、骨髄機能不全に伴う貧血、鉄欠乏性貧血、鉄剤不応答性貧血（ｉｒｏｎ　ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　ｉｒｏｎ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ａｎｅｍｉａ、ＩＲＩＤＡ）、赤血球造血刺激因子製剤（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ、ＥＳＡ）抵抗性の貧血、化学療法によって誘導される貧血、再生不良性貧血、ダイヤモンドブラックファン貧血、及び、βサラセミアもしくは鎌状赤血球症等の遺伝性ヘモグロビン異常症等が含まれる。慢性炎症に伴う貧血には、例えば、関節リウマチもしくは全身性エリテマトーデスもしくは自己免疫性溶血性貧血等の自己免疫疾患に伴う貧血、感染症に伴う貧血、炎症性大腸炎等の炎症性腸疾患に伴う貧血、心不全に伴う貧血、慢性腎臓病に伴う貧血、癌性貧血、マクロファージ活性化症候群に伴う貧血及びキャッスルマン病に伴う貧血等が含まれる。慢性腎臓病に伴う貧血には、例えば、糖尿病を伴う腎臓病、高血圧を伴う腎臓病、ネフローゼ症候群（例えば、フィンランド型先天性ネフローゼ症候群、びまん性メサンギウム硬化症、微小変化型ネフローゼ症候群、巣状分節性糸球体硬化症、膜性腎症、ギャロウェイ・モワト（Ｇａｌｌｏｗａｙ－Ｍｏｗａｔ）症候群、などが挙げられる）、慢性糸球体腎炎を伴う腎臓病（例えば、ＩｇＡ腎症、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、紫斑病性腎炎、抗糸球体基底膜腎炎（グッドパスチャー（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ）症候群）、アルポート症候群、エプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）症候群、ループス腎炎、顕微鏡的多発血管炎、非典型溶血性尿毒症症候群、ネイル・パテラ（Ｎａｉｌ－Ｐａｔｅｌｌａ）症候群（爪膝蓋症候群）、フィブロネクチン腎症、リポタンパク糸球体症、などが挙げられる）、慢性尿細管間質性腎炎を伴う腎臓病、慢性腎盂腎炎を伴う腎臓病、アミロイド沈着を伴う腎臓病、常染色体優性尿細管間質性腎臓病、ネフロン癆を伴う腎臓病、腎奇形を伴う腎臓病（例えば、多発性嚢胞腎などが挙げられる）、等の慢性腎臓病に伴う貧血が含まれる。癌性貧血には、例えば、多発性骨髄腫、急性白血病、慢性白血病、肺癌又は乳癌などの癌に伴う貧血が含まれる。骨髄機能不全に伴う貧血には、例えば、骨髄線維症に伴う貧血、骨髄異形成症候群に伴う貧血、慢性骨髄単球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ　ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＭＭＬ）に伴う貧血、化学療法による骨髄抑制に伴う貧血、再生不良性貧血、ダイヤモンドブラックファン貧血、ファンコニ貧血等が含まれる。
　本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、好ましくは、慢性炎症に伴う貧血、骨髄機能不全に伴う貧血の治療又は予防に用いられ得、より好ましくは、関節リウマチもしくは全身性エリテマトーデスもしくは自己免疫性溶血性貧血等の自己免疫疾患に伴う貧血、感染症に伴う貧血、炎症性大腸炎等の炎症性腸疾患に伴う貧血、心不全に伴う貧血、慢性腎臓病に伴う貧血、癌性貧血、キャッスルマン病に伴う貧血、骨髄線維症に伴う貧血、骨髄異形成症候群に伴う貧血、慢性骨髄単球性白血病に伴う貧血、及び化学療法による骨髄抑制に伴う貧血の治療又は予防に用いられ得る。
　本明細書において、「併用」とは、２以上の異なる薬剤を、同時、別個又は順次に投与することをいう。本発明は、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを他の１又は２以上の薬剤と併用することを含む、貧血の治療又は予防方法を提供する。本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、本発明の効果を奏する限り他の１又は２以上の薬剤と併用してもよい。好ましくは、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを、貧血症状に対する作用機序が異なる他の薬剤と併用することでより大きな治療効果を提供し得る。例えば、骨髄異形成症候群（Ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ，　ＭＤＳ）に対しては、赤血球の増殖を促すことで貧血を治療する作用機序を持つＥＳＡ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）、赤血球の分化を促すことで貧血を治療する作用機序を持つルスパテルセプト（Ｌｕｓｐａｔｅｒｃｅｐｔ）などの薬剤、ＤＮＡメチル化を抑制し異常な細胞を殺傷する作用機序を持つアザシチジン（Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）などの薬剤が処方される場合があるが、これらの薬剤とＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとは作用機序が異なる。従って、これらの薬剤とＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとの併用は、ＭＤＳに対して、単剤よりも大きな治療効果を提供し得る。また、慢性腎臓病に伴う貧血に対しては、赤血球の増殖を促すことで貧血を治療する作用機序を持つＥＳＡやＨＩＦＰＨＤ（ｈｙｐｏｘｉａ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｐｒｏｌｙｌ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）阻害薬などの薬剤が処方される場合があるが、これらの薬剤とＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとは作用機序が異なる。従って、これらの薬剤とＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとの併用は、慢性腎臓病に伴う貧血に対して、単剤よりも大きな治療効果を提供し得る。また、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂは骨髄線維症に対して、主にｓｐｌｅｎｏｍｅｇａｌｙなどの症状に対して治療効果を示すことが知られている（Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　２０１２；　３６６：７９９－８０７）。しかし、貧血症状に対する効果は限局的か無効、あるいは貧血を悪化させることが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　＆　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　２０１３，　６：７９）。ルキソリチニブ（Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ）による貧血が悪化する機序としては、ＪＡＫ２を阻害することによって赤血球細胞の増殖に必要とされるＥＰＯシグナルが抑制されてしまうことにあると考えられている。しかしながら、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂは骨髄線維症において、貧血を除く症状に対して一定の治療効果を挙げていることから、ＲｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂとＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとの併用は、骨髄線維症における貧血に対して有用な治療効果を提供し得る。同様に、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ以外の他のＪＡＫ２阻害薬との併用によっても骨髄線維症における貧血に対して有用な治療効果を提供し得る。他のＪＡＫ２阻害薬としては、例えば、フェドラチニブ（Ｆｅｄｒａｔｉｎｉｂ）、パクリチニブ（Ｐａｃｒｉｔｉｎｉｂ）及びモメロチニブ（Ｍｏｍｅｌｏｔｉｎｉｂ）などが挙げられる。
　本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを他の薬剤と併用して用いる場合、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを投与する順序は本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、併用する他の薬剤と同時に投与されてもよく、併用する他の薬剤の投与の前又は後に投与されてもよい。本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドと併用し得る薬剤としては、例えば、他の貧血治療薬又は貧血の原因となる疾患の治療薬が挙げられる。他の貧血治療薬としては、例えば、ＥＳＡ、ＨＩＦＰＨＤ（ｈｙｐｏｘｉａ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｐｒｏｌｙｌ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）阻害薬、経口鉄剤、静注鉄剤、ダナゾール（Ｄａｎａｚｏｌ）、Ｌｕｓｐａｔｅｒｃｅｐｔ、などが挙げられる。ＥＳＡとしては、例えば、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンベータペゴル、エポエチンカッパ、ダルベポエチンアルファ等が挙げられる。ＨＩＦＰＨＤ阻害薬としては、例えば、ロキサデュスタット、バダデュスタット、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット等が挙げられる。経口鉄剤としては、例えば、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、フマル酸第一鉄、溶性ピロリン酸第二鉄、乾燥硫酸鉄等が挙げられる。静注鉄剤としては、例えば、カルボキシマルトース第二鉄、含糖酸化鉄等が挙げられる。また、貧血の原因となる疾患の治療薬としては、例えば、骨髄線維症治療薬、骨髄異形成症候群治療薬、慢性腎臓病治療薬、抗がん剤等が挙げられる。骨髄線維症治療薬としては、例えば、ＪＡＫ２阻害薬が挙げられる。ＪＡＫ２阻害薬としては、例えば、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ、Ｆｅｄｒａｔｉｎｉｂ、Ｐａｃｒｉｔｉｎｉｂ、及びＭｏｍｅｌｏｔｉｎｉｂ等が挙げられ、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂとの併用が好ましい。骨髄異形成症候群治療薬としては、例えば、Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ、レナリドミド（Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）等が挙げられ、Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ又はレナリドミドとの併用が好ましい。慢性腎臓病治療薬としては、例えば、ＳＧＬＴ２（ｓｏｄｉｕｍ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｃｏ―ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ２）阻害薬、レニン・アンジオテンシン系阻害薬（例えば、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ＡＲＢ）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬など）、カルシウム拮抗薬、利尿薬、糖尿病治療薬、高脂血症治療薬、ステロイド、免疫抑制薬等が挙げられる。抗がん剤には化学療法薬が含まれ、化学療法薬としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、アムルビシン等が挙げられる。
　また、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは鉄過剰症の治療薬と併用してもよい。貧血に対する治療として血液細胞輸血を行う場合、慢性的な血液細胞輸血に伴い鉄過剰症を発症し得る。鉄過剰症とは、肝臓や心臓などの組織において、輸血した血液細胞由来の鉄が蓄積することで生じる病態であり、肝不全、心不全、糖尿病、関節痛、甲状腺機能低下症、下垂体機能低下、又は性機能不全等を呈し得る。したがって、貧血に対する治療において鉄過剰症の治療又は予防のために鉄過剰症治療薬を用いる場合があり、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドと好適に併用し得る。鉄過剰症の治療薬としては、例えば、鉄キレート剤等が挙げられ、鉄キレート剤としてはデフェラシロクス（Ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ）、デフェロキサミン（Ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、デフェリプロン（Ｄｅｆｅｒｉｐｒｏｎｅ）等が挙げられる。
＜３．Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチド＞
　本発明は、センス鎖領域が以下の式（Ｉ）に示すオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖領域が以下の式（ＩＩ）に示すオリゴヌクレオチドからなり、さらに以下の（ａ）乃至（ｇ）に示される特徴を有するＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチド（以下、「Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチド」という）又はその薬学上許容される塩を提供する：
センス鎖領域：５’　ＳＯ５－Ｓａ－Ｓ１９－Ｓ１８－Ｓ１７－Ｓ１６－Ｓ１５－Ｓ１４－Ｓ１３－Ｓ１２－Ｓ１１－Ｓ１０－Ｓ９－Ｓ８－Ｓ７－Ｓ６－Ｓ５－Ｓ４－Ｓ３－Ｓ２－Ｓ１－ＳＯ３　３’　（Ｉ）
アンチセンス鎖領域：５’　ＡＯ５－Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８－Ａ９－Ａ１０－Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５－Ａ１６－Ａ１７－Ａ１８－Ａ１９－Ａａ－ＡＯ３　３’　（ＩＩ）
（ａ）Ｓ１～Ｓ１９は、それぞれ１個のヌクレオシドを示し、Ｓ１は３’－修飾ヌクレオシドである。Ｓａは０～１０個のヌクレオシド、好ましくは０～５個又は０～４個、より好ましくは０～３個、０～２個、又は０～１個、のヌクレオシドである。ＳＯ３及びＳＯ５は、それぞれ独立して、０～５個、好ましくは０～４個、より好ましくは、０～３個、０～２個、又は０～１個、のヌクレオシドである。各ヌクレオシド間の結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を示す；
（ｂ）Ａ１～Ａ１９は、それぞれ１個のヌクレオシドを示し、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４及びＡ１５のうち少なくとも１つはＤＮＡ、ＲＮＡ、2'-O,4'-C-架橋化ヌクレオシド又は２’－ＭＯＥ　ＲＮＡである。Ａａは０～１０個のヌクレオシド、好ましくは０～５個又は０～４個、より好ましくは０～３個、０～２個、又は０～１個、のヌクレオシドである。ＡＯ３及びＡＯ５は、それぞれ独立して、０～５個、好ましくは０～４個、より好ましくは、０～３個、０～２個、又は０～１個、のヌクレオシドである。各ヌクレオシド間の結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を示す；
（ｃ）Ａ２～Ａａの間のヌクレオチド配列は、標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列（標的対応配列）からなり、Ａ１は標的配列の対応するヌクレオシドと相補的な塩基を有するヌクレオシド、アデニンを有するヌクレオシド、チミンを有するヌクレオシド、又はウラシルを有するヌクレオシドであり、ＡＯ３とＡＯ５が存在する場合、そのヌクレオチド配列は、それぞれ独立して、標的配列の対応するヌクレオシドとは独立に選択されるヌクレオチド配列である；
（ｄ）Ｓ１～Ｓａの間のヌクレオチド配列とＡ１～Ａａの間のヌクレオチド配列とは、互いに実質的に相補的なヌクレオチド配列からなる相補領域であり、かつ、２本鎖構造を形成している；
（ｅ）ＳＯ５とＡＯ３の両方が存在する場合、ＳＯ５及びＡＯ３は、互いに相補的ではないヌクレオシドである；
（ｆ）ＳＯ３とＡＯ５の両方が存在する場合、ＳＯ３及びＡＯ５は、互いに相補的ではないヌクレオシドである；、並びに、
（ｇ）センス鎖領域及び／又はアンチセンス鎖領域の、５’末端のヌクレオシドの５’位及び／又は３’末端のヌクレオシドの３’位もしくは３’末端のヌクレオシドが３’－修飾ヌクレオシドである場合はその２’位、が化学修飾されていてもよい。
＜３－１．センス鎖領域＞
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域は、上記式（Ｉ）で表される領域、すなわち、ＳＯ５～ＳＯ３をいう。Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域における相補領域は、３’末端のヌクレオシドから附番したＳ１～Ｓ１９、及び相補領域の５’側に位置するＳａとして表示する。すなわち、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖における相補領域は、上記式（Ｉ）におけるＳ１～Ｓａの領域である。Ｓ１～Ｓ１９は、それぞれ一つのヌクレオシドを表し、Ｓａは０～５個、好ましくは０～４個、より好ましくは、０～３個、０～２個、又は０～１個、のヌクレオシドを表す。また、センス鎖領域のオーバーハング構造は、５’末端に付加するものをＳＯ５、３’末端に付加するものをＳＯ３と表示し、それぞれ０～５個、好ましくは０～４個、より好ましくは、０～３個、０～２個、又は０～１個、のヌクレオシドを表す。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドは、センス鎖領域における相補領域の３’末端に位置するヌクレオシド（すなわち、上記式（Ｉ）におけるＳ１）が、３’－修飾ヌクレオシドであることを特徴とする。そのような３’－修飾ヌクレオシドとしては、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドがＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り特に限定されないが、好ましくは、３’－デオキシ－３’－フルオロＲＮＡ（３’－Ｆ　ＲＮＡ）、３’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、又は３’－ＭＯＥ　ＲＮＡであり、より好ましくは３’－ＯＭｅ　ＲＮＡである。さらに、この３’－修飾ヌクレオシドの２’位は、水酸基、修飾されていてもよいアルコキシ基（好ましくは、メトキシ基、エトキシ基、メトキシエトキシ基）、又は修飾されていてもよいリン酸基（好ましくは、チオリン酸基、ジチオリン酸基、メチルリン酸基、エチルリン酸基）であってもよく、オーバーハング構造（すなわち、上記式（Ｉ）におけるＳＯ３）のヌクレオシドの５’位と結合してもよく、又は、リンカー構造と結合していてもよい。好ましくは、２’位は水酸基である。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域における相補領域のＳ１以外のヌクレオシドは、特に限定されず、様々な天然ヌクレオシド又は糖修飾ヌクレオシドを採用することができるが、好ましくは、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡである。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域における相補領域の一つの態様は、３’末端から１１、１２、１３及び１５番目のヌクレオシド（すなわち、上記式（Ｉ）におけるＳ１１、Ｓ１２、Ｓ１３及びＳ１５）のうち、少なくとも一つが、２’－Ｆ　ＲＮＡであり、それ以外のヌクレオシドは、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又はそれらの組み合わせである。好ましくは、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３及びＳ１５はすべて２’－Ｆ　ＲＮＡである。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域における相補領域の一つの好ましい態様は、センス鎖領域における相補領域のＳ２～Ｓ１０、Ｓ１４、Ｓ１６～Ｓ１９及びＳａのヌクレオシドが、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡ或いはそれらから選択される2種類が交互に配置された修飾パターンであり、より好ましくは、それぞれ独立して２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ又はＤＮＡ或いはそれらが交互に配置された修飾パターン、さらにより好ましくはそれらすべてが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである。Ｓａのヌクレオシド数は０～１０個の間で適宜選択することができ、必要に応じて、その３’側から、Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、Ｓ２３、Ｓ２４、Ｓ２５、Ｓ２６、Ｓ２７、Ｓ２８、及びＳ２９として表示する場合がある。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域における相補領域のヌクレオチド配列（すなわち、上記式（Ｉ）におけるＳ１～Ｓａ）は、アンチセンス領域における相補領域（すなわち、上記式（ＩＩ）におけるＡ１～Ａａ）と実質的に相補的なヌクレオチド配列である。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域は、その相補領域の３’末端及び／又は５’末端にオーバーハング構造（すなわち、上記式（Ｉ）におけるＳＯ３及びＳＯ５）を有していてもよい。ＳＯ３及びＳＯ５はそれぞれ独立して、０～５個（好ましくは、４、３、２、１又は０個）のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又は2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドである。好ましくは、ＳＯ３、及び、ＳＯ５は存在せず、である。
　ＳＯ３及びＳＯ５が存在する場合、その塩基は、オーバーハングとしての機能を発揮する限り特に限定されないが、好ましくは、オリゴU、又は、オリゴTである。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域の修飾パターンを以下式（Ｉａ）～（Ｉｃ）に例示する。
５’　ＳＯ５（N(M)）－Ｓａ（N(M)-N(M)）－Ｓ１９（N(M)）－Ｓ１８（N(M)）－Ｓ１７（N(M)）－Ｓ１６（N(M)）－Ｓ１５（N(F)）－Ｓ１４（N(M)）－Ｓ１３（N(F)）－Ｓ１２（N(F)）－Ｓ１１（N(F)）－Ｓ１０（N(M)）－Ｓ９（N(M)）－Ｓ８（N(M)）－Ｓ７（N(M)）－Ｓ６（N(M)）－Ｓ５（N(M)）－Ｓ４（N(M)）－Ｓ３（N(M)）－Ｓ２（N(M)）－Ｓ１（N(3M)）－２’Ｈ　３’（Ｉａ）
５’　Ｓａ（N(M)）－Ｓ１９（N(M)）－Ｓ１８（N(M)）－Ｓ１７（N(M)）－Ｓ１６（N(M)）－Ｓ１５（N(F)）－Ｓ１４（N(M)）－Ｓ１３（N(F)）－Ｓ１２（N(F)）－Ｓ１１（N(F)）－Ｓ１０（N(M)）－Ｓ９（N(M)）－Ｓ８（N(M)）－Ｓ７（N(M)）－Ｓ６（N(M)）－Ｓ５（N(M)）－Ｓ４（N(M)）－Ｓ３（N(M)）－Ｓ２（N(M)）－Ｓ１（N(3M)）－２’Ｈ　３’（Ｉｂ）
５’　Ｓ１９（N(M)）－Ｓ１８（N(M)）－Ｓ１７（N(M)）－Ｓ１６（N(M)）－Ｓ１５（N(F)）－Ｓ１４（N(M)）－Ｓ１３（N(F)）－Ｓ１２（N(F)）－Ｓ１１（N(F)）－Ｓ１０（N(M)）－Ｓ９（N(M)）－Ｓ８（N(M)）－Ｓ７（N(M)）－Ｓ６（N(M)）－Ｓ５（N(M)）－Ｓ４（N(M)）－Ｓ３（N(M)）－Ｓ２（N(M)）－Ｓ１（N(3M)）－２’Ｈ　３’（Ｉｃ）
［上記式において、（N(M)）は2'-OMe RNAを表し、（N(F)）は2'-F RNAを表し、（N(3M)）は3'-OMe RNAを表す。ＳＯ５（N(M)）及びＳａ（N(M)）は０～３個の2'-OMe RNAからなるヌクレオシドを表す。各オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端から3個のヌクレオシドの2か所のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、それ以外のヌクレオシド間結合はリン酸ジエステル結合である。すなわち、各オリゴヌクレオチドは、３’末端と５’末端に、それぞれ２か所ずつ、合計４か所のホスホロチオエート結合を有している。］
＜３－２．アンチセンス鎖領域＞
