TW201307376A - 經修飾之單股多核苷酸 - Google Patents

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Makoto Koizumi
Yasuhide Hirota
Makiko Nakayama
Mika Ikeda
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Abstract

本發明係提供對RNA分解酵素安定，具有RNA干擾作用之多核苷酸等。該多核苷酸係單股多核苷酸，其係以具有：對應於標的基因之正義股多核苷酸，及具有與該正義股多核苷酸互補之鹼基序列之反義股多核苷酸之雙股多核苷酸為來源，且具有：該反義股之5’末端及正義股之3’末端藉由在上述各端形成磷酸二酯構造之含有苯基之連結基而結合成之構造。

Description

經修飾之單股多核苷酸
本發明係關於具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之單股多核苷酸，該多核苷酸之使用，使用該多核苷酸抑制基因表現之方法，及含有該多核苷酸之醫藥等。
就阻礙細胞、組織、或個體內標的基因之表現之方法而言，有將雙股RNA導入該等細胞、組織、或個體內之手法。藉由雙股RNA之導入，與其序列具有同源性之mRNA將被分解，而阻礙標的基因之表現。該效果被稱為「RNA干擾」或「RNAi」。關於RNA干擾，最初係在線蟲中被發現(例如，參照非專利文獻1)，隨後在植物中亦被發現(例如，參照非專利文獻2)。
據報告在3’末端具有2核苷酸之垂懸體(overhang)且正義股及反義股分別包含21個核苷酸之雙股RNA(小型干擾RNA：siRNA)在脊椎動物之培養細胞中具有RNA干擾作用(例如，參照非專利文獻3)。siRNA雖然在基因功能之鑑定、有用物質生產用細胞株之篩選、參與疾病之基因之控制等上有用，但具有所謂容易被RNA分解酵素分解之性質(例如，參照非專利文獻4)。
對於RNA分解酵素安定之具有RNA干擾作用之雙股多核苷酸，據報告具有由DNA與2’-OMeRNA交互組合而成之核苷酸單元之雙股多核苷酸可代替構成siRNA之RNA(參照專利文獻1)。
關於siRNA之正義股，反義股之5’末端之修飾，有數個報告。據報告在正義股或反義股之5’末端具有6-胺基己基磷酸基之siRNA具有標的mRNA表現抑制活性(例如，參照非專利文獻5)。另一方面，據報告在反義股之5’末端具有相同的6-胺基己基磷酸基之siRNA沒有標的mRNA表現抑制活性(例如，參照非專利文獻6)。又，據報告雖然在正義股之5’末端具有3-胺基丙基磷酸基之siRNA具有標的mRNA表現抑制活性，但在反義股之5’末端具有3-胺基丙基磷酸基之siRNA沒有標的mRNA表現抑制活性(例如，參照非專利文獻7)。又，報告在反義股之5’末端具有同樣之6-胺基己基磷酸基或3-胺基丙基磷酸基之siRNA，與未經修飾之siRNA相比，雖然見到標的mRNA表現抑制活性之降低，但沒有完全喪失活性(例如，參照非專利文獻8)。
據報告在正義股或反義股之5’末端具有螢光黃(fluorescein)之siRNA中，具有標的mRNA表現抑制活性(例如，參照非專利文獻9)。據報告在正義股或反義股之5’末端具有類固醇或脂質之構造之siRNA中，在正義股之5’末端具有類固醇或脂質之構造之siRNA，具有抑制標的mRNA表現之活性(例如，參照非專利文獻8)。又，據報告在於反義股之5’末端具有藉由UV照射可脫離之鄰硝基苯甲基衍生物之情況，使用UV照射可控制標的mRNA表現抑制活性(例如，參照非專利文獻10)。
用包含約4核苷酸單元之環(loop)將正義股之3’末端及反義股之5’末端結合而成之siRNA成為單股多核苷酸，其被稱為短髮夾RNA(Short hairpin,shRNA)。莖(stem)部為19鹼基對之shRNA，與具有和其相同之鹼基序列之19鹼基對之siRNA相比，顯示活性降低(例如，參照非專利文獻9)。又，合成環(loop)內2個核苷酸用丙基磷酸單元等非核苷酸連結基置換且包含19個鹼基對之莖部之shRNA，並測定其之標的mRNA表現抑制活性，結果與未修飾shRNA相比未見到活性之提高(例如，參照非專利文獻9)。就正義股之3’末端及反義股之5’末端藉由非核苷酸連結基結合而成之siRNA而言，有使用鄰硝基苯甲基衍生物之例子(例如，參照非專利文獻8)。該藉由鄰硝基苯甲基衍生物結合而成之19鹼基對之siRNA，與未修飾siRNA相比，標的mRNA表現抑制活性降低。再者，以UV照射轉染有該siRNA之培養細胞10分鐘，並測定標的mRNA表現抑制活性，結果與未修飾siRNA相比，標的mRNA表現抑制活性降低。已知一種單股多核苷酸，其具有：反義股之5’末端及正義股之3’末端藉由在上述各端形成磷酸二酯構造之含有苯基之連結基而結合成之構造。
已知會參與RNAi活性之Argonaute蛋白質(Ago)與反義股之複合體之X光解析顯示反義股之5’末端之磷酸基及其近傍之核苷酸會強力地鍵結於Ago之PIWI結構域(domain)(例如，參照非專利文獻11)。據報告若將化學合成之siRNA導入細胞內，則正義股與反義股二者之5’末端將被磷酸化(例如，參照非專利文獻12)。據報告在人類之細胞中，RNA激酶hC1p1負責siRNA之5’-磷酸化(例如，參照非專利文獻13)。由於將5’末端經磷酸化之siRNA及5’末端未經磷酸化之siRNA導入細胞內並比較RNAi活性時，未見到在兩者之活性上有差異，所以認為5’末端未經磷酸化之siRNA在細胞內容易被磷酸化(例如，參照非專利文獻9)。
在使用正義股之3’末端及反義股之5’末端以環結合而成之shRNA之情況，在細胞內被Dicer或內切核酸酶(endonuclease)切斷，生成具有5’末端之磷酸基之反義股(例如，參照非專利文獻9)。由於在環內之2個核苷酸被丙基磷酸單元置換並包含19鹼基對之莖部之shRNA中，丙基磷酸單元具核酸酶(nuclease)耐性，所以預期在細胞內不會被Dicer或內切核酸酶切斷(例如，參照非專利文獻9)。又，在環中具鄰硝基苯甲基衍生物之19鹼基對之shRNA，雖然預期藉由UV照射將生成具有5’末端之磷酸基之反義股，但若考量到副作用及需送達至身體內部，則難以將UV照射應用於身體(例如，參照非專利文獻8)。目前不知道在不進行UV照射下，在細胞內可被Dicer或內切核酸酶切斷而生成具有5’末端之磷酸基之反義股，並且在環中具有只包含非核苷酸之連結基之包含19鹼基對以下之莖部之單股多核苷酸。
本發明者，為了取得具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之多核苷酸，進行深入研究，發現一種具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之單股多核苷酸，其來自具有對應於標的基因之正義股多核苷酸，及含與該正義股多核苷酸互補之鹼基序列之反義股多核苷酸之雙股多核苷酸，且具有：該反義股之5’末端及正義股之3’末端藉由在上述各端形成磷酸二酯構造之含有苯基之連結基而結合成之構造，而完成本發明。
先行技術文獻 專利文獻
專利文獻1　國際公開第2010/001909號公報
非專利文獻
非專利文獻1　Nature，1998年，第391卷，p.806-811
非專利文獻2　Science，1999年，第286卷，p.950-952
非專利文獻3　Nature，2001年，第411卷，p.494-498
非專利文獻4　Clinical Chemistry，2002年，第48卷，p.1647-1653
非專利文獻5　Molecular Cell，2002年，第10卷，p.537-548
非專利文獻6　Nucleic Acids Research，2003年，第31卷，p.2705-2716
非專利文獻7　Molecular Cell，2002年，第10卷，p.549-561
非專利文獻8　Oligonucleotides，2007年，第17卷，p.35-43
非專利文獻9　Antisense Nucleic Acid Drug Development，2003年，第13卷，p.83-105
非專利文獻10　Biochimicaet Biophysica Acta，2006年，第1758卷，p.394-403
非專利文獻11　Nature，2005年，第434卷，p.663-666
非專利文獻12　Cell，2001年，第107卷，p.309-321
非專利文獻13　Nature，2007年，第447卷，p.222-226
本發明之一課題為提供具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之多核苷酸。
本發明之一課題為提供對於RNA分解酵素安定之具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之多核苷酸。
本發明之另一課題為提供藉由上述多核苷酸抑制基因表現之方法。
本發明之再一課題為提供含有上述多核苷酸之醫藥品。
亦即，本發明包含：
(1)一種多核苷酸或其鹽，其係具有：對應於標的基因之正義股多核苷酸，及含與該正義股多核苷酸互補之鹼基序列之反義股多核苷酸之多核苷酸，該多核苷酸係該反義股多核苷酸之5’末端及該正義股多核苷酸之3’末端藉由在上述各端形成磷酸二酯構造之連結基而結合成之多核苷酸，該連結基具有下式所示之構造：
[化1]
式中，與苯基鍵結之氧原子鍵結於反義股之5’末端且形成磷酸二酯構造，R1、R2及R3之任一者表示下式所示之構造：-L1-(CH2)m-L2-L3-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→，式中，m表示0至4之整數，n1表示0至4之整數，n2表示0或2至10之整數，L1表示單鍵或-O-，L2表示單鍵或-CH(-NH-L4-R)-，L3係以與L2之鍵結做為基點，表示單鍵、-(C=O)-NH-、或-NH-(C=O)-，L3為單鍵以外者時，n2表示2至10之整數；L1及L2為單鍵，m為1，n1及n2為0時，L3-O→表示：-CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Ser、-CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Thr、-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Ser、或-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Thr，該等絲胺酸及羥丁胺酸之羥基部分係與正義股多核苷酸之3’末端之磷酸基鍵結，再者，絲胺酸及羥丁胺酸之胺基可經醯基取代，j表示0至2之整數，L4表示單鍵、-(C=O)-(CH2)k-NH-、或-(C=O)-(CH2)k-，k表示1至6之整數，R表示氫原子、碳數1至6之烷基、可為飽和或不飽和之碳數2至30之烴羰基、可為飽和或不飽和之碳數2至30之烴氧羰基；R1、R2及R3中之其餘2個，各自獨立地表示選自包含下列基之群之基：氫原子、可具有取代基之碳數1至8之烷基、可具有取代基之碳數1至8之烷氧基、鹵素原子、具有碳數1至9之烷基之烷羰胺基、及包含可具有取代基之碳數1至8之烷基之烷基羰基；
(2)於(1)中記載之多核苷酸或其鹽，其中R1及R3為氫原子；
(3)於(2)中記載之多核苷酸或其鹽，其中L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m與n2之和為3以上之整數；
(4)於(2)中記載之多核苷酸或其鹽，其中L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m與n2之和為8以上之整數；
(5)於(2)中記載之多核苷酸或其鹽，其中L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為0或2，n2為6以上之整數；
(6)於(2)中記載之多核苷酸或其鹽，其中L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為0或2，n2為6或8；
(7)於(2)中記載之多核苷酸或其鹽，其中L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為0或2，n2為8；
(8)於(1)中記載之多核苷酸或其鹽，其中R1及R3為氫原子，L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為2，n2為8；
(9)一種多核苷酸或其鹽，其係具有：對應於標的基因之正義股多核苷酸，及具有與該正義股多核苷酸互補之鹼基序列之反義股多核苷酸之多核苷酸，該多核苷酸係該反義股多核苷酸之5’末端及該正義股多核苷酸之3’末端在經由磷酸二酯鍵媒介下藉由連結基而結合成之多核苷酸，該多核苷酸具有下式所示之構造：
[化2]
式中，p表示0至4之整數，q表示4至10之整數，L5表示單鍵或-O-，L6係以與(CH2)p之鍵結為基點，表示-(C=O)-NH-、或-NH-(C=O)-，L5在苯環上之鍵結位置為對位或間位，L5為-O-時，p表示1至4之整數；
(10)在(9)中記載之多核苷酸或其鹽，其中p與q之和為3以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(11)在(9)中記載之多核苷酸或其鹽，其中p與q之和為8以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(12)在(9)中記載之多核苷酸或其鹽，其中p為0或2，q為6以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(13)在(9)中記載之多核苷酸或其鹽，其中p為0或2，q為6或8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(14)在(9)中記載之多核苷酸或其鹽，其中p為0或2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(15)在(9)中記載之多核苷酸或其鹽，其中p為2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(16)在(1)至(15)之任一項中記載之多核苷酸或其鹽，其中正義股多核苷酸包含以下之式(II)所示之多核苷酸，反義股多核苷酸包含以下之式(III)所示之多核苷酸，再者，具有以下(a)至(d)所示之特徴：
5’-(γ-β)9-γ-λt-3’(II)
5’-β-(γ-β)9-υu-3’(III)
(a)γ表示RNA，β表示2’-OMeRNA，λ及υ表示DNA；
(b)t及u為相同或相異，表示0~5之任一者整數；
(c)式(II)所示之多核苷酸之中，(γ-β)9-γ包含與標的基因相同之核苷酸序列；
(d)式(II)中之(γ-β)9-γ及式(III)中之β-(γ-β)9包含彼此互補之核苷酸序列；
(17)在(1)至(15)之任一項中記載之多核苷酸或其鹽，其中正義股多核苷酸包含以下之式(IV)所示之多核苷酸，反義股多核苷酸包含以下之式(V)所示之多核苷酸，再者，具有以下(a)至(d)所示之特徴：
5’-(α-β)9-αp-λt-3’(IV)
5’-δs-(α-β)9-υu-3’(V)
(a)α及β相異，表示DNA或2’-OMeRNA，δ及λ相同或相異，表示DNA或2’-OMeRNA，υ為相同或相異，表示選自DNA、RNA及2’-OMeRNA之任一核苷酸；
(b)p表示0或1之整數，於p為0時，t為0，於p為1時，t表示0~5之任一整數；s表示0或1之整數，u表示0~5之任一整數；
(c)式(IV)所示之多核苷酸之中，(α-β)9-αp包含與標的基因相同之核苷酸序列；
(d)式(IV)中之(α-β)9及式(V)中之(α-β)9包含彼此互補之核苷酸序列；
(18)在(1)至(15)之任一項中記載之多核苷酸或其鹽，其中正義股多核苷酸包含以下之式(VI)所示之多核苷酸，反義股多核苷酸包含以下之式(VII)所示之多核苷酸，再者，具有以下之(a)至(d)所示之特徴：
5’-β-(α-β)8-αp-λt-3’(VI)
5’-δs-(α-β)8-(α-β)-υu-3’(VII)
(a)α及β為相異，表示DNA或2’-OMeRNA，δ及λ為相同或相異，表示DNA或2’-OMeRNA，υ為相同或相異，表示選自DNA、RNA及2’-OMeRNA之任一核苷酸；
(b)p表示0或1之整數，於p為0時，t為0，於p為1時，t表示0~5之任一整數；s表示0或1之整數，u表示0~5之任一整數；
(c)式(VI)所示之多核苷酸之中，β-(α-β)8-αp包含與標的基因相同之核苷酸序列；
(d)式(VI)中之(α-β)8及式(VII)中之(α-β)8包含彼此互補之核苷酸序列；
(19)在(17)或(18)中記載之多核苷酸或其鹽，其中α為DNA，β為2’-OMeRNA；
(20)在(16)至(19)之任一項中記載之多核苷酸或其鹽，其中λt及υu為相同或相異，係具有胸腺嘧啶鹼基、腺嘌呤鹼基或鳥糞嘌呤鹼基之DNA，或者具有尿嘧啶鹼基、腺嘌呤鹼基或鳥糞嘌呤鹼基之2’-OMeRNA之任一者；
(21)在(16)至(20)之任一項中記載之多核苷酸或其鹽，其中t為0，u為2；
(22)在(17)至(20)之任一項中記載之多核苷酸或其鹽，其中p及t為0，s為1，u為2；
(23)在(17)至(20)之任一項中記載之多核苷酸或其鹽，其中p及t為0，s為0或1，u為2，υ2為DNA或2’-OMeRNA；
(24)在(1)至(15)之任一項中記載之多核苷酸或其鹽，其中正義股多核苷酸包含以下之式(VIII)所示之多核苷酸，反義股多核苷酸包含以下之式(IX)所示之多核苷酸，再者，具有以下之(a)至(c)所示之特徴：
5’-(α-β)9-3’(VIII)
5’-β-(α-β)9-(α-β)-3’(IX)
(a)α為DNA，β為2’-OMeRNA；
(b)式(IX)所示之多核苷酸之中，β-(α-β)9包含與標的基因互補之核苷酸序列；
(c)式(VIII)中之(α-β)9及式(IX)中之(α-β)9包含彼此互補之核苷酸序列；
(25)在(16)至(24)之任一項中記載之多核苷酸或其鹽，其中2’-OMeRNA之任意1~4個殘基可被ENA或2’,4’-BNA/LNA取代；
(26)在(16)至(25)之任一項中記載之多核苷酸或其鹽，其中DNA之任意1~4個殘基可被RNA、ENA或2’,4’-BNA/LNA取代；
(27)在(1)至(26)之任一項中記載之多核苷酸或其鹽，其中各核苷酸係以磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵來鍵結；
(28)一種醫藥，其含有在(1)至(27)之任一項中記載之多核苷酸或其鹽，做為有效成分；
(29)如在(28)中記載之醫藥，其係用於治療源自基因表現之疾病；
(30)一種標的基因之表現抑制方法，其係藉由將選自(1)至(29)之多核苷酸或其鹽投與至哺乳動物；
(31)一種試藥，其含有在(1)至(27)之任一項中記載之多核苷酸或其鹽；
(32)一種化合物或其鹽，其具有式(X)
[化3]
[式中，Tr表示羥基之保護基，p表示0至4之整數，q表示4至10之整數，L5表示單鍵或-O-，L6係以與(CH2)p之鍵結為基點，表示-(C=O)-NH-、或-NH-(C=O)-，L5在苯環上之鍵結位置為對位或間位]；
(33)在(32)中記載之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)氧雜蒽基(pixyl)、三苯甲基、乙醯基丙醯基(levulinyl)、或雙(三甲基矽烷基氧基)(環己基氧基)矽烷基；
(34)在(32)中記載之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p與q之和為3以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(35)在(32)中記載之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p與q之和為8以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(36)在(32)中記載之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為0或2，q為6以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(37)在(32)中記載之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為0或2，q為6或8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(38)在(32)中記載之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為0或2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(39)在(32)中記載之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(40)在(32)中記載之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(41)一種製造具有式(XI)之化合物之方法，該化合物係具有：對應於標的基因之正義股多核苷酸，及含與該正義股多核苷酸互補之鹼基序列之反義股多核苷酸之多核苷酸，該多核苷酸係該反義股多核苷酸之5’末端及該正義股多核苷酸之3’末端在經由磷酸二酯鍵媒介下藉由X而結合成之具有式(XI)
[化4]
之化合物[式中，W2’表示除去5’末端及3’末端之羥基之正義股多核苷酸，W1’-Y’表示除去5’末端及3’末端之羥基之反義股多核苷酸，X表示式(XII)
[化5]
[式中，p表示0至4之整數，q表示4至10之整數，L5表示單鍵或-O-，L6係以與(CH2)p之鍵結做為基點，表示-(C=O)-NH-或-NH-(C=O)-，L5在苯環上之鍵結位置為對位或間位，L5為-O-時，p表示1至4之整數]，末端之亞甲基鍵結於該正義股多核苷酸之3’末端並形成磷酸二酯鍵，與苯基鍵結之氧原子鍵結於該反義股多核苷酸之5’末端並形成磷酸二酯鍵]；
該方法包含下述步驟：
(i)使具有式Tr-O-X-H[式中，Tr表示羥基之保護基，X之-(CH2)q-鍵結於Tr-O-，與苯基鍵結之氧原子鍵結於氫]之化合物之羥基與具有式(XIII)
[化6]
或，式(XIV)
[化7]
[式中，R4表示2-氰基乙基、甲基、甲磺醯基乙基、2,2,2-三氯乙基、或4-氯苯基甲基，R5表示N-嗎啉基(morpholino)、二異丙基胺基、二乙基胺基、或二甲基胺基]之化合物反應，製造具有式(XV)
[化8]
之化合物之步驟；
(ii)藉由亞磷醯胺法，使在上述(i)中所得到之化合物與具有式HO-W1-Y-CPG[式中，W1-Y表示除去5’末端及3’末端之羥基且經保護之反義股多核苷酸，CPG表示具有能與多核苷酸鍵結之連結基之聚合物支撐體]之化合物反應，繼而，藉由亞磷醯胺法，製造式Tr1-O-W2-O-P(=O)(OR4)-O-[式中，Tr1表示羥基之保護基，W2表示除去5’末端及3’末端之羥基且經保護之正義股多核苷酸]之部分，而製得具有式(XVI)
[化9]
之化合物之步驟；及，
(iii)從CPG切出在上述(ii)中所得到之化合物，並進行保護基之除去步驟；
(42)在(41)中記載之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)氧雜蒽基、三苯甲基、乙醯基丙醯基、或雙(三甲基矽烷基氧基)(環己基氧基)矽烷基；
(43)在(41)中記載之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p與q之和為3以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(44)在(41)中記載之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p與q之和為8以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(45)在(41)中記載之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為0或2，q為6以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(46)在(41)中記載之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為0或2，q為6或8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(47)在(41)中記載之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為0或2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(48)在(41)中記載之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(49)在(41)中記載之方法，其中Tr及Tr1為4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；
(50)在(41)至(49)之任一項中記載之方法，其中R4為2-氰基乙基、甲基、甲磺醯基乙基、2,2,2-三氯乙基、或4-氯苯基甲基，R5為N-嗎啉基、二異丙基胺基、二乙基胺基、或二甲基胺基；
(51)在(41)至(49)之任一項中記載之方法，其中R4為2-氰基乙基或甲基，R5為N-嗎啉基或二異丙基胺基；
(52)在(41)至(49)之任一項中記載之方法，其中具有式(XIII)之化合物為氯(N-嗎啉基)甲氧基膦、氯(N-嗎啉基)氰乙氧基膦、氯(二異丙基胺基)甲氧基膦或氯(二異丙基胺基)氰乙氧基膦；
(53)在(41)至(49)之任一項中記載之方法，其中具有式(XIV)之化合物為雙(二異丙基胺基)氰乙氧基膦；
(54)一種選自下述之多核苷酸或其鹽：HO-Cp-Gm1p-Ap-Gm1p-Ap-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Am1p-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Um1p-Cp-Um1p-Cp-Gm1p-Tp-Um1t-H(HS-005)、HO-Cp-Am1p-Gp-Am1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-Tp-Gm1p-Gp-Gm1p-Tp-Gm1p-Cp-Um1p-Ap-Um1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Ap-Um1p-Ap-Gm1p-Cp-Am1p-Cp-Cm1p-Cp-Am1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Tp-Cm1p-Tp-Gm1p-Tp-Um1t-H(HS-006)、HO-Cp-Gm1p-Ap-Gm1p-Ap-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Am1p-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Um1p-Cp-Um1p-Cp-Gm1p-Ts-Um1t-H(HS-005s)、或者HO-Cp-Am1p-Gp-Am1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-Tp-Gm1p-Gp-Gm1p-Tp-Gm1p-Cp-Um1p-Ap-Um1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Ap-Um1p-Ap-Gm1p-Cp-Am1p-Cp-Cm1p-Cp-Am1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Tp-Cm1p-Tp-Gm1p-Ts-Um1t-H(HS-006s)[式中，Ap、Gp、Cp、Tp、Ts、Am1p、Gm1p、Cm1p、Um1p、Um1t表示具有下式所示之構造之核苷、或核苷酸：
[化10]
X之前方表示對應於標的基因之正義股多核苷酸，X之後方表示含有與該正義股多核苷酸互補之鹼基序列之反義股多核苷酸，X表示具有式(XVII)
[化11]
所示之構造之連結基，末端之亞甲基鍵結於該正義股多核苷酸之3’末端並形成磷酸二酯鍵，與苯基鍵結之氧原子鍵結於該反義股多核苷酸之5’末端並形成磷酸二酯鍵]。
(55)一種醫藥，其含有在(54)中記載之多核苷酸或其鹽，做為有效成分；
(56)在(55)中記載之醫藥，其係用於治療源自Hsp47基因之表現之疾病；
(57)在(56)中記載之醫藥，其中源自Hsp47基因之表現之疾病為纖維症；
(58)一種Hsp47基因之表現抑制方法，其係藉由將在(54)中記載之多核苷酸或其鹽投與至哺乳動物；
(59)一種試藥，其含有在(54)中記載之多核苷酸或其鹽。
