CN104321334A - 三环核苷及由其制备的低聚化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供新的三环核苷及由其制备的低聚化合物。预期将一个或多个三环核苷结合到低聚化合物中增强了低聚化合物的一种或多种性质。这样的低聚化合物也可以包括在双链组合物中。在某些实施方案中，预期本文提供的低聚化合物与靶RNA的一部分杂交，导致靶RNA丧失正常功能。
Description
发明领域
本发明涉及通式I描述的烷基-取代的三环核苷及由其制备的低聚化合物。
发明背景
反义技术是一种降低特定基因产物表达的有效方法，且因此可用于治疗、诊断和研究应用。通常，反义技术的原理为：反义化合物(寡核苷酸或其类似物的序列)与靶核酸杂交，并调节基因表达活性或功能，比如转录和/或翻译。不论特定机制如何，其序列特异性使反义化合物作为靶标验证和基因功能化的工具，以及作为选择性地调节涉及疾病发病机理的基因表达的治疗剂受到关注。
化学修饰的核苷通常掺入到反义化合物中以增强其性质，比如核酸酶抗性、药代动力学或对靶RNA的亲和性。
化学修饰已改善了反义化合物的效力和功效，从而提高了他们口服递送或皮下给药的可能性，或降低了他们导致副作用的可能性。增强反义化合物效力的化学修饰允许以较低剂量给药，其降低了毒性的可能性。增强降解抗性的修饰导致从体内清除减慢，允许低频率给药。
三环核苷的合成(Steffens等，Helvetica Chimica Acta，1997，80，2426-2439)及其掺入到低聚化合物已经在文献中进行了报道(Steffens等，J.Am.Chem.Soc.，1997，119，11548-11549；Steffens等，J.Am.Chem.Soc.，1999，121，3249-3255；Renneberg等，J.Am.Chem.Soc.，2002，124，5993-6002；Scheidegger等，Chem.Eur.J.，2006，12，8014-8023)。完全修饰的三环寡核苷酸与未修饰的寡脱氧核苷酸相比显示在抵抗胎牛血清中溶核降解(nucleolytic degradation)方面更稳定，并且在细胞分析中产生生物学反义作用，比如突变β-球蛋白的剪接修复(Renneberg等,Nucleic Acids Res.2002，30，2751-2757)；或亲环素A中的外显子跳读(exon skipping)(Ittig等，Nucleic Acids Research，2004，32，346-353)。
发明简述
本文提供具有式I的三环核苷和由其制备的低聚化合物。更特别地，具有式I的三环核苷用于在低聚化合物的一个或多个位置掺入。在某些实施方案中，本文提供的低聚化合物的特征在于一种或多种增强的性质，比如核酸酶稳定性、细胞渗透性、生物利用度或毒性。在某些实施方案中，如本文提供的低聚化合物与靶RNA的一部分杂交，导致靶RNA丧失正常功能。本文提供的低聚化合物也用作诊断应用中的引物和探针。在某些实施方案中，本文提供的包含三环核苷的低聚物显著地改善了—与未修饰的DNA或RNA低聚物相比—细胞摄取而不依赖于转染试剂比如脂质体。在某些实施方案中，本文提供的包含三环核苷的低聚物显示显著提高的热稳定性(双链体解链温度)—与未修饰的DNA或RNA低聚物相比。
变量单独地在本文中更详细地定义。应当理解，本文提供的具有式I的三环核苷和低聚化合物包括所公开实施方案和本文定义的变量的所有组合。
根据本发明的第一个方面，提供由通式I描述的三环核苷：
其中：
-Bx为杂环碱基部分；
-T1和T2中一个为羟基(-OH)或保护的羟基，且T1和T2中另一个为磷酸酯或反应性磷基团；T1任选地为用于寡核苷酸合成的固体载体；
-q1和q2各自独立地为H、F或Cl，
-q3、q4和q5的至少一个独立地为通式–A1-Xh-A2-Yn描述的基团，其中
-A1为Ck-烷基、Ck-链烯基或Ck-炔基，k为选自0至20范围的整数，
-Xh为-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NR-、-O-、-S-、-NR-、-C(＝O)R、-C(＝O)OR、-C(＝O)NR2-、-OR、-SR或-NR2，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基、丁基、乙酰基和2-羟乙基，且h为0或1，
-A2为Ci-烷基、Ci-链烯基或Ci-炔基，i为选自0至20范围的整数，
-Y为连接到A1和/或A2上任一个碳原子的取代基，选自-F、-Cl、-Br、＝O、-OR、-SR、-NR2、-NR3 +、NHC(＝NH)NH2、-CN、-NC、-NCO、-NCS、-SCN、-COR、-CO2R、CONR2、-R，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基、丁基、乙酰基和2-羟乙基，且n为0、1、2、3、4、5或6，
-其中k+i等于至少1，
-并且其中R为H的任一个-OR、-SR、-NR2、-CO2R、CONR2可以任选地被固相寡核苷酸化学中使用的保护基进行保护，
-q3、q4和q5中其他基团独立地为H、F或Cl，
-z1和z2中一个为H，且z1和z2中另一个为H、-OH、F、Cl、OCH3、OCF3、OCH2CH3、OCH2CF3、OCH2-CH＝CH2、O(CH2)2-OCH3、O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2、OCH2C(＝O)-N(H)CH3、OCH2C(＝O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2或OCH2-N(H)-C(＝NH)NH2。
有机化学领域的普通技术人员理解—关于选择氧(＝O)作为取代基团—氧原子经由双键连接至A1或A2上任一碳原子。在本说明书上下文中的Ck-烷基、Ck-链烯基或Ck–炔基分别指在直链中具有k个碳原子的烷基、链烯基或炔基部分。其类似地应用于A2中的指数i。应当理解，对于k为0的实施方案，A1不存在，且对于i为0的实施方案，A2不存在。如果存在n个取代基团，则这些可以同时存在于A1和A2上。
在一些实施方案中，Bx为嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤。在一些实施方案中，Bx选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤。在一些实施方案中，Bx为当掺入到DNA或RNA低聚物中时能够代替碱基尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤形成碱基对的芳族杂环部分。
在一些实施方案中，T1为羟基或保护的羟基，并且T2为选自H-膦酸酯或亚磷酰胺(phosphoramidite)的反应性磷基团。在一些实施方案中，T1为三磷酸酯基团，且T2为OH。在一些实施方案中，其中T1为4,4'-二甲氧基三苯甲基，且T2为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺。在一些实施方案中，T1为可控多孔玻璃表面。根据该实施方案的某些实施方式，T1为长链烷基胺可控多孔玻璃表面或寡核苷酸固相合成中使用的类似固相载体，3'-O-琥珀酰化(succinylated)核苷经由酰胺官能团与其连接。
在一些实施方案中，z1和z2中一个为F、OCH3或O(CH2)2-OCH3。在一些实施方案中，z1和z2中一个为F。在一些实施方案中，z1和z2中一个F，且另一个为H。在一些实施方案中，z1和z2各自为H。在一些实施方案中，z1和z2各自为F。在一些实施方案中，z1和z2各自为H。
在一些实施方案中，q1和q2为H。在一些实施方案中，q1和q2中一个为F且另一个为H。
在某些实施方案中，三环核苷在位置q3、q4或q5中载有一个具有3至约18个碳原子的取代基，任选地在链上具有阳离子基团。这样的取代基掺入到寡核苷酸中是有用的，与烷基取代基链长度及这种修饰核苷酸的取代和数目相关，提供了寡核苷酸在体内转运的改善和细胞摄取的改善。不希望受到理论的束缚，本发明人假定所观察到的这种修饰的寡核苷酸的性能可以至少部分地通过疏水性相互作用导致的寡核苷酸自聚集来解释。
实施方案A)：在一些实施方案中，取代基为C3至C16烷基部分，即，k为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，h为0，i为0且n为1、2或3。在其亚组中，C3至C16烷基部分位于位置q3；q4和q5为H，并且任选地，q1和q2中一个为H，另一个为F或Cl，或者q1和q2两个都为H。在其另一亚组中，具有1-6个取代基的C3至C16烷基部分位于位置q4或q5；q4和q5的另一个及q3为H，并且任选地，q1和q2中一个为H，另一个为F或Cl，或者q1和q2两个都为H。
实施方案B)∶在一些实施方案中，取代基为乙酸C3至C16酰胺或酯，即k为1，h为1且X为COO-、CONH-或CONR-，i为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，且n为1、2或3。在其亚组中，乙酸C3至C16酰胺或酯位于位置q3；q4和q5为H，并且任选地，q1和q2中一个为H，另一个为F或Cl，或者q1和q2两个都为H。在其另一亚组中，乙酸C3至C16酰胺或酯位于位置q4或q5，q4和q5的另一个及q3为H，并且任选地，q1和q2中一个为H，另一个为F或Cl，或者q1和q2两个都为H。
实施方案C)∶在一些实施方案中，取代基为C3至C16烷氧基部分，即k为0，h为1，X为-O-，i为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，且n为1、2或3。在其亚组中，C3至C16烷氧基部分位于位置q3；q4和q5为H，并且任选地，q1和q2中一个为H，另一个为F或Cl，或者q1和q2两个都为H。在其另一亚组中，C3至C16烷氧基部分位于位置q4或q5，q4和q5的另一个及q3为H，并且任选地，q1和q2中一个为H，另一个为F或Cl，或者q1和q2两个都为H。
实施方案D)∶在一些实施方案中，q3为通式–A1-Xh-A2-Yn描述的基团，k和i独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，k和i之和为至少3且不大于17，h为1，X选自COO-、CONH-、CONR-、-O-和CO，且n为0、1、2或3。在其亚组中，q4和q5为H，并且任选地，q1和q2中一个为H，另一个为F或Cl，或者q1和q2两个都为H。
实施方案E)∶在一些实施方案中，q4或q5的任一个为通式–A1-Xh-A2-Yn所描述的基团，k和i独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，k和i之和为至少3且不大于17，h为1，X选自COO-、CONH-、CONR-、-O-和CO，且n为0、1、2或3。在其亚组中，q4和q5的另一个及q3为H，并且任选地，q1和q2中一个为H，另一个为F或Cl，或者q1和q2两个都为H。
A、B、C、D和E组的实施方案、或这些实施方案任一个的亚组的其他定义的特征在于n为1，且取代基Y为选自NH2、NHR、NR2、NR3 +和NHC(＝NH)NH2(胍基)的阳离子取代基，R具有上述给出的含义。在这些实施方案的某些中，阳离子取代基位于距核苷环最远的烷基链的ω-位(末端C)上(A组实施方案中的A1，B、C、D和E组实施方案中的A2)。
实施方案F)∶在一些实施方案中，三环核苷载有一个由下述参数定义的取代基∶k为0，h为1，Xh为-O-、-C(＝O)O-或-C(＝O)NH-，且A2-Y为(CH2)mCH3、(CH2)mCH2OH、(CH2)mCH2NH2或(CH2)mCH2NHC(＝NH)NH2，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在其亚组中，如前述句子中定义的取代基位于位置q3；在另一个亚组中，如前述句子中定义的取代基位于位置q4或q5。q3、q4和q5的所有其它位置为H。任选地，q1和q2中一个为H，且另一个为F或Cl，或者q1和q2两个都为H。
具有单个取代基q3的实施方案：在一些实施方案中，q1、q2、q4和q5为H，且q3为通式–A1-Xh-A2-Yn描述的基团。特定实例为如G、H、I和J组给出的。