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域は、上記式（ＩＩ）で表される領域、すなわち、ＡＯ５～ＡＯ３をいう。Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域は、５’末端のヌクレオシドから附番したＡ１～Ａ１９、及び相補領域の３’側に位置するＡａとして表示する。すなわち、アンチセンス鎖の相補領域は、上記式（ＩＩ）におけるＡ１～Ａａの領域である。Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域のヌクレオチド配列は、標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列であればよく、例えば、標的配列と５、４、３、２又は1塩基のミスマッチが含まれていてもよく、好ましくは完全に相補的である。Ａ１～Ａ１９は、それぞれ一つのヌクレオシドを表し、Ａａは０～５個のヌクレオシドを表す。また、アンチセンス鎖領域のオーバーハング構造は、５’末端に付加するものをＡＯ５、３’末端に付加するものをＡＯ３と表示する。
　Ａ１は、標的配列の対応する塩基と実質的に相補的な塩基であってもよく、標的配列とは独立してアデニン、ウラシル又はチミンであってもよい。ｓｉＲＮＡのセンス鎖の相補領域における３’末端の塩基が、標的配列とは無関係にアデニン又はウラシルである場合に、良好なＲＮＡ干渉活性を示すことは、特許US10093923等に記載されている。また、文献（Nature 465, 818-822 (2010)）には、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオシドはＲＮＡ干渉活性に関与するＡｇｏ２タンパク質に結合し、標的ｍＲＮＡに結合しないことが示されている。アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオシドがアデニン又はウラシルヌクレオシドである場合の方が、グアニン又はシトシンである場合よりも、Ａｇｏ２タンパク質に強く結合することも示されていることから、アンチセンス鎖の5’末端はアデニン又はウラシルヌクレオシドであることが好ましい。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域のＡ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４及びＡ１５のうち、少なくとも一つ（好ましくは、２つ以上）が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシド及び２’－ＭＯＥ　ＲＮＡからなる群から選択されるいずれかである。ここで用いられる2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドとしては、特に限定されないが、好ましくは、ＬＮＡ又はＥＮＡである。アンチセンス鎖相補領域において、前記で同定されるヌクレオシド以外のヌクレオシドは、特に限定されず、様々な天然ヌクレオシド又は糖修飾ヌクレオシドを採用することができるが、好ましくは、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡである。
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域のＡ１４が、ＲＮＡであるオリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、図２の５６型、５７型、図３の６１型、６２型、６６型及び６７型、図５の７５型～８３型、図６の９１型～９５型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　Ａ１４がＲＮＡであるオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域の好ましい態様としては、Ａ１３が2'-O, 4'-C-架橋化修飾ヌクレオシド、2'-OMe RNA又は2'-F RNAであり、より好ましくは2'-O, 4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドであり、更に好ましくはENA又はLNAである（図５の７６型～８３型、及び、図６の９１型～９３型）。このようなＳ３Ｍ－オリゴヌクレオチドにおいて、Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５の修飾パターンとして好ましくは、以下式（ＩＩＩａ）～（ＩＩＩｈ）のいずれかである。
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩａ）
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｂ）
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｃ）
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｄ）
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｅ）
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｆ）
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｇ）
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｈ）
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域のＡ１４が2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドであるオリゴヌクレオチドが提供される。ここで、2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドとして、好ましくはENA又はLNAである。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、図４の７０型～７４型、及び図６の８８型～９０型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　Ａ１４が2'-O, 4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドであるオリゴヌクレオチドの好ましい態様としては、Ａ１２がDNAである。このようなＳ３Ｍ－オリゴヌクレオチドにおいて、アンチセンス鎖相補領域のＡ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５の修飾パターンとして好ましくは、以下式（ＩＩＩｉ）～（ＩＩＩｌ）のいずれかである。
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(DNA) －Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(ENA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｉ）
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(ENA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｊ）
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(LNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｋ）
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(LNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｌ）
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域のＡ１４がDNAであるオリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、図２の５８型及び５９型、図３の６３型、６４型、６８型及び６９型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域の式（ＩＩ）のＡ１５が２’－ＭＯＥ　ＲＮＡであるオリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、図５の７９型及び８３型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域の５’末端から１１～１３番目のヌクレオシド（式（ＩＩ）のＡ１１、Ａ１２、Ａ１３）のいずれかが2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドであるオリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、ENAは図１の４３型、４５型、図４の７５型～８４型、図６の８５型、８６型、及び、９１型～９３型、LNAは図１の４４型、４６型、及び図３の６７型、６９型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域の５’末端から１１～１３番目のヌクレオシド（式（ＩＩ）のＡ１１、Ａ１２、Ａ１３）のいずれかがDNAであるオリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、図１の４１型、４２型、図４の７１型、及び図６の８７型～９０型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域の５’末端から１１～１３番目のヌクレオシド（式（ＩＩ）のＡ１１、Ａ１２、Ａ１３）のいずれかが２’－ＭＯＥ　ＲＮＡであるオリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、図１の４７型、４８型、及び図４の７４型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　本発明のＳ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域において、上記で特定されたヌクレオシド以外のヌクレオシドは様々な種類を適宜選択することができるが、好ましくは、Ａ２、Ａ６及びＡ１６の少なくとも一つ（好ましくは全て）のヌクレオシドが、２’－Ｆ　ＲＮＡである。さらに好ましいアンチセンス鎖領域は、Ａ２、Ａ６及びＡ１６に加えて更に、Ａ８、Ａ９及びＡ１０からなる群から選択される１又は２個のヌクレオシドが２’－Ｆ　ＲＮＡであり、前記で特定された以外のヌクレオシド（たとえば、Ａ１、Ａ３～Ａ５、Ａ７、Ａ１７～Ａ１９及びＡａ）は、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ又はＤＮＡである。
　本発明のＳ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域において、Ａ１１～Ａ１５以外の領域の好ましい修飾パターンは、例えば以下の表A-1および表A-2に例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
［上記表において、（M）は2'-OMe RNAであり、（F）は2'-F RNAである。Ａａは、０～５個のヌクレオシドであり、０以外の場合全て同一のヌクレオシドである。ＡＯ３は、０～５個のヌクレオシドであり、０以外の場合全て同一のヌクレオシドである。ヌクレオシド間結合は、リン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合が適宜選択される。］
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドに含まれるアンチセンス鎖領域は、その相補領域の３’末端及び／又は５’末端にオーバーハング構造（すなわち、上記式（ＩＩ）におけるＡＯ３及ＡびＡＯ５）を有していてもよい。ＡＯ３及びＡＯ５はそれぞれ独立して、０～５個（好ましくは、３、２、１又は０個）のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又は2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドである。好ましくは、ＡＯ３は、２又は３個の２’－ＯＭｅ　ＲＮＡからなるオーバーハングであるか、あるいは、１又は２個の２’－ＯＭｅ　ＲＮＡと１又は２個の2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドとからなるオーバーハングであり、ＡＯ５は存在しない。
　ＡＯ３及びＡＯ５が存在する場合、その塩基は、オーバーハングとしての機能を発揮する限り特に限定されないが、好ましくは、オリゴU、又は、オリゴTである。
＜３－３．ヌクレオシド間結合＞
　本発明のＳ３Ｍ－オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間の結合様式は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を適宜選択することができ、好ましくは、リン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合であり、それらをそれぞれ単独で、又は、組み合わせて採用することができる。好ましくは、リン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合の組み合わせであり、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域それぞれに含まれるヌクレオシド間結合において、ホスホロチオエート結合の含有率が、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２９％以下、２８％以下、２７％以下、２６％以下または２５％以下である。
　RNA及び／又は２’－Ｆ　ＲＮＡが採用される場合、当該ヌクレオシドとその３’側に隣接するヌクレオシドとの間の結合がホスホロチオエート結合であってもよい。好ましくは、ＲＮＡが採用される場合、当該ヌクレオシドとその３’側に隣接するヌクレオシドとの間の結合はホスホロチオエート結合である。
　本発明のＳ３Ｍ－オリゴヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端から１、２、３、４又は５番目のヌクレオシド間結合（ヌクレオシド間の結合数として、１、２、３、又は４か所）は、ホスホロチオエート結合を採用することが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、センス鎖領域とアンチセンス鎖領域が異なるオリゴヌクレオチドに含まれる場合、センス鎖領域の５’末端及び３’末端から１、２、３、４又は５番目のそれぞれのヌクレオシド間、並びに　アンチセンス鎖領域の５’末端及び３’末端から１、２、３、４又は５番目のそれぞれのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合であってもよく、好ましくは、センス鎖領域の５’末端及び３’末端から１、２、３番目のそれぞれのヌクレオシド間結合（ヌクレオシド間の結合数として、２か所）、並びに　アンチセンス鎖領域の５’末端から１、２、３番目のそれぞれのヌクレオシド間結合（ヌクレオシド間の結合数として、２か所）、及び３’末端から１、２、３又は４番目のそれぞれのヌクレオシド間結合（ヌクレオシド間の結合数として、３か所）、がホスホロチオエート結合である。
＜４．オリゴヌクレオチドの合成方法＞
　本発明のオリゴヌクレオチドの調製方法としては所望のオリゴヌクレオチドが合成できる限り特に制限はないが、既知の化学合成法（リン酸トリエステル法、ホスホロアミダイト法、又は、Ｈ－ホスホネート法等）を用いることができる。例えば、市販の核酸合成機を用いて、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成に使われる試薬を用いて合成することができる。
　通常のホスホロアミダイト法により、所望のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機、例えばパーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２などを用いて文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１２，　４５３９（１９８４））記載の方法に準じて合成することができる。
　各種ヌクレオシドに対応したアミダイト試薬は市販されているものを購入して使用してもよく、公知の方法に従って合成することもできる。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、市販の合成機（例えば、パーキンエルマー社のホスホロアミダイド法によるモデル３９２）などを用いて、文献（Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))に記載の方法に準じて合成することができる。その際に用いられるホスホロアミダイト試薬は、天然型のヌクレオシド及び2'-O-メチルヌクレオシド（すなわち、2'-O-メチルグアノシン、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルウリジン）については、市販のホスホロアミダイト試薬を用いることができる。2'-O-アルキル基の炭素数が２～６個の2'-O-アルキルグアノシン、2'-O-アルキルアデノシン、2'-O-アルキルシチジンおよび2'-O-アルキルウリジンについては、以下の通りである。
　2'-O-アミノエチルグアノシン、2'-O-アミノエチルアデノシン、2'-O-アミノエチルシチジン、2'-O-アミノエチルウリジンは、文献（Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　2'-O-プロピルグアノシン、2'-O-プロピルアデノシン、2'-O-プロピルシチジン、2'-O-プロピルウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　2'-O-アリルグアノシン、2'-O-アリルアデノシン、2'-O-アリルシチジン、2'-O-アリルウリジンは、市販のホスホロアミダイト試薬を用いることができる。
　２’－ＭＯＥ　ＲＮＡについて、2'-O-メトキシエチルグアノシン、2'-O-メトキシエチルアデノシン、2'-O-メトキシエチル-5-メチルシチジン、2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジンは、特許（US6261840）または、文献（Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成でき、市販のホスホロアミダイト試薬を用いることもできる。
　2'-O-ブチルグアノシン、2'-O-ブチルアデノシン、2'-O-ブチルシチジン、2'-O-ブチルウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　2'-O-ペンチルグアノシン、2'-O-ペンチルアデノシン、2'-O-ペンチルシチジン、2'-O-ペンチルウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　2'-O-プロパルギルグアノシン、2'-O-プロパルギルアデノシン2'-O-プロパルギルシチジン、2'-O-プロパルギルウリジンは、市販のホスホロアミダイト試薬を用いることができる。
　２’－Ｆ　ＲＮＡについて、2'-デオキシ-2'-フルオログアノシン、2'-デオキシ-2'-フルオロアデノシン、2'-デオキシ-2'-フルオロシチジン、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンは、文献（J. Med. Chem. 36, 831 (1993)）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成でき、市販のホスホロアミダイト試薬を用いることもできる。
　３’－修飾ヌクレオシドである３’－Ｆ　ＲＮＡについて、3'-デオキシ-3'-フルオログアノシンはWO2017027645に従って、3'-デオキシ-3'-フルオロアデノシンはWO2018198076に従って、3'-デオキシ-3'-フルオロウリジンはUS2011/0196141に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。また、3'-デオキシ-3'-フルオロシチジンは前記文献など、公知の方法を参考にして合成することができる。
　３’－修飾ヌクレオシドである3'-OMe RNAについて、3'-O-メチルグアノシン、3'-O-メチルアデノシン、3'-O-メチルシチジン、3'-O-メチルウリジンは、市販のホスホロアミダイト試薬を用いて合成することができる。
　３’－修飾ヌクレオシドである3’-MOE RNAについて、3'-O-メトキシエチルグアノシン、3'-O-メトキシエチルアデノシン、3'-O-メトキシエチル-5-メチルシチジン、3'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジンは、US2003/0096979に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　ＬＮＡについて、2'-O,4'-C-メチレングアノシン、2'-O,4'-C-メチレンアデノシン、2'-O,4'-C-メチレンシチジン、2'-O,4'-C-メチレン-5-メチルシチジンおよび2'-O,4'-C-メチレン-5-メチルウリジンについては、WO99/14226に記載の方法に従って対応するホスホロアミダイト試薬を製造することができる。
　2'-O,4'-C-架橋部分のアルキレン基の炭素数が２～５個の2'-O,4'-C-アルキレングアノシン、2'-O,4'-C-アルキレンアデノシン、2'-O,4'-C-アルキレンシチジン、2'-O,4'-C-アルキレン-5-メチルシチジンおよび2'-O,4'-C-アルキレン-5-メチルウリジンについては、WO00/47599に記載の方法に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を製造することができる。
　D-リボフラノースの2'-デオキシ-2'-C,4'-C-メチレンオキシメチレン化されたヌクレオシドは、文献（Wang,G. et al. Tetrahedron (1999), 55, 7707-7724に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　S-cEt（constrained ethyl）は、文献（Seth,P.P. et al. J.Org.Chem (2010), 75, 1569-1581.）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　AmNAは、文献（Yahara,A. et al. ChemBioChem (2012), 13, 2513-2516.）または、WO2014/109384に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　ホスホロアミダイト試薬をカップリング後、硫黄、テトラエチルチウラムジスルフィド（TETD、アプライドバイオシステム社）、Beaucage試薬（Glen Research社）、または、キサンタンヒドリドなどの試薬を反応させることにより、ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができる（Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198）。
　合成機で用いるコントロールド　ポア　グラス（CPG）、及び、ポリスチレンを固相担体として、2'-O-メチルヌクレオシド及び3'-O-メチルヌクレオシドが結合した固相担体は、市販のものを利用することができる。また、2'-O,4'-C-メチレングアノシン、2'-O,4'-C-メチレンアデノシン、2'-O,4'-C-メチレン-5-メチルシチジンおよび2'-O,4'-C-メチレン-5-メチルウリジンについては、WO99/14226に記載の方法に従って、アルキレン基の炭素数が２～５個の2'-O,4'-C-アルキレングアノシン、2'-O,4'-C-アルキレンアデノシン、2'-O,4'-C-アルキレン-5-メチルシチジンおよび2'-O,4'-C-アルキレン-5-メチルウリジンについては、WO00/47599に記載の方法に従って製造したヌクレオシドを文献（Oligonucleotide Synthesis, Edited by M.J.Gait, Oxford University Press, 1984）に従って、CPGに結合することができる。また、ユニバーサルレジンを用いて、上述のホスホロアミダイト試薬を結合させることにより合成できる。また、修飾されたCPG（特開平７－８７９８２の実施例１２ｂに記載）を用いることにより、3'末端に2-ヒドロキシエチルリン酸基が結合したオリゴヌクレオチドを合成できる。また、3'-amino-Modifier C3 CPG, 3'-amino-Modifier C7 CPG, Glyceryl CPG, (Glen Research), 3'-specer C3 SynBase CPG 1000, 3'-specer C9 SynBase CPG 1000（link technologies）を使えば、3'末端にヒドロキシアルキルリン酸基、または、アミノアルキルリン酸基が結合したオリゴヌクレオチドを合成できる。
　また、オリゴヌクレオチド類縁体をチオエート化する場合は、硫黄のほかテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ、アプライドバイオシステムズ社）、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬、フェニルアセチルジスルフィド／ピリジン－アセトニトリル（１：１　ｖ／ｖ）溶液（Ｒａｖｉｋｕｍａｒ，　Ｖ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００６）　１６，ｐ．２５１３－２５１７）等の試薬を用い、文献（Ｔｅｔａｒｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　３２，　３００５（１９９１）、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１１２，　１２５３（１９９０））記載の方法に準じてチオエート誘導体を得ることができる。
