TW202345867A - 抑制運鐵蛋白受體2表現的siRNA - Google Patents

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Abstract

本發明之課題係提供一種新穎siRNA等，該siRNA具有針對編碼TfR2的mRNA的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用。  本發明之解決手段係一種寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽等，其具有針對運鐵蛋白受體2之mRNA的減弱作用，該寡核苷酸包含反義股區域及有義股區域，其中該反義股區域包含與編碼TfR2的mRNA中的標的序列實質上互補的標的對應序列，該有義股區域包含與前述反義股區域之標的對應序列實質上互補的核苷酸序列。

Description

抑制運鐵蛋白受體2表現的siRNA
本發明係關於一種具有針對編碼運鐵蛋白受體2(TfR2)的mRNA之RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用的siRNA、該siRNA之用途、使用該siRNA的TfR2基因表現抑制方法、含有該siRNA的醫藥等。
針對編碼TfR2蛋白質的mRNA之siRNA可抑制TfR2的mRNA表現，並抑制於鐵代謝中負責中心任務的鐵調素(hepcidin)之產生。其結果，可期待藉由活化活體內的鐵代謝而促進由紅血球前驅細胞所致的鐵之生體可用率並可治療貧血。因此，以鐵調素產生的抑制為標的，正研討使用用於抑制TfR2之mRNA表現的siRNA。
鐵調素係主要由肝臟產生而被分泌至血液中之由25個胺基酸所構成的肽激素，於活體內之鐵代謝中負責中心任務。已知鐵調素會與鐵運輸的運輸蛋白之運鐵素(Ferroportin) (SLC40A1)結合，藉由促進運鐵素之蛋白質分解，而抑制來自腸管的鐵吸收與來自巨噬細胞的鐵釋放，藉此來負向控制鐵代謝。已報告血液中之鐵調素濃度的上升係藉由抑制鐵代謝而限制紅血球前驅細胞中的鐵之生體可用率，從而導致各式各樣的貧血疾病(非專利文獻1)。
就觀察到血液中之鐵調素上升的貧血疾病而言，可列舉例如：伴隨慢性腎臟病的貧血、伴隨癌症的貧血、由化學療法所誘導的貧血、對鐵劑療效不佳的貧血(iron refractory iron deficiency anemia，IRIDA)、伴隨類風濕性關節炎或卡斯爾曼氏病(Castleman disease)等之慢性炎症的貧血(anemia of chronic disease，ACD)、戴布二氏貧血(Diamond-Blackfan anemia)、再生不良性貧血、β地中海型貧血、鐮狀細胞貧血症(sickle cell anemia)、陣發性夜間血紅素尿症、自體免疫溶血性貧血、伴隨骨髓化生不良症候群的貧血、慢性骨髓單核球白血病、伴隨骨髓纖維化的貧血等。又，在骨髓纖維化患者中，可與伴隨紅血球輸血的鐵負荷或慢性的炎症性細胞激素(cytokine)之上升相關而呈現血液中之鐵調素濃度的上升(非專利文獻2)。然而，如骨髓纖維化，在主要起因於由骨髓中的造血功能不全所致的紅血球產生能力本身的不足之貧血中，認為伴隨血液中的鐵調素上升的鐵利用障礙對病態的貢獻低，迄今為止尚未報告由鐵調素之產生抑制所致的貧血治療效果。就伴隨骨髓纖維化等之骨髓功能不全(bone marrow failure)的貧血的治療藥而言，目前雖有使用ESA(紅血球生成刺激劑(erythropoiesis stimulating agent))等藥物的情形，但其治療效果有限。
專利文獻1揭示對猴投予TfR2 siRNA之AD-52590的結果，觀察到肝臟中的TfR2之mRNA表現的減少、鐵調素之mRNA表現的減少、血液中之鐵調素濃度的減少、血液中之鐵濃度的上升。又，揭示對呈現伴隨炎症性的貧血病態的大鼠投予AD-47882的結果，觀察到肝臟中的TfR2 mRNA表現的減少、血液中之鐵調素濃度的減少、血液中之鐵濃度的上升、血紅素值的上升。然而，專利文獻1呈現投予將siRNA包覆於脂質奈米粒子(lipid nanoparticle，LNP)而成者的結果，並且投予路徑限定於靜脈內投予。又，專利文獻1所揭示的TfR2 siRNA之治療效果係限定於針對伴隨炎症的貧血的治療效果，並未揭示對於伴隨骨髓功能低下的貧血等其他貧血的治療效果。
作為抑制細胞、組織、或個體內之標的基因的表現的方法，有將雙股RNA導入該細胞、組織、或個體內的手法。藉由雙股RNA之導入而與該序列具有同源性的mRNA被分解，標的基因之表現被阻礙。此效果稱為「RNA干擾」或「RNAi」。已有報告在3’末端具有2個核苷酸的外伸(overhang)的有義股、反義股分別由21個核苷酸所構成的雙股RNA(短小干擾RNA (small interfering RNA)：siRNA)，在脊椎動物之培養細胞中具有RNA干擾作用(例如，參照非專利文獻3)。
siRNA雖對於基因功能的鑑定、適合有用物質生產的細胞株之篩選、參與疾病的基因之控制等係有用的，但因容易被RNA分解酵素分解，而有在體內的活性持續困難、合成成本變高的缺點。因此，為了開發對於RNA分解酵素的穩定性高、可低價地製造、保持RNAi活性的寡核苷酸，已嘗試各式各樣的化學修飾。
已知將寡核苷酸中之磷酸二酯鍵的磷酸基之非交聯氧原子取代為硫原子的硫代磷酸酯(phosphorothioate，PS)鍵係變得對核酸酶有耐性。然而，已報告若寡核苷酸中之PS鍵的數目增加，則發生雙股RNA的熱力學的不穩定化及與非特異性的蛋白質的結合，因而不佳(例如，參照非專利文獻4)。
又，採用DNA、2’-O-甲基核苷、2’-去氧-2’-氟核苷、2’-O,4’-C橋聯核苷等之糖修飾核苷作為核苷的siRNA已揭示於例如專利文獻2、專利文獻3、專利文獻4等。
亦已進行藉由將天然型之RNA取代為修飾RNA而取得穩定的siRNA的嘗試。例如，已報告許多將RNA之2’-OH基烷基化而使其不成為RNase的受質之作成2’-O-烷基核苷的衍生物。2’-O-甲基核苷酸係在tRNA中亦可見到的天然存在的修飾核苷酸，從反義研究的早期時就已被研究(例如，參照非專利文獻5)。
已報告若將siRNA之有義股或反義股的一者或兩者的全部之RNA以2’-O-甲基核苷酸取代，則RNAi活性減弱或完全喪失(參照例如非專利文獻6、非專利文獻7、非專利文獻8、非專利文獻9等)，又，已報告若連續導入3個2’-O-甲基核苷酸，則在向有義股的導入中未見到活性降低，但在向反義股的導入中觀察到活性降低，特別是對有義股之5’末端導入的情形，活性顯著降低(參照例如非專利文獻10)。
為人工合成的修飾RNA之具有2’-去氧-2’-氟核苷酸(2’-F、或2’-F RNA)的寡核苷酸，係優先形成與核糖核苷酸相同的N型構形，與RNA的親和性亦變高，但由磷酸二酯鍵構成者無核酸酶抗性，因此有必要作成硫代磷酸酯鍵，使其具有核酸酶抗性(參照例如非專利文獻11)。
ENA (2’-O,4’-C-伸乙基-橋聯核酸(2’-O,4’-C-ethylene-bridged nucleic acids))為具有對於核酸酶的穩定性的修飾核酸，但已報告在siRNA之有義股、反義股的一者或兩者之3’末端的外伸部位之2個核苷酸中導入ENA的情形，RNAi活性降低(參照例如非專利文獻12)。
有許多關於組合複數個修飾核酸的siRNA的報告。例如，已報告在siRNA之有義股、反義股中交替導入2’-O-甲基核苷酸與2’-F，可獲得與未修飾siRNA比較而為相同程度以上之RNAi活性，在血清中比較穩定地被保持(參照例如非專利文獻13)。
已報告組合DNA、2’-O-甲基RNA、及2’-F的雙股寡核苷酸，特別是已報告從反義股之5’末端至第14號為2’-F的siRNA(參照例如專利文獻5、6)。又，已報告組合DNA、2’-O-甲基RNA、2’-F RNA、及LNA (2’-O,4’-C-亞甲基-橋聯核酸(2’-O,4’-C-methylene-bridged nucleic acids))的雙股寡核苷酸，特別是已報告從反義股之5’末端至第2號或第14號為2’-F、DNA或LNA的siRNA之活性(參照例如專利文獻5、專利文獻7)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2012/177921號小冊  [專利文獻2]美國專利第US9,399,775號公報  [專利文獻3]美國專利第US9,796,974號公報  [專利文獻4]美國專利第US10,612,024號公報  [專利文獻5]國際公開第2012/058210號小冊  [專利文獻6]國際公開第2013/074974號小冊及美國專利第US9,399,775號公報、美國專利第US9,796,974號公報  [專利文獻7]國際公開第2016/028649號小冊、美國專利第US10,612,024號公報  [非專利文獻]
[非專利文獻1] Pharmaceuticals 2019, 12, 170  [非專利文獻2] Am. J. Hematol. 88:312-316, 2013.  [非專利文獻3] Nature，2001年，第411卷，p.494-498  [非專利文獻4] Antisense Nucleic Acid Drug Development，2000年，第10卷，p.117-121  [非專利文獻5] Nucleic Acids Research，1987年，第15卷，p.6131-6148  [非專利文獻6] EMBO Journal，2001年，第20卷，p.6877-6888  [非專利文獻7] RNA，第9卷，2003年，p.1034-1048  [非專利文獻8] Biochemistry，2003年，第42卷，p.7967-7975  [非專利文獻9] Nucleic Acids Research，2003年，第31卷，p.2705-2716  [非專利文獻10] Journal of Medical Chemistry，2005年，第48卷，p.4247-4253  [非專利文獻11] Journal of Medical Chemistry，1993年，第36卷， p.831-841  [非專利文獻12] Antisense and Nucleic Acid Drug Development，2002年， 第12卷，p.301-309  [非專利文獻13] Journal of Medicinal Chemistry.，2005年，第48卷，p.901-904
[發明欲解決之課題]
冀求可預防、改善、及/或治療貧血之具有高藥理活性的TfR2 siRNA。又，冀求對於細胞的毒性低、血液中的穩定性及藥物遞輸性優異的TfR2 siRNA。
於伴隨慢性炎症的貧血觀察到鐵調素之上升的情形，藉由抑制血液中之鐵調素產生雖可獲得治療效果，但此與其說是主要起因於紅血球之產生異常，不如說是主要起因於由鐵調素之上升所致的鐵利用障礙。然而，伴隨骨髓纖維化等之骨髓功能不全的貧血，大多情形係起因於紅血球的產生降低，因此即使觀察到鐵調素的上升的情形，無法期待藉由抑制鐵調素的產生可獲得治療效果，亦無此種報告。因此，特別冀求對於伴隨骨髓纖維化等之骨髓功能不全的貧血之新穎有效的治療藥。又，於本發明人等之研究中，關於專利文獻1之TfR2 siRNA的標的序列，確認到序列特異性的細胞毒性，因此先前技術之siRNA有安全性之疑慮。
本發明係以提供一種新穎siRNA為目的，該siRNA具有針對編碼TfR2的mRNA的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用(有時亦將此等之作用稱為減弱(knockdown)作用)。又，本發明係以提供一種細胞毒性、穩定性、及/或藥物遞輸性改善的新穎TfR2 siRNA為目的。再者，本發明係以提供一種新穎醫藥組成物為目的，該醫藥組成物係用於治療或預防可藉由抑制TfR2 mRNA之表現而治療或預防的疾病。 [用以解決課題之手段]
本發明人等進行深入研究的結果，發現將TfR2 mRNA中的特定位置之鹼基序列作為標的序列的TfR2 siRNA係具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，且在專利文獻1之標的序列所觀察到的對於細胞的毒性並未在本發明之標的序列觀察到。又，發現具有適宜組合DNA、RNA、2’-O-甲基RNA、2’-F RNA、LNA、ENA、3’-O-甲基RNA而成的寡核苷酸的siRNA係具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，且於活體內為穩定。又，發現藉由對siRNA附加GalNAc等之運輸用單元而改善藥物遞輸性。再者，本發明人等發現藉由使用TfR2 siRNA來抑制TfR2 mRNA之表現，不僅在伴隨炎症的貧血模式小鼠中，且在伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中亦觀察到貧血症狀的改善，而完成本發明。
即，本發明係提供以下。 ［1］一種寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其具有針對運鐵蛋白受體2之mRNA的減弱作用，且包含以下的(A)之反義股區域及(B)之有義股區域：  (A) 由18～31個鹼基長度所構成的反義股區域，其包含與由序列識別號1之核苷酸編號2845至2867、或核苷酸編號1534至1556之間的區域中連續的18～21個鹼基所構成的標的序列實質上互補的標的對應序列，且該標的對應序列之5’末端的核苷為與該標的序列之3’末端的核苷實質上互補的核苷、具有腺嘌呤的核苷、或具有尿嘧啶的核苷，在該標的對應序列之5’末端及/或3’末端可附加5個鹼基以下之外伸結構；及  (B) 由18～31個鹼基長度所構成的有義股區域，其含有與前述反義股區域之標的對應序列實質上互補的核苷酸序列，且進一步在該核苷酸序列之5’末端及/或3’末端可附加5個鹼基以下之外伸結構。  ［2］如［1］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述標的序列係由序列識別號1之核苷酸編號2847～2865、或核苷酸編號1536～1554之19個鹼基所構成的核苷酸序列。  ［3］如［1］或［2］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述反義股區域之標的對應序列中的5’末端之核苷為具有腺嘌呤或尿嘧啶的核苷。  ［4］如［1］～［3］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述反義股區域之標的對應序列為與由序列識別號1之核苷酸編號2847～2865、或核苷酸編號1536～1554之19個鹼基所構成的標的序列完全互補的核苷酸序列。  ［5］如［1］～［4］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中構成寡核苷酸的糖及/或磷酸二酯鍵之至少1個被修飾。  ［6］如［5］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中構成寡核苷酸的糖為D-核呋喃糖，糖之修飾為D-核呋喃糖之2’位的羥基之修飾。  ［7］如［6］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中糖之修飾為D-核呋喃糖之2’-去氧化、2’-O-烷基化、2’-O-烷氧基烷基化、2’-鹵化、及/或2’-O,4’-C-伸烷基化。  ［8］如［7］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述2’-O-烷基化為2’-O-甲基化，前述2’-O-烷氧基烷基化為2’-O-甲氧基乙基化，前述2’-鹵化為2’-氟化，以及前述2’-O,4’-C-伸烷基化為2’-O,4’-C-亞甲基化及/或2’-O,4’-C-伸乙基化。  ［9］如［5］～［8］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中磷酸二酯鍵之修飾為硫代磷酸酯。  ［10］如［5］～［9］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中有義股區域及/或反義股區域之3’末端的核苷中的D-核呋喃糖經3’-O-烷基化。  ［11］如［10］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述3’-O-烷基化為3’-O-甲基化。  ［12］如［1］～［11］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中在有義股區域及/或反義股區域之5’末端及/或3’末端附加3個鹼基以下之外伸結構。  ［13］如［12］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中外伸結構為2個鹼基。  ［14］如［13］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中外伸結構為2個連續的包含胸腺嘧啶的核苷、或2個連續的包含尿嘧啶的核苷。  ［15］如［14］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中外伸結構為附加在反義股區域之3’末端的2個連續的U(M)。  ［16］如［1］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中有義股區域由以下之式(I)表示的寡核苷酸所構成，反義股區域由以下之式(II)表示的寡核苷酸所構成，進一步具有以下之(a)至(g)所示的特徵：  有義股區域：5’ S O5-S a-S 19-S 18-S 17-S 16-S 15-S 14-S 13-S 12-S 11-S 10-S 9-S 8-S 7-S 6-S 5-S 4-S 3-S 2-S 1-S O33’(I)  反義股區域：5’ A O5-A 1-A 2-A 3-A 4-A 5-A 6-A 7-A 8-A 9-A 10-A 11-A 12-A 13-A 14-A 15-A 16-A 17-A 18-A 19-A a-A O33’(II)  (a) S 1為3’-修飾核苷，S 2～S 19係表示1個核苷且各自獨立為2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，S a表示0～3個核苷且各自之核苷係獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，S O3及S O5係各自獨立表示0～3個核苷且各自之核苷係獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷；各核苷間之鍵結係表示可經化學修飾的磷酸二酯鍵；  (b) A 11、A 12、A 13、A 14及A 15係表示1個核苷，其中至少1個為DNA、RNA、2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷或2’-MOE RNA，其餘為2’-OMe RNA或2’-F RNA，A 1～A 10及A 16～A 19係表示1個核苷且各自獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，A a係表示0～3個核苷且各自之核苷係獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，A O3及A O5係各自獨立表示0～3個核苷且各自之核苷係獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷；各核苷間之鍵結係表示可經化學修飾的磷酸二酯鍵；  (c) A 2～A a之間的核苷酸序列係由與標的序列實質上互補的核苷酸序列所構成，A 1為具有與標的序列之對應的核苷互補的鹼基的核苷、具有腺嘌呤的核苷、具有胸腺嘧啶的核苷、或具有尿嘧啶的核苷，A O3與A O5存在的情形，該核苷酸序列係各自獨立為與標的序列之對應的核苷獨立地選擇的核苷酸序列；  (d) S 1～S a之間的核苷酸序列、與A 1～A a之間的核苷酸序列，係彼此實質上互補的核苷酸序列，且形成雙股結構；  (e) S O5與A O3兩者存在的情形，S O5與A O3係彼此不互補的核苷酸序列；  (f) S O3與A O5兩者存在的情形，S O3與A O5係彼此不互補的核苷酸序列；以及  (g) 有義股區域及/或反義股區域之5’末端之核苷的5’位及/或3’末端之核苷的3’位可經化學修飾，或者3’末端之核苷為3’-修飾核苷的情形，其2’位可經化學修飾。  ［17］如［16］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，S 1為3’-OMe RNA。  ［18］如［16］或［17］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷為LNA或ENA。  ［19］如［16］～［18］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 11、A 12、A 13、A 14及A 15之2個以上可相同或各自相異，為DNA、RNA、2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷或2’-MOE RNA。  ［20］如［19］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 14為RNA或2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷。  ［21］如［20］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 13為2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷或2’-OMe RNA，A 14為RNA。  ［22］如［21］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 11-A 12-A 13-A 14-A 15為以下之任一者：  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(ENA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-F RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(ENA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-F RNA)-A 13(ENA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(LNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-F RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(LNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-F RNA)-A 13(LNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-F RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、或  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-F RNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)。  ［23］如［20］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 12為DNA，A 14為2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷。  ［24］如［23］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 11-A 12-A 13-A 14-A 15為以下之任一者：  A 11(2’-F RNA)-A 12(DNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(ENA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(DNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(ENA)-A 15(2’-OMe RNA)、A 11(2’-F RNA)-A 12(DNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(LNA)-A 15(2’-OMe RNA)、或  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(DNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(LNA)-A 15(2’-OMe RNA)。  ［25］如［16］～［24］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 2、A 6及A 16為2’-F RNA。  ［26］如［25］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，進一步選自由A 8、A 9及A 10所組成的群組的1或2個核苷為2’-F RNA，A 1、A 3～A 5、A 7、A 17～A 19及A a之核苷為2’-OMe RNA。  ［27］如［26］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 2、A 6、A 8、A 10及A 16為2’-F RNA，A 1、A 3～A 5、A 7、A 9、A 17～A 19及A a之核苷為2’-OMe RNA。  ［28］如［16］～［27］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(I)中，S 11、S 12、S 13及S 15為2’-F RNA。  ［29］如［28］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(I)中，S 2～S 10、S 14、S 16～S 19及S a為2’-OMe RNA。  ［30］如［16］～［29］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中採用RNA的情形，該RNA與鄰接其3’側的核苷之間的鍵結為硫代磷酸酯鍵。  ［31］如［16］～［30］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中在前述寡核苷酸之從5’末端及3’末端起2～5個核苷酸中，各核苷間鍵結為硫代磷酸酯鍵。  ［32］如［16］～［31］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中S O3、S O5、A O5及A O3之核苷數為0～2。  ［33］如［32］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中S O3之核苷數為0。  ［34］如［33］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中S O3、S O5及A O5之核苷數為0，A O3之核苷數為2。  ［35］如［1］～［34］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述反義股區域及有義股區域係作為各自獨立的寡核苷酸而形成雙股寡核苷酸。  ［36］如［1］～［34］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述反義股區域之5’末端的核苷與有義股區域之3’末端的核苷係藉由連接子(linker)結構而連結。  ［37］如［36］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述連接子結構為下述式所表示的結構，
[式中，虛線表示鍵結肢(bonding hand)，與苯基鍵結的氧原子表示與鄰接的反義股區域之5’末端的核苷酸之5’-磷酸基作成磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵，另一者之末端的亞甲基表示與鄰接的有義股區域之3’末端的核苷酸之3’-磷酸基(3’位經修飾的核苷酸則為2’位的磷酸基)作成磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵]。 ［38］如［1］～［37］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中寡核苷酸之5’末端的核苷之5’位及/或3’末端之核苷的3’位經GalNAc單元進行化學修飾，或者3’末端之核苷為3’-修飾核苷的情形，其2’位經GalNAc單元進行化學修飾。  ［39］如［38］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述GalNAc單元為下式所表示的單元，
[式中，虛線表示與鄰接的核苷酸之5’末端的磷酸基及/或3’末端的磷酸基(3’位經修飾的核苷酸則為2’位的磷酸基)作成磷酸二酯鍵]。  ［40］如［1］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中排除外伸結構的有義股區域為以下之式(I-1)，排除外伸結構的反義股區域為以下之式(II-1)～(II-10)之任一者，前述有義股區域及反義股區域係作為各自獨立的寡核苷酸而形成雙股寡核苷酸，前述有義股區域及前述反義股區域係各自獨立而可包含外伸結構。  (式)  5’ C(M)G(M)U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U (M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(3M)3’ (I-1)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A (M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)3’ (II-1)  5’ U(M)U(F)G(M)A(F)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)3’ (II-2)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (F)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M) 3’(II-3)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(F)G(M)3’ (II-4)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A (M)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)3’ (II-5)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (F)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)3’ (II-6)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(F)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)3’ (II-7)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(F)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)3’ (II-8)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)3’ (II-9)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(F)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)3’ (II-10)  [關於核酸之鹼基，A表示腺嘌呤，U表示尿嘧啶，T表示胸腺嘧啶，G表示鳥糞嘌呤，C表示胞嘧啶(惟，C為ENA時，表示2’-O,4’-C-伸乙基橋聯-5-甲基胞苷)，關於核酸，(R)表示RNA，(D)表示DNA，(M)表示2’-OMe RNA，(3M)表示3’-OMe RNA，(F)表示2’-F RNA，(E)表示ENA。又，式中，「^」表示核苷間之鍵結為硫代磷酸酯鍵(-P(=S)(OH)-)，在未特別記載的情形，表示核苷間之鍵結為磷酸二酯鍵(-P(=O)(OH)-)，但即使在未特別記載的情形，有義股區域之從5’末端及3’末端起3個核苷中的2處核苷間鍵結、以及反義股區域之從5’末端起3個核苷中的2處核苷間鍵結及從3’末端起4個核苷中的3處核苷間鍵結亦為硫代磷酸酯鍵]。  ［41］如［40］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中在有義股區域及/或反義股區域之5’末端及/或3’末端附加3個鹼基以下之外伸結構。  ［42］如［41］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中外伸結構為2個鹼基。  ［43］如［42］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中外伸結構為2個連續的包含胸腺嘧啶的核苷、或2個連續的包含尿嘧啶的核苷。  ［44］如［43］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中外伸結構為附加在反義股區域之3’末端的2個連續的U(M)。  ［45］如［40］～［44］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中有義股區域之5’末端經以下式所表示的GalNAc單元進行化學修飾，
[式中，虛線表示與鄰接的有義股區域之5’末端的核苷酸之5’-磷酸基作成磷酸二酯鍵]。  ［46］如［1］記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中有義股區域為以下之式(I-2)，反義股區域為以下之式(II-11)～(II-20)之任一者，前述有義股區域及反義股區域係作為各自獨立的寡核苷酸而形成雙股寡核苷酸。  (式)  5’ GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U (F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 3’ (I-2 )  5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A (M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-11)   5’ U(M)^U(F)^G(M)A(F)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-12)   5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (F)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-13)   5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(F)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-14)   5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A (M)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-15)   5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (F)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-16)   5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(F)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-17)   5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(F)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-18)   5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-19)   5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(F)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-20)   [式中，「GN」表示下述式所表示的GalNAc單元， (式中，虛線表示與鄰接的有義股區域之5’末端的核苷酸之5’-磷酸基作成磷酸二酯鍵)，關於核酸之鹼基，A表示腺嘌呤，U表示尿嘧啶，T表示胸腺嘧啶，G表示鳥糞嘌呤，C表示胞嘧啶(惟，C為ENA時，表示2’-O,4’-C-伸乙基橋聯-5-甲基胞苷)，關於核酸，(R)表示RNA，(D)表示DNA，(M)表示2’-OMe RNA，(3M)表示3’-OMe RNA，(F)表示2’-F RNA，(E)表示ENA。又，式中，「^」表示核苷間之鍵結為硫代磷酸酯鍵(-P(=S)(OH)-)，在未特別記載的情形，表示核苷間之鍵結為磷酸二酯鍵(-P(=O)(OH)-)。有義股區域之3’末端的核苷酸之3’位、反義股區域之5’末端的核苷酸之5’位、及反義股區域之3’末端的核苷酸之3’位係各自為羥基]。  ［47］一種醫藥組成物，其含有如［1］～［46］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽作為有效成分。  ［48］如［47］記載之醫藥組成物，其係用於治療或預防可藉由抑制運鐵蛋白受體2之表現而治療或預防的疾病。  ［49］如［48］記載之醫藥組成物，其係用於預防或治療貧血。  ［50］如［49］記載之醫藥組成物，其中貧血為伴隨慢性炎症的貧血或伴隨骨髓功能不全的貧血。  ［51］如［50］記載之醫藥組成物，其中前述伴隨慢性炎症的貧血為伴隨自體免疫疾病的貧血、伴隨感染症的貧血、伴隨炎症性腸疾病的貧血、伴隨心臟衰竭的貧血、伴隨慢性腎臟病的貧血、癌性貧血、或伴隨卡斯爾曼氏病的貧血。  ［52］如［50］記載之醫藥組成物，其中前述伴隨骨髓功能不全的貧血為伴隨骨髓纖維化的貧血、伴隨骨髓化生不良症候群的貧血、或伴隨慢性骨髓單核球白血病的貧血、伴隨由化學療法所致的骨髓抑制的貧血。  ［53］如［47］～［52］記載之醫藥組成物，其以接受利用其他藥劑的治療的患者為對象。  ［54］如［53］記載之醫藥組成物，其中前述其他藥劑為貧血治療藥、成為貧血之原因的疾病之治療藥、或血鐵沉積症(iron overload)治療藥。  ［55］如［54］記載之醫藥組成物，其中前述貧血治療藥為紅血球生成刺激因子製劑、HIFPHD(缺氧誘導因子脯胺醯基羥化酶(hypoxia inducible factor prolyl hydroxylase))抑制藥、經口鐵劑、靜脈注射鐵劑、羅特西普(Luspatercept)、或達那唑(Danazol)。  ［56］如［55］記載之醫藥組成物，其中前述紅血球生成刺激因子製劑為依泊汀(epoetin) α、依泊汀β、依泊汀β PEGOL、依泊汀kappa、或達貝泊汀(darbepoetin) α。  ［57］如［55］記載之醫藥組成物，其中前述HIFPHD(缺氧誘導因子脯胺醯基羥化酶)抑制藥為羅沙司他(roxadustat)、伐度司他(vadadustat)、達普司他(daprodustat)、恩那司他(enarodustat)、或莫立司他(molidustat)。  ［58］如［55］記載之醫藥組成物，其中前述經口鐵劑為檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵、反丁烯二酸亞鐵、可溶性焦磷酸鐵、乾燥硫酸鐵。  ［59］如［55］記載之醫藥組成物，其中前述靜脈注射鐵劑為羧基麥芽糖鐵(ferric carboxymaltose)、含糖氧化鐵(saccharated iron oxide)。  ［60］如［54］記載之醫藥組成物，其中前述成為貧血之原因的疾病之治療藥為骨髓纖維化治療藥、骨髓化生不良症候群治療藥、慢性腎臟病治療藥或抗癌劑。  ［61］如［60］記載之醫藥組成物，其中前述骨髓纖維化治療藥為JAK2抑制藥。  ［62］如［61］記載之醫藥組成物，其中前述JAK2抑制藥為魯索利替尼(Ruxolitinib)、菲卓替尼(Fedratinib)、帕克替尼(Pacritinib)或莫美洛替尼(Momelotinib)。  ［63］如［60］記載之醫藥組成物，其中前述骨髓化生不良症候群治療藥為阿扎胞苷(Azacitidine)或來那度胺(Lenalidomide)。  ［64］如［60］記載之醫藥組成物，其中前述慢性腎臟病治療藥為SGLT2(鈉-葡萄糖共同運輸蛋白2 (sodium glucose co-transporter 2))抑制藥、腎素-血管張力素系統(renin-angiotensin system)抑制藥、鈣拮抗藥、利尿藥、糖尿病治療藥、高脂血症治療藥、類固醇、或免疫抑制藥。  ［65］如［64］記載之醫藥組成物，其中前述腎素-血管張力素系統抑制藥為血管張力素II受體拮抗藥或血管張力素轉化酶抑制藥。  ［66］如［60］記載之醫藥組成物，其中前述抗癌劑為化學療法藥。  ［67］如［66］記載之醫藥組成物，其中前述化學療法藥為順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、多柔比星(doxorubicin)、紫杉醇(paclitaxel)、或氨柔比星(amrubicin)。  ［68］如［54］記載之醫藥組成物，其中前述血鐵沉積症治療藥為鐵螯合劑。  ［69］如［68］記載之醫藥組成物，其中前述鐵螯合劑為地拉羅司(Deferasirox)、去鐵胺(Deferoxamine)、或去鐵酮(Deferiprone)。   ［70］一種治療或預防貧血之方法，其包含將如［1］～［46］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽之有效量投予至對象。  ［71］一種治療或預防貧血之方法，其包含將如［47］～［69］中任一項記載之醫藥組成物投予至對象。  ［72］一種如［1］～［46］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其係用於治療或預防貧血之用途。  ［73］一種如［1］～［46］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其係用於作為如［47］～［69］中任一項記載之醫藥組成物的有效成分之用途。 ［74］一種如［1］～［46］中任一項記載之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽之用途，其係用於製造如［47］～［69］中任一項記載之醫藥組成物。
又，於某一態樣，本發明係提供以下。 ［75］一種用於治療或預防伴隨骨髓功能不全的貧血之醫藥組成物，其以具有減弱運鐵蛋白受體2基因的效果的化合物作為有效成分。 ［76］如［75］記載之醫藥組成物，其中前述化合物為RNAi-寡核苷酸。 [發明之效果]
本發明之siRNA可抑制TfR2 mRNA之表現。又，本發明之siRNA可抑制在活體內肝臓中的TfR2 mRNA之表現，並可預防、改善、及/或治療貧血。
[用以實施發明的形態]
＜1. 用語之説明＞ 在本說明書，「標的基因」係指針對編碼運鐵蛋白受體2 (transferrin receptor 2，TfR2)的基因的mRNA，可為接受RNA加工前之未成熟mRNA(亦稱為mRNA前驅體或pre-mRNA)，亦可為接受RNA加工而成熟的mRNA。RNA加工包含例如RNA剪接、5’末端的帽(cap)結構形成、及3’末端的多腺苷酸(poly-A)尾部形成等。
TfR2係主要在肝臟表現的第2型膜蛋白，已知由細胞內區域、跨膜區域、細胞外區域所構成(The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 35 (2003) 292-296)。已知TfR2在鐵代謝中負責具重要任務之鐵調素的產生、及在鐵代謝的控制中負責中心任務(Front. Pharmacol., 06 March 2014、Haematologica 2011;96(4):500-506.、Blood. 2011;117(10):2960-2966)。