实施方案G)∶在一些实施方案中，q3为
--(CH2)mCH3、-(CH2)mCH2OH、(CH2)mCH2NH2、(CH2)mCH2NHC(＝NH)NH2，或
--CO(CH2)mCH3、CO-(CH2)mCH2OH、CO(CH2)mCH2NH2或CO(CH2)mCH2NHC(＝NH)NH2，
--COO(CH2)mCH3、COO(CH2)mCH2OH、COO(CH2)mCH2NH2或COO(CH2)mCH2NHC(＝NH)NH2，或
--CONH(CH2)mCH3、CONH(CH2)mCH2OH、CONH(CH2)mCH2NH2或CONH(CH2)mCH2NHC(＝NH)NH2，
m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在其亚组中，m为3、4、5、6、7或8。
烷基链的长度允许小心地调节其中具有q3中的这种特定修饰核苷被掺入的寡核苷酸化合物的递送、生物利用度或渗透性特征。
实施方案H)∶在一些实施方案中，q3为通式–A1-Xh-A2-Yn描述的基团，其中
-A1的k为0，h为1，Xh为-O-，A2为C5-烷基且Yn的n为0，因此q3为-O-(CH2)4CH3，或
-k为0，h为1，Xh为-C(＝O)O-，A2为C6-烷基和n为0，因此q3为-C(＝O)O-(CH2)5CH3，或
-A1为C2-烷基，h为1，Xh为-C(＝O)O-，A2为C6-烷基和n为0，因此q3为-(CH2)2-C(＝O)O-(CH2)5CH3，或
-k为0，h为1，Xh为-C(＝O)-，A2为C4-烷基且n为0，因此q3为-C(＝O)-(CH2)3CH3，或
-k为0，h为0，A2为C8烷基，n为1，且Yn为-OH，其中取代基-OH连接至A2的C8-烷基的ω-碳原子，因此q3为-(CH2)7CH2OH，或
-A1为-CH2-，h为1，Xh为-CO2H，其中i和n各自为0，因此q3为-CH2-COOH，或
-A1为CH2，h为1，Xh为-C(＝O)O-，A2为C2-烷基和n为0，因此q3为-CH2-C(＝O)O-CH2CH3，或
-A1为CH2，h为1，Xh为–CONH2，i和n各自为0，因此q3为-CH2-CONH2，或
-A1为CH2，h为1，Xh为-C(＝O)O-，A2为C16-烷基和n为0，因此q3为CH2-C(＝O)O-(CH2)15CH3，或
-A1为CH2，h为1，Xh为-C(＝O)O-，A2为C3-烷基，n为1且Yn为-NH2，其中取代基-NH2连接至A2的C3-烷基的ω-碳原子，因此q3为CH2-C(＝O)O-(CH2)3NH2，或
-A1为CH2，h为1，Xh为-C(＝O)NH-，A2为C3-烷基，n为1且Yn为-NH2，其中取代基-NH2连接至A2的C3-烷基的ω-碳原子，因此q3为CH2-C(＝O)NH-(CH2)3NH2，或
-A1为CH2，h为1，Xh为-C(＝O)NH-，A2为C3-烷基，n为1且Yn为-OH，其中取代基-OH连接至A2的C3-烷基的ω-碳原子，因此q3为CH2-C(＝O)NH-(CH2)3OH。
实施方案I)：在一些实施方案中，q3为通式–A1-Xh-A2-Yn描述的基团，其中A1为CH2，h为1，Xh为-C(＝O)OR、C(＝O)NR2、-C(＝O)O-或-C(＝O)NR-，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基、丁基、乙酰基和2-羟乙基，特别地选自H、甲基、乙基、丙基和丁基。在其亚组中，z1、z2、q1、q2、q4和q5为H。在其进一步的亚组中，q3为下述之一：-CH2COOH、-CH2C(＝O)OCH2CH3、-CH2CONH2、-CH2C(＝O)O(CH2)3NH2、-CH2COO(CH2)12-16CH3、-CH2COO(CH2)12-16NH2或-CH2C(＝O)O-(CH2)3NH(Fmoc)。
实施方案J)∶在一些实施方案中，q3为下述之一：-CH2COOH、-CH2C(＝O)OCH2CH3、-CH2CONH2、-CH2C(＝O)O(CH2)3NH2、-CH2COO(CH2)12-16CH3、或-CH2COO(CH2)12-16NH2或CH2C(＝O)O-(CH2)3NH(Fmoc)。
在其进一步的亚组中，三环核苷选自下组：
其中Bx选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤。
本文还提供如实施例1的化合物8、实施例2的化合物13或实施例3的化合物17示例的核苷前体化合物，特别是：
其中Bx选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤。
实施方案K)∶在一些实施方案中，k为0，h为1，Xh为-CR2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NR-、-O-、-S-、-NR-，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，A2为Ci-烷基、Ci-链烯基或Ci-炔基，i为选自1至20范围内的任何整数，Y为连接到A2上任一个碳原子的取代基，选自-F、-Cl、-Br、-OR、-SR、-NR2、-CN、-NC、-NCO、-NCS、-SCN、-COR、-CO2R、CONR2，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，且n为0、1、2、3、4、5或6，
实施方案L)∶在一些实施方案中，k为0，h为1，Xh为-CR2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NR-、-O-、-S-、-NR-，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，A2为Ci-烷基、Ci-链烯基或Ci-炔基，i为选自1至20范围内的任何整数，Y为连接到A2上任一个碳原子的取代基，选自-F、-Cl、-Br、-OR、-SR、-NR2、-CN、-NC、-NCO、-NCS、-SCN、-COR、-CO2R、CONR2，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，且n为0、1、2、3、4、5或6，其中如果z1、z2、q1、q2、q4和q5为H，则q3为下述之一：-CH2COOH、-CH2C(＝O)OCH2CH3、-CH2CONH2、-CH2C(＝O)O(CH2)3NH2、-CH2COO(CH2)12-16CH3、-CH2COO(CH2)12-16NH2或-CH2C(＝O)O-(CH2)3NH(Fmoc)，特别是下述之一：-CH2C(＝O)OCH2CH3、-CH2C(＝O)O(CH2)3NH2、-CH2COO(CH2)15CH3或-CH2C(＝O)O-(CH2)3NH(Fmoc)。
实施方案M)∶在一些实施方案中，A1为CH2，h为1，Xh为-CR2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NR-、-O-、-S-、-NR-，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，A2为Ci-烷基、Ci-链烯基或Ci-炔基，i为选自1至20范围内的任何整数，Y为连接到A2上任一个碳原子的取代基，选自-F、-Cl、-Br、-OR、-SR、-NR2、-CN、-NC、-NCO、-NCS、-SCN、-COR、-CO2R、CONR2，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，且n为0、1、2、3、4、5或6。
实施方案N)∶在一些实施方案中，A1为CH2，h为1，Xh为-CR2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NR-、-O-、-S-、-NR-，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，A2为Ci-烷基、Ci-链烯基或Ci-炔基，i为选自1至20范围内的任何整数，Y为连接到A2上任一个碳原子的取代基，选自-F、-Cl、-Br、-OR、-SR、-NR2、-CN、-NC、-NCO、-NCS、-SCN、-COR、-CO2R、CONR2，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，且n为0、1、2、3、4、5或6，其中如果z1、z2、q1、q2、q4和q5为H，则q3为如下之一：-CH2COOH、-CH2C(＝O)OCH2CH3、-CH2CONH2、-CH2C(＝O)O(CH2)3NH2、-CH2COO(CH2)12-16CH3、-CH2COO(CH2)12-16NH2或-CH2C(＝O)O-(CH2)3NH(Fmoc)，特别地为如下之一：-CH2C(＝O)OCH2CH3、-CH2C(＝O)O(CH2)3NH2、-CH2COO(CH2)15CH3或-CH2C(＝O)O-(CH2)3NH(Fmoc)。
实施方案O)：在一些实施方案中，q3、q4和q5中一个选自CH2COOH、CH2CONH2、CH2COO(CH2)3-6CH3、-CH2COO(CH2)3-7NH2、-CH2COO(CH2)3-7NHC(＝NH)NH2、CONH(CH2)3-6CH3、CONH(CH2)3-7OH、CONH(CH2)3-7CH2NH2或CONH(CH2)3-7CH2NHC(＝NH)NH2。
在一些实施方案中，q1、q2、q3、q4和q5的至少一个为F，q3、q4和q5的一个为通式–A1-Xh-A2-Yn所描述的基团。
在一些实施方案中，q3和z1为F，q4和q5中一个为通式–A1-Xh-A2-Yn描述的基团。
在一些实施方案中，q3选自通式–A1-Xh-A2-Yn描述的基团，且z1、z2、q1、q2、q4和q5中一个为F。
在一些实施方案中，q3为通式-A1-Xh-A2-Yn描述的基团，A1为CH2，h为1，Xh为-C(＝O)OH、C(＝O)NH2-、-C(＝O)O-或-C(＝O)NR-，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基、丁基、乙酰基和2-羟乙基，特别地选自H、甲基、乙基、丙基、丁基，且z1、z2、q1、q2、q4和q5中一个为F。
在一些实施方案中，q3、q4和q5中两个为通式–A1-Xh-A2-Yn描述的基团。
在一些实施方案中，q3为通式–A1-Xh-A2-Yn描述的基团，其中A1为CH2，h为1，Xh为-C(＝O)OH、C(＝O)NH-、-C(＝O)O-或-C(＝O)NR-，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基、丁基、乙酰基和2-羟乙基，特别地选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，且q4和q5中一个为如上定义的通式–A1-Xh-A2-Yn描述的基团，而另一个为H。
根据本发明的第二个方面，提供低聚化合物，其包含至少一个具有式II的三环核苷：
其中独立地对于式II的各个三环核苷：
-Bx为杂环碱基部分；
-T3和T4中一个为将式II的三环核苷连接至低聚化合物的核苷间连接基团，T3和T4的另一个为羟基、保护的羟基、5'或3'端基或将三环核苷连接至低聚化合物的核苷间连接基团；
-q1和q2各自独立地为H、F或Cl，
-q3、q4和q5中至少一个独立地为通式–A1-Xh-A2-Yn描述的基团，其中
-A1为Ck-烷基、Ck-链烯基或Ck-炔基，k为选自0至20范围的整数，
-Xh为-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NR-、-O-、-S-、-NR-、-C(＝O)R、-C(＝O)OR、-C(＝O)NR2-、-OR、-SR或-NR2，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基、丁基、乙酰基和2-羟乙基，且h为0或1，
-A2为Ci-烷基、Ci-链烯基或Ci-炔基，i为选自0至20范围的整数，
