JP5637849B2 - 2本鎖ポリヌクレオチド - Google Patents
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Description
polyI:polyCなどの2本鎖RNAは古くからインターフェロン誘導剤として知られており、そのメカニズムにはTLR3(Toll−like receptor 3)が関与している。siRNAもTLR3及びそのサブセットのTLR7、TLR8に認識され、インターフェロンやサイトカインを誘導することが知られている。特にGU配列、UGUGU配列、GUCCUUCAA配列を有するsiRNAに免疫応答が起こりやすいという報告がある(例えば、非特許文献39、40、41参照。)。また、DNAや2’−OMeRNAなどの化学修飾ヌクレオチドをsiRNAに導入するにより、これらの免疫応答を抑制できることが示されている(例えば、非特許文献41、42、43、43参照。)。
本発明者らは、RNA分解酵素に安定でしかも安価に合成可能なRNA干渉作用を有するポリヌクレオチドを取得すべく、鋭意研究を行ったところ、DNAと2’−O−メチルRNAを交互に組み合わせたオリゴヌクレオチドユニットを含む2本鎖ポリヌクレオチドが上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
(1)
以下の(a)乃至(d)からなる特徴を有する、式(I)に示されるポリヌクレオチド及び式(II)に示されるポリヌクレオチドからなる、2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩:
5’−X−(α−β)q−αp−λm−3’(I)
5’−δs−(α−β)r−Y−υn−3’(II)
(a)α及びβは異なってDNA又は2’−OMeRNAを示し、δ及びλは同一又は異なってDNA又は2’−OMeRNAを示し、υは同一又は異なってDNA、RNA及び2’−OMeRNAから選択されるいずれかのヌクレオチドを示し、X及びYはDNA、RNA及び修飾核酸から選択される同一又は異なる種類のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを示す;
(b)pは0又は1の整数を示し、mはpが0のときは0であり、pが1のときは0〜5のいずれかの整数を示す。qは3〜9のいずれかの整数を示し、(α−β)qとXの合計ヌクレオチド数は17乃至18である。sは0又は1の整数を示し、nは0〜5のいずれかの整数を示す。rは3〜9のいずれかの整数を示し、(α−β)rとYの合計ヌクレオチド数は17乃至18である。
(c)式(I)で示されるポリヌクレオチドのうち、X−(α−β)q−αpは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる;
(d)式(I)におけるX−(α−β)qと式(II)における(α−β)r−Yは互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
(2)
式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて、qが3で、Xが(γ−β)6、(α−β)−(γ−β)5、(α−β)2−(γ−β)4、(α−β)3−(γ−β)3、(α−β)4−(γ−β)2、(α−β)5−(γ−β)、(α−β)6、β12、(α−β)−β10、(α−β)2−β8、(α−β)3−β6、(α−β)4−β4、(α−β)5−β2、β−(γ−β)5、β−(α−β)−(γ−β)4、β−(α−β)2−(γ−β)3、β−(α−β)3−(γ−β)2、β−(α−β)4−(γ−β)、β11、β−(α−β)−β8、β−(α−β)2−β6、β−(α−β)3−β4、β−(α−β)4−β2、及びβ−(α−β)5(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(1)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(3)
式(II)に示されるポリヌクレオチドにおいて、rが3で、Yが(γ−β)6、(γ−β)5−(α−β)、(γ−β)4−(α−β)2、(γ−β)3−(α−β)3、(γ−β)2−(α−β)4、(γ−β)−(α−β)5、(α−β)6、α6−(α−β)3、α4−(α−β)4、α2−(α−β)5、(γーβ)5−α、(γ−β)4−(α−β)−α、(γ−β)3−(α−β)2−α、(γ−β)2−(α−β)3−α、(γ−β)−(α−β)4−α、α6−(α−β)2−α、α4−(α−β)3−α、β2−(α−β)4−α、及び(α−β)5−α(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(1)又は(2)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(4)
式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて、qが3で、(γ−β)6、(α−β)−(γ−β)5、(α−β)2−(γ−β)4、(α−β)3−(γ−β)3、(α−β)4−(γ−β)2、(α−β)5−(γ−β)、(α−β)6、β12、(α−β)−β10、(α−β)2−β8、(α−β)3−β6、(α−β)4−β4、(α−β)5−β2、β−(γ−β)5、β−(α−β)−(γ−β)4、β−(α−β)2−(γ−β)3、β−(α−β)3−(γ−β)2、β−(α−β)4−(γ−β)、β11、β−(α−β)−β8、β−(α−β)2−β6、β−(α−β)3−β4、β−(α−β)4−β2、及びβ−(α−β)5からなる群から選択されるいずれか一つであり、式(II)に示されるポリヌクレオチドにおいて、rが3で、Yが(γ−β)6、(γ−β)5−(α−β)、(γ−β)4−(α−β)2、(γ−β)3−(α−β)3、(γ−β)2−(α−β)4、(γ−β)−(α−β)5、(α−β)6、α6−(α−β)3、α4−(α−β)4、α2−(α−β)5、(γーβ)5−α、(γ−β)4−(α−β)−α、(γ−β)3−(α−β)2−α、(γ−β)2−(α−β)3−α、(γ−β)−(α−β)4−α、α6−(α−β)2−α、α4−(α−β)3−α、α2−(α−β)4−α、及び(α−β)5−α(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(1)又は(2)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(5)
式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて、qが4で、Xが(γ−β)5、(α−β)−(γ−β)4、(α−β)2−(γ−β)3、(α−β)3−(γ−β)2、(α−β)4−(γ−β)、(α−β)5、β10、(α−β)−β8、(α−β)2−β6、(α−β)3−β4、(α−β)4−β2、β−(γ−β)4、β−(α−β)−(γ−β)3、β−(α−β)2−(γ−β)2、β−(α−β)3−(γ−β)、β9、β−(α−β)−β6、β−(α−β)2−β4、β−(α−β)3−β2、及びβ−(α−β)4(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(1)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(6)
式(II)に示されるポリヌクレオチドにおいて、rが4で、Yが(γ−β)5、(γ−β)4−(α−β)、(γ−β)3−(α−β)2、(γ−β)2−(α−β)3、(γ−β)−(α−β)4、(α−β)5、β6−(α−β)2、β4−(α−β)3、β2−(α−β)4、(γーβ)4−α、(α−β)4−α、(γ−β)3−(α−β)−α、(γ−β)2−(α−β)2−α、(γ−β)−(α−β)3−α、α6−(α−β)−α、α4−(α−β)2−α、α2−(α−β)3−α及び(α−β)4−α(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(1)又は(5)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(7)
式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて、qが4で、Xが(γ−β)5、(α−β)−(γ−β)4、(α−β)2−(γ−β)3、(α−β)3−(γ−β)2、(α−β)4−(γ−β)、(α−β)5、β10、(α−β)−β8、(α−β)2−β6、(α−β)3−β4、(α−β)4−β2、β−(γ−β)4、β−(α−β)−(γ−β)3、β−(α−β)2−(γ−β)2、β−(α−β)3−(γ−β)、β9、β−(α−β)−β6、β−(α−β)2−β4、β−(α−β)3−β2、及びβ−(α−β)4、からなる群から選択されるいずれか一つであり、式(II)に示されるポリヌクレオチドにおいて、rが4で、Yが(γ−β)5、(γ−β)4−(α−β)、(γ−β)3−(α−β)2、(γ−β)2−(α−β)3、(γ−β)−(α−β)4、(α−β)5、α6−(α−β)2、α4−(α−β)3、α2−(α−β)4、(γーβ)4−α、(α−β)4−α、(γ−β)3−(α−β)−α、(γ−β)2−(α−β)2−α、(γ−β)−(α−β)3−α、α6−(α−β)−α、α4−(α−β)2−α、α2−(α−β)3−α、及び(α−β)4−α(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(1)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(8)
式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて、qが5で、Xが(γ−β)4、(α−β)−(γ−β)3、(α−β)2−(γ−β)2、(α−β)3−(γ−β)、(α−β)4、β8、(α−β)−β6、(α−β)2−β4、(α−β)3−β2、β−(γ−β)3、β−(α−β)−(γ−β)2、β−(α−β)2−(γ−β)、β7、β−(α−β)−β4、β−(α−β)2−β2、及びβ−(α−β)3、(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(1)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(9)
式(II)に示されるポリヌクレオチドにおいて、rが5で、Yが(γ−β)4、(γ−β)3−(α−β)、(γ−β)2−(α−β)2、(γ−β)−(α−β)3、(α−β)4、β6−(α−β)、β4−(α−β)2、β2−(α−β)3、(γーβ)3−α、(γ−β)2−(α−β)−α、(γ−β)−(α−β)2−α、α7、α4−(α−β)−α、α2−(α−β)2−α、及び(α−β)3−α、(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(1)又は(8)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(10)
式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて、qが5で、Xが(γ−β)4、(α−β)−(γ−β)3、(α−β)2−(γ−β)2、(α−β)3−(γ−β)、(α−β)4、(α−β)−β6、(α−β)2−β4、(α−β)3−β2、β−(γ−β)3、β−(α−β)−(γ−β)2、β−(α−β)2−(γ−β)、β7、β−(α−β)−β4、β−(α−β)2−β2、及びβ−(α−β)3、からなる群から選択されるいずれか一つであり、式(II)に示されるポリヌクレオチドにおいて、rが5で、Yが(γ−β)4、(γ−β)3−(α−β)、(γ−β)2−(α−β)2、(γ−β)−(α−β)3、(α−β)4、α6−(α−β)、α4−(α−β)2、α2−(α−β)3、(γーβ)3−α、(γ−β)2−(α−β)−α、(γ−β)−(α−β)2−α、α7、α4−(α−β)−α、α2−(α−β)2−α、及び(α−β)3−α(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(1)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(11)
以下の(a)乃至(d)からなる特徴を有する、式(I)及び式(III)に示されるポリヌクレオチドからなる、2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩:
5’−X−(α−β)q−αp−λm−3’(I)
5’−δs−(β−α)r−Y−υn−3’(III)
(a)α及びβは異なってDNA又は2’−OMeRNA、δ及びλは同一又は異なってDNA又は2’−OMeRNA、υは同一又は異なってはDNA、RNA及び2’−OMeRNAから選択されるいずれかのヌクレオチドを示し、X及びYはDNA、RNA及び修飾核酸から選択される同一又は異なる種類のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを示す;
(b)pは0又は1の整数を示し、mはpが0のときは0であり、pが1のときは0〜5のいずれかの整数を示す。qは3〜9のいずれかの整数を示し、(α−β)qとXの合計ヌクレオチド数は17乃至18である。sは0又は1の整数を示し、nは0〜5のいずれかの整数を示す。rは3〜9のいずれかの整数を示し、(α−β)rとYの合計ヌクレオチド数は17乃至18である;
(c)式(I)で示されるポリヌクレオチドのうち、X−(α−β)q−αpは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる;
(d)式(I)におけるX−(α−β)qと式(III)における(β−α)r−Yは互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
(12)
式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて、qが3で、Xが(γ−β)6、(α−β)−(γ−β)5、(α−β)2−(γ−β)4、(α−β)3−(γ−β)3、(α−β)4−(γ−β)2、(α−β)5−(γ−β)、(α−β)6、β12、(α−β)−β10、(α−β)2−β8、(α−β)3−β6、(α−β)4−β4、(α−β)5−β2、β−(γ−β)5、β−(α−β)−(γ−β)4、β−(α−β)2−(γ−β)3、β−(α−β)3−(γ−β)2、β−(α−β)4−(γ−β)、β11、β−(α−β)−β8、β−(α−β)2−β6、β−(α−β)3−β4、β−(α−β)4−β2、及びβ−(α−β)5(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(11)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(13)
式(III)に示されるポリヌクレオチドにおいて、rが3で、Yが(β−γ)6、(β−γ)5−(β−α)、(β−γ)4−(β−α)2、(β−γ)3−(β−α)3、(β−γ)2−(β−α)4、(β−γ)−(β−α)5、(β−α)6、β6−(β−α)3、β4−(β−α)4、β2−(β−α)5、(β−γ)5−β、(β−γ)4−(β−α)−β、(β−γ)3−(β−α)2−β、(β−γ)2−(β−α)3−β、(β−γ)−(β−α)4−β、β6−(β−α)2−β、β4−(β−α)3−β、β2−(β−α)4−β、及び(β−α)5−β(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(11)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(14)