藉由本發明，提供具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之多核苷酸。又，藉由本發明，提供對於選自RNA分解酵素、磷酸酯酶及外切核酸酶(exonuclease)之至少任一者安定且具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之多核苷酸。又，藉由本發明，提供對於RNA分解酵素、磷酸酯酶及外切核酸酶安定且具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之多核苷酸。又，藉由本發明，可在不需分別製造正義股多核苷酸及反義股多核苷酸之步驟，而且不需以使兩鏈成為同量之方式正確混合而形成雙股之煩雜操作下，提供具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之多核苷酸。可使用該多核苷酸解析各種基因之功能；又，可提供包含該多核苷酸之醫藥品。
又，藉由本發明，提供在得到該多核苷酸上有用的合成中間體。又，藉由本發明，提供該多核苷酸之製造方法。
1.用語之說明
在本說明書中，所謂的「標的基因」，在導入其之細胞、組織或個體(以下，將其稱為「被導入體」)中若為RNA，將無特別限制，其可為能轉譯成蛋白質之mRNA，也可為無法轉譯成蛋白質之非編碼RNA。就非編碼RNA而言，可列舉功能性RNA，例如，mRNA之非轉譯領域、tRNA、rRNA、mRNA型ncRNA(類似mRNA之非編碼RNA)、長鏈ncRNA(長鏈非編碼RNA)、snRNA(小型核RNA)、snoRNA(小型核仁RNA)、miRNA(顯微RNA)等。具體而言，該RNA在待導入之被導入體中可為內在性者，亦可為藉由基因導入等手法導入之外來性者。又，可為存在於染色體上之基因，亦可為在染色體外者。就外來性之基因而言，雖可列舉如：來自可感染被導入體之病毒、細菌、真菌或原生動物者，但非限制於該等。關於基因之功能，可為已知者，也可為未知者。
就此等標的基因之例子而言，可列舉在具有特定疾病之患者中特異性地表現上昇及/或特異性地變異之基因，此等疾病例如為：中樞疾病(例如，阿茲海默症、痴呆、攝食障礙等)、炎症性疾病(例如過敏、風濕症、變形性關節症、紅斑性狼瘡等)、循環器官疾病(例如、高血壓症、心臟肥大、狹心症、動脈硬化症、高膽固醇血症等)、癌(例如非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、胰臟癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌等)、呼吸器官疾病(例如肺炎、支氣管炎、氣喘、慢性阻塞性肺疾病等)、糖尿病、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎病、貧血(例如伴隨慢性疾病之貧血、鐵不耐受性鐵缺乏性貧血等)、年齡相關性黃斑變性症、免疫系疾病(例如、克隆氏病(Crohn’s disease)、異位性皮膚炎、自體免疫疾病、免疫缺陷、白血病等)、肝臟‧膽囊疾病(例如非酒精性脂肪性肝炎、肝硬變、肝炎、肝功能衰竭、膽汁鬱滞症、結石等)、消化道疾病(例如、潰瘍、腸炎、吸收不良等)、感染症、肥胖、纖維症(肺纖維症、肝纖維症、腎纖維症、骨髓纖維症等)；關於此等疾病之原因基因，雖可列舉如：紡錘體驅動蛋白(kinesin spindle protein(KSP))、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor、(VEGF))、運甲狀腺素蛋白(transthyretin(TTR))、前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisn/kexin type 9(PCSK9))、polo樣激酶(polo-like kinase(PLK))、ApoB-100、核醣核苷酸還原酶M2亞單元(ribonucleotide reductase M2 subunit(RRM2))、成簇蛋白(clusterin)、熱激蛋白(heat shock protein 27(Hsp27))、生存素(survivin)、真核起始因子-4E(eukaryotic initiation factor-4E(eIF-4E))、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion moleculel(ICAM-1))、間白素4受體之α亞單位(alpha subunit of the interleukin 4 receptor(IL-4R-alpha))、因子XI、因子VII、N-ras、H-ras、K-ras、bcl-2、bcl-xL、Her-1、Her-2、Her-3、Her-4、MDR-1、人類β-連環素(β-catenin)基因、DDX3(DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)箱型多肽3、X-鍵連)、髓樣細胞白血病序列1(myeloid cell leukemia sequence 1(MCL1))基因、PKR(Eif2ak2)、Hsp47(Serpinh1)、人鐵調素(Hepcidin)、活性化蛋白質C(APC)、生存素(survivin)、轉錄之信息傳遞及活化子(STAT3)，但不限於此等基因。
在本說明書中，所謂「天然型之核苷」係指2’-去氧腺苷、2’-去氧鳥苷、2’-去氧胞苷、2’-去氧-5-甲基胞苷、胸苷等2’-去氧核苷；腺苷、鳥苷、胞苷、5-甲基胞苷、尿苷等核糖核苷。又，所謂「寡核苷酸」係指由核苷之糖部分與磷酸形成酯之化合物所構成之寡核苷酸。在本說明書中，寡核苷酸及多核苷酸係以相同之意義來使用。
在本說明書中，有時亦將2’-去氧腺苷以At表示，將2’-去氧鳥苷以Gt表示，將2’-去氧胞苷以Ct表示，將2’-去氧-5-甲基胞苷以5meCt表示，將胸苷以Tt表示，將2’-去氧尿苷以Ut表示，將腺苷以Art表示，將鳥苷以Grt表示，將胞苷以Crt表示，將5-甲基胞苷以5meCrt表示，將尿苷以Urt表示。又，在本說明書中，有時亦將2’-去氧腺苷酸以Ap表示，將2’-去氧鳥苷酸以Gp表示，將2’-去氧胞苷酸以Cp表示，將2’-去氧-5-甲基胞苷酸以5meCp表示，將胸苷酸以Tp表示，將2’-去氧尿苷酸以Up表示，將腺苷酸以Arp表示，將鳥苷酸以Grp表示，將胞苷酸以Crp表示，將5-甲基胞苷酸以5meCrp表示，將尿苷酸以Urp表示。
在本說明書中，關於以硫代磷酸酯代替核苷酸之磷酸酯而成之硫代磷酸酯，對應於Ap者以As表示，對應於Gp者以Gs表示，對應於Cp者以Cs表示，對應於5meCp者以5meCs表示，對應於Tp者以Ts表示，對應於Up者以Us表示，對應於Arp者以Ars表示，對應於Grp者以Grs表示，對應於Crp者以Crs表示，對應於5meCrp者以5meCrs表示，對應於Urp者以Urs表示。
在本說明書中，所謂「糖修飾核苷」係指核苷之糖部分經過修飾之核苷。
其中，就2’-O-甲基修飾之例子而言，有2’-O-甲基核苷及2’-O-甲基核苷酸，對應於Art者以Am1t表示，對應於Grt者以Gm1t表示，對應於Crt者以Cm1t表示，對應於5meCrt者以5meCm1t表示，對應於Urt者以Um1t表示，對應於Arp者以Am1p表示，對應於Grp者以Gm1p表示，對應於Crp者以Cm1p表示，對應於5meCrp者以5meCm1p表示，對應於Urp者以Um1p表示，對應於Ars者以Am1s表示，對應於Grs者以Gm1s表示，對應於Crs者以Cm1s表示，對應於5meCs者以5meCm1s表示，對應於Urs者以Um1s表示。
本說明書中所謂2’-O,4’-C-伸乙基核苷酸單元及「ENA單元」係指上述各核苷、各核苷酸之中，具有ENA者，有時亦以下述方式來表示具有ENA單元之核苷及核苷酸：將對應於A者稱為A2t，對應於Ap者稱為Ae2p，對應於As者稱為Ae2s，對應於Gt者稱為G2t，對應於Gp者稱為Ge2p，對應於Gs者稱為Ge2s，對應於5meCt者稱為C2t，對應於5meCp者稱為Ce2p，對應於5meCs者稱為Ce2s，對應於Tt者稱為T2t，對應於Tp者稱為Te2p，對應於Ts者稱為Te2s。
在本說明書中所謂2’-O,4’-C-亞甲基核苷酸單元及「2’,4’-BNA/LNA單元」係指上述之各核苷、各核苷酸之中，具有2’,4’-BNA/LNA者，有時亦以下述方式來表示具有2’,4’-BNA/LNA單元之核苷及核苷酸：將對應於At者稱為A1t，對應於Ap者稱為Ae1p，對應於As 稱為Ae1s，對應於Gt者稱為G1t，對應於Gp者稱為Ge1p，對應於Gs者稱為Ge1s，對應於5meCt者稱為C1t，對應於5meCp者稱為Ce1p，對應於5meCs者稱為Ce1s，對應於Tt者稱為T1t，對應於Tp者稱為Te1p，對應於Ts者稱為Te1s。
以下展現各核苷酸之構造式。
[化12]
[化13]
[化14]
[化15]
[化16]
[化17]
在本說明書中之多核苷酸或其鹽，其特徵為以具有對應於標的基因之正義股多核苷酸，及含有與該正義股多核苷酸互補之鹼基序列之反義股多核苷酸之雙股多核苷酸為來源，並且具有：該反義股之5’末端及正義股之3’末端藉由在上述各端形成磷酸二酯構造之具下述構造式所示構造之連結基而結合成之單股構造。亦即，形成多核苷酸-3’-P(=O)(OH)-[連結基]-P(=O)(OH)-5’-多核苷酸之構造[其中，『多核苷酸-3’』表示不具有多核苷酸之3’末端之羥基上之氫原子之構造，『5’-多核苷酸』表示不具有多核苷酸之5’末端之羥基上之氫原子之構造]。
該連結基含有苯基，與該苯基鍵結之氧原子部分，即在下述化18之構造式中所明示之氧原子，為與反義股之5’末端鍵結之部分，其在5’末端藉由形成磷酸二酯鍵而鍵結。該苯基進一步具有R1、R2及R3，其中之一為與正義股之3’末端鍵結之部位並藉由形成磷酸二酯鍵而鍵結。再者，R1、R2及R3與苯基之鍵結可經由氧原子中介，該等氧原子非為與反義股之5’末端鍵結之部位。該連結基之構造如下述。
[化18]
式中，所明示之與苯基鍵結之氧原子鍵結於反義股之5’末端而形成磷酸二酯構造；R1、R2及R3之任一者表示下式所示之構造：-L1-(CH2)m-L2-L3-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→，[式中，m表示0至4之整數，n1表示0至4之整數，n2表示0或2至10之整數，L1表示單鍵或-O-，L2表示單鍵或-CH(-NH-L4-R)-，L3表示單鍵、-(C=O)-NH-或-NH-(C=O)-，但是，L3表示單鍵以外者時，n2表示2至10之整數；L1及L2為單鍵且m為1，n1及n2為0時，L3-O→表示：-CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Ser、-CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Thr、-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Ser、或-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Thr，其中，該等絲胺酸或羥丁胺酸之羥基部分與正義股多核苷酸之3’末端之磷酸基鍵結形成磷酸二酯構造，j表示0至2之整數；L4表示單鍵、-(C=O)-(CH2)k-NH-、或-(C=O)-(CH2)k-，k表示1至6之整數，R表示氫原子、碳數1至6之烷基、可為飽和或不飽和之碳數2至30之烴羰基、可為飽和或不飽和之碳數2至30之烴氧羰基]；R1，R2及R3之中之其餘2個各自獨立地表示選自包含下列基之群之基：氫原子、可具有取代基之碳數1至8之烷基、可具有取代基之碳數1至8之烷氧基、鹵素原子、具有碳數1至9之烷基之烷羰胺基，及含有可具取代基之碳數1至8之烷基之烷基羰基。
在連結基所包含之苯基中雖然存在R1、R2及R3，不過此等基以「其中1個具有連結基功能，成為與正義股之3’末端鍵結之部位，並在構造上形成磷酸二酯構造」為特徴。其餘2個沒有連結基功能，僅為苯基上之取代基。
接下來說明具有連結基功能之構造之中除了苯基部分以外之部分，亦即，-L1-(CH2)m-L2-L3-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→。
L1為單鍵，或者為2價氧原子-O-。
L2為單鍵，或為在亞甲基之碳原子上具有胺基之構造，該胺基可具有取代基。該胺基經由連結基構造L4媒介而具有取代基R。
L4為單鍵，或者為亞甲基或碳數2至4之聚亞甲基，或者為-(C=O)-CH2-CH2-(C=O)-O-構造。-(C=O)-CH2-CH2-(C=O)-O-構造之羰基在構造式之左端與胺基鍵結，形成-NH-(C=O)-CH2-CH2-(C=O)-O-之構造。
R為碳數1至6之烷基時，該烷基可為直鏈狀、分枝鏈狀之任一種。可列舉如：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基、戊基、己基等。
R為碳數1至6之烷基時，其可為直鏈狀或分枝鏈狀之任一種。可列舉如：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基、戊基、己基等。
R為飽和或不飽和之碳數2至30之烴羰基(烴基-(C=O)-)時，或為飽和或不飽和之碳數2至30之烴氧羰基(烴基-O-(C=O)-)時，該等烴基部分可為直鏈狀或分枝鏈狀。又，烴基可為飽和，也可為不飽和。就此等烴基而言，可列舉從脂肪族烴導出之基。該烴基例如為碳數可達30之烷基。此外，該烷基內之碳碳鍵可成為雙鍵而成為不飽和之烷類。再者，該烴基部分可包含不飽和鍵結，且成為稠合環狀構造。就此等環狀烴基而言，可列舉膽固醇基：
L3為單鍵，或者成為-(C=O)-NH-或-NH-(C=O)-之構造。L3，左端與L2鍵結，視情況場合有時亦可與化8所示之苯基直接鍵結。再者，L3非為單鍵時，即L3為-(C=O)-NH-或-NH-(C=O)-時，鍵結於該等之下述構造中，亞甲基或聚亞甲基必須存在。亦即，在此情況中n2不得為0。
-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→為鍵結在L3之右端之構造。二亞甲基氧構造可為1個(n1=1)，或者以其為1單元使重複之2至4個(n1=2~4)單元鍵結而成。再者，視情況有時亦可不存在二亞甲基氧構造。二亞甲基氧構造，以重複2或3個者為較佳。亦即，n1係以2或3為較佳。更佳地，二亞甲基氧構造為2個，即n1以為2為更佳。
在該二亞甲基氧構造之右端，雖然可鍵結亞甲基或達9個亞甲基所構成之聚亞甲基，但有時可不存在該亞甲基或聚亞甲基。就亞甲基或聚亞甲基而言，以聚亞甲基為較佳。於存在聚亞甲基之情況，鏈長以碳數計，以成為2至10者為較佳。聚亞甲基鏈，以鏈長越長者為越佳，以碳數5以上之聚亞甲基鏈為較佳。以碳數7以上之聚亞甲基鏈為更佳。
二亞甲基氧構造與亞甲基或聚亞甲基可混合存在，在此情況，就鏈長而言，只要原子數為約2至10者即可。
L1及L2為單鍵，m為1且n1及n2為0時，-L1-(CH2)m-L2-L3-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→部分成為-CH2-L3-O→，該L3-O→表示：-CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Ser、-CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Thr、-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Ser、或-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Thr之各個構造。
該各構造雖然為多肽，不過只要該多肽之一端為酪胺酸，另一端為含羥基之胺基酸即可。再者，酪胺酸之苯基，為與5’末端之磷酸二酯構造鍵結之部位，另一端之胺基酸之羥基部分，則為與3’末端之磷酸二酯構造鍵結之部位。與3’末端鍵結之胺基酸只要為含有羥基之胺基酸，將可為任一種，即可為絲胺酸或羥丁胺酸。再者，該絲胺酸及羥丁胺酸之胺基可經醯基取代。該醯基可為苯基羰基或烷基羰基。苯基羰基之苯基可經碳數1至6之烷基、碳數1至6之烷氧基、鹵素原子等取代。烷基羰基之烷基只要為碳數1至6之烷基即可，其可為直鏈狀或分枝鏈狀，且可經碳數1至6之烷氧基、鹵素原子等進一步取代。此等醯基之中，以烷基羰基為較佳，以乙醯基為特佳。
例如，←O-Ph-CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Ser之構造為絲胺酸，或以絲胺酸為末端之多肽鍵結於酪胺酸之胺基而成之構造。該肽構造，如←O-Ph-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Ser般，可在酪胺酸之羧基末端形成多肽。
形成多肽之胺基酸可為L-型、D-型、DL-型之任一種。
就多肽而言，可為二肽至四肽。鍵結在酪胺酸與絲胺酸或羥丁胺酸之中間之胺基酸無特別限制，可為甘胺酸、丙胺酸、β-丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、絲胺酸、羥丁胺酸、酪胺酸、天冬胺酸、麩胺酸等胺基酸。就胺基酸而言，較佳者為甘胺酸、丙胺酸、β-丙胺酸。鍵結於酪胺酸與絲胺酸或羥丁胺酸之中間之二胺基酸無特別限制，只要為包含上述胺基酸之二胺基酸即可。就胺基酸而言，較佳者為甘胺酸-甘胺酸、甘胺酸-丙胺酸、甘胺酸-β-丙胺酸、丙胺酸-甘胺酸、丙胺酸-丙胺酸、丙胺酸-β-丙胺酸、β-丙胺酸-甘胺酸、β-丙胺酸-丙胺酸、β-丙胺酸-β-丙胺酸。
存在於構成連結基之苯基上之R1、R2及R3中之任一者為-L1-(CH2)m-L2-L3-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→所示之構造且具有連結基功能。R1、R2及R3內之2個為苯基上之取代基。就此等取代基而言，只要為選自包含下列之群之基即可：氫原子、可具有取代基之碳數1至8之烷基、可具有取代基之碳數1至8之烷氧基、鹵素原子、具有碳數1至9之烷基之烷羰胺基，及可具有取代基之包含碳數1至8之烷基之烷基羰基。
R1、R2及R3中之2個為可具有取代基之碳數1至8之烷基時，烷基可為直鏈狀或分枝鏈狀之任一者。可列舉如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基、戊基、己基、庚基、辛基等。烷基具有取代基時，該取代基為選自包含羥基、胺基、鹵素原子、碳數1至6之烷硫基、碳數1至6之烷氧基、羧基、含有碳數1至6之烷氧基之烷氧基羰基之群組中之1個或1個以上之基。在取代基為1個以上之情況，可為相同或相異。羥基或胺基為烷基之取代基時，該等以取代在烷基之末端之碳原子上為更佳。就含有羥基之烷基而言，以羥基甲基，2-羥基乙基，2-羥基丙基，3-羥基丙基為較佳。在以鹵素原子做為烷基之取代基之情況，烷基雖然可為碳數1至6之直鏈狀或分枝狀之任一者，但以甲基或乙基上具有鹵素原子者為更佳，以甲基為特佳。鹵素原子為烷基之取代基時，鹵素原子以氟原子為較佳。氟原子之數目可為單取代至全氟取代之任一者。可例示單氟甲基、二氟甲基、三氟甲基及2,2,2-三氟乙基。以單氟甲基、二氟甲基及三氟甲基為較佳。就碳數1至6之烷硫基及碳數1至6之烷氧基而言，可為直鏈狀或分枝鏈狀之任一者，可列舉如：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基等。羧基或含有碳數1至6之烷氧基之烷氧基羰基為烷基之取代基時，以該等取代在烷基之末端碳原子上為更佳。含有碳數1至6之烷氧基之烷氧基羰基之烷基可為直鏈狀或分枝鏈狀之任一者，可列舉如：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基等。
R1、R2及R3中之2個為可具有取代基之碳數1至8之烷氧基時，該烷氧基只要為包含在上文中所示之烷基及氧原子之烷氧基即可。
在R1、R2及R3中之2個為鹵素原子之情況，只要為氟原子、氯原子、溴原子、或碘原子即可。此等之中，以氯原子或氟原子為較佳，以氟原子為更佳。
R1、R2及R3中之2個為可具有取代基之包含碳數1至9之烷基之烷基羰基(脂肪族醯基)時，該烷基部分只要為包含在上文中所示之碳數1至8之烷基之碳數可達9之烷基即可，烷基羰基只要為包含此等烷基及羰基者即可。烷基羰基係以乙醯基為較佳。
就R1、R2及R3而言，以R1及R3為氫原子，且R2為-L1-(CH2)m-L2-L3-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→所示之連結基構造為較佳。
再者，R1及R3為氫原子時，以下述組合為較佳：L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，且m與n2之和為3以上之整數；L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，且m與n2之和為8以上之整數；L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為0或2，且n2為6以上之整數；L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為0或2，且n2為6或8；L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為0或2，且n2為8；L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為2，且n2為8。
在本說明書中，亦將上述之以具有對應於標的基因之正義股多核苷酸，及含與該正義股多核苷酸互補之鹼基序列之反義股多核苷酸之雙股多核苷酸為來源，以具有該反義股之5’末端及正義股之3’末端藉由在上述各端形成磷酸二酯構造之具下述構造式所示構造之連結基而結合成之單股構造為特徴，而形成多核苷酸-3’-P(=O)(OH)-[連結基]-P(=O)(OH)-5’-多核苷酸之構造之多核苷酸稱為「3L5-多核苷酸」。
就3L5-多核苷酸而言，以具有下式所示之構造之多核苷酸為較佳。
[化20]
式中，p表示0至4之整數，q表示4至10之整數，L5表示單鍵或-O-，L6以與(CH2)p之鍵結為基點，表示-(C=O)-NH-、或-NH-(C=O)-，L5在苯環上之鍵結位置為對位或間位，L5為-O-時，p表示1至4之整數。
再者，以下述組合為更佳：p與q之和為3以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，且L5在苯環上之鍵結位置為對位；p與q之和為8以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；p為0或2，q為6以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；p為0或2，q為6或8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；p為0或2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；p為2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位；在本說明書中，所謂「互補之核苷酸」係指核苷酸之鹼基部分為互補之核苷酸，例如，鹼基部分為腺嘌呤與胸腺嘧啶、鳥糞嘌呤與胞嘧啶，鳥糞嘌呤與5-甲基胞嘧啶及腺嘌呤與尿嘧啶之核苷酸為彼此互補之核苷酸。
在本說明書中，所謂「互補之核苷酸序列」除了包含相對於對象之核苷酸序列，全部為由互補之核苷酸所構成之核苷酸序列之外，亦包含雖然1或數個核苷酸非為互補之核苷酸，但多數核苷酸與對象核苷酸序列形成鹼基對之核苷酸序列。
在本說明書中，所謂之多核苷酸之雙股構造亦係指：2種多核苷酸之彼此互補之核苷酸序列之間形成沃森-克里克鹼基對(Watson-Crick base pair)而具有雙股構造者，以及在單股多核苷酸之內部互補之序列之間形成沃森-克里克鹼基對而在單股多核苷酸內部中具有雙股構造者。
在本說明書中之3L5-多核苷酸雖然為互補之核苷酸之間形成沃森-克里克鹼基對，而形成有雙股構造之單股多核苷酸，但非全部之多核苷酸均形成沃森-克里克鹼基對也可。
在本說明書中，構成3L5-多核苷酸之多核苷酸之中，將包含與標的基因相同之核苷酸序列者稱為對應於標的基因之隨從鏈(passenger strand)或正義股，將包含與標的基因互補之核苷酸序列者稱為對應於標的基因之引導鏈(guide strand)或反義股。對應標的基因之反義股具有與標的基因之mRNA互補之核苷酸序列。
在本說明書中，標的基因「包含與標的基因相同之核苷酸序列」係指包含與標的基因之至少一部分之核苷酸序列相同之序列，亦即3L5-多核苷酸，除了包含完全相同之序列之外，只要對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，亦包含實質相同之序列。「包含與標的基因互補之核苷酸序列」係指包含與標的基因之至少一部分之核苷酸序列互補之序列，亦即除了包含完全互補之序列之外，只要對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，3L5-多核苷酸亦包含實質相同之序列。又，在已知標的基因具有SNPs等之情況，具有此等變異之序列亦包含於相同核苷酸序列中。在本說明書中，將包含與標的基因互補之核苷酸序列且對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之多核苷酸稱為「對抗標的基因之多核苷酸」。
對抗標的基因之3L5-多核苷酸之核苷酸序列，只要對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，將無特別限制，例如，可藉由使用電腦軟體(例如，GENETYX(登錄商標)：GENETYX COORPORATION製等)並根據預測對標的基因具有RNA干擾作用之序列來決定正義股及反義股之序列而決定，並且亦可進一步藉由確認根據所選擇之序列製作之3L5-多核苷酸之RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用而決定。
在本說明書中，所謂基因表現抑制作用，除了完全抑制基因表現之作用之外，亦包含與對照組相比減少基因表現之作用，基因靜默(gene silencing)亦包含於基因表現抑制作用中。又，在本說明書中，基因表現抑制作用與基因表現抑制活性係當作相同意義來使用。
RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，雖然可用本技術人士通常進行之方法來確認，例如，可藉由將對抗標的基因之3L5-多核苷酸投與至會表現標的基因之細胞，經過一定時間後，藉由西方點漬法(western blot)解析定量為標的基因之轉譯產物之蛋白質，然後藉由將蛋白質之表現量與對照組比較可以確認。又，亦可藉由以即時(real-time)PCR之手法，即時測定投與對抗標的基因之單股多核苷酸後之標的基因之表現量來確認。
所謂具有與標的基因之至少一部分核苷酸序列相同或實質相同之序列之多核苷酸，係包含與標的基因之核苷酸序列中之任何部分之18個核苷酸以上之序列相同或實質上相同之序列之多核苷酸。其中，所謂「實質上相同之序列」係指與標的基因之核苷酸序列有70%以上，較佳80%以上，更佳90%以上之同源性(homology)之序列。核苷酸序列之同源性，可用BLAST(註冊商標)等習知之基因解析軟體來計算。
在隨附於本說明書之序列表中，在各序列之＜223＞之項目中，“cm”表示2’-O-甲基胞苷(2’-O-Methylcytidine)，“um”表示2’-O-甲基尿苷(2’-O-Methyluridine)，“gm”表示2’-O-甲基鳥苷(2’-O-Methylguanosine)。
2. 3L5-多核苷酸
構成本發明中之3L5-多核苷酸之正義股及反義股之鏈長，只要具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，從18個核苷酸至包含標的基因之開啟讀碼框(open reading frame)(ORF)全長之長度皆可。就正義股而言，以18~21之鏈長者為較佳，以18~19之鏈長者為更佳。就反義股而言，以19~21之鏈長者為較佳，以21鏈長者為更佳。3L5-多核苷酸無需其全體皆為雙股構造，亦包含5’及/或3’末端一部分突出者，其突出末端為1~5個核苷酸，以1~3個核苷酸為較佳，以2個核苷酸為更佳。又，就最佳例而言，可列舉：反義股之多核苷酸之3’末端具有2個核苷酸突出之構造(垂懸體構造)，並形成18個鹼基對之多核苷酸。
3L5-多核苷酸具有選自下述(a)~(h)之至少一種性質：
(a)對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用；
(b)對RNA分解酵素為安定，且對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用；
(c)對於磷酸酯酶為安定，且對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用；
(d)對於外切核酸酶為安定，且對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用；
(e)對於RNA分解酵素、磷酸酯酶及外切核酸酶為安定，且對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用；
(f)反義股對於磷酸酯酶為安定，且對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用；
(g)反義股對於外切核酸酶為安定，且對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用；