-Y为连接到A1和/或A2上任一个碳原子的取代基，选自-F、-Cl、-Br、＝O、-OR、-SR、-NR2、-NR3 +、NHC(＝NH)NH2、-CN、-NC、-NCO、-NCS、-SCN、-COR、-CO2R、CONR2、–R，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基、丁基、乙酰基和2-羟乙基，且n为0、1、2、3、4、5或6，
-其中k+i等于至少1，
-q3、q4和q5的其它基团独立地为H、F或Cl，
-z1和z2中一个为H，且z1和z2中另一个为H、-OH、F、Cl、OCH3、OCF3、OCH2CH3、OCH2CF3、OCH2-CH＝CH2、O(CH2)2-OCH3、O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2、OCH2C(＝O)-N(H)CH3、OCH2C(＝O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2或OCH2-N(H)-C(＝NH)NH2，
-和其中所述低聚化合物包含8至40个单体亚单元。
在本发明的该方面的某些实施方案中，Bx为嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤。在一些实施方案中，Bx选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤。在一些实施方案中，当掺入到DNA或RNA低聚物中时，Bx为能够代替碱基尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤形成碱基对的芳族杂环部分。
在一些实施方案中，对于式II的每个三环核苷，z1和z2中一个为F、OCH3或O(CH2)2-OCH3。在一些实施方案中，对于式II的每个三环核苷，z1和z2中一个为F。在一些实施方案中，对于式II的每个三环核苷，z1和z2各自为F。在一些实施方案中，对于式II的每个三环核苷，z1和z2中一个为F，且另一个为H。在一些实施方案中，对于式II的每个三环核苷，z1和z2各自为H。
在一些实施方案中，对于式II的每个三环核苷，q1和q2各自为H。在一些实施方案中，对于式II的每个三环核苷，q1和q2中一个为F，且另一个为H。在一些实施方案中，对于式II的每个三环核苷，q1和q2各自为F。
在本发明的该方面的某些实施方案中，每个核苷间连接基团独立地为磷酸二酯核苷间连接基团或硫代磷酸酯(phosphorothioate)核苷间连接基团。在一些实施方案中，基本上每个核苷间连接基团都为硫代磷酸酯核苷间连接基团。
在一些实施方案中，本发明的低聚化合物包含第一区域，该第一区域具有至少两个连续的式II的三环核苷。在一些实施方案中，本发明的低聚化合物包含具有至少两个连续的式II的三环核苷的第一区域，和具有至少两个连续的单体亚单元的第二区域，其中第二区域中的每个单体亚单元为不同于所述第一区域的式II三环核苷的修饰核苷。根据该实施方案的另一种替代方案，所述低聚化合物包含位于所述第一和第二区域之间的第三区域，其中所述第三区域中的每个单体亚单元独立地为不同于第一区域的各个式II三环核苷和第二区域的各个单体亚单元的核苷或修饰核苷。
在一些实施方案中，本发明的低聚化合物包含具有6至14个连续单体亚单元的内部区域、所述内部区域在每侧侧接1至5个连续单体亚单元的外部区域的带间隙的(gapped)低聚化合物，其中每个外部区域的每个单体亚单元为式II的三环核苷，并且内部区域中的每个单体亚单元独立地为核苷或修饰核苷。在一些实施方案中，所述内部区域包含约8至约14个连续β-D-2'-脱氧核糖核苷。在一些实施方案中，所述内部区域包含约9至约12个连续的β-D-2'-脱氧核糖核苷。
在一些实施方案中，包含在本发明的低聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述A组实施方案。在一些实施方案中，包含在本发明的低聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述B组实施方案。在一些实施方案中，包含在本发明的低聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述C组实施方案。在一些实施方案中，包含在本发明的低聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述D组实施方案。在一些实施方案中，包含在本发明的低聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述E组实施方案。在一些实施方案中，包含在本发明的低聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述F组实施方案。在一些实施方案中，包含在本发明的低聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述G组实施方案。在一些实施方案中，包含在本发明的低聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述H组实施方案。在一些实施方案中，包含在本发明的低聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述I组实施方案。在一些实施方案中，包含在本发明的低聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述J组实施方案。在一些实施方案中，包含在本发明的低聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述K组实施方案。在一些实施方案中，包含在本发明的低聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述L组实施方案。在一些实施方案中，包含在本发明的低聚聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述M组实施方案。在一些实施方案中，包含在本发明的低聚聚化合物中的各个式II三环核苷选自上述N组实施方案。
在一些实施方案中，对于各个式II的三环核苷，q3为C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C1-C20链烯基、取代的C1-C20链烯基、C1-C20炔基、取代的C1-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、取代的氨基、硫醇或取代的硫醇。在一些实施方案中，对于各个式II的三环核苷，q4和q5中一个为H，且q4和q5的另一个为C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C1-C20链烯基、取代的C1-C20链烯基、C1-C20炔基、取代的C1-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、取代的氨基、硫醇或取代的硫醇。
在一些实施方案中，对于各个式II的三环核苷：q3为C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6链烯基、取代的C1-C6链烯基、C1-C6炔基、取代的C1-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、氨基、取代的氨基、硫醇或取代的硫醇。在一些实施方案中，对于各个式II的三环核苷：q4和q5中一个为H，且q4和q5中另一个为C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6链烯基、取代的C1-C6链烯基、C1-C6炔基、取代的C1-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、氨基、取代的氨基、硫醇或取代的硫醇。
在一些实施方案中，本发明的低聚化合物包含一个或几个选自以下的核苷酸嵌段：
其中T3和T4具有上述给出的含义。
在一些实施方案中，对于各个式II的三环核苷，q3、q4和q5中至少两个为通式–A1-Xh-A2-Yn描述的基团。
根据本发明的再另一个方面，提供一种寡核苷酸固相合成的方法，其包括使用根据本发明的第一个方面的三环核苷。根据本发明的这一方面，根据本发明的第一个方面的核苷(其中任何反应性的OH、NH2或其它反应性基团由如本文别处列举的保护基保护)用作例如亚磷酰胺(phosphoamidite)活化的结构单元且掺入到初生(nascent)低聚链中。用于这样的目的的方法和试剂是本领域技术人员已知的，并且通过本文提供的实施例来示例说明。
在某些实施方案中，提供带间隙的低聚化合物，其包含具有6至14个连续单体亚单元的内部区域，所述内部区域在每侧侧接1至5个连续单体亚单元的外部区域，其中每个外部区域的每个单体亚单元为式II的三环核苷，并且内部区域中的每个单体亚单元独立地为核苷或修饰核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约8至约14个连续的β-D-2'-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约9至约12个连续的β-D-2'-脱氧核糖核苷。
在某些实施方案中，提供抑制基因表达的方法，其包括用包含如本文提供的5'修饰核苷的低聚化合物或包含至少一种含如本文提供的5'修饰核苷的低聚化合物的双链组合物接触细胞，其中所述低聚化合物包含约8至约40个单体亚单元并且与靶RNA互补。在某些实施方案中，细胞在动物中。在某些实施方案中，细胞在人体中。在某些实施方案中，靶RNA选自mRNA、前-mRNA和微RNA。在某些实施方案中，靶RNA为mRNA。在某些实施方案中，靶RNA为人mRNA。在某些实施方案中，靶RNA被切割，从而抑制其功能。在某些实施方案中，所述方法进一步包括检测靶RNA的水平。
在某些实施方案中，提供抑制基因表达的体外方法，其包括用如本文提供的低聚化合物或双链组合物接触一种或多种细胞或组织。
在某些实施方案中，如本文提供的低聚化合物或双链组合物用于抑制基因表达的体内方法中，所述方法包括用如本文提供的低聚化合物或双链组合物之一接触一种或多种细胞、组织或动物。
在某些实施方案中，如本文提供的低聚化合物和双链组合物用于医学治疗中。
在某些实施方案中，对于式II的每个三环核苷，在取代基位置q3、q4、q5之一处安置一般地定义为–A1-Xh-A2-Yn的取代基增强了低聚物的生物分布、细胞摄取或递送。在某些实施方案中，对于式II的每个三环核苷，在取代基位置q1、q2、q3、q4、q5、z1或z2之一处安置取代基F增强了所述低聚化合物的一种或多种性质，例如且不限于稳定性、核酸酶抗性、结合亲和性、特异性、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷、药效学和药代动力学。在某些实施方案中，对于式II的每个三环核苷，预期在取代基位置q1、q2、q3、q4、q5、z1或z2之一处安置F增强结合亲和性。
发明详述
本文提供具有式I的新三环核苷和由其制备的低聚化合物。具有式I的三环核苷可用于增强它们掺入到其中的低聚化合物的一种或多种性质，比如但不限于核酸酶抗性、细胞进入、细胞内递送、体内(特别是血液中)转运、药物配制简易性和药物代谢。在某些实施方案中，如本文提供的低聚化合物与靶RNA的一部分杂交，导致靶RNA丧失正常功能。在某些实施方案中，提供具有式I的三环核苷，其可以掺入到反义低聚化合物中，以在体外和体内减少靶RNA，比如信使RNA。在一个方面，靶RNA的功能降低或丧失可经由多种途径用于抑制基因表达。这样的途径包括例如经由单链或双链低聚化合物进行mRNA的切割和mRNA的转录和/或翻译的空间封阻。本文提供的低聚化合物预期也可用作诊断应用中的引物和探针。
在某些实施方案中，提供双链组合物，其中每个双链组合物包含：
-第一低聚化合物和第二低聚化合物，其中第一低聚化合物与第二低聚化合物互补，并且第二低聚化合物与核酸靶标互补；
-第一和第二低聚化合物的至少一种包含至少一个式II的三环核苷；和
其中所述组合物任选地包含一个或多个末端基团。