　ＲＮＡの2’-水酸基の保護基として、ｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基などのシリル系の保護基を用いている場合、フッ化 テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）、ＨＦ－ピリジン、又は、ＨＦ－トリエチルアミンなどを用いて脱保護することができる。
　濃アンモニア水、メタノール性アンモニア、エタノール性アンモニア、濃アンモニア水－エタノール（３：１Ｖ／Ｖ）混液、濃アンモニア水－４０％メチルアミン水溶液（１：１Ｖ／Ｖ）混液、メチルアミン、０．５Ｍ　ＬｉＯＨ水溶液、３．５Ｍ　トリエチルアミン/メタノール溶液の（１：１０Ｖ／Ｖ）混液、0.05M 炭酸カリウム含メタノールなどを用いて、塩基部のアシル基、及び、リン酸基部のシアノエチル基を脱保護することができ、好適には濃アンモニア水、濃アンモニア水―エタノール混液（３：１Ｖ／Ｖ）である。
　逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィーを含む。）等の各種クロマトグラフィーなど、通常の核酸の精製に用いられる精製操作で精製することにより、本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができる。
　本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドを標的組織又は標的細胞に輸送するための輸送用ユニットが結合したオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような輸送用ユニットが結合したオリゴヌクレオチドとしては、例えば、所望の化学構造にアミノアルキルリン酸基（例えば、アルキルとしては、３乃至９の炭素数を持つ。）を導入したユニットを、オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドの５’位及び／又は３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）に結合させたオリゴヌクレオチドを挙げることができる。そのような輸送用ユニットとしては、例えば肝臓実質細胞のアシアロ糖受容体（ＡＳＧＲＰ）に結合するＧａｌＮＡｃユニット、肝臓や筋組織へ輸送するための脂肪酸（例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸など）ユニット（例えば、Nucleic Acids Res. (2020) 47, 6029-6044、WO2017/19267号公報など参照）等を、適宜採用することができる。
　ＧａｌＮＡｃユニットとは、ＡＳＧＲＰに結合可能なＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む構造単位で、本発明のオリゴヌクレオチドを肝臓に送達するために用いることができる。ＧａｌＮＡｃユニットは、直鎖または分岐したリンカー構造を有していてもよく、例えば、直鎖、２分岐以上、３分岐以上、又は４分岐以上、あるいは、４分岐以下、３分岐以下、又は２分岐以下の分岐したリンカー構造を有し得る。また、ＧａｌＮＡｃユニットは、オリゴヌクレオチドとの結合のためのリン酸基またはチオリン酸基を含んでいてもよい。ＡＳＧＲＰへの結合能が維持される限り、一つのＧａｌＮＡｃユニットに含まれるＧａｌＮＡｃの数に制限は無く、またＧａｌＮＡｃの構造が修飾されていてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドに用いることができるＧａｌＮＡｃユニットとしては、例えば、ＷＯ２０２１／０４９５０４号公報、ＷＯ２００９／０７３８０９号公報、ＷＯ２０１４／０７６１９６号公報、ＷＯ２０１４／１７９６２０号公報、ＷＯ２０１５／００６７４０号公報、ＷＯ２０１５／１０５０８３号公報、ＷＯ２０１６／０５５６０１２０１７／０２３８１７号公報、ＷＯ２０１７／０８４９８７号公報、ＷＯ２０１７／１３１２３６号公報、Methods in Enzymology、1999年、313巻、２９７～３２１頁、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 26 (2016) 3690-3693、等の公知のＧａｌＮＡｃユニットを適宜採用することができる。
　例えば、採用できるＧａｌＮＡｃユニットとしては、下記式のものが挙げられ、ＷＯ２０２１／０４９５０４に記載の方法にしたがって適宜調整できる。
（上記式中、破線は結合手を示し、結合手の酸素原子は、隣接するヌクレオチドと結合することを表し、５’末端のヌクレオチドと結合する場合は５’－リン酸基と、３’末端のヌクレオチドと結合する場合は３’－リン酸基（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位のリン酸基）と、リン酸ジエステル結合を形成することを表し、形成されるリン酸ジエステル結合は、ホスホロチオエート結合などの化学修飾されたリン酸ジエステル結合であってもよい。）
　本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドにコレステロールユニット、脂質ユニット又は、ビタミンＥユニットを導入したもの（例えば、Ｌｏｒｅｎｚ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　Ｌｅｔｔ．，１４，ｐ．４９７５－４９７７（２００４）；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ，４３２，ｐ．１７３－１７８，　（２００４）；　Ｗｏｌｆｒｕｍ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　２５，ｐ．１１４９－１１５７，（２００７））Ｋｕｂｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，　１７，　ｐ．１－２０，（２００７）；　Ｋｕｂｏ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ．　３６５，ｐ．５４－６１，（２００８）；　Ｎｉｓｈｉｎａ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｔｈｅｒ．　１６，ｐ．７３４－７４０，（２００８）参照。）、及びオリゴヌクレオチドの末端に、タンパク質に結合する核酸分子であるアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を結合したものも含む。
　本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドとモノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）や、タンパク質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）が結合したものも含む（例えば、Ｓｏｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　２３，ｐ．７０９－７１７（２００５）；　Ｘｉａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｒｅｓ．　２４，ｐ．２３０９－２３１６（２００７）、Ｋｕｍａｒ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐ．３９－４３（２００７）参照。）。
　また、本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドにカチオニックポリマーを加えることで、正電荷を帯びた複合体としたものも含む（臓器及び細胞への分布を達成することができた例として、Ｌｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｅｄ．　７，ｐ．９７７－９８６（２００５），Ｂａｉｇｕｄｅ　ｅｔ　ａｌ．２，ｐ．２３７－２４１，　ＡＣＳ　Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．（２００７），Ｙａｄａｖａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　１７，ｐ．２１３－２２２（２００７）参照）。
　本発明のオリゴヌクレオチドには、上記のオリゴヌクレオチドのあらゆる薬学的に許容可能な塩類、エステル、又はそのようなエステルの塩類を含む。本発明のオリゴヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩類としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリ－ルスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマ－ル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
　本発明のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩は、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩は、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することで、鉄代謝において中心的な役割を担っているｈｅｐｃｉｄｉｎの産生を抑制し得る。作用機序は特に限定されないが、本発明のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩は、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現及び／又はｈｅｐｃｉｄｉｎの産生を抑制することにより治療又は予防可能な疾患の治療又は予防に用いることができる。好ましい一つの態様として、貧血患者に投与された場合に、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することができ、貧血症状の改善効果が期待できる。また、本発明のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩は、該オリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物として用いることもできる。
　本発明のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所的又は取り込み、分配及び／又は吸収を補助するための他の処方として、他の分子、分子構造又は化合物の混合物と混合される、封入される、共役される。本発明のオリゴヌクレオチドを、疾患の予防薬又は治療薬として使用する場合には、前記オリゴヌクレオチド、又は、その薬学上許容される塩を、それ自体あるいは適宜の薬学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、又は、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。
　これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
　上記のように調製されたオリゴヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写され得るものであれば、特に制限されない。被導入体としては細胞、組織、あるいは個体を意味する。
　本発明のオリゴヌクレオチドが導入される細胞としては、生殖系列細胞、体性細胞、分化全能性細胞、多分化能細胞、分割細胞、非分割細胞、実質組織細胞、上皮細胞、不滅化細胞、形質転換細胞、神経細胞又は免疫細胞のいずれのものであってもよい。
　組織としては単一細胞胚又は構成性細胞、又は多重細胞胚、胎児組織等を含む。また、上記分化細胞としては、例えば、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌線又は外分泌腺の細胞等が挙げられる。このような細胞の例としては、ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　ｂａｎｋ）、ショウジョウバエＳ２細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，　ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｅｍｂｒｙｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｍｏｒｐｈ．，　２７，ｐ．３５３－３６５（１９７２）、ヒトＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ－２）、あるいは、ヒトＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－１５７３）等が好ましく用いられる。
　さらに本発明のオリゴヌクレオチドの被導入体として用いられる個体として、具体的には、植物、動物、原生動物、ウイルス、バクテリア、又は真菌類に属するもの等が挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物又は裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物又は無脊椎動物であってもよい。脊椎動物としてはマウス、ラット、サル、イヌ及びヒトを含む哺乳類が好ましい。
　被導入体への本発明のオリゴヌクレオチドの導入方法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルス感染、３Ｌ５－オリゴヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウイルス感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には植物体の体腔又は間質細胞等への注入又は灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、皮下、筋肉内及び静脈内投与、非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、経膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウイルス感染等が用いられる。経口導入の方法としては、本発明のオリゴヌクレオチドを生物の食物と直接混合する方法を使うこともできる。
　本発明のオリゴヌクレオチドを患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，ｐ．６８２－；Ｂｌｕｍｅ　ａｎｄ　Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，ｐ．９１－；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｓ．，１９９４，２３，ｐ．１１９－；Ｃｈｏｎｎ　ａｎｄ　Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，ｐ．６９８－）。サイズ範囲が０．２－０．４μｍである単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Ｆｒａｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８１，６，ｐ．７７－）。
　リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種又はそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。
　特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４－１８の炭素原子、特に１６－１８の炭素原子を含有し、飽和している（１４－１８の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。
　代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
　リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的又は能動的のいずれかであってもよい。
　受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。
　一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスのタンパク質コート（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），１９９３，９０，ｐ．８４７４－）、モノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）、糖、糖脂質又はタンパク質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、又は天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げることができる。
　標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。
　本発明のオリゴヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子又はその適切なオリゴペプチドフラグメント、又は（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、又はその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ；Ｆ（ａｂ’）２）、であり得る。２種又はそれ以上の生物活性剤は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。
　内容物の細胞内安定性及び／又は標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
　本発明のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩の使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１ｍｇ（好適には、３０ｍｇ）、上限２０００ｍｇ（好適には、１５００ｍｇ）を、静脈内投与または皮下投与の場合には、１回当り下限０．５ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限１０００ｍｇ（好適には、２５０ｍｇ）を、気管内投与の場合には、１回当り下限０．５ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限５００ｍｇ（好適には、２５０ｍｇ）を、眼球内投与の場合には、１回当り下限０．０５ｍｇ（好適には、０．５ｍｇ）、上限１０ｍｇ（好適には、５ｍｇ）を、成人に対して、１日当り１乃至３回症状に応じて投与することが望ましい。また、安定性が高められた薬剤の場合は、１週間に１乃至３回、さらに安定性が高められた薬剤の場合は、１ヶ月、３ヶ月、６か月、１２か月、１８か月又は２４か月に１乃至３回、症状に応じて投与することが望ましい。
　局所的投与に対する医薬組成物及び処方は、経皮的パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、飴、坐薬、スプレー、液体及び粉末を含む。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞に対する毒性が小さく、安全性が高い医薬品に適用し得る。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することで、鉄代謝において中心的な役割を担っているｈｅｐｃｉｄｉｎの産生を抑制し得る。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することで、血漿中鉄濃度及び／又はＨＧＢ値を上昇し得る。作用機序は特に限定されないが、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現及び／又はｈｅｐｃｉｄｉｎの産生を抑制することにより治療又は予防可能な疾患の治療又は予防に用いることができる。そのような疾患としては、例えば、貧血が挙げられる。作用機序は特に限定されないが、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、例えば、ＨＧＢ値を上昇させることで貧血を治療又は予防し得る。また、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、血液細胞輸血が必要な貧血患者に対して、血液細胞輸血の頻度及び／又は輸血量を軽減し得る。例えば、貧血患者に対して一定期間（例えば、１日、１週間、２週間、４週間、８週間、１２週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月又１年）における血液細胞輸血の頻度及び／又は輸血量を約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％軽減し得る。
　本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する貧血の治療又は予防に用いる医薬組成物、当該オリゴヌクレオチドの有効量を投与することを含む貧血を治療又は予防する方法、貧血の治療又は予防に使用するための当該オリゴヌクレオチド、貧血の治療又は予防用医薬組成物の製造における本発明のオリゴヌクレオチドの使用、等の医薬用途発明を提供する。本発明のオリゴヌクレオチドが治療又は予防し得る貧血には例えば、慢性炎症に伴う貧血（ａｎｅｍｉａ　ｏｆ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＣＤ）、骨髄機能不全に伴う貧血、鉄欠乏性貧血、鉄剤不応答性貧血（ｉｒｏｎ　ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　ｉｒｏｎ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ａｎｅｍｉａ、ＩＲＩＤＡ）、赤血球造血刺激因子製剤（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ、ＥＳＡ）抵抗性の貧血、化学療法によって誘導される貧血、再生不良性貧血、ダイヤモンドブラックファン貧血、及び、βサラセミアもしくは鎌状赤血球症等の遺伝性ヘモグロビン異常症等が含まれる。慢性炎症に伴う貧血には、例えば、関節リウマチもしくは全身性エリテマトーデスもしくは自己免疫性溶血性貧血等の自己免疫疾患に伴う貧血、感染症に伴う貧血、炎症性大腸炎等の炎症性腸疾患に伴う貧血、心不全に伴う貧血、慢性腎臓病に伴う貧血、癌性貧血、マクロファージ活性化症候群に伴う貧血及びキャッスルマン病に伴う貧血等が含まれる。慢性腎臓病に伴う貧血には、例えば、糖尿病を伴う腎臓病、高血圧を伴う腎臓病、ネフローゼ症候群（例えば、フィンランド型先天性ネフローゼ症候群、びまん性メサンギウム硬化症、微小変化型ネフローゼ症候群、巣状分節性糸球体硬化症、膜性腎症、ギャロウェイ・モワト（Ｇａｌｌｏｗａｙ－Ｍｏｗａｔ）症候群、などが挙げられる）、慢性糸球体腎炎を伴う腎臓病（例えば、ＩｇＡ腎症、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、紫斑病性腎炎、抗糸球体基底膜腎炎（グッドパスチャー（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ）症候群）、アルポート症候群、エプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）症候群、ループス腎炎、顕微鏡的多発血管炎、非典型溶血性尿毒症症候群、ネイル・パテラ（Ｎａｉｌ－Ｐａｔｅｌｌａ）症候群（爪膝蓋症候群）、フィブロネクチン腎症、リポタンパク糸球体症、などが挙げられる）、慢性尿細管間質性腎炎を伴う腎臓病、慢性腎盂腎炎を伴う腎臓病、アミロイド沈着を伴う腎臓病、常染色体優性尿細管間質性腎臓病、ネフロン癆を伴う腎臓病、腎奇形を伴う腎臓病（例えば、多発性嚢胞腎などが挙げられる）、等の慢性腎臓病に伴う貧血が含まれる。癌性貧血には、例えば、多発性骨髄腫、急性白血病、慢性白血病、肺癌又は乳癌などの癌に伴う貧血が含まれる。骨髄機能不全に伴う貧血には、例えば、骨髄線維症に伴う貧血、骨髄異形成症候群に伴う貧血、慢性骨髄単球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ　ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＭＭＬ）に伴う貧血、化学療法による骨髄抑制に伴う貧血、再生不良性貧血、ダイヤモンドブラックファン貧血、ファンコニ貧血等が含まれる。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、慢性炎症に伴う貧血、骨髄機能不全に伴う貧血の治療又は予防に用いられ得、より好ましくは、関節リウマチもしくは全身性エリテマトーデスもしくは自己免疫性溶血性貧血等の自己免疫疾患に伴う貧血、感染症に伴う貧血、炎症性大腸炎等の炎症性腸疾患に伴う貧血、心不全に伴う貧血、慢性腎臓病に伴う貧血、癌性貧血、キャッスルマン病に伴う貧血、骨髄線維症に伴う貧血、骨髄異形成症候群に伴う貧血、慢性骨髄単球性白血病に伴う貧血、及び化学療法による骨髄抑制に伴う貧血の治療又は予防に用いられ得る。