(h)反義股對於5’-3’外切核酸酶為安定，且對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用。
2-1.
就3L5-多核苷酸之一例而言，可列舉一種多核苷酸，其特徵為：以具有對應於標的基因之正義股多核苷酸，及含有與該正義股多核苷酸互補之鹼基序列之反義股多核苷酸之雙股多核苷酸為來源，並且具有：該反義股之5’末端及正義股之3’末端藉由在上述各端形成磷酸二酯構造之具下述構造式所示構造之連結基而結合成之單股構造，亦即，形成多核苷酸-3’-P(=O)(OH)-[連結基]-P(=O)(OH)-5’-多核苷酸之構造[其中，『多核苷酸-3’』表示不具有多核苷酸之3’末端之羥基上之氫原子之構造，『5’-多核苷酸』表示不具有多核苷酸之5’末端之羥基上之氫原子之構造]。
就3L5-多核苷酸之另一例而言，可列舉一種多核苷酸，其具有一RNA之反義股之5’末端及其正義股之3’末端藉由在上述各端形成磷酸二酯構造之連結基而結合成之構造；該RNA為正義股及反義股包含18至23鹼基長且具有雙股構造之單離RNA分子，其中各RNA鏈具有18~23鹼基長，至少1鏈具有包含1~3個鹼基之3’突出部；該RNA分子係可標的特異性地干擾RNA；該RNA分子之1鏈，除了3’突出部之外，包含具有與預定mRNA標的分子100%相同性之序列，其中該mRNA標的分子係存在於細胞或生物中者。
就3L5-多核苷酸之另一例而言，可列舉一種多核苷酸或其鹽，其特徵為：正義股多核苷酸包含以下之式(II)所示之多核苷酸，反義股多核苷酸包含以下之式(III)所示之多核苷酸，該多核苷酸具有反義股之5’末端及正義股之3’末端藉由在上述各端形成磷酸二酯構造之連結基而結合成之構造，並進一步具有以下之(a)至(d)所示之特徴：
5’-(γ-β)9-γ-λt-3’(II)
5’-β-(γ-β)9-υu-3’(III)
(a)γ表示RNA，β表示2’-OMeRNA，λ及υ表示DNA；
(b)t及u為相同或相異’表示0~5之任一整數；
(c)式(III)所示之多核苷酸之中，(γ-β)9-γ包含與標的基因相同之核苷酸序列；
(d)式(II)中之(γ-β)9-γ與式(III)中之β-(γ-β)9包含彼此互補之核苷酸序列。
γ，β，λ及υ表示核苷單元，連結各核苷間之線表示磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵。所謂的核苷單元表示核酸鹼基之N-糖基體如上述之「天然型核苷」或「糖修飾核苷」，即多核苷酸之構成單元。
就3L5-多核苷酸之另一例而言，可列舉一種多核苷酸或其鹽，其特徵為：正義股多核苷酸包含以下之式(IV)所示之多核苷酸，反義股多核苷酸包含以下之式(V)所示之多核苷酸，該多核苷酸具有反義股之5’末端及正義股之3’末端藉由在上述各端形成磷酸二酯構造之連結基而結合成之構造，並進一步具有以下之(a)至(d)所示之特徴：
5’-(α-β)9-αp-λt-3’(IV)
5’-δs-(α-β)9-υu-3’(V)
(a)α及β為相異，表示DNA或2’-OMeRNA，δ及λ為相同或相異，表示DNA或2’-OMeRNA，υ為相同或相異，表示選自DNA、RNA及2’-OMeRNA之任一者之核苷酸；
(b)p表示0或1之整數，t於p為0時表示0，於p為1時表示0~5之任一整數；s表示0或1之整數，u表示0~5之任一整數；
(c)式(IV)所示之多核苷酸之中，(α-β)9-αp包含與標的基因相同之核苷酸序列；
(d)式(IV)中之(α-β)9與式(V)中之(α-β)9包含彼此互補之核苷酸序列。
α，β，δ及λ表示核苷單元，連結各核苷間之線表示磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵。所謂的核苷單元表示核酸鹼基之N-糖基體如上述之「天然型核苷」或「糖修飾核苷」，即多核苷酸之構成單元。
就3L5-多核苷酸之另一例而言，可列舉一種多核苷酸或其鹽，其特徵為：正義股多核苷酸包含以下之式(VI)所示之多核苷酸，反義股多核苷酸包含以下之式(VII)所示之多核苷酸，該多核苷酸具有反義股之5’末端及正義股之3’末端藉由在上述各端形成磷酸二酯構造之連結基而結合成之構造，並進一步具有以下之(a)至(d)所示之特徴：
5’-β-(α-β)8-αp-λt-3’(VI)
5’-δs-(α-β)8-(α-β)-υu-3’(VII)
(a)α及β為相異，表示DNA或2’-OMeRNA，δ及λ為相同或相異，表示DNA或2’-OMeRNA，υ為相同或相異，表示選自DNA、RNA及2’-OMeRNA之任一者之核苷酸；
(b)p表示0或1之整數，t於p為0時表示0，於p為1時表示0~5之任一整數；s表示0或1之整數，u表示0~5之任一整數；
(c)式(VI)所示之多核苷酸之中，β-(α-β)8-αp包含與標的基因相同之核苷酸序列；
(d)式(VI)中之(α-β)8與式(VII)中之(α-β)8包含彼此互補之核苷酸序列。
就3L5-多核苷酸之另一例而言，可列舉一種多核苷酸或其鹽，其特徵為：正義股多核苷酸包含以下之式(VIII)所示之多核苷酸，反義股多核苷酸包含以下之式(IX)所示之多核苷酸，該多核苷酸具有反義股之5’末端及正義股之3’末端藉由在上述各端形成磷酸二酯構造之連結基而結合成之構造，並進一步具有以下之(a)至(c)所示之特徴：
5’-(α-β)9-3’(VIII)
5’-β-(α-β)9-(α-β)-3’(IX)
(a)α為DNA，β為2’-OMeRNA；
(b)式(IX)所示之多核苷酸之中，β-(α-β)9包含與標的基因互補之核苷酸序列；
(c)式(VIII)中之(α-β)9與式(IX)中之(α-β)9包含彼此互補之核苷酸序列。
在3L5-多核苷酸中，只要具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，亦包含3L5-多核苷酸中之任意1~4個殘基被其他糖修飾核苷酸取代者。
糖修飾核苷酸包含本發明所屬技術領域中已知之糖修飾之全部樣式。糖修飾核苷酸可保持所有雜環鹼基部位以及核苷間(internucleoside)鍵結，再者，上述糖修飾包含獨立的族群。糖修飾核苷之族群包含2’-修飾核苷、4’-硫修飾核苷，4’-硫-2’-修飾核苷及二環式糖修飾核苷。
就2’-修飾之例而言，為鹵素、烯丙基、胺基、疊氮基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2’-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、或O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)，各Rm及Rn個別地為H、胺基保護基、或者經取代或未經取代之C1-C10烷基。2’-修飾係以-F、-OCH3、或-O-(CH2)2-O-CH3為較佳。以-OCH3為更佳。
就4’-硫修飾核苷之例子而言，可列舉4’-氧原子被硫原子置換之β-D-核糖核苷(Hoshika，S. Et al. FEBS Lett.579，p.3115-3118，(2005)；Dande，P. Et al. J.Med.Chem.49，p.1624-1634(2006)；Hoshika，S. et al. ChemBioChem. 8，p.2133-2138，(2007))。
就4’-硫-2’-修飾核苷之例子而言，可列舉保持2’-H、或2’-O-甲基之4’-硫-2’-修飾核苷(Matsugami，et al. Nucleic Acids Res. 36，1805(2008))。
就二環式糖修飾核苷之例子而言，可列舉具有藉由架橋核糖環之2原子所形成之第二環之核苷，此等核苷之例子例如為：以亞甲基鏈架橋2’-氧原子與4’-碳原子而成之2’,4’-BNA/LNA(架橋核酸/鎖核酸)(Obika，S. et al. Tetrahedron Lett.,38,p.8735-(1997)；Obika,S. et al.,Tetrahedron Lett.,39,p.5401-(1998)；A.A. Koshkin,A.A. et al.Tetrahedron,54,p.3607(1998)；Obika,S. Bioorg. Med. Chem.,9，p.1001(2001))，以2’,4’-BNA/LNA之亞甲基鏈延長一碳而成之伸乙基鏈架橋而成之ENA(2’-O,4’-C-伸乙基-架橋核酸)(Morita，K. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett.,12,p.73(2002)；Morita,K. et al. Bioorg. Med. Chem.,11,p.2211(2003))。
在包含2’-OMeRNA之3L5-多核苷酸中之2’-OMeRNA之任意1~4個殘基被糖修飾核苷酸取代之情況，更佳之糖修飾核苷酸為上述糖修飾核苷酸之中，相同或相異之ENA或2’,4’-BNA/LNA。
在3L5-多核苷酸中亦包含多核苷酸中之DNA之1~4個殘基為相同或相異，被RNA、ENA或2’,4’-BNA/LNA取代而成之多核苷酸。
2-2 3L5-多核苷酸正義股之合成方法
就構成3L5-多核苷酸之多核苷酸之調製方法而言，只要可合成期望之多核苷酸，將無特別限制，可使用既知之化學合成法(磷酸三酯法，亞磷醯胺法，或H-膦酸酯法等)。例如，可使用市售之核酸合成機，並使用市售之DNA/RNA合成所採用之試藥來合成。
2-3 3L5-多核苷酸之合成方法
只要可合成3L5-多核苷酸，其製造方法將無限制，例如，可藉由以下之方法來合成。
2-3-1 A法
2-3-1-1 A-1步驟
將A-1步驟之概要示於第1圖中。
本步驟為：使用鍵結有所期望核苷之聚合物支撐體(1)(A-1法中，以Tr1-O-Y-CPG來表示。式中，CPG表示具有可與多核苷酸鍵結之連結基之聚合物支撐體，Y表示除去5’-及3’-羥基且核酸鹼基部分之胺基經保護之核苷單元)，製造包含期望之核苷酸序列之寡核苷酸類似物即化合物(2)之步驟(A法中，以HO-W1-Y-CPG表示。式中，W1-Y表示除去5’-末端及3’-末端之羥基之經保護多核苷酸。Tr1表示羥基之保護基)。
Tr1，若為在不脫離核酸之保護基下可脫保護之羥基保護基，將無特別限定，可列舉如：4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)氧雜蒽基、三苯甲基、乙醯基丙醯基、雙(三甲基矽烷基氧基)(環己基氧基)矽烷基，以4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基為較佳。
就核酸鹼基部之胺基之保護基而言，只要為通常所使用者，將無特別限制，可列舉如：苯甲醯基，異丁基，乙醯基，苯氧基乙醯基，4-(三級丁基)苯氧基乙醯基，烯丙基氧羰基，對-硝基苯基乙基羰基。
就CPG而言，可列舉可控孔度玻璃(controlled-pore glass)、長鏈烷基胺基可控孔度玻璃(Oligonucleotide synthesis Edited by M.J.Gait,IRL Press,1984,pp84-115)、聚苯乙烯珠粒(Tetrahedron Lett. 34,3373(1994))等。此時，可列舉聚合物支撐體上具有如胺基丙基、胺基己基之胺基烷基者。
就可與多核苷酸鍵結之連結基而言，可列舉-OC(=O)-CH2CH2C(=O)-，亦即琥珀酸經由氧原子酯鍵結於Y之3’位，琥珀酸之另一端之羧酸與聚合物支撐體上之胺基形成醯胺鍵者。除了琥珀酸之外，可列舉肌胺酸(-OC(=O)-CH2-NCH3-)，草酸連結基(-OC(=O)C(=O)-)等。
就Tr1-O-Y-CPG而言，其中，Tr1為4,4’-二甲氧基三苯甲基，CPG為聚合物支撐體，其藉由琥珀酸連結基(-OC(=O)-CH2CH2C(=O)-)連結於Y，亦即該琥珀酸連結基經由氧原子酯鍵結於Y之3’位，琥珀酸連結基之另一端之羧酸與聚合物支撐體上之胺基形成醯胺鍵之市售品的例子而言，可列舉Glen Research公司之：2’-OMe-A-RNA-CPG(20-3600-10)、2’-OMe-C-RNA-CPG(20-3610-10)、2’-OMe-G-RNA-CPG(20-3621-10)、2’-OMe-U-RNA-CPG(20-3630-10)、Bz-A-RNA-CPG(20-3303-10)、Ac-C-RNA-CPG(20-3315-10)、iPr-Pac-G-RNA-CPG(20-3324-10)、U-RNA-CPG(20-3330-10)，dA-CPG(20-2000-10)、dC-CPG(20-2010-10)dG-CPG(20-2020-10)、dT-CPG(20-2030-10)等。
使用製造化合物(2)時所必需之亞磷醯胺試藥等，並使用DNA自動合成機之通常亞磷醯胺法來製造化合物(2)。具有所期望之核苷酸序列之寡核苷酸類似物，可藉由使用DNA合成機，例如柏金愛爾默(PerkinElmer)公司之藉由亞磷醯胺法之392型等，並依照文獻(Nucleic Acids Research,12,4539(1984))所記載之方法來合成。
又，如期望，將寡核苷酸類似物硫代酯(thioate)化之情況，可使用硫或四乙胺硫甲醯基二硫化物(tetraethylthiuram disulfide,TETD，Applied Biosystems公司)、Beaucage試藥、苯基乙醯基二硫化物/吡啶-乙腈(1：1 v/v)溶液(Ravikumar，V.T. et al. Bioorg.Med.Chem.Lett.(2006)16，p.2513-2517)等試藥，依照文獻(Tetarhedron Letters,32,3005(1991),J.Am.Chem. Soc.,112,1253(1990))所記載之方法，得到硫代酯(thioate)衍生物。
2-3-2 C法
C法之概要示於第2圖。
2-3-2-1 C-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(9)於存在脫氧劑下，於酸性條件與可除去之保護化試藥(以二甲氧基三苯甲基氯為較佳)反應，得到化合物(9)之羥基已被保護之化合物(10)之步驟。
就可使用之溶劑而言，只要為不阻礙反應，並可以某種程度溶解起始物質者，將無特別限定，可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿之鹵化烴類；如乙醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類；如二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸之亞碸類；如丙酮、甲基乙基酮之酮類；如吡啶之雜環胺類或如乙腈之腈類，其中以雜環胺類(尤其是吡啶)為較佳。
就可使用之保護化試藥而言，可列舉三苯甲基氯、單甲氧基三苯甲基氯、二甲氧基三苯甲基氯、三甲氧基三苯甲基氯等三苯甲基鹵化物類，不過以單甲氧基三苯甲基氯、二甲氧基三苯甲基氯為較佳。
就可使用之脫氧劑而言，只要為不阻礙反應，且不會分解生成物及起始物質者，將無特別限定，不過以如吡啶、二甲胺基吡啶之芳香族胺類為較佳。
關於反應溫度及反應時間，隨所使用之保護化試藥或脫氧劑之種類而異；在使用二甲氧基三苯甲基氯作為保護化試藥，並使用吡啶兼做溶劑及脫氧劑之情況，於室溫下反應2小時。
反應結束後，目的之化合物係依照常法，從反應混合物中提取。例如，藉由將反應混合物適當地中和，又，不溶物存在時藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水無法混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，將溶劑餾去而得到。所得到之目的化合物可視需要藉由常法，例如再結晶、再沈澱或層析法等更進一步精製。
2-3-2-2 C-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(10)之羧基與具有胺基之酚反應，形成具有醯胺鍵之化合物(11)之步驟。
就所使用之溶劑而言，只要為不阻礙反應者，將無特別限定，可列舉如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類，如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類，其中以鹵化烴類(尤其是二氯甲烷)，醯胺類(尤其是二甲基甲醯胺)為較佳。
就所使用之酚而言，可列舉4-胺基酚、3-胺基酚，不過以4-胺基酚為較佳。
就所使用之醯胺形成性試藥而言，可列舉例如N-羥基琥珀醯亞胺、1-羥基苯并三唑、N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯亞胺之N-羥基化合物類；如1,1’-草醯基二咪唑、N,N’-羰基二咪唑之二咪唑化合物類；如2,2’-二吡啶基二硫化物之二硫化合物類；如N,N’-二琥珀醯亞胺基碳酸酯之琥珀酸化合物類；如N,N’-雙(2-側氧基-3-唑啶基)次磷醯氯之次磷醯氯化合物類；如N,N’-二琥珀醯亞胺基草酸酯(DSO)、N,N-二酞醯亞胺基草酸酯(DPO)、N,N’-雙(降冰片烯基琥珀醯亞胺基)草酸酯(BNO)、1,1’-雙(苯并三唑基)草酸酯(BBTO)、1,1’-雙(6-氯苯并三唑基)草酸酯(BCTO)、1,1’-雙(6-三氟甲基苯并三唑基)草酸酯(BTBO)之草酸酯化合物類、二環己基碳化二亞胺(DCC)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(EDC)等碳化二亞胺類，不過以二咪唑化合物類、碳化二亞胺類(尤其EDC)為較佳。
就反應補助試藥而言，亦可添加1-羥基苯并三唑(HOBT)。
反應溫度及反應時間，隨所使用之醯胺形成試藥及溶劑之種類而異，通常為於0℃至100℃反應5至50小時，尤其在於二氯甲烷中使用4-胺基酚及EDC之情況，係於室溫反應18小時。
反應結束後，目的之化合物可依照常法從反應混合物中提取。例如，藉由將反應混合物適當地中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水無法混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，將溶劑餾去而得到。所得到之目的化合物視需要可藉由常法，例如再結晶、再沈澱或層析法等進一步精製。
2-3-3 D法
將D法之概要示於第2圖中。圖中，n1，n2，m，及L1表示與上述相同者，具體而言，m表示0至4之整數，L1表示單鍵或-O-。
2-3-3-1 D-1a步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(12a)之胺基與具有羧基之酚反應，形成具有醯胺鍵之化合物(13a)之步驟。
就所使用之酚而言，可列舉3-羥基苯基乙酸、4-羥基苯基乙酸、3-(3-羥基苯基)丙酸、3-(4-羥基苯基)丙酸、4-(3-羥基苯基)纈草酸、4-(4-羥基苯基)纈草酸、3-羥基苯氧基乙酸、4-羥基苯氧基乙酸等，不過以3-(4-羥基苯基)丙酸為較佳。
本步驟可依照與C-2步驟同樣之方法進行。
2-3-3-2 D-2a步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(13a)，於脫氧劑存在下，於酸性條件與可除去之保護化試藥(以二甲氧基三苯甲基氯為較佳)反應，得到化合物(13a)之羥基已被保護之化合物(14a)之步驟。
本步驟可依照與C-1步驟同樣之方法進行。
2-3-3-3 D-1b步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(12b)之胺基與具有羧基之酚反應，形成具有醯胺鍵之化合物(13b)之步驟。
就所使用之酚而言，可列舉3-羥基苯基乙酸、4-羥基苯基乙酸、3-(3-羥基苯基)丙酸、3-(4-羥基苯基)丙酸、4-(3-羥基苯基)纈草酸、4-(4-羥基苯基)纈草酸、3-羥基苯氧基乙酸、4-羥基苯氧基乙酸等，不過以3-(4-羥基苯基)丙酸為較佳。
本步驟可依照與C-2步驟同樣之方法進行。
2-3-3-4 D-2b步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(13b)，在脫氧劑存在下，於酸性條件與可除去之保護化試藥(以二甲氧基三苯甲基氯為較佳)反應，得到化合物(13b)之羥基已被保護之化合物(14b)之步驟。
本步驟可依照與C-1步驟同樣之方法進行。
2-3-3-5 D-1c步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(12a)之胺基與具有羧基之酚反應，形成具有醯胺鍵結之化合物(13c)之步驟。
就可使用之酚而言，可列舉N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-酪胺酸。
本步驟可依照與C-2步驟同樣之方法進行。
2-3-3-6 D-2c步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(13c)，於脫氧劑存在下，於酸性條件與可除去之保護化試藥(以二甲氧基三苯甲基氯為較佳)反應，得到化合物(13c)之羥基已被保護之化合物(14c)之步驟。
本步驟可依照與C-1步驟同樣之方法進行。
2-3-4 E法
將E法之概要示於第3圖中。
2-3-4-1 E-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(15)，於脫氧劑存在下，於酸性條件與可除去之保護化試藥(以單甲氧基三苯甲基氯化物為較佳)反應，得到化合物(15)之羥基已被保護之化合物(16)之步驟。
本步驟可依照與C-1步驟同樣之方法進行。
2-3-4-2 E-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(16)之羧基與酪胺酸酯反應，形成具有醯胺鍵之化合物(17)之步驟。
就所使用之酪胺酸酯而言，可列舉酪胺酸甲酯，酪胺酸乙酯等，不過以酪胺酸乙酯為較佳。
本步驟可依照與C-2步驟同樣之方法進行。
將E法之概要示於第3圖中。
2-3-5 F法
將F法之概要示於第3圖中。圖中，A表示-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2CH2-、-CH[CH2CH(CH3)2]-、及-CH[CH(CH3)CH2CH3]-。
2-3-5-1 F-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(18)之胺基與胺基經t-Boc基保護之胺基酸(19)反應，形成具有醯胺鍵之化合物(20)之步驟。
就經t-Boc基保護之胺基酸之種類而言，可列舉甘胺酸、丙胺酸、β-丙胺酸、白胺酸、異白胺酸等，不過以甘胺酸、丙胺酸、β-丙胺酸為較佳。
本步驟可依照與C-2步驟同樣之方法進行。
2-3-5-2 F-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(20)與脫保護化試藥反應，將胺基之保護基選擇性地除去，製造化合物(21)之步驟。
就所使用之溶劑而言，較佳者可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類；如二乙基醚、二異丙基醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷、二伸乙基二醇二甲基醚之醚類；如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、三級丁醇、異戊醇、二乙二醇、甘油、辛醇、環己醇、乙二醇甲醚之醇類；如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類，更佳者可列舉醇類(尤其甲醇、乙醇)，或二氯甲烷；使用乙酸做為脫保護化試藥時，溶劑以用乙酸與水之混合液為更佳。
就所使用之脫保護化試藥而言，只要為通常所用者，將無特別限制，在保護基為t-Boc基之情況，可列舉：乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸、鹽酸及如溴化鋅等之路易士酸類，其中以乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸為較佳。
反應溫度雖隨所使用之試藥、原料、溶劑等而異，不過通常為-10至100℃，而以0至50℃為較佳。
反應時間雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為1分鐘至50小時，而以1分鐘至24小時為較佳。
反應結束後，目的之化合物係依照常法，從反應混合物中提取。
2-3-5-3 F-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(21)之胺基與化合物(16)反應，形成具有醯胺鍵之化合物(22)之步驟。
本步驟可依照與C-2步驟同樣之方法進行。
2-3-6 G法
將G法之概要示於第4圖中。
2-3-6-1 G-1步驟
本步驟為使在C-2步驟中所製造之化合物(11)，在D-2a步驟中所製造之化合物(14a)，在D-2b步驟中所製造之化合物(14b)，在D-2c步驟中所製造之化合物(14c)，在E-2步驟中所製造之化合物(17)，及在F-3步驟中所製造之化合物(22)的酚(第4圖中，以Tr-O-X-H表示；Tr表示羥基之保護基)之羥基，與亞磷醯胺化(amidite化)所使用之單取代-氯(烷氧基)膦類(第4圖中，以R5-P(-O-R4)-Cl表示)或二取代-烷氧基膦類(第4圖中，以(R5-)2P(-O-R4)表示)反應，製造化合物(23)之步驟。
Tr只要為不會使核酸保護基脫離，而可將羥基保護基脫保護者，將無特別限定，可列舉如：4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)氧雜蒽基、三苯甲基、乙醯丙醯基、雙(三甲基矽烷基氧基)(環己基氧基)矽烷基，其中以4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基為較佳。
就所使用之溶劑而言，只要為不對反應造成影響者，將無特別限定，較佳者可列舉：如四氫呋喃、二乙基醚、二烷之醚類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類。
本步驟中之R4，可列舉2-氰基乙基、甲基、甲磺醯基乙基、2,2,2-三氯乙基、烯丙基，其中以氰基乙基、甲基為較佳。
本步驟中之R5，可列舉：N-嗎啉基、二異丙基胺基、二乙基胺基、二甲基胺基，其中以二異丙基胺基為較佳。
就所使用之單取代-氯(烷氧基)膦類而言，可列舉：如氯(N-嗎啉基)甲氧基膦、氯(N-嗎啉基)氰基乙氧基膦、氯(二甲基胺基)甲氧基膦、氯(二甲基胺基)氰基乙氧基膦、氯(二異丙基胺基)甲氧基膦、氯(二異丙基胺基)氰基乙氧基膦之膦類，其中以氯(N-嗎啉基)甲氧基膦、氯(N-嗎啉基)氰基乙氧基膦、氯(二異丙基胺基)甲氧基膦、氯(二異丙基胺基)氰基乙氧基膦為較佳。
在使用單取代-氯(烷氧基)膦類之情況，可使用脫氧劑，此時，就可使用之脫氧劑而言，可列舉：如吡啶、二甲基胺基吡啶之雜環胺類、如三甲基胺、三乙基胺、二異丙基乙基胺之脂肪族胺類，不過以脂肪族胺類(尤其是二異丙基乙基胺)為較佳。
就所使用之二取代-烷氧基膦類而言，可列舉例如雙(二異丙基胺基)氰基乙氧基膦、雙(二乙基胺基)甲磺醯基乙氧基膦、雙(二異丙基胺基)(2,2,2-三氯乙氧基)膦、雙(二異丙基胺基)(4-氯苯基甲氧基)膦之膦類，不過以雙(二異丙基胺基)氰基乙氧基膦為較佳。
在使用二取代-烷氧基膦類之情況，可使用酸，在此情況，就可使用之酸而言，以四唑，乙酸或對甲苯磺酸為較佳。
反應溫度無特別限定，通常為0至80℃，而以室溫為較佳。
反應時間雖隨所使用之原料、試藥、溫度等而異，不過通常為5分鐘至30小時，較佳者在於室溫反應之情況，為30分鐘至10小時。
反應結束後，本反應之目的化合物(7)可藉由例如將反應混合物適當地中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水無法混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，並用無水硫酸鎂等乾燥後，將溶劑餾去而得到。
所得到之目的化合物可視需要依照常法，例如再結晶、再沈澱或層析法等更進一步精製。
2-3-6-2 G-2步驟
本步驟為將在A-1中所製造之化合物(2)與在G-1中所製造之化合物(23)，藉由使用DNA自動合成機之通常之亞磷醯胺法，製造化合物(24)之步驟(圖中，W2表示將5’末端及3’末端之羥基除去保護之正義股多核苷酸，W1-Y表示將5’末端及3’末端之羥基除去保護之反義股多核苷酸，Tr1表示羥基之保護基)。
Tr1只要為不會使核酸之保護基脫離，並可將羥基之保護基脫保護者，將無特別限定，可列舉如：4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)氧雜蒽基、三苯甲基、乙醯丙醯基、雙(三甲基矽烷基氧基)(環己基氧基)矽烷基，其中以4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基為較佳。
藉由使用DNA自動合成機之通常之亞磷醯胺法製造化合物(24)。具有期望之核苷酸序列之寡核苷酸類似物，可使用DNA合成機，例如Perkin Elmer公司之藉由亞磷醯胺法實施之392型等，根據文獻(Nucleic Acids Research,12,4539(1984))記載之方法來合成。
