KR20140001224A

KR20140001224A - 수식 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드

Info

Publication number: KR20140001224A
Application number: KR1020137013927A
Authority: KR
Inventors: 마코토 고이즈미; 야스히데 히로타; 마키코 나카야마; 미카 이케다
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2010-12-02
Filing date: 2011-12-01
Publication date: 2014-01-06
Also published as: JPWO2012074038A1; CA2819944A1; EP2647713B1; WO2012074038A1; EP2647713A1; CN103370416A; US8987226B2; BR112013013522A2; ES2664992T3; TW201307376A; US20130253038A1; EP2647713A4; RU2013129999A; JP5939685B2; AU2011337658A1

Abstract

RNA 분해 효소에 안정적인, RNA 간섭 작용을 갖는 폴리뉴클레오티드 등을 제공하는 것.
표적 유전자에 대한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드, 및 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기 배열을 갖는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 갖는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드를 유래로 하고, 이 안티센스 사슬의 5' 말단 및 센스 사슬의 3' 말단이 각각에 있어서 인산디에스테르 구조를 형성한 페닐기를 함유하는 링커에 의해 결합되어 있는 구조를 갖는 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드.

Description

수식 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드{MODIFIED SINGLE-STRAND POLYNUCLEOTIDE}

본 발명은 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드의 사용, 그 폴리뉴클레오티드를 사용한 유전자 발현 억제 방법, 그 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 등에 관한 것이다.

세포, 조직 또는 개체 내의 표적 유전자의 발현을 저해시키는 방법으로서 당해 세포, 조직 또는 개체 내에 2 개 사슬 RNA 를 도입하는 수법이 있다. 2 개 사슬 RNA 의 도입에 따라, 그 배열에 상동성을 갖는 mRNA 가 분해되고, 표적 유전자의 발현이 저해된다. 이런 효과는 「RNA 간섭」또는 「RNAi」라고 불린다. RNA 간섭은 선충에서 처음으로 보고되었고 (예를 들어, 비특허문헌 1 참조), 그 후에 식물에서도 보고되었다 (예를 들어, 비특허문헌 2 참조).

3' 말단에 2 뉴클레오티드의 오버행을 갖는, 센스 사슬, 안티센스 사슬 각각 21 뉴클레오티드로 이루어지는 2 개 사슬 RNA (small interfering RNA : siRNA) 는, 척추 동물의 배양 세포에 있어서, RNA 간섭 작용을 갖는 것이 보고되어 있다 (예를 들어, 비특허문헌 3 참조). siRNA 는 유전자 기능의 동정, 유용 물질 생산에 적합한 세포주의 스크리닝, 질환에 관여하는 유전자의 제어 등에 유용하다고 여겨지고 있지만, RNA 분해 효소에 의해 용이하게 분해된다는 성질을 갖는다 (예를 들어, 비특허문헌 4 참조).

RNA 분해 효소에 대해 안정적인 RNA 간섭 작용을 갖는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드로는, siRNA 를 구성하는 RNA 대신에 DNA 및 2'-OMeRNA 를 교대로 조합한 뉴클레오티드 유닛을 갖는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드가 보고되어 있다 (특허문헌 1 참조).

siRNA 의 센스 사슬, 안티센스 사슬의 5' 말단의 수식에 관해서는, 몇 가지 보고가 있다. 센스 사슬 또는 안티센스 사슬의 5' 말단에 6-아미노헥실인산기를 갖는 siRNA 는 표적 mRNA 발현 억제 활성이 있다고 보고되어 있다 (예를 들어, 비특허문헌 5 참조). 한편, 안티센스 사슬의 5' 말단에 동일한 6-아미노헥실인산기를 갖는 siRNA 는 표적 mRNA 발현 억제 활성이 없다고 보고되어 있다 (예를 들어, 비특허문헌 6 참조). 또, 센스 사슬의 5' 말단에 3-아미노프로필인산기를 갖는 siRNA 는 표적 mRNA 발현 억제 활성이 있지만, 안티센스 사슬의 5' 말단에 3-아미노프로필인산기를 갖는 siRNA 는 표적 mRNA 발현 억제 활성이 없다고 보고되어 있다 (예를 들어, 비특허문헌 7 참조). 안티센스 사슬의 5' 말단에 동일한 6-아미노헥실인산기 또는 3-아미노프로필인산기를 갖는 siRNA 는, 미수식 siRNA 와 비교하여, 표적 mRNA 발현 억제 활성의 저하가 보이지만 완전히 활성이 상실되는 것이 아니라고 보고되어 있다 (예를 들어, 비특허문헌 8 참조).

센스 사슬 또는 안티센스 사슬의 5' 말단에 플루오레세인을 갖는 siRNA 에 있어서도 표적 mRNA 발현 억제 활성을 갖는다고 보고되어 있다 (예를 들어, 비특허문헌 9 참조). 센스 사슬 또는 안티센스 사슬의 5' 말단에 스테로이드 또는 지질의 구조를 갖는 siRNA에 있어서, 센스 사슬의 5' 말단에 스테로이드 또는 지질의 구조를 갖는 siRNA 에서는, 표적 mRNA 의 발현을 억제하는 활성을 갖는다고 보고되어 있다 (예를 들어, 비특허문헌 8 참조). UV 조사에 의해 탈리될 수 있는 오르토니트로벤질 유도체를 안티센스 사슬의 5' 말단에 갖는 경우, UV 조사를 이용하여 표적 mRNA 발현 억제하는 활성을 제어할 수 있다고 보고되어 있다 (예를 들어, 비특허문헌 10 참조).

센스 사슬의 3' 말단과 안티센스 사슬의 5' 말단을 4 개 정도의 뉴클레오티드 유닛으로 이루어지는 루프로 결합한 siRNA 는 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드가 되어, short hairpin RNA (shRNA) 라고 불린다. 줄기 부분이 19 염기쌍인 shRNA 는, 그것과 동일한 염기 배열을 갖는 19 염기쌍의 siRNA 와 비교하여, 활성이 저하되는 것이 나타나 있다 (예를 들어, 비특허문헌 9 참조). 또, 루프 내의 2 개의 뉴클레오티드를 프로필인산 유닛 등의 비뉴클레오티드 링커로 치환한 19 염기쌍의 줄기로 이루어지는 shRNA 가 합성되어, 표적 mRNA 발현 억제 활성이 측정되었지만, 미수식 shRNA 와 비교하여 활성의 향상은 인정되지 않았다 (예를 들어, 비특허문헌 9 참조). 센스 사슬의 3' 말단과 안티센스 사슬의 5' 말단을 비뉴클레오티드 링커로 결합한 siRNA 로서 오르토니트로벤질 유도체를 사용한 예가 있다 (예를 들어, 비특허문헌 8 참조). 이 오르토니트로벤질 유도체로 결합한 19 염기쌍의 siRNA 는 미수식 siRNA 와 비교하여 표적 mRNA 발현 억제 활성이 저하되어 있다. 또한, 이 siRNA 를 트랜스펙트한 배양 세포에 10 분간 UV 조사하여, 표적 mRNA 발현 억제 활성이 측정되었지만, 미수식 siRNA 와 비교하여 표적 mRNA 발현 억제 활성이 저하되어 있다. 안티센스 사슬의 5' 말단 및 센스 사슬의 3' 말단이 각각에 있어서 인산디에스테르 구조를 형성한 페닐기를 함유하는 링커에 의해 결합되어 있는 구조를 갖는 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드는 알려져 있지 않다.

RNAi 활성에 관여하는 것이 알려져 있는 Argonaute 단백질 (Ago) 과 안티센스 사슬의 복합체 X 선 해석으로부터, 안티센스 사슬의 5' 말단의 인산기 및 그 근방의 뉴클레오티드가 Ago 의 PIWI 도메인에 강하게 결합되어 있는 것이 나타나 있다 (예를 들어, 비특허문헌 11 참조). 화학 합성된 siRNA 를 세포 내에 도입하면, 센스 사슬과 안티센스 사슬의 양방의 5' 말단이 인산화되는 것이 보고되어 있다 (예를 들어, 비특허문헌 12 참조). 인간 세포에 있어서는, RNA 키나아제 hClp1 이 siRNA 의 5'-인산화를 담당하고 있는 것이 보고되어 있다 (예를 들어, 비특허문헌 13 참조). 5' 말단을 인산화한 siRNA 와 5' 말단을 인산화하지 않은 siRNA 를 세포 내에 도입하여 RNAi 활성을 비교하면, 양자의 활성에 차이가 보이지 않았던 점에서, 5' 말단 비인산화 siRNA 는 세포 내에서 용이하게 인산화를 받는 것으로 생각할 수 있다 (예를 들어, 비특허문헌 9 참조).

센스 사슬의 3' 말단과 안티센스 사슬의 5' 말단이 루프로 결합된 shRNA 를 사용한 경우에는, 세포 내에서 Dicer 또는 엔도뉴클레아제에 의해 절단되어, 5' 말단의 인산기를 갖는 안티센스 사슬이 생성된다 (예를 들어, 비특허문헌 9 참조). 루프 내의 2 개의 뉴클레오티드를 프로필인산 유닛으로 치환한 19 염기쌍의 줄기로 이루어지는 shRNA 에서는, 프로필인산 유닛이 뉴클레아제 내성이기 때문에, 세포 내에서 Dicer 또는 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 기대할 수 없다 (예를 들어, 비특허문헌 9 참조). 또, 오르토니트로벤질 유도체를 루프에 갖는 19 염기쌍의 shRNA 는 UV 조사에 의해 5' 말단의 인산기를 갖는 안티센스 사슬이 생성되는 것을 기대할 수 있지만, 부작용의 염려나 생체 내부로의 송달을 고려하면, UV 조사를 생체에 응용하는 것이 곤란하다 (예를 들어, 비특허문헌 8 참조). UV 조사하지 않고, 세포 내에서 Dicer 또는 엔도뉴클레아제에 의해 절단되어 5' 말단의 인산기를 갖는 안티센스 사슬이 생성되고, 비뉴클레오티드만으로 이루어지는 링커를 루프에 갖고, 19 염기쌍 이하의 줄기로 이루어지는 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드는 알려져 있지 않다.

본 발명자들은 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 폴리뉴클레오티드를 취득하기 위해 예의 연구를 실시한 바, RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는, 표적 유전자에 대한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드, 및 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기 배열을 갖는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 갖는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드를 유래로 하고, 이 안티센스 사슬의 5' 말단 및 센스 사슬의 3' 말단이, 각각에 있어서 인산디에스테르 구조를 형성한 페닐기를 함유하는 링커에 의해 결합되어 있는 구조를 갖는 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드를 찾아내어, 본 발명을 완성시켰다.

국제 공개 제2010/001909호 팜플렛

Nature, 1998년, 제 391 권, p.806-811 Science, 1999년, 제 286 권, p.950-952 Nature, 2001년, 제 411 권, p.494-498 Clinical Chemistry, 2002년, 제 48 권, p.1647-1653 Molecular Cell, 2002년, 제 10 권, p.537-548 Nucleic Acids Research, 2003년, 제 31 권, p.2705-2716 Molecular Cell, 2002년, 제 10 권, p.549-561 Oligonucleotides, 2007년, 제 17 권, p.35-43 Antisense Nucleic Acid Drug Development, 2003년, 제 13 권, p.83-105 Biochimica Biophysica Acta, 2006년, 제 1758 권, p.394-403 Nature, 2005년, 제 434 권, p.663-666 Cell, 2001년, 제 107 권, p.309-321 Nature, 2007년, 제 447 권, p.222-226

본 발명의 하나의 과제는 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 과제는 RNA 분해 효소에 안정적인 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 과제는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 유전자 발현을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 과제는 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약품을 제공하는 것이다.

즉, 본 발명은,

(1) 표적 유전자에 대한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드, 및 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기 배열을 갖는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드로서, 그 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 각각에 있어서, 인산디에스테르 구조를 형성하고 있는 다음 식으로 나타내는 구조의 링커에 의해 결합된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염

[화학식 1]

식 중,

페닐기에 결합되어 있는 산소 원자는 안티센스 사슬의 5' 말단에 결합하여 인산디에스테르 구조를 형성하고,

R¹, R² 및R³ 중 어느 1 개는 다음 식으로 나타내는 구조：

-L¹-(CH₂)_m-L²-L³-(CH₂CH₂O)_n1-(CH₂)_n2-O→

를 나타내지만, 식 중,

m 은 0 내지 4 의 정수를 나타내고,

n1 은 0 내지 4 의 정수를 나타내고,

n2 는 0 또는 2 내지 10 의 정수를 나타내고,

L¹ 은 단결합 또는 -O- 를 나타내고,

L² 는 단결합 또는 -CH(-NH-L⁴-R)- 를 나타내고,

L³ 은 L² 와의 결합을 기점으로 하여 단결합, -(C=O)-NH- 또는 -NH-(C=O)- 를 나타내지만,

L³ 이 단결합 이외일 때, n2 는 2 내지 10 의 정수를 나타낸다.

L¹ 및L² 가 단결합이고, m 이 1, n1 및 n2 가 0 일 때, L³-O→ 는,

-CH(COOH)NH-(아미노산 잔기)_j-Ser,

-CH(COOH)NH-(아미노산 잔기)_j-Thr,

-CH(NH₂)CO-(아미노산 잔기)_j-Ser, 또는

-CH(NH₂)CO-(아미노산 잔기)_j-Thr,

을 나타내지만, 이들의 세린 및 트레오닌의 수산기 부분은 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 인산기와 결합하고 있고, 또한 세린 및 트레오닌의 아미노기는 아실기로 치환되어 있어도 되고,

j 는 0 내지 2 의 정수를 나타내고,

L⁴ 는 단결합, -(C=O)-(CH₂)_k-NH-, 또는 -(C=O)-(CH₂)_k- 를 나타내고,

k 는 1 내지 6 의 정수를 나타내고,

R 은 수소 원자, 탄소수 1 내지 6 의 알킬기, 포화 또는 불포화이어도 되는 탄소수 2 내지 30 의 탄화수소카르보닐기, 포화 또는 불포화이어도 되는 탄소수 2 내지 30 의 탄화수소옥시카르보닐기를 나타낸다.

R¹, R² 및R³ 중 나머지 2 개는 각각 독립적으로,

수소 원자,

치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 8 의 알킬기,

치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 8 의 알콕시기,

할로겐 원자,

탄소수 1 내지 9 의 알킬기를 갖는 알킬카르보닐아미노기, 및

치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 8 의 알킬기를 포함하는 알킬카르보닐기,

로 이루어지는 군의 기에서 선택되는 기를 나타낸다,

(2) R¹ 및R³ 이 수소 원자인 (1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(3) L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 과 n2 의 합이 3 이상의 정수인 (2) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(4) L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 과 n2 의 합이 8 이상의 정수인 (2) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(5) L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 이 0 또는 2 이고, n2 가 6 이상의 정수인 (2) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(6) L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 이 0 또는 2 이고, n2 가 6 또는 8 인 (2) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(7) L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 이 0 또는 2 이고, n2 가 8 인 (2) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(8) R¹ 및R³ 이 수소 원자이고, L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 이 2 이고, n2 가 8 인 (1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(9) 표적 유전자에 대한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드, 및 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기 배열을 갖는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드로서, 그 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단이 인산디에스테르 결합을 통해 링커에 의해 결합된 다음 식으로 나타내는 구조의 폴리뉴클레오티드 또는 그 염

[화학식 2]

식 중,

p 는 0 내지 4 의 정수를 나타내고,

q 는 4 내지 10 의 정수를 나타내고,

L⁵ 는 단결합 또는 -O- 를 나타내고,

L⁶ 은 (CH₂)_p 와의 결합을 기점으로 하여 -(C=O)-NH- 또는 -NH-(C=O)- 를 나타내고,

L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치는 파라 위치 또는 메타 위치이고,

L⁵ 가 -O- 일 때는, p 는 1 내지 4 의 정수를 나타낸다,

(10) p 와 q 의 합이 3 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (9) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(11) p 와 q 의 합이 8 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (9) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(12) p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (9) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(13) p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 또는 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (9) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(14) p 가 0 또는 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (9) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(15) p 가 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (9) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(16) 센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (II) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (III) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 또한 이하의 (a) 내지 (d) 에 나타내는 특징을 갖는 (1) 내지 (15) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염：

(a) γ 는 RNA, β 는 2'-OMeRNA, λ 및 υ 은 DNA 를 나타낸다；

(b) t 및 u 는 동일 또는 상이하며, 0 ∼ 5 중 어느 것의 정수를 나타낸다.；

(c) 식 (II) 로 나타내는 폴리뉴클레오티드 중 (γ-β)₉-γ 는 표적 유전자와 동일한 뉴클레오티드 배열로 이루어진다；

(d) 식 (II) 에 있어서의 (γ-β)₉-γ 와 식 (III) 에 있어서의 β-(γ-β)₉ 는 서로 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다,

(17) 센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (IV) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (V) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 또한 이하의 (a) 내지 (d) 에 나타내는 특징을 갖는 (1) 내지 (15) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염：

(a) α 및 β 는 상이하여 DNA 또는 2'-OMeRNA, δ 및 λ 는 동일 또는 상이하여 DNA 또는 2'-OMeRNA, υ 은 동일 또는 상이하여 DNA, RNA 및 2'-OMeRNA 에서 선택되는 어느 것의 뉴클레오티드를 나타낸다；

(b) p 는 0 또는 1 의 정수를 나타내고, t 는 p 가 0 일 때는 0 이고, p 가 1 일 때는 0 ∼ 5 중 어느 것의 정수를 나타낸다. s 는 0 또는 1 의 정수를 나타내고, u 는 0 ∼ 5 중 어느 것의 정수를 나타낸다.；

(c) 식 (IV) 로 나타내는 폴리뉴클레오티드 중 (α-β)₉-α_p 는 표적 유전자와 동일한 뉴클레오티드 배열로 이루어진다；

(d) 식 (IV) 에 있어서의 (α-β)₉ 와 식 (V) 에 있어서의 (α-β)₉ 는 서로 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다,

(18) 센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (VI) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (VII) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 또한, 이하의 (a) 내지 (d) 에 나타내는 특징을 갖는 (1) 내지 (15) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염：

(b) p 는 0 또는 1 의 정수를 나타내고, t 는 p 가 0 일 때는 0 이고, p 가 1 일 때는 0 ∼ 5 중 어느 것의 정수를 나타낸다. s 는 0 또는 1 의 정수를 나타내고, u 는 0 ∼ 5 중 어느 것의 정수를 나타낸다；

(c) 식 (VI) 으로 나타내는 폴리뉴클레오티드 중 β-(α-β)₈-α_p 는 표적 유전자와 동일한 뉴클레오티드 배열로 이루어진다；

(d) 식 (VI) 에 있어서의 (α-β)₈ 과 식 (VII) 에 있어서의 (α-β)₈ 은 서로 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다,

(19) α 가 DNA, β 가 2'-OMeRNA 인 것을 특징으로 하는 (17) 또는 (18) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(20) λ_t 및υ_u 가 동일 또는 상이하여 티민 염기, 아데닌 염기 또는 구아닌 염기를 갖는 DNA, 또는, 우라실 염기, 아데닌 염기 또는 구아닌 염기를 갖는 2'-OMeRNA 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 (16) 내지 (19) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(21) t 가 0, u 가 2 인 것을 특징으로 하는 (16) 내지 (20) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(22) p 및 t 가 0, s 가 1, u 가 2 인 것을 특징으로 하는 (17) 내지 (20) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(23) p 및 t 가 0, s 가 0 또는 1, u 가 2 이고, υ₂ 가 DNA 또는 2'-OMeRNA 인 것을 특징으로 하는 (17) 내지 (20) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(24) 센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (VIII) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (IX) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 또한, 이하의 (a) 내지 (c) 에 나타내는 특징을 갖는 (1) 내지 (15) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염：

(a) α 가 DNA, β 가 2'-OMeRNA 이다；

(b) 식 (IX) 로 나타내는 폴리뉴클레오티드 중 β-(α-β)₉ 는 표적 유전자와 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다；

(c) 식 (VIII) 에 있어서의 (α-β)₉ 와 식 (IX) 에 있어서의 (α-β)₉ 는 서로 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다,

(25) 2'-OMeRNA 의 임의의 1 ∼ 4 잔기가 ENA 또는 2',4'-BNA/LNA 로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 (16) 내지 (24) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(26) DNA 의 임의의 1 ∼ 4 잔기가 RNA, ENA 또는 2',4'-BNA/LNA 로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 (16) 내지 (25) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(27) 각 뉴클레오티드가 인산디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (26) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(28) (1) 내지 (27) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 유효 성분으로서 함유하는 의약,

(29) 유전자 발현에서 유래하는 질환을 치료하기 위한 (29) 에 기재된 의약,

(30) (1) 내지 (29) 에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 포유 동물에 투여하는 것에 의한 표적 유전자의 발현 억제 방법,

(31) (1) 내지 (27) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 함유하는 시약.