　本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを他の１又は２以上の薬剤と併用することを含む、貧血の治療又は予防方法を提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の効果を奏する限り他の１又は２以上の薬剤と併用してもよい。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドを、貧血症状に対する作用機序が異なる他の薬剤と併用することでより大きな治療効果を提供し得る。例えば、骨髄異形成症候群（Ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ，　ＭＤＳ）に対しては、赤血球の増殖を促すことで貧血を治療する作用機序を持つＥＳＡ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）、赤血球の分化を促すことで貧血を治療する作用機序を持つルスパテルセプト（Ｌｕｓｐａｔｅｒｃｅｐｔ）などの薬剤、ＤＮＡメチル化を抑制し異常な細胞を殺傷する作用機序を持つアザシチジン（Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）などの薬剤が処方される場合があるが、これらの薬剤とＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとは作用機序が異なる。従って、これらの薬剤とＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとの併用は、ＭＤＳに対して、単剤よりも大きな治療効果を提供し得る。また、慢性腎臓病に伴う貧血に対しては、赤血球の増殖を促すことで貧血を治療する作用機序を持つＥＳＡやＨＩＦＰＨＤ（ｈｙｐｏｘｉａ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｐｒｏｌｙｌ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）阻害薬などの薬剤が処方される場合があるが、これらの薬剤とＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとは作用機序が異なる。従って、これらの薬剤とＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとの併用は、慢性腎臓病に伴う貧血に対して、単剤よりも大きな治療効果を提供し得る。また、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂは骨髄線維症に対して、主にｓｐｌｅｎｏｍｅｇａｌｙなどの症状に対して治療効果を示すことが知られている（Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　２０１２；　３６６：７９９－８０７）。しかし、貧血症状に対する効果は限局的か無効、あるいは貧血を悪化させることが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　＆　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　２０１３，　６：７９）。ルキソリチニブ（Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ）による貧血が悪化する機序としては、ＪＡＫ２を阻害することによって赤血球細胞の増殖に必要とされるＥＰＯシグナルが抑制されてしまうことにあると考えられている。しかしながら、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂは骨髄線維症において、貧血を除く症状に対して一定の治療効果を挙げていることから、ＲｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂとＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとの併用は、骨髄線維症における貧血に対して有用な治療効果を提供し得る。同様に、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ以外の他のＪＡＫ２阻害薬との併用によっても骨髄線維症における貧血に対して有用な治療効果を提供し得る。他のＪＡＫ２阻害薬としては、例えば、フェドラチニブ（Ｆｅｄｒａｔｉｎｉｂ）、パクリチニブ（Ｐａｃｒｉｔｉｎｉｂ）及びモメロチニブ（Ｍｏｍｅｌｏｔｉｎｉｂ）などが挙げられる。
　本発明のオリゴヌクレオチドを他の薬剤と併用して用いる場合、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを投与する順序は本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、併用する他の薬剤と同時に投与されてもよく、併用する他の薬剤の投与の前又は後に投与されてもよい。本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドと併用し得る薬剤としては、例えば、他の貧血治療薬又は貧血の原因となる疾患の治療薬が挙げられる。他の貧血治療薬としては、例えば、ＥＳＡ、ＨＩＦＰＨＤ（ｈｙｐｏｘｉａ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｐｒｏｌｙｌ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）阻害薬、経口鉄剤、静注鉄剤、ダナゾール（Dａｎａｚｏｌ）、Ｌｕｓｐａｔｅｒｃｅｐｔ、などが挙げられる。ＥＳＡとしては、例えば、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンベータペゴル、エポエチンカッパ、ダルベポエチンアルファ等が挙げられる。ＨＩＦＰＨＤ阻害薬としては、例えば、ロキサデュスタット、バダデュスタット、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット等が挙げられる。経口鉄剤としては、例えば、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、フマル酸第一鉄、溶性ピロリン酸第二鉄、乾燥硫酸鉄等が挙げられる。静注鉄剤としては、例えば、カルボキシマルトース第二鉄、含糖酸化鉄等が挙げられる。また、貧血の原因となる疾患の治療薬としては、例えば、骨髄線維症治療薬、骨髄異形成症候群治療薬、慢性腎臓病治療薬、抗がん剤等が挙げられる。骨髄線維症治療薬としては、例えば、ＪＡＫ２阻害薬が挙げられる。ＪＡＫ２阻害薬としては、例えば、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ、Ｆｅｄｒａｔｉｎｉｂ、Ｐａｃｒｉｔｉｎｉｂ、及びＭｏｍｅｌｏｔｉｎｉｂ等が挙げられ、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂとの併用が好ましい。骨髄異形成症候群治療薬としては、例えば、Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ、レナリドミド（Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）等が挙げられ、Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ又はレナリドミドとの併用が好ましい。慢性腎臓病治療薬としては、例えば、ＳＧＬＴ２（ｓｏｄｉｕｍ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｃｏ―ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ２）阻害薬、レニン・アンジオテンシン系阻害薬（例えば、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ＡＲＢ）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬など）、カルシウム拮抗薬、利尿薬、糖尿病治療薬、高脂血症治療薬、ステロイド、免疫抑制薬等が挙げられる。抗がん剤には化学療法薬が含まれ、化学療法薬としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、アムルビシン等が挙げられる。
　また、本発明のオリゴヌクレオチドは鉄過剰症の治療薬と併用してもよい。貧血に対する治療として血液細胞輸血を行う場合、慢性的な血液細胞輸血に伴い鉄過剰症を発症し得る。鉄過剰症とは、肝臓や心臓などの組織において、輸血した血液細胞由来の鉄が蓄積することで生じる病態であり、肝不全、心不全、糖尿病、関節痛、甲状腺機能低下症、下垂体機能低下、又は性機能不全等を呈し得る。したがって、貧血に対する治療において鉄過剰症の治療又は予防のために鉄過剰症治療薬を用いる場合があり、本発明のオリゴヌクレオチドと好適に併用し得る。鉄過剰症の治療薬としては、例えば、鉄キレート剤等が挙げられ、鉄キレート剤としてはデフェラシロクス（Ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ）、デフェロキサミン（Ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、デフェリプロン（Ｄｅｆｅｒｉｐｒｏｎｅ）等が挙げられる。
（実施例１～８２）
　表１に示す実施例１～８２の化合物は、それぞれ独立したオリゴヌクレオチドであるセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域から構成される２本鎖オリゴヌクレオチドであり、該センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の相補領域はすべてが天然型のＲＮＡ（すなわち、Ａ（Ｒ）、Ｇ（Ｒ）、Ｃ（Ｒ）、及びＵ（Ｒ））で構成されている。また、各ヌクレオシド間結合は化学修飾されていないリン酸ジエステル結合である。各実施例の化合物におけるアンチセンス鎖領域は、表１に記載された各標的配列（開始位置及び終了位置に挟まれた領域の塩基配列）と完全に相補的な配列からなる相補領域を有し、該相補領域の３’末端にオーバーハング構造として２個の連続したＴ（Ｄ）が結合したオリゴヌクレオチドである。また、各実施例の化合物におけるセンス鎖領域は、対応するアンチセンス鎖領域の相補領域におけるヌクレオチド配列と完全に相補的な配列からなる相補領域を有し、該相補領域の３’末端にオーバーハング構造として２個の連続したＴ（Ｄ）が結合したオリゴヌクレオチドである。なお、実施例６１の化合物は、ＷＯ２０１２／１７７９２１に記載されているヒトＴｆＲ２（ｈＴｆＲ２）に対するｓｉＲＮＡであるＡＤ－４７８２６における１９塩基対が全て天然型のＲＮＡであって、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の各3’末端にオーバーハング構造として２個の連続したＴ（Ｄ）が結合しているものである。
　表１の各化合物は、ホスホロアミダイト法（Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)、Nature Communications 6, Article number: 6317 (2015)）を用いて合成を行った。各実施例の化合物は、負イオンESI質量分析により同定し、その結果を表１に記載した。また、各実施例の化合物は、それぞれ個別に合成したセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域を等モルずつ１つのチューブに入れてアニーリング処理後、未変性ゲルで２本鎖オリゴヌクレオチドを形成していることを確認した。
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
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　表中の「標的配列の開始位置」および「標的配列の終了位置」は、それぞれ配列番号１に示すヒトＴｆＲ２　ｍＲＮＡの塩基配列における塩基の位置を示す。各実施例の化合物は、これらに挟まれた塩基配列を標的配列とする２本鎖オリゴヌクレオチドである。すなわち各実施例のアンチセンス鎖領域は、当該標的配列の開始位置および終了位置に挟まれた塩基配列と相補的な配列を有し、センス鎖領域は当該アンチセンス鎖領域と相補的な配列を有する。例えば、実施例１９の化合物（ＴｆＲ２－０１９）におけるセンス鎖領域の相補領域の配列は、5' CGUGGAGUUUCAAUAUCAA 3'（配列番号４３）であり、アンチセンス鎖領域の相補領域の配列は、5' UUGAUAUUGAAACUCCACG 3'（配列番号４４）である。また、実施例３９の化合物（ＴｆＲ２－０３９）におけるセンス鎖領域の相補領域の配列は、5' ACCUCAAAGCCGUAGUGUA 3'（配列番号４５）であり、アンチセンス鎖領域の相補領域の配列は、5' UACACUACGGCUUUGAGGU 3'（配列番号４６）である。また、表１の各実施例の化合物のセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域における各相補領域の３’末端には、オーバーハング構造として２個の連続したＴ（Ｄ）が結合している。各オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドの５’位及び３’末端のヌクレオチドの３’位は、水素原子が、上述した各ヌクレオシドの構造図中の酸素原子と結合した水酸基となっている。また、表中の「分子量」は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
（実施例８３～１８４）
　表２に示す実施例８３～１３３の化合物は、それぞれセンス鎖領域の３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）及びアンチセンス鎖領域の５’末端のヌクレオチドの５’位が上述した式（Ｚ）で示されるリンカーで連結した１本鎖オリゴヌクレオチドであり、センス鎖領域の相補領域と、アンチセンス鎖領域の相補領域とで２本鎖構造を形成している。また、表３に示す実施例１３４～１８４の化合物は、それぞれ独立したオリゴヌクレオチドであるセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域を有する２本鎖オリゴヌクレオチドである。
　実施例１８０（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｓ１）及び実施例１８１（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｓ２）の化合物は、実施例１６９の化合物（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ）におけるアンチセンス鎖領域の３’末端のオーバーハング構造がそれぞれ１ヌクレオチドであるか、又は存在しない、ｓｉＲＮＡである。実施例１８２（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｅ１）及び実施例１８３（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｅ２）の化合物は、実施例１９の化合物（ＴｆＲ２－０１９）における標的配列（すなわち、配列番号１の２８４７～２８６５番目の配列）を５’末端側にそれぞれ１又は２個のヌクレオチド鎖長延ばした配列（すなわち、それぞれ配列番号１の２８４６～２８６５番目の配列及び２８４５～２８６５番目の配列）を標的配列とし、相補領域の鎖長がそれぞれ２０ｂｐ、２１ｂｐであるｓｉＲＮＡである。実施例１８４（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｅ３）の化合物は、実施例１６９の化合物（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ）におけるアンチセンス鎖領域の３’末端のオーバーハング構造をＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）としたｓｉＲＮＡである。
　表２及び表３に示す実施例８３～１８４の化合物も実施例１～８２と同様に合成した。配列中、「２」の部分を合成する際には、DMT-ethane-Diol phosphoramidite（ChemGene、カタログ番号：CLP-2250）を用い、「Z」の部分を合成する際には、WO2012/074038の実施例１２に記載された方法を用いた。「2'-O-メチルヌクレオシド」の部分は、Nucleic Acids Research 17, 3373 (1989)に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「DNA」の部分は、Nucleic Acids Research 11, 4539 (1984)に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「3'-O-メチルヌクレオシド」の部分は、3'-O-Methyl Adenosine (n-bz) CED phosphoramidite（ChemGene、カタログ番号：ANP-2901）、3'-O-Methyl Cytidine (n-bz) CED phosphoramidite（ChemGene、カタログ番号：ANP-2902）、3'-O-Methyl Guanosine (n-ibu) CED phosphoramidite（ChemGene、カタログ番号：ANP-2903）、または、3'-O-Methyl Uridine CED phosphoramidite（ChemGene、カタログ番号：ANP-2904）を用いて合成した。「2'-O,4'-C-メチレンヌクレオシド」の部分は、WO99/14226に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「2'-デオキシ-2'-フルオロヌクレオシド」の部分は、J. Med. Chem. 36, 831 (1993) に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「2'-O-メトキシエチルヌクレオシド」の部分は、Helv. Chim. Acta 78, 486－504 (1995)に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「GN」の部分は、WO2019/172286参考例41に記載に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。なお、実施例１３４～１７９の化合物については、センス鎖領域の塩基配列を表３－１～表３－５、アンチセンス鎖領域の塩基配列を表３－６～表３－１０にそれぞれ示した。また、実施例１８０～１８４の化合物については、センス鎖領域の塩基配列を表３－１１、アンチセンス鎖領域の塩基配列を表３－１２にそれぞれ示した。
　実施例１３４～１８４の化合物は、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域を等モルずつ１つのチューブに入れてアニーリング処理後、未変性ゲル、または、ＨＰＬＣを使って２本鎖オリゴヌクレオチドを形成していることを確認した。
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　表中の「分子量」は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。表中の「塩基配列」においてN(R)はRNA、N(D)はDNA、N(M)は2'-OMe RNA、N(m)は2'-MOE RNA、N(3M)は3'-OMe RNA、N(F)は2'-F RNA、N(L)はLNA、N(E)はENA、を示す。それぞれのヌクレオシドの構造は、上述した各構造式で表される。
　表中の「GN」は、上述した式（ＧＮ）で表されるＧａｌＮＡｃユニットを示す。表中の「２」は-O(CH2)2O-（上述した式（２）で示す）、「Z」は-O(CH2)8NHC(=O)(CH2)2PhO-（上述した式（Ｚ）で示す）、をそれぞれ示す。ヌクレオシド間の結合、または、ヌクレオシドとＧａｌＮＡｃユニット、「２」、もしくは「Ｚ」との結合について、表中の「^」は、ホスホロチオエート結合（-P(=S)(OH)-、上述したヌクレオシド間結合の構造図（PS）で示す）を示す。特に記載のない場合は、リン酸ジエステル結合（-P(=O)(OH)-、上述したヌクレオシド間結合の構造図（Ｐ）で示す）で結合したものを示す。
　各オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドの５’位及び３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）は、水素原子が、上述した各ヌクレオシドの構造図中の酸素原子と結合した水酸基となっている。「２」が末端になっている場合、上述した「２」の構造図において、水素原子が、オリゴヌクレオチドと結合していない結合手側の酸素原子と結合した水酸基となっている。「^」が末端になっている場合、上述した「PS」の構造図において、水酸基がリン原子と結合している。但し、「GN」が末端になっている場合は、水素原子の結合を必要としない。
試験例１：ＨｅｐＧ２細胞に対するＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡのフォワードトランスフェクション法によるスクリーニング
　ＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとして実施例１～８２の化合物を用いて、以下の実験を行った。トランスフェクションの前日に、１０％　ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）１００μＬ中に、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製品）に１ウェルあたり２．５ｘ１０＾４個のＨｅｐＧ２細胞を播種した。トランスフェクション当日、ｓｉＲＮＡ検体を１種類あたり２ウェル分、ｓｉＲＮＡの代わりに蒸留水としたネガティブコントロール（ＮＴ）を２ウェル分、ポジティブコントロールとしてＴｆＲ２－０６１（実施例６１）を２ウェル分作製した。ｓｉＲＮＡ　１検体のトランスフェクションを実施するための試薬調製としては、５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と３μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を混合したものに、５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭと１μＬのｓｉＲＮＡ（濃度は１０μＭ）を添加し、室温で１５分間インキュベートした。その後、予め調製し、３７℃で温めた１０％　ＦＢＳを含んだＤＭＥＭを１ｍＬ加えた。このうちの１１０μＬを、ＨｅｐＧ２細胞を播種した９６ウェルプレートに培地を除去した後に添加した。
ｓｉＲＮＡの最終濃度は全ての検体において１０ｎＭとした。ネガティブコントロール用の試薬調製としては、５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と３μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を混合したものに、５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭと１μＬの蒸留水を添加し、室温で１５分間インキュベートした。
　トランスフェクションして２日後に、ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて細胞を１回洗浄し、ＲＮＡの抽出を行った。ＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＵＡＧＥＮ社製）を用いてキットのプロトコルに従って実施した。得られた３００　ｎｇのＲＮＡを、Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ　ｔｏ　ｃＤＮＡ　ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて逆転写反応しｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲによって内因性のｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ量を測定した。ハウスキーピング遺伝子としては、ヒト１８Ｓ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＲＮＡ（ｈ１８Ｓ）のｍＲＮＡ量を測定した。
　定量的ＰＣＲは、ＩＤＴ　ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、以下のように行った。得られたｃＤＮＡは、蒸留水を用いて１０倍に希釈した（ｃＤＮＡ　１５μＬおよび蒸留水１３５μＬを混合した）。３８４ウェルのＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）の１ウェルあたり、５μＬのＩＤＴ　ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、０．５μＬのｈＴｆＲ２プライマー（Ｈｓ．ＰＴ．５８．２０５９９４３４、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．５μＬのｈ１８Ｓプライマー（Ｈｓ．ＰＴ．３９ａ．２２２１４８５６．ｇ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、２μＬの蒸留水、２μＬのｃＤＮＡの割合で混合（計１０μＬ）し、各ｃＤＮＡに対して２ウェル分調製し、定量的ＰＣＲを行った。ｈＴｆＲ２とｈ１８ＳのｍＲＮＡ発現量を２ウェル間の平均値として測定した。ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｈ１８ＳのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ネガティブコントロールにおけるｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を１．０としたときの相対値として、各ｓｉＲＮＡを処置した検体の相対ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を算出して表記した。結果は以下の表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000060