又，視需要，在將寡核苷酸類似物硫代酯化之情況，除使用硫外，可使用四乙胺硫甲醯基二硫化物(TETD，Applied Biosystems公司)、Beaucage試藥、苯基乙醯基二硫化物/吡啶-乙腈(1：1 v/v)溶液(Ravikumar,V.T. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett.(2006) 16,p.2513-2517)等試藥，根據文獻(Tetarhedron Letters,32,3005(1991),J. Am. Chem. Soc.,112,1253(1990))記載之方法，得到硫代酯衍生物。
2-3-6-3 G-3步驟
本步驟為將在G-2中所製造之化合物(24)從CPG切出，進行保護基之除去，製造最終化合物(25)之步驟(圖中，式中W2’表示將5’末端及3’末端之羥基除去之正義股多核苷酸，W1’-Y’表示將5’末端及3，末端之羥基除去之反義股多核苷酸)。
就所使用之鹼而言，可列舉：濃氨水、甲醇性氨、乙醇性氨、濃氨水-乙醇(3：1V/V)混合液、濃氨水-40%甲基胺水溶液(1：1V/V)混合液、甲基胺、0.5M LiOH水溶液、3.5M三乙基胺/甲醇溶液之(1：10V/V)混合液，其中以濃氨水、濃氨水-乙醇混合液(3：1V/V)為較佳。
反應溫度無特別限定，通常為-50至80℃，而以室溫至60℃為較佳。
反應時間隨使用之原料、試藥、溫度等而異，不過通常為5分鐘至30小時，在60℃反應之情況，則以5小時為較佳。
反應結束後，藉由將溶劑餾去所得到之化合物，在與Tr1鍵結之情況，可藉由逆相層析法、離子交換層析法(包含高速液體層析法)等各種層析法等精製操作來進行精製。
Tr1，例如4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)氧雜蒽基、三苯甲基等，若在鹼性條件下未脫保護時，可以與F-2步驟同樣之方法，在酸性條件下將Tr1脫保護。其中以使用80%乙酸水溶液為較佳。
將如此得到之包含化合物(25)之反應混合物，藉由逆相層析法、離子交換層析法(包含高速液體層析法)等各種層析法等通常核酸精製所使用之精製操作來進行精製，可得到化合物(25)。
藉由本方法，可取得3L5-多核苷酸及正義股之3’末端及反義股之5’末端之磷酸未經修飾之雙股多核苷酸。
在3L5-多核苷酸之中包含：將膽固醇單元、脂質單元或維生素E單元導入3L5-多核苷酸中者(例如參照Lorenz,C. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett.,14,p.4975-4977(2004)；Soutschek,J.,et al. Nature,432,p.173-178(2004)；Wolfrum,C. et al. Nature Biotech. 25,p.1149-1157(2007)) Kubo,T. et al. Oligonucleotides,17,p.1-20(2007)；Kubo,T.,et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 365,p.54-61(2008)；Nishina,K.,et al.,Mol. Ther. 16,p.734-740(2008))，以及將鍵結於蛋白質之核酸分子即適體(aptamer)鍵結於3L5-多核苷酸之末端者。
在3L5-多核苷酸之中，亦包含3L5-多核苷酸與單株抗體(或其適當之鍵結部分)或蛋白質(或其適當之寡肽片段)鍵結而成者(例如參照Song,et al. Nature Biotech. 23,p.709-717(2005)；Xia et al. Pharm. Res. 24,p.2309-2316(2007),Kumar,et al. Nature,448,p.39-43(2007))。
又，在3L5-多核苷酸之中，亦包含在3L5-多核苷酸附加陽離子聚合物，形成攜帶正電荷之複合物者(就可達成對臟器及細胞之分布之例子而言，參照Leng et al. J. Gen. Med. 7,p.977-986(2005)；Baigude et al.2，p.237-241,ACS Chem. Biol.(2007)；Yadava et al. Oligonucleotide 17,p.213-222(2007))。
3L5-多核苷酸包含上述3L5-多核苷酸之所有藥學上可容許之鹽類、酯、或此等酯之鹽類。
就3L5-多核苷酸之藥學上可容許之鹽類而言，適合者可列舉：如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼金屬鹽，如鈣鹽、鎂鹽之鹼土金屬鹽，鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等金屬鹽；如銨鹽之無機鹽，如三級辛基胺鹽、二苯甲基胺鹽、嗎啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍(guanidine)鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苯甲基乙二胺鹽、氯普魯卡因(chloroprocaine)鹽、普魯卡因(procaine)鹽、二乙醇胺鹽、N-苯甲基-苯乙基胺鹽、哌嗪鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽之有機鹽等胺鹽；如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽之鹵素原子化氫酸鹽，如硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等之無機酸鹽；如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽之低碳烷磺酸鹽，如苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽之芳基磺酸鹽，如乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等之有機酸鹽；及如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽之胺基酸鹽。
含有3L5-多核苷酸之組成物，可與例如脂質體，受體標的分子，作為輔助之經口、直腸、局部性攝取、分配及/或吸收用之其他處方的其他分子、分子構造或化合物之混合物進行混合、被封入其中或與之連結(conjugate)。
在將3L5-多核苷酸做為疾病之預防藥或治療藥使用之情況，上述多核苷酸或其藥理學上容許之鹽，其本身或與適當的藥理學上容許之賦形劑、稀釋劑等混合後，可藉由錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑或糖漿劑等而以經口之方式，或者藉由注射劑、栓劑、貼付劑、或外用劑等而以非經口之方式投與。
在此等製劑中，可使用賦形劑(可列舉例如，如乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇之糖衍生物；如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、α澱粉、糊精之澱粉衍生物；如結晶纖維素之纖維素衍生物；阿拉伯膠；葡聚糖；如出芽短梗孢糖(pullulan)之有機系賦形劑；及如輕質無水矽酸、合成矽酸鋁、矽酸鈣、偏矽酸鋁酸鎂之矽酸鹽衍生物；如磷酸氫鈣之磷酸鹽；如碳酸鈣之碳酸鹽；如硫酸鈣之硫酸鹽等無機系賦形劑)、潤滑劑(可列舉例如，如硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂之硬脂酸金屬鹽；滑石；膠體矽石；如蜜蠟、鯨蠟之蠟類；硼酸；己二酸；如硫酸鈉之硫酸鹽；乙二醇；富馬酸；苯甲酸鈉；DL白胺酸；如月桂基硫酸鈉、月桂基硫酸鎂之月桂基硫酸鹽；如無水矽酸、矽酸水合物之矽酸類；及上述澱粉衍生物)、黏合劑(可列舉例如羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇(macrogol)、及與前述賦形劑同樣之化合物)、崩散劑(可列舉如：如低取代度羥基丙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、內部交聯羧甲基纖維素鈉之纖維素衍生物；如羧甲基澱粉、羧甲基澱粉鈉、交聯聚乙烯基吡咯烷酮之經化學修飾之澱粉.纖維素類)、乳化劑(可列舉例如：如皂土、蜂膠之膠體性黏土；如氫氧化鎂、氫氧化鋁之金屬氫氧化物；如硫酸月桂酯鈉、硬脂酸鈣之陰離子界面活性劑；如氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)之陽離子界面活性劑；及如聚氧伸乙基烷基醚、聚氧伸乙基山梨醇酐脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯之非離子界面活性劑)、安定劑(可列舉如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯之對氧苯甲酸酯類；如氯丁醇、苯甲醇、苯基乙醇之醇類；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)；如酚、甲酚之酚類；硫柳汞(thimerosal)；脫氫乙酸；及山梨酸)、矯味矯臭劑(可列舉例如：通常使用之甜味料、酸味料、香料等)、稀釋劑等添加劑，以習知之方法製造。
3. 3L5-多核苷酸對細胞、組織或個體之導入，及標的基因之表現調節
就導入以上述方式調製之3L5-多核苷酸之被導入體而言，只要標的基因可在該細胞內轉錄為RNA即可，無特別限制。就被導入體而言，意指細胞、組織、或個體。
就可利用3L5-多核苷酸之細胞而言，亦可為生殖系列細胞、體細胞、分化全能性細胞、多分化能細胞、分裂細胞、非分裂細胞、實質組織細胞、上皮細胞、不死細胞、轉形細胞、神經細胞或免疫細胞之任一種。
就組織而言，包含單一細胞胚或構成性細胞、或多細胞胚、胎兒組織等。又，就上述分化細胞而言，可列舉例如脂肪細胞、纖維母細胞、肌肉細胞、心肌細胞、內皮細胞、神經細胞、神經膠質細胞、血液細胞、巨核球、淋巴球、巨噬細胞、嗜中性白血球、嗜酸性白血球、嗜鹼性白血球、肥大細胞、白血球、顆粒球、角質生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及內分泌線或外分泌腺之細胞等。就此等細胞之例子而言，以使用CHO-K1細胞(RIKEN Cell bank)、猩猩蠅S2細胞(Schneider,l. et al.,J. Embryol. Exp. Morph.,27,p.353-365(1972)、人類HeLa細胞(ATCC：CCL-2)、或人類HEK293細胞(ATCC：CRL-1573)等為較佳。
再者，做為3L5-多核苷酸之被導入體之個體，具體而言，可列舉屬於植物、動物、原生動物、病毒、細菌、或真菌類者等。植物可為單子葉植物、雙子葉植物或裸子植物，動物可為脊椎動物或無脊椎動物。就脊椎動物而言，以包含小鼠、大鼠、猴子、狗及人類之哺乳類為較佳。
就將3L5-多核苷酸導入被導入體之方法而言，被導入體為細胞或組織時，可使用磷酸鈣法、電穿孔法、脂質體轉染(lipofection)法、病毒感染法、浸漬於3L5-多核苷酸溶液中、或轉形法等。又，就導入胚胎之方法而言，可列舉顯微注射法、電穿孔法、或病毒感染法等。被導入體為植物時，可使用對植物體之體腔或間質細胞等之注入或灌流，或藉由噴霧之方法。又，為動物個體時，可使用藉由經口、局部、皮下、肌內及靜脈內投與、非經口、經陰道、經直腸、經鼻、經眼、經膜內投與等進行全身性導入之方法，或電穿孔法或病毒感染法等。就經口導入之方法而言，亦可使用將3L5-多核苷酸與生物之食物直接混合之方法。
關於將3L5-多核苷酸導入患者之方法，除上述方法之外，可使用膠體分散系。
對於膠體分散系，可期待提高化合物在生物體內之安定性之效果，或者使化合物有效率地輸送至特定臟器、組織或細胞之效果。
膠體分散系只要為通常使用者，將無特別限定，可列舉高分子複合物、奈米膠囊、微球體(microsphere)、珠粒及水中油系乳化劑，膠束(micelle)、混合膠束及將包含脂質體之脂質糊劑化而得之分散系，其中以具有可將化合物有效率地輸送至特定臟器、組織或細胞之效果之，複數個脂質體、人工膜之小胞為較佳(Mannino et al.,Biotechniques,1988,6,p.682-；Blume and Cevc,Biochem.et Biophys. Acta,1990,1029,p.91-；Lappalainen et al.,Antiviral Res.,1994,23,p.119-；Chonn and Cullis,Current Op. Biotech.,1995,6,p.698-)。
製成0.2-0.4μm之大小範圍之單膜脂質體，可使含有巨大分子之水性緩衝液之相當比例被包住，化合物被包在該水性內膜，而可呈生物學上活性之狀態輸送至腦細胞(Fraley et al.,Trends Biochem. Sci.,1981,6,p.77-)。
脂質體之組成，通常係將脂質，特別是磷脂質，尤其相轉移溫度高之磷脂質，與1種或以上之類固醇，特別是膽固醇進行通常複合者。
在脂質體生產上有用之脂質之例子，包含如磷脂醯甘油(phosphatidylglycerol)、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲胺酸、神經鞘脂質、磷脂醯乙醇胺、腦苷脂(cerebroside)及神經節苷脂(ganglioside)之磷脂醯化合物。
特別有用者為二醯基磷脂醯甘油，其中脂質部分含有14-18個碳原子(尤其以16-18個碳原子為特佳)，並成為飽和(在14-18個碳原子鏈之內部沒有雙鍵)。
代表性磷脂質包含磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼及二硬脂醯基磷脂醯膽鹼。
包含脂質體之膠體分散系之標的化，可為被動性或主動性之任一種。
被動性標的化，係藉由利用脂質體原本意欲分布於含有洞樣毛細血管之臟器之網狀系統細胞之傾向而達成。
另一方面，主動性標的化，可列舉如：藉由使病毒之蛋白質外套(Morishita et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.),1993,90,p.8474-)、單株抗體(或其之適當結合部分)、如醣、醣脂質或蛋白質(或其之適當寡肽片段)之特定配體與脂質體結合，或者為了能分布在天然存在之局部部位以外之臟器及細胞型，藉由改變脂質體之組成而修飾脂質體之手法等。
標的化之膠體分散系之表面，可藉由各種方法修飾。
經以脂質體標的化之輸送系統，為了當與脂質雙層緊密會合時維持標的配體，脂質基可被插入脂質體之脂質雙層。
為了使脂質鏈與標的配體連結，可使用各種連結基。
可與在3L5-多核苷酸被期望送達之細胞上主要呈現之特定細胞表面分子結合之標的配體，例如有：(1)可與在被期望送達之細胞上主要呈現之特定細胞受體結合之激素、成長因子或此等之適當寡肽片段，或(2)可與在標的細胞上主要呈現之抗原性決定部位(epitope)特異性結合之多株或單株抗體、或其之適當片段(例如，Fab；F(ab’)2)。
2種或以上之生物活性劑，可在單一脂質體內部進行複合，並投與。
在膠體分散系內亦可追加用於提高內容物之細胞內安定性及/或標的化之藥劑。
3L5-多核苷酸或其藥理學上容許之鹽之使用量雖隨症狀、年齡等而異，不過在經口投與之情況，每次下限為1mg(較佳為30mg)，上限為2000mg(較佳為1500mg)；在靜脈內投與或皮下投與之情況，每次下限為0.5mg(較佳為5mg)，上限為500mg(較佳為250mg)；在氣管內投與之情況，每次下限為0.5mg(較佳為5mg)，上限為500mg(較佳為250mg)；在眼球內投與之情況，每次下限為0.05mg(較佳為0.5mg)，上限為10mg(較佳為5mg)；對成人而言，每日1至3次依照症狀投與為較佳。又，在提高安定性之藥劑之情況，1週1至3次，進一步提高安定性之藥劑之情況，1個月1至3次依照症狀投與為較佳。
針對局部性投與之藥學組成物及處方，包含經皮膚之貼劑、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、軟糖、栓劑、噴劑、液體及粉末。
[實施例]
以下，藉由實施例、參考例及試驗例更具體地說明本發明，不過本發明並不受其等之限定。再者，下述實施例中關於基因操作之各種操作若無特別明示，係依照「分子選殖(Molecular Cloning)」[Sambrook,J. Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，由Cold Spring Harbor Laboratory Press於1989年發行]中所記載之方法進行，或者使用市售之試藥或套組時依照市售品之說明書使用。實施例中所合成之各種多核苷酸之X之構造式，用質量分析計所測得之各個多核苷酸之分子量之測定值示於表1中。
(參考例1)
HO-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Amlp-Gp-Amlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Amlp-Cp-Amlt-H(序列表之序列編號1)(CT-169)之合成
使用核酸自動合成機(PerkinElmer公司製ABI 394型DNA/RNA合成機)，依照0.2μmol規模之RNA合成程式進行。各合成循環中之溶劑、試藥、亞磷醯胺之濃度係使用與天然寡聚去氧核苷酸合成時相同者。
使用去氧核苷亞磷醯胺時，係將5’-O-二甲氧基三苯甲基-6-N-苯甲醯基-2’-去氧腺苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2-N-異丁醯基-2’-去氧鳥苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-4-N-苯甲醯基-2’-去氧胞苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺從Proligo公司購入並適當調整後使用。
使用2’-O-甲基核苷亞磷醯胺時，係將5’-O-二甲氧基三苯甲基-6-N-苯甲醯基-2’-O-甲基腺苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2-N-異丁醯基-2’-O-甲基鳥苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-4-N-乙醯基-2’-O-甲基胞苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-甲基尿苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺從Glen Research購入並適宜調製後使用。
使用核糖核苷亞磷醯胺時，係將5’-O-二甲氧基三苯甲基-6-N-苯甲醯基-2’-O-(三級丁基二甲基矽烷基)腺苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2-N-二甲基甲脒-2’-O-(三級丁基二甲基矽烷基)鳥苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-4-N-乙醯基-2’-O-(三級丁基二甲基矽烷基)胞苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-(三級丁基二甲基矽烷基)尿苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺從Proligo公司購入並適當調製後使用。
在使用2’-O,4’-C-伸乙基核苷亞磷醯胺之情況，係將專利3420984號之實施例14(5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O,4’-C-伸乙基-6-N-苯甲醯基腺苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺)、實施例27(5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O，4’-C-伸乙基-2-N-異丁基鳥苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺)、實施例22(5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O,4’-C-伸乙基-4-N-苯甲醯基-5-甲基胞苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺)、實施例9(5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O,4’-C-伸乙基-5-甲基尿苷-3’-O-(2-氰基乙基N,N-二異丙基)亞磷醯胺)之化合物適當調製而使用。
在5’-末端有磷酸基部分之情況，係將Phosphalink(ABI製)適當調製而使用。
亞磷醯胺(phosphoroamidite)係安裝在適當核酸自動合成機中，合成具有期望序列之多核苷酸。就固相支撐體而言，係使用0.5μmol之結合有期望核苷之CPG(可控孔度玻璃(controlled pore glass)；Applied Biosystem公司製，或Glen Research公司製)，合成表記之多核苷酸。在核酸自動合成機之最終步驟中，不進行酸處理(二甲氧基三苯甲基鍵結於寡核苷酸上)。本多核苷酸係於用氨水處理後，藉由逆相HPLC(島津製作所製LC-10VP；管柱(Merck，Chromolith Performance RP-18e(4.6×100mm))；A溶液：5%乙腈，0.1M乙酸三乙基胺鹽水溶液(TEAA)，pH7.0；B溶液：乙腈，B%：10%→60%(10分鐘，線性梯度)；60℃；2毫升/分鐘；260nm)精製，收集具有二甲氧基三苯甲基之目的物之波峰。加水並於減壓下餾去，除去TEAA。二甲氧基三苯甲基鍵結時，添加80%乙酸水溶液(2mL)，並放置20分鐘，進行二甲氧基三苯甲基之脫保護。餾去溶劑之後，將殘餘物溶解於500μl之水中，用乙酸乙酯洗淨，冷凍乾燥後，得到為目的之寡核苷酸。又，視需要可藉由含有7M尿素之20%聚丙烯醯胺凝膠電泳(1xTBE，600V，4小時)精製。電泳後，使用UV燈使區帶(band)成為可見的，使用刀具將區帶切出，添加1mL之0.2M NaCl，10mM EDTA(pH7.2)之溶液，放置一夜，使多核苷酸從凝膠片中溶出。添加乙醇，使寡核苷酸沈澱，離心並回收。本多核苷酸之分子量係藉由負離子ESI質量分析鑑定。
分子量：計算值：5767.86，測定值：5767.78
鹼基序列：含有人類β-連環素(catenin)基因(基因銀行登錄號：NM＿001904.3)之核苷酸編號3139-3156之序列。
(實施例1)
HO-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Amlp-Gp-Amlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Tp-Cmlp-Tp-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Umlt-H(CT-437)之合成
CT-437係序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。
以與參考例1同樣之方式合成CT-437。在本多核苷酸中，將如下調製之XAmidite試藥偶合於X部分。將在參考例3中所取得之化合物(20mg)溶解於2mL之乙腈：二氯甲烷(1：1 v/v)中，添加2-氰基乙基四異丙基磷醯二胺(74μL，0.23mmol)、360μL之1H-四唑(0.45M)之乙腈溶液，並攪拌2小時。藉由TLC確認反應之進行後，進行過濾器過濾，調製XAmidite試藥。將CT-437之構造示於第6圖。
(實施例2)
HO-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Amlp-Gp-Amlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Tp-Cmlp-Tp-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Umlt-H(CT-455)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-455。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥，係使用在參考例4中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-455係序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸，經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-455之構造示於第6圖。
(實施例3)
HO-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Amlp-Gp-Amlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Tp-Cmlp-Tp-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Umlt-H(CT-456)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-456。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例5中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-456為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-456之構造示於第6圖。
(實施例4)
HO-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Amlp-Gp-Amlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Tp-Cmlp-Tp-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Umlt-H(CT-446)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-446。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例6中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-446為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-446之構造示於第6圖。
(實施例5)
HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(CT-447)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-447。在本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例7中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-447為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。CT-447之構造示於第6圖。
(實施例6)
HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(CT-448)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-448。在本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例8中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-448為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-448之構造示於第6圖。
(實施例7)
HO-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Amlp-Gp-Amlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Tp-Cmlp-Tp-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Umlt-H(CT-449)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-449。在本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例9中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-449為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-449之構造示於第6圖。