貧血係指血液中之存在於紅血球中且具有氧運輸能力的血紅素之濃度降低的病態。貧血參與身體活動的降低、死亡率的上升(Ann N Y Acad Sci. 2019 August;1450(1): 15-31.)。貧血依其原因、臨床表徵、平均紅血球容積(mean curpuscular volume，MCV)等之紅血球指數等而進行各種分類(日本內科學會雜誌104卷7號：1375-1382、臨床檢查指南JSLM2015：175-180)。紅血球之產生不足、紅血球的過度破壞、缺鐵等被認為是貧血的主要原因之一，對於此等，已知例如伴隨慢性炎症等的鐵利用障礙、骨髓功能不全等多樣的病態係複雜地參與(Ann N Y Acad Sci. 2019 August;1450(1): 15-31.)。  在伴隨慢性炎症的貧血中，已知因介白素6 (Interleukin 6，IL6)等之炎症性細胞激素之慢性的上升，藉由在鐵代謝中負責主要任務的鐵調素之血液中濃度上升而引起鐵利用障礙，因此而造血功能降低(Med Clin North Am. 2017 March;101(2): 285-296.)。就該種慢性炎症之原因而言，可列舉例如：自體免疫性疾病、感染症、炎症性腸疾病、心臟衰竭、慢性腎臟病、癌症等之慢性疾病。就伴隨慢性炎症的貧血而言，可列舉例如：伴隨類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡或自體免疫溶血性貧血等之自體免疫疾病的貧血、伴隨感染症的貧血、伴隨巨噬細胞活化症候群的貧血、伴隨卡斯爾曼氏病的貧血、伴隨炎症性大腸炎等之炎症性腸疾病的貧血、伴隨心臟衰竭的貧血、伴隨慢性腎臟病的貧血、及癌性貧血等。癌性貧血包含例如伴隨多發性骨髓瘤、急性白血病、慢性白血病、肺癌或乳癌等之癌症的貧血。  伴隨骨髓功能不全的貧血係由於某種主要因素而紅血球產生能力顯著受阻而致貧血。就伴隨骨髓功能不全的貧血而言，可列舉例如：伴隨骨髓化生不良症候群的貧血、伴隨骨髓纖維化的貧血、伴隨慢性骨髓單核球白血病(chronic myelomonocytic leukemia，CMML)的貧血、伴隨由化學療法所致的骨髓抑制的貧血、再生不良性貧血、戴布二氏貧血、範可尼貧血(Fanconi anemia)等。骨髓纖維化係指由於在造血幹細胞後天地發生JAK2V617F等之基因變異，而源自異常造血幹細胞的殖株增殖，且慢性的炎症之亢進及骨髓纖維化係進行，因此骨髓功能降低的疾病，已知呈現重度貧血、脾臟腫大等(Am J Hematol. 2021;96:145-162.)。
在本說明書，核酸或核酸分子係指核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸之總稱。
「核苷」係意指遺傳資訊中重要的鹼基部分與分子之物理化學的性質中重要的糖部分所鍵結而成的化學結構部分。
「核苷酸」係指核苷之糖部分的3’位(在3’位被修飾的情形為2’位)之羥基與磷酸基形成酯的化合物。
「寡核苷酸」係指由2個以上之核苷酸其中的1個核苷酸之磷酸基部分與另一核苷酸之糖部分的5’位之羥基鍵結的結構(磷酸二酯鍵)所構成的寡聚物。惟，3’末端之核苷酸的3’位(3’位經修飾的核苷酸則為2’位)、及/或5’末端之核苷酸的5’位可為羥基或磷酸基，亦可為彼等經化學修飾的結構。又，核苷間的磷酸二酯鍵可經化學修飾。在本說明書，寡核苷酸與多核苷酸係以相同的意義使用。
核酸之鹼基部分為腺嘌呤(A)、鳥糞嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)、胸腺嘧啶(T)，A與U或T、G與C係各自藉由氫鍵而形成沃森-克里克鹼基對(Watson-Crick base pair)，將在形成鹼基對的關係中的鹼基彼此的關係稱為「互補」。各自的鹼基部分有經化學修飾的情形，但即使為經修飾的鹼基，通常亦有顯示與原本鹼基相同的鹼基對形成能力的情形。就代表性的修飾鹼基而言，已知有5-甲基胞嘧啶(5C)、5-甲基尿嘧啶(5U)等，5U為與T相同的結構。在本說明書所附序列表中，5C表示為C，5U表示為T或U。
在本說明書，核酸之標記方法有表示為「鹼基之記號(糖部分之記號)」的情形。關於糖部分之記號，在以下之各種核苷的記載處進行説明。
在本說明書，寡核苷酸之「修飾型式」，只要未特別提及，係與鹼基之序列無關地意指構成寡核苷酸的各核苷之糖部分的修飾樣式之配置。又，未特別提及的情形，進一步意指與各核苷間之鍵結樣式組合的修飾型式。糖部分的結構及核苷間鍵結，並不依賴於標的序列，由於係對作為分子之穩定性、起因於該穩定性的結合性能帶來影響的要素，而被認為由對於某標的序列經確認的修飾型式所致的作用效果，在對於另一標的序列應用相同修飾型式的情形亦顯示有同樣的作用效果的或然性高(參照例如Mol Ther. (2018) 26:708-717)。
在本說明書，「天然型之核苷」係指2’-去氧核苷或核糖核苷。對應各鹼基的2’-去氧核苷(也稱為「DNA」；表示糖部分的記號為(D)，亦有以鹼基部分的小文字標記表示的情形)具有以下之式所表示的結構，亦有將2’-去氧腺苷標記為A(D)或a、2’-去氧鳥苷標記為G(D)或g、2’-去氧胞苷標記為C(D)或c、胸苷標記為T(D)或t、2’-去氧-5-甲基胞苷標記為5C(D)或5c、2’-去氧尿苷標記為U(D)或u的情形。又，未特定鹼基的2’-去氧核苷有標記為N(D)的情形。
(上述各式中，虛線表示鍵結肢。)
對應各鹼基的核糖核苷(亦稱為「RNA」；表示糖部分的記號為(R)，亦有以鹼基部分之大文字標記表示的情形)具有以下之式所表示的結構，亦有腺苷標記為A(R)或A、鳥苷標記為G(R)或G、胞苷標記為C(R)或C、尿苷標記為U(R)或U的情形。又，未特定鹼基的核糖核苷有標記為N(R)的情形。
(上述各式中，虛線表示鍵結肢。)
在本說明書，「修飾核苷」及「修飾核苷酸」係意指在天然之核苷的鹼基部分、糖部分或磷酸二酯部分包含至少一個經化學修飾的結構的核苷或核苷酸。
在本說明書，「可經化學修飾的磷酸二酯鍵」係意指在天然之核苷間鍵結所採用的磷酸二酯鍵、或經化學修飾的磷酸二酯鍵。天然之核苷間鍵結為下述式(P)所表示的磷酸二酯鍵，於本說明書中的鹼基序列之表示中，係在核苷間、或是核苷與鄰接的結構單元(例如GalNAc單元)、化學修飾結構(例如，後述的「2」所表示的結構)、或者化學連接子或寡核苷酸連接子(例如，後述的「Z」所表示的結構)之間未包夾文字及記號地表示。又，在本說明書，「經化學修飾的磷酸二酯鍵」係意指磷酸二酯鍵中所包含的磷原子經化學修飾的鍵結樣式。就經化學修飾的磷酸二酯鍵之例而言，可列舉下述式(PS)所表示的硫代磷酸酯鍵、為對磷原子附加氮原子的修飾鍵結之胺基磷酸酯(phosphoramidate)鍵、為對磷原子附加可取代的烷基的修飾鍵結之烷基膦酸酯鍵(例如，甲基的情形，成為甲基膦酸酯鍵)、為對磷酸基之非共價鍵的氧原子附加可取代的烷基的修飾鍵結之磷酸三酯鍵。採用硫代磷酸酯鍵的情形，在本說明書中的鹼基序列之表示中，於核苷間、或是核苷與其鄰接的結構單元(例如GalNAc單元)、化學修飾結構(例如，後述的「2」所表示的結構)、或者化學連接子或寡核苷酸連接子(例如，後述的「Z」所表示的結構)之間表示為「^」。
(上述各式中，虛線表示鍵結肢，一個鍵結肢表示與5’側所鄰接的核苷之3’-羥基的氧原子(3’位經修飾的核苷則為2’位的氧原子)、鄰接的結構單元、或者化學連接子或寡核苷酸連接子作成酯鍵，另一個鍵結肢表示與3’側所鄰接的核苷之5’-羥基的氧原子、結構單元、或者化學連接子或寡核苷酸連接子作成酯鍵。)
在本說明書，「糖修飾核苷」係指核苷之糖部分經修飾的核苷。在糖修飾核苷中包含本發明所屬技術領域中已知的糖修飾全部的樣式。就糖修飾核苷之例而言，可列舉2’-修飾核苷、3’-修飾核苷、4’-硫修飾核苷、4’-硫-2’-修飾核苷及2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷等。就較佳糖修飾而言，可例示2’-O-烷基化(甲基化、乙基化、丙基化、異丙基化、丁基化等)、2’-O-烷氧基烷基化(甲氧基乙基化、甲氧基丙基化、甲氧基丁基化等)、2’-鹵化(氯化、氟化等)、3’-O-烷基化(甲基化、乙基化、丙基化、異丙基化、丁基化等)、3’-O-烷氧基烷基化(甲氧基乙基化、甲氧基丙基化、甲氧基丁基化等)、3’-鹵化(氯化、氟化等)、2’-O,4’-C-橋聯化(伸烷基化橋聯等)等。
在本說明書，「2’-修飾核苷」係指核苷中所包含的核呋喃糖之2’位經化學修飾的核苷。就該種修飾之例而言，可例示例如：2’-O-烷基化(甲基化、乙基化、丙基化、異丙基化、丁基化等)核苷、2’-O-烷氧基烷基化(甲氧基乙基化、甲氧基丙基化、甲氧基丁基等)核苷、2’-鹵化(氯化、氟化等)核苷、2’-烯丙基化核苷、2’-胺基化核苷、2’-疊氮化核苷、2’-O-烯丙基化核苷、2’-OCF 3核苷、2’-O(CH 2) 2SCH 3核苷、2’-O-(CH 2)2-O-N(R m)(R n)核苷、或2’-O-CH 2-C(=O)-N(R m)(R n)核苷(各R m與R n係個別地為H、胺基保護基、或者取代或非取代C1-C10烷基)等。較佳2’-修飾核苷為2’-O-烷基化核苷、2’-O-烷氧基烷基化核苷、或2’-鹵化核苷。
糖修飾核苷中，就2’-O-烷基化修飾之例而言，可列舉例如2’-O-甲基核苷(亦有表示為「2’-OMe RNA」或「2’-O-甲基RNA」的情形；表示糖部分的記號為(M))。對應各鹼基的2’-O-甲基核苷具有以下之式所表示的結構，亦有將2’-O-甲基腺苷標記為A(M)、2’-O-甲基鳥苷標記為G(M)、2’-O-甲基胞苷標記為C(M)、2’-O-甲基-5-甲基胞苷標記為5C(M)、2’-O-甲基尿苷標記為U(M)、2’-O-甲基-5-甲基尿苷標記為T(M)的情形。又，未特定鹼基的2’-O-甲基核苷有標記為N(M)的情形。
(上述各式中，虛線表示鍵結肢。)
又，就2’-O-烷氧基烷基化修飾之例而言，可列舉例如2’-O-甲氧基乙基核苷(亦有表示為「2’-MOE RNA」、「2’-O-甲氧基乙基RNA」或「2’-甲氧基乙氧基RNA」的情形；表示糖部分的記號為(m))。對應各鹼基的2’-O-甲氧基乙基核苷具有以下之式所表示的結構，亦有將2’-O-甲氧基乙基腺苷標記為A(m)、2’-O-甲氧基乙基鳥苷標記為G(m)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷標記為C(m)(鹼基之結構為5C，但方便上表示為C(m)；亦可取代為2’-O-甲氧基乙基胞苷而使用)、2’-O-甲氧基乙基尿苷標記為U(m)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷表示為T(m)的情形。又，未特定鹼基的2’-O-甲氧基乙基核苷有標記為N(m)的情形。
(上述各式中，虛線表示鍵結肢。)
又，就2’-鹵化修飾之例而言，可列舉例如2’-去氧-2’-氟核苷(亦有表示為「2’-F RNA」或「2’-去氧-2’-氟RNA」的情形；表示糖部分的記號為(F))。對應各鹼基的2’-去氧-2’-氟核苷具有以下之式所表示的結構，亦有將2’-去氧-2’-氟腺苷標記為A(F)、2’-去氧-2’-氟鳥苷標記為G(F)、2’-去氧-2’-氟胞苷標記為C(F)、2’-去氧-2’-氟-5-甲基胞苷標記為5mC(F)、2’-去氧-2’-氟尿苷標記為U(F)、2’-去氧-2’-氟-5-甲基尿苷標記為T(F)的情形。又，未特定鹼基的2’-去氧-2’-氟核苷有標記為N(F)的情形。
(上述各式中，虛線表示鍵結肢。)
在本說明書，「3’-修飾核苷」係指核苷中所包含的核呋喃糖之3’位經化學修飾的核苷。3’-修飾核苷中的2’位之羥基可經修飾。就該種修飾之例而言，可例示例如：3’-O-烷基化(甲基化、乙基化、丙基化、異丙基化、丁基化等)核苷、3’-O-烷氧基烷基化(甲氧基乙基化、甲氧基丙基化、甲氧基丁基化等)核苷、3’-鹵化(氯化、氟化等)核苷、3’-烯丙基化核苷、3’-胺基化核苷、3’-疊氮化核苷、3’-O-烯丙基化核苷、3’-OCF 3核苷、3’-O(CH 2) 2SCH 3核苷、3’-O-(CH 2)2-O-N(R m)(R n)核苷、或3’-O-CH 2-C(=O)-N(R m)(R n)核苷(各R m與R n係個別地為H、胺基保護基、或者取代或非取代C1-C10烷基)等。較佳3’-修飾核苷可例示3’-O-烷基化核苷、3’-O-烷氧基烷基化核苷、或3’-鹵化核苷等。
3’-修飾核苷中，就3’-O-烷基化修飾之例而言，可列舉例如3’-O-甲基核苷(亦有表示為「3’-OMe RNA」的情形；表示糖部分的記號為(3M))。對應各鹼基的3’-O-甲基核苷具有以下之式所表示的結構，亦有將3’-O-甲基腺苷標記為A(3M)、3’-O-甲基鳥苷標記為G(3M)、3’-O-甲基胞苷標記為C(3M)、3’-O-甲基-5-甲基胞苷標記為5mC(3M)、3’-O-甲基尿苷標記為U(3M)、3’-O-甲基-5-甲基尿苷標記為T(3M)的情形。又，未特定鹼基的3’-O-甲基核苷有標記為N(3M)的情形。
(上述各式中，虛線表示鍵結肢。)
又，就3’-O-烷氧基烷基化修飾之例而言，可列舉例如3’-O-甲氧基乙基核苷(亦有表示為「3’-MOE RNA」、「3’-O-甲氧基乙基RNA」或「3’-甲氧基乙氧基RNA」的情形；表示糖部分的記號為(3m))。對應各鹼基的3’-O-甲氧基乙基核苷具有在對應各鹼基的3’-O-甲基核苷之上述結構圖中，甲氧基乙基代替與3’位之氧原子鍵結的甲基而鍵結的結構。對應各鹼基的3’-O-甲氧基乙基核苷亦有將3’-O-甲氧基乙基腺苷標記為A(3m)、3’-O-甲氧基乙基鳥苷標記為G(3m)、3’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷標記為C(3m)(鹼基之結構為5C，但方便上表示為C(3m)；亦可取代為3’-O-甲氧基乙基胞苷而使用)、3’-O-甲氧基乙基尿苷標記為U(3m)、3’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷標記為T(3m)的情形。又，未特定鹼基的3’-O-甲氧基乙基核苷有標記為N(3m)的情形。
又，就3’-鹵化修飾之例而言，可列舉例如3’-去氧-3’-氟核苷(亦有表示為「3’-F RNA」或「3’-去氧-3’-氟RNA」的情形；表示糖部分的記號為(3F))。對應各鹼基的3’-去氧-3’-氟核苷具有在對應各鹼基的3’-O-甲基核苷之上述結構圖中，氟原子代替與3’位之碳原子鍵結的甲氧基而鍵結的結構。對應各鹼基的3’-去氧-3’-氟核苷亦有將3’-去氧-3’-氟腺苷表示為A(3F)、3’-去氧-3’-氟鳥苷表示為G(3F)、3’-去氧-3’-氟胞苷表示為C(3F)、3’-去氧-3’-氟-5-甲基胞苷表示為5mC(3F)、3’-去氧-3’-氟尿苷表示為U(3F)、3’-去氧-3’-氟-5-甲基尿苷表示為T(3F)的情形。又，未特定鹼基的3’-去氧-3’-氟核苷有標記為N(3F)的情形。
在本說明書，「4’-硫修飾核苷」係指核苷中所包含的核呋喃糖之4’位的氧原子經硫原子取代的核苷。就4’-硫修飾核苷之例而言，可列舉4’-氧原子經硫原子取代的β-D-核糖核苷(Hoshika, S. et al. FEBS Lett. 579, p.3115-3118, (2005)；Dande, P. et al. J. Med. Chem. 49, p.1624-1634 (2006)；Hoshika, S. et al. ChemBioChem. 8, p.2133-2138, (2007))。
在本說明書，「4’-硫-2’-修飾核苷」係指核苷中所包含的核呋喃糖之2’位經化學修飾，且核呋喃糖之4’位的氧原子經硫原子取代的核苷。就4’-硫-2’-修飾核苷之例而言，可列舉保持2’-H、或2’-O-甲基的4’-硫-2’-修飾核苷(Matsugami, et al. Nucleic Acids Res. 36, 1805 (2008))。
糖修飾核苷中，就2’-O,4’-C-橋聯化修飾之例而言，可列舉例如2’-O,4’-C-伸乙基橋聯核苷(亦有表示為「ENA」或「ENA單元」的情形；表示糖部分的記號為(E)) (Morita， K. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 12, p.73 (2002).；Morita, K. et al. Bioorg. Med. Chem., 11, p.2211 (2003).)。對應各鹼基的2’-O,4’-C-伸乙基橋聯核苷具有以下之式所表示的結構，亦有將2’-O,4’-C-伸乙基橋聯腺苷標記為A(E)、2’-O,4’-C-伸乙基橋聯鳥苷標記為G(E)、2’-O,4’-C-伸乙基橋聯-5-甲基胞苷標記為C(E)(鹼基之結構為5C，但方便上表示為C(E)；亦可取代為2’-O,4’-C-伸乙基橋聯胞苷而使用)、2’-O,4’-C-伸乙基橋聯尿苷標記為U(E)、2’-O,4’-C-伸乙基橋聯-5-甲基尿苷標記為T(E)的情形。又，未特定鹼基的2’-O,4’-C-伸乙基橋聯核苷有標記為N(E)的情形。
(上述各式中，虛線表示鍵結肢。)
又，就2’-O,4’-C-橋聯化修飾之另一例而言，可列舉例如2’-O,4’-C-亞甲基橋聯核苷(亦有表示為「LNA」或「LNA單元」的情形；表示糖部分的記號為(L)) (Obika, S. et al. Tetrahedron Lett., 38, p.8735- (1997).；Obika, S. et al., Tetrahedron Lett., 39, p.5401- (1998).；A. A. Koshkin, A. A. et al. Tetrahedron, 54, p.3607 (1998).；Obika, S. Bioorg. Med. Chem., 9, p.1001 (2001).)。對應各鹼基的2’-O,4’-C-亞甲基橋聯核苷具有以下之式所表示的結構，亦有將2’-O,4’-C-亞甲基橋聯腺苷表示為A(L)、2’-O,4’-C-亞甲基橋聯鳥苷表示為G(L)、2’-O,4’-C-亞甲基橋聯-5-甲基胞苷表示為C(L)(鹼基之結構為5C，但方便上表示為C(L)；亦可取代為2’-O,4’-C-亞甲基橋聯胞苷而使用)、2’-O,4’-C-亞甲基橋聯尿苷表示為U(L)、2’-O,4’-C-亞甲基橋聯-5-甲基尿苷表示為T(L)的情形。又，未特定鹼基的2’-O,4’-C-亞甲基橋聯核苷有標記為N(L)的情形。
(上述各式中，虛線表示鍵結肢。)
本發明之寡核苷酸或其鹽具有：具有與標的序列之核苷酸序列實質上互補的核苷酸序列的反義股區域(有時亦僅稱為反義股)、及具有與該反義股區域之互補區域中的核苷酸序列實質上互補的核苷酸序列的有義股區域(有時亦僅稱為有義股)。有義股區域及反義股區域雖在互補區域之核苷酸序列中形成雙股結構，但可作為各自獨立的寡核苷酸而形成雙股寡核苷酸，亦可一者之5’末端的核苷酸之5’位與另一者之3’末端的核苷酸之3’位(3’位經修飾的核苷酸則為2’位)連結而形成單股寡核苷酸。即，本發明之寡核苷酸可為2分子之寡核苷酸，亦可為1分子之寡核苷酸。本發明之寡核苷酸為1分子之寡核苷酸的情形，就有義股區域及反義股區域之連結樣式而言，只要本發明之寡核苷酸具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用則未特別限定，可列舉例如一者之5’末端的核苷酸之5’位與另一者之3’末端的核苷酸之3’位(3’位經修飾的核苷酸則為2’位)之利用所期望之化學連接子或寡核苷酸連接子的連結。就該種連接子而言，可列舉例如WO2012/074038記載之連接子，較佳可列舉下述式(Z)所表示的連接子。下述式(Z)所表示的連接子可按照WO2012/074038而適宜調整。
(上述式中，虛線表示鍵結肢，與苯基鍵結的氧原子表示與鄰接的反義股區域之5’末端的核苷酸之5’-磷酸基作成磷酸二酯鍵，另一者之末端的亞甲基表示與鄰接的有義股區域之3’末端的核苷酸之3’-磷酸基(3’位經修飾的核苷酸則為2’位的磷酸基)作成磷酸二酯鍵，形成的各磷酸二酯鍵可為硫代磷酸酯鍵等之經化學修飾的磷酸二酯鍵。)
本發明之寡核苷酸中3’末端之核苷酸之3’位(3’位經修飾的核苷酸則為2’位)及/或5’末端之核苷酸之5’位可為羥基或磷酸基，彼等可為經化學修飾的結構。就經化學修飾的結構而言，可列舉例如下述式(2)表示的結構。
(上述式中，虛線表示鍵結肢，一者之鍵結肢表示與鄰接的核苷酸鍵結，與5’末端之核苷酸鍵結的情形係表示與5’-磷酸基形成磷酸二酯鍵，與3’末端之核苷酸鍵結的情形係表示與3’-磷酸基(3’位經修飾的核苷酸則為2’位的磷酸基)形成磷酸二酯鍵，另一者之鍵結肢係表示與氫原子鍵結而成為羥基，形成的磷酸二酯鍵可為硫代磷酸酯鍵等之經化學修飾的磷酸二酯鍵。)
本說明書中的「實質上相同之核苷酸序列」係除了相對於成為對象的核苷酸序列而言由全部相同的鹼基所構成的核苷酸序列之外，亦包含：具有70%以上之序列同一性的核苷酸序列、雖包含1或數個不相同的鹼基但可發揮作為寡核苷酸所期望之功能的核苷酸序列。此處，「相同的鹼基」係除了與原本的鹼基完全相同的鹼基之外，還包含具有與原本的鹼基同等以上之鹼基對形成能力的鹼基。就該種鹼基而言，例如，為化學修飾鹼基且具有與原本的鹼基同等以上之鹼基對形成能力的鹼基(例如，C與5C、U與T(5U))係視為各自相同的鹼基。關於序列之同一性，係指相對於成為對象的核苷酸序列而言具有較佳為80%以上、進一步較佳為90%以上、進一步更佳為91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同一性的序列；或者具有3個鹼基、2個鹼基或1個鹼基的錯誤配對的序列。核苷酸序列之同一性可使用BLAST(註冊商標)等之周知基因解析軟體進行計算。
本說明書中的「實質上互補的核苷酸序列」係除了相對於成為對象的核苷酸序列而言由全部互補的核苷酸所構成的核苷酸序列之外，亦包含雖1或數個(例如，5個、4個、3個、或2個)核苷酸並非互補的核苷酸但寡核苷酸彼此形成鹼基對的核苷酸序列。又，在本說明書，「互補的鹼基」係指相對於成為對象的鹼基而言可形成沃森-克里克鹼基對的鹼基，可為未修飾之鹼基，亦可為經化學修飾的鹼基。例如，5-甲基尿嘧啶與腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶與鳥糞嘌呤係各自彼此互補的鹼基。
本說明書中的寡核苷酸之「雙股結構」係指彼此實質上互補的核苷酸序列彼此形成沃森-克里克鹼基對而具有雙股之結構者。形成雙股結構的核苷酸序列可為2個分子之不同寡核苷酸間的實質上互補的核苷酸序列彼此，亦可為單股寡核苷酸之內部中實質上互補的序列彼此。
在本說明書，「結構單元」係指對寡核苷酸賦予所期望之功能的化學結構單元。就賦予寡核苷酸的所期望之功能而言，可列舉例如將寡核苷酸運輸到標的組織或標的細胞(亦稱為標的組織等)的功能、改善寡核苷酸之體內動態的功能等。結構單元能以周知之方法與寡核苷酸鍵結，例如，藉由結構單元中具有亞磷醯胺(amidite)結構，可與寡核苷酸之3’末端的核苷酸之3’位(3’位經修飾的核苷酸則為2’位)或5’末端之核苷酸之5’位鍵結。又，藉由結構單元中具有配體(ligand)等之促進對標的組織等的運輸之結構，可對寡核苷酸賦予對於標的組織等的運輸能力，就該種結構而言，可列舉用以運輸至肝細胞的GalNAc單元、用以運輸至肝臟或肌肉組織的脂肪酸單元等。在本說明書，有時將此種用以賦予對於標的組織等的運輸能力的結構單元特別稱為「運輸用單元」。
＜2. RNAi-寡核苷酸＞ 在本說明書，「RNAi-寡核苷酸」係指於有義股區域及反義股區域中所包含的實質上互補的核苷酸彼此形成沃森-克里克鹼基對，包含形成雙股結構的互補區域，且具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用的寡核苷酸。只要具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，RNAi-寡核苷酸中所包含的互補區域的全部鹼基可不形成沃森-克里克鹼基對。在本說明書，RNAi-寡核苷酸亦有記載為「siRNA」的情形。
在本說明書，「與標的序列實質上相同之核苷酸序列」係指與標的序列相同之核苷酸序列，但除了完全相同的序列之外，只要RNAi-寡核苷酸具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，亦包含實質上相同之核苷酸序列。
在本說明書，「與標的序列實質上互補的核苷酸序列」係指與標的序列互補的核苷酸序列，但除了完全互補的序列之外，只要RNAi-寡核苷酸具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，亦包含實質上互補的核苷酸序列。
在本說明書，將包含與標的序列實質上互補的核苷酸序列且對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用的寡核苷酸稱為針對標的基因的RNAi-寡核苷酸。
針對標的基因的RNAi-寡核苷酸之核苷酸序列只要具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，則未特別限制，但例如可使用電腦軟體(例如，GENETYX(註冊商標)：GENETYX COORPORATION製等)，基於預測具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用的序列而決定。再者，亦可藉由確認基於選擇的序列所製作的RNAi-寡核苷酸之RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用而決定。
在本說明書中，基因表現抑制作用係除了完全抑制基因之表現的作用之外，亦包含與對照相比而使基因之表現減少的作用，基因緘默化(gene silencing)亦包含於基因表現抑制作用中。又，於本說明書，將基因表現抑制作用與基因表現抑制活性用於相同的意義。
RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用能以該發明所屬技術領域中具有通常知識者通常進行的方法確認，例如可藉由下述而確認：將對表現標的基因的細胞投予針對標的基因的RNAi-寡核苷酸而經過一定時間後之標的基因的轉譯產物的蛋白質，藉由西方墨點解析而定量，並將蛋白質之表現量與對照進行比較。又，亦可藉由下述而確認：藉由即時PCR之手法，而即時地測定針對標的基因的RNAi-寡核苷酸投予後之標的基因之表現量。
在本說明書，「標的序列」係指針對標的基因的編碼運鐵蛋白受體2的基因的mRNA之核苷酸序列中可為任一部分的18個核苷酸以上之序列，意指作為本發明之RNAi-寡核苷酸的標的之序列。又，在標的序列中已知有SNPs等的情形，具有彼等的變異的序列亦包含於標的序列。於本發明之RNAi-寡核苷酸中，反義股區域之至少一部分包含與標的序列實質上互補的序列(以下，「標的對應序列」)。
在本說明書，「互補區域」係意指RNAi-寡核苷酸中所包含的有義股區域與反義股區域之核苷酸序列彼此實質上互補的區域。有義股區域與反義股區域在其互補區域中，未必需要完全互補，但至少互補區域中的末端的鹼基彼此為互補。在本發明之RNAi-寡核苷酸，反義股區域之互補區域包含標的對應序列，但在互補區域之5’末端及/或3’末端進一步延長的區域，可維持與有義股區域之互補性。
構成本發明中的RNAi-寡核苷酸的反義股區域中之標的對應序列的鏈長只要具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，則未特別限定，可為從18個核苷酸至標的基因的開讀框(ORF)之全長為止的任一長度。例如，標的對應序列的鏈長可作成18～29個核苷酸，較佳為18～24個核苷酸、18～23個核苷酸、或18～22個核苷酸，更佳為18～21個核苷酸，進一步較佳為18或19個核苷酸。
構成本發明中的RNAi-寡核苷酸的有義股區域及反義股區域中的各互補區域之鏈長只要具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，則未特別限定，可為任一長度。例如，互補區域之鏈長可作成19～29個核苷酸，較佳為19～24個核苷酸、19～23個核苷酸、或19～22個核苷酸，更佳為19～21個核苷酸，進一步較佳為19個核苷酸。
構成本發明中的RNAi-寡核苷酸的有義股區域及反義股區域之鏈長只要具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，則未特別限定，可為任一長度。就有義股區域之鏈長而言，例如，可作成19～39個核苷酸，較佳為19～29個核苷酸，更佳為19～24個核苷酸、19～23個核苷酸、或19～22個核苷酸，進一步較佳為19～21個核苷酸，最佳為19個核苷酸。就反義股區域之鏈長而言，例如，可作成19～39個核苷酸，較佳為19～29個核苷酸，更佳為19～24個核苷酸、19～23個核苷酸、或19～22個核苷酸，進一步較佳為21～23個核苷酸，最佳為21個核苷酸。
於本發明之RNAi-寡核苷酸中，有義股區域與反義股區域存在於不同的寡核苷酸分子的情形，不需要其全體皆為雙股結構，且可具有5’及/或3’末端之核苷一部分突出、或不形成雙股結構的外伸結構。該種外伸結構可列舉例如由1～5個核苷、較佳為1～3個核苷、進一步較佳為2個核苷所構成的結構。又，外伸結構可存在於雙股寡核苷酸之全部的末端，亦可僅存在於其一部分。在本說明書，就外伸結構的表示而言，有分別將有義股區域之5’末端表示為S O5、3’末端表示為S O3，將反義股區域之5’末端表示為A O5、3’末端表示為A O3的情形。外伸結構的鹼基序列未特別限定，可採用寡聚T (Oligo T)或寡聚U (Oligo U)。
RNAi-寡核苷酸具有選自下述之(i)～(iv)的至少一者的性質。 (i)具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用；  (ii)對RNA分解酵素為穩定，且具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用；  (iii)對於核酸外切酶為穩定，且具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用；  (iv)對於RNA分解酵素、核酸外切酶為穩定，且具有針對標的基因的RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用。
就RNAi-寡核苷酸之一例而言，源自雙股寡核苷酸，該雙股寡核苷酸具有：針對標的基因的反義股區域、及具有與該反義股區域實質上互補的核苷酸序列的有義股區域，此反義股區域之5’末端的核苷酸之5’位及有義股區域之3’末端的核苷酸之3’位(3’位經修飾的核苷酸則為2’位)各自可藉由形成可經化學修飾的磷酸二酯結構的連接子而鍵結。此種寡核苷酸可列舉形成寡核苷酸3’-P(=O)(OH)-[連接子]-P(=O)(OH)-5’-寡核苷酸之結構[此處，『寡核苷酸3’』表示寡核苷酸之3’末端的核苷酸之3’位(3’位經修飾的核苷酸則為2’位)不具有羥基上的氫原子的結構，『5’-寡核苷酸』表示寡核苷酸之5’末端的核苷酸之5’位不具有羥基上的氫原子的結構]的寡核苷酸。此種連接子，例如記載於WO2012/074038等，可參考此等文獻的記載而合成。
構成RNAi-寡核苷酸的核苷可為天然型核苷，亦可採用糖修飾核苷。又，核苷間鍵結為可經化學修飾的磷酸二酯鍵，例如，可適宜選擇磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵。
本發明之RNAi-寡核苷酸可抑制TfR2 mRNA之表現。又，本發明之RNAi-寡核苷酸對於細胞的毒性小，可應用於安全性高的醫藥品。又，本發明之RNAi-寡核苷酸可藉由抑制TfR2 mRNA之表現，而抑制在鐵代謝中負責中心任務的鐵調素之產生。又，本發明之RNAi-寡核苷酸可藉由抑制TfR2 mRNA之表現，而使血漿中鐵濃度及/或HGB值上升。作用機制雖未特別限定，但本發明之RNAi-寡核苷酸可用於治療或預防藉由抑制TfR2 mRNA之表現及/或鐵調素之產生而可治療或預防的疾病。就該種疾病而言，可列舉例如貧血。作用機制雖未特別限定，但本發明之RNAi-寡核苷酸，例如，可藉由使HGB值上升而治療或預防貧血。又，本發明之RNAi-寡核苷酸對於需要血液細胞輸血的貧血患者，可減輕血液細胞輸血之頻率及/或輸血量。例如，對於貧血患者，可將一定期間(例如，1日、1週、2週、4週、8週、12週、1個月、2個月、3個月、6個月或1年)的血液細胞輸血之頻率及/或輸血量減輕約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、或約100%。
本發明提供：含有本發明之RNAi-寡核苷酸作為有效成分的用於治療或預防貧血的醫藥組成物、包含投予該寡核苷酸之有效量之治療或預防貧血的方法、用以於貧血之治療或預防中使用的該寡核苷酸、本發明之RNAi-寡核苷酸在貧血之治療或預防用醫藥組成物之製造中的用途等之醫藥用途發明。本發明之RNAi-寡核苷酸可治療或預防的貧血包含例如：伴隨慢性炎症的貧血(anemia of chronic disease，ACD)、伴隨骨髓功能不全的貧血、缺鐵性貧血、對鐵劑療效不佳的貧血(iron refractory iron deficiency anemia，IRIDA)、紅血球生成刺激因子製劑(erythropoietin stimulating agent，ESA)抵抗性之貧血、由化學療法所誘導的貧血、再生不良性貧血、戴布二氏貧血、及β地中海型貧血或鐮狀細胞貧血症等之遺傳性血紅素異常症等。伴隨慢性炎症的貧血包含例如：伴隨類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡或自體免疫溶血性貧血等之自體免疫疾病的貧血、伴隨感染症的貧血、伴隨炎症性大腸炎等之炎症性腸疾病的貧血、伴隨心臟衰竭的貧血、伴隨慢性腎臟病的貧血、癌性貧血、伴隨巨噬細胞活化症候群的貧血及伴隨卡斯爾曼氏病的貧血等。伴隨慢性腎臟病的貧血包含伴隨例如下列慢性腎臟病的貧血：伴隨糖尿病的腎臟病、伴隨高血壓的腎臟病、腎病症候群(可列舉例如芬蘭型先天性腎病症候群、瀰漫性腎絲球環間膜硬化症(diffuse mesangial sclerosis)、微小改變型腎病症候群、局灶節段性腎絲球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis)、膜性腎病變、加洛威-莫沃特(Galloway-Mowat)症候群等)、伴隨慢性腎絲球腎炎的腎臟病(可列舉例如IgA腎病變、腎絲球環間膜增殖性腎絲球腎炎、膜性增生性腎絲球腎炎、紫瘢性腎炎、抗腎絲球基底膜腎炎(古德巴斯捷(Goodpasture)症候群)、艾柏(Alport)症候群、愛潑斯坦(Epstein)症候群、狼瘡性腎炎、顯微多血管炎、非典型溶血性尿毒症候群、甲髕(Nail-Patella)症候群(指甲髕骨症候群)、纖維接合素腎絲球病變(fibronectin glomerulopathy)、脂蛋白腎絲球病變(lipoprotein glomerulopathy)等)、伴隨慢性腎小管間質性腎炎的腎臟病、伴隨慢性腎盂腎炎的腎臟病、伴隨類澱粉沉積的腎臟病、體染色體顯性腎小管間質性腎臟病、伴隨腎消耗病(nephronophthisis)的腎臟病、伴隨腎臟畸形的腎臟病(可列舉例如   多囊性腎等)等。癌性貧血包含例如伴隨多發性骨髓瘤、急性白血病、慢性白血病、肺癌或乳癌等之癌症的貧血。伴隨骨髓功能不全的貧血包含例如：伴隨骨髓纖維化的貧血、伴隨骨髓化生不良症候群的貧血、伴隨慢性骨髓單核球白血病(chronic myelomonocytic leukemia，CMML)的貧血、伴隨由化學療法所致的骨髓抑制的貧血、再生不良性貧血、戴布二氏貧血、範可尼貧血等。
本發明之RNAi-寡核苷酸較佳可用於治療或預防伴隨慢性炎症的貧血、伴隨骨髓功能不全的貧血，更佳可用於治療或預防伴隨類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡或自體免疫溶血性貧血等之自體免疫疾病的貧血、伴隨感染症的貧血、伴隨炎症性大腸炎等之炎症性腸疾病的貧血、伴隨心臟衰竭的貧血、伴隨慢性腎臟病的貧血、癌性貧血、伴隨卡斯爾曼氏病的貧血、伴隨骨髓纖維化的貧血、伴隨骨髓化生不良症候群的貧血、伴隨慢性骨髓單核球白血病的貧血、及伴隨由化學療法所致的骨髓抑制的貧血。
在本說明書，「併用」係指將2個以上之不同藥劑同時、各別或依序投予。本發明提供一種貧血之治療或預防方法，其包含將本發明之RNAi-寡核苷酸與其他之1或2個以上之藥劑併用。本發明之RNAi-寡核苷酸只要發揮本發明之效果，可與其他之1或2個以上之藥劑併用。較佳為藉由將本發明之RNAi-寡核苷酸與對於貧血症狀的作用機制不同的其他藥劑併用，可提供更大的治療效果。例如，對於骨髓化生不良症候群(Myelodysplastic syndrome，MDS)，有開立具有藉由促進紅血球之增殖而治療貧血的作用機制的ESA(紅血球生成刺激劑)、具有藉由促進紅血球之分化而治療貧血的作用機制的羅特西普(Luspatercept)等之藥劑、具有抑制DNA甲基化並殺傷異常細胞的作用機制的阿扎胞苷(Azacitidine)等之藥劑的處方的情形，但此等藥劑與TfR2 siRNA係作用機制不同。因此，此等藥劑與TfR2 siRNA之併用，對於MDS可提供比單劑更大的治療效果。又，對於伴隨慢性腎臟病的貧血，有開立具有藉由促進紅血球之增殖而治療貧血的作用機制的ESA或HIFPHD(缺氧誘導因子脯胺醯基羥化酶)抑制藥等之藥劑的處方的情形，但此等藥劑與TfR2 siRNA係作用機制不同。因此，此等藥劑與TfR2 siRNA之併用，對於伴隨慢性腎臟病的貧血可提供比單劑更大的治療效果。又，魯索利替尼已知對於骨髓纖維化，主要對於脾腫大等之症狀顯示治療效果(N Engl J Med 2012; 366:799-807)。然而，已知對於貧血症狀的效果係局限性的或無效、或者使貧血惡化(Journal of Hematology & Oncology 2013, 6:79)。就由魯索利替尼(Ruxolitinib)所致的貧血惡化的機制而言，認為在於藉由阻礙JAK2而會抑制紅血球細胞之增殖所必要的EPO訊息。然而，魯索利替尼於骨髓纖維化中，對於排除貧血的症狀而言得到一定的治療效果，因此魯索利替尼與TfR2 siRNA的併用可提供對於骨髓纖維化中的貧血有用的治療效果。同樣地，藉由與魯索利替尼以外之其他JAK2抑制藥的併用，亦可提供對於骨髓纖維化中的貧血有用的治療效果。就其他之JAK2抑制藥而言，可列舉例如菲卓替尼(Fedratinib)、帕克替尼(Pacritinib)及莫美洛替尼(Momelotinib)等。
將本發明之RNAi-寡核苷酸與其他藥劑併用而使用的情形，投予本發明之RNAi-寡核苷酸的順序只要發揮本發明之效果則未特別限定，可與併用的其他藥劑同時投予，亦可於併用的其他藥劑之投予之前或後投予。就可與本發明之RNAi-寡核苷酸併用的藥劑而言，可列舉例如其他之貧血治療藥或成為貧血之原因的疾病之治療藥。就其他之貧血治療藥而言，可列舉例如：ESA、HIFPHD(缺氧誘導因子脯胺醯基羥化酶)抑制藥、經口鐵劑、靜脈注射鐵劑、達那唑(Danazol)、羅特西普等。就ESA而言，可列舉例如：依泊汀α、依泊汀β、依泊汀β PEGOL、依泊汀kappa、達貝泊汀α等。就HIFPHD抑制藥而言，可列舉例如：羅沙司他、伐度司他、達普司他、恩那司他、莫立司他等。就經口鐵劑而言，可列舉例如：檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵、反丁烯二酸亞鐵、可溶性焦磷酸鐵、乾燥硫酸鐵等。就靜脈注射鐵劑而言，可列舉例如羧基麥芽糖鐵、含糖氧化鐵等。又，就成為貧血之原因的疾病之治療藥而言，可列舉例如：骨髓纖維化治療藥、骨髓化生不良症候群治療藥、慢性腎臟病治療藥、抗癌劑等。就骨髓纖維化治療藥而言，可列舉例如JAK2抑制藥。就JAK2抑制藥而言，可列舉例如魯索利替尼、菲卓替尼、帕克替尼、及莫美洛替尼等，較佳為與魯索利替尼之併用。就骨髓化生不良症候群治療藥而言，可列舉例如阿扎胞苷、來那度胺(Lenalidomide)等，較佳為與阿扎胞苷或來那度胺的併用。就慢性腎臟病治療藥而言，可列舉例如：SGLT2(鈉-葡萄糖共同運輸蛋白2)抑制藥、腎素-血管張力素系統抑制藥(例如，血管張力素II受體拮抗藥(ARB)、血管張力素轉化酶(ACE)抑制藥等)、鈣拮抗藥、利尿藥、糖尿病治療藥、高脂血症治療藥、類固醇、免疫抑制藥等。於抗癌劑中包含化學療法藥，就化學療法藥而言，可列舉例如：順鉑、卡鉑、多柔比星、紫杉醇、氨柔比星等。
又，本發明之RNAi-寡核苷酸可與血鐵沉積症之治療藥併用。進行血液細胞輸血作為對於貧血的治療的情形，伴隨慢性的血液細胞輸血可能使血鐵沉積症發病。血鐵沉積症係指由於源自輸血的血液細胞的鐵蓄積在肝臟、心臟等之組織中所產生的病態，可能呈現肝臟衰竭、心臟衰竭、糖尿病、關節痛、甲狀腺功能低下症、垂體機能減退、或性功能障礙等。因此，在對於貧血的治療中，有使用用於治療或預防血鐵沉積症之血鐵沉積症治療藥的情形，可適合地與本發明之RNAi-寡核苷酸併用。就血鐵沉積症之治療藥而言，可列舉例如鐵螯合劑等，就鐵螯合劑而言，可列舉地拉羅司(Deferasirox)、去鐵胺(Deferoxamine)、去鐵酮(Deferiprone)等。
＜3. S3M-寡核苷酸＞ 本發明提供一種RNAi-寡核苷酸(以下，稱為「S3M-寡核苷酸」)或其藥學上可容許的鹽，其中有義股區域係由以下之式(I)表示的寡核苷酸所構成，反義股區域係由以下之式(II)表示的寡核苷酸所構成，且進一步具有以下之(a)至(g)所示的特徵：  有義股區域：5’ S O5-S a-S 19-S 18-S 17-S 16-S 15-S 14-S 13-S 12-S 11-S 10-S 9-S 8-S 7-S 6-S 5-S 4-S 3-S 2-S 1-S O33’ (I)  反義股區域：5’ A O5-A 1-A 2-A 3-A 4-A 5-A 6-A 7-A 8-A 9-A 10-A 11-A 12-A 13-A 14-A 15-A 16-A 17-A 18-A 19-A a-A O33’ (II)  (a) S 1～S 19係各自表示1個核苷，S 1為3’-修飾核苷。S a為0～10個核苷，較佳為0～5個或0～4個，更佳為0～3個、0～2個、或0～1個核苷。S O3及S O5係各自獨立為0～5個核苷，較佳為0～4個核苷，更佳為0～3個、0～2個、或0～1個核苷。各核苷間之鍵結係表示可經化學修飾的磷酸二酯鍵；  (b) A 1～A 19係各自表示1個核苷，A 11、A 12、A 13、A 14及A 15中至少一者為DNA、RNA、2’-O,4’-C-橋聯化核苷或2’-MOE RNA。A a為0～10個核苷，較佳為0～5個或0～4個核苷，更佳為0～3個、0～2個、或0～1個核苷。A O3及A O5係各自獨立為0～5個，較佳為0～4個，更佳為0～3個、0～2個、或0～1個核苷。各核苷間之鍵結係表示可經化學修飾的磷酸二酯鍵；  (c) A 2～A a之間的核苷酸序列係由與標的序列實質上互補的核苷酸序列(標的對應序列)所構成，A 1為具有與標的序列之對應的核苷互補的鹼基的核苷、具有腺嘌呤的核苷、具有胸腺嘧啶的核苷、或具有尿嘧啶的核苷，A O3與A O5存在的情形，該核苷酸序列係各自獨立為與標的序列之對應的核苷獨立地選擇的核苷酸序列；  (d) S 1～S a之間的核苷酸序列與A 1～A a之間的核苷酸序列係由彼此實質上互補的核苷酸序列所構成的互補區域，且形成雙股結構；  (e) S O5與A O3兩者存在的情形，S O5與A O3係彼此不互補的核苷；  (f) S O3與A O5兩者存在的情形，S O3與A O5係彼此不互補的核苷；以及  (g) 有義股區域及/或反義股區域之5’末端之核苷的5’位及/或3’末端之核苷的3’位可經化學修飾，或者3’末端之核苷為3’-修飾核苷的情形，其2’位可經化學修飾。
＜3-1. 有義股區域＞ S3M-寡核苷酸之有義股區域係指上述式(I)所表示的區域，即S O5～S O3。S3M-寡核苷酸之有義股區域中的互補區域係表示為從3’末端之核苷起編號的S 1～S 19、及位於互補區域之5’側的S a。即，S3M-寡核苷酸之有義股中的互補區域為上述式(I)中的S 1～S a的區域。S 1～S 19係各自表示一個核苷，S a係表示0～5個核苷，較佳為0～4個核苷，更佳為0～3個、0～2個、或0～1個核苷。又，有義股區域之外伸結構係將附加於5’末端者表示為S O5、附加於3’末端者表示為S O3，各自表示0～5個核苷，較佳為0～4個核苷，更佳為0～3個、0～2個、或0～1個核苷。
S3M-寡核苷酸係以位於有義股區域中的互補區域之3’末端的核苷(即，上述式(I)中的S 1)為3’-修飾核苷作為特徵。就該種3’-修飾核苷而言，只要S3M-寡核苷酸具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，則未特別限定，較佳為3’-去氧-3’-氟RNA (3’-F RNA)、3’-OMe RNA、或3’-MOE RNA，更佳為3’-OMe RNA。再者，此3’-修飾核苷之2’位可為羥基、可經修飾的烷氧基(較佳為甲氧基、乙氧基、甲氧基乙氧基)、或可經修飾的磷酸基(較佳為硫代磷酸基、二硫代磷酸基、甲基磷酸基、乙基磷酸基)，亦可與外伸結構(即，上述式(I)中的S O3)之核苷的5’位鍵結，或可與連接子結構鍵結。較佳係2’位為羥基。
S3M-寡核苷酸之有義股區域中的互補區域之S 1以外之核苷未特別限定，可採用各式各樣的天然核苷或糖修飾核苷，較佳係各自獨立為2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA。
S3M-寡核苷酸之有義股區域中的互補區域之一個態樣係從3’末端起第11、12、13及15號之核苷(即，上述式(I)中的S 11、S 12、S 13及S 15)中，至少一者為2’-F RNA，其以外之核苷為2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或彼等之組合。較佳係S 11、S 12、S 13及S 15全部為2’-F RNA。
S3M-寡核苷酸之有義股區域中的互補區域之一個較佳態樣係有義股區域中的互補區域之S 2～S 10、S 14、S 16～S 19及S a之核苷各自獨立為2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA或者為由彼等選擇的2種類交互地配置的修飾型式，更佳係各自獨立為2’-OMe RNA或DNA或者為彼等交互地配置的修飾型式，進一步更佳係彼等全部為2’-OMe RNA。S a之核苷數可在0～10個間適宜選擇，因應必要，有從其3’側起表示為S 20、S 21、S 22、S 23、S 24、S 25、S 26、S 27、S 28、及S 29的情形。
S3M-寡核苷酸之有義股區域中的互補區域之核苷酸序列(即，上述式(I)中的S 1～S a)係與反義股區域中的互補區域(即，上述式(II)中的A 1～A a)實質上互補的核苷酸序列。
S3M-寡核苷酸之有義股區域在其互補區域之3’末端及/或5’末端可具有外伸結構(即，上述式(I)中的S O3及S O5)。S O3及S O5係各自獨立表示0～5個(較佳為4、3、2、1或0個)核苷，各自之核苷係獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷。較佳為S O3及S O5不存在。