試験例１－１：ＨｅｐＧ２細胞を用いた細胞毒性の評価
　試験例２と同様の方法で、リバーストランスフェクション法を用いてｓｉＲＮＡをＨｅｐＧ２細胞に導入して４日後における、細胞毒性の評価を行った。ｓｉＲＮＡとして、ＴｆＲ２－０６１（実施例６１）、ＴｆＲ２－０１９（実施例１９）、及びＴｆＲ２－０３９（実施例３９）を用いた。
　肝臓細胞に対するｓｉＲＮＡの細胞毒性について、ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｋｉｔ－８（ＣＣＫ８、同仁化学研究所）を用いて試験した。培養上清を除去した後に、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ　１００μＬあたり１０μＬのＣＣＫ８試薬を調製した溶液を１１０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。その後３０分間、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で細胞をインキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーを用いてＯＤ４５０ｎｍ吸光度を測定した。ネガティブコントロール（ＮＴ）におけるＯＤ４５０ｎｍ値を１．０としたときの相対値として、各ｓｉＲＮＡを処置したｗｅｌｌにおけるＯＤ４５０ｎｍ値を相対値として算出して表記した。結果は、図１１に示した。
　この結果は、特にＴｆＲ２－０１９及びＴｆＲ２－０３９において、肝臓細胞に対する毒性が小さいことを示すものである。
試験例２：ＨｅｐＧ２細胞に対するＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡのリバーストランスフェクション法によるスクリーニング
　ＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとして各実施例の化合物を用いて、以下の実験を行った。リバーストランスフェクション法によって以下のようにｓｉＲＮＡのスクリーニングを行った。トランスフェクション当日、ｓｉＲＮＡ検体を１種類あたり２ウェル分、ｓｉＲＮＡの代わりに蒸留水としたネガティブコントロール（ＮＴ）を２ウェル分、ポジティブコントロールとしてＴｆＲ２－０６１（実施例６１）又はＷＯ２０１２／１７７９２１に記載されているｈＴｆＲ２に対するｓｉＲＮＡ（ＡＤ－５２５９０）を２ウェル分作製した。
　１ウェルあたり１４．８μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．２μＬのＲＮＡｉＭＡＸの混合液に５μＬのｓｉＲＮＡを添加し、室温で２０分間インキュベートした。ネガティブコントロール用の試薬調製としては、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭとＲＮＡｉＭＡＸの混合液に対して、ｓｉＲＮＡの代わりに５μＬの蒸留水を添加した。ポジティブコントロール用の試薬調製としては、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭとＲＮＡｉＭＡＸの混合液に対して、５μＬのＴｆＲ２－０６１（実施例６１）またはＡＤ－５２５９０を添加した。次に、ｓｉＲＮＡまたはネガティブコントロールまたはポジティブコントロールを含む混合液を２０μＬずつ９６ウェルの細胞培養用プレート（ＳＵＭＩＲＯＮ社製）に添加した。混合液を添加した９６ウェルプレートに、予め３７℃に温めておいた１０％　ＦＢＳを含んだＤＭＥＭを用いて調製した２ｘ１０＾４　ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＨｅｐＧ２細胞を、１ウェルあたり８０μＬずつ播種した。ｓｉＲＮＡの最終濃度としては、１０ｎＭから１０倍または５０倍公比になるように調製した。
　トランスフェクションして１日後または２日後に、ＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄した。Ｓｕｐｅｒｐｒｅｐ　Ｃｅｌｌ　Ｌｙｓｉｓ　ＲＴ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　ｑＰＣＲ（タカラバイオ社製）を用いて、キットのプロトコルに従ってＲＮＡ抽出および逆転写反応を実施しｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲによって内因性のｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ハウスキーピング遺伝子としては、ｈ１８ＳのｍＲＮＡ発現量を測定した。
　定量的ＰＣＲは、ＩＤＴ　ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、以下のように行った。得られたｃＤＮＡは原液として使用した。３８４ウェルのＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）の１ウェルあたり、５μＬのＩＤＴ　ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、０．２５μＬのｈＴｆＲ２プライマー（Ｈｓ．ＰＴ．５８．２０５９９４３４、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）または、０．２５μＬのｈ１８Ｓプライマー（Ｈｓ．ＰＴ．３９ａ．２２２１４８５６．ｇ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、２．７５μＬの蒸留水、２μＬのｃＤＮＡの割合で混合（計１０μＬ）し、各ｃＤＮＡに対して２ウェル分調製し、定量的ＰＣＲを行った。ｈＴｆＲ２とｈ１８ＳのｍＲＮＡ発現量を２ウェル間の平均値として測定した。ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｈ１８ＳのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ネガティブコントロールにおけるｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を１．０としたときの相対値として、各ｓｉＲＮＡを処置した検体の相対ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を算出して表記した。結果は、以下の表５～表２０に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000061
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000063
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000064
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
試験例２－１：ＨｅｐＧ２細胞を用いたｈＴｆＲ２ノックダウン活性
　試験例２と同様の方法で、リバーストランスフェクション法を用いてｓｉＲＮＡをＨｅｐＧ２細胞に導入して２日後における、ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の評価を行った。ｓｉＲＮＡとして、ＴｆＲ２－０１９（実施例１９）、及びＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ（実施例１６９）を用いた。
　ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量の評価について、ネガティブコントロール（ＮＴ）におけるｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を１．０としたときの相対値として、各ｓｉＲＮＡを処置した検体の相対ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を算出して表記した。結果は、図１２に示した。
　この結果は、特にＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧが、ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡに対する高いノックダウン活性を有することを示すものである。
試験例３：雄性カニクイザルに対するＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの単回投与試験
　ＴｆＲ２－０３９．５Ｇ（実施例１２７）またはＴｆＲ２－０３９．２３ＤＵＧ（実施例１４４）を、３０　ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した後の血漿中鉄濃度および血漿中ｈｅｐｃｉｄｉｎ濃度を測定した。血漿中鉄濃度は、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて測定した。血漿中ｈｅｐｃｉｄｉｎ濃度は、ＬＣ／ＭＳを用いて測定した。ＴｆＲ２－０３９．５Ｇ（実施例１２７）を投与した結果は表２１、ＴｆＲ２－０３９．２３ＤＵＧ（実施例１４４）を投与した結果は表２２にそれぞれ示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000092
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
試験例４：　ＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを用いたｓｉＲＮＡ封入核酸脂質粒子の調製
（１）ｓｉＲＮＡ封入核酸脂質粒子の調製
　ジステアロイルホスファチジルコリン（１，２－Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ：以下ＤＳＰＣと表記，ＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：以下Ｃｈｏｌと表記，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．）、酢酸（７Ｒ，９Ｚ）－１８－（｛[３－（ジメチルアミノ）プロピルオキシ]カルボニル｝オキシ）オクタコサ－９－エン－７－イル（ＷＯ２０１５／００５２５３の実施例２８に記載の化合物）（以下ＬＰと表記）、及びポリエチレングリコール分子量が約２０００の１、２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール　メトキシポリエチレン　グリコール（１，２－Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎ－Ｇｌｙｃｅｒｏ－３－Ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ、以下ＰＥＧ－ＤＭＧと表記，ＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を、１０：４８：４０：２のモル比にて、総脂質濃度１０ｍＭになるようにエタノールに溶解した。
　一方、マウスＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとしてＡＤ－４７８８２（ＷＯ２０１２／１７７９２１に記載されているマウスＴｆＲ２に対するｓｉＲＮＡ）を、クエン酸緩衝液（２０ｍＭ　Ｃｉｔｒａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ４．０）にて希釈調製した。
　上記の脂質溶液とｓｉＲＮＡ溶液を、ｓｉＲＮＡに対する総脂質重量比が１１となり、且つその体積比が１：３となるようにＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ　ＢｅｎｃｈＴｏｐ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）を用いてマイクロ流路内で混合し、核酸脂質粒子の粗分散液を得た。核酸脂質粒子の分散液を約２５～５０倍量のリン酸緩衝液にて１２～１８時間透析（Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｇ２，ＭＷＣＯ：１，０００ｋＤ，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）することにより、エタノール除去を行い、精製されたｓｉＲＮＡ封入核酸脂質粒子の分散液を得た。尚、ＬＰはＷＯ２０１５／００５２５３の実施例２８に記載の方法に従い合成した。
（２）ｓｉＲＮＡ封入核酸脂質粒子の特性評価
　（１）で調製した核酸脂質粒子を含む分散液について以下の特性評価を行った。
（２－１）ｓｉＲＮＡの封入率
　ｓｉＲＮＡの封入率は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ　ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ　ＲＮＡ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付文書に準じて測定した。すなわち、０．０１５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００界面活性剤存在下及び非存在下において、核酸脂質粒子の分散液中のｓｉＲＮＡを定量し、次式により封入率を算出した。
　封入率（％）＝｛（［界面活性剤存在下におけるｓｉＲＮＡ量］－［界面活性剤非存在下におけるｓｉＲＮＡ量］）／［界面活性剤存在下におけるｓｉＲＮＡ量］｝ｘ　１００（％）
（２－２）ｓｉＲＮＡと脂質の比率
　核酸脂質粒子分散液を１．０％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００にて希釈調製し、核酸脂質粒子の分散液中のｓｉＲＮＡ量をイオン交換クロマトグラフィーにて測定した（Ｓｙｓｔｅｍ：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２６０ｓｅｒｉｅｓ，Ｃｏｌｕｍｎ：Ｄｉｏｎｅｘ　ＢｉｏＬＣ　ＤＮＡＰａｃ　ＰＡ２００（８μｍ，４．０ｍｍ×２５０ｍｍ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ：１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液，
２５ｍＭ　過塩素酸ナトリウム，２０％エタノール（ｐＨ７．０），Ｂｕｆｆｅｒ　Ｂ：１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液，２５０ｍＭ　過塩素酸ナトリウム，２０％エタノール（ｐＨ７．０），（Ｂ％）：２０－７０％（１５ｍｉｎ），Ｆｌｏｗ　Ｒａｔｅ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ，Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：４０℃，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：２６０ｎｍ）。
　核酸脂質粒子分散液を、エタノールにて希釈調製し、核酸脂質粒子の分散液中の各脂質量を逆相クロマトグラフィーにて測定した（Ｓｙｓｔｅｍ：ＤＩＯＮＥＸ　ＵｌｔｉＭａｔｅ　３０００，Ｃｏｌｕｍｎ：ＸＳｅｌｅｃｔ　ＣＳＨ　Ｃ１８（１３０Å，３．５μｍ，３．０ｍｍ×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　１８６００５２６３），Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ：０．２％ギ酸，Ｂｕｆｆｅｒ　Ｂ：０．２％ギ酸，メタノール，（Ｂ％）：７５－９５％（１５ｍｉｎ），９５％（２ｍｉｎ），Ｆｌｏｗ　Ｒａｔｅ：０．４５ｍＬ／ｍｉｎ，Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：５０℃，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｃｏｒｏｎａ　ＣＡＤ（Ｃｈａｒｇｅｄ　Ａｅｒｏｓｏｌ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ））。ｓｉＲＮＡに対する総脂質量の比率は次式により算出した。
　ｓｉＲＮＡに対する総脂質量（ｗｔ／ｗｔ）＝［総脂質濃度］／［ｓｉＲＮＡ濃度］　（ｗｔ／ｗｔ）
（２－３）平均粒子径
　核酸脂質粒子の粒子径は、Ｚｅｔａ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ／Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｅｒ　ＮＩＣＯＭＰＴＭ　３８０ＺＬＳ　（ＰＡＲＴＩＣＬＥ　ＳＩＺＩＮＧ　ＳＹＳＴＥＭＳ）にて測定した。表中の平均粒子径は体積平均粒子径を表し、±以下は、偏差を表す。各特性評価の結果は表２３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000094
　以上の結果より、これらの核酸脂質粒子は、ｓｉＲＮＡの約９５％が脂質粒子内に封入されており、約９０ｎｍの平均粒子径を有していることが明らかとなった。
試験例５：骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを封入した核酸脂質粒子の薬効評価試験
　マウスＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを封入した核酸脂質粒子としてＡＤ－４７８８２（ＷＯ２０１２／１７７９２１に記載されているマウスＴｆＲ２に対するｓｉＲＮＡ）を封入した核酸脂質粒子を用いて以下の実験を行った。核酸脂質粒子は試験例４と同様の方法で調整した。骨髄機能の低下を誘発するために、１００　ｍｇ／ｋｇのｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ（東京化成工業社製）を雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。骨髄機能の低下を誘導しない対象群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎの代わりにＰＢＳをｉ．ｐ．投与した（ｎ＝５）。Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎを投与して４日後に、血漿中鉄濃度とＨＧＢ値を基に群化した後に、薬剤処置を行った（ｎ＝５／群）。薬剤は、０．５　ｍｇ／ｋｇ（０．５ｍｐｋ）および０．２５　ｍｇ／ｋｇ（０．２５ｍｐｋ）のＡＤ－４７８８２について、それぞれ核酸脂質粒子として静脈内投与（ｉ．ｖ．）を一回行った。ｖｅｈｉｃｌｅ対象群としては、薬剤の代わりにＰＢＳをｉ．ｖ．投与した。ＡＤ－４７８８２の投与前（Ｄａｙ０）、および、ＡＤ－４７８８２を投与してから３日後（Ｄａｙ３）、７日後（Ｄａｙ７）、１０日後（Ｄａｙ１０）、１１日後（Ｄａｙ１１）に尾静脈採血を行い、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ　Ｗｈｏｌｅ　Ｂｌｏｏｄ　ＨＢ　ｋｉｔ（Ｂｉｏａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、ＨＧＢ値を測定した。ＨＧＢ値の結果は、図７Ｃに示した。ＡＤ－４７８８２の投与前（Ｄａｙ０）、投与してから３日後（Ｄａｙ３）、７日後（Ｄａｙ７）においては、血漿中鉄濃度および血漿中ｈｅｐｃｉｄｉｎ濃度の測定を行った。血漿中鉄濃度は、血漿中鉄濃度は、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて測定した。血漿中ｈｅｐｃｉｄｉｎ濃度は、ＬＣ／ＭＳを用いて測定した。血漿中鉄濃度と血漿中ｈｅｐｃｉｄｉｎ濃度の結果は、ぞれぞれ、図７Ａと図７Ｂに示した。また、ＡＤ－４７８８２を処置して１１日後（Ｄａｙ１１）において、イソフルラン麻酔下で腹大静脈内採血を行い、多項目自動血球分析装置ＸＴ２０００（シスメックス株式会社製）を用いて、ｍｅａｎ　ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＭＣＨ）値を測定した。ＭＣＨ値の結果は、図７Ｄに示した。
　また、マウスを放血処置により安楽殺後、肝臓を採材し、マウスＴｆＲ２（ｍＴｆＲ２）およびマウスＨｅｐｃｉｄｉｎ（ｍＨｅｐｃｉｄｉｎ）のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＵＡＧＥＮ社製）を用いてキットのプロトコルに従って実施した。得られた５０００　ｎｇのＲＮＡを、Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ　ｔｏ　ｃＤＮＡ　ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて逆転写反応することによって得られたｃＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲによって内因性のマウスＴｆＲ２とＨｅｐｃｉｄｉｎのｍＲＮＡ量を測定した。
　定量的ＰＣＲは、ＩＤＴ　ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、以下のように行った。得られたｃＤＮＡは、蒸留水を用いて１０倍に希釈した（ｃＤＮＡ　１５μＬおよび蒸留水１３５μＬを混合した）。３８４ウェルのＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）の１ウェルあたり、５μＬのＩＤＴ　ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、０．２５μＬのマウスＴｆＲ２（ｍＴｆＲ２）プライマー（Ｍｍ．ＰＴ．５８．７８６０１８５、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、または、０．２５μＬのマウスＨｅｐｃｉｄｉｎ（ｍＨｅｐｃｉｄｉｎ）プライマー（Ｍｍ．ＰＴ．５８．４３５６３３９３．ｇ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、２．７５μＬの蒸留水、２μＬのｃＤＮＡの割合で混合（計１０μＬ）し、各ｃＤＮＡに対して２ウェル分調製し、定量的ＰＣＲを行った。ハウスキーピング遺伝子としては、マウスβ―ａｃｔｉｎ（ｍＡｃｔｂ）プライマー（Ｍｍ．ＰＴ．３９ａ．２２２１４８４３．ｇ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用し、上記に記したような割合で混合し、各ｃＤＮＡに対して２ウェル分調製し、定量的ＰＣＲを行った。ｍＴｆＲ２、ｍＨｅｐｃｉｄｉｎ、およびｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ量を２ウェル間の平均値として測定した。ｍＴｆＲ２およびｍＨｅｐｃｉｄｉｎのｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ発現量で正規化した。骨髄機能の低下を誘導していないｃｏｎｔｒｏｌ群におけるｍＲＮＡ量を１．０としたときの相対値として、ｖｅｈｉｃｌｅ群およびＡＤ－４７８８２処置群における相対ｍＲＮＡ量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。肝臓におけるｍＴｆＲ２およびｍＨｅｐｃｉｄｉｎのｍＲＮＡ発現量の結果は、それぞれ図７Ｅ及び図７Ｆに示した。
　これらの結果は、ＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によってＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を抑制することでＨＧＢ値を上昇させ、骨髄機能不全に伴う貧血、例えば、骨髄線維症に伴う貧血などの貧血疾患に対して治療効果を提供できる可能性を示すものである。
試験例６：骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとして、ＡＤ４７８８２．２３ＤＵＧ（実施例１７１）を用いて以下の実験を行った。骨髄機能の低下を誘発するために、１００　ｍｇ／ｋｇのＣａｒｂｏｐｌａｔｉｎを腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。骨髄機能の低下を誘導しない対象群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎの代わりにＰＢＳをｉ．ｐ．投与した（ｎ＝５）。Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎを投与して４日後における、ＨＧＢ値を基に群化した後に、薬剤処置を行った（ｎ＝９又は１０／群）。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡ処置群は、３　ｍｇ／ｋｇ（３ｍｐｋ）の用量で１回皮下投与した。陽性対象群としては、ａｃｔｉｖｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ　ＩＩＢ（ＡｃｔＲＩＩＢ）のリガンドをトラップする薬剤として、ＦｃをコンジュゲートしたＡｃｔＲＩＩＢ（ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ）を１０　ｍｇ／ｋｇの用量で３または４日おきに計３回皮下投与した。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃは、Ｌｕｓｐａｔｅｒｃｅｐｔ（ＡＣＥ－５３６）の細胞外ドメインをマウスＩｇＧ２ａのＦｃドメインに結合させた蛋白製剤であり（ＷＯ２０１６０９０１８８、Ｂｌｏｏｄ．　２０１４；１２３（２５）：３８６４－３８７２）、Ｓｍａｄ２／３シグナルを抑制することで赤血球分化を促進し、βサラセミアモデルマウスや骨髄異形成症候群モデルマウスに対して治療効果を示すことが知られている（Ｂｌｏｏｄ．　２０１４；１２３（２５）：３８６４－３８７２、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｖｏｌｕｍｅ　２０，　ｐａｇｅｓ４０８－４１４　（２０１４））。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを３から４日おきに計３回皮下投与した。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃの併用処置群としては、上記のようにｓｉＲＮＡを１回、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを計３回皮下投与した。