(實施例8)
HO-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Amlp-Gp-Amlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Tp-Cmlp-Tp-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Umlt-H(CT-450)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-450。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例10中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-450為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-450之構造示於第6圖。
(實施例9)
HO-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Amlp-Gp-Amlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Tp-Cmlp-Tp-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Umlt-H(CT-451)之合成
以與實施例90同樣之方式合成CT-451。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例11中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-451為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-451之構造示於第6圖。
(實施例10)
HO-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Amlp-Gp-Amlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Tp-Cmlp-Tp-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Umlt-H(CT-452)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-452。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例12中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-452為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-452之構造示於第6圖。
(實施例11)
HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(CT-453)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-453。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例13中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-453為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-453之構造示於第6圖。
(實施例12)
HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(CT-454)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-454。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用參考例14中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-454為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-454之構造示於第6圖。
(實施例13)
HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(CT-460)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-460。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例17中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-460為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-460之構造示於第7圖。
(實施例14)
HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(CT-461)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-461。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例21中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-461為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-461之構造示於第7圖。
(實施例15)
HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(CT-462)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-462。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例22中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-462為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-462之構造示於第7圖。
(實施例16)
HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(CT-463)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-463。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例23中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-463為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-463之構造示於第7圖。
(實施例17)
HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(CT-464)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-464。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用參考例26中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-464為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-464之構造示於第7圖。
(實施例18)
HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(CT-465)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-465。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例24中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-465為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-465之構造示於第7圖。
(實施例19)
HO-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Amlp-Gp-Amlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Tp-Cmlp-Tp-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Umlt-H(CT-466)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-466。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用參考例25中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-466為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-466之構造示於第7圖。
(實施例20)
HO-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Amlp-Gp-Amlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Tp-Cmlp-Tp-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Umlt-H(CT-467)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-467。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用參考例27中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-467為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-467之構造示於第7圖。
(實施例21)
HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(CT-468)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-468。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例28中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-468為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-468之構造示於第7圖。
(實施例22)
HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(CT-469)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-469。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例29中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-469為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-469之構造示於第7圖。
(實施例23)
HO-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Amlp-Gp-Amlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Tp-Cmlp-Tp-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Umlt-H(CT-470)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-470。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例30中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-470為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-470之構造示於第7圖。
(實施例24)
HO-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Amlp-Gp-Amlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Tp-Cmlp-Tp-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Umlt-H(CT-471)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-471。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用參考例31中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-471為序列表之序列編號1中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號2中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-471之構造示於第7圖。
(實施例25)
HO-Grp-Crp-Arp-Crp-Arp-Arp-Grp-Arp-Arp-Urp-Grp-Grp-Arp-Urp-Crp-Arp-Crp-Arp-Arp-Urp-Urp-X-P(=O)(OH)-O-Urp-Urp-Grp-Urp-Grp-Arp-Urp-Crp-Crp-Arp-Urp-Urp-Crp-Urp-Urp-Gp-Urp-Grp-Crp-Urp-Urt-H(CT-472)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-472。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用參考例14中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-472為序列表之序列編號3中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸與序列編號4中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-472之構造示於第7圖。
(實施例26)
HO-Grp-Cmlp-Arp-Cmlp-Arp-Amlp-Grp-Amlp-Arp-Umlp-Grp-Gmlp-Arp-Umlp-Crp-Amlp-Crp-Amlp-Arp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Urp-Gmlp-Urp-Gmlp-Arp-Umlp-Crp-Cmlp-Arp-Umlp-Urp-Cmlp-Urp-Umlp-Grp-Umlp-Grp-Cmlp-Urp-Urt-H(CT-473)之合成
以與實施例1同樣之方式合成CT-473。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例14中所取得之化合物(20mg)來調製。
CT-473為序列表之序列編號5中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸與序列編號6中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將CT-473之構造示於第7圖。
將在實施例1～16中所記載之多核苷酸之X部分之構造及分子量示於表1中。表中，X之末端之亞甲基鍵結於正義股多核苷酸之3’末端而形成磷酸二酯鍵，與苯基鍵結之氧原子鍵結於反義股多核苷酸之5’末端而形成磷酸二酯鍵。
將在實施例17～26中所記載之多核苷酸之X部分之構造及分子量示於表2。表中，X之末端之亞甲基鍵結於正義股多核苷酸之3’末端而形成磷酸二酯鍵，與苯基鍵結之氧原子則鍵結於反義股多核苷酸之5’末端而形成磷酸二酯鍵。
(參考例2)
HO-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Ap-Umlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Tp-Cmlp-Tp-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Umlt-H(序列表之序列編號2)(CT-157)之合成
以與參考例1同樣之方式合成CT-157。將CT-157之構造示於第6圖。
鹼基序列：含有與人類β-連環素基因(基因銀行登錄號：NM＿001904.3)之核苷酸編號3139-3157互補之序列。
(參考例3)
將6-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)己酸(722mg，1.67mmol，J. Org. Chem.,1995,60,3358-3364)溶解於二氯甲烷2mL中，添加4-胺基酚(200mg，1.84mmol)、EDC(288mg，2.5mmol)、HOBT(225mg，2.5mmol)、三乙基胺(260μL)，攪拌一夜。藉由TLC確認反應終結後，藉由二氯甲烷、5%碳酸氫鈉水溶液進行分液，並將有機相用飽和食鹽水洗淨。將有機相用硫酸鈉乾燥後，將溶劑於減壓下濃縮。將殘餘物藉由矽凝膠管柱(30g，2%甲醇/二氯甲烷)精製，得到為無定形之化合物(649mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.43-6.75(17H,m),3.78(6H,s),3.08-3.02(2H,m),2.32-2.28(2H,m),1.73-1.59(4H,m),1.49-1.38(2H,m)
FAB-MAS(mNBA)：525 M+
(參考例4)
將8-羥基辛酸(100mg，0.59mmol)溶解於1.5mL之吡啶中，添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(237mg，0.7mmol)，攪拌一夜。藉由TLC確認反應終止後，用二氯甲烷、水進行分液，並將有機相用硫酸鈉乾燥後，將溶劑於減壓下濃縮。將殘餘物藉由矽凝膠管柱(4g，二氯甲烷)精製，得到為無定形之8-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)辛酸(348mg)。將所得到之8-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)辛酸溶解於1mL之二氯甲烷中，添加4-胺基酚(70.9mg，0.64mmol)，EDC(101.6mg，0.88mmol)，HOBT(79mg，0.886mmol)，三乙基胺(92μL)，攪拌一夜。藉由TLC確認反應終結後，用矽凝膠管柱(5g，30%→50%乙酸乙酯/正己烷)精製，得到為無定形之化合物(148mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.52-6.59(17H,m),3.79(6H,s),3.05-3.01(2H,m),2.31-2.27(2H,m),1.71-1.58(4H,m),1.35-1.24(6H,m)
FAB-MAS(mNBA+KI)：592(M+K)+
(參考例5)
將10-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)癸酸(0.707g，1.19mmol，Tetrahedron Letters,1994,35,2353-2356)溶解於2mL之二氯甲烷中，添加4-胺基酚(141.8mg，1.28mmol)、EDC(203mg，1.76mmol)、HOBT(158mg，1.76mmol)、三乙基胺(183μL)，攪拌一夜。藉由TLC確認反應終止後，藉由矽凝膠管柱(7.5g，30%→50%乙酸乙酯/正己烷)精製，得到為無定形之化合物(485mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.52-6.59(17H,m),3.78(6H,s),3.04-3.01(2H,m),2.33-2.29(2H,m),1.74-1.56(4H,m),1.33-1.24(10H,m)
FAB-MAS(mNBA)：580(M-H)+
(參考例6)
對於4-胺基-1-丁醇(160.45mg，1.8mmol)、4-羥基苯甲酸(207.18mg，1.5mmol)，添加EDC(383mg，2mmol)、HOBT(67.5mg，0.5mmol)溶解於3mL二氯甲烷之溶液，再添加三乙基胺(260μL)，震盪一夜。藉由TLC確認反應終止後，以矽凝膠管柱(5g，以二氯甲烷→乙酸乙酯溶出)精製，得到為油狀之醯胺化合物(0.20g)。將其溶解於吡啶1.5mL中，添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(500mg，1.5mmol)，並於室溫攪拌3小時。藉由TLC確認反應終止後，添加0.5mL之甲醇，使用乙酸乙酯、5%碳酸氫鈉水溶液進行分液，並將有機相之溶劑於減壓下濃縮。將殘餘物藉由矽凝膠管柱(10g，40%→50%乙酸乙酯/正己烷)精製，得到為無定形之化合物(325mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.70-6.78(17H,m),6.11(1H,brs),5.69(1H,s),3.78(6H,s),3.44-3.41(2H,m),3.13-3.10(2H,m),1.70-1.69(4H,m)
FAB-MAS(mNBA)：511 M+
(參考例7)
使用6-胺基-1-己醇(210.94mg，1.8mmol)、4-羥基苯甲酸(207.18mg，1.5mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為無定形之化合物(445mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.67-6.79(17H,m),5.97(1H,brs),5.56(1H,s),3.78(6H,s),3.43-3.38(2H,m),3.06-3.02(2H,m),1.63-1.55(4H,m),1.45-1.34(4H,m)
FAB-MAS(mNBA)：539 M+
(參考例8)
使用8-胺基-1-辛醇(261.43mg，1.8mmol)、4-羥基苯甲酸(207.18mg，1.5mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為無定形之化合物(486mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.68-6.80(17H,m),5.98(1H,brs),5.54(1H,s),3.79(6H,s),3.44-3.39(2H,m),3.04-3.01(2H,m),1.62-1.55(4H,m),1.34-1.24(8H,m)
FAB-MAS(mNBA)：567 M+
(參考例9)
使用4-胺基-1-丁醇(160.45mg，1.8mmol)、3-羥基苯甲酸(207.18mg，1.5mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為無定形之化合物(566mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.52-6.79(17H,m),6.25(1H,brs),6.06(1H,s),3.78(6H,s),3.47-3.47-3.42(2H,m),3.15-3.12(2H,m),1.72-1.66(4H,m)
FAB-MAS(mNBA)：511 M+
(參考例10)
使用6-胺基-1-己醇(210.94mg，1.8mmol)、3-羥基苯甲酸(207.18mg，1.5mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為無定形之化合物(580mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.52-6.80(17H,m),6.08(1H,brs),6.04(1H,s),3.78(6H,s),3.45-3.40(2H,m),3.06-3.03(2H,m),1.65-1.56(4H,m),1.45-1.34(4H,m)
FAB-MAS(mNBA)：539 M+
(參考例11)
使用8-胺基-1-辛醇(261.43mg，1.8mmol)、3-羥基苯甲酸(207.18mg，1.5mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為無定形之化合物(675mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.52-6.80(17H,m),6.21(1H,brs),6.11(1H,s),3.78(6H,s),3.46-3.41(2H,m),3.04-3.01(2H,m),1.63-1.58(4H,m),1.39-1.33(8H,m)
FAB-MAS(mNBA)：566(M-H)+
(參考例12)
使用4-胺基-1-丁醇(160.45mg，1.8mmol)、3-(4-羥基苯基)丙酸(249.26mg，1.5mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為無定形之化合物(540mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.52-6.68(17H,m),5.37(1H,brs),4.87(1H,s),3.79(6H,s),3.21-3.16(2H,m),3.06-3.03(2H,m),2.86(2H,t,J=7.56Hz),2.35(2H,t,J=7.56Hz),1.54-1.48(4H,m)
FAB-MAS(mNBA)：540(M+H)+
(參考例13)
使用6-胺基-1-己醇(210.94mg，1.8mmol)、3-(4-羥基苯基)丙酸(249.26mg，1.5mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為無定形之化合物(559mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.44-6.70(17H,m),5.21(1H,brs),5.03(1H,s),3.79(6H,s),3.18-3.13(2H,m),3.05-3.02(2H,m),2.87(2H,t,J=7.33Hz),2.39(2H,t,J=7.56Hz),1.59-1.13(8H,m)
FAB-MAS(mNBA)：568(M+H)+
(參考例14)
使用8-胺基-1-辛醇(261.43mg，1.8mmol)，3-(4-羥基苯基)丙酸(249.26mg，1.5mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為糖飴狀之化合物(720mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.52-6.71(17H,m),5.26(1H,brs),5.10(1H,s),3.78(6H,s),3.20-3.15(2H,m),3.05-3.01(2H,m),2.88(2H,t,J=7.56Hz),2.41(2H,t,J=7.56Hz),1.62-1.17(12H,m)
FAB-MAS(mNBA)：594(M-H)+
(參考例15)
N-(4-甲氧基三苯甲基)-L-酪胺酸乙酯
將L-酪胺酸乙酯(418mg，2mmol)溶解於5mL之吡啶，添加4-甲氧基三苯甲基氯(741mg，2.4mmol)，於室溫下攪拌5小時。藉由TLC確認反應終結後，以乙酸乙酯、5%碳酸氫鈉水溶液進行分液，將有機相用硫酸鈉乾燥後，將溶劑於減壓下濃縮。將殘餘物藉由矽凝膠管柱(30g，30%乙酸乙酯/正己烷)精製，得到為無定形之化合物(687mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.42-6.72(18H,m),4.69(1H,s),3.76(3H,s),3.53-3.33(3H,m),2.94-2.81(2H,m),2.58(1H,d),0.88-0.85(3H,m)