S O3及S O5存在的情形，其鹼基只要發揮作為外伸的功能，則未特別限定，較佳為Oligo U或Oligo T。
在以下式(Ia)～(Ic)中例示S3M-寡核苷酸之有義股區域之修飾型式。 5’ S O5(N(M))-S a(N(M)-N(M))-S 19(N(M))-S 18(N(M))-S 17(N(M))-S 16(N(M))-S 15(N(F))-S 14(N(M))-S 13(N(F))-S 12 (N(F))-S 11(N(F))-S 10(N(M))-S 9(N(M))-S 8(N(M))-S 7(N(M)) -S 6(N(M))-S 5(N(M))-S 4(N(M))-S 3(N(M))-S 2(N(M))-S 1(N (3M))-2’H 3’(Ia)  5’ S a(N(M))-S 19(N(M))-S 18(N(M))-S 17(N(M))- S 16(N(M))-S 15(N(F))-S 14(N(M))-S 13(N(F))-S 12(N(F))-S 11(N (F))-S 10(N(M))-S 9(N(M))-S 8(N(M))-S 7(N(M))-S 6(N(M))-S 5(N(M))-S 4(N(M))-S 3(N(M))-S 2(N(M))-S 1(N(3M))-2’H 3’ (Ib)  5’ S 19(N(M))-S 18(N(M))-S 17(N(M))-S 16(N(M))-S 15 (N(F))-S 14(N(M))-S 13(N(F))-S 12(N(F))-S 11(N(F))-S 10(N (M))-S 9(N(M))-S 8(N(M))-S 7(N(M))-S 6(N(M))-S 5(N(M))-S 4 (N(M))-S 3(N(M))-S 2(N(M))-S 1(N(3M))-2’H 3’(Ic)  [於上述式中，(N(M))表示2’-OMe RNA，(N(F))表示2’-F RNA，(N(3M))表示3’-OMe RNA。S O5(N(M))及S a(N(M))表示由0～3個2’-OMe RNA所構成的核苷。各寡核苷酸之從5’末端及3’末端起3個核苷的2處之核苷間鍵結為硫代磷酸酯鍵，其以外之核苷間鍵結為磷酸二酯鍵。即，各寡核苷酸係在3’末端與5’末端，各自有2處，合計4處之硫代磷酸酯鍵。]
＜3-2. 反義股區域＞ S3M-寡核苷酸之反義股區域係指上述式(II)所表示的區域，即A O5～A O3。S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域係表示為從5’末端之核苷起編號的A 1～A 19、及位於互補區域之3’側的A a。即，反義股之互補區域為上述式(II)中的A 1～A a的區域。S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之核苷酸序列係與標的序列實質上互補的核苷酸序列即可，例如，可包含與標的序列之5、4、3、2或1個鹼基的錯誤配對，較佳為完全互補。A 1～A 19係各自表示一個核苷，A a表示0～5個核苷。又，反義股區域之外伸結構係將附加於5’末端者表示為A O5、附加於3’末端者表示為A O3。
A 1可為與標的序列之對應的鹼基實質上互補的鹼基，亦可與標的序列獨立地為腺嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶。siRNA之有義股的互補區域中的3’末端的鹼基係與標的序列無關地為腺嘌呤或尿嘧啶的情形，顯示良好的RNA干擾活性，此已記載於US專利10093923等。又，於文獻(Nature 465, 818-822 (2010))顯示反義股之5’末端的核苷會與參與RNA干擾活性的Ago2蛋白質結合，而不與標的mRNA結合。亦顯示反義股之5’末端的核苷為腺嘌呤或尿嘧啶核苷的情形，比起為鳥糞嘌呤或胞嘧啶的情形，會與Ago2蛋白質更強地結合，因此反義股之5’末端較佳為腺嘌呤或尿嘧啶核苷。
S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之A 11、A 12、A 13、A 14及A 15中至少一者(較佳為2個以上)為選自由DNA、RNA、2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷及2’-MOE RNA所組成的群組的任一者。就此處使用的2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷而言，未特別限定，但較佳為LNA或ENA。於反義股互補區域，前述中所鑑定的核苷以外之核苷未特別限定，可採用各式各樣的天然核苷或糖修飾核苷，但較佳係各自獨立為2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA。
作為本發明之一例，提供S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之A 14為RNA的寡核苷酸。就此種寡核苷酸之修飾型式而言，可例示例如圖2之56型、57型、圖3之61型、62型、66型及67型、圖5之75型～83型、圖6之91型～95型所示者，但未限定於此等。
就A 14為RNA的寡核苷酸之反義股區域之較佳態樣而言，A 13為2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷、2’-OMe RNA或2’-F RNA，更佳為2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷，進一步較佳為ENA或LNA(圖5之76型～83型、及圖6之91型～93型)。於此種S3M-寡核苷酸，作為A 11-A 12-A 13-A 14-A 15之修飾型式，較佳為以下式(IIIa)～(IIIh)之任一者。  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(ENA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA) (IIIa)  A 11(2’-F RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(ENA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA) (IIIb)  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-F RNA)-A 13(ENA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA) (IIIc)  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(LNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA) (IIId)  A 11(2’-F RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(LNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA) (IIIe)  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-F RNA)-A 13(LNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA) (IIIf)  A 11(2’-F RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA) (IIIg)  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-F RNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA) (IIIh)
作為本發明之一例，提供S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之A 14為2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷的寡核苷酸。此處，作為2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷，較佳為ENA或LNA。就此種寡核苷酸之修飾型式而言，可例示例如圖4之70型～74型、及圖6之88型～90型所示者，但未限定於此等。
就A 14為2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷的寡核苷酸之較佳態樣而言，A 12為DNA。於此種S3M-寡核苷酸，作為反義股互補區域之A 11-A 12-A 13-A 14-A 15之修飾型式，較佳為以下式(IIIi)～(IIIl)之任一者。 A 11(2’-F RNA)-A 12(DNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(ENA)-A 15(2’-OMe RNA) (IIIi)  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(DNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(ENA)-A 15(2’-OMe RNA) (IIIj)  A 11(2’-F RNA)-A 12(DNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(LNA)-A 15(2’-OMe RNA) (IIIk)  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(DNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(LNA)-A 15(2’-OMe RNA) (IIIl)
作為本發明之一例，提供S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之A 14為DNA的寡核苷酸。就此種寡核苷酸之修飾型式而言，可例示例如圖2之58型及59型、圖3之63型、64型、68型及69型所示者，但未限定於此等。
作為本發明之一例，提供S3M-寡核苷酸之反義股區域之式(II)之A 15為2’-MOE RNA的寡核苷酸。就作為此種寡核苷酸之修飾型式而言，可例示例如圖5之79型及83型所示者，但未限定於此等。
作為本發明之一例，提供S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之從5’末端起第11～13號之核苷(式(II)之A 11、A 12、A 13)之任一者為2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷的寡核苷酸。就此種寡核苷酸之修飾型式而言，例如，ENA可例示圖1之43型、45型、圖4之75型～84型、圖6之85型、86型、及91型～93型所示者，LNA可例示圖1之44型、46型、及圖3之67型、69型所示者，但未限定於此等。
作為本發明之一例，提供S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之從5’末端起第11～13號之核苷(式(II)之A 11、A 12、A 13)之任一者為DNA的寡核苷酸。就此種寡核苷酸之修飾型式而言，可例示例如圖1之41型、42型、圖4之71型、及圖6之87型～90型所示者，但未限定於此等。
作為本發明之一例，提供S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域之從5’末端起第11～13號之核苷(式(II)之A 11、A 12、A 13)之任一者為2’-MOE RNA的寡核苷酸。就此種寡核苷酸之修飾型式而言，可例示例如圖1之47型、48型、及圖4之74型所示者，但未限定於此等。
於本發明之S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域，上述所特定的核苷以外之核苷可適宜選擇各式各樣的種類，但較佳係A 2、A 6及A 16之至少一者(較佳為全部)之核苷為2’-F RNA。進一步較佳的反義股區域係除了A 2、A 6及A 16之外，進一步選自由A 8、A 9及A 10所組成的群組的1或2個核苷為2’-F RNA，前述所特定的以外之核苷(例如，A 1、A 3～A 5、A 7、A 17 ～A 19及A a)為2’-OMe RNA或DNA。
於本發明之S3M-寡核苷酸之反義股區域中的互補區域，A 11～A 15以外的區域之較佳修飾型式係例如例示於以下之表A-1及表A-2。
[表A-1]
   A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 A 8 A 9 A 10
型式1 (M) (F) (M) (M) (M) (F) (M) (M) (M) (M)
型式2 (M) (F) (M) (M) (M) (F) (M) (F) (M) (M)
型式3 (M) (F) (M) (M) (M) (F) (M) (F) (M) (M)
型式4 (M) (F) (M) (M) (M) (F) (M) (M) (F) (M)
型式5 (M) (F) (M) (M) (M) (F) (M) (M) (M) (F)
型式6 (M) (F) (M) (M) (M) (F) (M) (F) (M) (F)
型式7 (M) (F) (M) (M) (M) (F) (F) (M) (F) (M)
型式8 (M) (F) (M) (F) (M) (F) (M) (M) (M) (M)
型式9 (M) (F) (M) (F) (M) (F) (M) (F) (M) (M)
型式10 (M) (F) (M) (F) (M) (F) (M) (F) (M) (F)
型式11 (M) (F) (M) (F) (M) (F) (M) (F) (F) (M)
型式12 (M) (F) (M) (F) (M) (F) (M) (F) (F) (F)
型式13 (M) (F) (M) (M) (M) (F) (M) (F) (F) (M)
型式14 (M) (F) (M) (F) (M) (F) (M) (M) (F) (M)
型式15 (M) (F) (M) (M) (M) (F) (M) (M) (F) (M)
型式16 (M) (F) (M) (M) (M) (F) (M) (M) (F) (F)
[表A-2]
   A 16 A 17 A 18 A 19 A a A O3
型式1 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式2 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式3 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式4 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式5 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式6 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式7 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式8 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式9 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式10 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式11 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式12 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式13 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式14 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
型式15 (F) (M) (F) (M) (M) (M)
型式16 (F) (M) (M) (M) (M) (M)
[於上述表中，(M)為2’-OMe RNA，(F)為2’-F RNA。A a為0～5個核苷，0以外的情形全部為相同之核苷。A O3為0～5個核苷，0以外的情形全部為相同之核苷。核苷間鍵結係適宜選擇磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵。]
S3M-寡核苷酸中所包含的反義股區域在其互補區域之3’末端及/或5’末端可具有外伸結構(即，上述式(II)中的A O3及A O5)。A O3及A O5係各自獨立表示0～5個(較佳為3、2、1或0個)核苷，各自之核苷係獨立為2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷。較佳係A O3為由2或3個2’-OMe RNA所構成的外伸、或者由1或2個2’-OMe RNA與1或2個2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷所構成的外伸，A O5不存在。
A O3及A O5存在的情形，其鹼基只要發揮作為外伸的功能則未特別限定，較佳為Oligo U或Oligo T。
＜3-3. 核苷間鍵結＞ 本發明之S3M-寡核苷酸的各核苷間之鍵結樣式可適宜選擇可經化學修飾的磷酸二酯鍵，較佳為磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵，可將彼等各自單獨採用、或組合而採用。較佳為磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵之組合，於有義股區域及反義股區域各自所包含的核苷間鍵結，硫代磷酸酯鍵之含有率為50%以下、40%以下、30%以下、29%以下、28%以下、27%以下、26%以下或25%以下。
採用RNA及/或2’-F RNA的情形，該核苷與鄰接其3’側的核苷之間的鍵結可為硫代磷酸酯鍵。較佳為採用RNA的情形，該核苷與鄰接其3’側的核苷之間的鍵結為硫代磷酸酯鍵。
於本發明之S3M-寡核苷酸，寡核苷酸之從5’末端及/或3’末端起第1、2、3、4或5號之核苷間鍵結(作為核苷間之鍵結數，有1、2、3、或4處)較佳為採用硫代磷酸酯鍵。於本發明之寡核苷酸，有義股區域與反義股區域被包含於不同寡核苷酸的情形，有義股區域之從5’末端及3’末端起第1、2、3、4或5號之各自之核苷間、以及反義股區域之從5’末端及3’末端起第1、2、3、4或5號之各自之核苷酸間鍵結可為硫代磷酸酯鍵，較佳係有義股區域之從5’末端及3’末端起第1、2、3號之各自之核苷間鍵結(作為核苷間之鍵結數，為2處)、以及反義股區域之從5’末端起第1、2、3號之各自之核苷間鍵結(作為核苷間之鍵結數，為2處)、及從3’末端起第1、2、3或4號之各自之核苷間鍵結(作為核苷間之鍵結數，為3處)為硫代磷酸酯鍵。
＜4. 寡核苷酸之合成方法＞ 就本發明之寡核苷酸的製備方法而言，只要可合成所期望的寡核苷酸，則未特別限制，可使用已知之化學合成法(磷酸三酯法、亞磷醯胺法(phosphoramidite method)、或H-膦酸酯法(H-phosphonate method)等)。例如，可使用市售之核酸合成機，使用市售之DNA/RNA合成所使用的試藥進行合成。
藉由通常之亞磷醯胺法，具有所期望之核苷酸序列的寡核苷酸可使用DNA合成機，例如PerkinElmer公司之利用亞磷醯胺法的型號392等，依據文獻(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))記載之方法進行合成。
對應各種核苷的亞磷醯胺試藥可購入市售者而使用，亦可按照周知方法而合成。
本發明之寡核苷酸，可使用市售之合成機(例如，PerkinElmer公司之利用亞磷醯胺法的型號392)等，依據文獻(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))記載之方法而進行合成。此時使用的亞磷醯胺試藥，關於天然型之核苷及2’-O-甲基核苷(即，2’-O-甲基鳥苷、2’-O-甲基腺苷、2’-O-甲基胞苷、2’-O-甲基尿苷)，可使用市售之亞磷醯胺試藥。關於2’-O-烷基之碳數為2～6個之2’-O-烷基鳥苷、2’-O-烷基腺苷、2’-O-烷基胞苷及2’-O-烷基尿苷，係如以下所示。
2’-O-胺基乙基鳥苷、2’-O-胺基乙基腺苷、2’-O-胺基乙基胞苷、2’-O-胺基乙基尿苷可按照文獻(Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.)合成對應的亞磷醯胺試藥。
2’-O-丙基鳥苷、2’-O-丙基腺苷、2’-O-丙基胞苷、2’-O-丙基尿苷可按照文獻(Lesnik, E. A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.)合成對應的亞磷醯胺試藥。
2’-O-烯丙基鳥苷、2’-O-烯丙基腺苷、2’-O-烯丙基胞苷、2’-O-烯丙基尿苷可使用市售之亞磷醯胺試藥。
關於2’-MOE RNA，2’-O-甲氧基乙基鳥苷、2’-O-甲氧基乙基腺苷、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷可按照專利(US6261840)或文獻(Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.)合成對應的亞磷醯胺試藥，亦可使用市售的亞磷醯胺試藥。
2’-O-丁基鳥苷、2’-O-丁基腺苷、2’-O-丁基胞苷、2’-O-丁基尿苷可按照文獻(Lesnik, E. A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.)合成對應的亞磷醯胺試藥。
2’-O-戊基鳥苷、2’-O-戊基腺苷、2’-O-戊基胞苷、2’-O-戊基尿苷可按照文獻(Lesnik, E. A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.)合成對應的亞磷醯胺試藥。
2’-O-炔丙基鳥苷、2’-O-炔丙基腺苷、2’-O-炔丙基胞苷、2’-O-炔丙基尿苷可使用市售之亞磷醯胺試藥。
關於2’-F RNA，2’-去氧-2’-氟鳥苷、2’-去氧-2’-氟腺苷、2’-去氧-2’-氟胞苷、2’-去氧-2’-氟尿苷可按照文獻(J. Med. Chem. 36, 831 (1993))合成對應的亞磷醯胺試藥，亦可使用市售之亞磷醯胺試藥。
關於為3’-修飾核苷的3’-F RNA，3’-去氧-3’-氟鳥苷可按照WO2017027645，3’-去氧-3’-氟腺苷可按照WO2018198076，3’-去氧-3’-氟尿苷可按照US2011/0196141，而合成對應的亞磷醯胺試藥。又，3’-去氧-3’-氟胞苷可參考前述文獻等周知的方法而合成。
關於為3’-修飾核苷的3’-OMe RNA，3’-O-甲基鳥苷、3’-O-甲基腺苷、3’-O-甲基胞苷、3’-O-甲基尿苷可使用市售之亞磷醯胺試藥進行合成。
關於為3’-修飾核苷的3’-MOE RNA，3’-O-甲氧基乙基鳥苷、3’-O-甲氧基乙基腺苷、3’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷、3’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷可按照US2003/0096979合成對應的亞磷醯胺試藥。
關於LNA，關於2’-O,4’-C-亞甲基鳥苷、2’-O,4’-C-亞甲基腺苷、2’-O,4’-C-亞甲基胞苷、2’-O,4’-C-亞甲基-5-甲基胞苷及2’-O,4’-C-亞甲基-5-甲基尿苷，可按照WO99/14226記載之方法製造對應的亞磷醯胺試藥。
關於2’-O,4’-C-橋聯部分的伸烷基之碳數為2～5個之2’-O,4’-C-伸烷基鳥苷、2’-O,4’-C-伸烷基腺苷、2’-O,4’-C-伸烷基胞苷、2’-O,4’-C-伸烷基-5-甲基胞苷及2’-O,4’-C-伸烷基-5-甲基尿苷，可按照WO00/47599記載之方法製造對應的亞磷醯胺試藥。
D-核呋喃糖之2’-去氧-2’-C,4’-C-亞甲基氧基亞甲基化的核苷，可按照文獻(Wang, G. et al. Tetrahedron (1999), 55, 7707-7724)合成對應的亞磷醯胺試藥。
S-cEt(約束乙基(constrained ethyl))可按照文獻(Seth, P. P. et al. J. Org. Chem (2010), 75, 1569-1581.)合成對應的亞磷醯胺試藥。
AmNA可按照文獻(Yahara, A. et al. ChemBioChem (2012), 13, 2513-2516.)或WO2014/109384合成對應的亞磷醯胺試藥。
將亞磷醯胺試藥偶合後，藉由使硫、二硫化四乙基秋蘭姆(tetraethylthiuram disulfide) (TETD，Applied Biosystems公司)、Beaucage試藥(Glen Research公司)、或氫化黃原素(xanthane hydride)等之試藥反應，可合成具有硫代磷酸酯鍵的反義寡核苷酸(Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991)、J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)、PCT/WO98/54198)。
將合成機中使用的可控孔徑玻璃珠(controlled pore glass，CPG)、及聚苯乙烯作為固相擔體，結合有2’-O-甲基核苷及3’-O-甲基核苷的固相擔體可使用市售者。又，關於2’-O,4’-C-亞甲基鳥苷、2’-O,4’-C-亞甲基腺苷、2’-O,4’-C-亞甲基-5-甲基胞苷及2’-O,4’-C-亞甲基-5-甲基尿苷，可按照WO99/14226記載之方法，關於伸烷基之碳數為2～5個之2’-O,4’-C-伸烷基鳥苷、2’-O,4’-C-伸烷基腺苷、2’-O,4’-C-伸烷基-5-甲基胞苷及2’-O,4’-C-伸烷基-5-甲基尿苷，可按照WO00/47599記載之方法，製造的核苷可按照文獻(Oligonucleotide Synthesis, Edited by M. J. Gait, Oxford University Press, 1984)與CPG結合。又，可藉由使用通用樹脂(universal resin)，使上述之亞磷醯胺試藥結合而合成。又，藉由使用經修飾的CPG(記載於日本特開平7-87982之實施例12b)，可合成在3’末端鍵結有2-羥基乙基磷酸基的寡核苷酸。又，若使用3’-amino-Modifier C3 CPG、3’-amino-Modifier C7 CPG、Glyceryl CPG (Glen Research)、3’-specer C3 SynBase CPG 1000、3’-specer C9 SynBase CPG 1000 (link technologies)，可合成在3’末端鍵結有羥基烷基磷酸基或胺基烷基磷酸基的寡核苷酸。
又，將寡核苷酸類似物進行硫代酯(thioate)化的情形，除了硫之外，還可使用二硫化四乙基秋蘭姆(TETD，Applied Biosystems公司)、Beaucage試藥、二硫化苯乙醯/吡啶-乙腈(1:1 v/v)溶液(Ravikumar, V. T. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2006) 16, p.2513-2517)等之試藥，依據文獻(Tetarhedron Letters, 32, 3005 (1991)、J. Am. Chem. Soc., 112, 1253 (1990))記載之方法而獲得硫代酯衍生物。
作為RNA之2’-羥基的保護基，使用三級丁基二甲基矽(TBS)基等之矽基系的保護基的情形，可使用氟化四丁基銨(TBAF)、HF-吡啶、或HF-三乙基胺等而進行脱保護。
使用濃氨水、甲醇性氨、乙醇性氨、濃氨水-乙醇(3:1 V/V)混液、濃氨水-40%甲基胺水溶液(1:1 V/V)混液、甲基胺、0.5M LiOH水溶液、3.5M三乙基胺/甲醇溶液之(1:10 V/V)混液、含0.05M碳酸鉀的甲醇等，可將鹼基部的醯基、及磷酸基部的氰基乙基進行脱保護，適合為濃氨水、濃氨水-乙醇混液(3:1 V/V)。
藉由以逆相層析、離子交換層析(包含高效液相層析)等之各種層析等之通常的核酸純化所使用的純化操作進行純化，可獲得本發明之寡核苷酸。
本發明之寡核苷酸包含鍵結有運輸用單元的寡核苷酸，該運輸用單元係用於將寡核苷酸運輸至標的組織或標的細胞。就該種鍵結有運輸用單元的寡核苷酸而言，可列舉例如：使在所期望的化學結構中導入有胺基烷基磷酸基(例如，就烷基而言，具有3至9之碳數)的單元與寡核苷酸之5’末端的核苷酸之5’位及/或3’末端之核苷酸之3’位(3’位經修飾的核苷酸則為2’位)鍵結而成的寡核苷酸。就該種運輸用單元而言，例如，可適宜採用會與肝臟實質細胞之脫唾液酸糖(asialo sugar)受體(ASGRP)結合的GalNAc單元、用以運輸至肝臟或肌肉組織的脂肪酸(例如，肉荳蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、俞樹酸等)單元(例如，參照Nucleic Acids Res. (2020) 47, 6029-6044、WO2017/19267號公報等)等。
GalNAc單元係指包含可與ASGRP結合的N-乙醯基-D-半乳胺糖(GalNAc)的結構單元，可用於將本發明之寡核苷酸遞送至肝臟。GalNAc單元可具有直鏈或分支的連接子結構，例如，可具有直鏈、2分支以上、3分支以上、或4分支以上、或者4分支以下、3分支以下、或2分支以下之分支的連接子結構。又，GalNAc單元亦可包含用以與寡核苷酸鍵結的磷酸基或硫代磷酸基。只要能維持與ASGRP的結合能力，則一個GalNAc單元中所包含的GalNAc的數目並無限制，並且GalNAc之結構可被修飾。就本發明之寡核苷酸中可使用的GalNAc單元而言，可適宜採用例如：WO2021/049504號公報；WO2009/073809號公報；WO2014/076196號公報；WO2014/179620號公報；WO2015/006740號公報；WO2015/105083號公報；WO2016/0556012017/023817號公報；WO2017/084987號公報；WO2017/131236號公報；Methods in Enzymology，1999年，313卷，297～321頁；Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 26 (2016) 3690-3693等之周知GalNAc單元。
例如，就可採用的GalNAc單元而言，可列舉下述式者，並可按照WO2021/049504記載之方法適宜調整。
(上述式中，虛線表示鍵結肢，鍵結肢之氧原子表示與鄰接的核苷酸鍵結，與5’末端之核苷酸鍵結的情形係表示與5’-磷酸基形成磷酸二酯鍵，與3’末端之核苷酸鍵結的情形係表示與3’-磷酸基(3’位經修飾的核苷酸則為2’位的磷酸基)形成磷酸二酯鍵，形成的磷酸二酯鍵可為硫代磷酸酯鍵等之經化學修飾的磷酸二酯鍵。)
本發明之寡核苷酸中亦包含對寡核苷酸導入有膽固醇單元、脂質單元或維生素E單元者(參照例如Lorenz, C. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, p.4975-4977 (2004)；Soutschek, J., et al. Nature, 432, p.173-178, (2004)；Wolfrum, C. et al. Nature Biotech. 25, p.1149-1157, (2007)；Kubo, T. et al. Oligonucleotides, 17, p.1-20, (2007)；Kubo, T., et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 365, p.54-61, (2008)；Nishina, K., et al., Mol. Ther. 16, p.734-740, (2008))；及在寡核苷酸之末端鍵結有適體(aptamer)者，該適體為會與蛋白質結合的核酸分子。
本發明之寡核苷酸中亦包含寡核苷酸與單株抗體(或其適當的結合部分)、蛋白質(或其適當的寡肽片段)鍵結而成者(參照例如Song, et al. Nature Biotech. 23, p.709-717 (2005)；Xia et al. Pharm. Res. 24, p.2309-2316 (2007)；Kumar, et al. Nature, 448, p.39-43 (2007))。 又，本發明之寡核苷酸中亦包含藉由對寡核苷酸加入陽離子聚合物，而作成帶正電荷的複合體者(作為可達成對臟器及細胞的分布之例，參照Leng et al. J. Gen. Med. 7, p.977-986 (2005)；Baigude et al. 2, p.237-241, ACS Chem. Biol. (2007)；Yadava et al. Oligonucleotide 17, p.213-222 (2007))。
本發明之寡核苷酸中包含上述之寡核苷酸之各種藥學上可容許的鹽類、酯、或該種酯之鹽類。就本發明之寡核苷酸之藥學上可容許的鹽類而言，適合地可列舉如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽的鹼金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽的鹼土金屬鹽；鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等之金屬鹽；如銨鹽的無機鹽；如三級辛基胺鹽、二苄基胺鹽、啉鹽、葡糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、氯普魯卡因(chloroprocaine)鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙基胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽的有機鹽等之胺鹽；如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽的鹵素原子化氫酸鹽、硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等之無機酸鹽；如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽的低級烷烴磺酸鹽；如苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽的芳基磺酸鹽；乙酸鹽、蘋果酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等之有機酸鹽；及如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽的胺基酸鹽。
本發明之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽可抑制TfR2 mRNA之表現。又，本發明之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽係藉由抑制TfR2 mRNA之表現，可抑制在鐵代謝中負責中心任務的鐵調素的產生。作用機制並未特別限定，本發明之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽可用於治療或預防藉由抑制TfR2 mRNA之表現及/或鐵調素的產生而可治療或預防的疾病。作為較佳之一態樣，在被投予至貧血患者的情形，可抑制TfR2 mRNA之表現，並可期待貧血症狀之改善效果。又，本發明之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽亦可作成含有該寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽作為有效成分的醫藥組成物而使用。
含有本發明之寡核苷酸的醫藥組成物可作成例如脂質體、受體標靶分子、經口、直腸、局部的或用於補助攝取、分佈及/或吸收的其他調配物，而與其他之分子、分子結構或化合物的混合物進行混合、包覆、共軛。在將本發明之寡核苷酸使用作為疾病之預防藥或治療藥的情形，可將前述寡核苷酸、或其藥學上可容許的鹽本身，或者與適宜之藥學上可容許的賦形劑、稀釋劑等混合，藉由錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑或糖漿劑等而經口地投予，或者藉由注射劑、栓劑、貼附劑、或外用劑等而非經口地投予。
此等之製劑可使用賦形劑(可列舉例如：如乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇的糖衍生物；如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、α澱粉、糊精的澱粉衍生物；如結晶纖維素的纖維素衍生物；阿拉伯樹膠；葡聚醣；聚三葡萄糖之類的有機系賦形劑；及如輕質無水矽酸、合成矽酸鋁、矽酸鈣、偏矽酸鋁鎂(magnesium aluminometasilicate)的矽酸鹽衍生物；如磷酸氫鈣的磷酸磷；如碳酸鈣的碳酸鹽；如硫酸鈣的硫酸鹽等之無機系賦形劑)、潤滑劑(可列舉例如：如硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂的硬脂酸金屬鹽；滑石；膠體氧化矽；如蜂蠟、鯨蠟的蠟類；硼酸；己二酸；如硫酸鈉的硫酸鹽；二醇；反丁烯二酸；苯甲酸鈉；DL白胺酸；如月桂基硫酸鈉、月桂基硫酸鎂的月桂基硫酸鹽；如無水矽酸、矽酸水合物的矽酸類；及上述澱粉衍生物)、黏合劑(可列舉例如：羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯二醇(macrogol)、及與前述賦形劑相同的化合物)、崩散劑(可列舉例如：如低取代度羥基丙基纖維素、羧基甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈣、內部交聯羧基甲基纖維素鈉的纖維素衍生物；羧基甲基澱粉、羧基甲基澱粉鈉、交聯聚乙烯吡咯啶酮之類的經化學修飾的澱粉・纖維素類)、乳化劑(可列舉例如：如皂土、VEEGUM的膠質黏土；如氫氧化鎂、氫氧化鋁的金屬氫氧化物；如月桂基硫酸鈉、硬脂酸鈣的陰離子界面活性劑；如氯化苄烷銨的陽離子界面活性劑；及如聚氧伸乙基烷基醚、聚氧伸乙基山梨醇酐脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯的非離子界面活性劑)、穩定劑(可列舉：如對羥苯甲酸甲酯(methylparaben)、對羥苯甲酸丙酯的對羥基苯甲酸酯類；如氯丁醇、苄醇、苯乙醇的醇類；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)；如苯酚、甲酚的酚類；硫柳汞；去氫乙酸；及山梨酸)、矯味矯臭劑(可列舉例如通常使用之甘味料、酸味料、香料等)、稀釋劑等之添加劑而以周知之方法製造。
就導入如上述製備的寡核苷酸的被導入體而言，若為標的基因可在其細胞內被轉錄成RNA者，即未特別限制。就被導入體而言，意指細胞、組織、或個體。
就本發明之寡核苷酸所導入的細胞而言，可為生殖系列細胞、體性細胞、分化全能性細胞、多分化能細胞、分裂細胞、非分裂細胞、實質組織細胞、上皮細胞、永生化細胞、轉形細胞、神經細胞或免疫細胞之任一者。
就組織而言，包含單細胞胚或構成性細胞、或多細胞胚、胎兒組織等。又，就上述分化細胞而言，可列舉例如：脂肪細胞、纖維母細胞、肌肉細胞、心肌細胞、內皮細胞、神經細胞、神經膠細胞、血液細胞、巨核球、淋巴球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、肥胖細胞、白血球、顆粒球、角質細胞、軟骨細胞、成骨細胞、蝕骨細胞、肝細胞及內分泌腺或外分泌腺之細胞等。就此類的細胞之例而言，較佳使用CHO-K1細胞(RIKEN Cell bank)、果蠅S2細胞(Schneider, l. et al., J. Embryol. Exp. Morph., 27, p.353-365 (1972)、人類HeLa細胞(ATCC：CCL-2)、或人類HEK293細胞(ATCC：CRL-1573)等。
再者，作為用作本發明之寡核苷酸之被導入體的個體，具體而言，可列舉屬於植物、動物、原生動物、病毒、細菌、或真菌類者等。植物可為單子葉植物、雙子葉植物或裸子植物，動物可為脊椎動物或無脊椎動物。就脊椎動物而言，較佳為包含小鼠、大鼠、猴、狗及人類的哺乳類。
就本發明之寡核苷酸對被導入體的導入方法而言，在被導入體為細胞、或組織的情形，可使用磷酸鈣法、電穿孔法、脂質轉染法(lipofection)、病毒感染、對3L5-寡核苷酸溶液之浸漬、或轉形法等。又，就導入至胚的方法而言，可列舉顯微注射、電穿孔法、或病毒感染等。在被導入體為植物的情形，可使用對植物體之體腔或間質細胞等的注入或灌流、或利用噴霧的方法。又，在動物個體的情形，可使用藉由經口、局部、皮下、肌內及靜脈內投予、非經口、經陰道、經直腸、經鼻、經眼、經膜內投予等而全身性導入的方法、或者電穿孔法或病毒感染等。就經口導入之方法而言，亦可使用將本發明之寡核苷酸與生物的食物直接混合的方法。
關於對患者導入本發明之寡核苷酸的方法，除了上述之外，亦可使用膠體分散系統。膠體分散系統被期待有提高化合物之活體內的穩定性的效果、有效率地將化合物運輸至特定臟器、組織或細胞的效果。膠體分散系統只要為通常使用者，則並未限定，但可列舉高分子複合體、奈米膠囊、微球、珠粒、以及包含水中油系之乳化劑、微胞、混合微胞及脂質體的將脂質作為基質的分散系統，較佳為具有將化合物有效率地運輸至特定臟器、組織或細胞的效果之複數個脂質體、人工膜之小胞(Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, p.682-；Blume and Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, 1990, 1029, p.91-；Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, p.119-；Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, p.698-)。大小範圍為0.2-0.4μm的單膜脂質體可將相當大比例的含有巨大分子的水性緩衝液加以包覆化，化合物被包覆化於此水性內膜中，並以生物學上活性的形態被運輸至腦細胞(Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 1981, 6, p.77-)。
脂質體之組成通常為脂質，特別是磷脂質，尤其是將相轉移溫度高的磷脂質與1種或其以上之類固醇(特別是膽固醇)通常複合而成者。脂質體生產上有用的脂質之例包含如磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲胺酸、神經鞘脂質、磷脂醯乙醇胺、腦苷脂及神經節苷脂的磷脂醯化合物。
特別有用的為二醯基磷脂醯甘油，此處脂質部分含有14-18個碳原子，特別是16-18個碳原子，且為飽和(14-18個碳原子鏈之內部中缺少雙鍵)。
代表性的磷脂質包含磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼及二硬脂醯基磷脂醯膽鹼。
包含脂質體的膠體分散系統之標靶化可為被動的或主動的之任一者。
被動的標靶化係藉由利用脂質體原本的傾向，即分布至含有竇狀毛細血管的臟器之網狀內皮細胞而達成。
另一方面，主動的標靶化可列舉例如：使如病毒之蛋白質外殼(Morishita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 1993, 90, p.8474-)、單株抗體(或其適當的結合部分)、糖、糖脂質或蛋白質(或其適當的寡肽片段)的特定配體結合至脂質體；或藉由改變脂質體之組成而修飾脂質體的手法以達成對天然存在的局部部位以外之臟器及細胞型的分布等。
經標靶化的膠體分散系統的表面能以多樣作法進行修飾。為脂質體且經標靶的遞送系統中，為了在與脂質雙層之緊密締合中維持住標的配體，可對脂質體之脂質雙層併入脂質基。為了將脂質鏈與標的配體連結，可使用各式各樣的連結基。
會與期望遞送本發明之寡核苷酸的細胞上優勢性地被發現的特定之細胞表面分子結合之標的配體可為例如：(1)會與藉由期望遞送的細胞而優勢性地表現的特定之細胞受體結合之激素、成長因子或其適當的寡肽片段；或(2)會與標的細胞上優勢性地被發現的抗原性表位特異性結合之多株或單株抗體、或其適當的片段(例如，Fab；F(ab’)2)。2種或其以上之生物活性劑亦可在單一之脂質體內部進行複合、投予。
亦可向膠體分散系統追加提高內容物之細胞內穩定性及/或標靶化的藥劑。
本發明之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽的使用量係依症狀、年齡等而異，對於成人，期望在經口投予的情形，每1次下限1mg(較佳為30mg)、上限2000mg(較佳為1500mg)；在靜脈內投予或皮下投予的情形，每1次下限0.5mg(較佳為5mg)、上限1000mg(較佳為250mg)；在氣管內投予的情形，每1次下限0.5mg(較佳為5mg)、上限500mg(較佳為250mg)；在眼球內投予的情形，每1次下限0.05mg(較佳為0.5mg)、上限10mg(較佳為5mg)，而因應症狀每1日投予1至3次。又，期望在穩定性提高的藥劑的情形，因應症狀而每1週投予1至3次，在穩定性進一步提高的藥劑的情形，因應症狀而每1個月、3個月、6個月、12個月、18個月或24個月投予1至3次。