如本文使用的术语“烷基”指含有至多24个、特别是至多20个碳原子的饱和的直链或支链烃基。烷基的实例包括而不限于甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基通常包括1至约20个碳原子，更通常1至约12个碳原子(C1-C12烷基)，1至约6个碳原子是更优选的。如本文使用的术语“低级烷基”包括1至约6个碳原子。
如本文使用的术语“链烯基”指含有至多24个、特别地至多20个碳原子且具有至少一个碳-碳双键的直链或支链烃链基团。链烯基的实例包括而不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基，二烯比如1,3-丁二烯等。链烯基通常包括2至约20个碳原子，更通常为2至约12个碳原子，2至约6个碳原子是更优选的。
如本文使用的术语“炔基”指含有至多24个、特别地至多20个碳原子且具有至少一个碳-碳三键的直链或支链烃基团。炔基的实例包括而不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基等。炔基典型地包括2至约20个碳原子，更通常2至约12个碳原子，2至约6个碳原子是更优选的。
如本文使用的术语“烷氧基”指烷基和氧原子之间形成的基团，其中氧原子用于将烷氧基连接到母体分子。烷氧基的实例包括而不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。如本文使用的烷氧基可以任选地包括进一步的取代基。
如本文使用的术语“氨基烷基”指氨基取代的C1-C12烷基。该基团的烷基部分与母体分子形成共价键。氨基可以位于任何位置，并且氨基烷基可在烷基和/或氨基部分被其他取代基取代。
如本文使用的术语“保护基”指不稳定的化学部分，本领域已知其在合成过程期间保护反应性基团(包括而不限于羟基、氨基和硫醇基)免于不期望的反应。保护基通常用于在反应期间在其它反应性位点选择性地保护位点，并且然后可以被除去以留下原样的未保护的基团或用于进一步的反应。如本领域已知的保护基通常描述在Greene's Protective Groups inOrganic Synthesis,第4版，John Wiley & Sons，New York，2007中。
基团可以作为前体选择性地结合到如本文提供的低聚化合物中。例如，氨基可以作为叠氮基置于如本文提供的化合物中，该基团可以在合成中期望的时间点化学转化成氨基。通常，基团被保护或作为使它们对修饰母体分子的其它区域的反应无活性而在合适时间转变成它们的最终基团的前体存在。其他代表性保护基团或前体基团为在Agrawal等,Protocols forOligonucleotide Conjugates，Humana Press；New Jersey，1994，26，1-72中讨论的。
羟基保护基的实例包括而不限于：乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)-乙基、对-氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、2,6-二氯苄基、二苯基甲基、对-硝基苄基、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、2-三甲基甲硅烷基乙基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、[(三异丙基甲硅烷基)-氧基]甲基(TOM)、苯甲酰基甲酸酯基、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、特戊酰基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、9-芴基甲基碳酸酯基(9-fluorenylmethylcarbonate)、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、三苯基甲基(三苯甲基)、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、三甲氧基三苯甲基、1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(FPMP)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。其中，更通常使用的羟基保护基包括而不限于：苄基、2,6-二氯苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、苯甲酰基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。
氨基保护基的实例包括而不限于：氨基甲酸酯-保护基，比如2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基(Teoc)、1-甲基-1-(4-联苯基)-乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)和苄基氧基羰基(Cbz)；酰胺保护基，比如甲酰基、乙酰基、三卤代乙酰基、苯甲酰基和硝基苯乙酰基；磺酰胺保护基，比如2-硝基苯磺酰基；及亚胺-保护基和环亚胺保护基，比如苯二甲酰亚氨基和二硫代琥珀酰基(dithiasuccinoyl)。
硫醇保护基的实例包括而不限于三苯基甲基(三苯甲基)、苄基(Bn)等。
本文所述的化合物含有一个或多个不对称中心，因此产生可以基于绝对立体化学如(R)或(S)定义的对映异构体、非对映异构体、及其它立体异构形式。本文包括所有这样的可能异构体，以及他们的外消旋形式和光学纯形式。除非文中明确说明，否则本文出现的任何碳-碳双键的构型都是仅仅为了方便起见所选择的，而不意欲限制具体的构型。
在一些实施方案中，如本文使用的烷基、链烯基或炔基可以任选地包括一个或多个进一步的取代基团。术语“取代基”和“取代基团”意思是包括通常加入到其他基团或母体化合物中以增强期望的性质或提供其他预期效果的基团。取代基团可以是保护的或未保护的，并且可以加入到母体化合物中的一个可用位点或许多可用位点。取代基团也可以进一步被其他取代基团取代，并且可以直接地或经由连接基团比如烷基或烃基(hydrocarbyl)连接到母体化合物。
本文适合的取代基团包括而不限于卤素、氧、羟基、烷基、链烯基、炔基、酰基(-C(O)Raa)、羧基(-C(O)O-Raa)、脂族基、脂环基、烷氧基、取代的氧基(-O-Raa)、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基、杂芳基烷基、氨基(-N(Rbb)(Rcc))、亚氨基(＝NRbb)、酰氨基(-C(O)N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)C(O)Raa)、叠氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、异氰基(-NC)、氰酰基(-OCN)、异氰酰基(-NCO)、氰硫基(-SCN)；异氰硫基(-NCS)；氨基甲酸酯基(-OC(O)N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)C(O)ORaa)，脲基(-N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc))、硫脲基(-N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc))、胍基(-N(Rbb)C(＝NRbb)N(Rbb)(Rcc))、脒基(-C(＝NRbb)N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)C(＝NRbb)(Raa))、硫醇基(-SRbb)、亚磺酰基(-S(O)Rbb)、磺酰基(-S(O)2Rbb)和磺酰胺基(-S(O)2N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)S(O)2Rbb)。其中Raa、Rbb和Rcc各自独立地为H、任选连接的化学官能团或其他取代基团，优选的种类包括而不限于H、烷基、链烯基、炔基、脂族基、烷氧基、酰基、芳基、芳烷基、杂芳基、脂环、杂环和杂芳基烷基。本文所述化合物之内所选择的取代基具有一定程度的重复出现性。
在该上下文中，“重复出现的取代基”意思是指一个取代基可以代表其自身的另一次出现。由于这样的取代基的重复出现性质，理论上，在任意给定权利要求中可以存在大量取代基。药物化学和有机化学领域的普通技术人员理解这样的取代基的总数受预期化合物的期望性质的合理限制。这样的性质包括，例如而不限于物理性质比如分子量、溶解度或logP，应用性质比如针对预期靶标的活性，以及实用性质比如合成方便性。
重复出现的取代基是本发明的预期范围。药物化学和有机化学领域的普通技术人员理解这样的取代基的多样性。关于重复出现的取代基在本发明权利要求中的存在程度，总数目应当如上所述确定。
在一些实施方案中，如本文使用的烷基、链烯基或炔基含有一个、两个或三个独立地选自下述的进一步取代基：-F、-Cl、-Br、＝O、NH2、SH、OH、OR、SR、NHR、-NR2、-CN、-NC、-NCO、-NCS、-SCN、-COR、-CO2R、CONR2、-R，R选自甲基、乙基、丙基、丁基、乙酰基和2-羟乙基。
在一些实施方案中，如本文使用的烷基、链烯基或炔基不包含进一步的取代基，而是仅仅由碳和氢原子组成。
如本文使用的术语“核碱基”指未修饰的或天然存在的核碱基，其包括但不限于嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。如本文使用的术语“杂环碱基部分”指未修饰的或天然存在的核碱基以及修饰的或非天然存在的核碱基及其合成模拟物(比如，例如吩噁嗪类)。在某些实施方案中，杂环碱基部分为含有能够与核酸的杂环碱基氢键键合的一个或多个原子或基团的任何杂环系统。
在某些实施方案中，杂环碱基部分包括而不限于修饰的核碱基，比如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基及其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶(pseudouracil))、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基及其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基及其它5-取代的尿嘧啶类和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤和7-去氮杂腺嘌呤、3-去氮杂鸟嘌呤和3-去氮杂腺嘌呤、通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基(promiscuous bases)、扩环碱基(size-expandedbases)和如本文定义的氟化碱基。
在某些实施方案中，杂环碱基部分包括而不限于三环嘧啶类，比如1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮、1,3-二氮杂吩噻嗪-2-酮和9-(2-氨基乙氧基)-1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(G-钳(G-clamp))。杂环碱基部分还包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环取代的那些，例如7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其他杂环碱基部分包括而不限于本领域已知的那些(参见例如∶美国专利No.3,687,808；Swayze等，The Medicinal Chemistry ofOligonucleotides in Antisense a Drug Technology，Chapter 6，pages 143-182，Crooke，S.T.，ed.，2008)；The Concise Encyclopedia Of PolymerScience And Engineering，Kroschwitz，J.I.，Ed.，John Wiley&Sons，1990，858-859；Englisch等,Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613；Sanghvi，Y.S.，Chapter 15，Antisense Research andApplications，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，Eds.，CRC Press，1993，273-302。