　薬剤処置を行う前（Ｄａｙ０）、処置して３日後（Ｄａｙ３）、８日後（Ｄａｙ８）に尾静脈採血を行い、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ　Ｗｈｏｌｅ　Ｂｌｏｏｄ　ＨＢ　ｋｉｔ（Ｂｉｏａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、ＨＧＢ値を測定した。ＨＧＢ値の結果は、図８Ａに示している（平均値±標準誤差）。図８Ｂは、薬剤処置をして３日後におけるＨＧＢ値を示した結果であり、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃとの併用効果を示すものである。薬剤処置をして９日後（Ｄａｙ９）において、イソフルラン麻酔下で腹大静脈内採血を行い、多項目自動血球分析装置ＸＴ２０００（シスメックス株式会社製）を用いて、ＨＧＢ値、ＭＣＨ値、ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ（ＨＣＴ）値、およびｒｅｄ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ　（ＲＢＣ）数を測定した。それぞれの結果は、図８Ｄから図８Ｇに示した（平均値±標準誤差）。また、マウスを放血処置により安楽殺後、肝臓を採材し、ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＲＮＡの抽出および定量的ＰＣＲは、試験例５に記載の通りに実施した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の結果は、図８Ｃに示した。骨髄機能の低下を誘導していないｃｏｎｔｒｏｌ群におけるｍＲＮＡ量を１．０としたときの相対値として、その他の群における相対ｍＲＮＡ量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。
　これらの結果は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によってＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を抑制することでＨＧＢ値を上昇させ、骨髄機能不全に伴う貧血、例えば、骨髄線維症に伴う貧血などの貧血疾患に対して治療効果を提供できる可能性を示すものである。また、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとＬｕｓｐａｔｅｒｃｅｐｔとの併用投与によって、例えば、骨髄線維症に伴う貧血などの貧血疾患に対して、単剤よりも大きな治療効果を提供できる可能性を示すものである。
試験例７：炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとして、ＡＤ４７８８２．５Ｇ（実施例１３１）、ＡＤ４７８８２．２３Ｇ（実施例１３２）、ＡＤ４７８８２．２３ｓＧ（実施例１３３）、ＡＤ４７８８２．２３ＤＵＧ（実施例１７１）、およびＡＤ４７８８２．２３ｓＤＵＧ（実施例１７２）の化合物を用いて以下の実験を行った。各ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを１　ｍｇ／ｋｇ（１ｍｐｋ）の用量で雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に１回投与した（Ｄａｙ０）。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを皮下投与した。ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳを処置して、５日後（Ｄａｙ５）にｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを１５０μＬ／マウスで皮下投与して炎症を誘導した。炎症を誘導しない対象群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、ｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅの代わりにＰＢＳをｓ．ｃ．投与した。本試験ではｎ＝５／群とした。１回目のｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを投与して２日後（Ｄａｙ７）に血漿中鉄濃度と血漿中ｈｅｐｃｉｄｉｎ濃度を測定した。血漿中鉄濃度は、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて測定した。血漿中ｈｅｐｃｉｄｉｎ濃度は、ＬＣ／ＭＳを用いて測定した。結果は、それぞれ図９Ａと図９Ｂに示した。
　１回目のｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを投与して６日後（Ｄａｙ１１）に再度ｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを１５０μＬ／マウスで皮下投与した。２回目のｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを投与して２日後（Ｄａｙ１３）において、イソフルラン麻酔下で腹大静脈内採血を行い、多項目自動血球分析装置ＸＴ２０００（シスメックス株式会社製）を用いて、ＨＧＢ値、ＭＣＨ値、ＲＢＣ数を測定した。結果はそれぞれ、図９Ｃから図９Ｅに示した。また、マウスを放血処置により安楽殺後、肝臓を採材し、ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＲＮＡの抽出および定量的ＰＣＲは、試験例５に記載の通りに実施した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の結果は、図９Ｆに示した。炎症を誘導していないｃｏｎｔｒｏｌ群におけるｍＲＮＡ量を１．０としたときの相対値として、その他の群における相対ｍＲＮＡ量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。
　これらの結果は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によってＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を抑制することでＨＧＢ値を上昇させ、炎症に伴う貧血、例えば、慢性腎臓病に伴う貧血や癌性貧血などの貧血疾患に対して治療効果を提供できる可能性を示すものである。
試験例８：炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとして、ＡＤ４７８８２．４１ＤＵＧ（実施例１７３）、ＡＤ４７８８２．８８ＤＵＧ（実施例１７４）、ＡＤ４７８８２．８９ＤＵＧ（実施例１７５）、ＡＤ４７８８２．９１ＤＵＧ（実施例１７６）、ＡＤ４７８８２．９２ＤＵＧ（実施例１７７）、およびＡＤ４７８８２．９３ＤＵＧ（実施例１７８）を用いて以下の実験を行った。各ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを１　ｍｇ／ｋｇ（１ｍｐｋ）の用量で雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に１回投与した（Ｄａｙ０）。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを皮下投与した。ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳを処置して、４日後（Ｄａｙ４）にｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを１５０μＬ／マウスで皮下投与して炎症を誘導した。炎症を誘導しない対象群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、ｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅの代わりにＰＢＳをｓ．ｃ．投与した。本試験ではｎ＝５／群とした。１回目のｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを投与して２日後（Ｄａｙ６）に血漿中鉄濃度を測定した。血漿中鉄濃度は、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて測定した。結果は、それぞれ図１０Ａに示した。
　１回目のｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを投与して７日後（Ｄａｙ１１）に再度ｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを１５０μＬ／マウスで皮下投与した。２回目のｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを投与して３日後（Ｄａｙ１４）において、イソフルラン麻酔下で腹大静脈内採血を行い、多項目自動血球分析装置ＸＴ２０００（シスメックス株式会社製）を用いて、ＨＧＢ値、ＭＣＨ値、ＲＢＣ数を測定した。結果はそれぞれ、図１０Ｂから１０Ｄに示した。また、マウスを放血処置により安楽殺後、肝臓を採材し、ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＲＮＡの抽出および定量的ＰＣＲは、試験例５に記載の通りに実施した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の結果は、図１０Ｅに示した。炎症を誘導していないｃｏｎｔｒｏｌ群におけるｍＲＮＡ量を１．０としたときの相対値として、その他の群における相対ｍＲＮＡ量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。
　これらの結果は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によってＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を抑制することでＨＧＢ値を上昇させ、炎症に伴う貧血、例えば、慢性腎臓病に伴う貧血や癌性貧血などの貧血疾患に対して治療効果を提供できる可能性を示すものである。
　試験例９：ＨｅｐＧ２細胞に対するＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡのリバーストランスフェクション法によるスクリーニング
　試験例２と同様の方法で、ｓｉＲＮＡとしてＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ（実施例１６９）、ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｓ１（実施例１８０）、ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｓ２（実施例１８１）、ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｅ１（実施例１８２）、ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｅ２（実施例１８３）、及びＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｅ３（実施例１８４）を用いて、ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量について試験した。ネガティブコントロール（ＮＴ）におけるｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を１．０としたときの相対値として、各ｓｉＲＮＡを処置した検体の相対ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を算出して表記した。結果は、以下の表２４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000095
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000096
試験例１０：正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたｓｉＲＮＡとしてＡＤ４７８８２．５Ｇ（実施例１３１）及びＡＤ４７８８２．９４ＤＵＧ（実施例１７９）を用いて、以下の実験を行った。ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたｓｉＲＮＡとして、ＡＤ４７８８２．５Ｇを１０　ｍｇ／ｋｇ（１０ｍｐｋ）または３　ｍｇ／ｋｇ（３ｍｐｋ）または１　ｍｇ／ｋｇ（１ｍｐｋ）の用量で雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に皮下投与（ｓ．ｃ．）した（ｎ＝５／群）。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを皮下投与した（ｎ＝５／群）。ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳの処置前（Ｄａｙ０）、処置して７日後（Ｄａｙ７）、２１日後（Ｄａｙ２１）、２８日後（Ｄａｙ２８）に尾静脈採血を行い、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて、血漿中鉄濃度を測定した。血漿中鉄濃度の結果を図１３Ａに示した（平均値±標準誤差）。
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたｓｉＲＮＡとして、ＡＤ４７８８２．９４ＤＵＧを３　ｍｇ／ｋｇ（３ｍｐｋ）または１　ｍｇ／ｋｇ（１ｍｐｋ）または０．３　ｍｇ／ｋｇ（０．３ｍｐｋ）の用量で雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に皮下投与（ｓ．ｃ．）した（ｎ＝５／群）。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを皮下投与した（ｎ＝５／群）。ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳの処置前（Ｄａｙ０）、処置して７日後（Ｄａｙ７）、２１日後（Ｄａｙ２１）、２８日後（Ｄａｙ２８）に尾静脈採血を行い、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて、血漿中鉄濃度を測定した。血漿中鉄濃度の結果を図１３Ｂに示した（平均値±標準誤差）。
　この結果は、特にＡＤ４７８８２．９４ＤＵＧが、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて安定的にＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を抑制し、血漿中鉄濃度を上昇させることを示すものである。また同様に、ＡＤ４７８８２．８８ＤＵＧ（実施例１７４の化合物）、ＡＤ４７８８２．８９ＤＵＧ（実施例１７５の化合物）、ＡＤ４７８８２．９１ＤＵＧ（実施例１７６の化合物）、ＡＤ４７８８２．９２ＤＵＧ（実施例１７７の化合物）、ＡＤ４７８８２．９３ＤＵＧ（実施例１７８の化合物）、ＡＤ４７８８２．７１ＤＵＧ（ＡＤ４７８８２．８８ＤＵＧの化合物に対して、７１型の修飾パターンを施した化合物）、ＡＤ４７８８２．８０ＤＵＧ（ＡＤ４７８８２．８８ＤＵＧの化合物に対して、８０型の修飾パターンを施した化合物）、又はＡＤ４７８８２．９０ＤＵＧ（ＡＤ４７８８２．８８ＤＵＧの化合物に対して、９０型の修飾パターンを施した化合物）をそれぞれ正常マウスに処置した他の試験において、処置して２８日後における血漿中鉄濃度が上昇していることが確認された。これらの結果から、標的配列が異なるＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡに対してこれらの化合物と同様の修飾パターンを施すことで、安定的にＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を抑制し、血漿中鉄濃度を上昇させることができるｓｉＲＮＡが得られることが示唆される。
試験例１１：骨髄機能低下に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとして、ＡＤ４７８８２．２３ＤＵＧ（実施例１７１）及びＡＤ４７８８２．９４ＤＵＧ（実施例１７９）を用いて以下の実験を行った。骨髄機能の低下を誘発するために、１００　ｍｇ／ｋｇのｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎを雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎを投与して４日後における、ＨＧＢ値及び血漿中鉄濃度を基に群化した後に、薬剤処置を行った（ｎ＝６／群）。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡ処置群は、３　ｍｇ／ｋｇ（３ｍｐｋ）の用量で１回皮下投与（ｓ．ｃ．）した。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを１回皮下投与した。
　薬剤処置を行う前（Ｄａｙ０）に尾静脈採血を行い、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ　Ｗｈｏｌｅ　Ｂｌｏｏｄ　ＨＢ　ｋｉｔ（Ｂｉｏａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、ＨＧＢ値を測定した。薬剤処置前のＨＧＢ値の結果は、図１４Ａに示した（平均値±標準誤差）。また、血漿中鉄濃度は、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて測定した。薬剤処置前の血漿中鉄濃度の結果は、図１４Ｂに示した（平均値±標準誤差）。図１４Ｃは、薬剤処置をして８日後（Ｄａｙ８）における血漿中鉄濃度を示した結果である。薬剤処置をして９日後（Ｄａｙ９）において、イソフルラン麻酔下で腹大静脈内採血を行い、多項目自動血球分析装置ＸＴ２０００（シスメックス株式会社製）を用いて、ＨＧＢ値、ＭＣＨ値、ＲＢＣ数を測定した。それぞれの結果は、図１４Ｄから図１４Ｆに示した（平均値±標準誤差）。
　これらの結果は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によって血漿中鉄濃度を上昇させることでＨＧＢ値を上昇させ、骨髄機能不全に伴う貧血、例えば、骨髄線維症に伴う貧血などの貧血疾患に対して治療効果を提供できる可能性を示すものである。
試験例１２：炎症に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとして、ＡＤ４７８８２．９２ＤＵＧ（実施例１７７）及びＡＤ４７８８２．９４ＤＵＧ（実施例１７９）を用いて以下の実験を行った。炎症を誘発するために、ｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを１５０μＬ／マウスで週３回、雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に皮下投与（ｓ．ｃ．）した。炎症を誘導しない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、ｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅの代わりにＰＢＳを皮下投与した。１回目のｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを投与して７日後（Ｄａｙ０）において、尾静脈採血を行い、血漿中鉄濃度及びＨＧＢ値を測定した。血漿中鉄濃度は、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて測定した。また、ＨＧＢ値はＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ　Ｗｈｏｌｅ　Ｂｌｏｏｄ　ＨＢ　ｋｉｔ（Ｂｉｏａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。結果はそれぞれ図１５Ａ及び図１５Ｂに示した（平均値±標準誤差）。薬剤は雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に投与した（ｎ＝５／群）。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡ処置群は、３　ｍｇ／ｋｇ（３ｍｐｋ）の用量で１回皮下投与した。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを１回皮下投与した。
　薬剤処置をして４日後（Ｄａｙ４）、処置して８日後（Ｄａｙ８）に尾静脈採血を行い、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて血漿中鉄濃度を測定した。結果は図１５Ａに示した（平均値±標準誤差）。また、薬剤処置をして８日後において、イソフルラン麻酔下で腹大静脈内採血を行い、多項目自動血球分析装置ＸＴ２０００（シスメックス株式会社製）を用いて、ＨＧＢ値、ＭＣＨ値、ＲＢＣ数を測定した。それぞれの結果は、図１５Ｃから図１５Ｅに示した（平均値±標準誤差）。また、マウスをイソフルラン麻酔下で放血処置により安楽殺後、肝臓を採材し、ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＲＮＡの抽出および定量的ＰＣＲは、試験例５に記載の通りに実施した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の結果は、図１５Ｆに示した。炎症を誘導していないｃｏｎｔｒｏｌ群におけるｍＲＮＡ量を１．０としたときの相対値として、その他の群における相対ｍＲＮＡ量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。
　これらの結果は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によってＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を抑制することでＨＧＢ値を上昇させ、炎症に伴う貧血、例えば、慢性腎臓病に伴う貧血や癌性貧血などの貧血疾患に対して治療効果を提供できる可能性を示すものである。
試験例１３：ＮＵＰ９８－ＨＯＸＤ１３マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　無効造血および不十分な赤血球分化成熟という特徴を有する骨髄異形成症候群（Ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ，　ＭＤＳ）のモデルマウスとして、ＮＵＰ９８－ＨＯＸＤ１３マウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（Ｖａｖ１－ＮＵＰ９８／ＨＯＸＤ１３）Ｇ２Ａｐｌａ／Ｊ）が知られている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｖｏｌｕｍｅ　２０，　ｐａｇｅｓ４０８-４１４　（２０１４））。ＭＤＳに対するＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの治療効果を検証するために、ＮＵＰ９８－ＨＯＸＤ１３マウスに対する、ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの投与試験を行った。化合物は、ＡＤ４７８８２．２３ＤＵＧ（実施例１７１）を用いた。
　ＮＵＰ９８－ＨＯＸＤ１３マウスは、ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン株式会社から購入し実験に使用した。４か月齢のＮＵＰ９８－ＨＯＸＤ１３マウスにおける血漿中鉄濃度とＨＧＢ値と体重値を基に群化した後、薬剤処置を行った（ｎ＝８／群）。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡ処置群は、５　ｍｇ／ｋｇ（５ｍｐｋ）の用量で１週間に１回皮下投与（ｓ．ｃ．）した。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを１週間に１回皮下投与した。