(32) 식 (X)

[화학식 3]

[식 중, Tr 은 수산기의 보호기를 나타내고, p 는 0 내지 4 의 정수를 나타내고, q 는 4 내지 10 의 정수를 나타내고, L⁵ 는 단결합 또는 -O- 를 나타내고, L⁶ 은 (CH₂)_p 와의 결합을 기점으로 하여 -(C=O)-NH- 또는 -NH-(C=O)- 를 나타내고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치는 파라 위치 또는 메타 위치이다]

을 갖는 화합물 또는 그 염,

(33) Tr 이 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기, 픽실기, 트리틸기, 레불리닐기, 또는 비스(트리메틸실릴옥시)(시클로헥실옥시)실릴기인 (32) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(34) Tr 이 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 와 q 의 합이 3 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (32) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(35) Tr 이 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 와 q 의 합이 8 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (32) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(36) Tr 이 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (32) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(37) Tr 이 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 또는 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (32) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(38) Tr 이 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 0 또는 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (32) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(39) Tr 이 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (32) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염,

(40) Tr 이 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (32) 에 기재된 화합물 또는 그 염,

(41) 표적 유전자에 대한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드, 및 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기 배열을 갖는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드로서, 그 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단이 인산디에스테르 결합을 통해 X 에 의해 결합된, 식 (XI)

[화학식 4]

을 갖는 화합물 [식 중, W^2' 는 5' 말단 및 3' 말단의 수산기를 제외한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타내고, W^1'-Y' 는 5' 말단 및 3' 말단의 수산기를 제외한 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타내고, X 는 식 (XII)

[화학식 5]

[식 중, p 는 0 내지 4 의 정수를 나타내고, q 는 4 내지 10 의 정수를 나타내고, L⁵ 는 단결합 또는 -O- 를 나타내고, L⁶ 은 (CH₂)_p 와의 결합을 기점으로 하여 -(C=O)-NH- 또는 -NH-(C=O)- 를 나타내고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치는 파라 위치 또는 메타 위치이고, L⁵ 가 -O- 일 때는, p 는 1 내지 4 의 정수를 나타낸다] 를 나타내고, 말단의 메틸렌기는 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성하고, 페닐기에 결합되어 있는 산소 원자는 그 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성한다] 을 제조하는 방법으로서,

(i) 식 Tr-O-X-H [식 중, Tr 은 수산기의 보호기를 나타내고, X 의 -(CH₂)_q- 는 Tr-O- 에 결합하고, 페닐기에 결합되어 있는 산소 원자는 수소에 결합한다] 를 갖는 화합물의 수산기를, 식 (XIII)

[화학식 6]

또는, 식 (XIV)

[화학식 7]

[식 중, R⁴ 는 2-시아노에틸기, 메틸기, 메탄술포닐에틸기, 2,2,2-트리클로로에틸기, 또는 4-클로로페닐메틸기를 나타내고, R⁵ 는 모르폴리노기, 디이소프로필아미노기, 디에틸아미노기, 또는 디메틸아미노기를 나타낸다] 를 갖는 화합물과 반응시켜, 식 (XV)

[화학식 8]

를 갖는 화합물을 제조하는 공정；

(ii) 상기 (i) 에서 얻어진 화합물을 포스포라미디트법에 의해, 식 HO-W¹-Y-CPG [식 중, W¹-Y 는 5' 말단 및 3' 말단의 수산기를 제외한 보호된 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타내고, CPG 는 폴리뉴클레오티드와 결합할 수 있는 링커를 갖는 폴리머 서포트를 나타낸다] 를 갖는 화합물과 반응시키고, 계속해서, 포스포라미디트법에 의해, 식 Tr¹-O-W²-O-P(=O)(OR⁴)-O- [식 중, Tr¹ 은 수산기의 보호기를 나타내고, W² 는 5' 말단 및 3' 말단의 수산기를 제외한 보호된 센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타낸다] 부분을 제조하고, 식 (XVI)

[화학식 9]

을 갖는 화합물을 제조하는 공정；및,

(iii) 상기 (ii) 에서 얻어진 화합물을 CPG 로부터 잘라내고, 보호기의 제거를 실시하는 공정으로 이루어지는, 식 (XI) 을 갖는 화합물을 제조하는 방법,

(42) Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기, 픽실기, 트리틸기, 레불리닐기, 또는 비스(트리메틸실릴옥시)(시클로헥실옥시)실릴기인 (41) 에 기재된 방법,

(43) Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 와 q 의 합이 3 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (41) 에 기재된 방법,

(44) Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 와 q 의 합이 8 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (41) 에 기재된 방법,

(45) Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (41) 에 기재된 방법,

(46) Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 또는 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (41) 에 기재된 방법,

(47) Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 0 또는 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (41) 에 기재된 방법,

(48) Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (41) 에 기재된 방법,

(49) Tr 및 Tr¹ 이 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 (41) 에 기재된 방법,

(50) R⁴ 가 2-시아노에틸기, 메틸기, 메탄술포닐에틸기, 2,2,2-트리클로로에틸기, 또는 4-클로로페닐메틸기이고, R⁵ 가 모르폴리노기, 디이소프로필아미노기, 디에틸아미노기, 또는 디메틸아미노기인 (41) 내지 (49) 중 어느 한 항에 기재된 방법,

(51) R⁴ 가 2-시아노에틸기 또는 메틸기이고, R⁵ 가 모르폴리노기 또는 디이소프로필아미노기인 (41) 내지 (49) 중 어느 한 항에 기재된 방법,

(52) 식 (XIII) 을 갖는 화합물이 클로로(모르폴리노)메톡시포스핀, 클로로(모르폴리노)시아노에톡시포스핀, 클로로(디이소프로필아미노)메톡시포스핀 또는 클로로(디이소프로필아미노)시아노에톡시포스핀인 (41) 내지 (49) 중 어느 한 항에 기재된 방법,

(53) 식 (XIV) 를 갖는 화합물이 비스(디이소프로필아미노)시아노에톡시포스핀인 (41) 내지 (49) 중 어느 한 항에 기재된 방법,

(54) 하기에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염

[식 중, A^p, G^p, C^p, T^p, T^s, A^m1p, G^m1p, C^m1p, U^m1p, U^m1t 는 다음 식으로 나타내는 구조의 뉴클레오시드, 또는, 뉴클레오티드를 나타내고,

[화학식 10]

X 의 전방은 표적 유전자에 대한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타내고, X 의 후방은 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기 배열을 갖는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드를 나타내고, X 는 식 (XVII)

[화학식 11]

로 나타내는 구조의 링커를 나타내고, 말단의 메틸렌기는 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성하고, 페닐기에 결합되어 있는 산소 원자는 그 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성한다],

(55) (54) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 유효 성분으로서 함유하는 의약,

(56) Hsp47 유전자의 발현에서 유래하는 질환을 치료하기 위한 (55) 에 기재된 의약,

(57) Hsp47 유전자의 발현에서 유래하는 질환이 섬유증인 (56) 에 기재된 의약,

(58) (54) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 포유 동물에 투여하는 것에 의한 Hsp47 유전자의 발현 억제 방법,

(59) (54) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 함유하는 시약,

으로 이루어진다.

본 발명에 의해, RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 폴리뉴클레오티드가 제공되었다. 또, 본 발명에 의해, RNA 분해 효소, 포스파타아제, 및 엑소뉴클레아제에서 선택되는 적어도 어느 하나에 대해 안정적인 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 폴리뉴클레오티드가 제공되었다. 또 본 발명에 의해, RNA 분해 효소, 포스파타아제, 및 엑소뉴클레아제에 대해 안정적인 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 폴리뉴클레오티드가 제공되었다. 또, 본 발명에 의해, 센스 사슬 폴리뉴클레오티드와 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 각각 제조하는 공정이 불필요하고, 또한 양사슬이 동량이 되도록 정확히 혼합하여 2 개 사슬을 형성시키는 번잡한 조작이 불필요하고, RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 폴리뉴클레오티드가 제공되었다. 그 폴리뉴클레오티드를 사용하여 각종 유전자의 기능 해석이 가능해지고, 또, 그 폴리뉴클레오티드를 포함하는 의약품이 제공된다.

또 본 발명에 의해, 그 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서 유용한 합성 중간체가 제공되었다. 또 본 발명에 의해, 그 폴리뉴클레오티드의 제조 방법이 제공되었다.

도 1 은 A-1 공정의 개요를 나타내는 도면이다.
도 2 는 C 법 및 D 법의 개요를 나타내는 도면이다.
도 3 은 E 법 및 F 법의 개요를 나타내는 도면이다.
도 4 는 G 법의 개요를 나타내는 도면이다.
도 5 는 참고예 3 ∼ 참고예 14, 참고예 17, 참고예 21 ∼ 참고예 23 에 기재된 화합물의 구조를 나타내는 도면이다.
도 6 은 인간 β-카테닌 유전자에 대한 폴리뉴클레오티드를 나타내는 도면이다. 이하, 각 도면 중, 센스 사슬, 안티센스 사슬의 실시예의 폴리뉴클레오티드의 조합을 나타낸다. 심볼 중, 흑색 원 (●) 은 DNA, 백색 원 (○) 은 2'-O-메틸 RNA 를 나타낸다. 흑색 원-백색 원 사이의 선은 뉴클레오시드 사이의 인산디에스테르 결합을 나타낸다. 도면 중의 p 는 -P(=O)(OH)- 를 나타내고, p 가 결합하고 있는 경우, 폴리뉴클레오티드의 말단의 수산기의 수소 원자는 제외된다. 폴리뉴클레오티드의 말단에 아무것도 결합하고 있지 않은 경우, DNA, 또는, 2'-O-메틸 RNA 의 3' 말단 또는 5' 말단은 OH 기이다. n 은 탄소수를 나타낸다. 도 7 및 도 11 에서도 동일하다. 또, 각 폴리뉴클레오티드의 염기 배열도 나타낸다.
도 7 은 인간 β-카테닌 유전자에 대한 폴리뉴클레오티드를 나타내는 도면이다.
도 8 은 리얼 타임 PCR 해석에 의한 폴리뉴클레오티드의 유전자 억제 활성을 나타내는 도면이다.
도 9 는 리얼 타임 PCR 해석에 의한 폴리뉴클레오티드의 유전자 억제 활성을 나타내는 도면이다.
도 10 은 참고예 24 ∼ 참고예 31 에 기재된 화합물의 구조를 나타내는 도면이다.
도 11 은 인간 β-카테닌 유전자에 대한 폴리뉴클레오티드를 나타내는 도면이다.
도 12 는 리얼 타임 PCR 해석에 의한 폴리뉴클레오티드의 유전자 억제 활성을 나타내는 도면이다.
도 13 은 인간 β-카테닌 유전자에 대한 폴리뉴클레오티드를 나타내는 도면이다. 심볼 중, 백색 사각 (□) 은 RNA, 흑색 원 (●) 은 DNA, 백색 원 (○) 은 2'-O-메틸 RNA 를 나타낸다. 각 뉴클레오시드 사이를 잇는 선은 인산디에스테르 결합을 나타낸다. 도면 중의 p 는 -P(=O)(OH)- 를 나타내고, p 가 결합하고 있는 경우, 폴리뉴클레오티드의 말단의 수산기의 수소 원자는 제외된다. 폴리뉴클레오티드의 말단에 아무것도 결합하고 있지 않은 경우, RNA, DNA, 또는, 2'-O-메틸 RNA 의 3' 말단 또는 5' 말단은 OH 기이다. n 은 탄소수를 나타낸다. 도 15, 도 16 및 도 19 에서도 동일하다. 또, 각 폴리뉴클레오티드의 염기 배열도 나타낸다.
도 14 는 리얼 타임 PCR 해석에 의한 폴리뉴클레오티드의 유전자 억제 활성을 나타내는 도면이다.
도 15 는 마우스 PKR 유전자에 대한 폴리뉴클레오티드를 나타내는 도면이다.
도 16 은 래트, 인간 Hsp47 유전자에 대한 폴리뉴클레오티드를 나타내는 도면이다. 도면 중의 s 는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
도 17 은 리얼 타임 PCR 해석에 의한 폴리뉴클레오티드의 유전자 억제 활성을 나타내는 도면이다. 폴리뉴클레오티드의 농도로서 백색 바는 0.1 nM 의 경우를 나타내고, 흑색 바는 1 nM 의 경우를 나타낸다. 도 18 및 도 20 에서도 동일하다.
도 18 은 리얼 타임 PCR 해석에 의한 폴리뉴클레오티드의 유전자 억제 활성을 나타내는 도면이다.
도 19 는 래트, 인간 Hsp47 유전자에 대한 폴리뉴클레오티드를 나타내는 도면이다.
도 20 은 리얼 타임 PCR 해석에 의한 폴리뉴클레오티드의 유전자 억제 활성을 나타내는 도면이다.

1. 용어의 설명

본 명세서에 있어서, 「표적 유전자」 란, 이것을 도입하는 세포, 조직 또는 고체 (이하 이것을 「피도입체」라고 칭하는 경우가 있다) 에 있어서 RNA 이면 특별히 제한되지 않고, 단백질로 번역되는 mRNA 이어도 단백질로 번역되지 않는 논코딩 RNA 이어도 된다. 논코딩 RNA 로는, 기능성 RNA, 예를 들어, mRNA 의 비번역 영역, tRNA, rRNA, mRNA 형 ncRNA (mRNA-like non-coding RNA), 장사슬 ncRNA (long non-coding RNA), snRNA (small nuclear RNA), snoRNA (small nucleolar RNA), miRNA (microRNA) 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 도입하는 피도입체에 내재성의 것이어도 되고, 유전자 도입 등의 수법에 의해 도입되는 외래성의 것이어도 된다. 또, 염색체 상에 존재하는 유전자이어도 되고, 염색체 외의 것이어도 된다. 외래성의 유전자로는, 예를 들어, 피도입체에 감염 가능한 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 원생 동물 유래의 것을 들 수 있는데 이들에 제한되지 않는다. 유전자의 기능에 대해서는 이미 알려진 것이어도 되고, 알려지지 않은 것이어도 된다.

그러한 표적 유전자의 예로는, 특정 질환을 갖는 환자에 있어서 특이적으로 발현이 상승하고 있는 및/또는 특이적으로 변이하고 있는 유전자를 들 수 있으며, 질환으로는, 중추 질환 (예를 들어, 알츠하이머 병, 치매, 섭식 장해 등), 염증성 질환 (예를 들어, 알레르기, 류마티스, 변형성 관절증, 에리테마토서스 등), 순환기 질환 (예를 들어, 고혈압증, 심장 비대, 협심증, 동맥경화증, 고콜레스테롤혈증 등), 암 (예를 들어, 비소세포 폐암, 난소암, 전립선암, 위암, 췌장암, 간암, 방광암, 유방암, 자궁 경부암, 대장암, 결장암, 직장암 등), 호흡기 질환 (예를 들어, 폐렴, 기관지염, 천식, 만성 폐색성 폐질환 등), 당뇨병, 당뇨병 망막증, 당뇨병성 신장 질환, 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 수반하는 빈혈, 철불응성 철결핍성 빈혈 등), 가령성 황반 변성증, 면역계 질환 (예를 들어, 크론병, 아토피성 피부염, 자가 면역 질환, 면역 부전, 백혈병 등), 간장·담낭 질환 (예를 들어, 비알코올성 지방성 간염, 간경변, 간염, 간부전, 담즙울체증, 결석 등), 소화관 질환 (예를 들어, 궤양, 장염, 흡수 불량 등), 감염증, 비만, 섬유증 (폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 골수 섬유증 등) 을 들 수 있고, 이들 질환의 원인 유전자로는, 예를 들어, kinesin spindle protein (KSP), vascular endothelial growth factor, (VEGF), transthyretin (TTR), proprotein convertase subtilisn/kexin type 9 (PCSK9), polo-like kinase (PLK), ApoB-100, ribonucleotide reductase M2 subunit (RRM2), clusterin, heat shock protein 27 (Hsp27), survivin, eukaryotic initiation factor-4E (eIF-4E), intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), alpha subunit of the interleukin 4 receptor (IL-4R-alpha), Factor XI, Factor VII, N-ras, H-ras, K-ras, bcl-2, bcl-xL, Her-1, Her-2, Her-3, Her-4, MDR-1, 인간 β-카테닌 유전자, DDX3 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked), Myeloid Cell Leukemia Sequence 1 (MCL1) 유전자, PKR (Eif2ak2), Hsp47 (Serpinh1), Hepcidin, 활성화 프로테인 C (APC), survivin, signal tranducer and activator of transcription (STAT3) 을 들 수 있지만 이들에 한정되지는 않는다.

본 명세서에 있어서, 「천연형 뉴클레오시드」란, 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시-5-메틸시티딘, 티미딘 등의 2'-데옥시뉴클레오시드, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 5-메틸시티딘, 우리딘 등의 리보뉴클레오시드를 말한다. 또, 「올리고뉴클레오티드」란, 뉴클레오시드의 당 부분이 인산과 에스테르를 형성하고 있는 화합물로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 본 명세서에 있어서는, 올리고뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드는 동일한 의미로 사용하고 있다.

본 명세서에 있어서는 2'-데옥시아데노신을 A^t, 2'-데옥시구아노신을 G^t, 2'-데옥시시티딘을 C^t, 2'-데옥시-5-메틸시티딘을 5meC^t, 티미딘을 T^t, 2'-데옥시우리딘을 U^t, 아데노신을 A^rt, 구아노신을 G^rt, 시티딘을 C^rt, 5-메틸시티딘을 5meC^rt, 우리딘을 U^rt로 표기하는 경우도 있다. 또, 본 명세서 중에서는, 2'-데옥시아데노신뉴클레오티드를 A^p, 2'-데옥시구아노신뉴클레오티드를 G^p, 2'-데옥시시티딘뉴클레오티드를 C^p, 2'-데옥시-5-메틸시티딘뉴클레오티드를 5meC^p, 티미딘뉴클레오티드를 T^p, 2'-데옥시우리딘뉴클레오티드를 U^p, 아데노신뉴클레오티드를 A^rp, 구아노신뉴클레오티드를 G^rp, 시티딘뉴클레오티드를 C^rp, 5-메틸시티딘뉴클레오티드를 5meC^rp, 우라실뉴클레오티드를 U^rp로 표기하는 경우도 있다.

본 명세서에 있어서는 뉴클레오티드의 인산에스테르 대신에 포스포로티오에이트에스테르가 되어 있는 포스포로티오에이트에스테르에 대해서, A^p 에 대응되는 것으로서 A^s, G^p 에 대응되는 것으로서 G^s, C^p 에 대응되는 것으로서 C^s, 5meC^p 에 대응되는 것으로서 5meC^s, T^p 에 대응되는 것으로서 T^s, U^p 에 대응되는 것으로서 U^s, A^rp 에 대응되는 것으로서 A^rs, G^rp 에 대응되는 것으로서 G^rs, C^rp 에 대응되는 것으로서 C^rs, 5meC^rp 에 대응되는 것으로서 5meC^rs, U^rp 에 대응되는 것으로서 U^rs로 표기하는 경우도 있다.

본 명세서에서의 「당 수식 뉴클레오시드」란, 뉴클레오시드의 당 부분이 수식되어 있는 뉴클레오시드를 말한다.

이 중, 2'-O-메틸 수식의 예로는, 2'-O-메틸 뉴클레오시드 및 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 있고, A^rt 에 대응되는 것으로서 A^m1t, G^rt 에 대응되는 것으로서 G^m1t, C^rt 에 대응되는 것으로서 C^m1t, 5meC^rt 에 대응되는 것으로서 5meC^m1t, U^rt 에 대응되는 것으로서 U^m1t, A^rp 에 대응되는 것으로서 A^m1p, G^rp 에 대응되는 것으로서 G^m1p, C^rp 에 대응되는 것으로서 C^m1p, 5meC^rp 에 대응되는 것으로서 5meC^m1p, U^rp 에 대응되는 것으로서 U^m1p, A^rs 에 대응되는 것으로서 A^m1s, G^rs 에 대응되는 것으로서 G^m1s, C^rs 에 대응되는 것으로서 C^m1s, 5meC^s 에 대응되는 것으로서 5meC^m1s, U^rs 에 대응되는 것으로서 U^m1s로 표기하는 경우도 있다.

본 명세서에 있어서 2'-O,4'-C-에틸렌뉴클레오티드 유닛 및 「ENA 유닛」이란 상기의 각 뉴클레오시드, 각 뉴클레오티드에 있어서 ENA 를 갖는 것을 말하고, A^t 에 대응되는 것으로서 A^2t, A^p 에 대응되는 것으로서 A^e2p, A^s 에대해서는 A^e2s, G^t 에 대응되는 것으로서 G^2t, G^p 에 대응되는 것으로서 G^e2p, G^s 에대해서는 G^e2s, 5meC^t 에 대응되는 것으로서 C^2t, 5meC^p 에 대응되는 것으로서 C^e2p, 5meC^s에대해서는 C^e2s, T^t 에 대응되는 것으로서 T^2t, T^p 에 대응되는 것으로서 T^e2p, T^s에대해서는 T^e2s와 같이 ENA 유닛을 갖는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 표기하는 경우도 있다.

본 명세서에 있어서 2'-O,4'-C-메틸렌뉴클레오티드 유닛 및 「2',4'-BNA/LNA 유닛」이란 상기의 각 뉴클레오시드, 각 뉴클레오티드에 있어서 2',4'-BNA/LNA 를 갖는 것을 말하고, A^t 에 대응되는 것으로서 A^1t, A^p 에 대응되는 것으로서 A^e1p, A^s 에대해서는 A^e1s, G^t 에 대응되는 것으로서 G^1t, G^p 에 대응되는 것으로서 G^e1p, G^s 에대해서는 G^e1s, 5meC^t 에 대응되는 것으로서 C^1t, 5meC^p 에 대응되는 것으로서 C^e1p, 5meC^s 에대해서는 C^e1s, T^t 에 대응되는 것으로서 T^1t, T^p 에 대응되는 것으로서 T^e1p, T^s 에대해서는 T^e1s 와 같이 2',4'-BNA/LNA 유닛을 갖는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 표기하는 경우도 있다.

이하에 각 뉴클레오티드의 구조식을 나타낸다.

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]

[화학식 16]

[화학식 17]

본 명세서 중에 있어서의 폴리뉴클레오티드 또는 그 염은 표적 유전자에 대한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드, 및 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기 배열을 갖는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 갖는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드를 유래로 하고, 이 안티센스 사슬의 5' 말단 및 센스 사슬의 3' 말단이 각각에 있어서 인산디에스테르 구조를 형성한 하기 구조식으로 나타내는 구조의 링커에 의해 결합되어 있는 1 개 사슬 구조를 갖는 것이 특징이다. 즉, 폴리뉴클레오티드-3'-P(=O)(OH)-[링커]-P(=O)(OH)-5'-폴리뉴클레오티드의 구조를 형성하고 있다. [여기서, 『폴리뉴클레오티드-3'』 는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 수산기 상의 수소 원자를 갖지 않는 구조를 나타내고, 『5'-폴리뉴클레오티드』 는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 수산기 상의 수소 원자를 갖지 않는 구조를 나타낸다]

이 링커는 페닐기를 함유하고 있고, 이 페닐기에 결합하는 산소 원자 부분, 다음 화학식 18 의 구조식에 있어서 명시되고 있는 산소 원자를 나타내는데, 안티센스 사슬의 5' 말단과의 결합 부분이며, 5' 말단에 있어서 인산디에스테르 결합을 형성하여 결합하고 있다. 이 페닐기는 R¹, R² 및 R³ 을 추가로 갖고 있으며, 그 중의 1 개가 센스 사슬의 3' 말단과의 결합 부위로 되어 있어 인산디에스테르 결합을 형성하여 결합한다. 또한, R¹, R² 및R³ 의 페닐기에 대한 결합이 산소 원자를 개재하고 있어도 이들 산소 원자는 안티센스 사슬의 5' 말단에 대한 결합 부위로는 되지 않는다. 이 링커의 구조는 다음과 같다.

[화학식 18]

식 중,

명시되어 있는 페닐기에 결합한 산소 원자는 안티센스 사슬의 5' 말단에 결합하여 인산디에스테르 구조를 형성하고,

R¹, R² 및R³ 중 어느 1 개는 다음 식으로 나타내는 구조：

-L¹-(CH₂)_m-L²-L³-(CH₂CH₂O)_n1-(CH₂)_n2-O→

를 나타내지만, 식 중,

m 은 0 내지 4 의 정수를 나타내고,

n1 은 0 내지 4 의 정수를 나타내고,

n2 는 0 또는 2 내지 10 의 정수를 나타내고,

L¹ 은 단결합 또는 -O- 를 나타내고,

L² 는 단결합 또는 -CH(-NH-L⁴-R)- 를 나타내고,

L³ 은 단결합, -(C=O)-NH- 또는 -NH-(C=O)- 를 나타내지만,

L³ 이 단결합 이외일 때, n2 는 2 내지 10 의 정수를 나타낸다.

L¹ 및L² 가 단결합이고, m 이 1, n1 및 n2 가 0 일 때, L³-O→ 는,

-CH(COOH)NH-(아미노산 잔기)_j-Ser,

-CH(COOH)NH-(아미노산 잔기)_j-Thr,

-CH(NH₂)CO-(아미노산 잔기)_j-Ser, 또는

-CH(NH₂)CO-(아미노산 잔기)_j-Thr,

을 나타내지만, 이들의 세린 또는 트레오닌의 수산기 부분은 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 인산기와 결합하여 인산디에스테르 구조를 형성하고 있고,

j 는 0 내지 2 의 정수를 나타내고,

L⁴ 는 단결합, -(C=O)-(CH₂)_k-NH- 또는 -(C=O)-(CH₂)_k- 를 나타내고,

k 는 1 내지 6 의 정수를 나타내고,

R¹, R² 및R³ 중 나머지 2 개는 각각 독립적으로,

수소 원자,

치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 8 의 알킬기,

치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 8 의 알콕시기,

할로겐 원자,

로 이루어지는 군의 기에서 선택되는 기를 나타낸다.

링커에 포함되는 페닐기에는 R¹, R² 및R³ 이 존재하지만, 그 중의 1 개는 링커 기능을 가진, 센스 사슬의 3' 말단과의 결합 부위로 되어 있고, 구조적으로는 인산디에스테르 구조를 형성하는 것을 특징으로 하고 있다. 나머지 2 개는 링커 기능은 없고, 페닐기 상의 단순한 치환기이다.