FAB-MAS(mNBA)：482(M+H)+
(參考例16)
3-(4-甲氧基三苯甲氧基)-2-乙醯胺基-丙酸(Ac-Ser(MMTr)-OH)
將N-乙醯基-D,L-絲胺酸(1.775g，12mmol)溶於20mL之吡啶中，添加4-甲氧基三苯甲基氯(4.1g，13.2mmol)，於室溫下攪拌一夜。藉由TLC確認反應終結後，以乙酸乙酯、5%碳酸氫鈉水溶液進行分液，將有機相用硫酸鈉乾燥後，將溶劑於減壓下濃縮。將殘餘物藉由矽凝膠管柱(120g，30%丙酮/正己烷)精製，得到為無定形之化合物(3.93g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.41-6.81(14H,m),6.15(1H,d,J=7.33Hz),4.70-4.66(1H,m),3.78(3H,s),3.77-3.73(1H,m),3.42-3.38(1H,m),2.02(3H,s)
FAB-MAS(mNBA)：419 M+
(參考例17)
Ac-Ser(MMTr)-Tyr-OEt
將參考例16之化合物(629mg，1.5mmol Ac-Ser(MMTr)-OH)溶解於3mL之二氯甲烷中，並添加L-酪胺酸乙酯(334mg，1.6mmol)、EDC(383mg，2mmol)、HOBT(67.5mg，0.5mmol)、三乙基胺(260μL)，攪拌4小時。將反應液藉由矽凝膠管柱(15g，40%→50%乙酸乙酯/正己烷)精製，得到為無定形之化合物(460mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.40-6.61(18H,m),6.11-6.06(1H,m),4.87-4.77(1H,m),4.56-4.48(1H,m),4.19-4.05(2H,m),3.79,3.78(3H,ds),3.73-3.59(1H,m),3.19-2.96(3H,m),1.93,1.91(1H,ds),1.28-1.22(3H,m)
FAB-MAS(mNBA)：611(M+H)+
(參考例18)
t-Boc-βAla-Tyr-OEt
使用N-t-Boc-β-丙胺酸(283mg，1.5mmol，t-Boc-βAla-OH)、L-酪胺酸乙酯(376mg，1.8mmol，H-Tyr-OEt)，以與參考例17同樣之方式合成，得到為無定形之化合物(497mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)6.97-6.74(4H,m),6.03(1H,brs),5.11(1H,brs),4.80(1H,q,J=6.72Hz),4.22-4.15(2H,m),3.37-3.36(2H,m),3.10-3.01(2H,m),2.38(2H,m),1.41(9H,s),1.29-1.23(3H,m)
FAB-MAS(mNBA)：381(M+H)+
(參考例19)
t-Boc-Ala-Tyr-OEt
使用N-t-Boc-丙胺酸(283mg，1.5mmol，t-Boc-Ala-OH)、L-酪胺酸乙酯(376mg，1.8mmol)，以與參考例17同樣之方式合成，得到為無定形之化合物(490mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)6.98-6.71(4H,m),6.49(1H,d),5.16(1H,s),4.95-4.76(1H,m),4.20-4.13(3H,m),3.11-2.99(2H,m),1.41(9H,s),1.33,1.31(3H,ds),1.28-1.21(3H,m)
FAB-MAS(mNBA)：381(M+H)+
(參考例20)
t-Boc-Gly-Tyr-OEt
使用N-t-Boc-甘胺酸(263mg，1.5mmol)、L-酪胺酸乙酯(376mg，1.8mmol)，以與參考例17同樣之方式合成，得到為無定形之化合物(434mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)6.98-6.72(4H,m),6.46(1H,d),5.06(1H,brs),4.84-4.79(1H,m),4.21-4.13(2H,m),3.85-3.72(2H,m),3.10-3.01(2H,m),1.41(9H,s),1.29-1.24(3H,m),1.28-1.21(3H,m)
FAB-MAS(mNBA)：367(M+H)+
(參考例21)
Ac-Ser(MMTr)-βAla-Tyr-OEt
將在參考例18中所取得之化合物(490mg，1.29 mmol)溶解於二氯甲烷4mL中，添加4mL之TFA，於室溫下放置15分鐘後，將溶劑於減壓下濃縮。將殘餘物溶解於3mL之二氯甲烷、三乙基胺(260μL)中，添加在參考例16中所取得之化合物(544mg，1.3mmol)，EDC(383mg，2mmol)、HOBT(67.5mg，0.5mmol)、三乙基胺(260μL)，攪拌一夜。將反應液藉由矽凝膠管柱(20g，80%乙酸乙酯/正己烷→乙酸乙酯)精製，得到為無定形之化合物(469mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.41-6.71(18H,m),4.91-4.75(1H,m),4.54-4.44(1H,m),4.26-4.15(2H,m),3.78(3H,s),3.46-2.20(8H,m),2.02,1.98(3H,ds),1.34-1.24(3H,m)
FAB-MAS(mNBA)：682(M+H)+
(參考例22)
Ac-Ser(MMTr)-Ala-Tyr-OEt
使用參考例19之化合物(485mg，1.26mmol)、在參考例16中所取得之化合物(544mg，1.3mmol)，以與參考例21同樣之方式合成，得到為白色固體之化合物(448mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.41-6.49(18H,m),4.81-4.71(1H,m),4.56-4.43(2H,m),4.21-4.11(2H,m),3.79-3.78(3H,ds),3.46-2.83(4H,m),2.01,1.94(3H,ds),1.37-1.17(6H,m)
FAB-MAS(mNBA)：682(M+H)+
(參考例23)
Ac-Ser(MMTr)-Gly-Tyr-OEt
使用在參考例20中所取得之化合物(430mg，1.17 mmol)、在參考例16中所取得之化合物(544mg，1.3 mmol)，以與參考例21同樣之方式合成，得到為白色固體之化合物(486mg)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)9.22(1H,s),8.41-8.34(1H,m),8.24-8.20(1H,m),8.08-8.05(1H,m),7.38-6.63(18H,m),4.62-4.58(1H,m),4.39-4.33(1H,m),4.04-3.97(2H,m),3.92-3.61(2H,m),3.74(3H,s),3.09-3.08(1H,m),2.86-2.50(1H,m),1.85(3H,s),1.11-1.06(3H,m)
FAB-MAS(mNBA)：668(M+H)+
(參考例24)
使用10-胺基-1-癸醇(260mg，1.5mmol)、4-羥基苯甲酸(299mg，1.8mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為無定形之化合物(568mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.67-6.80(17H,m),6.01-5.99(2H,m),3.78(6H,s),3.45-3.40(2H,m),3.02(2H,t,J=6.64Hz),1.63-1.24(14H,m)
FAB-MAS(mNBA)：595 M+
(參考例25)
使用10-胺基-1-癸醇(260mg，1.5mmol)、3-(4-羥基苯基)丙酸(249mg，1.8mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為糖飴狀之化合物(411mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.45-6.71(17H,m),5.27(1H,brs),5.03(1H,s),3.79(6H,s),3.21-3.16(2H,m),3.03(2H,t,J=6.64Hz),2.88(2H,t,J=7.56Hz),2.41(2H,t,J=7.56Hz),1.62-1.17(14H,m)
FAB-MAS(mNBA)：646(M+Na)+
(參考例26)
使用8-胺基-1-辛醇(218mg，1.5mmol)、(4-羥基苯氧基)乙酸(303mg，1.8mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為糖飴狀之化合物(489mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.45-6.74(17H,m),6.56(1H,brs),4.95(1H,s),4.46(2H,s),3.79(6H,s),3.34-3.29(2H,m),3.03(2H,t,J=6.64Hz),1.63-1.24(12H,m)
FAB-MAS(mNBA)：596(M-H)+
(參考例27)
使用10-胺基-1-癸醇(260mg，1.5mmol)、(4-羥基苯氧基)乙酸(303mg，1.8mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為糖飴狀之化合物(579mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.45-6.75(17H,m),6.56(1H,brs),5.02(1H,s),4.42(2H,s),3.79(6H,s),3.35-3.30(2H,m),3.03(2H,t,J=6.64Hz),1.63-1.24(14H,m)
FAB-MAS(mNBA)：624(M-H)+
(參考例28)
使用(PEO)3-單胺(CHEM-IPEX INTERNATIONAL，224mg，1.5mmol)、4-羥基苯甲酸(299mg，1.8mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為無定形之化合物(520mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.58-6.64(17H,m),6.61(1H,brs),5.81(1H,s),3.78(6H,s),3.71-3.60(10H,m),3.23(2H,t,J=5.27Hz)
FAB-MAS(mNBA)：571 M+
(參考例29)
使用(PEO)3-單胺(CHEM-IPEX INTERNATIONAL，224mg，1.5mmol)、3-(4-羥基苯基)丙酸(249mg，1.8mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為糖飴狀之化合物(543mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.46-6.68(17H,m),5.88(1H,brs),5.30(1H,s),3.77(6H,s),3.67-3.64(4H,m),3.58-3.56(2H,m),3.51-3.47(2H,m),3.43-3.38(2H,m),3.26-3.23(2H,m),2.83-2.81(2H,m),2.27(2H,t,J=7.79Hz)
FAB-MAS(mNBA)：622(M+Na)+
(參考例30)
使用(PEO)3-單胺(CHEM-IPEX INTERNATIONAL，224mg，1.5mmol)、(4-羥基苯氧基)乙酸(303mg，1.8mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為糖飴狀之化合物(471mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.52-6.68(18H,m),5.05(1H,s),4.39(2H,s),3.78(6H,s),3.67-3.51(10H,m),3.23(2H,t,J=5.27Hz)
FAB-MAS(mNBA)：600(M-H)+
(參考例31)
使用8-胺基-1-辛醇(218mg，1.5mmol)、N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-酪胺酸(N-Fmoc-L-酪胺酸，726mg，1.8mmol)，以與參考例6同樣之方式合成，得到為無定形狀之化合物(358mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.77-6.71(25H,m),5.46(1H,brs),5.39(1H,brs),5.06(1H,s),4.43-4.18(4H,m),3.78(6H,s),3.12-3.02(6H,m),1.62-1.12(12H,m)
FAB-MAS(mNBA)：833 M+
(參考例32)
HO-Grp-Crp-Arp-Crp-Arp-Arp-Grp-Arp-Arp-Urp-Grp-Grp-Arp-Urp-Crp-Arp-Crp-Arp-Arp-Urp-Urt-H(序列表之序列編號7)(CT-106)之合成
以與參考例1同樣之方式合成CT-106。但是，將具有目的序列之經保護多核苷酸類似物用氨水：乙醇溶液(3：1v/v)2mL，於55℃處理16小時，而將寡聚物從支持體切出，同時，將為磷酸基保護基之氰乙基及核酸鹼基上之保護基脫除。濾除CPG，用乙醇洗淨，合併濾液及洗液，將溶劑於減壓下餾去。在剩下之殘餘物中，添加0.3mL之三乙胺三氫氟酸鹽，於室溫下放置19小時後，進行精製。將CT-106之構造示於第13圖中。
分子量：計算值：6727.16，測定值：6726.73
鹼基序列：包含人類β-連環素基因(基因銀行登錄號：NM＿001904.3)之核苷酸編號3139-3157之序列。(參考例33)
HO-Urp-Urp-Grp-Urp-Grp-Arp-Urp-Crp-Crp-Arp-Urp-Urp-Crp-Urp-Urp-Grp-Urp-Grp-Crp-Urp-Urt-H(序列表之序列編號8)(CT-041)之合成
以與參考例32同樣之方式合成CT-041。將CT-041之構造示於第13圖。
分子量：計算值：6565.88，測定值：6565.34
鹼基序列：包含與人類β-連環素基因(基因銀行登錄號：NM＿001904.3)之核苷酸編號3139-3157互補之序列。
(參考例34)CT-001
HO-Grp-Cm1p-Arp-Cm1p-Arp-Am1p-Grp-Am1p-Arp-Um1p-Grp-Gm1p-Arp-Um1p-Crp-Am1p-Crp-Am1p-Arp-Tp-Tt-H(序列表之序列編號9)(CT-001)之合成
以與參考例32同樣之方式合成CT-001。將CT-001之構造示於第13圖。
分子量：計算值：6849.46，測定值：6850.8
鹼基序列：包含人類β-連環素基因(基因銀行登錄號：NM＿001904.3)之核苷酸編號3139-3157之序列。
(參考例35)CT-005
HO-Um1p-Urp-Gm1p-Urp-Gm1p-Arp-Um1p-Crp-Cm1p-Arp-Um1p-Urp-Cm1p-Urp-Um1p-Grp-Um1p-Grp-Cm1p-Tp-Tt-H(序列表之序列編號10)(CT-005)之合成
以與參考例32同樣之方式合成CT-005。將CT-005之構造示於第13圖。
分子量：計算值：6702.20，測定值：6702.2
鹼基序列：包含與人類β-連環素基因(基因銀行登錄號：NM＿001904.3)之核苷酸編號3139-3157互補之序列。
將在參考例3～14，17及21～23中所記載之化合物之構造示於第5圖，將在參考例24～31中所記載之化合物之構造示於第10圖。
(實施例27)形成雙股構造用之緩冷配對反應(annealing)
藉由上述參考例1與參考例2之組合，將各300pmol之正義股及反義股加入每支試管中，於減壓下乾燥，並添加30μL之siRNA懸浮緩衝液(QIAGEN)，於65℃加溫1分鐘後，於室溫下放置5分鐘，使正義股及反義股進行緩冷配對反應，得到10μM之雙股多核苷酸溶液。
雙股多核苷酸有時僅以正義股、反義股之組合表示者。亦即，例如包含CT-169/CT-157之組合之雙股多核苷酸僅以「CT169/CT157」或「CT169/157」來表示。
依照本方法，如第6及7圖所示，可取得雙股多核苷酸之反義股之5’端與正義股之3’端經由磷酸二酯鍵中介，以連結基結合而成之3L5-多核苷酸。
(試驗例1)
如以下之方式比較單股或雙股多核苷酸所產生之人類β-連環素基因表現抑制活性之強度。
(1)轉染
將人類大腸癌SW480細胞株(從人類大腸腺癌而來)在含有10%牛胎血清之RPMI1640培養基(Invitrogen公司製)中調製成100000個細胞/毫升之濃度。然後，以每孔1mL之量接種在12孔平底培養盤(Corning公司製)中，於37℃，5.0%二氧化碳下培養1日。繼而，將7.5μL之脂質體轉染試藥Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen公司製)與單股或雙股多核苷酸溶液，以使後者之最終濃度成為0.3、0.03、及0.003nM之方式，在OPTI-MEM培養基中混合，再於室溫靜置20分鐘。在各孔中添加該混合液，繼續培養3日。
(2)即時PCR
轉染後，從孔除去培養上清液，以RNeasy Mini kit(QIAGEN公司製)萃取mRNA。對於所得到之mRNA，藉由iScriptTMcDNA合成套組(QIAGEN公司製)，依照說明書之記載，從0.5μgRNA調製cDNA。繼而，為了進行即時PCR，使用含有人類β-連環素基因之PCR引子(引子對ID：HA135664，Takara-Bio公司製)、做為內部標準之針對人類-GAPDH基因之PCR引子(引子對ID：HA067812，Takara-Bio公司製)及PCR所需藥劑之即時PCR套組(QIAGEN公司製)，如以下方式進行mRNA之定量。
β連環素基因ID：HA135664
正向引子5’-TCTGAGGACAAGCCACAAGATTACA-3’(序列編號11)
反向引子5’-TGGGCACCAATATCAAGTCCAA-3’(序列編號12)
GAPDH基因ID：HA067812
正向引子5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’(序列編號13)
反向引子5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’(序列編號14)
在96孔PCR平底培養盤(Applied Biosystems公司製)之每1孔中，添加25μL之即時PCR套組所含之2×QuantiTect SYBR GREEN PCR Master Mix，18μL之不含RNase之水，5μL之各PCR引子(最終濃度0.3μM)，2μL之所調製之cDNA溶液，並將總量調成50μL，置於Mx3000P(STRATAGENE公司製)中，依照以下之條件實施PCR。
PCR初期活化95℃，15分鐘
PCR 94℃，15秒
56℃，30秒
72℃，30秒
此PCR循環重複進行40次。校正線係使用從只用脂質體轉染試藥處理過之細胞(=NC)萃取之mRNA所調製之cDNA之5倍系列稀釋液。依據該校正線定量各被轉染物(transfectant)之人類β-連環素及人類GAPDH，以人類β-連環素基因量除以人類GAPDH量所得之相對量作圖。實施即時PCR2次(N=2)，在圖中顯示其平均值(多核苷酸之構造及其核苷酸序列示於第6圖及第7圖)
(3)即時PCR解析
(a)基因抑制活性解析1
調查CT-169/CT-157、CT-437、CT-455、CT-456、CT-446、CT-447、CT-448、CT-449、CT-450、CT-451、CT-452、CT-453、CT-454、及CT-461(構造參照第6圖及第7圖)之β-連環素基因表現抑制活性。
如第8圖所示，CT-437、CT-455、CT-456、CT-446、CT-447、CT-448、CT-449、CT-450、CT-451、CT-452、CT-453、CT-454、及CT-461，與CT-169/CT-157同樣地強烈地抑制β-連環素基因之表現。CT-448及CT-454呈現比CT-169/CT-157強之活性。此顯示將反義股5’末端及正義股3’末端用修飾苯基經由磷酸基鍵結而成之單股多核苷酸具有強的基因表現抑制活性。
(試驗例2)
與試驗例1同樣地比較單股或雙股多核苷酸所產生之人類β-連環素基因表現抑制活性之強度。
即時PCR解析
a)基因抑制活性解析1
調查CT-169/CT-157、CT-460、CT-461、CT-462及CT-463(構造參照第7圖)之β-連環素基因表現抑制活性。
如第9圖所示，CT-460、CT-461、CT-462及CT-463，比CT-169/CT-157強烈地抑制β-連環素基因之表現。此顯示反義股5’末端及正義股3’末端用修飾苯基經由磷酸基鍵結而成之單股多核苷酸具有強基因表現抑制活性。
(試驗例3)
比較單股或雙股多核苷酸所產生之人類β-連環素基因表現抑制活性之強度。
(1)轉染
將人類大腸癌SW480細胞株(人類大腸腺癌由來)在含有10%牛胎血清之RPMI1640培養基(Invitrogen公司製)中調製成100000個細胞/毫升之濃度。然後，以每孔1mL之量接種在12孔平底培養盤(Corning公司製)中。繼而，將7.5μL之脂質體轉染試藥Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen公司製)與單股或雙股多核苷酸溶液，以使後者之最終濃度成為0.3、0.03、及0.003nM之方式，在OPTI-MEM培養基中混合，於室溫下靜置20分鐘。在各孔中添加該混合液，於37℃，5.0%二氧化碳下繼續培養3日。
(2)即時PCR
以與試驗例1同樣之方法進行。
(3)即時PCR解析
a)基因抑制活性解析1
調查CT-169/CT-157、CT-448、CT-454、CT-464、CT-465、CT-466、CT-467、CT-468、CT-469、CT-470及CT-471(構造參照第11圖)之β-連環素基因表現抑制活性。
如第12圖所示，CT-470與CT-169/CT-157同樣地強烈抑制β-連環素基因之表現。CT-448、CT-454、CT-464、CT-465、CT-466、CT-467、CT-468、CT-469及CT-471顯示比CT-169/CT-157強之活性。此顯示反義股5’末端及正義股3’末端用修飾苯基經由磷酸基鍵結而成之單股多核苷酸具有強的基因表現抑制活性。
b)基因抑制活性解析2
調查CT-106/CT-041及CT-472(構造參照第13圖)之β-連環素基因表現抑制活性。
如第14圖所示，CT-472與CT-106/CT-041同樣地強烈抑制β-連環素基因之表現。此顯示反義股5’末端及正義股3’末端用修飾苯基經由磷酸基鍵結而成之單股多核苷酸具有強的基因表現抑制活性。
c)基因抑制活性解析4
調查CT-001/CT-005及CT-473(構造參照第13圖)之β-連環素基因表現抑制活性。
如第14圖所示，CT-473比CT-001/CT-005強烈抑制β-連環素基因之表現。此顯示反義股5’末端及正義股3’末端用修飾苯基經由磷酸基鍵結而成之單股多核苷酸具有強的基因表現抑制活性。
(實施例27)
HO-Gp-Cm1p-Tp-Cm1p-Gp-Um1p-Cp-Um1p-Ap-Um1p-Gp-Am1p-Cp-Am1p-Ap-Gm1p-Tp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Am1p-Cp-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Cm1p-Ap-Um1p-Ap-Gm1p-Ap-Cm1p-Gp-Am1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(PK-009)之合成
以與實施例1同樣之方式合成PK-009。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例14中所取得之化合物(20mg)來調製。
PK-009為序列表之序列編號17中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸與序列編號18中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將PK-009之構造示於第15圖。
(實施例28)
HO-Cp-Gm1p-Ap-Gm1p-Ap-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Am1p-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Um1p-Cp-Um1p-Cp-Gm1p-Tp-Um1t-H(HS-005)之合成
以與實施例1同樣之方式合成HS-005。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例14中所取得之化合物(20mg)來調製。
HS-005為序列表之序列編號23中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸與序列編號24中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將HS-005之構造示於第16圖。
(實施例29)
HO-Cp-Amlp-Gp-Amlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-Tp-Gmlp-Gp-Gmlp-Tp-Gmlp-Cp-Umlp-Ap-Umlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Ap-Umlp-Ap-Gmlp-Cp-Amlp-Cp-Cmlp-Cp-Amlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Tp-Cmlp-Tp-Gmlp-Tp-Umlt-H(HS-006)之合成
以與實施例1同樣之方式合成HS-006。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用在參考例14中所取得之化合物(20mg)來調製。
HS-006為序列表之序列編號25中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸與序列編號26中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。HS-006之構造示於第16圖。
(實施例30)
HO-Cp-Gmlp-Ap-Gmlp-Ap-Cmlp-Ap-Cmlp-Ap-Umlp-Gp-Gmlp-Gp-Umlp-Gp-Cmlp-Tp-Amlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Tp-Amlp-Gp-Cmlp-Ap-Cmlp-Cp-Cmlp-Ap-Umlp-Gp-Umlp-Gp-Umlp-Cp-Umlp-Cp-Gmlp-Ts-Umlt-H(HS-005s)之合成
以與實施例1同樣之方式合成HS-005。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用參考例14中所取得之化合物(20mg)來調製。本多核苷酸中，硫代磷酸酯鍵結部分，係藉由0.2M苯基乙醯基二硫化物/吡啶-乙腈(1：1 v/v)溶液經3分鐘處理而調製。
HS-005s為序列表之序列編號27中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號28中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。HS-005s之構造示於第16圖。
(實施例31)
HO-Cp-Amlp-Gp-Amlp-Cp-Amlp-Cp-Amlp-Tp-Gmlp-Gp-Gmlp-Tp-Gmlp-Cp-Umlp-Ap-Umlp-X-P(=O)(OH)-O-Umlp-Ap-Umlp-Ap-Gmlp-Cp-Amlp-Cp-Cmlp-Cp-Amlp-Tp-Gmlp-Tp-Gmlp-Tp-Cmlp-Tp-Gmlp-Ts-Umlt-H(HS-006s)之合成
以與實施例1同樣之方式合成HS-006s。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用參考例14中所取得之化合物(20mg)來調製。本多核苷酸中，硫代磷酸酯鍵結部分係藉由0.2M苯基乙醯基二硫化物/吡啶-乙腈(1：1 v/v)溶液經3分鐘處理而調製。
HS-006s為序列表之序列編號29中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號30中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。將HS-006s之構造示於第16圖。