　薬剤処置を開始して２週間後、４週間後、及び８週間後に尾静脈採血を行い、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて血漿中鉄濃度を測定した。結果は図１６Ａに示した（平均値±標準誤差）。また、薬剤処置を開始して２週間後、４週間後、６週間後、及び８週間後に尾静脈採血を行い、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ　Ｗｈｏｌｅ　Ｂｌｏｏｄ　ＨＢ　ｋｉｔ（Ｂｉｏａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＨＧＢ値を測定した。結果は図１６Ｂに示した（平均値±標準誤差）。また、薬剤処置を開始して８週間後において、イソフルラン麻酔下で腹大静脈内採血を行い、多項目自動血球分析装置ＸＴ２０００（シスメックス株式会社製）を用いて、ＨＧＢ値、ＭＣＨ値、ＲＢＣ数を測定した。それぞれの結果は、図１６Ｃから図１６Ｅに示した（平均値±標準誤差）。また、マウスをイソフルラン麻酔下で放血処置により安楽殺後、肝臓を採材し、ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＲＮＡの抽出および定量的ＰＣＲは、試験例５に記載の通りに実施した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の結果は、図１６Ｆに示した。ｖｅｈｉｃｌｅ群におけるｍＲＮＡ量を１．０としたときの相対値として、その他の群における相対ｍＲＮＡ量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。
　これらの結果は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によってＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を抑制することで血漿中鉄濃度を上昇させ、その結果、ＨＧＢ値を上昇させることで、骨髄機能低下に伴う貧血疾患の１つであるＭＤＳに対して治療効果を提供できる可能性を示すものである。
試験例１４：慢性腎臓病に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとして、ＡＤ４７８８２．９４ＤＵＧ（実施例１７９）の化合物を用いて以下の実験を行った。慢性腎臓病とそれに伴う貧血を誘発するために、ａｄｅｎｉｎｅ（ＷＡＫＯ社製品、０１０－１１５１３）が０．２％含有量となるように調製した餌を雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に与えた。０．２％　ａｄｅｎｉｎｅ食を介入して２週間後に尾静脈採血を行い、血漿中鉄濃度及びＨＧＢ値を測定した。血漿中鉄濃度は、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて測定した。また、ＨＧＢ値は、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ　Ｗｈｏｌｅ　Ｂｌｏｏｄ　ＨＢ　ｋｉｔ（Ｂｉｏａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。結果はそれぞれ図１７Ａ及び図１７Ｂに示した（平均値±標準誤差）。これらの血漿中鉄濃度、ＨＧＢ値及び体重値を基に群化した後、薬剤処置を行った（ｎ＝６／群）。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡ処置群は、３　ｍｇ／ｋｇ（３ｍｐｋ）または１　ｍｇ／ｋｇ（１ｍｐｋ）または０．３　ｍｇ／ｋｇ（０．３ｍｐｋ）の用量で１週間に１回皮下投与した。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを１週間に１回皮下投与した。慢性腎臓病に伴う貧血を誘導しない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、０．２％　ａｄｅｎｉｎｅを含有しない餌を与えた。
　薬剤処置を開始して６週間後に尾静脈採血を行い、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて血漿中鉄濃度を測定した。結果は図１７Ｃに示した（平均値±標準誤差）。また、薬剤処置を開始して６週間後において、イソフルラン麻酔下で腹大静脈内採血を行って採取した血液を用いて、多項目自動血球分析装置ＸＴ２０００（シスメックス株式会社製）を用いて、ＨＧＢ値、ＭＣＨ値、ＲＢＣ数を測定した。それぞれの結果は、図１７Ｄから図１７Ｆに示した（平均値±標準誤差）。また、マウスをイソフルラン麻酔下で放血処置により安楽殺後、肝臓を採材し、ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＲＮＡの抽出および定量的ＰＣＲは、試験例５に記載の通りに実施した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の結果は、図１７Ｇに示した。ｖｅｈｉｃｌｅ群におけるｍＲＮＡ量を１．０としたときの相対値として、その他の群における相対ｍＲＮＡ量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。
　これらの結果は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によってＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を抑制することで血漿中鉄濃度及びＨＧＢ値を上昇させることで、慢性腎臓病に伴う貧血に対して治療効果を提供できる可能性を示すものである。
試験例１５：Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ（ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤）投与に伴う貧血モデルマウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ投与による貧血に対するＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの効果を検証するために、ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとして、ＡＤ４７８８２．２３ＤＵＧ（実施例１７１）の化合物を用いて以下の実験を行った。
　Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ投与による貧血を誘発するために、０．１％　Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ（ＬＣ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製品　Ｒ－６６８８）含有量となるように調製した餌を雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に与えた。０．１％　Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ含有食を介入して６週間後に尾静脈採血を行い、多項目自動血球分析装置ＸＴ２０００（シスメックス株式会社製）を用いて、ＨＧＢ値を測定した。結果は図１８Ａに示した（平均値±標準誤差）。これらのＨＧＢ値及び体重値を基に群化した後、薬剤処置を行った（ｎ＝５／群）。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡ処置群は、３　ｍｇ／ｋｇ（３ｍｐｋ）の用量で１週間に１回皮下投与（ｓ．ｃ．）した。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを１週間に１回皮下投与した。Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂによる貧血を誘導しない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、０．１％　Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂを含有しない餌を与えた。
　薬剤処置を開始して３週間後に尾静脈採血を行い、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて血漿中鉄濃度を測定した。結果は図１８Ｂに示した（平均値±標準誤差）。また、薬剤処置を開始して６週間後において、イソフルラン麻酔下で腹大静脈内採血を行って採取した血液を用いて、多項目自動血球分析装置ＸＴ２０００（シスメックス株式会社製）によって、ＨＧＢ値、ＭＣＨ値、ＲＢＣ数を測定した。それぞれの結果は、図１８Ｃから図１８Ｅに示した（平均値±標準誤差）。また、マウスをイソフルラン麻酔下で放血処置により安楽殺後、肝臓を採材し、ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＲＮＡの抽出および定量的ＰＣＲは、試験例５に記載の通りに実施した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の結果は、図１８Ｆに示した。０．１％　Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ含有餌を与えていないｃｏｎｔｒｏｌ群におけるｍＲＮＡ量を１．０としたときの相対値として、その他の群における相対ｍＲＮＡ量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。
　これらの結果は、骨髄線維症の治療におけるＲｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ等のＪＡＫ２阻害剤とＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとの併用効果を提供できる可能性を示すものである。
試験例１６：ヒトＴｆＲ２発現マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　株式会社特殊免疫研究所において作出した、ヒトＴｆＲ２遺伝子座を有する雄性または雌性のＴｆＲ２ヒト化マウスを用いて、ヒトＴｆＲ２　ｍＲＮＡに対するＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの効果を検証するために、以下の実験を行った。ＴｆＲ２ヒト化マウスは、ヒトＴＦＲ２遺伝子座を内包するＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）クローン（ＲＰ１１－２６４Ｎ５）を用いて作出した。ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとして、ＴｆＲ２－０１９．８８ＤＵＧ（実施例１６２の化合物）、ＴｆＲ２－０１９．９２ＤＵＧ（実施例１６７の化合物）、ＴｆＲ２－０１９．９３ＤＵＧ（実施例１６８の化合物）、ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ（実施例１６９の化合物）を用いた。
　ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡ処置群は、３　ｍｇ／ｋｇ（３ｍｐｋ）または０．３　ｍｇ／ｋｇ（０．３ｍｐｋ）の用量で１回皮下投与（ｓ．ｃ．）した（ｎ＝３／群）。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを１回皮下投与した（ｎ＝４／群）。
　薬剤処置を開始して７日後において、イソフルラン麻酔下でマウスを放血処置により安楽殺後、肝臓を採材し、ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＲＮＡの抽出および定量的ＰＣＲは、試験例５に記載の通りに実施した。ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ｈＴｆＲ２に対するプライマーは、試験例１及び試験例２に記載のものを使用した。ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の結果は、図１９に示した。ｖｅｈｉｃｌｅ群におけるｍＲＮＡ量を１．０としたときの相対値として、その他の群における相対ｍＲＮＡ量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。
　これらの結果は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によって、ヒトＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現量を抑制できることを示している。また、ヒトＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現量を抑制することでＨＧＢ値を上昇させ、骨髄機能不全に伴う貧血、例えば、骨髄線維症に伴う貧血などの貧血疾患や、炎症に伴う貧血、例えば、慢性腎臓病に伴う貧血などの貧血疾患に対して、治療効果を提供できる可能性を示すものである。また、ヒトＴｆＲ２発現マウスからさらに内在性のマウスＴｆＲ２をノックアウトしたマウスにＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ（実施例１６９の化合物）を処置した他の試験において、４２日後においてもヒトＴｆＲ２遺伝子の発現が抑制され、ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧの安定的なヒトＴｆＲ２遺伝子発現抑制効果が確認された。
試験例１７：ヒト初代肝臓細胞を用いたＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたｓｉＲＮＡは、肝臓ヘパトサイトに発現しているＡＳＧＰＲ（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１）を介して肝臓に取り込まれることが知られている。そこで、トランスフェクション試薬を用いない条件における、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの効果を検証するために、ヒト初代肝臓細胞を用いてＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験を行った。ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとして、ＴｆＲ２－０１９．８８ＤＵＧ（実施例１６２）、ＴｆＲ２－０１９．８９ＤＵＧ（実施例１６３）、ＴｆＲ２－０１９．９０ＤＵＧ（実施例１６４）、ＴｆＲ２－０１９．９１ＤＵＧ（実施例１６６）、ＴｆＲ２－０１９．９２ＤＵＧ（実施例１６７）、ＴｆＲ２－０１９．９３ＤＵＧ（実施例１６８）、ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ（実施例１６９）、ＴｆＲ２－０１９．９５ＤＵＧ（実施例１７０）、の化合物を用いた。
（ヒト初代肝臓細胞の培養）
　液体窒素タンクで保管されたヒト初代肝臓細胞（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製品、ＨＭＣＰＩＳ）を、３７℃の温浴を用いて融解し、予め３７℃で温めておいた１０　ｍＬのＣｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ　Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　Ｒｅｃｏｖｅｒｙ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＨＲＭ）（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製品、ＣＭ７０００）に注ぎ入れ転倒混和した。その後、遠心（１００ｇ、１０分間）を行い、上清を除去した後、予め３７℃に温めておいた５　ｍＬの細胞播種用培地を用いて細胞懸濁液を調製した。細胞播種用培地は、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製品、Ａ１２１７６０１）にＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｐｌａｔｉｎｇ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　Ｐａｃｋ（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製品、ＣＭ３０００）を添加することで調製した。その後、生細胞数をカウントし、５ｘ１０＾５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、細胞播種用培地を用いて調製し、コラーゲンコートの９６　ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌあたりに細胞を５ｘ１０＾４　ｃｅｌｌｓとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーターで４～６時間培養し、顕微鏡を用いて細胞がプレートに接着していることを確認した。その後、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの添加実験を行った。
（ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの添加）
　予め３７℃で温めておいた細胞培養用培地を用いてＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを含む培地を調製した。ｓｉＲＮＡ検体を１種類あたり２ウェル分、ｓｉＲＮＡの代わりに蒸留水としたネガティブコントロール（ＮＴ）を２ウェル分調製した。ｓｉＲＮＡの最終濃度としては、１００００ｎＭから４．８ｎＭまでの範囲で、５倍公比になるように調製した。細胞培養用培地は、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製品、Ａ１２１７６０１）にＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　Ｐａｃｋ（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製品、ＣＭ４０００）を添加することで調製した。９６ｗｅｌｌプレートに播種されたヒト初代肝臓細胞の各々のウェルにおける細胞播種用培地を吸引除去した後に、調製したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを含有した培地を１００μＬずつ添加した。化合物を添加して３日後にＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄し、ＲＮＡの抽出を行った。
（ＲＮＡ抽出、ｑＰＣＲ）
　ＲＮＡの抽出および定量的ＰＣＲは、試験例１に記載の通りに実施した。ｈＴｆＲ２とｈ１８ＳのｍＲＮＡ発現量を２ウェル間の平均値として測定した。ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｈ１８ＳのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ネガティブコントロール（ＮＴ）におけるｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を１．０としたときの相対値として、各ｓｉＲＮＡを処置した検体の相対ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。結果は、それぞれ図２０Ａ～図２０Ｃに示した。
　これらの結果は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によって、ヒト肝臓ヘパトサイトに取り込まれることで、ヒトＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現量を抑制できることを示している。また、ヒトＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を抑制することでＨＧＢ値を上昇させ、骨髄機能不全に伴う貧血、例えば、骨髄線維症に伴う貧血などの貧血疾患や、炎症に伴う貧血、例えば、慢性腎臓病に伴う貧血などの貧血疾患に対して、治療効果を提供できる可能性を示すものである。
試験例１８：ＨｅｐＧ２細胞を用いたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡのＨｅｐｃｉｄｉｎ遺伝子発現に対する効果
　試験例２と同様の方法で、リバーストランスフェクション法を用いてｓｉＲＮＡをＨｅｐＧ２細胞に導入して２日後における、ＨｅｐｃｉｄｉｎのｍＲＮＡ発現量の評価を行った。Ｈｅｐｃｉｄｉｎに対するプライマーは、Ｈｓ００２２１７８３＿ｍ１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。ｓｉＲＮＡとして、ＴｆＲ２－０１９（実施例１９）、ＴｆＲ２－０３９（実施例３９）、ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ（実施例１６９）、ＴｆＲ２－０３９．２３ＤＵＧ（実施例１４４）を用いた。
　Ｈｅｐｃｉｄｉｎ　ｍＲＮＡ発現量の評価について、ネガティブコントロール（ＮＴ）におけるＨｅｐｃｉｄｉｎ　ｍＲＮＡ発現量を１．０としたときの相対値として、各ｓｉＲＮＡを処置した検体の相対Ｈｅｐｃｉｄｉｎ　ｍＲＮＡ発現量を算出して表記した。結果は、図２１に示した。
　本発明のｓｉＲＮＡは、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現を抑制することができ、さらに鉄代謝において中心的な役割を担っているｈｅｐｃｉｄｉｎの産生を抑制し得る。本発明のｓｉＲＮＡは、ＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現及び／又はｈｅｐｃｉｄｉｎの産生を抑制することにより治療又は予防可能な疾患の治療又は予防に有用である。
配列番号１：ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２～２４：１本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
配列番号２５～２８：２本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域のヌクレオチド配列
配列番号２９～３５：２本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域のヌクレオチド配列
配列番号３６、３７：２本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域のヌクレオチド配列
配列番号３８～４２：２本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域のヌクレオチド配列
配列番号４３：ＴｆＲ２－０１９におけるセンス鎖領域の相補領域のヌクレオチド配列
配列番号４４：ＴｆＲ２－０１９におけるアンチセンス鎖領域の相補領域のヌクレオチド配列
配列番号４５：ＴｆＲ２－０３９におけるセンス鎖領域の相補領域のヌクレオチド配列
配列番号４６：ＴｆＲ２－０３９におけるアンチセンス鎖領域の相補領域のヌクレオチド配列
配列番号４７：２本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域のヌクレオチド配列

Claims (57)

  1. 　トランスフェリン受容体２のｍＲＮＡに対するノックダウン作用を有する、以下の（Ａ）のアンチセンス鎖領域及び（Ｂ）のセンス鎖領域を含むオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩；
    （Ａ）配列番号１のヌクレオチド番号２８４５から２８６７、又は、ヌクレオチド番号１５３４から１５５６の間の領域において連続する１８～２１塩基からなる標的配列と実質的に相補的な標的対応配列からなり、該標的対応配列の５’末端のヌクレオシドは、該標的配列の３’末端のヌクレオシドと実質的に相補的なヌクレオシド、アデニンを有するヌクレオシド、又はウラシルを有するヌクレオシドであり、該標的対応配列の５’末端及び／又は３’末端に５塩基以下のオーバーハング構造が付加していてもよい、１８～３１塩基長からなるアンチセンス鎖領域、及び、
    （Ｂ）前記アンチセンス鎖領域の標的対応配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含有し、さらに該ヌクレオチド配列の５’末端及び／又は３’末端に５塩基以下のオーバーハング構造が付加していてもよい、１８～３１塩基長からなるセンス鎖領域。