式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて、qが3で、Xが(γ−β)6、(α−β)−(γ−β)5、(α−β)2−(γ−β)4、(α−β)3−(γ−β)3、(α−β)4−(γ−β)2、(α−β)5−(γ−β)、(α−β)6、β12、(α−β)−β10、(α−β)2−β8、(α−β)3−β6、(α−β)4−β4、(α−β)5−β2、β−(γ−β)5、β−(α−β)−(γ−β)4、β−(α−β)2−(γ−β)3、β−(α−β)3−(γ−β)2、β−(α−β)4−(γ−β)、β11、β−(α−β)−β8、β−(α−β)2−β6、β−(α−β)3−β4、β−(α−β)4−β2、及びβ−(α−β)5からなる群から選択されるいずれか一つであり、式(III)に示されるポリヌクレオチドにおいて、rが3で、Yが(β−γ)6、(β−γ)5−(β−α)、(β−γ)4−(β−α)2、(β−γ)3−(β−α)3、(β−γ)2−(β−α)4、(β−γ)−(β−α)5、(β−α)6、β6−(β−α)3、β4−(β−α)4、β2−(β−α)5、(β−γ)5−β、(β−γ)4−(β−α)−β、(β−γ)3−(β−α)2−β、(β−γ)2−(β−α)3−β、(β−γ)−(β−α)4−β、β6−(β−α)2−β、β4−(β−α)3−β、β2−(β−α)4−β、及び(β−α)5−β(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(11)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(15)
式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて、qが4で、Xが(γ−β)5、(α−β)−(γ−β)4、(α−β)2−(γ−β)3、(α−β)3−(γ−β)2、(α−β)4−(γ−β)、(α−β)5、β10、(α−β)−β8、(α−β)2−β6、(α−β)3−β4、(α−β)4−β2、β−(γ−β)4、β−(α−β)−(γ−β)3、β−(α−β)2−(γ−β)2、β−(α−β)3−(γ−β)、β9、β−(α−β)−β6、β−(α−β)2−β4、β−(α−β)3−β2、及びβ−(α−β)4、(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(11)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(16)
式(III)に示されるポリヌクレオチドにおいて、rが4で、Yが(β−γ)5、(β−γ)4−(β−α)、(β−γ)3−(β−α)2、(β−γ)2−(β−α)3、(β−γ)−(β−α)4、(β−α)5、β6−(β−α)2、β4−(β−α)3、β2−(β−α)4、(β−γ)4−β、(β−α)4−β、(γ−β)3−(β−α)−β、(γ−β)2−(β−α)2−β、(β−γ)−(β−α)3−β、β6−(β−α)−β、β4−(β−α)2−β、β2−(β−α)3−β及び(β−α)4−β(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(11)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(17)
式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて、qが4で、Xが(γ−β)5、(α−β)−(γ−β)4、(α−β)2−(γ−β)3、(α−β)3−(γ−β)2、(α−β)4−(γ−β)、(α−β)5、β10、(α−β)−β8、(α−β)2−β6、(α−β)3−β4、(α−β)4−β2、β−(γ−β)4、β−(α−β)−(γ−β)3、β−(α−β)2−(γ−β)2、β−(α−β)3−(γ−β)、β9、β−(α−β)−β6、β−(α−β)2−β4、β−(α−β)3−β2、及びβ−(α−β)4、からなる群から選択されるいずれか一つであり、式(III)に示されるポリヌクレオチドにおいて、rが4で、Yが(β−γ)5、(β−γ)4−(β−α)、(β−γ)3−(β−α)2、(β−γ)2−(β−α)3、(β−γ)−(β−α)4、(β−α)5、β6−(β−α)2、β4−(β−α)3、β2−(β−α)4、(β−γ)4−β、(β−α)4−β、(γ−β)3−(β−α)−β、(γ−β)2−(β−α)2−β、(β−γ)−(β−α)3−β、β6−(β−α)−β、β4−(β−α)2−β、β2−(β−α)3−β及び(β−α)4−β(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(11)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(18)
式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて、qが5で、Xが(γ−β)4、(α−β)−(γ−β)3、(α−β)2−(γ−β)2、(α−β)3−(γ−β)、(α−β)4、β8、(α−β)−β6、(α−β)2−β4、(α−β)3−β2、β−(γ−β)3、β−(α−β)−(γ−β)2、β−(α−β)2−(γ−β)、β7、β−(α−β)−β4、β−(α−β)2−β2、及びβ−(α−β)3、(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(11)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(19)
式(III)に示されるポリヌクレオチドにおいて、rが5で、Yが(β−γ)4、(β−γ)3−(β−α)、(β−γ)2−(β−α)2、(β−γ)−(β−α)3(β−α)4、β6−(β−α)、β4−(β−α)2、β2−(β−α)3、(γーβ)3−β、(β−γ)2−(β−α)−β、(β−γ)−(β−α)2−β、β7、β4−(β−α)−β、β2−(β−α)2−β、及び(β−α)3−β、(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(11)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(20)
式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて、qが5で、Xが(γ−β)4、(α−β)−(γ−β)3、(α−β)2−(γ−β)2、(α−β)3−(γ−β)、(α−β)4、(α−β)−β6、(α−β)2−β4、(α−β)3−β2、β−(γ−β)3、β−(α−β)−(γ−β)2、β−(α−β)2−(γ−β)、β7、β−(α−β)−β4、β−(α−β)2−β2、及びβ−(α−β)3からなる群から選択されるいずれか一つであり、式(III)に示されるポリヌクレオチドにおいて、rが5で、Yが(β−γ)4、(β−γ)3−(β−α)、(β−γ)2−(β−α)2、(β−γ)−(β−α)3(β−α)4、β6−(β−α)、β4−(β−α)2、β2−(β−α)3、(γーβ)3−β、(β−γ)2−(β−α)−β、(β−γ)−(β−α)2−β、β7、β4−(β−α)−β、β2−(β−α)2−β、及び(β−α)3−β、(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、(11)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(21)
式(I)、(II)及び(III)に示されるポリヌクレオチドにおいて、qが9で、Xのヌクレオチド数が0であり、p及びmが0、rが9でYのヌクレオチド数が0であることを特徴とする、(1)又は(11)に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(22)
以下の式(a)乃至(d)からなる特徴を有する、式(IV)及び式(V)に示されるポリヌクレオチドからなる、2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩:
5’−(α−β)9−αp−λm−3’(IV)
5’−δs−(α−β)9−υn−3’(V)
(a)α及びβは異なってDNA又は2’−OMeRNA、δ及びλは同一又は異なってDNA又は2’−OMeRNA、υは同一又は異なってはDNA、RNA及び2’−OMeRNAから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す;
(b)pは0又は1の整数を示し、mはpが0のときは0であり、pが1のときは0〜5のいずれかの整数を示す。sは0又は1の整数を示し、nは0〜5のいずれかの整数を示す。;
(c)式(IV)で示されるポリヌクレオチドのうち、(α−β)9−αpは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる;
(d)式(IV)における(α−β)9と式(V)における(α−β)9は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
(23)
以下の式(a)乃至(d)からなる特徴を有する、式(VI)及び式(VII)に示されるポリヌクレオチドからなる、2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩:
5’−β−(α−β)8−αp−λm−3’(VI)
5’−δs−(α−β)8−(α―β)−υn−3’(VII)
(a)α及びβは異なってDNA又は2’−OMeRNA、δ及びλは同一又は異なってDNA又は2’−OMeRNA、υは同一又は異なってはDNA、RNA及び2’−OMeRNAから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す;
(b)pは0又は1の整数を示し、mはpが0のときは0であり、pが1のときは0〜5のいずれかの整数を示す。sは0又は1の整数を示し、nは0〜5のいずれかの整数を示す;
(c)式(VI)で示されるポリヌクレオチドのうち、β−(α−β)8−αpは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる;
(d)式(VI)における(α−β)8と式(VII)における(α−β)8は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
(24)
αがDNA、βが2’−OMeRNAであることを特徴とする、(1)乃至(23)のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(25)
λm及びυnが同一又は異なってチミン塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有するDNA、又は、ウラシル塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有する2’−OMeRNAのいずれかであることを特徴とする、(1)乃至(24)のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(26)
mが0、nが2であることを特徴とする、(1)乃至(25)のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(27)
p及びmが0、sが1、nが2であることを特徴とする、(1)乃至(26)のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(28)
2’−OMeRNAの任意の1〜4残基がENA又は2’,4’−BNA/LNAに置換されていることを特徴とする、(1)乃至(27)のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(29)
DNAの任意の1〜4残基がRNA、ENA又は2’,4’−BNA/LNAに置換されていることを特徴とする、(1)乃至(28)のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(30)
各ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合で結合していることを特徴とする、(1)乃至(29)のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(31)
少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドの5’末端にリン酸基が付加されていることを特徴とする、(1)乃至(30)のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(32)
アンチセンス鎖の5’末端にリン酸基が付加されている、(1)乃至(31)のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
(33)
(1)乃至(32)のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬、
(34)
(1)乃至(33)から選択される2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩を哺乳動物に投与することによる、標的遺伝子の発現抑制方法、
からなる。
本明細書において、「標的遺伝子」とは、これを導入する細胞、組織、あるいは固体(以下これを「被導入体」と称することがある。)においてmRNA及び/又はタンパク質を産生するように翻訳され得るものであれば特に制限されない。具体的には、導入する被導入体に内在性のものでも、遺伝子導入等の手法によって導入される外来性のものでもよい。また、染色体上に存在する遺伝子でも、染色体外のものでもよい。外来性の遺伝子としては、例えば、被導入体に感染可能なウイルス、バクテリア、真菌または原生動物由来のものが挙げられるがこれらに制限されない。遺伝子の機能については既知のものでも未知のものでもよい。
本発明における2本鎖ポリヌクレオチドの鎖長は、RNA干渉作用を有する限り、18ヌクレオチドから、標的遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の全長までのいかなる長さでもよい。センス鎖としては、18〜21の鎖長のものが好ましく、18〜19の鎖長のものが更に好ましい。アンチセンス鎖としては、19〜21の鎖長のものが好ましく、21鎖長のものが更に好ましい。2本鎖ポリヌクレオチドはその全体が2本鎖である必要はなく5’及び/又は3’末端が一部突出したものも含み、その突出末端は1〜5ヌクレオチド、好ましくは1〜3ヌクレオチド、さらに好ましくは2ヌクレオチドである。また、最も好ましい例としては、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドの3’末端が2ヌクレオチド突出している(オーバーハング構造)構造を有するものが挙げられる。
2本鎖ポリヌクレオチドの一例としては、以下の式(I)に示されるポリヌクレオチドからなるセンス鎖及び式(II)に示されるポリヌクレオチドからなるアンチセンス鎖からなる、2本鎖ポリヌクレオチドを挙げることができる。
5’−X−(α−β)q−αp−λm−3’(I)
5’−δs−(α−β)r−Y−υn−3’(II)
(a)α及びβは異なってDNA又は2’−OMeRNAを示し、δ及びλは同一又は異なってDNA又は2’−OMeRNAを示し、υは同一又は異なって、DNA、RNA及び2’−OMeRNAから選択されるいずれかのヌクレオチドを示し、X及びYはDNA、RNA及び修飾核酸から選択される同一又は異なる種類のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを示す;
(b)pは0又は1の整数、qは3〜9のいずれかの整数を示し、(α−β)qとXの合計ヌクレオチド数は17乃至18である。rは3〜9のいずれかの整数を示し、(α−β)rとYの合計ヌクレオチド数は17乃至18である。nは0〜5のいずれかの整数である。mはpが0のときは0であり、pが1のときは0〜5のいずれかの整数である;
(c)式(I)で示されるポリヌクレオチドのうち、X−(α−β)q−αpは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる;
(d)式(I)におけるX−(α−β)qと式(II)における(α−β)r−Yは互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
2−3.