針對局部的投予之醫藥組成物及調配物包含經皮的貼布、軟膏、乳液、乳霜、凝膠、糖果、栓劑、噴霧劑、液體及粉末。
本發明之寡核苷酸可抑制TfR2 mRNA之表現。又，本發明之寡核苷酸可應用至對於細胞的毒性小、安全性高的醫藥品。又，本發明之寡核苷酸係藉由抑制TfR2 mRNA之表現，可抑制在鐵代謝中負責中心任務的鐵調素之產生。又，本發明之寡核苷酸係藉由抑制TfR2 mRNA之表現，可使血漿中鐵濃度及/或HGB值上升。作用機制未特別限定，本發明之寡核苷酸可用於治療或預防藉由抑制TfR2 mRNA之表現及/或鐵調素之產生而可治療或預防的疾病。就該種疾病而言，可列舉例如貧血。作用機制未特別限定，本發明之RNAi-寡核苷酸可藉由例如使HGB值上升而治療或預防貧血。又，本發明之RNAi-寡核苷酸對於需要血液細胞輸血的貧血患者，可減輕血液細胞輸血之頻率及/或輸血量。例如，對於貧血患者，可將一定期間(例如，1日、1週、2週、4週、8週、12週、1個月、2個月、3個月、6個月或1年)中的血液細胞輸血之頻率及/或輸血量減輕約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、或約100%。
本發明提供：含有本發明之寡核苷酸作為有效成分的用於治療或預防貧血的醫藥組成物、包含投予該寡核苷酸之有效量的治療或預防貧血之方法、用以於貧血之治療或預防上使用的該寡核苷酸、本發明之寡核苷酸在貧血之治療或預防用醫藥組成物之製造中的用途等之醫藥用途發明。本發明之寡核苷酸可治療或預防的貧血中包含例如：伴隨慢性炎症的貧血(anemia of chronic disease，ACD)、伴隨骨髓功能不全的貧血、缺鐵性貧血、對鐵劑療效不佳的貧血(iron refractory iron deficiency anemia，IRIDA)、紅血球生成刺激因子製劑(erythropoietin stimulating agent，ESA)抵抗性之貧血、由化學療法所誘導的貧血、再生不良性貧血、戴布二氏貧血、及β地中海型貧血或鐮狀細胞貧血症等之遺傳性血紅素異常症等。伴隨慢性炎症的貧血中包含例如：伴隨類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡或自體免疫溶血性貧血等之自體免疫疾病的貧血、伴隨感染症的貧血、伴隨炎症性大腸炎等之炎症性腸疾病的貧血、伴隨心臟衰竭的貧血、伴隨慢性腎臟病的貧血、癌性貧血、伴隨巨噬細胞活化症候群的貧血及伴隨卡斯爾曼氏病的貧血等。伴隨慢性腎臟病的貧血中包含伴隨例如下列慢性腎臟病的貧血：伴隨糖尿病的腎臟病、伴隨高血壓的腎臟病、腎病症候群(可列舉例如芬蘭型先天性腎病症候群、瀰漫性腎絲球環間膜硬化症、微小改變型腎病症候群、局灶節段性腎絲球硬化症、膜性腎病變、加洛威-莫沃特(Galloway-Mowat)症候群等)、伴隨慢性腎絲球腎炎的腎臟病(可列舉例如IgA腎病變、腎絲球環間膜增殖性腎絲球腎炎、膜性增生性腎絲球腎炎、紫瘢性腎炎、抗腎絲球基底膜腎炎(古德巴斯捷(Goodpasture)症候群)、艾柏症候群、愛潑斯坦(Epstein)症候群、狼瘡性腎炎、顯微多血管炎、非典型溶血性尿毒症候群、甲髕(Nail-Patella)症候群(指甲髕骨症候群)、纖維接合素腎絲球病變、脂蛋白腎絲球病變等)、伴隨慢性腎小管間質性腎炎的腎臟病、伴隨慢性腎盂腎炎的腎臟病、伴隨類澱粉沉積的腎臟病、體染色體顯性腎小管間質性腎臟病、伴隨腎消耗病的腎臟病、伴隨腎臟畸形的腎臟病(可列舉例如多囊性腎等)等。癌性貧血中包含例如伴隨多發性骨髓瘤、急性白血病、慢性白血病、肺癌或乳癌等之癌症的貧血。伴隨骨髓功能不全的貧血中包含例如：伴隨骨髓纖維化的貧血、伴隨骨髓化生不良症候群的貧血、伴隨慢性骨髓單核球白血病(chronic myelomonocytic leukemia，CMML)的貧血、伴隨由化學療法所致的骨髓抑制的貧血、再生不良性貧血、戴布二氏貧血、範可尼貧血等。
本發明之寡核苷酸較佳可用於治療或預防伴隨慢性炎症的貧血、伴隨骨髓功能不全的貧血，更佳可用於治療或預防伴隨類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡或自體免疫溶血性貧血等之自體免疫疾病的貧血、伴隨感染症的貧血、伴隨炎症性大腸炎等之炎症性腸疾病的貧血、伴隨心臟衰竭的貧血、伴隨慢性腎臟病的貧血、癌性貧血、伴隨卡斯爾曼氏病的貧血、伴隨骨髓纖維化的貧血、伴隨骨髓化生不良症候群的貧血、伴隨慢性骨髓單核球白血病的貧血、及伴隨由化學療法所致的骨髓抑制的貧血。
本發明提供一種貧血之治療或預防方法，其包含將本發明之寡核苷酸與其他之1或2種以上之藥劑併用。本發明之寡核苷酸只要發揮本發明之效果，可與其他之1或2種以上之藥劑併用。較佳為藉由將本發明之寡核苷酸與對於貧血症狀的作用機制不同的其他藥劑併用，可提供更大的治療效果。例如，對於骨髓化生不良症候群(Myelodysplastic syndrome， MDS)，有開立具有藉由促進紅血球之增殖而治療貧血的作用機制之ESA(紅血球生成刺激劑)、具有藉由促進紅血球之分化而治療貧血的作用機制之羅特西普(Luspatercept)等之藥劑、具有抑制DNA甲基化並殺傷異常細胞的作用機制的阿扎胞苷(Azacitidine)等之藥劑的處方的情形，但此等藥劑與TfR2 siRNA係作用機制不同。因此，此等藥劑與TfR2 siRNA之併用，對於MDS可提供比單劑更大的治療效果。又，對於伴隨慢性腎臟病的貧血，有開立具有藉由促進紅血球之增殖而治療貧血的作用機制的ESA或HIFPHD(缺氧誘導因子脯胺醯基羥化酶)抑制藥等之藥劑的處方的情形，但此等藥劑與TfR2 siRNA係作用機制不同。因此，此等藥劑與TfR2 siRNA之併用，對於伴隨慢性腎臟病的貧血可提供比單劑更大的治療效果。又，魯索利替尼已知對於骨髓纖維化，主要對於脾腫大等之症狀顯示治療效果(N Engl J Med 2012; 366:799-807)。然而，已知對於貧血症狀的效果係局限性的或無效、或者使貧血惡化(Journal of Hematology & Oncology 2013, 6:79)。就由魯索利替尼(Ruxolitinib)所致的貧血惡化的機制而言，認為在於藉由阻礙JAK2而會抑制紅血球細胞之增殖所必要的EPO訊息。然而，魯索利替尼在骨髓纖維化中，對於排除貧血的症狀而言得到一定之治療效果，因此魯索利替尼與TfR2 siRNA之併用可提供對於骨髓纖維化中的貧血有用的治療效果。同樣地，藉由與魯索利替尼以外的其他JAK2抑制藥的併用，亦可提供對於骨髓纖維化中的貧血有用的治療效果。就其他之JAK2抑制藥而言，可列舉例如菲卓替尼(Fedratinib)、帕克替尼(Pacritinib)及莫美洛替尼(Momelotinib)等。
將本發明之寡核苷酸與其他藥劑併用而使用的情形，投予本發明之RNAi-寡核苷酸的順序只要發揮本發明之效果則未特別限定，可與併用的其他藥劑同時投予，亦可於併用的其他藥劑之投予之前或後投予。就可與本發明之RNAi-寡核苷酸併用的藥劑而言，可列舉例如其他之貧血治療藥或成為貧血之原因的疾病之治療藥。就其他之貧血治療藥而言，可列舉例如：ESA、HIFPHD(缺氧誘導因子脯胺醯基羥化酶)抑制藥、經口鐵劑、靜脈注射鐵劑、達那唑(Danazol)、羅特西普等。就ESA而言，可列舉例如：依泊汀α、依泊汀β、依泊汀β PEGOL、依泊汀kappa、達貝泊汀α等。就HIFPHD抑制藥而言，可列舉例如：羅沙司他、伐度司他、達普司他、恩那司他、莫立司他等。就經口鐵劑而言，可列舉例如：檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵、反丁烯二酸亞鐵、可溶性焦磷酸鐵、乾燥硫酸鐵等。就靜脈注射鐵劑而言，可列舉例如羧基麥芽糖鐵、含糖氧化鐵等。又，就成為貧血之原因的疾病之治療藥而言，可列舉例如：骨髓纖維化治療藥、骨髓化生不良症候群治療藥、慢性腎臟病治療藥、抗癌劑等。就骨髓纖維化治療藥而言，可列舉例如JAK2抑制藥。就JAK2抑制藥而言，可列舉例如魯索利替尼、菲卓替尼、帕克替尼、及莫美洛替尼等，較佳為與魯索利替尼之併用。就骨髓化生不良症候群治療藥而言，可列舉例如阿扎胞苷、來那度胺(Lenalidomide)等，較佳為與阿扎胞苷或來那度胺之併用。就慢性腎臟病治療藥而言，可列舉例如：SGLT2(鈉-葡萄糖共同運輸蛋白2)抑制藥、腎素-血管張力素系統抑制藥(例如，血管張力素II受體拮抗藥(ARB)、血管張力素轉化酶(ACE)抑制藥等)、鈣拮抗藥、利尿藥、糖尿病治療藥、高脂血症治療藥、類固醇、免疫抑制藥等。抗癌劑中包含化學療法藥，就化學療法藥而言，可列舉例如：順鉑、卡鉑、多柔比星、紫杉醇、氨柔比星等。
又，本發明之寡核苷酸可與血鐵沉積症之治療藥併用。進行血液細胞輸血作為對於貧血的治療的情形，伴隨慢性的血液細胞輸血可能使血鐵沉積症發病。血鐵沉積症係指由於源自輸血的血液細胞的鐵蓄積在肝臟、心臟等之組織中所產生的病態，可能呈現肝臟衰竭、心臟衰竭、糖尿病、關節痛、甲狀腺功能低下症、垂體機能減退、或性功能障礙等。因此，在對於貧血的治療中，有使用用於治療或預防血鐵沉積症之血鐵沉積症治療藥的情形，可適合地與本發明之寡核苷酸併用。就血鐵沉積症之治療藥而言，可列舉例如鐵螯合劑等，就鐵螯合劑而言，可列舉地拉羅司(Deferasirox)、去鐵胺(Deferoxamine)、去鐵酮(Deferiprone)等。 [實施例]
(實施例1～82) 表1所示的實施例1～82之化合物係由各自獨立的寡核苷酸的有義股區域及反義股區域所構成的雙股寡核苷酸，該有義股區域及反義股區域之互補區域全部係以天然型之RNA(即，A(R)、G(R)、C(R)、及U(R))所構成。又，各核苷間鍵結為未經化學修飾的磷酸二酯鍵。各實施例之化合物中的反義股區域係具有由與表1記載的各標的序列(開始位置及結束位置所包夾的區域之鹼基序列)完全互補的序列所構成的互補區域，且在該互補區域之3’末端鍵結有作為外伸結構之2個連續的T(D)的寡核苷酸。又，各實施例之化合物中的有義股區域係具有由與對應的反義股區域之互補區域中的核苷酸序列完全互補的序列所構成的互補區域，且在該互補區域之3’末端鍵結有作為外伸結構之2個連續的T(D)的寡核苷酸。此外，實施例61之化合物係WO2012/177921記載的針對人類TfR2 (hTfR2)的siRNA之AD-47826中的19個鹼基對全部為天然型之RNA，其中在有義股區域及反義股區域之各3’末端鍵結有作為外伸結構之2個連續的T(D)者。
表1之各化合物係使用亞磷醯胺法(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)、Nature Communications 6, Article number: 6317 (2015))而進行合成。各實施例之化合物係藉由負離子ESI質量分析而鑑定，並將其結果記載於表1。又，各實施例之化合物係將各自個別合成的有義股區域及反義股區域等莫耳地置入1個試管而降溫貼合處理後，以未變性凝膠確認到形成雙股寡核苷酸。
[表1-1]
實施例 化合物名稱 標的序列之開始位置 標的序列之結束位置 有義股區域之分子量 反義股區域之分子量
1 TfR2-001 2657 2675 6646.37 6649.27
2 TfR2-002 1114 1132 6624.72 6685.04
3 TfR2-003 399 417 6734.91 6548.29
4 TfR2-004 2157 2175 6652.11 6629.77
5 TfR2-005 2497 2515 6583.01 6715.25
6 TfR2-006 1669 1687 6667.45 6628.97
7 TfR2-007 2543 2561 6551.67 6733.92
8 TfR2-008 918 936 6653.14 6628.17
9 TfR2-009 2658 2676 6644.50 6633.72
10 TfR2-010 2180 2198 6559.74 6722.03
11 TfR2-011 1446 1464 6563.57 6729.86
12 TfR2-012 1843 1861 6752.25 6540.43
13 TfR2-013 1236 1254 6692.84 6605.73
14 TfR2-014 1824 1842 6552.53 6748.08
15 TfR2-015 2667 2685 6734.68 6550.24
16 TfR2-016 1042 1060 6480.05 6820.56
17 TfR2-017 2659 2677 6607.34 6678.06
18 TfR2-018 2680 2698 6611.58 6669.11
19 TfR2-019 2847 2865 6655.76 6613.08
20 TfR2-020 2544 2562 6529.26 6757.86
21 TfR2-021 2181 2199 6520.08 6760.85
22 TfR2-022 1671 1689 6649.91 6645.88
23 TfR2-023 1788 1806 6518.94 6777.18
24 TfR2-024 1233 1251 6706.11 6605.52
25 TfR2-025 2499 2517 6564.16 6716.94
26 TfR2-026 2422 2440 6654.04 6611.86
27 TfR2-027 1141 1159 6695.40 6621.10
28 TfR2-028 2175 2193 6682.89 6631.59
29 TfR2-029 1837 1855 6696.91 6583.11
30 TfR2-030 2534 2552 6523.62 6771.59
31 TfR2-031 1787 1805 6559.13 6752.32
32 TfR2-032 917 935 6666.78 6630.22
33 TfR2-033 2636 2654 6643.05 6656.46
34 TfR2-034 894 912 6626.34 6667.53
35 TfR2-035 2145 2163 6671.56 6621.64
[表1-2]
實施例 化合物名稱 標的序列之開始位置 標的序列之結束位置 有義股區域之分子量 反義股區域之分子量
36 TfR2-036 1308 1326 6625.92 6667.59
37 TfR2-037 2645 2663 6628.83 6668.09
38 TfR2-038 2824 2842 6764.86 6546.52
39 TfR2-039 1536 1554 6652.30 6646.75
40 TfR2-040 1841 1859 6778.08 6502.47
41 TfR2-041 2545 2563 6523.60 6740.06
42 TfR2-042 504 522 6695.27 6620.27
43 TfR2-043 93 111 6565.85 6746.68
44 TfR2-044 414 432 6643.58 6649.31
45 TfR2-045 415 433 6620.18 6691.65
46 TfR2-046 2143 2161 6670.24 6661.91
47 TfR2-047 1743 1761 6645.61 6666.08
48 TfR2-048 1998 2016 6689.93 6641.90
49 TfR2-049 1845 1863 6677.87 6606.31
50 TfR2-050 1842 1860 6780.09 6501.11
51 TfR2-051 1069 1087 6543.54 6773.30
52 TfR2-052 1742 1760 6672.60 6628.87
53 TfR2-053 2646 2664 6627.88 6673.84
54 TfR2-054 1623 1641 6623.58 6676.32
55 TfR2-055 2425 2443 6660.18 6610.74
56 TfR2-056 2423 2441 6675.54 6590.43
57 TfR2-057 2634 2652 6630.83 6670.68
58 TfR2-058 64 82 6701.99 6600.48
59 TfR2-059 1585 1603 6652.70 6631.57
60 TfR2-060 1668 1686 6687.20 6631.76
61 TfR2-061 241 259 6610.06 6701.54
62 TfR2-062 1746 1764 6567.92 6732.37
63 TfR2-063 2004 2022 6671.13 6645.01
64 TfR2-064 396 414 6696.31 6588.21
65 TfR2-065 1748 1766 6565.91 6732.86
66 TfR2-066 2800 2818 6605.37 6707.92
67 TfR2-067 397 415 6696.17 6593.60
68 TfR2-068 306 324 6557.51 6786.94
69 TfR2-069 1234 1252 6708.31 6607.12
70 TfR2-070 2427 2445 6660.36 6593.84
[表1-3]
實施例 化合物名稱 標的序列之開始位置 標的序列之結束位置 有義股區域之分子量 反義股區域之分子量
71 TfR2-071 2681 2699 6589.66 6709.78
72 TfR2-072 2799 2817 6605.45 6709.89
73 TfR2-073 465 483 6624.81 6692.06
74 TfR2-074 1312 1330 6591.52 6696.28
75 TfR2-075 1687 1705 6671.36 6632.90
76 TfR2-076 2553 2571 6551.07 6701.44
77 TfR2-077 2684 2702 6535.41 6751.70
78 TfR2-078 994 1012 6764.41 6547.17
79 TfR2-079 1789 1807 6559.74 6737.30
80 TfR2-080 66 84 6676.65 6641.69
81 TfR2-081 1468 1486 6719.88 6610.66
82 TfR2-082 2647 2665 6631.34 6671.27
表中之「標的序列之開始位置」及「標的序列之結束位置」係各自表示序列識別號1所示的人類TfR2 mRNA之鹼基序列中的鹼基之位置。各實施例之化合物為以被包夾於此等的鹼基序列作為標的序列的雙股寡核苷酸。即，各實施例之反義股區域具有與該標的序列之開始位置及結束位置所包夾的鹼基序列互補的序列，且有義股區域具有與該反義股區域互補的序列。例如，實施例19之化合物(TfR2-019)中的有義股區域之互補區域的序列為5’ CGUGGAGUUUCAAUAUCAA 3’(序列識別號43)，反義股區域之互補區域的序列為5’ UUGAUAUUGAAACUCCACG 3’(序列識別號44)。又，實施例39之化合物(TfR2-039)中的有義股區域之互補區域的序列為5’ ACCUCAAAGCCGUAGUGUA 3’(序列識別號45)，反義股區域之互補區域的序列為5’ UACACUACGGCUUUGAGGU 3’(序列識別號46)。又，在表1之各實施例的化合物之有義股區域及反義股區域中的各互補區域之3’末端鍵結有2個連續T(D)作為外伸結構。各寡核苷酸之5’末端的核苷酸之5’位及3’末端的核苷酸之3’位係成為氫原子與上述各核苷之結構圖中的氧原子鍵結而成的羥基。又，表中之「分子量」係顯示利用負離子ESI質量分析的實測值。
(實施例83～184) 表2所示的實施例83～133之化合物係各自有義股區域之3’末端的核苷酸之3’位(3’位經修飾的核苷酸則為2’位)及反義股區域之5’末端的核苷酸之5’位以上述式(Z)所表示的連接子連結而成的單股寡核苷酸，以有義股區域之互補區域與反義股區域之互補區域形成雙股結構。又，表3所示的實施例134～184之化合物係具有各自獨立的寡核苷酸的有義股區域及反義股區域的雙股寡核苷酸。
實施例180 (TfR2-019.94DUG.s1)及實施例181 (TfR2-019.94DUG.s2)之化合物係實施例169之化合物(TfR2-019.94DUG)中的反義股區域之3’末端的外伸結構分別為1個核苷酸或不存在的siRNA。實施例182 (TfR2-019.94DUG.e1)及實施例183 (TfR2-019.94DUG.e2)之化合物係以將實施例19之化合物(TfR2-019)中的標的序列(即，序列識別號1之第2847～2865號之序列)在5’末端側各自延長1或2個核苷酸鏈長的序列(即，各自為序列識別號1之第2846～2865號的序列及第2845～2865號的序列)作為標的序列，且互補區域之鏈長各自為20bp、21bp的siRNA。實施例184 (TfR2-019.94DUG.e3)之化合物係將實施例169之化合物(TfR2-019.94DUG)中的反義股區域之3’末端的外伸結構作成G(M)U(M)的siRNA。
表2及表3中所示的實施例83～184之化合物亦與實施例1～82同樣地合成。序列中，合成「2」之部分時，使用DMT-乙烷-二醇亞磷醯胺(DMT-ethane-Diol phosphoramidite) (ChemGene，目錄編號：CLP-2250)，合成「Z」之部分時，使用WO2012/074038之實施例12記載的方法。「2’-O-甲基核苷」之部分係使用記載於Nucleic Acids Research 17, 3373 (1989)的亞磷醯胺體進行合成。「DNA」之部分係使用記載於Nucleic Acids Research 11, 4539 (1984)的亞磷醯胺體進行合成。「3’-O-甲基核苷」之部分係使用3’-O-甲基腺苷(n-bz) CED亞磷醯胺(ChemGene，目錄編號：ANP-2901)、3’-O-甲基胞苷(n-bz) CED亞磷醯胺(ChemGene，目錄編號：ANP-2902)、3’-O-甲基鳥苷(n-ibu) CED亞磷醯胺(ChemGene，目錄編號：ANP-2903)、或3’-O-甲基尿苷CED亞磷醯胺(ChemGene，目錄編號：ANP-2904)進行合成。「2’-O,4’-C-亞甲基核苷」之部分係使用記載於WO99/14226的亞磷醯胺體進行合成。「2’-去氧-2’-氟核苷」之部分係使用記載於J. Med. Chem. 36, 831 (1993)的亞磷醯胺體進行合成。「2’-O-甲氧基乙基核苷」之部分係使用記載於Helv. Chim. Acta 78, 486-504 (1995)的亞磷醯胺體進行合成。「GN」之部分係使用記載於WO2019/172286參考例41的亞磷醯胺體進行合成。此外，關於實施例134～179之化合物，分別將有義股區域之鹼基序列示於表3-1～表3-5，將反義股區域之鹼基序列示於表3-6～表3-10。又，關於實施例180～184之化合物，分別將有義股區域之鹼基序列示於表3-11，將反義股區域之鹼基序列示於表3-12。
實施例134～184之化合物係將各自有義股區域及反義股區域等莫耳地置入1個試管而降溫貼合處理後，使用未變性凝膠或HPLC而確認到形成雙股寡核苷酸。
[表2-1]
實施例 化合物名稱 鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
83 TfR2-003.5 G(M)^U(M)^G(M)A(M)G(F)G(M)A(F)U(F)G(F)U(M)C(M)A(M)A(M)C(M)U(M)A(M)U(M)G(M)A(M)ZU(M)^C(F)^A(M)U(M)A(M)G(F)U(M)U(F)G(F)A(M)C(M)A(M)U(M)C(F)C(M)U(F)C(M)A(M)C(M)^U(M)^U(M) 13637.49 13635.29 2
84 TfR2-005.5 G(M)^C(M)^U(M)C(M)C(F)U(M)C(F)G(F)C(F)U(M)U(M)G(M)A(M)A(M)U(M)G(M)A(M)U(M)U(M)ZA(M)^A(F)^U(M)C(M)A(M)U(F)U(M)C(F)A(F)A(M)G(M)C(M)G(M)A(F)G(M)G(F)A(M)G(M)C(M)^U(M)^U(M) 13651.48 13650.29 3
85 TfR2-006.5 U(M)^G(M)^G(M)G(M)C(F)A(M)G(F)A(F)C(F)U(M)C(M)U(M)C(M)U(M)A(M)U(M)G(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^C(M)A(M)U(M)A(F)G(M)A(F)G(F)A(M)G(M)U(M)C(M)U(F)G(M)C(F)C(M)C(M)A(M)^U(M)^U(M) 13647.17 13650.29 4
86 TfR2-022.5 G(M)^G(M)^C(M)A(M)G(F)A(M)C(F)U(F)C(F)U(M)C(M)U(M)A(M)U(M)G(M)A(M)A(M)C(M)A(M)ZU(M)^G(F)^U(M)U(M)C(M)A(F)U(M)A(F)G(F)A(M)G(M)A(M)G(M)U(F)C(M)U(F)G(M)C(M)C(M)^U(M)^U(M) 13648.50 13650.29 5
87 TfR2-039.5 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13652.26 13650.29 6
88 TfR2-046.5 G(M)^C(M)^G(M)A(M)C(F)U(M)G(F)A(F)C(F)A(M)C(M)G(M)C(M)A(M)U(M)G(M)U(M)A(M)C(M)ZG(M)^U(F)^A(M)C(M)A(M)U(F)G(M)C(F)G(F)U(M)G(M)U(M)C(M)A(F)G(M)U(F)C(M)G(M)C(M)^U(M)^U(M) 13676.17 13680.29 7
89 TfR2-065.5 A(M)^G(M)^C(M)A(M)G(F)U(M)G(F)C(F)C(F)U(M)A(M)U(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)C(M)A(M)ZU(M)^G(F)^A(M)A(M)G(M)G(F)A(M)A(F)U(F)A(M)G(M)G(M)C(M)A(F)C(M)U(F)G(M)C(M)U(M)^U(M)^U(M) 13647.20 13650.29 8
90 TfR2-007.5 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)U(M)C(F)A(F)U(F)U(M)G(M)C(M)U(M)G(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)C(F)A(M)G(F)C(F)A(M)A(M)U(M)G(M)A(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13632.75 13635.29 9
91 TfR2-013.5 G(M)^G(M)^C(M)U(M)A(F)G(M)U(F)G(F)G(F)U(M)C(M)A(M)A(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(M)ZU(M)^G(F)^A(M)U(M)U(M)G(F)U(M)U(F)G(F)A(M)C(M)C(M)A(M)C(F)U(M)A(F)G(M)C(M)C(M)^U(M)^U(M) 13648.57 13650.29 10
92 TfR2-019.5 C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 13617.57 13620.29 11
[表2-2]
實施例 化合物名稱 鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
93 TfR2-037.5 A(M)^C(M)^C(M)C(M)U(F)A(M)A(F)U(F)G(F)U(M)G(M)A(M)C(M)G(M)G(M)U(M)C(M)A(M)U(M)ZA(M)^U(F)^G(M)A(M)C(M)C(F)G(M)U(F)C(F)A(M)C(M)A(M)U(M)U(F)A(M)G(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13652.76 13650.29 12
94 TfR2-076.5 G(M)^C(M)^U(M)G(M)A(F)U(M)C(F)A(F)A(F)U(M)U(M)U(M)C(M)U(M)C(M)A(M)U(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^A(M)U(M)G(M)A(F)G(M)A(F)A(F)A(M)U(M)U(M)G(M)A(F)U(M)C(F)A(M)G(M)C(M)^U(M)^U(M) 13602.76 13605.29 13
95 TfR2-077.5 U(M)^A(M)^G(M)C(M)A(F)U(M)C(F)C(F)C(F)U(M)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(M)C(M)A(M)ZU(M)^G(F)^U(M)G(M)A(M)U(F)U(M)G(F)A(F)A(M)G(M)G(M)G(M)A(F)U(M)G(F)C(M)U(M)A(M)^U(M)^U(M) 13632.45 13635.29 14
96 TfR2-081.5 C(M)^U(M)^G(M)G(M)G(F)A(M)C(F)G(F)G(F)U(M)G(M)G(M)U(M)G(M)A(M)C(M)U(M)U(M)U(M)ZA(M)^A(F)^A(M)G(M)U(M)C(F)A(M)C(F)C(F)A(M)C(M)C(M)G(M)U(F)C(M)C(F)C(M)A(M)G(M)^U(M)^U(M) 13682.43 13680.29 15
97 TfR2-061.5 C(M)^A(M)^G(M)G(M)C(F)A(M)G(F)C(F)C(F)A(M)A(M)A(M)C(M)C(M)U(M)C(M)A(M)U(M)U(M)ZA(M)^A(F)^U(M)G(M)A(M)G(F)G(M)U(F)U(F)U(M)G(M)G(M)C(M)U(F)G(M)C(F)C(M)U(M)G(M)^U(M)^U(M) 13666.44 13665.29 16
98 TfR2-006.3 U(M)^G(M)^G(M)G(M)C(D)A(M)G(D)A(D)C(D)U(M)C(M)U(M)C(M)U(M)A(M)U(M)G(M)A(M)A(M)ZU(M)^T(D)^C(M)A(M)U(M)A(D)G(M)A(D)G(D)A(M)G(M)U(M)C(M)T(D)G(M)C(D)C(M)C(M)A(M)^U(M)^U(M) 13496.61 13498.37 17
99 TfR2-007.3 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(D)U(M)C(D)A(D)T(D)U(M)G(M)C(M)U(M)G(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^T(D)^G(M)A(M)U(M)C(D)A(M)G(D)C(D)A(M)A(M)U(M)G(M)A(D)G(M)A(D)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13481.10 13483.36 18
100 TfR2-013.3 G(M)^G(M)^C(M)U(M)A(D)G(M)T(D)G(D)G(D)U(M)C(M)A(M)A(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(M)ZU(M)^G(D)^A(M)U(M)U(M)G(D)U(M)T(D)G(D)A(M)C(M)C(M)A(M)C(D)U(M)A(D)G(M)C(M)C(M)^U(M)^U(M) 13496.24 13498.40 19
101 TfR2-019.3 C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(D)A(M)G(D)T(D)T(D)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^T(D)^G(M)A(M)U(M)A(D)U(M)T(D)G(D)A(M)A(M)A(M)C(M)T(D)C(M)C(D)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 13507.44 13510.47 20
102 TfR2-039.3 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(D)A(M)A(D)A(D)G(D)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(D)^C(M)A(M)C(M)T(D)A(M)C(D)G(D)G(M)C(M)U(M)U(M)T(D)G(M)A(D)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13496.54 13498.37 21
[表2-3]
實施例 化合物名稱 鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
103 TfR2-076.3 G(M)^C(M)^U(M)G(M)A(D)U(M)C(D)A(D)A(D)U(M)U(M)U(M)C(M)U(M)C(M)A(M)U(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(D)^A(M)U(M)G(M)A(D)G(M)A(D)A(D)A(M)U(M)U(M)G(M)A(D)U(M)C(D)A(M)G(M)C(M)^U(M)^U(M) 13422.42 13425.29 13
104 TfR2-006.6 U(M)^G(M)^G(M)G(M)C(F)A(M)G(F)A(F)C(F)U(M)C(M)U(M)C(M)U(M)A(M)U(M)G(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^C(M)A(M)U(M)A(F)G(M)A(M)G(F)A(M)G(M)U(M)C(M)U(F)G(M)C(F)C(M)C(M)A(M)^U(M)^U(M) 13661.03 13662.32 4
105 TfR2-007.6 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)U(M)C(F)A(F)U(F)U(M)G(M)C(M)U(M)G(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)C(F)A(M)G(M)C(F)A(M)A(M)U(M)G(M)A(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13645.38 13647.32 9
106 TfR2-013.6 G(M)^G(M)^C(M)U(M)A(F)G(M)U(F)G(F)G(F)U(M)C(M)A(M)A(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(M)ZU(M)^G(F)^A(M)U(M)U(M)G(F)U(M)U(M)G(F)A(M)C(M)C(M)A(M)C(F)U(M)A(F)G(M)C(M)C(M)^U(M)^U(M) 13661.03 13662.32 10
107 TfR2-019.6 C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 13630.35 13632.32 11
108 TfR2-039.6 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13660.75 13662.32 6
109 TfR2-076.6 G(M)^C(M)^U(M)G(M)A(F)U(M)C(F)A(F)A(F)U(M)U(M)U(M)C(M)U(M)C(M)A(M)U(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^A(M)U(M)G(M)A(F)G(M)A(M)A(F)A(M)U(M)U(M)G(M)A(F)U(M)C(F)A(M)G(M)C(M)^U(M)^U(M) 13615.42 13617.32 13
110 TfR2-039.8 A(D)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13635.56 13632.29 6
111 TfR2-039.9 A(D)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13633.74 13632.29 6
112 TfR2-039.10 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZT(D)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13636.50 13634.29 22
113 TfR2-039.11 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZT(D)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13649.50 13646.32 22
[表2-4]
實施例 化合物名稱 鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
114 TfR2-039.12 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZT(D)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13650.20 13646.32 22
115 TfR2-019.8 C(D)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 13605.92 13602.29 11
116 TfR2-019.9 C(D)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(M)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 13599.79 13602.29 11
117 TfR2-019.15 C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)T(D)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(D)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 13633.59 13630.46 23
118 TfR2-019.17 C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)T(D)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(D)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(M)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 13634.22 13630.46 23
119 TfR2-039.19 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13675.42 13674.35 6
120 TfR2-039.20 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZT(D)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13662.17 13658.35 22
121 TfR2-039.21 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(3M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13650.03 13650.29 6
122 TfR2-039.22 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(3M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13663.25 13662.32 6
123 TfR2-039.23 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(3M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13664.40 13662.32 6
124 TfR2-039.24 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(3M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13669.00 13674.35 6
[表2-5]
實施例 化合物名稱 鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
125 TfR2-039.25 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(3M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(M)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13690.27 13686.38 6
126 TfR2-039.26 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(3M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 13687.73 13686.38 6
127 TfR2-039.5G GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 14554.80 14547.45 6
128 TfR2-019.6G GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 14536.80 14529.45 11
129 TfR2-019.22 C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(3M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 13632.67 13632.32 11
130 TfR2-019.22s C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)^ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 13679.53 13680.53 11
131 AD47882.5G GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)C(M)U(M)ZA(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M) 14555.13 14554.85 24
132 AD47882.23G GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)C(M)U(3M)ZA(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M) 14560.47 14559.47 24
133 AD47882.23sG GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M)^ZA(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M) 14615.25 14615.08 24
[表2-6]
化合物名稱 鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
TfR2-003.5 G(M)^U(M)^G(M)A(M)G(F)G(M)A(F)U(F)G(F)U(M)C(M)A(M)A(M)C(M)U(M)A(M)U(M)G(M)A(M)ZU(M)^C(F)^A(M)U(M)A(M)G(F)U(M)U(F)G(F)A(M)C(M)A(M)U(M)C(F)C(M)U(F)C(M)A(M)C(M)^U(M)^U(M) 2
TfR2-005.5 G(M)^C(M)^U(M)C(M)C(F)U(M)C(F)G(F)C(F)U(M)U(M)G(M)A(M)A(M)U(M)G(M)A(M)U(M)U(M)ZA(M)^A(F)^U(M)C(M)A(M)U(F)U(M)C(F)A(F)A(M)G(M)C(M)G(M)A(F)G(M)G(F)A(M)G(M)C(M)^U(M)^U(M) 3