링커 기능을 완수하는 구조 중 페닐기 부분을 제외한 부분, 즉, -L¹-(CH₂)_m-L²-L³-(CH₂CH₂O)_n1-(CH₂)_n2-O→ 에 대해 설명한다.

L¹ 은 단결합이거나 또는 2 가의 산소 원자의 -O- 이다.

L² 는 단결합이거나 또는 메틸렌 탄소 원자 상에 치환기를 갖고 있어도 되는 아미노기를 갖는 구조이다. 이 아미노기는 링커 구조 L⁴ 를 통해 치환기 R 을 갖는다.

L⁴ 는 단결합이거나, 메틸렌기 또는 탄소수 2 내지 4 의 폴리메틸렌기이거나, 또는 -(C=O)-CH₂-CH₂-(C=O)-O- 구조이다. -(C=O)-CH₂-CH₂-(C=O)-O- 구조의 카르보닐기는 아미노기와는 구조식의 좌단에서 결합하고, -NH-(C=O)-CH₂-CH₂-(C=O)-O- 의 구조를 형성한다.

R 이 탄소수 1 내지 6 의 알킬기일 때, 이 알킬기는 직사슬형이어도 분지사슬형이어도 어느 것이어도 된다. 예를 들어, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, 제 2 급 부틸기, 펜틸기, 헥실기 등을 들 수 있다.

R 이 탄소수 1 내지 6 의 알킬기일 때, 이것은 직사슬형 또는 분지사슬형 중 어느 것이어도 된다. 예를 들어, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, 제 2 급 부틸기, 펜틸기, 헥실기 등을 들 수 있다.

R 이 포화 또는 불포화이어도 되는 탄소수 2 내지 30 의 탄화수소카르보닐기 (탄화수소기 -(C=O)-) 일 때, 또는 포화 또는 불포화이어도 되는 탄소수 2 내지 30 의 탄화수소옥시카르보닐기 (탄화수소기 -O-(C=O)-) 일 때, 이들 탄화수소기 부분은 직사슬형 또는 분지사슬형이어도 된다. 또, 탄화수소기는 포화이어도 되지만, 불포화이어도 된다. 이와 같은 탄화수소기로는 지방족 탄화수소로부터 유도된 기를 들 수 있다. 탄화수소기로는 탄소수 30 까지의 알킬기를 들 수 있다. 이 밖에 이 알킬기 내의 탄소 탄소 결합이 이중 결합이 되어 불포화가 된 알칸류이어도 된다. 또한, 이 탄화수소기 부분은 불포화 결합을 포함하여, 축합 고리형 구조로 되어 있어도 된다. 이와 같은 고리형 탄화수소기로서 콜레스테릴기를 들 수 있다.

[화학식 19]

L³ 은 단결합이거나, -(C=O)-NH- 또는 -NH-(C=O)- 의 구조가 된다. L³ 은 좌단이 L² 와 결합하고 있고, 경우에 따라서는 화학식 8 에 나타내고 있는 페닐기와 직결하는 경우도 있다. 또한 L³ 이 단결합이 아닐 때, 즉 L³ 이 -(C=O)-NH- 또는 -NH-(C=O)- 일 때, 이들에 결합하는 하기 구조에 있어서 메틸렌기 또는 폴리메틸렌기가 반드시 존재한다. 즉, 이 경우에 있어서 n2 는 0 으로는 되지 않는다.

L³ 의 우단에는 -(CH₂CH₂O)_n1-(CH₂)_n2-O→ 가 결합하는 구조이다. 디메틸렌옥시 구조는 1 개 (n1 = 1), 또는 이것을 1 단위로 해서 반복된 2 내지 4 개 (n1 = 2 ∼ 4) 가 결합해도 된다. 또한, 경우에 따라서는 이 디메틸렌옥시 구조는 존재하지 않는 경우도 있다. 디메틸렌옥시 구조는 2 또는 3 개의 반복인 것이 바람직하다. 즉, n1 로는 2 또는 3 이 바람직하다. 보다 바람직하게는 디메틸렌옥시 구조가 2 개인 경우이고, n1 로는 2 가 보다 바람직하다.

이 디메틸렌옥시 구조의 우단에는 메틸렌기 또는 9 까지의 폴리메틸렌기가 결합하지만, 이 메틸렌기 또는 폴리메틸렌기는 존재하지 않는 경우도 있다. 메틸렌기 또는 폴리메틸렌기로는 폴리메틸렌기가 바람직하다. 폴리메틸렌기로서 존재하는 경우, 사슬 길이는 탄소수로 2 내지 10 이 되는 것이 바람직하다. 폴리메틸렌 사슬은 사슬 길이가 긴 것 쪽이 바람직하고, 탄소수 5 이상의 폴리메틸렌 사슬이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 탄소수 7 이상의 폴리메틸렌 사슬이다.

디메틸렌옥시 구조와 메틸렌기 또는 폴리메틸렌기는 혼재하고 있어도 되고, 이 경우, 사슬 길이로서 원자수 2 내지 10 정도의 것이면 된다.

L¹ 및L² 가 단결합이고, m 이 1 이고 n1 및 n2 가 0 일 때, -L¹-(CH₂)_m-L²-L³-(CH₂CH₂O)_n1-(CH₂)_n2-O→ 부분은 L³-O→ 가 되지만, 이 L³-O→ 는 -CH(COOH)NH-(아미노산 잔기)j-Ser, -CH(COOH)NH-(아미노산 잔기)j-Thr, -CH(NH₂)CO-(아미노산 잔기)j-Ser, 또는 -CH(NH₂)CO-(아미노산 잔기)j-Thr 의 각각의 구조를 나타낸다.

이 각 구조는 폴리펩티드로 되어 있지만, 그 폴리펩티드의 일단은 티로신이고, 타단은 수산기 함유 아미노산이면 된다. 또한, 티로신의 페닐기는 5' 말단과의 인산디에스테르 구조의 결합 부위이며, 타단의 아미노산의 수산기 부분은 3' 말단과의 인산디에스테르 구조의 결합 부위로 되어 있다. 3' 말단과 결합하고 있는 아미노산은 수산기를 함유하는 아미노산이면 어느 것이어도 되고, 세린 또는 트레오닌이면 된다. 또한, 이 세린 및 트레오닌의 아미노기는 아실기에 의해 치환되어 있어도 된다. 이 아실기는 페닐카르보닐기 또는 알킬카르보닐기이어도 된다. 페닐카르보닐기의 페닐기는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기, 탄소수 1 내지 6 의 알콕시기, 할로겐 원자 등으로 치환되어 있어도 된다. 알킬카르보닐기의 알킬기는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이면 되고, 직사슬형이어도 분지사슬형이어도 되고, 탄소수 1 내지 6 의 알콕시기, 할로겐 원자 등으로 추가로 치환되어 있어도 된다. 이와 같은 아실기 중에서는 알킬카르보닐기가 좋고, 특히 아세틸기가 바람직하다.

예를 들어, ←O-Ph-CH(COOH)NH-(아미노산 잔기)j-Ser 의 구조는 티로신의 아미노기에 세린, 또는 세린이 말단인 폴리펩티드가 결합한 구조이다. 이 펩티드 구조는, ←O-Ph-CH(NH₂)CO-(아미노산 잔기)j-Ser 과 같이, 티로신의 카르복시 말단에서 폴리펩티드를 형성해도 된다.

폴리펩티드를 형성하는 아미노산은 L- 형, D- 형, DL- 형 중 어느 것이어도 된다.

폴리펩티드로는 디펩티드 내지 테트라펩티드이면 된다. 티로신과 세린 또는 트레오닌의 중간에 결합하는 아미노산으로는 특별히 제한은 없지만, 글리신, 알라닌, β-알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 시스테인, 글루타민, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산 등의 아미노산이면 된다. 아미노산으로서 바람직한 것은 글리신, 알라닌, β-알라닌이다. 티로신과 세린 또는 트레오닌의 중간에 결합하는 디아미노산으로는 특별히 제한은 없지만, 상기 아미노산으로 구성되는 디아미노산이면 된다. 아미노산으로서 바람직한 것은 글리신-글리신, 글리신-알라닌, 글리신-β-알라닌, 알라닌-글리신, 알라닌-알라닌, 알라닌-β-알라닌, β-알라닌-글리신, β-알라닌-알라닌, β-알라닌-β-알라닌이다.

링커를 구성하는 페닐기 상에 존재하고 있는 R¹, R² 및R³ 중 어느 1 개는 -L¹-(CH₂)_m-L²-L³-(CH₂CH₂O)_n1-(CH₂)_n2-O→ 로 나타내는 구조로 링커 기능을 완수한다. R¹, R² 및R³ 중의 2 개는 페닐기 상의 치환기이다. 이와 같은 치환기로는, 수소 원자, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 8 의 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 8 의 알콕시기, 할로겐 원자, 탄소수 1 내지 9 의 알킬기를 갖는 알킬카르보닐아미노기, 및 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 8 의 알킬기를 포함하는 알킬카르보닐기로 이루어지는 군의 기에서 선택되는 기이면 된다.

R¹, R² 및R³ 중의 2 개가 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 8 의 알킬기일 때, 알킬기로는 직사슬형 또는 분지사슬형 중 어느 것이어도 된다. 예를 들어, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, 제 2 급 부틸기, 펜틸기, 헥실기, 헵틸기, 옥틸기 등을 들 수 있다. 알킬기가 치환기를 가질 때, 치환기로는, 수산기, 아미노기, 할로겐 원자, 탄소수 1 내지 6 의 알킬티오기, 탄소수 1 내지 6 의 알콕시기, 카르복시기, 탄소수 1 내지 6 의 알콕시기를 함유하는 알콕시카르보닐기로 이루어지는 군의 기에서 선택되는 기 1 또는 1 이상의 기를 치환기로서 갖고 있어도 된다. 치환기가 1 이상인 경우에는, 동일해도 상이해도 어느 것이어도 된다. 수산기 또는 아미노기가 알킬기의 치환기일 때, 이들은 알킬기의 말단의 탄소 원자 상에 치환된 것이 보다 바람직하다. 수산기를 갖는 알킬기로서 하이드록시메틸기, 2-하이드록시에틸기, 2-하이드록시프로필기, 3-하이드록시프로필기가 바람직하다. 할로겐 원자를 알킬기의 치환기로서 갖는 경우, 알킬기는 탄소수 1 내지 6 의 직사슬형 또는 분지상 중 어느 것이어도 되지만, 보다 바람직하게는 메틸기 또는 에틸기 상에 할로겐 원자를 갖는 것이고, 특히 메틸기가 바람직하다. 할로겐 원자가 알킬기의 치환기일 때, 할로겐 원자로는 불소 원자가 바람직하다. 불소 원자의 수는 모노 치환으로부터 퍼플루오로 치환까지 중 어느 것이어도 된다. 모노플루오로메틸기, 디플루오로메틸기, 트리플루오로메틸기, 및 2,2,2-트리플루오로에틸기를 예시할 수 있다. 모노플루오로메틸기, 디플루오로메틸기 및 트리플루오로메틸기가 바람직하다. 탄소수 1 내지 6 의 알킬티오기 및 탄소수 1 내지 6 의 알콕시기로는, 직사슬형 또는 분지사슬형 중 어느 것이어도 되고, 예를 들어, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, 제 2 급 부틸기 등을 들 수 있다. 카르복시기 또는 탄소수 1 내지 6 의 알콕시기를 함유하는 알콕시카르보닐기가 알킬기의 치환기일 때, 이들은 알킬기의 말단의 탄소 원자 상에 치환된 것이 보다 바람직하다. 탄소수 1 내지 6 의 알콕시기를 함유하는 알콕시카르보닐기의 알킬기는 직사슬형 또는 분지사슬형 중 어느 것이어도 되고, 예를 들어, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, 제 2 급 부틸기 등을 들 수 있다.

R¹, R² 및R³ 중의 2 개가 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 8 의 알콕시기일 때, 이 알콕시기는 상기에 나타낸 알킬기와 산소 원자로 구성된 알콕시기이면 된다.

R¹, R² 및R³ 중의 2 개가 할로겐 원자인 경우, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 또는 요오드 원자이면 된다. 이들 중에서는 염소 원자 또는 불소 원자가 바람직하고, 보다 바람직하게는 불소 원자이다.

R¹, R² 및R³ 중의 2 개가 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 9 의 알킬기를 포함하는 알킬카르보닐기 (지방족 아실기) 일 때, 이 알킬 부분은 상기에서 나타낸 탄소수 1 내지 8 의 알킬기를 포함하는 탄소수 9 까지의 알킬기이면 되고, 알킬카르보닐기는 이와 같은 알킬기와 카르보닐기로 구성되는 것이면 된다. 알킬카르보닐기로는 아세틸기가 바람직하다.

R¹, R² 및R³ 으로는, R¹ 및R³ 이 수소 원자이고, R² 가 -L¹-(CH₂)_m-L²-L³-(CH₂CH₂O)_n1-(CH₂)_n2-O→ 로 나타내는 링커 구조인 경우가 바람직하다.

또한, R¹ 및R³ 이 수소 원자일 때 이하의 조합이 바람직하다；

L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 과 n2 의 합이 3 이상의 정수인 경우.

L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 과 n2 의 합이 8 이상의 정수인 경우.

L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 이 0 또는 2 이고, n2 가 6 이상의 정수인 경우.

L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 이 0 또는 2 이고, n2 가 6 또는 8 인 경우.

L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 이 0 또는 2 이고, n2 가 8 인 경우.

L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 이 2 이고, n2 가 8 인 경우.

본 명세서 중에 있어서는, 상기 표적 유전자에 대한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드, 및 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기 배열을 갖는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 갖는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드를 유래로 하고, 이 안티센스 사슬의 5' 말단 및 센스 사슬의 3' 말단이 각각에 있어서 인산디에스테르 구조를 형성한 하기 구조식으로 나타내는 구조의 링커에 의해 결합되어 있는 1 개 사슬 구조를 갖는 것을 특징으로 하고, 폴리뉴클레오티드-3'-P(=O)(OH)-[링커]-P(=O)(OH)-5'-폴리뉴클레오티드의 구조를 형성하고 있는 폴리뉴클레오티드를 「3L5-폴리뉴클레오티드」 라고도 한다.

3L5-폴리뉴클레오티드로는, 다음 식으로 나타내는 구조의 폴리뉴클레오티드가 바람직하다.

[화학식 20]

식 중,

p 는 0 내지 4 의 정수를 나타내고,

q 는 4 내지 10 의 정수를 나타내고,

L⁵ 는 단결합 또는 -O- 를 나타내고,

L⁵ 가 -O- 일 때는, p 는 1 내지 4 의 정수를 나타낸다.

또한, 이하의 조합이 보다 바람직하다；

p 와 q 의 합이 3 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 경우.

p 와 q 의 합이 8 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 경우.

p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 경우.

p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 또는 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 경우.

p 가 0 또는 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 경우.

p 가 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 경우.

본 명세서 중에서의 「상보적인 뉴클레오티드」란, 뉴클레오티드의 염기 부분이 상보하는 뉴클레오티드를 말하며, 예를 들어, 염기 부분이 아데닌과 티민, 구아닌과 시토신, 구아닌과 5-메틸시토신 및 아데닌과 우라실인 뉴클레오티드는 서로 상보적인 뉴클레오티드이다.

본 명세서 중에서의 「상보적인 뉴클레오티드 배열」이란, 대상이 되는 뉴클레오티드 배열에 대하여, 모두가 상보적인 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열에 부가하여, 1 또는 몇 개의 뉴클레오티드가 상보적인 뉴클레오티드는 아니지만, 폴리뉴클레오티드끼리가 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드 배열도 포함한다.

본 명세서 중에 있어서의 폴리뉴클레오티드의 2 개 사슬 구조란, 2 종의 폴리뉴클레오티드의 서로 상보적인 뉴클레오티드 배열끼리가 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 2 개 사슬의 구조를 갖고 있는 것 및 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드의 내부에 있어서의 상보적인 배열끼리가 왓슨-크릭 염기쌍를 형성하여 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드 내부에 있어서 2 개 사슬 구조를 갖는 것도 말한다.

본 명세서 중에 있어서의 3L5-폴리뉴클레오티드는 상보적인 뉴클레오티드끼리가 왓슨-크릭 염기쌍를 형성하여 2 개 사슬 구조를 형성하는 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드이지만, 모든 폴리뉴클레오티드가 왓슨-크릭 염기쌍를 형성하고 있지 않아도 된다.

본 명세서 중에서는, 3L5-폴리뉴클레오티드를 구성하는 폴리뉴클레오티드 중, 표적 유전자와 동일한 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 표적 유전자에 대한 패신저 사슬 (passenger strand) 또는 센스 사슬이라고 부르며, 표적 유전자와 상보적인 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 표적 유전자에 대한 가이드 사슬 (guide strand) 또는 안티센스 사슬이라고 부른다. 표적 유전자에 대한 안티센스 사슬은 표적 유전자의 mRNA 와 상보적인 뉴클레오티드 배열을 갖는다.

본 명세서 중에 있어서, 표적 유전자 「표적 유전자와 동일한 뉴클레오티드 배열로 이루어진다」 란, 표적 유전자의 적어도 일부의 뉴클레오티드 배열과 동일한 배열로 이루어지는 것을 말하는데, 완전히 동일한 배열에 부가하여, 3L5-폴리뉴클레오티드가 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 한에 있어서, 실질적으로 동일한 배열도 포함한다. 「표적 유전자와 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다」 란, 표적 유전자의 적어도 일부의 뉴클레오티드 배열과 상보적인 배열로 이루어지는 것을 말하는데, 완전히 상보적인 배열에 부가하여, 3L5-폴리뉴클레오티드가 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 한에 있어서, 실질적으로 동일한 배열도 포함한다. 또, 표적 유전자에 SNPs 등이 알려져 있는 경우, 그들의 변이를 갖는 배열도 동일한 뉴클레오티드 배열에 포함된다. 본 명세서 중에 있어서, 표적 유전자와 상보적인 뉴클레오티드 배열을 포함하여 표적 유전자에 대해 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 폴리뉴클레오티드를 표적 유전자에 대한 폴리뉴클레오티드라고 한다.

표적 유전자에 대한 3L5-폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 배열은 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 한에 있어서 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 컴퓨터 소프트웨어 (예를 들어, GENETYX (등록상표)：GENETYX COORPORATION 제조 등) 를 사용하여 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 것으로 예상된 배열에 기초하여 센스 사슬 및 안티센스 사슬의 배열을 결정함으로써 결정할 수도 있고, 또한 선택된 배열에 기초하여 제조한 3L5-폴리뉴클레오티드의 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 확인함으로써 결정할 수도 있다.

본 명세서 중에 있어서 유전자 발현 억제 작용이란, 유전자의 발현을 완전히 억제하는 작용 외에, 컨트롤에 비해 유전자의 발현을 감소시키는 작용도 포함되고, 유전자 억제 (gene silencing) 도 유전자 발현 억제 작용에 포함된다. 또, 본 명세서에 있어서는, 유전자 발현 억제 작용과 유전자 발현 억제 활성을 동일한 의미로 사용하고 있다.

RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용은 당업자가 통상적으로 실시하는 방법으로 확인할 수 있는데, 예를 들어, 표적 유전자가 발현하고 있는 세포에 표적 유전자에 대한 3L5-폴리뉴클레오티드를 투여하여 일정 시간 경과 후의 표적 유전자의 번역 산물인 단백질을 웨스턴 블롯 해석에 의해 정량하여 단백질의 발현량을 컨트롤과 비교함으로써 확인할 수 있다. 또, 리얼 타임 PCR 의 수법에 의해 표적 유전자에 대한 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드 투여 후의 표적 유전자의 발현량을 리얼 타임으로 측정함으로써도 확인할 수 있다.

표적 유전자의 적어도 일부의 뉴클레오티드 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 배열을 갖는 폴리뉴클레오티드란, 표적 유전자의 뉴클레오티드 배열 중, 어느 부분이어도 되는 18 뉴클레오티드 이상의 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다. 여기서, 「실질적으로 동일한 배열」 이란, 표적 유전자의 뉴클레오티드 배열과 70 ％ 이상, 바람직하게는 80 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상의 상동성을 갖는 배열을 말한다. 뉴클레오티드 배열의 상동성은 BLAST (등록상표) 등의 공지된 유전자 해석 소프트웨어를 사용하여 계산할 수 있다.

본 명세서에 첨부하는 배열표에 있어서, 각 배열의 ＜223＞ 의 항목 중에서“cm”은 2'-O-메틸시티딘 (2'-O-Methylcytidine) 을 나타내고, “um”은 2'-O-메틸우리딘 (2'-O-Methyluridine) 을 나타내고, “gm”은 2'-O-메틸구아노신 (2'-O-Methylguanosine) 을 나타낸다.

2. 3L5-폴리뉴클레오티드

본 발명에 있어서의 3L5-폴리뉴클레오티드를 구성하는 센스 사슬 및 안티센스 사슬의 사슬 길이는, RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 한, 18 뉴클레오티드로부터, 표적 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 의 전체 길이까지 중 어떠한 길이라도 된다. 센스 사슬로는, 18 ∼ 21 사슬 길이의 것이 바람직하고, 18 ∼ 19 사슬 길이의 것이 더욱 바람직하다. 안티센스 사슬로는, 19 ∼ 21 사슬 길이의 것이 바람직하고, 21 사슬 길이의 것이 더욱 바람직하다. 3L5-폴리뉴클레오티드는 그 전체가 2 개 사슬 구조일 필요는 없고 5' 및/또는 3' 말단이 일부 돌출한 것도 포함하며, 그 돌출 말단은 1 ∼ 5 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 ∼ 3 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 2 뉴클레오티드이다. 또, 가장 바람직한 예로는, 안티센스 사슬의 폴리뉴클레오티드의 3' 말단이 2 뉴클레오티드 돌출하고 있는 (오버행 구조) 구조를 갖고, 18 염기쌍를 형성하고 있는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.

3L5-폴리뉴클레오티드는 하기의 (a) ∼ (h) 에서 선택되는 적어도 어느 하나의 성질을 갖는다.

(a) 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는다；

(b) RNA 분해 효소에 안정적이고, 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는다；

(c) 포스파타아제에 대해 안정적이고, 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는다；

(d) 엑소뉴클레아제에 대해 안정적이고, 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는다；

(e) RNA 분해 효소, 포스파타아제 및 엑소뉴클레아제에 대해 안정적이고, 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는다；

(f) 안티센스 사슬이 포스파타아제에 대해 안정적이고, 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는다；

(g) 안티센스 사슬이 엑소뉴클레아제에 대해 안정적이고, 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는다；

(h) 안티센스 사슬이 5'-3' 엑소뉴클레아제에 대해 안정적이고, 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는다.

2-1.

3L5-폴리뉴클레오티드의 일례로는, 표적 유전자에 대한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드, 및 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기 배열을 갖는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 갖는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드를 유래로 하고, 이 안티센스 사슬의 5' 말단 및 센스 사슬의 3' 말단이, 각각에 있어서 인산디에스테르 구조를 형성한 하기 구조식으로 나타내는 구조의 링커에 의해 결합되어 있는 구조를 갖는 것이 특징인, 즉, 폴리뉴클레오티드-3'-P(=O)(OH)-[링커]-P(=O)(OH)-5'-폴리뉴클레오티드의 구조를 형성하고 있는 [여기서, 『폴리뉴클레오티드 -3'』 는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 수산기 상의 수소 원자를 갖지 않는 구조를 나타내고, 『5'-폴리뉴클레오티드』 는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 수산기 상의 수소 원자를 갖지 않는 구조를 나타낸다] 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.