2本鎖ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖が式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて:
qが3で、Xが(γ−β)6、(α−β)−(γ−β)5、(α−β)2−(γ−β)4、(α−β)3−(γ−β)3、(α−β)4−(γ−β)2、(α−β)5−(γ−β)、(α−β)6、β12、(α−β)−β10、(α−β)2−β8、(α−β)3−β6、(α−β)4−β4、(α−β)5−β2、β−(γ−β)5、β−(α−β)−(γ−β)4、β−(α−β)2−(γ−β)3、β−(α−β)3−(γ−β)2、β−(α−β)4−(γ−β)、β11、β−(α−β)−β8、β−(α−β)2−β6、β−(α−β)3−β4、β−(α−β)4−β2、及びβ−(α−β)5からなる群から選択されるいずれか一つであるポリヌクレオチド;qが4で、Xが(γ−β)5、(α−β)−(γ−β)4、(α−β)2−(γ−β)3、(α−β)3−(γ−β)2、(α−β)4−(γ−β)、(α−β)5、β10、(α−β)−β8、(α−β)2−β6、(α−β)3−β4、(α−β)4−β2、β−(γ−β)4、β−(α−β)−(γ−β)3、β−(α−β)2−(γ−β)2、β−(α−β)3−(γ−β)、β9、β−(α−β)−β6、β−(α−β)2−β4、β−(α−β)3−β2、及びβ−(α−β)4からなる群から選択されるいずれか一つであるポリヌクレオチド;qが5で、Xが(γ−β)4、(α−β)−(γ−β)3、(α−β)2−(γ−β)2、(α−β)3−(γ−β)、(α−β)4、β8、(α−β)−β6、(α−β)2−β4、(α−β)3−β2、β−(γ−β)3、β−(α−β)−(γ−β)2、β−(α−β)2−(γ−β)、β7、β−(α−β)−β4、β−(α−β)2−β2、及びβ−(α−β)3、(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであるポリヌクレオチドであり、
アンチセンス鎖が式(II)に示されるポリヌクレオチドにおいて:
rが3で、Yが(γ−β)6、(γ−β)5−(α−β)、(γ−β)4−(α−β)2、(γ−β)3−(α−β)3、(γ−β)2−(α−β)4、(γ−β)−(α−β)5、(α−β)6、α6−(α−β)3、α4−(α−β)4、α2−(α−β)5、(γーβ)5−α、(γ−β)4−(α−β)−α、(γ−β)3−(α−β)2−α、(γ−β)2−(α−β)3−α、(γ−β)−(α−β)4−α、α6−(α−β)2−α、α4−(α−β)3−α、β2−(α−β)4−α、及び(α−β)5−αからなる群から選択されるいずれか一つであるポリヌクレオチド;rが4で、Yが(γ−β)5、(γ−β)4−(α−β)、(γ−β)3−(α−β)2、(γ−β)2−(α−β)3、(γ−β)−(α−β)4、(α−β)5、β6−(α−β)2、β4−(α−β)3、β2−(α−β)4、(γーβ)4−α、(α−β)4−α、(γ−β)3−(α−β)−α、(γ−β)2−(α−β)2−α、(γ−β)−(α−β)3−α、α6−(α−β)−α、α4−(α−β)2−α、α2−(α−β)3−α及び(α−β)4−αからなる群から選択されるいずれか一つであるポリヌクレオチド;rが5で、Yが(γ−β)4、(γ−β)3−(α−β)、(γ−β)2−(α−β)2、(γ−β)−(α−β)3、(α−β)4、β6−(α−β)、β4−(α−β)2、β2−(α−β)3、(γーβ)3−α、(γ−β)2−(α−β)−α、(γ−β)−(α−β)2−α、α7、α4−(α−β)−α、α2−(α−β)2−α、及び(α−β)3−αからなる群から選択されるいずれか一つであるポリヌクレオチド(γはRNAを示す。)、からなる2本鎖ポリヌクレオチドを挙げることができる。
2本鎖ポリヌクレオチドの他の一例としては、以下の式(I)に示されるポリヌクレオチドからなるセンス鎖及び式(III)に示されるポリヌクレオチドからなるアンチセンス鎖からなる、2本鎖ポリヌクレオチドを挙げることができる。
5’−X−(α−β)q−αp−λm−3’(I)
5’−δs−(β−α)r−Y−υn−3’(III)
(a)α及びβは異なってDNA又は2’−OMeRNA、δ及びλは同一又は異なってDNA又は2’−OMeRNA、υは同一又は異なってDNA、RNA及び2’−OMeRNAから選択されるいずれかのヌクレオチド、X及びYはDNA、RNA及び修飾核酸から選択される同一又は異なる種類のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを示す;
(b)pは0又は1の整数を示し、mはpが0のときは0であり、pが1のときは0〜5のいずれかの整数を示す。qは3〜9のいずれかの整数を示し、(α−β)qとXの合計ヌクレオチド数は17乃至18である。sは0又は1の整数を示し、nは0〜5のいずれかの整数を示す。rは3〜9のいずれかの整数を示し、(α−β)rとYの合計ヌクレオチド数は17乃至18である;
(c)式(III)で示されるポリヌクレオチドのうち、X−(α−β)q−αpは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる;
(d)式(III)におけるX−(α−β)qと式(IV)における(β−α)r−Yは互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
2本鎖ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖が、式(I)に示されるポリヌクレオチドにおいて;
qが3で、Xが(γ−β)6、(α−β)−(γ−β)5、(α−β)2−(γ−β)4、(α−β)3−(γ−β)3、(α−β)4−(γ−β)2、(α−β)5−(γ−β)、(α−β)6、β12、(α−β)−β10、(α−β)2−β8、(α−β)3−β6、(α−β)4−β4、(α−β)5−β2、β−(γ−β)5、β−(α−β)−(γ−β)4、β−(α−β)2−(γ−β)3、β−(α−β)3−(γ−β)2、β−(α−β)4−(γ−β)、β11、β−(α−β)−β8、β−(α−β)2−β6、β−(α−β)3−β4、β−(α−β)4−β2、及びβ−(α−β)5からなる群から選択されるいずれか一つであるポリヌクレオチド;qが4で、Xが(γ−β)5、(α−β)−(γ−β)4、(α−β)2−(γ−β)3、(α−β)3−(γ−β)2、(α−β)4−(γ−β)、(α−β)5、β10、(α−β)−β8、(α−β)2−β6、(α−β)3−β4、(α−β)4−β2、β−(γ−β)4、β−(α−β)−(γ−β)3、β−(α−β)2−(γ−β)2、β−(α−β)3−(γ−β)、β9、β−(α−β)−β6、β−(α−β)2−β4、β−(α−β)3−β2、及びβ−(α−β)4、からなる群から選択されるいずれか一つであるポリヌクレオチド;qが5で、Xが(γ−β)4、(α−β)−(γ−β)3、(α−β)2−(γ−β)2、(α−β)3−(γ−β)、(α−β)4、β8、(α−β)−β6、(α−β)2−β4、(α−β)3−β2、β−(γ−β)3、β−(α−β)−(γ−β)2、β−(α−β)2−(γ−β)、β7、β−(α−β)−β4、β−(α−β)2−β2、及びβ−(α−β)3(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つであるポリヌクレオチドであり、
アンチセンス鎖が式(III)に示されるポリヌクレオチドにおいて:
rが3で、Yが(β−γ)6、(β−γ)5−(β−α)、(β−γ)4−(β−α)2、(β−γ)3−(β−α)3、(β−γ)2−(β−α)4、(β−γ)−(β−α)5、(β−α)6、β6−(β−α)3、β4−(β−α)4、β2−(β−α)5、(β−γ)5−β、(β−γ)4−(β−α)−β、(β−γ)3−(β−α)2−β、(β−γ)2−(β−α)3−β、(β−γ)−(β−α)4−β、β6−(β−α)2−β、β4−(β−α)3−β、β2−(β−α)4−β、及び(β−α)5−βからなる群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド;rが4で、Yが(β−γ)5、(β−γ)4−(β−α)、(β−γ)3−(β−α)2、(β−γ)2−(β−α)3、(β−γ)−(β−α)4、(β−α)5、β6−(β−α)2、β4−(β−α)3、β2−(β−α)4、(β−γ)4−β、(β−α)4−β、(γ−β)3−(β−α)−β、(γ−β)2−(β−α)2−β、(β−γ)−(β−α)3−β、β6−(β−α)−β、β4−(β−α)2−β、β2−(β−α)3−β及び(β−α)4−βからなる群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド;rが5で、Yが(β−γ)4、(β−γ)3−(β−α)、(β−γ)2−(β−α)2、(β−γ)−(β−α)3(β−α)4、β6−(β−α)、β4−(β−α)2、β2−(β−α)3、(γーβ)3−β、(β−γ)2−(β−α)−β、(β−γ)−(β−α)2−β、β7、β4−(β−α)−β、β2−(β−α)2−β、及び(β−α)3−β、(γはRNAを示す。)からなる群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド、からなる2本鎖ポリヌクレオチドを挙げることができる。
2本鎖ポリヌクレオチドの他の一例としては、以下の式(IV)に示されるポリヌクレオチドからなるセンス鎖及び式(V)に示されるポリヌクレオチドからなるアンチセンス鎖からなる、2本鎖ポリヌクレオチドを挙げることができる。
5’−(α−β)9−αp−λm−3’(IV)
5’−δs−(α−β)9−υn−3’(V)
(a)α及びβは異なってDNA又は2’−OMeRNA、δ及びλは同一又は異なってDNA又は2’−OMeRNA、υは同一又は異なってDNA、RNA及び2’−OMeRNAから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す;
(b)pは0又は1の整数を示し、mはpが0のときは0であり、pが1のときは0〜5のいずれかの整数を示す。sは0又は1の整数を示し、nは0〜5のいずれかの整数を示す。;
(c)式(IV)で示されるポリヌクレオチドのうち、(α−β)9−αpは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる;
(d)式(IV)における(α−β)9と式(V)における(α−β)9は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
2本鎖ポリヌクレオチドの他の一例としては、以下の式(VI)に示されるポリヌクレオチドからなるセンス鎖及び式(VII)に示されるポリヌクレオチドからなるアンチセンス鎖からなる、2本鎖ポリヌクレオチドを挙げることができる。
5’−β−(α−β)8−αp−λm−3’(VI)
5’−δs−(α−β)8−(α―β)−υn−3’(VII)
(a)α及びβは異なってDNA又は2’−OMeRNA、δ及びλは同一又は異なってDNA又は2’−OMeRNA、υは同一又は異なってDNA、RNA及び2’−OMeRNAから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す;
(b)pは0又は1の整数、nは同一又は異なって、0〜5のいずれかの整数である。mはpが0のときは0であり、pが1のときは0〜5のいずれかの整数である;
(c)式(VI)で示されるポリヌクレオチドのうち、β−(α−β)8−αpは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる;
(d)式(VI)における(α−β)8と式(VII)における(α−β)8は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
2本鎖ポリヌクレオチドの他の一例としては以下の式(VIII)及び式(IX)に示される2本鎖ポリヌクレオチドを挙げることができる。
5’−X−(α−β)q−α−αm−3’(VIII)
5’−β−(α−β)r−Y−αn−3’(IX)
(a)αはDNA、βは2’−OMeRNA、X及びYはDNA、RNA、修飾核酸から選択される同一又は異なる種類のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを示す;
(b)qは3〜9の任意の整数を示し、(α−β)qとXの合計ヌクレオチド数は18である。rは3〜9の任意の整数を示し、(α−β)rとYの合計ヌクレオチド数は18である。n及びmは同一又は異なって、0〜5の整数である;
(c)式(VIII)で示されるポリヌクレオチドのうち、X−(α−β)q−αは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる;
(d)式(VIII)におけるX−(α−β)q−αと式(IX)におけるβ−(α−β)r−Yは互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
また、αm及びαnのαの好ましいヌクレオチドとしては、いずれもチミジンであるものを挙げることができる。
上記のように調製された2本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でRNAに転写、またはタンパク質に翻訳され得るものであれば、特に制限されない。被導入体としては細胞、組織、あるいは個体を意味する。
脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。
2種又はそれ以上の生物活性剤は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Arp−Um1p−Grp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号1)(CT−095)の合成
核酸自動合成機(パーキンエルマー社製 ABI model 394 DNA/RNA synthesizer)を用い、0.2μmolスケールのRNA合成プログラムに従って行った。各合成サイクルにおける溶媒、試薬、ホスホロアミダイトの濃度は天然オリゴデオキシヌクレオチド合成の場合と同じものを用いた。
2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドホスホロアミダイトを用いる場合は、特許3420984号の実施例14(5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−6−N−ベンゾイルアデノシン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例27(5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−2−N−イソブチリルグアノシン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例22(5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−4−N−ベンゾイル−5−メチルシチジン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例9(5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−5−メチルウリジン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、の化合物を適宜調製し用いた。
HO−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Arp−Um1p−Urp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Tt−H(配列表の配列番号4)(CT−096)の合成
実施例1と同様にCT−096を合成した。
分子量 計算値:6632.29、測定値:6632.17
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Grp−Am1p−Arp−Um1p−Grp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号5)(CT−097)の合成
実施例1と同様にCT−097を合成し、分子量を測定した。
分子量:計算値:6737.46、測定値:6737.38