TfR2-006.5 U(M)^G(M)^G(M)G(M)C(F)A(M)G(F)A(F)C(F)U(M)C(M)U(M)C(M)U(M)A(M)U(M)G(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^C(M)A(M)U(M)A(F)G(M)A(F)G(F)A(M)G(M)U(M)C(M)U(F)G(M)C(F)C(M)C(M)A(M)^U(M)^U(M) 4
TfR2-022.5 G(M)^G(M)^C(M)A(M)G(F)A(M)C(F)U(F)C(F)U(M)C(M)U(M)A(M)U(M)G(M)A(M)A(M)C(M)A(M)ZU(M)^G(F)^U(M)U(M)C(M)A(F)U(M)A(F)G(F)A(M)G(M)A(M)G(M)U(F)C(M)U(F)G(M)C(M)C(M)^U(M)^U(M) 5
TfR2-039.5 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6
TfR2-046.5 G(M)^C(M)^G(M)A(M)C(F)U(M)G(F)A(F)C(F)A(M)C(M)G(M)C(M)A(M)U(M)G(M)U(M)A(M)C(M)ZG(M)^U(F)^A(M)C(M)A(M)U(F)G(M)C(F)G(F)U(M)G(M)U(M)C(M)A(F)G(M)U(F)C(M)G(M)C(M)^U(M)^U(M) 7
TfR2-065.5 A(M)^G(M)^C(M)A(M)G(F)U(M)G(F)C(F)C(F)U(M)A(M)U(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)C(M)A(M)ZU(M)^G(F)^A(M)A(M)G(M)G(F)A(M)A(F)U(F)A(M)G(M)G(M)C(M)A(F)C(M)U(F)G(M)C(M)U(M)^U(M)^U(M) 8
TfR2-007.5 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)U(M)C(F)A(F)U(F)U(M)G(M)C(M)U(M)G(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)C(F)A(M)G(F)C(F)A(M)A(M)U(M)G(M)A(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 9
[表2-7]
化合物名稱 鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
TfR2-013.5 G(M)^G(M)^C(M)U(M)A(F)G(M)U(F)G(F)G(F)U(M)C(M)A(M)A(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(M)ZU(M)^G(F)^A(M)U(M)U(M)G(F)U(M)U(F)G(F)A(M)C(M)C(M)A(M)C(F)U(M)A(F)G(M)C(M)C(M)^U(M)^U(M) 10
TfR2-019.5 C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 11
TfR2-037.5 A(M)^C(M)^C(M)C(M)U(F)A(M)A(F)U(F)G(F)U(M)G(M)A(M)C(M)G(M)G(M)U(M)C(M)A(M)U(M)ZA(M)^U(F)^G(M)A(M)C(M)C(F)G(M)U(F)C(F)A(M)C(M)A(M)U(M)U(F)A(M)G(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 12
TfR2-076.5 G(M)^C(M)^U(M)G(M)A(F)U(M)C(F)A(F)A(F)U(M)U(M)U(M)C(M)U(M)C(M)A(M)U(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^A(M)U(M)G(M)A(F)G(M)A(F)A(F)A(M)U(M)U(M)G(M)A(F)U(M)C(F)A(M)G(M)C(M)^U(M)^U(M) 13
TfR2-077.5 U(M)^A(M)^G(M)C(M)A(F)U(M)C(F)C(F)C(F)U(M)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(M)C(M)A(M)ZU(M)^G(F)^U(M)G(M)A(M)U(F)U(M)G(F)A(F)A(M)G(M)G(M)G(M)A(F)U(M)G(F)C(M)U(M)A(M)^U(M)^U(M) 14
TfR2-081.5 C(M)^U(M)^G(M)G(M)G(F)A(M)C(F)G(F)G(F)U(M)G(M)G(M)U(M)G(M)A(M)C(M)U(M)U(M)U(M)ZA(M)^A(F)^A(M)G(M)U(M)C(F)A(M)C(F)C(F)A(M)C(M)C(M)G(M)U(F)C(M)C(F)C(M)A(M)G(M)^U(M)^U(M) 15
TfR2-061.5 C(M)^A(M)^G(M)G(M)C(F)A(M)G(F)C(F)C(F)A(M)A(M)A(M)C(M)C(M)U(M)C(M)A(M)U(M)U(M)ZA(M)^A(F)^U(M)G(M)A(M)G(F)G(M)U(F)U(F)U(M)G(M)G(M)C(M)U(F)G(M)C(F)C(M)U(M)G(M)^U(M)^U(M) 16
TfR2-006.3 U(M)^G(M)^G(M)G(M)C(D)A(M)G(D)A(D)C(D)U(M)C(M)U(M)C(M)U(M)A(M)U(M)G(M)A(M)A(M)ZU(M)^T(D)^C(M)A(M)U(M)A(D)G(M)A(D)G(D)A(M)G(M)U(M)C(M)T(D)G(M)C(D)C(M)C(M)A(M)^U(M)^U(M) 17
[表2-8]
化合物名稱 鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
TfR2-007.3 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(D)U(M)C(D)A(D)T(D)U(M)G(M)C(M)U(M)G(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^T(D)^G(M)A(M)U(M)C(D)A(M)G(D)C(D)A(M)A(M)U(M)G(M)A(D)G(M)A(D)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 18
TfR2-013.3 G(M)^G(M)^C(M)U(M)A(D)G(M)T(D)G(D)G(D)U(M)C(M)A(M)A(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(M)ZU(M)^G(D)^A(M)U(M)U(M)G(D)U(M)T(D)G(D)A(M)C(M)C(M)A(M)C(D)U(M)A(D)G(M)C(M)C(M)^U(M)^U(M) 19
TfR2-019.3 C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(D)A(M)G(D)T(D)T(D)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^T(D)^G(M)A(M)U(M)A(D)U(M)T(D)G(D)A(M)A(M)A(M)C(M)T(D)C(M)C(D)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 20
TfR2-039.3 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(D)A(M)A(D)A(D)G(D)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(D)^C(M)A(M)C(M)T(D)A(M)C(D)G(D)G(M)C(M)U(M)U(M)T(D)G(M)A(D)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 21
TfR2-076.3 G(M)^C(M)^U(M)G(M)A(D)U(M)C(D)A(D)A(D)U(M)U(M)U(M)C(M)U(M)C(M)A(M)U(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(D)^A(M)U(M)G(M)A(D)G(M)A(D)A(D)A(M)U(M)U(M)G(M)A(D)U(M)C(D)A(M)G(M)C(M)^U(M)^U(M) 13
TfR2-006.6 U(M)^G(M)^G(M)G(M)C(F)A(M)G(F)A(F)C(F)U(M)C(M)U(M)C(M)U(M)A(M)U(M)G(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^C(M)A(M)U(M)A(F)G(M)A(M)G(F)A(M)G(M)U(M)C(M)U(F)G(M)C(F)C(M)C(M)A(M)^U(M)^U(M) 4
TfR2-007.6 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)U(M)C(F)A(F)U(F)U(M)G(M)C(M)U(M)G(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)C(F)A(M)G(M)C(F)A(M)A(M)U(M)G(M)A(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 9
TfR2-013.6 G(M)^G(M)^C(M)U(M)A(F)G(M)U(F)G(F)G(F)U(M)C(M)A(M)A(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(M)ZU(M)^G(F)^A(M)U(M)U(M)G(F)U(M)U(M)G(F)A(M)C(M)C(M)A(M)C(F)U(M)A(F)G(M)C(M)C(M)^U(M)^U(M) 10
[表2-9]
化合物名稱 鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
TfR2-019.6 C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 11
TfR2-039.6 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6
TfR2-076.6 G(M)^C(M)^U(M)G(M)A(F)U(M)C(F)A(F)A(F)U(M)U(M)U(M)C(M)U(M)C(M)A(M)U(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^A(M)U(M)G(M)A(F)G(M)A(M)A(F)A(M)U(M)U(M)G(M)A(F)U(M)C(F)A(M)G(M)C(M)^U(M)^U(M) 13
TfR2-039.8 A(D)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6
TfR2-039.9 A(D)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6
TfR2-039.10 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZT(D)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 22
TfR2-039.11 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZT(D)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 22
TfR2-039.12 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZT(D)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 22
[表2-10]
化合物名稱 鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
TfR2-019.8 C(D)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 11
TfR2-019.9 C(D)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(M)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 11
TfR2-019.15 C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)T(D)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(D)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 23
TfR2-019.17 C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)T(D)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(D)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(M)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 23
TfR2-039.19 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6
TfR2-039.20 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZT(D)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 22
TfR2-039.21 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(3M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6
TfR2-039.22 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(3M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6
[表2-11]
化合物名稱 鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
TfR2-039.23 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(3M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6
TfR2-039.24 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(3M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6
TfR2-039.25 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(3M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(M)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6
TfR2-039.26 A(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(3M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6
TfR2-039.5G GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)U(M)A(M)ZU(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(F)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6
TfR2-019.6G GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 11
TfR2-019.22 C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(3M)ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 11
TfR2-019.22s C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)^ZU(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 11
[表2-12]
化合物名稱 鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
AD47882.5G GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)C(M)U(M)ZA(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M) 24
AD47882.23G GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)C(M)U(3M)ZA(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(F)A(M)A(M)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M) 24
AD47882.23sG GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M)^ZA(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M) 24
[表3-1]
實施例 化合物名稱 有義股名稱 有義股區域之鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
134 TfR2-039.28DU TfR2-039.28S A(D)^C(E)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(M) 6325.17 6323.42 25
135 TfR2-039.29DU TfR2-039.29S A(D)^C(M)^C(E)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(M) 6323.22 6323.42 25
136 TfR2-039.30DU TfR2-039.30S A(D)^C(M)^C(M)T(E)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(M) 6321.96 6323.41 47
137 TfR2-039.31DU TfR2-039.31S A(D)^C(M)^C(M)U(M)C(E)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(M) 6336.64 6335.45 25
138 TfR2-039.32DU TfR2-039.32S A(D)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(E)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(M) 6309.91 6309.39 25
139 TfR2-039.9DU TfR2-039.9S A(D)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(M) 6296.13 6297.38 25
140 TfR2-019.29DU TfR2-019.29S C(D)^G(M)^T(E)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(M) 6322.20 6325.39 26
141 TfR2-019.34DU TfR2-019.34S C(D)^G(M)^T(E)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(M) 6321.49 6325.39 26
142 TfR2-019.22DU TfR2-019.22S C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 6330.00 6329.39 27
143 TfR2-019.22sDU TfR2-019.22sS C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)^2 6470.00 6469.49 27
[表3-2]
實施例 化合物名稱 有義股名稱 有義股區域之鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
144 TfR2-039.23DUG TfR2-039.23SG GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M) 7228.28 7228.32 25
145 TfR2-039.35DUG TfR2-039.23SG GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M) 7228.28 7228.32 25
146 TfR2-039.36DUG TfR2-039.23SG GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M) 7228.28 7228.32 25
147 TfR2-039.37DUG TfR2-039.23SG GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M) 7228.28 7228.32 25
148 TfR2-039.38DUG TfR2-039.23SG GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M) 7228.28 7228.32 25
149 TfR2-039.39DUG TfR2-039.23SG GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M) 7228.28 7228.32 25
150 TfR2-039.40DUG TfR2-039.23SG GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M) 7228.28 7228.32 25
151 TfR2-039.41DUG TfR2-039.23SG GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M) 7228.28 7228.32 25
152 TfR2-039.42DUG TfR2-039.23SG GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M) 7228.28 7228.32 25
153 TfR2-039.43DUG TfR2-039.23SG GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M) 7228.28 7228.32 25
154 TfR2-039.45DUG TfR2-039.23SG GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M) 7228.28 7228.32 25
[表3-3]
實施例 化合物名稱 有義股名稱 有義股區域之鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
155 TfR2-019.22DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
156 TfR2-019.36DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
157 TfR2-019.38DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
158 TfR2-019.85DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
159 TfR2-019.86DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
160 TfR2-019.87DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
161 TfR2-019.71DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
162 TfR2-019.88DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
163 TfR2-019.89DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
164 TfR2-019.90DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
165 TfR2-019.80DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
[表3-4]
實施例 化合物名稱 有義股名稱 有義股區域之鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
166 TfR2-019.91DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
167 TfR2-019.92DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
168 TfR2-019.93DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
169 TfR2-019.94DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
170 TfR2-019.95DUG TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
171 AD47882.23DUG AD47882.23SG GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M) 7056.15 7056.20 28
172 AD47882.23sDUG AD47882.23sSG GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M)^2 7200.00 7199.99 28
173 AD47882.41DUG AD47882.23SG GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M) 7056.15 7056.20 28
174 AD47882.88DUG AD47882.23SG GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M) 7056.15 7056.20 28
175 AD47882.89DUG AD47882.23SG GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M) 7056.15 7056.20 28
176 AD47882.91DUG AD47882.23SG GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M) 7056.15 7056.20 28
[表3-5]
實施例 化合物名稱 有義股名稱 有義股區域之鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
177 AD47882.92DUG AD47882.23SG GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M) 7056.15 7056.20 28
178 AD47882.93DUG AD47882.23SG GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M) 7056.15 7056.20 28
179 AD47882.94DUG AD47882.23SG GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M) 7056.15 7056.20 28
[表3-6]
實施例 化合物名稱 反義股名稱 反義股區域之鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
134 TfR2-039.28DU TfR2-039.9AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6949.20 6949.72 29
135 TfR2-039.29DU TfR2-039.9AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6949.20 6949.72 29
136 TfR2-039.30DU TfR2-039.9AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6949.20 6949.72 29
137 TfR2-039.31DU TfR2-039.9AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6949.20 6949.72 29
138 TfR2-039.32DU TfR2-039.9AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6949.20 6949.72 29
139 TfR2-039.9DU TfR2-039.9AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6949.20 6949.72 29
140 TfR2-019.29DU TfR2-019.29AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(M)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 6917.88 6917.74 30
141 TfR2-019.34DU TfR2-019.34AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 6914.60 6917.74 30
142 TfR2-019.22DU TfR2-019.22AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 6918.0 6917.74 30
143 TfR2-019.22sDU TfR2-019.22AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 6918.0 6917.74 30
[表3-7]
實施例 化合物名稱 反義股名稱 反義股區域之鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
144 TfR2-039.23DUG TfR2-039.23AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 6950.0 6949.72 29
145 TfR2-039.35DUG TfR2-039.35AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 6963.03 6965.79 29
146 TfR2-039.36DUG TfR2-039.36AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(F)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 6964.35 6965.79 29
147 TfR2-039.37DUG TfR2-039.37AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(F)^U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 6977.99 6981.86 29
148 TfR2-039.38DUG TfR2-039.38AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(F)G(M)C(M)U(F)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 6942.14 6941.73 29
149 TfR2-039.39DUG TfR2-039.39AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(F)G(M)C(M)U(F)^U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 6957.52 6957.80 29
150 TfR2-039.40DUG TfR2-039.40AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)^G(F)^G(M)C(M)U(F)^U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 6987.83 6989.94 29
151 TfR2-039.41DUG TfR2-039.41AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)T(D)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 6949.06 6949.79 31
152 TfR2-039.42DUG TfR2-039.42AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)T(D)^U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 6964.35 6965.86 31
153 TfR2-039.43DUG TfR2-039.43AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(E)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 6994.48 6991.83 29
154 TfR2-039.45DUG TfR2-039.45AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)T(E)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 6994.74 6991.82 32
[表3-8]
實施例 化合物名稱 反義股名稱 反義股區域之鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
155 TfR2-019.22DUG TfR2-019.22AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 6918.0 6917.74 30
156 TfR2-019.36DUG TfR2-019.36AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(M)A(M)A(M)A(F)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6929.97 6929.99 30
157 TfR2-019.38DUG TfR2-019.38AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(F)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6905.91 6905.95 30
158 TfR2-019.85DUG TfR2-019.85AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(E)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6955.94 6956.00 30
159 TfR2-019.86DUG TfR2-019.86AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(E)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6941.94 6941.99 30
160 TfR2-019.87DUG TfR2-019.87AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6899.95 6899.98 30
161 TfR2-019.71DUG TfR2-019.71AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6926.06 6925.99 33
162 TfR2-019.88DUG TfR2-019.88AS U(M)^U(F)^G(M)A(F)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6926.05 6925.99 33
163 TfR2-019.89DUG TfR2-019.89AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6926.11 6925.99 33
164 TfR2-019.90DUG TfR2-019.90AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(F)^G(M)^U(M)^U(M) 6926.00 6925.99 33
165 TfR2-019.80DUG TfR2-019.80AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6958.09 6957.96 30
[表3-9]
實施例 化合物名稱 反義股名稱 反義股區域之鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
166 TfR2-019.91DUG TfR2-019.91AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6957.96 6957.96 30
167 TfR2-019.92DUG TfR2-019.92AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6958.07 6957.96 30
168 TfR2-019.93DUG TfR2-019.93AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6958.06 6957.96 30
169 TfR2-019.94DUG TfR2-019.94AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6935.66 6935.69 30
170 TfR2-019.95DUG TfR2-019.95AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 6935.68 6935.69 30
171 AD47882.23DUG AD47882.9AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M) 7118.03 7118.12 34
172 AD47882.23sDUG AD47882.9AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M) 7118.03 7118.12 34
173 AD47882.41DUG AD47882.41AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)T(D)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 7119.06 7118.1 35
174 AD47882.88DUG AD47882.88AS A(M)^G(F)^A(M)A(F)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(M)T(D)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 7130.10 7130.10 35
175 AD47882.89DUG AD47882.89AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(F)A(M)T(D)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 7130.11 7130.10 35
176 AD47882.91DUG AD47882.91AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(F)A(M)U(M)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 7162.09 7162.07 34
[表3-10]
實施例 化合物名稱 反義股名稱 反義股區域之鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
177 AD47882.92DUG AD47882.92AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(F)U(M)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 7163.08 7162.07 34
178 AD47882.93DUG AD47882.93AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(M)U(F)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 7162.05 7162.07 34
179 AD47882.94DUG AD47882.94AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(F)U(M)C(M)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 7136.04 7136.06 34
[表3-11]
實施例 化合物名稱 有義股名稱 有義股區域之鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
180 TfR2-019.94DUG.s1 TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
181 TfR2-019.94DUG.s2 TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
182 TfR2-019.94DUG.e1 TfR2-019.22SG.e1 GNG(M)^C(M)^G(M)U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7589.35 7589.35 36
183 TfR2-019.94DUG.e2 TfR2-019.22SG.e2 GNG(M)^G(M)^C(M)G(M)U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7948.42 7948.41 37