3L5-폴리뉴클레오티드의 다른 일례로는, 센스 사슬 및 안티센스 사슬이 18 내지 23 염기 길이로 이루어지고, 단리된 2 개 사슬 구조를 갖는 RNA 분자로서, 각 RNA 사슬이 18 ∼ 23 염기 길이를 갖고, 적어도 1 개의 사슬이 1 ∼ 3 염기로 이루어지는 3' 돌출부를 갖는 것이고, 그 RNA 분자는 표적 특이적인 RNA 간섭이 가능한 것이고, 3' 돌출부를 제외하는 그 RNA 분자의 1 개의 사슬이 미리 결정된 mRNA 표적 분자에 대해 100 ％ 의 동일성을 갖는 배열로 이루어지고, 또한, 그 mRNA 표적 분자가 세포 또는 생물 중에 존재하는 것인 상기 RNA 분자이며, 안티센스 사슬의 5' 말단 및 센스 사슬의 3' 말단이 각각에 있어서 인산디에스테르 구조를 형성한 링커에 의해 결합되어 있는 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.

3L5-폴리뉴클레오티드의 다른 일례로는, 센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (II) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (III) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬의 5' 말단 및 센스 사슬의 3' 말단이 각각에 있어서 인산디에스테르 구조를 형성한 링커에 의해 결합되어 있는 구조를 갖고, 또한 이하의 (a) 내지 (d) 에 나타내는 특징을 갖는, 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 들 수 있다：

(a) γ 는 RNA, β 는 2'-OMeRNA, λ 및 υ 은 DNA 를 나타낸다；

(b) t 및 u 는 동일 또는 상이하며, 0 ∼ 5 중 어느 것의 정수를 나타낸다；

(c) 식 (III) 으로 나타내는 폴리뉴클레오티드 중 (γ-β)₉-γ 는 표적 유전자와 동일한 뉴클레오티드 배열로 이루어진다；

(d) 식 (II) 에 있어서의 (γ-β)₉-γ 와 식 (III) 에 있어서의 β-(γ-β)₉ 는 서로 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다.

γ, β, λ 및 υ 은 뉴클레오시드 유닛을 나타내고, 각 뉴클레오시드 사이를 잇는 선은 인산디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 뉴클레오시드 유닛이란, 상기 서술한 「천연형 뉴클레오시드」나 「당 수식 뉴클레오시드」 와 같은 핵산 염기의 N-글루코실체로 폴리뉴클레오티드의 구성 단위를 나타낸다.

3L5-폴리뉴클레오티드의 다른 일례로는, 센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (IV) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (V) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬의 5' 말단 및 센스 사슬의 3' 말단이 각각에 있어서 인산디에스테르 구조를 형성한 링커에 의해 결합되어 있는 구조를 갖고, 또한 이하의 (a) 내지 (d) 에 나타내는 특징을 갖는, 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 들 수 있다：

(d) 식 (IV) 에 있어서의 (α-β)₉ 와 식 (V) 에 있어서의 (α-β)₉ 는 서로 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다.

α, β, δ 및 λ 는 뉴클레오시드 유닛을 나타내고, 각 뉴클레오시드 사이를 잇는 선은 인산디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 뉴클레오시드 유닛이란, 상기 서술한 「천연형 뉴클레오시드」나 「당 수식 뉴클레오시드」 와 같은 핵산 염기의 N-글루코실체로 폴리뉴클레오티드의 구성 단위를 나타낸다.

3L5-폴리뉴클레오티드의 다른 일례로는, 센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (VI) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (VII) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬의 5' 말단 및 센스 사슬의 3' 말단이 각각에 있어서 인산디에스테르 구조를 형성한 링커에 의해 결합되어 있는 구조를 갖고, 또한, 이하의 (a) 내지 (d) 에 나타내는 특징을 갖는, 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 들 수 있다：

(d) 식 (VI) 에 있어서의 (α-β)₈ 과 식 (VII) 에 있어서의 (α-β)₈ 은 서로 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다.

3L5-폴리뉴클레오티드의 다른 일례로는, 센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (VIII) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (IX) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬의 5' 말단 및 센스 사슬의 3' 말단이 각각에 있어서 인산디에스테르 구조를 형성한 링커에 의해 결합되어 있는 구조를 갖고, 또한, 이하의 (a) 내지 (c) 에 나타내는 특징을 갖는 (1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 들 수 있다：

(a) α 가 DNA, β 가 2'-OMeRNA 이다；

(c) 식 (VIII) 에 있어서의 (α-β)₉ 와 식 (IX) 에 있어서의 (α-β)₉ 는 서로 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다.

3L5-폴리뉴클레오티드에는, RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 한에 있어서, 3L5-폴리뉴클레오티드 중의 임의의 1 ∼ 4 잔기를 다른 당 수식 뉴클레오티드로 치환한 것도 포함된다.

당 수식 뉴클레오티드에는, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있는 당 수식의 모든 양식을 포함한다. 당 수식 뉴클레오티드는 모든 복소 고리 염기 부위 및 인터뉴클레오시드 결합을 유지할 수 있고, 또한 상기 당 수식과는 독립된 그룹을 포함한다. 당 수식 뉴클레오티드의 그룹은 2'-수식 뉴클레오시드, 4'-티오 수식 뉴클레오시드, 4'-티오-2'-수식 뉴클레오시드 및 2 고리형 당 수식 뉴클레오시드를 포함한다.

2'-수식 뉴클레오티드의 예로는, 할로, 알릴, 아미노, 아지드, O-알릴, O-C₁-C₁₀ 알킬, OCF₃, O-(CH₂)₂-O-CH₃, 2'-O(CH₂)₂SCH₃, O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n), 또는 O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n) 이고, 각 R_m 과 R_n 이 개별적으로 H, 아미노 보호기, 또는 치환 또는 비치환 C₁-C₁₀ 알킬이다. 바람직한 2'- 수식은 -F, -OCH₃, 또는 -O-(CH₂)₂-O-CH₃ 이다. 더욱 바람직하게는 -OCH₃ 이다.

4'-티오 수식 뉴클레오시드의 예로는, 4'-산소 원자가 황 원자로 치환된 β-D-리보뉴클레오시드를 들 수 있다 (Hoshika, S. et al. FEBS Lett. 579, p.3115-3118, (2005)；Dande, P. et al. J. Med. Chem. 49, p.1624-1634 (2006)；Hoshika, S. et al. ChemBioChem. 8, p.2133-2138, (2007)).

4'-티오-2'-수식 뉴클레오시드의 예로는, 2'-H, 또는, 2'-O-메틸을 유지하는 4'-티오-2'-수식 뉴클레오시드를 들 수 있다 (Matsugami, et al. Nucleic Acids Res. 36, 1805 (2008)).

2 고리형 당 수식 뉴클레오시드의 예로는, 리보오스 고리의 2 원자를 가교함으로써 형성된 제 2 고리를 유지하는 뉴클레오시드를 들 수 있고, 그러한 뉴클레오시드의 예로는, 2'-산소 원자와 4'-탄소 원자를 메틸렌 사슬로 가교한 2',4'-BNA/LNA (bridged nucleic acids/locked nucleic acids) (Obika, S. et al. Tetrahedron Lett., 38, p.8735- (1997).；Obika, S. et al., Tetrahedron Lett., 39, p.5401- (1998).；A. A. Koshkin, A. A. et al. Tetrahedron, 54, p.3607 (1998).；Obika, S. Bioorg. Med. Chem., 9, p.1001 (2001)), 2',4'-BNA/LNA 의 메틸렌 사슬을 1 탄소 연장한 에틸렌 사슬로 가교한 ENA (2'-O,4'-C-ethylene-bridged nucleic acids) 를 들 수 있다 (Morita, K. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 12, p.73 (2002).；Morita, K. et al. Bioorg. Med. Chem., 11, p.2211 (2003)).

2'-OMeRNA 를 포함하는 3L5-폴리뉴클레오티드 중의 2'-OMeRNA 의 임의의 1 ∼ 4 잔기가 당 수식 뉴클레오티드로 치환되어 있는 경우에, 보다 바람직한 당 수식 뉴클레오티드는 상기의 당 수식 뉴클레오티드 중, 동일 또는 상이하며 ENA 또는 2',4'-BNA/LNA 이다.

3L5-폴리뉴클레오티드에는, 폴리뉴클레오티드 중의 DNA 의 1 ∼ 4 잔기가 동일 또는 상이하며, RNA, ENA 또는 2',4'-BNA/LNA 로 치환되어 있는 폴리뉴클레오티드도 포함된다.

2-2 3L5-폴리뉴클레오티드 센스 사슬의 합성 방법

3L5-폴리뉴클레오티드를 구성하는 폴리뉴클레오티드의 조제 방법으로는 원하는 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있는 한 특별히 제한은 없지만, 이미 알려진 화학 합성법 (인산트리에스테르법, 포스포라미디트법, 또는, H-포스포네이트법 등) 을 사용할 수 있다. 예를 들어, 시판되는 핵산 합성기를 사용하여, 시판되는 DNA/RNA 합성에 사용되는 시약을 이용하여 합성할 수 있다.

2-3 3L5-폴리뉴클레오티드의 합성 방법

3L5-폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있는 한 그 제조 방법에 제한은 없지만, 예를 들어, 이하의 방법에 의해 합성할 수 있다.

2-3-1 A 법

2-3-1-1 A-1 공정

A-1 공정의 개요를 도 1 에 나타낸다.

본 공정은 원하는 뉴클레오시드가 결합한 폴리머 서포트 (1) (A-1 법 중, Tr¹-O-Y-CPG 로 나타낸다. 식 중, CPG 는 폴리뉴클레오티드와 결합할 수 있는 링커를 갖는 폴리머 서포트를 나타내고, Y 는, 5'- 및 3'- 수산기를 제외한, 핵산 염기부의 아미노기가 보호된 뉴클레오시드 유닛을 나타낸다.) 를 사용하여, 원하는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 유연체인 화합물 (2) 를 제조하는 공정이다 (A 법 중, HO-W¹-Y-CPG 로 나타낸다. 식 중, W¹-Y 는 5'- 말단 및 3'- 말단의 수산기를 제외한 보호된 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. Tr¹ 은 수산기의 보호기를 나타낸다.).

Tr¹ 은 핵산의 보호기를 탈리하지 않고 탈보호가 가능한 수산기의 보호기이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기, 픽실기, 트리틸기, 레불리닐기, 비스(트리메틸실릴옥시)(시클로헥실옥시)실릴기를 들 수 있으며, 바람직하게는 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기이다.

핵산 염기부의 아미노기의 보호기로는, 통상적으로 사용되는 것이면 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 벤조일기, 이소부티릴기, 아세틸기, 페녹시아세틸기, 4-(t-부틸)페녹시아세틸기, 알릴옥시카르보닐기, p-니트로페닐에틸카르보닐기를 들 수 있다.

CPG 로는, 콘트롤드 포아 글래스, 롱 체인 알킬아미노 콘트롤드 포아 글래스 (Oligonucleotide synthesis Edited by M. J. Gait, IRL Press, 1984, pp84-115), 폴리스티렌 비즈 (Tetrahedron Lett. 34, 3373 (1994)) 등을 들 수 있다. 그 때 폴리머 서포트 상에 아미노프로필기, 아미노헥실기와 같은 아미노알킬기를 갖는 것을 들 수 있다.

폴리뉴클레오티드와 결합할 수 있는 링커로는, Y 의 3' 위치에 대해 산소 원자를 개재하여 숙신산을 사용하여 에스테르 결합한 -OC(=O)-CH₂CH₂C(=O)- 가 사용되고, 숙신산의 타방의 카르복실산은 폴리머 서포트 상의 아미노기와 아미드 결합하고 있는 것을 들 수 있다. 숙신산 외에, 사르코신 (-OC(=O)-CH₂CH₂C(=O)-), 옥살산 링커 (-OC(=O)C(=O)-) 등을 들 수 있다.

Tr¹-O-Y-CPG 로서, Tr¹ 이 4,4'-디메톡시트리틸기이고, CPG 가 Y 의 3' 위치에 대해 산소 원자를 개재하여 숙신산을 사용하여 에스테르 결합한 -OC(=O)-CH₂CH₂C(=O)- 가 사용되고, 숙신산의 타방의 카르복실산이 폴리머 서포트 상의 아미노기와 아미드 결합을 하고 있는 것의 시판품의 예로서, Glen Research 사의 2'-OMe-A-RNA-CPG (20-3600-10), 2'-OMe-C-RNA-CPG (20-3610-10), 2'-OMe-G-RNA-CPG (20-3621-10), 2'-OMe-U-RNA-CPG (20-3630-10), Bz-A-RNA-CPG (20-3303-10), Ac-C-RNA-CPG (20-3315-10), iPr-Pac-G-RNA-CPG (20-3324-10), U-RNA-CPG (20-3330-10), dA-CPG (20-2000-10), dC-CPG (20-2010-10) dG-CPG (20-2020-10), dT-CPG (20-2030-10) 등을 들 수 있다.

화합물 (2) 를 제조하는데 필요한 포스포라미디트 시약 등을 사용하여, DNA 자동 합성기를 이용한 통상적인 포스포라미디트법에 의해 화합물 (2) 를 제조한다. 원하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드 유연체는 DNA 합성기, 예를 들어 퍼킨엘머사의 포스포라미디트법에 의한 모델 392 등을 사용하여 문헌 (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) 에 기재된 방법에 준하여 합성할 수 있다.

또 원하는 바에 따라, 올리고뉴클레오티드 유연체를 티오에이트화하는 경우에는, 황 외에 테트라에틸티우람디술파이드 (TETD, 어플라이드 바이오시스템즈사), Beaucage 시약, 페닐아세틸디술파이드/피리딘-아세토니트릴 (1：1 v/v) 용액 (Ravikumar, V. T. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2006) 16, p.2513-2517) 등의 시약을 사용하여, 문헌 (Tetarhedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc., 112, 1253 (1990)) 에 기재된 방법에 준하여 티오에이트 유도체를 얻을 수 있다.

2-3-2 C 법

C 법의 개요를 도 2 에 나타낸다.

2-3-2-1 C-1 공정

본 공정은, 불활성 용제 중, 화합물 (9) 에, 탈산제의 존재하, 산성 조건하에서 제거할 수 있는 보호화 시약 (바람직하게는 디메톡시트리틸클로라이드) 을 반응시켜, 화합물 (9) 의 수산기를 보호한 화합물 (10) 을 얻는 공정이다.

사용되는 용제로는, 반응을 저해하지 않고, 출발 물질을 어느 정도 용해하는 것이면 특별히 한정은 없지만, 벤젠, 톨루엔, 자일렌과 같은 방향족 탄화수소류；메틸렌클로라이드, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소류；에테르, 테트라하이드로푸란, 디옥산, 디메톡시에탄과 같은 에테르류；디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 헥사메틸포스포로트리아미드와 같은 아미드류；디메틸술폭사이드와 같은 술폭사이드류；아세톤, 메틸에틸케톤과 같은 케톤류；피리딘과 같은 복소 고리 아민류 또는 아세토니트릴과 같은 니트릴류를 들 수 있고, 바람직하게는 복소 고리 아민류 (특히 피리딘) 를 들 수 있다.

사용되는 보호화 시약으로는, 트리틸클로라이드, 모노메톡시트리틸클로라이드, 디메톡시트리틸클로라이드, 트리메톡시트리틸클로라이드 등의 트리틸할라이드류를 들 수 있는데, 바람직하게는 모노메톡시트리틸클로라이드, 디메톡시트리틸클로라이드이다.

사용되는 탈산제로는 반응을 저해하지 않고, 생성물 및 출발 물질을 분해하지 않는 것이면 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 피리딘, 디메틸아미노피리딘과 같은 방향족 아민류이다.

반응 온도와 반응 시간에 대해서는 사용하는 보호화 시약이나 탈산제의 종류에 따라 상이한데, 보호화 시약으로서 디메톡시트리틸클로라이드를 사용하고, 피리딘을 용제와 탈산제와 겸하여 사용하는 경우에는 실온에서 2 시간이다.

반응 종료 후, 목적 화합물은 통상적인 방법에 따라 반응 혼합물로부터 채취된다. 예를 들어, 반응 혼합물을 적절히 중화하고, 또, 불용물이 존재하는 경우에는 여과에 의해 제거한 후, 물과 아세트산에틸과 같은 혼화하지 않는 유기 용매를 첨가하고, 수세 후, 목적 화합물을 포함하는 유기층을 분리하고, 무수 황산마그네슘 등으로 건조 후, 용제를 증류 제거함으로써 얻어진다. 얻어진 목적 화합물은 필요하다면, 통상적인 방법, 예를 들어 재결정, 재침전 또는 크로마토그래피 등에 의해 추가로 정제할 수 있다.

2-3-2-2 C-2 공정

본 공정은, 불활성 용제 중, 화합물 (10) 의 카르복실기에, 아미노기를 갖고 있는 페놀과 반응시켜, 아미드 결합을 갖는 화합물 (11) 을 형성시키는 공정이다.

사용되는 용제로는, 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 한정은 없지만, 벤젠, 톨루엔, 자일렌과 같은 방향족 탄화수소류；메틸렌클로라이드, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 클로로벤젠, 디클로로벤젠과 같은 할로겐화 탄화수소류；포름산에틸, 아세트산에틸, 아세트산프로필, 아세트산부틸, 탄산디에틸과 같은 에스테르류, 아세톤, 메틸에틸케톤메틸이소부틸케톤, 이소포론, 시클로헥사논과 같은 케톤류；니트로에탄, 니트로벤젠과 같은 니트로 화합물류；아세토니트릴, 이소부티로니트릴과 같은 니트릴류；포름아미드, 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드, 헥사메틸포스포로트리아미드와 같은 아미드류；디메틸술폭사이드, 술포란과 같은 술폭사이드류를 들 수 있고. 바람직하게는 할로겐화 탄화수소류 (특히 메틸렌클로라이드), 아미드류 (특히 디메틸포름아미드) 이다.

사용되는 페놀로는, 4-아미노페놀, 3-아미노페놀을 들 수 있지만, 바람직하게는 4-아미노페놀이다.

사용되는 아미드 형성 시약으로는, 예를 들어, N-하이드록시숙신이미드, 1-하이드록시벤조트리아졸, N-하이드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시이미드와 같은 N-하이드록시 화합물류；1,1'-옥살릴디이미다졸, N,N'-카르보닐디이미다졸과 같은 디이미다졸 화합물류；2,2'-디피리딜디술파이드와 같은 디술파이드 화합물류；N,N'-디숙신이미딜카보네이트와 같은 숙신산 화합물류；N,N'-비스(2-옥소-3-옥사졸리디닐)포스피닉클로라이드와 같은 포스피닉클로라이드 화합물류；N,N'-디숙신이미딜옥살레이트 (DSO), N,N-디프탈이미딜옥살레이트 (DPO), N,N'-비스(노르보르네닐숙신이미딜)옥살레이트 (BNO), 1,1'-비스(벤조트리아졸릴)옥살레이트 (BBTO), 1,1'-비스(6-클로로벤조트리아졸릴)옥살레이트 (BCTO), 1,1'-비스(6-트리플루오로메틸벤조트리아졸릴)옥살레이트 (BTBO) 와 같은 옥살레이트 화합물류, 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 (EDC) 등의 카르보디이미드류를 들 수 있고, 바람직하게는 디이미다졸 화합물류, 카르보디이미드류 (특히, EDC) 이다.

반응 보조 시약으로서 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBT) 을 첨가해도 된다.

반응 온도 및 반응 시간은 사용되는 아미드 형성 시약 및 용제의 종류에 따라 상이하지만, 0 ℃ 내지 100 ℃ 에서 5 내지 50 시간, 특히 4-아미노페놀과 EDC 를 메틸렌클로라이드 중에서 사용하는 경우에는 실온에서 18 시간이다.

2-3-3 D 법

D 법의 개요를 도 2 에 나타낸다. 도면 중, n1, n2, m, 및 L¹ 은 상기와 동일한 것을 나타내며, 구체적으로는, m 은 0 내지 4 의 정수를 나타내고, L¹ 은 단결합 또는 -O- 를 나타낸다.

2-3-3-1 D-1a 공정

본 공정은, 불활성 용제 중, 화합물 (12a) 의 아미노기에, 카르복실기를 갖고 있는 페놀과 반응시켜, 아미드 결합을 갖는 화합물 (13a) 를 형성시키는 공정이다.

사용되는 페놀로는, 3-하이드록시페닐아세트산, 4-하이드록시페닐아세트산, 3-(3-하이드록시페닐)프로피온산, 3-(4-하이드록시페닐)프로피온산, 4-(3-하이드록시페닐)발레르산, 4-(4-하이드록시페닐)발레르산, 3-하이드록시페녹시아세트산, 4-하이드록시페녹시아세트산 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 3-(4-하이드록시페닐)프로피온산이다.

본 공정은 C-2 공정과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.

2-3-3-2 D-2a 공정

본 공정은, 불활성 용제 중, 화합물 (13a) 에, 탈산제의 존재하, 산성 조건하에서 제거할 수 있는 보호화 시약 (바람직하게는 디메톡시트리틸클로라이드) 을 반응시켜, 화합물 (13a) 의 수산기를 보호한 화합물 (14a) 를 얻는 공정이다.

본 공정은 C-1 공정과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.

2-3-3-3 D-1b 공정

본 공정은, 불활성 용제 중, 화합물 (12b) 의 아미노기에, 카르복실기를 갖고 있는 페놀과 반응시켜, 아미드 결합을 갖는 화합물 (13b) 를 형성시키는 공정이다.

본 공정은 C-2 공정과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.

2-3-3-4 D-2b 공정

본 공정은, 불활성 용제 중, 화합물 (13b) 에, 탈산제의 존재하, 산성 조건하에서 제거할 수 있는 보호화 시약 (바람직하게는 디메톡시트리틸클로라이드) 을 반응시켜, 화합물 (13b) 의 수산기를 보호한 화합물 (14b) 를 얻는 공정이다.

본 공정은 C-1 공정과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.

2-3-3-5 D-1c 공정

본 공정은, 불활성 용제 중, 화합물 (12a) 의 아미노기에, 카르복실기를 갖고 있는 페놀과 반응시켜, 아미드 결합을 갖는 화합물 (13c) 를 형성시키는 공정이다.

사용되는 페놀로는, N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-티로신을 들 수 있다.

본 공정은 C-2 공정과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.

2-3-3-6 D-2c 공정

본 공정은, 불활성 용제 중, 화합물 (13c) 에, 탈산제의 존재하, 산성 조건하에서 제거할 수 있는 보호화 시약 (바람직하게는 디메톡시트리틸클로라이드) 을 반응시켜, 화합물 (13c) 의 수산기를 보호한 화합물 (14c) 를 얻는 공정이다.

본 공정은 C-1 공정과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.

2-3-4 E 법

E 법의 개요를 도 3 에 나타낸다.

2-3-4-1 E-1 공정

본 공정은, 불활성 용제 중, 화합물 (15) 에, 탈산제의 존재하, 산성 조건하에서 제거할 수 있는 보호화 시약 (바람직하게는 모노메톡시트리틸클로라이드) 을 반응시켜, 화합물 (15) 의 수산기를 보호한 화합물 (16) 을 얻는 공정이다.

본 공정은 C-1 공정과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.

2-3-4-2 E-2 공정

본 공정은, 불활성 용제 중, 화합물 (16) 의 카르복실기에, 티로신에스테르와 반응시켜, 아미드 결합을 갖는 화합물 (17) 을 형성시키는 공정이다.