(實施例32)
HO-Cp-Gm1p-Ap-Cm1p-Ap-Gm1p-Gp-Cm1p-Cp-Um1p-Cp-Um1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Cp-Um1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Ap-Gm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Ap-Gm1p-Ap-Gm1p-Gp-Cm1p-Cp-Um1p-Gp-Um1p-Cp-Gm1p-Tp-Um1t-H(HS-012)之合成
以與實施例1同樣之方式合成HS-012。本多核苷酸中，X部分之Amidite試藥係使用參考例14中所取得之化合物(20mg)來調製。
HS-012為序列表之序列編號33中所示之多核苷酸之3’末端之核苷酸及序列編號34中所示之多核苷酸之5’末端之核苷酸經由與X之磷酸二酯鍵結而結合成之多核苷酸。HS-012之構造示於第19圖。
將在實施例27～32中所記載之多核苷酸之X部分之構造及分子量示於表3。表中，X之末端之亞甲基與正義股多核苷酸之3’末端鍵結，形成磷酸二酯鍵結，與苯基鍵結之氧原子與反義股多核苷酸之5’末端鍵結，形成磷酸二酯鍵結。
(參考例36)
HO-Grp-Crp-Urp-Crp-Grp-Urp-Crp-Urp-Arp-Urp-Grp-Arp-Crp-Arp-Arp-Grp-Urp-Arp-Arp-Urp-Urp-H(序列表之序列編號15)(PK-001)之合成
以與參考例32同樣之方式合成PK-001。將PK-001之構造示於第15圖。
分子量：計算值：6658.04，測定值：6658.23
鹼基序列：含有RNA-依存性蛋白質激酶基因(基因銀行登錄號：NM＿011163)之核苷酸編號743-762之序列。
(參考例37)
HO-Urp-Urp-Arp-Crp-Urp-Urp-Grp-Urp-Crp-Arp-Urp-Arp-Grp-Arp-Crp-Grp-Arp-Grp-Crp-Urp-G-H(序列表之序列編號16)(PK-002)之合成
以與參考例32同樣之方式合成PK-002。將PK-002之構造示於第15圖。
分子量：計算值：6674.04，測定值：6673.91
鹼基序列：含有與RNA-依存性蛋白質激酶基因(基因銀行登錄號：NM＿011163)之核苷酸編號743-762互補之序列。
(參考例38)
HO-Urp-Grp-Arp-Grp-Arp-Crp-Arp-Crp-Arp-Urp-Grp-Grp-Grp-Urp-Grp-Crp-Urp-Arp-Urp-Tp-Tt-H(序列表之序列編號19)(HS-001之正義股)之合成
以與參考例32同樣之方式合成HS-001之正義股。將HS-001之正義股之構造示於第16圖。
分子量：計算值：6710.12，測定值：6710.37
鹼基序列：含有熱激蛋白47基因(基因銀行登錄號：NM＿001235)之核苷酸編號1601-1619之序列。
(參考例39)
HO-Arp-Urp-Arp-Grp-Crp-Arp-Crp-Crp-Crp-Arp-Urp-Grp-Urp-Grp-Urp-Crp-Urp-Crp-Arp-Tp-Tt-H(序列表之序列編號20)(HS-001之反義股)之合成
以與參考例32同樣之方式合成HS-001之正義股。將HS-001之反義股之構造示於第16圖。
分子量：計算值：6590.04，測定值：6589.88
鹼基序列：含有與熱激蛋白47基因(基因銀行登錄號：NM＿001235)之核苷酸編號1601-1619互補之序列。
(參考例40)
HO-Grp-Arp-Grp-Arp-Crp-Arp-Crp-Arp-Urp-Grp-Grp-Grp-Urp-Grp-Crp-Urp-Arp-Urp-Arp-Tp-Tt-H(序列表之序列編號21)(HS-002之正義股)之合成
以與參考例32同樣之方式合成HS-001之正義股。將HS-001之正義股之構造示於第16圖。
分子量：計算值：6733.16，測定值：6733.22
鹼基序列：含有熱激蛋白47基因(基因銀行登錄號：NM＿001235)之核苷酸編號1602-1619之序列。
(參考例41)
HO-Urp-Arp-Urp-Arp-Grp-Crp-Arp-Crp-Crp-Crp-Arp-Urp-Grp-Urp-Grp-Urp-Crp-Urp-Crp-Tp-Tt-H(序列表之序列編號22)(HS-002之反義股)之合成
以與參考例32同樣之方式合成HS-001之正義股。將HS-001之反義股之構造示於第16圖。
分子量：計算值：6567.00，測定值：6566.99
鹼基序列：含有與熱激蛋白47基因(基因銀行登錄號：NM＿001235)之核苷酸編號1602-1619互補之序列。
(試驗例4)
單股或雙股多核苷酸所產生之小鼠PKR(Eif2ak2)基因表現抑制活性之測定法。
使用脂質體轉染試藥Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen公司製)，將在第15圖中所記載之單股或雙股多核苷酸導入鼠胎纖維母細胞(mouse embryonic fibroblast)中。
轉染24至48小時後，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司製)從細胞萃取全部的RNA，使用供qRT-PCR用之SuperScriptIII First-Strand Synthesis Super Mix(Invitrogen公司製)，mRNA反錄成cDNA。藉由使用SYBR Green之定量PCR系統(Applied Biosystems)測定PKR基因、及做為內部標準之36B4基因之表現量。引子係依照參考文獻(Nakamura T，et al.，Cell，140，338-348(2010))，使用：
PKR：5’-AAAACAA GGTGGATTGTCACACG-3’及
5’-GTTGGGCTCACACTGTT CATAAT-3’；
36B4：5’-CACTGGTCTAGGACCCGAGAA-3’及
5’-AGGGGGAGATGTTCAGCATGT-3’。
藉由將各樣本之PKR mRNA量除以相同樣本之36B4 mRNA量進行校正，可測定單股或雙股多核苷酸所產生之相對性基因抑制強度。
(試驗例5)
如以下方式測定單股或雙股多核苷酸所產生之大鼠Hsp47(Serpinh1)基因表現抑制活性。
(1)轉染
在12孔平底培養盤(住友Bakelite公司製)中添加200μL之OPTI-MEM培養基(Invitrogen公司製)及單股或雙股多核苷酸溶液(最終濃度1及0.1nM)。陰性對照組係使用從Qiagen公司購入之AllStars Negative Control siRNA。於其中添加1.2μL之脂質體轉染試藥Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen公司製)並混合，於室溫下靜置10分鐘至20分鐘。此時，將大鼠NRK-52E細胞株，於含有10%牛胎血清之經度百可氏修改之伊格培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(Invitrogen公司製)中，調製成62500個細胞/毫升之濃度。然後，在加入有脂質體-多核苷酸稀釋液之培養盤之各孔中各接種1mL，於37℃、5%二氧化碳條件下進行培養。
(2)即時PCR
轉染27小時後，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司製)從細胞萃取全部的RNA。Hsp47 mRNA之含量則係使用供qRT-PCR用之SuperScriptIII First-Strand Synthesis Super Mix(Invitrogen公司製)，將該mRNA反錄為cDNA之後，藉由使用TaqMan探針之定量性PCR進行測定。對於Hsp47基因之引子、探針，係使用TaqMan Gene Expression Assay(Applied Biosystems公司製Assay ID Rn00567777＿m1)。TaqMan反應係使用ABI Prism 7900HT Sequence detection system(Applied Biosystems公司製)進行。測定同一樣本之核糖體RNA(rRNA)之表現程度，做為內部標準。用於rRNA測定之引子、探針係使用TaqMan Ribosomal RNA Control Reagents VICTM Probe(Applied Biosystems公司製，型錄編號：4308329)。
將各樣本之Hsp47 mRNA量除以rRNA量，將只加入轉染試藥而不加多核苷酸之細胞之值設做1，將相對量作圖於第17圖中(圖中，在使用AllStars Negative Control siRNA(型錄編號：1027280)之情況，表記為：nagtive si)。第17圖呈現獨立3次實驗結果之平均值及其標準偏差(S.D.)值(多核苷酸之構造及其核苷酸序列示於第16圖中)。
(2)即時PCR解析
(a)基因抑制活性解析1
調查雙股多核苷酸HS-001、雙股多核苷酸HS-002、單股多核苷酸HS-005、及單股多核苷酸HS-006(構造參照第16圖)之大鼠Hsp47基因表現抑制活性。
如第17圖所示，HS-005比HS-001更強地抑制大鼠Hsp47基因之表現，HS-006比HS-002更強地抑制大鼠Hsp47基因之表現。此時，AllStars Negative Control siRNA並未顯示Hsp47基因之抑制活性。此顯示將反義股5’末端及正義股3’末端用修飾苯基經由磷酸基鍵結而成之單股多核苷酸具有比雙股多核苷酸強的基因表現抑制活性。
(試驗例6)
測定單股或雙股多核苷酸所產生之大鼠Hsp47(Serpinh1)基因表現抑制活性。
(1)轉染
使用為雙股多核苷酸之HS-001、HS-002，單股多核苷酸HS-005s及HS-006s(構造參照第16圖)，以與試驗例5同樣之方式進行。
但是，核酸之導入NRK-52E細胞，係使用24孔平底培養盤(住友Bakelite公司製)，以試驗例5之一半量之系統進行。
(2)即時PCR
以與試驗例5同樣之方式進行。
(a)基因抑制活性解析1
調查為雙股多核苷酸之HS-001、HS-002，單股多核苷酸HS-005s及HS-006s之大鼠Hsp47基因表現抑制活性。
如第18圖所示，HS-005s及HS-006s，與HS-001及HS-002相比，同等或更強烈地抑制大鼠Hsp47基因之表現。此顯示將反義股5’末端及正義股3’末端用修飾苯基經由磷酸基鍵結而成之單股多核苷酸具有比雙股多核苷酸強之基因表現抑制活性。
(試驗例7)
測定單股或雙股多核苷酸所產生之大鼠Hsp47(Serpinh1)基因表現抑制活性。
(1)轉染
使用為國際公開第2011/072082所記載之雙股多核苷酸之siHSP47C(序列表之序列編號31及32，構造參照第19圖)，及單股多核苷酸HS-012(構造參照第19圖)，以與試驗例6同樣之方式進行。
siHSP47C正義股5’-GGACAGGCCUCUACAACUATT-3’(序列編號31)
siHSP47C反義股5’-UAGUUGUAGAGGCCUGUCCTT-3’(序列編號32)
(2)即時PCR
以與試驗例5同樣之方式進行。
(a)基因抑制活性解析1
調查為雙股多核苷酸之siHSP47C，及單股多核苷酸HS-012之大鼠Hsp47基因表現抑制活性。
如第20圖所示，HS-012，與siHSP47C相較，為同等或更強烈地抑制大鼠Hsp47基因之表現。此顯示反義股5’末端及正義股3’末端用修飾苯基經由磷酸基鍵結而成之單股多核苷酸具有比雙股多核苷酸強的基因表現抑制活性。
[產業上之可利用性]
依照本發明，可提供具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之單股多核苷酸。又，依照本發明，可提供對RNA分解酵素安定，具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之單股多核苷酸。
該單股多核苷酸雖可用於基因之功能解析、醫藥品等，不過本發明之單股多核苷酸可利用之範圍並不限於該等產業領域。
[序列表，自由文本格式(freetext)]
序列編號1：CT-169
序列編號2：CT-157
序列編號3：CT-472之正義股區域
序列編號4：CT-472之反義股區域
序列編號5：CT-473之正義股區域
序列編號6：CT-473之反義股區域
序列編號7：CT-106
序列編號8：CT-041
序列編號9：CT-001
序列編號10：CT-005
序列編號11：β連環素基因正向引子
序列編號12：β連環素基因反向引子
序列編號13：GAPDH基因正向引子
序列編號14：GAPDH基因反向引子
序列編號15：PK-001
序列編號16：PK-002
序列編號17：PK-009之正義股區域
序列編號18：PK-009之反義股區域
序列編號19：HS-001之正義股
序列編號20：HS-001之反義股
序列編號21：HS-002之正義股
序列編號22：HS-002之反義股
序列編號23：HS-005之正義股區域
序列編號24：HS-005之反義股區域
序列編號25：HS-006之正義股區域
序列編號26：HS-006之反義股區域
序列編號27：HS-005s之正義股區域
序列編號28：HS-005s之反義股區域
序列編號29：HS-006s之正義股區域
序列編號30：HS-006s之反義股區域
序列編號31：siHSP47C之正義股
序列編號32：siHSP47C之反義股
序列編號33：HS-012之正義股區域
序列編號34：HS-012之反義股區域
第1圖係表示A-1步驟之概要圖。
第2圖係表示C法及D法之概要圖。
第3圖係表示E法及F法之概要圖。
第4圖係表示G法之概要圖。
第5圖係表示在參考例3～參考例14、參考例17、參考例21～參考例23中所記載之化合物之構造圖。
第6圖係表示對抗人類β-連環素基因之多核苷酸之圖。以下，表示各圖中正義股、反義股之實施例之多核苷酸之組合。符號之中，黒圓圈(●)表示DNA，白圓圈(○)表示2’-O-甲基RNA。黒圓圈-白圓圈之間之線表示核苷間之磷酸二酯鍵。圖中之p表示-P(=O)(OH)-，在與p鍵結之情況，多核苷酸之末端的羥基之氫原子被除去。在多核苷酸之末端沒有任何鍵結之情況，DNA或2’-O-甲基RNA之3’末端或5’末端為OH基。n表示碳數。在第7圖及第11圖中各符號所表示之意義亦同。又，亦展現各多核苷酸之鹼基序列。
第7圖係表示對抗人類β-連環素基因之多核苷酸之圖。
第8圖係展現藉由即時PCR解析之多核苷酸之基因抑制活性之圖。
第9圖係展現藉由即時PCR解析之多核苷酸之基因抑制活性之圖。
第10圖係展現&在參考例24～參考例31中所記載之化合物之構造之圖。
第11圖係展現對抗人類β-連環素基因之多核苷酸之圖。
第12圖係展現藉由即時PCR解析之多核苷酸之基因抑制活性之圖。
第13圖係展現對抗人類β-連環素基因之多核苷酸之圖。符號之中，白方形(□)表示RNA，黒圓圈(●)表示DNA，白圓圈(○)表示2’-O-甲基RNA。連結各核苷之間之線表示磷酸二酯鍵。圖中之p表示-P(=O)(OH)-，在與p鍵結之情況，多核苷酸之末端之羥基之氫原子被除去。多核苷酸之末端無任何鍵結時，RNA、DNA、或2’-O-甲基RNA之3’末端或5’末端為OH基。n表示碳數。在第15圖、第16圖及第19圖中各符號所表示之意義亦同。又，亦展現各多核苷酸之鹼基序列。
第14圖係展現藉由即時PCR解析之多核苷酸之基因抑制活性之圖。
第15圖係展現對抗小鼠PKR基因之多核苷酸之圖。
第16圖係展現對抗大鼠、人類Hsp47基因之多核苷酸之圖。圖中之s表示硫代磷酸酯鍵。
第17圖係展現藉由即時PCR解析之多核苷酸之基因抑制活性之圖。就多核苷酸之濃度而言，白色柱表示0.1nM之情況，黒色柱表示1nM之情況。在第18圖及第20圖中亦同。
第18圖係展現藉由即時PCR解析之多核苷酸之基因抑制活性之圖。
第19圖係展現對抗大鼠、人類Hsp47基因之多核苷酸之圖。
第20圖係展現由即時PCR解析之多核苷酸之基因抑制活性之圖。
<110>　第一三共股份有限公司
<120>　經修飾之單股多核苷酸
<130>　FP1145
<150>　JP2010-269498
<151>　2010-12-02
<150>　JP2011-100159
<151>　2011-04-27
<160>　34
<170>　PatentIn version 3.4
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<223>　正義股
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<220>
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<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(8)..(8)
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<221>　經修飾之鹼基
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<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<220>
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<212>　DNA
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<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　cm
<220>
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<223>　um
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<221>　經修飾之鹼基
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<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　um
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<221>　經修飾之鹼基
<222>　(17)..(17)
<223>　um
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<221>　經修飾之鹼基
<222>　(19)..(19)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(21)..(21)
<223>　um
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<220>
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<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(4)..(4)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<221>　經修飾之鹼基
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<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　gm
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<223>　um
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<223>　gm
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<221>　經修飾之鹼基
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<223>　gm
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<221>　經修飾之鹼基
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<223>　um
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<221>　經修飾之鹼基
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<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(13)..(13)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(15)..(15)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(17)..(17)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　cm
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<221>　經修飾之鹼基
<222>　(2)..(2)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<221>　經修飾之鹼基
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<223>　um
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<221>　經修飾之鹼基
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<223>　gm
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<223>　2’-0-甲基腺苷
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<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　um
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<221>　經修飾之鹼基
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<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　cm
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<221>　經修飾之鹼基
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<220>
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<223>　cm
<220>
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<211>　21
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<212>　DNA
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<220>
<223>　反義股區域HS-002
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<212>　DNA
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<223>　正義股區域HS-005
<220>
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<223>　gm
<220>
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<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(6)..(6)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(8)..(8)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(10)..(10)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　um
<220>
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<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(7)..(7)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(9)..(9)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(11)..(11)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(13)..(13)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(15)..(15)
<223>　um
<220>
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<222>　(17)..(17)
<223>　um
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<223>　gm
<220>
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<212>　DNA
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<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(6)..(6)
<223>　2’-0-甲基腺苷
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(8)..(8)
<223>　2’-0-甲基腺苷
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(10)..(10)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　gm
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<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<220>
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<220>
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<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　gm
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<221>　經修飾之鹼基
<222>　(15)..(15)
<223>　gm
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<221>　經修飾之鹼基
<222>　(17)..(17)
<223>　cm
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<221>　經修飾之鹼基
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<223>　um
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<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(6)..(6)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(8)..(8)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(10)..(10)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(12)..(12)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(14)..(14)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<221>　經修飾之鹼基