如本文使用的术语“糖部分”指具有呋喃糖环的天然存在的糖、具有修饰的呋喃糖环的合成或非天然存在的糖及其中呋喃糖环已经被环状环系统(比如，例如吗琳子基或己糖醇环系统)或非环状糖替代物(surrogate)(比如肽核酸中使用的)所替代的糖替代物。用于制备低聚化合物的糖部分的说明性实例包括而不限于β-D-核糖、β-D-2'-脱氧核糖、取代的糖(比如2'，5'和双取代的糖)、4'-S-糖(比如4'-S-核糖、4'-S-2'-脱氧核糖和4'-S-2'-取代的核糖)、三环修饰的糖(比如2'-O-CH2-4'或2'-O-(CH2)2-4'桥连核糖衍生的三环糖)和糖替代物(比如，例如当核糖环被吗琳子基、己糖醇环系统或开放非环状系统替代时)。
如本文使用的术语“核苷”指核碱基-糖组合。这样的核碱基的两种最常见类别为嘌呤和嘧啶。
如本文使用的术语核苷酸指进一步包含修饰的或未修饰的磷酸酯核苷间连接基团或非磷酸酯核苷间连接基团的核苷。对于包括呋喃戊糖基糖的核苷酸，核苷间连接基团可以连接到糖的2'、3'或5'羟基部分。磷酸酯和/或非磷酸酯核苷间连接基团通常用于彼此共价连接相邻的核苷以形成线性聚合化合物。
如本文使用的术语“核苷酸模拟物”意思是指包括掺入到低聚化合物中具有糖和连接替代基团的单体，比如，例如肽核酸(PNA)或吗琳子基(通过-N(H)-C(＝O)-O-连接)。一般而言，保持每个位置的杂环碱基以与核酸靶标杂交，但是糖和连接键被替代基团所替代，该替代基团预期天然基团类似在发挥功能但具有一种或多种增强的性质。
如本文使用的术语“核苷模拟物”意图包括用于替代低聚化合物的一个或多个位置的糖和碱基的那些结构。核苷模拟物的实例包括而不限于其中用吩噁嗪部分(例如，当与鸟苷碱基杂交时形成四个氢键的9-(2-氨基乙氧基)-1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮基团，也称为G-钳)替代杂环碱基部分，以及用基团比如，例如吗琳子基、环己烯基或双环[3.1.0]己基进一步替代糖部分的核苷。
如本文使用的术语“修饰的核苷”意思是包括可使用低聚物合成掺入到低聚化合物中的所有修饰核苷的方式。该术语意图包括对核苷进行的修饰，比如修饰的立体化学构型、一种或多种取代以及与本文别处描述的替代基团使用相反的基团的删除。该术语包括具有呋喃糖(或4’-S类似物)部分的核苷并且可以包括杂环碱基或可以为无碱基的核苷。一组代表性修饰的核苷包括而不限于：取代的核苷(比如2'、5'和/或4'取代的核苷)、4’-S-修饰的核苷(比如4’-S-核糖核苷、4’-S-2’-脱氧核糖核苷和4’-S-2’-取代的核糖核苷)、二环修饰的核苷(比如，例如，其中糖部分具有2’-O-CHRa-4’桥连基团的二环核苷，其中Ra为H、烷基或取代的烷基)以及碱基修饰的核苷。糖可以用超过一种所列出的这些修饰来修饰，比如，例如进一步包括5’-取代的二环修饰的核苷、或者进一步包括2’取代基的5’或4’取代的核苷。术语修饰的核苷还包括这些修饰的组合(比如碱基和糖修饰的核苷)。这些修饰意思是举例说明而非穷尽的，因为其他修饰是本领域已知的并且也被认为是本文所述的修饰的核苷的可能修饰。
如本文所用的术语“单体亚单元”意思是包括适合于低聚物合成的所有单体亚单元方式，一个优选的列表包括以下单体亚单元：比如β-D-核糖核苷；β-D-2’-脱氧核糖核苷；修饰的核苷，包括取代的核苷(诸如2’取代的、5’取代的和双取代的核苷)、4’-S-修饰的核苷(比如4'-S-核糖核苷、4’-S-2’-脱氧核糖核苷和4'-S-2’-取代的核糖核苷)、二环修饰的核苷(比如，其中糖部分具有2'-O-CHRa-4'桥连基团的二环核苷，其中Ra为H、烷基或取代的烷基)、其他修饰的核苷；核苷模拟物，具有糖替代物的核苷和如本文提供的三环核苷。许多其他单环、二环和三环环系统是本领域已知的，且适合用作可用于修饰掺入到如本文提供的低聚化合物中的核苷的糖替代物(参见例如，综述论文：Leumann，Christian J.Bioorg.& Med.Chem.，2002，10，841-854)。这样的环系统可以进行各种其它取代以进一步增强它们的活性。
如本文使用的术语“反应性磷”意思是包括与可以进一步连接低聚化合物的单体亚单元共价连接的基团，其可用于形成核苷间连接，包括例如磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷间连接。这样的反应性磷基团是本领域已知的，并且含有PIII或PV价态的磷原子，包括，但不限于亚磷酰胺、H-膦酸酯、磷酸三酯和含磷手性辅剂。在某些实施方案中，反应性磷基团选自二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺(-O*-P[N[(CH(CH3)2]2]O(CH2)2CN)和H-膦酸酯(-O*-P(＝O)(H)OH)，其中O*由单体的马库什(Markush)基团提供。优选的合成的固相合成采用亚磷酰胺(PIII化学)作为反应性亚磷酸酯(phosphite)。中间体亚磷酸酯化合物随后使用已知的方法被氧化成磷酸酯或硫代磷酸酯(PV化学)以得到磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷间连接。另外的反应性磷酸酯和亚磷酸酯公开在Tetrahedron Report Number 309(Beaucage和Iyer，Tetrahedron，1992，48，2223-2311)中。
如本文使用的“寡核苷酸”指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方案中，所述多个核苷的一个或多个是被修饰的。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
术语“寡核苷”指通过不具有磷原子的核苷间连接结合的核苷序列。该类型的核苷间连接包括短链烷基、环烷基、混合杂原子烷基、混合杂原子环烷基、一种或多种短链杂原子的和一种或多种短链杂环的。这些核苷间连接包括而不限于硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、乙酰基、甲酰基(formacetyl)、硫代甲酰基、亚甲基甲酰基、硫代甲酰基、烯基、氨基磺酸酯(sulfamate)、亚甲基亚氨基、亚甲基肼基、磺酸酯、磺酰胺、酰胺和其它具有混合的N、O、S和CH2组成部分的核苷间连接。本文中使用的
术语“低聚化合物”指连接的单体亚单元的连续序列。通常，每个连接的单体亚单元包括杂环碱基部分，但是单体亚单元也包括没有杂环碱基部分的那些，比如无碱基单体亚单元。在低聚化合物中，如果不是必需所有的话，至少一些且通常大多数的杂环碱基能够与核酸分子(通常为预选的RNA靶标)杂交。因此，术语“低聚化合物”包括寡核苷酸、寡核苷酸类似物和寡核苷。其还包括具有一个或多个核苷模拟物和/或具有糖替代物基团的核苷的聚合物。
在某些实施方案中，低聚化合物包括独立地选自天然存在的核苷、非天然存在的核苷、修饰的核苷、核苷模拟物和具有糖替代物基团的核苷的多个单体亚单元。在某些实施方案中，低聚化合物为单链的。在某些实施方案中，低聚化合物为包含双链体(duplex)的双链。在某些实施方案中，低聚化合物包括一个或多个缀合基团和/或末端基团。
如本文使用的术语“核苷间连接”或“核苷间连接基团”意思是包括本领域已知的所有核苷间连接基团方式，包括但不限于含磷核苷间连接基团，比如磷酸二酯和硫代磷酸酯，及非含磷核苷间连接基团比如甲酰基和亚甲基亚氨基。核苷间连接也包括中性非离子核苷间连接，比如酰胺-3(3'-CH2-C(＝O)-N(H)-5')、酰胺-4(3'-CH2-N(H)-C(＝O)-5')和甲基膦酸酯，其中磷原子并不总是存在。
在某些实施方案中，如本文提供的低聚化合物可以制备为具有一个或多个核苷间连接，其包含修饰的例如非天然存在的核苷间连接。两个主要种类的核苷间连接通过存在或不存在磷原子来定义。具有磷原子的修饰的核苷间连接包括而不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和其他烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯(phosphinate)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、具有正常的3'-5'连接的硒代磷酸酯和硼烷磷酸酯(boranophosphate)、这些物质的2'-5'连接的类似物，以及具有反极性的那些，其中一种或多种核苷酸间连接是3'至3'、5至5'或2'至2'连接。具有反极性的寡核苷酸可以在3'-最末端的核苷酸间连接处包含单个3'至3'连接，即可能为无碱基(核碱基缺失或具有代替核碱基的羟基)的单个反转核苷残基。还包括多种盐、混合盐和游离酸形式。
在一些实施方案中，可以制备具有一个或多个不含磷核苷间连接的如本文提供的低聚化合物。这样的低聚化合物包括而不限于由短链烷基或环烷基核苷间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接、或一种或多种短链杂原子的或杂环的核苷间连接形成的那些低聚化合物。这些核苷间连接包括那些具有硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；核乙酰基(riboacetyl)主链；含烯烃主链；氨基磺酸酯(sulfamate)主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他主链的那些。
教导上述寡核苷制备的代表性的美国专利包括而不限于U.S.:5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,677,439；5,646,269和5,792,608，其中某些为与本申请共同拥有的专利，并将每篇专利通过引用并入本文。
在某些实施方案中，如本文提供的低聚化合物可以通过共价连接一个或多个缀合基团来修饰。通常，缀合基团改善他们连接的低聚化合物的一种或多种性质。这样的寡核苷酸性质包括而不限于药效学、药代动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除。缀合基团通常用于化学领域中，并且直接地或经由任选的连接部分或连接基连接到母体化合物，比如低聚化合物。缀合基团的优选列表包括而不限于插入剂(intercalators)、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇类、硫代胆固醇类、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。
在某些实施方案中，如本文提供的低聚化合物可以通过一个或多个末端基共价连接到5'或3'-末端基团来修饰。末端基团也可以连接到低聚化合物的末端之一的任何其他位置。如本文使用的术语“5'-末端基团”、“3'-末端基团”、“末端基团”及其组合意思是包括本领域技术人员已知的有用的基团，其可以分别被置于低聚化合物的一个或两个末端(包括但不限于低聚化合物的5'和3'-端)，用于多种目的，比如使得能够进行低聚化合物的示踪(荧光标记或其它报告基团)、提高低聚化合物的药代动力学或药效学(比如，例如：摄取和/或递送)或增强低聚化合物的一种或多种其他期望的性质(改善核酸酶稳定性或结合亲和性的基团)。在某些实施方案中，5'和3'-末端基团包括而不限于修饰的或未修饰的核苷；两个或多个连接的核苷(其独立地为修饰的或未修饰的)；缀合基团；封端基团；磷酸酯部分；和保护基。
如本文使用的术语“磷酸酯部分”指末端磷酸酯基，其包括磷酸酯以及修饰的磷酸酯。磷酸酯部分可以位于任一末端，但优选的位于5'-末端核苷。在一个方面，末端磷酸酯为修饰的，具有式-O-P(＝O)(OH)OH。在另一个方面，末端磷酸酯为修饰的以使得一个或多个O和OH基团被H、O、S、N(R)或烷基替代，其中R为H、氨基保护基或者未取代的或取代的烷基。在某些实施方案中，5'和/或3'末端基团可以包括1至3个磷酸酯部分，其各自独立地为未修饰的(二或三磷酸酯)或修饰的。