사용되는 티로신에스테르로는, 티로신메틸에스테르, 티로신에틸에스테르 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 티로신에틸에스테르이다.

본 공정은 C-2 공정과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.

E 법의 개요를 도 3 에 나타낸다.

2-3-5 F 법

F 법의 개요를 도 3 에 나타낸다. 도면 중, A 는 -CH₂-, -CH(CH₃)-, -CH₂CH₂-, -CH[CH₂CH(CH₃)₂]-, 및, -CH[CH(CH₃)CH₂CH₃]- 를 나타낸다.

2-3-5-1 F-1 공정

본 공정은, 불활성 용제 중, 화합물 (18) 의 아미노기에, 아미노기가 t-Boc 기로 보호된 아미노산 (19) 과 반응시켜, 아미드 결합을 갖는 화합물 (20) 을 형성시키는 공정이다.

t-Boc 기로 보호된 아미노산의 종류로는, 글리신, 알라닌, β-알라닌, 류신, 이소류신 등을 들 수 있지만, 바람직하게는, 글리신, 알라닌, β-알라닌이다.

본 공정은 C-2 공정과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.

2-3-5-2 F-2 공정

본 공정은, 불활성 용제 중, 화합물 (20) 에 탈보호화 시약을 반응시켜, 아미노기의 보호기를 선택적으로 제거하여, 화합물 (21) 을 제조하는 공정이다.

사용되는 용제로는, 바람직하게는, 벤젠, 톨루엔, 자일렌과 같은 방향족 탄화수소류；메틸렌클로라이드, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 클로로벤젠, 디클로로벤젠과 같은 할로겐화 탄화수소류；포름산에틸, 아세트산에틸, 아세트산프로필, 아세트산부틸, 탄산디에틸과 같은 에스테르류；디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 테트라하이드로푸란, 디옥산, 디메톡시에탄, 디에틸렌글리콜디메틸에테르와 같은 에테르류；메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, t-부탄올, 이소아밀알코올, 디에틸렌글리콜, 글리세린, 옥탄올, 시클로헥산올, 메틸셀로솔브와 같은 알코올류；아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 이소포론, 시클로헥사논과 같은 케톤류；니트로에탄, 니트로벤젠과 같은 니트로 화합물류；아세토니트릴, 이소부티로니트릴과 같은 니트릴류；포름아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 헥사메틸포스포로트리아미드와 같은 아미드류；디메틸술폭사이드, 술포란과 같은 술폭사이드류를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는, 알코올류 (특히 메탄올, 에탄올) 나 염화메틸렌 및 탈보호화 시약으로서 아세트산을 사용하는 경우에는 아세트산과 물의 혼액을 들 수 있다.

사용되는 탈보호화 시약으로는, 통상적으로 사용되는 것이면 특별히 제한은 없지만, 보호기가 t-Boc 기인 경우에는, 예를 들어 아세트산, 디클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 염산 및 브롬화아연과 같은 루이스산류를 들 수 있고, 바람직하게는 아세트산, 디클로로아세트산, 트리플루오로아세트산이다.

반응 온도는 사용되는 시약, 원료, 용제 등에 따라 상이하지만, 통상적으로 ―10 내지 100 ℃ 이고, 바람직하게는 0 내지 50 ℃ 이다.

반응 시간은 사용되는 원료, 용제, 반응 온도 등에 따라 상이하지만, 통상적으로 1 분간 내지 50 시간이고, 바람직하게는 1 분간 내지 24 시간이다.

반응 종료 후, 목적 화합물은 통상적인 방법에 따라 반응 혼합물로부터 채취된다.

2-3-5-3 F-3 공정

본 공정은, 불활성 용제 중, 화합물 (21) 의 아미노기에, 화합물 (16) 과 반응시켜, 아미드 결합을 갖는 화합물 (22) 를 형성시키는 공정이다.

본 공정은 C-2 공정과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.

2-3-6 G 법

G 법의 개요를 도 4 에 나타낸다.

2-3-6-1 G-1 공정

본 공정은 C-2 공정에서 제조되는 화합물 (11), D-2a 공정에서 제조되는 화합물 (14a), D-2b 공정에서 제조되는 화합물 (14b), D-2c 공정에서 제조되는 화합물 (14c), E-2 공정에서 제조되는 화합물 (17), 및, F-3 공정에서 제조되는 화합물 (22) 의 페놀 (도 4 중, Tr-O-X-H 로 나타낸다. Tr 은 수산기의 보호기를 나타낸다.) 의 수산기에, 아미디트화에 사용하는 모노 치환-클로로(알콕시)포스핀류 (도 4 중, R⁵-P(-O-R⁴)-Cl 로 나타낸다) 또는 디 치환-알콕시포스핀류 (도 4 중, (R⁵-)₂P(-O-R⁴) 로 나타낸다) 를 반응시켜, 화합물 (23) 을 제조하는 공정이다.

Tr 은 핵산의 보호기를 탈리하지 않고 탈보호가 가능한 수산기의 보호기이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기, 픽실기, 트리틸기, 레불리닐기, 비스(트리메틸실릴옥시)(시클로헥실옥시)실릴기를 들 수 있고, 바람직하게는, 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기이다.

사용되는 용제로는, 반응에 영향을 주지 않는 것이면 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 테트라하이드로푸란, 디에틸에테르, 디옥산과 같은 에테르류；메틸렌클로라이드, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 클로로벤젠, 디클로로벤젠과 같은 할로겐화 탄화수소류를 들 수 있다.

본 공정도 중의 R⁴ 는 2-시아노에틸기, 메틸기, 메탄술포닐에틸기, 2,2,2-트리클로로에틸기, 알릴기를 들 수 있고, 바람직하게는 시아노에틸기, 메틸기이다.

본 공정도 중의 R⁵ 는 모르폴리노기, 디이소프로필아미노기, 디에틸아미노기, 디메틸아미노기를 들 수 있고, 바람직하게는 디이소프로필아미노기이다.

사용되는 모노 치환-클로로(알콕시)포스핀류로는, 예를 들어, 클로로(모르폴리노)메톡시포스핀, 클로로(모르폴리노)시아노에톡시포스핀, 클로로(디메틸아미노)메톡시포스핀, 클로로(디메틸아미노)시아노에톡시포스핀, 클로로(디이소프로필아미노)메톡시포스핀, 클로로(디이소프로필아미노)시아노에톡시포스핀과 같은 포스핀류를 들 수 있고, 바람직하게는, 클로로(모르폴리노)메톡시포스핀, 클로로(모르폴리노)시아노에톡시포스핀, 클로로(디이소프로필아미노)메톡시포스핀, 클로로(디이소프로필아미노)시아노에톡시포스핀이다.

모노 치환-클로로(알콕시)포스핀류를 사용하는 경우에는, 탈산제가 사용되고, 그 경우에, 사용되는 탈산제로는, 피리딘, 디메틸아미노피리딘과 같은 복소 고리 아민류, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민과 같은 지방족 아민류를 들 수 있지만, 바람직하게는 지방족 아민류 (특히 디이소프로필에틸아민) 이다.

사용되는 디 치환-알콕시포스핀류로는, 예를 들어, 비스(디이소프로필아미노)시아노에톡시포스핀, 비스(디에틸아미노)메탄술포닐에톡시포스핀, 비스(디이소프로필아미노)(2,2,2-트리클로로에톡시)포스핀, 비스(디이소프로필아미노)(4-클로로페닐메톡시)포스핀과 같은 포스핀류를 들 수 있고, 바람직하게는 비스(디이소프로필아미노)시아노에톡시포스핀이다.

디 치환-알콕시포스핀류를 사용하는 경우에는, 산이 사용되고, 그 경우에 사용되는 산으로는, 바람직하게는 테트라졸, 아세트산 또는 p-톨루엔술폰산이다.

반응 온도는 특별히 한정은 없지만, 통상적으로 0 내지 80 ℃ 이고, 바람직하게는 실온이다.

반응 시간은 사용하는 원료, 시약, 온도 등에 따라 상이하지만, 통상적으로 5 분 내지 30 시간이고, 바람직하게는, 실온에서 반응한 경우, 30 분 내지 10 시간이다.

반응 종료 후, 본 반응의 목적 화합물 (7) 은, 예를 들어, 반응 혼합물을 적절히 중화하고, 또, 불용물이 존재하는 경우에는, 여과에 의해 제거한 후, 물과 아세트산에틸과 같은 혼화하지 않는 유기 용매를 첨가하고, 수세 후, 목적 화합물을 포함하는 유기층을 분리하고, 무수 황산마그네슘 등으로 건조 후, 용제를 증류 제거함으로써 얻어진다.

얻어진 목적 화합물은 필요하다면, 통상적인 방법, 예를 들어, 재결정, 재침전 또는 크로마토그래피 등에 의해 추가로 정제할 수 있다.

2-3-6-2 G-2 공정

본 공정은 A-1 에서 제조되는 화합물 (2) 에 G-1 에서 제조되는 화합물 (23) 을 DNA 자동 합성기를 사용한 통상적인 포스포라미디트법에 의해 화합물 (24) 를 제조하는 공정이다 (도면 중, W² 는 5' 말단 및 3' 말단의 수산기를 제외한 보호된 센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타내고, W¹-Y 는 5' 말단 및 3' 말단의 수산기를 제외한 보호된 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타내고, Tr¹ 은 수산기의 보호기를 나타낸다).

Tr¹ 은 핵산의 보호기를 탈리하지 않고 탈보호가 가능한 수산기의 보호기이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기, 픽실기, 트리틸기, 레불리닐기, 비스(트리메틸실릴옥시)(시클로헥실옥시)실릴기를 들 수 있고, 바람직하게는 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기이다.

DNA 자동 합성기를 사용한 통상적인 포스포라미디트법에 의해 화합물 (24) 를 제조한다. 원하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드 유연체는 DNA 합성기, 예를 들어 퍼킨엘머사의 포스포라미디트법에 의한 모델 392 등을 사용하여 문헌 (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) 에 기재된 방법에 준하여 합성할 수 있다.

2-3-6-3 G-3 공정

본 공정은 G-2 에서 제조되는 화합물 (24) 의 CPG 로부터 잘라내고, 보호기의 제거를 실시하여, 최종 화합물 (25) 를 제조하는 공정이다 (도면 중, 식 중, W^2' 는 5' 말단 및 3' 말단의 수산기를 제외한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타내고, W^1'-Y' 는 5' 말단 및 3' 말단의 수산기를 제외한 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타낸다).

사용하는 염기로는, 진한 암모니아수, 메탄올성 암모니아, 에탄올성 암모니아, 진한 암모니아수-에탄올 (3：1 V/V) 혼액, 진한 암모니아수-40 ％ 메틸아민 수용액 (1：1 V/V) 혼액, 메틸아민, 0.5 M LiOH 수용액, 3.5 M 트리에틸아민/메탄올 용액의 (1：10 V/V) 혼액을 들 수 있고, 바람직하게는 진한 암모니아수, 진한 암모니아수-에탄올 혼액 (3：1 V/V) 이다.

반응 온도는 특별히 한정은 없지만, 통상적으로 ―50 내지 80 ℃ 이며, 바람직하게는 실온 내지 60 ℃ 이다.

반응 시간은 사용하는 원료, 시약, 온도 등에 따라 상이하지만, 통상적으로 5 분 내지 30 시간이며, 바람직하게는, 60 ℃ 에서 반응한 경우, 5 시간이다.

반응 종료 후, 용제를 증류 제거함으로써 얻어지는 화합물이, Tr¹ 이 결합하고 있는 경우, 역상 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 (고속 액체 크로마토그래피를 포함한다) 등의 각종 크로마토그래피 등의 정제 조작으로 정제할 수 있다.

Tr¹ 이, 예를 들어 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기, 픽실기, 트리틸기 등이 염기성 조건으로 탈보호되고 있지 않는 경우, F-2 공정과 동일한 방법의 산성 조건으로 Tr¹ 을 탈보호할 수 있다. 바람직하게는, 80 ％ 아세트산수이다.

이와 같이 하여 얻어지는 화합물 (25) 를 포함하는 반응 혼합물을, 역상 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 (고속 액체 크로마토그래피를 포함한다) 등의 각종 크로마토그래피 등, 통상적인 핵산의 정제에 사용되는 정제 조작으로 정제함으로써, 화합물 (25) 를 얻을 수 있다.

본 방법에 의해, 3L5-폴리뉴클레오티드 및 센스 사슬의 3' 말단과 안티센스 사슬의 5' 말단의 인산이 수식되어 있지 않은 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드를 취득할 수 있다.

3L5-폴리뉴클레오티드에는, 3L5-폴리뉴클레오티드에 콜레스테롤 유닛, 지질 유닛 또는 비타민 E 유닛을 도입한 것 (예를 들어, Lorenz, C. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, p.4975-4977 (2004)；Soutschek, J., et al. Nature, 432, p.173-178, (2004)；Wolfrum, C. et al. Nature Biotech. 25, p.1149-1157, (2007)) Kubo, T. et al. Oligonucleotides, 17, p.1-20, (2007)；Kubo, T., et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 365, p.54-61, (2008)；Nishina, K., et al., Mol. Ther. 16, p.734-740, (2008) 참조) 및 3L5-폴리뉴클레오티드의 말단에, 단백질에 결합되는 핵산 분자인 앱타머 (aptamer) 를 결합시킨 것도 포함한다.

3L5-폴리뉴클레오티드에는, 3L5-폴리뉴클레오티드와 모노클로날 항체 (또는 그 적절한 결합 부분) 나, 단백질 (또는 그 적절한 올리고펩티드프래그먼트) 이 결합한 것도 포함한다 (예를 들어, Song, et al. Nature Biotech. 23, p.709-717 (2005)；Xia et al. Pharm. Res. 24, p.2309-2316 (2007), Kumar, et al. Nature, 448, p.39-43 (2007) 참조).

또, 3L5-폴리뉴클레오티드에는, 3L5-폴리뉴클레오티드에 카티오닉 폴리머를 첨가함으로써, 정전하를 띤 복합체로 한 것도 포함한다 (장기 및 세포에 대한 분포를 달성할 수 있던 예로서, Leng et al. J. Gen. Med. 7, p.977-986 (2005), Baigude et al. 2, p.237-241, ACS Chem. Biol. (2007), Yadava et al. Oligonucleotide 17, p.213-222 (2007) 참조).

3L5-폴리뉴클레오티드에는, 상기 3L5-폴리뉴클레오티드의 모든 약학적으로 허용 가능한 염류, 에스테르, 또는 그러한 에스테르의 염류를 포함한다.

3L5-폴리뉴클레오티드의 약학적으로 허용 가능한 염류로는, 바람직하게는 나트륨염, 칼륨염, 리튬염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속염, 알루미늄염, 철염, 아연염, 구리염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염；암모늄염과 같은 무기염, t-옥틸아민염, 디벤질아민염, 모르폴린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N-벤질-페네틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염과 같은 유기염 등의 아민염；불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염과 같은 할로겐 원자화 수소산염, 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염；메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염과 같은 저급 알칸술폰산염, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염과 같은 아릴술폰산염, 아세트산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염；및, 글리신염, 리신염, 아르기닌염, 오르니틴염, 글루탐산염, 아스파르트산염과 같은 아미노산염을 들 수 있다.

3L5-폴리뉴클레오티드를 함유하는 조성물은 예를 들어 리포솜, 수용체 표적 분자, 경구, 직장, 국소적 또는 도입, 분배 및/또는 흡수를 보조하기 위한 다른 처방으로서, 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 혼합되고, 봉입되고, 공액된다.

3L5-폴리뉴클레오티드를 질환의 예방약 또는 치료약으로서 사용하는 경우에는, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그 약리학상 허용되는 염을, 그 자체 또는 적절히 약리학적으로 허용되는, 부형제, 희석제 등과 혼합하여, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제 또는 시럽제 등에 의해 경구적으로, 또는 주사제, 좌제, 첩부제, 또는 외용제 등에 의해 비경구적으로 투여할 수 있다.

이들 제제는 부형제 (예를 들어, 유당, 백당, 포도당, 만니톨, 소르비톨과 같은 당 유도체；옥수수 전분, 감자 전분, α 전분, 덱스트린과 같은 전분 유도체；결정 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체；아라비아검；덱스트란；풀루란과 같은 유기계 부형제；및, 경질 무수 규산, 합성 규산알루미늄, 규산칼슘, 메타규산알루민산마그네슘과 같은 규산염 유도체；인산수소칼슘과 같은 인산염；탄산칼슘과 같은 탄산염；황산칼슘과 같은 황산염 등의 무기계 부형제를 들 수 있다), 활택제 (예를 들어, 스테아르산, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘과 같은 스테아르산 금속염；탤크；콜로이드 실리카；비즈 왁스, 경랍과 같은 왁스류；붕산；아디프산；황산나트륨과 같은 황산염；글리콜；푸마르산；벤조산나트륨；DL 류신；라우릴황산나트륨, 라우릴황산마그네슘과 같은 라우릴황산염；무수 규산, 규산 수화물과 같은 규산류；및, 상기 전분 유도체를 들 수 있다), 결합제 (예를 들어, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 매크로골 및, 상기 부형제와 동일한 화합물을 들 수 있다), 붕괴제 (예를 들어, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 내부 가교 카르복시메틸셀룰로오스나트륨과 같은 셀룰로오스 유도체；카르복시메틸스타치, 카르복시메틸스타치나트륨, 가교 폴리비닐피롤리돈과 같은 화학 수식된 전분ㆍ셀룰로오스류를 들 수 있다), 유화제 (예를 들어, 벤토나이트, 비이검과 같은 콜로이드성 점토；수산화마그네슘, 수산화알루미늄과 같은 금속 수산화물；라우릴황산나트륨, 스테아르산칼슘과 같은 음이온 계면활성제；염화벤잘코늄과 같은 양이온 계면활성제；및, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르와 같은 비이온 계면활성제를 들 수 있다), 안정제 (메틸파라벤, 프로필파라벤과 같은 파라옥시벤조산에스테르류；클로로부탄올, 벤질알코올, 페닐에틸알코올과 같은 알코올류；염화벤잘코늄；페놀, 크레졸과 같은 페놀류；티메로살；데하이드로아세트산；및, 소르브산을 들 수 있다), 교미 교취제 (예를 들어, 통상적으로 사용되는, 감미료, 산미료, 향료 등을 들 수 있다), 희석제 등의 첨가제를 사용하여 주지된 방법으로 제조된다.

3. 3L5-폴리뉴클레오티드의 세포, 조직 또는 개체에 대한 도입 및 표적 유전자의 발현 조절

상기와 같이 조제된 3L5-폴리뉴클레오티드를 도입하는 피도입체로는, 표적 유전자가 그 세포 내에서 RNA 에 전사될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 피도입체로는 세포, 조직 또는 개체를 의미한다.

3L5-폴리뉴클레오티드가 사용되는 세포로는, 생식 계열 세포, 체성 세포, 분화 전능성 세포, 다분화능 세포, 분할 세포, 비분할 세포, 실질 조직 세포, 상피 세포, 불멸화 세포, 형질 전환 세포, 신경 세포 또는 면역 세포 중 어느 것이어도 된다.

조직으로는 단일 세포 배아 또는 구성성 세포, 또는 다중 세포 배아, 태아 조직 등을 포함한다. 또, 상기 분화 세포로는, 예를 들어, 지방 세포, 선유아 세포, 줄기 세포, 심근 세포, 내피 세포, 신경 세포, 글리어, 혈액 세포, 거핵구, 림프구, 매크로파지, 호중구, 호산구, 호염기구, 마스트 세포, 백혈구, 과립구, 케라틴 생성 세포, 연골 세포, 골아 세포, 파골 세포, 간 세포 및 내분비선 또는 외분비선의 세포 등을 들 수 있다. 이와 같은 세포의 예로는, CHO-K1 세포 (RIKEN Cell bank), 쇼죠바에 S2 세포 (Schneider, I. et al., J. Embryol. Exp. Morph., 27, p.353-365 (1972), 인간 HeLa 세포 (ATCC : CCL-2), 또는 인간 HEK293 세포 (ATCC : CRL-1573) 등이 바람직하게 사용된다.

또한 3L5-폴리뉴클레오티드의 피도입체로서 사용되는 개체로서 구체적으로는, 식물, 동물, 원생 동물, 바이러스, 박테리아, 또는 진균류에 속하는 것 등을 들 수 있다. 식물은 단자엽 식물, 쌍자엽 식물 또는 나자 식물이어도 되고, 동물은 척추 동물 또는 무척추 동물이어도 된다. 척추 동물로는 마우스, 래트, 원숭이, 개 및 인간을 포함하는 포유류가 바람직하다.

피도입체에 대한 3L5-폴리뉴클레오티드의 도입 방법으로는, 피도입체가 세포 또는 조직인 경우에는, 칼슘포스페이트법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션법, 바이러스 감염, 3L5-폴리뉴클레오티드 용액에 대한 침지, 또는 형질 전환법 등이 이용된다. 또, 배아에 도입하는 방법으로는, 마이크로인젝션, 일렉트로포레이션법, 또는 바이러스 감염 등을 들 수 있다. 피도입체가 식물인 경우에는 식물체의 체강 또는 간질 세포 등에 대한 주입 또는 관류, 또는 분무에 의한 방법이 이용된다. 또, 동물 개체인 경우에는, 경구, 국소, 피하, 근육 내 및 정맥 내 투여, 비경구, 경질 (經膣), 경직장, 경비, 경안, 경막 내 투여 등에 의해 전신적으로 도입하는 방법, 또는 일렉트로포레이션법이나 바이러스 감염 등이 사용된다. 경구 도입의 방법으로는, 3L5-폴리뉴클레오티드를 생물의 음식물과 직접 혼합하는 방법을 사용할 수도 있다.

3L5-폴리뉴클레오티드를 환자에게 도입하는 방법에 대해서는, 상기에 추가하여 콜로이드 분산계를 사용할 수 있다.

콜로이드 분산계는 화합물의 생체 내의 안정성을 높이는 효과나, 특정 장기, 조직 또는 세포로 화합물을 효율적으로 수송하는 효과가 기대된다.

콜로이드 분산계는 통상적으로 사용되는 것이면 한정하지 않지만, 고분자 복합체, 나노 캡슐, 미크로스페어, 비즈 및 수중 유계의 유화제, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질을 베이스로 하는 분산계를 들 수 있고, 바람직하게는 특정 장기, 조직 또는 세포로 화합물을 효율적으로 수송하는 효과가 있는, 복수의 리포솜, 인공막의 소포 (小胞) 이다 (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, p.682-；Blume and Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, 1990, 1029, p.91-；Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, p.119-；Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, p.698-).

0.2 - 0.4 ㎛ 의 사이즈 범위를 취하는 단막 리포솜은 거대 분자를 함유하는 수성 완충액의 상당한 비율을 피포화 (被包化) 시킬 수 있고, 화합물은 이 수성 내막에 피포화되어 생물학적으로 활성인 형태로 뇌 세포로 수송된다 (Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 1981, 6, p.77-).

리포솜의 조성은 통상적으로 지질, 특히 인지질, 특히 상전이 온도가 높은 인지질을 1 종 또는 그 이상의 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 통상적으로 복합시킨 것이다.

리포솜 생산에 유용한 지질의 예는, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 세린, 스핑고 지질, 포스파티딜 에탄올아민, 세레브로시드 및 강글리오시드와 같은 포스파티딜 화합물을 포함한다.

특히 유용한 것은 디아실포스파티딜글리세롤이며, 여기서는 지질 부분이 14 - 18 의 탄소 원자, 특히 16 - 18 의 탄소 원자를 함유하며, 포화되어 있다 (14 - 18 의 탄소 원자 사슬의 내부에 이중 결합이 결여되어 있다).