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Arp−Um1p−Urp−Cm1p−Urp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Tt−H(配列表の配列番号6)(CT−098)の合成
実施例1と同様にCT−098を合成した。
分子量:計算値:6634.26、測定値:6634.90
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Grp−Cm1p−Arp−Cm1p−Arp−Am1p−Grp−Am1p−Arp−Um1p−Grp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号7)(CT−099)の合成
実施例1と同様にCT−099を合成した。
分子量:計算値:6785.46、測定値:6785.12
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Arp−Um1p−Urp−Cm1p−Urp−Um1p−Grp−Um1p−Grp−Cm1p−Tp−Tt−H(配列表の配列番号8)(CT−100)の合成
実施例1と同様にCT−100を合成した。
分子量:計算値:6666.26、測定値:6665.71
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
実施例1と同様にCT−112を合成した。核酸自動合成機の最終工程で、酸処理をしなかった(ジメトキシトリチル基がオリゴヌクレオチド上に結合している)。本ポリヌクレオチドにおいては、アンモニア水:エタノール溶液(3:1v/v)で処理した後、逆相HPLC(島津製作所製LC−10VP、カラム(Merck, Chromolith Performance RP−18e (4.6×100mm))、A溶液:5%アセトニトリル、0.1M 酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH7.0、B溶液:アセトニトリル、B%:10%→60%(10min, linear gradient);60℃;2ml/min;260nm)にて精製し、ジメトキシトリチル基を有する目的物のピークを集めた。水を加え、減圧下留去することで、TEAAを除いた。80%酢酸水溶液(2mL)を加え、20分放置することで、ジメトキシトリチル基の脱保護を行った。溶媒を留去したのち、残渣を500μlの水に溶解し、酢酸エチルで洗浄し、凍結乾燥後、目的とするオリゴヌクレオチドを得た。
分子量:計算値:6715.50、測定値:6714.92
:塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
実施例7と同様にCT−113を合成した。
分子量:計算値:6731.50、測定値:6732.22
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
実施例7と同様にCT−114を合成した。
分子量:計算値:6701.47、測定値:6701.06
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Ce2p−Ap−Am1p−Gp−Ae2p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号12)(CT−115)の合成
実施例7と同様にCT−115を合成した。
分子量:計算値:6727.51、測定値:6728.07
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ae2p−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Tt−H(配列表の配列番号13)(CT−116)の合成
実施例7と同様にCT−116を合成した。
分子量:計算値:6656.35、測定値:6655.97
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Te2p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Tt−H(配列表の配列番号14)(CT−117)の合成
実施例7と同様にCT−117を合成した。
分子量:計算値:6640.35、測定値:6640.88
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Te2p−Tp−Cm1p−Tp−Te2p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Tt−H(配列表の配列番号15)(CT−118)の合成
実施例7と同様にCT−118を合成した。
分子量:計算値:6666.39、測定値:6666.04
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号16)(CT−091)の合成
実施例7と同様にCT−091を合成した。
分子量:計算値:6689.46、測定値:6689.81
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Tt−H(配列表の配列番号17)(CT−092)の合成
実施例7のと同様にCT−092を合成した。
分子量:計算値:6614.31、測定値:6614.80
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Am1p−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号18)(CT−101)の合成
実施例7と同様にCT−101を合成した。
分子量:計算値:6719.49、測定値:6719.67
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Arp−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号19)(CT−102)の合成
実施例1と同様にCT−102を合成した。
分子量:計算値:6705.46、測定値:6705.58
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Am1p−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Tt−H(配列表の配列番号20)(CT−107)の合成
実施例7と同様にCT−107を合成した。
分子量:計算値:6644.34、測定値:6644.47
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Arp−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Tt−H(配列表の配列番号21)(CT−108)の合成
実施例1と同様にCT−108を合成した。
分子量:計算値:6630.31、測定値:6630.48
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−At−H(配列表の配列番号22)(CT−103)の合成
実施例7と同様にCT−103を合成した。
分子量:計算値:6081.07、測定値:6081.08
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1t−H(配列表の配列番号23)(CT−109)の合成
実施例7と同様にCT−109を合成した。
分子量:計算値:6005.92、測定値:6005.89
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Am1p−Um1p−Gm1p−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号24)(CT−127)の合成
実施例7と同様にCT−127を合成した。
分子量:計算値:6749.52、測定値:6749.26
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gm1p−Am1p−Am1p−Um1p−Gm1p−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号25)(CT−128)の合成
実施例7と同様にCT−128を合成した。
分子量:計算値:6779.54、測定値:6779.31
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Am1p−Am1p−Gm1p−Am1p−Am1p−Um1p−Gm1p−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号26)(CT−129)の合成
実施例7と同様にCT−129を合成した。
分子量:計算値:6809.57、測定値:6809.23
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gm1p−Am1p−Am1p−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号27)(CT−130)の合成
実施例7と同様にCT−130を合成した。
分子量:計算値:6749.52、測定値:6749.21
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Am1p−Am1p−Gm1p−Am1p−Am1p−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号28)(CT−131)の合成
実施例7と同様にCT−131を合成した。
分子量:計算値:6779.54、測定値:6779.17
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Ae2p−Ap−Te2p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号29)(CT−132)の合成
実施例7と同様にCT−132を合成した。
分子量:計算値:6727.51、測定値:6728.00
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Ae2p−Gp−Ae2p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号30)(CT−133)の合成
実施例7と同様にCT−133を合成した。
分子量:計算値:6713.48、測定値:6713.77
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Ae2p−Gp−Am1p−Ap−Te2p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号31)(CT−134)の合成
実施例7と同様にCT−134を合成した。
分子量:計算値:6727.51、測定値:6728.04
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Ae2p−Gp−Ae2p−Ap−Te2p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号32)(CT−135)の合成
実施例7と同様にCT−135を合成した。
分子量:計算値:6739.52、測定値:6740.48
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Ce2p−Ap−Am1p−Gp−Ae2p−Ap−Te2p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号33)(CT−137)の合成
実施例7と同様にCT−137を合成した。
分子量:計算値:6753.55、測定値:6754.15
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Ce2p−Ap−Ae2p−Gp−Ae2p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号34)(CT−136)の合成
実施例7と同様にCT−136を合成した。
分子量:計算値:6739.52、測定値:6739.51
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Ce2p−Ap−Ae2p−Gp−Ae2p−Ap−Te2p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号35)(CT−138)の合成
実施例7と同様にCT−138を合成した。
分子量:計算値:6765.56、測定値:6765.76
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Gm1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Gm1p−Ap−Am1p−Tp−Gm1p−Gp−Am1p−Tp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Tp−Tt−H(配列表の配列番号36)(CT−119)の合成
実施例7と同様にCT−119を合成した。
分子量:計算値:6747.54、測定値:6747.39
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Am1p−Tp−Cm1p−Cp−Am1p−Tp−Um1p−Cp−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Cp−Tp−Tt−H(配列表の配列番号37)(CT−120)の合成
実施例7と同様にCT−120を合成した。
分子量:計算値:6598.32、測定値:6598.26
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Gs−Cm1s−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Grp−Am1p−Arp−Um1p−Grp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1s−As−Ts−Tt−H(配列表の配列番号38)(CT−097S)の合成
実施例1と同様にCT−097Sを合成する。但し、ホスホスホロチオエート結合を有する部分は、よう素/テトラヒドロフラン/ピリジン/H2O溶液で酸化する代わりに、0.2 M フェニルアセチルジスルフィド/ピリジン−アセトニトリル(1:1 v/v)溶液で3分間処理することにより合成できる(Ravikumar, V.T. et al. Bioorg.Med. Chem. Lett.(2006)16,p.2513−2517)。CT−097S、負イオン質量分析により同定する。
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Um1s−Ts−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Arp−Um1p−Urp−Cm1p−Urp−Um1p−Gp−Um1p−Gs−Cm1s−Ts−Tt−H(配列表の配列番号39)(CT−098S)の合成
実施例36と同様にCT−098Sを合成する。CT−098Sは、負イオン質量分析により同定する。
塩基配列:(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
実施例7と同様にCT−139を合成した。但し、ホスホスホロチオエート結合を有する部分は、よう素/テトラヒドロフラン/ピリジン/H2O溶液で酸化する代わりに、0.2M フェニルアセチルジスルフィド/ピリジン−アセトニトリル(1:1 v/v)溶液で3分間処理した(Ravikumar, V.T. et al. Bioorg.Med.Chem.Lett.(2006) 16,p.2513−2517)。CT−139は、負イオンESI質量分析により同定した。
分子量:計算値:6781.78、測定値:6781.89
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Um1s−Ts−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gs−Cm1s−Ts−Tt−H(配列表の配列番号41)(CT−141)の合成
実施例38と同様にCT−141を合成した。
分子量:計算値:6829.82、測定値:6830.13