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<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(7)..(7)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(9)..(9)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(11)..(11)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(13)..(13)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(15)..(15)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(17)..(17)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(19)..(19)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(21)..(21)
<223>　um
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
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<221>　經修飾之鹼基
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<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(6)..(6)
<223>　2’-0-甲基腺苷
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(8)..(8)
<223>　2’-0-甲基腺苷
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(10)..(10)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(12)..(12)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(14)..(14)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(16)..(16)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(18)..(18)
<223>　um
<400>　29
<210>　30
<211>　21
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　反義股區域HS-006s
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(1)..(1)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(3)..(3)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(5)..(5)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(7)..(7)
<223>　2’-0-甲基腺苷
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(9)..(9)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(11)..(11)
<223>　2’-0-甲基腺苷
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(13)..(13)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(15)..(15)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(17)..(17)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(19)..(19)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(21)..(21)
<223>　um
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<211>　21
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
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<212>　DNA
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<223>　正義股區域HS-012
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(2)..(2)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(4)..(4)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(6)..(6)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(8)..(8)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
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<223>　um
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<221>　經修飾之鹼基
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<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(16)..(16)
<223>　2’-0-甲基腺苷
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(18)..(18)
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<223>　反義股區域HS-012
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<221>　經修飾之鹼基
<222>　(1)..(1)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(3)..(3)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(5)..(5)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(7)..(7)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(9)..(9)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(11)..(11)
<223>　gm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(13)..(13)
<223>　cm
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(15)..(15)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(17)..(17)
<223>　um
<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(19)..(19)
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<220>
<221>　經修飾之鹼基
<222>　(21)..(21)
<223>　um
<400>　34

Claims (59)

  1. 一種多核苷酸或其鹽，其係具有：對應於標的基因之正義股多核苷酸，及含與該正義股多核苷酸互補之鹼基序列之反義股多核苷酸之多核苷酸，該多核苷酸係該反義股多核苷酸之5’末端及該正義股多核苷酸之3’末端藉由在上述各端形成磷酸二酯構造之連結基而結合成之多核苷酸，該連結基具有下式所示之構造： 式中，與苯基鍵結之氧原子鍵結於反義股之5’末端且形成磷酸二酯構造，R1、R2及R3之任一者表示下式所示之構造：-L1-(CH2)m-L2-L3-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→，式中，m表示0至4之整數，n1表示0至4之整數，n2表示0或2至10之整數，L1表示單鍵或-O-，L2表示單鍵或-CH(-NH-L4-R)-，L3係以與L2之鍵結做為基點，表示單鍵、-(C=O)-NH-、或-NH-(C=O)-，L3為單鍵以外者時，n2表示2至10之整數；L1及L2為單鍵，m為1，n1及n2為0時，L3-O→表示：-CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Ser、-CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Thr、-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Ser、或-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Thr，該等絲胺酸及羥丁胺酸之羥基部分係與正義股多核苷酸之3’末端之磷酸基鍵結，再者，絲胺酸及羥丁胺酸之胺基可經醯基取代，j表示0至2之整數，L4表示單鍵、-(C=O)-(CH2)k-NH-、或-(C=O)-(CH2)k-，k表示1至6之整數，R表示氫原子、碳數1至6之烷基、可為飽和或不飽和之碳數2至30之烴羰基、可為飽和或不飽和之碳數2至30之烴氧羰基；R1、R2及R3中之其餘2個各自獨立地表示選自下列基所組成之群之基：氫原子、可具有取代基之碳數1至8之烷基、可具有取代基之碳數1至8之烷氧基、鹵素原子、具有碳數1至9之烷基之烷羰胺基、及包含可具有取代基之碳數1至8之烷基之烷基羰基。
  2. 如申請專利範圍第1項之多核苷酸或其鹽，其中R1及R3為氫原子。
  3. 如申請專利範圍第2項之多核苷酸或其鹽，其中L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m與n2之和為3以上之整數。
  4. 如申請專利範圍第2項之多核苷酸或其鹽，其中L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m與n2之和為8以上之整數。
  5. 如申請專利範圍第2項之多核苷酸或其鹽，其中L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為0或2，n2為6以上之整數。
  6. 如申請專利範圍第2項之多核苷酸或其鹽，其中L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為0或2，n2為6或8。
  7. 如申請專利範圍第2項之多核苷酸或其鹽，其中L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為0或2，n2為8。
  8. 如申請專利範圍第1項之多核苷酸或其鹽，其中R1及R3為氫原子，L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為2，n2為8。
  9. 一種多核苷酸或其鹽，其係具有：對應於標的基因之正義股多核苷酸，及具有與該正義股多核苷酸互補之鹼基序列之反義股多核苷酸之多核苷酸，該多核苷酸係該反義股多核苷酸之5’末端及該正義股多核苷酸之3’末端在經由磷酸二酯鍵媒介下藉由連結基而結合成之多核苷酸，該多核苷酸具有下式所示之構造： 式中，p表示0至4之整數，q表示4至10之整數，L5表示單鍵或-O-，L6係以與(CH2)p之鍵結為基點，表示-(C=O)-NH-、或-NH-(C=O)-，L5在苯環上之鍵結位置為對位或間位，L5為-O-時，p表示1至4之整數。
  10. 如申請專利範圍第9項之多核苷酸或其鹽，其中p與q之和為3以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  11. 如申請專利範圍第9項之多核苷酸或其鹽，其中p與q之和為8以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  12. 如申請專利範圍第9項之多核苷酸或其鹽，其中p為0或2，q為6以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  13. 如申請專利範圍第9項之多核苷酸或其鹽，其中p為0或2，q為6或8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  14. 如申請專利範圍第9項之多核苷酸或其鹽，其中p為0或2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  15. 如申請專利範圍第9項之多核苷酸或其鹽，其中p為2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  16. 如申請專利範圍第1至15項中任一項之多核苷酸或其鹽，其中正義股多核苷酸包含以下之式(II)所示之多核苷酸，反義股多核苷酸包含以下之式(III)所示之多核苷酸，再者，具有以下(a)至(d)所示之特徴：5’-(γ-β)9-γ-λt-3’(II)5’-β-(γ-β)9-υu-3’(III)(a)γ表示RNA，β表示2’-OMeRNA，λ及υ表示DNA；(b)t及u為相同或相異，表示0~5之任一者整數；(c)式(II)所示之多核苷酸之中，(γ-β)9-γ包含與標的基因相同之核苷酸序列；(d)式(II)中之(γ-β)9-γ及式(III)中之β-(γ-β)9包含彼此互補之核苷酸序列。
  17. 如申請專利範圍第1至15項中任一項之多核苷酸或其鹽，其中正義股多核苷酸包含以下之式(IV)所示之多核苷酸，反義股多核苷酸包含以下之式(V)所示之多核苷酸，再者，具有以下(a)至(d)所示之特徴：5’-(α-β)9-αp-λt-3’(IV)5’-δs-(α-β)9-υu-3’(V)(a)α及β相異，表示DNA或2’-OMeRNA，δ及λ相同或相異，表示DNA或2’-OMeRNA，υ為相同或相異，表示選自DNA、RNA及2’-OMeRNA之任一核苷酸；(b)p表示0或1之整數，於p為0時，t為0，於p為1時，t表示0~5之任一整數；s表示0或1之整數，u表示0~5之任一整數；(c)式(IV)所示之多核苷酸之中，(α-β)9-αp包含與標的基因相同之核苷酸序列；(d)式(IV)中之(α-β)9及式(V)中之(α-β)9包含彼此互補之核苷酸序列。
  18. 如申請專利範圍第1至15項中任一項之多核苷酸或其鹽，其中正義股多核苷酸包含以下之式(VI)所示之多核苷酸，反義股多核苷酸包含以下之式(VII)所示之多核苷酸，再者，具有以下之(a)至(d)所示之特徴：5’-β-(α-β)8-αp-λt-3’(VI)5’-δs-(α-β)8-(α-β)-υu-3’(VII)(a)α及β為相異，表示DNA或2’-OMeRNA，δ及λ為相同或相異，表示DNA或2’-OMeRNA，υ為相同或相異，表示選自DNA、RNA及2’-OMeRNA之任一核苷酸；(b)p表示0或1之整數，於p為0時，t為0，於p為1時，t表示0~5之任一整數；s表示0或1之整數，u表示0~5之任一整數；(c)式(VI)所示之多核苷酸之中，β-(α-β)8-αp包含與標的基因相同之核苷酸序列；(d)式(VI)中之(α-β)8及式(VII)中之(α-β)8包含彼此互補之核苷酸序列。
  19. 如申請專利範圍第1至15項中任一項之多核苷酸或其鹽，其中α為DNA，β為2’-OMeRNA。
  20. 如申請專利範圍第16至19項中任一項之多核苷酸或其鹽，其中λt及υu為相同或相異，係具有胸腺嘧啶鹼基、腺嘌呤鹼基或鳥糞嘌呤鹼基之DNA，或者具有尿嘧啶鹼基、腺嘌呤鹼基或鳥糞嘌呤鹼基之2’-OMeRNA之任一者。
  21. 如申請專利範圍第16至20項中任一項之多核苷酸或其鹽，其中t為0，u為2。
  22. 如申請專利範圍第17至20項中任一項之多核苷酸或其鹽，其中p及t為0，s為1，u為2。
  23. 如申請專利範圍第17至20項中任一項之多核苷酸或其鹽，其中p及t為0，s為0或1，u為2，υ2為DNA或2’-OMeRNA。
  24. 如申請專利範圍第1至15項中任一項之多核苷酸或其鹽，其中正義股多核苷酸包含以下之式(VIII)所示之多核苷酸，反義股多核苷酸包含以下之式(IX)所示之多核苷酸，再者，具有以下之(a)至(c)所示之特徴：5’-(α-β)9-3’(VIII)5’-β-(α-β)9-(α-β)-3’(IX)(a)α為DNA，β為2’-OMeRNA；(b)式(IX)所示之多核苷酸之中，β-(α-β)9包含與標的基因互補之核苷酸序列；(c)式(VIII)中之(α-β)9及式(IX)中之(α-β)9包含彼此互補之核苷酸序列。
  25. 如申請專利範圍第16至24項中任一項之多核苷酸或其鹽，其中2’-OMeRNA之任意1~4個殘基可被ENA或2’,4’-BNA/LNA取代。
  26. 如申請專利範圍第16至25項中任一項之多核苷酸或其鹽，其中DNA之任意1~4個殘基可被RNA、ENA或2’,4’-BNA/LNA取代。
  27. 如申請專利範圍第1至26項中任一項之多核苷酸或其鹽，其中各核苷酸係以磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵來鍵結。
  28. 一種醫藥，其係以如申請專利範圍第1至27項中任一項之多核苷酸或其鹽，做為有效成分。
  29. 如申請專利範圍第28項之醫藥，其係用於治療源自基因表現之疾病。
  30. 一種標的基因之表現抑制方法，其係藉由將選自如申請專利範圍第1至29項中任一項之多核苷酸或其鹽投與至哺乳動物。
  31. 一種試藥，其含有如申請專利範圍第1至27項中任一項之多核苷酸或其鹽。
  32. 一種化合物或其鹽，其具有式(X) [式中，Tr表示羥基之保護基，p表示0至4之整數，q表示4至10之整數，L5表示單鍵或-O-，L6係以與(CH2)p之鍵結為基點，表示-(C=O)-NH-、或-NH-(C=O)-，L5在苯環上之鍵結位置為對位或間位]。
  33. 如申請專利範圍第32項之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)氧雜蒽基、三苯甲基、乙醯基丙醯基、或雙(三甲基矽烷基氧基)(環己基氧基)矽烷基。
  34. 如申請專利範圍第32項之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p與q之和為3以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  35. 如申請專利範圍第32項之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p與q之和為8以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  36. 如申請專利範圍第32項之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為0或2，q為6以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  37. 如申請專利範圍第32項之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為0或2，q為6或8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  38. 如申請專利範圍第32項之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為0或2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  39. 如申請專利範圍第32項之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  40. 如申請專利範圍第32項之多核苷酸或其鹽，其中Tr為4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  41. 一種製造具有式(XI)之化合物之方法，該化合物係具有：對應於標的基因之正義股多核苷酸，及含與該正義股多核苷酸互補之鹼基序列之反義股多核苷酸之多核苷酸，該多核苷酸係該反義股多核苷酸之5’末端及該正義股多核苷酸之3’末端在經由磷酸二酯鍵媒介下藉由X而結合成之具有式(XI) 之化合物[式中，W2’表示除去5’末端及3’末端之羥基之正義股多核苷酸，W1’-Y’表示除去5’末端及3’末端之羥基之反義股多核苷酸，X表示式(XII) [式中，p表示0至4之整數，q表示4至10之整數，L5表示單鍵或-O-，L6係以與(CH2)p之鍵結做為基點，表示-(C=O)-NH-或-NH-(C=O)-，L5在苯環上之鍵結位置為對位或間位，L5為-O-時，p表示1至4之整數]，末端之亞甲基鍵結於該正義股多核苷酸之3’末端並形成磷酸二酯鍵，與苯基鍵結之氧原子鍵結於該反義股多核苷酸之5’末端並形成磷酸二酯鍵]；該方法包含下述步驟：(i)使具有式Tr-O-X-H[式中，Tr表示羥基之保護基，X之-(CH2)q-鍵結於Tr-O-，與苯基鍵結之氧原子鍵結於氫]之化合物之羥基與具有式(XIII) 或，式(XIV) [式中，R4表示2-氰基乙基、甲基、甲磺醯基乙基、2,2,2-三氯乙基、或4-氯苯基甲基，R5表示N-嗎啉基、二異丙基胺基、二乙基胺基、或二甲基胺基]之化合物反應，製造具有式(XV) 之化合物之步驟；(ii)藉由亞磷醯胺法，使在上述(i)中所得到之化合物與具有式HO-W1-Y-CPG[式中，W1-Y表示除去5’末端及3’末端之羥基且經保護之反義股多核苷酸，CPG表示具有能與多核苷酸鍵結之連結基之聚合物支撐體]之化合物反應，繼而，藉由亞磷醯胺(phosphoroamidite)法，製造式Tr1-O-W2-O-P(=O)(OR4)-O-[式中，Tr1表示羥基之保護基，W2表示除去5’末端及3’末端之羥基且經保護之正義股多核苷酸]之部分，而製得具有式(XVI) 之化合物之步驟；以及(iii)從CPG切出在上述(ii)中所得到之化合物，並進行保護基之除去步驟。
  42. 如申請專利範圍第41項之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)氧雜蒽基、三苯甲基、乙醯基丙醯基、或雙(三甲基矽烷基氧基)(環己基氧基)矽烷基。
  43. 如申請專利範圍第41項之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p與q之和為3以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  44. 如申請專利範圍第41項之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p與q之和為8以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  45. 如申請專利範圍第41項之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為0或2，q為6以上之整數，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  46. 如申請專利範圍第41項之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為0或2，q為6或8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  47. 如申請專利範圍第41項之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為0或2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  48. 如申請專利範圍第41項之方法，其中Tr與Tr1為相同或相異，為4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  49. 如申請專利範圍第41項之方法，其中Tr及Tr1為4,4’-二甲氧基三苯甲基，p為2，q為8，L5為單鍵，L6為-(C=O)-NH-，L5在苯環上之鍵結位置為對位。
  50. 如申請專利範圍第41至49項中之任一項之方法，其中R4為2-氰基乙基、甲基、甲磺醯基乙基、2,2,2-三氯乙基、或4-氯苯基甲基，R5為N-嗎啉基、二異丙基胺基、二乙基胺基、或二甲基胺基。
  51. 如申請專利範圍第41至49項中之任一項之方法，其中R4為2-氰基乙基或甲基，R5為N-嗎啉基或二異丙基胺基。
  52. 如申請專利範圍第41至49項中之任一項之方法，其中具有式(XIII)之化合物為氯(N-嗎啉基)甲氧基膦、氯(N-嗎啉基)氰乙氧基膦、氯(二異丙基胺基)甲氧基膦或氯(二異丙基胺基)氰乙氧基膦。
  53. 如申請專利範圍第41至49項中之任一項之方法，其中具有式(XIV)之化合物為雙(二異丙基胺基)氰基乙氧基膦。
  54. 一種選自下述之多核苷酸或其鹽：HO-Cp-Gm1p-Ap-Gm1p-Ap-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Am1p-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Um1p-Cp-Um1p-Cp-Gm1p-Tp-Um1t-H(HS-005)、HO-Cp-Am1p-Gp-Am1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-Tp-Gm1p-Gp-Gm1p-Tp-Gm1p-Cp-Um1p-Ap-Um1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Ap-Um1p-Ap-Gm1p-Cp-Am1p-Cp-Cm1p-Cp-Am1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Tp-Cm1p-Tp-Gm1p-Tp-Um1t-H(HS-006)、HO-Cp-Gm1p-Ap-Gm1p-Ap-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Am1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Am1p-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Um1p-Cp-Um1p-Cp-Gm1p-Ts-Um1t-H(HS-005s)、或者HO-Cp-Am1p-Gp-Am1p-Cp-Am1p-Cp-Am1p-Tp-Gm1p-Gp-Gm1p-Tp-Gm1p-Cp-Um1p-Ap-Um1p-X-P(=O)(OH)-O-Um1p-Ap-Um1p-Ap-Gm1p-Cp-Am1p-Cp-Cm1p-Cp-Am1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Tp-Cm1p-Tp-Gm1p-Ts-Um1t-H(HS-006s)[式中，Ap、Gp、Cp、Tp、Ts、Am1p、Gm1p、Cm1p、Um1p、Um1t表示具有下式所示之構造之核苷、或核苷酸： X之前方表示對應於標的基因之正義股多核苷酸，X之後方表示含有與該正義股多核苷酸互補之鹼基序列之反義股多核苷酸，X表示具有式(XVII) 所示之構造之連結基，末端之亞甲基鍵結於該正義股多核苷酸之3’末端並形成磷酸二酯鍵，而與苯基鍵結之氧原子鍵結於該反義股多核苷酸之5’末端並形成磷酸二酯鍵]。
  55. 一種醫藥，含有如申請專利範圍第54項之多核苷酸或其鹽，做為有效成分。
  56. 如申請專利範圍第55項之醫藥，其係用於治療源自Hsp47基因之表現之疾病。
  57. 如申請專利範圍第57項之醫藥，其中該源自Hsp47基因之表現之疾病為纖維症。
  58. 一種Hsp47基因之表現抑制方法，其係藉由將如申請專利範圍第54項之多核苷酸或其鹽投與至哺乳動物。
  59. 一種試藥，其含有如申請專利範圍第54項之多核苷酸或其鹽。
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