대표적인 인지질은 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린을 포함한다.

리포솜을 포함하는 콜로이드 분산계의 표적화는 수동적 또는 능동적 중 어느 것이어도 된다.

수동적인 표적화는 동양모세혈관을 함유하는 장기의 망내계 세포에 분포하고자 하는 리포솜 본래의 경향을 이용함으로써 달성된다.

한편, 능동적인 표적화는, 예를 들어, 바이러스의 단백질 코트 (Morishita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 1993, 90, p.8474-), 모노클로날 항체 (또는 그 적절한 결합 부분), 당, 당 지질 또는 단백질 (또는 그 적절한 올리고펩티드프래그먼트) 과 같은 특정 리간드를 리포솜에 결합시키는 것, 또는 천연으로 존재하는 국재 부위 이외의 장기 및 세포형에 대한 분포를 달성하기 위해서 리포솜의 조성을 바꿈으로써 리포솜을 수식하는 수법 등을 들 수 있다.

표적화된 콜로이드 분산계의 표면은 여러가지 방식으로 수식될 수 있다.

리포솜으로 표적된 딜리버리 시스템에서는, 지질 이중층과의 긴밀한 회합에 있어서 표적 리간드를 유지하기 위해서, 리포솜의 지질 이중층에 지질기가 포함될 수 있다.

지질 사슬을 표적 리간드와 연결시키기 위해서 여러가지 연결기가 사용될 수 있다.

3L5-폴리뉴클레오티드의 딜리버리가 소망되는 세포 상에 지배적으로 발견되는 특정 세포 표면 분자에 결합되는 표적 리간드는, 예를 들어, (1) 딜리버리가 소망되는 세포에 의해 지배적으로 발현되는 특정의 세포 수용체와 결합되어 있고, 호르몬, 성장 인자 또는 그 적절한 올리고펩티드프래그먼트, 또는 (2) 표적 세포 상에서 지배적으로 발견되는 항원성 에피토프와 특이적으로 결합되는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 또는 그 적절한 프래그먼트 (예를 들어, Fab；F(ab')2) 일 수 있다.

2 종 또는 그 이상의 생물 활성제는 단일 리포솜 내부에서 복합시켜 투여할 수도 있다.

내용물의 세포 내 안정성 및/또는 표적화를 높이는 약제를 콜로이드 분산계에 추가하는 것도 가능하다.

3L5-폴리뉴클레오티드 또는 그 약리학상 허용되는 염의 사용량은 증상, 연령 등에 따라 상이한데, 경구 투여인 경우에는, 1 회당 하한 1 ㎎ (바람직하게는 30 ㎎), 상한 2000 ㎎ (바람직하게는 1500 ㎎) 을, 정맥 내 투여 또는 피하 투여인 경우에는, 1 회당 하한 0.5 ㎎ (바람직하게는 5 ㎎), 상한 500 ㎎ (바람직하게는 250 ㎎) 을, 기관 내 투여인 경우에는, 1 회당 하한 0.5 ㎎ (바람직하게는, 5 ㎎), 상한 500 ㎎ (바람직하게는, 250 ㎎) 을, 안구 내 투여인 경우에는, 1 회당 하한 0.05 ㎎ (바람직하게는, 0.5 ㎎), 상한 10 ㎎ (바람직하게는, 5 ㎎) 을, 성인에 대하여, 1 일당 1 내지 3 회 증상에 따라 투여하는 것이 바람직하다. 또, 안정성이 높아진 약제의 경우에는, 1 주간에 1 내지 3 회, 더욱 안정성이 높아진 약제의 경우에는, 1 개월에 1 내지 3 회 증상에 따라 투여하는 것이 바람직하다.

국소적 투여에 대한 약학적 조성물 및 처방은 경피적 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 엿, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함한다.

실시예

이하, 실시예, 참고예 및 시험예에서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 하기 실시예에 있어서, 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시되어 있지 않는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」[Sambrook, J., Fritsch, E.F. 및 Maniatis, T. 저, Cold Spring Harbor Laboratory Press 에서 1989 년에 발간] 에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 사용하였다. 실시예에서 합성된 각 폴리뉴클레오티드의 X 의 구조식, 질량 분석계로 측정된 각 폴리뉴클레오티드의 분자량의 측정값을 표 1 에 나타냈다.

(참고예 1)

핵산 자동 합성기 (퍼킨엘머사 제조 ABI model 394 DNA/RNA synthesizer) 를 사용하여 0.2 μ㏖ 스케일의 RNA 합성 프로그램에 따라 실시하였다. 각 합성 사이클에 있어서의 용매, 시약, 포스포라미디트의 농도는 천연 올리고데옥시뉴클레오티드 합성의 경우와 동일한 것을 사용하였다.

데옥시뉴클레오시드포스포라미디트를 사용하는 경우에는, 5'-O-디메톡시트리틸-6-N-벤조일-2'-데옥시아데노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-2-N-이소부티릴-2'-데옥시구아노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-4-N-벤조일-2'-데옥시시티딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트, 5'-O-디메톡시트리틸티미딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트를 Proligo 사에서 구입하여 적절히 조정하여 사용하였다.

2'-O-메틸뉴클레오시드포스포라미디트를 사용하는 경우에는, 5'-O-디메톡시트리틸-6-N-벤조일-2'-O-메틸아데노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-2-N-이소부티릴-2'-O-메틸구아노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-4-N-아세틸-2'-O-메틸시티딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-메틸우리딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트를 Glen Research 에서 구입하여 적절히 조제하여 사용하였다.

리보뉴클레오시드포스포라미디트를 사용하는 경우에는, 5'-O-디메톡시트리틸-6-N-벤조일-2'-O-(tert-부틸디메틸실릴)아데노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-2-N-디메틸포름아미딘-2'-O-(tert-부틸디메틸실릴)구아노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-4-N-아세틸-2'-O-(tert-부틸디메틸실릴)시티딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-(tert-부틸디메틸실릴)우리딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트를 Proligo 사에서 구입하여 적절히 조제하여 사용하였다.

2'-O,4'-C-에틸렌뉴클레오시드포스포라미디트를 사용하는 경우에는, 일본 특허 제3420984호의 실시예 14 (5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-6-N-벤조일아데노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트), 실시예 27 (5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-2-N-이소부티릴구아노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트), 실시예 22 (5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-4-N-벤조일-5-메틸시티딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트), 실시예 9 (5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-5-메틸우리딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포라미디트) 의 화합물을 적절히 조제하여 사용하였다.

5'- 말단에 인산기 부분이 있는 경우에는, 포스파링크 (ABI 제조) 를 적절히 조제하여 사용하였다.

포스포라미디트는 적절히 핵산 자동 합성기에 부착하여 원하는 배열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 합성하였다. 고상 담체로서 원하는 뉴클레오시드가 결합된 CPG (콘트롤드 포아 글래스；어플라이드 바이오시스템 제조, 또는 Glen Research 제조) 0.5 μ㏖ 을 사용하여 표기의 폴리뉴클레오티드를 합성하였다. 핵산 자동 합성기의 최종 공정에서 산처리를 하지 않았다 (디메톡시트리틸기가 올리고뉴클레오티드 상에 결합되어 있다). 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, 암모니아수로 처리한 후, 역상 HPLC (시마즈 제작소 제조 LC-10VP, 칼럼 (Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6×100 mm)), A 용액 : 5 ％ 아세토니트릴, 0.1 M 아세트산트리에틸아민 수용액 (TEAA), pH 7.0, B 용액 : 아세토니트릴, B ％ : 10 ％ → 60 ％ (10 min, linear gradient)；60 ℃ ；2 ㎖/min；260 nm) 로 정제하여 디메톡시트리틸기를 갖는 목적물의 피크를 모았다. 물을 첨가하고 감압하 증류 제거함으로써, TEAA 를 제거하였다. 디메톡시트리틸기가 결합되어 있는 경우에는, 80 ％ 아세트산 수용액 (2 ㎖) 을 첨가하고 20 분 방치함으로써, 디메톡시트리틸기의 탈보호를 실시하였다. 용매를 증류 제거한 후, 잔류물을 500 ㎕ 의 물에 용해시키고, 아세트산에틸로 세정하여, 동결 건조 후, 목적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 얻었다. 또 필요에 따라, 7 M 우레아를 함유하는 20 ％ 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (1x TBE, 600 V, 4 시간) 으로 정제하였다. 전기 영동 후, UV 램프를 사용하여 밴드를 가시화하고, 나이프를 사용하여 밴드를 잘라내고, 1 ㎖ 의 0.2 M NaCl, 10 mM EDTA (pH 7.2) 의 용액을 첨가하고, 하룻밤 방치시켜, 폴리뉴클레오티드를 겔편으로부터 용출시켰다. 에탄올을 첨가하여 올리고뉴클레오티드를 침전시키고, 원심하여 회수하였다. 본 폴리뉴클레오티드의 분자량은 부 (負) 이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다

분자량：계산값：5767.86, 측정값：5767.78

염기 배열：인간 β-카테닌 유전자 (GenBank accession No. NM＿001904.3) 의 뉴클레오티드 번호 3139-3156 의 배열을 포함한다.

(실시예 1)

CT-437 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다.

참고예 1 과 동일하게 CT-437 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분에 이하와 같이 조제한 X 아미디트 시약을 커플링했다. 참고예 3 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 아세토니트릴：염화메틸렌 (1：1 v/v) 2 ㎖ 에 용해시키고, 2-cyanoethyl tetraisopropylphosphorodiamidite (74 ㎕, 0.23 m㏖), 1 H Tetrazole 0.45 M 아세토니트릴 용액 360 ㎕ 를 추가하고, 2 시간 교반했다. TLC 로 반응의 진행을 확인 후, 필터 여과를 실시하여, X 아미디트 시약을 조제했다. CT-437 의 구조를 도 6 에 나타낸다.

(실시예 2)

실시예 1 과 동일하게 CT-455 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 4 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-455 는 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-455 의 구조를 도 6 에 나타낸다.

(실시예 3)

실시예 1 과 동일하게 CT-456 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 5 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-456 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-456 의 구조를 도 6 에 나타낸다.

(실시예 4)

실시예 1 과 동일하게 CT-446 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 6 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-446 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-446 의 구조를 도 6 에 나타낸다.

(실시예 5)

실시예 1 과 동일하게 CT-447 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 7 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-447 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-447 의 구조를 도 6 에 나타낸다.

(실시예 6)

실시예 1 과 동일하게 CT-448 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 8 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-448 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-448 의 구조를 도 6 에 나타낸다.

(실시예 7)

실시예 1 과 동일하게 CT-449 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 9 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-449 는 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-449 의 구조를 도 6 에 나타낸다.

(실시예 8)

실시예 1 과 동일하게 CT-450 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 10 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-450 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-450 의 구조를 도 6 에 나타낸다.

(실시예 9)

실시예 1 과 동일하게 CT-451 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 11 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-451 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-451 의 구조를 도 6 에 나타낸다.

(실시예 10)

실시예 1 과 동일하게 CT-452 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 12 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-452 는 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-452 의 구조를 도 6 에 나타낸다.

(실시예 11)

실시예 1 과 동일하게 CT-453 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 13 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-453 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-453 의 구조를 도 6 에 나타낸다.

(실시예 12)

실시예 1 과 동일하게 CT-454 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 14 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-454 는 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-454 의 구조를 도 6 에 나타낸다.

(실시예 13)

실시예 1 과 동일하게 CT-460 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 17 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-460 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-460 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

(실시예 14)

실시예 1 과 동일하게 CT-461 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 21 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-461 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-461 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

(실시예 15)

실시예 1 과 동일하게 CT-462 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 22 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-462 는 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-462 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

(실시예 16)

실시예 1 과 동일하게 CT-463 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 23 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-463 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-463 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

(실시예 17)

실시예 1 과 동일하게 CT-464 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 26 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-464 는 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-464 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

(실시예 18)

실시예 1 과 동일하게 CT-465 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 24 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-465 는 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-465 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

(실시예 19)

실시예 1 과 동일하게 CT-466 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 25 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-466 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-466 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

(실시예 20)

실시예 1 과 동일하게 CT-467 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 27 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-467 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-467 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

(실시예 21)

실시예 1 과 동일하게 CT-468 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 28 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-468 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-468 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

(실시예 22)

실시예 1 과 동일하게 CT-469 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 29 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-469 는 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-469 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

(실시예 23)

실시예 1 과 동일하게 CT-470 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 30 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-470 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-470 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

(실시예 24)

실시예 1 과 동일하게 CT-471 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 31 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-471 은 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 2 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-471 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

(실시예 25)

실시예 1 과 동일하게 CT-472 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 14 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-472 는 배열표의 배열 번호 3 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 4 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-472 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

(실시예 26)

실시예 1 과 동일하게 CT-473 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 14 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

CT-473 은 배열표의 배열 번호 5 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 6 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. CT-473 의 구조를 도 7 에 나타낸다.

실시예 1 ∼ 16 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 X 부분의 구조와 분자량을 표 1 에 나타낸다. 표 중, X 의 말단의 메틸렌기는 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성하고, 페닐기에 결합되어 있는 산소 원자는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성한다.

실시예 17 ∼ 26 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 X 부분의 구조와 분자량을 표 2 에 나타낸다. 표 중, X 의 말단의 메틸렌기는 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성하고, 페닐기에 결합되어 있는 산소 원자는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성한다.

(참고예 2)

참고예 1 과 동일하게 CT-157 을 합성했다. CT-157 의 구조를 도 6 에 나타낸다.

염기 배열：인간 β-카테닌 유전자 (GenBank accession No. NM＿001904.3) 의 뉴클레오티드 번호 3139-3157 에 상보적인 배열을 포함한다.

(참고예 3)

6-(4,4'-dimethoxytrityloxy)hexanoic acid (722 ㎎, 1.67 m㏖, J. Org. Chem., 1995, 60, 3358-3364) 를 메틸렌클로라이드 2 ㎖ 에 용해하고, 4-아미노페놀 (200 ㎎, 1.84 m㏖), EDC (288 ㎎, 2.5 m㏖), HOBT (225 ㎎, 2.5 m㏖), 트리에틸아민 (260 ㎕) 을 첨가하고, 하룻밤 교반했다. 반응의 종결을 TLC 로 확인 후, 메틸렌클로라이드, 5 ％ 탄산수소나트륨 수용액으로 분액하고, 유기상을 포화 식염수로 세정했다. 유기상을 황산나트륨으로 건조 후, 용매를 감압하 농축했다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 (30 g, 2 ％ 메탄올/메틸렌클로라이드) 으로 정제하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (649 ㎎).

(참고예 4)

8-hydroxyoctanoic acid (100 ㎎, 0.59 m㏖) 를 피리딘 1.5 ㎖ 에 용해하고, 4,4'-dimethoxytrityl chloride (237 ㎎, 0.7 m㏖) 를 첨가하고, 하룻밤 교반했다. 반응의 종결을 TLC 로 확인 후, 메틸렌클로라이드, 물로 분액하고, 유기상을 황산나트륨으로 건조 후, 용매를 감압하 농축했다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 (4 g, 메틸렌클로라이드) 으로 정제하여, 아모르퍼스상의 8-(4,4'-dimethoxytrityloxy)octanoic acid 를 얻었다 (348 ㎎). 얻어진 8-(4,4'-dimethoxytrityloxy)octanoic acid 를 메틸렌클로라이드 1 ㎖ 에 용해하고, 4-아미노페놀 (70.9 ㎎, 0.64 m㏖), EDC (101.6 ㎎, 0.88 m㏖), HOBT (79 ㎎, 0.886 m㏖), 트리에틸아민 (92 ㎕) 을 첨가하고, 하룻밤 교반했다. 반응의 종결을 TLC 로 확인 후, 실리카 겔 칼럼 (5 g, 30 ％ → 50 ％ 아세트산에틸/n-헥산) 으로 정제하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (148 ㎎).

(참고예 5)

10-(4,4'-dimethoxytrityloxy)decanoic acid (0.707 g, 1.19 m㏖, Tetrahedron Letters, 1994, 35, 2353-2356) 을 메틸렌클로라이드 2 ㎖ 에 용해하고, 4-아미노페놀 (141.8 ㎎, 1.28 m㏖), EDC (203 ㎎, 1.76 m㏖), HOBT (158 ㎎, 1.76 m㏖), 트리에틸아민 (183 ㎕) 을 첨가하고, 하룻밤 교반했다. 반응의 종결을 TLC 로 확인 후, 실리카 겔 칼럼 (7.5 g, 30 ％ → 50 ％ 아세트산에틸/n-헥산) 으로 정제하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (485 ㎎).

(참고예 6)

4-아미노-1-부탄올 (160.45 ㎎, 1.8 m㏖), 4-하이드록시벤조산 (207.18 ㎎, 1.5 m㏖) 에 대해, EDC (383 ㎎, 2 m㏖), HOBT (67.5 ㎎, 0.5 m㏖) 가 메틸렌클로라이드 3 ㎖ 에 용해된 용액을 첨가하고, 추가로 트리에틸아민 (260 ㎕) 을 첨가하여, 하룻밤 진탕했다. 반응의 종결을 TLC 로 확인 후, 실리카 겔 칼럼 (5 g, 메틸렌클로라이드 → 아세트산에틸로 용출) 으로 정제하여, 오일상의 아미드 화합물을 얻었다 (0.20 g). 이것을 피리딘 1.5 ㎖ 에 용해하고, 4,4'-dimethoxytrityl chloride (500 ㎎, 1.5 m㏖) 를 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반했다. 반응의 종결을 TLC 로 확인 후, 메탄올 0.5 ㎖ 를 첨가하고, 아세트산에틸, 5 ％ 탄산수소나트륨 수용액으로 분액하고, 유기상의 용매를 감압하 농축했다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 (10 g, 40 ％ → 50 ％ 아세트산에틸/n-헥산) 으로 정제하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (325 ㎎).

(참고예 7)

6-아미노-1-헥산올 (210.94 ㎎, 1.8 m㏖), 4-하이드록시벤조산 (207.18 ㎎, 1.5 m㏖) 을 사용해서 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (445 ㎎).

(참고예 8)

8-아미노-1-옥탄올 (261.43 ㎎, 1.8 m㏖), 4-하이드록시벤조산 (207.18 ㎎, 1.5 m㏖) 을 사용해서 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (486 ㎎).

(참고예 9)

4-아미노-1-부탄올 (160.45 ㎎, 1.8 m㏖), 3-하이드록시벤조산 (207.18 ㎎, 1.5 m㏖) 을 사용해서 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (566 ㎎).

(참고예 10)

6-아미노-1-헥산올 (210.94 ㎎, 1.8 m㏖), 3-하이드록시벤조산 (207.18 ㎎, 1.5 m㏖) 을 사용해서 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (580 ㎎).

(참고예 11)

8-아미노-1-옥탄올 (261.43 ㎎, 1.8 m㏖), 3-하이드록시벤조산 (207.18 ㎎, 1.5 m㏖) 을 사용해서 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (675 ㎎).

(참고예 12)

4-아미노-1-부탄올 (160.45 ㎎, 1.8 m㏖), 3-(4-하이드록시페닐)프로피온산 (249.26 ㎎, 1.5 m㏖) 을 사용해서 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (540 ㎎).

(참고예 13)

6-아미노-1-헥산올 (210.94 ㎎, 1.8 m㏖), 3-(4-하이드록시페닐)프로피온산 (249.26 ㎎, 1.5 m㏖) 을 사용해서 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (559 ㎎).

(참고예 14)

8-아미노-1-옥탄올 (261.43 ㎎, 1.8 m㏖), 3-(4-하이드록시페닐)프로피온산 (249.26 ㎎, 1.5 m㏖) 을 사용하여 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 엿상의 화합물을 얻었다 (720 ㎎).

(참고예 15)

N-(4-methoxytrityl)-L-tyrosine ethyl ester

L-티로신 에틸 (418 ㎎, 2 m㏖) 을 피리딘 5 ㎖ 에 용해하고, 4-methoxytrityl chloride (741 ㎎, 2.4 m㏖) 를 첨가하고, 실온에서 5 시간 교반했다. 반응의 종결을 TLC 로 확인 후, 아세트산에틸, 5 ％ 탄산수소나트륨 수용액으로 분액하고, 유기상을 황산나트륨으로 건조 후, 용매를 감압하 농축했다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 (30 g, 30 ％ 아세트산에틸/n-헥산) 으로 정제하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (687 ㎎).

(참고예 16)

3-(4-methoxytrityloxy)-2-acetylamino-propionic acid (Ac-Ser(MMTr)-OH)

N-아세틸-D,L-세린 (1.775 g, 12 m㏖) 을 피리딘 20 ㎖ 에 용해하고, 4-methoxytrityl chloride (4.1 g, 13.2 m㏖) 를 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응의 종결을 TLC 로 확인 후, 아세트산에틸, 5 ％ 탄산수소나트륨 수용액으로 분액하고, 유기상을 황산나트륨으로 건조 후, 용매를 감압하 농축했다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 (120 g, 30 ％ 아세톤/n-헥산) 으로 정제하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (3.93 g).

(참고예 17)

Ac-Ser(MMTr)-Tyr-OEt

참고예 16 의 화합물 (629 ㎎, 1.5 m㏖ Ac-Ser(MMTr)-OH) 을 메틸렌클로라이드 3 ㎖ 에 용해하고, L-티로신 에틸 (334 ㎎, 1.6 m㏖), EDC (383 ㎎, 2 m㏖), HOBT (67.5 ㎎, 0.5 m㏖), 트리에틸아민 (260 ㎕) 을 첨가하고, 4 시간 교반했다. 반응액을 실리카 겔 칼럼 (15 g, 40 ％ → 50 ％ 아세트산에틸/n-헥산) 으로 정제하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (460 ㎎).

(참고예 18)

t-Boc-βAla-Tyr-OEt

N-t-Boc-β-Alanine (283 ㎎, 1.5 m㏖, t-Boc-βAla-OH), L-티로신 에틸 (376 ㎎, 1.8 m㏖, H-Tyr-OEt) 을 사용해서 참고예 17 과 동일하게 합성하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (497 ㎎).

(참고예 19)

t-Boc-Ala-Tyr-OEt

N-t-Boc-Alanine (283 ㎎, 1.5 m㏖, t-Boc-Ala-OH), L-티로신 에틸 (376 ㎎, 1.8 m㏖) 을 사용해서 참고예 17 과 동일하게 합성하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (490 ㎎).

(참고예 20)

t-Boc-Gly-Tyr-OEt

N-t-Boc-Glycine (263 ㎎, 1.5 m㏖), L-티로신 에틸 (376 ㎎, 1.8 m㏖) 을 사용해서 참고예 17 과 동일하게 합성하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (434 ㎎).

(참고예 21)

Ac-Ser(MMTr)-βAla-Tyr-OEt

참고예 18 에서 취득된 화합물 (490 ㎎, 1.29 m㏖) 을 메틸렌클로라이드 4 ㎖ 에 용해하고, TFA 4 ㎖ 를 첨가하고, 실온에서 15 분 방치 후, 용매를 감압하 농축했다. 잔류물을 메틸렌클로라이드 3 ㎖, 트리에틸아민 (260 ㎕) 에 용해하고, 참고예 16 에서 취득된 화합물 (544 ㎎, 1.3 m㏖), EDC (383 ㎎, 2 m㏖), HOBT (67.5 ㎎, 0.5 m㏖), 트리에틸아민 (260 ㎕) 을 첨가하고, 하룻밤 교반했다. 반응액을 실리카 겔 칼럼 (20 g, 80 ％ 아세트산에틸/n-헥산 → 아세트산에틸) 으로 정제하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (469 ㎎).