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Gs−Cm1s−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gm1p−Am1p−Am1p−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1s−As−Ts−Tt−H(配列表の配列番号42)(CT−140)の合成
実施例38と同様にCT−140を合成した。
分子量:計算値:6694.62、測定値:6694.71
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
実施例7と同様にCT−114Lを合成する。但し、2’,4’−BNA/LNA部分は、文献(A. A. Koshkin, A.A. et al.Tetrahedron, 54, p.3607−(1998))記載の5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−メチレン−6−N−ベンゾイルアデノシン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトを用いることにより合成する。CT−114Lは、負イオンESI質量分析により同定する。
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Tt−H(配列表の配列番号17)(CT−149)の合成
実施例7と同様にCT−149を合成した。但し、5’−末端のリン酸基部分は、フォスファリンク(ABI製)を用いた。
分子量:計算値:6694.28、測定値:6694.55
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH)−O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Urp−Tt−H(配列表の配列番号52)(CT−155)の合成
実施例42と同様にCT−155を合成した。
分子量:計算値:6696.27、測定値:6696.44
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Um1p−Tt−H(配列表の配列番号53)(CT−156)の合成
実施例42と同様にCT−156を合成した。
分子量:計算値:6710.29、測定値:6710.13
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号54)(CT−157)の合成
実施例42と同様にCT−157を合成した。‘
分子量:計算値:6710.29、測定値:6710.39
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Urp−Um1t−H(配列表の配列番号55)(CT−158)の合成
実施例42と同様にCT−158を合成した。
分子量:計算値:6712.27、測定値:6712.50
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Um1p−Um1t−H(配列表の配列番号56)(CT−159)の合成
実施例42と同様にCT−159を合成した。
分子量:計算値:6726.29、測定値:6726.40
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Urt−H(配列表の配列番号57)(CT−160)の合成
実施例42とCT−160を合成した。
分子量:計算値:6696.27、測定値:6696.26
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Urp−Urt−H(配列表の配列番号58)(CT−161)の合成
実施例42と同様にCT−161を合成した。
分子量:計算値:6698.24、測定値:6698.34
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Um1p−Urt−H(配列表の配列番号59)(CT−162)の合成
実施例42と同様にCT−162を合成した。
分子量:計算値:6712.27、測定値:6712.30
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1t−H(配列表の配列番号60)(CT−169)の合成
実施例7と同様にCT−169を合成した。
分子量:計算値:5767.86、測定値:5767.78
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3156の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cpt−H(配列表の配列番号61)(CT−170)の合成
実施例7と同様にCT−170を合成した。
分子量:計算値:5424.62、測定値:5424.47
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3155の配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1t−H(配列表の配列番号62)(CT−171)の合成
実施例7と同様にCT−171を合成した。
分子量:計算値:5135.44、測定値:5134.53
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3154の配列を含む。
HO−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−At−H(配列表の配列番号63)(CT−172)の合成
実施例7と同様にCT−172を合成した。
分子量:計算値:5751.86、測定値:5751.80
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3140−3157の配列を含む。
HO−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−At−H(配列表の配列番号64)(CT−173)の合成
実施例7と同様にCT−173を合成した。
分子量:計算値:5432.65、測定値:5432.62
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3141−3157の配列を含む。
HO−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−At−H(配列表の配列番号65)(CT−174)の合成
実施例7と同様にCT−174を合成した。
分子量:計算値:5119.44、測定値:5119.39
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3142−3157の配列を含む。
HO−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1t−H(配列表の配列番号66)(CT−175)の合成
実施例7と同様にCT−175を合成した。
分子量:計算値:5438.65、測定値:5438.55
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3140−3156の配列を含む。
HO−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cpt−H(配列表の配列番号67)(CT−176)の合成
実施例7と同様にCT−176を合成した。
分子量:計算値:5095.42、測定値:5095.25
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3140−3155の配列を含む。
HO−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Am1p−Cp−Am1t−H(配列表の配列番号68)(CT−177)の合成
実施例7と同様にCT−177を合成した。
分子量:計算値:5119.44、測定値:5119.33
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3141−3156の配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Ap−Um1t−H(配列表の配列番号69)(CT−204)の合成
実施例42と同様にCT−204を合成した。
分子量:計算値:6719.31、測定値:6719.99
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Gp−Um1t−H(配列表の配列番号70)(CT−205)の合成
実施例42と同様にCT−205を合成した。
分子量:計算値:6735.31、測定値:6735.79
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Cp−Um1t−H(配列表の配列番号71)(CT−206)の合成
実施例42と同様にCT−206を合成した。
分子量:計算値:6695.28、測定値:6696.00
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Am1t−H(配列表の配列番号72)(CT−207)の合成
実施例42と同様にCT−207を合成した。
分子量:計算値:6733.33、測定値:6733.98
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Gm1t−H(配列表の配列番号73)(CT−208)の合成
実施例42と同様にCT−208を合成した。
分子量:計算値:6749.33、測定値:6750.11
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Cm1t−H(配列表の配列番号74)(CT−209)の合成
実施例42と同様にCT−209を合成した。
分子量:計算値:6709.31、測定値:6709.81
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Am1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号75)(CT−221)の合成
実施例42と同様にCT−221を合成した。
分子量:計算値:6733.23、測定値:6733.00
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3156に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Gm1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号76)(CT−222)の合成
実施例42と同様にCT−222を合成した。
分子量:計算値:6749.33、測定値:6749.06
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3156に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Cm1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号77)(CT−223)の合成
実施例42と同様にCT−223を合成した。
分子量:計算値:6709.31、測定値:6709.00
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3156に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号78)(CT−202)の合成
実施例42と同様にCT−202を合成した。
分子量:計算値:6391.06、測定値:6391.70
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3140−3157に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH) −O−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号79)(CT−203)の合成
実施例42と同様にCT−203を合成した。
分子量:計算値:6390.10、測定値:6390.72
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3156に相補的な配列を含む。
(実施例71)
HO−P(=O)(OH) −O−Gm1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Gm1p−Ap−Am1p−Tp−Gm1p−Gp−Am1p−Tp−Cm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号80)(CT−210)の合成
実施例42と同様にCT−210を合成した。
分子量:計算値:6843.52、測定値:6844.23
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
(実施例72)
HO−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Am1p−Tp−Cm1p−Cp−Am1p−Tp−Um1p−Cp−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ct−H(配列表の配列番号81)(CT−211)の合成
実施例42と同様にCT−211を合成した。
分子量:計算値:5989.92、測定値:5990.31
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
(実施例73)
HO−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Am1p−Tp−Cm1p−Cp−Am1p−Tp−Um1p−Cp−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1t−H(配列表の配列番号82)(CT−212)の合成
実施例7と同様にCT−212を合成した。
分子量:計算値:5700.74、測定値:5701.15
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3140−3157に相補的な配列を含む。
(実施例74)
HO−P(=O)(OH) −O−Ap−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号83)(CT−243)の合成
実施例42と同様にCT−243を合成した。
分子量:計算値:6703.31、測定値:6703.35
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3156に相補的な配列を含む。
(実施例75)
HO−P(=O)(OH) −O−Gp−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号84)(CT−244)の合成
実施例42と同様にCT−244を合成した。
分子量:計算値:6719.13、測定値:6719.46
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3156に相補的な配列を含む。
(実施例76)
HO−P(=O)(OH) −O−Cp−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号85)(CT−245)の合成
実施例42と同様にCT−245を合成した。
分子量:計算値:6679.28、測定値:6679.43
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3156に相補的な配列を含む。
(実施例77)
HO−P(=O)(OH) −O−Tp−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号86)(CT−246)の合成
実施例42と同様にCT−246を合成した。
分子量:計算値:6694.29、測定値:6694.49
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
(実施例78)
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Gp−Am1t−H(配列表の配列番号87)(CT−247)の合成