如本文使用的术语“磷部分”指具有下式的基团：
其中∶
Rx和Ry各自独立地为羟基、保护的羟基、硫醇、保护的硫醇基、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、保护的氨基或取代的氨基；和
Rz为O或S。
作为单体比如亚磷酰胺或H-膦酸酯，保护的磷部分优选地在低聚物合成期间保持稳定性。在掺入到低聚化合物中之后，磷部分可以包括脱保护的基团。
本文包括的磷部分可以连接到可用于制备低聚化合物的单体，其中所述单体可以使用O、S、NRd或CReRf连接，其中Rd包括而不限于H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6链烯基、取代的C2-C6链烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基，Re和Rf各自独立地包括而不限于H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或取代的C1-C6烷氧基。这种连接的磷部分包括而不限于磷酸酯、修饰的磷酸酯、硫代磷酸酯、修饰的硫代磷酸酯、膦酸酯、修饰的膦酸酯、氨基磷酸酯和修饰的氨基磷酸酯。
与天然寡核苷酸相比，化学修饰的低聚化合物结合互补的核酸链的相对能力通过获得所述化学修饰的低聚化合物与其互补的未修饰的靶核酸的杂交复合物的解链温度来测量。解链温度(Tm)(双螺旋的特征性物理性质)表示出现50％螺旋(helical)对卷曲(coiled)(未杂交)形式时的以摄氏度计的温度。Tm(通常也称为结合亲和性)是通过使用UV光谱测定杂交的形成和分解(解链)来测量的。在杂交期间发生的碱基堆积伴随UV吸收的减少(减色性)。因此，UV吸收的减少表明较高的Tm。
本领域已知反义化合物：RNA靶双链体的相对双链体稳定性可以通过使化学修饰的核苷掺入到反义化合物中来调节。糖-修饰的核苷提供了调节反义化合物与靶RNA的Tm的最有效方式。增加C3'-内式(endo)(Northern，RNA样糖折叠(pucker))构型的糖的总量或将糖锁定(lock)在加C3'-内式构型中的糖-修饰的核苷主要提供反义化合物针对互补RNA靶的每个修饰的Tm增加。增加C2'-内式(Southern，DNA样糖折叠)构型的糖的总量或将糖锁定在C2'-内式构型中的糖-修饰的核苷主要提供反义化合物针对互补RNA靶的每个修饰的Tm降低。给定的糖-修饰核苷的糖折叠不是决定核苷提高或降低反义化合物针对互补RNA的Tm的能力的唯一因素。例如，糖-修饰的核苷三环DNA主要处于C2'-内式构型中，然而其赋予针对互补RNA的Tm的每修饰1.9至3℃的提高。没有采取C3'-内式构型的糖-修饰的高亲和性核苷的另一个实例是α-L-LNA(本文中更详细地描述的)。
如本文使用的"Tm"(解链温度)是双链体核酸的两个链分离的温度。Tm通常用作反义化合物针对互补RNA分子的双链体稳定性的量度。
如本文使用的关于核碱基的“互补性”指能够与另一核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补。例如，在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补。在某些实施方案中，互补核碱基指能够与其靶核酸的核碱基进行碱基配对的反义化合物的核碱基。例如，如果反义化合物的特定位置的核碱基能够与靶核酸特定位置的核碱基氢键键合，则寡核苷酸和靶核酸之间氢键键合的位置被认为在该核碱基对处是互补的。包含某些修饰的核碱基或更广泛的杂环碱基部分可以保持与对应核碱基配对的能力，因此仍然能够具有互补性。
如本文使用的关于核碱基“非互补的”指不能彼此形成氢键或不能以其他方式支持杂交的核碱基对。
如本文使用的关于连接的核苷、寡核苷酸、低聚化合物或核酸的“互补的”指低聚化合物通过核碱基或更广泛的杂环碱基互补性与另一低聚化合物或核酸杂交的能力。在某些实施方案中，当每个分子中足够数量的对应位置被可以彼此键合以允许反义化合物和靶之间进行稳定结合的核碱基占据时，反义化合物与其靶是互补的。本领域技术人员认识到可能包含错配而不会消除低聚化合物保持结合的能力。因此，本文描述的反义化合物可以包含至多约20％的错配核苷酸(即，不是与靶的相应核苷酸互补的核碱基)。优选地，反义化合物包含不超过约15％、更优选地不超过约10％、最优选地不超过5％的错配或没有错配。其余核苷酸为互补的或以其他方式不破坏杂交的核碱基(例如，通用碱基)。本领域普通技术人员应当认识到本文提供的化合物与靶核酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
本领域理解低聚化合物的序列不必与其可特异性杂交的靶核酸的序列100％互补。而且，低聚化合物可以在一个或多个节段上杂交以使得插入节段和相邻节段不参与杂交事件(例如，环结构或发夹结构)。在某些实施方案中，低聚化合物可以包括与它们所靶向的靶核酸序列内的靶区域的至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％的序列互补性。例如，其中低聚化合物的20个核碱基中的18个与靶区域互补并且因此特异地杂交的低聚化合物将代表90％互补性。在这个实例中，其余非互补核碱基可以是簇集的或者穿插互补核碱基，因而不必彼此邻接或与互补核碱基邻接。如此，具有4(四)个非互补核碱基(其侧接与靶核酸完全互补的两个区域)的长度为18个核碱基的低聚化合物将具有与该靶核酸的77.8％的总体互补性，并且将因此落入该范围之内。低聚化合物与靶核酸的区域的百分互补性可以使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序来常规地确定(Altschul等，J.Mol.Biol.，1990，215，403-410；Zhang和Madden，Genome Res.，1997，7，649-656)。
如本文使用的“杂交”指互补的低聚化合物的配对(例如，反义化合物及其靶核酸)。虽然不限于特定机制，但是最常见的配对机制包括氢键键合，其可以是互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反式Hoogsteen氢键键合。例如，天然碱基腺嘌呤是与通过形成氢键配对的天然核碱基胸苷和尿嘧啶互补的核碱基。天然碱基鸟嘌呤是与天然碱基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶互补的核碱基。杂交可以在可变环境下发生。
如本文使用的"靶核酸"指其表达、量或活性能够被反义化合物调节的任何核酸分子。在某些实施方案中，靶核酸为DNA或RNA。在某些实施方案中，靶RNA为mRNA、前-mRNA、非编码RNA、pri-microRNA、pre-microRNA、成熟微RNA、启动子指导的RNA、或天然反义转录物。例如，靶核酸可以是其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因(或从基因转录的mRNA)、或来自传染物的核酸分子。在某些实施方案中，靶核酸为病毒或细菌核酸。
本文还包括低聚化合物，比如反义低聚化合物、反义寡核苷酸、核酶、外部引导序列(EGS)寡核苷酸、可变剪接物(alternate splicers)、引物、探针及与靶核酸的至少一部分杂交的其他低聚化合物。因而，这些低聚化合物可以以单链、双链、环状或发夹低聚化合物的形式引入，并且可以含有结构元件比如内部或末端凸起或环。一旦引入到系统中，本文提供的低聚化合物可以引发一种或多种酶或结构蛋白质产生靶核酸修饰的作用。可选地，所述低聚化合物可以通过基于占据(occupancy-based)的方法抑制靶核酸的活性，因此干扰该靶核酸的活性。
这样的酶的一种非限制性实例为RNA酶H，一种切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域已知"DNA样"的单链低聚化合物引发RNA酶H。因此，RNA酶H的激活导致RNA靶的切割，由此极大地增强寡核苷酸介导的基因表达抑制的效率。对于其他核糖核酸酶比如在RNA酶III和核糖核酸酶L家族的酶中的那些，已经推测了类似的作用。
尽管低聚化合物的一种形式是单链反义寡核苷酸，但是在许多物种中双链结构比如双链RNA(dsRNA)分子的引入已经显示出诱导基因或其相关基因产物功能的有力且特异的反义介导的降低。这种现象在植物和动物中都发生，并且被认为与病毒防御和转座子沉默具有进化上的关联。
如本文使用的术语“可药用盐”指保留化合物的期望活性且不会赋予其不期望的毒理学作用的盐。术语“可药用盐”包括从可药用无毒酸或碱制备的盐，所述无毒酸或碱包括无机的或有机的酸和碱。
本文所述低聚化合物的可药用盐可以通过本领域众所周知的方法制备。对于可药用盐的综述，参见Stahl和Wermuth，Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties，Selection and Use(Wiley-VCH，Weinheim，Germany，2002)。反义寡核苷酸的钠盐对于治疗性给药于人是有用的且是良好接受的。因此，在某些实施方案中，本文所述低聚化合物为钠盐的形式。
在某些实施方案中，本文提供的低聚化合物包含约8至约80个单体亚单元的长度。本领域普通技术人员应当理解这具体描述了长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个单体亚单元或其间任何范围的低聚化合物。
低聚化合物通常使用与液相方法相对的固体载体方法制备。通常用于利用固体载体方法制备低聚化合物的市售可获得的装置是由多家供应商销售的，包括例如Applied Biosystems(Foster City，CA)。另外或可选地，可以采用本领域已知用于这种合成的任何其他装置。合适的固相技术，包括自动合成技术，描述在Oligonucleotides and Analogues，a PracticalApproach，F.Eckstein，Ed.，Oxford University Press，New York，1991中。
相对于DNA和相关类似物的合成，RNA和相关类似物的合成已经随着RNA干扰和微RNA方面的工作的增加而不断的增多。目前商业上使用的主要RNA合成策略包括5'-O-DMT-2'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、5'-O-DMT-2'-O-[1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基](FPMP)、2'-O-[(三异丙基甲硅烷基)-氧基]-甲基(2'-O-CH2-O-Si(iPr)3(TOM)和5'-O-甲硅烷基醚-2'-ACE(5'-O-双(三甲基甲硅烷氧基)-环十二烷基氧基甲硅烷基醚(DOD)-2'-O-双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)。目前提供RNA产品的一些主要公司的当前列表包括Pierce Nucleic Acid Technologies、DharmaconResearch Inc.、Ameri Biotechnologies Inc.和Integrated DNA Technologies，Inc。一家公司(Princeton Separations)在销售RNA合成活化剂，其宣称减少偶联次数，尤其是对于TOM和TBDMS化学作用。用于商业RNA合成的主要基团为：TBDMS:5'-O-DMT-2'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基；TOM:2'-O-[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基；DOD/ACE:(5'-O-双(三甲基甲硅烷氧基)-环十二烷基氧基甲硅烷基醚-2'-O-双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基；和FPMP:5'-O-DMT-2'-O-[1(2-氟苯基)-4-乙氧基哌啶-4-基]。在某些实施方案中，前述RNA合成策略的每一种都可以用于本文中。在某些实施方案中，前述RNA合成策略可以按混合方式一起进行，例如使用一种策略的5'-保护基团与另一种策略的2'-O-保护基团。