(참고예 22)

Ac-Ser(MMTr)-Ala-Tyr-OEt

참고예 19 의 화합물 (485 ㎎, 1.26 m㏖), 참고예 16 에서 취득된 화합물 (544 ㎎, 1.3 m㏖) 을 사용하여 참고예 21 과 동일하게 합성하여, 백색 고체의 화합물을 얻었다 (448 ㎎).

(참고예 23)

Ac-Ser(MMTr)-Gly-Tyr-OEt

참고예 20 에서 취득된 화합물 (430 ㎎, 1.17 m㏖), 참고예 16 에서 취득된 화합물 (544 ㎎, 1.3 m㏖) 을 사용하여 참고예 21 과 동일하게 합성하여, 백색 고체의 화합물을 얻었다 (486 ㎎).

(참고예 24)

10-아미노-1-데칸올 (260 ㎎, 1.5 m㏖), 4-하이드록시벤조산 (299 ㎎, 1.8 m㏖) 을 사용해서 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (568 ㎎).

(참고예 25)

10-아미노-1-데칸올 (260 ㎎, 1.5 m㏖), 3-(4-하이드록시페닐)프로피온산 (249 ㎎, 1.8 m㏖) 을 사용하여 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 엿상의 화합물을 얻었다 (411 ㎎).

(참고예 26)

8-아미노-1-옥탄올 (218 ㎎, 1.5 m㏖), (4-하이드록시페녹시)아세트산 (303 ㎎, 1.8 m㏖) 을 사용하여 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 엿상의 화합물을 얻었다 (489 ㎎).

(참고예 27)

10-아미노-1-데칸올 (260 ㎎, 1.5 m㏖), (4-하이드록시페녹시)아세트산 (303 ㎎, 1.8 m㏖) 을 사용하여 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 엿상의 화합물을 얻었다 (579 ㎎).

(참고예 28)

(PEO)₃-mono-amine (CHEM-IPEX INTERNATIONAL, 224 ㎎, 1.5 m㏖), 4-하이드록시벤조산 (299 ㎎, 1.8 m㏖) 을 사용해서 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (520 ㎎).

(참고예 29)

(PEO)₃-mono-amine (CHEM-IPEX INTERNATIONAL, 224 ㎎, 1.5 m㏖), 3-(4-하이드록시페닐)프로피온산 (249 ㎎, 1.8 m㏖) 을 사용하여 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 엿상의 화합물을 얻었다 (543 ㎎).

(참고예 30)

(PEO)₃-mono-amine (CHEM-IPEX INTERNATIONAL, 224 ㎎, 1.5 m㏖), (4-하이드록시페녹시)아세트산 (303 ㎎, 1.8 m㏖) 을 사용하여 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 엿상의 화합물을 얻었다 (471 ㎎).

(참고예 31)

8-아미노-1-옥탄올 (218 ㎎, 1.5 m㏖), N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-티로신 (N-Fmoc-L-티로신, 726 ㎎, 1.8 m㏖) 을 사용해서 참고예 6 과 동일하게 합성하여, 아모르퍼스상의 화합물을 얻었다 (358 ㎎).

(참고예 32)

참고예 1 과 동일하게 CT-106 을 합성했다. 단, 목적 배열을 갖는 보호된 폴리뉴클레오티드 유연체를 암모니아수：에탄올 용액 (3：1 v/v) 2 ㎖ 로 55 ℃, 16 시간 처리함으로써 올리고머를 지지체로부터 잘라냄과 함께, 인산기의 보호기인 시아노에틸기와 핵산 염기상의 보호기를 떼어냈다. CPG 를 여과하여 제거하고, 에탄올로 세정하고, 여과액과 세액과 합하여, 용매를 감압하 증류 제거했다. 남은 잔류물에 Triethylamine trihydrofluoride 를 0.3 ㎖ 첨가하고, 실온에서 19 시간 방치 후, 정제했다. CT-106 의 구조를 도 13 에 나타낸다.

분자량：계산값：6727.16, 측정값：6726.73

염기 배열：인간 β-카테닌 유전자 (GenBank accession No. NM＿001904.3) 의 뉴클레오티드 번호 3139-3157 의 배열을 포함한다.

(참고예 33)

참고예 32 와 동일하게 CT-041 을 합성했다. CT-041 의 구조를 도 13 에 나타낸다.

분자량：계산값：6565.88, 측정값：6565.34

(참고예 34) CT-001

참고예 32 와 동일하게 CT-001 을 합성했다. CT-001 의 구조를 도 13 에 나타낸다.

분자량：계산값：6849.46, 측정값：6850.8

(참고예 35) CT-005

참고예 32 와 동일하게 CT-005 를 합성했다. CT-005 의 구조를 도 13 에 나타낸다.

분자량：계산값：6702.20, 측정값：6702.2

참고예 3 ∼ 14, 17 및 21 ∼ 23 에 기재된 화합물의 구조를 도 5 에 나타내고, 참고예 24 ∼ 31 에 기재된 화합물의 구조를 도 10 에 나타낸다.

(실시예 27) 2 개 사슬 구조 형성을 위한 어닐링

상기 참고예 1 및 참고예 2 의 조합으로, 센스 사슬 및 안티센스 사슬을 300 p㏖ 씩 1 개의 튜브에 넣어, 감압하 건조시키고, 30 ㎕ 의 siRNA suspension buffer (QIAGEN) 를 첨가하여, 65 ℃, 1 분간 가온한 후, 실온에 5 분간 방치하고, 센스 사슬 및 안티센스 사슬을 어닐링시켜, 10 μM 의 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드 용액을 얻었다.

2 개 사슬 폴리뉴클레오티드는 센스 사슬, 안티센스 사슬의 조합만으로 나타내는 경우도 있다. 즉, 예를 들어, CT-169/CT-157 의 조합으로 이루어지는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드는 간단히 「CT169/CT157」 또는 「CT169/157」 으로도 표기한다.

본 방법에 의해, 도 6 및 7 에 나타내는, 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드 및 안티센스 사슬의 5' 와 센스 사슬의 3' 가 인산디에스테르 결합을 통해 링커로 결합되어 있는 3L5-폴리뉴클레오티드를 취득할 수 있다.

(시험예 1)

이하와 같이 1 개 사슬 또는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드에 의한 인간 β-카테닌 유전자 발현 억제 활성의 강도를 비교했다.

(1) 트랜스펙션

인간 대장암 SW480 세포주 (인간 대장선암 유래) 를, 10 ％ Fetal bovine serum 을 포함하는 RPMI1640 배지 (Invitrogen 사 제조) 중에 100000 cells/㎖ 의 농도로 조제했다. 그리고, 12 구멍 평저 플레이트 (Corning 사 제조) 에 1 ㎖ 씩 파종하고, 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에서 1 일간 배양했다. 리포펙션 시약 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen 사 제조) 를 7.5 ㎕, 1 개 사슬 또는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드 용액을 최종 농도가 0.3, 0.03, 및 0.003 nM 이 되도록 OPTI-MEM 배지 중에서 혼합하고, 20 분 실온에서 가만히 정지시켰다. 각 웰에 혼합액을 첨가하고, 추가로 3 일간 배양을 계속했다.

(2) 리얼 타임 PCR

트랜스펙션 후, 웰로부터 배양 상청을 제거하여, RNeasy Mini kit (QIAGEN 사 제조) 에서 mRNA 를 추출했다. 얻어진 mRNA 를 iScript^TMcDNA Synthesis kit (QIAGEN 사 제조) 에서 설명서의 기재에 따라 0.5 ㎍ RNA 로부터 cDNA 를 조제했다. 다음으로, 리얼 타임 PCR 을 위해서 인간 β-카테닌 유전자 PCR 프라이머 (primer set ID：HA135664, 다카라 바이오사 제조), 내부 표준으로서 사람-GAPDH 유전자에 대한 PCR 프라이머 (primer set ID：HA067812, 다카라 바이오사 제조) 및 PCR 에 필요한 약제를 포함하는 리얼 타임 PCR 키트 (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여 다음과 같이 mRNA 의 정량을 실시했다.

β 카테닌 유전자 ID：HA135664

포워드 프라이머 5'-TCTGAGGACAAGCCACAAGATTACA-3' (배열 번호 11)

리버스 프라이머 5'-TGGGCACCAATATCAAGTCCAA-3' (배열 번호 12)

GAPDH 유전자 ID：HA067812

포워드 프라이머 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3' (배열 번호 13)

리버스 프라이머 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3' (배열 번호 14)

96 구멍 PCR 플레이트 (Applied Biosystems 사 제조) 1 웰당, 리얼 타임 PCR 키트에 포함되는 2×QuantiTect SYBR GREEN PCR Master Mix 를 25 ㎕, RNase-Free Water 를 18 ㎕, 각 PCR 프라이머를 5 ㎕ (최종 농도 0.3 μM), 조제한 cDNA 용액을 2 ㎕ 첨가하여 총량을 50 ㎕ 로 하고, Mx3000P (STRATAGENE 사 제조) 에 세트하여, 이하의 조건으로 PCR 을 실시했다.

PCR 초기 활성화 95 ℃, 15 분간

PCR 94 ℃, 15초간

56 ℃, 30초

72 ℃, 30초

이 PCR 사이클은 40 회 반복했다. 검량선은 리포펙션 시약만으로 처리한 세포 (=NC) 에서 추출한 mRNA 로부터 조제한 cDNA 5 배 희석한 것을 사용하였다. 검량선을 바탕으로, 각 트랜스펙턴트의 인간 β-카테닌과 인간 GAPDH 를 정량하고, 인간 β-카테닌 유전자량을 인간 GAPDH 량으로 나눈 상대량을 그래프에 플롯했다. 리얼 타임 PCR 은 N = 2 로 실시하고, 그래프에는 그 평균을 나타냈다 (폴리뉴클레오티드의 구조 및 그 뉴클레오티드 배열은 도 6 및 도 7 에 나타내고 있다).

(3) 리얼 타임 PCR 해석

(a) 유전자 억제 활성 해석 1

CT-169/CT-157, CT-437, CT-455, CT-456, CT-446, CT-447, CT-448, CT-449, CT-450, CT-451, CT-452, CT-453, CT-454, 및, CT-461 (구조는 도 6 및 도 7 참조) 의 β-카테닌 유전자 발현 억제 활성을 조사했다.

도 8 에 나타내는 바와 같이, CT-437, CT-455, CT-456, CT-446, CT-447, CT-448, CT-449, CT-450, CT-451, CT-452, CT-453, CT-454, 및, CT-461 은 CT-169/CT-157 과 동일하게 β-카테닌 유전자의 발현을 강하게 억제했다. CT-448 및 CT-454 는 CT-169/CT-157 보다 강한 활성을 나타냈다. 이것은, 안티센스 사슬 5' 말단과 센스 사슬 3' 말단을 수식 페닐기를 사용하여 인산기를 통해 결합한 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드가 강한 유전자의 발현 억제 활성을 갖는 것을 나타낸다.

(시험예 2)

시험예 1 과 동일하게 1 개 사슬 또는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드에 의한 인간 β-카테닌 유전자 발현 억제 활성의 강도를 비교했다.

리얼 타임 PCR 해석

a) 유전자 억제 활성 해석 1

CT-169/CT-157, CT-460, CT-461, CT-462, 및, CT-463 (구조는 도 7 참조) 의 β-카테닌 유전자 발현 억제 활성을 조사했다.

도 9 에 나타내는 바와 같이, CT-460, CT-461, CT-462, 및, CT-463 은 CT-169/CT-157 보다 β-카테닌 유전자의 발현을 강하게 억제했다. 이것은, 안티센스 사슬 5' 말단과 센스 사슬 3' 말단을 수식 페닐기를 사용하여 인산기를 통해 결합한 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드가 강한 유전자의 발현 억제 활성을 갖는 것을 나타낸다.

(시험예 3)

1 개 사슬 또는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드에 의한 인간 β-카테닌 유전자 발현 억제 활성의 강도를 비교했다.

(1) 트랜스펙션

인간 대장암 SW480 세포주 (인간 대장선암 유래) 를, 10 ％ Fetal bovine serum 을 포함하는 RPMI1640 배지 (Invitrogen 사 제조) 중에 100000 cells/㎖ 의 농도로 조제했다. 그리고, 12 구멍 평저 플레이트 (Corning 사 제조) 에 1 ㎖ 씩 파종했다. 다음으로, 리포펙션 시약 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen 사 제조) 를 7.5 ㎕, 1 개 사슬 또는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드 용액을 최종 농도가 0.3, 0.03, 및 0.003 nM 이 되도록 OPTI-MEM 배지 중에서 혼합하고, 20 분 실온에서 가만히 정지시켰다. 각 웰에 혼합액을 첨가하고, 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하 3 일간 배양을 계속했다.

(2) 리얼 타임 PCR

시험예 1 과 동일한 방법으로 실시했다.

(3) 리얼 타임 PCR 해석

a) 유전자 억제 활성 해석 1

CT-169/CT-157, CT-448, CT-454, CT-464, CT-465, CT-466, CT-467, CT-468, CT-469, CT-470, 및, CT-471 (구조는 도 11 참조) 의 β-카테닌 유전자 발현 억제 활성을 조사했다.

도 12 에 나타내는 바와 같이, CT-470 은 CT-169/CT-157 과 마찬가지로 β-카테닌 유전자의 발현을 강하게 억제했다. CT-448, CT-454, CT-464, CT-465, CT-466, CT-467, CT-468, CT-469, 및, CT-471 은 CT-169/CT-157 보다 강한 활성을 나타냈다. 이것은, 안티센스 사슬 5' 말단과 센스 사슬 3' 말단을 수식 페닐기를 사용하여 인산기를 통해 결합한 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드가 강한 유전자의 발현 억제 활성을 갖는 것을 나타낸다.

b) 유전자 억제 활성 해석 2

CT-106/CT-041, 및, CT-472 (구조는 도 13 참조) 의 β-카테닌 유전자 발현 억제 활성을 조사했다.

도 14 에 나타내는 바와 같이, CT-472 는 CT-106/CT-041 과 동일하게 β-카테닌 유전자의 발현을 강하게 억제했다. 이것은, 안티센스 사슬 5' 말단과 센스 사슬 3' 말단을 수식 페닐기를 사용하여 인산기를 통해 결합한 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드가 강한 유전자의 발현 억제 활성을 갖는 것을 나타낸다.

c) 유전자 억제 활성 해석 4

CT-001/CT-005, 및, CT-473 (구조는 도 13 참조) 의 β-카테닌 유전자 발현 억제 활성을 조사했다.

도 14 에 나타내는 바와 같이, CT-473 은 CT-001/CT-005 보다 β-카테닌 유전자의 발현을 강하게 억제했다. 이것은, 안티센스 사슬 5' 말단과 센스 사슬 3' 말단을 수식 페닐기를 사용하여 인산기를 통해 결합한 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드가 강한 유전자의 발현 억제 활성을 갖는 것을 나타낸다.

(실시예 27)

실시예 1 과 동일하게 PK-009 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 14 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

PK-009 는 배열표의 배열 번호 17 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 18 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. PK-009 의 구조를 도 15 에 나타낸다.

(실시예 28)

실시예 1 과 동일하게 HS-005 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 14 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

HS-005 는 배열표의 배열 번호 23 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 24 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. HS-005 의 구조를 도 16 에 나타낸다.

(실시예 29)

실시예 1 과 동일하게 HS-006 을 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 14 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

HS-006 은 배열표의 배열 번호 25 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 26 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. HS-006 의 구조를 도 16 에 나타낸다.

(실시예 30)

실시예 1 과 동일하게 HS-005 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 14 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, 포스포로티오에이트 결합 부분은 0.2 M 페닐아세틸디술파이드/피리딘-아세토니트릴 (1：1 v/v) 용액 3 분간 처리함으로써 조제했다.

HS-005s 는 배열표의 배열 번호 27 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 28 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. HS-005s 의 구조를 도 16 에 나타낸다.

(실시예 31)

실시예 1 과 동일하게 HS-006s 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 14 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, 포스포로티오에이트 결합 부분은 0.2 M 페닐아세틸디술파이드/피리딘-아세토니트릴 (1：1 v/v) 용액 3 분간 처리함으로써 조제했다.

HS-006s 는 배열표의 배열 번호 29 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 30 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. HS-006s 의 구조를 도 16 에 나타낸다.

(실시예 32)

실시예 1 과 동일하게 HS-012 를 합성했다. 본 폴리뉴클레오티드에 있어서는, X 부분의 아미디트 시약은 참고예 14 에서 취득된 화합물 (20 ㎎) 을 사용하여 조제했다.

HS-012 는 배열표의 배열 번호 33 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드와 배열 번호 34 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드가 X 와의 인산디에스테르 결합을 통해 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. HS-012 의 구조를 도 19 에 나타낸다.

실시예 27 ∼ 32 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 X 부분의 구조와 분자량을 표 3 에 나타낸다. 표 중, X 의 말단의 메틸렌기는 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성하고, 페닐기에 결합되어 있는 산소 원자는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성한다.

(참고예 36)

참고예 32 와 동일하게 PK-001 을 합성했다. PK-001 의 구조를 도 15 에 나타낸다.

분자량：계산값：6658.04, 측정값：6658.23

염기 배열：RNA-dependent protein kinase 유전자 (GenBank accession No. NM＿011163) 의 뉴클레오티드 번호 743-762 의 배열을 포함한다.

(참고예 37)

참고예 32 와 동일하게 PK-002 를 합성했다. PK-002 의 구조를 도 15 에 나타낸다.

분자량：계산값：6674.04, 측정값：6673.91

염기 배열：RNA-dependent protein kinase 유전자 (GenBank accession No. NM＿011163) 의 뉴클레오티드 번호 743-762 에 상보적인 배열을 포함한다.

(참고예 38)

참고예 32 와 동일하게 HS-001 의 센스 사슬을 합성했다. HS-001 의 센스 사슬의 구조를 도 16 에 나타낸다.

분자량：계산값：6710.12, 측정값：6710.37

염기 배열：heat shock protein 47 유전자 (GenBank accession No. NM＿001235) 의 뉴클레오티드 번호 1601-1619 의 배열을 포함한다.

(참고예 39)

참고예 32 와 동일하게 HS-001 의 센스 사슬을 합성했다. HS-001 의 안티센스 사슬의 구조를 도 16 에 나타낸다.

분자량：계산값：6590.04, 측정값：6589.88

염기 배열：heat shock protein 47 유전자 (GenBank accession No. NM＿001235) 의 뉴클레오티드 번호 1601-1619 에 상보적인 배열을 포함한다.

(참고예 40)

분자량：계산값：6733.16, 측정값：6733.22

염기 배열：heat shock protein 47 유전자 (GenBank accession No. NM＿001235) 의 뉴클레오티드 번호 1602-1619 의 배열을 포함한다.

(참고예 41)

분자량：계산값：6567.00, 측정값：6566.99

염기 배열：heat shock protein 47 유전자 (GenBank accession No. NM＿001235) 의 뉴클레오티드 번호 1602-1619 에 상보적인 배열을 포함한다.

(시험예 4)

1 개 사슬 또는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드에 의한 마우스 PKR (Eif2ak2) 유전자 발현 억제 활성 측정법을 나타낸다.

Mouse embryonic fibroblast 에 리포펙션 시약 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen 사 제조) 을 사용하여 도 15 에 기재된 1 개 사슬 또는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있다.

트랜스펙션 24 내지 48 시간 후에, 세포로부터 RNeasy Mini Kit (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여 전체 RNA 를 추출하고, mRNA 를 Super ScriptIII First-Strand Synthesis Super Mix for qRT-PCR (Invitrogen 사 제조) 를 사용하여 cDNA 에 역전사한다. SYBR Green 을 사용한 정량적 PCR 시스템 (Applied Biosystems) 에 의해 PKR 유전자, 내부 표준으로서 36B4 유전자의 발현량을 측정한다. 프라이머는 참고 문헌 (Nakamura T, et al., Cell, 140, 338-348 (2010)) 에 따라, PKR：5'-AAAACAAGGTGGATTGTCACACG-3' 와 5'-GTTGGGCTCACACTGTTCATAAT-3', 36B4：5'-CACTGGTCTAGGACCCGAGAA-3' 와 5'-AGGGGGAGATGTTCAGCATGT-3' 를 사용한다. 각 샘플의 PKR mRNA 양을 동일한 샘플의 36B4 mRNA 양으로 나눔으로써 보정하고, 1 개 사슬 또는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드에 의한 상대적인 유전자 억제의 강도를 측정할 수 있다.

(시험예 5)

이하와 같이 1 개 사슬 또는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드에 의한 래트 Hsp47 (Serpinh1) 유전자 발현 억제 활성을 측정했다.

(1) 트랜스펙션

12 구멍 평저 플레이트 (스미토모 베이크라이트사 제조) 에 200 ㎕ 의 OPTI-MEM 배지 (Invitrogen 사 제조) 와 1 개 사슬 또는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드 용액 (최종 농도 1 및 0.1 nM) 을 추가했다. 네거티브 컨트롤로서 Qiagen 사로부터 구입한 AllStars Negative Control siRNA 를 사용하였다. 거기에 리포펙션 시약 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen 사 제조) 를 1.2 ㎕ 추가해서 혼합하여 10 분간 내지 20 분간 실온에서 가만히 정지시켰다. 그 동안에 래트 NRK-52E 세포주를, 10 ％ Fetal bovine serum 을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen 사 제조) 중에 62500 cells/㎖ 의 농도로 조제했다. 그리고, 리포솜 - 폴리뉴클레오티드 희석액이 들어간 플레이트의 각 웰에 1 ㎖ 씩 파종하고, 37 ℃, 5 ％ 이산화탄소 조건하에 있어서 배양했다.

(2) 리얼 타임 PCR

트랜스펙션 27 시간 후, 세포로부터 RNeasy Mini Kit (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여 전체 RNA 를 추출했다. Hsp47 mRNA 레벨은 SuperScriptIII First-Strand Synthesis Super Mix for qRT-PCR (Invitrogen 사 제조) 을 사용하여 cDNA 에 역전사한 후 TaqMan 프로브를 사용한 정량적 PCR 에 의해 측정했다. Hsp47 유전자에 대한 프라이머, 프로브는 TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems 사 제조 Assay ID Rn00567777＿m1) 를 사용하였다. TaqMan 반응은 ABI Prism 7900HT Sequence detection system (Applied Biosystems 사 제조) 을 사용하여 실시했다. 내부 표준으로서 동일한 샘플의 ribosomal RNA (rRNA) 의 발현 레벨을 측정했다. rRNA 측정의 프라이머, 프로브에는 TaqMan Ribosomal RNA Control Reagents VIC^TM Probe (Applied Biosystems 사 제조, 카탈로그 번호：4308329) 를 사용하였다.

각 샘플의 Hsp47 mRNA 양을 rRNA 양으로 나누고, 트랜스펙션 시약만을 첨가하여 폴리뉴클레오티드를 첨가하지 않은 세포의 값을 1 로 하여 상대량을 도 17 에 플롯했다 (도면 중, AllStars Negative Control siRNA (카탈로그 번호：1027280) 를 사용한 경우에는, nagtive si 로 표기했다). 도 17 은 독립된 3 회의 실험 결과의 평균과 그 S. D. 값을 나타냈다 (폴리뉴클레오티드의 구조 및 그 뉴클레오티드 배열은 도 16 에 나타내고 있다).

(2) 리얼 타임 PCR 해석

(a) 유전자 억제 활성 해석 1

2 개 사슬 폴리뉴클레오티드 HS-001, 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드 HS-002, 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드 HS-005, 및, 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드 HS-006 (구조는 도 16 참조) 의 래트 Hsp47 유전자 발현 억제 활성을 조사했다.