実施例42と同様にCT−247を合成した。
分子量:計算値:6758.35、測定値:6758.46
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
(実施例79)
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Gp−Gm1t−H(配列表の配列番号88)(CT−248)の合成
実施例42と同様にCT−248を合成した。
分子量:計算値:6774.35、測定値:6774.55
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
(実施例80)
HO−P(=O)(OH) −O−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Gp−Cm1t−H(配列表の配列番号89)(CT−249)の合成
実施例42と同様にCT−249を合成した。
分子量:計算値:6734.32、測定値:6734.35
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
(実施例81)
HO−P(=O)(OH) −O−Tp−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Gp−Um1t−H(配列表の配列番号90)(CT−253)の合成
実施例42とCT−253を合成した。
分子量:計算値:6719.31、測定値:6719.44
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
(実施例82)
HO−P(=O)(OH) −O−Tp−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Gp−Am1t−H(配列表の配列番号91)(CT−254)の合成
実施例42と同様にCT−254を合成した。
分子量:計算値:6742.35、測定値:6742.45
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
(実施例83)
HO−P(=O)(OH) −O−Tp−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Gp−Gm1t−H(配列表の配列番号92)(CT−255)の合成
実施例42と同様に目CT−255を合成した。
分子量:計算値:6758.35、測定値:6758.66
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
(実施例84)
HO−P(=O)(OH) −O−Tp−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Gp−Cm1t−H(配列表の配列番号93)(CT−256)の合成
実施例42と同様にCT−256を合成した。
分子量:計算値:6718.32、測定値:6718.59
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
(実施例85)
HO−P(=O)(OH) −O−Tp−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Ap−Am1t−H(配列表の配列番号94)(CT−257)の合成
実施例42と同様にCT−257を合成した。
分子量:計算値:6726.35、測定値:6726.52
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
(実施例86)
HO−P(=O)(OH) −O−Tp−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Ap−Gm1t−H(配列表の配列番号95)(CT−258)の合成
実施例42と同様にCT−258を合成した。
分子量:計算値:6742.35、測定値:6742.54
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
(実施例87)
HO−P(=O)(OH) −O−Up−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号96)(CT−264)の合成
実施例42と同様にCT−264を合成した。但し、Up部分は、DMT−deoxyuridine−β−cyanoethylphosphoramidite(DMT−dUridine Amidite, Sigma Aldrich製)を用いた。
分子量:計算値:6680.27、測定値:6680.29
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
(実施例88)
HO−P(=O)(OH) −O−5meCp−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号97)(CT−265)の合成
実施例42と同様にCT−265を合成した。但し、5MeCp部分は、DMT−5−methyl−deoxycytidine(ac)−β−cyanoethylphosphoramidite(5−Methyl−dC(ac) Amidite, Sigma Aldrich製)を用いた。
分子量:計算値:6693.31、測定値:6693.23
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3156に相補的な配列を含む。
(実施例89)
HO−P(=O)(OH) −O−Cp−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Gp−Gm1t−H(配列表の配列番号98)(CT−266)の合成
実施例42と同様にCT−266を合成した。
分子量:計算値:6743.34、測定値:6743.78
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3156に相補的な配列を含む。
(実施例90)
HO−P(=O)(OH) −O−5meCp−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Cm1p−Gp−Gm1t−H(配列表の配列番号99)(CT−267)の合成
実施例88と同様にCT−267を合成した。
分子量:計算値:6757.36、測定値:6757.52
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3156に相補的な配列を含む。
HO−Gm1p−Cp−Am1p−Cp−Am1p−Ap−Gm1p−Ap−Am1p−Tp−Gm1p−Gp−Am1p−Tp−Cm1p−Ap−Cm1p−At−H(配列表の配列番号102)(CT−288)の合成
実施例7と同様にCT−288を合成した。
分子量:計算値:5795.91、測定値:5795.76
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3156の配列を含む。
HO−P(=O)(OH)−O−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gp−Am1p−Tp−Cm1p−Cp−Am1p−Tp−Um1p−Cp−Um1p−Tp−Gm1p−Tp−Gm1p−Cp−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号103)(CT−289)の合成
実施例42と同様にCT−289を合成した。
分子量:計算値:6694.29、測定値:6694.09
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Gp−Gm1p−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Gm1p−Ap−Am1p−Gp−Cm1p−Tp−Gm1p−Cp−Am1p−Gp−Am1t−H(配列表の配列番号104)(CT−278)の合成
実施例7と同様にCT−278を合成した。
分子量:計算値:5876.95、測定値:5877.25
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号2137−2154の配列を含む。
HO−P(=O)(OH)−O−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Gm1p−Cp−Am1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1p−Cp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Cp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号105)(CT−279)の合成
実施例42と同様にCT−279を合成した。
分子量:計算値:6645.26、測定値:6645.44
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号2137−2155に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH)−O−Tp−Tp−Cm1p−Tp−Gm1p−Cp−Am1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1p−Cp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Cp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号106)(CT−280)の合成
実施例42と同様にCT−280を合成した。
分子量:計算値:6629.26、測定値:6629.51
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号2137−2155に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH)−O−Tp−Tp−Cm1p−Tp−Gm1p−Cp−Am1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1p−Cp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Gm1t−H(配列表の配列番号107)(CT−281)の合成
実施例42と同様にCT−281を合成した。
分子量:計算値:6677.31、測定値:6677.65
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号2137−2155に相補的な配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Cp−Um1p−Cp−Am1p−Gp−Am1p−Tp−Um1p−Cp−Gm1p−Tp−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1p−At−H(配列表の配列番号108)(DD−016)の合成
実施例7と同様にDD−016を合成した。
分子量:計算値:6040.00、測定値:6040.44
塩基配列:DDX3(DEAD (Asp−Glu−Ala−Asp) box polypeptide 3, X−linked)遺伝子(GenBank accession No.NM_001356.3)のヌクレオチド番号1929−1947の配列を含む。
HO−P(=O)(OH)−O−Um1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Am1p−Cp−Gm1p−Ap−Am1p−Tp−Cm1p−Tp−Gm1p−Ap−Gm1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号109)(DD−017)の合成
実施例7と同様にDD−017を合成した。
分子量:計算値:6779.41、測定値:6780.29
塩基配列:DDX3遺伝子(GenBank accession No.NM_001356.3)のヌクレオチド番号1929−1947に相補的な配列を含む。
HO−Gp−Cm1p−Cp−Um1p−Cp−Am1p−Gp−Am1p−Tp−Um1p−Cp−Gm1p−Tp−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1t−H(配列表の配列番号110)(DD−022)の合成
実施例7と同様にDD−022を合成した。
分子量:計算値:5726.79、測定値:5726.89
塩基配列:DDX3遺伝子(GenBank accession No.NM_001356.3)のヌクレオチド番号1929−1946の配列を含む。
HO−P(=O)(OH)−O−Tp−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Am1p−Cp−Gm1p−Ap−Am1p−Tp−Cm1p−Tp−Gm1p−Ap−Gm1p−Gp−Cm1p−Tp−Um1t−H(配列表の配列番号111)(DD−023)の合成
実施例42と同様にDD−023を合成した。
分子量:計算値:6763.42、測定値:6763.69
塩基配列:DDX3遺伝子(GenBank accession No.NM_001356.3)のヌクレオチド番号1929−1947に相補的な配列を含む。
HO−P(=O)(OH)−O−Tp−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Am1p−Cp−Gm1p−Ap−Am1p−Tp−Cm1p−Tp−Gm1p−Ap−Gm1p−Gp−Cm1p−Ap−Gm1t−H(配列表の配列番号112)(DD−024)の合成
実施例42と同様にDD−024を合成した。
分子量:計算値:6811.47、測定値:6811.66
塩基配列:DDX3遺伝子(GenBank accession No.NM_001356.3)のヌクレオチド番号1929−1947に相補的な配列を含む。
HO−Gs−Cm1s−Ap−Cm1p−Ap−Am1p−Gp−Am1p−Ap−Um1p−Gp−Gm1p−Ap−Um1p−Cs−Am1s−Cs−Am1t−H(配列表の配列番号113)(CT−169S)の合成
実施例36と同様にCT−169Sを合成する。CT−169Sは、負イオン質量分析により同定する。
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3156の配列を含むものである。
HO−P(=O)(OH) −O−Um1s−Ts−Gm1p−Tp−Gm1p−Ap−Um1p−Cp−Cm1p−Ap−Um1p−Tp−Cm1p−Tp−Um1p−Gp−Um1p−Gs−Cm1s−Ts−Um1t−H(配列表の配列番号114)(CT−157S)の合成
実施例42と同様にCT−157Sを合成する。但し、ホスホスホロチオエート結合を有する部分は、ヨウ素/テトラヒドロフラン/ピリジン/H2O溶液で酸化する代わりに、0.2M フェニルアセチルジスルフィド/ピリジン−アセトニトリル(1:1 v/v)溶液で3分間処理する(Ravikumar, V.T. et al. Bioorg.Med.Chem.Lett.(2006) 16, p.2513−2517)。CT−157Sは、負イオン質量分析により同定する。
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Grp−Cm1p−Arp−Cm1p−Arp−Am1p−Grp−Am1p−Arp−Um1p−Grp−Gm1p−Arp−Um1p−Crp−Am1p−Crp−Am1p−Arp−Tp−Tt−H(配列表の配列番号44)(CT−001)の合成
実施例1と同様にCT−001を合成した。
分子量:計算値:6849.46、測定値:6850.8
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Um1p−Urp−Gm1p−Urp−Gm1p−Arp−Um1p−Crp−Cm1p−Arp−Um1p−Urp−Cm1p−Urp−Um1p−Grp−Um1p−Grp−Cm1p−Tp−Tt−H(配列表の配列番号45)(CT−005)の合成
実施例1と同様にCT−005を合成した。
分子量:計算値:6702.20、測定値:6702.2