在某些实施方案中，“合适的靶节段”可以用于筛选调节所选择蛋白质的表达的另外的低聚化合物。“调节剂”为减少或增加编码蛋白的核酸分子的表达且包含与合适的靶节段互补的至少8核碱基部分的那些低聚化合物。筛选方法包括如下步骤：用一种或多种候选调节剂接触编码蛋白的核酸分子的合适靶节段，并且选择减少或增加编码蛋白质的核酸分子的表达的一种或多种候选调节剂。一旦显示出该一种或多种候选调节剂能够调节(例如，减少或增加)编码肽的核酸分子的表达，则该调节剂可以在本文中用于进行肽功能的进一步调查研究，或者用作研究剂、诊断剂或治疗剂。在靶向微RNA的低聚化合物的情况下，可以通过候选调节剂增加微RNA靶RNA或蛋白质的表达的程度来评估候选调节剂(因为干扰微RNA的活性将导致微RNA的一种或多种靶标的表达增加)。
如本文使用的“表达”指基因最终产生蛋白质的过程。表达包括但不限于转录、剪接、转录后修饰和翻译。
合适的靶节段也可以与本文提供的其相应互补低聚化合物组合以形成稳定的双链(双链体)寡核苷酸。本领域中已经表明这样的双链寡核苷酸部分经由反义机制调节靶标表达和调控翻译以及RNA加工。而且，双链部分可以接受化学修饰(Fire等，Nature，1998，391，806-811；Timmons和Fire，Nature，1998，395，854；Timmons等，Gene，2001，263，103-112；Tabara等，Science，1998，282，430-431；Montgomery等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，15502-15507；Tuschl等，GenesDev.，1999，13，3191-3197；Elbashir等，Nature，2001，411，494-498；Elbashir等，Genes Dev.，2001，15，188-200)。例如，这样的双链部分已经显示通过双链体的反义链与靶标的典型杂交而抑制靶标，从而触发靶标的酶促降解(Tijsterman等，Science，2002，295，694-697)。
本文提供的低聚化合物也可以用于药物研发和靶标验证的领域中。在某些实施方案中，本文提供低聚化合物和本文鉴别的靶标在药物研发工作中以阐明蛋白质和疾病状态、表型或病症之间存在的关系的用途。这些方法包括检测或调节靶肽，其包括用本文提供的一种或多种低聚化合物接触样品、组织、细胞或生物体，在处理后一定时间测量靶标的核酸或蛋白质水平和/或相关表型或化学终点，并任选地比较测定值与非处理样品或与用如本文提供的其他低聚化合物处理的样品。这些方法也可以平行进行或与其他实验组合进行，以确定未知基因对于靶标校验过程的功能、或确定特定基因产物作为靶对于治疗或预防特定疾病、病症或表型的有效性。在某些实施方案中，提供低聚化合物用于治疗中。在某些实施方案中，治疗是减少靶信使RNA。
如本文使用的术语“剂量”指单次给药中提供的药剂的规定量。在某些实施方案中，剂量可以以两个或多个推注、片剂或注射给药。例如，在某些实施方案中，当期望皮下给药时，期望剂量需要的体积不是容易通过一次注射供应。在这样的实施方案中，可以使用两次或多次注射实现期望剂量。在某些实施方案中，剂量可以通过两次或多次注射给药以使个体注射部位的反应最小化。
在某些实施方案中，与未修饰的DNA相比，本文提供的化学修饰的低聚化合物对靶RNA可具有更高的亲和性。在某些这样的实施方案中，更高亲和性进而提供了增强的功效，从而允许给药较低剂量的这种化合物、降低毒性潜能、改善治疗指数和降低治疗整体花费。
核苷修饰对RNAi活性的作用根据现有文献进行评价(Elbashir等，Nature，2001，411，494-498；Nishikura等，Cell，2001，107，415-416；和Bass等，Cell，2000，101，235-238.)。
在某些实施方案中，本文提供的低聚化合物可以用于诊断、治疗、预防和作为研究试剂和试剂盒。此外，能够以精密的特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸通常被本领域普通技术人员用于阐明特定基因的功能或用于区分生物途径的各个成员的功能。在某些实施方案中，本文提供的低聚化合物可以单独使用或者与其他低聚化合物或其它治疗剂组合使用，作为差异和/或组合分析中的工具以阐明细胞和组织内表达的基因的一部分或全部互补的表达模式。在有利于基因扩增或检测的情况下，低聚化合物也可以分别有效地用作引物和探针。这些引物和探针用于需要特异性检测编码蛋白质的核酸分子的方法中和用于核酸分子扩增中以用于检测或用于进一步研究中。如本文提供的低聚化合物(尤其是引物和探针)与核酸的杂交可以通过本领域已知的方法检测。这样的方法可包括将酶与寡核苷酸缀合、放射性标记寡核苷酸或任何其它合适的检测方法。也可以制备使用这样的检测方式检测样品中所选蛋白质的水平的试剂盒。
作为一个非限制性实例，将用一种或多种本文提供的低聚化合物处理的细胞或组织内的表达模式与未用低聚化合物处理的对照细胞或组织进行比较，并对产生的模式进行基因表达差异水平的分析，因为它们与例如所检查基因的疾病相关性、信号传导途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能相关。这些分析可以在刺激或未刺激的细胞上且在存在或不存在影响表达模式的其他化合物和/或低聚化合物的情况下进行。
本领域已知的基因表达分析方法的实例包括DNA阵列或微阵列(Brazma和Vilo，FEBS Lett.，2000，480，17-24；Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16)、SAGE(基因表达的系列分析)(Madden等，Drug Discov.Today，2000，5，415-425)、READS(消化cDNA的限制性内切酶扩增)(Prashar和Weissman，Methods Enzymol.，1999，303，258-72)、TOGA(总基因表达分析)(Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，1976-81)、蛋白质阵列和蛋白组学(Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Jungblut等，Electrophoresis，1999，20，2100-10)、表达序列标签(EST)测序(Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Larsson等，J.Biotechnol.，2000，80，143-57)、消减RNA指纹(SuRF)(Fuchs等，Anal.Biochem.，2000，286，91-98；Larson等，Cytometry，2000，41，203-208)、消减克隆、差异展示(DD)(Jurecic和Belmont，Curr.Opin.Microbiol.，2000，3，316-21)、比较基因组杂交(Carulli等，J.CellBiochem.Suppl.，1998，31，286-96)、FISH(荧光原位杂交)技术(Going和Gusterson，Eur.J.Cancer，1999，35，1895-904)和质谱学方法(To，Comb.Chem.High Throughput Screen，2000,3，235-41)。
本领域技术人员根据本公开内容将能够制备低聚化合物以实施本文公开的方法，所述化合物包含基本上任何可行长度的连接单体亚单元的连续序列。这样的低聚化合物包括至少一个，优选地多个本文提供的三环核苷，并且也可以包括其他单体亚单元，包括但不限于核苷、修饰的核苷、包含糖替代基团的核苷和核苷模拟物。
虽然在某些实施方案中，本文提供的低聚化合物可以如所描述的使用，但是提供下述实施例仅仅用于举例说明而不意味着限制。
无论对于单个可分离特征的可选项(比如，例如对于q1、q4、T1或T2、或者Bx、或者A1、A2、X、h、Y或n所给出的任何可选项)在本文中是否作为“实施方案”列出，都应当理解这样的可选项可以自由地组合以形成本文公开的本发明的各种独立实施方案。
实施例(一般方法)
1H和13C NMR谱分别在300MHz和75MHz Bruker谱仪上记录。
核苷亚磷酰胺的合成
核苷亚磷酰胺的制备按照本文和本领域(比如但不限于美国专利6,426,220和WO02/36743)中所示例的方法进行。
低聚化合物的合成
根据本发明使用的低聚化合物可以通过固相合成方便且常规地进行制备。
低聚化合物∶可以使用标准亚磷酰胺化学法，采用碘氧化，在自动DNA合成仪(例如Applied Biosystems，型号394)上合成未取代的和取代的磷酸二酯(P＝O)低聚化合物。
在某些实施方案中，合成硫代磷酸酯核苷间连接(P＝S)，类似于磷酸二酯核苷间连接，除了以下不同：利用3,H-1,2-苯并二硫杂环戊二烯(benzodithiole)-3-酮1,1-二氧化物在乙腈中的10％w/v溶液进行硫杂化，用来氧化亚磷酸酯连接。硫杂化反应步骤时间提高到180秒，在常规加帽步骤之后进行。在从CPG柱切下并在55℃的浓氢氧化铵中去封闭(12-16小时)之后，用大于3倍体积的乙醇从1M NH4OAc溶液中沉淀来回收低聚化合物。亚膦酸酯核苷间连接可以如美国专利5,508,270中描述的制备。烷基膦酸酯核苷间连接可以如美国专利4,469,863中描述的制备。3’-脱氧-3’-亚甲基膦酸酯核苷间连接可以如美国专利5,610,289或5,625,050中描述的制备。亚磷酰胺核苷间连接可以如美国专利5,256,775或美国专利5,366,878中描述的制备。烷基硫代膦酸酯核苷间连接可以如公布的PCT申请PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(分别公布为WO94/17093和WO 94/02499)中描述的制备。3'-脱氧-3'-氨基氨基磷酸酯核苷间连接可以如美国专利5,476,925中描述的制备。磷酸三酯核苷间连接可以如美国专利5,023,243中描述的制备。硼烷磷酸酯(borano phosphate)核苷间连接可以如美国专利5,130,302和5,177,198中描述的制备。
具有一个或多个非含磷核苷间连接的低聚化合物包括而不限于亚甲基甲基亚氨基连接的寡核苷(也称为MMI连接的寡核苷)、亚甲基二甲基亚肼基连接的寡核苷(也称为MDH连接的寡核苷)、亚甲基羰基氨基连接的寡核苷(也称为酰胺-3连接的寡核苷)、和亚甲基氨基羰基连接的寡核苷(也称为酰胺-4连接的寡核苷酸)、以及具有例如交替MMI和P＝O或P＝S连接的混合主链低聚化合物都可以如美国专利5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240和5,610,289中描述的制备。
甲酰基和硫代甲酰基核苷间连接可以如美国专利5,264,562和5,264,564中描述的制备。氧化乙烯核苷间连接可以如美国专利5,223,618中描述的制备。
低聚化合物的分离和纯化
在从可控多孔玻璃固体载体或其它支持介质上切下并在55℃的浓氢氧化铵中去封闭12-16小时，用>3倍体积的乙醇从1M NH4OAc中沉淀来回收低聚化合物(包括而不限于寡核苷酸和寡核苷)。通过电喷雾质谱(分子量测定)和毛细管凝胶电泳分析合成的低聚化合物。通过正确分子量与-16amu产物(+/-32+/-48)的比率来确定合成中获得的硫代磷酸酯和磷酸二酯连接的相对量。对于某些研究，通过HPLC纯化低聚化合物，如Chiang等，J.Biol.Chem.1991，266，18162-18171中所描述的。用HPLC-纯化的材料得到的结果一般类似于由非-HPLC纯化的材料得到的结果。
实施例1∶化合物10的制备
按照Steffens等，Helvetica Chimica Acta，1997，80，2426-2439公开的方法制备化合物1，并得到端基异构的混合物(α:β＝4:1)。用碘乙酸乙酯烷基化得到呈4种异构体混合物的化合物2，随后在-78℃下用LiHDMS和TBDMS-Cl处理将其转化为硅烷烯醇。此时，通过柱色谱分离端基异构混合物。用Et2Zn处理3的α-端基异构体，得到4(产率约40％)与约30％的相应差向异构环丙烷。然后，通过用TMS-三氟甲磺酸酯处理将化合物4转化为烯糖5。用全甲硅烷基化的(persilylated)胸腺嘧啶进行5的NIS介导的核苷化(nucleosidation)立体特异性地得到碘代核苷6，随后通过用Bu3SnH基团还原将其去碘化(deiondinated)为三环核苷7。用在吡啶中的HF除去甲硅烷基保护基，得到化合物8，接着进行三苯甲基化(tritylated)和亚磷酸酯化(phosphitylated)以得到期望的亚磷酰胺10。通过谱分析确认所有的结构。