184 TfR2-019.94DUG.e3 TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 7230.30 7230.28 27
[表3-12]
實施例 化合物名稱 反義股名稱 反義股區域之鹼基序列(5’-3’) 分子量 理論值 序列識別號
180 TfR2-019.94DUG.s1 TfR2-019.94AS.s1 U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M) 6599 6599.58 38
181 TfR2-019.94DUG.s2 TfR2-019.94AS.s2 U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M) 6263 6263.31 39
182 TfR2-019.94DUG.e1 TfR2-019.94AS.e1 U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^C(M)^U(M)^U(M) 7254 7255.06 40
183 TfR2-019.94DUG.e2 TfR2-019.94AS.e2 U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)C(M)^C(M)^U(M)^U(M) 7574 7574.27 41
184 TfR2-019.94DUG.e3 TfR2-019.94AS.e3 U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^G(M)^U(M) 6974 6974.88 42
[表3-13]
有義股名稱 有義股區域之鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
TfR2-039.28S A(D)^C(E)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(M) 25
TfR2-039.29S A(D)^C(M)^C(E)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(M) 25
TfR2-039.30S A(D)^C(M)^C(M)T(E)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(M) 47
TfR2-039.31S A(D)^C(M)^C(M)U(M)C(E)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(M) 25
TfR2-039.32S A(D)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(E)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(M) 25
TfR2-039.9S A(D)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(M) 25
TfR2-019.29S C(D)^G(M)^T(E)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(M) 26
TfR2-019.34S C(D)^G(M)^T(E)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(M) 26
[表3-14]
有義股名稱 有義股區域之鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
TfR2-019.22S C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 27
TfR2-019.22sS C(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M)^2 27
TfR2-039.23SG GNA(M)^C(M)^C(M)U(M)C(F)A(M)A(F)A(F)G(F)C(M)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)U(M)G(M)^U(M)^A(3M) 25
TfR2-019.22SG GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 27
AD47882.23SG GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M) 28
AD47882.23sSG GNC(M)^C(M)^A(M)C(M)G(F)U(M)G(F)A(F)U(F)U(M)C(M)U(M)C(M)C(M)U(M)U(M)U(M)^C(M)^U(3M)^2 28
TfR2-019.22SG.e1 GNG(M)^C(M)^G(M)U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 36
TfR2-019.22SG.e2 GNG(M)^G(M)^C(M)G(M)U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 37
[表3-15]
反義股名稱 反義股區域之鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
TfR2-039.9AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 29
TfR2-019.29AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(M)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 30
TfR2-019.34AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 30
TfR2-019.22AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^U(M)^U(M) 30
TfR2-039.23AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)U(M)^U(M)^U(M) 29
TfR2-039.35AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 29
TfR2-039.36AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(F)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 29
TfR2-039.37AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(F)^U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 29
[表3-16]
反義股名稱 反義股區域之鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
TfR2-039.38AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(F)G(M)C(M)U(F)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 29
TfR2-039.39AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(F)G(M)C(M)U(F)^U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 29
TfR2-039.40AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)^G(F)^G(M)C(M)U(F)^U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 29
TfR2-039.41AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)T(D)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 31
TfR2-039.42AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)T(D)^U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 31
TfR2-039.43AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(E)U(M)U(M)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 29
TfR2-039.45AS U(M)^A(F)^C(M)A(M)C(M)U(F)A(M)C(F)G(M)G(M)C(M)U(M)T(E)U(F)G(M)A(F)G(M)G(M)^U(M)^U(M)^U(M) 32
TfR2-019.36AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(M)A(M)A(M)A(F)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 30
[表3-17]
反義股名稱 反義股區域之鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
TfR2-019.38AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(F)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 30
TfR2-019.85AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(M)C(E)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 30
TfR2-019.86AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(E)A(M)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 30
TfR2-019.87AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)U(F)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 30
TfR2-019.71AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 33
TfR2-019.88AS U(M)^U(F)^G(M)A(F)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 33
TfR2-019.89AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 33
TfR2-019.90AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(F)^G(M)^U(M)^U(M) 33
[表3-18]
反義股名稱 反義股區域之鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
TfR2-019.80AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A(M)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 30
TfR2-019.91AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(F)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 30
TfR2-019.92AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 30
TfR2-019.93AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 30
TfR2-019.94AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 30
TfR2-019.95AS U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(M)A(F)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 30
AD47882.9AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)U(M)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)G(M)^U(M)^U(M) 34
AD47882.41AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(F)G(M)A(M)A(M)T(D)C(M)A(F)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 35
[表3-19]
反義股名稱 反義股區域之鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
AD47882.88AS A(M)^G(F)^A(M)A(F)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(M)T(D)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 35
AD47882.89AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(F)A(M)T(D)C(M)A(E)C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 35
AD47882.91AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(F)A(M)U(M)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 34
AD47882.92AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(F)U(M)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 34
AD47882.93AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(M)U(F)C(E)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 34
AD47882.94AS A(M)^G(F)^A(M)A(M)A(M)G(F)G(M)A(M)G(F)A(M)A(F)U(M)C(M)A(R)^C(M)G(F)U(M)G(M)^G(M)^U(M)^U(M) 34
TfR2-019.94AS.s1 U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M) 38
TfR2-019.94AS.s2 U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M) 39
[表3-20]
反義股名稱 反義股區域之鹼基序列(5’-3’) 序列識別號
TfR2-019.94AS.e1 U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)^C(M)^U(M)^U(M) 40
TfR2-019.94AS.e2 U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M)C(M)^C(M)^U(M)^U(M) 41
TfR2-019.94AS.e3 U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A(M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^G(M)^U(M) 42
表中之「分子量」表示利用負離子ESI質量分析的實測值。在表中之「鹼基序列」，N(R)表示RNA，N(D)表示DNA，N(M)表示2’-OMe RNA，N(m)表示2’-MOE RNA，N(3M)表示3’-OMe RNA，N(F)表示2’-F RNA，N(L)表示LNA，N(E)表示ENA。各自之核苷的結構係以上述各結構式表示。
表中之「GN」係表示上述式(GN)所表示的GalNAc單元。各自表中之「2」表示-O(CH 2) 2O-(以上述式(2)表示)，「Z」表示-O(CH 2) 8NHC(=O)(CH 2) 2PhO-(以上述式(Z)表示)。關於核苷間之鍵結、或者核苷與GalNAc單元、「2」、或「Z」的鍵結，表中之「^」表示硫代磷酸酯鍵(-P(=S)(OH)-，以上述的核苷間鍵結的結構圖(PS)表示)。在未特別記載的情形，表示以磷酸二酯鍵(-P(=O)(OH)-，以上述核苷間鍵結之結構圖(P)表示)鍵結者。
各寡核苷酸之5’末端的核苷酸之5’位及3’末端之核苷酸之3’位(3’位經修飾的核苷酸則為2’位)係成為氫原子與上述各核苷之結構圖中的氧原子鍵結而成的羥基。「2」成為末端的情形，在上述的「2」之結構圖中，係成為氫原子與未和寡核苷酸鍵結的鍵結肢側之氧原子鍵結而成的羥基。「^」成為末端的情形，在上述的「PS」之結構圖中，羥基與磷原子鍵結。惟，「GN」成為末端的情形，氫原子之鍵結並非必要。
試驗例1：對於HepG2細胞的TfR2 siRNA之利用正向轉染法的篩選 使用實施例1～82之化合物作為TfR2 siRNA，進行以下之實驗。在轉染之前一日，在96孔盤(Corning公司製品)中每1孔，於添加有10% FBS (Gibco公司製)的DMEM培養基(Gibco公司製)100μL中接種2.5x10 4個HepG2細胞。轉染當日，製作siRNA檢體每1種類2孔份、以蒸餾水代替siRNA的陰性對照(NT) 2孔份、作為陽性對照之TfR2-061(實施例61) 2孔份。就用以實施siRNA 1檢體之轉染的試藥製備而言，在將50μL之Opti-MEM (Life Technology公司製)與3μL之RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific公司製)混合而成者中，添加50μL之Opti-MEM與1μL之siRNA(濃度為10μM)，在室溫下培養15分鐘。之後，添加預先製備並在37℃加溫的包含10% FBS的DMEM 1mL。將其中的110μL添加到接種HepG2細胞並去除培養基後的96孔盤中。  siRNA之最終濃度在全部之檢體中皆為10nM。就陰性對照用之試藥製備而言，在將50μL之Opti-MEM (Life Technology公司製)與3μL之RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific公司製)混合者中，添加50μL之Opti-MEM與1μL之蒸餾水，並於室溫下培養15分鐘。
轉染2日後，使用PBS (Thermo Fisher Scientific公司製)而將細胞洗淨1次，進行RNA的萃取。RNA之萃取係使用RNeasy Mini Kit (QUAGEN公司製)而按照套組的程序實施。將獲得的300 ng之RNA，使用High Capacity RNA to cDNA kit (Applied Biosystems公司製)進行反轉錄反應，合成cDNA。使用獲得的cDNA，藉由定量的PCR而測定內因性hTfR2的mRNA量。作為持家基因(housekeeping gene)，測定人類18S 核糖體RNA (h18S)之mRNA量。
定量的PCR係使用IDT PrimeTime Gene Expression Master Mix (Integrated DNA Technologies公司製)，如以下方式進行。獲得的cDNA係使用蒸餾水稀釋10倍(將cDNA 15μL及蒸餾水135μL加以混合)。384孔之PCR盤(Applied Biosystems公司製)之每1孔，以5μL之IDT PrimeTime Gene Expression Master Mix、0.5μL之hTfR2引子(Hs.PT.58.20599434，Integrated DNA Technologies公司製)、0.5μL之h18S引子(Hs.PT.39a.22214856.g，Integrated DNA Technologies公司製)、2μL之蒸餾水、2μL之cDNA的比例進行混合(共計10μL)，對於各cDNA製備2孔份，進行定量的PCR。測定作為2孔間之平均值的hTfR2與h18S之mRNA表現量。hTfR2之mRNA表現量係以為持家基因的h18S之mRNA表現量進行正規化。作為將陰性對照中的hTfR2 mRNA表現量設為1.0時之相對值，算出以各siRNA處置的檢體之相對hTfR2 mRNA表現量並標記。結果示於以下之表4。
[表4-1]
化合名稱 相對值
TfR2-001 0.35
TfR2-002 0.41
TfR2-003 0.41
TfR2-004 0.43
TfR2-005 0.42
TfR2-006 0.43
TfR2-007 0.35
TfR2-008 0.53
TfR2-009 0.40
TfR2-010 0.42
TfR2-011 0.53
TfR2-012 0.49
TfR2-013 0.31
TfR2-014 0.49
TfR2-015 0.33
TfR2-016 0.50
TfR2-017 0.48
TfR2-018 0.39
TfR2-019 0.30
TfR2-020 0.49
TfR2-021 1.01
TfR2-022 0.43
TfR2-023 1.18
TfR2-024 0.41
TfR2-025 0.81
TfR2-026 1.16
TfR2-027 0.61
TfR2-028 0.45
NT 1.00
TfR2-061 0.19
[表4-2]
化合物名稱 相對值
TfR2-029 0.55
TfR2-030 0.98
TfR2-031 1.22
TfR2-032 0.55
TfR2-033 0.53
TfR2-034 0.48
TfR2-035 0.40
TfR2-036 0.48
TfR2-037 0.35
TfR2-038 0.48
TfR2-039 0.36
TfR2-040 0.65
TfR2-041 0.39
TfR2-042 1.02
TfR2-043 0.44
TfR2-044 0.58
TfR2-045 0.90
TfR2-046 0.38
TfR2-047 0.76
TfR2-048 0.77
TfR2-049 0.87
TfR2-050 0.50
TfR2-051 0.45
TfR2-052 0.40
TfR2-053 0.32
TfR2-054 0.45
TfR2-055 0.54
TfR2-056 0.43
NT 1.00
TfR2-061 0.22
[表4-3]
化合物名稱 相對值
TfR2-057 0.46
TfR2-058 0.50
TfR2-059 0.63
TfR2-060 0.63
TfR2-062 0.61
TfR2-063 0.73
TfR2-064 0.47
TfR2-065 0.43
TfR2-066 0.63
TfR2-067 0.49
TfR2-068 0.69
TfR2-069 0.50
TfR2-070 0.54
TfR2-071 0.52
TfR2-072 0.53
TfR2-073 0.55
TfR2-074 0.58
TfR2-075 0.57
TfR2-076 0.39
TfR2-077 0.40
TfR2-078 0.52
TfR2-079 0.90
TfR2-080 0.50
TfR2-081 0.38
TfR2-082 0.35
NT 1.00
TfR2-061 0.35
試驗例1-1：使用HepG2細胞的細胞毒性之評價 以與試驗例2同樣之方法，使用反向轉染法，將siRNA導入至HepG2細胞，4日後進行細胞毒性之評價。作為siRNA，使用TfR2-061(實施例61)、TfR2-019(實施例19)、及TfR2-039(實施例39)。
關於siRNA對於肝臟細胞的細胞毒性，使用cell counting kit-8 (CCK8，同仁化學研究所)進行試驗。去除培養上清液後，以110μL/孔添加每100μL含有10% FBS的DMEM中含有10μL之CCK8試藥的製備溶液。之後30分鐘，在37℃之CO 2培養箱內培養細胞。之後，使用微量盤分析儀(microplate reader)測定OD450nm吸光度。作為將陰性對照(NT)中的OD450nm值設為1.0時之相對值，算出以各siRNA處置的孔中的OD450nm值作為相對值而標記。結果示於圖11。
此結果顯示，特別是於TfR2-019及TfR2-039，對於肝臟細胞的毒性小。
試驗例2：對於HepG2細胞的TfR2 siRNA之利用反向轉染法的篩選 使用各實施例之化合物作為TfR2 siRNA，進行以下之實驗。藉由反向轉染法，如以下方式進行siRNA之篩選。轉染當日，製作siRNA檢體每1種類2孔份、以蒸餾水代替siRNA的陰性對照(NT) 2孔份、作為陽性對照之TfR2-061(實施例61)或WO2012/177921記載的針對hTfR2的siRNA (AD-52590) 2孔份。
每1孔，於14.8μL之Opti-MEM與0.2μL之RNAiMAX的混合液中，添加5μL之siRNA，在室溫下培養20分鐘。作為陰性對照用之試藥製備，對於Opti-MEM與RNAiMAX之混合液，添加5μL之蒸餾水代替siRNA。作為陽性對照用之試藥製備，對Opti-MEM與RNAiMAX之混合液，添加5μL之TfR2-061(實施例61)或AD-52590。接著，各添加20μL包含siRNA或陰性對照或陽性對照的混合液至96孔之細胞培養用盤(SUMIRON公司製)。在添加混合液的96孔盤中每1孔各接種80μL之使用預先在37℃加溫的包含10% FBS的DMEM所製備的2x10 4個細胞/mL之HepG2細胞。作為siRNA之最終濃度，以10nM至成為10倍或50倍公比的方式製備。
轉染1日後或2日後，使用PBS而將細胞洗淨1次。使用Superprep Cell Lysis RT Kit for qPCR (Takara Bio公司製)，按照套組的程序實施RNA萃取及反轉錄反應，合成cDNA。使用獲得的cDNA，藉由定量的PCR測定內因性hTfR2的mRNA表現量。作為持家基因，測定h18S之mRNA表現量。
定量的PCR係使用IDT PrimeTime Gene Expression Master Mix (Integrated DNA Technologies公司製)，如以下方式進行。獲得的cDNA係作為原液使用。384孔之PCR盤(Applied Biosystems公司製)之每1孔，以5μL之IDT PrimeTime Gene Expression Master Mix、0.25μL之hTfR2引子(Hs.PT.58.20599434，Integrated DNA Technologies公司製)或0.25μL之h18S引子(Hs.PT.39a.22214856.g，Integrated DNA Technologies公司製)、2.75μL之蒸餾水、2μL之cDNA的比例進行混合(共計10μL)，對於各cDNA製備2孔份，進行定量的PCR。測定作為2孔間之平均值的hTfR2與h18S之mRNA表現量。hTfR2之mRNA表現量係以為持家基因的h18S之mRNA表現量進行正規化。作為將陰性對照中的hTfR2 mRNA表現量設為1.0時之相對值，算出以各siRNA處置的檢體之相對hTfR2 mRNA表現量並標記。結果示於以下之表5～表20。
[表5-1]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-061 10 0.07
1 0.07
0.1 0.11
TfR2-007 10 0.19
1 0.20
0.1 0.21
TfR2-013 10 0.11
1 0.17
0.1 0.14
TfR2-015 10 0.38
1 0.47
0.1 0.37
TfR2-019 10 0.19
1 0.19
0.1 0.66
TfR2-037 10 0.37
1 0.32
0.1 0.28
TfR2-076 10 0.39
1 0.74
0.1 0.28
TfR2-077 10 0.26
1 0.19
0.1 0.30
TfR2-081 10 0.13
1 0.15
0.1 0.27
[表5-2]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-061 10 0.10
1 0.10
0.1 0.13
TfR2-003 10 0.56
1 0.43
0.1 0.83
TfR2-005 10 0.36
1 0.26
0.1 0.27
TfR2-006 10 0.31
1 0.37
0.1 0.75
TfR2-022 10 0.25
1 0.22
0.1 0.20
TfR2-039 10 0.21
1 0.25
0.1 0.23
TfR2-046 10 0.30
1 0.27
0.1 0.24
TfR2-065 10 0.14
1 0.15
0.1 0.15
[表6-1]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 1 0.05
0.02 0.44
0.0004 0.81
TfR2-003.5 1 0.10
0.02 0.46
0.0004 0.87
TfR2-005.5 1 0.07
0.02 0.20
0.0004 0.56
TfR2-006.5 1 0.08
0.02 0.34
0.0004 0.76
TfR2-007.5 1 0.12
0.02 0.24
0.0004 1.03
TfR2-013.5 1 0.12
0.02 0.44
0.0004 0.75
TfR2-019.5 1 0.05
0.02 0.31
0.0004 0.82
TfR2-022.5 1 0.36
0.02 0.37
0.0004 0.78
TfR2-037.5 1 0.16
0.02 0.31
0.0004 0.58
[表6-2]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 1 0.03
0.02 0.24
0.0004 0.60
TfR2-039.5 1 0.09
0.02 0.38
0.0004 0.54
TfR2-061.5 1 0.02
0.02 0.11
0.0004 0.38
TfR2-065.5 1 0.22
0.02 0.16
0.0004 0.36
TfR2-076.5 1 0.04
0.02 0.10
0.0004 0.50
TfR2-077.5 1 0.06
0.02 0.12
0.0004 0.43
TfR2-081.5 1 0.02
0.02 0.26
0.0004 0.43
[表7-1]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.001 0.92
0.01 0.72
0.1 0.44
1 0.14
10 0.09
TfR2-006.5 0.001 0.86
0.01 0.69
0.1 0.36
1 0.20
10 0.15
TfR2-013.5 0.001 0.84
0.01 0.67
0.1 0.46
1 0.23
10 0.16
TfR2-039.5 0.001 0.70
0.01 0.72
0.1 0.51
1 0.27
10 0.23
[表7-2]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.001 0.80
0.01 0.57
0.1 0.26
1 0.08
10 0.08
TfR2-007.5 0.001 0.68
0.01 0.53
0.1 0.25
1 0.19
10 0.16
TfR2-019.5 0.001 0.58
0.01 0.31
0.1 0.14
1 0.08
10 0.07
TfR2-076.5 0.001 0.64
0.01 0.27
0.1 0.28
1 0.17
10 0.15
[表8-1]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.001 1.02
0.01 0.77
0.1 0.45
1 0.14
10 0.15
TfR2-006.3 0.001 1.06
0.01 1.02
0.1 0.67
1 0.34
10 0.39
TfR2-013.3 0.001 1.04
0.01 1.16
0.1 0.81
1 0.45
10 0.37
TfR2-039.3 0.001 0.95
0.01 1.05
0.1 0.92
1 0.79
10 0.81
[表8-2]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.001 0.90
0.01 0.62
0.1 0.31
1 0.13
10 0.12
TfR2-007.3 0.001 0.95
0.01 0.94
0.1 0.86
1 0.76
10 0.67
TfR2-019.3 0.001 0.77
0.01 0.55
0.1 0.36
1 0.25
10 0.25
TfR2-076.3 0.001 0.80
0.01 0.57
0.1 0.39
1 0.27
10 0.28
[表8-3]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.001 0.72
0.01 0.71
0.1 0.45
1 0.24
10 0.04
TfR2-006.6 0.001 0.93
0.01 0.91
0.1 0.39
1 0.17
10 0.10
TfR2-013.6 0.001 0.77
0.01 1.16
0.1 0.44
1 0.15
10 0.14
TfR2-039.6 0.001 0.91
0.01 0.88
0.1 0.50
1 0.17
10 0.22
[表8-4]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.001 0.78
0.01 0.44
0.1 0.24
1 0.04
10 0.04
TfR2-007.6 0.001 0.91
0.01 0.58
0.1 0.34
1 0.16
10 0.07
TfR2-019.6 0.001 0.54
0.01 0.31
0.1 0.18
1 0.09
10 0.11
TfR2-076.6 0.001 0.79
0.01 0.45
0.1 0.27
1 0.16
10 0.18
[表9]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.001 0.73
0.01 0.47
0.1 0.22
1 0.06
10 0.06
TfR2-039.5 0.001 0.82
0.01 0.69
0.1 0.36
1 0.20
10 0.21
TfR2-019.6 0.001 0.56
0.01 0.32
0.1 0.17
1 0.09
10 0.06
TfR2-039.5G 0.001 0.73
0.01 0.64
0.1 0.39
1 0.19
10 0.19
TfR2-019.6G 0.001 0.53
0.01 0.33
0.1 0.17
1 0.08
10 0.06
[表10]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.001 0.97
0.01 0.81
0.1 0.34
1 0.14
10 0.12
TfR2-039.5 0.001 0.98
0.01 0.83
0.1 0.50
1 0.28
10 0.29
TfR2-039.10 0.001 0.87
0.01 0.81
0.1 0.55
1 0.29
10 0.26
TfR2-039.11 0.001 0.95
0.01 0.65
0.1 0.47
1 0.32
10 0.28
TfR2-039.12 0.001 0.81
0.01 0.73
0.1 0.53
1 0.32
10 0.35
[表11-1]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.001 0.92
0.01 0.74
0.1 0.39
1 0.14
10 0.10
TfR2-039.5 0.001 1.09
0.01 0.99
0.1 0.63
1 0.31
10 0.40
TfR2-039.19 0.001 1.12
0.01 0.91
0.1 0.53
1 0.36
10 0.29
TfR2-039.20 0.001 1.08
0.01 0.96
0.1 0.63
1 0.32
10 0.29
TfR2-039.8 0.001 0.81
0.01 0.75
0.1 0.46
1 0.31
10 0.22
[表11-2]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-019.6 0.001 0.72
0.01 0.51
0.1 0.28
1 0.22
10 0.12
TfR2-019.8 0.001 0.84
0.01 0.41
0.1 0.25
1 0.19
10 0.11
TfR2-019.9 0.001 0.73
0.01 0.38
0.1 0.29
1 0.14
10 0.09
TfR2-019.15 0.001 0.78
0.01 0.55
0.1 0.28
1 0.17
10 0.12
TfR2-019.17 0.001 0.75
0.01 0.42
0.1 0.27
1 0.15
10 0.11
[表12-1]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.001 0.91
0.01 0.72
0.1 0.35
1 0.14
10 0.10
TfR2-039.5 0.001 1.09
0.01 0.79
0.1 0.51
1 0.30
10 0.31
TfR2-039.21 0.001 1.03
0.01 0.83
0.1 0.60
1 0.30
10 0.30
TfR2-039.22 0.001 0.93
0.01 0.96
0.1 0.60
1 0.33
10 0.26
TfR2-039.23 0.001 1.05
0.01 0.83
0.1 0.54
1 0.32
10 0.36
[表12-2]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-039.5 0.001 0.81
0.01 0.77
0.1 0.57
1 0.29
10 0.36
TfR2-039.24 0.001 1.11
0.01 1.03
0.1 0.60
1 0.34
10 0.34
TfR2-039.25 0.001 1.40
0.01 0.91
0.1 0.73
1 0.44
10 0.39
TfR2-039.26 0.001 1.22
0.01 1.10
0.1 0.87
1 0.42
10 0.53
[表13-1]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.01 0.46
0.1 0.19
1 0.03
10 0.05
TfR2-039.5 0.01 0.60
0.1 0.34
1 0.22
10 0.21
TfR2-039.9 0.01 0.64
0.1 0.33
1 0.17
10 0.19
TfR2-039.9DU 0.01 0.92
0.1 0.57
1 0.20
10 0.13
TfR2-039.28DU 0.01 1.44
0.1 0.94
1 0.29
10 0.19
[表13-2]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.01 0.52
0.1 0.21
1 0.07
10 0.06
TfR2-039.9 0.01 0.81
0.1 0.45
1 0.31
10 0.32
TfR2-039.29DU 0.01 1.14
0.1 0.80
1 0.35
10 0.27
TfR2-039.30DU 0.01 1.08
0.1 0.95
1 0.32
10 0.30
TfR2-039.31DU 0.01 1.19
0.1 0.74
1 0.32
10 0.30
[表13-3]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.01 0.48
0.1 0.18
1 0.07
10 0.07
TfR2-039.5 0.01 0.63
0.1 0.28
1 0.22
10 0.23
TfR2-039.9 0.01 0.85
0.1 0.35
1 0.25
10 0.28
TfR2-039.32DU 0.01 1.05
0.1 0.93
1 0.43
10 0.38
[表14]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
AD-52590 0.001 0.84
0.01 0.66
0.1 0.31
1 0.07
10 0.07
TfR2-019.6 0.001 0.57
0.01 0.37
0.1 0.22
1 0.12
10 0.08
TfR2-019.29DU 0.001 0.69
0.01 0.43
0.1 0.22
1 0.12
10 0.06
TfR2-019.34DU 0.001 0.71
0.01 0.42
0.1 0.21
1 0.11
10 0.06
[表15]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-019.6 0.001 0.65
0.01 0.36
0.1 0.23
1 0.14
10 0.11
TfR2-019.22 0.001 0.66
0.01 0.34
0.1 0.22
1 0.14
10 0.08
TfR2-019.22s 0.001 0.68
0.01 0.36
0.1 0.21
1 0.13
10 0.07
TfR2-019.22DU 0.001 0.79
0.01 0.48
0.1 0.28
1 0.15
10 0.11
TfR2-019.22sDU 0.001 0.80
0.01 0.47
0.1 0.28
1 0.15
10 0.08
[表16-1]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-019.6G 0.001 0.66
0.01 0.33
0.1 0.18
1 0.13
10 0.13
TfR2-039.5G 0.001 0.93
0.01 0.71
0.1 0.40
1 0.32
10 0.29
TfR2-039.23DUG 0.001 1.02
0.01 0.94
0.1 0.75
1 0.43
10 0.39
TfR2-039.38DUG 0.001 0.93
0.01 0.95
0.1 0.59
1 0.30
10 0.24
TfR2-039.41DUG 0.001 0.96
0.01 0.84
0.1 0.50
1 0.28
10 0.26
[表16-2]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-039.23DUG 0.001 1.00
0.01 0.95
0.1 0.89
1 0.49
10 0.42
TfR2-039.35DUG 0.001 1.03
0.01 0.93
0.1 0.76
1 0.42
10 0.29
TfR2-039.36DUG 0.001 0.93
0.01 0.93
0.1 0.65
1 0.32
10 0.30
TfR2-039.37DUG 0.001 0.96
0.01 0.89
0.1 0.62
1 0.31
10 0.25
TfR2-039.38DUG 0.001 1.03
0.01 0.92
0.1 0.62
1 0.30
10 0.24
[表17-1]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-039.23DUG 0.001 0.91
0.01 0.72
0.1 0.60
1 0.35
10 0.27
TfR2-039.39DUG 0.001 0.79
0.01 0.81
0.1 0.42
1 0.18
10 0.13
TfR2-039.40DUG 0.001 0.83
0.01 0.81
0.1 0.47
1 0.15
10 0.14
TfR2-039.41DUG 0.001 0.81
0.01 0.63
0.1 0.31
1 0.13
10 0.14
TfR2-039.42DUG 0.001 0.66
0.01 0.73
0.1 0.37
1 0.16
10 0.12
[表17-2]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-039.23DUG 0.001 0.75
0.01 0.76
0.1 0.59
1 0.25
10 0.21