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Grp−Crp−Arp−Crp−Arp−Arp−Grp−Arp−Arp−Urp−Grp−Grp−Arp−Urp−Crp−Arp−Crp−Arp−Arp−Urp−Urt−H(配列表の配列番号46)(CT−106)の合成
実施例1と同様にCT−106を合成した。
分子量:計算値:6727.16、測定値:6726.73
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Urp−Urp−Grp−Urp−Grp−Arp−Urp−Crp−Crp−Arp−Urp−Urp−Crp−Urp−Urp−Grp−Urp−Grp−Crp−Urp−Urt−H(配列表の配列番号47)(CT−041)の合成
実施例1と同様にCT−041を合成した。
分子量:計算値:6565.88、測定値:6565.34
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Grp−Crp−Arp−Crp−Arp−Arp−Grp−Arp−Arp−Urp−Grp−Gp−Ap−Tp−Cp−Ap−Cp−Ap−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号48)(CT−104)の合成
実施例1と同様に目CT−104を合成した。
分子量:計算値:6609.25、測定値:6608.98
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Tp−Tp−Gp−Tp−Gp−Ap−Tp−Cp−Crp−Arp−Urp−Urp−Crp−Urp−Urp−Grp−Urp−Grp−Crp−Tp−Tt−H(配列表の配列番号49)(CT−110)の合成
実施例1と同様にCT−110を合成した。
分子量:計算値:6490.05、測定値:6489.61
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Gp−Cp−Ap−Cp−Ap−Ap−Gp−Ap−Ap−Tp−Gp−Gp−Ap−Tp−Cp−Ap−Cp−Ap−Ap−Tp−Tt−H(配列表の配列番号50)(CT−105)の合成
実施例7と同様にCT−105を合成した。
分子量:計算値:6447.28、測定値:6447.58
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Tp−Tp−Gp−Tp−Gp−Ap−Tp−Cp−Cp−Ap−Tp−Tp−Cp−Tp−Tp−Gp−Tp−Gp−Cp−Tp−Tt−H(配列表の配列番号51)(CT−111)の合成
実施例7と同様にCT−111を合成した。
分子量:計算値:6384.19、測定値:6384.05
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Grp−Crp−Arp−Crp−Arp−Arp−Grp−Arp−Arp−Urp−Grp−Grp−Arp−Urp−Crp−Arp−Crp−Arp−Art−H(配列表の配列番号100)(CT−125)の合成
実施例1と同様にCT−125を合成した。
分子量:計算値:6114.82、測定値:6114.59
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157の配列を含む。
HO−Urp−Urp−Grp−Urp−Grp−Arp−Urp−Crp−Crp−Arp−Urp−Urp−Crp−Urp−Urp−Grp−Urp−Grp−Crt−H(配列表の配列番号101)(CT−126)の合成
実施例1と同様にCT−126を合成した。
分子量:計算値:5953.54、測定値:5953.38)。
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No. NM_001904.3)のヌクレオチド番号3139−3157に相補的な配列を含む。
HO−Grp−Grp−Arp−Crp−Arp−Arp−Grp−Grp−Arp−Arp−Grp−Crp−Urp−Grp−Crp−Arp−Grp−Arp−Arp−Tp−Tt−H(配列表の配列番号115)(CT−165)の合成
実施例1と同様にCT−165を合成した。
分子量:計算値:6818.28、測定値:6818.27
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号2137−2155の配列を含む。
HO−Urp−Urp−Crp−Urp−Grp−Crp−Arp−Grp−Crp−Urp−Urp−Crp−Crp−Urp−Urp−Grp−Urp−Crp−Crp−Tp−Tt−H(配列表の配列番号116)(CT−166)の合成
実施例1と同様にCT−166を合成した。
分子量:計算値:6496.90、測定値:6496.99
塩基配列:ヒトβ−カテニン遺伝子(GenBank accession No.NM_001904.3)のヌクレオチド番号2137−2155に相補的な配列を含む。
上記、実施例及び参考例において合成したポリヌクレオチドを表1及び表2に示す組み合わせで、センス鎖及びアンチセンス鎖を300pmolずつ1つのチューブに入れて、減圧下乾燥し、30μLのsiRNA suspension buffer(QIAGEN)を加え、65℃、1分間加温した後、室温に5分間放置し、センス鎖及びアンチセンス鎖をアニーリングさせ、10μMの2本鎖ポリヌクレオチド溶液を得た。
(参考例13)Ambion社 Silencer Pre−designed siRNA, Gene Symbol: DDX3X, Locus ID: 1654 [Ambion] siRNA ID # 145804 より2本鎖RNAを購入して、使用した。以後DDX3 siRNA#5と呼ぶ。
(試験例1)
(1)トランスフェクション
ヒト大腸癌SW480細胞株(ヒト大腸腺癌由来)を、10% Fetal bovine serumを含むRPMI1640培地(Invitrogen)で培養した。100000cells/wellの濃度になるように、SW480の培養液を12穴プレートに播種し、一晩培養した。次に各ウェルにリポフェクション試薬HiPerFect Transfection Reagent(QIAGEN)を最終濃度0.5%、2本鎖ポリヌクレオチド溶液を最終濃度が、30、3、0.3、および0.03nM(または、30、3、1、0.3、0.1、および0.03nM)となるよう添加して、更に3日間培養を継続した。その後、培地を除いてPBS(Phosphate buffered saline)で細胞を洗浄後、5% 2−メルカプトエタノール含有Laemmli Sample Buffer 100μLを直接添加して細胞を溶解させた。細胞溶解液をチューブに回収後、100℃で5分間加熱して蛋白質を変性させた。2本鎖ポリヌクレオチドの構造及びそのヌクレオチド配列は図1、図2、図4、図6、図7、図8、図9、図13、図14、図16、図18、図20、図21に示している。
各サンプル(蛋白質量として1μg分)をポリアクリルアミドゲル電気泳動(5−20% グラジエントゲル)によって分離し、ニトロセルロース膜に電気的に転写した。5%スキムミルク液でブロッキング後、一次抗体としてウサギ抗β−カテニン抗体(Cell Signaling)を二次抗体としてHRP標識抗ウサギIgG抗体(GE Healthcare Life Sciences)を用いてβ−カテニン蛋白質を検出した。陰性対象としてβ−アクチン蛋白質を抗β−アクチンモノクローナル抗体(GE Healthcare Life Sciences)およびHRP標識抗マウスIgG抗体(GE Healthcare Life Sciences)を用いて検出した。各蛋白質の検出は、Western Lightning(PerkinElmer Life Sciences)を基質として使用した時に生じた化学発光によってHigh Performance Chemiluminescence Film(GE Healthcare Life Sciences)を感光させることで可視化して実施した。
(a)参考例として合成した2本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子発現抑制活性
2本鎖ポリヌクレオチドの全てのヌクレオチドがRNAからなるCT−106/CT−041の組み合わせからなる2本鎖ポリヌクレオチド(以下、2本鎖ポリヌクレオチドは、センス鎖、アンチセンス鎖の組み合わせのみで表すこともある。すなわち、例えば、CT−106/CT−041の組み合わせからなる2本鎖ポリヌクレオチドは、単に、「CT−106/CT−041」とも表す。)及び、2本鎖ポリヌクレオチドを構成するRNAの一部又は全てをDNAに置換した2本鎖ポリヌクレオチドCT−104/CT−110、CT−105/CT−111、CT−105/CT−041、CT−106/CT−111について実験を行った。これらの2本鎖ポリヌクレオチドの構造は図1に示している。
RNAを1つおきに2’−O−メチルRNAに置き換え、overhang部分はDNAとしたCT−001/CT−005(図2参照。)は、全てのヌクレオチドがRNAからなるCT−106/CT−041と同程度にヒトβ−カテニン遺伝子の発現を抑制していた(図3)。以後の実験では、CT−001/CT−005を、対照として利用した。
2本鎖ポリヌクレオチドCT−091/CT−092、CT−097/CT−092とCT−091/CT−098(図6参照。)についての実験結果を図10に示す。
2本鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖の中央部以外は、2’−O−メチルRNAまたはDNAであり、センス鎖の中央部を2’−O−メチルRNAに置き換えた2本鎖ポリヌクレオチド、CT−127/CT−092、CT−128/CT−092、CT−129/CT−092、CT−101/CT−092、CT−130/CT−092、CT−131/CT−092(図7参照。)についての結果を図10、11に示す。
2本鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖の中央部以外は、2’−O−メチルRNAまたはDNAであって、さらにセンス鎖の中央部にENAを導入した2本鎖ポリヌクレオチド、CT−112/CT−092、CT−114/CT−092、CT−132/CT−092、CT−133/CT−092、CT−134/CT−092、CT−115/CT−092、CT−135/CT−092、CT−137/CT−092(図8参照。)、CT−136/CT−092及びCT−138/CT−092(図16参照。)についての結果を図11、図12、及び図17に示す。
2本鎖ポリヌクレオチドCT−091/CT−092内の一部分をRNA、ENAまたは2’−O−メチルRNAに置き換えた2本鎖ポリヌクレオチドCT−102/CT−092、CT−091/CT−107、CT−091/CT−108(図2参照。)、CT−091/CT−116、CT−091/CT−117、CT−091/CT−118(図13参照。)、CT−113/CT−092、CT−115/CT−118(図14参照)のヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の解析結果を図3及び図15に示す。全ての2本鎖ポリヌクレオチドがCT−091/CT−092と同程度のヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性を示した。
2本鎖ポリヌクレオチドCT−091/CT−092及びそのoverhang部分を有していない2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/CT−109(図2参照。)の遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。図3に示すように、overhang部分を有しているCT−091/CT−092の方がoverhang持たないCT−103/CT−109よりもヒトβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制していた。このことは、2本鎖ポリヌクレオチドの設計においてoverhangが重要であることを示している。
2本鎖ポリヌクレオチドCT−091/CT−092、DNA及び2’−O−メチルRNAの配列の順番を変えたCT−119/CT−120、さらに、CT−091/CT−092及びCT−119/CT−120のセンス鎖、アンチセンス鎖を組み替えたCT−119/CT−092、CT−091/CT−120(図9参照。)のヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性を図12に示す。CT−119/CT−120、CT−119/CT−092及びCT−091/CT−120は、β−カテニン遺伝子の発現を抑制したが、CT−091/CT−092(図10参照。)の方がより強く遺伝子の発現を抑制していた。
試験例1と同様の方法で、以下のように2本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
(a)2本鎖ポリヌクレオチドのoverhang部分及び5’−リン酸基の有無による活性の比較
試験例1と同様の方法で2本鎖ポリヌクレオチドCT−091/CT−092、両鎖の3’末端にoverhang部分を有していない2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/CT−109、アンチセンス鎖のみ3’末端にoverhang部分を有するCT−103/CT−092、センス鎖のみ3’末端にoverhang部分を有するCT−091/CT−109、両鎖にoverhang部分を有しアンチセンス鎖5’末端にリン酸基を有する2本鎖ポリヌクレオチドCT−091/CT−149、及び、アンチセンス鎖の3’末端にoverhang部分を有しさらに5’末端リン酸基を有する2本鎖ポリヌクレオチドCT−091/CT−149(図22参照。)の遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
アンチセンス鎖の5’末端リン酸基を有する2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/CT−149は、アンチセンス鎖(CT−149)3’−overhang部分にDNAのTT2量体の配列を有する。アンチセンス鎖(CT−149)3’−overhang部分のDNAチミジン2量体を、ウリジン、チミジン、または2’−O−メチルウリジンで組み合わせうる2量体に変換した2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/CT−155、CT−103/CT−156、CT−103/CT−157、CT−103/CT−158、CT−103/CT−159、CT−103/CT−160、CT−103/CT−161、及び、CT−103/CT−162(図24参照。)の遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/CT−149のセンス鎖の3’−末端から1乃至3ヌクレオチドを欠損させた2本鎖ポリヌクレオチドCT−169/CT−149、CT−170/CT−149、及びCT−171/CT−149(図27参照。)の遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。図29に示すように、センス鎖の3’−末端から1ヌクレオチドを欠損させた2本鎖ポリヌクレオチドCT−169/CT−149は、CT−103/CT−149と同様にヒトβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制していた。しかしながら、センス鎖の3’−末端から2乃至3ヌクレオチドを欠損させた2本鎖ポリヌクレオチドCT−170/CT−149、及びCT−171/CT−149は、CT−103/CT−149と比較してヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が低下した。