实施例2
化合物15的制备
如实施例1中示例说明的制备化合物7。用KOH进行7的碱水解，得到酸11，通过用Fmoc保护的氨丙醇和冷凝剂EDC处理将其转化为化合物12。除去甲硅烷基保护基，接着进行三苯甲基化和亚磷酸酯化得到期望的亚磷酰胺15。通过谱分析确认所有的结构。
实施例3
化合物19的制备
如实施例2中示例说明的制备化合物11，并且用十六醇和作为冷凝剂的EDC将其酯化为化合物16。用HF进行脱甲硅烷基化，接着用DMT-Cl进行三苯甲基化和进行亚磷酸酯化得到期望的亚磷酰胺19。通过谱分析确认所有的结构。
实施例4
化合物21的制备
如实施例2中示例说明的制备化合物11，并且用单独保护的1,3-二氨基丙烷和作为冷凝剂的EDC将其转化为化合物20。用HF进行脱甲硅烷基化得到化合物21。通过谱分析确认所有的结构。
实施例5
低聚化合物的制备
按照本领域众所周知的合成方法(其中一些在本文中示例说明)，使用实施例中示例说明的一种或多种亚磷酰胺化合物例如DMT亚磷酰胺(参见化合物10、化合物15或化合物19)制备具有至少一个三环核苷的低聚化合物。
实施例6
用于Tm研究的低聚化合物的制备
按照标准自动化DNA合成方案，制备包含一个或多个三环核苷的低聚化合物用于Tm研究。在从固体载体切下之后，通过离子交换HPLC纯化该低聚化合物，并且使用标准方法通过LCMS分析。当与DNA或RNA双链化时，将修饰的10聚体低聚化合物的Tm与未修饰的10聚体DNA寡核苷酸进行比较。
使用Cary 100Bio分光光度计测定Tm，并且使用Cary Win UV热程序(thermal program)测量吸光度相对于温度。对于Tm实验，在150mMNaCl、10mM磷酸盐、0.1mM EDTA的缓冲液，pH 7中制备浓度为1.2μM的低聚化合物。在混合等体积的所选择低聚化合物和互补RNA或DNA之后，在85℃下测定的浓度为1.2μM。通过将双链体加热至90℃持续5分钟然后冷却至室温使该低聚化合物与互补RNA或DNA杂交。使用分光光度计进行Tm测量，同时从15℃开始以0.5℃/分钟的速率加热在比色杯中的双链体溶液直到温度为85℃。使用Vant Hoff算法(A260相对温度曲线)，使用非自身互补序列测定Tm值，其中将与双链体有关的最小吸光度和与非双链体单链有关的最大吸光度人工整合到程序中。
与DNA或RNA双链体化的未修饰低聚化合物A01的Tm分别为47.9℃和48.3℃。各个核苷间连接基团为磷酸二酯。后面没有下标的各个核苷为β-D-2'-脱氧核糖核苷，后面有下标“a”至下标“f”的各个核苷为如下定义的。
实施例7
用于Hela细胞摄取研究的低聚化合物的制备
在37℃下，在补充有10％(v/v)胎牛血清(Amimed)、100单位/ml青霉素(Invitrogen)和100μg/mL链霉素(Invitrogen)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Invitrogen)中培养Hela细胞。对于转染实验，在转染前24小时，将1×105个细胞一式两份接种在六孔培养板中，其中一半含盖玻片。然后，用在DMEM+/+(FCS，P/S)中含有序列5'-T-t-T-t-T-t-T-t-T-t-FAM-3'[其中T为脱氧胸苷，t为任一个tceeT(实施例6的下标b)、tchdT(实施例6的下标e)或tcT(实施例6的下标a)，且FAM为6-羧基荧光素]的寡核苷酸溶液(10mM最终浓度)代替培养基。
在37℃下48小时之后，除去转染培养基，用2×1ml PBS洗涤细胞，并将其再悬浮在1ml新鲜DMEM+/+中。使用低聚甲醛的溶液(1ml，在PBS中3.7％)进行盖玻片上细胞的固定，持续10分钟，接着用PBS(2×1ml)洗涤，用Triton x-100(0.2％，Promega)渗透细胞膜10分钟，并且用PBS(2×1ml)洗涤。用几滴聚乙烯醇(Mowiol)和核染剂40,60-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)处理盖玻片。在转染48小时后，通过荧光显微镜(LeicaDMI6000B，Leica Microsystems；软件∶Leica Application Suite)分析细胞。
显微图像显示在用含有tchdT(实施例6的下标e)的寡核苷酸处理的细胞的细胞溶质中有强荧光素荧光，而当使用含有tceeT(实施例6的下标b)或tcT(实施例6的下标a)的寡核苷酸时没有观察到荧光。
实施例8
用于HEK293T细胞摄取研究的低聚化合物的制备
在37℃下，在补充有10％(v/v)胎牛血清(Amimed)、100单位/ml青霉素(Invitrogen)和100μg/mL链霉素(Invitrogen)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Invitrogen)中培养HEK293T细胞。对于转染实验，在转染前24小时，将2×105个细胞一式两份接种在六孔培养板中，其中一半含有盖玻片。然后，用在DMEM+/+(FCS，P/S)中含有序列5'-T-t-T-t-T-t-T-t-T-t-FAM-3'[其中T为脱氧胸苷，t为任一未修饰的脱氧胸苷、tceeT(实施例6的下标b)、tchdT(实施例6的下标e)或tcT(实施例6的下标a)，和FAM为6-羧基荧光素]的寡核苷酸溶液(10mM最终浓度)代替培养基。在37℃下48小时之后，除去转染培养基，用2×1ml PBS洗涤细胞，并将其再悬浮在1ml新鲜DMEM+/+中。使用低聚甲醛的溶液(1ml，在PBS中3.7％)进行盖玻片上细胞的固定，持续10分钟，接着用PBS(2×1ml)洗涤，用Triton x-100(0.2％，Promega)渗透细胞膜10分钟，并且用PBS(2×1ml)洗涤。用几滴聚乙烯醇(Mowiol)和核染剂40,60-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)处理盖玻片。在转染48小时后，通过荧光显微镜(LeicaDMI6000B，Leica Microsystems；软件∶Leica Application Suite)分析细胞。
显微镜图像显示在用含有tchdT的寡核苷酸(实施例5的下标e)处理的细胞的细胞溶质中有强荧光素荧光，而当使用含有tceeT(实施例5的下标b)或tcT(实施例5的下标a)的寡核苷酸时没有观察到荧光。
Claims (23)
1.通式I所述的三环核苷∶
其中∶
-Bx为杂环碱基部分；
-T1和T2中一个为羟基(-OH)或保护的羟基，且T1和T2中另一个为磷酸酯或反应性磷基团；
-q1和q2各自独立地为H、F或Cl，
-q3、q4和q5的至少一个独立地为通式–A1-Xh-A2-Yn描述的基团，其中：
-A1为Ck–烷基、Ck–链烯基或Ck-炔基，k为选自0至20范围的整数，
-Xh为-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NR-、-O-、-S-、-NR-、-C(＝O)R、-C(＝O)OR、-C(＝O)NR2-、-OR、-SR或-NR2，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基、丁基、乙酰基和2-羟乙基，且h为0或1，
-A2为Ci-烷基、Ci-链烯基或Ci-炔基，i为选自0至20范围的整数，
-Y为连接到A1和/或A2上任一个碳原子的取代基，选自-F、-Cl、-Br、＝O、-OR、-SR、-NR2、-NR3 +、NHC(＝NH)NH2、-CN、-NC、-NCO、-NCS、-SCN、-COR、-CO2R、CONR2、–R，每个R独立地选自H、甲基、乙基、丙基、丁基、乙酰基和2-羟乙基，且n为0、1、2、3、4、5或6，
-其中k+i等于至少1，
-q3、q4和q5的其它基团独立地为H、F或Cl，
-z1和z2中一个为H，且z1和z2中另一个为H、-OH、F、Cl、OCH3、OCF3、OCH2CH3、OCH2CF3、OCH2-CH＝CH2、O(CH2)2-OCH3、O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2、OCH2C(＝O)-N(H)CH3、OCH2C(＝O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2或OCH2-N(H)-C(＝NH)NH2。
2.权利要求1的三环核苷，其中Bx为尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。
3.前述权利要求中任一项的三环核苷，其中T1为羟基或保护的羟基，并且其中T2为选自H-膦酸酯或亚磷酰胺的反应性磷基团。
4.前述权利要求中任一项的三环核苷，其中T1为4,4'-二甲氧三苯甲基，且T2为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺或受控多孔玻璃表面。
5.前述权利要求中任一项的三环核苷，其中q3为通式–A1Xh-A2-Yn所描述，且q4和q5彼此独立地为H、F或Cl。
6.前述权利要求中任一项的三环核苷，其中k为3至16的整数，h为0，i为0，且n为1、2或3。
7.前述权利要求1至5中任一项的三环核苷，其中k为1，h为1，X为-O-、COO-、CONH-或CONR-，i为3至16的整数，且n为1、2或3。
8.前述权利要求6至7中任一项的三环核苷，其中n为1且Y选自NH2、NHR、NR2、NR3 +和NHC(＝NH)NH2，R具有上述定义的含义。
9.权利要求8的三环核苷，其中Y处于ω-位。
10.前述权利要求中任一项的三环核苷，其中i+k的和为3至16的整数，特别是3至12，更特别地5至10。
11.前述权利要求中任一项的三环核苷，其中A1为CH2，h为1，Xh为-C(＝O)O-，-C(＝O)NH-，A2为C2至C16烷基，Yn为NH2，且n为0或1。
12.权利要求1的三环核苷，其中A1为CH2。
13.权利要求1的三环核苷，其中k为0。
14.三环核苷，选自
其中Bx选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤。
15.低聚化合物，其包含根据权利要求1至0中任一项的至少一种三环核苷，其中所述低聚化合物包含8至40个单体亚单元。
16.权利要求15的低聚化合物，其中每个Bx独立地为尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。
17.权利要求15至16中任一项的低聚化合物，其中每个核苷间连接基团独立地为磷酸二酯核苷间连接基团或硫代磷酸酯核苷间连接基团。
18.权利要求15至17中任一项的低聚化合物，其包含第一区域，该第一区域具有至少两个连续的式II的三环核苷。
19.权利要求18的低聚化合物，其包含具有至少两个连续的单体亚单元的第二区域，其中第二区域中的每个单体亚单元为不同于所述第一区域的式II三环核苷的修饰核苷。
20.权利要求19的低聚化合物，其进一步包含位于所述第一和第二区域之间的第三区域，其中所述第三区域中的每个单体亚单元独立地为不同于第一区域的各个式II三环核苷和第二区域的各个单体亚单元的核苷或修饰核苷。
21.权利要求15至20中任一项的低聚化合物，其包含具有6至14个连续单体亚单元的内部区域、所述内部区域在每侧侧接1至5个连续单体亚单元的外部区域的带间隙的低聚化合物，其中每个外部区域的每个单体亚单元为式II的三环核苷，并且内部区域中的每个单体亚单元独立地为核苷或修饰核苷。
22.权利要求15至21中任一项的低聚化合物，其包含一个或几个选自以下的核苷酸嵌段：
其中T3和T4具有上述给出的含义。
23.根据权利要求1至0中任一项的三环核苷用于寡核苷酸固相合成方法中的用途。
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