TfR2-039.36DUG 0.001 0.58
0.01 0.59
0.1 0.39
1 0.12
10 0.09
TfR2-039.41DUG 0.001 0.66
0.01 0.63
0.1 0.26
1 0.08
10 0.07
TfR2-039.43DUG 0.001 0.72
0.01 0.52
0.1 0.59
1 0.42
10 0.35
TfR2-039.45DUG 0.001 0.48
0.01 0.47
0.1 0.44
1 0.23
10 0.21
[表18-1]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-019.6G 0.001 0.88
0.01 0.37
0.1 0.20
1 0.13
10 0.14
TfR2-019.22DUG 0.001 0.87
0.01 0.46
0.1 0.23
1 0.12
10 0.15
TfR2-019.38DUG 0.001 0.89
0.01 0.54
0.1 0.30
1 0.16
10 0.12
TfR2-019.36DUG 0.001 0.88
0.01 0.49
0.1 0.25
1 0.14
10 0.13
TfR2-019.87DUG 0.001 0.95
0.01 0.43
0.1 0.25
1 0.15
10 0.13
[表18-2]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-019.6G 0.001 0.84
0.01 0.44
0.1 0.25
1 0.12
10 0.11
TfR2-019.22DUG 0.001 0.89
0.01 0.51
0.1 0.22
1 0.13
10 0.10
TfR2-019.85DUG 0.001 0.64
0.01 0.36
0.1 0.17
1 0.15
10 0.09
TfR2-019.86DUG 0.001 0.72
0.01 0.34
0.1 0.19
1 0.15
10 0.10
TfR2-039.41DUG 0.001 0.93
0.01 0.89
0.1 0.57
1 0.33
10 0.28
[表19-1]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-061.5 0.001 0.75
0.01 0.50
0.1 0.33
1 0.15
10 0.15
TfR2-019.22DUG 0.001 1.07
0.01 0.61
0.1 0.33
1 0.25
10 0.22
TfR2-019.71DUG 0.001 0.97
0.01 0.88
0.1 0.57
1 0.32
10 0.31
TfR2-019.88DUG 0.001 0.86
0.01 0.76
0.1 0.46
1 0.28
10 0.24
TfR2-019.89DUG 0.001 0.81
0.01 0.71
0.1 0.40
1 0.30
10 0.19
[表19-2]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-019.6G 0.001 0.84
0.01 0.62
0.1 0.30
1 0.21
10 0.16
TfR2-019.22DUG 0.001 1.09
0.01 0.73
0.1 0.30
1 0.20
10 0.15
TfR2-019.90DUG 0.001 1.02
0.01 0.93
0.1 0.45
1 0.29
10 0.22
TfR2-019.80DUG 0.001 1.06
0.01 0.76
0.1 0.35
1 0.26
10 0.21
TfR2-019.91DUG 0.001 1.02
0.01 0.66
0.1 0.33
1 0.25
10 0.17
[表19-3]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-019.6G 0.001 0.79
0.01 0.53
0.1 0.35
1 0.29
10 0.19
TfR2-019.92DUG 0.001 0.88
0.01 0.67
0.1 0.33
1 0.24
10 0.24
TfR2-019.22DUG 0.001 0.83
0.01 0.55
0.1 0.34
1 0.23
10 0.24
TfR2-019.93DUG 0.001 0.85
0.01 0.67
0.1 0.40
1 0.26
10 0.24
TfR2-046.5 0.001 0.84
0.01 0.78
0.1 0.55
1 0.35
10 0.37
[表20]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
TfR2-019.92DUG 0.001 0.85
0.01 0.52
0.1 0.35
1 0.16
10 0.13
TfR2-019.93DUG 0.001 0.68
0.01 0.42
0.1 0.22
1 0.11
10 0.08
TfR2-019.94DUG 0.001 0.65
0.01 0.48
0.1 0.28
1 0.15
10 0.16
TfR2-019.95DUG 0.001 0.91
0.01 0.53
0.1 0.25
1 0.18
10 0.09
試驗例2-1：使用HepG2細胞的hTfR2減弱活性 以與試驗例2同樣之方法，使用反向轉染法，將siRNA導入至HepG2細胞，2日後進行hTfR2之mRNA表現量的評價。作為siRNA，使用TfR2-019(實施例19)、及TfR2-019.94DUG(實施例169)。
關於hTfR2 mRNA表現量之評價，作為將陰性對照(NT)中的hTfR2 mRNA表現量設為1.0時之相對值，算出以各siRNA處置的檢體之相對hTfR2 mRNA表現量而標記。結果示於圖12。
此結果顯示，特別是TfR2-019.94DUG具有針對hTfR2 mRNA的高減弱活性。
試驗例3：TfR2 siRNA對於雄性食蟹獼猴之單次投予試驗 測定將TfR2-039.5G(實施例127)或TfR2-039.23DUG(實施例144)以30 mg/kg之用量皮下投予後之血漿中鐵濃度及血漿中鐵調素濃度。血漿中鐵濃度係使用Metallo Assay Iron Assay kit (Metallogenics公司製)測定。血漿中鐵調素濃度係使用LC/MS測定。分別將投予TfR2-039.5G(實施例127)的結果示於表21，將投予TfR2-039.23DUG(實施例144)的結果示於表22。
[表21]
猴1
投予後日數 血漿Fe ug/dL 鐵調素(nM)
0 146.5 15.5
3 209.0 11.3
7 214.0 11.6
14 271.0 11.2
21 300.0 13.1
29 285.5 13.9
35 204.0 20.0
42 219.5 17.6
49 203.5 15.6
56 187.5 18.8
[表22]
猴2 猴3
投予後日數 血漿Fe ug/dL 鐵調素(nM) 血漿Fe ug/dL 鐵調素(nM)
-14 108.5 16.4 121.5 13.0
0 142.5 16.4 140.5 11.7
7 183.0 11.9 121.0 12.4
14 215.0 9.45 140.5 9.83
21 198.5 9.77 180.0 8.88
28 197.5 10.4 168.0 9.60
37 169.5 10.8 196.0 10.4
42 183.5 11.5 131.0 4.95
49 156.5 未測定 124.0 未測定
試驗例4：使用TfR2 siRNA的包覆siRNA的核酸脂質粒子(siRNA-encapsulated nucleic acid lipid particle)之製備 (1) 包覆siRNA的核酸脂質粒子之製備  將二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)：以下標記為DSPC，NOF CORPORATION)、膽固醇(Cholesterol：以下標記為Chol，Sigma-Aldrich, Inc.)、乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)二十八-9-烯-7-基酯(WO2015/005253之實施例28記載之化合物)(以下標記為LP)、及聚乙二醇分子量為約2000之1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Methoxypolyethylene Glycol，以下標記為PEG-DMG，NOF CORPORATION)，以10:48:40:2之莫耳比，溶解於乙醇使總脂質濃度成為10mM。
另一方面，將作為小鼠TfR2 siRNA之AD-47882 (WO2012/177921記載的針對小鼠TfR2之siRNA)以檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，pH4.0)稀釋製備。
將上述之脂質溶液與siRNA溶液，以相對於siRNA的總脂質重量比成為11，且其體積比成為1:3的方式，使用NanoAssemblr BenchTop (Precision Nanosystems Inc.)在微流道內進行混合，獲得核酸脂質粒子之粗分散液。藉由將核酸脂質粒子之分散液以約25～50倍量的磷酸緩衝液進行12～18小時透析(Float-A-Lyzer G2，MWCO：1,000kD，Spectra/Por)，而進行乙醇去除，獲得經純化的包覆siRNA的核酸脂質粒子之分散液。此外，LP係按照WO2015/005253之實施例28記載之方法進行合成。
(2) 包覆siRNA的核酸脂質粒子之特性評價 對於(1)所製備的包含核酸脂質粒子的分散液，進行以下之特性評價。  (2-1) siRNA之包覆率  siRNA之包覆率係使用Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit (Invitrogen)，依據所附說明書測定。即，在0.015% Triton X-100界面活性劑存在下及不存在下，定量核酸脂質粒子之分散液中的siRNA，藉由下式算出包覆率。  包覆率(%)={([界面活性劑存在下的siRNA量]-[界面活性劑不存在下的siRNA量])/[界面活性劑存在下的siRNA量]}x 100(%)
(2-2) siRNA與脂質之比率 將核酸脂質粒子分散液以1.0% Triton X-100稀釋製備，將核酸脂質粒子之分散液中的siRNA量以離子交換層析進行測定(系統：Agilent 1260系列，管柱：Dionex BioLC DNAPac PA200 (8μm，4.0mm×250mm) (ThermoFisher Scientific)，緩衝液A：10mM Tris-鹽酸緩衝液、25mM過氯酸鈉、20%乙醇(pH7.0)，緩衝液B：10mM Tris-鹽酸緩衝液、250mM過氯酸鈉、20%乙醇(pH7.0)，(B%)：20-70% (15min)，流率：0.5mL/min，溫度：40℃，檢測：260nm)。
將核酸脂質粒子分散液以乙醇稀釋製備，將核酸脂質粒子之分散液中的各脂質量以逆相層析測定(系統：DIONEX UltiMate 3000，管柱：XSelect CSH C18 (130Å，3.5μm，3.0mm×150mm) (Waters catalog # 186005263)，緩衝液A：0.2%甲酸，緩衝液B：0.2%甲酸、甲醇，(B%)：75-95% (15min)、95% (2min)，流率：0.45mL/min，溫度：50℃，檢測：Corona CAD (電霧式檢測器(Charged Aerosol Detector)))。相對於siRNA的總脂質量之比率係藉由下式算出。  相對於siRNA的總脂質量(wt/wt)=[總脂質濃度]/[siRNA濃度](wt/wt)
(2-3) 平均粒徑 核酸脂質粒子之粒徑係以Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS (PARTICLE SIZING SYSTEMS)進行測定。表中之平均粒徑表示體積平均粒徑，±以下表示偏差。各特性評價之結果示於表23。
[表23]
包覆率(%) 粒徑(nm) 總脂質/siRNA(wt/wt)
AD-47882 95 91±26 11
由以上之結果可知，此等之核酸脂質粒子係有siRNA之約95%被包覆於脂質粒子內，且具有約90nm之平均粒徑。
試驗例5：伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中的包覆有TfR2 siRNA的核酸脂質粒子之藥效評價試驗 使用包覆有AD-47882 (WO2012/177921記載的針對小鼠TfR2的siRNA)的核酸脂質粒子作為包覆有小鼠TfR2 siRNA的核酸脂質粒子，進行以下之實驗。核酸脂質粒子係以與試驗例4同樣之方法製備。為了誘發骨髓功能低下，對雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)腹腔內投予(i.p.) 100 mg/kg之卡鉑(東京化成工業公司製)。就未誘發骨髓功能低下的對照組(control)而言，代替卡鉑而將PBS進行i.p.投予(n=5)。投予卡鉑4日後，基於血漿中鐵濃度與HGB值分組後，進行藥劑處置(n=5/組)。藥劑係就0.5 mg/kg (0.5mpk)及0.25 mg/kg (0.25mpk)之AD-47882，各自作為核酸脂質粒子而進行1次靜脈內投予(i.v.)。作為媒劑對照組，代替藥劑而將PBS進行i.v.投予。在AD-47882之投予前(第0日)、及自投予AD-47882起3日後(第3日)、7日後(第7日)、10日後(第10日)、11日後(第11日)，進行尾靜脈採血，並使用QuantiChrom Whole Blood HB kit (Bioassay Systems公司製)測定HGB值。HGB值之結果係示於圖7C。在AD-47882之投予前(第0日)、自投予起3日後(第3日)、7日後(第7日)，進行血漿中鐵濃度及血漿中鐵調素濃度之測定。血漿中鐵濃度係將血漿中鐵濃度使用Metallo Assay Iron Assay kit (Metallogenics公司製)進行測定。血漿中鐵調素濃度係使用LC/MS進行測定。血漿中鐵濃度與血漿中鐵調素濃度之結果係分別示於圖7A與圖7B。又，以AD-47882處置而在11日後(第11日)，在異氟烷(isoflurane)麻醉下進行腹大靜脈內採血，使用多項目自動血球分析裝置XT2000 (Sysmex股份有限公司製)測定平均血球血紅素量(MCH)值。MCH值之結果係示於圖7D。
又，藉由放血處置將小鼠安樂死後，採集肝臟，測定小鼠TfR2 (mTfR2)及小鼠鐵調素(mHepcidin)之mRNA表現量。RNA之萃取係使用RNeasy Mini Kit (QUAGEN公司製)而按照套組之程序實施。將獲得的5000 ng之RNA，使用High Capacity RNA to cDNA kit (Applied Biosystems公司製)而進行反轉錄反應，使用藉此所獲得的cDNA，藉由定量的PCR而測定內因性之小鼠TfR2與鐵調素之mRNA量。
定量的PCR係使用IDT PrimeTime Gene Expression Master Mix (Integrated DNA Technologies公司製)，如以下方式進行。獲得的cDNA使用蒸餾水而稀釋10倍(將cDNA 15μL及蒸餾水135μL進行混合)。384孔之PCR盤(Applied Biosystems公司製)之每1孔，以5μL之IDT PrimeTime Gene Expression Master Mix、0.25μL之小鼠TfR2 (mTfR2)引子(Mm.PT.58.7860185，Integrated DNA Technologies公司製)或0.25μL之小鼠鐵調素(mHepcidin)引子(Mm.PT.58.43563393.g，Integrated DNA Technologies公司製)、2.75μL之蒸餾水、2μL之cDNA的比例進行混合(共計10μL)，對於各cDNA製備2孔份，進行定量的PCR。作為持家基因，使用小鼠β-肌動蛋白(mActb)引子(Mm.PT.39a.22214843.g，Integrated DNA Technologies公司製)，以如上述記載的比例進行混合，對於各cDNA製備2孔份，進行定量的PCR。測定作為2孔間的平均值之mTfR2、mHepcidin、及mActb之mRNA量。mTfR2及mHepcidin之mRNA表現量係以為持家基因的mActb之mRNA表現量進行正規化。作為將未誘導骨髓功能低下的對照組中的mRNA量設為1.0時之相對值，算出媒劑組及AD-47882處置組中的相對mRNA量而標記(平均值±標準誤差)。肝臟中的mTfR2及mHepcidin之mRNA表現量的結果係各自示於圖7E及圖7F。
此等之結果顯示下述的可能性，藉由TfR2 siRNA之處置而抑制TfR2之mRNA表現量，藉此使HGB值上升，可對於伴隨骨髓功能不全的貧血、例如伴隨骨髓纖維化的貧血等之貧血疾病提供治療效果。
試驗例6：伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中的結合GalNAc的TfR2 siRNA (GalNAc-conjugated TfR2 siRNA)之藥效評價試驗 作為結合有GalNAc的TfR2 siRNA，使用AD47882.23DUG(實施例171)而進行以下之實驗。為了誘發骨髓功能低下，將100 mg/kg之卡鉑進行腹腔內投予(i.p.)。作為未誘導骨髓功能低下的對照組(control)，代替卡鉑而將PBS進行i.p.投予(n=5)。基於投予卡鉑的4日後的HGB值進行分組後，進行藥劑處置(n=9或10/組)。結合GalNAc的TfR2 siRNA處置組係以3 mg/kg (3mpk)之用量進行1次皮下投予。作為陽性對照組，就捕獲活化素受體IIB型(activin receptor type IIB，ActRIIB)之配體的藥劑而言將結合有Fc的ActRIIB (ActRIIB-Fc)以10 mg/kg之用量，每隔3或4日進行共計3次皮下投予。ActRIIB-Fc已知係一種使羅特西普(ACE-536)之細胞外域與小鼠IgG2a之Fc域結合的蛋白製劑(WO2016090188、Blood. 2014;123(25):3864-3872)，藉由抑制Smad2/3訊息而促進紅血球分化，對於β地中海型貧血模式小鼠或骨髓化生不良症候群模式小鼠顯示治療效果(Blood. 2014;123(25):3864-3872、Nature Medicine volume 20, pages408-414 (2014))。作為媒劑組，將PBS每隔3至4日進行共計3次皮下投予。作為結合GalNAc的TfR2 siRNA與ActRIIB-Fc之併用處置組，如上述將siRNA進行1次皮下投予，將ActRIIB-Fc進行共計3次皮下投予。
在進行藥劑處置前(第0日)、進行處置的3日後(第3日)、8日後(第8日)，進行尾靜脈採血，使用QuantiChrom Whole Blood HB kit (Bioassay Systems公司製)測定HGB值。HGB值之結果係示於圖8A(平均值±標準誤差)。圖8B係顯示進行藥劑處置的3日後的HGB值的結果，顯示結合GalNAc的TfR2 siRNA與ActRIIB-Fc之併用效果。於進行藥劑處置的9日後(第9日)，在異氟烷麻醉下進行腹大靜脈內採血，使用多項目自動血球分析裝置XT2000 (Sysmex股份有限公司製)測定HGB值、MCH值、血容比(HCT)值、及紅血球(RBC)數。各自之結果係示於圖8D至圖8G(平均值±標準誤差)。又，藉由放血處置將小鼠安樂死後，採集肝臟，測定mTfR2之mRNA表現量。RNA之萃取及定量的PCR係如試驗例5所記載地實施。mTfR2之mRNA表現量係以為持家基因的mActb之mRNA表現量進行正規化。mTfR2之mRNA表現量的結果係示於圖8C。作為將未誘導骨髓功能低下的對照組中的mRNA量設為1.0時之相對值，算出其他組中的相對mRNA量而標記(平均值±標準誤差)。
此等之結果顯示下述的可能性，藉由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置而抑制TfR2之mRNA表現量，藉此使HGB值上升，可對於伴隨骨髓功能不全的貧血、例如伴隨骨髓纖維化的貧血等之貧血疾病提供治療效果。又，顯示下述的可能性，藉由結合GalNAc的TfR2 siRNA與羅特西普之併用投予，可對於例如伴隨骨髓纖維化的貧血等之貧血疾病提供比單劑更大的治療效果。
試驗例7：伴隨炎症的貧血模式小鼠中的結合GalNAc的TfR2 siRNA之藥效評價試驗 使用AD47882.5G(實施例131)、AD47882.23G(實施例132)、AD47882.23sG(實施例133)、AD47882.23DUG (實施例171)、及AD47882.23sDUG(實施例172)之化合物作為結合有GalNAc的TfR2 siRNA而進行以下之實驗。將各結合GalNAc的TfR2 siRNA以1 mg/kg (1mpk)之用量，對雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)投予1次(第0日)。作為媒劑組，皮下投予PBS。以siRNA或PBS進行處置，5日後(第5日)，將松節油(turpentine)以150μL/小鼠進行皮下投予而誘導炎症。作為未誘導炎症的對照組(control)，代替松節油而將PBS進行s.c.投予。在本試驗中，設為n=5/組。投予第1次之松節油而於2日後(第7日)測定血漿中鐵濃度及血漿中鐵調素濃度。血漿中鐵濃度係使用Metallo Assay Iron Assay kit (Metallogenics公司製)而測定。血漿中鐵調素濃度係使用LC/MS而測定。結果係各自示於圖9A及圖9B。
投予第1次之松節油而於6日後(第11日)再次將松節油以150μL/小鼠進行皮下投予。投予第2次之松節油而於2日後(第13日)在異氟烷麻醉下進行腹大靜脈內採血，使用多項目自動血球分析裝置XT2000 (Sysmex股份有限公司製)而測定HGB值、MCH值、RBC數。結果係各自示於圖9C至圖9E。又，藉由放血處置將小鼠安樂死後，採集肝臟，測定mTfR2之mRNA表現量。RNA之萃取及定量的PCR係如試驗例5所記載地實施。mTfR2之mRNA表現量係以為持家基因的mActb之mRNA表現量進行正規化。mTfR2之mRNA表現量之結果係示於圖9F。作為將未誘導炎症的對照組中的mRNA量設為1.0時之相對值，算出其他組中的相對mRNA量而標記(平均值±標準誤差)。
此等之結果顯示下述的可能性，藉由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置而抑制TfR2之mRNA表現量，藉此使HGB值上升，可對於伴隨炎症的貧血、例如伴隨慢性腎臟病的貧血或癌性貧血等之貧血疾病提供治療效果。
試驗例8：伴隨炎症的貧血模式小鼠中的結合GalNAc的TfR2 siRNA之藥效評價試驗 使用AD47882.41DUG(實施例173)、AD47882.88DUG(實施例174)、AD47882.89DUG(實施例175)、AD47882.91DUG(實施例176)、AD47882.92DUG (實施例177)、及AD47882.93DUG(實施例178)作為結合有GalNAc的TfR2 siRNA而進行以下之實驗。將各結合GalNAc的TfR2 siRNA以1 mg/kg (1mpk)之用量對雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)進行1次投予(第0日)。作為媒劑組，將PBS進行皮下投予。以siRNA或PBS進行處置，於4日後(第4日)將松節油以150μL/小鼠進行皮下投予而誘導炎症。作為未誘導炎症的對照組(control)，代替松節油而將PBS進行s.c.投予。在本試驗中設為n=5/組。投予第1次之松節油而於2日後(第6日)測定血漿中鐵濃度。血漿中鐵濃度係使用Metallo Assay Iron Assay kit (Metallogenics公司製)進行測定。結果係各自示於圖10A。
投予第1次之松節油而於7日後(第11日)再次將松節油以150μL/小鼠進行皮下投予。投予第2次之松節油而於3日後(第14日)在異氟烷麻醉下進行腹大靜脈內採血，使用多項目自動血球分析裝置XT2000 (Sysmex股份有限公司製)而測定HGB值、MCH值、RBC數。結果係各自示於圖10B至10D。又，藉由放血處置將小鼠安樂死後，採集肝臟，測定mTfR2之mRNA表現量。RNA之萃取及定量的PCR係如試驗例5所記載地實施。mTfR2之mRNA表現量係以為持家基因的mActb之mRNA表現量進行正規化。mTfR2之mRNA表現量之結果係示於圖10E。作為將未誘導炎症的對照組中的mRNA量設為1.0時之相對值，算出其他組中的相對mRNA量而標記(平均值±標準誤差)。
此等之結果顯示下述的可能性，藉由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置而抑制TfR2之mRNA表現量，藉此使HGB值上升，對於伴隨炎症的貧血、例如伴隨慢性腎臟病的貧血或癌性貧血等之貧血疾病可提供治療效果。
試驗例9：對於HepG2細胞的TfR2 siRNA之利用反向轉染法的篩選 以與試驗例2同樣之方法，作為siRNA，使用TfR2-019.94DUG(實施例169)、TfR2-019.94DUG.s1(實施例180)、TfR2-019.94DUG.s2(實施例181)、TfR2-019.94DUG.e1(實施例182)、TfR2-019.94DUG.e2(實施例183)、及TfR2-019.94DUG.e3(實施例184)，對於hTfR2之mRNA表現量進行試驗。作為將陰性對照(NT)中的hTfR2 mRNA表現量設為1.0時之相對值，算出以各siRNA處置的檢體之相對hTfR2 mRNA表現量而標記。結果係示於以下之表24。
[表24-1]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
19.94DUG 0.001 0.97
0.01 0.58
0.1 0.26
1 0.05
10 0.03
19.94DUG.s1 0.001 1.13
0.01 0.48
0.1 0.17
1 0.07
10 0.02
19.94DUG.s2 0.001 1.02
0.01 0.53
0.1 0.26
1 0.08
10 0.04
19.94DUG.e1 0.001 0.92
0.01 0.40
0.1 0.20
1 0.06
10 0.02
19.94DUG.e2 0.001 0.89
0.01 0.51
0.1 0.21
1 0.08
10 0.04
[表24-2]
化合物名稱 濃度(nM) 相對值
NT - 1.00
19.94DUG 0.001 0.86
0.01 0.63
0.1 0.30
1 0.10
10 0.06
19.94DUG e3 0.001 0.99
0.01 0.60
0.1 0.27
1 0.09
10 0.03
試驗例10：正常小鼠中的結合GalNAc的TfR2 siRNA之藥效評價試驗 使用AD47882.5G(實施例131)及AD47882.94DUG (實施例179)作為結合有GalNAc的siRNA，而進行以下之實驗。作為結合有GalNAc的siRNA，將AD47882.5G以10 mg/kg (10mpk)或3 mg/kg (3mpk)或1 mg/kg (1mpk)之用量，對雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)進行皮下投予(s.c.) (n=5/組)。作為媒劑組，將PBS進行皮下投予(n=5/組)。siRNA或PBS之處置前(第0日)、進行處置的7日後(第7日)、21日後(第21日)、28日後(第28日)，進行尾靜脈採血，使用Metallo Assay Iron Assay kit (Metallogenics公司製)測定血漿中鐵濃度。將血漿中鐵濃度之結果示於圖13A(平均值±標準誤差)。
作為結合有GalNAc的siRNA，將AD47882.94DUG以3 mg/kg (3mpk)或1 mg/kg (1mpk)或0.3 mg/kg (0.3mpk)之用量，對雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)進行皮下投予(s.c.) (n=5/組)。作為媒劑組，將PBS進行皮下投予(n=5/組)。在siRNA或PBS之處置前(第0日)、進行處置的7日後(第7日)、21日後(第21日)、28日後(第28日)，進行尾靜脈採血，使用Metallo Assay Iron Assay kit (Metallogenics公司製)測定血漿中鐵濃度。將血漿中鐵濃度之結果示於圖13B(平均值±標準誤差)。
此結果顯示，特別是AD47882.94DUG在活體內穩定地抑制TfR2之mRNA表現量，使血漿中鐵濃度上升。又同樣地，各自以AD47882.88DUG(實施例174之化合物)、AD47882.89DUG(實施例175之化合物)、AD47882.91DUG(實施例176之化合物)、AD47882.92DUG(實施例177之化合物)、AD47882.93DUG(實施例178之化合物)、AD47882.71DUG(對於AD47882.88DUG之化合物施予71型之修飾型式而成的化合物)、AD47882.80DUG(對於AD47882.88DUG之化合物施予80型之修飾型式而成的化合物)、或AD47882.90DUG(對於AD47882.88DUG之化合物施予90型之修飾型式而成的化合物)對正常小鼠進行處置的其他試驗中，確認到進行處置的28日後的血漿中鐵濃度上升。由此等之結果暗示，藉由對於標的序列不同的TfR2 siRNA施予與此等化合物同樣之修飾型式，可獲得可穩定地抑制TfR2之mRNA表現量，使血漿中鐵濃度上升的siRNA。
試驗例11：伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中的結合GalNAc的TfR2 siRNA之藥效評價試驗 作為結合有GalNAc的TfR2 siRNA，使用AD47882.23DUG(實施例171)及AD47882.94DUG(實施例179)而進行以下之實驗。為了誘發骨髓功能低下，將100 mg/kg之卡鉑對雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)進行腹腔內投予(i.p.)。基於投予卡鉑的4日後之HGB值及血漿中鐵濃度分組後，進行藥劑處置(n=6/組)。結合GalNAc的TfR2 siRNA處置組係以3 mg/kg (3mpk)之用量進行1次皮下投予(s.c.)。作為媒劑組，將PBS進行1次皮下投予。
在進行藥劑處置前(第0日)，進行尾靜脈採血，使用QuantiChrom Whole Blood HB kit (Bioassay Systems公司製)測定HGB值。藥劑處置前之HGB值之結果係示於圖14A(平均值±標準誤差)。又，血漿中鐵濃度係使用Metallo Assay Iron Assay kit (Metallogenics公司製)而測定。藥劑處置前之血漿中鐵濃度之結果係示於圖14B(平均值±標準誤差)。圖14C係顯示進行藥劑處置的8日後(第8日)中的血漿中鐵濃度的結果。進行藥劑處置的9日後(第9日)，在異氟烷麻醉下進行腹大靜脈內採血，使用多項目自動血球分析裝置XT2000 (Sysmex股份有限公司製)而測定HGB值、MCH值、RBC數。各自之結果係示於圖14D至圖14F(平均值±標準誤差)。
此等之結果顯示下述的可能性，藉由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置而使血漿中鐵濃度上升，藉此使HGB值上升，對於伴隨骨髓功能不全的貧血、例如伴隨骨髓纖維化的貧血等之貧血疾病可提供治療效果。
試驗例12：伴隨炎症的貧血模式小鼠中的結合GalNAc的TfR2 siRNA之藥效評價試驗 作為結合有GalNAc的TfR2 siRNA，使用AD47882.92DUG(實施例177)及AD47882.94DUG(實施例179)進行以下之實驗。為了誘發炎症，將松節油以150μL/小鼠且每週3次，對雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)進行皮下投予(s.c.)。就未誘導炎症的對照組(control)而言，代替松節油而將PBS進行皮下投予。投予第1次之松節油而於7日後(第0日)進行尾靜脈採血，測定血漿中鐵濃度及HGB值。血漿中鐵濃度係使用Metallo Assay Iron Assay kit (Metallogenics公司製)進行測定。又，HGB值係使用QuantiChrom Whole Blood HB kit (Bioassay Systems公司製)進行測定。結果係各自示於圖15A及圖15B(平均值±標準誤差)。藥劑係對雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)進行投予(n=5/組)。結合GalNAc的TfR2 siRNA處置組係以3 mg/kg (3mpk)之用量進行1次皮下投予。作為媒劑組，將PBS進行1次皮下投予。
在進行藥劑處置的4日後(第4日)、進行處置的8日後(第8日)，進行尾靜脈採血，使用Metallo Assay Iron Assay kit (Metallogenics公司製)測定血漿中鐵濃度。結果示於圖15A(平均值±標準誤差)。又，進行藥劑處置的8日後，在異氟烷麻醉下進行腹大靜脈內採血，使用多項目自動血球分析裝置XT2000 (Sysmex股份有限公司製)而測定HGB值、MCH值、RBC數。各自之結果係示於圖15C至圖15E(平均值±標準誤差)。又，將小鼠在異氟烷麻醉下藉由放血處置而安樂死後，採集肝臟，測定mTfR2之mRNA表現量。RNA之萃取及定量的PCR係如試驗例5所記載地實施。mTfR2之mRNA表現量係以為持家基因的mActb之mRNA表現量進行正規化。mTfR2之mRNA表現量之結果係示於圖15F。作為將未誘導炎症的對照組中的mRNA量設為1.0時之相對值，算出其他組中的相對mRNA量而標記(平均值±標準誤差)。
此等之結果顯示下述的可能性，藉由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置而抑制TfR2之mRNA表現量，藉此使HGB值上升，對於伴隨炎症的貧血、例如伴隨慢性腎臟病的貧血或癌性貧血等之貧血疾病可提供治療效果。
試驗例13：NUP98-HOXD13小鼠中的結合GalNAc的TfR2 siRNA之藥效評價試驗 作為具有所謂無效造血(ineffective erythropoiesis)及不充分的紅血球分化成熟的特徵之骨髓化生不良症候群(Myelodysplastic syndrome，MDS)之模式小鼠，已知有NUP98-HOXD13小鼠(C57BL/6-Tg(Vav1-NUP98/HOXD13) G2Apla/J) (Nature Medicine volume 20, pages408-414 (2014))。為了驗證TfR2 siRNA對於MDS的治療效果，進行結合有GalNAc的TfR2 siRNA對於NUP98-HOXD13小鼠之投予試驗。化合物係使用AD47882.23DUG(實施例171)。
NUP98-HOXD13小鼠係購自Jackson Laboratory Japan股份有限公司而使用於實驗。基於4個月齡之NUP98-HOXD13小鼠中的血漿中鐵濃度與HGB值與體重值進行分組後，進行藥劑處置(n=8/組)。結合GalNAc的TfR2 siRNA處置組係以5 mg/kg (5mpk)之用量進行1週1次皮下投予(s.c.)。就媒劑組而言，將PBS進行1週1次皮下投予。
開始藥劑處置的2週後、4週後、及8週後進行尾靜脈採血，使用Metallo Assay Iron Assay kit (Metallogenics公司製)而測定血漿中鐵濃度。結果係示於圖16A(平均值±標準誤差)。又，開始藥劑處置的2週後、4週後、6週後、及8週後進行尾靜脈採血，使用QuantiChrom Whole Blood HB kit (Bioassay Systems公司製)測定HGB值。結果係示於圖16B(平均值±標準誤差)。又，開始藥劑處置的8週後，在異氟烷麻醉下進行腹大靜脈內採血，使用多項目自動血球分析裝置XT2000 (Sysmex股份有限公司製)而測定HGB值、MCH值、RBC數。各自之結果係示於圖16C至圖16E(平均值±標準誤差)。又，將小鼠在異氟烷麻醉下藉由放血處置而安樂死後，採集肝臟，測定mTfR2之mRNA表現量。RNA之萃取及定量的PCR係如試驗例5所記載地實施。mTfR2之mRNA表現量係以為持家基因的mActb之mRNA表現量進行正規化。mTfR2之mRNA表現量之結果係示於圖16F。作為將媒劑組中的mRNA量設為1.0時之相對值，算出其他組中的相對mRNA量而標記(平均值±標準誤差)。
此等之結果顯示下述的可能性，藉由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置而抑制TfR2之mRNA表現量，藉此使血漿中鐵濃度上升，其結果，藉由使HGB值上升，而對於為伴隨骨髓功能低下的貧血疾病之1種的MDS可提供治療效果。
試驗例14：伴隨慢性腎臟病的貧血模式小鼠中的結合GalNAc的TfR2 siRNA之藥效評價試驗 作為結合有GalNAc的TfR2 siRNA，使用AD47882.94DUG(實施例179)之化合物而進行以下之實驗。為了誘發慢性腎臟病與伴隨其的貧血，將以腺嘌呤(WAKO公司製品，010-11513)成為0.2%含量的方式製備的餌給予雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)。以0.2%腺嘌呤食物進行介入，而於2週後進行尾靜脈採血，測定血漿中鐵濃度及HGB值。血漿中鐵濃度係使用Metallo Assay Iron Assay kit (Metallogenics公司製)進行測定。又，HGB值係使用QuantiChrom Whole Blood HB kit (Bioassay Systems公司製)進行測定。結果係各自示於圖17A及圖17B(平均值±標準誤差)。基於此等之血漿中鐵濃度、HGB值及體重值分組後，進行藥劑處置(n=6/組)。結合GalNAc的TfR2 siRNA處置組係以3 mg/kg (3mpk)或1 mg/kg (1mpk)或0.3 mg/kg (0.3mpk)之用量進行1週1次皮下投予。就媒劑組而言，將PBS進行1週1次皮下投予。作為未誘導伴隨慢性腎臟病的貧血的對照組(control)，給予不含有0.2%腺嘌呤的餌。
開始藥劑處置的6週後進行尾靜脈採血，使用Metallo Assay Iron Assay kit (Metallogenics公司製)測定血漿中鐵濃度。結果示於圖17C(平均值±標準誤差)。又，開始藥劑處置的6週後在異氟烷麻醉下進行腹大靜脈內採血，使用採取的血液，使用多項目自動血球分析裝置XT2000 (Sysmex股份有限公司製)而測定HGB值、MCH值、RBC數。各別之結果係示於圖17D至圖17F(平均值±標準誤差)。又，將小鼠在異氟烷麻醉下藉由放血處置而安樂死後，採集肝臟，測定mTfR2之mRNA表現量。RNA之萃取及定量的PCR係如試驗例5所記載地實施。mTfR2之mRNA表現量係以為持家基因的mActb之mRNA表現量進行正規化。mTfR2之mRNA表現量之結果係示於圖17G。作為將媒劑組中的mRNA量設為1.0時之相對值，算出其他組中的相對mRNA量而標記(平均值±標準誤差)。
此等之結果顯示下述的可能性，藉由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置而抑制TfR2之mRNA表現量，藉此使血漿中鐵濃度及HGB值上升，對於伴隨慢性腎臟病的貧血可提供治療效果。
試驗例15：伴隨魯索利替尼(JAK1/JAK2抑制劑)投予之貧血模式小鼠中的結合GalNAc的TfR2 siRNA之藥效評價試驗 為了驗證TfR2 siRNA對於由魯索利替尼投予所致的貧血之效果，作為結合有GalNAc的TfR2 siRNA，使用AD47882.23DUG(實施例171)之化合物進行以下之實驗。
為了誘發由魯索利替尼投予所致的貧血，將以成為0.1%魯索利替尼(LC Laboratories公司製品 R-6688)含量的方式製備的餌給予雄性之C57BL/6NJcl小鼠(CLEA Japan公司製)。以含有0.1%魯索利替尼的食物進行介入，而於6週後進行尾靜脈採血，使用多項目自動血球分析裝置XT2000 (Sysmex股份有限公司製)而測定HGB值。結果示於圖18A(平均值±標準誤差)。基於此等之HGB值及體重值進行分組後，進行藥劑處置(n=5/組)。結合GalNAc的TfR2 siRNA處置組係以3 mg/kg (3mpk)之用量進行1週1次皮下投予(s.c.)。作為媒劑組，將PBS進行1週1次皮下投予。作為未誘導由魯索利替尼所致的貧血的對照組(control)，給予不含有0.1%魯索利替尼的餌。
開始藥劑處置的3週後進行尾靜脈採血，使用Metallo Assay Iron Assay kit (Metallogenics公司製)測定血漿中鐵濃度。結果示於圖18B(平均值±標準誤差)。又，開始藥劑處置的6週後，在異氟烷麻醉下進行腹大靜脈內採血，使用採取的血液，藉由多項目自動血球分析裝置XT2000 (Sysmex股份有限公司製)測定HGB值、MCH值、RBC數。各自之結果係示於圖18C至圖18E(平均值±標準誤差)。又，將小鼠在異氟烷麻醉下藉由放血處置而安樂死後，採集肝臟，測定mTfR2之mRNA表現量。RNA之萃取及定量的PCR係如試驗例5所記載地實施。mTfR2之mRNA表現量係以為持家基因的mActb之mRNA表現量進行正規化。mTfR2之mRNA表現量之結果係示於圖18F。作為將未給予含有0.1%魯索利替尼的餌的對照組中的mRNA量設為1.0時之相對值，算出其他組中的相對mRNA量而標記(平均值±標準誤差)。
此等之結果顯示可提供骨髓纖維化之治療中的魯索利替尼等之JAK2抑制劑與TfR2 siRNA之併用效果的可能性。
試驗例16：人類TfR2發現小鼠中的結合GalNAc的TfR2 siRNA之藥效評價試驗 使用於特殊免疫研究所股份有限公司作出之具有人類TfR2基因座的雄性或雌性之TfR2人源化小鼠，為了驗証結合GalNAc的TfR2 siRNA針對人類TfR2 mRNA的效果，進行以下之實驗。TfR2人源化小鼠係使用內包人類TFR2基因座的BAC(人造細菌染色體(bacterial artificial chromosome))殖株(RP11-264N5)而作出。作為結合有GalNAc的TfR2 siRNA，使用TfR2-019.88DUG(實施例162之化合物)、TfR2-019.92DUG(實施例167之化合物)、TfR2-019.93DUG(實施例168之化合物)、TfR2-019.94DUG(實施例169之化合物)。
結合GalNAc的TfR2 siRNA處置組係以3 mg/kg (3mpk)或0.3 mg/kg (0.3mpk)之用量進行1次皮下投予(s.c.) (n=3/組)。作為媒劑組，將PBS進行1次皮下投予(n=4/組)。
於開始藥劑處置的7日後，在異氟烷麻醉下藉由放血處置將小鼠安樂死後，採集肝臟，測定hTfR2之mRNA表現量。RNA之萃取及定量的PCR係如試驗例5所記載地實施。hTfR2之mRNA表現量係以為持家基因的mActb之mRNA表現量進行正規化。針對hTfR2的引子係使用試驗例1及試驗例2記載者。hTfR2之mRNA表現量之結果係示於圖19。作為將媒劑組中的mRNA量設為1.0時之相對值，算出其他組中的相對mRNA量而標記(平均值±標準誤差)。
此等之結果顯示，藉由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置，可抑制人類TfR2 mRNA之表現量。又，顯示下述的可能性，藉由抑制人類TfR2 mRNA之表現量，而使HGB值上升，對於伴隨骨髓功能不全的貧血、例如伴隨骨髓纖維化的貧血等之貧血疾病，以及對於伴隨炎症的貧血、例如伴隨慢性腎臟病的貧血等之貧血疾病，可提供治療效果。又，對從人類TfR2表現小鼠進一步剔除(knockout)內源性小鼠TfR2的小鼠以TfR2-019.94DUG(實施例169)進行處置的其他試驗中，即使42日後人類TfR2基因之表現亦被抑制，確認到TfR2-019.94DUG之穩定的人類TfR2基因表現抑制效果。
試驗例17：使用人類原代肝臟細胞的結合GalNAc的TfR2 siRNA之藥效評價試驗 已知結合有GalNAc的siRNA係透過在肝臟肝細胞上表現的ASGPR(去唾液酸糖蛋白受體1 (asialoglycoprotein receptor 1))而被攝入至肝臟。因此，為了驗證在不使用轉染試藥的條件下的結合GalNAc的TfR2 siRNA之效果，使用人類原代肝臟細胞而進行結合GalNAc的TfR2 siRNA之藥效評價試驗。作為結合有GalNAc的TfR2 siRNA，使用TfR2-019.88DUG(實施例162)、TfR2-019.89DUG(實施例163)、TfR2-019.90DUG(實施例164)、TfR2-019.91DUG(實施例166)、TfR2-019.92DUG(實施例167)、TfR2-019.93DUG(實施例168)、TfR2-019.94DUG(實施例169)、TfR2-019.95DUG(實施例170)之化合物。
(人類原代肝臟細胞之培養) 將於液氮罐保存的人類原代肝臟細胞(LIFE TECHNOLOGIES公司製品，HMCPIS)，使用37℃之溫浴進行融解，注入至預先在37℃加溫的10 mL之Cryopreserved Hepatocytes Recovery Medium (CHRM) (LIFE TECHNOLOGIES公司製品，CM7000)並倒轉混合。之後，進行離心(100g、10分鐘)，去除上清液後，使用預先在37℃加溫5 mL之細胞接種用培養基而製備細胞懸浮液。細胞接種用培養基係藉由對William’s Medium E (LIFE TECHNOLOGIES公司製品，A1217601)添加Hepatocyte Plating Supplement Pack (LIFE TECHNOLOGIES公司製品，CM3000)而製備。之後，計數活細胞數，使用細胞接種用培養基而製備成5x10 5個細胞/mL，於膠原蛋白塗被之96孔盤中每1孔，以成為5x10 4個細胞的方式接種細胞，在CO 2培養箱中培養4～6小時，使用顯微鏡確認到細胞附著於盤。之後，進行結合GalNAc的TfR2 siRNA之添加實驗。