アンチセンス鎖の5’末端リン酸基を有する2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/CT−157は、アンチセンス鎖(CT−157)の3’−overhang部分にチミジン、及び2’−O−メチルウリジンからなる2量体の配列を有する。アンチセンス鎖(CT−157)の3’−overhang部分2量体の配列を変換した2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/CT−204、CT−103/CT−205、CT−103/CT−206、CT−103/CT−207、CT−103/CT−208、及び、CT−103/CT−209(図31参照。)の遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/CT−157は、アンチセンス鎖(CT−157)の5’末端に2’−O−メチルウリジンを有する。アンチセンス鎖(CT−157)5’末端の2’−O−メチルウリジンの塩基部を変換した2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/CT−221、CT−103/CT−222、及び、CT−103/CT−223(図34参照。)の遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
アンチセンス鎖の5’末端リン酸基を有する2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/CT−157は、19塩基対の2本鎖構造を有する。センス鎖の5’末端及びアンチセンス3’末端から1塩基対を欠損させた2本鎖ポリヌクレオチドCT−172/CT−202、及び、センス鎖の3’末端及びアンチセンス鎖の5’末端から1塩基対を欠損させた2本鎖ポリヌクレオチドCT−169/CT−203(図36参照。)の遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
アンチセンス鎖の5’末端リン酸基を有する2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/CT−157は、末端の構造に着目すると、センス鎖−アンチセンス鎖が非対称になっている。即ち、2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/CT−157の場合、アンチセンス鎖は、5’末端にリン酸基を有し、3’末端overhang構造を有しているが、センス鎖では、5’末端にリン酸基を有さず、3’末端はoverhang構造を有さない。そこで、センス鎖に5’末端にリン酸基、及び、3’末端overhang構造を有するようにし、アンチセンス鎖に5’末端にリン酸基、及び、3’末端overhang構造を持たないようにした2本鎖ポリヌクレオチドCT−210/CT−211を合成し(図38参照。)、5’末端にリン酸基、及び、3’末端overhang構造を持たないアンチセンス配列による遺伝子発現抑制活性を調べた。図39に示すように、CT−210/CT−211は、CT−103/CT−157の場合と比較して若干の活性低下にとどまった。
非対称2本鎖ポリヌクレオチドCT−169/CT−157は、アンチセンス鎖(CT−157)の5’末端に2’−O−メチルウリジンを有する。アンチセンス鎖(CT−157)5’末端の2’−O−メチルウリジンをDNAに変換した2本鎖ポリヌクレオチドCT−169/CT−243、CT−169/CT−244、CT−169/CT−245、及び、CT−169/CT−226(図40参照。)の遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
非対称2本鎖ポリヌクレオチドCT−169/CT−157は、アンチセンス鎖の3’−overhang部分にチミジン、及び2’−O−メチルウリジンからなる2量体の配列を有する。アンチセンス鎖(CT−157)3’−overhang部分2量体の配列を変換した2本鎖ポリヌクレオチドCT−169/CT−205、CT−169/CT−247、CT−169/CT−248、及び、CT−169/CT−249(図42参照。)の遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
非対称2本鎖ポリヌクレオチドCT−169/CT−246は、アンチセンス鎖(CT−246)の5’末端にチミジンを有する。アンチセンス鎖(CT−246)3’−overhang部分2量体の配列を変換した2本鎖ポリヌクレオチドCT−169/CT−253、CT−169/CT−254、CT−169/CT−255、CT−169/CT−256、CT−169/CT−257、及び、CT−169/CT−258(図44参照。)の遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
(a)トランスフェクション試薬を用いない場合
健常人の末梢血単核球をFicoll−Paque密度勾配遠心分離により調製した。調製したヒト末梢血単核球(2×105 cells/well)は96穴プレートを用いて2本鎖ポリヌクレオチド存在下で24時間培養し、回収した上清中のIFN−αをELISA kit(Human IFN−α ELISA Kit、Pestka Biomedical Laboratories, Inc.)で測定した。各種2本鎖ポリヌクレオチドは、PolyI:C(Sigma−Aldrich):2μg/ml、imiquimod(Invivogen):10−5M、ssRNA40(Invivogen):2μg/ml、ssRNA41(Invivogen):2μg/ml、ODN 2336(Invivogen):10−5 M、ODN 2336 control(Invivogen):10−5 M、未修飾siRNA CT−106/041、2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/157、2本鎖ポリヌクレオチドCT−169/157:10−7−10−5 Mの溶液を用いた。
健常人の末梢血単核球をFicoll−Paque密度勾配遠心分離により調製した。調製したヒト末梢血単核球(1.1×106 cells/well)は24穴プレートを用いて2本鎖ポリヌクレオチド存在下で24時間培養し、回収した上清中のIFN−αをELISA kit(Human IFN−α ELISA Kit、Pestka Biomedical Laboratories, Inc.)で測定した。トランスフェクション試薬を用いる場合は、実施例及び参考例に記載の2本鎖ポリヌクレオチド(CT−103/157及びCT−169/157)及び(CT−106/041)を予めLipofectamine 2000(Invitrogen Corporation)と混和したものを細胞培養液に添加した。標準化合物は、PolyI:C(Sigma−Aldrich):2μg/ml、imiquimod(Invivogen):10−5M、ssRNA40(Invivogen):2μg/ml、ssRNA41(Invivogen):2μg/ml、ODN 2336(Invivogen):10−5M、ODN 2336 control(Invivogen):10−5Mの溶液を、トランスフェクション試薬を用いずに使用した。未修飾siRNA CT−106/041・2本鎖ポリヌクレオチドCT−103/157・2本鎖ポリヌクレオチドCT−169/157:10−7Mの溶液としてトランスフェクション試薬を用いて試験を行った。
2本鎖ポリヌクレオチド、CT−106/CT−041、CT−105/CT−111、CT−001/CT−005、CT−091/CT−092、CT−095/CT−096、CT−097/CT−098、CT−099/CT−100、CT−001/CT−092及びCT−104/CT−110(図18参照。)のそれぞれ50pmolをRNase One buffer (10mM Tris−HCl pH7.5, 5mM EDTA, 200mM DTT, 200mM sodium acetate,プロメガ)で総容量を14.5μLとし、5U RNase One(0.5μL、プロメガ)を加え、37℃で処理した。
試験例1と同様の方法で、以下のように2本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
(a)DNA及び2’−O−メチルRNA修飾位置の異なる非対称2本鎖ポリヌクレオチドによる活性の比較
2本鎖ポリヌクレオチドCT−169/CT−157、DNA及び2’−O−メチルRNA修飾の順番を変えたCT−288/CT−289、さらに、CT−169/CT−157及びCT−288/CT−289のセンス鎖、アンチセンス鎖を組み替えたCT−288/CT−157、CT−169/CT−289(図50参照。)のヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性を図51に示す。CT−288/CT−289及びCT−169/CT−289よりも、CT−169/CT−157及びCT−288/CT−157の方がより強く遺伝子の発現を抑制していた。
(b)ヒトβ−カテニン遺伝子の別の配列を標的とした2本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子発現抑制活性
試験例1及び2で用いた標的配列とは異なる配列をヒトβ−カテニン遺伝子内から選択し、2本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性を検討した。3’末端のoverhang部分がTTであって、残り全てのヌクレオチドがRNAからなるCT−165/CT−166(図52参照。)は、図53に示すように、ヒトβ−カテニン遺伝子の発現を抑制していた。2本鎖ポリヌクレオチドを2’−O−メチルRNAまたはDNAとしたCT−278/CT−279、CT−278/CT−280及びCT−278/CT−281は、CT−165/CT−166と同様にヒトβ−カテニン遺伝子の発現を抑制した。
(試験例6)
以下のように2本鎖ポリヌクレオチドによるDDX3遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
ヒト肺癌NCI−H322細胞株(ヒト細気管支肺胞上皮癌由来)を、10% Fetal bovine serumを含むRPMI1640培地(Invitrogen社製)中に200000cells/mLの濃度に調製した。そして、96穴平底プレート(Corning社製)に100μLずつ播種し、37℃、5.0%炭酸ガス下で1日間培養した。リポフェクション試薬Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen社製)を0.3μL、2本鎖ポリヌクレオチド溶液を最終濃度が、5nMとなるようにRPMI1640培地中で混合し、20分室温で静置した。各ウェルに混合液を添加して、さらに3日間培養を継続した。
トランスフェクション後、ウェルより培養上清を除いて、RNeasy Micro kit(QIAGEN社製)でmRNAを抽出した。リアルタイムPCRのためにDDX3に対するTaqManプローブ(Applied Biosystems社製)と、内部標準として、β―アクチンに対するTaqManプローブ(Applied Biosystems社製)、それからPCRに必要な薬剤を含むリアルタイムPCRキット(QIAGEN社製)を用いて次のようにmRNAの定量を行った。96穴PCRプレート(Applied Biosystems社製)1ウェルあたり、リアルタイムPCRキットに含まれるQuantiTect Probe RT−PCR Master Mixを10μL、RNase―Free Waterを4.8μL、QuantiTect RT Mixを0.2μL注入した。さらにTaqManプローブを1μL、抽出したmRNA溶液を4μL添加して総量を20μLとし、Mx3000P(STRATAGENE社製)にセットし、以下の条件でPCRを実施した。
逆転写反応 50℃、30分間
PCR初期活性化 95℃、15分間
PCR 94℃、15秒間
60℃、1分間
このPCRサイクルは48回繰り返した。検量線は、リポフェクション試薬のみで処理した細胞から抽出したmRNAをUV定量したもので作製した。検量線を元に、各トランスフェクタントのDDX3とβ―アクチンを定量し、DDX3量をβ―アクチン量で割った商をグラフにプロットした。リアルタイムPCRはN=3で実施し、グラフにはSEを示した(2本鎖ポリヌクレオチドの構造及びそのヌクレオチド配列は図1、図2、図4、図6、図7、図8、図9、図13、図14、図16、図18、図20、図21に示している。)
(3)リアルタイムPCR解析結果
ヒトDDX3遺伝子に対する2本鎖天然型ポリヌクレオチド(DDX3 siRNA#5)2本鎖ポリヌクレオチドによるヒトDDX3遺伝子の発現抑制活性をリアルタイムPCRにより検討した。2本鎖ポリヌクレオチドを2’−O−メチルRNAまたはDNAとしたDD−016/DD−017、DD−022/DD−017、DD−022/DD−023及びDD−022/DD−024(図54参照。)は、図56に示すように、2本鎖天然型ポリヌクレオチド(DDX3 siRNA#5)と同程度にヒトDDX3遺伝子の発現を抑制した。
Claims (11)
- 以下の式(a)乃至(d)からなる特徴を有する、式(IV)及び式(V)に示されるポリヌクレオチドからなる、2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩:
5’−(α−β)9−αp−λm−3’(IV)
5’−δs−(α−β)9−υn−3’(V)
(a)α及びβは異なってDNA又は2’−OMeRNA、δ及びλは同一又は異なってDNA又は2’−OMeRNA、υは同一又は異なってはDNA及び2’−OMeRNAから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す;
(b)pは0又は1の整数を示し、mはpが0のときは0であり、pが1のときは0〜5のいずれかの整数を示す。sは0又は1の整数を示し、nは0〜5のいずれかの整数を示す。;
(c)式(IV)で示されるポリヌクレオチドのうち、(α−β)9−αpは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる;
(d)式(IV)における(α−β)9と式(V)における(α−β)9は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。 - αがDNA、βが2’−OMeRNAであることを特徴とする、請求項1に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
- λm及びυnが同一又は異なってチミン塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有するDNA、又は、ウラシル塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有する2’−OMeRNAのいずれかであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
- mが0、nが2であることを特徴とする、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
- p及びmが0、sが1、nが2であることを特徴とする、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
- 2’−OMeRNAの任意の1〜4残基がENA又は2’,4’−BNA/LNAに置換されていることを特徴とする、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
- DNAの任意の1〜4残基がENA又は2’,4’−BNA/LNAに置換されていることを特徴とする、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
- 各ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合で結合していることを特徴とする、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
- 少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドの5’末端にリン酸基が付加されていることを特徴とする、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
- アンチセンス鎖の5’末端にリン酸基が付加されている、請求項1乃至9のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
- 請求項1乃至10のいずれか1項に記載の2本鎖ポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬。
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