  2. 　前記標的配列が、配列番号１のヌクレオチド番号２８４７～２８６５、又はヌクレオチド番号１５３６～１５５４の１９塩基からなるヌクレオチド配列である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  3. 　前記アンチセンス鎖領域の標的対応配列における５’末端のヌクレオシドが、アデニン又はウラシルを有するヌクレオシドである、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  4. 　前記アンチセンス鎖領域の標的対応配列が、配列番号１のヌクレオチド番号２８４７～２８６５、又はヌクレオチド番号１５３６～１５５４の１９塩基からなる標的配列と完全に相補的なヌクレオチド配列である、請求項１～３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  5. 　オリゴヌクレオチドを構成する糖及び／又はリン酸ジエステル結合の少なくとも１個が修飾されている、請求項１～４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  6. 　オリゴヌクレオチドを構成する糖がＤ－リボフラノースであり、糖の修飾がＤ－リボフラノースの２’位の水酸基の修飾である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  7. 　糖の修飾が、Ｄ－リボフラノースの２’－デオキシ化、２’－Ｏ－アルキル化、２’－Ｏ－アルコキシアルキル化、２’－ハロゲン化、及び／又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－アルキレン化である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  8. 　前記２’－Ｏ－アルキル化が２’－Ｏ－メチル化、前記２’－Ｏ－アルコキシアルキル化が２’－Ｏ－メトキシエチル化、前記２’－ハロゲン化が２’－フルオロ化、並びに、前記２’－Ｏ，４’－Ｃ－アルキレン化が２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン化及び／又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン化である、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  9. 　リン酸ジエステル結合の修飾がホスホロチオエートである、請求項５～８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  10. 　センス鎖領域及び／又はアンチセンス鎖領域の３’末端のヌクレオシドにおけるＤ－リボフラノースが３’－Ｏ－アルキル化されていることを特徴とする、請求項５～９のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  11. 　前記３’－Ｏ－アルキル化が３’－Ｏ―メチル化である、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  12. 　センス鎖領域及び／又はアンチセンス鎖領域の５’末端及び／又は３’末端に、３塩基以下のオーバーハング構造が付加している、請求項１～１１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  13. 　オーバーハング構造が２塩基である、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  14. 　オーバーハング構造が、２個の連続したチミンを含むヌクレオシド、又は２個の連続したウラシルを含むヌクレオシドである、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  15. 　オーバーハング構造が、アンチセンス鎖領域の３’末端に付加した２個の連続したＵ（Ｍ）である、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  16. 　センス鎖領域が以下の式（Ｉ）に示すオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖領域が以下の式（ＩＩ）に示すオリゴヌクレオチドからなり、さらに以下の（ａ）乃至（ｇ）に示される特徴を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩：
    センス鎖領域：５’　ＳＯ５－Ｓａ－Ｓ１９－Ｓ１８－Ｓ１７－Ｓ１６－Ｓ１５－Ｓ１４－Ｓ１３－Ｓ１２－Ｓ１１－Ｓ１０－Ｓ９－Ｓ８－Ｓ７－Ｓ６－Ｓ５－Ｓ４－Ｓ３－Ｓ２－Ｓ１－ＳＯ３　３’（Ｉ）
    アンチセンス鎖領域：５’　ＡＯ５－Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８－Ａ９－Ａ１０－Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５－Ａ１６－Ａ１７－Ａ１８－Ａ１９－Ａａ－ＡＯ３　３’（ＩＩ）
    （ａ）Ｓ１は３’－修飾ヌクレオシドであり、Ｓ２～Ｓ１９は１個のヌクレオシドを示し、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡであり、Ｓａは０～３個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、ＳＯ３及びＳＯ５はそれぞれ独立して、０～３個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドを示す。各ヌクレオシド間の結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を示す；
    （ｂ）Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４及びＡ１５は１個のヌクレオシドを示し、そのうち少なくとも１つはＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシド又は２’－ＭＯＥ　ＲＮＡであり、それ以外は２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ又は２’－Ｆ　ＲＮＡであり、Ａ１～Ａ１０及びＡ１６～Ａ１９は１個のヌクレオシドを示し、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、Ａａは０～３個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、ＡＯ３及びＡＯ５はそれぞれ独立して、０～３個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドを示す。各ヌクレオシド間の結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を示す；
    （ｃ）Ａ２～Ａａの間のヌクレオチド配列は、標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列からなり、Ａ１は標的配列の対応するヌクレオシドと相補的な塩基を有するヌクレオシド、アデニンを有するヌクレオシド、チミンを有するヌクレオシド、又はウラシルを有するヌクレオシドであり、ＡＯ３とＡＯ５が存在する場合、そのヌクレオチド配列は、それぞれ独立して、標的配列の対応するヌクレオシドとは独立に選択されるヌクレオチド配列である；
    （ｄ）Ｓ１～Ｓａの間のヌクレオチド配列と、Ａ１～Ａａの間のヌクレオチド配列とは、互いに実質的に相補的なヌクレオチド配列であり、かつ、２本鎖構造を形成している；
    （ｅ）ＳＯ５とＡＯ３の両方が存在する場合、ＳＯ５及びＡＯ３は、互いに相補的ではないヌクレオチド配列である；
    （ｆ）ＳＯ３とＡＯ５の両方が存在する場合、ＳＯ３及びＡＯ５は、互いに相補的ではないヌクレオチド配列である；並びに、
    （ｇ）センス鎖領域及び／又はアンチセンス鎖領域の、５’末端のヌクレオシドの５’位及び／又は３’末端のヌクレオシドの３’位もしくは３’末端のヌクレオシドが３’－修飾ヌクレオシドである場合はその２’位、が化学修飾されていてもよい。
  17. 　式（ＩＩ）において、Ｓ１が３’－ＯＭｅ　ＲＮＡである請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  18. 　２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡ又はＥＮＡである、請求項１６又は１７に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  19. 　式（ＩＩ）において、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４及びＡ１５の２つ以上が同一又はそれぞれ異なっていてもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシド又は２’－ＭＯＥ　ＲＮＡである請求項１６～１８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  20. 　式（ＩＩ）において、Ａ１４がＲＮＡ又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドである、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  21. 　式（ＩＩ）において、Ａ１３が２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシド又は２’－ＯＭｅ　ＲＮＡであり、Ａ１４がＲＮＡである、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  22. 　式（ＩＩ）において、Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５が以下のいずれか；
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、又は、
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    である、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  23. 　式（ＩＩ）において、Ａ１２がＤＮＡであり、Ａ１４が２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドである、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  24. 　式（ＩＩ）において、Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５が以下のいずれか；
    Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(ENA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(ENA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(LNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、又は、
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(LNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    である、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  25. 　式（ＩＩ）において、Ａ２、Ａ６及びＡ１６が２’－Ｆ　ＲＮＡである、請求項１６～２４のいずれ１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  26. 　式（ＩＩ）において、更に、Ａ８、Ａ９及びＡ１０からなる群から選択される１又は２個のヌクレオシドが２’－Ｆ　ＲＮＡであり、Ａ１、Ａ３～Ａ５、Ａ７、Ａ１７～Ａ１９及びＡａのヌクレオシドが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  27. 　式（ＩＩ）において、Ａ２、Ａ６、Ａ８、Ａ１０及びＡ１６が２’－Ｆ　ＲＮＡであり、Ａ１、Ａ３～Ａ５、Ａ７、Ａ９、Ａ１７～Ａ１９及びＡａのヌクレオシドが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  28. 　式（Ｉ）において、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３及びＳ１５が２’－Ｆ　ＲＮＡである請求項１６～２７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  29. 　式（Ｉ）において、Ｓ２～Ｓ１０、Ｓ１４、Ｓ１６～Ｓ１９及びＳａが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである請求項２８のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  30. 　式（ＩＩ）においてＲＮＡが採用される場合、当該ＲＮＡとその３’側に隣接するヌクレオシドとの間の結合がホスホロチオエート結合であることを特徴とする、請求項１６～２９のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  31. 　前記オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端から２～５ヌクレオチドにおいて、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であることを特徴とする、請求項１６～３０のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  32. 　ＳＯ３、ＳＯ５、ＡＯ５及びＡＯ３のヌクレオシド数が０～２である、請求項１６～３１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  33. 　ＳＯ３のヌクレオシド数が０である、請求項３２に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  34. 　ＳＯ３、ＳＯ５及びＡＯ５のヌクレオシド数が０であり、ＡＯ３のヌクレオシド数が２である、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  35. 　前記アンチセンス鎖領域及びセンス鎖領域が、それぞれ独立したオリゴヌクレオチドとして２本鎖オリゴヌクレオチドを形成していることを特徴とする、請求項１～３４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  36. 　前記アンチセンス鎖領域の５’末端のヌクレオシドとセンス鎖領域の３’末端のヌクレオシドとがリンカー構造により連結されていることを特徴とする、請求項１～３４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  37. 　前記リンカー構造が、下記式
    [式中、破線は結合手を示し、フェニル基に結合している酸素原子は、隣接するアンチセンス鎖領域の５’末端のヌクレオチドの５’－リン酸基とリン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合することを表し、他方の末端のメチレン基は、隣接するセンス鎖領域の３’末端のヌクレオチドの３’－リン酸基（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位のリン酸基）とリン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合することを表す。]
    で表される構造である、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  38. 　オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオシドの５’位及び／又は３’末端のヌクレオシドの３’位もしくは３’末端のヌクレオシドが３’－修飾ヌクレオシドである場合はその２’位、がＧａｌＮＡｃユニットで化学修飾されていることを特徴とする、請求項１～３７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  39. 　前記ＧａｌＮＡｃユニットが、
    [式中、破線は隣接するヌクレオチドの５’末端のリン酸基及び／又は３’末端のリン酸基（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位のリン酸基）とリン酸ジエステル結合することを表す。]
    で表されるユニットであることを特徴とする、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  40. 　オーバーハング構造を除くセンス鎖領域が以下の式（Ｉ－１）であり、オーバーハング構造を除くアンチセンス鎖領域が以下の式（ＩＩ－１）～（ＩＩ－１０）のいずれかであり、前記センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域がそれぞれ独立したオリゴヌクレオチドとして２本鎖オリゴヌクレオチドを形成しており、前記センス鎖領域及び前記アンチセンス鎖領域はそれぞれ独立してオーバーハング構造を含んでいてもよい、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
    （式）
    ５’　C(M)G(M)U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(3M)　３’　（Ｉ－１）
    ５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－１）
    ５’　U(M)U(F)G(M)A(F)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－２）
    ５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－３）
    ５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(F)G(M)　３’　（ＩＩ－４）
    ５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－５）
    ５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－６）
    ５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－７）
    ５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－８）
    ５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－９）
    ５’　U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)　３’　（ＩＩ－１０）
    [式中、核酸の塩基についてAはアデニン、Uはウラシル、Tはチミン、Gはグアニン、Cはシトシン（ただし、CがＥＮＡのときは２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋－５－メチルシチジンを示す）を示し、核酸について(R)はRNA、(D)はDNA、(M)は2'-OMe RNA、(3M)は3'-OMe RNA、(F)は2'-F RNA、(E)はENAを示す。また、式中、「^」はヌクレオシド間の結合がホスホロチオエート結合（-P(=S)(OH)-）であること示し、特に記載のない場合はヌクレオシド間の結合がリン酸ジエステル結合（-P(=O)(OH)-）であることを示すが、特に記載のない場合であってもセンス鎖領域の５’末端及び３’末端から３個のヌクレオシドにおける２か所のヌクレオシド間結合、並びに、アンチセンス鎖領域の５’末端から３個のヌクレオシドにおける２か所のヌクレオシド間結合及び３’末端から４個のヌクレオシドにおける３か所のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。]
  41. 　センス鎖領域及び／又はアンチセンス鎖領域の５’末端及び／又は３’末端に、３塩基以下のオーバーハング構造が付加している、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  42. 　オーバーハング構造が２塩基である、請求項４１に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  43. 　オーバーハング構造が、２個の連続したチミンを含むヌクレオシド、又は２個の連続したウラシルを含むヌクレオシドである、請求項４２に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  44. 　オーバーハング構造が、アンチセンス鎖領域の３’末端に付加した２個の連続したＵ（Ｍ）である、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  45. 　センス鎖領域の５’末端が以下の式　
    [式中、破線は隣接するセンス鎖領域の５’末端のヌクレオチドの５’－リン酸基とリン酸ジエステル結合することを表す。]
    で表されるＧａｌＮＡｃユニットで化学修飾されていることを特徴とする、請求項４０～４４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  46. 　センス鎖領域が以下の式（Ｉ－２）であり、アンチセンス鎖領域が以下の式（ＩＩ－１１）～（ＩＩ－２０）のいずれかであり、前記センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域がそれぞれ独立したオリゴヌクレオチドとして２本鎖オリゴヌクレオチドを形成している、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
    （式）
    ５’　GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)　３’　（Ｉ－２）
    ５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１１）
    ５’　U(M)^U(F)^G(M)A(F)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１２）
    ５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１３）
    ５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(F)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１４）
    ５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１５）
    ５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１６）
    ５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１７）
    ５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１８）
    ５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－１９）
    ５’　U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M)　３’　（ＩＩ－２０）
    [式中、「GN」は下記式
    （式中、破線は隣接するセンス鎖領域の５’末端のヌクレオチドの５’－リン酸基とリン酸ジエステル結合していることを表す。）で表されるＧａｌＮＡｃユニットを示し、核酸の塩基についてAはアデニン、Uはウラシル、Tはチミン、Gはグアニン、Cはシトシン（ただし、CがＥＮＡのときは２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋－５－メチルシチジンを示す）を示し、核酸について(R)はRNA、(D)はDNA、(M)は2'-OMe RNA、(3M)は3'-OMe RNA、(F)は2'-F RNA、(E)はENAを示す。また、式中、「^」はヌクレオシド間の結合がホスホロチオエート結合（-P(=S)(OH)-）であること示し、特に記載のない場合はヌクレオシド間の結合がリン酸ジエステル結合（-P(=O)(OH)-）であることを示す。センス鎖領域の３’末端のヌクレオチドの３’位、アンチセンス鎖領域の５’末端のヌクレオチドの５’位、及びアンチセンス鎖領域の３’末端のヌクレオチドの３’位はそれぞれ水酸基である。]
  47. 　請求項１～４６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
  48. 　トランスフェリン受容体２の発現を抑制することにより治療又は予防可能な疾患の治療又は予防のための、請求項４７に記載の医薬組成物。
  49. 　貧血の予防又は治療のための、請求項４８に記載の医薬組成物。
  50. 　貧血が、慢性炎症に伴う貧血又は骨髄機能不全に伴う貧血である、請求項４９に記載の医薬組成物。
  51. 　前記慢性炎症に伴う貧血が、自己免疫疾患に伴う貧血、感染症に伴う貧血、炎症性腸疾患に伴う貧血、心不全に伴う貧血、慢性腎臓病に伴う貧血、癌性貧血、又はキャッスルマン病に伴う貧血である、請求項５０に記載の医薬組成物。
  52. 　前記骨髄機能不全に伴う貧血が、骨髄線維症に伴う貧血、骨髄異形成症候群に伴う貧血、又は慢性骨髄単球性白血病に伴う貧血、化学療法による骨髄抑制に伴う貧血である、請求項５０に記載の医薬組成物。
  53. 　貧血治療薬、貧血の原因となる疾患の治療薬、又は鉄過剰症治療薬による治療を受けている患者を対象とする、請求項４７～５２記載の医薬組成物。
  54. 　前記貧血治療薬、貧血の原因となる疾患の治療薬、又は鉄過剰症治療薬がルスパテルセプト又はルキソリチニブである、請求項５３記載の医薬組成物。
  55. 　対象に、請求項１～４６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩の有効量を投与することを含む、貧血を治療又は予防する方法。
  56. 　貧血の治療または予防における使用のための請求項１～４６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  57. 　請求項４７～５４のいずれか１つに記載の医薬組成物の製造における請求項１～４６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩の使用。
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