(結合GalNAc的TfR2 siRNA之添加) 使用預先在37℃加溫的細胞培養用培養基而製備包含結合GalNAc的TfR2 siRNA的培養基。製備siRNA檢體每1種類2孔份、以蒸餾水代替siRNA的陰性對照(NT) 2孔份。就siRNA之最終濃度而言，在10000nM至4.8nM為止的範圍，以成為5倍公比的方式製備。細胞培養用培養基係藉由對William’s Medium E (LIFE TECHNOLOGIES公司製品，A1217601)添加Hepatocyte Maintenance Supplement Pack (LIFE TECHNOLOGIES公司製品，CM4000)而製備。將接種於96孔盤的人類原代肝臟細胞之各個孔中的細胞接種用培養基吸除後，各添加100μL之製備的含有結合GalNAc的TfR2 siRNA的培養基。添加化合物而於3日後使用PBS將細胞洗淨1次，進行RNA的萃取。
(RNA萃取、qPCR) RNA之萃取及定量的PCR係如試驗例1所記載地實施。測定作為2孔間之平均值的hTfR2與h18S之mRNA表現量。hTfR2之mRNA表現量係以為持家基因的h18S之mRNA表現量進行正規化。作為將陰性對照(NT)中的hTfR2 mRNA表現量設為1.0時之相對值，算出以各siRNA處置的檢體之相對hTfR2 mRNA表現量而標記(平均值±標準誤差)。結果係各自示於圖20A～圖20C。
此等之結果顯示，藉由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置，而被攝入至人類肝臟肝細胞，藉此可抑制人類TfR2 mRNA之表現量。又，顯示下述的可能性，藉由抑制人類TfR2 mRNA表現量，而使HGB值上升，對於伴隨骨髓功能不全的貧血、例如伴隨骨髓纖維化的貧血等之貧血疾病，以及對於伴隨炎症的貧血、例如伴隨慢性腎臟病的貧血等之貧血疾病，可提供治療效果。
試驗例18：使用HepG2細胞的TfR2 siRNA對於鐵調素基因表現的效果 以與試驗例2同樣之方法，使用反向轉染法，將siRNA導入至HepG2細胞，2日後進行鐵調素之mRNA表現量的評價。針對鐵調素的引子係使用Hs00221783-m1 (Thermo Fisher Scientific公司製)。作為siRNA，使用TfR2-019(實施例19)、TfR2-039(實施例39)、TfR2-019.94DUG(實施例169)、TfR2-039.23DUG(實施例144)。
關於鐵調素mRNA表現量之評價，作為將陰性對照(NT)中的鐵調素mRNA表現量設為1.0時之相對值，算出以各siRNA處置的檢體之相對鐵調素mRNA表現量而標記。結果示於圖21。 [產業上利用之可能性]
本發明之siRNA可抑制TfR2 mRNA之表現，並進一步可抑制在鐵代謝中負責中心任務的鐵調素之產生。本發明之siRNA對於治療或預防藉由抑制TfR2 mRNA之表現及/或鐵調素之產生而可治療或預防的疾病係有用的。 [序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1：hTfR2 mRNA之核苷酸序列  序列識別號2～24：單股寡核苷酸之核苷酸序列  序列識別號25～28：雙股寡核苷酸之有義股區域之核苷酸序列  序列序列識別號29～35：雙股寡核苷酸之反義股區域之核苷酸序列  序列識別號36、37：雙股寡核苷酸之有義股區域之核苷酸序列  序列識別號38～42：雙股寡核苷酸之反義股區域之核苷酸序列  序列識別號43：TfR2-019中的有義股區域之互補區域之核苷酸序列  序列識別號44：TfR2-019中的反義股區域之互補區域之核苷酸序列  序列識別號45：TfR2-039中的有義股區域之互補區域之核苷酸序列  序列識別號46：TfR2-039中的反義股區域之互補區域之核苷酸序列  序列識別號47：雙股寡核苷酸之有義股區域之核苷酸序列
無
圖1係顯示雙股siRNA之修飾型式的圖。圖中，黑色圓圈表示2’-O-甲基RNA，白色圓圈表示2’-去氧-2’-氟RNA，黑色三角形表示DNA，白色三角形表示3’-O-甲基RNA，白色菱形表示ENA，黑色菱形表示RNA，內有垂直條的白色圓圈表示LNA，內有橫條的白色圓圈表示2’-O-甲氧基乙基RNA，連接符號與符號的線表示磷酸二酯鍵，於連接符號與符號的線上記載「s」的情形表示硫代磷酸酯鍵。圖中，上部的股表示有義股(或過客股(passenger strand))，有義股的左側末端表示5’末端，右側末端表示3’末端。下部的股表示反義股(或引導股(guide strand))，反義股的右側末端表示5’末端，左側末端表示3’末端。各siRNA以NNN-xxx表示，NNN-xxx之後所記載的數字與字母表示圖1至6記載之修飾型式的縮寫。  圖2係顯示雙股siRNA中的反義股之A 14為DNA或RNA的情形之修飾型式的圖。各記號、配置、修飾等係以與圖1相同的樣式表示。  圖3係顯示雙股siRNA中的反義股之A 8及A 9為2’-去氧-2’-氟RNA的情形之修飾型式的圖。各記號、配置、修飾等係以與圖1相同的樣式表示。  圖4係顯示雙股siRNA中的反義股之A 14為ENA的情形之修飾型式的圖。各記號、配置、修飾等係以與圖1相同的樣式表示。  圖5係顯示雙股siRNA中的反義股之A 8及A 9為2’-去氧-2’-氟RNA且反義股之A 13為ENA的情形之修飾型式的圖。各記號、配置、修飾等係以與圖1相同的樣式表示。  圖6係顯示雙股siRNA中的反義股之A 8為2’-O-甲基RNA及A 9為2’-去氧-2’-氟RNA的情形之修飾型式的圖。各記號、配置、修飾等係以與圖1相同的樣式表示。  圖7中圖7A係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中由包覆有TfR2 siRNA的核酸脂質粒子之處置所致的血漿中鐵濃度之推移的圖。圖7B係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中由LNP包覆的TfR2 siRNA之處置所致的血漿中鐵調素濃度之推移的圖。圖7C係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中由LNP包覆的TfR2 siRNA之處置所致的血紅素值(hemoglobin，HGB)之推移的圖。圖7D係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中由LNP包覆的TfR2 siRNA之處置所致的平均血球血紅素量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)值的圖。圖7E係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中由LNP包覆的TfR2 siRNA之處置所致的肝臟Tfr2 (mTfr2) mRNA表現量的圖。圖7F係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中由LNP包覆的TfR2 siRNA之處置所致的肝臟鐵調素(mHepcidin) mRNA表現量的圖。  圖8-1中圖8A係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA (GalNAc-conjugated TfR2 siRNA)之處置所致的HGB值之推移的圖。圖8B係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中進行藥劑處置的3日後之HGB值的圖。圖8C係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的肝臟mTfR2 mRNA表現量的圖。圖8D係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的HGB值的圖。  圖8-2中圖8E係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的MCH值的圖。圖8F係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的血容比(HCT)值的圖。圖8G係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的紅血球(RBC)數的圖。  圖9中圖9A係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的血漿中鐵濃度的圖。圖9B係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的血漿中鐵調素濃度的圖。圖9C係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的HGB值的圖。圖9D係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的MCH值的圖。圖9E係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的RBC數的圖。圖9F係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的肝臟mTfR2 mRNA表現量的圖。  圖10中圖10A係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的血漿中鐵濃度的圖。圖10B係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的HGB值的圖。圖10C係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的MCH值的圖。圖10D係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的RBC數的圖。圖10E係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的肝臟mTfR2 mRNA表現量的圖。  圖11係顯示HepG2細胞中的siRNA之細胞毒性評價結果的圖。  圖12係顯示HepG2細胞中的siRNA之hTfR2減弱活性的圖。  圖13係顯示正常小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的血漿中鐵濃度之推移的圖。  圖14中圖14A係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置前的HGB值的圖。圖14B係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置前的血漿中鐵濃度的圖。圖14C係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中以結合GalNAc的TfR2 siRNA進行處置的8日後之血漿中鐵濃度的圖。圖14D係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中以結合GalNAc的TfR2 siRNA進行處置的9日後之HGB值的圖。圖14E係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中以結合GalNAc的TfR2 siRNA進行處置的9日後之MCH值的圖。圖14F係顯示伴隨骨髓功能低下的貧血模式小鼠中以結合GalNAc的TfR2 siRNA進行處置的9日後之RBC數的圖。  圖15中圖15A係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的血漿中鐵濃度之推移的圖。圖15B係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置前之HGB值的圖。圖15C係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中以結合GalNAc的TfR2 siRNA進行處置的8日後的HGB值的圖。圖15D係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中以結合GalNAc的TfR2 siRNA進行處置的8日後的MCH值的圖。圖15E係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中以結合GalNAc的TfR2 siRNA進行處置的8日後的RBC數的圖。圖15F係顯示伴隨炎症的貧血模式小鼠中以結合GalNAc的TfR2 siRNA進行處置的8日後的肝臟mTfR2 mRNA表現量的圖。  圖16中圖16A係顯示MDS模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的血漿中鐵濃度之推移的圖。圖16B係顯示MDS模式小鼠中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的HGB值之推移的圖。圖16C係顯示MDS模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的8週後的HGB值的圖。圖16D係顯示MDS模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的8週後的MCH值的圖。圖16E係顯示MDS模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的8週後的RBC數的圖。圖16F係顯示MDS模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的8週後的肝臟mTfR2 mRNA表現量的圖。  圖17-1中圖17A係顯示伴隨慢性腎臟病的貧血模式小鼠中結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置前的血漿中鐵濃度的圖。圖17B係顯示伴隨慢性腎臟病的貧血模式小鼠中結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置前的HGB值的圖。圖17C係顯示伴隨慢性腎臟病的貧血模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的6週後的血漿中鐵濃度的圖。圖17D係顯示伴隨慢性腎臟病的貧血模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的6週後的HGB值的圖。  圖17-2中圖17E係顯示伴隨慢性腎臟病的貧血模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的6週後的MCH值的圖。圖17F係顯示伴隨慢性腎臟病的貧血模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的6週後的RBC數的圖。圖17G係顯示伴隨慢性腎臟病的貧血模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的6週後的肝臟mTfR2 mRNA表現量的圖。  圖18中圖18A係顯示由魯索利替尼所致的貧血模式小鼠中結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置前的HGB值的圖。圖18B係顯示由魯索利替尼所致的貧血模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的3週後的血漿中鐵濃度的圖。圖18C係顯示由魯索利替尼所致的貧血模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的6週後的HGB值的圖。圖18D係顯示由魯索利替尼所致的貧血模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的6週後的MCH值的圖。圖18E係顯示由魯索利替尼所致的貧血模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的6週後的RBC數的圖。圖18F係顯示由魯索利替尼所致的貧血模式小鼠中開始結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置的6週後的肝臟mTfR2 mRNA表現量的圖。  圖19係顯示hTfR2 Tg小鼠中以結合GalNAc的TfR2 siRNA進行處置的7日後的肝臟hTfR2 mRNA表現量的圖。  圖20係顯示人類原代肝臟細胞中由結合GalNAc的TfR2 siRNA之處置所致的hTfR2 mRNA表現量的圖。  圖21中圖21A係顯示HepG2細胞中的TfR2-019及TfR2-039之鐵調素mRNA表現抑制活性的圖。圖21B係顯示HepG2細胞中的TfR2-019.94DUG及TfR2-039.23DUG之鐵調素mRNA表現抑制活性的圖。  圖22係顯示編碼人類運鐵蛋白受體2 (hTfR2)的基因之mRNA之鹼基序列(序列識別號1)的圖。底線之序列(第2847～2865號的序列)表示TfR2-019之標的序列，雙底線之序列(第1536～1554號之序列)表示TfR2-039之標的序列。
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無。

Claims (57)

  1. 一種寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其具有針對運鐵蛋白受體2之mRNA的減弱作用，且包含以下的(A)之反義股區域及(B)之有義股區域：  (A) 由18～31個鹼基長度所構成的反義股區域，其包含與由序列識別號1之核苷酸編號2845至2867、或核苷酸編號1534至1556之間的區域中連續的18～21個鹼基所構成的標的序列實質上互補的標的對應序列，且該標的對應序列之5’末端的核苷為與該標的序列之3’末端的核苷實質上互補的核苷、具有腺嘌呤的核苷、或具有尿嘧啶的核苷，在該標的對應序列之5’末端及/或3’末端可附加5個鹼基以下之外伸結構；及  (B) 由18～31個鹼基長度所構成的有義股區域，其含有與前述反義股區域之標的對應序列實質上互補的核苷酸序列，且進一步在該核苷酸序列之5’末端及/或3’末端可附加5個鹼基以下之外伸結構。
  2. 如請求項1之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述標的序列係由序列識別號1之核苷酸編號2847～2865、或核苷酸編號1536～1554之19個鹼基所構成的核苷酸序列。
  3. 如請求項1或2之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述反義股區域之標的對應序列中的5’末端之核苷為具有腺嘌呤或尿嘧啶的核苷。
  4. 如請求項1至3中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述反義股區域之標的對應序列係與由序列識別號1之核苷酸編號2847～2865、或核苷酸編號1536～1554之19個鹼基所構成的標的序列完全互補的核苷酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中構成寡核苷酸的糖及/或磷酸二酯鍵之至少1個被修飾。
  6. 如請求項5之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中構成寡核苷酸的糖為D-核呋喃糖，糖之修飾為D-核呋喃糖之2’位的羥基之修飾。
  7. 如請求項6之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中糖之修飾為D-核呋喃糖之2’-去氧化、2’-O-烷基化、2’-O-烷氧基烷基化、2’-鹵化、及/或2’-O,4’-C-伸烷基化。
  8. 如請求項7之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述2’-O-烷基化為2’-O-甲基化，前述2’-O-烷氧基烷基化為2’-O-甲氧基乙基化，前述2’-鹵化為2’-氟化，以及前述2’-O,4’-C-伸烷基化為2’-O,4’-C-亞甲基化及/或2’-O,4’-C-伸乙基化。
  9. 如請求項5至8中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中磷酸二酯鍵之修飾為硫代磷酸酯。
  10. 如請求項5至9中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中有義股區域及/或反義股區域之3’末端的核苷中的D-核呋喃糖經3’-O-烷基化。
  11. 如請求項10之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述3’-O-烷基化為3’-O-甲基化。
  12. 如請求項1至11中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中在有義股區域及/或反義股區域之5’末端及/或3’末端附加3個鹼基以下之外伸結構。
  13. 如請求項12之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中外伸結構為2個鹼基。
  14. 如請求項13之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中外伸結構為2個連續的包含胸腺嘧啶的核苷、或2個連續的包含尿嘧啶的核苷。
  15. 如請求項14之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中外伸結構為附加在反義股區域之3’末端的2個連續的U(M)。
  16. 如請求項1之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中有義股區域係由以下之式(I)表示的寡核苷酸所構成，反義股區域係由以下之式(II)表示的寡核苷酸所構成，進一步具有以下之(a)至(g)所示的特徵：  有義股區域：5’ S O5-S a-S 19-S 18-S 17-S 16-S 15-S 14-S 13-S 12-S 11-S 10-S 9-S 8-S 7-S 6-S 5-S 4-S 3-S 2-S 1-S O33’(I)  反義股區域：5’ A O5-A 1-A 2-A 3-A 4-A 5-A 6-A 7-A 8-A 9-A 10-A 11-A 12-A 13-A 14-A 15-A 16-A 17-A 18-A 19-A a-A O33’(II)  (a) S 1為3’-修飾核苷，S 2～S 19係表示1個核苷且各自獨立為2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，S a表示0～3個核苷且各自之核苷係獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，S O3及S O5係各自獨立表示0～3個核苷且各自之核苷係獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷；各核苷間之鍵結係表示可經化學修飾的磷酸二酯鍵；  (b) A 11、A 12、A 13、A 14及A 15係表示1個核苷，其中至少1個為DNA、RNA、2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷或2’-MOE RNA，其餘為2’-OMe RNA或2’-F RNA，A 1～A 10及A 16～A 19係表示1個核苷且各自獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，A a係表示0～3個核苷且各自之核苷係獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA或DNA，A O3及A O5係各自獨立表示0～3個核苷且各自之核苷係獨立表示2’-OMe RNA、2’-F RNA、DNA或2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷；各核苷間之鍵結係表示可經化學修飾的磷酸二酯鍵；  (c) A 2～A a之間的核苷酸序列係由與標的序列實質上互補的核苷酸序列所構成，A 1為具有與標的序列之對應的核苷互補的鹼基的核苷、具有腺嘌呤的核苷、具有胸腺嘧啶的核苷、或具有尿嘧啶的核苷，A O3與A O5存在的情形，該核苷酸序列係各自獨立為與標的序列之對應的核苷獨立地選擇的核苷酸序列；  (d) S 1～S a之間的核苷酸序列、與A 1～A a之間的核苷酸序列，係彼此實質上互補的核苷酸序列，且形成雙股結構；  (e) S O5與A O3兩者存在的情形，S O5與A O3係彼此不互補的核苷酸序列；  (f) S O3與A O5兩者存在的情形，S O3與A O5係彼此不互補的核苷酸序列；以及  (g) 有義股區域及/或反義股區域之5’末端之核苷的5’位及/或3’末端之核苷的3’位可經化學修飾，或者3’末端之核苷為3’-修飾核苷的情形，其2’位可經化學修飾。
  17. 如請求項16之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，S 1為3’-OMe RNA。
  18. 如請求項16或17之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷為LNA或ENA。
  19. 如請求項16至18中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 11、A 12、A 13、A 14及A 15之2個以上可相同或各自相異，為DNA、RNA、2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷或2’-MOE RNA。
  20. 如請求項19之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 14為RNA或2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷。
  21. 如請求項20之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 13為2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷或2’-OMe RNA，A 14為RNA。
  22. 如請求項21之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 11-A 12-A 13-A 14-A 15為以下之任一者：  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(ENA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-F RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(ENA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-F RNA)-A 13(ENA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(LNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-F RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(LNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-F RNA)-A 13(LNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-F RNA)-A 12(2’-OMe RNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)、或  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(2’-F RNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(RNA)-A 15(2’-OMe RNA)。
  23. 如請求項20之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 12為DNA，A 14為2’-O,4’-C-橋聯化修飾核苷。
  24. 如請求項23之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 11-A 12-A 13-A 14-A 15為以下之任一者：  A 11(2’-F RNA)-A 12(DNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(ENA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(DNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(ENA)-A 15(2’-OMe RNA)、  A 11(2’-F RNA)-A 12(DNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(LNA)-A 15(2’-OMe RNA)、或  A 11(2’-OMe RNA)-A 12(DNA)-A 13(2’-OMe RNA)-A 14(LNA)-A 15(2’-OMe RNA)。
  25. 如請求項16至24中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 2、A 6及A 16為2’-F RNA。
  26. 如請求項25之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，進一步選自由A 8、A 9及A 10所組成的群組的1或2個核苷為2’-F RNA，A 1、A 3～A 5、A 7、A 17～A 19及A a之核苷為2’-OMe RNA。
  27. 如請求項26之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中，A 2、A 6、A 8、A 10及A 16為2’-F RNA，A 1、A 3～A 5、A 7、A 9、A 17～A 19及A a之核苷為2’-OMe RNA。
  28. 如請求項16至27中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(I)中，S 11、S 12、S 13及S 15為2’-F RNA。
  29. 如請求項28之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(I)中，S 2～S 10、S 14、S 16～S 19及S a為2’-OMe RNA。
  30. 如請求項16至29中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中於式(II)中採用RNA的情形，該RNA與鄰接其3’側的核苷之間的鍵結為硫代磷酸酯鍵。
  31. 如請求項16至30中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中在前述寡核苷酸之從5’末端及3’末端起2～5個核苷酸中，各核苷間鍵結為硫代磷酸酯鍵。
  32. 如請求項16至31中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中S O3、S O5、A O5及A O3之核苷數為0～2。
  33. 如請求項32之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中S O3之核苷數為0。
  34. 如請求項33之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中S O3、S O5及A O5之核苷數為0，A O3之核苷數為2。
  35. 如請求項1至34中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述反義股區域及有義股區域係作為各自獨立的寡核苷酸而形成雙股寡核苷酸。
  36. 如請求項1至34中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述反義股區域之5’末端的核苷與有義股區域之3’末端的核苷係藉由連接子(linker)結構而連結。
  37. 如請求項36之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述連接子結構為下述式所表示的結構， [式中，虛線表示鍵結肢，與苯基鍵結的氧原子表示與鄰接的反義股區域之5’末端的核苷酸之5’-磷酸基作成磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵，另一者之末端的亞甲基表示與鄰接的有義股區域之3’末端的核苷酸之3’-磷酸基(3’位經修飾的核苷酸則為2’位的磷酸基)作成磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵]。
  38. 如請求項1至37中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中寡核苷酸之5’末端的核苷之5’位及/或3’末端之核苷的3’位經GalNAc單元進行化學修飾，或者3’末端之核苷為3’-修飾核苷的情形，其2’位經GalNAc單元進行化學修飾。
  39. 如請求項38之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中前述GalNAc單元為下式所表示的單元， [式中，虛線表示與鄰接的核苷酸之5’末端的磷酸基及/或3’末端的磷酸基(3’位經修飾的核苷酸則為2’位的磷酸基)作成磷酸二酯鍵]。
  40. 如請求項1之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中排除外伸結構的有義股區域為以下之式(I-1)，排除外伸結構的反義股區域為以下之式(II-1)～(II-10)之任一者，前述有義股區域及反義股區域係作為各自獨立的寡核苷酸而形成雙股寡核苷酸，前述有義股區域及前述反義股區域係各自獨立而可包含外伸結構，  (式)  5’ C(M)G(M)U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F)U (M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)A(M)A(3M) 3’ (I-1)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A (M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M) 3’ (II-1)  5’ U(M)U(F)G(M)A(F)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M) 3’ (II-2)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (F)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)G(M) 3’ (II-3)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(F)G(M) 3’ (II-4)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A (M)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M) 3’ (II-5)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (F)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M) 3’ (II-6)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(F)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M) 3’ (II-7)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(F)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M) 3’ (II-8)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M) 3’ (II-9)  5’ U(M)U(F)G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(F)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)G(M) 3’ (II-10)  [式中，關於核酸之鹼基，A表示腺嘌呤，U表示尿嘧啶，T表示胸腺嘧啶，G表示鳥糞嘌呤，C表示胞嘧啶(惟，C為ENA時，表示2’-O,4’-C-伸乙基橋聯-5-甲基胞苷)，關於核酸，(R)表示RNA，(D)表示DNA，(M)表示2’-OMe RNA，(3M)表示3’-OMe RNA，(F)表示2’-F RNA，(E)表示ENA；又，式中，「^」表示核苷間之鍵結為硫代磷酸酯鍵(-P(=S)(OH)-)，在未特別記載的情形，表示核苷間之鍵結為磷酸二酯鍵(-P(=O)(OH)-)，但即使在未特別記載的情形，有義股區域之從5’末端及3’末端起3個核苷中的2處核苷間鍵結、以及反義股區域之從5’末端起3個核苷中的2處核苷間鍵結及從3’末端起4個核苷中的3處核苷間鍵結亦為硫代磷酸酯鍵]。
  41. 如請求項40之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中在有義股區域及/或反義股區域之5’末端及/或3’末端附加3個鹼基以下之外伸結構。
  42. 如請求項41之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中外伸結構為2個鹼基。
  43. 如請求項42之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中外伸結構為2個連續的包含胸腺嘧啶的核苷、或2個連續的包含尿嘧啶的核苷。
  44. 如請求項43之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中外伸結構為附加在反義股區域之3’末端的2個連續的U(M)。
  45. 如請求項40至44中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中有義股區域之5’末端經以下之式所表示的GalNAc單元進行化學修飾， [式中，虛線表示與鄰接的有義股區域之5’末端的核苷酸之5’-磷酸基作成磷酸二酯鍵]。
  46. 如請求項1之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其中有義股區域為以下之式(I-2)，反義股區域為以下之式(II-11)～(II-20)之任一者，前述有義股區域及反義股區域係作為各自獨立的寡核苷酸而形成雙股寡核苷酸，  (式)  5’ GNC(M)^G(M)^U(M)G(M)G(F)A(M)G(F)U(F)U(F) U(M)C(M)A(M)A(M)U(M)A(M)U(M)C(M)^A(M)^A(3M) 3’ (I-2)  5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A (M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-11)  5’ U(M)^U(F)^G(M)A(F)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-12)  5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (F)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-13)  5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(D)C(M)T(E)C(M)C(F)A(M)C(F)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-14)  5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(F)G(F)A (M)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-15)  5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (F)A(M)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-16)  5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(F)A(M)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-17)  5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(F)C(E)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-18)  5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(F)A(M)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-19)  5’ U(M)^U(F)^G(M)A(M)U(M)A(F)U(M)U(M)G(F)A (M)A(M)A(F)C(M)U(R)^C(M)C(F)A(M)C(M)^G(M)^U(M)^U(M) 3’ (II-20)  [式中，「GN」表示下述式所表示的GalNAc單元， (式中，虛線表示與鄰接的有義股區域之5’末端的核苷酸之5’-磷酸基作成磷酸二酯鍵)，關於核酸之鹼基，A表示腺嘌呤，U表示尿嘧啶，T表示胸腺嘧啶，G表示鳥糞嘌呤，C表示胞嘧啶(惟，C為ENA時，表示2’-O,4’-C-伸乙基橋聯-5-甲基胞苷)，關於核酸，(R)表示RNA，(D)表示DNA，(M)表示2’-OMe RNA，(3M)表示3’-OMe RNA，(F)表示2’-F RNA，(E)表示ENA；又，式中，「^」表示核苷間之鍵結為硫代磷酸酯鍵(-P(=S)(OH)-)，在未特別記載的情形，表示核苷間之鍵結為磷酸二酯鍵(-P(=O)(OH)-)；有義股區域之3’末端的核苷酸之3’位、反義股區域之5’末端的核苷酸之5’位、及反義股區域之3’末端的核苷酸之3’位係各自為羥基]。
  47. 一種醫藥組成物，其含有如請求項1至46中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽作為有效成分。
  48. 如請求項47之醫藥組成物，其係用於治療或預防可藉由抑制運鐵蛋白受體2之表現而治療或預防的疾病。
  49. 如請求項48之醫藥組成物，其係用於預防或治療貧血。
  50. 如請求項49之醫藥組成物，其中貧血為伴隨慢性炎症的貧血或伴隨骨髓功能不全的貧血。
  51. 如請求項50之醫藥組成物，其中前述伴隨慢性炎症的貧血為伴隨自體免疫疾病的貧血、伴隨感染症的貧血、伴隨炎症性腸疾病的貧血、伴隨心臟衰竭的貧血、伴隨慢性腎臟病的貧血、癌性貧血、或伴隨卡斯爾曼氏病(Castleman disease)的貧血。
  52. 如請求項50之醫藥組成物，其中前述伴隨骨髓功能不全的貧血為伴隨骨髓纖維化的貧血、伴隨骨髓化生不良症候群的貧血、或伴隨慢性骨髓單核球白血病的貧血、伴隨由化學療法所致的骨髓抑制的貧血。
  53. 如請求項47至52之醫藥組成物，其以接受利用貧血治療藥、成為貧血之原因的疾病之治療藥、或血鐵沉積症治療藥的治療的患者為對象。
  54. 如請求項53之醫藥組成物，其中前述貧血治療藥、成為貧血之原因的疾病之治療藥、或血鐵沉積症治療藥為羅特西普(Luspatercept)或魯索利替尼(Ruxolitinib)。
  55. 一種治療或預防貧血之方法，其包含將如請求項1至46中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽之有效量投予至對象。
  56. 一種如請求項1至46中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽，其係用於治療或預防貧血之用途。
  57. 一種如請求項1至46中任一項之寡核苷酸或其藥學上可容許的鹽之用途，其係用於製造如請求項47至54中任一項之醫藥組成物。
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