도 17 에 나타내는 바와 같이, HS-005 는 HS-001 보다 래트 Hsp47 유전자의 발현을 강하게 억제하고, HS-006 은 HS-002 보다 래트 Hsp47 유전자의 발현을 강하게 억제했다. 이 때, AllStars Negative Control siRNA 는 Hsp47 유전자의 억제 활성을 나타내지 않았다. 이것은, 안티센스 사슬 5' 말단과 센스 사슬 3' 말단을 수식 페닐기를 사용하여 인산기를 통해 결합한 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드가 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드보다 강한 유전자의 발현 억제 활성을 갖는 것을 나타낸다.

(시험예 6)

1 개 사슬 또는 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드에 의한 래트 Hsp47 (Serpinh1) 유전자 발현 억제 활성을 측정했다.

(1) 트랜스펙션

2 개 사슬 폴리뉴클레오티드인 HS-001, HS-002, 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드 HS-005s, 및, HS-006s (구조는 도 16 참조) 를 사용하여, 시험예 5 와 동일하게 실시했다. 단, NRK-52E 세포에 대한 핵산의 도입은 24 구멍 평저 플레이트 (스미토모 베이크라이트사 제조) 를 사용하여 시험예 5 의 절반 양의 계에서 실시했다.

(2) 리얼 타임 PCR

시험예 5 와 동일하게 실시했다.

(a) 유전자 억제 활성 해석 1

2 개 사슬 폴리뉴클레오티드인 HS-001, HS-002, 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드 HS-005s, 및, HS-006s 의 래트 Hsp47 유전자 발현 억제 활성을 조사했다.

도 18 에 나타내는 바와 같이, HS-005s 및 HS-006s 는, HS-001, 및 HS-002 와 비교하여, 동등 또는 그 이상으로 래트 Hsp47 유전자의 발현을 강하게 억제했다. 이것은, 안티센스 사슬 5' 말단과 센스 사슬 3' 말단을 수식 페닐기를 사용하여 인산기를 통해 결합한 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드가 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드보다 강한 유전자의 발현 억제 활성을 갖는 것을 나타낸다.

(시험예 7)

(1) 트랜스펙션

국제 공개 제2011/072082 에 기재된 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드인 siHSP47C (배열표의 배열 번호 31 및 32, 구조는 도 19 참조), 및, 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드 HS-012 (구조는 도 19 참조) 를 사용하여, 시험예 6 과 동일하게 실시했다.

siHSP47C 센스 사슬 5'-GGACAGGCCUCUACAACUATT-3' (배열 번호 31)

siHSP47C 안티센스 사슬 5'-UAGUUGUAGAGGCCUGUCCTT-3' (배열 번호 32)

(2) 리얼 타임 PCR

시험예 5 와 동일하게 실시했다.

(a) 유전자 억제 활성 해석 1

2 개 사슬 폴리뉴클레오티드인 siHSP47C, 및, 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드 HS-012 의 래트 Hsp47 유전자 발현 억제 활성을 조사했다.

도 20 에 나타내는 바와 같이, HS-012 는 siHSP47C 와 비교하여, 동등 또는 그 이상으로 래트 Hsp47 유전자의 발현을 강하게 억제했다. 이것은, 안티센스 사슬 5' 말단과 센스 사슬 3' 말단을 수식 페닐기를 사용하여 인산기를 통해 결합한 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드가 2 개 사슬 폴리뉴클레오티드보다 강한 유전자의 발현 억제 활성을 갖는 것을 나타낸다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의해, RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있었다. 또, 본 발명에 의해, RNA 분해 효소에 대해 안정적이고, RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있었다.

그 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드는 유전자의 기능 해석, 의약품 등에 이용하는 것이 가능하지만, 본 1 개 사슬 폴리뉴클레오티드를 이용할 수 있는 한에 있어서 그 산업 분야는 제한되지 않는다.

배열 번호 1：CT-169

배열 번호 2：CT-157

배열 번호 3：CT-472 의 센스 사슬 영역

배열 번호 4：CT-472 의 안티센스 사슬 영역

배열 번호 5：CT-473 의 센스 사슬 영역

배열 번호 6：CT-473 의 안티센스 사슬 영역

배열 번호 7：CT-106

배열 번호 8：CT-041

배열 번호 9：CT-001

배열 번호 10：CT-005

배열 번호 11：β 카테닌 유전자 포워드 프라이머

배열 번호 12：β 카테닌 유전자 리버스 프라이머

배열 번호 13：GAPDH 유전자 포워드 프라이머

배열 번호 14：GAPDH 유전자 리버스 프라이머

배열 번호 15：PK-001

배열 번호 16：PK-002

배열 번호 17：PK-009 의 센스 사슬 영역

배열 번호 18：PK-009 의 안티센스 사슬 영역

배열 번호 19：HS-001 의 센스 사슬

배열 번호 20：HS-001 의 안티센스 사슬

배열 번호 21：HS-002 의 센스 사슬

배열 번호 22：HS-002 의 안티센스 사슬

배열 번호 23：HS-005 의 센스 사슬 영역

배열 번호 24：HS-005 의 안티센스 사슬 영역

배열 번호 25：HS-006 의 센스 사슬 영역

배열 번호 26：HS-006 의 안티센스 사슬 영역

배열 번호 27：HS-005s 의 센스 사슬 영역

배열 번호 28：HS-005s 의 안티센스 사슬 영역

배열 번호 29：HS-006s 의 센스 사슬 영역

배열 번호 30：HS-006s 의 안티센스 사슬 영역

배열 번호 31：siHSP47C 의 센스 사슬

배열 번호 32：siHSP47C 의 안티센스 사슬

배열 번호 33：HS-012 의 센스 사슬 영역

배열 번호 34：HS-012 의 안티센스 사슬 영역

SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LTD. <120> modified single-stranded polynucleotides <130> FP1145 <150> JP2010-269498 <151> 2010-12-02 <150> JP2011-100159 <151> 2011-04-27 <160> 34 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-O-methyladenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-O-methyladenosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> um <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> um <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-O-methyladenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-O-methyladenosine <400> 1 gcacaagaau ggaucaca 18 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> um <220> 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<220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-O-methyladenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-O-methyladenosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> um <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> um <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-O-methyladenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-O-methyladenosine <400> 5 gcacaagaau ggaucacaa 19 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand region of CT-473 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> um <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> um <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> um <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> um <220> <221> modified_base <222> 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Artificial Sequence <220> <223> CT-005 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> um <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> um <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> um <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> um <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> um <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> cm <400> 10 uugugaucca uucuugugct t 21 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> beta-catenin forward primer <400> 11 tctgaggaca agccacaaga ttaca 25 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> beta-catenin reverse primer <400> 12 tgggcaccaa tatcaagtcc aa 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH forward primer <400> 13 gcaccgtcaa ggctgagaac 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 14 tggtgaagac gccagtgga 19 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PK-001 <400> 15 gcucgucuau gacaaguaau u 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PK-002 <400> 16 uuacuuguca uagacgagcu g 21 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand region of PK-009 <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> um <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> um <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> um <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-O-methyladenosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-O-methyladenosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-O-methyladenosine <400> 17 gctcgucuau gacaagta 18 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand 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Claims

표적 유전자에 대한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드, 및 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기 배열을 갖는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드로서, 그 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 각각에 있어서, 인산디에스테르 구조를 형성하고 있는 다음 식으로 나타내는 구조의 링커에 의해 결합된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염
[화학식 1]

식 중,
페닐기에 결합되어 있는 산소 원자는 안티센스 사슬의 5' 말단에 결합하여 인산디에스테르 구조를 형성하고,
R¹, R² 및R³ 중 어느 1 개는 다음 식으로 나타내는 구조：
-L¹-(CH₂)_m-L²-L³-(CH₂CH₂O)_n1-(CH₂)_n2-O→
를 나타내지만, 식 중,
m 은 0 내지 4 의 정수를 나타내고,
n1 은 0 내지 4 의 정수를 나타내고,
n2 는 0 또는 2 내지 10 의 정수를 나타내고,
L¹ 은 단결합 또는 -O- 를 나타내고,
L² 는 단결합 또는 -CH(-NH-L⁴-R)- 를 나타내고,
L³ 은 L² 와의 결합을 기점으로 하여 단결합, -(C=O)-NH- 또는 -NH-(C=O)- 를 나타내지만,
L³ 이 단결합 이외일 때, n2 는 2 내지 10 의 정수를 나타낸다.
L¹ 및L² 가 단결합이고, m 이 1, n1 및 n2 가 0 일 때, L³-O→ 는,
-CH(COOH)NH-(아미노산 잔기)_j-Ser,
-CH(COOH)NH-(아미노산 잔기)_j-Thr,
-CH(NH₂)CO-(아미노산 잔기)_j-Ser, 또는
-CH(NH₂)CO-(아미노산 잔기)_j-Thr,
을 나타내지만, 이들의 세린 및 트레오닌의 수산기 부분은 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단의 인산기와 결합하고 있고, 또한 세린 및 트레오닌의 아미노기는 아실기로 치환되어 있어도 되고,
j 는 0 내지 2 의 정수를 나타내고,
L⁴ 는 단결합, -(C=O)-(CH₂)_k-NH-, 또는 -(C=O)-(CH₂)_k- 를 나타내고,
k 는 1 내지 6 의 정수를 나타내고,
R 은 수소 원자, 탄소수 1 내지 6 의 알킬기, 포화 또는 불포화이어도 되는 탄소수 2 내지 30 의 탄화수소카르보닐기, 포화 또는 불포화이어도 되는 탄소수 2 내지 30 의 탄화수소옥시카르보닐기를 나타낸다.
R¹, R² 및R³ 중 나머지 2 개는 각각 독립적으로,
수소 원자,
치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 8 의 알킬기,
치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 8 의 알콕시기,
할로겐 원자,
탄소수 1 내지 9 의 알킬기를 갖는 알킬카르보닐아미노기, 및
치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 8 의 알킬기를 포함하는 알킬카르보닐기,
로 이루어지는 군의 기에서 선택되는 기를 나타낸다.
제 1 항에 있어서,
R¹ 및R³ 이 수소 원자인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 2 항에 있어서,
L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 과 n2 의 합이 3 이상의 정수인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 2 항에 있어서,
L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 과 n2 의 합이 8 이상의 정수인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 2 항에 있어서,
L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 이 0 또는 2 이고, n2 가 6 이상의 정수인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 2 항에 있어서,
L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 이 0 또는 2 이고, n2 가 6 또는 8 인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 2 항에 있어서,
L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 이 0 또는 2 이고, n2 가 8 인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 1 항에 있어서,
R¹ 및R³ 이 수소 원자이고, L¹ 및L² 가 단결합이고, L³ 이 -(C=O)-NH- 이고, m 이 2 이고, n2 가 8 인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
표적 유전자에 대한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드, 및 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기 배열을 갖는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드로서, 그 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단이 인산디에스테르 결합을 통해 링커에 의해 결합된 다음 식으로 나타내는 구조의 폴리뉴클레오티드 또는 그 염
[화학식 2]

식 중,
p 는 0 내지 4 의 정수를 나타내고,
q 는 4 내지 10 의 정수를 나타내고,
L⁵ 는 단결합 또는 -O- 를 나타내고,
L⁶ 은 (CH₂)_p 와의 결합을 기점으로 하여 -(C=O)-NH- 또는 -NH-(C=O)- 를 나타내고,
L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치는 파라 위치 또는 메타 위치이고,
L⁵ 가 -O- 일 때는, p 는 1 내지 4 의 정수를 나타낸다.
제 9 항에 있어서,
p 와 q 의 합이 3 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 9 항에 있어서,
p 와 q 의 합이 8 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 9 항에 있어서,
p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 9 항에 있어서,
p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 또는 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 9 항에 있어서,
p 가 0 또는 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 9 항에 있어서,
p 가 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (II) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (III) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 또한 이하의 (a) 내지 (d) 에 나타내는 특징을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염：

(a) γ 는 RNA, β 는 2'-OMeRNA, λ 및 υ 은 DNA 를 나타낸다；
(b) t 및 u 는 동일 또는 상이하며, 0 ∼ 5 중 어느 것의 정수를 나타낸다；
(c) 식 (II) 로 나타내는 폴리뉴클레오티드 중 (γ-β)₉-γ 는 표적 유전자와 동일한 뉴클레오티드 배열로 이루어진다；
(d) 식 (II) 에 있어서의 (γ-β)₉-γ 와 식 (III) 에 있어서의 β-(γ-β)₉ 는 서로 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (IV) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (V) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 또한 이하의 (a) 내지 (d) 에 나타내는 특징을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염：

(a) α 및 β 는 상이하여 DNA 또는 2'-OMeRNA, δ 및 λ 는 동일 또는 상이하여 DNA 또는 2'-OMeRNA, υ 은 동일 또는 상이하여 DNA, RNA 및 2'-OMeRNA 에서 선택되는 어느 것의 뉴클레오티드를 나타낸다；
(b) p 는 0 또는 1 의 정수를 나타내고, t 는 p 가 0 일 때는 0 이고, p 가 1 일 때는 0 ∼ 5 중 어느 것의 정수를 나타낸다. s 는 0 또는 1 의 정수를 나타내고, u 는 0 ∼ 5 중 어느 것의 정수를 나타낸다；
(c) 식 (IV) 로 나타내는 폴리뉴클레오티드 중 (α-β)₉-α_p 는 표적 유전자와 동일한 뉴클레오티드 배열로 이루어진다；
(d) 식 (IV) 에 있어서의 (α-β)₉ 와 식 (V) 에 있어서의 (α-β)₉ 는 서로 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (VI) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (VII) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 또한, 이하의 (a) 내지 (d) 에 나타내는 특징을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염：

(a) α 및 β 는 상이하여 DNA 또는 2'-OMeRNA, δ 및 λ 는 동일 또는 상이하여 DNA 또는 2'-OMeRNA, υ 은 동일 또는 상이하여 DNA, RNA 및 2'-OMeRNA 에서 선택되는 어느 것의 뉴클레오티드를 나타낸다；
(b) p 는 0 또는 1 의 정수를 나타내고, t 는 p 가 0 일 때는 0 이고, p 가 1 일 때는 0 ∼ 5 중 어느 것의 정수를 나타낸다. s 는 0 또는 1 의 정수를 나타내고, u 는 0 ∼ 5 중 어느 것의 정수를 나타낸다；
(c) 식 (VI) 에서 나타나는 폴리뉴클레오티드 중 β-(α-β)₈-α_p 는 표적 유전자와 동일한 뉴클레오티드 배열로 이루어진다；
(d) 식 (VI) 에 있어서의 (α-β)₈ 과 식 (VII) 에 있어서의 (α-β)₈ 은 서로 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다.
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
α가 DNA, β 가 2'-OMeRNA 인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
λ_t 및υ_u 가 동일 또는 상이하여 티민 염기, 아데닌 염기 또는 구아닌 염기를 갖는 DNA, 또는, 우라실 염기, 아데닌 염기 또는 구아닌 염기를 갖는 2'-OMeRNA 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 16 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
t 가 0, u 가 2 인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
p 및 t 가 0, s 가 1, u 가 2 인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
p 및 t 가 0, s 가 0 또는 1, u 가 2 이고, υ₂ 가 DNA 또는 2'-OMeRNA 인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (VIII) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드가 이하의 식 (IX) 에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 또한, 이하의 (a) 내지 (c) 에 나타내는 특징을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염：

(a) α 가 DNA, β 가 2'-OMeRNA 이다；
(b) 식 (IX) 로 나타내는 폴리뉴클레오티드 중 β-(α-β)₉ 는 표적 유전자와 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다；
(c) 식 (VIII) 에 있어서의 (α-β)₉ 와 식 (IX) 에 있어서의 (α-β)₉ 는 서로 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어진다.
제 16 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
2'-OMeRNA 의 임의의 1 ∼ 4 잔기가 ENA 또는 2',4'-BNA/LNA 로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 16 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
DNA 의 임의의 1 ∼ 4 잔기가 RNA, ENA 또는 2',4'-BNA/LNA 로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
각 뉴클레오티드가 인산디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
제 28 항에 있어서,
유전자 발현에서 유래하는 질환을 치료하기 위한 의약.
제 1 항 내지 제 29 항에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 포유 동물에 투여하는 것에 의한 표적 유전자의 발현 억제 방법.
제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 함유하는 시약.
식 (X)
[화학식 3]

[식 중, Tr 은 수산기의 보호기를 나타내고, p 는 0 내지 4 의 정수를 나타내고, q 는 4 내지 10 의 정수를 나타내고, L⁵ 는 단결합 또는 -O- 를 나타내고, L⁶ 은 (CH₂)_p 와의 결합을 기점으로 하여 -(C=O)-NH- 또는 -NH-(C=O)- 를 나타내고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치는 파라 위치 또는 메타 위치이다]
을 갖는 화합물 또는 그 염.
제 32 항에 있어서,
Tr 이 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기, 픽실기, 트리틸기, 레불리닐기, 또는 비스(트리메틸실릴옥시)(시클로헥실옥시)실릴기인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 32 항에 있어서,
Tr 이 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 와 q 의 합이 3 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 32 항에 있어서,
Tr 이 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 와 q 의 합이 8 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 32 항에 있어서,
Tr 이 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 32 항에 있어서,
Tr 이 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 또는 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 32 항에 있어서,
Tr 이 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 0 또는 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 32 항에 있어서,
Tr 이 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
제 32 항에 있어서,
Tr 이 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 화합물 또는 그 염.
표적 유전자에 대한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드, 및 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기 배열을 갖는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드로서, 그 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단이 인산디에스테르 결합을 통해 X 에 의해 결합된, 식 (XI)
[화학식 4]

을 갖는 화합물 [식 중, W^2' 는 5' 말단 및 3' 말단의 수산기를 제외한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타내고, W^1'-Y' 는 5' 말단 및 3' 말단의 수산기를 제외한 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타내고, X 는 식 (XII)
[화학식 5]

[식 중, p 는 0 내지 4 의 정수를 나타내고, q 는 4 내지 10 의 정수를 나타내고, L⁵ 는 단결합 또는 -O- 를 나타내고, L⁶ 은 (CH₂)_p 와의 결합을 기점으로 하여 -(C=O)-NH- 또는 -NH-(C=O)- 를 나타내고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치는 파라 위치 또는 메타 위치이고, L⁵ 가 -O- 일 때는, p 는 1 내지 4 의 정수를 나타낸다] 를 나타내고, 말단의 메틸렌기는 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성하고, 페닐기에 결합되어 있는 산소 원자는 그 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성한다] 을 제조하는 방법으로서,
(i) 식 Tr-O-X-H [식 중, Tr 은 수산기의 보호기를 나타내고, X 의 -(CH₂)_q- 는 Tr-O- 에 결합하고, 페닐기에 결합되어 있는 산소 원자는 수소에 결합한다] 를 갖는 화합물의 수산기를, 식 (XIII)
[화학식 6]

또는, 식 (XIV)
[화학식 7]

[식 중, R⁴ 는 2-시아노에틸기, 메틸기, 메탄술포닐에틸기, 2,2,2-트리클로로에틸기, 또는 4-클로로페닐메틸기를 나타내고, R⁵ 는 모르폴리노기, 디이소프로필아미노기, 디에틸아미노기, 또는 디메틸아미노기를 나타낸다] 를 갖는 화합물과 반응시켜, 식 (XV)
[화학식 8]

를 갖는 화합물을 제조하는 공정；
(ii) 상기 (i) 에서 얻어진 화합물을 포스포라미디트법에 의해, 식 HO-W¹-Y-CPG [식 중, W¹-Y 는 5' 말단 및 3' 말단의 수산기를 제외한 보호된 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타내고, CPG 는 폴리뉴클레오티드와 결합할 수 있는 링커를 갖는 폴리머 서포트를 나타낸다] 를 갖는 화합물과 반응시키고, 계속해서, 포스포라미디트법에 의해, 식 Tr¹-O-W²-O-P(=O)(OR⁴)-O- [식 중, Tr¹ 은 수산기의 보호기를 나타내고, W² 는 5' 말단 및 3' 말단의 수산기를 제외한 보호된 센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타낸다] 부분을 제조하고, 식 (XVI)
[화학식 9]

을 갖는 화합물을 제조하는 공정；및,
(iii) 상기 (ii) 에서 얻어진 화합물을 CPG 로부터 잘라내고, 보호기의 제거를 실시하는 공정으로 이루어지는, 식 (XI) 을 갖는 화합물을 제조하는 방법.
제 41 항에 있어서,
Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기, 픽실기, 트리틸기, 레불리닐기, 또는 비스(트리메틸실릴옥시)(시클로헥실옥시)실릴기인 방법.
제 41 항에 있어서,
Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 와 q 의 합이 3 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 방법.
제 41 항에 있어서,
Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 와 q 의 합이 8 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 방법.
제 41 항에 있어서,
Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 이상의 정수이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 방법.
제 41 항에 있어서,
Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 0 또는 2 이고, q 가 6 또는 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 방법.
제 41 항에 있어서,
Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 0 또는 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 방법.
제 41 항에 있어서,
Tr 및 Tr¹ 이 동일 또는 상이하여, 4-메톡시트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 방법.
제 41 항에 있어서,
Tr 및 Tr¹ 이 4,4'-디메톡시트리틸기이고, p 가 2 이고, q 가 8 이고, L⁵ 가 단결합이고, L⁶ 이 -(C=O)-NH- 이고, L⁵ 의 벤젠 고리 상의 결합 위치가 파라 위치인 방법.
제 41 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,
R⁴ 가 2-시아노에틸기, 메틸기, 메탄술포닐에틸기, 2,2,2-트리클로로에틸기, 또는 4-클로로페닐메틸기이고, R⁵ 가 모르폴리노기, 디이소프로필아미노기, 디에틸아미노기, 또는 디메틸아미노기인 방법.
제 41 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,
R⁴ 가 2-시아노에틸기 또는 메틸기이고, R⁵ 가 모르폴리노기 또는 디이소프로필아미노기인 방법.
제 41 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,
식 (XIII) 을 갖는 화합물이 클로로(모르폴리노)메톡시포스핀, 클로로(모르폴리노)시아노에톡시포스핀, 클로로(디이소프로필아미노)메톡시포스핀 또는 클로로(디이소프로필아미노)시아노에톡시포스핀인 방법.
제 41 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,
식 (XIV) 를 갖는 화합물이 비스(디이소프로필아미노)시아노에톡시포스핀인 방법.
하기에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 염

[식 중, A^p, G^p, C^p, T^p, T^s, A^m1p, G^m1p, C^m1p, U^m1p, U^m1t 는 다음 식으로 나타내는 구조의 뉴클레오시드, 또는, 뉴클레오티드를 나타내고,
[화학식 10]

X 의 전방은 표적 유전자에 대한 센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 나타내고, X 의 후방은 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기 배열을 갖는 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드를 나타내고, X 는 식 (XVII)
[화학식 11]

로 나타내는 구조의 링커를 나타내고, 말단의 메틸렌기는 그 센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성하고, 페닐기에 결합되어 있는 산소 원자는 그 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 결합하여 인산디에스테르 결합을 형성한다].
제 54 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
제 55 항에 있어서,
Hsp47 유전자의 발현에서 유래하는 질환을 치료하기 위한 의약.
제 56 항에 있어서,
Hsp47 유전자의 발현에서 유래하는 질환이 섬유증인 의약.
제 54 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 포유 동물에 투여하는 것에 의한 Hsp47 유전자의 발현 억제 방법.
제 54 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 함유하는 시약.